PL222219B1 - Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza - Google Patents

Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza

Info

Publication number
PL222219B1
PL222219B1 PL393641A PL39364104A PL222219B1 PL 222219 B1 PL222219 B1 PL 222219B1 PL 393641 A PL393641 A PL 393641A PL 39364104 A PL39364104 A PL 39364104A PL 222219 B1 PL222219 B1 PL 222219B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
cells
polypeptide
amino acid
host cell
Prior art date
Application number
PL393641A
Other languages
English (en)
Other versions
PL393641A1 (pl
Inventor
Pablo Umana
Peter Bruenker
Claudia Ferrara
Tobias Suter
Original Assignee
Glycart Biotechnology Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glycart Biotechnology Ag filed Critical Glycart Biotechnology Ag
Publication of PL393641A1 publication Critical patent/PL393641A1/pl
Publication of PL222219B1 publication Critical patent/PL222219B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01038—Beta-N-acetylglucosaminylglycopeptide beta-1,4-galactosyltransferase (2.4.1.38)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01094—Protein N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.94)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01114—2-Coumarate O-beta-glucosyltransferase (2.4.1.114)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01144—Beta-1,4-mannosyl-glycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.144)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01024—Alpha-mannosidase (3.2.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01114—Mannosyl-oligosaccharide 1,3-1,6-alpha-mannosidase (3.2.1.114)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/05—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a GOLGI retention signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01024—1,4-Alpha-glucan 6-alpha-glucosyltransferase (2.4.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01096—Hexosyltransferases (2.4.1) sn-Glycerol-3-phosphate 1-galactosyltransferase (2.4.1.96)

