ES2897740T3 - Normalización del cultivo de células endoteliales de la córnea - Google Patents

Abstract

Uso de un inhibidor de la fibrosis para la normalización del cultivo de células endoteliales de la córnea, en el que dicho inhibidor de la fibrosis comprende un agente inhibidor de la señal del factor de crecimiento por transformación (TGF) β.

Description

DESCRIPCIÓN

Normalización del cultivo de células endoteliales de la córnea

[Campo técnico]

La presente invención está dirigida a una técnica y un procedimiento para cultivar una célula endotelial corneal en un estado normal.

[Técnica antecedente]

La información visual se reconoce de tal manera que la luz que entra en la córnea, que es un tejido transparente en la parte delantera del globo ocular, llega a la retina, estimulando la célula nerviosa de la retina, y una señal eléctrica generada se transfiere a través del nervio óptico a la corteza visual del cerebro. Para obtener una visión favorable, la córnea debe ser transparente. La transparencia de la córnea se mantiene gracias a las células endoteliales de la córnea, que funcionan como una bomba y una barrera para mantener un contenido de humedad constante.

Las células endoteliales de la córnea humana están presentes en una densidad de aproximadamente 3.000 por 1 milímetro cuadrado al nacer. Sin embargo, una vez que las células endoteliales de la córnea están dañadas, no tienen la capacidad de regenerarse. En la distrofia corneal endotelial o queratopatía bullosa, causada por una disfunción del endotelio corneal debida a diversas causas, la córnea se vuelve opaca debido al edema, lo que provoca una importante pérdida de visión. Actualmente, la queratoplastia perforante se realiza en la queratopatía bullosa, en la que se trasplantan las tres capas, es decir, la epidermis, el estroma y el endotelio, de la córnea. Sin embargo, la donación de córneas es insuficiente en Japón, y el número de trasplantes de córnea realizados en el país es de unos 1.700 al año, mientras que hay unos 2.600 pacientes que están en lista de espera para un trasplante de córnea.

En los últimos años, con el objetivo de reducir el riesgo de respuesta de rechazo o las complicaciones postoperatorias y obtener un mejor rendimiento visual, está ganando atención el concepto de "trasplante parcial", en el que sólo se trasplanta un tejido dañado. Entre los tipos de trasplantes de córnea, se está empezando a realizar un trasplante de tejidos del estroma, es decir, la queratoplastia lamelar profunda, un trasplante de tejidos endoteliales de la córnea, es decir, la queratoplastia endotelial automatizada con tira de Descemet, y otros similares. Además, ya se ha aplicado clínicamente el trasplante de epitelio mucoso cultivado, en el que se trasplanta epitelio corneal o mucosa oral cultivada ex vivo en lugar de epitelio corneal. También se tiene en cuenta un procedimiento para trasplantar endotelio corneal cultivado ex vivo. Las láminas similares al endotelio corneal, que consisten en una capa endotelial corneal que se cultiva sobre una capa de colágeno, se conocen para su uso en el trasplante de endotelio corneal (véase la literatura de patente 1). Sin embargo, en lo que respecta a las células endoteliales de la córnea, y en particular a las células endoteliales de la córnea derivadas de seres humanos, los donantes de córneas son limitados, y el cultivo es difícil in vitro. Por lo tanto, se requiere tiempo y coste para obtener la cantidad de células cultivadas necesarias para el trasplante.

Las células madre embrionarias (ES) humanas tienen una gran capacidad de autorreplicación y multipotencia, por lo que están llamando la atención como forma de aplicación médica. Sin embargo, las células madre embrionarias humanas provocan fácilmente la muerte celular debido a una operación de dispersión de las células durante un proceso de cultivo. Por lo tanto, ha habido un problema de reducción significativa del número de células en la parte práctica. En los últimos años, se ha encontrado que la muerte celular causada cuando se cultivan células ES humanas es causada por la activación de la Rho quinasa (ROCK), y que la inhibición de ROCK suprime en gran medida la muerte celular; y se ha informado de que es posible cultivar en masa células ES humanas y producir células cerebrales utilizando un inhibidor de ROCK, Y-27632, o similar (Literatura no de Patente 1). En consecuencia, los inventores han divulgado un procedimiento de cultivo masivo de células endoteliales de la córnea utilizando Y-27632 o similares (Literatura de Patente 2).

Además de esto, la Literatura de Patente 3 divulga un procedimiento de neuroesferas utilizando células precursoras endoteliales de la córnea.

La Literatura de Patentes 4 divulga el uso de un inhibidor de la quinasa TGF-p y un inhibidor de la MAPK p38 para el cultivo de células epiteliales.

Además, las Literaturas no de Patente 2 y 4 describen la implicación de TGF-p, p38 MAPK y Smad en una enfermedad endotelial corneal específica grave. La literatura no de Patente 3 describe las perspectivas de crecimiento de las células endoteliales de la córnea humana utilizando un inhibidor de ROCK. La Literatura no de Patente 5 indica que la fibrosis durante un trastorno grave de la córnea se debe a la IL-1p, y debido a la activación de la p38 MAPK durante el curso de la misma. La literatura no de Patente 6 indica que la fibrosis presente en el exceso de lesiones externas debidas a la congelación con conejos se suprime utilizando un inhibidor con activación de p38 MAPK. En la literatura no de patente 7 se describe que en los medios convencionales de cultivo de células endoteliales de la córnea, si se produce el subcultivo, el crecimiento mientras se mantiene un estado normal se hace imposible. La literatura no de Patente 8 divulga un medio de cultivo para las células endoteliales de la córnea. Se describe que este medio de cultivo incluye FBS, EGF y NGF, y no se puede realizar un cultivo favorable en este medio de cultivo si las células que se van a cultivar no provienen de organismos en su edad joven. La literatura no de Patente 9 divulga un medio de cultivo para células endoteliales de la córnea que utiliza FGF básico. La literatura no de Patente 10 divulga un medio de cultivo para las células endoteliales de la córnea utilizando colagenasa. La literatura no de Patente 11 divulga un medio de cultivo para células endoteliales de la córnea que utiliza un medio de cultivo condicionado. Se han desarrollado diversos tipos de medios de cultivo como en las literaturas no de Patente 8 a 11; sin embargo, como se indica en la literatura no de Patente 7, se sabe que en los medios de cultivo convencionales de células endoteliales de la córnea, si se produce el subcultivo, el crecimiento se hace imposible mientras se mantiene un estado normal. Las literaturas no de Patente 12 a 14 también describen la fabricación de una lámina endotelial corneal cultivada. Las literaturas no de Patente 9 a 12 y 15 divulgan el trasplante de células madre derivadas del tejido ocular humano y del endotelio autocorneal. Las literaturas no de Patente 16 y 17 también describen la fabricación de una lámina endotelial corneal cultivada.

[Lista de citas]

[Literatura de patente]

Literatura de patente 1: Publicación japonesa Abierta al público No. 2005-229869

Literatura de patente 2: Publicación internacional No. WO 2009/28631

Literatura de patente 3: Publicación japonesa Abierta al público No. 2006-187281

Literatura de patente 4: Publicación de la solicitud de patente estadounidense No. 2006/0234911 [Literatura no de patente]

Literatura no de patente 1: Watanabe K., et al., Nat Biotechnol.2007, 25, pp 681

Literatura no de patente 2: Saika, Dai 324 Kai Kansai Ganshikkan Kenkyukai Tokubetsu Koen [Conferencia especial en el 324° Grupo de Investigación de Enfermedades Oculares de Kansai] "Jouhi-Kanyoukei Ikou To Ganshikkan [Transición epitelio-sistema mesenquimal y enfermedad ocular]" 23 de junio de 2010, http://ohpth.kpu-m.ac.jp/wp-content/uploads/2010/07/tit le20100623.doc

Literatura no de patente 3: Koizumi, Saisentan - Programa Jisedai Kenkyu Kaihatsu Shien [Programa de apoyo a la investigación y el desarrollo de próxima generación http://www.jsps.go.jp/jjisedai/data/life/LS117_outline.pdf

Literatura no de patente 4 : Sumioka T., et al., Molecular Vision 2008; 14:2272-2281

Literatura no de patente 5: Lee JG., et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009; 50: 2067-2076

Literatura no de patente 6: Song SK., et al, Invest Ophthalmol Vis Sci.2010; 51: 822-829)

Literatura no de patente 7: Peh GS., et al., ARVO 2011, 561 Corenal Endothelium: Salud y Enfermedades 6595 (1-5 de mayo de 2011) Literatura no de patente 8: Nancy C. Joyce, et al., Cornea 2004; 23(Suppl.1): S8-S19)

Literatura no de patente 9: MiyataK., et al., Cornea 20(1):59-63,2001

Literatura no de patente 10: Wei Li, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007; 48:614-620

Literatura no de patente 11: Xiaoyan Lu, et al., Molecular Vision 2010; 16:611-622

Literatura no de patente 12: Mimura T., et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004 Sep; 45(9): 2992-2997 Literatura no de patente 13: Mimura T., et al., Exp Eye Res. 2003 Jun; 76(6): 745-751

Literatura no de patente 14: Yokoo S., et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Mayo; 46(5): 1626-1631 Literatura no de patente 15: Amano S et al., Curr Eye Res. 2003 Jun; 26(6):313-318

Literatura no de patente 16: Ide T et al., Biomateriales. 2006 Feb; 27(4): 607-14. Epub 2005 Ago 15.

Literatura no de patente 17: Sumide T et al., FASEB J. 2006 Feb; 20(2):392-4. Epub 2005 Dic 9.

[Resumen de la invención]

[Solución del problema]

Los inventores han encontrado una técnica que permite cultivar células endoteliales de la córnea manteniendo sus funciones normales mediante la inhibición de la vía del factor de necrosis tumoral p (TGF-p). Como resultado, se ha hecho posible cultivar una cantidad relativamente grande de células endoteliales de la córnea que tienen funciones normales.

[Efectos ventajosos de la invención]

La presente invención proporciona una técnica que es capaz de hacer crecer una célula endotelial corneal manteniendo sus funciones normales, lo cual era difícil de conseguir antes. Las funciones normales incluyen las funciones bioquímicas de las células endoteliales de la córnea, como la ZO-1 y la Na+/K+-ATPasa, la posibilidad de trasplante a primates y similares, y abarcan las funciones para lograr el trasplante de córnea.

[Breve descripción de los dibujos]

[Figura 1] La Figura 1 muestra un cambio morfológico en el cultivo de células de mono cynomolgus y de humanos en un procedimiento convencional. El lado superior muestra el cambio morfológico en los monos cynomolgus y la parte inferior muestra el cambio morfológico en los humanos. El resultado del cultivo es bajo las condiciones de DMEM 10 % FBS 2 ng/ml de FGF básico para los monos cynomolgus, mientras que el resultado del cultivo para los humanos es bajo las condiciones de Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Líquido 8 % FBS 200 mg/ml CaC^2H2O+0,08 % de ácido condroitín sulfúrico 20 pg/ml de ácido ascórbico 50 pg/ml de gentamicina 5ng/ml de EGF. El lado izquierdo muestra las células del endotelio corneal en una forma normal, pero se produce fácilmente un cambio morfológico mediante el cultivo a largo plazo o el subcultivo, como se muestra en el lado derecho.

[Figura 2] La Figura 2 muestra que se pierde una función normal en el cultivo basado en la técnica anterior. Los dos paneles de la izquierda muestran el resultado de la inmunotinción. El panel del extremo izquierdo muestra una célula endotelial de córnea de mono (MCEC) que fue cultivada en una forma normal, y el segundo panel de la izquierda muestra una MCEC que fue cambiada morfológicamente a un fenotipo fibroblástico debido al cultivo a largo plazo. Las dos imágenes superiores de los resultados de la inmunotinción muestran la tinción con ZO-1 mientras que las dos imágenes inferiores muestran la tinción con Na+/K+-ATPasa. El panel superior derecho muestra los resultados obtenidos mediante transferencia Western. El panel inferior derecho muestra los resultados utilizando la PCR en tiempo real. Tanto en el panel superior derecho como en el oanel inferior derecho, la parte izquierda muestra una MCEC que fue cultivada normalmente, mientras que la parte derecha muestra una MCEC morfológicamente cambiada a un fenotipo fibroblástico por el cultivo convencional a largo plazo. Para los resultados de transferencia Western y p Cr en tiempo real, se muestra la tinción con un anticuerpo o sonda dirigida a la Na+/K+-ATPasa, ZO-1 y g A p DH, empezando por la parte superior.

[Figura 2A] La Figura 2A muestra un fibroblasto de célula endotelial corneal de primate (CEC) que genera una matriz extracelular anormal, es decir, la función normal se pierde cuando se cultiva según la técnica anterior. (A) muestra la expresión de fibronectina y colágeno tipo 1 en células con fenotipo de fibroblasto y fenotipo normal. La fila superior muestra la fibronectina, y la fila inferior muestra el colágeno tipo 1. El lado izquierdo muestra un fenotipo de célula normal, y el lado derecho muestra un fenotipo de fibroblasto. El fenotipo de los fibroblastos indicaba un exceso de matriz extracelular como la fibronectina y el colágeno tipo 1. Por otro lado, el fenotipo celular normal ha perdido completamente su capacidad de tinción. (B) muestra la transferencia Western que muestra la expresión de la proteína fibronectina en células con fenotipo de fibroblastos y fenotipo normal. El GAPDH se utiliza como control. El nivel de expresión proteica de la fibronectina estaba más regulado en las células con fenotipo de fibroblastos que en las células con fenotipo normal. (C) muestra los resultados semicuantitativos de la PCR de la expresión de colágeno tipo 1, tipo 4 y tipo 8, fibronectina, integrina a5 e integrina p1 (enumerados en orden desde la parte superior) en células de fenotipo fibroblástico (derecha) y fenotipo normal (izquierda) de. GAPDH se utiliza como control. Mediante el análisis semicuantitativo por PCR, los transcritos de colágeno tipo 1 (a1(I)ARNm) se expresaron abundantemente en las células de fenotipo fibroblástico, mientras que la expresión de a1(I)ARNm disminuyó en las células de fenotipo normal. Mientras que el ARNm de a1 (IV) y el ARNm de a1 (VIII), que eran un fenotipo de colágeno de la membrana basal, se expresaban en las células del fenotipo normal y del fenotipo de fibroblastos, el grado de expresión era menor en las células del fenotipo normal que en las del fenotipo de fibroblastos. Mientras que el ARNm de la fibronectina y la integrina a5 se observó en el fenotipo de fibroblastos, el ARNm de los dos tipos no se expresó en las células del fenotipo normal. En cuanto al ARNm de la integrina p1, se observó un nivel de expresión similar en ambos fenotipos.

[Figura 3] La Figura 3 muestra la fibrosis en un procedimiento convencional. Un medio de cultivo condicionado (Medio condicionado) para las células alimentadoras 3T3 suprime el cambio fibroblástico (transformación) (centro), pero se indica que el subcultivo da lugar a la transformación después de todo (derecha). El lado izquierdo muestra que cuando se cultivó una célula endotelial de córnea humana en las condiciones de Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Líquido 8 % FBS 200mg/ml CaC^2H2O 0,08 % de ácido condroitín sulfúrico 20 pg/ml de ácido ascórbico 50 pg/ml de gentamicina 5ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF), la célula se transformó de forma fibroblástica. El centro muestra un resultado con un medio de cultivo similar como medio de cultivo condicionado utilizando 3T3, que es un fibroblasto derivado de ratón. La parte derecha es una fotografía (obtenida con un microscopio en contraste de fase) de una célula endotelial de córnea humana 3T3 7 días después de su cultivo y subcultivo en un medio de cultivo condicionado. Se trata de unas células agrandadas que se transformaron en un fenotipo de fibroblasto y se disponen de forma multicapa. Por ello, se entiende que se genera fibrosis cuando se realiza el subcultivo en un medio de cultivo convencional.

[Figura 4] La Figura 4 muestra los resultados de transferencia Western que demuestran que la vía Simad, la vía p38 MAPK y la vía JNK se activan en una célula fibrótica de una célula endotelial de córnea de mono. En cada panel, el lado izquierdo muestra una célula endotelial de córnea de mono (MCEC) en un fenotipo normal, y el lado derecho muestra una MCEC que está morfológicamente cambiada a un fenotipo de fibroblasto. El panel izquierdo muestra los resultados de transferencia Western con anticuerpos dirigidos a pSmad2, Smad2, pERK1/2 y ERK1/2 (enumerados desde la parte superior). El panel derecho muestra los resultados de transferencia Western con anticuerpos dirigidos a pp38, p38, pJNK y JNK (enumerados desde la parte superior). Se confirma que pueden obtenerse resultados diferentes en función del estado de crecimiento de las células, ya que en la fosforilación de ERK influye no sólo el cambio debido a la fibrosis, sino que también influye el crecimiento celular.

[Figura 5] La Figura 5 muestra que la señalización del TGF-p fue inhibida por un inhibidor de la fosforilación de un receptor, que fue capaz de suprimir la transformación del endotelio de la córnea de mono. La imagen de la izquierda muestra el cultivo de células de un endotelio corneal de un mono cynomolgus con DMEM 10 %FBS 2ng/ml de FGF básico (también referido aquí como medio de cultivo normal), que fue morfológicamente cambiado al fenotipo de fibroblasto. La imagen de la derecha muestra el cultivo celular de una córnea del mismo sujeto que el medio de cultivo normal pero con un inhibidor de la fosforilación de un receptor (es decir, SB431542), donde se inhibió la señalización del TGF-p,. Se reconoce una capa de células poligonales con poca diferencia de tamaño, lo que permite entender que el cambio morfológico se suprime en las células de fenotipo fibroblástico.

[Figura 6] La Figura 6 muestra que la pérdida de la proteína asociada a la función debido a la fibrosis de una célula endotelial de córnea de mono fue suprimida por la inhibición de la señal del TGF-p. El panel de la izquierda muestra una MCEC que cambió morfológicamente al fenotipo de fibroblasto cuando se cultivó el endotelio corneal de un mono cynomolgus con DMEM 10 %FBS 2ng/ml de FGF básico (medio de cultivo normal). El segundo panel desde la izquierda de las imágenes de inmunotinción muestra una inmunotinción de ZO-1 (imagen superior) y Na+/K+-ATPasa (imagen inferior), que son marcadores asociados a la función de las MCEC que fueron tratadas con SB431542 y cultivadas en un fenotipo normal. El panel superior derecho muestra los resultados de transferencia Western. El panel inferior derecho muestra los resultados de la PCR en tiempo real. Tanto en el panel superior derecho como en el panel inferior derecho, el lado izquierdo muestra una MCEC, que fue tratada con SB431542 y cultivada en un fenotipo normal, y el lado derecho muestra una MCEC que fue cambiada morfológicamente a un fenotipo de fibroblasto. Tanto para los experimentos de transferencia Western como para los de PCR en tiempo real, la tinción se realizó con un anticuerpo o una sonda dirigida a la Na+/K+-ATPasa, ZO-1 y GAPDH (enumerados en orden desde la parte superior).

[Figura 7] La Figura 7 es un diagrama que muestra la adición de TGF-p para inducir la transformación, perdiendo así una proteína asociada a la función, con el fin de confirmar que una señal de TGF-p está asociada a la transformación de un endotelio corneal de mono. Las imágenes de la fila superior muestran las MCEC de un control; y las imágenes inferiores muestran el resultado de las células tratadas con TGF-p. El panel de la izquierda muestra fotografías de una forma celular utilizando un microscopio en contraste de fase. El centro muestra los resultados de la tinción con un anticuerpo dirigido a la Na+/K+-ATPasa. El lado derecho muestra los resultados de la tinción con un anticuerpo dirigido a ZO-1.

[Figura 8] La Figura 8 es un diagrama que muestra una célula endotelial de córnea de mono que se vuelve fibrótica y cambia morfológicamente por el TGF-p, perdiendo así una proteína asociada a la función. El cambio está directamente relacionado con la concentración de TGF-p (en el panel de la izquierda, se muestran 0ng/ml, 1ng/ml, 3ng/ml, 10ng/ml y 30ng/ml de la izquierda. En el panel de la derecha, se muestran 0ng/ml, 1ng/ml y 10ng/ml desde la izquierda). En el panel superior izquierdo, se muestran los resultados de transferencia Western con anticuerpos dirigidos a la Na+/K+-ATPasa, ZO-1 y GAPDH. En el lado derecho, se muestran los resultados de la tinción con anticuerpos dirigidos a pSmad2 y Smad2 desde la parte superior.

[Figura 9] La Figura 9 muestra resultados que indican que la transformación se suprime al inhibir la señalización del TGF-p utilizando un inhibidor de la fosforilación de un receptor en un endotelio corneal humano, cultivando así un endotelio normal. El lado izquierdo es un control (medio de cultivo normal), y el lado derecho muestra un resultado de tinción con SB431542.

[Figura 9A] La Figura 9A muestra que el SB431542 mantiene las funciones de una célula endotelial de la córnea humana (HCEC) y suprime el cambio de la célula endotelial de la córnea humana al fenotipo de fibroblasto (A, B). En (A), la parte izquierda muestra células endoteliales corneales humanas que se cultivaron en un medio de cultivo normal, y la parte derecha muestra el mismo tipo de células que se cultivaron en un medio de cultivo normal con la adición de 1|jM de SB431542 a. Cuando se realizó la inmunotinción con Na+/K+-ATPasa (función de bombeo) y ZO-1 (función de barrera), que son marcadores asociados a la función de las células endoteliales corneales, la expresión de estos marcadores se reconoció en una subpoblación de células en un medio de cultivo normal, mientras que la expresión se reconoció en todas las células en un medio de cultivo al que se añadió SB431542. La barra de escala muestra 100jim. En (B), se muestran los resultados de transferencia Western con tres concentraciones de SB431542 (10|j M, 1|jM y 0,1|j M desde la derecha). El control indica un medio de cultivo al que no se añadió nada. Se muestra la expresión de la Na+/K+-ATPasa, la ZO-1 y la GAPDH (control) (enumeradas desde la parte superior). Al bloquear la señalización del receptor del TGF utilizando el SB431542, se hizo posible la localización intracelular de la Na+/K+-ATPasa y la ZO-1 en una membrana celular, y se hizo posible mantener su expresión proteica. (C) muestra el ensayo ELISA. La concentración de colágeno tipo 1 secretado en el sobrenadante celular se midió en ausencia (control, utilizado como referencia) y en presencia de SB431542. El ensayo ELISA indicó que el SB431542 reguló significativamente la secreción de colágeno tipo 1 en el sobrenadante celular. **P<0,05. (D y E) muestran los resultados de la PCR cuantitativa. En estos gráficos, la expresión del colágeno tipo 1 (D) y de la fibronectina (E) en presencia y ausencia de SB43152 (1jiM) se normalizó con GAPDH y llas relaciones se expresan en relación con el control (es decir, el control es 1). Estos muestran que el SB431542 disminuyó significativamente la expresión del colágeno tipo 1 y la fibronectina a nivel de ARNm. *P<0,01, **P<0,05.

[Figura 10] La Figura 10 es un diagrama que muestra que se contrarrestó una señal de TGF-p y se suprimió la transformación de un endotelio corneal humano en un procedimiento distinto al SB431542. El resultado de la fila superior se obtuvo con un microscopio en contraste de fase. La fila inferior muestra un resultado de la tinción con faloidina (la tinción verde (aspecto de red alrededor de las células) es faloidina, y la tinción roja (partículas) es PI). El panel de la izquierda es una célula endotelial de córnea humana que fue cultivada con Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Líquido 8 % FBS 200mg/ml CaC^2H2O 0,08 % de ácido condroitín sulfúrico 20 jg/m l de ácido ascórbico 50 jg/m l de gentamicina 5 ng/ml de EGF como medio de cultivo (que se muestra como medio de cultivo normal en la Figura), y el panel derecho muestra los resultados del cultivo con 100ng/ml de BMP-7 añadidos al medio de cultivo.

[Figura 10A] La Figura 10A muestra los efectos de la BMP-7 a varias concentraciones como se muestra en una mayor ampliación en la Figura 10. Aquí se indica que la BMP-7 suprime el cambio de la célula endotelial de la córnea humana de forma fibroblástica y mantiene su función. (A) es una fotografía obtenida con un microscopio en contraste de fase. La imagen superior izquierda es un control sin adición de BMP-7 (mostrado como Control). La imagen superior derecha muestra 10ng/ml, la imagen inferior derecha muestra 100 ng/ml, y la imagen inferior izquierda muestra 1.000 ng/ml, de BMP-7. La forma celular alargada del fenotipo de los fibroblastos se convirtió en una forma celular poligonal en respuesta a la presencia de BMP-7, de manera dependiente de la concentración. La barra de escala muestra 100 jim. (B) es una fotografía de la tinción con faloidina. La imagen superior izquierda es un control sin BMP-7 añadido. La imagen superior derecha muestra 10ng/ml, la imagen inferior derecha muestra 100ng/ml, y la imagen inferior izquierda muestra 1.000 ng/ml, de BMP-7. La BMP-7 permite una forma celular hexagonal normal, y permite la distribución del citoesqueleto en una capa de actina en la superficie celular. La barra de escala muestra 100jm. (C) y (D) son cada una una fotografía de la tinción de Na+/K+-ATPasa y ZO-1. La imagen superior izquierda es un control sin BMP-7 añadido. La imagen superior derecha muestra 10ng/ml, la imagen inferior derecha muestra 100ng/ml, y la imagen inferior izquierda muestra 1.000 ng/ml, de BMP-7. La BMP-7 mantuvo la localización intracelular de la Na+/K+-ATPasa y la ZO-1 en la membrana celular. La barra de escala muestra 100jm. (E) y (F) son gráficos que muestran el porcentaje de células positivas a la Na+/K+-ATPasa (E) y a la ZO-1 (F) en medios de cultivo con tres concentraciones de BMP-7, además del control. El control no tiene aditivos. La relación aumentó significativamente tanto en la célula positiva a la Na+/K+-ATPasa como en la célula positiva a la ZO-1 cuando se trató con la BMP-7, en comparación con el control. *P<0,01, **P<0,05.

[Figura 11] La Figura 11 muestra los resultados que demuestran que cuando se añadió un inhibidor de la p38 MAPK junto con el SB431542, las células endoteliales de la córnea humana conservaron su forma en alta densidad incluso después de subcultivos repetitivos debido a la inhibición de la p38 MAPK la inhibición de la señal del TGF-p, permitiendo así el cultivo. La fotografía superior izquierda muestra el control (medio de cultivo normal). La fotografía superior derecha muestra un resultado sólo con SB431542. La fotografía inferior izquierda muestra un resultado sólo con SB203580, y la fotografía inferior derecha muestra un resultado tanto con SB431542 como con SB203580.

[Figura 12] La Figura 12 es un ejemplo de un procedimiento de cultivo estándar de una célula endotelial de la córnea humana, establecido por la presente invención. El panel superior muestra una vista esquemática del subcultivo, y muestra una vista esquemática de los procedimientos de cultivo 1 a 3 que se realizaron en el Ejemplo 8. En cada uno de los procedimientos estaban presentes el SB203580 y el SB431432. El procedimiento de cultivo 1 es un procedimiento en el que se introdujo Y-27632 tres veces (durante 48 horas cada vez) y se retiró entre cada reintroducción. En el procedimiento de cultivo 2, el Y-27632 está presente todo el tiempo. En el procedimiento de cultivo 3, el Y-27632 no está presente en absoluto.

[Figura 13] La Figura 13 muestra un resultado del cultivo final de células endoteliales de la córnea humana establecido. Como se muestra en la fotografía del lado izquierdo, se entiende que la fibrosis está suprimida y el crecimiento es favorable. Como se muestra en la fotografía del lado derecho, se conservaron las funciones normales, como se desprende de la tinción de la ZO-1 mostrada en la parte superior y de la Na+/K+-ATPasa mostrada en la parte inferior.

[Figura 14] La Figura 14, descrita en el Ejemplo 9, muestra que las células endoteliales de la córnea humana, que se cultivaron de forma normal manteniendo su función, se cultivaron en una lámina de colágeno, y luego se trasplantaron a un modelo de queratopatía bullosa de mono cynomolgus, obteniendo así una curación transparente de la córnea. El lado izquierdo muestra un resultado de trasplantar sólo las células que fueron cultivadas por el procedimiento de cultivo según la presente invención, mientras que el lado derecho muestra un resultado de inyectar un inhibidor de ROCK, Y-27632, al trasplantar las células cultivadas por el procedimiento de cultivo según la presente invención.

[Figura 15] La Figura 15 muestra un resultado de una imagen capturada a través de un microscopio de fluorescencia en el Ejemplo 9 en el que después de la eutanasia 2,5 meses después, se extrajo una córnea y se fijaron los tejidos, y luego se sometieron a inmunotinción con faloidina, Na+/K+-ATPasa, y ZO-1 similar al Ejemplo 2. La fila superior muestra un resultado de las células inhibidor de ROCK, y la fila inferior muestra un resultado con las células solamente. El panel de la izquierda muestra la tinción de faloidina (el color original es verde; y en una escala de grises, está en una apariencia de red, como muestra la imagen superior y parece estar difusa, como muestra la imagen inferior) y DAPI (el color original es azul; y en una escala de grises, el interior de las células se tiñe de forma particulada, como se muestra en la imagen superior; las células también se tiñen en forma de partículas, como se muestra en la imagen inferior, pero el número disminuye en comparación con el de la imagen superior, y parecen superponerse con la tinción de faloidina). El panel central muestra la tinción de ZO-1 (el color original es verde; en una escala de grises, tiene un aspecto de red, como muestra la imagen superior, y parece haber quedado parcialmente en la esquina superior izquierda y en la esquina inferior derecha, como muestra la imagen inferior) y de DAPI (el color original es azul; y en una escala de grises, el interior de las células está teñido en forma de partículas, como muestra la imagen superior y la tinción en partículas desapareció, y es fina aunque se observa la tinción global, como muestra la imagen inferior). El lado derecho muestra la tinción de la Na+/K+-ATPasa (el color original es verde; en una escala de grises, está en una apariencia de red, como se muestra en la imagen superior mientras que aparece permaneció parcialmente en el centro, como se muestra en la imagen inferior) y DAPI (el color original es azul; en una escala de grises, el interior de las células se tiñe en forma de partículas en la parte superior, las células también se tiñen en forma de partícullas, como se muestra en la imagen inferior, pero el número es menor en comparación con el de la imagen superior, y aparecen superpuestas con la tinción de faloidina).

[Figura 16] La Figura 16 muestra la normalización del cultivo en un caso de uso de un anticuerpo de neutralización anti-TGF-p, que se realizó en el Ejemplo 10. El lado izquierdo muestra un resultado con un medio de cultivo normal, y el lado derecho muestra un resultado con un anticuerpo de neutralización anti-TGF-p.

[Figura 17] La Figura 17 muestra la normalización del cultivo en un caso de uso de un inhibidor de Smad3, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrol[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona (número de catálogo: 566405), disponible en Calbiochem, que se realiza en el Ejemplo 11. El panel de la izquierda muestra un resultado con un medio de cultivo normal, y el panel central y derecho muestran los resultados con un inhibidor de Smad3 a 0,3 mM y 3 mM.

[Descripción de las realizaciones]

A continuación, se describirá la presente invención. A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se mencione específicamente, una expresión en forma singular debe entenderse que abarca el concepto de su forma plural. Por lo tanto, a menos que se mencione específicamente, los artículos de forma singular (por ejemplo, "a", "an", "the" o similares en inglés, y los artículos y adjetivos correspondientes o similares en otros idiomas) deben entenderse como que abarcan el concepto de su forma plural. Además, los términos utilizados en el presente documento, a menos que se haga referencia específica a ellos, deben entenderse en el sentido habitualmente utilizado en la técnica. Por lo tanto, a menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí presentes tienen el mismo significado generalmente reconocido por los expertos en la técnica. En caso de contradicción, rige la presente memoria descriptiva (incluida la definición).

(Definición)

Tal como se utiliza en este documento, "inhibidor de la fibrosis" se refiere a cualquier agente para suprimir la fibrosis. El inhibidor de la fibrosis, tal como se utiliza en el presente documento, incluye una citoquina y similares que se sabe que tienen una acción antifibrosis, tal como un agente inhibidor de la señal del factor de crecimiento por transformación (TGF)-p, un agente inhibidor de la proteína quinasa activadora del factor amitogénico (MAPK)38, a interleucina (IL)-12, IL-10, interferón (IFN)-y y la BMP-7 (OP-1). La información sobre estas citoquinas y similares está disponible en bases de datos públicas, tal como GenBank, y en revistas y publicaciones. Aunque no se quiere restringir por teorías, la presente invención ha podido lograr un aumento significativo de las células endoteliales de la córnea suprimiendo la fibrosis, mientras que convencionalmente era difícil lograr el crecimiento de una célula que tuviera una función normal. En consecuencia, se entiende que el inhibidor de la fibrosis utilizado en la presente invención puede ser cualquier agente siempre que proporcione el crecimiento de una célula que tenga una función normal.

Por ejemplo, mientras que una variedad de polipéptidos de IFN-y de mamíferos puede utilizarse para el tratamiento de enfermedades humanas, la proteína humana se utiliza generalmente para una célula endotelial corneal humana. La secuencia de codificación del IFN-y humano puede encontrarse en los números de acceso P01579 y CAA00375 del GenBank. La secuencia del genoma correspondiente puede encontrarse en los números de acceso del GenBank J00219, M37265 y V00536. Por ejemplo, véase Gray et al. (1982) Nature 295:501 (GenBank X13274); y Rinderknecht et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6790.

