CZ2005490A3 - Fúzní konstrukty a jejich pouzití pro prípravu protilátek se zvýsenou vazebnou afinitou k receptorum Fc a efektorovou funkcí - Google Patents

Fúzní konstrukty a jejich pouzití pro prípravu protilátek se zvýsenou vazebnou afinitou k receptorum Fc a efektorovou funkcí Download PDF

Info

Publication number
CZ2005490A3
CZ2005490A3 CZ20050490A CZ2005490A CZ2005490A3 CZ 2005490 A3 CZ2005490 A3 CZ 2005490A3 CZ 20050490 A CZ20050490 A CZ 20050490A CZ 2005490 A CZ2005490 A CZ 2005490A CZ 2005490 A3 CZ2005490 A3 CZ 2005490A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polypeptide
antibody
host cell
nucleic acid
increased
Prior art date
Application number
CZ20050490A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ308720B6 (cs
Inventor
Umana@Pablo
Bruenker@Peter
Ferrara@Claudia
Suter@Tobias
Original Assignee
Glycart Biotechnology Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glycart Biotechnology Ag filed Critical Glycart Biotechnology Ag
Publication of CZ2005490A3 publication Critical patent/CZ2005490A3/cs
Publication of CZ308720B6 publication Critical patent/CZ308720B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01038—Beta-N-acetylglucosaminylglycopeptide beta-1,4-galactosyltransferase (2.4.1.38)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01094—Protein N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.94)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01114—2-Coumarate O-beta-glucosyltransferase (2.4.1.114)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01144—Beta-1,4-mannosyl-glycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.144)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01024—Alpha-mannosidase (3.2.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01114—Mannosyl-oligosaccharide 1,3-1,6-alpha-mannosidase (3.2.1.114)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/05—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a GOLGI retention signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01024—1,4-Alpha-glucan 6-alpha-glucosyltransferase (2.4.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01096—Hexosyltransferases (2.4.1) sn-Glycerol-3-phosphate 1-galactosyltransferase (2.4.1.96)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

Predmetný vynález se vztahuje ke glykosylacnímu sestrojování proteinu. Predmetný vynález se vztahuje zejména k molekulám nukleových kyselin, vcetne fúzních konstruktu, majícím katalytickou aktivitu ajejich pouzití v glykosylacním sestrojování hostitelských bunek pro generování polypeptidu se zlepsenými terapeutickými vlastnostmi, vcetne protilátek se zvýsenou vazbou afinitou k Fc receptorum a zvýsenou efektorovou funkcí.

