JPWO2015064768A1 - 角膜内皮の小胞体細胞死関連疾患治療薬 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)TGFβシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の小胞体(ER)ストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬。
(2)前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィに関する障害である、項目(1)に記載の処置または予防薬。
(3)前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害を抑制することを含む、項目(1)または(2)に記載の処置または予防薬。
(4)前記疾患、障害または状態は、角膜内皮密度低下、guttaeの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレアおよび角膜実質の浮腫からなる群より選択される少なくとも1つを含む、項目(1)〜(3)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(5)前記TGFβシグナル阻害剤は、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド、BMP−7、抗TGF−β抗体、抗TGF−βレセプター抗体、TGF−βのsiRNA、TGF−βレセプターのsiRNA、TGF−βのshRNA、TGF−βレセプターのshRNA、TGF−βのアプタマー、TGF−βレセプターのアプタマー、TGF−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、6,7−ジメトキシ−2−((2E)−3−(1−メチル−2−フェニル−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル−プロプ−2−エノイル))−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノロン、3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン、6−(4−(ピペリジン−1−イル)エトキシ)フェニル)−3−(ピリジン−4−イル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン、2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)−4−[(4−ピリジニル)アミノ]プテリジン、4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−キノリン、A−83−01(3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノロリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド)、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも1種含む、項目(1)〜(4)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(6)前記TGF−βシグナル阻害剤は、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、項目(1)〜(5)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(7)前記角膜内皮は霊長類のものである、項目(1)〜(6)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(8)前記角膜内皮はヒトのものである、項目(1)〜(7)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(9)さらなる医薬成分を含む、項目(1)〜(8)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(10)点眼薬である、項目(1)〜(9)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(11)角膜内皮の小胞体(ER)ストレスに関連する障害の処置または予防のためのTGFβシグナル阻害物質。
(11A)前記TGFβシグナル阻害物質は、項目(1)〜(10)のいずれか1項の阻害剤の特徴を有する、項目(11)に記載のTGFβシグナル阻害物質。
(12)被験体における角膜内皮の小胞体(ER)ストレスに関連する障害の処置または予防のための方法であって、該方法は該被験体に対して有効量のTGFβシグナル阻害剤を投与する工程を包含する、方法。
(12A)項目(1)〜(10)のいずれか1項に記載の特徴を有する、項目(12)に記載の方法。
(A1)TGF−βシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の小胞体(ER)関連ストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬。
(A2)前記疾患、障害または状態は、ミトコンドリア機能不全に関連するものである、項目(A1)に記載の処置または予防薬。
(A3)前記疾患、障害または状態は、ミトコンドリア機能不全によるアポトーシスに関連するものである、項目(A1)または(A2)に記載の処置または予防薬。
(A4)前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィに関するものである、項目(A1)〜(A3)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A5)前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害を抑制することを含む、項目(A1)〜(A4)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A6)前記疾患、障害または状態は、角膜内皮密度低下、guttaeの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレアおよび角膜実質の浮腫からなる群より選択される少なくとも1つを抑制することを含む、項目(A1)〜(A5)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A7)前記TGF−βシグナル阻害剤は、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド
、BMP−7、抗TGF−β抗体、抗TGF−βレセプター抗体、TGF−βのsiRNA、TGF−βレセプターのsiRNA、TGF−βのshRNA、TGF−βレセプターのshRNA、TGF−βのアプタマー、TGF−βレセプターのアプタマー、TGF−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、6,7−ジメトキシ−2−((2E)−3−(1−メチル−2−フェニル−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル−プロプ−2−エノイル))−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノロン、3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン、6−(4−(ピペリジン−1−イル)エトキシ)フェニル)−3−(ピリジン−4−イル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン、2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)−4−[(4−ピリジニル)アミノ]プテリジン、4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−キノリン、A−83−01(3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノロリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド)、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも1種含む、項目(A1)〜(A6)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A8)前記TGF−βシグナル阻害剤は、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、項目(A1)〜(A7)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A9)さらにERストレスにより生じるミトコンドリア機能不全の治療剤を含む、項目(A1)〜(A8)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A10)前記ERストレスにより生じるミトコンドリア機能不全の治療剤は、BiP inducer X(BIX)、4−フェニル酪酸(4−phenyl butyric acid(PBA))、トリメチルアミンN−オキシド(trimethylamineN−oxide(TMAO))、タウロウルソデオキシコール酸(tauroursodeoxycholic acid(TUDCA))およびテプレノン(セルベックス(selbex)としても販売されている)からなる群より選択される、項目(A9)に記載の処置または予防薬。
(A11)前記角膜内皮は霊長類のものである、項目(A1)〜(A10)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A12)前記角膜内皮はヒトのものである、項目(A1)〜(A11)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A13)さらなる医薬成分を含む、項目(A1)〜(A12)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A14)点眼薬である、項目(A1)〜(A13)のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(A14A)前記疾患、障害または状態は、アグリソームの発現増加を伴うものである、上記項目のいずれかに記載の処置または予防薬。
(A14B)前記疾患、障害または状態は、アグリソームに関連する疾患、障害または状態である、上記項目のいずれかに記載の処置または予防薬。
(A14C)前記疾患、障害または状態は、タンパク質のフォールディングの異常を伴うものである上記項目のいずれかに記載の処置または予防薬。
(A14D)前記疾患、障害または状態は、タンパク質のフォールディングの異常を原因とするものである、上記項目のいずれかに記載の処置または予防薬。
(A15)小胞体(ER)関連ストレスに関連する障害の処置または予防のためのTGF−βシグナル阻害物質。
(A15A)前記TGFβシグナル阻害物質は、項目(A1)〜(A14)、および(A14A)〜(A14D)のいずれか1項の阻害剤の特徴を有する、項目(A15)に記載のTGFβシグナル阻害物質。
(A16)被験体における小胞体(ER)関連ストレスに関連する障害の処置または予防のための方法であって、該方法は該被験体に対して有効量のTGF−βシグナル阻害剤を投与する工程を包含する、方法。
(A16A)項目(A1)〜(A14)、および(A14A)〜(A14D)のいずれか1項に記載の特徴を有する、項目(A16)に記載の方法。
本明細書において「iFECD」(immobilized Fuchs’ endothelial corneal dystrophy)は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。
の略称である。
機能することが十分裏付けられている。
1つの実施形態では、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、アグリソームの発現増加を伴うものである。あるいは、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、アグリソームに関連する疾患、障害または状態である。
別の実施形態では、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、タンパク質のフォールディングの異常を伴うものである。あるいは、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、タンパク質のフォールディングの異常を原因とするものである。
哺乳動物細胞において,フォールディングしなかったり(unfolded)、ミスフォールディングやタンパク質分解の異常などにより凝集したタンパク質(折りたたみ不全タンパク質、変性タンパク質(unfolded protein)ともいう。)はユビキチン化され,微小管上を移動するダイニンモーターにより中心体付近に蓄積し、アグリソームという封入体を形成することが知られる。一般的にアグリソームは熱ショックやウイルス感染,酸化ストレスなどによって形成される。ヒトでは,パーキンソン病の神経細胞に見られるLewy小体や,アルコール性肝臓疾患の肝臓細胞で見られるMallory小体,筋萎縮性側索硬化症の星状細胞で見られる硝子様小体など,細胞内の封入体が関与する疾患がいくつか知られている。
生じる。グッテー(Corneal guttae)およびデスメ膜の肥厚はフックス角膜内皮ジストロフィ患者における羞明、霧視の原因であり患者のQOLを著しく損なう。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約2600人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は1700件程度である。
al.ExpEye Res Vol.93(6),880−888,2011)や不死化の報告(Azizi B,et al.
