CN116462768B - 针对folr1的双特异性抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开了针对FOLR1的双特异性抗体及其用途，具体公开了针对FOLR1和CD3的双特异性抗体、编码该抗体的核酸、包含该核酸的载体，以及包含该核酸或该载体的宿主细胞。还公开了包含所述抗体的药物组合物和抗体‑药物缀合物，以及使用所述抗体的治疗方法。

Description

针对FOLR1的双特异性抗体及其用途

技术领域

本发明涉及靶向FOLR1和CD3的双特异性抗体，以及此类抗体的用途，特别是它们在癌症治疗中的用途。

背景技术

重定向T细胞疗法的潜力已由blinatumomab在血液系统恶性肿瘤中的批准证实，并且最近由靶向实体瘤(如结直肠癌和前列腺癌)的CD3双特异性抗体的早期临床活性的报告证实。CD3双特异性抗体具有作为有效癌症治疗剂的潜力，因为它们募集并激活广泛的T细胞库以对抗表达肿瘤相关细胞表面抗原的肿瘤细胞。它们绕开了T细胞受体和与抗原性肽复合的MHC I类结合的需要，而是将T细胞募集到表达细胞表面抗原的靶细胞。双特异性抗体的一个臂与肿瘤相关细胞表面抗原结合，另一臂与T细胞上的CD3蛋白结合，导致针对肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。

鉴于CD3双特异性抗体的高效力，用在正常组织中具有最小或受限表达的抗原以展现肿瘤选择性活性非常重要。叶酸受体-α (FRα，也称为FOLR1)是一种糖基磷脂酰肌醇连接的细胞表面糖蛋白，对叶酸具有高亲和力。大多数正常组织不表达FOLR1，并且生理性叶酸向大多数细胞的转运被认为是由其他几种蛋白质介导的，最显著的是还原叶酸载体。在浆液性和子宫内膜样上皮性卵巢癌、子宫内膜腺癌和腺癌亚型的非小细胞肺癌中发现了高水平的FOLR1。重要的是，FOLR1表达在卵巢癌患者的转移灶和复发癌中以及上皮性卵巢癌和子宫内膜癌化疗后得到维持。这些特性表明，FOLR1可以为全身性施用的T细胞重定向疗法的肿瘤特异性激活提供有前景的靶抗原。

发明内容

本公开提供了双特异性T细胞接合剂(BiTE)形式的FOLR1xCD3双特异性抗体FR1-V4-LLG-P329G-1.1和FR1-V4-LFLE-P329G。多种功能测定已证明双特异性T细胞接合剂形式的工程化FOLR1xCD3双特异性抗体对多种癌症(特别是FOLR1阳性癌症，例如结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、尿路上皮癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌)具有有效的抗肿瘤作用。

在一方面，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含与FOLR1结合的第一抗原结合区和与CD3结合的第二抗原结合区，该第一抗原结合区包含第一轻链可变区(VL1)和第一重链可变区(VH1)，该第二抗原结合区包含第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)，其中VL1包含分别具有如SEQ ID NO: 1-3所示氨基酸序列的LCDR 1-3；VH1包含分别具有如SEQ ID NO: 5-7所示氨基酸序列的HCDR 1-3；VL2包含分别具有如SEQ IDNO: 9-11所示氨基酸序列的LCDR 1-3；VH2包含分别具有如SEQ ID NO: 13-15所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

在本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，VL1包含与SEQID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；VH1包含与SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；VL2包含与SEQ ID NO: 12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；并且VH2包含与SEQ ID NO: 16具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VL1包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列；VH1包含如SEQID NO: 8所示的氨基酸序列；VL2包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列；并且VH2包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合区包含scFv，该scFv包含VL1和VH1，并且scFv任选地经由接头连接至VL2或VH2的N端。

在一些实施方案中，双特异性抗体包含：第一多肽链，从N端至C端包含：VH2、重链恒定区1 (CH1)、铰链区、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)；和第二多肽链，从N端至C端包含：scFv、任选的接头、VL2、轻链恒定区(CL)、铰链区、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)。

在一些实施方案中，CH1、CH2、CH3和铰链区各自独立地衍生自免疫球蛋白同种型IgG (例如人IgG)，优选地衍生自选自IgG1、IgG2和IgG4的IgG亚型(例如人IgG1、IgG2和IgG4)。

在一些实施方案中，CL衍生自λ轻链或κ轻链。

在一些实施方案中，铰链区各自独立地包含选自SEQ ID NO: 23-25中任一项的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CH2之一或两者包含能够降低双特异性抗体的效应功能的至少一个氨基酸突变，优选地至少一个突变选自L234A、L235A、G237A、P329G或其任何组合，或选自L234F、L235E、P329G或其组合。

在一些实施方案中，CH3之一或两者包含能够降低第一和第二多肽链之间的同二聚化的至少一个氨基酸突变。

在一些实施方案中，接头包含选自(G4S)n和GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n为选自1-5的整数，优选地接头包含如SEQ ID NO: 21或22所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 18具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 19具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 20具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，并且第二多肽链包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列，并且第二多肽链包含如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体是双特异性T细胞接合剂(BiTE)。

在另一方面，本公开提供了包含编码本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的核酸。

在又一方面，本公开提供了包含本文公开的核酸的载体。

在又一方面，本公开提供了包含本文公开的核酸或本文公开的载体的宿主细胞。

在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或赋形剂。

在本发明公开的药物组合物的一些实施方案中，药物组合物进一步包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

在又一方面，本公开提供了包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段和与其缀合的化学部分的缀合物。

在本发明公开的缀合物的一些实施方案中，化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。

在又一方面，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物。

在本文公开的方法的一些实施方案中，癌症是FOLR1阳性癌症。在一些实施方案中，癌症选自卵巢癌(例如，卵巢上皮癌，如浆液性和子宫内膜样上皮性卵巢癌)、子宫内膜癌(例如，子宫内膜腺癌)、输卵管癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)和肺癌(例如，非小细胞肺癌)。

在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

在另一方面，本公开提供了本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。

在另一方面，本公开提供了本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物，其用于治疗受试者的癌症。

在本文公开的用途的一些实施方案中，癌症是FOLR1阳性癌症。在一些实施方案中，癌症选自卵巢癌(例如，卵巢上皮癌，如浆液性和子宫内膜样上皮性卵巢癌)、子宫内膜癌(例如，子宫内膜腺癌)、输卵管癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)和肺癌(例如，非小细胞肺癌)。在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物与第二治疗剂组合。在一些实施方案中，第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

附图说明

可通过参考如利用了本发明的原理的示例性实施方案及其附图所示的以下详细描述来获得对本发明的特征和优点的理解：

图1显示了本发明的FOLR1×CD3 BiTE的一个实例的示意图。

图2显示了通过ELISA测量的FOLR1×CD3 BiTE针对重组人FOLR1的结合。

图3显示了通过ELISA测量的FOLR1×CD3 BiTE针对重组人CD3的结合。

图4A显示了通过流式细胞术测量的FOLR1×CD3 BiTE针对FOLR1表达细胞系SKOV3的结合。

图4B显示了通过流式细胞术测量的FOLR1×CD3 BiTE针对HT1080-FR1稳定细胞系的结合。

图5A显示了FOLR1×CD3 BiTE在FOLR1表达细胞系HT1080-FR1的存在下诱导的T细胞活化。

图5B显示了FOLR1×CD3 BiTE在FOLR1表达细胞系SKOV3的存在下诱导的T细胞活化。FR1-mAb、CD3-mAb以及FR1-mAb和CD3-mAb的组合用作对照。

图5C显示了FOLR1×CD3 BiTE在FOLR1阴性细胞系HT1080的存在下诱导的T细胞活化。FR1-mAb、CD3-mAb以及FR1-mAb和CD3-mAb的组合用作对照。

图5D显示了在靶细胞不存在的情况下FOLR1×CD3 BiTE诱导的T细胞活化。

图6显示了在人PBMC存在的情况下FOLR1×CD3 BiTE对FOLR1阳性HT1080-FR1细胞的杀伤。

图7显示了在人PBMC存在的情况下FOLR1×CD3 BiTE对FOLR1阴性HT1080细胞的杀伤。

图8A显示了用HT1080-FR1/PBMC异种移植并用FR1-V4-LFLE-P329G或FR1-V4-LLG-P329G-1.1处理的B-NDG小鼠的肿瘤体积。每组五只小鼠随机分组并用500 μg/kg的FR1-V4-LFLE-P329G或FR1-V4-LLG-P329G-1.1进行静脉内处理。肿瘤体积每周测量三次，持续15天。数据代表平均肿瘤体积±SEM。