Description

Oblast techniky
Předmětný vynález se vztahuje ke glykosylačnímu sestrojování proteinů. Předmětný vynález se vztahuje zejména k molekulám nukleových kyselin, včetně fúzních konstruktů, majícím katalytickou aktivitu a jejich použití v glykosylačním sestrojování hostitelských buněk pro.generování polypeptidů se zlepšenými terapeutickými vlastnostmi, včetně protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k Fc receptorům a zvýšenou efektorovou funkcí.
55/ Stav techniky
Glykoproteiny zprostředkovávají mnoho podstatných funkcí v lidských bytostech, jiných eukaryotických organizmech a v některých prokaryotech, včetně katalýzy signalizace, mezibuněčné komunikace a rozeznávání a asociace buněk. Tvoří většinu necytosolových proteinů v eukaryotických organizmech. (Lis et al., Eur. J. Biochem. 218:1-27 (1993)). Mnoho glykoproteinů bylo využito pro terapeutické účely, a během posledních dvou desetiletí byly rekombinantní verze vylučovaných glykoproteinů vyskytujících se v přírodě hlavním produktem biotechnologického průmyslu. Příklady zahrnují erythropoietin (EPO), terapeutické monoklonální protilátky (terapeutické mAbs), tkáňový plazminogenový aktivátor (tPA), interferon-β (IFN-β), faktor simulující kolonie makrofágy-granulocyty (GM-CSF) a lidský choriopový gonádotropin (hCG). (Cumming et al., Glycobiology 1:115-130 (1991)).
. , Oligosacharidová komponenta může podstatně ovlivnit vlastnosti odpovědné za účinnost terapeutického glykoproteinů, včetně fyziologické stability, odolnosti proti ataku proteázy, interakce--s imunitním systémem, farmakokinetiky a specifické biologické aktivity. Takové vlastnosti mohou záviset nejen na přítomnosti nebo nepřítomnosti oligosacharidů, ale také na specifických strukturách. Mohou se učinit některá zevšeobecnění mezi strukturou oligosacharidů a funkcí glykoproteinů. Například jisté oligosacharidové struktury zprostředkovávají rychlé odstranění glykoproteinů z krevního řečiště vlivem interakcí se specifickými proteiny vážícími se na karbohydráty, zatímco jiné mohou být vázány protilátkami a spouštět nežádoucí imunitní rekce. (Jenkins et al., Nátuře Biotechnol. 14:97581 (1996)).
Savčí buňky jsou upřednostňovanými hostiteli pro produkci terapeutických glykoproteinů díky jejich schopnosti glykosylovat proteiny ve formě nejkompaktibilnější pro humánní aplikace. (Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., Nátuře
Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Baktérie glykosylují proteiny velmi zřídka, a stejně jako.u jiných typů obecných hostitelů, jako kvasinky, vláknité houby, hmyzí a rostlinné buňky, jsou získané glykosylační modely spojené s rychlým odstraněním z krevního řečiště, nežádoucími imunitními reakcemi a v některých specifických příkladech se sníženou biologickou aktivitou. Mezi savčími buňkami se nejčastěji používají během posledních dvou desetiletí buňky z vaječníku čínského křečka (CHO). Navíc k tomu, že poskytují vhodné glykosylační modely, tyto buňky dovolují konzistentní generování geneticky stabilních, vysoce produktivních klonovaných buněčných linií. Mohou se kultivovat ve vysokých hustotách v jednoduchých bioreaktorech s použitím média bez obsahu séra a dovolují rozvoj bezpečných a reprodukovatelných bioprocesů. Jiné obecně používané zvířecí buňky zahrnují ledvinové buňky mláďat křečků a buňky myších myelomů NSO a SP2/0. Nyní byla testována také produkce z transgenních zvířat. (Jenkins et al., Nátuře Biotechnol. 14:975-81 (1996)).
Všechny protilátky obsahují karbohydrátové struktury na určitých pozicích v konstantních oblastech těžkého řetězce, s každým izotypem majícím rozdílné seskupení karbohydrátových struktur připojených k atomu N, které různě působí na na skladbu proteinu, vylučování nebo funkční aktivitu. (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-321,(1997)). Struktura karbohydrátů připojených k atomu N se značně mění v závislosti na stupni zpracování, a může zahrnovat vysoce manózní, mnohonásobně větvené, stejně jako dvouvláknové komplexní oligosacharidy. (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech, 15:26-32 (1997)). Typicky se jedná o heterogenní zpracování oligosacharidových struktur jádra připojených na konkrétním glykosylačním místě tak, že dokonce monoklonální protilátky existují jako více glykoforem. Podobně bylo ukázáno, že mezi buněčnými liniemi se vyskytují větší rozdíly v glykosylaci protilátek, a dokonce menší rozdíly jsou pozorovány pro danou buněčnou linii rostoucí za různých podmínek kultivace. (Lifely, M. R.et al., Glycobiology 5 (8):813-22 (1995)).
Nekonjugované monoklonální protilátky (mAbs) mohou být užitečnými léčivy pro léčení rakoviny, jak je demonstrováno schválením rituximabu (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, and Genentech lne., San Francisco, CA) uděleném U. S. Food and Drug Administration pro léčení B-pozitivních buněk CD20, jiného než Hodgkinsova lymfomů nebo lymfomů nízkého stupně, trastuzumabu (Herceptin™; Genentech lne,) pro léčení pokročilé rakoviny prsu (Grillo-Lopez, A.-J., et al., Semiš.Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, Μ. M., Clin.Ther. 21:309-18 (1999)), gemtuzumabu (Mylotarg™, Celltech / Wyeth-Ayerst) pro léčení recidiv akutní myeloidní leukémie a alemtuzumabu (CAMPATH™, MilleniumPharmaceuticals / Schering AG) pro léčení chronické leukémie B-lymfocytů. Úspěch těchto produktů počítá nejenom s jejich účinností, ale i s jejich vynikajícími bezpečnostními profily (Grillo-Lopez,A.-J., et al., Semin. Oncol. 26:66-73 (1999);
• · · · · · • · · • · · · ·
Goldenberg, M. M.,Cliva. Ther. 21:309-18 (1999)). Navzdory úspěchům těchto léků je v současnosti velký zájem o získání specifičtější aktivity protilátek, než jakou typicky dovoluje nekonjugovaná terapie mAb.
Jednou cestou získání velkého vzrůstu potenciálu při požívání jednoduchého procesu výroby a možného vyvarování se podstatným nežádoucím vedlejším účinkům je zvýšení přirozené efektorové funkce mAbs zprostředkované buňkami sestrojením jejich oligosacharidové komponenty (Umana, P. et al., Nátuře Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Protilátky typu lgG1, protilátky nejobecněji používané při léčení rakoviny, jsou glykoproteiny, které mají zachované glykosylační místo připojené k atomu N na Asn297 v každé doméně CH2. Dva komplexní dvouvláknové oligosacharidy připojené kAsn297 jsou skryté mezi doménami CH2, tvořící extenzívní kontakty s polypeptidovou páteří, a jejich přítomnost je podstatná pro protilátku, aby zprostředkovávala efektorové funkce, jako je buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15:26-32(1997)).
Současní původci vynálezu dříve ukázali, že nadměrná exprese β(Ι,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII), glykosyltransferázy katalyzující tvorbu dělených oligosacharidů, v buňkách z vaječníku čínského křečka (CHO) podstatně zvyšuje aktivitu ADCC in vitro antineuroblastomové chimérní monoklonální protilátky (chCE7), produkované sestrojenými buňkami CHO. (Viz Umana, P. et al., Nátuře Biotechnol. 17:176-180 (1999), mezinárodní publikace č. WO 99/54342, jejichž celý obsah je zde zahrnut odkazem v jeho úplnosti). Protilátka chCE7 patří k velké třídě nekonjugovaných mAbs, které mají vysokou afinitu a specificitu k nádoru, ale mají příliš malou sílu na to, aby byly klinicky užitečné, jestliže jsou produkovány ve standardních průmyslových buněčných liniích postrádajících enzym GnTIII (Umana, P. et al., Nátuře Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Tato studie byla první, která ukázala, že rozsáhlé zvýšení aktivity ADCC se může být získat sestrojením buněk produkujících protilátky tak, aby exprimovaly GnTGIII, což také vedlo ke zvýšení podílu konstantní oblasti (Fc)-asociovaných dělených oligosacharidů, včetně dělených nefukózylovaných oligosacharidů, nad hodnoty nalezené v přirozeně se vyskytujících protilátkách.
Výsledky četných studií svědčí o tom, že mechanismy závislé na Fc-receptorech podstatně přispívají k působení cytotoxických protilátek proti nádorům a ukazují, že optimální protilátka proti nádorům by se měla vázat přednostně na aktivací receptorů Fc a minimálně na inhibičního partnera FcyRIlB. (Clynes, R. A., et al., Nátuře Medicine 6 (4):443-446 (2000); Kalergis, A. M. , and Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195 (12):1653-1659 (June 2002). Například výsledky přinejmenším jedné studie naznačují, že zejména receptor FcyRIlB je silně spojen s účinností terapie protilátkami. (Cartron, G. , et al., Blood 99 (3):754-757 (February 2002)). Tato studie ukázala, že pacienti homozygotní k FcyRIIB má lepší odpověď na rituximab než heterozygotní pacienti. Autoři došli k závěru, že lepší odpověď byla způsobena lepším navázáním protilátky na FcyRIIB in vivo , což vedlo k lepší aktivitě ADCC proti buňkám lymfomu. (Cartron, G., et al., Blood 99 (3):754-757 (February 2002)).
Navíc k ADCC úspěšné protirakovinné monoklonální protilátky často indukují přímý signální mechanizmus nezávislý na Fc, který omezuje přežití, proliferaci anebo smrt cílových buněk aktivací buněčných signálních kaskád nebo blokováním přístupu k růstovým faktorům. (Selenko, N., et al., J Clin. Immunol. 22 (3):124-130 (2002)). Například se ukázalo, že léčení B-buněk CD20+ rituximabem indukovalo lýzi zprostředkovanou komplementem a indukci apoptózy indukovanou Mab stejně jako ADCC. (Selenko, N., et al., J Clin. Immunol. 22 (3): 124-130 (2002)). Navíc apoptóza buněk lymfomu indukovaná rituximabem nejen zabíjí buňky, ale také podporuje absorpci a křížové předávání peptidů odvozených z lymfatických buněk pomocí dendritických buněk (DC) předávajících antigeny, indukuje zrání DC, a dovoluje generování specifických T- lymfocztů (CTL).
Stručný popis vynálezu
Když původci rozpoznali obrovský terapeutický potenciál protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k receptoru Fc a zvýšenou efektorovou funkcí, vyvinuli způsob výroby takových protilátek, které zahrnují sestrojení glykosylačního profilu protilátky oblast Fc.
Předmětný vynález je široce zaměřen na způsoby řízení glykosylace hostitelských buněk, aby se změnil glykosylační profil jednoho nebo více polypeptidů produkovaných hostitelskou buňkou. Způsoby podle vynálezu se mohou použít k produkci terapeutických protilátek s modifikovanou glykosylací v oblasti Fc, včetně snížené fukózylace, kde mají protilátky zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vaznost na receptor Fc jako důsledek modifikované glykosylace. Protilátky s řízenou glykosylací podle předmětného vynálezu jsou zejména užitečné při terapeutickém ošetřování nádorů v pacientech. V jedněch provedeních hostitelské buňky podle předmětného vynálezu mají řízenou glykosylací, aby exprimovaly molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní protein s katalytickou aktivitou GnTIII nebo katalytickou aktivitou GalT. Ve výhodném provedení jsou fúzní konstrukty exprimovány společně s molekulou nukleové kyseliny kódující polypeptid, který má katalytickou aktivitu Manil a/nebo s molekulou nukleové kyseliny kódující polypeptid, který má katalytickou aktivitu GnTII. V ještě jiném provedení jsou polypeptidy s řízenou glykosylací podle předmětného vynálezu produkovány hostitelskou buňkou, aby měly
9999 9 99
9 9 9 9 9 9
C 9 9 9 9 9 # 9 9 9 9 9
9 9 9 9 ## 9 999 9999
9999 • 9 9
9 9 9 9
9 9
9 9
9 9 9 9 zvýšenou expresi molekuly nukleové kyseliny kódující polypeptid, který má katalytickou aktivitu Manil.
Podle toho v jednom aspektu je vynález směrován na izolovanou nukleovou kyselinu, obsahující sekvenci kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III („GnTIII) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu. Vjednom provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III. V dalším provedení je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny, skládající se z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény 3(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I („GnTI“), lokalizační domény domény p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II („GnTII“), lokalizační domény manózidázy I, a lokalizační domény a1-6 jádrové fukózyltransferázy. Ve výhodném provedení obsahuje sekvence izolované nukleové kyseliny nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obr. 24 nebo na obr. 25. V jiném výhodném provedení sekvence izolované nukleové kyseliny kóduje polypeptid mající sekvenci znázorněnou na obr. 24 nebo na obr. 25. v ještě jiném výhodném provedení sekvence izolované nukleové kyseliny kóduje polypeptid mající sekvenci alespoň z 80 % identickou s aminokyselinovou sekvencí na obr. 24 nebo obr. 25.
V jiném aspektu je vynález směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu P(1,4)-galaktózyltransferázy („GalT“) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu. Vjednom provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu P(1,4)-galaktózyltransferázy. V jiném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu p(1,4)-galaktózyltransferázy. V dalším provedení je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny, skládající se z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I („GnTI“), lokalizační domény β(1,2)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy II („GnTII“), lokalizační domény manózidázy I a lokalizační domény a1-6 jádrové fukózyltransferázy.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na expresní vektor obsahující izolovanou nukleovou kyselinu, obsahující sekvenci kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu. Vjednom provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu 3(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a Golgiho lokalizační doména je vybraná ze skupiny, skládající se z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, lokalizační domény
9··· • 9 99 9·99 • 9 9 9
9 9999
9 9 9 9
9 999 p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II, lokalizační domény manózidázy I a lokalizační domény a1-6 jádrové fukózyltransferázy.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na expresní vektor obsahující izolovanou nukleovou kyselinu, obsahující sekvenci kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu 3(1,4)-galaktózyltransferázy a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidů. V jednom provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu β(1,4)-galaktózyltransferázy a Golgiho lokalizační doména je vybraná ze skupiny, skládající se z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, lokalizační domény p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II, lokalizační domény manózidázy I a lokalizační domény oťl-6 jádrové fukózyltransferázy.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na hostitelskou buňku obsahující výše popsaný expresní vektor.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu P(1,4)-N-acetylglukózamínyltransferázy III („GnTIH“) v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky obsahující oblast Fc a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblastí Fc imunoglobulinu. V jednom provedení fúzní polypeptid mající aktivitu GnTIH obsahuje katalytickou doménu P(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy a Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidů vybraného ze skupiny, skládající se z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény a1-6 jádrové fukózyltransferázy.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy („GalT“) v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky obsahující oblast Fc a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. V jednom provedení fúzní polypeptid mající aktivitu GalT obsahuje katalytickou doménu β(1,4)-galaktózyltransferázy a Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidů vybraného ze skupiny, skládající se • · · · φ φ • Φ·· z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény a1-6 jádrové fukózyltransferázy.
Golgiho lokalizační doména je výhodně vybraná ze skupiny, skládající se z manózidázy II nebo p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, nebo popřípadě z galaktózyltransferázy.
Podle toho v jednom aspektu je vynález směrován na fúzní polypeptid mající aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. V jednom provedení fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu obsahuje katalytickou doménu fl(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III. V jiném provedení je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny, skládající se z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény β(1,2)-Nacetylglukózaminyltransferázy I, lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény domény P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény a1-6 jádrové fukózyltransferázy.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na fúzní polypeptid mající aktivitu P(1,4)-galaktózyltransferázy a obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. V jednom provedení fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu obsahuje katalytickou doménu p(1,4)-galaktózyltransferázy. V jiném provedení je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny, skládající se z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény domény p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény a1 -6 jádrové fukózyltransferázy.
Golgiho lokalizační doména je výhodně vybraná ze skupiny, skládající se z manózidázy II nebo p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I („GnTI“), nebo popřípadě z galaktózyltransferázy („GalT“).
V jiném aspektu je vynález směrován na způsob produkce fúzního polypeptidu majícího aktivitu fl(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III, zahrnující kultivaci hostitelských buněk podle předmětného vynálezu v médiu za podmínek dovolujících expresi nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a získání fúzního polypeptidu z výsledné kultury. V jednom provedení fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu obsahuje katalytickou doménu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III. Fúzní polypeptid výhodně obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu vybranou ze skupiny, skládající se z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy I, lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény ·« ···· · ·· ·· 9999
9 9 99 9 9 · 9 9
9 9 9 9 9 9 999
9 9 9 9 9 9 9
9 999 9999 99 999 domény p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény oc1-6 jádrové fukózyltransferázy.
V jiném aspektu je vynález směrován na způsob produkce fúzního polypeptidu majícího aktivitu p(1,4)-galaktózyltransferázy, zahrnující kultivaci hostitelských buněk podle předmětného vynálezu v médiu za podmínek dovolujících expresi nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a získání fúzního polypeptidu z výsledné kultury. V jednom provedení fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu obsahuje katalytickou doménu P(1,4)-galaktózyltransferázy. Fúzní polypeptid výhodně obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu vybranou ze skupiny, skládající se z lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy I, lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény domény P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény oťl-6 jádrové fukózyltransferázy.
Golgiho lokalizační doména je výhodně vybraná ze skupiny, skládající se z manózidázy II nebo p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, nebo popřípadě z galaktózyltransferázy („GalT“).
V dalším aspektu je vynález směrován na způsob modifikace glykosylačního profilu polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou zahrnující zavedená alespoň jedné nukleové kyseliny nebo expresního vektoru podle předmětného vynálezu do hostitelské buňky. Polypeptid je výhodně IgG nebo jeho fragment obsahující oblast Fc polypeptidu. Ve zvláště výhodném provedení je polypeptid výhodně IgG nebo jeho fragment obsahující oblast Fc polypeptidu. Alternativně je polypeptid fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc lidského IgG.
V jiném aspektu je vynález veden na způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, obsahující (a) kultivaci hostitelské buňky, sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselino kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III, nebo alternativně aktivitu p(1,4)-galaktózyltransferázy („GalT“) za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny obsahující celou molekulu protilátky, fragment protilátky obsahující oblast Fc polypeptidu a fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblast Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství vhodném pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a (b) izolaci polypeptidu. Fúzní polypeptid výhodně obsahuje katalytickou doménu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III nebo P(1,4)-galaktózyltransferázy („GalT“) a dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu vybranou ze skupiny, skládající se z ·* ···· • · • · ·· ·* ···· • · · · · · · · • · · 4 · · • · · * · · · · · · • · · · · ·· · ·· 4 449 4449 44 444 lokalizační domény manózidázy II, lokalizační domény p(1,2)-N-acetylglukózaminyl-transferázy I, lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény domény β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény a1-6 jádrové fukózyltransferázy. Ve výhodných provedeních má polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vaznost na receptor Fc jako výsledek modifikace. Ve zvláště výhodných provedeních je zvýšená efektorová funkce je zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na monocyty, zvýšená vaznost na polymorfonukleární buňky, zvýšená přímá apoptóza indukovaná signalizací, zvýšené zrání dendritických buněk a/nebo zvýšené zásobování T-buňkami, a zvýšená vaznost na receptor Fc je zvýšená vaznost na receptor aktivující Fc, jako je FcyRIIIA. Polypeptid vykazující zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vaznost na receptor Fc je výhodně protilátka, fragment protilátky nebo fúzní protein obsahující oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu a má zvýšený podíl nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc.
V jiném aspektu je vynález směrován na farmaceutické kompozice obsahující protilátku, fragment protilátky nebo fúzní protein obsahující oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu podle předmětného vynálezu, a použití takové farmaceutické kompozice při léčení nádorů, jako je rakovina, a jiných nemocí. V jednom provedení je léčení zdecimováním B-buněk podáváním terapeuticky účinného množství farmaceutické kompozice pacientovi, tj. člověku, v případě potřeby.
V ještě dalším aspektu vynález poskytuje hostitelskou buňku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu; a expresní vektor obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manil). Ve výhodných provedeních obsahuje fúzní polypeptid katalytickou doménu GnTIII a Golgiho lokalizační doména je vybraná ze skupiny, skládající se z lokalizační domény Manil, lokalizační domény GnTI, lokalizační domény Maní a lokalizační domény a1-6 jádrové fukózyltransferázy. V jednom provedení hostitelská buňka dále obsahuje expresní vektor kódující polypeptid mající aktivitu GnTII, molekuly nukleové kyseliny kódují fúzní polypeptid, polypeptid mající aktivitu Manil a polypeptid mající aktivitu GnTII mohou být každý v separátních expresních vektorech nebu v tomtéž expresním vektoru.
V dalším aspektu je vynález veden na hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu GnTIII a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu φφ φφφφ φ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φφ φφφ φφ φφφφ φ φφ • · φ φφ φ φ φφφ φ φ φφφφφ φ φφφ φ φ φφφ φφφ φφφφ produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
V dalším provedení vynález poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GnTIII, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
V dalším aspektu poskytuje vynález hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblastí Fc imunoglobulinu.
V dalším aspektu vynález poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, zahrnující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu GnTIII a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného že skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou; a izolaci polypeptidu.
• to toto·· to toto toto tototo· • · · ·· ·· ·>· ··· * ··* ··· to·· · · ···· · • •to toto ·· · ·· · to·· ···· ·· ···
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, zahrnující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou; a izolaci polypeptidu.
V dalším aspektu poskytuje vynález způsob produkce polypeptidu mající zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc, zahrnující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde úroveň exprese GalT nebo Manil je postačující pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid má zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc jako výsledek modifikace; a izolaci polypeptidu majícího zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob produkce polypeptidu mající zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc, zahrnující (a) kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu α-manózidázy II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid mající aktivitu amanózidázy II je exprimován v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, a (b) izolaci polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou.
V jiném aspektu vynález poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu ct-manózidázy II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid mající aktivitu amanózidázy II je exprimován v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou.
·· ···· • ·· 1 · ····
• • • • ♦ •
• • * • · * • ···
• « • • Φ • • •
• · • ··· ···· ·· ···
V ještě dalším aspektu je předmětný vynález směrován na polypeptidy produkované takovou hostitelskou buňkou, zejména protilátky mající zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vaznost k receptoru Fc jako výsledek modifikovaných oligosacharidů.
Stručný popis obrázků
Obr. 1. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní nemodifikované (s nesestrojenými glykosidy) protilátky anti-CD lgG1 produkované v BHK. Buňky byly transfekovány expresním vektorem protilátky pETR1502. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 2. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD lgG1 se sestrojenými glykosidy produkované v BHK sestrojených s nukleovou kyselinou kódující divoký type („wt“) GnTIII. Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTII, pETR1166. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 3. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD lgG1 se sestrojenými glykosidy produkované v BHK sestrojených s nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid („G1-GnTIII“) s aktivitou GnTIII a lokalizovanou přes Golgiho lokalizační doménu Golgiho α-manózidázy II. Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTIII, pETR1425. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 4. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD IgGl se sestrojenými glykosidy produkované v BHK sestrojených s nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid („M2-GnTIH“) s aktivitou GnTIII a lokalizovanou přes Golgiho lokalizační doménu Golgiho α-manózidázy II (Manil). Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTIII, pETR1506. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 5. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD lgG1 se sestrojenými glykosidy produkované v buňkách
HEK293-EBNA. Buňky byly transfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502.
Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
89 9999 9 99 99 8999
9 9 9 99 9 · 9 9 9
9 9 9 • 9 9 9 899
9 9 9 9 9 8 9 9
99 9 999 9999 9 9 998
Obr. 6. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD lgG1 se sestrojenými glykosidy produkované v HEK293EBNA sestrojené s nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid („M2-GnTW“) s aktivitou GnTIII a lokalizovanou přes Golgiho lokalizační doménu Golgiho α-manózidázy II (Manil). Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTIII, pETR1519. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 7. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD lgG1 se sestrojenými glykosidy produkované v HEK293EBNA sestrojené s nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid („M2-GnTIH“) s aktivitou GnTIII a lokalizovanou přes Golgiho lokalizační doménu Golgiho α-manózidázy II (Manil). Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTIII, pETR1519. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1. (a) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázouF bez dalšího enzymatického působení, (b) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázouF dále rozložených pomocí EndoH.
Obr. 8. (a) Schematický popis digesce oligosacharidů katalyzovaného EndoH. EndoH může rozložit hybrid (a rozdělený hybrid), ale ne komplexní nebo komplexní rozdělené oligosacharidy. (b) Rozlišením mezi oligosacharidy komplexního a hybridního typu dovoluje působení pomocí Endo-H strukturální stanovení píků oligosacharidů, které mají stejné poměry m/z ve spektrech MALDI/TOF-MS, původně pocházející z působení PNGázyF.
Obr. 9. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) chimérních protilátek antiCD20 IgG se sestrojenými glykosidy „G1-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách BHK. Produkční a glykosylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 3 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 1. Cílové buňky (T) byly lidské lymfoblastoidní buňky SKW6.4. Efektorové buňky (E) byly čerstvě izolované lidské PBMC. Poměr E : T - 25 : 1 se použil při 4hodinové inkubaci ve stanovení ADCC měřící cytotoxicitu uvolňováním laktátdehydrogenázy (LDH) ve vztahu ke kontrolám uvolňování (s použitím detergentu místo protilátky) a spontánnímu uvolňování (kultivační médium místo protilátky). Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 10. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) chimérních protilátek antiCD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTW“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykosylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5. Cílové buňky (T) byly ·· φφφφ • · · φ • · φ • φ φ φ • φ φ φφφ φ ·· φφ φφφφ • φ φφφ φ φ φ φφφ • φφφ φ • φφφ • ••Φ φφ φφφ lidské lymfoblastoidní buňky SKW6.4. Efektorové buňky (E) byly čerstvě izolované lidské PBMC. Poměr E : T - 25 : 1 se použil při 4hodinové inkubaci ve stanovení ADCC měřící cytotoxicitu uvolňováním laktátdehydrogenázy (LDH) ve vztahu ke kontrolám uvolňování (s použitím detergentu místo protilátky) a spontánnímu uvolňování (kultivační médium místo protilátky). Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 11. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) chimérních protilátek antiCD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTW“ ve srovnání s rekombinantními protilátkami se sestrojenými glykosidy „wt-GnTIII“ stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách BHK. Produkční a glykosylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy M2GnTIII je znázorněn na obr. 4 a totéž pro protilátku se sestrojenými glykosidy wt-GnTIII na obr. 2. Cílové buňky (T) byly lidské lymfoblastoidní buňky SKW6.4. Efektorové buňky (E) byly čerstvě izolované lidské PBMC. Poměr E : T - 25 : 1 se použil při 4hodinové inkubaci ve stanovení ADCC měřící cytotoxicitu uvolňováním laktátdehydrogenázy (LDH) ve vztahu ke kontrolám uvolňování (s použitím detergentu místo protilátky) a spontánnímu uvolňování (kultivační médium místo protilátky). Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 12. Vazba chimérních protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2GnTIH“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu na receptor FcyRIIIa na buňkách NK. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293EBNA. Produkční a glykosylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1. Lidské buňky NK exprimující receptor FcyRIIIa na svém povrchu byly izolovány z z donoru genotypu známého tím, že neprodukuje receptor FcyRIIc (tj. homozygotní pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci s kódující sekvencí FcyRIIc). Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu protilidské protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK. Vazba detekovaná v tomto stanovení je specifická k FcyRIIIa, jak je ukázáno použitím kompetitivního fragmentu protilátky specifické k FcyRIIIa (viz obr. 13).
Obr. 13. Vazba chimérních protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2GnTIII“ ve srovnání s rekombinantními protilátkami se sestrojenými glykosidy „wt-GnTHI“ stejného typu na receptor FcyRIIIa na buňkách NK. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykosylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1, ale při společné inkubaci čištěných buněk NK s rekombinantní protilátkou (vždy při konečné
9999
9 9
9 999
9 9 9
9 9
999 ·· ···· • · · ♦ · · • · · · • · · ·· · koncentraci 3 μρ/ηηΙ) a se zvyšujícími se a měnícími koncentracemi (viz graf) kompetitivního fragmentu 3G8-Fab2 protilátky anti- FcyRIIIa. Lidské buňky NK exprimující receptor FcyRIIIa na svém povrchu byly izolovány od dárce genotypu známého tím, že neprodukuje receptor FcyRIIc (tj. homozygotního pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci s kódující sekvencí FcyRIIc). Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu protilidské protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK.
Obr. 14. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených od rekombinantních protilátek lgG1 „L19“ rozeznávajících izoformu fibronektinu ED-B+ a produkovaných v buňkách HEK293-EBNA. (a) Nemodifikovaná protilátka produkovaná v buňkách HEK293-EBNA transfekovaných protilátkovým expresním vektorem pETR1546. (b) protilátka se sestrojenými glykosidy M2-GnTIII produkovaná v buňkách HEK293-EBNA kotransfekovaných protilátkovým expresním vektorem pETR1546 a expresním vektorem GnTIII pETR1519. Obě protilátky byly vyčištěny od kultivačního média proteinovou afinitní chromatogafií A následovanou krokem gelové chromatografie na matrici Superex 200 (Amersham) vyměňující pufr na solný pufrovaný fosfátem (PBS). Oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 15. Vazba chimérních protilátek IgG proti fibronektinu ED-B+ se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu na receptor FcyRIIc lidských buněk lymfomu Ráji. Produkční a glykosylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 14b a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 14a. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1. Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu protilidské protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na B-buňky lymfomu Ráji.
Obr. 16. Vazba chimérních protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami lgG1 stejného typu na receptor FcyRIIIa na buňkách NK od různých dárců. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykosylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1. Lidské buňky NK exprimující receptor FcyRIIIa na svém povrchu byly izolovány od dárce genotypu známého tím, že neprodukuje receptor FcyRIIc (tj. homozygotního pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci s kódující sekvencí FcyRIIc). U dvou dárců se zjistil fenotyp jako homozygotní varianta 158V-„vyšší afinita“ receptoru FcyRIIIa. U dalších dvou
9999
9
999
99*9
9 9
999 dárců se zjistil fenotyp jako homozygotní varianta 158V-„vyšší afinita“ a 158F-„nižší varianta“ receptoru FcyRIIIa Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu protilidské protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK. Vazba detekovaná v tomto stanovení je specifická k FcyRIIIa, jak je ukázáno použitím kompetitivního fragmentu protilátky specifické k FcyRIIIa (viz obr. 13).
Obr. 17. Analýza FACS zkrácené exprese CD4 (tCD4) (a) BHK1502-28 (divoký typ) a (b) klonu stabilních buněčných linií BHK-1502-28-11 se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ produkujících protilátku anti-CD20 IgG. Exprese tCD4 je operativně připojená na expresi M2-GnTIII přes element IRES v expresním vektoru pETR1537 GnTIII, a proto se používá jako nepřímý markér exprese GnTIII. Průměr a geometrický průměr intenzit fluorescence byl 27,6 a 19,9 pro buněčné linie se sestrojenými glykosidy a 4,7 a 4,1 pro divoký typ.
Obr. 18. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených od rekombinantních protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy M2-GnTIII produkovaných buněčnou linií BHK-1502-28-11. Buněčná linie, čištění protilátky, příprava a analýza oligosacharidů jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 19. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, uvolněných PNGázou F a dále rozložených EndoH, odvozených od rekombinantních protilátek antiCD20 IgG se sestrojenými glykosidy M2-GnTIII produkovaných buněčnou linií BHK-1502-2811. Buněčná linie, čištění protilátky, příprava a analýza oligosacharidů jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 20. Vazba chimérních protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami lgG1 stejného typu, produkovaných stabilními buněčnými liniemi, na receptor FcyRIIIa na buňkách NK. Glykosylační profil sestrojené protilátky je ukázán na obr. 18 a 19. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1. Lidské buňky NK exprimuj ící receptor FcyRIIIa na svém povrchu byly izolovány od dárce genotypu známého tím, že neprodukuje receptor FcyRIIc (tj. homozygotního pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci s kódující sekvencí FcyRIIc). Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu protilidské protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK. Vazba detekovaná v tomto stanovení je specifická k FcyRIIIa, jak je ukázáno použitím kompetitivního fragmentu protilátky specifické k FcyRIIIa (viz obr. 13).
·· ··»·
Obr. 21. Lýze zprostředkovaná komplementem (CML) chimérních protilátek antiCD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami lgG1 stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykosylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5.Pro toto stanovení se použil lidský komptement. Lýze se měřila uvolňováním LDH. Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 22. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, odvozených z rekombinantních chimérních protilátek lgG1 „C225“, rozeznávajících receptor lidského epidermálního růstového faktoru (EGFR) , a produkovaných buňkami HEK-293-EBNA. (a) nemodifikovaná protilátka produkovaná v buňkách HEK-293-EBNA transfekováných expresním vektorem protilátky pURSI28. (b) Protilátka se sestrojenými glykosidy M2-GnTIII produkovaná v buňkách HEK-293-EBNA kotransfekovaných expresním vektorem protilátky pURSI28 expresním vektorem GnTIII pETR1519. Obě protilátky byly vyčištěny od kultivačního média proteinovou afinitní chromatogafií A následovanou krokem gelové chromatografie na matrici Superex 200 (Amersham) vyměňující pufr na solný pufrovaný fosfátem (PBS). Oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 23. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) chimérních protilátek IgG anti-EGFR „C225“ se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykosylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 22b a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 2. Cílové buňky (T) byly buňky lidského karcinomu dlaždicového epitelu A431 (ECACC No. 85090402). Efektorové buňky (E) byly čerstvě izolované lidské PBMC. Poměr E : T - 25 : 1 se použil při 4hodinové inkubaci ve stanovení ADCC měřící cytotoxicitu uvolňováním laktátdehydrogenázy (LDH) ve vztahu ke kontrolám uvolňování (s použitím detergentu místo protilátky) a spontánnímu uvolňování (kultivační médium místo protilátky). Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 24. Sekvence nukleové kyseliny a odpovídající aminokyselinová sekvence fúzního polypeptidu manózidázy II - GnTIII podle vynálezu.
Obr. 25. Sekvence nukleové kyseliny a odpovídající aminokyselinová sekvence fúzního polypeptidu GnTI - GnTIII podle vynálezu.
Obr. 26. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, odvozených z nemodifikovaných rekombinantních chimérních protilátek lgG1 C2B8 anti-CD20 („Cwt“), produkovaných buňkami HEK-293-EBNA transfekovaných expresním vektorem protilátky ·· ··»· • · · • ♦ · • « · • · · ·· · « ·· ·· ···» ·· · · · · · • · · · ··· • · · · · · • · · · · ··· ···· ·· ··· pETR1520. Protilátka byla vyčištěna od kultivačního média a oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 5.
Obr. 27. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, odvozených z nemodifikovaných rekombinantních chimérních protilátek lgG1 se sestrojenými glykosidy C2B8 anti-CD20 („Cbrt“), produkovaných buňkami HEK-293-EBNA transfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520 a fůzním expresním vektorem polypeptidu GnTIII (pETR1519). Protilátka byla vyčištěna od kultivačního média a oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 5. (A) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázouF bez dalšího enzymatického působení. (B) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázouF dále rozložených EndoH.
Obr. 28. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, odvozených z nemodifikovaných rekombinantních chimérních protilátek lgG1 se sestrojenými glykosidy C2B8 anti-CD20 („Cm“), produkovaných buňkami HEK-293-EBNA kotransfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520, fůzním expresním vektorem polypeptidu GnTIII (pETR1519) a expresním vektorem polypeptidu manózidázy II (pCLF9). Protilátka byla vyčištěna od kultivačního média a oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 5. (A) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázouF bez dalšího enzymatického působení. (B) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázouF dále rozložených EndoH.
Obr. 29. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) zprostředkovaná chimérními protilátkami anti-CD20 s glykosidy sestrojenými expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid ManlI-GnTIII v buňkách HEK293-EBNA, kde katalytická doména GnTIII je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, kde nukleová kyselina kódující ManlI-GnTIII je exprimována buď samostatně (protilátka Cbrt), nebo koexprimována v buňkách produkujících protilátky společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm). Cwt je nemodifikovaná rekombinantní chimérní protilátka IgG C2B8 anti-CD20, produkovaná v buňkách HEK-EBNA, transfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520. Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 30. Vazba receptoru FcyRIIIa a chimérních protilátek anti-CD20 s glykosidy sestrojenými expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid ManlI-GnTIII v buňkách HEK293-EBNA, kde katalytická doména GnTIII je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, kde nukleová kyselina kódující ManlI-GnTIII je exprimována buď samostatně (protilátka Cbrt), nebo koexprimována v buňkách produkujících protilátky společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm). Cwt je nemodifikovaná rekombinantní chimérní protilátka IgG C2B8 anti-CD20, produkovaná v buňkách HEK-EBNA, transfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520. Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály
a metody příkladu 1. Lidské buňky NK exprimující receptor FcyRIIIa na svém povrchu byly izolovány od dárce genotypu známého tím, že neprodukuje receptor FcyRIIc (tj. homozygotního pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci s kódující sekvencí FcyRIIc). Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu protilidské protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK. Vazba detekovaná v tomto stanoveni je specifická k FcyRIIIa, jak je ukázáno použitím kompetitivního fragmentu protilátky specifické k FcyRIIIa (viz obr. 13).
Obr. 31. Komplementem zprostředkovaná cytotoxicita chimérních protilátek antiCD20 s glykosidy sestrojenými expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid ManlIGnTIII v buňkách HEK293-EBNA, kde katalytická doména GnTIII je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, kde nukleová kyselina kódující ManlI-GnTIII je exprimována buď samostatně (protilátka Cbrt), nebo koexprimována v buňkách produkujících protilátky společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm). Cwt je nemodifikovaná rekombinantní chimérní protilátka IgG C2B8 anti-CD20, produkovaná v buňkách HEK-EBNA, transfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520.
Obr. 32 (A-C). Expresní vektory pCLF9 (A), pETR1842 (B) a pETR1843 (C).
Obr. 33 (A a B). Expresní vektory pro fúzní protein ManlI-GalT (A) a GalT (B).
Obr. 34. Oligosacharidový profil monoklonální protilátky anti-CD20 produkované v přítomnosti manózidázy II a relativní procentické zastoupení nalezených struktur asociovaných k části protilátky Fc.
Obr. 35 (A a B). Oligosacharidový profil monoklonální protilátky anti-CD20 produkované v přítomnosti fúzního proteinu ManlI-GalT a relativní procentické zastoupení nalezených struktur asociovaných k oblasti protilátky Fc. Oligosacharidové profily po digesci PNGázouF (A) a EndoH (B).
Obr. 36. protilátka produkovaná v přítomnosti manózidázy II (Manil) navázané na receptor FcyRIIIA s větší afinitou než divoké typy protilátek.
Obr. 37. Celulární cytotoxicita závislá na protilátce, zprostředkovaná chimérní antiCD20 se sestrojenými glykosidy.
Detailní popis vynálezu
Termíny použité zde jsou obecně používané v oboru, pokud nejsou jinak definovány zde.
Jak je použito zde, termín protilátka je míněn tak, že zahrnuje celé molekuly protilátka, včetně monoklonálních, polyklonálních a multispecifických (tj. bispecifických) protilátek, tejně jako fragmenty protilátek majících oblast Fc a fúzní proteiny, které zahrnují region ekvivalentní k regionu Fc imunoglobulinu. Jsou zahrnuty rovněž humanizované a chimérní protilátky.
Jak je použito zde, termín oblast Fc 'ie míněn tak, že odkazuje k C-terminální oblasti těžkého řetězce IgG. Ačkoliv ohraničení oblasti Fc těžkého řetězce IgG se mohou lehce měnit, oblast Fc těžkého řetězce lidského IgG je obvykle definována tak, že se táhne od aminokyselinového zbytku Cys226 ke karboxylovému konci.
Jak je použito zde, termín oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu je míněn tak, že zahrnuje přirozeně se vyskytující alelické varianty oblast Fc imunoglobulinu, stejně jako varianty mající alterace které vznikají substitucemi, adicemi a delecemi, ale které podstatně nesnižují schopnost imunoglobulinu zprostředkovat efektorové funkce (jako celulární cytotoxicitu zprostředkovanou protilátkou). Například jedna nebo více aminokyselin se může odstranit z N-konce nebo C-konce oblasti Fc imunoglobulinu bez podstatné ztráty biologické funkce. Takové varianty se mohou vybrat podle obecných pravidel známých ze stavu techniky tak, že mají minimální účinek na aktivitu. (Viz Bowie, J. U. et al., Science 247: 1306-10(1990)).
Jak je použito zde, termín fúzní polypeptid „mající aktivitu β(1,4)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy III odkazuje na fúzní polypeptidy, které jsou schopné katalyzovat adici skupiny N-acetylglukózaminu (GIcNAc) v připojení β-1-4 na β-připojený manózid v trimanosylovém jádru N-připojených oligosacharidů. To zahrnuje fúzní polypeptidy vykazující enzymatickou aktivitu podobnou, ale ne nutně identickou, aktivitě β(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III, také známé jako p-1-4-manózylglykoprotein-4-p-N-acetylglukózaminyltransferáza (E.C.2.4.1.144) podle Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), jak je změřeno v jednotlivém biologickém stanovení, se závislostí na dávce nebo bez ní. V případě, že závislost na dávce existuje, nemusí být identická se závislostí na dávce β(1,4)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy III (tj. kandidátský polypeptid bude vykazovat větší aktivitu nebo ne méně než 25krát menší, výhodně ne méně než desetkrát menší, nejvýhodněji ne méně než třikrát menší ve srovnání s βΟ/Ο-Ν-θοβίγ^^όζθΓηίηγΗτθηείβΓέζου III. je použit zde, fúzní polypeptid „mající aktivitu β(1,4)galaktózyltransferázy“ nebo „mající aktivitu GalT“ se vztahuje k fúzním polypeptidům, které jsou schopné katalyzovat adici galaktózové skupiny z UDP galaktózy na neredukující terminál GIcNAc nacházející se v N-připojených oligosacharidech. To zahrnuje fúzní polypeptidy vykazující enzymatickou aktivitu podobnou, ale ne nutně identickou, aktivitě p(1,4)galaktózyltransferázy, také známé jako UDPGal:GlcNAc p-1,4-galaktózyltransferáza (E.C.2.4.1.38) podle Nomenclature Committee of the ·· ···· · ·· ·· ···· • · · ···· ··· ··· · · ·····
International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), jak je měřeno v jednotlivém biologickém stanovení se závislostí na dávce nebo bez ní. V případě, že závislost na dávce existuje, nemusí být identická se závislostí na dávce P(1,4)galaktózyltransferázy (tj. kandidátský polypeptid bude vykazovat větší aktivitu nebo ne méně než 25krát menší, výhodně ne méně než desetkrát menší, nejvýhodněji ne méně než třikrát menší ve srovnání s p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázou III.
Nukleovou kyselinou nebo polynukleotidem majícím alespoň například „95 % identity“ s referenční nukleotidovou sekvencí podle předmětného vynálezu se míní, že nukleotidová sekvence polynukleotidu je identická s referenční sekvenci s výjimkou, že polynukleotidová sekvence má do pěti bodových mutací na 100 nukleotidů referenční nukleotidové sekvence. Jinými slovy, aby se získal polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci alespoň na 95 % identickou s referenční nukleotidovou sekvencí, až 5 % nukleotidů v referenční sekvenci může být eliminováno nebo substituováno jiným nukleotidem, nebo až 5 % celkového počtu nukleotidů v referenční sekvenci se může zavést do referenční sekvence. Sekvence, o kterou jde, může být celá sekvence ukázaná na obr. 24 nebo obr. 25.
