CN1257545A - Ⅱ型TGF－β受体/免疫球蛋白恒定区融合蛋白 - Google Patents

Abstract

描述了包含与免疫球蛋白恒定链的一部分相连接的Ⅱ型TGF－β受体的融合蛋白。也描述了利用本发明融合蛋白治疗多种纤维增生性紊乱的方法。

Description

II型TGF-β受体/免疫球蛋白恒定区融合蛋白

发明背景

本发明涉及可溶性TGF-β受体融合蛋白及其在治疗以TGF-β的过量产生为特征的疾病，包括纤维增生的应用。

背景

转化生长因子-β(TGF-β)代表一个多肽家族，其中TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3这三种存在于哺乳动物。这些因子对细胞生长和分化(Roberts与Sporn(1990)药理学实验手册(Handbk.Exp.Pharm.)95：419-58)有全面影响。越来越多的证据表明TGF-β也调节免疫过程(Wahl等人(1989)当代免疫学(Immunol.Today)10：258-61)。除了刺激免疫细胞在受伤位置聚集外，TGF-β也为其本身的连续合成提供了强的正反馈作用(Kim等人(1990)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)10：1492-1497)。

TGF-β可能是纤维增生性紊乱的病因学中的一个主要因子。已知TGF-β刺激细胞产生更多蛋白质，包括胶原蛋白、双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和纤连蛋白；并且抑制降解这些蛋白质的酶。因此，TGF-β能导致纤维组织积聚。例如，在均为纤维增生性紊乱的糖尿病性肾病和人肾小球系膜增生性肾小球肾炎中，一个突出和重要的病理学特征是肾小球系膜基质的积聚(Mauer等人(1984)临床研究杂志(J.Clin.Invest)74：1143-55)。同样，辐照后纤维变性的特征在于过量的TGF-β，成纤维细胞增生和结缔组织的过量产生(Canney与Dean(1990)英国放射学杂志(Brit.J.Radiol)63：620-23)。本领域的工作者试图通过给予抗TGF-β抗体来抑制TGF-β的作用。见Border等人(1990)自然(Nature)346：371-74；Border等人((1992)国际肾学(Kidney Int)41：566-570)。

TGF-β的生物学效应受几种特异性细胞表面蛋白质的调节，包括所谓的I型、II型和III型TGF-β受体。最初是用双功能试剂DSS将放射性碘化TGF-β化学交联到细胞表面鉴别这些蛋白质的。几乎所有的TGF-β效应细胞系表达I型和II型两种受体，即使它们的表达水平在不同细胞类型之间可能不同。虽然单独的II型受体能结合TGF-β，I型和II型在没有对方存在时都不能介导TGF-β反应。

在开发改进的TGF-β抑制剂以治疗纤维增生性紊乱时，重要的是要认识到这样的抑制剂应当具有比抗TGF-β抗体低得多的分子量和更高的亲和力。这些特征的结合将使剂量大大降低并使给药更加容易。而且天然蛋白质不会导致种间反应。

发明概述

因此，本发明涉及用于纤维增生性紊乱患者的治疗性处理的新组合物和方法。

本发明也涉及重组DNA载体和其使用方法。这些载体能允许TGF-β受体融合蛋白在细菌和哺乳动物宿主细胞中表达。

本发明的一个实施方案是竞争性抑制TGF-β与TGF-β受体结合的分离的TGF-β受体融合蛋白。优选地，该蛋白是连接到另一种蛋白质上的II型TGF-β受体，所述另一种蛋白不是II型TGF-β受体，而是一种免疫球蛋白的恒定区。其他优选的蛋白包含位于TGF-β受体/免疫球蛋白连接处的每一侧包围融合区域的新氨基酸序列SEQ ID NOS：11和13。

此处也包含编码表达连接到另一种非II型TGF-β受体的蛋白质上的II型TGF-β受体的分离的多核苷酸。优选的多核苷酸选自：(a)SEQ IDNOS：1、2、3、4、10和12；(b)在标准杂交条件下可与上述序列杂交，并且编码具有II型TGF-β受体融合蛋白的TGF-β抑制活性的蛋白质的多核苷酸；和(c)一种多核苷酸，其编码经表达所得的蛋白质是由任何上述多核苷酸序列编码的蛋白质。

本发明的药物组合物的示例为药学可接受的载体中的TGF-β受体融合蛋白，该融合蛋白的剂量足够竞争性抑制TGF-β与TGF-β配体的结合。

本发明的方法包括制备TGF-β受体融合蛋白的方法，它包括培养含有本发明的载体的宿主细胞，容许该细胞表达该融合蛋白，分离和纯化融合蛋白。

一个实施方案是降低个体中TGF-β水平的方法，包含给予此个体有效剂量的TGF-β拮抗剂，该拮抗剂是一种包含SEQ ID NOS：8、9、11和13的氨基酸序列的TGF-β受体融合蛋白。

另一个实施方案是降低患有关节炎的个体中TGF-β水平的方法，包含给予此个体有效剂量的TGF-β拮抗剂，该拮抗剂是一种包含SEQ IDNOS：8、9、11和13的氨基酸序列的TGF-β受体融合蛋白。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗带有与纤维增生性紊乱相关的医学症状的个体的方法。此方法提供了将足够剂量的可溶性TGF-β受体融合蛋白给予个体的非肠道给药、口服或局部给药方法，以减少或改善个体的紊乱和/或阻断个体中TGF-β活性。

在另外一个实施方案中，本发明的方法提供了静脉内、眼内、关节内、经皮的和经肠内施用TGF-β受体融合蛋白的方法。在本发明另外一个实施方案中，TGF-β受体融合蛋白施用于有胶原蛋白血管紊乱的患者，如全身性硬皮病、多发性肌炎、硬皮病、皮肌炎或系统性红斑狼疮。

在本发明另外一个实施方案中，TGF-β受体融合蛋白被给予有眼内及肺纤维变性的患者，在另一个实施方案中，TGF-β受体融合蛋白被施用于患糖尿病性肾病、肾小球肾炎、增生性玻璃体视网膜病和类风湿性关节炎的患者。

在另外一个实施方案中，本发明提供了治疗个体的伤口的方法，以避免与TGF-β上调相关的结缔组织结构的过量产生。该方法提供了将足够剂量的TGF-β受体融合蛋白给予个体以降低个体中TGF-β的量或活性的方法。在另外一个实施方案中，伤口类型包括外科切口、外伤引起的撕裂，以及涉及腹膜的伤口，对它来说结缔组织结构的过量产生是腹部粘连。在另外一个实施方案中，被避免的结缔组织结构的过量产生包括疤痕和肥大性疤痕以及瘢痕瘤，其中疤痕包括涉及血管再狭窄的那些疤痕。

在另外一个实施方案中，本发明提供了防止正进行或将要进行放射治疗的个体中辐照后纤维变性的方法。给予足够剂量的TGF-β受体融合蛋白以防止纤维组织结构的过量产生。

需要理解的是上述概括性描述和下面详细描述都是示范性的和解释性的，并意在为所要求保护的专利提供进一步的解释。附图为本发明提供进一步的理解被包括进来并组成此说明书的一部分，阐明本发明的几个实施方案，并与描述一起用于解释本发明的原理。序列表SEQ ID NO：1    兔TGFβRII：Fc表达载体的核苷酸序列

1     GAATTCGAGC TTGCATGCCT GCAGGTCGTT ACATAACTTA CGGTAAATGG

51    CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA

101   CGTATGTTCC CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATTG ACGTCAATGG

151   GTGGAGTATT TACGGTAAAC TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA

201   TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCT

251   GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC TTGGCAGTAC

301   ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA

351   CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC

401   ACCCCATTGA CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC

451   TTTCCAAAAT GTCGTAACAA CTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAG

501   GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG AGCTCGTTTA GTGAACCGTC

551   AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA TAGAAGACAC

601   CGGGACCGAT CCAGCCTCCG GACTCTAGAG GATCCGGTAC TCGAGGAACT

651   GAAAAACCAG AAAGTTAACT GGTAAGTTTA GTCTTTTTGT CTTTTATTTC

701   AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG GTGCAAATCA AAGAACTGCT CCTCAGTGGA

751   TGTTGCCTTT ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC TGCTCTAAAA801      GCTGCGGAAT TGTACCCGCG GCCGCTCTGC CATGGGTCGG GGGCTGCTCC851      GGGGCCTGTG GCCGCTGCAC CTCGTCCTGT GGACGCGCAT CGCCAGCACG901      ATCCCGCCGC ACGTTCAGAA GTCGGTTAAT AACGACATGA TGGTCACGGA951      CAACAATGGC GCCGTCAAGT TCCCACAACT GTGCAAGTTT TGCGATGTGC1001     GATCTTCCAC CTGTGACAAC CAGAAGTCCT GCATGAGCAA CTGCAGCATC1051     ACGTCCATCT GTGAGAAGGC ACACGAAGTC TGCGTGGCCG TCTGGAGGAA1101     GAACGATGAA AACATAACCC TGGAGACTGT GTGTCACGAC CCCAAGCTCG1151     CCTACCATGG ATTCCTTCTG GAAGATTCTG CCTCTCCAAA GTGTATCATG1201     AAAGAAAAGA AGGTGTTTGG GGAGACTTTC TTCATGTGTT CCTGCAGCAC1251     TGACGAGTGC AATGACCACA TCATCTTCTC TGAGGAATAC ACCACCAGCA1301     GTCCGGATCT GGTCGACAAA ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCACCT1351     GAACTCCTGG GGGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA1401     CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTG GTGGTGGACG1451     TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG1501     GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC1551     GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG1601     GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC1651     GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA1701     CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA1751     CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG1801     AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGTTGGA1851     CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA1901     GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG1951     CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAATGAGT2001     GCggccgcGT CGACCGTGAC CCCTGCGCCG CGCGGACTCC TGCCCCGAGG2051     GTCCGGACGC GCCCCAGCTC GCGCCCCTTC CCATATTTAT TCGGACCCCA2101     AGCATCGCCC CAATAAAGAC CAGCAAGCAA CCGGCTGGGG TGTCCGTGCG2151     TGTTAGGGGG CCCGTGGGAC CTCCCTTGCC GTCTCTCCTC GCGCACGGCC2201     CGGGTCCGCC CTGTAGCGCT CGCTGTCTCT CCCCTGCCTG AAGCGCCCCA2251     CCACCGTCTT TCAGGCCCCG GACTTGGTGC CGGGTCCAGG CGTAAAGGAG2301     CAGGTGACTC TGCGCAGCAC TCGCTTTATT TCGCCAGAGT CGCGGGGCGT2351     CCAGAAGGGG CCCCTGGACT CCGGCGCGGG GCCGGCTCAG TCCCGCCCCT2401     TGCCTGCGCG GAGCTTCTGG CGACTCCCAG GCCGCTGCTC CTCGTCGGGA2451     CGCCTCGGGG ACACCCAGGC CTGCTTCTTC CTGGGCTCGG CGTCCCTGGA2501     GTCCCGTGCC CACGGCCGGT GGCCCCCTTC GCGTGACTCC CAGCGCTGGG2551     GTAGGGCTTC CCGGGGCTCC CTGGCGGCCC GTGGCCTCTC CTCTTTCCGC2601     GGCCTCTCTT TCTTAGGTCT CTCCTCCTTC CGCGGCTTCT CCTTCCGCGG2651     CTTCCCCTCT CTCCGAGGCC TCTCCTTGGG TCCCCGGTCT GCGAGGGTCA2701     CACGGTCCTC CCGGACGGCC TCTCCGGTGG CCTCGCCGGG CTCCTCTTCG2751     TCGTTCTCTG CAGCCTCCCG ACTCCCGGGA ATCTTGGGTC TGACCTCTGC2801     CTCGGCCCGG GGCGCAGGCG GCGCTGATGG AGGCGCCTGG GCCTCGAACT2851     TAGGCTGCAA GACAGAGTGG GGTCCTGGGG TAAGCGCCCA CCTTCCCCCC2901     GGCCCGGGCT CCTTCTTTCC TTGGGGATGA AGGTCCCAAT GCCCGCGGTC2951     AGTGGAAGGA AGCTCTTACC AGGGGCGACG ATGGCTCCCT CGGGGCTGAG3001     CTTGGCGGGA CCCAGGGCTC GGGCACACGT GCTTGGAGTG CTGCCTCCGC3051     AGGGACGGCG TCTGCAGCGA CAGGGTCGGG ACCCGAGTCA GCTGGGCCGA3101     GGCACGGTCC ACACTGTCCA TCCCTCCCTC ACCCCTAGAG CCCCCCTCCC3151     TGGACAGTTG GAGTGGGGCT CCCCCGGTAC GGCTGAGACT AAGGATGCCC3201     CCGAGCCGTG GGAAGGGACT CCGGGACTCC GCTGCCGCGG CGCCCCTTCT3251     CCGAACCTCG CTCTTTCAAT TGGTCATTCT TCCCCCCGAC CACGGGCTGT3301     AGGAGGCCCC TAGCAAGGGA GGGGTCGCAG GAGTGCCCCC GGGGGGCGCT3351     CACGAGCTGA GCGGTCCCCA GAGAGGGCGC AGGGGAAAGG CGGCAGAACG3401     CTACGAGGCA GGAGGGGTTG CACAAGGTTC ATCCGGAAGC CAGAACCTAC3451     TCGCGGCGAG GGGAATGGGC CCCGCAAAAG GTCCACACCG GGTGAGAGGG3501     GCGCGCAAGG CCCGTCActt aaGGGACATA TGACGTGAGC TCAGATCTTT3551     GTGAAGGAAC CTTACTTCTG TGGTGTGACA TAATTGGACA AACTACCTAC3601     AGAGATTTAA AGCTCTAAGG TAAATATAAA ATTTTTAAGT GTATAATGTG3651     TTAAACTACT GATTCTAATT GTTTGTGTAT TTTAGATTCC AACCTATGGA3701     ACTGATGAAT GGGAGCAGTG GTGGAATGCC TTTAATGAGG AAAACCTGTT3751     TTGCTCAGAA GAAATGCCAT CTAGTGATGA TGAGGCTACT GCTGACTCTC3801     AACATTCTAC TCCTCCAAAA AAGAAGAGAA AGGTAGAAGA CCCCAAGGAC3851     TTTCCTTCAG AATTGCTAAG TTTTTTGAGT CATGCTGTGT TTAGTAATAG3901     AACTCTTGCT TGCTTTGCTA TTTACACCAC AAAGGAAAAA GCTGCACTGC3951     TATACAAGAA AATTATGGAA AAATATTCTG TAACCTTTAT AAGTAGGCAT4001     AACAGTTATA ATCATAACAT ACTGTTTTTT CTTACTCCAC ACAGGCATAG4051     AGTGTCTGCT ATTAATAACT ATGCTCAAAA ATTGTGTACC TTTAGCTTTT4101     TAATTTGTAA AGGGGTTAAT AAGGAATATT TGATGTATAG TGCCTTGACT4151     AGAGATCATA ATCAGCCATA CCACATTTGT AGAGGTTTTA CTTGCTTTAA4201     AAAACCTCCC ACACCTCCCC CTGAACCTGA AACATAAAAT GAATGCAATT4251     GTTGTTGTTA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA AATAAAGCAA4301     TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT TTTTTCACTG CATTCTAGTT4351     GTGGTTTGTC CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG GATCCTCTAC4401     GCCGGACGCA TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG CGGTTGCTGG4451     CGCCTATATC GCCGACATCA CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG4501     GGCTCATGAG CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA TGGTGGCAGG CCCCGTGGCC4551     GGGGGACTGT TGGGCGCCAT CTCCTTGCAT GCACCATTCC TTGCGGCGGC4601     GGTGCTCAAC GGCCTCAACC TACTACTGGG CTGCTTCCTA ATGCAGGAGT4651     CGCATAAGGG AGAGCGTCGA GACTCCATCT CAAAAATAAA ATAAAATAAA4701     AATTAAAAAA AAAGGG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GTGAGCAA8801   AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA8851   TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA8901   GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA8951   AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC9001   TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC9051   GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATTCCGSEQ ID NO：2    兔TGFβRII：Fc的核苷酸序列