Description

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 22.01.2004 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:
377967 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
22.01.2004, PCT/IB04/000844 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
05.08.2004, WO04/065540 (51) Int.Cl.
C12N 9/10 (2006.01) C07K 16/00 (2006.01) C12N 15/54 (2006.01) (54) Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
(30) Pierwszeństwo: 22.01.2003, US, 60/441,307 (73) Uprawniony z patentu:
ROCHE GLYCART AG, Z^ich, CH
31.07.2003, US, 60/491,254 15.08.2003, US, 60/495,142 (72) Twórca(y) wynalazku:
PABLO UMANA, Zurich, CH
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 20.02.2006 BUP 04/06 PETER BRUENKER, Hittnau, CH CLAUDIA FERRARA, Zurich, CH TOBIAS SUTER, Baden, CH
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska
29.07.2016 WUP 07/16
PL 222 219 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza.
Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny manipulacji glikozylacją białek, a bardziej konkretnie cząsteczek kwasu nukleinowego, w tym, konstruktów fuzyjnych mających aktywność katalityczną i ich zastosowania w manipulacji glikozylacją w komórkach gospodarzy w celu wytworzenia polipeptydów o zwiększonych właściwościach terapeutycznych, w tym przeciwciał o zwiększonym powinowactwie wiązania się z receptorem Fc i zwiększonej funkcji efektorowej.
Glikoproteiny pośredniczą w wielu istotnych funkcjach u ludzi, w innych organizmach eukariotycznych i niektórych prokariotycznych, włączając w to katalizę, przekazywanie sygnałów, komunikację międzykomórkową oraz rozpoznawanie i asocjację cząsteczek. Stanowią one większość niecytosolowych białek w organizmach eukariotycznych. (Lis i wsp., Eur. J Biochem. 218: 1-27 (1993)). Wiele glikoprotein jest wykorzystywanych do celów terapeutycznych i w czasie ostatnich dwóch dziesięcioleci zrekombinowane wersje występujących naturalnie, wydzielanych glikoprotein były głównym produktem przemysłu biotechnologicznego. Przykłady obejmują erytropoetynę (EPO), terapeutyczne przeciwciała monoklonalne (terapeutyczne mAb), aktywator tkankowy plazminogenu (tPA), interferon-β (IFN-β), czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów (GM-CSF) i ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG). (Cumrning i wsp., Glycobiology 1 : 115-130 (1991)).
Składnik oligosacharydowy może znacząco wpływać na właściwości związane ze skutecznością terapeutycznej glikoproteiny, w tym, stabilność fizyczną, odporność na atak proteaz, oddziaływania z układem odpornościowym, farmakokinetykę i specyficzną aktywność biologiczną. Takie właściwoś ci mogą zależeć nie tylko od obecności albo nieobecności, ale również od specyficznych struktur oligosacharydów. Można dokonać pewnych uogólnień pomiędzy strukturą oligosacharydu i funkcją glikoproteiny. Na przykład, pewne struktury oligosacharydowe pośredniczą w szybkim usuwaniu glikoproteiny z krwiobiegu przez oddziaływania ze specyficznymi białkami wiążącymi węglowodany, podczas gdy inne struktury mogą być wiązane przez przeciwciała i wzbudzać niepożądane reakcje odpornościowe. (Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)).
Komórki ssaków są korzystnymi gospodarzami do wytwarzania terapeutycznych glikoprotein dzięki ich zdolności do glikozylacji białek w postaci najbardziej odpowiedniej do zastosowań u ludzi. (Cumrning i wsp., Glycobiology 1 : 115-30 (1991); Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)). Bakterie bardzo rzadko glikozylują białka i podobnie jak inne typy powszechnie stosowanych gospodarzy, takie jak drożdże, grzyby nitkowate, komórki owadzie i roślinne, dają wzory glikozylacji związane z szybkim usuwaniem z krwiobiegu, niepożądanymi reakcjami odpornościowymi i w niektórych konkretnych przypadkach, zmniejszoną aktywnością biologiczną.
Wśród komórek ssaczych, w ciągu ostatnich dwóch dziesięcioleci najczęściej były używane komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). Poza dawaniem odpowiednich wzorów glikozylacji komórki te umożliwiają powtarzalne wytwarzanie stabilnych genetycznie, wysoce produktywnych klonów linii komórkowych. Można je hodować do wysokich gęstości w prostych bioreaktorach przy zastosowaniu wolnej od surowicy pożywki, co umożliwia opracowywanie bezpiecznych i powtarzalnych bioprocesów. Inne powszechnie stosowane komórki zwierzęce obejmują komórki nerki oseska chomika (BHK), komórki mysiego szpiczaka NSO i SP2/0. Ostatnio testowano również wytwarzanie transgenicznych zwierząt. (Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)).
Wszystkie przeciwciała zawierają struktury węglowodanów z konserwowanymi pozycjami w regionach stałych łańcucha ciężkiego, przy czym każdy izotyp posiada odrębny układ N-związanych struktur węglowodanowych, które w różny sposób wpływają na składanie, sekrecję lub aktywność funkcjonalną (Wright, A., i Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)}. Te struktury N-związanych węglowodanów różnią się znacząco w zależności od stopnia obróbki i mogą obejmować bogate w mannozę, wielokrotnie rozgałęzione jak również dwuantenowe złożone oligosacharydy. (Wright, A. i Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Typowo, ma miejsce heterogenna obróbka struktur rdzenia oligosacharydowego przyłączonego w konkretnym miejscu glikozylacji, tak, że istnieją nawet przeciwciała monoklonalne jako liczne glikoformy. Podobnie, wykazano, że główne różnice w glikozylacji przeciwciał występują pomiędzy liniami komórkowymi, a nawet mniejsze różnice są widoczne dla danej linii komórkowej hodowanej w różnych warunkach hodowli. (Lifely, M. R. i wsp., Glycobiology 5 (8): 81322 (1995)).
PL 222 219 B1
Nieskoniugowane przeciwciała monoklonalne (mAb) mogą być przydatnymi lekami do leczenia raka, co zostało pokazane przez zatwierdzenie przez U. S. Food and Drug Administration Rituximabu (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA oraz Genentechlnc., San Francisco, CA) do leczenia chłoniaka nieziarniczego komórek B CD20-dodatnich o niskim stopniu złośliwości lub grudkowego, Trastuzumabu (Herceptin™; Genentechlnc,) do leczenia zaawansowanego raka sutka (Grillo-Lopez, A.-J., i wsp., Semis.Oncol. 26: 66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin.Ther. 21: 309-18 (1999)), Gemtuzumabu (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst) do leczenia nawracającej ostrej białaczki szpikowej i Alemtuzumabu (CAMPATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) do leczenia przewlekłej białaczki limfocytowej z komórek B. Sukces tych produktów wynika nie tylko z ich skuteczności, ale również ich wyróżniających się profili bezpieczeństwa (Grillo-Lopez, A.-J., i wsp., Semin. Oncol. 26: 66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Cliva. Ther. 21: 309-18 (1999)). Pomimo sukcesu tych leków, istnieje obecnie ogromne zainteresowanie otrzymaniem wyższej aktywności swoistych przeciwciał niż osiąga się zazwyczaj poprzez terapię z nieskoniugowanymi mAb.
Jedną z dróg uzyskania znacznego zwiększenia mocy przy utrzymaniu prostego procesu wytwarzania i potencjalnym uniknięciu znacznych, niepożądanych efektów ubocznych jest wzmocnienie naturalnych funkcji efektorowych mAb, w których pośredniczą komórki przez manipulację ich składnikiem ligosacharydowym (Umana, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Przeciwciała typu IgG1, czyli przeciwciała najczęściej stosowane w immunoterapii raka, są glikoproteinami, które mają konserwowane N-związane miejsce glikozylacji w pozycji Asn297 w każdej domenie CH2. Dwa złożone dwuantenowe oligosacharydy przyłączone do Asn297 są zagłębione pomiędzy domenami CH2, tworząc silne miejsce styku ze szkieletem poli peptydowym i ich obecność jest niezbędna, aby przeciwciało pośredniczyło w funkcjach efektorowych, takich jak cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciała (ADCC) (Lifely, M R., i wsp., Glycobiology 5: 813-822 (1995); Jefferis, R., i wsp., Immunol Rev. 163: 59-76 (1998); Wright, A. i Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)).
Niniejsi twórcy wykazali uprzednio, że nadekspresja w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) β(1, 4)-N-acetylogiukozaminylotransferazy III (GnT III), glikozylotransferazy katalizującej tworzenie się przeciętych oligosacharydów, znacznie zwiększa aktywność ADCC in vitro chimerowych przeciwciał monoklonalnych wobec nerwiaka niedojrzałego (chCE7) wytwarzanych przez poddane zabiegom inżynierii genetycznej komórki CHO. (Patrz Umana, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176180 (1999), międzynarodowa publikacja nr WO 99/54342). Przeciwciało chCE7 należy do dużej klasy nieskoniugowanych przeciwciał, które mają wysokie powinowactwo i swoistość wobec nowotworu, ale zbyt małą moc, aby być klinicznie przydatne, gdy są wytwarzane w standardowych przemysłowych liniach komórkowych z brakiem enzymu GnT III (Umana, P., i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Były to pierwsze badania, które wykazały, że można uzyskać ogromne zwiększenie aktywności ADCC przez poddanie zabiegom inżynierii genetycznej komórek wytwarzających przeciwciała, tak aby wyrażały GnT III, co prowadzi również do zwiększenia proporcji związanych z regionem stałym (Fc) przeciętych oligosacharydów, w tym przeciętych niefukozylowanych oligosacharydów, powyżej poziomów znalezionych w przeciwciałach występujących naturalnie.
Wyniki wielu badań sugerują, że mechanizmy zależne od receptora Fc mają istotny udział w działaniu cytotoksycznych przeciwciał przeciw nowotworom i wskazują, że optymalne przeciwciało przeciw nowotworom będzie wiązać się preferencyjnie z aktywacyjnymi receptorami Fc, a minimalnie z partnerem inhibitorowym FcyRIIB. (Clynes, R. A., i wsp., Nature Medicine 6 (4): 443-446 (2000); Kalergis, A. M. oraz Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195 (12); 1653-1659 (czerwiec 2002). Na przykład, wyniki z co najmniej jednego badania sugerują, że zwłaszcza receptor FcyRIIB jest silnie związany ze skutecznością terapii przeciwciałem. (Cartron, G., i wsp., Blood 99 (3): 754-757 (luty 2002)). Badania te wykazały, że pacjenci homozygotyczni pod względem FcyRIIIa mieli lepszą odpowiedź na Rituximab niż pacjenci heterozygotyczni. Autorzy wyciągnęli wniosek, że lepsza odpowiedź była dzięki lepszemu wiązaniu się przeciwciała z FcyRIIIa in vivo, czego wynikiem była lepsza aktywność ADCC przeciw komórkom chłoniaka. (Cartron, G., i wsp., Blood 99(3): 754-757 (luty 2002)).
Poza ADCC, przeciwciała monoklonalne o działaniu przeciwnowotworowym często indukują niezależne od Fc mechanizmy bezpośredniego przekazywania sygnałów, które regulują przeżywanie, proliferację lub śmierć komórek docelowych przez aktywację kaskad przekazywania sygnałów w komórkach albo blokowanie dostępu dla czynników wzrostu. (Selenko, N., i wsp., J Clin. Immunol. 22 (3): 124-130 (2002)). Na przykład, wykazano, że traktowanie Rituximabem komórek B CD20+ indukuje liżę za pośrednictwem dopełniacza i indukowaną przez Mab indukcję apoptozy, jak również ADCC. (Selenko, N., i wsp., J. Clin. Immunol. 22 (3): 124-130 (2002)). Ponadto, apoptoza komórek chłoniaka
PL 222 219 B1 indukowana przez Rituximab nie tylko zabija komórki, ale również promuje pobieranie i prezentację krzyżową peptydów pochodzących z komórek chłoniaka przez prezentujące antygen komórki dendrytyczne (DC), indukuje dojrzewanie DC i umożliwia wytwarzane swoistych cytotoksycznych limfocytów T (CTL).
Znając ogromny potencjał terapeutyczny przeciwciał o zwiększonym powinowactwie wiązania się z receptorem Fc i zwiększonej funkcji efektorowej, niniejsi twórcy opracowali sposób wytwarzania takich przeciwciał, który obejmuje manipulacje profilem glikozylacji regionu Fc przeciwciała.
Twórcy niniejszego wynalazku badali ogólnie sposoby manipulacji systemem glikozylacji komórki gospodarza w celu dokonania zmian wzoru glikozylacji jednego albo większej liczby polipeptydów wytwarzanych przez tę komórkę gospodarza. Sposób według wynalazku można zastosować do wytwarzania terapeutycznych przeciwciał o zmodyfikowanej glikozylacji w regionie Fc, w tym zmniejszonej fukozylacji, przy czym przeciwciała mają zwiększoną funkcję efektorową i/lub zwiększone wiązanie się z receptorem Fc w wyniku zmodyfikowanej glikozylacji. Poddane zmianom glikozylacji przeciwciała są szczególnie przydatne w traktowaniu terapeutycznym nowotworów u pacjentów.
Niniejszy wynalazek dotyczy komórki gospodarza zawierającej:
(a) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT), przy czym fuzja polipeptydowa obejmuje domenę katalityczną GalT i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I (GnTI) lub mannozydazy II (Manii), przy czym domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK.
ID. NR: 22, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 901 identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR: 24, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR; 23, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi;
(b) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący polipeptyd mający aktywność Man II, przy czym polipeptyd mający aktywność Man II obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR: 18, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi; i (c) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza, który jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki pełnego przeciwciała, fragmentu przeciwciała, fuzji białkowej i który obejmuje region Fc ludzkiej IgG;
przy czym fuzja polipeptydowa i polipeptyd mający aktywność Man II są wyrażane w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez tę komórkę gospodarza.
Korzystnie domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją amino- kwasową SEK. ID. NR: 22, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasowa, co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR: 24, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR : 23, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, i przy czym polipeptyd mający aktywność Manii obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR: 18, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
Korzystnie domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. ID. NR: 22, domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. ID.
NR: 24, domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. ID. NR: 23, i przy czym polipeptyd mający aktywność Man II obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. ID. NR: 18.
PL 222 219 B1
Korzystnie co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową mającą aktywność GalT obejmuje sekwencję nukleotydową SEK ID. Nr: 19.
Korzystnie polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza wykazuje w wyniku modyfikacji zwiększone powinowactwo wiązania z receptorem Fc.
Korzystnie polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza wykazuje zwiększoną funkcję efektorową w wyniku tej modyfikacji. Korzystnie zwiększoną funkcją efektorową jest cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc lub zwiększone wiązanie się z komórkami NK, lub makrofagami lub komórkami wielojądrzastymi lub monocytami lub zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnału indukującego apoptozę lub zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych lub zwiększone piętnowanie komórek T.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza, obejm ującego:
a. hodowanie komórki gospodarza według wynalazku powyżej w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie tego polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, przy czym fuzja polipept ydowa jest wyrażana w ilości dostatecznej do modyfikacji oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza; i
b. izolowanie takiego polipeptydu wytwarzanego przez tę komórkę gospodarza.
Korzystnie domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji Man II lub domena lokalizacji GnTI.
Korzystnie polipeptyd ma zwiększoną funkcję efektorową w wyniku modyfikacji.
Korzystnie polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza ma zwiększony udział przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu. Korzystniej przecięte, niefukozylowane oligosacharydy są hybrydowe lub złożone. Korzystniej co najmniej 20% lub 25% lub 30% lub 35% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu jest przeciętych, niefukozylowanych.
Krótki opis figur
Fig. 1. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, niezmodyfikowanego (bez zmienionej glikozylacji) przeciwciała IgG1 anty-CD20, wytworzonego w komórkach BHK. Komórki transfekowano wektorem pETR1502 do ekspresji przeciwciała. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 2. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmieniona glikozylacją IgG 1 anty-CD20, wytworzonego w BHK, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym dzikiego typu („wt”) GnT III. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1502 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1166 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 3. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w BHK, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („G1-GnTIII”) o aktywności GnT III i zlokalizowaną dzięki domenie lokalizacji GnT I w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1502 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1425 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 4. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w BHK, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydowa ( „M2-GnTIII”) o aktywności GnT III i zlokalizowaną w aparacie Golgiego dzięki domenie lokalizacji alfamannozydazy II (Man II) w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1502 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1506 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 5. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, niezmodyfikowanego (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciała IgG1 anty-CD20, wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA. Komórki transfekowano wektorem pETR1520 do ekspresji przeciwciała. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
PL 222 219 B1
Fig. 6. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w HEK293-EBNA, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („M2-GnTIII”) o aktywności GnT III i zlokalizowaną w aparacie Golgiego dzięki domenie lokalizacji alfa-mannozydazy II (Man II) w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1520 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1519 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 7. Widma MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w HEK293-EBNA, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („M2-GnTIII”) o aktywności GnT III i zlokalizowaną w aparacie Golgiego dzięki domenie lokalizacji alfamannozydazy II (Man II) w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1520 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1519 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. (a) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych przez PNGazę F, bez dodatkowej obróbki enzymatycznej. (b) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych przez PNGazę F, trawionych następnie EndoH.
Fig. 8. (a) Schematyczny opis trawienia oligosacharydów katalizowanego przez EndoH. EndoH może ciąć hybrydy (i hybrydy przecięte, ale nie może ciąć złożonych lub złożonych przeciętych oligosacharydów. (b) Przez rozróżnianie pomiędzy oligosacharydami złożonymi i typu hybrydowego, obróbka EndoH umożliwia przypisanie cech strukturalnych pikom oligosacharydów o takich samych stosunkach m/z w widmach MALDI/TOF-MS, otrzymanych po początkowej obróbce PNGazą F.
Fig. 9. Zależna od przeciwciała cytotoksyczność komórkowa (ADCC) warunkowana przez przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „G1-GnTIII” w porównaniu z warunkowaną przez niezmodyfikowane, zrekombinowane chimerowe przeciwciała IgG1 anty-CD20. Oba przeciwciała wytworzono w komórkach BHK. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na fig. 3, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na fig. 1. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4, Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4 godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E:T wynosił 25:1, cytotoksyczność mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 10. Zależna od przeciwciała cytotoksyczność komórkowa (ADCC) warunkowana przez przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z warunkowaną przez nie zmodyfikowane, zrekombinowane ant-y-CD20 chimerowe przeciwciała IgG1. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293- EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na fig. 5. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4-godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E:T wynosił 25:1, cytotoksyczność mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 11. Zależna od przeciwciała cytotoksyczność komórkowa (ADCC) przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu ze zrekombinowanym anty-CD2G, chimerowym przeciwciałem IgG1 o glikozylacji zmienionej przez „wt-GnT III”. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach BHK. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III przedstawiono na fig. 4, a profil dla przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez wt-GnT III na fig. 2. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4-godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E:T wynosił 25:1, cytotoksyczność mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w st osunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
PL 222 219 B1
Fig. 12. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1, z receptorem FcgammaRIIIa na komórkach NK. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na fig. 5. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano wykorzystując konkurujący fragment przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz fig. 13).
Fig. 13. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1 z receptorem FcgammaRIIIa na komórkach NK w obecności rosnących stężeń konkurującego fragmentu przeciwciała anty-FcgammaRIII. Oba zrekombinowane przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na fig. 5. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1, przy czym oczyszczone komórki NK inkubowano razem z rekombinowanym przeciwciałem (zawsze w końcowym stężeniu 3 μg/ml) i z różnymi, rosnącymi stężeniami (patrz wykres) konkurującego fragmentu 3G8-Fab2 przeciwciała anty-Fcgammmalll. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK.
Fig. 14. Widma MALDI/TOF-MS obojętnych mieszanin oligosacharydów pochodzących od zrekombinowanych przeciwciał IgG1 „L19” rozpoznających formę izomeryczną ED-B+ fibronektyny i wytworzonych w komórkach HEK293-EBNA. (a) Niezmodyfikowane przeciwciało wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem pETR1546 do ekspresji przeciwciała .(b) Przeciwciało o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III wytworzone w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem pETR1546 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1519 do ekspresji GnT III. Oba przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej chromatografią powinowactwa do białka A, a następni chromatografią wykluczania według wielkości w złożu Superdex200 (Amersham) wymieniając bufor na sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 15, Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-ED-B+fibronektyna chimerowych przeciwciał IgG1 z receptorem FcgammaRIIb na ludzkich komórkach chłoniaka Raji. Oba przeciwciała wytworzono w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na fig. 14b, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na fig. 14a. Test wiązania wykonano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1. Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach chłoniaka Raji pochodzącego z komórek B.
Fig. 16. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1 z receptorem FcgammaRIIIa na komórkach NK pochodzących od różnych dawców. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na fig. 5. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawców o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji, kodującej FcgammaRIIc). Dwóch dawców
PL 222 219 B1 genotypowano jako homozygoty pod względem wariantu 158V-„o wyższym powinowactwie” receptora FcgammaRIIIa. Dwóch innych dawców genotypowano jako heterozygoty 158V/F pod względem wariantów 158V-„o wyższym powinowactwie” i 158F-„o niższym powinowactwie” receptora FcgammaRIIIa. Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano przez zastosowanie konkurencyjnego fragmentu przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz fig. 13).
Fig. 17. Analiza FACS ekspresji skróconego CD4 (tCD4) w liniach komórkowych stabilnie wytwarzających chimerowe przeciwciała anty-CD2.0 IgGl (a) BHK-1502-28 (dzikiego typu) i w (b) klonie BHK-1502-28-11 (o glikozylacji zmienionej przez M2-GnTIII). Ekspresja tCD4 jest funkcjonalnie sprzężona z ekspresją M2-GnT III przez element 1RES na wektorze ekspresyjnym pETR1537 GnT III, w związku z tym jest stosowana jako pośredni marker dla ekspresji GnT III. Średnie i średnie geometryczne intensywności fluorescencji wynosiły odpowiednio 27,6 i 19,9 dla linii komórkowych poddanych manipulacji glikozylacją oraz 4,7 i 4,1 dla linii komórkowych typu dzikiego.
Fig. 18. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III, przeciwciała chimerowego IgG1 antyCD20, wytworzonego w linii komórkowej BHK-1502-28-11. Linię komórkową, oczyszczanie przeciwciała i otrzymywanie oraz analizę oligosacharydów opisano w rozdziale „Materiały i Metody w Przykładzie 1.
Fig. 19. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligo- sacharydów pochodzącej od oligosacharydów uwalnianych przez PNGazę F, trawionych następnie EndoH, pochodzących z zrekombinowanego, o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III, przeciwciała chimerowego IgG1 anty-CD20, wytworzonego w linii komórkowej BHK-1502-28-11. Linię komórkową, oczyszczanie przeciwciała i otrzymywanie oraz analizę oligosacharydów opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 20. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnT III” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1, wytworzonych w stabilnych liniach komórkowych, z receptorem FcgammaRIIIa na komórkach NK. Profil glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na fig. 18 i na fig. 19. Test wiązania wykonano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano przez zastosowanie konkurencyjnego fragmentu przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz fig. 13).
Fig. 21. Liza za pośrednictwem dopełniacza (CML) zależna od przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnT III” w porównaniu do zależnej od niezmodyfikowanego, zrekombinowanego anty-CD20 chimerowego przeciwciała IgG1. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmieniona glikozylacją przedstawiono na fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na fig. 5. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. W teście zastosowano ludzki układ dopełniacza. Lizę mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDHj. Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 22. Widma MALDI/TOF-MS obojętnych mieszanin oligosacharydów pochodzących od zrekombinowanych, chimerowych przeciwciał IgG1 „C225” rozpoznających ludzki receptor czynnika wzrostu naskórka (EGFR) i wytworzonych w komórkach HEK293-EBNA. (a) Niezmodyfikowane przeciwciało wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciała pURST28. (b) Przeciwciało o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III wytworzone w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciała pE-TRURSI28 i wektorem pETR15l9 do ekspresji GnT III. Oba przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej chromatografią powinowactwa do białka A, a następnie chromatografią wykluczania według wielkości w złożu Superdex2Q0 (Amersham) wymieniając bufor na sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) . Oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
PL 222 219 B1
Fig. 23. Zależna od przeciwciała cytotoksyczność komórkowa (ADCC) przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnT III” w porównaniu do niezmodyfikowanego, zrekombinowanego antyEGFR chimerowego przeciwciała IgGl „C225”. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na fig. 22b, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na fig. 22a. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki raka płaskokomórkowego (nr ECACC 85090402). Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4-godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E:T wynosił 25:1, cytotoksyczność mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 24. Sekwencja kwasu nukleinowego i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa fuzji polipeptydowej Mannozydaza II-GnT III.
Fig. 25. Sekwencja kwasu nukleinowego i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa fuzji poiipeptydowej GnTI-GnTIII.
Fig. 26. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od niezmodyfikowanego, chimerowego przeciwciała IgGl C2B8 anty-CD20 („Cwt”), wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w przykładzie 5.
Fig. 27. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, chimerowego przeciwciała IgG1 ze zmieniona, glikozylacją C2B8 anty-CD20 („Cbrt”), wytworzonego w komórkach KEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520 i wektorem do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519). Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 5. (A) Profil oligosacharydowy uwalnia nych przez PNGazę F oligosacharydów, bez dodatkowej obróbki enzymatycznej. (B) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych przez PNGazę F, trawionych następnie EndoH.
Fig. 28. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, chimerowego przeciwciała IgG1 ze zmienioną glikozylacją C2B8 anty-CD20 („Cm”), wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520, wektorem do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519) i wektorem do ekspresji polipeptydu mannozydazy II (pCLF9). Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej oligosacharydy otrzymano i analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 5. (A) Profil oligosachary dowy uwalnianych PNGazą F oligosacharydów, bez dodatkowej obróbki enzymatycznej. (B) Profil oligosacharydowy uwalnianych PNGazą F oligosacharydów, trawionych następnie EndoH.
Fig. 29. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC), w której pośredniczą przeciwciała chimerowe anty-CD20 o glikozylacji zmienionej przez ekspresję w komórkach HEK293-EBNA kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, gdzie zachodzi ekspresja samego kwasu nukleinowego kodującego Man II-GnT III (przeciwciało Cbrt), jak i koekspresja razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm) w komórkach wytwarzających przeciwciała. Cwt jest to niezmodyfikowane, zrekombinowane przeciwciało chimerowe IgG1 C2B8 anty-CD20 („Cwt”) wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem pETRI520 do ekspresji przeciwciała. Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1.
Fig. 30. Wiązanie się z receptorem FcgammaRIIIa przeciwciał chimerowych anty-CD20 o zmienionej glikozylacji przez ekspresję w komórkach HEK293-EBNA kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji Man II Golgi, gdzie zachodzi ekspresja samego kwasu nukleinowego kodującego Man II-GnT III (przeciwciało Cbrt) jak i koekspresja razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm) w komórkach wytwarzających przeciwciała. Cwt jest to niezmodyfikowane, zrekombinowane przeciwciało chimerowe IgG1 C2B8 anty-CD20 („Cwt”) wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520. Test wiązania przeprowadzono, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania
PL 222 219 B1 receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fluorescencji mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała antyludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano wykorzystując konkurujący fragment przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz fig. 13).
Fig. 31. Cytotoksyczność, w której pośredniczy dopełniacz, przeciwciał chimerowych anty-CD20 o glikozylacji poddanej manipulacji przez ekspresję w komórkach HEK293-EBNA kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest zlokalizowana przez domenę lokalizacji Man II w aparacie Golgiego, gdzie zachodzi ekspresja kwasu nukleinowego kodującego Man II-GnT III (przeciwciało Cbrt) jak i koekspresja razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm) w komórkach wytwarzających przeciwciała. Cwt jest to niezmodyfikowane, zrekombinowane przeciwciało chimerowe IgGl C2B8 anty-CD20 („Cwt”) wytworzone w komórkach HEK293-EBNĄ transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520.
Fig. 32(A-C). Wektory ekspresyjne pCLF9 (A) pETR1842 (B) i pETR1843 (C).
Fig. 33(A i B). Wektory ekspresyjne dla fuzji białkowej Man II-GalT (A) i GalT (B).
Fig. 34. Profil oligosacharydowy monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności a-mannozydazy II i względny procent struktur, dla których wykazano, że są związane z fragmentem Fc przeciwciała.
Fig. 35 (Ai B). Profil oligosacharydowy monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności fuzji białkowej Man II-GalT i względny procent struktur, dla których stwierdzono, że są związane z fragmentem Fc przeciwciała.
Profil oligosacharydowy po trawieniu PNGazą F (A) i po trawieniu EndoH (B).
Fig. 36. Przeciwciało wytworzone w obecności α-mannozydazy II (Man II) wiąże się z receptorem FcyRIIIA z większym powinowactwem niż przeciwciała typu dzikiego.
Fig. 37. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał, w której pośredniczy przeciwciało chimerowe anty-CD20 ze zmienioną glikozylacją.
Stosowane tu terminy są takie, jak są powszechnie stosowane w dziedzinie, chyba, że określono je inaczej w następujący sposób.
Stosowany tutaj termin „przeciwciało ma obejmować cząsteczki całych przeciwciał, w tym przeciwciał monoklonalnych, poliklonalnych i wielowartościowych (np. dwuwartościowych), a także fragmenty przeciwciał mające region Fc i fuzje białkowe zawierające region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny. Termin ten obejmuje także przeciwciała humanizowane i chimerowe.
Stosowany tutaj termin „region Fc ma odnosić się do C-końcowego regionu łańcucha ciężkiego IgG. Ponieważ granice regionu Fc łańcucha ciężkiego IgG mogą się nieznacznie różnić, zwykle określa się, że region Fc łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG rozciąga się od reszty aminokwasowej w pozycji Cys226 do końca karboksylowego.
Stosowany tutaj termin „region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny’ ma obejmować naturalnie występujące allełiczne warianty regionu Fc immunoglobulin, a także warianty mające zmiany, które wytwarzają podstawienia, wstawienia lub delecje, ale które nie zmniejszają istotnie zdolności immunoglobuliny do pośredniczenia w funkcjach efektorowych (takich jak cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał}. Na przykład, można usunąć jeden lub więcej aminokwasów z N-końca lub C-końca regionu Fc immunoglobuliny bez istotnej utraty funkcji biologicznej. Takie warianty można wybierać według ogólnych zasad znanych w dziedzinie, tak, aby miały minimalny wpływ na aktywność (patrz, np. Bowie, J. U. i wsp., Science 247:1306-10 (1990)).
Stosowany tutaj termin fuzja polipeptydowa „mająca aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III odnosi się do fuzji poiipeptydowych, które mają zdolność do katalizowania dod awania reszty N-acetyloglukozaminowej (GlcNAc) w w-iązaniu β-1-4 do β-związanego mannozydu rdzenia trimannozylowego N-związanych oligosacharydów. Termin ten obejmuje fuzje polipeptydowe wykazujące aktywność enzymatyczną podobną, ale nie koniecznie identyczną, do aktywności e(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III, znanej także jako 4-beta-N-acetyloglukozaminylotransferaza e-1,4-mannozyloglikoproteinowa (EC 2.4.1.144), według nomenklatury Komitetu Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej („Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology”; NC-IUBMB), jak zmierzona w konkretnym teście biologicznym, zależna lub niezależną od dawki. W przypadku istnienia zależności od dawki, nie musi ona być identyczna z zależnością dla e(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazą III, ale raczej znacząco
PL 222 219 B1 podobna do zależności od dawki dla danej aktywności w porównaniu z β(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazą III (tj. polipeptyd-kandydat będzie wykazywał większą aktywność lub nie więcej niż około 25-krotnie mniejszą i korzystnie nie wiecej niż około 10-krotnie mniejszą, a najkorzystniej nie więcej niż około trzykrotnie mniejszą aktywność w stosunku do e(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III).
Stosowany tutaj termin fuzja polipeptydowa „mająca aktywność e(1,4)-galaktozylotransferazy lub „mająca aktywność GalT” odnosi się do fuzji polipeptydowych, które mają zdolność do katalizowania dodawania reszty galaktozy z UDP galaktozy do ńieredukującego końca GlcNAc znajdującego się w N-połączonych oligosacharydach. Termin ten obejmuje fuzje polipeptydowe wykazujące aktywność enzymatyczną podobną, ale nie koniecznie identyczną, do aktywności e(1,4)-galaktozylotransferazy, znanej także jako UDP-Gal:GlcNAc e-1,4-galaktozylotransferaza (EC 2.4.1.38), według nomenklatury Komitetu Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej („Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology”; NC-IUBMB), jak zmierzona w konkretnym teście biologicznym, zależną lub niezależną od dawki. W przypadku istnienia zależności od dawki, nie musi ona być identyczna z zależnością dla e(1,4)-galaktozylotransferazy, ale raczej znacząco podobna do zależności od dawki dla danej aktywności w porównaniu do e(1,4)-galaktozylotransferazy (tj. polipeptyd kandydat będzie wykazywał wyższą aktywność lub nie wiecej niż 25-krotnie mniejszą i korzystnie nie więcej niż 10-krotnie mniejszą, a najkorzystniej nie więcej niż trzykrotnie mniejszą aktywność w stosunku do e(1,4)-N-acetyłoglukozaminylotransferazy III).
Przez kwas nukleinowy lub polinukleotyd mający sekwencję nukleotydową co najmniej, na przykład, w 95% identyczną z referencyjną sekwencją nukleotydową, rozumie się, że sekwencja nukleotydową poiinukleotydu jest identyczna z referencyjną sekwencją z takim wyjątkiem, że sekwencja polinukleotydowa może zawierać do pięciu mutacji punktowych na każde 100 nukleotydów referencyjnej sekwencji nukleotydowej. Innymi słowy, w celu otrzymania poiinukleotydu mającego sekwencję nukleotydową identyczną co najmniej w 95% z referencyjną sekwencją nukleotydową, w referencyjnej sekwencji można usunąć lub podstawić innymi nukleotydami do 5% nukleotydów, lub ilość nukleotydów stanowiąca do 5% wszystkich nukleotydów w sekwencji referencyjnej może być wstawiona do sekwencji referencyjnej. Sekwencją zapytania może być cała sekwencja przedstawiona na fig. 24 lub fig. 25.
Z praktycznej strony, można określić w standardowy sposób, czy konkretną cząsteczka kwasu nukleinowego lub polipeptydu jest co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczna z sekwencją nukleotydową lub sekwencją polipeptydowa ujawnioną w niniejszym wynalazku, stosując znane programy komputerowe. Korzystnym sposobem wyznaczania najlepszego, ogólnego dopasowania pomiędzy sekwencją zapytania (sekwencją ujawnioną w niniejszym wynalazku) i sekwencją, docelową, także określanego jako globalne przyrównanie sekwencji, może być wyznaczanie za pomocą programu komputerowego FASTDB wykorzystującego algorytm Brutlaga i wsp., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). W dopasowywaniu sekwencji, obie sekwencje zapytania i docelowa, są sekwencjami DNA. Sekwencję RN A można porównać zamieniając U na T. Wynik powyższego globalnego dopasowywania sekwencji jest podany w postaci procentu podobieństwa. Korzystnymi parametrami stosowanymi w budowaniu dopasowania sekwencji DNA w FASTDB w celu wyliczenia procentu podobieństwa są: Macierz=jednostkowa (ang. Matrix=Unitary), k-tuple=4, kara za niedopasowanie (ang. Mismatch Penalty)=1, kara za połączenie (ang. Joining Penalty=30), długość grupy randomizowanej=0, wynik odcięcia=1, kara za przerwę=5, kara za wielkość przerwy 0,05, wielkość okna=500 lub długość nukleotydowej sekwencji docelowej, jeżeli jest krótsza.
Jeżeli sekwencja docelowa jest krótsza niż sekwencja zapytania z uwagi na delecje 5' lub 3', a nie z uwagi na wewnętrzne delecje, należy wprowadzić ręczne korekty do wyników. Jest to spowodowane tym, że program FASTDB nie liczy skróconych końców 5' i 3' sekwencji docelowej podczas wyliczania procentu identyczności. Dla sekwencji docelowych skróconych na końcach 5' i 3' w stosunku do sekwencji zapytania, procent identyczności jest korygowany przez wyliczenie ilości zasad sekwencji zapytania, które są końcami 5' i 3' sekwencji docelowej, które nie są sparowane/przyrównane, jako procent całkowitej ilości zasad sekwencji zapytania. To czy nukleotyd jest sparowany/dopasowany, określa się w wyniku dopasowywania sekwencji w FASTDB. Następnie odejmuje się tę wartość procentową od procentu identyczności, wyliczonego w powyższym programie FASTDB, wykorzystując ustalone parametry, aby osiągnąć ostateczną wartość procentu identyczności. Ta poprawiona wartość jest wykorzystywana na potrzeby obecnego wynalazku. Jedynie zasady poza zasadami 5' i 3' sekwencji docelowej, jak jest pokazywane w dopasowywaniu FASTDB, które nie są sparowane/dopasowane do sekwencji zapytania, są brane pod uwagę w ręcznym wyliczaniu wartości procentu identyczności.
PL 222 219 B1
Na przykład, aby wyznaczyć procent identyczności dopasowania, sekwencję docelową złożoną z 90 zasad przyrównano z sekwencją zapytania o 100 zasadach. Delecje znajdują się na końcu 5' sekwencji docelowej i stąd dopasowanie FASTDB nie pokazuje sparowania/dopasowania pierwszych 10 zasad z końca 5'. 10 niesparowanych zasad odpowiada 10% sekwencji (ilość niesparowanych zasad na końcach 5' lub 3' (całkowita ilość zasad w sekwencji zapytania), tak więc 10% odejmuje się od wartości procentu identyczności wyliczonego w programie FASTDB. Jeżeli pozostałe 90 zasad pasuje idealnie, końcowy procent identyczności wynosi 90%. W innym przykładzie porównano sekwencję docelową złożoną z 90 zasad z sekwencją zapytania o 100 zasadach. W tym przypadku delecje znajdują się wewnątrz, tak że nie ma niesparowanych/dopasowanych zasad na końcach 5' lub 3' sekwencji docelowej w stosunku do sekwencji zapytania. W tym przypadku, procent identyczności wyliczany w FASTDB nie podlega ręcznemu poprawieniu. I znów, jedynie zasady z końców 5' i 3' sekwencji docelowej, które nie są sparowane/dopasowane do sekwencji zapytania, podlegają ręcznemu poprawianiu. Dla celów niniejszego wynalazku nie muszą być wprowadzone żadne inne ręczne poprawki.
Przez polipeptyd mający sekwencję aminokwasową co najmniej, na przykład, w 95% identyc zną z sekwencją aminokwasową zapytania, rozumie się, że sekwencja aminokwasowa docelowego polipeptydu jest identyczna z sekwencją zapytania z wyjątkiem takim, że sekwencja polipeptydu docelowego może zawierać do pięciu zmian aminokwasów na każde 100 aminokwasów sekwencji aminokwasowej zapytania. Innymi słowy, aby otrzymać polipeptyd mający sekwencję co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową zapytania, można wstawić, usunąć lub podstawić innymi aminokwasami do 5% reszt aminokwasowyeh w sekwencji docelowej. Te zmiany w sekwencji referencyjnej mogą wystąpić w pozycjach na końcu karboksylowym lub aminowym referencyjnej sekwencji aminokwasowej lub gdziekolwiek między tymi końcowymi pozycjami, mogą być rozrzucone albo pojedynczo między resztami sekwencji referencyjnej albo w jednej lub więcej sąsiednich grupach w sekwencji referencyjnej.
Z praktycznej strony, można określić w standardowy sposób, czy konkretny polipeptyd jest co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczny z polipeptydem referencyjnym, stosując znane programy komputerowe. Korzystnym sposobem określania najlepszego, ogólnego dopasowania między sekwencją zapytania (sekwencją ujawnioną w niniejszym wynalazku) i sekwencją docelową, określanego również jako globalne dopasowanie sekwencji, można określić za pomocą programu komputerowego FASTDB bazującego na algorytmie Brutlaga i wsp., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). Przy dopasowaniu sekwencji, obie sekwencje zapytania i docelowa, są sekwencjami nukleotydowymi lub obie są sekwencjami aminokwasowymi. Wynik powyższego globalnego dopasowania sekwencji jest podany w postaci procentu identyczności. Korzystnymi parametrami stosowanymi w dopasowywaniu sekwencji aminokwasowych w FASTDB są: Macierz=PAM 0, k-tuple=2, kara za niedopasowanie=1, kara za połączenie=20, długość grupy randomizowanej=0, wynik odcięcia=1, wielkość okna=długość sekwencji, kara za przerwę=5, kara za wielkość przerwy=0,5, wielkość okna=500 lub długość sekwencji docelowej, jeżeli jest krótsza.
Jeżeli sekwencja docelowa jest krótsza niż sekwencja zapytania z powodu delecji na końcu N lub C, a nie z powodu wewnętrznych delecji, należy dokonać ręcznej korekty wyników. Jest to spowodowane tym, że program FASTDB nie liczy skróconych końców N lub G sekwencji docelowej podczas wyliczania globalnego procentu identyczności. Dla sekwencji docelowych skróconych na końcach N lub C w stosunku do sekwencji zapytania, procent identyczności jest poprawiany przez wyliczenie ilości reszt sekwencji zapytania, które są końcem N lub C sekwencji docelowej, które nie są sparowane/dopasowane do odpowiadającej im reszty docelowej, jako procent całkowitej ilości zasad sekwencji zapytania. To czy reszta jest sparowana/dopasowana, określa się wynikami dopasowania sekwencji w FASTDB. Następnie odejmuje się tę wartość procentową od procentu identyczności wyliczonego w powyższym programie FASTDB, z zastosowaniem ustalonych parametrów, w celu osiągnięcia ostatecznej wartości procentu identyczności. Tę końcową, poprawioną wartość procentu identyczności wykorzystuje się na potrzeby niniejszego wynalazku. Jedynie reszty końców N lub C sekwencji docelowej, które nie są sparowane/dopasowane do sekwencji zapytania, są brane pod uwagę w ręcznym wyliczaniu wartości procentu istotności, to jest, jedynie pozycje reszt zapytania poza najdalszymi resztami końców N lub C sekwencji docelowej.
Na przykład, aby określić procent identyczności przyrównano docelową sekwencję aminokwasową złożoną z 90 reszt z sekwencją zapytania o 100 resztach. Delecje występują na końcu N sekwencji docelowej i dlatego dopasowanie FASTDB nie pokazuje sparowania/dopasowania pierwszych 10 reszt z końca N. 10 niesparowanych reszt reprezentuje 10% sekwencji (ilość niesparowanych reszt na
PL 222 219 B1 końcach N i C (całkowita ilość reszt w sekwencji zapytania), tak więc 10% odejmuje się od wartości procentu identyczności wyliczonego w programie FASTDB. Jeżeli pozostałe 90 reszt było doskonale dopasowanych, końcowy procent identyczności wynosiłby 90%. W innym przykładzie, porównano sekwencję docelową złożoną z 90 reszt z sekwencją zapytania o 100 resztach. W tym przypadku delecje są delecjami wewnętrznymi tak, że nie ma niesparowanych/niedopasowanych reszt na końcach N lub C sekwencji docelowej w stosunku do sekwencji zapytania. W tym przypadku, procent identyczności wyliczany w FASTDB nie podlega ręcznemu poprawianiu. Ponownie, jedynie pozycje reszt poza końcami N lub C sekwencji docelowej, jak przedstawiono w dopasowaniu FASTDB, które nie są sparowane/dopasowane do sekwencji zapytania są korygowane ręcznie. Nie ma potrzeby wykonywania żadnych innych ręcznych poprawek dla celów niniejszego wynalazku.
Jak tu stosowano kwas nukleinowy, który „hybrydyzuje w ostrych warunkach’’ z sekwencją kwasu nukleinowego odnosi się do poiinukleotydu, który hybrydyzuje podczas całonocnej inkubacji w 42°C w roztworze obejmującym 50% formamid, 5x SSC (750 m NaCl, 75 mM cytrynian sodu), 50 mM fosforanu sodu (pH 7,6), 5x odczynnik Denhardta, 10% siarczan dekstranu i 20 μg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia, z późniejszym płukaniem filtrów w 0,1x SSC w około 65°C.
Stosowany tutaj termin „domena lokalizacji w aparacie Colgiego odnosi się do sekwencji aminokwasowej polipeptydu znajdującego się w aparacie Golgiego, która jest odpowiedzialna za jego zakotwiczenie w miejscu znajdującym się w aparacie Golgiego. Na ogół, domeny lokalizacji obejmują aminokońcowe „ogony’ enzymu.
Stosowany tutaj termin „funkcja efektorowa odnosi się do tych biologicznych aktywności, którymi cechuje się region Fc (natywna sekwencja regionu Fc lub wariant sekwencji aminokwasowej regionu Fc) przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciał obejmują, ale nie wyłącznie, powinowactwo wiązania się z receptorem Fc, cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC), fagocytozę komórkową zależną od przeciwciał (ADCP), wydzielanie cytokin, pobieranie antygenu zależne od kompleksów immunologicznych przez komórki prezentujące antygen, negatywną regulację powierzchniowych receptorów komórek, itd.
Stosowany tutaj termin „manipulować, poddane manipulacji, manipulowanie i manipulacja glikozylacją, ma obejmować dowolną manipulację wzorem glikozylacji naturalnie występującego polipeptydu lub jego fragmentu. Manipulowanie glikozylacją obejmuje manipulowanie metaboliczne systemem glikozylacji komórki, w tym, manipulacje genetyczne szlakami syntezy oligosacharydów, w celu osiągnięcia zmiany glikozylacji glikoprotein wyrażanych w komórkach. Dalej, manipulowanie glikozylacją obejmuje wpływy mutacji i środowiska komórki na glikozylację.
Stosowany tutaj termin „komórka gospodarza obejmuje dowolny rodzaj układu komórkowego, który można poddać manipulacji w celu wytwarzania postaci o zmodyfikowanej glikozylacji białek, fragmentów białek lub peptydów będących przedmiotem zainteresowania, w tym, przeciwciał, fragmentów przeciwciał i fuzji białkowych. Zwykle, komórki gospodarza zmieniono tak, aby wyrażały GnT III na optymalnym poziomie. Komórki gospodarza obejmują komórki z hodowli, np. ssacze komórki z hodowli, takie jak komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki nybrydoma, komórki drożdży, komórki owadzie i komórki roślinne, aby wymienić tylko kilka, ale także komórki ze zwierząt transgenicznych, roślin transgenicznych lub roślin hodowlanych lub z tkanek zwierzęcych.
Stosowany tutaj termin „cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc obejmuje cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) i cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy rozpuszczalna fuzja białkowa Fc zawierająca ludzki region Fc. Jest to mechanizm odpornościowy prowadzący do lizy „komórek docelowych opłaszczonych przez przeciwciała’, powodowanej przez ludzkie, efektorowe komórki układu odpornościowego, w którym:
„Ludzkimi, efektorowymi komórkami układu odpornościowego’ są populacje leukocytów, które eksponują na swojej powierzchni receptory Fc, przez które wiążą się z regionem Fc przeciwciał lub fuzji białkowych Fc i wykazują funkcje efektorowe. Taka populacja może obejmować, ale nie wyłącznie, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i/lub komórki NK (NK).
„Komórki docelowe opłaszczone przez przeciwciała są to komórki związane przez przeciwciała lub fuzje białkowe Fc. Przeciwciała lub fuzje białkowe Fc wiążą się do docelowych komórek przez część białkową N-końcową w stosunku do regionu Fc.
Stosowany tutaj termin „zwiększona cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc określa wzrost ilości „opłaszczonych przez przeciwciała komórek poddanych lizie w danym czasie, przy danym stężeniu przeciwciał lub fuzji białkowej Fc, w pożywce otaczającej komórki docelowe,
