CN110573532B - TGF-β 受体胞外域融合分子及其用途 - Google Patents

TGF-β 受体胞外域融合分子及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明一般地涉及能够结合并中和转化生长因子β(TGF‑β)配体的多肽，以及这些多肽用于治疗与TGF‑β表达或活化相关的病症(例如癌症和纤维化疾病)的用途以及制造此类分子的方法。

Description

TGF-β受体胞外域融合分子及其用途
技术领域
本发明涉及TGF-β受体胞外域融合分子及其用途。更具体地，本发明涉及TGF-β超家族受体胞外域融合分子及其在TGF-β配体中和方面的用途。
背景技术
TGF-β是超过30种配体的超家族的一部分，这些配体调节几种生理过程，包括细胞增殖、迁移和分化。它们的水平和/或信号的扰动(perturbation)引起了显著的病理学效应。例如，TGF-β和激活素配体在包括癌症在内的许多疾病中发挥关键的致病作用(Hawinkels&Ten Dijke,2011；Massague等,2000；Rodgarkia-Dara等,2006)。特别地，TGF-β被认为是肿瘤进展的关键调节因子，并被大多数肿瘤类型过度表达。它通过在上皮肿瘤细胞中诱导上皮-间充质转化(EMT)而部分有利于肿瘤发生，导致侵袭性转移(Thiery等,2009)。TGF-β还通过作为肿瘤微环境中免疫应答的强力抑制剂来促进肿瘤发生(Li等,2006)。事实上，TGF-β被认为是肿瘤微环境中存在的最有效免疫抑制因子之一。TGF-β干扰许多免疫细胞类型(包括树突细胞、巨噬细胞、NK细胞、中性粒细胞、B细胞和T细胞)的分化、增殖和存活；因此，它调节先天免疫和适应性免疫(Santarpia等，2015；Yang等，2010)。有证据突出了TGF-β在肿瘤微环境中的重要性，表明在几种肿瘤类型(包括黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌)中，TGF-β配体水平的升高与疾病进展和复发、转移及死亡率相关。因此，已经投入了大量努力来设计涉及TGF-β抑制的抗肿瘤治疗方法(Arteaga,2006；Mourskaia等,2007；Wojtowicz-Praga,2003)。这些方法包括使用基于结合或“捕获(trap)”TGF-β配体的TGF-β受体胞外域的多肽融合物(参见WO01/83525；WO2005/028517；WO2008/113185；WO2008/157367；WO2010/003118；WO2010/099219；WO2012/071649；WO2012/142515；WO2013/000234；US5693607；US2005/0203022；US2007/0244042；US8318135；US8658135；US8815247；US2015/0225483和US2015/0056199)。
开发抑制TGF-β功能的治疗剂的一种方法是使用抗体或可溶性诱饵受体(也称为基于受体胞外域(ECD)的配体捕获物(trap))来结合和螯合(sequester)配体，从而阻止配体接触其细胞表面受体(Zwaagstra等,2012)。通常，基于受体ECD的捕获物是一类能够螯合大范围配体的治疗剂，并且可使用蛋白质工程方法进行优化(Economides等,2003；Holash等,2002；Jin等,2009)。
以前，使用了新的蛋白质工程设计策略来生成单链的二价TGF-βII型受体胞外域(TβRII-ECD)捕获物，由于亲合力(avidity)效应而能够有效中和TGF-β配体超家族的成员(Zwaagstra等,2012)[WO2008/113185；WO2010/031168]。在这种情况下，通过使用位于TβRII-ECD的结构化配体结合结构域侧翼的固有无序区(IDR)的区域，通过两个TβRII胞外域的共价连接实现了二价。这些单链二价捕获物T22d35的一个例子表现出比单价非工程化TβRII胞外域高约100倍的TGF-β中和效力，尽管二价捕获物不能中和TGF-β2同种型并具有相对较短的循环半衰期。
提供具有改善性质(例如增强的效力)的基于TβRII-ECD的捕获物将是有用的。
发明内容
本发明提供了具有增强的抑制TGFβ的效力的多肽构建体。
本发明的多肽构建体包含第一区和第二区，其中第一区包含第一和/或第二TGFβ受体胞外域(ECD)；且其中第二区包含抗体重链的第二恒定结构域(CH2)和/或第三恒定结构域(CH3)。在优选的非限制性实施方案中，第一区的C-末端与第二区的N-末端连接。在优选的非限制性实施方案中，多肽构建体的第一区包含第一TβRII-ECD(ECD1)和/或第二TβRII-ECD(ECD2)，其中ECD1和ECD2串联连接。
提供了多肽构建体，其中第一区包含在其C-末端与抗体恒定结构域连接的(TβRII-ECD)-(TβRII-ECD)二联体，与具有在其C-末端与抗体恒定结构域连接的单个TβRII-ECD的对应构建体(即当不存在第二ECD时，在本文中也称为单体)相比，所述多肽构建体抑制TGFβ活性的效力高至少600倍。
所提供的多肽构建体包含与第一ECD串联连接的第二TGFβ受体胞外域ECD，其中与抗体恒定结构域连接的多肽构建体(即ECD二联体构建体)表现出比不存在抗体恒定结构域的对应构建体(即ECD二联体构建体，在本文中也称为未融合Fc的二联体)高至少100、200、300、400、500、600、700、800或900倍的TGFβ中和(抑制)。
关于TβRII-ECD和它们抑制TGF-β活性的效力，已经发现，通过仔细选择它们的构成可以令人惊讶地增强效力。当某些TβRII-ECD串联连接且其C-末端与抗体恒定结构域(Fc)的N-末端连接时，就会发生这种情况。当处于其融合且二聚的形式时，包含通过每个多肽的恒定结构域之间的半胱氨酸桥相交联的两个这种多肽，得到的所谓“Fc融合物”在两个“臂”的每一个上都具有两个TβRII-ECD(ECD“二联体”)，与在两个“臂”的每一个上具有一个胞外域的“Fc融合物”相比，能够表现出超过600倍的更高TGF-β1抑制活性和超过20倍的更高TGF-β3抑制活性，如通过人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞的TGF-β1和TGF-β3诱导的IL-11分泌的抑制所证实的，等等。相对于缺少Fc区或缺少第二ECD(即ECD“单体”)的对应构建体，效力增强是明显的。融合Fc的二联体的效力增强比融合Fc的单体高至少100、200、300、400、500或600倍。Fc融合二联体的效力增强比未融合Fc的二联体高至少100、200、300、400、500、600、700、800、900倍和约1000倍。相对于缺少Fc区(与未融合Fc的二联体相比，Fc融合二联体T22d35-Fc针对TGF-β1和TGF-β3分别好972倍和243倍)或者缺少第二ECD(ECD“单体”；与未融合Fc的二联体相比，Fc融合二联体T22d35-Fc针对TGF-β1和TGF-β3分别好615倍和24倍)的对应构建体，效力增强是明显的。更具体而言，与未融合Fc的ECD二联体相比，Fc-二联体(T22d35-Fc)表现出高至少970倍的针对TGF-β1的效力增强和高至少240倍的针对TGF-β3的效力增强。此外，与Fc-单体(T2m-Fc)相比，Fc-二联体(T22d35-Fc)表现出高至少600倍的针对TGF-β1的效力增强，高超过20倍的针对TGF-β3的效力增强。
