KR20220062084A - 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료를 위한 재조합 IgG Fc 다량체 - Google Patents

면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료를 위한 재조합 IgG Fc 다량체 Download PDF

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체에스엘 베링 렝나우 아게
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Abstract

본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료를 위한 재조합 IgG Fc 다량체의 용도 및 상기 다량체를 투여함에 의해 면역 복합체 매개된 콩팥 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료를 위한 재조합 IgG Fc 다량체
본원의 개시내용은 면역 복합체-매개된 콩팥 장애의 치료를 위한 재조합 IgG Fc 다량체의 용도 및 상기 다량체를 투여함에 의해 면역 복합체-매개된 콩팥 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
혈장-유래된 면역글로불린 G (IgG)는 1차 및 2차 면역결핍을 치료하기 위해 클리닉에서 사용된다. 상기 경우에, IgG는 정맥내 (IVIG) 또는 피하 (SCIG)로 투여된다. 둘다는 10,000명 초과의 공여자의 대형 혈장 풀로부터 제조하여 다양한 항체 레퍼토리를 보장한다.
고용량의 IVIG 또는 SCIG(1-2g/kg/용량)의 투여는 면역 혈소판 감소증(ITP), 길랑-바레 증후군, 가와사키 질환, 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증(CIDP), 중증 근무력증(MG) 및 기타 여러 희귀 질환과 같은 만성 또는 급성 자가면역 및 염증성 질환을 갖는 환자의 치료를 위해 점점 더 많이 사용되고 있다. 추가로, 예를 들어 류마티스 관절염(RA)의 치료와 같은 여러 다른 적응증에 대한 IVIG 또는 SCIG의 오프라벨 사용이 현재 연구 중에 있다.
고용량 IVIG/SCIG의 항염증 효과에 대해 수많은 작용 기전이 제안되었다. 이들은 Fcγ 수용체 (FcγR)의 차단, 자가항체 제거를 증진시키기 위한 신생아 FcR (FcRn)의 포화, 억제성 FcγRIIB (CD32B)의 상향 조절, 보체 단백질 단편의 소거 및 보체 단편 침착의 억제, IVIG/SCIG에서 항이디오타입 항체(Ab)의 억제, 면역 매개체 (예를 들어, 사이토킨)의 결합 또는 중화 또는 면역 세포의 조절(예를 들어, 조절 T 세포, B 세포 및 관용성 수지상 세포의 유도)을 포함한다.
면역 복합체-매개된 콩팥 장애에 대해 효과적이고 안전한 치료요법이 요구된다. 이들 장애는 콩팥 또는 콩팥 구조물의 염증에 의해 매개된다. 이들은 무엇보다 신염, 사구체신염, 간질성신염, 항-사구체기저막(항-GBM) 사구체신염, 굿파스처 증후군, 자가면역 콩팥 질환, 루푸스신염, 막성신병증, 막증식성 사구체신염(MPGN) 및 브라이트 (Bright) 질환을 포함한다.
항-GBM 항체는 사구체 기저막을 따라 이들 항체의 침착을 특징으로 하는 생명을 위협하는 신장 질환인 굿파스처 증후군의 발병에 필수적인 역할을 수행한다(문헌참조: Otten et al., J Immunol 2009; 183:3980-3988). 이들 침착은 초승달 형성, 흉터 및 실제 기능 상실로 이어진다.
관절염, ITP 및 염증성 신경병증의 실험 동물 모델에서 효능을 보인 Fc 융합 및 다량체 단백질을 포함하는 다양한 재조합 Fc 기반 치료제가 개발 중이다(문헌참조: Anthony et al., 2008, Science 320, 373-376; Czajkowsky et al., 2015, Sci. Rep. 5, 9526; Jain et al., 2012, Arthritis Res. 14, R192; Lin et al., 2007, J. Neuroimmunol. 186, 133-140; Niknami et al., 2013, J. Peripher. Nerv. Syst. 18, 141-152; Thiruppathi et al., 2014, J. Autoimmun. 52, 64-73).
다중 Fc 도메인을 포함하는 예상 IVIG 대체 단백질은 WO2008/151088, WO2012/016073, WO2013/112986, WO2017/214321 또는 WO2017/019565에 기재되어 있다. 다중 Fc 단편을 갖는 작제물의 다양한 상이한 구조를 고려하면서, 기재된 주요 부류의 상기 작제물은 소위 스트라도머(stradomer)이고, 이는 IgG2 힌지 영역과 같은 다량체화 도메인을 갖는 Fc 단편을 포함한다. 그러나. WO2008/151088에서, 예상된 다량체 단백질의 효능에 관한 어떠한 실시예도 제공되어 있지 않다.
순 등(Sun et al)은 보체 의존성 질환의 치료에서 특정 스트라도머의 용도를 기재한다(문헌참조: Sun et al., J Autoimmun 2017; 84:97-108). 특히, 순 등(Sun et al)은 2개의 재조합 Fc 다량체 (스트라도머 GL-2045로부터 생성된)의 시험을 기재하고 있고, 상기 다량체는 변형되어 낮은/중간 정도의 친화성 FcγR과 상호작용하는 제한된 능력을 갖지만, C1q에 대해서는 고친화성을 갖는다. 이들 화합물은 순차적이고, 고도로 정렬된 Fc 다량체로 구성된 것으로 밝혀졌다. 상기 저자들은 GL-2045와 유사하게 이들 약물이 C1q 싱크로서 작용함에 의해 기능하는 것으로 결론지었다. 주어처 등(Zuercher et al.)은 GL-2045가 사람 IgG2 힌지 영역을 사람 IgG1 Fc에 융합하여 설계된 것으로서, IgG1 Fc 단편이 순차적으로 중합하여 다양한 길이 또는 다량체화 정도의 Fc 다량체의 이종 풀을 생성하여 필수적으로 래더(ladder)를 형성함을 논이한다(문헌참조: Zuercher et al., Autoimmun Rev. 2016; 15(8):781-5).
본 발명에서 유용할 수 있는 다량체화 도메인을 갖는 다른 Fc 다량체 작제물은 IgM 테일피스(tailpiece)가 IgG Fc 단편을 다량체화하는 데 사용되는 육량체 작제물을 포함한다. 예를 들어, WO2014/060712는 절단된 힌지 영역을 갖는 IgG1 Fc 영역, 상기 Fc의 C-말단에 4개의 아미노산 링커 및 IgM 테일피스를 포함하여 다량체화하여 주로 육량체 구조를 형성하는 Fc 다량체 작제물을 기재한다. IgM의 서열을 모방하기 위해 Fc 잔기 309 및 310에서의 돌연변이(L309C 및 H310L)가 도입되었다.
WO2015/132364 및 WO2015/132365는 5개의 아미노산 힌지 영역, IgG1, IgG4, 또는 IgG1 및 IgG4 CH2 및 CH3 도메인의 하이브리드로부터 유래된 Fc 영역 및 IgM 또는 IgA 테일피스를 포함하는 여러 Fc 다량체 작제물을 기재한다. 본원의 개시내용은 융합 펩타이드의 Fc 영역에서 아미노산 변화의 도입을 통해 IgG Fc 다량체의 안전성 및 효능을 개선시키는 것에 관한 것이다.
최적화된 육량체 Fc-μTP 작제물은 WO2017/129737에 기재되어 있고, 이는 이전에 기재된 것들 보다 생체내, 생체외 및 시험관내에서 여러 이득을 갖는 것으로 나타났다. Fc-μTP- 및 Fc-μTP-L309C-결합된 C1q는 보체 단백질 C2의 절단을 유도하지 않았고, 따라서 어떠한 C3 컨버타제가 형성되지 않았다(C4b2a). Fc-μTP 및 Fc-μTP-L309C는 선택적으로 완전한 고전적 보체 경로의 활성화를 억제하였고; 대안적 경로와의 어떠한 간섭도 관찰되지 않았다.
다른 Fc 다량체는 WO2015/168643, WO2017/205436 및 WO2017/205434에 기재되어 있다. 이들 Fc 다량체는 다량체화 도메인의 사용 없이 어셈블리된 다중 Fc 단량체를 포함한다. 대신, 2개 이상의 Fc 폴리펩타이드는 예를 들어, 가요성 펩타이드 링커를 통해 선형 정렬로 융합될 수 있고, 추가의 Fc 폴리펩타이드와 공동 발현될 수 있고; 상기 Fc 단량체의 어셈블리는 선택적 모듈 (예를 들어, 크놉-인-홀 또는 정전기의 돌연변이)의 사용에 의해 지시되고, 이는 단지 특정 Fc 폴리펩타이드가 조합할 수 있음을 제공한다.
본원 발명자들은 이제 놀랍게도 Fc-μTP-L309C, CC, SIF1 및 Q1을 포함하는 본 발명에 사용된 Fc 다량체가 예를 들어 항-GBM 사구체신염과 같은 면역 복합체-매개 콩팥 장애의 치료에 효과적이라는 것을 발견하였다 .
본 발명에 사용된 Fc 다량체는 순 등(Sun et al.)의 스트라도머로서 예를 들어, C1q와 같은 보체 시스템 단백질에 대해 증진된 결합에 대한 임의의 돌연변이가 부재이지만, 이들은 면역 복합체 매개의 콩팥 장애의 발병기전을 강력하게 억제할 수 있다. 예를 들어, 항-GBM 사구체신염의 마우스 모델에서, C1q로의 증진된 결합을 유도하는 임의의 돌연변이를 갖지 않는 본 발명의 Fc 다량체는 보체 의존성 세포독성 및 항체 의존성 세포독성을 억제함에 의해 알부민뇨를 예방하는데 보다 우수한 효능을 입증하였다.
발명의 개요
본원 개시내용은 다량체화 도메인 또는 링커의 존재를 통해 어셈블리되고 보체 시스템 단백질에 대한 결합 친화성을 증가시키는 어떠한 돌연변이도 포함하지 않는 Fc 다량체를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 복합체-매개 콩팥 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 구현에에서, 본 발명에 사용되는 Fc 다량체는 2 내지 6개 IgG Fc 융합 단량체를 포함한다. 각각의 IgG Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하며, 여기서, 상기 Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 이의 결합 친화성을 증가시키기 위한 돌연변이가 부재이다. 일부 바람직한 구현예에서, 보체 시스템 단백질은 C1q이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용된 Fc 다량체에 존재하지 않는 돌연변이는 위치 267, 268, 또는 324 중 어느 하나에서 Fc 다량체의 IgG1 Fc 도메인에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 또는 S324T 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 위치 267, 268, 및 324 중 어느 하나에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 위치 233, 234, 235, 236, 238, 265, 297, 299, 또는 328 중 어느 하나에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 또는 L328F 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 299에서의 아미노산은 트레오닌으로부터 세린 또는 시스테인 이외의 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 298에서의 아미노산은 프롤린 이외의 다른 임의의 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 236에서 아미노산은 결실되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 스트라도머가 아니다. 일부 구현예에서, Fc 다량체는 다량체화 도메인으로서 IgG2 힌지 도메인을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 여기서 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고, 여기서 다량체화 도메인은 IgG2 힌지를 포함하지 않는다. 이들 구현예의 일부 양상에서, Fc 다량체는 스트라도머가 아니다.
본 발명의 일부 구현예에서, Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 여기서 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고, 여기서 Fc 다량체는 스트라도머가 아니다.
일부 바람직한 구현예에서, Fc 다량체는 6개 IgG 융합 단량체를 포함하는 Fc 육량체이다. 일부 바람직한 구현예에서, Fc 다량체는 다량체화 도메인으로서 IgM 테일피스를 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 추가로 IgG 힌지 영역을 포함하고 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
예를 들어, 일부 바람직한 구현예에서,, 본 발명에 사용된 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG1 힌지 영역, IgG1 Fc 도메인, 및 IgM 테일피스를 포함하고, Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄에서 IgM 테일피스는 IgG1 Fc 폴리펩타이드의 불변 영역의 C-말단에서 232개 아미노산과 융합된 18개 아미노산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 1이다. 추가로 바람직한 구현예에서, Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 1이고, 최대 5개 보존성 아미노산 변화를 갖는다. 별도의 바람직한 구현예에서, Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 2(WO2017/129737의 서열번호 7에 상응하는)로서 발현되고, 이로부터 신호 펩타이드는 분비 동안에 절단되어 성숙한 Fc 육량체를 형성한다. 일부 구현예에서, Fc 육량체는 스트라도머가 아니다.
일부 바람직한 구현예에서, 성숙한 Fc 육량체는 재조합 사람 Fc 육량체이다. 일부 구현예에서, Fc 육량체는 보체 시스템 단백질에 대한 이의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 일부 바람직한 구현예에서, 보체 시스템 단백질은 C1q이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용된 Fc 다량체에 존재하지 않는 돌연변이는 위치 267, 268, 또는 324 중 어느 하나에서 Fc 육량체의 IgG1 Fc 도메인에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 또는 S324T 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 위치 267, 268, 및 324 중 어느 하나에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 위치 233, 234, 235, 236, 238, 265, 297, 299, 또는 328 중 어느 하나에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 또는 L328F 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 299에서의 아미노산은 트레오닌으로부터 세린 또는 시스테인 이외의 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 298에서의 아미노산은 프롤린 이외의 다른 임의의 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 236에서 아미노산은 결실되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
바람직한 구현예에서 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG1 힌지 영역, IgG1 Fc 도메인, 및 IgM 테일피스를 포함하고, 여기서 IgG1 Fc 도메인은 (EU 넘버링에 따라) 위치 309에서 류신 대신 시스테인을 갖고, 여기서 Fc 융합 폴리펩타이드는 Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않고 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 3(WO2017/129737의 서열번호 2에 상응)이다. 추가로 바람직한 구현예에서, Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 3이고, 최대 5개 보존성 아미노산 변화를 갖는다. 별도의 바람직한 구현예에서, Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 4(WO 2017/129737의 서열번호 8에 상응하는)로서 발현되고, 이로부터 신호 펩타이드는 분비 동안에 절단되어 성숙한 Fc 육량체를 형성한다.
본 발명에서 사용되는 추가의 구체예는 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드는 또한 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄에 연결된 신호 펩타이드를 암호화한다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 다량체화 도메인을 함유하지 않는다.
하나의 구현예에서, Fc 다량체는 3개의 Fc 단량체를 형성하는 4개의 폴리펩타이드로 구성된다. 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 폴리펩타이드, 제1 링커, 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제2 폴리펩타이드는 제3 Fc 폴리펩타이드, 제2 링커, 및 제4 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제3 폴리펩타이드는 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제4 폴리펩타이드는 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 양상에서, 제1 폴리펩타이드 및 제3 폴리펩타이드는 조합하여 함께 제1 Fc 단량체를 형성하고; 제5 Fc 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드는 조합하여 함께 제2 Fc 단량체를 형성하고; 제6 Fc 폴리펩타이드 및 제4 Fc 폴리펩타이드는 조합하여 함께 제3 Fc 단량체를 형성한다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 항원-인지 영역, 예를 들어, 가변 도메인(예를 들어, VH, VL, 초가변 영역 (HVR)) 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하지 않는다.
