PL224787B1 - Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego - Google Patents

Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego

Info

Publication number
PL224787B1
PL224787B1 PL415463A PL41546304A PL224787B1 PL 224787 B1 PL224787 B1 PL 224787B1 PL 415463 A PL415463 A PL 415463A PL 41546304 A PL41546304 A PL 41546304A PL 224787 B1 PL224787 B1 PL 224787B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
antibody
polypeptide
nucleic acid
amino acid
Prior art date
Application number
PL415463A
Other languages
English (en)
Other versions
PL415463A1 (pl
Inventor
Pablo Umana
Peter Bruenker
Claudia Ferrara
Tobias Suter
Original Assignee
Roche Glycart Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Glycart Ag filed Critical Roche Glycart Ag
Publication of PL415463A1 publication Critical patent/PL415463A1/pl
Publication of PL224787B1 publication Critical patent/PL224787B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01038—Beta-N-acetylglucosaminylglycopeptide beta-1,4-galactosyltransferase (2.4.1.38)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01094—Protein N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.94)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01114—2-Coumarate O-beta-glucosyltransferase (2.4.1.114)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01144—Beta-1,4-mannosyl-glycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.144)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01024—Alpha-mannosidase (3.2.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01114—Mannosyl-oligosaccharide 1,3-1,6-alpha-mannosidase (3.2.1.114)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/05—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a GOLGI retention signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01024—1,4-Alpha-glucan 6-alpha-glucosyltransferase (2.4.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01096—Hexosyltransferases (2.4.1) sn-Glycerol-3-phosphate 1-galactosyltransferase (2.4.1.96)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji i wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego.
Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny manipulacji glikozylacją białek. Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczek kwasu nukleinowego, włączając w to konstrukty fuzyjne mające aktywność katalityczną i ich zastosowania w manipulacji glikozylacją komórek gospodarzy w celu wytworzenia polipeptydów o zwiększonych właściwościach terapeutycznych, włączając w to przeciwciała o zwiększonym powinowactwie wiązania się z receptorem Fc i zwiększonych funkcjach efektorowych.
Tło wynalazku
Glikoproteiny pośredniczą w wielu istotnych funkcjach u ludzi, w innych organizmach eukariotycznych i niektórych prokariotycznych, włączając w to katalizę, przekazywanie sygnałów, komunik ację międzykomórkową oraz rozpoznawanie i asocjację cząsteczek. Stanowią one większość niecyt osolowych białek w organizmach eukariotycznych. (Lis i wsp., Eur. J Biochem. 218; 1-27 (1993)). Wiele glikoprotein jest wykorzystywanych do celów terapeutycznych i w czasie ostatnich dwóch dziesięcioleci zrekombinowane wersje występujących naturalnie, wydzielanych glikoprotein było głównym produktem przemysłu biotechnologicznego. Przykłady obejmują erytropoetynę (EPO), terapeutyczne przeciwciała monoklonalne (terapeutyczne mAb), aktywator tkankowy plazminogenu (tPA), interferon-β (IFN-β), czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów (GM-CSF) i ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG). (Cumming i wsp., Glycobiology 1: 115-130 (1991)).
Składnik oligosacharydowy może znacząco wpływać na właściwości związane ze skutecznością terapeutycznej glikoproteiny, włączając w to stabilność fizyczną, odporność na atak proteaz, oddziaływania z układem immunologicznym, farmakokinetykę i specyficzną aktywność biologiczną. Takie właściwości mogą zależeć nie tylko od obecności albo nieobecności, ale również specyficznych struktur oligosacharydów. Można dokonać pewnych uogólnień pomiędzy strukturą oligosacharydu i funkcją glikoproteiny.
Przykładowo, pewne struktury oligosacharydowe pośredniczą w szybkim usuwaniu glikoproteiny z krwiobiegu poprzez oddziaływania ze specyficznymi białkami wiążącymi węglowodany, podczas gdy inne mogą być wiązane przez przeciwciała i włączać niepożądane reakcje immunologiczne. (Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)).
Komórki ssaków są korzystnymi gospodarzami do wytwarzania terapeutycznych glikoprotein dzięki ich zdolności do glikozylacji białek w postaci najbardziej odpowiedniej do zastosowań u ludzi. (Cumming i wsp., Glycobiology 1: 115-30 (1991); Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)). Bakterie bardzo rzadko glikozylują białka i podobnie jak inne typy powszechnie stosowanych gospodarzy, takich jak drożdże, grzyby nitkowate, komórki owadzie i roślinne, dają wzory glikozylacji związane z szybkim usuwaniem z krwiobiegu, niepożądanymi reakcjami immunologicznymi i w niektórych konkretnych wykonaniach, zmniejszoną aktywnością biologiczną. Wśród komórek ssaczych, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) były używane najczęściej w ciągu ostatnich dwóch dziesięcioleci. Poza dawaniem odpowiednich wzorów glikozylacji komórki te umożliwiają powtarzalne wytwarzanie stabilnych genetycznie, wysoce produktywnych klonów linii komórkowych. Można je hodować do wysokich gęstości w prostych bioreaktorach przy zastosowaniu wolnej od surowicy pożywki, co umożliwia opracowywanie bezpiecznych i powtarzalnych bioprocesów. Inne powszechnie stosowane komórki zwierzęce obejmują komórki nerki młodego chomika (BHK), komórki mysiego szpiczaka NSO i SP2/0. Ostatnio testowano również wytwarzanie transgenicznych zwierząt. (Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)).
Wszystkie przeciwciała zawierają struktury węglowodanów w konserwowanych pozycjach w regionach stałych łańcucha ciężkiego, przy czym każdy izotyp posiada odrębny układ przyłączonych poprzez N struktur węglowodanowych, które w różny sposób wpływają na składanie, sekrecję lub aktywność funkcjonalną (Wright, A., i Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Te struktury przyłączonych poprzez N węglowodanów różnią się znacząco w zależności od stopnia obróbki i mogą obejmować bogate w mannozę, mocno rozgałęzione jak również dwuramienne złożone oligosacharydy. (Wright, A. i Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Typowo, ma miejsce heterogenna obróbka struktur rdzenia oligosacharydowego przyłączonego w konkretnym miejscu glikozylacji, tak, że istnieją nawet przeciwciała monoklonalne jako liczne glikoformy. Podobnie, pokazano,
PL 224 787 B1 że główne różnice w glikozylacji przeciwciał występują pomiędzy liniami komórkowymi, a nawet mnie jsze różnice są widoczne dla danej linii komórkowej hodowanej w różnych warunkach hodowli. (Lifely, M. R. i wsp., Glycobiology 5 (8): 813-22 (1995)).
Nieskoniugowane przeciwciała monoklonalne (mAb) mogą być przydatnymi lekami do lecz enia raka, co zostało pokazane poprzez zatwierdzenie przez U. S. Food and Drug Administration Rituximabu (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA oraz GenentechInc., San Francisco, CA) do leczenia chłoniaka nieziarniczego komórek B CD20-dodatnich o niskiej złośliwości lub grudkowego, Trastuzumabu (Herceptin™; GenentechInc,) do leczenia zaawansowanego raka piersi (Grillo-Lopez, A.-J., i wsp., Semis. Oncol. 26: 66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21: 309-18 (1999)), Gemtuzumabu (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst) do leczenia nawracającej ostrej białaczki szpikowej i Alemtuzumabu (CAMPATHTM, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) do leczenia przewlekłej białaczki limfocytowej z komórek B. Sukces tych produktów wynika nie tylko z ich skuteczności, ale również ich wyróżniających się profili bezpieczeństwa (Grillo-Lopez, A.-J., i wsp., Semin. Oncol. 26: 66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Cliva. Ther. 21: 309-18 (1999)). Pomimo sukcesu tych leków, istnieje obecnie ogromne zainteresowanie otrzymaniem wyższej aktywności swoistych przeciwciał niż osiąga się zazwyczaj poprzez terapię z nieskoniugowanymi mAb,
Jedną z dróg uzyskania znacznego zwiększenia mocy przy utrzymaniu prostego procesu wytwarzania i potencjalnie unikając znacznych, niepożądanych efektów ubocznych jest wzmocnienie naturalnych funkcji efektorowych mAb, w których pośredniczą komórki, poprzez manipulację ich składnikiem oligosacharydowym (Umana, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Przeciwciała typu IgG1 , czyli przeciwciała najczęściej stosowane w immunoterapii raka, to glikoproteiny, które mają konserwowane miejsce glikozylacji poprzez N w pozycji Asn297 w każdej domenie CH2. Dwa złożone dwuramienne oligosacharydy przyłączone do Asn297 są zagłębione pomiędzy domenami CH2, tworząc silne miejsce styku ze szkieletem polipeptydowym i ich obecność jest niezbędna, aby przeciwciało pośredniczyło w funkcjach efektorowych, takich jak cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciała (ADCC od ang. antibody dependent cellular cytotoxicity) (Lifely, M. R., i wsp., Glyc obiology 5: 813-822 (1995); Jefferis, R., i wsp., Immunol Rev. 163: 59-76 (1998); Wright, A. i Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)).
Obecni wynalazcy pokazali uprzednio, że nadekspresja w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III), glikozylotransferazy katalizującej tworzenie się podzielonych na dwie części oligosacharydów, znacznie zwiększa aktywność ADCC in vitro chimerowych przeciwciał monoklonalnych wobec nerwiaka niedojrzałego (chCE7) wytwarzanych przez poddane zabiegom inżynierii genetycznej komórki CHO. (Patrz Umana, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999), międzynarodowa publikacja nr WO 99/54342, cała zawartość każdej z nich włączona tu w całości, jako odniesienie). Przeciwciało chCE7 należy do dużej klasy nieskoniugowanych Ab, które mają wysokie powinowactwo i swoistość wobec nowotworu, ale zbyt małą siłę, aby być klinicznie przydatne, kiedy są wytwarzane w standardowych przemysłowych liniach komórkowych z brakiem enzymu GnT III (Umana, P., i wsp., Nature Bi otechnol. 17: 176-180 (1999)). Te badania były pierwszymi, które wykazały, że można uzyskać ogromne zwiększenie aktywności ADCC poprzez poddanie zabiegom inżynierii genetycznej k omórek wytwarzających przeciwciała, tak aby wyrażały GnT III, co prowadzi również do zwiększenia proporcji związanych z regionem stałym (Fc) dwuczęściowych oligosacharydów, włączając w to dwuczęściowe niefukozylowane oligosacharydy, powyżej poziomów znajdywanych w prz eciwciałach występujących naturalnie.
Wyniki wielu badań sugerują, że mechanizmy zależne od receptora Fc mają istotny udział w działaniu cytotoksycznych przeciwciał przeciw nowotworom i wskazują, że optymalne przeci wciało przeciw nowotworom będzie wiązać się preferencyjnie z aktywacyjnymi receptorami Fc, a minimalnie z partnerem inhibitorowym FcyRIIB. (Clynes, R. A., i wsp., Nature Medicine 6 (4): 443-446 (2000); Kalergis, A. M. oraz Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195 (12): 1653-1659 (czerwiec 2002). Przykładowo, wyniki co najmniej jednego badania sugerują, że w szczególności receptor FcyRIIB jest silnie związany ze skutecznością terapii przeciwciałowej. (Cartron, G., i wsp., Blood 99 (3): 754-757 (luty 2002)). Te badania pokazały, że pacjenci homozygotyczni pod względem FcyRIIIa mieli lepszą odpowiedź na Rituximab niż pacjenci heterozygotyczni. Autorzy wyciągnęli wniosek, że lepsza odpowiedź była dzięki lepszemu wiązaniu się przeciwciała z FcyRIIIa, czego wynikiem była lepsza aktywność ADCC przeciw komórkom chłoniaka. (Cartron, G., i wsp., Blood 99 (3): 754-757 (luty 2002)).
PL 224 787 B1
Poza ADCC, przeciwciała monoklonalne o działaniu przeciwnowotworowym często indukują niezależne od Fc mechanizmy bezpośredniego przekazywania sygnałów, które regulują przeżywanie, proliferację lub śmierć komórek docelowych poprzez aktywację kaskad przekazywania sygnałów w komórkach albo blokowanie dostępu dla czynników wzrostu. (Selenko, N., i wsp., J Clin. Immunol. 22 (3): 124-130 (2002)). Przykładowo, pokazano, że traktowanie komórek B CD20+ Rituximabem indukuje lizę za pośrednictwem dopełniacza i indukowaną przez Mab indukcję apoptozy, jak również ADCC. (Selenko, N., i wsp., J. Clin. Immunol. 22 (3): 124-130 (2002)). Ponadto, apoptoza komórek chłoniaka indukowana przez Rituximab nie tylko zabija komórki, ale również promuje pobieranie i prezentację krzyżową peptydów pochodzących z komórek chłoniaka przez prezentujące antygen komórki dendrytyczne (DC), indukuje dojrzewanie DC i umożliwia wytwarzane swoistych cytotoksycznych limfocytów T (CTL).
Krótkie streszczenie wynalazku
Wiedząc o ogromnym potencjale terapeutycznym, przeciwciał o zwiększonym powinowactwie wiązania się z receptorem Fc i zwiększonej funkcji efektorowej, obecni wynalazcy opracowali sp osób wytwarzania takich przeciwciał, który obejmuje manipulacje profilem glikozylacji regionu Fc przeciwciała.
Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję kodującą fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT), przy czym fuzja polipeptydowa obejmuje domenę katalityczną GalT i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I (GnTI) lub mannozydazy II (Man II), przy czym domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 22, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji Man II w aparacie Golgiego obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 23, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena GnTI lokalizacji w aparacie Golgiego obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 24, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
Korzystnie domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji Man II.
Korzystnie wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego określona powyżej ma sekwencję nukleotydową SEK. ID. Nr: 19.
Korzystniej domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 23, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokw asową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 24, z konserw atywnymi podstawieniami aminokwasowymi, lub korzystnie domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową o SEK. ID. NR: 22, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokwasową o SEK. ID. NR: 23.
Korzystnie domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena GnT I.
Korzystniej domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 22, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 24, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
Wynalazek dotyczy również ssaczego wektora ekspresyjnego, który obejmuje wyizolowany kwas nukleinowy określony powyżej.
W zakres wynalazku wchodzi również fuzja polipeptydowa mająca aktywność β(1,4) galaktozylotransferazy (GalT), która obejmuje katalityczną domenę GalT i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego ssaczej β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy I (GnT I) lub ssaczej mannozydazy II.
Korzystnie domeną lokalizacji w aparacie Golgiego w fuzji jest domena lokalizacji ssaczej Man II lub domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji ssaczej GnT I.
Korzystnie fuzja polipeptydowa obejmuje sekwencję SEK. ID. NR: 20.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania fuzji polipeptydowej mającej aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT), który obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku opisanej powyżej w pożywce w warunkach umożliwiających ekspresję kwasu nukleinowego kodującego taką fuzję polipeptydową i odzyskanie fuzji polipeptydowej z otrzymanej hodowli.
PL 224 787 B1
Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu in vitro lub ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, który obejmuje wprowadzenie do komórki gospodarza kwasu nukleinowego według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi sposób in vitro lub ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, który obejmuje wprowadzenie do komórki gospodarza wektora ekspresyjnego według wynalazku.
Korzystnie polipeptydem jest IgG lub jej fragment, korzystniej IgG1 lub jej fragmentem.
Korzystnie polipeptyd jest fuzją białkową, która obejmuje region odpowiadający regionowi Fc ludzkiej IgG.
W zakres wynalazku wchodzi również komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny, przy czym wektor ekspresyjny obejmuje cząsteczkę wyizolowanego kwasu nukleinowego określoną powyżej i cząsteczkę wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd mający aktywność mannozydazy II (Man II), przy czym polipeptyd mający aktywność Man II obejmuje SEK. ID. NR: 18.
Niniejszy wynalazek dotyczy również komórki gospodarza, która obejmuje:
a) pierwszy wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę wyizolowanego kwasu nukleinowego określoną powyżej; i
b) drugi wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd mający aktywność mannozydazy II (Man II), przy czym polipeptyd mający aktywność Man II obejmuje SEK. ID. NR: 18.
Korzystnie komórka jest wybrana z grupy składającej się z komórki ssaczej, komórki drożdży i komórki owadziej.
Korzystnie jest wybrana z grupy składającej się z komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysiej komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 i komórki hybrydoma.
Wynalazek dotyczy ogólnie sposobów manipulacji systemem glikozylacji komórki gospodarza w celu dokonania zmian wzoru glikozylacji jednego albo większej liczby polipeptydów wytwarzanych przez tę komórkę gospodarza.
Sposoby według wynalazku można zastosować do wytwarzania terapeutycznych przeciwciał o zmodyfikowanej glikozylacji w regionie Fc, włączając w to zmniejszoną fukozylację, gdzie przeciwciała mają zwiększoną funkcję efektorową i/lub zwiększone wiązanie się z receptorem Fc w wyniku zmodyfikowanej glikozylacji. Poddane zmianom glikozylacji przeciwciała według wynalazku są szczególnie przydatne w traktowaniu terapeutycznym nowotworów u pacjentów. W jednym z wykonań k omórki gospodarzy według wynalazku są poddane manipulacjom systemem, glikozylacji, tak aby uzyskać ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej fuzję polipeptydową z aktywnością katalityczną GnT III lub aktywnością katalityczną GalT.
W korzystnym wykonaniu konstrukty fuzji ulegają koekspresji z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd mający aktywność katalityczną ludzkiej Man II i/lub cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd z aktywnością katalityczną GnT II. W jeszcze innym wykonaniu poddane zmianom glikozylacji polipeptydy według niniejszego wynalazku są wytwarzane przez komórkę gospodarza poddaną manipulacjom systemem glikozylacji, tak aby mieć zwiększoną ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z aktywnością katalityczną Man II.
A zatem, w jednym z aspektów wynalazek dotyczy wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą fuzję polipeptydową, gdzie ta fuzja polipeptydową ma aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III („GnT III”) i zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego peptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego. W jednym z wykonań fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III. W dalszym wykonaniu domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybrana z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I („GnT I”), domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II („GnT II”), domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy α1-6 rdzenia.
W korzystnym wykonaniu wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową przedstawioną na Fig. 24 lub Fig. 25.
PL 224 787 B1
W innym korzystnym wykonaniu wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową przedstawioną na Fig. 24 lub Fig. 25.
W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową w co najmniej 80% identyczną z sekwencją aminokwasową na Fig. 24 lub Fig. 25.
W innym aspekcie wynalazek dotyczy wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą fuzję polipeptydową, gdzie ta fuzja polipeptydowa ma aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”) i zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego peptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego. W jednym z wykonań fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną 3(1,4)-galaktozylotransferazy. W innym wykonaniu domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybrana z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I („GnT I”), domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II („GnT II”), domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy α1-6 rdzenia.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy wektora ekspresyjnego zawierającego wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą fuzję polipeptydową, gdzie ta fuzja polipeptydowa ma aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III i zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego peptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego. W jednym z wykonań wektor ekspresyjny koduje fuzję polipeptydową zawierającą domenę katalityczną 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybrana z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I, domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II, domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy a1-6 rdzenia.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy wektora ekspresyjnego zawierającego wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję kodującą fuzję polipeptydową, gdzie ta fuzja polipeptydowa ma aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy i zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego peptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego. W jednym z wykonań wektor ekspr esyjny koduje fuzję polipeptydową zawierającą domenę katalityczną 3(1,4)-galaktozylotransferazy, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybrana z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I, domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II, domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy α1-6 rdzenia.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy komórki gospodarza zawierającej opisany powyżej wektor ekspresyjny.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III („GnT III”) w ilości dostatecznej do modyfikacji oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, gdzie taki polipeptyd wytwarzany przez taką komórkę gospodarza jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc imnunoglobuliny. W jednym, z wykonań fuzja polipeptydowa mająca aktywność katalityczną GnT III zawiera domenę katalityczną 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego wybraną z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny Iokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I, domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II, domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy α1-6 rdzenia.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”) w ilości dostatecznej do modyfikacji oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, gdzie taki polipeptyd wytwarzany przez taką komórkę gospodarza jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny. W jednym z wykonań fuzja polipeptydowa mająca aktywność katalityczną GalT zawiera domenę katalityczną 3(1,4)-galaktozylotransferazy i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu umiejscowionego w aparacie
PL 224 787 B1
Golgiego wybraną z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I, domeny lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II, domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy a1-6 rdzenia.
Korzystne jest, jeżeli domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest z mannozydazy II lub β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I albo, alternatywnie, galaktozylotransferazy.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy fuzji polipeptydowej mającej aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy IIl i zawierającej domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heter ologicznego polipeptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego. W jednym z wykonań fuzja polipept ydowa zawiera domenę katalityczną β(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III.
W innym wykonaniu domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybrana z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I, domeny lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II, domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy α1-6 rdzenia.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy fuzji polipeptydowej mającej aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy i zawierającej domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego pol ipeptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego. W jednym z wykonań fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną β(1,4)-galaktozylotransferazy. W dalszym wykonaniu domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybrana z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I, domeny lokalizacji β (1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II, domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy a1-6 rdzenia.
Korzystne jest, jeżeli domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest z mannozydazy II lub β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I („GnT I”) albo, alternatywnie, galaktozylotransferazy („GalT”).
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania fuzji polipeptydowej mającej aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III obejmującego hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w pożywce w warunkach umożliwiających ekspresję kwasu nukl einowego kodującego fuzję polipeptydową i odzyskanie fuzji polipeptydowej z otrzymanej w rezult acie hodowli.
W jednym z wykonań fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną β(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III.
Korzystne jest, jeżeli fuzja polipeptydowa zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego wybraną z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji β(1,2)-N-ace-tyloglukozaminylotransferazy I, domeny lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II, domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy a1-6 rdzenia.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania fuzji polipeptydowej mającej aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy obejmującego hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w pożywce, w warunkach umożliwiających ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową i odzyskanie fuzji polipeptydowej z otrzymanej w rezultacie hodowli.
W jednym z wykonań fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną β(1,4)-galaktozylotransferazy.
Korzystne jest, jeżeli fuzja polipeptydowa zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego wybraną z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I, domeny lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II, domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy a1-6 rdzenia.
Korzystne jest, jeżeli domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest z mannozydazy II lub β(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I albo galaktozylotransferazy („GalT”).
W dalszymi aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy sposobu modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza obejmującego wprowadzenie do komórki gospodarza, co najmniej jednego wektora ekspresyjnego według wynalazku.
Korzystne jest, jeżeli polipeptydem jest IgG albo jego fragment zawierający region Fc polipeptydu. Alternatywnie, polipeptydem jest fuzja białkowa, która zawiera region równoważny regionowi Fc ludzkiej IgG.
PL 224 787 B1
W innym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza, obejmującego:
a) hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III, lub, alternatywnie, p(1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”) w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie ta fuzja polipeptydową jest wyrażana w ilości dostatecznej do modyfikacji oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza; i
b) izolowanie takiego polipetydu.
Korzystne jest, jeżeli fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III lub 3(1,4)-galaktozylotransferazy i zawiera ponadto domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego wybraną z grupy składającej się z domeny lokalizacji mannozydazy II, domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I, domeny lokalizacji 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy II, domeny lokalizacji mannozydazy I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy α1-6 rdzenia.
W korzystnych wykonaniach polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza ma zwiększoną funkcję efektorową i/lub zwiększone wiązanie się z receptorem Fc w wyniku modyfikacji.
W szczególnie korzystnych wykonaniach zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększona cytotoksyczność komórkowa za pośrednictwem Fc, zwiększone wiązanie się z komórkami NK, zwiększone wiązanie się z makrofagami, zwiększone wiązanie się z monocytami, zwiększone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi, zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnału indukujące apoptozę, zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych i/lub zwiększone uczulanie komórek T, a zwiększonym wiązaniem się z receptorem Fc jest zwiększone wiązanie się z receptorem aktywującym Fc, takim jak FcyRIIIA.
Korzystne jest, jeżeli polipeptydem wykazującym zwiększoną funkcją efektorową i zwiększone wiązanie się z receptorem Fc jest przeciwciało, fragment przeciwciała albo fuzja białkowa zawierająca region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny i ma ono zwiększoną proporcję niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc.
W innym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej przeciwciało, fragment przeciwciała zawierający region Fc lub fuzję białkową zawierającą region Fc immunoglobuliny według wynalazku i zastosowania takiej kompozycji farmaceutycznej do leczenia nowotworów, takich jak rak i inne choroby. W jednym, z wykonań leczeniem jest usunięcie komórek B poprzez podawanie terapeutycznie skutecznej ilości takiej kompozycji farmaceutycznej pacjentowi, np. człowi ekowi tego potrzebującemu.
W jeszcze dalszym aspekcie, wynalazek dostarcza komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fuzję polipeptydową, gdzie ta fuzja polipeptydowa ma aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego peptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego oraz wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptydową, gdzie ten polipeptyd ma aktywność mannozydazy (Man II). W korzystnych wykonaniach fuzja polipeptydową zawiera domenę katalityczną GnT III, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybrana z grupy składającej się z domeny lokalizacji Man II, domeny lokalizacji GnT I, domeny lokalizacji GnT II, domeny lokalizacji Man I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy α1-6 rdzenia. W jednym z wykonań komórka gospodarza zawiera wektor ekspresyjny kodujący polipeptyd mający aktywność GnT II. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące fuzję polipeptydową, polipeptyd mający aktywność Man II i polipeptyd mający aktywność GnT II mogą być każda w odrębnym wektorze ekspresyjnym lub w tym samym wektorze ekspresyjnym.
W dodatkowym aspekcie, wynalazek dotyczy komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fuzję polipeptydową, gdzie ta fuzja polipeptydową ma aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego peptydu umiejscowionego w aparacie Golgiego oraz wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, gdzie ten polipeptyd ma aktywność mannozydazy (Man II).
PL 224 787 B1
W korzystnych wykonaniach fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną GnT III, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybrana z grupy składającej się z domeny lokaliz acji Man II, domeny lokalizacji GnT I, domeny lokalizacji GnT II, domeny lokalizacji Man I i domeny lokalizacji fukozylotransferazy a1-6 rdzenia. W jednym z wykonań komórka gospodarza zawiera wektor ekspresyjny kodujący polipeptyd mający aktywność GnT II. Cząsteczki kwasu nukleinow ego kodujące fuzję polipeptydową, polipeptyd mający aktywność Man II i polipeptyd mający aktywność GnT II mogą być każda w odrębnym, wektorze ekspresyjnym lub w tym samym wektorze ekspresyjnym.
W dalszym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GnT III i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność Man II w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza, gdzie taki polipeptyd wytwarzany przez taką komórkę gospodarza jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny.
W dodatkowym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GnT III, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność Man II i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GnT II w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza, gdzie taki polipeptyd w ytwarzany przez taką komórkę gospodarza jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny.
W dalszym aspekcie, wynalazek dostarcza komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GalT i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność Man II w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza, gdzie taki polipeptyd wytwarzany przez taką komórkę gospodarza jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny.
W dodatkowym aspekcie, wynalazek dostarcza komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową, mającą aktywność GalT, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność Man II i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GnT II w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza, gdzie taki polipeptyd wytwarzany przez taką komórkę gospodarza jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny.
W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza, obejmującego hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GnT III i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność Man II w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie taka fuzja polipeptydową jest w ytwarzana w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza i izolowanie takiego polipeptydu.
W innym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza, obejmującego hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową, mającą aktywność GalT i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność Man II w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy składającej się z czą10
PL 224 787 B1 steczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie taka fuzja polipeptydowa jest wytwarzana w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza i izolowanie takiego polipeptydu.
W dodatkowym aspekcie dostarczony jest sposób wytwarzania polipeptydu, mającego zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc w komórce gospodarza, obejmującego hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową, mającą aktywność GalT i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, mający aktywność Man II w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie poziom ekspresji jednego z albo obydwu, GalT lub Man II jest wystarczający do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc takiego polipe ptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza i gdzie taki polipeptyd ma zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc w wyniku takiej modyfikacji i izolowanie takiego polipeptydu mającego zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza, obejmującego:
a) hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność α-mannozydazy II w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie taki polipeptyd mający aktywność α-mannozydazy II jest wytwarzany w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza
b) izolowanie takiego polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza.
W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, mający aktywność α-mannozydazy II w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała, zawierającego region Fc oraz fuzji białkowej, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie taki polipeptyd, mający aktywność α-mannozydazy II jest wytwarzany w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę g ospodarza.
W jeszcze innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydów wy twarzanych przez takie komórki gospodarza, a w szczególności przeciwciał mających zwiększoną funkcję efektorową i/lub zwiększone wiązanie się z receptorem Fc w wyniku obecności takich zmodyfikowanych olig osacharydów.
Krótki opis figur
Fig. 1. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, niezmodyfikowanego (bez zmnienionej glikozylacją) przeciwciała IgG1 anty-CD20, wytworzonego w komórkach BHK.
Komórki transfekowano wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1502. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 2. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w BHK, zmanipulowanych kwasem nukleinowym kodującym dzikiego typu („wt”) GnT III. Komórki kotransfekowano wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1502 i wektorem do ekspresji GnT III pETR1166. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 3. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w BHK, zmanipulowanych kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („G1-GnTIII”) o aktywności GnT III i lokalizowaną dzięki domenie lokalizacji GnT I w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektoPL 224 787 B1 rem do ekspresji przeciwciał pETR1502 i wektorem do ekspresji GnT III pETR1425. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 4. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w BHK, zmanipulowanych kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („M2-GnTIII”) o aktywności GnT III i lokalizowaną w aparacie Golgiego dzięki domenie lokalizacji alfa-mannozydazy II (Man II) w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1502 i wektorem do ekspresji GnT III pETR1506. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 5. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, niezmodyfikowanego (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciała IgG1 anty-CD20, wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA. Komórki transfekowano wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 6. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w HEK293EBNA, zmanipulowanych kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („M2-GnTIII”) o aktywności GnT III i lokalizowaną w aparacie Golgiego dzięki domenie lokalizacji alfa-mannozydazy II (Man II) w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520 i wektorem do ekspresji GnT III pETR1519. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 7. Widma MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w HEK293EBNA, zmanipulowanych kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („M2-GnTIII”) o aktywności GnT III i lokalizowaną w aparacie Golgiego dzięki domenie lokalizacji alfa-mannozydazy II (Man II) w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520 i wektorem do ekspresji GnT III pETR1519. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. (a) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych dzięki PNGazie F, bez dodatkowej obróbki enzymatycznej, (b) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych dzięki PNGazie F, ciętych następnie EndoH.
Fig. 8. (a) Schematyczna ilustracja cięcia oligosacharydów katalizowanego przez EndoH. EndoH może ciąć hybrydy (i hybrydy dwuczęściowe), ale nie może ciąć złożonych lub złożonych dwuczęściowych oligosacharydów. (b) Poprzez rozróżnianie pomiędzy oligosacharydami złożonymi a typu hybrydowego, obróbka EndoH umożliwia przypisywanie cech strukturalnych szczytowym odczytom oligosacharydów o takich samych współczynnikach m/z dla widm MALDI/TOF-MS, otrzymanych po początkowej obróbce PNGazą F.
Fig. 9. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) warunkowana przez przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „G1-GnTIII” w porównaniu do warunkowanej przez niezmodyfikowane, zrekombinowane chimerowe przeciwciała IgG1 anty-CD20. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach BHK. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 3, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 1. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4 godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E:T wynosił 25:1, cytotoksyczność mierzono poprzez ilość uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymaInego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 10. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) warunkowana przez przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu do warunkowanej przez niezmodyfikowane, zrekombinowane anty-CD20 chimerowe przeciwciała IgG1. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6 a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4 godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E:T wynosił
PL 224 787 B1
25:1, cytotoksyczność mierzono poprzez ilość uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 11. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) warunkowana przez przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu do warunkowanej przez zrekombinowane anty-CD20, chimerowe przeciwciała IgG1 o glikozylacji zmienionej przez „wt-GnTIII”. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach BHK. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III przedstawiono na Fig. 4, a profil dla przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez wt-GnT IIl na Fig. 2. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4-godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E:T wynosił 25:1, cytotoksyczność m ierzono poprzez ilość uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spont anicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w dziale „Mat eriały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 12. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu do wiązania niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1, do receptora FcgammaRIIIa na komórkach NK. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293 EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano z dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fIuorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano wykorzystując współzawodniczący fragment przeciwciała specyfic znego dla FcgammaRIIIa (patrz Fig. 13).
Fig. 13. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu do wiązania niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1 do receptora FcgammaRIIIa na komórkach NK w obecności rosnących stężeń współzawodniczącego fragmentu przeciwciała anty-FcgammaRIII. Oba zrekombinowane przeciwciała otrzymano w k omórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6 a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1 , przy czym oczyszczone komórki NK inkubowano razem z rekombinowanym przeciwciałem (zawsze w końcowym stężeniu 3 pg/ml) i z różnymi, rosnącymi stężeniami (patrz wykres) współzawodniczącego fragmentu 3G8 Fab2 przeciwciała anty-FcgammaRlll. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano z dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytw arzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fIuorescencji, mierzona metodą FACS z wkorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK.
Fig. 14. Widma MALDI/TOF-MS obojętnych mieszanin oligosacharydów pochodzących od zrekombinowanych przeciwciał IgG1 „L19” rozpoznających formę izomereczną ED-B+fibronektyny i wytworzonych w komórkach HEK293-EBNA. (a) Niezmodyfikowane przeciwciało wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1546. (b) Przeciwciało o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III wytworzone w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1546 i wektorem pETR1519 do ekspresji GnT III. Oba przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej poprzez chromatografię powinowactwa do białka A i następnie przez chromatografię sączenia molekularnego w złożu Superdex200 (Amersham) wymieniając bufor na sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Oligosacharydy otrzymano i analizowano tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
PL 224 787 B1
Fig. 15. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu do wiązania niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-ED-B+fibronektyna chimerowych przeciwciał IgG1 do receptora FcgammaRIIb na ludzkich komórkach chłoniaka Raji. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmieni oną glikozylacją przedstawiono na Fig. 14b, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 14a. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Średnia geometryczna intensywności fIuorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem, znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombin owanego przeciwciała związanego na komórkach chłoniaka Raji pochodzącego z komórek B.
Fig. 16. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu do wiązania niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1 do receptora FcgammaRIIIa na komórkach NK pochodzących od różnych dawców. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmieni oną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawców o gen otypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji k odującej FcgammaRIIc). Określono genotypy dwóch dawców na homozygoty pod względem w ariantu 158V- „o wyższym powinowactwie” receptora FcgammaRIIIa. Określono genotypy dwóch innych dawców na heterozygoty 158V/F pod względem wariantów 158V - „o wyższym powinowactwie” i 158F- „o niższym, powinowactwie” receptora FcgammaRIIIa. Średnia geometryczna intensywności fIuorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem, znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-Iudzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wyk azano wykorzystując współzawodniczący fragment przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz Fig. 13).
Fig. 17. Analiza FACS ekspresji skróconego CD4 (tCD4) w liniach komórkowych stabilnie produkujących chimerowe przeciwciała anty-CD20 IgG1 (a) BHK-1502-28 (dzikiego typu) i w (b) klonie BHK-1502-28-11 (o glikozylacji zmienionej przez M2-GnTIII). Ekspresja tCD4 jest funkcjonalnie sprzężona z ekspresją M2-GnT III poprzez element IRES na wektorze ekspresyjnym pETR1537 GnT III, przez co jest stosowana, jako pośredni marker dla ekspresji GnT III. Średnie i średnie geometryczne intensywności fIuorescencji wynosiły odpowiednio 27,6 i 19,9 dla linii k omórkowych poddanych manipulacji glikozylacją oraz 4,7 i 4,1 dla linii komórkowych dzikiego typu.
Fig. 18. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III, przeciwciała chimerowego IgG1 anty-CD20, wytworzonego w linii komórkowej BHK-1502-28-11. Linię komórkową, oczyszczanie przeciwciała i otrzymywanie oraz analizę oligosacharydów opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 19. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od ol igosacharydów uwalnianych dzięki PNGazie F, ciętych następnie EndoH, pochodzących z zr ekombinowanego, o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III przeciwciała chimerowego IgG1 antyCD20, wytworzonego w linii komórkowej BHK-1502-28-11. Linię komórkową, oczyszczanie przeciwciała i otrzymywanie oraz analizę oligosacharydów opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 20. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnT III” w porównaniu do wiązania niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1, wytworzonych w stabilnych liniach komórkowych, do receptora FcgammaRIIIa na komórkach NK.
Profil glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 18 i na Fig. 19. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. hom ozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc) średnia geometryczna intensywności fIuorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte
PL 224 787 B1 w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIla, co wykazano wykorzystując współzawodniczący fragment przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz Fig. 13).
Fig. 21. Liza za pośrednictwem dopełniacza (CML) zależna od przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnT III” w porównaniu do zależnej od niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1. Cba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. W teście zastosowano ludzki układ dopełniacza. Lizę mierzono poprzez ilość uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Test opisano szczegółowo w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 22. Widma MALDI/TOF-MS obojętnych mieszanin oligosacharydów pochodzących od zrekombinowanych, chimerowych przeciwciał IgG1 „C225” rozpoznających ludzki receptor czynnika wzrostu naskórka (EGFR) i wytworzonych w komórkach HEK293-EBNA. (a) Niezmodyfikowane przeciwciało wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pURSI28. (b) Przeciwciało o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III wytworzone w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETRURSl28 i wektorem pETR1519 do ekspresji GnT III. Oba przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej poprzez chromatografię powinowactwa do białka A i następnie przez chromatografię sączenia molekula rnego w złożu Superdex200 (Amersham) wymieniając bufor na sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Oligosacharydy otrzymano i analizowano tak, jak opisano w dziale „Materiały i M etody” w Przykładzie 1.
Fig. 23. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) warunkowana przez przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnT III” w porównaniu do warunkowanej przez niezmodyfikowane, zrekombinowane anty-EGFR chimerowe przeciwciała IgG1 „C225”. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 22b a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 22a. K omórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki raka płaskokomórkowego (nr ECACC 85090402). Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4-godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E:T wynosił 25:1, cytotoksyczność mierzono poprzez ilość uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów ma ksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w dziale „Mat eriały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 24. Sekwencja kwasu nukleinowego i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa fuzji polipeptydowej według wynalazku Mannozydaza II-GnT III.
Fig. 25. Sekwencja kwasu nukleinowego i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa fuzji polipeptydowej według wynalazku GnT-I-GnT-III.
Fig. 26. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od niezmodyfikowanego, chimerowego przeciwciała IgG 1 C2B8 anty-CD20 („Cwt”), wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 5.
Fig. 27. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, chimerowego przeciwciała IgG1 ze zmienioną glikozylacją C2B8 anty-CD20 („Cbrt”), wytworzonego w komórkach HEK293-E3NA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520 i wektorem do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519). Przeci wciało oczyszczono z pożywki hodowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 5. (A) Profil oligosacharydowy oligosachar ydów uwalnianych dzięki PNGazie F, bez dodatkowej obróbki enzymatycznej. (B) Profil oligosach arydowy oligosacharydów uwalnianych dzięki PNGazie F, ciętych następnie EndoH.
Fig. 28. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, chimerowego przeciwciała IgG1 ze zmienioną glikozylacją C2B8 anty-CD20 („Cm”), wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520, wektorem do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519) i wekt orem do ekspresji polipeptydu mannozydazy II (pCLF9). Przeciwciało oczyszczono z pożywki h odowlanej i otrzymano oraz analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w dziale „Materiały
PL 224 787 B1 i Metody” w Przykładzie 5. (A) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych dzięki P NGazie F, bez dodatkowej obróbki enzymatycznej. (B) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych dzięki PNGazie F, ciętych następnie EndoH.
Fig. 29. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC), w której pośredniczą przeciwciała chimerowe anty-CD20 o glikozylacji zmienionej poprzez ekspresję w komórkach HEK293-EBNA kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana poprzez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, gdzie kwas nukleinowy kodujący Man II-GnT III jest zarówno poddawany ekspresji samodzielnie (przeciwciało Cbrt) jak i poddawany koekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciała razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm). Cwt to niezmodyfikowane, zrekombinowane przeciwciało chimerowe IgG1 C2B8 anty-CD20 („Cwt”; wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520. Test opisano szczegółowo w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 30. Wiązanie się z receptorem FcgammaRIIIa przeciwciał chimerowych anty-CD20 o glikozylacji zmienionej poprzez ekspresję w komórkach HEK29 3-EBNA kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana poprzez domenę lokalizacji Man II Golgi, gdzie kwas nukleinowy kodujący Man II-GnT III jest zarówno poddawany ekspresji samodzielnie (przeciwciało Cbrt) jak i poddawany koekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciała razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm). Cwt to niezmodyfikowane, zrekombinowane przeciwciało chimerowe IgG1 C2B8 anty-CD20 („Cwt”) wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano z dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano wykorzystując współzawodniczący fragment przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz Fig. 13).
Fig. 31. Cytotoksyczność, w której pośredniczy dopełniacz, zależna od przeciwciał chim erowych anty-CD20 o glikozylacji poddane manipulacji poprzez ekspresję w komórkach HEK293EBNA kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana poprzez domenę lokalizacji Man II Golgi, gdzie kwas nukleinowy kodujący Man II-GnT III jest zarówno poddawany ekspresji samodzielnie (przeciwciało Cbrt) jak i poddawany koekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciała razem z kwasem nuklein owym kodującym Man II (Cm). Cwt to niezmodyfikowane, zrekombinowane przeciwciało chimerowe IgG1 C2B8 anty-CD20 („Cwt”) wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520.
Fig. 32 (A-C). Wektory ekspresyjne pCLF9 (A) pETR1842 (B) i pETR1843 (C).
Fig. 33 (A i B). Wektory do ekspresji fuzji białkowej Man II-GalT (A) i GalT (B).
Fig. 34. Profil oligosacharydowy monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności α-mannozydazy II i względny stosunek procentowy struktur, dla których wykazano, że związane są z fragmentem Fc przeciwciała.
Fig. 35. Profil oligosacharydowy monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności fuzji białkowej Man II-GalT i względny stosunek procentowy struktur, dla których wykazano, że związane są z fragmentem Fc przeciwciała. Profil oligosacharydowy po obróbce PNGazą F (A) i po trawieniu EndoH (B).
Fig. 36. Przeciwciało wytworzone w obecności α-mannozydazy II (Man II) wiąże się z receptorem FcyRIIIA z większym powinowactwem niż przeciwciała dzikiego typu.
Fig. 37. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał, w której pośredniczy chimerowe anty-CD20 ze zmienioną glikozylacją.
Szczegółowy opis wynalazku
Terminy tutaj zastosowano tak, jak są powszechnie stosowane w dziedzinie, chyba, że zdefiniowano je inaczej w następujący sposób.
PL 224 787 B1
Stosowany tutaj termin „przeciwciało” ma obejmować cząsteczki całych przeciwciał, w tym przeciwciał monoklonalnych, poliklonalnych i wielowartościowych (np. dwuwartościowych), a także fragmenty przeciwciał posiadające regiony Fc i fuzje białkowe zawierające region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny. Termin ten obejmuje także przeciwciała humanizowane i chimerowe.
Stosowany tutaj termin „region Fc” ma odnosić się do C-końcowego regionu ciężkiego łańcucha IgG. Ponieważ granice regionu Fc ciężkiego łańcucha IgG mogą się nieznacznie różnić, zwykle określa się, że region Fc ciężkiego łańcucha ludzkiego IgG rozciąga się od reszty aminokwasowej w poz ycji Cys226 do końca karboksylowego.