  ATGGGTCGGGGGCTGCTCCGGGGCCTGTGGCCGCTGCACCTCGTCCTGTGGACGCGCATC832

  GCCAGCACGATCCCGCCGCACGTTCAGAAGTCGGTTAATAACGACATGATGGTCACGGAC892

  AACAATGGCGCCGTCAAGTTCCCACAACTGTGCAAGTTTTGCGATGTGCGATCTTCCACC952

  TGTGACAACCAGAAGTCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACGTCCATCTGTGAGAAGGCA1012

  CACGAAGTCTGCGTGGCCGTCTGGAGGAAGAACGATGAAAACATAACCCTGGAGACTGTG1072

  TGTCACGACCCCAAGCTCGCCTACCATGGATTCCTTCTGGAAGATTCTGCCTCTCCAAAG1132

  TGTATCATGAAAGAAAAGAAGGTGTTTGGGGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGCAGCACT1192

  GACGAGTGCAATGACCACATCATCTTCTCTGAGGAATACACCACCAGCAGTCCGGATCTG1252

  GTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA1312

  GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC1372

  ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG1432

  GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG1492

  TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC1552

  AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC1612

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 AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA1972SEQ ID NO：3  人TGFβRII：Fc表达载体的核苷酸序列1    GAATTCGAGC TTGCATGCCT GCAGGTCGTT ACATAACTTA CGGTAAATGG51   CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA101  CGTATGTTCC CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATTG ACGTCAATGG151  GTGGAGTATT TACGGTAAAC TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA201  TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCT251  GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC TTGGCAGTAC301  ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA351  CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC401  ACCCCATTGA CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC451  TTTCCAAAAT GTCGTAACAA CTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAG501  GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG AGCTCGTTTA GTGAACCGTC551  AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA TAGAAGACAC601  CGGGACCGAT CCAGCCTCCG GACTCTAGAG GATCCGGTAC TCGAGGAACT651  GAAAAACCAG AAAGTTAACT GGTAAGTTTA GTCTTTTTGT CTTTTATTTC701  AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG GTGCAAATCA AAGAACTGCT CCTCAGTGGA751  TGTTGCCTTT ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC TGCTCTAAAA801  GCTGCGGAAT TGTACCCGCG GCCGCTCTGC CATGGGTCGG GGGCTGCTCA851  GGGGCCTGTG GCCGCTGCAC ATCGTCCTGT GGACGCGTAT CGCCAGCACG901  ATCCCACCGC ACGTTCAGAA GTCGGTTAAT AACGACATGA TAGTCACTGA951    CAACAACGGT GCAGTCAAGT TTCCACAACT GTGTAAATTT TGTGATGTGA1001   GATTTTCCAC CTGTGACAAC CAGAAATCCT GCATGAGCAA CTGCAGCATC1051   ACCTCCATCT GTGAGAAGCC ACAGGAAGTC TGTGTGGCTG TATGGAGAAA1101   GAATGACGAG AACATAACAC TAGAGACAGT TTGCCATGAC CCCAAGCTCC1151   CCTACCATGA CTTTATTCTG GAAGATGCTG CTTCTCCAAA GTGCATTATG1201   AAGGAAAAAA AAAAGCCTGG TGAGACTTTC TTCATGTGTT CCTGTAGCTC1251   TGATGAGTGC AATGACAACA TCATCTTCTC AGAAGAATAT AACACCAGCA1301   ATCCTGACTT GGTCGACAAA ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCACCT1351   GAACTCCTGG GGGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA1401   CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTG GTGGTGGACG1451   TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG1501   GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC1551   GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG1601   GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC1651   GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA1701   CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA1751   CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG1801   AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGTTGGA1851   CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA1901   GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG1951   CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAATGAGT2001   GCggccgcGT CGACCGTGAC CCCTGCGCCG CGCGGACTCC TGCCCCGAGG2051   GTCCGGACGC GCCCCAGCTC GCGCCCCTTC CCATATTTAT TCGGACCCCA2101   AGCATCGCCC CAATAAAGAC CAGCAAGCAA CCGGCTGGGG TGTCCGTGCG2151   TGTTAGGGGG CCCGTGGGAC CTCCCTTGCC GTCTCTCCTC GCGCACGGCC2201   CGGGTCCGCC CTGTAGCGCT CGCTGTCTCT CCCCTGCCTG AAGCGCCCCA2251   CCACCGTCTT TCAGGCCCCG GACTTGGTGC CGGGTCCAGG CGTAAAGGAG2301   CAGGTGACTC TGCGCAGCAC TCGCTTTATT TCGCCAGAGT CGCGGGGCGT2351   CCAGAAGGGG CCCCTGGACT CCGGCGCGGG GCCGGCTCAG TCCCGCCCCT2401   TGCCTGCGCG GAGCTTCTGG CGACTCCCAG GCCGCTGCTC CTCGTCGGGA2451   CGCCTCGGGG ACACCCAGGC CTGCTTCTTC CTGGGCTCGG CGTCCCTGGA2501   GTCCCGTGCC CACGGCCGGT GGCCCCCTTC GCGTGACTCC CAGCGCTGGG2551   GTAGGGCTTC CCGGGGCTCC CTGGCGGCCC GTGGCCTCTC CTCTTTCCGC2601   GGCCTCTCTT TCTTAGGTCT CTCCTCCTTC CGCGGCTTCT CCTTCCGCGG2651   CTTCCCCTCT CTCCGAGGCC TCTCCTTGGG TCCCCGGTCT GCGAGGGTCA2701   CACGGTCCTC CCGGACGGCC TCTCCGGTGG CCTCGCCGGG CTCCTCTTCG2751   TCGTTCTCTG CAGCCTCCCG ACTCCCGGGA ATCTTGGGTC TGACCTCTGC2801   CTCGGCCCGG GGCGCAGGCG GCGCTGATGG AGGCGCCTGG GCCTCGAACT2851   TAGGCTGCAA GACAGAGTGG GGTCCTGGGG TAAGCGCCCA CCTTCCCCCC2901   GGCCCGGGCT CCTTCTTTCC TTGGGGATGA AGGTCCCAAT GCCCGCGGTC2951   AGTGGAAGGA AGCTCTTACC AGGGGCGACG ATGGCTCCCT CGGGGCTGAG3001   CTTGGCGGGA CCCAGGGCTC GGGCACACGT GCTTGGAGTG CTGCCTCCGC3051   AGGGACGGCG TCTGCAGCGA CAGGGTCGGG ACCCGAGTCA GCTGGGCCGA3101   GGCACGGTCC ACACTGTCCA TCCCTCCCTC ACCCCTAGAG CCCCCCTCCC3151   TGGACAGTTG GAGTGGGGCT CCCCCGGTAC GGCTGAGACT AAGGATGCCC3201   CCGAGCCGTG GGAAGGGACT CCGGGACTCC GCTGCCGCGG CGCCCCTTCT3251   CCGAACCTCG CTCTTTCAAT TGGTCATTCT TCCCCCCGAC CACGGGCTGT3301   AGGAGGCCCC TAGCAAGGGA GGGGTCGCAG GAGTGCCCCC GGGGGGCGCT3351   CACGAGCTGA GCGGTCCCCA GAGAGGGCGC AGGGGAAAGG CGGCAGAACG3401   CTACGAGGCA GGAGGGGTTG CACAAGGTTC ATCCGGAAGC CAGAACCTAC3451   TCGCGGCGAG GGGAATGGGC CCCGCAAAAG GTCCACACCG GGTGAGAGGG3501   GCGCGCAAGG CCCGTCActt aaGGGACATA TGACGTGAGC TCAGATCTTT3551   GTGAAGGAAC CTTACTTCTG TGGTGTGACA TAATTGGACA AACTACCTAC3601   AGAGATTTAA AGCTCTAAGG TAAATATAAA ATTTTTAAGT GTATAATGTG3651   TTAAACTACT GATTCTAATT GTTTGTGTAT TTTAGATTCC AACCTATGGA3701   ACTGATGAAT GGGAGCAGTG GTGGAATGCC TTTAATGAGG AAAACCTGTT3751   TTGCTCAGAA GAAATGCCAT CTAGTGATGA TGAGGCTACT GCTGACTCTC3801   AACATTCTAC TCCTCCAAAA AAGAAGAGAA AGGTAGAAGA CCCCAAGGAC3851   TTTCCTTCAG AATTGCTAAG TTTTTTGAGT CATGCTGTGT TTAGTAATAG3901   AACTCTTGCT TGCTTTGCTA TTTACACCAC AAAGGAAAAA GCTGCACTGC3951   TATACAAGAA AATTATGGAA AAATATTCTG TAACCTTTAT AAGTAGGCAT4001   AACAGTTATA ATCATAACAT ACTGTTTTTT CTTACTCCAC ACAGGCATAG4051   AGTGTCTGCT ATTAATAACT ATGCT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 ATGGGTCGGGGGCTGCTCAGGGGCCTGTGGCCGCTGCACATCGTCCTGTGGACGCGTATC832

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 AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG1732

  GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGAC1792

  TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG1852

  GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG1912

  AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAT1972SEQ ID NO：5  正向引物-兔与人

5′  -AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCTGCCATGGGTCGGGGGCTG-  3′SEQ ID NO：6  反向引物-兔

5′  -AGTTTTGTCGACCAGATCCGGACTGCTGGGTGGT-  3′SEQ ID NO：7  反向引物-人

5′  -AGTTTTGTCGACCAAGTCAGGATTGCTGGTGTTA-  3′SEQ ID NO：8  兔TGFβRII：Fc的氨基酸序列M   G   R   G   L   L   R   G   L   W   P   L   H   L   V   L   W   T   R   I1A   S   T   I   P   P   H   V   Q   K   S   V   N   N   D   M   M   V   T   DN   N   G   A   V   K   F   P   Q   L   C   K   F   C   D   V   R   S   S   TC   D   N   Q   K   S   C   M   S   N   C   S   I   T   S   I   C   E   K   AH   E   V   C   V   A   V   W   R   K   N   D   E   N   I   T   L   E   T   VC   H   D   P   K   L   A   Y   H   G   F   L   L   E   D   S   A   S   P   KC   I   M   K   E   K   K   V   F   G   E   T   F   F   M   C   S   C   S   TD   E   C   N   D   H   I   I   F   S   E   E   Y   T   T   S   S   P   D   LV   D   K   T   H   T   C   P   P   C   P   A   P   E   L   L   G   G   P   S161V   F   L   F   P   P   K   P   K   D   T   L   M   I   S   R   T   P   E   VT   C   V   V   V   D   V   S   H   E   D   P   E   V   K   F   N   W   Y   VD   G   V   E   V   H   N   A   K   T   K   P   R   E   E   Q   Y   N   S   TY   R   V   V   S   V   L   T   V   L   H   Q   D   W   L   N   G   K   E   YK   C   K   V   S   N   K   A   L   P   A   P   I   E   K   T   I   S   K   AK   G   Q   P   R   E   P   Q   V   Y   T   L   P   P   S   R   D   E   L   TK   N   Q   V   S   L   T   C   L   V   K   G   F   Y   P   S   D   I   A   VE   W   E   S   N   G   Q   P   E   N   N   Y   K   T   T   P   P   V   L   DS   D   G   S   F   F   L   Y   S   K   L   T   V   D   K   S   R   W   Q   QG   N   V   F   S   C   S   V   M   H   E   A   L   H   N   H   Y   T   Q   KS   L   S   L   S   P   G   KSEQ IDNO：9    人TGFβRII：Fc的氨基酸序列M   G   R   G   L   L   R   G   L   W   P   L   H   I   V   L   W   T   R   I1A   S   T   I   P   P   H   V   Q   K   S   V   N   N   D   M   I   V   T   DN   N   G   A   V   K   F   P   Q   L   C   K   F   C   D   V   R   F   S   TC   D   N   Q   K   S   C   M   S   N   C   S   I   T   S   I   C   E   K   PQ   E   V   C   V   A   V   W   R   K   N   D   E   N   I   T   L   E   T   VC   H   D   P   K   L   P   Y   H   D   F   I   L   E   D   A   A   S   P   KC   I   M   K   E   K   K   K   P   G   E   T   F   F   M   C   S   C   S   SD   E   C   N   D   N   I   I   F   S   E   E   Y   N   T   S   N   P   D   LV   D   K   T   H   T   C   P   P   C   P   A   P   E   L   L   G   G   P   S161V   F   L   F   P   P   K   P   K   D   T   L   M   I   S   R   T   P   E   VT   C   V   V   V   D   V   S   H   E   D   P   E   V   K   F   N   W   Y   VD   G   V   E   V   H   N   A   K   T   K   P   R   E   E   Q   Y   N   S   TY   R   V   V   S   V   L   T   V   L   H   Q   D   W   L   N   G   K   E   YK   C   K   V   S   N   K   A   L   P   A   P   I   E   K   T   I   S   K   AK   G   Q   P   R   E   P   Q   V   Y   T   L   P   P   S   R   D   E   L   TK   N   Q   V   S   L   T   C   L   V   K   G   F   Y   P   S   D   I   A   VE   W   E   S   N   G   Q   P   E   N   N   Y   K   T   T   P   P   V   L   DS   D   G   S   F   F   L   Y   S   K   L   T   V   D   K   S   R   W   Q   QG   N   V   F   S   C   S   V   M   H   E   A   L   H   N   H   Y   T   Q   KS   L   S   L   S   P   G   KSEQ ID NO：10    兔RII：Fc融合“结合部”核苷酸序列

