KR20230025673A - CD3 및 FolR1에 결합하는 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 예컨대, T 세포를 활성화하기 위한 CD3 및 엽산 수용체 1(FolR1)에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 상기 항체를 생성하기 위한 방법, 및 질병의 치료에서 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

CD3 및 FolR1에 결합하는 항체
본 발명은 일반적으로, 예컨대, T 세포를 활성화하기 위한 CD3 및 엽산 수용체 1(FolR1)에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 상기 항체를 생성하기 위한 방법, 및 질병의 치료에서 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
개별 세포 또는 특정 세포 유형의 선택적 파괴는 종종 다양한 임상 환경에서 바람직하다. 예를 들어, 암 요법의 주요한 목적은 건강한 세포 및 조직을 원형 및 손상되지 않은 상태로 남겨두면서 종양 세포를 특이적으로 파괴하는 것이다.
이러한 목적을 달성하는 매력적인 방식은 종양에 대한 면역 반응을 유도함으로써 종양 세포를 공격하고 파괴하기 위한 면역 효과기 세포, 예컨대, 자연 살해(NK) 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL)를 유도하는 것이다. CTL은 면역 체계의 가장 강력한 효과기 세포를 구성하지만, 기존 치료용 항체의 Fc 도메인에 의해 매개되는 효과기 메커니즘에 의해 활성화될 수 없다.
이와 관련하여, 표적 세포 상의 표면 항원에 하나의 "팔"로 결합하고, T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화 불변 구성요소에 제2 "팔"로 결합하도록 설계된 이중특이적 항체가 최근 수년 간 관심의 대상이 되었다. 이러한 항체의 두 표적 모두에 대한 동시 결합은 표적 세포와 T 세포 사이에 일시적인 상호작용을 강제하여 임의의 세포독성 T 세포를 활성화시키고 후속하여 표적 세포를 용해시킬 것이다. 따라서, 면역 반응은 표적 세포를 다시 지향하고 표적 세포에 의한 펩티드 항원 제시 또는 CTL의 정상적인 MHC 제한 활성화와 관련된 T 세포의 특이성과 무관하다. 이러한 맥락에서 표적 세포가 이중특이적 항체를 제시할 때만 CTL이 이에 활성화된다는 것이 중요하다. 즉, 면역학적 시냅스가 모방된다. 특히 바람직한 것은 표적 세포의 효율적인 용해를 유도하기 위해 림프구 전처리 또는 동시 자극을 필요로 하지 않는 이중특이적 항체이다.
CD3은 약물 표적으로서 광범위하게 탐구되고 있다. CD3을 표적으로 하는 단일클론 항체는 자가면역 질환, 예컨대, I형 당뇨병에서 면역억제제 요법으로서, 또는 이식 거부반응의 치료에서 이용되고 있다. CD3 항체 무로모납-CD3(OKT3)은 1985년에 인간에서 임상적 사용을 위해 승인된 첫 번째 단일클론 항체이었다.
CD3 항체의 더욱 최근의 적용은 한편으로 CD3 및 다른 한편으로 종양 세포 항원에 결합하는 이중특이적 항체의 형태이다. 이러한 항체의 이들 표적 둘 모두에 대한 동시적 결합은 표적 세포 및 T 세포 사이에 일시적인 상호작용을 강제하여, 임의의 세포독성 T 세포를 활성화 및 표적 세포의 차후 용해를 유발할 것이다.
FOLR1은 다양한 기원, 예컨대, 난소암, 폐암, 유방암, 신장암, 결장직장암, 자궁내막암의 상피 종양 세포에서 발현된다. 파레투주맙, 항체 약물 접합체 또는 종양 영상화를 위한 양자 T 세포 요법과 같은 치료용 항체로 FOLR1을 표적화하는 여러 접근법이 기재되었다(Kandalaft et al., J Transl Med. 2012 Aug 3;10:157. doi: 10.1186/1479-5876-10-157; van Dam et al., Nat Med. 2011 Sep 18;17(10):1315-9. doi: 10.1038/nm.2472; Cliftonet al., Hum Vaccin. 2011 Feb;7(2):183-90. Epub 2011 Feb 1; Kelemen et al., Int J Cancer. 2006 Jul 15;119(2):243-50; Vaitilingam et al., J Nucl Med. 2012 Jul;53(7); Teng et al., 2012 Aug;9(8):901-8. doi: 10.1517/17425247.2012.694863. Epub 2012 Jun 5. 엽산 수용체 및 CD3을 표적으로 하는 구조로 엽산 수용체 양성 종양을 표적으로 하려는 일부 시도가 있었다(Kranz et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 26, 1995; 92(20): 9057-9061; Roy et al., Adv Drug Deliv Rev. 2004 Apr 29;56(8):1219-31; Huiting Cui et al Biol Chem. Aug 17, 2012; 287(34): 28206-28214; Lamers et al., Int. J. Cancer. 60(4):450 (1995); Thompson et al., MAbs. 2009 Jul-Aug;1(4):348-56. Epub 2009 Jul 19; Mezzanzanca et al., Int. J. Cancer, 41, 609-615 (1988). 하지만, 지금까지 취해진 접근 방식에는 많은 단점이 있다. 지금까지 사용된 분자는 화학적 가교결합이 필요하기 때문에 쉽고 안정적으로 생산할 수 없었다. 유사하게, 하이브리드 분자는 인간 단백질로서 대규모로 생산될 수 없으며, 인간에게 투여될 때 고도의 면역원성이고, 따라서 제한된 치료적 가치를 갖는 래트, 뮤린 또는 기타 단백질의 사용을 필요로 한다. 추가로, 기존의 많은 분자는 FcgR 결합을 유지하였다.
좀 더 최근에는, WO2016/079076이 CD3 및 FolR1을 표적으로 하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개시한다.
치료 목적을 위해, 항체가 충족해야 하는 중요한 요건은 시험관내(약물의 보관 동안) 및 생체내(환자에 투여 후) 둘 모두에서 충분한 안정성이다.
아스파라긴 탈아미드화와 같은 변형은 재조합 항체에 대한 통상적인 분해이고, 시험관내 안정성 및 생체내 생물학적 기능 둘 모두에 영향을 줄 수 있다.
항체, 특히 T 세포 활성화를 위한 이중특이적 항체의 엄청난 치료 잠재력을 감안할 때, 최적화된 특성을 갖는 이중특이적 CD3/FolR1 항체가 필요하다.
본 발명은 CD3에 결합하고, 예컨대, 아스파라긴 탈아미드화에 의한 분해에 내성이고, 따라서 치료 목적을 위해 요구된 대로 특히 안정되는, 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 항체를 포함한, 항체를 제공한다. 제공되는 (다중특이적)항체는 낮은 독성 및 유리한 약동학적 특성과 함께 우수한 효능 및 생산 가능성을 추가로 결합한다.
본원에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의해 제공된, CD3에 결합하는, 다중특이적 항체를 포함한, 항체는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정된 바와 같이, pH 6, -80℃에서 2주 후 결합 활성에 비하여, pH 7.4, 37℃에서 2주 후 CD3에 대한 약 90% 초과의 결합 활성을 유지한다.
특정 양태에서, 본 발명은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정된 바와 같이, pH 6, -80℃에서 2주 후 결합 활성에 비하여, pH 7.4, 37℃에서 2주 후 CD3에 대한 약 90% 초과의 결합 활성을 유지하는 CD3 및 엽산 수용체 1(FolR1)에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
일 양태에서, CD3 및 엽산 수용체 1(FolR1)에 결합하는 이중특이적 항체가 제공되고, 여기서 상기 이중특이적 항체는,
(i) 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 3의 HCDR 2, 및 서열번호 5의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인; 및
(ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 이중특이적 항체가 제공되고, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고/또는 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 이중특이적 항체는 CD3 및 FolR1에 결합하고, 여기서 이중특이적 항체는,
(i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 11의 VL 서열을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인; 및
(ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 제1 항원 결합 도메인은 Fab 분자이다.
일 양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 이중특이적 항체는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 제2 항원 결합 도메인 및/또는 존재하는 경우에, 제3 항원 결합 도메인은 Fab 분자이다.
일 양태에서, 제1 항원 결합 도메인은 Fab 분자이고, 여기서 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH는 상호 대체된다.
일 양태에서, 제2 항원 결합 도메인 및 존재하는 경우에, 제3 항원 결합 도메인은 종래의 Fab 분자이다.
일 양태에서, 제2 항원 결합 도메인 및 존재하는 경우에, 제3 항원 결합 도메인은 Fab 분자이고, 여기서 불변 도메인 CL 내 위치 124의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링) 위치 123의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 불변 도메인 CH1 내 위치 147의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링) 위치 213의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
일 양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다.
일 양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고, (i) 상기 제2 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되거나, 또는 (ii) 상기 제1 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다.
일 양태에서, 상기 제1 항원 결합 도메인, 상기 제2 항원 결합 도메인 및 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고, 상기 항체는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하고; (i) 상기 제2 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제1 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되거나, 또는 (ii) 상기 제1 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제2 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되며; 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합된다.
일 양태에서, Fc 도메인은 IgG, 특히, IgG1 Fc 도메인이다.
일 양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.
일 양태에서, Fc는 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 화합을 증진시키는 변형을 포함한다.
일 양태에서, 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2 항원 결합 도메인 및 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 서열번호 124의 HCDR 1, 서열번호 125의 HCDR 2, 및 서열번호 126의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 8의 LCDR 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일 양태에서, 상기 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체가 제공되고, 여기서 상기 제2 항원 결합 도메인 및 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 서열번호 123의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및/또는 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
일 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
일 양태에서, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 생성하는 방법으로서, (a) 상기 이중특이적 항체의 발현에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로 (b) 상기 이중특이적 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
일 양태에서, 상기 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된 CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체가 제공된다.
일 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항체 또는 본 발명의 약학적 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 이중특이적 항체 또는 본 발명의 약학적 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 약제의 제조에서 본 발명의 이중특이적 항체 또는 본 발명의 약학적 조성물의 사용이 제공된다.
일 양태에서, 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 이중특이적 항체 또는 본 발명의 약학적 조성물의 사용이 제공된다.
일 양태에서, 개체에서 질병을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 이중특이적 항체 또는 본 발명의 약학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 상기 질병은 암이다.
도 1 본 발명의 (다중특이적)항체의 예시적인 구성. (A, D) “1+1 크로스맵(CrossMab)” 분자의 도시. (B, E) 크로스맵 및 Fab 구성요소의 대안적 순서(“반전됨”)를 갖는 “2+1 IgG 크로스Fab” 분자의 도시. (C, F) “2+1 IgG 크로스Fab” 분자의 도시. (G, K) 크로스Fab 및 Fab 구성요소의 대안적 순서(“반전됨”)를 갖는 “1+1 IgG 크로스Fab” 분자의 도시. (H, L) “1+1 IgG 크로스Fab” 분자의 도시. (I, M) 2개의 크로스Fab를 갖는 “2+1 IgG 크로스Fab” 분자의 도시. (J, N) 2개의 크로스Fab 및 크로스Fab와 Fab 구성요소의 대안적 순서(“반전됨”)를 갖는 “2+1 IgG 크로스Fab” 분자의 도시. (O, S) “Fab-크로스Fab” 분자의 도시. (P, T) “크로스Fab-Fab” 분자의 도시. (Q, U) "(Fab)2-크로스Fab" 분자의 도시. (R, V) "크로스Fab-(Fab)2" 분자의 도시. (W, Y) "Fab-(크로스Fab)2" 분자의 도시. (X, Z) "(크로스Fab)2-Fab" 분자의 도시. 검은색 점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인의 선택적 변형. ++, --: CH1 및 CL 도메인에 임의적으로 도입된 반대 전하의 아미노산. 크로스Fab 분자는 VH 및 VL 영역의 교환을 포함하는 것으로 도시되지만, - 전하 변형이 CH1 및 CL 도메인에 도입되지 않는 양태들에서 - CH1 및 CL 도메인의 교환을 대안적으로 포함할 수도 있다.
도 2 40℃ pH 6에서 14 d 후, 또는 37℃ pH 7.4에서 14 d 후, 스트레스가 없는 조건에서 SPR에 의해 측정될 때, 재조합 CD3에 대한 본래 및 최적화된 CD3 결합체, CD3orig 및 CD3opt의 상대적 결합 활성(IgG 형식).
도 3 유세포분석법에 의해 측정할 때, 저캇(Jurkat) NFAT 세포에 대한 본래 및 최적화된 CD3 결합체, CD3orig 및 CD3opt (IgG 형식)의 결합. 저캇 NFAT 세포에 결합된 항체는 형광 표지화된 항인간 Fc 특이적 이차 항체로 검출되었다.
도 4 실시예 3에서 사용된 CD3 활성화 검정의 개략적 도시.
도 5 본래 및 최적화된 CD3 결합체, CD3orig 및 CD3opt로 저캇 NFAT 활성화(IgG 형식). 저캇 NFAT 리포터 세포는 CD3orig 또는 CD3opt IgG PGLALA, 또는 음성 대조군으로서 CD3opt IgG wt의 존재하에서 항 PGLALA 발현 CHO(CHO-PGLALA) 세포와 공동배양되었다. 24 시간 후 발광을 측정함으로써, CD3 활성화가 정량화되었다.
도 6 실시예에서 제조된 T 세포 이중특이적 항체(TCB) 분자의 개략적 도시. 모든 검사된 TCB 항체 분자는 전하 변형(CD3 결합체에서 VH/VL 교환, 표적 항원 결합체에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K)을 갖는 “2+1 IgG 크로스Fab, 반전됨”으로서 생성되었다.
도 7 40℃ pH 6에서 14 d 후, 또는 37℃ pH 7.4에서 14 d 후, 스트레스가 없는 조건에서 SPR에 의해 측정될 때, 재조합 CD3에 대한 본래 또는 최적화된 CD3 결합체, CD3orig 또는 CD3opt를 포함하는 TYRP1 TCB의 상대적 결합 활성.
도 8 40℃ pH 6에서 14 d 후, 또는 37℃ pH 7.4에서 14 d 후, 스트레스가 없는 조건에서 SPR에 의해 측정될 때, 재조합 TYRP1에 대한, 본래 또는 최적화된 CD3 결합체, CD3orig 또는 CD3opt를 포함하는 TYRP1 TCB, 또는 상응하는 TYRP1 IgG의 상대적 결합 활성.
도 9 유세포분석법에 의해 측정될 때, 저캇 NFAT 세포에 대한 본래 또는 최적화된 CD3 결합체, CD3orig 또는 CD3opt를 포함하는 TYRP1 TCB의 결합. 저캇 NFAT 세포에 결합된 TCB는 형광 표지화된 항인간 Fc 특이적 이차 항체로 검출되었다.
도 10 본래 또는 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 TYRP1 TCB를 사용한 저캇 NFAT 활성화. 저캇 NFAT 리포터 세포는 TYRP1 TCB CD3orig 또는 TYRP1 TCB CD3opt의 존재하에서 흑색종 세포주 M150543과 공동배양되었다. 24시간 후 발광을 측정함으로써 TCB의 존재하에서 CD3 활성화가 정량화되었다.
도 11 본래 또는 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 TYRP1 TCB로 종양 세포 사멸 및 T 세포 활성화. 3명의 상이한 건강한 공여자(A-F: 공여자 1, G-L: 공여자 2, M-R: 공여자 3)로부터 PBMC에 의한 TYRP1 TCB CD3orig 및 TYRP1 TCB CD3opt로 처리 시에 흑색종 세포주 M150543의 사멸이 24시간 후(A, G, M) 및 48시간 후(B, H, N), LDH 방출에 의해 결정되었다. 병렬적으로, PBMC 내에 CD8(E, F, K, L, Q, R) 및 CD4(C, D, I, J, O, P) T 세포에서 CD25(C, E, I, K, O, Q) 및 CD69(D, F, J, L, P, R) 상향조절이 48시간 후 T 세포 활성화에 대한 마커로서 유세포분석법에 의해 측정되었다.
도 12 EGFRvIII IgG PGLALA의 특이적 결합. EGFRwt에 대한 교차반응성 없이, EGFRvIII에 대한 EGFRvIII IgG PGLALA 항체의 특이적 결합이 CHO-EGFRvIII(A), EGFRvIII 양성 DK-MG(B) 및 EGFRwt 발현 MKN-45(C)에서 유세포분석법에 의해 검사되었다. 세툭시맙이 EGFRwt 발현에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 13 EGFRvIII IgG PGLALA로 CAR J 활성화. 항 PGLALA CAR을 발현하는 저캇 NFAT 리포터 세포는 EGFRvIII 발현 DK-MG 세포 및 EGFRvIII IgG PGLALA 항체, 또는 음성 대조군으로서 DP47 IgG PGLALA와 공동배양되었다. 22시간 후 발광을 측정함으로써 저캇 NFAT 세포의 활성화가 정량화되었다.
도 14 EGFRvIII IgG PGLALA 및 해당 TCB의 EGFRvIII에 대한 결합. CHO-EGFRvIII(A) 및 MKN-45(B) 세포에 대한 IgG PGLALA로서 및 TCB로 전환된 EGFRvIII 결합체의 특이적 결합이 유세포분석법에 의해 측정되었다.
도 15 EGFRvIII TCB로 저캇 NFAT 활성화. 저캇 NFAT 활성화는 EGFRvIII 양성 DK-MG 세포의 존재하에서 EGFRvIII TCB와의 CD3 결합에 대한 마커로서 결정되었다. DP47 TCB가 음성 대조군으로서 포함되었다.
도 16 EGFRvIII TCB로 종양 세포 용해. EGFRvIII TCB에 의한 특이적 종양 세포 용해의 유도는 24시간(A, C) 또는 48시간(B, D) 동안 새로 단리된 PBMC 및 EGFRvIII 양성 DK-MG 세포(A, B) 또는 EGFRwt 양성 MKN-45 세포(C, D) 중에서 어느 한 가지와의 공동배양 시에 결정되었다.
도 17 EGFRvIII TCB로 T 세포 활성화. EGFRvIII TCB에 의한 T 세포 활성화의 유도는 CD4 T 세포(A-D) 또는 CD8 T 세포(E-H)에서 활성화 마커 CD25(A, C, E, G) 또는 CD69(B, D, F, H)를 이용하여, 새로 단리된 PBMC 및 EGFRvIII 양성 DK-MG 세포(A, B, E, F) 또는 EGFRwt 양성 MKN-45 세포(C, D, G, H) 중에서 어느 한 가지와의 공동배양 시에 결정되었다.
도 18 EGFRvIII TCB로 사이토킨 방출. EGFRvIII TCB에 의한 IFNg(A, D), TNFa(B, E) 및 그랜자임 B(C, F)의 방출의 유도는 새로 단리된 PBMC 및 EGFRvIII 양성 DK-MG 세포(A-C) 또는 EGFRwt 양성 MKN-45 세포(D-F) 중에서 어느 한 가지와의 공동배양 시에 결정되었다.
도 19 친화성 성숙된 EGFRvIII IgG PGLALA의 특이적 결합. EGFRvIII에 대한 친화성 성숙된 EGFRvIII 항체의 특이적 결합은 U87MG-EGFRvIII 세포(A) 및 EGFRwt 양성 세포주 MKN-45(B)에서 모 EGFRvIII 결합체와 비교되었다.
도 20 EGFRvIII TCB에 의한 저캇 NFAT 활성화. 저캇 NFAT 활성화는 EGFRvIII 양성 DK-MG 세포(A), U87MG-EGFRvIII 세포(B) 및 MKN-45 세포(C)의 존재하에서 EGFRvIII TCB와의 CD3 결합에 대한 마커로서 결정되었다. DP47 TCB가 음성 대조군으로서 포함되었다.
도 21 40℃ pH 6에서 14 d 후, 또는 37℃ pH 7.4에서 14 d 후, 스트레스가 없는 조건에서 SPR에 의해 측정될 때, 재조합 CD3에 대한 본래 또는 최적화된 CD3 결합체, CD3orig 또는 CD3opt를 포함하는 EGFRvIII TCB의 상대적 결합 활성.
도 22 40℃ pH 6에서 14 d 후, 또는 37℃ pH 7.4에서 14 d 후, 스트레스가 없는 조건하에서 SPR에 의해 측정될 때, 재조합 EGFRvIII에 대한 본래 또는 최적화된 CD3 결합체, CD3orig 또는 CD3opt를 포함하는 EGFRvIII TCB의 상대적 결합 활성.
도 23 유세포분석법에 의해 측정될 때, 저캇 NFAT 세포에 대한 본래 또는 최적화된 CD3 결합체, CD3orig 또는 CD3opt를 포함하는 EGFRvIII TCB의 결합. 저캇 NFAT 세포에 결합된 TCB는 형광 표지화된 항인간 Fc 특이적 이차 항체로 검출되었다.
도 24 유세포분석법에 의해 측정될 때, U87MG-EGFRvIII 세포에 대한 P063.056 또는 P056.021 EGFRvIII 결합체를 포함하는 EGFRvIII TCB의 결합. U87MG-EGFRvIII 세포에 결합된 TCB는 형광 표지화된 항인간 Fc 특이적 이차 항체로 검출되었다.
도 25 EGFRvIII TCB로 종양 세포 용해 및 T 세포 활성화. EGFRvIII TCB에 의한 특이적 종양 세포 용해(A, B) 및 T 세포 활성화(C, D)의 유도는 24시간(A, C) 또는 48시간(B, D) 동안, 새로 단리된 PBMC 및 U87MG-EGFRvIII 세포와의 공동배양 시에 결정되었다. DP47 TCB가 음성 대조군으로서 포함되었다.
도 26 EGFRvIII TCB 2+1 형식 및 1+1 형식을 비교하는 저캇 NFAT 활성화. 저캇 NFAT 활성화는 EGFRvIII 양성 U87MG-EGFRvIII 세포의 존재하에서 2+1 반전된 형식에서 및 1+1 두미 형식에서 EGFRvIII TCB와의 CD3 결합에 대한 마커로서 결정되었다.
도 27 EGFRvIII TCB 2+1 형식 및 1+1 형식을 비교하는 종양 세포 용해 및 T 세포 활성화. 2+1 반전된 형식에서 및 1+1 두미 형식에서 EGFRvIII TCB에 의한 특이적 종양 세포 용해(A, B) 및 T 세포 활성화(C, D)의 유도는 24시간(A, C) 또는 48시간(B, D) 동안 새로 단리된 PBMC 및 U87MG-EGFRvIII 세포와의 공동배양 시에 결정되었다.
도 28 EGFRvIII TCB로 T 세포 활성화와 증식. EGFRvIII TCB에 의한 CD4 T 세포(A, B) 및 CD8 T 세포(C, D)의 T 세포 증식(A, C) 및 T 세포 활성화의 유도는 건강한 공여자로부터 단리된 U87MG-EGFRvIII 및 PBMC의 공동배양 시에 결정되었다.
도 29 EGFRvIII TCB로 종양 세포 용해, T 세포 활성화 및 사이토킨 방출. EGFRvIII TCB에 의한 종양 세포 용해(A, B), T 세포 활성화(C, D) 및 IFNγ와 TNFα의 방출(E, F)의 유도는 U87MG-EGFRvIII 세포의 PBMC와의 공동배양 시에 결정되었다. 종양 세포 용해가 24시간 및 48시간의 처리 후 측정되었고, T 세포 활성화 및 사이토킨 방출이 48시간 후 측정되었다.
도 30 TYRP-1 TCB로 종양 세포 용해, T 세포 활성화 및 사이토킨 방출. TYRP-1 TCB에 의한 종양 세포 용해(A, B), T 세포 활성화(C, D) 및 IFNγ와 TNFα의 방출(E, F)의 유도는 환자 유래된 흑색종 세포주 M150543의 PBMC와의 공동배양 시에 결정되었다. 종양 세포 용해가 24시간 및 48시간의 처리 후 측정되었고, T 세포 활성화 및 사이토킨 방출이 48시간 후 측정되었다.
도 31 TYRP-1 TCB의 생체내 효능. 흑색종 피하 이종이식 모델에서 종양 성장 저해를 연구하기 위해, IGR-1 인간 흑색종 세포주가 인간화 NSG 마우스에 피하 주입되었다. 유의미한 종양 성장 저해(TGI)는 비히클 군과 비교하여 TYRP-1 TCB 군(68% TGI, p=0.0058*)에서 관찰되었다.
도 32 EGFRvIII TCB의 생체내 효능. 교모세포종 피하 이종이식 모델에서 종양 성장 저해를 연구하기 위해, U87-huEGFRvIII 인간 교모세포종 세포주가 인간화 NSG 마우스에 피하 주입되었다. 유의미한 종양 제어는 EGFRvIII TCB 군에서 관찰되었고, 모든 마우스가 완전 관해를 달성하였다.
도 33 FolR1 TCB 분자의 형식. 도 33a: (G4S)2 링커를 통해 내부 FOLR1 Fab의 VH에 융합된 CD3 Fab를 가진 고전적인 2+1 TCB 분자. Fc에서의 PGLALA 돌연변이인 구멍 내 돌기 기술에 의한 이종이량체화. 도 33b: Fc돌기 사슬 내의 CD3opt Fab를 가진 반전된 2+1 FOLR1 TCB. 도 33c. (G4S)2 링커를 통해 내부 FOLR1 Fab의 VH에 융합된 CD3opt Fab를 가진 고전적인 1+1 두미 FOLR1 TCB 분자. Fc에서의 PGLALA 돌연변이인 구멍 내 돌기 기술에 의한 이종이량체화. 도 33d. Fc돌기 사슬 내의 CD3opt Fab를 가진 반전된 1+1 두미 FOLR1 TCB. 도 33e: Fc 돌기 사슬에 CD3opt Fab 및 Fc 구멍 사슬에 FOLR1 Fab를 가진 FOLR1 TCB 분자와 같은 1+1 IgG. Fab. Fc에서의 PGLALA 돌연변이인 구멍 내 돌기 기술에 의한 이종이량체화.
도 34 FOLR1-TCB(CD3opt)에 의해 매개되는 저캇 NFAT 활성화. CD3opt을 가진 FOLR1-TCB에 의해 매개되는 저캇 NFAT 활성화가 도시된다. FOLR1-TCB를 huFOLR1 코팅된 비드 및 저캇 NFAT 효과기 세포와 함께 37℃에서 5.5시간 동안 배양하였다. 점선은 TCB가 없는 저캇 세포를 갖는 비드를 나타낸다. 각 점은 기술적 세 가지 경우의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대에 의해 표시된다(n=1).
도 35 FOLR1(pro-) TCB(CD3opt)를 사용한 종양 세포 용해 및 T 세포 활성화. 용량 의존적 종양 세포 용해 및 T 세포 활성화는 배양 24시간 및 48시간 후에 인간 PBMC(효과기 세포) 및 FOLR1 양성 표적 세포(Ovcar-3)를 FOLR1 TCB와 공동 배양한 후 분석하였다(E:T = 10 :1, 효과기는 인간 PBMC임). 24시간 및 48시간 후 종양 세포 용해의 유도(A). FACS에 의한 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 CD69의 정량화에 의해 처리 48시간 후에 T 세포 활성화를 측정하였다. CD69 양성 CD4 T 세포(C) 및 CD8 T 세포(D)는 상단 패널에 표시된다. 하단 패널에서 CD69{PE}에 대한 중앙값은 CD4(E) 및 CD8(F) 양성 T 세포에 대해 플로팅되었다. 각 점은 기술적 세 가지 경우의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대에 의해 표시된다.
I. 정의
용어는 하기에서 다르게 규정되지 않는 한, 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 도메인 등에 대한 용어 “제1”, “제2” 또는 “제3”은 각 유형의 모이어티가 하나를 초과하여 있을 때 편의상 식별을 위해 사용된다. 이들 용어의 사용은, 명시적으로 언급되지 않는 한, 모이어티의 특정한 순서 또는 배향을 부여하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "항 CD3 항체" 및 "CD3에 결합하는 항체"는 항체가 CD3를 표적하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 하기에 충분한 친화도로 CD3에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 일 양태에서, 관련 없는 비 CD3 단백질에 대한 항 CD3 항체의 결합 정도는, 예컨대, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정될 때 CD3에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 특정 양태들에서, CD3에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 500 nM, ≤ 200 nM, 또는 ≤ 100 nM의 해리 상수(KD)를 갖는다. 항체는, 예컨대, SPR에 의해 측정될 때, 상기 항체가 1 μM 또는 그 이하의 KD를 가질 때, CD3“에 특이적으로 결합”하는 것으로 일컬어진다. 특정 양태들에서, 항 CD3 항체는 상이한 종으로부터 CD3 사이에서 보존되는 CD3의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편(이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 수반한다.