在通常的方面，提供了包含至少两个串联连接的TβRII-ECD(即ECD二联体)和抗体恒定结构域的多肽构建体，该抗体恒定结构域至少包含抗体重链的第二恒定结构域(CH2)和/或第三恒定结构域(CH3)，其中胞外域的C-末端与抗体恒定域的N-末端连接。在这种形式中，构建体是单链多肽。因此，抗体恒定结构域可以仅包含CH2结构域，或者它可以包含CH2结构域和CH3结构域。
在实施方案中，多肽作为二聚融合多肽提供，其包含两个单链多肽和共价偶联所述链的交联方式。
在其他实施方案中，就其通常结合靶和/或其靶种类而言，两个胞外域是相同的。
在优选的实施方案中，第一区包含两个TGF-β受体胞外域(TGFβR-ECD或'TβR-ECD')。在优选的实施方案中，TβR-ECD是TGF-βII型受体胞外域(TβRII-ECD)。在优选的实施方案中，TβR-ECD包含SEQ ID NO:1和与其基本相同的序列。
第二区可包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24的序列和与其基本相同的序列。
在优选的实施方案中，本发明的多肽构建体的第二区还可包含CH1。在实施方案中，构建体是单功能性的。
本发明的多肽构建体采用人源的抗体重链。在优选的实施方案中，抗体重链选自人IgG1(SEQ ID NO:15)和IgG2(SEQ ID NO:24)。
因此，在另一方面，提供了根据本发明的多肽构建体，其中构建体是二聚多肽；其中二聚多肽包含：
(i)第一单链多肽，其包含第二区和第一区，所述第二区包含抗体重链的第二恒定结构域(CH2)和第三恒定结构域(CH3)，所述第一区包含两个TGF-β受体胞外域(TβRII-ECD)，其中第一区的C-末端与第二区的N-末端连接，以及
(ii)第二单链多肽，其包含第二区和第一区，所述第二区包含抗体重链的第二恒定结构域(CH2)和第三恒定结构域(CH3)，所述第一区包含串联连接的两个TGF-β受体胞外域(TβRII-ECD)，其中第一区的C末端与第二区的N末端连接，且第一单链多肽与第二单链多肽相交联。
还提供了编码本发明的任一多肽构建体的核酸分子。还提供了包含本发明的核酸分子的载体。
还提供了包含一种或多于一种的独立选择的本发明多肽构建体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
还提供了包含本发明的核酸分子或载体的转基因细胞宿主。当第二多肽构建体与第一多肽构建体相同或不同时，转基因细胞宿主还可包含编码第二多肽构建体的第二核酸分子或第二载体。当两种多肽构建体不同(异二聚体)时，必然存在第二核酸分子或第二载体，但当构建体相同(同型二聚体)时，则不是必需的。
还提供了根据本发明的多肽构建体用于治疗医学病况、疾病或病症的用途；其中所述医学病况、疾病或病症包括但不限于癌症、眼部疾病、纤维化疾病或结缔组织遗传病症以及免疫病症。
本发明的多肽构建体可包含来自人源抗体重链的CH2和CH3或者仅CH2。例如且不希望是限制性的，抗体重链可选自人IgG1和IgG2。在实施方案中，构建体中的恒定结构域是CH2本身或CH3本身或者CH2-CH3。合适地，抗体重链组分提供相同或不同单链多肽构建体之间的二硫键交联。同样合适的是，抗体重链提供了由宿主细胞所产生的二聚多肽的基于蛋白质A的分离。
在实施方案中，受体胞外域区包含两个独立选择的胞外域，它们串联连接，即以线性方式连接。在一些实施方案中，胞外域的序列相同，或者至少就其靶配体而言相同。
本发明还提供了编码如本文所述的多肽构建体的核酸分子。包含刚刚描述的核酸分子的载体也包括在本发明中。本发明还包括转基因细胞宿主，其包含如本文所述的核酸分子或载体；细胞宿主还可包括编码不同于第一多肽构建体的第二多肽构建体的第二核酸分子或第二载体。用于产生本多肽的系统可以是分泌系统，特别是在需要通过二硫桥来二聚化的情况下，并且表达多核苷酸由此编码在分泌到培养基中时被宿主切割的分泌信号。
包含一种或多于一种的独立选择的本文所述的多肽构建体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物也包括在本发明中。
现在将参考附图通过示例来描述本发明的这些和其他特征，其中：
附图说明
图1A/B是TGF-βII型受体胞外域(TβRII-ECD；也缩写为T2m)和两个T2m结构域的单链融合物(也缩写为T22d35)的示意图(图1A)；图1B提供了对应的氨基酸序列，其中天然接头序列(SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8)带有下划线，TβRII结构化结构域的序列(SEQ ID NO:4)以粗体显示。
图2A-G，其中图2A/B/C是T2m和T22d35模块与IgG2 Fc区的重链N末端(2A)融合以产生融合蛋白T2m-Fc(2B)和T22d35-Fc(2C)的示意图；图2D提供了T2m-Fc和T22d35-Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10)。图2E提供了T22d35-Fc融合物中Fc和ECD区之间的接头区的另外的变体的比对序列。图2F和2G提供了使用人IgG1 Fc(图2F；SEQ IDNO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20)和人IgG2 Fc区(图2G；SEQ ID NO:23)的T22d35-Fc接头变体的氨基酸序列。天然接头序列(SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8)带有下划线，TβRII结构化结构域(SEQ ID NO:4)的序列以粗体显示，人IgG Fc序列变体(SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:24)以粗斜体显示。
图3A/B/C显示了T2m-Fc融合蛋白的制备性SEC洗脱曲线(3A)；合并级分(Fr.)6-11并浓缩。然后通过UPLC-SEC曲线(3B)以及在非还原(NR)和还原(R)条件下的SDS-PAGE评估(3C)来评估SEC纯化的材料的蛋白质完整性。
图4A/B/C显示了T22d35-Fc融合蛋白的制备性SEC洗脱曲线(4A)；合并级分7-10并浓缩。然后通过UPLC-SEC曲线(4B)以及在非还原(NR)和还原(R)条件下的SDS-PAGE评估(4C)来评估SEC纯化的材料的蛋白质完整性。