图8B显示了用HT1080-FR1/PBMC异种移植并用FR1-V4-LFLE-P329G或FR1-V4-LLG-P329G-1.1处理15天的B-NDG小鼠的体重。数据代表平均体重±SEM。

具体实施方式

通过结合附图和以下实施方案的详细描述，本发明的上述特征和优点及其另外的特征和优点将在下文中得到更清楚的理解。

本文参照附图描述的实施方案是解释性的、示例性的，并用于一般性理解本发明。实施方案不应解释为限制本发明的范围。相同或相似的元素和具有相同或相似功能的元素在整个说明书中使用相同的参考数字表示。

除非另有说明或定义，否则所使用的所有术语都具有技术人员所清楚的本领域通常的含义。例如参考标准手册，如Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.和Klbl, H. eds., "Amultilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)",Helvetica Chimica Acta (1995), CH-4010 Basel, Switzerland; Sambrook等人, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel等人, eds., "Current protocols inmolecular biology", Green Publishing and Wiley InterScience, New York (1987);Roitt等人, "Immunology (6th Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001);以及Janeway等人, "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/ChurchillLivingstone, New York (2005)，以及以上引用的通用背景技术。

定义

如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个抗体”包括复数个抗体以及在一些实施方案中提及“一个抗体”包括多个抗体，诸如此类。

除非另有说明或定义，术语“包含”及其变体诸如“包括”和“含有”应理解为意味着包括所述的元素或步骤或元素组或步骤组，但不排除任何其他元素或步骤或元素组或步骤组。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其具有特异性结合特定抗原的能力。此类分子通常包含通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(或结构域)(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(或结构域)(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分如C1q (补体激活经典途径中的第一组分)。

免疫球蛋白的重链可分为三个功能区：Fd区、铰链区和Fc区(可结晶片段)。Fd区包含VH和CH1结构域，并与轻链结合形成Fab (抗原结合片段)。Fc片段负责免疫球蛋白效应功能，包括例如补体结合和与效应细胞的同源Fc受体结合。在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白类别中发现的铰链区充当柔性间隔区，允许Fab部分相对于Fc区在空间中自由移动。铰链结构域在结构上是多样的，在免疫球蛋白类别和亚类之间的序列和长度都不同。

根据晶体学研究，免疫球蛋白铰链区在结构和功能上可进一步细分为三个区域：上铰链、核心铰链和下铰链(Shin等人, Immunological Reviews 130:87, 1992)。上铰链包括从CH1的羧基末端到铰链中限制运动的第一个残基的氨基酸，通常是在两条重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫键。下铰链区连接CH2结构域的氨基末端，并包括CH2结构域中的残基。人IgG1的核心铰链区含有当通过二硫键形成二聚化时会产生环状八肽的序列，据信环状八肽充当枢轴，从而赋予柔性。免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性允许的构象变化可以影响抗体Fc部分的效应功能。

“轻链可变区”(VL)或“重链可变区”(VH)由通过三个“互补决定区”或“CDR”分隔的“框架”区组成。框架区用于对齐特异性结合抗原表位的CDR。CDR包括抗体中主要负责抗原结合的氨基酸残基。VL结构域和VH结构域从氨基端到羧基端都包含以下框架区(FR)和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3；VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

每个VL结构域和VH结构域的氨基酸排列与CDR的任何常规定义一致。常规定义包括Kabat定义(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, 1987和1991))、Chothia定义(Chothia和Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia等人, Nature 342:878-883, 1989)；Chothia Kabat CDR的复合，其中CDR-H1是Chothia CDR和Kabat CDR的复合；OxfordMolecular的抗体建模软件使用的AbM定义；以及Martin等人的CONTACT定义(world wideweb bioinfo.org.uk/abs)。Kabat提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号系统)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被赋予相同的编号。本公开可以使用根据这些编号系统中任一项定义的CDR，但是优选实施方案使用Kabat定义的CDR。

基于抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分子可以分为五类(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并可以进一步分为不同的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。基于轻链的氨基酸序列，抗体的轻链可以分为lambda (λ)链和kappa (κ)链。

如本文所用，术语“抗体”应以其最广泛的意义来理解，并且包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段和含有至少两个抗原结合区的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体可以含有另外的修饰，如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出期望的生物活性。

术语“双特异性抗体”在本发明的上下文中应理解为具有由不同的抗体序列限定的两个不同抗原结合区域的抗体。这可以理解为与不同的靶标结合，但也包括与一个靶标的不同表位相结合。本文所用术语“双特异性抗体”应以其最广泛的含义理解，包括全长双特异性抗体及其抗原结合片段。双特异性抗体可以含有另外的修饰，如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。双特异性抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出期望的生物活性。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原的能力。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。

术语抗体的“抗原结合部分”中涵盖的抗原结合片段的实例涵盖：(i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab’)₂片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii) Fab’片段，其本质上是具有部分铰链区的Fab；(iv) Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(v) Fd’片段，其具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；(vi) Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(vii)dAb片段，其由VH结构域组成；(viii) 分离的互补决定区(CDR)；(ix) 纳米抗体，含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头连接它们，使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv))。此类单链抗体也意在涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内。此外，该术语还包括包含一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)的“直链抗体”，其与互补的轻链多肽以及保留抗原结合活性的任何前述片段的修饰形式共同形成抗原结合区域。

这些抗原结合片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子之间如抗体和其靶抗原之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。亲和力代表抗原与抗体解离的平衡常数(KD)，是抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD的值越小，抗原决定簇和抗体之间的结合强度就越强。替代性地，亲和力也可以表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD。

亲合力是抗体和相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力涉及抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间的亲和力以及抗体上存在的相关结合位点的数量。通常，抗体结合抗原将以以下解离常数(KD)结合抗原：10^-5M至10^-12M或更小，并且优选10^-7M至10^-12M或更小，并且更优选10^-8M至10^-12M，和/或具有以下结合亲和力：至少10⁷M^-1，优选至少10⁸M^-1，更优选至少10⁹M^-1，如至少10¹²M^-1。通常认为任何大于10^-4M的K_D值表示非特异性结合。抗体与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以任何已知的合适方式来确定，包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，以及本领域已知的其不同变型。

术语“表位”是指抗原上抗体结合的位点。表位可以由连续的氨基酸或由一个或多个蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在变性溶剂的暴露中保留，而由三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在变性溶剂的处理中丢失。表位通常包括独特的空间构象中的至少3个，更通常地至少5个或8-10个氨基酸。表位限定了抗体的最小结合位点，并因此是抗体或其抗原结合片段的特异性靶标。

如本文所用，术语“序列同一性”是指两条序列(氨基酸)对齐后在相同位置具有相同残基的程度。例如，“一条氨基酸序列与SEQ ID NO:Y X%相同”是指氨基酸序列与SEQ IDNO: Y有X%的同一性，并被阐述为氨基酸序列中X%的残基与SEQ ID NO: Y中公开的序列的残基相同。通常，使用计算机程序进行此类计算。比较和对齐序列对的示例性程序包括ALIGN (Myers和Miller, 1988)、FASTA (Pearson和Lipman, 1988; Pearson, 1990)以及gapped BLAST (Altschul等人, 1997)、BLASTP、BLASTN或者GCG (Devereux等人, 1984)。

此外，在确定两条氨基酸序列之间的序列同一性的程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为氨基酸残基被替换为具有类似化学结构的另一种氨基酸残基的氨基酸取代，其对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有影响或基本上没有影响。此类保守氨基酸取代是本领域众所周知的。

此类保守取代优选地是以下组(a)至(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

特别优选的保守取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

如本文所用，术语“双特异性T细胞接合剂”或“BiTE”是指具有两个抗原结合结构域的多肽链分子，其中一个结合T细胞抗原并且第二个结合靶细胞表面呈递的抗原(参见PCT公开WO 05/061547；Baeuerle等人，2008，Drugs of the Future 33：137-147；Bargou等人，2008，Science 321：974-977，其通过整体引用并入本发明)。因此，本公开的BiTE有一个与FOLR1结合的抗原结合区和一个指向T细胞抗原的第二抗原结合区。

如本文所用，术语“载体”意在指能够运输其所连接的另一种核酸的核酸分子。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指已引入表达载体的细胞。

术语“药学上可接受”是指载剂或赋形剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有实质性毒害，和/或此类载剂或赋形剂被批准或可用于包括在对人肠胃外施用的药物组合物中。