Stosowany tutaj termin „region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny” ma obejmować naturalnie występujące alleliczne warianty regionu Fc immunoglobulin, a także warianty ze zmianami powodującymi podstawienia, wstawienia lub delecje, ale takie, które nie zmniejszają istotnie zdolności immunoglobulin do pośredniczenia w funkcjach efektorowych (takich jak cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał). Na przykład, można usunąć jeden lub więcej aminokwasów z N-końca lub C-końca regionu Fc immunoglobuliny bez istotnej utraty funkcji biologicznej. Takie warianty można wybierać według ogólnych zasad znanych w dziedzinie, tak aby miały minimalny wpływ na aktywność (patrz, np. Bowie, J. U. i wsp. Science 247:1306-10 (1990)).
Stosowany tutaj termin „fuzja polipeptydowa mająca aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III” odnosi się do fuzji polipeptydowych, które mają zdolność do katalizowania dodawania podstawnika N-acetyloglukozoaminowego (GlcNAc) poprzez wiązanie β-1-4 do mannozydu związanego w pozycji β rdzenia trimannozowego oligosacharydów przyłączonych poprzez N. Termin ten obejmuje fuzje polipeptydowe wykazujące aktywność enzymatyczną podobną, ale nie koniecznie identyczną, do aktywności β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III, znanej także jako 4-beta-N-acetyloglukozoaminylo-transferaza β-1,4-mannozyloglikoproteinowa (EC 2.4.1.144), według nomenklatury Komitetu Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej („Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology”; NC-IUBMB), zmierzonej w odpowiednim teście biologicznym, zależnej Iub nie od dawki. W przypadku zależności od dawki, nie musi być identyczna z β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazą III, ale raczej istotnie podobna do zależności od dawki dla danej aktywności w porównaniu do β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (tj. wybierany polipeptyd będzie wykazywał wyższą aktywność lub nie mniejszą niż 25 razy mniejszą i korzystnie nie mniejszą niż 10 razy mniejszą a najkorzystniej nie mniejszą niż trzy razy mniejszą aktywność w stosunku do β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III).
Stosowany tutaj termin „fuzja polipeptydowa mająca aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy” lub „mająca aktywność GalT” odnosi się do fuzji polipeptydowych, które mają zdolność do katalizowania dodawania reszty galaktozydowej z UDP galaktozy do nieredukującego końcowej GlcNAc znajdującego się w N-połączonych oligosacharydach. Termin ten obejmuje fuzje polipeptydowe wykazujące aktywność enzymatyczną podobną, ale nie koniecznie identyczną, do aktywności β(1,4)^laktozylotransferazy, znanej także jako UDP-Gal : GlcNAc β-1,4-galaktozylotransferaza (EC 2.4.1.38), według nomenklatury Komitetu Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej („Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology”; NC-IUBMB), zmierzonej w odpowiednim teście biologicznym, zależnej lub nie od dawki. W przypadku zależności od dawki, nie musi być identyczna z β(1 ,4)-galaktozylotransferazą, ale raczej istotnie podobna do zależności od dawki dla danej aktywności w porównaniu do β(1,4)-galaktozylotransferazy (tj. wybierany polipeptyd będzie wykazywał wyższą aktywność lub nie mniejszą niż 25 razy mniejszą i korzystnie nie mniejszą niż 10 razy mniejszą a najkorzystniej nie mniejszą niż trzy razy mniejszą aktywność w stosunku do β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III).
Przez kwas nukleinowy lub polipeptyd posiadający sekwencję nukleotydową co najmniej, dla przykładu, w 95% podobną do wzorcowej sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku, rozumie się, że sekwencja nukleotydową polinukleotydu jest identyczna do wzorcowej sekwencji z wyjątkiem takim, że sekwencja polinukleotydu może zawierać do pięciu punktowych mutacji na każde 100 nukleotydów wzorcowej sekwencji nukleotydowej. Innymi słowy, aby otrzymać polinukleotyd posiadający sekwencję identyczną co najmniej w 95% do wzorcowej sekwencji nukleotydowej, można do 5% nukleotydów w wzorcowej sekwencji usunąć lub podstawić innymi nukleotydami, lub odpowiednią ilość nukleotydów stanowiąca do 5% wszystkich nukleotydów w wzorcowej sekwencji może być wstawiona do sekwencji wzorcowej. Sekwencją w zapytaniu może być cała sekwencja przedst awiona na Fig. 24 lub Fig. 25.
PL 224 787 B1
Z praktycznej strony, można określić w standardowy sposób, czy konkretna cząsteczka kwasu nukleinowego lub polipeptydu jest co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczna z sekwencją nukleotydową lub sekwencją polipeptydową według niniejszego wynalazku, stosując znane programy komputerowe.
Korzystnym sposobem wyznaczania najlepszego, ogólnego dopasowania pomiędzy sekwencją w zapytaniu (sekwencją według niniejszego wynalazku) i sekwencją docelową, także określanego jako globalne przyrównanie sekwencji, może być wyznaczanie za pomocą programu komputerowego FASTDB wykorzystującego algorytm Brutlaga i wsp., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). W przyrównaniu sekwencji, sekwencja w zapytaniu i sekwencja docelowa obie są sekwencjami DNA. Sekwencję RNA można porównać zamieniając U na T. Wynik powyższego globalnego przyrównania sekwencji jest podany w postaci procentu podobieństwa.
Korzystnymi parametrami stosowanymi w budowaniu przyrównania sekwencji DNA w FASTDB w celu wyliczenia procentu podobieństwa są: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500 lub długość nukleotydowej sekwencji docelowej, jeżeli jest krótsza.
Jeżeli sekwencja docelowa jest krótsza niż sekwencja w zapytaniu z uwagi na delecje 5' lub 3', a nie z uwagi na wewnętrzne delecje, należy wprowadzić ręczne korekty do wyników. Jest to spowodowane tym, że program FASTDB nie liczy skróconych 5' i 3' końców sekwencji docelowej podczas wyliczania procentu podobieństwa. Dla sekwencji docelowych skróconych na 5' i 3' końcach w stosunku do sekwencji w zapytaniu, procent podobieństwa jest poprawiany wyliczając ilość zasad sekwencji z zapytania, które są 5' i 3' końcami sekwencji docelowej, które nie są sparowane/przyrównane, jako procent całkowitej ilości zasad sekwencji w zapytaniu. Czy nukleotyd jest sparowany/przyrównany jest wyznaczane w wyniku przyrównania sekwencji w FASTDB. Następnie odejmuje się tą wartość procentową od procentu podobieństwa, wyliczonego w powyższym programie FASTDB, wykorzystując ustalone parametry, aby osiągnąć ostateczną wartość procentu podobieństwa. Ta poprawiona wartość jest tym, co jest wykorzystywane na potrzeby obecnego wynalazku. Jedynie zasady poza zasadami 5' i 3' sekwencji docelowej, jak pokazywane jest w przyrównaniu FASTDB, które nie są sparowane/przyrównane z sekwencją z zapytania, są brane pod uwagę w ręcznym, wyliczaniu wartości procentu podobieństwa.
Na przykład, aby wyznaczyć procent podobieństwa przyrównano sekwencję docelową złożoną z 90 zasad z sekwencją w zapytaniu o 100 zasadach. Delecje znajdują się na 5' końcu sekwencji docelowej i stąd przyrównanie FASTDB nie pokazuje sparowania/przyrównania pierwszych 10 zasad z 5' końca. 10 niesparowanych zasad odpowiada 10% sekwencji (ilość niesparowanych zasa d na 5' lub 3' końcach/całkowita ilość zasad w sekwencji z zapytania) tak, więc 10% odejmuje się od wartości procentu podobieństwa wyliczonego w programie FASTDB. Jeżeli pozostałe 90 zasad pasuje idealnie, końcowy procent podobieństwa wynosi 90%. W innym przykładzie, porównano sekwencję docelową złożoną z 90 zasad z sekwencją w zapytaniu o 100 zasadach. W tym przypadku delecje znajdują się wewnątrz tak, że nie ma niesparowanych/przyrównanych zasad na 5' lub 3' końcach sekwencji docelowej w stosunku do sekwencji z zapytania. W tym przypadku, procent podobieństwa wyliczany w FASTDB nie podlega ręcznemu poprawianiu. Jeszcze raz, jedynie zasady z 5' i 3' końców sekwencji docelowej, które nie są sparowane/przyrównane z sekwencją z zapytania podlegają ręcznemu poprawianiu. Nie ma potrzeby wykonywania żadnych innych ręcznych poprawek na potrzeby obecnego wynalazku.
Przez polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową co najmniej, dla przykładu, w 95% podobną do sekwencji aminokwasowej według niniejszego wynalazku z zapytania, rozumie się, że sekwencja aminokwasowa docelowego polipeptydu jest identyczna do sekwencji w zapytaniu z wyjątkiem takim, że sekwencja polipeptydu docelowego może zawierać do pięciu zmian aminokwasów na każde 100 aminokwasów sekwencji aminokwasowej z zapytania. Innymi słowy, aby otrzymać polipeptyd posiadający sekwencję identyczną co najmniej w 95% do odpowiadającej mu sekwencji aminokwasowej z zapytania, można do 5% reszt aminokwasowych w sekwencji docelowej wstawić, usunąć lub podstawić innymi aminokwasami. Te zmiany wzorcowej sekwencji mogą być wprowadzane w pozycjach na końcu karboksylowym lub aminowym wzorcowej sekwencji aminokwasowej lub gdziekolwiek pomiędzy tymi końcowymi pozycjami, mogą być rozłożone zarówno w oddzielnych pozycjach pośród reszt wzorcowej sekwencji lub w jednej lub więcej ciągłych zgrupowaniach w wzorcowej sekwencji.
PL 224 787 B1
Z praktycznej strony, można określić w standardowy sposób czy konkretny polipeptyd jest co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczny z wzorcową sekwencją aminokwasową, stosując znane programy komputerowe.
Korzystnym sposobem wyznaczania najlepszego, ogólnego dopasowania pomiędzy sekwencją w zapytaniu (sekwencją według niniejszego wynalazku) i sekwencją docelową, także określanego jako globalne przyrównanie sekwencji, może być wyznaczanie za pomocą programu komputerowego FASTDB wykorzystującego algorytm Brutlaga i wsp., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). W przyrównaniu sekwencji, sekwencja w zapytaniu i sekwencja docelowa obie mogą być sekwencjami nukleotydowymi lub obie mogą być sekwencjami aminokwasowymi. Wynik powyższego globalnego przyrównania sekwencji jest podany w postaci procentu podobieństwa. Korzystnymi parametrami stosowanymi w budowaniu przyrównania sekwencji aminokwasowych w FASTDB są: Matrix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Window Size=sequence length, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, Window Size=500 lub długość sekwencji docelowej, jeżeli jest krótsza.
Jeżeli sekwencja docelowa jest krótsza niż sekwencja w zapytaniu z uwagi na delecje na końcu N lub C, a nie z uwagi na wewnętrzne delecje, należy wprowadzić ręczne korekty do wyników. Jest to spowodowane tym, że program FASTDB nie liczy skróconych końców N lub C sekwencji docelowej podczas wyliczania globalnego procentu podobieństwa. Dla sekwencji docelowych skróconych końcach N lub C w stosunku do sekwencji w zapytaniu, procent podobieństwa jest poprawiany wyliczając ilość reszt sekwencji z zapytania, które są końcami N lub C sekwencji docelowej, które nie są sparowane/przyrównane z odpowiadającymi im resztami docelowymi, jako procent całkowitej ilości reszt sekwencji w zapytaniu. Czy reszta jest sparowana/przyrównana jest wyznaczane w wyniku prz yrównania sekwencji w FASTDB. Następnie odejmuje się tą wartość procentową od procentu podobieństwa, wyliczonego w powyższym programie FASTDB, wykorzystując ustalone parametry, aby osiągnąć ostateczną wartość procentu podobieństwa. Ta końcowa, poprawiona wartość procentu podobieństwa jest tym, co jest wykorzystywane na potrzeby obecnego wynalazku.
Jedynie reszty końców N lub C sekwencji docelowej, które nie są sparowane/przyrównane z sekwencją z zapytania, są brane pod uwagę w ręcznym wyliczaniu wartości procentu podo bieństwa. To jest, jedynie pozycje reszt z zapytania poza najdalszymi resztami końców N lub C sekwe ncji docelowej.
Na przykład, aby wyznaczyć procent podobieństwa przyrównano aminokwasową sekwencję docelową złożoną z 90 reszt z sekwencją w zapytaniu o 100 resztach. Delecje znajdują się na końcu N sekwencji docelowej i stąd przyrównanie FASTDB nie pokazuje sparowania/przyrównania pierwszych 10 reszt z końca N. 10 niesparowanych reszt odpowiada 10% sekwencji (ilość niesparowanych reszt na końcach N i C (całkowita ilość reszt w sekwencji z zapytania) tak, więc 10% odejmuje się od wartości procentu podobieństwa wyliczonego w programie FASTDB. Jeżeli pozostałe 90 reszt pasuje idealnie, końcowy procent podobieństwa wynosi 90%. W innym przykładzie, porównano sekwencję docelową złożoną z 90 reszt z sekwencją w zapytaniu o 100 resztach. W tym przypadku delecje znajdują się wewnątrz tak, że nie ma niesparowanych/przyrównanych reszt na końcach N lub C sekwencji docelowej w stosunku do zapytania. W tym przypadku, procent podobieństwa wyliczany w FASTDB nie podlega ręcznemu poprawianiu. Jeszcze raz, jedynie pozycje reszt poza końcami N lub C s ekwencji docelowej, jak przedstawiono w przyrównaniu FASTDB, które nie są sparowane/przyrównane z sekwencją z zapytania podlegają ręcznemu poprawianiu. Nie ma potrzeby wykonywania żadnych innych ręcznych poprawek na potrzeby niniejszego wynalazku.
Stosowany tutaj termin kwas nukleinowy, który „hybrydyzuje w ostrych warunkach” z sekwencją kwasu nukleinowego według wynalazku odnosi się do polinukleotydu, który hybrydyzuje podczas inkubacji prowadzonej przez noc w 42°C w roztworze, składającym się z 50% formamidu, 5x SSC (750 m NaCl, 75 mM cytrynian sodu), 50 mM fosforanu sodu (pH 7,6), 5x odczynnika Denhardta, 10% siarczanu dekstranu i 20 pg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia, po wypłukaniu filtrów w 0,1x SSC w ok. 65°C.
Stosowany tutaj termin „domena lokalizacji w aparacie Golgiego” odnosi się do sekwencji aminokwasowej polipeptydu znajdującego się w aparacie Golgiego, która jest odpowiedzialna za jego kotwiczenie w miejscu znajdującym się w aparacie Golgiego. Ogólnie, domeny lokalizacji obejmują „ogony” enzymów znajdujące się na końcach aminowych.
PL 224 787 B1
Stosowany tutaj termin „funkcja efektorowa” odnosi się do biologicznych aktywności, którymi cechuje się region Fc (natywna sekwencja regionu Fc lub wariant sekwencji aminokwasowej regionu Fc) przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciał obejmują, ale nie ograniczają się do, powinowactwo wiązania się z receptorem Fc, cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC), fagocytozę komórkową zależną od przeciwciał (ADCP), wydzielanie cytokin, pobieranie antygenu zależne od kompleksów immunologicznych przez komórki prezentujące antygen, negatywną regulację powierzchniowych receptorów komórek, itd.
Stosowany tutaj termin „manipulować, poddane manipulacji, manipulowanie i manipulacja glik ozylacją”, ma obejmować dowolną manipulację wzorem glikozylacji naturalnie występującego polipeptydu lub jego fragmentu. Manipulowanie glikozylacją obejmuje metaboliczne manipulowanie systemem glikozylacji komórki, w tym manipulacje genetyczne szlakami syntezy oligosacharydów, w celu osiągnięcia manipulacji glikozylacją glikoprotein wyrażanych w komórkach. Dalej, manipulowanie glikozylacją obejmuje wpływ mutacji i środowiska komórki na glikozylację.
Stosowany tutaj termin „komórka gospodarza” obejmuje dowolny rodzaj układu komórkowego, który można poddać manipulacji w celu wytwarzania postaci o zmodyfikowanej glikozylacji białek, fragmentów białek lub peptydów będących obiektem zainteresowania, w tym przeciwciał, fragmentów przeciwciał i fuzji białkowych. Zwykle, komórki gospodarza zmieniono tak, aby wyrażały GnT III na optymalnym poziomie. Komórki gospodarza obejmują komórki z hodowli, np. ssacze komórki z hodowli, takie jak komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma, komórki drożdży, komórki owadów i komórki roślinne, aby tylko wymienić kilka, ale także komórki ze zwierząt transgenicznych, roślin transgenicznych lub roślin hodowlanych lub z tkanek zwierzęcych.
Stosowany tutaj termin „cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc” obejmuje cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) i cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy rozpuszczalna fuzja białkowa Fc zawierającej ludzki region Fc. Jest to mechanizm immunologiczny prowadzący do Iizy komórek opłaszczanych przez przeciwciała, powodowanej przez ludzkie, efektorowe komórki układu immunologicznego, gdzie:
„Ludzkimi, efektorowymi komórkami układu immunologicznego” są populacje leukocytów, które posiadają na swojej powierzchni receptory Fc, poprzez które wiążą się do regionów Fc przeciwciał lub fuzji białkowych Fc i wykonują funkcje efektorowe. Takie populacje mogą obejmować, między innymi, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i/lub komórki NK (NK).
„Komórki opłaszczone” przez przeciwciała to komórki związane przez przeciwciała lub fuzje białkowe Fc. Przeciwciała lub fuzje białkowe Fc wiążą się do docelowych komórek poprzez część białkową, N-końcową w stosunku do regionu Fc.
Stosowany tutaj termin „zwiększona cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc” jest zdefiniowany jako zarówno wzrost ilości „opłaszczonych przez przeciwciała komórek” poddanych lizie w danym czasie, przy danym stężeniu przeciwciał lub fuzji białkowej Fc, w pożywce otaczającej komórki docelowe, poprzez zdefiniowany powyżej mechanizm cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc, i/lub zmniejszenie stężenia przeciwciał lub fuzji białkowej Fc w pożywce otaczającej komórki docelowe, wymaganego do osiągnięcia Iizy danej liczby „opłaszczonych komórek” w danym czasie, poprzez mechanizm cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc. Wzrost cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc jest względny w stosunku do cytotoksyczności komórkowej zależnej od tego samego przeciwciała lub fuzji białkowej Fc, wytworzonego w tym samym rodzaju komórek gospodarza, z zastosowaniem tych samych standardów produkcji, oczyszczania, przygotowywania i sposobów przechowywania, znanych specjalistom w dziedzinie, ale takich, które nie zostały wytworzone w komórkach gospodarza zmanipulowanych sposobami tutaj opisanymi tak, aby wyrażały glikotransferazę GnT III.
Jako przeciwciało wykazujące zwiększoną cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) rozumie się przeciwciało wykazujące zwiększoną ADCC, wyznaczaną dowolnym, odpowiednim sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Jeden z przyjętych in vitro testów ADCC jest opisany poniżej:
1) w teście stosuje się komórki docelowe, o których wiadomo, że wyrażają antygen docelowy, rozpoznawany przez region wiążący antygen przeciwciała;
2) w teście, jako komórki efektorowe, stosuje się ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), izolowane z krwi od losowo wybranych, zdrowych dawców;
3) test wykonuje się wg poniższego protokołu:
PL 224 787 B1
i) PBMC izoluje się stosując standardowe metody wirowania faz o różnej gęstości i zawiesza się w pożywce RPMI do hodowli komórek w ilości 5 x 106 komórek/ml;
ii) komórki docelowe hoduje się standardowymi metodami hodowli tkankowych, zbiera się w wykładniczej fazie wzrostu przy żywotności wyższej niż 90%, płucze się hodowlaną pożywką RPMI, znakuje się dodając 100 mikro Curie 51Cr, płucze dwukrotnie pożywką do hodowli komórkowych i za5 wiesza w pożywce do hodowli doprowadzając do gęstości 105 komórek/ml;
iii) 100 mikrolitrów powyższej, końcowej zawiesiny komórek docelowych przenosi się do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania;
iv) przeciwciało rozcieńcza się seryjnie w przedziale od 4000 ng/ml do 0,04 ng/ml w pożywce do hodowli komórkowych i dodaje się po 50 mikrolitrów otrzymanego roztworu przeciwciała do komórek docelowych na 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania, testując w trzech powtórzeniach różne stężenia przeciwciała pokrywające cały, powyższy zakres stężeń;
v) dla kontroli maksymalnego uwalniania (MR), do 3 dodatkowych studzienek na płytce zawierające wyznakowane komórki docelowe, dodaje się 50 mikrolitrów 2% (obj./obj.) wodnego roztworu nie jonowego detergentu (Nonidet, Sigma, St. Louis) zamiast roztworu przeciwciała (punkt iv powyżej);
vi) dla kontroli spontanicznego uwalniania (SR), do 3 dodatkowych studzienek na płytce zawierające wyznakowane komórki docelowe, dodaje się 50 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych RPMI zamiast roztworu przeciwciała (punkt iv powyżej);
vii) następnie wiruje się 96-studzienkową płytkę do mikromiareczkowania przy 50 x g przez 1 minutę i inkubuje się przez 1 godzinę w 4°C;
viii) dodaje się po 50 mikrolitrów zawiesiny PBMC (punkt i powyżej) do każdej ze studzienek tak, aby osiągnąć stosunek komórek efektorowych: docelowych 25:1, płytki następnie umieszcza się w inkubatorze w atmosferze 5% CO2 i w 37°C na 4 godziny;
ix) zbiera się nadsącz wolny od komórek z każdej ze studzienek i uwolniona w czasie testu radioaktywność (ER) jest mierzona z wykorzystaniem licznika gamma;
x) procent specyficznej Iizy jest wyliczany dla każdego stężenia przeciwciała na podstawie wzoru (ER-MR)/(MR-SR) x 100, gdzie ER jest średnią radioaktywnością zliczoną (patrz punkt ix powyżej) dla tego stężenia przeciwciała, MR jest średnią radioaktywnością zliczoną (patrz punkt ix powyżej) dla kontroli MR (patrz punkt v powyżej) i SR jest średnią radioaktywnością zliczoną (patrz punkt ix powyżej) dla kontroli SR (patrz punkt vi powyżej);
4) „zwiększona ADCC” jest zdefiniowana jako zarówno wzrost maksymalnego procentu specyficznej Iizy obserwowanej dla danego, testowanego powyżej przedziału stężeń przeciwciała i/lub zmniejszenie stężenia przeciwciała wymaganego do osiągnięcia połowy maksymalnego procentu specyficznej Iizy obserwowanej dla danego, testowanego powyżej przedziału stężeń przeciwciała. Wzrost ADCC jest względny w stosunku do ADCC mierzonej w powyższym, teście, zależnej od tego samego przeciwciała wytworzonego w tym samym rodzaju komórek gospodarza, z zastosowaniem tych samych standardów produkcji, oczyszczania, przygotowywanie i sposobów przechowywania, znanych specjalistom w tej dziedzinie, ale takiego, które nie zostało wytworzone w komórkach gospodarza poddanych manipulacji sposobami tutaj opisanymi tak, aby uzyskać nadekspresję glikotransferazy GnT III.
Stosowany tutaj termin „przeciwciało anty-CD20”, oznacza przeciwciało, które specyficznie rozpoznaje fosfoproteinę powierzchni komórki o masie 35000 Daltonów, zwykle określaną jako antygen różnicowy Bp35 specyficzny dla ludzkich limfocytów B, potocznie określaną jako CD20.
Podstawą niniejszego wynalazku jest odkrycie, że manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciała tak, aby wyrażały nową fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) lub alternatywnie mającą aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”), i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, pozwala na otrzymanie przeciwciał o zwiększonym powinowactwie wiązania się z receptorem Fc i ze wzmocnionymi funkcjami efektorowymi. Alternatywnie, przeciwciała ze wzmocnionymi funkcjami efektorowymi i/lub zwiększonym wiązaniem się z receptorem Fc mnożna otrzymać manipulując komórkami wytwarzającymi przeciwciała tak, aby miały zwiększoną ekspresję cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy posiadające katalityczną aktywność α-mannozydazy II. W korzystnych wykonaniach, konstrukty fuzji posiadających aktywności GnT III lub GalT ulegają koekspresji z cząsteczkami kwasów nukleinowych kodujących Man II lub GalT II.
Zgodnie z tym, w jednym z wykonań, niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanego kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję kodującą fuzję polipeptydową, gdzie fuzja polipeptydowa ma a ktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawiera domenę lokalizacji w aparaPL 224 787 B1 cie Golgiego dla polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. W korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III, a domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji mannozydazy II. W jeszcze innym wykonaniu, domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji GalT.
Korzystnie, wyizolowany kwas nukleinowy posiada sekwencję nukleotydową pokazaną na Fig. 24 i SEK. NR ID: 12. W innym, korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III, a domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy I (GnT I). Korzystnie, wyizolowany kwas nukleinowy ma sekwencję nukleotydową pokazaną na Fig. 25 i SEK. NR ID: 14. Alternatywnie, można zastosować domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla innego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. W innym, korzystnym wykonaniu, domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybierana z grupy obejmującej domenę lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II, domenę lokalizacji mannozydazy I i domenę lokalizacji fukozylotransferazy a1-6 rdzenia.
W innym, korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanego kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję kodującą polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową pokazaną na Fig. 24 i SEK. NR ID: 13 lub Fig. 25 i SEK. NR ID: 15. Niniejszy wynalazek obejmuje także wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję, która hybrydyzuje w ostrych warunkach do sondy hybrydyzacyjnej o sekwencji nukleotydowej, która jest składnikiem sekwencji nukleotydowej pokazanej na Fig. 24 i SEK. NR ID: 12 lub Fig. 25 i SEK. NR ID: 14. Niniejszy wynalazek dotyczy dalej wyizolowanego kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję identyczną co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 93% lub 99% z sekwencją nukleotydową pokazaną na Fig. 24 i SEK. NR ID: 12 lub Fig. 25 i SEK. NR ID: 14. W innym wykonaniu, niniejszy wynalazek obejmuje także wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję kodującą polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową identyczną co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% z sekwencją aminokwasową z Fig. 24 i SEK. NR ID: 13 lub Fig. 25 i SEK. NR ID: 15. Wynalazek dotyczy także wyizolowanego kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję kodującą polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową z Fig. 24 i SEK. NR ID: 13 lub Fig. 25 i SEK. NR ID: 15, z substytucjami konserwowanych aminokwasów.
W innym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy wektora ekspresyjnego, zawierającego wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku, taki jak te opisane powyżej.
W dalszym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy fuzji polipeptydowej mającej aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III lub alternatywnie mającej aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”) i zawierającej domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. W korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa według wynalazku zawiera domenę katalityczną β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III. W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku, fuzje polipeptydowe zawierają dodatkowo domenę lokalizacji w aparacie Golgiego mannozydazy II lub β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy I (GnT I). W alternatywnym wykonaniu, domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybierana z grupy obejmującej domenę lokalizacji mannozydazy I, domenę lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II i domenę lokalizacji fukozylotransferazy a1-6 rdzenia. Fuzje polipeptydowe według niniejszego wynalazku można otrzymać hodując komórki gospodarza według niniejszego wynalazku w pożywce w warunkach pozwalających na ekspresję kwasu nukleinowego kodującego taką fuzję polipeptydową i na odzyskanie takiej fuzji polipeptydowej z otrzymanej hodowli.
Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto sposobów modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego w komórce gospodarza, co obejmuje wprowadzanie do takiej komórki gospodarza kwasu nukleinowego lub wektora według wynalazku. Korzystnie, modyfikowanym polipeptydem jest IgG lub jego fragment zawierający region Fc. Najbardziej korzystnie, polipeptydem jest IgG1 lub jego fragment zawierający region Fc. W innym, korzystnym wykonaniu, modyfikowanym polipeptydem, jest fuzja białkowa zawierająca region odpowiadający regionowi Fc ludzkiej IgG.
Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto komórek gospodarza zawierających kwasy nukleinowe lub wektory według wynalazku. W jednym z wykonań, niniejszy wynalazek dotyczy komórek gospodarza poddanych manipulacji tak, aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III lub alternatywnie mającą aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”), w ilości wystarczającej do zmodyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza, gdzie taki polipeptyd jest wybierany z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała i fuzję białkową obejmującą region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuli22
PL 224 787 B1 ny. W korzystnym wykonaniu, polipeptyd wytwarzany przez taką komórkę gospodarza to IgG lub jej fragment. Najbardziej korzystnie, jeżeli polipeptyd wytwarzany przez taką komórkę gospodarza to IgG1 lub jej fragment. Alternatywnie, polipeptyd wytwarzany przez taką komórkę gospodarza to fuzja białkowa zawierająca region odpowiadający regionowi Fc ludzkiej IgG, np. IgG1.
Modyfikowane polipeptydy wytwarzane przez komórki gospodarza według wynalazku jako rezultat modyfikacji wykazują zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc i/lub wzmocnioną funkcję efektorową. Korzystnie, zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc zwiększa wiązanie się z receptora aktywującego Fcy, takiego jak receptor FcyRIIIa. Wzmocnioną funkcją efektorową jest korzystnie zwiększenie jednego z następujących: zwiększenie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał, zwiększenie fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP), zwiększenie wydzielania cytokin, zwiększenie pobierania antygenów zależnego od kompleksów immunologicznych przez komórki prezentujące antygen, zwiększona cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc, zwiększone wiązanie się z komórkami NK, zwiększone wiązanie się z makrofagami, zwiększone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi (PMN), zwiększone wiązanie się z monocytami, zwiększone krzyżowe sieciowanie związanych docelowo przeciwciał, zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnałów indukujące apoptozę, zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych i zwiększone uczulanie komórek T.
W szczególnie korzystnym, wykonaniu komórką gospodarza według wynalazku jest komórka CHO, komórka BHK, komórka NSO, komórka SP2/0, komórka szpiczaka YO, mysia komórka szpiczaka P3X63, komórka PER, komórka PER.C6 lub komórka hybrydoma, a polipeptydem wytwarzanym, przez taką komórkę gospodarza jest przeciwciało anty-CD20, takie jak IDEC-C2B8. W innym korzystnym wykonaniu, komórką gospodarza jest chimerowe monoklonalne przeciwciało C225 anty-ludzki EGFR.
Dodatkowo, poza kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową według wynalazku, komórki gospodarza wynalazku mogą zawierać jeszcze co najmniej jeden transfekowany kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę przeciwciała, fragment przeciwciała, zachowujący funkcjonalny region Fc lub fuzję białkową, która zawiera region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny. W korzystnych wykonaniach, co najmniej jeden transfekowany kwas nukleinowy koduje przeciwciało anty-CD20, chimerowe przeciwciało monoklonalne chCE7 przeciw ludzkiemu nerwiakowi, chimerowe przeciwciało monoklonalne chG250 przeciw rakowi komórek nerki, chimerowe przeciwciało monoklonalne ING-1 przeciw ludzkim rakom okrężnicy, płuc i piersi, humanizowane monoklonalne przeciwciało 3622W94 anty-ludzki antygen 17-1A, humanizowane monoklonalne przeciwciało A33 przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka, przeciwciało R24 przeciw czerniakowi człowieka skierowane przeciwko gangliozydowi GD3, chimerowe przeciwciało monoklonalne SF-25 przeciw rakowi płaskokomórkowemu, przeciwciało anty-ludzki EGFR, przeciwciało anty-ludzki EGFRvlll, przeciwciało anty-ludzki PSMA, przeciwciało anty-ludzki PSCA, przeciwciało anty-ludzki CD22, przeciwciało anty-ludzki CD30, przeciwciało anty-ludzki TAG72, przeciwciało anty-wysokocząsteczkowy antygen związany z czerniakiem (HMWMAA), przeciwciało anty-gangliozyd GD3, przeciwciało anty-gangliozyd GD2, przeciwciało antygangliozyd GM2, przeciwciało anty-ludzki gangliozyd, przeciwciało anty-EGFRvIII, przeciwciało antyintegryna, przeciwciało anty-CD80, przeciwciało anty-LeY, przeciwciało anty-mucyna, przeciwciało anty-MUC18, przeciwciało anty-ludzki CD33, przeciwciało anty-ludzki CD38 człowieka, przeciwciało anty-ludzki CD40, przeciwciało anty-ludzki CD45, przeciwciało anty-ludzki CD52, przeciwciało antyludzki CD138, przeciwciało anty-ludzki wariant HLA-DR, przeciwciało anty-ludzki EpCAM, przeciwciało anty-ludzki CEA, przeciwciało anty-ludzki MUC1, przeciwciało anty-ludzki białko rdzenia MUC1, przeciwciało przeciw nieprawidłowo glikozylowanemu ludzkiemu MUC1, przeciwciało przeciw wariantom ludzkiej fibronektyny zawierających domenę EB-D lub przeciwciało anty-ludzki HER2/neu.
Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza obejmującego (a) hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacji tak, aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III lub alternatywnie mającą aktywność β(1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”), w warunkach pozwalających na produkcję polipeptydu, który jest wybierany z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała z zachowaniem funkcjonalnego regionu Fc i fuzję białkową obejmującą region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie taka fuzja polipeptydowa mająca aktywność GnT III lub alternatywnie aktywność GalT jest wyrażana na poziomie wystarczającym do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza; i (b) izolowanie takiego polipeptydu. W korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną β(1,4)-N-acetyloglukozoaminyloPL 224 787 B1 transferazy III. W szczególnie korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa zawiera dodatkowo domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. Korzystnie, domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji mannozydazy II lub p(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy I (GnT I). Alternatywnie, domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybierana z grupy obejmującej: domenę lokalizacji mannozydazy I, domenę lokalizacji β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II i domenę lokalizacji fukozylotransferazy a1-6 rdzenia. Polipeptydy wytworzone sposobami według niniejszego wynalazku posiadają zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc i/lub wzmocnione funkcje efektorowe. Wzmocnioną funkcją efektorową jest korzystnie zwiększenie jednego z następujących: zwiększenie cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc (w tym cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał), zwiększenie fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP), zwiększenie wydzielania cytokin, zwiększenie pobierania antygenów zależnego od kompleksów immunologicznych przez komórki prezentujące antygen, zwiększone wiązanie się z komórkami NK, zwiększone wiązanie się z makrofagami, zwiększone wiązanie się z monocytami, zwiększone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi, zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnałów indukujące apoptozę, zwiększone krzyżowe sieciowanie związanych docelowo przeciwciał, zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych lub zwiększone uczulanie komórek T. Korzystnie, zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc zwiększa wiązanie się z receptorami aktywującymi Fc, takimi jak receptor FcyRIIIa.
W innym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydu wytworzonego sposobami według wynalazku, który ma zwiększone proporcje dwuczęściowych oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu. W jeszcze innym wykonaniu, polipeptyd wytworzony sposobami według wyn alazku jako wynik takiej modyfikacji posiada zwiększone proporcje niefukozylowanych oligosachar ydów w regionie Fc. Niefukozylowane oligosacharydy mogą być typu hybrydowego lub złożonego. W szczególnie korzystnym wykonaniu, polipeptyd wytworzony w komórkach gospodarza i spos obami według wynalazku posiada zwiększone proporcje dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc. Dwuczęściowe, niefukozylowane oligosacharydy mogą być zarówno typu hybrydowego lub złożonego. W szczególności, sposoby według niniejszego wynalazku mogą być wykorzystane do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 45%, korzystniej co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 55%, korzystniej co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 65%, korzystniej co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 96%, korzystniej co najmniej 97%, korzystniej co najmniej 98%, korzystniej co najmniej 99% oligosacharydów; w regionie Fc polipeptydu jest niefukozylowanych. Sposoby według niniejszego wynalazku mogą być także wykorzystane do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 45%, korzystniej co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 55%, korzystniej co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 65%, korzystniej co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 96%, korzystniej co najmniej 97%, korzystniej co najmniej 98%, korzystniej co najmniej 99% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest dwuczęściowych. Ponadto, sposoby według niniejszego wynalazku mogą być wykorzystane do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 45%, korzystniej co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 55%, korzystniej co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 65%, korzystniej co najmniej 10%, korzystniej co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 96%, korzystniej co najmniej 97%, korzystniej co najmniej 98%, korzystniej co najmniej 99% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest dwuczęściowych, nie-fukozylowanych. Sposoby według niniejszego wynalazku mogą być także wykorzystane do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystn iej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest dwuczęściowych, hybrydowych, niefukozylowanych.
PL 224 787 B1
W innym wykonaniu, niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciało wytworzone sposobami według niniejszego wynalazku, zmienione tak, aby posiadało wzmocnione funkcje efektorowe i/lub zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc. Wzmocnioną funkcją efektorową jest korzystnie zwiększenie jednego z następujących: zwiększenie cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc (w tym cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał), zwiększenie fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP), zwiększenie wydzielania cytokin, zwiększenie pobierania antygenów zależnego od kompleksów immunologicznych przez komórki prezentujące antygen, zwiększone wiązanie się z komórkami NK, zwiększone wiązanie się z makrofagami, zwiększone wiązanie się z monocytami, zwiększone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi, zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnałów indukujące apoptozę, zwiększone krzyżowe sieciowanie związanych docelowo przeciwciał, zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych lub zwiększone uczulanie komórek T. W korzystnym wykonaniu, zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc zwiększa wiązanie się z aktywującymi receptorami Fc, najkorzystniej z receptorem FcyRIIIa. Wynalazek dotyczy ponadto fragmentów przeciwciał zawierających region Fc i fuzji białkowych zawierających region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny. Takie fragmenty przeciwciał lub fuzji białkowych wykazują zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc i/lub wzmocnione funkcje efektorowe.
Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto kompozycji farmaceutycznych zawierających przeciwciała, fragmenty przeciwciał zachowujących region Fc i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny według niniejszego wynalazku oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto stosowania takich kompozycji farmaceutycznych w sposobach leczenia nowotworów. W szczególności, niniejszy wynalazek obejmuje sposoby leczenia nowotworów obejmujące podawanie skutecznej leczniczo ilości kompozycji farmaceutycznej według wynalazku.
Niniejszy wynalazek dotyczy także komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fuzję polipeptydową, gdzie fuzja polipeptydowa ma aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego; i wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, gdzie polipeptyd ma aktywność mannozydazy II (Man II). W korzystnych wykonaniach, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzję polipeptydowa i cząsteczką kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność mannozydazy II są na tym samym lub oddzielnych wektorach ekspresyjnych. W innym, korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną GnT III. W dodatkowym, korzystnym wykonaniu, domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji Man II, β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy I, β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II, mannozydazy I lub fukozylotransferazy a1-6 rdzenia. W dalszym, korzystnym wykonaniu komórka gospodarza jest wybierana z grupy obejmującej komórkę ssaka, komórkę drożdży, komórkę owada i roślinną komórkę. Korzystnie, komórką gospodarza jest komórka CHO, komórka BHK, komórka NSO, komórka SP2/0, komórka szpiczaka YO, mysia komórka szpiczaka P3X63, komórka PER, komórka PER.C6 lub komórka hybrydoma.
Wynalazek dostarcza dalej komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, gdzie polipeptyd ma aktywność mannozydazy II (Man II) i wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, gdzie polipeptyd ma aktywność β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II (GnT II). W korzystnych wykonaniach, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzję polipeptydową, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność Man II i cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mającego aktywność GnT II są na tym samym lub oddzielnych wektorach ekspresyjnych. Jest również korzystne, gdy cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzję polipeptydową znajduje się na jednym wektorze ekspresyjnym, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność Man II i cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność GnT II są na tym samym wektorze ekspresyjnym. Jest również korzystne, gdy cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca Man II znajduje się na jednym wektorze ekspresyjnym, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzję polipeptydową i cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność GnT II są na tym samym wektorze ekspresyjnym. W innym wykonaniu, GnT II znajduje się na jednym wektorze ekspresyjnym, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzję polipeptydową i cząsteczka
PL 224 787 B1 kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność Man II są na tym samym wektorze ekspresyjnym.
W dodatkowym aspekcie, wynalazek dotyczy komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fuzję polipeptydową, gdzie fuzja polipeptydowa ma aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego; i wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, gdzie polipeptyd ma aktywność mannozydazy II (Man II). W korzystnych wykonaniach, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzję polipeptydową i cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność Man II są na tym samym lub oddzielnych wektorach ekspresyjnych. Korzystnie, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną GalT. W dodatkowym wykonaniu, domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji Man II, 3(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy I, 3(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II, mannozydazy I lub fukozylotransferazy a1-6 rdzenia. W korzystnym wykonaniu, komórka gospodarza jest wybierana z grupy obejmującej komórkę ssaka, komórkę drożdży, komórkę owada i komórkę roślinną. Korzystnie, komórką gospodarza jest komórka CHO, komórka BHK, komórka NSO, komórka SP2/0, komórka szpiczaka YO, mysia komórka szpiczaka P3X63, komórka PER, komórka PER.C6 lub komórka hybrydoma.
W dodatkowym aspekcie, wynalazek dotyczy komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fuzję polipeptydową, gdzie fuzja polipeptydowa ma aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i zawiera domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego; i wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, gdzie polipeptyd ma aktywność mannozydazy II (Man II); i wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, gdzie polipeptyd ma aktywność 3(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II (GnT II). Korzystnie, każda cząsteczka kwasu nukleinowego jest na tym samym wektorze ekspresyjnym. W odrębnym wykonaniu, każda cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje się na innym wektorze ekspresyjnym. Wynalazek przewiduje ponadto, żeby cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzję polipeptydową znajdowała się na jednym wektorze ekspresyjnym, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność Man II i cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność GnT II znajdowały się na tym samym wektorze ekspresyjnym. Wynalazek przewiduje także, żeby cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca Man II znajdowała się na jednym wektorze ekspresyjnym a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzję polipeptydową i cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność GnT II znajdowały się na tym samym wektorze ekspresyjnym. Wynalazek przewiduje także, żeby cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca GnT II znajdowała się na jednym wektorze ekspresyjnym, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzję polipeptydową i cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd mający aktywność Man II znajdowały się na tym samym wektorze ekspresyjnym. W korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną GalT. W dalszym korzystnym wykonaniu, domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji Man II, 3(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy I, 3(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II, mannozydazy I lub fukozylotransferazy a1-6 rdzenia.
Wynalazek dostarcza ponadto komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GnT III i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność Man II, w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, gdzie polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza jest wybrany z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała i fuzję białkową, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny.
Wynalazek dotyczy także komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GnT III, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający Man II i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność GnT II, w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, gdzie polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza jest wybrany z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała i fuzję białkową, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny.
PL 224 787 B1
Niniejszy wynalazek dostarcza dodatkowo komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GalT i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność Man II, w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, gdzie polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza jest wybrany z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała i fuzję białkową, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny.
W odrębnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy także komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GalT, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność Man II i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność GnT II, w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, gdzie polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza jest wybrany z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała i fuzję białkową, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny. Korzystnie, polipe ptyd wytworzony przez komórkę gospodarza, jako rezultat modyfikacji wykazuje zwiększone powinowactwo wiązania receptora Fc. W dodatkowo korzystnym wykonaniu, polipeptyd wytworzony przez komórkę gospodarza, jako wykazuje wzmocnioną funkcję efektorową w wyniku modyfikacji. Wzmocnioną funkcją efektorową jest korzystnie zwiększenie jednego z następujących: zwiększenie cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc, zwiększone wiązanie się z komórkami NK, zwiększone wiązanie się makrofagami, zwiększone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi, zwiększone wiązanie się z monocytami, zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnałów indukujące apoptozę, zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych i/lub zwiększone uczulanie komórek T.
