KR20180019725A - 신규의 피디 1 면역 조절제 - Google Patents

신규의 피디 1 면역 조절제 Download PDF

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KR20180019725A
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레니어 제이. 브랑센
홀리 제인 잭슨
쳉 리우
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메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터
유레카 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 출원은 항-PD-1 항원-결합 단백질 또는 그의 단편뿐만 아니라 상기와 같은 항원-결합 단백질 또는 단편을 발현하는 핵산 또는 CAR T 세포를 포함하는 구조물을 제공한다. 또한, 상기와 같은 구조물 또는 세포를 사용하여 T 세포를 조절하거나 또는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

신규의 피디 1 면역 조절제{NOVEL PD-1 IMMUNE MODULATING AGENTS}
관련출원의 상호참조
본 출원은 2015년 6월 23일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/183,297 호 및 2015년 12월 11일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/266,398 호에 대한 우선권을 주장하며; 각 출원의 내용은 본 명세에 참고로 인용된다.
서열 목록
본 출원은 2016년 6월 16일자로 생성된 서열 목록을 함유하며; 파일은 ASCII 포맷으로 3314070AWO_SequenceListing_ST25.txt로 표시되며 크기가 104 킬로바이트이다. 상기 파일은 내용 전체가 본 출원에 참고로 인용된다.
기술 분야
본 명세는 일반적으로 면역기능에 관련된 항원-결합 단백질에 관한 것이다. 보다 특히, 본 명세는 PD-1에 대한 특이성을 갖는 재조합 항체, 키메릭 항원 수용체 및 그의 단편에 관한 것이다.
암 면역요법의 목적은 암 특이성 면역반응을 조절함으로써 악성 질병을 치료하는 것이다. 주 표적은 예정세포사(PD-1) 수용체이며, 상기 수용체는 활성화된 T 세포의 표면상에서 발현되고 그의 리간드, PD-L1 및 PD-L2 중 하나에 결합시 세포내 억제 신호를 도출한다.
PD-1은 암에서 한 역할을 하는 것으로 나타났다. 인간에서, PD-1 및/또는 PD-L1의 발현은 면역조직화학에 의해 평가된 다수의 1차 종양 생검에서 발견되었다. 상기와 같은 조직은 폐, 간, 난소, 자궁경부, 피부, 결장, 신경교종, 방광, 유방, 신장, 식도, 위, 구강 편평상피세포, 요로 상피세포, 및 췌장의 암뿐만 아니라 두경부의 종양을 포함한다. 더욱 또한, 종양 세포상에서의 PD-리간드 발현은 다수의 종양 유형에 걸쳐 암 환자의 불량한 예후와 상관되었다.
PD-1을 표적화하고 PD-1의 작용물질 또는 그의 길항물질로서 기능하는 항체 및 다른 항원-결합 단백질을 포함하는 신규의 치료제가 계속해서 필요하다.
본 명세는 T 세포상의 예정세포사, PD-1과 관련된 단백질 수용체에 특이적으로 결합하여 상기 T 세포에 의한 면역 반응을 조절할 수 있는 항체 및 키메릭 항원 수용체와 같은 항원-결합 단백질을 기재한다. 상기 PD-1의 그의 리간드, PD-L1에의 결합을 억제함에 의한 상기 PD-1 신호전달 경로의 봉쇄는 상기 T 세포의 세포사멸을 억제한다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 명세는 PD-1에 특이적으로 결합하고 그의 리간드의 결합을 방지하는 재조합 항원-결합 단백질, 항체 및 키메릭 항원 수용체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 명세는 하기 중 하나를 포함하는 재조합 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(A) 서열번호 10, 서열번호 21, 서열번호 32, 서열번호 43, 서열번호 53, 서열번호 61, 서열번호 72, 서열번호 83, 서열번호 94, 서열번호 103, 서열번호 114, 서열번호 125, 서열번호 133, 서열번호 142; 그의 단편 및 그의 상동성 서열로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 서열번호 6 및 8; 서열번호 17 및 19; 서열번호 28 및 30; 서열번호 39 및 41; 서열번호 49 및 51; 서열번호 57 및 59; 서열번호 68 및 70; 서열번호 79 및 81; 서열번호 90 및 92; 서열번호 99 및 101; 서열번호 110 및 112; 서열번호 121 및 123; 서열번호 129 및 131; 서열번호 138 및 140; 이들의 단편 및 이들의 상동성 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 각각 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항원 결합 영역; 또는
(C) 하기를 포함하는 항원 결합 영역:
(i) 아미노산 서열 QSISSY (서열번호 1), AAS 및 QQSYSTPLT (서열번호 2)를 갖는, 각각 경쇄 상보성 결정 영역 (LCCDR) LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTSSSYW (서열번호 4), IKQDGSEK (서열번호 5) 및 ARGGWSYDM (서열번호 6)을 갖는, 각각 중쇄 상보성 결정 영역 (HCCDR) HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(ii) 아미노산 서열 SSNIGAGYA (서열번호 12), TNN 및 QSYDSSLSGVI (서열번호 13)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTLTELS (서열번호 14), FDPEDGET (서열번호 15) 및 ARAYYGFDQ (서열번호 16)를 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(iii) 아미노산 서열 SSNIGNNA (서열번호 23), YND 및 AAWDDSVNGYV (서열번호 24)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTRFG (서열번호 25), ISVNNGNT (서열번호 26) 및 ARYMYGRRDS (서열번호 27)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(iv) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDS 및 QVWDNHSDVV (서열번호 35)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 RNKFSSYA (서열번호 36), ISGSGGTT (서열번호 37) 및 ARWYSSYYDV (서열번호 38)를 포함하는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(v) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDS 및 QVWDSSSDYV (서열번호 45)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARNYISMFDS (서열번호 48)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(vi) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDS 및 QVWDSSSDHV (서열번호 55)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARGYSSYYDA (서열번호 56)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(vii) 아미노산 서열 RSNIGENT (서열번호 63), SNN 및 AAWDDRLNGYV (서열번호 64)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTNYG (서열번호 65), IGAQKGDT (서열번호 66) 및 ARSQGVPFDS (서열번호 67)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(viii) 아미노산 서열 RSNIGSNT (서열번호 74), NNN 및 ATWDDSLNEYV (서열번호 75)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTRYG (서열번호 76), ISGYNGNT (서열번호 77) 및 ARHGYGYHGD (서열번호 78)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(ix) 아미노산 서열 SSNIGAGYV (서열번호 85), HNN 및 QSYDSSLSGWV (서열번호 86)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFKDYY (서열번호 87), ISTSGNSV (서열번호 88) 및 ARSPGHSDYDS (서열번호 89)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(x) 아미노산 서열 NIGDKS (서열번호 96), YDS 및 QVWASGTDHPYVI (서열번호 97)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARMYGSYTDM (서열번호 98)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(xi) 아미노산 서열 SSNIGYNY (서열번호 105), RNN 및 TSWDDSLSGYV (서열번호 106)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GNAFTNFY (서열번호 107), INPSGTDLT (서열번호 108) 및 ARQYAYGYSGFDM (서열번호 109)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(xii) 아미노산 서열 QSVSNW (서열번호 116), AAS 및 QQSYSTPIT (서열번호 117)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTSYY (서열번호 118), INPNTGGS (서열번호 119) 및 ARGDVTYDE (서열번호 120)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(xiii) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDD 및 QVWDINDHYV (서열번호 127)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARSQASFMDI (서열번호 128)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열; 또는
(xiv) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), DDS 및 QVWDSSSDQGV (서열번호 135)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), IGTGGGT (서열번호 136) 및 ARGTGYDGDQ (서열번호 137)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열.
일부 실시태양에서, 상기 재조합 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 적어도 하나의 인용된 서열번호의 전체 길이의 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 상기 인용된 서열번호 중 적어도 하나의 단편을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 적어도 하나의 인용된 서열번호에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 일치성을 갖는 상기 인용된 서열번호 중 적어도 하나에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
관련된 태양에서, 본 명세는 재조합 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 여기에서 상기 재조합 항원-결합 단백질은 항체, 키메릭 항원 수용체(CAR), 그의 융합 단백질 또는 접합체이다. 하나의 실시태양에서, 상기 재조합 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 치료제, 예를 들어 약물, 독소 또는 세포독성 부분, 방사성동위원소, 단백질 또는 펩티드에 접합시킨다.
본 명세의 항체는 완전-길이 항체, 완전 항체, 비제한적으로 Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 그의 단편 및 상동성 서열이다.
상기 재조합 항원-결합 단백질에서, 상기 항원-결합 영역은 인간 PD-1의 에피토프에 특이적으로 결합하며, PD-1의 그의 리간드(들)에의 결합을 차단한다.
관련된 태양에서, 본 명세는 본 명세의 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산뿐만 아니라 상기와 같은 핵산 또는 항원-결합 단백질을 포함하는 벡터 및 세포에 관한 것이다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 명세는 치료 유효량의 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편을 투여함을 포함하는, 대상 (subject)에 있어서 T 세포 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 치료 유효량의 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편의 투여는 PD-1에 의해 매개되는 신호전달(signal transduction)을 억제하거나, 감소시키거나, 조절하거나 또는 제거한다.
더욱 또 다른 관련된 태양에서, 본 명세는 PD1-양성 질병을 갖는 대상 (subject)에게 치료 유효량의 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편을 투여함을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 투여한다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 본 명세는 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것으로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 명세는 본 명세서에 기재된 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 관련된 태양에서, 본 명세는 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것으로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않다. 또 다른 관련된 태양에서, 본 명세는 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질 및 키메릭 항원 수용체를 포함하는 세포에 관한 것으로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않다.
본 명세서에 기재된 벡터 또는 세포의 일부 실시태양에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 PD-1에 특이적으로 결합하지 않는다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 본 명세는 대상에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질, 벡터, 세포 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는 상기 대상에서 T 세포 반응을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 PD-1 길항물질이다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양에서, 본 명세는 대상에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질, 벡터, 세포 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는 상기 대상에 있어서 T 세포 반응을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 PD-1 작용물질이다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 본 명세는 PD1-양성 질병을 갖는 대상에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질, 벡터, 세포 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는 상기 대상의 치료 방법을 제공한다.
관련된 태양에서, 본 명세는 PD1-양성 질병을 갖는 대상 (subject)의 적어도 하나의 T 세포에, 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 형질도입시킴을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법을 제공하며, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시태양에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 PD-1에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 PD1-양성 질병은 암이다. 일부 실시태양에서, 상기 PD1-양성 질병은 자가면역 질병이다.
도 1은 PD-1 단량체에 대한 scFv-Fc 클론의 상대적인 결합 친화성을 도시한다. PD-1에 결합하는 scFv-Fc 클론의 능력을 PD-1 단량체에의 결합 수준을 검출함으로써 측정하였다. 상기 scFv-Fc 클론의 결합 친화성을 순위화하였으며 여기에서 클론 31은 약하게 결합하였고 클론 26 및 27이 가장 강하게 결합하였다(31 < 23 < 40 < 18 < 16 = 27 < 26).
도 2a 및 b는 PD-1과 그의 리간드, PD-L1과의 상호작용의 붕괴를 도시한다. a는 상기 PD-1/PD-L1 상호작용을 붕괴시키는 scFv-Fc의 능력을 측정하는데 사용되는 경쟁 결합 분석의 개략도이다. (1) 비오틴화된 PD-1-Fc를 연속적으로 희석된 ET901 ScFv-Fc(음성 대조용) 또는 항-PD1 ScFv-Fc와 혼합하고; (2) 이어서 PD-L1-Fc 코팅된 플레이트에 가하였다. 단계 (3)에서, 코팅된 PD-L1에 대한 PD-1-Fc 결합을 HRP-접합된 스트렙트아비딘을 통해 시각화하였다. b. 상기 경쟁 결합 분석 결과를 비교하기 위해서, 상기 scFv의 농도가 1.7 내지 5.25 ug/㎖인 점들에 원을 그렸다. 클론 40 및 23은 상기 상호작용을 붕괴시키는 능력이 가장 약하였으며 클론 26은 가장 강하였다(26 > 27 = 16 > 18 > 31 > 23 = 40).
도 3은 사용된 구조물의 개략도이다. 분비성 scFv를, 쥐 카파 리더 서열을 포함시켜 세포로부터 상기 scFv의 수출을 허용하도록 설계하였다. 세린 글리신 링커(G4S)를 사용하여 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 연결시켰다. HIS/HA 태그를, 상기 scFv의 검출을 허용하도록 포함시켰다. SFG-1928z/scFv 레트로바이러스 구조물의 개략도는 5' 및 3' 긴 말단 반복부(LTR), 이어맞추기 공여체(SD), 이어맞추기 수용체(SA), 패키징 요소(ψ), CD8 리더 서열(CD8), 단쇄 가변 단편(scFv)의 가변 중(VH) 및 가변 경(VL) 쇄, 막관통 도메인(TM), 인간 CD28 신호전달 도메인(hCD28), 인간 제타 쇄 신호전달 도메인(hζ 쇄) 및 항-PD-1 scFv의 위치를 묘사한다.