如本文所用，术语“治疗”、“疗法”、“处理”等是指为了获得效果的目的而施用药剂或进行程序。这些效果在完全或部分地预防疾病或其症状方面可以是预防性的，和/或在实现疾病和/或疾病症状的部分或完全治愈方面可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”可以包括治疗哺乳动物，特别是人的疾病或病症(例如癌症)，并且包括：(a)在可能易感该疾病(例如，包括可能与原代疾病相关或由其引起的疾病)而尚未被诊断患病的受试者中预防疾病或疾病症状的发生;(b)抑制疾病，即阻止其发展;和(c)缓解疾病，即导致疾病的消退。治疗可以指在癌症的治疗或改善或预防中的任何成功指标，包括任何客观或主观参数，如症状的减少；缓解；消除疾病症状或使疾病病症对患者更容易忍受；减慢恶化或衰退速度；或使恶化的最后节点衰弱减少。症状的治疗或改善基于一个或多个客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，术语“治疗”包括本文公开的抗体或组合物或缀合物的施用，以预防或延迟、缓解、或阻止或抑制与疾病(例如癌症)相关的症状或病症的发展。术语“治疗效果”是指受试者中疾病、疾病症状或疾病副作用的减少、消除或预防。

如本文所用，术语“有效量”是指施用于受试者以治疗疾病的量足以实现该疾病的治疗。

如本文所用，术语“受试者”是指期望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者。用于治疗目的的“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜、以及实验室、动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。

双特异性抗体

本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含与FOLR1结合的第一抗原结合区和与CD3结合的第二抗原结合区，该第一抗原结合区包含第一轻链可变区(VL1)和第一重链可变区(VH1)，该第二抗原结合区包含第二轻链可变区(VL2)和第二重链可变区(VH2)，其中VL1包含分别具有如SEQ ID NO: 1-3所示氨基酸序列的LCDR 1-3；VH1包含分别具有如SEQ ID NO: 5-7所示氨基酸序列的HCDR 1-3；VL2包含分别具有如SEQ ID NO: 9-11所示氨基酸序列的LCDR 1-3；并且VH2包含分别具有如SEQ ID NO: 13-15所示氨基酸序列的HCDR 1-3。

在一些实施方案中，CDR序列根据Kabat编号系统定义。

当根据Kabat编号系统定义CDR序列时，本文公开的抗体的VL1包含分别具有如SEQID NO: 1 (SVSSSISSNNLH)、SEQ ID NO: 2 (GTSNLAS)和SEQ ID NO: 3 (QQWSSYPYMYT)所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，本文公开的抗体的VH1包含分别具有如SEQ ID NO:5 (GYGLS)、SEQ ID NO: 6 (MISSGGSYTYYADSVKG)和SEQ ID NO: 7 (HGDDPAWFAY)所示氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，本文公开的抗体的VL2包含分别具有如SEQ ID NO: 9(RSSTGAVTTSNYAN)、SEQ ID NO: 10 (GANKRAP)和SEQ ID NO: 11 (ALWYSNLWV)所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且本文公开的抗体的VH2包含分别具有如SEQ ID NO: 13(TYAMN)、SEQ ID NO: 14 (RIRSKYNNYATYYADSVKG)和SEQ ID NO: 15 (HGNFGSSYVSYFAY)所示氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，VL1包含与SEQID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；VH1包含与SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；VL2包含与SEQ ID NO: 12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；并且VH2包含与SEQ ID NO: 16具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VL1包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留与FOLR1结合的能力。在一些实施方案中，VH1包含如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留与FOLR1结合的能力。在一些实施方案中，VL2包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留与CD3结合的能力。在一些实施方案中，VH2包含如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸形成，前提是功能变体保留与CD3结合的能力。

功能变体包含或组成为与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、或至少99.9%的序列同一性的氨基酸序列。

在功能变体的内容中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40%，更优选不超过35%，更优选是1%至33%，更优选是5%至30%，更优选是10%至25%，更优选是15%至20%。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1至20，优选是1至10，更优选是1至7，还更优选是1至5，最优选是1至2。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量是1、2、3、4、5、6或7。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(FR)区，例如在FR1、FR2、FR3和/或FR4进行。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。此类保守取代优选地是以下组(a)至(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

特别优选的保守取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

在优选的实施方案中，VL1包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列；VH1包含如SEQID NO: 8所示的氨基酸序列；VL2包含如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列；并且VH2包含如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合区包含含有VL1和VH1的scFv，并且scFv任选地经由接头连接至VL2或VH2的N端。在一些实施方案中，scFv任选地经由接头连接至VL2的N端。在一些实施方案中，scFv任选地经由接头连接至VH2的N端。在一些实施方案中，scFv是通过经由接头连接VL1和VH1而形成的。

在一些实施方案中，接头可以是任何柔性接头。在一些实施方案中，接头包含(G4S)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGS (SEQ ID NO: 26)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ IDNO: 27)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 21)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29)。在优选的实施方案中，接头包含如SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

在其他实施方案中，接头包含GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGS (SEQ ID NO: 30)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 22)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 32)。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸序列GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 33)。在优选的实施方案中，接头包含如SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列。

本文公开的双特异性抗体可包含抗体的铰链区和包含CH2和CH3的Fc区。

IgG类抗体的铰链区是指重链CH1和CH2部分之间的短氨基酸序列区域，在抗体天然状态下相对柔性。

铰链区可包含野生型铰链序列的部分或全部或其具有一处或多处取代的变体。在一些实施方案中，铰链区可包含以下氨基酸序列之一：EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:34)；PKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 35)；KSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 36)；SCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 37)；CDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 24)；DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 38)；KTHTCPPCP (SEQ ID NO: 39)；THTCPPCP (SEQ ID NO: 40)；HTCPPCP (SEQ ID NO: 41)；TCPPCP (SEQ ID NO: 42)；或CPPCP (SEQ ID NO: 23)；或其具有一个或多个取代(例如，1-6个取代，例如1-5、1-4、1、2、3、4、5或6个取代)的变体。例如，铰链区可包含氨基酸序列：CGGSGSCPPCP (SEQ ID NO: 25)。

Fc区可以是任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且可以包含一种或多种突变或修饰。在一个实施方案中，Fc区是IgG1同种型或由其衍生，任选地具有一个或多个突变或修饰。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1 Fc。

在一个实施方案中，Fc区具有降低的效应功能，例如降低的ADCC、ADCP、CDC和/或Clq、FcγRI、FcγRII或FcγRIIIA结合。例如，Fc区可以是IgGl同种型，或非IgGl型，例如IgG2、IgG3或IgG4，其已被突变使得介导效应功能的能力降低甚至消除。此类突变已经例如描述于Dall’Acqua WF等人, J Immunol. 177(2):1129-1138 (2006)以及Hezareh M, JVirol. ; 75(24):12161-12168 (2001)中。例如，Fc区可包含与野生型序列相比，具有一个或多个以下氨基酸取代的氨基酸序列：E233P、L234A、L234F、L235A、L235E、G237A、N297A、N297D、P331S和P329G。

在一个实施方案中，Fc区包含去除Asn连接的糖基化的受体位点的突变或以其他方式被操作以改变糖基化特性的突变。例如，在IgG1 Fc区中，可以使用N297Q突变去除Asn连接的糖基化位点。因此，在具体的实施方案中，Fc区包含具有N297Q突变的IgG1序列。

在进一步的实施方案中，Fc区被糖工程化以减少岩藻糖并因此增强ADCC，例如通过在抗体产生期间向培养基中添加化合物，如US2009317869中所述或者如van Berkel等人(2010) Biotechnol. Bioeng. 105:350中所述，或者通过使用FUT8敲除细胞，例如Yamane-Ohnuki等人(2004) Biotechnol. Bioeng 87:614中所述。替代性地，可以使用Umaña等人(1999) Nature Biotech 17:176描述的方法来优化ADCC。在另一个实施方案中，Fc区被工程改造以增强补体激活，例如在Natsume等人(2009) Cancer Sci. 100:2411中所述。

在一些实施方案中，Fc区包含可以抑制Fc同二聚化的修饰或突变。在一些实施方案中，Fc区包含人IgG1 Fc野生型序列的变体。该变体可以包含在人IgG1 T366和Y407位置处(Kabat编号)的氨基酸取代。优选地，T366被L (亮氨酸)取代。优选地，Y407被I (异亮氨酸)、F (苯丙氨酸)、L (亮氨酸)、M (甲硫氨酸)、H (组氨酸)、K (赖氨酸)、S (丝氨酸)、Q(谷氨酰胺)、T (苏氨酸)、W (色氨酸)、A (丙氨酸)、G (甘氨酸)或N (天冬酰胺)取代。更优选地，Y407被H取代。在一个实施方案中，T366被L取代，并且Y407被H取代。