W dodatkowymi wykonaniu, wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza, obejmujący hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GnT III i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność Man II, w warunkach pozwalających na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała i fuzję białkową, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie fuzja polipeptydowa jest wyrażana w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza; i izolowanie polipeptydu. Korzystnie, komórka gospodarza jest dalej poddana manipulacji tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność GnT II. W dodatkowym korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną GnT III. W dalszym korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa posiada dalej domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. Korzystnie, domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji mannozydazy II, β(1,2)-acetyloglukozoaminylotransferazy I, mannozydazy I, β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II lub fukozylotransferazy a1-6 rdzenia. Korzystnie, polipeptyd ma wzmocnioną funkcję efektorową w wyniku powyższej modyfikacji.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza, obejmującego hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność GalT i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność Man II, w warunkach pozwalających na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała i fuzję białkową, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, gdzie fuzja polipeptydowa jest wyrażana w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza; i izolowanie polipeptydu. W następnym wykonaniu, komórka gospodarza jest dalej poddana manipulacji tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność GnT II. Korzystnie, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną GalT. Jest także korzystne, aby fuzja polipeptydowa posiadała dalej domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. Korzystnie, domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji mannozydazy II, β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy I, mannozydazy I, β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy II lub fukozylotransferazy a1-6 rdzenia. Korzystnie, polipeptyd ma wzmocnioną funkcję efektorową w wyniku modyfikacji. Szczególnie, w korzystnym wyk oPL 224 787 B1 naniu, polipeptyd wytworzony w komórce gospodarza posiada zwiększone proporcje dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu. Korzystnie, dwuczęściowe, niefukozylowane oligosacharydy są hybrydowe. Jeszcze bardziej korzystnie, dwuczęściowe, niefuk ozylowane oligosacharydy są złożone. W korzystnym wykonaniu, co najmniej od około 10% do 95% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest dwuczęściowych, niefukozylowanych. Szczególnie korzystne jest, że około 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydów o zmienionej glikozylacji według niniejszego wynalazku jest dwuczęściowych, niefukozylowanych.
W dodatkowym korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek przewiduje, że przeciwciała podd ane manipulacjom zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku, mają wzmocnione funkcje efektorowe.
W dodatkowym wykonaniu, wynalazek dostarcza ponadto kompozycji farmaceutycznych zawierających przeciwciała poddane manipulacjom zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku. Korzystnie, kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku zawierają dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu leczenia guzów nowotworowych obejmującego podawanie skutecznej leczniczo ilości kompozycji farmaceutycznych według niniejszego wynalazku, pacjentom ich potrzebującym.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania polipeptydu mającego zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc, w komórce gospodarza, obejmujący hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego GalT i co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego Man II, w warunkach pozwalających na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała zawierający region Fc immunoglobuliny, gdzie poziom ekspresji jednego z GalT lub Man II lub obu, jest wystarczający do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, gdzie polipeptyd w wyniku modyfikacji posiada zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc; i izolowanie polipeptydu posiadającego zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc. W dodatkowo korzystnym wykonaniu, poziom ekspresji GalT pozwala na wytwarzanie cząsteczki przeciwciała lub fragmentu przeciwciała zawierającego region Fc immunoglobuliny mający zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania w komórce gospodarza polipeptydu mającego zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc, obejmującego hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego GalT i CO najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego Man II, w warunkach pozwalających na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała zawierający region Fc imnmnoglobuliny, gdzie poziom ekspresji jednego z GalT lub Man II lub obu, jest wystarczająca do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, gdzie polipeptyd ma zwiększoną cytotoksyczność komórkową w której pośredniczy Fc w wynika modyfikacji; i izolowanie polipeptydu posiadającego zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc. W korzystnym wykonaniu, powyższa komórka gospodarza zawiera dodatkowo, co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący GnT III, gdzie poziom ekspresji GnT III jest wystarczający do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza i gdzie polipeptyd ma zwiększoną cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc w wyniku modyfikacji. Korzystnie, poziom ekspresji jednego lub więcej z GalT, Man II lub GnT III jest wystarczający do tworzenia dwuczęściowych oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu. Jeszcze bardziej korzystnie, proporcja dwuczęściowych oligosacharydów w regionie Fc do wszystkich oligosacharydów w regionie Fc wynosi co najmniej 25, 35, 45, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 lub 95 procent. Korzystnie, proporcja dwuczęściowych oligosacharydów w regionie Fc do wszystkich oligosacharydów w regionie Fc wynosi, co najmniej 45 procent. W korzystnym wykonaniu dwuczęściowe oligosacharydy są złożonymi lub hybrydowymi. Korzystnie, komórką gospodarza jest komórka ssaka, komórka drożdży, komórka owada i komórka roślinna. Jeszcze bardziej korzystnie, komórką gospodarza jest komórka roślinna.
W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza obejmującego:
PL 224 787 B1
a. hodowanie komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak aby uzyskać ekspresję co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność α-mannozydazy II, w warunkach pozwalających na wytwarzanie polipeptydu wybranego z grupy obejmującej cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała, fuzję polipeptydową obejmującą region równoważny r egionowi Fc immunoglobuliny, gdzie ten polipeptyd mający aktywność α-mannozydazy II jest wyrażany na poziomie wystarczającym do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza;
b. izolowanie takiego polipeptydu wytwarzanego przez taką komórkę gospodarza.
Niniejszy wynalazek dotyczy także polipeptydów, w szczególności przeciwciał, mających wzmocnioną funkcję efektorową i/lub zwiększone wiązanie się z receptorem Fc dzięki tym zmodyfikowanym oligosacharydom, a także ich zastosowanie w kompozycjach terapeutycznych do leczenia zaburzeń, w szczególności nowotworów.
Identyfikacja i wytwarzanie kwasów nukleinowych kodujących białko, którego wzór glikozylacji chce się poddać modyfikacji.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów wytwarzania i stosowania systemów komórek gospodarza do wytwarzania glikoform przeciwciał, fragmentów przeciwciał zawierających region Fc, fuzji białkowych z regionem równoważnym regionowi Fc, mających zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc, korzystnie aktywującymi receptorami Fc, i/lub wzmocnione funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciała. W zakresie wynalazku jest identyfikacja docelowych epitopów i wytwarzanie przeciwciał mających potencjalną wartość leczniczą, dla których pożądana jest modyfikacja wzoru glikozylacji i izolacja odpowiednich kodujących je sekwencji kwasów nukleinowych.
Można zastosować różne procedury znane w tej dziedzinie do wytwarzania przeciwciał wobec docelowych epitopów będących przedmiotem zainteresowania. Takie przeciwciała obejmują, między innymi, przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, chimerowe, humanizowane, w pełni ludzkie, jednołańcuchowe, fragmenty Fab i fragmenty wytworzone dzięki bibliotece ekspresyjnej ScFv, Fab, VH, IgG. Takie przeciwciała mogą być użyteczne np. jako czynniki diagnostyczne lub lecznicze. Jako czynniki lecznicze, szczególnym przedmiotem zainteresowania są przeciwciała neutralizujące, tj. te, które konkurują z o wiązanie z ligandem, substratem lub cząsteczką adaptorową.
W celu otrzymania przeciwciał, immunizuje się różne zwierzęta gospodarza przez wstrzyknięcie docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania w tym, między innymi, króliki, myszy, szczury itd. Przeciwciała poliklonalne można otrzymać w zwierzętach poprzez wielokrotne podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) wstrzyknięcie odpowiedniego antygenu i adiuwanta. Można zastosować różne adiuwanty, aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną, w zależności od gatunków gospodarza w tym, ale bez ograniczania do, adiuwant Freunda (pełny lub niepełny), żele mineralne takie jak wodorotlenek glinu, substancje czynne powierzchniowo takie jak lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, peptydy, saponina, emulsje olejowe, hemocjanina ze skałoczepa, dinitrofenol i potencjalnie użyteczne adiuwanty ludzkie, takie jak BCG (Bacille Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Zwierzęta immunizuje się przeciw antygenowi, immunogennym koniugatom lub pochodnym łącząc np. 100 g lub 5 g białka lub koniugatu (odpowiednio dla królików lub myszy) z 3 objętościami pełnego adiuwanta Freunda i wstrzykując roztwór śródskórnie w wielu miejscach. Miesiąc później, zwierzętom podaje się zastrzyk wzmacniający w ilości 1/5 do 1/10 wyjściowej ilości peptydu lub koniugatu w pełnym adiuwancie Freunda podając śródskórnie w wielu miejscach. Siedem do 14 dni później skrwawia się zwierzęta i oznacza się w surowicy miano przeciwciała. Zwierzętom podaje się zastrzyk wzmacniający aż do osiągnięcia plateau mian. Korzystnie, zwierzętom podaje się zastrzyk wzmacniający z koniugatem tego samego antygenu, ale skoniugowanym. z innym białkiem i/lub poprzez inny odczynnik sieciujący. Koniugaty można otrzymać także w hodowlach zrekombinowanych komórek jako fuzje białkowe.
Przeciwciała monoklonalne dla celu będącego przedmiotem zainteresowania można otrzymać z wykorzystaniem dowolnej techniki pozwalającej na wytwarzanie cząsteczek przeciwciała przez ciągłe linie komórkowe w hodowli. Obejmuje to, między innymi, techniki hybrydoma najpierw opisane przez Kohlera i Milsteina, Nature 255: 495-97 (1975), techniki hybrydoma limfocytów B człowieka (Kosbor i wsp., Immunology Today 4: 72 (1983); Cote i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 202630 (1983) i techniki hybrydoma EBV (Cole i wsp., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77-96 (Alan R. Liss, Inc., 1985)). Dodatkowo, można zastosować techniki opracowane do wytwarzania „przeciwciał chimerowych” (Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-55 (1984); Neuberger i wsp., Nature 312: 604-08 (1984); Takeda i wsp., Nature 314: 452-54 (1985)) wykorzystujące
PL 224 787 B1 składanie genów dla cząsteczki mysiego przeciwciała o specyficzności wobec odpowiedniego antyg enu z genami dla cząsteczki ludzkiego przeciwciała o odpowiedniej aktywności biologicznej. Techniki te również mogą być wykorzystane do wytwarzania przeciwciał chimerowych zawierających cząsteczkę przeciwciała pochodząca od innych ssaków. Alternatywnie, można zaadoptować techniki opisane dla wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych (zgłoszenie patentowe USA nr 4,945,778) do otrzymywania przeciwciał jednołańcuchowych posiadających pożądaną specyficzność. Wynalazek dotyczy dalej humanizowanych przeciwciał, które poddano zmianom glikozylacji według sposobów obecnego wynalazku. Techniki otrzymywania humanizowanych przeciwciał opisano, np. w zgłoszeniu patentowym USA nr należącym do Queen i wsp., którego całą zawartość włączono tutaj w całości.
Stosując znane techniki można otrzymać fragmenty przeciwciał zawierające miejsca specyficznego wiązania się z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Na przykład, takie fragmenty obejmują, między innymi, fragmenty F(ab')2, które można otrzymać po trawieniu pepsyną cząsteczki przeciwciała i fragmenty Fab, które można otrzymać redukując mostki dwusiarczkowe fragmentów F(ab')2. Alternatywnie, można skonstruować biblioteki ekspresyjne Fab (Huse i wsp., Science 246: 1275-81 (1989)), aby pozwolić na szybką i łatwą identyfikację monoklonalnych fragmentów Fab o pożądanej specyficzności wobec białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Po zidentyfikowaniu przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, których wzór glikozylacji chce się poddać modyfikacji, izoluje się kodujące je sekwencje kwasów nukleinowych przy pomocy znanych technik.
a. Otrzymywanie linii komórkowych do wytwarzania białek ze zmienionym wzorem glikozylacji.
Niniejszy wynalazek dostarcza systemów ekspresji w komórkach gospodarza do otrzymywania białek ze zmienionym wzorem glikozylacji. W szczególności, niniejszy wynalazek dostarcza systemów ekspresji w komórkach gospodarza do otrzymywania glikoform białek, posiadających podniesioną wartość leczniczą. Tak, więc, w jednym z aspektów, wynalazek dostarcza systemów ekspresji w k omórkach gospodarza wybrane lub poddane manipulacjom tak, aby wyrażały np. fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. Szczególnie, takie systemy ekspresji w komórkach gospodarza można poddać manipulacjom tak, aby zawierały rekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą taką fuzję polipeptydową, połączoną funkcjonalnie z konstytutywnym lub regulowanym systemem promotorowym.
W jednym konkretnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza komórki gospodarza podd anej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. W jednym, z aspektów, komórka gospodarza jest poddana manipulacji poprzez zastosowanie najmniej jednej cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej gen kodujący fuzję pol ipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego.
Ogólnie, wyjściowo może być zastosowana dowolna, hodowlana linia komórkowa w celu opracowania linii komórkowej gospodarza według niniejszego wynalazku. W korzystnym wykonaniu, w celu otrzymania linii komórkowej gospodarza według niniejszego wynalazku stosuje się jako wyjściową linię komórkową komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma lub inne komórki ssacze, komórki drożdży, komórki owadów lub komórki roślinne. (Patrz Ma, J.K.C. i wsp., Nature Genetics 4: 794-805 (October 2003) (której cała zawartość i odniesienia tam cytowane włączone są tu w całości jako odniesienie).
Zakłada się, że wynalazek obejmuje dowolną poddaną manipulacjom linię komórek gospodarza wyrażającą fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, tak jak tutaj zdefiniowano.
Jeden lub kilka kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, może być poddawanych ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora lub alternatywnie, regulowanego sytemu ekspresji. Odpowiednie regulowane systemy ekspresji obejmują, między innymi, system ekspresji regulo30
PL 224 787 B1 wany tetracykliną, system ekspresji indukowany ekdyzonem, system ekspresji uruchamiany lac, system ekspresji i indukowany glukokortykoidami, system promotorowy indukowany temperaturą lub system ekspresji metalotioneiny indukowany metalem. Jeżeli układ komórek gospodarza zawiera szereg różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, część z nich można poddać ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora, podczas gdy inne są poddawane ekspresji pod kontrolą regulowanego promotora. Maksymalny poziom ekspresji to najwyższy, możliwy poziom stabilnej ekspresji fuzji polipeptydowej, który nie wywiera znaczącego, negatywnego wpływu na tempo wzrostu komórki, i możliwy jest do wyznaczenia standardowymi metodami eksperymentalnymi. Poziomy ekspresji wyznacza się metodami ogólnie znanymi w tej dziedzinie, w tym analizą immunologiczną na filtrach z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec polipeptydu mającego aktywność GnT III lub przeciwciał specyficznych wobec znacznika peptydowego połączonego z polipeptydem mającym aktywność GnT III, hybrydyzacją Northern z wykorzystaniem sondy w postaci kwasu nukleinowego specyficznego do genu kodującego polipeptyd mający aktywność GnT III lub mierząc aktywność GnT III. Alternatywnie, można zastosować lektynę, która wiąże się do produktów biosyntetycznych GnT III, na przykład, E4-PHA lektynę. Alternatywnie, można zastosować test funkcjonalny, w którym mierzy się zwiększone wiązanie do receptora Fc lub zwiększone funkcje efektorowe przeciwciał, otrzymanych w komórkach poddanych manipulacji przy użyciu kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność GnT III. W innym alternatywnym, wyjściu, kwas nukleinowy może być połączony funkcjonalnie z genem reporterowym; poziomy ekspresji fuzji polipeptydowej mającej aktywność β(1,4)-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającej domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego wyznacza się mierząc sygnał związany z poziomem ekspresji genu reporterowego. Gen reporterowy może ulegać transkrypcji je dnocześnie z kwasem(ami) nukleinowym(ymi) kodującym fuzję polipeptydową jako pojedyncza cząsteczka RNA; ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone zarówno poprzez wewnętrzne miejsce przyłączania rybosomów (IRES) lub przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Gen reporterowy może ulegać translacji razem, z co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, tak, że powstaje pojedynczy łańcuch polipeptydowy. Kwasy nukleinowe kodujące fuzje polipeptydowe według niniejszego wynalazku mogą być połączone funkcjonalnie z genem reporterowym pod kontrolą pojedynczego promotora, tak, że kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową i gen reporterowy są transkrybowane do jednej cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana na dwie oddzielne cząsteczki RNA informacyjnego (mRNA); jeden z otrzymanych mRNA podlega translacji do białka reporterowego, a inny jest podlega translacji do fuzji polipeptydowej.
Jeżeli ekspresji podlega kilka różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, mogą być one ułożone w taki sposób, że są transkrybowane jako jedna lub szereg cząsteczek mRNA. Jeżeli są transkrybowane jako jedna cząsteczka mRNA, ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone zarówno poprzez wewnętrzne miejsce przyłączania rybosomów (IRES) lub przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Mogą być transkrybowane z jednego promotora do cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana do szeregu oddzielnych cząsteczek RNA informacyjnego (mRNA), które, wtedy są poddawane translacji do odpowiednich, kodowanych przez nie fuzji polipeptydowych.
W innych wykonaniach, niniejszy wynalazek dostarcza systemów ekspresji w komórkach gospodarza do wytwarzania przeciwciał leczniczych, posiadających zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc, w szczególności wiązanie do aktywacyjnych receptorów Fc i wzmocnione funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał. Ogólnie, ekspresyjne systemy komórek gospodarza poddano manipulacji i/lub wybrano tak, aby uzyskać ekspresję kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało, dla którego pożądane jest wytwarzanie zmienionej glikoformy, razem, z co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. W jednym z wykonań, system komórek gospodarza transfekowano co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodująPL 224 787 B1 cym taką fuzję polipeptydową. Zwykle, stransfekowane komórki są selekcjonowane w celu identyfikacji i izolacji klonów, które stabilnie wyrażają fuzję polipeptydową według niniejszego wynalazku.
Wyjściowo może być zastosowana dowolna, hodowlana linia komórkowa w celu opracowania linii komórkowej gospodarza według niniejszego wynalazku. W korzystnym wykonaniu, można zastosować komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma, inne komórki ssacze, komórki drożdży, komórki owadów lub komórki roślinne. Zwykle, takie komórki poddaje się manipulacji tak, aby zawierały, co najmniej jeden transfekowany kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała zawierający region Fc immunoglobuliny lub fuzję białkową, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny. Zwykle, takie linie komórkowe wytwarzające przeciwciała pochodzą od klonów wytwarzających i wydzielających przeciwciała z wysoką specyficznością wytwarzania w zakresie od 20 do 120 pg/(komórkę dziennie). W alternatywnym wykonaniu, jako wyjściowa linia komórkowa w celu opracowania poddanych manipulacji komórek gospodarza według wynalazku, można zastosować linię komórek hybrydoma, wyrażającą konkretne przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania.
W jednym z wykonań, kwasy nukleinowe kodujące przeciwciało, fragment przeciwciała lub fuzję polipeptydową Fc, klonuje się na wektorach do ekspresji przeciwciał, a następnie transfekuje do komórek gospodarza i klony komórek selekcjonuje i przeszukuje się pod kątem wysokiej i stabilnej produkcji specyficznych przeciwciał. Takie wyselekcjonowane klony są następnie transfekowane wektorami ekspresyjnymi dla glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny, zawierającymi kwasy nukleinowe kodujące na przykład (a) fuzję polipeptydową mającą aktywność beta (1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) lub (b) fuzję polipeptydową mającą aktywność beta 1,4-galaktozylotransferazy (GalT) lub (c) polipeptyd mający aktywność alfa-mannozydazy II (Man II) aparatu Golgiego (d) fuzję polipeptydową mającą aktywność GnT III lub (e) fuzję polipeptydową mającą aktywność GalT i kolejny polipeptyd mający aktywność Man II. Klony są następnie selekcjonowane i przeszukiwane pod kątem stabilnej ekspresji genów kodujących przeciwciała na poziomach pozwalających na wysoką specyficzność wytwarzania przeciwciał przy stabilnej ekspresji genów glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny na poziomach pozwalających na modyfikację wzoru glikozylacji r egionu Fc, w tym na zwiększenie udziału frakcji niefukozyIowanych oligosacharydów, które mogą być zarówno dwuczęściowe lub nie dwuczęściowe, i które dalej mogą być typu złożonego lub hybrydowego, który jest związany ze zwiększeniem wiązania się z receptorem Fc, w szczególności ze wzrostem powinowactwa wiązania Fc-FcyRIII i ze wzmocnieniem, funkcji efektorowych zależnych od Fc, w tym, między innymi, cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc. Metody selekcji i przeszukiwania opisano poniżej.
W innym wykonaniu, odwrócona jest kolejność dwóch transfekcji opisanych powyżej, a mianowicie transfekcji wektorami do ekspresji przeciwciał i transfekcji wektorami do ekspresji glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny, tj. komórki gospodarza są najpierw transfekowane wektorami do ek spresji glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny a następnie wektorami do ekspresji przeciwciał. W takim podejściu, klony z pierwszej transfekcji mogą być przeszukane pod kątem odpowiednich poziomów stabilnej ekspresji genów glikotransferaz dowolną metodą opisaną dalej poniżej lub alternatywnie można poddać przejściowej transfekcji repliki takich klonów z wektorami do ekspresji przeciwciał i wtedy można zastosować metody przeszukiwania opisane dalej poniżej, w celu identyfikacji klonów o stabilnej ekspresji genów glikotransferaz na poziomach pozwalających na modyfikację wzoru glikozylacji regionu Fc prowadzącego do zwiększenia powinowactwa wiązania się z receptorami Fc, w tym receptorów Fc-FcyRIII i do wzmocnienia funkcji efektorowych, w których pośredniczy Fc, w tym cytotoksyczności komórkowej zależnej od Fc.
W dalszym wykonaniu, transfekuje się jednocześnie genami kodującymi przeciwciała i genami glikotransferaz w pojedynczej transfekcji, zarówno jednym wektorem ekspresyjnym lub oddzielnymi wektorami.
Zwykle, co najmniej jeden kwas nukleinowy w systemie komórki gospodarza koduje fuzję polipeptydową mającą aktywność β(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) lub alternatywnie β(1,4)-galaktozylotransferazy i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego lub alternatywnie koduje polipeptyd o aktywności α-mannozydazy II (Man II) z aparatu Golgiego.
Jeden lub kilka kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową według wynalazku może być poddawanych ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora lub alternatywnie, regulowanego
PL 224 787 B1 sytemu ekspresji. Odpowiednie regulowane systemy ekspresji obejmują, między innymi, system ekspresji regulowany tetracykliną, system ekspresji indukowany ekdyzonem, system ekspresji uruchamiany lac, system ekspresji indukowany glukokortykoidami, system promotorowy indukowany temperaturą lub system ekspresji metalotioneiny indukowany metalem. Jeżeli układ komórek gospodarza zawiera szereg różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, część z nich może podlegać ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora, podczas gdy inne są wyrażane pod kontrolą regulowanego promotora. Maksymalny poziom ekspresji to najwyższy, możliwy poziom stabilnej ekspresji fuzji polipeptydowej, który nie wywiera znaczącego, negatywnego wpływu na tempo wzrostu komórki, i możliwy jest do wyznaczenia standardowymi metodami eksperymentalnymi. Poziomy ekspresji wyznacza się metodami ogólnie znanymi w tej dziedzinie, w tym analizą immunologiczną na filtrach z wykorzystaniem np. przeciwciał specyficznych wobec polipeptydu mającego aktywność GnT IlI lub przeciwciał specyficznych wobec znacznika peptydowego połączonego z polipeptydem mającym aktywność GnT III, hybrydyzacją Northern z wykorzystaniem sondy w postaci kwasu nukleinowego specyficznego np. do genu kodującego polipeptyd mający aktywność GnT III lub mierząc aktywność enzymatyczną GnT III. Alternatywnie, można zastosować lektynę, która wiąże się do produktów biosyntetycznych GnT III, na przykład, E4-PHA lektynę. Alternatywnie, można zastosować test funkcjonalny, w którym mierzy się zwiększone wiązanie do receptora Fc lub zwiększone funkcje efektorowe przeciwciał, otrzymanych w komórkach zmanipulowanych kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd mający aktywność GnT III. W innym alternatywnym wyjściu, kwas nukleinowy może być operacyjnie połączony z genem reporterowym; poziomy ekspresji fuzji polipeptydowej według wynalazku wyznacza się mierząc sygnał związany z poziomem ekspresji genu reporterowego. Gen reporterowy może ulegać transkrypcji jednocześnie z kwasem(ami) nukleinowym(ymi) kodującym rzeczone glik otransferazy modyfikujące glikoproteiny jako pojedyncza cząsteczka RNA; ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone zarówno poprzez wewnętrzne miejsce przyłączania rybosomów (IRES) lub przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Gen reporterowy może ulegać translacji razem, z co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, tak, że powstaje pojedynczy łańcuch polipeptydowy. Kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową według niniejszego wynalazku może być połączony funkcjonalnie z genem reporterowym pod kontrolą pojedynczego promotora, tak, że kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową według wynalazku i gen reporterowy są transkrybowane do cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana do dwóch oddzielnych cząsteczek RNA informacyjnego (mRNA); jeden z otrzymanych mRNA ulega translacji do takiego białka reporterowego, a inny ulega translacji do fuzji polipeptydowej.
Jeżeli ekspresji podlega kilka różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, mogą być one ułożone w taki sposób, że są transkrybowane jako jedna lub szereg cząsteczek mRNA. Jeżeli są transkrybowane jako jedna cząsteczka mRNA, ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone zarówno poprzez wewnętrzne miejsce przyłączania rybosomów (IRES) lub przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Mogą być transkrybowane z jednego promotora do cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana do szeregu oddzielnych cząsteczek RNA informacyjnego (mRNA); które, ulegają wtedy translacji do odpowiednich, kodowanych przez nie fuzji polipeptydowych.
i. Systemy ekspresji
Można zastosować metody znane specjalistom w tej dziedzinie, aby skonstruować wektory ekspresyjne zawierające sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, razem z odpowiednimi sygnałami kontroli transkrypcji/translacji. Metody te obejmują techniki rekombinacji DNA in vitro, techniki syntezy i rekombinacji in vivo/rekombinacji genetycznej. Dla przykładu patrz na techniki opisane przez Maniatis i wsp., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) i przez Ausubel i wsp.,
PL 224 787 B1
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989).
Do ekspresji sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową według niniejszego wynalazku można zastosować szereg systemów gospodarz-wektor ekspresyjny. Korzystnie, stosowane są komórki ssacze jako system komórek gospodarza transfekowany wektorami ekspresyjnymi będącymi DNA rekombinowanego plazmidu lub DNA rekombinowanego kosmidu, zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową. Najkorzystniej, jako system komórek gospodarza można zastosować komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma, inne komórki ssacze, komórki drożdży, komórki owadów lub komórki roślinne. Pewne przykłady systemów ekspresji i metod selekcji opisano w następujących odnośnikach, i w odnośnikach w nich zawartych: Borth i wsp., Biotechnol. Bioen. 71(4): 266-73 (2000-2001), w Werner i wsp., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8): 870-80 (1998), w Andersen and Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13: 117123 (2002), w Chadd and Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12: 188-194 (2001) i w Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001). W innych wykonaniach można rozważać stosowanie innych systemów eukariotycznych komórek gospodarza, w tym, komórek drożdży transformowanych zrekombinowanymi drożdżowymi wektorami ekspresyjnymi zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową według niniejszego wynalazku; systemu komórek owadów infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjn ymi (np. pochodzącymi od bakulowirusów) zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem, zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową według niniejszego wynalazku; systemu komórek roślinnych infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. pochodzącymi od wirusa mozaiki kalafiora, CaMV; od wirusa mozaiki tytoniu, TMV) lub transformowanych rekombinowanymi wektorami ekspresyjnymi pochodzącymi od plazmidów (np. plazmidu Ti) zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową według niniejszego wynalazku lub systemy komórek zwierzęcych infekowanych rekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. pochodzącymi od adenowirusów, wirusa ospy krowiej), w tym linie komórkowe poddane manipulacjom tak, aby zawierały wiele kopii DNA kodujących białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową według wynalazku, zarówno amplifikowane stabilnie (CHO/dhfr) lub nie stabilnie amplifikowane w chromosomach typu „duble-minute” (np. mysie linie komórkowe).
W sposobach według tego wynalazku, ogólnie, stabilna ekspresja jest korzystniejsza od przejściowej, ponieważ zwykle pozwala osiągnąć bardziej powtarzalne wyniki i jest także bardziej odp owiednia dla wytwarzania na dużą skalę, tj. wytwarzania przeciwciał o zmienionej glikozylacją według niniejszego wynalazku w liniach komórkowych dla skali produkcyjnej. Zamiast wykorzystywać wektory ekspresyjne zawierające wirusowe ośrodki replikacji, komórki gospodarza można transformować odpowiednimi, kodującymi kwasami nukleinowymi, kontrolowanymi poprzez odpowiednie elementy kontrolujące ekspresję (np. promotor, wzmacniacz, sekwencje, terminatory transkrypcji, miejsca poliadenylacji itp.) i marker selekcyjny. Po wprowadzeniu obcego DNA, pozwala się, aby poddane manipulacji komórki wzrastały przez 1 -2 dni we wzbogaconych pożywkach, a następnie przenosi się je do pożywek selekcyjnych. Marker selekcyjny na z zrekombinowanych plazmidach nadaje oporność na selekcję i pozwala na selekcję komórek, w których plazmidy są włączone stabilnie do ich chromosomów i na wzrost powodujący powstawanie foci, które dzięki temu można klonować i namnażać otrzymując linie komórkowe.
Można zastosować szereg systemów selekcji, w tym, między innymi geny kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (Wigier i wsp., Cell 11: 223 (1977)), fosforybozylotransferazy hypoksantyna-gunina (Szybalska i Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026 (1962)), fosforybozylotransferazy adeninowej (Lowy i wsp., Cell 22: 817 (1980)), które można zastosować odpowiednio w komórkach tk-, hgprt- lub aprt-. Można zastosować także oporność na antymetabolity jako podstawę do selekcji na dhfr, który nadaje oporność na metotreksat (Wigier i wsp., Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567 (1989); O'Hare i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981)); gpt, który nadaje oporność na kwas mikofenolowy (Mulligan i Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981)); neo, który nadaje oporność na aminoglikozyd G-418 (Colberre-Garapin i wsp., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)); i hygro, który nadaje oporność na higromycynę (Santerre i wsp., Gene 30: 147 (1984). Ostatnio opisano dodatkowe geny selekcyjne, mianowicie trpB, który pozwala komórkom na rozkład indolu zamiast tryptofanu; hisD, który
PL 224 787 B1 pozwala komórkom na rozkład histynolu zamiast histydyny (Hartman i Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047 (1988)); system syntazy glutaminy i ODC (dekarboksylazy ornitynowej), który nadaje oporność na inhibitor dekarboksylazy ornitynowej, 2-(difIuorometyIo)-DL-ornitynę, DFMO (McConlogue, w: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)).
ii. Identyfikacja transfektantów lub transformantów, które wyrażają białko o zmienionym wzorze glikozylacji.
Komórki gospodarza, które zawierają sekwencję kodującą i które wyrażają biologicznie aktywne produkty genów można identyfikować wykorzystując, co najmniej cztery ogólne podejścia: (a) hybrydyzację DNA-DNA lub DNA-RNA; (b) obecność lub brak funkcji genu „markerowego”; (c) oznaczanie poziomu transkrypcji określanego poprzez pomiar ekspresji odpowiednich transkryptów mRNA w komórce gospodarza; (d) wykrywanie produktów genów poprzez pomiar w testach immunologicznych lub poprzez jego aktywność biologiczną.
W pierwszym podejściu, obecność sekwencji kodującej białko będące przedm iotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową według wynalazku, wstawionych do wektora ekspresyjnego, można wykrywać poprzez hybrydyzację DNA-DNA lub DNA-RNA z zastosowaniem sond zawierających sekwencje nukleotydowe, które są homologiczne odpowiednio do odpowiednich sekwencji kodujących, ich części lub pochodnych.
W drugim podejściu, system zrekombinowany wektor ekspresyjny/gospodarz może być identyfikowany i selekcjonowany na podstawie obecności lub braku funkcji konkretnego genu „markerowego” (np., aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki, oporności na metotreksat, fenotypu po transformacji, tworzenia ciał okluzyjnych w bakulowirusach, itd.). Na przykład, jeżeli sekwencja kodująca białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencja kodującą fuzję polipeptydową według wynalazku została wstawiona do sekwencji genu markerowego na wektorze, rekombinanty zawierające odpowiednie sekwencje kodujące można identyfikować poprzez brak funkcji genu markerowego. Alternatywnie, gen markerowy może być umieszczony tandemowo z sekwencjami kodującymi pod kontrolą tego samego lub innego promotora, wykorzystywanego do kontrolowania ekspresji sekwencji kodujących. Ekspresja markera w odpowiedzi na indukcję lub selekcję wskazuje na ekspresję s ekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową.
W trzecim podejściu, w testach hybrydyzacyjnych można określać aktywność transkrypcyjną regionu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową według wynalazku. Na przykład, można wyizolować RNA i poddać analizie Northern z wykorzystaniem sondy homologicznej do sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową według wynalazku lub do ich konkretnego fragmentu. Alternatywnie, można wyizolować całkowite kwasy nukleinowe komórki gospodarza i poddać analizie h ybrydyzacyjnej z takimi sondami.
W czwartym podejściu, ekspresję produktów białkowych białka będącego przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, można określać immunologicznie, np. w testach immunologicznych na filtrach, testach immunologicznych takich jak radioimmunologiczne testy precypitacji, testy immunoenzymatyczne i tym podobnych. Jednakże, ostateczny test działania systemu ekspresyjnego, obejmuje wykrywanie aktywnych biologicznie produktów genów.
b. Wytwarzanie i stosowanie białek i fragmentów białek o zmienionych wzorach glikozylacji. i. Wytwarzanie i stosowanie przeciwciał o zwiększonych funkcjach efektorowych, w tym cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał.
W korzystnych wykonaniach, niniejszy wynalazek dostarcza glikoform przeciwciał i fragmentów przeciwciał, mających zwiększone wiązanie się z receptorem Fc i/lub wzmocnione funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał.
Testy kliniczne niekoniugowanych przeciwciał monoklonalnych (mAB) w leczeniu pewnych typów raka dostarczyły ostatnio zachęcających wyników. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12: 223-25 (1997); Deo i wsp., Immunology Today 18: 127 (1997). Chimerowe, niekoniugowane IgG1 zostały zaaprobowane w leczeniu nieziarniczego chłoniaka z limfocytów B o niskim stopniu zróżnicowania, Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12: 223-25 (1997), podczas, gdy inne, niekoniugowane mAb, humanizowane IgG1 przeciw litym guzom piersi, także wykazywało obiecujące wyniki w fazie III testów klinicznych. Deo i wsp., Immunology Today 18: 127 (1997). Antygeny dla tych dwóch mAb
PL 224 787 B1 są wyrażane na wysokich poziomach w odpowiadającym im komórkach nowotworowych i przeciwciała pośredniczą w silnym niszczeniu przez komórki efektorowe in vitro i in vivo. Dla odmiany, wiele innych niekoniugowanych mAb o wysokich specyficznościach wobec nowotworu nie może uruchamiać wystarczająco silnych funkcji efektorowych dla stosowania klinicznego. Frost i wsp., Cancer 80: 317-33 (1997); Surfus i wsp., J. Immunother. 19: 184-91 (1996). Dla tych słabszych mAb, bada się obecnie leczenie z wykorzystaniem dodatkowych cytokin. Dodanie cytokin może stymulować cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) poprzez wzrost aktywności i ilości krążących limfocytów. Frost i wsp., Cancer 80: 317-33 (1997); Surfus i wsp., J. Immunother. 19: 184-91 (1996). ADCC, atak lityczny na komórki opłaszczone przeciwciałami, jest uruchamiany przez związanie receptorów leukocytów do regionu stałego (Fc) przeciwciał. Deo i wsp., Immnunology Today 18: 127 (1997).
Inne, ale uzupełniające podejście do wzmocnienia aktywności ADCC niekoniugowanych przeciwciał IgG1 to manipulowanie regionem Fc przeciwciała. Badania z manipulowaniem białkami wykazały, że FcyR oddziałują z niższym regionem zawiasowym domeny CH2 IgG. Lund i wsp., J. Immunol. 157: 4963-69 (1996). Jednakże, wiązanie FcyR wymaga także obecności oligosacharydów związanych kowalencyjnie do konserwowanego Asn297 w regionie CH2 Lund i wsp., J. Immunol. 157: 496369 (1996); Wright i Morrison, Trends Biotech. 15: 26-31 (1997), co sugeruje, że zarówno oligosacharyd i polipeptyd, oba bezpośrednio składają się na miejsce oddziaływania lub to, że oligosacharyd jest wymagany do zachowania konformacji aktywnego polipeptydu CH2. Tak, więc, modyfikacje struktury oligosacharydu mogą być badane jako środki zwiększające powinowactwo w oddziaływaniu.
Cząsteczka IgG posiada dwa połączone poprzez N oligosacharydy w regionie Fc, po jednym na każdym ciężkim łańcuchu. Jak każda glikoproteina, przeciwciało jest wytwarzane jako populacja glik oform, które mają taki sam szkielet polipetydowy ale mają różne oligosacharydy przyłączone do miejsc glikozylacji. Oligosacharydy znajdujące się zwykle w regionie Fc surowiczych IgG są typu złożonego lub dwuramiennego (Wormald i wsp., Biochemistry 36: 130-38 (1997)), o niskim poziomie końcowych podstawników kwasu sjalowego i rozdzielających na dwie części N-acetyloglukozoamin (GlcNAc) i o różnym stopniu końcowej glikozylacji i fukozylacji rdzenia. Pewne badania sugerują, że minimalna struktura węglowodanowa wymagana do wiązania FcyR zawarta jest w rdzeniu oligosacharydowym. Lund i wsp., J. Immunol. 157: 4963-69 (1996).
Linie komórkowe pochodzące od myszy lub chomika używane w przemyśle lub w badaniach akademickich do wytwarzania niekoniugowanych, leczniczych mAb zwykle przyłączają wymagane detrminanty oligosacharydowe do miejsc Fc. IgG wyrażane w tych liniach komórkowych nie posiadają jednak rozdzielającej na dwie części N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) znalezionej w małej ilości w surowiczych IgG. Lifely i wsp., Glycobiology 318: 813-22 (1995). Dla odmiany, ostatnio obserwowano, że pewne postacie glikozylacji szczurzego, wytworzonego przeciw czerniakowi, humanizowanego IgG (CAMPATH-1H) niosą rozdzielającą na dwie części GlcNAc. Lifely i wsp., Glycobiology 318: 813-22 (1995). Przeciwciało pochodzące z komórki szczurzej, osiąga podobny, maksymalny poziom aktywności ADCC in vitro jak przeciwciało CAMPATH-1H wytworzone w standardowych liniach komórkowych, ale przy znacząco niższych stężeniach przeciwciała.
Antygen CAMPATH jest zwykle obecny na wysokim poziomie na komórkach chłoniaka i jego chimerowe mAb mają wysoką aktywność ADCC przy braku rozdzielającej na dwie części GlcNAc. Lifely i wsp., Glycobiology 318: 813-22 (1995). W szlaku glikozylacji poprzez N, rozdzielająca na dwie części GlcNAc jest dodawana przez enzym 3(1,4)-N-acetyloglukozoaminylotransferazę III (GnT III). Schachter, Biochem. Cell Biol. 64: 163-81 (1986).
W poprzednich badaniach wykorzystano linię komórkową CHO wytwarzającą pojedyncze przeciwciało, która wcześniej poddano manipulacji tak, aby wyrażała w sposób regulowany zewnętrznie, różne poziomy sklonowanego genu enzymu GnT III (Umana, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176180 (1999)). Podejście to, po raz pierwszy wykazało silny związek pomiędzy ekspresją GnT III i aktywnością ADCC modyfikowanego przeciwciała.
Dalsze przeciwciała według wynalazku, posiadające zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc i wzmocnioną funkcję efektorową obejmują, między innymi, przeciwciało monoklonalne (chCE7) przeciw ludzkiemu nerwiakowi wytworzone sposobami według wynalazku, chimerowe przeciwciało monoklonalne (chG250) przeciw rakowi komórek nerki wytworzone sposobami według wynalazku, humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-HER2 (np. Trastuzumab (HERCEPTIN)) wytworzone sposobami według wynalazku, chimerowe przeciwciało monoklonalne (IKG-1) przeciw ludzkim rakom okrężnicy, płuc i piersi wytworzone sposobami według wynalazku, humanizowane m onoklonalne przeciwciało anty-ludzki antygen 17-1A (3622W94) wytworzone sposobami według wyna36
PL 224 787 B1 lazku, humanizowane monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka (A33) wytworzone sposobami według wynalazku, przeciwciało przeciw czerniakowi człowieka skierowane przeciwko gangliozydom GD3 (R24) wytworzone sposobami według wynalazku, chimerowe przeciwciało monoklonalne przeciw rakowi płaskokomórkowemu (SF-25) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw drobnokomórkowemu rakowi płuc człowieka (BEC2, ImClone Systems, Merck KgaA) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw chłoniakowi nieziarniczemu człowieka (Bexxar (tositumomab, Coulter Pharmaceuticals), Oncolym (Techniclone, Alpha Therapeutic)) wytworzone sposobami według wynalazku, przeciwciało monoklonalne przeciw rakowi płaskokomórkowemu głowy i szyi człowieka (C225, ImClone Systems) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka (Panorex (edrecolomab), Centocor, Glaxo Wellcome) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi jajników człowieka (Theragyn, Antisoma) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw ostrej białaczki szpikowej człowieka (SmartM195, Protein Design Labs, Kanebo) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw złośliwemu glejakowi człowieka (Cotara, Techniclone, Cambridge Antibody Technology) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw chłoniakowi człowieka wywodzącemu się z limfocytów B (IDEC-Y2B8, IDEC Pharmaceuticals) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw litym guzom człowieka (CEA-Cide, Immunomedics) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka (lodine 131 -MN-14, Immunomedics) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi jajników, nerki, piersi i prostaty człowieka (MDX-210, Medarex, Novartis) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu oraz trzustki człowieka (TTMA, Pharmacie & Upjohn) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi człowieka w yrażającemu TAG-72 (MDX-220, Medarex, Novartis) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi człowieka wyrażającemu EGFr (MDK-447) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało Anty-VEGF (Genentech) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi piersi, płuc, prostaty i trzustki człowieka (BrevaRex, AltaRex) wytworzone sposobami według wynalazku, monoklonalne przeciwciało przeciw ostrej białaczce szpikowej człowieka (Monoclonal Antibody Conjugate, Immunex) wytworzone sposobami według wynalazku. Dodatkowo, wynalazek obejmuje fragmenty przeciwciał i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunoglobulin.
ii. Wytwarzanie i stosowanie fuzji białkowych zawierających region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, który promuje cytotoksyczność, w której pośredniczy Fc.
Jak dyskutowano powyżej, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu zwiększania powinowactwa wiązania się z receptorem Fc i/lub funkcji efektorowej leczniczych przeciwciał. Osiągane jest to poprzez zmianę wzoru glikozylacji regionu Fc takich przeciwciał, w szczególności manipulując komórkami wytwarzającymi przeciwciała tak, aby wytwarzały polipeptydy o aktywności np. GnT III lub o aktywności GalT lub o aktywności Man II, które modyfikują oligosacharydy przyłączone do regionu Fc takich przeciwciał. Strategia ta może być zastosowana do wzmocnienia cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc, przeciwko niepożądanym komórkom, w której pośredniczy dowolna cząsteczka niosąca region, który jest równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, a nie tylko lecznicze przeciwciała, gdyż zmiany wprowadzone poprzez manipulację glikozylacją dotyczą jedynie regionu Fc i dla tego dotyczą jego oddziaływania z receptorami Fc na powierzchni komórek efektorowych, biorących udział w mechanizmie ADCC. Cząsteczki zawierające Fc, do których można zastosować obecnie opisywane sposoby, obejmują, między innymi, (a) rozpuszczalne fuzje białkowe otrzymane z białkowej domeny kierującej połączonej z końcem N regionu Fc (Chamov and Ashkenazi, Trends Biotech. 14: 52 (1996)) i (b) fuzji białkowych zakotwiczonych w błonie plazmatycznej otrzymanych z domeny transbłonowej typu II, która lokalizuje w błonie plazmatycznej, połączonej z końcem N regionu Fc (Stabila, P.F., Nature Biotech. 16: 1357 (1998)).
