JP6974311B2

JP6974311B2 - 新規ｐｄ−１免疫調節剤

Info

Publication number: JP6974311B2
Application number: JP2018519261A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ブレンチェンス，レニエ; ジェインジャクソン，ホリー; リュー，チェン
Original assignee: Eureka Therapeutics Inc
Current assignee: Eureka Therapeutics Inc
Priority date: 2015-06-23
Filing date: 2016-06-23
Publication date: 2021-12-01
Anticipated expiration: 2036-06-23
Also published as: EP3313883A1; US20180127502A1; WO2016210129A1; TW201718648A; KR20180019725A; CN114133448A; JP2021177768A; US11136392B2; IL256463A; AU2016281641B2; CN108337890B; JP2018518540A; AU2016281641A1; CN108337890A; HK1254803A1; TWI773647B; EP3313883B1; CA3006224A1

Description

関連出願の相互参照

本出願は、それぞれの内容が本開示に引用により組み込まれる、２０１５年６月２３日出願の米国仮出願第６２／１８３，２９７号および２０１５年１２月１１日出願の米国仮出願第６２／２６６，３９８号からの優先権を主張する。

配列表
本出願は、２０１６年６月１６日に作成された配列表を包含し、ＡＳＣＩＩフォーマットにおけるそのファイルは、３３１４０７０ＡＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、そのサイズは１０４キロバイトである。そのファイルは、引用によりその全体が本出願に組み込まれる。

本開示は一般に、免疫機能に関与する抗原結合性タンパク質に関する。より具体的には、本開示は、ＰＤ−１に対する特異性を有する、組換え抗体、キメラ抗原受容体およびそれらの断片に関する。

癌免疫療法の目的は、癌特異的免疫応答を調節することにより悪性疾患を治療することである。主要な標的は、活性化Ｔ細胞の表面に発現し、そのリガンドである、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の１つに結合すると細胞内抑制性シグナルを導く、プログラム細胞死（ＰＤ−１）受容体である。

ＰＤ−１は、癌において役割を果たしていることが示されている。ヒトにおいて、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の発現は、免疫組織化学により評価して、多数の原発腫瘍生検において見られている。かかる組織としては、肺、肝臓、卵巣、子宮頸部、皮膚、結腸、神経膠腫、膀胱、乳房、腎臓、食道、胃、口腔扁平細胞、尿路上皮細胞、および膵臓の癌ならびに頭頸部の腫瘍が挙げられる。さらに、腫瘍細胞上のＰＤ−リガンド発現は、複数の腫瘍タイプにわたって癌患者の予後不良と相関している。

ＰＤ−１を標的とし、ＰＤ−１のアゴニストまたはそのアンタゴニストのいずれかとして機能する、抗体およびその他の抗原結合性タンパク質を含む、新しい治療法が現在必要とされている。

本開示は、Ｔ細胞上の、プログラム細胞死に関連するタンパク質受容体である、ＰＤ−１に特異的に結合することができ、それによりＴ細胞による免疫応答を調節する、抗体およびキメラ抗原受容体などの抗原結合性タンパク質を記載する。ＰＤ−１のそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との結合を阻害することにより、ＰＤ−１シグナル経路の遮断がＴ細胞のアポトーシスを阻害する。

１つの態様において、それゆえ、本開示は、ＰＤ−１に特異的に結合し、そのリガンドとの結合を妨げる、組換え抗原結合性タンパク質、抗体およびキメラ抗原受容体またはそれらの抗原結合部分に関する。

１つの態様において、それゆえ、本開示は、以下の１つを含む組換え抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片に関する：
（Ａ）配列番号１０、配列番号２１、配列番号３２、配列番号４３、配列番号５３、配列番号６１、配列番号７２、配列番号８３、配列番号９４、配列番号１０３、配列番号１１４、配列番号１２５、配列番号１３３、配列番号１４２；その断片、およびその相同配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域；
（Ｂ）配列番号６および８；配列番号１７および１９；配列番号２８および３０；配列番号３９および４１；配列番号４９および５１；配列番号５７および５９；配列番号６８および７０；配列番号７９および８１；配列番号９０および９２；配列番号９９および１０１；配列番号１１０および１１２；配列番号１２１および１２３；配列番号１２９および１３１；配列番号１３８および１４０；それらの断片、ならびにそれらの相同配列から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有する可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む抗原結合領域；または
（Ｃ）以下を含む抗原結合領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１）、ＡＡＳおよびＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号２）をそれぞれ有する軽鎖相補性決定領域（ＬＣＣＤＲ）ＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＳＳＳＹＷ（配列番号４）、ＩＫＱＤＧＳＥＫ（配列番号５）およびＡＲＧＧＷＳＹＤＭ（配列番号６）をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域（ＨＣＣＤＲ）ＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＩＧＡＧＹＡ（配列番号１２）、ＴＮＮおよびＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＩ（配列番号１３）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＬＴＥＬＳ（配列番号１４）、ＦＤＰＥＤＧＥＴ（配列番号１５）およびＡＲＡＹＹＧＦＤＱ（配列番号１６）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＩＧＮＮＡ（配列番号２３）、ＹＮＤおよびＡＡＷＤＤＳＶＮＧＹＶ（配列番号２４）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＲＦＧ（配列番号２５）、ＩＳＶＮＮＧＮＴ（配列番号２６）およびＡＲＹＭＹＧＲＲＤＳ（配列番号２７）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｉｖ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＮＨＳＤＶＶ（配列番号３５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＲＮＫＦＳＳＹＡ（配列番号３６）、ＩＳＧＳＧＧＴＴ（配列番号３７）およびＡＲＷＹＳＳＹＹＤＶ（配列番号３８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｖ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＳＳＳＤＹＶ（配列番号４５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＮＹＩＳＭＦＤＳ（配列番号４８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｖｉ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶ（配列番号５５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＧＹＳＳＹＹＤＡ（配列番号５６）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｖｉｉ）アミノ酸配列ＲＳＮＩＧＥＮＴ（配列番号６３）、ＳＮＮおよびＡＡＷＤＤＲＬＮＧＹＶ（配列番号６４）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＮＹＧ（配列番号６５）、ＩＧＡＱＫＧＤＴ（配列番号６６）およびＡＲＳＱＧＶＰＦＤＳ（配列番号６７）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＳＮＩＧＳＮＴ（配列番号７４）、ＮＮＮおよびＡＴＷＤＤＳＬＮＥＹＶ（配列番号７５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＲＹＧ（配列番号７６）、ＩＳＧＹＮＧＮＴ（配列番号７７）およびＡＲＨＧＹＧＹＨＧＤ（配列番号７８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｉｘ）アミノ酸配列ＳＳＮＩＧＡＧＹＶ（配列番号８５）、ＨＮＮおよびＱＳＹＤＳＳＬＳＧＷＶ（配列番号８６）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＫＤＹＹ（配列番号８７）、ＩＳＴＳＧＮＳＶ（配列番号８８）およびＡＲＳＰＧＨＳＤＹＤＳ（配列番号８９）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｘ）アミノ酸配列ＮＩＧＤＫＳ（配列番号９６）、ＹＤＳおよびＱＶＷＡＳＧＴＤＨＰＹＶＩ（配列番号９７）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＭＹＧＳＹＴＤＭ（配列番号９８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；およびそれらの断片または相同配列；
（ｘｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＩＧＹＮＹ（配列番号１０５）、ＲＮＮおよびＴＳＷＤＤＳＬＳＧＹＶ（配列番号１０６）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＮＡＦＴＮＦＹ（配列番号１０７）、ＩＮＰＳＧＴＤＬＴ（配列番号１０８）およびＡＲＱＹＡＹＧＹＳＧＦＤＭ（配列番号１０９）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｘｉｉ）アミノ酸配列ＱＳＶＳＮＷ（配列番号１１６）、ＡＡＳおよびＱＱＳＹＳＴＰＩＴ（配列番号１１７）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹＹ（配列番号１１８）、ＩＮＰＮＴＧＧＳ（配列番号１１９）およびＡＲＧＤＶＴＹＤＥ（配列番号１２０）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；
（ｘｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＤおよびＱＶＷＤＩＮＤＨＹＶ（配列番号１２７）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＳＱＡＳＦＭＤＩ（配列番号１２８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片またはそれらの相同配列；または
（ｘｉｖ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＤＤＳおよびＱＶＷＤＳＳＳＤＱＧＶ（配列番号１３５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＧＴＧＧＧＴ（配列番号１３６）およびＡＲＧＴＧＹＤＧＤＱ（配列番号１３７）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）およびそれらの断片またはそれらの相同配列。

ある実施形態において、組換え抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、少なくとも１つの上記の配列番号の全長の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である上記の配列番号の少なくとも１つの断片を含む。ある実施形態において、組換え抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、少なくとも１つの上記の配列番号に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有する、上記の配列番号の少なくとも１つに相同的な配列を含む。

関連する態様において、本開示は、組換え抗原結合性タンパク質またはそれらの抗原結合性断片に関し、ここで、組換え抗原結合性タンパク質は、抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、融合タンパク質またはその接合体である。１つの実施形態において、組換え抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、治療薬、例えば、薬物、毒素もしくは細胞毒性部分、放射性同位元素、タンパク質またはペプチドに接合している。

本開示の抗体は、全長抗体、インタクトな抗体、それらの断片および相同配列であり、これらに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。

組換え抗原結合性タンパク質において、抗原結合領域は、ヒトＰＤ−１のエピトープに特異的に結合し、ＰＤ−１のその（１つまたは複数の）リガンドへの結合をブロックする。

関連する態様において、本開示は、本開示の抗原結合性タンパク質をコードする核酸ならびにかかる核酸または抗原結合性タンパク質を含むベクターおよび細胞に関する。

さらに別の態様において、本開示は、治療上有効量の抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片を投与することを含む、対象におけるＴ細胞応答を上昇させる方法に関する。治療上有効量の抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片の投与は、ＰＤ−１によって媒介されるシグナル伝達を、阻害するか、低下させるか、調節するかまたは消失させる。

さらに別の関連する態様において、本開示は、対象に治療上有効量の抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片を投与することを含む、ＰＤ１−陽性疾患を有する対象を治療する方法に関する。１つの実施形態において、抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物が投与される。

本発明の別の態様において、本開示は、組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターに関し、ここで、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質は、前記キメラ抗原受容体と同一ではない。

さらに別の態様において、本開示は、本明細書に記載するベクターを含む細胞に関する。関連する態様において、本開示は、組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む細胞に関し、ここで、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質は、前記キメラ抗原受容体と同一ではない。別の関連する態様において、本開示は、組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質およびキメラ抗原受容体を含む細胞に関し、ここで、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質は、前記キメラ抗原受容体と同一ではない。

本明細書に記載するベクターまたは細胞のある実施形態において、キメラ抗原受容体はＰＤ−１に特異的に結合するものではない。

本発明の別の態様において、本開示は、対象に治療上有効量の、本明細書に記載する組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質、ベクター、細胞、または医薬組成物を投与することを含む、対象におけるＴ細胞応答を上昇させる方法を提供し、ここで、組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質はＰＤ−１アンタゴニストである。

本発明のさらに別の態様において、本開示は、対象に治療上有効量の、本明細書に記載する組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質、ベクター、細胞、または医薬組成物を投与することを含む、対象におけるＴ細胞応答を低下させる方法を提供し、ここで、組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質はＰＤ−１アゴニストである。