도 4는 1928z CAR을 단독으로 또는 PD-1 scFv와 함께 발현하도록 변형된 인간 말초 혈액 T 세포의 확대를 도시한다. 형질도입된 T 세포를 50 IU/㎖ 재조합 인간 IL-2 중에서 배양하고 확대를 모니터하였다. 상기 CAR을 발현하고 항-PD-1 scFv 클론 23 또는 27을 분비하도록 변형된 T 세포는 상기 CAR을 단독으로 발현하는 T 세포와 적어도 균등한 확대를 가졌다. 상기 1928z CAR을 발현하고 항-PD-1 scFv 클론 16, 18, 26, 31 또는 40을 분비하도록 변형된 세포는 시험관내에서 확대되지 않았다. 도시된 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 5는 항-PD-1 scFv를 분비하는 종양 표적화된 T 세포로부터의 INF-γ 분비(pg/㎖)를 도시한다. 상기 CAR 또는 CAR을 발현하고 항-PD-1 scFv를 분비하는 T 세포를 CD19+ 라지(Raji) 종양 세포와 함께 공배양하였다. 상등액을 루미넥스(Luminex) 기술로 분석하여 상기 T 세포로부터 분비된 사이토킨의 수준을 검출하였다. 상기 1928z CAR을 발현하고 항-PD-1 scFv 클론 23 및 27을 분비하도록 변형된 T 세포는 상기 CAR을 단독으로 발현하도록 변형된 세포에 비해 IFN-γ의 증가된 분비를 가졌다. 상기 1928z CAR을 발현하고 항-PD-1 scFv 클론 16, 18, 2, 31 또는 40을 분비하도록 변형된 세포는 상기 CAR 단독으로 변형된 세포에 비해 적은 IFN-γ를 분비하였다.
도 6은 1928z CAR 및 유레카(Eureka) 항-PD-1 scFv에 의한 인간 T 세포의 형질도입 결과를 도시한다. (상부 패널) 형질도입에 이어서, 인간 T 세포를 상기 1928z CAR에 특이적인 항체(19E3)를 사용하여 유식 세포측정 (flow cytometry)에 의해 평가하여 CAR 발현을 검출하였다. 형질도입 효율은 시험된 모든 구조물에 대해 55% 초과였으며 재현가능하였다. (하부 패널) 유레카 항-PD-1 scFv 클론 26, 27 및 40을 함유하는 구조물은 현저하게 더 낮은 형질도입 효율을 가졌다, *p<0.05. 4개의 독립적인 실험으로부터의 형질도입 효율, 도시된 데이터는 평균 +/-SEM이다.
도 7은 1928z CAR 및 유레카 항-PD-1 scFv를 발현하도록 변형된 T 세포에서 항-PD-1 scFv의 존재의 효과를 도시한다. 상기 CAR 및 유레카 항-PD-1 scFv를 발현하도록 형질도입된 인간 T 세포를 웨스턴 블럿 용해물의 제조에 앞서 4시간 동안 골지 억제제와 함께 배양하였다. 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 막을 항-HA 항체로 탐침조사함으로써 항-PD-1 scFv를 검출하였다. 막을 로딩 대조용으로서 항-GAPDH 항체로 탐침조사하였다.
도 8은 PD-L1/L2의 존재/부재하에서 1928z CAR 및 항-PD-1 scFv를 발현하도록 변형된 인간 T 세포의 확대를 도시한다. 상기 CAR을 발현하고 항-PD-1 scFv 클론 23, 26, 27 및 40을 분비하도록 변형된 인간 T 세포를, 인간 PD-1L1/L2를 발현하거나 또는 발현하지 않는 인공 항원 제공 세포(aAPC, 쥐 3T3 섬유아세포)상에 놓았다. aAPC와 24시간 배양 후에, CD3/CD28 활성화 비드를 상기 세포에 가하여 증식을 자극하였다(1:2 비드:T 세포 비). 3일 후에, T 세포를 트립판 블루 배제를 사용하여 계수하였다. 상기 1928zCAR 및 항-PD-1 scFv 클론 26 및 23을 발현하도록 변형된 T 세포는, 억제성 리간드를 발현하지 않는 aAPC에 비해 PD-L1/L2를 발현하는 aAPC상에서 감소된 증식을 가졌다. 대조적으로, 상기 1928zCAR 및 항-PD-1 scFv 클론 27을 발현하도록 변형된 T 세포는 PD-L1/L2를 발현하는 aAPC상에서 증가된 확대를 가졌다. 도시된 데이터는 하나의 실험을 나타낸다.
도 9는 본 명세의 일부 항원-결합 단백질의 가변 경쇄 및 중쇄에 대한 상보성 결정 영역(CDR)에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
도 10은 항-PD-1 특이성 scFv로부터 생성된 단클론 항체가 인간 T 세포상의 PD-1에 결합함을 도시한다. 상기 PD-1 특이성 scFv로부터 인간 단클론 항체를 생성시키고 이를 인간 PD-1을 과발현하도록 변형된 인간 T 세포와 배양하였다(1 ㎍/㎖). 유식 세포측정을, 염소 항-인간 Ig FITC 접합된 항체를 사용하여 결합된 항체를 검출하는데 사용하였다. 클론 23, 26 및 27 단클론 항체는 P-1 인간 T 세포에 각각 51%, 78% 및 67%로 결합하였다. 대조용 항체(클론 901)는 T 세포상의 인간 PD-1에 결합하지 않았다. 도시된 데이터는 하나의 실험을 나타낸다.
도 11은 PD-L1/L2를 발현하는 aAPC상에서 배양된, 1세대 CAR을 발현하도록 변형된 T 세포가 항-PD-1 클론 27 단클론 항체 존재시 확대됨을 도시한다. 상기 1세대 CD19-특이성 CAR(19z1)을 발현하도록 변형된 인간 T 세포를 24시간 동안 항-PD-1 단클론 항체와 배양하고 이어서 PD-L1/L2를 발현하거나 발현하지 않는 aAPC상에 놓았다. aAPC에 의한 24시간 자극 후에, 상기 세포를 CD3/CD28 비드로 자극하였다. 3일 후에, 상기 세포를 계수하였다. 단클론 항체 없이 배양된 19z1 T 세포(점 표시된 막대), 대조용 항체, 901(체크 표시된 막대) 및 클론 23(수평 줄무늬 막대) 및 26(수직 줄무늬 막대) 단클론 항체와 배양된 19z1 T 세포는 억제성 리간드가 없는 aAPC에 비해 PD-1 리간드를 발현하는 aAPC(상응하는 빈 막대)상에서 훨씬 적게 확대되었다. 그러나, 항-PD-1 클론 27 단클론 항체(사선 줄무늬 막대)와 배양된 19z1 T 세포는 PD-L1/L2 aAPC상에서 보다 큰 정도로 확대되었다. 도시된 데이터는 하나의 실험을 나타낸다.
도 12a 내지 12d는 PD-1 차단 scFv, E27를 분비하도록 추가로 변형된 CAR T 세포의 생성을 도시한다. a. CD19-특이성 CAR(1928z라 칭함) 또는 난소 종양 항원 특이성 CAR(4H1128z라 칭함) 및 상기 PD-1 차단 scFv, E27을 암호화하는 이중시스트론성 레트로바이러스 구조물을 생성시켰다. 상기 E27은 상기 scFv의 분비가 허용되도록 신호 펩티드, 마우스 IgK가 선행되었다. HA/His 태그를 또한 포함시켜 일단 상기 T 세포로부터 분비된 scFv를 검출하였다. b. 인간 말초 혈액 T 세포를 상기 CAR, 1928z, 또는 상기 CAR 및 E27 PD-1 차단 scFv, 1928z-E27을 암호화하는 레트로바이러스 구조물로 형질도입시켰다. 형질도입에 이어서, 유식 세포측정을, 19E3이라 칭하는 CD19-표적화된 CAR에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 상기 CAR의 발현을 검출하는데 사용하였다. c. 형질도입된 인간 T 세포로부터의 상등액의 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 항-HA 항체로 PD-1 차단 scFv를 검출하였다. 우리는 또한 상기 CAR 및 대조용 scFv, B6(항-c-myc 태그 항체를 사용하여 검출됨)를 발현하도록 변형된 T 세포로부터의 scFv 분비를 조사하였다. d. 2개의 CD19+ 종양 표적에 대한 표준 51Cr 방출 분석을 수행하여, scFv의 분비가 T 세포 세포용해 능력을 재지시하는 상기 CAR의 능력을 확실히 방해하지 않게 하였다. 상기 CAR 단독(1928z 또는 4H1128z 대조용 CAR), 상기 CAR 및 E27 scFv(1928z-E27 또는 4H1128z-E27), 또는 상기 CAR 및 대조용 scFv(1928z-B6H12.2 또는 4H1128z-B6H12.2)를 발현하는 CAR T 세포를 4시간 동안 51Cr 표지된 종양 세포(라지 또는 Nalm6)와 함께 배양하였다. 상기 CD19 특이성 CAR을 발현하는 T 세포는 상기 종양 표적을 균등한 수준으로 용해시킬 수 있었으며, 난소-표적화된 CAR T 세포는 라지 또는 Nalm6을 용해시킬 수 없었다. 따라서, 우리는 상기 scFv의 분비가 T 세포 용해 능력을 재지시하는 상기 CAR의 능력을 방해하지 않는다는 결론을 내렸다.
도 13a 내지 13d는 CAR을 발현하고 PD-1 차단 scFv를 분비하도록 변형된 T 세포가 시험관내에서 PD-L1-PD-1 상호작용으로부터의 억제에 저항함을 도시한다. a. 상기 CAR 단독(1928z), 또는 상기 CAR 및 PD-1 차단 scFv(1928z-E27)를 발현하는 T 세포를 3T3 세포 빈(empty) 세포 또는 인간 PD-L1을 발현하도록 변형된 3T3 세포상에서 배양하였다. 상기 3T3 지지 세포(feeder cell)상에서 24시간에 이어서, 세포를 상기 배양물에 1:3 비드:T 세포비로 첨가된 CD3/CD28 비드로 자극하였다. T 세포의 확대를 트립판 블루 계수로 측정하고 새로운 비드를 상기 배양물에 2회 가하였다(화살표로 표시됨). 1928z T 세포는 3T3 빈 지지 세포상에서 확대되었으나, 상기 3T3-PD-L1 지지 세포상에서는 확대되지 않았다. 대조적으로, 1928z-E27 T 세포는 상기 3T3 빈 및 3T3-PD-L1 지지 세포 모두에서 확대되었으며, 이는 PD-L1-PD-1 매개된 억제에 대한 저항을 가리킨다. b. 도 13a에 도시된 바와 같은 3T3 빈 또는 3T3-PD-L1 세포상에서 배양된 T 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하여 억제성 수용체, PD-1, 2B4 및 LAG3상에서의 발현을 검출하였다. 1928z 세포는 1928z-E27 세포보다 증가된 수준의 PD-1을 발현하였다(도시되지 않음). PD-1+ 세포상에서 통문시, 2B4 및 LAG3의 분석은 1928z 세포가 1928z-E27 세포에 비해 보다 높은 비율의 PD-1+, 2B4+ 및 LAG3+ 세포를 가짐을 밝혀내었다. c. 형질도입된 T 세포를 72시간 동안 다양한 표화기 대 표적(E:T) 비(1:1, 1:3, 1:5)로 라지-PDL1 또는 Nalm6-PDL1 종양 세포와 배양하였다. 항-CD3 및 항-CD19 항체 및 계수 비드에 의한 염색에 이은 유식 세포측정을 사용하여 시간에 따른 T 세포의 확대 및 종양 표적의 용해 (lysis)를 모니터하였다. 1928z-E27 세포(상부 곡선)는 PDL1+ 종양 세포와 배양시 1928z T 세포(하부 곡선)에 비해 보다 큰 수준으로 계속 확대되었다. d. 형질도입된 T 세포를 도 3c에 도시된 바와 같이 Nalm6-PDL1 종양 세포로 자극하고 1:5 T E:T 비로 Nalm6-PDL1 종양 세포로 재-자극하였다. 48시간 공-배양 후에 유식 세포측정을 사용하여 종양 표적의 용해를 측정하였다. 1928z-E27은 1928z 세포에 비해 재-자극시 PD-L1 종양 표적을 용해하는 능력을 유지하였다.