“항체 단편"은 원형 항체가 결합하는 항원에 결합하는 원형 항체의 일부를 포함하는 원형 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자(예컨대, scFv 및 scFab), 단일 도메인 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편들에 대한 검토는, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)를 참고한다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전 항체 (whole antibody)"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 말하는데, 가령, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 가령, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대항하는 상이한 항체를 일반적으로 함유하는 다중클론성 항체 제재들과 대조적으로, 단클론 항체 제재들의 각 단클론 항체는 항원에 있는 단일 결정인자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단클론(monoclonal)"은 실질적으로 동질성 항체 모집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 구성요소에서 분리된 항체이다. 일부 양태들에 있어서, 항체는 예를 들면, 전기영동의 (예로써, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프 (예로써, 이온 교환 또는 역상 HPLC, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도이상으로 정제된다. 항체 순도를 평가하는 방법들을 검토하려면, 예컨대 Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다. 일부 양태들에서, 본 발명에 의해 제공된 항체는 단리된 항체이다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종들로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종들로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
"인간화" 항체는 비인간 CDR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 양태들에 있어서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나의, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 여기서 CDR들의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 항체에 대응하며, FR들의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체에 대응한다. 이러한 가변 도메인은 본원에서 “인간화 가변 영역”으로서 본원에서 지칭된다. 인간화 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는, 예컨대, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 또는 개선하기 위해, 비인간 항체(예컨대, 이로부터 CDR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다. 항체, 예컨대, 비인간 항체의 “인간화 형태”는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 암호화 서열을 이용하는 비인간 출처로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 이러한 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 배제시킨다. 특정 양태들에서, 인간 항체는 비인간 유전자도입 포유동물, 예를 들어, 마우스, 랫트, 또는 토끼로부터 유래된다. 특정 양태들에서, 인간 항체는 하이브리도마 세포주로부터 유래된다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편 역시 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편인 것으로 고려된다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 결합하고 상보성인 영역을 포함하는, 항체의 부분을 지칭한다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로 또한 불림)에 의해 제공될 수 있다. 바람직한 양태들에서, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다.
용어 “가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각, VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs) 및 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함한다. 예컨대, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman & Co., page 91 (2007)을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VH 또는 VL 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위하여 상기 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예컨대, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)을 참조한다. 가변 영역 서열과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이 "카바트 넘버링"은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 의해 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 본원에서 “카바트에 따른 넘버링” 또는 “카바트 넘버링”으로서 지칭되는 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에서 기재된 카바트 넘버링 시스템에 따라서 넘버링된다. 구체적으로, 카바트 넘버링 시스템(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 페이지 647-660을 참조)은 카파와 람다 동형의 경쇄 불변 도메인 CL에 사용되고, 카바트 EU 색인 넘버링 시스템(페이지 661-723을 참조)은 중쇄 불변 도메인(CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 이용되는데, 이는 본원에서 이 경우에 있어서 “카바트 EU 색인에 따른 넘버링” 또는 “카바트 EU 색인 넘버링”을 참조함으로써 더욱 명료해진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변성이고 항원 결합 특이성을 결정하는 항체 가변 도메인의 각 영역, 예를 들어, “상보성 결정 영역”(“CDR”)을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 CDR; VH에서 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및 VL에서 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 CDR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 발생하는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 발생하는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); 및
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에 발생하는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).
달리 지시되지 않는 한, CDR은 위와 같이 Kabat et al.,에 따라서 결정된다. 당업자는 CDR 지정이 위와 같이 코티아(Chothia), 위와 같이 맥컬럼(McCallum), 또는 임의의 다른 과학적으로 용인된 명명법 시스템에 따라서 또한 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
“프레임워크” 또는 “FR”은 상보성 결정 영역(CDR) 이외에 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 이에 따라, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 나타난다: FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4.
달리 지시되지 않는 한, CDR 잔기들 및 가변 도메인 내 다른 잔기들(예컨대, FR 잔기)은 상기 Kabat et al.에 따라 본원에서 넘버링된다.
본원의 목적과 관련하여 "수용체 인간 프레임워크"는, 하기 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 "유래된" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 양태들에서, 아미노산 변화의 수는 10 또는 그 이하, 9 또는 그 이하, 8 또는 그 이하, 7 또는 그 이하, 6 또는 그 이하, 5 또는 그 이하, 4 또는 그 이하, 3 또는 그 이하, 또는 2 또는 그 이하이다. 일부 양태들에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열에서 동일하다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에 있어서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열들은 가변 도메인 서열들의 한 하위군으로부터 유래한다. 일반적으로, 서열들의 하위군들은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서와 같은 하위군이다.
본원에서 용어 “면역글로불린 분자”는 자연 발생 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, IgG 분류의 면역글로불린은 이황화 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N 말단에서부터 C 말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)에 이어서 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단에서부터 C 말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 영역으로도 불리는 가변 도메인(VL)에 이어서 경쇄 불변 영역으로도 불리는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)라 불리는 5가지 유형 중 하나로 지정될 수 있으며, 이들 중 일부는 하위 유형, 예컨대, γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) 및 α2 (IgA2)로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)라고 불리는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 면역글로불린은 필수적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된 2개의 Fab 분자와 Fc 도메인으로 구성된다.
항체 또는 면역글로불린의 "분류"는 이의 중쇄에 의해 보유된 불변 영역 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있으며: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위분류(동형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분화될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인("Fab 중쇄") 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인("Fab 경쇄")으로 구성되는 단백질을 지칭한다.
“교차” Fab 분자(“크로스맵”으로 또한 명명됨)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 또는 불변 도메인이 교환되는(즉, 상호 대체되는) Fab 분자를 의미한다. 다시 말하면, 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 도메인 VL 및 중쇄 불변 도메인 1 CH1로 구성되는 펩티드 사슬(VL-CH1, N에서 C 말단 방향으로), 및 중쇄 가변 도메인 VH 및 경쇄 불변 도메인 CL로 구성되는 펩티드 사슬(VH-CL, N에서 C 말단 방향으로)을 포함한다. 명료함을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 불변 도메인 1 CH1을 포함하는 펩티드 사슬은 본원에서 (교차) Fab 분자의 “중쇄” 로서 지칭된다. 반대로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 도메인이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 가변 도메인 VH를 포함하는 펩티드 사슬은 본원에서 (교차) Fab 분자의 “중쇄” 로서 지칭된다.
그것과 대조적으로, “종래의” Fab 분자는 이의 자연 형식에서, 다시 말하면, 중쇄 가변과 불변 도메인으로 구성되는 중쇄 (VH-CH1, N에서 C 말단 방향으로), 그리고 경쇄 가변과 불변 도메인으로 구성되는 경쇄 (VL-CL, N에서 C 말단 방향으로)를 포함하는 Fab 분자인 것으로 의미된다.
특정 구현예들에서, 본 발명은 이중특이적 분자에 관한 것이며, 여기서 적어도 2개의 결합 모이어티는 동일한 경쇄 및 각각의 항원(예컨대, CD3 및 FolR1)에 대한 특이적 결합을 부여하는 상응하는 개조된 중쇄를 갖는다. 이러한 소위 "공통 경쇄" 원칙의 사용, 즉 하나의 경쇄를 공유하지만 여전히 별도의 특이성을 갖는 2개 이상의 결합체를 결합하여 경쇄의 쌍형성 오류를 방지한다. 따라서, 생성 중에 부산물이 적어, 이중특이적 분자의 균질한 제조가 용이하게 된다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 하지만, 숙주 제포에 의해 생성된 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 절단을 겪을 수 있다. 이러한 이유로, 전장 중쇄를 암호화하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생성되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 전장 중쇄의 개열된 변이체를 포함할 수 있다. 이는 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, 카바트 EU 색인에 따른 넘버링)인 경우에 그러할 수 있다. 따라서, Fc 영역의 C 말단 리신(Lys447), 또는 C 말단 글리신(Gly446) 및 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. Fc 영역(또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위)을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열은 달리 지시되지 않는 한, C 말단 글리신-리신 디펩티드가 없이 표시된다. 일 양태에서, 본 발명에 따른 항체에 포함된, 본원에 특정된 Fc 영역(아단위)을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, 카바트 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 일 양태에서, 본 발명에 따른 항체에 포함되는 본원에 특정된 Fc 영역(아단위)을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신 잔기(G446, 카바트 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원에서 다르게 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재된 바와 같이 "카바트의 EU 색인에 따른 넘버링" 또는 "카바트 EU 넘버링"이라고도 하는 "EU 넘버링 시스템에 따른"다. 본원에 사용된 바와 같이, Fc 도메인의 "아단위"는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉 안정한 자가 결합이 가능한 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 영역들을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 아단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"융합된"은 구성요소(예컨대, Fab 분자 및 Fc 도메인 아단위)가 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 펩티드 결합에 의해 연결됨을 의미한다.
용어 "다중특이적"은 항체가 적어도 2개의 구별되는 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 다중특이적 항체는, 예를 들어, 이중특이적 항체일 수 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체는 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 이들은 각각 상이한 항원 결정인자에 대해 특이적이다. 특정 양태들에서, 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 항체는 2개의 항원 결정인자, 특히 2개의 구별되는 세포 상에서 발현되는 2개의 항원 결정인자에 동시에 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합가(valent)"는 항원 결합 분자 내에 특정된 수의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, 용어 "항원에 대한 1가 결합"은 항원 결합 분자 내에 항원에 대해 특이적인 하나(및 하나 이하)의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 아미노산 잔기를 포함한다. 선천적 면역글로불린 분자는 통상적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 통상적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결정인자" 또는 "항원"은 항원 결합 도메인이 결합하여, 항원 결합 도메인-항원 복합체가 형성되는, 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들어, 아미노산의 연속 신장부(stretch) 또는 비인접 아미노산들의 상이한 영역들로 구성된 입체형태적 구성)를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는, 예를 들어, 종양 세포의 표면, 바이러스에 감염된 세포의 표면, 다른 질병 세포의 표면, 면역 세포의 표면상에서, 혈청내 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에서 자유롭게 발견될 수 있다. 바람직한 양태에서, 항원은 인간 단백질이다.
"CD3"은 달리 지시가 없는 한, 영장류(예컨대, 인간), 비인간 영장류(예컨대, 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처의 임의의 천연 CD3을 지칭한다. 이 용어는 "전장"의, 비처리 CD3, 뿐만 아니라 세포에서 처리된 임의의 형태의 CD3를 포함한다. 이 용어는 또한 CD3의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 일 양태에서, CD3은 인간 CD3, 특히 인간 CD3의 입실론 아단위(CD3ε)이다. 인간 CD3ε의 아미노산 서열은 서열번호 112로 나타낸다(신호 펩티드 없이). 또한, 유니프롯(UniProt, www.uniprot.org) 수탁 번호 P07766(버전 189), 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1.1을 참조한다. 다른 양태에서, CD3은 시노몰구스(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) CD3, 특히 시노몰구스 CD3이다. 시노몰구스 CD3ε의 아미노산 서열은 서열번호 113으로 나타낸다(신호 펩티드 없이). 또한, NCBI GenBank 번호 BAB71849.1을 참조한다. 특정한 양태들에서, 본 발명의 항체는 상이한 종으로부터 CD3 항원, 특히 인간 및 시노몰구스 CD3 사이에서 보존되는 CD3의 에피토프에 결합한다. 바람직한 양태들에서, 상기 항체는 인간 CD3에 결합한다.
본원에 사용된 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들어 암 세포 또는 종양 기질의 세포(이 경우 "종양 세포 항원")와 같은 종양 내의 세포의 표면에 제시된 항원 결정인자를 지칭한다. 바람직하게는, 표적 세포 항원은 CD3이 아니고, 그리고/또는 CD3과 상이한 세포 상에서 발현된다. 일 양태에서, 표적 세포 항원은 TYRP-1, 특히 인간 TYRP-1이다. 다른 양태에서, 표적 세포 항원은 EGFRvIII, 특히 인간 EGFRvIII이다. 바람직한 구현예에서, 표적 항원은 엽산 수용체 1(FolR1)이다.
"FolR1"은 엽산 수용체 1(동의어에는 엽산 수용체 알파(FRA), 엽산 결합 단백질(FBP), MOv18, P15328, FRA1, FRAI가 포함되지만, 이에 제한되지는 않음)을 나타나고, 세포 내부로의 엽산 및 감소된 엽산 유도체의 업데이트를 매개하는 단백질 수용체이다. 인간 FolR1의 서열은 서열번호 137에 나타내었다. 또한, 유니프롯 등록 번호 P15328을 참조한다. 본원에 사용된 바와 같이 "FolR1"은 달리 지시가 없는 한, 영장류(예컨대, 인간), 비인간 영장류(예컨대, 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처의 임의의 천연 FolR1을 지칭한다. 이 용어는 "전장"의, 비처리 FolR1 뿐만 아니라 세포에서 처리된 임의의 형태의 FolR11을 수반한다. 이 용어는 또한 FolR1의 자연 발생 변이체, 예컨대, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 수반한다. 일 양태에서, FolR1은 인간 FolR1이다.
“TYRP1” 또는 “TYRP-1”은 멜라닌 합성에 관련된 효소인 티로신 관련 단백질 1을 의미한다. 본래 gp75로 또한 불리는 TYRP1의 성숙 형태는 75 kDa 막관통 당단백질이다. 인간 TYRP1의 서열은 서열번호 114로 나타내었다(신호 펩티드 없이). 또한, 유니프롯 등록 번호 P17643(버전 185)을 참조한다. 본원에 사용된 바와 같이 "TYRP1"은 달리 지시가 없는 한, 영장류(예컨대, 인간), 비인간 영장류(예컨대, 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처의 임의의 천연 TYRP1을 지칭한다. 이 용어는 "전장"의, 비처리 TYRP1, 뿐만 아니라 세포에서 처리된 임의의 형태의 TYRP1을 포함한다. 이 용어는 또한 TYRP1의 자연 발생 변이체, 예컨대, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 수반한다. 일 양태에서, TYRP1은 인간 TYRP1이다.
“EGFRvIII”은 접합부에서 글리신 치환으로 267개 아미노산의 결실을 야기하는, 엑손 2-7의 인프레임 결실에 의해 형성된, EGFR의 돌연변이체인 표피 성장 인자 수용체 변이체 III을 의미한다. 인간 EGFRvIII의 서열은 서열번호 115로 나타내었다(신호 펩티드 없이). 야생형 인간 EGFR의 서열은 서열번호 116으로 나타내었다(신호 펩티드 없이). 또한, 유니프롯 등록 번호 P00533(버전 258)을 참조한다. 본원에 사용된 바와 같이 "EGFRvIII"은 달리 지시가 없는 한, 영장류(예컨대, 인간), 비인간 영장류(예컨대, 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처의 임의의 천연 EGFRvIII을 지칭한다. 이 용어는 "전장"의, 비처리 EGFRvIII(야생형 EGFR는 제외) 뿐만 아니라 세포에서 처리된 임의의 형태의 EGFRvIII를 수반한다. 일 양태에서, EGFRvIII은 인간 EGFRvIII이다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예컨대, 항체)와 이의 결합 짝(예컨대, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 지시되지 않은 한, 본원에 사용된 바와 같이 "결합 친화도"는 결합쌍(예컨대, 항체 및 항원)의 구성요소 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 그 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 잘 확립된 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화도의 바람직한 측정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
"친화도 성숙된" 항체는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)에 하나 이상의 변경을 보유하지 않는 모항체와 비교하여 이러한 변경이 있는 항체를 지칭하며, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화도를 개선한다.
"감소된 결합", 예를 들어, Fc 수용체에 대한 감소된 결합은 예를 들어 SPR에 의해 측정시 각각의 상호작용에 대한 친화도의 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 또한, 제로(또는 분석 방법의 검출 한계 미만)까지 친화성의 감소, 다시 말하면, 상호작용의 완전한 소멸을 포함한다. 이와 반대로, "증가된 결합"은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화도의 증가를 지칭한다.
본원에 사용된 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택되는 T 림프구, 특히, 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다. T 세포 활성화를 측정하기 위한 적절한 검정은 본원에 기재된 기술분야에 공지되어 있다.
“Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형”은 동종이합체를 형성하는, Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드의 동일한 폴리펩티드와의 화합을 감소시키거나 또는 예방하는 펩티드 중추의 조작 또는 Fc 도메인 아단위의 번역후 변형이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 화합을 증진하는 변형은 바람직하게는, 화합하기 원하는 2개의 Fc 도메인 아단위 각각(다시 말하면, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위)에 만들어진 별개의 변형을 포함하고, 여기서 이들 변형은 2개의 Fc 도메인 아단위의 화합을 증진하기 위해 서로에 상보성이다. 예를 들어, 화합을 증진하는 변형은 Fc 도메인 아단위의 연결을 각각, 입체적으로 또는 정전으로 우호적으로 만들기 위해, 이들 중에서 하나 또는 둘 모두의 구조 또는 전하를 변경할 수 있다. 따라서, 각각의 아단위(예컨대, 항원 결합 도메인)에 융합된 추가 구성요소가 동일하지 않다는 의미에서 비동일할 수 있는, 제1 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 및 제2 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 사이에서 (이종)이량체화가 일어난다. 일부 양태들에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 양태에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인의 2개 아단위 각각에서 별개의 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다.
용어 “효과기 기능”은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 동형에 따라서 변한다. 항체 효과기 기능들의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체 매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체)의 하향조절, 및 B 세포 활성화.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인에 의한 결합 후 효과기 기능을 수행하도록 수용체 보유 세포를 자극하는 신호전달 이벤트를 유도하는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), 및 FcαRI (CD89)를 포함한다.
항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체 코팅된 표적 세포의 용해를 초래하는 면역 메커니즘이다. 표적 세포는 일반적으로 Fc 영역의 N 말단인 단백질 부분을 통해 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체가 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에 사용된 용어 "감소된 ADCC"는, 상기 정의된 ADCC의 메커니즘에 의해 표적 세포를 둘러싸고 있는 배지에서 주어진 항체 농도에서 주어진 시간에 용해되는 표적 세포 수의 감소, 및/또는 ADCC의 메커니즘에 의해 주어진 시간에 주어진 수의 표적 세포의 용해를 달성하는 데 필요한 표적 세포를 둘러싼 배지에서 항체 농도의 증가로 정의된다. ADCC의 감소는 동일한 표준 생산, 정제, 제형 및 저장 방법(이는 당업자에게 공지됨)을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되었으나 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비해 상대적이다. 예를 들어, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 Fc 도메인에 포함하는 항체에 의해 매개되는 ADCC의 감소는 Fc 도메인에서 이러한 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비해 상대적이다. ADCC를 측정하기에 적합한 검정은 당업계에 잘 공지되어 있다(예컨대, PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831 참조).
본원에 사용된 용어 "조작하다, 조작된, 조작"은 펩티드 골격의 임의의 조작 또는 천연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작에는 개별 아미노산들의 아미노산 서열의, 당화 패턴의 또는 측쇄 기의 변형과 이러한 접근 방식의 조합이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포함하는 것을 의미한다. 최종 작제물이 원하는 특성, 예컨대, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 다른 펩티드와의 증가된 결합을 보유하는 한, 최종 작제물에 도달하도록 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노- 및/또는 카르복시 말단 결실 및 아미노산 삽입을 포함한다. 바람직한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예컨대, Fc 영역의 결합 특성을 변경하기 위한 목적으로, 비보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산에 의한, 또는 20개의 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체(예컨대, 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록실리신)에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에서 널리 공지된 유전학적 또는 화학적 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위 지정 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 화학적 변형과 같은 유전 공학 이외의 방법에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변경하는 방법이 또한 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 나타내는 다양한 명칭이 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 위치 329에 있는 프롤린의 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G 또는 Pro329Gly로 표시될 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기들과 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기들의 백분율로 정의되며, 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 대안적으로, 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성될 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍 회사(Genentech, Inc.)에 의해 작성되었고, 소스 코드가 사용자 문서로 미국 저작권 사무소(U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559)에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087하에 등록되고 WO 2001/007611에서 설명된다.
별도로 지시되지 않으면, 본원에서 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 BLOSUM50 비교 매트릭스를 갖는 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 그 이후 버전의 ggsearch 프로그램을 이용하여 산출된다. 상기 FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson and D. J. Lipman (“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85 (1988) 2444-2448), W. R. Pearson (“Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266 (1996) 227- 258), 및 Pearson et. al. (Genomics 46 (1997) 24-36)에 의해 제작되었으며, www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml or www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta에서 공개적으로 입수 가능하다. 대안적으로, fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 액세스할 수 있는 공용 서버를 사용하여 ggsearch (global protein : protein) 프로그램 및 기본 옵션(BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 사용하여 서열을 비교함으로써 로컬이 아닌 글로벌 정렬이 실시되도록 할 수 있다. 아미노산 동일성 퍼센트는 출력 정렬 헤더에 제공된다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"는 뉴클레오티드 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 구체적으로, 퓨린- 또는 피리미딘 염기(즉, 시토신(C), 구아닌(G), 아데닌(A), 티민(T) 또는 우라실(U)), 당(즉, 데옥시리보스 또는 리보스), 및 인산기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기 서열로 기재되며, 상기 염기는 핵산 분자의 1차 구조(선형 구조)를 나타낸다. 염기들의 서열은 일반적으로 5’에서 3’ 방향으로 나타낸다. 본원에서, 용어 핵산 분자는, 예컨대, 상보성 DNA(cDNA) 및 게놈 DNA를 포함한 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 특히, 메신저 RNA(mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태들, 그리고 둘 이상의 이러한 분자들을 포함하는 혼합 중합체를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다. 또한, 핵산 분자라는 용어는 센스 및 안티센스 가닥 모두, 뿐만 아니라 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 더욱이, 본원에 기재된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비자연 발생 뉴클레오티드의 예에는 유도된 당 또는 포스페이트 골격 연결부 또는 화학적으로 변형된 잔기가 있는 변형된 뉴클레오티드 염기가 포함된다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예컨대, 숙주 또는 환자에서 본 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA 및 RNA 분자를 수반한다. 이러한 DNA(예컨대, cDNA) 또는 RNA(예컨대, mRNA) 벡터는 비변형 또는 변형될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 RNA 벡터의 안정성 및/또는 암호화된 분자의 발현을 개선하기 위하여 화학적으로 변형될 수 있으며, 이러한 mRNA는 대상체에 주사되어 생체내에서 항체를 생성할 수 있다(예컨대, Stadler et al. (2017) Nature Medicine 23:815-817, or EP 2 101 823 B1을 참조).
"단리된" 핵산 분자는 자연 환경의 구성 요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산 분자는 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.
"항체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드(또는 핵산)"는, 단일 벡터 또는 별도의 벡터에 있는 이러한 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자, 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 폴리뉴클레오티드 분자(들)을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 이것이 연결되는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어에는 자가 복제 핵산 구조체로서의 벡터 그리고 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터가 포함된다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그 세포의 자손을 비롯하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 계대 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 항체를 생성함에 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예컨대, 포유동물 배양된 세포, 예를 들자면, HEK 세포, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함하지만, 또한 유전자삽입 동물, 유전자삽입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다. 일 양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포이다. 일 양태에서, 숙주 세포는 인체 내의 세포가 아니다.
용어 "약학적 조성물" 또는 “약학적 제제”란 이 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제재를 지칭하며, 해당 조성물이 투여되는 대상체에게 수용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외에 약학적 조성물 또는 제형 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, “치료” (및 이의 문법적 변이, 예컨대 “치료한다” 또는 “치료하는”)는 치료되는 개체에서 질환의 자연 경과를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 그리고 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 양태들에서, 본 발명의 항체는 질병의 발달을 지연시키거나 또는 질병의 진행을 늦추는 데 이용된다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 양태들에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
작용제, 예컨대, 약학적 조성물의 "유효량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
용어 “포장 삽입물”은 치료 산물의 상업적인 패키지 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는 데 이용되는데, 이것은 이러한 치료 산물의 이용에 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 함유한다.
II. 조성물 및 방법
본 발명은 CD3 및 FolR1에 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체는, 예컨대, 유효성과 안전성, 약물동력학뿐만 아니라 생산력에 대하여, 치료적 적용을 위한 다른 우호적인 특성과 함께 우수한 안정성을 보여준다. 본 발명의 항체는 예를 들어 암과 같은 질환의 치료에 유용하다.
A. 이중특이적 항 CD3 항 FolR1 항체
일 양태에서, 본 발명은 CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 일 양태에서, CD3 및 FolR1에 결합하는 단리된 이중특이적 항체가 제공된다. 일 양태에서, 본 발명은 CD3 및 FolR1에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 특정 양태들에서, 이중특이적 항 CD3 항 FolR1 항체는 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정될 때, pH 6, -80℃에서 2주 후 결합 활성에 비하여, pH 7.4, 37℃에서 2주 후 CD3에 대한 약 90% 이상의 결합 활성을 유지한다.
일 양태에서, 본 발명은 CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 제1 항원 결합 도메인으로서, 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 3의 HCDR 2, 및 서열번호 5의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제1 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 상기 항체는 인간화 항체이다. 일 양태에서, 상기 항원 결합 도메인은 인간화 항원 결합 도메인(즉, 인간화 항체의 항원 결합 도메인)이다. 일 양태에서, 상기 VH 및/또는 VL은 인간화 가변 영역이다.
일 양태에서, 상기 VH 및/또는 VL은 수용체 인간 프레임워크, 예컨대, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 중쇄 가변 영역 서열의 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열(즉, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4 서열)을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태들에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항체는 CD3에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태들에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 7의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태들에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 임의적으로, 상기 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역후 변형도 포함한다.
일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 경쇄 가변 영역 서열의 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열(즉, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4 서열)을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태들에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항체는 CD3에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태들에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 11의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태들에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 일 양태에서, 상기 VL는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다. 임의적으로, 상기 VL는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역후 변형도 포함한다.
일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 CD3에 결합하는 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 11의 VL 서열을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 7의 VH의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 11의 VL의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 VL을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 7의 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열 및 서열번호 11의 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 7의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 7의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 VH는 서열번호 7의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 7의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 11의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 11의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 11의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공하고, 여기서 상기 항체는 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VH 서열 및 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VL 서열을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 불변 영역을 포함한다. 일 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 인간 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 분자, 특히 인간 CH1, CH2, CH3 및/또는 CL 도메인을 포함하는 IgG 부류 면역글로불린 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 120 및 서열번호 121(각각, 인간 카파 및 람다 CL 도메인), 그리고 서열번호 122(인간 IIgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에서 제시된다. 일 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 120 또는 서열번호 121의 아미노산 서열, 특히 서열번호 120의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 122의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변 영역은 본원에 기재된 바와 같이 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 제1 항원 결합 도메인은 인간 불변 영역을 포함한다. 일 양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 인간 불변 영역, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 일 양태에서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 120 또는 서열번호 121의 아미노산 서열, 특히 서열번호 120의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변 영역은 “전하 변형”하에서 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, 그리고/또는 만약 교차 Fab 분자 내에 있으면 하나 이상(특히 2개)의 N 말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 122의 아미노산 서열에 포함된 CH1 도메인 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변 영역(특이적으로 CH1 도메인)은 “전하 변형”하에서 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 단일클론 항체이다.
일 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 IgG, 특히 IgG1 항체이다. 일 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 전장 항체이다.
다른 양태에서, 상기 제1 및/또는 제2 및/또는 추가의 항원 결합 도메인(들)은 Fv 분자(들), scFv 분자(들), Fab 분자(들), 및 F(ab’)2 분자(들)의 군으로부터 선택되는 항체 단편(들); 특히 Fab 분자(들)이다. 다른 양태에서, 상기 항체 단편(들)은 이량체(들), 삼량체(들) 또는 사량체(들)이다.
일 양태에서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 Fab 분자이다. 바람직한 양태에서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 Fab 분자이고, 여기서 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH가 상호 대체된다(다시 말하면, 상기 제1 항원 결합 도메인은 교차 Fab 분자이다).
추가의 양태에서, 상기 양태들 중 임의의 것에 따른 항체는 하기의 섹션 II. A. 1.-8.에 기재된 바와 같은 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합으로 통합할 수 있다.
바람직한 양태에서, 상기 항체는 Fc 도메인, 특히 IgG Fc 도메인, 더욱 특히 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 일 양태에서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 상기 Fc 도메인은 제1 및 제2 아단위로 구성되고, Fc 도메인 변이체와 관련하여 하기(섹션 II. A. 8.)에 기재된 특징들 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합으로 통합할 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, 상기 항체는 제2 항원에 결합하는 제2 및 임의적으로 제3 항원 결합 도메인을 포함한다(다시 말하면, 항체는 하기(섹션 II. A. 7.)에 추가로 기재된 바와 같이 다중특이적 항체이다).
1. 항체 단편
특정 양태들에서, 본원에서 제공된 항체는 항체 단편이다.
일 양태에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab’, Fab’-SH, 또는 F(ab’)2 분자, 특히 본원에 기재된 바와 같은 Fab 분자이다. “Fab’ 분자”는 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 잔기의 부가에 의해 Fab 분자와 상이하다. Fab’-SH 분자들은 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab’ 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위(2개의 Fab 분자) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab’)2 분자를 생성한다.
다른 양태에서, 상기 항체 단편은 이량체, 삼량체 또는 사량체이다. “이량체”는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)을 참조한다. 삼량체 및 사량체가 또한 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다.
추가의 양태에서, 상기 항체 단편은 단일 사슬 Fab 분자이다. "단일 사슬 Fab 분자"또는 "scFab"은 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 구성된 폴리펩티드로서, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N 말단에서 C 말단 방향으로 하기의 순서 중에서 하나를 갖는다: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1, 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL. 특히, 상기 링커는 적어도 30개 아미노산, 바람직하게는 32개 내지 50개 사이의 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 분자는 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이에 자연 이황화 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단일 사슬 Fab 분자들은(예컨대, 카바트 넘버링에 따라 가변 중쇄에서 위치 44 및 가변 경쇄에서 위치 100) 시스테인 잔기의 삽입을 통한 사슬간 이황화 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수 있다.
다른 양태에서, 상기 항체 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. “단일 사슬 가변 단편” 또는 “scFv”는 링커에 의해 연결된, 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 도메인의 융합 단백질이다. 특히, 상기 링커는 10 내지 25개 아미노산의 짧은 폴리펩티드이고, 통상적으로, 유연성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, 그리고 VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나 또는 그 반대일 수 있다. 상기 단백질은 불변 영역의 제거와 링커의 도입에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 단편들의 검토는, 예컨대, Pl
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ckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)를 참조하고; 미국 WO 93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 5,587,458호를 또한 참조한다.