本発明の別の態様において、本開示は、対象に、治療上有効量の本明細書に記載する組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質、ベクター、細胞、または医薬組成物を投与することを含む、ＰＤ１−陽性疾患を有する対象を治療する方法を提供する。

関連する態様において、本開示は、対象の少なくとも１つのＴ細胞に、組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を形質導入することを含む、ＰＤ１−陽性疾患を有する対象を治療する方法を提供し、ここで、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質は、前記キメラ抗原受容体と同一ではない。

本明細書に記載する方法のある実施形態において、キメラ抗原受容体は、ＰＤ−１に特異的に結合するものではない。ある実施形態において、ＰＤ１−陽性疾患は癌である。ある実施形態において、ＰＤ１−陽性疾患は自己免疫疾患である。

ＰＤ−１単量体に対するｓｃＦｖ−Ｆｃクローンの相対的結合親和性を示す。ｓｃＦｖ−ＦｃクローンがＰＤ−１に結合する能力を、ＰＤ−１単量体への結合のレベルを検出することによって決定した。ｓｃＦｖ−Ｆｃクローンの結合親和性を、クローン３１が弱く結合し、クローン２６および２７が最も結合したとして順位付けした（３１＜２３＜４０＜１８＜１６＝２７＜２６）。

ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との相互作用の破壊を示す。Ａ．は、ｓｃＦｖ−ＦｃがＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊する能力を測定するために使用した競合的結合アッセイの模式図である。（１）ビオチン化ＰＤ−１−Ｆｃを、段階希釈したＥＴ９０１ＳｃＦｖ−Ｆｃ（陰性対照）または抗ＰＤ１ＳｃＦｖ−Ｆｃと混合し；（２）次いでＰＤ−Ｌ１−Ｆｃコートプレートに添加した。工程（３）において、コートＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１−Ｆｃ結合を、ＨＲＰ−接合ストレプトアビジンを介して可視化した。Ｂ．競合的結合アッセイの結果を比較するために、ｓｃＦｖの濃度が１．７〜５．２５μｇ／ｍｌであった点を丸で囲む。クローン４０および２３が相互作用を破壊する最も弱い能力を有しており、クローン２６が最も強い能力を有していた（２６＞２７＝１６＞１８＞３１＞２３＝４０）。

使用したコンストラクトの模式図である。分泌可能ｓｃＦｖを、細胞からのｓｃＦｖの移出を可能にするマウスカッパリーダー配列を含むように設計した。セリングリシンリンカー（Ｇ_４Ｓ）は、可変重鎖と可変軽鎖とを連結するために用いた。ＨＩＳ／ＨＡタグを、ｓｃＦｖの検出を可能にするよう含めた。５’および３’末端反復配列（ＬＴＲ）、スプライスドナー（ＳＤ）、スプライスアクセプター（ＳＡ）、パッケージングエレメント（ψ）、ＣＤ８リーダー配列（ＣＤ８）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、ヒトＣＤ２８シグナル伝達ドメイン（ｈＣＤ２８）、ヒトゼータ鎖シグナル伝達ドメイン（ｈζ鎖）および抗ＰＤ−１ｓｃＦｖの位置を示すＳＦＧ−１９２８ｚ／ｓｃＦｖレトロウイルスコンストラクトの模式図。

１９２８ｚＣＡＲのみまたはＰＤ−１ｓｃＦｖとともに発現するよう改変されたヒト末梢血Ｔ細胞の増殖。形質導入されたＴ細胞を、５０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２中で培養し、増殖をモニターした。ＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン２３または２７を分泌するよう改変されたＴ細胞は、ＣＡＲのみを発現するＴ細胞と少なくとも同等の増殖を示した。１９２８ｚＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン１６、１８、２６、３１または４０を分泌するよう改変された細胞は、インビトロで増殖しなかった。示したデータは、２回の独立した実験の代表である。

抗ＰＤ−１ｓｃＦｖを分泌する腫瘍標的化Ｔ細胞からのＩＮＦ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）。ＣＡＲを発現するＴ細胞またはＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖを分泌するＴ細胞を、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞と共培養した。上清をＬｕｍｉｎｅｘ技術により分析し、Ｔ細胞から分泌されたサイトカインのレベルを検出した。１９２８ｚＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン２３および２７を分泌するよう改変されたＴ細胞は、ＣＡＲのみを発現するよう改変された細胞と比較して、上昇したＩＦＮ−γの分泌を示した。１９２８ｚＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン１６、１８、２６、３１または４０を分泌するよう改変された細胞は、ＣＡＲのみにより改変された細胞と比較してより少ないＩＦＮ−γを分泌した。

１９２８ｚＣＡＲおよびＥｕｒｅｋａ抗ＰＤ−１ｓｃＦｖによるヒトＴ細胞の形質導入の結果を示す。（上側パネル）形質導入の後、ヒトＴ細胞をフローサイトメトリーにより評価して、１９２８ｚＣＡＲに対して特異的な抗体（１９Ｅ３）を用いてＣＡＲ発現を検出した。形質導入効率は、試験したすべてのコンストラクトについて５５％を上回り、再現性があった。（下側パネル）Ｅｕｒｅｋａ抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン２６、２７および４０を含有するコンストラクトは、有意により低い形質導入効率を示し、＊ｐ＜０．０５であった。４回の独立した実験からの形質導入効率であり、示されたデータは平均＋／−ＳＥＭである。

１９２８ｚＣＡＲおよびＥｕｒｅｋａ抗ＰＤ−１ｓｃＦｖを発現するよう改変されたＴ細胞における抗ＰＤ−１ｓｃＦｖの存在の効果を示す。ＣＡＲおよびＥｕｒｅｋａ抗ＰＤ−１ｓｃＦｖを発現するよう形質導入されたヒトＴ細胞を、ウェスタンブロット可溶化液の調製に先立って４時間ゴルジ阻害剤とともにインキュベートした。ウェスタンブロット分析を用いて、メンブレンを抗ＨＡ抗体によりプローブすることにより、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖを検出した。メンブレンを、ローディング対照として抗ＧＡＰＤＨ抗体によりプローブした。

１９２８ｚＣＡＲおよび抗ＰＤ−１ｓｃＦｖを発現するよう改変されたヒトＴ細胞の、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２の存在下／非存在下における増殖を示す。ＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン２３、２６、２７および４０を分泌するよう改変されたヒトＴ細胞を、ヒトＰＤ−１Ｌ１／Ｌ２を発現するか、または発現しない、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ、マウス３Ｔ３線維芽細胞）上に置いた。ａＡＰＣとの２４時間のインキュベーションの後、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを細胞に添加して、増殖を刺激した（１：２のビーズ：Ｔ細胞比）。３日後、Ｔ細胞を、トリパンブルー排除を用いて数え上げた。１９２８ｚＣＡＲおよび抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン２６および２３を発現するよう改変されたＴ細胞は、抑制性リガンドを発現しないａＡＰＣと比べてＰＤ−Ｌ１／Ｌ２を発現するａＡＰＣ上で低下した増殖を示した。一方、１９２８ｚＣＡＲおよび抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン２７を発現するよう改変されたＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２を発現するａＡＰＣ上で上昇した増殖を示した。示したデータは１回の実験の代表である。

本開示のいくつかの抗原結合性タンパク質の軽および重可変鎖についての相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を示す。

抗ＰＤ−１特異的ｓｃＦｖから作成したモノクローナル抗体は、ヒトＴ細胞上のＰＤ−１に結合することを示す。ＰＤ−１特異的ｓｃＦｖからヒトモノクローナル抗体を作成し、ヒトＰＤ−１（１μｇ／ｍｌ）を過剰発現するよう改変されたヒトＴ細胞とともにインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して、ヤギ抗ヒトＩｇＦＩＴＣ接合抗体を用いて結合した抗体を検出した。クローン２３、２６および２７モノクローナル抗体は、それぞれ５１％、７８％および６７％にてＰＤ−１ヒトＴ細胞に結合した。対照抗体（クローン９０１）はＴ細胞上のヒトＰＤ−１に結合しなかった。示したデータは１回の実験の代表である。

ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２を発現するａＡＰＣ上でインキュベートした第１世代ＣＡＲを発現するよう改変されたＴ細胞は、抗ＰＤ−１クローン２７モノクローナル抗体が存在する場合に増殖することを示す。第１世代ＣＤ１９−特異的ＣＡＲ（１９ｚ１）を発現するよう改変されたヒトＴ細胞を、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とともに２４時間インキュベートし、次いでＰＤ−Ｌ１／Ｌ２を発現するか、または発現しないａＡＰＣ上に置いた。ａＡＰＣによる２４時間の刺激の後、細胞を次いでＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激した。３日後、細胞を数え上げた。モノクローナル抗体なし（点刻バー）で、対照抗体、９０１（格子バー）およびクローン２３（水平縞バー）および２６（垂直縞バー）モノクローナル抗体とともにインキュベートした１９ｚ１Ｔ細胞は、抑制性リガンドを発現しないａＡＰＣと比較して、ＰＤ−１リガンドを発現するａＡＰＣ（対応する白色バー）上での増殖がより少なかった。しかしながら、抗ＰＤ−１クローン２７モノクローナル抗体とともにインキュベートした１９ｚ１Ｔ細胞（斜線縞バー）は、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２ａＡＰＣ上でより高い程度に増殖した。示したデータは１回の実験の代表である。

ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖである、Ｅ２７を分泌するようさらに改変されたＣＡＲＴ細胞の作成を示す。Ａ．２シストロン性レトロウイルスコンストラクトを、ＣＤ１９−特異的ＣＡＲ（１９２８ｚと命名した）または卵巣腫瘍抗原特異的ＣＡＲ（４Ｈ１１２８ｚと命名した）およびＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖである、Ｅ２７をコードするように作成した。Ｅ２７は、ｓｃＦｖの分泌を可能にするように、シグナルペプチドである、マウスＩｇＫにより先行された。Ｔ細胞からいったん分泌されたｓｃＦｖを検出するために、ＨＡ／Ｈｉｓタグもまた含めた。Ｂ．ヒト末梢血Ｔ細胞を、ＣＡＲ、１９２８ｚ、またはＣＡＲおよびＥ２７ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖ、１９２８ｚ−Ｅ２７をコードするレトロウイルスコンストラクトにより形質導入した。形質導入の後、フローサイトメトリーを使用して、１９Ｅ３と命名されたＣＤ１９−標的化ＣＡＲに特異的に結合する抗体を用いて、ＣＡＲの発現を検出した。Ｃ．形質導入されたヒトＴ細胞からの上清のウェスタンブロット分析を利用して、抗ＨＡ抗体によりＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖを検出した。本発明者らはまた、ＣＡＲおよび対照ｓｃＦｖである、Ｂ６を発現するよう改変されたＴ細胞からのｓｃＦｖ分泌を調べ、これは抗ｃ−ｍｙｃタグ抗体を用いて検出した。Ｄ．２つのＣＤ１９^＋腫瘍標的に対する標準的^５１Ｃｒ放出アッセイを行って、ｓｃＦｖの分泌が、ＣＡＲがＴ細胞の細胞溶解能力を再指示する能力を妨げないことを確証した。ＣＡＲのみ（１９２８ｚまたは４Ｈ１１２８ｚ対照ＣＡＲ）、ＣＡＲおよびＥ２７ｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｅ２７または４Ｈ１１２８ｚ−Ｅ２７）、またはＣＡＲおよび対照ｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｂ６Ｈ１２．２または４Ｈ１１２８ｚ−Ｂ６Ｈ１２．２）のいずれかを発現するＣＡＲＴ細胞を、^５１Ｃｒ標識化腫瘍細胞（ＲａｊｉまたはＮａｌｍ６）とともに４時間インキュベートした。ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞は、腫瘍標的を同等のレベルで溶解することができ、卵巣−標的化ＣＡＲＴ細胞は、ＲａｊｉもＮａｌｍ６も溶解することができなかった。それゆえ、本発明者らは、ｓｃＦｖの分泌は、ＣＡＲがＴ細胞溶解能力を再指示する能力を妨げなかったと結論する。

ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖを分泌するよう改変されたＴ細胞は、インビトロでＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１相互作用からの阻害に耐えることを示す。Ａ．ＣＡＲのみ（１９２８ｚ）、またはＣＡＲおよびＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｅ２７）を発現するＴ細胞を、３Ｔ３空細胞またはヒトＰＤ−Ｌ１を発現するよう改変された３Ｔ３細胞上で培養した。３Ｔ３フィーダー細胞上での２４時間の後、細胞を、１：３のビーズ：Ｔ細胞比にて培養物に添加したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激した。Ｔ細胞の増殖をトリパンブルーでの数え上げにより決定し、新しいビーズを２回培養物に添加した（矢印によって示す）。１９２８ｚＴ細胞は、３Ｔ３空フィーダー細胞上で増殖したが、しかし、３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１フィーダー細胞上では増殖しなかった。一方、１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、３Ｔ３空および３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１フィーダー細胞の両方の上で増殖し、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１に媒介される抑制に対する抵抗性を示した。Ｂ．図１３Ａに示されるように３Ｔ３空または３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１細胞上でインキュベートしたＴ細胞をフローサイトメトリーにより分析して、抑制性受容体である、ＰＤ−１、２Ｂ４およびＬＡＧ３についての発現を検出した。１９２８ｚ細胞は、１９２８ｚ−Ｅ２７細胞よりも上昇したレベルのＰＤ−１を発現した（示さず）。ＰＤ−１^＋細胞でゲートをかけた場合、２Ｂ４およびＬＡＧ３の分析により、１９２８ｚ細胞は１９２８ｚ−Ｅ２７細胞と比較してＰＤ−１^＋、２Ｂ４^＋およびＬＡＧ３^＋細胞のより高い割合を有していたことが明らかになった。Ｃ．形質導入されたＴ細胞を、Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１またはＮａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞とともに、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（１：１、１：３、１：５）で７２時間培養した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９抗体での染色後のフローサイトメトリーおよびビーズの数え上げを使用して、腫瘍標的の溶解およびＴ細胞の増殖を経時的にモニターした。ＰＤＬ１^＋腫瘍細胞とともに培養された場合、１９２８ｚ−Ｅ２７細胞（上側の曲線）は、１９２８ｚＴ細胞（下側の曲線）と比較してより高レベルに増殖し続けた。Ｄ．形質導入されたＴ細胞を図１３Ｃに示すようにＮａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞で刺激し、Ｎａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞で１：５のＴＥ：Ｔ比にて再刺激した。４８時間の共培養の後、フローサイトメトリーを使用して腫瘍標的の溶解を決定した。１９２８ｚ−Ｅ２７は、１９２８ｚ細胞と比較して、再刺激の際にＰＤ−Ｌ１腫瘍標的を溶解する能力を保持していた。

ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖを分泌するよう改変されたＴ細胞のインビボでの抗腫瘍効力を示す。Ａ．ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、０日目に静脈内注入を介してＲａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞を接種した。１日目に、マウスに１０^６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を静脈内に注入し、生存を臨床的にモニターした。後肢麻痺が生じるとマウスを安楽死させた。

ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖである、Ｅ２７の選択に関する。Ａ．ＰＤ−１ブロッキングｍＡｂ候補であるＥ２７、Ｅ２６およびＥ２３を競合的結合アッセイにおいて使用して、ヒトには存在しないハプテンを標的とする対照ｍＡｂと比較して、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合の妨害を様々な濃度にて検出した。Ｅ２３、Ｅ２６およびＥ２７ｍＡｂはすべてＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を妨げた。Ｂ．Ａにおいて使用したＥ２３、Ｅ２６およびＥ２７ｍＡｂから設計したＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖの設計の模式図であり、ここで、シグナルペプチドを可変重配列およびセリングリシンリンカーおよび可変軽配列に連結した。このＨＩＳ／ＨＡタグをｓｃＦｖの検出のために含めた。Ｃ．１９２８ｚＣＡＲとともに分泌可能ｓｃＦｖを発現するように形質導入された２９３Ｇｌｖ９パッケージング細胞からのＳＮに対する、抗ＨＡ抗体により染色したウェスタンブロット。Ｅ２７ｓｃＦｖは最高のレベルで検出され、それゆえ、本明細書の残りの部分において使用した。Ｄ．抗ＨＡｍＡｂで染色した、ＰＢＭＣｓ＋４Ｈ１１２８ｚおよびＰＢＭＣｓ＋４Ｈ１１２８ｚＥ２７からのＳＮに対するウェスタンブロット。

Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖである、Ｅ２７を分泌するよう共改変できることを示す。Ａ．１９２８ｚＣＡＲのみ（１９２８ｚ）または１９２８ｚＣＡＲおよびＥ２７ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｅ２７）による形質導入後、１９２８ｚＣＡＲに特異的に結合する１９Ｅ３ｍＡｂによる染色後の同等のＣＡＲ発現を実証する代表的フローサイトメトリープロット。Ｂ．１９２８ｚ−Ｅ２７細胞においてのみの約３０ｋＤａタンパク質を示す、抗ＨＡｍＡｂにより染色した１９２８ｚおよび１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞からのＳＮについてのウェスタンブロットであり、Ｅ２７ｓｃＦｖは、１９２８ｚ−Ｅ２７により形質導入されたＴ細胞から分泌され、ＣＡＲのみにより形質導入されたＴ細胞からは分泌されないことを実証している。Ｃ．形質導入の後、１９２８ｚＴ細胞と比較して１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞上のより低いレベルのＰＤ−１発現を実証する、代表的フローサイトメトリー。Ｄ．ＰＤ−１の発現は、１９２８ｚＴ細胞と比較して１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞上で統計的に有意により低かった。示されたデータは、４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＥＭである。Ｅ．Ｒａｊｉ腫瘍細胞の溶解は、Ｅ２７ｓｃＦｖの分泌によって影響されなかったことを実証する４時間^５１Ｃｒ放出アッセイ。１９２８ｚおよび１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞はＲａｊｉ腫瘍細胞を同等に溶解した。対照４Ｈ１１２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、４Ｈ１１２８ｚＴ細胞と比較してＲａｊｉ細胞の溶解の上昇を媒介しなかった。示したデータは、２回の独立した実験の代表である。

ＣＡＲおよびＥ２７の発現は、ＣＤ１９^＋ＰＤ−Ｌ１^＋腫瘍細胞の場合においてＴ細胞の増殖および溶解能力を保護することを示す。Ａ．Ｒａｊｉ腫瘍細胞をヒトＰＤ−Ｌ１を発現するようにレトロウイルスにより改変し（Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１）、ＰＤ−Ｌ１に特異的なｍＡｂで染色した。親Ｒａｊｉ腫瘍（Ｒａｊｉ）はＰＤ−Ｌ１を発現せず、Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞は高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現した。Ｂ．１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、７２時間の共培養の後のフローサイトメトリーにより決定して、１９２８ｚＴ細胞と比較してＲａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞をより多く溶解することを示す代表的フローサイトメトリープロット。Ｃ．１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、１９２８ｚＴ細胞と比較して統計的に有意により多くのＲａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞を溶解する。示されたデータは、４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＥＭである。Ｄ．１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、フローサイトメトリーおよびビーズの数え上げにより決定してＲａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞との共培養の後により多数増殖する。示されたデータは４回の独立した実験からのＴ細胞の平均総数＋／−ＳＥＭである。Ｅ．Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞との７日間の共培養の後に、１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞と比較して１９２８ｚＴ細胞上で、上昇したＰＤ−１発現を示す代表的フローサイトメトリープロットである。Ｆ．１９２８ｚＴ細胞は、パーセンテージ陽性細胞およびＰＤ−１染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して、１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞と比較して有意により多くのＰＤ−１を発現する。データは４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＥＭにて示す。Ｇ．Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１との７日間の共培養の後に１９２８ｚ−Ｅ２７細胞と比較して２Ｂ４＋ＰＤ−１＋１９２８ｚＴ細胞のパーセンテージの上昇を示す代表的フローサイトメトリープロットである。１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞はまた、２Ｂ４＋ＰＤ−１＋集団について、より少ないＢＴＬＡおよびＴＩＭ３を発現する。示したデータは、３回の独立した実験の代表である。

Ｅ２７は、ＰＤ−Ｌ１に関してＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞の増殖能力を保護することを示す。Ａ．ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヒトＰＤ−Ｌ１を発現するようレトロウイルスにより改変し（３Ｔ３−ＰＤＬ１）、ＰＤ−Ｌ１に特異的なｍＡｂで染色した。親ＮＩＨ３Ｔ３（３Ｔ３−空）はＰＤ−Ｌ１を発現せず、３Ｔ３−ＰＤＬ１腫瘍細胞は高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現した。Ｂ．１９２８ｚおよび１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞を３Ｔ３−空または３Ｔ３−ＰＤＬ１細胞とともに培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。細胞を数え上げ、３、６、９および１２日目に新しい３Ｔ３細胞上に再び蒔いた。１９２８ｚＴ細胞は３Ｔ３−空細胞と比較して３Ｔ３−ＰＤＬ１細胞とともに培養した場合に増殖の低下を示した。１９２８ｚ−Ｅ２７細胞は、３Ｔ３−空または３Ｔ３−ＰＤＬ１細胞上で培養した場合に同等の増殖を示した。示したデータは、４回の独立した実験からの平均倍数増殖＋／−ＳＥＭである。Ｃ．３Ｔ３−空細胞上で培養した１９２８ｚＴ細胞と比較して、３Ｔ３−ＰＤＬ１とともに培養した１９２８ｚＴ細胞上の２Ｂ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ３の発現の上昇を示す代表的フローサイトメトリープロットである。１９２８ｚ−Ｅ２７細胞は、３Ｔ３−空および３Ｔ３−ＰＤＬ１とともに培養した場合、２Ｂ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ−４およびＴＩＭ３の同等の発現を示した。示したデータは、３回の独立した実験の代表である。

Ｅ２７ｓｃＦｖを分泌するＣＡＲＴ細胞はインビボで上昇した抗腫瘍機能を有することを示す。ＳＣＩＤ−ベージュマウスにＲａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞を静脈内に接種し、翌日にＣＡＲＴ細胞を静脈内に注入した。１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞で処理したマウスは、１９２８ｚＴ細胞で処理したマウスと比較して向上した生存を示した。１９２８ｚＴ細胞で処理したマウスは非処理マウスおよび無関係の抗原を標的としたＣＡＲＴ細胞である、４Ｈ１１２８ｚおよび４Ｈ１１２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞で処理したマウスよりも長く生存した。示したデータは２回の独立した実験からのものである。

抗ＰＤ−１抗体である、ＥＴ１３０−２３、ＥＴ１３０−２６およびＥＴ１３０−２７を用いたＰＤ１／ＰＤＬ１ブロッキングＥＬＩＳＡの結果を示す。ＥＴ９０１（陰性対照）は結合を示さず、一方ＥＴ１３０−２３、ＥＴ１３０−２６およびＥＴ１３０−２７は、０．０３１と１０μｇ／ｍｌとの間の濃度範囲にわたってＰＤ１／ＰＤＬ１結合に対するブロッキング効果を示した。