Alternativamente, un agente bloqueador de los canales de calcio, tal como el verapamilo, puede utilizarse como inhibidor de la fibrosis. Tal inhibidor de la fibrosis puede tener, no sólo la capacidad de disminuir la síntesis de colágeno tipo I, sino también una acción antifibrosis debido a la estimulación de la degradación de las fibras de colágeno tipo I. Las pruebas in vitro relativas a los fibroblastos demuestran que el suministro extracelular de colágeno depende de la presencia de calcio. Un agente bloqueador de los canales de calcio, el verapamilo, disminuye la concentración de calcio intracelular y aumenta la actividad de la colagenasa. Esto también inhibe el crecimiento de los fibroblastos.

Tal como se utiliza en el presente documento, "factor p de crecimiento por transformación (factor p de crecimiento por transformación; también denominado de forma abreviada TGF-p) " se utiliza con el significado similar al de los utilizados en la técnica; y el factor p de crecimiento por transformación es una citoquina multifuncional homodimérica de un peso molecular de 25kD, que presenta diversos tipos de actividad biológica. El TGF-p desempeña un papel en la patogénesis de una variedad de enfermedades esclerosantes, la artritis reumatoide y la vitreorretinopatía proliferativa, y está muy involucrado en la pérdida de cabello, la supresión de la acción de las células inmunocompetentes, la supresión de la hiperproducción de proteasa para evitar la degradación de los tejidos pulmonares y la prevención del enfisema, y la supresión del crecimiento de las células cancerosas, y similares. En los seres humanos existen tres isoformas de TGF-p, a saber, TGF-p1 a p3. El TGF-p se produce como un tipo latente inactivo con un peso molecular de aproximadamente 300kD, que no es capaz de unirse a un receptor. El TGF-p se activa en la superficie de una célula diana o en la periferia de la misma para convertirse en un tipo activo capaz de unirse a un receptor, ejerciendo así su acción.

Aunque no se quiere restringir por teorías, se considera que la acción del TGF-p en una célula diana se transmite por una vía de fosforilación de un conjunto de proteínas para realizar la transmisión de información, denominada Smad. En primer lugar, cuando el TGF-p activo se une a un receptor de TGF-p de tipo II presente en una superficie de una célula diana, se forma un complejo receptor que consiste en dos moléculas de un receptor de tipo II y dos moléculas de un receptor de TGF-p de tipo I, y el receptor de tipo II fosforila al receptor de tipo I. A continuación, el receptor de tipo I fosforilado fosforila a Smad2 o Smad3, y el Smad2 o Smad3 fosforilado forma un complejo con Smad4, y el complejo se transfiere a un núcleo, se une a una secuencia diana denominada caja CAGA, que está presente en una región promotora de un gen diana, e induce la expresión transcripcional de un gen diana junto con un coactivador.

La vía de señalización del factor de crecimiento de transformación-p(TGF-p) es capaz de regular muchas actividades celulares, como el crecimiento y la diferenciación celular, la detención del crecimiento, la apoptosis y la conversión de epitelial a mesenquimal (EMT), mediante la regulación de un gen diana del mismo. Los miembros de la familia TGF-p, incluyendo el propio TGF-p (tal como TGF-p1, TGF-p2 yTGF-p3), la activina y la proteína morfogénica ósea (BMP), son fuertes agentes reguladores del crecimiento, la diferenciación, la migración y la apoptosis celular.

El TGF-p es una proteína de aproximadamente 24Kd, que es producida por muchas células, incluyendo el linfocito B, el linfocito T y el macrófago activado, y por muchos otros tipos de células. Los efectos del TGF-p en los sistemas inmunitarios incluyen la inducción del receptor de la IL-2, la inhibición del crecimiento de las células tímicas inducido por la IL-1 y el bloqueo de la activación de los macrófagos inducida por el IFN-y. Se cree que el TGF-p está implicado en una variedad de condiciones patológicas (Border et al. (1992) J. Clin. Invertir. 90:1), y está suficientemente apoyada para funcionar como sustancia inhibidora de tumores o como promotora de tumores.

El TGF-p media la señalización del mismo mediante dos receptores de superficie celular de serina/treonina, el TGF-pRII y el ALK5. La señalización del TGF-p se inicia mediante la dimerización del receptor inducida por el ligando, lo que permite que el TGF-pRII fosforile un receptor ALK5. La fosforilación de la misma es tal que la actividad quinasa de ALK5 se activa y la a LK5 activada fosforila a continuación una proteína Smad efectora corriente abajo (homóloga vertebrada de la proteína MAD o "Madres contra DPP (decapentaplejía)"), Smad2 o 3. El complejo p-Smad2/3 con Smad4 entra en el núcleo para activar la transcripción de un gen diana.

Smad3 es un miembro de un subgrupo R-Smad (Smad activado por el receptor) de Smad, y es un mediador directo de la activación de la transcripción por un receptor TGF-p. La estimulación del TGF-p provoca la fosforilación y activación de Smad2 y Smad3, que forma un complejo con Smad4 ("Smad común" o "co-Smad" en los vertebrados), que se acumula junto a un núcleo para regular la transcripción de un gen diana. R-Smad se localiza en el citoplasma y forma un complejo con un co-Smad a través de la fosforilación inducida por el ligando de un receptor de TGF-p; y el complejo se desplaza al núcleo, donde regula la expresión génica que se asocia con la cromatina y un factor de transcripción cooperativo. Smad6 y Smad7 son cada una de ellas Smad inhibidoras ("I-Smad"), es decir, son inducidas transcripcionalmente por el TGF-p y funcionan como inhibidoras de la señalización del TGF-p (Feng et al. (2005) Annu.

Rev. Cell. Dev. Biol. 21:659). Smad6/7 inhibe la activación de R-Smad mediada por el receptor para ejercer su efecto inhibidor; y se asocian con un receptor de tipo I, que impide competitivamente la movilización y fosforilación de R-Smad. Se sabe que Smad6 y Smad7 reponen la ubiquitina ligasa E3, que provoca la ubiquitinación y degradación de la proteína interactiva Smad6/7.

Con respecto a la vía de señalización del TGF-p, existe además otra vía transmitida por la BMP-7 o similar, que se considera que presenta funciones a través de ALK-1/2/3/6 y luego a través de Smad1/5/8. Con respecto a la vía de señalización del TGF-p, véase también J. Massagu'e, Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 753-91 Vilar JMG, Jansen R, Sander C (2006) PLoS Comput Biol 2(1):e3 Leask, A., Abraham, D. J. FASEB J.18,816-827 (2004) Coert Margadant & Arnoud Sonnenberg EMBO reports (2010) 11, 97-105 Joel Rosenbloom y otros, Ann Intern Med. 2010; 152: 159­ 166 y similares.

Tal como se utiliza en el presente documento, "agente inhibidor de la señal del factor de crecimiento por transformación (TGF)-p" se refiere a cualquier factor que inhibe la señalización del TGF. Cuando se contrarresta el TGF-p, el agente responsable puede denominarse antagonista. Sin embargo, en el caso de la presente invención, el antagonista del TGF-p se abarca en el agente inhibidor de la señal del TGF-p.

Por lo tanto, el agente inhibidor de la señal de TGF-p utilizado en la presente invención incluye típicamente, sin limitación, un antagonista de TGF-p, un antagonista de un receptor de TGF-p y un inhibidor de Smad3.

Los agentes inhibidores de la señal del TGF-p ejemplares utilizados en la presente invención incluyen, sin limitación, SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida), BMP-7, anticuerpo anti-TGF-p, anticuerpo del receptor anti-TGF-p, ARNip del TGF-p, ARNip del receptor del TGF-p, oligonucleótido antisentido del TGF-p, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona, A83-01(3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinoliny 1)-1H-pirazol-1-carbotioamida), Stemolecule™ inhibidor de la TLK(2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naptiridina), Stemolecule™ inhibidor de la BMP LDN-193189(6-(4-(piperidin-1-il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidina), SD-208(2-(5-cloro-2-fluorofenil)-4-[(4-piridinil)amin o]pteridina), LY364947(4-[3-(2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-quinolina ), una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y similares.

Otros agentes inhibidores de la señal de TGF-p incluyen, sin limitación, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal contra una o más isoformas de TGF-p (Patente de EE.UU. No. 5.571.714; véase también Publicación internacional No. WO 97/13844 y Publicación Internacional No. WO 00/66631), receptor de TGF-p, una forma soluble de dicho receptor (por ejemplo, receptor soluble de TGF-p tipo III), o un anticuerpo dirigido a un receptor de TGF-p (Patente estadounidense No. 5, 693, 607, Patente estadounidense No. 6.001.969, Patente estadounidense No.

6.010.872, Patente estadounidense No. 6.086.867, Patente estadounidense No. 6.201.108 Publicación internacional No. WO 98/48024 Publicación Internacional No. WO 95/10610 Publicación Internacional No. WO 93/09228 Publicación Internacional No. WO 92/00330), péptido latente y asociado (Publicación Internacional No. WO 91/08291), gran TGF-p latente (Publicación Internacional No. WO 94/09812), fetuina (Patente estadounidense No. 5.821.227), la decorina y el biglicano, la fibromodulina, el lumican y la endoglina y otros proteoglicanos (Publicación internacional No. WO 91/10727, Patente estadounidense No. 5.654.270, Patente estadounidense No. 5.705.609, Patente estadounidense No. 5.726.149, Patente estadounidense No. 5.824.655, Publicación internacional No. WO 91/04748, Patente estadounidense No. 5.830.847, Patente estadounidense No. 6.015.693, Publicación internacional No. WO 91/10727, Publicación Internacional No. WO 93/09800 y Publicación Internacional No. WO 94/10187), la somatostatina (Publicación Internacional No. WO 98/08529), ácido manosa-6-fosfórico o ácido manosa-1-fosfórico (Patente estadounidense No. 5.520.926), prolactina (Publicación internacional No. WO 97/40848), el factor de crecimiento similar a la insulina II (Publicación internacional No. WO 98/17304), IP-10 (Publicación internacional No. WO 97/00691), el péptido que contiene Arg-Gly-Asp (Pfeffer, Patente estadounidense No. 5.958.411 Publicación internacional No. Wo 93/10808), extractos de plantas, hongos y bacterias (EP-A-813875 Publicación Japonesa No. 8­ 119984; y Matsunaga et al., patente estadounidense No. 5.693.610), oligonucleótido en antisentido (Patente estadounidense No. 5.683.988 Patente estadounidense No. 5.772.995,Patente estadounidense No. 5.821.234, Patente estadounidense No. 5.869.462y Publicación internacional No. WO 94/25588), proteína asociada a la señalización del TGF-p, incluyendo Smad y MAD (EP-A-874046 Publicación internacional No. WO 97/31020 Publicación internacional No. WO 97/38729 Publicación Internacional No. WO 98/03663 Publicación Internacional No. WO 98/07735 Publicación Internacional No. WO 98/07849 Publicación Internacional No. WO 98/45467 Publicación Internacional No. WO 98/53068 Publicación Internacional No. WO 98/55512 Publicación internacional No. WO 98/56913 Publicación Internacional No. WO 98/53830 Publicación internacional No. WO 99/50296 Patente estadounidense No. 5.834.248 Patente estadounidense No. 5.807.708 y Patente estadounidense No. 5.948.639), Ski y Sno (Vogel, 1999, Science, 286:665 y Stroschein et al.,1999, Science, 286:771 a 774), uno o más aptámeros de oligonucleótidos monocatenarios o un plásmido de expresión que los codifica, adecuados para inhibir o interferir la unión de TGF-p a un receptor del mismo origen, y cualquier mutante, fragmento o derivado de una molécula identificada anteriormente, que conserva una capacidad de inhibir la actividad de TGF-p. El inhibidor del TGF-p puede ser un antagonista del TGF-p, y puede ser un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado (o un fragmento F(ab)2, un fragmento Fv, un anticuerpo de cadena simple y otras formas o fragmentos de un anticuerpo que conserve la capacidad de unirse al TGF-p, un fragmento del mismo o similares), que bloquea la unión del TGF-p al receptor. El receptor de TGF-p y un fragmento de unión a TGF-p, y en particular un fragmento soluble, de un receptor de TGF-p son antagonistas de TGF-p que son útiles en el procedimiento según la presente invención. En una determinada realización, un inhibidor preferible para las funciones del TGF-p es un receptor soluble del TGF-p, y en particular, un receptor del TGF-p tipo II (TGFBIIR) o un receptor del TGF-p tipo III (TGFBIIIR o betaglicano) que incluye, por ejemplo, el TGFBIIR o el dominio extracelular del TGFBIIIR, preferentemente un receptor soluble del TGF-p recombinante (rsTGFBIIR o rsTGFBIIIR). El receptor TGF-p y un fragmento de unión al TGF-p del receptor TGF-p, en particular un fragmento soluble, son antagonistas del TGF-p útiles en el procedimiento según la presente invención. Los receptores de TGF-p y los ácidos nucleicos que los codifican son suficientemente conocidos en la técnica. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de TGF-p tipo 1 se divulga en el número de acceso L15436 del GenBank y Patente de Estados Unidos No. 5.538.892 (Donahoe et al.). Una secuencia de ácido nucleico de un receptor de TGF-p tipo 2 está disponible públicamente bajo el número de acceso de GenBank AW236001, AI35790, AI279872, AI074706 y AA808255. Una secuencia de ácido nucleico de un receptor de TGF-p tipo 3 también está disponible públicamente bajo el número de acceso de GenBank NM003243, AI887852, AI817295, y AI681599.

Además, todavía otros agentes o antagonistas inhibidores de la señal TGF-p y procedimientos para producirlos, son suficientemente conocidos en el arte, además de muchos de los que están actualmente en desarrollo. Cualquiera de los antagonistas eficaces del TGF-p puede ser útil en el procedimiento según la presente invención, y por lo tanto, los agentes o antagonistas específicos inhibidores de la señal del TGF-p utilizados no son aquellos con características limitadas. Ejemplos de tales antagonistas incluyen un anticuerpo monoclonal y policlonal contra el TGF-p de uno o más isotipos (Patente estadounidense No. 5.571.714 y Publicación internacional No. WO 97/13844), receptor de TGF-p, un fragmento del mismo, un derivado del mismo y un anticuerpo contra un receptor de TGF-p (Patente estadounidense No. 5.693.607, Patente estadounidense No. 6.008.011, Patente estadounidense No. 6.001.969 y Patente estadounidense No. 6.010.872 y Publicación internacional No. WO 92/00330, Publicación Internacional No. WO 93/09228, Publicación Internacional No. WO 95/10610y Publicación Internacional No. WO 98/48024) ; péptido asociado a la latencia (péptido asociado a la latencia Publicación Internacional No. WO 91/08291), el TGF-p lacente grande (Publicación Internacional No. WO 94/09812), fetuina (Patente estadounidense No. 5.821.227), decorina, y biglicano, fibromodulina, lumicán, endoglina y otros proteoglicanos (Patente estadounidense No. 5.583.103, Patente estadounidense No. 5.654.270, Patente estadounidense No. 5.705.609, Patente estadounidense No. 5.726.149, Patente estadounidense No. 5.824.655, Patente estadounidense No. 5.830.847, Patente estadounidense No.

6.015.693 y Publicación internacional No. WO 91/04748, Publicación Internacional No. WO 91/10727, Publicación Internacional No. WO 93/09800 y Publicación internacional No. WO 94/10187).

Ejemplos adicionales de tales antagonistas incluyen una serie de otras proteínas asociadas con la señalización del TGF-p, incluyendo la somatostatina (Publicación internacional No. WO 98/08529), el ácido manosa-6-fosfórico o el ácido manosa-1-fosfórico (Patente estadounidense No. 5.520.926), prolactina (Publicación internacional No. WO 97/40848), el factor de crecimiento similar a la insulina II (Publicación internacional No. WO 98/17304), IP-10 (Publicación internacional No. WO 97/00691), el péptido que contiene arginina (arg), glicina (gly) y ácido asparagínico (asp) (Patente estadounidense No. 5.958.411 y Publicación internacional No. WO 93/10808), extractos de plantas, hongos y bacterias (Publicación de solicitud de patente europea No. 813875, Publicación japonesa Abierta al público No. 8-119984 y Patente estadounidense No. 5.693.610), el oligonucleótido antisentido (Patente estadounidense No.

5.683.988, Patente estadounidense No. 5.772.995, Patente estadounidense No. 5.821.234 y Patente estadounidense No. 5.869.462y Publicación internacional No. WO 94/25588), y Smad y MAD (Solicitud de patente europea No. EP874046, Publicación Internacional No. WO 97/31020, Publicación internacional No. WO 97/38729, Publicación Internacional No. WO 98/03663, Publicación Internacional No. WO 98/07735, Publicación Internacional No. WO 98/07849, Publicación Internacional No. WO 98/45467, Publicación Internacional No. WO 98/53068, Publicación Internacional No. WO 98/55512, Publicación Internacional No. WO 98/56913, Publicación internacional No. WO 98/53830 y Publicación Internacional No. WO 99/50296 y Patente estadounidense No. 5.834.248, La patente estadounidense No. 5.807.708 y Patente estadounidense No. 5.948.639), y Ski y Sno (G.Vogel,Science,286:665(1999) y Stroschein et al.,Science,286:771-74(1999)), y cualquier fragmento y derivado de la citada molécula que conserve la capacidad de inhibir la actividad del TGF-p.

Los antagonistas del TGF-p adecuados para el uso en la presente invención también incluyen un mutante funcional, un mutante, un derivado y un análogo del antagonista del TGF-p mencionado anteriormente siempre que se mantenga su capacidad de inhibir la cantidad o la actividad del TGF-p. Los términos "mutante", "derivado" y "análogo", tal y como se utilizan en el presente documento, se refieren a una molécula que tiene una forma o estructura similar a la de su compuesto original y que conserva la capacidad de funcionar como antagonista del TGF-p. Por ejemplo, cualquiera de los antagonistas del TGF-p divulgados en la presente memoria descriptiva puede ser cristalizado, y pueden diseñarse razonablemente análogos útiles basados en sitios que tienen un papel en la formación de (uno o más) sitios activos. En cambio, los expertos en la técnica pueden alterar un grupo funcional de los antagonistas conocidos, o pueden cribar dicha molécula alterada con respecto a la actividad, la semivida, la biodisponibilidad u otras características deseables, sin necesidad de realizar experimentos innecesarios. Cuando el antagonista del TGF-p es un polipéptido, puede producirse un fragmento y una variante del polipéptido para aumentar la facilidad de administración, la actividad, la semivida y similares (por ejemplo, los anticuerpos humanizados o los fragmentos de anticuerpos funcionales comentados anteriormente). Teniendo en cuenta el nivel técnico en el arte para producir polipéptidos sintéticos y recombinantes, tal variante puede lograrse sin experimentos innecesarios. Los expertos en la técnica también pueden diseñar un inhibidor novedoso basado en el conocimiento de una estructura cristalina y/o sitio activo del inhibidor de TGF-p como se describe en el presente documento. Un inhibidor polipeptídico, como un receptor de TGF-p soluble, puede introducirse eficazmente mediante transferencia genética. En consecuencia, una determinada realización para el procedimiento según la presente invención incluye el uso de un vector adecuado para la expresión de un receptor de TGF-p o un socio de unión, preferentemente un receptor soluble o un socio de unión soluble. En una realización preferible, la administración de un antagonista soluble del TGF-p puede lograrse mediante la transferencia genética que utiliza un vector que comprende un ADNc que codifica un antagonista soluble o un ADNc que codifica un dominio extracelular de un receptor del TGF-p tipo II (rsTGFBIIR) o un receptor del TGF-p tipo III (rsTGFBIIIR). Este vector provoca una expresión in situ de un antagonista soluble del TGF-p en una célula que se transfecta con el vector, inhibe la actividad del TGF-p y suprime la fibrogénesis mediada por el TGF-p. Se puede utilizar cualquier vector adecuado. Los vectores preferibles incluyen un vector de adenovirus, un vector de lentivirus, un vector del virus de Epstein-Barr (EBV), un vector del virus adeno-asociado (AAV) y un vector de retrovirus, desarrollados con el fin de transferir genes. También pueden utilizarse otros procedimientos no vectoriales para la transferencia de genes, como el complejo lípido/ADN, el conjugado proteína/ADN y los procedimientos de transferencia de ADN desnudo. Otros antagonistas del TGF-p adecuados desarrollados para su administración mediante transferencia genética de adenovirus incluyen, sin limitación, un ADNc quimérico que codifica un dominio extracelular de un receptor del TGF-p de tipo II, fusionado con un dominio Ig Fc (Isaka et al., 1999, Kidney Int., 55:pp.465 a 475), un vector de transferencia de genes de adenovirus de un mutante negativo dominante de un receptor de TGF-p tipo II (Zhao et al., 1998, Mech. Dev., 72:pp.89 a 100), y un vector de transferencia de genes de adenovirus de decorina, que es un proteoglicano de unión al TGF-p (Zhao et al., 1999, Am. J. Physiol., 277: pp. L412 a L422). La transferencia de genes mediada por adenovirus tiene una eficacia extremadamente alta en comparación con otras formas de administración de genes.

El receptor TGF-p y un fragmento de unión al TGF-p, un fragmento soluble y similares del receptor TGF-p son antagonistas del TGF-p útiles en la presente invención. Los receptores TGF-p y los ácidos nucleicos que los codifican son suficientemente conocidos en la técnica. La secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de TGF-p tipo 1 se divulga en GenBank, número de acceso L15436 y la patente estadounidense No. 5.538.892 de Donahoe et al. Una secuencia de ácido nucleico del receptor de TGF-p tipo 2 también está disponible públicamente bajo el número de acceso de GenBank AW236001; AI35790; AI279872; AI074706; y AA808255. Una secuencia de ácido nucleico del receptor de TGF-p tipo 3 también está disponible públicamente bajo el número de acceso de GenBank NM003243; AI887852; AI817295; y AI681599. En una realización ejemplar, el antagonista del TGF-p es un anticuerpo que bloquea la unión del TGF-p a un receptor del mismo, o a un fragmento F(ab)2, un fragmento Fv, un anticuerpo monocatenario y un fragmento de otros tipos de "anticuerpos" que conservan la capacidad de unirse al TGF-p. El anticuerpo del mismo puede estar quimerizado o humanizado. En este caso, el anticuerpo quimerizado incluye una región constante de un anticuerpo humano, una región variable de un anticuerpo murino y otros anticuerpos no humanos. El anticuerpo humanizado incluye una región constante y una región variable marco (es decir, regiones variables distintas de las regiones hipervariables) de un anticuerpo humano, y una región hipervariable de un anticuerpo murino y otros anticuerpos no humanos. Por supuesto, el anticuerpo del mismo puede seleccionarse a partir de un sistema de visualización de fagos, o puede ser un anticuerpo derivado de cualquier otro tipo, como un anticuerpo humano seleccionado a partir del mismo o producido a partir de un XenoMouse.

Los hallazgos relacionados con Smad están aumentando. La vía de señalización del TGF-p se inicia cuando esta molécula se une a un complejo de superficie celular heterodímero formado por un receptor de serina/treonina quinasa de tipo I (TbRI) y de tipo II (TbRII) e induce este complejo de superficie celular heterodímero. A continuación, el receptor del heterodímero transmite dicha señal a través de la fosforilación de una proteína Smad diana en la corriente abajo. Como se ha descrito anteriormente, existen tres clases funcionales para la proteína Smad, y son, por ejemplo, Smad (R-Smad) restringido por un receptor como Smad2 y Smad3, un co-mediador (Co-Smad) que también se denomina Smad4, y un Smad inhibidor (I-Smad). Seguido de la fosforilación por el complejo receptor heterodímero, este R-Smad forma un complejo con este Co-Smad, se desplaza a dicho núcleo, y trabajando conjuntamente con otras proteínas respectivas, regulan la transcripción del gen diana (Derynck, R., et al. (1998) Cell 95: 737-740) Massague, J. y Wotton, D. (2000) EMBO J. 19:1745). Una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Smad3 humana se divulgan, por ejemplo, en el GenBank Accession No. gi : 42476202. Una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Smad3 murino se divulga, por ejemplo, en GenBank Accession No. gi: 31543221. Como se ha descrito anteriormente, la estimulación del TGF-p proporciona la fosforilación y activación de Smad2 y Smad3, que forman un complejo con Smad4 (también denominado "Smad común" o "co-Smad"), y el complejo se acumula con un núcleo para regular la transcripción del gen diana. En consecuencia, la inhibición de la señal de TGF-p también puede lograrse mediante la inhibición de Smad2, 3 o co-Smad (Smad4). El R-Smad se localiza en un citoplasma, y forma un complejo con un co-Smad a través de la fosforilación inducida por el ligando de un receptor de TGF-p para trasladarse a un núcleo, en el que regulan la expresión de genes asociados a una cromatina y a un factor de transcripción cooperativo. Por lo tanto, la inhibición de la señal de TGF-p también puede lograrse mediante la inhibición de R-Smad, ya sea directa o indirectamente. Smad6 y Smad7 son Smad inhibitorios (I-Smad), es decir, son inducidos transcripcionalmente por el TGF-p para funcionar como inhibidor de la señalización del TGF-p (Feng et al., (2005) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21: 659). Smad6/7 impide la activación de R-Smad mediada por el receptor, ejerciendo así su efecto inhibidor. Se asocian a un receptor de tipo I, que inhibe competitivamente la movilización y fosforilación de R-Smad. Se sabe que Smad6 y Smad7 reponen la ubiquitina ligasa e 3, que provoca la ubiquitinación y degradación de la proteína interactiva Smad6/7. Así, Smad6 y 7 pueden funcionar como un agente inhibidor de la señal TGF-p en la presente invención.

Los inhibidores de Smad3 que pueden utilizarse en la presente invención incluyen, sin limitación, nucleótidos antisentido, ARNip, anticuerpos y similares, y además, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona, y similares disponibles en Calbiochem, como un compuesto de bajo peso molecular.

Tal y como se utiliza en el presente documento, la "normalización del cultivo" de una célula endotelial de la córnea se refiere al cultivo manteniendo al menos una característica, como las funciones que la célula endotelial de la córnea tiene originalmente (que también se denomina "función normal" en el presente documento) o similares. Dichas funciones incluyen, sin limitación, ZO-1 y Na+/K+-ATPasa, adaptabilidad a un trasplante de córnea, (Matsubara M, Tanishima T: Wound-healing of the corneal endotheliumin the monkey: a morphometric study, Jpn J Ophthalmol 1982, 26:264-273;MatsubaraM, Tanishima T: Wound-healing of corneal endothelium in monkey: anautoradiographic study, Jpn J Ophthalmol 1983, 27:444-450 Van Horn DL, Hyndiuk RA: Endothelial wound repair in primate cornea, Exp Eye Res 1975, 21:113-124 y VanHorn DL, Sendele DD, Seideman S, Buco PJ: Regenerative capacity of the cornealendothelium in rabbit and cat, Invest Ophthalmol Vis Sci 1977, 16:597-613) y similares. Específicamente, se entiende que la "función normal" puede ser una función requerida para lograr el trasplante de córnea o un índice que indique la suficiencia de la misma.

Con respecto a la adaptabilidad al trasplante de córnea, normalmente, un endotelio corneal puede ser mecánicamente tratado con cureta como un modelo de queratopatía bullosa con animales de experimentación como los conejos para realizar una prueba de implantación de una célula cultivada. Sin embargo, las células endoteliales de la córnea de los conejos crecen in vivo. Así pues, no se puede negar la posibilidad de una curación espontánea debida al crecimiento de las células endoteliales de la córnea del huésped (Matsubara M, et al., Jpn J Ophthalmol 1982, 26:264-273 Matsubara M, et al., Jpn J Ophthalmol 1983, 27:444-450 Van Horn DL, et al., Exp Eye Res1975, 21:113-124 y Van Horn DL, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 1977, 16:597-613). Por lo tanto, para evaluar con mayor precisión la adaptabilidad del trasplante, es preferible evaluar el injerto en primates. En un caso de evaluación de la adaptabilidad del trasplante a los seres humanos, con un primate como el mono cynomolgus, la adaptabilidad se evalúa tras el paso de, por ejemplo, al menos un mes, preferentemente al menos dos meses, más preferentemente al menos tres meses, más preferentemente al menos seis meses, aún más preferentemente al menos doce meses. Es importante confirmar la adaptabilidad del trasplante con primates, como los monos, para la aplicación a los humanos en particular.

Tal como se utiliza en el presente documento, "agente normalizador del cultivo" se refiere a un agente para evitar que se pierda una característica, como una función normal, de una célula endotelial de la córnea o similar, que puede ocurrir durante el cultivo. Para que se reconozca que un agente normalizador de cultivos ejerce su función, es posible confirmarlo mediante una prueba para determinar si se mantiene o no una función normal de una célula endotelial de la córnea, tal como se describe en el presente documento, o si la función disminuye. Por ejemplo, un procedimiento para juzgar la normalización puede ejecutarse utilizando una proteína funcional en una célula endotelial de la córnea, como la ZO-1 y la Na+/K+-ATPasa, como índice para ver el cambio en la expresión de la misma, o examinando si se injerta en un mono o similar mediante trasplante para que funcione. Un procedimiento para juzgar por el trasplante puede realizarse de la siguiente manera. Específicamente, el endotelio corneal se cultiva sobre colágeno de tipo I para preparar una lámina de endotelio corneal cultivada. Bajo anestesia general, se corta la porción periférica de la córnea de un mono cynomolgus en 1,5 mm y se introduce un instrumento quirúrgico de silicona en la cámara anterior para curar mecánicamente una célula endotelial de la córnea, creando así un modelo de queratopatía bullosa. A continuación, se corta la porción periférica de la córnea 5-6 mm y se introduce la lámina de endotelio corneal cultivada en la cámara anterior. Al sustituir la cámara anterior por aire, la lámina se adhiere a la superficie del endotelio corneal. El efecto terapéutico del trasplante de la lámina de endotelio corneal cultivada en la queratopatía bullosa se evalúa mediante la transparencia corneal a través de un microscopio de lámpara de hendidura.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "inhibidor de la proteína activada por el factor mitógeno celular (MAP)" se refiere a cualquier inhibidor para inhibir una vía de señalización de la MAP quinasa, ya sea directa o indirectamente. Así, un inhibidor de la MAP quinasa está relacionado con un compuesto que se dirige, disminuye o inhibe una proteína activada por mitógenos para. Las MAP quinasas son un grupo de proteínas serina/treonina quinasa que se activan en respuesta a diversos tipos de estimulación extracelular y que median la señalización desde la superficie celular hasta el núcleo. Controlan algunos fenómenos celulares fisiológicos y patológicos, como la inflamación, la muerte celular por apoptosis, la transformación carcinogénica, la invasión de células tumorales y la metástasis.

El inhibidor de MAP quinasa útil según la presente invención puede inhibir cualquier factor de MAP quinasa, tal como, sin limitación, MAPK, ERK, MEK, MEKK, ERK1, ERK2, Raf, MOS, p21ras, GRB2, SOS, JNK, c-jun, SAPK, JNKK, PAK, RAC yp38. Los ejemplos del inhibidor de la MAP quinasa incluyen, sin limitación, PD184352, VX-745, SB202190, anisomicina, PD98059, s B203580, U0126, AG126, apigenina, un inhibidor de la quinasa HSP25, 5-iodotubercidina, oligonucleótido antisentido de la MAP quinasa, oligonucleótido de control de la MAP quinasa, un inhibidor de la cascada de la MAP quinasa, conjunto de inhibidores de la MAP quinasa 1, Conjunto de inhibidores de la MAP quinasa 2, conjunto de inhibidores de la MEK, olomoucina, isoolomoucina, N9 isopropil olomoucina, un inhibidor de la MAP quinasa p38, PD169316, SB202474, SB202190 clorhidrato, SB202474 dihidrocloruro, SB203580 sulfona, Ioto-SB203580, SB220025, SC68376, SKF-86002, Tyrphostin AG 126, U0124, U0125, y ZM33637. Véase la página del catálogo de CalBioChem, ixxviii;http://www.tocris.com/; y http://www.vpharm.com/frame09.html.

La MAP quinasa es un nombre general utilizado para describir la familia de serina/treonina quinasa. La MAP quinasa también se denomina proteína quinasa regulada por señales extracelulares o ERK, y es una enzima terminal de 3 cascadas de quinasas. La repetición de 3 cascadas de quinasas a una vía de señalización relacionada, pero separada, demuestra el concepto de una vía MAPK como un elemento de señalización multifuncional del módulo, que funciona secuencialmente en una vía. En esta vía, cada enzima se caracteriza por estar fosforilada, activando así el siguiente miembro de la secuencia. Así, un módulo MAPK estándar consiste en tres proteínas quinasas. Específicamente, una MAPK quinasa (o MEKK) activa otra MAPK quinasa (o MEK), que activa secuencialmente una enzima MAPK/ERK. Las cascadas MAPK/ERK, JNK (proteína quinasa c-junamino terminal (o SAPK)) y p38 nsisten cada una de tres módulos enzimáticos que incluyen MEKK, MEK y ERK, o miembros de la superfamilia MAPK. Una variedad de señales extracelulares se fusionan con sus respectivos receptores de la superficie celular, desencadenando un evento inicial, y luego esta señal se transmite al interior de la célula, donde se activa una cascada apropiada.

La MAPK es una superfamilia de proteína quinasa activada por mitógenos (o ERK), y tiene una secuencia consenso TXY en un núcleo catalítico. ERK1/2, p38HOG y JNK/SAPK son enzimas terminales que están relacionadas con vías paralelas, pero son diferentes entre sí.