도 14는 CAR을 발현하고 PD-1 차단 scFv를 분비하도록 변형된 T 세포의 생체내 항-종양 효능을 도시한다. SCID-베이지색 마우스에게 0일째에 정맥내 주입을 통해 라지-PD-L1 종양 세포를 접종하였다. 1일째에, 마우스에게 106 CAR+ T 세포를 정맥내로 주입하고 생존을 임상적으로 모니터하였다. 마우스를 뒷다리 마비 발생시 안락사시켰다.
도 15a 내지 15d는 PD-1 차단 scFv, E27의 선택에 관한 것이다. a. PD-1 차단 mAb 후보 E27, E26 및 E23을 경쟁 결합 분석에 사용하여, 인간에 존재하지 않는 합텐에 대해 표적화된, 대조용 mAb와 비교된, 다양한 농도에서의 PD-L1에의 PD-1 결합의 방해를 검출하였다. E23, E26 및 E27 mAb는 모두 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 방지하였다. b. a에 사용된 E23, E26 및 E27 mAb로부터 설계된 PD-1 차단 scFv의 설계의 개략도, 여기에서 신호 펩티드는 가변 중쇄 서열 및 세린 글리신 링커 및 가변 경쇄 서열에 연결되었다. 상기 HIS/HA 태그는 상기 scFv의 검출을 위해 포함되었다. c. 항-HA 항체로 염색된, 1928z CAR과 함께 분비성 scFv를 발현하도록 형질도입된 293Glv9 패키징 세포로부터의 SN상의 웨스턴 블럿. 상기 E27 scFv는 가장 높은 수준으로 검출되었으며 따라서 상기는 본 간행물의 나머지에 사용되었다. d. PBMC + 4H1128z 및 항-HA mAb로 염색된 PBMC + 4H1128z로부터의 SN상의 웨스턴 블럿.
도 16a 내지 16e는 T 세포가 CAR을 발현하고 PD-1 차단 scFv, E27을 분비하도록 공-변형될 수 있음을 도시한다. a. 1928z CAR 단독(1928z) 또는 상기 1928z CAR 및 E27 PD-1 차단 scFv(1928z-E27)에 의한 형질도입에 이어서, 상기 1928z CAR에 특이적으로 결합하는 19E3 mAb에 의한 염색에 따른 균등한 CAR 발현을 입증하는 전형적인 유식 세포측정 플롯 (flow cytometry plot). b. 항-HA mAb로 염색된 1928z 및 1928z-E27 T 세포로부터의 SN상의 웨스턴 블럿으로, 상기 1928z-E27 세포 중 단지 ∼30 kDa 단백질만이 보이며, 이는 상기 E27 scFv가 상기 1928z-E27 형질도입된 T 세포로부터 분비되고 상기 CAR이 단독으로 형질도입된 것으로부터는 분비되지 않음을 입증한다. c. 형질도입에 이어서 1928z T 세포에 비해 1928z-E27 T 세포상에서 보다 낮은 수준의 PD-1 발현을 입증하는 전형적인 유식 세포측정. d. PD-1의 발현은 1928z T 세포에 비해 1928z-E27 T 세포상에서 통계학적 유의수준으로 더 낮았으며, 도시된 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 +/-SEM이다. e. 라지 종양 세포의 용해가 상기 E27 scFv의 분비에 의해 영향을 받지 않았음을 입증하는 4시간 51Cr 방출 분석. 1928z 및 1928z-E27 T 세포는 라지 종양 세포를 균등하게 용해시켰다. 대조용 4H1128z-E27 T 세포는 4H1128z T 세포에 비해 라지 세포의 용해 증가를 매개하지 않았다. 도시된 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 17a 내지 17g는 CAR 및 E27의 발현이 CD19+ PD-L1+ 종양 세포와 관련하여 T 세포의 증식 및 용해 능력을 보호함을 도시한다. a. 라지 종양 세포는 인간 PD-L1을 발현하도록 레트로바이러스에 의해 변형되고(라지-PDL1) PD-L1에 특이적인 mAb로 염색되었다. 모 라지 종양(라지)은 PD-L1을 발현하지 않고 라지-PDL1 종양 세포는 높은 수준의 PD-L1을 발현하였다. b. 72시간 공-배양에 이어서 유식 세포측정에 의해 측정된 바와 같은, 1928z-E27 T 세포가 1928z T 세포에 비해 보다 많은 라지-PDL1 종양 세포를 용해시킴을 도시하는 전형적인 유식 세포측정 플롯. c. 1928z-E27 T 세포는 1928z T 세포에 비해 통계학적 유의수준으로 더 많은 라지-PDL1 종양 세포를 용해시키며, 도시된 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 +/-SEM이다. d. 1928z-E27 T 세포는 유식 세포측정 및 계수 비드에 의해 측정된 바와 같이, 라지-PDL1 종양 세포와 공-배양에 이어서 보다 큰 수로 확대되며, 도시된 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터의 T 세포의 평균 총수 +/-SEM이다. e. 라지-PDL1 종양 세포와 7일 공-배양에 이어서 1928z-E27 T 세포와 비교된 1928z T 세포상에서의 증가된 PD-1 발현을 도시하는 전형적인 유식 세포측정 플롯. f. 1928z T 세포는 양성 세포의 백분율 및 PD-1 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 관하여, 1928z-E27 T 세포에 비해 현저하게 더 많은 PD-1을 발현한다. 데이터를 4개의 독립적인 실험으로부터 평균 +/-SEM으로 나타낸다. g. 7일 동안 라지-PDL1과의 공배양에 이어서 1928z-E27 세포와 비교된 2B4+PD-1+1928z T 세포의 증가된 백분율을 도시하는 전형적인 유식 세포측정 플롯. 1928z-E27 T 세포는 또한 상기 2B4+PD-1+ 집단상에서 보다 적은 BTLA 및 TIM3을 발현한다. 도시된 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 18a 내지 18c는 E27이 PD-L1과 관련하여 CD3/CD28 자극된 T 세포의 증식 능력을 보호함을 도시한다. a. NIH3T3 세포는 인간 PD-L1을 발현하도록 레트로바이러스에 의해 변형되고(3T3-PDL1) PD-L1에 특이적인 mAb로 염색되었다. 모 NIH3T3(3T3-EMPTY)은 PD-L1을 발현하지 않고 3T3-PDL1 종양 세포는 높은 수준의 PD-L1을 발현하였다. b. 1928z 및 1928z-E27 T 세포를 3T3-EMPTY 또는 3T3-PDL1 세포와 배양하고 CD3/CD28 비드로 자극하였다. 세포를 계수하고 3, 6, 9 및 12일째에 새로운 3T3 세포상에 재-도말하였다. 1928z T 세포는 3T3-EMPTY 세포에 비해 3T3-PDL1 세포와 배양시 감소된 확대를 가졌다. 1928z-E27 세포는 3T3-EMPTY 또는 3T3-PDL1 세포상에서 배양시 균등한 확대를 가졌다. 도시된 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 확대배수(fold expansion) +/-SEM이다. c. 3T3-EMPTY 세포상에서 배양된 1928z T 세포에 비해 3T3-PDL1과 배양된 1928z T 세포상에서의 2B4, PD-1, BTLA 및 TIM3의 증가된 발현을 나타내는 전형적인 유식 세포측정 플롯. 1928z-E27 세포는 3T3-EMPTY 및 3T3-PDL1과 배양시 2B4, PD-1, BTLA-4 및 TIM3의 균등한 발현을 가졌다. 도시된 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 19는 E27 scFv를 분비하는 CAR T 세포가 생체내에서 증가된 항-종양 기능을 가짐을 도시한다. SCID-베이지색 마우스에게 라지-PDL1 종양 세포를 정맥내로 접종하고, 다음날 CAR T 세포를 정맥내로 주입하였다. 1928z-E27 T 세포로 처리된 마우스는 1928z T 세포로 처리된 마우스에 비해 증대된 생존을 가졌다. 1928z T 세포로 처리된 마우스는 처리되지 않은 마우스 (즉 미처리 마우스), 및 관련없는 항원에 대해 표적화된 CAR T 세포, 4H1128z 및 4H1128z-E27 T 세포로 처리된 마우스보다 더 오래 생존하였다. 도시된 데이터는 2개의 독립적인 실험으로부터이다.
도 20은 항-PD-1 항체, ET130-23, ET130-26 및 ET130-27을 사용한 PD1/PDL1 차단 ELISA의 결과를 도시한다. ET901(음성 대조용)은 결합을 나타내지 않은 반면, ET130-23, ET130-26 및 ET130-27은 0.031 내지 10 ㎍/㎖의 농도 범위에 걸쳐 PD1/PDL1 결합에 차단 효과를 나타내었다.
도 21은 항-PD-1 항체, ET130-23, ET130-26 및 ET130-27을 사용한 PD1/PDL2 차단 ELISA의 결과를 도시한다. ET901(음성 대조용)은 결합을 나타내지 않은 반면, ET130-23, ET130-26 및 ET130-27은 0.031 내지 10 ㎍/㎖의 농도 범위에 걸쳐 PD1/PDL1 결합에 차단 효과를 나타내었다.
본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 및 다른 참고문헌들은 그들의 내용 전체가 본 명세에 참고로 인용된다.
본 명세의 실시에서, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학에서의 다수의 통상적인 기법이 사용되며, 이들 기법은 당해 분야의 기술 내에 있다. 이들 기법은 예를 들어 하기 문헌들에 보다 상세히 기재된다: Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3rd edition, J.F. Sambrook and D.W. Russell, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001; Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Melvyn Little, ed. Cambridge University Press 2009; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001). 이들 참고문헌 및 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되고 이들이 의존하는 표준 프로토콜을 함유하는 다른 참고문헌은 제조사의 설명서를 포함하여 본 명세의 부분으로서 본 발명에 참고로 인용된다.
하기의 설명에서, 몇몇 규약들이 용어의 사용에 관하여 이어질 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 사용된 용어들을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 바와 같은 용어들의 의미와 일관되게 해석하고자 한다.
"항원-결합 단백질"은 항원-결합 영역 또는 항원-결합 부분을 포함하는, 즉 상기가 결합하는 또 다른 분자에 대해 강한 친화성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 항원-결합 단백질은 항체, 키메릭 항원 수용체 및 융합 단백질을 포함한다.
당해 분야에 공지된 바와 같은 "항체" 및 "항체들"이란 용어는 면역계의 항원 결합 단백질을 지칭한다. 본 명세서에 언급된 바와 같은 "항체"란 용어는 전체, 완전길이 항체 및 상기 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 영역"이 유지되어 있는 그의 임의의 단편, 또는 그의 단쇄를 포함한다. 천연 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH라 약기함) 및 중쇄 불변(CH) 영역으로 구성된다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL이라 약기함) 및 경쇄 불변 CL 영역으로 구성된다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역을 고가변성 영역들(상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하며, 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 보다 보존된 영역들과 함께 산재되어 있다)로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서부터 카복시-말단까지 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체의 불변 영역은 숙주 조직, 또는 면역계의 다양한 세포(예를 들어 효과기 세포) 및 고전적인 보체계의 첫 번째 성분(C1q)을 포함한 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 영역"이란 용어는 항원 특이성을 부여하는 항체의 영역 또는 부분을 지칭하며; 따라서 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체의 단편은 항원(예를 들어 HLA-펩티드 복합체)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 완전길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항체 단편"이란 용어내에 포함되는 항원-결합 단편의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 가지의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어지는 Fab 단편(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
더욱 또한, 상기 Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들을 재조합 방법을 사용하여, 상기 VL 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 결합시킬 수 있다. 이들은 단쇄 Fv(scFv)로서 공지되어 있다: 예를 들어 문헌[Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883]을 참조하시오. 상기와 같은 단쇄 항체를 또한 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어내에 포함하고자 한다. 이들 항체 단편은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득되며, 상기 단편들은 완전 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 선별된다.
"재조합 항체" 또는 "재조합 항원-결합 단백질"은 재조합적으로 생성된 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체에 포함시키기 위한 결합 특징을 근거로 동정되고 선택된 항원 결합 부분을 갖는 것이다.
"그의 상동성 서열"이란 용어는 표 1 내지 14에 나타낸 서열에 60 내지 99.9% 일치하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상동성 서열은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 일치성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상동성 서열은 95 내지 99.9% 일치성을 가지며, 또 다른 실시태양에서 상기 상동성 서열은 98 내지 99.9%를 갖는다.
