BR112019018779A2

BR112019018779A2 - anticorpos isolados, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método para tratar um indivíduo tendo câncer e para produzir um anticorpo, formulação farmacêutica e uso do anticorpo

Info

Publication number: BR112019018779A2
Application number: BR112019018779A
Authority: BR
Inventors: Zwick Adrian; Klein Christian; Fischer Jens; Codarri Deak Laura; Alexander Aaron Weber Patrick; Dengl Stefan; Seeber Stefan
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2020-05-05
Also published as: IL268620B1; JP6871415B2; MX2019011916A; EP4112644A1; EP3606954A1; CN110392698A; JP2020512818A; RU2019134231A3; PL3606954T3; TWI707871B; SI3606954T1; EP3606954B1; ZA201905966B; UA128387C2; TW201841940A; RS63591B1; LT3606954T; PH12019502283A1; CO2019009365A2; PE20210256A1

Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos anti-lag3, a métodos de produção destas moléculas e métodos de utilização dos mesmos.

Description

“ANTICORPOS ISOLADOS, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA TRATAR UM INDIVÍDUO TENDO CÂNCER E PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO ANTICORPO”

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se anticorpos anti-LAG3, a métodos de produção destas moléculas e métodos de utilização dos mesmos.

Antecedentes da Invenção [002] O gene 3 de ativação de linfócitos (LAG3 ou CD223) foi inicialmente descoberto em uma experiência concebida para isolar seletivamente moléculas expressas em uma linhagem celular de NK dependente de IL-2 (Triebel F et al., Cancer Lett. 235 (2006), 147-153). A LAG-3 é uma proteína transmembrana única, com homologia estrutural ao CD4, com quatro domínios semelhante à superfamília extracelular de imunoglobulina (D1-D4). O domínio IgG distai da membrana contém uma sequência curta de aminoácidos, o chamado loop extra que não é encontrado em outras proteínas da superfamília de IgG. O domínio intracelular contém uma sequência de aminoácidos única (KIEELE) que é necessária para que a LAG-3 exerça um efeito negativo na função das células T. A LAG-3 pode ser clivada no peptídeo de ligação (CP) por metaloproteases para gerar uma forma solúvel, que é detectável no soro. Tal como o CD4, a proteína LAG3 liga-se a moléculas MHC de classe II, contudo com uma afinidade maior e em um local distinto do CD4 (Huard et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 94 (1997), 5744-5749). A LAG3 é expressa por células T, células B, células NK e células dendríticas plasmocitoides (pDCs) e é regulada positivamente após a ativação de células T. Ela modula a função das células T, bem como a homeostase das células T. Subconjuntos de células T convencionais que são anérgicas ou apresentam funções prejudicadas expressam LAG3. As células T LAG3⁺ são enriquecidas em locais tumorais e

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2/126 durante infecções virais crônicas (Sierro et al. Expert Opin. Ther. Targets 15 (2011), 91-101). Foi demonstrado que a LAG3 desempenha um papel na exaustão de células T CD8 (Blackburn et al. Nature Immunol. 10 (2009), 29-37). Assim, existe uma necessidade de anticorpos que antagonizem a atividade da LAG3 e possam ser usados para gerar e restaurar a resposta imune aos tumores.

[003] Os anticorpos monoclonais para LAG3 foram descritos, por exemplo, no documento WO 2004/078928, em que uma composição compreendendo anticorpos que se ligam especificamente a CD223 e uma vacina anticâncer é reivindicada. O documento WO 2010/019570 revela anticorpos humanos que se ligam a LAG3, por exemplo, os anticorpos 25F7 e 26H10. O documento US 2011/070238 refere-se a um anticorpo citotóxico anti-LAG3 útil no tratamento ou prevenção de rejeição de transplante de órgãos e doença autoimune. O documento WO 2014/008218 descreve anticorpos LAG3 com propriedades funcionais otimizadas (isto é, locais de desamidação reduzidos) em comparação com o anticorpo 25F7. Além disso, os anticorpos LAG3 são divulgados em WO 2015/138920 (por exemplo BAP050), WO 2014/140180, WO 2015/116539, WO 2016/028672, WO 2016/126858, WO 2016/200782 e WO 2017/015560.

Descrição Resumida da Invenção [004] A invenção fornece anticorpos anti-LAG3 e métodos de uso dos mesmos.

[005] A invenção fornece um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende

A) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

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SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

B) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

C) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

D) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; ou

E) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos

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4/126 de SEQ ID NO: 36; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[006] A invenção fornece ainda um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende

A) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

B) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

C) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e (iii) HVR-L3 compreendendo a

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5/126 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

D) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 27; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; ou

E) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 35; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[007] A invenção fornece ainda um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo

i) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8;

ii) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16;

iii) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24;

iv) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; ou

v) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 39 e uma

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6/126 sequência VL de SEQ ID NO: 40.

[008] A invenção fornece ainda anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo:

i) compete pela ligação a LAG3 com um anticorpo anti-LAG3 compreendendo a VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e/ ou ii) se liga a uma LAG3 humana e de cinomolgo; e/ ou iii) inibe a ligação de MHC-II expressa em células tumorais A375 humanas; e/ ou iv) aumenta a liberação de granzima B ou IL-2 em um ensaio de reação mista de linfócitos (mMLR).

[009] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-LAG3 de acordo com a invenção é um anticorpo monoclonal.

[0010] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-LAG3 de acordo com a invenção é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.

[0011] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-LAG3 de acordo com a invenção, que é um componente de anticorpo que se liga a LAG3.

[0012] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-LAG3 de acordo com a invenção, é o fragmento Fab.

[0013] A invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.

[0014] A invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo esse ácido nucleico.

[0015] A invenção fornece um método para produzir um anticorpo que compreende cultivar a célula hospedeira de modo a que o anticorpo seja produzido.

[0016] A invenção fornece este método para produzir um

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7/126 anticorpo, compreendendo ainda a recuperação do anticorpo da célula hospedeira.

[0017] A invenção fornece uma formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo aqui descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0018] A invenção fornece o anticorpo aqui descrito para uso como medicamento.

[0019] A invenção fornece o anticorpo aqui descrito para uso no tratamento de câncer.

[0020] A invenção fornece o uso do anticorpo aqui descrito na fabricação de um medicamento. Em uma forma de realização o medicamento é para tratamento de câncer, para tratar ou retardar a progressão de uma doença relacionada ao sistema imune, tais como a imunidade do tumor, ou para estimular uma resposta ou função imune, tais como a atividade de células T.

[0021] A invenção fornece um método para tratar um indivíduo com câncer, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo aqui descrito.

[0022] Os anticorpos da presente invenção mostram propriedades valiosas de indução da liberação de Granzima B, liberação de IFN-γ e secreção de IL-2 por células T CD4 humanas e, portanto, pode estimular a resposta imune através de células T (funções efetoras reforçadas de células T específicas de antígeno ao tumor) isoladamente ou em combinação com inibidores PD1.

Breve Descrição das Figuras [0023] Figura 1: Efeito de anticorpos anti-LAG3 na liberação de Granzima B citotóxica e secreção de IL-2 por células T CD4 humanas cocultivadas com células dendríticas maduras alogênicas Figura 1 A: Secreção de Granzima B; Figura 1B: Secreção de IL-2.

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8/126 [0024] Figura 2: Efeito de anticorpos anti-LAG3 na liberação de Granzima B citotóxica por células T CD4 humanas co-cultivadas com uma linhagem celular linfoblatoide de células B (ARH77).

[0025] Figura 3: Efeito de anticorpos anti-LAG3 na supressão Treg de liberação de Granzima B e IFN-γ pelas células T CD4 humanas cocultivadas com PBMC alogênicas irradiadas. Figura 3A: Liberação de Granzima B; Figura 3B: Liberação de IFN-γ.

Descrição Detalhada da Invenção [0026] Uma “estrutura humana aceitadora” para os propósitos daqui é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácidos de uma estrutura de domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma estrutura de domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana, conforme definido abaixo. Uma estrutura humana aceitadora “derivada de” uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma, ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em algumas formas de realização, o número de alterações de aminoácidos são 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Em algumas formas de realização, a estrutura humana aceptora de VL é idêntica em sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana VL ou sequência de estrutura de consenso humana.

[0027] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não-covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, como aqui utilizado, “afinidade de ligação” refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1: 1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma

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9/126 molécula X por seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na arte, incluindo aqueles aqui descritos. Formas de realização ilustrativas e exemplares específicas para medir a afinidade de ligação são descritas a seguir.

[0028] Um anticorpo “amadurecido por afinidade” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), comparado a um anticorpo original que não possui tais alterações, resultando em uma melhora na afinidade do anticorpo ao antígeno.

[0029] O termo “LAG3”, como usado aqui, refere-se a qualquer LAG3 nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo humanos) e roedores (por exemplo, ratos e camundongos), salvo indicação em contrário. O termo engloba LAG3 “completo”, não processado, assim como qualquer forma de LAG3 resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de LAG3, por exemplo, variantes de emenda (splice) ou variantes alélicas. Em uma forma de realização preferida, o termo “LAG3” refere-se a LAG3 humana. A sequência de aminoácidos de uma LAG3 processada exemplificativamente (sem sequências de sinal) apresentada na SEQ ID NO: 54. A sequência de aminoácidos de uma LAG3 de Domínio Extracelular (ECD) exemplar é apresentada na SEQ ID NO: 55.

[0030] Os termos “anticorpo anti-LAG3” e “um anticorpo que se liga a LAG3” referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a LAG3 com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ ou terapêutico no direcionamento de LAG3. Em uma forma de realização, a extensão da ligação de um anticorpo anti-LAG3 a uma proteína não LAG3 não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo a LAG3 como medida, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas

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10/126 formas de realização, um anticorpo que se liga a LAG3 tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10’⁸M ou menos, por exemplo, de 10’⁸M a 10’¹³M, por exemplo, de 10’⁹ M a 10’¹³ M). Em certas formas de realização, um anticorpo anti-LAG3 se liga a um epítopo de LAG3 que é conservado entre LAG3 de espécies diferentes. Em uma forma de realização preferida, um “anticorpo anti-LAG3”, “um anticorpo que se liga especificamente a LAG3 humana” e “um anticorpo que se liga a LAG3 humana” refere-se a um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno LAG3 humano ou ao seu domínio extracelular (ECD) com uma afinidade de ligação de um valor Kode 1,0 x 10’⁸mol/L ou inferior, em uma forma de realização de um valor Kode 1,0 x 10’⁹mol/L ou inferior, em uma forma de realização de um valor Kode 1,0 x 10’⁹mol/L a 1,0 x 10’¹³ mol/L. Neste contexto, a afinidade de ligação é determinada com um ensaio de ligação padrão, tal como a técnica de ressonância de plasmon de superfície (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suécia), por exemplo, utilizando o domínio extracelular de LAG3.

[0031] O termo “anticorpo” é aqui utilizado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpo, incluindo mas não limitado a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multi-específicos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejado.

[0032] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab’, Fab’SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

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11/126 [0033] O termo “epítopo” denota o local em um antígeno, proteico ou não proteico, ao qual um anticorpo anti-LAG3 se liga. Os epítopos podem ser formados tanto a partir de extensões de aminoácidos contíguos (epítopo linear) ou compreendendo aminoácidos não contíguos (epítopo conformacional), por exemplo, vindo em proximidade espacial devido à dobragem do antígeno, isto é, pelo dobramento terciário de um antígeno proteico. Os epítopos lineares estão tipicamente ainda ligados por um anticorpo anti-LAG3 após exposição do antígeno proteico a agentes desnaturantes, enquanto os epítopos conformacionais são tipicamente destruídos por tratamento com agentes desnaturantes. Um epítopo compreende pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única.

[0034] A varredura de anticorpos que se ligam a um epítopo particular (isto é, os que se ligam ao mesmo epítopo) pode ser feita utilizando métodos de rotina na técnica tais como, por exemplo, sem limitação a varredura de alanina, manchas de peptídeo (ver Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463), análise de divagem de peptídeo, excisão de epítopo, extração de epítopo, modificação química de antígenos (ver Prot. Sei. 9 (2000) 487-496) e bloqueio cruzado (ver “Antibodies”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY).

[0035] O Perfil de Anticorpo baseado em Estrutura de Antígeno (ASAP), também conhecido como Perfil Assistido por Modificação (MAP), permite agrupar uma multiplicidade de anticorpos monoclonais especificamente ligados a LAG3 com base no perfil de ligação de cada um dos anticorpos da multidão a superfícies de antígeno modificadas química ou enzimaticamente (ver, por exemplo, US 2004/0101920). Os anticorpos em cada grupo ligam-se ao mesmo epítopo que pode ser um epítopo único, distintamente diferente ou parcialmente sobreposto ao epítopo representado por outro grupo.

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12/126 [0036] Também se pode utilizar a ligação competitiva para determinar facilmente se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo da LAG3 como, ou compete pela ligação com, um anticorpo anti-LAG3 de referência. Por exemplo, um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo” como um anticorpo anti-LAG3 de referência refere-se a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo anti-LAG3 de referência ao seu antígeno em um teste de competição em 50% ou mais e, inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais. Também por exemplo, para determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-LAG3 de referência, deixa-se que o anticorpo de referência se ligue a LAG3 sob condições de saturação. Após a remoção do excesso do anticorpo anti-LAG3 de referência, avalia-se a capacidade de um anticorpo anti-LAG3 na questão se ligar a LAG3. Se o anticorpo anti-LAG3 for capaz de se ligar a LAG3 após a ligação de saturação do anticorpo anti-LAG3 de referência, pode ser concluído que o anticorpo anti-LAG3 em questão se liga a um epítopo diferente do anticorpo anti-LAG3 de referência. Mas, se o anticorpo anti-LAG3 em questão não for capaz de se ligar a LAG3 após a ligação de saturação do anticorpo anti-LAG3 de referência, então o anticorpo anti-LAG3 em questão pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo LAG3 de referência. Para confirmar se o anticorpo em questão se liga ao mesmo epítopo ou é apenas impedido de ligar por razões estéricas, pode ser usada a experimentação de rotina (por exemplo, mutações de peptídeos e análises de ligação usando ELISA, RIA, ressonância plasmônica de superfície, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio qualitativo de ligação de anticorpos disponível na técnica). Este ensaio deve ser realizado em dois tempos de preparação, ou seja, com ambos os anticorpos sendo o anticorpo saturante. Se, em ambos os tempos de preparação, apenas o primeiro anticorpo (saturante) é capaz de se ligar a LAG3, então pode ser concluído que

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13/126 o anticorpo anti-LAG3 em questão e o anticorpo anti-LAG3 de referência competem pela ligação a LAG3.

[0037] Em algumas formas de realização, considera-se que dois anticorpos se ligam ao mesmo ou a um epítopo sobreposto se um excesso de 1,5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibir a ligação do outro em pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90% ou mesmo 99% ou mais, tal como medido em um ensaio de ligação competitiva (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502).

[0038] Em algumas formas de realização, considera-se que dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo também reduzem ou eliminam a ligação do outro. Considera-se que dois anticorpos possuem “epítopos sobrepostos” se apenas um subconjunto das mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduz ou elimina a ligação do outro.

[0039] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[0040] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuído por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG-ι, lgG2, IgGa, lgG4, IgAi, e lgA2. Em certas formas de realização, o anticorpo é do isotipo lgG4 com a mutação S228P na região de dobradiça para melhorar a estabilidade do anticorpo lgG4. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente.

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14/126 [0041] O termo “agente citotóxico”, tal como aqui utilizado, referese a uma substância que inibe ou previne uma função celular e/ ou causa morte ou destruição celular. Agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, isótopos radioativos (por exemplo, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² e isótopos radioativos de Lu); agentes quimioterapêuticos ou drogas (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes); agentes inibidores do crescimento; enzimas e seus fragmentos, tais como enzimas nucleolicas; antibióticos; toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ ou variantes das mesmas; e os vários agentes antitumorais ou anticancerígenos divulgados abaixo.

[0042] “Funções efetoras” referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); Ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.

[0043] Uma “quantidade eficaz” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.

[0044] O termo “região Fc” aqui é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma forma de realização, uma região Fc da cadeia

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15/126 pesada de IgG humana estende-se desde Cys226, ou desde Pro230, ao terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. Em uma forma de realização, o anticorpo anti-Lag3 como aqui descrito do isotipo lgG1 e compreende um domínio de cadeia pesada constante de SEQ ID NO: 51 ou de SEQ ID NO: 52. Em uma forma de realização compreende adicionar a lisina C-terminal (Lys447). Em uma forma de realização, o anticorpo anti-Lag3 como aqui descrito do isotipo lgG4 e compreende um domínio de cadeia pesada constante de SEQ ID NO: 53. Em uma forma de realização, compreende adicionalmente a lisina C-terminal (Lys447). A menos que aqui especificado de outro modo, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante de acordo com o sistema de numeração da UE, também denominado de índice UE, como descrito em Kabat et al. Protein Sequences of Immunological Interest, 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[0045] “Framework” ou “FR” refere-se a resíduos do domínio variável que não sejam resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Por conseguinte, as sequências HVR e FR aparecem geralmente na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

[0046] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são aqui utilizados indistintamente para referir um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativo ou possuindo cadeias pesadas que contêm uma região Fc como aqui definida.

[0047] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de célula hospedeira” são usados de forma intercambiável e referem-se a células nas quais o ácido nucléico exógeno foi

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16/126 introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir da mesma sem ter em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucléico a uma célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada é aqui incluída.

