ES2926859T3

ES2926859T3 - Anticuerpos anti-LAG3

Info

Publication number: ES2926859T3
Application number: ES18715026T
Authority: ES
Inventors: Deak Laura Codarri; Stefan Dengl; Jens Fischer; Christian Klein; Stefan Seeber; Patrick Alexander Aaron Weber; Adrian Zwick
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2022-10-31
Anticipated expiration: 2038-04-03
Also published as: PT3606954T; EP4112644A1; LT3606954T; TWI707871B; KR20190122752A; EP3606954A1; MX2019011916A; MA49034A; RU2019134231A3; US20240002506A1; CN110392698A; CN110392698B; KR102294136B1; BR112019018779A2; RU2019134231A; EP3606954B1; AU2018247797A1; DK3606954T3; TW201841940A; SI3606954T1

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-LAG3, a métodos para producir estas moléculas y métodos para usar las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-LAG3

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-LAG3, a procedimientos de producción de estas moléculas y procedimientos de uso de las mismas.

Antecedentes

El gen de activación de linfocitos 3 (LAG3 o CD223) se descubrió inicialmente en un experimento diseñado para aislar selectivamente moléculas expresadas en una línea de células NK dependiente de IL-2 (Triebel F et al., Cancer Lett. 235 (2006), 147-153). LAG-3 es una proteína transmembranaria única con homología estructural con CD4 con cuatro dominios similares a la superfamilia de inmunoglobulinas extracelulares (D1-D4). El dominio de IgG distal a la membrana contiene una secuencia de aminoácidos corta, el denominado bucle adicional que no se encuentra en otras proteínas de la superfamilia de IgG. El dominio intracelular contiene una secuencia de aminoácidos única (KIEELE) que se requiere para que LAG-3 ejerza un efecto negativo sobre la función de los linfocitos T. LAG-3 se puede escindir en el péptido conector (CP) por metaloproteasas para generar una forma soluble, que es detectable en el suero. Al igual que CD4, la proteína LAG3 se une a moléculas de MHC de clase II, aunque con una mayor afinidad y en un sitio distinto de c D4 (Huard et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 5744-5749). LAG3 se expresa por linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK y células dendríticas plasmocitoides (CDp) y se regula por incremento después de la activación de los linfocitos T. Modula la función de los linfocitos T, así como la homeostasis de los linfocitos T. Los subconjuntos de linfocitos T convencionales que son anérgicos o presentan funciones alteradas expresan LAG3. Los linfocitos T LAG3+ se enriquecen en los sitios tumorales y durante las infecciones víricas crónicas (Sierro et al Expert Opin. Ther. Targets 15 (2011), 91-101). Se ha demostrado que LAG3 desempeña un papel en el agotamiento de los linfocitos T CD8 (Blackburn et al. Nature Immunol. 10 (2009), 29-37). Por tanto, existe la necesidad de anticuerpos que antagonicen la actividad de LAG3 y se puedan usar para generar y restablecer la respuesta inmunitaria a los tumores.

Se han descrito anticuerpos monoclonales frente a LAG3, por ejemplo, en el documento WO 2004/078928, en el que se reivindica una composición que comprende anticuerpos que se unen específicamente a CD223 y una vacuna contra el cáncer. El documento WO 2010/019570 divulga anticuerpos humanos que se unen a LAG3, por ejemplo, los anticuerpos 25F7 y 26H10. El documento US 2011/070238 se refiere a un anticuerpo anti-LAG3 citotóxico útil en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplantes de órganos y enfermedades autoinmunitarias. El documento WO 2014/008218 describe anticuerpos frente a LAG3 con propiedades funcionales optimizadas (es decir, sitios de desamidación reducidos) en comparación con el anticuerpo 25F7. Además, los anticuerpos frente a LAG3 se divulgan en los documentos WO 2015/138920 (por ejemplo, BAP050), WO 2014/140180, WO 2015/116539, WO 2016/028672, WO 2016/126858, WO 2016/200782 y WO 2017/015560.

Sumario

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier otro aspecto expuesto en el presente documento que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones es solo para fines informativos.

La invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a LAG3 humana, en el que el anticuerpo comprende

(a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

La invención proporciona además un anticuerpo aislado que se une a LAG3 humana, en la que el anticuerpo

comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 7 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 8.

En un modo de realización de la invención, dicho anticuerpo aislado que se une a LAG3 humana:

i) compite por la unión a LAG3 con un anticuerpo anti-LAG3 que comprende el VH con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y VL con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, y/o

ii) se une a una LAG3 humana y de macaco cangrejero; y/o

iii) inhibe la unión de MHC-II expresado en células tumorales A375 humanas; y/o

iv) potencia la liberación de granzima B o IL-2 en un ensayo de reacción linfocítica mixta (RLMm).

En un modo de realización, el anticuerpo anti-LAG3 de acuerdo con la invención es un anticuerpo monoclonal. En un modo de realización, el anticuerpo anti-LAG3 de acuerdo con la invención es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

La invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica dicho anticuerpo aislado que se une a LAG3 humana.

La invención proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico.

La invención proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de modo que se produzca el anticuerpo.

La invención proporciona dicho procedimiento de producción de un anticuerpo, que comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped.

La invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona el anticuerpo descrito en el presente documento para su uso en el tratamiento del cáncer. Los anticuerpos de la presente invención muestran propiedades valiosas: la inducción de la liberación de granzima B, la liberación de IFN-^yy la secreción de IL-2 por los linfocitos T CD4 humanos y, por lo tanto, pueden estimular la respuesta inmunitaria por medio de los linfocitos T (funciones efectoras de linfocitos T específicos de antígeno tumoral potenciadas) solos o bien en combinación con inhibidores de PD1.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: efecto de los anticuerpos anti-LAG-3 sobre la liberación de granzima B citotóxica y la secreción de IL-2 por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con células dendríticas maduras alogénicas Fig. 1A: secreción de granzima B

Fig. 1B: secreción de IL-2

Figura 2: efecto de los anticuerpos anti-LAG-3 sobre la liberación de granzima B citotóxica por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con una línea celular linfoblastoide de linfocitos B (ARH77).

Figura 3: efecto de los anticuerpos anti-LAG-3 sobre la supresión de Treg de granzima B y la liberación de IFN-y por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con PBMC alogénicos irradiados.

Fig. 3 A: liberación de granzima B

Fig. 3B: liberación de IFN-^y

Descripción detallada de la invención

Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios aminoacídicos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora del VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana del V^lo secuencia de la región estructural consenso humana.

"Afinidad" se refiere a la intensidad de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar, en general, por la constante de disociación (Kd). Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los modos de realización ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.

Un anticuerpo "madurado en afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

El término "LAG3" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier LAG3 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otro modo. El término engloba LAG3 sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de LAG3 que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de lAG3, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En un modo de realización preferente, el término "LAG3" se refiere a LAG3 humana. La secuencia de aminoácidos de una LAG3 procesado (sin secuencias señal) ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 54. La secuencia de aminoácidos de una ^lAG3 de dominio extracelular (DEC) ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 55.

Los términos "anticuerpo anti-LAG3" y "un anticuerpo que se une a LAG3" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a LAG3 con una afinidad suficiente de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para seleccionar LAG3. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-LAG3 a una proteína distinta de LAG3 no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a LAG3 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une a LAG3 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, de 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-LAG3 se une a un epítopo de LAG3 que se conserva entre LAG3 de especies diferentes. En un modo de realización preferente, un "anticuerpo anti-LAG3", "un anticuerpo que se une específicamente a LAG3 humana" y "un anticuerpo que se une a LAG3 humana" se refieren a un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de LAG3 humana o su dominio extracelular (DEC) con una afinidad de unión de un valor de Kd de 1,0 x 10-8 mol/l o inferior, en un modo de realización de un valor de Kd de 1,0 x 10-9 mol/l o inferior, en un modo de realización de un valor de Kd de 1,0 x 10-9 mol/l a 1,0 x 10-13 mol/l. En este contexto, la afinidad de unión se determina con un ensayo de unión estándar, tal como la técnica de resonancia de plasmón superficial (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suecia), por ejemplo, usando el dominio extracelular de LAG3.

Se usa el término "anticuerpo" en el presente documento en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')²; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

El término "epítopo" indica el sitio en un antígeno, proteínico o bien no proteínico, al que se une un anticuerpo anti-LAG3. Los epítopos se pueden formar tanto a partir de tramos de aminoácidos contiguos (epítopo lineal) o comprender aminoácidos no contiguos (epítopo conformacional), por ejemplo, acercándose espacialmente debido al plegamiento del antígeno, es decir, por el plegamiento terciario de un antígeno proteínico. Los epítopos lineales típicamente todavía están unidos por un anticuerpo anti-LAG3 después de la exposición del antígeno proteínico a agentes desnaturalizantes, mientras que los epítopos conformacionales típicamente se destruyen tras el tratamiento con agentes desnaturalizantes. Un epítopo comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

El cribado de anticuerpos que se unen a un epítopo particular (es decir, aquellos que se unen al mismo epítopo) se puede realizar usando procedimientos rutinarios en la técnica tales como, por ejemplo, sin limitación, cribado de alanina, transferencias de péptidos (véase Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463), análisis de escisión de péptidos, escisión de epítopos, extracción de epítopos, modificación química de antígenos (véase Prot. Sci. 9 (2000) 487-496) y antagonismo cruzado (véase "Antibodies", Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY).

El análisis de anticuerpos basado en la estructura de antígenos (ASAP), también conocido como análisis asistido por modificación (MAP), permite agrupar una multitud de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a LAG3 en base al perfil de unión de cada uno de los anticuerpos de la multitud a superficies de antígeno química o enzimáticamente modificadas (véase, por ejemplo, el documento US 2004/0101920). Los anticuerpos en cada agrupación se unen al mismo epítopo que puede ser un epítopo único claramente diferente de o bien parcialmente superpuesto al epítopo representado por otra agrupación.

También se puede usar la unión competitiva para determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo de LAG3 que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-LAG3 de referencia. Por ejemplo, un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo anti-LAG3 de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo anti-LAG3 de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. También, por ejemplo, para determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-LAG3 de referencia, se deja que el anticuerpo de referencia se una a LAG3 en condiciones de saturación. Después de retirar el exceso del anticuerpo anti-LAG3 de referencia, se evalúa la capacidad de un anticuerpo anti-LAG3 en cuestión para unirse a LAG3. Si el anticuerpo anti-LAG3 se puede unir a LAG3 después de la unión por saturación del anticuerpo anti-LAG3 de referencia, se puede concluir que el anticuerpo anti-LAG3 en cuestión se une a un epítopo diferente al del anticuerpo anti-LAG3 de referencia. Pero, si el anticuerpo anti-LAG3 en cuestión no se puede unir a LAG3 después de la unión por saturación del anticuerpo anti-LAG3 de referencia, entonces el anticuerpo anti-LAG3 en cuestión se puede unir al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo anti-LAG3 de referencia. Para confirmar si el anticuerpo en cuestión se une al mismo epítopo o simplemente se ve impedido de unirse por motivos estéricos, se puede usar la experimentación de rutina (por ejemplo, mutación peptídica y análisis de unión usando ELISA, RIA, resonancia de plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo de unión a anticuerpos cuantitativo o cualitativo disponible en la técnica). Este ensayo se debe llevar a cabo en dos configuraciones, es decir, siendo ambos anticuerpos el anticuerpo de saturación. Si, en ambas configuraciones, solo el primer anticuerpo (saturación) se puede unir a LAG3, entonces se puede concluir que el anticuerpo anti-LAG3 en cuestión y el anticuerpo anti-LAG3 de referencia compiten por la unión a LAG3.