在一些实施方案中，Fc区可以是单体人IgG1 Fc (例如，mFc7.2)，如PCT申请号PCT/US2018/016524中所述，其通过整体引用并入本文。

在一些实施方案中，双特异性抗体包含：第一多肽链，从N端到C端包含：VH2、重链恒定区1 (CH1)、铰链区、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)；和第二多肽链，从N端到C端包含：scFv、任选的接头、VL2、轻链恒定区(CL)、铰链区、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)。

在一些实施方案中，CH1、CH2、CH3和铰链区各自独立地衍生自免疫球蛋白同种型IgG (例如人IgG)，优选地衍生自选自IgG1、IgG2和IgG4的IgG亚型(例如人IgG1、IgG2和IgG4)。在一些实施方案中，CL衍生自λ轻链或κ轻链。

在一些实施方案中，铰链区各自独立地包含选自SEQ ID NO: 23-25和34-42中任一个的氨基酸序列。在优选的实施方案中，铰链区各自独立地包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，铰链区各自独立地包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，铰链区各自独立地包含SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CH2之一或两者包含能够降低双特异性抗体的效应功能的至少一个氨基酸突变。例如，CH2可包含选自E233P、L234A、L234F、L235A、L235E、G237A、N297A、N297D、P331S和P329G的至少一个氨基酸取代或其任何组合。在一些实施方案中，至少一个突变选自L234A、L235A、G237A、P329G或其任何组合。在优选的实施方案中，至少一个突变选自L234A、L235A、G237A和P329G。在一些实施方案中，至少一个突变选自L234F、L235E、P329G或其组合。在优选的实施方案中，至少一个突变选自L234F、L235E和P329G。

在一些实施方案中，CH3之一或两者包含能够降低第一和第二多肽链之间的同二聚化的至少一个氨基酸突变。在优选的实施方案中，CH3之一或两者的氨基酸T366被L (亮氨酸)取代，并且CH3之一或两者的氨基酸Y407被I (异亮氨酸)、F (苯丙氨酸)、L (亮氨酸)、M (蛋氨酸)、H (组氨酸)、K (赖氨酸)、S (丝氨酸)、Q (谷氨酰胺)、T (苏氨酸)、W (色氨酸)、A (丙氨酸)、G (甘氨酸)或N (天冬酰胺)取代。在一个实施方案中，CH3之一或两者的氨基酸T366被L取代，并且CH3之一或两者的氨基酸Y407被H取代。在优选的实施方案中，第一和第二多肽链两者的CH3中，T366被L取代并且Y407被H取代。

接头可以是如上所述的那些。例如，接头可以是任何柔性接头。在一些实施方案中，接头包含选自(G4S)n和GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数。在优选的实施方案中，接头包含如SEQ ID NO: 21或22所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体可包含恒定结构域，该恒定结构域包含如上所述的CH1、铰链区、CH2和CH3。在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体可包含恒定结构域，该恒定结构域包含如上所述的CL、铰链区、CH2和CH3。在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体的第一多肽链可包含恒定结构域，该恒定结构域包含如上所述的CH1、铰链区、CH2和CH3，并且本文公开的双特异性抗体的第二多肽链可包含恒定结构域，该恒定结构域包含如上所述的CL、铰链区、CH2和CH3。在一些实施方案中，恒定结构域可包含如SEQ ID NO: 43-46中任一个所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，第一多肽链可包含恒定结构域，该恒定结构域包含如SEQ ID NO: 43或44所示的氨基酸序列。在其他优选实施方案中，第二多肽链可包含恒定结构域，该恒定结构域包含如SEQ ID NO: 45或46所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 18具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含与SEQ ID NO: 19具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且第二多肽链包含与SEQ ID NO: 20具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 17或19所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸而形成，前体是功能变体保留与CD3结合的能力。在一些实施方案中，第二多肽链包含如SEQ ID NO: 18或20所示的氨基酸序列的功能变体，其通过插入、缺失和/或取代其中的一个或多个氨基酸而形成，前提是功能变体保留与FOLR1和CD3结合的能力。

功能变体包含或组成为与亲本多肽的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、或至少99.9%的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量优选不超过亲本氨基酸序列中氨基酸总数的40%，更优选不超过35%，更优选是1%至33%，并且更优选是5%至30%，更优选是10%至25%，更优选是15%至20%。例如，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量可以是1至50，优选是1至20，更优选是1至10，还更优选是1至5。在优选的实施方案中，插入、缺失和/或取代的氨基酸的数量是1、2、3、4、5、6或7。

在一些实施方案中，插入、缺失和/或取代可以在框架(FR)区，例如FR1、FR2、FR3和/或FR4；和/或恒定区，例如CL、CH1、CH2和/或CH3进行。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守取代。保守取代的实例如上所述。

在优选的实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，并且第二多肽链包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，第一多肽链包含如SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列，并且第二多肽链包含如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异性抗体是双特异性T细胞接合剂(BiTE)。在一些实施方案中，双特异性抗体是HBiTE的形式，如PCT申请号PCT/US2018/016524 (其通过整体引用并入本文)中所述。在HBiTE中，轻链从N端至C端包含抗靶标VL结构域、抗CD3 VL-CL和单体人IgG1 Fc (例如，mFc7.2)；并且重链从N端至C端包含抗靶标VH结构域、抗CD3 VH-CH1和单体人IgG1 Fc (例如，mFc7.2)。单体Fc7.2含有能够抑制Fc同二聚化的两个氨基酸突变(T366L和Y407H)。

核酸

本公开提供了包含编码本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的核酸。

术语“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。核酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰如溴尿苷和肌苷衍生物、核糖修饰如2’,3’-二脱氧核糖、核苷酸间键修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯。

例如，本发明提供了编码本文公开的任一个重链可变区序列的核酸分子。本发明还提供与编码本文公开的任一个重链可变区序列的核酸至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的核酸分子。

例如，本发明提供了编码本文公开的任一个轻链可变区序列的核酸分子。本发明还提供与编码本文公开的任一个轻链可变区序列的核酸至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的核酸分子。

例如，本发明提供编码以下的核酸分子：(i)本文公开的任一个重链可变区序列和(ii)本文公开的任一个轻链可变区序列。本发明还提供了与编码以下的核酸至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的核酸分子：(i)本文公开的任一个重链可变区序列和(ii)本文公开的任一个轻链可变区序列。

例如，本发明提供了编码重链可变区序列的核酸分子，该重链可变区序列包含本文公开的任一个重链可变区序列的CDR序列。本发明还提供了编码重链可变区序列的核酸分子，该重链可变区序列包含与本文公开的任一个重链可变区序列的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列。

例如，本发明提供了编码轻链可变区序列的核酸分子，该轻链可变区序列包含本文公开的任一个轻链可变区序列的CDR序列。本发明还提供了编码轻链可变区序列的核酸分子，该轻链可变区序列包含与本文公开的任一个轻链可变区序列的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列。

例如，本发明提供编码以下的核酸分子：(i)重链可变区序列，其包含本文公开的任一个重链可变区序列的CDR序列，和(ii)轻链可变区序列，其包含本文公开的任一个轻链可变区的CDR序列。本发明还提供编码以下的核酸分子：(i)重链可变区序列，其包含与本文公开的任一个重链可变区序列的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列和(ii)轻链可变区序列，其包含与本文公开的任一个轻链可变区的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列。

在一些实施方案中，核酸是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实施方案中，本发明提供包含编码本文公开的双特异性抗体的核苷酸序列的核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，本发明提供包含编码本文公开的双特异性抗体的脱氧核苷酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)。

在一些实施方案中，可将脱氧核糖核酸(DNA)体内引入人体细胞中。在一些实施方案中，本发明的脱氧核糖核酸(DNA)包含在载体或递送剂中。在一些实施方案中，本发明的脱氧核糖核酸(DNA)被整合到细胞的基因组中。

在一些实施方案中，可将核糖核酸(RNA)体内引入人体细胞中。在一些实施方案中，本发明的核糖核酸(DNA)包含在载体或递送剂中。

载体

本公开提供了包含本文公开的核酸的载体。

在一些实施方案中，载体是能够表达包含双特异性抗体的重链或轻链可变区的多肽的表达载体。例如，本发明提供了包含上述任何核酸分子的表达载体。

任何载体都可以适用于本公开。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein Barr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(AAV)、慢病毒载体或其任何组合。合适的示例性载体包括例如pGAR、pBABE-puro、pBABE-neo largeTcDNA、pBABE-hygro-hTERT、pMKO.1 GFP、MSCV-IRES-GFP、pMSCV PIG(Puro IRES GFP空质粒)、pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE、MSCV IRES萤光素酶、pMIG、MDH1-PGK-GFP_2.0、TtRMPVIR、pMSCV-IRES-mCherry FP、pRetroX GFP T2A Cre、pRXTN、pLncEXP和pLXIN-Luc。