Por ejemplo, la activación constitutiva de la MAP quinasa se asocia con el tumor primario derivado de una variedad de órganos humanos (riñones, intestino grueso y pulmones) y un gran número de linajes celulares de cáncer (páncreas, intestino grueso, pulmones, ovarios y riñones) (Hoshino et al., Oncogene, 18 (3):813-22(Ene.1999)). Además, la p38 MAP quinasa regula la producción de dos citoquinas, el TNFa y la IL-1, que se asocian con el inicio y la progresión de la inflamación. El inhibidor de la p38 MAP quinasa también desempeña un papel en el futuro en el tratamiento de enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide, y además, en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, el ictus, las enfermedades neurogénicas y otras enfermedades. Como tal, el inhibidor de la MAP quinasa es útil para el tratamiento de diversos tipos de enfermedades, desde el cáncer hasta la inflamación.

Además, la ERK es el único sustrato con respecto a la MEK1, por lo tanto, esta estrecha selectividad indica que, junto con el aumento de la expresión de los componentes esenciales de la misma en las células tumorales y el papel central en la vía de la MAP quinasa, la inhibición de la vía es una ruta importante tanto para la sensibilización química como para la radiación de las células tumorales, y es un objetivo para las enfermedades proliferativas que puede ser utilizado para la intervención farmacológica.

Sebolt-Leopoldetal., Nat. Med., 5(7):810-6 (Jul, 1999) describe un sistema de ensayo en cascada in vitro para identificar un inhibidor de molécula pequeña de una vía de MAP quinasa (MAPK). Se preparó la proteína de fusión glutatión-S-transferasa (GST)-MEK1 y GST-MAPK a partir de células bacterianas, y se utilizaron para la fosforilación secuencial a MAPK de MEK1, y a MBP (proteína básica de la mielina) en el sistema de ensayo. También se ha encontrado el PD184352 [2-(2-cloro-4-yodo-fenilamino)-N-ciclopropil metoxi-3,4-difluoro-benzamida], que inhibe directamente la MEK1.

Ejemplos del inhibidor de la MAP quinasa incluyen el inhibidor de la MAP quinasa :AG126, apigenina (Apigenin), inhibidor de la HSP25 quinasa, 5-yodotubercidina, oligonucleótido antisentido de la MAP quinasa, oligonucleótido de control de la MAP quinasa, inhibidor de la cascada de la MAP quinasa, conjunto de inhibidores de la MAP quinasa 1, conjunto de inhibidores de la MAP quinasa 2, conjunto de inhibidores de la MEK olomoucina, isoolomoucina, N9 isopropilolomoucina, inhibidor de p38 MAP quinasa, PD98059 (2'-amino-3'-metoxiflavona), solución de PD98059, PD169316(Calbiochem), SB202474, SB202190 (4-[4-(4-fluorofenil)-5-(4-piridinil)-1H-imidazol-2-il]fenol; Laboratorios de investigación BIOm Ol ., Inc.), SB202190 solución, SB202190 clorhidrato, SB202474 dihidrocloruro, SB203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfonilfenil)-5(4-piridil)imidazol Journal of Biological Chemistry 272 (18) 12116-12121, 1997), SB203580 solución, SB203580 clorhidrato, SB203580 sulfona, Ioto-SB203580, SB220025, SP600125(1,9-pirazoloantrona, antrapirazol), SB239063 (trans-4-[4-(4-fluorofenil)-5-(2-metoxi-4-pirimidinil)-1H-imidazol-1-il]ciclohexanol), SC68376, FR167653(Nikken Chemical Co, Ltd.), BIRB796BS (o BIRB-796; 1-(5-tert-butil-2-p-tril-2H-pirazol-3-il)-3 (4-(2-morfolin-4-il-etoxi)naftalin-1-il)urea, Blood101,4446-4448,2003), SKF-86002, trifostina AG126, U0124, U0125, U0126(1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis[2-aminofeniltio]butadieno), 4-azaindol, 3-(4-fluorofenil)-2-(piridin-4-il)-1H-pirrolo[3,2-b]piridina, ZM336372, CalBio506126(2-(4-clorofenil)-4-(4-fluorofenil)-5-piridin-4-il-1,2-dihidropirazol-3-ona), RO3201195, R1487, y similares. También se puede consultar la página ixxviii del catálogo de CalBioChem. Otros inhibidores de la MAP quinasa que pueden utilizarse en la presente invención incluyen, por ejemplo, un anticuerpo de neutralización de la MAP quinasa, un compuesto para inhibir la actividad de la MAP quinasa, un compuesto (por ejemplo, ácido nucleico antisentido, iARN, ribozima) para inhibir la transcripción de un gen que codifica la MAP quinasa, un péptido y un componente vegetal (por ejemplo, polifenol, flavonoide y glucósido) y otros compuestos. Con respecto a la concentración utilizada, para SB203580, SB202190, PD169316, FR167653, BIRB796BS y similares, se ejemplifica alrededor de 50 nmol/l a 100 pmol/l, y normalmente incluye, sin limitación, alrededor de 0,001 a 100 pmol/l, preferentemente, alrededor de 0,01 a 75 pmol/l, alrededor de 0,05 a 50 pmol/l, alrededor de 1 a 10 pmol/l, alrededor de 0,01 a 10 pmol/l, alrededor de 0,05 a 10 pmol/l, alrededor de 0,075 a 10 pmol/l, alrededor de 0,1 a 10 pmol/l, alrededor de 0,5 a 10 pmol/l, alrededor de 0,75 a 10 pmol/l, alrededor de 1,0 a 10 pmol/l, alrededor de 1,25 a 10 pmol/l, alrededor de 1,5 a 10 pmol/l, 1,75 a 10 pmol/l, 2,0 a 10 pmol/l, 2,5 a 10 pmol/l, 3.0 a 10 pmol/l, 4,0 a 10 pmol/l, 5,0 a 10 pmol/l, 60 a 10 pmol/l, alrededor de 7,0 a 10 pmol/l, alrededor de 8,0 a 10 pmol/l, alrededor de 9,0 a 10 pmol/l, alrededor de 0,01 a 50 pmol/l, alrededor de 0,05 a 5,0 pmol/l, alrededor de 0,075 a 5,0 pmol/l, alrededor de 0,1 a 5,0 pmol/l, alrededor de 0,5 a 5,0 pmol/l, alrededor de 0,75 a 5,0 pmol/l, alrededor de 1.0 a 5,0 pmol/l, alrededor de 1,25 a 5,0 pmol/l, alrededor de 1,5 a 5,0 pmol/l, alrededor de 1,75 a 5,0 pmol/l, alrededor de 2,0 a 5,0 jmol/l, de 2,5 a 5,0 jmol/l, de 3,0 a 5,0 jmol/l, de 4,0 a 5,0 jmol/l, de 0,01 a 3,0 jmol/l, de 0,05 a 3,0 |jmol/l, de 0,075 a 3,0 jmol/l.0 jmol/l, de 0,1 a 3,0 jmol/l, de 0,5 a 3,0 jmol/l, de 0,75 a 3,0 jmol/l, de 1,0 a 3,0 jmol/l, de 1,25 a 3,0 jmol/l, de 1,5 a 3,0 jmol/l, de 1,75 a 3,0 jmol/l. 0 jmol/l, alrededor de 2,0 a 3,0 jmol/l, alrededor de 0,01 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,05 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,075 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,1 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,5 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,75 a 1,0 jmol/l alrededor de 009 a 35 jmol/l, alrededor de 0,09 a 3,2 jmol/l, más preferentemente, alrededor de 0,05 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,075 a 1,0 jmol/l alrededor de 0,1 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,5 a 1,0 jmol/l, y alrededor de 0,75 a 1,0 jmol/l.

Tal como se utiliza en el presente documento, "inhibidor del envejecimiento" o "antioxidante" para las células endoteliales de la córnea se refiere a cualquier agente capaz de suprimir la senescencia celular. Las células humanas normales pierden su capacidad de dividirse después de repetir un número determinado o más de divisiones, y entonces se vuelven senescentes (senescencia replicativa). Las células senescentes experimentan cambios morfológicos y fisiológicos específicos, e inducen genes específicos. Además, las células normales presentan un fenómeno similar a los descritos anteriormente a través de varios tipos de tratamiento (senescencia prematura). Como tal, "suprimir la senescencia" de las células se refiere aquí a tener un efecto de aumentar el grado de densidad de las células. Así, más específicamente, "inhibidor del envejecimiento" o "antioxidante" se refiere a cualquier agente para aumentar el grado de densidad de las células. El grado de senescencia de las células puede examinarse mediante la observación morfológica de las mismas (cuando las células se vuelven senescentes, se produce un aplanamiento y una hipertrofia) y mediante la observación de una imagen teñida de p-galactosidasa, conocida como marcador de senescencia (cuando la senescencia progresa, la imagen teñida de p-galactosidasa aumenta de tamaño). Por lo tanto, para el inhibidor del envejecimiento utilizado en la presente invención, se puede utilizar cualquier agente siempre que tenga la acción mencionada anteriormente para suprimir la senescencia. La acción para suprimir la senescencia es una acción que suprime la disminución de la función de las células normales que están sufriendo senescencia, incluyendo, por ejemplo, una acción para suprimir la detención del ciclo celular, una acción para suprimir el acortamiento de la vida útil de las células normales en división, una acción para suprimir la disminución de la tasa de supervivencia de las células normales, una acción para suprimir el cambio morfológico acompañado de senescencia en las células normales, y similares. Aunque no se quiere restringir con teorías, según Funayama R e Ishikawa F (Chromosoma (2007) 116:431-440), se indica que, aunque no es un caso de células endoteliales de la córnea, la senescencia debida a diversos tipos de estrés celular en el fibroblasto y similares se debe a la activación de la p38 MAPK. Además, se ha informado de que un inhibidor de p38 MAPK, SB203580, es capaz de inhibir la senescencia celular debida al estrés celular. En los resultados experimentales que se ejemplificaron en los Ejemplos de la invención, se indicó que el SB203580 no sólo ejercía un efecto de supresión de la fibrosis, sino que también suprimía la disminución del grado de densidad celular para permitir el cultivo de células endoteliales corneales de alto grado de densidad. Así, se entiende que, cuando se utiliza en la presente invención, cualquier inhibidor del envejecimiento puede suprimir la disminución del grado de densidad de las células y mejorar el cultivo de las células endoteliales corneales de alto grado de densidad.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el juicio para "suprimir la senescencia" se basa en la capacidad de suprimir la disminución del grado de densidad de las células endoteliales de la córnea mientras se mantiene el alto grado de densidad. Se sabe que la densidad del endotelio corneal disminuye de acuerdo con la senescencia en un organismo vivo (Kunitoshi OHARA, Tadahiko TSURU, Shigeru INODA: Kakumaku Naihi Saibou Keitai No Parameter [Parameter of Corneal Endothelial Cell Form]. Nippan Ganka Gakkai Zasshi 91:1073-1078, 1987), que también es un buen índice para juzgar la senescencia desde el punto de vista clínico. Además, aunque la disminución de la relación núcleo/citoplasma es un índice típico de senescencia celular, la relación también puede utilizarse para el endotelio corneal. Además, otros ejemplos para el inhibidor del envejecimiento incluyen, sin limitación, otros inhibidores de la p38 MAP quinasa.

Tal como se utiliza en el presente documento, "inhibidor de la MAP quinasa p38" se refiere a cualquier agente para inhibir la señalización de la MAP quinasa asociada a p38. Así, un inhibidor de la p38 MAP quinasa está relacionado con un compuesto dirigido a un miembro de la familia MAPK, la p38-MAPK, para su disminución o inhibición.

La p38 es un miembro de la superfamilia MAPK de los mamíferos y se activa por el estrés, la radiación ultravioleta y las citoquinas inflamatorias. Su núcleo catalítico tiene una secuencia consenso TGY.

Se reconoce gradualmente que la quinasa regulada de forma aberrante es una causa principal de enfermedad para muchas enfermedades, y en particular para los trastornos proliferativos e inflamatorios. Uno de los genes causantes del cáncer que se identificó primero en una región cancerosa fue el de la quinasa del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR), y su sobreexpresión está relacionada con el cáncer de pulmón, mama, cerebro, próstata, GI y ovario. Por ejemplo, la activación constitutiva de la MAP quinasa se asocia con el tumor primario derivado de una variedad de órganos humanos (riñones, intestino grueso y pulmones) y un gran número de linajes celulares de cáncer (páncreas, intestino grueso, pulmones, ovarios y riñones) (Hoshino et al., Oncogene, 18(3): 813-22 (enero de 1999)). Además, la p38 MAP quinasa regula la producción de dos citoquinas, el TNFay la IL-1, que están asociadas al inicio y al progreso de la inflamación. El inhibidor de la p38 MAP quinasa también desempeña un papel en el futuro en el tratamiento de enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide, y además, en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, el ictus, las enfermedades neurogénicas y otras enfermedades. Como tal, el inhibidor de la MAP quinasa es útil para el tratamiento de varios tipos de enfermedades, desde el cáncer hasta la inflamación.

Los inhibidores de la p38 MAP quinasa que pueden utilizarse en la presente invención no están particularmente limitados, siempre que se trate de un compuesto que tenga actividad para inhibir la p38 MAP quinasa, además del VX-745 (Vertex Pharmaceuticals Inc.); e incluye compuestos descritos en publicaciones de patentes, tales como Publicación Japonesa Abierta al público No. 2002-97189, la publicación japonesa de fase nacional PCT Abierta al público No 2000-503304, la publicación nacional japonesa PCT Abierta al público No 2001-522357Publicación PCT Abierta al público de fase nacional japonesa No 2003-535023, Fase Nacional Japonesa PCT Abierta al público Publicación No 2001-506266, Fase Nacional Japonesa PCT Abierta al público Publicación No 9-508123, Publicación Internacional No. WO 01/56553, Publicación Internacional No. WO 93/14081, Publicación internacional No. WO 01/35959, Publicación Internacional No. WO 03/68229, Publicación Internacional No. WO 03/85859, Publicación japonesa en fase nacional PCT Abierta al público No 2002-534468Publicación nacional japonesa PCT Abierta al público No 2001-526222, Publicación PCT Abierta al público de fase nacional japonesa No 2001-526223, Patente estadounidense No. 6344476, Publicación internacional No. WO 03/99811, Publicación Internacional No. WO 03/99796, Publicación nacional japonesa PCT Abierta al público No 2004-506042, Publicación Internacional No. WO 04/60286, Publicación Nacional Japonesa PCT Abierta al público No 2002-363179, Publicación nacional japonesa PCT Abierta al público No 2004-107358, Patente estadounidense No. 5.670.527, Patente estadounidense No.

6.096.753, Publicación internacional No. WO 01/42189, Publicación internacional No. WO 00/31063. Preferentemente, los compuestos son 4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxifenil)-5-(4-piridil)-1H -imidazol(SB-202190), trans-4-[4-(4-fluorofenil)-5-(2-metoxi-4-pirimidinil)-1H-imidazol-1-il]ciclohexanol(SB-239063), 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol(SB-203580), 4-(4-fluorofenil)-5-(2-metoxipirimidina-4-il)-1-(pipe ridina-4-il)imidazol (SB-242235), 4-(fluorofenil)-2-(4-hidroxi-1-butil)-1 -(3-fenilp ropil)-5-(4-piridil)imidazol(RWJ-67657), 4-(4-fluorofenil)-1-(piperidin-4-il)-5-(4-piridil)imidazol(HEP-689), (s)-2-(2-amino-3-fenilpropilamino)-1-metil-5-(2-naftil)-4-(4-piridil)pirimidin-6-ona(AMG-548), 2-chloro-4-(4-fluoro-2-metilanilino)-2'-metilbenzofenona (EO-1606), 3-(4-clorofenil)-5-(1-hidroxietilpiperidin-4-il)-4 -(pirimidina-4-il)pirazol(SD-06), 5-(2,6-diclorofenil)-2-(2,4-difluorofeniltio)pirimido[3,4-b]piridazin-6-ona (VX-745), 4-acetilamino-N-tert-butilbenzamida(CPI-1189), N-[3-tert-butil-1-(4-metilfenil)pirazol-5-il)-N'-[4-(2-morfolinoetoxi)-1-naftil]urea(Dramapimod), 2-benzamida-4-[2-etil-4-(3-metilfenil)tiazol-5-il] piridina(TAK-715), SCIO-469, VX-702, g Sk-681323, PS-540446, SC-80036, AVE-9940, RO-320-1195, SB-281832, SCIO-323, KC-706, N,N' -bis[3,5-bis[1-(2-amidinohidrazono)etil]fenil]decanodiamida, N,N'-bis[3,5-bis[2-(aminoiminometil)hidrazono]etil]fenil]decanodiamida(Semapimod).

Además, Tocris Cookson (St Louis, EE.UU.) proporciona una variedad de inhibidores de la MAP quinasa ejemplificados en http://www.tocris.com/. Por ejemplo, el SB202190 (4-[4-(4-fluorofenil)-5-(4-pyridinil)-1H-imidazol-2-il] fenol) es un inhibidor de la p38 MAP quinasa que es altamente selectivo, fuerte y permeable a las células (SmithKline Beecham, plc) (Jiang et al., J. Biol. Chem., 271:17920 (1996) Frantz et al, Biochemistry, 37:138-46 (1998) Nemoto et al, J. Biol. Chem., 273:16415 (1998); y Davies et al, Biochem. J., 351:95 (2000)). Además, la anisomicina ((2R,3S,4S)-2-[(4-metoxifenil)metil]-3,4-pirrolidina diol-3-acetato) es un inhibidor de la síntesis de proteínas (que bloquea la traducción). Es un fuerte activador de la proteína quinasa activada por el estrés (JNK/SAPK) y de la p38 MAP quinasa, y actúa como un fuerte agonista de señalización para inducir selectivamente la desensibilización homóloga inducida por un gen temprano inmediato (c-fos, fosB, c-jun, junB y junD). El PD98059 (2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H-1-benzopirano-4-ona) es un inhibidor específico de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPKK) (Pfizer = Warner-Lambert Company). El SB203580 (4-[5-(4-fluorofenil)-2-[4-(metilsulfonil)fenil]-1H-imidazol-4-il]piridina) es un inhibidor altamente selectivo (SmithKlineBeecham, plc) de la proteína quinasa activada por mitógenos p38. Está indicado para inhibir el crecimiento de las células T inducido por la interleucina-2, la ciclooxigenasa-1 y -2 y la tromboxano sintasa. El clorhidrato SB203580 (4-[5-(4-fluorofenil)-2-[4-(metilsulfonil)fenil]-1H-imidazol-4-il]pirdina) es una sal soluble en agua de un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos p38, que es altamente selectivo. Está indicado para inhibir el crecimiento de células T inducido por la interleucina -2, la ciclooxigenasa-1 y -2 y la tromboxano sintasa. El U0126 (1,4-diamino2,3-dicianol,4-bis[2-aminofeniltio] butadieno) es un inhibidor selectivo, no competitivo de la MAP quinasa.

En cuanto a un inhibidor preferible de p38 MAPK, sin limitación, se ejemplifica SB203580 4-[4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-1H-imidazol-5-il] piridina).

Tal y como se utiliza en el presente documento, "agente promotor de la adhesión celular" o "agente promotor de la adhesión" de una célula endotelial corneal se refiere a un agente para proporcionar o mejorar una propiedad adhesiva de una célula, y se puede utilizar cualquier agente siempre que el agente tenga dicha función. Un agente promotor de la adhesión ejemplar para las células endoteliales de la córnea incluye, sin limitación, los inhibidores de la Rho quinasa.

En la presente invención, "Rho quinasa" significa serina/treonina quinasa que se activa de acuerdo con la activación de Rho. Por ejemplo, se incluyen ROKa (ROCK-II: Leung, T. y otros, J. Biol. Chem., 270, 29051-29054, 1995), p160ROCK (ROKp, ROCK-I: Ishizaki, T. et al., TheEMBOJ., 15(8), 1885-1893, 1996) y otras proteínas con actividad serina/treonina quinasa.

Los inhibidores de la Rho-quinasa incluyen compuestos divulgados en los siguientes documentos: Patente estadounidense No. 4678783, Patente japonesa No. 3421217, Publicación internacional No. WO 95/28387, Publicación Internacional No. WO 99/20620, Publicación Internacional No. WO 99/61403, Publicación Internacional No. WO 02/076976, Publicación Internacional No. WO 02/076977, Publicación Internacional No. WO 2002/083175, Publicación internacional No. WO 02/100833, Publicación internacional No. WO 03/059913, Publicación internacional No. WO 03/062227, Publicación internacional No. WO 2004/009555, Publicación internacional No. WO 2004/022541, Publicación internacional No. WO 2004/108724, Publicación internacional No. WO 2005/003101, Publicación internacional No. WO 2005/039564, Publicación internacional No. WO 2005/034866, Publicación internacional No. WO 2005/037197, Publicación internacional No. WO 2005/037198, Publicación internacional No. WO 2005/035501, Publicación internacional No. WO 2005/035503, Publicación internacional No. WO 2005/035506, Publicación internacional No. WO 2005/080394, Publicación internacional No. WO 2005/103050, Publicación internacional No. WO 2006/057270, Publicación internacional No. WO 2007/026664 y similares. Cada uno de los compuestos en cuestión puede fabricarse mediante los procedimientos descritos en los documentos en los que se divulgan los respectivos compuestos. Los ejemplos específicos incluyen la 1-(5-isoquinolinesulfonil) homopiperazina o una sal de la misma (por ejemplo, fasudil(1-(5-isoquinolinesulfonil)homopiperazina)), (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilcarbamoil)ciclohexano((R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-ciclohexanocarboxamida) o una sal de la misma (por ejemplo, Y-27632((R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-ciclohexanocarboxamida2 clorhidrato 1 hidrato) y similares) y similares. En cuanto a estos compuestos, también pueden utilizarse preferentemente productos comercializados (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Asahi Kasei Pharma Corporation y similares).

(+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilcarbamoil)ciclohexano, 1-(5-isoquinolinsulfonil)homopiperazina y una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y similares son particularmente excelentes para la promoción de la adhesión de las células endoteliales de la córnea, por lo que se utilizan preferentemente. En cuanto a la sal del compuesto, es preferible una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable, y dicho ácido incluye el ácido muriático, el ácido bromhídrico, el ácido sulfúrico y otro ácido inorgánico, y el ácido metanosulfónico, el ácido fumárico, el ácido maleico, el ácido mandélico, el ácido cítrico, el ácido tartárico, el ácido salicílico y otro ácido orgánico. Son más preferibles el clorhidrato de (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilcarbamoil)ciclohexano((R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-ciclohexanocarboxamida)-2 (que también puede ser monohidrato), y el clorhidrato de 1-(5-isoquinolinesulfonil)homopiperazina.

En la presente invención, la "promoción de la adhesión de las células endoteliales de la córnea" incluye, por ejemplo, tanto la promoción de la adhesión de las células del endotelio de la córnea, como la promoción de la adhesión de una célula endotelial de la córnea y un sustrato de cultivo.

El agente promotor de la adhesión (celular) que puede utilizarse en la presente invención ejerce una acción promotora de la adhesión a una célula endotelial corneal separada de un tejido corneal derivado de un mamífero (por ejemplo, humanos, ratones, ratas, hámsteres, conejos, gatos, perros, vacas, ovejas, monos y similares) o una célula endotelial corneal separada y subcultivada. El agente promotor de la adhesión según la presente invención es excelente en una acción de promoción de la adhesión de las células endoteliales corneales derivadas de seres humanos, que se consideran particularmente difíciles de cultivar y subcultivar. Por lo tanto, es preferible definir como objeto la célula endotelial corneal derivada del ser humano.

Las células endoteliales de la córnea desempeñan un papel en el mantenimiento del grado de transparencia de la córnea. Si la densidad de las células endoteliales disminuye por debajo de un determinado límite, se producirá una inflamación en la córnea y no se mantendrá el grado de transparencia en la misma, lo que dará lugar a un daño endotelial corneal. El agente promotor de la adhesión que puede utilizarse en la presente invención promueve la adhesión de una célula endotelial corneal, lo que permite mejorar la formación de una capa de células endoteliales corneales con una forma celular favorable y una alta densidad celular.

Tal como se utiliza en el presente documento, "sustancia (por ejemplo, ácido nucleico) para suprimir la expresión (de TGF-p o similar)" no está particularmente limitada siempre que dicha sustancia sea una sustancia que suprima la transcripción del ARNm de un gen diana, una sustancia que degrade un ARNm transcrito (por ejemplo, ácido nucleico), o una sustancia (por ejemplo, ácido nucleico) que suprima la traducción de la proteína a partir del ARNm. En cuanto a las sustancias, se ejemplifican el ARNip, el oligonucleótido antisentido, la ribozima, un vector de expresión del mismo y otros ácidos nucleicos. Entre ellos, son preferibles el ARNip y un vector de expresión del mismo, y el ARNip es particularmente preferible. "Sustancia que suprime la expresión de un gen" incluye, además de las descritas anteriormente, proteínas, péptidos y otras pequeñas moléculas. Obsérvese que un gen diana en el presente documento significa cualquier gen que esté asociado a una vía de señalización del TGF-p.

En cuanto a un procedimiento para inhibir la expresión de un gen endógeno específico, como el TGF-p, al que se dirige la presente invención, un procedimiento que utiliza una técnica antisentido es bien conocido por los expertos en la técnica. En cuanto a las acciones para que un ácido nucleico antisentido inhiba la expresión de un gen diana, hay una pluralidad de factores como los siguientes. Específicamente, tales factores son: inhibición de la iniciación de la transcripción debido a la formación de triplex; inhibición de la transcripción debido a la formación de híbridos con un sitio donde se forma localmente una estructura de bucle abierto debido a la ARN polimerasa; inhibición de la transcripción debido a la formación de híbridos con un ARN cuya síntesis está en curso; inhibición del empalme debido a la formación de híbridos en una unión de intrón y exón; inhibición del empalme debido a la formación de híbridos con un sitio de formación de espliceosomas; inhibición de la transferencia de un núcleo a un citoplasma debido a la formación de híbridos con ARNm; inhibición del empalme debido a la formación de un híbrido con un sitio de tapado o un sitio de adición de poli (A); inhibición de la iniciación de la traducción debido a la formación de un híbrido con un sitio de unión del factor de iniciación de la traducción; inhibición de la traducción debido a la formación de un híbrido con un sitio de unión del ribosoma cerca de un codón de iniciación; inhibición de la elongación de una cadena peptídica debido a la formación de un híbrido con un sitio de unión del polisoma o una región de traducción del ARNm; e inhibición de la expresión génica debido a la formación de un híbrido con un sitio de interacción de un ácido nucleico y una proteína, y similares. Como tal, un ácido nucleico antisentido inhibe una serie de procesos, como la transcripción, el empalme o la traducción, para inhibir la expresión de un gen diana (Hirashima e Inoue, Shinsei Kagaku Jikken Kouza [New Chemical Experiment Course] 2, Nucleic Acid, IV Idenshi no Fukusei to Hatsugen [Duplication and Expression of Gene], Editado por la Sociedad Bioquímica Japonesa, Tokio Kagaku Dozin, 1993, 319-347).

El ácido nucleico antisentido utilizado en la presente invención puede inhibir la expresión y/o la función o un gen (ácido nucleico) que codifica un miembro o similar de una vía de señalización del TGF-p antes mencionado mediante cualquiera de las acciones mencionadas. En una realización, se considera que es eficaz para la inhibición de la traducción de un gen cuando se diseña una secuencia antisentido complementaria en una región de no traducción cerca de la terminal 5' del ARNm de un gen que codifica el antes mencionado TGF-p o similar. Además, es posible utilizar una secuencia complementaria a una región codificante o a una región de no-traducción 3'. Como tal, la región de traducción de un gen que codifica el anters mencionado TGF-p o similar, así como un ácido nucleico que incluye una secuencia antisentido de una secuencia de una región de no traducción se incluyen en el ácido nucleico antisentido que se utiliza en la presente invención. El ácido nucleico antisentido utilizado se conecta a una secuencia corriente abajo de un promotor apropiado, y se conecta preferentemente a una secuencia que incluye una señal de terminación de la transcripción en el lado más cercano a 3'. Un ácido nucleico preparado de esta manera puede transformarse en un animal (célula) deseado mediante un procedimiento conocido públicamente. Aunque la secuencia del ácido nucleico antisentido es preferentemente una secuencia complementaria a un gen, o a una parte del mismo, que codifica TGF-p o similar de un animal (célula) que se va a transformar, no tiene que ser completamente complementaria siempre que la secuencia pueda suprimir eficazmente la expresión de los genes. El ARN transcrito tiene preferentemente un 90 % o más, y más preferentemente un 95 % o más, de complementariedad con un producto de transcripción de un gen diana. Para inhibir eficazmente la expresión de un gen diana utilizando un ácido nucleico antisentido, la longitud del ácido nucleico antisentido es preferentemente de al menos 12 bases o más pero de menos de 25 bases. Sin embargo, el ácido nucleico antisentido según la presente invención no está necesariamente limitado a esta longitud, y el ácido nucleico antisentido puede tener, por ejemplo, 11 bases o menos, 100 bases o más, o 500 bases o más. Aunque el ácido nucleico antisentido puede estar compuesto únicamente por ADN, también puede incluir ácidos nucleicos distintos del ADN, como el ácido nucleico bloqueado (LNA). En una realización, el ácido nucleico antisentido utilizado en la presente invención puede ser un ácido nucleico antisentido que contenga LNA y que incluya LNA en el terminal 5' y l Na en el terminal 3'. Además, en una realización en la que se utiliza un ácido nucleico antisentido en la presente invención, se puede diseñar una secuencia antisentido basada en una secuencia de ácido nucleico, como TGF-p, utilizando un procedimiento descrito en Hirashima e Inoue, Shinsei Kagaku Jikken Kouza [New Chemical Experiment Course] 2, Nucleic Acid, IV Idenshi no Fukusei to Hatsugen [Duplication and Expression of Gene], Editado por la Sociedad Bioquímica Japonesa, Tokio Kagaku Dozin, 1993, 319-347 por ejemplo.

La inhibición de la expresión de TGF-p o similares también puede realizarse mediante el uso de ribozima, o ADN que codifique ribozima. La ribozima se refiere a una molécula de ARN con actividad catalítica. Hay varios tipos de ribozimas que tienen varios tipos de actividades, y las investigaciones centradas en una ribozima como enzima para escindir el ARN han permitido diseñar una ribozima para escindir el ARN de una manera específica para el sitio. Mientras que entre las ribozimas se incluyen las que tienen 400 nucleótidos o más, como las del tipo intrón del grupo I y el ARN M1 incluido en la RNasa P, también hay ribozimas de este tipo que tienen un dominio de actividad de hasta 40 nucleótidos, como las denominadas tipo cabeza de martillo y tipo horquilla (Makoto Koizumi y Eiko Ohtsuka, Tanpakushitu Kakusan Kouso [Protein Nucleic Acid Enzyme], 1990, 35, 2191).

Por ejemplo, el dominio de autoescisión de la ribozima de tipo cabeza de martillo escinde el lado más cercano a 3' de C15 en una secuencia denominada G13U14C15, y se considera que la formación de pares de bases de U14 y A9 es importante para la actividad de la misma; y se indica que la escisión puede realizarse por A15 o U15, en lugar de c15 (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228). Si se diseña una ribozima en la que un sitio de unión de sustancias sea complementario a una secuencia de ARN cercana a un sitio diana, se puede crear una una ribozima de escisión de ARN enzimático de restricción que reconozca una secuencia como UC, UU o UA en un ARN diana (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285., Makoto Koizumi y Eiko Ohtsuka, Tanpakushitu Kakusan Kouso [Protein Nucleic Acid Enzyme], 1990, 35, 2191., Koizumi, M. et al., Nucl. Acids Res., 1989, 17, 7059).

Además, las ribozimas de tipo horquilla también son útiles para el propósito de la presente invención. Una ribozima de este tipo se encuentra, por ejemplo, en una cadena negativa de un ARN satélite del virus de las manchas anulares del tabaco (Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.). Se ha indicado que se puede crear una una ribozima de escisión de ARN específica de la diana a partir de una ribozima de tipo horquilla (Kikuchi, Y. & Sasaki,N., Nucl. Acids Res,1991, 19, 6751., Kikuchi, Yo, Kagaku to Seibutu [Chemistry and Living Organism], 1992, 30, 112.). Como tal, un producto de transcripción de un gen que codifica TGF-p o similar se escinde específicamente utilizando ribozima, de modo que la expresión del gen puede ser inhibida.

La supresión de la expresión de un gen endógeno de TGF-p o similar también puede realizarse mediante interferencia por ARN (en adelante, abreviado como "iARN") utilizando un ARN de doble cadena que tenga una secuencia idéntica o similar a una secuencia del gen diana. Cuando el iARN de doble cadena (ARNbc) se introduce directamente en una célula, se suprime la expresión de un gen que tenga una secuencia homóloga a la del ARNd, un procedimiento que actualmente está llamando la atención. En las células de mamíferos, se utiliza un ARNbc de cadena corta (ARNip) para poder inducir el iARN. En comparación con los ratones knockout, el iARN tiene muchas ventajas, como su gran estabilidad, su fácil experimentación y su bajo coste. El ARNip se describirá en detalle en otra parte de la presente memoria descriptiva.

