JP2024528217A - 二重特異性抗体および使用方法 - Google Patents

二重特異性抗体および使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関する。本発明は、これらの分子を生成する方法、その使用方法、その薬学的組成物、ならびにがん、急性および慢性感染症、ならびに移植片対宿主病の治療のための医薬としてのそれらの使用にさらに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関する。本発明は、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、および二重特異性抗体またはイムノコンジュゲートを使用する方法にさらに関する。
プログラム死１タンパク質（ＰＤ１またはＣＤ２７９）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む細胞表面受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーであり、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に結合し（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）２３：５１５－４８；Ｆｒｅｅｍａｎ Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．（２０００）１９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２：２６１－８）、いわゆるＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１軸を形成する。ＰＤ１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上に発現される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ，ｓｕｐｒａ；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。ＰＤ１遺伝子は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部である、５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：７６５－７２）。ＰＤ１は、膜近位免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および膜遠位チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含有する（Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｌ．（１９９５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８１：１：１９５３－６；Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ．ａｎｄ Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １８：２８６－９１）。ＰＤ１は、ＣＴＬＡ－４と構造的に類似しているが、Ｂ７－１およびＢ７－２の結合に重要なＭＹＰＰＰＹモチーフ（配列番号７１）を欠く。ＰＤ１に対する２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）およびＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３）が同定されており、これらは、ＰＤ１に結合するとＴ細胞活性化をダウンレギュレートすることが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２はいずれも、ＰＤ１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７ホモログである。様々なヒトがんでは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１に対する１つのリガンドが豊富である（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ ８：７８７－９）。モノクローナル抗体および小分子薬物によるＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１免疫学的チェックポイントの標的化は、免疫腫瘍学では主要な焦点となっている。
ＰＤ１は、ＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーとしてのその役割に加えて、自己免疫性脳脊髄炎、全身性紅斑性狼瘡、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病および関節リウマチに何らかの役割を果たすことが見出されている（Ｓａｌａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：７１－７８；Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ ａｎｄ Ａｌａｒｃｏｎ－Ｒｉｑｕｅｌｍｅ（２００４）Ｈｕｍ ＭｏＩ Ｇｅｎｅｔ １３：Ｒ１４３；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｌｕｐｕｓ １３：５１０）。マウスＢ細胞腫瘍株では、ＰＤ１のＩＴＳＭは、Ｂ細胞受容体によって媒介されるＣａ２＋の流動、および下流エフェクター分子のチロシンリン酸化をブロックするのに必須であることが示された（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３８６６－７１）。
以下を含む様々な特許出願は、抗ＰＤ１抗体の産生、ならびに／またはＰＤ－Ｌ１結合および／もしくはＰＤ１シグナル伝達に干渉する薬剤（抗ＰＤ１抗体を含む）を用いて免疫応答を増強する方法を開示している：米国特許第２００３／００３９６５３号、米国特許第２００４／０２１３７９５号、米国特許第２００６／０１１０３８３号、米国特許第２００７／００６５４２７号、米国特許第２００７／０１２２３７８号、米国特許第２０１２／２３７５２２号、国際公開第２００４／０７２２８６号、国際公開第２００６／１２１１６８号、国際公開第２００６／１３３３９６号、国際公開第２００７／００５８７４号、国際公開第２００８／０８３１７４号、国際公開第２００８／１５６７１２号、国際公開第２００９／０２４５３１号、国際公開第２００９／０１４７０８号、国際公開第２００９／１１４３３５号、国際公開第２０１０／０２７８２８号、国際公開第２０１０／０２７４２３号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０２９４３５号、国際公開第２０１０／０２９４３４号、国際公開第２０１０／０６３０１１号、国際公開第２０１０／０８９４１１号、国際公開第２０１１／０６６３４２号、国際公開第２０１１／１１０６０４号、国際公開第２０１１／１１０６２１号および国際公開第２０１２／１４５４９３号。
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、鉄－トランスフェリン複合体に結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスによってそれを内部移行することによって、細胞内への鉄輸送に関与する膜受容体である。ＴｆＲは、その迅速な内部移行および再利用速度のために、細胞内送達の治療手法にとって魅力的な標的である。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達は、身体全体にわたる膨大なＴｆＲ発現のために、ほとんどが非効率的かつ非特異的である。