     TCTGAGGAATACACCACCAGCAGTCCGGATCTGGTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCASEQ ID NO：11    兔RII：Fc融合“结合部”氨基酸序列

     S  E  E  Y  T  T  S  S  P  D  L  V  D  K  T  H  T  C  P  P  C  PSEQ ID NO：12    人RIII：Fc融合“结合部”核苷酸序列

     TCTCAGAAGAATATAACACCAGCAATCCTGACTTGGTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC

     CCASEQ ID NO：13    人RII：Fc融合“结合部”氨基酸序列

     S  E  E  Y  N  T  S  N  P  D  L  V  D  K  T  H  T  C  P  P  C  P详细描述此处用下列术语：定义

用于此处的“重组体”是指衍生自重组(如微生物的或哺乳动物的)表达系统的一种蛋白质。“微生物的”指的是由细菌或真菌(如酵母)表达系统产生的重组蛋白质。作为一种产物，“微生物重组体”是指由基本上无天然内源性物质的微生物表达系统产生的一种蛋白质。大多数细菌培养物如大肠杆菌中表达的蛋白质不含多糖。酵母中表达的蛋白质可能具有与哺乳动物细胞中表达的蛋白质不同的糖基化类型。

用于整个说明书中作为TGF-β受体的一个特征的术语“有生物学活性的”，表示的是一种特定分子，它与本发明此处公开的实施方案有足够的氨基酸序列同源性，因此能与可检测量的TGF-β相结合，和/或将TGF-β刺激传递给细胞，例如作为杂合受体构建体的一部分，或者可与针对天然(即非重组的)来源的TGF-β受体产生的抗TGF-β受体抗体发生交叉反应。优选地，本发明范围内包括的有生物学活性的TGF-β受体融合蛋白能够在标准结合方法中与多于每纳摩尔受体0.1纳摩尔量的TGF-β结合，最优选地，能与超过每纳摩尔受体0.5纳摩尔量的TGF-β结合。

类似地，用于此处的“TGF-β结合分子”是任何表现出与TGF-β受体融合蛋白相同的，或者基本上相同的生物学活性的分子。

“个体”指的是活的生物体，包括人、其他哺乳动物和任何其他产生TGF-β的动物。

用于此处的“TGF-β过量产生”是指存在于血清或组织中的明显超过正常水平的TGF-β的数量。更优选地，TGF-β过量产生是正常水平的约2到约20倍的水平。更优选地，TGF-β过量产生是正常水平的约2到约15倍的水平。例如，Deguchi测定了支气管肺泡细胞的24小时TGF-β产生量，并且报道正常水平为410±225pg/10⁷个细胞，而在系统性红斑狼疮中过量TGF-β的产生水平是1288±453pg/10⁷个细胞，在硬皮病中水平为1417±471pg/10⁷个细胞((1992)风湿病学年鉴(Ann.Rheum.Dis)51：362-65)，可以通过测定TGF-β蛋白、TGF-βmRNA或者TGF-β所刺激合成的产物如胶原蛋白来测定TGF-β的过量产生以及其正常水平。

“结缔组织”是特征在于存在成纤维细胞和例如胶原蛋白和弹性蛋白的纤维性蛋白的纤维性组织。

“纤维性增生紊乱”的特征在于成纤维细胞的增生和相应的细胞外基质如纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白的过量产生。

用于此处的“药物组合物”被定义为包含本发明的蛋白质和其它生理学相容的成分。药物组合物可以包含赋形剂如水、矿物质和载体如蛋白质。

用于此处的“足够剂量的”本发明的蛋白质是指能中和过量的TGF-β生物学活性的量的TGF-β受体融合蛋白。它的确定可以通过(1)适当的临床参数改善，(2)对纤维变性和/或对纤维变性的免疫抑制或预防的影响的病理学评价，或(3)TGF-β的直接抑制。

“氨基酸”是肽、多肽或蛋白质的单体单位。在天然存在的肽、多肽和蛋白质中发现有20种氨基酸，都是L-异构体。此术语也包括这些氨基酸的类似物和这些蛋白质氨基酸的D-异构体及其类似物。

“蛋白质”是任何基本上由20种氨基酸中任何一种构成的多聚物。虽然“多肽”经常用于指相对大的多肽，“肽”经常用于指小的多肽，本领域中这些术语的用法已经交叉并且可以改变。除非另外指出，用于此处的术语“蛋白质”指的是肽、蛋白质和多肽。

一种氨基酸残基的“功能等同物”是指一种与被功能等同物替换的氨基酸残基具有类似的物理化学特性的氨基酸。

“融合”是指两种或多种蛋白质或其片段通过它们各自的肽骨架进行串联的共价连接，最优选地是通过编码这些蛋白质的多核苷酸分子的遗传表达。

“突变”是生物体遗传物质的任何改变，尤其是野生型多核苷酸序列的任何改变(即缺失、替换、添加或变更)或野生型蛋白质的任何改变。

“野生型”是正常存在于体内的，天然存在的一种蛋白质的外显子或其一部分的多核苷酸序列，或者是蛋白质序列或其一部分。

“标准杂交条件”是盐和温度条件基本上为杂交和洗涤均用0.5×SSC到约5×SSC和65℃。因此用于此处的术语“标准杂交条件”是一个操作定义，包括一定范围的杂交条件。例如严格性较高的条件可以包括与噬斑筛选缓冲液(0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％Ficoll 400；0.2％牛血清白蛋白，50mM Tris-HCl(pH7.5)；1M NaCl；0.1％焦磷酸钠；1％SDS)；10％硫酸葡聚糖和100μg/ml变性的、超声处理的鲑鱼精DNA在65℃杂交12-20小时，并用75mM NaCl/7.5mM柠檬酸钠(0.5×SSC)/1％SDS在65℃洗涤。严格性较低的条件可以包括例如与噬斑筛选缓冲液、10％硫酸葡聚糖和110μg/ml变性的、超声处理的鲑鱼精DNA在55℃杂交12-20小时，并用300mM NaCl/30mM柠檬酸钠(2.0×SSC)/1％SDS在55℃洗涤。也可以见当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，Inc.New York，6.3.1-6.3.6，(1989)

“表达控制序列”是当与基因有效连接时控制和调节这些基因表达的一段多核苷酸序列。

“有效连接”是当表达控制序列可控制和调节该多核苷酸序列的转录和翻译时，一段多核苷酸序列(DNA，RNA)称为有效连接到表达控制序列上。术语“有效连接”包括在待表达的多核苷酸序列前面带有合适的启始信号(如ATG)，维持正确的读框使多核苷酸序列在表达控制序列的控制下表达，并且产生所期望的该多核苷酸序列编码的多肽。

“表达载体”是当表达载体被导入宿主细胞时允许至少一个基因表达的一段多核苷酸，如DNA质粒或噬菌体(在其它常见实例中)。该载体可以有或没有在细胞中复制的能力。

“分离的”(可以与“基本上纯的”互换使用)，当用于核酸即编码多肽的多核苷酸序列时，表示DNA或RNA多核苷酸、基因组多核苷酸的一部分、cDNA或合成的多核苷酸，由于其来源或处理的特点，它(i)不与本身天然相关的多核苷酸结合(如作为表达载体或者其一部分存在于宿主细胞中)，或者(ii)与核酸或其它化学部分连接，而不是与其天然连接的物质连接，或者(iii)天然不存在。“分离的”还表示多核苷酸序列(i)通过如聚合酶链式反应(PCR)体外扩增得到的；(ii)化学合成的；(iii)通过克隆重组产生的；或(iv)通过切割和凝胶分离纯化得到的。

因此，“基本上纯的核酸”是与其来源的生物体之天然存在的基因组中正常相邻的编码序列的一端或两端均不再紧密相邻的核酸。基本上纯的DNA也包括作为编码附加序列的杂合基因的一部分的重组DNA。

“分离的”(可以与“基本上纯的”互换使用)，当用于多肽时，表示多肽或其一部分，由于其来源或处理的特点，它(i)作为表达载体的一部分的表达产物存在于宿主细胞中，或(ii)与蛋白质或其它化学部分连接，而不是与其天然连接的物质连接，或者(iii)天然不存在。“分离的”还可表示蛋白质，它是(i)化学合成的；或者(ii)在宿主细胞中表达并且从相关蛋白质中纯化出来的。此术语通常表示从其天然存在的其它蛋白质和核酸中分离出来的一种多肽，优选地，此多肽也可以从例如用于纯化它的抗体或凝胶基质(聚丙烯酰胺)的物质中分离得到。

用于此处的“异源启动子”是不与基因或纯化的核酸天然相关的启动子。

用于此处的“同源的”与术语“等同”同义，指的是两种多肽、分子或两种核酸之间的序列相似性。当要比较的两种序列在某一位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单位占据时(例如，如果两个DNA分子在某一位置都是腺嘌呤，或者两个多肽在某一位置都是赖氨酸)，那么两个分子在此位置是同源的。两段序列之间的同源性百分率是如下表示的一种函数，两段序列之间匹配或同源的位置的数量除以要比较的位置的数量乘100。例如，如果两段序列的10个位置有6个是匹配或同源的，那么这两段序列有60％的同源性。以举例的方式，DNA序列CTGACT和CAGGTT有50％的同源性(总共6个位置中有3个匹配)。通常，当两段序列排列产生最高同源性时进行比较。参考的实例见定义。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”此处可以互换使用。术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”此处也可以互换使用。

除非另外指出，本发明的实施将应用本领域技术人员已知的传统的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白质化学和免疫学技术。文献中描述了这些技术。见，例如，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版(Sambrook，Frisch和Maniatis编)冷泉港实验室出版，1989；DNA克隆(DNA Cloning)，卷I与II(D.N.Glover编)，1985；寡聚核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，(M.J.Gate，编)，1984；美国专利第4,683,195(Mulls等人)；核酸杂交(Necleic Acid Hybridization)(B.D.Hames与S.J.Higgins，编)，1984；转录与翻译(Transcription andTranslation)(B.D.Hames与S.J.Higgins，编)，1984；动物细胞培养(Culture of Animal Cells)(R.J.Freshney，编)，Alan R.Liss，Inc.，1987；固定化细胞与酶(Immobilized Cells and Enzymes)，IRL Press，1986；分子克隆操作指南(A Pratical Guide to Molecular Cloning)(B.Perbal)，1984；酶学方法(Methods in Enzymology)，卷154与155(Wu等人，编)，Academic Press，New York；哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.H.Miller与M.P.Calos，编)，1987，冷泉港实验室；细胞与分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology)(Mayer与Walker，编)，Academic Press，London，1987；实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)，卷I-IV(D.M.Weir与C.C.Blackwell，编)，1986；小鼠胚胎操作(Manipulating the MouseEmbryo)，冷泉港实验室出版，1986。II分离的蛋白质和多核苷酸的普通性质A.作为TGF-β拮抗剂的可溶性TGF-β受体融合蛋白和它们的类似物

本发明使用分离和纯化过的TGF-β拮抗剂多肽。本发明中使用的分离和纯化过的TGF-β拮抗剂多肽基本上无其他天然或内源性污染物，并且包含少于约1％质量百分比的制备过程中的蛋白质污染物残留。本发明使用的TGF-β拮抗剂多肽可以任选的无相关的天然类型的糖基化。

用于此处的术语“TGF-β受体”是指具有基本上类似于天然哺乳动物TGF-β受体或TGF-β结合分子序列的氨基酸序列的蛋白质，并且它能够结合TGF-β，并抑制TGF-β与含有TGF-β受体的细胞膜结合。优选的TGF-β受体是成熟的全长II型TGF-β受体。II型TGF-β受体是一种膜结合蛋白质，具有胞内结构域、跨膜结构域和可与TGF-β结合的胞外部分。已确定人II型TGF-β受体具有Lin等人，细胞(Cell)：68，775-785(1992)中所示的氨基酸序列，并在美国专利5,693,607中被更正。

本发明中优选的TGF-β受体是II型TGF-β受体的可溶性形式，以及II型TGF-β结合分子。可溶性TGF-β受体包括例如，具有至少20个氨基酸并且表现出与II型TGF-β受体或TGF-β结合分子至少有某些相同的生物学活性的天然蛋白质的类似物或者亚单位。

术语“II型TGF-β受体融合蛋白”或“TGF-β RII：Fc”可以互换使用，代表本发明的组合物的最优选的实施方案。这种融合蛋白包含与另一种蛋白质(非II型TGF-β受体)的至少一部分相连接的TGF-β受体(II型)的至少一部分。尤其地，另一种蛋白质可以是免疫球蛋白(优选IgG，最优选IgG1)的恒定区，或是其一部分如铰链区，C_H2或C_H3。本发明优选的融合蛋白是相互之间以二硫键连接的同源二聚体，但异源二聚体形式也可以落在本发明的范围内，见IV部分。

因此，本发明最优选的组合物为可溶性融合蛋白的TGF-β拮抗剂，例如具有取代了免疫球蛋白分子的轻链和重链之一或全部的可变区的TGF-β序列，并且具有未修饰的恒定区结构域的重组嵌合抗体分子。例如，嵌合TGF-β RII/IgG1由嵌合基因：TGF-β RII/人γ1重链嵌合体产生。在嵌合基因转录和翻译之后，基因产物装配进具有TGF-β受体成对出现的同源二聚体中。这种TGF-β受体的多价形式可能具有对TGF-β配体的提高的结合亲和力。

本发明的可溶性TGF-β受体构建体缺乏跨膜区(并且从细胞中分泌)但保留了结合TGF-β的能力。多种生物学等同的蛋白质和氨基酸类似物具有相应于天然TGF-β受体的全部或部分的氨基酸序列(如SEQ IDNO：8或9)，或者具有与SEQ ID NO：8或9的序列基本上类似或至少有60％同源性的氨基酸序列，并且该序列有生物学活性，表现在它们可与TGF-β配体结合。等同的TGF-β受体包括从这些序列通过一个或多个缺失、替换或添加而变化来的多肽，这些多肽保留了与TGF-β结合的能力，以及抑制经由细胞表面结合的TGF-β受体蛋白质的TGF-β信号传导活性的能力。TGF-β信号传导活性的抑制可以通过将重组TGF-β受体DNA转染细胞以获得重组受体表达来确定。然后将细胞与TGF-β接触并检查得到的代谢效果。如果得到的结果是由于配体的作用，那么重组受体具有信号传导活性。确定一种多肽是否具有信号传导活性的示范性步骤被Idzerda等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)171：861(1990)；Curtis等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)86：3045(1989)；Prywes等人EMBO J.5：2179(1986)和Chou等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)262：1842(1987)公开。或者，也可以用表达内源性TGF-β受体并且具有可检测到的对TGF-β的生物反应的原代细胞或细胞系。