PL 222 219 B1 przez zdefiniowany powyżej mechanizm cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc, i/lub zmniejszenie stężenia przeciwciał lub fuzji białkowej Fc w pożywce otaczającej komórki docelowe, wymaganego do osiągnięcia lizy danej liczby „opłaszczonych przeciwciałami komórek” w danym czasie, przez mechanizm cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc. Wzrost cytotoksyczn ości komórkowej, w której pośredniczy Fc jest zależny od cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy to samo przeciwciało lub fuzji białkowej Fc, wytworzonej w tym samym rodzaju komórek gospodarza, z zastosowaniem tych samych standardów wytwarzania, oczyszczania, formułowania i metod przechowywania, znanych specjalistom w dziedzinie, ale takich, które nie zostały wytworzone w komórkach gospodarza zmanipulowanych sposobami tutaj opisanymi tak, aby wyrażały glukozylotransferazę GnT III.
Przez przeciwciało mające zwiększoną cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) rozumie się przeciwciało mające zwiększoną ADCC, określoną dowolnym, odpowiednim sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Jeden z przyjętych in vitro testów ADCC jest opisany poniżej:
1) w teście stosuje się komórki docelowe, o których wiadomo, że wyrażają antygen docelowy, rozpoznawany przez wiążący antygen region przeciwciała;
2) w teście, jako komórki efektorowe stosuje się ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), wyizolowane z krwi od losowo wybranych, zdrowych dawców;
3) test przeprowadza się zgodnie z poniższym protokołem:
i) PBMC izoluje się stosując standardowe procedury wirowania w gradiencie gęstości i zawiesza się w pożywce RPMI do hodowli komórek w ilości 5 x 106 komórek/ml;
ii) komórki docelowe hoduje się standardowymi metodami hodowli tkankowych, zbiera się w fazie wzrostu wykładniczego przy żywotności wyższej niż 90%, przemywa się hodowlaną pożywką
RPMI, znakuje się dodając 100 MiKrocurie 51Cr, przemywa dwukrotnie pożywką do hodowli komórko5 wej i zawiesza w pożywce do hodowli komórkowej przy gęstości 105 komórek/ml;
iii) 100 mikrolitrów powyższej, końcowej zawiesiny komórek docelowych przenosi się do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania;
iv) przeciwciało rozcieńcza się seryjnie od 4000 ng/ml do 0,04 ng/ml w pożywce do hodowli komórkowej i dodaje się po 50 mikrolitrów otrzymanych roztworów przeciwciała do komórek docelowych na 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania, testując w trzech powtórzeniach różne stężenia przeciwciała pokrywające cały, powyższy zakres stężeń;
v) dla kontroli maksymalnego uwalniania (MR), do 3 dodatkowych studzienek na płytce zawierającej wyznakowane komórki docelowe dodaje się 50 mikrolitrów 2% (obj./obj.) wodnego roztworu niejonowego detergentu (Nonidet, Sigma, St. Louis) zamiast roztworu przeciwciała (punkt iv powyżej);
vi) dla kontroli spontanicznego uwalniania (SR), do 3 dodatkowych studzienek na płytce zawierającej wyznakowane komórki docelowe dodaje się 50 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowej RPMI zamiast roztworu przeciwciała (punkt iv powyżej);
vii) następnie 96-studzienkową płytkę do mikromiareczkowania wiruje się przy 50 x g przez 1 minutę i inkubuje się przez 1 godzinę w 4°C;
viii) do każdej ze studzienek dodaje się po 50 mikrolitrów zawiesiny PBMC (punkt i powyżej), aby osiągnąć stosunek komórek efektorowych: docelowych 25:1 i płytki umieszcza się w inkubatorze w atmosferze 5% CO2 w 37°C na 4 godziny;
ix) z każdej ze studzienek zbiera się nadsącz wolny od komórek, a uwolnioną eksperymentalnie radioaktywność (ER) mierzy się stosując licznik gammma;
x) procent specyficznej lizy wylicza się dla każdego stężenia przeciwciała na podstawie wzoru (ER-MR)/(MR-SR) x 100, w którym ER jest średnią radioaktywnością zliczoną (patrz punkt ix powyżej) dla tego stężenia przeciwciała, MR jest średnią radioaktywnością zliczoną (patrz punkt ix powyżej) dla kontroli MR (patrz punkt v powyżej) i SR jest średnią radioaktywnością zliczoną (patrz punkt ix powyżej) dla kontroli SR (patrz punkt vi powyżej);
4) „zwiększona ADCC jest określona jako wzrost maksymalnego procentu specyficznej lizy obserwowanej dla danego, testowanego powyżej przedziału stężeń przeciwciała i/lub zmniejszenie stężenia przeciwciała wymaganego do osiągnięcia połowy maksymalnego procentu specyficznej lizy obserwowanej dla danego, testowanego powyżej przedziału stężeń przeciwciała. Wzrost ADCC jest względny w stosunku do ADCC mierzonej w powyższym teście, zależnej od tego samego przeciwciała wytworzonego w tym samym rodzaju komórek gospodarza, z zastosowaniem tych samych standardów wytwarzania, oczyszczania, formułowania i metod przechowywania, znanych specjalistom w tej
PL 222 219 B1 dziedzinie, ale takiego, które nie zostało wytworzone w komórkach gospodarza poddanych manipulacji sposobami tutaj opisanymi tak, aby uzyskać nadekspresję glikozylotransferazy GnT III.
Stosowany tutaj termin „przeciwciało anty-CD20, oznacza przeciwciało, które specyficznie rozpoznaje na powierzchni komórkowej nieglikozylowaną fosfoproteinę o masie 35000 Daltonów, zwykle określaną jako antygen różnicowania Bp35 specyficzny dla ludzkich limfocytów B, potocznie określaną jako CD20.
Fuzje polipeptydowa tu ujawnione można otrzymać hodując komórki gospodarza według niniejszego wynalazku w pożywce w warunkach pozwalających na ekspresję kwasu nukleinowego kodującego taką fuzję polipeptydową i na odzyskanie takiej fuzji polipeptydowej z otrzymanej hodowli.
Sposoby modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego w komórce gospodarza obejmują wprowadzanie do takiej komórki gospodarza kwasu nukleinowego lub wektora. Modyfikowanym polipeptydem może być IgG lub jej fragment zawierający region Fc, korzystnie, IgG1 lub jej fragment zawierający region Fc, lub modyfikowanym polipeptydem może być fuzja białkowa zawierająca region odpowiadający regionowi Fc ludzkiej IgG.
Niniejszy wynalazek dotyczy komórki gospodarza zawierającej kwasy nukleinowe poddanej manipulacji tak, aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”), w ilości wystarczającej do zmodyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza, przy czym taki polipeptyd jest wybierany z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała i fuzję białkową obejmującą region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny. W korzystnym wykonaniu, polipeptydem wytwarzanym przez taką komórkę gospodarza jest IgG lub jej fragment. Najbardziej korzystnie, polipeptydem wytwarzanym przez taką komórkę gospodarza jest IgG1 lub jej fragment. Alternatywnie, polipeptyd wytwarzany przez taką komórkę gospodarza to fuzja białkowa zawierająca region odpowiadający regionowi Fc ludzkiej IgG, np. IgG1.
Modyfikowane polipeptydy wytwarzane przez komórki gospodarza według wynalazku jako rezultat modyfikacji wykazują zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc i/lub wzmocnioną funkcję efektorową. Korzystnie, zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc zwiększa wiązanie się z receptorem Fcy, takim jak receptor FcyRIII.
Zwiększoną funkcją efektorową jest korzystnie zwiększenie jednego z następujących: zwiększenie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał, zwiększenie fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP), zwiększenie wydzielania cytokin, zwiększenie pobierania antygenów zależnego od kompleksów immunologicznych przez komórki prezentujące antygen, zwiększona cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc, zwiększone wiązanie się z komórkami NK, zwiększone wiązanie się z makrofagami, zwiększone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi (PMN), zwiększone wiązanie się z monocytami, zwiększone krzyżowe sieciowanie związanych docelowo przeciwciał, zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnałów indukujące apoptozę, zwiększone dojrzewanie komórek dendry- tycznych i zwiększone uczulanie komórek T.
Komórką gospodarza według wynalazku może być komórka gospodarza wybrana z grupy obejmującej komórkę ssaka, komórkę drożdży, komórkę owadzią i roślinną. Korzystnie, komórką gospodarza jest komórka CHO, komórka BHK, komórka NSO, komórka SP2/0, komórka szpiczaka YO, mysia komórka szpiczaka P3X63, komórka PER, komórka PER.C6 lub komórka hybrydoma.
Poza kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową, komórki gospodarza wynalazku zawierają jeszcze co najmniej jeden transfekowany kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę przeciwciała, fragment przeciwciała, zachowujący funkcjonalny region Fc lub fuzję białkową, która zawiera region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny. W innych wykonaniach, co najmniej jeden transfekowany kwas nukleinowy koduje przeciwciało anty-CD20, chimerowe przeciwciało monoklonalne chCE7 przeciw ludzkiemu nerwiakowi, chimerowe przeciwciało monoklonalne chG250 przeciw rakowi komórek nerki, chimerowe przeciwciało monoklonalne ING-1 przeciw ludzkim rakom okrężnicy, płuc i sutków, humanizowane monoklonalne przeciwciało 3622W94 anty-ludzki antygen 17-1A, humanizowane monoklonalne przeciwciało A33 przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka, przeciwciało R24 przeciw czerniakowi człowieka skierowane przeciwko gangliozydowi GD3, chimerowe przeciwciało monoklonalne SF-25 przeciw rakowi płaskokomórkowemu, przeciwciało anty-ludzki EGFR, przeciwciało anty-ludzki EGFRvIII, przeciwciało anty-ludzki PSMA, przeciwciało anty-ludzki PSCA, przeciwciało anty-ludzki CD22, przeciwciało anty-ludzki CD30, przeciwciało anty-ludzki TAG72, przeciwciało antywysokocząsteczkowy antygen związany z czerniakiem (HMWMAA), przeciwciało anty-gangliozyd GD3, przeciwciało anty-gangliozyd GD2, przeciwciało anty-gangliozyd GM2, przeciwciało anty-ludzki
PL 222 219 B1 gangliozyd, przeciwciało anty-EGFRvIII, przeciwciało anty-integryna, przeciwciało anty-GD80, przeciwciało anty-LeY, przeciwciało anty-mucyna, przeciwciało anty-MUC18, przeciwciało anty-ludzki CD33, przeciwciało anty-ludzki CD38 człowieka, przeciwciało anty-ludzki CD40, przeciwciało antyludzki CD45, przeciwciało anty-ludzki CD52, przeciwciało anty-ludzki CD138, przeciwciało anty-ludzki wariant HLA-DR, przeciwciało anty-ludzki EpCAM, przeciwciało anty-ludzki CEA, przeciwciało antyludzki MUC1, przeciwciało anty-ludzki białko rdzenia MtJCl, przeciwciało przeciw nieprawidłowo glikozylowanemu ludzkiemu MUC1, przeciwciało przeciw wariantom ludzkiej fibronektyny zawierających domenę EB-D lub przeciwciało anty-ludzki HER2/neu.
Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza obejmującego (a) hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacji według wynalazku tak, aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydowa mającą aktywność aktywność e(1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”), w warunkach pozwalających na produkcję polipeptydu, który jest wybierany z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała z zachowaniem funkcjonalnego regionu Fc i fuzję białkową obejmującą region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie taka fuzja polipeptydowa mająca aktywność aktywność GalT jest wyrażana na poziomie wystarczającym do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza; i (b) izolowanie takiego polipeptydu.
Polipeptyd wytworzany sposobami według wynalazku, który ma zwiększone proporcje przeciętych oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu. W jeszcze innym wykonaniu, polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku jako wynik takiej modyfikacji ma zwiększone proporcje niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc. Niefukozylowane oligosacharydy mogą być typu hybrydowego lub złożonego. W szczególnie korzystnym wykonaniu, polipeptyd wytworzony w komórkach gospodarza sposobem według wynalazku ma zwiększone proporcje przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc. Przecięte, niefukozylowane oligosacharydy mogą być zarówno typu hybrydowego lub złożonego. W szczególności, sposób według niniejszego wynalazku może być stosowany do wytwarzania polipepty- dów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 45%, korzystniej co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 55%, korzystniej co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 65%, korzystniej co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 96%, korzystniej co najmniej 97%, korzystniej co najmniej 98%, korzystniej co najmniej 99% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest niefukozylowanych. Sposób według niniejszego wynalazku może być także stosowany do wytwarzania połipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 45%, korzystniej co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 55%, korzystniej co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 65%, korzystniej co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 96%, korzystniej co najmniej 97%, korzystniej co najmniej 98%, korzystniej co najmniej 99% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest przeciętych. Ponadto, sposób według niniejszego wynalazku może być stosowany do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 2C korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej. 35%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 45%, korzystniej co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 55%, korzystniej co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 65%, korzystniej co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 96%, korzystniej co najmniej 97% , korzystniej co najmniej 98%, korzystniej co najmniej 99% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest przeciętych, niefukozylowanych. Sposób według niniejszego wynalazku może być także stosowany do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest przeciętych, hybrydowych, niefukozylowanych.
Przeciwciała, fragmenty przeciwciał zachowujących region Fc i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny wytworzone sposobem według niniejszego wynalazku mogą być stosowane jako substancje czynne w kompozycjach farmaceutycznych do stosowania w sposobach leczenia nowotworów. Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać przeciwciała, fragmenty
PL 222 219 B1 przeciwciał zachowujących region Fc i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Leczenie nowotworów obejmuje podawanie skutecznej leczniczo ilości kompozycji farmaceutycznej.
W korzystnym wykonaniu każda cząsteczka kwasu nukleinowego zawarta w komórce gospodarza według niniejszego wynalazku jest na tym samym wektorze ekspresyjnym. W innym wykonaniu, każda cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje się na innym wektorze ekspresyjnym.
Identyfikacja i wytwarzanie kwasów nukleinowych kodujących białko, którego wzór glikozylacji ma być poddany modyfikacji.
Niniejszy wynalazek dotyczy komórek gospodarza do wytwarzania glikoform przeciwciał, fragmentów przeciwciał zawiera jących region Fc, fuzji białkowych z regionem równoważnym re gionowi Fc, mających zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc, korzystnie aktywującymi receptorami Fc, i/lub wzmocnione funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciała. Ujawniono identyfikację docelowych epitopów i wytwarzanie przeciwciał mających potencjalną wartość leczniczą, dla których pożądana jest modyfikacja wzoru glikozylacji i izolację odpowiednich kodujących je sekwencji kwasów nukleinowych.
Do wytwarzania przeciwciał wobec docelowych epitopów bę dących przedmiotem zainteresowania można zastosować różne procedury znane w tej dziedzinie. Takie przeciwciała obejmują, ale nie wyłącznie, przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, chimerowe, humanizowane, w pełni ludzkie, jednołańcu- chowe, fragmenty Fab i fragmenty wytworzone dzięki bibliotece ekspresyjnej ScFv, Fab, VH, IgG. Takie przeciwciała mogą być przydatne np. jako czynniki diagnostyczne lub terapeutyczne. Jako czynniki lecznicze, szczególnym przedmiotem zainteresowania cieszą się przeciwciała neutralizujące, tj. te, które konkurują o wiązanie z ligandem, substratem lub cząsteczką adaptorową.
W celu wytworzenia przeciwciał immunizuje się różne zwierzęta-gospodarzy przez wstrzyknięcie docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania w tym, ale nie wyłącznie, króliki, myszy, szczury itd. Przeciwciała poliklonalne można wzbudzić w zwierzętach przez wielokrotne podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) wstrzyknięcie odpowiedniego antygenu i adiuwanta. Aby wzmocnić odpowiedź odpornościową można zastosować różne adiuwanty w zależności od gatunków gospodarza w tym, ale nie wyłącznie, adiuwant Freunda (pełny lub niepełny), żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, poliole Pluronic, polianiony, peptydy, saponina, emulsje olejowe, hemocyjanina ze skałoczepa, dinitrofenol i potencjalnie użyteczne adiuwanty ludzkie, takie jak BCG (Bacille Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Zwierzęta immunizuje się przeciw antygenowi, immunogennym koniugatom lub pochodnym przez kombinację np. 100 g lub 5 g białka lub koniugatu (odpowiednio dla królików lub myszy) z 3 objętościami pełnego adiuwanta Freunda i wstrzyknięcie roztworu śródskórnie w wielu miejscach. Miesiąc później, zwierzętom podaje się dawkę przypominającą w ilości 1/5 do 1/10 wyjściowej ilości peptydu lub koniugatu w pełnym adiuwancie Freunda przez iniekcję śródskórną w wielu miejscach. Siedem do 14 dni później skrwawią się zwierzęta i oznacza się w surowicy miano przeciwciała. Zwierzętom podaje się dawkę przypominającą aż do osiągnięcia plateau miana. Korzystnie, zwierzętom podaje się dawkę przypominającą koniugatu tego samego antygenu, ale skoniugowanego z innym białkiem i/lub przez inny reagent sieciujący. Koniugaty można wytworzyć także w hodowlach zrekombino- wąnych komórek jako fuzje białkowe.
Przeciwciała monoklonalne dla celu będącego przedmiotem zainteresowania można otrzymać z wykorzystaniem dowolnej techniki, która zapewnia wytwarzanie cząsteczek przeciwciała przez ciągłe linie komórkowe w hodowli. Obejmuje to, ale nie wyłącznie, techniki hybrydoma najpierw opisane przez
Kohlera i Milsteina, Nature 256:495-97 (1975), techniki hybrydoma ludzkich limfocytów B (Kosbor i wsp., Immunology Today 4:72 (1983); Cote i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-30 (1983) i techniki hybrydoma EBV (Cole i wsp., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77-96 (Alan R. Liss, Inc., 1985)). Ponadto, można zastosować techniki opracowane do wytwarzania „przeciwciał chimerowych” (Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 81:6851-55 (1984); Neuberger i wsp., Nature 312:604-08 (1984); Takeda i wsp., Nature 314:452-54 (1985)) przez składanie genów z cząsteczki mysiego przeciwciała o specyficzności wobec odpowiedniego antygenu z genami z cząsteczki ludzkiego przeciwciała o odpowiedniej aktywności biologicznej. Techniki te również mogą być wykorzystane do wytwarzania przeciwciał chimerowych obejmujących cząsteczkę przeciwciała pochodzącą od innych ssaków. Alternatywnie, można zaadaptować techniki opisane dla wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych (zgłoszenie patentowe USA nr 4,946,778) do otrzymywania przeciwciał jednołańcuchowych mających
PL 222 219 B1 żądaną specyficzność. Ujawniono ponadto humanizowane przeciwciała, które poddano zmianom glikozylacji zgodnie ze sposobem według, niniejszego wynalazku. Techniki otrzymywania humanizowanych przeciwciał ujawniono, np. w zgłoszeniu patentowym USA nr 6,180,320 Queen i wsp. Stosując znane techniki można wytworzyć fragmenty przeciwciał zawierające miejsca specyficznego wiązania się z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Na przykład, takie fragmenty obejmują, ale nie wyłącznie, fragmenty F(ab')2, które można wytworzyć przez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała i fragmenty Fab, które można wytworzyć przez redukcję mostków disulfidowych fragmentów F(ab')2. Alternatywnie, można skonstruować biblioteki ekspresyjne Fab (Huse i wsp., Science 246:1275-81 (1989)), aby umożliwić szybką i łatwą identyfikację monoklonalnych fragmentów Fab o żądanej specyficzności wobec białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Po zidentyfikowaniu przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, których wzór glikozylacji ma być poddany modyfikacji, izoluje się kodującą je sekwencję kwasu nukleinowego za pomocą znanych technik.
a. Generowanie linii komórkowych do wytwarzania białek ze zmienionym wzorem glikozylacji
Niniejszy wynalazek dostarcza komórek gospodarza do generowania białek ze zmienionym wzorem glikozylacji. W szczególności, niniejszy wynalazek dostarcza komórek gospodarza do generowania glikoform białek, mających poprawioną wartość terapeutyczną. Zatem, w jednym aspekcie, wynalazek dostarcza komórek gospodarza poddanych manipulacjom tak, aby wyrażały np. fuzję polipeptydową mającą aktywność e(1,4.)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. Szczególnie, takie komórki można poddać manipulacjom, aby zawierały rekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą taką fuzję polipeptydową, połączoną funkcjonalnie z konstytutywnym lub regulowanym systemem promotorowym.
W jednym konkretnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność e(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego. W jednym aspekcie, komórka gospodarza jest poddana manipulacji cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą co najmniej jeden gen kodujący fuzję polipeptydową mającą aktywność e(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego.
Na ogół może być zastosowany dowolny rodzaj, hodowlanej linii komórkowej jako podstawa do skonstruowania linii komórkowej gospodarza. W korzystnym wykonaniu, w celu skonstruowania linii komórkowej gospodarza jako wyjściową linię komórkową stosuje się komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma lub inne komórki ssacze, komórki drożdży, komórki owadów lub komórki roślinne. (Patrz Ma, J.K.C. i wsp., Nature Genetics 4:794-805 (October 2003).
Jeden lub kilka kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową może być poddawanych ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora lub alternatywnie, regulowanego systemu ekspresji. Odpowiednie regulowane systemy ekspresji obejmują, ale nie wyłącznie, system ekspresji regulowany tetracykliną, system ekspresji indukowany ekdyzonem, system ekspresji uruchamiany lac, system ekspresji indukowany glukokortykoidem, system promotorowy indukowany temperaturą lub system ekspresji metalotioneiny indukowany metalem. Jeżeli układ komórek gospodarza zawiera szereg różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową część z nich można poddać ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora, podczas gdy inne są poddawane ekspresji pod kontrolą regulowanego promotora. Maksymalny poziom ekspresji jest to najwyższy, możliwy poziom stabilnej ekspresji fuzji polipeptydowej, który nie wywiera znaczącego, negatywnego wpływu na tempo wzrostu komórki, i możliwy jest do określenie standardowymi metodami eksperymentalnymi. Poziomy ekspresji określa się metodami ogólnie znanymi w tej dziedzinie, w tym analizą Western biot z zastosowaniem przeciwciał specyficznych wobec polipeptydu mającego aktywność GalT lub przeciwciała specyficznego wobec znacznika peptydowego połączonego z polipeptydem mającym aktywność GalT, hybrydyzacją Northern z zastosowaniem sondy w postaci kwasu nukleinowego specyficznego dla genu kodującego polipeptyd mający aktywność GalT lub sondy w postaci kwasu nukleinowego swoistej wobec kwasu nukleinowego kodującego znacznik peptydowy sfuzowany z polipeptydem mającym aktywność GalT, lub mierząc aktywność GalT. Alternatywnie, można zastosować lektynę, która wiąże się z produktami biosyntetycznymi GalT, na przykład, lektynę E-j-PHA. Alternatywnie, można zastosować test
PL 222 219 B1 funkcjonalny, w którym mierzy się zwiększone wiązanie do receptora Fc lub zwiększoną funkcję efektorową przeciwciał, otrzymanych w komórkach poddanych manipulacji przy użyciu kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność GalT. W innym alternatywnym wykonaniu, kwas nukleinowy może być połączony funkcjonalnie z genem reporterowym; poziomy ekspresji fuzji polipeptydowej mającej aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawierającej domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heteroiogicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego określa się mierząc sygnał związany z poziomem ekspresji genu reporterowego. Gen reporterowy może ulegać transkrypcji razem z kwasem (ami) nukleinowym(ymi) kodującym fuzję polipeptydową jako pojedyncza cząsteczka RNA; ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone zarówno przez wewnętrzne miejsce wiązania rybosomów (1RES) lub przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Gen reporterowy może ulegać translacji razem z co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową mającą aktywność e(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heteroiogicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego, tak, że tworzy się pojedynczy łańcuch polipeptydowy. Kwasy nukleinowe kodujące fuzje polipeptydowe mogą być połączone funkcjonalnie z genem reporterowym pod kontrolą pojedynczego promotora, tak, że kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową i gen reporterowy są transkrybowane do jednej cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana na dwie oddzielne cząsteczki RNA informacyjnego (mRNA); jeden z otrzymanych mRNA podlega translacji do białka reporterowego, a inny podlega translacji do fuzji polipeptydowej.
Jeżeli ekspresji podlega kilka różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową mającą aktywność e(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heteroiogicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, mogą być one ułożone w taki sposób, że są transkrybowane. jako jedna lub szereg cząsteczek mRNA. Jeżeli są. transkrybowane jako jedna cząsteczka mRNA, ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone zarówno przez wewnętrzne miejsce wiązania rybosomów (1RES) lub przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Mogą być transkrybowane z jednego promotora do cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana do szeregu oddzielnych cząsteczek RNA informacyjnego (mRNA), które, następnie są poddawane translacji, do odpowiednich, kodowanych przez nie fuzji polipeptydowych.
W innych wykonaniach dostarczane są systemy ekspresji w komórkach gospodarza do wytwarzania przeciwciał terapeutycznych, mających zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc, w szczególności wiązanie z aktywacyjnymi receptorami Fc i wzmocnione funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał. Ogólnie, ekspresyjne systemy komórek gospodarza poddano manipulacji tak, aby uzyskać ekspresję kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało, dla którego pożądane jest wytwarzanie zmienionych głikoform, razem, z co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT)) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heteroiogicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego. W jednym wykonaniu, system komórek gospodarza transfekowano co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym taką fuzję polipeptydową. Zwykle, stransfekowane komórki są selekcjonowane w celu identyfikacji i izolacji klonów, które stabilnie wyrażają fuzję polipeptydową.
Wyjściowo może być zastosowana dowolna, hodowlana linia komórkowa do Skonstruowania linii komórkowej gospodarza według niniejszego wynalazku. W korzystnym wykonaniu, można zastosować komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma, inne komórki ssacze, komórki drożdży, komórki owadów lub komórki roślinne. Zwykle, konstruuje się takie linie komórkowe, aby zawierały ponadto, co najmniej jeden transfekowany kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała zawierający region Fc immunoglobuliny lub fuzję białkową, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny. Zwykle, takie linie komórkowe wytwarzające przeciwciała pochodzą od klonów wytwarzających i wydzielających przeciwciało z wysoką specyficznością wytwarzania w zakresie od 20 do 120 μg/(komórkę dziennie). W alternatywnym wykonaniu, w celu wytworzenia skonstruowanych komórek gospodarza według wynalazku jako wyjściową linię komórkową, można zastosować linię komórek hybrydoma wyrażającą konkretne przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania.
W jednym wykonaniu, kwasy nukleinowe kodujące przeciwciało, fragment przeciwciała lub fuzję, polipeptydową Fc, klonuje się w wektorach do ekspresji przeciwciał, a następnie transfekuje do komórek gospodarza a klony komórek selekcjonuje się i przeszukuje pod kątem wysokiej i stabilnej
PL 222 219 B1 produkcji specyficznych przeciwciał. Takie wyselekcjonowane klony są następnie transfekowąne wektorami ekspresyjnymi dla glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny zawierającymi kwasy nukleinowe kodujące, na przykład, (a) fuzję polipeptydową o aktywności beta 1,4-galaktozylotransferazy (GalT) lub (b) polipeptyd o aktywności alfa-mannozydazy II (Man II) aparatu Golgiego (c) fuzję polipeptydową o aktywności GnT III lub (d) fuzję polipeptydową o aktywności GalT i kolejny polipeptyd o aktywności. Man II. Klony są następnie selekcjonowane i przeszukiwane pod kątem stabilnej ekspresji genów kodujących przeciwciała na poziomach prowadzących do wysokiej specyficzności wytwarzania przeciwciał przy stabilnej ekspresji genów glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny na poziomach ekspresji prowadzących do modyfikacji wzoru glikozylacji regionu Fc, w tym zwiększenia udziału frakcji niefukozylowanych oligosacharydów, które mogą być zarówno podzielone lub niepodzielone i które ponadto mogą być typu złożonego lub hybrydowego, który jest związany ze zwiększeniem wiązania z receptorem Fc, szczególnie ze zwiększeniem powinowactwa wiązania Fc-FcyRIII i ze zwiększeniem funkcji efektorowych, w których pośredniczy Fc, w tym, ale nie wyłącznie, cytotoksyczności komórkowej zależnej od Fc. Metody selekcji i przeszukiwania opisano poniżej.
W innym wykonaniu, odwrócona jest kolejność dwóch transfekcji opisanych powyżej, a mianowicie transfekcji wektorami do ekspresji przeciwciał i transfekcji wektorami do ekspresji glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny, tj. komórki gospodarza są najpierw transfekowane wektorami do ekspresji glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny a następnie wektorami do ekspresji przeciwciał. W takim podejściu, klony z pierwszej transfekcji mogą być przeszukane pod kątem odpowiednich poziomów stabilnej ekspresji genów glikotransferaz dowolną z metod opisanych dalej poniżej lub alternatywnie można poddać przejściowej transfekcji repliki takich klonów z wektorami do ekspresji przeciwciał i wtedy można zastosować metody przeszukiwania opisane dalej poniżej, w celu identyfikacji klonów o stabilnej ekspresji genów glikotransferaz na poziomach prowadzących do modyfikacji wzoru glikozylacji regionu Fc i do zwiększenia powinowactwa wiązania się z receptorami Fc, w tym receptorami Fc-FcyRIII i do zwiększenia funkcji efektorowych, w których pośredniczy Fc, w tym cytotoksyczności komórkowej zależnej od Fc.
W dalszym wykonaniu, transfekuje się jednocześnie genami kodującymi przeciwciała i genami glikotransferaz w pojedynczym etapie transfekcji albo jednym wektorem ekspresyjnym albo oddzielnymi wektorami.
Zwykle, co najmniej jeden kwas nukleinowy w systemie komórki gospodarza koduje fuzję polipeptydową mającą aktywność e(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heteroiogicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego lub alternatywnie koduje polipeptyd o aktywności a-mannozydazy IX (Man II) z aparatu Golgiego.
i. Systemy ekspresji
Można zastosować metody dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie, aby skonstruować wektory ekspresyjne zawierające sekwencję kodującą, białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową mającą aktywność e(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heteroiogicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego, razem z odpowiednimi sygnałami kontroli transkrypcji/translacji. Metody te obejmują techniki rekombinacji DNA in vitro, techniki syntezy i in vivo rekombinacji /rekombinacji genetycznej. Dla przykładu patrz na techniki opisane przez Maniatis i wsp., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1.989) i przez Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and-Wiley Interscience, N.Y. (1989).
Do ekspresji sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową można zastosować szereg systemów gospodarz-wektor ekspresyjny. Korzystnie, stosowane są komórki ssacze jako system komórek gospodarza transfekowany wektorami ekspresyjnymi będącymi DNA rekombinowanego plazmidu lub DNA kosmidu, zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową. Najkorzystniej, jako system komórek gospodarza można zastosować komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER. C6 lub komórki hybrydoma, inne komórki ssacze, komórki drożdży, komórki owadów lub komórki roślinne. Pewne przykłady systemów ekspresji i metod selekcji są opisane w następujących odnośnikach i w odnośnikach w nich zawartych: Borth i wsp., Biotechnol. Bioen. 71(4): 266-73 (2000-2001), w Werner i wsp., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), w Andersen and Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), w Chadd and Chamów, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001) i w Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12:450-454 (2001). W alternatywnych wykonaniach można
PL 222 219 B1 rozważać zastosowanie innych systemów eukariotycznych komórek gospodarza, w tym, komórek drożdży transformowanych zrekombinowanymi drożdżowymi wektorami ekspresyjnymi zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową; systemów komórek owadzich infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np, bakulowirus) zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową; systemów komórek roślinnych infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. wirus mozaiki kalafiora, CaMV; wirus mozaiki tytoniu, TMV) lub transformowanych rekombinowanymi plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi (np. plazmid Ti) zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową lub systemy komórek zwierzęcych infekowanych rekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. adenowirus, wirus ospy krowiej), w tym linie komórkowe poddane manipulacjom, aby zawierały wiele kopii DNA kodujących białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową, zarówno amplifikowane stabilnie (CHO/dhfr) lub amplifikowane niestabilnie w chromosomach typu „duble-minute” (np. mysie linie komórkowe).
W sposobie według wynalazku, ogólnie, stabilna ekspresja jest korzystniejsza od przejściowej, ponieważ zwykle osiąga się bardziej powtarzalne wyniki i jest także bardziej odpowiednia dla wytwarzania na dużą skalę, tj. wytwarzania przeciwciał o zmienionej glikozylacji w liniach komórkowych w skali produkcyjnej. Zamiast wykorzystywać wektory ekspresyjne zawierające wirusowe miejsce początku, komórki gospodarza można transformować, odpowiednimi, kodującymi kwasami nukleinowymi, kontrolowanymi przez odpowiednie elementy kontrolujące ekspresję (np. promotor, wzmacniacz, sekwencje, terminatory transkrypcji, miejsca poliadenylacji itp.) i marker selekcyjny. Po wprowadzeniu obcego DNA, umożliwia się skonstruowanym komórkom wzrost przez. 1-2 dni we wzbogaconych pożywkach, a następnie przenosi się je do pożywek selekcyjnych. Marker selekcyjny na zrekombinowanym plazmidzie nadaje oporność na selekcję i umożliwia selekcję komórek, w których plazmidy są włączone stabilnie do ich chromosomów i na wzrost powodujący powstawanie ognisk (foci), które dzięki temu można klonować i namnażać otrzymując linie komórkowe.
Można zastosować szereg systemów selekcji, w tym, ale nie wyłącznie, geny kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (Wigler i wsp., Cell 11:223 (1977)), fosforybozylotransferazy hypoksantyna-gunina (Szybalska i Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), fosforybozyiotransferazy adeninowej (Lowy i wsp., Cell 22:817 (1980)), które można zastosować Odpowiednio w komórkach tk-, hgprt- lub aprt-. Można wykorzystać również oporność na antymetabolity jako podstawę do selekcji na dhfr, który nadaje oporność na metotre.ksat (Wigier i wsp., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O'Hare i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, który nadaje oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan i Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, który nadaje oporność na aminoglikozyd G-418 (Colberre-Garapin i wsp., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); i hygro, który nadaje oporność na hygromycynę (Santerre i wsp., Gene 30:147 (1984). Ostatnio opisano dodatkowe geny selekcyjne, mianowicie trpB, który umożliwia komórkom wykorzystanie indolu zamiast tryptofanu; hisD, który umożliwia komórkom wykorzystanie histynolu zamiast histydyny (Hartman i Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); system syntazy glutaminy i ODC (dekarboksylazy ornitynowej), który nadaje oporność na inhibitor dekarboksylazy ornitynowej, 2-(difluorometyloj-DL-ornitynę, DFMO (McConlogue, w: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)).
ii. Identyfikacja transfektantów lub transformantów, które wyrażają białko o zmodyfikowanym wzorze glikozylacji
Komórki gospodarza, które zawierają sekwencję kodującą i które wyrażają biologicznie aktywne produkty genów, można identyfikować co najmniej czterema ogólnymi podejściami: (a) hybrydyzacją DNA-DNA lub DNA-RNA; (b) obecnością lub brakiem funkcji genu „markerowego”; (c) oceną poziomu transkrypcji jak zmierzona ekspresją odpowiednich transkryptów mRNA w komórce gospodarza; (d) wykrywania produktu genu przez pomiar testem immunologicznym lub jego aktywnością biologiczną.
W pierwszym podejściu, obecność sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową, wstawionych do wektora ekspresyjnego, można wykrywać przez hybrydyzację DNA-DNA lub DNA-RNA z zastosowaniem sond obejmujących sekwencje nukleotydowe, które są homologiczne odpowiednio do odpowiednich sekwencji kodujących, ich części lub pochodnych.
PL 222 219 B1
W drugim podejściu, system zrekombinowany wektor ekspresyjny/gospodarz, może być zidentyfikowany i selekcjonowany na podstawie obecności lub braku funkcji konkretnego genu „markerowego” (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki, oporności na metotreksat, fenotypu po transformacji, tworzenia ciał okluzyjnych w bakuiowirusach, itd.). Na przykład, jeżeli sekwencja kodująca białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencja kodującą fuzję polipeptydową została wstawiona do sekwencji genu markerowego wektora rekombinanty zawierające odpowiednie sekwencje kodujące można zidentyfikować przez brak funkcji genu markerowego. Alternatywnie, gen markerowy można umieścić tandemowo z sekwencjami kodującymi pod kontrolą tego samego lub innego promotora, wykorzystywanego do kontrolowania ekspresji sekwencji kodujących. Ekspresja markera, w odpowiedzi na indukcję lub selekcję wskazuje na ekspresję sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową.
W trzecim podejściu, w testach hybrydyzacyjnych można określać aktywność transkrypcyjną regionu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową. Na przykład, można wyizolować RNA i poddać analizie Northern z wykorzystaniem sondy homologicznej do sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową lub do ich konkretnego fragmentu. Alternatywnie, można wyizolować całkowite kwasy nukleinowe komórki gospodarza i poddać analizie hybrydyzacyjnej z takimi sondami.
W czwartym podejściu, ekspresję produktów białkowych białka będącego przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heteroiogicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, można określać immunologicznie, np. przez Western biot, w testach immunologicznych takich jak radioimmunologiczne testy precypitacji, testy immunoenzymatyczne i tym podobne. Jednak, ostateczny test działania systemu ekspresyjnego, obejmuje wykrywanie aktywnych biologicznie produktów genów.
b. Wytwarzanie i stosowanie białek i fragmentów białek o zmienionych wzorach glikozylacji i. Wytwarzanie i stosowanie przeciwciał mających zwiększone funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał.
W korzystnych wykonaniach, niniejszy wynalazek dostarcza glikoform przeciwciał i fragmentów przeciwciał, mających zwiększone wiązanie się z receptorem Fc i/lub zwiększone funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał.
Testy kliniczne nieskoniugowanych przeciwciał monoklonalnych (mAB) w leczeniu pewnych typów raka dostarczyły ostatnio zachęcających wyników. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Deo i wsp., Immunology Today 18:127 (1997). Chimerowe, nieskoniugowane IgG1 zostały dopuszczone do leczenia nieziarniczego chłoniaka z limfocytów B o niskim stopniu zróżnicowania, Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997), podczas, gdy inne, nieskoniugowane mAb, humanizowane IgG1 ukierunkowane na lite guzy sutków, także wykazywały obiecujące wyniki w fazie III testów klinicznych. Deo i wsp., Immunology Today 18:127 (1997). Antygeny dla tych dwóch mAb są wyrażane na wysokich poziomach w odpowiednich komórkach nowotworowych, i przeciwciała pośredniczą w silnym niszczeniu nowotworu przez komórki efektorowe in vitro i in vivo. Przeciwnie, wiele innych, nieskoniugowanych mAb o wysokich specyficznościach wobec nowotworu nie może wzbudzić wystarczająco silnych funkcji efektorowych , aby być przydatnymi klinicznie. Frost i wsp., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus i wsp., J. Immunother. 19:184-91 (1996). Dla pewnych słabszych mAb, testuje się obecnie leczenie dodatkowymi cytokinami. Dodanie cytokin może stymulować cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) przez wzrost aktywności i ilości krążących limfocytów. Frost i wsp., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus i wsp., J. Immunother. 19:184-91 (1996). ADCC, atak lityczny na komórki opłaszczone przeciwciałami, jest wzbudzany przez związanie receptorów leukocytów z regionem stałym (Fc) przeciwciał. Deo. i wsp., Immunology Today 18:127 (1997).
Innym, ale uzupełniającym podejściem do wzmocnienia aktywności ADCC niekoniugowanych przeciwciał IgG1 jest manipulowanie regionu Fc przeciwciała. Badania z manipulowaniem białkami wykazały, że FcyR oddziałują z niższym regionem zawiasowym domeny CH2 IgG. Lund i wsp., J. Immunol. 157:4963-69 (1996). Jednak, wiązanie FcyR wymaga również obecności oligosacharydów przyłączonych kowalencyjnie przy konserwatywnym Asn297 w regionie CH2 Lund i wsp., J. Immunol. 157:4963-69 (1996); Wright i Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), co sugeruje, że oba zarówno oligosacharyd jak i. polipeptyd bezpośrednio przyczyniają się do miejsca oddziaływania lub, że oligoPL 222 219 B1 sacharyd jest wymagany do zachowania konformacji aktywnego polipeptydu CH2. Zatem, modyfikacja struktury oligosacharydu może być badana jako środek zwiększający powinowactwo oddziaływania.
Cząsteczka IgG niesie dwa N-połączone oligosacharydy w swoim regionie Fc, po jednym na każdym ciężkim łańcuchu. Jak każda glikoproteina, przeciwciało jest wytwarzane jako populacja glikoform, które mają taki sam szkielet polipetydowy ale mają różne oligosacharydy przyłączone do miejsc glikozylacji. Oligosacharydy znajdujące się zwykle w regionie Fc surowiczych IgG są typu złożonego lub dwuantenowego (Wormald i wsp., Biochemistry 36:130-38 (1997)), o niskim poziomie końcowych podstawników kwasu sjalowego i przecinającej N-acetyloglukozaminy CGlcNAc) i o różnym stopniu końcowej glikozylacji i fukozylacji rdzenia. Niektóre badania sugerują, że minimalna struktura węglowodanowa wymagana do wiązania FcyR zawarta jest w rdzeniu oligosacharydowym. Lund i wsp., J. Immunol. 157:4963-69 (1996).
Linie komórkowe pochodzące od myszy lub chomika używane w przemyśle lub w badaniach akademickich do wytwarzania niekoniugowanych, terapeutycznych mAb zwykle przyłączają wymagane detrminanty oligosacharydowe do miejsc Fc. IgG wyrażanym w tych liniach komórkowych brak jednak przecinającej N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) znalezionej w małych ilościach w surowiczych IgG. Lifely i wsp., Glycobiology 318:813-22 (1995). Dla odmiany, ostatnio zaobserwowano, że pewne postacie glikoform szczurzej, wytworzonej przeciw czerniakowi, humanizowanej IgG1 (CAMPATH-1H) niosą przecinającą GlcNAc. Lifely i wsp., Glycobiology 318:813-22 (1995). Przeciwciało pochodzące z komórki szczurzej, osiągnęło podobny, maksymalny poziom aktywności ADCC in vitro jak przeciwciała CAMPATH-1H wytworzone w standardowych liniach komórkowych, ale przy znacząco niższych stężeniach przeciwciała.
Antygen CAMPATH jest zwykle obecny na wysokim poziomie na komórkach chłoniaka i jego chimerowe mAb ma wysoką aktywność ADCC pod nieobecność przecinającej GlcNAc. Lifely i wsp., Glycobiology 318:813-22 (1995). W szlaku N-połączonej glikozylacji, przecinająca GlcNAc jest dodawana przez enzym e(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazę III (GnT III). Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986).
W poprzednich badaniach stosowano linię komórkową CHO wytwarzającą pojedyncze przeciwciało, którą wcześniej skonstruowano tak, aby wyrażała w regulowany zewnętrznie sposób różne poziomy sklonowanego genu enzymu GnT III (Umana, P. i wsp., 7:176-180 (1999)). Podejście to, po raz pierwszy ustaliło silny związek między ekspresją GnT III i aktywnością ADCC modyfikowanego przeciwciała.
Dalsze przeciwciała mające zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc i zwiększoną funkcję efektorową obejmują, ale nie wyłącznie, przeciwciało monoklonalne (chCE7) przeciw ludzkiemu nerwiakowi, chimerowe przeciwciało monoklonalne (chG250) przeciw rakowi komórek nerki, humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-HER2 (np. Trastuzumab (HERCEPTIN)) chimerowe przeciwciało monoklonalne (ING-1) przeciw ludzkim rakom okrężnicy, płuc i piersi humanizowane monoklonalne przeciwciało anty-ludzki antygen 17-1A (3622W94), humanizowane monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka (A33), przeciwciało przeciw czerniakowi człowieka skierowane przeciwko gangiiożydom GD3 (R24), chimerowe przeciwciało monoklonalne przeciw rakowi piaskokomórkowemu (SF-25), monoklonalne przeciwciało przeciw drobnokomórkowemu rakowi płuc człowieka (BEC2, ImClone Systems, Merck KgaA), monoklonalne przeciwciało przeciw chłoniakowi nieziarniczemu człowieka (Bexxar (tositumomab, Coulter Pharmaceuticals), Oncolym (Techniclone, Alpha Therapeutic)), przeciwciało monoklonalne przeciw rakowi piaskokomórkowemu głowy i szyi człowieka (C225, ImClone Systems), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka (Panorex (edrecolomab), Centocor, Glaxo Wellcome), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi jajników człowieka (Theragyn, Antisoma), monoklonalne przeciwciało przeciw ostrej białaczka szpikowej człowieka (SmartMl95, Protein Design Labs, Kanebo), monoklonalne przeciwciało przeciw złośliwemu glejakowi człowieka (Cotara, Techniclone, Cambridge Antibody Technology), monoklonalne przeciwciało przeciw chłóniakowi człowieka wywodzącemu się z limfocytów B (IDEC-Y2B8, IDEC Pharmaceuticals), monoklonalne przeciwciało przeciw litym guzom człowieka (CEA-Cide, Immunomedics), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka (Iodine 131-MN-14, Immunomedics), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi jajników, nerki, sutka i prostaty człowieka (MDX-210, Medarex, Novartis), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu oraz trzustki człowieka (TTMA, Pharmacie & Upjohn), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi człowieka wyrażającemu TAG-72 (MDX-220, Medarex, Novartis), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi człowieka wyrażającemu EGFr (MDX-447), monoklonalne przeciwciało Anty-VEGF (Genen24
PL 222 219 B1 tech), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi piersi, płuc, prostaty i trzustki człowieka (BrevaRex, AltaRex), monoklonalne przeciwciało przeciw ostrej białaczce szpikowej człowieka (Monoclonal Antibody Conjugate, Immunex). Ponadto ujawnionofragmenty przeciwciał i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunoglobulin.
ii. Wytwarzanie i zastosowanie fuzji białkowych zawierających region równoważny regionowi Fc immunoglobuiiny, który promuje cytotoksyczność, w której pośredniczy Fc
Powyżej omówiono sposób zwiększania powinowactwa wiązania się z receptorem Fc i/lub funkcji efektorowej leczniczych przeciwciał. Zwiększenie to osiągane jest to przez zmianę wzoru glikozylacji regionu Fc takich przeciwciał, w szczególności przez manipulację komórkami wytwarzającymi przeciwciała tak, aby wytwarzały polipeptydy o aktywności np. GnT III lub o aktywności GalT lub o aktywności Man II, które modyfikują oligosacharydy przyłączone do regionu Fc takich przeciwciał. Strategię tę można zastosować do zwiększenia cytotoksyczności komórkowej za pośrednictwem Fc, przeciwko niepożądanym komórkom, w której pośredniczy dowolna cząsteczka niosąca region, który jest równoważny regionowi Fc immunoglobuiiny nie tylko lecznicze przeciwciała, ponieważ zmiany wprowadzone przez manipulację glikozylacją dotyczą jedynie regionu Fc, a zatem jego oddziaływań z receptorami Fc na powierzchni komórek efektorowych biorących udział w mechanizmie ADCC. Cząsteczki zawierające Fc, do których można zastosować ujawnione niniejszym sposoby, obejmują, ale nie wyłącznie, (a) rozpuszczalne fuzje białkowe wytworzone z białkowej domeny kierującej połączonej z N-końcem regionu Fc (Chamov and Ashkenazi, Trends Biotech. 14:52 (1996)) i (b) fuzji białkowych zakotwiczonych w błonie plazraatycznej wytworzonych z domeny transbłonowej typu II, która lokalizuje w błonie plazmatycznej połączonej z N-końcem regionu Fc (Stabila, P.F., Nature Biotech, 16:1357 (1998)).
W przypadku rozpuszczalnych fuzji białkowych (a) domena kierująca kieruje wiązaniem się fuzji białkowej z niepożądanymi komórkami, takimi jak komórki rakowe, tj. w analogiczny sposób do przeciwciał terapeutycznych. Zastosowanie obecnie opisanego sposobu zwiększania funkcji efektorowej, w tym aktywności cytotoksyczności komórkowej za pośrednictwem Fc, w której pośredniczą te Cząsteczki, będzie identyczne ze sposobem stosowanym dla przeciwciał terapeutycznych.
W przypadku fuzji białkowych zakotwiczonych w błonie plazmatycznej (b) komórki w organizmie niepożądane muszą mieć ekspresję genu kodującego fuzję białkową. Można to osiągnąć przez podejścia terapii genowej, tj. transfekując komórki in vivo plazmidem lub wektorem wirusowym, który kieruje ekspresję genów kodujących fuzję białkową do niepożądanych komórek lub przez implantację w organizmie komórek poddanych manipulacjom genetycznym tak, aby wyrażały fuzję białkową na swojej powierzchni. Te ostatnie komórki będą zwykle implantowane do organizmu wewnątrz kapsułki polimerowej (terapia enkapsulowanymi komórkami), przy czym nie mogą być zniszczone przez dowolny mechanizm cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc. Jednak, gdy kapsułka ulegnie uszkodzeniu, komórki mogą się wydostać i staną się niepożądanymi, wtedy mogą być zniszczone przez cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc. Stabila et al., Nature Biotech. 16:1357 (1998). W tym przypadku, obecnie ujawniony sposób byłby stosowany zarówno przez wprowadzenie do wektora terapii genowej dodatkowej kasety do ekspresji genu, zapewniającego odpowiednie lub maksymalne poziomy ekspresji fuzji poiipeptydowej lub przez manipulację komórkami,, które mają. być implantowane tak, aby wyrażały fuzję polipeptydową na odpowiednich lub maksymalnych poziomach.