W przypadku rozpuszczalnych fuzji białkowych (a) domena kierująca wyznacza wiązanie się fuzji białkowej z niepożądanymi komórkami, takimi jak komórki rakowe, tj. w analogiczny sposób do przeciwciał leczniczych. Zastosowanie obecnie opisanego sposobu do wzmacniania funkcji efektorowej, w tym aktywności cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc, w której pośredniczą te cząsteczki, będzie identyczne ze sposobem stosowanym dla przeciwciał leczniczych.
PL 224 787 B1
W przypadku fuzji białkowych zakotwiczonych w błonie plazmatycznej (b) komórki niepożądane w ciele muszą mieć ekspresję genu kodującego fuzję białkową. Można to osiągnąć stosując podejścia terapii genowej, tj. transfekując komórki in vivo plazmidem lub wektorem wirusowym, który kieruje ekspresję genów kodujących fuzję białkową do niepożądanych komórek lub przez implantację w ciele komórek poddanych manipulacjom genetycznym tak, aby wyrażały fuzję białkową na swojej powierzchni. Te komórki zwykle będą implantowane do ciała wewnątrz kapsułki polimerowej (terapia komórkami zawartymi w kapsułkach), gdzie nie mogą być zniszczone poprzez dowolny mechanizm cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc. Jednak, gdy kapsułka ulegnie uszkodzeniu, komórki mogą się wydostać i staną się niepożądanymi i mogą być zniszczone poprzez cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc. Stabila, P.F., Nature Biotech. 16: 1357 (1998). W tym przypadku, obecnie opisany sposób będzie stosowany zarówno przez włączenie do wektora terapii genowej dodatkowej kasety do ekspresji genu, zapewniającego odpowiednie lub maksymalne poziomy ekspresji fuzji polipeptydowej według wynalazku lub przez manipulację komórkami, które mają być implantowane tak, aby wyrażały fuzję polipeptydową według wynalazku na odpowiednich lub maksymalnych poziomach.
Terapeutyczne zastosowanie przeciwciał, fragmentów przeciwciał i fuzji polipetydowych otrzymanych zgodnie ze sposobami według wynalazku.
Przeciwciała (tj. przeciwciała, fragmenty przeciwciał i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny) można stosować samodzielnie do spłaszczania i zabijania komórek nowotworów in vivo. Przeciwciała można również stosować w połączeniu ze standardowymi lub konwencjonalnymi metodami, takimi jak chemioterapia, radioterapia lub mogą być koniugowane lub łączone z leczniczym lekiem lub toksyną, jak również z limfokiną lub czynnikiem hamującym wzrost guza, w celu dostarczania czynników terapeutycznych w miejsce raka.
Techniki koniugacji takich czynników terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane [patrz, np., Amon i wsp., „Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy”, w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld i wsp. (wyd.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i wsp., „Antibodies For Drug Delivery”, w Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson i wsp. (wyd.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, „Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Reviev”, w Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera i wsp. (wyd.), str. 475-506 (1985); i Thorpe i wsp., „The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)].
Alternatywnie, przeciwciało ze zmienioną glikozylacją może być sprzęgnięte z promieniowaniem o dużej energii, np. z radioizotopem takim jak <I31>I, który po lokalizacji w miejscu guza powoduje zabijanie kilku średnic komórek [patrz, np. Order, „Analysis, Results, and Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”, w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i wsp., (wyd.), str. 303-16 (Academic Press 1985)]. Według jeszcze innego zastosowania, przeciwciała według wynalazku można koniugować z innym przeciwciałem, aby utworzyć heterokoniugat przeciwciał w celu leczenia komórek nowotworowych tak, jak opisano przez Segal w zgłoszeniu patentowym USA nr 4,676,980.
Jeszcze inne zastosowania terapeutyczne dla przeciwciał według wynalazku obejmują koniugowanie lub łączenie, np. przez techniki rekombinowania DNA, z enzymem zdolnym do przemiany prekursora leku w lek cytotoksyczny i zastosowanie takich koniugatów przeciwciało-enzym w połączeniu z prekursorem leku do przekształcania prekursora leku do czynnika cytotoksycznego w miejscu raka [patrz, np., Senter i wsp., „Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4842-46 (1988); „Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibcdy-Alkaline Phosphatase Conjugates”, Cancer Research 49: 5789-5792 (1989); i Senter, „Activation of Prodrugs by AntibodyEnzyme Conjugates: A Nev Approach to Cancer Therapy”, FASEB J. 4: 188-193 (1990)].
Jeszcze inne zastosowania terapeutyczne przeciwciał według wynalazku obejmują stosowanie, albo w obecności dopełniacza albo jako część koniugatu przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, w celu usuwania komórek nowotworowych ze szpiku kostnego pacjentów z rakiem. Według tego podejścia, autologiczny szpik kostny może być przeczyszczony ex vivo przez traktowanie przeciwciałem i szpik kostny może być wprowadzony z powrotem pacjentowi [patrz, np. Ramsay i wsp., „Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies”, J. Clin. Immunol., 8(2): 81-88 (1988)].
Ponadto, w leczeniu można zastosować przeciwciała chimerowe, rekombinowane immunotoksyny i inne rekombinowane konstrukty według wynalazku zawierające specyficzność regionu wią38
PL 224 787 B1 żącego antygen pożądanego przeciwciała monoklonalnego. Na przykład, do leczenia ludzkich raków in vivo można zastosować jednołańcuchowe immunotoksyny według wynalazku.
Podobnie, do leczenia ludzkich raków in vivo można zastosować fuzję polipeptydową zawierającą, co najmniej region wiązania antygenu przeciwciała według wynalazku połączony, co najmniej z funkcjonalnie aktywną częścią innego białka mającego aktywność przeciwnowotworową, np. Iimfokiny lub onkostatyny. Dalej, techniki rekombinacji znane w tej dziedzinie można zastosować do konstrukcji przeciwciał dwuwartościowych, w których jedna ze specyficzności wiązania jest skierowana przeciw antygenowi związanemu z nowotworem, podczas gdy druga specyficzność wiązania przeciwciała jest skierowana przeciw cząsteczce innej niż ten antygen związany z nowotworem.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu selektywnego zabijania komórek nowotworowych w yrażających antygen, który wiąże się specyficznie z przeciwciałem monoklonalnym według niniejszego wynalazku lub z funkcjonalnym ekwiwalentem. Sposób ten obejmuje reagowanie przeciwciał ze zmienioną glikozylacją według niniejszego wynalazku lub zawierających je immunokoniugatów (np. i mmunotoksyn) z takimi komórkami nowotworowymi. Te komórki nowotworowe mogą pochodzić z ludzkiego raka.
Dodatkowo, wynalazek ten dostarcza sposobu leczenia raków (na przykład ludzkich raków) in vivo. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi skutecznej leczniczo ilości kompozycji zawierającej, co najmniej jedno przeciwciało ze zmienioną glikozylacją według niniejszego wynalazku lub zawierające je immunokoniugaty (np. immunotoksyny).
W dalszym aspekcie wynalazek obejmuje ulepszony sposób leczenia chorób autoimmunologicznych wywoływanych w całości albo w części przez patogenne przeciwciała, w oparciu o usuwanie komórek B, obejmujący podawanie skutecznej leczniczo ilości immunologicznie czynnych przeciwciał osobnikowi ludzkiemu tego potrzebującemu, gdzie ulepszenie obejmuje podawanie skutecznej leczniczo ilości przeciwciał mających zwiększoną ADCC, przygotowanych zgodnie ze sposobami według wynalazku. W korzystnym, wykonaniu, przeciwciałem jest przeciwciało anty-CD20. Przykłady chorób lub zaburzeń autoimmunologicznych obejmują, między innymi, trombocytopenie związane z zaburzeniami układu immunologicznego, takie jak ostra idiopatyczna plamica małopłytkowa, przewlekła idiopatyczna plamica małopłytkowa, zapalenie skórno-mięśniowe, pląsawica Sydenhama, nerkową postać tocznia, gorączkę reumatyczną, zespoły wielogruczołowe, plamicę Henocha-Schonleina, zapalenie nerek po infekcji streptokokami, rumień guzowaty, chorobę Takayasu, chorobę Addisona, rumień wielopostaciowy, wieloguzkowe zapalenie naczyń, zesztywniające zapalenia stawów kręgosłupa, zespół Goodpasturea, zakrzepowe zapalenie naczyń, pierwotna żółciowa marskość wątroby, zapalenie tarczycy typu Hashimoto, tyrotoksykoza, przewlekłe czynne zapalenie wątroby, skórnomięśniowe, zapalenie wielochrząstkowe, pęcherzyca zwykła, ziarniniak Wegenera, zapalenie błony filtracyjnej w kłębuszkach nerkowych, boczny zanik mięśni, wiąd rdzenia, ból wielomięśniowy, anemię złośliwą, piorunujące kłębuszkowe zapalenie nerek i zwłóknienie pęcherzyków płucnych, odpowiedzi zapalne takie jak choroby zapalne skóry w tym łuszczycę i zapalenie skóry (np. atopowe zapalenie skóry); twardzinę układową; odpowiedzi związane z chorobami zapalnymi jelit (takie jak choroba Crohna i wrzodziejące zapalenie jelit); zespół ostrego wyczerpania oddechowego (w tym zespół ostrego w yczerpania oddechowego dorosłych; ARDS); zapalenie skóry; zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych; zapalenie mózgu; zapalenie błony naczyniowej oka; zapalenie jelit; kłębuszkowe zapalenie nerek; stany alergiczne, takie jak egzema i astma i inne stany, w których dochodzi do naciekania komórkami T i przewlekłe odpowiedzi zapalne; miażdżycę; zaburzenia adhezji leukocytów; reumatoidalne zapalenie stawów; toczeń układowy (SLE); cukrzycę (np. cukrzycę typu I lub cukrzycę insulinozależną); stwardnienie rozsiane; zespół Reynauda, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy; alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia; zespół Sjorgena; cukrzycę młodzieńczą; i odpowiedzi immunologiczne związane z ostrą i opóźnioną nadwrażliwością związaną z cytokinami i Iimfocytami T zwykle występującą w gruźlicy, sarkoidoza, zapalenie wielomięśniowe, ziarniniakowatość i zapalenie naczyń; anemię złośliwą (chorobę Addisona); choroby związane z diapedezą leukocytów; zapalenie ośrodkowego układu nerwowego (CNS); obrażenia wielonarządowe; anemię hemolityczną (w tym, między innymi, krioglobuninemię lub anemię immunohemolityczną z dodatnim odczynem Coombsa); ciężkie osłabienie mięśni; choroby powodowane przez kompleksy antygen-przeciwciało; chorobę związaną z przeciwciałami przeciw błonie podstawnej kłębuszka nerkowego; zespół antyfosfolipidowy; alergiczne zapalenie nerwu; chorobę Gravesa; zespół miasteniczny Lamberta-Eatona; pemfigoid pęcherzowy; pęcherzycę; choroby endokrynologiczne na podłożu autoimmunologicznym; chorobę Reitera; zapalenie stawów kręgosłupa, chorobę Behceta; olbrzymiokomórkowe zapalenie naczyń; zapalenie nerek wywoływane
PL 224 787 B1 kompleksami immunologicznymi; nefropatię IgA; zapalenia wielonerwowe wywoływane IgM; plamicę małopłytkową na podłożu immunologicznym (ITP) lub małopłytkowość autoimmunologiczną, itd. W tym aspekcie wynalazku, przeciwciała według wynalazku są stosowane do ograniczenia we krwi normalnych komórek B w dłuższym przedziale czasu.
Zgodnie z wykonaniami według tego wynalazku, osobnikiem może być człowiek, koń, świnia, wół, mysz, pies, kot lub ptak. Wynalazek obejmuje także inne zwierzęta stałocieplne.
Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobu leczenia osobnika chorego na raka. Osobnikiem może być człowiek, pies, kot, mysz, szczur, królik, koń, koza, owca, krowa, kura. Rak może być rozpoznany jako rak piersi, pęcherza, siatkówczak, brodawkowaty torbielakogruczolakowłókniak jajnika, guz Wilma lub drobnokomórkowy rak płuc i jest ogólnie charakteryzowany jako grupa komórek posiadająca antygeny związane z nowotworem. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi zabijającej raka ilości przeciwciała nakierowanego na nowotwór połączonego z czynnikiem cytotoksycznym. Ogólnie, łączenie przeciwciała nakierowanego na nowotwór z czynnikiem cytotoksycznym wykonuje się w warunkach pozwalających przeciwciału tak połączonemu na wiązanie jego celu na powierzchni komórki. Wiążąc się ze swoim celem, przeciwciało nakierowane na nowotwór działa bezpośrednio lub pośrednio powodując lub przyczyniając się do zabijania komórek tak związanych, lecząc tak osobnika.
Dostarczony jest także sposób hamowania proliferacji ssaczych komórek nowotworowych obejmujący doprowadzenie do kontaktu ssaczych komórek nowotworowych z wystarczającymi stężeniami przeciwciał ze zmienioną glikozylacją według wynalazku lub zawierających je immunokoniugatów tak, aby hamować proliferację ssaczych komórek nowotworowych.
Przedmiot wynalazku dostarcza dalej sposobów hamowania wzrostu ludzkich komórek nowotworowych, leczenia nowotworu u pacjenta i leczenia chorób proliferacyjnych u pacjenta. Sposoby te obejmują podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji według wynalazku.
A zatem oczywiste jest, że niniejszy wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne, kombinacje i sposoby leczenia ludzkich raków. Na przykład, wynalazek zawiera kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu ludzkich raków zawierające farmaceutycznie skuteczną ilość przeciwciała według niniejszego wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Kompozycje mogą zawierać przeciwciało lub fragmenty przeciwciała, zarówno nie zmodyfikowane, skoniugowane z czynnikiem terapeutycznym (np. lekiem, toksyną, enzymem lub drugim przeciwciałem) lub w postaci rekombinowanej (np. przeciwciała chimerowe, fragmenty przeciwciał chim erowych, przeciwciała dwuwartościowe). Kompozycje mogą zawierać dodatkowo przeciwciała lub k oniugaty do leczenia raków (np. koktajl z przeciwciał).
Kompozycje przeciwciał, koniugatów przeciwciał lub immunotoksyn według wynalazku mogą być podawane z wykorzystaniem konwencjonalnych sposobów podawania w tym, między innymi, dożylnie, dootrzewnowo, doustnie, poprzez układ limfatyczny lub podając bezpośrednio do guza. Korzystne jest podawanie dożylne.
Kompozycje według wynalazku mogą być w szeregu różnych postaci dawkowania, które obejmują, między innymi, płynne roztwory lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, czopki, polimeryczne mikrokapsułki lub mikropęcherzyki, liposomy lub roztwory do zastrzyków lub wlewów. Korzystna postać zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.
Kompozycje według wynalazku także korzystnie zawierają konwencjonalne, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i adiuwanty znane w tej dziedzinie, takie jak albumina osocza człowieka, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, lecytyna, substancje buforujące takie jak fosforany, glicyna, kwas so rbinowy, sorbat potasu oraz sole i elektrolity, takie jak siarczan protaminy.
Najbardziej skuteczny sposób podawania i warunki dawkowania kompozycji zależą od ciężkości i przebiegu choroby, stanu zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i oceny leczącego lekarza. W edług tego, dawkowanie kompozycji powinno być dostosowane indywidualnie do pacjenta. Niemniej, skuteczna dawka kompozycji według tego wynalazku może zawierać się w przedziale od około 1 do 2000 mg/kg.
Cząsteczki tutaj opisane mogą być w szeregu różnych postaciach dawkowania, które obejmują, między innymi, płynne roztwory lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, czopki, polimeryczne mikrokapsułki lub mikropęcherzyki, liposomy lub roztwory do zastrzyków lub wlewów. Korzystna postać zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.
Najbardziej skuteczny sposób podawania i warunki dawkowania cząsteczek według niniejszego wynalazku zależą od umiejscowienia leczonego nowotworu, od ciężkości i przebiegu raka, stanu
PL 224 787 B1 zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i oceny leczącego lekarza. Według tego, dawkowanie cząsteczek powinno być dostosowane indywidualnie do pacjenta.
Wzajemne zależności dawkowania dla zwierząt różnych rozmiarów i gatunków i człowieka, na podstawie mg/kg w stosunku do obszaru powierzchni opisano w Freireich, E.J. i wsp., Cancer Chemother., Rep. 50(4): 219-244 (1966). Można dokonać zmian w warunkach dawkowania, aby zoptymalizować hamowanie wzrostu komórek nowotworowych i zabijającą odpowiedź, np. dawkę można podzielić i podawać na podstawie codziennych obserwacji lub można zmniejszyć proporcjonalnie, w zależności od sytuacji (np. można podawać kilka podzielonych dawek dziennie lub zmniejszonych proporcjonalnie w zależności od specyficznej sytuacji leczniczej).
Jest oczywiste, że dawkę kompozycji według wynalazku, wymaganą do osiągnięcia leczenia, można dalej zmniejszać przy optymalizacji harmonogramu.
Zgodnie z wykonywaniem wynalazku, nośnikiem farmaceutycznym może być nośnik lipidowy. Nośnikiem lipidowym może być fosfolipid. Dalej, nośnikiem lipidowym może być kwas tłuszczowy. Także, nośnikiem lipidowym może być detergent. Jak zastosowano tutaj, detergentem jest dowolna substancja, która zmienia napięcie powierzchniowe cieczy, zwykle je obniżając.
W jednym z przykładów wynalazku, detergent może być detergentem nie jonowym. Przykłady nie jonowych detergentów obejmują, między innymi, polisorbat 80 (znany także jako Tween 80 lub monooleinian polioksyetylenosorbitanu), Brij i Triton (na przykład Triton WR-1339 i Triton A-20).
Alternatywnie, detergentem może być detergent jonowy. Przykład jonowego detergentu obejmuje, między innymi, bromek alkilotrimetyloamonowy.
Dodatkowo, zgodnie z wynalazkiem, nośnikiem lipidowym może być liposom. Jak stosowano w tym zgłoszeniu, „liposom” to dowolny pęcherzyk związany z błoną zawierający cząsteczki według wynalazku lub ich kombinacje.
Przykłady poniżej wyjaśniają wynalazek bardziej szczegółowo. Poniższe sposoby otrzymywania i przykłady zostały podane, aby umożliwić specjalistom w tej dziedzinie jaśniejsze zrozumienie i wyk onywanie wynalazku. Jednak, niniejszy wynalazek nie jest ograniczony zakresem przykładowych w ykonań, którymi zamierzono jedynie zilustrować pojedyncze aspekty wynalazku i funkcjonalnie równorzędne sposoby mieszczą się w zakresie wynalazku. Istotnie, szereg modyfikacji wynalazku dodatkowych w stosunku do tutaj opisanych będzie oczywistych dla specjalistów w tej dziedzinie na podstawie poniższego opisu i towarzyszących im rysunków. Takie modyfikacje mają być objęte zakresem dołączonych zastrzeżeń.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1
Materiały i Metody
1. Konstruowanie ekspresyjnych wektorów dla przeciwciał
Wektor ekspresyjny pETR1502 dla przeciwciała anty-CD20
Wektor ekspresyjny pETR1502 dla przeciwciała anty-CD20 C2B8 składa się z czterech niezależnych, oddzielnych kaset ekspresyjnych (jedna dla łańcucha lekkiego przeciwciała C2B8, jedna dla łańcucha ciężkiego przeciwciała C2B8, jedna dla genu oporności na neomycynę oraz jedna dla m ysiego genu dhfr). Wszystkie geny znajdują się pod kontrolą promotora wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego (MPSV) i zawierają syntetyczny sygnał zgodności dla poliadenylacji pochodzący z sygnału poliadenylacji króliczego genu β-globiny.
Cząsteczki cDNA kodujące rejony zmienne ciężkiego (VH) oraz lekkiego (VL) łańcucha przeciwciała C2B8 anty-CD20 zostały złożone z zestawu zachodzących na siebie jednoniciowych oligonukleotydów w jednoetapowym procesie przy zastosowaniu PCR (Kobayashi, N., i wsp., Biotechniques 23: 500-503 (1997)). Oryginalna sekwencja kodująca rejony VL oraz VH C2B8 została uzyskana z opublikowanej międzynarodowej aplikacji patentowej (międzynarodowa publikacja numer: WO 94/11026). Złożone fragmenty cDNA VL i VH zostały poddane subklonowaniu do pBluescriptllKS(+) w celu uzyskania plazmidów pBlue-C2B8VH oraz pBlue-C2B8VL oraz sekwencjonowaniu.
Zmienne łańcuchy C2B8 zostały powielone z odpowiedniego plazmidu pBlue-C2B8VH i pBlueC2B8VL przy zastosowaniu starterów wprowadzających miejsce restrykcyjne AscI na końcu 5' oraz odpowiednie miejsca restrykcyjne na połączeniu rejonu zmiennego ze stałym (BsiWI dla łańcucha lekkiego i NheI dla łańcucha ciężkiego). Rejony stałe IgG1 zostały powielone z biblioteki cDNA ludzkich leukocytów (Quickclone, Clontech) przy zastosowaniu starterów wprowadzających dogodne miejsca restrykcyjne na końcach 5' i 3' (BsiWI oraz BamHI dla rejonu stałego łańcucha lekkiego oraz NheI i BamHI dla rejonu stałego łańcucha ciężkiego).
PL 224 787 B1
Po potwierdzeniu poprawności sekwencji DNA, każdy z łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała C2B8 został połączony z promotorem MPSV i sygnałami poliadenylacji. W pierwszym etapie, skonstruowano dwa różne wektory ekspresyjne: jeden dla łańcucha lekkiego C2B8 (pETR1315) i drugi dla łańcucha ciężkiego C2B8 (pETR1316). W drugim etapie, do wektora pETR1315 wprowadzono kasetę ekspresyjną oporności na neomycynę (gen oporności na neomycynę uzyskany z transpozonu Tn5 i umieszczony pod kontrolą minimalnego promotora MPSV), w wyniku, czego powstał plazmid pETR1481. Kaseta ekspresyjna genu dhfr znajdującego się pod kontrolą promotora MPSV została wstawiona do wektora pETR1316, w wyniku, czego powstał plazmid pETR1328. W końcowym etapie, oba moduły ekspresyjne (łańcuch lekki C2B8 + neo i łańcuch ciężki C2B8 + dhfr) zostały połączone w jeden wektor, co doprowadziło do powstania plazmidu pETR1502.
Wektor ekspresyjny pETR1520 dla przeciwciała anty-CD20 pETR1520 stanowi połączenie wektora ekspresyjnego dla przeciwciała C2B8 z miejscem inicjacji replikacji z wirusa Epstein-Barra (oriP) dla replikacji i utrzymania wektora episomalnego w komórkach wytwarzających jądrowy antygen wirusa Epstein-Barra (EBNA). W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego C2B8, pETR1520, moduł ekspresyjny C2B8 z pETR1416 został wstawiony jako fragment HinDIII do wektora pETR1507 zawierającego ori-P. Wektor pETR1416 jest podobny pETR1502 z wyjątkiem tego, że w plazmidzie tym, gen oporności na neomycynę znajduje się pod kontrolą całk owitego, zamiast minimalnego, promotora MPSV.
Wektor ekspresyjny pETR1546 przeciwciała przeciw fibronektynie
Wektor ten jest identyczny z wektorem pETR1520, z wyjątkiem tego, że rejony kodujące zmienny łańcuch ciężki i lekki przeciwciała C2B8 anty-CD20 zostały zastąpione przez odpowiednie rejony kodujące przeciwciała L19, ludzkiego przeciwciała rozpoznającego domenę ED-B fibronektyny. Fragmenty DNA kodujące rejony zmienne zostały zsyntetyzowane za pomocą metody wydłużania w reakcji PCR zachodzących na siebie regionów przy zastosowaniu syntetycznych oligonukleotydów opartych na sekwencji rejonów zmiennych przeciwciała L19 (Pini, A. i wsp. J. Biol. Chem. 273(34): 21769-76 (1998)).
Wektor ekspresyjny pURSI28 przeciwciała przeciw EGFR (C225)
Wektor ten jest identyczny z wektorem pETR1520, z wyjątkiem tego, że rejony kodujące zmienny łańcuch ciężki i lekki przeciwciała C2B8 anty-CD20 zostały zastąpione przez odpowiednie rejony kodujące przeciwciała C225, chimerowego przeciwciała rozpoznającego receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu. Fragmenty DNA kodujące rejony zmienne zostały zsyntetyzowane za pomocą metody zachodzącego wydłużania PCR przy zastosowaniu syntetycznych oligonukleotydów opartych na sekwencji rejonów zmiennych przeciwciała C225 (sekwencje mogą zostać znalezione w opublikowanym wniosku patentowym o międzynarodowym numerze publikacji WO 96/40210, Fig. 16 i 17 tego wniosku patentowego odpowiednio dla łańcuchów ciężkich i lekkich).
2. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych fuzji - GnT III pETR1166
Wektor do konstytutywnej ekspresji GnT III
W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego GnT III pETR166 powielano szczurzy GnT III z biblioteki cDNA nerki szczurzej (Clontech) za pomocą PCR. C-końcowy znacznik c-myc-epitop dodawano powyżej kodonu stop genu (sekwencja aminokwasowa: PEQKLISEEDL) w celu późniejszego, dogodnego wykrywania GnT III za pomocą testów immunologicznych na filtrach. Po potwierdzeniu poprawnej sekwencji GnT III, gen wstawiano pod kontrolę promotora MPSV i dodawano syntetyczny sygnał poliadenylacji króliczej beta globiny. Końcowy wektor ekspresyjny GnT III zawierał także oddzielną kasetę oporności na puromycynę w celu selekcji, z genem oporności na puromycynę pod kontrolą promotora MPSV i syntetycznego sygnału poliadenylacji króliczej beta-globiny.
pETR1425: Zamiana pierwszych 76 aminokwasów GnT III przez pierwsze 102 aminokwasy ludzkiego GnT I
Konstruowanie tego hybrydowego genu glikotransferazy przeprowadzono za pomocą metody wydłużania w reakcji PCR zachodzących na siebie regionów. W jednej reakcji strukturalny region ludzkiego GnT I powielano z zastosowaniem starterów GAB-179 oraz GAB-180. Podczas tej reakcji PCR na 5' końcu wstawiane były także sekwencja największej zgodności Kozak oraz miejsce restrykcyjne AscI. Uzyskany fragment PCR posiadał 23 bp zachodzące na początek GnT II w pozycji 229. W drugiej reakcji PCR rejon GnT III od pozycji 229 do 380 był powielany z zastosowaniem starterów GAB-177 oraz GAB-178 wytwarzając fragment PCR z pojedynczym miejscem dla BstXI na 3' końcu oraz 22 bp zakładką ze strukturalnym rejonem GnT I na 5' końcu. Oba fragmenty PCR były oczyszczane i stosowane jako matryce w trzeciej reakcji PCR (startery GAB-179 oraz GAB-178). Uzyskany
PL 224 787 B1 fragment oczyszczano i trawiono za pomocą AscI i ligowano z wektorem pETR1001 (trawionym za pomocą AscI oraz Smal) uzyskując plazmid pETR1404. Po potwierdzeniu sekwencji wstawki, do pETR1404 dodawano element promotora MPSV jako fragment AscI (trawienie częściowe)/PmeI uzyskując plazmid pETR1423. Fragment SphI/BstXI z pETR1166, wektora ekspresyjnego zawierającego pierwotny szczurzy gen GnT III, zastępowano następnie odpowiednim fragmentem pETR1423 otrzymując plazmid pETR1425 zawierający fuzję GnT I-GnT III pod kontrolą promotora MPSV oraz kasetę oporności na puromycynę w celu selekcji.
Sekwencje starterów:
GAB-177; GCGTGTGCCTGTGACCCCCGCGCCCCTGCTCCAGCCACTGTCCCC
GAB-178: GAAGGTTTCTCCAGCATCCTGGTACC
GAB-179: CTGAGGCGCGCCGCCACCATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGC
GAB-180: GGGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGCGCGGGGGTCACAGGCACACGCGGC pETR1506: Zamiana 76 N-końcowych aminokwasów GnT III przez pierwsze 100 aminokwasy ludzkiej mannozydazy II
Konstruowanie pETR1506 przeprowadzono analogicznie do konstruowania pETR1425. Rejon strukturalny ludzkiego genu mannozydazy II powielano z zastosowaniem starterów GAB-252 oraz GAB-253 stosując jako matrycę wektor pBlue-man. Podczas tej reakcji PCR na 5' końcu wstawiano miejsce FseI oraz sekwencję największej zgodności Kozak. Uzyskany fragment PCR zachodzi na gen GnT III zaczynający się w pozycji 229 przez 23 bp. W drugiej reakcji PCR część genu GnT III (pozycja 229-460) powielano ze starterami GAB-254 i GAB-255. Ta reakcja PCR wytworzyła fragment zawierający zakładkę o 43 bp z genem mannozydazy II na 5' końcu i pojedyncze miejsce Stul na 3' końcu. Oba fragmenty oczyszczano i stosowano jako matryce w trzeciej reakcji PCR ze starterami GAB-252 i GAB-255. Uzyskany fragment wstawiano do pIC19H otrzymując wektor pETR1484. Po potwierdzeniu prawidłowej sekwencji wstawki całkowity gen fuzyjny był konstruowany przez ligowanie fragmentu Fsel/Stul pETR1484 z fragmentem StuI/BamHI z pETR1166 w wektorze pETR12177 (FseI/BmHI). Otrzymany plazmid (pETR1500) zawierał hybrydowy gen Man II-GnT III (SEK. NR ID: 14) pod kontrolą promotora MPSV. W celu selekcji plazmidu w komórkach ssaczych wstawiano kasetę oporności na puromycynę jako fragment SpeI z pETR1166 uzyskując plazmid pETR1506.
Sekwencje starterów:
GAB-252: GCTAGGCCGGCCGCCACCATGAAGTTAAGCCGCCAGTTCACCGTGTTCGG
GAB-253:
GGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGTGAGCCAGCACCTGGCTGAAATTGCTTTGTGAACTTTT
CGG
GAB-254:
TCCGAAAAGTTCACAAAGCAATTTCAGCCAAGGTGCTGGCTCACCCCTGCTCCAGCCACTG
TCCCC
GAB-255: ATGCCGCATAGGCCTCCGAGCAGGACCCC pETR1519: Połączenie hybrydowego genu fuzyjnego Man II-GnT III z miejscem inicjacji replikacji oriP z wirusa Epstein'a Barr'a
Stosując startery GAB-261 i GAB-262 powielano 2 kb fragment zawierający oriP z plazmidu pCEP4 (Invitrogen). Podczas tej reakcji PCR na obu końcach fragmentu wstawiano miejsca SspI i EcoRI. W celu sekwencjonowania fragment oriP wstawiano do wektora pIC19H. Po potwierdzeniu poprawnej sekwencji, oriP wstawiano jako fragment SspI do wektora pERT1001 (trawionego za pomocą BsmBI i z lepkimi 5'-końcami wypełnionymi za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy). Otrzymany plazmid oznaczono jako pETR1507. Kasetę ekspresyjną SphI/NruI Man II-GnT III z pETR1510 wstawiano do pETR1507 trawionego takimi samymi endonukleazami restrykcyjnymi otrzymując plazmid pETR1519.
Sekwencje starterów:
GAB-261: GCTAAAATATTGAATTCCCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGC
GAB-262: TAGCAATATTGAATTCGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGC pETR1537: Połączenie hybrydowego genu fuzyjnego Man II-GnT III i skróconego genu markera powierzchni komórkowej CD4
Wektor ekspresyjny pETR1506 modyfikowano w celu dodatkowej ekspresji skróconego genu markera powierzchni komórkowej CD4. W skrócie, kasetę ekspresyjną fuzyjnego genu hybrydowego Man II-GnT III przekształcono z monocistronowej na bicistronową kasetę ekspresyjną przez wstawienie, poniżej kodonu stop fuzji Man II-GnT III, elementu IRES wirusa polio, za którym znajdował się
PL 224 787 B1 cDNA kodujący skrócone ludzkie białko CD4 (obejmujący sekwencję liderową ludzkiego CD4 do wydzielania, za którą znajdują się domeny przezbłonowe i zewnątrzkomórkowe).
3. Transfekcja ssaczych komórek fuzją GnT III i wektorami ekspresyjnymi dla przeciwciał
Transfekowanie komórek BHK
Komórki w wykładniczej fazie wzrostu (żywotność 90-95%) umieszczano w odpowiedniej liczbie butelek T75 w stężeniu 0,9 x 106 komórek/ml 24 godziny przed elektroporacją. Jako pożywkę hodowlaną stosowano Invitrus (Cell Culture Technologies, Switzerland) uzupełnianą 10% płodową surowicą bydlęcą (FCS). Komórki zliczano przed elektroporacją. Zbierano 8 x 106 komórek przez odwirowanie (5 minut, 200 x g), a supernatant usuwano. Komórki zawieszano w 800 μl pożywki Invitrus i przenoszono do sterylnej kuwety elektroporacyjnej (szczelina 0,4 cm) już zawierającej 8 μg DNA kolistego plazmidu i inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Komórki elektroporowano stosując Gene Pulser II (BioRad) w następujących warunkach: 400 V, 960 μF dwoma pulsami w 30 sekundowym odstępie. Po elektroporacji komórki natychmiast przenoszono do butelki T25 zawierającej 5 ml pożywki wzrostowej (Invitrus/20% (obj./obj.) FCS/1,25% (obj./obj.) DMSO) i inkubowano w 37°C w inkubatorze z 5% zawartością CO2. W celu wytwarzania niezmodyfikowanych (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciał, komórki transfekowano jedynie wektorami ekspresyjnymi dla przeciwciał. W celu wytwarzania przeciwciał z manipulacją glikozylacją, komórki kotransfekowano dwoma plazm idami, jednym do ekspresji przeciwciała i drugim do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III (SEK. NR ID: 15), w stosunku odpowiednio 3:1.
Transfekcja komórek HEK293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA w wykładniczej fazie wzrostu transfekowano za pomocą sposobu z fosforanem wapnia. Komórki hodowano w postaci przylegających jednowarstwowych hodowli w butelkach T stosując pożywkę hodowlaną DMEM uzupełnianą 10% FCS i transfekowano, gdy osiągnęły one 50-80% konfluencji. W celu transfekcji butelki T75, 8 milionów komórek umieszczano 24 godziny przed transfekcją w 14 ml pożywki hodowlanej DMEM z FCS (w końcowym stężeniu 10% obj./obj.), 250 μg/ml neomycyny i komórki umieszczano w 37°C w inkubatorze z 5% stężeniem CO2 przez noc. Dla każdej butelki T75 przeznaczonej do transfekcji, przygotowywano roztwór DNA, CaCl2 i wody przez mieszanie 47 μg DNA całkowitego wektora plazmidowego, 235 μl 1M roztworu CaCl2 i dodawanie wody do końcowej objętości 469 μΚ Do tego roztworu dodawano 469 μl roztworu 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4 o pH 7,05, mieszano natychmiast przez 10 sekund i zostawiano do odstania w temperaturze pokojowej przez 20 sekund. Zawiesinę rozcieńczano 12 ml DMEM uzupełnioną 2% FCS i dodawano do T75 w miejsce istniejącej pożywki. Komórki inkubowano w 37°C, z 5% CO2 przez około 17 do 20 godzin, następnie pożywkę zastępowano 12 ml DMEM, 10% FCS. W celu wytworzenia niezmodyfikowanych (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciał, komórki transfekowano jedynie wektorami ekspresyjnymi dla przeciwciał. W celu wytwarzania przeciwciał ze zmienioną glikozylacją, komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jednym do ekspresji przeciwciała i drugim do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III, w stosunku odpowiednio 4:1. Piątego dnia po transfekcji, zbierano supernatant, odwirowywano przez 5 minut przy 1200 rpm, a następnie ponownie odwirowywano przez 10 minut przy 4000 rpm i trzymano w 4°C.
Wytwarzanie stabilnej ssaczej linii komórkowej wyrażającej zrekombinowane przeciwciało antyCD20
Komórki BHK (BHK21-13c) transfekowano za pomocą elektroporacji wektorem ekspresyjnym pETR1502 przeciwciała C2B8, który zawiera kasetę ekspresyjną genu oporności na neomycynę. Klony oporne na neomycynę najpierw selekcjonowano w celu uzyskania zbioru klonów, które posiadają zintegrowany chromosomalnie DNA wektora pETR1502. Następnie klony przeszukiwano pod kątem wytwarzania zrekombinowanego przeciwciała stosując oznaczenie ELISA. W skrócie, 24 godziny po elektroporacji, żywotne komórki zliczano i ustalano wydajność transfekcji przez zliczanie komórek fluorescencyjnych równoległej, kontrolnej elektroporacji wykonanej z wektorem ekspresyjnym pEYFP. Komórki rozcieńczano w pożywce selekcyjnej Invitrus zawierającej 10% FCS i 1 mg/ml neomycyny. Zazwyczaj na 8 96-dołkowych płytek nakładano różne stężenia żywotnych, stransfekowanych komórek (1 x 10 , 5 x 10 oraz 1 x 10 komórek na studzienkę) i inkubowano w 37°C do czasu, gdy można było zidentyfikować klony. Gdy klony wzrosły do stadium niemal całkowitego złączenia się, supern atanty analizowano za pomocą ELISA pod kątem wytwarzania przeciwciała. Klony pozytywne w teście ELISA rozsiewano początkowo na 24-dołkowe, a następnie 6-dołkowe płytki, a następnie do butelek T25. Po pięciu dniach wzrostu w butelkach T25 ustalano końcowe miano przeciwciała stosując oznaczenie ELISA. Stosując tę elektroporację i procedurę selekcji wyizolowano klon komórek BHK wyraża44
PL 224 787 B1 jący przeciwciało anty-CD20 C2B8 (BHK-1502-28), który wytwarzał 13 μg/ml przeciwciała w powyższych warunkach hodowli.
Wytwarzanie stabilnej ssaczej linii komórkowej wyrażającej zrekombinowane przeciwciało antyCD20 i fuzję GnT III
Klon BHK-1502-28, wyrażający konstytutywnie geny monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 i gen oporności na neomycynę, transfekowano wektorem ekspresyjnym pETR1537 za pomocą elektroporacji. pETR1537 jest wektorem do konstytutywnej ekspresji genu Man II-GnT III i skróconej postaci ludzkiego CD4 wyrażanej zależnie od IRES. Wektor ten zawiera także kasetę ekspresyjną genu oporności na puromycynę. Klony oporne na puromycynę najpierw selekcjonowano w celu uzyskania zbioru klonów, które posiadały zintegrowany chromosomalnie DNA wektora pETR1537. Następnie klony przeszukiwano pod kątem powierzchniowego wyrażania skróconego CD4 (tCD4), który służy jako znacznik poziomu ekspresji bicistronowej jednostki ekspresyjnej genu Man II-GnT III+tCD4. Wytwarzanie zrekombinowanego przeciwciała z wybranych klonów potwierdzano stosując oznaczenie ELISA.
W skrócie, DNA wektora pETR1537 linearyzowano z użyciem XmnI. Równolegle przeprowadzano kontrolną transfekcję z wektorem ekspresyjnym EYFP. Wydajność transfekcji ustalano po 24 godzinach przez zliczanie komórek wyrażających EYET w stosunku do wszystkich komórek. Spośród wszystkich komórek 58% wyrażało EYFP. Żywotność komórkowa wynosiła 91%. Jeden dzień po transfekcji, komórki stransfekowane pETR1537 lub pEYFP kolejno rozcieńczano w stosunku 1:100, 1:500, 1:1000 i 1:5000 i umieszczano na 96-dołkowych płytkach, w końcowej objętości 0,2 ml pożywki selekcyjnej (Invitrus, 10% FCS, 20 μg/ml puromycyny, 1 mg/ml neomycyny). Klony stawały się widoczne po dwóch tygodniach. Były one rozsiewane i przeszukiwane pod kątem ekspresji skróconego CD4 (tCD4) i ekspresji przeciwciała.
W celu przeszukiwania poziomu ekspresji tCD4, w przybliżeniu 500 000 komórek przemywano buforem FACS i inkubowano z 5 μl anty-ludzkich CD4 FITC (Becton Dickinson, Switzerland) przez 20 minut w lodzie. Po dwóch płukaniach komórki zawieszano w 0,5 ml buforu FACS i analizowano z FACS (Fig. 17A-B). Wyizolowano klon (BHK-1502-28-11) z dobrym poziomem ekspresji tCD4. Po pięciu dniach wzrostu w butelce T25, wytwarza on przeciwciało anty-CD20 o końcowym mianie około 17 μg/ml, jak ustalono przez ELISA.
4. Wytwarzanie i oczyszczanie przeciwciał niezmodyfikowanych i z modyfikacją glikozylacji
Zbieranie pożywki hodowlanej
W przypadku komórek BHK stransfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała plus wektorem ekspresyjnym fuzji-GnT III, supernatant hodowlany zbierano po hodowli stransfekowanych komórek 96 godzin po transfekcji. W zależności od oczekiwanej wydajności, przeprowadzano kilka elektroporacji (10-15) dla tego samego wektora.
W przypadku komórek HEK293-EBNA stransfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała plus wektorem ekspresyjnym fuzji-GnT III, pożywkę hodowlaną wymieniano na świeżą pożywkę hodowlaną w przybliżeniu 16 godzin po transfekcji i taką pożywkę zbierano następnie po hodowli stransfekowanych komórek przez kolejne 120 godzin.
Dla stabilnej linii komórkowej BHK-1502-28-11, hodowlę nanoszono w stężeniu 500 000 komórek/ml, a supernatant zbierano po 4 dniach hodowli, gdy gęstość komórek wynosiła 1,7 x 106 żywotnych komórek/ml, a żywotność komórek wynosiła 69%.
Oczyszczanie przeciwciała
Przeciwciało monoklonalne oczyszczano z supernatantu hodowlanego stosując dwa kolejne etapy chromatograficzne. Pierwszy etap składał się z chromatografii Białka A stosując elucję w gradiencie pH, która wydajnie oddziela bydlęce i ludzkie IgG. Po tym następował etap chromatografii kationowymiennej w celu wymiany próbki buforu na roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS).
5. Analiza oligosacharydów
Oligosacharydy uwalniano enzymatycznie z przeciwciał przez trawienie PNGazą F, z przeciwciałami albo unieruchomionymi na membranie PVDF albo w roztworze.
Otrzymany roztwór trawienny zawierał uwolnione oligosacharydy albo bezpośrednio gotowe do analizy MALDI/TOF-MS albo dalej trawione za pomocą glikozydazy EndoH w celu przygotowania próbki do analizy MALDI/TCF-MS.
Sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał unieruchomionych na membranie PVDF
PL 224 787 B1
Studzienki 96-studzienkowej płytki wytworzonej z membraną PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts) nawilżano 100 gl metanolu, a płyn przepuszczano przez membranę PVDF przy zastosowaniu próżni stosowanej w próżniowym kolektorze Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts). Membrany PVDF przemywano trzykrotnie 300 gl wody. Następnie studzienki przemywano 50 gl buforu RCM (8M mocznik, 360 mM Tris, 3,2 mM EDTA, pH 8,6). Nanoszono pomiędzy 30-40 gg przeciwciała na studzienkę zawierający 10 gl buforu RCM. Płyn w dołku przepuszczano przez membranę przez podłączenie próżni, a membranę kolejno przemywano dwukrotnie 50 gl buforu RCM. Przeprowadzano redukcję mostków dwusiarczkowych przez dodanie 50 gl 0,1M ditiotretiolu w RCM i inkubację w 37°C przez 1 godzinę.