表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括设计用于增殖和扩增或用于表达或两者的载体，如质粒和病毒。例如，载体可以选自pUC系列(Fermentas LifeSciences, Glen Burnie, Md.)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, Calif.)、pET系列(Novagen, Madison, Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)和pEX系列(Clontech, Palo Alto, Calif.)。也可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII (Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。可用于本公开内容的植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19 (Clontech)。可用于本公开内容的动物表达载体的实例包含pcDNA、pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo (Clontech)。

重组表达载体可以使用描述于例如Sambrook等人, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N.Y. 2001;以及Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Associates and John Wiley&Sons, NY, 1994中的标准重组DNA技术制备。可以制备环形或线性的表达载体构建体以含有在原核或真核宿主细胞中的复制系统功能。复制系统可以衍生自例如COLEL、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。

例如，载体可以是包含编码本文公开的双特异性抗体的核苷酸序列的腺病毒载体。载体可以被施用到受试者体内，然后体内进入受试者的细胞，从而将本文公开的编码双特异性抗体的核苷酸序列整合到细胞的基因组中，随后细胞表达本文公开的双特异性抗体。

宿主细胞

本公开提供了包含本文公开的核酸或本文公开的载体的宿主细胞。

任何细胞都可以用作本公开的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，细胞可以是原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞如哺乳动物细胞。合适的原核细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobactehaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E. coli)；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌(Shigella)；杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括例如CHO细胞，如CHOS细胞和CHO-K1细胞，或HEK293细胞，如HEK293A、HEK293T和HEK293FS。

本发明的宿主细胞通过在体外或离体引入本文公开的载体或本文公开的核酸来制备。可以将本发明的宿主细胞施用于受试者体内，并且该宿主细胞在体内表达本文公开的双特异性抗体。

本发明提供其中已引入任何上述载体的宿主细胞。本发明还提供了制备本发明的双特异性抗体的方法，该方法包括a)在适合产生双特异性抗体的条件下培养本发明第四方面的宿主细胞；和b)从培养物中获得双特异性抗体。

药物组合物

本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或赋形剂。

本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段或试剂(在本文中也称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同系物可掺入适合施用的药物组合物中。此类组合物通常包含双特异性抗体或其抗原结合片段或药剂以及药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类载剂或赋形剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水媒介物如不挥发油。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于组合物中。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。

在一些实施方案中，药物组合物还包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

在一些实施方案中，治疗剂是化学治疗剂。化学治疗剂可以包括例如细胞毒剂、抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物等)、拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱衍生物、蒽醌、蒽环类、表鬼臼毒素、喹啉生物碱等)、抗微管剂(例如紫杉烷、长春花生物碱)、蛋白质合成抑制剂(例如三尖杉碱、喜树碱衍生物、喹啉生物碱)、烷化剂(例如烷基磺酸盐、氮丙环、氮芥、亚硝基脲、铂衍生物、三氮烯等)、生物碱、萜类化合物和激酶抑制剂。

可以配制本发明的药物组合物以与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、透皮(即局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二酸四乙胺(EDTA)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。pH值可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF, Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的并且应该是以易于注射的程度存在的流体。其在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载剂可以是溶剂或分散介质，溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其合适混合物。适当的流动性可以例如通过使用包被如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持需要的粒度和通过使用表面活性剂来保持。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。

无菌可注射溶液可以通过如下制备：将所需量的活性化合物与上文列举的一种成分或成分的组合(根据需要)掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，分散体通过将活性化合物引入无菌载体中来制备，该载体含有基本分散介质和来自上述列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他期望成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载剂。它们可以封装在明胶胶囊中或压制成片剂。出于口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用用作漱口水的流体载剂来制备，其中将流体载剂中的化合物口服施用并漱口并吐出或吞服。药学上相容的结合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包含在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或类似性质的化合物：结合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷油、水杨酸甲酯或橙子调味剂。

对于吸入施用，化合物以气溶胶喷雾的形式从压力容器或含有合适的推进剂(例如气体如二氧化碳)的分配器或喷雾器中递送。

全身施用也可以通过透粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮施用，在配制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮施用，活性化合物被配制成本领域公知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。

活性化合物也可以制成栓剂形式(例如，使用常规栓剂基质如可可脂和其他甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂。

在一个实施方案中，活性化合物与将保护化合物免于从体内快速消除的载剂(如控释配制剂，包括植入物和微囊化递送系统)一起制备。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类配制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。

本发明提供包含本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。根据本发明的治疗组合物将与合适的载剂、赋形剂和掺入配制剂中的其他药剂一起施用以提供改善的转移、递送、耐受性等。许多合适的配制剂可见于所有药物化学家已知的处方中：Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA。这些配制剂包括，例如，粉末、糊剂、软膏、果冻、蜡、油、脂质、含囊泡脂质(阳离子或阴离子)(如LIPOFECTIN™)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、聚乙二醇乳液(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。另见Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm SciTechnol 52:238-311。

缀合物

本公开提供了包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段和与其缀合的化学部分的缀合物。

在本公开的上下文中，“缀合物”是共价连接至化学部分的抗体或抗体片段(如抗原结合片段)。化学部分可以是例如药物、毒素、治疗剂、可检测标记、蛋白质、核酸、脂质、纳米颗粒、碳水化合物或重组病毒。抗体缀合物通常称为“免疫缀合物”。当缀合物包含连接至药物(例如，细胞毒剂)的抗体时，缀合物通常被称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”。

术语“缀合”或“连接”可以指使两个多肽成为一个连续的多肽分子。在一个实施方案中，抗体连接至化学部分。在另一个实施方案中，连接至化学部分的抗体进一步连接至脂质或其他分子至蛋白质或肽以增加其在体内的半衰期。连接可以通过化学或重组方式进行。在一个实施方案中，连接是化学的，其中抗体部分和化学部分之间的反应产生了在两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。肽接头(短肽序列)可以任选地包括在抗体和化学部分之间。

可以使用本领域技术人员已知的任何数量的方式将化学部分连接至本发明的抗体。可以使用共价和非共价连接方式。将化学部分附接至抗体的程序根据化学部分的化学结构而变化。多肽通常含有多种官能团；如羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)或巯基(-SH)基团，它们可用于与抗体上合适的官能团反应以导致化学部分的结合。替代性地，抗体被衍生化以暴露或附接额外的反应性官能团。衍生化可以涉及附接许多已知接头分子中的任何一种。接头可以是用于将抗体连接到化学部分的任何分子。接头能够与抗体和化学部分两者形成共价键。合适的接头是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。在抗体和化学部分是多肽的情况下，接头可以通过它们的侧基连接至组成氨基酸(如通过二硫键至半胱氨酸)或连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。

在某些情况下，当免疫缀合物到达其靶位点时，期望从抗体中释放化学部分。因此，在这些情况下，免疫缀合物将包含在靶位点附近可切割的连接。

酶促活性或免疫缀合物在靶细胞内或靶位点附近所经受的条件可能促使接头裂解以从抗体释放化学部分。

鉴于已报道的用于将各种放射诊断化合物、放射治疗化合物、标记物(如酶或荧光分子)、药物、毒素和其他药剂附接至抗体的大量方法，本领域技术人员将能够确定将给定药剂附接至抗体或其他多肽的合适方法。

本文公开的抗体可以衍生化或连接到另一个分子(如另一个肽或蛋白质)。通常，抗体或其部分被衍生化，使得与靶抗原的结合不受衍生化或标记的不利影响。例如，抗体可以功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他分子实体，如另一种抗体(例如，双特异性抗体或二价抗体)、检测剂、药剂、和/或可介导抗体或抗体部分与另一分子(如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽。

一种类型的衍生抗体是通过交联两种或多种抗体(相同类型或不同类型)产生的。合适的交联剂包括具有被合适的间隔区隔开的两个明显反应性基团(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的异双官能交联剂或同双官能交联剂(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。此类接头是可商购的。

在本发明公开的缀合物的一些实施方案中，化学部分选自治疗剂、可检测基团和免疫刺激分子。

在一些实施方案中，治疗剂包括但不限于免疫调节剂、放射性化合物、酶(例如穿孔素)、化学治疗剂(例如顺铂)或毒素。在一些实施方案中，治疗剂可以是例如美登素、格尔德霉素、微管蛋白抑制剂如微管蛋白结合剂(例如奥瑞他汀类)或小沟结合剂如加利车霉素。