抗ＰＤ−１抗体である、ＥＴ１３０−２３、ＥＴ１３０−２６およびＥＴ１３０−２７を用いたＰＤ１／ＰＤＬ２ブロッキングＥＬＩＳＡの結果を示す。ＥＴ９０１（陰性対照）は結合を示さず、一方ＥＴ１３０−２３、ＥＴ１３０−２６およびＥＴ１３０−２７は、０．０３１と１０μｇ／ｍｌとの間の濃度範囲にわたってＰＤ１／ＰＤＬ１結合に対するブロッキング効果を示した。

発明の詳細な説明

本明細書において言及するすべての刊行物、特許およびその他の引用文献は、それら全体が本開示に引用により組み込まれる。

本開示を実施するにあたり、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の多くの従来技術が使用され、それらは当業者の技術範囲内である。これらの技術は、より詳細に、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｆ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ２００１；ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＭｅｌｖｙｎＬｉｔｔｌｅ，ｅｄ．ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ２００９；「ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ，ｅｄｓ．，１９８７，および定期的アップデート）；「ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓｅｔａｌ，ｅｄ．，１９９４）；「ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」（ＰｅｒｂａｌＢｅｒｎａｒｄＶ．，１９８８）；「ＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（Ｂａｒｂａｓｅｔａｌ，２００１）において記載される。製造業者らの指示書を含む、当業者に広く知られ、信頼されている標準的プロトコールを含むこれらの引用文献およびその他の引用文献の内容は、本開示の一部として引用により本明細書に組み込まれる。

以下の記載において、用語の使用に関してはいくつかの慣習にしたがう。一般に、本明細書に使用される用語は、当業者に知られているその用語の意味と一致するよう解釈されることが意図される。

「抗原結合性タンパク質」は、抗原結合領域または抗原結合部分を含むタンパク質またはポリペプチド、即ち、それが結合するその他の分子に対して強い親和性を有するタンパク質またはポリペプチドである。抗原結合性タンパク質は、抗体、キメラ抗原受容体および融合タンパク質を包含する。

「抗体」および「複数の抗体」はそれらの用語が当該技術分野において知られている通り、免疫系の抗原結合性タンパク質のことをいう。本明細書において言及される「抗体」という用語は、全体の、全長抗体および「抗原結合部分」または「抗原結合領域」が保持されているその任意の断片、またはその単鎖を含む。天然の「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略称する）および重鎖定常（ＣＨ）領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと略称する）および軽鎖定常ＣＬ領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域により分散された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端の順に以下の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合領域」という用語は、本明細書において用いる場合、抗原特異性を付与する抗体の領域または部分をいい；抗原結合性タンパク質の断片、例えば、抗体は、それゆえ抗原（例えば、ＨＬＡ−ペプチド複合体）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行され得ることが示されている。抗体の「抗体断片」という用語に包含される抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域にてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるＦａｂ断片（Ｗａｒｄｅｔａｌ，１９８９Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４〜５４６）；および単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。

さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインである、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子にコードされているが、それらは、それらをＶＬおよびＶＨ領域が対となって一価分子を形成している一本のタンパク質鎖として作ることを可能とする合成リンカーによって、組換え方法を用いて連結することができる。これらは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ，１９８８Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎｅｔａｌ，１９８８Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９〜５８８３を参照されたい。かかる単鎖抗体もまた抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に含まれる意図である。これらの抗体断片は当業者に知られた常套技術を用いて得られ、これら断片はインタクトな抗体と同様にして有用性についてスクリーニングされる。

「組換え抗体」または「組換え抗原結合性タンパク質」は、組換えにより作成された抗原結合性タンパク質、例えば、抗体への包含について、結合特性に基づいて同定され、選択された抗原結合部分を有するものである。

「その相同配列」という用語は、表１〜１４に示される配列に対して６０〜９９．９％同一であるアミノ酸およびヌクレオチド配列をいう。ある実施形態において、相同配列は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性を有する。１つの実施形態において、相同配列は９５〜９９．９％の同一性を有し；別の実施形態において、相同配列は９８〜９９．９％の同一性を有する。

１つの実施形態において、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を選択し、試験した。ｓｃＦｖは、独占の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）完全にヒト抗体ｓｃＦｖファージライブラリー（ＥｕｒｅｋａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅＣＡ）であるファージディスプレーライブラリーから単離した。このライブラリーは、１００名を超える白人およびアジア人の健康ドナー、および自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、強皮症等を有するドナーからのヒト抗体レパートリーから構成される。

抗体ファージパニングに使用した抗原は、組換え融合タンパク質である、ヒトＩｇＧ１
Ｆｃに融合させたＰＤ−１細胞外ドメイン（ＰＤ−１ＥＣＤ−Ｆｃドメイン）であった。ＰＤ−１ＥＣＤおよびｈＩｇＧ１ＦｃをコードするＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）により合成された。ＤＮＡ配列を次いでＥｕｒｅｋａの所有する哺乳類発現ベクターにサブクローニングし、これを次いで融合タンパク質発現のためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＰＤ−１ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を細胞が死滅した後にＨＥＫ２９３細胞培地から標準的ＦＰＬＣ方法によって精製した。

ヒトｓｃＦｖ抗体ファージディスプレーライブラリーをｍＡｂクローンの選択のために使用する。簡単に説明すると、ビオチン化抗原（ＰＤ−１ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質）をまずヒトｓｃＦｖファージライブラリーと混合することができ、次いで抗原−ｓｃＦｖ抗体複合体を、ストレプトアビジン−接合ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０により磁気ラックを介してプルダウンすることができる。結合したクローンを次いで溶出し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させるのに使用することができる。細菌中で発現したｓｃＦｖファージクローンを精製することができる（ＹａｓｍｉｎａＮＡ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｂｉｎｇｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄａｆｆｉｎｉｔｙｏｆｔａｎｅｚｕｍａｂ，ａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉ−ＮＧＦｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ｕｓｉｎｇａｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｏｆｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ２００８；１７（８）：１３２６〜１３３５；ＲｏｂｅｒｔｓＷＫ，ｅｔａｌ．ＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＣＤ２０ｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎｄｕｃｅｓａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ２００２：９９（１０）：３７４８〜３７５５）。パニングを３〜４サイクル行って、ＰＤ−１に特異的に結合するｓｃＦｖファージクローンを濃縮することができる。陽性クローンは、ビオチン化単鎖ＰＤ−１に対する標準的ＥＬＩＳＡ方法によって決定することができる。陽性クローンは、生細胞表面上のＰＤ−１へのそれらの結合について、ＰＤ−１^＋細胞株、例えば、３Ｔ３細胞株を用いてフローサイトメトリーによってさらに試験することができる。

本開示により包含されるいくつかのクローンを、本明細書においてクローン１４、１６、１８、１９、２３、２６、２７、３１、３６、３７、４０、４２、４６、および４７と称する。これらの実施形態をコードする可変軽（ＶＬ）および可変重（ＶＨ）鎖アミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下の表１〜１４に示す。ある実施形態において、ＶＬおよびＶＨ配列をセリングリシンリンカーによって連結してｓｃＦｖを形成した。ある実施形態において、ＨＡ／Ｈｉｓタグを、ｓｃＦｖの検出を可能とするために含めることができる。

ある実施形態において、本開示は、二価タンパク質が生じるようにヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を有する抗体を形成するよう、重鎖の１以上の定常ドメインと融合させたｓｃＦｖ配列を有する抗体を含み、これにより、抗体の全体の結合活性（ａｖｉｄｉｄｔｙ）および安定性が上昇する。さらに、例えば、抗原定量研究における使用のために、親和性測定のために抗体を固定化するために、治療薬の標的化送達のために、免疫エフェクター細胞を用いてＦｃ−媒介細胞毒性を試験するために、およびその他の多くの用途のために、Ｆｃ部分は、これらに限定されないが、蛍光色素、細胞毒素、放射性同位元素等が含まれる他の分子の抗体との直接の接合を可能とする。

ある実施形態において、抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質は、タンパク質安定性、抗体結合、発現レベルを改良するよう、または治療薬の接合のための部位を導入するよう、設計された１以上のフレームワーク領域アミノ酸置換を含み得る。これらのｓｃＦｖは次いで、当業者に知られた方法にしたがって組換えヒトモノクローナルＩｇを産生するために使用される。

ある実施形態において、抗原結合性タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。キメラ抗原受容体療法（ＣＡＲ−Ｔ療法）は、標的化免疫療法の新しい形態である。それは、モノクローナル抗体の精巧な標的化特異性と、細胞傷害性Ｔ細胞によって提供される強力な細胞傷害性および長期間持続性とを組み合わせたものである。この技術は、Ｔ細胞が内因性ＴＣＲとは独立した長期間新規抗原特異性を獲得することを可能とする。臨床試験により、神経芽細胞腫（ＬｏｕｉｓＣ．Ｕ．ｅｔａｌ，Ｂｌｏｏｄ１１８（２３）：６０５０〜６０５６）、Ｂ−ＡＬＬ（ＭａｕｄｅＳ．Ｌ．ｅｔａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７１（１６）：１５０７〜１５１７，２０１４）、ＣＬＬ（ＢｒｅｎｔｊｅｎｓＲ．Ｊ．ｅｔａｌ，Ｂｌｏｏｄ１１８（１８）：４８１７〜４８２８，２０１１）およびＢ細胞リンパ腫（ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪ．Ｎ．ｅｔａｌ，Ｂｌｏｏｄ．１１６（２０）：４０９９〜４１０２，２０１０）においてＣＡＲ−Ｔ療法の臨床的に有意な抗腫瘍活性が示されている。１つの研究において、ＣＤ１９−ＣＡＲＴ療法で治療したＢ−ＡＬＬを有する３０名の患者における９０％の完全寛解率が報告された（ＭａｕｄｅＳ．Ｌ．ｅｔａｌ，前掲）。

ある実施形態において、キメラ抗原受容体は、抗体部分を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列および同時刺激シグナル伝達配列を含む。ある実施形態において、同時刺激シグナル伝達配列は、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列である。

本開示のその他の態様には、限定されないが、ＰＤ１関連疾患の治療のため、診断および予後判定用途ならびに細胞および組織におけるＰＤ１の検出のためのリサーチツールとしての使用のための、抗原結合性タンパク質およびそれらをコードする核酸の使用が含まれる。開示された抗原結合性タンパク質および核酸を含む医薬組成物が本開示に包含される。ベクター化免疫療法による抗体に基づく治療のための本開示の核酸を含むベクターもまた、本開示により意図される。ベクターは、抗体の発現および分泌を可能とする発現ベクター、ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原結合性タンパク質の細胞表面発現に向けられたベクターを含む。

核酸を含む細胞、例えば、本開示のベクターによりトランスフェクトされた細胞もまた本開示に包含される。

診断および研究用途における使用のための、本開示のＰＤ１抗体または核酸、アッセイ試薬、バッファーなどを含有するキットもまた提供される。

抗原結合性タンパク質が全長抗体である１つの実施形態において、本開示の抗体の重および軽鎖は全長であってもよく（例えば、抗体は、少なくとも１つ、好ましくは２つの、完全な重鎖、および少なくとも１つ、好ましくは２つの、完全な軽鎖を含み得る）または抗原結合部分（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖ断片（「ｓｃＦｖ」））を含むものであってもよい。別の実施形態において、抗体重鎖定常領域は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択される。ある実施形態において、免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択され、より具体的には、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）である。抗体タイプの選択は、抗体が誘発するよう設計された免疫エフェクター機能に依存するであろう。