다른 양태에서, 상기 항체 단편은 단일 도메인 항체이다. “단일 도메인 항체”는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 양태들에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예컨대, 미국 특허 제6,248,516 B1호를 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 원형 항체의 단백질분해성 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예컨대, 대장균(E. coli))에 의한 재조합 생산을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
2. 인간화 항체
특정 양태들에서, 본원에서 제공된 항체는 인간화 항체이다. 통상적으로, 비인간 항체는 비인간 모 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDRs(또는 이들의 부분)가 비인간 항체로부터 유래되고, FRs(또는 이들의 부분)가 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 양태들에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비인간 항체(예컨대, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예컨대, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 예컨대, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5,821,337호, 7,527,791호, 6,982,321호, 및 7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(특이성 결정 영역(SDR) 이식을 기재함); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(“표면 노출 잔기 변형(resurfacing)”을 기재함); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)(“FR 셔플링(shuffling)”을 기재함); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 “유도된 선택” 접근법을 기재함)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용할 수 있는 인간 프레임워크 영역은: “최적의” 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예컨대, Sims et al. J. Immunol. J. Immunol. 151:2296 (1993)을 참조); 특정 하위군의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)을 참조); 인간 성숙(체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예컨대, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)을 참조); 및 FR 라이브러리 선별로부터 유래된 프레임워크 영역(예컨대, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)을 참조)에 기재되어 있다.
3. 글리코실화 변이체
특정 양태들에서, 본원에 제공된 항체는 이 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다. 항체에 대한 당화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 이루어질 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 올리고당이 변경될 수 있다. 포유동물 세포들에 의해 만들어지는 천연 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결부에 의해 일반적으로 부착된 분지화된, 이촉각성(biantennary) 올리고사카라이드를 통상적으로 포함한다. 예컨대, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)을 참조한다. 올리고당류는 다양한 탄수화물, 예컨대, 만노오스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나리 올리고당류 구조의 “줄기”에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형이 이루어질 수 있다.
일 양태에서, Fc 영역에 부착된(직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 비푸코실화된 올리고당류, 다시 말하면 올리고당류 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 이러한 비푸코실화된 올리고당(“비푸코실화된” 올리고당으로서 또한 지칭됨)는 특히 N 연결된 올리고당인데, 이는 이촉각성 올리고당 구조의 줄기에서 제1 GlcNAc에 부착된 푸코오스 잔기를 결여한다. 일 양태에서, 선천적 또는 모 항체와 비교하여 Fc 영역에서 증가된 비율의 비푸코실화된 올리고당을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 비푸코실화 올리고당의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80% 또는 심지어 약 100%(즉, 푸코실화 올리고당이 존재하지 않음)일 수 있다. 비푸코실화 올리고당의 백분율은, 예를 들어, WO 2006/082515에 기재되어 있는 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 올리고당(예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조들)의 합에 대한 푸코스 잔기가 없는 올리고당의 (평균)양이다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 항체에서 소수의 서열 변이로 인하여 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ±3개의 아미노산, 다시 말하면, 위치 294 및 300 사이에 또한 위치할 수 있다. Fc 영역에서 증가된 비푸코실화된 올리고당류를 갖는 이러한 항체는 개선된 FcγRIIIa 수용체 결합 및/또는 개선된 효과기 기능, 특히 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예컨대, US 2003/0157108; US 2004/0093621을 참조한다.
푸코실화가 감소된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예컨대, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO 2003/085107), GDP-퓨코스 합성 또는 수송체 단백질의 활성이 감소되거나 제거된 세포를 포함한다(예컨대, US2004259150, US2005031613, US2004132140, Us2004110282를 참조).
추가의 양태에서, 항체의 Fc 영역의 이촉각성 올리고당이 GlcNAc에 의해 양분되어 있는, 양분된 올리고당을 가진 항체 변이체들이 제공된다. 이러한 항체 변이체는 상기 기재된 바와 같이 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체들의 예들은, 예컨대, Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에 기재되어 있다.
Fc 영역에 부착된 올리고당에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예컨대, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 설명되어 있다.
4. 시스테인 가공된 항체 변이체
특정 양태들에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 조작된 항체, 예컨대, 티오맵(THIOMAB)™ 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 양태들에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근 가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 이러한 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 다른 모이어티, 예를 들어, 하기에서 설명되는 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 이 항체가 접합되어 면역접합체가 생성될 수 있다. 시스테인 조작된 항체는, 예컨대, 미국 특허 제7,521,541호, 8,30,930호, 7,855,275호, 9,000,130호, 또는 WO 2016040856호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
5. 항체 유도체
특정 양태들에서, 본원에 제공된 항체는 당해 분야에 공지되고 용이하게 이용 가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티들은 수용성 중합체들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체들의 비제한적 예들에는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥세인, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이의 혼합물이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 안정성으로 인하여 제조에 있어 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 중합체의 수는 가변적일 수 있고, 만약 하나를 초과한 중합체가 부착된 경우, 중합체들은 동일하거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용된 중합체의 수 및/또는 유형은 개선되는 항체의 특정 성질들 또는 기능들, 상기 항체 유도체가 특정 조건하에서 치료에 이용되는지의 여부를 포함하는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.
6. 면역접합체
본 발명은 또한, 한 가지 또는 그 이상의 치료제, 예컨대, 세포독성 작용제, 화학요법 작용제, 약물, 성장 저해제, 독소(예컨대, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된(화학적으로 접합된) 본원에서 항 CD3/항 FolR1 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일 양태에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체(ADC)인데, 여기서 항체는 전술된 치료제 중에서 한 가지 또는 그 이상에 접합된다. 항체는 통상적으로, 링커를 이용하여 상기 치료제 중 하나 이상에 연결된다. 치료제 및 약물 및 링커의 예시를 포함하는 ADC 기술의 개요는 Pharmacol Review 68:3-19 (2016)에 제시되어 있다.
다른 양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 효소적으로 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본 발명의 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 사용가능하다. 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 상기 방사성접합체가 검출용으로 이용될 때, 이는 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, Tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 영상화(자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)를 위한 회전 라벨, 예컨대, I123, I131, In111, F19, C13, N15, O17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 또한 함유할 수 있다.
항체와 세포독성 물질의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 커플링 물질, 예컨대, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체들(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체들(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플로린 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다. 상기 링커는 세포 안에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정 링커, 펩티다아제 민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물 함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호)가 이용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는, 상업적으로 이용가능한(예컨대, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A), BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포-SMPB, 그리고 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 비롯한 교차-결합 시약들(하지만, 이에 제한되지는 않음)을 사용하여 준비되는 접합체들을 명확히 고려하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
7. 다중특이적 항체
본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 특히, 이중특이적 항체다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원 결정인자(예컨대, 2개의 상이한 단백질 또는 동일한 단백질 상의 2개의 상이한 에피토프)에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 양태들에서, 다중특이적 항체는 3개 이상의 결합 특이성을 가진다. 일정한 양태들에서, 상기 결합 특이성 중에서 하나는 CD3에 대한 것이고, 다른 특이성은 임의의 FolR1에 대한 것이다. 특정 양태들에서, 다중특이적 항체는 CD3의 2가지(또는 그 이상)의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다중특이적(예컨대, 이중특이적)항체는 세포독성제 또는 세포를 CD3를 발현하는 세포에 국소화시키는데 사용될 수 있다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시 발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)을 참조), 및 "구멍 내 돌기(knob-in-hole)" 공학(예컨대, 미국 특허 제5,731,168호 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)을 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 가공하고(예컨대, WO 2009/089004를 참조); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교 결합하고(예컨대, 미국 특허 제4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)을 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 형성하고(예컨대, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605를 참조); 경쇄 쌍형성 오류 문제를 우회하기 위한 일반적인 경쇄 기술 사용하고(예컨대, WO 98/50431을 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용하고(예컨대, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참조); 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체 사용하며(예컨대, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)을 참조); 및, 예컨대, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기제된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들 수 있다.
예를 들어, “옥토퍼스 항체”, 또는 DVD-Ig를 포함하여, 3개 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체 또한 본원에 포함된다(예컨대, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715를 참조). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이적 항체의 다른 예는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에서 찾을 수 있다. 다중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 CD3 뿐만 아니라 다른 상이한 항원 또는 CD3의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예컨대, US 2008/0069820 및 WO 2015/095539를 참조).
다중특이적 항체는 또한 동일한 항원 특이성의 하나 또는 그 이상의 결합 팔에서 도메인 교차(이른바 “크로스맵(CrossMab)” 기술)로, 다시 말하면, VH/VL 도메인(예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447을 참조), CH1/CL 도메인(예컨대, WO 2009/080253을 참조) 또는 완전한 Fab 팔(예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299을 참조, 또한 Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20을 참조)을 교환함으로써 비대칭적 형태로 제공될 수 있다. 비대칭 Fab 팔은 또한, 하전된 또는 비하전된 아미노산 돌연변이를 도메인 인터페이스 내로 도입하여 정확한 Fab 페어링을 지시하도록 함으로써 조작될 수 있다. 예를 들어, WO 2016/172485를 참조한다.
상이한 특이성의 결합 팔이 공통 경쇄를 공유하는 다중특이적 항체가 또한 제공된다. 본 발명의 발명자들은 결합 모이어티가 CD3에 대한 모 단일특이적 항체의 특이성 및 효능을 유지하고 동일한 경쇄를 사용하여 제2 항원(예컨대, FolR1)에 결합할 수 있는 공통 경쇄를 공유하는 이중특이적 항체를 생성하였다. 모 항체의 결합 특성을 유지하는 공통 경쇄를 갖는 이중특이적 분자의 생성은 하이브리드 경쇄의 공통 CDR이 두 표적 모두에 대한 결합 특이성을 달성해야 하므로 간단하지 않다. 일 양태에서, 본 발명은 제1 및 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하며, 이 중 하나는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 다른 하나는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이며, 여기서 제1 및 제2 Fab 분자는 동일한 VLCL 경쇄를 가진다. 일 구현예에서, 상기 동일한 경쇄(VLCL)는 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 경쇄 CDR을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 동일한 경쇄(VLCL)는 서열번호 129를 포함한다.
다중특이적 항체에 대한 다양한 추가적인 분자 형태들이 당업계에 공지되어 있으며 본원에 포함된다(예컨대, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106을 참조).
본원에 또한 포함되는 다중특이적 항체의 특정 유형은 표적 세포를 사멸시키기 위한 T 세포의 재표적화를 위해, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포 상에서 표면 항원, 예컨대, FolR1에, 그리고 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화, 불변 구성요소, 예컨대 CD3에 동시에 결합하도록 설계된 이중특이적 항체이다. 따라서, 바람직한 양태들에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 특히 이중특이적 항체이고, 여기서 결합 특이성 중에서 하나는 CD3에 대한 것이고 다른 하나는 FolR1에 대한 것이다.
이러한 목적에 유용할 수 있는 이중특이적 항체 형태들의 예들에는 2개의 scFv 분자가 가요성 링커에 의해 융합되는 이른바 “BiTE”(이중특이적 T 세포 관여자) 분자(예컨대, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261 및 WO 2008/119567, Nagorsen and Bδuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)을 참조); 디아바디(Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 및 이들의 유도체, 예컨대 탠덤 디아바디(“TandAb”; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); 디아바디 형태에 기반하지만 추가 안정화를 위한 C 말단 이황화 다리를 특징으로 하는 “DART”(이중 친화성 재표적화) 분자(Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), 그리고 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자인 소위 트리오맙(Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)에서 검토)이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 포함되는 특정한 T 세포 이중특이적 항체 형태들은 WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498에 기재되어 있다.
본 발명의 다중특이적 항체의 바람직한 양태들은 하기에 기재되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 CD3에 결합하는 제1 항원 결합 도메인을 포함하고, FolR1에 결합하는 제2 항원 결합 도메인 및 임의적으로 제3 항원 결합 도메인을 포함하는, CD3에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태들에 따르면, 항체에 포함된 항원 결합 도메인은 Fab 분자(즉, 각각 가변 및 불변 도메인을 포함하는 중쇄 및 경쇄로 구성된 항원 결합 도메인)이다. 일 양태에서, 제1 항원 결합 도메인, 제2 항원 결합 도메인 및/또는 존재하는 경우에, 제3 항원 결합 도메인은 Fab 분자이다. 일 양태에서, 상기 Fab 분자는 인간이다. 바람직한 양태에서, 상기 Fab 분자는 인간화된다. 또 다른 양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
본원 발명에 따른 바람직한 양태에서, (다중특이적)항체는 제1 항원(즉, CD3) 및 제2 항원(즉, FolR1)에 동시에 결합할 수 있다. 일 양태에서, (다중특이적)항체는 CD3 및 FolR1에 동시에 결합함으로써 T 세포 및 표적 세포를 가교시킬 수 있다. 보다 더 바람직한 양태에서, 이러한 동시 결합은 표적 세포, 특히 표적 세포 항원(즉, FolR1) 발현 종양 세포의 용해를 발생시킨다. 일 양태에서, 이러한 동시 결합은 T 세포의 활성화를 발생시킨다. 다른 양태들에서, 이러한 동시 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현의 군으로부터 선택된 T 림프구, 특히, 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 발생시킨다. 일 양태에서, FolR1에 동시적 결합 없이 CD3에 대한 (다중특이적)항체의 결합은 T 세포 활성화를 발생시키지 않는다.
일 양태에서, (다중특이적)항체는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 전향시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 전향은 표적 세포에 의한 MHC 매개 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.
바람직하게는, 본 발명의 임의의 양태들에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 양태들에서, 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
a) 제1 항원 결합 도메인
본 발명의 (다중특이적)항체는 CD3에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인(제1 항원 결합 도메인)을 포함한다. 바람직한 양태들에서, Cd3은 인간 CD3(서열번호 112) 또는 시노몰구스 CD3(서열번호 113), 가장 상세하게는 인간 CD3이다. 한 양태에서, 제1 항원 결합 도메인은 인간 및 시노몰구스 CD3에 대해 교차 반응성이다(즉, 이에 특이적으로 결합한다). 일부 양태들에서, CD3은 CD3의 입실론 아단위(CD3 입실론)이다.
바람직한 양태에서, (다중특이적)항체는 CD3에 결합하는 1개 이하의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 양태에서, (다중특이적)항체는 CD3에 대한 1가 결합을 제공한다.
일 양태에서, CD3에 결합하는 항원 결합 도메인은 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자 및 F(ab')2 분자의 군으로부터 선택되는 항체 단편이다. 바람직한 양태에서, CD3에 결합하는 항원 결합 도메인은 Fab 분자이다.
b) 제2(및 제3) 항원 결합 도메인
특정 양태들에서, 본 발명의 (다중특이적)항체는 제2 항원에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 특히 Fab 분자를 포함한다. 제2 항원은 바람직하게는 CD3이 아니다, 즉 CD3과 상이하다. 일 양태에서, 제2 항원은 CD3과 상이한 세포 상에서 발현되는(예컨대, T 세포 이외의 세포 상에서 발현됨) 항원이다. 일 양태에서, 제2 항원은 표적 세포 항원, 특히 종양 세포 항원이다. 바람직한 구현예에서, 제2 항원은 FolR1이다. 제2 항원 결합 도메인은 (다중특이적)항체를 표적 부위, 예를 들어, 제2 항원을 발현하는 특정 유형의 종양 세포로 지시할 수 있다.
일 양태에서, 제2 항원(즉, FolR1)에 결합하는 항원 결합 도메인은 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자 및 F(ab')2 분자의 군으로부터 선택되는 항체 단편이다. 바람직한 양태에서, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 도메인은 Fab 분자이다.
특정 양태들에서, (다중특이적)항체는 제2 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 도메인, 특히 Fab 분자를 포함한다. 이러한 바람직한 양태에서, 각각의 이들 항원 결합 도메인은 동일한 항원 결정인자에 결합한다. 보다 더 바람직한 양태에서, 이들 항원 결합 도메인은 모두 동일하다. 즉, 이들은 동일한 분자 형식(예컨대, 종래의 Fab 분자)을 갖고 본원에 기재된 바와 같이(존재하는 경우) CH1 및 CL 도메인에서 동일한 아미노산 치환을 포함하는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, (다중특이적)항체는 제2 항원에 결합하는 2개 이하의 항원 결합 도메인, 특히 Fab 분자를 포함한다.
일 양태에서, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 인간 불변 영역을 포함한다. 한 양태에서, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 인간 불변 영역, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열들은 서열번호 120 및 121(각각 인간 카파 및 람다 CL 도메인) 및 서열번호 122(인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에서 제시된다. 일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 120 또는 서열번호 121의 아미노산 서열, 특히 서열번호 120의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변 영역은 “전하 변형”하에서 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, 그리고/또는 만약 교차 Fab 분자 내에 있으면 하나 이상(특히 2개)의 N 말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 양태들에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 122의 아미노산 서열에 포함된 CH1 도메인 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변 영역(특이적으로 CH1 도메인)은 “전하 변형”하에서 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
TYRP-1
본 개시의 일부 양태들에서, 상기 제2 항원은 TYRP-1, 특히 인간 TYRP-1(서열번호 114)이다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 15의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 16의 HCDR 2, 및 서열번호 17의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 19의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 20의 LCDR 2, 및 서열번호 21의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 인간화 항체(이로부터 유래)이다. 일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 인간화 항원 결합 도메인(즉, 인간화 항체의 항원 결합 도메인)이다. 일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH 및/또는 VL은 인간화 가변 영역이다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH 및/또는 VL은 수용체 인간 프레임워크, 예컨대, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 18의 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열(즉, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4 서열)을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태들에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항체는 TYRP-1에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태들에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 18의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 임의적으로, 상기 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역후 변형도 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VL은 서열번호 22의 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열(즉, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4 서열)을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태들에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항체는 TYRP-1에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태들에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 22의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태들에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 일 양태에서, 상기 VL는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다. 임의적으로, 상기 VL는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역후 변형도 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VL은 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 18의 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 22의 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 18의 VH 서열 및 서열번호 22의 VL 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 18의 VH의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 22의 VL의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 18의 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열 및 서열번호 22의 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 18의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 18의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 18의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 18의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 VH는 서열번호 18의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 18의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VL은 서열번호 22의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 22의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 22의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 22의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 VL은 서열번호 22의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 22의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다.
EGFRvIII
본 개시의 일부 양태들에서, 상기 제2 항원은 EGFRvIII, 특히 인간 EGFRvIII(서열번호 115)이다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 85의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 86의 HCDR 2, 및 서열번호 87의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 89의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 90의 LCDR 2, 및 서열번호 91의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 인간화 항체(이로부터 유래)이다. 일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 인간화 항원 결합 도메인(즉, 인간화 항체의 항원 결합 도메인)이다. 일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH 및/또는 VL은 인간화 가변 영역이다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH 및/또는 VL은 수용체 인간 프레임워크, 예컨대, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 88의 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열(즉, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4 서열)을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 88의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 88의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 88의 아미노산 서열과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태들에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항체는 EGFRvIII에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태들에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 88의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태들에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함한다. 임의적으로, 상기 VH는 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역후 변형도 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VL은 서열번호 92의 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열(즉, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4 서열)을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태들에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항체는 EGFRvIII에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태들에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 92의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태들에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 일 양태에서, 상기 VL는 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함한다. 임의적으로, 상기 VL는 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역후 변형도 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 88의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VL은 서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 88의 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 92의 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 88의 VH 서열 및 서열번호 92의 VL 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 88의 VH의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 92의 VL의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 88의 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열 및 서열번호 92의 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 88의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 88의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 88의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 88의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 VH는 서열번호 88의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 88의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VL은 서열번호 92의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 92의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 92의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 92의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 VL은 서열번호 92의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 92의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다.
대안적 양태들에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 EGFRvIII와 관련하여 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VH 서열, 그리고 EGFRvIII와 관련하여 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함하지만, 서열번호 85(HCDR1), 86(HCDR2), 87(HCDR3), 88(VH), 89(LCDR1), 90(LCDR2), 91(LCDR3) 및 92(VL) 대신에 하기의 서열(열의 순서로)에 기초한다:
Figure pct00002
FolR1
본 개시의 일부 양태들에서, 상기 제2 항원은 FolR1, 특히 인간 FolR1(서열번호 137)이다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 124의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 125의 HCDR 2, 및 서열번호 126의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 인간화 항체(이로부터 유래)이다. 일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 인간화 항원 결합 도메인(즉, 인간화 항체의 항원 결합 도메인)이다. 한 양태에서, 제2 (및, 존재하는 경우, 제3) 항원 결합 도메인의 VH 및/또는 VL은 인간화 가변 영역이다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH 및/또는 VL은 수용체 인간 프레임워크, 예컨대, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 123의 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열(즉, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4 서열)을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 123의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 123의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 123의 아미노산 서열과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태들에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항체는 FolR1에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태들에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 123의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태들에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함한다. 임의적으로, 상기 VH는 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역후 변형도 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VL은 서열번호 11의 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열(즉, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4 서열)을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태들에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항체는 FolR1에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태들에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 11의 아미노산 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 양태들에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 일 양태에서, 상기 VL는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다. 임의적으로, 상기 VL는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역후 변형도 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 123의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 123의 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 11의 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 123의 VH 서열 및 서열번호 11의 VL 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 123의 VH의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 11의 VL의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 서열번호 123의 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열 및 서열번호 11의 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 123의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 123의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 일 양태에서, 상기 VH는 서열번호 123의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 123의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 VH는 서열번호 123의 VH의 중쇄 CDR 서열 및 서열번호 123의 VH의 프레임워크 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 VL은 서열번호 11의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 11의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 일 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 11의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 VL은 서열번호 11의 VL의 경쇄 CDR 서열 및 서열번호 11의 VL의 프레임워크 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 프레임워크를 포함한다.
일 양태에서, 상기 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인은 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VH 서열, 그리고 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함한다.
항 TYRP-1 및 항 EGFRvIII 항체
본 개시는 또한 TYRP-1과 관련하여 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VH 서열 및 TYRP-1과 관련하여 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함하는 TYRP-1에 결합하는 항체(예를 들어, 서열번호 15의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 16의 HCDR 2, 및 서열번호 17의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 19의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 20의 LCDR 2, 및 서열번호 21의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 TYRP-1에 결합하는 항체; 또는 서열번호 18의 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 22의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 TYRP-1에 결합하는 항체)를 제공한다.
본 개시는 또한 EGFRvIII과 관련하여 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VH 서열 및 EGFRvIII과 관련하여 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함하는 EGFRvIII에 결합하는 항체(예를 들어, 서열번호 85의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 86의 HCDR 2, 및 서열번호 87의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 89의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 90의 LCDR 2, 및 서열번호 91의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 EGFRvIII에 결합하는 항체; 또는 서열번호 88의 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 92의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 TYRP-1에 결합하는 항체)를 제공한다.
항 FolR1 항체
본 개시는 또한 FolR1과 관련하여 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VH 서열 및 FolR1과 관련하여 상기 섹션에서 제공된 임의의 양태의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함하는 FolR1에 결합하는 항체(예를 들어, 서열번호 124의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 125의 HCDR 2, 및 서열번호 126의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 FolR1에 결합하는 항체; 또는 서열번호 123의 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 11의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 FolR1에 결합하는 항체)를 제공한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 임의의 상기 양태에 따른 FolR1에 결합하는 항체는 CD3에 결합하는 항체와 관련하여 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독적으로 또는 조합으로 통합할 수 있다(만약 항 CD3 항체, 예컨대 결합 서열에 대해 명백히 특이적이지 않으면).
c) 전하 변형
본 발명의 (다중특이적)항체는 경쇄와 비매칭 중쇄의 미스페어링(벤스-존스 유형 부산물)을 감소시키는 데 특히 효율적인 Fab 분자에 포함된 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 상기 미스페어링은 이의 결합 팔들 중 하나(또는 2개 초과의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우 그 이상)에서 VH/VL 교환을 갖는 Fab 기반 다중특이적 항체의 생성 과정에서 발생할 수 있다(또한 그 전체가 본원에 원용되는 PCT 공개 번호 WO 2015/150447, 특히 이의 실시예를 참조). 바람직하지 않은 부산물, 특히 결합 팔들 중 하나에서 VH/VL 도메인 교환을 갖는 다중특이적 항체에서 발생하는 벤스 존스형 부산물 대비 원하는(이중특이적) 항체의 비율은 CH1 및 CL 도메인의 특정 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입(본원에서 "전하 변형"이라고도 함)에 의해 개선될 수 있다.
이에 따라, (이중특이적)항체의 제1 및 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인이 모두 Fab 분자이고, 항원 결합 도메인 중 하나(특히 제1 항원 결합 도메인)에서 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 상호 교체된, 일부 양태들에서,
i) 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 양전하를 띤 아미노산으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 음전하를 띤 아미노산으로 치환되고(카바트 EU 색인에 따른 넘버링); 또는
ii) 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 양전하를 띤 아미노산으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 음전하를 띤 아미노산으로 치환된다(카바트 EU 인덱스에 따른 넘버링).
(이중특이적)항체는 i) 및 ii) 하에서 언급된 변형 둘 모두를 포함하지는 않는다. VH/VL 교환을 갖는 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 및 CH1은 상호 대체되지 않는다(즉, 교환되지 않은 상태로 남음).
더 특정한 양태에서,
i) 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되거나; 또는
ii) 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
상기 일 양태에서, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
추가의 양태에서, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
바람직한 양태에서, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
더 바람직한 양태에서, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루탐산(E)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루탐산(E)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
보다 더 바람직한 양태에서, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루탐산(E)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루탐산(E)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
바람직한 양태에서, 만약 상기 양태들에 따른 아미노산 치환이 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어지면, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다.
대안적으로, 상기 양태들에 따른 아미노산 치환은 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 대신에 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 만들어질 수 있다. 바람직한 이러한 양태들에서, 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL은 카파 동형이다.
이에 따라, 일 양태에서, 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E), 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
추가의 양태에서, 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 그리고 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D) (카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
또 다른 양태에서, 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 그리고 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D) (카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D) (카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
일 양태에서, 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신 (K) (카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 리신 (K) (카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 그리고 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루탐산 (E) (카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루탐산 (E) (카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 치환된다
다른 양태에서, 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신 (K) (카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123에서 아미노산이 아르기닌 (R) (카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 그리고 제1 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루탐산 (E) (카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213에서 아미노산이 글루탐산 (E) (카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 (다중특이적)항체는 하기의:
a) CD3에 결합하는 제1 항원 결합 도메인으로서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 상호 대체되는 Fab 분자이고, 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 3의 HCDR 2, 및 서열번호 5의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제1 항원 결합 도메인; 및
(b) CD19에 결합하는 제2 및 임의적으로 제3 항원 결합 도메인을 포함하고;
여기서 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 내에 위치 124에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 양태에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고 위치 123에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로(바람직한 양태에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되며, 제2(및 존재하는 경우에, 제3) 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147에서 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고 위치 213에서 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
d) 다중특이적 항체 형식
본 발명에 따른 (이중특이적 및/또는 다중특이적)항체는 다양한 구성을 가질 수 있다. 예시적인 구성은 도 1에 도시되어 있다.
바람직한 양태들에서, (다중특이적)항체에 포함된 항원 결합 도메인은 Fab 분자이다. 이러한 양태들에서, 제1, 제2, 제3 등의 항원 결합 도메인은 본원에서 각각 제1, 제2, 제3 등의 Fab 분자로서 지칭될 수 있다.
일 양태에서, (다중특이적)항체의 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 바람직한 양태들에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이다. 이러한 일 양태에서, 제1 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 이러한 다른 양태에서, 제2 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. (i) 제1 항원 결합 도메인이 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되거나 또는 (ii) 제2 항원 결합 도메인이 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되는 양태들에서, 추가로 제1 항원 결합 도메인의 Fab 경쇄 및 제2 항원 결합 도메인의 Fab 경쇄는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합될 수 있다.
제2 항원, 예컨대, 표적 세포 항원, 예컨대, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 도메인(예컨대, Fab 분자)을 갖는 (다중특이적)항체(예를 들어, 도 1의 A, D, G, H, K, L에서 도시된 바와 같은)는 높은 친화성 항원 결합 도메인의 결합 이후에 제2 항원의 내재화가 예상되는 경우에 특히 유용하다. 상기 경우에서, 제2 항원에 특이적인 하나 초과의 항원 결합 도메인의 존재는 제2 항원의 내재화를 향상시켜 그 이용가능성을 감소시킬 수 있다.
하지만, 다른 경우들에는, 예를 들어, 표적 부위에 대한 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원의 가교를 허용하기 위해, 제2 항원, 예컨대, 표적 세포 항원에 특이적인 2개 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, Fab 분자)을 포함하는 (이중특이적)항체를 갖는 것이 유리할 것이다(도 1의 B, C, E, F, I, J, M, N, 도 33의 A, B에 제시된 예를 참조).
이에 따라, 바람직한 양태들에서, 본 발명에 따른 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 제3 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 제3 항원 결합 도메인은 제2 항원, 예컨대, FolR1과 같은 표적 세포 항원에 결합한다. 일 양태에서, 제3 항원 결합 도메인은 Fab 분자이다.
일 양태에서, 제3 항원 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 동일하다.
일부 양태들에서, 제3 및 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고 제3 항원 결합 도메인은 제2 항원 결합 도메인과 동일하다. 따라서, 이들 양태들에서, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 동일한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하고 동일한 도메인 배열(즉, 통상적이거나 또는 교차)을 갖는다. 또한, 이들 양태들에서, 제3 항원 결합 도메인은 존재하는 경우 제2 항원 결합 도메인과 동일한 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, "전하 변형"으로서 본원에 기재된 아미노산 치환은 제2 항원 결합 도메인 및 제3 항원 결합 도메인 각각의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 이루어질 것이다. 대안적으로, 상기 아미노산 치환은 제1 항원 결합 도메인(바람직한 양태들에서 Fab 분자이기도 함)의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 이루어질 수 있지만, 제2 항원 결합 도메인 및 제3 항원 결합 도메인의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서는 그렇지 않다.
