JP2000510112A - ＴＧＦ―β拮抗物質としてのプロラクチンの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、プロラクチンにより、ＴＧＦ−βが細胞に対して示す作用が阻止されることが明らかにされた発見に基づくものである。本発明の目的は、プロラクチンを含む薬理学的に受け入れられる組成物の有効量を投与することにより、ＴＧＦ−βの存在に関連した疾患または障害に罹患しているとみられる患者を治療するための方法を請求することである。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＧＦ−β拮抗物質としてのプロラクチンの使用方法 背景技術 トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）は、ある構造的特性および 機能的特性を共有するポリペプチド因子の一群のファミリーに属する（Ｍａｓｓ ａｇｕｅら、Ｃｅｌｌ、４９：４３７（１９８７））。他のメンバーとして、ア クチビン、インヒビン、ミュラー抑制物質（ＭＩＳ）、骨誘導因子（ＢＭＰ）お よびショウジョウバエにおいて発見されたデカペンタレージック遺伝子生成物（ ＤＰＰ−Ｃ）があげられる。 トランスフォーミング増殖因子−αは無関係のペプチドであり、上皮増殖因子 （ＥＧＦ）と高度の相同を共有し、同じ受容体を結合する（Ｔｏｄａｒｏら、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：２５８（１９８０））。 ＴＧＦ−βはマウス肉腫ウイルス形質転換細胞の生成物として発見された（Ｄ ｅｌａｒｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：４０ ００１（１９７８））。ＴＧＦ−βは、線維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞（Ｊａ ｋｏｗｌｅｗら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５０：３７７（１９９２ ））、星状膠細胞（ｄａ Ｃｈｕｈａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、３ ６：１５７（１９９２））、および上皮細胞（Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｔら、Ｍｏ ｌ．Ｃａｒｃｉｎ．、５：３２（１９９２））を含む多数の種類の細胞により生 成される。正常線維芽細胞のその足場非依存性増殖刺激能に従って命名されたＴ ＧＦ−βは、腫瘍誘発因子−１（ＴＩＦ−１）として同定されたヒトグリア細胞 腫（Ｉｗａｔａら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、４５：２６８９（１９８５））およ び２つの軟骨誘発因子（ＣＩＦ−ＡおよびＣＩＦ−Ｂ）が精製されているウシ骨 （Ｓｅｙｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：２ ２６７（１９８５））を含む他の源からも単離されている。配列情報により、Ｃ ＩＦ−ＡはＴＧＦ−β１と同一であるとともに、ＣＩＦ−Ｂは第２の同種型、Ｔ ＧＦ−β２を表すことが確定されている。ＴＧＦ−βは、ｄｉｃｉｄｕａｌ抑 制因子（ＤＳＦ）と同一であるとみられる（Ｌｅａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 １４８：７７８（１９９２））。 十分に規定されたＴＧＦ−βの同種型がいくつかあり、これらのジスフィルド 結合同種二量体はＴＧＦ−β１からＴＧＦ−β５までの数字で示される。異種二 量体、ＴＧＦ−β１．２がブタ血小板において同定されている。ＴＧＦ−ｂ１お よびＴＧＦ−β２は多くの細胞型において生成されるが、ＴＧＦ−β３は主に間 葉源の細胞により発現する（ＲｏｂｅｒｔｓとＳｐｏｒｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｐ．３３９ （１９９２）；Ｌｙｏｎｓ ａｎｄ Ｍｏｓｅｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．、１８７：４６７（１９９０）；Ｄｅｒｙｎｃｋら、ＥＭＢＯ Ｊ．、７：３ ７３７（１９８８）；およびＭａｓｓａｇｕｅ、Ａｎｎ．ＲｅＶ．Ｃｅｌｌ Ｂ ｉｏｌ．、６：５９７（１９９０））。同種型間のアミノ酸相同範囲は、７０％ （β１対β２）〜７９％（β２対β３）である。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２お よびＴＧＦ−β３同種型のそれぞれは各種間で９８％より大きいアミノ酸配列相 同を示す（Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９９０）；およびＫｏｎｄｉａｈら、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１０８９（１９９０））。