当技術分野で記載されているＰＤ１抗体の効果は、ＰＤ１に結合することによってＰＤ－Ｌ１とＰＤ１との間の相互作用をブロックすることに依存している。ＰＤ１に対する抗ＰＤ１抗体の最も親和性の高い抗体結合であっても非共有結合性であり、したがって一過性であるため、公知の抗ＰＤ１抗体よりも改善された有効性および長い持続性効果を有する、ＰＤ１を標的とする新たな化合物を開発する必要がある。
一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１軸の分子に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む新規な二重特異性抗体を提供する。一態様では、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１軸分子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２からなる群から選択される。特定の一態様では、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１軸分子はＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１である。特定の一態様では、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１軸分子はＰＤ１である。本発明の抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体は、特に有利な特性、例えば、機能的に最適化された結合親和性、増加した生物活性、特定のＴ細胞の特異的標的化、および高い標的化効率を有する。
別の態様では、二重特異性抗体は、その表面上にＴｆＲおよびＰＤ１を発現および提示する細胞の表面上のＴｆＲ受容体およびＰＤ１受容体に結合する。好ましい態様では、ＴｆＲおよびＰＤ１への抗体の結合は同時である。細胞表面上のＴｆＲおよびＰＤ１に二重特異性抗体が結合すると、好ましくは、ＴｆＲおよびＰＤ１とともに二重特異性抗体によって形成される複合体が上記細胞内に内部移行することによって、ＴｆＲおよびＰＤ１を発現する上記細胞の表面からＰＤ１が枯渇する。その結果、好ましくは、ＴｆＲおよび結合した二重特異性抗体とともに、細胞表面からＰＤ１が枯渇する。本発明は、本発明の抗ＰＤ１抗ＴｆＲ二重特異性抗体が、細胞表面からＰＤ１を除去することによってＰＤ１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害するという有利な効果を有するという発見に少なくとも部分的に基づいており、これは、ＰＤ１の内部移行と、細胞表面からのＰＤ１の枯渇とをもたらさない抗ＰＤ１ブロッキング抗体の単なる結合によって達成可能な阻害よりも効果的であり、および／または持続性がある。
一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。したがって、この二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的な１つの抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的な２つの抗原結合ドメインとを有する。第１の標的に対する２つの結合ドメインと、第２の標的に対する１つの結合ドメインとを有するそのような分子は、２＋１フォーマットまたは２＋１フォーマット抗体とも呼ばれる。一態様では、これらの分子は、異なる立体配座で互いに共有結合的に結合して異なる２＋１フォーマット抗体をもたらし得るＩｇＧクラスＦａｂ断片、および任意にＩｇＧクラスＦｃ領域に基づく。抗原結合ドメインの異なる立体配座を有する異なる２＋１フォーマットの例を図１～図４に示す。さらなる立体配座は当技術分野に記載されている（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１７）ＭＡｂｓ ９（２）：１８２－２１２；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ（２０１５）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ２０（７）：８３８－４７；Ｂａｃａｃ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２４（１９）：４７８５－４７９７；Ｒｉｕｓ Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １０（４６１）：ｅａａｔ１４４５；Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．３１（３）：３９６－４１０；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５（８）：ｅ１２０３４９８；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２（１３）：３２８６－９７；Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（１）：１４９－１６２；Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｅｕｒｏｎ．８１（１）：４９－６０）。
驚くべきことに、そのような抗ＴｆＲ抗ＰＤ１ ２＋１フォーマット抗体、すなわち、それぞれ抗ＰＤ１および抗ＴｆＲを標的とする結合ドメインの化学量論が２：１である二重特異性抗体、または換言すれば、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、単一特異性二価ＰＤ１抗体よりも改善された生物活性を示し、ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の良好な阻害をもたらすことが見出された。
ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の一態様では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および／または存在する場合、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ断片である。さらなる態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む二重特異性抗体に関する。特定の態様では、二重特異性抗体に含まれるＦａｂ断片のうちの１つ以上が、Ｆｃドメインに融合されている。別の態様では、Ｆａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介してＦｃドメインに融合されている。追加の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ ＦｃドメインまたはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。特定の態様では、二重特異性抗体の重鎖は、γ型（ＩｇＧ）、特にγ１型のものである。別の特定の態様では、二重特異性抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）および／またはラムダ（λ）サブタイプのものである。