Terapeutyczne zastosowanie przeciwciał, fragmentów przeciwciał i fuzji polipetydowych wytworzonych sposobem według wynalazku
Przeciwciała (tj. przeciwciała, fragmenty przeciwciał i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunogiobuliny) można stosować samodzielnie do namierzania i zabijania komórek nowotworowych in vivo. Przeciwciała można również stosować w połączeniu z odpowiednim czynnikiem, terapeutycznym do leczenia ludzkiego raka. Na przykład, przeciwciała można również stosować w połączeniu ze standardowymi lub konwencjonalnymi metodami, takimi jak chemioterapia, radioterapia lub mogą być koniugowane lub łączone z lekiem lub terapeutyczną toksyną, jak również z limfokiną lub czynnikiem hamującym wzrost guza, w celu dostarczania czynników terapeutycznych do miejsca raka.
Techniki koniugacji takich czynników terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane [patrz, np., Amon i wsp., „Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld i wsp. (wyd.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i wsp., „Antibodies For Drug Delivery”, w Controlled Drug Delivery (wyd. 2), Robinson i wsp. (wyd.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, „Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In
PL 222 219 B1
Cancer Therapy: A Review”, w Monoclonal Antibodies' 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera i wsp. (wyd.), str. 475-506 (1985); i Thorpe i wsp., „The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)].
Alternatywnie, przeciwciało ze zmienioną glikozylacją może być połączone z promieniowaniem o dużej energii, np. z radioizotopem, takim jak <131>I, który po umiejscowieniu w miejscu guza powoduje zabicie kilku średnic komórek [patrz, np. Order, „Analysis, Results, and Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”, w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i wsp., (wyd.), str. 303-16 (Academic Press 1985)]. Zgodnie z jeszcze innym wykonaniem przeciwciała tu ujawnione można koniugować z innym przeciwciałem, aby utworzyć heterokoniugat przeciwciał w celu leczenia komórek nowotworowych, jak opisano przez Segal w opisiepatentowym USA nr 4,676,980.
Jeszcze inne zastosowania terapeutyczne dla ujawnionych tu przeciwciał obejmują koniugowanie lub łączenie, np. technikami rekombinowania DNA, z enzymem zdolnym do przemiany proleku w lek cytotoksyczny i zastosowanie takich koniugatów przeciwciało-enzym w kombinacji z prolekiem do przekształcania proleku w czynnik cytotoksyczny w miejscu raka [patrz, np., Senter i wsp., „Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-46 (1988); „Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates”, Cancer Research 49:5789-5792 (1989); i Senter, „Activation of Prodrugs. by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy”, FASEB J. 4:188-193 (1990)].
Jeszcze inne zastosowania terapeutyczne tu ujawnionych przeciwciał obejmują zastosowanie, albo w obecności dopełniacza albo jako część koniugatu przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, do usuwania komórek nowotworowych ze szpiku kostnego pacjentów z rakiem. Według tego podejścia, autolo- gićzny szpik kostny może być usunięty ex vivo przez traktowanie przeciwciałem i szpik kostny może być wprowadzony z powrotem pacjentowi [patrz, np. Ramsay i wsp., „Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies”, J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)].
Ponadto, w leczeniu można zastosować przeciwciała chimerowe, rekombinowane immunotoksyny i inne rekombinowane konstrukty tu ujawnione zawierające specyficzność regionu wiążącego antygen, żądanego przeciwciała monoklonalnego. Ma przykład, do leczenia ludzkiego raka in vivo można zastosować jednołańcuchowe immunotoksyny.
Podobnie, do leczenia ludzkiego raka in vitro można zastosować fuzję polipeptydową zawierającą, co najmniej region wiązania antygenu tu ujawnionego przeciwciała połączony co najmniej, z funkcjonalnie aktywną częścią innego białka mającego aktywność przeciwnowotworową, np. limfokiny lub onkostatyny. Ponadto, znane w tej dziedzinie techniki rekombinacji można zastosować do konstrukcji przeciwciał dwuwartościowych, w których jedna ze specyficzności wiązania przeciwciała jest skierowana przeciw antygenowi związanemu z nowotworem, podczas gdy druga specyficzność wiązania przeciwciała jest skierowana przeciw cząsteczce innej niż ten antygen związany z nowotworem.
Niniejszym ujawniono sposób selektywnego zabijania komórek nowotworowych wyrażających antygen, który wiąże się specyficznie z przeciwciałem monoklonalnym ujawnionym w niniejszym wynalazku lub z funkcjonalnym ekwiwalentem. Sposób ten obejmuje reagowanie przeciwciał ze zmienioną glikozylacją lub zawierających je immunokoniugatów (np. immunotoksyn) z takimi komórkami nowotworowymi. Te komórki nowotworowe mogą pochodzić z ludzkiego raka.
Ponadto ujawniono sposób leczenia raków (na przykład ludzkich raków) in vivo. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi skutecznej leczniczo ilości kompozycji zawierającej co najmniej jedno ujawnione tu przeciwciało ze zmienioną glikozylacją lub zawierające je immunokoniugaty (np. immunotoksyny).
W dalszym aspekcie ujawniono ulepszony sposób leczenia choroby autoimmunologicznej wywoływanej w całości albo w części przez patogenne przeciwciała opartej na zmniejszeniu komórek B, obejmujący podawanie skutecznej leczniczo ilości immunologicznie czynnych przeciwciał potrzebującemu tego osobnikowi ludzkiemu, przy czym ulepszenie obejmuje podawanie skutecznej leczniczo ilości przeciwciał mających zwiększoną ADCC przygotowanych zgodnie z ujawnionym tu sposobem. W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem jest przeciwciało anty-CD20. Przykłady chorób lub zaburzeń autoimmunologicznych obejmują, ale nie wyłącznie, trombocytopenie związane z zaburzeniami układu odpornościowego, takie jak ostra idiopatyczna plamica małopłytkowa, przewlekła idiopatyczna plamica małopłytkowa, zapalenie skórno-mięśniowe, pląsawica Sydenhama, nerkową postać tocznia, gorączkę reumatyczną, zespoły wielogruczołowe, plamicę Henocha-Schonleina, zapalenie nerek po infekcji
PL 222 219 B1 paciorkowcami, rumień guzowaty, chorobę Takayasu, chorobę Addisona, rumień wielopostaciowy, wieloguzkowe zapalenie naczyń, zesztywniające zapalenia stawów kręgosłupa, zespół Goodpasturea, zakrzepowo-zarostowe zapalenie naczyń, pierwotna żółciowa marskość wątroby, zapalenie tarczycy typu Hashimoto, tyrotoksykoza, przewlekłe czynne zapalenie wątroby, wielomięśniowe/zapalenie skórnomięśniowe, zapalenie wielochtząstkowe, pęcherzyca zwykła, ziarniniak Wegenera, zapalenie błony filtracyjnej w kłębuszkach nerkowych, stwardnienie zanikowe boczne, wiąd rdzenia, ból wielomięśniowy, anemię złośliwą, piorunujące kłębuszkowe zapalenie nerek i zwłóknienie pęcherzyków płucnych, odpowiedzi zapalne, takie jak choroby zapalne skóry, w tym, łuszczycę i zapalenie skóry (np. atopowe zapalenie skóry); twardzinę układową i stwardnienie; odpowiedzi związane z chorobami zapalnymi jelit (takie jak choroba Crohna i wrzodziejące zapalenie jelit); zespół ostrego wyczerpania oddechowego (w tym zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych; ARDS); zapalenie skóry; zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych; zapalenie mózgu; zapalenie błony naczyniowej oka; zapalenie jelit; kłębuszkowe zapalenie nerek; stany alergiczne, takie jak egzema i astma i inne stany, w których dochodzi do naciekania komórkami T i przewlekłe odpowiedzi zapalne; miażdżycę tętnic; zaburzenia adhezji leukocytów; reumatoidalne zapalenie stawów; toczeń układowy (SLE); cukrzycę (np. cukrzycę typu I lub cukrzycę insulinozależną); stwardnienie rozsiane; zespół Reynauda, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy; alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia; zespół Sjorgena; cukrzycę młodzieńczą; i odpowiedzi odpornościowe związane z ostrą i opóźnioną nadwrażliwością za pośrednictwem cytokin i limfocytów T zwykle występującą w gruźlicy, sarkoidozę, zapalenie wielomięśniowe, ziarniniakowatość i zapalenie naczyń; anemię złośliwą (chorobę Addisona); choroby z udziałem diapedezy leukocytów; zapalenie ośrodkowego układu nerwowego (OUN); zespół obrażeń wielonarządowych; anemię hemolityczną (obejmującą, ale nie wyłącznie, krioglobulinemię lub anemię immunohemolityczną z dodatnim odczynem Coombsa); miastenia rzekomoporaźna; choroby za pośrednictwem kompleksu antygen-przeciwciało; chorobę związaną z przeciwciałami przeciw błonie podstawnej kłębuszka nerkowego; zespół antyfosfolipidowy; alergiczne zapalenie nerwu; chorobę Gravesa; zespół miasteniczny Lamberta-Eatona; pemfigoid pęcherzowy; pęcherzycę; choroby endokrynologiczne na podłożu autoimmunologicznym; chorobę Reitera; zespół sztywności ogólnej; chorobę Behceta; olbrzymiokomórkowe zapalenie naczyń; zapalenie nerek wywoływane kompleksami immunologicznymi; nefropatię IgA; zapalenia wielonerwowe wywoływane IgM; plamicę małopłytkową na podłożu immunologicznym (ITP) lub małopłytkowość autoimmunologiczną, itd. W tym aspekcie ujawnione tu przeciwciała są stosowane do ograniczenia we krwi prawidłowych komórek B w dłuższym przedziale czasu.
Zgodnie z niniejszym ujawnieniem osobnikiem może być człowiek, koń, świnia, wół, mysz, pies, kot lub ptak, a także inne zwierzęta stałocieplne.
Niniejszym ujawniono również sposób leczenia osobnika chorego na raka. Osobnikiem może być człowiek, pies, kot, mysz, szczur, królik, koń, koza, owca, krowa, kura. Rak może być rozpoznany jako rak sutka, pęcherza, siatkówczak, brodawkowaty torbielakogruczolakowłókniak jajnika, guz Wilma lub drobnokomórkowy rak płuc i jest ogólnie charakteryzowany jako grupa komórek mających antygeny związane z. nowotworem. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi ilości przeciwciała nakierowanego na nowotwór połączonego z czynnikiem cytotoksycznym zabijającej raka. Na ogół, połączenie przeciwciała nakierowanego na nowotwór z czynnikiem cytotoksycznym wykonuje się w warunkach umożliwiających tak połączonemu przeciwciału wiązanie się z jego celem na powierzchni komórki. Wiążąc się ze swoim celem, przeciwciało nakierowane na nowotwór działa bezpośrednio lub pośrednio powodując lub przyczyniając się do zabijania komórek tak związanych, tym samym lecząc osobnika.
Ujawniony jest również sposób hamowania proliferacji ssaczych komórek nowotworowych obejmujący doprowadzenie do kontaktu ssaczych komórek nowotworowych z wystarczającymi stężeniami przeciwciał ze zmienioną glikozylacją lub zawierających je immunokoniugatów tak, aby hamować proliferację ssaczych komórek nowotworowych.
Ujawniono również kompozycje farmaceutyczne, kombinacje i sposoby leczenia ludzkich raków, na przykład, kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu ludzkich raków zawierające farmaceutycznie skuteczną ilość przeciwciała wytworzonego w komórce gospodarza według niniejszego wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Kompozycje mogą zawierać przeciwciało lub fragmenty przeciwciała, albo niezmodyfikowane, skoniugowane z czynnikiem terapeutycznym (np. lekiem, toksyną, enzymem lub drugim przeciwciałem) albo w postaci rekombinowanej (np. przeciwciała chimerowe, fragmenty przeciwciał chimerowych, przeciwciała dwuwartościowe). Kompozycje mogą zawierać dodatkowo przeciwciała lub koniugaty do leczenia raków (np. koktajl z przeciwciał).
PL 222 219 B1
Kompozycje przeciwciał, koniugatów przeciwciał lub immunotoksyn mogą być podawane z wykorzystaniem konwencjonalnych sposobów podawania w tym, między innymi, dożylnie, dootrzewnowo, doustnie, przez układ limfatyczny lub bezpośrednio do guza. Korzystne jest podawanie dożylne.
Kompozycje mogą być podawane w szeregu różnych postaciach dawkowania, które obejmują, między innymi, ciekłe roztwory lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, czopki, polimeryczne mikrokapsułki lub mikropęcherzyki, liposomy lub roztwory do iniekcji lub wlewów. Korzystna postać zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.
Kompozycje korzystnie zawierają również konwencjonalne, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i adiuwanty znane w tej dziedzinie, takie jak albumina osocza człowieka, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, lecytyna, substancje buforujące takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbinowy, sorbinian potasu oraz sole i elektrolity, takie jak siarczan protaminy.
Najbardziej skuteczny sposób podawania i warunki dawkowania kompozycji zależą od ciężkości i przebiegu choroby, stanu zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i oceny leczącego lekarza. Zatem, dawkowanie kompozycji powinno być dostosowane indywidualnie do pacjenta. Niemniej, skuteczna dawka kompozycji może zawierać się w przedziale od około 1 do 2000 mg/kg.
Cząsteczki tutaj opisane mogą być w szeregu różnych postaciach dawkowania, które obejmują, między innymi, płynne roztwory lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, czopki, polimeryczne mikrokapsułki lub mikropęchęrzyki, liposomy lub roztwory do zastrzyków lub wlewów. Korzystna postać zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.
Najbardziej skuteczny sposób podawania i warunki dawkowania cząsteczek zależą od umiejscowienia leczonego nowotworu, od ciężkości i przebiegu raka, stanu zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i oceny leczącego lekarza. Zatem, dawkowanie cząsteczek powinno być dostosowane indywidualnie do pacjenta.
Wzajemne zależności dawkowania dla zwierząt różnej wielkości i gatunków i człowieka, na podstawie mg/kg w stosunku do obszaru powierzchni opisano w Freireich, E.J. i wsp., Cancer Chemother., Rep. 50 (4):219-244 (1966). Można dokonać zmian w warunkach dawkowania, aby zoptymalizować hamowanie wzrostu komórek nowotworowych i zabijającą odpowiedź, np. dawkę można podzielić i podawać na podstawie codziennych obserwacji lub można zmniejszyć proporcjonalnie, w zależności od sytuacji (np. można podawać kilka podzielonych dawek dziennie lub zmniejszonych proporcjonalnie w zależności od specyficznej sytuacji leczniczej).
Jest oczywiste, że dawkę kompozycji wymaganą do osiągnięcia leczenia, można dalej zmniejszać przy optymalizacji harmonogramu.
Nośnikiem farmaceutycznym może być nośnik lipidowy. Nośnikiem lipidowym może być fosfolipid. Ponadto, nośnikiem lipidowym może być kwas tłuszczowy. Także, nośnikiem lipidowym może być detergent. Detergentem jest dowolna substancja, która zmienia napięcie powierzchniowe cieczy, zwykle je obniżając.
Detergent może być detergentem niejonowym. Przykłady niejonowych detergentów obejmują, między innymi, polisorbat 80 (znany także jako Tween 80 lub monooleinian polioksyetylenosorbitanu), Brij i Triton (na przykład Triton WR-1339 i Triton A-20).
Alternatywnie, detergentem może być detergent jonowy. Przykład jonowego detergentu obejmuje, między innymi, bromek alkilotrimetyloamoniowy.
Nośnikiem lipidowym może być liposom. „Liposom” jest to dowolny pęcherzyk związany z błoną zawierający opisane tu cząsteczki lub ich kombinacje.
Przykłady poniżej wyjaśniają wynalazek bardziej szczegółowo. Poniższe sposoby otrzymywania i przykłady zostały podane, aby umożliwić specjalistom w tej dziedzinie lepsze zrozumienie i wykonywanie wynalazku. Jednak, niniejszy wynalazek nie jest ograniczony zakresem przykładowych wykonań, którymi zamierzono jedynie zilustrować pojedyncze aspekty wynalazku i funkcjonalnie równorzędne sposoby mieszczą się w zakresie wynalazku. Szereg modyfikacji wynalazku dodatkowych w stosunku do tutaj Opisanych będzie oczywistych dla specjalistów w tej dziedzinie na podstawie poniższego opisu i towarzyszących im rysunków. Takie modyfikacje mają być objęte zakresem dołączonych zastrzeżeń.
P r z y k ł a d 1
Materiały i Metody
1. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych dla przeciwciał
Wektor ekspresyjny pETR1502 dla przeciwciała anty-CD20
PL 222 219 B1
Wektor ekspresyjny pETR1502 dla przeciwciała anty-CD20 C2B8 składa się z. czterech niezależnych, oddzielnych kaset ekspresyjnych (jedna dla łańcucha lekkiego przeciwciała C2B8, jedna dla łańcucha ciężkiego przeciwciała C2B8, jedna dla genu oporności na neomycynę oraz jedna dla mysiego genu dhfr). Wszystkie geny znajdują się pod kontrolą promotora wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego (MPSV) i zawierają syntetyczny sygnał zgodności dla poliadenylacji pochodzący z sygnału poliadenylacji króliczego genu β-globiny.
Cząsteczki cDNA kodujące rejony zmienne ciężkiego (VH) oraz lekkiego (VL) łańcucha przeciwciała C2B8 anty-CD20 zostały złożone z zestawu zachodzących na siebie jednoniciowych oligonukleotydów w jednoetapowym procesie z zastosowaniem PCR (Kobayashi, N., i wsp., Biotechniques 23:500-503 (1997)). Oryginalne sekwencje kodujące regiony VL i VH C2B8 uzyskano z opublikowanego międzynarodowego zgłoszenia patentowego (międzynarodowa publikacja numer: WO 94/11026). Złożone fragmenty cDNA VL i VH zostały poddane subklonowaniu do pBlu-escriptllKS (+) w celu uzyskania plazmidów pBlue-C2B8VH i pBlue-C2B8VL oraz sekwencjonowaniu.
Zmienne łańcuchy C2B8 amplifikowano z odpowiedniego plazmidu pBlue-C2B8VH i pBlue-C2B8VL z zastosowaniem starterów wprowadzających miejsca restrykcyjne Ascl na końcu 5' oraz odpowiednie miejsca restrykcyjne na połączeniu regionu zmiennego ze stałym (BsiWI dla łańcucha lekkiego i Nhel dla łańcucha ciężkiego). Regiony stałe IgG1 zostały amplifikowane z biblioteki cDNA ludzkich leukocytów (Quickclone, Clontech) z zastosowaniem Starterów wprowadzających dogodne miejsca restrykcyjne na końcach 5' i 3' (BsiWI i BamHI dla regionu stałego łańcucha lekkiego oraz Nhel i BamHI dla regionu stałego łańcucha ciężkiego).
Po potwierdzeniu poprawności sekwencji DNA, każdy z łań- cuchów lekkich i ciężkich przeciwciała C2B8 został połączony z promotorem MPSV i sygnałami poliadenylacji. W pierwszym etapie, skonstruowano dwa różne wektory ekspresyjne: jeden dla łańcucha lekkiego C2B8 (pETR1315), adrugi dla łańcucha ciężkiego C2B8 (pETR1316). W drugim etapie do wektora pETR1315 wprowadzono kasetę ekspresyjną oporności na neomycynę (gen oporności na neomycynę pochodzący z transpozonu Tn5 i umieszczony pod kontrolą minimalnego promotora MPSV), w wyniku, czego powstał plazmid pETR1481. Kaseta ekspresyjna genu dhfr pod kontrolą promotora MPSV została wstawiona do wektora pETR1316, w wyniku, czego powstał plazmid pETR1328. W końcowym etapie, oba moduły ekspresyjne (łańcuch lekki C2B8 + neo i łańcuch ciężki C2B8 + dhfr) zostały połączone w jeden wektor, co dało plazmid pETR1502.
Wektor ekspresyjny pETR1520 dla przeciwciała anty-CD20 pETR1520 stanowi połączenie wektora ekspresyjnego dla przeciwciała C2B8 z miejscem inicjacji replikacji z wirusa Epstein-Barra (oriP) dla replikacji i utrzymania wektora epi- somalnego w komórkach wytwarzających jądrowy antygen wirusa Epstein-Barra (EBNA). W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego C2B8, pETR1520, moduł ekspresyjny C2B8 z pETR1416 został wstawiony jako fragment HinDIII do wektora pETR1507 zawierającego ori-P. Wektor pETR1416 jest podobny do pETR1502 z wyjątkiem tego, że w plazmidzie tym gen oporności na neomycynę znajduje, się pod kontrolą całkowitego, zamiast minimalnego, promotora MPSV.
Wektor ekspresyjny pETR1546. przeciwciała przeciw fibronektynie
Wektor ten jest identyczny z wektorem pETR1520, z wyjątkiem tego, że regiony kodujące zmienny łańcuch ciężki i lekki przeciwciała C2B8 anty-CD20 zostały zastąpione przez odpowiednie regiony kodujące przeciwciała L19, ludzkiego przeciwciała rozpoznającego domenę ED-B fibronektyny. Fragmenty DNA kodujące regiony zmienne zostały zsyntetyzowane za pomocą metody wydłużania w reakcji PCR zachodzących na siebie regionów z zastosowaniem syntetycznych oligonukleotydów opartych na sekwencji regionów zmiennych przeciwciała L19 (Pini, A. i wsp. J. Biol. Chem. 273(34):21769-76 (1998)).
Wektor ekspresyjny pURSI28 przeciwciała (C225) przeciw. EGER
Wektor ten jest identyczny z. wektorem pETR1520, z wyjątkiem tego, że regiony kodujące zmienny łańcuch ciężki i lekki przeciwciała C2B8 anty-CD20 zostały zastąpione przez odpowiednie regiony kodujące przeciwciało C225, chimerowego przeciwciała rozpoznającego receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu. Fragmenty DNA kodujące regiony zmienne zostały zsyntetyzowane za pomocą metody zachodzącego wydłużania PCR (ang. overlap extension PCR) z zastosowaniem syntetycznych, oligonukleotydów opartych na sekwencji regionów zmiennych przeciwciała C225 (sekwencje można znaleźć w opublikowanym zgłoszeniu patentowym o międzynarodowym numerze publikacji WO 96/40210, Fig. 16 i 17 tego zgłoszenia patentowego odpowiednio dla łańcuchów ciężkich i lekkich).
PL 222 219 B1
2. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych fuzji-GnT III pETRH66 Wektor do konstytutywnej ekspresji GnT III
W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego GnT III pETR166 amplifikowano szczurzy GnT III z biblioteki cDNA nerki szczurzej (Clontech) za pomocą PCR. C-końcowy znacznik c-myc-epitop dodano powyżej kodonu stop genu (sekwencja ami- nokwasowa: PEQKLISEEDL) w celu późniejszego, dogodnego wykrywania GnT III przez Western biot. Po potwierdzeniu poprawnej sekwencji GnT III, gen wstawiano pod kontrolę promotora MPSV i dodawano syntetyczny sygnał poliadenylacji króliczej beta globiny. Końcowy wektor ekspresyjny GnT III zawierał także oddzielną kasetę oporności na puromycynę w celu selekcji, z genem oporności na puromycynę pod kontrolą promotora MPSV i syntetycznego sygnału poliadenylacji króliczej beta-globiny.
pETR1425: Zastąpienie pierwszych 76 aminokwasów GnT III przez pierwsze 102 aminokwasy ludzkiej GnT I
Konstruowanie tego hybrydowego genu giikozylotranśferazy przeprowadzono za pomocą reakcji zachodzącego wydłużania PCR W jednej reakcji strukturalny region ludzkiej GnT I amplifikowano z zastosowaniem starterów GAB-179 i GAB-180. Podczas tej reakcji PCR na końcu 5' wstawiono także sekwencja największej zgodności Kozaka oraz miejsce restrykcyjne Ascl. Uzyskany fragment PCR miał 23 pz zachodzące na początek GnT III zaczynając od pozycji 229. W drugiej reakcji PCR region GnT III od pozycji 229 do 380 był amplifikowany ze starterami GAB-177 i GAB-178 wytwarzając fragment PCR z pojedynczym miejscem dla BstXI na 3' końcu i 22 pz pokrywającymi się ze strukturalnym regionem GnT X na 5' końcu. Oba fragmenty PCR oczyszczono i zastosowano jako matryce w trzeciej reakcji PCR (startery GAB-179 i GAB-178). Uzyskany fragment oczyszczano i strawiono Ascl i zligowano z wektorem pETR1001 (ciętym Ascl i Smal) uzyskując plazmid pETR1404. Po potwierdzeniu sekwencji wstawki do pETR1404 dodawano element, promotorowy MPSV jako fragment Ascl (trawienie częściowe)/Pmel uzyskując plazmid pETR1423. Fragment SphI/BstXI z pETR1166, wektora ekspresyjnego niosącego oryginalny szczurzy gen GnT III, zastąpiono następnie odpowiadającym fragmentem pETR1423 otrzymując plazmid pETR1425 zawierający fuzję GnT I-GnT III pod kontrolą promotora MPSV i kasetę oporności na puromycynę dla selekcji.
Sekwencje starterów:
GAB-177: GCGTGTGCCTGTGACCC.CCGCGCCCCTGCTCCAGCCACTGTCCCC
GAB-178: GAAGGTTTCTCCAGCATCCTGGTACC
GAB-179: CTGAGGCGCGCCGCCACCATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGC
GAB-18 0: GGGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGCGCGGGGGTCACAGGCACACGCGGC pETR1506: Zastąpienie 76 N-końcowych aminokwasów GnT III przez pierwsze 100 aminokwasów ludzkiej mannozydazy II
Konstruowanie pETR1506 przeprowadzono analogicznie do konstruowania pETR1425. Region strukturalny ludzkiego genu mannozydazy II amplifikowano z zastosowaniem starterów GAB-252 i GAB-253 stosując jako matrycę wektor pBlue-man. Podczas tej reakcji PCR na 5' końcu wstawiano miejsce Fsel i sekwencję największej zgodności Kozaka. Uzyskany fragment PCR zachodzi na gen GnT III zaczynający się w pozycji 229 przez 23 pz. W drugiej reakcji PCR część genu GnT III (pozycja 229460) amplifikowano ze starterami GAB-254 i GAB-25S. Ta reakcja PCR wytworzyła fragment zawierający zakładkę o 43 pz z genem mannozydazy II na 5' końcu i pojedyncze miejsce Stul na 3' końcu. Oba fragmenty oczyszczono i zastosowano jako matryce w trzeciej reakcji PCR ze starterami GAB-252 i GAB-255. Uzyskany fragment wstawiono do pIC19H otrzymując wektor pETR1484. Po potwierdzeniu prawidłowej sekwencji wstawki skonstruowano całkowity gen fuzyjny przez zligowanie fragmentu Fsel/Stul pETR1484 z fragmentem StuI/BamHI z pETR1166 w wektorze pETR12177 (Fsel/BamHI). Otrzymany plazmid (pETRISOO) zawierał hybrydowy gen Man II-GnT III (SEK. NR ID: 14) pod kontrolą promotora MPSV. W celu selekcji plazmidu w komórkach ssaczych wstawiano kasetę oporności na puromycynę jako fragment Spel z pETR1166 uzyskując plazmid pETR1506.
Sekwencje starterów:
GAB-252: GCTAGGCCGGCCGCCACCATGAAGTTAAGCCGCCAGTTCACCGTGTTCGG
GAB-253: GGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGTGAGCCAGCACCTTGGCTGAAATTGCTTTGTGAACTTTTCGG
GAB-254: TCCGAAAAGTTCACAAAGCAATTTCAGCCAAGGTGCTGGCTCACCCCTGCTCCAGCCACTGTCCCC
GAB-255: ATGCCGCATAGGCCTCCGAGCAGGACCCC
PL 222 219 B1 pETR.1519: Połączenie hybrydowego genu fuzyjnego Man II-GnT III z miejscem Inicjacji replikacji oriP z wirusa Epstein'a Barr'a
Stosując startery GAB-261 i GAB-262 amplifikowano 2 kz fragment zawierający oriP z plazmidu pCEP4 (Invitrogen). Podczas tej reakcji PCR na obu końcach fragmentu wstawiono miejsca Sspl i EcoRI. W celu szekwencjonowania fragment oriP wstawiano do wektora pIC19H. Po potwierdzeniu poprawnej sekwencji, oriP wstawiano jako fragment Sspl do wektora pERT1001 (trawionego ą BsmBI i z lepkimi zachodzącymi 5'-końcami wypełnionymi za pomocą polimerazy Klenowa). Otrzymany plazmid oznaczono jako pETR1507. Kasetę ekspresyjną SphI/NruI Man II-GnT III z pETR15,10 wstawiono do pETR1507 trawionego takimi samymi endonukleazami restrykcyjnymi otrzymując plazmid pETR1519.
Sekwencje starterów:
GAB-261: GCTAAAATATTGAATTCCCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGC
GAB-2 62: TAGCAATATTGAATTCGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGC pETR1537: Połączenie hybrydowego genu fuzyjnego Man II-GnT III i skróconego genu markerowego powierzchni komórkowej CD4
Wektor ekspresyjny pETR1506 modyfikowano w celu dodatkowej ekspresji skróconego genu markerowego powierzchni komórkowej CD4. W skrócie, kasetę ekspresyjną fuzyjnego genu hybrydowego Man II-GnT HI przekształcono z monocistronowej na bicistronową kasetę ekspresyjną przez wstawienie, poniżej ko- donu stop fuzji Man II-GnT III, elementu 1RES wirusa polio, za którym znajdował się cDNA kodujący skrócone ludzkie białko CD4 (obejmujący sekwencję liderową ludzkiego GD4 do wydzielania, za którą znajdują się domeny przezbłonowe i zewnątrzko-mórkowe).
3. Transfekcja ssaczych komórek fuzją GnT III i wektorami ekspresyjnymi dla przeciwciał
Transfekowanie komórek BHK
Wykładniczo rosnące komórki (żywotność 90-95%) wysiano w odpowiedniej liczbie butelek T75 w stężeniu 0,9 x 106 komórek/ml 24 godziny przed elektroporacją. Jako pożywkę hodowlaną stosowano Invitrus (Cell Culture Technologies, Switzerland) uzupełnianą 10% płodową surowicą bydlęcą (FCS). Komórki zliczono przed elektroporacją. Zebrano 8 x 106 komórek przez odwirowanie (5 minut, 200 x g), a supernatant usunięto. Komórki zawieszono w 800 μl pożywki Invitrus i przeniesiono do sterylnej kuwety elektroporacyjnej (szczelina 0,4 cm) zawierającej już 8 μg DNA kolistego plazmidu i inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Komórki elektroporowano stosując Gene Puiser II (BioRad) w następujących warunkach: 400 V, 960 pF dwoma pulsami w 30 sekundowym odstępie. Po elektro- poracji komórki natychmiast przeniesiono do butelki T25 zawierającej 5 ml pożywki wzrostowej (Invitrus/20% (obj./obj.) FCS/1,25% (obj./obj.) DMSOj i inkubowano w 37°C w inkubatorze z 5% zawartością CO2. W celu wytwarzania nięzmodyfikowanych (bez manipulacji giikozylacją) przeciwciał, komórki stransfekowano jedynie wektorami ekspresyjnymi dla przeciwciał. W celu wytworzenia przeciwciał z manipulacją giikozylacją, komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jednym do ekspresji przeciwciała i drugim do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III (SEK. NR ID: 15), w stosunku odpowiednio 3:1.
Transfekcja komórek HEK293-EBNA
Wykładniczo rosnące komórki HEK293-EBNA stransfekowano za metodą z fosforanem wapnia. Komórki hodowano w postaci przylegających jednowarstwowych hodowli w butelkach T stosując pożywkę hodowlaną DMEM uzupełnianą 10% FCS i transfekowano, gdy osiągnęły one 50-80% konfluencji. W celu transfekcji butelki T75, 8 milionów komórek umieszczono 24 godziny przed transfekcją w 14 mi pożywki hodowlanej DMEM z FCS (w końcowym stężeniu 10% obj./obj.), 250 μg/ml neomycyny i komórki umieszczono w 37°C w inkubatorze z 5% stężeniem CO2 przez noc. Dla każdej butelki T75 przeznaczonej do transfekcji, przygotowano roztwór DNA, CaCl2 i wody przez zmieszanie 47 pg DNA całkowitego wektora plazmidowego, 235 μl 1M. roztworu CaCl2 i dodanie wody do końcowej objętości 469 pl. Do tego roztworu dodano 469 μl roztworu 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM NaaHPCP o pH 7,05, mieszano natychmiast przez 10 sekund i zostawiano do odstania w temperaturze pokojowej przez 20 sekund. Zawiesinę rozcieńczono 12 ml DMEM uzupełnioną 2% FCS i dodano do T75 w miejsce istniejącej pożywki. Komórki inkubowano w 37°C z 5% CO2 przez około 17 do 20 godzin, następnie pożywkę zastąpiono 12 ml DMEM, 10% FCS. W celu wytworzenia niezmodyfikowanych (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciał, komórki transfekowano jedynie wektorami ekspresyjnymi dla przeciwciał. W celu wytworzenia przeciwciał ze zmnienioną glikozylacją, komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jednym do ekspresji przeciwciała i drugim, do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III, w stosunku odpowiednio 4:1. Piątego dnia po transfekcji, zbierano supernatant, odwirowywaPL 222 219 B1 no przez 5 minut przy 1200 obr./min., a następnie ponownie odwirowywano przez 10 minut przy 4000 obr./min. i trzymano w 4°C.
Wytwarzanie stabilnej ssaczej linii komórkowej wyrażającej zrekombinowane przeciwciało antyCD20
Komórki BHK (BHK21-13c) transfekowano przezelektroporację wektorem ekspresyjnym pETR1502 przeciwciała C2B8, który zawiera kasetę ekspresyjną genu oporności na neomycynę. Klony oporne na neomycynę najpierw selekcjonowano w celu uzyskania zbioru klonów, które miały zintegrowany chrorcosomalnie DNA wektora pETR1502. Następnie klony przeszukano pod kontem wytwarzania zrekombinowanego przeciwciała stosując oznaczenie ELISA. W skrócie, 24 godziny po elektroporacji, żywotne komórki zliczono i określono wydajność transfekcji przez zliczanie komórek fluorescencyjnych równoległej, kontrolnej elektroporacji wykonanej z wektorem ekspresyjnym pEYFP. Komórki rozcieńczono w pożywce selekcyjnej Invitrus zawierającej 10% FCS i 1 mg/ml neomycyny. Zazwyczaj na 8 96-stu3 dzienkowych płytek nakładano różne stężenia żywotnych, stransfeko- wanych komórek (1 x 103, x 102 oraz 1 x 102 komórek na studzienkę) i inkubowano w 37°C do czasu, gdy można było zidentyfikować klony. Gdy klony wyrosły do stadium niemal całkowitej konfluencji, supernatanty przeanalizowano za pomocą ELISA pod kontem wytwarzania przeciwciała. Klony pozytywne w teście ELISA wysiano początkowo do 24-studzienkowych, a następnie 6- studzienkowych płytek, a następnie do butelek T25. Po pięciu dniach wzrostu w butelkach T25, określono końcowe miano przeciwciała stosując oznaczenie ELISA. Stosując tę elektrópórację i procedurę selekcji wyizolowano klon komórek BHK wyrażających przeciwciało C2B8 anty-CD20 (BHK-1502-28), który wytwarzał. 13 μg/ml przeciwciała w powyższych warunkach hodowli.
Wytwarzanie stabilnej ssaczej linii komórkowej wyrażającej zrekombinowane przeciwciało anty-CD20 i fuzję GnT III
Klon BHK-1502-28, wyrażający konstytutywnie geny monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 i gen oporności na neomycynę, stransfekowano wektorem ekspresyjnym pETR1537za pomocą elektroporacji. pETR1537 jest wektorem do konstytutywnej ekspresji genu Man II-GnT III i skróconej postaci ludzkiego CD4 wyrażanej zależnie od 1RES. Wektor ten zawiera także kasetę ekspresyjną genu oporności na puromycynę. Klony oporne na puromycynę najpierw zselekcjonowano w celu uzyskania zbioru klonów, które miały zintegrowany ehromosomalnie DNA wektora pETR1537. Następnie klony przeszukano pod kontem powierzchniowego wyrażania skróconego CD4 (tCD4), który służy jako znacznik poziomu ekspresji bicistronowei jednostki ekspresyjnej genu Man II-GnT III+tCD4. Wytworzenie zrekombinowanego przeciwciała z wybranych klonów potwierdzono stosując oznaczenie ELISA.
W skrócie, DNA wektora pETR1537 linearyzowano ż użyciem XmnI. Równolegle przeprowadzono kontrolną transfekeję z wektorem ekspresyjnym EYFP. Wydajność transfekcji ustalono po 24 godzinach przez zliczanie komórek wyrażających EYFP w stosunku do wszystkich komórek. Spośród wszystkich komórek 58% wyrażało EYFP. Żywotność komórek wynosiła 91%. Jeden dzień po transfekcji, komórki stransfekowane pETR1537 lub pEYFP rozcieńczono seryjnie w stosunku 1:100, 1:500, 1:1000 i 1:5000 i umieszczono na 96-studzienkowych płytkach, w końcowej objętości 0,2 ml pożywki selekcyjnej. (Invitrus, 10% FCS, 20 μg/ml puromycyny, 1 mg/ml neomycyny). Klony były widoczne po dwóch tygodniach. Klony wysiano i przeszukano pod kontem ekspresji skróconego CD4 (tCD4) i ekspresji przeciwciała.
W celu przeszukiwania poziomu ekspresji tCD4, w przybliżeniu 500 000 komórek przemyto buforem FACS i inkubowano z 5 pl anty-ludzkich CD4 FITC (Becton Dickinson, Switzerland) przez 20 minut w lodzie. Po dwóch płukaniach komórki zawieszono w 0,5 ml buforu FACS i analizowano z FACS (fig. 17A-B).
Wyizolowano klon (BHK-1502-28-11) z dobrym poziomem ekspresji tCD4. Po pięciu dniach wzrostu w butelce T25 wytwarza on przeciwciało anty-CD20 o końcowym mianie około 17 μg/ml, jak ustalono przez ELISA.
4. Wytwarzanie i oczyszczanie przeciwciał niezmodyfiko- wanych i z modyfikacją glikozylacji
Zbieranie pożywki hodowlanej
W przypadku komórek BHK stransfekowanych wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała plus wektorem, ekspresyjnym dla fuzji-GnT III, Supernatant hodowlany zebrano po hodowaniu stransfekowanych komórek przez 96 godzin po transfekcji. W zależności od oczekiwanej wydajności, przeprowadzono kilka elektroporacji (10-15) dla tego samego wektora.
PL 222 219 B1
W przypadku komórek HEK293-EBNA stransfekowanych wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała plus wektorem ekspresyjnym dla fuzji-GnT III, pożywkę hodowlaną zastąpiono świeżą pożywką hodowlaną w przybliżeniu 16 godzin po transfekcji, a następniepożywkę zebrano po hodowaniustransfekowanych komórek przez kolejne 120 godzin.
Dla stabilnej linii komórkowej BHK-1502-28-11, hodowlę wysiano w stężeniu 500 00Q komórek/ml, a supernatant zebrano po 4 dniach hodowli, gdy gęstość komórek wynosiła 1,7 x 106 żywotnych komórek/ml, a żywotność komórek wynosiła 69%.
Oczyszczanie przeciwciała
Przeciwciało monoklonalne oczyszczono z supernatantu hodowlanego stosując dwa kolejne etapy chromatograficzne.
Pierwszy etap składał się z chromatografii Białka A z zastosowaniem elucji w gradiencie pH, która wydajnie oddziela bydlęce i ludzkie IgG. Po tym następował etap chromatografii kationowo-wymiennej w celu wymiany próbki buforu na roztwór soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem (PBS).
5. Analiza oligosacharydów
Oligosacharydy uwalniono enzymatycznie z przeciwciał przez trawienie PNGazą F, z przeciwciałami albo unieruchomionymi na membranie PVDF albo w roztworze.
Otrzymany roztwór trawienny zawierający uwolnione oligosacharydy albo bezpośrednio gotowe do analizy MALDI/TOF-MS albo dalej trawione za pomocą glikozydazy EndoH w celu przygotowania próbki do analizy MALDI/TOF-MS.
Sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał unieruchomionych na membranie PVDF
Studzienki 96-studzienkowej płytki wytworzonej z membraną PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts) nawilżono 100 pl metanolu, a płyn przepuszczono przez membranę PVDF z użyciem próżni stosowanej w próżniowym kolektorze Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts). Membrany PVDF przemyto trzykrotnie 300 pl wody. Następnie studzienki przemyto 50 μl buforu RCM (8M mocznik, 360 mM Tris, 3,2 mM EDTA, pH 8,6). Na studzienkę zawierającą 10 μl buforu RCM naniesiono między 30-40 μg przeciwciała. Płyń w studzience przepuszczono przez membranę stosując próżnię, a następnie dwukrotnie przemyto membranę 50 μl buforu RCM. Przeprowadzono redukcję mostków disulfidowychrzez dodanie 50 μl 0,1 M ditiotretiolu w RCM i inkubację w 37°C przez 1 godzinę.
Po redukcji, zastosowano próżnię w celu usunięcia ze studzienki roztworu ditiotretiolu. Studzienki przemyto trzykrotnie 300 μl wody przed przeprowadzeniem karboksymetylacji reszt cysteinowych przez dodanie 50 μl 0,1 M kwasu jodooctowego w buforze RCM i inkubację w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
Po karboksymetylacji, studzienki osuszano przy pomocy próżni, a później przemyto trzykrotnie 300 μl wody. Następnie membranę PVDF blokowano, w celu zapobieżenia adsorpcji endoglikozydazy, przez inkubowanie 100 μl 1% wodnego roztworu poliwinylu 360 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie reagent blokujący usunięto delikatną próżnią z późniejszym trzykrotnym przemyciem 300 μl wody.
W celu usunięcia wszystkich potencjalnych naładowanych reszt monosacharydcwych, w końcowej objętości 25 μl w 20 mM NaHCO3, pH 7,0) N-związane oligosacharydy uwalniono przez dodanie 2,5 mU peptydo-N-glikozydazy F (rekombinowana N-glika- naza, GLYKO, Novato, CA) i 0,1 mU sialidazy (GLYKO, Novato, CA). Trawienie prowadzono przez 3 godziny w 37°C.
Sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał w roztworze
Między 40 a 50 μg przeciwciała zmieszano z 2,5 ml) PNGazy F (Gyko, U.S.A.) w 2 mM Tris, pH 7,0 w końcowej objętości 25 mikrolitrów i mieszaninę inkubowano przez 3 godziny w 37°C.
Stosowanie trawienia oligosacharydów uwolnionych PNGaząF endoglikozydazą H w celu przypisania struktur hybrydowych przeciętych na oligosacharydów do pików MALDI/TOF-MS neutralnych oligosacharydów
Oligosacharydy uwolnione PNGaząF strawiono następnie en- doglikozydazą H (EC 3.2.1.96). W celu trawienia EndoH, do trawienia PNGaząF dodano 16 mU EndoH (Roche, Szwajcaria) (sposób dla przeciwciał w roztworze, patrz powyżej), w celu uzyskania końcowej objętości 30 mikrolitrów, mieszaninę inkubowano przez 3 godziny w 37°C. EndoH tnie omiędzy resztami N-acetyloglukozaminy rdzenia chitobiozy N-związanych oligosacharydów. Enzym może trawić jedynie oligomannozę i wiele glikanów typu hybrydowego, podczas gdy złożone typy oligosacharydów nie podlegają hydrolizie.
Przygotowanie próbki dla MALDI/TOF-MS
PL 222 219 B1
Trawienia enzymatyczne zawierające uwolnione oligosacharydy inkubowano przez kolejne 3 godziny w warunkach pokojowych po dodaniu kwasu octowego w końcowym stężeniu 150 mM, a następnie przepuszczono przez 0,6 ml żywicy kationo-wymiennej (żywica AG50W-X8, postać wodorowa, ziarna 100-200, BioRad, Szwajcaria) nałożone na kolumnę chromatograficzną mikro-biospin (BioRad, Szwajcaria) w celu usunięcia kationów i białek. Jeden mikroiitr otrzymanej próbki nałożono na płytkę docelową ze stali nierdzewnej i zmieszano na płytce z 1 μl macierzy sDHB. Macierz sDHB przygotowano przez rozpuszczenie 2 mg kwasu 2,5-dihydrobenzoesowego plus 0,1 mg kwasu 5-metoksysalicylowego w 1 ml etanolu/10 mM wodnego chlorku sodu 1:1 (obj./obj.). Próbki wysuszono na powietrzu, nałożono 0,2 μl etanolu i umożliwiano re-krystalizację próbki w powietrzu atmosferycznym.
MALDI/TOF-MS
Spektrometrem masowym MALDI-TQF stosowanym do uzyskania widm masowych był Voyager Elite (Perspective Biosystems). Przyrząd działał w układzie liniowym, z przyspieszeniem 20 kV i opóźnieniem 80 nsek. Do oznaczania masy jonów stosowano zewnętrzną kalibrację z zastosowaniem standardów oligoscharydowych. Widma z 200 zdjęć laserowych zsumowano w celu uzyskania końcowego widma.
6. Przygotowanie PBMC
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywano stosując Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA) i stosując zasadniczo instrukcje producentów. W skrócie, heparynowanymi strzykawkami pobrano krew żylną od ochotników, których poproszono o bieganie z maksymalną szybkością przez 1 minutę w celu zwiększenia procentowego udziału limfocytów NK we krwi. Krew rozcieńczono 1:0,751,3 PBS niezwierającym Ca lub Mg i umieszczono warstwowo na Histopaque-1077. Gradient odwirowano przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerw. Zebrano interfazę zawierającą PBMC i przemyto ją PBS (50 ml na komórki z dwóch gradientów) i zebrano przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut, RT. Po ponownym zawieszeniu osadu w PBS, zliczono PBMC i przemyto drugi raz przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut w RT. Komórki następnie ponownie zawieszono w odpowiedniej pożywce do kolejnych procedur.
7. Izolacja limfocytów NK
Ludzkie limfocyty NK wyizolowano z PBMC stosując procedurę negatywnej selekcji przy użyciu magnetycznych kulek niewiążących komórek CD16- i CD56-dodatnich (układ MACS z Miltenyi Biotec GmbH, 51429 Bergisch Gladbach, GER). PBMC raz przemyto schłodzonym buforem MACS (PBS zawierający 2% FCS i 2 mM EDTA), ponownie zawieszono w stężeniu 20 komórek Mio na ml mieszaniny 1:1 FCS i buforu MACS i inkubowano przez 10 minut w 4°C. Komórki następnie osadzono i ponownie zawieszono w 80 pl buforu MACS zawierającego 10% FCS, na 10 milionów komórek. Następnie na 10 milionów komórek dodano 20 μl roztworu przeciwciała-Hapten. Komórki inkubowano przez 10 minut w 4°C z powtarzalnym zamieszaniem probówką. Po dwóch przemyciach buforem MACS, w co najmniej 10 x objętości buforu do znakowania, komórki ponownie zawieszono w buforze MACS zawierającym 10% FCS przy 10 milionach komórek na 80 μl i dodano 20 μl mikrokulek-anty-hapten na 10 milionów komórek. Probówkę inkubowano przez 15 minut w 4°C z mieszaniem. Po jednym przemyciu buforem MACS komórki ponownie zawieszono w stężeniu do 10 milionów komórek w 500 μl buforu MACS i umieszczono na kolumnie LS MACS, którą umieszczono w magnesie MINI-MACS i zrównoważono 3 ml buforu MACS. Kolumnę przemyto 3 x 3 ml buforu MACS. Komórki w przemytej frakcji zebrano, a następnie stosowano jako limfocyty NK. Czystość oznaczona za pomocą ekspresji CD56 wynosiła między 88-98%.
8. Oznaczenie ADCC
PBMC lub NK jako komórki efektorowe przygotowano jak to opisano powyżej. Stosunek efektora do celu wynosił 25:1 i 10:1 odpowiednio dla komórek PBMC i NK. Komórki efektorowe przygotowano w pożywce AIM-V w odpowiednim stężeniu w celu dodania 50 μl na studzienkę na 96-studzienkowych płytek o okrągłym dnie. Komórki docelowe dla przeciwciał C2B8 stanowiły komórki SKW6,4 lub komórki chłoniaka z limfocytów B Namalwa hodowane w DMEM zawierającym 10% FCS. Komórki docelowe przemyto PBS, zliczono i ponownie zawieszono w AIM-V w stężeniu 0,3 miliona na ml w celu dodania 30 000 komórek w 100 μl na mikrostudzienkę. Przeciwciała rozcieńczono w AIM-V, dodano w objętości 50 μl do uprzednio nałożonych komórek docelowych i umożliwiono związanie się z komórkami docelowymi przez 10 minut w RT. Następnie dodano komórki efektorowe i płytkę inkubowano przez 4 godziny w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Zabijanie komórek docelowych oszacowano przez pomiar uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) ze zniszczonych
PL 222 219 B1 komórek, stosując zestaw do wykrywania cytotoksyczności (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Szwajcaria). Po 4-godzinnej inkubacji płytki odwirowano przy 800 x g. 100 pl supernatantu z każdej studzienki przeniesiono do nowej przezroczystej 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem. Dodano 100 pl kolorowego buforu substratowego z zestawu na studzienkę. Ustalono wartości Vmax reakcji kolorowej w czytniku ELISA przy 490 nm przez co najmniej 10 minut, stosując oprogramowanie SOFTmaxPRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Spontaniczne uwalnianie LDH zmierzono w studzienkach zawierających jedynie docelowe i efektorowe komórki, ale nie przeciwciała. Maksymalne uwalniane ustalano ze studzienek zawierających jedynie komórki docelowe i 1% Triton X-100. Procent specyficznego zabijania z udziałem przeciwciał obliczano w następujący sposób: ((x-SR)/(MR-SR)*100, przy czym x jest średnią Vmax przy specyficznym stężeniu przeciwciała, SR jest średnią Vmax spontanicznego uwalniania, a MR jest średnią Vmax maksymalnego uwalniania.
9. Wiązanie FcyRIIIA na limfocytach NK
Świeżo wyizolowane limfocyty NK odwirowano przez 5 minut przy 200 x g i potraktowano 0,09% 5 (wag./obj.) roztworem kwasu mlekowego (140 mM NaCl, 5 mM KCl, pH 3,9) przez inkubowanie 3 x 105 komórek/ml w temperaturze pokojowej przez 5 minut, w celu usunięcia związanych z limfocytami NK IgG (De Haas M., J. Immunol., 156: 2948 (1996)).
Komórki przemyto dwukrotnie PBS, 0,1% BSA, 0,01% azydkiem sodu i doprowadzano do stężenia 2 x 106 komórek/ml w PBS, 0,15% BSA, 0,01% azydku sodu. 5 x 105 komórek inkubowano z 0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 pg/ml wariantów przeciwciała przez 30 minut w 4°C. Komórki następnie przemyto dwukrotnie i wiązanie przeciwciała wykryto przez inkubowanie z 1:200 skoniugowanym z fluorescencyjnym izotjocjanianem kozim F(ab')2 anty-ludzka IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, 5
PA) i anty-ludzkimi CD56-PE w stężeniu 5 pl/5 x 105 komórek (BD Pharmingen, San Diego, CA) przez 30 minut w 4°C (Shields R., i wsp., J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740 (2002)).
Natężenie fluorescencji odnoszące się do związanych wariantów przeciwciał określono dla komórek CD56+ na FACSalibur (BD Bioscience, San Jose, CA).
10. Wiązanie FCgammaRIIb na komórkach chloniaka Raji
Komórki limfocytów B ludzkiego chłoniaka Raj i przemywano 20 minut w 37°C w PBS (stężenie 0,3 komórek Mio/ml). Komórki następnie zawieszono przy 2,22 milionów komórek/ml w PBS, 1% BSA, 0,01% NaN3 i dodano 180 pl na probówkę FACS. Dziesięciokrotne rozcieńczenia przeciwciała (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 pg/ml) monoklonalnych przeciwciał niezmodyfi kowanych w pozycji L19 i z modyfikacją glikozylacji w pozycji L19 dodano do komórek Raji i inkubowano w 4°C przez 30 minut (końcowe stężenie komórek 2 miliony komórek/ml). Po dwóch przemyciach, 1:200 skoniugowanego z fluorescencyjnym izotjocjanianem koziego F(ab')2 anty-ludzka IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) dodano do komórek i inkubowano w 4°C przez 30 minut. Po jednym przemyciu, komórki zawieszono w 0,5 ml PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3, a natężenie fluorescencji odnoszące się do związanych odmian przeciwciała określono na FACSalibur (BD Bioscience, San Jose, CA) dla żyjących komórek.
11. Oznaczenie cytotoksyczności zależnej od dopełniacza
Komórki docelowe zliczono, przemyto PBS, zawieszono w AIM-V (Invitrogen) przy 1 milionie komórek na ml. W 96-studzienkowej płaskodennej płytce umieszczono po 50 pl komórek na studzienkę. Rozcieńczenia przeciwciał przygotowano w AIM-V i dodano w objętości 50 pl do komórek. Przeciwciałom umożliwiono wiązanie się do komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dopełniacz ludzkiej surowicy (Quidel) rczmrażono na świeżo, rozcieńczono 3-krotnie AIM-V i dodano w 50 pl do studzienek. Dopełniacz króliczy (Cedarlane Laboratories) przygotowano w sposób opisany przez producenta, rozcieńczono 3-krotnie w AIM-V i dodano do studzienek po 50 pl. Jako kontrolę, przed dodaniem do oznaczenia surowicez komplementem podgrzano przez 30 minut w 56°C.
Płytki do oznaczeń inkubowano przez 2 godziny w 37°C. Zabijanie komórek określono pomiarem uwalniania LDH. W skrócie, płytki odwirowano przy 300 x g przez 3 minuty. 50 pl supernatantu na studzienkę przeniesiono na nowa 96-studzienkową płytkę i dodano 50 pl reagenta do oznaczenia z zestawu Cytotoxicity (Roche). Przez kinetyczny pomiar z użyciem czytnika ELISA określono Vmax odpowiadającą stężeniu LDH w supernatancie. Maksymalne uwalnianie określono przez inkubację komórek w obecności 1% Triton X-100.
Wyniki i dyskusja
Glikomodyfikowane wariantyy chimerowych przeciwciał IgG1 anty-CD20 (przeciwciało chimerowe C2B8, znane również jako rituximab) wytwarzono przez kotransfekowanie hodowli ssaczych komórek wektorami do ekspresji genów przeciwciała oraz wektorami do ekspresji genów kodujących
PL 222 219 B1 różne polipeptydy o aktywności GnT III. Odmiana niezmodyfikowana (bez glikomodyfikacji) tego samego przeciwciała była wytwarzana przez transfekowanie ssaczych komórek jedynie wektorem do ekspresji genu przeciwciała. Transfekowane komórki trzymano w hodowli przez CO najmniej trzy dni, a wydzielone, zrekombinowane przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej za pomocą chromatografii powinowactwa Białka A. Ekspresja genów kodujących polipeptydy o aktywności GnT III nie miała znaczącego wpływu na żywotność komórek, wzrost komórek lub wytwarzanie przeciwciała, w odniesieniu do komórek niewytwarzających takich polipeptydów.
Oczyszczone przeciwciała były następnie analizowane pod kątem ich wzorów glikozylacji. Przeciwciała te niosą N-zwiazanych oligosacharydy dołączone jedynie do reszty Asn291 regionu Fc ludzkiego IgG1. Oligosacharydy były enzymatycznie usuwane z przeciwciał przez trawienie PNGaząF, a następnie analizowane za pomocą MALDI/TOF-MS. Stosując tę technikę, możliwe jest określenie frakcji różnych rodzajów oligosacharydów w całkowitej, pierwotnej populacji oligosacharydów Fc i możliwe jest także przypisanie danych struktur do różnych pików widma (Umana, P., i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)).
Na fig. 1 przedstawiono neutralne profile oligosacharydowe MALDI/TOF-MS ze zrekombinowanego, chimerowego przeciwciała IgG1 C2B8 anty-CD20 wytworzonego w komórkach BHK. Komórki te transfekowano wektorem, ekspresyjnym dla przeciwciała pETR1502. Na fig. 2 do 4 przedstawiono odpowiednie profile dla tego samego przeciwciała wytworzonego przez komórki BHK poddane manipulacji kwasami nukleinowymi kodującymi polipeptydy o aktywności GnT III. Profil na fig. 2 pochodzi z zastosowania kwasu nukleinowego kodującego GnT III typu dzikiego podlegającego ekspresji z wektora pETR1166. Profil na fig. 3 wynika z zastosowania kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową zawierającą na końcu N domenę lokalizacji GnT I połączoną z końcem C domeny katalitycznej GnT III. Ten gen fuzyjny podlegał ekspresji z wektora pETR1425. Profil na fig. 4 wynika z zastosowania kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową zawierającą na końcu N dom enę lokalizacji α-mannozydazy II (Man II) aparatu Golgiego. połączoną z domeną katalityczną GnT III. Ta fuzja genowa była poddawana ekspresji z wektora pETR1506.