ＴＧＦ−β４およびＴＧ Ｆ−β５の同種型の検出は、それぞれニワトリ胎仔軟骨細胞およびクセノプス胎 仔に限定されている（Ｈｕｍａｎ ＣｙｔｏｋｉｎｅｓのＲｏｂｅｒｔとＳｐｏ ｒｎ、（１９９２））。 ＴＧＦ−βの同種型は大型タンパク質前駆体として合成される。塩基性アミノ 酸残基部位でのタンパク質分解開裂により、Ｃ末端１１２−１１４アミノ酸から なる成熟単量体が生じる。生物学的に不活性な潜在性錯体が、成熟ＴＧＦ−β二 量体の非共有結合および非共有的に相互作用する２つのプロセグメントから形成 される（潜在性結合タンパク質、ＬＡＰ）（Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓの ＲｏｂｅｒｔとＳｐｏｒｎ、（１９９２）；ＬｙｏｎｓとＭｏｓｅｓ（１９９０ ））。 細胞源からの分泌の後には、必ず活性化が生じ、生物学的に活性の二量体型を 放出する。酸性化によりｉｎ ｖｉｖｏでＴＧＦ−β二量体が放出されるのに対 して、ｉｎ ｖｉｖｏ活性化が依然として調査の対象となっている。 生物学的に活性のＴＧＦ−β同種型はすべて２５ｋＤ二量体であり、これらは 還元条件下に１１．５〜１２．５ｋＤの単量体を生じる。ＴＧＦ−ｂ前駆体は３ 〜４個のＮ−グリコシル化部位を含むのに対して、成熟ＴＧＦ−β二量体を構成 する単量体には１個の部位も存在しない。成熟ＴＧＦ−βの単量体当たり９個の システインが存在する（Ｈｕｍａｎ ＣｙｔｏｋｉｎｅｓのＲｏｂｅｒｔとＳｐ ｏｒｎ、（１９９２））。ＴＧＦ−βのチョウ・ファスマン分析では、ヘリック 特性がきわめて小さい過剰なｂ−シート構造を示す（Ｇａｒｎｉｅｒら、Ｊ．Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１２０：９７（１９７８））。 多くのＴＧＦ−β受容体がＴＧＦ−β二量体の生物学的作用を媒介する。５つ のＴＧＦ−β受容体がÅＩ型（５３−６５ｋＤ）、ＩＩ型（８３−１１０ｋＤ） 、ＩＩＩ型（２５０−３１０ｋＤ）、ＩＶ型（６０ｋＤ）、およびＶ型（４００ ｋＤ）受容体として同定されている（Ｓｅｇａｒｉｎｉ、ＴＧＦ−βの臨床的応 用。Ｗｉｌｅｙ、ｐ．２９（１９９１）；Ｏ’Ｇｒａｄｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．、２６６：８５６３（１９９１）；Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ、６９ ：１０６７（１９９２）；およびＣｈｅｉｆｅｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．、２６３：１７２２５（１９８８））。Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶ型受容体は 、いくつかの腫瘍系を除き、検査したほとんどの細胞で共発現する。ＩＶ型受容 体は下垂体細胞でのみ同定されている（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ（１９８８））。ＴＧ Ｆ−βに対する細胞反応の喪失はＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体の喪失 と相関するため（Ｌａｉｈｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：９１０８ （１９９２））、これらはきわめて詳細に研究されている。 ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３の受容体の分化アフィニティ がそれぞれの受容体間に存在する。例えば、大多数のＩ型およびＩＩ型受容体は 、ＴＧＦ−β２よりも大きいアフィニティとＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３を 結合する（Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９９２））。しかし、多くの生物学的検定法に おいてＴＧＦ−β２はＴＧＦ−β１と効力が等しいため、結合アフィニティと生 物学的効力との間に直接的関係は認められない。同種型効力は、存在する受容体 型の組み合わせ、存在する各受容体型の数、および同等のアフィニティと３つの 同種型すべてを結合するＩ型およびＩＩ型受容体の存在を含む多くの因子と結合 する（Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９９２）；Ｃｈｅｉｆｅｔｚ（１９８８）；Ｌａｉ ｈｏ（１９９２）；およびＣｈｅｉｆｅｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２ ６５：２０５３３（１９９０））。 