其他合适的治疗剂包括例如小分子细胞毒剂，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的分子量小于700道尔顿的化合物。此类化合物还可以含有能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒剂还包括药物前体，即在生理条件下分解或转化以释放细胞毒剂的化合物。此类药剂的实例包括顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素、加利车霉素、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer钠光敏素II、替莫唑胺、拓扑替康、三甲双胍、奥瑞他汀E长春新碱和多柔比星；肽细胞毒素，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的蛋白质或其片段，例如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，即随着一种或多种a或β粒子或γ射线的同时发射而衰变的元素的不稳定同位素，例如碘-131、铼-186、铟-111、钇-90、铋-210、铋-213、锕-225和砹-213；螯合剂可用于促进这些放射性核素与分子或其多聚体的结合。

在一些实施方案中，可检测基团可以选自生物素、链霉亲和素、酶或其催化活性片段、放射性核素、纳米颗粒、顺磁性金属离子或荧光、磷光或化学发光分子。用于诊断目的的可检测基团包括例如荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。

双特异性抗体可以与可检测标记缀合；例如，能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜或诊断成像技术(如计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描(CAT)扫描、磁共振成像(MRI)、核磁共振成像NMRI)、磁共振断层扫描(MTR)、超声、纤维光学检查和腹腔镜检查)检测的可检测标记。可检测标记的具体、非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶促连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标记包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。也可以使用生物发光标记，如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。

双特异性抗体或抗原结合片段还可以与可用于检测的酶缀合，如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当双特异性抗体或抗原结合片段与可检测的酶结合时，可以通过添加酶用来产生可识别的反应产物的额外试剂来检测。例如，当存在辣根过氧化物酶试剂时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入会导致有色反应产物，这可以通过视觉检测到。双特异性抗体或抗原结合片段也可以与生物素缀合，并通过亲和素或链霉亲和素结合的间接测量来检测。应该注意的是，亲和素本身可以与酶或荧光标记缀合。

双特异性抗体可以与自标记蛋白标签(例如HaloTag)融合。例如，蛋白质标签可以克隆到恒定区的末端。HaloTag是衍生自细菌酶(卤代烷脱卤素酶)的自标记蛋白标签，旨在与合成配体共价结合。在一些情况下，合成配体包含附接至荧光团如近红外荧光团的氯代烷烃接头(Los等人(2008) ACS Chem Biol. 3(6):373-82)。

双特异性抗体可以用诸如钆的磁性剂标记。抗体也可以用镧系元素(如铕和镝)和锰标记。

顺磁性颗粒如超顺磁性氧化铁也可以用作标记。双特异性抗体也可以用第二报告基因识别的预定多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)标记。在一些实施方案中，标签由各种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻。

双特异性抗体也可以用放射性标记的氨基酸标记。放射性标记可以用于诊断和治疗目的。例如，放射性标记可用于通过X射线、发射光谱或其他诊断技术检测靶抗原的表达。多肽标记的实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。

在一些实施方案中，免疫刺激分子是刺激免疫应答的免疫效应分子。例如，免疫刺激分子可以是细胞因子如IL-2和IFN-γ、趋化因子如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白、补体激活剂；病毒/细菌蛋白结构域，或病毒/细菌肽。

治疗方法

本公开提供了治疗受试者癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物。

在本发明公开的方法的一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，癌症是FOLR1阳性癌症。

癌症的实例包括：骨和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨肉瘤(bone sarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、转移癌、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤例如但不限于神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤、非神经胶质瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果细胞瘤、松果体母细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘液性乳腺癌、管状乳腺癌、乳头状乳腺癌、原发性癌症、佩吉特氏病和炎性乳腺癌；肾上腺癌例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、髓样甲状腺上皮癌、髓样甲状腺癌和间变性甲状腺癌；GIST—胃肠道间质瘤；胰腺癌，例如但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、舒血管肠肽瘤、生长抑素分泌肿瘤和类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，例如但不限于库欣氏病、催乳素分泌肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，例如但不限于眼部黑色素瘤如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤和睫状体黑色素瘤，以及视网膜母细胞瘤；阴道癌，如鳞状细胞癌、腺癌和黑色素瘤；外阴癌，例如鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特氏病；宫颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌(例如子宫内膜腺癌)和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于浆液性和子宫内膜样上皮性卵巢癌、卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞肿瘤和间质瘤；食道癌，例如但不限于鳞状细胞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、真菌性(息肉样)、溃疡性、浅表扩散、弥漫性扩散、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌例如但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤，胆囊癌如腺癌；胆管癌例如但不限于乳头状、结节状和弥漫性；肺癌，如非小细胞肺癌(NSCLC，例如腺癌亚型)、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌(SCLC)；睾丸癌，例如但不限于生发瘤、精原细胞瘤、间变性、经典(典型)、精原细胞癌、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)、前列腺癌，例如但不限于腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；生殖器癌症，如阴茎癌；口腔癌，例如但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞癌和疣状癌；皮肤癌例如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性黑色素瘤、肢端黑色素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、腺癌、肾上腺瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管)；威尔姆斯瘤；膀胱癌，例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤、成骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌。优选地，癌症选自卵巢癌(例如，卵巢上皮癌，如浆液性和子宫内膜样上皮性卵巢癌)、子宫内膜癌(例如，子宫内膜腺癌)、输卵管癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)和肺癌(例如，非小细胞肺癌)。

在一些实施方案中，施用于受试者的剂量可随实施方案、所用药物、施用方法以及待治疗的部位和受试者而变化。然而，剂量应足以提供治疗反应。临床医生可以确定施用于人或其他受试者以治疗医学病症的有效量。治疗有效所需的精确量可能取决于许多因素，例如抗体的活性和施用途径。

本文所述的抗体、组合物或缀合物的剂量可以在合适的时间段内一次性或以一系列亚剂量施用于哺乳动物，例如根据需要，每天、每半周、每周、每两周、每半月、每两月、每半年或每年一次。包含有效量的抗体、组合物或缀合物的剂量单位可以单日剂量施用，或者总日剂量可以根据需要以每日施用的两个、三个、四个或更多个分剂量施用。

合适的施用方式可以由医生选择。施用途径可以是肠胃外施用，例如通过注射施用、经鼻施用、经肺施用或经皮施用。可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射进行全身或局部施用。在一些实施方案中，选择抗体、组合物或缀合物用于肠胃外递送、用于吸入或用于通过消化道递送，例如口服。施用剂量和方法可以根据受试者的重量、年龄、条件等而变化，并且可以适当地选择。

在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在某些实施方案中，本文公开的抗体、组合物或缀合物在第二治疗剂施用之前、基本上同时或之后施用。

在一些实施方案中，第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

在一些实施方案中，第二治疗剂是化疗剂。化学治疗剂可以包括例如细胞毒剂、抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物等)、拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱衍生物、蒽醌、蒽环类、表鬼臼毒素、喹啉生物碱等)、抗微管剂(例如紫杉烷、长春花生物碱)、蛋白质合成抑制剂(例如三尖杉碱、喜树碱衍生物、喹啉生物碱)、烷化剂(例如烷基磺酸盐、氮丙环、氮芥、亚硝基脲、铂衍生物、三氮烯等)、生物碱、萜类化合物和激酶抑制剂。

医疗用途

本公开提供了本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。

本公开还提供了本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物，其用于治疗受试者的癌症。

在本文公开的用途的一些实施方案中，癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是FOLR1阳性癌症。在一些实施方案中，癌症选自卵巢癌(例如，卵巢上皮癌，如浆液性和子宫内膜样上皮性卵巢癌)、子宫内膜癌(例如，子宫内膜腺癌)、输卵管癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)和肺癌(例如，非小细胞肺癌)。

在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物与第二治疗剂组合。在一些实施方案中，第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂选自布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

试剂盒

本公开提供了药物包装或试剂盒，其包括一个或多个容器，其中装有本文所述药物组合物的一种或多种成分，如本文公开的双特异性抗体或抗原结合片段。任选地，与此类容器相关联的可以是规范药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了制造、使用或销售机构对于人体施用的批准。

在具体实施方案中，该试剂盒包括含有本文公开的双特异性抗体的第一容器。在具体实施方案中，该试剂盒包括第一容器，其是在真空下含有作为冻干无菌粉末的双特异性抗体的小瓶，并且该试剂盒还包括含有药学上可接受的流体的第二容器。

在具体实施方案中，本文提供包含双特异性抗体的注射装置。在具体实施方案中，注射装置包含无菌溶液中的双特异性抗体。在具体实施方案中，注射装置是注射器。

实施例

出于说明本发明的各项实施方案的目的，给出以下实施例，但并不意味着以任何方式限制本发明。本实施例以及本文描述的方法当前代表优选实施方案，是示例性的，并非旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到包含在由权利要求的范围限定的本发明的精神内的变化和其他用途。