Jako praktická záležitost, jestli je každá jednotlivá molekula nukleové kyseliny nebo polypeptidu je alespoň na 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identická se sekvencí nukleové kyseliny nebo polypeptidu podle předmětného vynálezu, může být určeno konvenčně s použitím známých počítačových programů. Jako upřednostňovaný způsob pro určení nejlepší celkové shody mezi dotazovanou sekvencí (sekvencí podle předmětného vynálezu) a předmětnou sekvencí, také nazývanou globální sekvenční přiřazení, se může určit použitím počítačového programu FASTDB, založeném na algoritmu Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). V sekvenčním řazení jsou dotazovaná a předmětná sekvence obě sekvence DNA. Sekvence RNA se mohou srovnat konverzí U na T. Výsledkem globálního sekvenčního přiřazení je procentická identita. Upřednostňovanými parametry používanými v přiřazení sekvencí DNA podle FASTDB při počítání procentické identity jsou: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch Penalty=l, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=l, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500 nebo délka předmětné nukleotidové sekvence, co je kratší.
Jestliže je předmětná sekvence kratší než dotazovaná sekvence kvůli delecím na 5‘konci nebo 3‘-konci, ne kvůli interním delecím, musí se provést manuální korekce výsledků. To je proto, že program FASTDB nebere v úvahu delece na 5‘-konci nebo 3‘-konci předmětné sekvence, když kalkuluje procentickou identitu. Pro předmětné sekvence zkrácené na 5‘-konci nebo 3‘-konci ve vztahu k dotazované sekvenci se procentická identita koriguje spočítáním počtu bází dotazované sekvence, které jsou 5' a 3‘ předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené, jako procenta celkového počtu bází dotazované
sekvence. Zda je nukleotid odpovídající/přiřazený, se určuje podle výsledků sekvenčního přiřazení FASTDB. Tato procenta se potom odečtou od procent identity, spočítaných výše uvedeným programem FASTDB s použitím specifických parametrů, aby se došlo ke konečnému výsledku procent identity. Tento korigovaný výsledek se použije pro účely podle předmětného vynálezu. Pouze báze mimo báze 5‘ a 3‘ předmětné sekvence, jak je ukázáno přiřazením FASTDB, které nejsou odpovídající/přiřazené k dotazované sekvenci, se počítají pro účely manuální úpravy výsledku procentuální identity.
Například předmětná sekvence s 90 bázemi se přiřazuje k dotazované sekvenci se 100 bázemi k určení procentuální identity. Delece se vyskytují na 5‘-konci předmětné sekvence a proto přiřazení pomocí FASTDB neukazuje prvních 10 odpovídajících/ přiřazených bází na 5‘-konci. 10 nespárovaných bází představuje 10 % sekvence (počet bází na 5‘- a 3‘-koncích neodpovídá celkovému počtu bází v dotazované sekvenci), tak se odečte 10 % z výsledku procentuální identity vypočteného programem FASTDB. Jestliže zbývajících 90 bází perfektně odpovídá, finální procenta identity jsou 90 %. V jiném příkladě je předmětná sekvence s 90 bázemi srovnávána s dotazovanou sekvencí se 100 bázemi. Tentokrát jsou delece interními delecemi, takže nejsou žádné báze na pozicích 3* nebo 5‘ předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené s dotazem. V tomto případě se procenta identity spočítané FASTDB manuálně neopravují. Ještě jednou, manuálně se opravuje jen na základě bází na 5‘ a 3‘ konci předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené dotazované sekvenci. Žádné další manuální korekce se pro účely podle předmětného vynálezu nedělají.
Polypeptidem majícím aminokyselinovou sekvenci přinejmenším například na 95 % „identickou“ s dotazovanou aminokyselinovou sekvencí podle předmětného vynálezu se rozumí, že aminokyselinová sekvence předmětného polypeptidu je identická s dotazovanou sekvencí kromě toho, že předmětný polypeptid může zahrnovat do pěti záměn na každých 100 aminokyselin dotazované aminokyselinové sekvence. Jinými slovy, pro získání polypeptidu majícího aminokyselinovou sekvenci alespoň na 95 % identickou s dotazovanou aminokyselinovou sekvencí se může do 5 % aminokyselinových zbytků vložit, eliminovat nebo substituovat jinými aminokyselinami. Tyto změny referenční sekvence mohou nastat na amino- nebo karboxyterminálních pozicích referenční aminokyselinové sekvence nebo kdekoliv mezi těmito terminálními pozicemi, promísené buď jednotlivě mezi zbytky v referenční sekvenci, nebo v jedné nebo více spojitých skupinách uvnitř referenční sekvenceJako praktická záležitost se může určit konvenčně pomocí známých počítačových programů, zda je jakýkoliv jednotlivý polypeptidalespoň na 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identický s referenčním polypeptidem. Upřednostňovaným způsobem pro určení nejlepší celkové shody mezi dotazovanou sekvencí (sekvence podle předmětného vynálezu) a předmětnou sekvencí, také nazývanou globální sekvenční přiřazení, se může určit použitím počítačového programu FASTDB, založeném na algoritmu Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). V sekvenčním řazení jsou dotazovaná a předmětná sekvence, obě sekvence nukleotidové nebo obě sekvence aminokyselinové. Výsledkem globálního sekvenčního přiřazení je procentická identita. Upřednostňovanými parametry používanými v přiřazení sekvencí DNA podle FASTDB při počítání procentické identity jsou :Matrix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty=l, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=l, Window Size=délka sekvence, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500 nebo délka předmětné aminokyselinové sekvence, co je kratší.
Jestliže je předmětná sekvence kratší než dotazovaná sekvence kvůli delecím na Nkonci nebo C-konci, ne kvůli interním delecím, musí se provést manuální korekce výsledků. To je proto, že program FASTDB nebere v úvahu delece na N-konci nebo C-konci předmětné sekvence, když kalkuluje celkovou procentickou identitu. Pro předmětné sekvence zkrácené na N-konci nebo C-konci ve vztahu k dotazované sekvenci se procentická identita koriguje spočítáním počtu bází dotazované sekvence, které jsou N- a Ckoncové u předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené, jako procenta celkového počtu bází dotazované sekvence. Zda je nukleotid odpovídající/přiřazený, se určuje podle výsledků sekvenčního přiřazení FASTDB. Tato procenta se potom odečtou od procent identity, spočítaných výše uvedeným programem FASTDB s použitím specifických parametrů, aby se došlo ke konečnému výsledku procent identity. Tento korigovaný výsledek je to, co se použije pro účely podle předmětného vynálezu. Pouze báze mimo N- a Ckoncové báze předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené k dotazované sekvenci, se počítají pro účely manuální úpravy výsledku procentuální identity. To znamená pouze pozice dotazované sekvence mimo nevzdálenějších N- a C-koncových zbytků předmětné sekvence.Například předmětná sekvence s 90 aminokyselinami se přiřazuje k dotazované sekvenci se 100 zbytky k určení procentuální identity. Delece se vyskytují na N-konci předmětné sekvence a proto přiřazení pomocí FASTDB neukazuje prvních 10 odpovídajících/přiřazených aminokyselin na N-konci. 10 nespárovaných zbytků představuje 10 % sekvence (počet zbytků na N- a C-koncích neodpovídá celkovému počtu zbytků v dotazované sekvenci), tak se odečte 10 % z výsledku procentuální identity vypočteného programem FASTDB. Jestliže zbývajících 90 zbytků perfektně odpovídá, finální procenta identity jsou 90 %. V jiném příkladě je předmětná sekvence s 90 zbytky srovnávána s dotazovanou sekvencí se 100 zbytky. Tentokrát jsou delece interními delecemi, takže nejsou žádné báze na N- a C-koncových pozicích předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené s dotazem. V tomto případě se procenta identity spočítané FASTDB manuálně neopravují. Ještě jednou, manuálně se opravuje jen zbytky na pozicích mimo N- a ·· ···· • · · • · · · · ·· · ·· ···»
C-terminální konce předmětné sekvence, jak je ukázáno v přiřazení FASTDB, které nejsou odpovídající/přiřazené dotazované sekvenci. Žádné další manuální korekce se pro účely podle předmětného vynálezu nedělají.Jak je použito zde, nukleová kyselina, která „hybridizuje za přísných podmínek“ k sekvenci nukleové kyseliny podle vynálezu, se vztahuje k polynukleotidu, který hybridizuje při inkubaci přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím 50 % formamidu, 5x SSC (750 mM NaCI, 75 mM citrátu sodného), 50 mM fosforečnanu sodného (pH 7,6), 5x Denhardtův roztok, 10 % dextransulfátu a 20 pg/ml denaturovaného štěpeného lososího spermatu, následované promytím filtrů v 0,1x SSC při asi 65 °C.Jak je použito zde, nukleová kyselina, která „hybridizuje za přísných podmínek“ s nukleovou kyselinou podle předmětného vynálezu, se vztahuje k polynukleotidu, který hybridizuje při inkubaci přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím 50 % formamidu, 5x SSC (750 mM NaCI, 75 nM citrátu sodného) 50 mM fosforečnanu sodného (pH 7,6), 5x Denhardtův roztok, 10 % sulfát dextranu, a 20 pvg/ml denaturované, stříhané DNA z lososího spermatu, následované promytím filtrů 0,1x SSC při asi 65 °C.
Jak je použito zde, Golgiho lokalizační doména se vztahuje k aminokyselinové sekvenci Golgiho rezidentního polypeptidů, který je odpovědný za zakotvení se v umístění uvnitř Golgiho aparátu. Obecně lokalizační domény obsahují aminoterminální „ocasy“ enzymu.
Jak je použito zde, efektorová funkce se vztahuje k takovým biologickým aktivitám, přiřaditelným k oblasti Fc (oblast Fc s přirozenou sekvencí nebo oblast Fc s pozměněnou aminokyselinovou sekvencí) protilátky. Příklady efektorových funkcí protilátky zahrnují, ale nejsou tím omezeny, vazebnou aktivitu receptoru Fc, celulární cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC), celulární fagocytózu závislou na protilátce (ADCP), sekreci cytokinů, absorpci antigenů buňkami prezentujícími antigen zprostředkovanou imunokomplexem, sníženou regulaci buněčných povrchových receptorů atd.Jak je požito zde, termíny sestrojený, sestrojování, sestrojování glykosidů zahrnují jakoukoliv manipulaci s glykozylačním vzorem přirozeně se vyskytujícího polypeptidů nebo jeho fragmentu. Sestrojování glykosidů zahrnuje metabolické sestrojování glykozylačního aparátu buňky, včetně genetických manipulací cest syntézy oligosacharidů, aby se dosáhla změněná glykozylace glykoproteinů exprimovaných v buňkách. Sestrojování glykosidů dále zahrnuje působení mutací a buněčného prostředí na glykozylaci.
Jak je použito zde, termín hostitelská buňka pokrývá jakýkoliv druh buněčného systému, který se může sestrojit pro generování modifikovaných glykoforem proteinů, proteinových fragmentů nebo zajímavých peptidů, včetně protilátek, fragmentů protilátek a fúzních proteinů. Hostitelské buňky byly typicky manipulované, aby exprimovaly optimalizované úrovně GnTIH. Hostitelské buňky zahrnují kultivované buňky, tj. savčí ·«·· • 44 ·· ····
4 · 4 * · • · · 4 4 4 4
4 · · 4 ·
4 4 4 4
4444444 44 444 kultivované buňky, jako buňky CHO, BHK, NSO, SP2/0, buňky myelomu YO, buňky myšího myelomu P3X63, buňky PER, PER.C6 nebo hybridomové buňky, kvasinky, hmyzí buňky a rostinné buňky, aby se jmenovalo pouze několik, ale také buňky obsažené v transgenním zvířeti, transgenní rostlině nebo kulturní rostlině nebo zvířecí tkáni.
Jak je použito zde, termín buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc zahrnuje buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátce a buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou rozpustným fúzním proteinem Fc obsahujícím lidskou oblast Fc. Je to imunitní mechanizmus vedoucí k lýzi „buněk cílených protilátkou“ prostřednictvím „lidských imunoefektorových buněk“ kde:Lidské imunoefektorové buňky“ je populace leukocytů, která vykazuje na povrchu receptory Fc, jejichž prostřednictvím se vážou na fúzní proteiny Fc a provádějí efektorovou funkci. Taková populace může zahrnovat, ale není tím omezena, mononukleární buňky periferální krve (PBMC) a/nebo přirozené zabíječské buňky (NK).„Buňky cílené protilátkou“ jsou buňky vázané protilátkami nebo fúzními proteiny Fc. Protilátky nebo fúzní proteiny Fc se vážou na na cílové buňky proteinovou částí N-konce oblasti Fc.
Jak je použito zde, termín zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc je definován buď jako zvýšení počtu „buněk cílených protilátkou“, které jsou lýzovány v daném čase, dané koncentraci protilátky nebo fúzního proteinu Fc v médiu obklopujícím buňky mechanizmem buněčné cytotoxicity zprostředkovaným Fc definovaným výše, a/nebo snížením koncentrace protilátky nebo fúzního proteinu Fc v médiu obklopujícím buňky, požadované k dosažení lýze daného počtu počtu „buněk cílených protilátkou“ v daném čase mechanizmem buněčné cytotoxicity zprostředkovaným Fc. Zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc je vztažena k buněčné cytotoxicitě zprostředkované toutéž protilátkou nebo fúzním proteinem Fc, produkovanou stejným typem hostitelských buněk s použitím stejné standardní produkce, čištění, formulace a skladovacích metod, které jsou známy odborníkům v oboru, ale které se nepoužily u hostitelských buněk sestrojených pro exprimaci glykosyltransferázy GnTIII metodami popsanými zde.
Protilátkou mající zvýšenou buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC) se míní protilátka mající zvýšenou ADCC, jak se určí jakoukoliv vhodnou metodou známou odborníkům v oboru. Jedno akceptovaná stanovení in vitro následuje:
1) Stanovení používá cílové buňky, o kterých je známo, že exprimují cílový antigen rozeznatelný oblastí protilátky vázající antigen;
2) stanovení používá lidské mononukleární buňky periferní krve (PBMC), izolované z krve náhodně vybraného zdravého dárce, jako efektorové buňky;
3) stanovení se provádí podle následujícího protokolu:
i) PBMC se izolují s použitím standardních hustotních centrifugačních procedur a suspenduje se 5x106 buněk/ml v buněčném kultivačním médiu RPMI;
·· · ♦ · • · « • » · · · ·· • · • · ·*··
ii) cílové buňky se nechají růst s pomocí standardních tkáňových kultivačních metod, odeberou se za fáze exponenciálního růstu s životností větší než 90 %, promyjí se kultivačním médiem RPMI, označí se 100 μ-Curíe 51 Cr, promyjí dvakrát buněčným kultivačním médiem, a resuspendují se v buněčném kultivačním médiu při hustotě 105 buněk/ml;
iii) 100 μΙ finální suspenze cílových buněk uvedené výše se přenese do každé jamky 96jamkové mikrotitrační destičky;
iv) protilátka se sériově ředí od 4000 ng/ml po 0,04 ng/ml v buněčném kultivačním médiu a 50 μΙ výsledných roztoků protilátky se přidá k cílovým buňkám v 96jamkové mikrotitrační destičce, a třikrát se testují různé koncentrace protilátek s pokrytím celého výše uvedeného rozsahu koncentrací;
v) pro kontroly maximálního uvolnění (MR) se do 3 dalších jamek v destičce obsahující značené cílové buňky přidá 50 μΙ 2% obj. vodného roztoku neionogenního detergentu (Nonidet, Sigma, St.Louis, USA) namísto roztoku protilátky (bod iv výše);
vi) pro kontroly spontánního uvolnění (SR) se do 3 dalších jamek v destičce obsahující značené cílové buňky přidá 50 μΙ buněčného kultivačního média RPMI namísto roztoku protilátky (bod iv výše);
vii) 96jamková mikrotitrační destička se poté centrifuguje při 50 g po 1 minutu a inkubuje 1 hodinu při 4 °C;
viii) 50 μΙ suspenze PBMC (bod i výše) se přidá do každé jamky, aby se získal poměr efektorových:cílových buněk 25:1 a destičky se umístí do inkubátoru pod atmosféru s5 % CO2 při 37 °C po 4 hodiny;
ix) bezbuněčný supernatant se sebere z každé jamky a experimentem uvolněná radioaktivita (ER) se kvantifikuje s použitím γ čítače;
x) procentická hodnota specifické lýze se spočítá pro každou koncentraci protilátky podle vzorce (ER-MR)/(MR-SR)x100, kde ER je průměrná radioaktivita kvantifikovaná (viz bod ix výše) pro tuto koncentraci protilátky, MR je průměrná radioaktivita kvantifikovaná (viz bod ix výše) pro kontroly MR (viz bod iv výše), a SR je průměrná radioaktivita kvantifikovaná (viz bod ix výše) pro kontroly SR (viz bod vi výše);
4) „zvýšená ADCC“ se definuje buď jako zvýšení maximální procentické hodnoty specifické lýze pozorované uvnitř rozsahu koncentrace protilátky testovaného výše, a/nebo snížení koncentrace protilátky požadované pro dosažení poloviny maximální procentické hodnoty lýze pozorované uvnitř rozsahu koncentrací protilátky testovaného výše. Zvýšení ADCC je ve vztahu kADCC, měřeno uvedeným stanovením, zprostředkovanou toutéž protilátkou, produkovanou stejným typem hostitelských bunik s použitím stejné standardní produkce, ěištiní, formulace a skladovacích metod, které jsou známy odborníkům v oboru,
• ·· 9999 • 9 9 9« 9 9 9 9 9 9 9 9 9999 9
• • 9 9 9 9 9 999
• 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9
ale které se nepoužily u hostitelských bunik sestrojných pro zvýšenou exprimaci glykosyltransferázy GnTIII metodami popsanými zde.
Jak je použito zde, termín protilátka anti-CD20 se považuje za protilátku, která specificky rozpoznává neglykosylovaný fosfoprotein buněčného povrchu majícího molekulovou hmotnost 35 000, typicky označovaný jako lidský antigen omezené diferenciace B-lymfocytů Bp35, obecně označovaný jako CD20.
Předmětný vynález je založen na zjištění, že sestrojení buněk produkujících protilátku, aby exprimovaly nový fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII), nebo alternativně aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy („GalT“) a obsahující Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu vede k protilátkám se zvýšenou vazebnou afinitou receptorů Fc a zvýšenou efektorovou funkcí. Protilátky se zvýšenou efektorovou funkcí a/nebo se zvýšenou vazebnou afinitou receptorů Fc se mohou alternativně získat sestrojením buněk produkujících protilátky tak, aby měly zvýšenou expresi molekuly nikleové kyseliny kódující polypeptid mající katalytickou aktivitu α-manózidázy II. V upřednostňovaných provedeních jsou fúzní konstrukty mající aktivitu GnTIII nebo GalT koexprimovány s molekulami nukleové kyseliny kódujícími Manil nebo GnTII.
Podle toho je vynález vjednom provedení směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu β(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu. Ve výhodném provedení obsahuje fúzní polypeptid katalytickou doménu B(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II. V dalším provedení Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména GalT.
Izolovaná nukleové kyselina má výhodně sekvenci ukázanou na obr. 24 a SEQ ID NO:14. V jiném výhodném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu β(1,4)N-acetylglukózaminyltransferázy III a Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména B(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I (GnTI). Nukleové kyselina má výhodně sekvenci ukázanou na obr. 25 a SEQ ID NO: 12. Alternativně se může použít Golgiho lokalizační doména jiného Golgiho rezidentního polypeptidu.V jiném výhodném provedení je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny skládající se z lokalizační domény β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy II, lokalizační domény manózidázy I a lokalizační domény a1 -6 jádrové fukózyltransferázy.
V jiném přednostním provedení je předmětný vynález směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou φφ φφφφ φ ♦ φφφφ
ΦΦ φφφφ φφφ φ φ φ φφφ φ φ φφφφ · φφφ φφ φφ φ φφ φ φφφ ΦΦΦ· φφ φφφ sekvenci ukázanou na obr. 24 a SEQ ID N0:15, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO:13. Předmětný vynález také zahrnuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která hybridizuje za přísných podmínek na hybridizační sondu, jejíž nukleotidové sekvence se skládá z nukleotidové sekvence ukázané na obr. 24 a SEQ ID NO:15, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO: 12. Vynález je dále směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která je alespoň na 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identická se sekvencí nukleotidu ukázanou na obr. 24 a SEQ ID NO: 15, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO:12. V jiném přednostním provedení je předmětný vynález směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci alespoň na 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identickou s aminokyselinovou sekvencí na obr. 24 a SEQ ID NO:15, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO: 13. Vynález také obsahuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci ukázanou na obr. 24 a SEQ ID NO:15, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO:13 s konzervativními aminokyselinovými substitucemi.
V jiném provedení je předmětný vynález směrován na expresní vektor, který obsahuje izolovanou nukleovou kyselinu podle vynálezu, takovou, jak je popsána výše.
V dalším provedení je předmětný vynález směrován na fúzní polypeptid mající aktivitu 6(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III, nebo alternativně aktivitu β(1,4)galaktózyltransferázy I (“GalT“), a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. Ve výhodných provedeních fúzní polypeptidy podle vynálezu obsahují katalytickou doménu 3(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III. Ve zvláště výhodném provedení fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu manózidázy II nebo p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I (GnTI). V alternativním provedení je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny skládající se z lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény doménu p(1,2)-N-acety!glukózaminyltransferázy II a lokalizační domény a1-6 jádrové fukózyltransferázy. Fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu se může připravit kultivací hostitelských buněk podle předmětného vynálezu v médiu za podmínek dovolujících expresi nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a získání fúzního polypeptidu z výsledné kultury.
Předmětný vynález je dále směrován na způsob modifikace glykozylačního profilu polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou, obsahující zavedení nukleové kyseliny nebo vektoru podle vynálezu do hostitelské buňky. Modifikovaný polypeptid je výhodně IgG nebo jeho fragment obsahující oblast Fc. Nejvýhodněji je polypeptid výhodně lgG1 nebo jeho fragment obsahující oblast Fc. V jiném výhodném provedení je modifikovaný polypeptid fúzní protein , který obsahuje oblast ekvivalentní oblasti Fc lidského IgG.
9999
9999
9 9 9·
9 9
9 999
9 9
9 9
9 9 9 9
Předmětný vynález je dále směrován na hostitelskou buňku obsahující nukleové kyseliny a expresní vektory podle vynálezu. V jednom provedení je předmětný vynález směrován na hostitelskou buňku sestrojenou pro expresi alespoň jedné nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid mající aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III, nebo alternativně aktivitu p(1,4)-galaktózyltransferázy I (“GalT“) v množství postačujícím pro modifikaci polysacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je ve výhodném provedení IgG nebo jeho fragment. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je nejvýhodněji lgG1 nebo jeho fragment. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je alternativně fúzní protein, , který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc lidského IgG, tj. lgG1.
Modifikované polypeptidy produkované hostitelskými buňkami podle vynálezu vykazují zvýšenou vazebnou afinitu receptoru Fc a/nebo zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek modifikace. Zvýšená vazebná afinita receptoru Fc je výhodně zvýšená vaznost na aktivující receptor Fcy, jako je receptor FcyRIla. Zvýšená efektorová funkce je výhodně zvýšení v jednom nebo více z následujícího: zvýšená cytotoxicita závislá na protilátce, zvýšená fagocytóza závislá na protilátce (ADCP), zvýšená sekrece cytokinu, zvýšená absorpce antigenu buňkami prezentujícími antigen zprostředkovaná imunokomplexem, zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na polymorfonukleární buňky (PMN), zvýšená vaznost na monocyty, zvýšené propojení protilátek vázaných cílem, zvýšená apoptóza indukovaná přímou signalizací, zvýšené dozrávání dendritických buněk a zvýšené zásobení T-buňkami.
Ve zvláště výhodném provedení je hostitelská buňka podle vynálezu buóka CHO, BHK, NSO, SP2/0, buóka myelomu YO, buóka myšího myelomu P3X63, buóka PER, PER.C6 nebo hybridomová buóka, a polypeptid produkovaný hostitelskou buókou je protilátka anti-CD-20, jako je IDEC-C2B8. V jiném výhodném provedení je hostitelská buóka chimérní protilidské monoklonální protilátka EGFR C225.
Navíc k obsahu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid podle vynálezu může hostitelská buóka podle vynálezu dále obsahovat alespoó jednu transekovanou nukleovou kyselinu kódující molekulu protilátky, fragment protilátky obsahující funkění oblast Fc, nebo fúzní protein který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Ve výhodných provedeních alespoó jedna transekovaná nukleová kyselina kóduje protilátku anti-CD20, chimérní protilidskou neuroblastomovou monoklonální protilátku chCE7, chimérní protilidskou monoklonální protilátku proti karcinomu ledvinových bunik chG250, chimérní
I
8999 • * 8
9 9 89
9 9
9 8
9 9 99 ·♦ ···· • · · • · ·
9 9
9 9
9
9
9999 protilidskou monoklonální protilátku proti karcinomu tlustého stoeva, plic a hrudníku ING-1, humanizovanou protilidskou monoklonální protilátku antigenů 17-IA 3622W94, humanizovanou protilidskou protilátku kolorektálního nádoru A33, protilidskou melanomovou protilátku směřovanou proti GD3 gangliosidu R24, chimérní protilidskou monoklonální protilátku squamous-cell karcinomu SF-25, protilidskou protilátku EGFR, protilidskou protilátku EGFRvIII, protilidskou protilátku PSMA, protilidskou protilátku PSCA, protilidskou protilátku CD22, protilidskou protilátku CD30, protilátku anti-TAG72, protilátku antigenů asociovaného s melanomem o vysoké molekulové hmotnosti (HMWMAA), protilátku gangliosidu anti-GD3, protilátku gangliosidu anti-GD2, protilátku gangliosidu anti-GM2, protilidskou protilátku gangliosidu, protilátku anti-EGFRvIII, anti-integrinovou protilátku, protilátku anti-CD80, protilátku anti-LeY, anti-mucinovou protilátku, protilátku anti-MUC18, protilidskou protilátku CD33, protilidskou protilátku CD38, protilidskou protilátku CD40, protilidskou protilátku CD45, protilidskou protilátku CD52, protilidskou protilátku CD138, protilidskou protilátku HLA-DR variant, protilidskou protilátku EpCAM, protilidskou protilátku CEA, protilidskou protilátku MUC1, protilidskou protilátku jaderného proteinu MUC1, protilidskou protilátku aberantně glykosylovaného MUC1, protilátku proti variantám lidského fibronektinu obsahující doménu ED-B nebo protilidskou protilátku HER2/neu.
Předmětný vynález je také směrován na způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, obsahující (a) kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III, nebo alternativně aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy I (“GalT“) za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky obsahujícího funkční oblast Fc a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid mající aktivitu GnTIII nebo alternativně aktivitu GalT je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci polysacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a (b) izolaci polypeptidu.Ve výhodném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu βΟΛβΝ-θοβίγΙς^όζθίτιίηγΙύθηδίβΓόζν III. Ve zvláště výhodném provedení fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu. Golgiho lokalizační doména je výhodně lokalizační doména manózidázy II nebo β(1,2)-Nacetylglukózaminyltransferázy I (GnTI). Alternativně je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny skládající se z lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény doménu p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény oťl-6 jádrové fukózyltransferázy. Polypeptidy připravené způsoby podle předmětného vynálezu mají zvýšenou vazebnou afinitu k receptorů Fc a/nebo zvýšenou efektorovou funkci. Zvýšená efektorová funkce je výhodně jedno nebo více z následujícího: zvýšená buněčná cytotoxicita
9999
9 9
9 9 99
9 9
9 9
999
999 ·♦ ····
9 •
*·· 9 zprostředkovaná Fc (včetně zvýšené cytotoxicity závislé na protilátce), zvýšená fagocytóza závislá na protilátce (ADCP), zvýšená sekrece cytokinu, zvýšená absorpce antigenu buňkami prezentujícími antigen zprostředkovaná imunokomplexem, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na polymorfonukleární buňky (PMN), zvýšená vaznost na monocyty, zvýšené propojení protilátek vázaných cílem, zvýšená apoptóza indukovaná přímou signalizací, zvýšené dozrávání dendritických buněk a zvýšené zásobení T-buňkami. Zvýšená afinita navázání receptoru Fc je výhodně zvýšené navázání na receptory aktivující Fc jako FcyRIIIa.
V jiném provedení je předmětný vynález směrován na polypeptid produkovaný způsoby podle vynálezu, který má zvýšený podíl rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů. V ještě jiném provedení má polypeptid produkovaný způsoby podle vynálezu zvýšený podíl nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc jako výsledek modifikace. Nefukózylované oligosacharidy mohou být hybridního nebo komplexního typu. Ve zvláště výhodném provedení polypeptid produkovaný hostitelskými buňkami a způsoby podle vynálezu, který má zvýšený podíl rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc. Rozdělené nefukózylované oligosacharidy mohou být buď hybridní nebo komplexní. Způsoby podle předmětného vynálezu se mohou použít pro produkci polypeptidů, ve kterých je alespoň 15 %, výhodněji alespoň 20 %, výhodněji alespoň 25 %, výhodněji alespoň 30 %, výhodněji alespoň 35 %, výhodněji alespoň 40 %, výhodněji alespoň 45 %, výhodněji alespoň 50 %, výhodněji alespoň 55 %, výhodněji alespoň 60 %, výhodněji alespoň 65 %, výhodněji alespoň 70 %, výhodněji alespoň 75 %, výhodněji alespoň 80 %, výhodněji alespoň 85 %, výhodněji alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %, výhodněji alespoň 96 %, výhodněji alespoň 97 %, výhodněji alespoň 98 %, výhodněji alespoň 99 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů nefukózylovaných. Způsoby podle vynálezu se také mohou použít pro produkci polypeptidů, ve kterých je alespoň 15 %, výhodněji alespoň 20 %, výhodněji alespoň 25 %, výhodněji alespoň 30 %, výhodněji alespoň 35 %, výhodněji alespoň 40 %, výhodněji alespoň 45 %, výhodněji alespoň 50 %, výhodněji alespoň 55 %, výhodněji alespoň 60 %, výhodněji alespoň 65 %, výhodněji alespoň 70 %, výhodněji alespoň 75 %, výhodněji alespoň 80 %, výhodněji alespoň 85 %, výhodněji alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %, výhodněji alespoň 96 %, výhodněji alespoň 97 %, výhodněji alespoň 98 %, výhodněji alespoň 99 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů rozdělených. Ještě dále se způsoby podle vynálezu mohou použít pro produkcí polypeptidů, ve kterých je alespoň 15 %, výhodněji alespoň 20 %, výhodněji alespoň 25 %, výhodněji alespoň 30 %, výhodněji alespoň 35 %, výhodněji alespoň 40 %, výhodněji alespoň 45 %, výhodněji alespoň 50 %, výhodněji alespoň 55 %, výhodněji alespoň 60 %, výhodněji alespoň 65 %, výhodněji alespoň 70 %, výhodněji alespoň 75 %, výhodněji alespoň 80 %, výhodněji alespoň 85 %, • · • 9 ·
• 9
9999
9
9
999 9
výhodněji alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %, výhodněji alespoň 96 %, výhodněji alespoň 97 %, výhodněji alespoň 98 %, výhodněji alespoň 99 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů rozdělených nefukózylovaných. Způsoby podle vynálezu se také mohou použít pro produkci polypeptidů, ve kterých je alespoň 15 %, výhodněji alespoň 20 %, výhodněji alespoň 25 %, výhodněji alespoň 30 %, výhodněji alespoň 35 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů rozdělených hybridních nefukózylovaných.
V jiném provedení je předmětný vynález veden na protilátku sestrojenou tak, aby měla zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc. Zvýšená efektorová funkce je výhodně jedno nebo více z následujícího: zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc (včetně zvýšené cytotoxicity závislé na protilátce), zvýšená fagocytóza závislá na protilátce (ADCP), zvýšená sekrece cytokinu, zvýšená absorpce antigenů buňkami prezentujícími antigen zprostředkovaná imunokomplexem, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na polymorfonukleární buňky (PMN), zvýšená vaznost na monocyty, zvýšené propojení protilátek vázaných cílem, zvýšená apoptóza indukovaná přímou signalizací, zvýšené dozrávání dendritických buněk a zvýšené zásobení T-buňkami. Zvýšená afinita navázání receptoru Fc je ve výhodném provedení zvýšené navázání na receptory aktivující Fc, nejvýhodněji FcyRII la. Vynález je dále veden na fragmenty protilátky obsahující oblast Fc a fúzní proteiny, které obsahují oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Takové fragmenty protilátky a fúzní proteiny vykazují zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc a/nebo zvýšenou efektorovou funkci.
Předmětný vynález je dále veden na farmaceutické kompozice obsahující protilátky, fragmenty protilátek udržující i oblast Fc a fúzní proteiny mající oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu podle předmětného vynálezu a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
Předmětný vynález je dále veden na použití takových farmaceutických kompozic ve způsobech léčení rakoviny. Předmětný vynález je specificky veden na způsob léčení rakoviny obsahující podání terapeuticky účinného množství farmaceutické kompozice podle vynálezu.
Předmětný vynález je také veden na hostitelskou buňku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidů; a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manll).Ve výhodných provedeních molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a nukleová kyselina kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou na tomtéž nebo oddělených expresních vektorech. V jiném výhodném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu • ··
4 4
4
4
4 • 94 4444 ·· ·*·· • · · * · · • · · · • · φ ·· «
9449
4 4
4 944
4 4
4 4
944
GnTIII. V dalším výhodném provedení je Golgiho lokalizační doména lokalizační doména Manil, β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II, manózidázy I nebo a-1,6-N jaderné fukózyltransferázy. V dalším výhodném provedení je hostitelská buňka vybraná ze skupiny, skládající se ze savčí buňky, kvasinky, hmyzí buňky a rostlinné buňky. Hostitelská buňka je výhodně buňka CHO, BHK, NSO, SP2/0, buóka myelomu YO, buóka myšího myelomu P3X63, buóka PER, PER.C6 nebo hybridomová buóka.
Vynález dále poskytuje hostitelskou bučku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu, a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manil) a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,2)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy II (GnTII). Ve výhodných provedeních je molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném nebo oddělených expresních vektorech. Rovněž výhodné je to, že molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném expresním vektoru. Rovněž výhodné je to, že molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném expresním vektoru. V jiném provedení je molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil jsou na stejném expresním vektoru.
V dalším aspektu je vynález veden na hostitelskou buňku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy (GalT) obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu; a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manll).Ve výhodných provedeních molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a nukleová kyselina kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou na tomtéž nebo oddělených expresních vektorech. Fúzní polypeptid výhodně obsahuje katalytickou doménu GalT. V dalším provedení je Golgiho lokalizační doména lokalizační doména Manil, p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, φφ φφφφ φ φ • φφφ
ΦΦ ···· • Φ • · φ φφ φ » φ • · φ · φ φ φφφ φ φ φφφφ φ φφφ φφ φφ φ • Φ · φφφ φφφφ φφ φφφ
P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II, manózidázy I nebo α-1,6-Ν jaderné fukózyltransferázy. Ve výhodném provedení je hostitelská buňka vybraná ze skupiny, skládající se ze savčí buňky, kvasinky, hmyzí buňky a rostlinné buňky. Hostitelská buňka je výhodně buňka CHO, BHK, NSO, SP2/0, budka myelomu YO, buóka myšího myelomu P3X63, buóka PER, PER.C6 nebo hybridomová buóka.
V dalším aspektu je vynález veden na hostitelskou buóku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy (GalT) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu; a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manil); a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde polypeptid má aktivitu β(1,2)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy II (GnTII). Výhodně je každá nukleová kyselina na stejném expresním vektoru. V odděleném provedení je každá nukleová kyselina na oddělených expresních vektorech. Vynález dále poskytuje to, že molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném expresním vektoru. Vynález také poskytuje to, že molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném expresním vektoru. Vynález také poskytuje to, molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil jsou na stejném expresním vektoru. V dalším výhodném provedení je Golgiho lokalizační doména lokalizační doména Manil, p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II, manózidázy I nebo a-1,6-N jaderné fukózyltransferázy.
Vynález dále poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GnTIII, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
Vynález také poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu • 9999
9
9 • ·· ·· ···* ·· · · 9 9 9 • · « · 999
9 9 9 9 9
9 9 9 9
999 9999 9 9 9 99 nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
V odděleném provedení vynález poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou výhodně vykazuje zvýšenou vazebnou afinitu receptorů Fc jako výsledek modifikace. V dalším výhodném provedení polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou vykazuje zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek modifikace. Zvýšená efektorová funkce je výhodně jedno nebo více z následujícího: zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na polymorfonukleární buňky (PMN), zvýšená vaznost na monocyty, zvýšené propojení protilátek vázaných cílem, zvýšená apoptóza indukovaná přímou signalizací, zvýšené dozrávání dendritických buněk a/nebo zvýšené zásobení T-buňkami.
V dalším provedení je vynález veden na způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, obsahující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GnTIII a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a izolaci polypeptidu. Hostitelská buňka je dále výhodně sestrojena tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII. V dalším výhodném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu GnTIII. V dalším výhodném provedení fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. Golgiho lokalizační doména lokalizační je výhodně lokalizační doména Manil, P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, p(1,2)-N~acetylglukózaminyltransferázy II,
·· 999 · • 9 9
9 999
9 9
9 9
999 ·· • · ···· manózidázy I nebo α-1,6-Ν jaderné fukózyltransferázy. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má výhodně zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek uvedené modifikace.
Vynález je dále veden na způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, obsahující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a izolaci polypeptidu. V dalším provedení je hostitelská buňka dále sestrojena tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII. V dalším výhodném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu GalT. V dalším výhodném provedení fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. Golgiho lokalizační doména lokalizační je výhodně lokalizační doména manózidázy II, p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II, manózidázy I nebo a-1,6-N jaderné fukózyltransferázy. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má výhodně zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek uvedené modifikace. Specificky ve výhodném provedení polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšený podíl rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu. Rozdělené nefukózylované oligosacharidy jsou výhodně hybridní. Rozdělené nefukózylované oligosacharidy jsou ještě výhodněji komplexní. Ve výhodném provedení je alespoň 10 % až 95 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu rozdělených nefukózylovaných. Zvláště výhodné je to, že asi 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu se sestrojenou glykozylací podle předmětného vynálezu je rozdělených nefukózylovaných.
V dalším výhodném provedení předmětný vynález poskytuje to, že protilátky sestrojené podle způsobů předmětného vynálezu mají zvýšenou efektorovou funkci.
V dalším výhodném provedení předmětný vynález dále poskytuje farmaceutické kompozice obsahující protilátky sestrojené podle způsobů předmětného vynálezu. Farmaceutické kompozice podle předmětného vynálezu výhodně obsahují farmaceuticky přijatelný nosič.
Vynález dále poskytuje způsob léčení rakovinných nádorů obsahující podání terapeuticky účinného množství farmaceutických kompozic podle předmětného vynálezu pacientovi v případě potřeby.
• 9 9 99 9 ♦ 9
9 99 • ·· ·« ««·· • φ · • · · • · · 9 • 9 · ·· · ·
• 4 ···· • · · • · · ·· ···
Vynález je dále veden na způsob produkce polypeptidu majícího zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc v hostitelské buňce, obsahující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzni polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde úroveň exprese jedné nebo obou z GalT a Manil je postačující pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou a polypeptid má zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc jako výsledek modifikace; a izolaci polypeptidu majícího zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc. V dalším výhodném provedení úroveň exprese GalT produkuje molekulu protilátky nebo fragment protilátky, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu mající zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc.
Vynález je dále veden na způsob produkce polypeptidu majícího zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc v hostitelské buňce, obsahující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzni polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde úroveň exprese jedné nebo obou z GalT a Manil je postačující pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou a polypeptid má zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc jako výsledek modifikace; a izolaci polypeptidu majícího zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc. Ve výhodném provedení hostitelská buňka dále obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující GnTIII, kde GnTIII je exprimována v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou a kde polypeptid má zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc jako výsledek modifikace. Úroveň exprese jedné nebo více z GalT, Manil nebo GnTIII je výhodně postačující pro tvorbu rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu. Ještě výhodněji je podíl rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc k celkovým oligosacharidům v oblasti Fc alespoň asi 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 nebo 95 %. Výhodně je podíl rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc k celkovým oligosacharidům v oblastí Fc alespoň 45 %. Ve výhodném provedení jsou rozdělené oligosacharidy komplexní nebo hybridní. Hostitelská buňka je výhodně savčí buňka, kvasinka, hmyzí buňka nebo rostlinná buňka. Ještě výhodněji je hostitelská buňka rostlinná buňka.
• 4 ···· • ·· • · ···«
• « · ·· · · • • •
• • · • · • • • ··
• • · • · • « •
·« • ··· ···· • * ···
V jiném aspektu je předmětný vynález veden na způsob produkce polypeptidů v hostitelské buňce, obsahující:
a. kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidů vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid mající aktivitu manózidázy II je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou;
b. a izolaci polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou.
Předmětný vynález je také veden na polypeptidy, zejména protilátky, které mají zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vaznost na receptor Fc jako výsledek modifikovaných oligosacharidů stejně jako jejích použití v terapeutických kompozicích pro léčení nemocí, zejména nádorů.
Identifikace a generování nukleových kyselin kódujících protein, pro který je požadována modifikace glykozylačního modelu
Předmětný vynález poskytuje způsoby generování a použití systémů hostitelských buněk pro produkci glykoforem protilátek, fragmentů protilátek obsahujících oblast Fc a fúzních proteinů, které obsahují oblast ekvivalentní oblasti Fc , mající zvýšenou vazebnou afinitu na receptor Fc, výhodně na receptory aktivující Fc, a/nebo zvýšené efektorové funkce, včetně buněčné cytotoxicity závislé na protilátce. Identifikace cílových epitopů a generování protilátek majících potenciální terapeutickou hodnotu, pro které se požaduje modifikace glykozylačního modelu, a izolace příslušných kódujících sekvencí nukleových kyselin je v rámci vynálezu.
Různé procedury známé ve stavu techniky se mohou použít pro produkci protilátek na cílové epitopy zájmu. Takové protilátky zahrnují, ale nejsou tím omezeny, polyklonální, monoklonální, chimérní, humanizované, plně lidské, jednořetězcové, fragmenty Fab a fragmenty produkované ScFv, Fab, VH, expresní knihovnou IgG. Takové protilátky mohou být užitečné, tj. jako diagnostická nebo terapeutická činidla. Jako terapeutická činidla, neutralizující protilátky, tj. které soutěží o vazbu s ligandem, substrátem nebo molekulou adaptéru, jsou zvláště předmětem zájmu.
Pro produkci protilátek se imunizují různá hostitelská zvířata injekcí cílového proteinu předmětu zájmu včetně, ale ne tímto omezeno, králíků, myší, krys atd.. Polyklonální protilátky se mohou získat ve zvířatech více subkutánními (sc) nebo intraperitonálními (ip) ·· ···· ·· • ·· ·· ···** ·· · · · · · • · t · ··· • · · · · · • · · · · ··«···· ·· ··· injekcemi odpovídajícího antigenu a přídavné látky. Pro zvýšení imunologické odpovědi se mohou použít různé přídavné látky v závislosti na hostitelském druhu, včetně, ale ne tímto omezeno, Freundovo adjuvans (kompletního nebo nekompletního), minerální gely jako hydroxid hlinitý, povrchově aktivní látky jako lysolecitin, pluronní polyoly, poiyanionty, peptidy, saponin, olejové emulze, hemocyanin, dinitrofenol, a potenciálně užitečné lidské adjuvans jako BCG (bacil Calmet-Guerin) a Corynebacteríum parvum. Zvířata se imunizují proti antigenu, imunogenním konjugátům nebo derivátům kombinováním 100 g nebo 5 g proteinu nebo konjugátu (jednotlivě pro králíky nebo myši) ve 3 objemech Frendova kompletního adjuvans a injekcí roztoku intradermálně na více místech. O měsíc později se zvířata oživí 1/5 až 1/10 původního množství peptidu nebo konjugátu ve Freundově adjuvans subkutánní injekcí na více místech. O 7 až 14 dní později se zvířatům odebere krev a sérum se zkoumá na titr protilátky. Zvířata se oživují, dokud se titr neustálí. Výhodně je zvíře oživeno konjugátem téhož antigenu, ale konjugovaným na odlišný protein a/nebo prostřednictvím jiného zesíťujícího reagens. Konjugáty se také mohou dělat vrekombinantní buněčné kultuře jako proteinové fúze.
Monoklonální protilátky proti zajímavému cíli se mohou připravit s použitímm jakékoliv techniky, která poskytuje produkci molekul protilátky kontinuálními buněčnými liniemi v kultuře. Ty zahrnují, ale nejsou tím omezeny, hybridomovou techniku původně popsanou Kohlerem a Milsteinem, Nátuře 256 : 495-97 (1975), lidskou hybridomovou techniku B-buněk (Kosbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cote et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026-30 (1983) hybridomovou techniku EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77-96 (Alan R. Liss, lne., 1985) ). Navíc se mohou použít techniky pro produkci chimérních protilátek (Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81 : 6851-55 (1984); Neubergeretal., Nátuře 312 : 604-08 (1984); Takeda et al., Nátuře 314: 452-54 (1985) svázáním genů z molekuly myší protilátky vhodné antigenní specificity společně s geny z molekuly lidské protilátky vhodné antigenní specificity. Tyto techniky se rovněž mohou použít pro produkci chimérních protilátek složených z molekul protilátek ostatních savců. Elternativně techniky popsané pro produkci jednořetězcových protilátek (US patent 4 946 778) se mohou adaptovat pro produkci jednořetězcových protilátek majících požadovanou specificitu. Vynález je dále veden na humanizované protilátky, které mají sestrojené glykosidy, podle způsobů předmětného vynálezu. Techniky pro generování humanizovaných protilátek jsou popsány například v US patentu 6 180 320 Qeenem et al., jehož celý obsah je zde začleněn ve své úplnosti.
Fragmenty protilátek, které obsahují specifická vazebná místa zajímavých cílových proteinů se mohou generovat známými technikami. Takové fragmenty například zahrnují, ale nejsou tím omezeny, fragmenty F(ab‘)2, které se mohou produkovat rozložením molekuly ·· ···· * «· ·» ···· ·· · ···· ··· • · · · · · · ··· • · · · · «··· · • · · ·· · · · ·· · ·»· ··»· ·· ··· protilátky pepsinem a fragmenty Fab, které se mohou generovat redukcí disulfidických můstků fragmentů F(ab‘)2- Expresní knihovny Fab se mohou alternativně konstruovat (Huse et al., Science 246: 1275-81 (1989), aby se umožnila rychlá a snadná identifikace monoklonálních fragmentů Fab s požadovanou specificitou k cílovému proteinu.
Jestliže se pro protilátku nebo fragment protilátky identifikovalo, pro kterou modifikaci glykozylačního modelu je určena, je identifikována kódující sekvence nukleové kyseliny a izoluje se použitím technik dobře známých ve stavu techniky.
a. Generování buněčných linií pro produkci proteinů se změněným qlykozylačním modelem