图5A/B提供了蛋白质A纯化的T22d35-Fc、T22d35-Fc-IgG2-v2(CC)、T22d35-Fc-IgG1-v1(CC)、T22d35-Fc-IgG1-v2(SCC)、T22d35-Fc-IgG1-v3(GSL-CC)、hIgG1FcΔK(C)-T22d35、hIgG1FcΔK(CC)-T22d35和hIgG2FcΔK(CC)-T22d35变体在非还原(A)和还原(B)条件下的SDS-PAGE分析。
图6A/B/C提供了各种融合蛋白的完整单体(A)、聚集体(B)和片段(C)的百分比，表明在IgG Fc部分的N末端表达T22d35二联体是有利的。表格列出了所分析参数的数值差异。
图7A/B/C提供了A549 IL-11释放测定中T2m-Fc和T22d35-Fc融合蛋白与未融合Fc的单链T22d35捕获物相比的功能性评价。评估了TGF-β1(5A)、TGF-β2(5B)、TGF-β3(5C)的中和，并计算为TGF-β对照的百分比(一式三份实验的平均值+/-SD)。表格列出了在GraphpadPrism中计算的IC50值(4-PL算法((log(抑制剂)相对于响应–可变斜率(四参数))。
图8提供了A549 IL-11释放测定中T22d35-Fc、T22d35-Fc-IgG2-v2(CC)、T22d35-Fc-IgG1-v1(CC)、T22d35-Fc-IgG1-v2(SCC)和T22d35-Fc-lgG1-v3(GSL-CC)与C-末端Fc-融合的T22d35捕获物变体进行比较的功能性评价。评估了TGF-β1的中和，并计算为TGF-β1对照的百分比(一式三份实验的平均值+/-SD)。表格列出了在Graphpad Prism中计算的IC50值(4-PL算法((log(抑制剂)相对于响应–可变斜率(四参数))。
图9提供了A549 IL-11释放测定中由T22d35-Fc-IgG1-v1(CC)变体中和TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3的功能性评价。评估了TGF-β的中和，并计算为TGF-β对照的百分比(一式三份实验的平均值+/-SD)。表格列出了在Graphpad Prism中计算的IC50值(4-PL算法((log(抑制剂)相对于响应–可变斜率(四参数))。
图10T22d35-Fc融合蛋白在同系MC-38小鼠结肠癌模型中的功能性体内评价。(A)如所述计算肿瘤体积并绘制为每组的平均肿瘤值+/-SD。使用双因素方差分析(two-wayANOVA)来分析随时间变化在T22d35-Fc和CTL IgG治疗组中所算出的平均肿瘤体积之间是否有统计学显著差异。另外，对CTL IgG治疗组(B)和T22d35-Fc治疗组(C)的每一只小鼠绘制MC-38肿瘤生长(计算出的体积)。
鉴于以下描述，本发明的更多方面和优点将是显而易见的。详细描述和实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出，因为本发明范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
具体实施方式
现在提供了结合并中和所有转化生长因子β(TGF-β1、β2和β3)同种型的多肽构建体。这些多肽利用TGF-β受体胞外域捕获或螯合各种TGFβ种类，包括TGF-β1和TGF-β3，并在某种程度上包括TGF-β2。如本文所证实的，本发明的多肽构建体中和TGF-β1和TGF-β3的效力令人惊讶地远远高于相关构建体。由于这个原因，预期本构建体特别适合用为治疗医学适应症(如癌症、纤维化疾病和某些免疫病症)的药物。
本发明的多肽构建体包含串联连接(C-末端与N-末端连接)的两个TβR-ECD(例如TβRII-ECD)，还包含抗体恒定结构域，该抗体恒定结构域至少包含抗体重链的第二恒定结构域(CH2)和/或第三恒定结构域(CH3)。抗体恒定结构域(Fc)在其N-末端与胞外域的C-末端偶联。将胞外域作为二联体，并使该二联体与抗体恒定结构域的N末端偶联，就提供了具有增强中和效力的“捕获物”，与具有与抗体恒定结构域的N末端偶联的单个ECD的构建体相比，针对TGFβ1的效力增强为615倍，针对TGFβ3的效力增强为24倍。
如本文所使用的，术语TβRII-ECD是指结合TGF-β配体的TGF-βII型受体的细胞外区域。在本构建体的优选实施方案中，TGFβRII胞外域是TGFβR种类的胞外域(即TβRII-ECD)，其包含形成稳定的三维折叠结构的序列：
QLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIF(SEQ ID NO:4)。
在包含柔性天然侧翼序列的相关形式中，ECD可包括带下划线的结构，如下所示：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ IDNO:1)
该序列与称为TGF-β1和TGF-β3的TGF-β配体同种型结合。对TGF-β2的结合亲和力较小。
在本多肽构建体中，两个TβRII-ECD可包含相同的序列。两个胞外域串联连接，其中结果就是一个胞外域的C末端与另一个胞外域的N末端连接的线性多肽。
两个胞外域可通过直接融合来连接，从而不引入额外的氨基酸残基。或者，额外的氨基酸残基可形成串联偶联两个受体胞外域的接头。在本发明的蛋白质构建体中，本发明的多肽构建体的第一区和第二区也连接。术语“连接”是指两个区域共价键合。化学键可通过化学反应实现，或者可以是单个多肽链中两个区域的重组表达产物。在具体的非限制性例子中，第一区的C-末端直接与第二区的N-末端连接，即在两个区域之间不存在额外的“接头”氨基酸。在不存在接头的情况下，也就是说两个区域的直接融合，在完整胞外域的C末端和抗体恒定区CH2-CH3的N末端之间将存在直接连接。例如，通过具有SEQ ID NO:8的固有无序接头将Fc变体(SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24)与SEQ IDNO:1融合，该固有无序接头是具有SEQ ID NO:1的TβRII-ECD的一部分(即没有添加额外的“接头”氨基酸)，我们就将SEQ ID NO:1最后位置的天冬氨酸连接至分别在SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:24的第一位所存在的谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸或缬氨酸。
产生融合构建体的常见做法是在融合组分之间引入甘氨酸或甘氨酸-丝氨酸接头(GSL)，例如GGGGS或[G4S]n(其中n为1、2、3、4或5或更多，例如10、25或50)。如以上段落中所教导的，本发明的多肽融合物可以通过直接连接产生，而不使用除Fc区和受体胞外域中所存在的那些序列之外的任何额外的氨基酸序列。由此我们可以避免利用外来序列作为接头，这提供了因外来序列潜在的不需要的免疫原性和它们增加的分子量所带来的优势。熵因素也是甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸接头的潜在负担，它们是高度柔性的，可能在靶结合时部分受限，因此导致不利于结合亲和力的熵损失。因此，在本发明的实施方案中，仅使用TGFβRII-ECD的柔性的、固有无序的N-末端区域作为天然接头。然而，这些固有无序接头(例如SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8)的特定氨基酸组成和长度排除了准确预测所得直接融合构建体是否具有正确结合其预期的二聚配体所需的几何形状和有利的分子相互作用。在其他实施方案中，融合多肽可包括柔性人工GSL，如SEQ ID NO:20中的构建体中所例示，其中将具有SEQ ID NO:21的GS接头引入在具有SEQ ID NO:1的TβRII-ECD最后一位的天冬氨酸(D)和具有SEQ ID NO:15的Fc区变体第一位的苏氨酸(T)之间。