293 free style (293FS)细胞、CHO-S细胞和蛋白A琼脂糖购自ThermoFisherScientific。FOLR1阳性细胞系SKOV3由R&D Center U.S.A.赠与。FOLR1阴性细胞系HT1080购自National Collection of Authenticated Cell Cultures。人FOLR1蛋白、His标签(MALS验证)和人CD3蛋白购自ACRO。PE抗FOLR1 (叶酸结合蛋白)抗体购自Bio-Legend。在山羊中产生的抗人IgG (γ-链特异性)-R-藻红蛋白抗体、在山羊中产生的抗人IgG (Fc特异性)-过氧化物酶抗体购自Sigma。抗His标签抗体(HRP)、小鼠单克隆购自Sino Biological。

生成稳定的细胞系HT1080-FR1以促进体外和体内功效研究。简而言之，将商业FOLR1重组质粒pCMV-FOLR1 (Sino Biological)用Lipofectamine™ LTX试剂和PLUS™试剂(Thermo)和转染特异性培养基Opti-MEM™ I(Gibco)瞬时转染到HT1080细胞中。细胞培养物随后补充潮霉素B以选择阳性克隆。2-3周后，逐渐分离出单个阳性克隆，并用流式细胞术进行验证。获得FOLR1阳性稳定细胞系HT1080-FR1。

抗-FOLR1 mAb和抗-CD3 mAb的全轻链和重链序列如下所示。

抗FOLR1 mAb

重链：

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFTFSGYGLSWVRQAPGKGLEWVAMISSGGSYTYYADSVKGRFAISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARHGDDPAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 47)

轻链：

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISSNNLHWYQQKPGKAPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSYPYMYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 48)

抗CD3 mAb

重链：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGNFGSSYVSYFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 49)

轻链：

EIVVTQSPATLSVSPGERATLSCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGANKRAPGVPARFSGSLSGDEATLTISSLQSEDFAVYYCALWYSNLWVFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 50)

实施例1.FOLR1×CD3双特异性抗体的构建和初步表征

双特异性T细胞接合剂(BiTE)是一类新型的双特异性抗体，其通过同时结合肿瘤抗原和T细胞抗原如T细胞表面CD3分子，能够引导细胞毒性T细胞杀伤癌细胞。

为了生成FOLR1×CD3 BiTE，将抗FOLR1抗体的单链Fv (scFv)经由接头融合至抗CD3 Fab的VL结构域的N端。将抗CD3 Fab进一步融合至单体Fc (例如，mFc7.2)的N端。单体Fc7.2含有能够抑制Fc同二聚化的两个氨基酸突变(T366L和Y407H)，如PCT申请号PCT/US2018/016524中所述，该申请通过整体引用并入本文。FOLR1×CD3 BiTE的轻链由抗FOLR1scFv、抗CD3 VL、CL、铰链区、CH2和CH3结构域组成。重链由抗CD3 VH、CH1、铰链区、CH2和CH3结构域组成(图1)。两种FOLR1×CD3 BiTE，分别称为FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1，基于不同的铰链区、CH2和CH3结构域构建。为了获得全长轻链，通过融合克隆将抗FOLR1 scFv片段克隆到含有抗CD3 hSP34 VL-CL和完整工程化Fc的pBY质粒中。将重链构建到单个载体pBY中用于在哺乳动物细胞中表达。

将含有重链和轻链基因的两种质粒共转染至293FS或CHO-S细胞。将质粒和转染剂PEI以1:3的比例混合，然后滴加到293FS或CHO-S细胞培养物中。转染后细胞继续生长5-7天。通过以8000 rpm离心20分钟收获细胞培养物。将含有靶蛋白的培养物上清液加载到蛋白A Sepharose 4 Fast Flow柱(GE Healthcare)上。根据制造商的说明进行后续纯化。

FOLR1×CD3 BiTE在瞬时转染的293 free style (293FS)或CHO-S细胞中表达良好，并分泌到培养上清液中。在非还原SDS-PAGE上，FR1-V4-LFLE-P329G的表观分子量(aMW)为约127 kDa，而FR1-V4-LLG-P329G-1.1的表观分子量(aMW)为约128 kDa。

根据Kabat编号系统，FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1的CDR序列如表1所示。FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列如表2所示。FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1的全轻链和重链序列如表3所示。

表1. CDR序列

表2. VL和VH序列

表3. 重链和轻链序列

实施例2.FOLR1×CD3 BiTE与重组FOLR1和CD3的结合

根据标准方案进行ELISA，以确定FOLR1×CD3 BiTE对人FOLR1和人CD3的结合亲和力。简而言之，将人抗原CD3、His标签或人FOLR1包被在Corning EIA/RIA高结合96孔板(Corning)上，每孔100 ng，4°C过夜，并用3%脱脂牛奶封闭PBS (pH7.4)。加入从50 μg/mL五倍连续稀释的抗体，并在室温下孵育2 h。用含有1%脱脂牛奶的PBS清洗板。通过抗组氨酸标签抗体(HRP)(Sigma)检测结合的抗体。

该测定在室温下用TMB底物(Solarbio)显色，并用酶标仪在450 nm处检测。通过将数据拟合到Langmuir吸附等温线来计算半数最大结合(EC₅₀)。结果显示于图2-3中。

结果表明，FR1-V4-LFLE-P329G结合人FOLR1的EC₅₀为1614 ng/mL (图2)，结合CD3的EC₅₀为381.8 ng/mL (图3)，FR1-V4-LLG-P329G-1.1结合人FOLR1的EC₅₀为2835 ng/mL(图2)，结合CD3的EC₅₀为669.2 ng/mL (图3)。这些结果表明FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1可以在体外和体内发挥良好的功能。

实施例3.FOLR1×CD3 BiTE与细胞表面相关FOLR1的结合

为了测量FOLR1×CD3 BiTE与细胞表面相关FOLR1的结合能力，使用FOLR1阳性细胞系SKOV3和HT1080-FR1进行了流式细胞术。约5×10⁵个细胞与不同浓度的抗体(100 μg/mL、20 μg/mL、4 μg/mL、0.8 μg/mL、160 ng/mL、32 ng/mL、6.4 ng/mL、1.28 ng /mL、0.256ng/mL、0 ng/mL)在冰上孵育1 h。细胞用含有0.5%牛血清白蛋白的PBS (PBSA)洗涤一次，并重悬于100 µl PBSA中。然后加入1 µl/测试抗人IgG (γ链特异性)-R-藻红蛋白抗体(Sigma)并孵育30分钟。细胞用PBSA洗涤一次，然后用于流式细胞术分析。结果显示于图4A-4B中。

结果表明，FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1均以浓度依赖性方式与SKOV3和HT1080-FR1细胞系结合良好。

实施例4.FOLR1×CD3 BiTE介导的T细胞活化

FOLR1×CD3 BiTE在靶细胞(HT1080-FR1、SKOV3、HT1080)存在的情况下激活人T细胞的能力和特异性通过使用带有TCR/CD3效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)的Bio-Glo^TM萤光素酶测定系统评估。在三个测试的靶细胞系中，HT1080细胞不表达人FOLR1，而SKOV3细胞和FOLR1转染的稳定细胞HT1080-FR1均具有高水平的FOLR1表达。TCR/CD3效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)表达内源性TCR和CD3受体。当效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)与适当的TCR/CD3配体或抗TCR/CD3抗体接合时，TCR转导细胞内信号，导致TCR介导的T细胞活化并产生增强的荧光信号。

将靶细胞以1×10⁴(对于HT1080-FR1)或1.5×10⁴(对于SKOV3和HT1080)细胞的密度铺板在96孔板上，每孔100 μL RMPI 1640完全培养基过夜。去上清后，每孔加入5倍梯度稀释的50 μL抗体(FR1-V4-LFLE-P329G、FR1-V4-LLG-P329G-1.1、FR1-mAb、CD3-mAb和FR1-mAb+CD3-mAb)，最大浓度为100 μg/mL。然后在每孔50 μL RMPI 1640完全培养基中以1.2×10⁵个细胞的密度加入效应细胞(Jurkat-NFAT-CD3)。将板在加湿培养箱中于37°C孵育6小时。然后，将100 μL/孔的Stable-Lite萤光素酶测定系统溶液(Vazyme)添加到每个孔中，并在室温下避光孵育10分钟。使用SpectraMax®i3x ELISA阅读器(Molecular Devices)检测发光。结果显示于图5A-5D中。