Předmětný vynález poskytuje expresní systémy hostitelských buněk pro generování buněčných linií majících modifikované glykozylační modely. Předmětný vynález poskytuje zejména systémy hostitelských buněk pro generování glykoforem proteinů majících zvýšenou terapeutickou hodnotu. Proto v jednom aspektu poskytuje vynález expresní systémy hostitelských buněk vybraných nebo sestrojených tak, aby exprimovaly fúzní polypeptid mající aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. Takové expresní systémy hostitelských buněk se mohou sestrojit tak, aby obsahovaly molekulu rekombinantní nukleové kyseliny kódující takový fúzní polypeptid, operativně připojený ke kostitutivnímu nebo regulovanému systému promotoru. V jednom specifickém provedení poskytuje předmětný vynález hostitelskou buňku, která je sestrojená tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Ν-acetylglukózamínyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. V jednom aspektu je hostitelská buňka sestrojená s molekulou nukleové kyseliny obsahující alespoň jeden gen kódující fúzní polypeptid mající aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyítransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu.
Jakýkoliv typ kultivovaných buněčných linií se může obecně použít jako základ pro sestrojení hostitelských buněčných linií podle předmětného vynálezu. Ve výhodném provedení se použijí buňky CHO, BHK, NSO, SP2/0, buóky myelomu YO, buóky myšího myelomu P3X63, buóky PER, PER.C6 nebo hybridomové buóky, jiné savčí buňky, kvasinky, hmyzí buňky nebo rostlinné buňky jako základní buněčné linie pro generování sestrojených buněčných linií podle vynálezu. (Viz Ma, J. K.-C., et al., Nátuře Genetics 4:794-805 (říjen 2003) a reference tam citované) (jejichž celý obsah je tímto včleněn coby reference).
Vynález je zamýšlen tak, aby zahrnoval jakékoliv sestrojené hostitelské buňky exprimující fúzní polypeptid mající aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIH) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidů, jak je definován zde.
Jedna nebo několik nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptid mající aktivitu P(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy lil (GnTIH) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidů se může exprimovat pod kontrolou konstitutivního promotoru, nebo alternativně regulovaného expresního systému. Vhodný regulovaný expresní systém zahrnuje, ale není tím omezen, expresní systém regulovaný tetracyklinem, expresní systém indukovatelný ekdosynem, expresní systém lac-switch, expresní systém indukovatelný glukokortikoidem, promotorový systém indukovatelný teplotou, a expresní systém indukovatelný kovovým metalothieninem. Jestliže v systému hostitelské buňky je obsaženo několik různých nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptidy mající aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy lil (GnTIH) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidů, některé z nich se mohou exprimovat pod kontrolou konstitutivního promotoru, zatímco jiné se exprimují pod kontrolou regulovaného promotoru.Maximální úroveň exprese se považuje za nejvyšší možnou úroveň stabilní exprese fúzního polypeptidů, která nemá podstatný nepříznivý efekt na poměr růstu buněk, a určí se rutinním experimentem. Úrovně exprese se určují metodami obecně známými ve stavu techniky, včetně analýzy Western blot s použitím protilátky specifické pro polypeptid mající aktivitu GnTIH nebo protilátky specifické pro peptidový přívěsek připojený k polypeptidů majícím aktivitu GnTIH, analýzy Northern blot s použitím sondy nukleové kyseliny specifické pro gen kódující polypeptid mající aktivitu GnTIH nebo sondy nukleové kyseliny specifické pro nukleovou kyselinu kódující peptidový přívěsek připojený k polypeptidů majícím aktivitu GnTIH, nebo měřením aktivity GnTIH. Alternativně se může použít lecitin, který selektivně váže biosyntetické produkty GnTIH, například lecitin E4-PHA. Alternativně se může použít funkční stanovení, které měří zvýšenou vaznost Fc nebo zvýšenou efektorovou funkci zprostředkovanou protilátkami produkovanými buňkami sestrojenými s nukleovou kyselinou kódující polypeptid s aktivitou GnTIH. V další alternativě se může nukleová kyselina operativně připojit k reportérovému genu; hodnoty exprese genu majícího aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy lil (GnTIH) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidů se určují měřením signálu korelovaného s expresní hodnotou reportérového genu. Reportérovy gen se může transkribovat společně s nukleovou kyselinou (kyselinami) kódující fúzní polypeptid jako jednoduchá molekula mRNA; její jednotlivé kódující sekvence mohou být připojeny buď interním ribozomálním vstupním místem (IRES) nebo zesilovačem translace nezávislém na uzávěru (CITE). Reportérový gen se může přepisovat společně s alespoň jednou nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid mající aktivitu 3(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu takovou, že se tvoří jednoduchý řetězec polypeptidu. Nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptidy podle předmětného vynálezu mohou být operativně připojeny k reportérovému genu pod kontrolou jednoho promotoru tak, že nukleová kyselina kódující fúzní polypeptid a reportérový gen jsou transkribovány do molekuly RNA, která je popřípadě svázána do dvou separátních molekul messenger RNA (mRNA); jedna z výsledných mRNA je transkribována do reportérového proteinu, a druhá je transkribována do fúzního polypeptidu.
Jestliže je exprimováno několik různých nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptid mající aktivitu 3(1,4)-N-acetylglukózamínyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu, mohou být sestaveny takovým způsobem, že jsou transkribovány jako jedna nebo několik molekul mRNA. Jestliže jsou transkribovány jako jedna molekula mRNA, jejich jednotlivé kódující sekvence mohou být spojeny buď interním ribozomálním vstupním místem (IRES) nebo zesilovačem translace nezávislém na uzávěru (CITE). Mohou být transkribovány z jednoho promotoru do molekuly RNA, která je popřípadě svázaná do několika oddělených molekul messenger RNA (mRNA), které jsou poté transkribovány do jejich příslušně kódovaných fúzních polypeptidů.
V jiných provedeních poskytuje předmětný vynález expresní systémy hostitelských buněk pro generování terapeutických protilátek, majících zvýšenou afinitu receptoru Fc, zvláště vázajících se k aktivačním receptorům Fc, a zvýšenou efektorovou funkci, včetně buněčné cytotoxicity závislé na protilátce. Expresní systémy hostitelských buněk byly obecně sestrojeny a/nebo vybrány, aby exprimovaly nukleové kyseliny kódující protilátku, pro kterou je vyžadována pozměněná glykoforma, vedle alespoň jedné nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid mající aktivitu 3(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. V jednom provedení je systém hostitelských buněk transfekován alespoň jednou nukleovou kyselinou kódující takový fúzní polypeptid. Typicky jsou transfekované buňky vybrány tak, aby se identifikovaly a izolovaly klony, které stabilně exprimují fúzní polypeptidy podle vynálezu.
Jako podklad pro sestrojení linií hostitelských buněk podle předmětného vynálezu se může použít jakýkoliv typ kultivované buněčné linie. Ve výhodném provedení se mohou použít buňky CHO, BHK, NSO, SP2/0, buóky myelomu YO, buóky myšího myelomu P3X63, buóky PER, PER.C6 nebo hybridomové buóky, jiné savčí buňky, kvasinky, hmyzí buňky a rostlinné buňky. Takové buněčné linie jsou typicky sestrojeny tak, aby dále obsahovaly ·· ··· · • · ·· ···· · · · • · · · · · · • · · · · • · · · · • · · ······· alespoň jednu transfekovanou nukleovou kyselinu kódující celou molekulu protilátky, fragment protilátky obsahující oblast Fc imunoglobulinu, nebo fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Takové buněčné linie produkující protilátku jsou typicky odvozeny z klonů produkujících a vylučujících protilátku při vysokých specifických produktivitách v rozsahu 20 až 120 pg/(buňka.den). V alternativním provedení se použije hybridomová buněčná linie eprimující jednotlivou protilátku, která je předmětem zájmu, jako podkladová buněčná linie pro generování hostitelských buněčných linií podle vynálezu.
V jednom provedení nukleové kyseliny kódující protilátku, fragment protilátky nebo fúzní polypeptid Fc se klonují do vektorů exprimujících protilátku a poté se transfekují do hostitelských buněčných linií a selektují se a zkoumají buněčné klony na vysokou stabilní specifickou produkcí protilátky. Takové selektované klony se poté transfekují expresním vektorem glykosyltransferázy modifikující glykoprotein obsahujícím například (a) fúzní polypeptid s aktivitou p(1,4)-N-acetylglukózamínyltransferázy lil (GnTIII), nebo (b) fúzní polypeptid s aktivitou β(1,4)-N-galaktózyltransferázy (GalT), nebo (c) fúzní polypeptid s aktivitou Golgiho α-manózidázy II (Manil), nebo (c) fúzní polypeptid s aktivitou GnTIII a další polypeptid s aktivitou Manil, nebo (e) fúzní polypeptid s aktivitou GalT a další polypeptid s aktivitou Manil. Klony se poté selektují a zkoumají na stabilní expresi genů kódujících protilátku při úrovních vedoucích k vysokým produktivitám specifickým k protilátce, a se stabilní expresí genů glykosyltranferázy modifikující glykoprotein při expresních úrovních vedoucích modifikaci glykozylačního modelu oblasti Fc, včetně zvýšení podílu frakce nefukózylovaných oligosacharidů, které mohou být rozdělené nebo nerozdělené a které dále mohou být komplexního nebo hybridního typu, který je spojen se zvýšením vaznosti receptoru Fc, zejména zvýšením vazebné afinity Fc-FcyRIII, a zvýšením efektorových funkcí zprostředkovaných receptorem Fc, včetně, ale ne tímto omezeno, buněčné cytotoxicity závislé na Fc. Způsoby selekce a zkoumání jsou popsány níže.
V jiném provedení se obrátí pořadí dvou transfekcí popsaných výše, jmenovitě transfekce expresních vektorů protilátky a transfekce expresních vektorů glykosyltranferázy modifikující glykoprotein, tj. hostitelské buňky se nejprve transfekují expresními vektory glykosyltranferázy modifikující glykoprotein a poté expresními vektory protilátky. Při takovém přístupu se klony z první transfekce mohou prověřit na přiměřeně stabilní úroveň exprese genů glykosyltransferázy jakoukoliv metodou popsanou níže, nebo se alternativně transientně transfekují replikáty takovýchto klonů expresními vektory protilátky a poté se aplikují zkušební metody popsané dále, aby se identifikovaly klony se stabilní úrovní exprese genů glykosyltransferázy při úrovních vedoucích k modifikaci glykosylačního modelu oblasti Fc a ke zvýšení na receptoru Fc, včetně receptoru FcyRIII, vazebné afinity a zvýšení • · · · φ φ
ΦΦ φφφφ · ·· • · · φ · · · • · · · φ efektorových funkcí zprostředkovaných receptorem, včetně celulární cytotoxicity závislé na
Fc.
V dalším provedení se geny kódující protilátky a geny glykosyltranferázy transfekují společně v jednom kroku transfekce, buď v jednom expresním vektoru nebo v oddělených vektorech.
Alespoň jedna nukleová kyselina v sytému hostitelské buňky typicky kóduje fúzní polypeptid s aktivitou P(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII), nebo popřípadě fúzní polypeptid s aktivitou β(1,4)-N-galaktózyltransferázy, a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu, nebo popřípadě kóduje polypeptid s aktivitou Golgiho α-manózidázy II.
Jedna nebo několik nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptid podle vynálezu se může exprimovat za řízení konstitutivním promotorem, nebo popřípadě regulovaným expresním systémem. Vhodné regulované expresní systémy zahrnují, ale nejsou tím omezeny, expresní systém regulovaný tetracyklinem, expresní systém indukovatelný ekdysonem, expresní systém lac-switch, expresní systém indukovatelný glukokortikoidem, promotorový systém indukovatelný teplotou a metalothieninový expresní systém indukovatelný kovem. Jestliže v systému hostitelské buňky je obsaženo několik nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptid s aktivitou p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahujících Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu, některé z nich se mohou exprimovat za řízení konstitutivním promotorem, zatímco jiné se exprimují za řízení regulovaným promotorem. Za maximální úroveň exprese se považuje nejvyšší možná hodnota stabilní exprese fúzního polypeptidu, která nemá podstatný nepříznivý vliv na poměr růstu buněk, a určuje se s použitím rutinních pokusů. Úrovně exprese se určují způsoby obecně známými ve stavu techniky, včetně použití analýzy Western blot, tj. protilátkové specifické vůči polypeptidu majícím aktivitu GnTIII nebo protilátkové specifické vůči peptidovému přívěsku připojeném k polypeptidu majícímu aktivitu GnTIII, analýzy Northern blot používající sondu nukleové kyseliny specifickou pro nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTIII nebo sondu nukleové kyseliny kódující specifickou pro nukleovou kyselinu kódující peptidový přívěsek připojený k polypeptidu majícímu aktivitu GnTIII, nebo měřením enzymatické aktivity GnTIII. Popřípadě se může použít lektin, který se váže na biosyntetické produkty GnTIII, například lektin E4-PHA. Popřípadě se může použít funkční stanovení, které měří zvýšenou vaznost receptorů Fc nebo zvýšenou zprostředkovanou protilátkami produkovanými buňkami sestrojenými s nukleovou kyselinou kódující polypeptid s aktivitou GnTIII. V další alternativě může být nukleová kyselina operativně připojena k reportérovému genu; úrovně exprese fúzního polypeptidu podle vynálezu se určují měřením signálu korelovaného s úrovní exprese ···· • · · • · · • · 9 9 99
9 9 99 reportérového genu. Reportérový gen se může transkribovat společně s nukleovou kyselinou nebo kyselinami kódující glykosyltransferázu modifikující glykoprotein jako jedna molekula mRNA; její příslušné kódovací sekvence se mohou spojit buď interním ribozomálním vstupním místem (IRES) nebo zesilovačem translace nezávislém na uzávěru (CITE). Reportérový gen se může přepisovat společně s alespoň jednou nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid mající aktivitu p(1,4)-N-acetylgiukózaminyltransferázy lil (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidů takovou, že se tvoří jednoduchý řetězec polypeptidů. Nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptidy podle předmětného vynálezu mohou být operativně připojeny k reportérovému genu pod kontrolou jednoho promotoru tak, že nukleová kyselina kódující fúzní polypeptid a reportérový gen jsou transkribovány do molekuly RNA, která je popřípadě svázána do dvou separátních molekul messenger RNA (mRNA); jedna z výsledných mRNA je transkribována do reportérového proteinu, a druhá je transkribována do fúzního polypeptidů.
Jestliže je exprimováno několik různých nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptid mající aktivitu 3(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidů, mohou být sestaveny takovým způsobem, že jsou transkribovány jako jedna nebo několik molekul mRNA. Jestliže jsou transkribovány jako jedna molekula mRNA, jejich jednotlivé kódující sekvence mohou být spojeny buď interním ribozomálním vstupním místem (IRES) nebo zesilovačem translace nezávislém na uzávěru (CITE). Mohou být transkribovány z jednoho promotoru do molekuly RNA, která je popřípadě svázaná do několika oddělených molekul messenger RNA (mRNA), které jsou poté transkribovány do jejich příslušně kódovaných fúzních polypeptidů.
i. Expresní systémy
Způsoby, které jsou dobře známy odborníkovi v oboru, se mohou použít pro konstrukci expresních vektorů obsahujících kódující sekvencí proteinu podle zájmu a kódující sekvenci fúzního polypeptidů majícího aktivitu P(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy lil (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidů společně s vhodnými transkripčními/translačními řídícími signály. Tyto způsoby zahrnují rekombinantní techniky DNA in vitro, syntetické techniky a rekombinantní/genetické techniky in vivo. Viz například techniky popsané v Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989) a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y (1989).
9999
9
999
9999
9 9
9 9
Pro expresi kódující sekvence proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvence fúzního polypeptidu podle předmětného vynálezu, se mohou použít různé systémy hostitel-expresní vektor. Výhodně se jako systémy hostitelských buněk použijí savčí buňky transfekované rekombinantní plazmidovou DNA nebo kosmidové expresní vektory DNA obsahující kódující sekvenci proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvenci fúzního polypeptidu. Nejvýhodněji se jako systém hostitelských buněk použijí bučky CHO, BHK, NSO, SP2/0, buóky myelomu YO, bučky myšího myelomu P3X63, bučky PER, PER.C6 nebo hybridomové bučky, kvasinky, hmyzí bučky eboa rostinné bučky. Nikteré poíklady expresních systémů a selekěních metod jsou popsány v v následujících referencích, a v referencích uvedených v nich: Borth et al., Biotechnol. Bioen. 71 (4):266-73 (2000-2001), v Werner et al.,Arzneimitteforschung/Drug Res.,. 48(8):870-80 (1998), v Andersen a Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), v Chadd a Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001), a v Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12:450-454 (2001). V alternativních provedeních se mohou uvažovat alternativní systémy eukaryotických hostitelských buněk, včetně kvasinek transformovaných kvasinkovými expresními vektory obsahujícími kódující sekvenci fúzního polypeptidu podle vynálezu; systémy hmyzích buněk infikované rekombinantními virovými expresními vektory (tj. baculovirem) obsahujícími kódující sekvenci proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvenci fúzního polypeptidu podle vynálezu; systémy rostlinných buněk infikované rekombinantními virovými expresními vektory (tj. virem mozaiky květáku, CaMV; virem tabákové mozaiky, TMV) nebo transformované rekombinantními plazmidovými expresními vektory (tj. plazmidem Ti) obsahujícími kódující sekvenci proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvenci fúzního polypeptidu podle vynálezu; nebo systémy savčích buněk infikované rekombinantními virovými expresními vektory (adenovirem, virem kravských neštovic) včetně buněčných linií sestrojených tak, aby obsahovaly více kopií DNA kódujících protein, který je předmětem zájmu, a kódujících sekvenci fúzního polypeptidu podle vynálezu buď stabilně amplifikovaných (CHO/dhfr), nebo nestabilně amplifikovaných v dvojitých drobných chromozómech (tj. myší buněčné linie).
Pro způsoby podle tohoto vynálezu je obecně dávávána přednost stabilní expresi před přechodnou expresí, protože ta typicky dosahuje reprodukovatelnějších výsledků a je přístupnější pro produkci ve velkém měřítku, tj. produkci protilátek podle předmětného vynálezu se sestrojenými glykosidy v buněčných liniích produkčního měřítka. Spíše než použití expresních vektorů, které obsahují replikace virového původu, se mohou hostitelské buňky transformovat odpovídající kódující nukleovou kyselinou řízenou vhodnými expresními řídícími prvky (tj. promotory, enhancery, sekvence, terminátory transkripce, polyadenylační místa atd.), a selektovatelné markéry. Po zavedení cizí DNA se sestrojené buňky nechají
•9 9999 9 99 99 9 9 9999 9 99·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 99* 999 9 9 9 9 99
růst 1-2 dny v obohaceném médiu, a potom se přenesou do selektivního média. Selektovatelný markér v rekombinantním plazmidu udělí odolnost k selekci a dovolí selekci buněk, které mají plazmid stabilně integrován do svých chromozómů a růst, aby vznikla ohniska, která se naopak mohou klonovat a rozšiřovat do buněčných linií.
Může se použít množství selekčních systémů, včetně, ale není tím omezeno, geny thymidinkinázy viru herpes simplex, (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferázy (Szybalska & Szybalski, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), a adenin-fosforibosyltransferázy (Lowy et al.,Cell 22:817 (1980)), které se mohou použít v buňkách tk, hgprt nebo aprt. Také se může použít genů rezistence k antimetabolitům jako základ pro selekci pro dhfr, který uděluje rezistenci k methotrexátu (Wigler et al., Nati. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); 0'Hare et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527(1981)); pro gpt, který uděluje rezistenci ke kyselině mykofenolové (Mulligan & Berg, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)) ; pro neo, který uděluje rezistenci k aminoglykosidu G-418 (ColberreGarapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); a pro hygro, který uděluje rezistenci k hygromycinu (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). V současnosti byly popsány další selektovatelné geny, jmenovitě trpB, který dovoluje buňkám využít indol namísto tryptofanu; hisD, který dovoluje buňkám využít histinol místo histidinu (Hartman & Mulligan, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); systém glutaminsyntázy; a ODC (ornithindekarboxyláza) která uděluje rezistenci k inhibitoru ornithindekarboxylázy, 2-(difluormethyl)-DL-ornithinu, DFMO (McConlogue, in : Current Comunications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)).
ii. Identifikace transfektantů nebo transformantů, které exprimují protein mající modifikovaný model glykozylace
Hostitelská buňka, která obsahuje kódující sekvenci, a která exprimuje biologicky aktivní genové produkty, by se měla identifikovat alespoň čtyřmi obecnými přístupy: (a) hybridizací DNA - DNA nebo DNA - RNA; (b) přítomností nebo absencí „markerových“ genových funkcí; (c) zhodnocením úrovně transkripce, jak je změřena expresí příslušných transkriptů mRNA v hostitelské buňce; a (d) detekcí genového produktu, jak je změřeno imunoassayí nebo jeho biologickou aktivitou.
V prvním přístupu se může přítomnost kódující sekvence proteinu podle zájmu a kódující sekvence fúzního polypeptidu podle vynálezu viožená do expresního vektoru detekovat hybridizací DNA - DNA nebo DNA - RNA s použitím sond obsahujících nukleotidové sekvence, které jsou homologní k příslušným kódujícím sekvencím, nebo jejich části nebo deriváty.
» ···· • * • ··· ··· ···· ·· ···
V druhém přístupu se může rekombinantní expresní vektor/hostitelský systém identifikovat a selektovat na základě přítomnosti nebo absence jistých „markerových“ genových funkcí (tj. aktivity thymidinkinázy, rezistence k antibiotikům, rezistence k methotrexátu, transformace fenotypu, okluzní tvorba těla baculoviru atd.). Například, jestliže kódující sekvence proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvence fúzního polypeptidu podle vynálezu se zavedou do sekvence markerového genu vektoru, rekombinanty obsahující příslušné kódující sekvence se mohou identifikovat absencí funkce markerového genu. Alternativně se může markerový gen umístit v tandemu s kódujícími sekvencemi pod kontrolu téhož nebo jiného promotoru, pro řízení exprese kódujících sekvencí. Exprese markéru v odpovědi na indukci nebo selekci indikuje expresi kódující sekvence fúzního polypeptidu.
Ve třetím přístupu se může transkripční aktivita pro kódující oblast proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvence fúzního polypeptidu podle vynálezu vyhodnotit hybridizačními stanoveními. Například se může izolovat RNA a analyzovat metodou Northern blot s použitím sondy homologní ke kódujícím sekvencím proteinu, který je předmětem zájmu, a kódujícím sekvencím fúzního polypeptidu podle vynálezu, nebo jeho jednotlivým částem. Alternativně se mohou extrahovat a analyzovat celkové nukleové kyseliny hostitelské buňky na hybridizaci k takovým sondám.
Ve čtvrtém přístupu se imunologicky vyhodnocuje exprese proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvence fúzního polypeptidu majícího aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahujícího Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu, například analýzou Western blot, imunoassayemi, jako je radioimunoprecipitace, imunoassayemi připojených enzymů a podobně. Rozhodující test úspěchu expresního systému však zahrnuje detekci biologicky aktivních genových produktů.
b. Generování a použití proteinů a proteinových fragmentů majících změněný glykozylační model
i. Generování a použití protilátek majících zvýšenou efektorovou funkcí včetně celulární cytotoxicity závislé na protilátce
Předmětný vynález poskytuje ve výhodných provedeních glykoformy protilátek a fragmenty protilátek majících zvýšenou vaznost receptorů Fc a/nebo efektorovou funkci včetně celulární cytotoxicity závislé na protilátce.
Klinické zkoušky nekonjugovaných monoklonálních protilátek (mAb) pro léčení některých typů rakoviny v současné době poskytly povzbudivé výsledky. Dillman, Cancer ···· • · • ··· • · · · • · • · • · •·· ···· ·· ···· • · · • · · ·· • · · ·· ·
Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Chimérní nekonjugovaý lgG1 byl schválen pro nízkostupňový nebo folikulární ne-Hodgkinsův lymfom B-buněk. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997), zatímco jiná nekonjugovaná mAb, humanizovaný lgG1 cílená na pevné nádory prsu, také ukázala slibné výsledky ve fázi III klinických zkoušek. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Antigeny těchto dvou mAb jsou vysoce exprimovány v jejich odpovídajících nádorových buňkách a protilátky zprostředkují mocnou destrukci tumoru efektorovými buňkami in vitro a in vivo. V protiladu k tomu mnoho jiných nekonjugovaných mAb s výbornými nádorovými specifitami nemohou spustit efektorové funkce dostatečné mohutnosti, aby byly klinicky užitečné. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). Pro některé z těchto měkčích mAb se v současnosti testuje dodatečná cytokinová terapie.přidání cytokinů může stimulovat celulární cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC) zvýšením aktivity a počtu obíhajících lymfocytů. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). ADCC, lýzní atak na buňky cílené protilátkou, je spouštěn přes navázání leukocytových receptorů na konstantní oblast (Fc) protilátek. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997).
Odlišný, ale komplementární přístup ke zvýšení aktivity ADCC nekonjugovaných lgG1 je sestrojení oblasti Fc protilátky. Studie sestrojování proteinů ukázaly, že FCyR interagují s oblastí spodního závěsu domény IgG CH2. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996). Avšak navázání FcyR také vyžaduje přítomnost oligosacharidů kovalentně připojených na zachovaný Asn 297 v oblasti CH2. . Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996); Wright a Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), navrhují, že buď oba, polysacharid a polypeptid, přímo přispívají k interakčnímu místu, nebo že je oligosacharid potřebný pro udržování aktivní konformace CH2. modifikace oligosacharidové struktury může pak být vysvětlena jako prostředek zvýšení afinity interakce.
Molekula IgG nese dva oligosacharidy připojené přes n v oblasti Fc, jeden na každém těžkém řetězci. Jako každý glykoprotein je protilátka produkována jako populace glykoforem, které sdílejí tutéž polypeptidovou páteř, ale mají různé oligosacharidy připojené ke glykozylačním místům. Oligosacharidy, které se normálně nacházejí v oblasti Fc sérového IgG jsou komplexního dvouvláknového typu (Wormald et al., Biochemistry 36:130-38 (1997)), s nízkou hladinou terminální kyseliny sialové a rozdělujícího N-acetylglukózaminu (GIcNAc), a s různým stupněm terminální galaktózylace a jádrové fukózylace. Některé studie navrhují, že minimální struktura karbohydrátu požadovaná pro navázání fcyR leží uvnitř oligosacharidového jádra. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996).
Buněčné linie odvozené od myší nebo křečků, používané v průmyslu a akademiích pro produkci nekonjugovaných mAb normálně připojují požadované oligosacharidové ·* ···· • · · • · ··· ·Φ·« • · · ·· ··· determinanty k místům Fc. IgG exprimované v těchto buněčných liniích však postrádají dělící GIcNAc, nalezený v malých množstvích v sérových IgG. Lifely et al., Glycobiology 318:81322 (1995).V kontrastu ktomu bylo v současné době pozorováno, že krysí humanizované lgG1 produkované myelomem (CAMPATH-1H) nesl v některých svých glykoformách dělící GIcNAc. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). Krysí protilátky odvozené z buněk dosáhly maximální aktivitu podobnou ADCC in vitro jako protilátky CAMPATH-1H produkované ve standardních buněčných liniích, ale podstatně nižší koncentrace protilátek.
Antigen CAMPATH je normálně přítomen ve vysokých hladinách v lymfomových buňkách, a tato chimérická mAb má vysokou aktivitu ADCC v nepřítomnosti dělícího GIcNAc. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995).Při glykozylační cestě připojením N je dělící GIcNAc přidán enzymem p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázou III (GnTIII). Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986).
Předešlé studie použily buněčné linie CHO produkující jednoduché protilátky, které byly předtím sestrojeny, aby exprimovaly externě regulovaným způsobem různé hladiny enzymu klonovaného genu GnTIII (Umana, P., et al., Nátuře Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Tento přístup ustanovil poprvé rigorózní korelaci mezi expresí GnTIII a aktivitou ADCC modifikované protilátky.
Další protilátky podle vynálezu, mající zvýšenou vazebnou afinitu Fc a zvýšenou efektorovou funkci, zahrnují, ale nejsou tím omezeny, protilidskou neuroblastomovou monoklonální protilátku (chCE7) produkovanou způsoby podle vynálezu, chimérní protilidskou monoklonální protilátku karcinomu ledvinových buněk (ch-G250) produkovanou způsoby podle vynálezu, humanizovanou monoklonální protilátku anti-HER2 (tj. Trastuzumab (HERCEPTIN)) produkovanou způsoby podle vynálezu, chimérní protilidskou monoklonální protilátku karcinomu tlustého střeva, plic a prsu (ING-1) produkovanou způsoby podle vynálezu, humanizovanou protilidskou monoklonální protilátku antigenu 17-1A (3622W94) produkovanou způsoby podle vynálezu, humanizovanou protilidskou monoklonální protilátku kolorektálního tumoru (A33) produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou protimelanomovou protilátku (R24) namířenou proti gangliosidu GD3 produkovanou způsoby podle vynálezu, a chimérní protilidskou monoklonální protilátku karcinomu buněk dlaždicového epitelu (SF-25) produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku karcinomu malých buněk plic (BEC2, ImCIone Systems, Merck KgaA) produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku ne-Hodgkinsova lymfomu (Bexxar (tositumomab, Coulter Pharmaceuticals), Oncolym (Techniclone, Alpha Therapeutic)), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku karcinomu squamous buněk hlavy a hrdla (C225, ImCIone Systems) produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku karcinomu ·* φφφφ φφ φ* φφφφ φ · · φφφφ φ « φ φφφ φ φφφ φφφ φφφ φ φ φφφφ φ φφφ φφ φφφ φφ φ φφφ φφφφ φφ φφφ konečníku a tlustého střeva (Panorex (edrecolomab), Centocor, Glaxo Wellcome), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku karcinomu vaječníku (Theragyn, Antisoma), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku karcinomu akutní myelogenní leukémie (SmartM195, Protein Design Labs, Kanebo), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku maligního gliomu (Cotara, Techniclone, Cambridge Antibody Technology), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku ne-Hodgkinsova lymfomů Bbuněk (IDEC-Y2B8, IDEC Pharmaceuticals), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku pevných tumorů (CEA-Cide, Immunomedics), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku kolorektálního karcinomu (lodíne 131-MN-14, Immunomedics), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku karcinomu vaječníku, ledvin, prsu a prostaty (MDX-210, Novartis) produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku kolorektálního a pankreasového karcinomu (TTMA, Pharmacie & Upjohn), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku karcinomu exprimujícího TAG-72 (MDX-447), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku anti-VEGF (Genentech), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku karcinomu prsu, plic, prostaty a pankreatu a maligního melanomu (BrevaRex, AltaRex), produkovanou způsoby podle vynálezu, protilidskou monoklonální protilátku akutní myelogenní leukémie (Monoclonal Antibody Conjugate, Immunex), produkovanou způsoby podle vynálezu. Navíc je vynález směrován na fragment protilátky a fúzní proteiny obsahující oblast, která je ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
ii. Generování a použití fúzních proteinů obsahujících oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, které podporují cytotoxicitu zprostředkovanou Fc
Jak je diskutováno výše, předmětný vynález se vztahuje ke způsobu zvýšení vazebné afinity receptoru Fc a/nebo efektorové funkce terapeutických protilátek. Toho se dosahuje sestrojením glykozylačního modelu oblasti Fc takových protilátek, zejména sestrojením buněk produkujících protilátku, aby produkovaly polypeptidy s aktivitou GnTIII nebo GalT, nebo aktivitou Manil, které modifikují oligosacharidy připojené k oblasti Fc takových protilátek. Tato strategie se může aplikovat pro zvýšení celulární cytotoxicity zprostředkované Fc proti nežádoucím buňkám zprostředkované jakoukoliv molekulou nesoucí oblast, která je ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, nejen terapeutickými protilátkami, vzhledem k tomu, že změny zavedené sestrojením glykozylace působí pouze na oblast Fc a proto její interakce s receptory Fc na povrchu efektorových buněk jsou
zahrnuty v mechanismu ADCC. Molekuly obsahující Fc, na ktré se mohou aplikovat současně uváděné metody se mohou aplikovat včetně, ale ne tímto omezeno, (a) na rozpustné fúzní proteiny vyrobené z cílící proteinové domény připojené k N-konci oblasti Fc (Chamov and Ashkenazi, Trends Biotech. 14:52 (1996) a (b) na fúzní proteiny zakotvené na plazmatické membráně vyrobené z transmembránové domény typu II, která lokalizuje na plazmatickou membránu, připojené na N-konec oblasti Fc (Stabila, P.F., Nátuře Biotech. 16:1357 (1998)).
V případě rozpustných fúzních proteinů (a) cílící doména směřuje navázání fúzního proteinu na nežádoucí buňky, jako jsou rakovinné buňky, tj. analogickým způsobem jako terapeutické protilátky. Aplikace nyní uvedeného způsobu na zvýšení efektorové funkce, včetně celulární cytotoxicity zprostředkované Fc, zprostředkované těmito molekulami, by proto mohlo být identické se způsobem aplikovaným na terapeutické protilátky.
V případě fúzních proteinů zakotvených na membránu (b) musí nežádoucí buňky exprimovat gen kódující fúzní protein. Toho se může dosáhnout buď přístupy genové terapie, tj. transfekováním buněk in vivo plazmidovým nebo virovým vektorem, který směruje expresi genu kódujícího fúzní protein na nežádoucí buňky, nebo implantací buněk geneticky sestrojených, aby exprimovaly fúzní protein na svém povrchu, do těla. Druhé buňky se mohou normálně implantovat do těla uvnitř polymerní kapsle (buněčná terapie v kapslích), kde nemohou být zničeny mechanismem celulární cytotoxicity zprostředkované Fc. Když uzavření v kapsli může selhat a uvolněné buňky se stanou nežádoucí, pak mohou být eliminovány celulární cytotoxicitou zprostředkovanou Fc. (Stabila, P.F., Nátuře Biotech. 16:1357 (1998)). V tomto případě by se nyní uvedený způsob aplikoval buď zavedením další genové expresní kazety směrující adekvátní nebo maximální úrovně exprese fúzního polypeptidů podle vynálezu do vektoru genové terapie, nebo sestrojením buněk pro implantaci, aby exprimovaly adekvátní nebo maximální úroveň fúzního polypeptidů podle vynálezu.
Terapeutické aplikace protilátek, fragmentů protilátek a fúzních polypeptidů vyrobených podle způsobů vynálezu
Protilátky (tj. protilátky, fragmenty protilátek a fúzní proteiny obsahující oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu) podle předmětného vynálezu se mohou použít samostatně na zacílení a zabití nádorových buněk in vivo. Protilátky se také mohou použít ve spojení s vhodným terapeutickým činidlem pro léčení lidského karcinomu. Protilátky se mohou například použít v kombinaci se standardními nebo konvenčními léčebnými metodami, jako je chemoterapie, radiační terapie, nebo se mohou načasovat nebo spojit s léčivými drogami nebo toxiny, stejně jako s lymfokiny nebo faktory inhibice růstu tumoru pro podání terapeutického činidla do místa karcinomu.
Techniky pro časování takových terapeutických činidel k protilátkám jsou dobře známy [viz Amon et al. /'Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (vyd.), str. 243-56 (Alan R. Liss, lne. 1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, v Controlled Drug Delivery (2. vyd.), Robinson et al. (vyd.), str. 623-53 (Marcel Dekker, lne. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents ln Cancer Therapy: A Review, v Monoclonal Antibodies'84 : Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (vyd.), str. 475-506 (1985); a Thorpe et al., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)].
Protilátka se sestrojenými glykosidy se může alternativně spojovat s ozářením paprsky o vysoké energii , tj. radioizotopem jako 131J, který, je-li lokalizován v místě nádoru, vede k zabití několika průměrů buněk [viz Order, Analysis, Results, and Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (vyd.), str. 303-16 (Academie Press 1985)]. Podle ještě jiného provedení se mohou protilátky podle vynálezu konjugovat s druhou protilátkou, aby se vytvořil heterokonjugát protilátky pro léčení nádorových buněk, jak je popsáno Segalem v US patentu 4 676 980.
Ještě jiné léčebné aplikace protilátek podle vynálezu zahrnují konjugaci nebo připojení rekombinantními technikami DNA k enzymu schopnému konverze proléčiva na cytotoxické léčivo a použití tohoto konjugátu protilátka - enzym v kombinaci s proléčivem pro konverzi proléčiva na cytotoxické činidlo na místě nádoru [viz Senter et al.,Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:4842-46 (1988); Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates, Cancer Research 49:5789-5792 (1989); a Senter, Activation of Prodrugs by AntibodyEnzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy, FASEB J. 4:188-193 (1990)].
Ještě jiné léčebné použití protilátek podle vynálezu zahrnuje použití, buď v přítomnosti komplernentu nebo jako část konjugátu protilátka - léčivo nebo protilátka toxin, aby se odstranily nádorové buňky z kostní dřeně pacientů s rakovinou. Podle tohoto přístupu se může autologní kostní dřeň očistit ex vivo léčením protilátkou a dřeň se vrátit infuzí do pacienta [viz Ramsay et al. ,Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies, J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)].
Chimérní protilátky, rekombinantní imunotoxiny a jiné rekombinantní konstrukty podle vynálezu obsahující specificitu oblasti vázající antigen požadované monoklonální protilátky se mohou dále použít terapeuticky. Například jednořetězcové imunotoxiny podle vynálezu se mohou použít pro léčení lidského karcinomu in vivo.
Podobně se fúzní protein obsahující alespoň jednu oblast vázající antigen protilátky podle vynálezu připojený alespoň k jedné funkčně aktivní části druhého proteinu majícího protinádorovou aktivitu, tj. lymfokinu nebo onkostatinu, může použít pro léčení lidského karcinomu in vivo. Rekombinantní techniky známé ve stavu techniky se dále mohou použít pro konstrukci bispecifických protilátek, kde jedna z vazebných specifik protilátky je směrována k antigenu specifického pro nádor, zatímco druhá z vazebných specifik protilátky je ta, která pochází od molekuly jiné než antigenu specifického pro nádor.
Předmětný vynález poskytuje způsob pro selektivní zabíjení nádorových buněk exprimujících antigen, který se specificky váže k monoklonální protilátce podle předmětného vynálezu, nebo jejímu funkčnímu ekvivalentu. Tento způsob obsahuje zreagování protilátek se sestrojenými glykosidy podle předmětného vynálezu nebo imunokonjugátů (tj. imunotoxinů) obsahující tyto protilátky s nádorovými buňkami. Tyto nádorové buňky mohou být z lidského karcinomu.
Navíc tento vynález poskytuje způsob pro léčení karcinomů (například lidských karcinomů) in vivo. Tento způsob obsahuje podání subjektu farmaceuticky účinného množství kompozice obsahující alespoň jednu z protilátek se sestrojenými glykosidy podle vynálezu nebo imunokonjugátů (tj. imunotoxinů) obsahujících protilátku.
V dalším aspektu je vynález směřován ke zlepšenému způsobu léčení autoimunitních chorob, produkovaných zcela nebo zčásti patogenními protilátkami, založenými na spotřebování B-buněk, zahrnující podání terapeuticky účinného množství protilátky mající zvýšenou ADCC, připravené v souhlasu se způsoby podle vynálezu. Ve výhodném provedení je protilátka protilátkou proti anti-CD20. Příklady autoimunitních onemocnění nebo stavů zahrnují, ale nejsou tím omezeny, thrombocytopenie zprostředkované imunitou, jako akutní idiopathická trombocytopenická purpura a chronická idiopatická trombocytopenická purpura, dermatomyositóza, tanec sv. Víta, lupus nefritis, revmatická horečka, polyglandularní syndromy, Henoch-Schonleinova purpura, poststreptokokální nefritida, bércové vředy, Takayasova arteritida, Addisonova choroba, multiformní erytém, polyarteritis nodosa, ankylosující spondylitis, Goodpasturův syndrom, tromboangitis ubiterans, primární žlučová cirhóza, Hashimotova tyroiditida, tyrotoxikóza, chronická aktivní hepatitida, polymyositóza/dermatomyositóza, polychondritida, pamphigus vulgaris, Wegenerova granulomatóza, membránová nefropatie, amyotrofická vedlejší skleróza, tabes dorsalis, polymyaglie, zhoubná anémie, rychlá progresivní glomerulonefritida a fibrózní alveolitida, zánětlivé odpovědi, jako zánětlivá kožní onemocnění včetně psoriázy a dermatitidy (tj. atopické dermatitidy); systémová skleroderma a skleróza; odpovědi spojené se zánětlivými onemocněními střev (jako Crohnova choroba a vředová kolitida); syndrom respirační úzkosti (včetně syndromu respirační úzkostí dospělých; ARDS); dermatitida; meningitida; encefalitida; uveitida; kolitida; glomerulonefritida; alergické stavy jako ekzém a astma a jiné stavy zahrnující infiltrací T-buněk a chronické zánětlivé odpovědi; ateroskleróza; nedostatečnost adheze leukocytů; revmatická artritida; systémová lupus erythematosus (SLE); diabetes mellitus (tj. diabetes mellitus 1. typu nebo diabetes mellitus závislá na inzulínu); rozptýlená skleróza; Reynaudův syndrom; autoimunitní thyroiditida; alergická encefalomyelitida ; Sjorgenův syndrom; juvenilní počáteční diabetes; a imunitní odpovědi spojené s akutní a zpožděnou hypersenzitivitu zprostředkovanou cytokiny a T-lymfocyty které se typicky nacházejí při tuberkulóze, sarkoidža, polymyositida, granulomatóza a vaskulitida; zhoubná anémie (Addisonova choroba); choroby včetně diapedézy leukocytů; zánětlivé onemocnění centrálního nervového systému (CNS); syndrom poranění více orgánů; hemolytická anémie (včetně, ale ne omezeno na kryoglobinémii nebo Coombsovu pozitivní anémii); myasthenia gravis; choroby zprostředkované komplexem antigenprotilátka; antiglomerulární choroba bazální membrány; antifosolipidový syndrom; alergická neuritida; Gravesova choroba; Lambert-Eatonův myastenický syndrome; puchýře; autoimmunitní polyendokrinopatie; Reiterova choroba; syndrom ztuhlosti; Behcetova choroba; arteritida obrovských buněk; immunitní komplexní nefritida; IgA nefropatie; IgM polyneuropatie; imunitní thrombocytopenická purpura (ITP) nebo autoimunní trombocytopenie atd.. V tomto aspektu vynálezu se používají protilátky podle vynálezu pro vyčerpání normálních B-buněk krve po delší dobu.
V souhlasu s praxí tohoto vynálezu může být subjektem člověk, kůň, prase, skot, hlodavec, kočka a pták.Jiná teplokrevná zvířata jsou rovněž zahrnuta v tomto vynálezu.
Předmětný vynález také poskytuje způsob léčení subjektu trpícího rakovinou. Subjekt může být člověk, pes, kočka, myš, krysa, králík, kůň, koza, ovce, kráva, kuře. Rakovina se může identifikovat jako rakovina prsu, močového měchýře, retinoblastom, papilární cystadeokarcinom vaječníku, Wilmův nádor nebo karcinom malých buněk plic a je obecně charakterizován jako skupina buněk majících antigeny spojené s nádorem na buněčném povrchu. Tato metoda obsahuje podání množství protilátky zabíjející rakovinu subjektu, kde protilátka cílená proti nádoru je spojená s cytotoxickým činidlem. Obecně spojení protilátky cílené na nádor s cytotoxickým činidlem je učiněno za podmínek, které dovolují protilátce takto připojené vázat se na svůj cíl na povrchu buňky. Navázáním na cíl protilátka zacílená na nádor působí přímo nebo nepřímo a zapříčiňuje nebo přispívá k zabíjení buněk takto navázaných, čímž léčí subjekt.
Také je poskytnuta metoda inhibice proliferace savčích nádorových buněk, která zahrnuje kontaktování savčích nádorových buněk s dostatečnou koncentrací protilátek se
• · · · · ···· • · · · · · · sestrojenými glykosidy podle vynálezu nebo imunokonjugátů obsahujících protilátku tak, aby byla inhibována proliferace savčích nádorových buněk.
Předmětný vynález dále poskytuje způsoby inhibice růstu lidských nádorových buněk, léčící nádor v subjektu, a léčící onemocnění proliferativního typu v subjektu. Tyto metody zahrnují podání subjektu efektivního množství kompozice podle vynálezu.
Je zřejmé, že předmětný vynález obsahuje farmaceutické kompozice, kombinace a způsoby léčení lidských karcinomů. Vynález například zahrnuje farmaceutické kompozice pro použití při léčení lidských karcinomů, obsahující farmaceuticky účinné množství protilátky podle předmětného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.
Kompozice mohou obsahovat protilátku nebo fragmenty protilátky, buď nemodifikované, nebo konjugované k terapeutickému činidlu (tj. léčivu, toxinu, enzymu nebo jiné protilátce), nebo v rekombinantní formě (tj. chimérní protilátky, fragmenty chimérních protilátek, bispecifické protilátky). Kompozice mohou navíc obsahovat jiné protilátky nebo konjugáty pro léčení karcinomů (tj. koktejl protilátek).
Kompozice protilátky, konjugátu protilátky a imunotoxinu podle vynálezu se mohou podávat s použitím konvenčních způsobů podávání, zahrnujících, ale nejsou tím omezeny, intravenózního, intraperitonálního a intralymfatického podávání a podávání přímo do nádoru. Přednost se dává intravenóznímu podávání.
Kompozice podle vynálezu mohou být v různých formách, které zahrnují, ale nejsou tím omezeny, kapalné roztoky nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, čípky, polymerní mikrokapsle nebo mikroměchýřky, lipozómy a roztoky pro injekce nebo infúze. Upřednostňovaná forma závisí na způsobu podávání a terapeutické aplikaci.
Kompozice podle vynálezu také výhodně zahrnuje konvenční farmaceuticky akceptovatelné nosiče a adjuvans známé ve stavu techniky, jako lidský sérový albumin, iontoměniče, oxid hlinitý, lecithin, pufrovací látky jako fosfáty, glycin, kyselina sorbová, sorban draselný, a soli a elektrolyty jako protaminsulfát.
Nejefektivnější způsob podávání a režim dávkování pro kompozice podle tohoto vynálezu závisí na vážnosti a průběhu choroby, zdraví pacienta a odpovědi na léčení a na úsudku ošetřujícího lékaře. Podle toho se mohou dávky kompozice titrovat individuálnímu subjektu.
Vzájemné vztahy dávek pro zvířata různé velikosti a druhu a lidmi, založené na mg/kg nebo ploše povrchu, je popsaná ve Freireich, E. J. , et al. Cancer Chemother., Rep. 50 (4): 219-244 (1966). Má se udělat stanovení dávkovacího režimu, aby se optimalizovala odpověď inhibice růstu nádorových buněk a zabíjení buněk, tj. dávky se mají dělit a podávat na denním základě, nebo se snižovat proporcionálně v závislosti na situaci (tj. několik dělených
I · · · I • · • · · · dávek se má podávat denně, nebo proporcionálně snížené v závislosti na specifické terapeutické situaci).
Mělo by být jasné, že dávka kompozice podle vynálezu vyžadovaná k dosažení léčení může být dále snižována podle plánu optimalizace.
V souladu s praxí podle vynálezu může být farmaceutický nosič lipidový nosič. Lipidový nosič může být fosfolipid. Lipidový nosič může dále být mastná kyselina. Lipidový nosič také může být detergent. Jak je použito zde, detergent je jakákoliv látka, která mění povrchové napětí kapaliny, a obecně ho snižuje.
V jednom příkladu podle vynálezu detergent může být neionogenní detergent. Příklady neionogenních detergentů zahrnují, ale nejsou tím omezeny, polysorbát 80 (také známý jako Tween 80 nebo (polyoxyethylensorbitan monooleát), Brij, a Triton (například Triton WR-1339 a Triton A-20).
Detergent může být alternativně ionogenní detergent. Příklad ionogenního detergentů zahrnuje, ale není tím omezen, alkyltrimethylamoniumbromid.
Navíc, v souhlasu s vynálezem, lipidový nosič může být lipozóm. Jak je použito v této přihlášce, „lipozóm“ je jakýkoliv měchýřek ohraničený membránou, který obsahuje jakékoliv molekuly podle vynálezu nebo jejich kombinace.
Příklad níže vysvětluje vynález detailněji. Následující přípravky a příklady jsou dány, aby umožnily odborníkovi v oboru jasněji porozumět a praktikovat předmětný vynález. Avšak předmětný vynález není omezen v rozsahu provedeními v příkladech, které jsou považovány pouze za ilustrace jednotlivých aspektů vynálezu, a způsoby, které jsou funkčně ekvivalentní, jsou uvnitř rozsahu vynálezu. Různé modifikace vynálezu navíc k těm, které jsou popsány zde, budou rozhodně zřejmé odborníkovi v oboru z předchozího popisu a doprovodných obrázků. Takové modifikace se považují za spadající do rozsahu připojených nároků.
PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU
Příklad 1
Materiály a metody
1. Konstrukce expresních vektorů protilátky.
Expresní vektor PETR1502 protilátky anti-CD20
Expresní vektor pETR1502 protilátky C2B8 anti-CD20se skládá ze čtyř nezávislých oddělených expresních kazet Qedna pro lehký řetězec protilátky C2B8, druhá pro těžký
9
9 9 9 řetězec protilátky C2B8, jedna pro gen rezistence k neomycinu a pro myší gen dhfr). Všechny geny jsou pod kontrolou promotoru myeloproliferativního viru sarkomu (MPSV) a obsahují syntetický souhlasný polyadenylační signál, odvozený z polyadenylačního signálu králičího genu β-globinu.
CDNA kódující řetězce proměnného těžkého (VH) a proměnného lehkého (VL) řetězce protilátky C2B8 anti-CD20 jsou sestavené ze sady překrývajících se jednořetězcových oligonukleotidů v jednostupňovém procesu používajícím PCR (Kobayashi,
N., et al., Biotechniques 23:500-503 (1997)). Původní sekvence kódující oblasti C2B8 VL a VH byly získány z publikované mezinárodní patentové přihlášky (Mezinárodní publikační číslo WO94/11026). Sestavené fragmenty cDNA VL a VH byly subklonovány do intopBIuescriptlIKS (+) za vzniku plazmidů pBlue-C2B8VH a pBlue-C2B8VL a sekvencovány.