一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、Ｆｃドメインと、ＴｆＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂ断片と、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２の、および任意に第３のＦａｂ断片とを含む二重特異性抗体を提供する。特定の態様では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＴｆＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂ断片と、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２の、および任意に第３のＦａｂ断片とを含み、Ｆａｂ断片は、Ｆｃドメインに融合されている。一態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する正確に１つの（一価）抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する正確に２つの（一価）抗原結合ドメインとを含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、さらに具体的にはＩｇＧ１ ＦｃドメインまたはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。特定の一態様では、二重特異性抗体の重鎖は、γ型（ＩｇＧ）、特にγ１（ＩｇＧ１）サブタイプのものである。別の特定の態様では、二重特異性抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）および／またはラムダ（λ）サブタイプのものである。一態様では、二重特異性抗体はＪ鎖を含まない。別の態様では、二重特異性抗体は、ハイブリッドＩｇＡ／ＩｇＧ抗体配列および／またはハイブリッドＩｇＭ／ＩｇＧ抗体配列を含まない。さらなる態様では、二重特異性抗体は、本質的にモノマー形態であり、すなわち、本発明の複数の二重特異性抗体を含むダイマーまたはマルチマー（例えば、ペンタマー）構造を形成しない。特定の態様では、抗体の少なくとも９０％、さらに具体的には少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、さらに好ましくは少なくとも９９％がモノマー形態である。
一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗体に関する。特に、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む、二重特異性抗体に関する。一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、ノブ・イントゥー・ホール法（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ ｍｅｔｈｏｄ）に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、二重特異性抗体に関する。特定の態様では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を含むものである。
さらなる態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および存在する場合、第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、Ｆａｂ断片のうちの１つまたは２つでは、
ａ）可変ドメインＶＬおよびＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換えられているか、または
ｂ）定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部であり、ＣＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換えられている、二重特異性抗体を提供する。
好ましい態様では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換えられている。特定の態様では、二重特異性抗体は、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂ断片内で、可変ドメインＶＬおよびＶＨ、または定常ドメインＣＬおよびＣＨ１のいずれかが互いに置き換えられているものである。特に好ましい態様では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメイン内で互いに置き換えられている。一態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する正確に１つの（一価）抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する正確に２つの（一価）抗原結合ドメインとを含む。
追加の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および存在する場合、第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、定常ドメインＣＬ内のＦａｂ断片のうちの１つまたは２つでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１では、１４７位および２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、二重特異性抗体に関する。特定の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、定常ドメインＣＬ内の、ＴｆＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂ断片では、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１では、１４７位および２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、二重特異性抗体に関する。
特定の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂ断片および、存在する場合、第３のＦａｂ断片では、定常ドメインＣＬ内の１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１内の１４７位および２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、二重特異性抗体を提供する。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する、抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する、抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖とを含む二価抗体であって、第２の軽鎖および第２の重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられており、第２の軽鎖および第２の重鎖の定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている、二価抗体である。