Niezmodyfikowane przeciwciało ma typowy profil oligosacharydowy (fig. 1), z pikami o stosunkach m/z 1485, 1648 i 1810 zgodnymi dla dwuantenowymi, złożonych oligosacharydów o fukozylowanym rdzeniu, z odpowiednio 0, 1- i 2- resztami galaktozowymi. Podobne profile stwierdzono dla oligosacharydów regionów Fc niezmodyfikowanych przeciwciał IgG1 wytwarzonych przez inne standardowe ssacze, przemysłowe linie komórkowe takie, jak CHO i komórki mysiego szpiczaka (Lifely, M.R. i wsp., Glycobiology 5:813-822 (1995)). Manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciało przez ekspresję GnT III typu dzikiego prowadzi głównie do przeciętych, z fukozylowanym rdzeniem, złożonych, dwuantenowych oligosacharydów (fig. 2) z pikami o stosunkach m/z 1689, 1851 i 2014, stanowiącymi przecięte odpowiedniki dla pików nieprzeciętych fukozylowanych oligosacharydów charakterystycznych dla przeciwciała niezmodyfikowanego. Manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciało za pomocą ekspresji kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową GnT I-GnT III, przy czym domena katalityczna GnT III zlokalizowana jest przez domenę lokalizacji GnT I Golgi, prowadzi także do powstania głównie przeciętych, złożonych oligosacharydów dwuantenowych (zauważ piki przy m/z 1639 i 1851 na fig. 3). Jednakże w porównaniu z GnT III typu dzikiego, zastosowanie fuzji GnT I-GnT III prowadzi do zwiększenia ilości przeciętych, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych struktur (porównaj stosunki pików z m/z 1664, 1810, 1826 i 1973 w odniesieniu do całkowitego, między fig. 2 i 3). Synteza przeciętych niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych struktur pochodzi ze współzawodnictwa, dla oligosacharydowych substratów modyfikowanych GnT I, pomiędzy zrekombinowaną domena katalityczną GnT III oraz (i) rdzeniem endogennym, α1,6-fukozylotransferazą, (ii) α-mannozydazą II aparatu Golgieqo (Man II) i (iii) GnT II, ponieważ po zmodyfikowaniu oligosacharydu przecinającą GIcNAc dodana na drodze reakcji katalizowanej przez GnT III, te trzy pozostałe enzymy nie mogą więcej modyfikować przeciętych oligosacharydów. Zatem blokowanie działania Man II przez dodanie przecinającej GIcNAc skutecznie blokuje także GnT II, ponieważ GnT II działa poniżej Man II w szlaku biosyntezy N-związanych oligosacharydów. Piki przy m/z 1664 i 1826 są niefukozylowane, podczas gdy piki przy m/z 1810 i 1973 są fukozylowane. Trawienie glikozydazą EndoH, dzięki któremu można rozróżnić oli- gosacharydy hybrydowe i złożone (Fig. 8A), zastosowano w celu potwierdzenia, że wzrost tych pików spowodowany jest wzrostem udziału przeciętych połączonych z Fc, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych oligosacharydów (patrz poniżej).
W przeciwieństwie do innych zastosowanych tutaj kwasów nukleinowych kodujących aktywność GnT III, manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciała przez ekspresję kwasu nukleinowego
PL 222 219 B1 kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III (SEK. NR ID: 12), gdzie domena katalityczna GnT III umieszczana jest przez domenę lokalizacji Man II aparatu Golgiego, prowadzi głównie do powstania przeciętych, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych struktur (patrz piki przy m/z 1664, 1810, 1826 i 1973 na Fig. 4). Zatem, w porównaniu z typem dzikim GnT III i fuzją GnT I-GnT III (SEK. NR ID: 14 i 15) fuzja Man II-GnT III była wydajniejsza w syntetyzowaniu przyłączonych do Fc przeciętych, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych oligosacharydów (porównaj stosunki pików z m/z 1664 i 1810 w odniesieniu do całości pmiędzy fig. 2, 3 i 4). Udziały przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów-Fc powstałych z ekspresji kwasów nukleinowych kodujących dziki typ GnT III, fuzji GnT I-GnT III oraz fuzji Man II-GnT II wynosiły w przybliżeniu odpowiednio 4, 13 i 33%. Nie wykrywano przeciętych oligosacharydów w niezmodyfikowanym (niemanipulowanym) przeciwciele.
Zwiększanie ekspresji konstruktu fuzyjnego Man II-GnT III w komórkach wytwarzających przeciwciało prowadziło do dalszego wzrostu w udziale przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów. Zostało to wykazane przez ekspresję konstruktu Man II-GnT III z wektora (pETRISIS) z OriP dla episomalnej replikacji w stransfskowanych komórkach HEK293-EBNA. Ten układ ekspresyjny znany jest z prowadzenia do wysokich poziomów ekspresji i był także stosowany do ekspresji genów przeciwciała z wektora pETRI52CL Profil oligosacharydowy z oczyszczonego, niezmodyfikowanego (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciała wyrażanego na wysokich poziomach w tym układzie przedstawiono na fig. 5, która ponownie ukazuje typowy profil oligosacharydowy z pikami nieprzeciętych, fukozylowanych oligosacharydów mających 0, 1 i 2 reszty galaktozowe (np., porównaj fig. 1 i 5 ukazujące podobne profile oligosacharydowe niezmodyfikowanego przeciwciała wyrażanego w komórkach BHK lub na wyższych poziomach w komórkach HEK293-EBNA). Manipulacja komórkami wytwarzającymi przeciwciało z kwasem nukleinowym kodującym fuzję Man II-GnT III podlegającym ekspresji na wyższych poziomach w tym układzie prowadziła do wytwarzania przeciwciał, w których większość oligosacharydów-Fc było przeciętych, niefukozylowanych (patrz fig. 6, gdzie piki hybrydowych, niefukozylowanych, przeciętych oligosacharydów przy m/z 1664 i 1826 stanowią razem ponad 90% wszystkich oligosacharydów).
Jak wspomniano powyżej, w celu potwierdzenia przypisania przeciętych niefukozylowanych i przeciętych hybrydowych struktur z różnymi pikami oligosacharydów obserwowanymi w profilach MALDI stosowano endoglikozydazę H (EndoH). Profile oligosacharydów neutralnych MALDI/TOF-MS glikanów trawionych PNGaząF i PNGaząF+EndoH, uzyskanych z chimerowego przeciwciała IgG1 antyCD20, wytworzonych przez komórki HEK293 z manipulacją glikozylacji przez nadekspresję GnT III(M2), przedstawiono na fig. 7. Pik przy m/z 1664 może być przypisany dwóm różnym glikanom, mianowicie niefukozylowanemu hybrydoprzeciętemu lub niefukozylowanemu złożonemu, nieprzeciętemu. Różne struktury ukazują taki sam stosunek m/z z powodu takiej samej mieszaniny monosacharydowej (fig. 8B).
Trawienie glikanów uwolnionych PNGaząF za pomocą endoglikozydazy H wytwarza nowe struktury, z głównym pikiem przesuniętym z m/z 1664 do 1460 (fig. 7B). Różnica odnosi się do masy reszty GlcNAc. Jak wspomniano powyżej EndoH nie może trawić oligosacharydów złożonego. Zatem, główny pik przy m/z 1664 może być określony jako typ niefukozylowany hybrydowy przecięty po trawieniu endoglikozydaza H.
Inne piki, mogą być przypisane do złożonych lub hybrydowych przeciętych glikanów. Przy m/z 1.810; po trawieniu EndoH pik znika, zatem struktury mogą być przypisane do fukozylowanego hybr ydowego przeciętegowego typu. Odjęcie jednej reszty GlcNAc i jednej reszty fukozy (z rdzenia α-1,6 fukozylowanego, reszta GlcNAc końca redukującego) z piku m/z 1810 wytwarza strukturę o m/z 1460. Przy m/z 1502 zniknięcie tego piku przez trawienie EndoH (wyeliminowana reszta GlcNAc) i pojawienie się piku przy m/z 1298, ukazuje, że pik 1502 może być przypisany do niefukozylowanego hybr ydowego przeciętego typu. Przy m/z 1647 zniknięcie piku po trawieniu EndoH ukazuje, że pik ten jest fukozylowaną hybrydową przeciętą struktura. Usunięcie jednej reszty GlcNAc i jednej reszty fukozy wytwarza strukturę o m/z 1298. Pik przy m/z 1826, niefukozylowany hybrydowy przecięty typ był trawiony przez EndoH. Wytworzyło to strukturę z m/z 1622. Pik przy m/z 1053 po trawieniu EndoH może być przypisany do typu wielomannozowego (1257 m/z), strawionego przez EndoH. Pik przy m/z 1689 (złożony przecięty) nie był naruszony przez trawienie EndoH, jak się spodziewano. W syntezie, z danych uzyskanych w Tab. 1, stwierdzone, że 88% struktur oligosacharydowych niesie przeciętą GlcNAc, z których 60% to struktury oligosacharydów niefukozylowanych hybrydowych przeciętych, 22% fukozylowanych hybrydowych przeciętych, a 6% fukozylowanych złożonych przeciętych.
PL 222 219 B1
Tab. 1. Przypisanie oligosacharydów
m/z Możliwe struktury Względny % przed EndoH Oczekiwany m/z po EndoH Obserwowany m/z po EndoH Względny % po EndoH Przypisanie
1256 Wielomannozowa 9 1053 1053 11 Wielomannozowa (9%)
1502 Niefukoz. hybrydowa przecięta lub niefukoz. złożona 7 1298 lub 1502 1298 13 Niefukoz. hybrydowa przecięta (7%)
1647 Fukoz. hybrydowa precięta lub fukoz. złożona 7 1298 lub 1647 1298 13 Fukoz. hybrydowa przecięta (7%)
1664 Niefukoz. hybrydowy przecięta lub niefukoz. złożona 49 1460 lub 1664 1460 60 Fukoz. hybrydowa przecięta (7%)
1689 Fukoz. zlożona przecięta 3 1689 1689 5 Fukoz. złożona przecięta (3%)
1810 Niefukoz. hybrydowa przecięta lub niefukoz. złożona 15 1460 lub 1810 1460 1810 60 2 Fukoz. hybrydowa przecięta (13%) i fukoz. złożona (2%)
1826 Niefukoz. hybrydowa przecięta 4 1622 1622 7 Fukoz. hybrydowa przecięta (4%)
1851 Fukoz. zlożona przecięta 3 1851 1851 2 Fukoz. złożona przecięta (3%)
1972 Fukoz. hybrydowa przecięta 3 1622 1622 7 Fukoz. hybrydowa przecięta (3%)
Równowagi mas (w molach frakcji w %):
a) Piki przy m/z 1502 oraz 1647 : 7 + 7% = 14% (cczekiwana). Trawienie EndoH dla obu pików daje m/z 1298 (otrzymane 13% po EndoH)
b) Piki przy m/z 1664 i 1810:49 + 13% = 62%. EndoH daje m/z 1460 (otrzymane 60%)
c) Piki przy m/z 1826 i 1972: 4 + 3% = 7%. EndoH daje m/z 1622 (7%)
Podsumowanie:
Całkowity względny procent struktur niosących przeciętą GlcNAc: 88 niefukozylowany hybrydowy przecięty: 60% fukozyiowany hybrydowy dwuczęściowy: 22% fukozylowany złożony przecięty: 6%
Powyższe dane (fig. od 1 do 6) wskazują, że zarówno poziom ekspresji GnT III jak i szczególnej domeny lokaiizacji stosowanej do umieszczenia domeny katalitycznej GnT III w aparacie Golgiego, wpływają na współzawodnictwo o oligosacha- rydowe substraty modyfikowane GnT I między zrekombinowaną domeną katalityczną GnT III a endogenną rdzenną a 1,6-fukozylotransferazą, enzymami (Man III i GnT II. Wyższa ekspresja GnT III daje jej przewagę w tym współzawodnictwie, prowadząc do wyższych poziomów przeciętych, hybrydowych i przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów oraz do towarzyszącej redukcji poziomów przeciętych, złożonych i przeciętych fukozylowanych oligosacharydów. Było to również stwierdzone wcześniej dla GnT III typu dzikiego (Umana, P., i wsp., Nature Biotechnoł 17: 176-180 (1999)). Jednak, pomimo, że prowadzi do powstania podobnych całkowitych poziomów przeciętych oligosacharydów, umiejscowienie domeny katalitycznej GnT III przez domeny lokalizacji GnT I lub Man II prowadziło do skuteczniejszego współzawodnictwa, w stosunku do GnT III typu dzikiego dla substratów oligosacharydów zmodyfikowanych GnT I względem endogennego rdzenia a 1,6-fukozylctransferazy, enzymów Man II i GnT II.
Wyższą wydajność fuzji GnT I-GnT III w porównaniu z GnT III typu dzikiego dla syntezy przeciętych, hybrydowych i przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów można wyjaśnić przez wcześniejszą dystrybucję w aparacie Golgiego, w kierunku od cis do trans transportu substratu glikoproteinowego
PL 222 219 B1
GnT I w stosunku do GnT III. Dokładną dystrybucję GnT I i Man II w aparacie Golgiego ustalono wcześniej za pomocą ilościowej mikroskopii immunoelektronowej (Rabouille, C., i wsp., J. Cell Sci. 108: 1617-27 (1995)). Oba enzymy rozmieszczone są razem wzdłuż aparatu Golgiego, lokalizując się głównie w cysternach przyśrodkowych i trans stosu aparatu Golgiego, z wyższymi poziomami w c ysternach przyśrodkowych w porównaniu z cysternami trans. Dokładne ilościowe przestrzenne rozmieszczenia rdzenia a 1,6-fukozyiotransferazy, GnT II i GnT III typu dzikiego nie zostały jeszcze ustalone. Powyższe dane nie wyjaśniają jedna, dlaczego fuzja Man II-GnT III jest znacząco wydajniejsza niż fuzja GnT I-GnT HI, w syntezie przeciętych, hybrydowych i przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, ponieważ zarówno GnT I jak i Man II mają identyczne przestrzenne rozkłady wzdłuż subkompartmentów aparatu Golgiego.
Wyższa wydajność fuzji Man II-GnT III wskazuje na istnienie względnie zorganizowanych funkcjonalnych subkompartmentów reakcji glikozylacji wśród fizycznych subkompartmentów cysterny przyśrodkowej i trans aparatu Golgiego. Przyjmuje się, że tak zwane „enzymy glikozylacji środkowego aparatu Golgiego”, GnT I, GnT II i Man II występują w aparacie Golgiego w postaci kompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej. Jednak, jeżeli domeny lokalizacji umożliwiają tym enzymom tworzenie części tych kompleksów, tak samo byłoby dla fuzji GnT I- i Man II-GnT III. Ekspresja zrekombinowanej fuzji GnT I-GnT III nie doprowadziła do zastąpienia endogennego enzymu GnT I typu dzikiego w stopniu znaczącym dla syntezy Fc-oligosacharydów, ponieważ wszystkie zastosowane tutaj konstrukty GnT III prowadziły do większości oligosacharydów modyfikowanych w reakcjach przeprowadzanych zarówno przez GnT I, jak i GnT III.
Dane nasze wskazują, że za pomocą domeny lokalizacji Man II, ma miejsce bardziej specyfic zne funkcjonalne parowanie pomiędzy domenami katalitycznymi endogennego GnT I a zrekombinowaną fuzją Man II-GnT III. Wiadomo, że zorganizowane parowanie enzymów katalizujących kolejne reakcje na szlaku biosyntezy, w sposób, który promuje przenoszenie produktu pierwszej reakcji do drugiego miejsca katalitycznego w stosunku do zględem przenikania takiego produktu od enzymów, ma miejsce w innych szlakach biosyntezy, takich, jak glikoliza i biosynteza poliketydów. Obserwowano tworzenie przez GnT I i Man II „pokrewnych oligomerów”, przynajmniej podczas przemieszczania się jednego z tych enzymów do siateczki wewnątrzplazmatycznej Nilsson, T. i wsp. EMBO J. 13(3). 562-74 (1994)). Okazało się, że para naładowanych reszt aminokwasowych w każdym z rejonów strukturalnych obu tych enzymów jest kluczowa dla rozpoznawania tego rodzaju pokrewieństwa. Reszty w GnT I były odwrotnie naładowane w stosunku do reszt w Man II. Zidentyfikowaliśmy podobne reszty w równ oważnych miejscach regionów strukturalnych innych enzymów glikolizacyjnych aparatu Golgiego zaa ngażowanych w tę część szlaku biosyntetycznego N-związanych oligosacharydów, konkretnie w rdzeniu α1,6-fukozylotransferazy (takie same ładunki jak w GnT I zamiast komplementarnych ładunków jak w przypadku Man II), Man I iz GnT II. Ustaliliśmy także, że te reszty są konserwowane u różnych gatunków. Chociaż sugerowano, że reszty te nie są istotne dla łączenia się w tworzone przez enzymy kompleksy o wysokiej masie cząsteczkowej lub nawet dla lokalizacji w aparacie Golgiego (Opat, A.S. i wsp. J. Biol. Chem 275 (16): 11836-45 (2000)), możliwe jest, że są one zaangażowane w bardziej specyficzne parowanie domen katalitycznych w trakcie biosyntezy oligosacharydów. Parowanie takie nie musi być nieodwracalne, ale może być zależne od przejściowego, dynamicznego oddziaływania pomiędzy enzymami. Mogą istnieć dodatkowe determinanty parowania w którejkolwiek części regionu strukturalnego lub Ratalitycznego. Jednak, jakikolwiek udział w specyficznym parowaniu GnT I-Man II ze strony katalitycznej domeny Man II wiązałby się z utratą zrekombinowanej fuzji niosącej katalityczną domenę GnT III.
Na fig. 9 do 11 przedstawiono podwyższoną zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórk ową (ADCC), będącą wynikiem nadeksptesji w komórkach wytwarzających przeciwciała, kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd o aktywności GnT III, umieszczony w aparacie Golgiego za pomocą różnych domen lokalizacji. Podwyższoną ADCC będącą wynikiem wyrażenia zrekombinowanego polipeptydu o aktywności GnT III umieszczonego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego GnT I przedstawiono na fig. 9. Oligosacharydowy profil dla przeciwciała kontrolnego zastosowanego w teście ADCC widocznym na fig. 9, przedstawiono na fig. 1. Oligosacharydowy profil dla glikozmodyfikowanego przeciwciała zastosowanego w teście ADCC widocznym na fig. 9, przedstawiono na fig. 3. Podwyższona ADCC będąca wynikiem wyrażenia zrekombinowanego polipeptydu o aktywności GnT III umieszczonego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego glikozydazy, Man II, przedstawiono na fig. 10. Oligosacharydowy profil przeciwciała kontrolnego zastosowanego w teście ADCC widocznym na fig. 10, przedstawiono na fig. 5. Oligosacharydowy
PL 222 219 B1 profil glikomodyfikowanego przeciwciała zastosowanego w teście ADCC widocznym na fig. 10, przedstawiono na fig. 6.
Na fig. 11 pokazano, że wyrażanie zrekombinowanego polipeptydu o aktywności GnT III umieszczonego w aparacie Golgiego za pomocą domeny lokalizacji w aparacie Golgiego Man II prowadzi do podwyższenia aktywności ADCC w porównaniu z zastosowaniem polipeptydu GnT III typu dzikiego z jego własną domeną lokalizacji w aparacie Golgiego GnT III. Oligosacharydowy profil przeciwciała z manipulacją glikozylacji uzyskaną przez wyrażanie Gr.T III typu dzikiego, zastosowanego w teście ADCC widocznym na fig. 11, przedstawiono na fig. 2. Oligosacharydowy profil przeciwciała z manipulacją glikozylacji uzyskaną przez wyrażenie fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III, umieszczonego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II i zastosowanego w teście ADCC widocznym na fig. 11, przedstawiono na fig. 4. Dane te pokazują także, że przeciwciała zawierające przecięte oligosacharydy, w tym, przecięte hybrydowe i przecięte, niefukozylowane oligosacharydy, mają podwyższoną aktywność ADCC w porównaniu z przeciwciałami zawierającymi złożone, fukozylowane, nieprzecięte oligosacharydy. Należy zauważyć, że wszystkie spośród przeciętych oligosacharydów najbardziej aktywnego przeciwciała zastosowanego w teście ADCC widocznym na fig. 10 są przeciętymi, niefukozylowanymi hybrydowymi cligosacharydami. Jak wspomniano uprzednio, stosowanie fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III i umieszczonej w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II prowadzi do wydajniejszej syntezy niefukozylowanych, przeciętych oligosacharydów, a na fig. 11 pokazano, że przeciwciała o podwyższonych poziomach przeciętych, niefukozylowanych oligosachar ydów sa bardziej aktywne w teście ADCC w stosunku do przeciwciał o niższch poziomach tych oligos acharydów. Podwyższone aktywności ADCC są skorelowane ze zwiększeniem frakcji przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów w populacji oligosacharydów związanych z Fc, a znaczne wzrosty są widoczne, gdy frakcja ta jest większa niż 15 do 20%.
Wiadomo, że komórki naturalni zabójcy (NK) są ważnymi mediatorami ADCC. Komórki te niosą na swojej powierzchni receptor aktywujący Fc gamma IIIA, znany również jako CD16a. Wiązanie rej onu Fc przeciwciał połączonych z komórkami docelowymi, z receptorami Fc gammma RIIIA na komó rkach NK jest istotne dla usieciowania tych receptorów na komórce NK. i następującej po tym indukcji ADCC. Ważne jest, zatem oszacowanie wiązania przeciwciał wytworzonych opisanymi tutaj sposobami do receptorów Fc, a zwłaszcza do receptorów w naturalnej postaci, w której ludzk ie immunologiczne komórki efektorowe je prezentują. Na fig. 12 zademonstrowano, że przeciwciała z manipulacją glikozylacji wytworzone w wyniku ekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciała, kwasu nukleinowego kodującego fuzję poiipeptydową o aktywności GnT III, mają zwiększone powinowactwo wiązania do ludzkiego receptora aktywującego Fc gamma RIIIA. Jak wspomniano uprzednio dla oznaczeń ADCC, przeciwciała te mają podwyższone poziomy przeciętych, niefukozylowanych oligosach arydów, co jest wynikiem wyrażenia w komórkach wytwarzających przeciwciało fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III. Komórki NK zastosowane w tyra oznaczeniu pochodziły od dawcy o genotypie, który nie wyraża receptora Fc gamma RIIc na swoich komórkach NK (Metes, D., i wsp., J. Immunol. Methods 258 (1-2):85-95 (2001)). Zatem, jedyny receptor Fc znajdujący się na powierzchni tych komórek jest to aktywujący receptor Fc gamma RIIIA. Na fig. 13 pokazano, że analiza wiązania mierzy specyficzne powinowactwo wiązania się z tym receptorem. Zostało to wykazane przez współzawodnictwo z fragmentem specyficznego przeciwciała blokującego Fc gamma RUI (fragment 3G8 Fab2).
Silny dowód na wpływ wzmocnionych oddziaływań Fc-FcR na rezultat przeciwnowotworowej terapii przeciwciałami pochodzi z korelacji, stwierdzonej u pacjentów z chłoniakiem otrzymujących rituximab, między wydajnością a homozygotycznym genotypem receptora FcganunaRI IIA o wysokim powinowactwie (Carton, G., i wsp., Blood 99(3): 754-8 (2002)). Był to pojedynczy parametr związany z ogromnie zwiększonym tempem obiektywnej odpowiedzi oraz zwiększoną udziałem odpowiedzi cząsteczkowych. Zwiększona wydajność spowodowana wzmocnionymi oddziaływaniami FcgaramaR111A-Fc może pochodzić z funkcji pełnionych przez różne rodzaje komórek odpornościowych, w tym, komórek naturalnych zabójców (NK), makrdfagów, monocytów oraz komórek dendrytycznych. Usieciowanie aktywującego receptora FcgammaRIIIA na komórkach NK, makrofagach i monocytach może prowadzić do lizy komórki nowotworowej przez ADCC (powszechnie uważa się, że jest to pierwotny, zależny od FcR mechanizm zabijania in vivo) (Maloney, D. G., i wsp., Semin. Oncol. 29 (1 Suppl. 2) 2-9 (2002), Amigorena S., J. Exp. Med. 195(1): F1-3 (2002)) oraz komórkowej fagocytozy zależnej od przeciwciał (Hazenbos, W. L., i wsp., J. Immunol. 161(6): 3026-32 (1998), Reff, M. E. i Heard, C. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 40(1): 25-35 (2001)) i uwolnienia cytokin w sąsiedztwie komórek nowotworowych (Carson, W. E., i wsp., Eur. J. Immunol. 31: 3016-3025 (2001)). Cytokiny te mogą z kolei prowadzić do
PL 222 219 B1 kierowania wpływów cytotoksycznych na komórki nowotworowe do efektów przeciwangiogennych, które hamują wzrost nowotworu przez pozbawienie tlenu i związków odżywczych i do wzmocnionej prezentacji antygenów nowotworowych jako części odpowiedzi odpornościowej z udziałem aktywnych limfocytów T przeciwko komórkom nowotworowym. Komórki dendrytyczne mają kluczowe znaczenie w prezentowaniu antygenu limfocytom T, a usieciowanie FcgammaRIIIA na ich powierzchni (np., z wiązania z przeciwciałem obumierających komórek nowotworowych początkowo zaatakowanych in vivo na drodze ADCC) może prowadzić do zwiększonego dojrzewania komórki dendrytycznej, w ychwytu antygenów i prezentacji limfocytom T oraz krzyżowego piętnowania cytotoksycznych limfocytów T będących potencjalnym, bardzo wydajnym mechanizmem aktywowania oporności przeciwnowotworowej (Amigo rena S., J. Exp. Med. 195(1): F1-3 (2002), Kalergis, A. M., i Ravetch, J. V. J. Exp. Med. 195(12): 1653-1659 (2002), Selenko, N., i wsp., J. Clin. Immunol. 22(3): 124-130 (2002)). Usieciowanie przeciwciał związanych z komórka, docelową przez receptory Fc na odpornościowych komórkach efektorowych może także prowadzić do zwiększonego bezpośredniego zabijania komórek docelowych, na przykład na drodze apoptozy indukowanej przez usieciowanie cząsteczek docelowych z antygenowymi za pośrednictwem przeciwciał (Reff, M. E. i Heard, C., Grit Rev Oncol Hematol. 40(1): 25-35 (2001), Cragg, M. S., i wsp., Blood 101(3): 1045-1052 (2003)). Spośród wszystkich tych odpornościowych komórek efektorowych jedynie limfocyty NK posiadają na swojej powierzchni tylko aktywujący receptor FcgamaRIII. Na innych rodzajach komórek, aktywujący receptor FcgammaRIII jest obecny razem z hamującym receptorem FcgammaRllb, a indukcja efektorowych funkcji przeciwnowotworowych wynika z dodatniej równowagi sygnałów aktywujących w stosunku do sygnałów hamujących.
Na fig. 15 pokazano, że zwiększone wiązanie receptora Fc jest wybiórcze dla receptora aktywującego w stosunku do receptora hamującego FcgammaRIIb. Wybiórczość taka jest ważna dla funkcji efektorowych komórek odpornościowych innych niż limfocyty NK, jak to wyjaśniono powyżej. Ponadto, przyrosty w wiązaniu osiągnięte przez manipulację glikozylacją regionu Fc przeciwciała, z zastosowaniem opisanych tutaj sposobów, są dużo większe niż te obserwowane naturalnie dla pacjentów o h omozygotycznym genotypie FcgammaRIIA o większym powinowactwie/ donorów otrzymujących standardowe, niezmodyfikowane przeciwciało (fig. 16) oraz, że zostały już połączone z wyższą wydajnością przeciwciał anty-nowotworowych (Carton, G., i wsp., Blood 99(3): 754-8 (2002)).
Domena wiążąca aktywującego receptora FcgammaRIIIB jest prawie identyczna z taką domeną z FcgammaRIIIA. Zatem, powyższe dane wskazują także, że opisane tutaj przeciwciała ze zmienioną glikozylacją mogą prowadzić do wzrostu funkcji efektorowych, w których pośredniczą komórki efekt orowe prezentujące FcgammaRIIIb, takie jak komórki granulocytowe (PMN), obejmując uwolnienie toksycznych produktów i fagocytozę ((Reff, M. E., i Heard, C., Crit Rev Oncol Hematol. 40(1): 25-35 (2001), Daeron, FM. Annu. Rev. Immunol. 15: 203-34 (1997), Ravetch, J. V. i Bolland S. Annu. Rev. Immunol. 19; 275-90 (2001)).
Na fig. 18 przedstawiono oligosacharydowy profil przeciwciała anty-CD20 wytworzonego przez komórki BHK rosnące w zawiesinie i zmodyfikowane dla celów konstytutywnej ekspresji na wysokim poziomie zarówno przeciwciała rekombinowanego, jak i fuzji poiipeptydowej o aktywności GnT III. Oligosacharydowy profil przedstawia podwyższone poziomy przeciętych niefukozylowanych i przeciętych hybrydowych oligosacharydów przeciwciał pochodzących z komórek, poddanych manipulacji z fuzją GnT III (patrz również tab. 2). Struktury te nie występują, w przeciwciałach bez modyfikacji glikozylacji, wytworzonych przez komórki BHK bez modyfikacji glikozylacji (patrz fig. 1). Komórki poddane manipulacji wyrażające fuzję GnT III wykazywały normalny wzrost w zawiesinie i dobrą wydajność wytwarzania przeciwciał.
Względne procenty oligosacharydów monoklonalnych przeciwciał ze zmienioną glikozylacją w ytwarzanych przez stabilną linię komórkową BHK-1502-28-11 przedstawiono w tab. 2.
Tab. 2: Względny procent pików uzyskany przez MALDI/TOF-MS
Pik (m/z) Względny procent
1 1257 2,5%
2 1486 2,8%.
3 164 7 6%
4 1664 22,3%
5 1680 2,5%
PL 222 219 B1
6 1689 4,8%
7 1705 3%
8 1810 27,8%
9 1826 10%
10 1851 7,5%
11 1972 9%
12 2012 1,75%
Całkowite przecięte: 88,6% (4+5+6+7+8+9+10+11+12)
Całkowite niefukozylowane przecięte: 37,8% (4+5+7+9)
Całkowite fukozylowane przecięte: 50,8% (6+8+10+11+12)
Przecięte złożone: 17% (6+7+10+12)
Hybrydowe przecięte: 71,61 (4+5+8+9+11)
Analiza oligosacharydów wykazała, że 88,6% struktur zawiera przeciętą resztę GlcNAc, 50,8% jest fukozylowanych, a 37,8% jest niefukozylowanych. Trawienie uwolnionego przez PNGazę F oligosacharydu za pomocą endoglikozydazy H wykazało, że większość uzyskanych pików jest typu hybr ydowego przeciętego (fig. 19). Na fig. 20 przedstawiono zwiększone powinowactwo wiązania przeciwciała z modyfikacją glikozylacji, wytworzonego przez linię komórkową BHK-1502-28-11, do aktywującego receptora Fc FcgammaRIIIA na ludzkich limfocytach NK. Linie komórkowe rosnące w zawiesinie, z konstytutywną, stabilną ekspresją zarówno genów przeciwciał, jak i fuzji polipeptydowej GnT III są idealne do wytwarzania leczniczych przeciwciał na dużą skalę. Przy zastosowaniu standardowych sposobów manipulacji komórkowej można osiągnąć manipulację glikozylacją a albo przez wprowadzenie fuzji genowej GnT III do linii komórkowej zawierającej geny przeciwciał albo przez wprowadzenie genów przeciwciała do linii komórkowej zawierającej fuzję genową GnT III („produkcyjna linia k omórkowa przed manipulacja glikozylacji”) lub przez jednoczesne wprowadzenie genów przeciwciała i genów fuzji GnT III.
Przeciwciało anty-CD20 wytwarzane w komórkach zmodyfikowanych w celu uzyskania wysokiego poziomu ekspresji kwasu nukleinowego kodującego fuzję poiipeptydową z aktywnością GnT III i umieszczaną w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II, testowano również pod kątem lizy z udziałem dopełniacza (CML), innej funkcji efektorowej, która nie jest zależna od receptorów Fc na odpornościowych komórkach efektorowych. Znaczna większość oligosacharydów tego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji była przeciętego, hybrydowego, niefukozylowanego typu. Obniżoną aktywność CML obserwowano dla tego przeciwciała anty-CD20 w porównaniu z przeciwciałem niemodyfikowanymi (fig. 21). Dla takich samych zastosowań mogą być pożądane przeciwciała z podwyższoną ADCC ale z obniżonym CML, na przykład w celu zmniejszenia skutków ubocznych, takich jak zapalenie naczyń krwionośnych po stronie nowotworu, w którym pośredniczą CML. Inne znaczące skutki uboczne, w których pośredniczą CML obserwowano dla terapii z przeciwciałem anty-CD20 (van der Kolk L. E., i wsp., Br J Haematol. 115(4): 807-11 (2001)). Jednak, profile oiigosacharydowe opisane powyżej pokazują także, że możliwe jest również zmodyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciało, aby wyrażały fuzję pclipeptydowąGnT III na średnim poziomie ekspresji, który prowadzi do średnich poziomów przeciętych, hybrydowych, niefukozylowanych oligosacharydów (większych niż 15%), ale ze znaczącą frakcją oligosacharydów złożonych w populacji oligosacharydów Fc glikomodyfik owanego przeciwciała. Takie złożone oligosacharydy są związane z normalnymi, niezredukowanymi poziomami CML. Zatem, dane wskazujące, że przeciwciała o podwyższonym ADCC mogą być wytwarzane na tej drodze, która powinna utrzymywać bardzo podobne poziomy aktywności CML w porównaniu z niemodyfi kowanymi przeciwciałami.
Drugie, chimerowe przeciwciało IgG1 C225, znane także jako cetuximab, rozpoznaje ludzki receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) było poddane modyfikacji glikozylacji sposobami tu opisanymi. Na fig. 22 przedstawiono profile oiigosacharydowe niemodyfikowanego przeciwciała antyEGFR C225 i wersji tego samego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji.
To ostatnie było wytwarzane w komórkach z ekspresją kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GnT III i lokalizowane w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II. Na fig. 23 przedstawiono podwyższoną ADCC dla przeciwciała anty-EGFR wynikające z modyfikacji
PL 222 219 B1 jego glikozylacji. Przeciwciała z modyfikacją glikozylacji wytwarzane opisanymi tutaj sposobami i m ające podwyższoną ADCC oraz podwyższone powinowactwo wiązania do aktywujących receptorów Fc, są obiecującymi cząsteczkami do terapii przeciwciałami nowotworu oraz chorób autoimmunologicznych, ponieważ powinny prowadzić do zwiększonej wydajności, w porównaniu z odpowiadającą niezmodyfi kowaną (bez modyfikacji glikozylacji) wersją tych przeciwciał, dla tych terapii. Dodatkowo powinno być możliwe obniżenie dawek leczniczych przeciwciał z modyfikacją glikozylacji w porówn aniu z przeciwciałami niezmodyfi kowanymi, a to pozytywnie wpłynie na ekonomikę wytwarzania przeciwciał.
P r z y k ł a d 2
Leczenie immunozależnei małopłytkowości u pacjenta z przewlekłą chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi
Autoimmunologiczna malopiytkowość w przewlekłej chorobie przeszczepu przeciwko gospodarzowi reprezentuje przypadek dysregulacji limfocytów B prowadzącej do choroby klinicznej.
W celu leczenia małopłytkowości immunozależnej u pacjenta z przewlekłą chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi, pacjentowi podawane jest chimercswe monoklonalne przeciwciało anty-CD20 wytworzone sposobami ujawnionymi w niniejszym wynalazku i mające podwyższone ADCC, jak to opisano w Ratanatharathorn, V., i wsp., Ann. Inter. Med. 133(4): 275-79 (2000), (której cała zawartość włączona jest tu w całości jako odniesienie). Szczegółowo, cotygodniowa infuzja 375 2 mg/m przeciwciała jest podawana pacjentowi przez 4 tygodnie. Terapia przeciwciałami powoduje znaczny spadek limfocytów B we krwi obwodowej i spadek poziomów przeciwciała związanego z płytkami krwi.
P r z y k ł a d 3
Leczenie ciężkiej immunozależnej aplazji układu czerwo- nckrwinkowego i anemii hemolitycznej
Immunozależna, nabyta aplazja układu czerwonokrwinkowego (PRCA) to rzadkie schorzenie, często związane z innymi zjawiskami autoimmunologicznymi. W celu leczenia immunozależnej, nab ytej aplazji układu czerwonokrwinkowego pacjenta, chimerowe monoklonalne przeciwciało anty-CD20 wytworzone sposobami ujawnionymi w niniejszym wynalazku i mające podwyższoną ADCC podawane jest pacjentowi, jak to zostało opisane w Zecca, M., i wsp., Blood 12: 3995-97 (1997) (której cała zawartość włączona jest tu w całości jako odniesienie). Szczegółowo, pacjentowi z PRCA i autoimm u2 nologiczną anemią hemolityczną podaje się dwie dawki 375 mg/m przeciwciała tygodniowo. Po terapii przeciwciałami rozpoczyna się leczenie zastępcze dożylną immunoglobuliną. Leczenie to wytwarza znaczny spadek limfocytów B we krwi obwodowej i znaczny wzrost liczby retikulocytów związany ze wzrostem poziomów hemoglobiny.
P r z y k ł a d 4
Materiały i Metody
1. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych fuzji GalT
Wektor do konstytutywnego wyrażania GalT
W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego dla GalT, cDNA GalT jest powielane z biblioteki cPNA (Clontech) za pomocą PCR. Dodawany jest C-końcowy znacznik epitopu c-myc zaraz powyżej kodonu stop genu (sekwencja aminokwasowa : PEQKLISEEDL), w celu późniejszego, dogodnego wykrywania GalT za pomocą testów Western blot. Po potwierdzeniu poprawnej sekwencji GalT, gen umieszczany jest pod kontrolą promotora MP3V i dodawany jest sztuczny sygnał poliadenylacji króliczej beta-globiny. Końcowy wektor ekspresyjny GalT, zawiera również oddzielną kasetę oporności na puromycynę w celu selekcji, z genem oporności na puromycynę również znajdującym się pod kontrolą promotora MPSV oraz sztucznego sygnału poliadenylacji króliczej beta-globiny.
Zastąpienie aminokwasów tworzących domenę lokalizacji GalT aminokwasami tworzącymi domenę lokalizacji ludzkiego GnT I.
Konstruowanie takiego hybrydowego genu galaktozylotransferazy przeprowadza się, na przykład, przez reakcje zachodzącego PCR, w wyniku, czego powstaje plazmid zawierający fuzję GnT I-GalT pod kontrolą promotora MPSV oraz kasetę oporności na puromycynę do celów selekcji.
Zastąpienie aminokwasów tworzących domenę lokalizacji GalT aminokwasami tworzącymi domenę lokalizacji ludzkiej mannozydazy II.
Przeprowadza się konstruowanie wektora ekspresyjnego GalT. Powstały plazmid zawiera h ybrydowy gen Man II-GalT będący pod kontrolą promotora MPSV.
Łączenie hybrydowego genu fuzji Man II-GalT z miejscem inicjacji replikacji oriP pochodzącym z wirusa Epsteina Barra.
PL 222 219 B1
Fragment DNA zawierający oriP jest subklonowany w sposób opisany w przykładzie 1, do opisanego powyżej hybrydowego wektora ekspresyjnego Man II-GalT.
Łączenie hybrydowego genu fuzji Man II-GalT ze skróconym genem powierzchniowego znacznika komórek CD4.
Wektor ekspresyjny jest modyfikowany do celów dodatkowej ekspresji skróconego genu powierzchniowego znacznika komórek CD4. W skrócie, kaseta ekspresji hybrydowego genu fuzji. Man II-GalT przekształcana jest z jednocistronowej na dwucistronową kasetę ekspresyjnej przez wstawienie, poniżej kodonu stop fuzji Man II-GalT, elementu 1RES pochodzącego z wirusa polio, za którym leży cDNA kodujące skrócone białko ludzkiego CD4 (zawierające sekwencję liderową ludzkiego CD4 do wydzielania, za którą leżą domeny transbłonowa oraz zewnątrzkomórkowa).
3. Transfekcja komórek ssaczy.ch ekspresyjnymi wektorami dla fuzji GalT i przeciwciał
Transfekcja komórek BHK
Komórki w wykładniczej fazie wzrostu (żywotność 90-95%) są hodowane, zbierane, a następnie transfekowane w sposób opisany w przykładzie 1. W celu wytwarzania przeciwciał z modyfikacją glikozylacji komórki są kotransfekowane dwoma plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała i drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GalT odpowiednio w stosunku 4:1.
Transfekcja komórek HEK293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA w wykładniczej fazie wzrostu są transfekowane w sposób opisany w przykładzie 1. W celu wytwarzania przeciwciał z modyfikacją glikozylacji, komórki są kotransfek owane dwoma plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała i drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GalT odpowiednio w stosunku 4:1.5 dnia po transfekcji, supernatant jest zbierany, odwirowywany przez 5 minut przy 1200 obr./min., po czym ponownie odwirowywany przez 10 minut przy 4000 obr./min. i trzymany w 4°C.
Wytwarzanie stabilnej ssaczej linii komórkowej wyrażającej zrekombinowane przeciwciało antyCD20 oraz fuzyjne GalT
Klon BHK-1502-28, w którym konstytutywnej ekspresji ulegają geny moncklonalnego przeciwciała anty-CD20 oraz gen oporności na neomycynę, transfekowany jest wektorem ekspresyjnym przez elektroporację. Wektor umożliwia konstytutywną ekspresję genu Man II-GalT iskróconej formy ludzkiego CD4, przy czym ekspresja ostatniego zależna jest od 1RES. Wektor zawiera także kasetę ekspresyjną genu oporności na puromycynę. Klony oporne na puromycynę są najpierw poddawane selekcji w celu uzyskania zestawu klonów, mających wektor DNA zintegrowany z chromosomem. Klony są następnie przeszukiwane pod względem powierzchniowego wyrażania skróconego CD4 (tCD4), który służy jako znacznik poziomu ekspresji dwucistronowej jednostki ekspresyjnej genu Man IIGalT+tCD4. Wytwarzanie zrekombinowanego przeciwciała przez wyselekcjonowane klony jest weryf ikowane z zastosowaniem testu ELISA.
Transfekcja, po której następuje przeszukiwanie pod względem poziomu ekspresji tCD4 przeprowadzana jest w sposób opisany w przykładzie 1.
4. Wytwarzanie i oczyszczanie przeciwciał niezmodyfikowanych i z modyfikacją glikozylacji
W przypadku komórek BHK transfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała wraz z wektorem ekspresyjnym fuzyjnego GalT, supernatant z hodowli zbierany jest po hodowli transfekowanych komórek przez 96 godzin, po przeprowadzeniu transfekcji.
W zależności od oczekiwanej wydajności, dokonywanych jest kilka elektrcporacji (10-15) dla tego samego wektora.
W przypadku komórek HEK293-EBNA transfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym wraz z wektorem ekspresyjnym fuzyjnego GalT, pożywka hodowlana zastępowana jest świeżą pożywką hodowlaną w przybliżeniu 16 godzin po transfekcji, po czym ta ostatnia jest zbierana po hodowli transfekowanych komórek przez kolejne 120 godzin.
Dla stabilnej linii komórkowej BHK-1502-28-11, hodowla jest wysiewana w liczbie 500 000 komórek/ml, a supernatant zbierany po 4 dniach hodowli.
Oczyszczanie przeciwciał
Monoklonalne przeciwciało oczyszczane jest z hodowlanego supernatantu przy zastosowaniu dwóch kolejnych etapów chromatografii, chromatografii białka A oraz chromatografii kationo-wymiennej w sposób opisany w przykładzie 1.
PL 222 219 B1
5. Analiza oligosacharydów
Oligosacharydy są w sposób enzymatyczny uwalniane z przeciwciał przez trawienie PNGazą F, przy czym przeciwciała są unieruchomione na błonie PVDF lub znajdują się w roztworze.
Uzyskany roztwór trawienny zawierający uwolnione oligosacharydy jest albo przygotowywany bezpośrednio do analizy MALDI/TOF-MS albo dalej trawiony glikozydazą EndoH przed przygotowywaniem próbek dc analizy MALDI/TOF-MS.
Sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał unieruchomionych na błonie PVDF oraz sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał w roztworze są przeprowadzane tak, jak opisano w przykładzie i.
Zastosowanie trawienia endoglikozydazą H oligosacharydów uwolnionych PNGazą F do przypisania struktur hybrydowych ga- laktozylowanych oligosacharydów do pików neutralnych oligosacharydów MALDI/TOF-S.
Oligosacharydy uwolnione za pomocą PNGazy są następnie trawione endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96) w sposób opisany w przykładzie 1.
MALDI/TOF-MS
Próbki zawierające enzymatyczne trawienia zawierające uwolnione oligosacharydy są przyg otowywane, a następnie analizowane w spektrometrze masowym MALD/TOF w sposób opisany w przykładzie 1.
6. Przygotowywanie i izolacja komórek
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywane są z zastosowaniem Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA) w sposób zasadniczo zgodny z instrukcjami wytwórcy oraz protokołem opisanym w przykładzie 1.
Ludzkie limfocyty NK są izolowane z PBMC z zastosowaniem procedury negatywnej selekcji jak opisano w przykładzie 1.
8. Test ADCC
PBMC lub NK jako komórki efektorowe są przygotowywane w sposób opisany powyżej i oznaczone po względem ich zdolności do pośredniczenia w cytotoksyczności w teście cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) w sposób opisany w przykładzie 1.
Wiązanie FcgammaRIIIA na limfocytach NK oraz wiązanie FcgammaRIIb na komórkach chłoniaka Raji
9. Wiązanie FcgammaRIIIA na świeżo wyizolowanych limfocytach NK oraz wiązanie FcgammaRIIb na komórkach chłoniaka Raji ustalane jest w sposób opisany w przykładzie 1.
10. Test cytotoksyczności zależnej od dopełniacza
Testy cytotoksyczności zależnej od dopełniacza są przeprowadzane z zastosowaniem roztworów przeciwciał zgodnie ze sposobem opisanym w przykładzie 1.
Wyniki i Dyskusja
Przeprowadzane są testy w celu ukazania wpływu ekspresji genów kodujących polipeptydy o aktywności GalT na żywotność komórek, wzrost komórkowy lub wytwarzanie przeciwciał, w porównaniu z komórkami nie wytwarzającymi takich polipeptydów.
Oczyszczone przeciwciała są analizowane pod względem wzorów ich glikozylacji za pomocą MALDI/TOF-MS w sposób opisany w przykładzie 1. Przy zastosowaniu tej techniki możliwe jest określenie frakcji różnych rodzajów oligosacharydów w całkowitej, oryginalnej populacji oligosacharydówFc, a także możliwe jest przypisanie struktur różnym, pikom w widmach CUmana P. i wsp., Nature Bioteehnol. 17: 176-180 (1999)).
Ustalany jest profil oligosacharydowy przeciwciała nie- zmodyfikowanego. Szczegółowo, ustalone jest czy modyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciała przez ekspresję GalT typu dzikiego prowadzi głównie do oligosacharydów galaktozylowanych, złożonych dwuantenowych o fukozyiowanym rdzeniu. Ustalane jest także czy w porównaniu z GalT typu dzikiego modyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciała przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję połipeptydową GnT I-GalT, w którym katalityczna domena GalT jest lokalizowana przez domenę lokalizacji GnT I aparatu Golgiego, prowadzi głównie do powstania galaktozylowanych złożonych dwuantenowych oligosacharydów. Jeśli zsyntetyzcwane zostaną galaktozylowane, niefukozylowane i galaktozylowane struktury hybrydowe, może to wynikać ze współzawodnictwa między GalT a innymi glikozylotransferazami lub glikozydazami. Oczekuje się, że jak tylko oligosacharyd jest zmodyfikowany galaktozą dodaną na drodze reakcji katalizowanej przez GalT, rdzeń α 1,6-fukozylotiransferazy, α-mannodydaza II aparatu Golgiego (Man II) oraz GnT II nie mogą dłużej modyfikować galaktozylowanych oligosacharydów.
PL 222 219 B1
Trawienie galaktozydazą EndoH, które może rozróżnić oligosacharydy hybrydowe i złożone, stosuje się do oceny udziału galaktozylowanych oligosacharydów niefukozylowanych połączonych z Fc oraz oiigosacharydów galaktozylowanych, hybrydowych.
Przeprowadzane są testy w celu ustalenia czy modyfikacja komórek wytwarzających przeciwciało przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GalT, gdzie domena katalityczna GalT jest lokalizowana przez domenę lokalizacji Man II aparatu Golgiego, prowadzi głównie do galaktozylowanych, niefukozylowanych i galaktozylowanych hybrydowych oligosacharydów. W szczególności ustalane jest czy w stosunku do dzikiego typu GalT i do fuzji GnT I-GalT, fuzja Man II-GalT jest wydajniejsza w syntezie oligosacharydów galaktozylowanych, niefukozylowanych, połączonych z Fc oraz galaktozylowanych, hybrydowych.
Jak wspominano powyżej, endoglikozydaza H (EndoH) stosowana jest do potwierdzenia przypisania galaktozylowanych niefukozylowanych i galaktozylowanych, hybrydowych struktur do różnych pików oligosacharydowych obserwowanych w profilach MALDI. Spośród reszt galaktozydowych oiigosacharydów, które niosą resztę galaktozową, ustalane są procentowe udziały tych struktur, które są strukturami oligosacharydów niefukozylowanych hybrydowych, fukozylowanych hybrydowych oraz fukozylowanych złożonych.
Określany jest wpływ poziomu ekspresji GalT i konkretnej domeny lokalizacji, która jest stosowana do nakierowania domeny katalitycznej GalT do aparatu Golgiego, na współzawodnictwo dla substratów oligosacharydowych modyfikowanych GnT I między rekombinowaną domeną katalityczną GalT i endogennym rdzeniem α 1,6-fukozylotransferazy, enzymów Man II i GnT II. Określany jest poziom komórkowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC) wynikający z nadekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało, kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd o aktywności GalT, który umieszczany jest w aparacie Golgiego przez różne domeny lokalizacji.
Określane jest także, czy przeciwciała z modyfikacją glikozylacji wytwarzane przez ekspresję w komórkach wytwarzających przeciwciało kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GalT, mają zwiększone powinowactwo wiązania do ludzkiego aktywującego receptora Fc FcgammaRIIIA, czy też do hamującego receptora FcgammaRIIb.
Konstrukty GalT będą przewyższać aktywność enogennego rdzenia a1,6-fukozylotransferazy, modyfikując glikozylację rejonu Fc przeciwciała i w konsekwencji zwiększając ADCC.
Określany jest profil oligosacharydowy przeciwciała anty-CD20 wytwarzanego w komórkach BHK wzrastających w zawiesinie i modyfikowanego w celu konstytutywnej, ekspresji na wysokim poziomie zarówno przeciwciała rekombinowanego, jak i fuzji polipeptydowej o aktywności GalT. Określane są także względne udziały procentowe oligosacharydów monoklonalnego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji wytwarzanego w stabilnej linii komórkowej BHK1502-28-11.
P r z y k ł a d 5
Materiały i Metody
1. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych Man II i GnT II
W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego Man II, cDNA ludzkiej mannozydazy II (SEK. NR ID: 17; subklonowano do plazmidowego wektora ekspresyjnego poniżej promotora MPSV i powyżej sztucznego sygnału poliadenyiacji króliczej beta-globiny. W celu ekspresji GnT II, stosowany jest plazmidowywektor ekspresyjnego z cDNA ludzkiego GnT II suklonówanego poniżej promotora/wzmacniacza ludzkiego CMV i powyżej sygnału poliadenyiacj i bydlęcego hormonu wzrostu.
Połączenie wektorów ekspresyjnych z miejscem inicjacji replikacji oriP z wirusa Epsteina Barra
Fragment DNA z oriP subklonowano w sposób opisany w przykładzie 1, dc opisanego powyżej wektora ekspresyjnego Man II, w celu otrzymania wektora ekspresyjnego Man II pCLF9. Fragment DNA z oriP jest subklonowany w sposób opisany w przykładzie 1, do opisanego powyżej wektora ekspresyjnego GnT II w celu otrzymania wektora ekspresyjnego GanTII pGnT II.
2. Transfekcja komórek HEK293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA w fazie wykładniczego wzrostu transferowano w sposób opisany w przykładzie 1. W celu wytworzenia niezmodyfikowanego przeciwciała „Cwt”, komórki transfekowano wektorem ekspresyjnym przeciwciała (pETR1520). W celu wytworzenia przeciwciała „Cbrt” z modyfikacją glikozylacji, komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała (pETR1520) i drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519) w stosunku odpowiednio 4:1. W celu wytworzenia przeciwciała „Cm” z modyfikacją glikozylacji, komórki kotransfekowano trzema plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugim do wyrażania fuzji polipept ydowej GnT III (pETR1519) i trzecim do wyrażania mannozydazy II (pCLF9) w stosunku odpowiednio
PL 222 219 B1
3:1:1. W celu wytworzenia przeciwciała „Cmg” z modyfikacją glikozylacji, komórki kotransfekowano czterema plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugim, do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519), trzecim do wyrażania mannozydazy II (pCLF9) i czwartym do wyrażania GnT II (pGnT II) w stosunku odpowiednio 4:0,33:0,33:0,33.
3. Wytwarzanie i oczyszczanie niezmodyfikowanycn przeciwciał i przeciwciał z modyfikacją glikozylacji
Pożywkę hodowlaną powyższych stransfekowanych komórek wymieniano na świeżą pożywkę hodowlaną w przybliżeniu 16 godzin po transfekcji, a tę ostatnią pożywkę zbierano po hodowli stransfekowanych komórek przez dalszych 120 godzin. Zebrane supernatanty odwirowwano przez 5 minut przy 1200 febr./min., a następnie ponownie odwirowano przez 10 minut przy 4000 obr./min. i trzymano w 4°C.
Oczyszczanie przeciwciał
Przeciwciała monoklonaIne oczyszczono z superr.atantów hodowlanych stosując dwa następujące po sobie etapy chromatograficzne, chromatografię białka A i chromatografię katjonowymienną, w sposób opisany w przykładzie 1. Dla przeciwciał cwt7, cbrt5 i cml, po etapie kationowymiennym dodano dodatkowy etap chromatografii wykluczania według wielkości stosując kolumnę Superdex 200 (Amersham Pharmacia) oraz roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem i zebrane monomeryczny pik przeciwciał.
4. Analiza oiigosacharydów
Oligosacharydy uwalniono enzymatycznie z przeciwciał znajdujących się w roztworze przez trawienie PNGazą, w sposób opisany w przykładzie 1.
Zastosowanie trawienia endoglikozydazą H oiigosacharydów uwolnionych PNGazą w celu przypisania struktur oligosacharydów hybrydowych przeciętych do neutralnych pików oligosacharydowych MALDI/TOF-MS
Oligosacharydy uwolnione PNGazą trawiono następnie endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96), w sposób opisany na przykładzie 1.
MALDI/TOF-MS
Próbki zawierające trawienia enzymatyczne zawierające uwolnione oligosacharydy przygotowano do i następnie poddano analizie na spektrometrze masowym MALDI/TOF, jak to opisano w przykładzie 1.
5. Przygotowanie i izolowanie komórek
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowano stosując Histopaque-1077 (Sigma Diagnostic Inc., St. Louis, M063178 USA) w sposób zasadniczo zgodny z instrukcjami wytwórcy i protokołem opisanym w przykładzie 1.
6. Izolacja limfocytów NK
Ludzkie limfocyty NK wyizolowano z PBMC stosując procedurą selekcji negatywnej, w sposób opisany w przykładzie 1.
7. Test ADCC
PBMC jako komórki efektorowe przygotowano jak to opisano powyżej i przetestowano pod względem ich zdolności do pośredniczenia w cytotoksyczności w teście cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), jak to opisano w przykładzie 1.
8. Wiązanie FcgammaRIIIA na limfocytach NK
Wiązanie FcgammaRIIIA na świeżo wyizolowanych limfocytach NK oraz wiązanie Fcgamm aRIIb określono jak opisano w przykładzie 1.
9. Test cytotoksyczności zależnej od dopełniacza
Testy cytotoksyczności zależnej od dopełniacza przeprowadzono stosując rozcieńczenia przeciwciała zgodnie ze sposobem opisanym w przykładzie 1, z następującymi modyfikacjami w celu przygotowania źródła ludzkiego dopełniacza. W skrócie, normalną surowicę ludzką (NHS) przygotowywano z krwi zdrowych ochotników. Krew pozostawiono do skrzepnięcia przez jedną godzinę, a następnie była odwirowywano przy 1200 g przez 20 minut. Wolny od komórek supernatant surowicy podzielono na jed nakowe objętości i przechowywano w -80°C. Stosowano 20% końcowej objętości oznaczenia NHS.
Wyniki i Dyskusja
Wersje chimerowego przeciwciała IgG1 anty-CD20 z modyfi kacją giikozylacji (przeciwciało chimerowe C2B8, znane także jako rituximab) wytwarzono przez kotransfekowanie hodowli ssaczych komórek wektorami do ekspresji genów przeciwciała oraz wektorami do ekspresji genów kodujących polipeptydy o aktywności GnT III i mannozydazy II. Dodatkowa wersja przeciwciała z modyfikacją glikozylacji
PL 222 219 B1 jest także wytwarzana przez kotransfekowanie hodowli ssaczych komórek wektorami do ekspresji genów przeciwciała oraz wektorami do ekspresji genów kodujących polipeptydy aktywności GnT III, aktywności mannozydazy II i aktywności GnT II. Dla przeciwciała z modyfikacją glikozylacji „Cbrt” komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jeden był do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugi do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519). Dla przeciwciała z modyfikacją giikozylacji „Cm” komórki kotransfekowano trzema plazmidami, jeden był do wyrażania prze ciwciaia (pETP.1520), drugi do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519), trzeci do wyrażania mannozydazy II (pCLF9). Dla przeciwciała z modyfikacją glikozylacji „Cmg” komórki kotransfekowano czterema plazmidami, jeden był do wy rażania przeciwciała (pETR1520), drugi do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519), trzeci do wyrażania mannozydazy II (pCLF9), aczwarty do wyrażania GnT II (pGnT II). Nie zmodyfikowaną (bez modyfikacji giikozylacji) wersję tego samego przeciwciała „Cwt” wytworzono transfekując ssacze komórki jedynie wektorem do ekspresji genów przeciwciała.