ＩＩ型受容体のクローニングにより、細胞質ドメインは機能的セリン／トレオ ニンキナーゼを含むことが明らかにされている（Ｌｉｎら、Ｃｅｌｌ、６８：７ ７５（１９９２））。ＩＩＩ型受容体のクローニングにより、ベータグリカン構 造はシグナルモチーフなしに短い細胞質ドメインを含むことが明らかにされてい る（Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ、６７：７９７（１９９１））。ＩＩＩ型受容体は余 剰ＴＧＦ−ｂの貯蔵所として、もしくはＩ型またはＩＩ型受容体のリガンド結合 能または表面発現の調節器として機能すると考えられる（Ｗａｎｇ（１９９１） ）。その他のＴＧＦ−β受容体のクローニングは、ＩＩ型受容体とのリン酸化の 同じパターンを共有するかどうかを決定する必要がある。ＴＧＦ−ｂシグナル機 序を洞察し得るその他の所見として以下の点があげられる。 １．Ｊｕｎ Ｂ、ｃ−ｆｏｓ、およびｃ−ｍｙｃ発現における変化の誘発（Ｏ ｈｔｓｕｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１２：２６１（１９９２）） ； ２．網膜芽腫タンパク質の細胞周期依存リン酸化の予防（Ｏｈｔｓｕｋｉ（１ ９９２））； ３．グアニンヌクレオチド結合タンパク質の包含（Ｄｉａｚ−Ｍｅｃｏら、Ｍ ｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２：３０２（１９９２））； ４．ホスファチジルイノシトール代謝回転（Ｓｅｇａｒｉｎｉ（１９９１）） ；および ５．細胞質から細胞膜へのタンパク質キナーゼＣの転移（Ｓｅｇａｒｉｎｉ（ １９９１））。 ＴＧＦ−βは抑制および刺激因子として機能する。ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ −β２はほんのわずかな例外を除いて同様の効果を発揮する（Ｈｕｍａｎ Ｃｙ ｔｏｋｉｎｅｓのＲｏｂｅｒｔとＳｐｏｒｎ、（１９９２）；Ｒｉｚｚｉｏ、Ｄ ｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１３０：４１１（１９８８）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．、１４８：２１０９（１９９２））。 刺激活性として以下の点があげられる。 １．線維芽細胞および骨芽細胞増殖の刺激； ２．線維芽細胞、骨芽細胞、および内皮細胞による基質タンパク質合成の強化 ； ３．単球によるサイトカイン生成の誘発 ４．線維芽細胞、単球および好中球化学走性の促進； ５．抗原特異的Ｔヘルパー細胞のｉｎ ｖｉｖｏ効果器機能および記憶表現型 の強化；および ６．Ｂ細胞からのＩｇＡ分泌の刺激。 抑制活性として以下の点があげられる。 １．リンパ球、内皮細胞、肝細胞、角化細胞およびある種の腫瘍細胞系の増殖 抑制； ２．Ｂ細胞からのＩｇＧおよびＩｇＭ分泌の抑制； ３．単球における呼吸バースト能の抑制； ４．ＩＬ−３依存造血前駆因子の抑制； ５．巨核球増殖の抑制； ６．副腎皮質およびライディッヒ細胞におけるステロイド生合成の抑制；およ び ７．脂肪細胞および筋芽細胞分化の抑制。 発生時の時間依存様式におけるＴＧＦ−β同種型の発現およびクセノプス発生 における中胚葉マーカ誘発能（Ｒｏｓａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：７８３（ １９８８））は、胚発生におけるＴＧＦ−βの役割を明らかにするものと考えら れる。血小板脱顆粒による創傷部位で放出されるＴＧＦ−βは、他の効果器細胞 の浸潤、タンパク質基質合成およびＴＧＦ−βと結合し、脈管形成を媒介する他 の因子の分泌、および創傷治癒に伴う線維症を誘発することが報告されている。 同じくＴＧＦ−βは軟骨形成を刺激し、骨折治癒を媒介すると考えられている。 ＴＧＦ−βは、各種形態の癌（Ｍａｃｉａｓら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ．、７：１２７１（１９８７）；Ｓｉｒａｉら、Ｊａｐａｎ Ｊ Ｃａｎｃｅ ｒ Ｒｅｓ．、８３：６７６（１９９２）；Ｒｅｅｄら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏ ｌｏｇｙ、１４５：９７（１９９４））のほか、癌患者の治療に使用される化学 療法や骨髄移植手術の合併症として発症すること場合が多い肝肺疾患（Ｋｏｎｇ ら、Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２２２：１５５（１９９５）；およびＭｕｒａｓｅら、 骨髄移植、１５：１７３（１９９４）；Ａｎｓｃｈｅｒら、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍ ｅｄ、３２８：１５９２（１９９３）と関連している。