Invest Ophthalmol Vis Sci.2;52(13):9291−9297.2011)があるが、細胞外マト
リックスの過剰産生を伴うなどの疾患の特徴を維持した、治療薬、進行予防薬のスクリーニングに適切な細胞の報告はないため、その治療薬の開発には限界があり、現在のところ臨床で使用されている治療薬は存在せず角膜移植に頼らざるを得ない。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press、Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress;Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press;Adams,R.L.et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman & Hall;Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim;Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press;Hermanson,G.T.(1996).Bioconjugate Techniques,Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy Joyceらの報告{Joyce,2004#161}{Joyce,2003#7}がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
1つの局面において、本発明はTGFβシグナル阻害剤を含む、角膜内皮のERストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬を提供する。本発明では、角膜内皮においてERストレスが関連する疾患、障害または状態を、TGFβシグナル阻害剤を投与することによって、予想外にERストレスを低減または消失、あるいは正常レベルに維持または戻すことができたことを見出した。したがって、このようなTGFβシグナル阻害剤の角膜内皮のERストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防のための用途は従来の知見からは予想できなかった用途であるといえる。
本例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株(iFECD)を作製した。
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はOpti−MEM I Reduced−Serum Medium,Liquid(INVITROGEN カタログ番号:31985−070)に、8%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)、200mg/ml CaCl2・2H2O(SIGMA カタログ番号:C7902−500G)、0.08% コンドロイチン硫酸(SIGMA カタログ番号:C9819−5G)、20μg/mlアスコルビン酸(SIGMA カタログ番号:A4544−25G)、50μg/mlゲンタマイシン(INVITROGEN カタログ番号:15710−064)および5ng/ml EGF(INVITROGEN カタログ番号:PHG0311)を加えた3T3フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にSB431542(1μmol/l)およびSB203580(4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルホニルフェニル)−5(4−ピリジル)イミダゾール<4−[4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルフィニルフェニル)−1H−イミダゾール−5−イル]ピリジン)(1μmol/l)を添加したもの(本明細書では「SB203580+SB431542+3T3馴化培地」ともいう)で培養した。
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植(デスメ膜内皮角膜移植=DMEK)を実施されたヒト患者3名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。DMEKの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるOptisol−GS(ボシュロム社)に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、SB203580+SB431542+3T3馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はSV40ラージT抗原およびhTERT遺伝子をPCRにより増幅して、レンチウイルスベクター(pLenti6.3_V5−TOPO;Life Technologies Inc)に導入した。その後、レンチウイルスベクターを3種類のヘルパープラスミド(pLP1、pLP2、pLP/VSVG;Life Technologies Inc.)とともにトランスフェクション試薬(Fugene HD;Promega Corp.,Madison,WI)を用いて293T 細胞 (RCB2202;Riken Bioresource Center,Ibaraki,Japan)に感染させた。48時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、5μg/mlのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、SV40ラージT抗原およびhTERT遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の位相差顕微鏡像を確認した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した(iHCEC)。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株(iHCEC)および不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の位相差顕微鏡像をみると、iHCECおよびiFECDはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。iHCECおよびiFECDはDMEM+10%FBSにより維持培養を行った。SB431542は、TOCRIS社から得た(カタログ番号:1614)。SB203580はCALBIOCHEMから得た(カタログ番号:559389)。