Proměnné řetězce C2B8 byly amplifikovány zodpovídajících plazmidů pBlue-C2B8VH a pBlue-C2B8VLs použitím primerů, které zavádějí restrikční místo Ascl na 5‘-konci a vhodná restrikční místa na křížení variabilní a konstantní oblasti (BsiWI pro lehký řetězec a Nhel pro těžký řetězec). Konstantní oblasti IgGI se amplifikovaly z knihovny cDNA lidského leukocytu (Quickclone, Clontech) s použitím primerů, které zavádějí vhodná restrikční místa na 5‘-konci a 3‘-konci BsiWI a BamHI pro konstantní lehký řetězec a Nhel a BamHI pro konstantní těžký řetězec).
Po potvrzení správných sekvencí DNA byl každý z lehkých a těžkých řetězců protilátky C2B8 kombinovány s promotorem MPSV a polydenylačními signály. V prvním stopni byly konstruovány dva různé expresní vektory: jeden pro lehký řetězec C2B8 (pETR1315) a druhý pro těžký řetězec C2B8 (pETR1316). V druhém stupni se zavedla expresní kazeta resistence k neomycinu (gen rezistence k neomycinu, odvozený od transpozonu Tn5 a dán pod kontrolu minimálního promotoru MPSV) do vektoru pETR1315 za vzniku plazmidů pETR1481. Expresní kazeta genu dhfr pod kontrolou promotoru MPSV se zavedla do vektoru pETR1316 za vzniku plazmidů pETR1328. Ve finálním kroku se oba expresní moduly (lehký řetězec C2B8 + neo a těžký řetězec C2B8 + dhfr) zkombinovaly do jednoho vektoru za vzniku plazmidů pETR1502.
Expresní vektor anti-cd20 pETR1520 pETR1520kombinuje expresní vektor protilátky C2B8 anti-cd20 s původem replikace z viru Epstein-Barrové (oriP) pro replikaci epizomálního vektoru a zachování v buňkách produkujících nukleární antigen Epstein-Barrové (EBNA). Pro konstrukci expresního vektoru
C2B8, pETR1520, se zavedl expresní modul C2B8 zpETR1416 jako fragment hinDIII do vektoru pETR1502 obsahujícího ori-P. Vektor pETR1406 je podobný pETR1502 s výjimkou • · 4 4 · · toho, že v tomto plazmidu je gen rezistence proti neomycinu pod kontrolou plného namísto minimálního promotoru MPSV.
Anti-fibronektinový expresní vektor pETR1546
Tento vektor je stejný jako vektor pETR1520 kromě toho, že oblasti kódující proměnný lehký a těžký řetězec C2B8 protilátky anti-CD20 byly nahrazeny odpovídajícími kódujícími oblastmi protilátky L19, lidské protilátky rozeznávající doménu ED-B fibronektinu. Fragmenty kódující proměnnou oblast DNA se syntetizovaly metodou překrývajícího rozšíření PCR s použitím syntetických oligonukleotidů založených na sekvenci proměnné oblasti protilátky L19 (Pini, A. et al. J. Biol. Chem. 273 (34): 21769-76 (1998)).
Expresní vektor pURSI28 protilátky antí-EGFR (C225)
Tento vektor je stejný jako vektor pETR1520 kromě toho, že oblasti kódující proměnný lehký a těžký řetězec C2B8 protilátky anti-CD20 byly nahrazeny odpovídajícími kódujícími oblastmi protilátky C225, chimérní protilátky rozeznávající receptor lidského epidermálního růstového faktoru. Fragmenty kódující proměnnou oblast DNA se syntetizovaly metodou překrývajícího rozšíření PCR s použitím syntetických oligonukleotidů založených na sekvenci proměnné oblasti protilátky C225 (sekvence se mohou najít v publikované patentové přihlášce s mezinárodním publikačním číslem W096/40210, obr. 16 a 17 patentové přihlášky, jednotlivě pro lehký a těžký řetězec).
2. Konstrukce GnTIIl-fúzních expresních vektorů
PETR1166. Vektor pro konstitutivní expresi GnTIII
Pro konstrukci GnTIII-fúzních expresního vektoru pETR1166 se amplifikovala krysí GnTIII z knihovny cDNA krysích ledvin (Clontech) pomocí PCR. C-terminál přívěsku epitopu c-myc se přidal bezprostředně po směru stop kodónu genu (aminokyselinová sekvence: PEQKLISEEDL pro pozdější vhodnou detekci GnTIII pomocí Western blotu. Po potvrzení správné sekvence GnTIII se gen zavedl pod kontrolu promotoru MPSV a přidal se signál syntetické králičí β-globinové polyadenylace. Finální expresní vektor GnTIII také obsahuje oddělenou kazetu rezistence k puromycinu pro selekci s genem rezistence k puromycinu také pod kontrolou promotoru MPSV a signálu syntetické králičí β-globinové polyadenylace.
PETR1425: Náhrada prvních 76 aminokyselin GnTIII prvními 102 aminokyselinami lidské GnTI
Konstrukce tohoto hybridního genu glykosyltransferázy se provedla následnými překryvnými reakcemi PCR. V jedné reakci se amplifikuje kmenová oblast lidské GnTI za použití primerů GAB-179 a GAB-180. Během této reakce PCR se také zavede Kozáková konsensuální sekvence a restrikční místo Ascl na 5‘-konci. Výsledný fragment PCR má překryv 23 pb s GNTIII s počátkem na pozici 229.V druhé reakci PCR se amplifikuje oblast GnTIII od pozice 229 do 380 s primery GAB-177 a GAB-188, generující fragment PCR s jedinečným místem BstXI na 3‘-konci a překryvem 22 pb s kmenovou oblastí GnTI na 5‘konci. Oba fragmenty PCR se vyčistí a použijí jako templáty ve třetí reakci PCR (primery GAB-179 a GAB-178). Výsledný fragment se vyčistí a štěpí se Ascl a liguje se k vektoru pETR1001 (stříhanému Ascl a Smál), což vede k plazmidu pETR1404. Poté, co se sekvence inzertu potvrdí, přidá se prvek MPSV k pETR1404 jako fragment Ascl (parciální štěpení)/Pmel a získá se plazmid pETR1423. Fragment Sphl/BstXI z pETR1166, expresní vektor nesoucí původní gen GnTIII, se poté nahradí odpovídajícím fragmentem pETR1423, což vede k plazmidu pETR1425 obsahujícímu fúzi GnTI-GnTIII pod kontrolou promotoru MPSV a kazetou rezistence k puromycinu pro selekci.
Sekvence primerů:
GAB-177: GCGTGTGCCTGTGACCCCCGCGCCCCTGCTCCAGCCACTGTCCCC GAB-178: GAAGGTTTCTCCAGCATCCTGGTACC
GAB-179: CTGAGGCGCGCCGCCACCATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGC
GAB-180: GGGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGCGCGGGGGTCACAGGCACACGCGGC
PETR1506: Náhrada 76 N-terminálních aminokyselin GnTIII prvními 100 aminokyselinami lidské manózidázy II.
Konstrukce pETR1506 se provádí analogicky s konstrukcí pETR1425. kmenová oblast genu lidské manózidázy II se amplifikuje primery GAB-252 a GAB-253 s použitím vektoru pBlue-man jako templátu Během této PCR se zavede místo Fsel a Kozáková konsenzuální sekvence na 5‘-konci. Výsledné fragmenty PCR překrývají gen GnTIII 23pb s počátkem na pozici 229. V druhé reakci PCR se amplifikuje část genu GnTIII (pozice 229460) primery GAB-254 a GAB-255. tato reakce PCR generovaná fragmentem obsahujícím 43 pb se překrývá s genem manózidázy II na 5‘-konci a s jedinečným místem Stul na 3‘konci. Oba fragmenty se vyčistí a použijí jako templáty ve třetí PCR s primery GAB-252 a GAB-255. Výsledný fragment se zavede do plC19H, což dá vektor pETR1484. Poté, co se •to ·#·· ·· to • · · • *· ·· <<·* «·· · · «· • · to to tototo ·*· • · to • · · · · to······ ·· · ·» potvrdila správná sekvence, zkonstruoval se kompletní fúzní gen ligací fragmentu Fsel/Stul pETR1484 s fragmentem Stul/BamHI zpETR1166 ve vektoru pETR12177 (Fsel/BamHI). Výsledný plazmid (pETR1500) obsahuje hybridní gen GnTI-GnTIII (SEQ ID NO:14) pod kontrolou promotoru MPSV. Pro selekci plazmidu v savčích buňkách se zavedla kazeta rezistence k puromycinu jako fragment Spěl z pETR1166, za vzniku plazmidu pETR1506.
Sekvence primerů:
GAB-252: GCTAGGCCGGCCGCCACCATGAAGTTAAGCCGCCAGTTCACCGTGTTCGG GAB-253: GGGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGTGAGCCAGCACCTTGGCTGAAATTGCTT TGTGAACTTTTCGG
GAB-254: TCCGAAAAGTTCACAAAGCAATTTCAGCCAAGGTGCTGGCTCACCCCTGCTC CAGCCACTGTCCCC
GAB-255: ATGCCGCARAGGCCTCCGAGCAGGCCCC pETR1519: Kombinace hybridního fúzního genu ManlI-GnTIII s replikačním původcem oriP z viru Epstein-Barrové.
S použitím primerů Gab-261 a GAB-262 se amplifikoval 2 kb fragment obsahující oriP z plazmidu pCEP4 (Invitrogen). Během této rekce PCR se zavedly na obou koncích místa s fragmenty Sspl a EcoRI. Pro sekvencování se zavedl fragment oriP do vektoru plC19H. Poté, co se potvrdila správná sekvence, se orip zavedl jako fragment Sspl do vektoru pETR1001 (štěpený BsmBI a překrývající se 5‘-konce vyplněné s použitím Klenowovy polymerázy). Výslednáý plazmid byl označen pETR1507. Expresní kazeta Sphl/Nrul ManllGmtlll z pETR1520 se zavedla do pETR1507, štěpeného těmiž restrikčníml endonukleázami, které poskytly plazmid pETR1519.
Sekvence primerů:
GAB-261: GCTAAATATTGAAATTCCCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGC
GAB-262: TAGCAATATTGAATTCGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGC
PETR1537: Kombinace hybridního fúzního genu ManlI-GnTIII a zkráceného markerového genu povrchu buňky CD4
Expresní vektor pETR1506 se modifikoval pro další expresi zkráceným markerovým genem povrchu buňky CD4. Stručně, hybridní fúzní genová expresní kazeta ManlI-GnTIII byla konvertována z monocistronové na bicistronovou expresní kazetu zavedením proti směru od stop kodónu fůze ManlI-GnTIII, prvek polioviru IRES, následovaný cDNA kódující
9« 9···
zkrácený lidský protein CD4 (obsahující lidskou leader sekvenci CD4 pro sekreci následovanou transmembránovou a extracelulární doménou).
3. Transfekce savčích buněk fúzním GnTIII a protilátkovým expresním vektorem
Transfekce buněk BHK
Exponenciálně rostoucí buňky (živost 90 - 95 %) byly naočkovány ve vhodném počtu baněk T75 při koncentraci 0,9 x 106 buněk/ml 24 hod. před elektroporací. Jako kultivační médium bylo použito Invitrus (Cell Culture Technologies, Švýcarsko), doplněné 10 % fetálního telecího séra (FCS). Buňky byly před elektroporací spočteny. 8x10® buněk bylo sklizeno centrifugací (5 min., 200 x g) a supernatant byl odhozen. Buňky se resuspendovaly v v 800 μΙ média Invitrus a přenesly se do sterilní elektroporační kyvety (0,4 cm gap), již obsahující 8 pg cirkulární plazmidové DNA a inkubovaly se 5 min. při teplotě místnosti. Buňky se elektroporovaly za použití Gene Pulser II (BoiRad) za následujících podmínek. 400V, 960 pF dvěma pulsy v 30 s intervalu. Po elektroporací se buňky ihned převedly do baněk T75, obsahujících 5 ml růstového média (lnvitrus/20 % hmotn. FCS/1. 25 % hmotn. DMSO) a inkubovaly se při 3ý °C v inkubátoru s atmosférou 5 % CO2. Pro produkci nemodifikovaných protilátek (s nesestrojenými glykosidy) se buňky transfekovaly pouze expresními vektory protilátek. Pro produkci protilátek se sestrojenými glykosidy se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátek a druhým plazmidem exprese polypeptidů GnTIII (SEQ ID NO:15) v poměru 3 :1.
Transfekce buněk HEK293-EBNA
Exponenciálně rostoucí buňky HEK293-EBNA se transfekovaly kalciumfosfátovou metodou. Buňky se nechaly růst jako přilnuté jednovrstvé kultury v t-baňkách s použitím kultivačního média DMEM, doplněného 10 % FCS, a transfekovaly se, když byly na 50 až 80 % slité. Pro transfekci baňky T75 bylo naočkováno á miliónů buněk 24 hodin před transfekcí v kultivačním médiu DMEM doplněném FCS (finálně 10 % hmotn.), 250 pg/ml neomycinu a buňky byly umístěny při 37 °C v inkubátoru s 5 % CO2 přes noc. Pro každou baňku T75, která se měla transfekovat, se připravil roztok DNA, CaCI2 a vody smícháním 47 pg celkové plazmidové DNA, 235 pl 1M roztoku CaCI2 a přidáním vody do celkového objemu 469 pl. K tomuto roztoku se přidalo 469 pl roztoku 50 pM HEPES, 280 mM NaCI, 1,5 mM Na2HPO4 při pH 7,05, ihned se míchalo 10 s a nechalo stát při teplotě místnosti 20 s. Suspenze se zředila 12 ml DMEM doplněným 2 % FCS, a přidala do T75 místo existujícího média. Buňky
9« 9999 • 99 99 999· • 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9999
9 9 9 · ·
9 9 9 9
9999··· 9 · ··* se inkubovaly při 37 °C, 5 % CO2 po asi 17 až 20 hodin, poté se médium nahradilo 12 ml DMEM, 10 % FCS. Pro produkci nemodifikovaných protilátek (s nesestrojenými glykosidy) ) se buňky transfekovaly pouze expresními vektory protilátek. Pro produkci protilátek se sestrojenými glykosidy se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátek a druhým plazmidem exprese polypeptidu GnTIII (SEQ ID NO:15) v poměru 4:1. pátý den po transfekci se supernatant sebral, centrifugoval 5 minut při 1200 ot/min, a poté se centrifugoval podruhé po 10 min při 4000 ot/min a skladoval při 4 °C.
Generování stabilní buněčné linie exprimující rekombinantní protilátku anti-CD20
Buňky BHK (BHK21-13c) se transfekovaly elektroporací s vektorem pETR1502 exprimujícím protilátku C2B8, který obsahuje expresní kazetu rezistence k neomycinu. Nejprve byly vybrány klony rezistentní k neomycinu, aby se získala sada klonů, které měly chromozomálně integrovaný DNA vektor pETR1502. Klony se poté zkoumaly na produkci rekombinantní protilátky s použitím metody ELISA. Stručně, 24 hodin o elektroporací se spočítaly životaschopné buňky a účinnost transfekce se určila spočítáním fluoreskujících buněk paralelní kontrolní elektroporace s expresním vektorem pEYFP. Buňky se zředily v selekčním médiu Invitrus, obsahujícím 10 % FCS a 1 mg/ml neomycinu. Obvykle se naočkovalo osm 96jamkových destiček různými koncentracemi životaschopných transfekovaných buněk (1 x 103, 5 x 102 a 1 x 102 buněk na jamku) a inkubovaly se při 37 °C, až se mohly identifikovat klony. Jakmile klony dorostly téměř do slévání, supernatanty se analyzovaly metodou ELISA na produkci protilátek. Klony pozitivní na ELISA se expandovaly nejprve do 24jamkových a poté do 6jamkových destiček a poté do baněk T25. Po pěti dnech růstu v baňkách T25 se finální titr protilátky určil pomocí metody ELISA. Za použití této elektroporační a selekční metody se izoloval buněčný klon BHK exprimující protilátku anti-CD20 C2B8, který produkoval 13 gg/ml protilátky za výše uvedených kultivačních podmínek.
Generování stabilní savčí buněčné linie exprimující rekombinantní protilátku anti-CD20 a fúzní GnTIII
Klon BHK-1502-28, konstitutivně exprimující geny monoklonální protilátky anti-CD20 a geny rezistence k neomycinu se transfekoval elektroporací expresním vektorem pETR1537. pETR1537 je vektor pro konstitutivní expresi genu ManlI-GnTIII a zkrácené formy lidského CD4, který je exprimován v závislosti na IRES. Nejprve se selektovaly klony rezistentní na puromycin, aby se získala sada klonů, které chromozomálně integrovaly DNA •« ···· «··· • « · • « · • · · • · ♦ ♦ · * 9 9 9 9
9 99999
9 9 9 9 ·
9 9 9 9
99 9999 99 99 9 vektor pETR1537. Klony se poté screenovaly na povrchovou expresi zkráceného CD4 (tCD4), který slouží jako markér pro úroveň exprese expresní jednotky bicistronického genu Manll-GnTIII+tCD4. Produkce rekombinantní protilátky selektovaných klonů se ověřila s použitím metody ELISA.
Stručně, vektor pETR1537 se linearizoval pomocí Xmnl. Paralelně se provedla kontrolní transfekce expresním vektorem EYFP. Po 24 hodinách se určila účinnost transfekce spočítáním buněk exprimujících EYFP proti všem buňkám. Životaschopnost buněk byla 91 %. Jeden den po transfekci se buňky transfekované pETR1537 nebo pEYFP sériově zředily v poměru 1:100, 1:500, 1:1000 a 1:5000 a naočkovaly do 96jamkových destiček ve finálním objemu 0,2 ml selekčního média (Invitrus, 10 % FCS, 20 pg/ml puromycinu, 1 mg/ml neomycinu). Klony byly viditelné po dvou týdnech. Expandovaly se a screenovaly na expresi zkráceného CD4 (tCD4).
Pro screening expresní úrovně tCD4 se přibližně 500 000 buněk promylo pufrem FACS a inkubovalo se s 5 pl protilidského CD4 FICS (Becton Dickinson, Švýcarsko) po 20 minut na ledu. Po dvou promytích se buňky resuspendovaly v 0,5 ml pufru FACS a analyzovaly se FACS (obr. 17A-B). izoloval se klon s dobrou expresí tCD4 (BHK-1502-2811). Po 5 dnech růstu v baňce T75 produkoval protilátku anti-CD20 při finálním titru asi 17 pg/ml, jak se určilo pomocí ELISA.
4. Produkce a purifikace nemodifikovaných protilátek a se sestrojenými glykosidy
Sbírání kultivačního média
V případě buněk BHK transfekovaných expresním vektorem protilátky nebo kotransfekovaných expresním vektorem protilátky a fúzním expresním vektorem GnTIII se kultivační supernatant sbíral po kultivaci transfekovaných buněk 96 hod. po transfekci. V závislosti na očekávané produktivitě bylo pro tentýž vektor děláno několik (10 - 15) elektroporací.
V případě buněk HEK93-EBNA, transfekovaných expresním vektorem protilátky nebo kotransfekovaných expresním vektorem plus fúzním expresním vektorem se kultivační médium nahradilo čerstvým kultivačním médiem přibližně 16 hod. po transfekci a druhé médium se poté sbíralo po kultivaci transfekovaných buněk po dalších 120 hod..
Pro stabilní buněčnou linii BHK-1502-28-11 byla kultura naočkována 500 000 buňkami/ml a supernatant se sbíral po 4 dnech kultivace, kdy hustota buněk byla 1,7 x 106 životaschopných buněk/ml a životaschopnost buněk 69 %.
• · · · · · • ♦ * • ·· * ·
Purifikace protilátky
Monoklonální protilátka se purifikovala z kultivačního supernatantu s použitím dvou následných chromatografických kroků. První krok se skládal z chromatografie Protein A s použitím pH-gradientové eluce, která efektivně separuje hovězí a lidské IgG. Poté následoval chromatografický krok na kationtovém iontoměniči, aby se vyměnil pufr vzorku za solný fosfátový pufr (PBS).
5. Analýza oligosacharidů
Oligosacharidy se enzymaticky uvolnily z protilátek odštěpením PNGázouF, s protilátkami buď imobilizovanými na membráně PVDF nebo v roztoku.
Výsledný roztok po štěpení, obsahující uvolněné oligosacharidy, se buď připravil přímo pro ananlýzu MALDI/TOF-MS, nebo se dále rozštěpil glykosidázou EndoH před přípravou vzorku pro analýzu MALDI/TOF-MS.
Způsob uvolnění oligosacharidů pro protilátky imobilizované na membráně PVDF
Jamky 96jamkové destičky, připravené s membránou PVDF (Imobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts, USA) se zvlhčily 100 μΙ methanolu a kapalina se protáhla přes membránu PVDF s použitím vakua aplikovaného na vakuové zařízení Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts, USA). Membrány PVDF se promyly třikrát 300 μΙ vody. Jamky se poté promyly 50 μΙ pufru ROM (8 M močovina, 360 mM Tris, 3,2 mM EDTA, pH 8,6). Mezi 30 - 40 pg protilátky se vložilo do jamky obsahující 10 μΙ pufru RCM. Kapalina v jamce se protáhla přes membránu použitím vakua, a membrána se následně promyla dvakrát 50 μΙ pufru RCM. Redukce disulfidických můstků se provedla přidáním 50 μΙ dithiothreitolu v RCM a inkubací při 37 °C po 1 hod..
Po redukci se použilo vakuum k odstranění roztoku dithiothreitolu z jamek. Jamky se promyly třikrát 300 μΙ vody před provedením karboxymethylace cysteinových skupin přidáním 50 μΙ 0,1 M kyseliny jodoctové v pufru RCM a inkubací při teplotě místnosti v temnu po 30 min..
Po karboxymethylaci se jamky protáhly vakuem a následně promyly třikrát 300 μΙ vody. Membrána PVDF se té poté blokovala, aby se zabránilo adsorpcí endoglykosidázy, inkubací 100 μΙ 1% vodného roztoku polyvinylpyrolidonu 360 při teplotě místnosti po 1 φφ φφφφ
φφφ φ · φ • φφ φφ φφφ φφ * φ φφφ φ φφφ φφφ
Φ Φ · 9 ·
Φ Φ Φ Φ
ΦΦΦΦΦΦΦ Φ· ΦΦΦ hodinu. Blokovací činidlo se poté odstranilo jemným vakuem následovaným třemi promytími 300 μΙ vody.
N-připojené oligosacharidy se uvolnily adicí 2,5 mil peptid-N-glykosidázy F (recombinant N-Glycanase, GLYKO, Novato, CA, USA) a 0,1 mU Sialidase (GLYKO, Novato, CA, USA) aby se uvolnily jakékoliv potenciálně nabité monosacharidové zbytky, v konečném objemu 25 μΙ v 20 mn NaHCO3, pH 7,0. Štěpení se provádělo po 3 hodiny při 37 °C.
Způsob uvolnění oligosacharidů pro protilátky v roztoku
Mezi 40 a 50 μg protilátky se smíchalo s 2,5 mU PNGázyF (GLYKO, USA) ve 2mM Tris, pH 7,0 ve finálním objemu 25 μΙ, a směs se inkubovala po 3 hodiny při 37 °C.
Použití štěpení endoglykosidázou H na oligosacharidy uvolněné PNGázouF pro připsání hybridních rozdělených oliqosacharidových struktur pro neutrální oligosacharidové píky MALDI/TOF-MS
Oligosacharidy uvolněné PNGázouF se následně rozštěpily endoglykosidázou H (EC 3.2.1.96). Pro štěpení EndoH se přidalo 15 mU EndoH (Roche, Švýcarsko) do výtažku PNGázouF (protilátka v roztokové metodě výše) do konečného objemu 30 μΙ, a směs se inkubovala 3 hodiny při 37 °C. EndoH štěpí mezi N-acetylglukózaminovými zbytky chitobiózového jádra N-připojených oligosacharidů. Enzym může rozštěpit pouze oligomanózu a většinu glykanů hybridního typu, zatímco oligosacharidy komplexního typu se nehydrolyzují.
Příprava vzorku pro MALDI/TOF-MS
Enzymatické výtažky obsahující uvolněné oligosacharidy se inkubovaly po další 3 hodiny při teplotě místnosti po přidání kyseliny octové do konečné koncentrace 150 mM, a následně byly prolity skrz 0,6 ml kationové iontoměničové pryskyřice (pryskyřice AG50W-X8, kyselá forma, 100-200 mesh, BioRad, Švýcarsko), naplněné v mokro-bio-spin chromatografické koloně (BioRad, Švýcarsko), aby se odstranily kationy a proteiny. Jeden mikrolitr výsledného vzorku se aplikoval na nerezovou cílovou destičku, a na destičce se smíchal s 1 μΙ matrice sDHB. Matrice sDHB se připravila rozpuštěním 2 mg kyseliny 2,5dihydroxybenzoové a 0,1 mg kyseliny 5-methoxysalicylové v1 ml ethanol/10 mM vodný ·♦ ··«·
8 *
9 9
9 9
8 9 · · • ··
9 8 • f
9 • · 999 9989
8988 • 8 9
9 9 99
9 8 • 9 8
899 chlorid sodný 1 : 1 (obj./obj). Vzorky se vysušily na vzduchu, přidalo se 0,2 μΙ ethanolu, a vzorky se nechaly nakonec překrystalovat na vzduchu.
MALDI/TOF-MS
Hmotový spektrometr MALDI-TOF používaný k získání hmotových spekter byl Voyager Elitě (Perspective Biosystems). Přístroj se provozoval v lineární konfiguraci, s akcelerací 20 kV a zpožděním 80 ns. Pro stanovení hmoty iontů se použila externí kalibrace s použitím oligosacharidových standardů. Spektra z 200 laserových záblesků se sečetla pro získání konečného spektra.
6. Příprava PBMC
Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly připraveny za použití Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics lne., St. Louis, M063178, USA) a podle instrukcí výrobce. Stručně, žilní krev se odebrala heparinizovanými stříkačkami od dobrovolníků, kteří byli požádáni o běh plnou silo po 1 minutu, aby se zvýšilo procentické zastoupení zabíječských buněk (NK) v krvi. Krev se zředila 1 : 0,75 - 1,3 PBS neobsahující Ca nebo Mg a převrstvila se na Histopaque-1077. Gradient se centrifugoval při 400 x g po 30 min při teplotě místnosti (RT) bez přerušení. Mezifáze obsahující PBMC se shromáždila a promyla PBS (50 ml na buňky ze dvou gradientů) a buňky se odstředily při 300 x g po 10 minut při teplotě místnosti. Po resuspendaci pelety v PBS se PBMS spočítaly a promyly podruhé centrifugací při 200 x g po 10 minut při teplotě místnosti. Buňky se poté resuspendovaly ve vhodném médiu pro následné procedury.
7. Izolace buněk NK
Lidské buňky NK se izolovaly z PBMC aplikováním negativní selekční procedury s použitím magnetických tělísek nevázajících CD16- a CD-56pozitivní buňky (systém MACS od Miltenyi Biotec GmbH, 51429 Bergisch Gladbach, DE). PBMC se jednou promyly v ledovém pufru MACS (PBS obsahujícím 2 % FCS a 2 mM EDTA), resuspendovaly se 2 milióny buněk na ml ve směsi FCS a pufru MACS a inkubovaly se 10 min. při 4 °C. Buňky se poté peletovaly a resuspendovaly v 80 μΙ na 10 miliónů buněk s pufrem MACS obsahujícím 10 % FCS. Poté se přidalo 20 μΙ roztoku protilátky Hapten na 10 miliónů buněk. Buňky se inkubovaly po 10 minut při 4 °C s opakovaným kroužením zkumavkou. Po dvou promytích pufrem MACS v alespoň desetinásobku jmenovitého objemu se buňky resuspendovaly
99 9999 9 99 99 • 9 · ·
• 9 9 99 9 9 9 · •
• 9 9 9 9 9 • 099
9 9 9 9 9 9 9 9 999 9999 9’ 99 • 9 990
v pufru MACS obsahujícím 10 % FCS při 10 miliónech buněk na 80 μΙ a přidalo se 20 μΙ antihaptenových mikrotělísek na 10 miliónů buněk. Zkumavka se inkubovala 15 minut při 4 °C s opakovaným kroužením zkumavkou. Po jednom promytí pufrem MACS se buňky resuspendovaly v množství do 500 miliónů buněk v 500 μΙ MACS a nanesly na kolonu LS MACS, která byla umístěna v magnet MINI-MACS a ekvilibrována 3 ml pufru MACS. Kolona se promyly 3 x 3 ml pufru MACS. Buňky v průtokové frakci se shromáždily a následně použila jako buňky NK. Čistota byla mezi 88 - 95 %, jak se určilo expresí CD56.
8. Stanovení ADCC
Připravily se PBMC nebo NK jako efektorové buňky, jak je popsáno výše. Poměr efektorových k cílovým byl 25 : 1 a 10 : 1 jednotlivě pro buňky PBMC a NK. Efektorové buňky se připravily v médiu AIM-V ve vhodné koncentraci, aby se přidalo 50 μΙ ná jamku 96jamkové destičky s kulatými dny. Cílové buňky pro protilátky C2B8 byly B lymfomové buňky SKW6.4 nebo Namalwa, vyrostlé v DMEM obsahujícím 10 % FCS. Cílové buňky se promyly v PBS, spočítaly a resuspendovaly v AIM-V při 0,3 milionu na ml tak, aby se přidalo 30 000 buněk ve 100 μΙ na mikrojamku. Protilátky se rozpustily v AIM-V, přidaly v 50 μΙ k předem nadávkovaným cílovým buňkám a nechaly se navázat na cíle 10 minut při teplotě místnosti. Poté se přidaly efektorové buňky a destička se inkubovala 4 hod. při 37 °C ve vlhčené atmosféře obsahující 5 % CO2. Zabíjení cílových buněk se hodnotilo měřením uvolňování laktátdehydrogenázy (LDH) z poškozených buněk s použitím Cytotoxicíty Detection Kit (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Švýcarsko). Po 4hodinové inkubaci se destičky centrifugovaly při 800 x g. 100 μΙ supernatantu z každé jamky se přeneslo na novou 96jamkovou destičku s plochým průhledným dnem. Přidalo se 100 μΙ pufru s barvícím substrátem z kitu na jamku. Hodnoty Vmax barevné reakce se určily čítačem ELISA při 490 nm po alespoň 10 min. s použitím softwaru SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Spontánní uvolňování LDH se měřilo pouze v jamkách, obsahujících cílové a efektorové buňky, ale žádné protilátky. Maximální uvolňování se určovalo z jamek obsahujících pouze cílové buňky a 1 % Tritonu X-100. Procentické zastoupení specifického zabíjení zprostředkovaného protilátkou se počítalo následovně: ((x- SR)/ (MR-SR)*100, kde x je sřední hodnota Vmax pro koncentraci specifické protilátky, SR je střední hodnota pro spontánní uvolňování a MR je střední hodnota pro Vmax maximálního uvolňování.
9. Navázání FcyRIIIA na buňky NK
Čerstvě izolované buňky NK se centrifugovaly 5 minut při 200 x g a předpřipravily se
0,09 % (hmotn./obj.) roztoku kyseliny mléčné (140mM NaCI, 5 mM KCI, pH 3,9) inkubací
98
9 9
9
9898
9
888
9 9
9
998 89 99
9 8
898 x 105 buněk při teplotě místnosti po 5 minut, aby se odstranily IgG asociované s buňkami. (De Haas M., J.lmmunoi. 156 : 2948 (1996)).
Buňky se promyly dvakrát PBS, 0,1 % BSA, 0,01 % azidu sodného a koncentrace se nastavila na 2 x 10e buněk/ml v PBS, 0,15 BSA, 0,01 % azidu sodného. 5 x 105 buněk se inkubovalo s 0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 gg/ml různých protilátek po 30 min při 4 °C. Buňky se poté promyly dvakrát a navázání protilátky se detekovalo inkubací s 1:200 kozí protilidskou protilátkou F(ab‘)2 konjugovanou s fluorescein-izothiokyanátem (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA) a protilidskou CD56-PE při 5 μΙ/5 x105 buněk (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) po 30 minut při 4 °C. (Shields R. et al. J. Biol.Chem.277 (30) : 26733-26740 (2002)).
Intenzita fluorescence týkající se variant navázané protilátky se určovala pro buňky CD56+ na přístrojí FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA).
10. Navázání FcyRHb na lymfomové buňky Ráji
Lidské B lymfomové buňky Ráji se promyly 20 minut při 37 °C v PBS (koncentrace 0,3 miliónu buněk/ml). Buňky se poté resuspendovaly 2,2 miliónu buněk/ml v PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3, a 180 μΙ se přidalo do zkumavky FACS. Desetkrát zředěné protilátky (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 a 30 μg/ml) monoklonálních protilátek L19 nemodifikovaných a se sestrojenými glykosidy se přidalo k buňkám Ráji a inkubovalo při 4 °C 30 minut (finální koncentrace buněk 2 milióny buněk/ml). Po dvou promytích se k buňkám přidal kozí protilidský IgG F(ab‘)2 konjugovaný s fluorescein-izothiokyanátem (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA) a inkuboval se při 4 °C 30 min. po jednom promytí se buňky resuspendovaly v 0,5 ml PBS, 0,1 % BSA, 0,1 % NaN3 a intenzita fluorescence odpovídající variantám navázané protilátky pro živé buňky se určila na přístroji FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA).
11. Stanovení cytotoxicity závislé na komplementu
Cílové buňky se spočítaly, promyly PBS, resuspendovaly v AIM-V (Invitrogen) při 1 miliónu buněk na ml. 50 μΙ buněk se naneslo do jamky 96jamkové destičky s plochým dnem. Zředění protilátek se připravily v AIM-V a přidalo se 50 μΙ k buňkám. Protilátky se nechaly navázat na buňky 10 minut při teplotě místnosti. Lidský sérový komplement (Quidel) se čerstvě rozmrazil, 3krát se zředil AIM-V a přidalo se 50 μΙ do jamek. Králičí komplement (Cedarlane Laboratories) se připravil podle popisu výrobce, 3krát se zředil AIM-V a přidalo • · · *» * ··»· • 4 4
9 9
se 50 μΙ do jamek. Jako kontrola se zdroje komplementu zahřívaly na 56 °C 30 minut před přidáním do stanovení.
Destičky se stanovením se inkubovaly při 37 °C 2 hodiny. Zabíjení buněk se určilo měřením uvolňování LDH. Stručně, destičky se centrifugovaly při 300 x g 3 minuty. 50 μΙ supernatantu na jamku se přeneslo na novou 96jamkovou destičku a přidalo se 50 μΙ testovacího činidla z Cytotoxicity Kit (Roche). Kinetické měření na čítači ELISA určilo Vmax odpovídající koncentraci LDH v supernatantu. Maximální uvolňování se určilo inkubací buněk v přítomnosti 1 % Tritonu X-100.
Výsledky a diskuse
Verze chimérní protilátky anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy (chimérní protilátka C2B8, rovněž známá jako rituximab) se vyrobila kotransfekováním kultur savčích buněk pro expresi genů protilátky a vektory pro expresi genů kódujících různé polypeptidy s aktivitou GnTIII. Nemodifikovaná verze (s nesestrojenými glykosidy) téže protilátky se vyrobila transfekováním savčích buněk pouze vektorem pro expresi protilátky. Transfekované buňky se udržovaly v kultuře alespoň tři dny a vyloučené rekombinantní protilátky se vyčistily z kultivačního média afinítní chromatografií Protein A. Exprese genů kódujících polypeptidy s aktivitou GnTIII neměla podstatný efekt na životaschopnost buněk, růst buněk nebo produkcí protilátek ve vztahu k buňkám neprodukujícím takové polypeptidy.
Vyčištěné protilátky se poté analyzovaly na jejich glykozyiační modely. Tyto protilátky nesou N-připojené oligosacharidy pouze ke zbytku Asp297 oblasti Fc lidského lgG1. Oligosacharidy se enzymaticky odstranily z protilátek působením PNGázyF a následně se analyzovaly MALDI/TOF-MS. S použitím této techniky je možné frakci různých druhů oligosacharidů uvnitř celé původní populace Fc-oligosacharidů, a je možné také připsat struktury různým pikům spektra (Umana, P. et al., Nátuře Biotechnol. 17:176180 (1999)).
Obrázek 1 ukazuje profily MALDI/TOF-MS neutrálních oligosacharidů z rekombinantníeh chimérních protilátek C2B8 anti-CD20 lgG1 produkovaných v buňkách BHK. Tyto buňky byly transfekovány expresním vektorem protilátky pETR1502. obrázky 2 až 4 ukazují odpovídající profily pro tutéž protilátku produkovanou buňkami BHK sestrojenými s nukleovými kyselinami kódujícími polypeptidy s aktivitou GnTIII. Profil na obrázku 2 je výsledkem použití nukleové kyseliny kódující divoký typ GnTIII exprimovaný z vektoru pETR1166. Profil na obrázku 3 je výsledkem použití nukleové kyseliny kódující kódující fúzní polypeptid obsahující N-konec lokalizační domény GnTI připojený k C-konci katalytické domény GnTIII.tento fúzní gen je exprimován z vektoru pETR1425. Profil na obrázku 4 je •Φ φφφφ φ φ φ φφφ φφφ φ φφφ φφ φ φ φφ φφ φφφφ φφ φ φ φφφ φ φφφ φφφ φ φφφφ φ φ φ φφφ φφφ φφφφ φφ φφ* výsledkem použití nukleové kyseliny kódující kódující fúzní polypeptid, obsahující na N-konci lokalizační doménu Golgiho α-manózídázy II (Manil), připojenou ke katalytické doméně GnTIII. Tento fúzní gen byl exprimován z vektoru pETR1506.
Nemodifikovaná protilátka má typický oligosacharidový profil (obr. 1), špiky při poměrech m/z 1485, 1648 a 1810, které jsou konzistentní s dvouvláknovými, jádrově fukózylovanými komplexními oligosacharidy s 0, 1 a 2 galaktózovými zbytky. Podobné profily se nacházejí v oblasti Fc oligosacharidů nesestrojených protilátek lgG1 produkovaných ve standardních savčích průmyslových buněčných liniích, jako jsou CHO a myší myelomové buňky (Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5:813-822 (1995)). Sestrojování buněk produkujících protilátku expresí GnTIII divokého typu vede převážně k rozděleným, jádrově fukózylovaným komplexním oligosacharidům (obr. 2), s píky při poměrech m/z 1689, 1851 a 2014které jsou dvoudílným protějškem plků nedvoudílných oligosacharidů nacházejících se v nemodifikované protilátce. Sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid GnTI-GnTIII, kde katalytická doména GnTIII je lokalizovaná přes Golgiho katalytickou doménu GnTI, rovněž vede k zejména k rozděleným komplexním rozděleným oligosacharidům (povšimněte si píků 1689 a 1851 na obr. 3). Avšak v porovnání s divokým typem Gntlll použití fúze GnTI-GnTIII vede ke zvýšení podílu rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních struktur (porovnejte podíly píků s m/z 1664, 1810, 1826 a 1973 ve vztahu k celku mezi obr. 2 a 3). Syntéza rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních struktur je výsledkem kompetice, pro oligosacharidové substáty modifikované GnTI mezi rekombinantní katalytickou doménou GnTIII a (i) endogenním jádrem, a-1,6-fukózyltransferázou, (ii) Golgiho α-manózidázou II (Manil) a (iii) GnTII, protože jestliže je oligosacharid jednou modifikován dělícím GIcNAc přidaném reakcí katalyzovanou GnTIII, tyto tři další enzymy nemohou dále působit při modifikaci rozdělených oligosacharidů. Proto blokovací působení manózidázy II přidáním rozdělujícícho GLCNAc rovněž účinně blokuje GnTII, protože GnTII působí po směru od Manil biosyntetické cestě N-připojeného ologosacharidu. Píky při m/z 1664 a 1826 jsou nefukózylované zatímco píky při m/z 1810 a 1973 jsou fukózylované. Působení EndoH glykosidázy, která může rozlišovat mezi hybridními a komplexními oligosacharidy (obr. 8A), se použilo pro potvrzení toho, že zvýšení těchto píků je způsobeno zvýšením podílu Fcpřipojených rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních oligosacharidů (viz níže).
Ve kontrastu k jiným nukleovým kyselinám použitým zde, kódujícím aktivitu GnTIII, sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid
ManlI-GnTIII (SEQ ID NO:14) kde katalytická doména je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, vede hlavně k rozděleným nefukózylovaným a rozděleným φ» φφφφ φ » φ φφφ
ΦΦ φφφφ φ φ φ «φφφφ φφφ φ φ φ φφφ φ φ φφφφ · φφφ φφ φφ φ φφ φ φφφ φφφφ φφ φφφ hybridním strukturám (povšimněte si píků s m/z 1664, 1810, 1826 a 1973 na obr. 4). Proto v porovnání s divokým typem GnTIII a s fúzí GnTI-GnTIII (SEQ ID NO:12 a 13) fúze ManilGnTIII je účinnější při syntéze Fc-připojených rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních oligosacharidů (porovnejte podíly píků s m/z 1664 a 1810 ve vztahu k celku mezi obr. 2, 3 a 4). Podíl rozdělených nefukózylovaných FC-oligosacharidů původem z exprese nukleových kyselin kódujících GnTIII divokého typu fúze GnTI-GnTIII a fúze ManlI-GnTlllbyla přibližně 4, 13 a 33 %. Žádné rozdělené protilátky nebyly nedetekovány v nemodifikované (nesestrojené) protilátce.
Zvýšení exprese fúzního konstruktu Manil-GnTIII v buňkách produkujících protilátku vede k dalším zvýšením v podílu rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů. To bylo demonstrováno expresí konstruktu Manil-GnTIII z vektoru (pETR1512) s OriP pro epizomální replikaci v transfekovaných buňkách HEK293-EBNA. O tomto expresním systému je známo, že vede k vysokým úrovním exprese, a byl použit také pro expresi genů protilátky z vektoru pETR1520. Profil oligosacharidů z čištěné nemodifikované protilátky (s nesestrojenými glykosidy) exprimované na vysokých úrovních v tomto systému je ukázán na obr. 5, který opět ukazuje typický oligosacharidový profil s píky nerozdělených fukózylovaných oligosacharidů, majících 0, 1 a 2 galaktózové zbytky (tj. porovnejte obr. 1 a 5, ukazující podobné oligosacharidové profily exprimované v buňkách BHK nebo při vyšších úrovních v buňkách HEH293-EBNA). Sestrojování buněk produkujících protilátku s nukleovou kyselinou kódující fúzi Manil-GnTIII exprimované na vyšších úrovních v tomto systému vedlo k produkci protilátek, kde většina Fc-oliosacharidů byla rozdělená nefukózylovaná (viz obr. 6, kde rozdělené nefukózylované hybridní oligosacharidové píky při m/z 1664 a 1826 dohromady tvoří přes 90 % celkových oligosacharidů).
Jak je uvedeno výše, endoglykosidáza H (EndoH) se použila pro potvrzení určení rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních struktur různých oligosacharidových píků pozorovaných v profilech MALDI. Na obr. 7 jsou ukázány profily MALDI/TOF-MS neutrálních oligosacharidů glykanů rozložených PNGázouF a PNGázouF + EndoH, odvozených od chimérní protilátky anti-CD20 lgG1, produkovaných buňkami HEK293 sestrojenými přeexpresí GnTIII(M2) Pík při m/z 1664 se může připsat dvěma různým glykanům. Jmenovitě nefukózylovanému hybridnímu rozdělenému nebo nefukózylovanému komplexnímu nerozdělenému. Různé struktury vykazují tentýž poměr m/z z důvodu stejného složení monosacharidů (obr. 8b).
Štěpení glykanů, uvolněných PNGázouF, endoglykosidázou H generuje nové struktury s hlavním pikem posunutým od m/z 1664 na 1460 (obr. 7B). Rozdíl koresponduje hmotnosti zbytku GIcNAc. Jak je uveeno výše, EndoH nemůže štěpit oligosacharidy ·· ···· ·· >··· • · · ···· 9 9 9
9 9 9 9 9 9 999 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9
9 999 9999 99 999 komplexního typu. Proto se hlavní pík u m/z 1664 může po rozštěpení endoglykosidázou H připsat nefukózylovanému hybridnímu rozdělenému typu.
Jiné píky, které se mohou připsat komplexním nebo hybridním rozděleným glykanům. U m/z 1810; po rozštěpení endoglykosidázou H pík zmizel, tak se mohou struktury připsat fukózylovanému hybridnímu rozdělenému typu. Odečtením jednoho GIcNAc a jednoho fukózového zbytku (z jádra a-1,6-fukózylovaného zbytku redukujícího konce GIcNAc) z píku s m/z 1810 generuje strukturu o m/z 1460. Zmizení píku u m/z 1502 rozštěpením EndoH (eliminace zbytku GIcNAc) a objevení píku u m/z 1298 demonstruje, že pík 1502 se může připsat nefukózylovanému hybridnímu rozdělenému typu. Zmizení píku u m/z 1647 po rozštěpení EndoH demonstruje, že tento pík je fukózylovaná hybridní rozštěpená struktura. Odstranění jednoho GIcNAc a jednoho fukózového zbytku generuje strukturu o m/z 1298. Pík u m/z 1826, nefukózylovaný hybridní rozdělený typ, se rozštěpil EndoH. To generovalo strukturu o m/z 1622. Pík u m/z 1053 se po rozštěpení EndoH může připsat typu s vysokým obsahem manózy (múz 1257), rozloženému EndoH. Pík u m/z 1689 (komplexní rozdělený) není ovlivněn štěpením EndoH, jak se očekávalo. Ve shrnutí dat získaných v tabulce 1 jsme získali závěr, že 88 % oligosacharidových struktur nese rozdělující GIcNAc, z nichž 60 % jsou nefukózylované hybridní rozdělené struktury, 22 % fukózylované hybridní rozdělené a 6 % fukózylované komplexní rozdělené oligosacharidové struktury.
·· »·♦· • · • * ·· ·· ··»· * · ·· • · · »· • · » • · *
4· ·♦·
Tabulka 1. Určení oligosacharidů
m/z Možné struktury Relativní % před EndoH Očekávaný m/z po EndoH Pozorovaný m/z po EndoH Relativní % po EndoH Určení
1256 vysoká manóza 9 1053 1053 11 vysoká manóza (9 %)
1502 nefuk. hybrid rozdělený nebo nefuk. komplex 7 1298 nebol502 1298 13 nefuk. hybrid rozdělený (7 %)
1647 fuk. hybrid rozdělený nebo fuk. komplex 7 1298 nebo 1647 1298 13 fuk. hybrid rozdělený (7 %)
1664 nefuk. hybrid rozdělený nebo nefuk. komplex 49 1460 nebo 1644 1460 60 nefuk. hybrid rozdělený (49 %)
1689 fuk. komplex rozdělený 3 1689 1689 5 fuk. komplex rozdělený (3 %)
1810 fuk. hybrid rozdělený nebo fuk. komplex 15 1460 nebo 1810 1460 1810 60 2 fuk. hybrid rozdělený (13 %) a fuk. komplex (2 %)
1826 nefuk. hybrid rozdělený 4 1662 1662 7 nefuk. hybrid rozdělený (4 %)
1851 fuk. komplex rozdělený 3 1851 1851 2 fuk. komplex rozdělený (3 %)
1972 fuk. hybrid rozdělený 3 1662 1662 7 fuk. hybrid rozdělený (3 %)
Hmotnostní poměry (v mo árních frakcích v %):
a) píky u m/z 1502 a 1647: 7 + 7 % = 14 % (očekáváno). Rozštěpení EndoH pro oba píky dalo m/z 1298 (zjištěno 13 % po EndoH)
b) píky u m/z 1664 a 1810: 49 + 13 % = 62 %. EndoH dala m/z 1460 (zjištěno 60 %)
c) píky u m/z 1826 a 1972: 4 + 3 % = 7 %. EndoH dala 1622 (7 %)
Shrnutí: Celkové relativní zastoupení struktur nesoucích rozdělující GIcNAc: 88 %
Nefukózylované hybridní rozdělené: 60 %
Fukózylované hybridní rozdělené: 22 %
Fukózylované komplexní rozdělené: 6 % ·« «9*9 • 9 9
9 9
99 99 »999
9 9 9 9 9
9 9 9 499
9 9
9
9 9 9 9
999 9999 99 999
Výše uvedené údaje (obr. 1 až 6) ukazují, že úroveň exprese GnTIII i konkrétní lokalizační doména, která je použita k zacílení katalytické domény GnTIII na Golgiho aparát mají vliv kompetici substrátů modifikovaných GnTI mezi rekombinantní katalytickou doménou GnTIII a endogenní jádrovou a-1,6-fukózyltransferázou a enzymy Manil a GnTII. V této kompetici převládá vyšší exprese GnTIII, což vede k vyšším úrovním rozdělených hybridních a rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů a k současnému snížení úrovní rozdělených komplexních a rozdělených fukózylovaných oligosacharidů. To bylo také zpozorováno dříve pro divoký typ GnTIII (Umana, P. et al., Nátuře Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Avšak navzdory tomu, že vede k podobným úrovním rozdělených oligosacharidů, lokalizace katalytické domény GnTIII přes lokalizační domény GnTI nebo Manil vedla k efektivnější kompetici v porovnání s divokým typem GnTIII pro oligosacharidové substráty modifikované GnTI, ve srovnání s enzymy endogenní jádrovou a-1,6-fukózyltransferázou, Manil a GnTII.
Vyšší efektivita fúze GnTI-GnTIII ve srovnání s divokým typem GnTIII pro syntézu rozdělených hybridních a rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů se může vysvětlit dřívější Golgiho distribucí, směru transportu glykoproteinového substrátu cis-trans od GnTI vzhledem k GnTIII. Výborné Golgiho distribuce GnTI a Manil byly určeny dříve kvantitativní imunoelektronovou mikroskopií (Rabouille, C. et al. J. Cell Sci. 108:1617-27 (1995)). Oba enzymy distribuují společně podél Golgiho aparátu, jsou lokalizovány hlavně ve středních a trans nádržkách Golgiho aparátu, s vyššími úrovněmi ve středních ve srovnání s trans k trans nádržkám. Výborná kvantitativní prostorová distribuce a-1,6 jádrové fukózyltransferázy, GnTII a a GnTIII divokého typu nebyla dosud zjištěna. Avšak výše uvedené nevysvětluje, proč je fúze ManlI-GnTIII podstatně efektivnější než fúze GnTI-GnTIII pro syntézu rozdělených hybridních a rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, ačkoliv jak Manil, tak GnTI mají identické prostorové distribuce podél Golgiho substruktur.
Vyšší efektivita fúze ManlI-GnTIII ukazuje na existenci relativně organizovaných substruktur funkční glykosylační reakce uvnitř fyzických substruktur středních a trans Golgiho nádržek. O takzvaných „středových Golgiho glykosylačních enzymech“ GnTI, GnTII a Manil se věří, že existují v Golgiho aparátu jako komplexy o vysoké molekulární hmotnosti. Avšak jestliže lokalizační doména dovolí těmto enzymům tvořit část těchto komplexů, bylo by to stejné pro fúze GnTI- a ManlI-GnTIII. Exprese rekombinantní fúze GnTI-GnTIII nevede k přemístění endogenního enzymu GnTI divokého typu v žádném rozsahu podstatném pro syntézu Fc-oligosacharidů, protože všechny konstrukty GnTIII použité zde vedly k většině oligosacharidů modifikovaných zároveň reakcemi GnTI a GnTIII.
Naše údaje ukazují, že na základě lokalizačních domén Manil dochází k přesnějšímu funkčnímu párování mezi katalytickými doménami endogenní GnTI a rekombinantní fúzí
ManlI-GnTIII. O organizovaném párování enzymů katalyzujících následné reakce
«· ···· • · · • · ··· ·· • · · ·· • · · · • · * • ···· ·· ··· v biosyntetícké cestě, v cestě, která upřednostňuje přenos produktu první reakce na druhé katalytické místo ve vztahu k difúzi takového enzymu pryč od enzymů, je známo. Ze k němu dochází v jiných biosyntetíckých cestách, jako je glykolýza a biosyntéza polyketidu. O GnTI a Manil bylo oznámeno, že tvoří „příbuzné oligomery“, přinejmenším když se jeden z těchto enzymů relokalizuje v endoplazmatickém retikulu (Nilsson, T. et al. EMBO J. 13 (3). 562-74 (1994)). O páru nabitých aminokyselinových zbytků v každé z kmenových oblastí těchto enzymů bylo zjištěno, že jsou kritické pro toto příbuzenské rozeznání. Zbytky GnTI mají opačný náboj než zbytky Manil. Identifikovali jsme podobné zbytky na ekvivalentních pozicích kmenových oblastí jiných Golgiho glykosylačních enzymů zahrnutých v této části biosyntetícké cesty N-připojených oligosacharidů, jmenovitě v a-1,6 jádrové fukózyltransferáze, (stejné náboje jako v GnTI namísto komplementárních nábojů v případě Manil), Maní a GnTII. Identifikovali jsme také, že tyto zbytky jsou zachovány přes druhy. Ačkoliv bylo navrženo, že tyto zbytky nejsou podstatné pro inkorporaci do komplexů o vysoké molekulární hmotnosti tvořených enzymy nebo dokonce pro Golgiho lokalizaci (Opat, A. S. et al. J. Biol. Chem. 275 (16):1836-45 (2000)), je možné, že jsou zahrnuty v jemnějším párování katalytických domén během biosyntézy oligosacharidů. Takové párování nemusí být ireverzibilní, ale může být zprostředkováno přechodnými dynamickými interakcemi mezi enzymy. Také mohou existovat další determinanty pro párování kdekoliv v kmeni katalytické oblasti. Avšak jakýkoliv příspěvek ke specifickému párování GnTI-Manll z katalytické domény Manil by byl ztracen v rekombinantní fúzi nesoucí katalytickou doménu GnTIII.
Obrázky 9 až 11 ukazují zvýšenou cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC), která je výsledkem nadměrné exprese nukleových kyselin kódujících polypeptidy s aktivitou GnTIII, která je lokalizovaná ke Golgiho aparátu přes různé lokalizační domény v buňkách produkujících protilátku. Zvýšená ADCC, která je výsledkem exprese rekombinantního polypeptidu s aktivitou GnTIII a lokalizovaného v Golgiho aparátu přes Golgiho lokalizační doménu GnTI, je ukázána na obr. 9. Oligosacharidový profil kontrolní protilátky použité pro stanovení ADCC z obr. 9 je ukázán na obr. 1. Oligosacharidový profil protilátky se sestrojenými glykosidy použité pro stanovení ADCC z obr. 9 je ukázán na obr. 3. Zvýšená ADCC, která je výsledkem exprese rekombinantního polypeptidu s aktivitou GnTIII a lokalizovaného v Golgiho aparátu přes glykosidázu Manil, Golgiho lokalizační doména je ukázána na obr. 10. Oligosacharidový profil kontrolní protilátky použité pro stanovení ADCC na obr. 10 je ukázán na obr. 5. Oligosacharidový profil protilátky se sestrojenými glykosidy použité pro stanovení ADCC na obr. 10 je ukázán na obr. 6.
Obr. 11 ukazuje, že exprese rekombinantního polypeptidu s aktivitou GnTIII a lokalizovaného v Golgiho aparátu přes Golgiho lokalizační doménu vede ke zvýšené aktivitě
ADCC ve vztahu k použití polypeptidu GnTIII divokého typu se svou vlastní lokalizační
·· 9999 • ·· 99 • 999
• 9 9 99 · 9 9 9 •
9 • 9 9 9 9 9 999
• 9 9 9 9 • • 9
·· • 999 99 99 • · 999
doménou GnTIH. Oligosacharidový profil protilátky s glykosidy sestrojenými expresí GnTIH divokého typu a použité pro stanovení ADCC na obr. 11 je ukázán na obr. 2. Oligosacharidový profil protilátky s glykosidy sestrojenými expresí fúzního polypeptidů s aktivitou GnTIH, lokalizovaného v Golgiho aparátu přes Golgiho lokalizační doménu, a použité pro stanovení ADCC na obr. 11 je ukázán na obr. 4. Tyto údaje také ukazují, že protilátky s rozdělenými oligosacharidy, včetně rozdělených hybridních a rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, mají zvýšenou aktivitu ADCC ve srovnání s protilátkami s komplexními fukózylovanými nerozdělenými oligosacharidy. Mělo by se poznamenat, že všechny z těchto rozdělených oligosacharidů aktivnějších protilátek použitých ve stanovení ADCC na obr. 10 jsou rozdělené nefukózylované hybridní oligosacharidy. Jak bylo uvedeno dříve, použití fúzního polypeptidů s aktivitou GnTIH, lokalizovaného v Golgiho aparátu přes lokalizační doménu Manil, vede k efektivnější syntéze nefukózylovaných rozdělených oligosacharidů a obr. 11 ukazuje, že protilátky se zvýšenými úrovněmi těchto rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů jsou aktivnější v ADCC ve srovnání s protilátkami s nižšími úrovněmi těchto oligosacharidů. Zvyšování aktivity ADCC je v korelaci se zvyšováním frakce těchto rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů v populaci oligosacharidů spojených s Fc, a je pozorováno rozsáhlé zvýšení, jestliže je tato frakce vyšší než 15 až 20 %.
O zabíječských buňkách (NK) je známo, že jsou významnými zprostředkovateli ADCC. Buňky nesou na svém povrchu aktivující Fcy receptor lila, rovněž známý jako CD16a. Navázání oblasti Fc protilátek navázaných na cílové buňky na receptory FcyRIII buněk NKje podstatné pro propojení těchto receptorů na buňkách NK a následnou indukci ADCC. Proto je důležité vyhodnotit navázání protilátek produkovaných zde popsanými způsoby na receptory Fc, zejména na receptory v jejich přirozené formě, ve které se projevují u lidských imunoefektorových buněk. Obrázek 12 ukazuje, že protilátky se sestrojenými glykosidy produkované expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid s aktivitou GnTIH v buňkách produkujících protilátky mají zvýšenou vazebnou afinitu na lidský aktivující receptor FcyRIIIA. Jak je uvedeno výše pro stanovení ADCC, tyto protilátky mají zvýšenou úroveň rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, které vznikají expresí fúzního polypeptidů s aktivitou GnTIH v buňkách produkujících protilátku. Buňky NK použité v tomto stanovení byly z dárce genotypu, který neexprimoval receptor FcyRIIc ve svých buňkách NK (Meteš, D. et al.
J.Immunol. Methods 258 (1-2):85-95 (2001)). Proto jediný receptor Fc na povrchu těchto buněk je aktivující receptor FcyRIIIA. Obr. 13 ukazuje, že vazebným stanovením se měří specifická vazebná afinita k tomuto receptoru. To je ukázáno kompeticí s fragmentem protilátky specificky blokujícím FcyRIII (fragment 3G8 Fab2).