組換え免疫グロブリンの構築において、様々な免疫グロブリンアイソタイプの定常領域についての適当なアミノ酸配列および広範な抗体を産生する方法は当業者に知られている。

本明細書において同定された抗原結合性タンパク質をコードする核酸は、組換え免疫エフェクター細胞を操作するために利用することができる。遺伝子操作されたＴ−細胞を作成するための方法およびベクターは、例えば、当該技術分野において知られている（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓｅｔａｌ，ＳａｆｅｔｙａｎｄｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅｏｆａｄｏｐｔｉｖｅｌｙｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄａｕｔｏｌｏｇｏｕｓＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄＴｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｒｅｌａｐｓｅｄｏｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｒｅｆｒａｃｔｏｒｙＢ−ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａｓ，Ｂｌｏｏｄ１１８（１８）：４８１７〜４８２８，２０１１年１１月を参照されたい）。

本開示のその他の実施形態には、本開示の抗原結合性タンパク質またはそれらの抗原結合性断片をコードする核酸を含む細胞および発現ベクターが含まれる。細胞は、本開示にしたがって抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体を発現するよう遺伝子操作されたＴ−細胞などの組換え免疫エフェクター細胞であり得る。本開示にしたがって抗体を産生するよう操作された細胞もまた本開示に包含される。

さらに、本開示は、以下を含む本開示の抗体または抗体断片の産生方法を含む：（ａ）核酸配列が発現され、それにより軽および重鎖可変領域を含むポリペプチドが産生される条件下で培地中で本開示の抗体または抗体断片をコードする核酸を含む組換え細胞を培養すること；および（ｂ）宿主細胞または培地からポリペプチドを回収すること。

本開示の抗原結合性タンパク質のいくつかの実施形態は、アンタゴニスト性抗ＰＤ１抗体ならびにＰＤ１のアゴニストとして機能する抗ＰＤ１抗体を包含する。いくつかの抗ＰＤ１抗体はアンタゴニストであり、即ち、それはそのリガンドによるＰＤ１の結合をブロックするが、他の抗ＰＤ１抗体はアゴニスト、即ち、ＰＤ−１の免疫抑制シグナルを増強する効果を有し、例えば、自己免疫の治療に有用なものとする抗体である。アンタゴニスト活性を示す本開示の抗体にはクローン２３および２７が含まれるが、クローン１６、１８、２６、３１および４０はアゴニストとして機能するようである。

本開示はまた、本開示の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片の免疫応答を上昇させる医薬の調製のための使用ならびに本開示の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片の癌を治療する医薬の調製のための使用も含む。

本明細書に開示する抗原結合性タンパク質、抗体、核酸、ベクターまたは核酸または抗原結合性タンパク質を含む細胞を、医薬上許容され得る担体とともに含む医薬組成物もまた本開示に含まれる。

本開示は、本開示の抗ＰＤ−１抗体または抗体断片のワクチンアジュバントとしての使用もまた含む。

別の態様において、本開示は、本明細書に開示する抗原結合性タンパク質、抗体またはその抗原結合性断片である第１成分を含む免疫接合体に関する。免疫接合体は、細胞毒素、検出可能標識、放射性同位元素、治療薬、第２のアミノ酸配列を有する結合性タンパク質または分子である第２成分を含む。第２成分が結合性タンパク質または第２抗体である場合、結合性タンパク質または第２抗体は、第１成分が特異的であるＨＬＡ−ペプチド複合体とは異なる標的に対する結合特異性を有する。

本開示はまた、対象に、治療上有効量の、本明細書に開示する抗原結合性タンパク質、抗体またはその抗原結合性断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、抗原結合性タンパク質をコードする核酸または核酸もしくはタンパク質を含む細胞を投与することを含む、ＰＤ−１関連疾患を有する対象の治療方法に関する。

当業者であれば、いくつかの実施形態が本発明の範囲と精神の枠内で可能であることを認識するであろう。ここで、本発明を以下の非限定的な実施例に言及することにより、より詳細に記載する。以下の実施例は本発明をさらに例証するが、もちろん、その範囲をなんら限定するものと解釈すべきではない。

実施例１
ｓｃＦｖがＰＤ−１連結を阻害する能力を試験するために、ｓｃＦｖ−Ｆｃドメイン（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）融合タンパク質を作成し、ここで、ｓｃＦｖをマウスＦｃ（マウスＩｇＧ１ａ）ドメインに連結させた。ｓｃＦｖ−Ｆｃクローンを次いで、ＥＬＩＳＡプレートをヒトＰＤ−１単量体でコーティングすることにより、ＰＤ−１に結合する能力について分析した。ｓｃＦｖのＰＤ−１への結合をＨＲＰ−接合抗マウスＩｇＧ１Ｆｃ二次抗体を用いて定量した。７つのすべての抗体は、用量依存的にＰＤ１単量体に関して結合活性を示した（図１）。ＥＴ９０１ＳｃＦｖ−Ｆｃ（マウスＩｇＧ１Ｆｃ）を陰性対照として用いた。ｓｃＦｖ−Ｆｃクローンの結合親和性を順位付けしたところ、クローン３１が弱く結合し、クローン２６および２７が最も強く結合した（３１＜２３＜４０＜１８＜１６＝２７＜２６）。

実施例２
ＰＤ−Ｌ１と相互作用するＰＤ−１を阻害するｓｃＦｖ−Ｆｃの能力を試験するために、模式的に図２Ａに示す競合的リガンド−結合アッセイを行った。このアッセイにおいて、ＰＤ−Ｌ１−ＦｃをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ビオチン化−ＰＤ１−Ｆｃを段階希釈したＥＴ９０１ＳｃＦｖ−Ｆｃ（陰性対照）または抗ＰＤ１ＳｃＦｖ−Ｆｃと混合し、次いでＰＤ−Ｌ１−Ｆｃコートプレート中に添加した。プレート上にコーティングされたＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１−Ｆｃの結合をＨＲＰ−接合ストレプトアビジンを介して可視化した（図２Ｂ）。同様の濃度のｓｃＦｖ−Ｆｃを比較した場合（丸で囲む）、ＰＤ−１−ＰＤＬ１相互作用を破壊する能力を順位付けしたところ、クローン４０および２３が最も弱く、クローン２６が最も強い破壊能力を有していた（２６＞２７＝１６＞１８＞３１＞２３＝４０、図２Ｂ）。

実施例３
これらのクローンを次いで特異的Ｔ細胞機能を制御するそれらの能力について調べた。本発明者らは以前に、Ｔ細胞が腫瘍−特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようレトロウイルスにより形質導入されている、腫瘍−標的化Ｔ細胞を作成している。本発明者らは以前に、ＣＡＲの発現が所与の抗原を標的化するＴ細胞機能を再指示したことを実証している（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｓａｎｔｏｓｅｔａｌ，２００７）。本発明者らの研究室において、本発明者らは、１９２８ｚと称するＣＤ１９に特異的なＣＡＲを用いてＢ細胞悪性腫瘍を標的とする（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｓａｎｔｏｓら．２００７）。本発明者らは以前に、ＣＡＲ改変Ｔ細胞がインビトロおよびインビボおよび臨床研究において有意な抗腫瘍活性を示したことを実証している（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｌａｔｏｕｃｈｅら．２００３；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｄａｖｉｌａら．２０１３；Ｄａｖｉｌａ，Ｒｉｖｉｅｒｅら．２０１４）。７つのｓｃＦｖクローンが、アゴニスト性であるか（ＰＤ−１を刺激する）、アンタゴニスト性であるか（ＰＤ−１をブロックする）またはＰＤ−１に対して有意な効果を有さないかを決定するために、本発明者らは、抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ遺伝子の近位にマウスカッパリーダー配列を含めることにより分泌可能ｓｃＦｖを作成した（図３）。本発明者らは次いで、１９２８ｚＣＡＲの発現および形質導入されたヒト末梢血Ｔ細胞からの抗ＰＤ−１ｓｃＦｖの分泌を誘導するために２シストロン性レトロウイルスベクターを作成した。

実施例４
ＰＤ−１刺激がＴ細胞の増殖および機能を阻害する能力があるので、本発明者らは引き続いてＴ細胞増殖に対する抗ＰＤ−１ｓｃＦｖの効果を特徴決定する探索を行った。これを達成するために、ヒトＴ細胞を健康ドナーの末梢血から単離し、以前に記載されている方法を用いて、ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖを分泌するようレトロウイルス形質導入を介して改変した（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ、Ｓａｎｔｏｓら．２００７）。形質導入の後、改変されたＴ細胞をインビトロでの増殖についてモニターした（図４）。１９２８ｚＣＡＲを発現し、ＰＤ−１特異的ｓｃＦｖクローン２３および２７を分泌するＴ細胞は、１９２８ｚＣＡＲのみを発現するよう改変されたＴ細胞と同様に増殖した。ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖクローン１６、１８、２６、３１または４０を分泌するよう改変された細胞は増殖せず、これらのＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖクローンがアゴニスト性であり、潜在的にＰＤ−１を刺激し、そしてＴ細胞増殖の低下をもたらしたことが示唆された。

実施例５
増殖研究に加えて、本発明者らは、（ＣＡＲを発現する、またはＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖを分泌する）Ｔ細胞を、ＣＤ１９^＋バーキットリンパ腫腫瘍細胞株、Ｒａｊｉと共培養し、Ｔ細胞からのサイトカイン分泌のレベルを決定した。図５に示されるように、１９２８ｚＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖクローン２３または２７を分泌するよう改変されたＴ細胞は、ＣＡＲのみを発現するよう改変された細胞と比較してＩＦＮ−γの分泌の上昇を示し、これらのｓｃＦｖクローンがＰＤ−１シグナル伝達に関してアンタゴニスト性であったことが示唆された。１９２８ｚＣＡＲを発現し、ＰＤ−１−特異的ｓｃＦｖクローン１６、１８、２６、３１または４０を分泌するよう改変された細胞は、ＣＡＲのみにより改変された細胞と比較してより少ないＩＦＮ−γを分泌し、これらのｓｃＦｖがＰＤ−１に関してアゴニスト性であり、Ｔ細胞機能を阻害したことが示唆された。

実施例６
１９２８ＣＡＲおよびＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖを発現するよう改変されたヒトＴ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ＣＡＲの発現の検証（図６）の後、ｓｃＦｖの存在を、細胞可溶化液における検出を可能とするようにゴルジ阻害剤で処理されたヒトＴ細胞から調製した可溶化液についての（ｓｃＦｖ設計において組み込まれたＨＡタグに対して特異的な抗体を使用する）ウェスタンブロットを使用して決定した。１９２８ｚＣＡＲおよびクローン２３を発現するよう改変されたヒトＴ細胞では、その他のクローンと比較してｓｃＦｖタンパク質が有意に少なかった（図７）。これらの細胞を次いで、ＰＤ−１リガンドである、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２を発現するか、または発現しない、３Ｔ３マウス線維芽細胞（人工抗原提示細胞、ａＡＰＣ）上に蒔いた。ａＡＰＣとの２４時間の培養の後、ヒトＴ細胞を活性化させるために培養物にＣＤ３／Ｄ２８ビーズを添加した。ヒトＴ細胞、ａＡＰＣおよびビーズの培養の３日後、ヒトＴ細胞を数え上げて、ＰＤ−１リガンドの存在がヒトＴ細胞のビーズに駆動される増殖を阻害したか、または抗ＰＤ−１ｓｃＦｖがＴ細胞増殖のＰＤ−１リガンドに媒介される阻害を妨げたかを、決定した。１９２８ｚＣＡＲおよび抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン２６および２３を発現するよう改変されたＴ細胞では、抑制性リガンドを発現しないａＡＰＣと比較してＰＤ−Ｌ１／Ｌ２を発現するａＡＰＣ上での増殖が低下していた（図８）。一方、１９２８ｚＣＡＲおよび抗ＰＤ−１ｓｃＦｖクローン２７を発現するよう改変されたＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２を発現するａＡＰＣ上での増殖が上昇していた。