ａ）の抗体の２つのサブユニットは、ｂ）で報告されている修飾を含有せず、ａ）の重鎖および軽鎖は単離された鎖である。ｂ）の抗体の２つのサブユニットでは、軽鎖内で、可変軽鎖ドメインＶＬは、上記抗体の可変重鎖ドメインＶＨによって置き換えられており、定常軽鎖ドメインＣＬは、上記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１によって置き換えられており、重鎖内で、可変重鎖ドメインＶＨは、上記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによって置き換えられており、定常重鎖ドメインＣＨ１は、上記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬによって置き換えられている。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する、抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する、抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖とを含む二価抗体であって、第２の軽鎖および第２の重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられている、二価抗体である。
ａ）の抗体の２つのサブユニットは、ｂ）で報告されている修飾を含有せず、ａ）の重鎖および軽鎖は単離された鎖である。ｂ）の抗体の２つのサブユニットでは、軽鎖内で、可変軽鎖ドメインＶＬは、上記抗体の可変重鎖ドメインＶＨによって置き換えられており、重鎖内で、可変重鎖ドメインＶＨは、上記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによって置き換えられている。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する、抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する、抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖とを含む二価抗体であって、第２の軽鎖および第２の重鎖の定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている、二価抗体である。
ａ）の抗体の２つのサブユニットは、ｂ）で報告されている修飾を含有せず、ａ）の重鎖および軽鎖は単離された鎖である。ｂ）の抗体の２つのサブユニットでは、定常軽鎖ドメインＣＬは、上記抗体の定常重鎖ドメインＣＨ１によって軽鎖内で置き換えられており、定常重鎖ドメインＣＨ１は、上記抗体の定常軽鎖ドメインＣＬによって重鎖内で置き換えられている。
さらなる一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン、ならびに存在する場合、第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、二重特異性抗体を提供する。換言すれば、二重特異性抗体は、互いに融合したＦａｂ断片から構成される。第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、二重特異性抗体と、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で他の２つのＦａｂ重鎖のうちの１つの遊離Ｎ末端に、またはそのＦａｂ重鎖のＮ末端で他の２つのＦａｂ重鎖のうちの１つの遊離Ｃ末端に融合されている（例示的な立体配座については図４も参照）。一態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する正確に１つの（一価）抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する正確に２つの（一価）抗原結合ドメインとを含む。
一態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含み、上記二重特異性抗体は、
ａ）２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなり、ＰＤ１に特異的に結合する２つの抗原結合ドメインを含む完全長抗体と、
ｂ）ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または
ｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）
からなる第１のポリペプチドであって、
上記第１のポリペプチドが、そのＶＨドメインのＮ末端と、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されている、第１のポリペプチドと、
ｃ）ｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）または
ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなる第２のポリペプチドであって、
上記第２のポリペプチドが、ＶＬドメインまたはＣＬドメインのＮ末端と、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に任意に融合されている、第２のポリペプチドとを含む三価抗体であり、
第１のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、第２のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とは、ＴｆＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを一緒に形成する。
別の態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含み、上記二重特異性抗体は、
ａ）２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなり、ＰＤ１に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＴｆＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む完全長抗体と、
ｂ）ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または
ｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）
からなる第１のポリペプチドであって、
上記第１のポリペプチドが、そのＶＨドメインのＣ末端、または存在する場合、その定常ドメイン１（ＣＨ１）のＣ末端と、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＮ末端に融合されている、第１のポリペプチドと、
ｃ）ｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）または
ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなる第２のポリペプチドであって、
上記第２のポリペプチドが、ＶＬドメインのＣ末端、または存在する場合、ＣＬドメインのＣ末端と、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＮ末端に任意に融合されている、第２のポリペプチドとを含む三価抗体であり、
第１のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、第２のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とは、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを一緒に形成する。特定の態様では、第１および任意に第２のポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合する抗原結合ドメインのＶＨドメインを含む重鎖のＮ末端に融合されている。