En algunos modos de realización, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo o a un epítopo superpuesto si un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 90 % o incluso un 99 % o más como se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502).

En algunos modos de realización, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones aminoacídicas en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo también reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos superpuestos" si solo un subconjunto de las mutaciones aminoacídicas que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. En determinados modos de realización, el anticuerpo es del isotipo IgG4 con la mutación S228P en la región bisagra para mejorar la estabilidad del anticuerpo IgG4. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y |J, respectivamente.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211,I131,I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de micromoléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, el receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. En un modo de realización, el anticuerpo anti-Lag3 como se describe en el presente documento es de isotipo IgG1 y comprende un dominio de la cadena pesada constante de SEQ ID NO: 51 o de SEQ ID NO: 52. En un modo de realización, comprende adicionalmente la lisina C terminal (Lys447). En un modo de realización, el anticuerpo anti-Lag3 como se describe en el presente documento es de isotipo IgG4 y comprende un dominio de la cadena pesada constante de SEQ ID NO: 53. En un modo de realización, comprende adicionalmente la lisina C terminal (Lys447). A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada principal y la descendencia derivada de la misma, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la que se criba o selecciona en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. En determinados modos de realización, un anticuerpo humano se deriva de un mamífero transgénico no humano, por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo. En determinados modos de realización, un anticuerpo humano se deriva de una línea celular de hibridoma.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos de aminoácido que se producen lo más comúnmente en una selección de secuencias de la región estructural del VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias del VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En un modo de realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen:

(a) bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26 32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(b) CDR que se producen en los residuos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) contactos con el antígeno que se producen en los residuos de aminoácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); y

(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), que incluyen los residuos de aminoácido de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

En un modo de realización, los residuos de HVR comprenden los identificados en la descripción de las secuencias de aminoácidos a continuación.

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para evaluar la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que sea diferente de su localización cromosómica natural.

Un "ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-LAG3" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana; describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.

Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se enlazan por disulfuros. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y c H3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento con propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible al público tal como BLAST, BLAST-2, Clustal W, programa informático Megalign (DNASTAR) o el paquete de programas FASTA. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa ggsearch del paquete FASTA versión 36.3.8c o posterior con una matriz de comparación BLOSUM50. El paquete de programad FASTA se creó por W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzimol. 266:227-258; y Pearson et al. (1997) Genomics 46:24-36 y está disponible al público en http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. De forma alternativa, se puede usar un servidor público accesible en http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi para comparar las secuencias, usando el programa ggsearch (proteína global:proteína) y las opciones predeterminadas (BLOSUM50; abrir: -10; ext: -2; Ktup = 2) para garantizar que se realice una alineación global, en lugar de local. El porcentaje de identidad de aminoácidos se da en el encabezado de alineación de salida.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se trata, y que se puede realizar para su profilaxis o bien durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, se usan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural, en general, tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

I. Composiciones y procedimientos

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a LAG3.

En determinados modos de realización se proporcionan anticuerpos que se unen a LAG3 humana. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento del cáncer, para tratar o retrasar la progresión de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario tal como la inmunidad tumoral, o para estimular una respuesta o función inmunitaria, tal como la actividad de los linfocitos T; o para su uso como agente inmunoestimulador/ o estimular la secreción/liberación de granzima B (GrzB), interferón ^y(IFN-^y) y/o interleucina 2 (IL-2).

A. Anticuerpos anti-LAG3 ejemplares

En determinados modos de realización se proporciona un anticuerpo anti-LAG3, en el que el anticuerpo:

i) compite por la unión a LAG3 con un anticuerpo anti-LAG3 (que comprende VH y VL de aLAG3(0414)) que comprende VH con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y VL con la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 8, y/o

ii) se une a una LAG3 humana y de macaco cangrejero; y/o

iv) potencia la liberación de granzima B o IL-2 en un ensayo de reacción linfocítica mixta (RLMm) (como se muestra en el ejemplo 3).

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG3 que comprende seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3; y (b) un dominio VL que comprende las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6.

En cualquiera de los modos de realización anteriores, un anticuerpo anti-LAG3 es humano o humanizado. En un modo de realización, un anticuerpo anti-LAG3 comprende HVR como en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, respectivamente, incluyendo las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.

En otro aspecto de la invención, un anticuerpo anti-LAG3 de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En un modo de realización, un anticuerpo anti-LAG3 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')². En otro modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, siendo las sustituciones L234A, L235A y P329G (LALA-PG) en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana. (Véase, por ejemplo, el documento WO 2012/130831 A1).

En otro aspecto, un anticuerpo anti-LAG3 de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las Secciones 1-7 a continuación:

1. Afinidad del anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).

En un modo de realización, Kd se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En un modo de realización, se realiza un RIA con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno equilibrando los Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando, a continuación, el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 |jg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc, n.° 269620), se mezcla [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). A continuación, el Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 jl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que den menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otro modo de realización, Kd se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un modo de realización, se activan chips de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato de W-etilW-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 jg/m l (~0,2 jM ) antes de su inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Se calculan las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (programa informático de evaluación BIACORE® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación supera 106 M-1 s-1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, a continuación se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

2. Fragmentos de anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que conserva la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')², Fv, Fab monocatenario (scFab); fragmentos variables monocatenarios (scFv) y anticuerpos de dominio único (dAb). Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Holliger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005).

En un modo de realización, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, Fab', Fab'-SH o F(ab')², en particular un fragmento Fab. La digestión con papaína de anticuerpos intactos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" que contienen cada uno los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. El término "fragmento Fab" se refiere, por tanto, a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de la cadena ligera que comprende un dominio VL y un dominio constante de una cadena ligera (CL), y un dominio VH y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH son fragmentos Fab' en los que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes contiene(n) un grupo tiol libre. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')²que tiene dos sitios de combinación de antígeno (dos fragmentos Fab) y una parte de la región Fc. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')²que comprenden residuos de epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. ^uU. n.° 5.869.046.

En otro modo de realización, el fragmento de anticuerpo es un diacuerpo, un triacuerpo o un tetracuerpo. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

En otro modo de realización, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab monocatenario. Un "fragmento Fab monocatenario" o "scFab" es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1), un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo (CL) y un conector, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho conector tienen uno de los siguientes órdenes en dirección de N terminal a C terminal: a) VH-CH1-conector-VL-CL, b) VL-CL-conector-VH-CH1, c) VH-CL-conector-VL-CH1 o d) VL-CH1-conector-VH-CL. En particular, dicho conector es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos, preferentemente entre 32 y 50 aminoácidos. Dichos fragmentos Fab monocatenarios se estabilizan por medio del enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. Además, estas moléculas Fab monocatenarias se podrían estabilizar además por generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, la posición 44 en la cadena pesada variable y la posición 100 en la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat).

En otro modo de realización, el fragmento de anticuerpo es un fragmento variable monocatenario (scFv). Un "fragmento variable monocatenario (scFv)" es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (V^h) y ligera (V^l) de un anticuerpo, conectadas por un conector. En particular, el conector es un polipéptido corto de 10 a 25 aminoácidos y normalmente es rico en glicina para su flexibilidad, así como en serina o treonina para su solubilidad, y puede conectar el extremo N del V^hcon el extremo C del V^lo viceversa. Esta proteína conserva la especificidad del anticuerpo original, a pesar de la retirada de las regiones constantes y la introducción del conector. Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458.

En otro modo de realización, el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de dominio único. Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).

Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas que incluyen pero sin limitarse a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

3. Anticuerpos quiméricos y humanizados

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase de la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinados modos de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, se humaniza un anticuerpo no humano para reducir la inmunogenicidad con respecto a los seres humanos, mientras que se conservan la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunos modos de realización se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y procedimientos de prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe el injerto de región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

4. Anticuerpos humanos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Se describen anticuerpos humanos en general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que reemplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena en general se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech.

23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429 que describe la tecnología HuMab®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología V^elociM^ouse®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991)). Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

5. Anticuerpos derivados de colecciones

Se pueden aislar los anticuerpos de la invención cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Los procedimientos para cribar colecciones combinatorias se revisan, por ejemplo, en Lerner et al. en Nature Reviews 16:498-508 (2016). Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Frenzel et al. en mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. en Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) y Zhao et al. en Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016), así como en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y en Marks y Bradbury en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003).

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que a continuación se pueden cribar para detectar fagos de unión a antígeno como se describe en Winter et al. en Annual Review of Immunology 12:433-455 (1994). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad por el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio indiferenciado (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y también no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO Journal, 12:725-734 (1993). Finalmente, las colecciones indiferenciadas también se pueden preparar sintéticamente clonando segmentos del gen V no reordenados de células madre, y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter en Journal of Molecular Biology 227:381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos-anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: las patentes de EE. UU. n.os 5.750.373; 7.985.840; 7.785.903 y 8.679.490, así como las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 y 2007/0292936.

Otros ejemplos de procedimientos conocidos en la técnica para cribar colecciones combinatorias para detectar anticuerpos con una actividad o actividades deseadas incluyen presentación en ribosomas y ARNm, así como procedimientos para presentación y selección de anticuerpos en bacterias, células de mamífero, células de insecto o células de levadura. Se revisan los procedimientos para presentación en la superficie de levaduras, por ejemplo, en Scholler et al. en Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) y en Cherf et al. en Methods in Molecular Biology 1319:155-175 (2015), así como en Zhao et al. en Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012). Se describen los procedimientos para la presentación en ribosomas, por ejemplo, en He et al. en Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) y en Hanes et al. en PNAS 94:4937-4942 (1997).

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

6. Anticuerpos multiespecíficos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes, es decir, diferentes epítopos en diferentes antígenos o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En determinados modos de realización, el anticuerpo multiespecífico tiene tres o más especificidades de unión. En determinados modos de realización, una de las especificidades de unión es por LAG3 y la otra (dos o más) especificidad es por cualquier otro antígeno. En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos (o más) epítopos diferentes de LAG3. También se pueden usar anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) para localizar células o agentes citotóxicos en células que expresan LAG3. Los anticuerpos multiespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulinas que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)) y genomanipulación de "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168 y Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden preparar genomanipulando los efectos de dirección electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpos (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/089004); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) y el documento WO 2011/034605); usando la tecnología de cadena ligera común para eludir el problema de emparejamiento incorrecto de la cadena ligera (véase, por ejemplo, el documento WO 98/50431); usando la tecnología de "diacuerpo" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).