하나의 실시태양에서, 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 단쇄 가변 단편(scFv)을 선택하고 시험하였다. scFv를 독점적인 완전 인간 항체 scFv 파지 라이브러리(유레카 쎄라퓨틱스(Eureka Therapeutics), 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재)인 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다. 상기 라이브러리는 100명이 넘는 건강한 백인 및 아시아인 공여자, 및 자가면역 질병, 예를 들어 전신 홍반성 루푸스, 경피증 등이 있는 공여자로부터의 인간 항체 레퍼토리로 구성된다.
항체 파지 패닝(panning)에 사용되는 항원은 재조합 융합 단백질, 인간 IgG1 Fc에 융합된 PD-1 세포외 도메인(PD-1 ECD-Fc 도메인)이었다. PD-1 ECD 및 hlgG1 Fc를 암호화하는 DNA 서열은 젠와이즈 인코포레이티드(Genewiz, Inc.)(미국 뉴저지주 사우스 플레인필드 소재)에 의해 합성되었다. 이어서 상기 DNA 서열을 유레카 독점 포유동물 발현 벡터내에 서브클로닝하고, 이어서 이를 융합 단백질 발현을 위해서 HEK293 세포내에 형질감염시켰다. PD-1 ECD-Fc 융합 단백질을 세포의 자연적인 격감 후에 HEK293 세포 배양 배지로부터 표준 FPLC 방법에 의해 정제하였다.
인간 scFv 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 mAb 클론의 선택에 사용한다. 간단히, 비오틴화된 항원(PD-1 ECD-Fc 융합 단백질)을 먼저 인간 scFv 파지 라이브러리와 혼합하고, 이어서 항원-scFv 항체 복합체를 자석 랙을 통해 스트렙트아비딘-접합된 다이나비즈(Dynabeads) M-280에 의해 허물어 뜨릴 수 있다. 이어서 결합된 클론을 용출시키고 이 콜라이(E. Coli) XL1-블루의 감염에 사용할 수 있다. 상기 세균에서 발현된 scFv 파지 클론을 정제시킬 수 있다(Yasmina NA, et al. Probing the binding mechanism and affinity of tanezumab, a recombinant humanized anti-NGF monoclonal antibody, using a repertoire of biosensors. Protein Science 2008; 17(8): 1326-1335; Roberts WK, et al. Vaccination with CD20 peptides induces a biologically active, specific immune response in mice. Blood 2002: 99 (10): 3748-3755). 패닝을 3 내지 4 주기 동안 수행하여 PD-1에 특이적으로 결합하는 scFv 파지 클론을 농축시킬 수 있다. 양성 클론을 비오틴화된 단쇄 PD-1에 대한 표준 ELISA 방법에 의해 측정할 수 있다. 양성 클론을 PD-1+ 세포주, 예를 들어 3T3 세포주를 사용하여 유식 세포측정에 의해, 살아있는 세포 표면상의 PD-1에 대한 그의 결합에 대해 추가로 시험할 수 있다.
본 명세에 의해 포함되는 일부 클론을 본 명세서에서 클론 14, 16, 18, 19, 23, 26, 27, 31, 36, 37, 40, 42, 46, 및 47이라 칭한다. 이들 실시태양을 암호화하는 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 하기 표 1 내지 14에 나타낸다. 일부 실시태양에서, 상기 VL 및 VH 서열을 세린 글리신 링커로 연결시켜 scFv를 형성시켰다. 일부 실시태양에서, HA/His 태그를, 상기 scFv의 검출의 허용을 위해 포함시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 명세는 하나 이상의 중쇄 불변 도메인에 융합되어 인간 면역글로불린의 Fc 영역을 갖는 항체를 형성시켜 2가 단백질을 제공하여 상기 항체의 전체 결합활성 및 안정성을 증가시키는 scFv 서열을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 상기 Fc 부분은 예를 들어 항원 정량분석 연구에 사용하기 위해, 항체를 친화성 측정을 위해 고정화시키기 위해, 치료제의 표적화된 전달을 위해, 면역 효과기 세포를 사용하여 Fc-매개된 세포독성에 대해 시험하기 위해, 및 다수의 다른 용도를 위해 상기 항체에의, 비제한적으로 형광 염료, 세포독소, 방사성 동위원소 등을 포함하는 다른 분자의 직접적인 접합을 허용한다.
일부 실시태양에서, 상기 항-PD-1 항원-결합 단백질은 단백질 안정성, 항체 결합, 발현 수준을 개선시키거나 치료제의 접합을 위한 부위를 도입시키도록 설계된 하나 이상의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이어서 상기 scFv를 사용하여 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 따라 재조합 인간 단클론 Ig를 생성시킨다.
일부 실시태양에서, 상기 항원-결합 단백질은 키메릭 항원 수용체(CAR)이다. 키메릭 항원 수용체 치료법(CAR-T 치료법)은 새로운 형태의 표적화된 면역요법이다. 상기는 단클론 항체의 훌륭한 표적화 특이성을 세포독성 T 세포에 의해 제공된 효능 있는 세포독성 및 장기적인 지속성과 융합시킨다. 상기 기술은 T 세포가 내인성 TCR과 독립적인 장기적인 신규의 항원 특이성을 획득할 수 있게 한다. 임상 시험은 신경모세포종(Louis C.U. et al., Blood 118(23):6050-6056), B-ALL(Maude S.L. et al., N. Engl. J. Med. 371(16):1507-1517, 2014), CLL(Brentjens R.J. et al., Blood 118(18):4817-4828, 2011), 및 B 세포 림프종(Kochenderfer J.N. et al., Blood. 116(20):4099-4102, 2010)에서 CAR-T 치료법의 임상적으로 의미있는 항종양 활성을 입증하였다. 하나의 연구에서, CD19-CAR T 치료법으로 치료된 B-ALL이 있는 30명의 환자에서 90%의 완전 관해율이 보고되었다(상기 문헌[Maude S.L. et al.]).
일부 실시태양에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 상기 항체 부분을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 공-자극 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 공-자극 신호전달 서열은 CD28 세포내 신호전달 서열이다.
본 명세의 다른 태양은 비제한적으로 PD1 관련된 질병의 치료, 진단 및 예후 용도뿐만 아니라 세포 및 조직 중 PD1의 검출을 위한 연구 도구로서의 용도를 위해 암호화되는 항원-결합 단백질 및 핵산의 용도를 포함한다. 상기 개시된 항원-결합 단백질 및 핵산을 포함하는 약학 조성물이 본 명세에 의해 포함된다. 벡터화된 면역요법에 의한 항체-기반 치료를 위한 본 명세의 핵산을 포함하는 벡터가 또한 본 명세에 의해 고려된다. 벡터는 항체의 발현 및 분비를 가능하게 하는 발현 벡터뿐만 아니라 항원 결합 단백질, 예를 들이 키메릭 항원 수용체(CAR)의 세포 표면 발현에 대한 벡터를 포함한다.
상기 핵산을 포함하는 세포, 예를 들어 본 명세의 벡터로 형질감염된 세포가 또한 본 명세에 의해 포함된다.
진단 및 연구 용도에 사용하기 위해서, 본 명세의 PD1 항체 또는 핵산, 분석 시약, 완충제 등을 함유하는 키트가 또한 제공된다.
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상기 항원-결합 단백질이 완전길이 항체인 실시태양에서, 본 명세의 항체의 중쇄 및 경쇄는 완전길이이거나(예를 들어 항체는 적어도 하나, 및 바람직하게는 2개의 완전한 중쇄, 및 적어도 하나, 및 바람직하게는 2개의 완전한 경쇄를 포함할 수 있다) 또는 항원-결합 부분(Fab, F(ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv 단편("scFv"))을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 항체 중쇄 불변 영역은 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 면역글로불린 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 보다 특히 IgG1(예를 들어 인간 IgG1) 중에서 선택된다. 상기 항체 유형의 선택은 상기 항체가 유도하도록 설계된 면역 효과기 기능에 따라 변할 것이다.
재조합 면역글로불린의 구성에서, 광범위한 항체의 생성을 위한 다양한 면역글로불린 아이소타입의 불변 영역에 적합한 아미노산 서열 및 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다.
본 발명에서 동정된 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 사용하여 재조합 면역 효과기 세포를 조작할 수 있다. 예를 들어 유전자 변형된 T-세포의 생성을 위한 방법 및 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다(문헌[Brentjens et al., Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias in Blood 118(18):4817-4828, November 2011]을 참조하시오).
본 명세의 다른 실시태양은 본 명세의 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포 및 발현 벡터를 포함한다. 상기 세포는 재조합 면역 효과기 세포, 예를 들어, 본 명세에 따른 항원 결합 영역을 포함하는 키메릭 항원 수용체를 발현하도록 유전자 변형된 T-세포일 수 있다. 본 명세에 따른 항체를 생성하도록 조작된 세포가 또한 본 명세에 포함된다.
더욱이, 본 명세는 (a) 본 명세의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 세포를 상기 핵산 서열이 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성시키고; (b) 상기 폴리펩티드를 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 회수함을 포함하는, 본 명세의 항체 또는 항체 단편의 생성 방법을 포함한다.
본 명세의 항원-결합 단백질의 일부 실시태양은 PD1의 작용물질로서 기능하는 항-PD1 항체뿐만 아니라 길항작용성 항-PD1 항체를 포함한다. 일부 항-PD1 항체는 길항물질인 반면, 즉 그의 리간드에 의해 PD1의 결합을 차단하는 반면, 다른 것들은 PD-1의 면역억제 신호를 증대시켜 예를 들어 자가면역의 치료에 유용하게 하는 효과를 갖는 항체인 작용물질이다. 길항물질 활성을 나타내는 본 명세의 항체는 클론 23 및 27을 포함하는 반면, 클론 16, 18, 26, 31 및 40은 작용물질로서 기능하는 것으로 보인다.
본 명세는 또한 면역 반응을 증가시키기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세의 항-PD-1 항체 또는 항체 단편의 용도뿐만 아니라 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 명세의 항-PD-1 항체 또는 항체 단편의 용도를 포함한다.
상기 항원 결합 단백질, 항체, 핵산, 본 명세에 개시된 핵산 또는 항원 결합 단백질을 포함하는 벡터 또는 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물이 또한 본 명세에 의해 포함된다.
본 명세는 또한 백신 항원보강제로서 본 명세의 항-PD-1 항체 또는 항체 단편의 용도를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 명세는 본 명세에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 제1 성분을 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 상기 면역접합체는 세포독소, 검출가능한 표지, 방사성동위원소, 치료제, 결합 단백질 또는 제2 아미노산 서열을 갖는 분자인 제2 성분을 포함한다. 상기 제2 성분이 결합 단백질 또는 제2 항체인 경우, 상기 결합 단백질 또는 제2 항체는 상기 제1 성분에 특이적인 HLA-펩티드 복합체와 상이한 표적에 대해 결합 특이성을 갖는다.
본 명세는 또한 PD-1 관련된 질병을 갖는 대상에게 치료 유효량의 항원 결합 단백질, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 키메릭 항원 수용체(CAR), 상기 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 또는 단백질을 포함하는 세포를 투여함을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법에 관한 것이다.
당해 분야의 숙련가들은 다수의 실시태양이 본 발명의 범위 및 진의내에서 가능함을 인식할 것이다. 이제 본 발명을 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 보다 상세히 기재할 것이다. 하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시하나, 물론 이를 본 발명의 범위에 대한 어떠한 제한으로서도 해석해서는 안 된다.
실시예
실시예 1
PD-1 결찰을 억제하는 scFv의 능력을 시험하기 위해서, scFv-Fc 도메인(scFv-Fc) 융합 단백질을 생성시켰으며, 여기에서 상기 scFv를 쥐 Fc(마우스 IgG1a) 도메인에 연결시켰다. 이어서 상기 scFv-Fc 클론을, 인간 PD-1 단량체로 ELISA 플레이트를 코팅함으로써 PD-1에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. PD-1에 대한 scFv의 결합을 HRP-접합된 항-마우스 IgG1 Fc 2차 항체를 사용하여 정량분석하였다. 7개의 항체는 모두 PD1 단량체에 대한 결합 활성을 용량 의존적인 방식으로 나타내었다(도 1). ET901 ScFv-Fc(마우스 IgG1 Fc)는 음성 대조용으로서 작용하였다. 상기 scFv-Fc 클론의 결합 친화성을 순위화하였으며 여기에서 클론 31은 약하게 결합하였고 클론 26 및 27이 가장 강하게 결합하였다(31 < 23 < 40 < 18 < 16 = 27 < 26).