Tal como se utiliza en el presente documento, "ARNip" se refiere a una molécula de ARN que tiene una fracción de ARN de doble cadena que consiste en 15 a 40 bases, y el ARNip tiene la función de escindir el ARNm de un gen diana que tiene una secuencia complementaria a una cadena antisentido de dicho ARNip y suprimir la expresión del gen diana. Más específicamente, el ARNip según la presente invención es un ARN que incluye una fracción de ARN de doble cadena que consiste en una cadena de ARN en sentido que consiste en una secuencia homóloga a una secuencia de ARN contigua en el ARNm de TGF-p o similar, y una cadena de ARN antisentido que consiste en una secuencia complementaria a la secuencia de ARN en sentido. La fabricación y el diseño del ARNip y de un ARNip mutante que se describirá a continuación están dentro del alcance de la capacidad de los expertos en la técnica. El concepto de seleccionar cualquier región contigua de ARNm, que es un producto de transcripción de una secuencia de TGF-p o similar, y crear un ARN de doble cadena correspondiente a la región es simplemente una cuestión que los expertos en la técnica pueden realizar dentro de la capacidad creativa normal de ellos. Además, el concepto de seleccionar una secuencia de ARNip con un efecto de iARN más potente a partir de una secuencia de ARNm, que es un producto de transcripción de la secuencia objeto de estudio, puede ser realizado adecuadamente por los expertos en la técnica utilizando un procedimiento conocido públicamente. Además, si se identifica una de las cadenas, es fácil para los expertos en la técnica determinar la secuencia de bases de la otra cadena (cadena complementaria). Los expertos en la técnica pueden crear adecuadamente ARNip utilizando una máquina sintetizadora de ácidos nucleicos disponible en el mercado. Además, el servicio de encargo de síntesis puede utilizarse generalmente para la síntesis de ARN deseada.

La longitud de la molécula de ARN de doble cadena es, como base, de 15 a 40 bases, preferentemente de 15 a 30 bases, más preferentemente de 15 a 25 bases, aún más preferentemente de 18 a 23 bases, y más preferentemente de 19 a 21 bases. Se entiende que los límites superior e inferior de los mismos no se limitan a los especificados, sino que los límites pueden ser cualquier combinación de los enumerados. En cuanto a la estructura terminal de una cadena en sentido o antisentido del ARNip, no existe ninguna limitación particular, y puede seleccionarse adecuadamente en función del propósito. Por ejemplo, la estructura del terminal puede ser la que tiene un terminal al ras o la que tiene un terminal sobresaliente (voladizo), y el tipo con terminal sobresaliente 3' es preferible. Un ARNip que tiene un voladizo de varias bases, preferentemente de 1 a 3 bases, y aún preferentemente 2 bases, en el terminal 3' de la cadena de ARN en sentido y de la cadena de ARN antisentido suele tener un gran efecto de inhibición de la expresión de un gen diana, lo cual es preferible. El tipo de las bases del voladizo no está particularmente restringido, y el tipo puede ser una base que constituya un ARN o una base que constituya un ADN. Las secuencias voladizas preferibles incluyen dTdT (2bp desoxi T) en el terminal 3', y similares. Por ejemplo, los ARNip preferibles incluyen, sin limitación, aquellos en los que se añade dTdT (2bp desoxi T) al terminal 3' de las cadenas en sentido y antisentido de todo el ARNip.

Además, también es posible utilizar un ARNip en el que se suprimen, sustituyen, insertan y/o añaden de uno a varios nucleótidos en una o ambas cadenas sentido y antisentido del mencionado ARNip. A este respecto, el concepto de una a varias bases no está particularmente limitado, pero es preferentemente de 1 a 4 bases, aún preferentemente de 1 a 3 bases, más preferentemente de 1 a 2 bases. Entre los ejemplos específicos de la mutación en cuestión se incluyen, sin limitación, aquellos en los que el número de bases en la fracción del voladizo 3' es de 0 a 3, aquellos en los que la secuencia de bases de la fracción del voladizo 3' se cambia por otra secuencia de bases, aquellos en los que la longitud de la cadena de ARN en sentido y la cadena de ARN en antisentido antes mencionadas es diferente en 1 a 3 bases debido a la inserción, adición o eliminación de bases, aquellos en los que la base en una cadena en sentido y/o en una cadena en antisentido se sustituye por otra base, y similares. Sin embargo, es necesario que la cadena en sentido y la cadena en antisentido puedan hibridarse en estos iARNps mutantes, y es necesario que estos iARNps mutantes tengan una capacidad de inhibición de la expresión génica equivalente a la de los iARNps que no tienen mutación.

Además, el ARNip puede ser un ARNip (ARN de Horquilla Corta; ARNhc) en el que uno de los terminales tiene una molécula de estructura cerrada, como una estructura de horquilla. El ARNhc es un ARN de la cadena en sentido de una secuencia específica de un gen diana, un ARN de la cadena de antisentido que consiste en una secuencia complementaria a la secuencia de la cadena en sentido, y un ARN que incluye una secuencia enlazadora para conectar ambas cadenas, en el que la fracción de la cadena en sentido y la fracción de la cadena de antisentido se hibridan para formar una fracción de ARN de doble cadena.

Es deseable que el ARNip no muestre el llamado efecto fuera del objetivo cuando se utiliza clínicamente. El efecto de dianas ajenas se refiere a un efecto de supresión de la expresión de otro gen con homología parcial al ARNip utilizado, distinto del gen diana. Para evitar el efecto de dianas ajenas, es posible confirmar que un ARNip candidato no tiene reactividad cruzada utilizando un microarreglo de ADN o similar por adelantado. Además, es posible evitar el efecto de dianas ajenas confirmando si existe un gen que incluya una fracción que tenga una alta homología con una secuencia de un ARNip candidato, que no sea un gen diana, utilizando la base de datos conocida públicamente proporcionada por el NCBI (National Centerfor Biotechnology Information) o similar.

Para crear el ARNip según la presente invención, se puede utilizar adecuadamente un procedimiento conocido públicamente, como un procedimiento por síntesis química y un procedimiento que utilice una técnica de recombinación de genes. Con un procedimiento por síntesis, se puede sintetizar un ARN de doble cadena basado en la información de la secuencia, utilizando un procedimiento común. Además, también es posible crear un ARNip de este tipo construyendo un vector de expresión que codifique una secuencia de la cadena en sentido y una secuencia de la cadena del antisentido e introduciendo el vector en una célula huésped, y obteniendo entonces un ARN de la cadena del sentido y un ARN de la cadena del antisentido, cada uno de los cuales se produce por transcripción. Además, es posible crear un ARN de doble cadena deseado expresando un ARNhc, que incluye una cadena en sentido de una secuencia específica de un gen diana, una cadena en antisentido que consiste en una secuencia complementaria a la secuencia de la cadena en sentido, y una secuencia enlazadora para conectar ambas cadenas, y que forma una estructura de horquilla.

Con respecto al ARNip, la totalidad o parte de los ácidos nucleicos que constituyen el ARNip pueden ser un ácido nucleico natural o un ácido nucleico modificado, siempre que dicho ácido nucleico tenga una actividad para suprimir la expresión de un gen diana.

El ARNip según la presente invención no tiene que ser necesariamente un par de ARN de doble cadena a una secuencia diana, y puede ser una mezcla de una pluralidad (la "pluralidad" no está particularmente limitada, pero preferentemente se refiere a un número pequeño de aproximadamente 2 a 5) de ARN de doble cadena a una región que incluye una secuencia diana. A este respecto, los expertos en la técnica pueden crear adecuadamente ARNip, como una mezcla de ácidos nucleicos correspondiente a una secuencia diana, utilizando una máquina de síntesis de ácidos nucleicos disponible en el mercado y la enzima DICER; y en cuanto a la síntesis de un a Rn deseado, puede utilizarse generalmente el servicio de encargo de síntesis. Obsérvese que el ARNip según la presente invención incluye un denominado "cóctel de ARNip". Además, nótese que el ARNip según la presente invención es tal que no todos los nucleótidos tienen que ser un ribonucleótido (ARN). Específicamente, en la presente invención, uno o la pluralidad de ribonucleótidos que constituyen un ARNip pueden ser un desoxirribonucleótido correspondiente. El término "correspondiente" se refiere a que son del mismo tipo de base (adenina, guanina, citosina, timina (uracilo)) aunque la estructura de la porción de azúcar sea diferente. Por ejemplo, un desoxirribonucleótido correspondiente a un ribonucleótido con adenina se refiere a un desoxirribonucleótido que tiene adenina.

Además, un ADN (vector) que puede expresar el ARN mencionado anteriormente según la presente invención también se incluye en una realización preferida de un ácido nucleico que puede suprimir la expresión de TGF-p o similar. Por ejemplo, el ADN (vector) que puede expresar el ARN bicatenario antes mencionado según la presente invención es un ADN de este tipo que tiene una estructura en la que el ADN que codifica una de las cadenas del ARN bicatenario y un ADN que codifica la otra de las cadenas del ARN bicatenario están conectados a un promotor de manera que cada uno de los ADNs es capaz de expresarse. El mencionado ADN según la presente invención puede ser creado adecuadamente por los expertos en la técnica utilizando una técnica general de ingeniería genética. Más concretamente, el vector de expresión según la presente invención puede crearse insertando adecuadamente el ADN que codifica el ARN según la presente invención, en una variedad de vectores de expresión conocidos públicamente.

En la presente invención, se puede utilizar un ácido nucleico modificado para el ácido nucleico para suprimir la expresión de un gen diana. Por ácido nucleico modificado se entiende un ácido nucleico en el que la modificación se produce en un nucleósido (fracción de base, fracción de azúcar) y/o en un sitio de unión entre nucleósidos, y que tiene una estructura diferente a la de un ácido nucleico natural. "Nucleósido modificado", que constituye un ácido nucleico modificado, incluye, por ejemplo, nucleósido abásico; arabinonucleósido, 2'-desoxiuridina, a-desoxirribonucleósido, p-L-desoxirribonucleósido, nucleósido que tiene otra modificación de azúcar; ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico peptídico de unión al grupo fosfato (PHONA), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico morfolino y similares. El nucleósido mencionado que tiene una modificación de azúcar incluye 2'-O-metilribosa, 2'-desoxi-2'-fluoribosa, 3'-O-metilribosa y otras pentosas sustituidas; 1',2'-desoxirribosa; arabinosa; azúcar arabinosa sustituido; y nucleósido que tiene una modificación de azúcar de alfa-anómero y hexosa. Estos nucleósidos pueden ser una base modificada en la que se modifica la fracción de base. Estas bases modificadas incluyen, por ejemplo, 5-hidroxicitosina, 5-fluorouracilo, 4-tiouracilo y otras pirimidinas; la 6-metiladenina, la 6-tioguanosina y otras purinas; y otras bases heterocíclicas.

La "unión inter-nucleósido modificada", que constituye un ácido nucleico modificado, incluye la unión inter-nucleósido no natural, como el enlazador alquilo, el enlazador glicerilo, el enlazador amino, la unión poli(etilenglicol), la unión nucleósido fosfonato intermetilo, metilfosfonotioato, fosfotriester, fosfotiotriester, fosforotioato, fosforoditioato, profármaco triester, sulfona, sulfonamida, sulfamato, acetal de Holm, N-metilhidroxilamina, carbonato, carbamato, morfolino, boranofosfonato, fosforamidato y similares.

La secuencia de ácido nucleico incluida en el ARNip de doble cadena según la presente invención incluye un ARNip dirigido a un miembro de TGF-p u otros miembros de señalización de TGF-p, y similares.

También es posible introducir el ácido nucleico o el agente según la presente invención en liposomas u otros retículos endoplásmicos de fosfolípidos y administrar el retículo endoplásmico. Un retículo endoplásmico en el que se retiene un ARNip o un ARNhc puede introducirse en una célula predeterminada mediante un procedimiento de lipofección. A continuación, la célula obtenida se administra sistémicamente, por ejemplo, por vía intravenosa, intraarterial o similar. El retículo endoplásmico también puede ser administrado localmente en un sitio requerido en un ojo o similar. Aunque el ARNip muestra un excelente efecto específico de supresión de la transcripción in vitro, se degrada rápidamente in vivo debido a la actividad de las nucleasas en el suero sanguíneo. Por lo tanto, la duración es limitada, y debido a esto, ha habido una necesidad de desarrollo para un sistema de suministro mejor y más eficaz. En cuanto a un ejemplo, Ochiya, T et al., Nature Med., 5:707-710, 1999, Curr. Gene Ther., 1: 31-52, 2001 informa de lo siguiente: un material biocompatible, el atelocolágeno, se mezcla con un ácido nucleico para formar un complejo, que tiene una acción de protección de un ácido nucleico frente a una enzima degradante en un organismo vivo y que es un portador que es extremadamente adecuado como portador de ARNip. Aunque se puede utilizar dicha forma, el procedimiento para introducir un ácido nucleico o un medicamento según la presente invención no se limita a este procedimiento. De este modo, debido a la rápida degradación por la acción de la enzima degradadora del ácido nucleico en el suero sanguíneo de un organismo vivo, es posible lograr la continuación del efecto a largo plazo. Por ejemplo, Takeshita F. PNAS. (2003) 102 (34) 12177-82, Minakuchi Y Nucleic Acids Research (2004) 32 (13) e109 informa de lo siguiente: el atelocolágeno derivado de la piel bovina forma un complejo con un ácido nucleico, que tiene una acción de protección de un ácido nucleico frente a una enzima degradante en un organismo vivo y que es extremadamente adecuado como portador de ARNip. Se puede utilizar esta técnica.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "medio de cultivo" se refiere a cualquier medio de cultivo capaz de mantener o hacer crecer una célula endotelial corneal, y en un caso apropiado según sea necesario, el medio de cultivo puede adoptar cualquier forma, como un medio de cultivo líquido (solución de cultivo), un medio de cultivo en suspensión, un medio de cultivo sólido y similares. Los ingredientes de dicho medio de cultivo utilizado para las células endoteliales de la córnea incluyen, por ejemplo, DMEM (GIBCO BRL), OptiMEM (Life Technologies), suero sanguíneo (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS)), factor proliferativo/factor de crecimiento (por ejemplo, b-FGF), una sustancia antibiótica (como penicilina, estreptomicina y gentamicina), y similares.

(Técnicas generales)

La técnica biológica molecular, la técnica bioquímica y la técnica microbiológica, tal como se utilizan en el presente documento, son bien conocidas y de uso común en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbory 3rd Ed. (2001) Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols inMolecularBiology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience Ausubel, F. M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates Innis, M. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wileyy actualizaciones anuales Sninsky, J. J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRLPress Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues :: A Practical Approach, IRL Press Adams, R. L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim Blackburn, G. M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G. T. (1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press, Jikken Igaku Bessatsu [Experimental Medicine, Separate Volume], "Idenshi Dounyu & Hatsugen Kaiseki Jikken [Gene Introduction & Expression Analysis Experimental Technique" Yodosha Co., Ltd., 1997y similares. Con respecto a las células endoteliales de la córnea, el informe de Nancy Joyce y otros, {Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7} es bien conocido, mientras que en la actualidad se están llevando a cabo investigaciones para obtener procedimientos de cultivo eficaces realizando la transformación de forma fibroblástica mediante el cultivo a largo plazo y el subcultivo, como se ha descrito anteriormente.

(Descripción de la realización preferida)

En lo sucesivo, se describirán las realizaciones preferidas, pero debe entenderse que las realizaciones son una ejemplificación de la presente invención y el ámbito de la presente invención no se limita a dichas realizaciones preferidas. También debe entenderse que los expertos en la técnica pueden realizar fácilmente alteraciones, cambios y similares dentro del ámbito de la presente invención con referencia a los siguientes Ejemplos preferibles.

(Agente normalizador de cultivos)

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un agente normalizador de cultivo de una célula endotelial corneal, que incluye un inhibidor de la fibrosis. Antes de la provisión de la presente invención, era difícil cultivar una célula endotelial corneal manteniendo una forma adecuada para el trasplante. En particular, el trasplante sería difícil si el subcultivo se repite una y otra vez. La pérdida de proteína funcional indica que puede ser difícil realizar el trasplante. Convencionalmente, se sabía que el cambio morfológico se producía en un procedimiento de cultivo normal. En la presente invención, dado que esto era morfológicamente fibroblástico, se consideró como un cambio fibrótico, que se encontró involucrado con la activación de una señalización de TGF-p. A este respecto, la activación de la señal del TGF-p puede juzgarse, como se ejemplifica en los Ejemplos, examinando la cantidad, el nivel y similares de la fibronectina y el colágeno de tipo 1, la fibronectina de tipo 4 y de tipo 8, la integrina a5 y la integrina p1 y otras matrices extracelulares o integrinas. No pretende ser limitante, pero el nivel de expresión proteica de la fibronectina está fuertemente regulado al alza en el fenotipo de fibroblasto en comparación con el fenotipo normal. En la actualidad, se ha encontrado que la fibrosis de una célula endotelial de la córnea está implicada en una enfermedad extremadamente rara, como la sífilis congénita, en un organismo vivo; sin embargo, no se ha desarrollado un procedimiento de tratamiento para suprimir la fibrosis. Por lo tanto, no era posible anticipar si se podía mantener una función normal suprimiendo la fibrosis con fármacos en esas condiciones de enfermedad y de cultivo. Cuando los inventores utilizaron un agente conocido para suprimir la fibrosis, con un agente inhibidor de la señal TGF-p como ejemplo representativo en otras células, se hizo posible el cultivo con cambio morfológico suprimido y se mantuvo inesperadamente la función normal de las células durante el subcultivo (es decir, se hizo posible la normalización del cultivo). Como resultado, los inventores descubrieron un procedimiento para lograr un crecimiento significativo de las células endoteliales de la córnea. Convencionalmente era imposible cultivar una gran cantidad de células endoteliales de la córnea manteniendo su función normal. Por lo tanto, el efecto logrado por la presente invención debe considerarse realmente significativo.

En la presente invención, es posible incluir un inhibidor de la fibrosis solo, y también es posible incluir varios tipos en conjunto, según sea necesario.

La concentración del inhibidor de la fibrosis utilizado en la presente invención es, sin limitación, normalmente de aproximadamente 0,1 a 100 pmol/l, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 30 pmol/l, y más preferentemente de aproximadamente 1 pmol/l; cuando se utilizan varios tipos de los mismos, la concentración puede cambiarse adecuadamente, y otros intervalos de concentración incluyen, por ejemplo, normalmente de aproximadamente 0,001 a 100 pmol/l, preferentemente, aproximadamente 0,01 a 75 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 50 pmol/l, aproximadamente 1 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 10 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 2,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 4,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 5,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 6,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 7,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 8,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 9,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 50 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 5. 0 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 5. 0 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 4,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 3 0,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,09 a 35 pmol/l, aproximadamente 0,09 a 3,2 pmol/l, más preferentemente, aproximadamente 0,05 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 pmol/l, aproximadamente de 0,5 a 1,0 pmol/l y aproximadamente de 0,75 a 1,0 pmol/l.

En la presente invención, cuando se utiliza para un medio de cultivo o similar, puede incluirse un agente normalizador de cultivos solo, y pueden incluirse varios tipos del mismo junto con otros según sea necesario; y puede incluirse un único ingrediente eficaz en el agente normalizador de cultivos solo, y también pueden incluirse varios tipos del mismo junto con otros según sea necesario.

La concentración del agente normalizador de cultivos según la presente invención, utilizado en un medio de cultivo o similar, es sin limitación, normalmente de aproximadamente 0,1 a 100 pmol/l, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 30 pmol/l, más preferentemente alrededor de 1 pmol/l, cuando se utilizan varios tipos del mismo, la concentración puede cambiarse adecuadamente, y otros intervalos de concentración incluyen, por ejemplo, normalmente aproximadamente 0,001 y 100 pmol/l, preferentemente entre 0,01 y 75 pmol/l, entre 0,05 y 50 pmol/l, entre 1 y 10 pmol/l, entre 0,01 y 10 pmol/l, entre 0,05 y 10 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 10 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 2,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 4,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 5,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 6,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 7,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 8,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 9,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 50 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 5. 0 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 4,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,09 a 35 pmol/l, aproximadamente 0,09 a 3,2 pmol/l, y más preferentemente, aproximadamente 0,05 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 1.0 |jmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 jmol/l y aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l.

Las vías de señalización del TGF-p se clasifican en gran medida en un sistema Smad 2/3 a través de ALK 4, 5 o 7, y un sistema Smad1/5/8 a través de ALK 1, 2, 3 o 6; y se sabe que ambos están asociados a la fibrosis (J. Massagu'e, Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:753-91 Vilar JMG, Jansen R, Sander C (2006) PLoS Comput Biol 2 (1 ) : e3 Leask, A., Abraham, D. J. FASEB J. 18, 816-827 (2004) Coert Margadant & Arnoud Sonnenberg EMBO reports (2010) 11, 97­ 105 Joel Rosenbloomet al., Ann Intern Med. 2010; 152 : 159-166.). Se sabe que la BMP-7 suprime la señalización del TGF-p y que es capaz de suprimir la fibrosis (además de los documentos mencionados anteriormente, Ralf Weiskirchen, et al., Frontiers in Bioscience 14, 4992-5012, 1 de junio de 2009 Elisabeth M Zeisberg et al., Nature Medicine 13, 952-961 (2007) Michael Zeisberg et al., Nature Medicine 9, 964-968 (2003)). Sin embargo, mientras que la literatura no de Patente 2 y 4 describen la implicación del TGF-p con respecto a un estado asociado a los tejidos membranosos constituidos realmente por una matriz extracelular, como el colágeno, por una enfermedad extremadamente rara, la queratitis parenquimatosa sifilítica, o un trastorno grave creado artificialmente, es difícil conseguir el mantenimiento de la normalización a partir de ella. Además, la Literatura no de Patente 5 indica que la fibrosis durante una lesión grave en una córnea se debe a la IL-1p, y debido a la activación de la p38 MAPK en el curso. La Literatura no de Patente 6 indica, con conejos, que la fibrosis, observada cuando se produce una inflamación severa en el organismo vivo debido a una lesión externa excesiva por congelación, implica la activación de la p38 MAPK, y parte de la fibrosis puede ser suprimida por un inhibidor, con conejos. Estos documentos indican que la activación de la p38 MAPK está implicada en una situación en la que se produce una inflamación extremadamente fuerte en un organismo vivo y en la que están implicados tejidos membranosos compuestos por una matriz extracelular. Los documentos no mencionan que la fibrosis se produce en un estado de cultivo normal, y no mencionan que el agente inhibidor de la señal TGF-p y el inhibidor de la p38 MAPK son eficaces para mantener la normalización. Los documentos en cuestión no proporcionan ninguna sugerencia con respecto al mantenimiento de un estado normal. Como tal, anteriormente se consideraba que era difícil cultivar células endoteliales de la córnea manteniendo la función normal, y la Literatura No Patente 7 y los ejemplos comparativos en la presente memoria descriptiva, y similares demuestran que los medios de cultivo reportados en la Literatura No de Patente 7 a 11 y similares no eran después de todo capaces de mantener la capacidad de normalización. Además, no se consideró posible normalizar el cultivo de las células endoteliales de la córnea mediante la supresión de la fibrosis o de la vía de señalización del TGF-p.

En una realización, el inhibidor de la fibrosis utilizado en la presente invención incluye un agente inhibidor de la señal del factor de crecimiento por transformación (TGF) p. Así, la presente divulgación proporciona un agente normalizador de cultivos para células endoteliales de la córnea, que incluye un agente inhibidor de la señal TGF-p. El agente inhibidor de la señal del TGF-p utilizado en la presente invención puede ser cualquier agente siempre que el agente pueda inhibir la vía de señal del TGF-p. Además, como es bien sabido, la vía de señalización del TGF-p a inhibir puede ser un factor asociado a cualquier vía de señalización, siempre y cuando dicho factor ejerza en última instancia un efecto similar (opuesto en un caso de un inhibidor, un antagonista o similar) a la vía de señalización del TGF-p, como la BMP-7, además de los factores que se asocian directamente con que el TGF-p y el receptor del TGF-p.

En la presente invención, es posible incluir un agente inhibidor de la señal de TGF-p solo, y también es posible incluir varios tipos del mismo en combinación entre sí, según sea necesario.

La concentración del agente inhibidor de la señal de TGF-p utilizado en la presente invención es, sin limitación, normalmente de aproximadamente 0,1 a 100 jmol/l, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 30 jmol/l, y más preferentemente de aproximadamente 1 jmol/l; cuando se utilizan varios tipos de los mismos, la concentración puede cambiarse adecuadamente, y otros intervalos de concentración incluyen, por ejemplo, normalmente, de aproximadamente 0,001 a 100 jmol/l, preferentemente, de aproximadamente 0,01 a 75 jmol/l, de aproximadamente 0,05 a 50 jmol/l, de aproximadamente 1 a 10 jmol/l, de aproximadamente 0,01 a 10 jmol/l, alrededor de 0,05 a 10 jmol/l, alrededor de 0,075 a 10 jmol/l, alrededor de 0,1 a 10 jmol/l, alrededor de 0,5 a 10 jmol/l, alrededor de 0,75 a 10 jmol/l, alrededor de 1,0 a 10 jmol/l, alrededor de 1,25 a 10 jmol/l, alrededor de 1,5 a 10 jmol/l, alrededor de 1,75 a 10 jmol/l, alrededor de 2,0 a 10 jmol/l, 2,5 a 10 jmol/l, 3,0 a 10 jmol/l, 4,0 a 10 jmol/l, 5,0 a 10 jmol/l, 6,0 a 10 jmol/l, 7,0 a 10 jmol/l, 8,0 a 10 jmol/l, 9,0 a 10 jmol/l, 0,01 a 50 jmol/l, 0,05 a 5,0 jmol/l.05 a 5,0 jmol/l, alrededor de 0,075 a 5,0 jmol/l, alrededor de 0,1 a 5,0 jmol/l, alrededor de 0,5 a 5,0 jmol/l, alrededor de 0,75 a 5,0 jmol/l, alrededor de 1,0 a 5,0 jmol/l, alrededor de 1,25 a 5,0 jmol/l, alrededor de 1,5 a 5,0 jmol/l, alrededor de 1,75 a 5,0 jmol/l, alrededor de 2,0 a 50 jmol/l, de 2,5 a 5,0 jmol/l, de 3,0 a 5,0 jmol/l, de 4,0 a 5,0 jmol/l, de 0,01 a 3,0 jmol/l, de 0,05 a 3,0 jmol/l, de 0,075 a 3,0 jmol/l, de 0,1 a 3,0 jmol/l, de 0,5 a 3,0 jmol/l, de 0,75 a 3,0 jmol/l, de 1,0 a 3,0 jmol/l.0 a 3,0 jmol/l, 1,25 a 3,0 jmol/l, 1,5 a 3,0 jmol/l, 1,75 a 3,0 jmol/l, 2,0 a 3,0 jmol/l, 0,01 a 1,0 jmol/l, 0,05 a 1.0 jmol/l, 0,075 a 1,0 jmol/l, 0,1 a 1,0 jmol/l, 0,5 a 1,0 jmol/l.0 jmol/l, alrededor de 0,75 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,09 a 35 jmol/l, alrededor de 0,09 a 3,2 jmol/l, y más preferentemente, alrededor de 0,05 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,075 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,1 a 1,0 jmol/l, alrededor de 0,5 a 1,0 jmol/l, y alrededor de 0,75 a 1,0jmol/l.

En una realización, la normalización del cultivo incluye que la función celular sea normal, la cual se selecciona del grupo que consiste en aquellas que expresan ZO-1 y Na+/K+-ATPasa, que son morfológicamente poligonales y que no son multicapas.

En una realización, la normalización del cultivo es para fabricar una célula para trasplante que se adapte al trasplante de córnea. En una realización preferida, la célula mencionada anteriormente para el trasplante es una célula de un primate. En una realización preferida, la célula mencionada anteriormente para el trasplante es una célula de un humano.

En una realización, el agente inhibidor de la señal de TGF-p incluye al menos uno de un antagonista de TGF-p, un antagonista de un receptor de TGF-p o un inhibidor de Smad3, otros ingredientes ejemplificados en la presente memoria descriptiva, una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En cuanto al antagonista de TGF-p, el antagonista de un receptor de TGF-p, y el inhibidor de Smad3, puede utilizarse cualquiera de ellos descrito en otras partes de la presente memoria descriptiva.

En una realización, el agente inhibidor de la señal de TGF-p que puede utilizarse en la presente invención incluye al menos uno de los siguientes: SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il]benzamida), BMP-7, anticuerpo anti-TGF-p, anticuerpo del receptor de TGF-p, ARNip de TGF-p, ARNip de un receptor del TGF-p, oligonucleótido antisentido del TGF-p, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona, A83-01 (3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolin il)-1H-pirazol-1-carbotioamida), Stemolecule™ Inhibidor de la TLK (2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-napiridina), Stemolecule™ inhibidor de BMP LDN-193189(6-(4-(piperidin-1-il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidina), SD-208(2-(5-cloro-2-fluorofenil)-4-[(4-piridinil)amino]pteridina), LY364947(4-[3-(2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-quinolina), otros ingredientes ejemplificados en la presente memoria descriptiva, una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Aunque no se desea restringir por teorías, ya que la normalización se observa tanto en SB431542, que ejerce un efecto a través de Smad2/3(asociado a ALK4, 5 y 7), como en BMP-7, que ejerce un efecto a través de Smad1/5/8(asociado a ALK1, 2, 3 y 6), se entiende que el agente inhibidor de la señal TGF-p de cualquiera de las vías puede lograr el efecto de la presente invención.

En una realización preferida, el agente inhibidor de la señal TGF-p utilizado en la presente invención incluye SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il]benzamida). Esto se debe a que se suprimió la fibrosis y, además, se indicó que se conservó la proteína encargada de las funciones normales y el trasplante a los primates fue soportable. En una realización preferida, el SB431542 se incluye para estar presente en una concentración de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 10 pM en uso, preferentemente se incluye para estar presente en una concentración de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 pM en uso, y aún preferentemente se incluye para estar presente en una concentración de aproximadamente 1 pM en uso.

En otra realización preferida, el agente inhibidor de la señal TGF-p utilizado en la presente invención incluye BMP-7. Esto se debe a que se suprimió la fibrosis y, además, se indicó que se conservó la proteína encargada de las funciones normales y el trasplante a los primates fue soportable. En una realización preferida, la BMP-7 se incluye para estar presente en una concentración de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1.000 ng/ml en uso, y más preferentemente, se incluye para estar presente en una concentración de aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 1.000 ng/ml en uso. La BMP-7 puede incluirse para estar presente en una concentración de aproximadamente 100 ng/ml en uso, o puede incluirse para estar presente en una concentración de aproximadamente 1.000 ng/ml.

En una realización preferida, el inhibidor de la fibrosis utilizado en la presente invención incluye además un inhibidor de la MAP quinasa. Para el inhibidor de la MAP quinasa al que se dirige la presente invención, puede utilizarse cualquier agente siempre que éste sea capaz de inhibir la vía de señalización de la MAP quinasa. Además, la señal de la MAP quinasa que debe inhibirse está asociada a la fosforilación de la MAP quinasa; y mientras las señales se transmiten a la corriente arriba o corriente abajo de la misma, o hay una vía a la que se unen otras vías como una corriente menor, la señal puede ser cualquier señal.

En la presente invención, es posible incluir un tipo de inhibidor de la MAP quinasa solo, o también es posible incluir varios tipos de los mismos en combinación entre sí, según sea necesario.

La concentración del agente de MAP quinasa utilizado en la presente invención incluye, sin limitación, normalmente de aproximadamente 0,1 a 100 pmol/l, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 30 pmol/l, y más preferentemente de aproximadamente 1 pmol/l; cuando se utilizan varios tipos de los mismos, la concentración puede cambiarse adecuadamente, y otros intervalos de concentración incluyen, por ejemplo, normalmente, aproximadamente 0,001 a 100 pmol/l, preferentemente, aproximadamente 0,01 a 75 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 50 pmol/l, aproximadamente 1 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,05 10 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,5 10 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 10 pmol/l, aproximadamente 1.5 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 10 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 2.5 a 10 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 4,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 5.0 a 10 pmol/l, aproximadamente 6,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 7,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 8.0 a 10 pmol/l, aproximadamente 9,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 50 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 5. 0 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 5. 0 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 4,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,0 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,25 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,5 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,75 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 2,0 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,09 a 35 jmol/l, aproximadamente 0,09 a 3,2 jmol/l, y más preferentemente, aproximadamente 0,05 a 1,0 |jmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 1.0 jmol/l y aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l.

En una realización preferida, el inhibidor de la MAP quinasa utilizado en la presente invención incluye otros ingredientes ejemplificados en la presente invención, además de SB203580 (4-[4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-1H-imidazol-5-il]piridina).

En otra realización, el agente normalizador de cultivos según la presente invención incluye además un inhibidor de envejecimiento. En este caso, se entiende que cualquier agente conocido por suprimir la senescencia celular puede ser utilizado como el inhibidor del envejecimiento que puede ser utilizado.

En la presente invención, es posible incluir un tipo de inhibidor de envejecimiento solo, y también es posible incluir varios tipos de ellos en combinación, según sea necesario.

La concentración del inhibidor de envejecimiento utilizado en la presente invención incluye, sin limitación, normalmente alrededor de 0,1 a 100 jmol/l, preferentemente alrededor de 0,1 a 30 jmol/l, y más preferentemente alrededor de 1 jmol/l; cuando se utilizan varios tipos de los mismos, la concentración puede cambiarse adecuadamente, y otros intervalos de concentración incluyen, por ejemplo, normalmente, aproximadamente 0,001 a 100 jmol/l, preferentemente, aproximadamente 0,01 a 75 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 50 jmol/l, aproximadamente 1 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,25 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,5 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,75 a 10 jmol/l, aproximadamente 2,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 2,5 a 10 jmol/l, aproximadamente 3,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 4,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 5,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 6,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 7,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 8,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 9,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 50 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 5. 0 jmol/l, aproximadamente 1,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 1,25 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 1,5 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 1,75 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 2,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 2,5 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 3,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 4,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,0 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,25 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,5 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,75 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 2,0 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,09 a 35 jmol/l, aproximadamente 0,09 a 3,2 jmol/l, y más preferentemente, aproximadamente 0,05 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 jm ol/l y aproximadamente 0,75 a 1.0 jmol/l.