También se incluyen en el presente documento anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno, incluyendo, por ejemplo, "anticuerpos de tipo pulpo" o DVD-Ig (véase, por ejemplo, los documentos WO 2001/77342 y Wo 2008/024715). Otros ejemplos de anticuerpos multiespecíficos con tres o más sitios de unión a antígeno se pueden encontrar en los documentos WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y WO 2013/026831. El anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo también incluye un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a LAG3 así como a otro antígeno diferente, o dos epítopos diferentes de LAG3 (véase, por ejemplo, los documentos US 2008/0069820 y WO 2015/095539).

Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden proporcionar en forma asimétrica con un cruce de dominio en una o más ramas de unión de la misma especificidad de antígeno, es decir, intercambiando los dominios VH/VL (véase, por ejemplo, los documentos WO 2009/080252 y WO 2015/150447), los dominios CH1/CL (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/080253) o las ramas de Fab completas (véase, por ejemplo, los documentos W o 2009/080251, WO 2016/016299, véase también Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 y Klein et al., MAbs 8 (2016) 1010-20). En un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico comprende un fragmento cross-Fab. El término "fragmento cross-Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento" se refiere a un fragmento Fab, en el que las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera se intercambian. Un fragmento cross-Fab comprende una cadena polipeptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena polipeptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Las ramas de Fab asimétricas también se pueden genomanipular introduciendo mutaciones aminoacídicas con carga o sin carga en las interfaces de dominio para dirigir el emparejamiento de Fab correcto. Véase, por ejemplo, el documento WO 2016/172485.

Son conocidos en la técnica otros formatos moleculares diversos para anticuerpos multiespecíficos y se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

7. Variantes de anticuerpo

En determinados modos de realización se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

a) Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados modos de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.

Tabla 1

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para otro estudio tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o residuos que entran en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración de la afinidad por construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunos modos de realización de maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para su maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una colección secundaria. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis o modelado por barrido de alanina. A menudo se seleccionan, en particular, CDR-H3 y CDR-L3.

En determinados modos de realización se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de los residuos en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados modos de realización de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos con carga, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amínico y/o carboxílico que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incremente la semivida en suero del anticuerpo.

b) Variantes de glucosilación

En determinados modos de realización se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el oligosacárido fijado a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se fija en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright etal. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En un modo de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen un oligosacárido no fucosilado, es decir, una estructura de oligosacárido que carece de fucosa fijada (directa o indirectamente) a una región Fc. Dicho oligosacárido no fucosilado (también denominado oligosacárido "afucosilado") es en particular un oligosacárido unido a N que carece de un residuo de fucosa fijado a la primera GlcNAc en el tallo de la estructura de oligosacárido biantenario. En un modo de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo natural u original. Por ejemplo, la proporción de oligosacáridos no fucosilados puede ser de al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 80 % o incluso aproximadamente un 100 % (es decir, no están presentes oligosacáridos fucosilados). El porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es la cantidad (promedio) de oligosacáridos que carecen de residuos de fucosa, en relación con la suma de todos los oligosacáridos fijados a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2006/082515, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos hacia 5' o hacia 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichos anticuerpos que tienen una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc pueden tener una unión al receptor FcYRIIIa mejorada y/o una función efectora mejorada, en particular una función ADCC mejorada. Véase, por ejemplo, el documento US 2003/0157108; el documento US 2004/0093621.

Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos con fucosilación reducida incluyen células CHO Lec13 deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); documento US 2003/0157108; y documento WO 2004/056312, especialmente en el ejemplo 11), y líneas celulares desactivadas, tales como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células c Ho desactivadas (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004) Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107), o células con actividad reducida o suprimida de una proteína transportadora o de síntesis de GDP-fucosa (véanse, por ejemplo, los documentos US 2004259150, US 2005031613, US 2004132140, US 2004110282).

En otro modo de realización, las variantes de anticuerpo se proporcionan con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en los que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada como se describe anteriormente. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); el documento WO 99/54342; los documentos WO 2004/065540, WO 2003/011878.

También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087; el documento WO 1998/58964; y el documento WO 1999/22764.

c) Variantes de la región Fc

En determinados modos de realización, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando, de este modo, una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprenda una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.

En determinados modos de realización, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, que le convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo sea importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) sean innecesarias o perjudiciales. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carezca de unión a F^cyR (de ahí que probablemente carezca de actividad ADCC), pero conserve su capacidad de unión a FcRn. Las células principales para mediar en ADCC, linfocitos NK, expresan FcyRIII solo, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCc de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y de ahí que carezca de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos w O 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se pueden realizar determinaciones de unión a FcRn y aclaramiento/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006); documento WO 2013/120929 A1).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una unión a FcR mejorada o disminuida. (Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol. Chem.

9(2):6591-6604 (2001)).

En determinados modos de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de los residuos).

En determinadas modos de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas, que incrementan la unión a FcRn, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 252 y/o 254 y/o 256 de la región Fc (numeración EU de los residuos). En determinados modos de realización, la variante de anticuerpo comprende una región Fc con las sustituciones aminoacídicas en las posiciones 252, 254 y 256. En un modo de realización, las sustituciones son M252Y, S254T y T256E en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana.

En determinados modos de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con sustituciones aminoacídicas que disminuyen la unión a F^cyR, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 234 y 235 de la región Fc (numeración EU de los residuos). En un modo de realización, las sustituciones son L234A y L235A (LALA). En determinados modos de realización, la variante de anticuerpo comprende además D265A y/o P329G en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana. En un modo de realización, las sustituciones son L234A, L235A y P329G (LALA-PG) en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana. (Véase, por ejemplo, el documento WO 2012/130831 A1). En otro modo de realización, las sustituciones son L234A, L235A y D265A (LALA-DA) en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana.

En algunos modos de realización, las alteraciones se realizan en la región Fc que dan como resultado una unión a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, mejoradas o bien disminuidas), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Los anticuerpos con semividas incrementadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn) que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.371.826; Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524).

Se han identificado residuos de la región Fc cruciales para la interacción Fc de ratón-FcRn de ratón por mutagénesis dirigida al sitio (véase, por ejemplo, Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180). Los residuos I253, H310, H433, N434 y H435 (numeración EU de acuerdo con Kabat) están implicados en la interacción (Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). Se descubrió que los residuos I253, H310 y H435 eran cruciales para la interacción de Fc humana con FcRn murino (Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819). Los estudios del complejo Fc humana-FcRn humano han demostrado que los residuos I253, S254, H435 e Y436 son cruciales para la interacción (Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591 6604). En Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) se ha informado de y examinado diversos mutantes de los residuos 248 a 259 y 301 a 317 y 376 a 382 y 424 a 437.

En determinados modos de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a FcRn, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 253 y/o 310 y/o 435 de la región Fc (numeración EU de los residuos). En determinados modos de realización, la variante de anticuerpo comprende una región Fc con las sustituciones aminoacídicas en las posiciones 253, 310 y 435. En un modo de realización, las sustituciones son I253A, H310A y H435A en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana. Véase, por ejemplo, Grevys, A. et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.

En determinados modos de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a FcRn, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 310 y/o 433 y/o 436 de la región Fc (numeración EU de los residuos). En determinados modos de realización, la variante de anticuerpo comprende una región Fc con las sustituciones aminoacídicas en las posiciones 310, 433 y 436. En un modo de realización, las sustituciones son H310A, H433A y Y436A en una región Fc derivada de una región Fc de IgG1 humana. (Véase, por ejemplo, el documento WO 2014/177460 A1).

Véanse también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de EE. UU. n.° 5.648.260; la patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y el documento WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.

B. Composiciones y procedimientos recombinantes

Los anticuerpos se pueden producir usando composiciones y procedimientos recombinantes, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.816.567. Para estos procedimientos se proporcionan uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican un anticuerpo.

En el caso de un anticuerpo natural o fragmento de anticuerpo natural, se requieren dos ácidos nucleicos, uno para la cadena ligera o un fragmento de la misma y otro para la cadena pesada o un fragmento de la misma. Dicho(s) ácido(s) nucleico(s) codifica(n) una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, la(s) cadena(s) ligera(s) y/o pesada(s) del anticuerpo). Estos ácidos nucleicos pueden estar en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión.

En el caso de un anticuerpo biespecífico con cadenas pesadas heterodiméricas, se requieren cuatro ácidos nucleicos, uno para la primera cadena ligera, uno para la segunda cadena ligera que comprende el primer polipéptido de la región Fc heteromonomérico, uno para la segunda cadena ligera y uno para la segunda cadena pesada que comprende el segundo polipéptido de la región Fc heteromonomérico. Los cuatro ácidos nucleicos pueden estar comprendidos en una o más moléculas de ácido nucleico o vectores de expresión. Dicho(s) ácido(s) nucleico(s) codifica(n) una secuencia de aminoácidos que comprende el primer VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el primer VH que incluye la primera región Fc heteromonomérica y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el segundo VL y/o una secuencia de aminoácidos secuencia que comprende el segundo VH que incluye la segunda región Fc heteromonomérica del anticuerpo (por ejemplo, la primera y/o la segunda cadenas ligeras y/o la primera y/o la segunda cadenas pesadas del anticuerpo). Estos ácidos nucleicos pueden estar en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión, normalmente estos ácidos nucleicos están localizados en dos o tres vectores de expresión, es decir, un vector puede comprender más de uno de estos ácidos nucleicos. Los ejemplos de estos anticuerpos biespecíficos son CrossMab y biespecíficos de linfocitos T (véase, por ejemplo, Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191). Por ejemplo, una de las cadenas pesadas heteromonoméricas comprende las denominadas "mutaciones de botón" (T366W y opcionalmente una de S354C o Y349C) y la otra comprende las denominadas "mutaciones de ojal" (T366S, L368A e Y407V y opcionalmente Y349C o S354c ) (véase, por ejemplo, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73).

En un modo de realización se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican un anticuerpo como se usa en los procedimientos como se informa en el presente documento.

En otro modo de realización se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho(s) ácido(s) nucleico(s).

En otro modo de realización se proporciona una célula huésped que comprende dicho(s) ácido(s) nucleico(s).

En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con):

- en el caso de un anticuerpo compuesto por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se enlazan por disulfuro, o un VH y VL que comprende un fragmento de las mismas:

(1) un vector que comprende ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o

(2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo.