실시예 2
PD-1이 PD-L1과 상호작용하는 것을 억제하는 상기 scFv-Fc의 능력을 시험하기 위해서, 도 2a에 개략적으로 도시된 바와 같은 경쟁 리간드-결합 분석을 수행하였다. 상기 분석에서, PD-L1-Fc를 ELISA 플레이트상에 코팅하였다. 비오틴화된-PD1-Fc를 연속적으로 희석된 ET901 ScFv-Fc(음성 대조용) 또는 항-PD1 ScFv-Fc와 혼합하고 이어서 PD-L1-Fc 코팅된 플레이트에 가하였다. 상기 플레이트상에 코팅된 PD-L1에 대한 PD-1-Fc 결합을 HRP-접합된 스트렙트아비딘을 통해 시각화하였다(도 2b). 유사한 농도의 scFv-Fc(원으로 표시된)를 비교할 때, 상기 PD-1-PDL1 상호작용을 붕괴시키는 능력을 순위화하였으며 여기에서 클론 40 및 23은 그렇게 하는 능력이 가장 약하였고 클론 26은 가장 강하였다(26 > 27 = 16 > 18 > 31 > 23 = 40, 도 2b).
실시예 3
이어서 상기 클론을 특이적인 T 세포 기능을 조절하는 그의 능력에 대해 조사하였다. 우리는 앞서 종양-표적화된 T 세포를 생성시켰으며, 여기에서 T 세포를 종양-특이성 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 레트로바이러스로 형질도입시킨다. 우리는 앞서 CAR의 발현이 주어진 항원을 표적화하는 재지시된 T 세포 기능을 가짐을 입증하였다(Brentjens, Santos et al. 2007). 우리의 실험에서, 우리는 CD19에 특이적인 CAR(1928z라 칭함)을 사용하여 B 세포 암을 표적화한다(Brentjens, Santos et al. 2007). 우리는 앞서 CAR 변형된 T 세포가 시험관내 및 생체내 및 임상 연구에서 현저한 항-종양 활성을 나타냄을 입증하였다(Brentjens, Latouche et al. 2003; Brentjens, Davila et al. 2013; Davila, Riviere et al. 2014). 상기 7개의 scFv 클론이 작용성인지(PD-1을 자극함), 길항작용성인지(PD-1을 차단함) 또는 PD-1에 대해 그다지 효과가 없는지를 판정하기 위해서, 우리는 상기 항-PD-1 scFv 유전자 가까이에 쥐 카파 리더 서열을 포함시킴으로써 분비성 scFv를 생성시켰다(도 3). 이어서 우리는 상기 1928z CAR의 발현 및 형질도입된 인간 말초 혈액 T 세포로부터의 항-PD-1 scFv의 분비를 유도하기 위해 이중시스트론성 레트로바이러스 벡터를 생성시켰다.
실시예 4
T 세포 증식 및 기능을 억제하는 PD-1 자극의 능력이 주어진 경우, 우리는 후속으로 T 세포 증식에 대한 상기 항-PD-1 scFv의 효과를 특성화하고자 하였다. 이를 성취하기 위해서, 앞서 기재된 방법을 사용하여(Brentjens, Santos et al. 2007) 인간 T 세포를 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리하고 레트로바이러스 형질도입을 통해 상기 CAR을 발현하고 PD-1-특이성 scFv를 분비하도록 변형시켰다. 형질도입에 이어서, 변형된 T 세포를 시험관내에서 확대에 대해 모니터하였다(도 4). 상기 1928z CAR을 발현하고 PD-1 특이성 scFv 클론 23 및 27을 분비하는 T 세포뿐만 아니라 상기 1928z CAR만을 단독으로 발현하도록 변형된 T 세포도 확대되었다. 상기 CAR을 발현하고 PD-1-특이성 scFv 클론 16, 18, 26, 31 또는 40을 분비하도록 변형된 세포는 증식되지 않았으며, 이는 이들 PD-1-특이성 scFv 클론이 작용성이며, PD-1을 잠재적으로 자극하고, 차례로 T 세포 증식을 감소시켰음을 암시한다.
실시예 5
확대 연구 외에, 우리는 T 세포(상기 CAR 또는 CAR을 발현하고 PD-1-특이성 scFv를 분비한다)를 CD19+ 버킷 림프종 종양 세포주, 라지와 공-배양하고, 상기 T 세포로부터의 사이토킨 분비 수준을 측정하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 상기 1928z CAR을 발현하고 상기 PD-1-특이성 scFv 클론 23 또는 27을 분비하도록 변형된 T 세포는 상기 CAR만을 단독으로 발현하도록 변형된 세포에 비해 IFN-γ의 증가된 분비를 가졌으며, 이는 이들 scFv 클론이 PD-1 신호전달에 길항작용성임을 암시한다. 상기 1928z CAR을 발현하고 상기 PD-1-특이성 scFv 클론 16, 18, 2, 31 또는 40을 분비하도록 변형된 세포는 상기 CAR 단독에 의해 변형된 세포에 비해 적은 IFN-γ를 분비하였으며, 이는 이들 scFv가 PD-1에 작용성이고 T 세포 기능을 억제하였음을 암시한다.
실시예 6
상기 1928 CAR 및 PD-1 차단 scFv를 발현하도록 변형된 인간 T 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 상기 CAR의 발현의 확인에 이어서(도 6), 상기 scFv의 존재를, 골지 억제제로 처리된 인간 T 세포로부터 제조된 용해물상에서의 웨스턴 블럿(상기 scFv 설계에 통합된 HA 태그에 특이적인 항체 사용)을 사용하여 상기 세포 용해물 중에서의 검출을 허용하여 판정하였다. 1928z CAR 및 클론 23을 발현하도록 변형된 인간 T 세포는 다른 클론들에 비해 현저하게 적은 scFv 단백질을 가졌다(도 7). 이어서 상기 세포를 PD-1 리간드, PD-L1/L2를 발현하거나 발현하지 않는 3T3 쥐 섬유아세포(인공 항원 제공 세포, aAPC)상에 놓았다. 상기 aAPC와 24시간 배양에 이어서, CD3/CD28 비드를 상기 배양물에 가하여 인간 T 세포를 활성화시켰다. 인간 T 세포, aAPC 및 비드의 배양 후 3일째에, 상기 인간 T 세포를 계수하여, PD-1 리간드의 존재가 인간 T 세포의 비드-구동된 확대를 억제하는지, 또는 상기 항-PD-1 scFv가 T 세포 확대의 PD-1 리간드 매개된 억제를 방지하는지를 판정하였다. 상기 1928z CAR 및 항-PD-1 scFv 클론 26 및 23을 발현하도록 변형된 T 세포는 억제성 리간드를 발현하지 않는 aAPC에 비해 PD-L1/L2를 발현하는 aAPC상에서 감소된 증식을 가졌다(도 8). 대조적으로, 상기 1928z CAR 및 항-PD-1 scFv 클론 27을 발현하도록 변형된 T 세포는 PD-L1/L2를 발현하는 aAPC상에서 증가된 확대를 가졌다.
실시예 7
당해 분야에 공지된 재조합 기술을 사용하여, 재조합 인간 단클론 항체를 상기 PD-1 특이성 scFv로부터 생성시켰다, 즉 상응하는 scFv에서 발견되는 동일한 가변 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전 인간 Ig 분자를 제조하였다(상기 표 1 내지 14 및 도 9를 참조하시오). PD-1에 대한 상기 단클론 항체의 결합을 유식 세포측정을 사용하여 입증하였다(도 10 참조).
인간 T 세포를, 인간 PD-1을 과발현하도록 변형시키고, 이어서 1 ㎍/㎖의 항체와 배양하였다. 클론 27 mAb가 상기 PD-1 T 세포에 가장 강하게 결합하였고, 다음으로 클론 26 및 이어서 클론 23이 강하게 결합하였다(도 9). 대조용 단클론 항체, 901은 상기 PD-1 T 세포에 결합하지 않았다. 이어서 이들 항체와 배양된 T 세포를 비드와 함께 인공 항원 제공 세포(aAPC)상에 놓고 상기 T 세포의 확대에 대한 PD-1 리간드의 영향 및 상기 상호작용을 방지하는 상기 단클론 항체의 능력을 측정하였다. 항-PD-1 클론 27 단클론 항체와 배양된 19z1 T 세포는 PD-L1/L2 aAPC상에서 보다 큰 정도로 확대되었다.
실시예 8
PD-L1/L2를 발현하는 aAPC상에서 배양된 1세대 CAR을 발현하도록 변형된 T 세포는 항-PD-1 클론 27 단클론 항체가 존재할 때 확대된다. 상기 1세대 CD19-특이성 CAR(19z1)을 발현하도록 변형된 인간 T 세포를 24시간 동안 항-PD-1 단클론 항체와 배양하고, 이어서 PD-L1/L2를 발현하거나 발현하지 않는 aAPC상에 놓았다. aAPC로 24시간 자극 후, 상기 세포를 CD3/CD28 비드로 자극하였다. 3일 후에, 상기 세포를 계수하였다. 단클론 항체 없이, 대조용 항체(901) 및 클론 23 및 26 단클론 항체와 배양된 19z1 T 세포는 억제성 리간드 부재하의 aAPC(도 11 닫힌 막대)에 비해 PD-1 리간드를 발현하는 aAPC(도 11 빈 막대)상에서 훨씬 적게 확대되었다. 그러나, 항-PD-1 클론 27 단클론 항체와 배양된 19z1 T 세포는 PD-L1/L2 aAPC상에서 보다 큰 정도로 확대되었다. 도시된 데이터는 하나의 실험을 나타낸다.
실시예 9
PD-1 차단 scFv, E27을 분비하도록 추가로 변형된 CAR T 세포의 생성. CD19-특이성 CAR(1928z라 칭함) 또는 난소 종양 항원 특이성 CAR(4H1128z라 칭함) 및 PD-1 차단 scFv, E27을 암호화하는 이중시스트론성 레트로바이러스 구조물을 생성시켰다(도 12a). 상기 E27은 상기 scFv의 분비가 허용되도록 신호 펩티드, 마우스 IgK가 선행되었다. HA/His 태그를 또한 포함시켜 일단 상기 T 세포로부터 분비된 scFv를 검출하였다. 인간 말초 혈액 T 세포를 상기 CAR, 1928z, 또는 상기 CAR 및 E27 PD-1 차단 scFv, 1928z-E27을 암호화하는 레트로바이러스 구조물로 형질도입시켰다. 형질도입에 이어서, 유식 세포측정을, 19E3이라 칭하는 CD19-표적화된 CAR에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 상기 CAR의 발현을 검출하는데 사용하였다(도 12b). 형질도입된 인간 T 세포로부터의 상등액의 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 항-HA 항체로 PD-1 차단 scFv를 검출하였다(도 12c). 우리는 또한 상기 CAR 및 대조용 scFv, B6(항-c-myc 태그 항체를 사용하여 검출됨)를 발현하도록 변형된 T 세포로부터의 scFv 분비를 조사하였다. 2개의 CD19+ 종양 표적에 대한 표준 51Cr 방출 분석을 수행하여, scFv의 분비가 T 세포 세포용해 능력을 재지시하는 상기 CAR의 능력을 확실히 방해하지 않게 하였다. 상기 CAR 단독(1928z 또는 4H1128z 대조용 CAR), 상기 CAR 및 E27 scFv(1928z-E27 또는 4H1128z-E27), 또는 상기 CAR 및 대조용 scFv(1928z-B6H12.2 또는 4H1128z-B6H12.2)를 발현하는 CAR T 세포를 4시간 동안 51Cr 표지된 종양 세포(라지 또는 Nalm6)와 함께 배양하였다. 상기 CD19 특이성 CAR을 발현하는 T 세포는 상기 종양 표적을 균등한 수준으로 용해시킬 수 있었으며, 난소-표적화된 CAR T 세포는 라지 또는 Nalm6을 용해시킬 수 없었다(도 12d). 따라서, 우리는 상기 scFv의 분비가 T 세포 용해 능력을 재지시하는 상기 CAR의 능력을 방해하지 않는다는 결론을 내렸다.