在实施方案中，多肽构建体的第一区和第二区通过选自SEQ ID NO:8、13、16、19、25及与其基本相同的序列的天然固有无序多肽接头连接。在其他实施方案中，多肽构建体的区域通过选自SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22及与其基本上相同的序列的柔性接头连接。
在该实施方案中，本多肽构建体的一个区域包含TβRII-ECD二联体，其包含通过具有SEQ ID NO:6的天然固有无序多肽接头串联连接的第一和第二受体胞外域，并具有包含以下的氨基酸序列：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKS VNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO:5)。
本构建体还包含含有抗体恒定结构域的区域，所述抗体恒定结构域至少包含抗体重链的第二恒定结构域(CH2)和/或第三恒定结构域(CH3)。抗体恒定结构域在其N-末端与胞外域二联体的C-末端偶联，使得构建体的定向是TβRII-ECD(接头)TβRII-ECD(接头)CH2-CH3的单链。
抗体恒定结构域提供了两种本发明多肽构建体之间的交联。当表达的多肽构建体从其表达宿主分泌时，就实现了这一点。因此，单链多肽的产生提供了二聚体形式的构建体，其中两个构建体通过二硫桥交联，所述二硫桥涉及每个构建体中所存在的每个抗体恒定结构域内的一个或多个半胱氨酸残基。
理想地，存在于构建体中的抗体恒定结构域来自IgG恒定区，尤其是来自IgG1或IgG2的恒定结构域。
所提供的构建体是单功能性的，就这个意义而言，恒定区本身可能没有特定活性，除了作为可以由此形成多肽构建体二聚体的结构。通过掺入相应铰链区并任选地改变半胱氨酸残基组成，也可改变这些最小恒定区以提供一些益处。因此，可以取代或缺失参与桥接两个Fc片段或天然用于桥接全长抗体的重链和轻链之间的一些或所有半胱氨酸残基。使半胱氨酸残基数最小化的一个优点是降低了可能促进聚集的二硫键杂乱(scrambling)倾向。例如，在位于多肽构建体的第一区和第二区的连接处周围的天然或非天然接头序列中看得到这些半胱氨酸残基及其改变，其在以下列出：
人IgG1铰链区序列掺入变异的SEEYNTSNPDTHTCPPCPAPE(SEQ ID NO:16),SEEYNTSNPDVEPKSSDKTHTCPPCPAPE(SEQ ID NO:19),SEEYNTSNPDGGGSGGGSGGGTHTCPPCPAPE(SEQ ID NO:22)；和人IgG2铰链区序列掺入变异的SEEYNTSNPDERKCCVECPPCPAPP(SEQ IDNO:13)和SEEYNTSNPDVECPPCPAPP(SEQ ID NO:25)；以及与其基本相同的序列。
对于Fc同型二聚化的发生，并不需要形成所有天然存在的铰链间二硫键，同时注意到Fc同型二聚体的稳定性可能取决于分子间二硫桥的数量。
在本公开中，“抗体”(在本领域中也称为“免疫球蛋白”(Ig))是指由成对的重链和轻链多肽所构建的蛋白质。尽管在本文进行了概述，但抗体和每个结构域的结构都是本领域技术人员公知和熟悉的。当抗体正确折叠时，每条链折叠成许多不同的球状结构域，这些结构域由更多线性多肽序列连接；免疫球蛋白轻链折叠成可变(VL)和恒定(CL)结构域，而重链折叠成可变(VH)和三个恒定(CH1、CH2、CH3)结构域。一旦配对，重链和轻链可变结构域(VH和VL)和第一恒定结构域(CL和CH1)的相互作用就导致了含有结合区(Fv)的Fab(抗原结合片段)的形成；两条重链的相互作用引起CH2和CH3结构域的配对，导致了Fc(可结晶片段)的形成。本文所描述的CH2和CH3结构域的特征也适用于Fc。
在本发明及其具体实施方案中，表现出显著增强效力的多肽构建体包括以下：
T22d35-Fc：
T22d35-Fc-IgG2-v2(CC)：
T22d35-Fc-IgG1-v1(CC)：
T22d35-Fc-IgG1-v2(SCC)：
和
T22d35-Fc-IgG1-v3(GSL-CC)：
在具体实施方案中，多肽构建体包含表现出显著增强效力的本发明的多肽，例如，表现出显著增强效力的多肽可包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:23。在另一具体实施方案中，多肽构建体可以是包含两种表现出显著增强效力的多肽的同型二聚体；例如，如果表现出显著增强效力的多肽构建体是SEQ ID NO:14，则多肽构建体是包含两个多肽构建体的同型二聚体，其中每个多肽构建体都包含SEQID NO.14。同样地，如果表现出增强效力的多肽是SEQ ID NO:10、14、17、20或23，则本发明的同型二聚体同样包含两个多肽构建体，其中同型二聚体的每个多肽分别为SEQ ID NO:10、14、17、20或23。
如上所述，当从生产宿主分泌时，这些单链多肽构建体将二聚化，产生二聚多肽构建体，其包含通过在两个单链多肽的恒定结构域之间形成二硫桥连接的两个单链多肽。
“显著增强的效力”是指当在与评估TGF-β的生物活性相关的测定中测量时，该二聚体形式的本发明的多肽构建体的效果或活性高于对应构建体。本文举例说明了进行这种确认的适当方法。例如，N-末端Fc-融合的T22d35二联体比N-末端Fc-融合的T2m单体程度上好得多地中和TGF-β，如通过A549细胞的TGF-β诱导的IL-11释放所说明的(图7)。
观察到这种类型的融合构建体相对于基于TβRII受体-胞外域的分子的几种其他形式(包括未融合Fc的二价TGF-β受体胞外域构建体(例如T22d35二联体)和单一受体胞外域与Fc区的N末端融合的构建体)具有优势。特别地，由于Fc区的存在，目前提供的Fc融合构建体具有改善的可制造性(例如，可使用蛋白质A层析法实现纯化)。Fc区还使得能够改善循环半衰期。重要的是，与单体融合物(T2m-Fc)和未融合Fc的二联胞外域(T22d35)相比，本构建体具有实质上更高的TGF-β中和效力。所提供的N末端融合的TGF-βECD二联体Fc构建体(T22d35-Fc)在TGF-β配体中和效力的显著改善方面表现出优势(如例如相对于未融合Fc的二联体的TGF-β1中和超过970倍的改善所显示的，如图7所示)。此外，它们表现出改善的可制造性，如生物物理分析所证实的，其显示了>99％的单体含量(即聚集体的最低存在和纯化的N末端融合的T22d35-Fc构建体片段的缺失)(如图6所示)。因此，本发明的优点是TGF-β配体中和的意外高效力，包括TGF-β2的一定程度的中和，这在T2m-Fc(Fc-单体)或T22d35(未融合Fc)构建体中未观察到。