상기 양상의 일부 구현예에서, 제1 및 제3 Fc 폴리펩타이드 각각은 제1 Fc 폴리펩타이드와 제3 Fc 폴리펩타이드 간에 이량체화를 촉진시키는 상보성 이량체화 선택적 모듈을 포함하고/하거나; 제2 및 제5 Fc 폴리펩타이드 각각은 제2 Fc 폴리펩타이드와 제5 Fc 폴리펩타이드 간의 이량체화를 촉진시키는 상보성 이량체화 선택적 모듈을 포함하고/하거나; 제4 및 제6 Fc 폴리펩타이드 각각은 제4 Fc 폴리펩타이드와 제6 Fc 폴리펩타이드 간의 이량체화를 촉진시키는 상보성 이량체화 선택적 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, 상보성 이량체화 선택적 모듈은 Fc 폴리펩타이드의 선택적 이량체화를 촉진시킨다. Fc 폴리펩타이드의 선택적 이량체화를 촉진하기 위해 상보적 이량체화 선택적 모듈을 사용한 본원에 기재된 임의의 Fc 작제물에서, Fc 폴리펩타이드는 2개의 Fc 폴리펩타이드 사이(즉, Fc 폴리펩타이드와 Fc 작제물의 또 다른 Fc 폴리펩타이드 사이)에서 상이한 서열, 예를 들어 20개 이하의 아미노산(예를 들어, 15개, 10개 이하의 아미노산)만큼 상이한 서열, 예를 들어, 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 아미노산 만큼 상이한 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 작제물의 Fc 폴리펩타이드 서열은 임의의 Fc 작제물의 상보성 이량체화 선택적 모듈이 Fc 폴리펩타이드의 하나의 CH3 항체 불변 도메인에서 가공된 공동(cavity) 및 Fc 폴리펩타이드의 다른 CH3 항체 불변 도메인에서 가공된 돌기를 포함하고, 여기서 상기 가공된 공동 및 가공된 돌기는 Fc 폴리펩타이드의 공동으로의 돌기 쌍(protuberance-into-cavity pair)을 형성하도록 위치한다. 일부 구현예에서, Fc 작제물은 CH3 도메인에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 작제물은 선택적 이량체화를 위해 Fc 폴리펩타이드(하나 이상의 Fc 폴리펩타이드)의 CH3 도메인에 아미노산 변형을 포함한다. 예시적인 가공된 공동 및 돌기는 당업계에 공지되어 있다. 다른 구현예에서, 상보성 이량체화 선택적 모듈은 Fc 폴리펩타이드의 하나의 CH3 항체 불변 도메인에서 가공된 (치환된) 음전하 아미노산 및 다른 Fc 폴리펩타이드의 CH3 항체 불변 도메인에서 가공된 (치환된) 양전하 아미노산을 포함하고, 여기서 상기 음전하 아미노산 및 양전하 아미노산은 상보성 Fc 폴리펩타이드 간의 Fc 도메인의 형성을 촉진하도록 위치한다. 예시적인 상보성 아미노산 변화는 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 Fc 폴리펩타이드는 동일한 서열이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 Fc 폴리펩타이드는 동일한 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드의 1개, 2개, 3개 또는 4개만이 동일한 변형을 갖는다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 3개의 Fc 단량체를 형성하는 4개의 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 폴리펩타이드, 제1 링커 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드는 제3 Fc 폴리펩타이드, 제2 링커, 및 제4 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드는 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제4 폴리펩타이드는 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제3 Fc 폴리펩타이드는 제1 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제5 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제2 Fc 폴리펩타이드는 제2 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제6 Fc 폴리펩타이드 및 제4 Fc 폴리펩타이드는 제3 Fc 단량체를 형성한다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 링커를 통해 연결된 적어도 2개의 Fc 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 다량체는 적어도 1개의 링커를 포함한다. 링커는 3 내지 200개 아미노산 (예를 들어, 3-150, 3-100, 3-60, 3-50, 3-40, 3-30, 3-20, 3-10, 3-8, 3-5, 4-30, 5-30, 6-30, 8-30, 10-20, 10-30, 12-30, 14-30, 20-30, 15-25, 15-30, 18-22 및 20-30 아미노산)을 포함하는 아미노산 스페이서일 수 있다. 적합한 펩타이드 링커는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 글라이신 및 세린과 같은 가요성 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 모티프, 예를 들어, GS, GGS, GGSG, GGGGS, GGG, GGGG의 단일, 다중 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 GS, GGS, GGSG, GGGGS, GGG, GGGG 또는 서열번호 128 내지 155 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 탠덤 시리즈로 2개의 Fc 폴리펩타이드를 연결하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, 링커는 CL 및 CH1 항체 불변 도메인을 연결하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, 링커는 또한 글라이신 및 세린 이외의 다른 아미노산, 예를 들어, 서열번호 156 내지 162를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, Fc 다량체는 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존성 치환)을 갖는 서열번호 97-127 또는 서열번호 97-127을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 작제물의 Fc 도메인의 Fc 폴리펩타이드는 상이한 서열, 예를 들어, 2개의 Fc 폴리펩타이드 사이(즉, Fc 폴리펩타이드와 Fc 작제물의 또 다른 Fc 폴리펩타이드 사이)에서 20개 이하의 아미노산(예를 들어, 15개, 10개 이하의 아미노산)만큼 상이한 서열, 예를 들어, 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 아미노산 만큼 상이한 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, Fc 작제물에서 하나 이상의 폴리펩타이드는 말단 라이신 잔기를 함유한다. 일부 구현예에서, Fc 작제물에서 하나 이상의 Fc 폴리펩타이드는 말단 라이신 잔기를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, Fc 작제물에서 모든 Fc 폴리펩타이드는 말단 라이신 잔기를 함유한다. 일부 구현예에서, Fc 작제물에서 모든 Fc 폴리펩타이드는 말단 라이신 잔기를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 서열번호 98, 100, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 및 117 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어진 Fc 폴리펩타이드에서 말단 라이신 잔기는 제거되어 말단 라이신 잔기를 함유하지 않는 상응하는 Fc 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 말단 라이신 잔기는 서열번호 97, 99, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 및 118-127의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 필수적으로 이루어진 Fc 폴리펩타이드에 첨가되어 말단 라이신 잔기를 함유하는 상응하는 Fc 폴리펩타이드를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 Fc 다량체의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 일부 바람직한 구현예에서, 보체 시스템 단백질은 C1q이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용된 Fc 다량체에 존재하지 않는 돌연변이는 위치 267, 268, 또는 324 중 어느 하나에서 Fc 다량체의 IgG1 Fc 도메인에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 또는 S324T 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 위치 267, 268, 및 324 중 어느 하나에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 위치 233, 234, 235, 236, 238, 265, 297, 299, 또는 328 중 어느 하나에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 또는 L328F 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 299에서의 아미노산은 트레오닌으로부터 세린 또는 시스테인 이외의 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 298에서의 아미노산은 프롤린 이외의 다른 임의의 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 236에서 아미노산은 결실되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
바람직한 구현예에서, Fc 다량체는 정맥내 또는 비정맥내로 투여된다. 하나의 구현예에서, Fc 다량체는 피하로 투여된다. 하나의 구현예에서, Fc 다량체는 경구, 또는 척추강내로 또는 분무에 의한 폐내로 적용된다.
바람직한 구현예에서, Fc 다량체는 약 3　mg/kg 내지 약 200 mg/kg 범위의 양으로 투여된다. 하나의 구현예에서, Fc 다량체는 약 1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg 범위의 양으로 투여된다. 모든 용량은 Fc 다량체가 투여되는 대상체의 체중 kg 당이다.
대안적 구현예에서, 본 발명에 사용되는 Fc 다량체는 스트라도머이고, 여기서, IgG Fc 단편에는 WO2008/151088, WO2012/016073, WO2017/214321 또는 WO2017/019565에 기재된 바와 같이 다량체화 도메인, 바람직하게 IgG2 힌지 영역이 제공되지만, 상기 Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 이의 결합 친화성을 증가시키기 위한 임의의 돌연변이가 부재이다. 일부 바람직한 구현예에서, 보체 시스템 단백질은 C1q이다. 바람직한 구체예에서, Fc 다량체는 서열번호 5를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 발현함에 의해 생산되고, 이로써 성숙한 Fc 다량체는 서열번호 5의 잔기 21 내지 264를 포함한다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적이며, 본원 개시내용의 추가의 비제한적인 설명을 제공하기 위해 의도된 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 ELISA 키트에 의해 마우스 소변에서 검출된 알부민 수준으로 나타낸 항-GBM 사구체신염의 생체내 모델에서 CHO 세포에서 생성된 Fc-μTP-L309C 육량체(CSL777)의 효과를 보여준다.
도 2는 ELISA 키트에 의해 마우스 소변에서 검출된 알부민 수준으로 나타낸 항-GBM 사구체신염의 생체내 모델에서, CHO 세포(Fc-μTP-L309C (CHO)) 및 HEK293 세포 (Fc-μTP-L309C (HEK))에서 생성된 Fc-μTP-L309C 육량체(CSL777), 및 감소된 C1q 결합 능력(K322A)을 갖는 돌연변이체 육량체의 효과를 보여준다.
도 3은 ELISA 키트에 의해 마우스 소변에서 검출된 알부민 수준으로 나타낸 항-GBM 사구체신염의 생체내 모델에서 Fc-μTP-L309C 육량체(CSL777) 및 다른 Fc 다량체 (CC, SIF1 및 Q1)의 효과를 보여준다.
도 4는 ELISA 키트에 의해 마우스 소변에서 검출된 알부민 수준으로 나타낸 항-GBM 사구체신염의 생체내 모델에서 Fc-μTP-L309C 육량체(CSL777)의 용량-반응 효과를 도시한다.
도 5: WO2017/129737로부터의 서열
도 6: 본 발명의 구현예에서 사용된 다른 육량체 서열
도 7: 본 발명의 구현예에서 사용된 스트라도머 서열
도 8: 본 발명의 구현예에서 사용된, WO2017/172853에 기재된 바와 같은 재조합 Fc 화합물
도 9: 본 발명의 구현예에서 사용된 Fc 다량체에 사용된 적합한 힌지 영역의 예
도 10: 본 발명의 구현예에서 사용된 3가 Fc 다량체에 대한 서열
하기의 상세한 설명 및 실시예는 본원의 개시내용의 특정 구현예를 설명한다. 당업자는 이의 범위에 의해 포괄되는 본원 개시내용의 다수의 변화 및 변형이 있음을 인지할 것이다. 따라서, 특정 구현예의 기재는 제한하는 것으로서 간주되지 않아야 한다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 여기서 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고; Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 Fc 다량체의 결합 친화성을 증가시키기 위한 임의의 돌연변이가 부재이다.
일부 구현예에서, 보체 시스템 단백질에 대한 Fc 다량체의 결합 친화성을 증가시키고 따라서 본 발명에서 사용되는 Fc 다량체로부터 배제되는 돌연변이는 Fc 다량체의 하나 이상의 IgG1 Fc 도메인에서의 적어도 하나의 점 돌연변이일 수 있다. 일부 구현예에서 배제된 돌연변이는 IgG1 Fc 도메인의 위치 267, 268, 및/또는 324에서의 점 돌연변이에 상응한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 또는 S324T 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 위치 267, 268, 및/또는 324 중 적어도 하나에 상응하고 위치 233 및/또는 위치 234, 및/또는 위치 235, 및/또는 위치 236, 및/또는 위치 238, 및/또는 위치 265, 및/또는 위치 297, 및/또는 위치 299, 및/또는 위치 328에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 추가로 포함하는 하나 이상의 점 돌연변이일 수 있다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 위치 233, 및/또는 위치 234, 및/또는 위치 235, 및/또는 위치 236, 및/또는 위치 238, 및/또는 위치 265, 및/또는 위치 297, 및/또는 위치 299, 및/또는 위치 328일 수 있다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 또는 L328F 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 위치 299에서의 아미노산은 트레오닌으로부터 세린 또는 시스테인 이외의 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 298에서의 아미노산은 프롤린 이외의 다른 임의의 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 236에서 아미노산은 결실되지 않는다. 일부 구현예에서, 보체 시스템 단백질은 C1q일 수 있다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 스트라도머가 아니다. 일부 구현예에서, Fc 다량체는 다량체화 도메인으로서 IgG2 힌지를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 여기서 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고, 여기서 다량체화 도메인은 IgG2 힌지를 포함하지 않는다. 추가의 구현예에서, Fc 다량체는 스트라도머가 아니다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 여기서 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고, 여기서 Fc 다량체는 스트라도머가 아니다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 6개 IgG 융합 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 다량체는 다량체화 도메인으로서 IgGM 테일피스를 포함한다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 재조합 사람 Fc 육량체이다. 일부 구현예에서, 재조합 사람 Fc 육량체는 6개의 사람 IgG1 Fc 융합 단량체를 포함하고, 여기서 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 사람 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 사람 IgG1 Fc 폴리펩타이드 및 사람 IgM 테일피스를 포함하고, 추가로 여기서 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄 내 IgM 테일피스는 IgG1 Fc 폴리펩타이드의 불변 영역의 C-말단에서 232개 아미노산과 융합된 18개 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 사람 Fc 육량체는 보체 시스템 단백질에 대한 이의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 일부 바람직한 구현예에서, 보체 시스템 단백질은 C1q이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용된 Fc 다량체에 존재하지 않는 돌연변이는 위치 267, 268, 또는 324의 임의의 하나에서 Fc 육량체의 IgG1 Fc 도메인에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 또는 S324T 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 위치 267, 268, 및 324 중 어느 하나에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 위치 233, 234, 235, 236, 238, 265, 297, 299, 또는 328 중 어느 하나에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 또는 L328F 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 299에서의 아미노산은 트레오닌으로부터 세린 또는 시스테인 이외의 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 298에서의 아미노산은 프롤린 이외의 다른 임의의 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 236에서 아미노산은 결실되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 일부 구현예에서, 재조합 사람 Fc 육량체는 스트라도머가 아니다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 3개의 Fc 단량체를 형성하는 4개의 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 폴리펩타이드, 제1 링커 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드는 제3 Fc 폴리펩타이드, 제2 링커, 및 제4 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드는 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제4 폴리펩타이드는 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제3 Fc 폴리펩타이드는 제1 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제5 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제2 Fc 폴리펩타이드는 제2 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제6 Fc 폴리펩타이드 및 제4 Fc 폴리펩타이드는 제3 Fc 단량체를 형성한다.
추가의 구현예에서, Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 이의 결합을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 일부 바람직한 구현예에서, 보체 시스템 단백질은 C1q이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용된 Fc 다량체에 존재하지 않는 돌연변이는 위치 267, 268, 또는 324 중 어느 하나에서 Fc 다량체의 IgG1 Fc 도메인에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 또는 S324T 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 위치 267, 268, 및 324 중 어느 하나에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 위치 233, 234, 235, 236, 238, 265, 297, 299, 또는 328 중 어느 하나에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 또는 L328F 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 299에서의 아미노산은 트레오닌으로부터 세린 또는 시스테인 이외의 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 298에서의 아미노산은 프롤린 이외의 다른 임의의 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 236에서 아미노산은 결실되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “Fc 단량체”는 IgG, 또는 이의 변이체 또는 단편의 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 면역글로불린 G(IgG) 중쇄 불변 영역의 일부로서 정의된다. IgG CH2 및 CH3 도메인은 또한 각각 Cγ2 및 Cγ3 도메인으로서 언급된다.
Fc 단량체는 폴리펩타이드의 N-말단 부분에서 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 Fc 폴리펩타이드로 구성될 수 있다. IgG에 대해 설명된 디설파이드 결합의 배열은 천연 사람 항체와 관련이 있다. 이러한 항체가 본 발명의 맥락에서 적합할 수 있지만, 다른 척추동물 종으로부터의 항체간에는 약간의 변화가 있을 수 있다. Fc 폴리펩타이드는 재조합 발현 기술에 의해 생산될 수 있고 천연 항체에서 발생하는 바와 같이 디설파이드 결합에 의해 연합될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 새로운 시스테인 잔기는 디설파이드 결합이 형성될 수 있도록 Fc 폴리펩타이드 내 적절한 위치에 도입될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용된 Fc 단량체는 WO2017/129737에 기재된 바와 같이 사람 IgG1 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 동일한 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 Fc 단량체는 전체 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고 WO2017/129737에 기재된 바와 같이 각각 CH2의 N-말단 또는 CH3의 C-말단에서 절단된다. 전형적으로, Fc 단량체는 면역글로불린의 Fab 폴리펩타이드가 부재이다. Fab 폴리펩타이드는 CH1 도메인 및 중쇄 가변 영역 도메인으로 구성된다.
본 발명에서 사용되는 Fc 단량체는 면역글로불린의 CH2 및 CH3 부분 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 단량체는 면역글로불린의 힌지 영역, 이의 단편 또는 변이체, 또는 변형된 힌지 영역을 포함한다. 천연 힌지 영역은 천연 면역글로불린에서 CH1과 CH2 도메인 사이에 존재하는 면역글로불린 영역이다. 변이체 또는 변형된 힌지 영역은 길이 및/또는 조성이 천연 힌지 영역과 상이한 임의의 힌지이다. 상기 힌지는 다른 종으로부터의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 변형된 힌지 영역은 Fc 부분의 것과 상이한 부류 또는 아부류의 항체로부터 유래된 완전한 힌지 영역을 포함한다. 대안적으로, 변형된 힌지 영역은 천연 힌지의 일부 또는 반복 단위의 각 단위가 천연 힌지 영역으로부터 유래되는 반복 단위를 포함한다. 또 다른 대안에서, 상기 천연 힌지 영역은 시스테인 잔기의 수를 증가시키거나 감소시킴으로써 변경된다. 다른 변형된 힌지 영역은 완전히 비-천연이고 길이, 시스테인 조성 및 가요성과 같은 원하는 성질을 갖도록 디자인된다.
다수의 변형된 힌지 영역은 예를 들어, US5,677,425, WO1998/25971, WO1999/15549, WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에서 본 발명에 사용하기 위해 기재되었다.
본 발명의 하나의 구현예에 사용된 Fc 다량체 내 Fc 폴리펩타이드는 이의 N-말단에서 사람 IgG1 힌지 영역을 갖는다. 하나의 구현예에서, 힌지 영역은 서열번호 1의 잔기 1 내지 15의 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 Fc 폴리펩타이드 쇄는 WO 2017/129737에 개시된 바와 같은 신호 펩타이드를 포함하여 발현된다. 신호 펩타이드는 Fc 폴리펩타이드 쇄의 분비를 지시하고, 이후 Fc 폴리펩타이드 쇄의 나머지 부분으로부터 절단된다.
본 발명의 구현예에서 사용되는 Fc 폴리펩타이드는 힌지 영역의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드를 포함한다. 신호 펩타이드는 서열번호 2의 잔기 1 내지 19의 서열을 가질 수 있고; 그러나, 당업자는 포유동물 세포로부터 단백질의 분비를 지시하는 다른 신호 서열이 또한 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
2개 이상의 Fc 단량체의 다량체 구조의 형성을 개선시키기 위해 Fc 폴리펩타이드는 테일피스에 융합되어 단량체 단위가 다량체로 어셈블리되게 한다. 테일피스에 대한 Fc 폴리펩타이드의 융합 생성물은 본원에 사용된 바와 같은 "Fc 융합 폴리펩타이드"이다. Fc 폴리펩타이드가 이량체화되어 Fc 단량체를 형성함에 따라, Fc 융합 폴리펩타이드는 마찬가지로 이량체화되어 Fc 융합 단량체를 형성한다.
따라서, 본원에 사용된 "Fc 융합 단량체"는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 IgM 테일피스 또는 IgA 테일피스, 바람직하게는 IgM 테일피스를 포함한다.
적합한 테일피스는 IgM 또는 IgA로부터 유래한다. IgM 및 IgA는 공통 H2L2 항체 단위의 공유 다량체로서 사람에서 천연적으로 존재한다. IgM은 J-쇄가 혼입된 경우 5량체로 존재하고 J-쇄가 없는 경우 육량체로 존재한다. IgA는 단량체로서 존재하고 이량체를 형성한다. IgM 및 IgA의 중쇄는 각각 테일피스로서 알려진 C-말단 불변 도메인에 대한 각각의 18개 아미노산 연장을 보유한다. 상기 테일피스는 중합체의 중쇄 사이에 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하고 있고, 중합에 중요한 역할을 갖는 것으로 사료된다. 상기 테일피스는 또한 당화 부위를 함유한다.
본원 개시내용의 테일피스는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함한다. 테일피스는 천연적으로 존재하는 항체에서 발견되는 테일피스이거나, 대안적으로 천연 테일피스와 길이 및/또는 조성이 상이한 변형된 테일피스이다. 다른 변형된 테일피스는 완전히 비-천연적이고, 길이, 가요성 및 시스테인 조성과 같은 다량체화에 목적하는 성질을 갖도록 디자인된다.