실시예 10
CAR을 발현하고 PD-1 차단 scFv를 분비하도록 변형된 T 세포는 시험관내에서 PD-L1-PD-1 상호작용으로부터의 억제에 저항한다. 상기 CAR 단독(1928z), 또는 상기 CAR 및 PD-1 차단 scFv(1928z-E27)를 발현하는 T 세포를 3T3 세포 빈 세포 또는 인간 PD-L1을 발현하도록 변형된 3T3 세포상에서 배양하였다. 상기 3T3 지지 세포상에서 24시간에 이어서, 세포를 상기 배양물에 1:3 비드:T 세포비로 첨가된 CD3/CD28 비드로 자극하였다. T 세포의 확대를 트립판 블루 계수로 측정하고 새로운 비드를 상기 배양물에 2회 가하였다(화살표로 표시됨). 1928z T 세포는 3T3 빈 지지 세포상에서 확대되었으나, 상기 3T3-PD-L1 지지 세포상에서는 확대되지 않았다. 대조적으로, 1928z-E27 T 세포는 상기 3T3 빈 및 3T3-PD-L1 지지 세포 모두에서 확대되었으며, 이는 PD-L1-PD-1 매개된 억제에 대한 저항을 가리킨다(도 13a). 도 13a에 도시된 바와 같은 3T3 빈 또는 3T3-PD-L1 세포상에서 배양된 T 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하여 억제성 수용체, PD-1, 2B4 및 LAG3상에서의 발현을 검출하였다. 1928z 세포는 1928z-E27 세포보다 증가된 수준의 PD-1을 발현하였다(도시되지 않음). PD-1+ 세포상에서 통문시, 2B4 및 LAG3의 분석은 1928z 세포가 1928z-E27 세포에 비해 보다 높은 비율의 PD-1+, 2B4+ 및 LAG3+ 세포를 가짐을 밝혀내었다(도 13b). 형질도입된 T 세포를 72시간 동안 다양한 표화기 대 표적(E:T) 비(1:1, 1:3, 1:5)로 라지-PDL1 또는 Nalm6-PDL1 종양 세포와 배양하였다. 항-CD3 및 항-CD19 항체 및 계수 비드에 의한 염색에 이은 유식 세포측정을 사용하여 시간에 따른 T 세포의 확대 및 종양 표적의 용해를 모니터하였다. 1928z-E27 세포는 PDL1+ 종양 세포와 배양시 1928z T 세포에 비해 보다 큰 수준으로 계속 확대되었다(도 13c). 형질도입된 T 세포를 도 13c에 도시된 바와 같이 Nalm6-PDL1 종양 세포로 자극하고 1:5 T E:T 비로 Nalm6-PDL1 종양 세포로 재-자극하였다. 48시간 공-배양 후에 유식 세포측정을 사용하여 종양 표적의 용해를 측정하였다. 1928z-E27은 1928z 세포에 비해 재-자극시 PD-L1 종양 표적을 용해하는 능력을 유지하였다(도 13d).
실시예 11
CAR을 발현하고 PD-1 차단 scFv를 분비하도록 변형된 T 세포의 생체내 항-종양 효능을 도 14에 도시한다. SCID-베이지색 마우스에게 0일째에 정맥내 주입을 통해 라지-PD-L1 종양 세포를 접종하였다. 1일째에, 마우스에게 106 CAR+ T 세포를 정맥내로 주입하고 생존을 임상적으로 모니터하였다. 마우스를 뒷다리 마비 발생시 안락사시켰다.
실시예 12
PD-1 차단 mAb 후보 E27, E26 및 E23을 경쟁 결합 분석에 사용하여, 인간에 존재하지 않는 합텐에 대해 표적화된, 대조용 mAb와 비교된, 다양한 농도에서의 PD-L1에의 PD-1 결합의 방해를 검출하였다. E23, E26 및 E27 mAb는 모두 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 방지하였다(도 15a). 항-HA 항체로 염색된, 1928z CAR과 함께 분비성 scFv를 발현하도록 형질도입된 293Glv9 패키징 세포로부터의 SN상의 웨스턴 블럿. 상기 E27 scFv는 가장 높은 수준으로 검출되었으며 따라서 상기는 본 연구의 나머지에 사용되었다(도 15c).
실시예 13
T 세포는 CAR을 발현하고 PD-1 차단 scFv, E27을 분비하도록 공-변형될 수 있다. 도 16a는 1928z CAR 단독(1928z) 또는 상기 1928z CAR 및 E27 PD-1 차단 scFv(1928z-E27)에 의한 형질도입에 이어서, 상기 1928z CAR에 특이적으로 결합하는 19E3 mAb에 의한 염색에 따른 균등한 CAR 발현을 입증하는 전형적인 유식 세포측정 플롯이다. 도 16b는 항-HA mAb로 염색된 1928z 및 1928z-E27 T 세포로부터의 SN상의 웨스턴 블럿으로, 상기 1928z-E27 세포 중 단지 ∼30 kDa 단백질만이 보이며, 이는 상기 E27 scFv가 상기 1928z-E27 형질도입된 T 세포로부터 분비되고 상기 CAR이 단독으로 형질도입된 것으로부터는 분비되지 않음을 입증한다. 도 16c는 형질도입에 이어서 1928z T 세포에 비해 1928z-E27 T 세포상에서 보다 낮은 수준의 PD-1 발현을 입증하는 전형적인 유식 세포측정이다. PD-1의 발현은 1928z T 세포에 비해 1928z-E27 T 세포상에서 통계학적 유의수준으로 더 낮았으며, 도시된 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 +/-SEM이다(도 16d). 라지 종양 세포의 용해가 상기 E27 scFv의 분비에 의해 영향을 받지 않았음을 입증하는 4시간 51Cr 방출 분석. 1928z 및 1928z-E27 T 세포는 라지 종양 세포를 균등하게 용해시켰다. 대조용 4H1128z-E27 T 세포는 4H1128z T 세포에 비해 라지 세포의 용해 증가를 매개하지 않았다(도 16e). 도시된 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
실시예 14
CAR 및 E27의 발현은 CD19+ PD-L1+ 종양 세포와 관련하여 T 세포의 증식 및 용해 능력을 보호한다. 라지 종양 세포를 인간 PD-L1을 발현하도록 레트로바이러스에 의해 변형시키고(라지-PDL1) PD-L1에 특이적인 mAb로 염색하였다. 모 라지 종양(라지)은 PD-L1을 발현하지 않고 라지-PDL1 종양 세포는 높은 수준의 PD-L1을 발현하였다(도 17a). 도 17b는 72시간 공-배양에 이어서 유식 세포측정에 의해 측정된 바와 같은, 1928z-E27 T 세포가 1928z T 세포에 비해 보다 많은 라지-PDL1 종양 세포를 용해시킴을 도시하는 전형적인 유식 세포측정 플롯을 나타낸다. 1928z-E27 T 세포는 1928z T 세포에 비해 통계학적 유의수준으로 더 많은 라지-PDL1 종양 세포를 용해시키며, 도시된 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 +/-SEM이다(도 17c). 1928z-E27 T 세포는 유식 세포측정 및 계수 비드에 의해 측정된 바와 같이, 라지-PDL1 종양 세포와 공-배양에 이어서 보다 큰 수로 확대되며, 도시된 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터의 T 세포의 평균 총수 +/-SEM이다(도 17d). 도 17e는 라지-PDL1 종양 세포와 7일 공-배양에 이어서 1928z-E27 T 세포와 비교된 1928z T 세포상에서의 증가된 PD-1 발현을 도시하는 전형적인 유식 세포측정 플롯을 도시한다. 1928z T 세포는 양성 세포의 백분율 및 PD-1 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 관하여, 1928z-E27 T 세포에 비해 현저하게 더 많은 PD-1을 발현한다. 데이터를 4개의 독립적인 실험으로부터 평균 +/-SEM으로 나타낸다(도 17f). 도 17g는 7일 동안 라지-PDL1과의 공배양에 이어서 1928z-E27 세포와 비교된 2B4+PD-1+1928z T 세포의 증가된 백분율을 도시하는 전형적인 유식 세포측정 플롯을 나타낸다. 1928z-E27 T 세포는 또한 상기 2B4+PD-1+ 집단상에서 보다 적은 BTLA 및 TIM3을 발현한다. 도시된 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
실시예 15
E27은 PD-L1과 관련하여 CD3/CD28 자극된 T 세포의 증식 능력을 보호한다. NIH3T3 세포는 인간 PD-L1을 발현하도록 레트로바이러스에 의해 변형되고(3T3-PDL1) PD-L1에 특이적인 mAb로 염색되었다. 모 NIH3T3(3T3-EMPTY)은 PD-L1을 발현하지 않고 3T3-PDL1 종양 세포는 높은 수준의 PD-L1을 발현하였다(도 18a). 1928z 및 1928z-E27 T 세포를 3T3-EMPTY 또는 3T3-PDL1 세포와 배양하고 CD3/CD28 비드로 자극하였다. 세포를 계수하고 3, 6, 9 및 12일째에 새로운 3T3 세포상에 재-도말하였다. 1928z T 세포는 3T3-EMPTY 세포에 비해 3T3-PDL1 세포와 배양시 감소된 확대를 가졌다. 1928z-E27 세포는 3T3-EMPTY 또는 3T3-PDL1 세포상에서 배양시 균등한 확대를 가졌다(도 18b). 도시된 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 확대배수 +/-SEM이다. 도 18c는 3T3-EMPTY 세포상에서 배양된 1928z T 세포에 비해 3T3-PDL1과 배양된 1928z T 세포상에서의 2B4, PD-1, BTLA 및 TIM3의 증가된 발현을 나타내는 전형적인 유식 세포측정 플롯이다. 1928z-E27 세포는 3T3-EMPTY 및 3T3-PDL1과 배양시 2B4, PD-1, BTLA-4 및 TIM3의 균등한 발현을 가졌다. 도시된 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
실시예 16
E27 scFv를 분비하는 CAR T 세포는 생체내에서 증가된 항-종양 기능을 갖는다. SCID-베이지색 마우스에게 라지-PDL1 종양 세포를 정맥내로 접종하고, 다음날 CAR T 세포를 정맥내로 주입하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 1928z-E27 T 세포로 처리된 마우스는 1928z T 세포로 처리된 마우스에 비해 증대된 생존을 가졌다. 1928z T 세포로 처리된 마우스는 처리되지 않은 마우스, 및 관련없는 항원에 대해 표적화된 CAR T 세포, 4H1128z 및 4H1128z-E27 T 세포로 처리된 마우스보다 더 오래 생존하였다. 도시된 데이터는 2개의 독립적인 실험으로부터이다.
실시예 17
항-PD-1 항체 ET130-23, ET130-26 및 ET130-27을, PD1/PDL1 결합에 대한 차단 효과를 검사하기 위해서 ELISA에 의해 시험하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, ET901(음성 대조용)은 결합을 나타내지 않은 반면, ET130-23, ET130-26 및 ET130-27은 0.031 내지 10 ㎍/㎖의 농도 범위에 걸쳐 PD1/PDL1 결합에 차단 효과를 나타내었다.
유사하게, ET130-23, ET130-26 및 ET130-27을, PD1/PDL2 결합에 대한 차단 효과를 검사하기 위해서 ELISA에 의해 시험하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, ET901(음성 대조용)은 결합을 나타내지 않은 반면, ET130-23, ET130-26 및 ET130-27은 동일한 농도 범위에 걸쳐 PD1/PDL2 결합에 차단 효과를 나타내었다. ET130-26은 PD1/PDL2에 대해 가장 큰 차단 효과를 나타낸 반면, ET130-23은 최저의 효과를 나타내었다. 상기 차단 패턴은 PD1/PDL1 결합에 평행하다.
실시예 18
상기 항-PD-1 scFv 또는 단클론 항체의 적용을, 면역 반응을 약화시키고 자가면역 질병을 전복시키는 상기 scFv 또는 단클론 항체의 능력에 대해 조사한다. 상기를 또한 GVHD의 쥐 모델을 사용하여 조사할 수 있다. 인간 T 세포의 방사선조사된 NOD.SCID.IL-2Rγ-/-내로의 주입은 인간 세포의 생착 및 중증 GVHD(여기에서 상기 인간 T 세포는 상기 쥐 조직을 공격한다)를 생성시킨다. 항-PD-1 scFv를 분비하는 T 세포(또는 단클론 항체의 주사로 증대된 T 세포)를 대상(subject)에게 주입하고 GVHD의 발병을 평가한다. 상기 항-PD-1 scFv/mAb가 작용성인 경우, 상기 GVHD 반응은 상기 인간 T 세포의 억제로 인해 억제된다.