在具体的实施方案中，本发明的多肽构建体的第二区选自在如SEQ ID NO:12、15、18、24所示例的N-末端序列中显示出变异的序列。这些序列可以是长度不同和从铰链区保留的半胱氨酸残基的数量不同，作为调节Fc区二聚化程度并因此影响功效和可制造性二者的手段。因此，在实施方案中，多肽构建体包含恒定结构域中的变异，其中缺失或取代了至少一个参与交联的半胱氨酸残基。合适的取代包括丝氨酸或丙氨酸，优选丝氨酸。
基本相同的序列可包含一个或多个保守氨基酸突变，其仍然在分泌到培养基中时提供恰当的折叠。本领域已知，相对参考序列的一个或多个保守氨基酸突变可产生与参考序列相比在生理、化学、物理化学或功能特性上没有实质变化的突变肽；在这种情况下，参考序列和突变序列将被认为是“基本相同的”多肽。保守氨基酸取代在本文中定义为将氨基酸残基取代成具有相似化学性质(例如大小、电荷或极性)的另一氨基酸残基。可以对框架区进行这些保守氨基酸突变，同时维持恒定结构域的整体结构；由此维持了Fc的功能。
在具体的非限制性例子中，本发明的多肽构建体的第一区可包含TGF-βII型受体，例如：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ IDNO:1，本文也称为T2m)。
在优选的实施方案中，多肽构建体包含TβRII-ECD“二联体”，其中TβRII-ECD与另一TβRII-ECD串联连接，它们的胞外域可以是相同或不同的TGF-β超家族受体胞外域，例如：
-接头-
(SEQ ID NO:5，本文也称为T22d35)，其中在一个非限制性实施方案中，接头对应于SEQ ID NO:6；及与其基本相同的序列。“基本相同”是如上所定义的。
胞外域二联体可掺入相同或不同的胞外域，两者都属于TGFβ超家族受体家族。在实施方案中，胞外域结合相同的靶。在其他实施方案中，胞外域具有相同的受体种类。在其他实施方案中，胞外域是相同的，因此是同型聚体。
例如，本发明的多肽构建体可具有比单独的T22d35二联体分别更有效至少900倍和200倍的针对TGFβ1和TGF-β3的TGF-β中和效力。例如，在IL-11释放测定中，与单独的未融合Fc的T22d35二联体相比，T22d35-Fc二联构建体在中和TGF-β1方面更有效大约972倍，在中和TGF-β3方面更有效大约243倍。
在另一个例子中，与抗体恒定结构域与单个胞外域而不是二联体偶联的构建体相比，该构建体中和TGF-β1和TGF-β3的效力分别高至少600倍和至少20倍。当与抗体恒定结构域与单个胞外域而不是二联体偶联的构建体的效力相比时，本发明的多肽构建体可分别具有至少615倍和24倍的针对TGF-β1和TGF-β3的更佳中和效力。
中和效力可总结如下：Fc-融合的二联体(ECD-ECD-Fc)的中和效力强于Fc-融合的ECD单体(ECD-Fc)；即ECD-ECD-Fc>ECD-Fc，而ECD-Fc比未融合Fc的二联体(ECD-ECD)更有效，且未融合Fc的二联体ECD比未融合Fc的单体ECD更有效；即ECD-ECD-Fc>>ECD-Fc>ECD-ECD>>ECD)。就可制造性而言，Fc蛋白的存在使得能够进行蛋白质A纯化并避免了必须使用可切割标签。另外，单体或二联体ECD定位在Fc部分的N末端防止了由于Fc部分的铰链区中半胱氨酸残基的不恰当配对而引起的聚集问题。因此，ECD单体或二联体与Fc部分的N-末端的融合提供了相对于C-末端融合的改善的可制造性(N-末端融合具有更高百分比的单体物质、更少的聚集体、更少的片段)。此外，与N-末端Fc融合的T2m单体ECD相比，观察到了N末端Fc融合的二联体ECD在TGF-β中和效力方面对于所有TGF-β同种型的意外显著增加。
另外，当本发明的多肽构建体包括结合TGF-β的TβRII-ECD时，多肽构建体可在不同程度上中和TGF-β的所有三种同种型(即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)。
本发明的多肽构建体具有比二价比较多肽(即未融合Fc的T22d35(单独的二联体)和T2m-Fc(Fc融合的单体))显著更高(20倍或更高)的TGF-β中和效力。在本发明的一系列多肽构建体中，含有与Fc恒定区的N末端融合的两个或更多个拷贝的TβRII-ECD的那些构建体比仅含有一个拷贝的那些构建体具有更高的效力，如在基于细胞的测定中所评估的。
本发明的多肽构建体表达为单条多肽链。一旦表达，本发明的多肽构建体就形成二聚体，其中相应多肽构建体的CH2和CH3结构域相互作用以形成正确组装的Fc区，例如发生在表达产物被分泌到培养基中时。
本发明的多肽构建体还可以包含额外的序列以帮助重组抗体或其片段的表达、检测或纯化。可以使用本领域技术人员已知的任何此类序列或标签。例如且不希望是限制性的，抗体或其片段可包含靶向或信号序列(例如但不限于ompA)、检测/纯化标签(例如但不限于c-Myc、His5、His6或His8G)或其组合。在另一个例子中，信号肽可以是MDWTWRILFLVAAATGTHA(SEQ ID NO:11)。在进一步的例子中，额外序列可以是生物素识别位点，例如如[WO/1995/04069]或[WO/2004/076670]中所述的。如本领域技术人员也已知的，接头序列可以与额外序列或标签联合使用，或者可以用作检测/纯化标签。合适地，恒定区包含蛋白质A结合位点(通常大致位于CH2和CH3之间)，其允许使用蛋白质A亲和方法提取/分离单链多肽。
本发明还包括编码如上所述分子的核酸序列。鉴于遗传密码的简并性，许多核苷酸序列将具有编码所需多肽的作用，这将是本领域技术人员容易理解的。可将核酸序列进行密码子优化以在各种微生物中表达。本发明还包括含有刚刚所描述的核酸的载体，其中载体通常包含与编码构建体的多核苷酸可操作连接的启动子和信号序列，以驱动其在所选择的细胞生产宿主中表达。载体可以相同或不同，只要都产生二聚多肽构建体的分泌即可。
此外，本发明包括细胞，本文也称为转基因细胞宿主，其包含所述的编码第一多肽构建体的核酸和/或载体。宿主细胞可包含编码不同于第一多肽构建体的第二多肽构建体的第二核酸和/或载体。第一多肽构建体和第二多肽构建体的共表达可导致异二聚体的形成。
本发明还包括含有一种或多于一种的如本文所述的多肽构建体的组合物。组合物可包含如上所述的单个多肽构建体，或者可以是多肽构建体的混合物。组合物还可包含一种或多于一种的本发明的多肽构建体，其与一种或多于一种的货物分子连接。例如且不希望以任何方式进行限制，组合物可包含与细胞毒性药物连接的一种或多于一种的本发明的多肽构建体，以产生根据本发明的抗体-药物缀合物(ADC)。