本发明蛋白质的“片段”是能够结合TGF-β的蛋白质的一部分或全部。优选地，该片段具有对TGF-β的高亲和力。优选的融合蛋白片段是包含II型TGF-β受体的细胞外区域的至少一部分的蛋白质片段，且与免疫球蛋白恒定区的至少一部分相连接。虽然亲和力随着不同大小的片段改变相当大，范围从10^-7到10^-13M，优选地，亲和力的范围从约10^-11到10^-12M。在一个实施方案中，片段的长度为约10-110个氨基酸，并且包含与免疫球蛋白恒定区的至少一部分相连接的TGF-β结合位点。

如果TGF-β受体的细胞外结构域的天然氨基酸序列(如SEQ IDNO：8或9的1到160的氨基酸)被用于融合蛋白中，该氨基酸序列类似于II型受体的完整的细胞外部分的序列。当采用较小的II型TGF-β受体部分时，只要它们以高亲和力结合II型TGF-β，它们可类似于II型TGF-β受体的细胞外部分的多个部分。虽然所给“片段”的序列最优选是基于天然II型TGF-β受体的细胞外区域，此定义也包括了具有对TGF-β高亲和力的本发明蛋白质的类似物。这种类似物包括通过氨基酸的保守置换得到的那些，以及合成此片段的突变细胞产生的那些。

用于本发明方法的TGF-β受体家族成员包括任何天然存在的天然蛋白质，包括其等位变体、系统发育的等同物，或者天然来源或化学方法产生的它们的其他变体(包括突变蛋白质或突变体蛋白)，以及该家族的重组体形式和新的活性成员。这些多肽包含与SEQ ID NO：8或9的氨基酸序列有至少60％、80％、90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。该多肽也可以包含基本上与SEQ ID NO：8或9的氨基酸序列相同的氨基酸序列。该多肽长度至少为5、10、20、50、100或150个氨基酸，并且包含至少5个、优选10个、更优选20个、最优选至少50、100或150个SEQ ID NO：8或9的连续氨基酸。

本发明的多肽包括由于多基因、可变转录事件、可变RNA剪接事件、以及可变翻译和翻译后事件的存在而导致产生的那些多肽。该多肽可以全部通过合成方法产生，或者在由例如培养的细胞的系统中表达产生，其导致与当蛋白质在天然细胞中表达时基本上相同的翻译后修饰事件，或者在这样的系统中表达，其导致缺乏当在天然细胞中表达时所进行的翻译后修饰。B.分离的多核苷酸序列

本发明优选的多核苷酸衍生自编码经表达为野生型TGF-β受体(例如SEQ ID NO.：1-4、10和12)的多核苷酸，也可以见美国专利5,693,607。编码II型TGF-β受体分子的cDNA(即SEQ ID NO.：2或SEQ IDNO.：4的832-1311位置的核苷酸)是编码TGF-β受体的互补DNA(cDNA)。其它TGF-β受体家族的成员被称为野生型I型TGF-β多核苷酸(REF)和野生型III型多核苷酸(REF)。

此外，SEQ ID NOS.：1-4、10和12描述的分离的多核苷酸可以被改变以提供功能等同的多核苷酸。如果一种多核苷酸满足至少下列条件之一，那么它与SEQ ID NOS.：1-4、10和12的多核苷酸相比是“功能等同的”：(a)此“功能等同物”是在标准杂交条件下可与前述序列(SEQID NOS.：1-4、10、12)杂交的多核苷酸。最优选地，它编码具有与野生型TGF-β受体相同的生物学活性的TGF-β受体蛋白；和(b)此“功能等同物”是这样一种多核苷酸，其编码经表达所得氨基酸序列为被SEQID NOS.：1-4、10和12的任何多核苷酸编码的氨基酸序列。

由于核苷酸编码序列的简并性，也可以用其它多核苷酸编码TGF-β受体或其融合蛋白。对于II型TGF-β受体，这些多核苷酸包括通过替换了该序列中编码相同氨基酸残基的不同密码子，因此产生沉默改变的编码SEQ ID NO：8或9序列的DNA的全部或部分。这种改变的序列被称为SEQ ID NO：8或9的等同物。例如，苯丙氨酸(f)被两种密码子TTC或TTT编码，酪氨酸(Y)被TAC或TAT编码，组氨酸(H)被CAC或CAT编码。另一方面，色氨酸(W)被单独的密码子TGG编码。因此，可以理解对于给定的编码一种特定蛋白质的DNA序列，有多种DNA简并序列可以编码它。这些简并的DNA序列也认为落在本发明的范围内。

掺入兔II型TGF-β受体的本发明的融合蛋白，其cDNA和推导出的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：2和8。掺入人II型TGF-β受体的融合蛋白，其cDNA和推导出的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：4和9。

本发明优选的TGF-βRII：Fc蛋白质包括新的“接合”DNA序列SEQID NO：10和氨基酸SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：10代表位于兔TGF-βRII DNA和免疫球蛋白DNA之间CTG/GTC接合部的任意一侧的11个三联体密码子。在SEQ ID NO：10中，TGF-β序列在CTG三联体后结束，免疫球蛋白序列在GTC三联体处开始。相应的推导出的兔氨基酸“接合”序列在SEQ ID NO：11中给出，其中TGF-β受体序列的末端是亮氨酸，而免疫球蛋白序列的开始是紧接其后的缬氨酸。相应的“接合”人cDNA和氨基酸序列分别是SEQ ID NO：12和13。在SEQ ID NO：2中，相应的接合部在自核苷酸1309的三联体开始，在自核苷酸1312的三联体结束。

可能SEQ ID NO：10和12是在标准杂交条件下可与任何编码任一TGF-β受体：Fc融合蛋白的DNA序列杂交所需的最小的DNA。然而，在整个探针杂交到接合部的两侧以及TGF-β受体/恒定区接合部的两侧都参与了杂交的情况下，可以有更小的序列。而且，本领域普通技术人员应该理解比SEQ ID NO：10和12更大的DNA序列也应该适合于杂交。通过利用多核苷酸激酶以适当标记的ATP的磷标记单链有义寡核苷酸或单链反义寡核苷酸中任意一个的5′末端，一个本领域普通技术人员能够检测例如SEQ ID NO：10和12的特定探针是否能够与接合部的两侧都杂交。本发明的序列必定能与两种寡核苷酸探针杂交，因此被二者都标记上。进一步可以理解本发明包括编码SEQ ID NO：10和12接合部的完全简并的序列。

如同大多数哺乳动物基因，哺乳动物TGF-β受体被假定由多外显子基因编码。也可以使用由于转录后不同的mRNA剪接造成的、与此处所要求保护的cDNA有等同或类似的大段区域的其它mRNA构建体。包含TGF-βRII：Fc cDNA克隆的载体被用于表达和纯化可溶性TGF-βRII：Fc。表达融合蛋白的质粒已经被保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，12301 Parklawn Drive，Rockville，Md.20852，美国(保藏号＿＿＿＿)，名称为＿＿＿＿。

其它哺乳动物TGF-β受体cDNA可以通过利用合适的人TGF-β受体DNA序列作为探针从特定的哺乳动物cDNA文库中用种间杂交的方法分离。以举例的方式，用于本发明的哺乳动物TGF-β受体包括灵长类、人、鼠、犬、猫、牛、马、和猪的TGF-β受体。用衍生自人TGF-β受体DNA序列的单链cDNA作为杂交探针通过种间杂交方法，从哺乳动物cDNA文库中分离TGF-β受体cDNA，可以获得哺乳动物TGF-β受体。III重组多肽的制备

此处描述的分离的多肽可以用任何合适的本领域已知的方法制备。这些方法的范围包括从直接蛋白质合成方法，到构建编码分离的多肽序列的DNA序列并在合适的转化宿主中表达这些序列的方法。例如，用标记的编码SEQ ID NO：8、9、11或13的DNA片段从人cDNA文库中筛选并用放射自显影确定阳性克隆，获得cDNA。接下来用传统方法进行几次噬斑纯化和杂交。

在一个重组方法的实施方案中，通过分离或者合成编码野生型目标蛋白的DNA序列构建DNA序列。任选地，可通过定点突变诱变该序列以提供其功能类似物。见Zoeller等人，美国国家科学院院报81：5662-5066(1984)和美国专利4,588,585。另一种构建编码野生型目标蛋白的DNA序列的方法是利用寡核苷酸合成仪的化学合成方法。这样的寡核苷酸可优选地基于期望的多肽的氨基酸序列来设计，并且优选地选择那些适合于在其中产生重组目标多肽的宿主细胞的密码子。

可以用标准方法合成编码分离的目标多肽的分离的多核苷酸序列。例如，可以从完整的氨基酸序列构建反向翻译得出的基因，见Maniatis等人，出处同前。而且可以合成包含编码特定分离的多肽的核苷酸序列之DNA寡聚体。例如，可以合成编码期望的多肽部分的几种小寡核苷酸，然后将其连接。单个寡核苷酸典型地包含用于互补性装配的5′或3′冗余。

一旦装配(通过合成、定点突变或另外的方法)，编码特定分离的目标多肽的突变DNA序列会被插入表达载体，并且与适合于该蛋白质在期望宿主中表达的表达控制序列有效连接。通过核苷酸测序、限制性酶切图谱以及在合适的宿主中表达有生物学活性的多肽，可以证实正确的装配。如本领域众所周知的，为了获得宿主中转染基因的高表达水平，该基因必须与在所选表达宿主中有功能的转录和翻译表达控制序列有效连接。A.重组TGF-β受体的表达

优选用重组表达载体扩增或表达编码TGF-β受体融合蛋白的DNA。重组表达载体是具有合成的(或者得自cDNA的)DNA片段的可复制DNA构建体，该DNA片段编码TGF-β受体融合蛋白或者与合适的衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的转录或翻译调节元件有效连接的生物学等同的类似物。转录单位通常包含下列成分的组合：(1)遗传元件或者对基因表达具有调节作用的元件，如转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并且翻译成蛋白质的结构序列或编码序列，和(3)如后面详细描述的合适的转录和翻译启始序列和终止序列。这种调节元件可以包含控制转录的操纵子序列。另外可以附加上在宿主中复制的能力，这种能力通常由复制起点和便于识别转化子的选择性基因所赋予。当DNA区域为功能上彼此相关时称为有效连接。例如，当信号肽(分泌前导物)的序列作为参与一种多肽分泌的前体而表达时，它与这种多肽的DNA是有效连接；当启动子控制编码序列的转录时，它与该序列是有效连接；当核糖体结合位点所处位置容许翻译进行时，它与编码序列是有效连接。通常，有效连接表示相邻的，并且在分泌性前导物的情况下为连续的并位于读框中。试图用于酵母表达系统的结构元件优选地包含使宿主细胞中翻译的蛋白质能够分泌到细胞外的前导序列。或者，当重组蛋白质在没有前导物或运载序列情况下表达时，它可以包含一个N末端甲硫氨酸残基。此残基可以任选地随后被从表达的重组蛋白质中切除以获得最终产物。

作为融合蛋白在微生物中待表达的编码哺乳动物TGF-β受体的DNA序列可以优选地包含能够过早地终止DNA转录成mRNA的内含子，这是因为这种过早的转录终止可能是期望的，例如，它会造成含有有利的C末端平截的突变体，例如，跨膜区的缺失产生了不与细胞膜结合的可溶性受体。由于密码子的简并性，在编码相同氨基酸序列的核苷酸序列中可以有相当多的变化。如上面讨论的，其它的实施方案包括，在标准条件(50摄氏度，2×SSC)下能与提供eDNA的序列杂交的序列，以及能简并为编码本发明有生物学活性的蛋白质的序列或者能与之杂交的序列。

表达控制序列和表达载体的选择依赖于宿主的选择。可以采用多种表达宿主/载体的组合。用于真核宿主的表达载体包括例如，含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9和其衍生物，更广的宿主范围的质粒如M13和丝状单链DNA噬菌体。优选的大肠杆菌载体包括含有λ噬菌体pL启动子的pL载体(美国专利4,874,702)，含有T7聚合酶启动子的pET载体(Studier等人，酶学方法(Methods in Enzymology)185：60-89，1990)以及pSP72载体(Kaelin等人，如上述)。用于酵母细胞的表达载体例如包括2μ和着丝粒质粒。

另外，表达控制序列的任何一种广泛的变体都可以用于这些载体。这些有用的表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因相关的表达控制序列。有用的表达控制序列的实例包括，例如，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域(例如pL)、fd外壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子如Pho5、酵母α-交配系统的启动子和其它已知控制原核或真核细胞和其病毒的基因表达的序列，以及它们的不同组合。

重组TGF-β受体DNA或重组TGF-β R：Fc DNA在包含有合适宿主的基本上同源的纯培养的重组表达系统中表达或扩增，该宿主中已经将重组转录单位整合进(通过转化和转染)染色体DNA或者携带有作为驻留质粒成分的重组转录单位。通常，组成系统的细胞是单独的原初转化子的后代。通过与待表达的DNA序列或合成基因相连接的调节元件的诱导，此处定义的重组表达系统表达异源蛋白质。

表达哺乳动物TGF-β受体及其融合蛋白的合适宿主细胞包括受合适启动子控制的原核生物、酵母或更高等的真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。更高等的真核细胞包括下述已建立的哺乳动物来源的细胞系。利用衍生自本发明DNA构建体的RNA，也可以用无细胞翻译系统生产哺乳动物TGF-β受体和TGF-β R：Fc。与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的合适的克隆和表达载体的描述见Pouwels等人(克隆载体：实验室手册(Cloning Vectors：A Laboratory Manual)Elsveire，N.Y.，1985)，其相关的公开内容在此引入作为参考。

本发明的重组蛋白质也可以在酵母宿主中表达，优选地来自酵母属(Saccharomyces)的种，如酿酒酵母。也可以用其它属的酵母如毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。酵母载体通常包括来自2μ酵母质粒的一个复制起点或一段自主复制序列(ARS)、启动子、编码本发明蛋白质的DNA和用于多聚腺苷酸化和转录终止的DNA序列以及一个选择性基因。优选地，酵母载体包括一个复制起点和容许酵母和大肠杆菌都能转化的选择性标记，例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因，和为缺乏在色氨酸中生长的能力之酵母突变株提供选择性标记的酿酒酵母TRP1或URA3基因，以及一个衍生自诱导下游结构序列转录的高表达酵母基因的启动子。那么通过在无色氨酸或尿嘧啶时生长，酵母宿主细胞基因组中TRP1或URA3存在损伤为检测转化提供了有效的环境。