En una realización, el inhibidor del envejecimiento utilizado en la presente invención incluye un inhibidor de la p38 MAP quinasa.

En la presente invención, es posible incluir un tipo de inhibidor de la p38 MAP quinasa solo, y también es posible incluir varios tipos de los mismos en combinación entre sí, según sea necesario.

La concentración del agente de la p38 MAP quinasa utilizado en la presente invención incluye, sin limitación, normalmente alrededor de 0,1 a 100 jmol/l, preferentemente alrededor de 0,1 a 30 jmol/l, y más preferentemente alrededor de 1jmol/l; cuando se utilizan varios tipos de los mismos, la concentración puede cambiarse adecuadamente, y otros intervalos de concentración incluyen, por ejemplo, normalmente, aproximadamente 0,001 a 100 jmol/l, preferentemente, aproximadamente 0,01 a 75 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 50 jmol/l, aproximadamente 1 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,25 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,5 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,75 a 10 jmol/l, aproximadamente 2,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 2,5 a 10 jmol/l, aproximadamente 3,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 4,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 5,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 6,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 7,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 8,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 9,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 50 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 5. 0 jmol/l, aproximadamente 1,0 a 5. 0 jmol/l, aproximadamente 1,25 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 1,5 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 1,75 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 2,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 2,5 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 3,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 4,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 3,0 jmol/l, aproximadamente t 0,075 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,0 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,25 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,5 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,75 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 2,0 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,09 a 35 jmol/l, aproximadamente 0,09 a 3,2 jmol/l y más preferentemente, aproximadamente 0,05 a 1,0 |jmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 jmol/l y aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l.

En una realización preferida, el inhibidor de envejecimiento utilizado en la presente invención incluye SB203580 (4-[4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-1H-imidazol-5-il]piridina).

En una realización todavía preferida, la presente invención proporciona un agente normalizador de cultivos que incluye SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il]benzamida), y SB203580 (4-[4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-1H-imidazol-5-il]piridina). Debido a la combinación de los dos agentes, se mantiene la normalización mientras se aumenta la tasa de crecimiento y se mejora el cultivo con una densidad celular suficiente.

En otra realización, el agente normalizador de cultivos según la presente divulgación incluye además un agente promotor de la adhesión celular. Para el agente promotor de la adhesión celular utilizado en la presente invención, se puede utilizar cualquier agente siempre que éste sea capaz de promover la adhesión celular.

En una realización preferida, el agente promotor de la adhesión celular utilizado en la presente invención incluye 1-(5-isoquinolinesulfonil)homopiperazina o una sal de la misma (por ejemplo fasudil(1-(5-isoquinolinesulfonil)homopiperazina)), (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilcarbamoil)ciclohexanocarboxamida o una sal del mismo (por ejemplo, Y-27632 ((R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-ciclohexanocarboxamida 2 clorhidrato 1 hidrato) y similares) y otros inhibidores de la Rho quinasa.

El agente promotor de la adhesión que puede utilizarse en la presente invención puede añadirse a un agente normalizador del cultivo o a un medio de cultivo, como una solución de cultivo, cuando las células endoteliales de la córnea se cultivan in vitro. Se añade un inhibidor de la Rho quinasa al agente normalizador del cultivo o a un medio de cultivo para continuar con el cultivo, de modo que el inhibidor de la Rho quinasa y las células endoteliales de la córnea entren en contacto entre sí ex vivo para promover la adhesión de las células endoteliales de la córnea.

El medio de cultivo que puede utilizarse en la presente invención puede incluir un medio de cultivo utilizado para cultivar una célula endotelial (por ejemplo, DMEM(GIBCO BRL)), suero sanguíneo (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS)), factor de crecimiento (por ejemplo, (b-)FGF), una sustancia antibiótica (como penicilina y estreptomicina) y similares.

Se incluye un inhibidor de la Rho quinasa en el ingrediente del medio de cultivo de la presente invención para mejorar la adhesión de una célula endotelial corneal, de modo que se impida la caída de la célula, haciendo posible la formación de una capa de células endoteliales corneales que tenga una forma celular favorable y una alta densidad celular. Así, el inhibidor de la Rho quinasa se utiliza preferentemente en un procedimiento para fabricar la formulación endotelial corneal según la presente invención, tal como se describe en el presente documento. Además, la solución de cultivo según la presente invención se utiliza también para mantener la célula endotelial corneal.

El agente normalizador de cultivos según la presente divulgación puede contener además un inhibidor de Rho quinasa. El inhibidor de la Rho quinasa incluido en la presente invención es el descrito anteriormente. Tal y como se utiliza en el presente documento, la "solución de preservación de la córnea" es una solución líquida para preservar una pieza de córnea extraída de un donante durante un periodo hasta que se trasplante a un receptor, o para preservar una célula endotelial de la córnea antes del crecimiento o después del mismo.

El agente normalizador de cultivos según la presente divulgación también puede utilizarse como solución de conservación de la córnea. Dicha solución de preservación de la córnea, a la que puede añadirse el agente normalizador del cultivo según la presente invención, incluye una solución de preservación que se utiliza normalmente para el trasplante de córnea (solución de preservación de la pieza esclerocorneal (Optisol GS: marca registrada), una solución de preservación del globo ocular para el trasplante de córnea (EPII: marca registrada), solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y similares.

En este caso, es posible incluir un tipo de inhibidor de la Rho quinasa solo, y también es posible incluir varios tipos de los mismos en combinación entre sí, según sea necesario.

La concentración del inhibidor de la Rho quinasa en la presente invención incluye, sin limitación, normalmente de 1 a 100 jmol/l, preferentemente de 5 a 20 jmol/l, y más preferentemente de 10 jmol/l; cuando se utilizan varios tipos de los mismos, la concentración puede cambiarse adecuadamente, y otros intervalos de concentración incluyen, por ejemplo, normalmente, aproximadamente 0,001 a 100 jmol/l, preferentemente, aproximadamente 0,01 a 75 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 50 |jmol/l aproximadamente 1 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,01 10 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,1 10 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 10 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,0 10 jmol/l, aproximadamente 1.25 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,5 a 10 jmol/l, aproximadamente 1,75 10 jmol/l, aproximadamente 2.0 a 10 jmol/l, aproximadamente 2,5 a 10 jmol/l, aproximadamente 3,0 10 jmol/l, aproximadamente 4.0 a 10 jmol/l, aproximadamente 5,0 a 10 jmol/l, aproximadamente 6,0 10 jmol/l, aproximadamente 7.0 a 10 jmol/l, aproximadamente 8,0 a 10 jmol/l aproximadamente 9,0 10 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 50 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 5.0 jmol/l, aproximadamente 0,075 5.0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 5.0 jmol/l, aproximadamente 0,75 5.0 jmol/l, aproximadamente 1.0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 1,25 a 5. 0 jmol/l, aproximadamente 1,5 5.0 jmol/l, aproximadamente 1,75 a 5,0 jmol/l , aproximadamente 2,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 2,5 5.0 jmol/l, aproximadamente 3.0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 4,0 a 5,0 jmol/l, aproximadamente 0,01 3.0 jmol/l, aproximadamente 0,05 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 3.0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,0 3.0 jmol/l, aproximadamente 1.25 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,5 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 1,75 3.0 jmol/l, aproximadamente 2.0 a 3,0 jmol/l, aproximadamente 0,01 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,05 1.0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,09 a 35 jmol/l, aproximadamente 0,09 a 3,2 jmol/l, y más preferentemente, aproximadamente 0,05 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 jmol/l y aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l.

La presente invención evita que se produzca la transformación de una córnea, permite un cultivo normalizado o mejora la adhesión de una célula endotelial corneal para evitar que la célula se desprenda, haciendo posible la formación de una capa de células endoteliales corneales que tenga una forma celular favorable y una alta densidad celular. Así, la presente divulgación proporciona una solución de preservación para la córnea utilizada para el trasplante de órganos o similares. Además, el agente normalizador de cultivos utilizado en la presente invención también se utiliza como solución de conservación para criopreservar una célula endotelial corneal o un ingrediente de la misma. Para la criopreservación, también es posible añadir además glicerol, dimetilsulfóxido, propilenglicol, acetamida y similares a la solución de preservación según la presente invención.

En una realización, cuando se utiliza el agente normalizador de cultivos según la presente divulgación, se puede utilizar una pluralidad de agentes por separado como agente normalizador de cultivos. En una realización de este tipo, por ejemplo, se puede permitir que el inhibidor de la fibrosis esté presente en todo momento durante el cultivo de dicha célula endotelial corneal, mientras que se puede permitir que el agente promotor de la adhesión esté presente durante un determinado periodo de tiempo, y después se puede suprimir el agente promotor de la adhesión una vez, y permitir que el agente promotor de la adhesión celular esté presente durante un determinado periodo de tiempo una vez más.

En otra realización, cuando se utiliza el agente normalizador del cultivo según la presente divulgación, se puede permitir que tanto el inhibidor de la fibrosis como dicho agente promotor de la adhesión celular estén presentes en todo momento durante el cultivo de dicha célula endotelial corneal.

En una realización, las células endoteliales de la córnea cultivadas con el agente normalizador de cultivos según la presente divulgación son las derivadas de un primate. En una realización preferida, la célula endotelial corneal cultivada con el agente normalizador del cultivo según la presente divulgación se deriva de seres humanos.

En una realización preferida, el cultivo como objetivo de la presente invención es el cultivo de células para la prevención o el tratamiento del daño endotelial corneal.

(Medio de cultivo para el cu ltivo normal de células endoteliales de la córnea)

La presente divulgación proporciona un medio de cultivo para cultivar normalmente una célula endotelial de la córnea, que incluye un ingrediente de cultivo para el endotelio de la córnea y un agente normalizador del cultivo. Se entiende que cualquier forma descrita en el presente documento puede utilizarse para el agente normalizador de cultivos utilizado en el medio de cultivo. Además, puede utilizarse cualquier ingrediente como ingrediente de cultivo que pueda utilizarse en la presente invención, siempre que el ingrediente de cultivo pueda utilizarse para el cultivo del endotelio corneal. Dicho ingrediente puede ser un ingrediente del medio de cultivo que se ha vendido y utilizado convencionalmente. Alternativamente, dicho ingrediente puede ser un ingrediente desarrollado por separado para el endotelio corneal. Ejemplos de tal ingrediente de medio de cultivo incluyen, sin limitación, OptiMEM, DMEM, M199 y MEM (que están disponibles en INVITROGEN o similares).

(Procedimiento de cultivo normal de las células endoteliales de la córnea)

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para cultivar normalmente una célula endotelial de la córnea, que comprende el paso de cultivar una célula endotelial de la córnea utilizando un medio de cultivo según la presente divulgación.

Se entiende que cualquier forma descrita en el presente documento puede utilizarse para el agente normalizador de cultivos utilizado en el procedimiento según la presente invención. Además, se puede utilizar cualquier ingrediente como ingrediente de cultivo que se puede utilizar en el procedimiento según la presente invención, siempre que el ingrediente se pueda utilizar para el cultivo de endotelio corneal; y se pueden ejemplificar los descritos en la sección (Medio de cultivo para el cultivo normal de células endoteliales corneales).

En la Figura 12se muestra un procedimiento de cultivo ejemplar. Por ejemplo, en un procedimiento de cultivo ejemplar, una pluralidad de agentes puede utilizarse por separado como agente normalizador del cultivo según la presente invención. Por ejemplo, se puede permitir que el inhibidor de la fibrosis esté presente en todo momento durante un determinado periodo de tiempo (por ejemplo, 24 a 72 horas, o 48 horas, o similares) durante el cultivo de dicha célula endotelial corneal, mientras que se puede permitir que el agente promotor de la adhesión esté presente y luego se puede eliminar el agente promotor de la adhesión, y el agente promotor de la adhesión celular puede estar presente en todo momento durante un determinado período de tiempo (por ejemplo, 24 a 72 horas, o 48 horas, o similares; el período de tiempo puede variar cada vez, o puede ser el mismo). Alternativamente, existe un patrón en el que no se utiliza ningún agente promotor de la adhesión en estos procedimientos de cultivo. Específicamente, este procedimiento de cultivo ejemplar se muestra en la parte inferior de la Figura 12. Por ejemplo, en este procedimiento de cultivo ejemplar, se puede permitir que el inhibidor de la fibrosis esté presente en todo momento durante el cultivo de dicha célula endotelial corneal, como agente normalizador del cultivo según la presente invención.

En otra realización, en el procedimiento según la presente invención, el agente normalizador del cultivo a utilizar incluye tanto un inhibidor de la fibrosis como dicho agente promotor de la adhesión celular, y se puede permitir que estén presentes en todo momento durante el cultivo de dicha célula endotelial corneal.

En una realización, la célula endotelial corneal cultivada con el agente normalizador del cultivo según la presente divulgación se deriva de un primate. En una realización preferida, la célula endotelial corneal cultivada con el agente normalizador del cultivo según la presente divulgación se deriva de seres humanos.

En una realización preferida, el cultivo como objetivo del procedimiento según la presente invención es el cultivo de células para la prevención o el tratamiento del daño endotelial corneal, que puede utilizarse, en particular, para producir una célula, un tejido o algo similar para el trasplante.

(Célula endotelial de la córnea y formulación endotelial de la córnea)

La presente divulgación proporciona una célula endotelial corneal cultivada por un procedimiento según la presente invención. Se puede considerar que dicha célula tiene una característica que no tienen las células convencionales en el sentido de que la célula según la presente invención no experimenta fibrosis y no pierde la función normal incluso si se realiza un cultivo normal y también se realiza un subcultivo. Además, la característica más importante es que la célula tiene una característica del endotelio corneal normal como función. En consecuencia, la célula endotelial corneal de la presente divulgación puede proporcionarse como una formulación, lo que significa que la presente divulgación proporciona una formulación endotelial corneal.

Así, la presente invención proporciona un procedimiento para fabricar una formulación endotelial corneal, que comprende el paso de cultivar una célula endotelial corneal utilizando una solución de cultivo que incluye un agente normalizador de cultivo según la presente divulgación.

En un aspecto, la formulación endotelial corneal según la presente divulgación contiene un sustrato, y una capa de células endoteliales corneales cultivadas in vitro en el sustrato.

El sustrato utilizado en la presente divulgación no está particularmente limitado siempre que el sustrato pueda soportar una capa de células endoteliales corneales cultivadas y mantener su forma in vivo durante un cierto período de tiempo, preferentemente durante al menos 3 días, después del trasplante. Además, el sustrato puede tener una función como andamio cuando se cultiva una célula endotelial corneal in vitro, o el sustrato puede tener sólo una función de soporte de una capa de células endoteliales corneales después del cultivo. Preferentemente, el sustrato es un sustrato de este tipo que se utiliza para el cultivo de una célula endotelial corneal y que tiene un papel como andamio que puede ser sometido a trasplante tal cual, después de la finalización del cultivo.

Los sustratos utilizables incluyen, por ejemplo, el colágeno, la gelatina, la celulosa y otros materiales poliméricos derivados de productos naturales, el poliestireno, el poliéster, el policarbonato, la poli(N-isopropilacrilamida) y otros materiales poliméricos sintéticos, el ácido poliláctico, el ácido poliglicólico y otros materiales poliméricos biodegradables, la hidroxiapatita, el amnios y similares.

La forma del sustrato no está particularmente limitada siempre que tenga una forma que soporte la capa de células endoteliales de la córnea y sea adecuada para el trasplante, pero la forma es preferentemente una lámina. Cuando la formulación según la presente divulgación es una lámina, puede cortarse y utilizarse en un tamaño que se ajuste a un lugar de aplicación en el momento del trasplante. Además, también es posible enrollar la lámina e introducirla a través de una abertura de la herida. Como ejemplo específico preferido, se ejemplifica una forma circular que cubre aproximadamente el 80 % del área del endotelio corneal dañado. También es preferible hacer cortes en la parte periférica del círculo para que éste esté en estrecho contacto con el sitio aplicado.

El sustrato es preferentemente colágeno. En cuanto al colágeno, la lámina de colágeno descrita en Publicación Japonesa No. 2004-24852 puede utilizarse preferentemente. La lámina de colágeno en cuestión puede prepararse, por ejemplo, a partir de amnios de acuerdo con el procedimiento descrito en La publicación japonesa Abierta al público No. 2004-24852.

En lo sucesivo, se describirá la preparación de una capa de células endoteliales de la córnea como un ejemplo de formulación endotelial de la córnea.

La capa de células endoteliales de la córnea de la divulgación comprende preferentemente al menos una de las siguientes características. Más preferentemente, la capa de células endoteliales de la córnea comprende dos o más de las siguientes características, y aún más preferentemente comprende todas las siguientes características.

(1) La capa celular tiene una estructura monocapa. Esta es una de las características que presenta la capa de células endoteliales de la córnea de un organismo vivo.

(2) La densidad celular de la capa celular es de unas 1.000 a unas 4.000 células/mm2 En particular, cuando un adulto es un receptor (receptor de trasplante), la densidad celular está preferentemente en el intervalo de unas 2.000 a unas 3.000 células/mm2.

(3) La forma de las células que constituyen la capa celular en vista plana es sustancialmente hexagonal. Esta es una de las características que presenta una célula que constituye una capa de células endoteliales de la córnea en un organismo vivo. La formulación según la presente divulgación es similar a una capa de células endoteliales de la córnea de organismos vivos, es capaz de ejercer una función similar a la de una capa de células endoteliales de la córnea innata, y es capaz de ejercer la capacidad de crecimiento en organismos vivos.

(4) Las células se disponen con regularidad en la capa celular. En la capa de células endoteliales de la córnea de un organismo vivo, las células que constituyen la capa están dispuestas con regularidad, lo que se considera que mantiene las funciones normales y el alto grado de transparencia de la célula endotelial de la córnea, y que ajusta adecuadamente la humedad en la córnea. Por lo tanto, al comprender dicha característica morfológica, se espera que la formulación según la presente divulgación ejerza una función similar a la de la capa de células endoteliales de la córnea en los organismos vivos.

El procedimiento de fabricación según la presente invención comprende el paso de cultivar una célula endotelial corneal utilizando un agente normalizador de cultivo o un medio de cultivo según la presente divulgación.

<1>Recolección y cu ltivo in vitro de células endoteliales de la córnea

Las células endoteliales de la córnea se recolectan de la córnea del propio receptor o de un donante apropiado utilizando un procedimiento común. Teniendo en cuenta las condiciones de trasplante, basta con preparar células endoteliales corneales de origen homólogo. Por ejemplo, la membrana de Descemet y la capa de células endoteliales de los tejidos corneales se exfolian del parénquima de la córnea, y luego se transfieren a una placa de cultivo y se tratan con dispasa o similares. Como resultado, las células endoteliales de la córnea se desprenden de la membrana de Descemet. Las células endoteliales de la córnea que permanecen en la membrana de Descemet pueden desprenderse mediante un pipeteo o algo similar. Una vez retirada la membrana de Descemet, las células endoteliales de la córnea se cultivan en una solución de cultivo según la presente divulgación. En cuanto al medio o solución de cultivo, se puede utilizar, por ejemplo, un DMEM (Medio Eagle modificado de Dulbecco) disponible en el mercado (por ejemplo, iNv ITROGEN, número de catálogo: 12320 o similar) con FBS (suero fetal bovino) (por ejemplo, BIOWEST, número de catálogo: S1820-500), b-FGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico) (por ejemplo, INVITROGEN, número de catálogo: 13256-029), y penicilina, estreptomicina u otras sustancias antibióticas añadidas a la misma, según proceda, y un ingrediente del agente normalizador de cultivos según la presente divulgación añadido además a la misma. En cuanto a un recipiente de cultivo (placa de cultivo), es preferible utilizar los que tienen colágeno de tipo I, colágeno de tipo IV, fibronectina, laminina o una matriz extracelular de células endoteliales de córnea bovina recubierta en su superficie. Alternativamente, también es posible utilizar un recipiente de cultivo común tratado con la mezcla de recubrimiento FNC (marca registrada) (50ml (AES-0407), ATHENA, número de catálogo: 0407) u otro agente de recubrimiento disponible en el mercado. Esto se debe a que, al utilizar conjuntamente el recubrimiento del sujeto y la solución de cultivo según la presente divulgación, se promueve la adhesión de las células endoteliales de la córnea a la superficie del recipiente de cultivo, y se realiza un crecimiento favorable.

Las condiciones de temperatura en el cultivo de células endoteliales de la córnea no están particularmente limitadas mientras las células endoteliales de la córnea crezcan, pero están, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 25°C a aproximadamente 45°C, y en consideración de la eficiencia del crecimiento, preferentemente de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, aún preferentemente de aproximadamente 37°C. En cuanto al procedimiento de cultivo, el cultivo se realiza en una incubadora normal para el cultivo de células, bajo un ambiente humidificado, y bajo el ambiente de aproximadamente 5 a 10 % de concentración de co2.

<2> Subcultivo

Después de cultivar las células endoteliales de la córnea, se puede realizar un subcultivo. Preferentemente, el subcultivo se realiza en el momento de ser sub-confluyente o confluente. El subcultivo puede realizarse de la siguiente manera. En primer lugar, mediante un tratamiento con tripsina-EDTA o similar, se exfolian las células de la superficie de un recipiente de cultivo y, a continuación, se recolectan las células. Un agente normalizador del cultivo o medio de cultivo según la presente invención se añade a las células recolectadas para formar un líquido de suspensión celular. Es preferible realizar la centrifugación en el momento de la recolección de las células o después de la misma. La centrifugación permite preparar un líquido de suspensión celular con alta densidad celular. La densidad celular preferible está en un intervalo de aproximadamente 1 a 2*10® células/ml. Obsérvese que las condiciones para la centrifugación en este caso incluyen, por ejemplo, de 500 rpm (30g) a 1.000 rpm (70g), y de 1 a 10 minutos.

El líquido suspendido de células se disemina a un recipiente de cultivo similar al cultivo inicial antes mencionado, y a continuación se somete al cultivo. La relación de dilución en el momento del subcultivo es de aproximadamente 1:2 a 1:4, y preferentemente de 1:3, aunque varía en función del estado de las células. El subcultivo puede realizarse en condiciones de cultivo similares a las del cultivo inicial antes mencionado. El período de cultivo varía en función del estado de las células que se van a utilizar, y es, por ejemplo, de 7 a 30 días. El subcultivo antes mencionado puede realizarse varias veces según sea necesario. En el agente normalizador del cultivo o en el medio de cultivo según la presente divulgación, si se utiliza un agente promotor de la adhesión celular, se puede mejorar la adhesión celular en la etapa inicial del cultivo, lo que permite acortar el período de cultivo.

<3> Preparación de las capas de células endoteliales de la córnea

La suspensión celular líquida se disemina sobre un sustrato, tal como una lámina de colágeno, y se somete a cultivo. En esta fase, se ajusta el número de células a diseminar para formar una capa celular con la densidad celular deseada en la formulación endotelial corneal que se fabrica al final. Específicamente, las células se diseminan de manera que se forme una capa celular, cuya densidad celular será de unas 1.000 a unas 4.000 células/mm2. El cultivo puede realizarse en condiciones similares a las del cultivo inicial antes mencionado o similares. El periodo de cultivo es, por ejemplo, de 3 a 30 días, aunque varía en función del estado de las células que se vayan a utilizar.

Al realizar el cultivo como se ha descrito anteriormente, se obtiene una formulación endotelial corneal en la que la capa de células endoteliales corneales cultivadas in vitro se forma sobre el sustrato.

Para mantener la célula endotelial de la córnea, la formulación endotelial de la córnea puede incluir el agente normalizador del cultivo según la presente divulgación o un medio de cultivo que incluya el agente normalizador del cultivo. Además, la formulación endotelial corneal puede incluir el agente normalizador del cultivo según la presente invención o un medio de cultivo que incluya el agente normalizador del cultivo hasta que la formulación endotelial corneal se someta al trasplante. También se proporciona una combinación de la formulación endotelial corneal y el agente normalizador de cultivos según la presente divulgación o un medio de cultivo que incluye el agente normalizador de cultivos.

La formulación endotelial corneal obtenida por el procedimiento de fabricación según la presente invención puede utilizarse como injerto en el tratamiento de enfermedades que requieren el trasplante de endotelio corneal, como la queratopatía bullosa, el edema corneal, el leucoma corneal, en particular, la distrofia corneal, o la queratopatía bullosa causada por el daño endotelial corneal debido a una lesión externa o a una operación intraocular. La causa de la queratopatía bullosa o daño endotelial corneal incluye la distrofia endotelial corneal de Fuchs, el síndrome de pseudoexfoliación, la endotelitis corneal y otras similares, además de las operaciones.

El sujeto de la administración de la formulación endotelial corneal según la presente divulgación incluye mamíferos (por ejemplo, humanos, ratones, ratas, hámsters, conejos, gatos, perros, vacas, ovejas, monos y similares), y preferentemente primates (por ejemplo, humanos).

(Tratamiento o prevención de enfermedades, daños o afecciones del endotelio corneal)

La presente divulgación proporciona un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad, daño o condición endotelial de la córnea, incluyendo una célula endotelial de la córnea producida por un procedimiento para cultivar normalmente una célula endotelial de la córnea, comprendiendo el procedimiento el paso de cultivar una célula endotelial de la córnea utilizando un agente normalizador de cultivo o un medio de cultivo según la presente divulgación. Se entiende que el medio de cultivo o el agente normalizador del cultivo puede adoptar cualquier forma, como se describe en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, es posible referirse a los asuntos descritos en las secciones (Agente normalizador del cultivo), (Medio de cultivo para el cultivo normal de células endoteliales de la córnea) y (Procedimiento para el cultivo normal de células endoteliales de la córnea). Además, se entiende que la célula endotelial corneal utilizada como medicamento puede adoptar cualquier forma utilizada en la presente memoria descriptiva y, por ejemplo, es posible referirse a los asuntos descritos en la sección (Célula endotelial de la córnea y formulación endotelial de la córnea ).

En una realización, el medicamento según la presente divulgación es para el propósito de tratar o prevenir el endotelio corneal de un primate. Preferentemente, el objeto del tratamiento o de la prevención es el endotelio corneal humano.

En una realización, la célula endotelial corneal utilizada en el medicamento según la presente divulgación se deriva de un primate. Preferentemente, la célula endotelial de la córnea utilizada en el medicamento se deriva de seres humanos.

En una realización, la enfermedad, el daño o la condición endotelial de la córnea como objetivo del medicamento según la presente divulgación es la queratopatía bullosa, la endotelitis corneal, el edema corneal, el leucoma corneal y similares.

En una realización, el medicamento según la presente divulgación se proporciona en forma de una lámina o una sustancia suspendida.

En una realización, el medicamento según la presente divulgación comprende además un agente promotor de la adhesión celular. El agente promotor de la adhesión celular ejerce una acción promotora de la adhesión a una célula endotelial corneal separada de los tejidos corneales o a una célula endotelial corneal separada y subcultivada de los mismos. El agente promotor de la adhesión celular puede suministrarse junto con la célula endotelial de la córnea, o separado de ella, en forma de medicamento. En una realización específica, el agente promotor de la adhesión celular utilizado en el medicamento incluye un inhibidor de la Rho quinasa. En cuanto al inhibidor de la Rho quinasa, se incluyen los compuestos divulgados en los siguientes documentos : Patente estadounidense No. 4, 678, 783, Patente japonesa No. 3.421.217, Publicación internacional No. WO 95/28387, Publicación Internacional No. WO 99/20620, Publicación Internacional No. WO 99/61403, Publicación Internacional No. WO 02/076976, Publicación Internacional No. WO 02/076977, Publicación Internacional No. WO 2002/083175, Publicación internacional No. WO 02/100833, Publicación internacional No. WO 03/059913, Publicación internacional No. WO 03/062227, Publicación internacional No. WO 2004/009555, Publicación internacional No. WO 2004/022541, Publicación internacional No. WO 2004/108724, Publicación internacional No. WO 2005/003101, Publicación internacional No. WO 2005/039564, Publicación internacional No. WO 2005/034866, Publicación internacional No. WO 2005/037197, Publicación internacional No. WO 2005/037198, Publicación internacional No. WO 2005/035501, Publicación internacional No. WO 2005/035503, Publicación internacional No. WO 2005/035506, Publicación internacional No. WO 2005/080394, Publicación internacional No. WO 2005/103050, Publicación internacional No. WO 2006/057270, Publicación internacional No. WO 2007/026664 y similares. Los compuestos en cuestión pueden fabricarse mediante los procedimientos descritos en los documentos en los que se divulgan los respectivos compuestos. Por ejemplo, se incluye la 1-(5-isoquinolinesulfonil)homopiperazina o una sal de la misma (por ejemplo, fasudil(1-(5-isoquinolinesulfonil)homopiperazina)), (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilcarbamoil)ciclohexanocarboxamida o una sal de la misma (por ejemplo, Y-27632 ((R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-ciclohexanocarboxamida 2 clorhidrato 1 hidrato) y similares) y similares.

El sujeto de la administración (trasplante) del medicamento o procedimiento según la presente divulgación incluye mamíferos (por ejemplo, humanos, ratones, ratas, hámsters, conejos, gatos, perros, vacas, caballos, ovejas, monos y similares), y el sujeto es preferentemente primates, y particularmente preferentemente humanos. El tratamiento del endotelio corneal con primates no había logrado resultados suficientes hasta ahora, y desde ese punto de vista, la presente divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento y un medicamento innovadores.

Se proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, daño o condición endotelial de la córnea, que comprende el paso de utilizar una célula endotelial de la córnea producida por un procedimiento para cultivar normalmente una célula endotelial de la córnea, que comprende el paso de cultivar una célula endotelial de la córnea utilizando un agente normalizador de cultivo o un medio de cultivo según la presente divulgación.

Se proporciona un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad, daño o condición endotelial de la córnea de un ser humano, que comprende un agente promotor de la adhesión celular. La acción promotora de la adhesión del agente promotor de la adhesión celular se utiliza para una célula endotelial de la córnea separada de los tejidos de la córnea o una célula endotelial de la córnea separada y subcultivada de la misma. En una realización específica de este aspecto, el agente promotor de la adhesión celular utilizado en el medicamento según la presente divulgación incluye un inhibidor de la Rho quinasa. El inhibidor de la Rho quinasa incluye compuestos divulgados en los siguientes documentos: Patente estadounidense No. 4.678.783, Patente japonesa No. 3.421.217, Publicación internacional No. WO 95/28387, Publicación Internacional No. WO 99/20620, Publicación Internacional No. WO 99/61403, Publicación Internacional No. WO 02/076976, Publicación Internacional No. WO 02/076977, Publicación Internacional No. WO 2002/083175, Publicación internacional No. WO 02/100833, Publicación internacional No. WO 03/059913, Publicación internacional No. WO 03/062227, Publicación internacional No. WO 2004/009555, Publicación internacional No. WO 2004/022541, Publicación internacional No. WO 2004/108724, Publicación internacional No. WO 2005/003101, Publicación internacional No. WO 2005/039564, Publicación internacional No. WO 2005/034866, Publicación internacional No. WO 2005/037197, Publicación internacional No. WO 2005/037198, Publicación internacional No. WO 2005/035501, Publicación internacional No. WO 2005/035503, Publicación internacional No. WO 2005/035506, Publicación internacional No. WO 2005/080394, Publicación internacional No. WO 2005/103050, Publicación internacional No. WO 2006/057270, Publicación internacional No. WO 2007/026664 aminoácido. Los compuestos en cuestión pueden fabricarse por los procedimientos descritos en los documentos en los que se divulgan los respectivos compuestos, Por ejemplo, se incluye la 1-(5-isoquinolinsulfonil)homopiperazina o una sal de la misma (por ejemplo, fasudil(1-(5-isoquinolinesulfonil)homopiperazina)), (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilcarbamoil)ciclohexanocarboxamida o una sal de la misma (por ejemplo, Y-27632 ((R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1aminoetil)-cidohexanocarboxamida 2 clorhidrato 1 hidrato)y similares. En particular, la presente divulgación ha logrado un rendimiento de tratamiento favorable por primera vez utilizando un agente promotor de la adhesión celular en casos con modelos de primates y células humanas.

El medicamento que comprende el agente promotor de la adhesión celular según la presente divulgación se utiliza junto con una célula endotelial corneal producida por un procedimiento para cultivar normalmente una célula endotelial corneal, comprendiendo el procedimiento el paso de cultivar una célula endotelial corneal utilizando un agente normalizador de cultivo o un medio de cultivo según la presente divulgación. A este respecto, el medicamento que incluye el agente promotor de la adhesión celular según la presente divulgación puede administrarse o trasplantarse junto con la célula endotelial corneal, o puede administrarse o trasplantarse por separado.

En una realización específica, la enfermedad, daño o condición endotelial corneal a la que se dirige el medicamento que incluye el agente promotor de la adhesión celular según la presente divulgación incluye queratopatía bullosa, endotelitis corneal, edema corneal, leucoma corneal y similares.

También se divulga un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, daño o condición endotelial de la córnea de un humano, comprendiendo el procedimiento el paso de administrar un agente promotor de la adhesión celular a un sujeto que necesita tratamiento o prevención.

Con respecto al medicamento que incluye un agente promotor de la adhesión celular también, el objetivo para la administración (trasplante) del medicamento o procedimiento según la presente divulgación incluye mamíferos (por ejemplo, humanos, ratones, ratas, hámsters, conejos, gatos, perros, vacas, caballos, ovejas, monos y similares), y el sujeto es preferentemente primates, y particularmente preferentemente humanos. El tratamiento del endotelio corneal con primates no había logrado resultados suficientes hasta ahora, y desde ese punto de vista, la presente divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento y un medicamento innovadores.