[0048] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um humano ou célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificadoras de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humanos. Em certas formas de realização, um anticorpo humano é derivado de um mamífero transgênico não humano, por exemplo, um camundongo, um rato ou um coelho. Em certas formas de realização, um anticorpo humano é derivado de uma linhagem celular de hibridoma.

[0049] Uma “estrutura de consenso humana” é uma estrutura que representa os resíduos de aminoácidos mais comuns em uma seleção de sequências de estrutura VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobulina humana de um subgrupo de sequências de domínios variáveis. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Protein of Immunological Interest, Quinta Edição, Publicação NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 13. Em uma forma de realização, para o VL, o subgrupo é subgrupo kappa I como em Kabat et al. supra. Em uma forma de realização, para o VH, o

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17/126 subgrupo é subgrupo III como em Kabat et al. supra.

[0050] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácido de HVRs não humanos e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em certas formas de realização, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àqueles de um anticorpo não humano, e todos ou substancialmente todos os FRs correspondem aos de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, referese a um anticorpo que foi submetido a humanização.

[0051] O termo “região hipervariável” ou “HVR” como usado aqui refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência (“regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”) e/ ou formam alças estruturalmente definidas (“loops hipervariáveis”) e/ ou contêm os resíduos de contato com o antígeno (“contatos antigênicos”). Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs: três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). Exemplos de HVRs incluem:

(a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987));

(b) CDRs ocorrendo nos resíduos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) contatos antigênicos que ocorrem nos resíduos de

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18/126 aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) e 93101 (H3) (MacCalIum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) combinações de (a), (b) e/ ou (c), incluindo resíduos de aminoácidos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (HI), 26-35b (HI), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).

[0052] Em uma forma de realização, os resíduos de HVR compreendem aqueles identificados na Descrição das sequências de aminoácidos abaixo.

[0053] Salvo indicação em contrário, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são aqui numerados de acordo com Kabat et al. supra.

[0054] Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado com uma ou mais moléculas heterólogas, incluindo, mas não se limitando a, um agente citotóxico.

[0055] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camindongos e ratos). Em certas formas de realização, o indivíduo ou sujeito é um humano.

[0056] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado de um componente do seu ambiente natural. Em algumas formas de realização, um anticorpo é purificado para uma pureza superior a 95% ou 99% conforme determinado, por exemplo, eletroforético (por exemplo, SDS-PAGE, focagem isoeléctrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográfico (por exemplo, HPLC de troca iônica ou de fase inversa). Para revisão de métodos para avaliação da pureza do anticorpo, ver, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).

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19/126 [0057] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente do seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomicamente ou em uma localização cromossômica que diferente da sua localização cromossômica natural.

[0058] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo antiLAG3” refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificando cadeias pesadas e leves de anticorpo (ou fragmentos dos mesmos), incluindo tal(is) molécula(s) de ácido nucleico em um vector único ou vectores separados, e tal(is) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) em um ou mais locais em uma célula hospedeira.

[0059] O termo “anticorpo monoclonal”, tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ ou ligam-se ao mesmo epítopo, exceto quanto a possíveis anticorpos variantes, por exemplo, mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, estando estas variantes geralmente presentes em quantidades menores. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal dirigido contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador “monoclonal” indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos

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20/126 monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo mas não limitado ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fagos e métodos utilizando animais transgênicos contendo todos ou parte dos loci de imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplares para fazer anticorpos monoclonais sendo aqui descritos.

[0060] Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo que não é conjugado a uma porção heteróloga (por exemplo, uma porção citotóxica) ou radiomarcador. O anticorpo nu pode estar presente em uma formulação farmacêutica.

[0061] “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variáveis. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por dissulfeto. Do terminal N ao C terminal, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio variável pesado ou um domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Similarmente, do terminal N ao C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um de dois tipos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante.

[0062] O termo “folheto informativo” é usado para se referir às instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contra-indicações e/ ou advertências relativas ao uso de tais produtos terapêuticos.

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21/126 [0063] “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência polipeptídica de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para atingir a máxima percentagem de identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias maneiras que estão dentro da perícia na arte, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente tal como BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) ou o pacote de programas FASTA. Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas. Para os propósitos aqui descritos, no entanto, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa ggsearch do pacote FASTA versão 36.3.8c ou posterior com uma matriz de comparação BLOSUM50. O pacote do programa FASTA foi escrito por W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227-258; e Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36 e está publicamente disponível em http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. Alternativamente, um servidor público acessível em http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi pode ser usado para comparar as sequências, usando o programa ggsearch (proteína global: proteína) e opções padrão (BLOSUM50; aberto: -10; ext: -2; Ktup = 2) para garantir que um alinhamento global, e não local, seja realizado. A percentagem

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22/126 de identidade de aminoácidos é dada no cabeçalho de alinhamento de saída.

[0064] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está de tal forma que permita que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido na mesma seja eficaz e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrado.

[0065] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, que não seja um ingrediente ativo, o qual não é tóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante.

[0066] Como usado aqui, “tratamento” (e suas variações gramaticais, tais como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural do indivíduo a ser tratado, e pode ser realizada para profilaxia ou durante o curso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não se limitam a prevenir a ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença e remissão ou melhor prognóstico. Em algumas formas de realização, os anticorpos da invenção são utilizados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou retardar a progressão de uma doença.

[0067] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente possuem estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FR) e três regiões hipervariáveis (HVR). (Ver,

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23/126 por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6^th ed., W. H. Freeman e Co., página 91 (2007).) Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno particular podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antígeno para pesquisar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Ver, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).

[0068] O termo “vector”, como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui o vector como uma estrutura de ácido nucleico autoreplicante, bem como o vector incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucléicos aos quais eles estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como como “vetores de expressão”.

I. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS [0069] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos isolados que se ligam a LAG3.

[0070] Em certas formas de realização, são fornecidos anticorpos que se ligam a LAG3 humana. Os anticorpos da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de câncer, para tratar ou retardar a progressão de uma doença relacionada com o sistema imune, tal como imunidade tumoral, ou para estimular uma resposta ou função imunitárias, tal como a atividade das células T; ou para uso como agente imunoestimulante/ ou estimulante de Granzima B (GrzB), interferon-gama (IFN-gama) e ou secreção/ liberação de interleucina 2 (IL-2).

A. Anticorpos Anti-LAG3 Exemplificativos [0071] Em certas formas de realização, é fornecido um anti-LAG3

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24/126 em que o anticorpo:

i) compete pela ligação a LAG3 com um anticorpo anti-LAG3 (compreendendo o VH e VL de aLAG3 (0414)) compreendendo o VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e/ ou ii) se liga a uma LAG3 humana e de cinomolgo; e/ ou iii) inibe a ligação de MHC-II expressa em células tumorais

A375 humanas; e/ ou iv) aumenta a liberação de Granzima B ou IL-2 em um ensaio de reação mista de linfócitos (mMLR) (como mostrado no Exemplo 3).

[0072] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiLAG3 compreendendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0073] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em outra forma de realização, o anticorpo compreende HVRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e HVR-L3

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25/126 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0074] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0075] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2

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26/126 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0076] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 5; e (f) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 6.

[0077] Em qualquer uma das formas de realização acima, um anticorpo anti-LAG3 é humano ou humanizado. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-LAG3 compreende HVRs como em qualquer uma das formas de realização acima, e compreende ainda uma estrutura humana aceptora, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana.

[0078] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em certas formas de realização, uma sequência VH tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 7. Em certas formas de realização, substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto

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27/126 é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LAG3 compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 7, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0079] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em certas formas de realização, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 8. Em certas formas de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LAG3 compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 8, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0080] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer das formas de

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28/126 realização fornecidas acima e uma VL como em qualquer das formas de realização fornecidas acima. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende as sequências VH e VL na SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente, incluindo modificações pós-tradução dessas sequências.

[0081] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-LAG3 aqui fornecido aqui. Por exemplo, em certas formas de realização, é fornecido um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-LAG3 compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8. Em certas formas de realização, é fornecido um anticorpo que se liga a um epítopo do epítopo do cluster E3 dentro da LAG3 (ver exemplo 2).

[0082] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiLAG3 compreendendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

[0083] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Em outra forma de realização, o anticorpo compreende

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HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0084] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

[0085] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (i) HVR-L1

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30/126 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

[0086] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 13; e (f) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 14.

[0087] Em qualquer uma das formas de realização acima, um anticorpo anti-LAG3 é humano ou humanizado. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-LAG3 compreende HVRs como em qualquer uma das formas de realização acima e compreende ainda uma estrutura humana aceptora, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana.

[0088] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. Em certas formas de realização, uma sequência VH tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 15. Em certas formas de realização,

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31/126 substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LAG3 compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 15, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0089] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em certas formas de realização, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 16. Em certas formas de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LAG3 compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 16, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

[0090] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em

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32/126 que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer das formas de realização fornecidas acima e uma VL como em qualquer das formas de realização fornecidas acima. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende as sequências VH e VL na SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente, incluindo modificações pós-tradução dessas sequências.

[0091] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-LAG3 aqui fornecido. Por exemplo, em certas formas de realização, é fornecido um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-LAG3 compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16. Em certas formas de realização, é fornecido um anticorpo que se liga a um epítopo do epítopo do cluster E3 dentro de LAG3 (ver exemplo 2).

[0092] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiLAG3 compreendendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[0093] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos

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33/126 de SEQ ID NO: 19. Em outra forma de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[0094] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[0095] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 19; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos

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34/126 duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[0096] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 19; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 20; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 21; e (f) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 22.

[0097] Em qualquer uma das formas de realização acima, um anticorpo anti-LAG3 é humano ou humanizado. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-LAG3 compreende HVRs como em qualquer uma das formas de realização acima e compreende ainda uma estrutura humana aceptora, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana.

[0098] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. Em certas formas de realização, uma sequência VH tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído,

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35/126 inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 23. Em certas formas de realização, substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LAG3 compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 23, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[0099] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Em certas formas de realização, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 24. Em certas formas de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LAG3 compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 24, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

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36/126 [00100] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer das formas de realização fornecidas acima e uma VL como em qualquer das formas de realização fornecidas acima. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende as sequências VH e VL na SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, respectivamente, incluindo modificações pós-tradução dessas sequências.

[00101] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-LAG3 aqui fornecido. Por exemplo, em certas formas de realização, é fornecido um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-LAG3 compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24. Em certas formas de realização, é fornecido um anticorpo que se liga a um epítopo do epítopo do cluster E3 dentro da LAG3 (ver exemplo 2).

[00102] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG3 compreendendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; (c) HVR-H3 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 27; (d) HVR-L1 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (e) HVR-L2 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[00103] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-H3 compreendendo a

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37/126 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. Em outra forma de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

[00104] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[00105] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e (iii) HVR-H3

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38/126 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 27; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[00106] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 26; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 27; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 28; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 29; e (f) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 30.

[00107] Em qualquer uma das formas de realização acima, um anticorpo anti-LAG3 é humano ou humanizado. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-LAG3 compreende HVRs como em qualquer uma das formas de realização acima e compreende ainda uma estrutura humana aceptora, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana.

[00108] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em certas formas de realização, uma sequência VH tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou

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39/126 deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 31. Em certas formas de realização, substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LAG3 compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 31, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

[00109] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Em certas formas de realização, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 32. Em certas formas de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo antiLAG3 compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 32, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1

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40/126 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[00110] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer das formas de realização fornecidas acima e uma VL como em qualquer das formas de realização fornecidas acima. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende as sequências VH e VL na SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32, respectivamente, incluindo modificações pós-tradução dessas sequências.

[00111] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-LAG3 aqui fornecido. Por exemplo, em certas formas de realização, é fornecido um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-LAG3 compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32. Em certas formas de realização, é fornecido um anticorpo que se liga a um epítopo do epítopo do cluster E3 dentro da LAG3 (ver exemplo 2).

[00112] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG3 compreendendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (c) HVR-H3 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 35; (d) HVR-L1 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (e) HVR-L2 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 37; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[00113] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três

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41/126 sequências VH HVR selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em outra forma de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

[00114] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[00115] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos

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42/126 duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 35; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[00116] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo compreendendo (a) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 34; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 35; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 36; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 37; e (f) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 38.

[00117] Em qualquer uma das formas de realização acima, um anticorpo anti-LAG3 é humano ou humanizado. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-LAG3 compreende HVRs como em qualquer uma das formas de realização acima e compreende ainda uma estrutura humana aceptora, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana.

[00118] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. Em certas formas de realização, uma sequência VH tendo pelo menos

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WA 26

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 39. Em certas formas de realização, substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-LAG3 compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 39, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

[00119] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. Em certas formas de realização, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservatives), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-LAG3 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a LAG3. Em certas formas de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ ou eliminado na SEQ ID NO: 40. Em certas formas de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora dos HVRs (isto é, nos FRs). Opcionalmente, o anticorpo antiLAG3 compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 40, incluindo modificações

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44/126 pós-tradução dessa sequência. Em uma forma de realização particular, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[00120] Em outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer das formas de realização fornecidas acima e uma VL como em qualquer das formas de realização fornecidas acima. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende as sequências de VH e VL em SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40, respectivamente, incluindo modificações pós-tradução de tais sequências.

[00121] Em um outro aspecto da invenção, um anticorpo anti-LAG3 de acordo com qualquer uma das formas de realização acima referidas é um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-LAG3 é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab’, scFv, diacorpo ou F(ab’)2. Em outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo inteiro, por exemplo, com as substituições L234A, L235A e P329G (LALA-PG) em uma região Fc derivada de uma região Fc de lgG1 humana. (Veja, por exemplo, WO 2012/130831 A1).

[00122] Em um outro aspecto, um anticorpo anti-LAG3 de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, como descrito nas Secções 1 a 7 abaixo.

1. Afinidade com Anticorpos [00123] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10

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45/126 nM, < 1 ηΜ, < 0,1 ηΜ, < 0,01 ηΜ, ou < 0,001 ηΜ (por exemplo, 10’⁸ Μ ou menos, por exemplo, de 10’⁸ M a 10’¹³ M, por exemplo, de 10’⁹ M a 10’¹³ M).

[00124] Em uma forma de realização, o Kd medido por um ensaio de ligação ao antígeno radiomarcado (RIA). Em uma forma de realização, um RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e o seu antígeno. Por exemplo, a afinidade de ligação da solução de Fabs para o antígeno é medida por Fab de equilíbrio com uma concentração mínima de antígeno marcado com (¹²⁵l) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado, capturando depois o antígeno de ligação com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (ver, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)). Para estabelecer condições para o ensaio, as placas de múltiplos poços MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 pg/ ml de anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9,6) e subsequentemente bloqueadas com abumina de soro bovino a 2% (p/ v) em PBS durante duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). Em uma placa não adsorvente (Nunc # 269620), misturam-se 100 pM ou 26 pM de [¹²⁵l] com diluições em série de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Depois disso, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (por exemplo, durante uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com 0,1% de polissorbato 20 (TWEEN20®) em PBS. Quando as placas secaram, 150 μΙ/ poço de cintilante (MICROSCINT-20™; Packard) são adicionados e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT™ (Packard) por dez minutos. As

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46/126 concentrações de cada Fab que dão menos ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitiva.

[00125] De acordo com outra forma de realização, o Kd é medido utilizando um ensaio de ressonância de plasmon de superfície BIACORE®. Por exemplo, um ensaio utilizando um BIACORE® -2000 ou um BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25 °C com chips de antígeno CM5 imobilizados a ~10 unidades de resposta (RU). Em uma forma de realização, chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) são ativados com cloridrato de A/-etil-A/’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e /V-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, para 5 pg/ ml (~ 0,2 μΜ) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 μΙ/ minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, injeta-se 1 M de etanolamina para bloquear os grupos que não reagiram. Para medições cinéticas, duas diluições seriadas de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de polissorbato 20 (TWEEN-20™) tensoativo (PBST) a 25 °C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μΙ/ min. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo simples de ligação de Langmuir (BIACORE® Evaluation Software versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a razão koff/ kon. Ver, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Se a taxa de ataque (on-rate) exceder 106 M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície acima, então a taxa de ataque pode ser determinada usando uma técnica de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou diminuição da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de passagem de banda) a 25 °C de um anticorpo anti-antígeno 20

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47/126 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em um espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-AMINCO™ da série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.

2. Fragmentos de Anticorpo [00126] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido é um fragmento de anticorpo. O termo “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, Fab de cadeia simples (scFab); fragmentos variáveis de cadeia simples (scFv) e anticorpos de domínio único (dAbs). Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Holliger e Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005).

[00127] Em uma forma de realização, o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, Fab’, Fab’-SH ou F(ab’)2, em particular um fragmento Fab. A digestão com papaína de anticorpos intactos produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos “Fab” contendo cada um dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve e também o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. O termo “fragmento Fab” refere-se a um fragmento de anticorpo compreendendo um fragmento de cadeia leve compreendendo um domínio VL e um domínio constante de uma cadeia leve (CL) e um domínio VH e um primeiro domínio constante (CH1) de uma cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteinas da região de dobradiça do anticorpo. Fab’-SH são fragmentos Fab’ em que o(s)

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48/126 resíduo(s) de cisteina dos domínios constantes contêm um grupo tiol livre. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab’)2que possui dois locais de combinação com o antígeno (dois fragmentos Fab) e uma parte da região Fc. Para discussão de fragmentos Fab e F(ab’)2 compreendendo resíduos de epítopo de ligação ao receptor de salvamento e possuindo semi-vida in vivo aumentada, ver Patente US No. 5,869,046.