実施例７
当該技術分野において知られている組換え技術を使用して、ＰＤ−１特異的ｓｃＦｖから組換えヒトモノクローナル抗体を作成し、即ち、対応するｓｃＦｖにおいてみられるものと同じ可変重および軽鎖を有する完全にヒトのＩｇ分子を作った（上記表１〜１４および図９を参照されたい）。これらのモノクローナル抗体のＰＤ−１への結合をフローサイトメトリーを使用して実証した（図１０を参照されたい）。

ヒトＴ細胞を、ヒトＰＤ−１を過剰発現するように改変し、次いで１μｇ／ｍｌの抗体とともにインキュベートした。クローン２７ｍＡｂはＰＤ−１Ｔ細胞に最も結合し、次いでクローン２６であり、そして次にクローン２３であった（図９）。対照モノクローナル抗体である、９０１は、ＰＤ−１Ｔ細胞に結合しなかった。これらの抗体とともにインキュベートしたＴ細胞を次いで、ＰＤ−１リガンドの、Ｔ細胞の増殖およびモノクローナル抗体がこの相互作用を妨げる能力に対する影響を決定するために、ビーズとともに人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）上に蒔いた。抗ＰＤ−１クローン２７モノクローナル抗体とともにインキュベートされた１９ｚ１Ｔ細胞は、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２ａＡＰＣ上でより高い程度に増殖した。

実施例８
ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２を発現するａＡＰＣ上でインキュベートされた、第１世代ＣＡＲを発現するよう改変されたＴ細胞は、抗ＰＤ−１クローン２７モノクローナル抗体が存在する場合、増殖する。第１世代ＣＤ１９−特異的ＣＡＲ（１９ｚ１）を発現するよう改変されたヒトＴ細胞を、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とともに２４時間インキュベートし、次いでＰＤ−Ｌ１／Ｌ２を発現するか、または発現しないａＡＰＣ上に置いた。ａＡＰＣによる２４時間の刺激の後、細胞を次いでＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激した。３日後、細胞を数え上げた。モノクローナル抗体なしでインキュベートした１９ｚ１Ｔ細胞、対照抗体（９０１）およびクローン２３および２６モノクローナル抗体とともにインキュベートした１９ｚ１Ｔ細胞は、抑制性リガンドなしのａＡＰＣ上（図１１黒色バー）と比較して、ＰＤ−１リガンドを発現するａＡＰＣ上での増殖（図１１白色バー）がより低かった。しかしながら、抗ＰＤ−１クローン２７モノクローナル抗体とともにインキュベートした１９ｚ１Ｔ細胞はＰＤ−Ｌ１／Ｌ２ａＡＰＣ上でより高い程度に増殖した。示したデータは１回の実験の代表である。

実施例９
ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖである、Ｅ２７を分泌するようさらに改変されたＣＡＲＴ細胞の作成。ＣＤ１９−特異的ＣＡＲ（１９２８ｚと称する）または卵巣腫瘍抗原特異的ＣＡＲ（４Ｈ１１２８ｚと称する）およびＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖである、Ｅ２７をコードする２シストロン性レトロウイルスコンストラクトを作成した（図１２Ａ）。Ｅ２７は、ｓｃＦｖの分泌を可能にするように、シグナルペプチドである、マウスＩｇＫにより先行された。Ｔ細胞からいったん分泌されたｓｃＦｖを検出するために、ＨＡ／Ｈｉｓタグもまた含めた。ヒト末梢血Ｔ細胞に、ＣＡＲ、１９２８ｚ、またはＣＡＲおよびＥ２７ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖ、１９２８ｚ−Ｅ２７をコードするレトロウイルスコンストラクトを形質導入した。形質導入の後、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ１９−標的化ＣＡＲに特異的に結合する、１９Ｅ３と称する抗体を用いて、ＣＡＲの発現を検出した（図１２Ｂ）。形質導入されたヒトＴ細胞からの上清のウェスタンブロット分析を利用して、抗ＨＡ抗体を用いてＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖを検出した（図１２Ｃ）。本発明者らはまた、ＣＡＲおよび対照ｓｃＦｖである、Ｂ６を発現するよう改変されたＴ細胞からのｓｃＦｖ分泌を調べ、これは抗ｃ−ｍｙｃタグ抗体を用いて検出した。２つのＣＤ１９^＋腫瘍標的に対する標準的^５１Ｃｒ放出アッセイを行って、ｓｃＦｖの分泌が、ＣＡＲがＴ細胞の細胞溶解能力を再指示する能力を妨げないことを確証した。ＣＡＲのみ（１９２８ｚまたは４Ｈ１１２８ｚ対照ＣＡＲ）、ＣＡＲおよびＥ２７ｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｅ２７または４Ｈ１１２８ｚ−Ｅ２７）、またはＣＡＲおよび対照ｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｂ６Ｈ１２．２または４Ｈ１１２８ｚ−Ｂ６Ｈ１２．２）のいずれかを発現するＣＡＲＴ細胞を、^５１Ｃｒ標識化腫瘍細胞（ＲａｊｉまたはＮａｌｍ６）とともに４時間インキュベートした。ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞は、腫瘍標的を同等のレベルで溶解することができ、卵巣−標的化ＣＡＲＴ細胞はＲａｊｉもＮａｌｍ６も溶解することができなかった（図１２Ｄ）。それゆえ、本発明者らは、ｓｃＦｖの分泌は、ＣＡＲがＴ細胞溶解能力を再指示する能力を妨げなかったと結論する。

実施例１０
ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖを分泌するよう改変されたＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１相互作用からの阻害に、インビトロで耐える。ＣＡＲのみ（１９２８ｚ）、またはＣＡＲおよびＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｅ２７）を発現するＴ細胞を３Ｔ３空細胞またはヒトＰＤ−Ｌ１を発現するよう改変された３Ｔ３細胞上で培養した。３Ｔ３フィーダー細胞上での２４時間の後、細胞を、１：３のビーズ：Ｔ細胞比にて培養物に添加したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激した。Ｔ細胞の増殖をトリパンブルーでの数え上げにより決定し、新しいビーズを２回培養物に添加した（矢印によって示す）。１９２８ｚＴ細胞は、３Ｔ３空フィーダー細胞上で増殖したが、しかし、３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１フィーダー細胞上では増殖しなかった。一方、１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、３Ｔ３空および３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１フィーダー細胞の両方の上で増殖し、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１に媒介される抑制に対する抵抗性が示された（図１３Ａ）。図１３Ａに示すように３Ｔ３空または３Ｔ３−ＰＤ−Ｌ１細胞上でインキュベートしたＴ細胞をフローサイトメトリーによって分析して、抑制性受容体である、ＰＤ−１、２Ｂ４およびＬＡＧ３についての発現を検出した。１９２８ｚ細胞は、１９２８ｚ−Ｅ２７細胞よりも上昇したレベルのＰＤ−１を発現した（示さず）。ＰＤ−１^＋細胞でゲートをかけた場合、２Ｂ４およびＬＡＧ３の分析により、１９２８ｚ細胞は、１９２８ｚ−Ｅ２７細胞と比較してＰＤ−１^＋、２Ｂ４^＋およびＬＡＧ３^＋細胞のより高い割合を有していたことが明らかになった（図１３Ｂ）。形質導入されたＴ細胞を、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（１：１、１：３、１：５）で７２時間、Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１またはＮａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞とともに培養した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９抗体での染色後のフローサイトメトリーおよびビーズの数え上げを使用して、腫瘍標的の溶解およびＴ細胞の増殖を経時的にモニターした。１９２８ｚ−Ｅ２７細胞は、ＰＤＬ１^＋腫瘍細胞とともに培養した場合、１９２８ｚＴ細胞と比較してより高いレベルで増殖し続けた（図１３Ｃ）。形質導入されたＴ細胞を図１３Ｃに示すようにＮａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞で刺激し、Ｎａｌｍ６−ＰＤＬ１腫瘍細胞で１：５のＴＥ：Ｔ比で再刺激した。４８時間の共培養の後、フローサイトメトリーを使用して腫瘍標的の溶解を決定した。１９２８ｚ−Ｅ２７は、１９２８ｚ細胞と比較して再刺激の際にＰＤ−Ｌ１腫瘍標的を溶解する能力を保持していた（図１３Ｄ）。

実施例１１
ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖを分泌するよう改変されたＴ細胞のインビボ抗腫瘍効力を図１４に示す。ＳＣＩＤ−ベージュマウスに静脈内注入により０日目にＲａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞を接種した。１日目に、マウスに１０^６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を静脈内に注入し、生存を臨床的にモニターした。後肢麻痺が生じるとマウスを安楽死させた。

実施例１２
ＰＤ−１ブロッキングｍＡｂ候補である、Ｅ２７、Ｅ２６およびＥ２３を競合的結合アッセイにおいて使用して、様々な濃度で、ヒトには存在しないハプテンを標的とする対照ｍＡｂと比較してのＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合の妨害を検出した。Ｅ２３、Ｅ２６およびＥ２７ｍＡｂはすべてＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を妨げた（図１５Ａ）。１９２８ｚＣＡＲとともに分泌可能ｓｃＦｖを発現するよう形質導入された２９３Ｇｌｖ９パッケージング細胞からのＳＮについての、抗ＨＡ抗体により染色したウェスタンブロット。Ｅ２７ｓｃＦｖが最高レベルで検出され、それゆえ残りの研究において使用した（図１５Ｃ）。

実施例１３
Ｔ細胞を、ＣＡＲを発現し、ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖである、Ｅ２７を分泌するよう共改変することができる。図１６Ａは、１９２８ｚＣＡＲのみ（１９２８ｚ）または１９２８ｚＣＡＲおよびＥ２７ＰＤ−１ブロッキングｓｃＦｖ（１９２８ｚ−Ｅ２７）を形質導入した後の、１９２８ｚＣＡＲに特異的に結合する１９Ｅ３ｍＡｂによる染色の後での、同等のＣＡＲ発現を実証する代表的フローサイトメトリープロットである。図１６Ｂは、抗ＨＡｍＡｂで染色した、１９２８ｚおよび１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞からのＳＮについてのウェスタンブロットを示し、約３０ｋＤａタンパク質が１９２８ｚ−Ｅ２７細胞においてのみ示され、Ｅ２７ｓｃＦｖが、１９２８ｚ−Ｅ２７を形質導入されたＴ細胞から分泌されるが、ＣＡＲのみを形質導入されたＴ細胞からは分泌されないことを実証している。図１６Ｃは、形質導入の後に、１９２８ｚＴ細胞と比較して１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞上でのより低いレベルのＰＤ−１発現を実証する代表的フローサイトメトリーである。ＰＤ−１の発現は、１９２８ｚＴ細胞と比較して１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞上で統計的に有意により低かった。示されたデータは、４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＥＭである（図１６Ｄ）。Ｒａｊｉ腫瘍細胞の溶解はＥ２７ｓｃＦｖの分泌によって影響を受けなかったことを実証する４時間^５１Ｃｒ放出アッセイ。１９２８ｚおよび１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞はＲａｊｉ腫瘍細胞を同等に溶解した。対照４Ｈ１１２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、４Ｈ１１２８ｚＴ細胞と比較してＲａｊｉ細胞の溶解の上昇を媒介しなかった（図１６Ｅ）。示したデータは、２回の独立した実験の代表である。