Transfekowane komórki hodowano przez 5 dni, a wydzielone, rekombinowane przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej. Ekspresja genów kodujących polipeptydy aktywności GnT III lub Man II nie miała żadnego znaczącego wpływu na żywotność komórek, wzrost komórek lub wytwarzanie przeciwciał, w porównaniu z komórkami nieprodukującymi takich glikotransferaz lub peptydów glikozydaz.
Oczyszczone przeciwciała następnie analizowano pod kątem wzorów ich giikozylacji. Przeciwciała te niosą N-związanych przez oligosacharydy jedynie do reszty Asn297 regionu Fc ludzkiego IgG 1. Oligosacharydy usunięto enzymatycznie z przeciwciał trawiąc PNGazą F, a następnie analizowano za pomocą MALDI/TOF-MS. Przy zastosowaniu tej techniki możliwe jest określenie frakcji różnych rodzajów oligosacharydów w całkowitej, oryginalnej populacji oiigosacharydów-Fc, a także możliwe jest przypisanie struktur różnym pikom w widmach (Umana P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)).
Na fig. 26 przedstawiono neutralne profile oligosacharydowe MALDI/TOF-MS z niemodyfi kowanego, rekombinowanego, chimerowego IgG1 C2B8 anty-CD20 przeciwciała Cwt. Jak dla niemodyfikowanego przeciwciała poprzednio opisanego w przykładzie 1, fig. 5, Cwt wykazuje typowy profil oligosacharydowy z pikami o wartościach m/z 1485, 1648 i 1810 odpowiadającymi dwuantenowym, z fukozylowanym rdzeniem, złożonym oligosacharydom mającym odpowiednio 0, 1 i 2 reszty galaktozowe. Manipulacja komórkami wytwarzającymi przeciwciało poprzez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, w której domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, prowadziła do wytwarzania przeciwciała (Cbrt), w których większość oligosacharydów-Fc było przeciętymi, niefukozylowanymi hybrydami (patrz fig 27). Jak opisano w przykładzie 1, endoglikozydaza H (EndoH) została zastosowana do potwierdzenia przypisania przeciętych, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych struktur do różnych pików oligosacharydowych widocznych w profilach MALDI.
Manipulacja komórek wytwarzających przeciwciało przez jednoczesną ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II i kwasu nukleinowego kodującego Man II, prowadziła do wytwarzania przeciwciała (Cm), gdzie większość oligosacharydów-Fc było przeciętymi, niefukozylowanymi, złożonymi (patrz fig 28). Manipulacja komórek wytwarzających przeciwciało przez ko-ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, kwasu nukleinowego kodującego Man II i kwasu nukleinowego kodującego GnT II, prowadziła do wytwarzania przeciwciała (Cmg), gdzie większość oligosacharydów-Fc było przeciętymi, niefukozylowanymi, złożonymi z jeszcze większym udziałem przeciętych, niefukozylowanych, złożonych oligosacharydów prz yłączonych do Fc niż dla przeciwciała Cm.
Na fig. 29 pokazano dane wskazujące na zwiększenie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała (ADCC) spowodowanej ekspresją w komórkach wytwarzających przeciwciało kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, gdzie kwas nukleinowy kodujący Man II-GnT III jest poddawany ekspresji zarówno samodzielnie (przeciwciało Cbrt) jak i poddawany koekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm). Zatem, zwiększanie poziomu przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, zarówno typu hybrydowego jak i złożonego w regionie Fc przeciwciał z modyfikacją giikozylacji prowadzi do wzrostu aktywności ADCC.
PL 222 219 B1
Wiadomo, że ważnymi pośrednikami w ADCC są komórki NK (NK). Komórki te niosą na swojej powierzchni podlegający aktywacji receptor Fcgamma IIIA, znany także jako CD16a. Wiązanie się regionu Fc przeciwciał opłaszczajacych komórkę docelową z receptorami FcgammaRIIIA na komórkach NK jest konieczne do wiązania krzyżowego tych receptorów na komórkach NK i następującej po tym indukcji ADCC. Tak więc, jest ważne, aby oceniać wiązanie się przeciwciał wytworzonych spos obami tutaj przedstawionymi z receptorami Fc, w szczególności do receptorami w natywnej postaci, w której są prezentowane przez ludzkie komórki efektorowe. Na fig. 30 pokazano, że przeciwciała z modyfikacją giikozylacji otrzymane przez uzyskanie ekspresji, w komórkach wytwarzających przeciwciało, kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GnT III, poddanego ekspresji zarówno samodzielnie (przeciwciało Cbrt) jak i koekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm), mającym zwiększone powinowactwo wiązania się z aktywującym ludzkim receptorem FcgammaRIIIA. Jak wspomniano powyżej dla testów ADCC, przeciwciała te mają zwiększone poziomy przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, co jest wynikiem wyrażania fuzji poiipeptydowej o aktywności GnT III w komórkach wytwarzających przeciwciało.
A zatem, zwiększanie poziomu przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, zarówno typu hybrydowego jak i złożonego, w regionie Fc przeciwciał z modyfikacją giikozylacji prowadzi do wzrostu aktywności ADCC. Komórki NK zastosowane w tym teście pochodzą od dawcy o genotypie, który nie warunkuje wyrażania receptora FcgammaRIIc na swoich komórkach NK (Metes, D., i wsp., J. Immunol. Methods 258 (1-2):85-95 (2001)). Zatem, jedyny receptor Fc znajdujący się na powierzchni tych komórek, to aktywujący receptor Fc gamma RIIIA.
Domena wiążąca aktywującego receptora FcgammaRIIIB jest prawie identyczna z taką domeną FcgammaRIIIA. Zatem, powyższe dane wskazują także, że opisane tutaj przeciwciała z manipulacją glikozylacji mogą prowadzić do wzrostu funkcji efektorowych, w których pośredniczą komórki efektcrowe prezentujące FcgammaRIIIB, takie jak komórki granulocytów (PMN), obejmując uwolnienie toksycznych produktów oraz fagocytozę ((Reff, M. E., i Heard, C., Crit Rev Oncol Hematol. 40(1): 25-35 (2001), Daeron, FM. Annu. Rev. Immunol. 15: 203-34 (1997), Ravetch, J. V. i Bolland S. Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90 (2001)).
Cbrt, czyli przeciwciało anty-CD20 wytwarzane w komórkach zmodyfikowanych w celu uzyskania ekspresji kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GnT III i umieszczanego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II, przetestowano również pod kątem lizy z udziałem dopełniacza (CML), innej funkcji efektorowej, która nie jest zależna od receptorów Fc na odpornościowych komórkach efektorowych. Znaczna większość oligosacharydów tego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji była rodzaju przeciętego, hybrydowego, niefukozylowanego. Obniżoną aktywność CML zaobserwowano dla przeciwciała Cbrt w porównaniu z przeciwciałem niemodyfikowanym Cwt (fig. 31). Dla pewnych zastosowań mogą być pożądane przeciwciała z podwyższonym ADCC, ale z obniżonym. CML, na przykład, w celu zmniejszenia skutków ubocznych, takich jak zapalenie naczyń krwionośnych w miejscu nowotworu, w którym pośredniczy CML. Inne znaczące skutki uboczne, w których pośredniczą CML, zaobserwowano dla terapii z przeciwciałem anty-CD20 (van der Kolk L. E., i wsp., Br J Haematol. 115(4): 807-11 (2001)). Jednakże, możliwe jest otrzymanie przeciwciał z modyfikacją giikozylacji o zwiększonej aktywności ADCC i wiązaniu FcgammaRIII, ale bez znaczącego obniżenia aktywności CML w stosunku do niemodyfikowanego przeciwciała, jak w przypadku przeciwciała Cm (fig. 31). Takie przeciwciała są pożądane w zastosowaniach, w których maksymalna liczba eliminowanych komórek docelowych wymaga zarówno wysokiej ADCC, jak i wysokiej aktywacji dopełniacza i aktywności CML. Profile oligosacharydowe opisane powyżej pokazują, że możliwe jest zmodyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciało w celu wytwarzania przeciwciał, w których większość oligosacharydów przyłączonych do Fc jest przeciętymi, niefukozylowanymi, typu złożonego zamiast typu hybrydowego przez koekspresję fuzji polipeptydowej GnT III razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (przeciwciało Cm) lub razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II i z kwasem nukleinowym kodującym GnT II (przeciwciało Cmg). Przeciwciała z modyfikacją giikozylacji mają zwiększoną aktywność ADCC i zwiększone powinowactwo wiązania FcgammmaRI.II, które odpowiada ich zwiększonym poziomom przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, przy zwiększonej aktywności CML związanej ze wzrostem udziału oligosacharydów złożonych w stosunku do udziału oiigosacharydów hybrydowych.
Ten i wcześniejsze przykłady opisały wyrażanie fuzji polipeptydowej kodowanej przez kwasy nukleinowe, przy czym fuzja polipeptydowa zlokalizowana jest w aparacie Golgiego i ma domenę katalityczną,
PL 222 219 B1 która konkuruje z endogennymi fukozylotransferazami o akceptory oiigosacharydów, wcześniej zmodyfikowane dzięki reakcjom katalizowanym przez GnT 1. Rekombinowane glikoproteiny wytworzone w tak zmodyfikowanych komórkach gospodarza mają podwyższone poziomy niefukozylowanych oligosacharydów. Przykład ten pokazuje, że koekspresja w takich komórkach gospodarza kwasów nukleinowych kodujących Man II i/lub GnT II razem z powyższymi kwasami nukleinowymi kodującymi fuzję polipeptydową, prowadzi do przesunięcia w przebiegu biosyntezy w stronę złożonych zamiast hybrydowych oligosacharydów, a zatem do syntezy glikoprotein o zwiększonych poziomach niefukozylowanych, złożonych oligosacharydów w stosunku do glikoprotein wytwarzanych w komórkach bez jednoczesnej ekspresji kwasów nukleinowych kodujących Man II i/lub GnT II.
P r z y k ł a d 6
Nadekspresja α-mannozydazy
Klonowanie molekularne
Ludzka α-mannozydaza II
Gen kodujący ludzką α-mannozydazę („hMan II”)(E.C. 3.2.1.114) (SEK. NR ID: l7), pod kontrolą promotora MPSV wklonowanc do wektora ekspresyjnego zawierającego element OriP. Otrzymany wektor ekspresyjny pCLF9 przedstawiono na fig. 32A. Wektorami ekspresyjnymi kodującymi lekki i ciężki łańcuch monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 były, odpowiednio, pETR1842 i pETR1843 (fig. 32B i 32C).
Fuzja białkowa Man II-GalT
Fuzje białkową (SEK. NR ID: 20), składającą się z hMan II CTS i domeny katalitycznej β 1,4-galaktozylotransferazy człowieka (M22921, aminokwasy 126-397) skonstruowano jak opisano poniżej. Region hMan II CTS amplifikowano w PCR na matrycy pETR1448 (CF33, GAB252). Domenę katalityczną GalT (aminokwasy 126-397) amplifikowano z wykorzystaniem CF31 i CF35 na matrycy pBlueGalT. Połączono hMan II CTS z domeną katalityczną GalT, aby otrzymać fuzje białkową kontrolowaną promotorem MPSV (pCLF24). Cały gen GalT otrzymano z pBlueGalT. Gen kodujący GalT zsekwencjonowano (SEK. NR ID: 16):
MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSR
LPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDS
SPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDL
ELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHP
VLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDV
DLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLT
INGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKK
NEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS
Koniec 5' GalT amplifikowano z CF32/CF38 i dodano na początku genu miejsce restrykcyjne Fsel. Przez sekwencjonowanie stwierdzono, że sekwencja jest poprawna i podmieniono ją w pCLF24 przez trawienie Fsel/Dralll (pCLF26). Dodano OriP do pCLF24 i pCLF26, aby otrzymać odpowiednio pCLF25 i pCLF27 (Fig. 33A i 33B).
Wyrażanie α-mannozydazy i Man II-GalT w komórkach HEK 293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA transfekowano metodą z fosforanem wapnia. W skrócie, w celu transfekcji w butelce T150, 15 milionów komórek umieszczono 24 godziny przed transfekcją w 28 ml DMEM, 10% FCS, 250 pg/ml neomycyny i inkubowano w 37°C przy 5% CO2 przez noc.
Dla każdej butelki T150 przeznaczonej do transfekcji, przygotowano roztwór DNA, CaCl2 i wody przez zmieszanie 94 pg DNA całkowitego wektora plazmidowego, 469 pl 1M roztworu CaCl2 i dodanie wody do końcowej objętości 938 pl. Do tego roztworu dodano 938 pl roztworu 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4 o pH 7,05, zmieszano natychmiast przez 10 sekund i zostawiono do odstania w temperaturze pokojowej przez 20 sekund. Zawiesinę rozcieńczono 24 ml DMEM uzupełnioną 2% FCS i dodano do T150 w miejsce istniejącej pożywki. Komórki inkubowano w 37°C, z 5% CO2 przez około 17 do 20 godzin, następnie pożywkę zastąpiono 30 ml DMEM, 10% FCS. W celu testowania wpływu α-mannozydazy II na współzawodnictwo z fukozylotransferazą rdzenia, komórki transfekowano pETR1842, pETR1343 i pCLF9 w stosunku odpowiednio 2:2:1. Dla fuzji białkowej Man II-GalT komórki stransfekowano pETR1842, pETR1843 i pCLF9 w stosunku odpowiednio 2:2:1. Piątego dnia po transfekcji, zebrano supernatant, odwirowano przez 5 minut przy 1200 obr./min., a następnie ponownie odwirowano przez 10 minut przy 4000 obr./min. i trzymano w 4°C.
PL 222 219 B1
Oczyszczanie przeciwciała monoklonalnego anty-CD20
Przeciwciało monoklonalne oczyszczono z 30 ml supernatantu stosując dwa kolejne etapy chromatograficzne, obejmujące pierwszy etap składający się z chromatografii białka A, aby oddzielić przeciwciało raonoklonalne od przeciwciała krowiego obecnego w surowicy, po tym następował etap chromatografii kationo-wymiennie w celu wymiany buforu na PBS.
Analiza oligosacharydów
Trawienie PNGaząF
Próbkę przeciwciała monoklonalnego (50 pg) inkubowano z N-glikozydazą F (rekombinowana, Roche, Szwajcaria) w stężeniu 0,1 mU/pl. Trawienie przeprowadzono w buforze 2mM Tris, pH 7,0 przez 3 godziny w 37°C. Uwolnione neutralne oligosacharydy inkubowano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej po dodaniu kwasu octowego w końcowym stężeniu 150 mM. Następnie próbki odsolono na 0,6 ml żywicy kationo-wymiennej (żywica AG50W-X8, postać wodorowa, 100-200 mesh, BioRad, Hercules, CA) nałożonej na kolumnę chromatograficzną mikro-bic-spin (BioRad, Hercules, CA)
Trawienie EndoH
Przed traktowaniem kwasem octowym, uwolnione PNGaząF oligosacharydy strawiono endoglikozydaza. H (EC 3.2.1.96, ROCHE, Szwajcaria), enzymem tnącym między resztami N-acetyloglukozaminowymi rdzenia chitobiozy N-przyłaczonych oligosacharydów. Enzym przetnie oligomannozę i większość typów glikanów hybrydowych, podczas gdy oligosacharydy typu złożonego nie są hydrolizowane.
Oligosacharydy strawiono 0,2 mU/pl endoglikozydazą H w buforze 2mM Tris, pH 7,0. Trawienie prowadza się przez 3 godziny w 37°C. Oligosacharydy inkubowano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej po dodaniu kwasu octowego w końcowym stężeniu 150 mM, a następnie odsolono na 0,6 ml żywicy kationo-wymiennej (żywica AG50W-X8, postać wodorowa, 100-200 mesh, BioRad, Szwajcaria) nałożonej na kolumnę chromatograficzną mikro-bio-spin (BioRad, Szwajcaria).
Przygotowanie próbki i macierzy
Macierz kwasu 2,5-dihydrobenzoesowego (sDHB) przygotowano przez rozpuszczenie 2 mg kwasu 2,5-dihydrobenzoesowego + 0,1 mg kwasu 5-metoksysalicylowego w 1 ml etanolu/10 mM wodnego chlorku sodu 1:1 (obj./obj.). 1 pl próbki nałożono na płytkę docelową ze stali nierdzewnej i zmieszano na płytce z 1 pl podłoża sDHB. Próbki wysuszono na powietrzu, nałożonokładano 0,2 pl etanolu.
Analiza MALDI/TOF-MS
Spektrometrem masowym MALDI-TOF stosowanym do uzyskania widma masowego był Voyager Elite (Perspective Biosystems) z możliwością opóźnionej ekstrakcji. Przyrząd działał w układzie z reflektorem. Pozytywne jony przyspieszano do 20 kV po 75 nsek opóźnieniu. Pięć widm po 40 zdjęć (200 zdjęć) połączono w celu uzyskania końcowego widma. Do oznaczania masy jonów stosowano zewnętrzną kalibrację przy zastosowaniu standardów oligoscharydowych.
Profile oligosacharydowe
Profil oligosacharydowy przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności Man II przedstawiono na fig. 34. Stwierdzono, że oligosacharydy związane z częścią Fc przeciwciała mają strukturę złożoną, 48% z nich nie brak fukozy rdzenia, α-mannozydaza II współzawodniczy z fukozylotransferazą rdzenia, wytwarzając 48% struktur oligosacharydów w postaci niefukozylowanej. Przy braku α-mannozydazy II, oligosacharydy części Fc przeciwciała składają się tylko ze struktur fukozylowanych (przeciwciało dzikiego typu).
Profil oligosacharydowy przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności fuzji białkowej Man II-GalT przedstawiono na fig. 35A-B. Jak dla α-mannozydazy II, także w przypadku fuzji białkowej Man II-GalT, wzrasta ilość oligosacharydów o strukturze niefukozylowanej. Duży udział procentowy struktur niefukozylowanych jest zgodny z dużą ilością struktur z mannozą (n/z 1256, 1419 i 1581). Przy 67% tych niefukozylowanych cukrów, dodatkowe stwierdzono 30% struktur hybrydowych, niefukozylowanych m/z 1622). Zatem, próbka otrzymana w obecności fuzji białkowej Man II-GalT wykazuje prawie 100% niefukozylowanych struktur.
Aktywność biologiczna przeciwciał otrzymanych w obecności α-mannozydazy II i fuzji białkowej Man II-GalT
Aby określić wpływ działania enzymów α-mannozydazy II i Man II-GalT we współzawodnictwie z fukozylotransferazą rdzenia, wykonano odpowiednie testy biologiczne. Próbki testowano in vitro na cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) i na wiązanie się z receptorem CD16 wyrażanym na powierzchni modyfikowanej linii komórkowej CHO (CHO-1708-37).
PL 222 219 B1
Wiązanie IgG na CHO-17Q8-37
Linia komórkowa CHO-17C8-37 wyraża na swojej powierzchni receptor FcyRIIIA (CD16) i łańcuch γ receptora FcyRI. Wyrażanie receptora FcyRIIlA (CD16) oznaczono w analizie FACS z wykorzystaniem przeciwciała monoklonalnego 3G8-FITC (fig. 36). Komórki CHO-1708-37 inkubowano w stężeniu 1 milion/ml w PBS, 0,1% BSA z różnymi wariantami przeciwciał, w różnych stężeniach (10, 3, 1, 0,3, 0,1 μg/ml) i w trzech powtórzeniach. Komórki inkubowano przez 30 min. w 4°C, a następnie przepłukano PBS, 0,1% BSA. Wiązanie przeciwciał wykryto inkubując przez 30 min. w 4°C ze skoniugowanym z izotiocjanianem fluoresceiny 1:200 kozim przeciwciałem F(ab')2 anty-ludzka IgG (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA). Intensywność fluorescencji odwołująca się dowariantów związanego przeciwciała określono na żywych, bramkujących komórkach FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA).
Doświadczeniami z testami wiązania objęto następujące przeciwciała:
Cwt8 (typu dzikiego I)
Man II (α-mannozydaza II)
Przeciwciało wytworzone w obecności α-mannozydazy II (Man II) wiąże się z receptorami FcyRIIIA z wyższym powinowactwem niż przeciwciała typu dzikiego.
Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) in vitro
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywano stosując Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA) i zasadniczo stosując instrukcje producentów. W skrócie, heparynowanymi strzykawkami pobierano krew żylną od ochotników, których poproszono o bieganie z maksymalną szybkością przez 1 minute w celu zwiększenia procentowego udziału komórek NK (NK) we krwi. Krew rozcieńczono 1:0,75-1,3 PBS niezwierającym Ca lub Mg i umieszczono na Histopaque-1077. Gradient odwirowano przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerw. Zebrano interfazę zawierającą PBMC i przemyto ją PBS (50 ml na komórki z dwóch gradientów) i zebrano przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut, RT. Po ponownym zawieszeniu osadu w PBS, zliczano PBMC i przemyciu drugi raz przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut w RT. Komórki następnie ponownie zawieszono w odpowiedniej pożywce do kolejnych procedur.
Docelowe komórki Raji przemyto w F3S, zliczono i ponownie zawieszono w DMEM, 10% FCS, 1% Glutarnax w stężeniu 1 milion/ml. Dodano do nich kalceinę i komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C. Komórki następnie przemyto w PBS, zliczono i ponownie zawieszono w A1M-V w stężeniu 0,3 miliona/ml. Z tej zawiesiny komórek, dodano po 100 μl na studzienkę na okrągłodennej, 96-studzienkowej płytce. Przeciwciała rozcieńczono w AIM-V, dodano po 50 μl do wysianych komórek docelowych i umożliwiono wiązanie się z komórkami docelowymi przez 10 min. w temp. pokojowej. Jako komórki efektorowe PBMC przygotowano tak jak opisano powyżej. Stosunek komórek efektorowych do docelowych wynosił 25:1. Komórki efektorowe przygotowano w stężeniu 15 milionów na ml w pożywce AIM-V i dodano po 50 μl na studzienkę. Płytkę inkubowano przez 4 godziny w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Komórki przepłukano dwukrotnie PBS i dodano po 200 μl roztworu boranu. Zabijanie komórek mierzono na podstawie uwalniania kalceiny do pożywki po lizie roztworem boranowym (fig. 37).
Spontaniczne uwalnianie mierzono w studzienkach zawierających jedynie komórki docelowe i efektorowe, ale nie przeciwciała. Maksymalne uwalniane określonoo ze studzienek zawierających jedynie komórki docelowe i 1% Triton X-100. Procent specyficznego zabijania z udziałem przeciwciał obliczano w następujący sposób: ((x-SR)/(MR-SR)*100, gdzie x jest średnia Vmax w specyficznym stężeniu przeciwciała, SR jest średnią Vmax spontanicznego uwalniania, a MR jest średnią Vmax maksymalnego uwalniania.
P r z y k ł a d 7
Stosowanie monoklonalnego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji anty-EGFR w leczeniu łuszczycy
Pacjenci będący ludźmi z łuszczycą mogą być leczeni monoklonalnym przeciwciałem z modyfikacją giikozylacji anty-EGFR wytworzonym sposobem tu ujawnionym. Konkretnie, pacjenci otrzymują 2 cotygodniowe infuzje przeciwciała z modyfikacją giikozylacji w dawce początkowej 400 mg/m . Utrzy2 mujące dawki po 250 mg/m podaje się na podstawie cotygodniowych obserwacji aż do osiągnięcia pełnej odpowiedzi.
P r z y k ł a d 8
Stosowanie monoklonalnego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji Anty-ErbB2 w leczeniu przerzutującego raka prostaty, przerzutującego raka sutka, przerzutującego raka okrężnicy i odbytu, stadium Illb lub IV niedrobnokomórkowego raka płuc
PL 222 219 B1
RhuMAb2C4 jest pełnej długości, humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym (wytworzonym w komórkach CHO) skierowanym przeciw ErbB2. RhuMab 2C4 blokuje oddziaływania ErbB2 z innymi członkami rodziny ErbB, przez co hamuje przekazywanie sygnałów wewnątrzkomórkowych szlaku ErbB. RhuMab 2C4 nie tylko hamuje wzrost nowotworów z nadekspresją ErbB2, ale także blokuje wzrost nowotworów, które wymagają przekazywania sygnałów zależnego od ligandów ErbB.
Postać RhuMab 2C4 z modyfikacją giikozylacji, wytworzona ujawnionymi tu sposobami może być zastosowana jako pojedynczy czynnik w leczeniu pacjentów z hormononiezależnym (niewrażliwym na androgeny) przerzutującym rakiem prostaty, przerzutującym rakiem sutka, przerzutującym rakiem okrężnicy i odbytu stadium mb lui iv niedrobnofcomórkowpn rakiem płuc. Szczegółowo, przeciwciało RhuMab 2C4 z modyfikacją glikozylacji podaje się dożylnie (IV), co tydzień lub, co trzy tygodnie w ilości odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, aż do ustania postępów choroby. Przeciwciało jest dostarczane w postaci cieczy dla wielu dawek (20 ml przy stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).
Jest oczywistym, że wynalazek można stosować w inny sposób niż opisano szczegółowo w powyższych opisach i przykładach. Jest możliwy szereg modyfikacji i zmian obecnego wynalazku w świetle powyższych technik, a zatem są one objęte do łączonymi zastrzeżeniami.
Cala zawartość wszystkich publikacji (w tym publikacji patentowych, zgłoszeń patentowych, artykułów w pismach, podręczników laboratoryjnych, książek lub innych dokumentów) tutaj cytowanych włączona jest tu jako odniesienie.
PL 222 219 B1
P30045PL02
POPRAWIONA LISTA SEKWENC3I
<110> GlycArt Biotechnology AG Umana, Pablo Bruenker, Peter Ferrara, Claudia Suter, Tobias
<120> Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
<130> 1975.018PC03
<140> <141> To Be Assigned Herewith
<150> <151> US 60/441,307 2003-01-22
<150> <151> US 60/491,254 2003-07-31
<150> <151> US 60/495,142 2003-08-15
<160> 24
<170> Patentln version 3.5
<210> <211> <212> <213> 1 11 PRT Nieznane
<220> <223> Znacznik epitopowy c-myc
<400> 1
Pro Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 2 45 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223> Starter PCR GAB-177
<400> 2
PL 222 219 B1
gcgtgtgcct gtgacccccg cgcccctgct ccagccactg tcccc 45
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Starter PCR GAB-178
<400> 3
gaaggtttct ccagcatcct ggtacc 26
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Starter PCR GAB-179
<400> 4
ctgaggcgcg ccgccaccat gctgaagaag cagtctgcag ggc 43
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Starter PCR GAB-180
<400> 5
ggggacagtg gctggagcag gggcgcgggg gtcacaggca cacgcggc 48
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Starter PCR GAB-252
<400> 6
gctaggccgg ccgccaccat gaagttaagc cgccagttca ccgtgttcgg 50
<210> 7 <211> 65
PL 222 219 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-253 <400> 7 ggggacagtg gctggagcag gggtgagcca gcaccttggc tgaaattgct ttgtgaactt 60 ttcgg 65 <210> 8 <211> 66 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-254 <400> 8 tccgaaaagt tcacaaagca atttcagcca aggtgctggc tcacccctgc tccagccact gtcccc <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-255 <400> 9 atgccgcata ggcctccgag caggacccc 29 <21θ> 1Θ <211> 43 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-261 <400> 10 gctaaatatt gaattccctt tatgtgtaac tcttggctga agc <210>
<211>
<212>
DNA
PL 222 219 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-262 <400> 11 tagcaatatt gaattcgcag gaaaaggaca agcagcgaaa attcacgc 48 <210> 12 <211> 1715 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja nukleotydowa Manll-GnTIII <400> 12
atgaagttaa gccgccagtt caccgtgttc ggcagtgcga tcttctgtgt ggtgattttc 60
tcgctctacc tgatgctgga ccggggtcac ttagactacc ccaggaaccc gcgccgcgag 120
ggctccttcc ctcagggcca gctctcaatg ttgcaagaaa aaatagacca tttggagcgt 180
ttgctagctg agaataatga gatcatctca aatattagag actcagtcat caatttgagt 240
gagtctgtgg aggatggtcc gaaaagttca caaagcaatt tcagccaagg tgctggctca 300
cccctgctcc agccactgtc ccctagcaag gccaccgaag aactgcaccg ggtggacttc 360
gtgttgccgg aggacaccac agagtatttt gtgcgcacca aagctggcgg tgtgtgcttc 420
aaaccaggta ccaggatgct ggagaaacct tctccagggc ggacagagga gaagaccaag 480
gtggctgagg ggtcctcggt ccggggtcct gctcggaggc ctatgcggca tgtgttgagt 540
gcacgggagc gcctgggagg ccggggcact aggcgcaagt gggttgagtg tgtgtgcctg 600
ccaggctggc acgggcccag ctgcggggtg cccactgtgg tccagtattc caacctgccc 660
accaaggagc gcctggtacc cagggaggtg ccgaggcggg ttatcaacgc catcaacatc 720
aaccatgagt tcgacctgct ggatgtgcgc ttccatgagc tgggcgatgt tgtggacgcc 780
tttgtggtct gcgaatccaa tttcaccgcc tacggggagc ctcggccgct caagttccga 840
gagatgctga ccaatggcac cttcgagtac atccgccaca aggtgctcta cgtcttcctg 900
gaccacttcc cacctggtgg ccgtcaggac ggctggattg cagacgacta cctgcgtacc 960
ttcctcaccc aggatggtgt ctcccgcctg cgcaacctgc gacctgatga cgtctttatc 1020
atcgacgacg cggacgagat ccctgcgcgt gatggtgtgc tgttcctcaa gctctacgat 1080
PL 222 219 B1
ggctggacag agcccttcgc cttccatatg cgcaagtccc tgtatggttt cttttggaag 1140
caaccaggca cacggaggtg gtgtcaggct gcaccattga catgctgcag gctgtgtatg 1200
ggctggacgg catccgcctg cgccgccgtc agtactacac catgcccaac tttcgacagt 1260
atgagaaccg caccggccac atcctagtgc agtggtctct cggcagcccc ctgcacttcg 1320
cgggctggca ctgctcctgg tgcttcacac ccgagggcat ctacttcaaa ctcgtgtcgg 1380
cccagaatgg tgacttcccc cgctggggtg actacgagga caagagggac ctcaattaca 1440
tccgaagctt gattcgcact gggggatggt tcgacggcac gcagcaggag taccctcctg 1500
cagaccccag tgaacacatg tatgctccta agtacctgct caagaactat gaccagttcc 1560
gctacttgct cgaaaatccc taccgggagc ccaagagcac tgtagagggt gggcgccgga 1620
accagggctc agacggaagg tcatctgctg tcaggggcaa gttggataca acggagggcc 1680
cggaacagaa actgatctct gaagaggacc tgtag 1715
<210> 13 <211> 571 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa Manll-GnTIII <400> 13
Met 1 Lys Leu Ser Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe cys
5 10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp
20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu
35 40 45
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu
50 55 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser
65 70 75 80
PL 222 219 B1
Glu Ser Val Glu Asp Gly Pro Lys Ser Ser Gin Ser Asn Phe Ser Gin 85 90 95
Gly Ala Gly Ser Pro Leu Leu Gin Pro Leu Ser Pro Ser Lys Ala Thr 100 105 110
Glu Glu Leu His Arg Val Asp Phe Val Leu Pro Glu Asp Thr Thr Glu 115 120 125
Tyr Phe Val Arg Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro Gly Thr 130 135 140
Arg Met Leu Glu Lys Pro Ser Pro Gly Arg Thr Glu Glu Lys Thr Lys 145 150 155 160
Val Ala Glu Gly Ser Ser Val Arg Gly Pro Ala Arg Arg Pro Met Arg 165 170 175
His Val Leu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Gly Gly Arg Gly Thr Arg Arg 180 185 190
Lys Trp Val Glu Cys Val Cys Leu Pro Gly Trp His Gly Pro Ser Cys 195 200 205
Gly Val Pro Thr Val Val Gin Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Lys Glu Arg 210 215 220
Leu Val Pro Arg Glu Val Pro Arg Arg Val Ile Asn Ala Ile Asn Ile 225 230 235 240
Asn His Glu Phe Asp Leu Leu Asp Val Arg Phe His Glu Leu Gly Asp 245 250 255
Val Val Asp Ala Phe Val Val Cys Glu Ser Asn Phe Thr Ala Tyr Gly 260 265 270
Glu Pro Arg Pro Leu Lys Phe Arg Glu Met Leu Thr Asn Gly Thr Phe 275 280 285
PL 222 219 B1
Glu Tyr Ile Arg His Lys Val Leu Tyr Val Phe Leu Asp His Phe Pro 290 295 300
Pro Gly Gly Arg Gin Asp Gly Trp Ile Ala Asp Asp Tyr Leu Arg Thr 305 310 315 320
Phe Leu Thr Gin Asp Gly Val Ser Arg Leu Arg Asn Leu Arg Pro Asp 325 330 335
Asp Val Phe Ile Ile Asp Asp Ala Asp Glu Ile Pro Ala Arg Asp Gly 340 345 350
Val Leu Phe Leu Lys Leu Tyr Asp Gly Trp Thr Glu Pro Phe Ala Phe 355 360 365
His Met Arg Lys Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Trp Lys Gin Pro Gly Thr 370 375 380
Leu Glu Val Val Ser Gly Cys Thr Ile Asp Met Leu Gin Ala Val Tyr 385 390 395 40Θ
Gly Leu Asp Gly Ile Arg Leu Arg Arg Arg Gin Tyr Tyr Thr Met Pro 405 410 415
Asn Phe Arg Gin Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His Ile Leu Val Gin Trp 420 425 430
Ser Leu Gly Ser Pro Leu His Phe Ala Gly Trp His Cys Ser Trp Cys 435 440 445
Phe Thr Pro Glu Gly Ile Tyr Phe Lys Leu Val Ser Ala Gin Asn Gly 450 455 460
Asp Phe Pro Arg Trp Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Arg Asp Leu Asn Tyr 465 470 475 480
Ile Arg Ser Leu Ile Arg Thr Gly Gly Trp Phe Asp Gly Thr Gin Gin 485 490 495
Glu Tyr Pro Pro Ala Asp Pro Ser Glu His Met Tyr Ala Pro Lys Tyr
PL 222 219 B1
<210> 14 <211> 1722 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja nukleotydowa GnTI-GnTIII <4Θ0> 14
atgctgaaga agcagtctgc agggcttgtg ctgtggggcg ctatcctctt tgtggcctgg 60
aatgccctgc tgctcctctt cttctggacg cgcccagcac ctggcaggcc accctcagtc 120
agcgctctcg atggcgaccc cgccagcctc acccgggaag tgattcgcct ggcccaagac 180
gccgaggtgg agctggagcg gcagcgtggg ctgctgcagc agatcgggga tgccctgtcg 240
agccagcggg ggagggtgcc caccgcggcc cctcccgccc agccgcgtgt gcctgtgacc 300
cccgcgcccc tgctccagcc actgtcccct agcaaggcca ccgaagaact gcaccgggtg 360
gacttcgtgt tgccggagga caccacagag tattttgtgc gcaccaaagc tggcggtgtg 420
tgcttcaaac caggtaccag gatgctggag aaaccttctc cagggcggac agaggagaag 480
accaaggtgg ctgaggggtc ctcggtccgg ggtcctgctc ggaggcctat gcggcatgtg 540
ttgagtgcac gggagcgcct gggaggccgg ggcactaggc gcaagtgggt tgagtgtgtg 600
tgcctgccag gctggcacgg gcccagctgc ggggtgccca ctgtggtcca gtattccaac 660
ctgcccacca aggagcgcct ggtacccagg gaggtgccga ggcgggttat caacgccatc 720
aacatcaacc atgagttcga cctgctggat gtgcgcttcc atgagctggg cgatgttgtg 780
PL 222 219 B1
gacgcctttg tggtctgcga atccaatttc accgcctacg gggagcctcg gccgctcaag 840
ttccgagaga tgctgaccaa tggcaccttc gagtacatcc gccacaaggt gctctacgtc 900
ttcctggacc acttcccacc tggtggccgt caggacggct ggattgcaga cgactacctg 960
cgtaccttcc tcacccagga tggtgtctcc cgcctgcgca acctgcgacc tgatgacgtc 1020
tttatcatcg acgacgcgga cgagatccct gcgcgtgatg gtgtgctgtt cctcaagctc 1080
tacgatggct ggacagagcc cttcgccttc catatgcgca agtccctgta tggtttcttt 1140
tggaagcaac caggcacact ggaggtggtg tcaggctgca ccattgacat gctgcaggct 1200
gtgtatgggc tggacggcat ccgcctgcgc cgccgtcagt actacaccat gcccaacttt 1260
cgacagtatg agaaccgcac cggccacatc ctagtgcagt ggtctctcgg cagccccctg 1320
cacttcgcgg gctggcactg ctcctggtgc ttcacacccg agggcatcta cttcaaactc 1380
gtgtcggccc agaatggtga cttcccccgc tggggtgact acgaggacaa gagggacctc 1440
aattacatcc gaagcttgat tcgcactggg ggatggttcg acggcacgca gcaggagtac 1500
cctcctgcag accccagtga acacatgtat gctcctaagt acctgctcaa gaactatgac 1560
cagttccgct acttgctcga aaatccctac cgggagccca agagcactgt agagggtggg 1620
cgccggaacc agggctcaga cggaaggtca tctgctgtca ggggcaagtt ggatacaacg 1680
gagggcccgg aacagaaact gatctctgaa gaggacctgt ag 1722
<210> 15 <211> 573 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22θ>
<223> Sekwencja aminokwasowa fuzji GNTI-GnTIII <4Θ0> 15
Met Leu Lys Lys Gin Ser Ala Gly Leu Val Leu Trp Gly Ala Ile Leu 15 10 15
Phe Val Ala Trp Asn Ala Leu Leu Leu Leu Phe Phe Trp Thr Arg Pro 2Θ 25 30
Ala Pro Gly Arg Pro Pro Ser Val Ser Ala Leu Asp Gly Asp Pro Ala 35 40 45
PL 222 219 B1
Ser Leu Thr Arg Glu Val Ile Arg Leu Ala Gin Asp Ala Glu Val Glu 50 55 60
Leu Glu Arg Gin Arg Gly Leu Leu Gin Gin Ile Gly Asp Ala Leu Ser 65 70 75 80
Ser Gin Arg Gly Arg Val Pro Thr Ala Ala Pro Pro Ala Gin Pro Arg 85 90 95
Val Pro Val Thr Pro Ala Pro Leu Leu Gin Pro Leu Ser Pro Ser Lys 100 105 110
Ala Thr Glu Glu Leu His Arg Val Asp Phe Val Leu Pro Glu Asp Thr 115 12Θ 125
Thr Glu Tyr Phe Val Arg Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro 13Θ 135 140
Gly Thr Arg Met Leu Glu Lys Pro Ser Pro Gly Arg Thr Glu Glu Lys 145 150 155 160
Thr Lys Val Ala Glu Gly Ser Ser Val Arg Gly Pro Ala Arg Arg Pro 165 17Θ 175
Met Arg His Val Leu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Gly Gly Arg Gly Thr 180 185 190
Arg Arg Lys Trp Val Glu Cys Val Cys Leu Pro Gly Trp His Gly Pro 195 200 205
Ser Cys Gly Val Pro Thr Val Val Gin Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Lys 21Θ 215 220
Glu Arg Leu Val Pro Arg Glu Val Pro Arg Arg Val Ile Asn Ala Ile 225 230 235 240
Asn Ile Asn His Glu Phe Asp Leu Leu Asp Val Arg Phe His Glu Leu 245 250 255
PL 222 219 B1
PL 222 219 B1
Asn Gly Asp Phe Pro 465 Arg Trp Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Arg Asp Leu 480
470 475
Asn Tyr Ile Arg Ser Leu Ile Arg Thr Gly Gly Trp Phe Asp Gly Thr
485 490 495
Gin Gin Glu Tyr Pro Pro Ala Asp Pro Ser Glu His Met Tyr Ala Pro
500 505 510
Lys Tyr Leu Leu Lys Asn Tyr Asp Gin Phe Arg Tyr Leu Leu Glu Asn
515 520 525
Pro Tyr Arg Glu Pro Lys Ser Thr Val Glu Gly Gly Arg Arg Asn Gin
530 535 540
Gly Ser Asp Gly Arg Ser Ser Ala Val Arg Gly Lys Leu Asp Thr Thr
545 550 555 560
Glu Gly Pro Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
565 570
<210> 16
<211> 398
<212> PRT
<213> Nieznane
<220>
<223> Sekwencja aminokwasowa GalT z pBlueGalT
<400> 16
Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Leu Gin Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu
20 25 30
His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser
35 40 45
Arg Leu Pro Gin Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly Ser
50 55 60
PL 222 219 B1
PL 222 219 B1
Met Asp Lys 275 Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin Tyr Phe Gly Gly
280 285
Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro
290 295 300
Asn Asn Tyr Trp Gly T rp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg
305 31Θ 315 320
Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly
325 330 335
Arg cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn
340 345 350
Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser
355 360 365
Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg Tyr
370 375 380
Pro Leu Tyr Thr Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser
385 390 395
<210> 17
<211> 3435
<212> 1 DNA
<213> 1 Homo sapiens
<220>
<223> Sekwencja nukleotydowa Man II <400> 17
atgaagttaa gccgccagtt caccgtgttc ggcagtgcga tcttctgtgt ggtgattttc 60
tcgctctacc tgatgctgga ccggggtcac ttagactacc ccaggaaccc gcgccgcgag 120
ggctccttcc ctcagggcca gctctcaatg ttgcaagaaa aaatagacca tttggagcgt 180
ttgctagctg agaataatga gatcatctca aatattagag actcagtcat caatttgagt 240
gagtctgtgg aggatggtcc gaaaagttca caaagcaatt tcagccaagg tgctggctca 300
catcttctgc cctcacaatt atccctctca gttgacactg cagactgtct gtttgcttca 360
PL 222 219 B1
caaagtggaa gtcacaattc agatgtgcag atgttggatg tttacagtct aatttctttt 42Θ
gacaatccag atggtggagt ttggaagcaa ggatttgaca ttacttatga atctaatgaa 480
tgggacactg aaccccttca agtctttgtg gtgcctcatt cccataacga cccaggttgg 540
ttgaagactt tcaatgacta ctttagagac aagactcagt atatttttaa taacatggtc 600
ctaaagctga aagaagactc acggaggaag tttatttggt ctgagatctc ttacctttca 660
aagtggtggg atattataga tattcagaag aaggatgctg ttaaaagttt aatagaaaat 720
ggtcagcttg aaattgtgac aggtggctgg gttatgcctg atgaagctac tccacattat 780
tttgccttaa ttgatcaact aattgaagga catcagtggc tggaaaataa tataggagtg 840
aaacctcggt ccggctgggc tattgatccc tttggacact caccaacaat ggcttatctt 900
ctaaaccgtg ctggactttc tcacatgctt atccagagag ttcattatgc agttaaaaaa 960
cactttgcac tgcataaaac attggagttt ttttggagac agaattggga tctgggatct 1020
gtcacagata ttttatgcca catgatgccc ttctacagct atgacatccc tcacacttgt 1080
ggacctgatc ctaaaatatg ctgccagttt gattttaaac gtcttcctgg aggcagattt 1140
ggttgtccct ggggagtccc cccagaaaca atacatcctg gaaatgtcca aagcagggct 1200
cggatgctac tagatcagta ccgaaagaag tcaaagcttt ttcgtaccaa agttctcctg 1260
gctccactag gagatgattt ccgctactgt gaatacacgg aatgggattt acagtttaag 1320
aattatcagc agctttttga ttatatgaat tctcagtcca agtttaaagt taagatacag 1380
tttggaactt tatcagattt ttttgatgcg ctggataaag cagatgaaac tcagagagac 1440
aagggccagt cgatgttccc tgttttaagt ggagattttt tcacttatgc cgatcgagat 1500
gatcattact ggagtggcta ttttacatcc agaccctttt acaaacgaat ggacagaatc 1560
atggaatctc atttaagggc tgctgaaatt ctttactatt tcgccctgag acaagctcac 1620
aaatacaaga taaataaatt tctctcatca tcactttaca cggcactgac agaagccaga 1680
aggaatttgg gactgtttca acatcatgat gctatcacag gaactgcaaa agactgggtg 1740
gttgtggatt atggtaccag actttttcat tcgttaatgg ttttggagaa gataattgga 1800
aattctgcat ttcttcttat tttgaaggac aaactcacat acgactctta ctctcctgat 1860
accttcctgg agatggattt gaaacaaaaa tcacaagatt ctctgccaca aaaaaatata 1920
ataaggctga gtgcggagcc aaggtacctt gtggtctata atcctttaga acaagaccga 1980
PL 222 219 B1
atctcgttgg tctcagtcta tgtgagttcc ccgacagtgc aagtgttctc tgcttcagga 2040
aaacctgtgg aagttcaagt cagcgcagtt tgggatacag caaatactat ttcagaaaca 2100
gcctatgaga tctcttttcg agcacatata ccgccattgg gactgaaagt gtataagatt 2160
ttggaatcag caagttcaaa ttcacattta gctgattatg tcttgtataa gaataaagta 2220
gaagatagcg gaattttcac cataaagaat atgataaata ctgaagaagg tataacacta 2280
gagaactcct ttgttttact tcggtttgat caaactggac ttatgaagca aatgatgact 2340
aaagaagatg gtaaacacca tgaagtaaat gtgcaatttt catggtatgg aaccacaatt 2400
aaaagagaca aaagtggtgc ctacctcttc ttacctgatg gtaatgccaa gccttatgtt 2460
tacacaacac cgccctttgt cagagtgaca catggaagga tttattcgga agtgacttgc 2520
ttttttgacc atgttactca tagagtccga ctataccaca tacagggaat agaaggacag 2580
tctgtggaag tttccaatat tgtggacatc cgaaaagtat ataaccgtga gattgcaatg 2640
aaaatttctt ctgatataaa aagccaaaat agattttata ctgacctaaa tgggtaccag 2700
attcaaccta gaatgacact gagcaaattg cctcttcaag caaatgtcta tcccatgacc 2760
acaatggcct atatccagga tgccaaacat cgtttgacac tgctctctgc tcagtcttta 2820
ggggtttcga gtttgaatag tggtcagatt gaagttatca tggatcgaag actcatgcaa 2880
gatgataatc gtggccttga gcaaggtatc caggataaca agattacagc taatctattt 2940
cgaatactac tagaaaaaag aagtgctgtt aatacggaag aagaaaagaa gtcggtcagt 3000
tatccttctc tccttagcca cataacttct tctctcatga atcatccagt cattccaatg 3060
gcaaataagt tcttctcacc tacccttgag ctgcaaggtg aattctctcc attacagtca 3120
tctttgcctt gtgacattca tctggttaat ttgagaacaa tacagtcaaa ggtgggcaat 3180
gggcactcca atgaggcagc cttgatcctc cacagaaaag ggtttgattg tcggttctct 3240
agcaaaggca cagggctgtt ttgttctact actcagggaa agatattggt acagaaactt 3300
ttaaacaagt ttattgtcga aagtctcaca ccttcatcac tatccttgat gcattcacct 3360
cccggcactc agaatataag tgagatcaac ttgagtccaa tggaaatcag cacattccga 3420
atccagttga ggtga 3435
<210> 18
PL 222 219 B1 <211> 1144 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa Man II <400> 18
Met Lys Leu Sen Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys 15 10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp 20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu 35 40 45
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu 50 55 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser 65 70 75 80
Glu Ser Val Glu Asp Gly Pro Lys Ser Ser Gin Ser Asn Phe Ser Gin 85 90 95
Gly Ala Gly Ser His Leu Leu Pro Ser Gin Leu Ser Leu Ser Val Asp 100 105 11Θ
Thr Ala Asp Cys Leu Phe Ala Ser Gin Ser Gly Ser His Asn Ser Asp 115 120 125
Val Gin Met Leu Asp Val Tyr Ser Leu Ile Ser Phe Asp Asn Pro Asp 130 135 140
Gly Gly Val Trp Lys Gin Gly Phe Asp Ile Thr Tyr Glu Ser Asn Glu 145 150 155 160
Trp Asp Thr Glu Pro Leu Gin Val Phe Val Val Pro His Ser His Asn 165 170 175
PL 222 219 B1
PL 222 219 B1
385 390 395 400
Arg Met Leu Leu Asp Gin Tyr Arg Lys Lys Ser Lys Leu Phe Arg Thr 405 410 415
Lys Val Leu Leu Ala Pro Leu Gly Asp Asp Phe Arg Tyr Cys Glu Tyr 420 425 430
Thr Glu Trp Asp Leu Gin Phe Lys Asn Tyr Gin Gin Leu Phe Asp Tyr 435 440 445
Met Asn Ser Gin Ser Lys Phe Lys Val Lys Ile Gin Phe Gly Thr Leu 450 455 460
Ser Asp Phe Phe Asp Ala Leu Asp Lys Ala Asp Glu Thr Gin Arg Asp 465 470 475 480
Lys Gly Gin Ser Met Phe Pro Val Leu Ser Gly Asp Phe Phe Thr Tyr 485 490 495
Ala Asp Arg Asp Asp His Tyr Trp Ser Gly Tyr Phe Thr Ser Arg Pro 500 505 510
Phe Tyr Lys Arg Met Asp Arg Ile Met Glu Ser His Leu Arg Ala Ala 515 520 525
Glu Ile Leu Tyr Tyr Phe Ala Leu Arg Gin Ala His Lys Tyr Lys Ile 530 535 540
Asn Lys Phe Leu Ser Ser Ser Leu Tyr Thr Ala Leu Thr Glu Ala Arg 545 550 555 560
Arg Asn Leu Gly Leu Phe Gin His His Asp Ala Ile Thr Gly Thr Ala 565 570 575
Lys Asp Trp Val Val Val Asp Tyr Gly Thr Arg Leu Phe His Ser Leu 580 585 590
Met Val Leu Glu Lys Ile Ile Gly Asn Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu 595 600 605
PL 222 219 B1
Lys Asp Lys Leu Thr Tyr Asp Ser Tyr Ser Pro Asp Thr Phe Leu Glu 610 615 620
Met Asp Leu Lys Gin Lys Ser Gin Asp Ser Leu Pro Gin Lys Asn Ile 625 630 635 640
Ile Arg Leu Ser Ala Glu Pro Arg Tyr Leu Val Val Tyr Asn Pro Leu 645 650 655
Glu Gin Asp Arg Ile Ser Leu Val Ser Val Tyr Val Ser Ser Pro Thr 660 665 670
Val Gin Val Phe Ser Ala Ser Gly Lys Pro Val Glu Val Gin Val Ser 675 680 685
Ala Val Trp Asp Thr Ala Asn Thr Ile Ser Glu Thr Ala Tyr Glu Ile 690 695 700
Ser Phe Arg Ala His Ile Pro Pro Leu Gly Leu Lys Val Tyr Lys Ile 705 710 715 720
Leu Glu Ser Ala Ser Ser Asn Ser His Leu Ala Asp Tyr Val Leu Tyr 725 730 735
Lys Asn Lys Val Glu Asp Ser Gly Ile Phe Thr Ile Lys Asn Met Ile 740 745 750
Asn Thr Glu Glu Gly Ile Thr Leu Glu Asn Ser Phe Val Leu Leu Arg 755 760 765
Phe Asp Gin Thr Gly Leu Met Lys Gin Met Met Thr Lys Glu Asp Gly 770 775 780
Lys His His Glu Val Asn Val Gin Phe Ser Trp Tyr Gly Thr Thr Ile 785 790 795 800
Lys Arg Asp Lys Ser Gly Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asp Gly Asn Ala 805 810 815
PL 222 219 B1
Lys Pro Tyr Val 820 Tyr Thr Thr Pro Pro Phe Val Arg Val Thr His Gly
825 830
Arg Ile Tyr Ser Glu Val Thr Cys Phe Phe Asp His Val Thr His Arg
835 840 845
Val Arg Leu Tyr His Ile Gin Gly Ile Glu Gly Gin Ser Val Glu Val
850 855 860
Ser Asn Ile Val Asp Ile Arg Lys Val Tyr Asn Arg Glu Ile Ala Met
865 870 875 880
Lys Ile Ser Ser Asp Ile Lys Ser Gin Asn Arg Phe Tyr Thr Asp Leu
885 890 895
Asn Gly Tyr Gin Ile Gin Pro Arg Met Thr Leu Ser Lys Leu Pro Leu
900 905 910
Gin Ala Asn Val Tyr Pro Met Thr Thr Met Ala Tyr Ile Gin Asp Ala
915 920 925
Lys His Arg Leu Thr Leu Leu Ser Ala Gin Ser Leu Gly Val Ser Ser
930 935 940
Leu Asn Ser Gly Gin Ile Glu Val Ile Met Asp Arg Arg Leu Met Gin
945 950 955 960
Asp Asp Asn Arg Gly Leu Glu Gin Gly Ile Gin Asp Asn Lys Ile Thr
965 970 975
Ala Asn Leu Phe Arg Ile Leu Leu Glu Lys Arg Ser Ala Val Asn Thr
980 985 990
Glu Glu Glu Lys Lys Ser Val Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Ser His Ile 995 1000 1005
Thr Ser Ser Leu Met Asn His Pro Val Ile Pro Met Ala Asn Lys 1010 1015 1020
PL 222 219 B1
Phe Phe 1025 Ser Pro Thr Leu Glu 1030 Leu Gin Gly Glu Phe 1035 Ser Pro Leu
Gin Ser 1040 Ser Leu Pro Cys Asp 1045 Ile His Leu Val Asn 1050 Leu Arg Thr
Ile Gin 1055 Ser Lys Val Gly Asn 1060 Gly His Ser Asn Glu 1065 Ala Ala Leu
Ile Leu 1070 His Arg Lys Gly Phe 1075 Asp cys Arg Phe Ser 1080 Ser Lys Gly
Thr Gly 1085 Leu Phe Cys Ser Thr 1090 Thr Gin Gly Lys Ile 1095 Leu Val Gin
Lys Leu 1100 Leu Asn Lys Phe Ile 1105 Val Glu Ser Leu Thr 1110 Pro Ser Ser
Leu Ser 1115 Leu Met His Ser Pro 1120 Pro Gly Thr Gin Asn 1125 Ile Ser Glu
Ile Asn 1130 Leu Ser Pro Met Glu 1135 Ile Ser Thr Phe Arg 1140 Ile Gin Leu
Arg
<210> <211> <212> <213> 19 1116 DNA Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Sekwencja nukleotydowa Manll-GalT
<400> 19 atgaagttaa gccgccagtt caccgtgttc ggcagtgcga tcttctgtgt tcgctctacc tgatgctgga ccggggtcac ttagactacc ccaggaaccc ggctccttcc ctcagggcca gctctcaatg ttgcaagaaa aaatagacca ttgctagctg agaataatga gatcatctca aatattagag actcagtcat ggtgattttc gcgccgcgag tttggagcgt caatttgagt
120
180
240
PL 222 219 B1
gagtctgtgg aggatggtcc gaaaagttca caaagcaatt tcagccaagg tgctggctca 300
cccgcctgcc ctgaggagtc cccgctgctt gtgggcccca tgctgattga gtttaacatg 360
cctgtggacc tggagctcgt ggcaaagcag aacccaaatg tgaagatggg cggccgctat 420
gcccccaggg actgcgtctc tcctcacaag gtggccatca tcattccatt ccgcaaccgg 480
caggagcacc tcaagtactg gctatattat ttgcacccag tcctgcagcg ccagcagctg 540
gactatggca tctatgttat caaccaggcg ggagacacta tattcaatcg tgctaagctc 600
ctcaatgttg gctttcaaga agccttgaag gactatgact acacctgctt tgtgtttagt 660
gacgtggacc tcattccaat gaatgaccat aatgcgtaca ggtgtttttc acagccacgg 720
cacatttccg ttgcaatgga taagtttgga ttcagcctac cttatgttca gtattttgga 780
ggtgtctctg ctctaagtaa acaacagttt ctaaccatca atggatttcc taataattat 840
tggggctggg gaggagaaga tgatgacatt tttaacagat tagtttttag aggcatgtct 900
atatctcgcc caaatgctgt ggtcgggagg tgtcgcatga tccgccactc aagagacaaa 960
aaaaatgaac ccaatcctca gaggtttgac cgaattgcac acacaaagga gacaatgctc 1020
tctgatggtt tgaactcact cacctaccag gtgctggatg tacagagata cccattgtat 1080
acccaaatca cagtggacat cgggacaccg agctag 1116
<210> 20 <211> 371 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa Manll-GalT <400> 20
Met Lys Leu Ser Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys 15 10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp 20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu 35 40 45
PL 222 219 B1
PL 222 219 B1
260 265 270
Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp 275 280 285
Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro 290 295 300
Asn Ala Val Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys 305 310 315 320
Lys Asn Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys 325 330 335
Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gin Val Leu 340 345 350
Asp Val Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly 355 360 365
Thr Pro Ser 370 <210> 21 <211> 460 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej Gntlll <400> 21
Pro Leu Leu Gin Pro Leu Ser Pro Ser Lys Ala Thr Glu Glu Leu His 15 10 15
Arg Val Asp Phe Val Leu Pro Glu Asp Thr Thr Glu Tyr Phe Val Arg 20 25 30
Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro Gly Thr Arg Met Leu Glu 35 40 45
PL 222 219 B1
Lys Pro Ser Pro Gly Arg Thr Glu Glu Lys Thr Lys Val Ala Glu Gly 50 55 60
Ser Ser Val Arg Gly Pro Ala Arg Arg Pro Met Arg His Val Leu Ser 65 70 75 80
Ala Arg Glu Arg Leu Gly Gly Arg Gly Thr Arg Arg Lys Trp Val Glu 85 90 95
Cys Val Cys Leu Pro Gly Trp His Gly Pro Ser Cys Gly Val Pro Thr 100 105 110
Val Val Gin Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Lys Glu Arg Leu Val Pro Arg 115 120 125
Glu Val Pro Arg Arg Val Ile Asn Ala Ile Asn Ile Asn His Glu Phe 130 135 140
Asp Leu Leu Asp Val Arg Phe His Glu Leu Gly Asp Val Val Asp Ala 145 150 155 160
Phe Val Val Cys Glu Ser Asn Phe Thr Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Pro 165 17Θ 175
Leu Lys Phe Arg Glu Met Leu Thr Asn Gly Thr Phe Glu Tyr Ile Arg 180 185 190
His Lys Val Leu Tyr Val Phe Leu Asp His Phe Pro Pro Gly Gly Arg 195 200 205
Gin Asp Gly Trp Ile Ala Asp Asp Tyr Leu Arg Thr Phe Leu Thr Gin 210 215 220
Asp Gly Val Ser Arg Leu Arg Asn Leu Arg Pro Asp Asp Val Phe Ile 225 230 235 240
Ile Asp Asp Ala Asp Glu Ile Pro Ala Arg Asp Gly Val Leu Phe Leu 245 250 255
Lys Leu Tyr Asp Gly Trp Thr Glu Pro Phe Ala Phe His Met Arg Lys
PL 222 219 B1
270
260
265
Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Trp Lys Gin Pro Gly Thr Leu Glu Val Val 275 280 285
Ser Gly Cys Thr Ile Asp Met Leu Gin Ala Val Tyr Gly Leu Asp Gly 290 295 300
Ile Arg Leu Arg Arg Arg Gin Tyr Tyr Thr Met Pro Asn Phe Arg Gin 305 310 315 320
Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His Ile Leu Val Gin Trp Ser Leu Gly Ser 325 330 335
Pro Leu His Phe Ala Gly Trp His Cys Ser Trp Cys Phe Thr Pro Glu 340 345 350
Gly Ile Tyr Phe Lys Leu Val Ser Ala Gin Asn Gly Asp Phe Pro Arg 355 360 365
Trp Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Arg Asp Leu Asn Tyr Ile Arg Ser Leu 370 375 380
Ile Arg Thr Gly Gly Trp Phe Asp Gly Thr Gin Gin Glu Tyr Pro Pro 385 390 395 400
Ala Asp Pro Ser Glu His Met Tyr Ala Pro Lys Tyr Leu Leu Lys Asn 405 410 415
Tyr Asp Gin Phe Arg Tyr Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Arg Glu Pro Lys 420 425 430
Ser Thr Val Glu Gly Gly Arg Arg Asn Gin Gly Ser Asp Gly Arg Ser 435 440 445
Ser Ala Val Arg Gly Lys Leu Asp Thr Thr Glu Gly 450 455 460 <210> 22
PL 222 219 B1 <211> 271 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej GalT <400> 22
Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro 1 5
Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile 10 15
Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu 20
Glu Leu Val Ala Lys Gin Asn Pro 25 30
Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr 35 40
Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro 45
His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro 50 55
Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu 60
Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His 65 70
Pro Val Leu Gin Arg Gin Gin Leu 75 80
Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn 85
Gin Ala Gly Asp Thr Ile Phe Asn 90 95
Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly 100
Phe Gin Glu Ala Leu Lys Asp Tyr 105 11Θ
Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser 115 120
Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn 125
Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe 130 135
Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Val 140
Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser 145 150
Leu Pro Tyr Val Gin Tyr Phe Gly 155 160
Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin 165
Gin Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe 170 175
PL 222 219 B1
Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn 180 185 190
Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val 195 200 205
Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro 210 215 220
Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu 225 230 235 240
Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg 245 250 255
Tyr Pro Leu Tyr Thr Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 260 265 270
<210> 23
<211> 100
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> Sekwencja aminokwasowa domeny lokalizacji Man II w aparacie Golgiego
<400> 23
Met Lys Leu Ser . Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys
10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp 20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu 35 40 45
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu 50 55 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser 65 70 75 80
PL 222 219 B1
Glu Ser Val Glu Asp Gly Pro Lys Ser Ser Gin Ser Asn Phe Ser Gin 85 90 95
Gly Ala Gly Ser 100 <210> 24 <211> 102 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny lokalizacji GntI w aparacie Golgiego <400> 24
Met Leu Lys Lys Gin Ser Ala Gly Leu Val Leu Trp Gly Ala Ile Leu
10 15
Phe Val Ala Trp Asn Ala Leu Leu Leu Leu Phe Phe Trp Thr Arg Pro 20 25 30
Ala Pro Gly Arg Pro Pro Ser Val Ser Ala Leu Asp Gly Asp Pro Ala 35 40 45
Ser Leu Thr Arg Glu Val Ile Arg Leu Ala Gin Asp Ala Glu Val Glu 50 55 60
Leu Glu Arg Gin Arg Gly Leu Leu Gin Gin Ile Gly Asp Ala Leu Ser 65 70 75 80
Ser Gin Arg Gly Arg Val Pro Thr Ala Ala Pro Pro Ala Gin Pro Arg 85 90 95
Val Pro Val Thr Pro Ala 100
PL 222 219 B1