[00128] Em outra forma de realização, o fragmento de anticorpo é um diacorpo, um triacorpo ou um tetracorpo. Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Veja, por exemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993). Os triacorpos e tetracorpos são também descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

[00129] Em uma outra forma de realização, o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab de cadeia simples. Um “fragmento Fab de cadeia simples” ou “scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH), um domínio constante do anticorpo 1 (CH1), um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL), uma domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção do terminal N para o terminal C: a) VH-CH1- ligante-VL-CL, b) VL-CL-ligante-VH-CH1, c) VH-CL-ligante-VL-CH1 ou d) VL-CH1-ligante-VHCL. Em particular, o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, preferivelmente entre 32 e 50 aminoácidos. Os referidos fragmentos Fab de cadeia simples são estabilizados através da ligação dissulfeto natural entre o domínio CL e o domínio CH1. Adicionalmente, estas moléculas Fab de cadeia simples podem ser ainda estabilizadas por geração de ligações dissulfeto intercadeia através da inserção de resíduos de cisteina

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49/126 (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).

[00130] Em outra forma de realização, o fragmento de anticorpo é o fragmento variável de cadeia simples (scFv). Um “fragmento variável de cadeia simples (scFv)” é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (Vh) e leve (Vl) de um anticorpo, conectada por um ligante. Em particular, o ligante é um polipeptídeo curto de 10 a 25 aminoácidos e é geralmente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode ligar o N terminal da Vncom o C terminal da Vl, ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade do anticorpo original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Para uma revisão de fragmentos scFv, ver, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. (Springer-Verlag, Nova Iorque), pp. 269-315 (1994); ver também WO 93/16185; e Patentes US Nos. 5,571,894 e 5,587,458.

[00131] Em outra forma de realização, o fragmento de anticorpo é um anticorpo de domínio único. Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas formas de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por exemplo, Patente US No. 6,248,516 B1).

[00132] Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo mas não se limitando a digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coliou fago), como aqui descrito.

3. Anticorpos quimérico e humanizado [00133] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui

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50/126 fornecido é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente US No. 4,816,567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe comutada” em que a classe ou subclasse foi alterada daquela do anticorpo parental. Anticorpos quiméricos incluem os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

[00134] Em certas formas de realização, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais HVRs, por exemplo, CDRs (ou porções dos mesmos) são derivados de um anticorpo não humano, e FRs (ou suas porções) são derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas formas de realização, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade de anticorpos.

[00135] Anticorpos humanizados e métodos de produzí-los são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci 13: 16191633 (2008), e são descritos mais adiante, por exemplo, em Riechmann et al. Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 86:

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10029-10033 (1989); Patentes US Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 e 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (descrevendo o enxerto da região determinante de especificidade (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (descrevendo “recobertura”); Dall’Acqua et al., Methods 36: 4360 (2005) (descrevendo “embaralhamento de FR”); e Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) e Klimka et al. J. Câncer, 83: 252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de “seleção guiada” para embaralhar FR).

[00136] As regiões estruturais humanas que podem ser utilizadas para humanização incluem mas não se limitam a: regiões estruturais selecionadas utilizando o modo “melhor ajuste” (ver, por exemplo, Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)); regiões estruturais derivadas de sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis da cadeia leve ou pesada (ver, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285 (1992); e Presta et. al. J. Immunol., 151: 2623 (1993)); regiões de estrutura humanas maduras (somaticamente mutadas) ou regiões de estrutura de linhagem germinativa humana (ver, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas da varredura em bibliotecas de FR (ver, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 2261122618 (1996)).

4. Anticorpos Humanos [00137] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).

[00138] Os anticorpos humanos podem ser preparados

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52/126 administrando um imunogênio a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Estes animais contêm tipicamente toda ou uma parte dos loci de imunoglobulina humana, que substituem os loci de imunoglobulina endógenos, ou que estão presentes extracromossomicamente ou integrados aleatoriamente nos cromossomas do animal. Nestes camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulinas endógenas foram geralmente inativados. Para revisão de métodos para obtenção de anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, ver Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Ver também, por exemplo, as Patentes US Nos. 6,075,181 e 6,150,584 descrevendo a tecnologia XENOMOUSE™; A Patente US No 5,770,429 descreve tecnologia HuMab®; Patente US No. 7,041,870, descrevendo a tecnologia KM MOUSE®, e a publicação de pedido de patente US No. 2007/0061900, descrevendo a tecnologia VelociMouse®). As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por tais animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, combinando com uma região constante humana diferente.

[00139] Anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos baseados em hibridoma. Foram descritas linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos. (Ver, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Anticorpos humanos gerados via tecnologia de hibridoma de células B humanas são também descritos em Li et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 103: 3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem os descritos, por exemplo, na Patente US No. 7,189,826 (descrevendo a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhagens celulares de

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53/126 hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265-268 (2006) (descrevendo hibridomas humano-humano). A tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3): 185 -91 (2005).

[00140] Anticorpos humanos podem também ser gerados através do isolamento de sequências do domínio variável do clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de apresentação de fagos derivadas de humanos. Tais sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas para a seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.

5. Anticorpos Derivados de Biblioteca [00141] Anticorpos da invenção podem ser isolados rastreando bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Métodos para rastrear bibliotecas combinatórias são revisados, por exemplo, em Lerner et al. na Nature Reviews 16: 498-508 (2016). Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para gerar bibliotecas de exibição de fagos e rastrear tais bibliotecas para anticorpos possuindo as características de ligação desejadas. Tais métodos são revisados, por exemplo, em Frenzel et al. em mAbs 8: 1177-1194 (2016); Bazan et al. em Human Vaccines and Immunotherapeutics 8: 1817-1828 (2012) e Zhao et al. em Critical Reviews in Biotechnology 36: 276-289 (2016) bem como em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e em Marks e Bradbury em Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003).

[00142] Em determinados métodos de apresentação de fagos, os repertórios dos genes VH e VL são separadamente clonados por

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54/126 reação em cadeia de polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem então ser rastreadas para fago de ligação ao antígeno como descrito em Winter et al. em Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994). Os fagos apresentam tipicamente fragmentos de anticorpo, quer como fragmentos Fv de cadeia simples (scFv), quer como fragmentos Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunogênio sem a necessidade de construir hibridomas. Alternativamente, o repertório naive pode ser clonado (por exemplo, de humano) para proporcionar uma única fonte de anticorpos para uma vasta gama de não-próprios e também de auto-antígenos sem qualquer imunização, como descrito por Griffiths et al. em EMBO Journal 12: 725-734 (1993). Finalmente, também podem ser feitas sinteticamente bibliotecas naive por clonagem de segmentos de genes V não rearranjados a partir de células tronco, e utilizando iniciadores de PCR contendo sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, como descrito por Hoogenboom e Winter in Journal of Journal. Molecular Biology 227: 381-388 (1992). As publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patente US Nos. 5,750,373; 7,985,840; 7,785,903 e 8,679,490, bem como nas Publicações de Patente US Nos. 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 e 2007/0292936.

[00143] Outros exemplos de métodos conhecidos na técnica para rastrear bibliotecas combinatórias para anticorpos com uma atividade ou atividades desejadas incluem apresentação de ribossoma e RNAm, bem como métodos para apresentação e seleção de anticorpos em bactérias, células de mamífero, células de inseto ou células de levedura. Os métodos para a apresentação da superfície da levedura são revisados, por exemplo, em Scholler et al. em Methods in Molecular Biology 503: 135-56 (2012) e em Cherf

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55/126 et al. em Methods in Molecular biology 1319: 155-175 (2015) e também em Zhao et al. em Methods in Molecular Biology 889: 73-84 (2012). Os métodos para apresentação do ribossoma estão descritos, por exemplo, em He et al. em Nucleic Acids Research 25: 5132-5134 (1997) e em Hanes et al. em PNAS 94: 4937-4942 (1997).

[00144] Anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados de bibliotecas de anticorpos humanos são aqui considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos.

6. Anticorpos Multiespecíficos [00145] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois locais diferentes, isto é, diferentes epítopos em diferentes antígenos ou diferentes epítopos no mesmo antígeno. Em certas formas de realização, o anticorpo multiespecífico tem três ou mais especificidades de ligação. Em certas formas de realização, uma das especificidades de ligação é para LAG3 e a outra especificidade (duas ou mais) é para qualquer outro antígeno. Em certas formas de realização, os anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois (ou mais) epítopos diferentes da LAG3. Anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos ou células para células que expressem LAG3. Anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpos.

[00146] As técnicas para produzir anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitadas a co-expressão recombinante de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina possuindo especificidades diferentes (ver Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)) e engenharia “Knob-in-hole” (ver, por exemplo, Patente US No.

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5,731,168, e Atwell et al., J. Mol. Biol. 270: 26 (1997)). Anticorpos multiespecíficos podem também ser produzidos através da engenharia de efeitos de direção eletrostática para produzir moléculas heterodinâmicas de anticorpo Fc (ver, por exemplo, WO 2009/089004); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (ver, por exemplo, Patente US No. 4676980, e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); utilizando fechos de leucina para produzir anticorpos bi-específicos (ver, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992) e WO 2011/034605); utilizando a tecnologia de cadeia leve comum para contornar o problema de emparelhamento de cadeia leve (ver, por exemplo, WO 98/50431); utilizando a tecnologia “diacorpo” para produzir fragmentos de anticorpo biespecíficos (ver, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993)); e utilizando dímeros Fv de cadeia simples (sFv) (ver, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparar anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

[00147] Anticorpos modificados por engenharia genética com três ou mais locais de ligação ao antígeno, incluindo, por exemplo, “anticorpos Octopus”, ou DVD-lg também estão incluídos aqui (ver, por exemplo, WO 2001/77342 e WO 2008/024715). Outros exemplos de anticorpos multiespecíficos com três ou mais locais de ligação ao antígeno podem ser encontrados em WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO2010/ 145792 e WO 2013/026831. O anticorpo biespecífico ou o seu fragmento de ligação ao antígeno também inclui um “FAb de Duplo efeito” ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga a LAG3 bem como outro antígeno diferente, ou dois epítopos diferentes de LAG3 (ver, por exemplo, US 2008/ 0069820 e WO 2015/095539).

[00148] Anticorpos multiespecíficos também podem ser

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57/126 fornecidos em uma forma assimétrica com um domínio de cruzamento em um ou mais braços de ligação da mesma especificidade antigênica, isto é, por troca dos domínios VH/ VL (ver, por exemplo, WO 2009/080252 e WO 2015/150447), os domínios CH1/ CL (ver, por exemplo, WO 2009/080253) ou os braços Fab completos (ver, por exemplo, WO 2009/080251, WO 2016/016299, ver também Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, e Klein et al., MAbs 8 (2016) 1010-20). Em uma forma de realização, o anticorpo multiespecífico compreende um fragmento cross-Fab. O termo “fragmento cross-Fab” ou “fragmento xFab” ou “fragmento cross-Fab” refere-se a um fragmento Fab, em que as regiões variáveis ou as regiões constantes da cadeia pesada e leve são trocadas. Um fragmento cross-Fab compreende uma cadeia polipeptídica composta pela região variável da cadeia leve (VL) e a região constante da cadeia pesada (CH1) e uma cadeia polipeptídica composta pela região variável da cadeia pesada (VH) e pela região constante da cadeia leve (CL) Braços Fab assimétricos também podem ser manipulados por introdução de mutações de aminoácidos carregadas ou não carregadas em interfaces de domínios para dirigir o emparelhamento correto de Fab. Veja, por exemplo, o documento WO 2016/172485.

[00149] Vários outros formatos moleculares para anticorpos multiespecíficos são conhecidos na técnica e estão aqui incluídos (ver, por exemplo, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

7. Variantes de anticorpos [00150] Em certas formas de realização, estão contempladas variantes de sequência de aminoácidos dos anticorpos aqui contemplados. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes de sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas através da introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica

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58/126 o anticorpo ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ ou inserções e/ ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.

a) Variantes de Substituição, Inserção e Exclusão [00151] Em certas formas de realização, são fornecidas variantes de anticorpo com uma ou mais substituições de aminoácidos. Sítios de interesse para mutagênese por substituição incluem os HVRs e FRs. Substituições conservatives são mostradas na Tabela 1 sob o título de “substituições preferidas”. Mudanças mais substanciais são fornecidas na Tabela 1 sob o título de “substituições exemplificativas”, e como adicionalmente descrito abaixo em referência às classes de cadeias laterais de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos rastreados quanto a uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/ melhorada, imunogenicidade diminuída, ou ADCC ou CDC melhorado.

TABELA 1

Resíduo Original	Substituições Exemplificativas	Substituições Preferidas
Ala (A)	Vai; Leu; lie	Vai
Arg (R)	Lys; Gin; Asn	Lys
Asn (N)	Gin; His; Asp, Lys; Arg	Gin
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gin (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gin	Asp
Giy (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gin; Lys; Arg	Arg

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Resíduo Original	Substituições Exemplificativas	Substituições Preferidas
He O	Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina	Leu
Leu (L)	Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe	lie
Lys (K)	Arg; Gin; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; lie	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Vai; lie; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Vai; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Vai (V)	lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina	Leu

[00152] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral:

(1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, He;

(2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

(3) acídico: Asp, Glu;

(4) básico: His, Lys, Arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro;

(6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[00153] Substituições não conservatives implicarão a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[00154] Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para estudo adicional terá modificações (por exemplo, melhorias) em certas propriedades biológicas (por exemplo, maior afinidade, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ ou terá substancialmente retido certas propriedades biológicas do

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60/126 anticorpo parental. Uma variante substitucional exemplificativa é um anticorpo amadurecido por afinidade, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, utilizando técnicas de maturação de afinidade baseadas em apresentação de fagos, tais como as aqui descritas. Resumidamente, um ou mais resíduos HVR são mutados e os anticorpos variantes exibidos no fago e pesquisados quanto a uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação).

[00155] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em “hotspots” de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (ver, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)), e/ ou resíduos que entram em contato com o antígeno, com a variante resultante VH ou VL a ser testada quanto à afinidade de ligação. A maturação por afinidade construindo e reselecionando a partir de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Pressão, Totowa, NJ, (2001).) Em algumas formas de realização de maturação por afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erros, rearranjo de cadeias ou mutagênese dirigida por oligonucleotídeos). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então rastreada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens dirigidas a HVR, nas quais vários resíduos de HVR (por exemplo, 4-6 resíduos de cada vez) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, utilizando mutagênese de varredura de alanina ou modelagem. CDR-H3 e CDR-L3, em particular, são

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61/126 frequentemente direcionados.

[00156] Em certas formas de realização, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs, desde que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservatives (por exemplo, substituições conservatives como aqui fornecidas) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos de contato com o antígeno nas HVRs. Em certas formas de realização das sequências variantes VH e VL fornecidas acima, cada HVR é inalterada ou não contém mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[00157] Um método útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é chamado “mutagênese de varredura de alanina” como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, como arg, asp, his, lys e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente, ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. Variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[00158] As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de amino e/ ou carboxil terminal que variam em comprimento

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62/126 de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de um ou vários resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila Nterminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N ou C terminal do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou a um polipeptídeo que aumenta a semi-vida no soro do anticorpo.

b) Variantes de glicosilação [00159] Em certas formas de realização, um anticorpo aqui fornecido é alterado para aumentar ou diminuir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de locais de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que um ou mais sítios de glicosilação são criados ou removidos.

[00160] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, o oligossacarídeo ligado a este pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos compreendem tipicamente um oligossacarídeo ramificado, bianternário, que é geralmente ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Veja, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no “esqueleto” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas formas de realização, modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas de modo a criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.

[00161] Em uma forma de realização, as variantes de anticorpo são fornecidas possuindo um oligossacarídeo não fucosilado, isto é, uma estrutura de oligossacarídeo que não tem fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tal oligossacarídeo não fucosilado (também

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63/126 referido como oligossacarídeo “afucosilado”) é particularmente um oligossacarídeo ligado a N que não possui um resíduo de fucose ligado ao primeiro GlcNAc no esqueleto da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em uma forma de realização, são fornecidas variantes de anticorpo possuindo uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc em comparação com um anticorpo nativo ou parental. Por exemplo, a proporção de oligossacarídeos não fucosilados pode ser pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 80%, ou mesmo cerca de 100% (isto é, não estão presentes oligossacarídeos fucosilados). A porcentagem de oligossacarídeos não fucosilados é a quantidade (média) de oligossacarídeos sem resíduos de fucose, em relação à soma de todos os oligossacarídeos ligados a Asn 297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e de ricos em manose) medidas por espectrometria de massa MALDI-TOF, como descrito em WO 2006/082515, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado aproximadamente na posição 297 na região Fc (numeração EU dos resíduos da região Fc); no entanto, o Asn297 pode também estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a variações de sequência menores nos anticorpos. Tais anticorpos possuindo uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc podem ter ligação ao receptor FcyRIII melhorada e/ ou função efetora melhorada, em particular função ADCC melhorada. Veja, por exemplo, US 2003/0157108; US 2004/0093621.

[00162] Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos com fucosilação reduzida incluem células Led 3 CHO deficientes em fucosilação de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); US 2003/0157108; e WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, tais como o gene da alfa-1,6Petição 870190089671, de 10/09/2019, pág. 194/271

64/126 fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (ver, por exemplo, YamaneOhnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004)). Kanda, Y. et al., Biotechnol, Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006) e W02003/ 085107), ou células com atividade reduzida ou abolida de uma síntese ou proteína veículoa de GDP-fucose (ver, por exemplo, US2004259150, US2005031613, US2004132140,

US2004110282).