Silný důkaz účinku zesílených interakcí Fc-FcR na výsledek protinádorové terapie pochází z korelace, zjištěné u lymfomových pacientů užívajících rituximab, mezi účinností a genotypem receptoru FcyRIIIa se zvýšenou afinitou (Cartron, G. et al. Blood 99 (3):754-8 (2002)). To byl jediný parametr nalezený pro korelaci s obrovsky zesílenou mírou objektivní odpovědi a zvýšeným podílem molekulárních odpovědí. Zvýšená účinnost díky zvýšeným interakcím FcyRIIIA-Fc se může odvodit z funkcí vykonávaných různými typy imunitních buněk, včetně zabíječských buněk (NK), makrofágů, monocytů a dendritických buněk. Propojení aktivujících receptorů FcyRIIIA na buňkách NK, makrofágách a monocytech může vést k lýzi nádorových buněk ADCC (dalece se očekává, že se jedná o hlavní zabíječský mechanismus závislý na FcR in vivo) (Maloney, D. G. et al.Semin. Oncol. 29(1 Suppl. 2):2-9 (2002), Amigorena S., J Exp. Med. 195(1) :F1 -3 (2002)) a také k buněčné fagocytóze závislé na protilátce (Hazenbos, W. L. et al. J. Immunol. 161(6):3026-32(1998), Reff, Μ. E. a Heard, C.Crit Rev Oncol Hematol. 40(1) :25-35 (2001)) a k uvolňování eytokinů v blízkostí nádorových buněk (Carson, W. E. et al. Eur. J. Immunol. 31:3016-3025 (2001)). Tyto cytokiny mohou naopak vést k přímým cytotoxickým účinkům na nádorových buňkách, k antiangiogenním účinkům, které inhibují růst nádorů zbavením kyslíku a živin, a ke zvýšené prezentaci nádorových antigenů jako část imunitní odpovědi zprostředkované T-buňkami proti nádorovým buňkám. Dendritické buňky jsou rozhodující pro prezentaci antigenů T-buňkám, a propojení FcyRIHA na jejich povrchu (tj. z umírajících buněk s navázaným antigenem původně atakovaných in vivo ADCC) může vést ke zvýšenému dozrávání dendritických buněk, absorpci antigenu a prezentaci T-buňkám, a ke zkříženému vyzbrojení cytotoxických T-buněk, které jsou potenciálně velmi účinným mechanismem pro aktivaci protinádorové imunity (Amigorena S., J. Exp. Med. 195(1 ):F1-3(2002), Kalergis, A. M. a Ravetch, J. V. J. Exp. Med. 195 (12):1653-1659 (2002), Selenko, N. et al. J. Clin. Immunol. 22(3):124-130 (2002)). Propojení protilátek navázaných na cílové buňky s receptory Fc na imunoefektorových buňkách může také vést ke zvýšenému přímému zabíjení cílových buněk, například apoptózou indukovanou propojením molekul cíl-antigen zprostředkované molekulami protilátky (Reff, Μ. E. a Heard, C. Crit Rev Oncol Hematol. 40(1):25-35 (2001), Cragg, M. S. et al. Blood 101 (3): 1045-1052 (2003)). Ze všech těchto imunoefektorových buněk pouze buňky NK mají na svém povrchu samotné aktivující receptory Fcy. U j iných typů buněk je aktivující FcyRIII přítomen společně s inhibujícím receptorem FcyRIIb, a indukce protinádorových efektorových funkcí je výsledkem pozitivní bilance aktivujících signálů nad inhibičními.
Obr. 15 ukazuje, že zvýšená vaznost receptoru Fcje selektivní pro aktivující receptor ve srovnání s inhibujícím FcyRIIb. Taková selektivita je důležitá pro efektorové funkce prováděné imunitními buňkami jinými než jsou buňky NK, jak je vysvětleno výše. Navíc zvýšení vaznosti dosažené sestrojením glykosidů v oblasti Fc protilátky, za použití metod popsaných zde, je větší než to, které je pozorováno přirozeně pro homozygotní • · · ·
pacienty/donory s genotypem vysoké afinity FcyRIII A, kteří dostali standardní nemodifikovanou protilátku (obr. 16), a kteří již přišli do styku se zvýšenou účinností protirakovinných protilátek (Cartron, G. et al. Blood 99 (3): 754-8 (2002)). Vazebná doména aktivujícího receptorů FcyRIIIB je téměř identická s doménou FcyRIIIA. Proto výše uvedené údaje také ukazují, že protilátky se sestrojenými glykosidy popsané zde mohou vést ke zvýšeným efektorovým funkcím zprostředkovaným efektorovými buňkami vykazujícími FcyRIIIB, jako jsou polymorfonukleární buňky (PMN), včetně uvolnění toxických produktů a fagocytózy (Reff, Μ. E. a Heard, C. Crit Rev Oncol Henaatol. 40 (1):25-35 (2001), Daeron, FM. Annu. Rev. lmmu7701. 15:203-34 (1997), Ravetch, J. V. a Bolland S. Annu. Rev. Immunol. 19:275-90 (2001)).
Obr. 18 ukazuje oligosacharidový profil protilátky anti-CD20 produkované buňkami BHK rostoucími v suspenzi a sestrojenými pro konstitutivní expresi vysoké úrovně jak rekombinantní protilátky, tak fúzního polypeptidu s aktivitou GnTIII. Oligosacharidový profil vykazuje zvýšené úrovně rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních oligosacharidů pro protilátku z buněk sestrojených s fúzní GnTIII (viz také tab. 2). Tyto struktury se nenalézají v protilátkách s nesestrojenými glykosidy, produkovanými BHK buňkami s nesestrojenými glykosidy (viz obr. 1). Sestrojené buňky exprimující vykazovaly normální růst v suspenzi a dobrou produktivitu protilátek.
Relativní procentické zastoupení oligosacharidů v monoklonální protilátce se sestrojenými glykosidy, produkovaných stabilní buněčnou linií BHK-1502-28-11 je ukázána v tab. 2.
Tabulka 2: Relativní procentické zastoupení píků získaných pomocí MALDI/TOF-MS
Pík (m/z) Procentické zastoupení
1 1257 2,5 %
2 1486 2,8 %
3 1647 6%
4 1664 22,30 %
5 1680 2,5 %
6 1689 4,8 %
7 1705 3%
8 1810 27,8 %
9 1826 10%
10 1851 7,5 %
11 1972 9%
12 2012 1,75%
• * · • · · · • ·
Celkové rozdělené: 88,6 % (4+5+6+7+8+9+10+11 + 12)
Celkové nefukózylované rozdělené: 37,8 % (4+5+7+9)
Celkové fukózylované rozdělené: 50,8 % (6+8+10+11+12)
Komplexní rozdělené: 17 % (6+7+10+12)
Hybridní rozdělené: 71,6 % (4+5+8+9+11)
Analýza oligosacharidů ukázala, že 88,6 % struktur nese rozdělující zbytek GIcNAc,
50,8 % je fukózylováno a 37,8 % není fukózylováno. Rozštěpení oligosacharidů uvolněných PNGázouF pomocí endoglykosidázy H ukázalo, že většina získaných píků je hybridního rozděleného typu (obr. 19). Obr. 20 ukazuje zvýšenou vazebnou afinitu protilátky se sestrojenými glykosidy, produkované buněčnou linií BHK-1502-28-11, k aktivujícímu receptoru Fc FcyRIIIA na lidských buňkách NK. Buněčné linie rostoucí v suspenzi a s konstitutivní stabilní expresí jak genů protilátky, tak fúzního polypeptidu GnTIII, jsou ideální pro produkcii terapeutických protilátek ve velkém měřítku. S použitím standardních způsobů sestrojování buněk sestrojování glykosidů se může implementovat buď introdukcí fúzního genu GnTIII do buněčné linie obsahující geny protilátky, nebo zavedením genů protilátky do buňky obsahující fúzní gen GnTIII (produkční buněčná linie s předem sestrojenými glykosidy) nebo zavedením genu protilátky a fúzního genu GnTIII zároveň.
Protilátka anti-CD20 produkované v buňkách sestrojených pro expresi nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid s aktivitou GnTIII a lokalizované v Golgiho aparátu přes lokalizační doménu Manil s vysokou úrovní se testovala také na lýzi zprostředkovanou komplementem (CML), odlišnou efektorovou funkci, která není závislá na receptorech Fc imunoefektorových buněk. Obrovská většina oligosacharidů této protilátky se sestrojenými glykosidy je rozděleného hybridního nefukózylovaného typu. Snížená aktivita CML byla pozorována pro tuto protilátku anti-CD20 ve srovnání s nemodifikovanou protilátkou (obr. 21). Protilátky se zvýšenou ADCC, ale se sníženou CML, mohou být vhodné pro některé aplikace, například pro snížení vedlejších účinků, například zánětu cév v místě nádoru, zprostředkovaném CML. Byly pozorovány jiné významné vedlejší účinky zprostředkované CML pro terapii protilátkami anti-CD20 (van der Kolk L.E. et al. Br J Hematol. 115(4):80711(2001)). Avšak výše uvedené olígosacharidové profily také ukazují, že je také možné sestrojit buňky produkující protilátky pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII na střední úrovni exprese, které vede ke středním úrovním rozdělených hybridních nefukózylovaných oligosacharidů (vyšším než 15 %), ale s podstatnou frakcí komplexních oligosacharidů uvnitř populace oligosacharidů Fc protilátky se sestrojenými glykosidy. Takové komplexní oligosacharidy jsou spojeny s normální neredukovanou úrovní CML. Proto údaje ukazují, že • · φ · φ ·
ΦΦΦ φ
φφφφ φφφ φφφφ *· φφφ protilátky se zvýšenou ADCC mohou být produkovány tímto způsobem, který může zachovat velmi podobné úrovně aktivity CML ve srovnání s protilátkami s nesestrojenými glykosidy.
Druhá chimérní protilátka IgG, C225, rovněž známá jako cetuximab, která rozpoznává lidský receptor faktoru epidermálního růstu (EGFR), byla vyrobena se sestrojenými glykosidy způsoby popsanými zde. Obr. 22 ukazuje profily oligosacharidů nemodifikované protilátky anti-EGFR C225 a verzi se sestrojenými glykosidy téže protilátky. Druhá verze byla produkována v buňkách exprimujících nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid s aktivitou GnTIII a lokalizovanou v Golgiho aparátu přes lokalizační doménu Manil. Obr. 23 ukazuje zvýšenou ADCC protilátky anti-EGFR, pocházející z tohoto sestrojování glykosidů. Protilátky se sestrojenými glykosidy vyrobené způsoby popsanými zde a mající zvýšenou ADCC a zvýšenou vazebnou afinitu pro aktivaci receptorů Fc jsou slibné molekuly po léčení rakoviny a autoimunitních chorob protilátkami, protože by měly vést ke zvýšené efektivitě těchto terapií, vztaženo k odpovídající nemodifikované verzi (s nesestrojenými glykosidy) těchto protilátek. Navíc by mělo být možné snížit terapeutické dávky pro protilátky se sestrojenými glykosidy ve srovnání s nemodifikovanými, a to by pozitivně ovlivnilo ekonomiku výroby protilátek.
PŘÍKLAD 2
Léčení trombocytopénie zprostředkované imunitou v pacientovi s chronickou chorobou štěp versus hostitel
Autoimunitní trombocytopénie u chronické choroby štěp versus hostitel představuje příklad disregulace b-buněk, vedoucí ke klinické chorobě. Pro léčení trombocytopénie zprostředkované imunitou v subjektu s chronickou chorobou štěp versus hostitel se subjektu podává chimérní monoklonální protilátka anti-CD20 připravená způsoby podle předmětného vynálezu a mající zvýšenou ADCC, jak je popsáno v publikaci Ratanatharathorn, V. et al., Ann. Intern. Med. 133 (4) :275-79 (2000) (jejíž celý obsah je zde zahrnut svým odkazem). Konkrétně se podává subjektu týdenní infúze protilátky 375 mg/m2 po čtyři týdny. Protilátková terapie způsobuje zřetelné vyčerpání B-buněk v periferální krvi a snížené úrovně protilátky spojené s destičkami.
PŘÍKLAD 3
Léčení kritické aplasie čistě červených buněk zprostředkované imunitou a hemolytické anémie • · · ·
Získaná aplasie čistě červených buněk (PRCA) zprostředkovaná imunitou je vzácná choroba, často spojená s jinými autoimunitními jevy. Pro léčení získané aplasie čistě červených buněk zprostředkované imunitou v subjektu se subjektu podává chimérní monoklonální protilátka anti-CD20 připravená způsoby podle předmětného vynálezu a mající zvýšenou ADCC, jak je popsáno v publikaci Zecca, M. et al., Blood 12 : 3995-97 (1997) (jejíž celý obsah je zde zahrnut svým odkazem). Konkrétně se podávají subjektu s PRCA a hemolytickou anémií dvě dávky protilátky 375 mg/m2 týdně. Po terapii protilátkami se započne dodatečné léčení intravenózním imunoglobulinem. Toto léčení způsobuje zřetelné vyčerpání B-buněk a podstatné snížení počtu retikulocytů doprovázené zvýšenými úrovněmi hemoglobinu.
PŘÍKLAD 4
Materiály a metody
1. Konstrukce fúzních expresních vektorů GalT
Vektor pro konstitutivní expresi GalT
Pro konstrukci expresního vektoru GalT se amplifikuje cDNA GalT z knihovny cDNA (Clontech) pomocí PCR. C-koncový epitopový přívěsek c-myc se přidá bezprostředně po směru stop kodonu genu (aminokyselinová sekvence: PEQKLISEEDL) pro pozdější vhodnou detekci GalT pomocí Western blot. Po potvrzení správné sekvence GalT se gen vloží pod kontrolu promotoru MPSV a přidá se syntetický králičí β-globinový polyadenylační signál. Finální expresní vektor GalT rovněž obsahuje separátní rezistenci na puromycin pro selekci, s genem rezistence na puromycin také pod kontrolou promotoru MPSV a syntetického králičího β-globinového polyadenylačního signálu.
Náhrada aminokyselin kódujících lokalizační doménu GalT aminokyselinami kódujícími lokalizační doménu lidskéGnTI
Konstrukce tohoto hybridního genu galaktózyltransferázy se provádí například překrýváním reakcí PCR, vedoucím k plazmidu obsahujícímu fúzi GnTI-GalT pod kontrolou promotoru MPSV a kazety rezistence k puromycinu pro selekci.
Náhrada aminokyselin kódujících lokalizační doménu GalT aminokyselinami kódujícími lokalizační doménu lidské manózidázy II • · · · • · ·
9 9 9
9 9
9 9
99999 99 9 99
Provede se konstrukce expresního genu GalT. gen ManlI-GalT pod kontrolou promotoru MPSV.
Kombinace hybridního fúzního genu ManlI-GalT s replikačním zdrojem oriP z viru
Epstein-Barrové
Fragment DNA s oriP se subklonuje, jak je popsáno výše v příkladu 1, do hybridního expresního vektoru ManlI-GalT popsaného výše.
Kombinace hybridního fúzního genu ManlI-GalT a zkráceného markerového genu buněčného povrchu
Expresní vektor se modifikuje pro dodatečnou expresi zkráceného markerového genu buněčného povrchu. Stručně se expresní kazeta hybridního fúzního genu ManlI-GalT konvertuje z monocistronické na bicistronickou expresní kazetu zavedením prvku polioviru IRES po směru od stop kodonu fúze ManlI-GalT, následovaným cDNA kódující zkrácený lidský protein CD4 (obsahující lidskou leader sekvenci pro sekreci, následovanou transmembránovou a extracelulární doménou).
3. Transfekce savčích buněk expresními vektory fúzním GalT a protilátky
Transfekce buněk BHK
Exponenciálně rostoucí buňky (životaschopnost 90 - 95 %) se kultivovaly, sklidily a následně transfekovaly, jak je popsáno v příkladu 1. Pro produkco protilátek se sestrojenými glykosidy se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátky a druhým pro expresi fúzního polypeptidů GalT v poměru 3:1.
Transfekce buněk HEK293-EBNA
Exponenciálně rostoucí buňky HEK293-EBNA se transfekují, jak je popsáno v příkladu 1. Pro produkci protilátek se sestrojenými glykosidy se buňky kotransfekují dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátky a a druhým pro expresi fúzního polypeptidů GalT v poměru 4:1.5. den po transfekci se supernatant sebere, centrifuguje se 5 minut při 1200 ot/min, následováno druhou centrifugací 10 min. při 4000 ot/min a skladuje se při 4 °C.
Výsledný plazmid obsahuje hybridní
Generování stabilní savčí buněčné linie exprimující rekombinantní protilátku anti-CD20 a fúzní GalT ·· ····
Klon BHK-1502-28, konstitutivně exprimující geny monoklonální protilátky anti-CD20 a geny rezistence k neomycinu, se transfekuje expresním vektorem elektroporací. Vektor dovoluje konstitutivní expresi genu ManlI-GalT a zkrácenou formu lidského CD4, který je exprimován v závislosti na IRES. Vektor dovoluje konstitutivné expresi genu ManlI-GalT a zkrácené formy lidského CD4, jehož exprese je závislá na IRES. Vektor také obsahuje genovou expresní kazetu rezistence k puromycinu. Nejprve se selektují klony rezistentní na puromycin, aby se získala sada klonů, které chromozomálně integrovaly vektorovou DNA. U klonů se poté zjistí povrchová exprese zkrácené CD4 (tCD4), která slouží jako markér úrovně exprese expresní jednotky bicistronického genu Manll-GalT+CD4. Produkce rekombinantní protilátky selektovaných klonů se ověří použití stanovení ELISA.
Transfekce a následné stanovení úrovně exprese tCD4 se provede tak, jak je popsáno v příkladu 1.
4. Produkce a purifikace nemodifikované protilátky a protilátky se sestrojenými glykosidy
V případě buněk BHK, transfekovaných expresním vektorem protilátky, nebo kotransfekovaných expresním vektorem protilátky plus fůzním expresním vektorem GalT, se sbírá kultivační supernatant po kultivaci transfekovaných buněk 96 hodin po transfekci. V závislosti na očekávané produktivitě se pro stejný vektor provede několik (10 - 15) elektroporací.
V případě buněk HEK293-EBNA transfekovaných expresním vektorem protilátky, nebo kotransfekovaných expresním vektorem protilátky plus fůzním expresním vektorem GalT, se kultivační médium nahradí čerstvým kultivačním médiem přibližně 16 hodin po transfekci a druhé médium se poté sbírá po kultivaci transfekovaných buněk po dalších 120 hodin.
Pro stabilní buněčnou linii BHK-1502-28-11 se kultivační médium naočkuje 500 000 buněk/ml a supernatant se sbírá po 4 dnech kultivace.
Purifikace protilátky ·· φφφφ
φφ φφφφ • · φ • · · · · • · φ φ φ φ φ φ φ φφφ
Monoklonální protilátka se purifikuje z kultivačního supernatantu s použitím dvou následných chromatografických stupňů, chromatografie Protein A a kationtové iontoměničová chromatografie, jak je popsáno v příkladu 1.
5. Analýza oligosacharidů
Oligosacharidy se enzymaticky odštěpí z protilátek rozkladem PNGázou F, kde se protilátky buď imobilizují na membráně PVDF, nebo v roztoku.
Výsledný roztok po štěpení, obsahující uvolněné oligosacharidy, se buď připraví přímo pro analýzu MALDI/TOF-MS, nebo se dále štěpí glykosidázou EndoH před přípravou vzorku na analýzu MALDI/TOF-MS. Způsob uvolnění oligosacharidů pro protilátky imobilizované na membráně PVDF a způsob uvolnění oligosacharidů pro protilátky v roztoku se prováděly tak, jak je popsáno v příkladu 1.
Použití štěpení endoglykosidázou H na oligosacharidy uvolněné PNGázou F pro určení struktur hybridních qalaktózylovaných oligosacharidů vzhledem k neutrálním oligosacharidovým pikům MALDI/TOF-MS
Oligosacharidy uvolněné PNGázouF se následně štěpí endoglykosidázou H (EC 3.2.1.96), jak je popsáno v příkladu 1.
MALDI/TOF-MS
Vzorky obsahující enzymatické výtažky, obsahující uvolněné oligosacharidy, se připravily a následně analyzovaly na hmotovém spektrometru MALDI/TOF-MS, jak je popsáno v příkladu 1.
6. Příprava a izolace buněk
Mononukleární buňky periferální krve (PBMC) se připravily pomocí Hisopaque-1077 (Sigma Diagnostics lne., St. Louis, MO63178, USA) v podstatě podle instrukcí výrobce a protokolu popsaného v příkladu 1.
Lidské buňky NK se izolují z PBMC aplikací negativní selekční procedury, jak je popsána v příkladu 1.
8. Stanovení ADCC ·< 999 0
PBMC nebo NK jako efektorové buňky se připraví jak je popsáno výše a stanoví se jejich schopnost zprostředkovat cytotoxicitu ve stanovení celulární cytotoxicíty závislé na protilátce (ADCC), jak je popsáno v příkladu 1.
9. Navázání FcyRIIIA na buňky NK a navázání FcyRIIb na lymfomové buňky Ráji
Navázání FcyRIIIA na čerstvě izolované buňky NK a navázání FcyRIIb na lymfomové buňky Ráji se určí, jak je popsáno v příkladu 1.
10. Stanovení cytotoxicíty závislé na komplementu
Stanovení cytotoxicíty závislé na komplementu se provádějí s použitím zředění protilátek, jak je popsáno v příkladu 1.
Výsledky a diskuse
Stanovení se provádějí tak, aby se demonstroval vliv exprese polypeptidů kódovaných geny s aktivitou GalT na životaschopnost buněk, růst buněk nebo produkci protilátek ve vztahu k buňkám neprodukujícím takové polypeptidy.
Vyčištěné protilátky se analyzují na jejich glykosylační profil pomocí MALDI/TOF-MS, jak je popsáno v příkladu 1. S použitím této techniky je možné určit podíl různých druhů oligosacharidů z celku, původní populaci oligosacharidů Fc, a je také možné přiřadit struktury různým pikům ve spektru (Umana, P. et al., Nátuře Biotechnol. 17: 176-180 (1999)).
Určí se oligosacharidový profil nemodifikované protilátky. Specificky se určí, jestli sestrojení buněk produkujících protilátku expresí GalT divokého typu vede zejména ke galaktózylovaným, v jádru fukózylovaným komplexním dvouvláknovým oligosacharidům. Určí se také, jestli sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fúzni polypeptid GnTI-GalT, kde katalytická doména GalT je lokalizované přes Golgiho doménu GnTI, vede hlavně ke galaktózylovaným komplexním dvouvláknovým oligosacharidům ve vztahu k divokému typu GalT. Jestliže se syntetizují galaktózylované nefukózylované a galaktózylované hybridní struktury, mohou být výsledkem kompetice mezi GalT a jinými galaktózyltransferázami nebo glykosidázami. Očekává se, že jakmile je oligosacharid modifikován galaktózou reakcí katalyzovanou GalT, pak nemohou a-1,6fukózyltransferáza, Golgiho α-manózidáza II (Manil) a GnTII dále působit modifikaci galaktózylovaných oligosacharidů.
• 4 ···· · ·· ·· ···· • · · · · · · 8 · · «•φ · · «··«· • ' · ♦ · ···· · ··· · · · * * ·· « ··« ···· ·· ··♦
Štěpení glykosidázou EndoH, které může rozlišit mezi hybridními a komplexními oligosacharidy, se používá pro vyhodnocení podílu galaktózylovaných nefukózylovaných a galaktózylovaných hybridních oligosacharidů, připojených k Fc.
Prováděly se testy, aby se určilo sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid ManlI-GalT, kde katalytická doména GalT je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, což vede zejména ke galaktózylovaným nefukózylovaným a galaktózylovaným hybridním oligosacharidům. Určovalo se specificky, zda fúze ManlI-GalT je účinnější v syntéze galaktózylovaných nefukózylovaných a galaktózylovaných hybridních oligosacharidů, připojených k Fc, vzhledem ke GalT divokého typu a k fúzi GnTI-GalT.
Jak je uvedeno výše, endoglykosidáza H (EndoH) se používá pro potvrzení stanovení galaktózylovaných nefukózylovaných a galaktózylovaných hybridních struktur různým pikům oligosacharidů, pozorovaným v profilech MALDI. Určují se procentická zastoupení struktur oligosacharidových galaktózových zbytků, které jsou nefukózylované hybridní struktury, fukózylované hybridní a fukózylované komplexní oligosacharidové struktury.
Určuje se vliv úrovně exprese GalT a konkrétní lokalizační domény, která se používá k zacílení katalytické domény GalT ke Golgiho aparátu a konkrétní katalytické domény, která se použije k zacílení katalytické domény ke Golgiho aparátu, na kompetici pro oligosacharidové substráty modifikované GnTI mezi rekombinantní katalytickou doménou GalT a enzymy endogenní jádrovou a-1,6-fukózyltransferázou, Manil a GnTII. Určuje se úroveň buněčné cytotoxicity závislé na protilátce (ADCC), která je výsledkem nadměrné exprese nukleové kyseliny kódující polypeptid s aktivitou GalT, který je lokalizován v Golgiho aparátu v buňkách produkujících protilátku přes různé lokalizační domény.
Určuje se také, jestli protilátky se sestrojenými glykosidy produkované expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid s aktivitou GalT v buňkách produkujících protilátku zvýšilo vazebnou afinitu k lidskému aktivujícímu receptoru Fc FcyRIIIA nebo inhibujícímu FcyRIlb.
Konstrukty GalT zkompletují aktivitu endogenní a-1,6 jádrové fukózyltransferázy, sestrojení glykosidů oblasti Fc protilátky, a následně zvýšení ADCC.
Určuje se oligosacharidový profil protilátky anti-CD20, produkované z buněk BHK rostoucích v suspenzi a sestrojených pro konstitutivní expresi vysoké úrovně jak rekombinantní protilátky, tak fúzního polypeptidů s aktivitou GalT. Určuje se také relativní procentické zastoupení oligosacharidů monoklonální protilátky se sestrojenými glykosidy produkované stabilní buněčnou linií BHK-1502-28-11.
PŘÍKLAD 5 ·· 9999 » · · · · • to · · * • 9 • 9 » to · ·
Materiály a metody
1. Konstrukce expresních vektorů Manil a GnTII
Pro konstrukci expresního vektoru Manil se subklonovala cDNA lidské manózidázy II (SEQ ID NO: 17) do plazmidu expresního vektoru po směru od promotoru MPSV a proti směru od syntetického králičího β-globinového polyadenylačního signálu. Pro expresi GnTII se použije plazmid expresního vektoru s lidskou cDNA GnTII, subklonovanou po směru od lidského promotoru/enhanceru CMV a proti směru od hovězího polyadenanylačního signálu růstového hormonu.
Kombinace expresních vektorů s oriP replikačního původu z viru Epstein-Barrové
Fragment μ DNA s oriP se subklonoval, jak je popsáno v příkladu 1, do expresního vektoru Manil popsaného výše za vzniku expresního vektoru pCLF9. Fragment DNA s oriP se subklonoval jak je popsáno v příkladu 1 do expresního vektoru GnTII popsaného výše za vzniku expresního vektoru GnTII pGnTII.
2. Transfekce buněk HEK293-EBNA
Exponenciálně rostoucí buňky HEK293-EBNA se transfekovaly, jak je popsáno v příkladu 1. Pro produkci nemodifikované protilátky „Cwt“ se buňky transfekovaly expresním vektorem (pETR1520) protilátky. Pro produkci protilátky „Cbrt“ se sestrojenými glykosídy se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520) a druhým pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII (pETR1519) v poměru 4 : 1. Pro produkci protilátky se sestrojenými glykosídy „Cm“ se buňky kotransfekovaly třemi plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520), druhým pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII (pETR1519) a třetím pro expresi manózidázy II (pCLF9) v poměru 3 : 1 : 1. Pro produkci protilátky se sestrojenými glykosídy „Cmg“ se buňky kotransfekovaly čtyřmi plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520), druhým pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII (pETR1519), třetím pro expresi manózidázy II (pCLF9) a čtvrtým pro expresi GnTII (pGnTII) v poměru 4 : 0,33 :0,33 : 0,33.
3.
Produkce a purifikace protilátek nemodifikovaných a se sestrojenými glykosídy «· ···« > · · » ♦ ···
Kultivační médium transfekovaných buněk uvedených výše se nahradilo čerstvým kultivačním médiem přibližně 16 hodin po transfekci a druhé médium se poté sbíralo po kultivaci transfekovaných buněk po dalších 120 hodin. Sebrané supernatanty se centrifugovaly 5 minut při 1200 ot/min, následováno druhou centrifugací 10 min při 4000 ot/min a skladovaly se při 4 °C.
Purifikace protilátky
Monoklonální protilátky se purifikovaly z kultivačních supernatantů za použití dvou postupných chromatografických stupňů, chromatogragie Protein A a kationtové iontoměničové chromatografie, jak je popsáno v příkladu 1. Pro protilátky cwt7, cbrt5 a cm1 se dodatečně použil stupeň gelové chromatografie s použitím kolony Sephadex 200 (Amersham Pharmacia) a přidal se solný fosfátový pufr po kationtovém iontoměničovém stupni, a shromažďoval se pík monomerní protilátky.
4. Analýza oligosacharidů
Oligosacharidy se enzymaticky uvolnily z protilátek v roztoku štěpením PNGázou, jak je popsáno v příkladu 1.
Použití štěpení oligosacharidů uvolněných PNGázou F pomocí endoqlykosidázy H pro přiřazení hybridních rozdělených oliqosacharidových struktur neutrálním oliqosacharidovým pikům MALDI/TOF-MS
Oligosacharidy uvolněné PNGázou F se následně rozštěpily endoglykosidázou H (EC 3.2.1.96), jak je popsáno v příkladu 1.
MALDI/TOF-MS
Vzorky obsahující enzymatické výtažky obsahující uvolněné oligosacharidy se připravily a následně změřily na hmotovém spektrometru MALDI/TOF, jak je popsáno v příkladu 1.
5.
Příprava buněk a izolace
9· »«·« • · · • · · ··
Mononukleární buňky periferální krve (PBMC) se připravily pomocí Histopaque-1077 (Sigma Diagnostícs lne., St. Louis, MO63178, USA) v podstatě podle instrukcí výrobce a protokolu popsaného v příkladu 1.
6. Izolace buněk NK
Lidské buňky NK se izolují z PBMC aplikací negativní selekční procedury, jak je popsána v příkladu 1.
7. Stanovení ADCC
PBMC nebo NK jako efektorové buňky se připraví jak je popsáno výše a stanoví se jejich schopnost zprostředkovat cytotoxicitu ve stanovení celulární cytotoxícity závislé na protilátce (ADCC), jak je popsáno v příkladu 1.
8. Navázání FcyRIIIA na buňky NK
Navázání FcyRIIIA na čerstvě izolované buňky NK a navázání FcyRIIb se určí, jak je popsáno v příkladu 1.
9. Stanovení cytotoxícity závislé na komplementu
Stanovení cytotoxícity závislé na komplementu se provádějí s použitím zředění protilátek způsobem popsaným v příkladu 1, s následující modifikací pro přípravu zdroje lidského komplementu. Stručně řečeno, připraví se normální lidské sérum (NHS) z krve zdravých dobrovolníků. Krev se ponechá srážet 1 hodinu a poté se centrifuguje při 1200 g po 12 min.. Bezbuněčné supernatantní sérum se rozdělí a skladuje při -80 °C. NHS se použije při 20 % konečného objemu stanovení.
Výsledky a diskuse
Verze chimérní protilátky anti-CD20 se sestrojenými glykosidy (chimérní protilátka
C2B8, rovněž známá jako rituximab) se vyrobila kotransfekovánm kultur savčích buněk vektory pro expresi genů protilátky a vektory pro expresi genů kódujících polypeptidy s aktivitou GnTIII a manózidázy II. Další verze protilátky se sestrojenými glykosidy se rovněž připravily kontransfekováním kultur savčích buněk vektory pro expresi genů protilátky, • · · · · φ · φ • φ · φ · φ · φ φ · φ φφφφ φ • 9 9 9 9 9
999 9999 99 999 kódujícími polypeptidy s aktivitou GnTIII, manózidázy II a GnTII. Pro protilátku se sestrojenými glykosidy „Cbrt“ se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520) a druhým pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII (pETR1519). Pro protilátku se sestrojenými glykosidy „Cm“ se buňky kotransfekovaly třemi plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520), druhým pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII (pETR1519) a třetím pro expresi manózidázy II (pCLF9). Pro protilátku se sestrojenými glykosidy „Cmg“ se buňky kotransfekovaly čtyřmi plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520), druhým pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII (pETR1519), třetím pro expresi manózidázy II (pCLF9) a čtvrtým pro expresi GnTII (pGnTII). Nemodifikovaná verze (s nesestrojenými glykosidy) téže protilátky „Cwt“ se vyrobila transfekováním savčích buněk pouze vektorem genu pro expresi protilátky. Transfekované buňky se kultivovaly pět dní a vyloučené rekombinantní protilátky vyčistily od kultivačního média. Exprese genů kódujících polypeptidy s aktivitou GnTIII a Manil nemělo podstatný účinek na životaschopnost buněk, růst buněk nebo produkci protilátky ve vztahu k buňkám neprodukujícím takovéto polypeptidy glykosyltransferázy nebo glykosidázy.
Vyčištěné protilátky se poté analyzovali na jejich glykosylační model. Protilátky nesou N-připojené oligosacharidy připojené pouze ke zbytku Asn297 oblasti Fc lidského lgG1. Oligosacharidy se enzymaticky odstranily z protilátek štěpením PNGázou F a následně se analyzovaly MALDI/TOF-MS. Použitím této techniky je možné určit podíly různých druhů oligosacharidů ne celkové populaci původních oligosacharidů Fc, a je rovněž možné připsat struktury jednotlivým pikům ve spektru (Umana, P. et al., Nátuře Biotechnol. 17:176180(1999))
Obrázek 26 ukazuje profil MALDI/TOF-MS neutrálního oligosacharidů z nemodifikované rekombinantní protilátky lgG1 anti-CD20 C2B8 Cwt. Jak bylo předtím popsáno pro nemodifikovanou protilátku v příkladu 1, obrázek 5, Cwt měla typický oligosacharidový profil, s píky při poměrech m/z 1485, 1648 a 1810, které jsou konzistentní s dvouvláknovými, v jádře fukózylovanými komplexními oligosacharidy s 0, 1 a 2 galaktózovými zbytky. Sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid ManlI-GnTIII, kde je katalytická doména GnTIII lokalizované přes Golgiho lokalizační doménu Manil, vede k produkci protilátky (Cbrt), kde je většina oligosacharidů Fc rozdělených nefukózylovaných hybridních (viz obr. 27). Jak je popsáno v příkladu 1, endoglykosidáza H (EndoH) se použila pro připsání rozdělené nefukózylované a rozdělené hybridní struktury různým pikům oligosacharidů, pozorovaným v profilech MALDI.
Sestrojení buněk produkujících protilátku koexpresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid ManlI-GnTIII, kde je katalytická doména GnTIII lokalizované přes Golgiho lokalizační doménu Manil, a nukleové kyseliny kódující Manil, vede k produkci protilátky ·· ····
(Cm), kde většina oligosacharidů Fc byla rozdělených nefukózylovaných hybridních (viz obr. 28). Sestrojení buněk produkujících protilátku koexpresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid ManlI-GnTIII, kde je katalytická doména GnTIII lokalizované přes Golgiho lokalizační doménu Manil, nukleové kyseliny kódující Manil a nukleové kyseliny kódující GnTII, vede k produkci protilátky (Cmg), kde většina oligosacharidů Fc je rozdělených nefukózylovaných komplexních, s podílem rozdělených nefukózylovaných komplexních oligosacharidů připojených k Fc dokonce vyšším než u protilátky Cm.
Obrázek 29 ukazuje údaje, demonstrující zvýšenou cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC), která je výsledkem exprese nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid ManlIGnTIII, kde je katalytická doména GnTIII lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil v buňkách produkujících protilátku, kde je nukleové kyselina kódující ManlI-GnTIII exprimována buď samotná (protilátka Cbrt), nebo koexprimovaná v buňkách produkujících protilátku společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm). Proto zvýšená úroveň rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů buď hybridního nebo komplexního typu v oblasti Fc protilátek se sestrojenými glykosidy vede ke zvýšené aktivitě ADCC.
O zabíječských buňkách (NK) je známo, že jsou významnými mediátory ADCC. Tyto buňky nesou na svém povrchu aktivující receptor FcyRIIIA, rovněž známý jako CD16A. Navázání oblasti Fc protilátek navázaných na cílové buňky k receptorům FcyRIIIA na buňkách NK je podstatné pro propojení těchto receptorů na buňce NK a následné indukci ADCC. Proto je důležité vyhodnotit navázání protilátek vyrobených způsoby popsanými zde na receptory Fc, zejména na receptory v jejich přirozené formě, ve které se projevují na lidských imunoefektorových buňkách. Obrázek 30 ukazuje, že protilátky se sestrojenými glykosidy produkované expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid s aktivitou GnTIII v buňkách produkujících protilátky, exprimované buď samotné (protilátka Cbrt), nebo koexprimované v buňkách produkujících protilátky společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm), mají zvýšenou vazebnou afinitu k lidskému aktivujícímu receptorů Fc FcyRIIIA. Jak je uvedeno výše pro stanovení ADCC, tyto protilátky mají zvýšené úrovně rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, které jsou výsledkem exprese fúzního polypeptidu s aktivitou GnTIII v buňkách produkujících protilátku.
Proto zvýšení úrovně rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů buď hybridního, nebo komplexního typu v oblasti Fc protilátek se sestrojenými glykosidy vede ke zvýšené aktivitě ADCC. Buňky NK použité v tomto stanovení byly z dárce genotypu, který neexprimuje receptor FcyRIIc vjeho buňkách NK (Meteš, D. et al. J. Immunol. Methods 258(1-2):85-95(2001)). Proto jediným receptorem Fc na povrchu těchto buněk je aktivující receptor FcyRIIIA.
φφ ···· • · • φφφ φφ φφφφ
ΦΦΦ φ φ · φ φ φ φφ φφφ
Vazebná doména aktivujícího receptorů FcyRIIIB je téměř identická s vazebnou doménou FcyRIIIA. Proto výše uvedené údaje také ukazují, že protilátky se sestrojenými glykosidy zde popsané mohou vést ke zvýšeným efektorovým funkcím, zprostředkovaným efektorovými buňkami projevujícími FcyRIIIB, jako polymorfonukleární buňky (PMN), včetně uvolnění toxických produktů a fagocytózy (Reff, M. E.a Heard, C. Crit Rev Oncol Hematol. 40(1):25-35(2001), Daeron, F. M. Annu. Rev. Immunol. 15:203-34(1997), Ravtech, J. V. a Boland S. Annu. Rev. Immunol. 19:275-90(2001).
Cbrt, protilátka anti-CD20, produkovaná v buňkách sestrojených pro expresi nukleové kyseliny, kódující fúzní polypeptid s aktivitou GnTIII a lokalizovaný v Golgiho aparátu přes lokalizační doménu Manil, se také testovala na lýzi zprostředkovanou komplementem (CML), odlišnou efektorovou funkci, která není závislá na receptorech Fc imunoefektorových buněk. Velká většina oligosacharidů této protilátky se sestrojenými glykosidy byla rozděleného nefukózylovaného typu. Pro protilátku Cbrt byla pozorována snížená aktivita CML ve srovnání s nemodifikovanou protilátkou Cwt (obrázek 31). Pro některé aplikace mohou být vhodné protilátky za zvýšenou ADCC, ale se sníženou CML, například pro snížení vedlejších účinků, jako je zánět cév v místě nádoru zprostředkovaný CML. Byly pozorovány další významné vedlejší účinky zprostředkované CML pro léčbu protilátkami anti-CD20 (van der Kolk L. E. etal. Br J Haematol. 115 (4):807-11 (2001)). Avšak je možné produkovat protilátky se sestrojenými glykosidy se zvýšenou aktivitou ADCC a vazností na FcyRIII, ale bez podstatně snížené aktivity CML relativně k nemodifikované protilátce, jako je to v případě protilátky Cm (obr. 31). Takové protilátky by byly žádoucí pro aplikace, kde maximální eliminace cílových buněk vyžaduje jak vysokou aktivitu ADCC, tak vysokou aktivitu komplementu a aktivitu a CML. Oligosacharidové profily popsané výše ukazují, že je možné sestrojit buňky tak, aby produkovaly protilátky, kde většina oligosacharidů připojených k Fc je rozděleného nefukózylovaného komplexního typu namísto hybridního typu, koexprimací fúzního polypeptidu GnTIII společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (protilátka Cm), nebo společně s nukleovou kyselinou kódující Manil a nukleovou kyselinou kódující GnTII (protilátka Cmg). Protilátky se sestrojenými glykosidy mají zvýšenou aktivitu ADCC a sníženou vazebnou afinitu k FcyRIII, která je v korelaci ss jejich zvýšenou úrovní rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, zatímco jejich aktivita CML je zvýšená tak, jak podíl komplexních oligosacharidů ve vztahu k podílu hybridních oligosacharidů.
Tento a předchozí příklady popisovaly expresi nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptidy, kde fúzní polypeptid je lokalizován ke Golgiho aparátu a má katalytickou doménu, která soutěží s endogenními fukózyltransferázami o oligosacharidové akceptory předtím modifikované přes reakce katalyzované GnTI. Rekombinantní glykoproteiny produkované takto sestrojenými hostitelskými buňkami mají zvýšenou úroveň ·· ·»··· • · · • · · ·· • · · • · · ·· ··· ·· ···· » ·
nefukózylovaných oligosacharidů. Tento příklad demonstruje, že koexprese nukleových kyselin kódujících Manil a/nebo GnTII společně s nukleovou kyselinou kódující výše uvedený fúzní polypeptid v takových hostitelských buňkách vede ke zvýšení biosyntetického proudu směrem ke komplexním namísto hybridním oligosacharidům a proto k syntéze glykoproteinů se zvýšenou úrovní nefukózylovaných komplexních oligosacharidů ve vztahu ke glykoproteinům produkovaným v buňkách nekoexprimujících nukleové kyseliny kódující Manil a/nebo GnTII.
PŘÍKLAD 6
Nadexprese a-manózidázy
Molekulární klonování
Lidská g-manózidáza 2
Gen kódující lidskou α-manózidázu II („hManll“) (E.C.3.2.1.114) (SEQ ID NO:17) pod kontrolou promotoru MPSV se klonoval do expresního vektoru obsahujícího prvek OriP. Výsledný expresní vektor pCLF9 je ukázán na obrázku 32A. Expresní vektory kódující lehký a těžký řetězec monoklonální protilátky anti-CD20 byly jednotlivě pETR1842 a pETR1843 (obrázky 32B a 32C).
Fúzní protein ManlI-GalT
Fúzní protein (SEQ ID NO:20), obsahující Manil CTS a katalytickou doménu β-1,4-galaktózyltranferázy (M22921, aminokyseliny 126-397) se zkonstruovaly, jak je uvedeno níže. Oblast hManll CTS se amplifikovala pomocí PCR z pETR1484 (CF33, GAB252). Katalytická doména GalT (aminokyseliny 196-397) se amplifikovala s použitím CF31 a CF35 z pBlueGalT. HManll CTS se kombinovala s katalytickou doménou GalT, aby se získal fúzní protein kontrolovaný promotorem MPSV (pCLF24). Celý gen GalT se získal z pBlueGalT. Gen kódující GalT se sekvencoval (SEQ ID NO: 16):
MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSRLPQLVGVSTPLQ
GGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPH
TTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPF
RNRQELHKYWLYYLHPVLQRQQLDYGYIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYCFVS
DVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYW
GWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLS
DGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS
5‘ konec GalT se amplifikoval CF32/CF38 a před gen se přidalo restrikční místo Fsel. Sekvence byla ověřena sekvencováním jako správná a vyměněna v pCLF24 štěpením Fsel/Dralll (pCLF26). K pCLF24 a pCLF26 se přidal oriP, aby se generovaly jednotlivě pCLF25 a pCLF27 (obrázky 33A a 33B).
Exprese α-manózidázy a ManlI-GalT v buňkách HEK293-EBNA
Buňky Hek293-EBNA se transfekovaly kalciumfosfátovou metodou. Stručně, pro transfekci TI50 se naočkovalo 15 miliónů buněk 24 hodin před transfekcí do 28 ml DMEM, 10 % FCS, 250 pg/ml neomycinu a inkubovaly se při 37 °C, 5 % CO2 přes noc.
Pro každou baňku T150, která měla být transfekována, se připravil roztok DNA, CaCI2 a vody mícháním 94 pg celkové DNA, 469 μΙ 1 M roztoku CaCI2, a přidáním vody do celkového objemu 938 μΙ. K tomuto roztoku se přidalo 938 μΙ roztoku 50 mM HEPES, 280 mM NaCI, 1,5 mM Na2HPO4 při pH 7,04 a míchalo se okamžitě 10 s a nechalo stát při teplotě místnosti 20 s. Suspenze se zředila 24 ml DMEM doplněným 2 % FCS a přidalo se do T150 namísto existujícího média. Buňky se inkubovaly při 37 °C, 5 % CO2 17 až 20 hodin a médium se nahradilo 30 ml DMEM, 10 % FCS.
Pro testování účinku α-manózidázy II na kompetici s jádrovou fukózyltransferázou se buňky transfekovaly pETR1842, pETR1843 a pCLF9 v poměru 2:2:1. Pátý den po transfekci se sebral supernatant, centrifugoval se 5 min. při 1200 ot/min, následováno druhou centrifugaci po 10 min. při 4000 ot/min, zfiltroval se a skladoval při 4 °C.
Purifikace monoklonální protilátky anti-CD20
Monoklonální protilátka se purifikovala z 30 ml supernatantu dvoustupňovou chromatografii, zahrnující první stupeň chromatografie Protein A, aby se oddělila monoklonální protilátka od hovězí protilátky přítomné v séru, následováno kationtovou iontoměničovou chromatografii, aby se ve vzorku zaměnil pufr za PBS.
Analýza oligosacharidů
Štěpení PNGázouF
8999
8
998
9 99
9 9 89 9 8 9
9 9 9 9 8
9 9 9 9 9 9 8 8 8
9 9 9 9 9 9 9
9 888 8898 99 898
Vzorek monoklonální protilátky (50 μ9) se inkuboval s N-glykosidázou F (rekombinantní, Roche, Švýcarsko) při 0,1 mu/μΙ. Štěpení se provádělo v 2mM pufru Tris, pH 7,0 po 3 hodiny při 37 °C. Uvolněné neutrální oligosacharidy se pak inkubovaly v 150 mM kyselině octové po 3 hodiny při teplotě místnosti. Vzorky se poté odsolily pomocí 0,6 ml kationtového iontoměniče (AG 50 W-X8, kyselá forma, 100-200 mesh, BioRad, Hercules, CA, USA), plněném do chromatografické mikrokolony bio-spin (BioRad, CA, USA).
Digesce EndoH
Oligosacharidy uvolněné PNGázouF se štěpily endoglykosidázou H (EC 3.2.1.96, Roche, Švýcarsko) enzymem štěpícím mezi N-acetylglukózaminovými zbytky chitobiózového jádra N-připojených oligosacharidů, před působením kyselinou octovou. Enzym štěpí oligomanózu a většinu glykanů hybridního typu, zatímco oligosacharidy komplexního typu nejsou hydrolyzovány.
Oligosacharidy byly štěpeny pomocí 0,2 mU/ml endoglykosidázy H v 2 mM Tris, ph 7,0. Štěpení se provádělo při 37 °C po 3 hodiny. Oligosacharidy se inkubovaly 3 hodiny při teplotě místnosti ve 150 mm kyselině octové, a následně se odsolily pomocí 0,6 ml kationtového iontoměniče (AG 50 W-X8, kyselá forma, 100-200 mesh, BioRad, Hercules, CA, USA), plněném do chromatografické mikrokolony bio-spin (BioRad, CA, USA).
Příprava matrice a vzorku
Matrice kyseliny 2,5-dihydroxybenzoové (sDHB) se připravila rozpuštěním 2 mg kyseliny 2,5-dihydroxybenzoové + 0,1 mg kyseliny 5-methoxysalicylové v1 ml ethanol/10 mM vodný chlorid sodný 1 : 1 (obj.). 1 μΙ vzorku se nanesl na terčík z nerezové oceli a smíchal se s 1 μΙ matrice sDHB. Vzorky se vysušily na vzduchu a naneslo se 0,2 μΙ ethanolu.
Analýza MALDI/TOF
Hmotový spektrometr MALDI/TOF, použitý k získání hmotových spekter, byl Voyager Elitě (Perspective Biosystems), vybavený zpožděnou extrakcí. Přístroj byl provozován v reflexním módu. Pozitivní ionty se akcelerovaly na 20 kV po zpoždění 75 ns. Pro získání konečného spektra se zkombinovalo pět spekter po 40 záběrech (200 záběrů). Pro přiřazení hmot iontů se použila externí kalibrace používající oligosacharidové standardy.
·*·*·
ι*
99* 9999 <
• · ·
9 9
999
9» 9999 • «
999
Oligosacharidový profil
Oligosacharidový profil protilátky anti-CD 20, produkované v přítomnosti Manil, je ukázán na obr. 34. Nalezené olígosacharidy připojené k části Fc protilátky jsou komplexní struktury, z nichž 48 % postrádá jádrovou fukózu. α-manózidáza II soutěží s jádrovou fukózyltransferázou, čímž generuje 48 % nefukózylovaných oligosacharidových struktur. V nepřítomnosti α-manózidázy II jsou olígosacharidy části Fc protilátky složeny pouze z fukózylovaných struktur (protilátka divokého typu).
Oligosacharidový profil protilátky anti-CD20, produkované v přítomnosti fúzního proteinu ManlI-GalT, jsou ukázány na obrázku 35 A-B. Jak pro α-manózidázu II, tak v případě fúzního proteinu ManlI-GalT, se množství nefukózylovaných oligosacharidových struktur zvyšuje. Vysoké procentické zastoupení nefukózylovaných struktur spočívá ve strukturách s vysokým obsahem manózy (m /z 1256, 1419 a 1581). K těmto 67 % nefukózylovaných cukrů bylo nalezeno dalších 30 % hybridních nefukózylovaných struktur (m/z 1622). Proto vzorek produkovaný v přítomnosti fúzního proteinu ManlI-GalT vykazuje téměř 100 % nefukózylovaných struktur.
Biologická aktivita protilátek produkovaných v přítomnosti α-manózidázy II nebo fúzního proteinu ManlI-GalT
Aby se určil účinek působení enzymů α-manózidázy II a ManlI-GalT v kompetici s jádrovou fukózyltransferázou, provedla se odpovídající biologická stanovení. Vzorky se testovaly in vitro na buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC) a na navázání receptoru CD 16, exprimovaného na povrchu sestrojené buněčné linie CHO (CHO-1708-37).
Vazba IgG na CHO-1708-37
Buněčná linie CHO-1708-37 exprimuje na svém povrchu receptor FcyRIIIA (CD16) a řetězec γ receptoru FcyRI. Exprese receptoru FcyRIlA (CD16) se určila analýzou FACS s použitím monoklonální protilátky 3G8-FITC (obrázek 36). Buňky CHO-1708-37 se inkubovaly při 1 mii. buněk/ml v PBS, 0,1 % BSA s různými variantami protilátek při různých koncentracích (10, 3, 1, 0,3, 0,1 pg/ml) a třikrát. Buňky se inkubovaly 30 min. při 4 °C a následně se promyly PBS, 0,1 % BSA. Navázání protilátky se detekovalo inkubací s 1 : 200 kozím protilidským Igl, konjugovaným s fluorescein-izothiokyanátem fluoresceinem F(ab‘)ž (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) po 30 min. při 4 °C. Intenzita
99 99 999«
9 9 « 9 9
9 9 9 999
9 9 9 9 9
9 9 9 9
999 9999 99 999 ·* ·ν«· • 9 ·
9 9
9 9 9 • 99 • 9 9 fluorescence vztahující se k navázaným variantám protilátky se určila na přístroji FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), přičemž se vycházelo z živých buněk.
V pokusu stanovení vaznosti byly zahrnuty následující varianty protilátek:
Cwt8 (divoký typ 1) Manil (α-manózidáza II)
Protilátky produkované v přítomnosti α-manózidázy II (Manil) se váže na receptor FcyRIIIA s vyšší afinitou než divoké typy protilátek.
Celulární cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) in vitro
Mononukleární buňky periferální krve (PBMC) se připravily s použitím Histopaque1077 (Sigma Diagnostics lne., St. Louis, M063178 USA) a následováním instrukcí výrobce. Stručně, žitní krev se odebrala heparinizovanými stříkačkami od dobrovolníků, kteří byli požádáni, aby běžli 1 minutu plnou silou, aby se zvýšilo procentické zastoupení zabíječských buněk (NK) v krvi. Krev se zředila 1 : 0,75 - 1,3 PBS neobsahujícím Ca nebo Mg a navrstvila na Histopaque-1077. Gradient se centrifugoval při 400 x g po 30 minut při teplotě místnosti bez přerušení. Mezifáze obsahující PBS se shromáždila a promyla PBS (50 ml na buňky ze dvou gradientů) a odstředila se při 300 x g po 10 minut při teplotě místnosti. Po resuspendaci pelety s PBS se PBMC spočítaly a promyly podruhé centrifugací při 200 x g po 10 minut při teplotě místnosti. Buňky se poté resuspendovaly ve vhodném médiu pro následné procedury.
Cílové buňky Ráji se promyly v PBS, spočítaly a resuspendovaly v DMEM, 10 % FCS, 1 % Glutamax při 1 miliónu buněk v ml. K nim se přidal calcein 1 . 100 a buňky se inkubovaly 30 min. při 37 °C. Buňky se poté promyly v PBS, spočítaly a resuspendovaly v AIM-V při 0,3 miliónu na ml. 100 μΙ této buněčné suspenze se přidalo na jamku 96jamkové destičky s kulatými dny. Protilátky se zředily v AIM-V, přidaly se v 50 μΙ k cílovým buňkám na destičce a ponechaly se navázat na cíle po 10 min. při teplotě místnosti. PBMC jako efektorové buňky se připravily, jak je popsáno výše. Poměr efektorů k cíli byl 25 : 1. Efektorové buňky se připravily při 15 miliónech v ml v médiu AIM-V a 50 μΙ se přidalo na jamku. Destička se inkubovala 4 hod. při 37 °C ve vlhčené atmosféře obsahující 5 % CO2. Buňky se promyly dvakrát v PBS a přidalo se 200 μΙ borátového roztoku. Zabíjení cílových buněk se vyhodnocovalo měřením kalceinu uvolněného v médiu po lýzi s borátovým roztokem (obr. 37).
»4 ···· $9·*
Spontánní uvolňování se změřilo z jamek obsahujících pouze cílové a efektorové buňky, ale žádné protilátky. Maximální uvolňování se určilo z jamek obsahujících pouze cílové buňky a 1 % Triton X-100. Procentické zastoupení specifického zabíjení zprostředkovaného protilátkou se spočítalo následovně: ((x-SR)/(MR-SR)*100, kde x je střední hodnota Vmax při určité koncentraci protilátky, SR je střední hodnota Vmax spontánního uvolňování a MR je střední hodnota Vmax maximálního uvolňování.
PŘÍKLAD 7
Použití monoklonální protilátky anti-EGFR se sestrojenými glykosidy pro léčení psoriázy
Lidští pacienti s psoriázou mohou být léčeni monoklonální protilátkou anti-EGFR se sestrojenými glykosidy, vyprodukovanou způsobem podle vynálezu. Pacienti dostávají zejména týdenní infúze protilátky se sestrojenými glykosidy v zátěžové dávce 400 mg/m2. Udržovací dávka 250 mg/m2se podává na týdenní bázi, dokud není dosaženo úplné odpovědi.
PŘÍKLAD 8
Použití protilátky anti-ErbB2 se sestrojenými glykosidy pro léčení rakoviny prostaty s metastázemi, rakoviny prsu s metastázemi, kolorektální rakoviny s metastázemi, a rakoviny plic jiných než malých buněk ve stadiu Illb nebo IV
RhuMAb 2C4 je humanizovaná monoklonální protilátka plné délky (produkovaná v buňkách CHO), směrovaná proti ErbB2. RhuMAb 2C4 blokuje propojení ErbB2 s ostatními členy skupiny ErbB, čímž inhibuje intracelulární signalizaci cestou ErbB. RhuMAb 2C4 nejen inhibuje růst nádorů nadexprimujících ErbB2, ale také blokuje růst nádorů, které vyžadují signalizaci závislou na ligandu ErbB.
Forma RhuMAb 2C4 se sestrojenými glykosidy vyrobená způsobem podle předloženého vynálezu se může použít jako jediné činidlo pro léčení pacientů s rakovinou prostaty odolávající hormonům (nezávislou na androgenech), pacientů s rakovinou prsu s metastázemi, pacientů s kolorektální rakovinou s metastázemi a pacientů s rakovinou plic jiných než malých buněk ve stadiu Illb nebo IV. Konkrétně RhuMAb 2C4 se sestrojenými glykosidy se podává intravenózně (IV) týdně nebo každé tři týdny v jednotlivé dávce 2 až 4 • · • · · · • · 4 · · · » · · · ioo..· : ·..·...· mg/kg, dokud se pokrok choroby nezastaví. Protilátka se podává jako vícedávková kapalná formulace (20 ml náplň pří koncentraci 20 mg/ml nebo vyšší koncentraci).
Je jasné, že vynález se může praktikovat jinak, než je jednotlivě popsáno v předchozích popisech a příkladech. Jsou možné četné modifikace a variace předmětného vynálezu ve světle výše uvedených sdělení a proto uvnitř rámce připojených nároků.
Celé odhalení všech publikací (včetně patentů, patentových přihlášek, časopiseckých článků, laboratorních manuálů, knih nebo jiných dokumentů) citovaných zde je tímto začleněno odkazem.