Claims (25)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera:
    (a) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT), przy czym fuzja poiipeptydowa obejmuje domenę katalityczną GalT i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego e(1,2)-N-acetylogiukozcaminylotransferazy I (GnTI) lub mannozydazy II (Manii), przy czym domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR:22,z konserwatywnymi podstawieniami aminckwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR:24, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR: 23, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi;
    (b) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący polipeptyd mający aktywność Man II, przy czym polipeptyd mający aktywność Manii obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR:18, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi; i (c) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza, który jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki pełnego przeciwciała, fragmentu przeciwciała, fuzji białkowej i który obejmuje region Fc ludzkiej IgG;
    przy czym fuzja poiipeptydowa i polipeptyd mający aktywność Man II są wyrażane w ilości w ystarczającej do modyfikowania oiigosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez tę komórkę gospodarza.
  2. 2. Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że domena katalityczna GaJ.T obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR: 22, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową, co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR:24, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje se kwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR: 23, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, i przy czym polipeptyd mający aktywność Manii obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową SEK. ID. NR:18, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
  3. 3. Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. ID. NR:22, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. ID. NR: 24, domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. ID. NR: 23, i przy czym polipeptyd mający aktywność Man II obejmuje sekwencję aminokwasową SEK. ID. NR: 18.
  4. 4. Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową mającą aktywność Gall obejmuje sekwencję nukleotydową SEK ID Nr: 19.
  5. 5. Komórka gospodarza według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienna tym, że polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza wykazuje w wyniku modyfikacji zwiększone powinowactwo wiązania z receptorem Fc.
  6. 6. Komórka gospodarza według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienna tym, że polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza wykazuje zwiększoną funkcję efektorową w wyniku tej modyfikacji.
  7. 7. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc.
    PL 222 219 B1
  8. 8. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone wiązanie się z komórkami NK.
  9. 9. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone wiązanie się z makrofagami.
  10. 10. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest komórkami wielojądrzastymi.
  11. 11. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone monocytami.
  12. 12. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnału indukującego apoptozę.
  13. 13. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych.
  14. 14. Komórka gospodarza według zastrz. 6, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone piętnowanie komórek T.
  15. 15. Sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza, znamienny tym, że obejmuje:
    a. hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 1-4 w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie tego polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, przy czym fuzja polipeptydowa jest wyrażana w ilości dostatecznej do modyfikacji oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza; i
    b. izolowanie takiego polipeptydu wytwarzanego przez tę komórkę gospodarza.
  16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienna tym, że domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji Man II.
  17. 17. Sposób według zastrz. 15, znamienna tym, że domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji GnTI.
  18. 18. Sposób według zastrz. 15, znamienna tym, że polipeptyd ma zwiększoną funkcję efektorową w wyniku modyfikacji.
  19. 19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza ma zwiększony udział przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu.
  20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że przecięte, niefukozylowane oligosacharydy są hybrydowe.
  21. 21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że takie przecięte, niefukozylowane oligosacharydy są złożone.
  22. 22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że co najmniej 20% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu jest przeciętych, niefukozylowanych.
  23. 23. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że co najmniej 25% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu jesz przeciętych, niefukozylowanych.
  24. 24. Sposob według zastrz. 19, znamienny tym, że co najmniej 30% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu jest przeciętych, niefukozylowanych.
  25. 25. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że co najmniej 35% cligosacharydow w regionie Fc takiego polipeptydu jest przeciętych, niefukozylowanych.
PL393641A 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza PL222219B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44130703P 2003-01-22 2003-01-22
US49125403P 2003-07-31 2003-07-31
US49514203P 2003-08-15 2003-08-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL393641A1 PL393641A1 (pl) 2011-06-06
PL222219B1 true PL222219B1 (pl) 2016-07-29