[00163] Em uma outra forma de realização, as variantes de anticorpo são fornecidas com oligossacarídeos bissetados, por exemplo, em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bissectado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpo podem ter fucosilação reduzida e/ ou função ADCC melhorada como descrito acima. Exemplos de tais variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, em Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.

[00164] São também fornecidas variantes de anticorpo com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Tais variantes de anticorpos podem ter uma função CDC melhorada. Tais varias de anticorpos são descritas, por exemplo, nos documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764.

c) Variantes da região Fc [00165] Em certas formas de realização, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo aqui fornecido, gerando assim uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc humana lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4) compreendendo uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.

[00166] Em certas formas de realização, a invenção

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65/126 contempla uma variante de anticorpo que possui algumas mas não todas as funções efetoras, o que o torna um candidato desejável para aplicações em que a meia-vida do anticorpo in vivo é importante mas certas funções efetoras (como complemento e ADCC) são desnecessárias ou deletérias. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ ou in vivo podem ser realizados para confirmar a redução/ esgotamento das atividades de CDC e/ ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação ao receptor de Fc (FcR) podem ser realizados para assegurar que o anticorpo não tem ligação a FcgamaR (possivelmente falta de atividade de ADCC), mas mantém a capacidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FcgamaRIII, enquanto os monócitos expressam FcgamaRI, FcgamaRII e FcgamaRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991). Exemplos não limitativos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente US No. 5,500,362 (ver, por exemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 83: 7059- 7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 82: 14991502 (1985); 5,821,337 (ver Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 13511361 (1987)). Alternativamente, podem ser utilizados métodos de ensaios não radioativos (ver, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl) Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK) Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al. Proc Nat’l Acad Sei. EUA 95: 652-656 (1998). Ensaios de ligação a C1q podem também ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se

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66/126 ligar a C1q e, portanto, carece de atividade CDC. Ver, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser executado (ver, por exemplo, Gazzano-Santoro etal., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996), Cragg, MS et al., Blood 101: 1045-1052 (2003) e Cragg, MS e MJ Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). As determinações da ligação ao FcRn e afastamento/meia vida in vivo também podem ser realizadas utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Petkova, SB et al., Int’l. Immunol. 18 (12): 1759-1769 (2006); WO 2013/120929 A1).

[00167] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US No. 6,737,056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US No. 7,332,581).

[00168] Certas variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída às FcRs são descritas. (Ver, por exemplo, Patente US No. 6,737,056; WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2): 6591 6604 (2001)).

[00169] Em certas formas de realização, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram a ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ ou 334 da região Fc (numeração EU de resíduos).

[00170] Em certas formas de realização, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos, que aumentam a ligação de FcRn, por exemplo, substituições nas posições 252 e/ ou 254 e/ ou 256 da região Fc (numeração EU de

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67/126 resíduos). Em certas formas de realização, a variante de anticorpo compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 252, 254 e 256. Em uma forma de realização, as substituições são M252Y, S254T e T256E em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG 1 humana.

[00171] Em certas formas de realização, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com substituições de aminoácidos, que diminuem a ligação a FcyR, por exemplo, substituições nas posições 234 e 235 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em uma forma de realização, as substituições são L234A e L235A (LALA). Em certas formas de realização, a variante de anticorpo compreende adicionalmente D265A e/ ou P329G em uma região Fc derivada de uma região Fc de lgG1 humana. Em uma forma de realização, as substituições são L234A, L235A e P329G (LALA-PG) em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG 1 humana. (Veja, por exemplo, WO 2012/130831 A1). Em outra forma de realização, as substituições são L234A, L235A e D265A (LALA-DA) em uma região Fc derivada de uma região Fc de lgG1 humana.

[00172] Em algumas formas de realização, as alterações são feitas na região Fc que resultam na alteração (isto é, seja melhorada ou diminuída) de ligação a C1q e/ ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), por exemplo, como descrito na Patente US No. 6,194,551, WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[00173] Anticorpos com semi-vidas aumentadas e ligação melhorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferância de IgG maternais para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), são descritos em US 2005/0014934 A1 (Hinton et al.). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais

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68/126 resíduos da região Fc: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo da região Fc 434 (ver, por exemplo, Patente US No. 7,371,826; Dall’Acqua, WF, et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 2351423524).

[00174] Os resíduos da região Fc críticos para a interação FcRn de camundongo a Fc de camundongo foram identificados por mutagênese dirigida ao local (ver, por exemplo, Dall’Acqua, WF, et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180). Os resíduos I253, H310, H433, N434 e H435 (numeração EU de acordo com Kabat) estão envolvidos na interação (Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, JK, et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). Os resíduos I253, H310 e H435 foram considerados críticos para a interação de Fc humano com FcRn de murino (Kim, JK, et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819). Estudos do complexo FcRn humano-Fc humano mostraram que os resíduos I253, S254, H435 e Y436 são cruciais para a interação (Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, RL, et al., J. Biol. Chem., 276 (2001) 6591-6604). Em Yeung, YA, et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) foram relatados e examinados vários mutantes dos resíduos 248 a 259 e 301 a 317 e 376 a 382 e 424 a 437.

[00175] Em certas formas de realização, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos, que reduzem a ligação de FcRn, por exemplo, substituições nas posições 253 e/ ou 310, e/ ou 435 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certas formas de realização, a variante de anticorpo compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 253, 310 e 435. Em uma forma de realização as substituições são I253A, H310A e H435A em uma região Fc derivada de uma região Fc de lgG1 humana. Ver, por exemplo,

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Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.

[00176] Em certas formas de realização, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos, o que reduz a ligação a FcRn, por exemplo, substituições nas posições 310 e/ ou 433 e/ ou 436 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certas formas de realização, a variante de anticorpo compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 310, 433 e 436. Em uma forma de realização as substituições são H310A, H433A e Y436A em uma região Fc derivada de uma região Fc de lgG1 humana. (Veja, por exemplo, WO 2014/177460 Al).

[00177] Ver também Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988); Patente US No. 5,648,260; Patente US No. 5,624,821; e WO 94/29351 relativa a outros exemplos de variantes da região Fc.

B. Métodos e Composições Recombinantes [00178] Os anticorpos podem ser produzidos utilizando métodos e composições recombinantes, por exemplo, como descrito em US 4,816,567. Para estes métodos, são fornecidos um ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam um anticorpo.

[00179] No caso de um anticorpo nativo ou fragmento de anticorpo nativo, são necessários dois ácidos nucleicos, um para a cadeia leve ou um fragmento do mesmo e um para a cadeia pesada ou um fragmento do mesmo. Tal(is) ácido(s) nucleico(s) codifica(m) uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL e/ ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo (por exemplo, a(s) cadeia(s) leve e/ ou pesada(s) do anticorpo). Estes ácidos nucleicos podem estar no mesmo vetor de expressão ou em diferentes vetores de expressão.

[00180] No caso de um anticorpo biespecífico com cadeias pesadas heterodiméricas, são necessários quatro ácidos nucleicos, um para a

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70/126 primeira cadeia leve, um para a segunda cadeia leve compreendendo o primeiro polipeptídeo da região Fc hetreomonomérica, um para a segunda cadeia leve e um para a segunda cadeia pesada compreendendo o segundo polipeptídeo heteromonomérico da região Fc. Os quatro ácidos nucleicos podem estar compreendidos em uma ou mais moléculas de ácido nucleico ou vetores de expressão. Tal(is) ácido(s) nucleico(s) codifica(m) uma sequência de aminoácidos compreendendo a primeira VL e/ ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a primeira VH incluindo a primeira região Fc heteromonomérica e/ ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a segunda VL e/ ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a segunda VH incluindo a segunda região Fc heteromonomérica do anticorpo (por exemplo, a primeira e/ ou segunda leve e/ ou a primeira e/ ou segunda cadeia pesada do anticorpo). Estes ácidos nucleicos podem estar no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão diferentes, normalmente estes ácidos nucleicos estão localizados em dois ou três vetores de expressão, isto é, um vetor pode compreender mais do que um destes ácidos nucleicos. Exemplos destes anticorpos biespecíficos são CrossMabs e de células T biespecíficas (ver, por exemplo, Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191). Por exemplo, uma das cadeias pesadas heteromonoméricas compreende as chamadas “mutações de botão (knob)’’ (T366W e opcionalmente uma de S354C ou Y349C) e a outra compreende as chamadas “mutações de orifício (hole)” (T366S, L368A e Y407V e, opcionalmente, Y349C ou S354C) (ver, por exemplo, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73).

[00181] Em uma forma de realização, são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam um anticorpo, tal como utilizado nos métodos aqui descritos.

[00182] Em uma outra forma de realização, são fornecidos um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo

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71/126 esse(s) ácido(s) nucleico(s).

[00183] Em uma forma de realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo esse(s) ácido(s) nucleico(s).

[00184] Em uma tal forma de realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com):

no caso de um anticorpo composto por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que sejam ligadas por dissulfeto ou uma VH e uma VL que compreende um fragmento do mesmo:

(1) um vetor compreendendo ácidos nucleicos que codificam uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo;

no caso de um anticorpo biespecífico com cadeias pesadas heterodiméricas:

(1) um primeiro vetor compreendendo um primeiro par de ácidos nucleicos que codifica sequências de aminoácidos, uma delas compreendendo a primeira VL e o outro compreendendo a primeira VH do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um segundo par de ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácido, uma delas, compreendendo a segunda VL e a outra compreendendo a segunda VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo um dos domínios variáveis (preferivelmente um domínio variável de cadeia leve), um segundo vetor compreendendo um par de ácidos nucleicos que codificam

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72/126 sequências de aminoácidos, uma delas, compreendendo um domínio variável da cadeia leve e a outra compreendendo o primeiro domínio variável da cadeia pesada e um terceiro vetor compreendendo um par de ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos, uma delas, compreendendo o respectivo outro domínio variável da cadeia leve como no segundo vetor e a outra compreendendo o segundo domínio variável da cadeia pesada, ou (3) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a primeira VL do anticorpo, um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a primeira VH do anticorpo, um terceiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a segunda VL do anticorpo e um quarto vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a segunda VH do anticorpo.

[00185] Em uma forma de realização, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, Y0, NSO, célula Sp20). Em uma forma de realização, é fornecido um método para produzir de um anticorpo anti-LAG3, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira compreendendo ácidos nucleicos que codificam o anticorpo, como fornecido acima, sob condições adequadas para expressão do anticorpo e, opcionalmente, recuperando o anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura de células hospedeiras).

[00186] Para a produção recombinante de um anticorpo antiLAG3, os ácidos nucleicos que codificam um anticorpo, por exemplo, como descrito acima, são isolados e inseridos em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ ou expressão em uma célula hospedeira. Tais ácidos nucleicos podem ser prontamente isolados e sequenciados utilizando procedimentos

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73/126 convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo) ou produzidos por métodos recombinantes ou obtidos por síntese química.

[00187] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas aqui descritas. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, ver, por exemplo, US 5,648,237, US 5,789,199 e US 5,840,523, (Ver também Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli.) Após expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser ainda purificado.

[00188] Além dos procariotos, os micróbios eucariotos, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificadores de anticorpos, incluindo cepas de fungos e levedura cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com uma padrão de glicosilação totalmente humano. Veja Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; e Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

[00189] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são também derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Foram identificadas numerosas cepas baculovirais que podem ser utilizadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera

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74/126 frugiperda.

[00190] Culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiras. Ver, por exemplo, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 e US 6,417,429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para produzir anticorpos em plantas transgênicas).

[00191] Células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, linhagens celulares de mamífero que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 como descrito, por exemplo, em Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células renais de hamster bebê (BHK); células de sertoli de camundongo (células TM4 como descrito, por exemplo, em Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, como descritas, por exemplo, em Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamífero incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub, G. Et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220) e linhagens celulares de mieloma tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens celulares hospedeiras de mamífero adequadas para produção de anticorpos Ver, por exemplo, Yazaki, P. e Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, BKC (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

C. Ensaios [00192] Anticorpos anti-LAG3 aqui fornecidos podem ser

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75/126 identificados, rastreados para, ou caracterizado pelas suas propriedades físicas/ químicas e/ ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos no estado da técnica.

1. Ensaios de ligação e outros ensaios [00193] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado quanto à sua atividade de ligação ao antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos tais como ELISA, Western blot, etc.

[00194] Em outro aspecto, os ensaios de competição podem ser utilizados para identificar um anticorpo que compete com aLAG3(0414) pela ligação a LAG3. Em certas formas de realização, um tal anticorpo competidor se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que está ligado por aLAG3(0414). Métodos exemplificativos detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

[00195] Em um ensaio de competição exemplificativo, LAG3 imobilizado é incubado em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga a LAG3 (por exemplo, aLAG3(0414)) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade para competir com o primeiro anticorpo por ligação a LAG3. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, o LAG3 imobilizado é incubado em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação sob condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo a LAG3, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associada a LAG3 imobilizado é medida. Se a quantidade de marcador associada a LAG3 imobilizada é substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra controle, então isso indica que o

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76/126 segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo pela ligação a LAG3. Ver Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. Ensaios de atividade [00196] Em um aspecto, os ensaios são fornecidos para a identificação de anticorpos anti-LAG3 com atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, efeito de anticorpos anti-LAG3 (sozinho ou em combinação com anticorpos anti-PDL1) na liberação de Granzima B citotóxica e secreção de IL-2 por células T CD4 humanas de um ensaio de reação mista de linfócitos (mMLR) ou o efeito de anticorpos anti-LAG3 na supressão Treg, pela liberação de Granzima B e IFN-γ pelas células T CD4 humanas; ou a inibição da ligação de LAG-3 ao MHC-II expresso em células tumorais A375 humanas por anticorpos anti-LAG3. Anticorpos possuindo uma tal atividade biológica in vivo e/ ou in vitro são também fornecidos.

[00197] Em certas formas de realização, um anticorpo da invenção é testado para essa atividade biológica. Para detalhes, veja os exemplos 2 e 3 abaixo.

D. Métodos e Composições para Diagnóstico e Detecção [00198] Em certas formas de realização, qualquer um dos anticorpos anti-LAG3 aqui fornecidos é útil para detectar a presença de LAG3 em uma amostra biológica. O termo “detecção”, tal como é aqui utilizado, engloba a detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas formas de realização, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tal como tecido tumoral.

[00199] Em uma forma de realização, um anticorpo antiLAG3 é fornecido para uso em um método de diagnóstico ou detecção. Em um outro aspecto, é fornecido um método para detectar a presença de LAG3 em uma amostra biológica. Em certas formas de realização, o método compreende

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77/126 o contato da amostra biológica com um anticorpo anti-LAG3 como descrito aqui sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-LAG3 a LAG3, e detecção se um complexo é formado entre o anticorpo anti-LAG3 e LAG3. Esse método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-LAG3 é usado para selecionar indivíduos elegíveis para terapia com um anticorpo anti-LAG3, por exemplo, onde LAG3 é um biomarcador para seleção de pacientes.

[00200] Distúrbios exemplificativos que podem ser diagnosticados utilizando um anticorpo da invenção incluem o câncer em diferentes formas, tais como leucemia linfocítica crônica (CLL) câncer da mama, etc. (ver também a lista de cânceres abaixo).

[00201] Em certas formas de realização, são fornecidos anticorpos anti-LAG3 marcados. Os marcadores incluem, mas não se limitam a, marcadores ou porções que são detectadas diretamente (como marcadores fluorescentes, cromofóricos, elétron-densos, quimioluminescentes e radioativos), bem como porções, como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, os radioisótopos ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵l, ³H, e ¹³¹1, fluoróforos tais como quelatos de terras-raras ou fluoresceina e derivados dos mesmos, rodamina e derivados dos mesmos, dansila, umbeliferona, luceriferases por exemplo, luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana (Patente US No. 4,737,456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glucose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas tais como uricase e xantina oxidase, acopladas a uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/

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78/126 avidina, marcadores de spin, marcadores de bacteriófagos, radicais livres estáveis e semelhantes.

E. Formulações Farmacêuticas [00202] As formulações farmacêuticas de um anticorpo antiLAG3 como aqui descrito são preparadas misturando esse anticorpo possuindo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Flemington’s Pharmaceutical Sciences 16^a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues, e incluem, mas não estão limitados a: tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteina-Zn); e/ ou tensoativos não iônicos tais como polietileno glicol (PEG). Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplificativos aqui incluem ainda agentes de dispersão de droga intersticial, tais como glicoproteinas solúveis neutras-ativas de hialuronidase (sHASEGP), por exemplo, glicoproteinas hialuronidase Ph-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (Hylenex®, Baxter International, Inc.).

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Certos exemplos de sHASEGPs e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Publicações de Patente US Nos 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[00203] Exemplos de formulações de anticorpos liofilizados são descritos na patente US No. 6,267,958. Formulações aquosas de anticorpos incluem aqueles descritos na Patente US No. 6,171,586 e WO 2006/044908, as últimas formulações, incluindo um tampão de histidinaacetato.

[00204] A formulação aqui pode também conter mais do que um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável fornecer ainda anticorpos anti-PD1 ou anti PDL1, ou anticorpos anti-TIM3. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.

[00205] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de distribuição coloidal de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Flemington’s Pharmaceutical Sciences, 16^a edição, Osol, A. Ed. (1980).

