CN115335123A - 人4-1bb激动剂抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了与4‑1BB相结合的分离的或重组的单克隆抗体。在一些情况下，实施方案的抗体可以用于检测、诊断和/或治疗性治疗人疾病，例如癌症。

Description

人4-1BB激动剂抗体及其使用方法

本申请要求于2020年2月17日提交的美国临时专利申请号62/977,658(其通过提及而以其整体合并入本文)的权益。

序列表的合并

包含在名为“UTFCP1467WO_ST25.txt”的文件(其为23KB(在Microsoft

中测量的)，并且创建于2021年2月16日)中的序列表通过电子提交而随此提交，并且通过提及而合并入本文。

发明背景

1.领域

本发明总体而言涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及肿瘤坏死因子超家族受体(TNFSFR；4-1BB；CD137)激动剂抗体。

2.相关技术描述

4-1BB(CD137)(TNF受体超家族的成员)是一种由激活诱导的T-细胞共刺激分子(Vinay和Kwon,2012)。通过4-1BB的信号传导上调存活基因，增强细胞分裂，诱导细胞因子产生，并且防止T细胞中的由激活诱导的细胞死亡。4-1BB途径的重要性已经在许多疾病(包括癌症)中得到强调。越来越多的证据表明，抗-4-1BB单克隆抗体具有强的抗肿瘤特性，而这又是其强大的激活CD8⁺ T-细胞、产生IFN-γ和诱导细胞溶解标志物的能力的结果。另外，抗-4-1BB与其他抗癌试剂(例如辐射)的联合疗法针对非免疫原性或差免疫原性的肿瘤具有稳健的肿瘤消退能力。进一步地，来自事先经肿瘤处理的动物的离体抗-4-1BB-激活的CD8⁺ T细胞的过继转移在已经接种了新鲜肿瘤的受者小鼠中有效地抑制肿瘤进展。另外，用针对4-1BB的4-1BBL变体靶向肿瘤也具有强有力的抗肿瘤效应。但是，对于经改善的人4-1BB抗体的需求尚未得到满足。

发明概述

在第一个实施方案中，本公开内容提供了分离的单克隆抗体，其中所述抗体特异性地与4-1BB相结合并且包含：(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:3同一；(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:5同一；(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:7同一；(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:11同一；(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:13同一；和(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:15同一；或者(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:19同一；(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:21同一；(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:23同一；(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:27同一；(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:29同一；和(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:31同一；或者(a)第一个V_H CDR与SEQID NO:35同一；(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:37同一；(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:39同一；(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:43同一；(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:45同一；和(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:47同一；或者(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:51同一；(b)第二个V_HCDR与SEQ ID NO:53同一；(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:55同一；(d)第一个V_L CDR与SEQID NO:59同一；(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:61同一；和(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:63同一。

在一些方面，所述抗体包含与克隆54的V_H结构域(SEQ ID NO:2)至少大约80％同一，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的V_H结构域，和与克隆54的V_L结构域(SEQ ID NO:10)至少大约80％同一，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的V_L结构域。在特定方面，所述抗体包含与克隆54的V_H结构域(SEQ ID NO:2)同一的V_H结构域，和与克隆54的V_L结构域(SEQID NO:10)同一的V_L结构域。

在某些方面，所述抗体包含与克隆135B的V_H结构域(SEQ ID NO:18)至少大约80％同一，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的V_H结构域，和与克隆135B的V_L结构域(SEQ ID NO:26)至少大约80％同一，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的V_L结构域。在特定方面，所述抗体包含与克隆135B的V_H结构域(SEQ ID NO:18)同一的V_H结构域，和与克隆135B的V_L结构域(SEQ ID NO:26)同一的V_L结构域。

在一些方面，所述抗体包含与克隆138的V_H结构域(SEQ ID NO:34)至少大约80％同一，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的V_H结构域，和与克隆138的V_L结构域(SEQ ID NO:42)至少大约80％同一，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的V_L结构域。在特定方面，所述抗体包含与克隆138的V_H结构域(SEQ ID NO:34)同一的V_H结构域，和与克隆138的V_L结构域(SEQ ID NO:42)同一的V_L结构域。

在一些方面，所述抗体包含与克隆49A的V_H结构域(SEQ ID NO:50)至少大约80％同一，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的V_H结构域，和与克隆49A的V_L结构域(SEQ ID NO:58)至少大约80％同一，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的V_L结构域。在特定方面，所述抗体包含与克隆49A的V_H结构域(SEQ ID NO:50)同一的V_H结构域，和与克隆49A的V_L结构域(SEQ ID NO:58)同一的V_L结构域。

在某些方面，所述抗体是重组的。在一些方面，所述抗体为IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。在某些方面，所述抗体为Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。在特定方面，所述抗体为人抗体、人源化抗体或脱免疫化抗体(de-immunizedantibody)。在进一步的方面，所述抗体与显像剂、化学治疗试剂、毒素或放射性核素相缀合。

一个进一步的实施方案提供了组合物，其包含处于在药学上可接受的承载体中的本发明实施方案的抗体。本文还提供了分离的多核苷酸分子，其包含编码本发明实施方案的抗体的核酸序列。

另一个实施方案提供了重组多肽，所述重组多肽包含：抗体V_H结构域，其包含克隆54的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:3、5和7)、克隆135B的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:19、21和23)、克隆138的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:35、37和39)或者克隆49A的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:51、53和55)。

进一步的实施方案提供了重组多肽，所述重组多肽包含：抗体V_L结构域，其包含54的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:11、13和15)、135B的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:27、29和31)、138的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:43、45和47)或者49A的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:59、61和63)。

在一个更进一步的实施方案中，提供了重组多肽，所述重组多肽包含：包含克隆54的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:3、5和7)的抗体V_H结构域，和包含54的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:11、13和15)的抗体V_L结构域；包含克隆135B的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ IDNO:19、21和23)的抗体V_H结构域，和包含135B的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:27、29和31)的抗体V_L结构域；包含克隆138的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:35、37和39)的抗体V_H结构域，和包含138的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:43、45和47)的抗体V_L结构域；或者包含克隆49A的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:51、53和55)的抗体V_H结构域，和包含49A的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:59、61和63)的抗体V_L结构域。

进一步的实施方案提供了分离的多核苷酸分子，其包含编码本发明实施方案的多肽的核酸序列。本文还提供了宿主细胞，其包含一种或多种编码本发明实施方案的抗体或者本发明实施方案的重组多肽的多核苷酸分子。在一些方面，所述宿主细胞为哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

另一个实施方案提供了制备抗体的方法，所述方法包括：(a)在细胞中表达一种或多种编码本发明实施方案的抗体的V_L和V_H链的多核苷酸分子；和(b)从所述细胞中纯化出所述抗体。

一个进一步的实施方案提供了用于治疗具有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明实施方案的抗体。

在一些方面，所述癌症为乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。

在特定方面，所述抗体处于在药学上可接受的组合物中。在一些方面，所述抗体全身地进行施用。在一些方面，所述抗体以静脉内方式、以真皮内方式、以肿瘤内方式、以肌内方式、以腹膜内方式、以皮下方式或局部地进行施用。

在另外的方面，所述方法还包括向所述受试者施用至少第二抗癌疗法。在一些方面，所述第二抗癌疗法为外科手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。在某些方面，所述第二抗癌疗法包括过继T-细胞疗法。在一些方面，所述第二抗癌疗法包括免疫疗法。在特定方面，所述免疫疗法为免疫检查点抑制剂，例如抗-CTLA-4抗体、抗-PD-L1抗体和/或抗-PD1抗体。在特定方面，所述免疫检查点抑制剂为人程序性细胞死亡1(PD-1)结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂或PDL2结合拮抗剂。在一些方面，所述PD-1结合拮抗剂为单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些方面，所述PD-1结合拮抗剂为纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、CT-011(或称为匹地利珠单抗(pidilizumab))、BMS 936559、MPDL328OA(或称为阿替利珠单抗(atezolizumab))或AMP-224。

本发明的其他目标、特征和优点将绘从下面的详细描述中变得明显。但是，应当理解，详细描述和具体实施例虽然指明了本发明的某些实施方案，但是仅作为举例说明而给出，因为从该详细描述中在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将会变得明显。

附图简述

下面的附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步示范本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合在本文中所呈现的特定实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1A-1B：生成了多种高亲和力抗人4-1BB抗体。(图1A)显示了关于初始的融合后抗体上清液针对重组人4-1BB的ELISA结果。(图1B)4-1BB单克隆抗体克隆的滴定曲线。