- en el caso de un anticuerpo biespecífico con cadenas pesadas heterodiméricas:

(1) un primer vector que comprende un primer par de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos, uno de ellos comprendiendo el primer VL y el otro comprendiendo el primer VH del anticuerpo y un segundo vector que comprende un segundo par de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos, uno de ellos comprendiendo el segundo VL y el otro comprendiendo el segundo VH del anticuerpo, o

(2) un primer vector que comprende un primer ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende uno de los dominios variables (preferentemente un dominio variable de la cadena ligera), un segundo vector que comprende un par de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos, uno de ellos comprendiendo un dominio variable de la cadena ligera y el otro comprendiendo el primer dominio variable de la cadena pesada, y un tercer vector que comprende un par de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos, uno de ellos comprendiendo el otro dominio variable de la cadena ligera respectivo como en el segundo vector y el otro comprendiendo el segundo dominio variable de la cadena pesada, o

(3) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el primer VL del anticuerpo, un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el primer VH del anticuerpo, un tercer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el segundo VL del anticuerpo y un cuarto vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el segundo VH del anticuerpo.

En un modo de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfocítica (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un modo de realización se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo anti-LAG3, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-LAG3, los ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aíslan e insertan en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dichos ácidos nucleicos se pueden aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) o producirse por procedimientos recombinantes u obtenerse por síntesis química.

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523. (Véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gemgross, T.U., Nat. Biotech.

22 (2004) 1409-1414; y Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, los documentos US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 y US 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivarse en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 5974); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

C. Ensayos

Los anticuerpos anti-LAG3 proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar para determinar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

1. Ensayos de unión y otros ensayos

En un aspecto, un anticuerpo de la invención se somete a prueba para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos, tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc.

En otro aspecto se pueden usar los ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con aLAG3(0414) por la unión a LAG3. En determinados modos de realización, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que se une por aLAG3(0414). Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba LAG3 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a lAG3 (por ejemplo, aLAG3(0414)) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo por su unión a LAG3. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control se incuba LAG3 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones propicias para la unión del primer anticuerpo a LAG3, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con LAG3 inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con LAG3 inmovilizada se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a LAG3. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. Ensayos de actividad

En un aspecto se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-LAG3 de los mismos que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, el efecto de los anticuerpos anti-LAG3 (solos o en combinación con anticuerpos anti-PDL1) sobre la liberación de granzima B citotóxica y la secreción de IL-2 por linfocitos T CD4 humanos en un ensayo de reacción linfocítica mixta (RLMm) o el efecto de anticuerpos anti-LAG-3 sobre la supresión de Treg de la liberación de granzima B e IFN-y por linfocitos T CD4 humanos; o la inhibición de la unión de LAG-3 a MHC-II expresado en células tumorales A375 humanas por anticuerpos anti-LAG3. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.

En determinados modos de realización se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar dicha actividad biológica. Para obtener más información, véanse los ejemplos 2 y 3 a continuación.

D. Composiciones y procedimientos para diagnóstico y detección

En determinados modos de realización, cualquiera de los anticuerpos anti-LAG3 proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de LAG3 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados modos de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como un tejido tumoral.

En un modo de realización se proporciona un anticuerpo anti-LAG3 para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de LAG3 en una muestra biológica. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-LAG3 como se describe en el presente documento en condiciones propicias para la unión del anticuerpo anti-LAG3 a LAG3, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-LAG3 y LAG3. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En un modo de realización se usa un anticuerpo anti-LAG3 para seleccionar sujetos elegibles para su tratamiento con un anticuerpo anti-LAG3, por ejemplo, donde LAG3 es un biomarcador para la selección de pacientes.

Los trastornos ejemplares que se pueden diagnosticar usando un anticuerpo de la invención incluyen cáncer en diferentes formas tales como leucemia linfocítica crónica (LLC), cáncer de mama, etc., (véase también la lista de cánceres a continuación).

En determinados modos de realización se proporcionan anticuerpos anti-LAG3 marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

E. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-LAG3 como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (Pe G). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de e E. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

Se describen formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectados de forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además anticuerpos anti-PD1 o anti-PDL1, o anticuerpos anti-TIM3. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito destinado.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son, en general, estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

F. Composiciones y procedimientos terapéuticos

Se puede usar cualquiera de los anticuerpos anti-LAG3 proporcionados en el presente documento en procedimientos terapéuticos.

En un aspecto se proporciona un anticuerpo anti-LAG3 para su uso como medicamento. En otros aspectos se proporciona un anticuerpo anti-LAG3 para su uso en el tratamiento del cáncer. En determinados modos de realización se proporciona un anticuerpo anti-LAG3 para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG3 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene cáncer, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-LAG3. En un modo de realización, el anticuerpo es para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de una enfermedad inmunomediada tal como la inmunidad antitumoral. En un modo de realización, el anticuerpo es para su uso en la estimulación de una respuesta o función inmunitaria, tal como la actividad de los linfocitos T.

En otros modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG3 para uso como agente inmunoestimulador/ o estimulante de la secreción/liberación de granzima B (GrzB), interferón y (IFN-y) y/o interleucina 2 (IL-2). En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-LAG3 para su uso en un procedimiento de secreción/liberación de granzima B (GrzB), interferón y (IFN-y) y/o interleucina 2 (IL-2) en un individuo que comprende administrar al individuo una efectiva del anticuerpo anti-LAG3 para la secreción/liberación de granzima B (GrzB), interferón y (IFN-y) y/o interleucina 2 (IL-2).

Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es preferentemente un ser humano. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-LAG3 en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento del cáncer. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer que comprende administrar a un individuo que tiene cáncer una cantidad eficaz del medicamento. En otro modo de realización, el medicamento es para inducir la lisis mediada por células de células cancerosas. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de inducción de la lisis mediada por células de células cancerosas en un individuo que padece cáncer que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para inducir la apoptosis en una célula cancerosa/ o para inhibir la proliferación de células cancerosas. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

El término "cáncer" como se usa en el presente documento puede ser, por ejemplo, cáncer de pulmón, carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP), cáncer de pulmón bronquioloalveolar, cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma endometrial, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad hodgkiniana, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de partes blandas, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje medular, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisario, linfoma, leucemia linfocítica, incluyendo versiones resistentes al tratamiento de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. En un modo de realización preferente, dicho cáncer es cáncer de mama, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón o cáncer de próstata. En un modo de realización preferente, dicho cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón o cáncer de próstata. En otro modo de realización preferente, dicho cáncer es cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de tipo melanoma, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de tipo carcinoma gástrico, cáncer de esófago, mesotelioma, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, mielomas. En un modo de realización preferente, dichos cánceres se caracterizan además por la expresión o sobreexpresión de LAG3.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-LAG3 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-LAG3 proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-LAG3 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-LAG3 proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-LAG3 proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o bien en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, se puede coadministrar un anticuerpo de la invención con al menos un agente terapéutico adicional. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-LAG3 o anti-PDL1 o anti-TIM3.

Además del anticuerpo anti-LAG3, también se puede administrar un agente quimioterápico. En un modo de realización, dichos agentes quimioterápicos adicionales que se pueden administrar con el anticuerpo anti-LAG3 como se describe en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a, agentes antineoplásicos que incluyen agentes alquilantes que incluyen: mostazas nitrogenadas, tales como mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán y clorambucilo; nitrosoureas, tales como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) y semustina (metil-CCNU); Temodal(TM) (temozolamida), etileniminas/metilmelamina tales como trietilenmelamina (TEM), trietileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); sulfonatos de alquilo tales como busulfano; triacinas tales como dacarbazina (DTIC); antimetabolitos que incluyen análogos de ácido fólico tales como metotrexato y trimetrexato, análogos de pirimidina tales como 5-fluorouracilo (5FU), fluorodesoxiuridina, gemcitabina, arabinósido de citosina (AraC, citarabina), 5-azacitidina, 2,2'-difluorodesoxicitidina, análogos de purina tales como 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, T-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA); productos naturales que incluyen fármacos antimitóticos tales como paclitaxel, alcaloides de la vinca que incluyen vinblastina (VLB), vincristina y vinorelbina, taxotere, estramustina y fosfato de estramustina; pipodofilotoxinas tales como etopósido y tenipósido; antibióticos tales como actinomicina D, daunomicina (rubidomicina), doxorrubicina, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C y actinomicina; enzimas tales como L-asparaginasa; modificadores de la respuesta biológica tales como interferón a, IL-2, G-CSF y GM-CSF; agentes diversos que incluyen complejos de coordinación de platino tales como oxaliplatino, cisplatino y carboplatino, antracenodionas tales como mitoxantrona, urea sustituida tal como hidroxiurea, derivados de metilhidracina que incluyen N-metilhidracina (MIH) y procarbacina, supresores corticosuprarrenales tales como mitotano (o, p-DDD) y aminoglutetimida; hormonas y antagonistas que incluyen antagonistas de corticoesteroides tales como prednisona y equivalentes, dexametasona y aminoglutetimida; Gemzar(TM) (gemcitabina), progestina tal como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de megestrol; estrógenos tales como equivalentes de dietilestilbestrol y etinilestradiol; antiestrógenos tales como tamoxifeno; andrógenos que incluyen propionato de testosterona y fluoximesterona/equivalentes; antiandrógenos tales como flutamida, análogos de la hormona liberadora de gonadotropinas y leuprolida; y antiandrógenos no esteroideos tales como flutamida. Los tratamientos de selección del mecanismo epigenético que incluyen, pero sin limitarse a, inhibidores de histona desacetilasa, agentes desmetilantes (por ejemplo, Vidaza) y los tratamientos de liberación de represión transcripcional (ATRA) también se pueden combinar con las proteínas de unión a antígeno. En un modo de realización, el agente quimioterápico se selecciona del grupo que consiste en taxanos (como, por ejemplo, paclitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotere), paclitaxel modificado (por ejemplo, Abraxane y Opaxio), doxorrubicina, sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar) y otros inhibidores de multicinasa, oxaliplatino, cisplatino y carboplatino, etopósido, gemcitabina y vinblastina. En un modo de realización, el agente quimioterápico se selecciona del grupo que consiste en taxanos (como, por ejemplo, taxol (paclitaxel), docetaxel (Taxotere), paclitaxel modificado (por ejemplo, Abraxane y Opaxio). En un modo de realización, el agente quimioterápico adicional se selecciona de 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina, irinotecán u oxaliplatino. En un modo de realización, el agente quimioterápico es 5-fluorouracilo, leucovorina e irinotecán (FOLFIRI). En un modo de realización, el agente quimioterápico es 5-fluorouracilo y oxaliplatino (FOLFOX).

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del anticuerpo de la invención se puede producir antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente o agentes terapéutico(s) adicional(es). En un modo de realización, la administración del anticuerpo anti-LAG3 y la administración de un agente terapéutico adicional se producen en aproximadamente un mes, o en aproximadamente una, dos o tres semanas, o en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí. Los anticuerpos de la invención también se podrían usar en combinación con radioterapia.

Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo pero sin limitarse a administraciones únicas o múltiples durante diversos puntos temporales, administración intravenosa rápida e infusión pulsada.