제2 항원 결합 도메인과 마찬가지로, 제3 항원 결합 도메인은 바람직하게는 통상적인 Fab 분자이다. 모든 Fab 분자는 공통 경쇄를 공유할 수 있다. 하지만, 제2 및 제3 항원 결합 도메인이 교차 Fab 분자(및 제1 항원 결합 도메인은 종래의 Fab 분자)인 양태들이 또한 고려된다. 따라서, 바람직한 양태들에서, 상기 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 각각 종래의 Fab 분자이고, 제1 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교환/대체되어 있는 Fab 분자이다. 다른 양태들에서, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 각각 교차 Fab 분자이고 제1 항원 결합 도메인은 통상적인 Fab 분자이다.
만약 제3 항원 결합 도메인이 존재하면, 바람직한 양태에서 제1 항원 도메인은 CD3에 결합하고, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 제2 항원, 특히 표적 세포 항원, 예컨대 FolR1에 결합한다.
상기 및 도 33의 A-E에 도시된 바와 같이, 일 구현예에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 상이한 항원에 특이성을 부여하는 동일한 경쇄(VLCL) 및 상이한 중쇄(VHCL)를 갖는 2개 이상의 Fab 단편을 포함한다. 즉, 하나의 Fab 단편은 T 세포 활성화 항원 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고 다른 Fab 단편은 표적 세포 항원 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 양태들에서, 본 발명의 (다중특이적)항체는 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위는 안정적인 결합이 가능하다.
본 발명에 따른 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 상이한 구성을 가질 수 있다. 즉, 제1, 제2(및 임의적으로 제3) 항원 결합 도메인은 상이한 방식으로 서로에 및 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 구성요소들은 직접적으로 또는 바람직하게는 하나 이상의 적합한 펩티드 링커를 통해 서로에 융합될 수 있다. Fab 분자의 융합이 Fc 도메인의 아단위의 N 말단에 있는 경우, 융합은 일반적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 이루어진다.
일부 양태들에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고 제1 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 이러한 양태들에서, 제2 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 또는 Fc 도메인의 아단위 중 다른 하나의 N 말단에 융합될 수 있다. 이러한 바람직한 양태들에서, 제2 항원 결합 도메인은 종래의 Fab 분자이고, 제1 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교환/대체되어 있는 Fab 분자이다. 이러한 다른 양태들에서, 제2 항원 결합 도메인은 교차 Fab 분자이고 제1 항원 결합 도메인은 종래의 Fab 분자이다.
일 양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고, 제1 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합되고, 제2 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 필수적으로 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 구성되며, 여기서 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 이러한 구성은 도 1의 G 및 K에 개략적으로 도시되어 있다(이들 예에서 제1 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자임). 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄와 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
다른 양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합된다. 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 필수적으로 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 구성되며, 여기서 제1 및 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합된다. 이러한 구성은 도 1의 A 및 D(이러한 예에서 제1 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자이고 제2 항원 결합 도메인은 종래의 Fab 분자임) 및 도 33의 E(이 예에서 제1 및 제2 항원 결합 도메인의 경쇄는 동일함)에 개략적으로 도시되어 있다. 제1 및 제2 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 바람직한 양태에서, 제1 및 제2 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은, 특히, Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인, 인간 IgG1 힌지 영역이다.
일부 양태들에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고 제2 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 이러한 양태들에서, 제1 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 또는 (상기 기재한 바와 같이) Fc 도메인의 아단위 중 다른 하나의 N 말단에 융합될 수 있다. 이러한 바람직한 양태들에서, 상기 제2 항원 결합 도메인은 종래의 Fab 분자이고, 제1 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교환/대체되어 있는 Fab 분자이다. 이러한 다른 양태들에서, 상기 제2 항원 결합 도메인은 교차 Fab 분자이고 제1 항원 결합 도메인은 종래의 Fab 분자이다.
일 양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고, 제2 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합되고, 제1 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 필수적으로 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 구성되며, 여기서 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 이러한 구성은 도 1의 H 및 L(이러한 예에서 제1 항원 결합 도메인은 VH/VL 교차 Fab 분자이고 제2 항원 결합 도메인은 종래의 Fab 분자임) 및 도 33의 C 및 D(이 예에서 제1 및 제2 항원 결합 도메인의 경쇄는 동일함)에 개략적으로 도시되어 있다. 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄와 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
이러한 바람직한 양태에서, 제1 및 제3 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 각각 융합되고, 제2 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 본질적으로 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 구성되며, 여기서 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되고, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 제1 및 제3 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 바람직한 양태에서, 제1 및 제3 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은, 특히 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인, 인간 IgG1 힌지 영역이다. 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄와 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
이러한 다른 양태에서, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 각각 융합되고, 제1 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 필수적으로 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 구성되며, 여기서 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되고, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 제2 및 제3 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 바람직한 양태에서, 제2 및 제3 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은, 특히 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인, 인간 IgG1 힌지 영역이다. 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄와 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 각 아단위의 N 말단에 융합된 (다중특이적)항체의 구성에서, 2개의 Fab 분자, 힌지 영역 및 Fc 도메인은 필수적으로 면역글로불린 분자를 형성한다. 바람직한 양태에서, 면역글로불린 분자는 IgG 분류의 면역글로불린이다. 보다 더 바람직한 양태에서, 면역글로불린은 IgG1 하위분류 면역글로불린이다. 다른 양태에서, 면역글로불린은 IgG4 하위분류 면역글로불린이다. 추가의 바람직한 양태에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 양태들에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다. 일 양태에서, 면역글로불린은 인간 불변 영역, 특히 인간 Fc 영역을 포함한다.
본 발명의 (다중특이적)항체 중 일부에서, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다. 제1 및 제2 Fab 분자의 구성에 따라, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄는 이의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N 말단에 융합될 수 있거나, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 이의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N 말단에 융합될 수 있다. 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄들의 융합은 매칭되지 않는 Fab 중쇄 및 경쇄들의 미스페어링을 추가로 감소시키고, 또한 본 발명의 (다중특이적)항체의 일부의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 감소시킨다.
항원 결합 도메인은 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 또는 직접적으로 서로에 또는 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 해당 분야에 공지이고 본원에 기재된 바와 같다. 적합한, 비면역원성 펩티드 링커는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함한다. “n”은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다. 일 양태에서, 상기 펩티드 링커는 적어도 5개 아미노산의 길이, 일 양태에서 5 내지 100개의 길이, 추가 양태에서 10 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는다. 일 양태에서, 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm이며, G=글리신, S=세린, 및(x=3, n= 3, 4, 5 또는 6 및 m=0, 1, 2 또는 3) 또는 (x=4, n=2, 3, 4 또는 5 및 m= 0, 1, 2 또는 3)이고, 일 양태에서, x=4 및 n=2 또는 3이고, 추가의 양태에서, x=4 및 n=2이다. 일 양태에서, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄를 서로 융합시키기에 특히 적합한 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 제1 및 제2 Fab 단편의 Fab 중쇄를 연결하기에 적합한 예시적인 펩티드 링커는 서열 (D)-(G4S)2(서열번호 118 및 119)를 포함한다. 이러한 다른 적합한 링커는 서열 (G4S)4를 포함한다. 추가적으로, 링커는 면역글로불린 힌지 영역(의 일부)을 포함할 수 있다. 특히 Fab 분자가 Fc 도메인 아단위의 N 말단에 융합되는 경우, 추가 펩티드 링커에 의해 또는 없이 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부를 통해 융합될 수 있다.
일부 양태들에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 공통 경쇄를 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 제1 및 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하며, 이 중 하나는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고 다른 하나는 FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이며, 여기서 제1 및 제2 Fab 분자는 동일한 VLCL 경쇄를 가진다. 일 구현예에서, 상기 동일한 경쇄(VLCL)는 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 경쇄 CDR을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 동일한 경쇄(VLCL)는 서열번호 133을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 (i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 제1 항원 결합 모이어티; (ii) 엽산 수용체 1(FolR1)에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 124, 서열번호 125 및 서열번호 126으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
상기 일 구현예에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 2의 중쇄 CDR1 및 서열번호 3의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함하고, FolR1 항원 결합 모이어티 5는 서열번호 124의 중쇄 CDR1 및 서열번호 125의 중쇄 CDR2, 서열번호 126의 중쇄 CDR3, 서열번호 8의 경쇄 CDR1 및 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티, (ii) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 엽산 수용체 1(FolR1)에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은
(i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티, (ii) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 엽산 수용체 1(FolR1)에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (iii)
FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는(Fab 분자인) 제3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 상기 일 구현예에서, FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 상기 일 구현예에서, 제3 항원 결합 모이어티는 제2 항원 결합 모이어티와 동일하다.
이에 따라, 일 구현예에서, 본 발명은
(i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 제1 항원 결합 모이어티;
(ii) 엽산 수용체 1(FolR1)에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 제2 항원 결합 모이어티,
(iii) 엽산 수용체 1(FolR1)에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 32, 서열번호 5 33, 서열번호 34의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 제3 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
상기 일 구현예에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 37의 중쇄 CDR1 및 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 39의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함하고, FolR1 항원 결합 모이어티는 서열번호 16의 중쇄 CDR1 및 서열번호 17의 중쇄 CDR2, 서열번호 18의 중쇄 CDR3, 서열번호 32의 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은
(i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티,
(ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 엽산 수용체 1(FolR1)에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티,
(iii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 엽산 수용체 1(FolR1)에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제3 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 분자에 관한 것이며, 여기서 적어도 2개의 결합 모이어티는 T 세포 활성화 항원 CD3 및 표적 세포 항원 FolR1에 대한 특이적 결합을 각각 부여하는 상응하는 개조된 중쇄를 갖는다. 이러한 소위 "공통 경쇄" 원칙의 사용, 즉 하나의 경쇄를 공유하지만 여전히 별도의 특이성을 갖는 2개의 결합체를 결합하여 경쇄의 쌍형성 오류를 방지한다. 따라서, 생성 중에 부산물이 적어, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 균질한 제조가 용이하게 된다.
일부 구현예들에서, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정한 결합이 가능한 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 예시적인 구현예들이
하기에 기재되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하기의
a) CD3에 결합하는 제1 항원 결합 도메인으로서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 Fab 분자이고, 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 3의 HCDR 2, 및 서열번호 5의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제1 항원 결합 도메인;
b) 제2 항원, 특히 표적 세포 항원, 더 특히 FolR1에 결합하는 제2 항원 결합 도메인으로서, 상기 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인, 제2 항원 결합 도메인;
c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적) 항체를 제공하고,
여기서
(i) a)의 제1 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 b)의 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b)의 제2 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 c)의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합되거나, 또는
(ii) b)의 제2 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 a)의 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a)의 제1 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 c)의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합된다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 하기의
a) CD3에 결합하는 제1 항원 결합 도메인으로서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 Fab 분자이고, 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 3의 HCDR 2, 및 서열번호 5의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제1 항원 결합 도메인;
b) 제2 항원, 특히 표적 세포 항원, 더 특히 FolR1에 결합하는 제2 및 제3 항원 결합 도메인으로서, 상기 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 각각 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자인, 제2 및 제3 항원 결합 도메인; 및
c) 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적)항체를 제공하고,
여기서
(i) a)의 제1 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 b)의 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b)의 제2 항원 결합 도메인 및 b)의 제3 항원 결합 도메인은 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c)의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합되거나, 또는
(ii) b)의 제2 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 a)의 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a)의 제1 항원 결합 도메인 및 b)의 제3 항원 결합 도메인은 Fab 중쇄의 C 말단에서 c)의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합된다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기의
a) CD3에 결합하는 제1 항원 결합 도메인으로서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 Fab 분자이고, 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 3의 HCDR 2, 및 서열번호 5의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제1 항원 결합 도메인;
b) 제2 항원, 특히 표적 세포 항원, 더 특히 FolR1에 결합하는 제2 항원 결합 도메인으로서, 상기 제2 항원 결합 도메인은 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제2 항원 결합 도메인;
c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적)항체를 제공하고,
여기서
(i) a)의 제1 항원 결합 도메인 및 b)의 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 중쇄의 C 말단에서 c)의 Fc 도메인의 아단위 중 하나의 N 말단에 융합된다.
상기 양태들 중 임의의 것에 따르면, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 구성요소(예컨대, Fab 분자, Fc 도메인)는 직접적으로 또는 본원에 기재되어 있거나 당업계에 공지된 다양한 링커, 특히, 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2~20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한, 비면역원성 펩티드 링커는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함하고, 여기서 n은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다.
바람직한 양태서, 본 발명은 하기의
a) CD3에 결합하는 제1 항원 결합 도메인으로서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 Fab이고, 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 3의 HCDR 2, 및 서열번호 5의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 제1 항원 결합 도메인;
b) FolR1에 결합하는 제2 및 제3 항원 결합 도메인으로서, 상기 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고, 서열번호 124의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 125의 HCDR 2, 및 서열번호 126의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 제2 및 제3 항원 결합 도메인;
c) 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는 (이중특이적)항체를 제공하고,
여기서 제1 항원 결합 도메인 및 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
본 발명의 상기 양태들에 따른 일 양태에서, Fc 도메인의 제1 아단위에서 위치 366의 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 대체되고(T366W), Fc 도메인의 제2 아단위에서 위치 407의 티로신 잔기는 발린 잔기로 대체되고(Y407V) 임의적으로 위치 366의 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 대체되고(T366S) 위치 368의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체된다(L368A)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태들에 따른 추가 양태에서, Fc 도메인의 제1 아단위에서 추가로 위치 354의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되거나(S354C) 위치 356의 글루탐산 잔기가 시스테인 잔기로 대체되며(E356C)(특히 위치 354의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체됨), Fc 도메인의 제2 아단위에서 추가로 위치 349의 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 대체된다(Y349C)(카바트 EU 색인 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태들에 따른 다른 추가의 양태에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위 각각에서 위치 234의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체되고(L234A), 위치 235의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체되며(L235A) 위치 329의 프롤린 잔기는 글리신 잔기로 대체된다(P329G)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태들에 따른 다른 추가의 양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
바람직한 특정 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 127의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함한다. 추가의 바람직한 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함한다.
바람직한 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 127의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 바람직한 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
특정 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 130의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함한다. 추가의 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 130의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
특정 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 131의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 132의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함한다. 추가의 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 131의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 132의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1-1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
특정 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 133의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 134의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함한다. 추가의 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 133의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 134의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 3개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
특정 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 135의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 136의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 2개의 폴리펩티드)를 포함한다. 추가의 특정 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 135의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 136의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 2개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(특히, 2개의 폴리펩티드)를 포함하는, CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
e) Fc 도메인 변이체
바람직한 양태들에서, 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 제1 및 제2 아단위로 구성된 Fc 도메인을 포함한다.
(다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이며, 이의 각 아단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 아단위는 서로 안정되게 연결될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 하나 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
일 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 바람직한 양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 양태에서, 상기 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 더 특정한 양태에서, Fc 도메인은 S228 위치에 아미노산 치환(카바트 EU 색인 넘버링), 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 팔 교환을 감소시킨다(Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)을 참조). 추가의 바람직한 양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 보다 더 바람직한 양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적인 서열은 서열번호 117에서 제시된다.
f) 이종이량체화를 증진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 하나 또는 다른 하나에 융합될 수 있는 상이한 항원 결합 도메인들을 포함하고, 따라서 Fc 도메인의 2개의 아단위는 전형적으로 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 사슬에 포함된다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공동발현 및 후속된 이량체화는 이들 2개 폴리펩티드의 몇 가지 가능한 조합을 유도한다. 재조합 생산에서 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 수율 및 순도를 개선하기 위해, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 Fc 도메인에 원하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다.
이에 따라, 바람직한 양태들에서 본 발명에 따른 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 두 아단위 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 있다. 따라서, 일 양태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 있다.
이종이량체화를 실시하기 위해, Fc 도메인의 CH3 도메인을 변형하기 위한 여러 접근법이 존재하며, 이는 예컨대 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291에 잘 기재되어 있다. 전형적으로, 모든 이러한 접근법에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인은 모두 상보성인 방식으로 조작되어, 각각의 CH3 도메인(또는 이를 포함하는 중쇄)이 더 이상 그 자체로 동종이량체화하지 않고 상보성으로 조작된 다른 CH3 도메인과 강제로 이종이량체화된다(제1 및 제2 CH3 도메인이 이종이량체화되고 2개의 제1 또는 2개의 제2 CH3 도메인 사이에 동종이량체가 형성되지 않음). 개선된 중쇄 이종이량체화를 위한 이러한 상이한 접근법은 중쇄/경쇄 미스페어링 및 벤스 존스형 부산물을 감소시키는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체에서의 중쇄-경쇄 변형(예컨대, 하나의 결합 팔에서 VH 및 VL 교환/대체 및 CH1/CL 경계면에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산들의 치환의 도입)과 조합하여 상이한 대안으로서 고려된다.
특정 양태에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 경합을 촉진하는 상기 변형은 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 하나에서 "돌기" 변형 및 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 다른 하나에서 "구멍" 변형을 포함하는 소위 "구멍 내 돌기" 변형이다.
구멍 내 돌기 기술은, 예컨대, US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 제1 폴리펩티드의 경계면에 돌기("돌기") 그리고 제2 폴리펩티드의 경계면에 이에 상응하는 공동("구멍")을 도입시켜 상기 돌기가 상기 공동 안에 위치되게 함으로써 이종이량체 형성을 촉진시키고, 동종이량체 형성을 방해한다. 돌기는 제1 폴리펩티드의 경계면의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예컨대, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 제작된다. 상기 돌기와 동일 또는 유사한 크기의 상보성 공동(cavities)은, 제2 폴리펩티드의 경계면에서 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 생성된다.
따라서, 바람직한 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치 가능한 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 산출되고, Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치 가능한 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 산출된다.
바람직하게는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 돌기 및 공동은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 예컨대, 부위 특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 생성될 수 있다.
특정 양태에서, Fc 도메인의 제1 아단위("돌기" 아단위)(의 CH3 도메인)에서 366번 위치의 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 대체되고(T366W), Fc 도메인의 제2 아단위("구멍" 아단위)(의 CH3 도메인)에서 407번 위치의 티로신 잔기는 발린 잔기로 대체된다(Y407V). 일 양태에서, Fc 도메인의 제2 아단위에서, 추가로 366번 위치의 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 대체되고(T366S), 368번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체된다(L368A)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
또한 추가의 양태에서, Fc 도메인의 제1 아단위에서 추가로 위치 354의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되거나(S354C) 위치 356의 글루탐산 잔기가 시스테인 잔기로 대체되며(E356C)(특히 위치 354의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체됨), Fc 도메인의 제2 아단위에서 추가로 위치 349의 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 대체된다(Y349C)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 이들 2개 시스테인 잔기들의 도입은 Fc 도메인의 상기 2개 아단위 사이에 이황화물 교차결합을 형성시키고, 따라서 이량체를 추가로 안정화시킨다(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15(2001)).
바람직한 양태에서, Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고 Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다.
바람직한 양태에서, CD3에 결합하는 항원 결합 도메인은 Fc 도메인의 제1 아단위 (“돌기” 변형을 포함)에 융합된다(임의적으로, 제2 항원(즉, FolR1)에 결합하는 제2 항원 결합 도메인 및/또는 펩티드 링커를 통해). 이론에 한정됨 없이, Fc 도메인의 돌기 함유 아단위에 대한 CD3에 결합하는 항원 결합 도메인의 융합은 CD3에 결합하는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체들의 생성을 (추가로) 최소화할 것이다(2개의 돌기 함유 폴리펩티드들의 입체적 충돌).
이종이량체화를 실시하기 위한 다른 CH3 변형 기술은 본 발명에 따른 대안으로서 고려되며, 예컨대, WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에 기재되어 있다.
일 양태에서, EP 1870459에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 이러한 접근법은 Fc 도메인의 2개의 아단위 사이의 CH3/CH3 도메인 경계면 내 특정 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산들의 도입을 기반으로 한다. 본 발명의 (다중특이적)항체에 대한 특정 양태는 (Fc 도메인의)2개의 CH3 도메인들 중 하나에서 아미노산 돌연변이 R409D; K370E 및 Fc 도메인의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 아미노산 돌연변이 D399K; E357K(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)이다.
다른 양태에서, 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 그리고 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K을 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
다른 구현예에서, 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 또는 상기 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 그리고 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K를 포함한다(이들 모두 카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
일 양태에서, WO 2013/157953에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 일 양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 추가의 양태에서, 제1 CH3 도메인은 추가 아미노산 돌연변이 L351K를 포함한다. 추가의 양태에서, 제2 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E(특히 L368E)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)로부터 선택된 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다.
일 양태에서, WO 2012/058768에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 일 양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 양태에서, 제2 CH3 도메인은 위치 T411, D399, S400, F405, N390, 또는 K392에서 추가 아미노산 돌연변이, 예컨대, a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R, 또는 S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W, e) N390R, N390K 또는 N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E로부터 선택된 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 추가의 양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다. 추가의 양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 양태에서, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)을 추가로 포함한다.
일 양태에서, WO 2011/143545에 기재된 이종이량체화 접근법은 대안적으로, 예컨대, 368 및 409(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 변형과 함께 사용된다.
일 양태에서, WO 2011/090762에 기술된 이종이량체화 접근법(이는 또한 상기 기술된 구멍 내 돌기 기술을 사용함)이 대안적으로 사용된다. 일 양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 일 양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
일 양태에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체 또는 이의 Fc 도메인은 IgG2 하위분류이고 WO 2010/129304에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 사용된다.
대안적인 양태에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 회합을 촉진하는 변형은, 예컨대, PCT 공개 공보 WO 2009/089004에 기재된 정전기적 조향 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 2개의 Fc 도메인 아단위의 경계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 하전된 아미노산 잔기로의 대체를 포함하므로 동종이량체 형성은 정전기적으로 바람직하지 않지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 된다. 상기 일 양태에서, 제1 CH3 도메인은 K392 또는 N392의 음전하 아미노산(예컨대, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D), 특히 K392D 또는 N392D)으로의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인은 D399, E356, D356, 또는 E357의 양전하 아미노산(예컨대, 리신(K) 또는 아르기닌(R), 특히 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 더 특히 D399K 및 E356K)으로의 아미노산 치환을 포함한다. 추가의 양태에서, 제1 CH3 도메인은 K409 또는 R409의 음전하 아미노산(예컨대, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D), 특히 K409D 또는 R409D)으로의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 추가의 양태에서, 제1 CH3 도메인은 추가로 또는 대안적으로 K439 및/또는 K370의 음전하 아미노산(예컨대, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D))으로의 아미노산 치환을 포함한다(모두 카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
또 다른 양태에서, WO 2007/147901에 기술된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 일 양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K, 및 K322D를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K, 및 K292D를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
또 다른 양태에서, WO 2007/110205에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안적으로 사용될 수 있다.
일 양태에서, Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
g) Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
Fc 도메인은 표적 조직 내 우수한 축적에 원인이 되는 긴 혈청 반감기 및 바람직한 조직-혈액 분포 비율을 포함하여, (다중특이적)항체에 유리한 약동학적 특성들을 부여한다. 하지만, 동시에 이는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체를 바람직한 항원 보유 세포 보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 바람직하지 않은 표적화를 초래할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공동 활성화는 T 세포 활성화 특성 및 (다중특이적)항체의 긴 반감기와 함께 사이토카인 방출을 유도할 수 있으며, 이는 전신 투여시 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 심각한 부작용을 초래한다. T 세포 이외의 (Fc 수용체 보유)면역 세포의 활성화는, 예컨대, NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적 파괴로 인해 (다중특이적)항체의 효능을 감소시킬 수도 있다.
이에 따라, 바람직한 양태들에서, 본 발명에 따른 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 상기 일 양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체)은, 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적)항체)과 비교하여 Fc 수용체에 대해 50% 미만, 특히, 20% 미만, 보다 특히, 10% 미만 및 가장 특히, 5% 미만의 결합 친화도, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체)과 비교하여 50% 미만, 특히, 20% 미만, 보다 특히, 10% 미만, 가장 특히, 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 일 양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체)은 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고/하거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 바람직한 양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일 양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일 양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 일 양태에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP, 및 사이토카인 분비의 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 바람직한 양태에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 일 양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낸다. FcRn에 대해 실질적으로 유사한 결합은, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체)이 FcRn에 대하여 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체)의 결합 친화도의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 더 특히 약 90% 초과를 나타낼 때 달성된다.
특정 양태들에서, Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 바람직한 양태들에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 상기 Fc 도메인의 2개의 아단위 각각에 존재한다. 일 양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 일 양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 2배 이상, 5배 이상, 또는 10배 이상 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 있는 양태들에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 적어도 50배 만큼 감소시킬 수 있다. 일 양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체와 비교하여 Fc 수용체에 대해 20% 미만, 특히 10% 미만, 더 특히 5% 미만의 결합 친화도를 나타낸다. 바람직한 양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 양태들에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 양태들에서 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 양태들에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 특히 C1q에 대한 결합 친화도도 감소된다. 일 양태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 보존은 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체)이 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인(또는 상기 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체)의 FcRn에 대한 결합 친화도의 약 70% 초과를 나타낼 때 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 이러한 친화도의 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다. 특정 양태들에서, (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 이러한 효과기 기능의 감소는 비제한적으로 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 보체 의존성 세포독성(CDC) 감소, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 감소, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 감소, 사이토카인 분비 감소, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체 매개 항원 흡수 감소, NK 세포에 대한 결합 감소, 대식세포에 대한 결합 감소, 단핵세포에 대한 결합 감소, 다형핵세포에 대한 결합 감소, 직접적인 신호전달 유도 세포자멸사 감소, 표적 결합된 항체들의 가교결합 감소, 수지상세포 성숙화 감소, 또는 T 세포 프라이밍 감소. 일 양태에서 효과기 기능 감소는 CDC 감소, ADCC 감소, ADCP 감소, 및 사이토카인 분비 감소의 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 바람직한 양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 일 양태에서, ADCC 감소는 조작되지 않은 Fc 도메인(또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
일 양태에서, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일 양태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)의 군에서 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 양태에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)의 군에서 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 양태들에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 상기 일 양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 일 양태에서, 상기 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 양태에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)이다. 일 양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 그리고 E233, L234, L235, N297 및 P331(카바트 EU 색인에 따른 넘버링)에서 선택되는 위치에서 추가 아미노산 치환을 포함한다. 더 구체적인 양태에서 추가 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 바람직한 양태에서, Fc 도메인은 위치 P329, L234 and L235에서 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 더 바람직한 양태들에서, Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(“P329G LALA”, “PGLALA” 또는 “LALAPG”)를 포함한다. 구체적으로, 바람직한 양태들에서, Fc 도메인의 각 아단위는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 색인 넘버링)를 포함한다, 즉, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위 각각에서 위치 234의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체되고(L234A), 위치 235의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체되며(L235A) 위치 329의 프롤린 잔기는 글리신 잔기로 대체된다(P329G)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
상기 일 양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환들의 “P329G LALA” 조합은 PCT 특허출원 공개공보 제 WO 2012/130831(본원에 그 전체가 원용됨)에 기재된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(및 보체)를 거의 완전히 제거한다. WO 2012/130831은 또한 이러한 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법 및 이의 특성, 예컨대, Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 결정하는 방법을 기재하고 있다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 양태들에서, 본 발명의 (다중특이적)항체의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 일 양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 일 양태에서, IgG4 Fc 도메인은, Fc 수용체에 대한 이의 결합 친화도 및/또는 이의 효과기 기능을 추가로 감소시키기 위해, 위치 L235에 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 다른 양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 바람직한 양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 이러한 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 특성은 그 전체가 본원에 원용된, PCT 특허출원 공개공보 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
바람직한 양태에서, 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 선택적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인이거나, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 선택적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
특정 양태들에서, Fc 도메인의 N 당화가 제거되었다. 상기 일 양태에서, Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 색인에 따른 넘버링).
상기에 그리고 PCT 특허출원 공개공보 WO 2012/130831에 기재된 Fc 도메인 이외에도, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호)(카바트 EU 색인에 따른 넘버링). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 “DANA” Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581).
돌연변이 Fc 도메인을 해당 분야에 공지된 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형시켜 제조할 수 있다. 유전학적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는, 예를 들어, 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은, 예컨대, ELISA에 의해서 또는 BIAcore 기기(GE Healthcare)와 같은 표준 기기를 사용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해서 쉽게 측정할 수 있으며 이러한 Fc 수용체는 재조합 발현에 의해 얻을 수 있다. 또는, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적)항체의 결합 친화도를 특정 Fc 수용체, 예컨대, 인간 NK 세포 발현 FcγIIIa 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 효과기 기능을 해당 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 관심이 되는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예는 미국 특허 제5,500,362호; Hellstrom, I. et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); 미국 특허 제5,821,337호; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사능활성 검정들이 이용될 수 있다(예를 들어, 유동 세포 분석을 위한 ACTI™ 비방사능활성 세포독성 분석(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비방사능활성 세포독성 분석(Promega, Madison, WI)을 참조). 이러한 분석에 유용한 효과기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포들을 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예컨대, Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)에서 공개된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다.