图2A-2B：本发明的克隆54 4-1BB抗体(在本文中称为Curranlumab)高效率扩增人TIL。将克隆54(Curranlumab)的两种变体用于扩增来自患者肿瘤块的人肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，并且将每种变体在生成纯的、经扩展的CD8+ T细胞产物方面的效率与乌瑞芦单抗(Urelumab)(BMS-663513)进行比较。

图3：使用几种Ig可变结构域引物组合的PCR。星号显示了关于VH和VL链的正确的抗体转录物。所观察到的其余的PCR条带为通过测序确认的异常转录物。

图4A-4B：分离出成胶质细胞瘤和结肠直肠癌肿瘤，并且使用41BB激动剂抗体克隆54(作为人IgG1或小鼠IgG2a)来扩增肿瘤浸润T细胞。显示了扩增程度、CD8百分比和CD4百分比。用克隆54IgG1和克隆54IgG1扩增的来自成胶质细胞瘤和结肠直肠癌患者肿瘤的总TIL(图4A)。通过扩展方法生成的CD3+CD8+TIL或CD3+CD4+TIL的百分比(图4B)。

举例说明性实施方案的描述

肿瘤坏死因子超家族受体(TNFSFR)(也称为4-1BB和CD137)共刺激T细胞、NK细胞和髓样细胞(包括抗原呈递树突细胞)的激活。在CD8 T细胞上，4-1BB激活增加它们的增殖、细胞毒性、细胞因子产生、线粒体质量和生存力。因此，在本研究中生成了4-1BB激动剂抗体。用交替的细胞疫苗和基于重组蛋白质的疫苗对小鼠进行免疫接种，以生成靶向人4-1BB的抗体。在许多先导候选物中，选择了克隆54 4-1BB抗体，将其进行测序和表达(以各种各样的小鼠和人同种型)。本研究发现，克隆54 4-1BB抗体的IgG2a版本非常有效地使肿瘤浸润CD8 T细胞扩增和成熟。

因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了人4-1BB激动剂抗体，特别是4-1BBIgG2a激动剂单克隆抗体。本发明的抗体可以在符合GMP的条件下制备。本发明的抗体可以以单特异性或双特异性形式在患者中进行使用。在进一步的方面，本发明的抗体可以作为免疫疗法施用给具有癌症的患者，单独地或者与另外的免疫疗法例如免疫检查点抑制剂(例如，抗-PD1或抗-CTLA4抗体)相联合地。

I.定义

如在本文中所使用的，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于意指，所述特定组分中的任一种没有被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由于组合物的任何非故意的污染而引起的特定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的为这样的组合物，其中用标准分析方法无法检测到所述特定组分的量。

如在本文中在说明书中所使用的，“a”或“an”可以意指一或多。如在本文中在权利要求书中所使用的，当与词语“包括(包含)”结合使用时，词语“a”或“an”可以意指一或多于一。

在权利要求书中术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是互斥的，尽管本公开内容支持指仅备选方案和“和/或”的定义。如在本文中所使用的，“另一”可以意指至少第二或更多。术语“大约”通常意指所陈述的值±5％。

“治疗”是指为了获得疾病或健康相关状况的治疗益处的目的，向受试者施用或应用治疗试剂或者对于受试者施行程序或程式。

“受试者”和“患者”是指人或非人动物，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特别的实施方案中，所述受试者为人。

在整个本申请中所使用的术语“治疗益处”或“在治疗上有效的”是指相关于该状况的医学处理而言促进或增强受试者的福利的任何事物。这包括但不限于降低疾病的征候或症状的频率或严重度。例如，癌症的治疗可以牵涉例如减小肿瘤的大小、降低肿瘤的侵袭性、降低癌症的生长速率或者防止转移。癌症的治疗还可以是指延长具有癌症的受试者的存活。

“抗癌”试剂能够负地影响受试者中的癌细胞/肿瘤，例如通过促进癌细胞的杀伤，诱导癌细胞的凋亡，降低癌细胞的生长速率，降低转移的发生率或数目，减小肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少对肿瘤或癌细胞的血液供应，促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答，防止或抑制癌症的进展，或者增加具有癌症的受试者的寿命。

术语“抗体”在本文中以最宽泛的意义进行使用，并且具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出所希望的生物学活性。

如在本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指从实质上同质的抗体的群体中获得的抗体，例如，构成该群体的独个抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能的突变(例如，天然发生的突变)之外。因此，修饰语“单克隆(的)”指明了所述抗体的特征为不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型地包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中所述靶标结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的过程来获得。例如，所述选择过程可以是从多个克隆(例如，杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的汇集物)中选择独特的克隆。应当理解，可以进一步改变所选择的靶标结合序列，以例如改善对于靶标的亲和力、使靶标结合序列人源化、改善其在细胞培养中的产生、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等；并且包含该经改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对在抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优势还在于它们典型地不被其他免疫球蛋白污染。

当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述这样的过程，通过所述过程将治疗性构建体和化学治疗或放射治疗试剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并列放置。例如，为了实现细胞杀伤，将这两种试剂以对于杀伤细胞或防止其分裂来说有效的组合量递送至细胞。

术语“免疫检查点”是指免疫系统中的这样的分子例如蛋白质，其向其组分提供抑制信号以便平衡免疫反应。已知的免疫检查点蛋白质包括CTLA-4，PD1及其配体PD-L1和PD-L2，以及LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。牵涉LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的途径在本领域被认为构成与CTLA-4和PD-1依赖性途径类似的免疫检查点途径(参见例如，Pardoll,2012；Mellman等人,2011)。

“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点蛋白质的功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻断。特别地，所述免疫检查点蛋白质为人免疫检查点蛋白质。因此，所述免疫检查点蛋白质抑制剂特别地为人免疫检查点蛋白质的抑制剂。

II.抗-41BB抗体

在某些实施方案中，考虑了与4-1BB的至少一部分相结合并且激活信号传导(例如以刺激免疫应答)的抗体或其片段。如在本文中所使用的，术语“抗体”旨在泛指任何免疫学结合试剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和经遗传修饰的IgG以及包含保留了抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。所述抗体可以选自由下列各项组成的组：嵌合抗体、经亲和力成熟的抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体或抗原结合抗体片段或者天然或合成配体。优选地，所述抗-41BB抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

在一些实施方案中，所述抗-41BB抗体包含SEQ ID NO:2的重链的CDR 1-3(GYSFTDYN(SEQ ID NO:3)、INPNYGTT(SEQ ID NO:5)和ARSPVEDYFDY(SEQ ID NO:7))和SEQID NO:10的轻链的CDR 1-3(SSVSSSY(SEQ ID NO:11)、STS(SEQ ID NO:13)和QQYSGYPLIT(SEQ ID NO:15))。所述抗-41BB抗体可以与SEQ ID NO:1、2、9或10具有至少80％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。所述抗-41BB抗体可以与SEQ ID NO:17、18、25或26具有至少80％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。所述抗-41BB抗体可以与SEQID NO:33、34、41或42具有至少80％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。所述抗-41BB抗体可以与SEQ ID NO:49、50、57或58具有至少80％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。重链和轻链序列在下面描述。

克隆54 4-1BB，从构架1(FR1)开始的VH共有序列(位置77-505)，IgG2a

核苷酸序列：

GAGTTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTAATTAATCCTAACTATGGTACTACTAGCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTTACTGTAGACCAATCTTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCCCCGGTAGAGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGGTACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTA(SEQ ID NO:1)

氨基酸序列：

EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGVINPNYGTTSYNQKFKGKATFTVDQSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSPVEDYFDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTL(SEQ ID NO:2)

CDR1：

GYSFTDYN(SEQ ID NO:3)

GGTTACTCATTCACTGACTACAAC(SEQ ID NO:4)

CDR2：

INPNYGTT(SEQ ID NO:5)

ATTAATCCTAACTATGGTACTACT(SEQ ID NO:6)

CDR3：

ARSPVEDYFDY(SEQ ID NO:7)

GCAAGATCCCCGGTAGAGGACTACTTTGACTAC(SEQ ID NO:8)

从构架1(FR1)开始的VL共有序列(位置91-470)

核苷酸序列：

GAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGGGCCAGGTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGTGCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTTACCCACTCATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTT(SEQ ID NO:9)

氨基酸序列：

ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRARSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLITFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQ(SEQ ID NO:10)CDR1：

SSVSSSY(SEQ ID NO:11)

TCAAGTGTAAGTTCCAGTTAC(SEQ ID NO:12)