一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および存在する場合、第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、抗体が、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、
（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、
（ｉｉｉ）第３の抗原結合ドメインが、存在する場合、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、二重特異性抗体に関する。一態様では、二重特異性抗体は三価抗体である。別の態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する正確に１つの（一価）抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する正確に２つの（一価）抗原結合ドメインとを含む。ある特定の態様では、二重特異性抗体はＩｇＧクラスのものである。別の態様では、二重特異性抗体のＦａｂ断片および／またはＦｃ領域はＩｇＧクラスのものである。ある特定の態様では、二重特異性抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。別の態様では、二重特異性抗体のＦａｂ断片および／またはＦｃ領域はＩｇＧ１アイソタイプのものである。
さらなる態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および存在する場合、第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、抗体が、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、
ｉ）第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＮ末端で、Ｆｃドメインの第１もしくは第２のサブユニットのＣ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されているか、
または
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＮ末端で、Ｆｃドメインの第１もしくは第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、二重特異性抗体を提供する。一態様では、二重特異性抗体は三価抗体である。別の態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する正確に１つの（一価）抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する正確に２つの（一価）抗原結合ドメインとを含む。ある特定の態様では、二重特異性抗体はＩｇＧクラスのものである。追加の態様では、二重特異性抗体のＦａｂ断片および／またはＦｃ領域はＩｇＧクラスのものである。ある特定の態様では、二重特異性抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。さらに別の態様では、二重特異性抗体のＦａｂ断片および／またはＦｃ領域はＩｇＧ１アイソタイプのものである。
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む１つのＦａｂ断片、
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む２つのＣｒｏｓｓＦａｂ断片であって、ＣＨ１とＣＬドメインとが互いに交換されているＣｒｏｓｓＦａｂ断片、
ｃ）第１のＦｃ領域重鎖および第２のＦｃ領域重鎖を含む１つのＦｃ領域を含む三価抗体であって、
Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端が、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの一方のＮ末端に接続されており、一方のＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端が、他方の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続されており、他方のＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端が、Ｆａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に、またはＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に接続されている、三価抗体である。特定の態様では、接続は、ペプチド性リンカーを介する。別の態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する正確に１つの（一価）抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する正確に２つの（一価）抗原結合ドメインとを含む。ある特定の態様では、二重特異性抗体はＩｇＧクラスのものである。追加の態様では、二重特異性抗体のＦａｂ断片および／またはＦｃ領域はＩｇＧクラスのものである。ある特定の態様では、二重特異性抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。さらに別の態様では、二重特異性抗体のＦａｂ断片および／またはＦｃ領域はＩｇＧ１アイソタイプのものである。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
ａ）ＰＤ１に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、軽鎖内で、可変軽鎖ドメインＶＬが、上記抗体の可変重鎖ドメインＶＨによって置き換えられており、重鎖断片内で、可変重鎖ドメインＶＨが、上記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによって置き換えられている完全長抗体と、
ｂ）ＴｆＲに特異的に結合するＦａｂ断片とを含み、
Ｆａｂ断片重鎖のＮ末端は、完全長抗体の２つの重鎖のうちの１つのＣ末端に接続されている。別の態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する正確に１つの（一価）抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する正確に２つの（一価）抗原結合ドメインとを含む。ある特定の態様では、二重特異性抗体はＩｇＧクラスのものである。追加の態様では、Ｆａｂ断片および／または完全長抗体はＩｇＧクラスのものである。ある特定の態様では、二重特異性抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。さらに別の態様では、Ｆａｂ断片および／または完全長抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。
さらなる態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含み、
ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
または
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
一実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
または
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