본 발명의 구현예에서 사용되는 Fc 다량체의 테일피스는 서열번호 1 및 서열번호 9의 잔기 233 내지 250에 나타난 사람 IgM의 18개 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함한다. 대안적으로, 테일피스는 사람 IgM 테일피스의 단편 또는 변이체일 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서 사용되는 Fc 다량체의 테일피스는 Fc 폴리펩타이드의 불변 영역의 C-말단에 직접 융합되어 Fc 융합 폴리펩타이드를 형성한다. 대안적으로, 테일피스는 Fc 폴리펩타이드, 바람직하게는 사람 IgG1 Fc 폴리펩타이드의 불변 영역의 C-말단에서 232개 아미노산 분절에 융합된다. 대안적으로, 테일피스는 중재 아미노산 서열을 수단으로 간접적으로 융합된다. 예를 들어, 짧은 링커 서열은 테일피스와 Fc 폴리펩타이드 사이에 제공될 수 있다. 링커 서열은 길이가 1 내지 20개 아미노산일 수 있다.
다량체 구조의 형성은 Fc 융합 폴리펩타이드의 Fc 부분의 류신 309를 시스테인으로 돌연변이시킴에 의해 추가로 개선될 수 있다. L309C 돌연변이는 Fc 융합 단량체 간에 추가의 디설파이드 결합 형성을 가능하게 하여 Fc 융합 단량체의 다량체화를 추가로 촉진시킨다. IgG 부분의 잔기는 문헌(참조: Edelman GM et al (1969), Proc Natl Acad Sci 63, 78-85)에 기재된 바와 같이 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되고; 또한 문헌(Kabat et al., 1983, Sequences of proteins of immunological interest, US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, Washington, DC)을 참조한다. IgG의 Leu 309는 서열 상동성에 의해 IgM의 Cμ3 도메인에서 Cys 414 및 IgA의 Cα2 도메인에서 Cys 309에 상응한다.
추가로 또는 대안적으로 다른 돌연변이는 Fc 융합 폴리펩타이드에 도입하여 목적할 수 있는 효과를 성취한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “돌연변이”는 하나 이상의 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, WO2017/129737에 기재된 바와 같이, Fc 융합 폴리펩타이드는 최대 20개, 최대 10개, 최대 5개 또는 최대 2개의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에 사용된 Fc 다량체 내 돌연변이는 WO2017/129737에 기재된 바와 같이 보존성 아미노산 변화이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “보존성 아미노산 변화”는 아미노산이 유사한 생화학적 성질, 예를 들어, 전하, 소수성, 구조 및/또는 크기를 갖는 아미노산으로의 변화를 언급한다. 본 발명의 구현예에 사용된 Fc 융합 폴리펩타이드는 최대 20개, 최대 10개, 최대 5개, 또는 최대 2개의 보존성 아미노산 변화를 포함한다. 예를 들어, Fc 융합 폴리펩타이드는 최대 5개의 보존성 아미노산 변화를 포함한다.
보존성 아미노산 변화는 하기의 잔기 그룹 중에서의 변화를 포함한다: Val, Ile, Leu, Ala, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Gly, Ala; Lys, Arg, His; 및 Phe, Tyr, Trp.
펩타이드, 단백질 또는 이의 단편을 기재하기 위해 본원에 사용된 경우 “변이체”는 변형된 아미노산을 가질 수 있다. 적합한 변형은 아세틸화, 글리코실화, 하이드록실화, 메틸화, 뉴클레오타이딜화, 인산화, ADP-리보실화, 및 당업계에 공지된 다른 변형을 포함한다. 상기 변형은 펩타이드가 재조합 기술에 의해 제조되는 경우 해독후 일어날 수 있다. 다르게는, 변형은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 합성 펩타이드에 적용될 수 있다. 변형은 아미노산의 펩타이드로의 도입 전에 포함될 수 있다. 카복실산 그룹은 에스테르화되거나 아미드로 전환될 수 있거나, 아미노 그룹은 알킬화, 예를 들어, 메틸화될 수 있다. 변이체는 또한 해독후 변형되어 예를 들어, 탄수화물 측쇄 또는 개별 당 모이어티가 제거되거나 부가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “Fc 다량체”는 2개 이상의 중합된 Fc 단량체를 기재한다. Fc 단량체는 Fc 융합 단량체일 수 있다. Fc 다량체는 2 내지 6개의 Fc 단량체를 포함하여 Fc 이량체, Fc 삼량체, Fc 사량체, Fc 오량체 및 Fc 육량체를 생성한다. Fc 단량체는 상이한 수의 단량체 유닛을 갖는 중합체로 연합한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “연결된”은 화학적 접합, 재조합 수단 및 화학적 결합, 예를 들어, 디설파이드 결합 및 아미드 결합을 포함하는 수단에 의해 2개 이상의 요소, 성분 또는 단백질 도메인, 예를 들어, 폴리펩타이드의 조합 또는 부착을 기재하기 위해 사용된다. 예를 들어, 2개의 단일 폴리펩타이드는 연결되어 화학적 접합, 화학적 결합, 펩타이드 링커 또는 공유 연결의 임의의 다른 수단을 통해 하나의 연속 단백질 구조를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 폴리펩타이드는 링커, 예를 들어, 펩타이드 링커에 의해 제2 Fc 폴리펩타이드에 연결되고, 상기 펩타이드 링커의 N-말단은 화학적 결합, 예를 들어, 펩타이드 결합을 통해 제1 Fc 폴리펩타이드의 C-말단에 연결되고 펩타이드 링커의 C-말단은 화학적 결합, 예를 들어, 펩타이드 결합을 통해 제2 Fc 폴리펩타이드의 N-말단에 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “링커”는 2개의 요소들 사이에 “스페이서”, 예를 들어, Fc 폴리펩타이드를 언급한다. 용어 “스페이서”는 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 도메인 사이에 공간 및/또는 가요성을 제공하기 위해 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 도메인 사이에 존재하는 모이어티 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체) 또는 아미노산 서열 (예를 들어, 3-200개 아미노산, 3-150개 아미노산 또는 3-100개 아미노산 서열)을 언급한다. 아미노산 스페이서는 폴리펩타이드의 1차 서열의 일부 (예를 들어, 폴리펩타이드 백본을 통해 이격된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 도메인에 연결된)이다. “링커”는 가요성 및/또는 공간을 제공하기 위해 2개의 Fc 폴리펩타이드 사이에 존재할 수 있다.
WO2017/129737에서, 다수의 Fc 다량체는 Fc 육량체이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “다수”는 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과를 언급한다. 하나의 구현예에서, 80% 초과의 Fc 다량체는 Fc 육량체이다.
특정 수의 단량체를 함유하는 Fc 다량체가 요구되는 경우, Fc 다량체는 예를 들어, 겔 여과 (크기 배제 크로마토그래피)에 의해 분자 크기에 따라 분리될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용된 Fc 다량체는 예를 들어, WO2008/151088, 또는 WO2012/016073에 기재된 바와 같이 다수의 Fc 도메인을 포함하는 예상 IVIG 대체 단백질이다.
또 다른 구현예에서, WO2008/151088에 기재된 바와 같이, 다량체 Fc는 IgG2 힌지 영역과 같은 다량체화 도메인을 갖는 스트라도머이고, 여기서 상기 스트라도머는 보체 시스템 단백질에 대한 이의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 바람직한 구현예에서, 보체 시스템 단백질은 C1q이다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용된 Fc 다량체는 2개 이상의 다량체화된 유닛을 포함하는 화합물이고, 여기서, 상기 유닛 각각은 다량체화 영역 및 Fc 수용체에 결합할 수 있는 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하는 영역을 포함하고, 상기 유닛 각각은 다량체화 영역 단량체 및 적어도 하나의 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 영역을 포함하고, 상기 2개의 단량체의 이량체화는 다량체화 영역 및 Fc 수용체에 결합할 수 있는 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하는 영역을 형성하고, 상기 2개 이상의 유닛의 다량체화 영역은 다량체화하여 화합물을 형성하고, 상기 화합물은 제1 Fc 도메인을 통해 제1 Fc 수용체에 결합할 수 있고, 제2 Fc 도메인을 통해 제2 Fc 수용체에 결합할 수 있고, 상기 다량체화 영역은 IgG2 힌지, IgE CH2 도메인, 류신 지퍼, 이소류신 지퍼 및 아연 핑거로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, Fc 수용체에 결합할 수 있는 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하는 영역 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 WO2008/151088, WO2012/016073 및 WO2017/214321에 기재된 바와 같은 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 포함한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 예를 들어, C1q와 같은 보체 시스템 단백질에 대한 이들의 결합 친화성을 증가시키기 위한 임의의 돌연변이가 부재이다. 일부 구현예에서, 다량체화 영역은 IgG2 힌지 영역, 예를 들어, IgG2 12 아미노산 힌지 영역ERKCCVECPPCP (서열번호 5 중에 잔기 253 내지 264)이다. 보다 바람직하게, Fc 다량체는 IgG2 힌지 다량체화 도메인을 통해 자발적으로 다량체화하는 서열번호 5(WO 2012/016073에서 서열번호 4)의 폴리펩타이드의 발현에 의해 수득된다.
또 다른 대안적 구현예에서, 본 발명에 사용된 재조합 Fc 화합물은 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 WO2017/172853에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 재조합 Fc 화합물은 2개의 CH2-CH3 Fc 도메인, 및 올리고머화 펩타이드 도메인을 포함하는 단일쇄 Fc 펩타이드를 포함한다. 바람직하게, 재조합 Fc 화합물은 서열번호 6(WO2017172853에서 서열번호 6) 또는 서열번호 7 (WO2017172853에서 서열번호 4)의 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 Fc 다량체의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 보체 시스템 단백질의 하나의 예는 C1q이다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 위치 267, 268, 또는 324 중 어느 하나에서 Fc 다량체의 IgG1 Fc 도메인 내 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 또는 S324T 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 위치 267, 268, 및 324 중 어느 하나에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 위치 233, 234, 235, 236, 238, 265, 297, 299, 또는 328 중 어느 하나에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 배제된 돌연변이는 N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 또는 L328F 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 299에서의 아미노산은 트레오닌으로부터 세린 또는 시스테인 이외의 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 298에서의 아미노산은 프롤린 이외의 다른 임의의 아미노산으로 돌연변이되지 않는다. 일부 구현예에서, 위치 236에서 아미노산은 결실되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
또 다른 대안적 구현예에서, 본 발명에 사용된 재조합 Fc 화합물은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 WO2015/168643, WO2017/205436, WO2017/205434 및 WO2018/129255에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 재조합 Fc 화합물은 2-10개의 Fc 도메인을 포함하고, 예를 들어, Fc 작제물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 Fc 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 Fc 화합물은 3개의 Fc 도메인을 포함한다.
하나의 양상에서, 본원의 개시내용은 3개의 Fc 도메인을 형성하는 4개의 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 작제물을 특징으로 한다. 제1 폴리펩타이드는 화학식 A-L-B를 갖고, 여기서 A는 제1 Fc 폴리펩타이드를 포함하고; L은 링커이고; B는 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제2 폴리펩타이드는 화학식 A’-L’-B’를 갖고, 여기서 A’는 제3 Fc 폴리펩타이드를 포함하고; L’는 링커이고; B’는 제4 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제3 폴리펩타이드는 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제4 폴리펩타이드는 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 양상에서, A 및 A’는 조합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, B 및 제5 Fc 폴리펩타이드는 조합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, B’및 제6 Fc 폴리펩타이드는 조합하여 제3 Fc 도메인을 형성한다.
상기 양상의 일부 구현예에서, A 및 A’각각은 이들 Fc 폴리펩타이드 간에 이량체화를 촉진시키는 이량체화 선택적 모듈을 포함한다. 다른 구현예에서, B 및 제5 Fc 폴리펩타이드 각각은 이들 Fc 폴리펩타이드 간에 이량체화를 촉진시키는 이량체화 선택적 모듈을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, B’ 및 제6 Fc 폴리펩타이드 각각은 이들 Fc 폴리펩타이드 간에 이량체화를 촉진시키는 이량체화 선택적 모듈을 포함한다.
상기 양상의 일부 구현예에서, A, B, A’, B’, 제3 폴리펩타이드 및 제4 폴리펩타이드 중 하나 이상은 Fc 폴리펩타이드로 이루어진다. 일부 구현예에서, A, B, A’, B’, 제3 폴리펩타이드 및 제4 폴리펩타이드 각각은 Fc 폴리펩타이드로 이루어진다.
상기 양상의 일부 구현예에서, B 및 B’각각은 돌연변이 D399K 및 K409D를 포함하고, A 및 A’각각은 돌연변이 S354C, T366W, 및 E357K를 포함하고, 제5 및 제6 Fc 폴리펩타이드 각각은 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V, 및 K370D를 포함한다.
상기 양상의 일부 구현예에서, A 및 A’각각은 돌연변이 D399K 및 K409D를 포함하고, B 및 B’각각은 돌연변이 S354C, T366W, 및 E357K를 포함하고, 제5 및 제6 Fc 폴리펩타이드 각각은 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V, 및 K370D를 포함한다.
상기 양상의 일부 구현예에서, L 및 L’각각은 적어도 4, 8, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 글라이신을 포함한다. 일부 구현예에서, L 및 L’각각은 4-30, 8-30, 또는 12-30개의 글라이신을 포함한다. 상기 양상의 일부 구현예에서, L 및 L’각각은 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호155)를 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어진다.
일부 구현예에서, Fc 작제물은 추가로 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 IgG CL 항체 불변 도메인은 링커에 의해 IgG CH1 항체 불변 도메인의 N-말단에 부착되고, IgG CH1 항체 불변 도메인은 예를 들어, 링커에 의해 A의 N-말단에 부착된다. 하나의 구현예에서, Fc 작제물은 추가로 제2 IgG CL 항체 불변 도메인 및 제2 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 제2 IgG CL 항체 불변 도메인은 예를 들어, 링커에 의해 IgG CH1 항체 불변 도메인의 N-말단에 부착되고, 제2 IgG CH1 항체 불변 도메인은 예를 들어, 링커에 의해 A’의 N-말단에 부착된다.
일부 구현예에서, Fc 작제물은 추가로 이종성 모이어티, 예를 들어, 펩타이드, 예를 들어, 링커에 의해 B 또는 B’의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 알부민 결합 펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, Fc 작제물의 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖고, Fc 작제물의 제3 및 제4 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서열번호 120의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열번호 119의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어진다. 본원 개시내용의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 각각은 서열번호 120의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어지고, 최대 10개 (예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존성 치환)을 갖고, 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열번호 119의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 필수적으로 이루어지고, 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존성 치환)을 갖는다. 일부 경우에, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서열번호 125의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열번호 124의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어진다. 본원 개시내용의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 각각은 서열번호 125의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어지고, 최대 10개 (예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존성 치환)을 갖고, 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열번호 124의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 필수적으로 이루어지고, 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존성 치환)을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서열번호 113 또는 114의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열번호 107 또는 108의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어진다. 본원 개시내용의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 각각은 서열번호 113 또는 114의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어지고, 최대 10개 (예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존성 치환)을 갖고, 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열번호 107 또는 108의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 필수적으로 이루어지고, 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존성 치환)을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서열번호 126의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열번호 122의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어진다. 본원 개시내용의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 각각은 서열번호 126의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 이들로 필수적으로 이루어지고, 최대 10개 (예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존성 치환)을 갖고, 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열번호 122의 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 필수적으로 이루어지고, 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존성 치환)을 갖는다.
본원 개시내용의 상기 양상의 일부 구현예에서, 제1 및 제3 Fc 폴리펩타이드 각각은 제1 Fc 폴리펩타이드와 제3 Fc 폴리펩타이드 간의 이량체화를 촉진시키는 상보성 이량체화 선택적 모듈을 포함하고, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 각각은 제2 Fc 폴리펩타이드와 제4 Fc 폴리펩타이드 간의 이량체화를 촉진시키는 상보성 이량체화 선택적 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 Fc 폴리펩타이드 각각의 상보성 이량체화 선택적 모듈은 가공된 돌기를 포함하고, 제3 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 상보성 이량체화 선택적 모듈은 가공된 공동을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드의 하나 이상은 IgG 힌지 도메인 또는 이의 일부, IgG CH2 항체 불변 도메인 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드 각각은 IgG 힌지 도메인 또는 이의 일부, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드 각각은 IgG1 Fc 폴리펩타이드이다.
본원 개시내용의 이전 2개의 양상의 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드의 하나 이상에서 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 각각에서 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된다.
일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 하나 이상은 C-말단 라이신이 부재이다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 각각은 C-말단 라이신이 부재이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖고, 제3 폴리펩타이드 및 제4 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩타이드 및 제4 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, Fc 도메인의 적어도 하나는 (i) 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합 친화성, (ii) 이펙터 기능, (iii) Fc 도메인 황화 수준, (iv) 반감기, (v) 프로테아제 내성, (vi) Fc 도메인 안정성, 및/또는 (vii) 분해에 대한 민감성 중 하나 이상을 변경하는 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합 친화성을 변경하는 아미노산 변형, 예를 들어, S267E/L328F를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 수용체는 FcγRIIb이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형은 FcγRIIb 수용체에 대한 친화성을 증가시킨다. 일부 경우에, S267E/L328F 변형은 FcγRIIb에 대한 결합 친화성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 도메인 황화 수준을 변경하는 아미노산 변형, 예를 들어, 241F, 243F, 246K, 260T, 또는 301R을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 예를 들어, 하기의 세트로부터 선택되는, 프로테아제 내성을 변경하는 아미노산 변형을 포함한다: 233P, 234V, 235A, 및 236del; 237A, 239D, 및 332E; 237D, 239D, 및 332E; 237P, 239D, 및 332E; 237Q, 239D, 및 332E; 237S, 239D, 및 332E; 239D, 268F, 324T, 및 332E; 239D, 326A, 및 333A; 239D 및 332E; 243L, 292P, 및 300L; 267E, 268F, 324T, 및 332E; 267E 및 332E; 268F, 324T, 및 332E; 326A, 332E, 및 333A; 또는 326A 및 333A. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 분해에 대한 Fc 도메인 민감성을 변경하는 아미노산 변형, 예를 들어, C233X, D234X, K235X, S236X, T236X, H237X, C239X, S241X, 및 G249X를 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 a) i) 제1 Fc 폴리펩타이드; ii) 제2 Fc 폴리펩타이드; 및 iii) 제1 Fc 폴리펩타이드를 제2 Fc 폴리펩타이드에 연결하는 링커를 포함하는 제1 폴리펩타이드; b) i) 제3 Fc 폴리펩타이드; ii) 제4 Fc 폴리펩타이드; 및 iii) 제3 Fc 폴리펩타이드를 제4 Fc 폴리펩타이드에 연결하는 링커를 포함하는 제2 폴리펩타이드; c) 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및 d) 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 작제물을 특징으로 하고; 여기서 상기 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제5 Fc 폴리펩타이드는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제2 Fc 폴리펩타이드 및 제4 Fc 폴리펩타이드는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 폴리펩타이드 및 제6 Fc 폴리펩타이드는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 변형(예를 들어, 위치 I253에서 단일 아미노산 변형)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서로 동일하고 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘다는 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘다는 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘다는 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 I253A이다.