CDR2：

STS(SEQ ID NO:13)

AGCACATCC(SEQ ID NO:14)

CDR3：

QQYSGYPLIT(SEQ ID NO:15)

CAGCAGTACAGTGGTTACCCACTCATCACG(SEQ ID NO:16)

克隆135B 4-1BB，从构架1(FR1)开始的VH共有序列(位置45-407)，IgG1

核苷酸序列：

AGGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGATGGTACTACCTACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCCCTCTACGGTAGTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAG(SEQ IDNO:17)

氨基酸序列：

VKLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNDGTTYYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSLYGSSYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:18)

CDR1：

GYTFTDYY(SEQ ID NO:19)

GGATACACGTTCACTGACTACTAC(SEQ ID NO:20)

CDR2：

INPNNDGT(SEQ ID NO:21)

ATTAATCCTAACAATGATGGTACT(SEQ ID NO:22)

CDR3：

ARSLYGSSYYFDY(SEQ ID NO:23)

GCAAGATCCCTCTACGGTAGTAGCTACTACTTTGACTAC(SEQ ID NO:24)

从构架1(FR1)开始的VL共有序列(位置46-379)

核苷酸序列：

GATATTGTGATGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC(SEQ ID NO:25)

氨基酸序列：

DIVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:26)

CDR1：

KSVSTSGYSY(SEQ ID NO:27)

AAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTAT(SEQ ID NO:28)

CDR2：

LVS(SEQ ID NO:29)

CTTGTATCC(SEQ ID NO:30)

CDR3：

QQSNEDPWT(SEQ ID NO:31)

CAGCAAAGTAATGAGGACCCGTGGACG(SEQ ID NO:32)

克隆138 4-1BB，从构架1(FR1)开始的VH共有序列(位置56-409)，IgG2b

核苷酸序列：

AGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGTGGCAGTAATTCCATCTACTATGCAGACACAGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCCTCGAATAATGGTTACTTCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAG(SEQ ID NO:33)

氨基酸序列：

VQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSNSIYYADTVTGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCASNNGYFYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:34)

CDR1：

GFTFSTYG(SEQ ID NO:35)

GGATTCACTTTCAGTGACTATGGA(SEQ ID NO:36)

CDR2：

ISSGSNSI(SEQ ID NO:37)

ATTAGTAGTGGCAGTAATTCCATC(SEQ ID NO:38)

CDR3：

ASNNGYFYFDY(SEQ ID NO:39)

GCCTCGAATAATGGTTACTTCTACTTTGACTAC(SEQ ID NO:40)

从构架1(FR1)开始的VL共有序列(位置63-378)

核苷酸序列：

ATTGTGATCACCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAGTCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTGACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAAC(SEQ ID NO:41)

氨基酸序列：

IVITQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTVSRVEAEDAATYYCQQWSSDPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:42)

CDR1：

SSVSY(SEQ ID NO:43)

TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ ID NO:44)

CDR2：

ATS(SEQ ID NO:45)

GCCACATCC(SEQ ID NO:46)

CDR3：

QQWSSDPFT(SEQ ID NO:47)

CAGCAGTGGAGTAGTGACCCATTCACG(SEQ ID NO:48)

克隆49A 4-1BB，从构架1(FR1)开始的VH共有序列(位置65-427)，IgG1

核苷酸序列：

AGGTGAAACTGCAGCAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGGAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGGTTCTACCTACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGAGAAGTCCTCCAGCACAGCCTTCATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCCCTCTACGGTAGTACCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCCCTCTCACAGTCTCCTCAG(SEQ IDNO:49)

氨基酸序列：

VKLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKESHGKSLEWIGDINPNNGGSTYYNQKFKGKATLTVEKSSSTAFMELRSLTSEDSAVYYCARSLYGSTYYFDYWGQGTPLTVSS(SEQ ID NO:50)

CDR1：

GYTFTDYY(SEQ ID NO:51)

GGATACACGTTCACTGACTACTAC(SEQ ID NO:52)

CDR2：

INPNNGGS(SEQ ID NO:53)

ATTAATCCTAACAATGGTGGTTCT(SEQ ID NO:54)

CDR3：

ARSLYGSTYYFDY(SEQ ID NO:55)

GCAAGATCCCTCTACGGTAGTACCTACTACTTTGACTAC(SEQ ID NO:56)

从构架1(FR1)开始的VL共有序列(位置55-388)

核苷酸序列：

GATATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAGCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGGAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGACGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC(SEQ ID NO:57)

氨基酸序列：

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAGTYYCQQSNDDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:58)

CDR1：

QSVDYDGDSY(SEQ ID NO:59)

CAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTAT(SEQ ID NO:60)

CDR2：

AAS(SEQ ID NO:61)

GCTGCATCC(SEQ ID NO:62)

CDR3：

QQSNDDPWT(SEQ ID NO:63)

CAGCAAAGTAATGACGATCCGTGGACG(SEQ ID NO:64)

因此，通过已知方式和如在本文中所描述的，可以产生对于4-1BB、其各自表位中的一个或多个来说特异性的多克隆或单克隆抗体、抗体片段和结合结构域和CDR(包括上述中的任何一种的经改造的形式)，或者上述中的任何一种的缀合物，无论此类抗原或表位是从天然来源分离出的还是天然化合物的合成衍生物或变体。

适合于本发明实施方案的抗体片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，其由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成；(ii)“Fd”片段，其由V_H和C_H1结构域组成；(iii)“Fv”片段，其由单个抗体的V_L和V_H结构域组成；(iv)“dAb”片段，其由V_H结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，其为包含两个相连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中V_H结构域和V_L结构域通过允许这两个结构域相联合从而形成结合结构域的肽连接体相连接；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)；和(ix)双链抗体(diabody)，其是通过基因融合构建的多价或多特异性片段(美国专利申请公开20050214860)。Fv、scFv或双链抗体分子可以通过掺入连接V_H和V_L结构域的二硫桥来进行稳定化。也可以制备包含与CH3结构域相连接的scFv的微型抗体(minibody)(Hu等人,1996)。

在实施方案中还考虑了抗体样结合肽模拟物。Liu等人(2003)描述了“抗体样结合肽模拟物”(antibody like binding peptidomimetics；ABiPs)，其是这样的肽，所述肽可以充当缩减的抗体，并且具有更长的血清半衰期以及更不麻烦的合成方法的某些优点。

可以给动物接种抗原，例如4-1BB细胞外结构域(ECD)蛋白，以便产生特异于4-1BB的抗体。经常地，将抗原结合或缀合至另一种分子以增强免疫应答。如在本文中所使用的，缀合物是与用于在动物中引发免疫应答的抗原相结合的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质物质。响应于抗原接种而在动物中产生的抗体包括各种各样的非相同的分子(多克隆抗体)，其由各种各样的产生独个抗体的B淋巴细胞制备。多克隆抗体是抗体类别的混合群体，每种抗体类别可以识别在同一抗原上的不同表位。如果给予关于在动物中产生多克隆抗体的正确条件，那么在动物血清中的抗体的大多数将会识别在该动物已就其进行了免疫接种的抗原化合物上的集体表位。这种特异性通过亲和纯化(以仅选择识别目的抗原或表位的那些抗体)而进一步得到增强。

单克隆抗体是单一类别的抗体，其中每个抗体分子识别相同的表位，因为所有产生抗体的细胞都源自单一的B-淋巴细胞细胞系。用于生成单克隆抗体(Mab)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的那些方法相同的路线来开始。在一些实施方案中，啮齿动物例如小鼠和大鼠用于生成单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或青蛙细胞用于生成单克隆抗体。使用大鼠是众所周知的，并且可以提供某些优点。常规地使用小鼠(例如，BALB/c小鼠)，并且其通常给出高的稳定融合百分比。

杂交瘤技术牵涉来自事先用4-1BB抗原进行免疫接种的小鼠的单个B淋巴细胞与无限增殖骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)的融合。该技术提供了一种将单个产抗体细胞繁殖无限世代数目的方法，从而可以产生无限量的具有相同的抗原或表位特异性的在结构上相同的抗体(单克隆抗体)。