Po redukcji, podłączano próżnię w celu usunięcia roztworu ditiotretiolu z dołka. Studzienki przemywano trzykrotnie 300 gl wody przed przeprowadzeniem karboksymetylacji reszt cysteinowych przez dodanie 50 gl 0,1M kwasu jodooctowego w buforze RCM i inkubację w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
Po karboksymetylacji, studzienki osuszano przy pomocy próżni i kolejno przemywano trzykrotnie 300 gl wody. Membranę PVDF następnie blokowano, w celu zapobieżenia adsorpcji endoglikozydazy, przez inkubowanie 100 gl 1% wodnego roztworu poliwinylu 360 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie czynnik blokujący usuwano przez delikatną próżnię i następnie trzykrotne przemywanie 300 gl wody.
Przyłączone poprzez N oligosacharydy uwalniano przez dodanie 2,5 mU peptydo-N-glikozydazy F (rekombinowana N-glikanaza, GLYKO, Novato, CA) i 0,1 mU sialidazy (GLYKO, Novato, CA) w celu usunięcia wszystkich potencjalnych naładowanych reszt monosacharydowych, w końcowej objętości 25 gl w 20 mM NaHCO3, pH 7,0). Trawienie przeprowadzano przez 3 godziny w 37°C.
Sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał w roztworze
Pomiędzy 40 a 50 gg przeciwciała mieszano z 2,5 mU PNGazy F (Gyko, U.S.A.) w 2 mM Tris, pH 7,0 w końcowej objętości 25 mikrolitrów i mieszaninę inkubowano przez 3 godziny w 37°C.
Stosowanie trawienia endoglikozydazą H oligosacharydów uwolnionych PNGaząF, w celu przypisania struktur hybrydowych dwuczęściowych oligosacharydów do pików MALDI/TOF-MS neutralnych oligosacharydów.
Oligosacharydy uwolnione PNGaząF trawiono kolejno endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96). W celu trawienia EndoH, 15 mU EndoH (Roche, Switzerland) dodawano do trawienia PNGaząF (sposób dla przeciwciał w roztworze, patrz powyżej), w celu uzyskania końcowej objętości 30 makrolitrów, mieszaninę inkubowano przez 3 godziny w 37°C. EndoH tnie pomiędzy resztami N-acetyloglukozaminy rdzenia chitobiozy. Przyłączonych poprzez N oligosacharydów. Enzym może trawić jedynie oligomannozę i wiele glikanów typu hybrydowego, podczas gdy złożone typy oligosacharydów nie podlegają hydrolizie.
Przygotowanie próbki dla MALDI/TOF-MS
Trawienia enzymatyczne zawierające uwolnione oligosacharydy inkubowano przez kolejne 3 godziny w warunkach pokojowych po dodaniu kwasu octowego w końcowym stężeniu 150 mM, a następnie przepuszczano przez 0,6 ml żywicy kationo-wymiennej (żywica AG50W-X8, postać wodorowa, ziarna 100-200, BioRad, Switzerland) nałożone na kolumnę chromatograficzną mikro-bio-spin (BioRad, Switzerland) w celu usunięcia kationów i białek. Mikrolitr otrzymanej próbki nakładano na płytkę docelową ze stali nierdzewnej i mieszano na płytce z 1 gl macierzy sDHB. Macierz sDHB przygotowywano przez rozpuszczenie 2 mg kwasu 2,5-dihydrobenzoesowego plus 0,1 mg kwasu 5-metoksysalicylowego w 1 ml etanolu/10 mM wodnego chlorku sodu 1:1 (obj./obj.). Próbki suszono na powietrzu, nakładano 0,2 gl etanolu i umożliwiano re-krystalizację próbki w powietrzu atmosferycznym.
MALDI/TOF-MS
Spektrometrem masowym MALDI-TOF stosowanym do uzyskania widm masowych był Voyager Elite (Perspective Biosystems). Przyrząd działał w układzie liniowym, z przyspieszeniem 20 kV i 80 nsek opóźnieniem. Do oznaczania masy jonów stosowano zewnętrzną kalibrację przy zastosowaniu standardów oligoscharydowych. Widma z 200 zdjęć laserowych sumowano w celu uzyskania końcowego widma.
6. Przygotowanie PBMC
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywano stosując Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO53178 USA) oraz zasadniczo stosując instrukcje producentów. W skrócie, heparynowanymi strzykawkami pobierano krew żylną od ochotników, których proszono o bieganie z maksymalną szybkością przez 1 minutę w celu zwiększenia procentowego udziału limfocytów NK we krwi. Krew rozcieńczano 1:0,75-1,3 PBS nie zawierającym Ca lub Mg i umieszczano na
PL 224 787 B1
Histopaque-1077. Gradient odwirowywano przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerw. Zbierano interfazę zawierającą PBMC i przemywano ją PBS (50 ml na komórki z dwóch gradientów) i zbierano przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut, RT. Po ponownym zawieszeniu osadu w PBS, zliczano PBMC i przemywano drugi raz przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut w RT. Komórki następnie ponownie zawieszano w odpowiedniej pożywce do kolejnych procedur.
7. Izolacja limfocytów NK
Ludzkie limfocyty NK izolowano z PBMC stosując procedurę negatywnej selekcji przy użyciu magnetycznych kulek niewiążących komórek CD16- i CD56-dodatnich (układ MACS z Miltenyi Biotec GmbH, 51429 Bergisch Gladbach, GER). PBMC przemywano jednokrotnie schłodzonym buforem MACS (PBS zawierający 2% FCS i 2 mM EDTA), ponownie zawieszano w stężeniu 20 komórek Mio na ml mieszaniny 1:1 FCS i buforu MACS i inkubowano przez 10 minut w 4°C. Komórki następnie osadzano i ponownie zawieszano w 80 μl z buforu MACS zawierającego 10% FCS, na 10 milionów komórek. Następnie na 10 milionów komórek dodawano 20 μl roztworu przeciwciała-Hapten. Komórki inkubowano przez 10 minut w 4°C z mieszaniem probówki. Po dwóch przemyciach buforem MACS, w co najmniej 10 x objętości buforu do znakowania, komórki ponownie zawieszano w buforze MACS zawierającym 10% FCS przy 10 milionach komórek na 80 μl i dodawano 20 μl mikrokulek-anty-hapten na 10 milionów komórek. Probówkę inkubowano przez 15 minut w 4°C z mieszaniem. Po jednym przemyciu buforem MACS komórki ponownie zawieszano w stężeniu do 10 milionów komórek w 500 μl buforu MACS i umieszczano na kolumnie LS MACS, którą umieszczano w magnesie MINIMACS i równoważono 3 ml buforu MACS. Kolumnę przemywano 3 x 3 ml buforu MACS. Komórki w przemytej frakcji zbierano i następnie stosowano jako limfocyty NK. Czystość oznaczona za pomocą ekspresji CD56 wynosiła pomiędzy 88-98%.
8. Oznaczenie ADCC
PBMC oraz NK jako komórki efektorowe przygotowywano jak to opisano powyżej. Stosunek efektora do celu wynosił 25:1 i 10:1 odpowiednio dla komórek PBMC i NK. Komórki efektorowe przygotowywano w pożywce AIM-V w odpowiednim stężeniu w celu dodania 50 μl na studzienkę na 95-studzienkową płytkę o okrągłym dnie. Komórki docelowe dla przeciwciał C2B8 stanowiły komórki SKW6,4 lub komórki chłoniaka z limfocytów B Namalwa hodowane w DMEM zawierającym 10% FCS. Komórki docelowe przemywano PBS, zliczano i ponownie zawieszano w AIM-V w stężeniu 0,3 miliona na ml w celu dodania 30 000 komórek w 100 μl na mikrostudzienkę. Przeciwciała rozcieńczano w AIM-V, dodawano w objętości 50 μl do uprzednio nałożonych komórek docelowych i pozwalano na związanie się z komórkami docelowymi przez 10 minut w RT. Następnie dodawano komórki efektorowe i płytkę inkubowano przez 4 godziny w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO;. Zabijanie komórek docelowych szacowano przez pomiar uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) ze zniszczonych komórek, stosując zestaw do wykrywania cytotoksyczności (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland). Po 4-godzinnej inkubacji płytki odwirowywano przy 800 x g. 100 μl supernatantu z każdego dołka przenoszono do nowej przezroczystej 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem. Dodawano 100 μl kolorowego buforu substratowego z zestawu na studzienkę. Ustalano wartości Vmax reakcji kolorowej w czytniku ELISA przy 490 nm, przez co najmniej 10 minut, stosując oprogramowanie SOFTmaxPRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Spontaniczne uwalnianie LDH mierzono w studzienkach zawierających jedynie docelowe i efektorowe komórki, ale nie przeciwciała. Maksymalne uwalniane ustalano ze studzienek zawierających jedynie komórki docelowe i 1% Triton X-100. Procent specyficznego zabijania z udziałem przeciwciał obliczano w następujący sposób: ((x-SR) / (MR-SR) *100, gdzie x jest średnią Vmax w specyficznym stężeniu przeciwciała, SR jest średnią Vmax spontanicznego uwalniania, a MR jest średnią Vmax maksymalnego uwalniania.
9. Wiązanie FcyRIIIA na limfocytach NK
Świeżo wyizolowane limfocyty NK odwirowywano przez 5 minut przy 200 x g i traktowano 0,09% (wag./obj.) roztworem kwasu mlekowego (140 mM NaCl, 5 M KCl, pH 3,9), przez inkubowanie 3 x 10 komórek/ml w temperaturze pokojowej przez 5 minut, w celu usunięcia związanych z limfocytami NK IgG (De Haas M., J. Immunol., 156; 2948 (1996)).
Komórki przemywano dwukrotnie PBS, 0,1% BSA, 0,01% azydkiem sodu i doprowadzano do stężenia 2 x 106 komórek/ml w PBS, 0,15% BSA, 0,01% azydku sodu. 5 x 105 komórek inkubowano z 0, 0,1,0,3, 1,3, 10 μg/ml odmian przeciwciała przez 30 minut w 4°C. Komórki następnie przemywano dwukrotnie i wykrywano wiązanie przeciwciała przez inkubowanie z 1:200 skoniugowanym z fluorescencyjnym izotiocjanianem kozim F(ab')2 anty-ludzka IgG (Jackson ImmunoResearch, West
PL 224 787 B1
Grove, PA) oraz anty-ludzkie CD56-PE w stężeniu 5 gl/5 x 10 komórek (BD Pharmingen, San Diego, CA) przez 30 minut w 4°C (Shields R., i wsp., J. Bid. Chem. 277(30): 26733-26740 (2002)).
Natężenie fIuorescencji odnoszące się do związanych odmian przeciwciała ustalano dla komórek CD56+ na FACSalibur (BD Bicscience, San Jose, CA).
10. Wiązanie FCgammaRIIb na komórkach chłoniaka Raji
Komórki chłoniaka ludzkich limfocytów B Raji przemywano 20 minut w 37°C w PBS (stężenie 0,3 komórek Mio/ml), Komórki następnie zawieszano w stężeniu 2,22 milionów komórek/ml w PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3 i dodawano 180 gl na probówkę FACS. Dziesięciokrotne rozcieńczenia przeciwciała (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 gg/ml) monoklonalnych przeciwciał niezmodyfikowanych w pozycji L19 i z modyfikacją glikozylacji w pozycji L19 dodawano do komórek Raji i inkubowano w 4°C przez 30 minut (końcowe stężenie komórek 2 miliony komórek/ml). Po dwóch przemyciach, 1:200 skoniugowanego z fluorescencyjnym izotiocjanianem koziego F(ab')2 anty-ludzka IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) dodawano do komórek i inkubowano w 4°C przez 30 minut. Po jednym przemyciu, komórki zawieszano w 0,5 ml PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3, a natężenie fIuorescencji odnoszące się do związanych odmian przeciwciała ustalano na FACSalibur (BD Bioscience, San Jose, CA) dla żyjących komórek.
11. Oznaczenie cytotoksyczności zależnej od dopełniacza
Komórki docelowe zliczano, przemywano PBS, zawieszano w AIM-V (Invitrogen) w stężeniu 1 milion komórek na ml. W 96-studzienkowej płaskodennej płytce umieszczano po 50 gl komórek na studzienkę. Rozcieńczenia przeciwciał przygotowywano w AIM-V i dodawano w objętości 50 gl do komórek. Pozwalano na wiązanie się przeciwciał do komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dopełniacz ludzkiej surowicy (Quidel) rozmrażano na świeżo, rozcieńczano 3-krotnie AIM-V i dodawano w 50 gl do dołków. Dopełniacz króliczy (Cedarlane Laboratories) przygotowywano w sposób opisany przez producenta, rozcieńczano i 3-krotnie w AIM-V i dodawano w objętości po 50 gl do dołków. Jako kontrolę, surowice, z których pochodził dopełniacz podgrzewano przez 30 minut w przed dodaniem do oznaczenia.
Płytki do oznaczeń inkubowano przez 2 godziny w 37°C. Śmiertelność komórek określano poprzez pomiar uwalniania LDH. W skrócie, płytki odwirowywano przy 300 x g przez 3 minuty. Objętość 50 gl supernatantu na studzienkę przenoszono na nową 96-studzienkową płytkę i dodawano 50 gl odczynnika do oznaczenia z zestawu Cytotoxicity (Roche). Poprzez kinetyczny pomiar z użyciem czytnika ELISA określano Vmax odpowiadające stężeniu LDH w supernatancie. Maksymalne uwalnianie określano poprzez inkubację komórek w obecności 1% Triton X-100.
Wyniki i dyskusja
Manipulowane glikozylacją odmiany chimerowych przeciwciał IgG1 anty-CD20 (przeciwciało chimerowe C2B8, znane również jako rituxiraab) wytwarzano przez kotransfekowanie hodowli ssaczych komórek wektorami do ekspresji genów przeciwciała oraz wektorami do ekspresji genów kodujących różne polipeptydy o aktywności GnT III. Odmiana niezmodyfikowana (bez manipulacji glikozylacją) tego samego przeciwciała była wytwarzana przez transfekowanie ssaczych komórek jedynie wektorem do ekspresji genu przeciwciała. Transfekowane komórki trzymano w hodowli, przez co najmniej trzy dni, a wydzielone, zrekombinowane przeciwciała oczyszczano z pożywki hodowlanej za pomocą chromatografii powinowactwa Białka A. Ekspresja genów kodujących polipeptydy o aktywności GnT III nie miała znaczącego wpływu na żywotność komórek, wzrost komórek lub wytwarzanie przeciwciała, w odniesieniu do komórek nie wytwarzających takich polipeptydów.
Oczyszczone przeciwciała były następnie analizowane pod względem ich wzorów glikozylacji. Przeciwciała te posiadają przyłączone poprzez N oligosacharydy dołączone jedynie do reszty Asn297 rejonu Fc ludzkiego IgG1. Oligosacharydy były enzymatyczn ie usuwane z przeciwciał poprzez trawienie PNGaząF, a następnie analizowane za pomocą MALDI/TOF-MS. Stosując tę technikę, możliwe jest określenie frakcji różnych rodzajów oligosacharydów w całkowitej, pierwotnej populacji oligos acharydów Fc i możliwe jest także przypisanie danych struktur do różnych pików widma (Umana, P., i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)).
Fig. 1 przedstawia neutralne profile oligosacharydowe MALDI/TOF-MS ze zrekombinowanego, chimerowego przeciwciała IgG1 C2B8 anty-CD20 wytworzonego w komórkach BHK. Komórki te transfekowano wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała pETR1502. Fig. 2 do 4 przedstawiają odpowiednie profile dla tego samego przeciwciała wytworzonego przez komórki BHK poddane manipulacji kwasami nukleinowymi kodującymi polipeptydy o aktywności GnT III. Profil na Fig. 2 pochodzi z zastosowania kwasu nukleinowego kodującego GnT III typu dzikiego podlegającego ekspresji z wektora pETR1166.
PL 224 787 B1
Profil na Fig. 3 pochodzi z zastosowania kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową zawierającą na końcu N domenę lokalizacji GnT I połączoną z końcem C domeny katalitycznej GnT III. Ten gen fuzyjny podlegał ekspresji z wektora pETR1425. Profil na Fig. 4 pochodzi z zastosowania kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową zawierającą na końcu N domenę lokalizacji a-mannozydazy II (Man II) aparatu Golgiego połączoną z domeną katalityczną GnT III. Ta fuzja genowa była poddawana ekspresji z wektora pETR1506.
Niezmodyfikowane przeciwciało posiada typowy profil oligosacharydowy (Fig. 1), z pikami o proporcjach m/z 1485, 1648 i 1810 zgodnymi dla dwuramiennych, złożonych oligosacharydów o fukozylowanym rdzeniu, z odpowiednio 0, 1- i 2- resztami galaktozowymi. Podobne profile istnieją dla oligosacharydów rejonów Fc nie zmanipulowanych przeciwciał IgG1 wytwarzanych przez inne standardowe ssacze, przemysłowe linie komórkowe takie, jak CHO oraz komórki mysiego szpiczaka (Lifely, M.R. i wsp., Glycobiology 5: 813-822 (1995)). Manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciało poprzez ekspresję GnT III typu dzikiego prowadzi głównie do powstania dwuczęściowych, z fukozylowanym rdzeniem, złożonych, dwuramiennych oligosacharydów (Fig. 2) z pikami o proporcjach m/z 1689, 1851 i 2014, co stanowi dwuczęściowy odpowiednik dla pików niedwuczęściowych fukozylowanych oligosacharydów charakterystycznych dla przeciwciała niezmodyfikowanego. Manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciało za pomocą ekspresji kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową GnT I-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III lokalizowana jest poprzez domenę lokalizacji GnT I Golgi, prowadzi także do powstania głównie dwuczęściowych, złożonych oligosacharydów dwuramiennych (zauważ piki przy m/z 1689 i 1851 na Fig. 3). Jednakże w porównaniu z GnT III typu dzikiego, zastosowanie fuzji GnT I-GnT III prowadzi do zwiększenia ilości dwuczęściowych, niefukozylowanych i dwuczęściowych, hybrydowych struktur (porównaj proporcję pików o m/z 1664, 1810, 1826 i 1973 w odniesieniu do całkowitego, pomiędzy Fig. 2 i 3). Synteza dwuczęściowych, niefukozylowanych i dwuczęściowych, hybrydowych struktur pochodzi ze współzawodnictwa, dla oligosacharydowych substratów modyfikowanych GnT I, pomiędzy zrekombinowaną domeną katalityczną GnT III oraz (i) rdzeniem endogennym, a1,6-fukozylotransferazą, (ii) a-mannozydazą II aparatu Golgiego (Man II) oraz (iii) GnT II, ponieważ po zmodyfikowaniu oligosacharydu tnącym na dwie części GlcNAc dodawanym na drodze reakcji katalizowanej przez GnT III, te trzy pozostałe enzymy nie mogą więcej modyfikować dwuczęściowych oligosacharydów. Zatem blokowanie działania Man Il poprzez dodanie tnącego na dwie części GlcMAc, skutecznie blokuje także GnT II, ponieważ GnT II działa poniżej Man II w biosyntetycznej ścieżce przyłączonych poprzez N oligosacharydów. Piki przy m/z 1664 i 1826 są niefukozylowane, podczas gdy piki przy m/z 1810 i 1973 są fukozylowane. Trawienie glikozydazą EndoH, dzięki któremu można rozróżnić oligosachar ydy hybrydowe i złożone (Fig. 8A), stosowano w celu potwierdzenia, że wzrost tych pików spowodowany jest wzrostem proporcji dwuczęściowych połączonych z Fc, niefukozylowanych oraz dwuczęściowych, hybrydowych oligosacharydów (patrz poniżej).
W przeciwieństwie do innych zastosowanych tutaj kwasów nukleinowych kodujących aktywność GnT III, manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciała przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III (SEK. NR ID: 12), gdzie domena katalityczna GnT III umieszczana jest przez domenę lokalizacji Man II aparatu Golgiego, prowadzi głównie do powstania dwuczęściowych, niefukozylowanych i dwuczęściowych, hybrydowych struktur (zauważ piki przy m/z 1664, 1810, 1826 i 1973 na Fig. 4). Zatem, w porównaniu z dzikim-typem GnT III i fuzją GnT I-GnT III (SEK. NR ID: 14 i 153) fuzja Man II-GnT III była wydajniejsza w syntetyzowaniu przyłączonych do Fc dwuczęściowych, niefukozylowanych i dwuczęściowych hybrydowych oligosacharydów (porównaj proporcje pików z m/z 1664 i 1810 w odniesieniu do całości pomiędzy Fig. 2, 3 i 4). Proporcje dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów-Fc powstałych z ekspresji kwasów nukleinowych kodujących dziki typ GnT III, fuzji GnT I-GnT III oraz fuzji Man II-GnT II wynosiły w przybliżeniu odpowiednio 4, 13 i 33%. Nie wykrywano dwuczęściowych oligosacharydów w niezmodyfikowanym (niemanipulowanym) przeciwciele.
Zwiększanie ekspresji konstruktu fuzyjnego Man II-GnT III w komórkach wytwarzających przeciwciało prowadziło do dalszego wzrostu w proporcjach dwuczęściowych, niefukozylowanych oligos acharydów. Zostało to przedstawione przez ekspresję konstruktu Man II-GnT III z wektora (pETR1519) z OriP dla episomalnej replikacji w stransfekowanych komórkach HEK293-EBNA. Ten układ ekspresyjny znany jest z prowadzenia do wysokich poziomów ekspresji i był także stosowany do ekspresji genów przeciwciała z wektora pETR1520. Profil oligosacharydowy z oczyszczonego, niezmodyfikowanego (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciała wyrażanego na wysokich poziomach w tym ukłaPL 224 787 B1 dzie przedstawiono na Fig. 5, która ponownie ukazuje typowy profil oligosacharydowy z pikami niedwuczęściowych, fukozylowanych oligosacharydów posiadających 0, 1 i 2 reszty galaktozowe (np., porównaj Fig. 1 i 5 ukazujące podobne profile oligosacharydowe niezmodyfikowanego przeciwciała wyrażanego w komórkach BHK lub na wyższych poziomach w komórkach HEK293-EBNA). Manipulacja komórek wytwarzających przeciwciało z kwasem nukleinowym kodującym fuzję Man II-GnT III podlegającym ekspresji na wyższych poziomach w tym układzie prowadziła do wytwarzania przeciwciał, gdzie większość oligosacharydów-Fc było dwuczęściowych, niefukozylowanych (patrz Fig. 6, gdzie piki hybrydowych, niefukozylowanych, dwuczęściowych oligosacharydów przy m/z 1664 i 1826 stanowią razem ponad 90% wszystkich oligosacharydów).
Jak wspomniano powyżej, w celu potwierdzenia przypisania dwuczęściowych niefukozylowanych i dwuczęściowych hybrydowych struktur z różnymi pikami oligosacharydów obserwowanymi w profilach MALDI stosowano endoglikozydazę H (EndoH). Profile oligosacharydów neutralnych MALDI/TOF-MS glikanów trawionych PNGaząF oraz PNGaząF+EndoH, uzyskanych z chimerowego przeciwciała IgG1 anty-CD20, wytworzonych przez komórki HEK293 z manipulacją glikozylacji przez nadekspresję GnT III(M2), przedstawiono na Fig. 7. Pik przy m/z 1664 może być przypisany dwóm różnym glikanom, mianowicie niefukozylowanemu hybrydo-dwuczęściowemu lub niefukozylowanemu złożonemu, nie-dwuczęściowemu. Różne struktury ukazują taki sam stosunek m/z z powodu takiej samej mieszaniny monosacharydowej (Fig. 88).
Trawienie glikanów uwolnionych PNGaząF za pomocą endoglikozydazy H wytwarza nowe struktury, z głównym pikiem przesuniętym z m/z 1664 do 1460 (Fig. 7B). Różnica odnosi się do masy reszty GlcNAc. Jak wspomniano powyżej EndoH nie może trawić złożonego typu oligosacharydów. Zatem, główny pik przy m/z 1664 może być określony jako typ niefukozylowany hybrydowy dwuczęściowy po trawieniu endoglikozydazą H.
Inne piki, mogą być przypisane do złożonych lub hybrydowych dwuczęściowych glikanów. Przy m/z 1810; po trawieniu EndoH pik znika, więc struktury mogą być przypisane do fukozylowanego hybrydowego dwuczęściowego typu. Odjęcie jednej reszty GlcNAc i jednej reszty fukozy z rdzenia a-1,6 fukozylowanego, reszta GlcNAc końca redukującego) z piku m/z 1810 wytwarza strukturę o m/z 1460. Przy m/z 1502 zniknięcie tego piku przez trawienie EndoH (wyeliminowana reszta GlcNAc) i pojawienie się piku przy m/z 1298, ukazuje, że pik 1502 może być przypisany do niefukozylowanego hybrydowego dwuczęściowego typu. Przy m/z 1647 zniknięcie piku po trawieniu EndoH ukazuje, że pik ten jest fukozylowaną hybrydową dwuczęściową strukturą. Usunięcie jednej reszty GlcNAc i jednej reszty fukozy wytwarza strukturę o m/z 1298. Pik przy m/z 1826, niefukozylowany hybrydowy dwuczęściowy typ był trawiony przez EndoH. Wytworzyło to strukturę z m/z 1622. Pik przy m/z 1053 po trawieniu EndoH może być przypisany do wysokiego typu mannozy (1257 m/z), strawionego przez EndoH. Pik przy m/z 1689 (złożony dwuczęściowy) nie był naruszony przez trawienie EndoH, jak się spodziewano. W syntezie, z danych uzyskanych w Tab. 1, stwierdzono, że 88% struktur oligosacharydowych niesie dwuczęściowy GlcNAc, z których 60% to struktury oligosacharydów niefukozylowanych hybrydowych dwuczęściowych, 22% fukozylowanych hybrydowych dwuczęściowych oraz 6% fukozylowanych złożonych dwuczęściowych.
Tab. 1. Przypisanie oligosacharydów
m/z Możliwe struktury Względny % przed EndoH Oczekiwany m/z po EndoH Obserwowany m/z po EndoH Względny % po EndoH Przypisanie
1256 Wysoko mannozowa 9 1053 1053 11 Wysoko Mannozowa (9%)
1502 Niefukoz. hybrydowa dwuczęściowa lub niefukoz. złożona 7 1298 lub 1502 1298 13 Niefukoz. hybrydowa dwuczęściowa (7%)
1647 Fukoz. hybrydowa dwuczęściowa lub fukoz. złożona 7 1298 lub 1647 1298 13 Fukoz. hybrydowa dwuczęściowa (7%)
PL 224 787 B1
1664 Niefukoz. hybrydowy dwuczęściowa lub niefukoz. złożona 49 1460 lub 1664 1460 60 Niefukoz. hybrydowa dwuczęściowa (49%)
1689 Fukoz. złożona dwuczęściowa 3 1689 1689 5 Fukoz. złożona dwuczęściowa (3%)
1810 Fukoz. hybrydowa dwuczęściowa lub fukoz. złożona 15 1460 lub 1810 1460 1810 2 Fukoz. hybrydowa dwuczęściowa (13%) i fukoz. złożona (2%)
1826 Niefukoz. hybrydowa dwuczęściowa 4 1622 1622 7 Niefukoz. hybrydowa dwuczęściowa (4%)
1851 Fukoz. złożona dzielona 3 1851 1851 2 Fukoz. złożona dwuczęściowa (3%)
1972 Fukoz. hybrydowa dwuczęściowa 3 1622 1622 7 Fukoz. hybrydowa dwuczęściowa (3%)
Równowagi mas (w molach frakcji w %):
a) Piki przy m/z 1502 oraz 1647: 7 + 7% = 14% (oczekiwana). Trawienie EndoH dla obu pików daje m/z 1298 (otrzymane 13% po EndoH)
b) Piki przy m/z 1664 i 1810: 49 + 13% = 62%. EndoH daje m/z 1450 (otrzymane 60%)
c) Piki przy m/z 1826 i 1972: 4 + 3% = 7%. EndoH daje m/z 1622 (7%)
Podsumowanie:
Całkowity względny procent struktur posiadających dwuczęściowy GlcNAc: 88% niefukozylowany hybrydowy dwuczęściowy; 60% fukozylowany hybrydowy dwuczęściowy: 22% fukozylowany złożony dwuczęściowy: 6%
Powyższe dane (Fig. od 1 do 6) wskazują, że zarówno poziom ekspresji GnT III jak i szczególnej domeny lokalizacji stosowanej do umieszczenia domeny katalitycznej GnT III w aparacie Golgiego, wpływają na współzawodnictwo o oligosacharydowe substraty modyfikowane GnT I pomiędzy zrekombinowaną domeną katalityczną GnT III a endogenną rdzenną α 1,6-fukozylotransferazą, enzymami (Man II) i GnT II. Wyższa ekspresja GnT III daje jej przewagę w tym współzawodnictwie, prowadząc do wyższych poziomów dwuczęściowych, hybrydowych oraz dw uczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów oraz do towarzyszącej redukcji poziomów dwuczęściowych, złożonych i dwuczęściowych fukozylowanych oligosacharydów. Było to również stwierdzone wcześniej dla dzikiego typu GnT III (Umana, P., i wsp., Nature Biotechnol 17: 176180 (1999)). Jednak, pomimo, że prowadzi do powstania podobnych całkowitych poziomów dw uczęściowych oligosacharydów, umiejscowienie domeny katalitycznej GnT III przez domeny lokalizacji GnT I lub Man II prowadziło do skuteczniejszego współzawodnictwa, w stosunku do dzikiego typu GnT III dla substratów oligosacharydów zmodyfikowanych GnT I względem endogennego rdzenia α 1,6-fukozylotransferazy, enzymów Man II i GnT II.
Wyższą wydajność fuzji GnT I-GnT III w porównaniu do dzikiego typu GnT III dla syntezy dwuczęściowych, hybrydowych i dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów można wyjaśnić przez wcześniejszą dystrybucję w aparacie Golgiego, w kierunku od cis do trans tran sportu substratów glikoproteinowych GnT I w stosunku do GnT III. Dokładną dystrybucję GnT I i Man II w aparacie Golgiego ustalono wcześniej za pomocą ilościowej mikroskopii immunoelektronowej [Rabouille, C., i wsp., J. Cell Sci. 108; 1617-27 (1995)). Oba enzymy rozmieszczone są razem wzdłuż aparatu Golgiego, lokalizując się głównie w cysternach przyśrodkowych i trans st oPL 224 787 B1 su aparatu Golgiego, z wyższymi poziomami w cysternach przyśrodkowych w porównaniu z c ysternami trans. Dokładne ilościowe przestrzenne rozmieszczenia rdzenia α 1,6-fukozylotransferazy, GnT II oraz dzikiego typu GnT III nie zostały jeszcze ustalone. Powyższe dane nie wyjaśniają jednakże, dlaczego fuzja Man II-GnT III jest znacząco wydajniejsza niż fuzja GnT I-GnT III, w syntezie dwuczęściowych, hybrydowych i dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów, jako, że zarówno GnT I jak i Man II posiadają takie same przestrzenne rozkłady wzdłuż przedziałów ap aratu Golgiego.
Wyższa wydajność fuzji Man II-GnT III wskazuje na występowanie względnie zorganizowanych funkcjonalnych przedziałów reakcji glikozylacji pośród fizycznych przedziałów cysterny prz yśrodkowej i trans aparatu Golgiego. Przyjmuje się, że tak zwane „enzymy glikozylacji środkowego aparatu Golgiego”, GnT I, GnT II i Man II występują w aparacie Golgiego w postaci kompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej. Jednakże, jeżeli domeny lokalizacji pozwalają tym enzymom kształtować część tych kompleksów, tak samo będzie dla fuzji GnT I- oraz Man II-GnT III. Ekspresja zrekombinowanej fuzji GnT I-GnT III nie doprowadziła do zastąpienia endogennego dzikiego typu enzymu GnT I w stopniu znaczącym dla syntezy Fc-oligosacharydów, ponieważ wszystkie zastosowane tutaj konstrukty GnT III prowadziły do powstania większości oligosacharydów mod yfikowanych w reakcjach przeprowadzanych zarówno przez GnT I, jak i GnT III.
Dane nasze wskazują, że za pomocą domeny lokalizacji Man II, ma miejsce bardziej specyficzne funkcjonalne parowanie pomiędzy domenami katalitycznymi endogennego GnT I a zrekombinowaną fuzją Man II-GnT III. Wiadomo, że zorganizowane parowanie enzymów katalizujących kolejne reakcje na szlaku biosyntezy, w sposób, który promuje przenoszenie produktu pierwszej reakcji do drugiego miejsca katalitycznego względem oddyfundowywania takiego produktu od enzymów, ma miejsce w innych szlakach biosyntezy takich, jak glikoliza i biosynteza poliketydów. Obserwowano tworz enie przez GnT I i Man II „pokrewnych oligomerów”, przynajmniej podczas przemieszczania jednego z tych enzymów do siateczki wewnątrzplazmatycznej (Hilsson, T. i wsp. EMBO J. 13(3). 562-74 (1994)). Okazało się, że para naładowanych reszt aminokwasowych w każdym z rejonów strukturalnych obu tych enzymów jest kluczowa dla rozpoznawania tego rodzaju pokrewieństwa. Reszty w GnT I były odwrotnie naładowane w stosunku do reszt w Man II. Zidentyfikowaliśmy podobne reszty w równoważnych miejscach rejonów strukturalnych innych enzymów glikolizacyjnych aparatu Golgiego zaangażowanych w tę część szlaku biosyntetycznego przyłączonych poprzez N oligosacharydów, konkretnie w rdzeniu a1,6-fukozylotransferazy (takie same ładunki jak w GnT I zamiast komplementarnych ładunków jak w przypadku Man II), Man I oraz GnT II. Ustaliliśmy także, że te reszty są konserwowane u różnych gatunków. Chociaż sugerowano, że reszty te nie są istotne dla łączenia się w tworzone przez enzymy kompleksy o wysokiej masie cząsteczkowej lub nawet dla lokalizacji w aparacie Golgiego (Opat, A.S. i wsp. J. Biol. Chem 275 (16): 11836-45 (2000)), możliwe jest, że są one zaangażowane w bardziej specyficzne parowanie domen katalitycznych w trakcie biosyntezy oligosacharydów.
Parowanie takie nie musi być nieodwracalne, ale może być zależne od przejściowego, dynamicznego oddziaływania pomiędzy enzymami. Mogą istnieć dodatkowe determinanty parowania w którejkolwiek części rejonu strukturalnego lub katalitycznego. Jednakże, jakikolwiek udział w spec yficznym parowaniu GnT I-Man II ze strony katalitycznej domeny Man II wiązałby się z utratą zrekombinowanego połączenia zawierającego katalityczną domenę GnT III.
Fig. 9 do 11 przedstawiają podwyższoną zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC), będącą wynikiem nadekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciała, kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd o aktywności GnT III, umieszczony w aparacie Golgiego za pomocą różnych domen lokalizacji. Podwyższoną ADCC będącą wynikiem wyrażenia zrekombinowanego polipeptydu o aktywności GnT III umieszczonego w aparacie Golgiego poprzez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego GnT I przedstawiono na Fig. 9. Oligosacharydowy profil dla przeciwciała kontrolnego zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 9, przedstawiono na Fig. 1. Oligosacharydowy profil dla przeciwciała ze zmienioną glikozylacji zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 9, przedstawiono na Fig. 3. Podwyższona ADCC będąca wynikiem wyrażenia zrekombinowanego polipeptydu o aktywności GnT III umieszczonego w aparacie Golgiego poprzez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego glikozydazy, Man II, przedstawiono na Fig. 10. Oligosacharydowy profil przeciwciała kontrolnego zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 10, przedstawiono na Fig. 5. Oligosacharydowy profil przeciwciała ze zmienioną glikozylacją zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 10, przedstawiono na Fig. 6.
PL 224 787 B1
Fig. 11 pokazuje, że wyrażenie zrekombinowanego polipeptydu o aktywności GnT III umieszczonego w aparacie Golgiego za pomocą domeny lokalizacji w aparacie Golgiego Man II prowadzi do podwyższenia aktywności ADCC w porównaniu z zastosowaniem polipeptydu GnT III typu dzikiego z jego własną domeną lokalizacji w aparacie Golgiego GnT III. Oligosacharydowy profil przeciwciała z manipulacją glikozylacji uzyskaną poprzez wyrażenie GnT III typu dzikiego, zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 11, przedstawiono na Fig. 2. Oligosacharydowy profil przeciwciała z manipulacją glikozylacji uzyskaną poprzez wyrażenie fuzji pol ipeptydowej o aktywności GnT III, umieszczonego w aparacie Golgiego poprzez domenę lokalizacji Man II i zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 11, przedstawiono na Fig. 4. Dane te pokazują także, że przeciwciała zawierające dwuczęściowe oligosacharydy, wliczając dwuczęściowe, hybrydowe i dwuczęściowe, niefukozylowane oligosacharydy, wykazują podwyższoną aktywność ADCC w porównaniu z przeciwciałami zawierającymi złożone, fukozylowane, niedwuczęściowe oligosacharydy. Należy zauważyć, że wszystkie spośród dwuczęściowych oligos acharydów najbardziej aktywnych przeciwciał zastosowanych w teście ADCC widocznym na Fig. 10 są dwuczęściowymi, niefukozylowanymi hybrydowymi oligosacharydami. Jak wspomniano uprzednio, stosowanie fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III i umieszczonego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II prowadzi do wydajniejszej syntezy niefukozylowanych, dwuczęściowych oligosacharydów, a Fig. 11 pokazuje, że przeciwciała o podwyższonym poziomie dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów są bardziej aktywne w teście ADCC w st osunku do przeciwciał o niższym poziomie tych oligosacharydów. Podwyższone aktywności AD CC są skorelowane ze zwiększeniem frakcji owych dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosach arydów w populacji oligosacharydów związanych z Fc, a znaczne wzrosty są widoczne, gdy frakcja ta jest większa niż 15 do 20%.
Wiadomo, że komórki NK są ważnymi mediatorami ADCC. Komórki te posiadają na swojej powierzchni receptor aktywujący Fc gamma IIIA, znany również jako CD16a. Wiązanie rejonu Fc przeciwciał połączonych z komórkami docelowymi, z receptorami Fc gamma RIIIA na komórkach NK jest istotne dla krzyżowego połączenia tych receptorów na komórce NK i następującej po tym indukcji ADCC. Ważne jest, zatem oszacowanie wiązania przeciwciał wytworzonych za pomocą opisanych tutaj sposobów do receptorów Fc, a zwłaszcza do receptorów w naturalnej postaci, w której ludzkie immunologiczne komórki efektorowe je prezentują. Fig. 12 ukazuje, że przeci wciała z manipulacją glikozylacji wytworzone w wyniku ekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciała, kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GnT III , mają zwiększone powinowactwo wiązania do ludzkiego receptora aktywującego Fc gamma RIIIA. Jak wspomniano uprzednio dla oznaczeń ADCC, przeciwciała te mają podwyższone poziomy dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów, co jest wynikiem wyrażenia w komórkach wytwarzających przeciwciało fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III. Komórki NK zastosowane w tym oznaczeniu pochodziły od dawcy o genotypie, który nie wyraża receptora Fc gamma RIIc na swoich komórkach NK (Metes, D., i wsp., J. Immunol, Metho ds 258 (1-2): 85-95 (2001)). Zatem, jedyny receptor Fc znajdujący się na powierzchni tych komórek, to receptor Fc gamma RIIIA. Fig. 13 pokazuje, że oznaczenie wiązania mierzy specyficzne powinowactwo wiązania się z tym receptorem. Zostało to ukazane przez współzawodnictwo z fragmentem specyficznego przeci wciała blokującego Fc gamma RIII (fragment 3G8 Fab2).
Silny dowód na wpływ wzmocnionych oddziaływań Fc-FcR na rezultat przeciwnowotworowej terapii przeciwciałowej pochodzi z powiązania, wykrytego u pacjentów z chłoniakiem otrzym ujących rituximab, pomiędzy wydajnością oraz homozygotycznym genotypem receptora FcgammaRIIIA o wysokim powinowactwie (Carton, G., i wsp., Blood 99(3): 754-8 (2002)). Był to pojedynczy parametr związany z ogromnie zwiększonym tempem obiektywnej odpowiedzi oraz zwiększoną proporcji odpowiedzi cząsteczkowych. Zwiększona wydajność spowodowana wzmo cnionymi oddziaływaniami FcgammaRIIIA-Fc może pochodzić z funkcji pełnionych przez różne rodzaje komórek immunologicznych, włączając limfocyty NK, makrofagi, monocyty oraz komórki dendrytyczne. Powiązanie aktywującego receptora FcgammaRIIIA na limfocytach NK, makrofagach i monocytach może prowadzić do Iizy komórki nowotworowej przez ADCC (powszechnie uważa się, że jest to pierwotny, zależny od FcR mechanizm niszczący in vivo) (Maloney, D. G., i wsp., Semin. Oncol. 29 (1 Suppl. 2) 2-9 (2002), Amigorena S., J. Exp. Med. 195(1): F1-3 (2002)) oraz komórkowej fagocytozy zależnej od przeciwciał (Hazenbos, W. L., i wsp., J. Immunol. 161(6): 3026-32 (1998), Reff, M. E. i Heard, C. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 40 (1): 25-35 (2001)) oraz
PL 224 787 B1 uwolnienia cytokin w otoczeniu komórek nowotworowych (Carson, W. E., i wsp., Eur. J. Immunol. 31: 3016-3025 (2001)). Cytokiny te mogą z kolei prowadzić do kierowania wpływów cytotoksycznych na komórki nowotworowe, do efektów przeciwangiogennych, które hamują wzrost nowotw oru przez pozbawienie tlenu i związków odżywczych oraz do wzmocnionej prezentacji antygenów nowotworowych jako części odpowiedzi immunologicznej z udziałem aktywnych limfocytów T przeciwko komórkom nowotworowym. Komórki dendrytyczne mają kluczowe znaczenie w preze ntowaniu antygenu limfocytom T, a połączenie FcgammaRIIIA na ich powierzchni (np., z obumierających komórek nowotworowych połączonych z przeciwciałem, początkowo zaatakowanych in vivo na drodze ADCC) może prowadzić do zwiększonego dojrzewania komórki dendrytycznej, pobierania antygenów i prezentacji limfocytom T oraz krzyżowego uczulania cytotoksycznych limfocytów T będących potencjalnym, bardzo wydajnym mechanizmem aktywowania oporności przeciwnowotworowej (Amigorena S., J. Exp. Med. 195 (1): F1-3 (2002), Kalergis, A. M., oraz Ravetch, J. V. J. Exp. Med. 195 (12): 1653-1659 (2002), Selenko, N., i wsp., J. Clin. Immunol. 22 (3): 124-130 (2002)). Połączenie przeciwciał związanych z komórką docelową przez receptory Fc na immunologicznych komórkach efektorowych może także prowadzić do zwiększonego bezp ośredniego niszczenia komórek docelowych, na przykład na drodze apoptozy indukowanej przez połączenie cząsteczek docelowych z antygenowymi za pośrednictwem przeciwciał (Reff, M. E. i Heard, C., Crit Rev Oncol Hematol. 40(1): 25-35 (2001), Cragg, M. S., i wsp., Blood 101(3): 1045-1052 (2003)). Spośród wszystkich tych immunologicznych komórek efektorowych jedynie limfocyty NK posiadają na swojej powierzchni tylko aktywujący receptor FcgamaRIII. Na innych rodzajach komórek, aktywujący receptor FcgammaRIII obecny jest razem z hamującym recept orem FcgammaRIIb, a indukcja efektorowych funkcji przeciwnowotworowych wynika z dodatniej równowagi sygnałów aktywujących w stosunku do sygnałów hamujących.