일부 양태들에서, 보체 성분, 구체적으로 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합은 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된 일부 양태들에서, 효과기 기능 감소는 CDC 감소를 포함한다. C1q 결합 분석은 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체가 C1q에 결합할 수 있고 그리하여 CDC 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예컨대, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실시될 수 있다(예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood. 101, 1045-1052 (2003); 그리고 Cragg and Glennie, Blood. 103, 2738-2743 (2004)을 참조).
FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 측정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 실시될 수 있다(예컨대, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 Al를 참조).
B. 폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 공동 발현되는 전체 항체 또는 다중(예컨대, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동 발현된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는, 예컨대, 이황화 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 항체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 항체의 경쇄 부분은 항체의 중쇄를 포함하는 항체의 부분과는 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공동 발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 회합하여 항체를 형성할 것이다. 다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 아단위 중 하나 및 선택적으로 하나 이상의 Fab 분자(의 일부)를 포함하는 항체의 부분은 2개의 Fc 도메인 아단위 중 다른 하나 및 선택적으로 Fab 분자(의 일부)를 포함하는 항체의 일부로부터 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공동 발현되는 경우, Fc 도메인 아단위들은 회합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 양태들에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 전체 항체 분자를 암호화한다. 다른 양태들에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 본 발명에 따른 항체에 포함된 폴리펩티드를 암호화한다.
특정 양태들에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 양태들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
C. 재조합 방법
본 발명의 항체들은, 예를 들어, 고상 펩티드 합성(예를 들어, Merrifield 고상 합성) 또는 재조합 생산에 의해 수득할 수 있다. 재조합 생산을 위해, 이러한 항체를 암호화하는, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 단리되고 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내부에 삽입된다. 상기와 같은 폴리뉴클레오티드는 통상적인 과정을 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(즉, 단일 폴리뉴클레오티드 또는 다수의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터가 제공된다. 당업자들에게 주지된 방법을 사용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 이러한 항체의 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터를 제작할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)에 기재된 기술을 참조한다. 이러한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분이거나 또는 핵산 단편일 수 있다. 이러한 발현 벡터는 내부에 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 코딩 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능한 회합으로 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈들로 구성된 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, 존재하는 경우, 코딩 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 연접 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 비번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구조체에, 예를 들어 단일 벡터상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구조체에, 예를 들어, 별도의(상이한) 벡터상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수 있고 또는 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다, 예를 들어, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있으며, 이들은 단백질분해 절단을 통해 최종 단백질로 번역-후 또는 번역과 동시에 분리된다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 본 발명의 항체, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 또는 융합되지 않은 이종 코딩 영역들을 암호화할 수 있다. 이종 코딩 영역들은 제한없이, 특수화된 구성요소 또는 모티프, 예를 들어, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동가능한 회합은, 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 코딩 영역의 발현이 하나 이상의 조절 서열들의 영향 또는 제어하에 놓이도록 하는 방식으로 유전자 산물이 조절 서열들과 회합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어 폴리펩티드 코딩 영역 및 이와 회합된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 생성시키고 이러한 2개의 DNA 단편들 사이의 링키지의 성질이 이러한 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열들의 능력을 방해하지 않는 또는 전사될 DNA 템플릿의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 회합된다". 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전사를 실행할 수 있는 경우 이러한 핵산과 작동가능하게 회합될 것이다. 상기 프로모터는 오직 예정된 세포에서만 해당 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 외에, 다른 전사 조절 요소들, 예를 들어, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호가 이러한 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 회합되어 세포 특이적 전사를 유도할 수 있다. 적합한 프로모터 및 기타 전사 조절 영역이 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예를 들어 비제한적으로 거대세포바이러스로부터의 프로모터 및 인핸서 분절(예를 들어 인트론-A와 접합된, 극초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들어, 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들어 Rous 육종 바이러스)를 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들, 예를 들어 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈, 뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열들을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서, 뿐만 아니라 유도성 프로모터(예컨대, 테트라사이클린에 의해 유도가능한 프로모터)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당업자들에게 공지되어 있다. 이들에는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소들(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, 또한 CITE 서열로서 지칭됨)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 발현 카세트는 또한, 다른 특질 예컨대 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소 예컨대 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV) 반전 말단 반복(ITR)을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 분비를 지시하는, 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 또 다른 코딩 영역과 회합될 수 있다. 예를 들어, 항체의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 배치할 수 있다. 이러한 신호 가설에 따르면, 일단 거친면 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 사슬의 방출이 시작되면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 성숙한 단백질로부터 절단된 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 이는 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙한" 형태를 생성한다는 것을 알고 있다. 특정 양태들에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 이와 작동가능하게 회합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 해당 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 한편, 이종 포유동물 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 야생형 리더 서열을 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환할 수 있다.
추후 정제를 용이하게 하거나(예컨대, 히스티딘 태그) 또는 항체를 표지함에 도움을 주기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA를, 항체(단편) 암호화 폴리뉴클레오티드 내부에 또는 이의 단부에 포함시킬 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(즉, 단일 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 양태들에서, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 각각의 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에 기재된 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 조합하여 통합할 수 있다. 상기 일 양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 항체(의 일부)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함한다(예를 들어, 이러한 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 항체를 복제하고 이의 발현을 지원하기에 적합한 숙주 세포는 해당 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 이러한 세포는 특정한 발현 벡터로 적절히 형질감염 또는 형질도입 될 수 있으며 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효장치의 씨딩을 위해 증식시켜 임상용으로 충분한 양의 항체를 수득할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예를 들어, 대장균, 또는 다양한 진핵생물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드는, 특히 당화가 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생성될 수 있다. 발현 후에, 이러한 폴리펩티드는 용액 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리되어 추가로 정제될 수 있다. 원핵세포 이외에도, 진핵 미생물, 이를 테면 섬유상 진균 또는 효모는 폴리펩티드 암호화 벡터의 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 여기에는 당화 경로가 “인간화되고", 결과적으로 부분적으로 또는 온전하게 인간 당화 패턴을 가진 폴리펩티드가 생산되는 진균 및 효모 균주가 포함된다. Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), and Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)를 참조한다. (당화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포들은 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래한다. 무척추동물 세포들의 예로는 식물 및 곤충 세포들이 포함된다. 스포도프테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들의 형질감염을 위하여 곤충 세포들과 병용될 수 있는 많은 베큘로바이러스 균주들이 확인되었다. 식물 세포 배양물 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429호를 참조한다(유전자삽입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 을 설명). 척추동물 세포들 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 개조시킨 포유동물 세포주들이 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)에서 설명된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)에서 설명된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 경부 암종 세포 (HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 쥐 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)에서 설명된 바와 같이), MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주를 검토하려면, 예컨대 Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)를 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어, 몇 가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포를 포함하나, 또한 유전자삽입 동물, 유전자삽입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다. 일 양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포, 특히, 포유동물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프구 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 양태에서, 숙주 세포는 인체 내의 세포가 아니다.
이들 시스템에서 외래 유전자를 발현시키는 표준 기술은 해당 분야에 공지되어 있다. 항원 결합 도메인, 예를 들어, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포들은, 항체 사슬의 다른 하나를 또한 발현하도록 조작되어, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 모두 갖는 항체가 되게 할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 항체를 생산하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 본원에 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 구성성분들은 서로 유전적으로 융합될 수 있다. (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 이의 구성요소들이 서로 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 링커의 조성 및 길이는 당업계에 공지된 방법으로 측정될 수 있고 효능에 대해 테스트될 수 있다. (다중특이적) 항체의 상이한 구성성분들 사이의 링커 서열의 예가 본원에 제공된다. 또한, 이러한 융합 단백질의 개별 성분들, 예를 들어, 엔도펩티다제 인식 서열을 분리하기 위해, 또 다른 서열들이 필요에 따라 절단 부위에 혼입될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 항체들을 해당 분야에 공지된 기술, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 젤 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로, 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자들에게 자명할 것이다. 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서, 항체가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체의 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 기질을 사용할 수 있다. 순차적인 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여 본질적으로 실시예에 기재된 바와 같이 항체를 단리할 수 있다. 항체의 순도를 젤 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 임의의 다양한 공지의 분석 방법들에 의해 측정할 수 있다.
D. 분석
본원에 제공된 항체들은 해당 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 그 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
1. 결합 분석
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 항체의 결합(친화도)는 표준 기기, 예를 들어, BIAcore 기기(GE Healthcare), 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정할 수 있다. 대안적으로, 상이한 수용체 또는 표적 항원에 대한 항체의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여, 예를 들어 유동 세포 분석(FACS)에 의해 평가될 수 있다. CD3에 대한 결합 활성을 측정하기 위한 특정한 설명적이고 예시적인 양태가 하기에 기재되어 있다. 예시된 검정은 CD3 항원 대신에 FolR1 항원을 사용하고 숙련된 기술자가 쉽게 인식할 수 있는 약간의 조정을 사용하여 FolR1에 대한 결합 활성을 측정하도록 쉽게 조정될 수 있다.
일 양태에서, CD3에 대한 결합 활성은 다음과 같이 SPR에 의해 결정된다:
SPR은 Biacore T200 기기(GE Healthcare)에서 실시된다. 항 Fab 포획 항체(GE Healthcare, #28958325)가 4000 - 6000 공명 단위(RU)의 표면 밀도에서, 표준 아민 연계 화학을 이용하여 시리즈 S 센서 칩 CM5(GE Healthcare) 위에 고정된다. 러닝 및 희석 완충액으로 HBS-P+(10mM HEPES, 150mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20)를 사용했다. 2 μg/ml 농도의 CD3 항체(20 mM His, 140 mM NaCl, pH 6.0)를 5 μl/분의 유량으로 약 60초 동안 주입한다. 이용된 CD3 항원은 구멍 내 돌기 변형 및 C 말단 Avi 태그를 갖는 인간 Fc 도메인에 융합된, CD3 델타 및 CD3 엡실론 엑토도메인의 이종이량체이다(서열번호 28 및 29를 참조). CD3 항원은 10 μg/ml의 농도로 120초 동안 주입하고 해리는 약 120초 동안 5 μl/분의 유량으로 모니터링한다. 칩 표면은 각각 약 60초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1을 두 번 연속 주입하여 재생한다. 블랭크 주입을 차감함으로써, 그리고 블랭크 대조 흐름 셀로부터 획득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이가 교정된다. 평가를 위해, 결합 반응이 주입 종결 5 초 후에 취해진다. 결합 신호를 정규화하기 위해, CD3 결합이 항-Fab 반응 (고정된 항-Fab 항체 상에서 CD3 항체의 포획 시에 획득된 신호 (RU))에 의해 나눠진다. 상이한 처리 후 항체의 CD3에 대한 결합 활성에 비하여, 일정한 처리 후 항체의 CD3에 대한 결합 활성(상대적 활성 농도(RAC)로서 또한 지칭됨)은 일정한 처리 후 항체의 표본의 결합 활성을 상이한 처리 후 항체의 상응하는 표본의 결합 활성에 참조함으로써 계산한다.
2. 활성 분석
본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 생물학적 활성은 실시예에 기재된 바와 같은 다양한 검정에 의해 측정할 수 있다. 생물학적 활성은, 예를 들어, T 세포의 증식 유도, T 세포에서 신호전달 유도, T 세포에서 활성화 마커의 발현 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비 유도, 표적 세포, 예를 들어, 종양 세포의 용해 유도, 종양 퇴행의 유도 및/또는 생존의 개선을 포함할 수 있다.
E. 조성물, 제형 및 투여 경로
추가의 양태에서, 본원 발명은 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에서 이용을 위한 본원에서 제공된 임의의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 약학적 조성물은 본 발명에 따른 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 다른 양태에서, 약학적 조성물은 본원 발명에 따른 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체, 및, 예컨대, 하기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
또한, 생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 항체를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 본 발명에 따른 항체를 얻는 단계, 및 (b) 항체를 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체와 제형화함으로써, 생체내 투여용 항체의 제제가 제형화되는 단계를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체에 용해되거나 분산된, 유효량의 항체를 포함한다. 문구 "약학적으로 허용가능한"은 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉, 동물, 예를 들어 인간에게 적절히 투여시 불리하거나, 알러지성이거나 또는 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 항체 및 선택적으로 추가적인 활성 성분을 함유하는 약학적 조성물의 제제는 본 발명에 원용된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 예시된 바와 같이, 본원의 내용에 비추어 당업자들에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물(예컨대, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 사무국 또는 다른 국가의 해당 당국에서 요구하는 멸균, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같은, 임의의 모든 용매, 완충액, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예컨대, 항세균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연 작용제, 염, 보존제, 항산화제, 단백질, 약물, 약물 안정제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 이들과 유사한 물질 그리고 이들의 조합을 포함한다(예컨대, 본원에 원용된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329를 참조한다). 임의의 통상적인 담체는 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 약학적 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체(및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 치료의 경우 필요에 따라 병변내 투여 될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 부분적으로는 투약이 단기인지 만성인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 주사, 가령, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다.
비경구 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것들을 포함한다. 주사용으로, 본 발명의 항체를 수용액 중에, 특히 생리학적으로 적합한 완충제, 예를 들어 Hank 용액, Ringer액, 또는 생리식염수 완충제에서 제형화할 수 있다. 이러한 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁, 안정화 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 한편으로, 이러한 항체는 사용전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균된 발열물질 미함유 수로 조성되는 분말 형태 중에 존재할 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 항체를 필요에 따라, 이하에 열거되는 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매에 필요한 양으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 기본 분산 매질 및/또는 그 외 성분들을 함유하는 멸균 운반체에 다양한 멸균 활성 성분들을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액, 현탁액 또는 에멀전 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 또는 동결-건조 기술이며 이 방법은 사전에 멸균-여과된 이의 액체 매질로부터 활성 성분과 함께 원하는 임의의 추가 성분으로 된 분말을 생성한다. 상기 액체 매질을 필요한 경우 적합하게 완충시켜야 하며 상기 액체 희석제는 주사전에 먼저 충분한 염수 또는 포도당으로 등장성으로 만들어야 한다. 이러한 조성물은 제조 및 보관 조건들하에서 안정하여야 하며 미생물, 가령, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 내독소 오염을, 예를 들어 0.5 ng/mg 단백질 미만의 안전 수준에서 최소로 유지시켜야 함을 알 것이다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탈 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 낮은 분자량의(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루탐, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 물질 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점성도를 증가시키는 화합물들, 가령, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고농축 용액을 제조할 수 있도록 화합물들의 용해도를 증가시키는 제제들을 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물들의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클에는 지방 오일, 가령, 참기름, 또는 합성 지방산 에스터, 가령, 에틸 올레이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포좀이 포함된다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 준비된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼(macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 상기 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Ed. Mack Printing Company, 1990)에 개시되어 있다.. 서방형 제재가 제조될 수 있다. 서방형 제재의 적합한 예들에는 상기 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다. 특정 양태들에서, 주사 조성물의 흡수 연장은 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴, 또는 이의 조합을 조성물에 사용함으로써 이루어질 수 있다.
앞서 기재된 조성물들 외에, 항체들을 또한 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 이러한 장기 작용 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 항체는 적합한 중합체 또는 소수성 재료(예를 들어, 허용가능한 오일 중의 에멀전으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체를 포함하는 약학적 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다. 약학적 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 이러한 단백질의, 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
본 발명의 항체는 유리산 또는 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 상기 유리산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키는 염이다. 이들은 산 부가 염, 예를 들어, 단백질성 조성물의 유리 아미노기로 형성된 것, 또는 무기산, 가령, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성된 것들을 포함한다. 유리 카르복실기를 이용하여 형성된 염은 또한 무기 염기, 가령, 예를 들어, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘, 또는 수산화 철 (ferric hydroxides); 또는, 유기 염기, 가령, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 또는 프로케인으로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매 중에서 더 용해성으로 되는 성향이 있다.
F. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들어 암의 치료에서 면역치료제로서 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 양호한 의학적 수행과 합치하는 방식으로 제형화, 투약, 및 투여된다. 이와 관련하여 고려해야 할 요소에는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 병태, 장애의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 기타 요소가 포함된다.
일 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체가 제공된다. 추가의 양태들에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체가 제공된다. 특정 양태들에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체가 제공된다. 일 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체를 제공한다. 특정 양태들에서, 본 발명은 유효량의 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 질환을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체를 제공한다. 특정 양태들에서, 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 바람직한 양태에서, 질환은 암이다. 특정 양태들에서 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가의 양태들에서, 본원 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 데 이용을 위한 본원 발명의 항체를 제공한다. 특정 양태들에서, 본원 발명은 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 항체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 이용을 위한 본원 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체를 제공한다. 상기 양태들 중 임의의 것에 따른 “개체”는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 조제에 있어서 본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 용도를 제공한다. 일 양태에서, 약제는 이를 필요로 하는 개체의 질환의 치료를 위한 것이다. 추가의 양태에서, 약제는 질환이 있는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법에서의 용도에 관한 것이다. 특정 양태들에서, 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 바람직한 양태에서, 질환은 암이다. 일 양태에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가의 양태에서, 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 것이다. 다른 추가의 양태에서, 약제는 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 약제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 상기 양태들 중 임의의 것에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는, 인간 일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 항체의 유효량을 이러한 질환을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 양태에서 본 발명의 항체를 약학적으로 허용가능한 형태로 포함하는 조성물이 상기 개체에게 투여된다. 특정 양태들에서, 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 바람직한 양태에서, 질환은 암이다. 특정 양태들에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 상기 양태들 중 임의의 것에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는, 인간 일 수 있다.
추가의 양태에서, 본원 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 방법을 제공한다. 일 양태에서, 상기 방법은 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재하에 표적 세포를 본 발명의 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 추가의 양태에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법이 제공된다. 상기 일 양태에서, 상기 방법은 표적 세포의 용해를 유도하는 유효량의 본 발명의 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 양태에서, “개체”는 인간이다.
특정 양태들에서, 치료되는 질환은 증식성 장애, 특히, 암이다. 암의 비제한적 예에는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암, 골암 및 신장암이 포함된다. 본 발명의 항체를 사용하여 치료할 수 있는 다른 세포 증식 장애에는, 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 및 비뇨생식기 계통에 위치한 신생물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 전암성 병태 또는 병변 및 암 전이가 포함된다. 특정 양태들에서, 암은 신장암, 방광암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암, 두경부암 및 전립선암으로 구성된 군에서 선택된다. 일 양태에서, 특히 항체가 제2 항원으로서 FolR1에 결합하는 다중특이적 항체이면, 암은 FolR1을 발현하는 암이다. 일 양태에서, 특히 항체가 제2 항원으로서 FolR1에 결합하는 다중특이적 항체이면, 암은 피부암, 특히 흑색종이다. 당업자는 많은 경우에 항체가 완치를 제공하는 것이 아니라 부분적인 이점만 제공할 수 있음을 용이하게 알 수 이을 것이다. 일부 양태들에서, 일부 이점을 갖는 생리학적 변화 또한 치료적으로 유익한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 양태들에서, 생리학적 변화를 제공하는 항체의 양은 "유효량"으로 간주된다. 치료를 필요로 하는 대상체, 환자 또는 "개체"는 일반적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간이다.
일부 양태들에서, 본 발명의 항체의 유효량은 질환의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 본 발명의 항체의 적절한 용량(단독으로 또는 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 선행 또는 진행 중인 치료적 개입, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 투여를 담당하는 진료의는, 임의의 경우에, 개개의 대상체에 적절한 투여량(들) 및 조성물 내 활성 성분(들)의 농도를 결정할 것이다. 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 비롯한(하지만, 이에 제한되지는 않는) 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
상기 항체는 한 번에 또는 일련의 치료일정에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따르면, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체는 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 상기 언급된 요소들에 따라, 하나의 전형적인 일일 투여량의 범위는 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상이 될 수 있다. 수일 또는 보다 장기에 걸친 반복된 투여를 위하여, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증세가 바람직하게 억제될 때까지 지속될 것이다. 상기 항체 또는 면역접합체의 한 가지 예시적인 투여량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위 일 것이다. 다른 비제한적 예에서, 용량은 또한 투여 당 약 1 마이크로그램/kg 체중, 약 5 마이크로그램/kg 체중, 약 10 마이크로그램/kg 체중, 약 50 마이크로그램/kg 체중, 약 100 마이크로그램/kg 체중, 약 200 마이크로그램/kg 체중, 약 350 마이크로그램/kg 체중, 약 500 마이크로그램/kg 체중, 약 1 밀리그램/kg 체중, 약 5 밀리그램/kg 체중, 약 10 밀리그램/kg 체중, 약 50 밀리그램/kg 체중, 약 100 밀리그램/kg 체중, 약 200 밀리그램/kg 체중, 약 350 밀리그램/kg 체중, 약 500 밀리그램/kg 체중, 내지 약 1000 밀리그램/kg 체중 이상 및 이들 범위에서 유래하는 임의의 범위를 포함할 수도 있다. 본원에 열거된 숫자들로부터 유래될 수 있는 범위의 비제한적 예에서, 상기 숫자에 기초하여, 약 5 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 마이크로그램/kg 체중 내지 약 500 밀리그램/kg 체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들면 상기 환자는 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면 약 6회 용량의 항체를 제공받는다). 초기에는 보다 높은 부하 용량, 후속하여 보다 낮은 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터된다.
본 발명의 항체는 일반적으로 원하는 목적을 구현하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방함에 사용하기 위해, 본 발명의 항체, 또는 이의 약학적 조성물은 유효량으로 투여되거나 적용된다.
전신 투여의 경우 유효량은 세포 배양 분석과 같은 시험관내 분석에서 초기에 추정될 수 있다. 그런 다음, 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 구현하기 위한 용량이 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여, 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
초기 투여량은 또한 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 생체내 데이터, 예를 들어 동물 모델로부터 추정될 수 있다.
투여량 및 투여 간격은 치료 효과를 유지하기에 충분한 항체의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 통상적인 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일 범위이다. 치료적 유효 혈장 수준은 1일 다회 용량을 투여함으로써 구현될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어 HPLC로 측정할 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 항체의 유효량은 일반적으로 실질적인 독성을 유발하지 않으면서 치료 이점을 제공할 것이다. 항체의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 사용하여 LD50(모집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(모집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정할 수 있다. 독성 및 치료 효과간의 용량 비율은 치료 지수로서 이는 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 항체가 바람직하다. 일 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 사람에서 사용하기에 적합한 투여량 범위를 계산하는데 사용될 수 있다. 이러한 용량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성이 없이 ED50를 포함하는 순환 농도 범위에 속한다. 투여량은 다양한 인자, 예를 들어 사용된 투여 형태, 사용된 투여 경로, 대상체의 상태 등에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제제, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태에 비추어 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예컨대, 그 전체가 본원에 원용된 Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1을 참조).
본 발명의 항체로 치료되는 환자의 주치의는 독성 및 장기 오기능 등으로 인한 투여를 어떻게 및 언제 종결, 중단 또는 조정할지를 알 것이다. 역으로, 주치의는 임상적 반응이 적절치 못한 경우 (독성 제외)치료를 보다 높은 수준으로 조정할지 여부를 알 것이다. 관심 장애의 관리에 있어서, 투여되는 용량의 크기는 치료되는 병태의 중증도 및 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 병태의 중증도는 예를 들어 부분적으로 표준적인 예후 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 예상되는 투여 빈도는 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체는 요법에서 하나 이상의 기타 제제와 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가 치료제와 공동 투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 치료를 필요로 하는 개체의 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 제제를 포괄한다. 이러한 추가 치료제는 치료되는 특정 질환에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해 효과를 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 특정 양태들에서, 추가 치료제는 면역조절제, 세포증식 억제제, 세포 부착 억제제, 세포독성제 억제제, 세포 사멸의 활성화제, 또는 세포사멸 유도제에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 제제이다. 바람직한 양태에서, 추가 치료제는 다른 항암제, 예를 들면 미소관 교란물질, 대사길항물질, 국소이성화효소 저해제, DNA 삽입제, 알킬화제, 호르몬 요법, 키나아제 저해제, 수용체 길항제, 종양 세포 아폽토시스의 활성인자, 또는 항신생혈관제이다.
이러한 기타 제제는 의도한 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다. 이러한 다른 제제의 유효량은 사용된 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요소들에 따라 다르다. 항체들은 일반적으로 본원에 설명된 투여 경로로 동일한 투여량으로 이용되거나, 또는 본원에서 논의된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 판단된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 이용된다.
전술된 이러한 병용 요법은 병용 투여 (여기서 2가지 또는 그 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 조성물 내에 포함된다) 및 별개 투여를 포괄하고, 이러한 사례에서, 본원 발명의 (다중특이적, 예컨대, 이중특이적)항체의 투여는 추가 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 방사선 요법과 병용될 수 있다.
G. 제조 물품
본 발명의 다른 양태에서, 상기 설명된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 이러한 제조 물품은 용기 및 용기 위에 또는 용기에 결합된 라벨 또는 약품 설명서를 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 자체가 조성물을 보유하거나 병태의 치료, 방지 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 복합된 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 상기 용기는 피하 주사 바늘이 뚫을 수 있는 마개를 가진 정맥 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 약품 설명서에는 이 조성물이 선택된 병태 치료에 이용된다는 것이 명시되어 있다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 포함된 제1 용기, 여기에서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함하고; 그리고 (b) 조성물이 포함된 제2 용기, 여기에서 상기 조성물은 또 다른 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다. 본 발명의 상기 양태에서 제조물품은 이 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있음이 표시된 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편, 또는 추가적으로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 가령, 주사(BWFI)용 정균수, 포스페이트 완충된 염수, Ringer 용액 및 덱스트로즈 용액이 포함된 제2(또는 제3) 용기를 더 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기가 포함된 상업적 그리고 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 더 포함할 수 있다.
H. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 양태들에서, 본원에서 제공된 임의의 항체는 생물학적 샘플 내에서 표적(예컨대, CD3/FolR1)의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 양태들에서, 생물학적 샘플은 전립선 조직과 같은 세포 또는 조직을 포함한다.
일 양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플에서 CD3 및 FolR1 모두의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 양태들에서, 상기 방법은 CD3, TYRP-1, CEA, GPRC5D 또는 CD19에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키고, 항체와 CD3, TYRP-1, CEA, GPRC5D 또는 FolR1 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법 일 수 있다. 일 양태에서, 본원 발명의 항체는 예를 들면, CD3 및 FolR1이 환자의 선별을 위한 바이오마커인 경우에, CD3 및 FolR1에 결합하는 항체를 이용한 요법에 적격인 개체를 선별하는 데 이용된다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단할 수 있는 예시적인 장애는 암, 특히 피부암 또는 뇌암을 포함한다.
특정 양태들에서, 본 발명에 따른 항체가 제공되며, 여기서 항체는 표지된다. 표지에는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(형광, 발색, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지와 같은), 뿐만 아니라 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호 작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 세균성 루시페라제(미국 특허 제4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토실라제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 과산화수소를 사용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어, 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼, 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
III. 서열
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이중특이적 CD3/FolR1 항체 서열:
카바트에 따른 CDR 정의
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IV. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 다양한 다른 양태들이 전술한 일반적인 설명에 따라 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1 - 최적화된 CD3 결합체의 생성
본원에서 “CD3orig”로 명명되고 각각, 서열번호 6 및 11의 VH와 VL 서열을 포함하는 전술된(예컨대, 본원에 원용된 WO 2014/131712를 참조) CD3 결합체로부터 시작하여, 우리는 중쇄 CDR3의 카바트 위치 97 및 100에서 2개의 아스파라긴 탈아미드화 서열 모티프의 제거에 의해 이러한 결합체의 특성을 최적화하는 것을 목표로 하였다.
이러한 목표를 위해, 우리는 파지 전시에 적합한, 카바트 위치 97 및 100에서 아스파라긴 둘 모두가 제거되고, 그리고 이에 더하여 친화성-성숙 과정을 통해 Asn97 및 Asn100을 대체함으로써 유발된 친화성의 상실을 보상하기 위해 CDRs H1, H2 및 H3이 무작위화된 중쇄의 항체 라이브러리를 산출하였다.
이러한 라이브러리는 소수 외피 단백질 p3에 융합을 통해 실모양 파지 위에 놓이고(Marks et al. (1991) J Mol Biol 222, 581-597), 재조합 CD3에 결합에 대해 선별되었다.
초기 선별검사에서, Fab 단편(대장균(E. coli)에서 생산됨)으로서 SPR에 의해 측정될 때 재조합 항원 상에서 허용가능한 결합을 보여주는 10개의 후보 클론이 확인되었다.
하지만, 이들 클론 중에서 단지 하나만 IgG 형식으로의 전환 후 유세포분석법에 의해 측정할 때 CD3 발현 세포에 대한 허용가능 결합 활성을 보여주었다.
본원에서 “CD3opt”로 명명되고 각각, 서열번호 7 및 11의 VH와 VL 서열을 포함하는 선별된 클론은 추가로 평가되고, 그리고 하기에서 설명된 바와 같이 이중특이적 형식으로 전환되었다.
실시예 2 - CD3에 대한 최적화된 CD3 결합체의 결합
재조합 CD3에 결합
재조합 CD3에 결합은 Fc 영역 내에 P329G L234A L235A(“PGLALA”, EU 넘버링) 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 형식의 최적화된 CD3 결합체 “CD3opt” 및 본래 CD3 결합체 “CD3orig”(서열번호 12와 14(CD3orig) 및 서열번호 13과 14(CD3opt)) 둘 모두에 대한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정되었다.
탈아미드화 부위 제거의 효과 및 항체의 안정성에 대한 이의 효과를 평가하기 위해, 재조합 CD3에 대한 본래 및 최적화된 CD3 결합체의 결합이 37℃ 또는 40℃에서 14 일 동안 온도 스트레스 후 검사되었다. -80℃에서 보관된 표본이 참조로서 이용되었다. 참조 표본 및 40℃에서 스트레스 부하된 표본은 20 mM His, 140 mM NaCl, pH 6.0에서, 그리고 37℃에서 스트레스 부하된 표본은 PBS, pH 7.4에서, 1.2-1.3 mg/ml의 농도로 존재하였다. 스트레스 기간(14일) 후 PBS 중의 샘플을 추가 분석을 위해 20mM His, 140mM NaCl, pH 6.0으로 다시 투석했다.