血浆B细胞(CD45⁺CD5^-CD19⁺)可以从经免疫接种的兔的新鲜制备的兔外周血单核细胞中分离出来，并且进一步地就4-1BB结合细胞进行选择。在富集产生抗体的B细胞后，可以分离总RNA并且合成cDNA。来自重链和轻链两者的抗体可变区的DNA序列可以进行扩增，构建到噬菌体展示Fab表达载体中，并且转化到大肠杆菌(E.coli)中。4-1BB特异性结合Fab可以通过多轮富集淘选来选择出来并且进行测序。选择出的4-1BB结合命中可以在人胚胎肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中通过使用哺乳动物表达载体系统而表达为以兔和兔/人嵌合形式的全长IgG，并且用快速蛋白质液相色谱法(FPLC)分离单元通过使用G蛋白树脂来进行纯化。

在一个实施方案中，所述抗体为嵌合抗体，例如包含嫁接至异源的非人、人或人源化序列(例如，构架和/或恒定结构域序列)的来自非人供者的抗原结合序列的抗体。已经开发出了方法来用人来源的类似结构域替代单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，而使外源抗体的可变区保持完整。备选地，在关于人免疫球蛋白基因而言转基因的小鼠中产生“完全人的”单克隆抗体。还已经开发出了方法来通过重组构建具有啮齿动物(例如小鼠)和人氨基酸序列两者的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更加人的形式。在“人源化”单克隆抗体中，只有高变CDR源自小鼠单克隆抗体，并且构架区和恒定区源自人氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557)。认为将抗体中的对于啮齿动物来说特征性的氨基酸序列替代为在人抗体的相应位置处发现的氨基酸序列将会降低在治疗使用期间的不利免疫反应的可能性。杂交瘤或其他产生抗体的细胞也可以经历基因突变或其他变化，其可能会或可能不会改变由该杂交瘤所产生的抗体的结合特异性。

用于在各种动物物种中产生多克隆抗体以及用于产生各种类型的单克隆抗体(包括人源化的、嵌合的和完全人的)的方法在本领域中是众所周知的并且是高度可预测的。例如，下列美国专利和专利申请提供了此类方法的使能性描述：美国专利申请号2004/0126828和2002/0172677；和美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,196,265、4,275,149、4,277,437、4,366,241、4,469,797、4,472,509、4,606,855、4,703,003、4,742,159、4,767,720、4,816,567、4,867,973、4,938,948、4,946,778、5,021,236、5,164,296、5,196,066、5,223,409、5,403,484、5,420,253、5,565,332、5,571,698、5,627,052、5,656,434、5,770,376、5,789,208、5,821,337、5,844,091、5,858,657、5,861,155、5,871,907、5,969,108、6,054,297、6,165,464、6,365,157、6,406,867、6,709,659、6,709,873、6,753,407、6,814,965、6,849,259、6,861,572、6,875,434和6,891,024。在本文中和在那里所引用的所有专利、专利申请出版物和其他出版物均通过提及而合并入本申请中。

抗体可以从任何动物来源(包括鸟类和哺乳动物)产生。优选地，所述抗体是绵羊、鼠类(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的。另外，较新的技术允许从人组合抗体库中开发和筛选人抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在动物免疫接种不存在下产生特异性抗体，如在美国专利号6,946,546(其通过提及而合并入本文)中所描述的。这些技术进一步描述于：Marks(1992)；Stemmer(1994)；Gram等人(1992)；Barbas等人(1994)；和Schier等人(1996)。

完全预期到，对于4-1BB的抗体将会具有中和或抵消4-1BB的效应的能力，无论动物物种、单克隆细胞系或抗体的其他来源为何。某些动物物种可能对于生成治疗性抗体来说较不优选，因为它们可能更可能由于通过抗体的“Fc”部分激活了补体系统而引起变态应答。但是，完整抗体可以被酶促消化成“Fc”(补体结合)片段，以及具有结合结构域或CDR的抗体片段。Fc部分的去除降低了抗原抗体片段引发不希望的免疫应答的可能性，并因此没有Fc的抗体可能优先用于预防性或治疗性治疗。如上面所描述的，抗体也可以被构建为嵌合的或者部分或完全人的，以便减少或消除由于向动物施用在其他物种中产生的或者具有来自其他物种的序列的抗体而引起的不利的免疫学后果。

置换变体典型地在蛋白质内的一个或多个位点处包含一个氨基酸向另一个氨基酸的调换，并且可以被设计成调节所述多肽的一种或多种特性，具有或没有其他功能或特性的损失。置换可以是保守的，即将一个氨基酸替代为一个具有相似形状和电荷的氨基酸。保守置换在本领域中是众所周知的，并且包括例如下列变化：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。备选地，置换可以是非保守的，从而影响所述多肽的功能或活性。非保守变化典型地牵涉用在化学上不同的残基置换残基，例如将极性或带电荷的氨基酸置换为非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。

蛋白质可以是重组的或者体外合成的。备选地，可以从细菌中分离出非重组或重组的蛋白质。还考虑，可以在组合物和方法中实施包含此类变体的细菌。因此，不需要分离蛋白质。

考虑了，在组合物中每ml包含大约0.001mg至大约10mg的总多肽、肽和/或蛋白质。因此，在组合物中的蛋白质浓度可以为大约、至少大约或至多大约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或者从其中可导出的任何范围)。在这之中，大约、至少大约或至多大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可以为结合4-1BB的抗体。

抗体或优选地抗体的免疫学部分可以化学缀合至其他蛋白质或者表达为与其他蛋白质的融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求书的目的，所有此类融合的蛋白质都包括在抗体或抗体的免疫学部分的定义中。

实施方案提供了针对4-1BB的抗体和抗体样分子、多肽和肽，其与至少一种试剂相连接以形成抗体缀合物或有效负荷。为了提高抗体分子作为诊断或治疗试剂的功效，常规的是连接或共价结合或复合至少一种所希望的分子或部分。这样的分子或部分可以为但不限于，至少一种效应分子或报道分子。效应分子包括具有所希望的活性(例如细胞毒性活性)的分子。已附接至抗体的效应分子的非限制性实例包括：毒素、治疗性酶、抗生素、经放射性标记的核苷酸等。相反地，报道分子被定义为可以通过使用测定法来检测的任何部分。已缀合至抗体的报道分子的非限制性实例包括：酶、放射性标记物、半抗原、荧光标记物、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体(例如生物素)。

本领域已知几种用于将抗体附接或缀合至其缀合物部分的方法。一些附接方法牵涉使用金属螯合物络合物，其采用例如，有机螯合试剂例如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3-6？-二苯基甘脲-3，附接至抗体。单克隆抗体也可以在偶联试剂例如戊二醛或高碘酸盐存在下与酶进行反应。在这些偶联试剂存在下或者通过与异硫氰酸酯进行反应来制备具有荧光素标记物的缀合物。

II.疾病的治疗

本发明实施方案的某些方面可以用于预防或治疗与4-1BB信号传导相关的疾病或病症。本发明的4-1BB抗体可以用于治疗疾病，例如癌症、感染性疾病、炎性疾病或自身免疫性疾病。提供了进一步的用于施用疫苗的方法。合适的疫苗包括例如肿瘤细胞疫苗、DNA疫苗、经GM-CSF修饰的肿瘤细胞疫苗或加载有抗原的树突细胞疫苗。

在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法牵涉针对4-1BB的抗体或抗体片段以激活其在癌细胞增殖方面的活性，以及与之相组合的第二或额外疗法。

因此，在一些实施方案中，在本文中提供了用于在个体中治疗癌症或延缓其进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-41BB抗体。被考虑用于治疗的癌症的实例包括：肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺中的癌变前损伤、结肠癌、黑素瘤和膀胱癌。

在一些实施方案中，所述个体具有对于一种或多种抗癌疗法具有抗性(已被证明具有抗性)的癌症。在一些实施方案中，对于抗癌疗法的抗性包括癌症复发或难治性癌症。复发可以是指癌症在治疗后在原始部位或新部位处再次出现。在一些实施方案中，对于抗癌疗法的抗性包括在用所述抗癌疗法进行治疗期间癌症的进展。在一些实施方案中，所述癌症处于早期或晚期。

A.药学制备物

在进行包含抑制性抗体的治疗性组合物的临床应用时，制备适合于所意欲的应用的药学或治疗性组合物通常是有益的。在某些实施方案中，药学组合物可以包含例如至少大约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物例如可以占所述单位的重量的大约2％至大约75％，或大约25％至大约60％，以及从其中可导出的任何范围。

本发明实施方案的治疗性组合物有利地以可注射组合物的形式(作为液体溶液或悬浮液)进行施用；也可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。这些制备物也可以进行乳化。