Fig. 15 pokazuje, że zwiększone wiązanie receptora Fc jest wybiórcze dla receptora akt ywującego w stosunku do receptora hamującego FcgammaRIIb. Wybiórczość taka jest ważna dla funkcji efektorowych komórek immunologicznych innych niż limfocyty NK, jak to wyjaśniono pow yżej. Ponadto, przyrosty w wiązaniu osiągnięte przez manipulację glikozylacją rejonu Fc przeci wciała, z zastosowaniem opisanych tutaj sposobów, są dużo większe niż te obserwowane natura lnie dla pacjentów o homozygotycznym genotypie FcgammaRIIA o większym powinowactwie/donorów otrzymujących standardowe, niezmodyfikowane przeciwciało (Fig. 16) oraz, że z ostały już związane z wyższą wydajnością przeciwciał anty-nowotworowych (Carton, G., i wsp., Blood 99(3): 754-8 (2002)).
Domena wiążąca aktywującego receptora FcgammaRIIIB jest prawie identyczna z taką domeną FcgammaRIIIA. Zatem, powyższe dane wskazują także, że opisane tutaj przeciwciała ze zmienioną glikozylacją mogą prowadzić do wzrostu funkcji efektorowych w których pośredniczą komórki efektorowe prezentujące FcgammaRIIIb, takie jak komórki granulocytowe (PMN), włączając uwolnienie toksycznych produktów oraz fagocytozę ((Reff, M. E., i Heard, C., Crit Rev Oncol Hematol. 40(1): 25-35 (2001), Daeron, FM. Annu. Rev. Immunol. 15: 203-34 (19S7), Ravetch, J. V. i Boliand S. Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90 (2001)).
Fig. 18 przedstawia oligosacharydowy profil przeciwciała anty-CD20 wytworzonego przez komórki BHK wzrastające w zawiesinie i zmodyfikowane dla celów konstytutywnej ekspresji o wysokim poziomie zarówno przeciwciała rekombinowanego, jak i fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III. Oligosacharydowy profil przedstawia podwyższone poziomy dwuczęściowych niefukozylowanych i dwuczęściowych hybrydowych oligosacharydów przeciwciał pochodzących z komórek, poddanych manipulacji z fuzją GnT III (patrz też Tab. 2). Struktury te nie występują w przeciwciałach bez modyfikacji glikozylacji, wytworzonych przez komórki BHK bez modyfikacji glikozylacji (patrz Fig. 1). Komórki poddane manipulacji wyrażające fuzję GnT III wykazywały normalny wzrost w zawiesinie i dobrą wydajność wytwarzania przeciwciał.
Względne procentowe udziały oligosacharydów monoklonalnych przeciwciał ze zmienioną glikozylacją wytwarzanych przez stabilną linię komórkową BHK-1502-28-11 przedstawiono w Tab. 2.
PL 224 787 B1
Tab. 2: Względne procentowe udziały pików uzyskany przez MALDI/TOF-MS.
Pik (m/z) Względny procentowy udział
1 1257 2,5%
2 1486 2,8%
3 1647 6%
4 1664 22,3%
5 1680 2,5%
6 1689 4,8%
7 1705 3%
8 1810 27,8%
9 1826 10%
10 1851 7,5%
11 1972 9%
12 2012 1,75%
Całkowite dwuczęściowe: 88,6% (4+5+6+7+8+9+10+11+12)
Całkowite niefukozylowane dwuczęściowe: 37,8% (4+5+7+9)
Całkowite fukozylowane dwuczęściowe: 50,8% (6+8+10+11 +12)
Dwuczęściowe złożone: 17% (6+7+10+12)
Hybrydowe dwuczęściowe: 71,6% (4+5+8+9+11)
Analiza oligosacharydów wykazała, że 38,6% struktur zawiera dwuczęściową resztę GlcNAc, 50,8% jest fukozylowanych, a 37,8% jest niefukozylowanych. Trawienie uwolnionego przez PNGazę F oligosacharydu za pomocą endoglikozydazy H wykazało, że większość uzyskanych pików jest typu hybrydowego dwuczęściowego (Fig. 19). Fig. 20 ukazuje podwyższone powinowactwo wiązania przeciwciała z modyfikacją glikozylacji, wytworzonego przez linię komórkową BHK-1502-28-11, do aktywującego receptora Fc FcgammaRIIIA na ludzkich limfocytach NK. Linie komórkowe rosnące w zawiesinie, z konstytutywną, stabilną ekspresją zarówno genów przeci wciał, jak i fuzji polipeptydowej GnT III są idealne do wytwarzania leczniczych przeciwciał na dużą skalę. Przy zastosowaniu standardowych sposobów manipulacji komórkowej, manipulacja glikoz ylacją może zostać osiągnięta albo przez wprowadzenie fuzji genowej GnT III do linii komórkowej zawierającej geny przeciwciał albo przez wprowadzenie genów przeciwciała do linii komórkowej zawierającej fuzję genową GnT III („produkcyjna linia komórkowa przed manipulacją glikozylacji”) lub poprzez jednoczesne wprowadzenie genów przeciwciała oraz genów fuzji GnT III.
Przeciwciało anty-CD20 wytwarzane w komórkach zmodyfikowanych w celu uzyskania w ysokiego poziomu ekspresji kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową z aktywnością GnT III i umieszczane w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II, testowano również pod kątem Iizy z udziałem dopełniacza (CML), innej funkcji efektorowej, która nie jest zależna od receptorów Fc na immunologicznych komórkach efektorowych. Znaczna większość oligosacharydów tego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji była rodzaju dwuczęściowego, hybrydowego, niefukozylowanego. Obniżona aktywność CML obserwowano dla tego przeciwciała anty-CD20 w porównaniu z przeciwciałem niemodyfiko wanym (Fig. 21). Dla takich samych zastosowań mogą być pożądane przeciwciała z podwyższonym ADCC ale z obniżonym CML, na przykład w celu zmniejszenia efektów ubocznych, takich jak zapalenie naczyń krwionośnych po stronie nowotw oru, w którym pośredniczą CML. Inne znaczące efekty uboczne, w którym pośredniczą CML o bserwowano dla terapii z przeciwciałem anty-CD20 (van der Kolk L. E., i wsp., Br J Haematol. 115(4): 807-11 (2001)). Jednakże, profile oligosacharydowe opisane powyżej pokazują także, że możliwe jest również zmodyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciało w celu wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III na średnim poziomie ekspresji, który prowadzi do średnich poziomów dwuczęściowych, hybrydowych, niefukozylowanych oligosacharydów (większych niż 15%), ale ze znaczącą frakcją oligosacharydów złożonych pośród populacji oligosacharydów Fc przeciwciała
PL 224 787 B1 z modyfikacją glikozylacji. Takie złożone oligosacharydy związane są z normalnymi, niezreduk owanymi poziomami CML. Zatem, dane wskazujące, że przeciwciała z podwyższonym ADCC mogą być wytwarzane na tej drodze, która powinna utrzymywać bardzo podobne poziomy aktywności CML w porównaniu z niemodyfikowanymi przeciwciałami.
Drugie, chimerowe przeciwciało IgG1 C225, znane także jako cetuximab, rozpoznaje ludzki receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) było poddane modyfikacji glikozylacji za pomocą sp osobów tutaj opisanych. Fig. 22 przedstawia profile oligosacharydowe niemodyfikowanego przeciwciała anty-EGFR C225 i odmiany tego samego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji. To ostatnie było wytwarzane w komórkach z ekspresją kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową z aktywnością GnT III i lokalizowane w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II. Fig. 23 przedst awia podwyższone ADCC dla przeciwciała anty-EGFR wynikające z modyfikacji jego glikozylacji. Przeciwciała z modyfikacją glikozylacji wytwarzane za pomocą opisanych tutaj sposobów i posiadające podwyższone ADCC oraz podwyższone powinowactwo wiązania do aktywujących receptorów Fc, są obiecującymi cząsteczkami do terapii przeciwciałowej nowotworu oraz chorób autoimmunologicznych, jako, że powinny prowadzić do zwiększonej wydajności, w porównaniu z odpowiadającą niezmodyfikowaną (bez modyfikacji glikozylacji) odmianą tych przeciwciał, dla tych terapii. Dodatkowo, możliwe powinno być obniżenie dawek leczniczych przeciwciał z modyfikacją glikozylacji w porównaniu z przeciwciałami niezmodyfikowanymi, a to pozytywnie wpłynie na ekonomikę wytwarzania przeciwciała.
P r z y k ł a d 2
Leczenie immunozależnej małopłytkowości u pacjenta z przewlekłą chorobą przeszczepu przeciwko gospodarzowi
Autoimmunologiczna małopłytkowość w przewlekłej chorobie przeszczepu przeciwko gospodarzowi reprezentuje przypadek rozregulowania limfocytów B prowadzącego do choroby klinicznej. W celu leczenia małopłytkowości immunozależnej u pacjenta z przewlekłą chorobą przeszczepu przeciwko gospodarzowi, pacjentowi podawane jest chimerowe monoklonalne przeciwciało anty-CD20 wytworzone za pomocą sposobów według niniejszego wynalazku i posiadające podwyższone ADCC, jak to opisano w Ratanatharathorn, V., i wsp., Ann. Inter. Med. 133(4): 275-79 (2000), (której cała zawartość włączona jest tu w całości jako odniesienie). Szczegółowo, cotygodniowa infuzja 375 mg/m2 przeciwciała jest podawana pacjentowi przez 4 tygodnie. Terapia przeciwciałami powoduje znaczny spadek limfocytów B we krwi obwodowej i spadek poziomów przeciwciała związanego z płytkami krwi.
P r z y k ł a d 3
Leczenie ciężkiej immunozależnej aplazji układu czerwonokrwinkowego i anemii hemolitycznej
Immunozależna, nabyta aplazja układu czerwonokrwinkowego (PRCA) to rzadkie schorzenie, często związane z innymi zjawiskami autoimmunologicznymi. W celu leczenia immunozależnej, nab ytej aplazji układu czerwonokrwinkowego pacjenta, chimerowe monoklonalne przeciwciało anty-CD20 wytworzone za pomocą sposobów według niniejszego wynalazku i mające podwyższoną ADCC podawane jest pacjentowi, jak to zostało opisane w Zecca, M., i wsp., Blood 12: 3995-97 (1997) (której cała zawartość włączona jest tu w całości jako odniesienie). Szczegółowo, pacjentowi z PRCA i auto2 immunologiczną anemią hemolityczną podaje się dwie dawki 375 mg/m przeciwciała tygodniowo. Po terapii przeciwciałami rozpoczyna się leczenie zastępcze z dożylną immunoglobuliną. Leczenie to wytwarza znaczny spadek limfocytów B we krwi obwodowej i znaczny wzrost liczby retikulocytów związany ze wzrostem poziomów hemoglobiny.
P r z y k ł a d 4
Materiały i Metody
1. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych fuzji GalT
Wektor do konstytutywnego wyrażania GalT
W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego dla GalT, cDNA GalT jest powielane z biblioteki cDNA (Clontech) za pomocą PCR. Dodawany jest C-końcowy znacznik epitopu c-myc zaraz powyżej kodonu stop genu (sekwencja aminokwasowa: PEQKLISEEDL), w celu późniejszego, dogodnego wykrywania GalT za pomocą testów immunologicznych na filtrach. Po potwie rdzeniu poprawnej sekwencji GalT, gen umieszczany jest pod kontrolą promotora MPSV i dod awany jest sztuczny sygnał poliadenylacji króliczej beta-globiny. Końcowy wektor ekspresyjny GalT, zawiera również oddzielną kasetę oporności na puromycynę w celu selekcji, z genem opo r56
PL 224 787 B1 ności na puromycynę również znajdującym się pod kontrolą promotora MPSV oraz sztucznego sygnału poliadenylacji króliczej beta-globiny.
Zastąpienie aminokwasów tworzących domenę lokalizacji GalT aminokwasami tworzącymi domenę lokalizacji ludzkiego GnT I.
Konstruowanie takiego hybrydowego genu galaktozylotransferazy przeprowadzane jest na przykład, poprzez reakcje zachodzącego PCR, w wyniku, czego powstaje plazmid zawierający fuzję GnT I-GalT pod kontrolą promotora MPSV oraz kasetę oporności na puromycynę do celów selekcji.
Zastąpienie aminokwasów tworzących domenę lokalizacji GalT aminokwasami tworzącymi domenę lokalizacji ludzkiej mannozydazy II.
Przeprowadzane jest konstruowanie wektora ekspresyjnego GalT. Powstały plazmid zawiera hybrydowy gen Man II-GalT będący pod kontrolą promotora MPSV.
Łączenie hybrydowego genu fuzji Man II-GalT z miejscem inicjacji replikacji oriP pochodzącym z wirusa Epsteina Barra.
Fragment DNA zawierający oriP jest subklonowany w sposób opisany w Przykładzie 1, do opisanego powyżej hybrydowego wektora ekspresyjnego Man II-GalT.
Łączenie hybrydowego genu fuzji Man II-GalT ze skróconym genem powierzchniowego znacznika komórek CD4
Wektor ekspresyjny jest modyfikowany do celów dodatkowej ekspresji skróconego genu powierzchniowego znacznika komórek CD4. W skrócie, kaseta ekspresji hybrydowego genu fuzji Man IIGalT przekształcana jest z jednocistronowej na dwucistronową kasetę ekspresyjnej przez wstawienie, poniżej kodonu stop fuzji Man II-GalT, elementu IRES pochodzącego z wirusa polio, za którym leży cDNA kodujące skrócone białko ludzkiego CD4 (zawierające sekwencję liderową ludzkiego CD4 do wydzielania, za którą leżą domeny transbłonowa oraz zewnątrzkomórkowa).
3. Transfekcja komórek ssaczych ekspresyjnymi wektorami dla fuzji GalT i przeciwciał
Transfekcja komórek BHK
Komórki w wykładniczej fazie wzrostu (żywotność 90-95%) są hodowane, zbierane, a następnie transfekowane w sposób opisany w Przykładzie 1. W celu wytwarzania przeciwciał z modyfikacją glikozylacji komórki są kotransfekowane dwoma plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała i drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GalT odpowiednio w stosunku 4:1.
Transfekcja komórek HEK293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA w wykładniczej fazie wzrostu są transfekowane w sposób opisany w Przykładzie 1. W celu wytwarzania przeciwciał z modyfikacją glikozylacji, komórki są kotransfekowane dwoma plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała i drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GalT odpowiednio w stosunku 4:1.5 dnia po transfekcji, supernatant jest zbierany, odwirowywany przez 5 minut przy 1200 rpm, po czym ponownie odwirowywany przez 10 minut przy 4000 rpm i trzymany w 4°C.
Wytwarzanie stabilnej ssaczej linii komórkowej wyrażającej zrekombinowane przeciwciało antyCD20 oraz fuzyjne GalT
Klon BHK-1502-28, w którym konstytutywnej ekspresji ulegają geny monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 oraz gen oporności na neomycynę, transfekowany jest wektorem ekspresyjnym przez elektroporację. Wektor umożliwia konstytutywną ekspresję genu Man II-GalT oraz skróconej formy ludzkiego CD4, przy czym ekspresja ostatniego zależna jest od IRES. Wektor zawiera także kasetę ekspresyjną genu oporności na puromycynę. Klony oporne na puromycynę są najpierw poddawane selekcji w celu uzyskania zestawu klonów, mających wektor DNA zintegrowany do chromosomu. Klony są następnie przeszukiwane pod względem powierzchniowego wyrażania skróconego CD4 (tCD4), który służy jako znacznik poziomu ekspresji dwucistronowej jednostki ekspresyjnej genu Man IIGalT+tCD4. Wytwarzanie zrekombinowanego przeciwciała przez wyselekcjonowane klony jest weryf ikowane przy zastosowaniu testu ELISA.
Transfekcja, po której następuje przeszukiwanie pod względem poziomu ekspresji tCD4 przeprowadzana jest w sposób opisany w Przykładzie 1.
4. Wytwarzanie i oczyszczanie przeciwciał niezmodyfikowanych i z modyfikacją glikozylacji
W przypadku komórek BHK transfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała lub kotransfekowanym wektorem ekspresyjnym przeciwciała wraz z wektorem ekspresyjnym fuzyjnego GalT, supernatant z hodowli zbierany jest po hodowli transfekowanych komórek przez 96 godzin po przePL 224 787 B1 prowadzeniu transfekcji. W zależności od oczekiwanej wydajności, dokonywanych jest kilka elektroporacji (10-15) dla tego samego wektora.
W przypadku komórek HEK293-EBNA transfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym wraz z wektorem ekspresyjnym fuzyjne go GalT, pożywka hodowlana zastępowana jest świeżą pożywką hodowlaną w przybliżeniu 16 godzin po transfekcji, po czym to ostatnia jest zbierana po hodowli transfekowanych komórek przez k olejne 120 godzin.
Dla stabilnej linii komórkowej BHK-1502-28-11, hodowla jest wysiewana w liczbie 500 000 komórek/ml, a supernatant zbierany po 4 dniach hodowli.
Oczyszczanie przeciwciał
Monoklonalne przeciwciało oczyszczane jest z hodowlanego supernatantu przy zastosowaniu dwóch kolejnych etapów chromatografii, chromatografii białka A oraz chromatografii kationowymiennej w sposób opisany w Przykładzie 1.
5. Analiza oligosacharydów
Oligosacharydy są w sposób enzymatyczny uwalniane z przeciwciał przez trawienie PNGazą F, przy czym przeciwciała są unieruchomione na błonie PVDF lub znajdują się w roztworze.
Uzyskany roztwór trawienny zawierający uwolnione oligosacharydy jest albo przygotowywany bezpośrednio do analizy MALDI/TOF-MS albo dalej trawiony glikozydazą EndoH przed przygotowywaniem próbek do analizy MALDI/TOF-MS.
Sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał unieruchomionych na błonie PVDF oraz sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał w roztworze są przeprowadzane tak, jak opisano w Przykładzie 1.
Zastosowanie trawienia endoglikozydazą H oligosacharydów uwolnionych PNGazą F do przypisania struktur hybrydowych galaktozylowanych oligosacharydów do pików neutralnych oligosacharydów MALDI/TCF-S.
Oligosacharydy uwolnione za pomocą PNGazy są następnie trawione endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96) w sposób opisany w Przykładzie 1.
MALDI/TOF-MS
Próbki zawierające enzymatyczne trawienia zawierające uwolnione oligosacharydy są przyg otowywane, a następnie analizowane w spektrometrze masowym MALD/TOF w sposób opisany w Przykładzie 1.
6. Przygotowywanie i izolacja komórek
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywane są przy zastosowaniu Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178 USA) w sposób zasadniczo zgodny z instrukcjami wytwórcy oraz protokołem opisanymi w Przykładzie 1.
Ludzkie limfocyty NK są izolowane z PBMC przy zastosowaniu procedury negatywnej selekcji jak opisano w Przykładzie 1.
8. Test ADCC
PBKC lub NK jako komórki efektorowe są przygotowywane w sposób opisany powyżej i oznaczone po względem ich zdolności do pośredniczenia w cytotoksyczności w teście cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) w sposób opisany w Przykładzie 1.
9. Wiązanie FcgammaRIIIA na limfocytach NK oraz wiązanie FcgammaRIIb na komórkach chłoniaka Raji
Wiązanie FcgammaRIIIA na świeżo wyizolowanych limfocytach NK oraz wiązanie FcgammaRIIb na komórkach chłoniaka Raji ustalane jest w sposób opisany w Przykładzie 1.
10. Test cytotoksyczności zależnej od dopełniacza
Testy cytotoksyczności zależnej od dopełniacza są przeprowadzane przy zastosowaniu roztworów przeciwciał zgodnie ze sposobem opisanym w Przykładzie 1.
Wyniki i Dyskusja
Przeprowadzane są testy w celu ukazania wpływu ekspresji genów kodujących polipeptydy o aktywności GalT na żywotność komórek, wzrost komórkowy lub wytwarzanie przeciwciał, w porównaniu z komórkami nie wytwarzającymi takich polipeptydów.
PL 224 787 B1
Oczyszczone przeciwciała są analizowane pod względem wzorów ich glikozylacji za pomocą MALDI/TOF-MS w sposób opisany w Przykładzie 1. Przy zastosowaniu tej techniki możliwe jest określenie frakcji różnych rodzajów oligosacharydów w całkowitej, oryginalnej populacji oligosacharydówFc, a także możliwe jest przypisanie struktur różnym pikom w widmach (Umana P. i wsp., Natur e Biotechnol. 17: 176-180 (1999)).
Ustalany jest profil oligosacharydowy przeciwciała niezmodyfikowanego. Szczegółowo, ustalone jest czy modyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciała przez ekspresję GalT typu dzikiego prowadzi głównie do oligosacharydów galaktozylowanych, złożonych dwuramiennych, o fukozylowanym rdzeniu. Ustalane jest także czy w porównaniu z GalT typu dzikiego modyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciała przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową GnT I-GalT, w którym katalityczna domena GalT jest lokalizowana przez domenę lokalizacji GnT I aparatu Golgiego, prowadzi głównie do powstania galaktozylowanych złożonych dwuramiennych oligosacharydów. Jeśli zsyntetyzowane zostaną galaktozylowane, niefukozylowane i galaktozylowane struktury hybrydowe, może to wynikać ze współzawodnictwa pomiędzy GalT a innymi glikozylotransferazami lub glikozydazami. Oczekuje się, że jak tylko oligosacharyd jest zmodyfikowany galaktozą dodaną na drodze reakcji katalizowanej przez GalT, rdzeń α 1,6-fukozylotransferazy, α-mannozydaza II aparatu Golgiego (Man II) oraz GnT II nie mogą dłużej modyfikować galaktozylowanych oligosacharydów.
Trawienie galaktozydazą EndoH, które może rozróżnić oligosacharydy hybrydowe i złożone, stosuje się do oceny proporcji galaktozylowanych oligosacharydów niefukozylowanych połączonych z Fc oraz oligosacharydów galaktozylowanych, hybrydowych .
Przeprowadzane są testy w celu ustalenia czy modyfikacja komórek wytwarzających przeciwciało przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man Il-GalT, gdzie domena katalityczna GalT jest lokalizowana przez domenę lokalizacji Man II aparatu Golgiego, prowadzi głównie do galaktozylowanych, niefukozylowanych i galaktozylowanych hybrydowych oligosacharydów. W szczególności ustalane jest czy w stosunku do dzikiego typu GalT i do fuzji GnT I-GalT, fuzja Man II-GalT jest wydajniejsza w syntezie oligosacharydów galaktozylowanych, niefukozylowanych, połączonych z Fc oraz galaktozylowanych, hybrydowych.
Jak wspominano powyżej, endoglikozydaza H (EndoH) stosowana jest do potwierdzenia przypisania galaktozylowanych niefukozylowanych i galaktozylowanych, hybrydowych struktur do różnych pików oligosacharydowych obserwowanych w profilach MALDI. Spośród reszt galaktozydowych oligosacharydów, które niosą resztę galaktozową, ustalane są procentowe udziały tych struktur, które są strukturami oligosacharydów niefukozylowanych hybrydowych, fukozylowanych hybrydowych oraz fukozylowanych złożonych.
Ustalany jest wpływ poziomu ekspresji GalT oraz poszczególnej domeny lokalizacji, która jest stosowana do nakierowania domeny katalitycznej GalT do aparatu Golgiego, na współzawodnictwo dla substratów oligosacharydowych modyfikowanych GnT I pomiędzy rekombinowaną domeną katalityczną GalT i endogennym rdzeniem α 1,6-fukozylotransferazy, enzymów Man II i GnT II. Ustalany jest poziom komórkowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC) wynikający z nadekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało, kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z aktywnością GalT, który umieszczany jest w aparacie Golgiego przez różne domeny lokalizacji.
Ustalane jest także, czy przeciwciała z modyfikacją glikozylacji wytwarzane przez ekspresję w komórkach wytwarzających przeciwciało kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową z aktywnością GalT, posiadają zwiększone powinowactwo wiązania do ludzkiego aktywującego receptora Fc FcgammaRIIIA, czy też do hamującego receptora FcgammaRIIb.
Konstrukty GalT będą przewyższać aktywność enogennego rdzenia α 1,6-fukozylotransferazy, modyfikując glikozylację rejonu Fc przeciwciała i w konsekwencji zwiększając ADCC.
Ustalany jest profil oligosacharydowy przeciwciała anty-CD20 wytwarzanego w komórkach BHK wzrastających w zawiesinie i modyfikowanego w celu konstytutywnej, ekspresji na wysokim poziomie zarówno przeciwciała rekombinowanego, jak i fuzji polipeptydowej z aktywnością GalT. Ustalone są także względne udziały procentowe oligosacharydów monoklonalnego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji wytwarzanego w stabilnej linii komórkowej BHK1502-28-11.
P r z y k ł a d 5
Materiały i Metody
1. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych Man II i GnT II
W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego Man II, cDNA ludzkiej mannozydazy II (SEK. NR ID: 17) subklonowano do plazmidu wektora ekspresyjnego poniżej promotora MPSV i powyżej sztuc zPL 224 787 B1 nego sygnału poliadenylacji króliczej beta-globiny. W celu ekspresji GnT II, plazmid wektora ekspresyjnego stosowany jest z cDNA ludzkiego GnT II subklonowanego poniżej promotora/wzmacniacza ludzkiego CMV i powyżej sygnału poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
Połączenie wektorów ekspresyjnych z miejscem inicjacji replikacji oriP z wirusa Epsteina Barra.
Fragment DNA z oriP subklonowano w sposób opisany w Przykładzie 1, do opisanego powyżej wektora ekspresyjnego Man II, w celu otrzymania wektora ekspresyjnego Man II pCLF9. Fragment DNA z oriP jest subklonowany sposób opisany w Przykładzie 1, do opisanego powyżej wektora ek spresyjnego GnT II w celu otrzymania wektora ekspresyjnego GanTII pGnT II.
2. Transfekcja komórek HEK293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA w wykładniczej fazie wzrostu transfekowano w sposób opisany w Przykładzie 1. W celu wytwarzania niezmodyfikowanego przeciwciała „Cwt”, komórki transfekowano wektorem ekspresyjnym przeciwciała (pETR1520).
W celu wytwarzania przeciwciała „Cbrt” z modyfikacją glikozylacji, komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała (pETR1520) i drugim do wyrażania fuzji pol ipeptydowej GnT III (pETR1519) w stosunku odpowiednio 4:1. W celu wytwarzania przeciwciała „Cm” z modyfikacją glikozylacji, komórki kotransfekowano trzema plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519) i trzecim do wyrażania mannozydazy II (pCLF9) w stosunku odpowiednio 3:1:1. W celu wytwarzania przeciwciała „Cmg” z modyfikacją glikozylacji, komórki kotransfekowano czterema plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519), trzecim do wyrażania mannozydazy II (pCLF9) i czwartym do wyrażania GnT II (pGnT II) w stosunku odpowiednio 4:0,33:0,33:0,33.
3. Wytwarzanie i oczyszczanie niezmodyfikowanych przeciwciał i przeciwciał z modyfikacją glikozylacji
Pożywka hodowlana powyższych stransfekowanych komórek wymieniana była na świeżą pożywkę hodowlaną w przybliżeniu 16 godzin po transfekcji, a ta ostatnia pożywka była zbierana po hodowli stransfekowanych komórek przez dalszych 120 godzin. Zebrane supernatanty odwirowywano przez 5 minut przy 1200 rpm, a następnie ponownie odwirowywano przez 10 minut przy 4000 rpm i trzymano w 4°C.
Oczyszczanie przeciwciał
Przeciwciała monoklonalne oczyszczano z supernatantów hodowlanych stosując dwa następujące po sobie etapy chromatograficzne, chromatografię białka A i chromatografię kationo-wymienna, w sposób opisany w Przykładzie 1. Dla przeciwciał cwt7, cbrt5 i cm1, po etapie kationo-wymiennym dodawano dodatkowy etap sączenia molekularnego stosując kolumnę Superdex 200 (Amersham Pharmacia) oraz roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem i zbierano monomeryczny pik przeciwciał.
4. Analiza oligosacharydów
Oligosacharydy uwalniano enzymatycznie z przeciwciał znajdujących się w roztworze przez trawienie PNGazą, w sposób opisany w Przykładzie 1.
Zastosowanie trawienia endoglikozydazą H oligosacharydów uwolnionych PNGazą w celu przypisania struktur oligosacharydów hybrydowych dwuczęściowych do neutralnych pików oligosacharydowych MALDI/TOF-MS
Oligosacharydy uwolnione PNGazą trawiono następnie endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96), w sposób opisany na Przykładzie 1.
MALDI/TOF-MS
Próbki zawierające trawienia enzymatyczne zawierające uwolnione oligosacharydy przygotowywano do i następnie poddawano analizie na spektrometrze masowym MALDI/TOF, jak to opisano w Przykładzie 1.
5. Przygotowanie i izolowanie komórek
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywano stosując Histopaque-1077 (Sigma Diagnostic Inc., St. Louis, MO63178 USA) w sposób zasadniczo zgodny z instrukcjami wytwórcy i protokołem opisanym w Przykładzie 1.
PL 224 787 B1
6. Izolacja limfocytów NK
Ludzkie limfocyty NK izolowano z PBMC stosując procedurę selekcji negatywnej, w sposób opisany w Przykładzie 1 .
7. Test ADCC
PBMC jako komórki efektorowe przygotowywano jak to opisano powyżej i testowano pod względem ich zdolności do pośredniczenia w cytotoksyczności w teście cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), jak to opisano w Przykładzie 1.
8. Wiązanie FcgammaRIIIA na limfocytach NK
Wiązanie FcgammaRIIIA na świeżo wyizolowanych limfocytach NK oraz wiązanie FcgammaRIIb ustalano jak w sposób opisany w Przykładzie 1.
9. Test cytotoksyczności zależnej od dopełniacza
Testy cytotoksyczności zależnej od dopełniacza przeprowadzano stosując rozcieńczenia przeciwciała zgodnie ze sposobem opisanym w Przykładzie 1, z następującymi modyfikacjami w celu przygotowania źródła ludzkiego dopełniacza. W skrócie, normalna surowica ludzka (NHS) była przygotowywana z krwi zdrowych ochotników. Krew krzepła przez jedną godzinę, a następnie była odwirowywana przy 1200 g przez 20 minut. Wolny od komórek supernatant surowicy dzielono na jednakowe objętości i przechowywano w -80°C. Stosowano 20% końcowej objętości oznaczenia NHS.
Wyniki i Dyskusja
Wersje chimerowego przeciwciała IgG1 anty-CD20 z modyfikacją glikozylacji (przeciwciało chimerowe C2B8, znane także jako rituximab) wytwarzano przez kotransfekowanie hodowli ssaczych komórek wektorami do ekspresji genów przeciwciała oraz wektorami do ekspresji genów kodujących polipeptydy z aktywnością GnT III i mannozydazy II. Dodatkowa wersja przeciwciała z modyfikacją glikozylacji jest także wytwarzana przez kotransfekowanie hodowli ssaczych komórek wektorami do ekspresji genów przeciwciała oraz wektorami do ekspresji genów kodujących polipeptydy z aktywnością GnT III, aktywnością mannozydazy II i aktywnością GnT II. Dla przeciwciała z modyfikacją glikozylacji „Cbrt” komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jeden był do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugi do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519). Dla przeciwciała z modyf ikacją glikozylacji „Cm” komórki kotransfekowano trzema plazmidami, jeden był do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugi do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519), trzeci do wyrażania mannozydazy II (pCLF9). Dla przeciwciała z modyfikacją glikozylacji „Cmg” komórki kotransfekowano czterema plazmidami, jeden był do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugi do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519), trzeci do wyrażania mannozydazy II (pCLF9) i czwarty do wyrażania GnT II (pGnT II). Niezmodyfikowaną (bez modyfikacji glikozylacji) wersję tego samego przeciwciała „Cwt” wytworzono transfekując ssacze komórki jedynie wektorem do ekspresji genów przeciwci ała. Transfekowane komórki hodowano przez 5 dni i wydzielone, rekombinowane przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej. Ekspresja genów kodujących polipeptydy z aktywnością GnT III lub Man II nie miała żadnego znaczącego wpływu na żywotność komórek, wzrost komórek lub wytwarzanie przeciwciał, w porównaniu do komórek nieprodukujących takich glikotra nsferaz lub peptydów glikozydaz.
Oczyszczone przeciwciała były następnie analizowane pod względem wzorów ich glikozylacji. Te przeciwciała niosą przyłączone poprzez oligosacharydy dołączone jedynie do reszty Asn297 regi onu Fc ludzkiego IgG1. Oligosacharydy usunięto enzymatycznie z przeciwciał trawiąc PNGazą F i następnie analizowano za pomocą MALDI/TOF-MS. Przy zastosowaniu tej techniki możliwe jest określenie frakcji różnych rodzajów oligosacharydów w całkowitej, oryginalnej populacji oligosacharydów-Fc, a także możliwe jest przypisanie struktur różnym pikom w widmach (Umana P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)).
Fig. 26 przedstawia neutralne profile oligosacharydowe MALDI/TOF-MS z niemodyfikowanego, rekombinowanego, chimerowego IgG1 C2B8 anty-CD20 przeciwciała Cwt. Jak dla niemodyfikowanego przeciwciała poprzednio opisanego w Przykładzie 1, Fig. 5, Cwt wykazuje typowy profil oligosacharydowy z pikami o wartościach m/z 1485, 1648 i 1810 odpowiadającymi dwuramiennym, z fukozylowanym rdzeniem, złożonym oligosacharydom posiadającym odpowiednio 0, 1 i 2 reszty galaktozowe. Manipulacja komórek wytwarzających przeciwciało poprzez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana poprzez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, prowadziła do wytwarzania przeciwciała (Cbrt), gdzie
PL 224 787 B1 większość oligosacharydów-Fc było dwuczęściowymi, niefukozylowanymi hybrydami (patrz Fig. 27). Jak opisano w Przykładzie 1, endoglikozydaza H (EndoH) została zastosowana do potwierdzenia przypisania dwuczęściowych, niefukozylowanych i dwuczęściowych, hybrydowych struktur do różnych pików oligosacharydowych widocznych w profilach MALDI.
Manipulacja komórek wytwarzających przeciwciało poprzez jednoczesną ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana poprzez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II i kwasu nukleinowego kodującego Man II, prowadziła do wytwarzania przeciwciała (Cm), gdzie większość oligosacharydów-Fc było dwuczęściowym, niefukozylowanymi, złożonymi (patrz Fig. 28). Manipulacja komórek wytwarzających przeciwciało poprzez ko-eskprymowanie kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man IIGnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana poprzez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, kwasu nukleinowego kodującego Man II i kwasu nukleinowego kodującego GnT II, prowadziła do wytwarzania przeciwciała (Cmg), gdzie większość oligosacharydów-Fc było dwuczęściowymi, niefukozylowanymi, złożonymi z jeszcze większym udziałem dwuczęściowych, niefukozylowanych, złożonych oligosacharydów przyłączonych do Fc niż dla przeciwciała Cm.
Fig. 29 pokazuje dane wskazujące na zwiększenie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała (ADCC) spowodowanej wyrażaniem w komórkach wytwarzających przeciwciało kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana poprzez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, gdzie kwas nukleinowy kodujący Man II-GnT III jest poddawany ekspresji zarówno samodzielnie (przeciwciało Cbrt) jak i poddawany koekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało razem z kwasem nukleinowym, kodującym Man II (Cm). Tak więc, zwiększanie poziomu dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów, zarówno typu hybrydowego jak i złożonego w regionie Fc przeciwciał z modyfikacją glikozylacji prowadzi do wzrostu aktywności ADCC.
Wiadomo, że ważnymi pośrednikami w ADCC są komórki NK (NK). Komórki te niosą na swojej powierzchni podlegający aktywacji receptor Fcgamma IIIA, znany także jako CD16a. Wiązanie się regionu Fc przeciwciał opłaszczających komórkę docelową z receptorami FcgammaRIIIA na komórkach NK jest konieczne do wiązania krzyżowego tych receptorów na komórkach NK i następującej po tym indukcji ADCC. Tak, więc, jest ważne, aby oceniać wiązanie się przeciwciał wytworzonych spos obami tutaj przedstawionymi z receptorami Fc, w szczególności z receptorami w natywnej postaci, w której są prezentowane przez ludzkie komórki efektorowe. Fig. 30 pokazuje, że przeciwciała z modyfikacją glikozylacji otrzymane poprzez uzyskanie ekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GnT III, poddanego ekspresji zarówno samodzielnie (przeciwciało Cbrt) jak i koekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm), posiadają zwiększone powinowactwo wiązania się z aktywującym ludzkim receptorem FcgammaRIIIA. Jak wspomniano powyżej dla testów ADCC, przeciwciała te mają zwiększone poziomy dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów, co jest wynikiem wyrażania w komórkach wytwarzających przeciwciało fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III.
A zatem, zwiększanie poziomu dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów, zarówno typu hybrydowego jak i złożonego, w regionie Fc przeciwciał z modyfikacją glikozylacji prowadzi do wzrostu aktywności ADCC. Komórki NK zastosowane w tym teście pochodzą od dawcy o genotypie, który nie warunkuje wyrażania receptora FcgammaRIIc na swoich komórkach NK (Metes, D., i wsp., J. Immunol. Methods 258(1-2):85-95 (2001)). Zatem, jedyny receptor Fc znajdujący się na powierzchni tych komórek, to aktywujący receptor FcgammaRlIIA.
Domena wiążąca aktywującego receptora FcgammaRIIIB jest prawie identyczna z taką domeną FcgammaRIIIA. Zatem, powyższe dane wskazują także, że opisane tutaj przeciwciała z manipulacją glikozylacji mogą prowadzić do wzrostu funkcji efektorowych, w których pośredniczą komórki efektorowe prezentujące FcgammaRIIIB, takie jak komórki granulocytów (PMN), włączając uwolnienie toksycznych produktów oraz fagocytozę ((Reff, M. E., i Heard, C., Crit Rev Oncol Hematol. 40(1): 25-35 (2001), Daeron, FM. Annu. Rev. Immunol. 15: 203-34 (1997), Ravetch, J. V. i Bolland S. Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90 (2001)).
Cbrt, czyli przeciwciało anty-CD20 wytwarzane w komórkach zmodyfikowanych w celu uzyskania ekspresji kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową z aktywnością GnT III i umieszczanego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II, testowano również pod kątem Iizy z udziałem dopełniacza (CML), innej funkcji efektorowej, która nie jest zależna od receptorów Fc na
PL 224 787 B1 immunologicznych komórkach efektorowych. Znaczna większość oligosacharydów tego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji była rodzaju dwuczęściowego, hybrydowego, niefukozylowanego. Obniżoną aktywność CML obserwowano dla przeciwciała Cbrt w porównaniu z przeciwciałem niemodyfikowanym Cwt (Fig. 31). Dla pewnych zastosowań mogą być pożądane przeciwciała z podwyższonym ADCC, ale z obniżonym CML, na przykład w celu zmniejszenia efektów ubocznych, takich jak zapalenie naczyń krwionośnych w miejscu nowotworu, w którym, pośredniczy CML. Inne znaczące efekty uboczne, w których pośredniczą CML, obserwowano dla terapii z przeciwciałem anty-CD20 (van der Kolk L. E., i wsp., Br J Haematol. 115(4): 807-11 (2001)). Jednakże, możliwe jest otrzymanie przeciwciał z modyfikacją glikozylacji o zwiększonej aktywności ADCC i wiązaniu FcgammaRIII, ale bez znaczącego obniżenia aktywności CML w stosunku do niemodyfikowanego przeciwciała, jak w przypadku przeciwciała Cm (Fig. 31). Takie przeciwciała są pożądane w zastosowaniach, gdzie maksymalna liczba eliminowanych komórek docelowych wymaga zarówno wysokiej ADCC, jak i wysokiej aktywacji dopełniacza i aktywności CML. Profile oligosacharydowe opisane powyżej pokazują, że możliwe jest zm odyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciało w celu wytwarzania przeciwciał, gdzie większość oligosacharydów przyłączonych do Fc jest dwuczęściowymi, niefukozylowanymi, typu złożonego zamiast typu hybrydowego poprzez koekspresję fuzji polipeptydowej GnT III razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (przeciwciało Cm) lub razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II i z kwasem nukleinowym kodującym GnT II (przeciwciało Cmg). Przeciwciała z modyfikacją glikozylacji mają zwiększoną aktywność ADCC i zwiększone powinowactwo wiązania FcgammaRIII, które odpowiada ich zwiększonym poziomom dwuczęściowych, niefukozylowanych oligosacharydów, przy zwiększonej aktywności CML związanej ze wzrostem udziału oligosacharydów złożonych w stosunku do udziału oligosacharydów hybrydowych.
Ten i wcześniejsze Przykłady opisały wyrażanie fuzji polipeptydowej kodowanej przez kwasy nukleinowe, gdzie fuzja polipeptydowa lokalizowana jest w aparacie Golgiego i ma domenę katalityc zną, która konkuruje z endogennymi fukozylotransferazami o akceptory oligosacharydów, wcześniej zmodyfikowane dzięki reakcjom katalizowanym przez GnT I. Rekombinowane glikoproteiny wytworzone w tak modyfikowanych komórkach gospodarza mają podwyższone poziomy niefukozylowanych oligosacharydów. Przykład ten pokazuje, że koekspresja w takich komórkach gospodarza kwasów nukleinowych kodujących Man II i/lub GnT II razem z powyższymi kwasami nukleinowymi kodującymi fuzję polipeptydową, prowadzi do przesunięcia w przebiegu biosyntezy w stronę złożonych zamiast hybrydowych oligosacharydów, a zatem do syntezy glikoprotein o zwiększonych poziomach niefukozylowanych, złożonych oligosacharydów w stosunku do glikoprotein wytwarzanych w komórkach bez jednoczesnej ekspresji kwasów nukleinowych kodujących Man II i/lub GnT II.
P r z y k ł a d 6
Nadekspresja a-mannozydazy
Klonowanie molekularne a-mannozydaza człowieka
Gen kodujący a-mannozydazę człowieka („hMan II”) (E.C. 3.2.1.114) (SEK. NR ID: 17), pod kontrolą promotora MPSV wklonowano do wektora ekspresyjnego zawierającego element OriP. Otrzymany wektor ekspresyjny pCLF9 przedstawiono na Fig. 32A. Wektorami ekspresyjnymi kodującymi lekki i ciężki łańcuch monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 były, odpowiednio, pETR1842 i pETR1843 (Fig. 32B i 32C).
Fuzja białkowa Man II-GalT
Fuzję białkową (SEK. NR ID: 20), składającą się z hMan II CTS i domeny katalitycznej β 1,4-galaktozylotransferazy człowieka (M22921, aminokwasy 126-397) skonstruowano jak opisano poniżej. Region hMan II CTS powielono w PCR na matrycy pETR1448 (CF33, GAB252). Domenę katalityczną GalT (aminokwasy 126-397) powielono z wykorzystaniem CF31 i CF35 na matrycy pBlueGalT. Połączono hMan II CTS z domeną katalityczną GalT, aby otrzymać fuzję białkową kontrolowaną promotorem MPSV (pCLF24). Cały gen GalT otrzymano z pBlueGalT. Gen kodujący GalT zsekwencjonowano (SEK. NR ID: 16):
MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSR
LPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDS
SPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDL
ELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHP
VLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDV
PL 224 787 B1
DLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLT
INGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKK
NEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS
Koniec 5' GalT powielono z CF32/CF38 i dodano na początku genu miejsce restrykcyjne Fsel. Poprzez sekwencjonowanie stwierdzono, że sekwencja jest poprawna i podmieniono ją w pCLF24 poprzez trawienie Fsel/Dralll (pCLF26). Dodano OriP do pCLF24 i pCLF26, aby otrzymać odpowiednio pCLF25 i pCLF27 (Fig. 33A i 33B).