Family

ID=32777012

Family Applications (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL377967A PL224786B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, komórki gospodarza, fuzja polipeptydowa i sposób jej wytwarzania, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza
PL393641A PL222219B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL415463A PL224787B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego
PL393645A PL222206B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393647A PL222221B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393644A PL222220B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393646A PL222222B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Sposób wytwarzania polipeptydu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL377967A PL224786B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, komórki gospodarza, fuzja polipeptydowa i sposób jej wytwarzania, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza

Family Applications After (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL415463A PL224787B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego
PL393645A PL222206B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393647A PL222221B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393644A PL222220B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393646A PL222222B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Sposób wytwarzania polipeptydu

Country Status (19)

Country Link
US (2) US8367374B2 (pl)
EP (4) EP2264152B1 (pl)
JP (4) JP5425365B2 (pl)
KR (2) KR101498588B1 (pl)
CN (1) CN103540600B (pl)
AT (1) ATE475708T1 (pl)
AU (2) AU2004205802B2 (pl)
CA (1) CA2513797C (pl)
CZ (1) CZ308720B6 (pl)
DE (1) DE602004028337D1 (pl)
ES (3) ES2542885T3 (pl)
HK (1) HK1089205A1 (pl)
IL (2) IL169805A (pl)
MX (1) MXPA05007781A (pl)
NO (1) NO339270B1 (pl)
NZ (5) NZ603037A (pl)
PL (7) PL224786B1 (pl)
SG (2) SG179292A1 (pl)
WO (1) WO2004065540A2 (pl)

Families Citing this family (225)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
JP3528611B2 (ja) * 1998-07-16 2004-05-17 Ｊｆｅスチール株式会社 結束材の切断方法及びその装置
WO2003011878A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
PL224786B1 (pl) 2003-01-22 2017-01-31 Glycart Biotechnology Ag Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, komórki gospodarza, fuzja polipeptydowa i sposób jej wytwarzania, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza
EP1614693A4 (en) * 2003-03-31 2006-07-19 Kirin Brewery PURIFICATION OF A HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY AND A HUMAN POLYCLONAL ANTIBODY
SI2380911T1 (en) 2003-11-05 2018-07-31 Roche Glycart Ag ANTIGEN-RELATED PATIENTS WITH INCREASED ATTENTION ON THE RECEPTOR FC AND EFFECTORAL FUNCTION
TW200539855A (en) * 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
US20060045877A1 (en) * 2004-08-30 2006-03-02 Goldmakher Viktor S Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
AU2006211037B2 (en) 2005-02-07 2012-05-24 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
SG170006A1 (en) * 2005-02-18 2011-04-29 Medarex Inc Monoclonal antibodies against cd30 lacking fucosyl residues
US20060223096A1 (en) * 2005-03-25 2006-10-05 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules directed to MCSP and having increased Fc receptor binding affinity and effector function
MX2007013924A (es) * 2005-05-09 2008-01-28 Glycart Biotechnology Ag Moleculas que unen antigeno que tienen regiones fc modificadas y union alterada a receptores fc.
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
ES2530265T3 (es) 2005-07-21 2015-02-27 Genmab A/S Ensayos de potencia de unión de una sustancia medicamentosa de anticuerpo a un receptor FC
NO345919B1 (no) 2005-08-26 2021-10-18 Roche Glycart Ag Modifiserte antigen-bindende molekyler med endret celle-signaliseringsaktivitet
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
WO2008060645A2 (en) * 2006-03-21 2008-05-22 Genentech, Inc. Combinatorial therapy involving alpha5beta1 antagonists
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
US20100166741A1 (en) * 2006-07-13 2010-07-01 Genentech , Inc. Altered br-3 binding polypeptides
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
NZ576855A (en) 2006-10-12 2012-08-31 Forerunner Pharma Res Co Ltd Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
RU2479629C2 (ru) * 2007-03-07 2013-04-20 Гликофи, Инк. Продукция гликопротеинов с модифицированным фукозилированием
EP1995309A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
CA2795379A1 (en) 2007-06-15 2008-12-18 Centre National De La Recherche Scientifique Modifying glycoprotein production in plants
US8940298B2 (en) 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
MX2010002406A (es) 2007-09-05 2010-04-27 Hoffmann La Roche Terapia de combinacion con anticuerpos anti-cd20 de tipo i y de tipo ii.
PL2195017T3 (pl) 2007-10-01 2015-03-31 Bristol Myers Squibb Co Ludzkie antyciała, które wiążą mezotelinę i ich zastosowania
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
WO2009086072A2 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
DK2242772T3 (en) * 2007-12-26 2015-01-05 Biotest Ag Immunoconjugates that targets CD138, and uses thereof
BRPI0821447A2 (pt) * 2007-12-26 2015-06-16 Biotest Ag Anticorpo de alvejamento engenheirado, composição farmacêutica, hibridoma, ensaio com base em anticorpo, polipeptídeo isolado, e, método para ligação homogênea
JP2011508738A (ja) * 2007-12-26 2011-03-17 バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト Ｃｄ１３８発現腫瘍細胞のターゲティングを向上させる方法及び剤
EP2238169A1 (en) * 2007-12-26 2010-10-13 Biotest AG Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
AU2009204974A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Afucosylated antibodies against CCR5 and their use
KR101054362B1 (ko) * 2008-07-03 2011-08-05 재단법인 목암생명공학연구소 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법
CA2730668C (en) 2008-07-18 2020-04-28 Medicago Inc. New influenza virus immunizing epitope
WO2010048588A2 (en) * 2008-10-23 2010-04-29 Massachusetts Institute Of Technology Directed engagement of activating fc receptors
ES2712732T3 (es) 2009-02-17 2019-05-14 Cornell Res Foundation Inc Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
JP2012518680A (ja) 2009-03-31 2012-08-16 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト ヒト化抗ＥＧＦＲＩｇＧ１抗体及びイリノテカンによる癌の処置
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
CA2757531A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
JP5612663B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-22 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ＥｒｂＢ−１／抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
CA2757931C (en) 2009-04-07 2019-03-26 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
NZ613647A (en) * 2009-05-06 2015-02-27 Biotest Ag Uses of immunoconjugates targeting cd138
JP5719354B2 (ja) 2009-05-27 2015-05-20 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三重又は四重特異性抗体
WO2010137654A1 (ja) 2009-05-29 2010-12-02 株式会社未来創薬研究所 Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
NZ597325A (en) 2009-08-14 2014-03-28 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with fludarabine and/or mitoxantrone
TWI412375B (zh) 2009-08-28 2013-10-21 Roche Glycart Ag 人類化抗ｃｄｃｐ１抗體
TW201113037A (en) 2009-08-28 2011-04-16 Hoffmann La Roche Antibodies against CDCP1 for the treatment of cancer
RU2570554C2 (ru) 2009-08-31 2015-12-10 Роше Гликарт Аг Гуманизированные моноклональные антитела к сеа с созревшей аффинностью
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
SG179196A1 (en) 2009-09-16 2012-04-27 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
KR101860175B1 (ko) 2009-10-26 2018-05-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
CN102753194B (zh) 2009-12-02 2015-07-08 伊麦吉纳博公司 靶向人前列腺特异性膜抗原的j591微抗体和双抗体
HUE029026T2 (en) 2009-12-22 2017-01-30 Roche Glycart Ag Anti-HER3 antibodies and their applications
CN102686241A (zh) 2009-12-29 2012-09-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗体配制剂
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CN102844049B (zh) 2010-04-27 2016-06-01 罗切格利卡特公司 无岩藻糖基化CD20抗体与mTOR抑制剂的联合疗法
US20120100166A1 (en) 2010-07-15 2012-04-26 Zyngenia, Inc. Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
BR112013002535A2 (pt) 2010-08-03 2019-09-24 Hoffmann La Roche biomarcadores de leucemia linfocítica crônica (cll)
PT2603530T (pt) 2010-08-13 2018-01-09 Roche Glycart Ag Anticorpos anti-fap e métodos de utilização
WO2012020038A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Roche Glycart Ag Anti-tenascin-c a2 antibodies and methods of use
AR082693A1 (es) 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
CA2819436A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mdm2 inhibitor
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
JPWO2012105699A1 (ja) * 2011-02-03 2014-07-03 株式会社イーベック 補体依存性生物活性の高い抗体の産生法
SI3489255T1 (sl) 2011-02-10 2021-11-30 Roche Glycart Ag Mutantni polipeptidi interlevkina-2
US20120258073A1 (en) 2011-02-10 2012-10-11 Christian Gerdes Immunotherapy
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
JP5764677B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-19 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗原結合タンパク質
DK2681244T3 (da) * 2011-03-02 2018-01-29 Roche Glycart Ag Cea-antistoffer
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
DK2714738T3 (en) 2011-05-24 2019-01-28 Zyngenia Inc MULTIVALENT AND MONOVALENT MULTISPECIFIC COMPLEXES AND THEIR APPLICATIONS
FR2976811A1 (fr) 2011-06-22 2012-12-28 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un anticorps anti-cd20 a haute adcc pour le traitement de la maladie de waldenstrom
JP2014534806A (ja) 2011-08-23 2014-12-25 ロシュ グリクアート アーゲー 抗ｍｃｓｐ抗体
MY171038A (en) 2011-08-23 2019-09-23 Roche Glycart Ag Bispecific antigen binding molecules
EP2758435A1 (en) 2011-09-23 2014-07-30 Roche Glycart AG Bispecific anti-egfr/anti igf-1r antibodies
CN103890002A (zh) 2011-10-19 2014-06-25 罗切格利卡特公司 岩藻糖基化抗体的分离方法
US20130302274A1 (en) 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
US10117932B2 (en) 2011-12-08 2018-11-06 Biotest Ag Uses of immunoconjugates targeting CD138
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
WO2013113641A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Roche Glycart Ag Use of nkp46 as a predictive biomarker for cancer treatment with adcc- enhanced antibodies
BR112014019579A2 (pt) 2012-02-10 2019-10-15 Genentech, Inc Anticorpo de cadeia única, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo de cadeia única, heteromultímero e método de produção do heteromultímero
BR112014018374A8 (pt) 2012-03-02 2017-07-11 Roche Glycart Ag Método para predizer a resposta d eum paciente com câncer, kit, anticorpo, método para o tratamento do câncer e composição farmacêutica
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
WO2013174927A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Novartis International Pharmaceutical Limited Production of fucosylated glycoproteins
MX2014014162A (es) 2012-05-24 2015-02-04 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecificos.
CN107964042B (zh) 2012-05-30 2022-04-19 中外制药株式会社 靶组织特异性抗原结合分子
CA2871880A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
EP2874658A1 (en) * 2012-07-18 2015-05-27 Glycotope GmbH Novel therapeutic treatments with anti-her2 antibodies having a low fucosylation
EP3434695B1 (en) 2012-08-07 2020-12-02 Roche Glycart AG Improved immunotherapy
EP2912060B1 (en) 2012-10-29 2019-12-25 The University of North Carolina at Chapel Hill Compositions and methods for inhibiting pathogen infection
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
US20150259430A1 (en) 2012-11-05 2015-09-17 Mab Discovery Gmbh Method for the production of multispecific antibodies
EP3557260B1 (en) 2012-12-21 2022-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
US9180185B2 (en) 2013-01-11 2015-11-10 Hoffman-La Roche Inc. Combination therapy of anti-HER3 antibodies
WO2014114595A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Roche Glycart Ag Predictive biomarker for cancer treatment with adcc-enhanced antibodies
EP2953972B1 (en) 2013-02-05 2020-07-08 EngMab Sàrl Method for the selection of antibodies against bcma
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
CA2896259A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
MY185551A (en) 2013-03-13 2021-05-19 Genentech Inc Antibody formulations
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
US20160159919A1 (en) 2013-06-24 2016-06-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic Agent Comprising Humanized Anti-Epiregulin Antibody as Active Ingredient for Non-Small-Cell Lung Carcinoma Excluding Adenocarcinoma
KR20160044060A (ko) 2013-10-11 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체
WO2015082446A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-cdcp1 antibody and a taxane
KR102284503B1 (ko) 2013-12-04 2021-07-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 화합물의 농도에 따라 항원 결합능이 변화되는 항원 결합 분자 및 그의 라이브러리
BR112016013741A2 (pt) 2013-12-17 2017-10-03 Genentech Inc Usos de antagonistas de ligação de eixo de pd-1 e um anticorpo de anti-cd20, e kit compreendendo os mesmos
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
AR100353A1 (es) 2014-05-08 2016-09-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Droga de direccionamiento a glipicano 3 (gpc3) que se administra a un paciente que responde a la terapia con drogas de direccionamiento a gpc3
JP7093612B2 (ja) * 2014-05-27 2022-06-30 アカデミア シニカ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のフコシダーゼおよびそれを使用する方法
PT3148581T (pt) 2014-05-30 2020-01-06 Henlix Biotech Co Ltd Anticorpos antirrecetor do fator de crescimento epidérmico (egfr)
CA2954974A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
AU2015318001B2 (en) 2014-09-15 2021-03-25 Genentech, Inc. Antibody formulations
PL3262071T3 (pl) 2014-09-23 2020-08-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposób stosowania immunokoniugatów anty-CD79b
EP4141032A1 (en) 2014-11-20 2023-03-01 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
CA2984794A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
EP3936524A3 (en) 2015-05-11 2022-06-15 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
EP3313887A2 (en) 2015-06-26 2018-05-02 MAB Discovery GmbH Monoclonal anti-il-1racp antibodies
JP2018520153A (ja) 2015-06-29 2018-07-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 臓器移植における使用のためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
CA2992797A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Engmab Sarl Monoclonal antibodies against bcma
US11254744B2 (en) 2015-08-07 2022-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
MX2018003533A (es) 2015-09-24 2019-04-25 Abvitro Llc Composiciones de anticuerpo de virus de inmunodeficiencia humana (vih) y metodos de uso.
WO2017097723A2 (en) 2015-12-09 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment method
WO2017148880A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Obinutuzumab variants having altered cell death induction
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
WO2017194441A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified anti-tenascin antibodies and methods of use
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3257866A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 Academisch Medisch Centrum Modified anti-tnf antibody and use thereof in the treatment of ibd
EP3535295A1 (en) 2016-11-02 2019-09-11 EngMab Sàrl Bispecific antibody against bcma and cd3 and an immunological drug for combined use in treating multiple myeloma
PE20190921A1 (es) 2016-12-07 2019-06-26 Agenus Inc Anticuerpos y metodos de su utilizacion
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
WO2018184966A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to steap-1
DK3606954T3 (en) 2017-04-05 2022-09-26 Hoffmann La Roche Anti-LAG3-antistoffer
CA3059468A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Tesaro, Inc. Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
JP2020521791A (ja) 2017-06-02 2020-07-27 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんの治療のためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体及び抗ｃｄ２０／ｃｄ３０二重特異性抗体
CN110869391A (zh) 2017-07-26 2020-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 用BET抑制剂,Bcl-2抑制剂和抗CD20抗体的组合疗法
JP7437301B2 (ja) 2017-08-25 2024-02-22 ファイヴ プライム セラピューティクス インク Ｂ７－ｈ４抗体及びその使用方法
US11674125B2 (en) * 2017-12-18 2023-06-13 The General Hospital Corporation Glycoengineering
TWI805665B (zh) 2017-12-21 2023-06-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合hla-a2/wt1之抗體
EP3731865A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 F. Hoffmann-La Roche AG Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
EP3755719A1 (en) 2018-02-21 2020-12-30 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-h4 antibody dosing regimens
CA3091174A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-h4 antibody formulations
SG11202008105RA (en) 2018-03-02 2020-09-29 Five Prime Therapeutics Inc B7-h4 antibodies and methods of use thereof
EP3775184A1 (en) 2018-03-29 2021-02-17 F. Hoffmann-La Roche AG Modulating lactogenic activity in mammalian cells
CN112566938A (zh) 2018-06-03 2021-03-26 拉姆卡普生物测试有限公司 针对ceacam5和cd47的双特异性抗体
AU2019343952A1 (en) 2018-09-21 2021-04-22 Mucommune, Llc Synthetic binding agents for limiting permeation through mucus
CA3114955A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Five Prime Therapeutics, Inc. Combination therapy for cancer
KR20210100668A (ko) 2018-12-06 2021-08-17 제넨테크, 인크. 항-CD79b 면역접합체, 알킬화제 및 항-CD20 항체를 포함하는 미만성 큰 B-세포 림프종의 조합 요법
CN113621062A (zh) 2018-12-21 2021-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 与cd3结合的抗体
US11130804B2 (en) 2018-12-21 2021-09-28 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody that binds to VEGF and IL-1beta and methods of use
CN113613676A (zh) 2019-03-19 2021-11-05 中外制药株式会社 包含对抗原的结合活性因mta而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子及用于获得该抗原结合结构域的文库
KR20220007136A (ko) 2019-05-14 2022-01-18 제넨테크, 인크. 소포 림프종을 치료하기 위한 항-CD79b 면역접합체의 사용 방법
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
EP4004045A1 (en) 2019-07-31 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to gprc5d
AU2020323686B2 (en) 2019-07-31 2024-03-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to GPRC5D
EP4028054A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
CN114423791A (zh) 2019-09-18 2022-04-29 豪夫迈·罗氏有限公司 抗klk7抗体、抗klk5抗体、多特异性抗klk5/klk7抗体及使用方法
EP4045090A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
EP4076666A1 (en) 2019-12-18 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to hla-a2/mage-a4
CN115315446A (zh) 2020-03-06 2022-11-08 Go医疗股份有限公司 抗糖-cd44抗体及其用途
EP4127153A2 (en) 2020-03-26 2023-02-08 Genentech, Inc. Modified mammalian cells having reduced host cell proteins
KR20230005903A (ko) 2020-04-24 2023-01-10 제넨테크, 인크. 항-CD79b 면역접합체를 사용하는 방법
MX2022014422A (es) 2020-05-17 2022-12-07 Astrazeneca Uk Ltd Anticuerpos contra el sars-cov-2 y metodos de seleccion y uso de los mismos.
CN115697489A (zh) 2020-06-08 2023-02-03 豪夫迈·罗氏有限公司 抗hbv抗体及其使用方法
MX2022016069A (es) 2020-06-19 2023-02-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y cd19.
AR122656A1 (es) 2020-06-19 2022-09-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 / folr1
PE20230835A1 (es) 2020-06-19 2023-05-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
WO2021262783A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
PE20230434A1 (es) 2020-07-10 2023-03-08 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a celulas cancerosas y dirigen radionucleotidos a dichas celulas
CN116406377A (zh) 2020-07-17 2023-07-07 基因泰克公司 抗notch2抗体及其使用方法
US20220041694A1 (en) 2020-08-10 2022-02-10 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies for treatment and prevention of covid-19
CN116648507A (zh) 2020-08-28 2023-08-25 基因泰克公司 宿主细胞蛋白的CRISPR/Cas9多重敲除
KR20230061458A (ko) 2020-09-04 2023-05-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 Vegf-a 및 ang2에 결합하는 항체 및 사용 방법
JP2023545566A (ja) 2020-10-20 2023-10-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－１軸結合アンタゴニストとｌｒｒｋ２阻害剤との併用療法
TW202233671A (zh) 2020-10-20 2022-09-01 美商建南德克公司 Ｐｅｇ結合抗ｍｅｒｔｋ抗體及其使用方法
US20240082437A1 (en) 2021-01-12 2024-03-14 Hoffmann-La Roche Inc. Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
EP4277668A1 (en) 2021-01-13 2023-11-22 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
EP4301782A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
AR125074A1 (es) 2021-03-12 2023-06-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-klk7, anticuerpos anti-klk5, anticuerpos multiespecíficos anti-klk5 / klk7 y métodos de uso
WO2022198192A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
CA3215965A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Amy Shen Modified mammalian cells
JP2024514281A (ja) 2021-04-23 2024-04-01 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｎｋ細胞係合剤関連の有害作用の防止または軽減
TW202244059A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
CA3213632A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
EP4337266A1 (en) 2021-05-12 2024-03-20 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
WO2022246259A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Genentech, Inc. Modified cells for the production of a recombinant product of interest
EP4351582A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 F. Hoffmann-La Roche AG Combination of a particular braf inhibitor (paradox breaker) and a pd-1 axis binding antagonist for use in the treatment of cancer
WO2023288182A1 (en) 2021-07-12 2023-01-19 Genentech, Inc. Structures for reducing antibody-lipase binding
AU2022310847A1 (en) 2021-07-14 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies and methods of use
WO2023001884A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
CN117794953A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗体及使用方法
AU2022324456A1 (en) 2021-08-05 2024-02-15 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
US20230099756A1 (en) 2021-08-07 2023-03-30 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
CA3230934A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
CA3230933A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
WO2023094569A1 (en) 2021-11-26 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
US20230322958A1 (en) 2022-01-19 2023-10-12 Genentech, Inc. Anti-Notch2 Antibodies and Conjugates and Methods of Use
US20230414750A1 (en) 2022-03-23 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023201299A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
WO2023198727A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
WO2023209177A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
WO2023217933A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf-a and il6 and methods of use
WO2024077239A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO1996040210A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US6180320B1 (en) 1998-03-09 2001-01-30 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Method of manufacturing a semiconductor device having a fine pattern, and semiconductor device manufactured thereby
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
BR0014945A (pt) * 1999-10-21 2004-08-31 Monsanto Co Modificação pós-traducional de proteìnas recombinantes produzidas em plantas
CA2389217C (en) * 1999-10-26 2016-12-06 Plant Research International B.V. Mammalian-type glycosylation in plants
MXPA03000105A (es) 2000-06-28 2004-09-13 Glycofi Inc Metodo para producir glicoproteinas modificadas.
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
WO2002079255A1 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
NZ546945A (en) * 2002-03-19 2008-04-30 Plant Res Int Bv A plant host cell system for the expression of human GnTIII
PL224786B1 (pl) * 2003-01-22 2017-01-31 Glycart Biotechnology Ag Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, komórki gospodarza, fuzja polipeptydowa i sposób jej wytwarzania, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza

Also Published As

Publication number Publication date
PL222222B1 (pl) 2016-07-29
JP2006516893A (ja) 2006-07-13
HK1089205A1 (zh) 2006-11-24
KR101292000B1 (ko) 2013-08-01
PL393644A1 (pl) 2011-06-06
EP2264152B1 (en) 2015-05-20
EP1587921A2 (en) 2005-10-26
NO20053872D0 (no) 2005-08-18
NO339270B1 (no) 2016-11-21
KR20130048269A (ko) 2013-05-09
PL224786B1 (pl) 2017-01-31
ES2542885T3 (es) 2015-08-12
CA2513797C (en) 2016-05-03
JP5425365B2 (ja) 2014-02-26
JP2013233151A (ja) 2013-11-21
PL393646A1 (pl) 2011-06-06
AU2010200408B2 (en) 2012-05-17
NZ567320A (en) 2009-11-27
JP2015142590A (ja) 2015-08-06
WO2004065540A2 (en) 2004-08-05
CN103540600B (zh) 2017-12-01
CA2513797A1 (en) 2004-08-05
ES2574993T3 (es) 2016-06-23
IL169805A (en) 2013-11-28
JP2010233578A (ja) 2010-10-21
PL393645A1 (pl) 2011-06-06
CZ2005490A3 (cs) 2006-02-15
EP2248892A3 (en) 2011-03-16
US8859234B2 (en) 2014-10-14
ES2543734T3 (es) 2015-08-21
EP2264152A2 (en) 2010-12-22
EP2264151A2 (en) 2010-12-22
US20140073005A1 (en) 2014-03-13
EP2264152A3 (en) 2011-05-18
CN103540600A (zh) 2014-01-29
AU2004205802B2 (en) 2009-11-05
NZ591970A (en) 2012-11-30
KR101498588B1 (ko) 2015-03-05
NZ582315A (en) 2011-01-28
EP1587921B1 (en) 2010-07-28
ATE475708T1 (de) 2010-08-15
IL203402A (en) 2016-05-31
PL393647A1 (pl) 2011-06-06
CZ308720B6 (cs) 2021-03-24
AU2004205802A1 (en) 2004-08-05
DE602004028337D1 (de) 2010-09-09
US8367374B2 (en) 2013-02-05
NZ603037A (en) 2014-05-30
PL393641A1 (pl) 2011-06-06
US20040241817A1 (en) 2004-12-02
EP2264151B1 (en) 2016-04-20
AU2010200408A1 (en) 2010-02-25
PL415463A1 (pl) 2016-04-25
PL222221B1 (pl) 2016-07-29
NO20053872L (no) 2005-10-21
SG179292A1 (en) 2012-04-27
WO2004065540A3 (en) 2005-03-24
SG2013005590A (en) 2015-06-29
AU2010200408C1 (en) 2012-11-01
MXPA05007781A (es) 2005-09-30
PL377967A1 (pl) 2006-02-20
EP2248892B1 (en) 2015-04-22
EP2264151A3 (en) 2012-10-03
PL222220B1 (pl) 2016-07-29
EP2248892A2 (en) 2010-11-10
JP5953271B2 (ja) 2016-07-20
KR20050095867A (ko) 2005-10-04
NZ541503A (en) 2008-09-26
PL222206B1 (pl) 2016-07-29
PL224787B1 (pl) 2017-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2513797C (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
ES2349777T3 (es) Constructos de fusión y uso de los mismos para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de fc y función efectora.
RU2623167C2 (ru) КОНСТРУКЦИИ СЛИЯНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ С ПОВЫШЕННЫМИ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
AU2012213963B2 (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function