El medicamento para tratar o prevenir una enfermedad, daño o afección endotelial de la córnea que incluye una célula endotelial de la córnea producida mediante el procedimiento según la presente invención, que incluye un agente promotor de la adhesión celular o un inhibidor de la Rho quinasa se utiliza a la concentración, sin limitación, por ejemplo, normalmente de aproximadamente 0,00001 a 1 % p/v, preferentemente de aproximadamente 0,00001 a 0,1 % p/v, más preferentemente de aproximadamente 0,0001 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,001 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,002 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,003 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,004 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,005 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,006 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,007 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,008 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,009 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,01 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,02 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,03 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,04 a 0,05 % p/v, aproximadamente 0,003 a 0,04 % p/v, aproximadamente 0,004 a 0,04 % p/v, aproximadamente 0,005 a 0,04 % p/v, aproximadamente 0,006 a 0,04 % p/v, aproximadamente 0,007 a 0,04 % p/v, aproximadamente 0,008 a 0,04 p/v v %, aproximadamente 0,009 a 0,04 % p/v, aproximadamente 0,01 a 0,04 % p/v, aproximadamente 0,02 a 0,04 % p/v, aproximadamente 0,03 a 0,04 % p/v, aproximadamente 0,003 a 0,03 % p/v, aproximadamente 0,004 a 0,03 % p/v, aproximadamente 0,005 a 0,03 % p/v, aproximadamente 0,006 a 0,03 % p/v, aproximadamente 0,007 a 0,03 % p/v, aproximadamente 0,008 a 0,03 % p/v, aproximadamente 0,009 a 0,03 % p/v, aproximadamente 001 a 0,03 % p/v, aproximadamente 0,02 a 0,03 % p/v, aproximadamente 0,003 a 0,02 % p/v, aproximadamente 0,004 a 0,02 % p/v, aproximadamente 0,005 a 0,02 % p/v, aproximadamente 0,006 a 0,02 % p/v, aproximadamente 0,007 a 0,02 % p/v, aproximadamente 0,008 a 0,02 % p/v, aproximadamente 0,009 a 0,02 % p/v, aproximadamente 0,01 a 0,02 % p/v, aproximadamente 0,003 a 0,01 % p/v, aproximadamente 0,004 a 0,01 % p/v, aproximadamente 0,005 a 0,01 % p/v, aproximadamente 0,006 a 0,01 % p/v, aproximadamente 0,007 a 0,01 % p/v, aproximadamente 0,008 a 0,01 % p/v, y aproximadamente 0,009 a 0,01 % p/v. La cantidad de dosificación y la frecuencia de administración varían en función de los síntomas, las edades, los pesos o las formas de administración. En el caso del uso como loción ocular, por ejemplo, para adultos normales, la formulación, que contiene un ingrediente eficaz de aproximadamente 0,0001 a 0,1 p/v %, y preferentemente de aproximadamente 0,003 a 0,03 p/v %, puede administrarse de 1 a 10 veces por día, preferentemente de 1 a 6 veces por día, y más preferentemente de 1 a 3 veces por día, y en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 0,1 ml por vez. Cuando el medicamento según la presente divulgación se introduce en una cámara anterior, se puede utilizar el medicamento a una concentración de una décima a una milésima parte de la mencionada. Los expertos en la técnica pueden seleccionar adecuadamente el tipo y la concentración del agente promotor de la adhesión celular de acuerdo con los estados de la enfermedad.

La presente invención se ha descrito en lo anterior mostrando realizaciones preferidas de la misma para facilitar su comprensión. En lo sucesivo, la presente invención se describe en base a ejemplos, pero las descripciones mencionadas y los ejemplos siguientes se proporcionan meramente a efectos de ejemplificación y no se proporcionan con el fin de limitar la invención. En consecuencia, el alcance de la presente invención no se limita a las realizaciones o ejemplos que se describen específicamente en la presente memoria descriptiva, sino que está limitado por las reivindicaciones únicamente.

[Ejemplos]

A continuación, se describirán ejemplos de cultivo normal de una célula endotelial de la córnea según la presente invención. El animal de experimentación se utilizó de acuerdo con los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica con Animales, así como con la legislación relativa a la protección y el manejo de los animales, y las normas relativas a la alimentación y el alojamiento de los animales de experimentación. Este experimento se realizó de acuerdo con las Directrices de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología sobre el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. El aislamiento de los tejidos fue aprobado por el comité ético de experimentación animal del Laboratorio de Shiga, Nissei Bilis Co. (ciudad de Ohtsu, Shiga, Japón) y el comité de experimentación animal de Eve Bioscience, Co. (ciudad de Hashimoto, Wakayama, Japón). Además, en su caso, se observaron las normas estipuladas por el Ministerio de Sanidad, Trabajo y Bienestar, el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, o similares, para la manipulación de muestras biológicas o similares; y, si procede, la manipulación se llevó a cabo basándose en la Declaración de Helsinki o en los códigos éticos elaborados a partir de dicha Declaración. Para la donación de los ojos utilizados en la investigación, se obtuvieron acuerdos de los familiares cercanos de todos los donantes fallecidos. La presente investigación fue aprobada por el consejo de revisión institucional de SightLife™ (Seattle, WA) eyebank.

(Procedimiento experimental: Tejidos corneales de monos y grado de investigación, tejidos corneales humanos)

Se utilizaron ocho córneas de cuatro monos cynomolgus (de edades comprendidas entre 3 y 5 años; se supone que equivalen a entre 5 y 20 años en los seres humanos), alimentados respectivamente por el Laboratorio Shiga, Nissei Bilis Co., Ltd. y Eve Bioscience, Co., Ltd., para cultivar células endoteliales corneales de mono (MCEC). Se obtuvieron doce córneas de donantes humanos del banco de ojos SightLife™, y todas las córneas se conservaron en un medio de cultivo de preservación (Optisol; Chiron Vision Corporation, Irvine, CA) a la temperatura de 4°C durante el período de menos de 14 días anterior al cultivo primario.

(Análisis estadístico)

La diferencia estadísticamente significativa (valor P) del valor medio en la comparación de dos muestras se determinó mediante la prueba t de student. La diferencia estadísticamente significativa en la comparación de una pluralidad de conjuntos de muestras se analizó mediante la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Los valores indicados en el gráfico representan una media ±SE.

(Ejemplo comparativo 1)

En el presente ejemplo, se describirán los estados de las células endoteliales de la córnea de los monos cynomolgus y de los seres humanos, que se cultivaron mediante un procedimiento convencional. Los detalles se describirán más adelante.

(Material y procedimiento)

*Células endoteliales de córnea de mono cinomolgo (MCEC; fuente de suministro y procedimiento de cultivo): las MCEC se cultivaron mediante el protocolo de tipo mejorado descrito anteriormente [Koizumi N, et al. (2007) Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 4519-4526], [Li W, et al. (2007) Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 614-620]. En resumen, se compraron globos oculares de monos cynomolgus, sacrificados humanitariamente para otro fin (Nissei Bilis Co., Ltd., Ohtsu, Japón y Keari Co., Ltd., Wakayama, Japón) (el procedimiento se describe más arriba). Se exfolió la membrana de Descemet, incluidas las células endoteliales de la córnea, y las células endoteliales de la córnea se exfoliaron mecánicamente junto con las membranas basales, seguido de un tratamiento con dispasa o colagenasa (número de catálogo de ROCHE : 10 103586001) y luego el cultivo primario. Normalmente, el tratamiento se realizó con 1 mg/ml de colagenasa A (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) a 37°C durante 2 horas. Para el medio de cultivo se utilizó DMEM (número de catálogo 12320 de INVITROGEN) con un 10 % de FBS (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) y 2 ng/ml de FGF básico (INVITROGEN, número de catálogo: 13256-029) añadidos. Para el cultivo se utilizaron placas de 6 pocillos y similares, que se recubrieron con FNC Coating MIX (marca registrada) (Athena Environmental Sciences., Baltimore, MD). A continuación, las MCEC se cultivaron en un 5 % de CO2 a 37°C en una atmósfera humidificada, y los medios de cultivo se sustituyeron cada tres días. Cuando las MCEC alcanzaron la confluencia en 10 a 14 días, se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) libre de Ca2+ y Mg2+, se tripsinizaron a 37°C durante 5 minutos con tripsina-EDTA al 0,05 % (Life Technologies) y se subcultivaron en una proporción de 1:2 a 4. Se examinó un inhibidor selectivo del factor p de crecimiento por transformación (TGF-p), el SB431542 (Merck Millipore, Billerica, MA) en cuanto a su acción antifibroblástica. *

* Células endoteliales corneales humanas (HCEC; fuente de suministro y procedimiento de cultivo): las HCEC se cultivaron mediante una versión mejorada del protocolo utilizado para las MCEC. En resumen, las membranas de Descemet, incluidas las células endoteliales de la córnea, se exfoliaron de córneas de investigación adquiridas en el banco de Seattle, las células endoteliales de la córnea se exfoliaron mecánicamente junto con las membranas basales, y las células endoteliales de la córnea se retiraron de las membranas basales utilizando colagenasa (número de catálogo de ROCHE: 10 103 586 001) (normalmente, tratado a 37°C durante 2 horas con 1 mg/ml de colagenasa A (Roche Applied Science)). Tras la recolección, se realizó el cultivo primario. En cuanto al medio de cultivo para las muestras humanas, se utilizó Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Líquido (INVITROGEN número de catálogo:31985-070) 8 % de suero fetal bovino (FBS) (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) 200mg/ml CaCl2^2H2O (número de catálogo SIGMA: C7902-500G) ácido condroitín sulfúrico al 0,08 % (número de catálogo SIGMA: C9819-5G) 20 |jg/ml de ácido ascórbico (número de catálogo de SIGMA: A4544-25G) 50 |jg/ml de gentamicina (número de catálogo de INVITROGEN: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (número de catálogo de INVITROGEN: PHG0311), condicionado para las células alimentadoras 3T3. Específicamente, después de la digestión a 37°C, las HCEC obtenidas de córneas individuales se volvieron a suspender en un medio de cultivo, seguido de la siembra en un pocillo de una placa de 12 pocillos recubierta con FNC Coating Mix (marca registrada). El medio de cultivo se preparó de acuerdo con un protocolo conocido públicamente, al que se añadió una modificación parcial. En resumen, se preparó un medio de cultivo base que contenía OptiMEM-I (Life Technologies), 8 % de FBS, 5 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 20 jg/m l de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich), 200 mg/L de cloruro de calcio (Sigma-Aldrich), 0,08 % de ácido condroitín sulfúrico (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, ciudad de Osaka) y 50 jg/m l de gentamicina. A continuación, tras el cultivo de fibroblastos 3T3 inactivados, se recolectó el medio de cultivo condicionado. La inactivación del fibroblasto 3T3 se realizó como se ha descrito anteriormente. En resumen, los fibroblastos 3T3 confluentes, junto con 4 jg/m l de mitomicina C (MMC) (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd, Tokio), se incubaron bajo un 5 % de CO2 a 37°C durante 2 horas, seguido de la tripsinización y la colocación en una placa de plástico en la densidad de 2 *104 células/cm2 Las HCEC se cultivaron en un 5 % de CO2, a 37°C en una atmósfera humidificada, y los medios de cultivo se reemplazaron cada tres días. Cuando las HCECs alcanzaron la confluencia en 10 a 14 días, se enjuagaron en PBS libre de Ca2+ y Mg2+, se tripsinizaron a 37°C durante 5 minutos con tripsina-EDTA al 0,05 % y se subcultivaron en una proporción de 1:2. Se examinaron el SB431542 (Merck Millipore), el anticuerpo de neutralización dirigido al TGF-p (R&DSystems, Inc., Minneapolis, MN), el inhibidor de Smad3 (Merck Millipore) y la proteína osteogénica (BMP) BMP-7 (R&D Systems) con respecto a las acciones antifibroblásticas.

* se observaron las células mediante procedimientos tales como la tinción (Histología) utilizando un microscopio en contraste de fase. Además, tras la fijación de las células, se realizó una inmunotinción utilizando ZO-1, Na+/K+-ATPasa como marcador asociado a la función, seguida de la observación a través de un microscopio de fluorescencia. Para el examen de la tinción de los tejidos, las MCEC cultivadas o las HCEC se colocaron en Lab-Tek™ Chamber Slides™ (NUNC A/S, Roskilde, Dinamarca), se fijaron con formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) y se incubaron durante 30 minutos con

1 % de albúmina de suero bovino (BSA). Específicamente, las MCECs o HCECs cultivadas en el Lab-Tek™ Chamber Slides™ (NUNC A/S, Roskilde, Dinamarca) se fijaron a temperatura ambiente durante 10 minutos en formaldehído al 4 %, seguido de una incubación durante 30 minutos junto con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %. Para examinar el fenotipo de las CEC, se realizaron análisis inmunohistoquímicos dirigidos a una proteína asociada a la unión estrecha, ZO-1 (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA), a una proteína asociada a la función de bombeo, Na+/K+-ATPasa (Upstate Biotec, Inc., Lake Placid, NY), a la fibronectina (BD, Franklin Lakes, NJ) y a la actina. Como marcadores asociados a la función de las CEC, se utilizaron ZO-1 y Na+/K+-ATPasa; la fibronectina y el colágeno de tipo 1 se utilizaron para evaluar el cambio de forma fibroblástica; y la tinción de actina se utilizó para evaluar el fenotipo de las células. La tinción de ZO-1, Na+/K+-ATPasa, colágeno de tipo 1 y fibronectina se realizó cada una de ellas utilizando una dilución de 1:200 del anticuerpo policlonal de ZO-1, del anticuerpo monoclonal de Na+/K+-ATPasa y del anticuerpo monoclonal de fibronectina. En cuanto al anticuerpo secundario, se utilizó una dilución 1:2000 de la etiqueta Alexa Fluor (marca registrada) 488 o de la etiqueta Alexa Fluor (marca registrada) 594 de IgG antiratón de cabra (Life Technologies). La tinción de la actina se realizó utilizando una dilución 1:400 de faloidina con etiqueta Alexa Fluor (marca registrada) 488 (Life Technologies). A continuación, el núcleo de cada célula se tiñó con DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) o PI (Sigma-Aldrich). A continuación, los portaobjetos se observaron con un microscopio de fluorescencia (TCS SP2 AOBS; Leica Microsystems, Welzlar, Alemania).

(Resultado)

La Figura 1 muestra un resultado del cultivo en monos cynomolgus y en humanos utilizando un procedimiento de cultivo celular convencional. Como se desprende del resultado del cultivo, se entiende que se produjo una transformación en el endotelio corneal de los monos y de los humanos con el procedimiento de cultivo normal, es decir, se produjo una fibrosis en las células respectivas, lo que dio lugar a un fenotipo diferente al de las células normales, a saber, las células tienen una forma poligonal y una sola capa, lo que no es adecuado para el trasplante.

(Ejemplo comparativo 2)

En el presente ejemplo, se realizó un experimento para demostrar que las funciones normales se perderían en el cultivo basado en la técnica anterior. En el presente ejemplo, se demostró si el endotelio de la córnea de los monos perdería la expresión de la proteína asociada a la función utilizando la inmunotinción y una técnica de transferencia Western, así como un procedimiento de PCR en tiempo real. Los detalles se proporcionarán más adelante.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que se utilizaron en el Ejemplo Comparativo 1 y se sometieron a cultivo y similares de manera similar al Ejemplo Comparativo 1.

*Células endoteliales de la córnea del mono Cynomolgus: igual que el ejemplo comparativo 1.

*Células endoteliales de la córnea humana: igual que en el ejemplo comparativo 1.

* Anticuerpos contra la Na+/K+-ATPasa: se utilizaron los disponibles en Millipore (número de catálogo de Millipore: 05-369).

* Anticuerpos contra ZO-1: ratones, se utilizaron los disponibles en INVITROGEN (número de catálogo de INVITRo Ge N: 339100), y de conejo, se utilizaron los disponibles en ZYMED LABORATORIES (número de catálogo de ZYMED LABORATORIES: 61-7300).

*Anticuerpos contra la fibronectina: disponibles en BD BIOSCIENCES (número de catálogo: 610077)

*Anticuerpos contra el colágeno tipo 1: (disponible en ABEAM) (número de catálogo: ab292)

*Anticuerpos contra GAPDH: se utilizaron los disponibles en ABEAM (número de catálogo: ab36840).

*Anticuerpo secundario (anticuerpo secundario IgG anti-conejo de unión HER) disponible en Cell Signaling Technology (número de catálogo: 7074)

*Anticuerpo secundario (anticuerpo secundario IgG anti-conejo) disponible en Cell Signaling Technology (número de catálogo: 7076)

*Procedimiento de extracción o preparación de la fracción celular: las células que habían alcanzado la confluencia se lavaron tres veces con PBS (Dulbecco's PBS, Nissui, número de catálogo: 5913), seguido de una disolución con tampón RIPA (1*PBS, 1 % Nonidet P-40 (Nacalai Tesque, número de catálogo: 23640­ 94), desoxicolato de sodio al 0,5 % (NacalaiTesque, número de catálogo: 10712-12), y 0,1 % de SDS (lauril sulfato de sodio, Nacalai Tesque, número de catálogo:31607-65)). Al mencionado tampón RIPA se le añadió un cóctel de inhibidores de fosfatasas 2 (Sigma-Aldrich) y un cóctel de inhibidores de proteasas (Nacalai Tesque, Inc., ciudad de Kyoto). El lisado celular obtenido se centrifugó (15.000 rpm, 10 minutos) donde se recolectó el sobrenadante del mismo, y se cuantificó la proteína utilizando un KIT DE ANÁLISIS DE PROTEÍNAS BCA (PIERCE (número de catálogo: 23227)). La disolución se realizó con 100pl de tampón de disolución (tampón de muestra Laemmli) que incluía 5 mM de 2-mercaptoetanol (Nacalai Tesque (número de catálogo: 21418-42)).

*Inmunotinción: después de lavar las células que habían alcanzado la confluencia con PBS (Nissui, número de catálogo: 5913), las células se fijaron durante 10 minutos con etanol helado (Nacalai Tesque, número de catálogo: 14713-95) y ácido acético (número de catálogo WAKO:017-00256) (95:5).

El bloqueo se realizó mediante la incubación durante 1 hora con monolaurato de sorbitán de polietileno al 0,1 % (vol/vol) (Nacalai Tesque, número de catálogo: 28353-85) (TBS-T) y solución salina tamponada con Tris (10mTris-HCl, pH 7,4;100mMNaCl) con 10 % de suero fetalbovino. Se utilizaron como anticuerpos primarios el anticuerpo anti ZO-1 de conejo (1:200), y el anticuerpo anti Na+/K+-ATPasa de murino (1:200) para permitir la reacción durante 1 hora a temperatura ambiente. Lo mismo ocurrió con los anticuerpos contra la fibronectina y los anticuerpos contra el colágeno de tipo 1. En cuanto a la tasa de dilución, se utilizó 1:200 o 1:1000, según el caso.

A continuación, se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente con ALEXA FLUOR 488 (INVITROGEN (número de catálogo: A21206)) y ALEXA FLUOR 594 (INVITROGEN (número de catálogo: A21203)), diluido con TBS-T por 1.000 veces. Tras el lavado con PBS, la muestra se encapsuló con VECTASHIELD CON DAPI (VECTOR LABORATORIES (número de catálogo: 94010)) en un portaobjetos, seguido de la observación a través del microscopio confocal (Leica). *Técnica de transferencia Western: la proteína extraída por el tampón RIPA se electroforizó con poliacrilamida al 7,5 %. La proteína separada se transfirió a una película de PVDF (PALL LIFE SCIENCE (número de catálogo: EH-2222)). La película secante se incubó durante una hora con solución salina tamponada con Tris (10m MTris-HCl, pH 7,4; 100mM NaCl) (TBS-T) que incluía monolaurato de sorbitán de polietileno al 0,1 % (vol/vol) (Nacalai Tesque, número de catálogo: 28353-85) complementado con un 5 % de leche en polvo sin grasa (5 % NON Fa T DRY MILK, CELL SIGNALING, número de catálogo: 9999) a efectos de bloqueo. A continuación, el anticuerpo ZO-1 y el anticuerpo Na+/K+-ATPasa se diluyeron 1.000 veces con TBS-T, complementado con un 5 % de leche descremada. Las películas se sumergieron en una membrana durante una hora a temperatura ambiente para permitir que se produjera la reacción. Después de lavar 3 veces con TBS-T, se realizó la incubación con un complejo de anticuerpos murinos-IgG HRP (CELL SIGNALING (número de catálogo: 7074P2)). Tras el lavado, las bandas se detectaron utilizando un kit de detección de Transferencia Western ECL-ADVAVCE (GE healthcare Japan (número de catálogo: RPN2135V)). Los anticuerpos contra la fibronectina y los anticuerpos contra el colágeno tipo 1 también se utilizaron de forma similar. A continuación, se realizó la incubación con los siguientes anticuerpos primarios: Na+/K+-ATPasa (Merck Millipore), ZO-1, GAPDH (Abcam, Cambridge, Reino Unido), fibronectina y Smad2 (Cell Signaling Technology), Smad2 fosforilado (Cell Signaling Technology), ERK1/2 (BD), fosforilación ERK1/2 (BD), p38MAPK(BD), p38MAPK fosforilado (BD), JNK (BD) o JNK fosforilado (b D) (dilución 1:1000), y anticuerpo secundario IgG anti-conejo o anti-conejo marcado (Cell Signaling Technology) (dilución de 1:5000). La membrana se expuso utilizando un kit de detección de Transferencia Western ECL Advance (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y luego se examinó utilizando un sistema de imágenes LAS4000S (FUJIFILM Corporation, Tokio). *PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa semicuantitativa (RT-PCR)): además, se realizó un procedimiento de PCR para la Na+/K+-ATPasa, ZO-1 y GAPDH utilizando el siguiente procedimiento. Los cebadores se adquirieron de una empresa de síntesis de oligonucleótidos, INVITROGEN, y se utilizaron cebadores desalinizados. Se utilizaron como muestras las células endoteliales de la córnea que se transformaron de forma natural en una forma fibrosa y las células endoteliales de la córnea normal, y se examinó la cantidad de ARNm de la Na+/K+-ATPasa y la ZO-1 mediante un procedimiento de PCR semicuantitativo. Para la extracción del ARN total de las células, se utilizó RNEasy (QIAGEN, número de catálogo: 74106). El ARN extraído se sometió a una reacción de transcripción inversa (42°C, 60 minutos) utilizando ReverTra Ace (TOYOBO (número de catálogo: TRT-101)), y la Na+/K+-ATPasa y ZO-1 se amplificaron utilizando TAKARA Taq HotStart Version (TAKARA BIO INC., número de catálogo: RR001A) con GAp Dh como estándar interno. La misma cantidad de ADNc se amplificó utilizando una máquina de PCR (GeneAmp 9700; Applied Biosystems) y el siguiente par de cebadores. Para la reacción de PCR, se utilizaron los siguientes cebadores. También se utilizaron los siguientes cebadores de manera similar para la reacción de PCR a los anticuerpos contra la fibronectina, el colágeno tipo 1 y 4, la integrina a5 y la integrina p1.

*Na+/K+-ATPasa-F-CTTCCTCCGCATTTATGCTCATTCTCACCC (SEQ ID NO: 1)

*Na+/K+-ATPasa-R: GGATGATCATAAACTTAGCCTTGATGAACTC (SEQ ID NO: 2)

*ZO-1-F: GGACGAGGCATCCCTAA (SEQ ID NO: 3)

*ZO-1-R: CCAGCTTCTCGAAGAACCAC (SEQ ID NO: 4)

*GAPDH-F: GAGTCAACGGTGGTCGT (SEQ ID NO: 5)

*GAPDH-R: TTGATTTTGGAGGGATCTCG (SEQ ID NO: 6)

*Colágeno 1-F: TCGGCGAGCATGACCGATGGAT (SEQ ID NO: 7)

*Colágeno 1-R: GACGCTGTAGGT GAAGCGGCTGTT (SEQ ID NO: 8)

*Colágeno 4-F: AGCAAGGTGTTACAGGATTGGT (SEQ ID NO: 9)

*Colágeno 4-R: AGAAGGACACTGTGGGTCATCT (SEQ ID NO: 10)

*Colágeno 8-F: ATGTGATGGCTGTGCTGCTGCCT (SEQ ID NO: 11)

*Colágeno 8-R: CTCTTGGGCCAGGCTCCA (SEQ ID NO: 12)

*Fibronectina-F: AGATGAGTGGGAACGAATGTCT (SEQ ID NO: 13)

*Fibronectina-R: GAGGGTCACTGAATTCTCC (SEQ ID NO: 14)

*integrina a5-F: TCCTCAGCAAGAATCTCAACAA (SEQ ID NO: 15)

*integrina a5-R: GTTGAGTCCCGTAACTGGTC (SEQ ID NO: 16)

*integrina (31-F: GCTGAAGACTATCCCATTGACC (SEQ ID NO: 17)

*integrina P1-R: ATTTCCAGATATGCGCTGTTTT (SEQ ID NO: 18)

Los fragmentos de ADN amplificados se sometieron a electroforesis con un gel de agarosa al 1,5 % (Nacalai Tesque, número de catálogo: 01149-76), y detectado por tinción con bromuro de etidio (Nacalai Tesque, número de catálogo: 14603-51). *La PCR cuantitativa se realizó utilizando los siguientes cebadores TaqMan (marca registrada) (Invitrogen). colágeno tipo 1: Hs00164004_m1; fibronectina : Hs01549976_m1; GAPDH: Hs00266705_g1. La PCR se realizó con un sistema de PCR en tiempo real StepOne™ (Applied Biosystems). El GAPDH se utilizó como estándar interno. (Resultado)

Como se muestra en la Figura 2, cuando se realizó el cultivo celular basado en la técnica anterior, las funciones normales se perdieron en las células endoteliales de la córnea de mono, que se cambiaron morfológicamente al fenotipo de fibroblastos. En comparación con las células endoteliales de la córnea de los monos que se cultivaron de forma normal, se demostró que el endotelio de la córnea de los monos perdía la expresión de un marcador asociado a la función por el cambio morfológico al fenotipo de fibroblasto (fibroblástico), a través de la inmunotinción, la técnica de transferencia Western y el procedimiento de PCR en tiempo real.

Más particularmente, se mostraron dos fenotipos diferentes de CEC de primates en cultivo celular. Lo más interesante es que las CEC de primates en cultivo mostraron dos fenotipos diferentes cuando se determinaron las formas celulares y los fenotipos de tipo de inhibición de contacto característicos. Alrededor del 60 % de las células mantuvieron una forma celular poligonal característica y un fenotipo de inhibición de contacto, y estas células se denominaron fenotipo normal. Por otra parte, el 40 % de las células mostraron una forma fibroblástica con múltiples capas, y estas células se denominaron fenotipo similar al fibroblasto (Figura 1). A continuación, se examinaron estos dos fenotipos con respecto a las características endoteliales; el patrón de tinción de la Na+/K+-ATPasa y ZO-1 en la membrana plasmática estaba bien conservado en el fenotipo normal, mientras que el fenotipo similar al fibroblasto perdió por completo el perfil de tinción característico de la Na+/K+-ATPasa y ZO-1 en la membrana plasmática (lado izquierdo de la Figura 2). La expresión de dos proteínas funcionales, que se observó tanto a nivel de proteínas (arriba a la derecha, Figura 2) como a nivel de ARNm (abajo a la derecha, Figura 2), fue significativamente mayor en el fenotipo normal que en el fenotipo de fibroblastos.

(Comportamiento de la matriz extracelular)

La CEC de fibroblastos se examinó además con respecto al estado de la matriz extracelular y similares. La Figura 2A muestra los resultados.

La Figura 2A muestra que los fibroblastos CEC de primates producen una matriz extracelular anormal, y específicamente, muestra que las funciones normales se pierden cuando se cultivan en base al arte previo. (A) muestra la expresión en un fenotipo de fibroblasto y en un fenotipo de célula normal en fibronectina y colágeno tipo 1. La fila superior muestra la fibronectina y la fila inferior el colágeno tipo 1. El lado izquierdo muestra un fenotipo de célula normal, y el lado derecho muestra un fenotipo de fibroblasto. El fenotipo de los fibroblastos mostraba un exceso de matriz extracelular como la fibronectina y el colágeno tipo 1. Por otro lado, el fenotipo celular normal perdió completamente la capacidad de tinción. (B) muestra el transferencia Western de la expresión de la proteína fibronectina en las células de fenotipo fibroblasto y fenotipo normal. El GAPDH se utilizó como control. El nivel de expresión proteica de la fibronectina estaba más regulado en el fenotipo de fibroblastos que en el fenotipo normal. (C) muestra los resultados de la PCR semicuantitativa en el fenotipo de los fibroblastos (derecha) y en el fenotipo de las células normales (izquierda) del colágeno tipo 1, tipo 4 y tipo 8, la fibronectina, la integrina a5 y la integrina p1 (enumeradas en orden desde la parte superior). El GAPDH se utilizó como control. A partir del análisis semicuantitativo por PCR, mientras que los transcritos de colágeno tipo 1 (a1 (I) ARNm) se expresaban abundantemente en el fenotipo de fibroblastos, la expresión del a1(I)ARNm estaba disminuida en el fenotipo normal. El ARNm del colágeno de la membrana basal a1 (IV) y el ARNm de a1 (VIII) se expresaron tanto en el fenotipo normal como en el fenotipo de fibroblastos, pero el grado de expresión en el fenotipo normal fue menor que el del fenotipo de fibroblastos. El ARNm de la fibronectina y de la integrina a5 se observó en el fenotipo de fibroblastos, pero el ARNm de estos dos tipos no se expresó en el fenotipo normal. El ARNm de la integrina p1 se expresó en niveles similares en ambos fenotipos.

A partir de la comparación de las proteínas de la matriz extracelular (ECM) verdaderamente fibrosas, las del fenotipo fibroblasto mostraron un patrón de tinción de la ECM fibrosa de la fibronectina, mientras que el fenotipo normal perdió completamente la capacidad de tinción de la fibronectina (A en la Figura 2A). El nivel de proteína de la fibronectina estaba más regulado en el fenotipo de fibroblastos que en el fenotipo normal (B en la Figura 2A). El colágeno tipo 1 producido por el fenotipo de fibroblastos muestra una expresión en sitios superpuestos, que se observó tanto en la MEC como en el citoplasma. Curiosamente, el sitio del citoplasma en el colágeno tipo 1 está en el complejo de golgi, y por lo tanto la localización intracelular del mismo es esencial para la secreción. Estos resultados son similares a los datos existentes (Ko MK, Kay EP. Localización subcelular del procolágeno I y de la prolil 4-hidroxilasa en las células endoteliales de la córnea. Investigación celular experimental. 2001;264:363-71). Por otro lado, no se observó claramente la tinción de colágeno tipo 1 en el fenotipo normal (Figura 2A). La expresión de las principales proteínas ECM se midió mediante un análisis de RT-PCR. Se encontró que el transcrito del colágeno tipo 1 (a1 (I) ARNm) se expresaba abundantemente en el fenotipo de fibroblastos. Por otro lado, la expresión del ARNm de a1 (I) era insignificante en el fenotipo normal (Figura 2C). A diferencia del transcrito del colágeno tipo I, el ARNm de los fenotipos de colágeno de la membrana basal, el ARNm a1 (IV) y aI (VIII), se expresaba tanto en el fenotipo normal como en el fenotipo de fibroblastos, pero el grado de expresión era menor en el fenotipo normal que en el de fibroblastos. La expresión de la fibronectina y la integrina a5 se observó en el fenotipo de fibroblastos. Por el contrario, estos dos transcritos no se expresaban en el fenotipo normal (C en la Figura 2A). Por otra parte, el ARNm de la integrina p1 se expresaba a niveles similares tanto en el fenotipo normal como en el fenotipo fibroblasto (C en la Figura 2A).

(Ejemplo comparativo 3: Pérdida de las funciones normales en otro procedimiento de los procedimientos convencionales)

En el presente Ejemplo Comparativo, se confirmó que la fibrosis de las células endoteliales de la córnea se produjo con un procedimiento de cultivo convencional (Figura 3). El medio de cultivo condicionado derivado de las células alimentadoras 3T3 suprime el cambio fibroblástico. Sin embargo, se muestra que el uso de sólo el medio de cultivo condicionado derivado de las células alimentadoras 3T3 da lugar a la transformación cuando se realiza el subcultivo (lado derecho en la Figura 3).

(Material y procedimiento)

Entre los materiales usados, los materiales que eran iguales a los del Ejemplo Comparativo 1 y 2 se obtuvieron, cultivaron y similares de manera similar. *

*Control: el medio de cultivo utilizado para el cultivo de un control, célula endotelial corneal humana, fue el siguiente: Medio de suero reducido Opti-MEM I, líquido (número de catálogo de INVITROGEN: 31985-070) 8 % FBS (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) 200 mg/ml CaC^2H2O (número de catálogo SIGMA: C7902-500G) ácido condroitín sulfúrico al 0,08 % (número de catálogo SIGMA: C9819-5G) 20 |jg/ml de ácido ascórbico (número de catálogo de SIGMA: A4544-25G) 50 jg/m l de gentamicina (número de catálogo de INVITROGEN: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (número de catálogo de INVITROGEN: PHG0311).