표본의 상대적 활성 농도(RAC)가 하기와 같이 SPR에 의해 결정되었다.
SPR은 Biacore T200 기기(GE Healthcare)에서 실시하였다. 항-Fab 포획 항체(GE Healthcare, #28958325)가 표준 아민 연계 화학을 이용하여 시리즈 S 센서 칩 CM5(GE Healthcare) 위에 고정되어, 4000 - 6000 공명 단위(RU)의 표면 밀도가 유발되었다. 러닝 및 희석 완충액으로 HBS-P+(10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20)를 사용했다. 2 μg/ml 농도의 CD3 항체를 5 μl/분의 유량으로 약 60초 동안 주입한다. CD3 항원(하기를 참조)은 10 μg/ml의 농도로 120초 동안 주입하고 해리는 약 120초 동안 5 μl/분의 유량으로 모니터링하였다. 칩 표면은 각각 60초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1을 두 번 연속 주입하여 재생하였다. 벌크 굴절률 차이는 맹검액 주입을 빼고 맹검 대조 흐름 세포로부터 수득된 반응을 빼서 수정하였다. 평가를 위해, 결합 반응이 주입 종결 5 초 후에 취해졌다. 결합 신호를 정규화하기 위해, CD3 결합이 항 Fab 반응(고정된 항 Fab 항체 상에서 CD3 항체의 포획 시에 획득된 신호(RU))에 의해 나눠졌다. 상대 활성 농도는 각 온도 스트레스 샘플을 해당 비-응력 샘플에 참조하여 계산하였다.
이용된 항원은 구멍 내 돌기 변형 및 C 말단 Avi-태그를 갖는 인간 Fc 도메인에 융합된 CD3 델타 및 CD3 엡실론 엑토도메인의 이종이량체이었다(서열번호 28 및 29를 참조).
이러한 실험의 결과는 도 2에서 도시된다. 목격될 수 있는 바와 같이, 최적화된 CD3 결합체 CD3opt는 본래 CD3 결합체 CD3orig와 비교하여, 온도 스트레스(37℃, pH 7.4에서 2주) 후 CD3에 대한 강하게 향상된 결합을 보여주었다. 이러한 결과는 탈아미드화 부위 제거가 성공적이었고, 그리고 생체내 반감기뿐만 아니라 중성 pH에서 항체의 조제에 유관한 우수한 안정성 특성을 갖는 항체를 산출하였다는 것을 증명한다.
저캇 세포 상에서 CD3에 결합
인간 리포터 T 세포주 저캇 NFAT 상에서 CD3에 결합은 Fc 영역 내에 P329G L234A L235A(“PGLALA”, EU 넘버링) 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 형식의 최적화된 CD3 결합체 “CD3opt” 및 본래 CD3 결합체 “CD3orig”(서열번호 12와 14(CD3orig) 및 서열번호 13과 14(CD3opt)) 둘 모두에 대해 FACS에 의해 결정되었다.
저캇-NFAT 리포터 세포(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P; Promega #CS176501)는 인간 CD3을 발현하는, NFAT 프로모터를 갖는 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주이다. 이들 세포는 ml당 0.1-0.5 mio 세포로 RPMI1640, 2 g/l 글루코오스, 2 g/l NaHCO3, 10% FCS, 25 mM HEPES, 2 mM L-글루탐, 1 x NEAA, 1 x 나트륨-피루브산염에서 배양되었다. 세포가 계대될 때는 언제든지, ml당 200 μg 최종 농도의 히그로마이신 B를 첨가하였다.
결합 검정을 위해, 저캇 NFAT 세포를 회수하고, PBS로 세척하고, FACS 완충액에서 재현탁시켰다. 항체 염색을 96-웰 둥근 바닥 평판에서 실시하였다. 이러한 이유로 100,000 내지 200,000개 세포를 각 웰에 분주하였다. 플레이트를 다시 400 xg에서 4분 동안 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 검사 항체를 FACS 완충액에서 희석하고, 20 μl의 항체 용액을 4℃에서 30분 동안 이들 세포에 첨가하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해, 이들 세포는 희석된 이차 항체(PE 접합된 AffiniPure F(ab’)2 단편 염소 항인간 IgG Fcg 단편 특이적; Jackson ImmunoResearch #109-116-170)의 첨가 전 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 4℃에서 30 분 배양 후, 결합되지 않은 이차 항체가 씻겨 나갔다. 측정 전, 이들 세포는 200 μl FACS 완충액에서 재현탁시키고, 이후 BD Canto II 장치를 이용하여 유세포분석법에 의해 분석하였다.
도 3에서 도시된 바와 같이, 최적화된 CD3 결합체 “CD3opt” 및 본래 CD3 결합체 “CD3orig”는 저캇 세포 상에서 CD3에 동등하게 잘 결합하였다.
실시예 3 - 최적화된 CD3 결합체의 기능적 활성
최적화된 CD3 결합체 “CD3opt”의 기능적 활성은 저캇 리포터 세포 검정에서 검사하고, 본래 CD3 결합체 “CD3orig”의 활성과 비교하였다. 이들 IgG의 기능적 활성을 검사하기 위해, 증가하는 농도의 CD3opt 인간 IgG1 PGLALA 또는 CD3orig 인간 IgG1 PGLALA의 존재하에서 항 PGLALA 발현 CHO 세포를 저캇 NFAT 리포터 세포와 공동배양하였다. T 세포 교차연결 시에 저캇 NFAT 리포터 세포 상에서 CD3의 활성화는 루시페라아제의 생산을 유도하고, 발광을 활성화 마커로서 측정할 수 있다. 항 PGLALA 발현 CHO 세포에 결합할 수 없고, 이러한 이유로 저캇 NFAT 세포 상에서 교차연결될 수 없는 CD3orig 인간 IgG1 wt가 음성 대조로서 포함되었다. 검정의 개략적 도시는 도 4에서 제공된다.
항 PGLALA 발현 CHO 세포는 인간 IgG1 Fc(PGLALA)에 특이적으로 결합하는 항체를 표면 상에서 발현하도록 가공된 CHO-K1 세포이다(본원에 원용된 WO 2017/072210을 참조한다). 이들 세포는 5% FCS + 1% GluMax를 내포하는 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. 저캇 NFAT 리포터 세포는 실시예 2에서 기재된 바와 같다.
CHO 상에서 발현되는 항 PGLALA 및 저캇 NFAT 리포터 세포 상에서 발현되는 CD3에 대한 CD3 huIgG1 PGLALA의 동시적 결합 시에, NFAT 프로모터가 활성화되고 활성 개똥벌레 루시페라아제의 발현을 야기한다. 발광 신호(루시페라아제 기질의 첨가 시에 획득됨)의 강도는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다. 저캇-NFAT 리포터 세포는 현탁 상태에서 성장하고, ml당 0.1-0.5 mio 세포로 RPMI1640, 2 g/l 글루코오스, 2 g/l NaHCO3, 10 % FCS, 25 mM HEPES, 2 mM L-글루탐, 1 x NEAA, 1 x 나트륨-피루브산염, ml당 200 μg 히그로마이신에서 배양하였다. 검정을 위해, CHO 세포를 회수하고, ViCell을 이용하여 생존력이 결정하였다. 30,000개 표적 세포/웰을 편평한 바닥의 백색 벽 96-웰 평판(Greiner bio-one #655098) 내에 100 μl 배지에 도말하였고, 50 μl/웰의 희석된 항체 또는 배지(대조를 위해)를 이들 CHO 세포에 첨가하였다. 이후에, 저캇-NFAT 리포터 세포를 회수하고 ViCell을 이용하여 생존력을 평가하였다. 히그로마이신 B가 없는 세포 배양 배지에서 세포를 1.2 mio 세포/ml로 재현탁시키고, 2:1의 최종 효과기 대 표적(E:T) 비율 및 웰마다 200 μl의 최종 용적을 수득하기 위해 60,000개 세포/웰(50 μl/웰)로 CHO 세포에 첨가하였다. 이후, 4 ml의 GloSensor(Promega #E1291)를 각 웰에 첨가하였다(최종 용적의 2%). 세포를 가습된 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 시간의 종결 시점에서, TECAN Spark 10M을 이용하여 발광을 검출하였다.
도 5에서 도시된 바와 같이, 최적화된 CD3 결합체 CD3opt는 교차연결 시에 저캇 NFAT 세포 상에서 CD3orig와 유사한 활성을 가졌다.
실시예 4 - 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 T 세포 이중특이적 항체의 생성
TYRP1 TCB
실시예 1에서 확인된 최적화된 CD3 결합체(“CD3opt”, 서열번호 7(VH) 및 11(VL))를 CD3 및 TYRP1을 표적으로 하는 T 세포 이중특이적 항체(TCB)(“TYRP1 TCB”)를 생성하는 데 이용하였다.
이러한 TCB 내에 포함된 TYRP1 결합체는 TYRP1 결합체 “Ta99”(중쇄 및 경쇄 각각에 대해 GenBank 엔트리 AXQ57811 및 AXQ57813을 참조)의 인간화에 의해 생성되고, 각각 서열번호 18 및 22에서 도시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
TCB 분자의 개략적 도시는 도 6에서 제공되고, 이의 전체 서열은 서열번호 23, 24, 25 및 27에서 제시된다.
본래 CD3 결합 서열을 갖는 유사한 분자 역시 제조하였다(서열번호 23, 24, 25 및 26).
HEK293 EBNA 세포의 일시적인 형질감염에 의해 이중특이적 분자가 생성되었다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:2:1:1 비율로 형질감염시켰다(“벡터 중쇄(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)” : “벡터 경쇄(VL-CL)” : “벡터 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3)” : “벡터 경쇄(VH-CL)”) 세포를 원심분리하고 배지를 예열된 CD CHO 배지(Thermo Fisher, #10743029)로 교체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지에서 혼합하였고, PEI(폴리에틸렌이민, Polysciences, #23966-1)를 첨가하였고, 용액을 와류시키고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 이어서, 세포(2 mio/ml)를 벡터/PEI 용액과 혼합하고 플라스크로 옮기고 3시간 동안 37℃에서 5% CO2 대기의 진탕 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 보충물(총 용적의 80%)을 포함하는 Excell 배지를 첨가하였다. 형질감염 1일 후, 보충물(공급물, 총 부피의 12%)을 첨가하였다. 세포 상청액은 원심분리 및 후속 여과(0.2 μm 필터)에 의해 7일 후에 회수하였다.
여과된 세포 배양 상층액으로부터 단백질을 표준 방법에 의해 정제하였다. 요약하면, Fc 함유 단백질은 단백질 A 친화성 크로마토그래피(MabSelect Sure, GE Healthcare: 평형 완충액: 20 mM 구연산나트륨, 20 mM 인산나트륨, pH 7.5; 용리 완충액: 20 mM 구연산나트륨, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신 pH 3.0)로 정제하였다. pH 3.0에서 용리시킨 후 샘플을 즉각적으로 pH 중화시켰다. 단백질을 원심분리(Millipore Amicon® ULTRA-15 (#UFC903096))에 의해 농축하고, 응집된 단백질을 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, pH 6.0에서 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200, GE Healthcare)에 의해 단량체성 단백질로부터 분리하였다.
정제된 단백질의 농도는 Pace et al. (1995), Protein Science 4, 2411-23에 따라서 아미노산 서열에 기초하여 계산된 질량 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 흡수를 측정함으로써 결정하였다. 단백질의 순도 및 분자량은 LabChipGXII(Perkin Elmer)를 이용하여 환원제의 존재와 부재하에 CE-SDS에 의해 분석하였다(표 1). 응집체 함량의 결정은 작업 완충액(각각, 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노수화염화물, pH 6.7 또는 200 mM KH2PO4, 250 mM KCl pH 6.2)에서 평형화된 분석적 크기 배제 칼럼(TSKgel G3000 SW XL 또는 UP-SW3000)을 이용하여 25℃에서 HPLC 크로마토그래피에 의해 실시하였다(표 2).
표 1. TYRP1 TCB의 CE-SDS 분석(비환원됨).
Figure pct00037
표 2. TYRP1 TCB의 생성 및 정제에 대한 요약.
Figure pct00038
실시예 5 - CD3 및 TYRP1에 대한 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 T 세포 이중특이적 항체의 결합
재조합 CD3에 결합
재조합 CD3에 대한 TYRP1 TCB의 결합은 최적화된(TYRP1 TCB CD3opt) 또는 본래(TYRP1 TCB CD3orig) CD3 결합 서열 중에서 어느 한 가지를 포함하는 TCB를 이용하여 SPR에 의해 평가하였다.
SPR 실험은 HBS-EP를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20(GE Healthcare))으로서 이용하여, Biacore T200에서 실시하였다.
TYRP1 TCB는 인간 IgG1 Fc(PGLALA)에 특이적으로 결합하는 고정된 항체로, CM5 센서칩 표면 상에서 포획하였다(본원에 원용된 WO 2017/072210을 참조). 포획 항체는 표준 아민 결합 키트(GE Healthcare)를 이용한, pH 5.0에서 대략 8700 공명 단위(RU)의 직접적인 고정화에 의해 센서칩 표면에 결합되었다. TCB 분자는 10 μl/분의 유량으로 5 nM에서 30 s 동안 포획하였다.
인간 및 시노몰구스 항원(하기를 참조)을 240초에 걸쳐 유세포를 통해 30 μl/분의 흐름으로 12.35~3000 nM의 농도로 통과시켰다. 해리 단계는 240초 동안 모니터링하고 샘플 용액에서 HBS-EP로 전환하여 촉발하였다. 모든 주기 후, 30초 동안 10 mM 글리신 pH 2.0의 1회 주입을 이용하여 칩 표면을 재생시켰다.
이용된 항원은 구멍 내 돌기 변형 및 C 말단 Avi 태그를 갖는 인간 Fc 도메인에 융합된 인간 또는 시노몰구스 CD3 델타 및 CD3 엡실론 엑토도메인 중에서 어느 한 가지의 이종이량체이었다(서열번호 28과 29(인간 CD3) 및 서열번호 30과 31(시노몰구스 CD3)을 참조).
참조 흐름 세포(포획된 TCB 없음)에서 수득한 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 친화도 상수는 Biaeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합에 피팅함으로써 동역학 속도 상수로부터 유도하였다.
인간 및 시노몰구스 CD3에 결합에 대한 KD 값은 각각 TYRP1 TCB CD3opt에 대해 50 nM 및 20 nM로서 결정하였고 TYRP1 TCB CD3orig에 대한 것들(각각, 50 nM 및 40 nM)과 유사하였다.
이는 스트레스가 없는 조건에서 CD3opt 또는 CD3orig 중에서 어느 한 가지를 포함하는 TCB 둘 모두가 재조합 CD3에 동등하게 잘 결합하였다는 것을 보여준다.
재조합 인간 CD3에 대한 TYRP1 TCB의 결합은 또한, 최적화된 또는 본래 CD3 결합 서열 중에서 어느 한 가지를 포함하는 TCB를 이용하여, 37℃ 또는 40℃에서 14일 동안 온도 스트레스 후 평가하였다. 실험은 IgG 분자 대신에 TCB를 이용하여, 상기 실시예 2에서 설명된 바와 같이 실시하였다.
이러한 실험의 결과는 도 7에서 도시된다.
도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 최적화된 CD3 결합체 CD3opt를 포함하는 TCB는 본래 CD3 결합체 CD3orig를 포함하는 TCB와 비교하여 스트레스(37℃, pH 7.4에서 2주) 후 CD3에 대한 강하게 향상된 결합을 보여주었다. 이러한 결과는 최적화된 CD3 결합체의 향상된 특성(실시예 2 참조)이 TCB 수준에서 유지된다는 것을 확인한다.
재조합 TYRP1에 결합
재조합 TYRP1에 결합은 상응하는 항체의 플라스민 소화에 의해 제조된 TYRP1 Fab 단편을 이용하여 SPR에 의해 평가하였다.
SPR 실험은 HBS-EP를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20(GE Healthcare))으로서 이용하여 Biacore T200에서 실시하였다.
인간 IgG1 Fc(PGLALA)에 특이적으로 결합하는 항체(본원에 원용된 WO 2017/072210을 참조)는 표준 아민 결합 키트(GE Healthcare)를 이용하여 pH 5.0에서 CM5 센서 칩 상에 직접적으로 결합시켰다. 항원(하기를 참조)은 30초 동안 10 ml/분의 유량으로 포획하였다. TYRP1 Fab 단편의 3배 희석 계열을 180초 동안 30 ml/분으로 유세포에 통과시켜 결합 단계를 기록하였다. 해리 단계를 180 s 또는 1200 s 동안 모니터하고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발하였다. 모든 주기 후, 30초 동안 30 μl/분으로 10 mM 글리신 pH 2의 1회 주입을 이용하여 칩 표면을 재생하였다.
이용된 항원은 구멍 내 돌기(및 PG LALA) 변형 및 C 말단 Avi 태그를 갖는 인간 Fc 도메인에 인간, 시노몰구스 또는 마우스 TYRP1 세포외 도메인(ECD)의 단량체성 융합이었다(서열번호 32와 35(인간 TYRP1), 서열번호 33과 35(시노몰구스 TYRP1) 또는 서열번호 34와 35(마우스 TYRP1)를 참조).
참조 흐름 세포(포획된 항원 없음)에서 수득한 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. BIAeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수(KD)가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다.
인간, 시노몰구스 및 마우스 TYRP1에 결합에 대한 KD 값은 각각 130 pM, 180 pM 및 530 pM으로서 결정되었고, 모 TA99 항체에 대한 것들(각각 90 pM, 120 pM 및 310 pM)과 유사하였다.
재조합 TYRP1에 대한 TYRP1 TCB의 결합은 또한 최적화된 또는 본래 CD3 결합 서열 중에서 어느 하나를 포함하는 TCB를 이용하여 37℃ 또는 40℃에서 14일 동안 온도 스트레스 후 평가하였다.
실험은 재조합 TYRP1(Sino Biologicals)을 항원으로서 이용하여 CD3에 결합에 대해 전술된 바와 같이 실시하였다.
이러한 실험의 결과는 도 8에서 도시된다. 이들은 양쪽 TCB(뿐만 아니라 IgG 형식에서 상응하는 TYRP1 결합체)의 경우에, 인간 TYRP1에 대한 결합이 스트레스 조건에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 확인한다.
저캇 세포 상에서 CD3에 결합
인간 리포터 T 세포주 저캇 NFAT 상에서 CD3에 결합은 실시예 2에서 전술된 바와 같이, 최적화된 CD3 결합체 “CD3opt” 또는 본래 CD3 결합체 “CD3orig”를 포함하는 TYRP1 TCB에 대해 FACS에 의해 결정하였다.
도 9에서 도시된 바와 같이, 최적화된 CD3 결합체 “CD3opt”를 포함하는 TCB는 저캇 세포 상에서 CD3에 본래 CD3 결합체 “CD3orig”를 포함하는 TCB와 적어도 동등하게 잘 결합한다.
실시예 6 - 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 T 세포 이중특이적 항체의 생성
CD3 활성화
최적화된 CD3 결합체 CD3opt 또는 본래 CD3 결합체 CD3orig 중에서 어느 하나를 함유하는 TYRP1 TCB(실시예 4)는 TYRP1 양성 흑색종 세포 M150543(University of Zurich의 dermatology cell bank로부터 수득한 원발성 흑색종 세포주)의 존재하에서 저캇 NFAT 리포터 세포 검정(실시예 3 참조)에서 검사하였다.
TYRP1 양성 표적 세포 및 CD3 항원(저캇-NFAT 리포터 세포 상에서 발현됨)에 대한 TYRP1 TCB의 동시적 결합 시에, NFAT 프로모터가 활성화되어 활성 개똥벌레 루시페라아제의 발현을 야기한다. 발광 신호(루시페라아제 기질의 첨가 시에 수득함)의 강도는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다. 검정은 항 PGLALA 발현 CHO 세포 대신에 M150543을 이용하여 실시예 3에서 기재된 바와 같이 실시하였다.
이들 IgG (실시예 3)에 대해 알 수 있는 바와 같이, CD3opt 또는 CD3orig 중에서 어느 하나를 함유하는 TCB 둘 모두 저캇 NFAT 리포터 세포에 대한 유사한 기능적 활성을 갖고, CD3 활성화를 농도 의존성 방식으로 유도하였다(도 10).
표적 세포 사멸
그 다음 단계에서, 인간 흑색종 세포주 M150543과 공동배양된 3명의 상이한 공여자로부터 새로 단리된 인간 PBMCs를 이용한 종양 세포 사멸 검정에서 양쪽 TCB 분자를 검사하였다. 종양 세포 용해는 24시간 및 48시간 후 LDH 방출에 의해 결정하였다. CD4 및 CD8 T 세포의 활성화는 48시간 후 두 세포 하위 집합 모두에서 CD69 및 CD25의 상향 조절에 의해 분석하였다.
간단히 말하면, 표적 세포를 트립신/EDTA로 회수하고, 세척하고, 편평 바닥 96 웰 평판을 이용하여 30,000개 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 세포가 부착하도록 하룻밤 동안 방치하였다. 말초혈 단핵 세포(PBMCs)를 건강한 인간 공여자로부터 수득한 신선한 혈액의 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 준비하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 Histopaque 구배(Sigma, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후, PBMC 함유 간기를 초과하는 혈장을 폐기하였고, 50 ml의 PBS로 차후에 채워지는 새로운 Falcon 튜브 내로 PBMC를 옮겼다. 혼합물을 원심분리(400 xg, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고 PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계 350 xg, 10분). 결과의 PBMC 모집단이 자동적으로(ViCell) 계수되고, 그리고 추가 이용 때까지(24시간보다 길지 않음) 세포 배양기에서 37℃, 5% CO2에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루탐(Biochrom, #K0302)을 내포하는 RPMI1640 배지에서 보관되었다. 사멸 검정을 위해, 항체가 지시된 농도에서 삼중으로 첨가되었다. PBMC를 10:1의 최종 효과기 대 표적(E:T) 비율로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸은 37℃, 5% CO2에서 24시간의 배양 후, 아폽토시스성/괴사성 세포에 의해 세포 상층액 내로 방출된 LDH의 정량(LDH 검출 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001)에 의해 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 표적 세포를 1% Triton X-100과 함께 배양하여 달성하였다. 적어도 용해(= 0%)는 이중특이적 구조체 없이 효과기 세포와 공동 배양된 표적 세포를 의미한다.
TCB에 의해 매개된 표적 세포의 T 세포 사멸 시에 CD8과 CD4 T 세포의 활성화는 T 세포 활성화 마커 CD25(후기 활성화 마커) 및 CD69(초기 활성화 마커)를 인식하는 항체를 이용하여 유세포분석법에 의해 평가하였다. 48시간 배양 후, PBMC를 둥근 바닥 96 웰 평판으로 옮기고, 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고, FACS 완충액으로 2회 세척하였다. CD4 APC (BioLegend #300514), CD8 FITC (BioLegend #344704), CD25 BV421 (BioLegend #302630) 및 CD69 PE (BioLegend #310906)에 대한 표면 염색은 공급업체의 사용설명서에 따라서 실시하였다. 세포는 150 μl/웰 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 100 μl/웰 고정 완충액(BD, #554655)을 이용하여 4℃에서 15분 동안 고정시켰다. 원심분리 후, 표본은 200 μl/웰 FACS 완충액에서 재현탁시켰다. 표본은 BD FACS Fortessa에서 분석하였다.
3명의 공여자 모두에서, 최적화된 또는 본래 CD3 결합체 중에서 어느 한 가지를 포함하는 TCB 둘 모두가 T 세포 활성화 및 종양 세포 용해를 비슷한 방식으로 유도하였다 (도 11). 48 시간 후 3명의 공여자 모두에 대한 종양 세포 용해의 EC50 값은 표 3에서 요약된다.
표 3. 48 시간에서 TYRP1 TCB를 이용한 종양 세포 사멸의 EC50 값의 요약.
Figure pct00039
실시예 7 - 마우스에서 T 세포 이중특이적 항체를 사용한 PK 연구인간 FcRn 유전자도입(line32, 동형접합성) 및 FcRn 녹아웃 마우스(Jackson Laboratory 계통 번호 003982 및 014565)(n=3/계통/검사 화합물)에게 1 mg/kg에서 정맥내 일시 주사 투여 이후에, 상이한 CD3 결합체(CD3orig 및 CD3opt)를 포함하는 TYRP1 TCB의 약물동력학(PK)이 연구되었다. 연속 혈액 극소표본이 인간 FcRn 유전자도입(tg) 마우스에서 672 시간까지(투약후 5 분으로부터 672 시간까지 마우스마다 9개 표본) 및 FcRn 녹아웃(ko) 마우스에서 96 시간까지(투약후 5 분으로부터 96 마우스까지 마우스마다 8개 표본) 채취되었다. 혈청을 준비하고 분석시까지 냉동 보관했다. 비-GLP 조건 하에 cobas® e411 (Roche) 기기를 이용하여, 인간 Ig/Fab CH1/카파 도메인에 대해 특이적인 일반 ECLIA 방법으로 마우스 혈청 표본이 분석되었다. 약동학 평가는 표준 비구획 분석을 사용하여 실시하였다.
이 연구의 결과는 표 4에 제시되어 있다. 이는 CDR의 조작이 항체 청소율에 영향을 미칠 다른 서열 문제를 일으키지 않았음을 나타낸다. CD3opt는 증가된 CDR 안정성의 추가 유익성을 가지면서, 혈청 반감기의 관점에서 CD3orig와 동등하게 우수하다.
표 4. huFcRn tg 마우스 및 FcRn ko 마우스에서 소실 데이터(ml/일/kg; 평균 및 (CV)).
Figure pct00040
실시예 8 - 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 추가 T 세포 이중특이적 항체의 생성실시예 1에서 확인된 최적화된 CD3 결합체(“CD3opt”, 서열번호 7 (VH) 및 11 (VL))가 CD3 및 EGFRvIII을 표적으로 하는 T-세포 이중특이적 항체(TCB)(“EGFRvIII TCB”)를 생성하는 데 이용되었다.
이러한 TCB (P063.056) 내에 포함된 EGFRvIII 결합체는 파지 전시로부터 유래되고, 그 이후에 친화성 성숙이 뒤따랐고(하기 참조), 각각 서열번호 88 및 92에서 도시된 중쇄와 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
TCB 분자의 개략적 도해는 도 6에서 제공되고, 그리고 이의 전체 서열은 서열번호 109, 110, 111 및 27에서 제공된다.
본래 CD3 결합 서열을 갖는 유사한 분자 역시 제조되었다(서열번호 109, 110, 111 및 26).
이중특이적 분자가 HEK293 EBNA 세포의 일시적인 형질감염에 의해 산출되고, 정제되고, 그리고 실시예 4에서 전술된 바와 같이 분석되었다.
게다가, 파지 전시로부터 유래된 EGFRvIII 항체가 아래에 설명된 바와 같은 용도를 위해, 인간 IgG1 형식에서 유사한 방식으로 (HEK EBNA 세포를 IgG 중쇄와 경쇄에 대한 발현 벡터로 1:1 비율에서 형질감염시킴) 생산되었다.
모든 IgG 및 TCB 작제물이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정될 때 95%를 초과하는 단량체 함량으로, 동등한 품질로 정제되었다.
EGFRvIII 항체의 선택
EGFRvIII 항체는 파지 디스플레이 및 친화성 성숙으로부터 유도되었다. EGFRvIII에 대한 높은 친화성 결합 및 특이성을 보여주는 항체(P056.021 (서열번호 40과 44), P056.052 (서열번호 48과 52), P047.019 (서열번호 56과 60), P057.012 (서열번호 64와 68), P057.011 (서열번호 72와 76), P056.027 (서열번호 80과 84))는 EGFRvIII를 안정되게 발현하는 CHO 세포 및 EGFRvIII 양성 인간 교모세포종 세포주 DK-MG를 이용하여 세포 표면 상에서 발현되는 EGFRvIII에 결합에 대해 검사되었다. 특이성을 확증하고 야생형 EGFR (EGFRwt)에 대한 교차반응성을 배제하기 위해, 이들 선별된 항체는 EGFRwt 양성 인간 종양 세포주 MKN-45에 결합에 대해 검사되었다 (도 12). 세툭시맙이 EGFRwt에 결합에 대한 양성 대조로서 포함되었고, 그리고 표적화되지 않은 DP47 IgG가 음성 대조로서 포함되었다. 모든 선별된 항체는 EGFRwt에 대한 교차반응성 없이 EGFRvIII에 특이적으로 결합하였고 추가 특성화가 고려되었다.
그 다음 단계에서, 발광을 측정함으로써, 항-PGLALA 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 Jurkat NFAT 리포터 세포와 공동배양된 DK-MG 세포에서, IgG1 PGLALA (Fc 영역 내에 P329G L234A L235A (“PGLALA”, EU 넘버링) 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 형식)로서 이들 EGFRvIII 항체의 기능적 활성이 평가되었다 (CAR J 검정, 그 전체가 본원에 원용된 PCT 출원 번호 PCT/EP2018/086038을 참조한다). DP47 IgG1 PGLALA가 음성 대조로서 포함되었다. 모든 검사된 EGFRvIII 항체는 CAR-발현 Jurkat NFAT 리포터 세포의 강한 활성화를 유도하였다 (도 13). 가장 약한 결합 및 활성화를 보인 P047.019를 제외하고, 모든 검사된 EGFRvIII 항체가 TCB 형식 (CD3 결합체로서 CDorig 포함)으로의 전환을 위해 선택되었다.