组合物还可包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或运载体。稀释剂、赋形剂或运载体可以是本领域已知的任何合适的稀释剂、赋形剂或运载体，必须与组合物中的其他成分相容、与组合物的递送方法相容并对组合物的接受者无害。组合物可以是任何合适的形式；例如，组合物可以以混悬液形式、粉末形式(例如但限于冻干或包封的)、胶囊或片剂形式提供。例如且不希望是限制性的，当组合物以混悬液形式提供时，运载体可包含水、盐水、合适的缓冲剂或添加剂以改善溶解性和/或稳定性；在合适的pH下于缓冲液中进行重建以产生混悬液，以确保抗体或其片段的活力。干粉还可包括用于改善稳定性的添加剂和/或用于增加容量/体积的运载体；例如且不希望是限制性的，干粉组合物可包含蔗糖或海藻糖。在具体的非限制性例子中，可将组合物配制成将抗体或其片段递送至受试者的胃肠道。因此，组合物可包含用于递送抗体或其片段的包封、时间释放或其他合适的技术。制备包含本发明化合物的合适组合物将是本领域技术人员能力范围内的。
本发明的构建体可用于治疗与TGF-β超家族配体的过表达或过度活化相关的疾病或病症。所述疾病或病症可选自但不限于癌症、眼部疾病、纤维化疾病或结缔组织的遗传病症。
在癌症治疗领域，最近已经证实TGF-β是抑制由免疫疗法(例如免疫检查点抑制剂(ICI))引起的抗肿瘤应答的关键因素(Hahn&Akporiaye，2006)。具体而言，对ICI抗体的治疗应答主要来自肿瘤定位的T细胞的再活化。对ICI抗体的耐药性归因于存在免疫抑制机制，其导致了肿瘤微环境中T细胞的缺乏。因此，现在认识到，为了在耐药性患者中引起应答，ICI抗体需要与能够激活T细胞并诱导其募集到肿瘤中的试剂进行组合，即逆转“非T细胞炎症性”肿瘤表型。一篇出版物指出，克服非T细胞炎症性肿瘤微环境是免疫肿瘤学中最重要的下一个难关(Gajewski，2015)。
我们已使用原理论证证明了阻断TGF-β的TGF-β捕获物T22d35有效地逆转了“非T细胞炎症性”肿瘤表型(Zwaagstra等，2012)。这就将抗TGF-β分子定位为与ICI和其他免疫治疗剂的潜在协同组合。为了支持这一点，2014年的研究(Holtzhausen等，ASCO海报展示)检验了在生理学相关的转基因黑素瘤模型中组合抗-CTLA-4抗体时TGF-β阻断剂的作用。该研究证实，虽然抗-CTLA-4抗体单一疗法未能抑制黑素瘤进展，但TGF-β拮抗剂和抗-CTLA-4抗体的组合显著且协同地抑制了原发性黑素瘤肿瘤生长以及黑素瘤转移。这些观察结果与黑素瘤组织中效应T细胞的显著增加有关联。
我们在本文证明，具有T22d35-Fc基本结构的本发明的多肽显著降低了同系小鼠MC-38结肠癌模型中的肿瘤生长。这就由此将抗TGF-β分子定位成用于与其他免疫治疗剂的潜在协同组合。
本发明的构建体可用于治疗纤维化疾病，包括影响身体任何器官(包括但不限于肾、肺、肝、心脏、皮肤和眼睛)的疾病。这些疾病包括但不限于慢性阻塞性肺病(COPD)、肾小球肾炎、肝纤维化、梗死后心肌纤维化、再狭窄、系统性硬化、眼部手术诱发的纤维化以及瘢痕化。
结缔组织的遗传病症也可被治疗，包括但不限于马凡综合征(Marfan syndrome，MFS)和成骨不全症(Osteogenesis imperfecta，OI)。
在以下实施例中将进一步说明本发明。然而，应该理解这些实施例仅用于说明目的，不应以任何方式用于限制本发明的范围。
材料&方法
生产&纯化
瞬时CHO表达
各种TβRII-ECD融合变体(例如T2m-Fc和T22d35-Fc)各自都包含重链Fc区，并在其N-末端包括信号序列MDWTWRILFLVAAATGTHA(SEQ ID NO:11)。经合成(Biobasic Inc.或Genescript USA Inc.)制备出构建体的DNA编码区，并将其克隆到pTT5哺乳动物表达质粒载体(Durocher等,2002)的HindIII(5'端)和BamH1(3'端)位点。通过用重链T2m或T22d35与IgG重链融合的(分别为T2m-Hc和T22d35-HC)构建体瞬时转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来产生融合蛋白。简而言之，将T2m-HC或T22d35-HC质粒DNA分别转染到含有4mM谷氨酰胺和0.1％Kolliphor p-188(Sigma)的FreeStyle F17培养基(Invitrogen)中的CHO-3E7细胞的2.5L和4.6L培养物中，并维持在37℃。转染条件为：DNA(80％质粒构建体，15％AKT质粒，5％GFP质粒):PEIpro(比例1:2.5)：PEI(聚乙烯亚胺)pro(Polyplus)(比例＝1:2.5)。转染24小时后，加入10％胰蛋白胨N1补料(TekniScience Inc.)和0.5mM丙戊酸(Vaporic acid，VPA，Sigma)并将温度变为32℃以促进融合蛋白的产生和分泌，然后在转染后维持15天，之后收获细胞。在最终收获时，细胞存活率为89.6％。
稳定池CHO表达
通过用表达编码各种Fc融合的TβRII-ECD蛋白的靶基因的载体转染细胞来产生CHOBRI/rcTA细胞池。转染后第二天，将细胞以250rpm离心5分钟，并在选择培养基(补充有50μM甲硫氨酸亚砜亚胺(methionine sulfoximine)的PowerCHO2培养基)中以0.5×106个细胞/mL的密度接种。在14至18天的过程中每2-3天更换选择培养基，接种量为0.5×106个细胞/mL。如上所述用Cedex Innovatis的自动细胞计数Cedex分析仪来测量细胞数和存活率。当细胞存活率达到大于95％时，将细胞池以0.2×106个细胞/mL接种在125或250mL的锥形瓶中。对于补料分批培养，如上所述接种CHOBRI/rcTA细胞池。在接种后第三天，当细胞密度达到3.5至4.5×106个细胞/mL时，通过加入2μg/mL的cumate诱导重组蛋白的表达。将MSX浓度调节至125μM，加入F12.7补料(Irvine Scientific)，然后将温度变为32℃。每2-3天向培养物中补充5％(v:v)F12.7，收集样品进行重组蛋白(pA-HPLC)和葡萄糖(VITROS 350,Orthoclinical Diagnostics,USA)浓度测定。加入葡萄糖以保持17mM的最低浓度。
纯化
将来自CHO细胞的收获上清液过滤(0.2μm)并上样到蛋白质A MabSelect Sure柱(GE Healthcare)上。用2倍柱体积的PBS洗涤柱子，用3倍柱体积的0.1M柠檬酸钠pH 3.6洗脱蛋白质。为使产量最大化，将流穿液重新上样到蛋白质A柱上并如上所述洗脱。将洗脱的级分用1M Tris中和，合并含有融合蛋白的级分，然后上样到在制剂缓冲液(不含Ca2+、不含Mg2+的DPBS)中平衡过的Hi-load Superdex S200 26/60尺寸排阻层析(SEC)柱(GEHealthcare)上。使用1倍柱体积的制剂缓冲液洗脱蛋白质，收集连续级分并通过280nm处的UV吸光度进行检测。然后合并含有融合蛋白的主峰SEC级分并浓缩。在还原和非还原条件下(SYPRO Ruby染色)，通过UPLC-SEC和SDS-PAGE(4-15％聚丙烯酰胺)进一步分析合并级分中蛋白质A(Prot-A)和SEC纯化的融合蛋白的完整性。对于UPLC-SEC而言，将在DPBS(Hyclone，无Ca2+、无Mg2+)中的2-10μg蛋白质注射到Waters BEH200 SEC柱(1.7μm，4.6×150mm)上并使用Waters Acquity UPLC H-Class Bio-System在室温下以0.4mL/min的流速解析8.5分钟。在280nm处检测蛋白峰(Acquity PDA检测器)。