本実施例では、不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の正常機能の確認を行った。
まず、不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の正常機能の確認のために、Na+/K+−ATPaseおよびZO−1による免疫染色を行った。角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能を確認するためである。Na+/K+−ATPaseおよびZO−1はそれぞれ、角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能の正常性を示す。手法は以下のとおりである。
細胞観察は位相差顕微鏡にて行った。また、細胞を固定した後に機能関連マーカーとしてZO−1、Na+/K+−ATPaseを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、培養した細胞をLab−TekTM Chamber SlidesTM(NUNC A/S,Roskilde,Denmark)に入れ、4%ホルムアルデヒドで10分間室温(RT)で固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに30分間インキュベートした。具体的には、Lab−TekTMChamber SlidesTM(NUNC A/S,Roskilde,Denmark)上の培養細胞を室温で10分間4%ホルムアルデヒド中で固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに30分間インキュベートした。細胞の表現型を調べるために、密着結合関連タンパク質であるZO−1、ポンプ機能に関連するタンパク質であるNa+/K+−ATPaseの免疫組織化学分析を行った。細胞の機能に関連するマーカーとしてZO−1およびNa+/K+−ATPaseを使用した。ZO−1、Na+/K+−ATPaseの染色は、それぞれ、ZO−1ポリクローナル抗体(Zymed Laboratories,Inc.,South San Francisco,CA)、Na+/K+−ATPaseモノクローナル抗体(Upstate Biotec,Inc.,Lake Placid,NY)の1:200希釈を用いて実施した。二次抗体には、Alexa Fluor(登録商標)488標識、または、Alexa Fluor(登録商標)594標識ヤギ抗マウスIgG(Life Technologies)の1:2000希釈を使用した。次いで、細胞の核をDAPI(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)またはPI(Sigma−Aldrich)で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡(TCS SP2 AOBS;Leica Microsystems,Welzlar,Germany)で観察した。
本実施例では、小胞体ストレスについて調べるために、その代表例として、上記調製例で調製したフックス角膜内皮ジストロフィをモデルとして、その細胞において小胞体およびミトコンドリアの形態異常が見られるかどうか観察した。
次に、電子顕微鏡を用いた細胞の観察によりERストレスおよびECMの産生が亢進されていることを確認した。前固定として、細胞が播かれたトランスウェルを、0.1Mカコジル酸ナトリウムで希釈したpH7.2の2.5%グルタルアルデヒドで3時間室温で固定し、0.1Mカコジル酸ナトリウムで3回洗浄後、後固定として、0.1Mカコジル酸ナトリウムで希釈した1%オスミウム酸で1時間室温で固定し、蒸留水で3回洗浄した。細胞内小器官の局在と形態変化を調べるために、0.5%酢酸ウラニルに1時間室温で浸した。脱水処理のため、70%エタノール、90%エタノールに細胞をそれぞれ10分浸し、100%エタノールに20分浸した。その後、酸化プロピレンに30分浸し、酸化プロピレンとアラルダイト樹脂混合物を1:1の割合で混合したものに1時間室温で浸した。アラルダイト樹脂混合物の中にトランスウェルを浸し、2時間室温で浸潤させた。2時間ごとにアラルダイド樹脂混合物を3回交換し、12時間後に再度2時間ごとアラルダイド樹脂を3回交換した。続いて、アラルダイド樹脂混合物で包埋し、60℃で24時間インキュベートすることで硬化させた。ミクロトーム(LeicaEMUC7、Leica Microsystems、Welzlar,Germany)を用いて300nmの切片を作製し、グリッド上に回収した。グリッド染色後、電子顕微鏡で観察した。
結果を図2に示す。フックス角膜内皮ジストロフィにおいて小胞体およびミトコンドリアの形態が異常になっていることが判明した。より詳細にはiHCECでは正常形態の小胞体およびミトコンドリアを認め、細胞外マトリックスは認められなかった。他方、iFECDでは小胞体およびミトコンドリアが拡張し、形態異常を呈していた。また、細胞外マトリックスが細胞間に認められた。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいて、小胞体ストレスが亢進するかどうかを確認するために、小胞体ストレスに応答して発現する分子シャペロンであるGRP78およびGADD153の発現を観察した。GADD153は、種々のストレス、特に小胞体に対するストレスに応じて発現・誘導され、細胞周期を停止させ、アポトーシスに関与しているタンパク質として知られている(参考文献として、Verfaillie T,et al.Cancer Lett.2013 May 28;332(2):249−64を参照)。
(免疫染色による発現観察)
免疫染色によりERストレスに関連するGRP78およびGADD153の発現が亢進されていることを確認した。免疫染色の手法は、上記調製例2に準じ、抗体については、GRP78およびGADD153に対する抗体に変更して実験を行った。