実施例１４
ＣＡＲおよびＥ２７の発現は、ＣＤ１９^＋ＰＤ−Ｌ１^＋腫瘍細胞に関して、Ｔ細胞の増殖および溶解能力を保護する。Ｒａｊｉ腫瘍細胞を、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するようレトロウイルスにより改変し（Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１）、ＰＤ−Ｌ１に対して特異的なｍＡｂにより染色した。親Ｒａｊｉ腫瘍（Ｒａｊｉ）はＰＤ−Ｌ１を発現せず、Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞は高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現した（図１７Ａ）。図１７Ｂは、１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、７２時間の共培養の後のフローサイトメトリーにより決定して、１９２８ｚＴ細胞と比較してより多くのＲａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞を溶解することを示す代表的フローサイトメトリープロットを示す。１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、１９２８ｚＴ細胞と比較して統計的に有意により多くのＲａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞を溶解し、示されたデータは４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＥＭである（図１７Ｃ）。１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞は、フローサイトメトリーおよびビーズの数え上げにより決定して、Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞との共培養の後により多くの数に増殖し、示されたデータは４回の独立した実験からのＴ細胞の平均総数＋／−ＳＥＭである（図１７Ｄ）。図１７Ｅは、Ｒａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞との７日間の共培養の後の、１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞と比較して１９２８ｚＴ細胞上での上昇したＰＤ−１発現を示す、代表的フローサイトメトリープロットを示す。１９２８ｚＴ細胞は、パーセンテージ陽性細胞およびＰＤ−１染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して、１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞と比較して有意により多くのＰＤ−１を発現する。示されたデータは、４回の独立した実験からの平均＋／−ＳＥＭである（図１７Ｆ）。図１７Ｇは、７日間のＲａｊｉ−ＰＤＬ１との共培養の後に、１９２８ｚ−Ｅ２７細胞と比較して上昇したパーセンテージの２Ｂ４＋ＰＤ−１＋１９２８ｚＴ細胞を示す、代表的フローサイトメトリープロットを示す。１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞はまた、２Ｂ４＋ＰＤ−１＋集団について、より少ないＢＴＬＡおよびＴＩＭ３を発現する。示したデータは、３回の独立した実験の代表である。

実施例１５
Ｅ２７は、ＰＤ−Ｌ１に関してＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞の増殖能力を保護する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヒトＰＤ−Ｌ１を発現するようレトロウイルスにより改変し（３Ｔ３−ＰＤＬ１）、ＰＤ−Ｌ１に特異的なｍＡｂにより染色した。親ＮＩＨ３Ｔ３（３Ｔ３−空）は、ＰＤ−Ｌ１を発現せず、３Ｔ３−ＰＤＬ１腫瘍細胞は、高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現した（図１８Ａ）。１９２８ｚおよび１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞を３Ｔ３−空または３Ｔ３−ＰＤＬ１細胞とともに培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激した。細胞を数え上げ、３、６、９および１２日目に新しい３Ｔ３細胞上に再び蒔いた。１９２８ｚＴ細胞は３Ｔ３−空細胞と比較して３Ｔ３−ＰＤＬ１細胞とともに培養した場合に増殖の低下を示した。１９２８ｚ−Ｅ２７細胞は、３Ｔ３−空または３Ｔ３−ＰＤＬ１細胞上で培養した場合、同等の増殖を示した（図１８Ｂ）。示したデータは、４回の独立した実験からの平均倍数増殖＋／−ＳＥＭである。図１８Ｃは、３Ｔ３−空細胞上で培養した１９２８ｚＴ細胞と比較して３Ｔ３−ＰＤＬ１とともに培養した１９２８ｚＴ細胞上で２Ｂ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ３の発現の上昇を示す、代表的フローサイトメトリープロットである。１９２８ｚ−Ｅ２７細胞は、３Ｔ３−空および３Ｔ３−ＰＤＬ１とともに培養した場合、２Ｂ４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ−４およびＴＩＭ３の同等の発現を示した。示したデータは、３回の独立した実験の代表である。

実施例１６
Ｅ２７ｓｃＦｖを分泌するＣＡＲＴ細胞は、抗腫瘍機能のインビボでの上昇を示す。ＳＣＩＤ−ベージュマウスにＲａｊｉ−ＰＤＬ１腫瘍細胞を静脈内に接種し、翌日にＣＡＲＴ細胞を静脈内に注入した。図１９に示すように、１９２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞で処理されたマウスは１９２８ｚＴ細胞で処理されたマウスと比較して生存の向上を示した。１９２８ｚＴ細胞で処理したマウスは非処理マウスおよび無関係の抗原を標的としたＣＡＲＴ細胞である、４Ｈ１１２８ｚおよび４Ｈ１１２８ｚ−Ｅ２７Ｔ細胞で処理したマウスよりも長く生存した。示したデータは２回の独立した実験からのものである。

実施例１７
ＰＤ１／ＰＤＬ１結合に対するブロッキング効果を確認するために、抗ＰＤ−１抗体ＥＴ１３０−２３、ＥＴ１３０−２６およびＥＴ１３０−２７をＥＬＩＳＡにより試験した。図２０に示すように、ＥＴ９０１（陰性対照）は結合を示さず、一方、ＥＴ１３０−２３、ＥＴ１３０−２６およびＥＴ１３０−２７は、０．０３１〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたってＰＤ１／ＰＤＬ１結合に対してブロッキング効果を示した。

同様に、ＰＤ１／ＰＤＬ２結合に対するブロッキング効果を確認するために、ＥＴ１３０−２３、ＥＴ１３０−２６およびＥＴ１３０−２７をＥＬＩＳＡにより試験した。図２１に示すように、ＥＴ９０１（陰性対照）は結合を示さず、一方、ＥＴ１３０−２３、ＥＴ１３０−２６およびＥＴ１３０−２７は同じ濃度範囲にわたってＰＤ１／ＰＤＬ２結合に対するブロッキング効果を示した。ＥＴ１３０−２６はＰＤ１／ＰＤＬ２に対して最高のブロッキング効果を示し、一方、ＥＴ１３０−２３は最低の効果を示した。ブロッキングパターンは、ＰＤ１／ＰＤＬ１結合に対応している。