TCB 형식으로 전환된 선별된 EGFRvIII 항체의 CHO-EGFRvIII 세포에 대한 결합이 상응하는 IgG의 결합 (도 14)과 비교되어, TCB 형식으로의 전환이 EGFRvIII 항체의 결합능에 어떤 영향도 주지 않는다는 것이 확증되었다. 검사된 EGFRvIII 클론 중에서 대부분은 TCB 형식으로의 전환 시에 EGFRvIII에 결합하는 능력을 유지하였다; 단지 클론 P057.011만 상응하는 IgG와 비교하여 TCB 형식에서 EGFRvIII에 대한 약간 감소된 결합을 보여주었다 (표 5).
표 5. CHO-EGFRvIII에 대한 EGFRvIII IgG 및 TCB의 결합 (EC50).
Figure pct00041
차후에 EGFRvIII TCB의 기능적 활성이 EGFRvIII 양성 DK-MG 세포에 대한 Jurkat NFAT 리포터 세포 검정에서 검사되었다 (도 15). 모든 검사된 EGFRvIII TCB가 Jurkat NFAT 리포터 세포 검정에서 활성을 가졌는데, P056.021이 가장 강력하고, 유사한 활성을 갖는 P056.027, P056.052 및 P057.012가 그 뒤를 잇고, 그리고 P057.011이 가장 낮은 활성을 가졌다. 그 다음, 이들 EGFRvIII TCB는 EGFRwt에 대한 EGFRvIII TCB의 교차반응성을 배제하기 위해 DK-MG 또는 MKN-45 세포 중에서 어느 한 가지와 공동배양된 PBMCs를 이용한 종양 세포 용해 검정에서 검사되었다 (도 16). 이러한 검정에서, 종양 세포 용해와는 별개로, T 세포 활성화(도 17) 및 사이토킨 방출(도 18)을 추가 판독으로서 측정하였다. 앞선 리포터 세포 검정에서 목격되는 바와 같이, EGFRvIII TCB P056.021은 EGFRwt 양성 세포에 대한 어떤 활성도 없이, EGFRvIII 양성 세포에 대한 가장 높은 활성을 가졌다. EGFRvIII TCB P057.011은 EGFRwt 세포에서 비특이적 활성을 보였으므로 제외되었다. EGFRvIII TCBs P056.027, P056.052 및 P057.012는 비슷한 활성을 가졌다. 이들 결과에 근거하여, EGFRvIII 결합체 P056.021 및 P057.012가 추가 라운드의 친화성 성숙을 위해 선택되었다.P057.012로부터는 우수한 결합체가 유래될 수 없었다 (결과는 도시되지 않음). SPR에 의해 결정된 바와 같은, P056.021로부터 유래된 선별된 EGFRvIII 결합체의 EGFRvIII에 대한 친화성과 특이성은 표 6에서 도시된다.
표 6. SPR에 의해 결정된 바와 같은, 선별된 EGFRvIII 결합체의 EGFRvIII에 대한 친화성과 특이성.
Figure pct00042
친화성 성숙된 EGFRvIII 결합체(P063.056(서열번호 88과 92), P064.078(서열번호 96과 100), P065.036(서열번호 104와 108))는 또한, U87MG-EGFRvIII 및 MKN-45 세포 상에서 EGFRvIII에 특이적 결합에 대해 부모 결합체와 비교되었다(도 19). EGFRvIII에 대한 친화성과 특이성의 관점으로부터 최고 EGFRvIII 결합체, P063.056이 CD3orig 또는 CD3opt 중에서 어느 한 가지를 CD3 결합체로서 포함하는 TCB 형식으로의 전환을 위해 선택되었다.EGFRvIII TCB P063.056(CD3opt 또는 CD3orig를 포함)의 기능적 활성이 U87MG-EGFRvIII, DK-MG 및 MKN-45 세포에 대한 저캇 NFAT 리포터 세포 검정에서 부모 EGFRvIII TCB P056.021과 비교되었다(도 20). 3가지 TCB 모두 EGFRvIII 양성 세포의 존재에서만 특이적 저캇 NFAT 활성화를 유도한다. EGFRvIII TCB P063.056은 부모 EGFRvIII TCB P056.021보다 약간 더 높은 활성을 가졌다.
방법
표면 플라스몬 공명
EGFRvIII에 대한 EGFRvIII 항체의 친화성이 25 ℃에서, HBS-EP를 작업 완충액 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005 %(v/v) 계면활성제 P20; GE Healthcare)로서 이용하여 Biacore T200에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되었다. 항-EGFRvIII PGLALA IgG가 CM5 칩 위에 고정된, 인간 IgG1 Fc(PGLALA)에 특이적으로 결합하는 항체로 25 nM에서 30 s 동안 포획되었다(본원에 원용된 WO 2017/072210을 참조한다). EGFRvIII-ECD avi his 항원(하기 참조, 실시예 9)이 200 s에 걸쳐 모든 흐름 셀을 통해 30 μl/분의 유량으로 12.4-1000 nM의 농도에서 통과되었다. 해리 단계는 300초 동안 모니터링하고 샘플 용액에서 HBS-EP로 전환하여 촉발하였다. 모든 주기 후, 30초 동안 10 mM 글리신 pH 2.0의 1회 주입을 이용하여 칩 표면을 재생시켰다. 참조 흐름 세포(포획된 TCB 없음)에서 수득한 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. BIAeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다.
특이성 결정을 위해, 100 nM에서 40 s 동안 CM5 칩 위에 고정된 항-his(Penta His, Qiagen)로 EGFRvIII 및 EGFRwt ECD 항원이 포획되었다. 60 s 동안 10 mM 글리신 pH 2.0으로 재생 전, 500 nM에서 60 s 동안 항 EGFRvIII 항체의 단일 주입이 수행되었다. EGFRvIII 결합에 대해 50 이상의 반응 단위가 관찰되었다. 5 반응 단위(RU)를 초과하는 반응은 EGFRwt 결합에 대해 양성인 것으로 고려되었고, EGFRwt에 대해 5 RU 미만의 반응에서 IgG는 특이적인 것으로 분류되었다.
세포주
저캇 NFAT 리포터 세포(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P; Promega #CS176501)는 인간 CD3을 발현하는, NFAT 프로모터를 갖는 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주이다. 이들 세포는 ml당 0.1-0.5 mio 세포로 RPMI1640, 2g/l 글루코오스, 2 g/l NaHCO3, 10 % FCS, 25 mM HEPES, 1 % GlutaMAX, 1 x NEAA, 1 x 나트륨-피루브산염에서 배양되었다. 세포가 계대될 때는 언제든지, ml당 200 μg 최종 농도의 히그로마이신 B가 첨가되었다.
PGLALA CAR를 갖는 Jurkat NFAT 세포는 인하우스 산출되었다. 본래 세포주 (Jurkat NFAT; Signosis)는 인간 CD3을 통한 활성화 시에 루시페라아제 발현을 야기하는 NFAT 프로모터를 갖는 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주이다. 그들은 P293G LALA 돌연변이를 인식할 수 있는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작되었다. 배양될 때, 이들 세포는 10% FCS 및 1% 글루탐으로 보충되고 ml당 0.4-1.5 mio 세포 사이에 유지된 RPMI1640에서 현탁 상태에서 성장하였다.
CHO-EGFRvIII 세포는 기관 내에서 생성되었다. CHO-K1 세포는 EGFRvIII로 안정적으로 형질도입되었다. 세포를 5% FCS, 1% GlutaMAX 및 6 mg/ml 퓨로마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양하였다.
DK-MG (DSMZ #ACC 277)는 인간 교모세포종 세포주이다. DK-MG 세포는 EGFRvIII 발현에 대한 세포 분류에 의해 농축되었다. 이들 세포는 RPMI 1860, 10% FCS 및 1% GlutaMAX에서 배양되었다.
U87MG-EGFRvIII(ATCC HTB-14)는 EGFRvIII로 안정적으로 형질도입된 인간 교모세포종 세포주이다. 이들 세포는 DMEM, 10% FCS 및 1% GlutaMAX에서 배양되었다.
MKN-45 (DSMZ ACC 409)는 높은 수준의 EGFRwt를 발현하는 인간 위 선암종 세포이다. 이들 세포는 2% FCS 및 1% GlutaMAX를 함유하는 진전된 RPMI1640에서 배양되었다.
유세포분석법에 의한 표적 결합
결합 실험에 이용되는 세포를 회수하고, PBS로 세척하고, FACS 완충액에서 재현탁시켰다. 항체 염색을 96 웰 둥근 바닥 평판에서 실시하였다. 세포를 회수하고, 계수하고, 웰마다 100,000 내지 200,000개 세포를 분주하였다. 플레이트를 다시 400 xg에서 4분 동안 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 검사 항체를 FACS 완충액에서 희석하고, 20 μl의 항체 용액을 4℃에서 30분 동안 이들 세포에 첨가하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해, 이들 세포는 희석된 이차 항체 PE 접합된 AffiniPure F(ab’)2 단편 염소 항인간 IgG Fcg 단편 특이적(Jackson ImmunoResearch #109-116-170 또는 #109-116-098)의 첨가 전 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 4℃에서 30 분 배양 후, 결합되지 않은 이차 항체가 씻겨 나갔다. 측정 전, 이들 세포는 200 μl FACS 완충액에서 재현탁되고, 그리고 BD Canto II 또는 BD FACS Fortessa를 이용하여 유세포분석법에 의해 분석하였다.
EGFRvIII PGLALA IgG를 이용한 CAR J NFAT 리포터 세포 검정
T 세포 활성화를 유도하는 EGFRvIII PGLALA IgG의 효능을 CAR J NFAT 리포터 세포 검정을 이용하여 평가하였다. 상기 검정의 원리는 저캇-NFAT 가공된 효과기 세포를, 종양 항원을 발현하는 암 세포와 공동배양하는 것이다. PGLALA 돌연변이를 통한 CAR 및 표적 항원 EGFRvIII에 대한 IgG의 동시적 결합 시에만, NFAT 프로모터가 활성화되고, 저캇 효과기 세포에서 증가하는 루시페라아제 발현을 야기한다. 적절한 기질의 첨가 시에, 활성 개똥벌레 루시페라아제가 발광의 방출을 야기하는데, 이것은 CAR-매개된 활성화의 신호로서 측정할 수 있다. 간략하게, 표적 세포를 회수하고 생존력을 결정하였다. 검정이 시작되기 전날에, 30,000개 표적 세포/웰을 편평 바닥, 백색 벽 96 웰 평판(Greiner bio-one, #655098) 내에 100 μl 배지에 도말하였다. 그 다음 날, 배지를 제거하고, 25 μl/웰의 희석된 항체 또는 배지(대조를 위해)를 표적 세포에 첨가하였다. 차후에, 저캇 NFAT 리포터 세포를 회수하였고, ViCell을 이용하여 생존력율을 평가하였다. 세포는 세포 배양 배지에서 1.5 mio 세포/ml로 재현탁시키고, 2.5:1의 최종 효과기 대 표적(E:T) 비율 및 웰마다 75 μl의 최종 용적을 획득하기 위해 75,000개 세포/웰(50 μl/웰)로 종양 세포에 첨가하였다. 이후, 4 μl의 GloSensor(Promega, #E1291)를 각 웰에 첨가하였다(최종 용적의 2%). 세포를 가습된 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 시간의 종결 시점에서, 평판을 실온으로 조정하였다(약 15분). 이후, 25 ml/웰의 One-Glo 루시페라아제 (Promega, #E6120)를 첨가하였고, TECAN Spark를 이용하여 발광이 검출되기 전, 암실에서 15 분 동안 플레이트를 배양하였다.
EGFRvIII TCB를 이용한 Jurkat NFAT 리포터 세포 검정
T 세포 교차연결 및 차후에 T 세포 활성화를 유도하는 향상된 CD3 또는 본래 CD3 결합체 중에서 어느 하나를 포함하는 EGFRvIII TCB의 능력을 EGFRvIII 양성 세포 및 저캇-NFAT 리포터 세포를 이용하여 평가하였다. EGFRvIII 양성 표적 세포 및 CD3 항원 (Jurkat-NFAT 리포터 세포 상에서 발현됨)에 대한 EGFRvIII TCB의 동시적 결합 시에, NFAT 프로모터가 활성화되고, 그리고 활성 개똥벌레 루시페라아제의 발현을 야기한다. 발광 신호 (루시페라아제 기질의 첨가 시에 획득됨)의 강도는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다. 검정을 위해, 표적 세포를 회수하였고 ViCell을 이용하여 생존력을 결정하였다. 30,000개 표적 세포/웰을 편평 바닥, 백색 벽 96 웰 평판(Greiner bio-one #655098) 내에 100 ml 배지에 도말하였고, 50 μl/웰의 희석된 항체 또는 배지(대조를 위해)를 이들 표적 세포에 첨가하였다. 차후에, 저캇 NFAT 리포터 세포를 회수하였고, ViCell을 이용하여 생존율을 평가하였다. 히그로마이신 B가 없는 세포 배양 배지에서 세포를 1.2 mio 세포/ml로 재현탁시키고, 2:1의 최종 효과기 대 표적(E:T) 비율 및 웰마다 200 μl의 최종 용적을 수득하기 위해 60,000개 세포/웰(50 μl/웰)로 종양 세포에 첨가하였다. 이후, 4 μl의 GloSensor(Promega, #E1291)를 각 웰에 첨가하였다(최종 용적의 2%). 세포를 가습된 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 시간의 종결 시점에서, TECAN Spark를 이용하여 발광을 검출하였다.
T 세포 매개된 종양 세포 사멸
표적 세포를 트립신/EDTA로 회수하고, 세척하고, 편평 바닥 96 웰 평판을 이용하여 30,000개 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 세포가 부착하도록 하룻밤 동안 방치하였다. 말초혈 단핵 세포 (PBMCs)를 건강한 인간 공여자로부터 획득된 신선한 혈액의 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 준비하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 Histopaque 구배(Sigma, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리(450 xg, 30분, 실온) 후 PBMC 함유 경계면 위의 혈장을 버리고 PBMC를 새로운 팔콘 튜브로 옮긴 후 PBS 50 ml로 채웠다. 혼합물을 원심분리(400 xg, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고 PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계 350 xg, 10분). 결과의 PBMC 개체군을 자동적으로 (ViCell) 계수하고, 추가 이용 때까지(24시간보다 길지 않음) 세포 배양기에서 37℃, 5% CO2에서 10% FCS 및 1% GlutaMAX을 함유하는 RPMI1640 배지에서 보관하였다. 사멸 검정을 위해, 항체를 지시된 농도에서 삼중으로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 효과기 대 표적 (E:T) 비율에서 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸은 37℃, 5% CO2에서 24 시간의 배양 후, 아폽토시스성/괴사성 세포에 의해 세포 상층액 내로 방출된 LDH의 정량 (LDH 검출 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001)에 의해 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 표적 세포를 1% Triton X-100과 함께 배양하여 달성하였다. 적어도 용해(= 0%)는 이중특이적 구조체 없이 효과기 세포와 공동 배양된 표적 세포를 의미한다.
TCB에 의해 매개된 표적 세포의 T 세포 사멸 시에 CD8과 CD4 T 세포의 활성화는 T 세포 활성화 마커 CD25(후기 활성화 마커) 및 CD69(초기 활성화 마커)를 인식하는 항체를 이용하여 유세포분석법에 의해 평가하였다. 48 시간 배양 후, PBMC를 둥근 바닥 96 웰 평판으로 옮기고, 350 x g에서 5 분 동안 원심분리하고, FACS 완충액으로 2회 세척하였다. CD4 APC (BioLegend, #300514), CD8 FITC (BioLegend, #344704), CD25 BV421 (BioLegend, #302630) 및 CD69 PE (BioLegend, #310906)에 대한 표면 염색은 공급업체의 사용설명서에 따라서 실시하였다. 세포는 150 μl/웰 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 100 μl/웰 고정 완충액(BD, #554655)을 이용하여 4℃에서 15분 동안 고정시켰다. 원심분리 후, 표본은 200 μl/웰 FACS 완충액에서 재현탁시켰다. 표본은 BD FACS Fortessa에서 분석하였다.
상층액의 사이토카인 분비는 제조업체의 지침에 따라 세포측정 비드 어레이(CBA)를 사용하여 유세포 분석기로 측정하였지만, 50 μl 비드 및 샘플 대신 25 μl의 상층액과 비드만 사용하였다. 하기의 CBA 키트(BD Biosciences)를 사용하였다. CBA 인간 인터페론 감마(IFNγ) Flex Set, CBA 인간 그랜자임 ß Flex Set 및 CBA 인간 TNF Flex Set. 표본을 BD FACS Canto II 또는 BD FACS Fortessa를 이용하여 측정하였고 Diva 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 분석을 실시하였다.
실시예 9 - CD3 및 EGFRvIII에 대한 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 T 세포 이중특이적 항체의 결합
재조합 CD3에 결합
재조합 CD3에 대한 EGFRvIII TCB의 결합은 상기 실시예 5에서 TYRP1 TCB에 대해 설명된 바와 같이, 최적화된(EGFRvIII TCB CD3opt) 또는 본래(EGFRvIII TCB CD3orig) CD3 결합 서열 중에서 어느 하나를 포함하는 TCB를 이용하여, SPR에 의해 평가되었다. 포획 항체가 표준 아민 결합 키트(GE Healthcare)를 이용한 pH 5.0에서 대략 5200 공명 단위(RU)의 직접적인 고정화에 의해 센서칩 표면에 결합되었고, TCB 분자가 10 μl/분의 유량으로 20 nM에서 30 s 동안 포획되었다.
인간 및 시노몰구스 CD3에 결합에 대한 KD 값은 TYRP1 TCB CD3opt에 대해 각각, 30 nM 및 20 nM로서 결정되었고, TYRP1 TCB CD3orig에 대한 것들(각각 40 nM 및 30 nM)과 유사하였다.
이것은 스트레스가 없는 조건에서 CD3opt 또는 CD3orig 중에서 어느 한 가지를 포함하는 TCB 둘 모두가 재조합 CD3에 동등하게 잘 결합하였다는 것을 보여준다.
재조합 인간 CD3에 대한 EGFRvIII TCB의 결합은 또한, 최적화된 또는 본래 CD3 결합 서열 중에서 어느 한 가지를 포함하는 TCB를 이용하여, 37℃ 또는 40℃에서 14일 동안 온도 스트레스 후 평가되었다. 실험은 IgG 분자 대신에 TCB를 이용하여, 상기 실시예 2에서 설명된 바와 같이 실시되었다.
이러한 실험의 결과는 도 21에서 도시된다.
도 21에서 확인할 수 있는 바와 같이, 최적화된 CD3 결합체 CD3opt를 포함하는 TCB는 본래 CD3 결합체 CD3orig를 포함하는 TCB와 비교하여, 스트레스 (37℃, pH 7.4에서 2주) 후 CD3에 대한 강하게 향상된 결합을 보여주었다. 이러한 결과는 최적화된 CD3 결합체의 향상된 특성(실시예 2 참조)이 TCB 수준에서 유지된다는 것을 다시 한 번 확인한다.
재조합 EGFRvIII에 결합
재조합 EGFRvIII에 대한 EGFRvIII TCB의 결합은 SPR에 의해 평가되었다.
SPR 실험은 HBS-EP를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20(GE Healthcare))으로서 이용하여, Biacore T200에서 실시되었다.
항 Fc 항체(GE Healthcare)가 표준 아민 결합 키트(GE Healthcare)를 이용하여 pH 5.0에서 CM5 센서 칩 상에 직접적으로 결합되었다. EGFRvIII TCB(5 nM)를 30초 동안 10 ml/분의 유량으로 포획하였다. EGFRvIII 항원의 3배 희석 계열을 200초 동안 30 ml/분으로 유세포에 통과시켜 결합 단계를 기록하였다. 해리 단계가 300 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 30초 동안 20 μl/분으로 3 M MgCL2의 1회 주입을 이용하여 칩 표면을 재생하였다.
이용된 항원은 C 말단 상에서 Avi 태그 및 His 태그에 융합된 인간 EGFRvIII의 세포외 도메인을 함유한다(EGFRvIII-ECD avi his; 서열 번호 36).
참조 흐름 세포(포획된 TCB 없음)에서 수득한 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. BIAeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수(KD)가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다. 겉보기 결합능 상수 KD는 이러한 2:1 상호작용에서 1:1 결합 적합을 이용한, 속도 상수를 통한 동역학적 분석에 의해 근사되었다.
인간 EGFRvIII에 결합에 대한 KD 값(친화성)은 CD3opt 또는 CD3orig 중에서 어느 하나를 포함하는 EGFRvIII TCB 둘 모두에 대해 6 nM로서 결정되었다.
재조합 EGFRvIII에 대한 EGFRvIII TCB의 결합은 또한, 최적화된 또는 본래 CD3 결합 서열 중에서 어느 하나를 포함하는 TCB를 이용하여, 37℃ 또는 40℃에서 14 일 동안 온도 스트레스 후 평가되었다. 실험은 EGFRvIII-ECD avi his를 항원으로서 이용하여, 실시예 5에서 전술된 바와 같이 실시되었다(상기 참조).
이러한 실험의 결과는 도 22에서 도시된다. 이들은 양쪽 TCB의 경우에, 인간 EGFRvIII에 대한 결합이 스트레스 조건에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 확인한다.
저캇 세포 상에서 CD3에 결합
인간 리포터 T 세포주 저캇 NFAT 상에서 CD3에 결합은 실시예 2에서 전술된 바와 같이, 최적화된 CD3 결합체 “CD3opt” 또는 본래 CD3 결합체 “CD3orig”를 포함하는 EGFRvIII TCB에 대해 FACS에 의해 결정되었다.
도 23에서 도시된 바와 같이, 최적화된 CD3 결합체 “CD3opt” 또는 본래 CD3 결합체 “CD3orig” 중에서 어느 하나를 포함하는 TCB는 저캇 세포 상에서 CD3에 동등하게 잘 결합하였다.
U87MG-EGFRvIII 세포 상에서 EGFRvIII에 결합
인간 교모세포종 세포주 U87MG-EGFRvIII 상에서 EGFRvIII에 결합은 CD3opt 또는 CD3orig 중에서 어느 하나를 갖는 EGFRvIII 결합체 P063.056, 또는 CD3orig를 갖는 EGFRvIII 클론 P056.021을 포함하는 EGFRvIII TCB에 대해 FACS에 의해 결정되었다. EGFRvIII 결합체 P063.056 또한, IgG 형식에 포함되었다.
도 24에서 도시된 바와 같이, 3가지 TCB 모두 U87MG-EGFRvIII 세포 상에서 발현되는 EGFRvIII에 높은 친화성으로 결합하고, 결합이 TCB 형식으로의 전환에 의해 약화되지 않는다.
실시예 10 - 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 T 세포 이중특이적 항체의 생성
CD3 활성화
실시예 8에서 전술된 바와 같이, EGFRvIII 양성 교모세포종 세포 DK-MG, U87MG-huEGFRvIII 및 EGFRwt 양성 MKN45 세포의 존재에서 저캇 NFAT 리포터 세포 검정에서, 선별된 EGFRvIII 결합체(P063.056) 및 최적화된 CD3 결합체 CD3opt 또는 본래 CD3 결합체 CD3orig 중에서 어느 하나를 함유하는 EGFRvIII TCB가 검사되었다.
이들 IgG(실시예 3)에 대해 목격되는 바와 같이, CD3opt 또는 CD3orig 중에서 어느 하나를 함유하는 TCB 둘 모두 저캇 NFAT 리포터 세포에 대한 유사한 기능적 활성을 갖고, CD3 활성화를 농도 의존성 방식으로 유도하였다(도 20).
표적 세포 사멸
선별된 EGFRvIII 결합체(P063.056) 및 최적화된 CD3 결합체 CD3opt 또는 본래 CD3 결합체 CD3orig 중에서 어느 하나를 함유하는 EGFRvIII TCB는 실시예 8에서 전술된 바와 같이, 교모세포종 세포주 U87MG-EGFRvIII 및 PBMCs의 존재에서 종양 세포 사멸 실험에서, 부모 EGFRvIII 결합체 P056.021 및 CD3 결합체 CD3orig를 내포하는 EGFRvIII TCB와 비교되었다. Jurkat NFAT 리포터 세포에서 목격되는 바와 같이, CD3opt 또는 CD3orig 중에서 어느 하나를 포함하는 TCB의 기능적 활성은 CD69 상향조절에 의해 측정할 때, 종양 세포 용해의 유도 및 CD4와 CD8 T 세포의 활성화에 대하여 유사하다 (도 25).
이에 더하여, “2+1 형식”(도 6에서 도해된 바와 같음)에서 EGFRvIII 결합체 P063.056 및 최적화된 CD3 결합체 CD3opt를 포함하는 EGFRvIII TCB의 기능적 활성이 “1+1 두미 형식”(도 1G에서 개략적으로 묘사됨)에서 동일한 EGFRvIII 및 CD3 결합체를 포함하는 EGFRvIII TCB와 비교되었다. 이들 2가지 EGFRvIII TCB는 실시예 8에서 설명된 바와 같이, 저캇 NFAT 리포터 세포 검정에서 및 교모세포종 세포주 U87MG-EGFRvIII을 이용한 종양 세포 사멸 검정에서 검사되었다. 2+1 형식에서 EGFRvIII TCB는 Jurkat NFAT 리포터 세포 검정에서 측정된 CD3 활성화(도 26)에서, 그리고 PBMCs를 이용한 사멸 검정에서 종양 세포 사멸 및 T 세포 활성화의 유도(도 27)에서 우수한 기능적 활성을 나타내었다.
실시예 11 - 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 T 세포 이중특이적 항체의 기능적 특성화
EGFRvIII TCB에 의한 T 세포 증식 및 활성화
선별된 EGFR 결합체 (P063.056) 및 최적화된 CD3 결합체 CD3opt 또는 본래 CD3 결합체 CD3orig 중에서 어느 하나를 함유하는 EGFRvIII TCB의 기능적 활성은 U87MG-EGFRvIII 세포에 대한 T 세포 증식 검정에서, 부모 EGFRvIII 결합체 P056.021 및 CD3 결합체 CD3orig를 함유하는 EGFRvIII TCB와 비교되었다(도 28). 3가지 TCB 모두 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 강한 증식과 활성화를 유도하였다. CD3opt를 포함하는 P063.056 EGFRvIII TCB는 다른 2가지 EGFRvIII TCB보다 더욱 높은 활성을 가졌다.
EGFRvIII TCB에 의한 종양 세포 용해
그 다음, 선별된 EGFR 결합체(P063.056) 및 최적화된 CD3 결합체 CD3opt를 함유하는 EGFRvIII TCB, 및 부모 EGFRvIII 결합체 P056.021 및 CD3 결합체 CD3orig를 함유하는 EGFRvIII TCB는 DK-MG 세포와 공동배양된 PBMCs를 이용한 종양 세포 용해 검정에서 검사되었다(도 29). 이러한 검정에서, 종양 세포 용해와는 별개로, T 세포 활성화 및 사이토킨 방출이 추가 판독으로서 측정되었다. 앞서 목격된 바와 같이, CD3opt를 포함하는 P063.056 EGFRvIII TCB는 종양 세포 용해, T 세포 활성화 및 IFNγ와 TNFα의 방출에 대하여, CD3orig를 포함하는 P056.021 EGFRvIII TCB보다 더욱 높은 활성을 가졌다.
TYRP1 TCB에 의한 T 세포 활성화 및 종양 세포 용해
사이토킨 방출을 유도하는 TYRP1 TCB의 기능적 특성이 건강한 공여자로부터 단리된 PBMCs와 함께 원발성 흑색종 세포주 M150543의 공동배양에 의해 검사되었다. TYRP1 TCB를 통해 T 세포에 의해 매개된 종양 세포 용해가 24시간 및 48시간의 처리 후 분석되었다(도 30). 48시간의 처리 후, IFNγ 및 TNFα의 상층액 내로의 방출뿐만 아니라 CD4와 CD8 T 세포 활성화가 분석되었다. TYRP1 TCB는 24시간 후에 이미 강력한 종양 세포 용해를 유도할 수 있었다. 이는 CD25의 상향 조절뿐만 아니라 IFNγ 및 TNFα의 현저한 방출에 의해 결정된 CD4 및 CD8 T 세포의 강력한 활성화를 동반하였다.
방법
PBMC 분리
말초혈 단핵 세포(PBMCs)를 건강한 인간 공여자로부터 수득한 신선한 혈액의 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 준비하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 Histopaque 구배(Sigma, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리(450 xg, 30분, 실온) 후 PBMC 함유 경계면 위의 혈장을 버리고 PBMC를 새로운 팔콘 튜브로 옮긴 후 PBS 50 ml로 채웠다. 혼합물을 원심분리(400 xg, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고 PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계 350 xg, 10분). 결과의 PBMC 개체군이 자동적으로 (ViCell) 계수되고, 그리고 추가 이용 때까지 (24시간보다 길지 않음) 세포 배양기에서 37℃, 5% CO2에서 10% FCS 및 1% GlutaMAX을 내포하는 RPMI1640 배지에서 보관되거나, 또는 추가 이용 때까지 액체 질소에서 동결되고 보관되었다. 이용 전날에, 동결된 PBMCs가 해동되고 37℃에서 배지에서 하룻밤 동안 배양되었다.