・GRP78に対する抗体:(sc−376768、SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)
・GADD153に対する抗体:(sc−575、SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)
手短には以下のとおりに行った。
・ウェスタンブロット法:RIPAバッファーで抽出し得られたタンパク質を7.5%ポリアクリルアミドで電気泳動した。分離されたタンパク質はPVDF膜(PALL LIFE SCIENCE社製(カタログ番号:EH−2222))に転写した。5%無脂肪乾燥乳(5%NON FAT DRY MILK、CELL SIGNALING社 カタログ番号:9999)を補った0.1%(vol/vol)ポリエチレンソルビタンモノラウレート(ナカライテスク、カタログ番号:28353−85)を含むTris緩衝化食塩水(10mMTris−HCl、pH7.4;100mM NaCl)(TBS−T)と、ブロットした膜を1時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、抗GRP78抗体を5%無脂肪乾燥乳を補ったTBS−Tにて1000倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で1時間反応させた。TBS−Tで3回洗浄後、マウス−IgG抗体HRP複合体(CELL SIGNALING社(カタログ番号:7074P2))とインキュベートし、洗浄後、ECL−ADVAVCE Western Blotting Detection Kit(GE ヘルスケア・ジャパン社(カタログ番号:RPN2135V))で発光させたバンドを検出した。
・抗GRP78抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY、SC−376768)
・抗IRE1抗体(Cell Signaling Technology、14C10)
・抗GAPDH抗体(MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES、M171−3)
二次抗体は以下のとおりであった。
・HRP標識抗ウサギIgGまたは抗ウサギIgG(Cell Signaling Technology)(1:5000希釈)
一次抗体および二次抗体とともにインキュベーションを行った。メンブレンを、ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare,Piscataway,NJ)によって感光させ、次いで、LAS4000S画像化システム(富士フィルム株式会社、東京都)を用いて調べた。
10ng/ml TGFβ2(R&D SYSTEMS)にて細胞を24時間刺激した。またERストレスのポジティブコントロールとして10μM タプシガルジン(thapsigargin;TG;Alomone Laboratories Ltd.,Jerusalem,Israel)により24時間刺激したものを用いた。
結果を図3に示す。フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいて、正常角膜由来の角膜内皮細胞と比べて小胞体ストレスの亢進を示すGRP78およびGADD153の発現増加が見られた。
本実施例では、TGF−βは角膜内皮細胞のERストレスを促進することを確認するために、実施例2と同様のウェスタンブロットを行い、GRP78のほか、小胞体膜上のストレスシグナル伝達に関与する膜タンパク質であるIRE1の動向も観察した。10ng/ml TGFβ2(R&D SYSTEMS)にて細胞を刺激した。またERストレスのポジティブコントロールとしてタプシガルジン(thapsigargin;TG;Alomone Laboratories Ltd.,Jerusalem,Israel)により刺激したものを用いた。
ウェスタンブロットは、実施例2の記載に準じて行った。使用した抗体は実施例2のものに加え以下を用いた。
・抗IRE1に対する抗体:(14C10、Cell Signaling Technology)
・TGF−β2:(302−B2−002、R&D SYSTEMS)
結果を図4に示す。正常細胞においても、フックス角膜内皮ジストロフィモデルの細胞において、TGFβによりシャペロンであるGRP78やストレスセンサーであるIRE1の発現レベルが誘導された。特にフックス角膜内皮ジストロフィモデルの細胞においてその発現レベルが高くなった。TGはタプシガルジンのことであり、ERストレスのポジティブコントロールとして用いた。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞は小胞体ストレス高感受性であることを示すために、TGFβシグナルの阻害剤であるSB431542を投与し、ERストレスの亢進がキャンセルされるかどうかを確認した。
SB431542は、TOCRIS社から得た(カタログ番号:1614)。
調製例で調製したヒト角膜内皮細胞(iHCEC)あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞(iFECD)をFNC Coating Mixをコートした培養皿へ播種し、37℃で5%CO2の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約3日間培養した。さらに、TGFβ2、SB431542、TGを添加し37℃で5%CO2の条件下にて24時間インキュベートした。その後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
結果を図5に示す。iFECDにおいてのみTGFβ2により細胞が障害されiHCECと比べて多量の浮遊細胞が認められた。浮遊細胞はSB431542によってキャンセルされた。一方、TGにより特に、iFECDにおいて多量の浮遊細胞が認められたが、SB431542ではキャンセルされなかった。このことはSB431542は非特異的な細胞障害抑制薬としてではなく、TGFβシグナルにより誘導される細胞障害に特異的であることを示す。図6では図5の細胞におけるアポトーシスをフローサイトメトリーにより評価した結果の代表例を、図7ではグラフによりアネキシンV陽性のアポトーシス細胞を縦軸にプロットしたものを示す。
・フローサイトメトリー:
調製例で調製したヒト角膜内皮細胞(iHCEC)あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞(iFECD)をFNC Coating Mixをコートした培養皿へ播種し、37℃で5%CO2の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約3日間培養した。さらに、TGFβ2、SB431542を添加し37℃で5%CO2の条件下にて24時間インキュベートした。ACCUMAXで細胞を剥離し、MEBCYTO Apoptosis Kit(Annexin V−FITC Kit)100test(4700、MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES)により、AnnexinVとPIを使用してフローサイトメーター(FACS Aria
II(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ))でアネキシンV又はPI陽性細胞を測定した。
結果を図7に示す。示されるように、フックス角膜内皮ジストロフィの細胞は、TGFβ2によりアポトーシス細胞が増大し、その増大は、SB431542によりキャンセルされた。フックス角膜内皮ジストロフィにおいて自然発生するアポトーシスについても、TGFβシグナル阻害を行うことで小胞体(ER)関連ストレスを抑制することで、治療または進行予防が可能であることが示唆される。
本実施例では、SB431542以外のTGFβのシグナル阻害剤(A−83−01、ALK5阻害剤)でもフックス角膜内皮ジストロフィのアポトーシスを抑制することができるかを確認した。本実施例では、アポトーシスの指標として用いられるアネキシンVの陽性細胞を計数することによって、観察した。
調製例で調製したヒト角膜内皮細胞(iHCEC)あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞(iFECD)をFNC Coating Mixをコートした培養皿へ播種し、37℃で5%CO2の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約3日間培養した。さらに、TGFβ2、SB431542及びTGFβシグナル阻害剤であるA−83−01(Wako,Osaka;catalog No:018−22521)、ALK5阻害剤(Wako catalogNo:012−23021;CAS No.446859−33−2;2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン)を添加し37℃で5%CO2の条件下にて24時間インキュベートした。ACCUMAXで細胞を剥離し、アネキシンVとプロピジウムヨウ化物(PI)を使用してフローサイトメーター(FACS Aria II(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ))でアネキシンV又はPI陽性細胞を測定した。
結果を図8に示す。実施例6と同様にフックス角膜内皮ジストロフィの細胞は、TGFβ2によりアポトーシス陽性細胞が増大し、その増大は、SB431542によりキャンセルされた。さらに、SB431542以外のTGFβシグナル阻害剤であるA−83−01、ALK5阻害剤においてもアポトーシス細胞が抑制されることがわかった。
実施例8と同様の実験を抗TGF−β2抗体(R&D SYSTEMS;catalog No:AB−112−NA)およびSmad阻害剤(CALBIOCHEM;catalog No:556405)を用いて実施することができる。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィにおいて、TGF−βによりより強いERストレス誘導が生じることを確認するために、実施例2と同様のウェスタンブロットを行い、分子シャペロンであるGRP78、ERストレス応答によるアポトーシスに関与するCHOPの発現を調べた。また、小胞体膜上のストレスシグナル伝達に関与するリン酸化PERK、ATF6の発現も合わせて調べた。刺激は10ng/ml TGFβ2(R&D SYSTEMS)にて行った。また、経時変化も合わせて調べた。
ウェスタンブロットは、実施例2の記載に準じて行った。使用した抗体は実施例2のものに加え以下を用いた。
・PERKに対する抗体:(D11A8、Cell Signaling Technology)
・リン酸化PERKに対する抗体:(sc−32577,SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)
・ATF6に対する抗体:(73−505,Bio Academia)
・GRP78に対する抗体:(SC−376768,SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)
・CHOPに対する抗体:(L63F7、Cell Signaling Technology)
・TGF−β2:(302−B2−002、R&D SYSTEMS)
結果を図9に示す。TGF−βがERストレスセンサーであるPERKのリン酸化を促進し、ATF6の発現を促進することが示された。また、シャペロンであるGRP78の発現が上昇することが示された。これらのリン酸化の促進および発現の促進はiHCECに比べてiFECDにおいてより顕著に見られた。このように、TGF−βはまた、ERストレスマーカーを増大させたことが示された。さらにCHOPの発現が上昇し、ERストレスによりアポトーシスが生じることが示された。また、3時間後でこの増大は見られ、6時間後にその増大効果は増強されることが示された。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮細胞においてミトコンドリア機能不全が関与していることを確認する実験を行った。
本発明者らは、上述の調製例に記載されているように、FECD患者のヒト角膜内皮細胞(HCEC)の不死化細胞モデル(iFECD)および正常ドナー角膜HCEC(iHCEC)を樹立しており、これを本実施例で用いた。この実施例の目的は、細胞モデルを用いて、FECDのミトコンドリア機能不全の関与を調査することにある。