Los anticuerpos de la invención se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con las buenas prácticas médicas. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. No es necesario, pero el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y por las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra el anticuerpo con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 |jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, en general, se mantendrá el tratamiento hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una mayor dosis de carga inicial, seguido de una o más dosis menores. Una pauta de dosificación ejemplar comprende la administración. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que se puede llevar a cabo cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-LAG3.

G. Artículos de fabricación

En otro aspecto de la invención se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Descripción de las secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos

SEQ ID NO: 1 cadena pesada HVR-H1, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 2 cadena pesada HVR-H2, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 3 cadena pesada HVR-H3, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 4 cadena ligera HVR-L1, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 5 cadena ligera HVR-L2, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 6 cadena ligera HVR-L3, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 7 dominio variable de la cadena pesada VH, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 8 dominio variable de la cadena ligera VL, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 9 cadena pesada HVR-H1, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 10 cadena pesada HVR-H2, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 11 cadena pesada HVR-H3, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 12 cadena ligera HVR-L1, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 13 cadena ligera HVR-L2, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 14 cadena ligera HVR-L3, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 15 dominio variable de la cadena pesada VH, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 16 dominio variable de la cadena ligera VL, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 17 cadena pesada HVR-H1, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 18 cadena pesada HVR-H2, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 19 cadena pesada HVR-H3, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 20 cadena ligera HVR-L1, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 21 cadena ligera HVR-L2, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 22 cadena ligera HVR-L3, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 23 dominio variable de la cadena pesada VH, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 24 dominio variable de la cadena ligera VL, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 25 cadena pesada HVR-H1, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 26 cadena pesada HVR-H2, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 27 cadena pesada HVR-H3, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 28 cadena ligera HVR-L1, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 29 cadena ligera HVR-L2, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 30 cadena ligera HVR-L3, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 31 dominio variable de la cadena pesada VH, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 32 dominio variable de la cadena ligera VL, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 33 cadena pesada HVR-H1, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 34 cadena pesada HVR-H2, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 35 cadena pesada HVR-H3, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 36 cadena ligera HVR-L1, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 37 cadena ligera HVR-L2, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 38 cadena ligera HVR-L3, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 39 dominio variable de la cadena pesada VH, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 40 dominio variable de la cadena ligera VL, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 41 dominio variable de la cadena pesada VH, BMS-986016 (documentos WO2014/008218 y US2016/0326248)

SEQ ID NO: 42 dominio variable de la cadena ligera VL BMS-986016 (documentos WO2014/008218 y US2016/0326248)

SEQ ID NO: 43 dominio variable de la cadena pesada VH, MDX25F7 (25F7) (documentos US2011/0150892 y WO2014/008218)

SEQ ID NO: 44 dominio variable de la cadena ligera VL, MDX25F7 (25F7) (documentos US2011/0150892 y WO2014/008218)

SEQ ID NO: 45 dominio variable de la cadena pesada VH, BAP050 humanizado (LAG525) (documento US2015/0259420)

SEQ ID NO: 46 dominio variable de la cadena ligera VL, BAP050 humanizado (LAG525) (documento US2015/0259420)

SEQ ID NO: 47 dominio variable de la cadena pesada VH, MDX26H10 (26H10) (documento US 2011/0150892) SEQ ID NO: 48 dominio variable de la cadena ligera VL, MDX26H10 (26H10) (documento US 2011/0150892) SEQ ID NO: 49 región constante de la cadena ligera kappa humana

SEQ ID NO: 50 región constante de la cadena ligera lambda humana

SEQ ID NO: 51 región constante de la cadena pesada humana derivada de IgG1

SEQ ID NO: 52 región constante de la cadena pesada humana derivada de IgG1 con mutaciones L234A, L235A y P329G

SEQ ID NO: 53 región constante de la cadena pesada humana derivada de IgG4

SEQ ID NO: 54 secuencia de LAG3 humana ejemplar (sin secuencia señal)

SEQ ID NO: 55 dominio extracelular (DEC) de LAG3 humana

SEQ ID NO: 56 cebador rbHC.up

SEQ ID NO: 57 cebador rbHCf.do

SEQ ID NO: 58 cebador BcPCR_FHLC_leader.fw

SEQ ID NO: 59 cebador BcPCR_huCkappa.rev

En lo que sigue se enumeran las secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL, incluyendo las HVR marcadas (HVR en letras en negrita subrayadas) de los anticuerpos anti-LAG3:

1) aLAG3(0403)

SEQ ID NO 15: VH EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVROAPGKGLEWVS LVSWDGGGTYYTNSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYFCAK AITDTSLYGYDYWGOGILVTVSS SEQ ID NO 16: VL DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOSISSYLNWYOOKPGNAPKLLIYAAS SLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOTYSTPLTFGGGTKV EDC

2) aLAG3(0411)

SEQ ID NO 23: VH EVHLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFIVDDYTMNWVROAPGKGLEWVS VISWDGGATYYADSVKGRFTISRDDFKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAK GLTDPTLYGSDYWGOGTLVTVSS SEQ ID NO 24: VL

DIOMTOSPSSLSASVGPRVTITCRASOSIVSYLN W YQQKPGKAPKLL1YASS SLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOTYSTPLTFGGGTKV EIK

3) aLAG3(0414)

SEQ ID NO 7: VH

SEQ ID NO 8: VL

DIOMTQSPSSLSASVGDR.VTITCRASOS1SSYLM WYQQKPGKAPKLLl YAAS TLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOTYSSPLTFGGGTKV EIK

4) aLAG3(0416)

SEQ ID NO 39: VH EVOLVESGGGLVOPGGSLRLACAASGFTFSDYAMSWVROAPGKGLEWVS GIDNSGYYTYYTDSVKGRFTISRDDVKNTLYLOMNSLRAEDTAVYLCTK THSGLIVNDAFPIWGOGTMVTVSS SEQ ID NO 40: VL DIOLTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOSISSYLNWYOOKPGKAPKLLIYDAS SLESG VPSRFSGSGSGTD ATLTISSLQPEDF ATY YCQQS YSTPLTFGGGTK V IIK

5) aLAG3(0417)

SEQ ID NO 31: VH EVOLVESGGGLVOPGGSLRLACAASGFTFSDYAMSWVROAPGKGLEWVS GIPNSGYYTYYTPSVKGRFTISRDDVKNTLYLOMNSLRAEDTAVYLCTK THSGLIVNPAFPIWGOGTMVTVSS SEQ ID NO 32: VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASOSISSYLINWYQQKPGKAPKLLLYAAS SLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPCDFATYYCOOTYSTPLTrGGGTKV

EIK III. EJEMPLOS

Los siguientes son ejemplos de composiciones y procedimientos de la invención. No se han de interpretar como limitantes de la invención que se define por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1:

Generación de anticuerpos anti-LAG3

Inmunización de conejos

Se inmunizaron conejos transgénicos patentados por Roche que expresaban un repertorio de anticuerpos humanizados con ADN plasmídico que expresaba LAG3.

Se inmunizó genéticamente un conjunto de 3 conejos, usando un vector de expresión de plásmido que codificaba LAG3 humana de longitud completa (15352_pIntronA_fí-hLag3_DNA-IMS), por aplicación intradérmica de 400 ug de ADN de vector, seguido de electroporación (5 pulsos cuadrados de 750 V/cm, duración 10 ms, intervalo 1 s).

Los conejos recibieron 7 inmunizaciones consecutivas los días 0, 14, 28, 49, 70, 98 y 126. Se extrajo sangre (un 10 % de la volemia total estimada) los días 35, 77, 105 y 133. Se preparó suero que se usó para la determinación del valor por ELISA (véase a continuación), y se aislaron leucocitos monomorfonucleares periféricos que se usaron como fuente de linfocitos B específicos de antígeno en el proceso de clonación de linfocitos B a continuación. Determinación de valores séricos (ELISA)

Se inmovilizó la proteína LAG3 recombinante humana en una placa NUNC Maxisorp de 96 pocillos a 2 ug/ml, 100 ul/pocillo, en PBS, seguido de: bloqueo de la placa con Crotein C al 2 % en PBS, 200 ul/pocillo; aplicación de diluciones en serie de antisueros, por duplicado, en Crotein C al 0,5 % en PBS, 100 ul/pocillo; detección con (1) anticuerpo de burro anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16 000), o bien (2) anticuerpo de conejo anti-IgG humana conjugado con HRP (Pierce/Thermo Scientific 31423; 1/5000), o bien (3) anticuerpo caprino anti-kappa humana biotinilado (Southern Biotech/Biozol 2063-08, 1/5000) y estreptavidina-HRP; cada uno diluido en Crotein C al 0,5 % en PBS, 100 ul/pocillo. Para todas las etapas, se incubaron placas durante 1 h a 37 °C. Entre todas las etapas, se lavaron las placas 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se produjo la señal por adición de BM Blue POD Substrate soluble (Roche), 100 ul/pocillo; y se detuvo por adición de HCl 1 M, 100 ul/pocillo.

Se leyó la absorbancia a 450 nm, frente a 690 nm como referencia. Se definió el valor como la dilución de antisueros dando como resultado una señal semimáxima.

Aislamiento de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) de conejo

Se extrajeron muestras de sangre de conejos transgénicos inmunizados. Se diluyó dos veces la sangre completa que contenía EDTA con 1x PBS (PAA, Pasching, Austria) antes de la centrifugación por densidad usando Lympholyte Mammal (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canadá) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se lavaron los PBMC dos veces con 1x PBS.

Medio EL-4 B5

Se usó RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) complementado con FCS al 10 % (Hyclone, Logan, UT, EE. UU.), glutamina 2 mM, solución de penicilina/estreptomicina al 1 % (PAA, Pasching, Austria), piruvato de sodio 2 mM, HEPES 10 mM (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania) y b-mercaptoetanol 0,05 mM (Gibco, Paisley, Escocia).

Recubrimiento de placas con antígeno proteico

Se recubrieron placas de 6 pocillos de cultivo celular estériles con LAG3 humana de DEC conjugada con una parte de Fc humana (2 |jg/ml) en tampón carbonato (bicarbonato de sodio 0,1 M, hidrogenocarbonato disódico 34 mM, pH 9,55) durante la noche a 4 °C. Se lavaron las placas en PBS estéril tres veces antes de su uso.

Disminución de células

(a) Se usaron placas de 6 pocillos estériles (calidad de cultivo celular) recubiertas con una monocapa confluente de células CHO para disminuir los macrófagos/monocitos a través de la adhesión inespecífica así como la unión inespecífica de los linfocitos.

(b) Se usaron placas de 6 pocillos estériles en blanco (calidad de cultivo celular) para disminuir los macrófagos y monocitos y otras células a través de la adhesión inespecífica.

Se usó la mitad de la muestra de PBMC para (a) y la otra mitad para (b).

Se llenó cada pocillo al máximo con 4 ml de medio y hasta 6x106 de PBMC del conejo inmunizado y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la incubadora. Se usaron las células en el sobrenadante (linfocitos de sangre periférica (PBL)) para la etapa de selección de antígeno.