또 다른 양상에서, 본원의 개시내용은 a) i). 제1 Fc 폴리펩타이드; ii). 제2 Fc 폴리펩타이드; 및 iii). 제1 Fc 폴리펩타이드를 제2 Fc 폴리펩타이드에 연결하는 링커를 포함하는 제1 폴리펩타이드; b). i). 제3 Fc 폴리펩타이드; ii). 제4 Fc 폴리펩타이드; 및 iii). 제3 Fc 폴리펩타이드를 제4 Fc 폴리펩타이드에 연결하는 링커를 포함하는 제2 폴리펩타이드; c). 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및 d). 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 작제물을 특징으로 하고; 여기서 상기 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제5 Fc 폴리펩타이드는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제2 Fc 폴리펩타이드 및 제4 Fc 폴리펩타이드는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 폴리펩타이드 및 제6 Fc 폴리펩타이드는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형(예를 들어, 단일 아미노산 변형)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘다는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘다는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘다는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 위치 R292에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 위치 R292P에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함한다(즉, 각각의 Fc 단량체는 R292P 변형을 갖는다). 일부 구현예에서, 제1 및 제5 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P을 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 위치 R292에서 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 독립적으로 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 또는 R292Y로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 R292P이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 변형(예를 들어, 치환) I253A을 포함하고, 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 변형(예를 들어, 치환) R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A을 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P을 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 변형(예를 들어, 치환) I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A을 포함하고, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 경우에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 I253A 및 R292P를 포함한다(예를 들어, 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다). 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제2 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고; 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드의 하나 또는 둘다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc 작제물은 항원-인지 영역, 예를 들어, 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, Fc 작제물(또는 Fc 작제물 내 Fc 도메인)은 전체적으로 또는 부분적으로 상이한 폴리펩타이드 내 존재하는 Fc 폴리펩타이드의 연합에 의해 형성된다. 특정 구현예에서, Fc 작제물은 2개의 폴리펩타이드의 연합을 촉진시키는 추가의 도메인 (예를 들어, IgM 테일피스 또는 IgA 테일피스)를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 공유 결합 (예를 들어, 디설파이드 브릿지)은 연결되어 Fc 도메인을 형성하는 2개의 Fc 폴리펩타이드 사이에만 존재한다. 다른 구현예에서, Fc 작제물은 Fc 도메인 사이에 공유 결합 (예를 들어, 디설파이드 브릿지)을 포함하지 않는다. 여전히 다른 구현예에서, Fc 작제물은 Fc 작제물 내 모든 또는 실질적으로 모든 Fc 도메인이 세포 표면 상에 Fc 수용체와 동시에 작용할 수 있도록 하기 위해 충분한 구조적 가요성을 제공한다. 하나의 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 이들이 이량체화 선택적 모듈을 갖는 다는 점에서 야생형과 또는 서로 1차 서열에서 상이하다.
또 다른 양상에서, 본원의 개시내용은 Fc 폴리펩타이드의 선택적 이량체화를 촉진시키기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 본원의 개시내용은 Fc 도메인을 포함하고, 여기서 상기 Fc 도메인의 2개의 Fc 폴리펩타이드가 CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면에서 하전된 잔기의 환 내 적어도 2개의 위치에서 동일한 돌연변이를 포함한다. 본원의 개시내용은 또한 상기 Fc 도메인을 제조하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면에서 하전된 잔기의 환 내 적어도 2개의 위치에서 2개의 Fc 폴리펩타이드 서열에서 동일한 돌연변이를 갖는 상보성 이량체화 선택적 모듈을 도입하는 단계를 포함한다. CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면은 하전된 잔기의 환에 의해 둘러싸인 소수성 패치로 이루어진다. 하나의 CH3 항체 불변 도메인이 다른 도메인과 함께 합쳐지는 경우, 이들 하전된 잔기는 반대 전하의 잔기와 쌍을 형성한다. 잔기의 2개 이상의 상보적 쌍의 2개 구성원의 하전을 역전시킴에 의해, 돌연변이된 Fc 폴리펩타이드는 동일한 돌연변이된 서열의 Fc 폴리펩타이드와 상보적인 상태로 남아있지만 이들 돌연변이가 없는 Fc 폴리펩타이드와 보다 낮은 상보성을 갖는다. 상기 구현예에서, 동일한 이량체화 선택적 모듈은 동종이량체화를 촉진시킨다. 상기 Fc 도메인은 이중 돌연변이체 K409D/D399K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D399K, K392E/D399K, E357K/K370D, 또는 D356K/K439E를 함유하는 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 이중 돌연변이체의 임의의 쌍이 조합된 네 부분의 돌연변이체, 예를 들어, K409D/D399K/E357K/K370E를 포함하는 Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 동일한 이량체화 선택적 모듈에 추가로, Fc 도메인의 Fc 폴리펩타이드는 특이적 연합을 촉진시키는 동일하지 않은 돌연변이를 갖는 상보적 이량체화 선택적 모듈 (예를 들어, 가공된 공동 및 돌기)을 포함한다. 결과로서, 2개의 Fc 폴리펩타이드는 2개의 이량체화 선택적 모듈을 포함하고 사로 상보적인 상태로 남아있지만, 다른 Fc 폴리펩타이드와 감소된 상보성을 갖는다. 상기 구현예는 공동-함유 Fc 폴리펩타이드와 돌기-함유 Fc 폴리펩타이드 간의 이종이량체화를 촉진시킨다. 하나의 예에서, Fc 폴리펩타이드 둘다의 하전된 쌍 잔기 내 동일하지 않은 돌연변이를 갖는 상보성 이량체화 선택적 모듈은 하나의 Fc 폴리펩타이드 상의 돌기 및 다른 Fc 폴리펩타이드 상의 공동과 조합된다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인의 Fc 폴리펩타이드는 특이적 연합을 촉진시키는 동일하지 않은 돌연변이를 갖는 상보적 이량체화 선택적 모듈 (예를 들어, 가공된 공동 및 돌기)을 포함하고, 동일한 이량체화 선택적 모듈을 포함하지 않는다.
본원에 기재된 임의의 Fc 작제물에서, Fc 폴리펩타이드의 순서가 상호교환될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 화학식 A-L-B를 갖는 폴리펩타이드에서, A의 카복시 말단은 L의 아미노 말단에 연결될 수 있고, 이는 이어서 이의 카복시 말단에서 B의 아미노 말단에 연결된다. 대안적으로, B의 카복시 말단은 L의 아미노 말단에 연결될 수 있고, 이는 이어서 이의 카복시 말단에서 C의 아미노 말단에 연결된다. 이들 구성 둘다는 화학식 A-L-B에 의해 포함된다.
이들 작제물의 성질은 실질적으로 균질의 조성물의 효율적인 생성을 가능하게 한다. 조성물의 균질성 정도는 조성물의 약동학 및 생체내 수행능에 영향을 미친다. 조성물 내 상기 균질성은 조성물의 안전성, 효능, 균일성 및 신뢰성을 보장하기 위해 요구될 수 있다. 본원 개시내용의 Fc 작제물은 실질적으로 균질한 (예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 균질한) 집단 또는 조성으로 존재할 수 있다.
본원에서 추가로 상세하게 기재된 바와 같이, 본원의 개시내용은 상기 실질적으로 균질의 조성물을 제조하는 방법 뿐만 아니라 모두 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 함유하는 실질적으로 균질의 조성물을 특징으로 한다.
본원 개시내용의 Fc 작제물은 2-10개의 Fc 도메인 (예를 들어, 2-8개 Fc 도메인, 2-6개 Fc 도메인, 2-4개 Fc 도메인, 2-3개 Fc 도메인, 3-5개 Fc 도메인, 또는 5-10개 Fc 도메인)을 갖는 Fc 작제물, 예를 들어, 본원에 기재된 것들과 같이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 Fc 도메인을 갖는 작제물의 실질적으로 균질의 집단 (예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 균질한)을 포함하는 약제학적 조성물로 존재할 수 있다. 결과적으로, Fc 작제물의 상당한 응집 또는 원치 않는 다량체화를 갖지 않는 약제학적 조성물이 제조될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
본원의 개시내용은 추가로 Fc 융합 폴리펩타이드 또는 Fc 다량체에 대한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. “폴리뉴클레오타이드(들)"라는 용어는 일반적으로, 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 언급한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오타이드(들)"라는 용어는 또한 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 특이한 염기, 예를 들어, 이노신을 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 당업계의 숙련자들에게 공지된 여러가지 유용한 목적들을 제공하는 다양한 변형들이 DNA 및 RNA에 행해질 수 있음은 분명할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 “폴리뉴클레오타이드(들)”은 예를 들어, 단순하고 복잡한 세포를 포함하는 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형태 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드의 상기 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다.
당업자라면 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 주어진 폴리펩타이드가 다른 폴리뉴클레오타이들에 의해서도 암호화될 수 있음을 이해할 것이다. 이들 “변이체”는 본원에 기재된 Fc 다량체에 의해 포괄된다.
Fc 다량체의 폴리뉴클레오타이드는 단리된 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 용어 “단리된" 폴리뉴클레오타이드는 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA에 제한되지 않는 다른 핵산 서열들이 실질적으로 없는 폴리뉴클레오타이드를 언급한다. 하나의 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로부터 정제된다. 당업자에게 공지된 통상적인 핵산 정제 방법을 사용하여 분리된 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 상기 용어는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본원 개시내용의 또 다른 양상은 본원의 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다. 하나의 구현예에서, WO2017/129737에 기재된 바와 같이, 상기 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터를 포함한다. 하나의 구현예에서, 벡터는 사람 유전자 치료요법에 사용하기 위한 전달 벡터이다. 본원 개시내용의 또 다른 양상은 본원 개시내용의 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본원 개시내용의 숙주 세포는 Fc 다량체를 제조하는 방법에 사용된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 목적하는 삽입 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 본원 개시내용의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 임의로 상기 숙주 세포, 또는 상기 배양 배지로부터 목적하는 삽입 단백질을 회수하는 단계.
별도의 구현예에서, Fc 다량체는 오염 거대분자, 예를 들어, 다른 단백질 및 핵산과 관련하여 ≥80% 순도, ≥90% 순도, ≥95% 순도, ≥99% 순도, 또는 ≥99.9% 순도로 정제되고, 감염성 및 발열성 제제가 없다. 본원 개시내용의 단리된 Fc 다량체는 다른 관련되지 않은 폴리펩타이드가 실질적으로 부재일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, Fc 다량체는 WO2014/060712에 기재된 것들이다. 이의 예는 5개, 6개 또는 7개 폴리펩타이드 단량체 유닛을 포함하는 중합체 단백질을 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 2개의 면역글로불린 G 중쇄 불변 영역을 포함하는 Fc 수용체 결합 부분을 포함하고, 각각의 면역글로불린 G 중쇄 불변 영역은 디설파이드 결합을 통해 인접한 폴리펩타이드 단량체 유닛의 면역글로불린 G 중쇄 불변 영역의 시스테인 잔기에 연결되는 시스테인 잔기를 포함하고, 상기 중합체 단백질은 포유동물 대상체에 투여되는 경우 항원-특이적 면역억제를 유발하는 추가의 면역조절 부분 또는 항원 부분을 포함하지 않는다. 특정 양상에서, 2개의 면역글로불린 G 중쇄 불변 영역은 단일쇄 Fc로서 폴리펩타이드 링커를 통해 연결된다. 다른 양상에서, 폴리펩타이드 단량체 유닛은 단량체 유닛의 중합체로의 어셈블리를 촉진시키는, 2개의 면역글로불린 G 중쇄 불변 영역에 융합된 Fc 수용체 결합 부분 및 테일피스 영역으로 이루어진다.
다른 구현예에서, 면역글로불린 G 중쇄 불변 영역 각각은 포유동물 중쇄 불변 영역, 바람직하게 사람 중쇄 불변 영역; 또는 이의 변이체의 아미노산 서열을 포함한다. 적합한 사람 IgG 서브타입은 IgG1이다.
Fc 수용체 결합 부분은 면역글로불린 Fc 부분 보다 더 많이 포함할 수 있다. 예를 들어, WO2014/060712에 기재된 바와 같이, 이것은 본래의 면역글로불린 중에 CH1와 CH2 도메인 사이에 존재하는 면역글로불린의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 특정 면역글로불린에 대해, 힌지 영역은 Fc 수용체로의 결합을 위해 필요하다. 바람직하게, Fc 수용체 결합 부분은 CH1 도메인 및 중쇄 가변 영역 도메인(VH)이 부재이다. Fc 수용체 결합 부분은 상응하는 면역글로불린의 Fc 부분과 비교하여 C-및/또는 N-말단에서 절단될 수 있다. 중합체 단백질은 디설파이드 결합을 통해 인접한 폴리펩타이드 단량체 유닛의 면역글로불린 G 중쇄 불변 영역의 시스테인 잔기에 연결된 시스테인 잔기를 포함하는 각각의 면역글로불린 G 중쇄 영역에 의해 형성된다. IgG 중쇄 불변 영역을 기반으로 하는 단량체 유닛의 중합체 형성 능력은 IgG 중쇄 불변 영역의 일부를 IgM 또는 IgA의 상응하는 부분과 더 유사하게 변형시킴으로써 개선될 수 있다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체 각각은 위치 309에 시스테인 잔기, 및 바람직하게는 위치 310에 류신 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 IgG 중쇄 불변 영역이다.
테일피스 영역이 존재하는 본 발명의 양상에 대해, 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 2개의 면역글로불린 G 중쇄 불변 영역 각각에 융합된 테일피스 영역을 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛의 테일피스 영역은 WO2014/060712에 기재된 바와 같이 단량체 유닛의 중합체로의 어셈블리를 용이하게 한다. 예를 들어, 테일피스 영역은 2개의 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 각각에 C-말단 융합된다. 테일피스 영역은 IgM 또는 IgA 테일피스 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
하나의 구현예에서, 중재 아미노산 서열은 중쇄 불변 영역과 테일피스 사이에 제공될 수 있거나, 테일피스는 WO2014/060712에 기재된 바와 같이 중쇄 불변 영역의 C-말단에 직접 융합될 수 있다. 예를 들어, 짧은 링커 서열은 테일피스 영역과 면역글로불린 중쇄 불변 영역 사이에 제공될 수 있다. 전형적인 링커 서열은 길이가 1 내지 20개 아미노산, 전형적으로 길이는 2, 3, 4, 5, 6 또는 최대 8, 10, 12, 또는 16개 아미노산이다. 중쇄 영역과 테일피스 영역 사이에 포함되는 적합한 링커는 Leu-Val-Leu-Gly (서열번호 8)를 암호화한다. 바람직한 테일피스 영역은 사람 IgM의 테일피스 영역이고, 이는 PTLYNVSLVMSDTAGTCY (서열번호 9)이다(문헌참조: Rabbitts TH et al, 1981. Nucleic Acids Res. 9 (18), 4509- 4524; Smith et al (1995) J Immunol 154: 2226-2236). 상기 테일피스는 초기 Thr을 Pro로 치환함에 의해 N-말단에서 변형될 수 있다. 이것은 단량체의 중합화를 촉진시키는 테일피스의 능력에 영향을 주지 않는다. 사람 IgM 테일피스의 추가의 적합한 변이체는 문헌(참조: Sorensen et al (1996) J Immunol 156: 2858-2865)에 기재되어 있다. 추가의 IgM 테일피스 서열은 설치류 기원의 GKPTLYNVSLIMSDTGGTCY (서열번호 10)이다. 대안적 바람직한 테일피스 영역은 사람 IgA의 테일피스 영역이고, 이는 PTHVNVSVVMAEVDGTCY (서열번호 11)이다. 다른 종의 IgM 또는 IgA로부터의 다른 적합한 테일피스, 또는 심지어 단량체 유닛의 중합체로의 어셈블리를 촉진시키는 합성 서열이 사용될 수 있다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역이 유래하는 동일한 종 기원의 면역글로불린 테일피스를 사용할 필요는 없지만 그렇게 하는 것이 바람직하다.
특정 양상에서, 중합체 단백질은 보체의 고전적 경로를 활성화시키지 않지만, 이것은 C1q에 결합할 수 있다. 중합체 단백질은 전형적으로 약 20nm, 예를 들어, 15 내지 25 nm 또는 최대 30 nm의 직경을 갖는다. 분자 크기 및 직경의 결과로서, 중합체 단백질은 전형적으로 양호한 정도의 조직 침투를 갖는다.
WO2014/060712에 기재된 바람직한 FC 다량체는 서열번호 12의 육량체(WO2014/060712에서 서열번호 8)이고, 이로부터 신호 펩타이드는 분비 동안에 절단 제거되어 성숙한 생성물은 서열번호 12의 잔기 21 내지 269를 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 사용되는 Fc 다량체는 WO2015/132364에 기재된 것들이고, 이는 사람 Fc 수용체에 결합하는 다량체 융합 단백질에 관한 것이다. 융합 단백질은 위치 309에서 시스테인 잔기가 부재인 테일피스를 포함한다.
하나의 구현예에서, 다량체 융합 단백질은 2개 이상의 폴리펩타이드 단량체 유닛을 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 2개의 중쇄 Fc-영역을 포함하는 항체 Fc 도메인을 포함한다. 각각의 중쇄 Fc-영역은 위치 309에서 시스테인 이외의 다른 임의의 아미노산 잔기를 포함하고, 이의 C-말단에서 테일피스에 융합되어 이는 단량체 유닛이 다량체로 어셈블리되도록 한다. 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 임의의 항체 가변 영역을 포함하지 않는다.