酵母载体中合适的启动子序列包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)255：2073，1980)，或者其它糖酵解酶的启动子(Hess等人，(J.Adv.Enzyme.Reg.)7：149，1968；和Holland等人，生物化学(Biochem)7：4900，1978)，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。用于酵母表达的合适的载体和启动子还见R.Hitzeman等人，EPA73，657中的描述。优选的酵母载体可以用来自pUC18的DNA序列组装用于大肠杆菌中的筛选和复制。(Amp^r基因和复制起点)和包括一个葡萄糖抑制ADH2启动子和一个α-因子分泌前导序列的酵母DNA序列。ADH2启动子已经被Russell等人(生物化学杂志258：2674，1982)和Beier等人(自然(Nature)300：724，1982)描述。指导异源蛋白质分泌的酵母α-因子前导序列可以被插入到启动子和待表达的结构基因之间。见例如Kurjan等人，细胞(Cell)30：933，1982；和Bitter等人，美国国家科学院院报81：5330，1984。前导序列可以被修饰成在其3′末端附近包含一个或多个有用的限制性位点，以便于前导序列与外源蛋白质的融合。

本领域技术人员已知合适的酵母转化方案，如Sherman等人，酵母遗传学方法实验室操作手册(Laboratory Course Manual for Methodsin Yeast Genetics)，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.，1986所描述的，Hinnen等人，美国国家科学院院报75：1929，1978描述了一种示范性技术。

不同的哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以有利地被用于表达重组蛋白质。尤其优选在哺乳动物细胞中表达重组蛋白质，因为这样的蛋白质通常是正确折叠、被合适地修饰并且是完全有功能的。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括，Gluzman(细胞23：175，1981)描述的猴肾细胞的COS-7细胞系，以及其它能够表达合适载体的细胞系，包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa和BHK细胞的细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，例如与要表达的基因连接的复制起点、合适的启动子和增强子，以及其它5′或3′旁侧非转录序列，和5′或3′非翻译序列(例如必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列)。用于在昆虫细胞中制备异源蛋白质的杆状病毒系统被Luckow和Summers，在生物技术学(Bio/Technilogy)6：47(1988)中综述。

包含cDNA的重组表达载体被稳定地整合进宿主细胞的DNA。通过筛选具有数量增加的载体DNA之细胞系获得水平提高的表达产物。例如通过用包含DNA序列的一种载体转化宿主细胞，可以筛选具有数量增加的载体DNA的细胞系，其中该DNA序列编码一种被已知药物抑制的酶。此载体也可以包含编码期望蛋白质的DNA序列。另外，可以用包含编码期望蛋白质的DNA序列的另一种载体共转染宿主细胞。然后在增加浓度的该已知药物中培养转化或共转化的宿主细胞，籍此可筛选药物抗性细胞。通过过量产生(通常是编码此酶的基因扩增的结果)被该药物抑制的酶，这种药物抗性细胞可以在增加浓度的毒性药物中存活。当药物抗性是编码可抑制的酶的载体DNA之拷贝数增加造成时，宿主细胞DNA中伴随发生编码所期望蛋白质的载体DNA的共扩增。

用于这种共扩增的优选系统利用可被药物氨甲蝶呤(MTX)抑制的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。为获得共扩增，缺乏编码DHFR的活性基因的宿主细胞被用包含编码DHFR和所期望蛋白质的DNA序列的载体转染，或者被用包含编码DHFR的DNA序列之载体和包含编码所期望蛋白质的DNA序列之载体共转染。在含有水平增加的MTX的培养基中培养转化或共转化的宿主细胞，并筛选存活的那些细胞系。

尤其优选的共扩增系统利用谷氨酰胺合成酶(GS)的基因，其负责利用ATP水解为ADP和磷酸，驱动反应进行来合成谷氨酸和氨。GS易于受多种抑制剂的抑制，例如甲硫氨酸硫代亚胺(MSX)。因此，通过共扩增用包含编码GS和期望蛋白质的DNA序列之载体转化的细胞，或者共扩增用包含编码GS的DNA序列之载体和包含编码所期望蛋白质的DNA序列之载体共转染的细胞，在含有增加水平的MSX培养基中培养宿主细胞并筛选存活细胞，本发明的蛋白质可以被高浓度表达。GS共扩增系统、合适的重组表达载体和细胞系在下列PCT申请中被描述：WO87/04462、WO89/01036、WO89/10404和WO86/05807。

优选地通过在哺乳动物细胞中如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或另外的鼠骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14或NSO或大鼠骨髓瘤细胞系如PCT申请WO/89/10404和WO 86/05807公开的YB2/3.0-Ag20中DHFR或GS的共扩增，重组蛋白被表达。

应当理解的是，并非所有载体和表达控制序列对于表达给定的分离的多肽有同样好的功能。也并非所有宿主对于相同的表达系统有同样好的功能。然而，本领域的一个技术人员可以不经过过多的试验就从这些载体、表达控制系统和宿主中做出选择。B.重组TGF-β RII：Fc的纯化

按照任何合适的方法可以纯化转化的宿主所产生的蛋白质。这些标准方法包括层析(如离子交换、亲和与分级柱层析)、离心、溶解性差异或用其它任何用于蛋白质纯化的标准技术。亲和标记物如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感病毒外壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶可以被附加在蛋白质上，通过经合适的亲和柱使纯化易于进行。也可以利用如蛋白质水解、核磁共振和x射线晶体分析的技术从物理角度确切地表征分离的蛋白质。

例如，首先用市售的蛋白质浓缩滤膜，如Amicon或MilloporePellicon超滤单元浓缩来自将重组蛋白质分泌到培养基中的系统的上清液。浓缩步骤之后，将浓缩物加入到合适的纯化基质中。例如，合适的亲和基质可以包含与合适的支持物结合的TGF-β或凝集素或抗体分子或蛋白质A。或者，可以采用阴离子交换树脂，例如具有伸出的二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或底物。基质可以为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其它通常用于蛋白质纯化的类型。或者，可以采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括多种含有磺丙基或羧甲基基团的不溶性基质，优选磺丙基基团。最后，可利用采用疏水RP-HPLC介质(如具有伸出的甲基或其它脂肪族基团)的一步或多步反相高效液相层析(RP-HPLC)进一步纯化TGF-β RII：Fc组合物。可以采用前述纯化步骤的部分或全部，或者不同的组合，以提供异源重组蛋白质。

细菌培养物中产生的重组蛋白可以通过首先从细胞沉淀中提取，然后经一或多次浓缩、盐析、液体离子交换或大小排阻层析步骤来分离，最后，采用高效液相层析(HPLC)用于最后的纯化步骤。表达重组哺乳动物TGF-β受体中采用的微生物细胞可以通过任何方便的方法破碎，包括冻融循环、超声处理、机械破碎、或使用细胞裂解试剂。

以分泌蛋白的形式表达哺乳动物TGF-β受体融合蛋白的酵母的发酵显著地简化了纯化。可以用与Urdal等人，(层析杂志(J.Chromatog.)296：171，1984.)公开的方法类似的方法纯化由大规模发酵获得的分泌性重组蛋白质。此文献描述了用于在制备性HPLC柱上纯化重组人GM-CSF的两步连续的、反相HPLC步骤。C.片段和类似物的制备

利用本领域技术人员已知的方法，通过重组方法、蛋白质水解消化或者化学合成也可以有效地制备分离的蛋白质片段(例如SEQ ID NO：8的片段)。在重组方法中，通过从编码分离的多肽之DNA序列的一个末端(对于末端片段)或两个末端(对于中间片段)去除一或多个核苷酸，可以产生该多肽的中间或末端片段。诱变DNA的表达产生多肽片段，用“末端蚕食”的内切核酸酶也可以产生编码一组片段的DNA。也可以通过随机剪切、限制性消化或二者的组合产生编码蛋白质片段的DNA。

可以直接从完整的TGF-β受体蛋白产生TGF-β受体片段。用包括但不局限的纤溶酶、凝血酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶的蛋白水解酶可以特异性地酶切多肽。这些酶的每一种都对其攻击的肽键类型是特异性的。胰蛋白酶催化其中羧基来自碱性氨基酸的肽键的水解。胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶催化来自芳香族如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的肽键的水解。通过预防一个易于受蛋白水解酶作用的位点的断裂可以获得其它形式的蛋白质片段。例如，在温和碱性溶液中，赖氨酸的ε-氨基酸基团与三氟硫代乙酸乙酯的反应产生封闭的氨基酸残基，其相邻肽键不再对胰蛋白酶敏感。可以修饰蛋白质产生对蛋白水解酶敏感的肽键。例如，用β-卤代乙胺对半胱氨酸残基的烷基化产生可被胰蛋白酶水解的肽键(Lindley，自然178：647(1956))。此外，可以采用在特定残基切割肽的化学试剂。例如，溴化氰在甲硫氨酸残基切断肽链(Gross和Witkip，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc)83：1510(1961))。因此，通过用修饰剂、蛋白水解酶和/或化学试剂的多种组合处理蛋白质，可以将蛋白质分成期望长度的没有重叠的片段，或者分成期望长度的相互重叠片段。

用本领域已知的技术如Merrifield固相9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基(t-Boc)化学法也可以化学合成片段。Merrifield，激素研究的新进展(Recent Progress in Hormone Research)23：451(1967)。D.改变的DNA和肽序列的制备：随机方法

一种蛋白质的氨基酸序列变体(如SEQ ID NO.：8的变体)可以通过编码该蛋白质或其特定部分的DNA之随机诱变来制备。适用的方法包括PCR诱变和饱和诱变。通过合成一系列简并寡核苷酸序列也可以产生随机氨基酸序列变体的文库。用改变的DNA和肽产生给定蛋白质的氨基酸序列变体的种种方法在本领域众所周知。下列这些方法的实施例并不是试图局限本发明的范围，仅仅用于阐明代表性技术。在这一方面，具有本领域普通技术的人员可以认识到其它方法也是可行的。

PCR诱变：简言之，用Taq聚合酶(或其它聚合酶)将随机突变引入克隆的DNA片段(见Leung等人，技术(Technique)1：11-15(1989))。选择PCR条件以使由Taq聚合酶合成DNA的忠实性降低，例如，dGTP/dATP比例为5，并且将Mn⁺²加入PCR反应。所扩增的全部DNA序列被插入合适的载体用于产生随机突变体文库。

饱和诱变：Mayers等人，科学229：242(1989)中概括描述了一种方法。简言之，此技术包括通过体外化学处理或辐照单链DNA，以及合成cDNA链产生突变。通过处理的严重程度可以调整突变频率，并且基本上可以获得所有可能的碱基置换。

简并寡核苷酸诱变：从一系列简并寡核苷酸序列可以产生同源肽文库。在自动DNA合成仪中可以进行简并序列的化学合成，然后将合成的基因连接到合适的表达载体。见Itakura等人，重组DNA(RecombinantDNA)第三届大分子Cleveland研讨会(Cleveland Symposium onMacromolecules)273-289页(A.G.Walton，编)，Elsevier，Amsterdam，1981。E.改变的DNA和肽序列的制备：直接方法

非随机的、或直接诱变可在编码一种分离的多肽之多核苷酸序列的特定部分产生特定序列或突变，从而产生了变体，其中包括编码该已知分离多肽的氨基酸序列碱基的缺失、插入或置换。例如通过(1)首先用保守性氨基酸置换，然后依据得到的结果采用更激进的选择；(2)删除靶残基；或者(3)在选定位点相邻处插入相同或不同类型的残基，或者1-3三种选择的组合可对突变位点进行单独或一系列修饰。

丙氨酸扫描诱变：此方法可定位期望蛋白质的那些残基或区域中优选用于突变的位置。见Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989)。在丙氨酸扫描诱变中，选择一个残基或一组靶残基用丙氨酸或多聚丙氨酸替换。这种替换能够影响氨基酸与相邻氨基酸和/或与周围液体或膜环境的相互作用。对置换有功能敏感性的那些氨基酸通过在置换位点引入进一步的或其它变体加以精选。

寡核苷酸介导的诱变：此方法中的一种可用于制备DNA的置换、缺失、和插入变体.见Adelman等人，DNA2：183(1983)。简言之，通过将编码DNA突变的寡核苷酸引物与包含期望蛋白质(如该蛋白质)未改变的或野生型DNA序列模板的DNA模板杂交其中该DNA模板一般为质粒或噬菌体的单链形式，从而改变期望的DNA。杂交后，用DNA聚合酶合成第二链和模板DNA的互补链，其中掺入了寡核苷酸引物，且编码在期望DNA序列中选定的改变。通常，用至少25个核苷酸长度的寡核苷酸。最合适的寡核苷酸含有在突变的任意一侧与模板完全互补的12到15个核苷酸。这保证寡核苷酸正确地与单链DNA模板分子杂交。

盒式诱变：此方法(Wells等人，基因34：315(1985))要求包含待突变的蛋白质亚单位的质粒或其它载体。确定该蛋白质亚单位DNA中的密码子，用上述寡核苷酸指导的诱变方法在确定的突变位点每一侧插入一个单一限制性核酸内切酶位点。然后在这些位点切断质粒使之线性化。用标准方法合成双链寡核苷酸，其编码位于限制性位点之间但包含期望的突变的DNA序列。用标准方法分别合成两条链并杂交在一起。这种双链寡核苷酸是“盒”，并且含有与线性化质粒的末端相配合的3′和5′末端，使之能在此处直接连接。现在得到的质粒含有突变的、期望的蛋白质亚单位DNA序列。

组合诱变：在此方法中的一种中(Ladner等人，WO88/06630)，排列比较一组同源的或其它相关的蛋白质的氨基酸序列，优选地提高可能的最高同源性。可选择在排列比较的序列中给定位置出现的所有氨基酸以获得一组简并的组合序列，通过核酸水平的组合诱变获得被多样化基因文库编码的多样化文库。例如，可将合成的寡核苷酸混合物以酶法连接到基因序列，以使潜在序列的简并性系列作为单独的肽可被表达，或者作为包含全部简并序列的一组蛋白质可被表达。IV.其它分离的多肽的变体

本发明的蛋白质的衍生物也包括保留了生物学活性的原初蛋白质的多种结构形式。由于离子化氨基和羧基基团的存在，例如，TGF-β受体融合蛋白可以为酸性或碱性盐的形式，或者为中性的形式。单个的氨基酸残基也可以通过氧化或还原反应被修饰。通过与其它化学成分如糖基基团、脂类、磷酸、乙酰基以及类似部分形成共价或聚集偶联物，或者通过产生氨基酸序列变体，可以修饰原初氨基酸结构(例如TGF-β RII部分)。