细胞系
人A549非小细胞肺癌细胞购自ATCC(Cat#CCL-185,Cedarlane,Burlington,ON)。在补充有5％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)中培养细胞。MC-38小鼠结肠腺癌细胞购自Kerafast(Cat#ENH204,Boston,MA)，在补充有2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的Dulbecco改良MEM中培养。将两种细胞系维持在37℃补充有5％CO2的潮湿气氛中。
TGF-β诱导的A549细胞IL-11释放测定
将人A549肺癌细胞接种在96孔板中(5×103个细胞/孔)。第二天，在不存在或存在连续稀释的TGF-β捕获物融合蛋白的情况下，将在完全培养基中的10pM TGF-β在室温下温育30分钟，然后加入细胞中。温育21小时(37℃，5％CO2，潮湿气氛)后，收获条件培养基并加入到用2μg/mL生物素化小鼠抗人IL-11抗体(MAB618,R&D Systems,Minneapolis,MN)包被的MSD链霉抗生物素蛋白金板(Meso Scale Diagnostics,Gaithersburg,MD)上。18小时(4℃)后，用含有0.02％吐温20的PBS洗涤板，然后加入2μg/mL硫(SULFO)标记的山羊抗人IL-11抗体(AF-218-NA,R&D Systems Minneapolis,MN)，将板在室温下温育1小时。最后一次洗涤后，在MESO QuickPlex SQ120机器(Meso Scale Diagnostics,Gaithersburg,MD)中对板读数。与仅用TGF-β处理的对照细胞相比，将IL-11读数表示为IL-11释放百分比。使用Graphpad Prism(4-PL算法((log(抑制剂)相对于响应–可变斜率(四参数))计算IC50值(在需要时使用自动离群值选项)。
在同系小鼠结肠癌MC-38皮下小鼠模型中的体内评估
雌性C57BL/6-Elite小鼠(5-7周龄)购自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)。在第0天，用3×105个MC-38细胞经皮下注射到十三只C57BL/6小鼠的右侧腹中。当肿瘤达到50-100mm3的体积时(第5天)，将动物分成2组并开始治疗：
·组1(7只动物)：同种型对照(CTL IgG；BioxCell InVivo MAb大鼠IgG2b，抗-KLH；Clone LTF-2,Cat#BE0090)；在第5、7、9和11天，经腹膜内(i.p.)注射200μg(在100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)。
·组2(6只动物)：T22d35-Fc，5mg/kg(在100μL PBS中)，在第5、9、12和16天腹膜内注射。
在开始治疗后直到15天，使用数字卡尺每周测量肿瘤两次。如前所述(Tomayko等,1986)使用改进的椭圆球公式(Tvol＝π/6×(长×宽×宽))从这些测量结果计算肿瘤体积。
结果&讨论
融合构建体设计
为产生感兴趣的TGF-β捕获物，我们将TβRII-ECD单体(称为T2m)与另一这样的单体融合，从而形成与人(h)IgG2 Fc区和人IgG1 Fc区重链的N末端偶联的胞外域二联体(称为T22d35)。图1显示了T2m和T22d35的示意图(图1A)和氨基酸序列(图1B)。使用几个接头变体(图2E)将这些模块与IgG Fc区重链的N末端(图2A)融合，以产生T2m-Fc(图2B)和T22d35-Fc变体(图2C)融合物。这些融合物的序列如图2D所示。我们还设计了T22d35-Fc的变体，探索Fc结构域的铰链区中的半胱氨酸残基数、不同的IgG同种型(人IgG1与IgG2)以及作为T22d35与Fc结构域N-末端之间的接头的不同长度和性质的序列(图2E，2F&2G)。这些变异旨在探索并最终优化T22d35-Fc设计的功能性和可制造性属性。
表达和纯化
瞬时CHO材料的纯化
将各个融合蛋白构建体在CHO-3E7细胞中瞬时表达(参见表1)，之后收获条件培养基并使用蛋白质A亲和柱进行纯化，然后进行制备性尺寸排阻层析(SEC)。T2m-Fc(图3A)和T22d35-Fc(图4A)的SEC洗脱曲线显示，这些融合蛋白是相对纯的且没有聚集体。合并级分6-11(T2m-Fc)和7-10(T22d35-Fc)并浓缩至5.6mg/mL(T2m-Fc)和6.03mg/mL(T22d35-Fc)。T2m-Fc和T22d35-Fc的最终产量分别为267mg和168mg。通过UPLC-SEC显示最终产物(所述SEC合并级分)纯度>99％(图3B&4B)。SDS-PAGE评估(图3C&4C，Sypro RUBY染色)显示了在还原条件下～60kDa和～90kDa的T2m-Fc和T22d35-Fc条带，而能够检测到约90kDa和150kDa的条带则分别代表在非还原条件下完全组装的和高纯度的T2m-Fc和T22d35-Fc融合蛋白。表1列出了生产和纯化细节的概况。总之，这些结果证实了T2m-Fc和T22d35-Fc融合蛋白的良好可制造性。
表1：T2m-Fc和T22d35-Fc融合蛋白的生产(瞬时池)和纯化细节。
稳定CHO池材料的纯化
将N-和C-末端Fc-融合的T22d35变体在CHOBRI/rcTA细胞中稳定表达，以比较它们的表达水平和它们的一些生物物理特性。将每个变体的编码区连接到哺乳动物细胞表达质粒中，并在转染后选择稳定表达每种变体的富集细胞池。变体之间的主要差异可以在组成将T22d35二联体与Fc结构域分隔开的接头区氨基酸序列中找到(在N-末端融合物的情况下)，而对于C-末端Fc-融合物而言，每种变体之间的差异在蛋白质的最远氨基末端(表2)。
表2：N-和C-末端Fc-融合的T22d35融合物的接头区中氨基酸变异的描述(粗体：天然接头序列；斜体：人工接头序列)。每个变体中的成对半胱氨酸残基加下划线。
变体ID Fc定向/同种型 相关序列差异
T22d35-Fc N-末端/IgG2 T22d35........ERKCCVECPPCPAPP...
T22d35-Fc-IgG2-v2 N-末端/IgG2 T22d35.............VECPPCPAPP...
T22d35-Fc-IgG1-v1 N-末端/IgG1 T22d35............THTCPPCPAPE...
T22d35-Fc-IgG1-v2 N-末端/IgG1 T22d35....VEPKSSDKTHTCPPCPAPE...
T22d35-Fc-IgG1-v3 N-末端/IgG1 T22d35.GGGSGGGSGGGTHTCPPCPAPE...