특정 양상에서, 다량체 융합 단백질은 추가로 항원, 병원체-연합된 분자 패턴(PAMP), 약물, 리간드, 수용체, 사이토킨 또는 케모킨일 수 있는 융합 파트너를 포함한다. 융합 파트너는 힌지와 같은 중재 아미노산 서열에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 각각의 중쇄 Fc-영역의 N-말단에 융합된다. 짧은 링커 서열은 대안적으로 융합 파트너와 중쇄 Fc-영역 사이에 제공될 수 있다.
다른 양상에서, 다량체 융합 단백질은 하나 이상의 항체 가변 영역을 포함하지 않는다. 전형적으로, 분자는 VH 또는 VL 항체 가변 영역을 포함하지 않는다. 특정 추가의 양상에서, WO2015/132364의 다량체 융합 단백질은 Fab 단편을 포함하지 않는다.
또 다른 구현예에서, 다량체 융합 단백질의 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 예를 들어, 사람을 포함하는 임의의 적합한 종으로부터 유래할 수 있는 항체 Fc-도메인을 포함한다. 추가로, 항체 Fc-도메인은 IgA (아부류 lgA1 및 lgA2를 포함하는), IgD, IgE, IgG (아부류 lgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4을 포함하는), 및 IgM을 포함하는 임의의 적합한 부류의 항체로부터 유래할 수 있다.
항체 Fc-도메인은 2개의 Fc 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 쇄는 중쇄 Fc-영역으로 언급된다. 2개의 중쇄 Fc 영역을 이량체화하여 항체 Fc-도메인을 생성한다. 항체 Fc 도메인 내 2개의 중쇄 Fc 영역은 서로 상이할 수 있지만 전형적으로 동일하다.
전형적으로, 각각의 중쇄 Fc-영역은 2개 또는 3개의 중쇄 불변 도메인을 포함하거나 이들로 이루어진다. IgA, IgD 및 IgG는 예를 들어, 2개의 중쇄 불변 도메인(CH2 및 CH3)으로 구성되고, IgE 및 IgM은 3개의 중쇄 불변 도메인(CH2, CH3 및 CH4)으로 구성된다. 중쇄 Fc-영역은 항체의 하나 이상의 상이한 부류, 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개의 상이한 부류 기원의 중쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 구현예에 사용된 Fc 다량체에서 중쇄 Fc 영역은 WO2015/132364에 기재딘 바와 같이 IgG1으로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다. 별도의 구현예에서, 중쇄 Fc 영역은 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인 및 IgG1으로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 Fc 영역은 위치 355에서 아르기닌 잔기를 포함한다. 다른 구현예에서, 중쇄 Fc 영역은 위치 355에서 시스테인 잔기를 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에 사용된 Fc 다량체에서 중쇄 Fc 영역은 IgM으로부터 유래된 CH4 도메인을 포함한다. IgM CH4 도메인은 전형적으로 CH3 도메인과 테일피스 사이에 위치한다.
다른 양상에서, 중쇄 Fc-영역은 IgG로부터 유래된 CH2 및 CH3 도메인 및 IgM으로부터 유래된 CH4 도메인을 포함한다.
다량체 융합 단백질의 테일피스는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 테일피스는 천연에 존재하는 항체에서 발견될 수 있거나, 대안적으로 변형된 테일피스는 천연 테일피스와는 길이 및/또는 조성이 상이할 수 있다. 다른 변형된 테일피스는 완전히 합성일 수 있고, 길이, 가요성 및 시스테인 조성과 같은 다량체화에 목적하는 성질을 갖도록 디자인될 수 있다. 테일피스는 사람을 포함하는 임의의 적합한 종으로부터 유래할 수 있다.
테일피스는 서열번호 9 또는 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 사람 IgM 또는 IgA로부터의 18개 아미노산 테일피스 서열 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
테일피스는 중쇄 Fc-영역의 C-말단에 직접적으로 융합될 수 있거나, 대안적으로 중재 아미노산 서열에 의해 간접적으로 융합될 수 있다. 짧은 링커 서열은 예를 들어 테일피스와 중쇄 Fc 영역 사이에 제공될 수 있다.
테일피스는 상기된 본래의 서열의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. IgM 또는 IgA 테일피스의 변이체는 전형적으로 18개 아미노산 위치의 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17에서 본래의 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 단편은 전형적으로 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 아미노산을 포함한다. 테일피스는 하이브리드 IgM/lgA 테일피스일 수 있다.
본 발명의 구현예에 사용된 Fc 다량체에서 각각의 중쇄 Fc-영역은 임의로 이의 N-말단에서 본래의 또는 변형된 힌지 영역을 가질 수 있다. 본 발명에 사용된 Fc 다량체에 혼입될 수 있는 변형된 힌지 영역의 유형은 WO2015/132364에 기재되어 있다. 예를 들어, 중쇄 Fc-영역은 이의 N-말단에서 온전한 힌지 영역을 갖는다. WO2015/132364에 기재된 바와 같이 특정 양상에서, 중쇄 Fc-영역 및 힌지 영역은 lgG4로부터 유래하고, 힌지 영역은 돌연변이된 서열 CPPC (서열번호 13)를 포함한다.
적합한 힌지 서열의 예는 서열번호 13 내지 35에 나타낸다.
예를 들어, 다량체 융합 단백질은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 이상의 폴리펩타이드 단량체 유닛을 포함할 수 있다. 추가로, 다량체 융합 단백질은 일정 범위 수의 폴리펩타이드 단량체 유닛을 갖는, 상이한 크기의 다량체 융합 단백질의 혼합물을 포함할 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 사용된 다량체 융합 단백질은 6개의 폴리펩타이드 단량체 유닛으로 이루어지고, 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 항체 Fc-도메인 및 테일피스 영역으로 이루어지고, 각각의 항체 Fc 도메인은 2개의 중쇄 Fc-영역으로 이루어지고, 여기서, 위치 309에서 아미노산 잔기는 시스테인 이외의 다른 임의의 아미노산 잔기이고, 임의로, 각각의 중쇄 Fc 영역은 N-말단에서 힌지 영역을 갖고, 여기서 테일피스 영역은 각각의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 융합되고 단량체 유닛이 다량체로 어셈블리되도록 한다.
유사하게, 특정 다량체 융합 단백질 내 폴리펩타이드 단량체 유닛은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 단량체 유닛의 폴리펩타이드 쇄는 임의로 대안적 힌지 또는 테일피스 서열과 함께 서열번호 36 내지 57에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명에 사용된 다량체 융합 단백질은 2개 이상, 바람직하게 6개의 폴리펩타이드 단량체 유닛을 포함하거나 이들로 이루어지고, 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 2개의 동일한 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드 쇄는 상기 서열번호 36 내지 57 (WO2015/132364의 서열번호 26 내지 47)중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 항체 가변 영역을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 다량체 융합 단백질은 사이토킨 방출을 감소시키고/시키거나 혈소판 활성화를 감소시키고/시키거나 C1q 결합을 감소시키고/시키거나 항체-코팅된 표적 세포의 대식세포의 식세포작용의 억제의 효능을 증가시키고/시키거나 비변형된 다량체 융합 단백질과 비교하는 경우 하나 이상의 Fc-수용체로의 결합을 변경하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 사용되는 Fc 다량체는 WO2015/132365에 기재된 것들이고, 이는 사람 Fc 수용체에 결합하는 다량체 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 구현예에 사용된 다량체 융합 단백질은 2개 이상의 폴리펩타이드 단량체 유닛을 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 WO2015/132365에 기재된 것들과 같은 2개의 중쇄 Fc 영역을 포함하는 항체 Fc-도메인을 포함한다. 각각의 중쇄 Fc-영역은 위치 309에서 시스테인 잔기, 및 FcR 결합을 변경하는 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 포함하고, 이의 C-말단에서 테일피스에 융합되어 단량체 유닛이 다량체로 어셈블리되도록 한다. 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 임의의 항체 가변 영역을 포함하지 않는다.
특정 양상에서, 다량체 융합 단백질은 추가로 상기된 바와 같이 융합 파트너를 포함한다. 다른 양상에서, 다량체 융합 단백질은 상기된 바와 같이, 하나 이상의 항체 가변 영역 또는 Fab 단편을 포함하지 않는다. 하나의 구현예에서, 다량체 융합 단백질의 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 상기된 바와 같이 중쇄 Fc 영역과 함께 항체 Fc-도메인을 포함한다. 본 발명의 다량체 융합 단백질의 테일피스, 변형된 힌지 영역 및 폴리펩타이드 단량체 유닛은 상기된 특성을 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에 사용된 다량체 융합 단백질은 6개의 폴리펩타이드 단량체 유닛으로 이루어지고, 여기서 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 항체 Fc-도메인 및 테일피스 영역으로 이루어지고, 각각의 항체 Fc 도메인은 2개의 중쇄 Fc-영역으로 이루어지고, 여기서, 각각의 중쇄 Fc 영역 내 위치 309에서 아미노산 잔기는 시스테인 잔기이고, 각각의 중쇄 Fc 영역은 FcR 결합을 변경하는 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 포함하고, 임의로 각각의 중쇄 Fc 영역은 N-말단에 힌지 영역을 갖고, 상기 테일피스 영역은 각각의 중쇄 Fc 영역의 C-말단에 융합되고 단량체 유닛이 다량체로 어셈블리되도록 한다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 단량체 유닛의 폴리펩타이드 쇄는 상기된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 예에서, 다량체 융합 단백질은 2개 이상, 바람직하게 6개의 폴리펩타이드 단량체 유닛을 포함하거나 이들로 이루어지고, 여기서 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 2개의 동일한 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드 쇄는 상기 서열번호 58 내지 94 (WO2015/132365의 서열번호 26 내지 32 및 50 내지 64에 상응하는)중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 각각의 폴리펩타이드 단량체 유닛은 항체 가변 영역을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, WO2015/132365에 교시된 바와 같이, 본 발명에 사용되는 다량체 융합 단백질은 상기된 바와 같이 상기 기능을 가능하게 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본원 개시내용의 다양한 생성물들은 약제로서 유용하다. 따라서, 본원의 개시내용은 Fc 다량체, 본원 개시내용의 폴리뉴클레오타이드, 또는 본원 개시내용의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 복합체 매개된 콩팥 장애를 치료하는 방법이다. 상기 방법은 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 Fc 다량체를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 본원 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 또는 본원 개시내용의 플라스미드 또는 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
제안된 Fc 다량체의 발현
적합한 숙주 세포 내에서 고수준의 재조합 단백질들의 생성은 당업자에게 공지된 방법에 따른 다양한 발현 시스템에서 증식될 수 있는 재조합 발현 벡터 내에서 적합한 조절 요소들과 함께, 상기 언급한 변형된 폴리뉴클레오타이드 cDNA의 효율적인 전사 유닛으로의 어셈블리를 요구한다. 효율적인 전사 조절 요소들은 그들의 천연 숙주로서 동물 세포를 갖는 바이러스로부터, 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 시미안(Simian) 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스, 또는 로우스(Rous) 사코마 바이러스의 긴 말단 반복으로부터 유래된 프로모터-인핸서 조합, 또는 베타-액틴 또는 GRP78과 같이 동물 세포 내에서 항시성으로 강하게 전사된 유전자들을 포함하는 프로모터-인핸서 조합이 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사된 안정적인 높은 수준의 mRNA를 얻기 위해서는, 상기 전사 유닛은 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 그의 3'-근위부에 함유하여야 한다. 예를 들어, 상기 서열은 시미안 바이러스 40 어얼리 전사 영역, 토끼 베타-글로빈 유전자, 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성화인자 유전자로부터 유래할 수 있다.
이어서, 상기 cDNA는 Fc 다량체의 발현을 위해 적합한 숙주세포주의 게놈으로 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포주는 배양 배지로의 분비 뿐만 아니라 정확한 폴딩, 디설파이드 결합 형성, 아스파라긴-결합된 글리코실화 및 기타 해독후 변형을 보장하기 위해서 척추동물 기원의 동물 세포주이어야 한다. 기타 해독후 변형들에 대한 예들은 초기 폴리펩타이드 쇄의 티로신 O-황산화 및 단백질용해 처리이다. 사용될 수 있는 세포주의 예로는 몽키 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 콩팥 293 세포 및 햄스터 CHO-세포이다.
상응하는 cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 여러가지 다른 방식으로 동물 세포주에 도입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스들을 기반으로 한 벡터들로부터 생성될 수 있다. 이들의 예로는 바큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 소 유두종 바이러스를 기반으로 한 벡터들이다.
상응하는 DNA를 암호화하는 전사 유닛도, 게놈에 재조합 DNA가 통합된 특정 세포 클론들의 단리를 용이하게 하기 위해, 이들 세포들 내에서 우성 선택성 마커로서 기능할 수 있는 또 다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 유형의 우성 선택성 마커 유전자의 예는 젠타마이신(G418)에 대한 내성을 부여하는 TN4 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 퓨로마이신에 대한 내성을 부여하는 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제이다. 이러한 선택성 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 원하는 단백질의 cDNA를 암호화하는 벡터와 같은 동일한 벡터 상에 존재할 수 있거나, 또는 이는 숙주 세포의 게놈에 동시에 도입 및 통합되는 별도의 벡터 상에서 암호화될 수 있어, 서로 다른 전사 유닛들 사이에서 치밀한 물리적 결합을 생성하는 경우가 많다.
목적하는 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 기타 유형의 선택성 마커 유전자들은 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 암호화하는 다양한 전사유닛들을 기반으로 한다. 이러한 유형의 유전자를 내인성 dhfr-활성이 부재인 세포, 예를 들어, CHO-세포(DUKX-B11, DG-44)에 도입한 후에는, 뉴클레오사이드가 부재인 배지 내에서 이들의 증식을 가능하게 할 것이다. 이러한 배지의 예는 하이포크산틴, 티미딘 및 글라이신이 없는 Ham's F12이다. 이들 dhfr-유전자들은 IgG Fc 융합 단량체를 암호화하는 cDNA와 함께 동일한 벡터 상에서, 또는 상이한 벡터 상에서 결합된, 상기 유형의 CHO-세포 내로 도입되어, 재조합 단백질을 생성하는 dhfr-양성 세포주를 생성할 수 있다.
상기 세포주들이 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재 하에 성장하는 경우, 메토트렉세이트에 대한 내성이 있는 새로운 세포주들이 출현할 것이다. 이러한 세포주들은 증폭된 수의 결합된 dhfr 및 원하는 단백질의 전사 유닛들로 인해 재조합 단백질을 증가된 비율로 생성할 수 있다. 증가하는 농도의 메토트렉세이트(1-10,000nM)에서 이러한 세포주들을 증식시키는 경우, 목적하는 단백질을 매우 높은 비율로 생성하는 새로운 세포주들이 수득될 수 있다.
목적하는 단백질을 생성하는 상기 세포주들은 현탁액 배양물 내에서 또는 다양한 고체 지지체 상에서 대규모로 증식될 수 있다. 이러한 지지체들의 예는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스에 기초한 미세 담체, 또는 중공 섬유 또는 다양한 세라믹 재료 형태의 고체 지지체이다. 세포 현탁액 배양물 내에서, 또는 미세담체 상에서 증식되는 경우, 상기 세포주들의 배양은 장시간에 걸쳐 컨디셔닝된 배지를 연속적으로 제조하면서 욕조(bath) 배양으로 또는 관류 배양으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 상기 세포주들은 목적하는 재조합 단백질들을 제조하기 위한 산업적 방법을 개발하는데 매우 적합하다.
정제 및 제형
상기 재조합 단백질은 숙주 세포 또는 세포 배양 배지 내에서 목적하는 단백질과 다른 물질들 간의 크기, 전하, 소수성, 용해도, 특이적 친화성 등의 차이를 이용하는 방법을 비롯한 다양한 생화학적 및 크로마토그래피 방법들에 의해 농축 및 정제될 수 있다.
상기 정제의 예는 예를 들어, 고형 지지체 상에 고정화된 Fc 다량체 또는 또 다른 Fc-결합 리간드 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G)의 Fc 부분에 지시된 모노클로날 항체로의 재조합 단백질의 흡수이다. 상기 지지체로의 Fc 다량체의 흡수, 세척 및 탈착 후, 단백질은 상기 성질들에 기초한 다양한 크로마토그래피 기술들에 의해 추가로 정제될 수 있다. 정제 단계의 순서는 예를 들어, 해당 단계의 수용력과 선택성, 지지체의 안정성 또는 다른 양상들에 따라 선택된다. 정제 단계는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 단계, 면역 친화성 크로마토그래피 단계, 친화성 크로마토그래피 단계, 염료 크로마토그래피 단계 및 크기 배제 크로마토그래피 단계일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
바이러스 오염의 이론적인 위험을 최소화하기 위해, 바이러스를 효과적으로 불활성화시키거나 제거하는 추가 단계들이 공정에 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 단계는 액체 또는 고체 상태의 열 처리, 용매 및/또는 세제를 사용한 처리, 가시적 또는 UV 스펙트럼에서 방사능 조사, 감마-방사능 조사, 정제 동안에 분할, 또는 바이러스 여과(나노 여과)를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 Fc 다량체는 치료학적 사용을 위해 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 약제학적 제제의 성분들은 임의로 약제학적 부형제가 첨가될 수 있는 통상적인 생리학적으로 적합한 상용성 완충 수용액에 재현탁시키거나 용해시켜 약제학적 제제를 수득할 수 있다. 약제학적 제제의 성분들은 이미 모든 필요한 약제학적, 생리학적 상용성 부형제를 함유할 수 있고 주사용수에 용해시켜 약제학적 제제를 수득할 수 있다.