ＨＩＶ感染ドナーからの 抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴＧＦ−β分泌の増大についても報告されて いる（Ｋｅｋｏｗら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８７：１０１０（１９９１ ））。したがって、ＴＧＦ−βの拮抗薬がこうした形態の癌の治療において有効 であるとともに、ＴＧＦ−βにより引き起こされる数多くの作用の阻止に有効で あると考えられる。 発明の開示 本発明は、プロラクチンにより、ＴＧＦ−βが細胞に対して示す作用が阻止さ れることが明らかにされた発見に基づくものである。本発明の目的は、プロラク チンを含む薬理学的に受け入れられる組成物の有効量を投与することにより、Ｔ ＧＦ−βの存在に関連した疾患または障害に罹患しているとみられる患者を治療 するための方法を請求することである。 本発明の別の目的は、プロラクチンを含む組成物の有効量を投与することによ り、ＴＧＦ−βによる細胞増殖抑制を予防する方法を請求することである。 本発明の別の目的は、プロラクチンを含む組成物の有効量を投与することによ り、細胞増殖を強化する方法である。 図面の簡単な説明 図１ａは、ハイブリドーマクローン５Ｃ６に対するＴＧＦ−βの作用を示す図 である。 図１ｂは、ハイブリドーマクローン５Ｃ６に対するプロラクチンの効果を示す 図である。 図１ｃは、ハイブリドーマクローン５Ｃ６に対するＴＧＦ−βの作用を克服す るプロラクチンの能力を示す図である。 図２は、実施例２の結果を含む表である。 図３は、刺激ヒトＰＢＬに対するＴＧＦ−βの作用を克服するプロラクチンの 能力を示す図である。 発明の詳細な説明 本発明は、プロラクチンにより、ＴＧＦ−βが細胞に対して示す作用が阻止さ れることが明らかにされた発見に基づくものである。プロラクチンは、マウスハ イブリドーマ細胞およびヒト抹消血単核細胞の両方に対するＴＧＦ−βの抑制作 用を阻止することが発見された。 定義 本願中で用いられるように、「プロラクチン」は組織培養または組換え法や当 業者に周知のその他の方法により得られるポリペプチドを指し、このタンパク質 を特徴づける活性のスペクトルを示す。この語にはヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ ）のみならず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、ブタおよびウシプロ ラクチンなど他の哺乳類プロラクチンも含まれる。組換えＰＲＬ（ｒ−ＰＲＬ） が本願中では好ましい。 ｒ−ＰＲＬで示される「組換えプロラクチン」という語は、好ましくはヒトプ ロラクチンであり、当業者により周知の組換えＤＮＡ法で調製される天然プロラ クチンと同等の生物学的活性を有するプロラクチンを指す。一般に、プロラクチ ンの遺伝子コード化はその天然プラスミドから削除され、クローンされるクロー ニングベクターに移入され、さらに宿主生体を形質転換するために用いられる発 現ベクターに移入される。この宿主生体は外来遺伝子を発現し、発現条件下にプ ロラクチンを生成する。 本願中で用いられるように、「患者」という語は、その通常の意味、すなわち 疾患または障害に罹患し、その治療を受けている人を指す（ステッドマン医学辞 典、（１９８７））。 本願中で用いられるように、「疾患」という語は、その通常の意味、すなわち 病気、疾病、体の機能、構造、器官などの断絶、停止、または障害を指す（ステ ッドマン医学辞典、（１９８７））。 本願中で用いられるように、「障害」という語は、その通常の意味、すなわち 機能、構造、または両方の障害を指す（ステッドマン医学辞典、（１９８７）） 。 一般的方法 ＴＧＦ−βの作用を阻止するためのプロラクチンを含む調製液または組成物は 注射によりほとんど便利に投与されるが、他の投与方法も可能である。 標準調製液は液体注射剤または注射用の懸濁液または溶液として適切な液体に 取ることができる個体のいずれかである。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水 、デキストロース、グリセロール、エタノール等である。湿潤剤、緩衝液、また は乳剤など非毒性補助物質も添加することができる。 当業者により理解されるように、持続および継続放出調製液には相当の種類が あり、これらは本発明の方法に使用することができると思われる。 また、われわれはプロラクチンがＴＧＦ−βの作用を阻止できることを明らか にしているため、プロラクチン遺伝子の外因性投与により、ｉｎ ｖｉｖｏでプ ロラクチンが発現し、これで通常の手段によるか、遺伝子接種を介するかに関係 なくＴＧＦ−βを阻止する機能が得られるとみられる。プロラクチンの遺伝子配 列は（米国特許第４，７２５，５４９号）において開示されている。