[00206] Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes essas que estão na forma de artigos moldados, por

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80/126 exemplo, filmes ou microcápsulas.

[00207] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

F. MÉTODOS TERAPÊUTICOS E COMPOSIÇÕES [00208] Qualquer um dos anticorpos anti-LAG3 aqui fornecidos pode ser utilizado em métodos terapêuticos.

[00209] Em um aspecto, um anticorpo anti-LAG3 para uso como medicamento é fornecido. Em outros aspectos, é fornecido um anticorpo anti-LAG3 ou uso no tratamento de câncer. Em certas formas de realização, um anticorpo anti-LAG3 é fornecido para uso em um método de tratamento. Em certas formas de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG3 para uso em um método de tratamento de um indivíduo com câncer compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-LAG3. Em uma forma de realização, o anticorpo para uso no tratamento ou retardamento da progressão de uma doença relacionada com o sistema imune, tal como imunidade ao tumor. Em uma forma de realização o anticorpo é para ser utilizado na estimulação de uma resposta ou função imune, tais como a atividade de células T.

[00210] De acordo com outras formas de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG3 para uso como agente imunoestimulatório/ ou estimular secreção/ liberação da Granzima B (GrzB), do interferon-gama (IFN-gama) e/ ou da interleucina 2 (IL-2). Em certas formas de realização, a invenção fornece um anticorpo anti-LAG3 para uso em um método secreção/ liberação de Granzima B (GrzB), interferon-gama (IFNgama) e ou interleucina 2 (IL-2) em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LAG3

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81/126 efetivo para a secreção/ liberação de Granzima B (GrzB), interferon-gama (IFNgama) e ou interleucina 2 (IL-2).

[00211] Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima é de preferência um humano. Em um outro aspecto, a invenção fornece o uso de um anticorpo anti-LAG3 na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma forma de realização, o medicamento é para tratamento de câncer. Em outra forma de realização, o medicamento para ser utilizado em um método de tratamento de câncer compreendendo administrar a um indivíduo tendo câncer uma quantidade eficaz do medicamento. Em outra forma de realização, o medicamento para indução de lise mediada por células de células cancerosas. Em uma forma de realização adicional, o medicamento para uso em um método de indução de lise mediada por células de células cancerosas em um indivíduo sofrendo de câncer, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do medicamento para induzir apoptose em uma célula de câncer/ ou para inibir a proliferação de células cancerosas. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode ser um humano.

[00212] O termo “câncer” como aqui utilizado pode ser, por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquíolo-violares, câncer dos ossos, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma de trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma dos tecidos moles, câncer

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82/126 da uretra, câncer do pênis, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer biliar, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitoma, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma da pituitária, linfoma, leucemia linfocítica, incluindo versões refratárias de qualquer dos cânceres acima ou uma combinação de um ou mais dos cânceres anteriores. Em uma forma de realização preferida, tal câncer é um câncer da mama, câncer coloretal, melanoma, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pulmão ou câncer da próstata. Em uma forma de realização preferida, tal câncer é um câncer da mama, câncer do ovário, câncer do colo do útero, câncer de pulmão ou câncer de próstata. Em outra forma de realização preferida, tal câncer é câncer da mama, câncer do pulmão, câncer do colo do útero, câncer do ovário, câncer do melanoma, câncer da bexiga, câncer renal, câncer do rim, câncer do fígado, câncer da cabeça e pescoço, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer do carcinoma gástrico, câncer do esôfago, mesotelioma, câncer de próstata, leucemia, linfoma, mielomas. Em uma forma de realização preferida, esses cânceres são ainda caracterizados pela expressão ou superexpressão de LAG3.

[00213] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de câncer. Em uma forma de realização, o método compreende administrar a um indivíduo com câncer uma quantidade eficaz de um anti-LAG3. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode ser um humano.

[00214] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para induzir a lise mediada por células de células cancerígenas em um indivíduo que sofre de câncer. Em uma forma de realização, o método

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83/126 compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anti-LAG3 para induzir a lise mediada por células de células cancerosas no indivíduo que sofre de câncer. Em uma forma de realização, um “indivíduo” é um humano.

[00215] Em um outro aspecto, a invenção fornece formulações farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos antiLAG3 aqui fornecidos, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma forma de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer dos anticorpos anti-LAG3 aqui fornecidos e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00216] Em um outro aspecto, a invenção fornece formulações farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos antiLAG3 aqui fornecidos, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma forma de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer dos anticorpos anti-LAG3 aqui fornecidos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra forma de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer dos anticorpos anti-LAG3 aqui fornecidos e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo.

[00217] Anticorpos da invenção podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser co-administrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas formas de realização, um agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-LAG3 ou anti PDL1 ou anti TIM3.

[00218] Além do anticorpo anti-LAG3, um agente quimioterapêutico também pode ser administrado. Em uma forma de realização, tais agentes quimioterapêuticos adicionais, que podem ser administrados com anticorpo anti-LAG3 como aqui descrito e incluem, mas não estão limitados a, agentes antineoplásicos incluindo agentes alquilantes

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84/126 incluindo: mostardas de nitrogêio, tais como mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan e clorambucil; nitrosoureias, tais como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (metil-CCNU); Temodal (TM) (temozolamida), etileniminas/ metilmelamina tais como trietilenomelamina (TEM), trietileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); sulfonatos de alquila tais como bussulfano; triazinas tais como dacarbazina (DTIC); antimetabólitos incluindo análogos de ácido fólico tais como metotrexato e trimetrexato, análogos de pirimidina tais como 5-fluorouracil (5FU), fluorodesoxiuridina, gemcitabina, arabinosídeo de citosina (AraC, citarabina), 5azacitidina, 2,2’-difluorodeoxicitidina, análogos de purina tais como 6merca.rho.topurina, 6-tioguamne, azatioprina, T-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina e 2clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA); produtos naturais incluindo fármacos antimitóticos tais como paclitaxel, alcalóides de vinca incluindo vinblastina (VLB), vincristina e vinorelbina, taxotere, estramustina e fosfato de estramustina; pipodofilotoxinas tais como etoposídeo e teniposídeo; antibióticos tais como actinomicina D, daunomicina (rubidomicina), doxorrubicina, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C e actinomicina; enzimas tais como L-asparaginase; modificadores da resposta biológica tais como interferon-alfa, IL-2, G-CSF e GM-CSF; agentes diversos incluindo complexos de coordenação de platina tais como oxaliplatina, cisplatina e carboplatina, antracenedionas tais como mitoxantrona, ureia substituída tal como hidroxiureia, derivados de metilhidrazina incluindo N-metilhidrazina (MIH) e procarbazina, supressores adrenocorticais tais como mitotano (o, p-DDD) e aminoglutetimida; hormônios e antagonistas incluindo antagonistas de adrenocorticoesteroides tais como prednisona e equivalentes, dexametasona e aminoglutetimida; Gemzar(TM) (gemcitabina), progestina tal como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona e

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85/126 acetato de megestrol; estrogênio tal como os equivalentes de dietilestilbestrol e etinil estradiol; anti-estrogênio tal como tamoxifeno; andrógenos incluindo propionato de testosterona e fluoximesterona/ equivalentes; antiandrogênios, tais como flutamida, análogos da hormônio liberador de gonadotropina e leuprolide; e anti-androgênios não esteroidais tais como flutamida. Terapias visando o mecanismo epigenético incluindo, mas não limitado a, inibidores de histona desacetilase, agentes desmetilantes (por exemplo, Vidaza) e liberação de terapias de repressão transcricional (ATRA) também podem ser combinados com as proteínas de ligação ao antígeno. Em uma forma de realização, o agente quimioterapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em taxanos (como por exemplo paclitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotere), paclitaxel modificado (por exemplo, Abraxane e Opaxio), doxorrubicina, sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar) e outros inibidores de multiquinase, oxaliplatina, cisplatina e carboplatina, etoposídeo, gemcitabina e vimblastina. Em uma forma de realização, o agente quimioterapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em taxanos (como por exemplo taxol (paclitaxel), docetaxel (Taxotere), paclitaxel modificado (por exemplo Abraxane e Opaxio). Em uma forma de realização, o agente quimioterapêutico adicional é selecionado a partir de 5-fluorouracil (5-FU), leucovorina, irinotecan, ou oxaliplatina. Em uma forma de realização o agente quimioterapêutico é o 5-fluorouracil, leucovorina e irinotecano (FOLFIRI). Em uma forma de realização, o agente quimioterapêutico é 5-fluorouracil e oxaliplatina (FOLFOX).

[00219] Tais terapias de combinação referidas acima abrangem administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos nas mesmas formulações ou em formulações separadas) e administração separada, caso em que a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ ou depois, da administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em uma forma de

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86/126 realização, a administração do anticorpo anti-LAG3 e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, entre cada um. Anticorpos da invenção também podem ser utilizados em combinação com terapia de radiação.

[00220] Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parentérico, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte da administração ser breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários pontos de tempo, administração de bolus e infusão de pulso são aqui contemplados.

[00221] Os anticorpos da invenção seriam formulados, dosados e administrados de uma forma consistente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, o estado clínico do doente individual, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o esquema da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração como aqui descritas, ou cerca de 1 a

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99% das dosagens aqui descritas, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.

[00222] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando utilizado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, do gravidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e discrição do médico que o assiste. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 pg/ kg a 15 mg/ kg (por exemplo, 0,1 mg/ kg a 10 mg/ kg) de anticorpo pode ser uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dose diária típica pode variar de cerca de 1 pg/ kg a 100 mg/ kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplificativa do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/ kg a cerca de 10 mg/ kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/ kg, 2,0 mg/ kg, 4,0 mg/ kg ou 10 mg/ kg (ou qualquer combinação da mesma) podem ser administradas ao paciente. Tais doses podem ser administradas de forma intermitente, por exemplo, todas as semanas ou de três em três semanas (por exemplo, de tal modo que o paciente recebe de cerca de duas a cerca de vinte, ou por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses menores, pode ser administrada. Um regime de dosagem exemplificativo compreende a administração. No entanto, outros regimes posológicos podem ser úteis. O

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88/126 progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

[00223] Entende-se que qualquer uma das formulações acima ou métodos terapêuticos podem ser realizados utilizando um imunoconjugado da invenção em vez de, ou em adição a, um anticorpo antiLAG3.

G. Artigos de fabricação [00224] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo sobre ou associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, sacos de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco perfurável) por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou folheto informativo indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um outro agente citotóxico ou de outra forma um agente terapêutico. O artigo de fabricação nesta forma de realização da invenção pode ainda compreender um folheto informativo indicando que as composições podem ser utilizadas para tratar uma condição particular.

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Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Descrição das sequências de aminoácidos e das sequências de ácidos NUCLEICOS

SEQ ID NO: 1 HVR-H1 de cadeia pesada, aLAG3(0414);

SEQ ID NO: 2 HVR-H2 de cadeia pesada, aLAG3(0414);

SEQ ID NO: 3 HVR-H3 de cadeia pesada, aLAG3(0414);

SEQ ID NO: 4 HVL-L1 de cadeia leve, aLAG3(0414);

SEQ ID NO: 5 HVL-L2 de cadeia leve, aLAG3(0414);

SEQ ID NO: 6 HVL-L3 de cadeia leve, aLAG3(0414);

SEQ ID NO: 7 domínio variável de cadeia pesada VH, aLAG3(0414);

SEQ ID NO: 8 domínio variável de cadeia leve VL, aLAG3(0414);

SEQ ID NO: 9 HVR-H1 de cadeia pesada, aLAG3(0403);

SEQ ID NO: 10 HVR-H2 de cadeia pesada, aLAG3(0403);

SEQ ID NO: 11 HVR-H3 de cadeia pesada, aLAG3(0403);

SEQ ID NO: 12 HVL-L1 de cadeia leve, aLAG3(0403);

SEQ ID NO: 13 HVL-L2 de cadeia leve, aLAG3(0403);

SEQ ID NO: 14 HVL-L3 de cadeia leve, aLAG3(0403);

SEQ ID NO: 15 domínio variável de cadeia pesada VH, aLAG3(0403);

SEQ ID NO: 16 domínio variável de cadeia leve VL, aLAG3(0403);

SEQ ID NO: 17 HVR-H1 de cadeia pesada, aLAG3(0411);

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SEQ ID NO: 18 HVR-H2 de cadeia pesada, al_AG3(0411);

SEQ ID NO: 19 HVR-H3 de cadeia pesada, al_AG3(0411);

SEQ ID NO: 20 HVL-L1 de cadeia leve, al_AG3(0411);

SEQ ID NO: 21 HVL-L2 de cadeia leve, al_AG3(0411);

SEQ ID NO: 22 HVL-L3 de cadeia leve, al_AG3(0411);

SEQ ID NO: 23 domínio variável de cadeia pesada VH, al_AG3(0411);

SEQ ID NO: 24 domínio variável de cadeia leve VL, aLAG3(0411);

SEQ ID NO: 25 HVR-H1 de cadeia pesada, aLAG3(0417);

SEQ ID NO: 26 HVR-H2 de cadeia pesada, aLAG3(0417);

SEQ ID NO: 27 HVR-H3 de cadeia pesada, aLAG3(0417);

SEQ ID NO: 28 HVL-L1 de cadeia leve, aLAG3(0417);

SEQ ID NO: 29 HVL-L2 de cadeia leve, aLAG3(0417);

SEQ ID NO: 30 HVL-L3 de cadeia leve, aLAG3(0417);

SEQ ID NO: 31 domínio variável de cadeia pesada VH, aLAG3(0417);

SEQ ID NO: 32 domínio variável de cadeia leve VL, aLAG3(0417);

SEQ ID NO: 33 HVR-H1 de cadeia pesada, aLAG3(0416);

SEQ ID NO: 34 HVR-H2 de cadeia pesada, aLAG3(0416);

SEQ ID NO: 35 HVR-H3 de cadeia pesada, aLAG3(0416);

SEQ ID NO: 36 HVL-L1 de cadeia leve, aLAG3(0416);

SEQ ID NO: 37 HVL-L2 de cadeia leve, aLAG3(0416);

SEQ ID NO: 38 HVL-L3 de cadeia leve, aLAG3(0416);

SEQ ID NO: 39 domínio variável de cadeia pesada VH, aLAG3(0416);

SEQ ID NO: 40 domínio variável de cadeia leve VL, aLAG3(0416);

SEQ ID NO: 41 domínio variável de cadeia pesada VH, BMS986016 (WO 2014/008218 e US 2016/0326248);

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SEQ ID NO: 42 domínio variável de cadeia leve VL BMS-986016 (WO 2014/008218 e US 2016/0326248);

SEQ ID NO: 43 domínio variável de cadeia pesada VH, MDX25F7 (25F7) (US 2011/0150892 e WO 2014/008218);

SEQ ID NO: 44 domínio variável de cadeia leve VL, MDX25F7 (25F7) (US 2011/0150892 e WO 2014/008218);

SEQ ID NO: 45 domínio variável de cadeia pesada VH, BAP050 humanizado (LAG525) (US 2015/0259420);

SEQ ID NO: 46 domínio variável de cadeia leve VL, BAP050 humanizado (LAG525) (US 2015/0259420);

SEQ ID NO: 47 domínio variável de cadeia pesada VH, MDX 26H10 (26H10) (US 2011/0150892);

SEQ ID NO: 48 domínio variável de cadeia leve VL, MDX 26H10 (26H10) (US 2011/0150892);

SEQ ID NO: 49 região constante da cadeia leve kappa humana;

SEQ ID NO: 50 região constante da cadeia leve lambda humana;

SEQ ID NO: 51 região constante da cadeia pesada humana derivada de lgG1;

SEQ ID NO: 52 região constante da cadeia pesada humana derivada de IgG 1 com as mutações L234A, L235A e P329G;

SEQ ID NO: 53 região constante da cadeia pesada humana derivada de lgG4;

SEQ ID NO: 54 sequência exemplificativa de LAG3 humana (sem sequência de sinal);

SEQ ID NO: 55 domínio extracelular de LAG3 humana (ECD);

SEQ ID NO: 56 iniciador rbHC.up;

SEQ ID NO: 57 iniciador rbHCf.do;

SEQ ID NO: 58 iniciador BcPCR_FHLCJeader.fw;

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SEQ ID NO: 59 iniciador BcPCR_huCkappa.rev.

[00225] Nas seguintes sequências de aminoácidos dos domínios VL e VH incluindo HVRs marcados (HVRs em negrito, as letras sublinhadas) de anticorpos anti-LAG3, aLAG3(0403) a aLAG3(0417) são listados:

1) aLAG3(0403)

SEQ ID NO 15: VH

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVRQAPG KGLEWVSLVSWDGGGTYYTNSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YFCAKAITDTSLYGYDYWGQGILVTVSS

SEQ ID NO 16: VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGNA

PKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPLT FGGGTKVEIK

2) aLAG3(0411)

SEQ ID NO 23: VH

EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIVDDYTMNWVRQAPGK GLEWVSVISWDGGATYYADSVKGRFTISRDDFKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKGLTDDTLYGSDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO 24: VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIVSYLNWYQQKPGKAP KLLIYASSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPLTF GGGTKVEIK

3) aLAG3(0414)

SEQ ID NO 7: VH

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFDDYTMNWVRQAPGK

GLEWVAVISWDGGGTYYTDSVKGRFTISRDDFKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKGLTDTTLYGSDYWGQGTLVTVSS

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93/126

SEQ ID NO 8: VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAP

KLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSSPLTF GGGTKVEIK

4) aLAG3(0416)

SEQ ID NO 39: VH

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTFSDYAMSWVRQAPG

KGLEWVSGIDNSGYYTYYTDSVKGRFTISRDDVKNTLYLQMNSLRAEDTAVYL CTKTHSGLIVNDAFDIWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO 40: VL

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAP

KLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDATLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTF GGGTKVEIK

5) aLAG3(0417)

SEQ ID NO31: VH

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTFSDYAMSWVRQAPG

SEQ ID NO 32: VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAP

KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPLTF GGGTKVEIK.