シトクロムCのミトコンドリアから細胞質への放出は、Mitochondria Isolation Kit(Thermo SCIENTIFIC、89874)でミトコンドリアの分画を行い、ウェスタンブロットによって評価した(Anti−Cytochrome C antibody、abcam、ab13575)。
図10では、ミトコンドリア膜電位を蛍光プローブJC−1色素を用いて評価した。緑色蛍光はミトコンドリアを示し、赤色蛍光はミトコンドリア膜電位を示すものであるが、赤色蛍光の欠如はミトコンドリア膜電位が脱極していることを示すものである。iFECDの赤色蛍光はiHCECよりも弱かった。図11では、フローサイトメトリーを用いてミトコンドリア膜電位を評価した。JC−1およびMitoTracker(登録商標)での評価により、ミトコンドリア膜電位がiHCECよりもiFECDで低いことが判明した(それぞれ図10および11)。
本実施例では、角膜内皮細胞におけるミトコンドリア障害が細胞障害を生じるかどうかについて、実施例2と同様のウェスタンブロットを行いアポトーシスに関連するタンパク質であるカスパーゼ9、カスパーゼ3およびPARPの発現を調べた。ミトコンドリアの障害を誘導するためにスタウロスポリン(staurosporine)により刺激して経時的に変化を確認した。
ウェスタンブロットは、実施例2の記載に準じて行った。使用した抗体は実施例2のものに加え以下を用いた。
・カスパーゼ9に対する抗体:(9508S、Cell Signaling Technology)
・カスパーゼ3に対する抗体:(9662S、Cell Signaling Technology)
・PARPに対する抗体:(9542S、Cell Signaling Technology)
・スタウロスポリン:(ab120056、abcam)
結果を図13に示す。図13では、ミトコンドリアストレス因子のスタウロスポリンにより刺激されたiHCECにおけるウェスタンブロットによりシグナルの下流を評価した結果を示す。スタウロスポリンでミトコンドリア障害を誘導することによりカスパーゼ9、カスパーゼ3およびPARPが活性化された。電子顕微鏡による観察においてiHCECのミトコンドリアの形態は正常であったが、iFECDでは拡張を認めた。ミトコンドリア膜電位が低下した細胞は、iHCECで11.7±1.7%であったのに対して、iFECDでは41.9±10.2%と有意に増加した(p<0.05)。また、シトクロムcの細胞質への漏出は、iHCECと比較してiFECDにおいて強く認められた。これらの結果から、ミトコンドリアストレスにより、シトクロムcの漏出が引き起こされ、ミトコンドリア障害により活性化することが知られているカスパーゼ9の活性化を認め、さらにカスパーゼ3およびPARPの活性化を認めることからミトコンドリア障害によりアポトーシスが誘導されることが理解される。以上から、FECDの病態にミトコンドリア障害が関与していると理解される。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィにおいて変性タンパク質が亢進することを示す。
フローサイトメトリーによりフックス角膜内皮ジストロフィにアグリソームが蓄積していることを確認した。
(使用機器)
・ ProteoStat(登録商標)Aggresome DetectionKit:(EZN−51035−K100,Enabling Discovery in Life Science(登録商標))
手短には以下のとおりに行った。
ヒト角膜内皮細胞(iHCEC)あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞(iFECD)をFNC Coating Mixをコートした6well plateへ1×105cells播種し、37℃で5%CO2の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約2間培養した。さらに、TGFβ2(10ng/ml;R&D SYSTEMS)を添加し37℃で5%CO2の条件下にて24時間インキュベートした。その後、ACCUMAXTM(フナコシ)で細胞を剥離し、ProteoStat(登録商標)Aggresome DetectionKit:(EZN−51035−K100,Enabling Discovery in Life Science(登録商標))を使用してフローサイトメーター(FACS Aria II(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ))でアグリソームを測定した。
結果を図14に示す。フックス角膜内皮ジストロフィの細胞(iFECD)はヒト角膜内皮細胞(iHCEC)に比べてアグリソームの蛍光強度が1.22倍と有意に高かった。さらに、TGF−β2刺激によりフックス角膜内皮ジストロフィではアグリソームが1.11倍に増加し、著明な細胞死を認めた。
以上から、フックス角膜内皮ジストロフィでは変性タンパク質を細胞内に多く有し、TGF−βシグナルによりその量が増加することが示された。変性タンパク質による小胞体ストレスがフックス角膜内皮ジストロフィ(FECD)の病態に関わっている可能性があると理解される。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィにおいて変性タンパク質(unfolded protein)が蓄積することを示す。
培養したヒト角膜内皮細胞(iHCEC)あるいはフックス角膜内皮ジストロフィ角膜内皮細胞(iFECD)をFNC Coating Mixをコートした培養皿へ播種し、37℃で5%CO2の条件下にてサブコンフルエントに到達するまで約3日間培養する。ACCUMAXTM(フナコシ)で細胞を剥離し、ProteoStat(登録商標)Aggresome Detection Kit(EZN−51035−K100,Enabling Discovery in Life Science(登録商標))を使用してアグリソームを染色し、フローサイトメーター(FACS Aria II;BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)により測定する。
iHCECと比較してiFECDにおいてアグリソームの発現量が高くなる。このことはフックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいて、変性タンパク質が蓄積していることを示すものと解釈できる。
アグリソームおよび変性タンパク質の結果から、TGF−βシグナルについて、アグリソームおよび変性タンパク質による小胞体ストレスがフックス角膜内皮ジストロフィへの関与が示される。