これはプロ ラクチンｃＤＮＡをＤＮＡ送達媒介体（例えば、プラスミドベクター、リポソー ム、ウイルスベクター）に移入することにより得ることができた。これは、Ｐｅ ｌｌｅｇｒｉｎｉ Ｉ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｇｙ、６、１０ ２３（１９９２）、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら、分子クローニング：実験マニュ アル、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９ ）およびＦｅｌｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８ ４、７４１３、（１９９１）。実施例 実施例１：ＴＧＦ−βおよびＰＲＬに対する用量反応 マウスハイブリドーマ細胞株（５Ｃ６を含む）を２５％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ）、４０％ＮＳＯ調整培地、１０％ＮＣＴＣ １０９（Ｇｉｂｃｏ）、１５％Ｆ ＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％ＩＴＳ（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８４）、０．０５ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ） 、１０％ＯＲＩＧＩＮ（Ｉｇｅｎ、Ｉｎｃ．）からなるハイブリドーマ増殖培地 （ＨＧＭ）において維持した。細胞は使用前に供給し、対数期増殖を確保した。 検定当日、細胞を１５ｍＬ三角管にピペットで取り、１０００ｒｐｍで８分間 遠心分離した。培地を細胞から吸引し、８８％ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ ）、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、０ ．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ Ｇｉｂｃｏ）からなる５ｍＬの検定培地で２回洗浄した。細胞を２ｍＬのＲＰＭ Ｉ−１６４０検定培地に再懸濁し、カウントし、検定培地で希釈して２ｘ１０⁵ 細胞／ｍＬとした。容量１００μＬの細胞を９６穴無菌組織培養プレートのウェ ルにピペットで取った。プレートを使用まで３７℃インキュベータに配置した。 組換えヒトプロラクチンの一連の希釈液（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ、ｌｏｔ ０２Ａ、８００μｇ／ｍＬ）およびＴＧＦ−ｂ（Ｇｅｎｚｙｍ ｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ｌｏｔ ９４Ｆ００３、９６μｇ／ｍＬ）を検定 培地において調製した。２５μｌの各試薬を適切なウェルに添加した。いずれの 場合にも、ＴＧＦ−βを最初に添加した。 細胞を３７℃／５％ＣＯ₂で７２時間インキュベートし、増殖の量をトリチウ ム標識チミジン取り込みにより測定した。トリチウム標識チミジン（０．５μＣ ｉ）を最後の１８時間添加した。ＴＯＭＥＣハーベスター９６を用いてグラスフ ァイバフィルタ上に細胞を回収後、シンチレーション計数器（１２０５ Ｂｅｔ ａｐｌａｔｅ ＬＳＣ、Ｗａｌｌａｃ）により細胞内放射能を測定した。 結果を図１ａ−ｃに示す。図１ａは、ハイブリドーマ細胞の増殖に対するＴＧ Ｆ−βの容量反応を示す図である。ＴＧＦ−βは用量依存の形でこれらの細胞の 増殖を大幅に抑制することができる。 図１ｂは、この細胞株に対するｒ−ｈＰＲＬの用量反応を示す。分子は用量依 存の形でこれらの細胞の増殖を明らかに刺激する。 図１ｃは、これらの細胞の５０％を超える増殖を抑制することが明らかにされ たＴＧＦ−βの濃度である０．４μｇ／ｍＬＴＧＦ−βで各濃度のｒ−ｈＰＲＬ をインキュベートした効果を示す。ｒ−ｈＰＲＬは用量関連の形でこれらの細胞 に対するＴＧＦ−βの抑制作用を拮抗した。実施例２：マウスハイブリドーマクローンに対するＴＧＦ−βおよびＰＲＬの作 用 マウスハイブリドーマ細胞株を上述した通りハイブリドーマ増殖培地（ＨＧＭ ）において維持した。検定当日、細胞を１５ｍＬ三角管にピペットで取り、８分 間１０００ｒｐｍで遠心分離した。培地を細胞から吸引し、８８％ＲＰＭＩ−１ ６４０（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン （Ｇｉｂｃｏ）、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬＰ ｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）からなる５ｍＬの検定培地で２回洗浄した。