[00226] Nas seguintes formas de realização específicas da invenção estão listadas:

1. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende

A) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de

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SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 5; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 6; ou

B) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 9; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 13; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

C) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 19; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 20; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 21; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

D) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 26; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 27; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 28; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 29; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; ou

E) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de

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SEQ ID NO: 34; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 35; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 36; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 37; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 38,

2. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende

C) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 19; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a

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96/126 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

E) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 35; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38,

3. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo

i) compreende um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 7 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96% 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 8;

ii) compreende um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a

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97/126 sequência de SEQ ID NO: 15 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 16;

iii) compreende um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 23 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96% 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 24;

iv) compreende um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 31 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96% 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 32; ou

v) compreende um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 39 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96% 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 40,

4. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende

A) (a) um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 7 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 8; em que o domínio VH compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos sequência de aminoácidos selecionada a partir

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98/126 de SEQ ID NO: 3; e (b) o domínio VL compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

B) (a) um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 15 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95% 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 16; em que o domínio VH compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 11; e (b) o domínio VH compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

C) (a) um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 23 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%; 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 24; em que a VH compreende um domínio (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 19; e (b) o domínio VL compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

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99/126

D) (a) um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 31 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 32; em que o domínio VH compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 27; e (b) o domínio VL compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; ou

E) (a) um domínio VH com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 39 e um domínio VL com uma identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97% ou 98% em comparação com a sequência de SEQ ID NO: 40; em que o domínio VH compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos. sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 35; e (b) o domínio VL compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38,

5. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo

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100/126 ii) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 16;

iii) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 24;

v) compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 39 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 40,

6. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8,

7. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16,

8. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24,

9. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32,

10. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 39 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 40,

11. O anticorpo anti-LAG3 de acordo com qualquer uma das formas de realização anteriores, em que o anticorpo é caracterizado independentemente por uma ou mais das seguintes propriedades: o anticorpo anti-LAG3,

i) compete pela ligação a LAG3 com um anticorpo anti-LAG3

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101/126 compreendendo a VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e/ ou ii) se liga a uma LAG3 humana e de cinomolgo; e/ ou iii) inibe a ligação de MHC-II expressa em células tumorais A375 humanas; e/ ou iv) aumenta a liberação de Granzima B ou IL-2 em um ensaio de reação mista de linfócitos (mMLR) (como mostrado no Exemplo 3),

12. Um anticorpo isolado que se liga a LAG3 humana, em que o anticorpo:

i) compete pela ligação a LAG3 com um anticorpo anti-LAG3 compreendendo a VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e/ ou ii) se liga a uma LAG3 humana e de cinomolgo; e/ ou iii) inibe a ligação de MHC-II expressa em células tumorais A375 humanas; e/ ou iv) aumenta a liberação de Granzima B ou IL-2 em um ensaio de reação mista de linfócitos (mMLR) (como mostrado no Exemplo 3),

13. O anticorpo de qualquer das formas de realização anteriores, que é um anticorpo monoclonal,

14. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização anteriores, que é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico,

15. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização anteriores, que é um fragmento de anticorpo que se liga a LAG3,

16. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização anteriores, que é um anticorpo lgG1 de comprimento completo,

17. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização anteriores, que é um anticorpo lgG1 de comprimento completo com mutações L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de

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Kabat),

18. Ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização precedentes,

19. Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico da forma de realização 18,

20. Método para produzir um anticorpo compreendendo a cultura da célula hospedeira da forma de realização 19 de modo a que o anticorpo seja produzido,

21. O método da forma de realização 20; compreendendo ainda a recuperação do anticorpo da célula hospedeira,

22. Uma formulação farmacêutica que compreende o anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 17 e um veículo farmaceuticamente aceitável,

23. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 17 para uso como um medicamento,

24. O anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 17 para uso no tratamento de câncer,

25. Uso do anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 17, na fabricação de um medicamento,

26. O uso da forma de realização 25 em que o medicamento é para tratamento de câncer,

27. Método para tratar um indivíduo tendo câncer, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo da forma de realização 1,

28. Método para tratar ou retardar a progressão de uma doença relacionada com o sistema imune, tal como imunidade ao tumor, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo da forma de realização 1,

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29. Método para estimular uma resposta ou função imunitárias, tal como a atividade das células T, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo da forma de realização 1.

III. EXEMPLOS [00227] Os seguintes são exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras formas de realização podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

[00228] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum pormenor a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção. As divulgações de todas as patentes e literatura científica aqui citadas são expressamente incorporadas em sua totalidade por referência.

Exemplo 1: Geração de anticorpos anti-LAG3

Imunização de coelhos [00229] Os coelhos transgênicos de propriedade da Roche que expressam um reportório de anticorpo humanizado foram imunizados com DNA plasmídico que expressa LAG3.

[00230] Um conjunto de 3 coelhos foi imunizado geneticamente, utilizando um vetor de expressão de plasmídeo codificando LAG3 humana de comprimento completo (15352_plntronA_fl-hLag3_DNA-IMS), por aplicação intradérmica de 400 pg de DNA vetor, seguido por eletroporação (5 pulsos quadrados de 750 V/ cm, duração 10 ms, intervalo 1 s). Os coelhos receberam 7 imunizações consecutivas nos dias 0, 14, 28, 49, 70, 98 e 126. O sangue (10% do volume total de sangue estimado) foi colhido nos dias 35, 77, 105 e 133. O soro foi preparado, o qual foi utilizado para determinação de título por ELISA (ver abaixo), e foram isoladas células mononucleares periféricas, que foram utilizadas como fonte de células B específicas de antígeno no processo de

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104/126 clonagem de células B abaixo.

Determinação de títulos séricos (ELISA) [00231] A proteína LAG3 humana recombinante foi imobilizada em uma placa NUNC Maxisorp de 96 poços a 2 pg/ mL, 100 μΙ/ poço, em PBS, seguida de: bloqueio da placa com 2% de Croteina C em PBS, 200 μΙ/ poço; aplicação de diluições seriadas de anti-soros, em duplicatas, em 0,5% de Croteina C em PBS, 100 μΙ/ poço; detecção com (1) anticorpo IgG anticoelho de burro conjugado com HRP (Jackson Immunoresearch/ Dianova 711036-152; 1/16 000) ou (2) anticorpo anti-lgG humano de coelho conjugado com HRP (Pierce/ Thermo Scientific 31423; 1/5000), ou (3) anticorpo anti-kapa humano de cabra biotinilado (Southern Biotech/ Biozol 2063-08, 1/5 000) e estreptavidina-HRP; cada um diluído em 0,5% de Croteina C em PBS, 100 μΙ/ poço. Para todas as etapas, as placas foram incubadas durante 1 h a 37 °C. Entre todas as etapas, as placas foram lavadas 3 vezes com 0,05% de Tween 20 em PBS. O sinal foi desenvolvido por adição de Substrato solúvel BM Blue POD (Roche), 100 μΙ/ poço; e parou por adição de 1 M de HCI, 100 μΙ/ poço. A absorbância foi lida a 450 nm, contra 690 nm como referência. O título foi definido como diluição de anti-soros, resultando em meio sinal máximo.

Isolamento de células mononucleares do sangue periférico de coelho (PBMC) [00232] Amostras de sangue foram coletadas de coelhos transgênicos imunizados. Diluiu-se o sangue total contendo EDTA com 1x PBS (PAA, Pasching, Áustria) antes da centrifugação por densidade utilizando um mamífero linfólito (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontário, Canadá) de acordo com as especificações do fabricante. As PBMCs foram lavadas duas vezes com 1x PBS.

Meio EL-4 B5 [00233] RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Alemanha)

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105/126 suplementado com 10% de FCS (Hyclone, Logan, UT, EUA), 2 mM de Glutamina, solução a 1% de penicilina/ estreptomicina (PAA, Pasching, Áustria), 2 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES (PAN Biotech, Aidenbach, Alemanha) e 0,05 mM de b-mercaptoetanol (Gibco, Paisley, Escócia).

Revestimento de placas com antígeno proteico [00234] Revestiram-se placas de 6 poços de cultura de células estéreis com LAG3 ECD humano conjugado com uma parte Fc humana (2 pg/ mL) em tampão carbonato (0,1 M de bicarbonato de sódio, 34 mM de hidrogenocarbonato dissódico, pH 9,55) durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas em PBS estéril três vezes antes do uso.

Depleção de células (a) Placas estéreis de 6 poços (grau de cultura celular) cobertas com uma monocamada confluente de células CHO foram utilizadas para depleção de macrófagos/ monócitos através de adesão não específica, bem como de linfócitos de ligação não específica.

(b) Utilizaram-se placas de 6 poços esterilizadas em branco (grau de cultura de células) para eliminar macrófagos e monócitos e outras células através de adesão inespecífica.

[00235] Metade da amostra de PBMC foi usada para (a) e metade para (b).

[00236] Cada poço foi cheio no máximo com 4 ml de meio e até 6x106 PBMC do coelho imunizado e deixou-se ligar durante 1 h a 37 °C na incubadora. As células no sobrenadante (linfócitos do sangue periférico (PBLs)) foram utilizadas para a etapa de ligação (panning) do antígeno.

Enriquecimento de células B no antígeno LAG3

Antígeno Proteico [00237] Placas de cultura de tecidos de 6 poços revestidas

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106/126 com proteína LAG3-ECD-huFc foram semeadas com até 6 x 10e6 PBLs por 4 ml de meio das etapas de depleção utilizando a placa de 6 poços em branco e deixadas ligar durante 1 h a 37 °C em incubadora. As células não aderentes foram removidas lavando cuidadosamente os poços 1-2 vezes com 1x PBS. As células aderentes restantes foram separadas por tripsina durante 10 min a 37 °C na incubadora. A tripsinização foi interrompida com meio EL-4 B5. As células foram mantidas em gelo até a coloração de fluorescência imunológica.

Antígeno de superfície celular [00238] Placas de cultura de tecidos de 6 poços cobertas com uma monocamada de células CHO positivas para LAG3 humanas foram semeadas com até 6x10⁶ PBLs por 4 ml de meio a partir dos etapas de depleção utilizando a placa de 6 poços coberta com CHO e deixada ligar durante 1 h a 37 °C na incubadora. As células não aderentes foram removidas lavando cuidadosamente os poços 1-2 vezes com 1x PBS. As células aderentes restantes foram separadas por tripsina durante 10 min a 37 °C na incubadora. A tripsinização foi interrompida com o meio EL-4 B5. As células foram mantidas em gelo até a coloração de fluorescência imunológica.

Coloração por fluorescência imunológica e citometria de fluxo [00239] O anticorpo anti-lgG FITC (AbD Serotec, Düsseldorf, Alemanha) e o anticorpo anti-huCk PE (Dianova, Hamburgo, Alemanha) foram utilizados para triagem unicelular. Para coloração de superfície, as células da depleção e da etapa de enriquecimento foram incubadas com o anti-lgG FITC e o anticorpo anti-huCk PE em PBS e incubadas durante 45 min no escuro a 4 °C. Após a coloração, as PBMCs foram lavadas duas vezes com PBS gelado. Finalmente, as PBMCs foram ressuspensas em PBS gelado e imediatamente submetidas às análises FACS. Foi adicionado iodeto de propídio em uma concentração de 5 pg/ mL (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) antes das análises de FACS para discriminar entre células mortas e vivas.

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107/126 [00240] Um FACSAria Becton Dickinson equipado com urn computador e o software FACSDiva (BD Biosciences, EUA) foram usados para o tipo de célula única.

Cultivo de células B [00241] O cultivo das células B de coelho foi realizado por um método descrito por Seeber et al. (S Seeber et al. PLoS One 9 (2), e86184. 2014 04 de fevereiro). Resumidamente, células B de coelho separadas foram incubadas em placas de 96 poços com 200 μΙ_/ poço de meio EL-4 B5 contendo Pansorbin Cells (1: 100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland), 5% de sobrenadante de timócitos de coelho (MicroCoat, Bernried, Alemanha) e células de timoma EL-4 B5 murinas gama-irradiadas (5 χ 10e5 células/ poço) durante 7 dias a 37 °C na incubadora. Os sobrenadantes do cultivo de células B foram removidos para varredura e as células restantes foram colhidas imediatamente e foram congeladas a -80 °C em 100 μΙ de tampão RLT (Qiagen, Hilden, Alemanha).

Isolamento de domínios-V de anticorpos LAG3 Amplificação por PCR de domínios-V [00242] O RNA total foi preparado a partir de lisado de células B (ressuspenso em tampão RLT - Qiagen - Cat. No. 79216) utilizando o kit de RNA NucleoSpin 8/96 (Macherey & Nagel; 740709.4, 740698) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA foi eluido com 60 μΙ de água isenta de RNase. Utilizaram-se 6 μΙ de RNA para gerar cDNA por reação de transcriptase reversa utilizando o SuperMix First-Strand Synthesis Superscript III (Invitrogen 18080-400) e urn iniciador oligo dT de acordo com as instruções dos fabricantes. Todas as etapas foram realizadas em um sistema Hamilton ML Star. Utilizaram-se 4 μΙ de cDNA para amplificar as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulina (VH e VL) com o AccuPrime Supermix (Invitrogen 12344-040) em um volume final de 50 μΙ utilizando os iniciadores rbHC.up e rbHC.do para a cadeia pesada e BcPCR_FHLCJeader.fw e BcPCR_huCkappa.rev para a cadeia

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108/126 leve (Tabela 1.1). Todos os iniciadores forward foram específicos para o peptídeo sinal (respectivamente VH e VL) enquanto os iniciadores reverse foram específicos para as regiões constantes (respectivamente de VH e VL). As condições de PCR para o RbVH foram as seguintes: Início a quente a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 20 s a 94, 20 s a 70 °C, 45 s a 68 °C e uma extensão final a 68 °C durante 7 min. As condições de PCR para o HuVL foram as seguintes: início a quente a 94 °C durante 5 min; 40 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 52 °C, 45 s a 68 °C e uma extensão final a 68 °C durante 7 min.

Tabela 1.1

SEQ ID NO: 56 rbHC.up	AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC
SEQ ID NO: 57 rbHCf.do	ccattggtgagggtgcccgag
SEQ ID NO: 58 BcPCR FHLCJeader.fw	atggacatgagggtccccgc
SEQ ID NO: 59 BcPCR huCkappa.rev	gatttcaactgctcatcagatggc

[00243] Carregaram-se de 8 μΙ a 50 μΙ de solução de PCR em um 48 E-Gel a 2% (Invitrogen G8008-02). As reações de PCR positivas foram limpas utilizando o kit NucleoSpin Extract II (Macherey & Nagel; 740609250) de acordo com o protocolo do fabricante e eluídas em 50 μΙ de tampão de eluição. Todas as etapas de limpeza foram realizadas em um Hamilton Starlet System.

Expressão recombinante de anticorpos bivalentes monoclonais de coelho [00244] Para expressão recombinante de anticorpos bivalentes monoclonais de coelho, os produtos de PCR que codificam para VH ou VL foram clonados como cDNA em vetores de expressão pelo método de clonagem saliente (RS Haun et al., Biotechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al.., Nature Methods (2007) 4, 251-256). Os vetores de expressão continham uma cassete de expressão consistindo em um promotor 5’ de CMV incluindo o intron A e uma sequência de poli adenilação 3’ BGH. Além do cassete de expressão, os plasmídeos continham uma origem de replicação derivada de pUC18 e um gene de beta-lactamase conferindo resistência à ampicilina para amplificação do

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109/126 plasmídeo em E. coli. Utilizaram-se três variantes do plasmídeo básico: um plasmídeo contendo a região constante de IgG de coelho concebido para aceitar as regiões VH enquanto contêm a região constante de LC kappa humana para aceitar as regiões VL.

[00245] Os plasmídeos de expressão linearizados que codificam para a região constante kappa ou gama e os inserts VL/ VH foram amplificados por PCR utilizando iniciadores sobrepostos.

[00246] Os produtos de PCR purificados foram incubados com polimerase de DNA T4 que gerou saliências de cadeia simples. A reação foi parada por adição de dCTP.

[00247] Na etapa seguinte, o plasmídeo e o insert foram combinados e incubados com recA que induz recombinação específica do local. Os plasmídeos recombinados foram transformados em E. coli. No dia seguinte, as colônias cultivadas foram colhidas e testadas quanto ao plasmídeo recombinado correto por preparação de plasmídeo, análise de restrição e sequenciamento de DNA.

[00248] Para expressão de anticorpo, os plasmídeos HC e LC isolados foram co-transfectados transientemente em células HEK293 e os sobrenadantes foram recolhidos após 1 semana.