在FOLR1阳性HT1080-FR1细胞存在的情况下，Jurkat-NFAT-CD3细胞被FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1有效激活，其中EC₅₀分别为约82.98 ng/mL和97.89ng/mL (图5A)。对于FOLR1阳性SKOV3细胞，Jurkat-NFAT-CD3细胞也被FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1有效激活，其中EC₅₀分别为约1012 ng/mL和684.8 ng/mL (图5B)。然而，在FR1-mAb+CD3-mAb组合处理组以及FR1-mAb和CD3-mAb组中没有观察到明显的荧光信号(图5B)。此外，在FOLR1阴性HT1080细胞中未检测到明显的T细胞激活信号(图5C)。当FOLR1×CD3 BiTE与Jurkat-NFAT-CD3细胞单独孵育时，会发生一定程度的非特异性激活，导致微弱的荧光信号产生，但与FOLR1阳性细胞相比存在显著差异(图5D)。

结果表明，FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1均可同时结合效应细胞的CD3抗原和肿瘤细胞的FOLR1抗原，导致T细胞特异性激活。并且，FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1诱导的T细胞活化显著强于mAb组，表明FOLR1×CD3 BiTE的潜在抗肿瘤活性优于mAb。

实施例5.FOLR1×CD3 BiTE介导的针对人癌细胞系的杀伤

使用FOLR1转染细胞系HT1080-FR1通过CCK8测定评估FOLR1×CD3 BiTE的体外功效，并将FOLR1阴性HT1080细胞系用作阴性对照。将5×10³个靶细胞接种于100 μL RPMI1640完全培养基中，孵育约20 h。然后，加入效应细胞、人PBMC (hPBMC，每孔1×10⁵个细胞，在50 µl RPMI 1640完全培养基中)。同时，每孔加入从4 μg/ml 5倍连续稀释的50 μL抗体。孵育后48 h，从靶细胞中去除培养基，加入100 µl含有10% CCK8的RPMI 1640完全培养基，在CO₂培养箱中孵育30分钟。根据制造商的说明，使用酶标仪测量细胞杀伤活性。结果显示于图6-7中。

结果表明，FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1在1.6 ng/ mL至1000ng/mL的浓度范围内，针对FOLR1阳性HT1080-FR1细胞具有有效的体外T细胞依赖性细胞毒性(CTL)，其中CTL EC₅₀分别为1.70 ng/mL和3.62 ng/mL (图6)。然而，在FOLR1阴性细胞系HT1080中未观察到显著的CTL杀伤活性(图7)，表明CTL杀伤效力取决于双特异性抗体同时结合肿瘤细胞表面的FOLR1抗原和T细胞上的CD3蛋白。总之，结果表明FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1都具有显著的体外杀伤作用。

实施例6.FOLR1×CD3 BiTE介导的小鼠肿瘤生长抑制

使用B-NDG小鼠评估FOLR1×CD3 BiTE的体内功效。考虑到稳定细胞系HT1080-FR1的高FOLR1表达和优异的致瘤特性，通过混合HT1080-FR1和hPBMC在B-NDG小鼠中建立肿瘤模型。将1.7×10⁶HT1080-FR1细胞(100 μL)和1.7×10⁶新鲜分离的人PBMC (100 μL)的总计200 μL混合物皮下接种到B-NDG小鼠的右侧腹部。这些小鼠被随机分组并在100至150 mm³的肿瘤大小下分期。阴性对照组小鼠皮下注射生理盐水，同时实验组小鼠单次静脉注射FR1-V4-LFLE-P329G 500 μg/kg或FR1-V4-LLG-P329G-1.1 500 μg/kg。小鼠每周给药三次，总共处理15天。同时，测量小鼠的肿瘤体积和体重。使用以下公式计算肿瘤生长抑制率(TGI)：TGI(%)=[1-(T-T₀)/(C-C₀)]×100，(T和T₀：分别为特定实验日和随机分组日的肿瘤体积；C和C₀：对照组的相应平均肿瘤体积)。值>100%表示肿瘤缩小。结果显示于图8A-8B中。

通过以500 μg/kg的剂量施用FR1-V4-LFLE-P329G或FR1-V4-LLG-P329G-1.1，两个治疗组均显示出显著的抗肿瘤作用。FR1-V4-LFLE-P329G处理15天后肿瘤生长抑制率(TGI)达到115.28%，而FR1-V4-LLG-P329G-1.1处理15天后肿瘤发生缩小，肿瘤生长完全抑制(TGI=109.79%)(图8A)。同时，所有小鼠组的体重仅出现微小变化(图8B)，表明FOLR1×CD3 BiTE在体内具有低毒性优势。

综上所述，FR1-V4-LFLE-P329G和FR1-V4-LLG-P329G-1.1均具有优异的体内外药效学功能。因此，这些FOLR1×CD3 BiTE有望进行临床研究。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言，这些实施方案仅作为示例提供是显而易见的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变体、变化和替换。应当理解，可以采用本文描述的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (29)

1.双特异性抗体或其抗原结合片段，包含结合FOLR1的第一抗原结合区和结合CD3的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一轻链可变区VL1和第一重链可变区VH1，所述第二抗原结合区包含第二轻链可变区VL2和第二重链可变区VH2，其中

所述VL1包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-3所示的LCDR 1-3；

所述VH1包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5-7所示的HCDR 1-3；

所述VL2包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9-11所示的LCDR 1-3；和

所述VH2包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13-15所示的HCDR 1-3；

其中所述第一抗原结合区包含scFv，所述scFv从N端到C端包含VH1和VL1，并且所述scFv经由接头连接至所述VL2的N端；

其中所述双特异性抗体包含：

第一多肽链，其从N端至C端包含：所述VH2、重链恒定区1 (CH1)、铰链区、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3 (CH3)；和

第二多肽链，其从N端至C端包含：所述scFv、所述接头、所述VL2、轻链恒定区(CL)、铰链区、重链恒定区2 (CH2)和重链恒定区3 (CH3)。

2.根据权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

所述VL1包含与SEQ ID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；

所述VH1包含与SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；

所述VL2包含与SEQ ID NO: 12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；和

所述VH2包含与SEQ ID NO: 16具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求2的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

所述VL1包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

所述VH1包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；

所述VL2包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；和

所述VH2包含如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述CH1、CH2、CH3和铰链区各自独立地衍生自免疫球蛋白同种型IgG。

5.根据权利要求4的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述CH1、CH2、CH3和铰链区各自独立地衍生自选自IgG1、IgG2和IgG4的IgG亚型。

6.根据权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述CL衍生自λ轻链或κ轻链。

7.根据权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述铰链区各自独立地包含选自SEQ ID NO：23-25中任一项的氨基酸序列。

8.根据权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链中的CH2包含能够降低所述双特异性抗体的效应功能的至少一个氨基酸突变，并且其中所述至少一个氨基酸突变为L234A、L235A、G237A和P329G，或L234F、L235E和P329G。

9.根据权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链中的CH3包含能够降低所述第一多肽链和所述第二多肽链的同二聚化的至少一个氨基酸突变，并且所述至少一个氨基酸突变为T366L和Y407H。

10.根据权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述接头包含选自(G4S)n和GS(G4S)n的氨基酸序列，其中n为选自1-5的整数。

11.根据权利要求10的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述接头包含如SEQ IDNO：21或22所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求1的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

所述第一多肽链包含与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二多肽链包含与SEQ ID NO:18具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；或者

所述第一多肽链包含与SEQ ID NO: 19具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二多肽链包含与SEQ ID NO:20具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性的氨基酸序列。

13.根据权利要求12的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

所述第一多肽链包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，并且所述第二多肽链包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列；或者

所述第一多肽链包含如SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列，并且所述第二多肽链包含如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列。

14.根据权利要求1-13中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是双特异性T细胞接合剂(BiTE)。

15.核酸，其包含编码根据权利要求1-14中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

16.载体，其包含根据权利要求15的核酸。

17.宿主细胞，其包含根据权利要求15的核酸或根据权利要求16的载体。

18.药物组合物，其包含根据权利要求1-14中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或赋形剂。

19.根据权利要求18的药物组合物，其进一步包含第二治疗剂。

20.根据权利要求19的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。

21.根据权利要求19或20的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

22.缀合物，其包含根据权利要求1-14中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。

23.根据权利要求22的缀合物，其中所述化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。

24.根据权利要求1-14中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求18-21中任一项的药物组合物、或根据权利要求22或23的缀合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途，其中所述癌症是FOLR1阳性癌症。

25.根据权利要求24的用途，其中所述癌症选自卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、尿路上皮癌、乳腺癌和肺癌。

26.根据权利要求25的用途，其中所述癌症选自卵巢上皮癌、子宫内膜腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。

27.根据权利要求24的用途，其中所述药物与第二治疗剂组合。

28.根据权利要求27的用途，其中所述第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。

29.根据权利要求27或28的用途，其中所述第二治疗剂选自布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、ERK抑制剂、MAPK抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM3抑制剂、VEGF抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。