*Medio de cultivo condicionado para la célula alimentadora 3T3: Las células NIH3T3 se diseminaron en una placa de 150 mm (FALCON, número de catálogo: 3025), recubierto con gelatina al 0,1 % (SIGMA, número de catálogo: G1890-500G), utilizando FBS al 10 % (BiOw EST, número de catálogo: S1820-500) / DMEM (INVITROGEN, número de catálogo: 12320), seguido de un cultivo hasta la subconfluencia. A continuación, se realizó la incubación durante 2 horas en una solución de mitomicina C con una concentración final de 0. 04mg/ml (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd, número de catálogo: 874231) a 37°C, en una incubadora con 5 % de CO2. El cultivo se realizó durante la noche sustituyéndolo por un 10 % de FBS (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) / medio de cultivo DMEM. Medio de suero reducido Opti-MEMI, líquido (INVITROGEN, número de catálogo: 31985-070) 8 % FBS (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) 200 mg/ml CaC^2H2O (SIGMA, número de catálogo: c 7902-500G) ácido condroitinsulfúrico al 0,08 % (SIGMA, número de catálogo: C9819-5G) 20 pg/ml de ácido ascórbico (SIGMA, número de catálogo: A4544-25G) 50 pg/ml de gentamicina (INVITROGEN, número de catálogo: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (INVITROGEN, número de catálogo: PHG0311) se añadieron a las células NIH3T3 así creadas, y luego se cultivaron durante una noche para crear un medio de cultivo condicionado para cultivar el endotelio corneal humano.

*Procedimiento de cultivo: el cultivo se realizó utilizando los respectivos medios de cultivo en un procedimiento similar al del Ejemplo Comparativo 1.

*Procedimiento de observación de las células tal como tinción: la forma de las células se observó a través de un microscopio en contraste de fase.

(Resultado)

Como se muestra en la Figura 3, se indicó que la fibrosis se produjo en el cultivo con un medio de cultivo condicionado utilizando células alimentadoras 3T3, como otro procedimiento convencional, dio lugar a una condición que no era adecuada para el trasplante.

Los resultados de los Ejemplos Comparativos 1 y 3 permiten confirmar que cuando se realiza el subcultivo, resulta imposible que se produzca el crecimiento manteniendo una condición normal con los medios de cultivo convencionales para las células endoteliales de la córnea, como se muestra en la Literatura no de Patente 7.

(Ejemplo 1)

En el presente Ejemplo, centrándose en el hecho de que la transformación era de forma fibroblástica, se examinó la activación de una vía que se activaba en la inducción de la fibrosis conocida con una especie celular general utilizando un procedimiento de transferencia Western.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que se utilizaron en los Ejemplos Comparativos 1 a 3 y se sometieron a cultivo y similares de manera similar a los Ejemplos Comparativos 1 a 3.

*Célula endotelial de la córnea del mono Cynomolgus: Se adquirieron globos oculares de monos cynomolgus, que fueron sacrificados humanitariamente para otro fin (Nissei Bilis Co., Ltd., Ohtsu, Japón y Keari Co., Ltd., Wakayama, Japón), se exfoliaron mecánicamente las células endoteliales de la córnea junto con las membranas basales, y a continuación se exfoliaron de las membranas basales utilizando dispasa o colagenasa para su recolección, y luego se realizó el cultivo primario. Para el medio de cultivo, DMEM (INVITROGEN, número de catálogo: 12320) con un 10 % de FBS (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) y 2 ng/ml de FGF básico (INVITROGEN, número de catálogo: 13256-029) añadidos. En esta fase, las células endoteliales de la córnea de mono pueden cultivarse de forma normal, como se muestra en la Figura 1, pero a menudo cambian su forma de manera fibroblástica mediante un procedimiento de cultivo similar, el cultivo a largo plazo y el subcultivo. En consecuencia, se recolectaron células cultivadas de forma normal y células modificadas morfológicamente de forma fibroblástica y se utilizaron para un procedimiento de transferencia Western.

*Anticuerpos contra pSmad2: se utilizaron los obtenidos de CELL SIGNALING (número de catálogo: 3108P).

*Anticuerpos contra pSmad: se utilizaron los obtenidos de CELL SIGNALING (número de catálogo: 5339P).

*Anticuerpos contra la pp38: se utilizaron los obtenidos de BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES (igual que p38a/SAPK2a. número de catálogo: 612168). *

*Anticuerpos contra p38: se utilizaron los obtenidos de BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES (número de catálogo: 612280).

*Anticuerpos contra pERK1/2: se utilizaron los obtenidos de BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES (número de catálogo: 612358).

*Anticuerpos contra ERK1/2: se utilizaron los obtenidos de BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES (número de catálogo: 610030).

*Anticuerpos contra pJNK: se utilizaron los obtenidos de BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES (número de catálogo: 610627).

*Anticuerpos contra JNK: se utilizaron los obtenidos de BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES (número de catálogo: 612540).

(Procedimiento del experimento)

*Procedimientos de extracción y preparación de la fracción celular: las células que habían alcanzado la confluencia se lavaron tres veces con PBS, seguidas de una disolución con RIPAbuffer (1 * PBS (Nissui, número de catálogo: 5913), Nonidet P-40 al 1 % (Nacalai Tesque, número de catálogo: 23640-94), desoxicolato de sodio al 0,5 % (Nacalai Tesque, número de catálogo: 10712-12), y 0,1 % SDS (Nacalai Tesque, número de catálogo:31607-65)). El lisado celular así obtenido se centrifugó (15, 000 rpm, 10 minutos), se recolectó el sobrenadante del mismo y se cuantificó la proteína utilizando un KIT DE ANÁLISIS DE PROTEÍNAS BCA (PIERCE, número de catálogo: 23227). La disolución se realizó con 100 pl de tampón de disolución (tampón de muestra Laemmli) que incluía 5mM de 2-mercaptoetanol (Nacalai Tesque, número de catálogo: 21418-42).

*Técnica de transferencia Western: la proteína extraída con el tampón RIPA y obtenida se electroforizó con poliacrilamida al 7,5 %. La proteína separada se transcribió a una película de PVDF (PALL LIFE SCIENCE, número de catálogo: EH-2222). Las películas se incubaron durante una hora en solución salina tamponada con Tris (10 mM Tris-HCl, pH7,4;100 mM NaCl) complementada con 0,1 % (vol/vol) de monolaurato de sorbitán de polietileno (Nacalai Tesque, número de catálogo: 28353-85) (TBS-T) y leche en polvo sin grasa al 5 % (CELL SIGNALING, número de catálogo: 9999) para el bloqueo. A continuación, los anticuerpos Smad2, los anticuerpos pSmad2, los anticuerpos p38, los anticuerpos pp38, los anticuerpos ERK, los anticuerpos pERK, los anticuerpos JNK y los anticuerpos pJNK, que se diluyeron en 1, 000 veces con TBS-T suplementado con 5 % de l Ec HE SECA SIN GRASA (CELL S iGNALIn G, número de catálogo: 9999), y las películas se sumergieron en la solución de anticuerpos durante una hora a temperatura ambiente para permitir que se produjera la reacción. Después de lavar 3 veces con TBS-T, se realizó la incubación con un complejo HRP de anticuerpos murinos-IgG (CELL SIGNALING, número de catálogo: 7074P2) y un complejo HRP de anticuerpos de conejo-IgG (GE Healthcare, número de catálogo: NA934). Tras el lavado, las bandas se detectaron utilizando ECL-ADVAVCE (GE healthcare Japón, número de catálogo: RPN2135V).

(Resultado)

La Figura 4 muestra la actividad de la vía primaria, que está asociada a la causa de la transformación de la fibrosis, utilizando el endotelio de la córnea de mono, examinada mediante transferencia Western. En el fibroblasto, se determinó la fosforilación de Smad2 (activación de la vía del TGF-p), la activación de p38 MAPK y la activación de la vía de JNK. Por otro lado, se suprimió la fosforilación de ERK1/2. Según un informe, Smad2, p38, ERK1/2 y JNK participaron en la vía de la EMT [Chen KH, et al.(1999) Invest Ophthalmol Vis Sci 40: 2513-2519], [Kim TY, et al. (2001) Invest Ophthalmol Vis Sci 42: 3142-3149], [Naumann GO, etal. (2000) Ophthalmology 107: 1111-1124], [Parsons CJ, et al. (2007) J Gastroenterol Hepatol 22 Suppl 1: S79-84], [Ma FY, et al.(2009) Front Biosci (Schol Ed) 1: 171-187]. Así, los inventores examinaron si la Smad2 y la MAPK estaban implicadas en la transición endotelial-mesenquimal, similar a la EMT observada en las células epiteliales. Se comprobó que la fosforilación de Smad2 estaba muy promovida en el fenotipo tipo fibroblasto en comparación con los del fenotipo normal (Figura 4). La fosforilación de p38 y ERK1/2 estaba muy aumentada en el fenotipo tipo fibroblasto, mientras que la activación de JNK era insignificante. Sin embargo, la fosforilación de ERK está influenciada por el crecimiento de las células, además del cambio en la fibrosis de las mismas, se ha confirmado que se pueden observar diferentes resultados de acuerdo con las condiciones de crecimiento de las células. Estos hallazgos indican que la señalización del TGF-p puede adoptar un papel importante en la transición fibroblástica de la CEC.

(Ejemplo 2: ejemplo de inhibición de la transformación del endotelio corneal)

En el presente ejemplo, se describirá un ejemplo en el que las señales de TGF-p fueron inhibidas por un inhibidor de la fosforilación de un receptor, de modo que se pudo suprimir la transformación del endotelio de la córnea de mono.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados, los materiales que eran los mismos que los de los Ejemplos Comparativos 1 a 3 se obtuvieron, cultivaron y similares de manera similar a los del Ejemplo Comparativo 1 a 3.

*Célula endotelial de la córnea del mono Cynomolgus: Se adquirieron globos oculares de monos cynomolgus, que fueron sacrificados humanitariamente para otro fin (Nissei Bilis Co., Ltd., Ohtsu, Japón y Keari Co., Ltd., Wakayama, Japón), se exfoliaron mecánicamente las células endoteliales de la córnea junto con las membranas basales, y a continuación se exfoliaron de las membranas basales utilizando colagenasa para su recoleccón, y luego se realizó el cultivo primario. En esta fase, las mismas córneas se dividieron en dos y se les aplicó DMEM (INVITROGEN, número de catálogo: 12320)) con un medio de cultivo base para el cultivo del endotelio corneal de mono (10 % FBS (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) y 2 ng/ml de Fg F básico (INVITROGEN, número de catálogo: 13256-029) añadidos al mismo, y un medio de cultivo base con 1 pmol/1 SB431542 (TOCRIS, número de catálogo: 1614) añadido.

(Resultado)

Como se muestra en la Figura 5, mientras que las imágenes de diferencia de fase muestran que las CEC de los primates, cultivadas en presencia de SB431542, mostraron una verdadera forma de célula poligonal y una sola capa de tipo inhibición de contacto, se demostró que las CEC del control mostraron un fenotipo de fibroblasto. Mientras que la cultivada por el medio de cultivo base del control se reconoció transformada en fenotipo de fibroblastos y de varias capas, las células cultivadas en presencia del inhibidor de la fosforilación que resulta en la inhibición de la señalización del TGF-p el fenotipo era similar al del organismo vivo en el sentido de que se observaba una capa de células de forma poligonal, lo que demostraba la supresión de la transformación del endotelio corneal del mono.

(Ejemplo 3: Demostración de que el endotelio corneal mantiene sus funciones normales)

En el presente Ejemplo, mediante la presente invención, como demostración de la normalización del cultivo, se demostró que la proteína asociada a la función del endotelio corneal se mantendría. Los detalles se proporcionarán más adelante.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, los mismos materiales que los utilizados en los Ejemplos Comparativos anteriores. El procedimiento de cultivo y similares se llevó a cabo de manera similar a los Ejemplos Comparativos. En particular, se utilizaron materiales similares a los del ejemplo 2.

*SB431542: se obtuvo de TOCRIS (número de catálogo: 1614).

*Anticuerpos contra la Na+/K+-ATPasa: se utilizaron los obtenidos de MILLIPORE (número de catálogo: 05­ 369).

*Anticuerpos contra ZO-1: ratones, los obtenidos de INVITROGEN (número de catálogo: 339100); y los conejos, los obtenidos de ZYMED LABORATORIES (número de catálogo: 61-7300).

*Anticuerpos contra GAPDH: se utilizaron los obtenidos de ABCAM (número de catálogo: ab36840).

*Inmunotinción y similares: se fijaron las células cultivadas de manera similar al Ejemplo 2 y se realizó la inmunotinción de la Na+/K+-ATpasa y la ZO-1, seguida de la toma de imágenes con un microscopio de fluorescencia.

*Procedimiento de transferencia Western: de forma similar al Ejemplo 1, se realizó un procedimiento de transferencia Western sobre la Na+/K+-ATPasa, ZO-1 y GAPDH. *

*Procedimiento de PCR en tiempo real: además, se realizó la PCR para la Na+/K+-ATPasa, ZO-1 y GAPDH con el siguiente procedimiento. Los cebadores se adquirieron en una empresa de síntesis de oligonucleótidos, INVITROGEN, y se utilizaron cebadores desalinizados. Se utilizaron como muestras las células endoteliales de la córnea que se transformaron de forma natural en una forma fibrosa y las células endoteliales de la córnea normal, y se examinó la cantidad de ARNm para la Na+/K+-ATPasa y la ZO-1 mediante un procedimiento de PCR semicuantitativo. Para la extracción del ARN total de las células, se utilizó RNEasy (QIAGEN, número de catálogo: 74106). El ARN extraído se sometió a una reacción de transcripción inversa (42°C, 60 minutos) utilizando ReverTra Ace (TOYOBO (número de catálogo: TRT-101)), y la Na+/K+-ATPasa y ZO-1 se amplificaron utilizando TAKARA Taq HotStart Version (TAKARABIO INC., número de catálogo: RR001A) con GAPDH como estándar interno. Para la reacción de PCR, se utilizaron los cebadores descritos a continuación.

*Na+/K+-ATPasa-F-CTTCCTCCGCATTTATGCTCATTCTCACCC (SEQ ID NO: 1)

*Na+/K+-ATPasa-R-GGATGATCATAAACTTAGCCTTGATGAACTC (SEQ ID NO: 2)

*ZO-1-F-GGACGAGGCATCCCTAA(SEQ ID NO: 3)

*ZO-1-R-CCAGCTTCTCGAAGAACCAC (SEQ ID NO: 4)

*GAPDH-F-GAGTCAACGGATTTGGTCGT (SEQ ID NO: 5)

‘ GAPDH-R-TTGATTTTGGAGGGATCTCG (SEQ ID NO: 6)

Los fragmentos de ADN amplificados se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 % y se detectaron mediante tinción con bromuro de etidio.

(Resultado)

Como se muestra en la Figura 6, en las células endoteliales de la córnea de mono transformadas en el fenotipo de fibroblastos mediante el cultivo, se detectó la expresión de los marcadores asociados a la función como la Na+/K+-ATPasa y la ZO-1 mediante inmunotinción, transferencia Western y PCR. Mientras tanto, se indicó que la inhibición de las señales del TGF-p mediante el inhibidor de la fosforilación del receptor permitía mantener la proteína asociada a la función del endotelio de la córnea de mono. Específicamente, las CEC tratadas con SB431542 mostraron una tinción característica de la membrana plasmática de la Na+/K+-ATPasa y la ZO-1, mientras que las CEC del control perdieron su tinción. Por lo tanto, se sugirió que las células tratadas con SB431542 mantienen las funciones endoteliales (lado izquierdo de la Figura 6). Además, la expresión de la Na+/K+-ATPasa y de la ZO-1 estaba fuertemente potenciada en el fenotipo fibroblástico tratado con SB431542 tanto a nivel de proteínas (parte superior derecha de la Figura 6) como de ARNm (parte inferior derecha de la Figura 6). Estos datos confirmaron además que el TGF-p puede ser un mediador directo de la transición endotelial-mesenquimal observada en el cultivo de CEC de primates.

(Ejemplo 4: Normalización perdiendo capacidad de TGF-P)

En el presente Ejemplo, para confirmar que las señales de TGF-p están implicadas en la transformación del endotelio de la córnea de mono, se añadió TGF-p para inducir la transformación y mostrar que la proteína asociada a la función se perdería (inmunotinción). Además, mediante transferencia Western, se añadió TGF-p para inducir la transformación y demostrar que la proteína asociada a la función se perdería. Los detalles se proporcionarán más adelante.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que se utilizaron en los Ejemplos comparativos y los Ejemplos anteriores y se sometieron a cultivo y similares de manera similar a los Ejemplos comparativos y los Ejemplos.

*TGF-p: los disponibles en R&D SYSTEMS (número de catálogo: 240-B).

‘ Anticuerpos contra la Na+/K+-ATPasa : los disponibles en MILLIPORE (número de catálogo: 05-369).

‘ Anticuerpos contra ZO-1: ratones, se utilizaron los disponibles en INVITROGEN (número de catálogo: 339100); y en conejos, se utilizaron los disponibles en z Ym ED LABORATORIES (número de catálogo: 61­ 7300).

‘ Anticuerpos contra GAPDH: se utilizaron los disponibles en ABCAM (número de catálogo: ab36840).

‘ Anticuerpos contra pSmad2: se utilizaron los disponibles en CELL SIGNALING (número de catálogo: 3108P).

‘ Anticuerpos contra pSmad: los disponibles en CELL SIGNALING (número de catálogo: 5339P).

‘ Procedimiento de cultivo: las células endoteliales de la córnea de mono se cultivaron hasta su subconfluencia, y se les añadió TGF-p1 durante el cultivo para alcanzar la concentración final de 0, 1, 10 ng/ml, y se continuó el cultivo a 37C hasta que las células comenzaron a cambiar de forma.

‘ Procedimiento de tinción: el procedimiento fue el mismo que el de los ejemplos anteriores.

‘ Procedimiento de extracción de la fracción celular: el procedimiento fue el mismo que el de los ejemplos anteriores.

‘ Técnica de transferencia Western: el procedimiento fue el mismo que el de los ejemplos anteriores.

(Resultado)

Como se muestra en la Figura 7, se realizó una inmunotinción para confirmar que las señales de TGF-p estaban implicadas en la transformación del endotelio de la córnea de mono, y se indicó que la adición de TGF-p y la inducción de la transformación dieron lugar a la pérdida de la proteína asociada a la función. Específicamente, como se muestra en la Figura 7, se indicó que cuando el fenotipo normal se expuso al TGF-p exógeno, el fenotipo normal se transformó en una célula similar a un fibroblasto. Los patrones de tinción de la Na+/K+-ATPasa y la ZO-1 en las membranas plasmáticas del fenotipo normal se perdieron por completo al ser expuestas al TGF-p (columnas central y derecha de la Figura 7).

Además, como se muestra en la Figura 8, también se indicó en el transferencia Western que la adición de TGF-p y la inducción de la transformación dieron lugar a la pérdida de la proteína asociada a la función. Además, se puede confirmar que la fosforilación de Smad2 fue inducida por la adición de TGF-p y la adición de TGF-p provocó la activación de la señalización corriente abajo. En base a este resultado, se entiende que la activación del TGF-p y la señal corriente abajo del mismo es la causa directa de la pérdida de las funciones normales, y la normalización puede mantenerse inhibiendo la vía del mismo. Específicamente, mientras que el factor de crecimiento disminuyó significativamente la expresión de estas dos proteínas a nivel proteico en la forma dependiente de la concentración (columna izquierda de la Figura 8), la fosforilación de Smad2 aumentó considerablemente en la forma dependiente de la concentración (columna derecha de la Figura 8). Estos datos indican que incluso el fenotipo normal de las CEC de primates tiene tendencia a obtener un fenotipo similar al de los fibroblastos en respuesta a la estimulación del TGF-p.

(Ejemplo 5: Demostración con células humanas)

En el presente Ejemplo, también se confirmó que en el endotelio corneal humano, la inhibición de las señales de TGF-p mediante un inhibidor de la fosforilación de un receptor suprimía la transformación, cultivando así un endotelio normal. Los detalles se proporcionarán más adelante.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que se utilizaron en los Ejemplos comparativos y los Ejemplos anteriores y se sometieron a cultivo y similares de manera similar a los Ejemplos comparativos y los Ejemplos.

Las células endoteliales de la córnea se exfoliaron mecánicamente junto con las membranas basales de las córneas de investigación adquiridas en el banco de Seattle, seguido de la exfoliación de las membranas basales utilizando colagenasa para su recolección, y luego el cultivo primario. Para el medio de cultivo, Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Líquido (INVITROGEN, número de catálogo:31985-070) 8 % FBS (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) 200 mg/ml CaC^2H2O (SIGMA, número de catálogo: C7902-500G) ácido condroitinsulfúrico al 0,08 % (SlGMA, número de catálogo: C9819-5G) 20 pg/ml de ácido ascórbico (SIGMA, número de catálogo:A4544-25G) 50 pg/ml de gentamicina (INVITROGEN, número de catálogo: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (INVITROGEN, número de catálogo: PHG0311), que fueron acondicionadas para las células alimentadoras 3T3, se utilizaron como medio de cultivo base. Las células endoteliales corneales humanas recogidas se dividieron en dos, y un grupo de ellas se cultivó con el medio de cultivo base como control, y el otro grupo de ellas se cultivó con un medio de cultivo base con SB431542 (TOCRIS, número de catálogo: 1614) añadido al mismo de forma que la concentración final sea de 1 pmol/L. *Ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA): el colágeno de tipo 1 en un sobrenadante de cultivo de HCEC se analizó utilizando un kit ELISA para colágeno de tipo I alfa 2 (COL1a2) (Uscn Life Science Inc., Wuhan, China) de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante. Se utilizaron sobrenadantes de cultivos derivados de HCEC, cultivados junto con SB431542 o sin SB431542, para los respectivos grupos (n=5).

(Resultado)

Como se muestra en la Figura 9, cuando las células se cultivaron en el medio de cultivo base sin SB431542, las células se transformaron de manera fibroblástica para ser multicapas. Por otro lado, se cultivó una capa de células con una pequeña diferencia de tamaño de forma poligonal en el medio de cultivo con SB431542 añadido al mismo. Basándose en esto, no sólo en el endotelio de la córnea de los monos, sino también en el endotelio de la córnea humana, se confirmó que la inhibición de las señales del TGF-p mediante el inhibidor de la fosforilación del receptor suprimía la transformación, y se cultivó endotelio normal. Específicamente, basándose en el interesante hallazgo observado en las CEC de primates, se examinó más a fondo si las CECH estaban sometidas a un cambio similar e indeseable, inevitable, de las células a la transición endotelial-mesenquimal. Lo más interesante es que las HCEC cultivadas perdieron una estructura característica de una sola capa del tipo de inhibición de contacto y un fenotipo poligonal, y obtuvieron una forma celular de tipo fibroblástico como las CEC de primates (Figura 9).

(Análisis adicional sobre el SB431542)

A continuación, los inventores probaron si el SB431542 podía mantener las funciones de las células endoteliales. Aquí se demostró que el SB431542 mantendría las funciones de las HCEC y suprimiría el cambio de forma fibroblástica de las HCEC, a través de varios experimentos. Los resultados se muestran en la Figura 9A.

Como se muestra en A y B de la Figura 9A, el bloqueo de la señalización del receptor de TGF por SB431542 permite la localización intracelular de la Na+/K+-ATPasa y ZO-1 en una membrana celular, lo que hace posible mantener la expresión proteica de las mismas. La barra de escala muestra 100 pm. Como se muestra en la C de la Figura 9A, se indicó que el SB431542 reguló significativamente la secreción de colágeno tipo 1 al sobrenadante celular, mediante el ensayo ELISA. **P<0,05. Como se muestra en D y E de la Figura 9A, se indicó que el SB431542 disminuyó significativamente la expresión de colágeno tipo 1 y fibronectina a nivel de ARNm.

Como se describió anteriormente, sobre la base de los hallazgos mostrados en A y B de la Figura 9A, se demostró que el bloqueo de la señalización del receptor de TGF por SB431542 permite la localización intracelular de la Na+/K+-ATPasa y ZO-1 en una membrana celular (membrana plasmática), lo que hace posible mantener la expresión proteica de las mismas. Y lo que es más importante, se aclaró que el SB431542 regulaba significativamente la secreción de colágeno tipo 1 al sobrenadante del cultivo, mediante el ensayo ELISA (C en la Figura 9A). Además, el SB431542 disminuyó significativamente la expresión de colágeno tipo I y fibronectina a nivel de ARNm (D y E en la Figura 9A).

(Ejemplo 6: Ejemplo de normalización del cu ltivo del endotelio corneal mediante otro procedimiento)

En el presente Ejemplo, se demostró que las señales de TGF-p se pudieron contrarrestar y la transformación del endotelio corneal humano se pudo suprimir utilizando BMP-7 como procedimiento distinto a los que utilizan SB431542, que se utilizó en los Ejemplos mencionados anteriormente. Los detalles se proporcionarán más adelante.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que los utilizados en los Ejemplos Comparativos y los Ejemplos anteriores y se sometieron a cultivo y similares de manera similar a los Ejemplos Comparativos y los Ejemplos.

*BMP-7: se utilizaron los disponibles en R&D SYSTEMS (número de catálogo: 354-BP).

*faloidina: se utilizó Alexa Fluor (marca registrada) 488 (INVITROGEN, número de catálogo: A12379).

*Procedimiento de cultivo: Las células endoteliales de la córnea humana se cultivaron en un medio de cultivo condicionado utilizando un procedimiento similar al de la Figura 3. A continuación, mientras se realizaba el subcultivo con tripsina, se realizó una comparación entre las células cultivadas en un medio de cultivo obtenido añadiendo BMP-7 (100ng/ml) a un medio de cultivo condicionado similar, y las células cultivadas en un medio de cultivo condicionado similar como control.

*En una observación de forma mediante tinción del citoesqueleto con faloidina y un microscopio en contraste de fase, la transformación se produjo de forma fibroblástica para ser multicapa en el control mientras que la forma de una capa de células poligonales se mantuvo en el medio de cultivo con BMP-7 añadido al mismo.

(Resultado)

Como se muestra en la Figura 10, las señales de TGF-p pudieron ser contrarrestadas y la transformación del endotelio corneal humano pudo ser suprimida mediante el uso de BMP-7 como procedimiento distinto a los que utilizan SB431542. Se sabe que la b MP-7 es común como factor asociado a las señales del TGF-p, mientras que las otras vías de transferencia detalladas son diferentes de SB431542. Específicamente, las vías de señalización del TGF-p se clasifican a grandes rasgos en un sistema Smad2/3 a través de ALK4, 5 o 7, y un sistema Smad1/5/8 a través de ALK1,2, 3 o 6, cualquiera de los cuales es bien conocido por estar asociado a la fibrosis. En consecuencia, se entiende que al suprimir sustancialmente la señal global de TGF-p, se puede suprimir la transformación del endotelio corneal. Aunque no se desea restringir por teorías, ya que la normalización se observó tanto en SB431542, que ejerció el efecto a través de Smad2/3(asociado con ALK4, 5 y 7), como en BMP-7, que ejerció el efecto a través de Smad1/5/8 (asociado con ALK1, 2, 3 y 6), se entiende que cualquiera de los agentes inhibidores de la señal TGF-p de estas vías puede lograr el efecto según la presente invención. Las vías de señalización del TGF-p se clasifican a grandes rasgos en un sistema Smad2/3 a través de ALK4/5/7, y un sistema Smad1/5/8 a través de ALK1/2/3/6, cualquiera de los cuales es bien conocido por estar asociado a la fibrosis (J. Massagu'e, Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 753-91 Vilar JMG, Jansen R, Sander C (2006) PLoS Comput Biol 2(1) :e3 Leask, A., Abraham, D.J. FASEB J. 18, 816-827 (2004) CoertMargadant & Arnoud Sonnenberg EMb O reports (2010) 11,97-105 Joel Rosenbloom et al, Ann Intern Med. 2010; 152: 159-166). Así, cualquiera de los dos tipos de agentes inhibidores de la señal TGF-p representativos podría lograr la normalización del cultivo, y en base a estos resultados, se entiende que, independientemente de las vías de Smad, cualquier agente inhibidor de la señal TGF-p puede funcionar como agente normalizador del cultivo.

(Confirmación de la dependencia de la concentración de BMP-7)

A continuación, utilizando tres concentraciones diferentes, la BMP7 fue capaz de suprimir el cambio de un fenotipo de HCEC a un fenotipo de fibroblasto y mantener la función del mismo. La BMP-7 promueve la MET, y específicamente inhibe la transición epitelial-mesenquimal mediada por el TGF-p. Así, esta molécula se utiliza para antagonizar un proceso de EMT [ZeisbergM, et al. (2003) Nat Med 9: 964-968], [Simic P, et al. (2007) EMBO Rep 8: 327-331], [BuijsJT, et al. (2007) Am J Pathol 171: 1047-1057], [Zeisberg M, et al. (2007) J BiolChem 282: 23337-23347]. Por lo tanto, los inventores examinaron si la BMP-7 era capaz de antagonizar el cambio inevitable de la HCEC. La HCEC de tipo fibroblasto fue tratada con BMP-7 en una concentración que oscilaba entre 10 y 1.000 ng/ml.

Los resultados se muestran en la Figura 10A. Como se muestra en A de la Figura 10A, la forma celular alargada del fenotipo del fibroblasto se convirtió en una forma celular poligonal en respuesta en presencia de BMP-7, de manera dependiente de la concentración. La barra de escala muestra 100 pm. Como se muestra en B de la Figura 10A, son similares a los observados en la CEC normal [BarryPA, et al. (1995) Invest Ophthalmol Vis Sci 36: 1115-1124], la BMP-7 permitió una forma celular hexagonal normal, y permitió la distribución del citoesqueleto en la superficie celular de la actina. La barra de escala muestra 100 pm. Como se muestra en C y D de la Figura 10A, BMP-7 mantuvo la localización intracelular de Na+/K+-ATPasa y ZO-1 en una membrana celular (membrana plasmática). La barra de escala muestra 100 pm. Como se muestra en E y F de la Figura 10A, la BMP-7 fue capaz de mantener las CEC en un fenotipo de tipo de inhibición de contacto de forma poligonal, asociado a la expresión positiva de un marcador asociado a la función, a una concentración de 1.000 ng/ml. Tenga en cuenta que el control no se ha añadido. En lo que respecta a las células positivas a la Na+/K+-ATPasa y a las células positivas a la ZO-1, la proporción aumentó significativamente en comparación con el control cuando se trató con BMP-7. *P<0,01, **P<0,05.

Se demostró que el uso de BMP-7 suprime el cambio de manera fibroblástica y mantiene la función de las células endoteliales.

Los inventores examinaron si la proteína morfogénica ósea 7 (BMP-7) podía inhibir el cambio precedente de la HCEC. La HCEC de tipo fibroblasto fue tratada con BMP-7 en un intervalo de concentración de 10 ng/ml a 1.000 ng/ml. Es importante destacar que la forma celular alargada del fenotipo tipo fibroblasto se convirtió en una forma celular poligonal en respuesta en presencia de BMP-7, de manera dependiente de la concentración (A en la Figura 10A). Una forma celular hexagonal se ha hecho posible, y el mantenimiento de la distribución del citoesqueleto a la superficie celular de actina se ha hecho posible por BMP-7 (B en la Figura 10A). Este es un estado similar al observado con un CEC normal (Barry PA, Petroll WM, Andrews PM, Cavanagh HD, Jester JV. La organización espacial de las proteínas del citoesqueleto endotelial corneal y su relación con el complejo de unión apical. Investigative ophthalmology & visual science. 1995; 36:1115-24). También se mantuvo la localización intracelular de las células positivas a la Na+/K+-ATPasa (C en la Figura 10A) y de las células positivas a la ZO-1 (D en la Figura 10A) en una membrana celular. Así, se indicó que la BMP-7 era capaz de mantener las CEC en forma poligonal y de mantener el fenotipo debido a la inhibición del contacto acompañada de la expresión positiva del marcador asociado a la función, a una concentración de 1.000 ng/ml (E y F de la Figura 10A). Esta tendencia se observó a los 10 ng/ml, y la tendencia aumentó a los 100 ng/ml, y la tendencia fue más significativa a los 1.000 ng/ml.

(Ejemplo 7: Confirmación de efectos adicionales)

En el presente Ejemplo, se indica que en la señalización del TGF-p, el SB203580, que también es un inhibidor de la p38 MAPK, debe utilizarse con el SB431542, mejorando así la normalización del cultivo. Los detalles se proporcionarán más adelante.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que se utilizaron en los Ejemplos comparativos y los Ejemplos anteriores y se sometieron a cultivo y similares de manera similar a los Ejemplos comparativos y los Ejemplos.

Las células endoteliales de la córnea se exfoliaron mecánicamente junto con las membranas basales de las córneas de investigación adquiridas en el banco de Seattle, seguido de la exfoliación de las membranas basales utilizando colagenasa para su recolección, y luego el cultivo primario. Para el medio de cultivo con respecto a los humanos, Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Líquido (número de catálogo de INVITROGEN: 31985-070) 8 % FBS (BIOWe St , número de catálogo: S1820-500) 200 mg/ml CaC^2H2O (número de catálogo SIGMA: C7902-500G) ácido condroitín sulfúrico al 0,08 % (número de catálogo SIGMA: C9819-5G) 20 pg/ml de ácido ascórbico (número de catálogo de SIGMA: A4544-25G) 50 pg/ml de gentamicina (número de catálogo de INVITROGEN: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (número de catálogo INVITROGEN : PHG0311), que fueron acondicionadas para las células alimentadoras 3T3, se utilizaron como medio de cultivo base. Además, el cultivo se realizó utilizando un medio de cultivo base con SB431542 (1pmol/l, TOCRIS, número de catálogo: 1614), con SB203580 (1pmol/l, CALBIOCHEM, número de catálogo: 559389), y con SB431542 (1pmol/l) y SB203580 (1 pmol/l) añadidos al mismo.