Exemplo 2: Caracterização de anticorpos anti-LAG3

Tabela 2: Resumo da Caracterização de diferentes anticorpos anti-LAG3

Anticorpos antiLag3	aLAG3 (0403)	aLAG3 (411)	aLAG3 (414)	aLAG3 (416)	aLAG3 (417)	MDX-25F7(25F7)	BMS-986016	MDX-26H10 (26H10)	BAP I 050 humanizado I ÍLAG525)
KD [M] monovalente bivalente	tbd tbd	tbd tbd	4,63 E-10 tbd	2,82 E-11 tbd	tbd tbd	tbd tbd	tbd tbd	tbd tbd	tbd tbd

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Anticorpos antiLag3	aLAG3 (0403)	aLAG3 (411)	aLAG3 (414)	aLAG3 (416)	aLAG3 (417)	MDX-25F7(25F7)	BMS-986016	MDX-26H10 (26H10)	BAP 050 humanizado ÍLAG5251
kd [1/s]	5,00 E- 06	3,87 E- 05	1,95 E-04	2,21 E-04	9,48 E- 05	3,86 E-04		3,99 E-04
Epítopo Bin	E3	E3	E3	E2b	E3	E5 (D1loop)	E5	E4	E2b
MHCII/ ELISA IC50 [nM]	0,9	0,8	0,9	0,9	0,9	0,8/ 0,6	/0,4	0,9/ 0,6	/1,0
Ponto de inflexão de ELISA de célula CHO [ng/ml]	30,9	41,3	48,1	37,2	27,8	75

ELISA PARA LAG3 HUMANA [00249] Placas Nunc maxisorp (Nunc 464718) foram revestidas com 25 μΙ/ poço de Proteína Quimera Fc LAG-3 Humana recombinante (R&D Systems, 2319-L3) a uma concentração de proteína de 800 ng/ ml e incubadas a 4 °C durante a noite ou por 1 h temperatura ambiente. Após lavagem (3 x 90 μΙ / poço com tampão de PBST), cada poço foi incubado com 90 μΙ de tampão de bloqueio (PBS + BSA a 2% + Tween 20 a 0,05%) durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem (3 x 90 μΙ/ poço com tampão de PBST) foram adicionados 25 μΙ de amostras anti-Lag3 a uma concentração de 1-9 μΙ/ mL (diluições 1: 3 em tampão OSEP) e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem (3x90 μΙ/ poço com tampão PBST) foram adicionados 25 μΙ/ poço de anticorpo de cadeia anti-lgG κ humana de cabra conjugado com HRP (Milipore, AP502P) em uma diluição 1: 2000 e incubados à temperatura ambiente durante 1 h. Após lavagem (3 x 90 μΙ/ poço com tampão PBST), adicionou-se 25 μΙ/ poço de substrato TMB (Roche, 11835033001) e incubou-se durante 2-10 min. A medição ocorreu em

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111/126 um instrumento Tecan Satire 2 a 370 °C/ 492 nm.

ELISA DE LIGAÇÃO A LAG3 NA SUPERFÍCIE CELULAR [00250] 25 μΙ/ poço de células Lag3 (células CHO recombinantes expressando Lag3, 10000 células/ poço) foram semeadas em placas de 384 poços tratadas com cultura de tecidos (Corning, 3701) e incubadas a 37 °C durante um ou dois dias. No dia seguinte após a remoção do meio, adicionaram-se 25 μΙ de amostras anti-Lag3 (diluições 1: 3 em tampão OSEP, começando a uma concentração de 6-40 nM) e incubou-se durante 2 h a 4 °C. Após lavagem (1 x 90 μΙ em PBST) as células foram fixadas por adição de 30 μΙ/ poço de glutaraldeído até uma concentração final de 0,05% (Sigma Cat. No: G5882), 10 min à temperatura ambiente. Após lavagem (3 x 90 μΙ/ poço com tampão de PBST) adicionou-se 25 μΙ/ poço de anticorpo de cadeia anti-lgG κ humana de cabra conjugado com HRP (Milipore, AP502P) em uma diluição 1: 1000 e incubou-se a TA durante 1 h. Após lavagem (3 x 90 μΙ/ poço com tampão PBST), adicionou-se 25 μΙ/ poço de substrato TMB (Roche, 11835033001) e incubou-se durante 6 a 10 min. A medição ocorreu em um instrumento Tecan Satire 2 a 370/ 492 nm.

Caracterização SPR (Biacore) de anticorpos anti-LAG3 [00251] Um ensaio baseado em ressonância de plasmon de superfície (SPR) foi utilizado para determinar os parâmetros cinéticos da ligação entre anticorpos anti-Lag3 como fragmentos Fab monovalentes e domínios extracelulares de Lag3 humano (ECD) marcados com Fc humano a 25 °C.

[00252] Assim, duas células de fluxo de um chip biossensor C1 foram preparadas em um Biacore T200 imobilizando neutravidina, diluída para 25 pg/ ml em tampão acetato a pH 4,5, utilizando o “assistente de imobilização”. Isso rendeu em níveis de imobilização de cerca de 1900 RU. Em seguida, o Conjugado Biotina Anti-lgG-Fc (Humano) CaptureSelect™ foi ligado

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112/126 à neutravidina, usando uma diluição de 20 pg/ ml em tampão de corrida (HBSEP +, GE Healthcare).

[00253] O método em si consistia em quatro comandos por ciclo. Primeiro comando: captura de ~ 46 RU de huLag3-Fc (20s, 10 pl/ min). Segundo comando: injeção de amostra por 120s seguido por uma dissociação longa de 1200s a uma velocidade de fluxo de 30 pl/ min. Terceiro e quarto comando: regeneração pela injeção de Glicina-HCI pH 1,5 por 30 segundos.

[00254] Uma série de diluição (3,13 nM - 200 nM, diluições de duas vezes em tampão de corrida) de cada fragmento de anticorpo Fab e ciclos adicionais de branco foram então medidos utilizando o método anteriormente descrito. O software de avaliação Biacore T200 foi então utilizado para obter valores cinéticos pela aplicação de um ajuste de langmuir 1: 1 com o parâmetro de ajuste Rmax definido como local’, uma vez que os níveis de captura não eram perfeitamente reprodutíveis. Os resultados são mostrados na tabela 2.

[00255] Um ensaio baseado em ressonância de plasmon de superfície (SPR) foi utilizado para determinar as afinidades aparentes da interação entre ligantes de Lagag3 no seu formato bivalente e domínios extracelulares de Lag3 (ECDs) humanos a 25 °C.

[00256] Assim, um chip biossensor Biacore foi preparado em um Biacore T200, imobilizando um mínimo de cerca de 800 RU de anticorpo específico para mutação pontual P329G, utilizando condições padrão de acoplamento de amina.

[00257] Em seguida, em cada ciclo, o anticorpo da amostra foi capturado e uma concentração de uma série de concentrações de ECD huLag3 (consistindo em quatro concentrações no total) foi aplicada ao sistema por 200s, seguido por uma dissociação longa de 1200s. O chip do biossensor foi então regenerado.

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113/126 [00258] Os dados experimentais resultantes foram avaliados usando o recurso ‘Mapa de Interação’ fornecido pelo software Ridgeview Diagnostics TraceDrawer, para calcular a contribuição de ligação aparente individual de cada amostra.

[00259] Os resultados são mostrados na tabela 2.

Mapeamento de epítopo [00260] O armazenamento (binning) do epítopo foi realizado utilizando um ensaio baseado em ressonância de plasmon de superfície (SPR). Portanto, os ligantes de aLag3 foram ligados a huLag3 em um instrumento Biacore T200. Em seguida, foi avaliada a acessibilidade de outros ligantes ao complexo aglutinante aLag3 - huLag3 previamente formado.

[00261] Um kit SA CAP (GE Healthcare) foi usado para realizar este ensaio. Se não for descrito de outra forma, o ensaio foi feito de acordo com o manual SA CAP Kit.

[00262] A corrida incluiu apenas um tipo de ciclo. Após hibridação, permitiu-se que uma diluição de 10 nM de huLag3 marcado com huFc biotinilado se ligasse à estreptavidina no chip sensor durante 20 s a uma taxa de fluxo de 10 μΙ/ min. Em seguida, uma primeira amostra de 200 nM diluída em tampão de corrida foi injetada durante 180s a uma taxa de fluxo de 30 μΙ/ min, imediatamente seguida por uma segunda amostra sob as mesmas condições. A superfície foi então regenerada.

[00263] As amostras foram então atribuídas a diferentes grupos de epítopos com padrões de competição semelhantes. Uma primeira categorização grosseira foi feita, com base na resposta relativa da segunda injeção usando um limiar de 6,1 RU, que estava logo acima do valor mais alto observado quando um ligante foi injetado como primeira e segunda amostra. Todos os valores e decisões foram finalmente validados por inspeção visual dos sensores.

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114/126 [00264] Os resultados são apresentados na tabela 2. Foram identificados três padrões principais de epítopos (E1, E2 e E3). Como aLag30416 e o BAP 050 humanizado compartilham o mesmo grupo, mas não se inibem completamente, eles foram atribuídos aos subgrupos E2b e E2c.

Ligação de anticorpos anti-Lag3 de coelhos tg a células HEK positivas cyno Lag3recombinantes [00265] Além da análise de ligação utilizando células HEK recombinantemente expressando Lag3 humano à superfície, a ligação a células HEK positivas para Lag3 de cynomolgus foi também avaliada. Para este experimento, as células HEK293F congeladas, previamente transfectadas transitoriamente com cyno-LAG-3, foram descongeladas, centrifugadas e ressupplementadas em PBS/ 2% de FBS. 1,5x10⁵ células/ poço foram semeadas em placas de 96 poços. Anticorpos anti-Lag3 foram adicionados a uma concentração final normalizada de 10 pg/ ml. Para referência e como controles, os anticorpos de autofluoresccia e controle positivo (Medarex 25F7) bem como o controle de isotipo (hulgGI da Sigma, cat.no # 15154, dados não apresentados,) foram preparados e medidos no experimento. As células HEK foram incubadas com os anticorpos indicados durante 45 min em gelo, lavadas duas vezes com 200 μΙ de tampão PBS gelado contendo 2% de FBS, antes do anticorpo secundário (IgG-kappa anti-humano de cabra marcado com APC, Invitrogen, cat.no # MH10515) foi adicionado (1:50 diluído em FACS-Puffer/ poço) e ainda incubado por 30 min em gelo. As células foram novamente lavadas duas vezes com 200 μΙ de PBS gelado/ tampão FBS a 2% antes de as amostras serem finalmente ressuspensas em 150 μΙ de tampão FACS e a ligação foi medida no Módulo FACS CANTO-II HTS.

Resultados [00266] Na tabela abaixo, é mostrada a ligação e reatividade cruzada de diferentes anticorpos anti-Lag3 a células HEK293 que expressam

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115/126 cynol_AG3, ligação dada em % de células positivas ou o GeoMean da intensidade do sinal:

Anticorpo LAG3	% pos	GeoMean
Referência LAG3 anticorpo MDX25F7	41,2	3062
aLAG3(0411)	88,6	11007
aLAG3(0414)	81,6	9169
aLAG3(0416)	67,9	4221
aLAG3(0417)	75,9	7115
aLAG3(0403)	82,0	7457

Ligação de anticorpos anti-Lag3 de coelhos tg a células (ativadas)

PBMC/T EXPRESSANDO LAG3 DE CYNOMOLGUS [00267] Após ligação à proteína Lag3 recombinante e Lag3 expressos recombinantemente em células de mamífero, a ligação a Lag3 expressa em células T de Cynomolgus ativadas foi avaliada/ confirmada.

[00268] As características de ligação dos anticorpos antiLag3 recentemente gerados (derivados dos coelhos transgênicos da Roche) a Lag3 expressa na superfície celular de células T de cynomolgus ou PBMC foram confirmadas por análise FACS. Embora o Lag3 não seja expresso em células T naive, ele é regulado positivamente na ativação e/ ou nas células T exauridas. Assim, prepararam-se células mononucleares do sangue periférico de cynomolgus (PBMC) a partir de sangue de cynomolgus fresco e foram então ativadas por pré-tratamento com CD3/ CD28 (1 pg/ ml) durante 2-3 dias. As células ativadas foram subsequentemente analisadas quanto à expressão de LAG-3: Resumidamente, 1-3x10 ⁵ células ativadas foram coradas durante 3060 minutos em gelo com os anticorpos anti-LAG3 indicados e respectivos anticorpos de controle a 10 pg/ ml de concentração final. Os anticorpos antiLag3 ligados foram detectados via IgG anti-humana conjugada com

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116/126 fluorocromo ou anticorpos secundários IgG anti-coelho. Após a coloração, as células foram lavadas duas vezes com PBS/ 2% de FCS e analisadas em um FACS Fortessa (BD).

Resultados [00269] A tabela a seguir resume a porcentagem de células positivas para Lag3 dentro de PBMCs de cynomolgus ativadas:

Anticorpos Anti-Lag3/ Ctrl	% de células cyno positivas (PBLs) após ativação por CD3/ CD28
apenas o 2^o Ab (hu)	7,62
DP47 (isotipo humano)	9,19
Anticorpo de referência LAG3 (MDX25F7)	22,1
Anticorpo de referência LAG3 BMS-986016	18,6
Anticorpo de referência LAG-3 (BAP050 humanizado (LAG525))	50,7
apenas o 2^o Ab (rb)	5,26
aLAG3(0403)	44,2
aLAG3(0411)	46,6
aLAG3(0414)	43,0
aLAG3(0416)	38,9
aLAG3(0417)	35,3

[00270] Nas células T de Cynomolgus ativadas, todos os anticorpos anti-Lag3 de coelho demonstraram uma ligação significativa a células Lag3⁺. Por este meio, todos os anticorpos gerados de novo mostraram uma porcentagem aumentada de células positivas em comparação com

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117/126 anticorpos de referência anti-Lag3 humanos (por exemplo, como MDX25F7, BMS-986016).

Inibição da ligação de LAG-3 ao MHC-II expresso em células tumorais A375 HUMANAS (POR ELISA) [00271] 25 μΙ/ poço de células A375 (10000 células/ poço) foram semeadas em placas de 384 poços tratados com cultura de tecidos (Corning, 3701) e incubadas a 37 °C durante a noite. Os anticorpos anti-Lag3 foram pré-incubados durante 1 h com Lag3 biotinilado (250 ng/ mL) em meio de cultura de células em diluições de 1: 3 começando com 3 pg/ mL de concentração de anticorpo. Após remoção do meio dos poços com as células semeadas, 25 μΙ das misturas pré-incubadas de anticorpo Lag3 foram transferidos para os poços e incubados durante 2 h a 4 °C. Após lavagem (1 x 90 μΙ em PBST) as células foram fixadas por adição de 30 μΙ/ poço de glutaraldeído até uma concentração final de 0, 05% (Sigma Cat. No: G5882), 10 min à temperatura ambiente. Após lavagem (3 x 90 μΙ/ poço com tampão PBST) foram adicionados 25 μΙ/ poço de Poly-HRP40-Estreptavidina (Fitzgerald, 65R-S104PHRPx) em uma diluição de 1: 2000 ou 1: 8000 e incubados à temperatura ambiente durante 1 h. Após lavagem (3 x 90 μΙ/ poço com tampão PBST) adicionou-se 25 μΙ/ poço de substrato TMB (Roche, 11835033001) e incubou-se durante 2 a 10 minutos. A medição ocorreu em um instrumento Tecan Safire 2 a 370/ 492 nm.

Inibição da ligação de LAG-3 ao MHC-II expresso em células tumorais A375 HUMANAS (POR ANÁLISE FACS)

Princípio do ensaio [00272] Para estudar a função antagonista dos anticorpos anti-Lag3, foi realizado um ensaio de competição MHCII: Lag3. Células A375 humanas MHCII⁺ foram coradas com proteína de fusão Lag3: Fc biotinilada gerada in-house, com ou sem pré-incubação com anticorpos anti-Lag3. Esta

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118/126 análise foi estudada em um experimento de competição com FACS: Foram cultivadas células A375 (ATCC, # CRL-1619) durante 2-3 passagens em meio EM Eagle suplementado com EBSS (PAN, N.de catálogo # P04-00509), 10% de FBS, 2mM de L-glutamina, 1x NEAA e 1x de piruvato de sódio. Todos os anticorpos, foram diluídos em tampão FACS para uma concentração final de 20 pg/ ml em 25 μΙ (em placas de 96 cavidades em U). 25 μΙ de proteína de fusão LAG-3: Fc recombinante biotinilada, gerada internamente, foram adicionados a uma concentração final de 10 pg/ mL, tanto ao meio ou anticorpo anti-Lag3 ou aos controles, e foram pré-incubados durante 30 min à temperatura ambiente. As células A375 foram lavadas com PBS, e ajustadas para 3x10⁶ células/ ml em PBS. 100 pL foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços de fundo em V. As placas foram centrifugadas e o sobrenadante foi removido. Depois, a proteína de fusão LAG-3: Fc pré-incubada/ mistura de anticorpos (50 pl/ poço) foi adicionada às células e incubada durante 1 h à temperatura ambiente. Depois disto, as células foram lavadas com 200 pl de tampão FACS. Para detecção de proteína Lag3: Fc biotinilada ligada a MHCII celular, utilizouse um anticorpo anti-Biotina de cabra conjugado com APC a 3 pl/ amostra (Miltenyi Biotec, Cat. No. # 130-090-856) e incubou-se durante mais 10-15 minutos. Após a coloração, as células foram novamente lavadas e depois transferidas em 150 pl de tampão FACS (PBS/ 2% de FBS) para uma placa de fundo em U e analisadas em um FACS Canto-ll utilizando um módulo HTS.