Fc-IgG1-T22d35-v1 C-末端/IgG1 PPCPAPE...T22d35
Fc-IgG1-T22d35-v2 C-末端/IgG1 DKTHTCPPCPAPE...T22d35
Fc-IgG2-T22d35-v1 C-末端/IgG2 VECPPCPAPP...T22d35
通过蛋白质A亲和并使用100 mM柠檬酸盐(pH3.6)作为洗脱缓冲液纯化融合蛋白。将洗脱的融合蛋白样品用1 M HEPES中和，然后使用Zeba旋转柱进行与DPBS的缓冲液交换(表3)，同时通过SDS-PAGE评估几种纯化的融合蛋白的完整性(图5)。每种变体的纯化是相似的。尽管这些变体之间的许多特性非常相似，但聚集的可能性(这表明不恰当的折叠)显示出一些区别。蛋白质聚集可以指示降低的构象稳定性，且可导致活性、功效或效力降低。使用尺寸排阻层析-高效液相层析(SEC-HPLC)确定每个N-和C-末端Fc-融合变体的纯度。该方法允许精确测量完整单体物质的百分比以及杂质(如聚集体和/或降解产物)的存在。如图6所示，可在表达为N-末端Fc融合物的T22d35变体和表达为C-末端融合物的T22d35变体之间观察到显著差异。特别地，对于所有五种N-末端融合变体(SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:23)而言，完整单体的百分比(图6A)为约99％，而这对于三种C-末端融合物(SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28)而言就显著较低了。完整单体百分比的这种显著降低是由于在所有C-末端Fc-融合物中所观察到的增加的更高分子量聚集体的累积(图6B)以及在三个C-末端Fc融合物的两个中更低分子量片段的增加(图6C)。此外，对各个500 mL产物的滴度以及N-末端Fc-融合和C-末端Fc-融合的T22d35产物的平均滴度的评价表明，与C末端融合物相比，N末端Fc融合的T22d35变体能够以更高的产量产生(表4)。总之，这些结果表明，在部分(例如免疫球蛋白的Fc部分)的N-末端表达T22d35二联体存在显著且意想不到的优点。总而言之，这些数据证实了N-末端Fc-融合的T22d35蛋白的可制造性的增强。
表3：纯化500mL稳定池材料后T22d35变体的蛋白质产量概况。
表4：各个N-和C-末端Fc-融合的T22d35融合物的滴度比较
体外功能性评估
使用A549细胞IL-11释放测定来比较T2m-Fc和T22d35-Fc融合蛋白与未融合Fc的T22d35单链二联体捕获物的TGF-β中和效力，如图7A/B/C所示。该数据显示，对于所有TGF-β同种型而言，T22d35-Fc的效力优于T2m-Fc和未融合Fc的T22d35单链捕获物的效力，计算出的IC50对于TGF-β1和TGF-β3分别为0.003348和0.003908nM(表5)。这些值证实了比T22d35高至少970倍和高至少240倍的效力(对于TGF-β1和TGF-β3，IC50分别为3.253和0.9491nM)，比T2m-Fc高615倍和高24倍(对于TGF-β1和TGF-β3，IC50分别为2.059和0.0943nM)。此外，T22d35-Fc中和了TGF-β2，但是比TGF-β1和TGF-β3的程度低得多。相反，对于T2m-Fc或T22d35单链捕获物未观察到TGF-β2中和。应注意的是，尽管T22d35-Fc捕获物对于TGF-β1和TGF-β3的中和效力是相似的，但是T2m-Fc变体显示出比TGF-β1高～22倍的TGF-β3中和效力(分别为2.059nM和0.0943nM)。对更多N-末端Fc-融合的T22d35融合物[T22d35-Fc-IgG2-v2(CC),T22d35-Fc-IgG1-v1(CC),T22d35-Fc-IgG1-v2(SCC)和T22d35-Fc-IgG1-v3(GSL-CC)]的评价(图8，表6)表明，所有这些融合物都显示出相当的TGF-β1中和效力，其与T22d35-Fc的效力非常相似。对T22d35-Fc-IgG1-v1(CC)变体的额外评价(图9)证实，与T22d35-Fc变体一致，其针对TGF-β1和TGF-β3的中和效力非常相似(分别为IC50＝0.003327nM和0.003251nM)，而对TGF-β2的这种效力就要低得多(IC50＝17.33nM)。
表5：使用Graphpad Prism提供的4-PL算法((log(抑制剂)相对于响应–可变斜率(四参数))对图5所示曲线统计评价的概括。
表6：使用Graphpad Prism提供的4-PL算法((log(抑制剂)相对于响应–可变斜率(四参数))对图7所示曲线统计评价的概括。
体内功能性评估
使用同系MC-38小鼠结肠癌模型在体内评价T22d35-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:10)(图9)。将用T22d35-Fc融合物治疗的动物中的肿瘤生长与用对照IgG(CTL IgG)治疗的动物中的肿瘤生长进行比较。如图9所示，直到治疗后第11天都没有观察到肿瘤生长的显著差异，但是在第15天，当与CTL IgG相比时，用T22d35-Fc治疗的动物的肿瘤体积中可观察到肿瘤生长的显著降低(双因素方差分析)。该数据显示，与用CTL IgG治疗的组相比，施用T22d35-Fc引起了对MC-38肿瘤生长的显著抑制，这表明在该结直肠癌同系模型中的体内TGF-β阻断可中止(abrogate)肿瘤的生长。
序列表
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Claims (26)

1.用于抑制转化生长因子β(TGF-β)同种型的作用的多肽构建体，其中所述多肽构建体的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:23。
2.根据权利要求1所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体抑制TGF-β活性的效力比具有单个TβR-ECD的对应构建体高至少20倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或600倍。
3.根据权利要求1所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体抑制TGF-β活性的效力比未融合Fc的TβR-ECD二联体高至少100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍或900倍。
4.根据权利要求1所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体的氨基酸序列由SEQ IDNO:14组成。
5.用于抑制转化生长因子β(TGF-β)同种型的作用的同型二聚多肽构建体，其中所述同型二聚多肽构建体由两个相同的单链多肽组成，
其中所述单链多肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23。
6.编码权利要求1-5中任一项所述的任一多肽构建体的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码的所述多肽构建体是能够由所选表达宿主分泌的形式。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其中所述核酸分子的核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述核酸分子的核酸序列由SEQ ID NO:30组成。
10.包含权利要求6所述的核酸分子的表达载体。
11.包含权利要求9所述的核酸分子的载体。
12.用于抑制TGF-β活性的组合物，其包含有效量的权利要求1-5中任一项所述的多肽构建体以及药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。
13.包含权利要求6所述的核酸分子的转基因细胞宿主。
14.产生同型二聚多肽构建体的方法，其包括：
在允许多肽构建体被宿主表达并且二聚化形成同型二聚多肽构建体的条件下培养权利要求13所述的转基因细胞宿主；并且
从条件生长所述宿主的培养基中回收所述同型二聚多肽构建体。
15.权利要求1-5中任一项所述的多肽构建体在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
16.用于抑制TGF-β活性的药物组合物，其包含有效量的权利要求5所述的同型二聚多肽构建体。
17.权利要求5所述的同型二聚多肽构建体在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
18.用于抑制TGF-β活性的药物组合物，其包含有效量的权利要求4所述的多肽构建体。
19.编码权利要求4所述的多肽构建体的核酸分子。
20.根据权利要求19所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码的所述多肽构建体是能够由所选表达宿主分泌的形式，由此产生包含两个拷贝的Fc融合多肽构建体的同型二聚多肽构建体。
21.包含权利要求20所述的核酸分子的载体。
22.包含权利要求20所述的核酸分子的转基因细胞宿主。
23.产生同型二聚多肽构建体的方法，其包括：
在允许多肽构建体被宿主表达并且二聚化形成同型二聚多肽构建体的条件下培养权利要求22所述的转基因细胞宿主，其中所述同型二聚多肽构建体包含两个拷贝的Fc融合多肽构建体；并且
获得所述同型二聚多肽构建体。
24.同型二聚多肽构建体，其包含两个多肽构建体，所述两个多肽构建体各自为权利要求4所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体在相应抗体恒定结构域之间通过至少一个二硫桥连接。
25.用于抑制TGF-β活性的药物组合物，其包含有效量的权利要求24所述的同型二聚多肽构建体。
26.权利要求24所述的同型二聚多肽构建体在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
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