Enriquecimiento de linfocitos B en antígeno de LAG3

Antígeno proteico

Se sembraron placas de cultivo de tejido de 6 pocillos recubiertas con proteína LAG3-DEC-huFc con hasta 6 x 10e6 PBL por 4 ml de medio de las etapas de disminución usando la placa de 6 pocillos en blanco y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la incubadora. Se retiraron las células no adherentes lavando cuidadosamente los pocillos 1-2 veces con 1x PBS. Se desprendieron las células adherentes restantes por tripsina durante 10 min a 37 °C en la incubadora. Se detuvo la tripsinización con medio EL-4 B5. Se mantuvieron las células en hielo hasta la tinción con inmunofluorescencia.

Antígeno de superficie celular

Se sembraron placas de cultivo de tejido de 6 pocilios recubiertas con una monocapa de células CHO positivas para LAG3 humanas con hasta 6x106 PBL por 4 ml de medio de las etapas de disminución usando la placa de 6 pocillos recubierta con CHO y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la incubadora. Se retiraron las células no adherentes lavando cuidadosamente los pocillos 1-2 veces con 1x PBS. Se desprendieron las células adherentes restantes por tripsina durante 10 min a 37 °C en la incubadora. Se detuvo la tripsinización con medio EL-4 B5. Se mantuvieron las células en hielo hasta la tinción con inmunofluorescencia.

Tinción con inmunofluorescencia y citometría de flujo

Se usaron el anticuerpo anti-IgG FITC (AbD Serotec, Düsseldorf, Alemania) y el anticuerpo anti-huCk PE (Dianova, Hamburgo, Alemania) para la separación de células individuales. Para la tinción de la superficie se incubaron las células de la etapa de disminución y enriquecimiento con el anticuerpo anti-IgG FITC y el anticuerpo anti-huCk PE en PBS y se incubaron durante 45 min en la oscuridad a 4 °C. Después de la tinción, se lavaron los PBMC dos veces con PBS enfriada con hielo. Finalmente, se resuspendieron los PBMC en PBS enfriada con hielo y se sometieron de inmediato a los análisis por FACS. Se añadió yoduro de propidio en una concentración de 5 |jg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.) antes de los análisis FACS para discriminar entre células muertas y vivas.

Se usaron un Becton Dickinson FACSAria equipado con un ordenador y el programa informático FACSDiva (BD Biosciences, EE. UU.) para la separación de células individuales.

Cultivo de linfocitos B

Se realizó el cultivo de los linfocitos B de conejo por un procedimiento descrito por Seeber et al. (S Seeber et al. PLoS One 9 (2), e86184. 04 de feb. de 2014). En resumen, se incubaron linfocitos B de conejo separados individualmente en placas de 96 pocillos con 200 jl/pocillo de medio que contenía células Pansorbin (1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemania) EL-4 B5, sobrenadante de timocitos de conejo al 5 % (MicroCoat, Bernried, Alemania) y células de timoma EL-4 B5 murino irradiadas con gamma (5 x 10e5 células/pocillo) durante 7 días a 37 °C en la incubadora. Se retiraron los sobrenadantes del cultivo de linfocitos B para el cribado y se recogieron de inmediato las células restantes y se congelaron a -80 °C en 100 j l de tampón RLT (Qiagen, Hilden, Alemania).

Aislamiento de dominios V de anticuerpos LAG3

Amplificación por PCR de dominios V

Se preparó ARN total a partir del lisado de linfocitos B (resuspendido en tampón RLT - Qiagen - n.° de cat. 79216) usando el kit de ARN NucleoSpin 8/96 (Macherey&Nagel; 740709.4, 740698) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se eluyó el ARN con 60 j l de agua sin RNasa. Se usaron 6 j l de ARN para generar ADNc por reacción de retrotranscriptasa usando Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen 18080-400) y cebador oligo-dT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron todas las etapas en un sistema Hamilton ML Star. Se usaron 4 j l de ADNc para amplificar las regiones variables de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina (VH y VL) con AccuPrime Supermix (Invitrogen 12344-040) en un volumen final de 50 j l usando los cebadores rbHC.up y rbHC.do para la cadena pesada y BcPCR_FHLC_leader.fw y BcPCR_huCkappa.rev para la cadena ligera (tabla 1.1). Todos los cebadores directos eran específicos para el péptido señal (de VH y VL respectivamente) mientras que los cebadores inversos eran específicos para las regiones constantes (de VH y VL respectivamente). Las condiciones de la PCR para el RbVH fueron como sigue: inicio en caliente a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 70 °C, 45 s a 68 °C y una extensión final a 68 °C durante 7 min. Las condiciones de la PCR para HuVL fueron como sigue: inicio en caliente a 94 °C durante 5 min; 40 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 52 °C, 45 s a 68 °C y una extensión final a 68 °C durante 7 min.

Tabla 1.1

Se cargaron 8 j l de 50 j l de solución de PCR en un 48 E-Gel al 2 % (Invitrogen G8008-02). Se limpiaron las reacciones de la PCR positivas con el kit NucleoSpin Extract II (Macherey&Nagel; 740609250) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se eluyeron en 50 |jl de tampón de elución. Se realizaron todas las etapas de limpieza en un sistema Hamilton ML Starlet.

Expresión recombinante de anticuerpos bivalentes monoclonales de conejo

Para la expresión recombinante de anticuerpos bivalentes monoclonales de conejo, se clonaron los productos de PCR que codifican VH o VL como ADNc en vectores de expresión por el procedimiento de clonación con protuberancia (RS Haun et al., BioTechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251 256). Los vectores de expresión contenían un casete de expresión que consistía en un promotor de CMV en 5' que incluía el intrón A y una secuencia de poliadenilación de BGH en 3'. Además del casete de expresión, los plásmidos contenían un origen de replicación derivado de pUC18 y un gen de beta-lactamasa que confería resistencia a la ampicilina para la amplificación del plásmido en E. coli. Se usaron tres variantes del plásmido básico: un plásmido que contenía la región constante de IgG de conejo diseñado para aceptar las regiones VH mientras que contenía la región constante de LC kappa humana para aceptar las regiones VL.

Los plásmidos de expresión linealizados que codifican la región constante kappa o gamma y los insertos VL/VH se amplificaron por PCR usando cebadores superpuestos.

Se incubaron productos de PCR purificados con ADN-polimerasa T4 lo que generó protuberancias monocatenarias. Se detuvo la reacción por la adición de dCTP.

En la siguiente etapa, se combinaron el plásmido y el inserto y se incubaron con recA, lo que indujo la recombinación específica de sitio. Los plásmidos recombinados se transformaron en E. coli. Al día siguiente, se recogieron las colonias cultivadas y se sometieron a prueba para determinar el plásmido recombinado correcto por preparación del plásmido, análisis de restricción y secuenciación de ADN.

Para la expresión de anticuerpos, se cotransfectaron transitoriamente los plásmidos de HC y LC aislados en células HEK293 y se recogieron los sobrenadantes después de 1 semana.

Ejemplo 2:

Caracterización de anticuerpos anti-LAG3

Tabla 2: Resumen de caracterización de diferentes anticuerpos anti-LAG3

ELISA para Lag3 humana

Se recubrieron las placas Nunc maxisorp (Nunc 464718) con 25 |jl/podMo de proteína quimera de Fc de LAG-3 humana recombinante (R&D Systems, 2319-L3) a una concentración de proteína de 800 ng/ml y se incubaron a 4 °C durante la noche o durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se incubó cada pocillo con 90 j l de tampón de bloqueo (PBS BSA al 2 % Tween 20 al 0,05 %) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-Lag3 a una concentración de 1-9 jg/m l (diluciones 1:3 en tampón OSEP) y se incubaron 1 h a t.a. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de conjugado de anticuerpo caprino anti-cadena ^{k de}Ig humana-HRP(Milipore, AP502P) en una dilución 1:2000 y se incubó a t.a. durante 1 h. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó durante 2-10 min. Se realizó la medición en un instrumento Tecan Safire 2 a 370/492 nm.

ELISA de unión a Lag3 de superficie celular

Se sembraron 25 jl/pocillo de células Lag3 (células CHO recombinantes que expresan Lag3, 10000 células/pocillo) en placas de 384 pocillos tratadas con cultivo de tejido (Corning, 3701) y se incubaron a 37 °C durante uno o dos días. Al día siguiente después de retirar el medio, se añadieron 25 j l de muestras anti-Lag3 (diluciones 1:3 en tampón OSEP, comenzando a una concentración de 6-40 nM) y se incubaron durante 2 h a 4 °C. Después del lavado (1 x 90 j l en PBST) se fijaron las células por adición de 30 jl/pocillo de glutaraldehído hasta una concentración final de un 0,05 % (n.° de cat. de Sigma: G5882), 10 min a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de conjugado de anticuerpo caprino anti cadena ^{k de}Ig humana-HRP(Milipore, AP502P) en una dilución 1:1000 y se incubó a t.a. durante 1 h. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó durante 6-10 min. Se realizó la medición en un instrumento Tecan Safire 2 a 370/492 nm.

Caracterización por SPR (Biacore) de anticuerpos anti-LAG3

Se ha usado un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar los parámetros cinéticos de la unión entre anticuerpos anti-Lag3 como fragmentos Fab monovalentes y dominios extracelulares (DEC) de Lag3 humana marcados con Fc humana a 25 °C.

Por lo tanto, se prepararon dos cubetas de lectura de un chip biosensor C1 en un Biacore T200 inmovilizando neutravidina, diluida a 25 |jg/ml en tampón acetato, pH 4,5, sobre el mismo usando el "asistente de inmovilización". Esto proporcionó niveles de inmovilización de alrededor de 1900 UR. A continuación, se unió el conjugado anti-IgG-Fc-biotina (humano) CaptureSelect™ a la neutravidina, usando una dilución de 20 jg/m l en tampón de migración (HBS-EP+, g E Healthcare).

El procedimiento por sí mismo consistió en cuatro mandatos por ciclo. Primer mandato: captura de ~46 UR de huLag3-Fc (20 s, 10 jl/min). Segundo mandato: inyección de muestra durante 120 s seguida de una disociación de 1200 s de duración a una velocidad de flujo de 30 jl/min. Tercer y cuarto mandato: regeneración inyectando glicina-HCl, pH 1,5 durante 30 segundos.

A continuación, se midieron una serie de diluciones (3,13 nM-200 nM, diluciones dobles en tampón de migración) de cada fragmento Fab de anticuerpo y ciclos en blanco adicionales usando el procedimiento descrito previamente. A continuación, se utilizó el programa informático de evaluación Biacore T200 para obtener valores cinéticos aplicando un ajuste Langmuir 1:1 con el parámetro de ajuste Rmáx establecido en "local", puesto que los niveles de captura no eran perfectamente reproducibles. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Se ha usado un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar las afinidades aparentes de la interacción entre las proteínas de unión de aLag3 en su formato bivalente y los dominios extracelulares (DEC) de Lag3 humana a 25 °C.