이러한 약제학적 담체 및 부형제 및 적합한 약제학적 제형의 제제는 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들면, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)). 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 벌크제, 완충제 또는 안정화제와 같은 적어도 하나의 첨가제를 포함할 수 있다. 표준 약학적 제형 기술들은 당업자들에게 널리 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Gennaro et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000). 적합한 약제학적 첨가제는 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 락토스, 슈크로스, 트레할로스 등과 같은 당, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 글라이신, 알라닌, 류신, 세린, 트레오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 페닐알라닌, 프롤린 등과 같은 아미노산, 염화나트륨 또는 기타 염과 같은 등장성 병태를 성취하기 위한 첨가제, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 염화칼슘 등과 같은 안정화제, 트리스(하이드록시메틸아미노메탄) 등과 같은 생리학적 pH 완충제를 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 pH 완충 시약 및 습윤제 또는 유화제를 함유할 수 있다. 추가의 구현예에서, 상기 조성물은 보존제 또는 안정화제를 함유할 수 있다. 특히, 본원에 기재된 Fc 다량체를 포함하는 약제학적 제제는 동결건조되거나 안정한 가용성 형태로 제형화될 수 있다. Fc 다량체는 당업계에 공지된 다양한 과정에 의해 동결건조시킬 수 있다. 동결건조된 제형들은 주사용 멸균수 또는 멸균 생리식염용액 또는 적합한 완충 용액과 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제들을 첨가하여 사용하기 전에 재구성된다.
Fc 다량체의 약제학적 제제의 조성물(들)은 임의의 약제학적으로 적합한 수단에 의해 개체에 전달될 수 있다. 다양한 전달 시스템들이 공지되어 있어, 임의의 편리한 경로에 의해 상기 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. Fc 다량체의 약제학적 제제의 조성물(들)은 통상적인 방법에 따라 정맥내 또는 비-정맥내 주사 또는 장(예를 들어, 경구, 질 또는 직장) 전달을 위해 제형화될 수 있다. 비-정맥내 투여를 위해, Fc 다량체의 조성물(들)은 피하, 근육내, 관절내, 복강내, 뇌내, 척추강내, 폐내(예를 들어 분무), 비강내, 피내, 경구 또는 경피 투여를 위해 제형화될 수 있다. 하나의 구현예에서, Fc 다량체의 조성물(들)은 정맥내 주사용으로 제형화된다. 다른 구현예에서, Fc 다량체의 조성물(들)은 피하, 근육내 또는 경피 투여, 바람직하게는 피하 투여를 위해 제형화된다. 제제는 주입 또는 볼루스 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방형 시스템을 포함할 수 있다.
Fc 다량체의 약제학적 제제의 조성물(들)은 치료적 유효량으로 환자에게 투여된다. 본원에 사용된 용어 "치료학적으로 유효한"은 견딜 수 없는 부작용을 일으키는 용량을 교시하는 것 없이 목적하는 효과를 나타내거나, 면역 복합체 매개 콩팥 장애의 중증도 또는 확산을 예방 또는 감소시키거나, 또는 검출 가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내기에 충분한 용량을 기재한다. 정확한 용량은 예를 들어 제형 및 투여 방식과 같은 많은 요인에 따라 다양하다. 치료학적 유효량은 초기에 세포 배양 검정 또는 동물 모델, 예를 들어 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류 모델에서 추정될 수 있다. 이후, 이러한 정보는 인간에 있어서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 1회의 정맥내 또는 1회의 비-정맥 주사를 위한 Fc 다량체의 용량은 1,000 mg/kg 체중 미만, 800 mg/kg 체중 미만, 600 mg/kg 체중 미만, 400 mg/kg 체중 미만, 200 mg/kg 체중 미만, 또는 100 mg/kg 체중 미만이다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, Fc 다량체의 용량은 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 1,000 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중 내지 약 800 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중 내지 약 700 mg/kg 체, 1mg/kg 체중 내지 약 600 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중 내지 약 400 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중 내지 약 300 mg/kg 체중, 또는 약 3 mg/kg 체중 내지 약 200 mg/kg 체중이다. 하나의 구현예에서, Fc 다량체의 용량은 약 3 mg/kg 체중 내지 약 1,000 mg/kg 체중, 약 3 mg/kg 체중 내지 약 800 mg/kg 체중, 약 3 mg/kg 체중 내지 약 600 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중, 약 3 mg/kg 체중 내지 약 400 mg/kg 체중, 약 3 mg/kg 체중 내지 약 300 mg/kg 체중, 약 3 mg/kg 체중 내지 약 200 mg/kg 체중, 또는 약 3　mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중이다. 하나의 구현예에서 Fc 다량체의 용량은 약 10 mg/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중 내지 약 400 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중 내지 약 300 mg/kg 체중, 또는 약 10 mg/kg 체중 내지 약 200 mg/kg 체중이다.
별도의 구현예에서, Fc 다량체의 약제학적 조성물(들)은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여된다. 하나의 구현예에서, 이들 제제는 동일한 약제의 일부로서 혼입된다. 하나의 구현예에서, Fc 다량체는 스테로이드와 같은 면역억제 치료요법과 함께 투여된다. 또 다른 구현예에서, Fc 다량체는 임의의 B 세포 또는 T 세포 조절제 또는 면역조절제와 함께 투여된다.
Fc 다량체의 투여 빈도는 제형, 투여량 및 투여 방식과 같은 많은 인자에 의존한다. 하나의 구현예에서, Fc 다량체의 용량은 매일 수회, 매일 1회, 격일로 1회, 3일마다 1회, 매주 2회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 개월 당 1회 투여된다.
치료학적 효과
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 효과"는 질환 또는 장애를 특징짓는 파라미터를 개선하거나 대안적으로 상기 질환/장애 파라미터를 모두 예방함으로써 질환 또는 장애를 치료하는 것을 기재한다. 예를 들어, 치료학적 효과는 (1) 세포 배양 모델에서 시험관내, 또는 (2) Fc 다량체의 용량을 투여함으로써 질환의 마우스 모델에서 생체내에서 결정될 수 있다. Fc 다량체의 용량은 10 내지 1000 mg/kg, 예를 들어 200 mg/kg일 수 있다. Fc 다량체는 정맥내 또는 비-정맥내 주사 또는 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 동물에 대한 임상 평가는 Fc 다량체 투여 후 최종 시점까지 예정된 시간에 수행될 수 있다. 임상 평가는 특정 질환 또는 장애의 임상적 증상를 기반으로 한 스코어링을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 Fc 다량체 투여 후 최종 시점까지 예정된 시간에 동물로부터 채취될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 예를 들어 조직, 혈액 및 소변을 언급한다. 이어서 생물학적 샘플은 면역 복합체 매개 콩팥 장애의 마커 또는 지표의 개선에 대해 평가할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유도한다"는 유발, 생산, 유효화, 생성, 발생, 유도 또는 촉진하는 것으로 정의된다.
바람직한 구현예에서, Fc 다량체의 치료학적 효과는 Fc 다량체로 치료시 항-GBM 사구체신염의 마우스 모델에서 소변 알부민 수준의 감소에 의해 나타낼 수 있다. 항-GBM 사구체신염의 마우스 모델은 오텐 등(Otten et al.) (문헌참조: Otten et al., J Immunol 2009; 183:3980-3988)에 의해 기재된다. 상기 연구에서 저자들은 항-GBM 질환의 새로운 약독화 수동 모델에서 완전한 염증에 대해 FcγR과 보체 과정이 모두 필수적이라고 결론지었다. 상기 모델에서, 토끼 항-GBM 항체의 하위 신염 유발성 용량이 동물에 투여된 다음, 토끼 IgG에 대한 고정 용량의 마우스 mAb가 투여되어 사구체신염 유도를 위한 타이밍 및 투여가 가능하다. 이것은 야생형 마우스에서 보체 및 알부민뇨의 고전적 경로를 통해 재현 가능한 보체 활성화를 유도하였다. 알부민뇨는 FcR-γ-쇄 - / - 인 마우스 또는 C3 - / -에서 감소된 마우스에서 검출되지 않았으며, 이는 상기 모델의 발병기전에서 FcR-γ와 보체의 역할이 모두 있음을 시사한다. 또한, 기능적 전형적 및 렉틴 경로가 부재인 것으로 추정되는 C1q - / - 및 C4 - / - 마우스는 알부민뇨가 발병되는 것으로 밝혀졌기 때문에 오텐 등(Otten et al.)은 대안적 보체 경로의 관여를 시하였다.
고전적 보체 경로의 활성화
고전적 보체 경로는 특정 항체 반응을 매개하고 보체 성분의 캐스케이드에 의해 매개된다. 상기 캐스케이드는 주로 항원-항체 복합체에 의해 활성화된다. 경로의 초기 성분은 하나의 C1q와 C1r2s2의 2개 서브유닛으로 구성된 단백질 복합체 C1이다. C1q에 대한 면역글로불린의 결합은 C1r2s2가 촉매 활성 서브유닛으로 활성화함으로써 고전적 보체 경로 활성화의 제1 단계에 영향을 미친다. 활성화된 C1은 C4를 C4a 및 C4b로, C2를 C2a 및 C2b로 절단한다. 이어서 C2a는 C4b에 결합하여 C3 컨버타제로서 공지된 C4b2a를 형성한다. C3 컨버타제는 C3의 C3a 및 C3b로의 절단을 촉매한다. 이어서 C3b는 활성화된 C4b2a에 결합하여 C5 컨버타제로서도 공지된 C4b2a3b를 형성할 수 있다. C5 컨버타제는 C5를 단편 C5a 및 C5b로 전환시킨다. C5b는 C6, C7, C8 및 C9 성분과 함께 C5b-9 복합체로서 공지된 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 막 공격 복합체(MAC) 또는 말단 보체 복합체(TCC)로서도 공지되어 있고 표적 세포에서 막관통 채널을 형성하여 세포 용해를 유도한다.
본원에 사용된 "완전한 고전적 보체 경로의 활성화"는 상기된 바와 같은 전체 고전적 보체 경로의 모든 단계의 활성화로서 정의된다. 완전한 고전적 보체 경로의 활성화는 고전적 보체 경로의 활성화의 첫 번째 단계인 C1q에 대한 Fc 다량체의 결합 및 고전적 보체 경로에서 최종 이펙터인 C4a, C5a 또는 가용성 또는 막 결합된 C5b-9 복합체의 형성을 조사함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, Fc 다량체는 단백질이 C1q에 결합하지만 가용성 C5b-9가 본질적으로 형성되지 않는 경우, 즉 각각의 양성 대조군의 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만만이 형성되는 경우 고전적 보체 경로의 완전한 활성화를 유도하지 않는다. 고전적 보체 경로의 활성화는 또한 C4a의 생성, C2의 절단 또는 C3 컨버타제의 형성을 평가하여 결정할 수 있다. 예를 들어, Fc 다량체는 C4a의 생성을 유도하지만 C2의 절단을 유도하지 않거나 C3 컨버타제의 형성을 유도하지 않는 경우 완전한 고전적 보체 경로의 활성화를 유도하지 않는다. "유도하지 않는다"는 각각의 양성 대조군의 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만이 형성됨을 의미한다.
C1q에 결합하는 Fc 다량체의 능력은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 시험관내 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 96-웰 플레이트의 웰은 사람 C1q로 사전 코팅한 후 Fc 다량체를 첨가할 수 있다. 정제된 퍼옥시다제 표지된 항-사람 IgG 접합체를 추가하고 결합된 접합체는 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘(TMB)과 같은 발색 퍼옥시다제 기질을 사용하여 가시화할 수 있다.
Fc 다량체에 의한 고전적 보체 경로의 활성화는 시험관내 검정에 의해 결정될 수 있고 C4a 및 가용성 C5b-9의 생성에 의해 지적될 수 있다. 예를 들어, Fc 다량체의 상이한 농도는 예정된 기간 동안 전혈 또는 혈청에서 항온처리될 수 있고, C4a 또는 가용성 C5b-9(sC5b-9)의 임의의 수득한 생성은 ELISA와 같은 면역검출에 의해 결정할 수 있다. 사용되는 Fc 다량체의 농도는 0.01 mg/ml 내지 2 mg/ml, 예를 들어 0.04 mg/ml, 0.2 mg/ml 또는 1.0 mg/ml일 수 있다.
Fc 다량체에 의해 유도된 C4a 및 sC5b-9의 생성은 고전적 보체 경로의 강력한 활성화 인자인 열-응집 감마 글로불린(HAGG)에 의해 유도된 이들 성분의 생성과 상대적으로 비교할 수 있다. 예를 들어, 상기 검정은 전혈에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, WO2017/129737에 기재된 바와 같이, Fc 다량체는 HAGG에 의해 유도된 sC5b-9 생성과 비교하여, 50% 미만 sC5b-9 생성, 40% 미만 sC5b-9 생성, 30% 미만 sC5b-9 생성, 20% 미만 sC5b-9 생성 또는 10% 미만 sC5b-9 생성을 유도한다. 하나의 구현예에서, Fc 다량체는 전혈에서 HAGG에 의해 유도된 sC5b-9 생성과 비교하여 전혈에서 20% 미만의 sC5b-9 생성을 유도한다. 또 다른 구현예에서, Fc 다량체는 전혈에서 HAGG에 의해 유도된 sC5b-9 생성과 비교하여 전혈에서 10% 미만의 sC5b-9 생성을 유도한다. 여전히 또 다른 구현예에서, Fc 다량체는 어떠한 sC5b-9 생성을 유도하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "열응집된 IgG로 활성화된 정상 사람 혈청"은 거의 모든 C4의 절단이 열응집된 IgG로 유도된 정상 사람 혈청 샘플을 언급한다.
Fc 다량체에 의한 고전적 보체 경로의 활성화는 또한 C2 단백질을 검출함으로써 결정할 수 있다. C2 단백질이 C2a 및 C2b로 절단되는 경우, C2 단백질 수준이 감소하여 고전적 보체 경로의 활성화를 나타낸다. 상이한 농도의 Fc 다량체는 사전 결정된 기간, 예를 들어 2시간 동안 전혈 또는 혈청에서 항온처리될 수 있고, 그 후 C2 단백질 수준은 면역블롯팅과 같은 면역검출에 의해 결정될 수 있다. 고전적 보체 경로의 활성화는 C2 단백질의 절단에 의해 나타낸다. 정상 사람 혈청에서 C2 단백질의 수준은 C2 절단 및 이에 따른 고전적 보체 경로의 활성화의 양을 결정하기 위해 Fc 다량체와 사전 항온처리된 후에 생성된 C2 단백질의 수준과 비교할 수 있다. HAGG와 같은 고전적 보체 경로의 공지된 활성화인자는 정상 사람 혈청에서 다수의 C2 단백질의 절단을 유도하기 위한 양성 대조군으로서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "다수"는 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과를 포함하는 것으로 정의된다. 일부 구현예에서, WO2017/129737에 기재된 바와 같이, Fc 다량체는 다수의 C2 단백질의 절단을 유도하지 않는다.
Fc 다량체에 의한 고전적 보체 경로의 활성화는 또한 C3 컨버타제의 형성을 평가함으로써 결정할 수 있다. 상기된 바와 같이, C3 컨버타제는 C2a 및 C4b 서브유닛(C4b2a)으로 이루어진다. C2 단백질이 C2a 및 C2b로 절단되지 않는 경우, C3 컨버타제는 형성될 수 없다. 이와 같이, C3 컨버타제 형성은 C2 단백질 절단을 결정하기 위해 상기된 바와 같이 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, WO2017/129737에 기재된 바와 같이, Fc 다량체는 C3 컨버타제의 형성을 유도하지 않는다.
고전적 보체 경로의 억제
Fc 다량체에 의한 고전적 보체 경로의 억제는 C5a 및 sC5b-9 생성의 억제를 결정함으로써 또는 C2 단백질의 절단의 억제를 결정함으로써 결정될 수 있다. 상이한 농도의 Fc 다량체는 고전적 보체 경로의 공지된 활성화 인자와 함께 전혈 또는 혈청에서 항온처리될 수 있다. Fc 다량체 및 고전적 보체 경로의 공지된 활성화 인자의 존재 하에 생성된 sC5b-9의 수준은 이어서 고전적 보체 경로의 공지된 활성화 인자 단독으로 생성된 sC5b-9의 수준과 비교할 수 있다. 생성된 sC5b-9의 수준은 상기된 바와 같이 결정될 수 있다. 사용되는 Fc 다량체의 농도는 0.01 mg/ml 내지 2 mg/ml, 예를 들어 0.04　mg/ml, 0.2 mg/ml 또는 1.0 mg/ml일 수 있다. 고전적 보체 경로의 공지된 활성화 인자는 HAGG일 수 있다. Fc 다량체 및 고전적 보체 경로의 활성화 인자의 존재 하에 생성된 sC5b-9의 수준이 고전적 보체 경로의 활성화 인자 단독의 존재 하에 생성된 sC5b-9의 수준과 비교할 때 더 낮을수록 Fc 다량체에 의한 sC5b-9 생성의 억제는 보다 크다. 일부 구현예에서, Fc 다량체는 HAGG에 의해 유도된 sC5b-9 생성과 비교하여, 50% 초과 sC5b-9 생성, 60% 초과 sC5b-9 생성, 70% 초과 sC5b-9 생성, 80% 초과 sC5b-9 생성 또는 90% 초과 sC5b-9 생성을 억제한다. 하나의 구현예에서, WO2017/129737에 기재된 바와 같이, Fc 다량체는 HAGG에 의해 유도된 sC5b-9 생성을 80% 초과로 억제한다.
본원에 사용된 용어 "억제한다"는 억제, 제한, 방지, 간섭, 정지 또는 차단하는 것으로 정의된다.
C2 단백질의 절단 억제도 유사하게 결정될 수 있다. 상이한 농도의 Fc 다량체는 고전적 보체 경로의 공지된 활성화 인자와 함께 전혈 또는 혈청에서 항온처리될 수 있다. Fc 다량체 및 고전적 보체 경로의 공지된 활성화 인자의 존재 하에 C2 단백질의 수준이 고전적 보체 경로의 활성화 인자 단독의 존재 하에 C2 단백질의 수준과 비교할 때 더 높을수록 Fc 다량체에 의한 C2 절단의 억제는 보다 크다. C2 단백질의 수준은 상기된 바와 같이 결정될 수 있다. 사용되는 Fc 다량체의 농도는 0.01 mg/ml 내지 2 mg/ml, 예를 들어 0.04 mg/ml, 0.2 mg/ml 또는 1.0 mg/ml일 수 있다. 고전적 보체 경로의 공지된 활성화 인자는 HAGG일 수 있다. 일부 구현예에서, WO2017/129737에 기재된 바와 같이, Fc 다량체는 HAGG에 의한 다수의 C2 단백질의 절단을 억제한다.