예시적인 실시태양
1. 하기 중 하나를 포함하는 재조합 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편:
(A) 서열번호 10, 서열번호 21, 서열번호 32, 서열번호 43, 서열번호 53, 서열번호 61, 서열번호 72, 서열번호 83, 서열번호 94, 서열번호 103, 서열번호 114, 서열번호 125, 서열번호 133, 서열번호 142; 그의 단편 및 그의 상동성 서열로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 영역;
(B) 서열번호 6 및 8; 서열번호 17 및 19; 서열번호 28 및 30; 서열번호 39 및 41; 서열번호 49 및 51; 서열번호 57 및 59; 서열번호 68 및 70; 서열번호 79 및 81; 서열번호 90 및 92; 서열번호 99 및 101; 서열번호 110 및 112; 서열번호 121 및 123; 서열번호 129 및 131; 서열번호 138 및 140; 이들의 단편 및 이들의 상동성 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 각각 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항원 결합 영역;
(C) 하기를 포함하는 항원 결합 영역:
(i) 아미노산 서열 QSISSY (서열번호 1), AAS 및 QQSYSTPLT (서열번호 2)를 갖는, 각각 경쇄 상보성 결정 영역 (LCCDR) LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTSSSYW (서열번호 4), IKQDGSEK (서열번호 5) 및 ARGGWSYDM (서열번호 6)을 갖는, 각각 중쇄 상보성 결정 영역 (HCCDR) HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(ii) 아미노산 서열 SSNIGAGYA (서열번호 12), TNN 및 QSYDSSLSGVI (서열번호 13)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTLTELS (서열번호 14), FDPEDGET (서열번호 15) 및 ARAYYGFDQ (서열번호 16)를 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(iii) 아미노산 서열 SSNIGNNA (서열번호 23), YND 및 AAWDDSVNGYV (서열번호 24)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTRFG (서열번호 25), ISVNNGNT (서열번호 26) 및 ARYMYGRRDS (서열번호 27)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(iv) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDS 및 QVWDNHSDVV (서열번호 35)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 RNKFSSYA (서열번호 36), ISGSGGTT (서열번호 37) 및 ARWYSSYYDV (서열번호 38)를 포함하는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(v) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDS 및 QVWDSSSDYV (서열번호 45)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARNYISMFDS (서열번호 48)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(vi) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDS 및 QVWDSSSDHV (서열번호 55)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARGYSSYYDA (서열번호 56)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(vii) 아미노산 서열 RSNIGENT (서열번호 63), SNN 및 AAWDDRLNGYV (서열번호 64)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTNYG (서열번호 65), IGAQKGDT (서열번호 66) 및 ARSQGVPFDS (서열번호 67)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(viii) 아미노산 서열 RSNIGSNT (서열번호 74), NNN 및 ATWDDSLNEYV (서열번호 75)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTRYG (서열번호 76), ISGYNGNT (서열번호 77) 및 ARHGYGYHGD (서열번호 78)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(ix) 아미노산 서열 SSNIGAGYV (서열번호 85), HNN 및 QSYDSSLSGWV (서열번호 86)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFKDYY (서열번호 87), ISTSGNSV (서열번호 88) 및 ARSPGHSDYDS (서열번호 89)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(x) 아미노산 서열 NIGDKS (서열번호 96), YDS 및 QVWASGTDHPYVI (서열번호 97)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARMYGSYTDM (서열번호 98)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(xi) 아미노산 서열 SSNIGYNY (서열번호 105), RNN 및 TSWDDSLSGYV (서열번호 106)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GNAFTNFY (서열번호 107), INPSGTDLT (서열번호 108) 및 ARQYAYGYSGFDM (서열번호 109)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(xii) 아미노산 서열 QSVSNW (서열번호 116), AAS 및 QQSYSTPIT (서열번호 117)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTSYY (서열번호 118), INPNTGGS (서열번호 119) 및 ARGDVTYDE (서열번호 120)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
(xiii) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDD 및 QVWDINDHYV (서열번호 127)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARSQASFMDI (서열번호 128)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열; 또는
(xiv) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), DDS 및 QVWDSSSDQGV (서열번호 135)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), IGTGGGT (서열번호 136) 및 ARGTGYDGDQ (서열번호 137)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열.
2. 실시태양 1의 재조합 항원-결합 단백질에서, 상기 단백질은 항체이다.
3. 실시태양 2의 재조합 항원-결합 단백질에서, 상기 항체는 인간 항체이다.
4. 실시태양 2의 재조합 항원-결합 단백질에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 Ig, Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv이다.
5. 실시태양 1의 항원-결합 단백질에서, 상기 항원-결합 단백질은 PD-1 작용물질이다.
6. 실시태양 1의 항원-결합 단백질에서, 상기 항원-결합 단백질은 PD-1 길항물질이다.
7. 실시태양 1의 항원-결합 단백질에서, 상기 항원-결합 단백질은 키메릭 항원 수용체(CAR)이다.
8. 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나의 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산.
9. 실시태양 8의 핵산을 포함하는 벡터.
10. 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나의 항원-결합 단백질, 실시태양 8의 핵산 또는 실시태양 9의 벡터를 포함하는 세포.
11. 치료제에 접합된 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나의 항원-결합 단백질.
12. 실시태양 11의 항원-결합 단백질에서, 상기 치료제는 약물, 독소, 방사성동위원소, 단백질 또는 펩티드이다.
13. 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나의 항원-결합 단백질, 실시태양 8의 핵산, 실시태양 9의 벡터, 실시태양 10의 세포 또는 실시태양 11 또는 12의 항원-결합 단백질을 포함하는 약학 조성물.
14. 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 실시태양 13의 약학 조성물.
15. 대상 (subject)에게 치료 유효량의 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나의 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편, 실시태양 8의 핵산, 실시태양 9의 벡터, 실시태양 10의 세포, 실시태양 11 또는 12 중 어느 하나의 항원-결합 단백질 또는 실시태양 13 또는 14 중 어느 하나의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에 있어서 T 세포 반응을 증가시키는 방법.
16. 실시태양 15의 방법에서, 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편은 PD-1에 의해 매개된 신호전달(signal transduction)을 억제하거나, 감소시키거나, 조절하거나 또는 제거한다.
17. PD-1 양성 질병을 갖는 대상에게 치료 유효량의 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나의 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편, 실시태양 8의 핵산, 실시태양 9의 벡터, 실시태양 10의 세포, 실시태양 11 또는 12 중 어느 하나의 항원-결합 단백질 또는 실시태양 13 또는 14 중 어느 하나의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법.
18. 실시태양 17의 방법에서, 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편은 세포독성 부분이 연결된 접합체이다.
19. 실시태양 17 또는 18의 방법에서, 상기 PD-1 양성 질병은 암이다.
20. PD1 리간드에의 PD1 결합을 억제시킴으로써 PD1-양성 질병을 치료하기 위한 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나의 재조합 항-PD1 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편, 실시태양 8의 핵산, 실시태양 9의 벡터, 실시태양 10의 세포, 실시태양 11 또는 12 중 어느 하나의 항원-결합 단백질 또는 실시태양 13 또는 14 중 어느 하나의 약학 조성물의 용도.
21. 실시태양 20의 용도에서, 상기 PD1-양성 질병은 암이다.
22. PD-1 신호전달 경로를 억제시킴으로써 면역조절하기 위한 실시태양 1 내지 7 중 어느 하나의 재조합 항-PD1 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편, 실시태양 8의 핵산, 실시태양 9의 벡터, 실시태양 10의 세포, 실시태양 11 또는 12 중 어느 하나의 항원-결합 단백질 또는 실시태양 13 또는 14 중 어느 하나의 약학 조성물의 용도.
23. 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않다.
24. 실시태양 23의 벡터를 포함하는 세포.
25. 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않다.
26. 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질 및 키메릭 항원 수용체를 포함하는 세포로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않다.
27. 실시태양 23 내지 26 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 PD-1에 특이적으로 결합하지 않는다.
28. 실시태양 23 내지 27 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 항체이다.
29. 실시태양 23 내지 28 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 인간 항체이다.
30. 실시태양 23 내지 29 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 완전 Ig, Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv이다.
31. 실시태양 23 내지 30 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 PD-1 작용물질이다.
32. 실시태양 23 내지 30 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 PD-1 길항물질이다.
33. 실시태양 23 내지 32 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 분비성 단백질이다.
34. 실시태양 23 내지 33 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 실시태양 1에서 인용된 항원 결합 영역을 포함한다.
35. 실시태양 23 내지 34 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 CD-19에 특이적으로 결합한다.
36. 실시태양 23 내지 35 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 키메릭 항원 수용체를 인간 T 세포막에 삽입할 수 있다.
37. 실시태양 24 내지 36 중 어느 하나의 세포에서, 상기 세포는 T 세포이다.
38. 실시태양 23 내지 37 중 어느 하나의 벡터 또는 세포를 포함하는 약학 조성물.
39. 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 실시태양 38의 약학 조성물.
40. 대상에게 치료 유효량의 실시태양 23 내지 37 중 어느 하나의 벡터 또는 세포, 또는 실시태양 38 또는 39의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에서 T 세포 반응을 증가시키는 방법으로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 PD-1 길항물질이다.
41. 실시태양 40의 방법에서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 PD-1에 의해 매개된 신호전달을 억제하거나, 감소시키거나, 조절하거나 또는 제거한다.
42. 대상에게 치료 유효량의 실시태양 23 내지 37 중 어느 하나의 벡터 또는 세포, 또는 실시태양 38 또는 39의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에 있어서 T 세포 반응을 감소시키는 방법으로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 PD-1 작용물질이다.
43. PD1-양성 질병을 갖는 대상에게 치료 유효량의 실시태양 23 내지 37 중 어느 하나의 벡터 또는 세포, 또는 실시태양 38 또는 39의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법.
44. PD1-양성 질병을 갖는 대상 (subject)의 적어도 하나의 T 세포에, 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 형질도입시킴을 포함하는 상기 대상의 치료 방법으로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않다.
45. 실시태양 44의 방법에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 PD-1에 특이적으로 결합하지 않는다.
46. 실시태양 42 내지 45 중 어느 하나의 방법에서, 상기 PD1-양성 질병은 암이다.
47. PD1 리간드에의 PD1 결합을 억제시킴으로써 PD1-양성 질병을 치료하기 위한 실시태양 23 내지 37 중 어느 하나의 벡터 또는 세포, 또는 실시태양 38 또는 39의 약학 조성물의 용도.
48. 실시태양 47의 용도에서, 상기 PD1-양성 질병은 암이다.
49. PD-1 신호전달 경로를 억제시킴으로써 면역조절하기 위한 실시태양 23 내지 37 중 어느 하나의 벡터 또는 세포, 또는 실시태양 38 또는 39의 약학 조성물의 용도.
50. 자가면역 질병의 치료를 위한 실시태양 5의 항원-결합 단백질, 실시태양 23 내지 37 중 어느 하나의 벡터 또는 세포, 또는 실시태양 38 또는 39의 약학 조성물의 용도로, 여기에서 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 PD-1 작용물질이다.
51. 실시태양 23 내지 37 중 어느 하나의 벡터 또는 세포에서, 상기 항-PD-1 항원-결합 단백질 및 키메릭 항원 수용체 중 적어도 하나는 치료제에 접합된다.
52. 실시태양 51의 벡터 또는 세포에서, 상기 치료제는 약물, 독소, 방사성동위원소, 단백질 또는 펩티드이다.
53. 실시태양 17 및 42 내지 45 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항원-결합 단백질 또는 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질은 PD-1 작용물질이고, 상기 PD1-양성 질병은 자가면역 질병이다.