通过将特定的官能团与TGF-β受体氨基酸侧链连接或在N-或C-末端相连接，可以得到TGF-β受体的共价衍生物。其它TGF-β RII：Fc的衍生物包括TGF-β RII或其片段与其它蛋白质或多肽的共价或聚集偶联物，例如作为附加的N末端或C末端融合蛋白在重组培养物中合成的。例如，偶联的肽可以是位于蛋白质N末端区域的信号(或前导)多肽序列，其在翻译时或翻译后指导该蛋白质从其合成位置转移到细胞膜或细胞壁内部或外部的功能位置(如酵母α-因子前导序列)。TGF-β受体蛋白质可以包含被附加用以促进纯化或确定TGF-β受体的肽(如poly-His)。TGF-β受体的氨基酸序列也可以被连接到肽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(Hopp等人，生物技术6：1204，1988)。后一序列具有高度的抗原性，并且提供了由特定的单克隆抗体可逆结合的表位，这使对表达的重组蛋白质进行迅速分析和简便纯化成为可能。也用牛粘膜肠激酶在紧接Asp-Lys对之后的残基特异性酶切此序列。在大肠杆菌中末端带有此肽的融合蛋白也可以抗细胞内降解。

由于具有TGF-β配体的多个TGF-β受体结合位点，TGF-β受体的多价形式是适用的。例如，二价可溶性TGF-β受体可以包含两个被接头区分开的SEQ.ID.NO.：8或9的1-160位氨基酸的串联重复序列，此重复序列与免疫球蛋白的恒定结构域相连接。也可以构建其它多价形式，例如，通过将TGF-β受体Fc融合蛋白与任何临床允许的载体分子化学偶联，用传统偶联技术与Ficoll、聚乙二醇或葡聚糖进行化学偶联。或者，TGF-β受体融合蛋白可以与生物素化学偶联，然后生物素-TGF-β受体Fc偶联物与抗生物素蛋白结合，得到四价的抗生物素蛋白/生物素/TGF-β受体分子。TGF-β受体Fc融合蛋白也可以与二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)共价偶联并且得到的偶联物与抗DNP-或抗TNP-IgM免疫沉淀，形成与TGF-β受体结合位点的价数为10的十价偶联物。

通过寡核苷酸合成和连接或者位点特异性诱变技术可以产生TGF-βRII：Fc融合蛋白的功能性突变类似物，其具有失活的N-糖基化位点。用酵母表达系统可以以同源的、还原糖的形式高产量地生产这些类似物蛋白质。真核细胞蛋白质中的N-糖基化位点以氨基酸三联体Asn-A1-Z为特征，其中A1是除Pro以外的任何氨基酸，并且Z是Ser或Thr。在此序列中，Asn提供用于糖的共价附加的侧链氨基基团。通过用其它氨基酸替换Asn或残基Z、缺失Asn或Z、或者在A1和Z之间插入非Z的氨基酸、或者在Asn和A1之间插入除Asn以外的氨基酸，可以去除这一位点。通过TGF-β受体或其亚单位的突变也可以获得TGF-β受体的衍生物。通过例如替换多种对于生物学活性非必需的残基或序列，或者缺失对于生物学活性非必需的末端或内部残基或序列，可以构建TGF-β受体蛋白的生物学等同的类似物。

其它类似物包括TGF-β RII：Fc蛋白质或其有生物学活性的片段，其序列与SEQ ID NO：2或4的不同之处在于具有于一个或多个保守性氨基酸的置换或者一个或多个非保守性氨基酸的置换，或者具有并不破坏分离的蛋白质的生物学活性的缺失或插入。保守性置换典型地包括一种氨基酸被另一种相似性质氨基酸的置换，如下列组内的置换：缬氨酸、丙氨酸与甘氨酸；亮氨酸与异亮氨酸；天冬氨酸与谷氨酸；天冬酰胺与谷氨酰胺；丝氨酸与苏氨酸；赖氨酸与精氨酸；以及苯丙氨酸与酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸与甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺与谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸与谷氨酸。具有普通技术的工作人员可以容易地了解其它保守性置换。例如，对于丙氨酸，可以选择D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的任何一个进行保守性置换。对于赖氨酸，可以选择D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、同型精氨酸、甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、鸟氨酸或D-鸟氨酸的任何一个进行置换。

通常，预期引起分离的蛋白质功能特性改变的置换是发生以下情况的那些置换：(i)极性残基如丝氨酸或苏氨酸置换了(或被置换为)疏水性残基如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸；(ii)半胱氨酸残基置换了(或被置换为)任何其它残基；(iii)具有正电侧链的残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸置换了(或被置换为)具有负电侧链的残基如谷氨酸或天冬氨酸；或者(iv)具有大侧链的残基如苯丙氨酸置换了(或被置换为)无此侧链的残基如甘氨酸。

本发明包括的分离的分子有：等位变体，天然突变体，诱导突变体，在高度或低度严格的条件下可与编码如SE Q.ID.NOS.8或9的多肽的核酸杂交的DNA所编码的蛋白质，以及特异性地被抗血清与肽结合，尤其是被抗血清与活性位点或结合位点结合的多肽。此处描述的所有变体预期能够(i)保留原始蛋白质的生物学活性。V.实用性

本发明用于向患有医学症状的个体施用足够剂量的TGF-β受体融合蛋白(如TGF-β RII：Fc)，以抑制个体中TGF-β的活性。本发明进一步提供的是，例如在以纤维增生和免疫抑制为特征的诸如与感染性疾病相关的疾病状态下，将TGF-β RII：Fc递送到TGF-β过量的位置。

虽然不希望被任何特定的理论限制，看起来TGF-β RH：Fc通过与细胞表面受体竞争TGF-β调节TGF-β的活性。进一步还确信TGF-βRII：Fc通过从能与细胞表面受体相互作用的自由态TGF-β库中去除TGF-β而使TGF-β失活。依据清除的药物学特性，TGF-β RII：Fc/TGF-β复合物被从TGF-β的位置去除。这种与过量TGF-β的结合减少了自由TGF-β的量。当能与细胞受体复合的TGF-β减少时，TGF-β引起的纤维增生减慢，导致疾病状况的停滞。

本发明蛋白质片段的施用可以用于纤维增生性紊乱。如上所述，肾小球肾炎的动物模型已经显示，用抗TGF-β抗体阻断过量TGF-β获得良好的结果。这些抗体由于具有高分子量而难以被递送，并且当从其它种类产生时可能导致严重的变态反应。因此，对肾小球肾炎给予低分子量的、天然蛋白质或相近的类似物如TGF-β RII：Fc是优选的。与TGF-β过量相关的肾紊乱包括但不局限于肾小球系膜增生性肾小球肾炎、新月形肾小球肾炎、糖尿病性肾病、肾间质纤维变性、接受环孢菌素的肾移植患者的肾纤维变性以及HIV相关的肾病。这些病症与给予TGF-βRII：Fc应当能抑制的纤维组织结构的过量产生有关。

由于不知晓TGF-β RII本身具有除捕获TGF-β之外的副作用，可以在为导致增生性玻璃体视网膜病(PVR)的最普通的原因的视网膜复置术手术的期间或结束时给予TGF-βRII。(Connor等人，(1989)临床研究杂志83：1661-1666)另一种重要的纤维增生病症是也与过量TGF-β产生相关的类风湿性关节炎(RA)。数据显示在RA的发展或慢性期的任何时间阻断TGF-β，可以帮助阻止关节和骨的进行性恶化。因此，可以将本发明的融合蛋白给予早期关节疼痛的患者和长期关节疼痛和关节恶化的患者。目前的理论是RA中关节恶化是由于TGF-β的过量产生。实验动物被注射链球菌细胞壁后检测到过量的TGF-β，其存在据信导致了类风湿性关节炎(RA)。由于抗TGF-β抗体阻断此模型中的关节炎性变化，相信本发明的融合蛋白也可以有阳性效果。其它与过高的TGF-β水平相关的病症包括自发性肺纤维变性和骨髓纤维变性。为了与过量的TGF-β结合并且减慢过量的纤维性组织发育，试图将本发明的蛋白质施用于这些病症中。

本发明的蛋白质可以被用于治疗与TGF-β过量产生相关的胶原蛋白血管紊乱。目前相信在胶原蛋白血管紊乱如进行性全身性硬皮病(PSS)、多发性肌炎、硬皮病、皮肌炎、嗜酸性筋膜炎和硬斑病中存在TGF-β的过量产生。胶原蛋白血管紊乱也可能与雷诺综合症的发生相关。在其它作用中，TGF-β的过量产生也可能涉及间质肺纤维变性，这是一种与自主免疫失调如系统性红斑狼疮(SLE)和硬皮病相关的晚期肺紊乱(Deguchi，(1992)风湿病学年鉴(Ann.Rheum.Dis)51：362-65)；或者它可能是化学接触、对尘埃的变态反应和枯草热所导致的。可以给予治疗有效剂量的本发明的蛋白质以中和TGF-β的生物学活性，结果阻止不期望的纤维变性。

本发明的蛋白质也可以用于防止已知形成瘢痕瘤或肥大疤痕的患者中疤痕的过量产生。例如在治疗包括外科切口和外伤性撕裂的多种类型的伤口期间，可以给予TGF-β RII：Fc用于阻止疤痕化或疤痕的过量产生。在皮肤伤口愈合之前施用TGF-β RII：Fc融合蛋白有助于无疤痕形成愈合。本发明的蛋白质可以用于外科腹部伤口以帮助防止这种类型的手术后极易发生的粘连形成。本发明提供了局部给予足量的融合蛋白与局部过量产生的TGF-β相结合，并阻止愈合过程中的过量产生。

也报道在鼻息肉，一种以多发性息肉为特征的病症中TGF-β过量(Ohno等人，(1992)临床研究杂志14：1662-68)。融合蛋白能够帮助降低TGF-β的水平，并减慢导致息肉的过量增殖。例如，息肉手术后可以给予TGF-β RII：Fc以预防疤痕的过量产生和息肉的复发，也可以抑制肠道中息肉的形成。

也可以在冠状血管成形术后给予本发明的蛋白质，优选地沿着受影响的动脉内侧施用。按照Karas等人((1991)临床心脏病学(Clin.Cardiol)14：791-801)，冠状血管成形术后约三分之一接受手术的患者中可见血管的再狭窄或疤痕化和再闭合。由于最终发展成疤痕的纤维网状结构通常迅速聚集，早期给予如TGF-β RII：Fc将会减少此区域过量的TGF-β，并且减缓结缔组织的过量增殖和再狭窄。

在梗塞后的心脏纤维变性中和高血压血管病变中也观察到TGF-β过量。为帮助进行正确的无过量疤痕或纤维组织结构产生的治疗，可将本发明的蛋白质用于这些病症。在接受放射治疗的患者的组织中也观察到TGF-β过量。这种组织的特征在于与内皮细胞过度生长相关的过量的结缔组织发育、上皮变薄和血管阻塞。给予TGF-β RII：Fc将会结合过量的TGF-β，并有助于无过多纤维变性的治愈。VI.配方、给药和剂量

本发明的蛋白质的配方、给药方法和剂量取决于待治疗的紊乱和患者的医疗历史。这些因素在治疗过程中很容易确定。通过实验室检测、医疗历史和身体检查可以确定患有由于过量TGF-β造成的病症的合适患者。通过患者血清或受影响组织的免疫分析可以直接测定TGF-β的过量。通过如Kekow等人，(1990)美国国家科学院院报87：8321-25中描述的细胞增殖分析的生物学分析，也可以测定过量的TGF-β。通过检测TGF-β mRNA的水平(如用Kekow等人描述的聚合酶链式反应)也可以间接测定过量的TGF-β。

医疗历史可以揭示出支持下列诊断的事实：纤维增生性紊乱、胶原蛋白血管紊乱、免疫抑制、或潜在的伤口愈合障碍、手术后的腹膜粘连、冠状血管成形术后的血管再狭窄。据信被确定为与高水平的TGF-β和/或纤维组织增生相关的病症导致了TGF-β的过量。患者可能有广泛的预示这些紊乱的身体检查结果。已经用皮肤活组织检查测定全身性硬皮病患者中的TGF-β。关节炎中可见肿胀、热的关节。依据本发明的方法，配方包含可施用形式的本发明的蛋白质。本发明的方法提供了以对于本领域技术人员易于理解的方式配制本发明的蛋白质的方法。优选地，本发明的蛋白质溶解于生理学相容的溶媒中。

对于本发明的蛋白质生理学相容的溶媒包括静脉溶液，如生理盐水、血清白蛋白、5％葡萄糖、血浆制品、其它含蛋白质溶液以及TPN溶液。用于肠胃外给药的优选的溶媒是无菌的、等渗液体溶液，如盐溶液或5％葡萄糖。更优选的是含人血清白蛋白的生理盐水。为增强对疫苗的免疫反应，本发明的蛋白质可以与疫苗配方混合。

依据给药的方式，本发明的蛋白质可以采用液体或半固体的剂量制品，例如液体、悬浮液等。或者，溶液可以被置于植入物如渗透泵中，以在长时间段中缓慢释放。或者，本发明的蛋白质可以以持续释放载体制剂的形式被提供，例如栓剂或微囊形式的半渗透性聚合物载体。见例如，美国专利第3,773,919中的包含聚交酯的微囊持续释放基质；Sidmon等人，生物聚合物(Biopolymers)22(1)，547-556(1983)中的L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚合物；Langer等人，生物医学研究杂志(J.Biomed.Res.)15，167-277(1981)中的聚(2-羟乙基异丁烯酸)等。

给药方式将本发明的蛋白质以安全的、生理学有效的方式递送给个体。本发明的蛋白质可以采用眼内、鼻内、皮下、静脉内、肌内、皮内、腹膜内、关节内、肠内或其它传统给药方式。在一个优选实施方案中，本发明的蛋白质通过大剂量注射或灌注局部给予受影响的组织位置。例如，对于PVR，优选的给药方法是单独的眼内注射。在腹膜伤口中用局部给药以避免粘连形成，并且在其它伤口中有助于无瘢痕瘤或可见疤痕的愈合。对于鼻息肉，优选鼻腔滴注。在肺纤维变性中局部和系统性给药同等优选(肠胃外注射或鼻腔喷雾或滴注)。类风湿性关节炎(RA)可以通过关节内或系统性给药治疗。

系统性给药是肾小球肾炎和大范围皮肤紊乱(如进行性全身性硬皮病、弥散性筋膜炎、和泛发性硬斑病)中优选的给药方式。当本发明的蛋白质被用于增强负疫接种反应时也优选系统性给药方式。本发明的蛋白质可以与疫苗一起以皮下、肌内或皮内注射的方式给药。

依据上述普通患者的症状，本领域的技术人员可以容易地确定要给予的本发明蛋白质的剂量。以大剂量注射给予的本发明蛋白质的剂量优选在20ng至300mg之间。大剂量注射可以在几天之后重复，或者可以连续给予本发明的蛋白质。如果采用静脉内注射，24小时期间要注射的本发明蛋白质的剂量为约1mg至约100mg。