本実施例では、アグリソームを指標とした診断が可能であることを実証する。アグリソームの測定は、実施例13−14等の記載をもとに実施することができる。
前房内にアグリソームを染色できる色素を注入するなどの方法により、角膜内皮細胞のアグリソームの沈着を評価することで診断に用いることが可能である。
点眼剤の調製例
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
塩化ナトリウム 0.85g
リン酸二水素ナトリウム二水和物 0.1g
ベンザルコニウム塩化物 0.005g
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量100mg(pH7.0)。
リン酸二水素ナトリウム二水和物 0.1g
ベンザルコニウム塩化物 0.005g
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量100mg(pH7.0)。
Claims (16)
- TGF−βシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の小胞体(ER)関連ストレスに関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬。
- 前記疾患、障害または状態は、ミトコンドリア機能不全に関連するものである、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 前記疾患、障害または状態は、ミトコンドリア機能不全によるアポトーシスに関連するものである、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィに関するものである、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害を抑制することを含む、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 前記疾患、障害または状態は、角膜内皮密度低下、guttaeの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレアおよび角膜実質の浮腫からなる群より選択される少なくとも1つを抑制することを含む、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 前記TGF−βシグナル阻害剤は、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド、BMP−7、抗TGF−β抗体、抗TGF−βレセプター抗体、TGF−βのsiRNA、TGF−βレセプターのsiRNA、TGF−βのshRNA、TGF−βレセプターのshRNA、TGF−βのアプタマー、TGF−βレセプターのアプタマー、TGF−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、6,7−ジメトキシ−2−((2E)−3−(1−メチル−2−フェニル−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル−プロプ−2−エノイル))−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノロン、3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン、6−(4−(ピペリジン−1−イル)エトキシ)フェニル)−3−(ピリジン−4−イル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン、2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)−4−[(4−ピリジニル)アミノ]プテリジン、4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−キノリン、A−83−01(3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノロリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド)、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも1種含む、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 前記TGF−βシグナル阻害剤は、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項1に記載の処置または予防薬。
- さらにERストレスにより生じるミトコンドリア機能不全の治療剤を含む、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 前記ERストレスにより生じるミトコンドリア機能不全の治療剤は、BiPinducerX(BIX)、4−フェニル酪酸(4−phenyl butyric acid(PBA))、トリメチルアミンN−オキシド(trimethylamine N−oxide(TMAO))、タウロウルソデオキシコール酸(tauroursodeoxycholic acid(TUDCA))およびテプレノンからなる群より選択される、請求項9に記載の処置または予防薬。
- 前記角膜内皮は霊長類のものである、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 前記角膜内皮はヒトのものである、請求項1に記載の処置または予防薬。
- さらなる医薬成分を含む、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 点眼薬である、請求項1に記載の処置または予防薬。
- 小胞体(ER)関連ストレスに関連する障害の処置または予防のためのTGF−βシグナル阻害物質。
- 被験体における小胞体(ER)関連ストレスに関連する障害の処置または予防のための方法であって、該方法は該被験体に対して有効量のTGF−βシグナル阻害剤を投与する工程を包含する、方法。
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