Claims (282)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná nukleová kyselina obsahující sekvenci kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III nebo aktivitu 3(1,4)-galaktózyltransferázy a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidů.
  2. 2. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu 3(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III nebo β(1,4)-galaktózyltransferázy.
  3. 3. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 2, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  4. 4. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 3, mající nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obrázku 24 a SEQ ID NO: 14.
  5. 5. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 2, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I.
  6. 6. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, mající nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obrázku 25 a SEQ ID NO: 12.
  7. 7. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 2, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  8. 8. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 2, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy I.
  9. 9. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 2, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména a1-6 jádrové fukózyltransferázy.
  10. 10. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 3, obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 24 a SEQ ID NO: 15.
    10¾.· 2
  11. 11. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 25 a SEQ ID NO: 13.
  12. 12. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 3, obsahující sekvenci, která hybridizuje za přísných podmínek s hybridizační sondou, jejíž nukleotidová sekvence se skládá ze sekvence znázorněné na obrázku 24 a SEQ ID NO: 14.
  13. 13. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, obsahující sekvenci, která hybridizuje za přísných podmínek s hybridizační sondou, jejíž nukleotidová sekvence se skládá ze sekvence znázorněné na obrázku 25 a SEQ ID NO: 12.
  14. 14. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 3, obsahující sekvenci alespoň na 80 % identickou s nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obrázku 24 a SEQ ID NO:
    14.
  15. 15. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, obsahující sekvenci alespoň na 80 % identickou s nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obrázku 25 a SEQ ID NO:
    12.
  16. 16. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 3, obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci alespoň na 80 % identickou s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou na obrázku 24 a SEQ ID NO: 15.
  17. 17. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci alespoň na 80 % identickou s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou na obrázku 25 a SEQ ID NO: 13.
  18. 18. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 3, obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 24 a SEQ ID NO: 15 s konzervativními aminokyselinovými substitucemi.
  19. 19. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 25 a SEQ ID NO: 13 s konzervativními aminokyselinovými substitucemi.
    κη.· í
  20. 20. Expresní vektor, který obsahuje izolovanou nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19.
  21. 21. Fúzní polypeptid, mající aktivitu P(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy II! nebo aktivitu p(1,4)-galaktózyltransferázy a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu.
  22. 22. Fúzní polypeptid podle nároku 21, obsahující katalytickou doménu β(1,4)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy III nebo p(1,4)-galaktózyltransferázy.
  23. 23. Fúzní polypeptid podle nároku 21, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  24. 24. Fúzní polypeptid podle nároku 21, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména 3(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I.
  25. 25. Fúzní polypeptid podle nároku 21, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy I.
  26. 26. Fúzní polypeptid podle nároku 21, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  27. 27. Fúzní polypeptid podle nároku 21, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména ct1-6 jádrové fukózyltransferázy.
  28. 28. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 20.
  29. 29. Způsob výroby fúzního polypeptidu majícího aktivitu β(1,4)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy III nebo aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 28 v médiu za podmínek, dovolujících expresi nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a získání fúzního polypeptidu z výsledné kultury.
    4· ··· ·
    104..· I • ·· ·· ···· • · · · · · · • · · » « · · • · · · · ·
  30. 30. Způsob modifikace glykosylačního profilu polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19 do hostitelské buňky.
  31. 31. Způsob modifikace glykosylačního profilu polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení expresního vektoru podle nároku 20 do hostitelské buňky.
  32. 32. Způsob podle nároků 30 nebo 31, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptid je IgG nebo jeho fragment.
  33. 33. Způsob podle nároku 32, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptid je IgG 1 nebo jeho fragment.
  34. 34. Způsob podle nároku 32, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptid je fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc lidského IgG.
  35. 35. Hostitelská buňka sestrojená tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy III nebo aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy v množství postačujícím pro modifikaci polysacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou, kde polypeptid je vybrán ze skupiny skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
  36. 36. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je IgG nebo jeho fragment.
  37. 37. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je lgG1 nebo jeho fragment.
  38. 38. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc lidského IgG.
  39. 39. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou vykazuje zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc jako výsledek modifikace.
    ·« ····
    9 4 « • <· 4
    106..· ;
    99 9 9
    994 4499
  40. 40. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou vykazuje zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek modifikace.
  41. 41. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu p(1,4)-N-acetylglukózamínyltransferázy III nebo β(1,4)-galaktózyltransferázy.
  42. 42. Hostitelská buňka podle nároku 41, kde fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu.
  43. 43. Hostitelská buňka podle nároku 42, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  44. 44. Hostitelská buňka podle nároku 42, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I.
  45. 45. Hostitelská buňka podle nároku 42, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  46. 46. Hostitelská buňka podle nároku 42, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy I.
  47. 47. Hostitelská buňka podle nároku 42, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména a1-6 jádrové fukózyltranferázy.
  48. 48. Hostitelská buňka podle nároku 40, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc.
  49. 49. Hostitelská buňka podle nároku 40, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na buňky NK.
  50. 50. Hostitelská buňka podle nároku 40, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na makrofágy.
  51. 51. Hostitelská buňka podle nároku 40, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na polymorfonukleární buňky.
    10&
    φ ·······
  52. 52. Hostitelská buňka podle nároku 40, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na monocyty.
  53. 53. Hostitelská buňka podle nároku 40, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená apoptóza indukovaná přímým signálem.
  54. 54. Hostitelská buňka podle nároku 40, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšené dozrávání dendritických buněk.
  55. 55. Hostitelská buňka podle nároku 40, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšené zásobení T-buňkami.
  56. 56. Hostitelská buňka podle nároku 39, kde receptor Fc je aktivující receptor Fcy.
  57. 57. Hostitelská buňka podle nároku 39, kde receptor Fc je receptor FcyRIIIA.
  58. 58. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde hostitelská buňka je buňka CHO, buňka BHK, buňka NSO, buňka SP2/0, myelomová buňka YO, buňka myšího myelomu P3X63, buňka PER.C6 nebo hybridomová buňka.
  59. 59. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je protilátka anti-CD20.
  60. 60. Hostitelská buňka podle nároku 59, kde protilátka anti-CD20 je IDECC2B8.
  61. 61. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je chimérní protilidská monoklonální protilátka karcinomu renálních buněk chG250.
  62. 62. Hostitelská buňka podle nároku 35, dále obsahující alespoň jednu transfekovanou nukleovou kyselinu kódující molekulu protilátky, fragment protilátky nebo fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
  63. 63. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde alespoň jedna nukleová kyselina kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III ·» ···· · ·· ·· ···· nebo aktivitu p(1,4)-galaktózyltransferázy je operativně připojená k prvku konstitutivního promotoru.
  64. 64. Hostitelská buňka podle nároku 62, kde alespoň jedna transfekovaná nukleová kyselina kóduje protilátku anti-CD20, chimérní protilidskou neuroblastomovou monoklonální protilátku chCE7, chimérní protilidskou monoklonální protilátku karcinomu renálních buněk chG250, chimérní protilidskou monoklonální protilátku karcinomu tlustého střeva, plic a prsu ING-1, humanizovanou protilidskou monoklonální protilátku antigenu 17-1A 3622W4, humanizovanou protilidskou monoklonální protilátku kolorektálního nádoru A33, protilidskou melanomovou protilátku R24 směrovanou proti gangliosidu GD3, chimérní protilidskou monoklonální protilátku karcinomu buněk dlaždicového epitelu SF-25, protilidskou protilátku EGFR, protilidskou protilátku EGFRvIII, protilidskou protilátku PSMA, protilidskou protilátku PSCA, protilidskou protilátku CD22, protilidskou protilátku CD30, protilidskou protilátku CD33, protilidskou protilátku CD38, protilidskou protilátku CD40, protilidskou protilátku CD45, protilidskou protilátku CD45, protilidskou protilátku CD52, protilidskou protilátku CD138, protilidskou variantní protilátku HLA-DR, protilidskou protilátku EpCAM, protilidskou protilátku CEA, protilidskou protilátku MUC1, protilidskou protilátku jádrového proteinu MUC1, protilidskou aberantně glykosylovanou protilátku MUC1, protilátku proti variantám lidského fibronektinu obsahující doménu ED-B nebo protilidskou protilátku HER2/neu.
  65. 65. Způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce vyznačující se t i m, že zahrnuje:
    a) kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy III nebo aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a
    b) izolaci polypeptidu.
    • ·· · · · · · · ♦ · · · · · « • * · · · · · • · · · · · · * · · · * ··· ···· ·· ··«
  66. 66. Způsob podle nároku 65, v y z n a č u j í c í se t í m, že fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III nebo β(1,4)-galaktózyltransferázy.
  67. 67. Způsob podle nároku 65, v y z n a č u j í c í se t í m, že fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu.
  68. 68. Způsob podle nároku 67, v y z n a č u j í c í se t í m, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  69. 69. Způsob podle nároku 67, v y z n a č u j i c í se t i m, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I.
  70. 70. Způsob podle nároku 67, v y z n a č u j í c í se t í m, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy I.
  71. 71. Způsob podle nároku 67, v y z n a č u j í c i se t í m, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  72. 72. Způsob podle nároku 67, v y z n a č u j í c í se t í m, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména cd-6 jádrové fukózyltransferázy.
  73. 73. Způsob podle nároku 65, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptid má zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek modifikace.
  74. 74. Způsob podle nároku 73, v y z n a č u j i c í se t í m, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc.
  75. 75. Způsob podle nároku 73, v y z n a č u j í c í se t í m, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na buňky NK.
  76. 76. Způsob podle nároku 73, v y z n a č u j í c í se t í m, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na makrofágy.
  77. 77. Způsob podle nároku 73, v y z n a č u j í c í se t í m, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na monocyty.
    •to ···· • to to· ·· ·· to· ··· ioá to • toto* ·· · · ·
  78. 78. Způsob podle nároku 73, v y z n a č u j í c í se t í m, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na polymorfonukleární buňky.
  79. 79. Způsob podle nároku 73, v y z n a č u j í c í se t í m, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená apoptóza indukovaná přímým signálem.
  80. 80. Způsob podle nároku 73, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšené dozrávání dendritických buněk.
  81. 81. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že zvýšená efektorová funkce je zvýšené zásobení T-buňkami.
  82. 82. Způsob podle nároku 65, vyznačující se tím, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou vykazuje zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc jako výsledek modifikace.
  83. 83. Způsob podle nároku 82, v y z n a č u j í c í se t í m, že receptor Fc je aktivující receptor Fc.
  84. 84. Způsob podle nároku 82, v y z n a č u j í c í se t í m, že receptor Fc je receptor FcyRIIIA.
  85. 85. Způsob podle nároku 65, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšený podíl rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu.
  86. 86. Způsob podle nároku 65, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšený podíl nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu.
  87. 87. Způsob podle nároku 86, v y z n a č u j í c í se t í m, že nefukózylované oligosacharidy jsou hybridní.
  88. 88. Způsob podle nároku 86, v y z n a č u j í c í se t í m, že nefukózylované oligosacharidy jsou komplexní.
    110.
    9 99
    9 9 9 · · • 9 · • 9 9 9
    9 9 9
    9 99 99 99
    9999 « * • · 9 · • · ♦ ··
  89. 89. Způsob podle nároku 65, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšený podíl rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu.
  90. 90. Způsob podle nároku 89, vyznačující se tím, že rozdělené nefukózylované oligosacharidy jsou hybridní.
  91. 91. Způsob podle nároku 89, vyznačující se tím, že rozdělené nefukózylované oligosacharidy jsou komplexní.
  92. 92. Způsob podle nároku 89, v y z n a č u j ί o í se t í m, že alespoň 20 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je rozdělených nefukózylovaných.
  93. 93. Způsob podle nároku 89, vyzn a ču j í c í se t í m, že alespoň 25 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je rozdělených nefukózylovaných.
  94. 94. Způsob podle nároku 89, v y z n a č u j í c í se t í m, že alespoň 30 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je rozdělených nefukózylovaných.
  95. 95. Způsob podle nároku 89, vy z n a č u j í c í se t í m, že alespoň 35 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je rozdělených nefukózylovaných.
  96. 96. Protilátka sestrojená tak, aby měla zvýšenou efektorovou funkci, vyrobená způsobem podle kteréhokoliv z nároků 65 až 96.
  97. 97. Protilátka sestrojená tak, aby měla zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc, vyrobená způsobem podle kteréhokoliv z nároků 65 až 96.
  98. 98. Protilátka podle nároku 97, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc.
  99. 99. Protilátka podle nároku 97, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na buňky NK.
  100. 100. Protilátka podle nároku 97, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na makrofágy.
    11?
    98 8989 9 99 98 8889
    9 9 99 8 9 8 9 8
    9 9 9 8 99898
    9 9 8 9 9 8 8 8 8
    9 8 9 8 8 9 9
    99 9 998 9999 99 898
  101. 101. Protilátka podle nároku 97, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na monocyty.
  102. 102. Protilátka podle nároku 97, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na polymorfonukleární buňky.
    i. Protilátka podle nároku 97, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená apoptóza indukovaná přímým signálem. Protilátka podle nároku 97, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšené dozrávání dendritických buněk. i. Protilátka podle nároku 97, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšené
    zásobení T-buňkami.
  103. 106. Protilátka podle nároku 98, kde receptor Fcje aktivující receptor Fc.
  104. 107. Protilátka podle nároku 98, kde receptor Fcje receptor FcyRIHA.
  105. 108. Fragment protilátky obsahující oblast Fc a sestrojený tak, aby měl zvýšenou efektorovou funkci, vyrobený způsobem podle kteréhokoliv z nároků 65 až 96.
  106. 109. Fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu a sestrojený tak, aby měl zvýšenou efektorovou funkci, vyrobený způsobem podle kteréhokoliv z nároků 65 až 96.
  107. 110. Fragment protilátkyobsahující oblast Fc a sestrojený tak, aby měl zvýšenou vazebnou afinitu k receptorů Fc, vyrobený způsobem podle kteréhokoliv z nároků 65 až 96.
  108. 111. Fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu a sestrojený tak, aby měl zvýšenou vazebnou afinitu k receptorů Fc, vyrobený způsobem podle kteréhokoliv z nároků 65 až 96.
  109. 112. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle kteréhokoliv z nároků 97 až 108 a farmaceuticky přijatelný nosič.
    • · 9 99 9 9 9 9 9 · 9
    9 9 9 9 9 9
    I I < ·»··· + · • 9 9 99
    9 9 9 · • · · ·· 999
  110. 113. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje fragment protilátky podle nároku 109 nebo nároku 111a farmaceuticky přijatelný nosič.
  111. 114. Farmaceutická kompozice v y z n a č u j i c i se t i m, že obsahuje fúzni protein podle nároků 110 nebo 112 a farmaceuticky přijatelný nosič.
  112. 115. Způsob léčení rakoviny, v y z n ač u j i c i se t i m, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství farmaceutické kompozice podle kteréhokoliv z nároků 113 až 115 pacientovi v případě potřeby.
  113. 116. Zlepšený způsob léčení choroby založené na vyčerpání B-buněk, zahrnující podání terapeuticky účinného množství protilátky lidskému subjektu v případě potřeby, vyznačující se tím, že zlepšení zahrnuje podání terapeuticky účinného množství protilátky podle kteréhokoliv z nároků 65 až 96.
  114. 117. Zlepšený způsob podle nároku 117, v y z n a č uj i c i se t i m, že protilátka je monoklonální protilátka anti-CD20.
  115. 118. Zlepšený způsob podle nároku 118, v y z n a č uj i c i se t i m, že protilátka anti-CD20 je IDEC-C2B8.
  116. 119. Izolovaná nukleová kyselina obsahující sekvenci kódující fúzni polypeptid, kde fúzni polypeptid má aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu.
  117. 120. Izolovaná nukleová kyslina podle nároku 119, kde fúzni polypeptid obsahuje katalytickou doménu B(1,4)-galaktózyltransferázy.
  118. 121. Izolovaná nukleová kyslina podle nároku 2, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  119. 122. Expresní vektor, který obsahuje izolovanou nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 119 až 121.
  120. 123. Fúzni polypeptid mající aktivitu 3(1,4)-galaktózyltransferázy a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu.
    ·· ···· ft · · · I • · • ··· m,,·
  121. 124. Fúzní polypeptid podle nároku 123, obsahující katalytickou doménu β(1,4)-galaktózyltransferázy.
  122. 125. Fúzní polypeptid podle nároku 124, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  123. 126. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 122.
  124. 127. Způsob výroby fúzního polypeptidů majícího aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 126 v médiu za podmínek, dovolujících expresi nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, a získání fúzního polypeptidů z výsledné kultury.
  125. 128. Způsob modifikace glykosylačního profilu polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 119 až 121 do hostitelské buňky.
  126. 129. Způsob modifikace glykosylačního profilu polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení expresního vektoru podle nároku 122 do hostitelské buňky.
  127. 130. Hostitelská buňka obsahující:
    a) expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu β(1,4)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy III a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidů; a
    b) expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II.
  128. 131. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou na tomtéž expresním vektoru.
  129. 132. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou na různých expresních vektorech.
    114 : :
    φ · ♦
    • ·♦··
  130. 133. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu P(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III.
    ·· ···« φφ ·ΦΦ« • · φ ···
  131. 134. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  132. 135. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I.
  133. 136. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  134. 137. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy I.
  135. 138. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména a1,6-N jádrové fukózyltransferázy.
  136. 139. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde hostitelská buňka je vybraná ze skupiny skládající se ze savčí buňky, kvasinkové buňky, hmyzí buňky nebo rostlinné buňky.
  137. 140. Hostitelská buňka podle nároku 130, kde hostitelská buňka je vybraná ze skupiny skládající se z buňky CHO, buňky BHK, buňky NSO, buňky SP2/0, myelomové buňky YO, buňky P3X63 myšího myelomu, buňky PER, buňky PER.C6 a hybridomové buňky.
  138. 141. Hostitelská buňka podle nároku 130, obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu β(1,2)-Ν-acetylglukózaminyltransferázy II.
  139. 142. Hostitelská buňka podle nároku 141, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu β(1,2)N- -acetylglukózaminyltransferázy II jsou ve stejném expresním vektoru.
    • · · • · • ·« Φ· I
  140. 143. Hostitelská buňka podle nároku 141, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II jsou každá v různých expresních vektorech.
  141. 144. Hostitelská buňka podle nároku 141, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid je v jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II jsou ve stejném expresním vektoru.
  142. 145. Hostitelská buňka podle nároku 141, kde molekula nukleové kyseliny kódující manózidázu II je v jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II jsou ve stejném expresním vektoru.
  143. 146. Hostitelská buňka podle nároku 141, kde molekula nukleové kyseliny kódující P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II je v jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou ve stejném expresním vektoru.
  144. 147. Hostitelská buňka obsahující:
    a) expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu β(1,4)-galaktózyltransferázy a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu; a
    b) expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II.
    Hostitelská buňka podle nároku 147, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou ve stejném expresním vektoru.
  145. 148. Hostitelská buňka podle nároku 147, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou v různých expresních vektorech.
    • ···· ·« ·· ···· • · ·
    116: : :* · ·· · ·· ···» • · · • · ··· • · · • · ·
  146. 149. Hostitelská buňka podle nároku 147, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména galaktózyltransferázy.
  147. 150. Hostitelská buňka podle nároku 147, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  148. 151. Hostitelská buňka podle nároku 147, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména β(Ι, 2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I.
  149. 152. Hostitelská buňka podle nároku 147, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména β(Ι, 2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  150. 153. Hostitelská buňka podle nároku 147, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy I.
  151. 154. Hostitelská buňka podle nároku 147, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména a1,6-N jádrové fukózyltransferázy.
  152. 155. Hostitelská buňka podle nároku 147, kde hostitelská buňka je vybraná ze skupiny skládající se ze savčí buňky, kvasinkové buňky, hmyzí buňky nebo rostlinné buňky.
  153. 156. Hostitelská buňka podle nároku 147, kde hostitelská buňka je vybraná ze skupiny skládající se z buňky CHO, buňky BHK, buňky NSO, buňky SP2/0, myelomové buňky YO, buňky P3X63 myšího myelomu, buňky PER, buňky PER.C6 a hybridomové buňky.
  154. 157. Hostitelská buňka podle nároku 147, dále obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  155. 158. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu β(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II jsou ve stejném expresním vektoru.
    44 4444
    4 4 4
    4 · · • · 4
    117..· :
    4 44 44 4444
    44 4 4 4 4 4
    4 · 4 4 4 44 • «44· ·
    4 4 4 4 ·
    4·· 4444 44 ·4·
  156. 159. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II jsou každá v různých expresních vektorech.
  157. 160. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid je v jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II jsou ve stejném expresním vektoru.
  158. 161. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde molekula nukleové kyseliny kódující manózidázu II je v jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II jsou ve stejném expresním vektoru.
  159. 162. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde molekula nukleové kyseliny kódující P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II je v jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou ve stejném expresním vektoru.
  160. 163. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu galaktózyltransferázy.
  161. 164. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  162. 165. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména β(Ι, 2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I.
  163. 166. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména β(Ι, 2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  164. 167. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy I.
    •4 ·*·· • · · • · · ·· 99 9999
    9 9 9 9 9
    9 9 9999
    9 9 9 9 9
    9 9 9 9 • ♦·*· ·· ···
  165. 168. Hostitelská buňka podle nároku 158 kde Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména a1,6-N jádrové fukózyltransferázy.
  166. 169. Hostitelská buňka podle nároku 158, kde hostitelská buňka je vybraná ze skupiny skládající se ze savčí buňky, kvasinkové buňky, hmyzí buňky nebo rostlinné buňky.
  167. 170. Hostitelská buňka podle nároku 159, kde hostitelská buňka je vybraná ze skupiny skládající se z buňky CHO, buňky BHK, buňky NSO, buňky SP2/0, myelomové buňky YO, buňky P3X63 myšího myelomu, buňky PER, buňky PER C6 a hybridomové buňky.
  168. 171. Hostitelská buňka sestrojená tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu p(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
  169. 172. Hostitelská buňka sestrojená tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu P(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy li a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
  170. 173. Hostitelská buňka sestrojená tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu galaktózyltransferázy a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze
    Φ φ φφφφ
    ΦΛ φφφφ
    119..· φφ φφφφ φ φ φ • φφφφ φ φ · φ · φ φφ φφφ skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
  171. 174. Hostitelská buňka sestrojená tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu galaktózyltransferázy, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
  172. 175. Hostitelská buňka podle kteréhokoliv z nároků 172 až 175, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou vykazuje zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc jako výsledek modifikace.
  173. 176. Hostitelská buňka podle kteréhokoliv z nároků 172 až 175, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou vykazuje zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek modifikace.
  174. 177. Hostitelská buňka podle nároku 177, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc.
  175. 178. Hostitelská buňka podle nároku 177, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na buňky NK.
  176. 179. Hostitelská buňka podle nároku 177, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na makrofágy.
  177. 180. Hostitelská buňka podle nároku 177, 73, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na polymorfonukleární buňky.
  178. 181. Hostitelská buňka podle nároku 177, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na monocyty.
    i2o:
    ·· ···· • 9 ( · • · · • · ·· · ·· • ·
    99 9999
    9 9 9
    9 · ··« • ····
    9 9 9 9
    9 9 9
    99 999
  179. 182. Hostitelská buňka podle nároku 177, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšená apoptóza indukovaná přímým signálem.
  180. 183. Hostitelská buňka podle nároku 177, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšené dozrávání dendritických buněk.
  181. 184. Hostitelská buňka podle nároku 177, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšené zásobení T-buňkami.
  182. 185. Způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce vyznačující se t i m, že zahrnuje:
    a) kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a
    b) izolaci polypeptidu.
  183. 186. Způsob podle nároku 186, v y z n a č u j i c i se t i m, že hostitelská buňka je dále sestrojená tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu 8(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  184. 187. Způsob podle nároku 186 nebo 187, v y z n a č u j i c i se t i m, že fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu β(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III.
  185. 188. Způsob podle nároku 188, v y z n a č uj i c i se t i m, že fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu.
  186. 189. Způsob podle nároku 189, vyznačující se tím, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  187. 190. Způsob podle nároku 189, vyznačující se tím, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména 3(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I.
  188. 191. Způsob podle nároku 189, vyznačující se tím, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy I.
  189. 192. Způsob podle nároku 189, vyznačující se tím, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  190. 193. Způsob podle nároku 189, v y z n a č u j í c i se t i m, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména cc 1-6 jádrové fukózyltransferázy.
  191. 194. Způsob podle nároku 186, v y z n a č u j i c i se t í m, že polypeptid má zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek modifikace.
  192. 195. Způsob produkce polypeptidů v hostitelské buňce vyznačující se t i m, že zahrnuje:
    a) kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu galaktózyltransferázy a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidů vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou; a
    b) izolaci polypeptidů.
  193. 196. Způsob podle nároku 196, v y z n a č u j i c i se t í m, že hostitelská buňka je dále sestrojená tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu p(1,2)-N-acetylglukózamínyltransferázy II.
  194. 197. Způsob podle nároku 196 nebo 197, v y z n a č u j i c í se t í m, že fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu galaktózyltransferázy.
    • · · ·
  195. 198. Způsob podle nároku 198, v y z n a č uj í c í se t í m, že fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu.
  196. 199. Způsob podle nároku 199, vyznačující se tím, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II.
  197. 200. Způsob podle nároku 199, vyznačující se tím, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména p(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I.
  198. 201. Způsob podle nároku 199, vyznačující se tím, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy I.
  199. 202. Způsob podle nároku 199, vyznačující se tím, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména P(1,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II.
  200. 203. Způsob podle nároku 199, vyznačující se tím, že Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména a1-6 jádrové fukózyltransferázy.
  201. 204. Způsob podle nároku 199, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptid má zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek modifikace.
  202. 205. Způsob podle nároků 186 nebo 196, v y z n a č u j í c í se tím, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšený podíl rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu.
  203. 206. Způsob podle nároku 206, vyznačující se tím, že rozdělené nefukózylované oligosacharidy jsou hybridní.
  204. 207. Způsob podle nároku 206, vyznačující se tím, že rozdělené nefukózylované oligosacharidy jsou komplexní.
  205. 208. Způsob podle nároku 206, vyznačující se tím, že alespoň 20 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je rozdělených nefukózylovaných.
    123..· i .:..:.. »· ···
  206. 209. Způsob podle nároku 206, vyznačující se tím, že alespoň 25 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů je rozdělených nefukózylovaných.
  207. 210. Způsob podle nároku 206, vyznačující se tím, že alespoň 30 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů je rozdělených nefukózylovaných.
  208. 211. Způsob podle nároku 206, vyznačující se tím, že alespoň 35 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů je rozdělených nefukózylovaných.
  209. 212. Protilátka sestrojená tak, aby měla zvýšenou efektorovou funkci, vyrobená způsobem podle kteréhokoliv z nároků 196 až 212.
  210. 213. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 213 a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
  211. 214. Způsob léčení rakoviny, vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinného množství farmaceutické kompozice podle nároku 214 pacientovi v případě potřeby.
  212. 215. Způsob produkce polypeptidů, majícího zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc v hostitelské buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje:
    a) kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující galaktózyltransferázu a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující manózidázu II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidů vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky a fragmentu protilátky, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde úroveň exprese jedné nebo obou z galaktózyltransferázy a manózidázy II je postačující pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou a kde polypeptid má zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc jako výsledek modifikace; a
    b) izolaci polypeptidů, majícího zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc.
    124
  213. 216. Způsob podle nároku 216, v y z n a č u j í c I se 11 m, že v kroku a) hostitelská buňka obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující celou protilátku.
  214. 217. Způsob podle nároku 216, vyznačující se tím, že v kroku a) hostitelská buňka obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fragment protilátky.
  215. 218. Způsob podle nároku 216, vy z n a ču j i c i se t i m, že hodnota exprese galaktózyltransferázy produkuje molekulu protilátky nebo fragment protilátky, která zahrnuje oblast Fc imunoglobulinu majícího zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fc.
  216. 219. Způsob podle nároku 216, v y z n a č u j i c i se t i m, že hostitelská buňka dále obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující β(1,4)-Ν-acetylglukózaminyltransferázu III, kde 6(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferáza III je exprimována v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou a kde polypeptid má zvýšenou celulární cytotoxicitu zprostředkovanou Fcjako výsledek modifikace.
  217. 220. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 216 nebo 220, vyznačující se tím, že úroveň exprese jedné nebo více z galaktózyltransferázy, manózidázy II a β(1,4)-Ν-30βίγ^ΙυΚόζ3ΐηίηγΙΐΓ3η5ίβΓέζγ III je postačující pro tvorbu rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu.
  218. 221. Způsob podle nároku 221, v y z n a č u j i c i se t i m, že podíl rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc k celkovým oligosacharidům v oblasti Fc je alespoň 45 %.
  219. 222. Způsob podle nároku 221, vyznačující se tím, že rozdělené oligosacharidy jsou komplexní.
  220. 223. Způsob podle nároku 221, vyznačující se tím, že rozdělené oligosacharidy jsou hybridní.
    12$ • ·
  221. 224. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 216 nebo 220, vyznačující se tím, že hostitelská buňka je vybraná ze skupiny, skládající se ze savčí buňky, kvasinkové buňky, hmyzí buňky nebo rostlinné buňky.
  222. 225. Způsob podle nároku 225, v y z n a č u j i c i se t i m, že hostitelská buňka je rostlinná buňka.
  223. 226. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 216 nebo 220, vyznačující se t i m, že hostitelská buňka je vybraná ze skupiny, skládající se z buňky CHO, buňky BHK, buňky NSO, buňky SP2/0, myelomové buňky YO, buňky P3X63 myšího myelomu, buňky PER.C6 a hybridomové buňky
  224. 227. Způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce vyznačující se t i m, že zahrnuje:
    a) kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu α-manózidázy II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid mající aktivitu α-manózidázy II je exprimován v množstvím postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblast Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a
    b) izolaci polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou.
  225. 228. Způsob podle nároku 228, vyznačující se tím, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek modifikace.
  226. 229. Způsob podle nároku 229, vyznačující se tím, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc.
  227. 230. Způsob podle nároku 229, vyznačující se tím, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na buňky NK.
  228. 231. Způsob podle nároku 229, vyznačující se tím, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na makrofágy.
    126
  229. 232. Způsob podle nároku 229, vyznačující se tím, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená vaznost na polymorphonukleární buňky.
  230. 233. Způsob podle nároku 229, vyznačující efektorová funkce je zvýšená vaznost na monocyty.
    se t í m, že zvýšená
  231. 234. Způsob podle nároku 229, vyznačující se tím, že zvýšená efektorová funkce je zvýšená apoptóza indukovaná přímým signálem.
  232. 235. Způsob podle nároku 229, vyznačující se efektorová funkce je zvýšené dozrávání dendritických buněk.
    tím, že zvýšená
  233. 236. Způsob podle nároku 229, vyznačující efektorová funkce je zvýšené zásobení T-buňkami.
    se tim, že zvýšená
  234. 237. Způsob podle nároku 228, vyznačující se tím, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšenou vaznost receptorů Fc jako výsledek modifikace.
  235. 238. Způsob podle nároku 238, vyznačující se tím, že receptor Fc je aktivující receptor Fcy.
  236. 239. Způsob podle nároku 238, vyznačující se tím, že receptor Fc je receptor FcyRIIIA.
  237. 240. Hostitelská buňka podle nároku 35, kde hostitelská buňka je buňka CHO, buňka BHK, buňka NSO, buňka SP2/0, myelomová buňka YO, buňka myšího myelomu P3X63, buňka PER, buňka PER.C6 nebo hybridomová buňka.
  238. 241. Způsob podle nároku 228, vyznačující se tím, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je protilátka anti-CD20.
  239. 242. Způsob podle nároku 228, vyznačující se tím, že protilátka antiCD20je IDEC-C2B8.
    127·..’
  240. 243. Způsob podle nároku 228, vyznačující se tím, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je chimérní protilidská monoklonální protilátka karcinomu renálních buněk chG250.
  241. 244. Způsob podle nároku 228, vyznačující se tím, že hostitelská buňka dále obsahuje alespoň jednu transfekovanou nukleovou kyselinu kódující molekulu protilátky, fragment protilátky nebo fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
  242. 245. Způsob podle nároku 245, v y z n a č u j í c í se t í m, že alespoň jedna transfekovaná nukleová kyselina kóduje protilátku anti-CD20, chimérní protilidskou neuroblastomovou monoklonální protilátku chCE7, chimérní protilidskou monoklonální protilátku karcinomu renálních buněk chG250, chimérní protilidskou monoklonální protilátku karcinomu tlustého střeva, plic a prsu ING-1, humanizovanou protilidskou monoklonální protilátku antigenů 17-1A 3622W4, humanizovanou protilidskou monoklonální protilátku kolorektálního nádoru A33, protilidskou melanomovou protilátku směrovanou proti gangliosidu GD3, chimérní protilidskou monoklonální protilátku karcinomu buněk dlaždicového epitelu SF-25, protilidskou protilátku EGFR, protilidskou protilátku EGFRvIII, protilidskou protilátku PSMA, protilidskou protilátku PSCA, protilidskou protilátku CD22, protilidskou protilátku CD30, protilidskou protilátku CD33, protilidskou protilátku CD38, protilidskou protilátku CD40, protilidskou protilátku CD45, protilidskou protilátku CD45, protilidskou protilátku CD52, protilidskou protilátku CD138, protilidskou variantní protilátku HLA--DR, protilidskou protilátku EpCAM, protilidskou protilátku CEA, protilidskou protilátku MUC1, protilidskou protilátku jádrového proteinu MUC1, protilidskou aberantně glykosylovanou protilátku MUC1, protilátku proti variantám lidského fibronektinu obsahující doménu ED-B, nebo protilidskou protilátku HER2/neu.
  243. 246. Způsob podle nároku 228, vyznačující se tím, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšený podíl rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu.
  244. 247. Způsob podle nároku 228, vyznačující se tím, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšený podíl nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu.
    • 9 9 9 89
    9 9 • · • · · ·
    128·,.· :
    • · 8 9 9
    9 8 8888
    9 8 9 9 8
    8 9 8 9
    99989 99 989
  245. 248. Způsob podle nároku 248, vyznačující se tím, že nefukózylované oligosacharidy jsou hybridní.
  246. 249. Způsob podle nároku 248, vyznačující se tím, že nefukózylované oligosacharidy jsou komplexní.
  247. 250. Způsob podle nároku 228, vyznačující se tím, že polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšený podíl rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu.
  248. 251. Způsob podle nároku 251, vyznačující se tím, že rozdělené nefukózylované oligosacharidy jsou hybridní.
  249. 252. Způsob podle nároku 251, vyznačující se t i m, že rozdělené nefukózylované oligosacharidy jsou komplexní.
  250. 253. Způsob podle nároku 248, vyznačující se tím, že alespoň 20 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je nefukózylovaných.
  251. 254. Způsob podle nároku 248, vyznačující se tím, že alespoň 25 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je nefukózylovaných.
  252. 255. Způsob podle nároku 248, v y z n a č u j i c i se t i m, že alespoň 30 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je nefukózylovaných.
  253. 256. Způsob podle nároku 248, vyznačující se tím, že alespoň 35 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je nefukózylovaných.
  254. 257. Způsob podle nároku 248, vyznačující se tím, že alespoň 40 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je nefukózylovaných.
  255. 258. Způsob podle nároku 248, vyznačující se tím, že alespoň 45 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je nefukózylovaných.
  256. 259. Způsob podle nároku 248, vyznačující se tím, že alespoň 48 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu je nefukózylovaných.
    129· • ···«
  257. 260. Protilátka sestrojená tak, aby měla zvýšenou efektorovou funkci, vyrobená způsobem podle nároku 228.
  258. 261. Protilátka sestrojená tak, aby měla zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc, vyrobená způsobem podle nároku 228.
  259. 262. Protilátka podle nároku 261, kde buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc.
  260. 263. Protilátka podle nároku 261, kde vaznost na buňky NK.
  261. 264. Protilátka podle nároku 261, kde vaznost na makrofágy.
  262. 265. Protilátka podle nároku 261, kde vaznost na monocyty.
  263. 266. Protilátka podle nároku 261, kde vaznost na polymorfonukleární buňky.
    zvýšená efektorová funkce je zvýšená zvýšená efektorová funkce je zvýšená zvýšená efektorová funkce je zvýšená zvýšená efektorová funkce je zvýšená zvýšená efektorová funkce je zvýšená
  264. 267. Protilátka podle nároku 261, kde zvýšená efektorová funkce je apoptóza indukovaná přímým signálem.
  265. 268. Protilátka podle nároku 261, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšené dozrávání dendritických buněk.
  266. 269. Protilátka podle nároku 261, kde zvýšená efektorová funkce je zvýšené zásobení T-buňkami.
  267. 270. Protilátka podle nároku 262, kde receptor Fcje aktivující receptor Fc.
  268. 271. Protilátka podle nároku 262, kde receptor Fcje receptor FcyRIIIa.
  269. 272. Fragment protilátky obsahující oblast Fc a sestrojený tak, aby měl zvýšenou efektorovou funkci, vyrobený způsobem podle nároku 228.
    1305
    9 9999 •9 ····
    9 9 9 • · · ♦♦
  270. 273. Fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu sestrojený tak, aby měl zvýšenou efektorovou funkci, vyrobený způsobem podle nároku 228.
  271. 274. Fragment protilátky obsahující oblast Fc a sestrojený tak, aby měl zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc, vyrobený způsobem podle nároku 228.
  272. 275. Fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu sestrojený tak, aby měl zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc, vyrobený způsobem podle nároku 228.
  273. 276. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle kteréhokoliv z nároků 261 až 272 a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
  274. 277. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje fragment protilátky podle nároku 273 nebo nároku 275 a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
  275. 278. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje fúzní protein podle nároku 274 nebo nároku 276 a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
  276. 279. Způsob léčení nádoru vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinného množství farmaceutické kompozice podle kteréhokoliv z nároků 277 až 279 pacientovi v případě potřeby.
  277. 280. Zlepšený způsob léčení nemoci založené na spotřebování B-buněk, zahrnující podání terapeuticky účinného množství protilátky lidskému subjektu v případě potřeby, vyznačující se tím, že zlepšení zahrnuje podání terapeuticky účinného množství protilátky vyrobená způsobem podle nároku 228.
  278. 281. Zlepšený způsob podle nároku 281, v y z n a č u j i c i se t i m, že protilátka je monoklonální protilátka anti-CD20.
  279. 282. Způsob podle nároku 228, v y z n a č u j i c i se t i m, že molekula nukleové kyseliny zahrnuje SEQ ID NO: 17.
    •0 0000 • · ·
    00 000· ► 0 t > *0··
  280. 283. Způsob podle nároku 228, v y z n a č uj í c í se t í m, že polypeptid mající aktivitu α-manózidázy zahrnuje SEQ ID NO:18.
  281. 284. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 121, obsahující SEQ ID NO:19.
  282. 285.
    Fúzní polypeptid podle nároku 125, zahrnující SEQ ID NQ:20.
CZ2005490A 2003-01-22 2004-01-22 Fúzní konstrukty a jejich použití pro přípravu protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k receptorům Fc a efektorovou funkcí CZ308720B6 (cs)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44130703P 2003-01-22 2003-01-22
US2003441307 2003-01-22
US49125403P 2003-07-31 2003-07-31
US2003491254 2003-07-31
US49514203P 2003-08-15 2003-08-15
US2003495142 2003-08-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2005490A3 true CZ2005490A3 (cs) 2006-02-15
CZ308720B6 CZ308720B6 (cs) 2021-03-24