実施例１８
抗ＰＤ−１ｓｃＦｖまたはモノクローナル抗体の適用を、ｓｃＦｖまたはモノクローナル抗体が免疫応答を弱め、自己免疫疾患を消失させる能力について調べる。これはまた、ＧＶＨＤのマウスモデルを用いて調べることができる。ヒトＴ細胞の照射したＮＯＤ．ＳＣＩＤ．ＩＬ−２Ｒγ^−／−への注入の結果、ヒト細胞が生着し、ヒトＴ細胞がマウス組織を攻撃する重篤なＧＶＨＤが起こった。抗ＰＤ−１ｓｃＦｖを分泌するＴ細胞（またはモノクローナル抗体の注入により増強されたＴ細胞）を対象に注入し、ＧＶＨＤの発生を評価する。抗ＰＤ−１ｓｃＦｖ／ｍＡｂがアゴニスト性である場合、ＧＶＨＤ応答はヒトＴ細胞の抑制により阻害される。
例示的実施形態
１．以下の１つを含む組換え抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片：
（Ａ）配列番号１０、配列番号２１、配列番号３２、配列番号４３、配列番号５３、配列番号６１、配列番号７２、配列番号８３、配列番号９４、配列番号１０３、配列番号１１４、配列番号１２５、配列番号１３３、配列番号１４２；その断片およびその相同配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合領域；
（Ｂ）配列番号６および８；配列番号１７および１９；配列番号２８および３０；配列番号３９および４１；配列番号４９および５１；配列番号５７および５９；配列番号６８および７０；配列番号７９および８１；配列番号９０および９２；配列番号９９および１０１；配列番号１１０および１１２；配列番号１２１および１２３；配列番号１２９および１３１；配列番号１３８および１４０；それらの断片ならびにそれらの相同配列から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有する可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む抗原結合領域；
（Ｃ）以下を含む抗原結合領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１）、ＡＡＳおよびＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号２）をそれぞれ有する軽鎖相補性決定領域（ＬＣＣＤＲ）ＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＳＳＳＹＷ（配列番号４）、ＩＫＱＤＧＳＥＫ（配列番号５）およびＡＲＧＧＷＳＹＤＭ（配列番号６）をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域（ＨＣＣＤＲ）ＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＩＧＡＧＹＡ（配列番号１２）、ＴＮＮおよびＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＩ（配列番号１３）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＬＴＥＬＳ（配列番号１４）、ＦＤＰＥＤＧＥＴ（配列番号１５）およびＡＲＡＹＹＧＦＤＱ（配列番号１６）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＩＧＮＮＡ（配列番号２３）、ＹＮＤおよびＡＡＷＤＤＳＶＮＧＹＶ（配列番号２４）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＲＦＧ（配列番号２５）、ＩＳＶＮＮＧＮＴ（配列番号２６）およびＡＲＹＭＹＧＲＲＤＳ（配列番号２７）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｉｖ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＮＨＳＤＶＶ（配列番号３５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＲＮＫＦＳＳＹＡ（配列番号３６）、ＩＳＧＳＧＧＴＴ（配列番号３７）およびＡＲＷＹＳＳＹＹＤＶ（配列番号３８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｖ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＳＳＳＤＹＶ（配列番号４５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＮＹＩＳＭＦＤＳ（配列番号４８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｖｉ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶ（配列番号５５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＧＹＳＳＹＹＤＡ（配列番号５６）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｖｉｉ）アミノ酸配列ＲＳＮＩＧＥＮＴ（配列番号６３）、ＳＮＮおよびＡＡＷＤＤＲＬＮＧＹＶ（配列番号６４）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＮＹＧ（配列番号６５）、ＩＧＡＱＫＧＤＴ（配列番号６６）およびＡＲＳＱＧＶＰＦＤＳ（配列番号６７）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＳＮＩＧＳＮＴ（配列番号７４）、ＮＮＮおよびＡＴＷＤＤＳＬＮＥＹＶ（配列番号７５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＲＹＧ（配列番号７６）、ＩＳＧＹＮＧＮＴ（配列番号７７）およびＡＲＨＧＹＧＹＨＧＤ（配列番号７８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｉｘ）アミノ酸配列ＳＳＮＩＧＡＧＹＶ（配列番号８５）、ＨＮＮおよびＱＳＹＤＳＳＬＳＧＷＶ（配列番号８６）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＫＤＹＹ（配列番号８７）、ＩＳＴＳＧＮＳＶ（配列番号８８）およびＡＲＳＰＧＨＳＤＹＤＳ（配列番号８９）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｘ）アミノ酸配列ＮＩＧＤＫＳ（配列番号９６）、ＹＤＳおよびＱＶＷＡＳＧＴＤＨＰＹＶＩ（配列番号９７）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＭＹＧＳＹＴＤＭ（配列番号９８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｘｉ）アミノ酸配列ＳＳＮＩＧＹＮＹ（配列番号１０５）、ＲＮＮおよびＴＳＷＤＤＳＬＳＧＹＶ（配列番号１０６）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＮＡＦＴＮＦＹ（配列番号１０７）、ＩＮＰＳＧＴＤＬＴ（配列番号１０８）およびＡＲＱＹＡＹＧＹＳＧＦＤＭ（配列番号１０９）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｘｉｉ）アミノ酸配列ＱＳＶＳＮＷ（配列番号１１６）、ＡＡＳおよびＱＱＳＹＳＴＰＩＴ（配列番号１１７）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹＹ（配列番号１１８）、ＩＮＰＮＴＧＧＳ（配列番号１１９）およびＡＲＧＤＶＴＹＤＥ（配列番号１２０）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；
（ｘｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＤおよびＱＶＷＤＩＮＤＨＹＶ（配列番号１２７）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＳＱＡＳＦＭＤＩ（配列番号１２８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列；または
（ｘｉｖ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＤＤＳおよびＱＶＷＤＳＳＳＤＱＧＶ（配列番号１３５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＧＴＧＧＧＴ（配列番号１３６）およびＡＲＧＴＧＹＤＧＤＱ（配列番号１３７）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）；それらの断片ならびにそれらの相同配列。
２．前記タンパク質が抗体である、実施形態１に記載の組換え抗原結合性タンパク質。
３．前記抗体がヒト抗体である、実施形態２に記載の組換え抗原結合性タンパク質。
４．前記抗体またはその抗原結合性断片がインタクトなＩｇ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、実施形態２に記載の組換え抗原結合性タンパク質。
５．前記抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アゴニストである、実施形態１に記載の抗原結合性タンパク質。
６．前記抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アンタゴニストである、実施形態１に記載の抗原結合性タンパク質。
７．前記抗原結合性タンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態１に記載の抗原結合性タンパク質。
８．実施形態１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質をコードする核酸。
９．実施形態８に記載の核酸を含むベクター。
１０．実施形態１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、実施形態８に記載の核酸または実施形態９に記載のベクターを含む細胞。
１１．治療薬に接合した実施形態１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
１２．前記治療薬が、薬物、毒素、放射性同位元素、タンパク質、またはペプチドである、実施形態１１に記載の抗原結合性タンパク質。
１３．実施形態１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、実施形態８に記載の核酸、実施形態９に記載のベクター、実施形態１０に記載の細胞または実施形態１１もしくは１２に記載の抗原結合性タンパク質を含む、医薬組成物。
１４．医薬上許容され得る担体をさらに含む、実施形態１３に記載の医薬組成物。
１５．対象におけるＴ細胞応答を上昇させる方法であって、治療上有効量の、実施形態１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片、実施形態８に記載の核酸、実施形態９に記載のベクター、実施形態１０に記載の細胞、実施形態１１もしくは１２のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質または実施形態１３もしくは１４のいずれかに記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
１６．前記抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、ＰＤ−１によって媒介されるシグナル伝達を阻害する、低下させる、調節する、または消失させる、実施形態１５に記載の方法。
１７．ＰＤ１−陽性疾患を有する対象を治療する方法であって、治療上有効量の、実施形態１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片、実施形態８に記載の核酸、実施形態９に記載のベクター、実施形態１０に記載の細胞、実施形態１１もしくは１２のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質または実施形態１３もしくは１４のいずれかに記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
１８．前記抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、それに連結した細胞毒性部分を有する接合体である、実施形態１７に記載の方法。
１９．前記ＰＤ−１陽性疾患が癌である、実施形態１７または１８に記載の方法。
２０．実施形態１から７のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ１抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片、実施形態８に記載の核酸、実施形態９に記載のベクター、実施形態１０に記載の細胞、実施形態１１もしくは１２のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質または実施形態１３もしくは１４のいずれかに記載の医薬組成物の、ＰＤ１リガンドに対するＰＤ１の結合を阻害することによるＰＤ１−陽性疾患の治療のための、使用。
２１．前記ＰＤ１−陽性疾患が癌である、実施形態２０に記載の使用。
２２．実施形態１から７のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ１抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片、実施形態８に記載の核酸、実施形態９に記載のベクター、実施形態１０に記載の細胞、実施形態１１もしくは１２のいずれかに記載の抗原結合性タンパク質または実施形態１３もしくは１４のいずれかに記載の医薬組成物の、ＰＤ−１シグナル経路を阻害することによる免疫調節のための、使用。
２３．組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターであって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、ベクター。
２４．実施形態２３に記載のベクターを含む、細胞。
２５．組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む細胞であって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、細胞。
２６．組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質およびキメラ抗原受容体を含む細胞であって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、細胞。
２７．前記キメラ抗原受容体がＰＤ−１に特異的に結合するものではない、実施形態２３から２６のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
２８．前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が抗体である、実施形態２３から２７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
２９．前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がヒト抗体である、実施形態２３から２８のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
３０．前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、インタクトなＩｇ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、実施形態２３から２９のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
３１．前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アゴニストである、実施形態２３から３０のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
３２．前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アンタゴニストである、実施形態２３から３０のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
３３．前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が分泌可能タンパク質である、実施形態２３から３２のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
３４．前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、実施形態１に記載の抗原結合領域を含む、実施形態２３から３３のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
３５．前記キメラ抗原受容体がＣＤ−１９に特異的に結合する、実施形態２３から３４のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
３６．前記キメラ抗原受容体がヒトＴ細胞膜に挿入されることができる、実施形態２３から３５のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
３７．前記細胞がＴ細胞である、実施形態２４から３６のいずれか一項に記載の細胞。
３８．実施形態２３から３７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞を含む、医薬組成物。
３９．医薬上許容され得る担体をさらに含む、実施形態３８に記載の医薬組成物。
４０．対象におけるＴ細胞応答を上昇させる方法であって、治療上有効量の、実施形態２３から３７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または実施形態３８もしくは３９の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アンタゴニストである、方法。
４１．前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、ＰＤ−１によって媒介されるシグナル伝達を阻害する、低下させる、調節する、または消失させる、実施形態４０に記載の方法。
４２．対象におけるＴ細胞応答を低下させる方法であって、治療上有効量の実施形態２３から３７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または実施形態３８もしくは３９に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含み、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アゴニストである、方法。
４３．ＰＤ１−陽性疾患を有する対象を治療する方法であって、治療上有効量の、実施形態２３から３７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または実施形態３８もしくは３９に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
４４．ＰＤ１−陽性疾患を有する対象を治療する方法であって、前記対象の少なくとも１つのＴ細胞に、組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を形質導入することを含み、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、方法。
４５．前記キメラ抗原受容体がＰＤ−１に特異的に結合するものではない、実施形態４４に記載の方法。
４６．前記ＰＤ１−陽性疾患が癌である、実施形態４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
４７．実施形態２３から３７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または実施形態３８もしくは３９に記載の医薬組成物の、ＰＤ１リガンドへのＰＤ１の結合を阻害することによるＰＤ１−陽性疾患の治療のための、使用。
４８．前記ＰＤ１−陽性疾患が癌である、実施形態４７に記載の使用。
４９．実施形態２３から３７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または実施形態３８もしくは３９に記載の医薬組成物の、ＰＤ−１シグナル経路を阻害することによる免疫調節のための、使用。
５０．実施形態５に記載の抗原結合性タンパク質、実施形態２３から３７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または実施形態３８もしくは３９に記載の医薬組成物の、自己免疫疾患の治療のための使用であって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アゴニストである、使用。
５１．前記抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質およびキメラ抗原受容体の少なくとも１つが治療薬と接合している、実施形態２３から３７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
５２．前記治療薬が、薬物、毒素、放射性同位元素、タンパク質、またはペプチドである、実施形態５１に記載のベクターまたは細胞。
５３．前記抗原結合性タンパク質または前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アゴニストであり、前記ＰＤ１−陽性疾患が自己免疫疾患である、実施形態１７および４２から４５のいずれか一項に記載の方法。

参考文献
Brentjens, R. J., M. L. Davila, et al. (2013). "CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia." Sci Transl Med 5(177): 177ra138.
Brentjens, R. J., J. B. Latouche, et al. (2003). "Eradication of systemic B-cell tumors by genetically targeted human T lymphocytes co-stimulated by CD80 and interleukin-15." Nat Med 9(3): 279-286.
Brentjens, R. J., E. Santos, et al. (2007). "Genetically targeted T cells eradicate systemic acute lymphoblastic leukemia xenografts." Clin Cancer Res 13 (18 Pt 1): 5426-5435.
Davila, M. L., I. Riviere, et al. (2014). "Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia." Sci Transl Med 6(224): 224ra225.

Claims

（Ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む抗原結合領域；
（Ｂ）配列番号４９および５１のアミノ酸配列をそれぞれ有する可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む抗原結合領域；
（Ｃ）アミノ酸配列ＮＩＧＳＫＳ（配列番号３４）、ＹＤＳおよびＱＶＷＤＳＳＳＤＹＶ（配列番号４５）をそれぞれ有するＬＣＣＤＲ１、ＬＣＣＤＲ２およびＬＣＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号４６）、ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号４７）およびＡＲＮＹＩＳＭＦＤＳ（配列番号４８）をそれぞれ有するＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２およびＨＣＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）を含む抗原結合領域；
の１つを含む組換え抗原結合性タンパク質であって、
前記抗原結合性タンパク質は分泌可能ｓｃＦｖを含み、前記分泌可能ｓｃＦｖはプログラム細胞死（ＰＤ−１）に特異的に結合し、ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との結合を阻害する、前記組換え抗原結合性タンパク質。
前記抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アンタゴニストである、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
前記抗原結合性タンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質をコードする核酸。
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項４に記載の核酸または請求項５に記載のベクターを含む細胞。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項４に記載の核酸、請求項５に記載のベクター、又は請求項６に記載の細胞を含む、医薬組成物。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ１抗原結合性タンパク質、請求項４に記載の核酸、請求項５に記載のベクター、請求項６に記載の細胞、または請求項７に記載の医薬組成物の、ＰＤ１リガンドへのＰＤ１結合を阻害することによる、ＰＤ１−陽性疾患の治療のための医薬の製造への、使用。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ１抗原結合性タンパク質、請求項４に記載の核酸、請求項５に記載のベクター、請求項６に記載の細胞、または請求項７に記載の医薬組成物の、ＰＤ−１シグナル経路を阻害することによる、免疫調節のための医薬の製造への、使用。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターであって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、ベクター。
請求項１０に記載のベクターを含む細胞。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質をコードする核酸およびキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む細胞であって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、細胞。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質およびキメラ抗原受容体を含む細胞であって、前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、前記キメラ抗原受容体と同一ではない、細胞。
前記キメラ抗原受容体がＰＤ−１に特異的に結合するものではない、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が抗体である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がヒト抗体である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質がＰＤ−１アンタゴニストである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
前記組換え抗ＰＤ−１抗原結合性タンパク質が、請求項１に記載の抗原結合領域を含む、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
前記キメラ抗原受容体がＣＤ−１９に特異的に結合する、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
前記キメラ抗原受容体が、ヒトＴ細胞膜に挿入されることができる、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞。
前記細胞がＴ細胞である、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
請求項１０〜２１のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞を含む、医薬組成物。
請求項１０〜２１のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または請求項２２に記載の医薬組成物の、ＰＤ１リガンドへのＰＤ１結合を阻害することによる、ＰＤ１−陽性疾患の治療のための医薬の製造への、使用。
請求項１０〜２１のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞、または請求項２２に記載の医薬組成物の、ＰＤ−１シグナル経路を阻害することによる、免疫調節のための医薬の製造への、使用。