Wyrażanie α-mannozydazy i Man II-GalT w komórkach HEK 293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA transfekowano za pomocą sposobu z fosforanem wapnia. W skrócie, w celu transfekcji w butelce T150, 15 milionów komórek umieszczano 24 godziny przed transfekcją w 28 ml DMEM, 10% FCS, 250 μg/ml neomycyny i inkubowano w 37°C przy 5% CO2 przez noc.
Dla każdej butelki T150 przeznaczonej do transfekcji, przygotowywano roztwór DNA, CaCl2 i wody przez mieszanie 94 μg DNA całkowitego wektora plazmidowego, 469 μl 1M roztworu CaCl2 dodawanie wody do końcowej objętości 938 μ!. Do tego roztworu dodawano 938 μl roztworu 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4 o pH 7,05, mieszano natychmiast przez 10 sekund i zostawiano do odstania w temperaturze pokojowej przez 20 sekund. Zawiesinę rozcieńczano 24 ml DMEM uzupełnioną 2% FCS i dodawano do T150 w miejsce istniejącej pożywki. Komórki inkubowano w 37°C, z 5% CO2 przez około 17 do 20 godzin, następnie pożywkę zastępowano 30 ml DMEM, 10% FCS. W celu testowania wpływu α-mannozydazy II na współzawodnictwo z fukozylotransferazą rdzenia, komórki transfekowano pETR1842, pETR1843 i pCLF9 w stosunku odpowiednio 2:2:1. Dla fuzji białkowej Man II-GalT komórki transfekowano pETR1842, pETR1843 i pCLF9 w stosunku odpowiednio 2:2:1. Piątego dnia po transfekcji, zbierano supernatant, odwirowywano przez 5 minut przy 1200 rpm, a następnie ponownie odwirowywano przez 10 minut przy 4000 rpm i trzymano w 4°C.
Oczyszczanie przeciwciała
Przeciwciało monoklonalne oczyszczano z 30 ml nadsączu stosując dwa kolejne etapy chrom atograficzne, obejmujące pierwszy etap składający się z chromatografii białka A, aby oddzielić przeciwciało monoklonalne od przeciwciała krowiego obecnego w surowicy, po tym następował etap chromatografii kationo-wymiennej w celu wymiany buforu na PBS.
Analiza oligosacharydów
Trawienie PNGaząF
Próbkę przeciwciała monoklonalnego (50 μg) inkubowano z N-glikozydazą F (rekombinowana, Roche, Szwajcaria) w stężeniu 0,1 mU/μΗ Trawienie prowadzono w buforze 2mM Tris, pH 7,0 przez 3 godziny w 37°C. Uwolnione neutralne oligosacharydy inkubowano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej po dodaniu kwasu octowego w końcowym stężeniu 150 mM. Następnie próbki odsalano na 0,6 ml żywicy kationo-wymiennej (żywica AG50W-X8, postać wodorowa, ziarna 100-200, BioRad, Hercules, CA) nałożonej na kolumnę chromatograficzną mikro-bio-spin (BioRad, Hercules, CA)
Trawienie EndoH
Przed traktowaniem kwasem octowym, uwolnione PNGazaF oligosacharydy trawiono endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96, ROCHE, Szwajcaria), enzymem tnącym pomiędzy resztami N-acetyloglukozoaminowymi rdzenia chitybiozy przyłączonych poprzez N oligosacharydów. Enzym tnie oligomannozę i większość typów glikanów hybrydowych, podczas gdy oligosacharydy typu złożonego nie są hydrolizowane.
Oligosacharydy trawiono 0,2 mU^l endoglikozydazą H w buforze 2 mM Tris, pH 7,0. Trawienie prowadzono przez 3 godziny w 37°C. Oligosacharydy inkubowano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej po dodaniu kwasu octowego w końcowym stężeniu 150 mM i następnie odsalano na 0,6 ml żywicy kationo-wymiennej (żywica AG50W-X8, postać wodorowa, ziarna 100-200, BioRad, Szwajcaria) nałożonej na kolumnę chromatograficzną mikro-bio-spin (BioRad, Szwajcaria).
Przygotowanie próbki i podłoża
Podłoże z kwasu 2,5-dihydrobenzoesowego (sDHB) przygotowywano przez rozpuszczenie mg kwasu 2,5-dihydrobenzoesowego +0,1 mg kwasu 5-metoksysalicyloweqo w 1 ml etanolu/10 mM wodnego chlorku sodu 1:1 (obj./obj.). 1 μl próbki nakładano na płytkę docelową ze stali nierdzewnej i mieszano na płytce z 1 μl podłoża sDHB. Próbki suszono na powietrzu, nakładano 0,2 μl etanolu.
Analizy MALDI/TOF-MS
Spektrometrem masowym MALDI-TOF stosowanym do uzyskania widma masowego był Voyager Elite (Perspective Biosystems) z możliwością opóźnionej ekstrakcji. Przyrząd działał w układzie z reflektorem. Pozytywne jony przyspieszano do 20 kV po 75 nsek opóźnieniu. Pięć widm po 40 zdjęć
PL 224 787 B1 (200 zdjęć) sumowano w celu uzyskania końcowego widma. Do oznaczania masy jonów stosowano zewnętrzną kalibrację przy zastosowaniu standardów oligoscharydowych.
Profile oligosacharydowe
Profil oligosacharydowy przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności Man II przedstawiono na Fig. 34. Stwierdzono, że oligosacharydy związane z częścią Fc przeciwciała mają strukturę złożoną, 48% z nich nie posiada fukozy rdzenia, a-mannozydaza II współzawodniczy z fukozylotransferazą rdzenia, wytwarzając 48% struktur oligosacharydów w postaci niefukozylowanej. Przy braku a-mannozydazy II, oligosacharydy części Fc przeciwciała składają się tylko ze struktur fuk ozylowanych (przeciwciało dzikiego typu).
Profil oligosacharydowy przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności fuzji białkowej Man II-GalT przedstawiono na Fig. 35A-B. Jak dla a-mannozydazy II, także w przypadku fuzji białkowej Man II-GalT, wzrasta ilość oligosacharydów o strukturze niefukozylowanej. Duży udział procentowy struktur niefukozylowanych jest zgodny z dużą ilością struktur z mannozą (m/z 1256, 1419 i 1581). Przy 67% tych niefukozylowanych cukrów, dodatkowo stwierdzono 30% struktur hybrydowych, niefukozylowanych (m/z 1622). Zatem, próbka otrzymana w obecności fuzji białkowej Man II-GalT wykazuje prawie 100% niefukozylowanych struktur.
Aktywność biologiczna przeciwciał otrzymanych w obecności a-mannozydazy II i fuzji białkowej Man II-GalT
Aby określić wpływ działania enzymów a-mannozydazy II i Man II-GalT w współzawodnictwie z fukozylotransferazą rdzenia, wykonano odpowiednie testy biologiczne. Próbki testowano in vitro na cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) i na wiązanie się z receptorem CD16 wyrażanym na powierzchni modyfikowanej linii komórkowej CHO (CHO-1708-37).
Wiązanie IgG na CHO-1708-37
Linia komórkowa CHO-1708-37 wyraża na swojej powierzchni receptor FcyRIIIA (CD16) i łańcuch γ receptora FcyRI.
Wyrażanie receptora FcγRIIIA (CD16) było oznaczone w analizie FACS z wykorzystaniem przeciwciała monoklonalnego 3G3-FITC (Fig. 36). Komórki CHO-1708-37 inkubowano w stężeniu 1 milion/ml w PBS, 0,1% BSA z różnymi wariantami przeciwciał, w różnych stężeniach (10, 3, 1, 0,3, 0,1 μg/ml) i w trzech powtórzeniach. Komórki inkubowano przez 30 min. w 4°C, a następnie płukano PBS, 0,1% BSA. Wiązanie przeciwciał wykrywano inkubując przez 30 min. w 4°C ze skoniugowanym z izotiocjanianem fIuoresceiny 1:200 kozim przeciwciałem F(ab')2 anty-ludzka IgG (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA). Intensywność fIuorescencji odpowiadająca związanym wariantom przeciwciała wyznaczono na żywych, wyłapujących komórkach FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA).
Doświadczeniami z testami wiązania objęto następujące przeciwciała:
Cwt8 (typu dzikiego I)
Man II (a-mannozydaza II)
Przeciwciało wytworzone w obecności a-mannozydazy II (Man II) wiąże się z receptorami FcγRIIIA z wyższym powinowactwem niż przeciwciała dzikiego typu.
Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) in vitro
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywano stosując Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178 USA) oraz zasadniczo stosując instrukcje producentów. W skrócie, heparynowanymi strzykawkami pobierano krew żylną od ochotników, których proszono o bieganie z maksymalną szybkością przez 1 minutę w celu zwiększenia procentowego udziału komórek NK (NK) we krwi. Krew rozcieńczano 1:0,75-1,3 PBS nie zawierającym Ca lub Mg i umieszczano na Histopaque-1077. Gradient odwirowywano przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerw. Zbierano interfazę zawierającą PBMC i przemywano ją PBS (50 ml na komórki z dwóch gradientów) i zbierano przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut, RT. Po ponownym zawieszeniu osadu w PBS, zliczano PBMC i przemywano drugi raz przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut w RT. Komórki następnie ponownie zawieszano w odpowiedniej pożywce do kolejnych procedur.
Docelowe komórki Raji przemywano w PBS, zliczano i ponownie zawieszano w OMEM, 10% FCS, 1% Glutamax w stężeniu 1 milion/ml. Dodano do nich kalceinę i komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C. Komórki następnie przemywano w PBS, zliczano i ponownie zawieszano w AIM-V w stężeniu 0,3 miliona/ml. Z tej zawiesiny komórek, dodawano po 100 μl na studzienkę na okrągłodennej, 96-studzienkowej płytce. Przeciwciała rozcieńczano w AIM-V, dodawano po 50 μl do wysiaPL 224 787 B1 nych komórek docelowych i pozwalano na wiązanie z komórkami docelowym i przez 10 min. w temp. pokojowej. Jako komórki efektorowe PBMC przygotowano tak jak opisano powyżej. Stosunek efektorowych do docelowych komórek wynosił 25:1. Komórki efektorowe przygotowano w stężeniu 15 milionów na ml w pożywce AIM-V i dodawano po 50 μl na studzienkę. Płytkę inkubowano przez 4 godziny w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Komórki przepłukano dwukrotnie PBS i dodano po 200 μl roztworu boranu. Zabijanie komórek mierzono na podstawie uwalniania kalcecyny do pożywki po lizie roztworem boranowym (Fig. 37).
Spontaniczne uwalnianie mierzono w studzienkach zawierających jedynie komórki docelowe i efektorowe, ale nie przeciwciała. Maksymalne uwalniane ustalano ze studzienek zawierających jedynie komórki docelowe i 1% Triton Χ-100. Procent specyficznego zabijania z udziałem przeciwciał obliczano w następujący sposób: ((x-SR)/(MR-SR) * 100, gdzie x jest średnią Vmax w specyficznym stężeniu przeciwciała, SR jest średnią Vmax spontanicznego uwalniania, a MR jest średnią Vmax maksymalnego uwalniania.
P r z y k ł a d 7
Stosowanie monoklonalnego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji anty-EGFR w leczeniu łuszczycy
Pacjenci, ludzie z łuszczycą mogą być leczeni monoklonalnym przeciwciałem z modyfikacją glikozylacji anty-EGFR wytworzonymi według sposobów wynalazku. Konkretnie, pacjenci otrzymują 2 cotygodniowe infuzje przeciwciała z modyfikacją glikozylacji w dawce początkowej 400 mg/m . Utrzy2 mujące dawki po 250 mg/m2 podaje się na podstawie cotygodniowych obserwacji aż do osiągnięcia pełnej odpowiedzi.
P r z y k ł a d 8
Stosowanie monoklonalnego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji Anty-ErbB2 w leczeniu przerzutującego raka prostaty, przerzutującego raka piersi, przerzutującego raka okrężnicy i odbytu, stadium IIIb lub IV nie drobnokomórkowego raka płuc
RhuMab2C4 jest pełnej długości, humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym, (wytworzonym w komórkach CHO) skierowanym przeciw ErbB2. RhuMab 2C4 blokuje oddziaływania ErbB2 z innymi członkami rodziny ErbB, przez co hamuje przekazywanie sygnałów wewnątrzkomórkowych szlaku ErbB. RhuMab 2C4 nie tylko hamuje wzrost nowotworów z nadekspresją ErbB2, ale także blokuje wzrost nowotworów, które wymagają przekazywania sygnałów zależnego od ligandów ErbB.
Postać RhuMab2C4 z modyfikacją glikozylacji, wytworzona według sposobów obecnego wynalazku może być zastosowana jako pojedynczy czynnik w leczeniu pacjentów z hormononiezależnym (niewrażliwym na androgeny) przerzutującym rakiem prostaty, przerzutującym rakiem piersi, przerzutującym rakiem okrężnicy i odbytu, stadium IIIb lub IV nie drobnokomórkowym rakiem płuc. Szczegółowo, przeciwciało RhuMab2C4 z modyfikacją glikozylacji podaje się dożylnie (IV), co tydzień lub, co trzy tygodnie w ilości odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, aż do ustania postępów choroby. Przeciwciało jest dostarczane w postaci cieczy dla wielu dawek (20 ml przy stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).
Jest oczywistym, że wynalazek można stosować w inny sposób niż opisano szczegółowo w powyższych opisach i przykładach. Jest możliwy szereg modyfikacji i zmian obecnego wynalazku w świetle powyższych technik, a zatem są one objęte dołączonymi zastrzeżeniami.
Cała zawartość wszystkich publikacji (w tym publikacji patentowych, wniosków patentowych, artykułów w pismach, podręczników laboratoryjnych, książek lub innych dokumentów) tutaj cytowanych włączona jest tu jako odniesienie.
PL 224 787 B1
LISTA SEKWENCJI <110> GlycArt Biotechrtology AG Umana, Pablo Bruenker, Peter Ferrara, Claudia Suter, Tobias
Wyizolowany kwa» nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe. komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji < 120> pokpeptydowych, sposoby in vitro i ex νινο modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego <130> 1975.0I8PC03 <140> To Be Assigned <141> Herewith <1S0> US 60/441,307 <151> 2003-01-22 <1S0> US 60/491,254 <151> 2003-07-31 <150> US 60/495,142 <151> 2003-08-15 <160> 24 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Nieznane <220>
<223> Znacznik epitopowy c-myc <400> 1
Pro Glu Gln tys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5
<210> <211> <212> <213> 2 45 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223> Starter PCR GAB-177
<400> 2
PL 224 787 B1 gcgtgtgcct gtgacccccg cgcccctgct ccagccactg tcccc 45 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-178 <400> 3 gaaggtttct ccagcatcct ggtacc 26 <210> 4 <21i> 43 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GA8-179 <400> 4 ctgaggcgcg ccgccaccat gctgaagaag cagtctgcag ggc 43 <210> 5 <211 > 48 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-180 <400> 5 ggggacagtg gctggagcag gggcgcgggg gtcacaggca cacgcggc 48 <210> 6 <211> S0 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR 6AB-252 <400> 6 gctaggccgg ccgccaccat gaagttaagc cgccagttca ccgtgttcgg 50 <210> 7 <211> 65
PL 224 787 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223» Starter PCR GAB-253 <400> 7
ggggacagtg gctggagcag gggtgagcca gcaccttggc tgaaattgct ttgtgaactt 60
ttcgg 65
<210> 8
<211> 66
<212» DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<228>
<223» Starter PCR GAB-254
<400> 3
tccgaaaagt tcacaaagca atttcagcca aggtgctggc tcacccctgc tccagccact 60
gtcccc 66
<218> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220»
<223» Starter PCR GAB-255
<400> 9
atgccgcata ggcctccgag caggacccc 29
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<22Q>
<223> starter PCR GAB-261
<400> 10
gctaaatatt gaattccctt tatgtgtaac tcttggctga agc 43
<210> 11 <211> 48 <212» DNA
PL 224 787 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-262 <400> 11 tagcaatatt gaattcgcag gaaaaggaca agcagcgaaa attcacgc 48 <210> 12 <211> 1715 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja nukleotydową Manll-GnTIII <400> 12
atgaagttaa gccgccagtt caccgtgttc ggcagtgega tcttctgtgt ggtgattttc 60
tcgctctacc tgatgctgga ccggggtcac ttagactacc ccaggaaccc gcgccgcgag 120
ggctccttcc ctcagggcca gctctcaatg ttgcaagaaa aaatagacca tttggagcgt 180
ttgctagctg agaataatga gatcatctca aatattagag actcagtcat caatttgagt 240
gagtctgtgg aggatggtcc gaaaagttca caaagcaatt tcagccaagg tgctggctca 300
cccctgctcc agccactgtc ccctagcaag gccaccgaag aactgcaccg ggtggacttc 360
gtgttgccgg aggacaccac agagtatttt gtgcgcacca aagctggcgg tgtgtgcttc 420
aaaccaggta ccaggatgct ggagaaacct tctccagggc ggacagagga gaagaccaag 480
gtggctgagg ggtcctcggt ccggggtcct gctcggaggc etatgeggea tgtgttgagt 540
gcacgggagc gcctgggagg ccggggcact aggcgcaagt gggttgagtg tgtgtgcctg 600
ccaggctggc acgggcccag ctgcggggtg cccactgtgg tccagtattc caacctgccc 660
accaaggagc gcctggtacc cagggaggtg ccgaggcggg ttatcaacgc catcaacatc 720
aaccatgagt tcgacctgct ggatgtgcgc ttccatgagc tgggcgatgt tgtggacgcc 780
tttgtggtct gcgaatccaa tttcaccgcc tacggggagc ctcggccgct caagttccga 840
gagatgctga ccaatggcac cttcgagtac atccgccaca aggtgctcta cgtcttcctg 900
gaccacttcc cacctggtgg ccgtcaggac ggctggattg cagacgacta cctgcgtacc 960
ttcctcaccc aggatggtgt ctcccgcctg cgcaacctgc gacctgatga cgtctttatc 1020
atcgacgacg cggacgagat ccctgcgcgt gatggtgtgc tgttcctcaa getetaegat 1080
PL 224 787 B1 ggctggacag agcccttcgc cttccstatg cgcaagtccc tgtatggttt cttttggaag caaccaggca eacggaggtg gtgtcaggct gcaccattgą catgctgcag gctgtgtatg ggttggacgg catccgcctg cgccgccgtc agtactacac catgcccaac tttcgacagt atgagaaccg caccggccac atcętagtge agtggtctct cggcagcccc ćtgcacttcg cgggctggca ctgctcctgg tgcttcacac cegagggcat ctacttcaaa ctcgtgtcgg cccagaatgg tgaęttcccc cgctggggtg actacgagga caagagggac ctcaattaca tccgaagctt gattcgcact gggggatggt tcgacggcac gcagcaggag taccctcctg cagaćcccag tgaacacatg tatgctccta agtacctgct caagaactat gaccagttcc gctacttgct cgaaaatccc taccgggagc ccaagagcac tgtagagggt gggcgccgga accagggctc agacggaagg tcatctgctg tcaggggcaa gttggataca acggagggcc cggaacagaa actgatctct gaagaggacc tgtag
1140
1200
1260
1320
1380
1440
15Θ0
1560
1620
168Θ
1715 <210> 13 <211> 571 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa Manll-GnTIII <400> 13
Met Lys Leu Ser Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys
1 5 10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp
2© 25 30
Tyr Pro: Arg Asn Pro Ar*g Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu
35 40 45
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu
50 .55 60
Asn Asn Glu Ile ile Ser Asn Ile Arg ASp Ser Vał Ile Asn Leu Ser
7Θ 75 8Θ
PL 224 787 B1
PL 224 787 B1
Glu Tyr Ile Arg His Lys Val Leu Tyr Val Phe Leu Asp His Phe Pro 290 295 300
Pro Gly Gly Arg Gin Asp Gly Trp ile Ala Asp Asp Tyr Leu Arg Thr 305 310 315 320
Phe Leu Thr Gin Asp Gly Val Ser Arg Leu Arg Asrt Leu Arg Pro Asp 325 330 335
Asp Vąl Phe Ile Ile Asp Asp Ala Asp Glu Ile Pro Ala Arg Asp Gly 340 345 35Θ val Leu Phe Leu Lys Leu Tyr Asp Gly Trp Thr Glu Pro Phe Ala Phe 355 360 365
His Met Arg Lys Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Trp Lys Gin Pro Gly Thr 37Θ 375 380
Leu Glu Val Val Ser Gly Cys Thr Ile Asp Met Leu Gin Ala Val Tyr 385 390 395 400
Gly Leu Asp Gly Ile Arg Leu Arg Arg Arg Gin Tyr Tyr Thr Met Pro 405 410 415
Asn Phe Arg Gin Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His Ile Leu Val Gin Trp 420 42S 430
Ser Leu Gly Ser Pro Leu His Phe Ala Gly Trp His Cys Ser Trp Cys 435 446 445
Phe Thr Pro Glu Gly Ile Tyr Phe Lys Leu Val Ser Ala Gin Asn Gly 450 455 460
Asp Phe Pro Arg Trp Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Arg Asp Leu Asn Tyr 465 470 475 480
Ile Arg Ser Leu Ile Arg Thr Gly Gly Trp Phe Asp Gly Thr Gin Gin 485 490 495
Glu Tyr Pro Pro Ala Asp Pro Ser Glu His Met Tyr Ala Pro Lys Tyr
PL 224 787 B1
500 505 51©
Leu Leu Lys Asn Tyr Asp Gin Phe Arg Tyr Leu Leu Glu Asn Pro Tyr
515 52© S2S
Arg Glu Pro Lys Ser Thr Val Glu Gly Gly Arg Arg Asn Gin Gly Ser
53© 535 540
Asp Gly Arg Ser Ser Ala Val Arg Gly Lys Leu Asp Thr Thr Glu Gly
S45 550 555 560
Pro Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
565 570 <210> 14 <211> 1722 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja nukleotydową GnTI-GnTIII <4©θ> 14 atgctgaaga agcagtctgc agggcttgtg ctgtggggcg ctatcctctt tgtggcctgg 60 aatgccctgc tgctcctctt cttctggacg cgcccagcac ctggcaggcc accctcagtc 120 agcgctctcg atggcgaccc cgccagcctc acccgggaag tgattcgcct ggcccaagac 180 gccgaggtgg agctggagcg gcagcgtggg ctgctgcagc agatcgggga tgccctgtcg 240 agccagcggg ggagggtgcc caccgcggcc cctcccgccc agccgcgtgt gcctgtgacc 300 cccgcgcccc tgctccagcc actgtcccct agcaaggeca ccgaagaact gcaccgggtg 360 gacttcgtgt tgccggagga caccacagag tattttgtgc gcaccaaagc tggcggtgtg 420 tgcttcaaac caggtaccag gatgctggag aaaccttctc cagggcggac agaggagaag 480 accaaggtgg ctgaggggtc ctcggtccgg ggtcctgctc ggaggcctat gcggcatgtg 54© ttgagtgcac gggagcgcct gggaggccgg ggcactaggc gcaagtgggt tgagtgtgtg 60© tgcctgccag gctggcacgg gcccagctgc ggggtgccca ctgtggtcca gtattccaac 660 ctgcccacca aggagcgcet ggtacccagg gaggtgccga ggcgggttat caacgccatc 72© aacatcaacc atgagttcga cctgctggat gtgcgcttcc atgagctggg cgatgttgtg 780
PL 224 787 B1
gacgcctttg tggtctgcga atccaatttc accgcctacg gggagcctcg gccgctcaag 840
ttccgagaga tgctgaccaa tggcaccttc gagtacatcc gccacaaggt gctctacgtc 900
ttcctggacc acttcccacc tggtggccgt caggacggct ggattgcaga cgactacctg 960
cgtaccttee tcacccagga tggtgtctcc cgcctgcgca acctgcgacc tgatgacgtc 1020
tttatcatcg acgacgegga cgagatccct gcgcgtgatg gtgtgctgtt cctcaagctc 1080
tacgatggct ggacagagcc cttcgccttc catatgcgca agtccctgta tggtttcttt 1140
tggaagcaac caggcacact ggaggtggtg tcaggctgca ccattgacat gctgcaggct 1200
gtgtatgggc tggacggcat ccgcctgcgc cgccgtcagt actacaccat gcccaacttt 1260
cgacagtatg agaaccgcac cggccacatc ctagtgcagt ggtctctcgg cagccccctg 1320
cacttcgcgg gctggcactg ctcctggtgc ttcacacccg agggcatcta cttcaaactc 1380
gtgtcggccc agaatggtga cttcccccgc tggggtgact acgaggacaa gagggacctc 1440
aattacatcc gaagcttgat tcgcactggg ggatggttcg acggcacgca gcaggagtac 15Θ0
cctcctgcag accccagtga acacatgtat gctcctaagt acctgctcaa gaactatgac 156Θ
cagttccgct acttgctcga aaatccctac cgggagccca agagcactgt agagggtggg 1620
cgccggaacc agggctcaga cggaaggtca tctgctgtca ggggcaagtt ggatacaacg 1630
gagggcccgg aacagaaact gatctctgaa gaggacctgt ag 1722
<2Ι0> 15 <211> 573 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa fuzji GNTI-GnTIII <400> 15
Met Leu Lys Lys Gin Ser Ala Gly Leu Val Leu Trp Gly Ala Ile Leu
5 10 15
Phe Val Ala Trp Asn Ala Leu Leu Leu Leu Phe Phe Trp Thr Arg Pro
2Θ 25 3Θ
Ala Pro Gly Arg Pro Pro Ser Val Ser Ala Leu Asp Gly Asp Pro Ala 35 40 45
PL 224 787 B1
PL 224 787 B1
Gly Asp Val Val 260 Asp Ala Phe Val Val Cys Glu Ser Asn Phe Thr Ala
265 270
Tyr Gly Glu Pro Arg Pro Leu Lys Phe Arg Glu Met Leu Thr Asn Gly
275 28Θ 285
Thr Phe Glu Tyr Ile Arg His Lys Val Leu Tyr Val Phe Leu Asp His
290 295 300
Phe Pro Pro Gly Gly Arg Gin Asp Gly Trp Ile Ala Asp Asp Tyr Leu
305 310 315 32Θ
Arg Thr Phe Leu Thr Gln Asp Gly val Ser Arg Leu Arg Asn Leu Arg
325 330 335
Pro Asp Asp Val Phe Ile Ile Asp Asp Ala Asp Glu Ile Pro Ala Arg
340 345 350
Asp Gly Val Leu Phe Leu Lys Leu Tyr Asp Gly Trp Thr Glu Pro Phe
355 360 365
Ala Phe His Met Arg Lys Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Trp Lys Gln Pro
370 375 380
Gly Thr leu Glu Val Val Ser Gly Cys Thr Ile Asp Met Leu Gln Ala
385 390 395 400
Val Tyr Gly Leu Asp Gly Ile Arg Leu Arg Arg Arg Gln Tyr Tyr Thr
405 410 415
Met Pro Asn Phe Arg Gln Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His Ile Leu Val
420 425 43Θ
Gln Trp Ser Leu Gly Ser Pro Leu His Phe A-ł 3 Gly Trp His Cys Ser
435 440 445
Trp Cys Phe Thr Pro Glu Gly Ile Tyr Phe Lys Leu Val Ser Ala Gln
456 455 460
PL 224 787 B1
Asn Gly Asp Phe Pro 465 Arg Trp Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Arg Asp Leu
47Θ 475 480
Asn Tyr Ile Arg Ser Leu Ile Arg Thr Gly Gly Trp Phe Asp Gly Thr
485 490 495
Gin Gin Glu Tyr Pro Pro Ala Asp Pro Ser Glu His Met Tyr Ala Pro
500 505 510
Lys Tyr Leu Leu Lys Asn Tyr Asp Gin Phe Arg Tyr Leu Leu Glu Asn
515 520 525
Pro Tyr Arg Glu Pro Lys Ser Thr val Glu Gly Gly Arg Arg Asn Gin
530 535 540
Gly Ser Asp Gly Arg Ser Ser Ala Val Arg Gly Lys Leu Asp Thr Thr
545 550 555 560
Glu Gly Pro Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
565 570
<210> 16
<2łl> 398
<212> PRT
<213> Nieznane
<220>
<223> Sekwencja aminokwasowa GalT z pSlueGalT
<400> 16
Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Leu Gin Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu
20 25 30
His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser
35 40 45
Arg Leu Pro Gin Leu Vał Gly Val Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly Ser
50 55 60
PL 224 787 B1
Asn Ser Ala Ala Ala ile 65 70
Gly Gin Ser Ser Gly Glu 75
Leu Arg Thr Gly 8Θ
Gly Ala Arg Pro Pro Pro 85
Pro Leu Gly Ala Ser Ser 90
Gin Pro Arg Pro 95
Gly Gly Asp Ser Ser Pro 100
Val Val Asp Ser Gły Pro 105
Gly Pro Ala Ser 110
Asn Leu Thr Ser Val Pro 115
Val Pro His Thr Thr Ala 120
Leu Ser Leu Pro 125
Ala Cys Pro Glu Glu Ser 130
Pro Leu Leu Val Gly Pro 135 140
Met Leu Ile Glu
Phe Asn Met Pro Val Asp 145 150
Leu Glu Leu Val Ala Lys 155
Gin Asn Pro Asn 160
Val Lys Met Gly Gly Arg 165
Tyr Ala Pro Arg Asp Cys 170
Val Ser Pro His 175
Lys Val Ala Ile Ile Ile 180
Pro Phe Arg Asn Arg Gin 185
Glu His Leu Lys 190
Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu 195
His Pro Val Leu Gin Arg 200
Gin Gin Leu Asp 2Θ5
Tyr Gly Ile Tyr Val Ile 210
Asn Gin Ala Gly Asp Thr 215 220
Ile Phe Asn Arg
Ala Lys Leu Leu Asn Val 225 23Θ
Gly Phe Gin Glu Ala Leu 235
Lys Asp Tyr Asp 240
Tyr Thr Cys Phe Val Phe 245
Ser Asp Val Asp Leu Ile 250
Pro Met Asn Asp 255
His Asn Ala Tyr Arg Cys 260
Phe Ser Gin Pro Arg His 265
Ile Ser Vał Ala 270
PL 224 787 B1
Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin 280 Tyr Phe Gly 285 Gly
275
Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro
290 295 3Θ0
Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg
305 310 315 320
Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Vał Gly
325 330 335
Ang Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn
340 345 350
Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser
355 360 365
Asp Gły Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gin Val Leu ASp Val Gin Arg Tyr
370 375 380
Pro Leu Tyr Thr Gin Ile Thr val Asp Ile Gly Thr Pro Ser
385 390 395 <21θ> 17 <211> 3435 <212> DNA <213> Homo sapiens <22θ>
<223> Sekwencja nukleotydowa Man II <40θ> 17 atgaagttaa gccgccagtt caccgtgttc ggcagtgcga tcttctgtgt ggtgattttc 60 tcgctctacc tgatgctgga ccggggtcac ttagactacc ccaggaaccc gcgccgcgag 120 ggctccttce ctcagggcca gctctcaatg ttgcaagaaa aaatagacca tttggagcgt 18Θ ttgctagctg agaataatga gatcatctca aatattagag actcagtcat caatttgagt 240 gagtctgtgg aggatggtcc gaaaagttca caaagcaatt tcagccaagg tgctggctca 300 catcttctgc cctcacaatt atccctctca gttgacactg cagactgtct gtttgcttca 360
PL 224 787 B1 caaagtggaa gacaatccag tgggacactg ttgaagactt ctaaagctga aagtggtggg ggtcagcttg tttgccttaa aaacctcggt ctaaaccgtg cactttgcac gtcacagata ggacctgatc ggttgtccct cggatgctac gctccactag aattatcagc tttggaactt aagggccagt gatcattact atggaatctc aaatacaaga aggaatttgg gttgtggatt aattctgcat accttcctgg ataaggctga gtcacaattc atggtggagt aaccccttca tcaatgacta aagaagactc atattataga aaattgtgac ttgatcaact ccggctgggc ctggactttc tgcataaaac ttttatgcca ctaaaatatg ggggagtccc tagatcagta gagatgattt agctttttga tatcagattt cgatgttccc ggagtggcta atttaagggc taaataaatt gactgtttca atggtaccag ttcttcttat agatggattt gtgcggagcc agatgtgcag ttggaagcaa agtctttgtg ctttagagac acggaggaag tattcagaag aggtggctgg aattgaagga tattgatccc tcacatgctt attggagttt catgatgccc ctgccagttt cccagaaaca ccgaaagaag ccgctactgt ttatatgaat ttttgatgcg tgttttaagt ttttacatcc tgctgaaatt tctctcatca acatcatgat actttttcat tttgaaggac gaaacaaaaa aaggtacctt atgttggatg ggatttgaca gtgcctcatt aagactcagt tttatttggt aaggatgctg gttatgcctg catcagtggc tttggacact atccagagag ttttggagac ttctacagct gattttaaac atacatcctg tcaaagcttt gaatacacgg tctcagtcca ctggataaag ggagattttt agaccctttt ctttactatt tcactttaca gctatcacag tcgttaatgg aaactcacat tcacaagatt gtggtctata tttacagtct ttacttatga cccataacga atatttttaa ctgagatctc ttaaaagttt atgaagctac tggaaaataa caccaacaat ttcattatgc agaattggga atgacatccc gtcttcctgg gaaatgtcca ttcgtaccaa aatgggattt agtttaaagt cagatgaaac tcacttatgc acaaacgaat tcgccctgag cggcactgac gaactgcaaa ttttggagaa acgactctta ctctgccaca atcctttaga aatttctttt atctaatgaa cccaggttgg taacatggtc ttacctttca aatagaaaat tccacattat tataggagtg ggcttatctt agttaaaaaa tctgggatct tcacacttgt aggcagattt aagcagggct agttctcctg acagtttaag taagatacag tcagagagac cgatcgagat ggacagaatc acaagctcac agaagccaga agactgggtg gataattgga ctctcctgat aaaaaatata acaagaccga
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
102Θ
1080
1140
12ΘΘ
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
174Θ
18ΘΘ
1860
1920
198Θ
PL 224 787 B1 atctcgttgg tctcagtcta tgtgagttcc ccgacagtgc aagtgttctc tgcttcagga 2Θ4Θ aaacctgtgg aagttcaagt cagcgcagtt tgggatacag caaatactat ttcagaaaca 21ΘΘ gcctatgaga tctcttttcg agcacatata ccgccattgg gactgaaagt gtataagatt 2160 ttggaatcag caagttcaaa ttcacattta gctgattatg tcttgtataa gaataaagta 2220 gaagatagcg gaattttcac cataaagaat atgataaata ctgaagaagg tataacacta 2288 gagaactcct ttgttttact tcggtttgat caaactggac ttatgaagca aatgatgact 2340 aaagaagatg gtaaacacca tgaagtaaat gtgcaatttt catggtatgg aaccacaatt 24Θ0 aaaagagaca aaagtggtgc ctacctcttc ttacctgatg gtaatgccaa gccttatgtt 2460 tacacaacac cgccctttgt cagagtgaca catggaagga tttattcgga agtgacttgc 2520 ttttttgacc atgttactca tagagtccga ctataccaca tacagggaat agaaggacag 2580 tctgtggaag tttccaatat tgtggacatc cgaaaagtat ataaccgtga gattgcaatg 264Θ aaaatttctt ctgatataaa aagccaaaat agattttata ctgacctaaa tgggtaccag 270Θ attcaaccta gaatgacact gagcaaattg cctcttcaag caaatgtcta tcccatgacc 2760 acaatggcct atatccagga tgccaaacat cgtttgacac tgctctctgc tcagtcttta 2820 ggggtttcga gtttgaatag tggtcagatt gaagttatca tggatcgaag actcatgcaa 2880 gatgataatc gtggccttga gcaaggtatc caggataaca agattacagc taatctattt 2940 cgaatactac tagaaaaaag aagtgctgtt aataeggaag aagaaaagaa gtcggtcagt 3000 tatccttctc tccttagcca cataacttct tctctcatga atcatccagt cattccaatg 3Θ6Θ gcaaataagt tcttctcacc tacccttgag ctgcaaggtg aattctctcc attacagtca 3120 tctttgcctt gtgacattca tctggttaat ttgagaacaa tacagtcaaa ggtgggcaat 3180 gggcactcca atgaggcagc cttgatcctc cacagaaaag ggtttgattg tcggttctct 3240 agcaaaggca cagggctgtt ttgttctact actcagggaa agatattggt acagaaactt 33ΘΘ ttaaacaagt ttattgtcga aagtctcaca ccttcatcac tatccttgat gcattcacct 3360 cccggcactc agaatataag tgagatcaac ttgagtccaa tggaaatcag cacattccga 342Θ atccagttga ggtga 3435 <210> 18
PL 224 787 B1 <211> 1144 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa Man II <40S> 18
Met Lys Leu Ser Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys 15 1Θ 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp 20 25 38
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu 35 40 45
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu 5Θ 55 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser 65 70 75 80
Glu Ser Vał Glu Asp Gły Pro Lys Ser Ser Gin Ser Asn Phe Ser Gin 85 50 95
Gly Ala Gly ser His Leu Leu Pro Ser Gin Leu Ser Leu Ser val Asp 100 105 110
Thr Ala Asp Cys Leu Phe Ala Ser Gin Ser Gly Ser His Asn Ser Asp 115 12Θ 125
Val Gin Met Leu Asp Val Tyr Ser Leu Ile Ser Phe Asp Asn Pro Asp 130 135 140
Gly Gly Val Trp Lys Gin Gly Phe Asp Ile Thr Tyr Glu Ser Asn Glu 145 150 155 160
Trp Asp Thr Glu Pro Leu Gin Val Phe Val Val Pro His Ser His Asn 165 170 175
PL 224 787 B1
Asp Pro Gly Trp Leu Lys Thr Phe Asn Asp Tyr Phe Arg Asp Lys Thr
180 185 198
Gin Tyr Ile Phe Asn Asn Met Val leu Lys Leu Lys Glu Asp Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Phe Ile Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Leu Ser Lys Trp Trp Asp
210 215 220
Ile Ile Asp Ile Gin Lys Lys Asp Ala val Lys Ser Leu ile Glu Asn
225 230 235 240
Gly Gin Leu Glu Ile Val Thr Gly Gly Trp Val Met Pro Asp Glu Ala
245 250 255
Thr Pro His Tyr Phe Ala Leu Ile Asp Gin Leu Ile Glu Gly His Gin
260 265 270
Trp Leu Glu Asn Asn Ile Gly Val Lys Pro Arg Ser Gly Trp Ala Ile
275 280 285
Asp Pro Phe Gly His Ser Pro Thr Met Ala Tyr Leu Leu Asn Arg Ala
290 295 300
Gly Leu Ser His Het Leu Ile Gin Arg Val His Tyr Ala Val Lys Lys
3Θ5 310 315 320
His Phe Ala Leu His Lys Thr Leu Glu Phe Phe Trp Arg Gin Asn Trp
325 330 335
Asp Leu Gly Ser Val Thr Asp Ile Leu Cys His Met Met Pro Phe Tyr
340 345 350
Ser Tyr Asp Ile Pro His Thr Cys Gly Pro Asp Pro Lys ile Cys Cys
355 360 365
Gin Phe Asp Phe Lys Arg Leu Pro Gly Gly Arg Phe Gly Cys Pro Trp
370 375 38Θ
Gly Val Pro Pro Glu Thr Ile His Pro Gly Asn Val Gin Ser Arg Ala
PL 224 787 B1
385 390 395 400
Arg Met Leu Leu Asp Gin Tyr Arg Lys Lys Ser Lys Leu Phe Arg Thr 405 410 41S
Lys Val Leu Leu Ala Pro Leu Gly Asp Asp Phe Arg Tyr Cys Glu Tyr 42Θ 425 430
Thr Glu Trp Asp Leu Gin phe Lys Asn Tyr Gin Gin Leu Phe Asp Tyr 435 440 445
Met Asn Ser Gin Ser Lys Phe Lys Val Lys ile Gin Phe Gly Thr Leu 450 455 460
Ser Asp Phe Phe Asp Ala Leu Asp Lys Ala Asp Glu Thr Gin Arg Asp 465 470 475 4ΒΘ
Lys Gly Gin Ser Met Phe Pro Val Leu Ser Gly Asp Phe Phe Thr Tyr 485 490 495
Ala Asp Arg Asp Asp His tyr Trp Ser Gły Tyr Phe Thr Ser Arg Pro 5Θ0 505 '510.