Family

ID=32777012

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2005490A CZ308720B6 (cs) 2003-01-22 2004-01-22 Fúzní konstrukty a jejich použití pro přípravu protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k receptorům Fc a efektorovou funkcí

Country Status (18)

Country Link
US (2) US8367374B2 (cs)
EP (4) EP2264151B1 (cs)
JP (4) JP5425365B2 (cs)
KR (2) KR101498588B1 (cs)
CN (1) CN103540600B (cs)
AT (1) ATE475708T1 (cs)
AU (2) AU2004205802B2 (cs)
CA (1) CA2513797C (cs)
CZ (1) CZ308720B6 (cs)
DE (1) DE602004028337D1 (cs)
ES (3) ES2574993T3 (cs)
IL (2) IL169805A (cs)
MX (1) MXPA05007781A (cs)
NO (1) NO339270B1 (cs)
NZ (5) NZ591970A (cs)
PL (7) PL224787B1 (cs)
SG (2) SG2013005590A (cs)
WO (1) WO2004065540A2 (cs)

Families Citing this family (259)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
JP3528611B2 (ja) * 1998-07-16 2004-05-17 Ｊｆｅスチール株式会社 結束材の切断方法及びその装置
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
PL224787B1 (pl) * 2003-01-22 2017-01-31 Roche Glycart Ag Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego
US20060257972A1 (en) * 2003-03-31 2006-11-16 Takashi Ishihara Purification of human monoclonal antibody and human polyclonal antibody
EA025962B1 (ru) 2003-11-05 2017-02-28 Роше Гликарт Аг АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
TW200539855A (en) * 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
US20060045877A1 (en) * 2004-08-30 2006-03-02 Goldmakher Viktor S Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
PL1871805T3 (pl) * 2005-02-07 2020-03-31 Roche Glycart Ag Cząsteczki wiążące antygen, które wiążą egfr, wektory kodujące te cząsteczki oraz ich zastosowania
ES2498794T3 (es) * 2005-02-18 2014-09-25 Medarex, L.L.C. Anticuerpos monoclonales contra CD30 que carecen de restos fucosilo
RU2007139283A (ru) * 2005-03-25 2009-04-27 Гликарт Биотехнологи Аг (Ch) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ К MCSP И ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
RU2007145509A (ru) * 2005-05-09 2009-06-20 Гликарт Биотехнологи Аг (Ch) Антигенсвязывающие молекулы, имеющие модифицированные fc-участки и измененное связывание с fc-рецепторами
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
JP2009501913A (ja) 2005-07-21 2009-01-22 ゲンマブ エー／エス Ｆｃ受容体と結合する抗体原薬に関する効力アッセイ
WO2007031875A2 (en) 2005-08-26 2007-03-22 Glycart Biotechnology Ag Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
PL1989231T3 (pl) * 2006-03-21 2015-10-30 Genentech Inc Terapia kombinatoryczna z udziałem antagonistów alfa5beta1
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
WO2008008482A2 (en) * 2006-07-13 2008-01-17 Genentech, Inc. Altered br3-binding polypeptides
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
CA2665528C (en) 2006-10-12 2018-01-23 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
US20100028951A1 (en) * 2007-03-07 2010-02-04 Stephen Hamilton Production of glycoproteins with modified fucosylation
EP1995309A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
PL2155880T3 (pl) 2007-06-15 2017-06-30 Medicago Inc. Modyfikacja wytwarzania glikoproteiny w roślinach
EP2197491A4 (en) 2007-09-04 2011-01-12 Univ California HIGHAFFINE ANTI-PROSTATE STEM CELL ANTIGEN (PSCA) ANTIBODIES TO CANCER AND TO THE DETECTION OF CANCER
BRPI0816458A2 (pt) 2007-09-05 2013-03-12 Hoffmann La Roche terapia combinada com anticorpos anti-cd20 tipo i e tipo ii
JP5535074B2 (ja) 2007-10-01 2014-07-02 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー メソテリンに結合するヒト抗体およびその使用
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
WO2009086072A2 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
WO2009080831A1 (en) * 2007-12-26 2009-07-02 Biotest Ag Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
DK2242772T3 (en) * 2007-12-26 2015-01-05 Biotest Ag Immunoconjugates that targets CD138, and uses thereof
BRPI0821447A2 (pt) * 2007-12-26 2015-06-16 Biotest Ag Anticorpo de alvejamento engenheirado, composição farmacêutica, hibridoma, ensaio com base em anticorpo, polipeptídeo isolado, e, método para ligação homogênea
RU2486203C2 (ru) * 2007-12-26 2013-06-27 Биотест Аг Способы улучшения направленного воздействия на cd138-экспрессирующие опухолевые клетки и агенты для их осуществления
CA2710912A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Afucosylated antibodies against ccr5 and their use
KR101054362B1 (ko) * 2008-07-03 2011-08-05 재단법인 목암생명공학연구소 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법
EP2318530B1 (en) 2008-07-18 2016-06-22 Medicago Inc. New influenza virus immunizing epitope
US8394924B2 (en) * 2008-10-23 2013-03-12 Massachusetts Institute Of Technology Directed engagement of activating Fc receptors
WO2010096486A1 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
AU2010230346A1 (en) 2009-03-31 2011-07-28 Roche Glycart Ag Treatment of cancer with a humanized anti-EGFR IgG1antibody and irinotecan
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
MX2011010159A (es) 2009-04-02 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla.
MX2011010168A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos, trivalentes.
CN102378768A (zh) 2009-04-07 2012-03-14 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体
JP5612663B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-22 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ＥｒｂＢ−１／抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
NZ613647A (en) * 2009-05-06 2015-02-27 Biotest Ag Uses of immunoconjugates targeting cd138
MX2011011925A (es) 2009-05-27 2011-12-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos.
EP2436397B1 (en) 2009-05-29 2017-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing antagonist of egf family ligand as component
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
BR112012003066A2 (pt) 2009-08-14 2016-11-16 Roche Glycart Ag uso de um anticorpo anti-cd20 defucosilado e composição compreendendo um anticorpo anti-cd20 defucosilado
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
TW201113037A (en) 2009-08-28 2011-04-16 Hoffmann La Roche Antibodies against CDCP1 for the treatment of cancer
TWI412375B (zh) 2009-08-28 2013-10-21 Roche Glycart Ag 人類化抗ｃｄｃｐ１抗體
PE20121552A1 (es) 2009-08-31 2012-11-26 Roche Glycart Ag Anticuerpos monoclonales anti cea humanizados de afinidad madura
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
MX2012003396A (es) 2009-09-16 2012-04-10 Genentech Inc Complejos de proteina conteniendo helice super-enrollada y/o enlazador tether y usos de los mismos.
MX2012004682A (es) 2009-10-26 2012-09-07 Hoffmann La Roche Metodo para la produccion de una inmunoglobulina glicosilada.
JP6251477B2 (ja) 2009-12-02 2017-12-20 イマジナブ・インコーポレーテッド ヒト前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）をターゲッティングするｊ５９１ミニボディおよびｃｙｓダイアボディならびにこれらを使用するための方法
DK2516469T3 (en) 2009-12-22 2016-05-02 Roche Glycart Ag ANTI-HER3 antibodies and uses thereof
KR20120110175A (ko) 2009-12-29 2012-10-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 항체 제제
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
CA2795544A1 (en) 2010-04-27 2011-11-03 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mtor inhibitor
US20120100166A1 (en) 2010-07-15 2012-04-26 Zyngenia, Inc. Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
CN103153341B (zh) 2010-08-03 2015-05-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 慢性淋巴细胞性白血病(cll)生物标志物
AU2011288487B2 (en) 2010-08-13 2015-10-01 Roche Glycart Ag Anti-FAP antibodies and methods of use
MX2013001336A (es) 2010-08-13 2013-03-08 Roche Glycart Ag Anticuerpos ani-tenascina c a2 y metodos de utilizacion.
TW201208703A (en) 2010-08-17 2012-03-01 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated CD20 antibody with an anti-VEGF antibody
EP2609111B1 (en) 2010-08-24 2017-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized-fv fragment
EP2651976A1 (en) 2010-12-16 2013-10-23 Roche Glycart AG Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mdm2 inhibitor
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
JPWO2012105699A1 (ja) * 2011-02-03 2014-07-03 株式会社イーベック 補体依存性生物活性の高い抗体の産生法
US20120258073A1 (en) 2011-02-10 2012-10-11 Christian Gerdes Immunotherapy
PL3075745T3 (pl) 2011-02-10 2019-07-31 Roche Glycart Ag Zmutowane polipeptydy interleukiny-2
JP5768147B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 一価抗原結合タンパク質
MX341921B (es) 2011-02-28 2016-09-07 Hoffmann La Roche Proteinas de union a antigeno.
MA34927B1 (fr) 2011-03-02 2014-02-01 Roche Glycart Ag Anticorps anti-cea
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
CA2837169C (en) 2011-05-24 2021-11-09 Zyngenia, Inc. Multispecific complexes comprising angiopoietin-2-binding peptide and their uses
FR2976811A1 (fr) 2011-06-22 2012-12-28 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un anticorps anti-cd20 a haute adcc pour le traitement de la maladie de waldenstrom
HRP20181355T1 (hr) 2011-08-23 2018-10-19 Roche Glycart Ag Bispecifične molekule koje se vežu na antigen
CA2844141A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
RU2014114119A (ru) 2011-09-23 2015-10-27 Рош Гликарт Аг Биспецифические анти-egfr/анти igf-1r-антитела
US9994610B2 (en) 2011-10-19 2018-06-12 Roche Glycart Ag Separation method for fucosylated antibodies
US20130302274A1 (en) 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
KR20140100571A (ko) 2011-12-08 2014-08-14 바이오테스트 아게 Ｃｄ１３８을 타겟팅하는 면역접합체의 용도
TWI593705B (zh) * 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
WO2013113641A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Roche Glycart Ag Use of nkp46 as a predictive biomarker for cancer treatment with adcc- enhanced antibodies
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
JP2015511702A (ja) 2012-03-02 2015-04-20 ロシュ グリクアート アーゲー Ａｄｃｃ増強抗体を用いた癌治療のための予測バイオマーカー
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
WO2013174927A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Novartis International Pharmaceutical Limited Production of fucosylated glycoproteins
CA2869529A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Raffaella CASTOLDI Multispecific antibodies
CA2874721A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Tomoyuki Igawa Target tissue-specific antigen-binding molecule
KR20150023889A (ko) 2012-06-27 2015-03-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 2 개 이상의 상이한 결합 단위를 함유하는 맞춤-제작된 고도로 선별적이고 다중-특이적인 표적화 단위의 선별 및 제조 방법 및 이의 용도
EP2867254B1 (en) 2012-06-27 2017-10-25 F. Hoffmann-La Roche AG Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
JP6290209B2 (ja) 2012-08-07 2018-03-07 ロシュ グリクアート アーゲー 低下した及び増加したエフェクター機能を有するように操作された２つの抗体を含む組成物。
WO2014070786A1 (en) 2012-10-29 2014-05-08 The University Of North Carolina At Chapel Hill Compositions and methods for inhibiting pathogen infection
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
EP2914629A1 (en) 2012-11-05 2015-09-09 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
MA37961A1 (fr) * 2012-12-18 2016-06-30 Glycotope Gmbh Nouveaux traitements thérapeutiques par anticorps anti-her2 à basse fucosylation
EP4119947A1 (en) 2012-12-21 2023-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
US9180185B2 (en) 2013-01-11 2015-11-10 Hoffman-La Roche Inc. Combination therapy of anti-HER3 antibodies
WO2014114595A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Roche Glycart Ag Predictive biomarker for cancer treatment with adcc-enhanced antibodies
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
EP2953972B1 (en) 2013-02-05 2020-07-08 EngMab Sàrl Method for the selection of antibodies against bcma
RU2015140921A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Антитела к mcsp
RU2019120404A (ru) 2013-03-13 2019-08-06 Дженентек, Инк. Составы антител
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
CN105517571A (zh) 2013-06-24 2016-04-20 中外制药株式会社 含有人源化抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分的腺癌以外的非小细胞肺癌的治疗药
WO2015052230A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
WO2015082446A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-cdcp1 antibody and a taxane
DK3078744T3 (da) 2013-12-04 2020-09-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-bindende molekyler, antigen-bindingsaktiviteten af hvilke varierer i henhold til koncentrationen af forbindelser, og biblioteker af molekylerne
EP3083690A1 (en) 2013-12-17 2016-10-26 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and an anti-cd20 antibody
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
CN106459959A (zh) 2014-05-08 2017-02-22 中外制药株式会社 对gpc3靶向治疗剂疗法有效的患者施用的gpc3靶向治疗剂
KR20170010003A (ko) * 2014-05-27 2017-01-25 아카데미아 시니카 박테로이드 기원의 푸코시다제 및 이의 사용 방법
EP3148581B1 (en) 2014-05-30 2019-10-09 Henlius Biotech Co., Ltd. Anti-epidermal growth factor receptor (egfr) antibodies
EP3172333B1 (en) 2014-07-21 2020-05-13 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
EP3193932B1 (en) 2014-09-15 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody formulations
WO2016049214A1 (en) 2014-09-23 2016-03-31 Genentech, Inc. METHOD OF USING ANTI-CD79b IMMUNOCONJUGATES
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
ES2764111T3 (es) 2014-12-03 2020-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos
BR112017023849A2 (pt) 2015-05-07 2018-07-17 Agenus Inc. anticorpos anti-ox40 e métodos de uso dos mesmos
EP3936524A3 (en) 2015-05-11 2022-06-15 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
WO2016207091A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific antibodies specific for her2 and a blood brain barrier receptor and methods of use
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
EP3313887A2 (en) 2015-06-26 2018-05-02 MAB Discovery GmbH Monoclonal anti-il-1racp antibodies
CN108473573A (zh) 2015-06-29 2018-08-31 豪夫迈·罗氏有限公司 Ii型抗cd20抗体用于器官移植中
AU2016302881B2 (en) 2015-08-03 2022-09-15 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies against BCMA
JP7026613B2 (ja) 2015-08-07 2022-02-28 イマジナブ・インコーポレーテッド 標的分子に対する抗原結合コンストラクト
RU2757135C2 (ru) 2015-09-24 2021-10-11 АБВИТРО ЭлЭлСи Композиции антител к вич и способы их применения
JP7325186B2 (ja) 2015-12-09 2023-08-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗薬物抗体の形成を減少させるためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
EP3423491A1 (en) 2016-03-01 2019-01-09 H. Hoffnabb-La Roche Ag Obinutuzumab variants having altered cell death induction
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
WO2017194441A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified anti-tenascin antibodies and methods of use
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
AU2018276419A1 (en) 2016-06-02 2019-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Type II anti-CD20 antibody and anti-CD20/CD3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3257866A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 Academisch Medisch Centrum Modified anti-tnf antibody and use thereof in the treatment of ibd
JP7267914B2 (ja) 2016-11-02 2023-05-02 エンクマフ エスアーエールエル Ｂｃｍａ及びｃｄ３に対する二重特異性抗体、及び多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される免疫療法薬
CN118634323A (zh) 2016-12-07 2024-09-13 艾吉纳斯公司 抗体和其使用方法
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
EP3606963B1 (en) 2017-04-03 2023-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to steap-1
ES2926859T3 (es) 2017-04-05 2022-10-31 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-LAG3
WO2018201096A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Tesaro, Inc. Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
JP2020528061A (ja) 2017-07-26 2020-09-17 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ＢＥＴ阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤及び抗ＣＤ２０抗体を用いた併用療法
TWI870011B (zh) 2017-08-25 2025-01-11 美商戊瑞治療有限公司 Ｂ７－ｈ４抗體及其使用方法
EP3728570B1 (en) * 2017-12-18 2025-02-12 The General Hospital Corporation Glycoengineering
PE20201149A1 (es) 2017-12-21 2020-10-26 Hoffmann La Roche Anticuerpos de union a hla-a2/wt1
WO2019129677A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-vegf antibodies and methods of use
EP3737692A4 (en) 2018-01-09 2021-09-29 Elstar Therapeutics, Inc. CALRETICULIN AND MODIFIED T-LYMPHOCYTES BINDING CONSTRUCTIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
MA51903A (fr) 2018-02-21 2021-05-26 Five Prime Therapeutics Inc Formulations d'anticorps b7-h4
CN111868089B (zh) 2018-02-21 2025-08-22 戊瑞治疗有限公司 B7-h4抗体给药方案
KR20200144094A (ko) 2018-03-02 2020-12-28 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. B7-h4 항체 및 이의 사용 방법
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
JP2021519073A (ja) 2018-03-29 2021-08-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 哺乳動物細胞におけるラクトジェニック活性の制御
CA3102398A1 (en) 2018-06-03 2019-12-12 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
JP7554742B2 (ja) 2018-07-03 2024-09-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
WO2020061560A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Synthetic binding agents for limiting permeation through mucus
TWI835885B (zh) 2018-10-15 2024-03-21 美商戊瑞治療有限公司 用於癌症之組合療法
MX2021006573A (es) 2018-12-06 2021-07-15 Genentech Inc Tratamiento conjunto de linfoma difuso de linfocitos b grandes que comprende un inmunoconjugado anti-cd79b, un agente alquilante y un anticuerpo anti-cd20.
CN119708249A (zh) 2018-12-21 2025-03-28 豪夫迈·罗氏有限公司 与VEGF和IL-1β结合的抗体及其使用方法
CN118271445A (zh) 2018-12-21 2024-07-02 豪夫迈·罗氏有限公司 与cd3结合的抗体
EP3927744A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
CN114127111B (zh) 2019-02-21 2024-09-10 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
WO2020189748A1 (ja) 2019-03-19 2020-09-24 中外製薬株式会社 Ｍｔａ依存的に抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子及び当該抗原結合ドメイン取得用ライブラリ
EP3968993A1 (en) 2019-05-14 2022-03-23 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat follicular lymphoma
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
EP4003526A2 (en) 2019-07-31 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to gprc5d
WO2021018925A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to gprc5d
EP4028054A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
CR20220156A (es) 2019-09-18 2022-05-23 Genentech Inc Anticuerpos anti-klk7, anticuerpos anti-klk5, anticuerpos multiespecíficos anti-klk5/klk7 y métodos de uso
CN114945386A (zh) 2019-10-18 2022-08-26 基因泰克公司 使用抗CD79b免疫缀合物治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的方法
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
US11987632B2 (en) 2019-12-18 2024-05-21 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to HLA-A2/MAGE-A4
EP4114860A1 (en) 2020-03-06 2023-01-11 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
KR20220159426A (ko) 2020-03-26 2022-12-02 제넨테크, 인크. 감소된 숙주 세포 단백질을 보유하는 변형된 포유동물 세포
UY39135A (es) 2020-03-26 2021-10-29 Univ Vanderbilt ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS DIRIGIDOS CONTRAEL CORONAVIRUS 2 DEL SÍNDROME RESPIRATORIO AGUDO GRAVE (SARS-CoV-2)
IL297286A (en) * 2020-04-17 2022-12-01 Janssen Biotech Inc Biosynthetic glycoprotein populations
TW202206111A (zh) 2020-04-24 2022-02-16 美商建南德克公司 使用抗ｃｄ７９ｂ免疫結合物之方法
US20210355196A1 (en) 2020-05-17 2021-11-18 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of selecting and using the same
BR112022024996A2 (pt) 2020-06-08 2022-12-27 Hoffmann La Roche Anticorpos, ácido nucleico, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, agente terapêutico, uso do anticorpo e método para tratar um indivíduo com hepatite b
EP4168447A1 (en) 2020-06-19 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3 and cd19
IL296089A (en) 2020-06-19 2022-11-01 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
WO2021255143A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and folr1
JP2023533217A (ja) 2020-06-24 2023-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド アポトーシス耐性細胞株
MX2023000339A (es) 2020-07-10 2023-02-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a celulas cancerosas y dirigen radionucleotidos a dichas celulas.
BR112023000839A2 (pt) 2020-07-17 2023-02-07 Genentech Inc Anticorpos isolados, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, métodos para produzir um anticorpo que se liga a notch2 humano, para tratar um indivíduo com uma doença pulmonar muco-obstrutiva e para reduzir o número de células secretoras em um indivíduo, composição farmacêutica, anticorpo, anticorpo para uso e uso do anticorpo
IL300257A (en) 2020-08-10 2023-03-01 Astrazeneca Uk Ltd SARS-COV-2 antibodies for the treatment and prevention of COVID-19
TW202227625A (zh) 2020-08-28 2022-07-16 美商建南德克公司 宿主細胞蛋白質之ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多重剔除
MX2023002496A (es) 2020-09-04 2023-03-09 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular a (vegf-a) y a la angiopoyetina 2 (ang2) y metodos de uso.
WO2022084210A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1 axis binding antagonists and lrrk2 inhitibors
AR123855A1 (es) 2020-10-20 2023-01-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-mertk conjugados con peg y métodos de uso
WO2022152656A1 (en) 2021-01-12 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
AU2022207624A1 (en) 2021-01-13 2023-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
JP2024512324A (ja) 2021-03-05 2024-03-19 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｃｄ４４抗体およびその使用
JP2024512377A (ja) 2021-03-12 2024-03-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｋｌｋ７抗体、抗ｋｌｋ５抗体、多重特異性抗ｋｌｋ５／ｋｌｋ７抗体、及び使用方法
CA3213599A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
CA3215965A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Amy Shen Modified mammalian cells
JP2024514281A (ja) 2021-04-23 2024-04-01 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｎｋ細胞係合剤関連の有害作用の防止または軽減
AU2021443318A1 (en) 2021-04-30 2023-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
WO2022228706A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody
IL308351A (en) 2021-05-12 2024-01-01 Genentech Inc Methods for using anti-CD79B immunoconjugates to treat diffuse large B-cell lymphoma
WO2022246259A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Genentech, Inc. Modified cells for the production of a recombinant product of interest
EP4351582B1 (en) 2021-06-09 2025-10-08 F. Hoffmann-La Roche AG Combination of a particular braf inhibitor (paradox breaker) and a pd-1 axis binding antagonist for use in the treatment of cancer
EP4370545A1 (en) 2021-07-12 2024-05-22 Genentech, Inc. Structures for reducing antibody-lipase binding
JP2024527606A (ja) 2021-07-14 2024-07-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃ－ｃモチーフケモカイン受容体８（ｃｃｒ８）抗体及び使用方法
CN117730102A (zh) 2021-07-22 2024-03-19 豪夫迈·罗氏有限公司 异二聚体Fc结构域抗体
JP2024528217A (ja) 2021-08-03 2024-07-26 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗体および使用方法
WO2023014863A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
US20240336697A1 (en) 2021-08-07 2024-10-10 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
US20250136701A1 (en) 2021-09-03 2025-05-01 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
JP2024534910A (ja) 2021-09-03 2024-09-26 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｌａｍｐ１抗体およびその使用
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
EP4437006A1 (en) 2021-11-26 2024-10-02 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023141445A1 (en) 2022-01-19 2023-07-27 Genentech, Inc. Anti-notch2 antibodies and conjugates and methods of use
TW202342510A (zh) 2022-02-18 2023-11-01 英商Ｒｑ生物科技有限公司 抗體
EP4496631A1 (en) 2022-03-23 2025-01-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
CN119384432A (zh) 2022-04-13 2025-01-28 基因泰克公司 治疗性蛋白质的药物组合物和使用方法
KR20250004776A (ko) 2022-04-13 2025-01-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체의 약학 조성물 및 사용 방법
EP4514842A1 (en) 2022-04-29 2025-03-05 AstraZeneca UK Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
AR129268A1 (es) 2022-05-11 2024-08-07 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a e il6 y métodos de uso
KR20250060305A (ko) 2022-09-21 2025-05-07 사노피 바이오테크놀로지 인간화 항-il-1r3 항체 및 사용 방법
EP4598959A1 (en) 2022-10-07 2025-08-13 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies
JP2025537197A (ja) 2022-11-08 2025-11-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 小児期発症特発性ネフローゼ症候群を治療するための組成物および方法
WO2024100170A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a*02/foxp3
EP4631974A1 (en) 2022-12-08 2025-10-15 Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd. Antibody specifically binding to rsv
AR131638A1 (es) 2023-01-18 2025-04-16 Genentech Inc Anticuerpos multiespecíficos y usos de estos
WO2024156672A1 (en) 2023-01-25 2024-08-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to csf1r and cd3
WO2024167898A1 (en) 2023-02-07 2024-08-15 Go Therapeutics, Inc. ANTIBODY FUSION PROTEINS COMPRISING ANTI-GLYCO-MUC4 ANTIBODIES AND MIC PROTEIN α1-α2 DOMAINS, AND THEIR USES
WO2024191785A1 (en) 2023-03-10 2024-09-19 Genentech, Inc. Fusions with proteases and uses thereof
US20240327522A1 (en) 2023-03-31 2024-10-03 Genentech, Inc. Anti-alpha v beta 8 integrin antibodies and methods of use
AR132623A1 (es) 2023-05-08 2025-07-16 Hoffmann La Roche PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE INTERFERÓN a DIRIGIDAS Y MÉTODOS DE USO
WO2024238537A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Pd-1 -regulated il-2 immunocytokine and uses thereof
TW202502809A (zh) 2023-06-22 2025-01-16 美商建南德克公司 抗體及其用途
WO2025021838A1 (en) 2023-07-26 2025-01-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
TW202517673A (zh) 2023-09-25 2025-05-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與Ｃ３ｂＢｂ結合之抗體
WO2025099120A1 (en) 2023-11-09 2025-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies with conditional activity
WO2025125118A1 (en) 2023-12-11 2025-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease activatable fc domain binding molecules
WO2025125386A1 (en) 2023-12-14 2025-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies that bind to folr1 and methods of use
WO2025132503A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to ceacam5
WO2025133290A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Temper Bio Protein for immune regulation
WO2025133042A2 (en) 2023-12-22 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Activatable fusion proteins and methods of use
WO2025149633A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Laigo Bio B.V. Bispecific antigen binding proteins
WO2025181189A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
WO2025215060A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies that specifically bind modified oligonucleotides
WO2025215124A2 (en) 2024-04-12 2025-10-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination treatment of glofitamab and chemotherapy
WO2025226808A1 (en) 2024-04-24 2025-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
PL174721B1 (pl) 1992-11-13 1998-09-30 Idec Pharma Corp Przeciwciało monoklonalne anty-CD20
JPH11507535A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類
US6180320B1 (en) 1998-03-09 2001-01-30 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Method of manufacturing a semiconductor device having a fine pattern, and semiconductor device manufactured thereby
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
AU1573601A (en) * 1999-10-21 2001-04-30 Monsanto Company Post-translational modification of recombinant proteins produced in plants
CA2925231A1 (en) * 1999-10-26 2001-05-03 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mammalian-type glycosylation in transgenic plants expressing galactosyltransferase and sialyl transferase
AU7684201A (en) 2000-06-28 2002-01-08 Glycofi Inc Methods for producing modified glycoproteins
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US20030003097A1 (en) * 2001-04-02 2003-01-02 Idec Pharmaceutical Corporation Recombinant antibodies coexpressed with GnTIII
JP5350573B2 (ja) * 2002-03-19 2013-11-27 スティヒティング ディーンスト ランドバウクンディフ オンデルズーク 植物におけるｇｎｔｉｉｉ発現
PL224787B1 (pl) * 2003-01-22 2017-01-31 Roche Glycart Ag Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego

Also Published As

Publication number Publication date
PL415463A1 (pl) 2016-04-25
PL222219B1 (pl) 2016-07-29
EP2248892A3 (en) 2011-03-16
US20140073005A1 (en) 2014-03-13
US8367374B2 (en) 2013-02-05
JP5425365B2 (ja) 2014-02-26
JP2013233151A (ja) 2013-11-21
AU2010200408A1 (en) 2010-02-25
AU2010200408C1 (en) 2012-11-01
KR101498588B1 (ko) 2015-03-05
PL393645A1 (pl) 2011-06-06
NZ603037A (en) 2014-05-30
EP2264151B1 (en) 2016-04-20
IL203402A (en) 2016-05-31
PL393641A1 (pl) 2011-06-06
ES2542885T3 (es) 2015-08-12
ES2543734T3 (es) 2015-08-21
EP1587921B1 (en) 2010-07-28
PL224786B1 (pl) 2017-01-31
PL222206B1 (pl) 2016-07-29
SG2013005590A (en) 2015-06-29
NZ591970A (en) 2012-11-30
NZ541503A (en) 2008-09-26
ATE475708T1 (de) 2010-08-15
EP2264152A2 (en) 2010-12-22
NO20053872L (no) 2005-10-21
AU2004205802B2 (en) 2009-11-05
AU2004205802A1 (en) 2004-08-05
NZ582315A (en) 2011-01-28
EP2264151A3 (en) 2012-10-03
EP1587921A2 (en) 2005-10-26
NO339270B1 (no) 2016-11-21
PL222221B1 (pl) 2016-07-29
JP2015142590A (ja) 2015-08-06
PL377967A1 (pl) 2006-02-20
PL222220B1 (pl) 2016-07-29
EP2248892B1 (en) 2015-04-22
HK1089205A1 (zh) 2006-11-24
KR20130048269A (ko) 2013-05-09
PL393646A1 (pl) 2011-06-06
US20040241817A1 (en) 2004-12-02
KR101292000B1 (ko) 2013-08-01
CA2513797A1 (en) 2004-08-05
JP5953271B2 (ja) 2016-07-20
KR20050095867A (ko) 2005-10-04
PL393647A1 (pl) 2011-06-06
WO2004065540A2 (en) 2004-08-05
EP2248892A2 (en) 2010-11-10
EP2264152B1 (en) 2015-05-20
EP2264151A2 (en) 2010-12-22
SG179292A1 (en) 2012-04-27
ES2574993T3 (es) 2016-06-23
PL393644A1 (pl) 2011-06-06
JP2006516893A (ja) 2006-07-13
EP2264152A3 (en) 2011-05-18
CN103540600B (zh) 2017-12-01
IL169805A (en) 2013-11-28
MXPA05007781A (es) 2005-09-30
JP2010233578A (ja) 2010-10-21
NZ567320A (en) 2009-11-27
PL222222B1 (pl) 2016-07-29
CN103540600A (zh) 2014-01-29
PL224787B1 (pl) 2017-01-31
NO20053872D0 (no) 2005-08-18
US8859234B2 (en) 2014-10-14
CZ308720B6 (cs) 2021-03-24
DE602004028337D1 (de) 2010-09-09
WO2004065540A3 (en) 2005-03-24
CA2513797C (en) 2016-05-03
AU2010200408B2 (en) 2012-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2264151B1 (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased FC receptor binding affinity and effector function
CN1761746B (zh) 融合构建体及其用来生产Fc受体结合亲和性和效应子功能提高的抗体的用途
RU2623167C2 (ru) КОНСТРУКЦИИ СЛИЯНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ С ПОВЫШЕННЫМИ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
AU2012213963B2 (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function
HK1089205B (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20240122