也可以通过将局部组织的TGF-β浓度保持在亚正常水平或约1-1,000μg/ml确定要施用的本发明蛋白质的剂量。

优选地，局部应用本发明的蛋白质，将其注射于患处或静脉内注射。最优选地，在要控制TGF-β的位置通过大剂量注射给予本发明的蛋白质。通过静脉内注射，应当以保持循环血清中的浓度足以降低过量TGF-β的速率给予本发明的蛋白质。优选地，开始给予患者相对低剂量的本发明的蛋白质。优选地持续用低剂量，直到如身体检查结果和实验室结果所提示的，患者的急性状况有好转或有足够的改善。这种改善在两或三周后可见。如果无明显改善，应当增大本发明的蛋白质的剂量。

给予本发明分子的基因治疗方法也属于本发明的范围。术语“转化作用”和“转化”指的是对细胞的任何遗传修饰并且包括“转染”和“转导”。此处引用的“细胞的转染”指的是通过掺入附加DNA细胞接受了新的遗传物质。因此，转染指的是用物理或化学方法将核酸(如DNA)插入细胞，普通技术人员了解几种转染技术。相比之下，“细胞的转导”指的是用DNA或RNA病毒将核酸转移进细胞的方法。包含在病毒中的编码一或多种TGF-β RII：Fc蛋白质的一或多种多核苷酸序列可以被整合进被转导细胞的染色体。或者，用病毒转导细胞，该细胞不会有整合进其染色体的分离的多核苷酸，却能够在细胞内以染色体外的方式表达干扰素。按照一个实施方案，细胞被离体转化(如遗传修饰)。从哺乳动物(优选人)分离细胞，并用载体进行转化(如体外转导或转染)，载体中包含与一或多个用于表达重组分泌性蛋白质的表达控制序列有效连接的分离的多核苷酸，如重组TGF-β RII：Fc核苷酸，然后将细胞给予哺乳动物接受者以在原位递送蛋白质。优选地，哺乳动物接受者是人，要修饰的细胞是自身细胞，即细胞是从该哺乳动物接受者分离的。已经报道了细胞的分离和体外培养。按照另一个实施方案，细胞在体内被转化或进行其它遗传修饰。用包含类似的分离的多核苷酸的载体在体内转化(即转导或转染)来自哺乳动物接受者(优选人)的细胞，然后蛋白质在原位释放。

用基因转移方法如转染或转导将编码融合蛋白的分离的多核苷酸离体或在体内导入细胞，以获得遗传修饰的细胞。本领域普通技术人员了解多种表达载体(即，用于帮助将分离的多核苷酸递送到靶细胞中的媒介物)。典型地，被导入的物质包括本发明分离的多核苷酸以及控制转录的启动子。如果要将TGF-β RII：Fc多核苷酸递送到特定的组织，期望能定位此基因的表达。例如，文献中描述了很多只在特定组织中表达的启动子。因此，通过选择合适的启动子(组成型或诱导型；强或弱)，有可能控制遗传修饰的细胞中融合蛋白的存在与否以及表达水平。如果编码融合蛋白的基因受诱导型启动子的控制，通过将遗传修饰的细胞原位置于容许该蛋白质转录的条件下，例如注射特定的控制启动子转录的该诱导型启动子的诱导物，可以引起该蛋白质的原位释放。近来，已经开发了通过体外给予小分子实现基因表达精确调节的非常精密的系统，这些包括，FK506/纳巴霉素系统(Rivera等人，天然药物(NatureMedicine)2(9)：1028-1032，1996)；四环素系统(Gossen等人，科学268：1766-1768，1995)；蜕皮激素系统(No等人，美国国家科学院院报93：3346-3351，1996)和孕酮系统(Wang等人，天然生物技术(NatureBiotechnology)15：239-243，1997)。

因此，原位释放的融合蛋白的量受如下因素的控制：(1)用于指导插入的多核苷酸转录的启动子的性质(即：该启动子是组成型还是诱导型，强还是弱，或是组织特异性的)；(2)插入细胞的外源多核苷酸的拷贝数量；(3)给予(如植入)患者的转导/转染细胞的数量；(4)在离体方法中植入物的大小(如移植还是胶囊化表达系统)；(5)在离体方法中植入物的数量；(6)通过体内给药的转导/转染细胞的数量；(7)离体和体内两种方法中转导/转染细胞或植入物在某位置存留时间的长度；(8)遗传修饰的细胞中融合蛋白的产率。

用于基因治疗的与哺乳动物宿主细胞相适合的表达载体包括，例如，质粒；鸟、鼠和人反转录病毒载体；腺病毒载体；疱疹病毒载体；细小病毒载体和非复制型痘病毒。尤其地，只产生复制缺陷病毒的包装细胞系可以产生复制缺陷的重组病毒。见当代分子生物学方法9.10-9.14(Ausubel等人，编)，Greene Publishing Associates，1989。目前很好地建立了用于基因转移系统的特异性病毒载体。见例如：Madzak等人，普通病毒学杂志73：1533-36(1992)(乳多空病毒SV40)；Berkner等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol，158：39-61(1992)(腺病毒)；Moss等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol，158：25-38(1992)(痘苗病毒)；Muzyczka，Curr.Top.Microbiol.Immunol，158：97-123(1992)(腺伴随病毒)；Margulskee，Curr.Top.Microbiol.Immunol，158：67-93(1992)(单纯疱疹病毒(HSV)和埃-巴二氏病毒(HBV))；Miller，Curr.Top.Microbiol.Immunol，158：1-24(1992)(反转录病毒)；Brandyopadhyay等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，4：749-754(1984)(反转录病毒)；Miller等人，自然，357：455-450(1992)(反转录病毒)；Anderson，科学，256：808-813(1992)(反转录病毒)。优选的载体是包括腺病毒(优选基于Ad-2或Ad-5的载体)、疱疹病毒(优选基于单纯疱疹病毒的载体)和细小病毒(优选基于“缺陷的”或非自主的细小病毒的载体，更优选的基于腺伴随病毒的载体，最优选的基于AAV-2的载体。)的DNA病毒。见例如，Ali等人，基因治疗(Gene Therapy)1：367-384，1994；美国专利4,797,368和5,399,346以及下面的讨论。

也已经用腺伴随病毒(AAV)作为载体用于体细胞基因治疗。AAV是小的单链(ss)DNA病毒，它具有简单的基因组结构(4.7kb)，使之成为理想的基因工程底物。两个开放读框编码一组rep和cap多肽。Rep多肽(rep78、rep68、rep62和rep40)涉及AAV基因组的复制、援救和整合。cap蛋白质(VP1，VP2和VP3)形成病毒衣壳。在5′和3′末端包围rep和cap开放读框的是145bp的反向末端重复(ITR)，其中前125bp能够形成Y-或T-形双螺旋结构。开发AAV载体的重要性在于，完整的rep和cap结构域能够被切除并替换成治疗性或报告转基因。见B.J.Carter，细小病毒手册(Handbook of Parvoviruses)，P.Tijsser编，CRC Press，155-168(1990)。已经显示ITR是AAV基因组的复制、救援、包装和整合必需的最短序列。AAV的生活周期是双相的，由潜伏期和分裂期组成。在潜伏期时，AAV病毒体以包被的ssDNA的形式进入细胞，并很快到达核，在此处AAV DNA稳定地整合进宿主染色体，对宿主细胞的分裂无明显的需求。在无辅助病毒存在时，整合的AAV基因组保持潜伏但是能够被激活和援救。当驻留有AAV前病毒的细胞受到编码帮助AAV从宿主染色质切下来所需要的辅助功能的疱疹病毒或腺病毒的二次感染时，生活周期的分裂期开始(B.J.Carter，如上述)。感染性亲代单链(ss)DNA以rep依赖的方式扩展成为双螺旋复制型(RF)DNA。援救的AAV基因组被包装成为前体蛋白衣壳(直径约20nm的对称二十面体)，并且作为包装有+或-ssDNA基因组的感染性病毒体在细胞裂解之后释放。AAV在基因治疗中有明显潜力。病毒颗粒非常稳定，重组AAV(rAAV)具有“药物样”的特征，即rAAV能够通过沉淀或CsCl梯度显带法被纯化。它们有热稳定性，能够被冻干成粉末，再水化后恢复完全活性。它们的DNA稳定整合进宿主染色体因此表达是长期的。它们的宿主范围广泛并且AAV不导致已知的疾病，因此重组载体无毒性。近来，已经显示主要衍生自杆状病毒苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的重组杆状病毒能够体外转导哺乳动物细胞。(见Hofmann，C.，Sandig，V.，Jennings，G.，Rudolph，M.，Schlag，P.，和Strauss，M.(1995)，“用杆状病毒载体进行的人肝细胞的有效的基因转移”hepatocytes bybaculovirus vectors美国国家科学院院报92，10099-10103；Boyce，F.M.和Bucher，N.L.R.(1996)，“杆状病毒介导的哺乳动物细胞的基因转移”美国国家科学院院报93，2348-2352)。重组杆状病毒对于基因治疗有几种潜在的优势，包括插入很大DNA的能力；人体中无预先存在的免疫反应；哺乳动物中无复制能力，对哺乳动物无毒性；由于杆状病毒转录启动子的昆虫特异性在哺乳动物细胞中不表达病毒基因，以及，潜在地，不引起针对这些病毒蛋白质的细胞毒性T淋巴细胞反应。

通过下列非限制性实施例阐述本发明。实施例1：可溶性兔TGFβR：Fc融合蛋白的构建与表达

按照(di Clemente等人，分子内分泌学(Mol.Endocrinol)8：1006(1994))所述，从兔卵巢cDNA文库中分离编码兔II型TGF-beta(TGFβ)受体的全长克隆(MIS-3fl1)。按照下述构建包含有与人IgG1的Fc部分(SEQ ID NO.：2的核苷酸1312-1995)融合的兔II型受体的细胞外结构域(SEQ ID NO.：2的核苷酸832-1311)的重组兔TGFβRH：Fc融合基因：

片段1)479bp的片段，含有兔II型TGFβ受体的细胞外结构域，被用合适的寡核苷酸引物(SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：6)以传统的PCR方法从克隆MIS-3f11中扩增。这些寡核苷酸将得到的PCR产物的两侧赋予Not1和Sal1限制性酶切位点，然后这些位点被这两个限制性酶消化。

片段2)pSAB132(Miller等人，实验医学杂志178：211[1993])用限制性酶Not1消化，并且末端磷酸基团用小牛碱性肠磷酸酶消化除去。

片段3)pSAB144被构建。用H链特异的引物，通过对COS-7细胞的RNA进行cDNA的PCR扩增，其中COS-7细胞已被包含3千碱基对基因组插入序列的质粒转染，分离到包含铰链区C_H2和C_H3序列的人IgG1重(H)链恒定区(Miller等人，实验医学杂志178：211[1993])。设计重链特异的寡核苷酸引物以使得到的C_H2和C_H3 IgG1 PCR扩增序列两侧为5′Sal1和3′Not1限制性酶识别位点。用限制性酶Not1和Sal1消化pSAB144以放出包含人IgG1 Fc部分的700碱基对的片段。

将片段1、2和3连接在一起，并转化进转化感受态细菌。从转化子中收集质粒并用限制性酶消化和凝胶电泳进行分析，以获得正确定向的组装片段。此构建体包含重组兔TGFβRII：Fc融合基因，并用DNA测序证实完整的编码序列(SEQ ID NO.：1和2)。

于280伏特电穿孔将重组兔TGFβRII：Fc融合基因转染进中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。开始转染后，通过在缺乏甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷的选择性培养基中的传代培养筛选表达二氢叶酸还原酶(DHFR)的细胞。然后将得到的克隆转移到24孔板，分析兔TGFβRII：Fc融合基因的表达。将最高表达的培养物暴露于增加量的氨甲蝶呤中进行扩增。通过在96孔板中限制稀释度克隆能够在25nM的氨甲蝶呤中生长的细胞。将表达最高的克隆转移到悬浮培养液，筛选表达最高水平TGFβRII：Fc的克隆用于制备TGFβRII：Fc。

通过从商业途径获得的人卵巢cDNA(Clontech)中分离人II型TGFβ受体基因，并用SEQ ID NO.：7描述的寡核苷酸引物代替SEQ ID NO.：6描述的寡核苷酸引物，本领域的技术熟练人员能够构建并表达类似的包含人II型TGFβ受体的细胞外结构域的重组基因。实施例2：TGFβR：Fc融合蛋白与TGFβ的体外结合

于280伏特电穿孔将重组兔TGFβR：Fc融合基因(包含在SEQ IDNO.：1中的SEQ ID NO.：2)转染进COS细胞。转染的细胞在补充了10％胎牛血清的DMEM上生长。5天后，通过离心从培养基去除细胞，上清液通过SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)检测重组兔TGFβRII：Fc的表达。检测细胞培养上清液中存在的TGFβRII：Fc与TGFβ结合的能力。[¹²⁵I]-TGFβ(NEN Life Science Products)与包含兔TGFβR：Fc的条件细胞培养基，或对照IgG，以及与IgG的Fc部分结合的蛋白质A-琼脂糖共同温育2.5小时。离心收集得到的蛋白质A：Fc复合物，用磷酸缓冲盐液洗，并进行SDS/PAGE和放射自显影分析。TGFβRII：Fc，而不是对照IgG能够免疫沉淀[¹²⁵I]-TGFβ。实施例3：水貂肺细胞增殖分析

水貂肺上皮细胞(CCL64)的增殖被TGFβ1抑制。因此，能够检测TGFβR：Fc阻断TGFβ1抗增殖效应的能力。CCL64细胞生长于补充了100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的MEM中。为了检测，在96孔微量滴定组织培养板中，将一系列稀释度的TGFβR：Fc与0.1ng/ml TGFβ1于分析培养基(补充了100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的MEM)中温育1小时。将CCL64细胞再悬浮于分析培养基中并以4000细胞每孔的浓度加入到分析板。37℃温育细胞72小时，并进行额外4小时的[³H]胸苷(70-86Ci/mmol)脉冲标记。通过检测[³H]胸苷的掺入确定反映细胞增殖的DNA合成。当细胞能够单独在基质中增殖时，检测到掺入的[³H]胸苷量为188，745次每分钟(CPM)。当基质中包含TGFβ1时，增殖被抑制，检测到掺入的[³H]胸苷量为49088次每分钟。下面显示了当增加量的TGFβR：Fc或对照IgG被加入到基质后的结果：

浓度                 TGFβRII：Fc        对照IgG

μg/ml               (CPM)               (CPM)

10                   181933              53619

5                    179461              55097

2.5                  178770              54443

1.25                 168020              51443

0.62                 150106              56683

0.31                 118613              52415

0.16                 75112               52830

0.08                 63841               61894

0.04                 49929               54395

0.02                 57685               42993抑制0.1ng/ml TGFβ1抗增殖效应的50％所需要的TGFβRII：Fc的量等于0.5μg/ml。实施例4：大鼠血管损伤模型