特定の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、二重特異性抗体が、ＴｆＲおよびＰＤ１に同時に結合し、二重特異性抗体が同時に結合すると、二重特異性抗体とＴｆＲとＰＤ１とによって形成された複合体が、細胞内に内部移行され、ＰＤ１が、細胞表面から枯渇し、二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
または
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、
ならびに
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
または
（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および
（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインを含む、二重特異性抗体を提供する。
さらなる態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含み、
ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または
配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、
配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または
配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
さらなる態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、モノクローナル抗体である。
特定の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、
配列番号３５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、ならびに
配列番号３９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖、および配列番号４０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、
または
配列番号３７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、ならびに
配列番号３９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖、および配列番号４０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、
または
配列番号３５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、ならびに
配列番号４１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖、および配列番号４２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、
または
配列番号３７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、ならびに
配列番号４１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖、および配列番号４２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む二重特異性抗体に関する。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、
配列番号５９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖、配列番号５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、および配列番号５８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、
または
配列番号６１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖、配列番号５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、および配列番号５８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む二重特異性抗体に関する。
本発明の別の態様によれば、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、本明細書に記載され、当業者に公知の最新の方法によって決定された場合、ｎＭ～サブｎＭの範囲の親和性でＴｆＲおよびＰＤ１の両方に結合する抗体である。
本発明の別の態様によれば、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、以下の特性のうちの１つ以上によって独立して特徴付けられる：抗ＰＤ１抗ＴｆＲ二重特異性抗体は、
ｉ）ＴＣＲシグナル伝達のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介阻害を１ｎＭの濃度で２倍超だけ、もしくは１００ｎＭの濃度で４倍超だけ低減する（実施例４による共培養アッセイでは、ルシフェラーゼレポーター系に動作可能に連結されたＮＦＡＴ応答エレメントを使用して検出されたように）；および／または
ｉｉ）（実施例６による内部移行アッセイでは）活性化Ｔ細胞と接触すると、２５％超、好ましくは４０％超、さらに好ましくは５０％超だけ活性化Ｔ細胞内に内部移行する
ｉｉｉ）（実施例１４による最小混合リンパ球反応では）同種刺激Ｔ細胞によるグランザイムＢ分泌を増強する。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、多重特異性抗体である。
特定の一態様では、本発明は、配列番号３５の第１の重鎖と、配列番号３６の第１の軽鎖と、配列番号３９の第２の重鎖と、配列番号４０の第２の軽鎖とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
特定の一態様では、本発明は、配列番号３７の第１の重鎖と、配列番号３８の第１の軽鎖と、配列番号３９の第２の重鎖と、配列番号４０の第２の軽鎖とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
特定の一態様では、本発明は、配列番号３５の第１の重鎖と、配列番号３６の第１の軽鎖と、配列番号４１の第２の重鎖と、配列番号４２の第２の軽鎖とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
特定の一態様では、本発明は、配列番号３７の第１の重鎖と、配列番号３８の第１の軽鎖と、配列番号４１の第２の重鎖と、配列番号４２の第２の軽鎖とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
特定の一態様では、本発明は、配列番号５９の第１の重鎖と配列番号６０の第２の重鎖と、配列番号５７の第１の軽鎖と、配列番号５８の第２の軽鎖とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
特定の一態様では、本発明は、配列番号６１の第１の重鎖と配列番号６０の第２の重鎖と、配列番号５７の第１の軽鎖と、配列番号５８の第２の軽鎖とを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、ならびに細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートを提供する。特定の態様では、細胞傷害性剤は、シュードモナス外毒素Ａまたはアマトキシンである。