Por lo tanto, se preparó un chip biosensor Biacore en un Biacore T200, inmovilizando un mínimo de aproximadamente 800 UR de anticuerpo específico de mutación puntual P329G, utilizando condiciones estándar de acoplamiento de amina.

A continuación, en cada ciclo, se capturó el anticuerpo de muestra y se aplicó al sistema una concentración de una serie de concentraciones de DEC de huLag3 (que consistía en cuatro concentraciones en total) durante 200 s, seguida de una disociación de 1200 s de duración. A continuación, se regeneró el chip biosensor.

Los datos experimentales resultantes se evaluaron usando la función 'Mapa de interacción' proporcionada por el programa informático TraceDrawer de Ridgeview Diagnostics, para calcular la contribución de unión afín aparente individual para cada muestra.

Los resultados se muestran en la tabla 2.

Cartografía de epítopos

Se realizó el agrupamiento de epítopos usando un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR). Por lo tanto, se unieron las proteínas de unión de aLag3 a huLag3 en un instrumento Biacore T200. A continuación se evaluó la accesibilidad de otras proteínas de unión al complejo proteína de unión de aLag3-huLag3 formado previamente.

Se usó un kit SA CAP (GE Healthcare) para llevar a cabo este ensayo. Si no se describe de otro modo, se realizó el ensayo de acuerdo con el manual del kit SA CAP.

La tanda incluyó solo un tipo de ciclo. Después de la hibridación se dejó que una dilución 10 nM de huLag3 marcado con huFc biotinilado se uniera a la estreptavidina en el chip sensor durante 20 s a un caudal de 10 jl/min. A continuación, se inyectó una primera muestra 200 nM diluida en tampón de migración durante 180 s a un caudal de 30 jl/min, seguida de inmediato de una segunda muestra en las mismas condiciones. A continuación, se regeneró la superficie.

A continuación, se asignaron las muestras a diferentes grupos de epítopos con patrones de competencia similares. Se realizó una primera categorización aproximada, en base a la respuesta relativa de la segunda inyección usando un umbral de 6,1 UR, que estaba justo por encima del valor más alto observado cuando se inyectó una proteína de unión como primera y segunda muestra. Todos los valores y decisiones se validaron finalmente por inspección visual de los sensogramas.

Los resultados se muestran en la tabla 2. Se identificaron tres patrones principales de epítopos (E1, E2 y E3). Puesto que aLag3-0416 y BAP 050 humanizado comparten el mismo grupo pero no se inhiben completamente entre sí, se asignaron a los subgrupos E2b y E2c.

Unión de anticuerpos anti-Lag3 de conejos tg a células HEK positivas para Lag3 de macaco cangrejero recombinantes

Además del análisis de unión usando células HEK que expresan de forma recombinante Lag3 humana en la superficie, también se evaluó la unión a células HEK positivas para Lag3 de macaco cangrejero. Para este experimento se descongelaron células HEK293F congeladas, transfectadas previamente de forma transitoria con cyno-LAG-3, se centrifugaron y se volvieron a complementar en PBS/FBS al 2 %. Se sembraron 1,5x105 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos anti-Lag3 hasta una concentración final normalizada de l0 |jg/ml. Para referencia y como controles, se prepararon y midieron en el experimento anticuerpos de autofluorescencia y control positivo (Medarex 25F7), así como control de isotipo (hulgGI de Sigma, n.° de cat. n.° 15154, datos no mostrados). Se incubaron las células HEK con los anticuerpos indicados durante 45 min en hielo, se lavaron dos veces con 200 j l de tampón PBS enfriado con hielo que contenía FBS al 2 %, antes de que se añadiera el anticuerpo secundario (anticuerpo caprino anti-IgG-kappa humana marcado con APC, Invitrogen, n.° de cat. n.° MH10515) (diluido 1:50 en tampón FACS/pocillo) y se incubó adicionalmente durante 30 min en hielo. Se lavaron de nuevo las células dos veces con 200 j l de tampón PBS/FBS al 2 % enfriado con hielo antes de que se resuspendieran las muestras finalmente en 150 j l de tampón FACS y se midió la unión en el módulo FACS CANTO-II HTS.

Resultados

En la tabla a continuación se muestra la unión y la reactividad cruzada de diferentes anticuerpos anti-Lag3 a células HEK293 que expresan cynoLAG3, la unión se da en % de células positivas o bien la media geométrica de la intensidad de la señal:

Unión de anticuerpos anti-Lag3 de conejos tg a PBMC/linfocitos T de macaco cangrejero (activados) que expresan Lag3

Después de la unión a la proteína Lag3 recombinante y Lag3 expresada de forma recombinante en células de mamífero, se evaluó/confirmó la unión a Lag3 expresada en linfocitos T de macaco cangrejero activados.

Las características de unión de los anticuerpos anti-Lag3 recién generados (derivados de conejos transgénicos de Roche) a Lag3 expresada en la superficie celular de los linfocitos T de macaco cangrejero o PBMC se confirmaron por análisis FACS. Si bien Lag3 no se expresa en los linfocitos T indiferenciados, se regula por incremento tras la activación y/o en los linfocitos T agotados. Por tanto, se prepararon leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) de macaco cangrejero a partir de sangre roja de macaco cangrejero y a continuación se activaron por pretratamiento con CD3/CD28 (1 jg/m l) durante 2-3 días. Posteriormente, se analizaron las células activadas para determinar la expresión de Lag3: En resumen, se tiñeron 1-3x105 células activadas durante 30-60 min en hielo con los anticuerpos anti-Lag3 indicados y los respectivos anticuerpos de control a una concentración final de 10 jg/ml. Se detectaron los anticuerpos anti-Lag3 unidos por medio de anticuerpos secundarios anti-IgG humana o anti-IgG de conejo conjugados con fluorocromo. Después de la tinción, se lavaron las células dos veces con PBS/FCS al 2 % y se analizaron en un FACS Fortessa (BD).

Resultados

La siguiente tabla resume el porcentaje de células positivas para Lag3 dentro de los PBMC de macaco cangrejero activados:

En los linfocitos T de macaco cangrejero activados, todos los anticuerpos anti-Lag3 de conejo demostraron una unión significativa a las células Lag3+. De este modo, todos los anticuerpos recién generados mostraron un porcentaje incrementado de células positivas en comparación con los anticuerpos de referencia anti-Lag3 humanos (por ejemplo, tales como MDX25F7, BMS-986016).

Inhibición de la unión de LAG-3 a MHC-II expresado en células tumorales A375 humanas (por ELISA)

Se sembraron 25 |jl/pocillo de células A375 (10000 células/pocillo) en placas de 384 pocillos tratadas con cultivo de tejido (Corning, 3701) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Se preincubaron los anticuerpos anti-Lag3 durante 1 h con Lag3 biotinilada (250 ng/ml) en medio de cultivo celular en diluciones 1:3 comenzando a una concentración de anticuerpo de 3 jg/ml. Después de retirar el medio de los pocillos con las células sembradas, se transfirieron a los pocillos 25 j l de las mezclas preincubadas de anticuerpo-Lag3 y se incubaron durante 2 h a 4 °C. Después del lavado (1 x 90 j l en PBST), se fijaron las células por adición de 30 jl/pocillo de glutaraldehído hasta una concentración final de un 0,05 % (n.° de cat. de Sigma: G5882), 10 min a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de poli-HRP40-estreptavidina (Fitzgerald, 65R-S104PHRpx) en una dilución 1:2000 o 1:8000 y se incubó a t.a. durante 1 h. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó durante de 2 a 10 min. Se realizó la medición en un instrumento Tecan Safire 2 a 370/492 nm.

Inhibición de la unión de LAG-3 a MHC-II expresado en células tumorales A375 humanas (por análisis FACS)

Principio del ensayo

Para estudiar la función antagónica de los anticuerpos anti-Lag3, se llevó a cabo un ensayo de competencia MHCII:Lag3. Se tiñeron células A375 humanas MHCII+ con proteína de fusión Fc:Lag3 biotinilada generada internamente con o sin incubación previa con anticuerpos anti-Lag3. Este análisis se estudió en un experimento de competencia FACS: Se cultivaron células A375 (ATCC, n.° CRL-1619) durante 2-3 pases en medio EM de Eagle complementado con EBSS (PAN, n.° de cat. n.° P04-00509), FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, 1x NEAA y 1x piruvato de sodio. Todos los anticuerpos se diluyeron en tampón FACS hasta una concentración final de 20 jg/ml en 25 j l (en placas con fondo en U de 96 pocillos). Se añadieron 25 j l de proteína de fusión Fc:LAG-3 recombinante biotinilada generada internamente a una concentración final de 10 jg/m l al medio o bien a anticuerpos anti-Lag3 o bien controles y se preincubó durante 30 min a temperatura ambiente. Se lavaron las células A375 con PBS y se ajustaron a 3x106 células/ml en PBS. Se sembraron 100 j l por pocillo en una placa con fondo en V de 96 pocillos. Se centrifugaron las placas y se retiró el sobrenadante. A continuación, se añadió a las células la mezcla de proteína de fusión Fc:LAG-3/anticuerpo preincubada (50 jl/pocillo) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de esto, se lavaron las células con 200 j l de tampón FACS. Para la detección de la proteína Fc:Lag3 biotinilada unida a MHCII celular, se usó un anticuerpo caprino anti-biotina conjugado con APC a 3 jl/muestra (Miltenyi Biotec, n.° de cat. n.° 130-090-856) y se incubó durante 10-15 min adicionales. Después de la tinción, se lavaron de nuevo las células y a continuación se transfirieron en 150 j l de tampón FACS (PBS/FBS al 2 %) a una placa con fondo en U y se analizaron en un FACS Canto-II usando un módulo HTS.

Dos anticuerpos anti-Lag3 (clones 25F7 y 26H10; Medarex) sirvieron como controles positivos y una IgG1 humana (Sigma, n.° de cat. n.° 15154) como control de isotipo apropiado. Todos los anticuerpos se usaron a una concentración final de 10 jg/ml.

Resultados

En la tabla a continuación se muestra el resultado del análisis FACS que demuestra el porcentaje de inhibición de la unión de la proteína Lag3 a MHC-II en las células (calculado como la señal de unión reducida en referencia al valor máximo en ausencia de un anticuerpo bloqueador):

Estos datos respaldan una interacción funcional con Lag3 y el bloqueo de la interacción celular de todos los anticuerpos sometidos a prueba.