短语“在药学上或在药理学上可接受的”是指当施用给动物例如人(视情况而定)时不产生不利的、变应性的或其他不适当的反应的分子实体和组合物。鉴于本公开内容，本领域技术人员将会知晓包含抗体或另外的活性成分的药学组合物的制备。此外，对于动物(例如，人)施用，将会理解，制备物应当符合FDA生物标准办公室所要求的无菌性、致热性、总体安全性和纯度标准。

如在本文中所使用的，“在药学上可接受的承载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水，醇/水溶液，盐溶液，肠胃外载料，例如氯化钠、林格氏葡萄糖等)、非水性溶剂(例如，丙二醇，聚乙二醇，植物油，和可注射有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、包覆料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌或抗真菌试剂、抗氧化剂、螯合试剂和惰性气体)、等渗剂剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养补充物，此类类似材料及其组合，如本领域技术人员将会知晓的。根据众所周知的参数来调整在药学组合物中各种组分的pH和准确浓度。

术语“单位剂量”或“剂量”是指适合于在受试者中使用的在物理上离散的单位，每个单位包含预定量的治疗性组合物，其经计算以用于产生在上面相关于其施用(即合适的途径和治疗方案)所讨论的所希望的应答。根据治疗次数和单位剂量两者，待施用的量取决于所希望的效应。施用给患者或受试者的本发明实施方案的组合物的实际剂量可以通过身体和生理学因素来确定，例如受试者的体重、年龄、健康和性别，正进行治疗的疾病的类型，疾病渗透的程度，先前或并行的治疗干预，患者的特发病，施用途径，以及特定治疗性物质的效力、稳定性和毒性。例如，剂量也可以为每次施用大约1μg/kg/体重至大约1000mg/kg/体重(该此类范围包括介入剂量)或更多，以及从其中可导出的任何范围。在从本文中所列的数字中可导出的范围的非限制性实例中，可以施用大约5μg/kg/体重至大约100mg/kg/体重、大约5μg/kg/体重至大约500mg/kg/体重等的范围。在任何情况下，负责施用的医师将会确定在组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。

活性化合物可以被配制成用于肠胃外施用，例如配制成用于通过静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径进行注射。典型地，此类组合物可以制备成液体溶液或悬浮液；也可以制备适合于用于在注射之前在添加液体后制备溶液或悬浮液的固体形式；并且，所述制备物也可以进行乳化。

适合于可注射使用的药学形式包括无菌水性溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是流体以致于它可以容易地进行注射。它还应当在制备和储存条件下是稳定的，并且必须针对微生物(例如细菌和真菌)的污染作用进行保护。

蛋白质组合物可以被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基基团形成的)，并且其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或者有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基基团形成的盐也可以源自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

药学组合物可以包括溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，它们的合适的混合物，和植物油。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来带来对于微生物作用的防止。在许多情况下，包括等渗剂剂(例如，糖或氯化钠)将会是优选的。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来带来延长的可注射组合物的吸收。

B.联合治疗

在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法牵涉针对4-1BB的抗体或抗体片段以激活其活性，以及与之相组合的第二或额外疗法。例如，所述疾病可以为癌症。

所述方法和组合物(包括联合疗法)增强治疗或保护效应，和/或增加另一种抗癌或抗高增殖疗法的治疗效应。治疗性和预防性的方法和组合物可以以对于达到所希望的效应(例如，杀伤癌细胞和/或抑制细胞高增殖)来说有效的组合量来提供。该过程可以牵涉使细胞与抗体或抗体片段以及第二疗法相接触。可以使组织、肿瘤或细胞与一种或多种包含所述试剂(即抗体或抗体片段或者抗癌试剂)中的一种或多种的组合物或药理学制剂相接触，或者通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同的组合物或制剂相接触，其中一种组合物提供1)抗体或抗体片段，2)抗癌试剂，或3)抗体或抗体片段和抗癌试剂两者。此外，考虑了这样的联合疗法可以与化学疗法、放射疗法、外科手术疗法或免疫疗法相结合地进行使用。

当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述这样的过程，通过所述过程将治疗性构建体和化学治疗或放射治疗试剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并列放置。例如，为了实现细胞杀伤，将这两种试剂以对于杀伤细胞或防止其分裂来说有效的组合量递送至细胞。

可以相对于抗癌治疗而言在之前、在期间、在之后或以各种组合施用抑制性抗体。所述施用可以以从同时到数分钟到数天到数周变动的时间间隔。在其中将所述抗体或抗体片段与抗癌试剂分开地提供给患者的实施方案中，通常将会确保在每次递送的时刻之间没有经过重大的时间段，从而所述两种化合物将会仍然能够对于所述患者发挥有利联合效应。在这种情况下，考虑了可以在彼此相距大约12至24或72小时内，更特别地在彼此相距大约6-12小时内向患者提供所述抗体疗法和所述抗癌疗法。在一些情况下，可能希望显著地延长治疗时间段，其中在各自的施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。

在某些实施方案中，治疗过程将会持续1-90天或更长时间(该此类范围包括中间天数)。考虑了一种试剂可以在第1天至第90天(该此类范围包括中间天数)中的任何一天或者其任何组合给予，和另一种试剂在第1天至第90天(该此类范围包括中间天数)中的任何一天或者其任何组合给予。在单一天(24小时的时间段)内，可以给予患者所述试剂的一次或多次施用。此外，在治疗过程之后，考虑了存在有一段时间不施行抗癌治疗。该时间段可以持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长时间(该此类范围包括中间天数)，这取决于患者的状况，例如他们的预后、体力、健康等。预期治疗周期将会根据需要重复。

可以采用各种组合。对于下面的例子，抗体疗法是“A”，和抗癌疗法是“B”：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A。

考虑到所述试剂的毒性(如果有的话)，将本发明实施方案的任何化合物或疗法施用给患者将会遵循用于施用此类化合物的一般操作方案。因此，在一些实施方案中，存在有监测可归因于联合疗法的毒性的步骤。

1.化学疗法

根据本发明实施方案，可以使用多种多样的化学治疗试剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗试剂”用于表示在癌症的治疗中进行施用的化合物或组合物。这些试剂或药物根据它们在细胞内的活性模式来进行分类，例如它们是否影响以及在什么阶段影响细胞周期。备选地，可以基于其直接交联DNA、嵌入DNA中或者通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来对试剂进行表征。

化学治疗试剂的实例包括：烷基化试剂，例如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；氮杂环丙烷类和甲基三聚氰胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；乙酰精宁类(acetogenins)(尤其是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑制素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑制素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1)；烯二炔蒽环类抗生素，包括烯二炔蒽环抗生素A；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺药，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；5-氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦生类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；利索新；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族化合物(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；依立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲类，例如维甲酸；卡培他滨；卡铂；丙卡巴肼；普卡霉素；吉西他滨；诺维本；法呢基-蛋白质转移酶抑制剂；反铂；以及上述中任一个的在药学上可接受的盐、酸或衍生物。

2.放射疗法

引起DNA损伤并且已被广泛使用的其他因素包括通常所称的γ-射线、X-射线和/或放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束辐射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV-辐射。最可能的是，所有这些因素都对DNA、对DNA的前体、对DNA的复制和修复以及对染色体的装配和维持造成宽范围的损伤。关于X-射线的剂量范围的变动为50至200伦琴的日剂量持续延长的时间段(3至4周)到2000至6000伦琴的单一剂量。关于放射性同位素的剂量范围广泛地变化，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐射的强度和类型以及赘生性细胞进行的摄取。

3.免疫疗法

本领域技术人员将会理解，可以与所述实施方案的方法相组合地或相联合地使用另外的免疫疗法。在癌症治疗的情景下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应子可以为，例如包含对于在肿瘤细胞表面上的一些标志物来说特异性的抗体或嵌合抗原受体(CAR)。在进一步的方面，所述疗法可以包括施用被靶向特定癌细胞的T-细胞或NK-细胞。此类细胞可以为了抗癌细胞活性而进行改造或者仅仅进行选择。

在一些方面，单独的抗体可以充当疗法的效应子，或者它可以募集其他细胞去实际地影响细胞杀伤。也可以将所述抗体缀合至药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且充当靶向试剂。备选地，所述效应子可以是携带与肿瘤细胞靶标直接地或间接地相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

抗体-药物缀合物已作为用于开发癌症治疗剂的突破性方法而浮现。癌症是世界上主要的死亡原因之一。抗体-药物缀合物(ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。该方法组合了针对其抗原靶标的MAb的高特异性与高度强有力的细胞毒性药物，从而导致“经武装的”MAb，其将有效负荷(药物)递送至具有富集水平的抗原的肿瘤细胞。药物的靶向递送也使得其在正常组织中的暴露最小化，从而导致降低的毒性和经改善的治疗指数。由FDA对于两种ADC药物(