고전적 보체 경로의 억제는 또한 항체-감작화된 또는 옵소닌화된 적혈구를 사용하여 고전적 보체 경로에 대한 용혈 검정을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 양 적혈구 또는 적혈구는 토끼 항-양 항체로 옵소닌화될 수 있다. 정상 사람 혈청(NHS)은 옵소닌화된 적혈구의 용해를 유도한다. Fc 단백질은 NHS와 함께 사전 항온처리한 다음 적혈구에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리될 수 있다. Fc 작제물의 농도는 1-1000㎍/ml, 예를 들어 2.5, 25, 50, 125, 250, 또는 500㎍/ml일 수 있다. 대안적으로, Fc 단량체는 또한 Fc 작제물에 대해 지시된 것과 동일한 농도에서 NHS와 함께 사전 항온처리될 수 있다. 항온처리 후, 혼합물을 원심분리할 수 있고 용해 정도는 상등액의 412 nm에서 방출된 헤모글로빈의 흡광도를 측정하여 결정할 수 있다.
Fc 다량체에 의한 고전적 보체 경로의 억제는 NHS를 갖지만 Fc 다량체를 갖지 않는 혼합물과 비교하여 Fc 다량체를 포함하는 혼합물에서 적혈구의 감소된 용해에 의해 나타날 수 있다. Fc 다량체에 의한 옵소닌화된 적혈구 세포의 용해 억제는 또한 Fc 단량체의 존재 하에 옵소닌화된 적혈구 세포의 용해와 비교될 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 다량체는 Fc 단량체와 비교하여 옵소닌화된 양 적혈구 세포의 용해를 억제한다. 하나의 구현예에서, WO2017/129737에 기재된 바와 같이, Fc 다량체는 Fc 단량체와 비교하여 옵소닌화된 양 적혈구의 용해를 70% 이상 억제한다.
본 발명의 구현예에서, Fc 다량체는 고전적 보체 경로 또는 대안적 보체 경로의 활성화를 억제함에 의해 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 발병기전을 방지한다.
항체-의존성 세포 독성의 활성화
항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)이라고도 언급되는 항체 의존성 세포 세포독성은 항체가 표적 세포를 코팅하고 이펙터 세포를 동원하여 비-식세포작용 기전을 통해 표적 세포사를 유도하는 과정이다(문헌참조: Zahavi et al. 항체 치료제 2018;1(1):7-12). 항체는 항원 결합 단편(Fab) 부분을 통해 표적 세포 표면 상의 이들의 특이적 항원에 결합하고 이들의 단편 결정화될 수 있는 영역(Fc) 부분을 통해 이펙터 세포와 상호작용하여 이펙터를 표적에 연결하는 브릿지로서 작용한다. 이펙터 세포는 항체에 결합하는 Fc 수용체 (FcR)의 발현에 의해 ADCC를 수행할 수 있다. ADCC 활성은 호중구, 단핵구 및 Fc 수용체-보유(FcR+) T 및 비-T 림프구에 대해 보고되었다(문헌참조: Katz et al., J Clin Invest. 1980;65(1):55-63). FcR의 공지된 부류는 IgG에 결합하는 FcγR; IgA에 결합하는 FcαR; 및 IgE에 결합하는 FcεR을 포함한다. FcγR은 골수 세포에 의한 종양 세포 제거에 가장 중요하며 활성화 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIIA(CD16A) 및 억제 FcγRIIB(CD32B) 수용체로 구성된다(문헌참조: Zahavi et al.). FcγR이 항체의 Fc 부분에 결합하면 수용체 가교 및 다운스트림 신호 전달이 발생한다. 일단 이들 이펙터 세포가 활성화되면 이들은 세포독성 과립 방출, Fas 신호전달 또는 반응성 산소 종의 정교화를 통해 항체 코팅된 표적 세포의 사멸을 매개한다. ADCC에서 사용되는 최상의 특징화된 기전은 이펙터 세포 과립으로부터 퍼포린과 그랜자임의 방출이다.
항체-의존성 세포 독성의 억제
높은 생리학적 수준의 면역글로불린 G는 ADCC 유도를 목표로 하는 항체 기반 암 치료에서 ADCC를 강력하게 억제하는 것으로 밝혀졌다(문헌참조: Preithner et al. Mol Immunol. 2006;43(8):1183-93). 상기 관찰에 대한 설명은 Fc 수용체에 대한 결합에 대한 혈청 IgG 및 치료학적 항체의 경쟁에서 찾을 수 있다. 상기 경쟁 기전은 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 이용될 수 있다. 이전에 언급된 바와 같이, 고용량 IVIG의 항-염증 효과에 대해 제한된 작용 기전 중 하나는 Fcγ 수용체(FcγRs)의 차단이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 Fc 다량체는 Fc 수용체와 결합할 수 있고, 질환 항체와 경쟁할 수 있고 항체 의존성 세포독성을 억제할 수 있다.
예시적 구현예
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료에 사용하기 위한 Fc 다량체에 관한 것이고, 여기서 상기 Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고; 상기 Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 Fc 다량체의 결합 친화성을 증가시키기 위한 임의의 돌연변이가 부재이다. 본 발명의 일부 양상에서, 상기 배제된 돌연변이는 Fc 다량체의 IgG1 Fc 도메인에서 S267E, H268F, S324T, N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 및 L328F 중 적어도 하나이다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체는 스트라도머가 아니다. 본 발명의 일부 양상에서, 다량체화 도메인은 IgG2 힌지를 포함하지 않는다.
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료에 사용하기 위한 Fc 다량체에 관한 것이고, 여기서 상기 Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고; 상기 다량체화 도메인은 IgG2 힌지를 포함하지 않는다. 본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체는 스트라도머가 아니다.
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료에 사용하기 위한 Fc 다량체에 관한 것이고, 여기서 상기 Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고; 상기 Fc 다량체는 스트라도머가 아니다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체는 6개의 IgG 융합 단량체를 포함하는 육량체이다.
본 발명의 일부 양상에서 Fc 다량체는 IgG Fc 폴리펩타이드와 다량체화 도메인 사이에 링커 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 양상에서, 상기 다량체화 도메인은 IgM 테일피스를 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, IgM 테일피스는 IgM 테일피스 도메인으로부터 18개 이하의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, IgM 테일피스는 서열번호 1의 잔기 233 내지 250을 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, IgM 테일피스는 IgG Fc 폴리펩타이드의 C-말단의 232개 아미노산 분절에 융합된다.
본 발명의 일부 양상에서, 상기 IgG Fc 폴리펩타이드는 IgG1 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, IgG1 Fc 폴리펩타이드는 N-말단 말단에서 절단된 CH2 도메인 및/또는 C-말단에서 절단된 CH3 도메인을 포함한다.
본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 면역글로불린 힌지 영역, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 변형된 형태를 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG1 힌지 영역을 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 1의 잔기 1 내지 15를 포함하는 면역글로불린 힌지 영역을 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 1을 포함한다.
본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 2, 또는 서열번호 2의 잔기 20 내지 269를 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 3을 포함하고, 류신은 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄의 IgG Fc 폴리펩타이드의 위치 309에서 시스테인으로 돌연변이된다. 본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 4 또는 서열번호 4의 잔기 20 내지 269를 포함하고, 류신은 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄의 IgG Fc 폴리펩타이드의 위치 309에서 시스테인으로 돌연변이된다.
본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 최대 5개의 보존성 아미노산 변화를 갖는다.
본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료에 사용하기 위한 재조합 사람 Fc 육량체에 관한 것이고, 여기서 상기 재조합 사람 Fc 육량체는 6개의 사람 IgG1 Fc 융합 단량체를 포함하고, 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 사람 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 사람 IgG1 Fc 폴리펩타이드 및 사람 IgM 테일피스를 포함하고, 추가로 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄 내 IgM 테일피스는 IgG1 Fc 폴리펩타이드의 불변 영역의 C-말단에서 232개 아미노산과 융합된 18개 아미노산을 포함한다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 육량체는 보체 시스템 단백질에 대한 Fc 육량체의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 본 발명의 일부 양상에서, 상기 배제된 돌연변이는 Fc 육량체의 IgG1 Fc 도메인에서 S267E, H268F, S324T, N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 및 L328F 중 적어도 하나이다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 육량체는 스트라도머가 아니다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 육량체의 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드는 추가로 IgG1 힌지 영역을 포함하고, Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 육량체의 각각의 IgG1 Fc 폴리펩타이드는 위치 309에서 류신의 시스테인으로의 돌연변이를 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료에 사용하기 위한 Fc 다량체에 관한 것이고, 여기서 상기 Fc 다량체는 3개의 Fc 단량체를 형성하는 4개의 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 폴리펩타이드, 제1 링커 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드는 제3 Fc 폴리펩타이드, 제2 링커, 및 제4 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드는 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제4 폴리펩타이드는 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제3 Fc 폴리펩타이드는 제1 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제5 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제2 Fc 폴리펩타이드는 제2 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제6 Fc 폴리펩타이드 및 제4 Fc 폴리펩타이드는 제3 Fc 단량체를 형성한다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 Fc 다량체의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 본 발명의 일부 양상에서, 상기 배제된 돌연변이는 Fc 다량체의 IgG1 Fc 도메인에서 S267E, H268F, S324T, N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 및 L328F 중 적어도 하나이다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애를 치료하는 방법으로서 상기 방법은 Fc 다량체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고, 상기 Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 Fc 다량체의 결합 친화성을 증가시키기 위한 임의의 돌연변이가 부재이다. 본 발명의 일부 양상에서, 상기 배제된 돌연변이는 Fc 다량체의 IgG1 Fc 도메인에서 S267E, H268F, S324T, N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 및 L328F 중 적어도 하나이다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체는 스트라도머가 아니다. 본 발명의 일부 양상에서, 다량체화 도메인은 IgG2 힌지를 포함하지 않는다.
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 Fc 다량체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고; 다량체화 도메인은 IgG2 힌지를 포함하지 않는다. 본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체는 스트라도머가 아니다.
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 Fc 다량체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 Fc 다량체는 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하고; 상기 Fc 다량체는 스트라도머가 아니다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체의 다량체화 도메인은 IgM 테일피스를 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, IgM 테일피스는 서열번호 1의 잔기 233 내지 250을 포함한다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체의 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 추가로 IgG 힌지 영역을 포함하고, Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않는다. 본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체의 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 IgG1 힌지 영역 및 IgG1 Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체의 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 1 또는 서열번호 3을 포함한다. 본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체의 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 3을 포함하고, 류신은 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄의 IgG Fc 폴리펩타이드의 위치 309에서 시스테인으로 돌연변이된다. 본 발명의 일부 양상에서, 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 서열번호 4을 포함하고, 류신은 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄의 IgG Fc 폴리펩타이드의 위치 309에서 시스테인으로 돌연변이된다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체의 적어도 하나의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 최대 5개의 보존성 아미노산 변화를 갖는다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체는 6개의 IgG 융합 단량체를 포함하는 육량체이다.
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 재조합 사람 Fc 육량체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 재조합 사람 Fc 육량체는 6개의 사람 IgG1 Fc 융합 단량체를 포함하고, 각각의 Fc 융합 단량체는 2개의 사람 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄는 사람 IgG1 Fc 폴리펩타이드 및 사람 IgM 테일피스를 포함하고, 추가로 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄 내 IgM 테일피스는 IgG1 Fc 폴리펩타이드의 불변 영역의 C-말단에서 232개 아미노산과 융합된 18개 아미노산을 포함한다.
본 발명의 일부 양상에서, 재조합 사람 Fc 육량체는 보체 시스템 단백질에 대한 재조합 사람 Fc 육량체의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 본 발명의 일부 양상에서, 상기 배제된 돌연변이는 Fc 육량체의 IgG1 Fc 도메인에서 S267E, H268F, S324T, N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 및 L328F 중 적어도 하나이다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 육량체는 스트라도머가 아니다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 육량체의 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드는 추가로 IgG1 힌지 영역을 포함하고, Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 육량체의 각각의 IgG1 Fc 폴리펩타이드는 위치 309에서 류신의 시스테인으로의 돌연변이를 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 면역 복합체 매개된 콩팥 장애를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 Fc 다량체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 Fc 다량체는 3개의 Fc 단량체를 형성하는 4개의 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 폴리펩타이드, 제1 링커 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제2 폴리펩타이드는 제3 Fc 폴리펩타이드, 제2 링커, 및 제4 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드는 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제4 폴리펩타이드는 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제3 Fc 폴리펩타이드는 함께 제1 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제5 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제2 Fc 폴리펩타이드는 제2 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제6 Fc 폴리펩타이드 및 제4 Fc 폴리펩타이드는 제3 Fc 단량체를 형성한다.
일부 양상에서, Fc 다량체는 보체 시스템 단백질에 대한 Fc 다량체의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재이다. 본 발명의 일부 양상에서, 상기 배제된 돌연변이는 Fc 다량체의 IgG1 Fc 도메인에서 S267E, H268F, S324T, N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 및 L328F 중 적어도 하나이다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, L234A, 및 L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, N297A, E233P, L234V, L235A이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, L234A, L235A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, E233P, L234V, L235A이고, G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 D265A이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 G236R, S267E, H268F, S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265G, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, D265W, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T, S328F이고 G236의 결실이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, 및 L328F이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, 및 S324T이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 배제된 돌연변이는 P238D, S267E, H268F, S324T, 및 N297A이다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체 또는 재조합 사람 Fc 육량체는 시험관내 보체 의존성 세포독성 및 항체 의존성 세포독성을 억제한다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체 또는 재조합 사람 Fc 육량체는 고전적 보체 경로 또는 대안적 보체 경로의 활성화를 억제한다.
본 발명의 일부 양상에서 Fc 다량체 또는 재조합 사람 Fc 육량체는 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 마우스 모델에서 생체내 병리를 억제한다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체 또는 재조합 사람 Fc 육량체의 적어도 하나의 Fc 단량체 또는 Fc 융합 단량체는 Fcγ 수용체에 결합할 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, 제1 Fc 단량체 또는 Fc 융합 단량체는 제1 Fcγ 수용체에 결합할 수 있고, 제2 Fc 단량체 또는 Fc 융합 단량체는 제2 Fcγ 수용체에 결합할 수 있다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체 또는 재조합 사람 Fc 육량체는 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료에 사용되고, 여기서 상기 면역 복합체 매개된 콩팥 장애는 신염, 사구체신염, 간질성신염, 항-사구체기저막(항-GBM) 질환, 굿파스처 증후군, 자가면역 콩팥 질환, 루푸스신염, 막성 신장병증, 막증식성 사구체신염(MPGN), 또는 브라이트(Bright) 질환 중 하나이다. 본 발명의 일부 양상에서, 면역 복합체 매개된 콩팥 장애는 루프스신염이다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체 또는 재조합 사람 Fc 육량체는 정맥내, 피하, 경구, 척추강내 또는 분무에 의한 폐내로 투여된다.
본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체 또는 재조합 사람 Fc 육량체는 약 3 mg/kg 내지 약 200 mg/kg 범위의 양으로 대상체에게 투여된다. 본 발명의 일부 양상에서, Fc 다량체 또는 재조합 사람 Fc 육량체는 약 25 mg/kg 내지 약 500 mg/kg 범위의 양으로 투여된다.
실시예
실시예 1: IgG1 Fc 다량체의 제조
Fc-μTP는 사람 IgM 테일피스의 18개 아미노산 잔기 (PTLYNVSLVMSDTAGTCY 서열번호 9)를 사람 IgG1 Fc 단편 (아미노산 잔기 216-447, EU 넘버링; UniProtKB - P01857)의 불변 영역의 C-말단에 융합시킴에 의해 제조하였다. Fc-μTP-L309C는 Fc-μTP의 309 (EU 넘버링)에서 Leu 잔기를 Cys로 돌연변이시킴에 의해 제조하였다. Fc-μTP 및 Fc-μTP-L309C를 암호화하는 DNA 단편을 합성하고 연구소(ThermoFisher Scientific (MA, USA))에 의한 사람 세포 발현에 대해 코돈 최적화하였다. DNA 단편은 InTag 양성 선택 방법을 사용하여 pRhG4 포유동물 세포 발현 벡터의 ApaLI 및 XbaI 부위에 클로닝하였다(문헌참조: Chen, CG et al, (2014). Nucleic Acids Res 42(4):e26; Jostock T, et al (2004). J. Immunol. Methods. 289:65-80). 간략하게, Fc-μTP 및 Fc-μTP-L309C 단편은 ApaLI 및 AscI 분해에 의해 단리하였다. BGH 폴리A 첨가 부위 (BGHpA) 및 클로람페니콜 내성 유전자 (CmR)의 CmR InTag 어댑터는 또한 AscI 및 SpeI 분해에 의해 단리하였다(문헌참조: Chen, CG et al, (2014). Nucleic Acids Res 42(4):e26). Fc 분자 및 CmR InTag 어댑터는 T4 DNA 리가제를 사용하여 pRhG4 벡터의 ApaLI 및 XbaI 부위에 동시 클로닝하였다. 양성 클론은 34 ㎍/ml 클로람페니콜을 함유하는 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 미니프렙 (Miniprep) 플라스미드 DNA는 QIAprep 스핀 미니프렙 키트(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였고, 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 제한 효소 및 T4 DNA 리가제는 제조사(New England BioLabs (MA, USA))로부터 구입하였다.