さらなる一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含み、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長二重特異性抗体、ならびに
ｂ）１～４つのさらなる抗原に特異的に結合する（すなわち、第３および／または第４および／または第５および／または第６の抗原、好ましくは１つのさらなる抗原、すなわち、第３の抗原に特異的に結合する）１、２、３または４つの単鎖Ｆａｂ断片を含み、
ｂ）の上記単鎖Ｆａｂ断片が、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端で、ａ）の上記完全長抗体に融合されている多重特異性抗体である。追加の態様では、多重特異性抗体は、ＴｆＲに特異的に結合する正確に１つの（一価）抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する正確に２つの（一価）抗原結合ドメインとを含む。
さらなる一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含み、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長二重特異性抗体、ならびに
ｂ）ビオチンに特異的に結合する１、２、３または４つの単鎖Ｆａｂ断片を含み、
ｂ）の上記単鎖Ｆａｂ断片が、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端またはＮ末端で、ａ）の上記完全長抗体に融合されている多重特異性抗体である。
一態様では、第３の抗原に結合する１または２つの同一の単鎖Ｆａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端で完全長抗体に融合されている。好ましい態様では、第３の抗原はビオチンである。
一態様では、第３の抗原に結合する１または２つの同一の単鎖Ｆａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の重鎖のＣ末端で完全長抗体に融合されている。好ましい態様では、第３の抗原はビオチンである。
一態様では、第３の抗原に結合する１または２つの同一の単鎖Ｆａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の軽鎖のＣ末端で完全長抗体に融合されている。好ましい態様では、第３の抗原はビオチンである。
一態様では、第３の抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の各重鎖または軽鎖のＣ末端で完全長抗体に融合されている。好ましい態様では、第３の抗原はビオチンである。
一態様では、第３の抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の各重鎖のＣ末端で完全長抗体に融合されている。
一態様では、第３の抗原に結合する２つの同一の単鎖Ｆａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介して、上記完全長抗体の各軽鎖のＣ末端で完全長抗体に融合されている。
特定の一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、ビオチンに特異的に結合する第３の抗原結合ドメインとを含む三重特異性抗体を提供する。特定の一態様では、本発明は、配列番号４７の第１の重鎖、および配列番号４８の第１の軽鎖、配列番号４９の第２の重鎖、および配列番号５０の第２の軽鎖を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、ビオチンに特異的に結合する第３の抗原結合ドメインとを含む三重特異性抗体を提供する。別の態様では、ビオチンに特異的に結合する、三重特異性抗体の第３の抗原結合ドメインは、ビオチンにコンジュゲートされたペイロードを三重特異性抗体に結合させるために使用される。特定の態様では、ペイロードは、細胞傷害性剤、好ましくはシュードモナス外毒素Ａまたはアマトキシンである。
一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体をコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含むイムノコンジュゲートをコードする単離された核酸を提供する。さらなる態様では、本発明は、上記核酸を含む宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、または上記二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを産生する方法であって、抗体の発現に適した条件下で、上記二重特異性抗体または上記イムノコンジュゲートをコードする核酸を含む宿主細胞を培養する工程を含む方法に関する。特定の態様では、方法は、宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む。さらなる態様では、本発明はまた、そのような方法によって産生される二重特異性抗体に関する。
一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、または上記二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、ならびに薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。追加の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメイン、または上記二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、薬学的に許容される担体、ならびに追加の治療剤を含む薬学的組成物に関する。
別の態様では、本発明は、医薬として使用するための、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、または二重特異性抗体を含む薬学的組成物を提供する。
ｉ）免疫応答の調節、例えば、Ｔ細胞活性の回復、
ｉｉ）免疫応答もしくは機能の刺激、
ｉｉｉ）がんの予防もしくは治療、
ｉｖ）がんの進行の遅延、
ｖ）がんに罹患している患者の生存期間の延長、
ｖｉ）急性感染症、
ｖｉｉ）慢性および急性のウイルス感染症、ならびに／または
ｖｉｉｉ）ＰＤ１発現およびＰＤ１媒介免疫調節に依存する他の状態
に使用するための、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、または二重特異性抗体を含む薬学的組成物も本発明に包含される。
細胞傷害性ペイロードを有するイムノコンジュゲートまたは三重特異性抗体も、以下に有用である
ｉ）移植片対宿主病の治療、および／または
ｉｉ）自己免疫疾患の予防もしくは治療。
別の態様では、本発明は、がんの予防もしくは治療における使用のための、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、または二重特異性抗体を含む薬学的組成物を提供し、二重特異性抗体は、がん免疫療法に使用するための化学療法剤、照射および／または他の薬剤と組み合わせて投与される。
さらに、個体における腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、腫瘍細胞の成長を阻害するために、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、または二重特異性抗体を含む薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む方法が提供される。