始终采用重400g和约3-4月龄的雄性Sprague-Dawley大鼠(Bantin和Kingman，Edwards，WA)。所有手术步骤均在腹膜内注射赛拉嗪(2.2mg/kg，Anased TM，Lioyd Laboratories，Shenandoah，LA)和氯胺酮(540mg/kg，Ketaset TM，Aveco Co.，Fort Dodge，IA)的全身麻醉下进行。通过外侧颈动脉插入导管用2F带囊的导管剥露左侧颈总动脉。通过颈部中线切口将远端左侧颈总动脉和外侧颈动脉暴露。将囊中充满足够盐溶液的导管通过三次以产生轻微的阻力，此方法使颈动脉本身扩张。取出导管和切口闭合后缝合外侧颈动脉。

实验性处理包括每隔一天(手术后)以5mg/kg静脉内注射一系列1mlPBS中的TGFβRII：Fc(SEQ ID NO：8)。带囊的导管剥露14天后，麻醉所有大鼠，固定颈动脉，方法是通过在120mmHg压力下经逆行放置于腹主动脉中的大插管灌注0.1M，pH7.4磷酸缓冲液中的1％多聚甲醛和1.25％戊二醛。固定前十分钟，将这些动物静脉内注射伊文思蓝(0.3ml，于5％盐溶液中)。灌注后5分钟，取出完整的左侧和右侧颈总动脉，包括主动脉弓。将这些血管浸入与用于灌注的固定液相同的固定液中进一步固定。

通过从剥露、蓝染的左侧颈动脉获得三部分，并将它们用石蜡包埋用超薄切片机做横切片，分析动脉片段中内皮的存在与否。为测量内膜区域，从每只动物的3-4个横切片拍摄显微照片。将显微照片进行数字化处理并用图象分析软件(NIH Image 1.55 for MacIntosh)进行分析。通过测定腔和内部弹性基膜之间的区域检测内膜区域，通过测定内部和外部弹性基膜之间的区域检测中间区域，根据检测结果计算内膜/中间区域比率。

   在大鼠模型中TGFβRII：Fc对再狭窄的作用

表1内膜面积(平方毫米)

治疗        平均面积      标准差      标准误

对照(n＝4)  0.15          0.015       0.008

实验组：    0.068         0.016       0.007

5mg/kg/剂量

每个疗程35mg/kg

(n＝5)

不同治疗之间非成对T检验的统计学显著性p＝0.0001。

表2内膜/中间面积比例

治疗          平均比例      标准差       标准误

对照(n＝4)    0.076         0.03         0.015

实验组：      0.360         0.137        0.061

5mg/kg/剂量

每个疗程35mg/kg

(n＝5)

不同治疗之间非成对T检验的统计学显著性p＝0.0018。表明与非治疗组相

比，用SEQ ID NO：8处理明显减少了相对于中间层的内膜的形成。实施例5：肺纤维变性模型

肺中胶原蛋白的过量积累是肺纤维变性的特征。组织中胶原蛋白的含量依赖于胶原蛋白合成和胶原蛋白降解的比率。在纤维变性的情况时，胶原蛋白合成率远远超过胶原蛋白降解率。

从Charles River(Boston.MA)购买无慢性呼吸疾病的重120-130g的Golden Syrain仓鼠，4只一组放置于塑料笼中，设备由美国实验动物护理认可协会批准。开始实验前先使动物适应实验室条件一周。它们可以任意获得啮齿动物实验室咀嚼物5001(Purina Mills，Inc.，St.Louis，MO)和水，并且居住于能够得到过滤空气和具有12小时亮/12小时暗/循环的房间中。仓鼠分成如下各组进行生物化学和组织病理学研究：治疗组             生物化学研究(n)      组织病理研究(n)IT盐水+IT盐水              10                   6IT博莱霉素+IT盐水          10                   6IT博莱霉素+TGFβ受体：Fc   10                   6IT盐水+TGFβ受体：Fc       10                   6其中IT为气管内给药

在气管内(IT)滴注前将硫酸博莱霉素溶解于无致热原的无菌等渗盐溶液中。在戊巴比妥麻醉(25-35mg/kg，腹膜内)下合适组中的仓鼠经过口服途径接受博莱霉素(5.5单位/kg/4ml)或者接受等体积(4ml/kg)的无热原等渗盐溶液。滴注以后通过腹膜内(IP)或气管内途径给予合适组中的仓鼠治疗剂量的II型TGF-β受体：Fc，每周两次持续21-28天。之后，用过量的戊巴比妥钠(100-125mg/kg腹膜内)处死每组的动物，用它们的肺进行生物化学和组织病理学研究。1生物化学研究

经过右心室给用于生物化学研究的动物之肺原位灌注冰冷的等渗盐溶液，以经过左心室的开口洗去肺血管系统中的血液。迅速解剖无实质组织的肺叶，置于液氮中速冻并于-80℃贮存。然后融开冷冻的肺并用Polytron匀浆器在0.1M KC，0.02M Tris缓冲液(pH 7.6)中匀浆。将几个1ml等份的匀浆液贮存于-80℃直到进行各种生物化学分析。

按照Woessner，生物化学与生物物理学文献(Arch.Biochem.Biophys.)93：440-447(1961)的技术定量测定作为胶原蛋白含量标准的肺匀浆液中羟脯氨酸的含量，并按照Giri等人，生物化学与药理学(Biochem.Pharmacol.)54：1205-1216(1997)中描述的方法测定脂质过氧化。2组织病理学研究

将仓鼠麻醉至心跳停止的程度。打开胸廓，在心脏基底打结并插入导管。整个取出肺和心脏，称重并放置于生理盐水中，在400m渗摩和30cm水压下用0.12M二甲胂酸盐缓冲液中的1％戊二醛-多聚甲醛固定液滴注肺。经此压力将肺固定约2小时，然后堵塞导管贮存于固定液中。包埋之前，通过钝器解剖法将肺与心脏和所有非肺组织分离并取出，从每个肺的右颅、右尾和左肺叶的至少两片矢状片(2-3mm厚)上切下组织块。每个组织块带约1cm²的表面。将组织块用一系列梯度浓度的乙醇脱水并用石蜡包埋。从石蜡块切下切片(5μm厚)并用苏木精和伊红染色用于组织学评价。3数据分析和解释

对照和处理动物的肺的不同生物化学因子值按每毫克肺蛋白质或DNA来表示但是应当注意，基于每毫克肺蛋白质或DNA的数据表示方法会趋向于人为降低处理动物的值。这个问题归因于白细胞浸润和即使灌注以后还存在残留的血浆蛋白质，以及在长期研究过程中博莱霉素处理的仓鼠肺中II型细胞和成纤维细胞的增殖。为了避免人为降低这些值，数据被表示为每个肺的值，见Starcher等人，美国呼吸疾病综述(Am.Rev.Resp.Dis.)117：299-305(1973)和Witsch，毒理学分析(AssaysToxicol)6：125-191(1975)。

用平均值及其平均数的标准差和标准误分析数据。用基于统计软件包(SAS/STAT Guide，6th Ed.Cary，N.C.183-260(1985))的计算机进行学生t检验、卡方分布、相关系数、方差分析(ANOVA)和多重比较检验用以判断对照和处理组之间差异的显著性。实施例6：肾小球肾炎模型

用肾小球肾炎模型评价本发明蛋白质的效果。通过单次注射抗肾小球基底膜肾毒素血清(NTS)在大鼠中诱导实验性肾小球肾炎。实验性损伤是急性肾小球系膜增生性肾小球肾炎，其特征在于肾小球系膜基质的扩张和细胞过多。受伤的细胞也表达更多的TGF-β1mRNA和TGF-β1，并因此刺激两种蛋白多糖：双糖链蛋白聚糖和核心蛋白聚糖的合成。尤其令人感兴趣的是，肾炎经过肾小球和管状间质的疤痕化发展为晚期肾疾病的过程可以重复。

首先，通过静脉内注射NTS血清在大鼠中诱导肾小球肾炎。然后，连续6天，给予两组大鼠每天静脉内注射盐溶液(阴性对照组)或本发明的蛋白质。第十天，处死动物并制作肾的切片，用过碘酸-Schiff溶液染色以突出病理改变。阴性对照的肾中大部分的肾小球充满微粉红色的无定形纤维性物质，即已充分发展的肾小球肾炎。阳性对照的肾具有与正常肾小球相似的染色样式。用本发明蛋白质处理的肾也具有正常的外观，提示本发明的蛋白质阻断了由于TGF-β的过量分泌导致的反应。

通过对从每组正常动物和肾炎动物中30个随机挑选的肾小球进行肾小球细胞计数，可以对肾小球损伤的程度进行定量。到第10天，NTS处理的大鼠肾小球中有更多的细胞。通过检测尿中清蛋白的水平和定量肌酸酐廓清评价肾功能。

本发明蛋白质对疾病进程作用的另一种测量方法是定量肾小球中细胞外基质聚集的量。按照Raij等人，(1984)Kidney.Int.26：137-43的方法，肾小球基质扩张的程度依每个肾小球被肾小球系膜基质占据的百分率确定。期望TGF-β RII：Fc处理的肾含有与正常肾中相似的百分率的肾小球系膜基质，并含有明显少于阴性对照肾中的肾小球系膜基质。实施例7：关节炎模型

在重约100克的无病原体的雌性LEW大鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，Ind.)中诱导关节炎。按照Brandest等人，(1991)临床研究杂志87：1108中描述的技术，给每只动物腹膜内(ip)注射一定剂量的A群链球菌的细胞壁片段(SCW)(30微克鼠李糖/克体重)。注射SCW的和对照LEW大鼠在一只后踝中通过关节内(IA)注射给予下列组分：

1.25μlPBS中的本发明蛋白质

2.只有PBS，或者

3.IgG对照

通过测定在0(正常)到4(严重炎症)的范围内肿胀和变形的关节红斑的量，对关节进行临床监测。拍摄放射照片并用于评价软组织肿胀、关节腔狭窄、骨腐蚀和畸形。按照上述Brandes等人的描述，获得并制备组织标本用于组织病理学分析。按照Allen等人(1990)实验医学杂志171：231的方法，从切下的滑液组织分离总RNA。

SCW的注射导致了几小时内最长3-5天内临床可检测到的急性炎症反应。在腹膜内给予SCW之前直接将II型TGF-β受体：Fc注射到关节中时，24小时内观察到的炎症反应明显弱于注射无关抗体的关节中观察到的炎症反应。在急性反应高峰时，这样处理的关节炎症比注射无关抗体的关节炎症弱得多。即使当炎症完全发展时(第13天)，与注射无关抗体相比，即使给关节注射II型TGF-β受体：Fc，融合蛋白仍然具有明显的抗炎症效果。由于本发明的蛋白质也结合TGF-β，当它们在炎症进程的早期或晚期被给予时均有类似的有益效果。其它完善建立的RA的实验模型包括胶原蛋白和佐剂诱导的关节炎。见，例如JanuszMJ等人，炎症研究(Inflamm.Res.)46：503-508(1997)；Myers等人，生命科学(Life Sci)61：1861-1878(1997)；和Kock等人，临床免疫学与免疫病理学(Clin Immunol Immunopathol)86：199-208(1998)。等同物

通过实施例和直接描述已经详细阐述了本发明。显然本领域的普通技术人员应当能够推测所附权利要求书中描述的本发明的等同物，其也落入上述精神中。这些等同物均落在本发明的范围之内。

Claims (21)

1.一种竞争性抑制TGF-β与TGF-β受体结合的分离的TGF-β受体融合蛋白。

2.权利要求1的融合蛋白，其包含与非II型TGF-β受体的另一种蛋白质连接的II型TGF-β受体。

3.权利要求2的融合蛋白，其中另一种蛋白质是一种免疫球蛋白的恒定区。

4.权利要求3的融合蛋白，其包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9。

5.一种包含SEQ ID NO：8中1到160位氨基酸的分离的TGF-β受体融合蛋白。

6.一种包含SEQ ID NO：9中1到160位氨基酸的分离的TGF-β受体融合蛋白。

7.权利要求5或6的分离的蛋白质，其中氨基酸与一种免疫球蛋白恒定区的至少一部分连接。

8.一种分离的多核苷酸，其编码经表达为与非II型TGF-β受体的另一种蛋白质连接的II型TGF-β受体。

9.权利要求8的分离的多核苷酸，选自(a)SEQ ID NO：10或12；(b)在标准杂交条件下可与上述序列杂交的多核苷酸，其编码具有II型TGF-β受体融合蛋白的TGF-β抑制活性的蛋白质；和(c)一种编码经表达为由任何上述多核苷酸序列所编码的蛋白质的多核苷酸。

10.一种包含处于药学可接受的载体中的TGF-β受体融合蛋白的组合物，该融合蛋白的剂量足以竞争性抑制TGF-β与TGF-β配体的结合。

11.一种包含权利要求9的多核苷酸序列的载体。

12.一种包含权利要求11的载体的宿主细胞。

13.一种制备TGF-β受体融合蛋白的方法，其包括培养权利要求12的宿主细胞，使该细胞表达该融合蛋白，分离和纯化该融合蛋白。

14.一种降低有需求的个体中TGF-β水平的方法，其包括给予此个体降低TGF-β量的TGF-β拮抗剂，该拮抗剂是一种包含SEQ ID NOS：8或9的氨基酸序列的TGF-β受体融合蛋白。

15.一种降低患有关节炎的个体中TGF-β水平的方法，其包括给予此个体有效剂量的TGF-β拮抗剂，该拮抗剂是一种包含SEQ ID NOS：8或9的氨基酸序列的TGF-β受体融合蛋白。

16.一种治疗个体中与TGF-β过量产生相关的医学症状的方法，包括将具有SEQ ID NOS：8或9所示氨基酸序列的II型TGF-β受体融合蛋白给予个体的步骤，所用的剂量足以减少所述个体中TGF-β的活性。

17.权利要求16的方法，其中TGF-β受体融合蛋白通过选自静脉内、眼内、关节内、经皮和经肠内给药的方法被施用。

18.权利要求16的方法，其中所述医学症状包括纤维增生性紊乱。

19.权利要求18的方法，其中所述纤维增生性紊乱包括选自肾、眼内和肺纤维变性的纤维变性。

20.权利要求18的方法，其中所述纤维增生性紊乱选自糖尿病性肾病、肾小球肾炎、增生性玻璃体视网膜病和骨髓纤维变性。

21.权利要求18的方法，其中所述纤维增生性紊乱是选自全身性硬皮病、多发性肌炎、硬皮病、皮肌炎或系统性红斑狼疮的胶原蛋白血管紊乱。