Phe Tyr Lys Arg Met Asp Arg Ile Met Glu Ser His Leu Arg Ala Ala 515 520 525
Glu Ile Leu Tyr Tyr Phe Ala Leu Arg Gin Ala His Lys Tyr Lys Ile 530 535 540
Asn Lys Phe Leu ser Ser Ser leu Tyr Thr Ala Leu Thr Glu Ala Arg 545 550 555 560
Arg Asn Leu Gly Leu Phe Gin His His Asp Ala Ile Thr Gly Thr Ala 565 570 575
Lys Asp Trp Val Val Val Asp tyr Gly Thr Arg Leu Phe His Ser Leu 580 585 590
Met Val Leu Glu Lys Ile ile Gly Asn Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu 595 600 605
PL 224 787 B1
Lys Asp Lys Leu Thr Tyr Asp Ser Tyr Ser Pro Asp Thr Phe Leu Glu 610 615 620
Met Asp Leu Lys Gln Lys Ser Gln Asp Ser Leu Pro Gln Lys Asn Ile 625 630 635 640
Ile Arg Leu Ser Ala Glu Pro Arg Tyr Leu Val Val Tyr Asn Pro Leu 645 650 655
Glu Gln Asp Arg Ile Ser Leu Val Ser Val Tyr Val Ser Ser Pro Thr 660 665 670
Val Gln Val Phe Ser Ala Ser Gly Lys Pro Val Glu Val Gln Val Ser 675 680 685
Ala Val Trp Asp Thr Ala Asn Thr Ile Ser Glu Thr Ala Tyr Glu Ile 69Θ 695 700
Ser Phe Arg Ala His Ile Pro Pro Leu Gly Leu Lys Val Tyr Lys Ile 705 710 715 720
Leu Glu Ser Ala Ser Ser Asn Ser His Leu Ala Asp Tyr Val Leu Tyr 725 730 735
Lys Asn Lys Val Glu Asp Ser Gly Ile Phe Thr Ile Lys Asn Met Ile 740 745 750
Asn Thr Glu Glu Gly Ile Thr Leu Glu Asn Ser Phe Val Leu Leu Arg 755 760 765
Phe Asp Gin Thr Gly Leu Met Lys Gln Met Met Thr Lys Glu Asp Gly 770 775 780
Lys His His Glu Val Asn Val Gln Phe Ser Trp Tyr Gly Thr Thr Ile 785 790 795 800
Lys Arg Asp Lys Ser Gly Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asp Gly Asn Ala 805 810 815
PL 224 787 B1
Lys Pro Tyr Val Tyr Thr Thr Pro Pro Phe Val Arg Val Thr His Gly 82Θ 825 830
Arg Ile Tyr Ser Glu Val Thr Cys Phe Phe Asp His Val Thr His Arg 835 840 845
Val Arg Leu Tyr His Ile Gin Gly Ile Glu Gly Gir* Ser Val Glu Val 850 855 860
Ser Asn Ile Val Asp Ile Arg Lys Val Tyr Asn Arg Glu Ile Ala Met 865 87Θ 875 880 lys Ile Ser Ser Asp Ile Lys Ser Gin Asn Arg Phe Tyr Thr Asp Leu 885 890 895
Asn Gly Tyr Gin Ile Gin Pro Arg Met Thr Leu Ser Lys Leu Pro Leu 900 9Θ5 910
Gin Ala Asn Val Tyr Pro Met Thr Thr Met Ala Tyr Ile Gin Asp Ala 915 92Θ 925
Lys His Arg Leu Thr Leu Leu Ser Ala Gin Ser Leu Gly Val Ser Ser 930 935 94®
Leu Asn Ser Gly Gin Ile Glu Val Ile Met Asp Arg Arg Leu Met Gin 945 950 955 960
Asp Asp Asn Arg Gly Leu Glu Gin Gly Ile Gin Asp Asn Lys Ile Thr 965 97Θ 975
Ala Asn Leu Phe Arg Ile Leu Leu Glu Lys Arg Ser Ala Val Asn Thr 980 985 990
Glu Glu Glu Lys Lys Ser Val Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Ser His Ile 995 1600 1005
Thr Ser Ser Leu Met Asn His Pro Vał Ile Pro Met Ala Asn Lys 1010 1015 1020
PL 224 787 B1
Phe Phe 1025 Ser Pro Thr Leu Glu 1030 Leu Gin Gly Glu Phe 1Θ35 Ser Pro Leu
Gin Ser 1040 Ser Leu Pro Cys Asp 1045 Ile His Leu Val Asn 1050 Leu Arg Thr
Ile Gin 1055 Ser Lys Val Gly Asn 1060 Gly His Ser Asn Glu 1065 Ala Ala Leu
Ile Leu 1070 His Arg Lys Gly Phe 1075 Asp Cys Arg Phe Ser 1080 ser Lys Gly
Thr Gly 1085 Leu Phe Cys Ser Thr 1090 Thr Gin Gly Lys Ile 1095 Leu Val Gin
Lys Leu 1100 Leu Asn Lys Phe Ile 1105 Val Glu Ser Leu Thr 1110 Pro Ser Ser
Leu Ser 1115 Leu Met His Ser Pro 1120 Pro Gly Thr Gin Asn 1125 Ile Ser Glu
Ile Asn Leu Ser Pro Met Glu Ile Ser Thr Phe Arg Ile Gin Leu
1130 1135 1140
Arg <210> 19 <211> 1116 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja nukleotydową Manll-GałT <400> 19 atgaagttaa gccgccagtt caccgtgttc ggcagtgcga tcttctgtgt ggtgattttc 60 tcgctctacc tgatgctgga ccggggtcac ttagactacc ccaggaaccc gcgccgcgag 12Θ ggctccttcc ctcagggcca gctctcaatg ttgcaagaaa aaatagacca tttggagcgt 18© ttgctagctg agaataatga gatcatctca aatattagag actcagtcat caatttgagt 240
PL 224 787 B1
gagtctgtgg aggatggtcc gaaaagttca caaagcaatt tcagccaagg tgctggctca 3ΘΘ
cccgcctgcc ctgaggagtc cccgctgctt gtgggcccca tgctgattga gtttaacatg 360
cctgtggacc tggagctcgt ggcaaagcag aacccaaatg tgaagatggg cggccgctat 420
gcccctaggg actgcgtctc tcctcacaag gtggccatca tcattccatt ccgcaaccgg 480
caggagcacc tcaagtactg gctatattat ttgcacccag tcctgcagcg ccagcagctg 540
gactatggca tctatgttat caaccaggcg ggagacacta tattcaatcg tgctaagctc 600
ctcaatgttg gctttcaaga agccttgaag gactatgact acacctgctt tgtgtttagt 660
gacgtggacc tcattccaat gaatgaccat aatgcgtaca ggtgtttttc acagccacgg 720
cacatttccg ttgcaatgga taagtttgga ttcagcctac cttatgttca gtattttgga 780
ggtgtctctg ctctaagtaa acaacagttt ctaaccatca atggatttcc taataattat 840
tggggctggg gaggagaaga tgatgacatt tttaacagat tagtttttag aggcatgtct 900
atatctcgcc caaatgctgt ggtcgggagg tgtcgcatga tccgccactc aagagacaaa 960
aaaaatgaac ccaatcctca gaggtttgac cgaattgcac acacaaagga gacaatgctc 1020
tctgatggtt tgaactcact cacctaccag gtgctggatg tacagagata cccattgtat 108Θ
acccaaatca cagtggacat cgggacaccg agctag 1116
<210> 20 <211> 371 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa Manll-GalT <400> 20
Met Lys Leu Ser Arg Gln Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys
1 5 10 15
val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp
20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gln Gly Gln Leu
35 40 45
PL 224 787 B1
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu 50 SS 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser 65 70 75 80
Glu Ser Val Glu Asp Gly Pro Lys Ser Ser Gin Ser Asn Phe Ser Gin 85 90 95
Gly Ala Gly Ser Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly 100 105 110
Pro Met Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala 115 120 125
Lys Gin Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp 130 135 140
Cys Val Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg 145 150 155 160
Gin Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gin 165 170 175
Arg Gin Gin Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gin Ala Gly Asp 180 185 190
Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asrt Vał Gly Phe Gin Glu Ala 195 2Θ0 205
Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu 210 215 220
Ile Pro Met Asn Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg 225 230 235 240
His Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val 245 250 255
Gin Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe Leu Thr
PL 224 787 B1
260 265 276
Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp 275 280 285
Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro 290 295 380
Asn Ala Val Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys 305 310 315 320
Lys Asn Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys 325 330 335
Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gin Val Leu 340 345 35Θ
Asp Wal Gin Arg Tyr Pro leu Tyr Thr Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly 355 360 365
Thr Pro Ser 370 <210> 21 <211> 460 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej Gntill <40O> 21
Pro Leu Leu Gin Pro Leu Ser Pro Ser Lys Ala Thr Glu Glu Leu His 15 1Θ 15
Arg Vał Asp Phe val Leu Pro Glu Asp Thr Thr Glu Tyr Phe Wal Arg 2Θ 25 30
Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro Gly Thr Arg Met Leu Glu 35 40 45
PL 224 787 B1
Lys Pro Ser Pro Gly Arg Thr Glu Glu Lys Thr Lys Val Ala Glu Gly 50 55 68
Ser Ser Val Arg Gly Pro Ala Arg Arg Pro Met Arg His Val Leu Ser 65 70 75 80
Ala Arg Glu Arg Leu Gły Gly Arg Gly Thr Arg Arg Lys Trp Val Glu 85 90 95
Cys Val Cys Leu Pro Gly Trp His Gly Pro Ser Cys Gly Val Pro Thr 100 105 110
Val Val Gin Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Lys Glu Arg Leu Val Pro Arg 115 120 125
Glu Val Pro Arg Arg Val Ile Asn Ala Ile Asn Ile Asn His Glu Phe 130 135 140
Asp Leu Leu Asp Val Arg Phe His Glu Leu Gly Asp Val Val Asp Ala 145 15Θ 155 160
Phe Val Val Cys Glu Ser Asn Phe Thr Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Pro 165 170 175
Leu Lys Phe Arg Glu Met Leu Thr Asn Gly Thr Phe Glu Tyr Ile Arg 180 185 190
His Lys Val Leu Tyr Val Phe Leu Asp His Phe Pro Pro Gly Gly Arg 195 2ΘΘ 205
Gin Asp Gly Trp Ile Ala Asp Asp Tyr Leu Arg Thr Phe Leu Thr Gin 210 215 220
Asp Gly Val Ser Arg Leu Arg Asn Leu Arg Pro Asp Asp Val Phe Ile 225 230 235 240
Ile Asp Asp Ala Asp Glu Ile Pro Ala Arg Asp Gly Val Leu Phe Leu 245 250 255
Lys Leu Tyr Asp Gly Trp Thr Glu Pro Phe Ala Phe His Met Arg Lys
PL 224 787 B1
260 265 270
Ser Leu Tyr Gły Phe Phe Trp Lys Gin Pro Gly Thr Leu Glu Val Val 275 280 285
Ser Gly Cys Thr Ile Asp Ret Leu Gin Ala Val Tyr Gly Leu Asp Gly 290 295 3Θ0
Ile Arg Leu Arg Arg Arg Gin Tyr Tyr Thr Met Pro Asrt Phe Arg Gin 305 310 315 320
Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His Ile Leu Val Gin Trp Ser Leu Gly Ser 325 330 33S
Pro Leu His Phe Ala Gly Trp His Cys Ser Trp Cys Phe Thr Pro Glu 340 345 350
Gly Ile Tyr Phe Lys Leu Val Ser Ala Gin Asn Gly Asp Phe Pro Arg 355 360 365
Trp Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Arg Asp Leu Asn Tyr He Arg Ser Leu 370 375 380
Ile Arg Thr Gly Gly Trp Phe Asp Gly Thr Gin Gin Glu Tyr Pro Pro 385 390 395 400
Ala Asp Pro Ser Glu His Met Tyr Ala Pro Lys Tyr Leu Leu Lys Asrt 405 410 415
Tyr Asp Gin Phe Arg Tyr Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Arg Glu Pro Lys 420 425 430
Ser Thr Val Glu Gly Gly Arg Arg Asn Gin Gly Ser Asp Gly Arg Ser 435 440 445
Ser Ala Val Arg Gly Lys Leu Asp Thr Thr Glu Gly 450 455 460 <210> 22
PL 224 787 B1 <211> 271 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej GalT <409> 22
Pro Ala cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile
1 5 10 15
Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu val Ala Lys Gin Asn Pro
20 25 30
Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro
35 40 45
His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu
50 55 60
Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gin Arg Gin Gin Leu
65 70 75 88
Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gin Ala Gly Asp Thr Ile Phe Asn
85 90 95
Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gin Glu Ala Leu Lys Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Thr Cys Phe V8l Phe Ser ASp Val ASp Leu Ile Pro Met Asn
115 12Θ 125
Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Val
130 135 140
Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin Tyr Phe Gly
145 150 155 160
Gly Val Ser Ala Leu Ser tys Gin Gin Phe Leu Thr I le Asn Gly Phe
165 170 175
PL 224 787 B1
Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gły Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn
180 185 190
Arg leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val
19S 200 205
Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro
210 215 220
Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu
225 230 235 240
Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg
245 250 255
Tyr Pro Leu Tyr Thr Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser
260 265 270 <210> 23 <211> 100 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22θ>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny lokalizacji Man II w aparacie Golgiego <400> 23
Met Lys Leu Ser Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys
1 5 10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp
20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu
35 40 45
Ser Met leu Gin Glu Lys Ile ASp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu
5Θ 55 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser
70 75 80
PL 224 787 B1
Glu Ser Val Glu Asp Gły Pro Lys Ser Ser Gin Ser Asn Phe Ser Gin 85 90 95
Gly Ala Gly Ser 100 <210> 24 <211> 1Θ2 <212> PRT <213» Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny lokalizacji GntI w aparacie Golgiego <460> 24
Met Leu Lys Lys Gin Ser Ala Gly Leu Val Leu Trp Gły Ala Ile Leu 1 S 10 15
Phe Val Ala Trp Asn Ala Leu Leu Leu Leu Phe Phe Trp Thr Arg Pro 2Θ 25 3Θ
Ala Pro Gly Arg Pro Pro Ser Wal Ser Ala Leu Asp Gly Asp Pro Ala 35 40 45
Ser Leu Thr Arg Glu Val Ile Arg Leu Ala Gin Asp Ala Glu Val Glu
55 60
Leu Glu Arg Gin Arg Gly Leu Leu Gin Gin Ile Gly Asp Ala Leu Ser 65 70 75 80
Ser Gin Arg Gly Arg Val Pro Thr Ala Ala Pro Pro Ala Gin Pro Arg 85 90 95
Wal Pro Wal Thr Pro Ala

Claims (24)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję kodującą fuzję polipeptydową mającą aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT), przy czym fuzja polipeptydowa obejmuje domenę katalityczną GalT i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego 3(1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I (GnTI) lub mannozydazy II (Man II), przy czym domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 22, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji Man II w aparacie Golgiego obejmiuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 23, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena GnTI lokalizacji w aparacie Golgiego obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 24, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
  2. 2. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji Man II.
  3. 3. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, znamienny tym, że domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 23, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 24, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
  4. 4. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, znamienny tym, że domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową o SEK. ID. NR: 22, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego ManII obejmuje sekwencję aminokwasową o SEK. ID. NR: 23.
  5. 5. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena GnTI.
  6. 6. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 5, znamienny tym, że domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 22, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową o SEK. ID. NR: 24, z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
  7. 7. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 5, znamienny tym, że domena katalityczna GalT obejmuje sekwencję aminokwasową o SEK. ID. NR: 22, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI stanowi sekwencję aminokwasową o SEK.ID.NR: 24.
  8. 8. Ssaczy wektor ekspresyjny, znamienny tym, że obejmuje wyizolowany kwas nukleinowy określony w dowolnym z zastrz. 1-7.
  9. 9. Fuzja polipeptydowa mająca aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT), znamienna tym, że obejmuje katalityczną domenę GalT i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego ssaczej β(1,2)-N-acetyloglukozoaminylotransferazy I (GnTI) lub ssaczej mannozydazy II.
  10. 10. Fuzja polipeptydowa według zastrz. 9, znamienna tym, że domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji ssaczej Man II.
  11. 11. Fuzja polipeptydowa według zastrz. 9, znamienna tym, że domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji ssaczej GnTI.
  12. 12. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje wektor ekspresyjny określony w zastrz. 8.
  13. 13. Sposób wytwarzania fuzji polipeptydowej mającej aktywność 3(1,4)-galaktozylotransferazy (GalT), znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 12 w pożywce w warunkach umożliwiających ekspresję kwasu nukleinowego kodującego taką fuzję polipeptydową i odzyskanie fuzji polipeptydowej z otrzymanej hodowli.
  14. 14. Sposób in vitro Iub ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie do komórki gospodarza kwasu nukleinowego określonego w dowolnym z zastrz. 1-7.
    PL 224 787 B1
  15. 15. Sposób in vitro lub ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie do komórki gospodarza wektora ekspresyjnego określonego w zastrz. 8.
  16. 16. Sposób według zastrz. 14 lub 15, znamienny tym, że polipeptydem jest IgG lub jej fragment.
  17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że polipeptydem jest IgG1 lub jej fragment.
  18. 18. Sposób według zastrz. 14 lub 15, znamienny tym, że polipeptyd jest fuzją białkową, która obejmuje region odpowiadający regionowi Fc ludzkiej IgG.
  19. 19. Komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny, znamienna tym, że wektor ekspresyjny obejmuje cząsteczkę wyizolowanego kwasu nukleinowego określoną w dowolnym z zastrz. 1-7 i cząsteczkę wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd mający aktywność mannozydazy II (Man II), przy czym polipeptyd mający aktywność Man II obejmuje Sek. Id. Nr: 18.
  20. 20. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje
    a) pierwszy wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę wyizolowanego kwasu nukleinowego określoną w dowolnym z zastrz. 1-7; i
    b) drugi wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd mający aktywność mannozydazy II (ManII), przy czym polipeptyd mający aktywność Man II obejmuje SEK. ID. NR 18.
  21. 21. Komórka gospodarza według zastrz. 20, znamienna tym, że jest wybrana z grupy składającej się z komórki ssaczej, komórki drożdży i komórki owadziej.
  22. 22. Komórka gospodarza według zastrz. 20, znamienna tym, że jest wybrana z grupy składającej się z komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, m ysiej komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 i komórki hybrydoma.
  23. 23. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego określona w zastrz. 2 mająca sekwencję nukleotydową SEK. ID. NR 19.
  24. 24. Fuzja polipeptydowa według zastrz. 10, znamienna tym, że obejmuje sekwencję SEK. ID.
PL415463A 2003-01-22 2004-01-22 Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego PL224787B1 (pl)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44130703P 2003-01-22 2003-01-22
US60/441,307 2003-01-22
US49125403P 2003-07-31 2003-07-31
US60/491,254 2003-07-31
US49514203P 2003-08-15 2003-08-15
US60/495,142 2003-08-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL415463A1 PL415463A1 (pl) 2016-04-25
PL224787B1 true PL224787B1 (pl) 2017-01-31

Family

ID=32777012

Family Applications (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL393644A PL222220B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393641A PL222219B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393645A PL222206B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393647A PL222221B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393646A PL222222B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Sposób wytwarzania polipeptydu
PL415463A PL224787B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego
PL377967A PL224786B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, komórki gospodarza, fuzja polipeptydowa i sposób jej wytwarzania, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza

Family Applications Before (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL393644A PL222220B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393641A PL222219B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393645A PL222206B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393647A PL222221B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
PL393646A PL222222B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Sposób wytwarzania polipeptydu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL377967A PL224786B1 (pl) 2003-01-22 2004-01-22 Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, komórki gospodarza, fuzja polipeptydowa i sposób jej wytwarzania, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza

Country Status (19)

Country Link
US (2) US8367374B2 (pl)
EP (4) EP2264151B1 (pl)
JP (4) JP5425365B2 (pl)
KR (2) KR101292000B1 (pl)
CN (1) CN103540600B (pl)
AT (1) ATE475708T1 (pl)
AU (2) AU2004205802B2 (pl)
CA (1) CA2513797C (pl)
CZ (1) CZ308720B6 (pl)
DE (1) DE602004028337D1 (pl)
ES (3) ES2542885T3 (pl)
HK (1) HK1089205A1 (pl)
IL (2) IL169805A (pl)
MX (1) MXPA05007781A (pl)
NO (1) NO339270B1 (pl)
NZ (5) NZ541503A (pl)
PL (7) PL222220B1 (pl)
SG (2) SG179292A1 (pl)
WO (1) WO2004065540A2 (pl)

Families Citing this family (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP3528611B2 (ja) * 1998-07-16 2004-05-17 Ｊｆｅスチール株式会社 結束材の切断方法及びその装置
NZ603111A (en) 2001-08-03 2014-05-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP5425365B2 (ja) * 2003-01-22 2014-02-26 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 増加したＦｃレセプター結合親和性およびエフェクター機能を有する抗体を作製するための融合構築物およびその使用
JPWO2004087761A1 (ja) * 2003-03-31 2006-07-27 麒麟麦酒株式会社 ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製
CN102373214B (zh) 2003-11-05 2014-07-09 罗氏格黎卡特股份公司 具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体
TW200539855A (en) * 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
CA2486285C (en) * 2004-08-30 2017-03-07 Viktor S. Goldmakher Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
TWI387602B (zh) 2005-02-07 2013-03-01 Roche Glycart Ag 與上皮生長因子受體（ｅｇｆｒ）結合之抗原結合分子，編碼該抗原結合分子之載體及其用途
EP1848745B1 (en) * 2005-02-18 2014-07-09 Medarex, L.L.C. Monoclonal antibodies against cd30 lacking in fucosyl residues
AU2006226060A1 (en) * 2005-03-25 2006-09-28 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules directed to MCSP and having increased Fc receptor binding affinity and effector function
WO2007039818A2 (en) * 2005-05-09 2007-04-12 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
CA2615846A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Genmab A/S Potency assays for antibody drug substance binding to an fc receptor
CN101291954B (zh) 2005-08-26 2013-03-27 罗氏格黎卡特股份公司 具有改变的细胞信号传导活性的修饰的抗原结合分子
JP2009531324A (ja) 2006-03-20 2009-09-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌標的化のための操作された抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
BRPI0709338A2 (pt) * 2006-03-21 2011-07-12 Genentech Inc anticorpo, molécula de ácido nucleico isolada, célula, composições, método de detecção da proteìna alfa5beta1, uso de anticorpo, métodos de tratamento, kit, uso de uma composição, uso de uma antagonista de alfa5beta e uso de uma antagonista de vegf
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
WO2008008482A2 (en) * 2006-07-13 2008-01-17 Genentech, Inc. Altered br3-binding polypeptides
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
US9017684B2 (en) 2006-10-12 2015-04-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-EREG antibody
CA2679732A1 (en) * 2007-03-07 2008-09-18 Glycofi, Inc. Production of glycoproteins with modified fucosylation
EP1995309A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
BRPI0812538B1 (pt) * 2007-06-15 2021-03-16 Medicago Inc. processo para a síntese de uma proteína de interesse com fucosilação e xilosilação reduzidas, ácido nucleico, e proteína híbrida gnt1-galt
EP2197491A4 (en) 2007-09-04 2011-01-12 Univ California HIGHAFFINE ANTI-PROSTATE STEM CELL ANTIGEN (PSCA) ANTIBODIES TO CANCER AND TO THE DETECTION OF CANCER
MX2010002406A (es) 2007-09-05 2010-04-27 Hoffmann La Roche Terapia de combinacion con anticuerpos anti-cd20 de tipo i y de tipo ii.
CA2700860C (en) 2007-10-01 2016-07-19 Jonathan A. Terrett Human antibodies that bind mesothelin, and uses thereof
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
US20090169550A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
WO2009080829A1 (en) * 2007-12-26 2009-07-02 Biotest Ag Agents targeting cd138 and uses thereof
EP2238169A1 (en) * 2007-12-26 2010-10-13 Biotest AG Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
WO2009080832A1 (en) * 2007-12-26 2009-07-02 Biotest Ag Methods and agents for improving targeting of cd138 expressing tumor cells
AR069980A1 (es) * 2007-12-26 2010-03-03 Biotest Ag Inmunoconjugados dirigidos contra cd 138 y sus usos
EP2235061A1 (en) * 2008-01-15 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Afucosylated antibodies against ccr5 and their use
KR101054362B1 (ko) * 2008-07-03 2011-08-05 재단법인 목암생명공학연구소 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법
WO2010006452A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Medicago Inc. New influenza virus immunizing epitope
EP2349327A4 (en) * 2008-10-23 2012-11-28 Massachusetts Inst Technology COMMITMENT DIRECTED FC RECEIVERS ACTIVATORS
JP5906090B2 (ja) 2009-02-17 2016-04-20 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッドＣｏｒｎｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 癌の診断のための方法およびキットならびに治療価の推定
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
SG174963A1 (en) 2009-03-31 2011-11-28 Roche Glycart Ag Treatment of cancer with a humanized anti-egfr igg1 antibody and irinotecan
WO2010112193A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
SG175081A1 (en) 2009-04-07 2011-11-28 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
US20100256340A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
MX2011010169A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-1/anti-c-met.
JP2012526079A (ja) * 2009-05-06 2012-10-25 バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト Ｃｄ１３８を標的とする免疫複合体の使用
SG176219A1 (en) 2009-05-27 2011-12-29 Hoffmann La Roche Tri- or tetraspecific antibodies
US20120141501A1 (en) 2009-05-29 2012-06-07 Forerunner Pharma Research Co. Ltd Pharmaceutical Composition Containing Antagonist of EGF Family Ligand as Component
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
SG178322A1 (en) 2009-08-14 2012-03-29 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with fludarabine and/or mitoxantrone
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
TW201113037A (en) 2009-08-28 2011-04-16 Hoffmann La Roche Antibodies against CDCP1 for the treatment of cancer
TWI412375B (zh) 2009-08-28 2013-10-21 Roche Glycart Ag 人類化抗ｃｄｃｐ１抗體
MX339608B (es) 2009-08-31 2016-05-31 Roche Glycart Ag Anticuerpos del antigeno carcinoembrionario (cea).
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
NZ598962A (en) 2009-09-16 2014-12-24 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
KR101985153B1 (ko) 2009-10-26 2019-05-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
JP6251477B2 (ja) 2009-12-02 2017-12-20 イマジナブ・インコーポレーテッド ヒト前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）をターゲッティングするｊ５９１ミニボディおよびｃｙｓダイアボディならびにこれらを使用するための方法
EP2516469B1 (en) 2009-12-22 2016-03-30 Roche Glycart AG ANTI-HER3 Antibodies and uses thereof
WO2011080209A2 (en) 2009-12-29 2011-07-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel antibody formulation
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
BR112012026707A2 (pt) 2010-04-27 2017-03-14 Roche Glycart Ag uso de um anticorpo anti-cd20 afucosilado, composição que compreende um anticorpo anti-cd20 afucosilado e método de tratamento de pacientes que sofrem de câncer por meio da administração de um anticorpo anti-cd20 afucosilado
WO2012009705A1 (en) 2010-07-15 2012-01-19 Zyngenia, Inc. Ang-2 binding complexes and uses thereof
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
JP2013541501A (ja) 2010-08-03 2013-11-14 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 慢性リンパ性白血病（ｃｌｌ）のバイオマーカー
EP2603530B1 (en) 2010-08-13 2017-11-08 Roche Glycart AG Anti-fap antibodies and methods of use
JP5841149B2 (ja) 2010-08-13 2016-01-13 ロシュ グリクアート アーゲー 抗テネイシンｃａ２抗体及び使用の方法
AR082693A1 (es) 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
KR101586128B1 (ko) 2010-08-24 2016-01-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 디술피드 안정화 ― Ｆｖ 단편을 포함하는 이중특이적 항체
KR20130088170A (ko) 2010-12-16 2013-08-07 로슈 글리카트 아게 비푸코실화 ｃｄ20 항체와 ｍｄｍ2 저해제와의 조합 치료
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
JPWO2012105699A1 (ja) * 2011-02-03 2014-07-03 株式会社イーベック 補体依存性生物活性の高い抗体の産生法
KR20130118941A (ko) 2011-02-10 2013-10-30 로슈 글리카트 아게 면역치료법
PL3489255T3 (pl) 2011-02-10 2021-11-22 Roche Glycart Ag Zmutowane polipeptydy interleukiny-2
MX341921B (es) 2011-02-28 2016-09-07 Hoffmann La Roche Proteinas de union a antigeno.
KR101572338B1 (ko) 2011-02-28 2015-11-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 1가 항원 결합 단백질
PL2681244T3 (pl) 2011-03-02 2018-04-30 Roche Glycart Ag Przeciwciała przeciwko antygenowi rakowo-płodowemu
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
WO2012162561A2 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
FR2976811A1 (fr) 2011-06-22 2012-12-28 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un anticorps anti-cd20 a haute adcc pour le traitement de la maladie de waldenstrom
US9309306B2 (en) 2011-08-23 2016-04-12 Roche Glycart Ag Anti-MCSP antibodies
MX349095B (es) 2011-08-23 2017-07-11 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno.
BR112014006537A2 (pt) 2011-09-23 2017-11-28 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos, formulação farmacêutica, usos de um anticorpo biespecífico, método de tratamento, ácido nucleico, vetores de expressão, célula hospedeira e método para a produção de um anticorpo biespecífico
MX355048B (es) 2011-10-19 2018-04-03 Roche Glycart Ag Metodo de separacion para anticuerpos fucosilados.
US20130302274A1 (en) 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
JP6218746B2 (ja) 2011-12-08 2017-10-25 バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト Ｃｄ１３８を標的とする免疫複合体の使用
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
WO2013113641A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Roche Glycart Ag Use of nkp46 as a predictive biomarker for cancer treatment with adcc- enhanced antibodies
CN104105711B (zh) 2012-02-10 2018-11-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单链抗体及其他异多聚体
RU2014138586A (ru) 2012-03-02 2016-04-20 Рош Гликарт Аг Прогностический биомаркер для лечения рака антителами с повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью
EP2832856A4 (en) 2012-03-29 2016-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-LAMP5 ANTIBODIES AND USE THEREOF
WO2013174927A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Novartis International Pharmaceutical Limited Production of fucosylated glycoproteins
CN104379604A (zh) 2012-05-24 2015-02-25 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 多特异性抗体
EP2857420B1 (en) 2012-05-30 2020-09-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Target-tissue-specific antigen-binding molecule
BR112014028368A2 (pt) 2012-06-27 2017-11-14 Hoffmann La Roche método de produção de conjugado de região fc de anticorpo, conjugado de região fc de anticorpo e formulação farmacêutica
KR20150023889A (ko) 2012-06-27 2015-03-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 2 개 이상의 상이한 결합 단위를 함유하는 맞춤-제작된 고도로 선별적이고 다중-특이적인 표적화 단위의 선별 및 제조 방법 및 이의 용도
WO2014013019A1 (en) * 2012-07-18 2014-01-23 Glycotope Gmbh Novel therapeutic treatments with anti-her2 antibodies having a low fucosylation
JP6290209B2 (ja) 2012-08-07 2018-03-07 ロシュ グリクアート アーゲー 低下した及び増加したエフェクター機能を有するように操作された２つの抗体を含む組成物。
EP2912060B1 (en) 2012-10-29 2019-12-25 The University of North Carolina at Chapel Hill Compositions and methods for inhibiting pathogen infection
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
WO2014067642A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Mab Discovery Gmbh Method for the production of multispecific antibodies
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
EP3557260B1 (en) 2012-12-21 2022-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
AR094403A1 (es) 2013-01-11 2015-07-29 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos anti-her3
WO2014114595A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Roche Glycart Ag Predictive biomarker for cancer treatment with adcc-enhanced antibodies
PL2953972T3 (pl) 2013-02-05 2021-03-08 Engmab Sàrl Metoda wyboru przeciwciał przeciwko bcma
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
RU2015140921A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Антитела к mcsp
EP3744345B1 (en) 2013-03-13 2022-02-09 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody formulations
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
EP3015115A4 (en) 2013-06-24 2017-02-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent comprising humanized anti-epiregulin antibody as active ingredient for non-small-cell lung carcinoma excluding adenocarcinoma
CA2922912A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
WO2015082446A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-cdcp1 antibody and a taxane
AU2014358191B2 (en) 2013-12-04 2020-12-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
WO2015095410A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and an anti-cd20 antibody
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
SG11201609014TA (en) 2014-05-08 2016-12-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Gpc3 -targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
EP3149161B1 (en) * 2014-05-27 2021-07-28 Academia Sinica Fucosidase from bacteroides and methods using the same
TWI689520B (zh) 2014-05-30 2020-04-01 漢霖生技股份有限公司 抗表皮生長因子受體（ｅｇｆｒ）抗體
AU2015293949B2 (en) 2014-07-21 2019-07-25 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy Production of glycoproteins with mammalian-like N-glycans in filamentous fungi
WO2016044334A1 (en) 2014-09-15 2016-03-24 Genentech, Inc. Antibody formulations
AU2015320678B2 (en) 2014-09-23 2021-07-22 Genentech, Inc. Method of using anti-CD79b immunoconjugates
BR112017010324A2 (pt) 2014-11-20 2018-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag método para tratar ou retardar a progressão de um câncer em um indivíduo, moléculas, métodos para aumentar a função imune em um indivíduo e para selecionar um paciente para tratamento, kits, composição farmacêutica e usos de uma combinação de uma molécula
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
TWI820377B (zh) 2015-05-07 2023-11-01 美商艾吉納斯公司 抗ｏｘ４０抗體及其使用方法
EP3936524A3 (en) 2015-05-11 2022-06-15 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
EP3960765A1 (en) 2015-06-26 2022-03-02 Sanofi Biotechnology SAS Monoclonal anti-il-1racp antibodies
WO2017004091A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Genentech, Inc. Type ii anti-cd20 antibody for use in organ transplantation
US10683369B2 (en) 2015-08-03 2020-06-16 Engmab Sàrl Monoclonal antibodies against BCMA
WO2017027325A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
ES2768957T3 (es) 2015-09-24 2020-06-24 Abvitro Llc Composiciones de anticuerpos contra el VIH y métodos de uso
WO2017097723A2 (en) 2015-12-09 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment method
WO2017148880A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Obinutuzumab variants having altered cell death induction
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
CN109071640B (zh) 2016-05-11 2022-10-18 豪夫迈·罗氏有限公司 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
TW201902512A (zh) 2016-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療方法
EP3257866A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 Academisch Medisch Centrum Modified anti-tnf antibody and use thereof in the treatment of ibd
CN110167964B (zh) 2016-11-02 2023-12-01 百时美施贵宝公司 组合用于治疗多发性骨髓瘤的针对bcma和cd3的双特异性抗体和免疫药物
CA3046082A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
MA49289A (fr) 2017-04-03 2020-02-12 Hoffmann La Roche Anticorps se liant à steap-1
JP6871415B2 (ja) 2017-04-05 2021-05-12 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｌａｇ３抗体
MX2019012793A (es) 2017-04-27 2020-02-13 Tesaro Inc Agentes anticuerpos dirigidos contra el gen de activación de linfocitos-3 (lag-3) y usos de los mismos.
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
JP2020528061A (ja) 2017-07-26 2020-09-17 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ＢＥＴ阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤及び抗ＣＤ２０抗体を用いた併用療法
SG11202000387YA (en) 2017-08-25 2020-03-30 Five Prime Therapeutics Inc B7-h4 antibodies and methods of use thereof
JP7374118B2 (ja) * 2017-12-18 2023-11-06 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 糖鎖改変
TWI805665B (zh) 2017-12-21 2023-06-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合hla-a2/wt1之抗體
WO2019129679A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
MA51903A (fr) 2018-02-21 2021-05-26 Five Prime Therapeutics Inc Formulations d'anticorps b7-h4
MA51902A (fr) 2018-02-21 2021-05-26 Five Prime Therapeutics Inc Schémas posologiques d'anticorps b7-h4
EA202091810A1 (ru) 2018-03-02 2021-01-29 Файв Прайм Терапьютикс, Инк. Антитела к b7-h4 и способы их применения
EP3775184A1 (en) 2018-03-29 2021-02-17 F. Hoffmann-La Roche AG Modulating lactogenic activity in mammalian cells
EP3802599B1 (en) 2018-06-03 2023-12-20 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
CN113166236A (zh) 2018-09-21 2021-07-23 北卡罗来纳大学查佩尔希尔分校 限制穿过黏液的合成粘合剂
TWI835885B (zh) 2018-10-15 2024-03-21 美商戊瑞治療有限公司 用於癌症之組合療法
KR20210100668A (ko) 2018-12-06 2021-08-17 제넨테크, 인크. 항-CD79b 면역접합체, 알킬화제 및 항-CD20 항체를 포함하는 미만성 큰 B-세포 림프종의 조합 요법
EP3898671A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody that binds to vegf and il-1beta and methods of use
SG10202105790QA (en) 2018-12-21 2021-07-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
CN113613676A (zh) 2019-03-19 2021-11-05 中外制药株式会社 包含对抗原的结合活性因mta而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子及用于获得该抗原结合结构域的文库
MX2021013825A (es) 2019-05-14 2022-01-18 Genentech Inc Procedimientos de uso de inmunoconjugados anti-cd79b para tratar el linfoma folicular.
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
EP4004045A1 (en) 2019-07-31 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to gprc5d
CR20220019A (es) 2019-07-31 2022-02-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se fijan a gprc5d
EP4028054A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
JP2022549087A (ja) 2019-09-18 2022-11-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｋｌｋ７抗体、抗ｋｌｋ５抗体、多重特異性抗ｋｌｋ５／ｋｌｋ７抗体および使用方法
BR112022007216A2 (pt) 2019-10-18 2022-08-23 Genentech Inc Métodos para tratamento de linfoma difuso, kit e imunoconjugado
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
US11987632B2 (en) 2019-12-18 2024-05-21 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to HLA-A2/MAGE-A4
CN115315446A (zh) 2020-03-06 2022-11-08 Go医疗股份有限公司 抗糖-cd44抗体及其用途
KR20220159426A (ko) 2020-03-26 2022-12-02 제넨테크, 인크. 감소된 숙주 세포 단백질을 보유하는 변형된 포유동물 세포
TW202206111A (zh) 2020-04-24 2022-02-16 美商建南德克公司 使用抗ｃｄ７９ｂ免疫結合物之方法
US20210355196A1 (en) 2020-05-17 2021-11-18 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of selecting and using the same
BR112022024996A2 (pt) 2020-06-08 2022-12-27 Hoffmann La Roche Anticorpos, ácido nucleico, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, agente terapêutico, uso do anticorpo e método para tratar um indivíduo com hepatite b
WO2021255142A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
MX2022015887A (es) 2020-06-19 2023-01-24 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y folr1.
IL298402A (en) 2020-06-19 2023-01-01 Hoffmann La Roche Antibodies that bind to CD3 and CD19
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
IL299161A (en) 2020-06-24 2023-02-01 Genentech Inc Cell lines resistant to apoptosis
EP4178985A1 (en) 2020-07-10 2023-05-17 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
CN116406377A (zh) 2020-07-17 2023-07-07 基因泰克公司 抗notch2抗体及其使用方法
US20220041694A1 (en) 2020-08-10 2022-02-10 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies for treatment and prevention of covid-19
TW202227625A (zh) 2020-08-28 2022-07-16 美商建南德克公司 宿主細胞蛋白質之ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多重剔除
CA3193163A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf-a and ang2 and methods of use
MX2023004342A (es) 2020-10-20 2023-05-04 Hoffmann La Roche Politerapia de antagonistas de union al eje de pd-1 e inhibidores de lrrk2.
AR123855A1 (es) 2020-10-20 2023-01-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-mertk conjugados con peg y métodos de uso
AU2022207615A1 (en) 2021-01-12 2023-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
US20240173442A1 (en) 2021-01-13 2024-05-30 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy
JP2024509695A (ja) 2021-02-03 2024-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性結合タンパク質分解プラットフォームおよび使用方法
JP2024512324A (ja) 2021-03-05 2024-03-19 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｃｄ４４抗体およびその使用
WO2022192647A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
IL305283A (en) 2021-03-15 2023-10-01 Genentech Inc Compositions and methods for the treatment of lupus nephritis
IL307501A (en) 2021-04-19 2023-12-01 Hoffmann La Roche Modified mammalian cells
JP2024514281A (ja) 2021-04-23 2024-04-01 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｎｋ細胞係合剤関連の有害作用の防止または軽減
CA3217803A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody
AU2021443318A1 (en) 2021-04-30 2023-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
JP2024520901A (ja) 2021-05-12 2024-05-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための抗ｃｄ７９ｂイムノコンジュゲートを使用する方法
KR20240010469A (ko) 2021-05-21 2024-01-23 제넨테크, 인크. 관심 재조합 생성물의 생성을 위한 변형된 세포
TW202313045A (zh) 2021-06-09 2023-04-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於癌症治療之組合療法
TW202306985A (zh) 2021-07-12 2023-02-16 美商建南德克公司 降低抗體－脂酶結合之結構
CR20240074A (es) 2021-07-14 2024-03-08 Genentech Inc Anticuerpos anti-receptor de quimiocinas de motivo c-c 8 (ccr8) y métodos de uso
EP4373859A1 (en) 2021-07-22 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Heterodimeric fc domain antibodies
CN117794953A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗体及使用方法
CA3228178A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
EP4380978A1 (en) 2021-08-07 2024-06-12 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
TW202325733A (zh) 2021-09-03 2023-07-01 美商Ｇｏ治療公司 抗醣化-lamp1抗體及其用途
TW202328188A (zh) 2021-09-03 2023-07-16 美商Ｇｏ治療公司 抗醣化-cmet抗體及其用途
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
WO2023094569A1 (en) 2021-11-26 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
US20230322958A1 (en) 2022-01-19 2023-10-12 Genentech, Inc. Anti-Notch2 Antibodies and Conjugates and Methods of Use
TW202346365A (zh) 2022-03-23 2023-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及化學療法之組合治療
WO2023201299A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
WO2023198727A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
WO2023209177A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
TW202402810A (zh) 2022-05-11 2024-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｖｅｇｆ—ａ及ｉｌ６結合之抗體及其使用方法
WO2024077239A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024100170A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a*02/foxp3

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DK0669836T3 (da) 1992-11-13 1996-10-14 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom
EP0831880A4 (en) 1995-06-07 2004-12-01 Imclone Systems Inc ANTIBODIES AND FRAGMENTS OF ANTIBODIES INHIBITING TUMOR GROWTH
US6180320B1 (en) 1998-03-09 2001-01-30 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Method of manufacturing a semiconductor device having a fine pattern, and semiconductor device manufactured thereby
AU3657899A (en) * 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
EP1224309A2 (en) * 1999-10-21 2002-07-24 Monsanto Company Post-translational modification of recombinant proteins produced in plants
DK1772518T3 (da) * 1999-10-26 2010-11-22 Stichting Dienst Landbouwkundi Pattedyrsagtig glykosylering i planter
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
DK1297172T3 (da) 2000-06-28 2006-02-13 Glycofi Inc Fremgangsmåder til frembringelse af modificerede glucoproteiner
WO2002079255A1 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
EP2319935B1 (en) * 2002-03-19 2016-04-27 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek GnTIII (UDP-N-acetylglucosamine:Beta -D mannoside Beta (1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III) expression in plants.
JP5425365B2 (ja) * 2003-01-22 2014-02-26 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 増加したＦｃレセプター結合親和性およびエフェクター機能を有する抗体を作製するための融合構築物およびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
PL222222B1 (pl) 2016-07-29
EP2264152A3 (en) 2011-05-18
ES2543734T3 (es) 2015-08-21
AU2010200408B2 (en) 2012-05-17
JP2015142590A (ja) 2015-08-06
EP2248892A3 (en) 2011-03-16
NO20053872L (no) 2005-10-21
KR101292000B1 (ko) 2013-08-01
EP2264151A3 (en) 2012-10-03
PL222206B1 (pl) 2016-07-29
PL393645A1 (pl) 2011-06-06
PL222221B1 (pl) 2016-07-29
DE602004028337D1 (de) 2010-09-09
EP2248892A2 (en) 2010-11-10
MXPA05007781A (es) 2005-09-30
WO2004065540A3 (en) 2005-03-24
ATE475708T1 (de) 2010-08-15
KR101498588B1 (ko) 2015-03-05
PL393647A1 (pl) 2011-06-06
AU2010200408A1 (en) 2010-02-25
CN103540600B (zh) 2017-12-01
JP2010233578A (ja) 2010-10-21
AU2010200408C1 (en) 2012-11-01
CZ308720B6 (cs) 2021-03-24
EP2264152B1 (en) 2015-05-20
EP1587921B1 (en) 2010-07-28
CZ2005490A3 (cs) 2006-02-15
US20040241817A1 (en) 2004-12-02
PL415463A1 (pl) 2016-04-25
CA2513797C (en) 2016-05-03
ES2574993T3 (es) 2016-06-23
PL393644A1 (pl) 2011-06-06
NZ603037A (en) 2014-05-30
NZ567320A (en) 2009-11-27
SG2013005590A (en) 2015-06-29
JP2013233151A (ja) 2013-11-21
NO339270B1 (no) 2016-11-21
NZ591970A (en) 2012-11-30
IL203402A (en) 2016-05-31
PL393641A1 (pl) 2011-06-06
ES2542885T3 (es) 2015-08-12
KR20130048269A (ko) 2013-05-09
PL224786B1 (pl) 2017-01-31
EP2264151A2 (en) 2010-12-22
US20140073005A1 (en) 2014-03-13
EP2264152A2 (en) 2010-12-22
NZ582315A (en) 2011-01-28
AU2004205802A1 (en) 2004-08-05
PL222219B1 (pl) 2016-07-29
US8367374B2 (en) 2013-02-05
PL222220B1 (pl) 2016-07-29
AU2004205802B2 (en) 2009-11-05
CA2513797A1 (en) 2004-08-05
JP5425365B2 (ja) 2014-02-26
CN103540600A (zh) 2014-01-29
WO2004065540A2 (en) 2004-08-05
IL169805A (en) 2013-11-28
NO20053872D0 (no) 2005-08-18
PL377967A1 (pl) 2006-02-20
JP2006516893A (ja) 2006-07-13
SG179292A1 (en) 2012-04-27
JP5953271B2 (ja) 2016-07-20
KR20050095867A (ko) 2005-10-04
HK1089205A1 (zh) 2006-11-24
PL393646A1 (pl) 2011-06-06
EP2248892B1 (en) 2015-04-22
EP1587921A2 (en) 2005-10-26
US8859234B2 (en) 2014-10-14
EP2264151B1 (en) 2016-04-20
NZ541503A (en) 2008-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2513797C (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
RU2623167C2 (ru) КОНСТРУКЦИИ СЛИЯНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ С ПОВЫШЕННЫМИ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
AU2012213963B2 (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function