細 胞を２ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０検定培地に再懸濁し、カウントし、検定培地で 希釈して２ｘ１０⁵細胞／ｍＬとした。容量１００μＬの細胞を９６穴無菌組織 培養プレートのウェルにピペットで取った。プレートを使用まで３７℃インキュ ベータに配置した。 ＴＧＦ−βの１０倍の一連の希釈液（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎ、ｌｏｔ ９４Ｆ００３、９６μｇ／ｍＬ）を検定培地において調製し、２５ μｌを適切なウェルに添加した。その後、１μｇのＰＲＬをウェルに添加し、細 胞を細胞を３７℃／５％ｃｏ２で７２時間インキュベートした。 トリチウム標識チミジン（０．５μＣｉ）を最後の１８時間添加した。増殖の 量をトリチウム標識チミジン取り込みにより測定した。ＴＯＭＥＣハーベスター ９６を用いてグラスファイバフィルタ上に細胞を回収後、シンチレーション計数 器（１２０５ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ ＬＳＣ、Ｗａｌｌａｃ）により細胞内放射 能を測定した。 結果を表（図２）に示す。ハイブリドーマのＴＧＦ−βに対する感受性には変 動があったが、すべての場合において、ＴＧＦ−βの存在下に細胞増殖の減少が 確認された。ＴＧＦ−βの抑制作用を克服するプロラクチンの能力は部分的にＴ ＧＦ−βの濃度に依存した。プロラクチンは、０．１μｇＴＧＦ−βでインキュ ベートしたすべてのハイブリドーマ（８／８）、１μｇＴＧＦ−βでインキュベ ートした７／８のハイブリドーマ、および１０μｇＴＧＦ−βでインキュベート した５／８のハイブリドーマについて、ＴＧＦ−βの抑制性を克服することが確 認された。実施例３：ヒト抹消血単各細胞に対するＴＧＦ−βおよびＰＲＬの作用 ヒト抹消血単各細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）勾配遠心分離により単離した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、１％ＦＣ Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１５ｍＭＨＥＰＥ Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲ ＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地に再懸濁した。細胞を２ｘ１０⁶細胞／ｍ Ｌの最終細胞密度に調整し、０．１ｍＬをマイクロ滴定組織培養プレートのウェ ルに配置した。細胞を３７℃下、５％ＣＯ₂加湿インキュベータで一晩インキュ ベートした。 翌日、ウェルにＰＨＡを２０μｇ／ｍｌ添加し、休止ヒト抹消血リンパ球（Ｐ ＢＬ）を刺激した。その直後に、ＴＧＦ−βを０．０５〜１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧ Ｆ−βの濃度で培養液に添加した後、０、１０、および２０μｇ／ｍｌのＰＲＬ を添加した。 培養液を９６時間インキュベートし、最後の８時間は０．５μＣｉトリチウム 標識チミジン／ウェルでパルスした。ＴｏｍＴｅｃ Ｍａｃｈ １１細胞ハーベ スターを用いてグラスファイバフィルタに細胞を回収し、Ｗａｌｌａｃ １２０ ５ Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンタを用いて取り込み放射能標識をカウントした。 結果を図３に示す。プロラクチンはＰＨＡ刺激ヒトＰＢＬのＴＧＦ−β抑制を拮 抗した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． プロラクチンを含む薬理学的に受け入れられる組成物の有効量を投与する ことにより、ＴＧＦ−βに関連した疾患または障害に罹患した患者を治療するた めの方法。 ２． プロラクチンを含む組成物の有効用量を投与することにより、ＴＧＦ−β による細胞成長抑制を予防する方法。 ３． プロラクチンを含む組成物の有効量を投与することにより細胞成長を強化 する方法。 ４． プロラクチンはヒトプロラクチンであることを特徴とする請求の範囲１、 ２、および３のいずれかに記載の方法。 ５． プロラクチンは組換えプロラクチンであることを特徴とする請求の範囲１ 、２、および３のいずれかに記載の方法。 ６． 細胞はリンパ系細胞であることを特徴とする請求の範囲１、２、および３ のいずれかに記載の方法。 ７． 細胞は内皮細胞であることを特徴とする請求の範囲１、２、および３のい ずれかに記載の方法。 ８． 細胞は上皮細胞であることを特徴とする請求の範囲１、２、および３のい ずれかに記載の方法。 ９． プロラクチンＤＮＡを含む薬理学的に受け入れられる組成物の有効量を投 与することにより、ＴＧＦ−βに関連した疾患または障害に罹患した患者を治療 するための方法。