(brentuximab vedotin)，2011年；和

(曲妥珠单抗-emtansine或T-DM1)，2013年)的批准验证了该方法。目前存在有超过30种ADC药物候选物处于用于癌症治疗的临床试验的各个阶段。随着抗体工程和连接体-有效负荷优化变得越来越成熟，新的ADC的发现和开发日益依赖于适合于该方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向性MAb的生成。关于ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中的上调/高的表达水平以及稳健的内化。

在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带一些易于靶向，即不存在于大多数其他细胞上的标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些中的任一种可以适合于在本发明实施方案的情景下进行靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酰路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个备选的方面是组合抗癌效应与免疫刺激效应。也存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子，例如MIP-1、MCP-1、IL-8；和生长因子，例如FLT3配体。

目前正在调查研究或使用的免疫疗法的实例为：免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ，IL-1，GM-CSF，和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人,1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如抗-CD20、抗-神经节苷脂GM2和抗-p185(Hollander,2012；Hanibuchi等人,1998；美国专利5,824,311)。考虑了可以将一种或多种抗癌疗法与在本文中所描述的抗体疗法一起进行使用。

在一些实施方案中，所述免疫疗法可以为免疫检查点抑制剂。免疫检查点为在免疫系统中的分子，其要么调高信号(例如，共刺激分子)要么调低信号。可以被免疫检查点阻断所靶向的抑制性检查点分子包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞激活基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V-结构域Ig抑制因子(VISTA)。特别地，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

所述免疫检查点抑制剂可以为药物例如小分子，重组形式的配体或受体，或者特别地为抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll,2012；两者均通过提及而合并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白质的已知的抑制剂或者其类似物，特别地可以使用抗体的嵌合、人源化或人形式。如本领域技术人员将会知晓的，对于在本公开内容中所提及的某些抗体可以使用备选和/或等价的名称。此类备选和/或等价的名称在本发明的情景下是可互换的。例如，已知兰洛利珠单抗(lambrolizumab)也以备选和等价的名称MK-3475和帕博利珠单抗而为人所知。

在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为抑制PD-1与其配体结合伙伴结合的分子。在一个特别的方面，所述PD-1配体结合伙伴为PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂为抑制PDL1与其结合伙伴结合的分子。在一个特别的方面，PDL1结合伙伴为PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，所述PDL2结合拮抗剂为抑制PDL2与其结合伙伴结合的分子。在一个特别的方面，PDL2结合伙伴为PD-1。所述拮抗剂可以为抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性的抗体描述在美国专利号US8735553、US8354509和US8008449(均通过提及而合并入本文)中。用于在本文中所提供的方法之中使用的其他PD-1轴拮抗剂在本领域中是已知的，例如描述在美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369(均通过提及而合并入本文)中。

在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为抗-PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，所述抗-PD-1抗体选自由下列各项组成的组：纳武单抗、帕博利珠单抗和CT-011。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)相融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂为AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和

)是在WO2006/121168中所描述的抗-PD-1抗体。帕博利珠单抗(也称为MK-3475、Merck 3475、兰洛利珠单抗、

和SCH-900475)是在WO2009/114335中所描述的抗-PD-1抗体。CT-011(也称为hBAT或hBAT-1)是在WO2009/101611中所描述的抗-PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是在WO2010/027827和WO2011/066342中所描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。

可以在本文中所提供的方法之中靶向的另一个免疫检查点为细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4被发现于T细胞的表面上，并且当与在抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时作为“关”开关起作用。CTLA4是在辅助T细胞表面上表达的免疫球蛋白超家族的成员，并且向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T-细胞共刺激蛋白CD28相似，并且这两种分子都与在抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)相结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也被发现于调节T细胞中，并且可能对于其功能来说是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞激活导致增加的CTLA-4(关于B7分子的抑制性受体)的表达。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗-CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。

适合于在本方法中进行使用的抗人CTLA-4抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)可以通过使用本领域中众所周知的方法来生成。备选地，可以使用本领域认可的抗-CTLA-4抗体。例如，在本文中所公开的方法之中可以使用公开于下列文献中的抗-CTLA-4抗体：US8,119,129，WO 01/14424，WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；以前称为替西木单抗)，美国专利号6,207,156；Hurwitz等人,(1998)ProcNatl Acad Sci USA 95(17):10067-10071；Camacho等人,(2004)J Clin Oncology 22(145):Abstract No.2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等人,(1998)Cancer Res58:5301-5304。上面提及的出版物中的每一个的教导通过提及而合并入本文。也可以使用与这些本领域公认的抗体中的任何抗体竞争与CTLA-4的结合的抗体。例如，在国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504和美国专利号US8017114(均通过提及而合并入本文)中描述了人源化的CTLA-4抗体。

一种示例性的抗-CTLA-4抗体为伊匹木单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和

)或者其抗原结合片段和变体(参见例如，WOO 1/14424)。在其他实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹木单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与上面提及的抗体竞争与CTLA-4的结合和/或与上面提及的抗体结合相同的在CTLA-4上的表位。在另一个实施方案中，所述抗体与上面提及的抗体具有至少大约90％可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹木单抗具有至少大约90％、95％或99％可变区同一性)。

其他用于调节CTLA-4的分子包括CTLA-4配体和受体，其例如描述在美国专利号US5844905、US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752(均通过提及而合并入本文)中；和免疫粘附，其例如描述在美国专利号US8329867(其通过提及而合并入本文)中。

4.外科手术

大约60％的具有癌症的人将会经历一些类型的外科手术，其包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性外科手术。治愈性外科手术包括其中所有或部分癌性组织被物理移除、切除和/或破坏的切除术，并且可以与其他疗法(例如，本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或备选的疗法)相联合地进行使用。肿瘤切除术是指肿瘤的至少一部分的物理移除。除了肿瘤切除术外，通过外科手术进行的治疗包括激光外科手术、低温外科手术、电外科手术和显微控制的外科手术(莫斯外科手术)。

在切除部分或所有癌性细胞、组织或肿瘤后，在身体中可能形成空腔。治疗可以通过对该区域灌注、直接注射或局部应用另外的抗癌疗法来完成。这样的治疗可以重复，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有变化的剂量。

5.其他试剂

考虑了可以与本发明实施方案的某些方面相组合地使用其他试剂以改善治疗的治疗功效。这些另外的试剂包括：影响细胞表面受体和GAP连接的上调的试剂，细胞抑制和分化试剂，细胞粘附的抑制剂，增加高增殖性细胞对于凋亡诱导剂的敏感性的试剂，或其他生物学试剂。通过提高GAP连接的数目而导致的细胞间信号传导的增加将会增加对于相邻的高增殖性细胞群体的抗高增殖效应。在其他实施方案中，可以与本发明实施方案的某些方面相组合地使用细胞抑制或分化试剂以改善治疗的抗高增殖功效。细胞粘附的抑制剂被考虑用于改善本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例为局部粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑了可以与本发明实施方案的某些方面相组合地使用其他增加高增殖性细胞对于凋亡的敏感性的试剂，例如抗体c225，以改善治疗功效。

III.试剂盒和诊断

在所述实施方案的各个方面，设想了试剂盒，其包含治疗试剂和/或其他治疗和递送试剂。在一些实施方案中，本发明实施方案考虑了用于制备和/或施用所述实施方案的疗法的试剂盒。所述试剂盒可以包含一个或多个密封的小瓶，所述小瓶包含本发明实施方案的药学组合物中的任何一种。所述试剂盒可以包括例如至少一种4-1BB抗体，以及用于制备、配制和/或施用所述实施方案的组分或者用于施行本发明方法的一个或多个步骤的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含合适的容器，其为不会与试剂盒的组分反应的容器，例如eppendorf管、测定平板、注射器、瓶子或管。所述容器可以由可灭菌的材料(例如，塑料或玻璃)制成。

所述试剂盒还可以包括说明书，其概述了在本文中所阐述的方法的程序步骤，并且将会遵循与在本文中所描述的那些实质上相同的或者本领域技术人员已知的程序。指导信息可以在包含机器可读指令的计算机可读介质中，所述指令在当使用计算机来执行时引起递送药学有效量的治疗试剂的真实或虚拟程序的展示。