[00273] Dois anticorpos anti-Lag3 (clones 25F7 e 26H10; Medarex) serviram como controles positivos e uma lgG1 humana (Sigma, cat. N° 15154) como controle de isotipo apropriado. Todos os anticorpos foram utilizados a concentração final de 10 pg/ ml.

Resultados [00274] É mostrado na tabela abaixo o resultado da análise FACS demonstrando a inibição percentual da ligação da proteína Lag3 ao

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MHC-II nas células (calculada como o sinal de ligação reduzido em referência ao valor máximo na ausência de um anticorpo bloqueador):

Anticorpo LAG3.	% de inibição
aLAG3(0403)	34,9
aLAG3(0414)	67,3
aLAG3(0411)	45,6
aLAG3(0416)	68,6
aLAG3(0417)	59,1
Referência MDX25F7	70,0
Referência MDX26H10	71,7
Controle de isotipo	-2,9
Nenhum mAb	0,0

[00275] Estes dados suportam uma interação funcional com Lag3 e bloqueio da interação celular de todos os anticorpos testados.

Potência neutralizante dos anticorpos anti-LAG3 novos em um padrão bloqueio LAG-3 Bio/ Reporterassay [00276] Para testar a potência neutralizante dos novos anticorpos anti-Lag3 na restauração de uma resposta suprimida de células T in vitro, foi utilizado um sistema repórter comercialmente disponível. Este sistema consiste em células efetoras Lag3⁺ NFAT Jurkat (Promega, cat. No. # CS194801), células Raji MHC-II⁺(ATCC, # CLL-86) e um super-antígeno. Em resumo, o sistema repórter baseia-se em três etapas: (1) ativação de células NFAT induzidas por superantígeno; (2) inibição do sinal de ativação mediada pela interação inibitória entre MHCII (células Raji) e células efetoras Lag3⁺NFAT Jurkat; (3) recuperação do sinal de ativação NFAT por construções de fusão aVH-Fc antagonistas/ neutralizantes de Lag3.

[00277] Para este experimento, as células T efetoras Raji e

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Lag-3⁺ Jurkat/ NFAT-luc2 foram cultivadas como descrito pelo fornecedor. Diluições em série (40 pg/ ml a 50 pg/ ml) de vários anticorpos anti-Lag3 e de referência foram preparadas em meio de ensaio (RPMI 1640 (PAN Biotech, cat. No. # P04-18047), 1% de FCS) em placas de cultura de fundo plano branco de 96 poços (Costar, cat. No. # 3917). 1x10⁵ células Lag3⁺NFAT-Jurkat/ poço) foram adicionados à solução de anticorpo. Após esta etapa, 2,5x10⁴ células de Raji/ poço foram adicionados à mistura de células/ anticorpo Jurakt, bem como 50 ng/ ml de concentração final de antígeno a SED super-antígeno (Toxin technology, cat. No. DT303). Após uma incubação de seis horas a 37 °C e 5% de CO2, 0 substrato Bio-GIo (Promega, # G7940) foi aquecido até à temperatura ambiente e 75 pl foram adicionados por poço, incubados durante 5-10 min antes da luminescência global foi medido em um leitor Tecan Infinite de acordo com a recomendação do fabricante do kit.

[00278] Nos diagramas, é mostrada a restauração de uma supressão mediada pelo MHCII/ Lag3 do sinal da NFAT luciferase por diferentes anticorpos anti-Lag3 na estimulação de SED (dados como valores de CE50):

Anti-LAG3	EC50 [nM] em Jurkat LAG3 + SED + Raji
1^o ensaio	2^o ensaio	3^o ensaio
Referência MDX25F7	7,8/ 5,9	8,6	nt
Referência BMS-986016	nt	9,6	nt
BAP050 humanizado de referência (LAG525)	nt	22,6	nt
Lag3 IgG -Fc	nt	sem efeito	nt
aLAG3(0411)	1,1	1,0	nt
aLAG3(0414)	1,1	1,0	1,8
aLAG3(0416)	3,1	2,5	3,5
aLAG3(0417)	1,0	nt	nt

nt. moléculas não testadas neste experimento

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Exemplo 3: Atividade Biológica em ensaios diferentes: Efeito de diferentes

ANTICORPOS ANTI-LAG3 (POR SI SÓ OU EM COMBINAÇÃO COM ANTICORPOS ANTIPD1)

Tabela 3: Resumo da atividade biológica de diferentes anticorpos antiLAG3 (SOZINHOS OU EM COMBINAÇÃO COM ANTICORPOS ANTI-PP1)

Tipo de ensaio	Anti- Lag3 aLAG3 (0403)	Anti- Lag3 aLAG3 (0411)	Anti- Lag3 aLAG3 (0414)	Anti- Lag3 aLAG3 (0416)	Anti- Lag3 aLAG3 (0417)	Referência 1 BMS 986016	Referência 2 ΒΑΡ050 humanizado (LAG525)
mMLR (GrzB)	+	-	+++	++	+	-	++
mMLR (IL- 2)	-	-	+	+	++	+	++
CD4 + ARH77			+++	+++		+	+
Supressão de Treg (GrzB)			+++	+		-	+
Supressão de Treg (IFN-g)			+++	++		+	+
PBMCs de pacientes com melanoma			+++

Efeito do bloqueio de PD-1 e LAG-3 na liberação citotóxica de Granzima

B E SECREÇÃO DE IL-2 POR CÉLULAS T CD4 HUMANAS CO-CULTIVADAS COM CÉLULAS DENDRÍTICAS MADURAS ALOGÊNICAS [00279] Para rastrear anticorpos bloqueadores de antiLAG3 em combinação com anti-PD-1 em um ambiente alogênico, desenvolvemos um ensaio no qual células T CD4 recentemente purificadas são co-cultivadas por 5 dias na presença de células dendríticas maduras (mDCs) alogênicas derivadas de monócitos. Os monócitos foram isolados de PBMCs frescas uma semana antes através de aderência plástica seguida

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122/126 pela remoção das células não aderentes. Em seguida, geramos DCs imaturas dos monócitos cultivando-as por 5 dias em meio contendo GM-CSF (50 ng/ ml) e IL-4 (100 ng/ ml). Para induzir a maturação dos iDCs, adicionamos TNF-alfa, IL-1beta e IL-6 (50 ng/ ml cada) ao meio de cultura por 2 dias adicionais. Em seguida, avaliou-se a maturação das DC medindose a expressão de superfície do Complexo Principal de Histocompatibilidade de Classe II (MHCII), CD80, CD83 e CD86 por citometria de fluxo (LSRFortessa, BD Biosciences).

[00280] No dia da reação mínima de linfócitos mistos (mMLR), as células T CD4 foram enriquecidas através de um kit de microesferas (Miltenyi Biotec) a partir de 108 PBMC obtidas de um dador não relacionado. Antes da cultura, as células T CD4 foram marcadas com 5 μΜ de Carboxy-Fluorescein-Succinimidyl Esther (CFSE). 10⁵ células T CD4 foram então plaqueadas em uma placa de 96 poços juntamente com aloDCs maduras (5: 1) na presença ou ausência de anticorpo anti-PD-1 bloqueador aPD1 (0376) (= PD1-0103-0312, do Pedido PCT

PCT/EP2016/073248) sozinho ou em combinação com anticorpos quiméricos anti-LAG3 (aLAG3(0403) a aLAG(0418) ((0403) a (0418)) ou anticorpos de referência (BAP050 humanizado (LAG525) e BMS 986016), na concentração de 10 pg/ ml. DP47 é um IgG não ligante humano com uma mutação LALA na porção Fc para evitar o reconhecimento pelo FcyR e foi usado como controle negativo.

[00281] Cinco dias depois, coletamos os sobrenadantes da cultura celular, usados posteriormente para medir os níveis de IL-2 por ELISA (R&D systems), e deixamos as células a 37 graus Celsius por mais 5 horas na presença de Golgi Plug (Brefeldin A) e Golgi Stop (Monensin). As células foram então lavadas, coradas na superfície com anticorpo anti-CD4 humano e o corante fixável Live/ Dead Aqua (Invitrogen) antes de serem

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123/126 fixadas/ permeabilizadas com Fix/ Perm Buffer (BD Bioscience). Realizamos coloração intracelular para Granzima B (BD Bioscience) e IFN-γ (eBioscience). Os resultados são mostrados nas Figuras 1A e B.

Efeito do bloqueio de PD-1 e LAG-3 na liberação de Granzima B citotóxica POR CÉLULAS T CD4 HUMANAS CO-CULTIVADAS COM UMA LINHAGEM CELULAR LINFOBLATOIDE DE CÉLULAS B (ARH77).

[00282] Em estudos funcionais, co-cultivamos células T CD4 com a linhagem celular tumoral ARH77, uma linhagem celular linfoblastoide de células B que expressa níveis mais baixos de PDL-1 do que os CDMs, para melhor caracterizar a contribuição do antagonismo LAG-3 para o bloqueio PD1. O resto da configuração e leitura experimental permaneceu inalterada a partir do mMLR. Os nossos anticorpos anti-LAG3 (aLAG3(0414) e aLAG3(0416), escolhidos com base na sua capacidade para co-secretarem IL2 e Granzima B no mMLR) em combinação com o anticorpo anti-PD-1, mostraram um aumento significativo na secreção de Granzima B pelas células T CD4 do que os anticorpos anti-LAG3 de referência ((BAP050 humanizado (LAG525) e BMS 986016)) (P <0,05) e anti-PD-1 isolado (P <0,01), Figura 2.

Efeito do bloqueio de PD-1 e a LAG-3 na supressão Treg de liberação de Granzima B e IFN-γ pelas células T CD4 humanas co-cultivadas com PBMC ALOGÊNICAS IRRADIADAS.

[00283] Em estudos funcionais envolvendo ensaios de supressão de células T reguladoras (Treg), PBMCs do mesmo doador foram divididas em duas amostras: uma foi enriquecida em células T CD4 e a outra em Tregs definida como células T CD4 CD25^altasCD127^baixas através de um kit de microesferas (Miltenyi Biotec). Uma vez purificadas as duas populações, as células T CD4 foram marcadas com 5 μΜ de Carboxy-Fluorescein-Succinimidyl Esther (CFSE) enquanto Tregs com 5 μΜ Cell-Trace-Violet (CTV) para serem capazes de distingui-las na FACS mais tarde.

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124/126 [00284] Ambas as células T CD4 (10⁵) e Tregs (10⁵) foram então co-cultivadas em uma placa de 96 poços na proporção de 1: 1 juntamente com PBMCs irradiadas (10⁵) de um doador não relacionado na presença ou ausência de nossos anticorpos anti-LAG-3 (aLAG-3 (0414) e aLAG-3 (0416) ou referenciar os anticorpos anti-LAG3 (BAP050 humanizados (LAG525) e BMS 986016) em combinação com o nosso anticorpo anti-PD-1 na concentração de 10 pg/ ml. Como controle para estimar a magnitude da supressão das funções efetoras das células T CD4 pelas Tregs, as células T CD4 (10⁵) foram também co-cultivadas com PBMC irradiadas (10⁵) na ausência de Tregs.

[00285] Cinco dias depois, recolheu-se os sobrenadantes de cultura celular, utilizados mais tarde para medir níveis de IFNy por ELISA (R&D Systems), e as células foram deixadas a 37 graus Celsius durante 5 horas adicionais na presença de Golgi Plug (Brefeldina A) e de Golgi Stop (Monensina). As células foram então lavadas, coradas na superfície com anticorpo anti-CD4 humano e o corante fixável Live/ Dead Aqua (Invitrogen) antes de serem fixadas/ permeabilizadas com Fix/ Perm Buffer (BD Bioscience). Realizamos coloração intracelular para Granzima B (BD Bioscience) e IFN-γ (eBioscience). Os resultados são mostrados nas Figuras 3Ae B.

[00286] Os anticorpos anti-LAG3 (aLAG3 (0414) e aLAG3 (0416), em combinação com o anticorpo anti-PD-1 aPD1 (0376) (= PD1-01030312, do pedido PCT PCT/EP2016/073248) elicitou fuga de Tconv do controle apertado de células T reguladoras, como demonstrado pela secreção de significativamente maior quantidade de Granzima B do que Tconv na presença de anticorpos anti-DP-1 sozinho (P < 0,05) ou na ausência de inibidores de checkpoint (P < 0,001). Anticorpos de referência anti-LAG3 (BAP050 humanizado (LAG525) e BMS 986016) em combinação com anti-PD-1 não

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125/126 resgataram significativamente as funções efetoras de Tconv da supressão de Treg. Resultados semelhantes foram obtidos para IFN-g mesmo se a diferença não tenha alcançado significância estatística com apenas 4 doadores.

Efeito do bloqueio de PD-1 e LAG-3 na secreção de Granzima B e IFN-r por CÉLULAS T CD4 DE PBMCS DE PACIENTES COM MELANOMA APÓS CONVOCAÇÃO COM POOLS IMUNOGÊNICOS DE PEPTÍDEOS DE ANTÍGENO-MELANOMA [00287] Foi descrito anteriormente que as PBMCs do paciente com melanoma contêm frequências detectáveis de células T específicas de antígeno tumoral. Por conseguinte, para fins de POC, testamos o anticorpo anti-LAG3 (0414) mais anti-PD-1 versus ou anti-PD-1 sozinho em PBMCs de paciente com melanoma re-estimulado durante a noite com pools peptídicos de antígenos associados a melanoma imunogênico.

[00288] 10⁵a 10⁶ PBMCs de doentes com melanoma, foram incubadas à temperatura ambiente na presença ou ausência de concentrações saturantes (10 pg/ ml) de anticorpos anti-DP-1 sozinho (0376), em combinação com anti-LAG3 (aLAG3(0414) = (0414), 10 pg/ ml) de anticorpo. As células T foram então re-estimuladas durante a noite com um pool de antígenos relacionados a tumor imunogênico como MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, Melan-A/ MART-1, NYESO-1, proteína de melanócito Pmel 17 gp100, tirosinase, proteína 2 relacionada à tirosinase na presença de inibidores de transporte de proteínas, Golgi Plug (Brefeldin A) e Golgi Stop (Monensin).

[00289] As células foram então lavadas, coradas na superfície com anticorpo anti-CD4 humano e o corante fixável Live/ Dead Aqua (Invitrogen) antes de serem fixadas/ permeabilizadas com Fix/ Perm Buffer (BD Bioscience). Realizamos coloração intracelular para Granzima B (BD Bioscience) e IFN-γ (eBioscience).

[00290] A combinação de anticorpos anti-LAG3 e anti-PD-1 (P < 0,01 e P < 0,001) significativamente (P < 0,01 e P < 0,0001) aumentou as

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126/126 funções efetoras de células T específicas do antígeno de tumor (isto é, secreção de Granzima B e IFN-γ ), enquanto o bloqueio de PD-1 sozinho não mostrou qualquer efeito (dados não mostrados).

[00291] Analogamente, um técnico no assunto pode prolongar o acima mencionado em estudos de cultura celular/ animais do exemplo 3 para métodos de tratamento humanos.

Claims

Reivindicações

1. ANTICORPO ISOLADO que se liga a Iag3 humana, caracterizado pelo anticorpo compreender

A) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 5; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

B) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 9; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 13; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

C) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 17; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 18; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 19; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 20; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 21; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

D) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 26; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 27; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

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2/7

SEQ ID NO: 28; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; ou

E) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 34; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 35; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 36; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 37; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo compreender

A) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 5; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

B) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 33; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 34; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 35; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 36; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidosde

SEQ ID NO: 37; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.
3. ANTICORPO ISOLADO que se liga a Iag3 humana, caracterizado pelo anticorpo compreender

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3/7

A) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

B) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou

C) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 19; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou

D) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ

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4/7

ID NO: 27; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; ou

E) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 35; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 °C e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo anticorpo compreender

A) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

B) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 35; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (ii) HVR-L2 compreendendo a

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5/7 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 °C e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

5. ANTICORPO ISOLADO QUE SE LIGA A LAG3 HUMANA, caracterizado pelo anticorpo

i) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8;

ii) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16;

iii) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 23 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 24;

iv) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 31 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 32; ou

v) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 39 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 40.
6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo anticorpo

i) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 8; ou ii) compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 39 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 40.
7. ANTICORPO ISOLADO QUE SE LIGA A LAG3 HUMANA, caracterizado pelo anticorpo:

i) competir pela ligação a LAG3 com um anticorpo anti-LAG3 compreendendo a VH com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e VL com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e/ ou ii) se ligar a uma LAG3 humana e de cinomolgo; e/ ou iii) inibir a ligação de MHC-II expressa em células tumorais A375 humanas; e/ ou

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6/7 iv) aumentar a liberação de Granzima B ou IL-2 em um ensaio de reação mista de linfócitos (mMLR).
8. ANTICORPO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.
9. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser um anticorpo lgG1 de comprimento total com mutações L234A, L235A e P329G (numerada de acordo com o índice EU de Kabat).
10. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, caracterizado por codificar o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 10.
12. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, caracterizado por compreender a cultura da célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 11, de modo que o anticorpo seja produzido.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12; caracterizado por compreender ainda a recuperação do anticorpo da célula hospedeira.
14. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por ser para uso no tratamento de câncer.
16. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por ser para uso como medicamento.
17. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por ser para uso no tratamento de câncer.
18. USO DO ANTICORPO, conforme definido em qualquer

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7/7 uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por ser na fabricação de um medicamento.
19. USO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo medicamento ser para o tratamento de câncer.
20. MÉTODO PARA TRATAR UM INDIVÍDUO TENDO CÂNCER, caracterizada pelo método compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo, conforme definido na reivindicação 1.