Expi293™ 발현 시스템(Life Technologies, NY, USA)을 사용한 일과성 형질감염은 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, 플라스미드 DNA (0.8 μg)는 0.4 ml의 Opti-MEM에 희석시키고 약하게 혼합하였다. 엑스피펙타민(Expifectamine) 293 시약 (21.6 μL)은 0.4 ml의 Opti-MEM에 희석시키고, 약하게 혼합하고 실온에서 5분동안 항온처리하였다. 이어서 희석된 엑스피펙타민을 이어서 희석된 DNA에 첨가하고 약하게 혼합하고 20 내지 30분동안 실온에서 항온처리하여 DNA-엑스피펙타민 복합체가 형성되도록 한다. 이어서 상기 DNA-엑스피펙타민 복합체를 6.8 ml의 Expi293 세포를 함유하는 50ml의 생물반응기 튜브(2x 107 세포)에 첨가하였다. 세포는 대략 16-18시간 동안 250 rpm에서 진탕시키면서 8% CO2와 함께 37℃ 항온처리기에서 항온처리하였다. 40 μl의 증진제 1 (Life Technologies, NY, USA), 400 μl의 증진제 2 (Life Technologies, NY, USA) 및 200 μl의 LucraTone™ 루핀으로 이루어진 마스터 혼합물을 제조하고 각각의 생물반응기 튜브에 첨가하였다. 세포는 250rpm에서 진탕시키면서 8% CO2와 함께 37 ℃ 항온처리기에서 추가로 4일동안 항온처리하였다. 단백질은 20분동안 4000rpm에서의 원심분리 상등액으로부터 수거하고 HPLC 정량 및 정제 전에 0.22　μm 필터를 사용하여 투명한 튜브에 여과하였다.
IgG1 Fc 다량체를 생성하기 위해, 재조합 사람 IgG1 Fc의 C-말단을 IgM의 18개 아미노산 테일피스에 융합시켰다. IgM 테일피스(μTP)는 오량체 및 육량체의 형성을 촉진시킨다. Fc 융합 단백질은 야생형 (WT) 사람 IgG1 Fc 펩타이드 (Fc-μTP) 또는 잔기 309에서 류신의 시스테인으로의 점 돌연변이를 갖는 변이체(Fc-μTP-L309C)를 제조하였다. 류신 309의 시스테인으로의 점 돌연변이(Fc-μTP-L309C)는 Fc 분자 간의 공유 결합 형성으로 인해 WT (Fc-μTP) 보다 안정한 구조를 제공할 것으로 예측되었다. 상기 안정화는 J-쇄 없이 성취된다.
Fc-μTP 및 Fc-μTP-L309C 융합 단량체 서브유닛은 하기의 영역을 포함하는 2개의 펩타이드로부터 비롯된다(잔기 번호는 각각 서열번호 2 및 4에서의 번호를 언급한다):
신호 펩타이드 잔기 1-19
사람 IgG1의 힌지 영역 잔기 20-34
사람 IgG1의 Fc 영역 잔기 35-251
사람 IgM의 테일피스 잔기 252-269
Fc-μTP 및 Fc-μTP-L309C 펩타이드의 성숙한 형태에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 3으로서 제공된다. 핵산 암호화 서열은 각각 서열번호 95 (WO2017/129737의 서열번호 9에 상응하는) 및 서열번호 96 (WO2017/129737의 서열번호 10에 상응하는)으로서 제공된다.
발현 동안에, 신호 펩타이드는 절단 제거되어 성숙한 Fc-μTP 및 Fc-μTP-L309C 융합 펩타이드를 형성한다. 미성숙한 융합 펩타이드의 서열은 각각 서열번호 2 및 4에 제공된다.
다량체 Fc 단백질의 SDS-PAGE는 Fc 작제물의 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 및 육량체에 상응하는 각각의 제조물에 대해 래더링 패턴을 보여주었다. Fc-μTP가 아닌 Fc-μTP-L309C는 예상된 육량체 위치에서 명확한 밴드를 가졌고, 이는 파괴성 전기영동 완충액 조건하에서 보다 안정한 구조와 일치하였다. 육량체의 이량체일 가능성이 가장 높은 고차 구조도 Fc-μTP-L309C에 대해 분명하였다. 하기의 실시예에 대해, 상기 물질의 육량체 분획을 정제하였다.
재조합 사람 IgG1 Fc 단량체(서열번호 1의 잔기 1 내지 232)를 또한 생성하고 대조군으로서 사용하였다.
실시예 4에 사용된 3가 Fc 작제물의 작제를 위해, Fc DNA 서열은 사람 IgG1 Fc로부터 유래하였다. 돌기, 공동 및 전하 돌연변이는 모계 Fc 서열에서 치환되었다. 사람 면역글로불린 카파 경쇄로부터 유래된 리더 펩타이드를 암호화하는 DNA는 5’ 영역에 부착시켰다. 다양한 리더 펩티드 중 임의의 하나가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 리더 펩타이드는 일반적으로 ER 루멘에서 절단된다. 5’ 말단 EcpR1 부위를 함유하는 11개 뉴클레오타이드 서열은 ATG 개시 코돈의 업스트림에 첨가하였다. 3’말단 Xho1 부위를 함유하는 30개 뉴클레오타이드 서열은 3’ 말단 TGA 해독 말단 코돈의 다운스트림에 첨가하였다. DNA 서열은 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다.
실시예 4에 사용된 분비된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기에 제공된다.
SIF1
서열번호 107 또는 108
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(K)
서열번호 113 또는 114
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(K)
CC
서열번호 124
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 125
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Q1
서열번호 122
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 126
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fc 작제물의 단백질 발현을 위해, 상기 나타낸 폴리펩타이드 쌍을 발현하는 DNA 플라스미드 작제물 중 2개는 EXPI293 세포(LifeTechnologies)에 형질감염시켰다. 리포좀 형질감염을 사용하여 플라스미드 DNA를 EXPI293 세포에 도입하였다. 형질감염된 플라스미드 작제물의 총양은 고정된 반면 상이한 플라스미드 작제물의 비율은 다양하게 하여 목적하는 작제물의 수율을 최대화한다.
단백질 발현 후, 발현된 작제물을 단백질 A 기반 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 배지 상등액을 AKTA Avant 정제용 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 Poros MabCapture A(LifeTechnologies)상에 부하하였다. 이어서 포획된 Fc 작제물은 포스페이트 완충 식염수 (저염 세척)에 이어서 500mM NaCl (고염 세척)이 보충된 포스페이트 완충 식염수로 세척하였다. Fc 작제물은 100mM 글라이신, 150mM NaCl, pH 3 완충액으로 용출시켰다. 컬럼으로부터 나오는 단백질 용액은 1M TRIS pH 7.4를 100mM의 최종 농도로 첨가하여 중화시켰다. Fc 작제물은 추가로 Poros® XS 수지 (Applied Biosciences Cat. # 4404336)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피로 분획화하였다. 컬럼을 10mM MES, pH 6(완충액 A)로 미리 평형화하고, 샘플을 10mM MES, 500mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)에 대한 구배로 용출시켰다.
정제된 Fc 작제물을 환원 및 비환원 조건 둘다에서 SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)에 의해 분석한 후 예상되는 크기의 단백질 밴드의 존재를 확인하기 위해 쿠마시 블루 염색을 하였다.
실시예 2: Fc-μTP-L309C (CHO)는 항-GBM 사구체신염을 억제한다
CHO 세포[Fc-μTP-L309C (CHO)]로부터 생성된 Fc-μTP-L309C의 효과는 항-사구체 기저막 (GBM) 사구체신염의 생체내 모델에서 결정하였다.
간략하게, 항-GBM 사구체신염은 0일에 폴리클로날 토끼 항-GBM 항체 1mg을 정맥내(i.v., 꼬리 정맥) 주사한 후 6일에 마우스 모노클로날 항-토끼 IgG(하이브리도마 CRL-1753(ATCC)에서 생산된 MsαRb IgG) 2mg을 복강내(i.p.) 주사함으로써 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. 마우스에는 MsαRb IgG mAb를 주사하기 대략 1 시간 전에, 6일자에 PBS 또는 50, 100 또는 200 mg/kg의 Fc-μTP-L309C를 i.p. 주사하였다. MsαRb의 주사 후, 마우스는 개별적으로 대사 케이지 (Tecniplast)에 넣고 24시간 동안의 소변을 수거하였다. 소변 알부민 수준은 ELISA 키트 (Bethyl Laboratories)를 사용하여 측정하고 마우스 당 알부민뇨를 μg/24 h로서 플롯팅한다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 소변 알부민 수준은 시험된 모든 용량에서 Fc-μTP-L309C (PBS 대 200mg/kg에서 Fc-μTP-L309C: p=0.0016; PBS 대 100mg/kg에서 Fc-μTP-L309C: p=0.0036; PBS 대 50mg/kg에서 Fc-μTP-L309C: p=0.0101)로 처리된 마우스에서 유의적으로 감소하였다. 표 1은 측정된 값을 보여준다.
[표 1]
Figure pct00001
실시예 3: Fc-μTP-L309C 및 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 이의 변이체는 항-GBM 사구체신염을 억제한다.
CHO [Fc-μTP-L309C (CHO)] 및 HEK293 세포[Fc-μTP-L309C (HEK)]로부터 생성된 Fc-μTP-L309C 및 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 돌연변이체(HEK293 세포로부터 생성된 K322A)의 효과는 항-GBM 사구체신염의 생체내 모델에서 결정하였다.
간략하게, 항-GBM 사구체신염은 0일에 폴리클로날 토끼 항-GBM 항체 1mg을 정맥내(i.v., 꼬리 정맥) 주사한 후 6일에 마우스 모노클로날 항-토끼 IgG(하이브리도마 CRL-1753(ATCC)에서 생산된 MsαRb IgG) 2mg을 복강내(i.p.) 주사함으로써 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. MsαRb IgG mAb를 주사하기 대략 1시간 전에, 마우스에는 PBS, 50mg/kg으로 Fc-μTP-L309C (CHO), Fc-μTP-L309C (HEK) 또는 K322A를 i.p. 주사하였다. MsαRb의 주사 후, 마우스는 개별적으로 대사 케이지 (Tecniplast)에 넣고 24시간 동안의 소변을 수거하였다. 소변 알부민 수준은 ELISA 키트 (Bethyl Laboratories)를 사용하여 측정하고 마우스 당 알부민뇨를 μg/24 h로서 플롯팅한다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 소변 알부민 수준은 모든 형태의Fc-μTP-L309C (PBS 대 CHO 세포로부터 생성된 Fc-μTP-L309C: p=0.0038; PBS 대 HEK293세포로부터의Fc-μTP-L309C: p=0.0012; PBS 대 Fc-μTP-L309C K322A 변이체: p=0.0011)로 처리된 마우스에서 유의적으로 감소하였다. 표 2는 측정된 값을 보여준다.
[표 2]
Figure pct00002
실시예 4: Fc-μTP-L309C, CC SIF1, 및 Q1은 항-GBM 사구체신염을 억제한다
HEK293 세포로부터 생성된 Fc-μTP-L309C, 즉, Fc-μTP-L309C (HEK), 및 3가 Fc 다량체(실시예 1에 기재된 바와 같이) CC, SIF1 및 Q1의 효과는 항-GBM 사구체신염의 생체내 모델에서 결정하였다.
간략하게, 항-GBM 사구체신염은 0일에 폴리클로날 토끼 항-GBM 항체 1mg을 정맥내(i.v., 꼬리 정맥) 주사한 후 6일에 마우스 모노클로날 항-토끼 IgG(하이브리도마 CRL-1753(ATCC)에서 생산된 MsαRb IgG) 2mg을 복강내(i.p.) 주사함으로써 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. MsαRb IgG mAb를 주사하기 대략 1시간 전에, 마우스에는 PBS, 50mg/kg에서 Fc-μTP-L309C (HEK) 또는 3개의 3가 Fc 다량체 (CC, SIF1 및 Q1) 중 하나를 i.p. 주사하였다. MsαRb의 주사 후, 마우스는 개별적으로 대사 케이지 (Tecniplast)에 넣고 24시간 동안의 소변을 수거하였다. 소변 알부민 수준은 ELISA 키트 (Bethyl Laboratories)를 사용하여 측정하고 마우스 당 알부민뇨를 μg/24 h로서 플롯팅한다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 소변 알부민 수준은 Fc-μTP-L309C 또는 3가 Fc 다량체로 처리된 마우스에서 유의적으로 감소하였다. (PBS 대 Fc-μTP-L309C: p=0.0220; PBS 대 CC: p=0.0190; PBS 대 SIF1: p=0.0208; PBS 대 Q1: p=0.0119). 표 3은 측정된 값을 보여준다.
[표 3]
Figure pct00003
실시예 5: Fc-μTP-L309C는 용량 의존적으로 항-GBM 사구체신염을 억제한다
HEK293 세포[Fc-μTP-L309C (HEK)]로부터 생성된 Fc-μTP-L309C의 용량-반응 효과는 항-사구체 기저막 (GBM) 사구체신염의 생체내 모델에서 결정하였다.
간략하게, 항-GBM 사구체신염은 0일에 폴리클로날 토끼 항-GBM 항체 1mg을 정맥내(i.v., 꼬리 정맥) 주사한 후 6일에 마우스 모노클로날 항-토끼 IgG(하이브리도마 CRL-1753(ATCC)에서 생산된 MsαRb IgG) 2mg을 복강내(i.p.) 주사함으로써 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. 마우스에는 MsαRb IgG mAb를 주사하기 대략 1 시간 전에, 6일자에 PBS 또는 1, 5, 10, 20 또는 50 mg/kg의 Fc-μTP-L309C를 i.p. 주사하였다. MsαRb의 주사 후, 마우스는 개별적으로 대사 케이지 (Tecniplast)에 넣고 24시간 동안의 소변을 수거하였다. 뇨 알부민 수준은 ELISA 키트 (Bethyl Laboratories)를 사용하여 측정하고 마우스 당 알부민뇨를 μg/24 h로서 플롯팅한다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Fc-μTP-L309C는 용량 의존성 방식(PBS 대 50 mg/kg에서 Fc-μTP-L309C: p=0.0194; PBS 대 20mg/kg에서 Fc-μTP-L309C: p=0.0201; PBS 대 10 mg/kg에서 Fc-μTP-L309C: p=0.0286; PBS 대 5mg/kg에서 Fc-μTP-L309C: p=0.2505; PBS 대 1 mg/kg에서 Fc-μTP-L309C : p=0.7875)으로 항-GBM 항체 유도된 사구체신염을 억제하였다. 표 4은 측정된 값을 보여준다.
[표 4]
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> CSL Behring Lengnau AG <120> Treatment of immune-complex mediated kidney disorders <130> 2019_L003_A297 <150> EP2019197287 <151> 2019-09-13 <160> 162 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu 225 230 235 240 Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr 245 250 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 35 40 45 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 50 55 60 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 65 70 75 80 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 85 90 95 Glu 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Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly 20 25 30 Thr Gly Ser Gly 35 <210> 162 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 162 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser 35

Claims (14)

  1. 면역 복합체 매개된 콩팥 장애의 치료에 사용하기 위한 IgG Fc 다량체로서, 상기 Fc 다량체에는 C1q에 대한 상기 Fc 다량체의 결합 친화성을 증가시키는 임의의 돌연변이가 부재인, IgG Fc 다량체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 부재인 돌연변이가 상기 Fc 다량체의 IgG1 Fc 도메인에서 S267E, H268F, S324T, N297A, T299A, P238D, E233P, G236R, L234V, E233P, L234A, L235A, P238D, D265A, D265W, N297A, N297Q, T299A, 및 L328F 중 적어도 하나인, IgG Fc 다량체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 다량체가 2 내지 6개의 IgG Fc 융합 단량체를 포함하고, 상기 각각의 Fc 융합 단량체가 2개의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄가 IgG Fc 폴리펩타이드 및 다량체화 도메인을 포함하는, IgG Fc 다량체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 다량체화 도메인이 IgG2 힌지를 포함하지 않는, IgG Fc 다량체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 다량체가 스트라도머(stradomer)가 아닌, IgG Fc 다량체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 다량체가 6개의 사람 IgG1 Fc 융합 단량체를 포함하고, 상기 각각의 Fc 융합 단량체가 2개의 사람 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 상기 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄가 사람 IgG1 Fc 폴리펩타이드 및 사람 IgM 테일피스를 포함하는, IgG Fc 다량체.
  7. 제6항에 있어서, 각각의 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄에서 상기 IgM 테일피스가 상기 IgG1 Fc 폴리펩타이드의 불변 영역의 C-말단에서 232개 아미노산과 융합된 18개 아미노산을 포함하는, IgG Fc 다량체.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 각각의 IgG1 Fc 폴리펩타이드가 위치 309에서 류신의 시스테인으로의 돌연변이를 포함하는, IgG Fc 다량체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 Fc 융합 폴리펩타이드 쇄가 서열번호 3의 서열을 포함하는, IgG Fc 다량체.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 다량체가 3개의 Fc 단량체를 형성하는 4개의 폴리펩타이드를 포함하고, 제1 폴리펩타이드가 제1 Fc 폴리펩타이드, 제1 링커 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드가 제3 Fc 폴리펩타이드, 제2 링커, 및 제4 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제3 폴리펩타이드가 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제4 폴리펩타이드가 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제3 Fc 폴리펩타이드가 제1 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제5 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제2 Fc 폴리펩타이드가 제2 Fc 단량체를 형성하고, 상기 제6 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제4 Fc 폴리펩타이드가 제3 Fc 단량체를 형성하는, IgG Fc 다량체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드가 동일하고, 추가로 상기 제3 폴리펩타이드 및 상기 제4 폴리펩타이드가 동일한, IgG Fc 다량체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호 120을 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드 및 상기 제4 폴리펩타이드가 서열번호 119를 포함하거나; 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호 125를 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드 및 상기 제4 폴리펩타이드가 서열번호 124를 포함하거나; 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호 126을 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드 및 상기 제4 폴리펩타이드가 서열번호 122를 포함하거나; 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호 107 또는 서열번호 108을 포함하고, 상기 제3 폴리펩타이드 및 상기 제4 폴리펩타이드가 서열번호 113 또는 서열번호 114를 포함하는, IgG Fc 다량체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 복합체 매개된 콩팥 장애가 신염, 사구체신염, 간질성신염, 항-사구체기저막(항-GBM) 질환, 굿파스처 증후군, 자가면역 콩팥 질환, 루푸스신염, 막성 신장병증, 막증식성 사구체신염(MPGN), 또는 브라이트(Bright) 질환 중 하나인, IgG Fc 다량체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 다량체가 보체 의존성 세포독성 및/또는 항체 의존성 세포독성을 억제하는, IgG Fc 다량체.
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