IV.实施例

包括了下面的实施例以示范本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应当意识到，在下面的实施例中所公开的技术代表了由发明人发现在本发明的实践中很好地发挥功能的技术，并且因此可以被认为构成了关于本发明的实践的优选方式。但是，根据本公开内容，本领域技术人员应当意识到，在所公开的特别的实施方案中可以进行许多变化，并且其仍然获得同样或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。

实施例1–抗-41BB抗体的产生和表征

用交替的细胞疫苗(经逆转录病毒改造以表达4-1BB的巨噬细胞或树突细胞)和基于重组蛋白质的疫苗(具有Fc或HIS标签的重组人4-1BB细胞外区域)对小鼠进行免疫接种，以生成靶向人4-1BB的抗体(图1)，包括克隆54(IgG2a)、克隆49A(IgG1)、克隆138(IgG2b)、克隆151(IgG3)和克隆111A(IgG1)。通过ELISA完成克隆的滴定曲线，并且确定EC50值(图1B)。

RNA提取：杂交瘤细胞粒状沉淀由Long Vien(Monoclonal Antibody CoreFacility MDACC)提供。从所述杂交瘤细胞粒状沉淀中提取总mRNA。使用RNA提取实验方案(Zymo Research)，从杂交瘤克隆271-54 41-BB细胞粒状沉淀中提取总RNA。

RT-PCR：用随机引物(RT SuperscritIII,Life Technologies)，通过逆转录从RNA产生cDNA。使用可变结构域引物的PCR反应扩增出单克隆抗体DNA的VH和VL区，从而给出在图3中的条带。将VH和VL产物进行凝胶纯化，并且克隆到测序载体pCR^TM

中并转化到DH5a细胞中。接下来，使用M16正向和反向引物(mFVIj正向引物(位置59-76)序列：ACTGCAGGTGTCCTCTCT(SEQ ID NO:65)；mRevIgG2a反向引物(位置526-506)序列：TAACCCTTGACCAGGCATCC(SEQ ID NO:66)；mFVK4/5a正向引物(位置47-67)序列：TCAGCTTCYTGCTAATCAGTG(SEQ ID NO:67)；1mRK反向引物(位置491-471)序列：ACTGAGGCACCTCCAGATGTT(SEQ ID NO:68))，通过PCR来筛选阳性转化体。挑选出所选择的菌落用于进行小量制备质粒纯化，并且通过DNA测序(MDACC核心设施)来进行分析。

在许多先导候选物中，选择了克隆54 4-1BB抗体，将其进行测序和表达(以各种各样的小鼠和人同种型)。将患者肿瘤块在肿瘤浸润淋巴细胞培养基中进行培养，以支持它们在细胞培养物中的存活和快速增殖。本研究发现，克隆54 4-1BB抗体的小鼠IgG2a版本与抗人4-1BB抗体乌瑞芦单抗一样有效地使人肿瘤浸润CD8 T细胞和CD4 T细胞扩增和成熟(图2B)。另外，克隆54有效地扩增了来自具有成胶质细胞瘤或结肠直肠癌的患者的肿瘤的肿瘤浸润CD8 T细胞和CD4 T细胞(图4)。

***

所有在本文中所公开的和所要求保护的方法都可以根据本公开内容来进行制作和施行，而无需过度的实验。虽然已经按照优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说将会明显的是，可以对于在本文中所描述的方法和在本文中所描述的方法的步骤中或步骤顺序中施加变化，而不背离本发明的构思、精神和范围。更特别地，将会明显的是，某些在化学上和在生理学上都相关的试剂可以替代在本文中所描述的试剂，而将会取得相同或相似的结果。所有此类对于本领域技术人员来说明显的相似的替代或修饰都被认为在本发明的精神、范围和构思之内，如由所附的权利要求书所定义的。

参考文献

下面的参考文献通过提及而特别地合并入本文，达到它们提供示例性的对于在本文中所阐述的那些来说补充性的程序或其他细节的程度。

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 429

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 1

gagttccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tgaactgggt gaagcagagc 120

aatggaaaga gccttgagtg gattggagta attaatccta actatggtac tactagctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacattt actgtagacc aatcttccag cacagcctac 240

atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatccccg 300

gtagaggact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 360

acaacagccc catcggtcta tccactggcc cctgtgtgtg gaggtacaac tggctcctcg 420

gtgactcta 429

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 2

Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu

130 135 140

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 3

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn

1 5

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 4

ggttactcat tcactgacta caac 24

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 5

Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr

1 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 6

attaatccta actatggtac tact 24

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 7

Ala Arg Ser Pro Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 9

gaaaatgtgc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 60

atgacctgca gggccaggtc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

tcaggtgcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acttggcttc tggagtccct 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagtgtggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtacagtg gttacccact catcacgttc 300

ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 360

ccaccatcca gtgagcagtt 380

<210> 10

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 10

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Arg Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

100 105 110

Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 11

Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 12

tcaagtgtaa gttccagtta c 21

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 13

Ser Thr Ser

1

<210> 14

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 14

agcacatcc 9

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 15

Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Ile Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 16

cagcagtaca gtggttaccc actcatcacg 30

<210> 17

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 17

aggtgaagct gcagcagtca ggacctgagc tggtgaagcc tggggcttca gtgaagatat 60

cctgtaaggc ttctggatac acgttcactg actactacat gaactgggtg aagcagagcc 120

atggaaagag ccttgagtgg attggagata ttaatcctaa caatgatggt actacctact 180

acaaccagaa gttcaagggc aaggccacat tgactgtaga caagtcctcc agcacagcct 240

acatggagct ccgcagcctg acatctgagg actctgcagt ctattactgt gcaagatccc 300

tctacggtag tagctactac tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct 360

cag 363

<210> 18

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 18

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

20 25 30

Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Asp Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 19

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 20

ggatacacgt tcactgacta ctac 24

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 21

Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr

1 5

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 22

attaatccta acaatgatgg tact 24

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 23

Ala Arg Ser Leu Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 24

gcaagatccc tctacggtag tagctactac tttgactac 39

<210> 25

<211> 334

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 25

gatattgtga tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggacccgtgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334

<210> 26

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 26

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

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Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 27

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 28

aaaagtgtca gtacatctgg ctatagttat 30

<210> 29

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 29

Leu Val Ser

1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 30

cttgtatcc 9

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 31

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 32

cagcaaagta atgaggaccc gtggacg 27

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 33

aggtgcagct gcaggagtct gggggaggct tagtgaagcc tggagggtcc ctgaaactct 60

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cagacacagt gacgggccga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac accctgttcc 240

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gttacttcta ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcag 354

<210> 34

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 34

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly

20 25 30

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

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Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu

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Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

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Ser Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 35

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 36

ggattcactt tcagtgacta tgga 24

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 37

Ile Ser Ser Gly Ser Asn Ser Ile

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 38

attagtagtg gcagtaattc catc 24

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 39

Ala Ser Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 40

gcctcgaata atggttactt ctactttgac tac 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 41

attgtgatca cccagtctcc agcaatcctg tctgcatctc caggggagaa ggtcacaatg 60

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tcccccaaac cctggattta tgccacatcc aacctggctt ctggagtccc tgctcgcttc 180

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aagttggaaa taaaac 316

<210> 42

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 42

Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

20 25 30

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala

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Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp

65 70 75 80

Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Phe Thr Phe

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Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

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Ser Ser Val Ser Tyr

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 44

tcaagtgtaa gttac 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 45

Ala Thr Ser

1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 46

gccacatcc 9

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 47

Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Phe Thr

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 48

cagcagtgga gtagtgaccc attcacg 27

<210> 49

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 49

aggtgaaact gcagcagtca ggacctgagc tggtgaagcc tggggcttca gtgaagatat 60

cctgtaaggc ttctggatac acgttcactg actactacat gaactgggtg aaggagagcc 120

atggaaagag ccttgagtgg attggagata ttaatcctaa caatggtggt tctacctact 180

acaaccagaa gttcaagggc aaggccacat tgactgtaga gaagtcctcc agcacagcct 240

tcatggagct ccgcagcctg acatctgagg actctgcagt ctattactgt gcaagatccc 300

tctacggtag tacctactac tttgactact ggggccaagg cacccctctc acagtctcct 360

cag 363

<210> 50

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 50

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

20 25 30

Met Asn Trp Val Lys Glu Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

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Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Glu Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

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Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Ser Leu Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 51

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 52

ggatacacgt tcactgacta ctac 24

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 53

Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ser

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

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attaatccta acaatggtgg ttct 24

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 55

Ala Arg Ser Leu Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 56

gcaagatccc tctacggtag tacctactac tttgactac 39

<210> 57

<211> 334

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 57

gatattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120

caacagaagc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tggaacctat tactgtcagc aaagtaatga cgatccgtgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334