참고문헌
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gccgtgtatt actgtgcgcg ctacatgtac ggtcgtcgtg attcttgggg tcaaggtact 720 ctggtgaccg tctcctcagc cggccagcac catcaccatc accatggcgc atacccgtac 780 gacgttccgg actacgcttc ttag 804 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Asn Ile Gly Ser Lys Ser 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gln Val Trp Asp Asn His Ser Asp Val Val 1 5 10 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Arg Asn Lys Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ala Arg Trp Tyr Ser Ser Tyr Tyr Asp Val 1 5 10 <210> 39 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser 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cagtctgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaggccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctattatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgattatgt cttcggaatt 300 gggaccaagg tcaccgtcct aggt 324 <210> 51 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Ile Ser Met Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 52 <211> 351 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ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgattatgt cttcggaatt 300 gggaccaagg tcaccgtcct aggtggtggt ggtggtagcg gcggcggcgg ctctggtggt 360 ggtggatccg aggtgcagct ggtggagtct ggaggaggct tgatccagcc tggggggtcc 420 ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc 480 cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtagc 540 acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 600 acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg 660 cgcaactaca tctctatgtt cgattcttgg ggtcaaggta ctctggtgac cgtctcctca 720 caccatcacc atcaccatgg cgcatacccg tacgacgttc cggactacgc ttcttag 777 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ala Arg Gly Tyr Ser Ser Tyr Tyr Asp Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala 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tatcataaca acgatcggcc ctcaggggtc 180 ccttaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttgg 300 gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtggtg gtggtggtag cggcggcggc 360 ggctctggtg gtggtggatc cgaggtgcag ctggtggagt ctgggggagg cctagtcaag 420 cctggagggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcacctttaa agactactac 480 atgaactgga tccgccaggc tccagggaag ggcctggagt ggatttcaca cattagtacc 540 agcggtaata gtgtagatta tgcagactct gtcaagggcc ggttcaccat ctccagggac 600 aacgccaaga attcactgta cctgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggccgta 660 tattactgtg cgcgctctcc gggtcattct gactacgatt cttggggtca aggtactctg 720 gtgaccgtct cctcacacca tcaccatcac catggcgcat acccgtacga cgttccggac 780 tacgcttctt ag 792 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Asn Ile Gly Asp Lys Ser 1 5 <210> 97 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Gln Val Trp Ala Ser Gly Thr Asp His Pro Tyr Val Ile 1 5 10 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens 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attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgcatgtac 300 ggttcttaca ctgatatgtg gggtcaaggt actctggtga ccgtctcctc a 351 <210> 103 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Ala Ser Gly Thr Asp His 85 90 95 Pro Tyr Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 115 120 125 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 130 135 140 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 145 150 155 160 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 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accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccagcatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctattatgat gacatgcggc cctcaggtat ccctgagcga 180 ttctctggct ccagctctgg gaacacggcc accctgacca tcagcccggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatattaatg atcattatgt cttcgcatcg 300 gggaccaagg tcaccgtcct aggt 324 <210> 131 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gln Ala Ser Phe Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 132 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgctctcag 300 gcttctttca tggatatctg gggtcaaggt actctggtga ccgtctcctc a 351 <210> 133 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Asp Asp Met Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Pro Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Asn Asp His Tyr 85 90 95 Val Phe Ala Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly 165 170 175 Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gln Ala 210 215 220 Ser Phe Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr 245 250 255 Ala Ser <210> 134 <211> 777 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccagcatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctattatgat gacatgcggc cctcaggtat ccctgagcga 180 ttctctggct ccagctctgg gaacacggcc accctgacca tcagcccggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatattaatg atcattatgt cttcgcatcg 300 gggaccaagg tcaccgtcct aggtggtggt ggtggtagcg gcggcggcgg ctctggtggt 360 ggtggatccg aggtgcagct ggtggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 420 ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc 480 cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtagc 540 acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 600 acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg 660 cgctctcagg cttctttcat ggatatctgg ggtcaaggta ctctggtgac cgtctcctca 720 caccatcacc atcaccatgg cgcatacccg tacgacgttc cggactacgc ttcttag 777 <210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gln Gly Val 1 5 10 <210> 136 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr 1 5 <210> 137 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Ala Arg Gly Thr Gly Tyr Asp Gly Asp Gln 1 5 10 <210> 138 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gln 85 90 95 Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 139 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 ctgcctgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaattctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgatcaggg cgtcttcgga 300 actgggacca aggtcaccgt cctaggt 327 <210> 140 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Thr Gly Tyr Asp Gly Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 141 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 gaagtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctagggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt tcgccaggct 120 ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcagct attggtactg gtggtggcac atactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agggacaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccatgtatt actgtgcgcg cggtactggt 300 tacgacggtg atcagtgggg tcaaggtact ctggtgaccg tctcctca 348 <210> 142 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gln 85 90 95 Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly 165 170 175 Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Gly 210 215 220 Tyr Asp Gly Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr 245 250 255 Ala Ser <210> 143 <211> 777 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 ctgcctgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaattctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgatcaggg cgtcttcgga 300 actgggacca aggtcaccgt cctaggtggt ggtggtggta gcggcggcgg cggctctggt 360 ggtggtggat ccgaagtgca gctggtgcag tctgggggag gcttggtaca gcctaggggg 420 tccctgagac tctcctgtgc aggctctgga ttcaccttca gtagctatgc tatgcactgg 480 gttcgccagg ctccaggaaa aggtctggag tgggtatcag ctattggtac tggtggtggc 540 acatactatg cagactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagggacaa tgccaagaac 600 tccttgtatc ttcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca ccgccatgta ttactgtgcg 660 cgcggtactg gttacgacgg tgatcagtgg ggtcaaggta ctctggtgac cgtctcctca 720 caccatcacc atcaccatgg cgcatacccg tacgacgttc cggactacgc ttcttag 777

Claims (41)

  1. 하기 중 하나를 포함하는 재조합 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편:
    (A) 서열번호 10, 서열번호 21, 서열번호 32, 서열번호 43, 서열번호 53, 서열번호 61, 서열번호 72, 서열번호 83, 서열번호 94, 서열번호 103, 서열번호 114, 서열번호 125, 서열번호 133, 서열번호 142; 그의 단편 및 그의 상동성 서열로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 영역;
    (B) 서열번호 6 및 8; 서열번호 17 및 19; 서열번호 28 및 30; 서열번호 39 및 41; 서열번호 49 및 51; 서열번호 57 및 59; 서열번호 68 및 70; 서열번호 79 및 81; 서열번호 90 및 92; 서열번호 99 및 101; 서열번호 110 및 112; 서열번호 121 및 123; 서열번호 129 및 131; 서열번호 138 및 140; 이들의 단편 및 이들의 상동성 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 각각 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 포함하는 항원 결합 영역;
    (C) 하기를 포함하는 항원 결합 영역:
    (i) 아미노산 서열 QSISSY (서열번호 1), AAS 및 QQSYSTPLT (서열번호 2)를 갖는, 각각 경쇄 상보성 결정 영역 (LCCDR) LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTSSSYW (서열번호 4), IKQDGSEK (서열번호 5) 및 ARGGWSYDM (서열번호 6)을 갖는, 각각 중쇄 상보성 결정 영역 (HCCDR) HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (ii) 아미노산 서열 SSNIGAGYA (서열번호 12), TNN 및 QSYDSSLSGVI (서열번호 13)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTLTELS (서열번호 14), FDPEDGET (서열번호 15) 및 ARAYYGFDQ (서열번호 16)를 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (iii) 아미노산 서열 SSNIGNNA (서열번호 23), YND 및 AAWDDSVNGYV (서열번호 24)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTRFG (서열번호 25), ISVNNGNT (서열번호 26) 및 ARYMYGRRDS (서열번호 27)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (iv) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDS 및 QVWDNHSDVV (서열번호 35)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 RNKFSSYA (서열번호 36), ISGSGGTT (서열번호 37) 및 ARWYSSYYDV (서열번호 38)를 포함하는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (v) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDS 및 QVWDSSSDYV (서열번호 45)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARNYISMFDS (서열번호 48)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (vi) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDS 및 QVWDSSSDHV (서열번호 55)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARGYSSYYDA (서열번호 56)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (vii) 아미노산 서열 RSNIGENT (서열번호 63), SNN 및 AAWDDRLNGYV (서열번호 64)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTNYG (서열번호 65), IGAQKGDT (서열번호 66) 및 ARSQGVPFDS (서열번호 67)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (viii) 아미노산 서열 RSNIGSNT (서열번호 74), NNN 및 ATWDDSLNEYV (서열번호 75)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTRYG (서열번호 76), ISGYNGNT (서열번호 77) 및 ARHGYGYHGD (서열번호 78)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (ix) 아미노산 서열 SSNIGAGYV (서열번호 85), HNN 및 QSYDSSLSGWV (서열번호 86)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFKDYY (서열번호 87), ISTSGNSV (서열번호 88) 및 ARSPGHSDYDS (서열번호 89)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (x) 아미노산 서열 NIGDKS (서열번호 96), YDS 및 QVWASGTDHPYVI (서열번호 97)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARMYGSYTDM (서열번호 98)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (xi) 아미노산 서열 SSNIGYNY (서열번호 105), RNN 및 TSWDDSLSGYV (서열번호 106)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GNAFTNFY (서열번호 107), INPSGTDLT (서열번호 108) 및 ARQYAYGYSGFDM (서열번호 109)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (xii) 아미노산 서열 QSVSNW (서열번호 116), AAS 및 QQSYSTPIT (서열번호 117)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GYTFTSYY (서열번호 118), INPNTGGS (서열번호 119) 및 ARGDVTYDE (서열번호 120)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열;
    (xiii) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), YDD 및 QVWDINDHYV (서열번호 127)를 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), ISGSGGST (서열번호 47) 및 ARSQASFMDI (서열번호 128)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열; 또는
    (xiv) 아미노산 서열 NIGSKS (서열번호 34), DDS 및 QVWDSSSDQGV (서열번호 135)을 갖는, 각각 LCCDR1, LCCDR2 및 LCCDR3을 포함하는 경쇄(LC) 및 아미노산 서열 GFTFSSYA (서열번호 46), IGTGGGT (서열번호 136) 및 ARGTGYDGDQ (서열번호 137)을 갖는, 각각 HCCDR1, HCCDR2 및 HCCDR3을 포함하는 중쇄(HC); 그의 단편 또는 그의 상동성 서열.
  2. 제1항에 있어서,
    단백질이 항체인 재조합 항원-결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    항체가 인간 항체인 재조합 항원-결합 단백질.
  4. 제2항에 있어서,
    항체 또는 그의 항원-결합 단편이 완전 Ig, Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv인 재조합 항원-결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    PD-1 작용물질인 항원-결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    PD-1 길항물질인 항원-결합 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    키메릭 항원 수용체(CAR)인 항원-결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산.
  9. 제8항의 핵산을 포함하는 벡터.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질, 제8항의 핵산 또는 제9항의 벡터를 포함하는 세포.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질, 제8항의 핵산, 제9항의 벡터, 제10항의 세포를 포함하는 약학 조성물.
  12. 대상에게 치료 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편, 제8항의 핵산, 제9항의 벡터, 제10항의 세포, 또는 제11항의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에 있어서 T 세포 반응을 증가시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편이 PD-1에 의해 매개된 신호전달을 억제하거나, 감소시키거나, 조절하거나 또는 제거하는 방법.
  14. PD-1 양성 질병을 갖는 대상에게 치료 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편, 제8항의 핵산, 제9항의 벡터, 제10항의 세포, 또는 제11항의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법.
  15. PD1 리간드에의 PD1 결합을 억제시킴으로써 PD1-양성 질병을 치료하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 항-PD1 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편, 제8항의 핵산, 제9항의 벡터, 제10항의 세포, 또는 제11항의 약학 조성물의 용도.
  16. PD-1 신호전달 경로를 억제시킴으로써 면역조절하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 항-PD1 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편, 제8항의 핵산, 제9항의 벡터, 제10항의 세포, 또는 제11항의 약학 조성물의 용도.
  17. 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않은 벡터.
  18. 제17항의 벡터를 포함하는 세포.
  19. 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포로서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않은 세포.
  20. 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질 및 키메릭 항원 수용체를 포함하는 세포로서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않은 세포.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메릭 항원 수용체가 PD-1에 특이적으로 결합하지 않는 벡터 또는 세포.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 항체인 벡터 또는 세포.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 인간 항체인 벡터 또는 세포.
  24. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 완전 Ig, Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv인 벡터 또는 세포.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 PD-1 작용물질인 벡터 또는 세포.
  26. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 PD-1 길항물질인 벡터 또는 세포.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 분비성 단백질인 벡터 또는 세포.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 제1항에 인용된 항원 결합 영역을 포함하는 벡터 또는 세포.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메릭 항원 수용체가 CD-19에 특이적으로 결합하는 벡터 또는 세포.
  30. 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메릭 항원 수용체가 인간 T 세포막에 삽입될 수 있는 벡터 또는 세포.
  31. 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포인 세포.
  32. 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터 또는 세포를 포함하는 약학 조성물.
  33. 대상에게 치료 유효량의 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터 또는 세포, 또는 제32항의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에 있어서 T 세포 반응을 증가시키는 방법으로서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 PD-1 길항물질인 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 PD-1에 의해 매개된 신호전달을 억제하거나, 감소시키거나, 조절하거나 또는 제거하는 방법.
  35. 대상에게 치료 유효량의 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터 또는 세포, 또는 제32항의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에서 T 세포 반응을 감소시키는 방법으로서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 PD-1 작용물질인 방법.
  36. PD1-양성 질병을 갖는 대상에게 치료 유효량의 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터 또는 세포, 또는 제32항의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법.
  37. PD1-양성 질병을 갖는 대상의 적어도 하나의 T 세포에, 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 형질도입시킴을 포함하는 상기 대상의 치료 방법으로서, 상기 재조합 항-PD-1 항원-결합 단백질이 상기 키메릭 항원 수용체와 동일하지 않은 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    키메릭 항원 수용체가 PD-1에 특이적으로 결합하지 않는 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD-1-양성 질병이 암인 방법.
  40. PD1 리간드에의 PD1 결합을 억제시킴으로써 PD1-양성 질병을 치료하기 위한 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터 또는 세포, 또는 제32항의 약학 조성물의 용도.
  41. PD-1 신호전달 경로를 억제시킴으로써 면역조절하기 위한 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터 또는 세포, 또는 제38항 또는 제39항의 약학 조성물의 용도.
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