T 세포 증식
간단히 말하면, 표적 세포가 수확되고, 계수되고, 그리고 PBS로 2회 세척되었다. 세포가 PBS에서 ml당 5 mio 세포로 재현탁되었다. 세포가 37℃에서 10 분 동안 5 μM의 최종 농도에서 세포 증식 염료 eFluor 670 (eBioscience, #65-0840-85)로 염색되었다. 염색 반응을 중단시키기 위해, 4 볼륨의 차가운 완전한 세포 배양 배지가 세포 현탁액에 첨가되고, 4℃에서 5 분 동안 배양되고, 그리고 이후, 배지로 3회 세척되었다. 표지화된 표적 세포가 계수되고, 그리고 RPMI1640, 10% FCS 및 1% GlutaMax에서 ml당 0.1 mio 세포로 조정되었다. 웰마다 10,000개 표적 세포가 96 웰 평판 내로 파종되었다. 이후 처리가 지시된 농도에서 첨가되었고, 그리고 종말에는 건강한 공여자로부터 단리된 100,000개 PBMCs가 웰마다 첨가되었다. 이들 세포는 37℃에서 5 일 동안 배양되었고, 이후 PBMCs가 수확되고 CD3 BUV395 (BioLegend, #563548), CD4 PE (BioLegend, #300508), CD8 APC (BioLegend, #344722), CD25 PE/Cy7 (BioLegend, #302612)로 염색되었다. 유세포분석법 (FACS Fortessa, BD Bioscience)에 의해 측정한 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에서 eFluor 670 염료의 희석에 의해 증식을 결정하였고, CD25 상향조절을 측정함으로써 CD4와 CD8 T 세포의 활성화를 결정하였다.
T 세포 매개된 종양 세포 사멸
표적 세포가 트립신/EDTA로 수확되고, 세척되고, 그리고 편평 바닥 96 웰 평판을 이용하여 30,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포가 부착하도록 하룻밤 동안 방치되었다. 사멸 검정을 위해, 항체가 지시된 농도에서 삼중으로 첨가되었다. PBMC를 10:1의 최종 효과기 대 표적(E:T) 비율에서 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸은 37℃, 5% CO2에서 24시간의 배양 후, 아폽토시스성/괴사성 세포에 의해 세포 상층액 내로 방출된 LDH의 정량(LDH 검출 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001)에 의해 평가하하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 표적 세포를 1% Triton X-100과 함께 배양하여 달성하였다. 적어도 용해(= 0%)는 이중특이적 구조체 없이 효과기 세포와 공동 배양된 표적 세포를 의미한다.
T 세포 활성화
TCB에 의해 매개된 표적 세포의 T 세포 사멸 시에 CD8과 CD4 T 세포의 활성화가 T 세포 활성화 마커 CD25(후기 활성화 마커) 및 CD69(초기 활성화 마커)를 인식하는 항체를 이용하여 유세포분석법에 의해 평가하였다. 48 시간 배양 후, PBMCs가 둥근 바닥 96 웰 평판으로 옮기고, 350 x g에서 5 분 동안 원심분리하고, FACS 완충액으로 2회 세척하였다. CD4 APC (BioLegend, #300514), CD8 FITC (#344704, BioLegend), CD25 BV421 (BioLegend, #302630) 및 CD69 PE (BioLegend, #310906)에 대한 표면 염색을 공급업체의 사용설명서에 따라서 실시하였다. 세포는 150 μl/웰 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 100 μl/웰 고정 완충액(BD, #554655)을 이용하여 4℃에서 15 분 동안 고정시켰다. 원심분리 후, 표본은 200 μl/웰 FACS 완충액에서 재현탁시켰다. 표본은 BD FACS Fortessa에서 분석하였다.
사이토카인 분비
상층액의 사이토카인 분비는 제조업체의 지침에 따라 세포측정 비드 어레이(CBA)를 사용하여 유세포 분석기로 측정하였지만, 50 μl 비드 및 샘플 대신 25 μl의 상층액과 비드만 사용하였다. 하기의 CBA 키트(BD Biosciences)를 사용하였다. CBA 인간 인터페론 감마(IFNγ) 플렉스 세트 및 CBA 인간 TNF 플렉스 세트. 표본을 BD FACS Canto II 또는 BD FACS Fortessa를 이용하여 측정하였고, Diva 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 분석을 실시하였다.
실시예 13 - 최적화된 CD3 결합체를 포함하는 T 세포 이중특이적 항체의 생체내 효능
TYRP1 TCB(실시예 1에서 확인된 최적화된 CD3 결합체를 포함)가 인간 종양 세포주의 이종이식 마우스 모형인 IGR-1 흑색종 이종이식 모형에서 항종양 효능에 대해 검사되었다.
IGR-1 세포(인간 흑색종)가 10% FCS(Sigma)를 함유하는 DMEM 배지에서 배양되었다. 이들 세포는 물 포화된 공기 하에 5% CO2에서 37℃에서 배양되었다. 이식을 위해 계대 6이 이용되었다. 마우스 생존력은 96.7%이었다. 동물마다 2x106개 세포가 1 ml 투베르쿨린 주입기 (BD Biosciences, Germany)를 이용하여 마우스의 옆구리 내로 100 μl의 RPMI 세포 배양 배지(Gibco)에 담겨 피하 주입되었다.
완전 인간화 NSG 암컷 마우스(Roche Glycart AG, Switzerland)는 약속된 지침(GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라서 12시간 밝음 / 12시간 어둠의 매일 주기에서 특정 병원체 부재 조건 하에 유지되었다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부(ZH223/2017)에 의해 검토되고 승인되었다. 지속적인 건강 모니터링을 정기적으로 실시하였다.
연구 0일에 2x106개의 IGR-1 세포를 마우스에 피하 주사하고, 무작위 배정하고, 무게를 측정하였다. 종양 세포 주입 20일 후(종양 부피 > 200 mm3), 마우스에 i.v. 10 μg(0.5 mg/kg) TYRP1 TCB를 5주 동안 매주 2회 투여하였다. 모든 마우스에 200 μl의 적절한 용액을 i.v. 주사하였다. 비히클 군에서 마우스는 히스티딘 완충액을 주사하였고, 치료군은 TYRP1 TCB 작제물을 주사하였다. 200 μl당 합당한 양의 항체를 획득하기 위해, 필요할 때 원액이 히스티딘 완충액으로 희석되었다. 종양 크기를 캘리퍼스로 주 3회 측정하고, GrahPad Prism 소프트웨어로 용적 (mm3 +/- SEM)으로서 플롯팅하였다. 통계학적 분석을 JMP12 소프트웨어로 실시하였다.
도 31은 TYRP1 TCB가 비히클 군과 비교하여, 종양 성장 저해의 관점에서 유의미한 효능을 매개하였다는 것을 보여준다(68% TGI, p=0.0058*).
EGFRvIII TCB(실시예 1에서 확인된 최적화된 CD3 결합체를 포함)가 인간 종양 세포주의 이종이식 마우스 모형인 U87-EGFRvIII 교모세포종 이종이식 모형에서 항종양 효능에 대해 유사하게 검사되었다.
U87 세포(인간 교모세포종)는 ATCC(Manassas, USA)로부터 최초 획득되었고, 인간 EGFRvIII 단백질을 발현하도록 안정되게 형질감염되었다(Roche Glycart AG, Switzerland). 확대 후 이들 세포는 Roche Glycart 내부 세포 은행에 기탁되었다. U87-EGFRvIII 세포주는 10% FCS(Sigma) 및 0.5 μg/ml 푸로마이신(Invitrogen)을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 이들 세포는 물 포화된 공기 하에 5% CO2에서 37℃에서 배양하였다. 이식을 위해 계대 8을 사용하였다. 세포 생존율은 94.7%이었다. 동물마다 5x105개 세포가 1 ml 투베르쿨린 주입기(BD Biosciences, Germany)를 이용하여 마우스의 옆구리 내로 100 μl의 RPMI 세포 배양 배지(Gibco)에 담겨 피하 주입되었다.
완전 인간화 NSG 암컷 마우스(Roche Glycart AG, Switzerland)는 약속된 지침(GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라서 12시간 밝음/12시간 어둠의 매일 주기에서 특정 병원체 부재 조건 하에 유지되었다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부(ZH223/2017)에 의해 검토되고 승인되었다. 지속적인 건강 모니터링을 정기적으로 실시하였다.
연구 0일에 5x105개의 U87-EGFRvIII 세포를 마우스에 피하 주사하고, 무작위 배정하고, 무게를 측정하였다. 종양 세포 주입 2주 후(종양 부피 > 200 mm3), 마우스에 i.v. 10 μg(0.5 mg/kg) EGFRvIII TCB를 3주 동안 매주 2회 투여하였다. 모든 마우스에 200 μl의 적절한 용액을 i.v. 주사하였다. 비히클 군에서 마우스는 히스티딘 완충액이 주사되었고, 치료군은 EGFRvIII TCB 작제물이 주사되었다. 200 μl당 합당한 양의 항체를 획득하기 위해, 필요할 때 원액이 히스티딘 완충액으로 희석되었다. 종양 크기가 캘리퍼스로 주 3회 측정되고, GrahPad Prism 소프트웨어로 용적(mm3 +/- SEM)으로서 플롯팅되었다.
도 32는 EGFRvIII TCB가 종양 성장 조절의 관점에서 유의미한 효능을 매개하며, 모든 마우스가 완전 관해를 달성하였다는 것을 보여준다.
실시예 14 - 마우스에서 EGFRvIII TCB를 이용한 PK 연구
최적화된 CD3 결합체, CD3opt를 포함하는 EGFRvIII TCB의 약물동력학(PK)은 인간 FcRn 유전자도입(line32, 동형접합성) 및 NOD-SCID 마우스에게 1 mg/kg에서 정맥내 일시 주사 투여 이후에 연구되었다. 연속 혈액 극소표본이 인간 FcRn 유전자도입(tg) 마우스 및 NOD-SCID 마우스로부터 672시간까지(투약후 5분으로부터 672시간까지 마우스마다 9개 표본) 채취되었다. EGFRvIII TCB로 처리된 마우스 혈청의 표본은 비 GLP 조건 하에 특이적 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 이용하여 분석되었다. EGFRvIII TCB의 포획은 스트렙타비딘 코팅된 마이크로 역가 평판(SA-MTP) 상에서, 비오틴화된 EGFRvIII 항원(huEGFRvIII his 비오틴)으로 실시되었다. 결합된 EGFRvIII TCB는 인간 IgG1 Fc(PGLALA)에 대한 디곡시제닌 표지화된 단일클론 항체로 검출되고(실시예 3 참조), 그 이후에 항디곡시제닌-POD 이차 검출 항체의 첨가가 뒤따랐다. 신호는 퍼옥시다아제 기질(ABTS)의 첨가에 의해 생성되었다. 보정 범위는 2.35 ng/ml 내지 150 ng/ml이며, 2.5 ng/ml가 최저 정량 한계(LLOQ)이었다.
이 연구의 결과는 표 7에 제시되어 있다. EGFRvIII TCB의 PK 프로필은 검사된 마우스 계통 둘 모두에 대한 예상된 범위 내에 있다. 이는 CD3 결합체의 CDRs의 가공이 항체 소실에 영향을 줄 다른 서열 결점을 발생시키지 않았다는 것을 지시한다.
표 7. huFcRn tg 마우스 및 NOD-SCID 마우스에서 소실 데이터(ml/일/kg; 평균).
Figure pct00043
실시예 15 - CD3 결합제로서 CD3 opt 를 이용한 FOLR1 TCB:CD3 결합제로서 CD3 opt 를 사용하는 FOLR1 TCB의 변환 및 생성
CD3opt FOLR1 TCB('고전적인 2+1 형식' = CD3 Fab 외부, FOLR1 Fab 내부 Fc 돌기 사슬, 도 33의 A, 서열번호 127, 128, 129)의 생성을 위해, CD3 결합제 CD3opt의 가변 도메인을 적합한 발현 벡터 내에 삽입하였다. 분자는 Fc 효과기 기능을 없애기 위해 Fc 영역(LL234/235AA 및 P329G)에 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 백본으로 구성된다. T 세포 이중특이적 분자는 구멍 내 돌기 기술(표적 항원에 대한 2개의 결합 모이어티 및 CD3에 대한 1개의 결합 모이어티)에 기초한 독점 2+1 이종이량체 형식으로 생성하였다.
CD3 결합제로서 CD3 opt 를 사용하는 FOLR1 TCB의 형질감염 및 발현　
FOLR1 TCB의 발현은 ExpiCHO-S™ 세포(ExpiCHO™ 발현 시스템; 써모/깁코 #A29133)의 일시적 형질감염에 의해 실시하였다. ExpiCHO-S 세포는 제조업체의 지침에 따라 사전 배양하였다. 형질감염 당일, 멸균된 일회용 진탕 플라스크에 500 ml 세포를 6 x 10E6 생존 세포/mL로 분주하였다. 최적의 형질감염을 위해, 배양 부피 mL 당 총 1.0 μg 플라스미드 DNA 및 0.64 μl ExpiFectamine™ CHO 시약을 사용하였다.
차가운 OptiPRO™ Medium에 있는 ExpiFectamine™ CHO 시약의 개별 희석액 및 차가운 OptiPRO™ Medium에 있는 DNA를 실온에서 5분 동안 배양하였다. 희석된 ExpiFectamine™ CHO 시약을 희석된 DNA에 첨가하고 완전히 혼합한 다음 실온에서 5분 더 배양하였다. 이어서, 복합 혼합물을 세포에 첨가하고 회전 진탕기 플랫폼에서 상대 습도가 80% 이상이고 CO2가 8%인 37°C 배양기에서 배양한다.
공급업체의 권장 사항에 따라, High Titer Protocol을 단백질 발현에 사용하였다. 형질감염 후 1일째에 ExpiFectamine™ CHO Enhancer 및 단일 공급을 추가하고; 형질감염 후 1일째에 세포를 32°C로 이동하였다. 형질감염 후 8일째에 세포 상청액을 정제를 위해 회수하였다.
FOLR1 TCB의 정제
FOLR1 TCB를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 요약하면, 1 x PBS pH7.4로 평형화된 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼(GE Healthcare)에 상청액을 로딩하였다. 컬럼 부피가 5인 평형 완충액을 이용한 세척 단계 후, proTCB를 100 mM 아세트산나트륨 pH3.0을 사용하여 용출하였다. 유량은 5 ml/분으로 설정하였다. 취합한 분획을 물(1:5 v/v)로 희석하고 POROS HS 50 컬럼(써모피셔 사이언티픽)에 로딩하여 40 mM 아세트산나트륨 pH5.5로 평형화하였다. 평형 완충액으로 세척한 후, TCB를 27 컬럼 부피에 걸쳐 40 mM에서 1 M까지의 아세트산나트륨 구배를 사용하여 용출하였다. 유량은 7 ml/분으로 설정하였다. 수집된 분획을 분석적 크기 배제 크로마토그래피(Waters BioSuite)로 분석하고 단량체 종의 함량에 따라 취합하였다. 이어서, 취합한 분획을 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 장치(밀리포어(Millipore))를 사용하여 최종 부피 15 ml로 농축하였다. 농축된 풀을 하이로드(HiLoad) 26/60 수퍼덱스(Superdex) 분취용 등급 컬럼(GE Healthcare), 컬럼 부피 320 ml에 로딩하였다. 작업 완충액은 20 mM 히스티딘-HCl, 140 mM NaCl(pH 6.0)이었고, 유량은 3 ml/분으로 설정하였다. 단량체 종의 함량에 따라 분획을 취합하였다.　
Figure pct00044
표 8: CD3 결합제로서 cl22를 사용한 FOLR1 TCB의 생성/정제 결과
실시예 16 - FOLR1-TCB(CD3 opt )에 의해 매개되는 저캇 NFAT 활성화
CD3 클론22 결합제를 함유하는 FOLR1-TCB를 먼저 저캇 NFAT 리포터 분석에서 시험하였다.
FOLR1 표적 T 세포 이중특이적 항체(TCB)는 T 세포(저캇 NFAT) 상의 huFOLR1 코팅 비드 및 CD3엡실론에 동시에 결합하여 T 세포 활성화를 유도한다. T 세포 활성화는 저캇 NFAT 루시퍼라제 세포가 CD3엡실론(CD3ε)을 통해 활성화 시 루시퍼라제를 발현하기 때문에 발광으로 측정할 수 있다. 저캇-NFAT 리포터 세포주(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P; Promega #CS176501)는 인간 CD3ε을 발현하는 NFAT 프로모터를 갖는 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주이다. TCB가 종양 표적에 결합하고 CD3(교차결합)이 CD3ε에 결합하는 경우, One-Glo 기질(Promega)을 첨가한 후 Luminescence에서 루시페라아제 발현을 측정할 수 있다.
저캇 NFAT 검정 배지: RPMI1640, 2 g/l 포도당, 2 g/l NaHCO3, 10% FCS, 25 mM HEPES, 2 mM L-글루탐, 1 x NEAA, 1 x 피루브산나트륨
저캇 NFAT 배양 배지: RPMI1640, 2 g/l 포도당, 2 g/l NaHCO3, 10% FCS, 25 mM HEPES, 2 mM L-글루탐, 1 x NEAA, 1 x 피루브산나트륨; 새로 첨가된 히그로마이신 B 200 μg/ml.
65 μl 스트렙타비딘 다이나비드(Streptavidin Dynabeads)를 10 ml PBS에 희석하였다. 상기 비드를 400 rcf에서 4분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그런 다음, 30 μg의 비오티닐화된 FolR1 항원을 1.5 ml DPBS에 첨가한 다음, 스트렙타비딘 비드에 첨가하였다. 비드-항원 혼합물을 천천히 회전하면서 4°C에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 10 ml DPBS를 비드-ag 접합체에 첨가하고, 원심분리(4분, 400 rcf)하고 상청액을 버렸다. 접합체를 다시 5 ml DPBS로 세척한 다음 펠릿을 6 ml 검정 배지에 재현탁시켰다. 효과기 세포(저캇 NFAT)를 회수하고, 계수하고, 생존율을 확인하였다. 세포를 12 ml 검정 배지에 재현탁하기 전에 4분 동안 350 rcf에서 원심분리하였다. cAMP를 효과기 세포 현탁액(2% 최종 부피)에 첨가하였다.
코팅된 비드(10 μl/웰) 및 저캇 NFAT 효과기 세포(20 μl/웰 중 20.000개 세포/웰)를 cAMP와 혼합하고 384 웰 백색 벽 투명 바닥 플레이트(Greiner BioOne)에 첨가하였다. FOLR1-TCB는 희석 행이 준비되기 전에 저캇 분석 배지에서 희석하였고 웰당 10 μl를 첨가하였다. 세포를 가습 배양기에서 37°C에서 5.5시간 동안 비드 및 TCB/배지와 함께 배양한 후, 약 10분 동안 배양기에서 꺼내 실온에 적응시킨 후, 테칸 스파크(Tecan Spark)에서 검출 시간으로서 0.5초/웰을 사용하여 발광을 판독하였다.
FOLR1-TCB는 가교결합을 위해 huFOLR1 코팅된 비드를 사용하여 용량 의존적 저캇 NFAT 활성화를 유도하였다(도 34).
실시예 17 - FOLR1 pro-TCB(CD3 클론22)에 의해 매개되는 T 세포 사멸
CD3opt로 FOLR1-TCB의 유효성을 평가하기 위해, FOLR1 양성 Ovcar-3 세포를 사용하여 FOLR1-TCB에 의해 매개되는 표적 세포 세포독성 및 T 세포 활성화를 평가하였다. 인간 PBMC를 효과기 세포로 사용하고 T 세포 활성화 마커를 분자 및 세포와 함께 48시간 배양한 후 염색하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 건강한 인간 공여자로부터 수득한 버피 코트에서 분리하였다. 버피 코트를 멸균 PBS로 1:1로 희석하고 Histopaque 구배(시그마, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리(450 x g, 30분, w/o 제동, 실온) 후, PBMC 함유 간기를 50 ml의 PBS로 차후에 채워지는 새로운 팔콘 튜브에 이전하였다. 혼합물을 원심분리(400 x g, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고 PBMC 펠릿을 적혈구 용해를 위해 2 ml ACK 완충액에 재현탁시켰다. 약 2~3분 동안 37°C에서 배양한 후, 튜브를 멸균 PBS로 50 ml까지 채우고 350 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이 세척 단계는 2% FCS, 1X 글루타맥스(GlutaMax) 및 10% DMSO를 포함하는 고급 RPMI1640 배지에서 PBMC를 재현탁하기 전에 한 번 반복하였다. PBMC는 -80°C에서 CoolCell® Cell Freezing Containers(BioCision)에서 서서히 동결시킨 다음, 액체 질소로 옮겼다. 검정 시작 하루 전에, 접착성 표적 세포를 트립신/EDTA로 회수하고, 계수하고, 생존율을 확인하고, 검정 배지(RPMI1640, 2% FCS, 1X 글루타맥스)에 재현탁시켰다. 검정 시작 약 24시간 전에, PBMC를 RPMI1640 배지(10% FCS, 1X 글루타맥스)에서 해동시켰다. PBMC를 350 g에서 7분 동안 원심분리하고 신선한 배지(RPMI1640, 10% FCS, 1X 글루타맥스)에 재현탁시켰다. PBMC는 검정에 사용되기 전에 최대 24시간 동안 보관하였다. 검정 배지는 RPMI + 2% FCS + 1% 글루타맥스이었다.
표적 세포를 96 웰 편평 바닥 플레이트를 사용하여 20,000개 세포/웰(검정 배지에서 50 μl/웰)의 밀도로 분주하였다. 세포를 37°C의 가습 배양기에서 밤새 배양하였다. 분자를 검정 배지에서 희석하고 지시된 농도로 3중으로 첨가하였다. PBMCS를 회수하고 검정 배지에 재현탁하기 전에 7분 동안 350 g에서 원심분리하였다. 100 μl/웰에서 0.2 mio huPBMC(E:T 10:1, 분주된 표적 세포의 수를 기준으로 함)를 첨가한 후 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 표적 세포 사멸은 37℃, 5% CO2에서 48시간의 배양 후, 아폽토시스성/괴사성 세포에 의해 세포 상층액 내로 방출된 LDH의 정량(LDH 검출 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001)에 의해 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 LDH 판독 전에 1시간 동안 1% 트리톤 X-100과 함께 표적 세포의 배양에 의해 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 작제물 없이 효과기 세포와 공동배양된 표적 세포를 지칭한다. 흡광도(A492 nm-A650 nm)를 측정하여 LDH 방출을 측정하였다.
T 세포 활성화는 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포에서 CD69의 정량화에 의해 37°C, 5% CO2에서 48시간 배양 후 평가하였다.
플레이트를 400 x g에서 4분 동안 원심분리하기 전에 DPBS를 PBMC를 함유하는 웰에 첨가하였다. 상청액을 흡인하고 세포를 다시 PBS로 세척하고, 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 플레이트를 조심스럽게 와류시켜 세포 펠릿을 재현탁시켰다. 5 μl의 LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain을 DPBS에서 1:1000으로 희석하였다. 50 μl의 희석된 염료를 PBMC를 함유하는 웰에 첨가하였다. 보상 비드(Invitrogen ArcTM, 반응성 비드) 1방울을 첨가하여 빈 웰 1개를 준비하고 희석되지 않은 LIVE/DEAD 염료 1 μl를 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 과량의 색을 제거하기 위해 세포를 2회 세척하였고, 첫 번째는 150 μl PBS로, 두 번째는 150 μl FACS 완충액으로 세척하였다. 플레이트를 400 x g에서 4분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 세포를 조심스럽게 와류시켜 재현탁시켰다. 음성 비드(Invitrogen ArcTM, 음성 비드) 1방울을 LIVE 염색된 비드를 포함하는 보상 대조군 웰에 첨가하였다. 25 μl의 희석된 CD4/CD8/CD25/CD69 항체 혼합물(0.8 μl 각 색상/웰), 단일 항체(보상 대조군용; 0.8 μl AB + 24 μl FACS 완충액) 또는 FACS 완충액(염색되지 않은 대조군용)을 웰에 재현탁된 세포에 첨가하고, 플레이트를 4°C에서 60분 동안 배양하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해, 세포를 웰당 150 μl FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하고 세포를 조심스럽게 와류시켜 재현탁시켰다. 다음 주 분석을 위해 세포를 밤새 150 ul FACS + 1% PFA 완충액에 고정시켰다. 다음 날, 이들 세포를 150 μl FACS 완충액에서 재현탁시켰다. FACS LSR Fortessa를 사용하여 형광을 측정하였다.
용량 의존적 표적 세포 사멸은 huPBMC 및 FOLR1-TCB(CD3opt)와 함께 배양된 Ovcar-3 세포에 대해 나타날 수 있다(도 35의 A). 점선은 TCB 없이 표적 세포와 함께 배양된 huPBMC를 나타낸다. 표적 세포 세포독성은 CD4 및 CD8 양성 T 세포에 대해 CD69에 의해 측정된 T 세포 활성화와 상관관계가 있다(도 35의 B).
* * *
전술한 발명을 이해를 명확히 하기 위해 예시 및 실시예를 예로 들어 상세히 설명하였으나, 이러한 예시 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antibodies binding to CD3 and FolR1 <130> P36031 <160> 137 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3orig HCDR1 <400> 1 Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3opt HCDR1 <400> 2 Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3orig / CD3opt HCDR2 <400> 3 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3orig HCDR3 <400> 4 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3opt HCDR3 <400> 5 His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3orig VH <400> 6 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3opt VH <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 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Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Val His Ser Gly Pro Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110 Ile Lys <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII P056.052 HCDR1 <400> 45 Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII P056.052 HCDR2 <400> 46 Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Arg Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII P056.052 HCDR3 <400> 47 Val Ser Arg Ser Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII 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Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII P056.027 HCDR1 <400> 77 Asn Asn Trp Ile Ala 1 5 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII P056.027 HCDR2 <400> 78 Val Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII P056.027 HCDR3 <400> 79 Val Ser Arg Ser Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 80 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRvIII P056.027 VH <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Asn 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val 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Claims (31)

  1. CD3 및 엽산 수용체 1(FolR1)에 결합하는 이중특이적 항체로서,
    상기 이중특이적 항체는,
    (i) CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인으로서, 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 3의 HCDR 2, 및 서열번호 5의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제1 항원 결합 도메인; 및
    (ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 항원 결합 도메인의 VH는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고/또는 상기 VL은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체.
  3. CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체로서,
    상기 이중특이적 항체는,
    (i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 11의 VL 서열을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인; 및
    (ii) FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원 결합 도메인은 Fab 분자인, 이중특이적 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    FolR1에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항원 결합 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제2 항원 결합 도메인, 및/또는 존재하는 경우, 상기 제3 항원 결합 도메인은 Fab 분자인, 이중특이적 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원 결합 도메인은 Fab 분자이고, 여기서 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH가 상호 대체되는, 이중특이적 항체.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항원 결합 도메인, 및 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 종래의 Fab 분자인, 이중특이적 항체.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항원 결합 도메인, 및 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 Fab 분자이고, 여기서 불변 도메인 CL 내 위치 124에서 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 따른 넘버링), 위치 123에서 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되며(카바트에 따른 넘버링), 불변 도메인 CH1 내 위치 147에서 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고(카바트에 EU 색인에 따른 넘버링), 위치 213에서 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되는(카바트 EU 색인에 따른 넘버링), 이중특이적 항체.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 상기 제2 항원 결합 도메인은 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합되는, 이중특이적 항체.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 상기 제2 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고, (i) 상기 제2 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되거나, 또는 (ii) 상기 제1 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되는, 이중특이적 항체.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원 결합 도메인, 상기 제2 항원 결합 도메인, 및 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 각각 Fab 분자이고, 상기 이중특이적 항체는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함하고; (i) 상기 제2 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제1 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제1 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되거나, 또는 (ii) 상기 제1 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 도메인의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 상기 제2 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되며; 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 상기 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합되는, 이중특이적 항체.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1, Fc 도메인인, 이중특이적 항체.
  15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인인, 이중특이적 항체.
  16. 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc는 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 화합을 증진하는 변형을 포함하는, 이중특이적 항체.
  17. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 이중특이적 항체.
  18. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항원 결합 도메인, 및 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 서열번호 124의 HCDR 1, 서열번호 125의 HCDR 2, 및 서열번호 126의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 8의 LCDR 1, 서열번호 9의 LCDR 2, 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함하는, 이중특이적 항체.
  19. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    상기 제2 항원 결합 도메인, 및 존재하는 경우에, 상기 제3 항원 결합 도메인은 서열번호 123의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및/또는 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 이중특이적 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  21. 제20항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  22. CD3 및 FolR1에 결합하는 이중특이적 항체를 생성하는 방법으로서,
    (a) 상기 이중특이적 항체의 발현에 적합한 조건하에서 제21항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로 (b) 상기 이중특이적 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 따른 방법에 의해 생성된 CD3 및 FolR1에 결합하는, 이중특이적 항체.
  24. 제1항 내지 제19항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  25. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제19항 또는 23 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제24항에 따른 약학적 조성물.
  26. 질병의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제19항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제24항에 따른 약학적 조성물.
  27. 약제의 제조에서 제1항 내지 제19항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제24항에 따른 약학적 조성물의 사용.
  28. 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제19항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제24항에 따른 약학적 조성물의 사용.
  29. 개체에서 질병을 치료하는 방법으로서,
    제1항 내지 제19항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제24항에 따른 약학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 질병은 암인, 방법.
  31. 전술한 바와 같은 발명.
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