<210> 58

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 58

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

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Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

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Asp Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 59

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr

1 5 10

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 60

caaagtgttg attatgatgg tgatagttat 30

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 61

Ala Ala Ser

1

<210> 62

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 62

gctgcatcc 9

<210> 63

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 63

Gln Gln Ser Asn Asp Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 64

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的抗体

<400> 64

cagcaaagta atgacgatcc gtggacg 27

Claims (45)

1.分离的单克隆抗体，其中所述抗体特异性地与4-1BB相结合并且包含：

(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:3同一；

(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:5同一；

(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:7同一；

(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:11同一；

(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:13同一；和

(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:15同一；

或者

(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:19同一；

(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:21同一；

(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:23同一；

(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:27同一；

(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:29同一；和

(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:31同一；

或者

(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:35同一；

(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:37同一；

(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:39同一；

(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:43同一；

(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:45同一；和

(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:47同一；

或者

(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:51同一；

(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:53同一；

(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:55同一；

(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:59同一；

(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:61同一；和

(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:63同一。

2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：

(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:3同一；

(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:5同一；

(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:7同一；

(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:11同一；

(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:13同一；和

(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:15同一。

3.权利要求2的抗体，其中所述抗体包含与克隆54的V_H结构域(SEQ ID NO:2)至少大约80％同一的V_H结构域，和与克隆54的V_L结构域(SEQ ID NO:10)至少大约80％同一的V_L结构域。

4.权利要求2的抗体，其中所述抗体包含与克隆54的V_H结构域(SEQ ID NO:2)至少大约90％同一的V_H结构域，和与克隆54的V_L结构域(SEQ ID NO:10)至少大约90％同一的V_L结构域。

5.权利要求2的抗体，其中所述抗体包含与克隆54的V_H结构域(SEQ ID NO:2)同一的V_H结构域，和与克隆54的V_L结构域(SEQ ID NO:10)同一的V_L结构域。

6.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：

(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:19同一；

(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:21同一；

(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:23同一；

(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:27同一；

(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:29同一；和

(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:31同一。

7.权利要求6的抗体，其中所述抗体包含与克隆135B的V_H结构域(SEQ ID NO:18)至少大约80％同一的V_H结构域，和与克隆135B的V_L结构域(SEQ ID NO:26)至少大约80％同一的V_L结构域。

8.权利要求6的抗体，其中所述抗体包含与克隆135B的V_H结构域(SEQ ID NO:18)至少大约90％同一的V_H结构域，和与克隆135B的V_L结构域(SEQ ID NO:26)至少大约90％同一的V_L结构域。

9.权利要求6的抗体，其中所述抗体包含与克隆135B的V_H结构域(SEQ ID NO:18)同一的V_H结构域，和与克隆135B的V_L结构域(SEQ ID NO:26)同一的V_L结构域。

10.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：

(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:35同一；

(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:37同一；

(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:39同一；

(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:43同一；

(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:45同一；和

(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:47同一。

11.权利要求10的抗体，其中所述抗体包含与克隆138的V_H结构域(SEQ ID NO:34)至少大约80％同一的V_H结构域，和与克隆138的V_L结构域(SEQ ID NO:42)至少大约80％同一的V_L结构域。

12.权利要求10的抗体，其中所述抗体包含与克隆138的V_H结构域(SEQ ID NO:34)至少大约90％同一的V_H结构域，和与克隆138的V_L结构域(SEQ ID NO:42)至少大约90％同一的V_L结构域。

13.权利要求10的抗体，其中所述抗体包含与克隆138的V_H结构域(SEQ ID NO:34)同一的V_H结构域，和与克隆138的V_L结构域(SEQ ID NO:42)同一的V_L结构域。

14.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：

(a)第一个V_H CDR与SEQ ID NO:51同一；

(b)第二个V_H CDR与SEQ ID NO:53同一；

(c)第三个V_H CDR与SEQ ID NO:55同一；

(d)第一个V_L CDR与SEQ ID NO:59同一；

(e)第二个V_L CDR与SEQ ID NO:61同一；和

(f)第三个V_L CDR与SEQ ID NO:63同一。

15.权利要求14的抗体，其中所述抗体包含与克隆49A的V_H结构域(SEQ ID NO:50)至少大约80％同一的V_H结构域，和与克隆49A的V_L结构域(SEQ ID NO:58)至少大约80％同一的V_L结构域。

16.权利要求14的抗体，其中所述抗体包含与克隆49A的V_H结构域(SEQ ID NO:50)至少大约90％同一的V_H结构域，和与克隆49A的V_L结构域(SEQ ID NO:58)至少大约90％同一的V_L结构域。

17.权利要求14的抗体，其中所述抗体包含与克隆49A的V_H结构域(SEQ ID NO:50)同一的V_H结构域，和与克隆49A的V_L结构域(SEQ ID NO:58)同一的V_L结构域。

18.权利要求1-5中任一项的抗体，其中所述抗体是重组的。

19.权利要求1的抗体，其中所述抗体为IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。

20.权利要求1-19中任一项的抗体，其中所述抗体为Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。

21.权利要求1中任一项的抗体，其中所述抗体为人抗体、人源化抗体或脱免疫化抗体。

22.权利要求1-21中任一项的抗体，其中所述抗体与显像剂、化学治疗试剂、毒素或放射性核素相缀合。

23.组合物，其包含处于在药学上可接受的承载体中的权利要求1-22中任一项的抗体。

24.分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求1-21中任一项的抗体的核酸序列。

25.重组多肽，所述重组多肽包含：抗体V_H结构域，其包含克隆54的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:3、5和7)、克隆135B的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:19、21和23)、克隆138的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:35、37和39)或者克隆49A的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ IDNO:51、53和55)。

26.重组多肽，所述重组多肽包含：抗体V_L结构域，其包含54的V_L结构域的CDR 1-3(SEQID NO:11、13和15)、135B的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:27、29和31)、138的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:43、45和47)或者49A的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:59、61和63)。

27.重组多肽，所述重组多肽包含：

包含克隆54的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:3、5和7)的抗体V_H结构域，和包含54的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:11、13和15)的抗体V_L结构域；

包含克隆135B的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:19、21和23)的抗体V_H结构域，和包含135B的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:27、29和31)的抗体V_L结构域；

包含克隆138的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:35、37和39)的抗体V_H结构域，和包含138的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:43、45和47)的抗体V_L结构域；或者

包含克隆49A的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:51、53和55)的抗体V_H结构域，和包含49A的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:59、61和63)的抗体V_L结构域。

28.分离的多核苷酸分子，其包含编码权利要求25-27中任一项的多肽的核酸序列。

29.宿主细胞，其包含一种或多种编码权利要求1-21中任一项的抗体或者权利要求25-27中任一项的重组多肽的多核苷酸分子。

30.权利要求29的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

31.制备抗体的方法，所述方法包括：

(a)在细胞中表达一种或多种编码权利要求1-21中任一项的抗体的V_L和V_H链的多核苷酸分子；和

(b)从所述细胞中纯化出所述抗体。

32.用于治疗具有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项的抗体。

33.权利要求32的方法，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。

34.权利要求32的方法，其中所述抗体处于在药学上可接受的组合物中。

35.权利要求32的方法，其中所述抗体全身地进行施用。

36.权利要求32的方法，其中所述抗体以静脉内方式、以真皮内方式、以肿瘤内方式、以肌内方式、以腹膜内方式、以皮下方式或局部地进行施用。

37.权利要求32的方法，其还包括向所述受试者施用至少第二抗癌疗法。

38.权利要求37的方法，其中所述第二抗癌疗法为外科手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。

39.权利要求37的方法，其中所述第二抗癌疗法包括过继T-细胞疗法。

40.权利要求37的方法，其中所述第二抗癌疗法包括免疫疗法。

41.权利要求40的方法，其中所述免疫疗法为免疫检查点抑制剂。

42.权利要求41的方法，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂为抗-CTLA-4抗体、抗-PD-L1抗体和/或抗-PD1抗体。

43.权利要求28的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为人程序性细胞死亡1(PD-1)结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂或PDL2结合拮抗剂。

44.权利要求43的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂为单克隆抗体或其抗原结合片段。

45.权利要求43的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂为纳武单抗、帕博利珠单抗、CT-011(匹地利珠单抗)、BMS-936559(MDX-1105)、MPDL328OA(阿替利珠单抗)或AMP-224(PD-L2 Fc融合蛋白)。

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