Las células endoteliales de la córnea humana recolectadas se dividieron en dos, un grupo de ellas se cultivó con el medio de cultivo base como control, y el otro grupo de ellas se cultivó con un medio de cultivo base con SB431542 (TOCRIS) añadido al mismo de manera que la concentración final fuera de 1 pmol/l.

(Resultado)

Como se muestra en la Figura 11, en la señalización de TGF-p, se utilizó SB203580, que también es un inhibidor de p38 MAPK, junto con SB431542, y se demostró que la normalización del cultivo mejoraba; y además, al añadir SB203580, que es un inhibidor contra p38 MAPK que se sabe que se activa debido al envejecimiento, se aumentó la densidad del endotelio corneal (se sabe que la densidad disminuye debido al envejecimiento). En base a este hecho, se entiende que el efecto se ve potenciado por la adición de SB203580 que suprime aún más el envejecimiento (manteniendo un estado indiferenciado). Como tal, se ha descubierto que mediante la inhibición de la señal TGF-p además de la inhibición de la p38 MAPK, incluso si las células endoteliales de la córnea humana repiten el subcultivo, se hace posible el cultivo de células endoteliales de la córnea humana (HCEC) que conservan su forma con alta densidad, y se mejora aún más la normalización del cultivo (lo que indica que se pueden producir HCEC que conservan su forma con alta densidad incluso si se repite el subcultivo).

La Literatura no de Patente 7 describe que los medios de cultivo convencionales para las células endoteliales de la córnea no son capaces de permitir el crecimiento de las células manteniendo el estado normal en el subcultivo. Además, las literaturas no de Patente 8 a 11 describen un medio de cultivo que incluye FBS, EGF yNGF, un medio de cultivo con b-FGF utilizado para ello, un medio de cultivo con colagenasa utilizado para ello, y un medio de cultivo con un medio de cultivo condicionado utilizado para ello, respectivamente. Sin embargo, tal como se indica en la literatura no relacionada con la patente 7 y en los ejemplos comparativos, ninguno de los medios de cultivo es capaz de cultivar células endoteliales de la córnea manteniendo las funciones celulares normales. Si se evalúa el efecto del medio de cultivo o del agente normalizador de cultivos según la presente invención en referencia a este documento, se entiende que el medio de cultivo o el agente normalizador de cultivos tiene una capacidad de mantenimiento de la normalización significativamente mayor en comparación con los medios de cultivo de la técnica anterior.

(Ejemplo 8: Establecimiento de un procedimiento de cultivo preferente)

Sobre la base de los resultados de los Ejemplos mencionados y similares, se intentó establecer un procedimiento de cultivo preferible para una célula endotelial corneal humana. Los detalles se proporcionarán más adelante.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que se utilizaron en los Ejemplos comparativos y los Ejemplos anteriores y se sometieron a cultivo y similares de manera similar a los Ejemplos comparativos y los Ejemplos.

Las células endoteliales de la córnea se exfoliaron mecánicamente junto con las membranas basales de las córneas de investigación adquiridas en el banco de Seattle, seguido de la exfoliación de las membranas basales utilizando colagenasa para su recoleccón, y luego el cultivo primario. Para el medio de cultivo con respecto a los humanos, Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Líquido (número de catálogo de INVITROGEN: 31985-070) 8 % FBS (BIOWe St , número de catálogo: S1820-500) 200 mg/ml CaC^2H2O (número de catálogo SIGMA: C7902-500G) ácido condroitín sulfúrico al 0,08 % (número de catálogo SIGMA: C9819-5G) 20 pg/ml de ácido ascórbico (número de catálogo de SIGMA: A4544-25G) 50 pg/ml de gentamicina (número de catálogo de INVITROGEN: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (número de catálogo INVITROGEN : PHG0311), que fueron acondicionadas para las células alimentadoras 3T3, se utilizaron para el cultivo como medio de cultivo base, con la adición al mismo de SB431542 (1 pmol/l) y SB203580 (1 pmol/l).

El protocolo se ejemplifica en la Figura 12. Los detalles son los siguientes.

(Procedimiento de cultivo 1)

En el cultivo primario y en el subcultivo, se añadió un inhibidor de la Rho quinasa que tiene una acción promotora de la adhesión, Y-27632 (WAKO o TOCRIS), durante 48 horas con una concentración final de 10 pmol/l.

(Procedimiento de cultivo 2)

Un inhibidor de Rho quinasa, Y-27632 (WAKO, número de catálogo: 253-00513), con una concentración final de 10 pmol/l se añadió en todo momento durante el cultivo.

(Procedimiento de cultivo 3)

Sin añadir Y-27632, el cultivo se realizó con SB431542 (1 pmol/l) y SB203580 (1 pmol/l) añadidos como medio de cultivo base.

(Resultado)

La Figura 13 muestra un ejemplo de cultivo de células endoteliales de la córnea humana que se ha establecido en última instancia. Como se muestra en la Figura del sujeto y en la Figura 12, se confirmó que cualquiera de los procedimientos de cultivo 1 a 3 hizo crecer células endoteliales corneales humanas, con alta densidad, como células que indican un estado normal de una capa de forma poligonal manteniendo las funciones normales de la misma, y se pudo establecer un ejemplo de procedimiento de cultivo estándar.

(Ejemplo 9: Ejemplo de trasplante de endotelio corneal humano cultivado)

Se describirá un resultado, en el que las células endoteliales corneales humanas cultivadas utilizando el procedimiento de cultivo 3, entre los procedimientos de cultivo establecidos en el Ejemplo 8, se trasplantaron a un modelo de fallo endotelial corneal (modelo de queratopatía bullosa) utilizando un primate, el mono cynomolgus. Se indica que las células endoteliales de la córnea humana, que fueron cultivadas junto con un inhibidor de ROCK que tiene una acción promotora de la adhesión, fueron trasplantadas y se logró la curación de la transparencia en la córnea. Esto indica que las células endoteliales corneales humanas cultivadas en la presente invención también ejercen una función normal en un cuerpo vivo y pueden aplicarse para la medicina regenerativa.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que se utilizaron en los Ejemplos comparativos y los Ejemplos anteriores y se sometieron a cultivo y similares de manera similar a los Ejemplos comparativos y los Ejemplos.

*Mono Cynomolgus: después de realizar una revisión ética en el Centro de Investigación de Ciencias de la Vida Animal de la Universidad de Ciencias Médicas de Shiga, se realizaron los siguientes exámenes desde el punto de vista de la protección de los animales en la medida de lo posible.

Bajo anestesia general, se corta la porción periférica de una córnea de un mono cynomolgus en 1,5 mm, y se inserta un instrumento quirúrgico de silicona en una cámara anterior para curar mecánicamente una célula endotelial de la córnea, creando así un modelo de queratopatía bullosa. A continuación, de las células endoteliales de la córnea humana cultivadas por el procedimiento según la presente invención ex vivo, se suspendieron 2,0*105 en un medio de cultivo basal, y se añadió un inhibidor de ROCK que tiene un efecto promotor de la adhesión, el Y-27632, de forma que la concentración final fuera de 100 jmol/l, seguido de la introducción en la cámara anterior. Como control, se introdujeron 2,0*105 células endoteliales corneales humanas, suspendidas en un medio de cultivo basal, sin un inhibidor de ROCK. Después de la introducción, el modelo se mantuvo con la cabeza hacia abajo durante tres horas para que el globo ocular estuviera hacia abajo, promoviendo así la adhesión celular a la superficie del endotelio corneal. Los efectos terapéuticos de la queratopatía bullosa mediante el trasplante de una lámina de endotelio corneal cultivada se evaluaron mediante la evaluación de la transparencia de la córnea a través de un microscopio de lámpara de hendidura, y la medición del grosor de la córnea mediante un taquímetro ultrasónico (Figura 14). Como se muestra en la Figura l4 , en un modelo de fracaso endotelial corneal de primates, las células cultivadas por el procedimiento según la presente invención demostraron un resultado terapéutico favorable por las células solas, y el resultado terapéutico mejoró adicionalmente después de añadir el inhibidor de ROCK.

Al modelo se le aplicó la eutanasia 2,5 meses después, y se extrajeron las córneas y se fijaron los tejidos. A continuación, de forma similar al Ejemplo 2, se realizó una inmunotinción dirigida a la faloidina, la Na+/K+-ATPasa y la ZO-1, seguida de la toma de imágenes con un microscopio de fluorescencia (Figura 15). Los resultados se muestran en la Figura 15. Como también se muestra en la Figura 15, en el modelo de fracaso endotelial corneal de primates, las células cultivadas por el procedimiento según la presente invención demostraron un resultado terapéutico favorable por las células solas, y el resultado terapéutico mejoró aún más después de añadir el inhibidor de ROCK. En particular, por primera vez con sujetos humanos, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento que mantiene una función normal del endotelio corneal, lo cual no se había logrado antes.

(Ejemplo 10: Ejemplo con el anticuerpo de neutralización anti-TGF-P)

En el presente Ejemplo, se confirmó si la normalización del cultivo se lograría o no de manera similar con un anticuerpo de neutralización anti-TGF-p. Salvo el intercambio de agentes, el experimento se llevó a cabo de acuerdo con los Ejemplos comparativos y los Ejemplos mencionados anteriormente.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que se utilizaron en los Ejemplos comparativos y los Ejemplos anteriores y se sometieron a cultivo y similares de manera similar a los Ejemplos comparativos y los Ejemplos.

*Anticuerpo de neutralización anti-TGF-p: se utilizaron los disponibles en R&D SYSTEMS (número de catálogo: MAB240).

*Procedimiento de cultivo: las células endoteliales de la córnea humana se cultivaron utilizando un procedimiento similar al que demostró el resultado de la Figura 3 (véase el ejemplo comparativo 3 y similares). A continuación, se realizó el subcultivo con tripsina. Se compararon las células cultivadas en Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Líquido (número de catálogo de INVITROGEN: 31985-070) 8 % de suero fetal bovino (FBS) (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) 200 mg/ml CaC^2H2O (número de catálogo SIGMA: C7902-500G) ácido condroitín sulfúrico al 0,08 % (número de catálogo SIg Ma : C9819-5G) 20 |jg de ácido ascórbico (número de catálogo de SIGMA: A4544-25G) 50 jg/m l de gentamicina (número de catálogo de INVITROGEN: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (número de catálogo de INVITROGEN: PHG0311) como medio de cultivo normal, y células cultivadas en el citado medio de cultivo con anticuerpos de neutralización del TGF-p (500 ng/ml) añadidos al mismo.

*En una observación de forma a través de un microscopio en contraste de fase, como se muestra en la Figura 16, se produjo la transformación y se perdió la forma de una célula poligonal, y se reconocieron muchas células con diferencia de tamaño en el medio de cultivo normal, mientras que se mantuvo una capa de células poligonales con alta densidad en el medio de cultivo con anticuerpos de neutralización del TGF-p. De conformidad con la CEC de primates, cuando se cultivó la CEC junto con un inhibidor específico (SB431542) de un receptor del TGF-p, este inhibidor fue capaz de bloquear la forma de la célula para que no cambiara a un fenotipo similar al de los fibroblastos. De forma similar a la acción inhibidora del SB431542 de los fenotipos similares a los fibroblastos, el anticuerpo de neutralización (Figura 16B) del TGF-p también bloqueó la obtención de un fenotipo similar al de los fibroblastos por parte de las células.

Como tal, se utilizó el anticuerpo de neutralización anti-TGF-p, en lugar de SB431542 o BMP-7, para realizar una experimentación similar, confirmando así la normalización del cultivo.

También en el presente Ejemplo, al neutralizar el propio TGF-p, se indicó que, aunque se inhibiera la señalización del TGF-p, se suprimía la fibrosis y se conservaba la actividad de ZO-1 y de la Na+/K+-ATPasa. De este modo, se demostró que incluso si se realiza un subcultivo, las células pueden crecer manteniendo la actividad de "normalización".

(Ejemplo 11: Ejemplo de normalización del cu ltivo del endotelio corneal mediante otro procedimiento)

En el presente Ejemplo, se demostró que las señales de TGF-p se inhibirían mediante el uso de un inhibidor de Smad3, como procedimiento distinto al SB431542 utilizado en el Ejemplo mencionado, para suprimir la transformación de un endotelio corneal humano. Los detalles se proporcionarán más adelante.

(Material y procedimiento)

Entre los materiales utilizados en lo sucesivo, se obtuvieron los mismos materiales que se utilizaron en los Ejemplos comparativos y los Ejemplos anteriores y se sometieron a cultivo y similares de manera similar a los Ejemplos comparativos y los Ejemplos.

*Inhibidor de Smad3: 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona (número de catálogo: 566405) disponible en Calbiochem. El inhibidor de Smad3 también está disponible en Merck Millipore.

*Procedimiento de cultivo: las células endoteliales de la córnea humana se cultivaron utilizando un procedimiento similar al que demostró el resultado de la Figura 3 (véase el ejemplo comparativo 3 y similares). A continuación, se realizó el subcultivo con tripsina. Se compararon las células cultivadas en Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Líquido (número de catálogo de INVITROGEN: 31985-070) 8 % de suero fetal bovino (FBS) (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) 200 mg/ml CaC^2H2O (número de catálogo SIGMA: C7902-500G) ácido condroitín sulfúrico al 0,08 % (número de catálogo SIg Ma : C9819-5G) 20 |jg de ácido ascórbico (número de catálogo de SIGMA: A4544-25G) 50 jg/m l de gentamicina (número de catálogo de INVITROGEN: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (número de catálogo de INVITROGEN: PHG0311) como medio de cultivo normal, y células cultivadas en el medio de cultivo antes mencionado con el inhibidor de Smad3 (0,3mM y 3mM) añadido al mismo.

La Figura 17 muestra el resultado, en una observación de forma a través de un microscopio en contraste de fase, las células se transformaron y perdieron la forma de una célula poligonal y muchas células fueron reconocidas por tener diferencia de tamaño en el medio de cultivo normal, mientras que una capa de células poligonales con alta densidad se mantuvo tanto con 0,3 mM como con 3 mM en el medio de cultivo con inhibidor de Smad3. Específicamente, de conformidad con la CEC de primates, cuando se cultivó la CEC junto con un inhibidor específico (SB431542) del receptor del TGF-p, este inhibidor fue capaz de bloquear la forma de la célula para que no cambiara a un fenotipo similar al de los fibroblastos. De forma similar a la acción inhibidora del SB431542 de los fenotipos similares a los fibroblastos, el inhibidor de Smad3 (Figura 17) también bloqueó que las células obtuvieran un fenotipo similar a los fibroblastos.

(Consideración)

La disfunción endotelial de la córnea asociada a una deficiencia visual es una indicación importante de las operaciones de trasplante de córnea [Darlington JK, et al. (2006) Ophthalmology 113: 2171-2175], [Price MO, et al. (2010) Clin Experiment Ophthalmol 38: 128-140]. Aunque el trasplante de córnea se realiza ampliamente para la disfunción endotelial de la córnea, los investigadores están buscando actualmente un procedimiento alternativo para recuperar un endotelio corneal sano. Como el endotelio corneal se cultiva a partir de un donante joven para ser almacenado como "célula maestra", se hace posible el trasplante de una célula con alta capacidad funcional. Además, el trasplante adoptivo HLA para reducir el riesgo de rechazo [Khaireddin R, et al. (2003) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 241: 1020-1028], [Coster DJ, et al. (2005) Am J Ophthalmol 140: 1112-1122] se hace posible. La biónica tisular es un nuevo enfoque para desarrollar un tratamiento para los pacientes que han perdido la vista [Engelmann K, et al. (2004) Exp Eye Res 78: 573-578]. Hasta la fecha, existen dos procedimientos que utilizan un enfoque biónico: 1) uso de un cultivo de HCEC donante adherido a una construcción biónica [Ishino Y, et al. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci 45: 800-806], [Mimura T, et al. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci 45: 2992-2997], [Koizumi N, et al. (2007) Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 4519-4526], [Koizumi N, et al. (2012) Exp Eye Res 95: 60-67], y 2) el trasplante de HCe C cultivadas en una cámara ocular anterior [Okumura N, et al. (2012) Am J Pathol 181: 268-277], [Mimura T, et al. (2003) Exp Eye Res 76: 745­ 751], [Mimura T, et al. (2005) Invest Ophthalmol Vis Sci 46: 3128-3135], [Patel SV, et al. (2009) Invest Ophthalmol Vis Sci 50: 2123-2131]. Independientemente de la aplicación de cualquiera de los dos procedimientos en función de las situaciones clínicas, el establecimiento de una técnica de cultivo eficaz para los HCEH es imperativo e inevitable [Peh GS, et al. (2011) Transplantation 91: 811-819]. Muchos investigadores admiten que es extremadamente difícil establecer el cultivo permanente y a largo plazo de HCEC [Engelmann K, et al. (2004) Exp Eye Res 78: 573-578]. Aunque varios grupos han informado del éxito del cultivo de HCEC, el aislamiento y los procedimientos asociados con el protocolo de cultivo posterior varían enormemente entre los laboratorios de investigación [Peh GS, et al. (2011) Transplantation 91: 811-819]. Uno de los problemas más difíciles es que la HCEC es escandalosamente susceptible de sufrir cambios similares a los de los fibroblastos en cada subcultivo [Engelmann K, et al. (2004) Exp Eye Res 78: 573-578]. Por lo tanto, es esencial encontrar un medio para evitar la transición voluntaria de la CEC con el fin de mantener el fenotipo fisiológico para su posterior uso con fines de trasplante.

La transición de una célula endotelial a una célula similar a un fibroblasto se denomina transición endotelialmesenquimal. Dicha transición es inducida por el TGF-p a través de la vía Smad2/3 [Saika S (2006) Lab Invest 86: 106-115]. La transición endotelial-mesenquimal provoca la pérdida de una capa única de tipo de inhibición de contacto, y la pérdida de la proteína de unión apical en una membrana plasmática y otra pérdida del fenotipo endotelial característico. Además, esto provoca la inducción de proteínas fibrosas, como el colágeno de tipo 1 y la fibronectina. En la presente investigación, los inventores demostraron que el fenotipo similar al de los fibroblastos de las CEC cultivadas perdía en gran medida las características endoteliales; la expresión de la Na+/K+-ATPasa y de la ZO-1 disminuía significativamente, y la localización intracelular de las mismas se encontraba, no en la verdadera membrana celular, sino en el citosol. Además, el fenotipo similar al de los fibroblastos aumenta significativamente la producción, no del fenotipo de la membrana basal (colágeno tipo IV y tipo VIII), sino de la proteína ECM fibrosa (colágeno tipo 1, fibronectina e integrina a5). La presencia de una célula tan indeseable impedirá en gran medida el éxito del trasplante de células cultivadas en una circunstancia clínica. Por lo tanto, es importante determinar qué causa el cambio de fenotipos y cómo interfiere dicho proceso de transición endotelial-mesenquimal de las CEC cultivadas. Basándose en el hecho de que la fosforilación de Smad2/3 aumenta en gran medida en el fenotipo similar al de los fibroblastos, los inventores han concluido que el fenotipo similar al de los fibroblastos está mediado por la señalización del TGF-p en la CEC tanto de los primates como de los humanos. Así, los inventores utilizaron un inhibidor específico (SB431542) de un receptor del TGF-p para bloquear el proceso de transición endotelial-mesenquimal observado en el fenotipo similar al fibroblasto [Inman GJ, et al. (2002) Mol Pharmacol 62: 65-74]. El SB431542 anula completamente un cambio indeseable de las células; y cuando el cultivo de CEC de primates o humanas fue tratado con SB431542, el cambio inevitable de las células a un fenotipo similar al de los fibroblastos fue completamente anulado. Al mismo tiempo, la posición intracelular característica de ZO-1 y Na+/K+-ATPasa volvió a la membrana plasmática, y, la expresión de estas dos proteínas se incrementó en gran medida en ambos niveles de ARNm y proteína, lo que sugiere que las funciones de barrera y bombeo están intactas en dicho cultivo. Además, los inventores también encontraron que la producción de proteína ECM fibrosa disminuía considerablemente. Los inventores examinaron además una acción de reversión del fenotipo similar al de los fibroblastos de las HCEC mediante un factor antiEMT bien conocido, la BMP-7 [Zeisberg M, et al. (2003) Nat Med 9: 964-968], [Zeisberg M, et al. (2007) J Biol Chem 282: 23337-23347]. La BMP-7 también invirtió el fenotipo similar al de los fibroblastos para convertirlo en una célula endotelial corneal normal con una adhesión endotelial característica de una sola capa. En resumen, tanto el SB431542 como la BMP-7 pueden ser una poderosa herramienta para mantener un fenotipo endotelial normal de las CEC cultivadas, que por tanto conducen al éxito en el trasplante posterior.

Como conclusión, los hallazgos de los Inventores indicaron que el uso del inhibidor (SB431542) del receptor TGF-p y/o de la molécula anti-EMT (BMP-7) hizo posible el crecimiento de las HCEC manteniendo las funciones fisiológicas normales (es decir, las funciones de barrera y de bombeo). Aunque una investigación más profunda y futura es beneficiosa, los inventores no han visto ningún efecto claro y perjudicial en los tratamientos consecutivos con SB431542 o BMP-7, en lo que respecta a las formas o funciones, incluso después de varios pases. Se puede demostrar que la presente investigación consiste en proporcionar un protocolo relacionado con un procedimiento de cultivo eficaz ex vivo de HCEC para ser utilizado en la medicina regenerativa. Además, esta nueva estrategia de inhibición del cambio de tipo fibroblasto durante el cultivo puede, en última instancia, proporcionar a los clínicos una nueva modalidad de tratamiento en medicina regenerativa, no sólo para el tratamiento de la disfunción endotelial corneal, sino también para varios tipos de enfermedades patológicas en general.

(Ejemplo 12: Ejemplo con otros inhibidores)

En el presente Ejemplo, se confirma si la normalización del cultivo se logra o no de manera similar con otros agentes inhibidores de la señal de TGF-p. Salvo el intercambio de agentes, el experimento puede llevarse a cabo de acuerdo con los Ejemplos mencionados.

(Material y procedimiento)

*A83-01 (disponible en TOCRIS o Miltenyi Biotec): A83-01 es una sustancia inhibidora selectiva del receptor de TGF-b tipo I ALK5, del receptor de Activina/Nodal ALK4 y del receptor de Nodal ALK7. *

*Inhibidor Stemolecule™ ALK5 (disponible en Miltenyi Biotec): se trata de una sustancia inhibidora selectiva y competitiva por ATP de un receptor de TGF-b de tipo I, la quinasa smiliar al receptor de activina (ALK5).

*LDN-193189 (disponible en Miltenyi Biotec): esto inhibe los receptores BMP tipo I ALK2 y ALK3.

*ARNip de Smad (sintetizado con un procedimiento estándar)

Los materiales anteriores se utilizaron en lugar de SB431542 o BMP-7, que se utilizaron en los Ejemplos mencionados, para realizar un experimento similar, confirmando la normalización del cultivo.

También en el presente Ejemplo, se indicó que cualquiera de los agentes inhibidores de la señal TGF-p suprimió la fibrosis y conservó la actividad de ZO-1 y Na+/K+-ATPasa; y se demuestra que incluso si se realiza el subcultivo, las células pueden crecer mientras se mantiene la actividad de "normalización".

(Ejemplo 12: Formulación ejemplar: solución de cultivo para preparar láminas de endotelio corneal) En el presente Ejemplo, como formulación ejemplar, una solución de cultivo para preparar la lámina de endotelio corneal, que contiene el agente normalizador de cultivo según la presente invención, se fabrica como sigue.

Utilizando un procedimiento común, se prepara la solución de cultivo indicada a continuación.

SB431542 3,8439 mg

SB203580 3,7743 mg

FBS 10 ml

solución de penicilina-estreptomicina 1 ml

FGF básico 200 ng

Cantidad adecuada de DMEM

cantidad total 100 ml

El FBS está disponible, por ejemplo, en BIOWEST (número de catálogo: S1820-500) o Invitrogen. La solución de penicilina-estreptomicina está disponible en Nacalai Tesque (contiene 5.000 u/ml de penicilina y 5.000 pg/ml de estreptomicina). FGF básico está disponible, por ejemplo, en Invitrogen (INVITROGEN, número de catálogo: 13256-029). SB431542 está disponible en TOCRIS. SB203580 está disponible en CALBIOCHEM. DMEM está disponible en Invitrogen.

(Ejemplo 13: Formulación ejemplar: solución de conservación de la córnea que contiene un agente normalizador del cultivo)

En el presente Ejemplo, como formulación ejemplar, una solución de preservación de la córnea que contiene el agente normalizador del cultivo según la presente invención se fabrica como sigue.

La solución de conservación indicada a continuación se prepara mediante un procedimiento común.

SB431542 3,8439 mg

SB203580 3,7743 mg

Optisol-GS (Bausch-Lomb) cantidad adecuada

cantidad total 100 ml

Los ingredientes respectivos están disponibles de manera similar a la descrita en el Ejemplo 12.

(Ejemplo 14: Creación de una lámina de células endoteliales corneales cultivadas con fines de trasplante) En el presente Ejemplo, se utilizan células endoteliales de córnea de conejo preparadas mediante la técnica establecida en el Ejemplo 8 o un procedimiento equivalente del mismo. Además, en el presente Ejemplo, se utiliza un inhibidor de la Rho quinasa o una sustancia de control como agente promotor de la adhesión celular preparado mediante un procedimiento similar al del Ejemplo 9.

Durante la creación de la lámina de células endoteliales corneales cultivadas para el trasplante, se añade un inhibidor de Rho quinasa, por ejemplo, Y-27632, y se realiza una tinción de fluorescencia de células inmunes utilizando una técnica similar a la de los Ejemplos mencionados anteriormente, en ZO-1 y Na+/K+ATPasa, que son proteínas funcionales de las células endoteliales corneales, para confirmar la expresión.

Se fija una lámina de endotelio corneal con etanol al 95 % (-30°C) durante 10 minutos. Tras el lavado con PBS, la lámina de endotelio corneal se trata con TritonX-100/PBS al 0,5 % durante 5 minutos. A continuación, se realiza un tratamiento con BSA/PBS al 1 % durante 1 hora. A continuación, los anticuerpos anti-ZO-1 o los anticuerpos anti-Na+/K+ATPasa se tratan durante la noche. Tras el lavado con PBS, se tratan los anticuerpos secundarios marcados con Alexa-488 durante 1 hora. Tras el lavado con PBS, se añade gota a gota el agente de montaje que contiene DAPI, y a continuación se encapsula con un cubreobjetos. Se toman fotografías con un microscopio de fluorescencia para confirmar la expresión de ZO-1 y Na+/K+ ATPasa.

(Ejemplo 15: Preparación ejemplar de un agente de impregnación) Preparación ejemplar de una loción para los ojos

La composición se muestra para las sustancias de prueba de las concentraciones respectivas, como sigue.

Y-27632 (WAKO, número de catálogo: 253-00513) u otros inhibidores de la Rho-quinasa 0,003g, 0,01g, 0,03g, 0,05g o 0,1g (dosis como cuerpo de deshidrocloración)

cloruro de sodio 0,85 g

dihidrogenofosfato de sodio dihidratado 0,1 g

cloruro de benzalconio 0,005 g

hidróxido de sodio cantidad adecuada

agua purificada cantidad adecuada

La loción ocular puede diluirse con una base.

La composición de la base es la siguiente.

cloruro de sodio 0,85 g

dihidrogenofosfato de sodio dihidratado 0,1 g

cloruro de benzalconio 0,005 g

hidróxido de sodio cantidad adecuada

agua purificada cantidad adecuada

cantidad total 100 mg (pH 7,0)

[Aplicabilidad industrial]

La presente invención proporciona un procedimiento para el cultivo normalizado de células endoteliales de la córnea, y proporciona una técnica que puede ser utilizada en una industria (como la industria de cultivo de células y la industria farmacéutica) involucrada en las técnicas relacionadas con el trasplante de córnea.

[Lista de secuencias de texto libre]

SEQ ID NO: 1: cebador directo de la Na+/K+-ATPasa; CTTCCTCCGCATTTATGCTCATTCTCACCC SEQ ID NO: 2: cebador inverso de la Na+/K+-ATPasa; GGATGATCATAAACTTAGCCTTGATGAACTC SEQ ID NO: 3: cebador directo de ZO-1; GGACGAGGCATCATCCCTAA

SEQ ID NO: 4: cebador inverso de ZO-1; CCAGCTTCTCGAAGAACCAC

SEQ ID NO: 5: cebador directo de GAPDH: GAGTCAACGGTGGTCGT

SEQ ID NO: 6: cebador inverso de GAPDH: TTGATTTTGGAGGGATCTCG

SEQ ID NO: 7: cebador directo del colágeno 1: TCGGCGAGAGCATGACCGATGGAT

SEQ ID NO: 8: cebador inverso del colágeno 1: GACGCTGTAGGT GAAGCGGCTGTT

SEQ ID NO: 9: cebador directo del colágeno 4: AGCAAGGTGTTACAGGATTGGT

SEQ ID NO: 10: cebador inverso del colágeno 4: AGAAGGACACTGTGGGTCATCT

SEQ ID NO: 11: cebador directo del colágeno 8: ATGTGATGGCTGTGCTGCTGCCT

SEQ ID NO: 12: cebador inverso del colágeno 8: CTCTTGGGCCAGGCTCCA

SEQ ID NO: 13: cebador directo de la fibronectina: AGATGAGTGGGAACGAATGTCT

SEQ ID NO: 14: cebador inverso de la fibronectina: GAGGGTCACTGAATTCTCC

SEQ ID NO: 15: cebador directo de la integrina a5: TCCTCAGCAAGAATCTCAACAA

SEQ ID NO: 16: cebador inverso de la integrina a5: GTTGAGTCCCGTAACTGGTC

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Uso de un inhibidor de la fibrosis para la normalización del cultivo de células endoteliales de la córnea, en el que dicho inhibidor de la fibrosis comprende un agente inhibidor de la señal del factor de crecimiento por transformación (TGF) p.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicha normalización del cultivo comprende que una función celular sea normal, siendo la función celular seleccionada del grupo que consiste en ZO-1 y Na+/K+-ATPasa.

3. El uso según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha normalización del cultivo es para fabricar una célula para trasplante que se adapte al trasplante de córnea.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que dicha célula para el trasplante es una célula de un primate, preferentemente humano.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho agente inhibidor de la señal TGF-p es un antagonista de un TGF-p, un antagonista de un receptor de TGF-p o un inhibidor de Smad3.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho agente inhibidor de la señal del TGF-p comprende al menos uno de 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida (SB431542), BMP-7, anticuerpo anti-TGF-p, anticuerpo del receptor anti-TGF-p, ARNip de un TGF-p, ARNip de un receptor del TGF-p, un oligonucleótido en antisentido de un TGF-p, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona, 3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1 -carbotioamida (A83-01), 2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, 6-(4-(piperidin-1-il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidina (LDN-193189), 2-(5-cloro-2-fluorofenil)-4-[(4-piridinil)amino]pteridina (SD-208), 4-[3-(2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-quinolina (LY364947), una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, preferentemente 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida (SB431542) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

7. El uso según las reivindicaciones 1-6, en el que dicho inhibidor de la fibrosis comprende además un agente inhibidor de la p38 MAP quinasa, preferentemente 4-[4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-1H-imidazol-5-il]piridina (SB203580) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

8. El uso según la reivindicación 1, que comprende además 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida (SB431542) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y 4-[4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-1H-imidazol-5-il]piridina) (SB203580) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

9. El uso según la reivindicación 1, que comprende además un agente promotor de la adhesión celular, preferentemente (R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-ciclohexanocarboxamida (Y-27632) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que se permite que dicho inhibidor de la fibrosis esté presente en todo momento durante el cultivo de dicha célula endotelial corneal, mientras que se permite que dicho agente promotor de la adhesión esté presente durante un determinado periodo de tiempo, y luego se elimina una vez el agente promotor de la adhesión, y se permite de nuevo que el agente promotor de la adhesión celular esté presente durante un determinado periodo de tiempo.

11. El uso según la reivindicación 9, en el que se permite que tanto dicho inhibidor de la fibrosis como dicho agente promotor de la adhesión celular estén presentes en todo momento durante el cultivo de dicha célula endotelial corneal.

12. El uso según la reivindicación 3, en el que dicha célula para el trasplante es para la prevención o el tratamiento del daño endotelial corneal.

13. Uso de un medio de cultivo para la normalización del cultivo de células endoteliales de la córnea, comprendiendo dicho medio de cultivo el inhibidor de la fibrosis como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un ingrediente de cultivo del endotelio de la córnea.

14. Un procedimiento para la normalización del cultivo de células endoteliales de la córnea, que comprende el paso de cultivar una célula endotelial de la córnea utilizando el inhibidor de la fibrosis como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

15. Uso de una solución de preservación para preservar una célula endotelial corneal in vitro, comprendiendo dicha solución de preservación el inhibidor de la fibrosis como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

16. Un procedimiento para fabricar células endoteliales corneales adecuadas para tratar o prevenir una enfermedad, daño o condición endotelial corneal, preferentemente de un primate, más preferentemente de un humano, preferentemente queratopatía bullosa o endotelitis corneal, siendo la célula endotelial corneal preferentemente derivada de un primate, más preferentemente de un humano, siendo el procedimiento caracterizado porque comprende un paso de cultivo de células endoteliales corneales utilizando el inhibidor de la fibrosis para la normalización del cultivo celular como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que dichas células endoteliales de la córnea están en forma de lámina o de sustancia en suspensión.

18. El procedimiento según la reivindicación 16 o 17, que comprende además un agente promotor de la adhesión celular, preferentemente (R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-ciclohexanocarboxamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.