Potencia neutralizante de los anticuerpos anti-Lag3 novedosos en un bioensayo/ensayo indicador estándar de bloqueo de LAG3

Para someter a prueba la potencia neutralizante de los anticuerpos anti-Lag3 novedosos en el restablecimiento de una respuesta de linfocitos T suprimida in vitro, se usó un sistema indicador disponible comercialmente. Este sistema consiste en células efectoras Jurkat del NFAT Lag3+ (Promega, n.° de cat. n.° CS194801), células Raji MHC-II+ (ATCC, n.° CLL-86) y un superantígeno. En resumen, el sistema indicador se basa en tres etapas: (1) activación celular del NFAT inducida por superantígeno, (2) inhibición de la señal de activación mediada por la interacción inhibidora entre el MHCII (células Raji) y las células efectoras Jurkat del NFAT Lag3+, y (3) recuperación de la señal de activación del NFAT por las construcciones de fusión Lag3-antagonista/aVH-Fc neutralizante.

Para este experimento, se cultivaron linfocitos T efectores Jurkat/NFAT-luc2 Lag-3+ y Raji como se describe por el proveedor. Se prepararon diluciones en serie (40 pg/ml-50 |jg/ml) de varios anticuerpos anti-Lag3 y de referencia en medio de ensayo (RPMI 1640 (PAN Biotech, n.° de cat. n.° P04-18047), FCS al 1 %) en placas de cultivo de 96 pocillos planas con fondo blanco (Costar, n.° de cat. n.° 3917). Se añadieron 1x105 células NFAT-Jurkat Lag3+/pocillo) a la solución de anticuerpos. Después de esta etapa, se añadieron 2,5x104 células Raji/pocillo a la mezcla de células Jurkat/anticuerpos, así como una concentración final de 50 ng/ml del superantígeno SED (Toxin technology, n.° de cat. DT303). Después de una incubación de seis horas a 37 °C y CO2 al 5 %, se calentó el sustrato Bio-Glo (Promega, n.° G7940) hasta temperatura ambiente y se añadieron 75 j l por pocillo, se incubó durante 5-10 min antes de medirse la luminiscencia global en un lector Tecan Infinite de acuerdo con la recomendación del fabricante del kit.

En los diagramas se muestra el restablecimiento de una supresión mediada por MHCII/Lag3 de la señal de luciferasa del NFAT por diferentes anticuerpos anti-Lag3 tras la estimulación con SED (dados como valores CE50):

n.s.p. moléculas no sometidas a prueba en este experimento

Ejemplo 3: Actividad biológica en diferentes ensayos: efecto de diferentes anticuerpos anti-LAG3 (solos o en combinación con anticuerpos anti-PD1)

Tabla 3: Resumen de la actividad biológica de diferentes anticuerpos anti-LAG3 (solos o en combinación con anticuerpos anti-PD1)

Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la liberación de granzima B citotóxica y la secreción de IL-2 por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con células dendríticas maduras alogénicas

Para cribar anticuerpos bloqueadores anti-LAG-3 en combinación con anti-PD-1 en un entorno alogénico, se desarrolló un ensayo en el que los linfocitos T CD4 recién purificados se cocultivan durante 5 días en presencia de células dendríticas maduras (CDm) alogénicas derivadas de monocitos. Se aislaron monocitos a partir de PBMC recién obtenidos una semana antes a través de adherencia plástica seguido de la retirada de las células no adheridas. A continuación se generaron CD inmaduras a partir de los monocitos cultivándolos durante 5 días en medios que contenían GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (100 ng/ml). Para inducir la maduración de las CDi, se añadieron TNF-alfa, IL-1beta e IL-6 (50 ng/ml de cada una) a los medios de cultivo durante 2 días adicionales. A continuación se evaluó la maduración de CD midiendo su expresión en superficie del complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHCII), CD80, CD83 y CD86 a través de citometría de flujo (LSRFortessa, B^dBiosciences).

El día de la reacción linfocítica mixta mínima (RLMm), se enriquecieron linfocitos T CD4 por medio de un kit de microesferas (Miltenyi Biotec) a partir de 108 PBMC obtenidos de un donante no relacionado. Antes del cultivo, se marcaron linfocitos T CD4 con 5 |^jM de carboxifluoresceína-éster succinimidílico (CFSE). A continuación, se sembraron 105 linfocitos T CD4 en una placa de 96 pocillos conjuntamente con alo-CD maduras (5:1) en presencia o ausencia del anticuerpo anti-PD-1 aPD1(0376) bloqueador (= PD1-0103-0312, de la solicitud de PCT PCT/EP2016/073248) solo o en combinación con anticuerpos anti-LAG-3 quiméricos (de aLAG3(0403) a aLAG(0418) (de (0403) a (0418)) o anticuerpos de referencia (BAP050 humanizado (LAG525) y BMS 986016) a una concentración de 10 jg/ml. DP47 es una IgG humana que no se une con una mutación LALA en la porción Fc para evitar el reconocimiento por F^cyR y se usó como control negativo.

Cinco días más tarde, se recolectaron los sobrenadantes del cultivo celular, que más tarde se usaron para medir los niveles de IL-2 por ELISA (R&D systems), y se dejaron las células a 37 °C durante 5 horas adicionales en presencia de Golgi Plug (Brefeldin A) y Golgi Stop (Monensina). A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó una tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience) e IFN-y (eBioscience). Los resultados se muestran en las figuras 1A y B.

Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la liberación de granzima B citotóxica por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con una línea celular linfoblastoide-linfocitos B (ARH77).

En estudios funcionales, se cocultivaron linfocitos T CD4 con la línea celular tumoral ARH77, una línea celular linfoblastoide de linfocitos B que expresa menores niveles de PDL-1 que las CDm, para caracterizar mejor la contribución del antagonismo de LAG-3 al bloqueo de PD-1. El resto de la configuración experimental y la lectura permanecieron sin cambios con respecto a la RLMm. Los presentes anticuerpos anti-LAG-3 (aLAG3(0414) y aLAG3(0416), elegidos en base a su capacidad para secretar conjuntamente IL-2 y granzima B en la RLMm) en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 mostraron un incremento significativo en la secreción de granzima B por los linfocitos T CD4 que los anticuerpos anti-LAG-3 de referencia ((BAP050 humanizado (LAG525) y BMS 986016)) (P<0,05) y anti-PD-1 solo (P<0,01), figura 2.

Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la supresión de Treg de liberación de granzima B e IFN-^ypor linfocitos T CD4 humanos cocultivados con PBMC alogénicos irradiados.

En estudios funcionales que implican ensayos de supresión de linfocitos T reguladores (T reg), los PBMC del mismo donante se dividieron en dos muestras: una estaba enriquecida con linfocitos T CD4 y la otra con Treg definidos como linfocitos T CD4+CD25alto CD127bajo por medio de un kit de microesferas (Miltenyi Biotec). Una vez purificadas las dos poblaciones, los linfocitos T CD4 se marcaron con 5 |jM de carboxifluoresceína-éster succinimidílico (CFSE) mientras que los Treg con 5 ^jM de CellTrace Violet (CTV) para poder distinguirlas en el FACS más adelante.

A continuación, tanto los linfocitos T CD4 (105) como los Treg (105) se cocultivaron en una placa de 96 pocillos en una proporción de 1:1 conjuntamente con PBMC irradiados (105) de un donante no relacionado en presencia o ausencia de los presentes anticuerpos anti-LAG-3 (aLAG3(0414) y aLAG3(0416) o los anticuerpos anti-LAG-3 de referencia (BAP050 humanizado (LAG525) y BMS 986016) en combinación con el presente anticuerpo anti-PD-1 a una concentración de 10 jg/ml. Como control para estimar la magnitud de la supresión de las funciones efectoras de linfocitos T CD4 por Treg, los linfocitos T CD4 (105) también se cocultivaron con PBMC irradiados (105) en ausencia de Treg.

Cinco días más tarde, se recolectaron los sobrenadantes del cultivo celular, que más tarde se usaron para medir los niveles de IFN-y por ELISA (R&D systems), y se dejaron las células a 37 °C durante 5 horas adicionales en presencia de Golgi Plug (Brefeldin A) y Golgi Stop (Monensin). A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó una tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience) e IFN-^y(eBioscience). Los resultados se muestran en las figuras 3A y B.

Los anticuerpos anti-LAG-3 (aLAG3(0414) y aLAG3(0416), en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 aPD1(0376) (= PD1-0103-0312, de la solicitud de PCT PCT/EP2016/073248) provocaron la resistencia de Tconv del control estricto de los linfocitos T reguladores como se demuestra por la secreción de una cantidad significativamente mayor de granzima B que de Tconv en presencia de anti-PD-1 solo (P<0,05) o en ausencia de inhibidores del punto de control (P<0,001). Los anticuerpos anti-LAG-3 de referencia (BAP050 humanizado (LAG525) y BMS 986016) en combinación con anti-PD-1 no rescataron significativamente las funciones efectoras de Tconv de la supresión de Treg. Se obtuvieron resultados similares para IFN-g incluso si la diferencia no alcanzó significación estadística con solo 4 donantes.

Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la secreción de granzima B e IFN-^ypor linfocitos T CD4 de PBMC de pacientes con melanoma después de la recuperación con grupos de péptidos de antígeno de melanoma inmunogénico.

Se ha descrito previamente que los PBMC de pacientes con melanoma contienen frecuencias detectables de linfocitos T específicos de antígeno tumoral. Por lo tanto, para propósitos de POC, se sometió a prueba el anticuerpo anti-LAG-3 (0414) más anti-PD-1 frente a anti-PD-1 solo en PBMC de pacientes con melanoma reestimulados durante la noche con grupos de péptidos de antígenos asociados al melanoma inmunogénico.

Se incubaron de 105 a 106 PBMC de pacientes con melanoma a temperatura ambiente en presencia o ausencia de concentraciones de saturación (10 jg/m l) de anticuerpo anti-PD-1 solo (0376), en combinación con anticuerpo anti-LAG-3 (aLAG3(0414) = (0414), 10 jg/ml). A continuación, los linfocitos T se volvieron a estimular durante la noche con un grupo de antígenos relacionados con el tumor inmunogénico como MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, Melan-A/MART-1, NYESO-1, proteína de melanocitos Pmel 17 gp100, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa 2 en presencia de inhibidores del transporte de proteínas Golgi Plug (Brefeldin A) y Golgi Stop (Monensin).

A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó una tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience) e IFN-y (eBioscience).

La combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-PD-1 (P<0,01 y P<0,001) potenció significativamente (P<0,01 y P<0,0001) las funciones efectoras de los linfocitos T específicos del antígeno tumoral (es decir, secreción de granzima B e IFN-^y) mientras que el bloqueo de PD-1 solo no mostró ningún efecto (datos no mostrados).

De forma análoga, un experto en la técnica podría ampliar lo anterior en el ejemplo 3 de cultivos celulares/estudios en animales a procedimientos de tratamiento en seres humanos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une a LAG3 humana, en el que el anticuerpo comprende

(a) un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3; y (b) un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de VH de SEQ ID ⁿO: 7 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 8.

3. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el anticuerpo:

ii) se une a una LAG3 humana y de macaco cangrejero; y/o

4. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

5. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo IgG1 de longitud completa con mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

6. Ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 7 de modo que se produzca el anticuerpo.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, que comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped.

10. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento del cáncer.