特定の態様では、本発明は、以下の治療のための医薬の製造における、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、または二重特異性抗体を含む薬学的組成物に関する
ｉ．がん、
ｉｉ．感染症または
ｉｉｉ．移植片対宿主病。
さらに、本発明は、以下のための医薬の製造における、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、または二重特異性抗体を含む薬学的組成物の使用を開示する
ｉ）免疫応答の調節、例えば、Ｔ細胞活性の回復
ｉｉ）免疫応答もしくは機能の刺激
ｉｉｉ）がんの進行の遅延、および／または
ｉｖ）生存期間の延長、もしくはがんに罹患している患者。
一態様では、本発明は、移植片対宿主病を有する個体を治療する方法であって、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、または二重特異性抗体を含む薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む方法を提供する。追加の態様では、移植片対宿主病を有する個体を治療する方法であって、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、または二重特異性抗体を含む薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含み、追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む方法が提供される。追加の治療剤は、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、照射、ならびに／またはがん免疫療法に使用するための他の薬剤、例えば、免疫サイトカイン、ＩＬ－２およびそのバリアント、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、共刺激分子、例えば、ＦＡＰ－４－１ＢＢＬ／ＯＸ４０／ＣＤ４０、ＴＬＲアゴニスト、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ならびに免疫療法のための、および腫瘍の「ｃｏｌｄ－ｔｏ－ｈｏｔ」変換のための潜在的な「プライマー」として使用され得る細胞傷害性融合タンパク質からなる群から好ましくは選択される。
さらに、個体におけるＰＤ１機能を阻害する方法であって、ＰＤ１機能を阻害するために、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート、または二重特異性抗体を含む薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む方法が提供される。個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。
抗ＰＤ１および抗ＴｆＲに特異的な結合ドメインの化学量論が１＋１である、本発明の二重特異性抗体の例示的な構成の概略図。２つの異なる結合ドメインは、それらのパターンによって区別される。各構成について、ヘテロ二量体化を促進する電荷バリアント（＋＋または－－によって示される）の２つの可能な配向が示されており、１つは電荷がＦａｂ（上段）にあり、もう１つはＣｒｏｓｓＦａｂ（下段）にある。（Ａ、Ｆ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＶＨ－ＶＬ」分子の図。（Ｂ、Ｇ）ＣｒｏｓｓＦａｂ成分とＦａｂ成分との順序が異なる「１アーム１＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＶＨ－ＶＬ」分子の図。（Ｃ、Ｈ）「１アーム１＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＶＨ－ＶＬ」分子の図。（Ｄ、Ｉ）「Ｆａｂ－ＣｒｏｓｓＦａｂ ＶＨ－ＶＬ」融合分子の図。（Ｅ、Ｊ）「ＣｒｏｓｓＦａｂ－Ｆａｂ ＶＨ－ＶＬ」融合分子の図。黒点：ヘテロ二量体化を促進する、Ｆｃドメイン内の任意の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入されていてもよい反対の電荷のアミノ酸。ＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域およびＶＬ領域の交換を含むものとして示されているが、電荷修飾がＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入されない態様では、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの交換を代替的に含み得る。 抗ＰＤ１および抗ＴｆＲに特異的な結合ドメインの化学量論が２＋１である、本発明の二重特異性抗体の例示的な構成の概略図（１つの結合ドメインが、１つのＦａｂの重鎖のＮ末端に結合している（「ＴＣＢフォーマット」））。異なる結合ドメインは、それらのパターンによって区別される。２回存在する結合ドメインは、抗ＰＤ１結合ドメインである。１回存在する結合ドメインは、ＴｆＲ結合ドメインである。ＣｒｏｓｓＭａｂの各構成について、ヘテロ二量体化を促進する電荷バリアント（＋＋または－－によって示される）の２つの可能な配向が示されており、１つは電荷がＦａｂ（上段）にあり、もう１つはＣｒｏｓｓＦａｂ（下段）にある。（Ａ、Ｅ）「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＶＨ－ＶＬ」分子の図。（Ｂ、Ｆ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂと、そのＣＨ１ドメインのＣ末端を介してＣｒｏｓｓＦａｂのうちの１つのＶＬドメインのＮ末端に融合されている１つのＦａｂとを有する「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＶＨ－ＶＬ」分子の図。（Ｃ、Ｇ）２つのＣｒｏｓｓＦａｂならびに順序が異なるＣｒｏｓｓＦａｂ成分およびＦａｂ成分（「反転型」）を有する「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＶＨ－ＶＬ」分子の図。（Ｄ、Ｈ）「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子（「反転型」）の図。黒点：ヘテロ二量体化を促進する、Ｆｃドメイン内の任意の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入されていてもよい反対の電荷のアミノ酸。ＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域およびＶＬ領域の交換を含むものとして示されているが、電荷修飾がＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入されない態様では、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの交換を代替的に含み得る。 抗ＰＤ１および抗ＴｆＲに特異的な結合ドメインの化学量論が２＋１である、本発明の二重特異性抗体の例示的な構成の概略図（１つの結合ドメインが、１つのＦｃ重鎖のＣ末端に結合している（「ＢＢＢフォーマット」））。異なる結合ドメインは、この模式図では、それらのパターンによって区別される。２回存在する結合ドメインは、抗ＰＤ１結合ドメインである。１回存在する結合ドメインは、ＴｆＲ結合ドメインである。各構成について、ヘテロ二量体化を促進する電荷バリアント（＋＋または－－によって示される）の２つの可能な配向が示されており、１つは電荷がＦａｂ（上段）にあり、もう１つはＣｒｏｓｓＦａｂ（下段）にある。（Ａ、Ｅ）「（ＣｒｏｓｓＦａｂ）２－Ｆｃ－Ｆａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｆ）「（Ｆａｂ）２－Ｆｃ－ＣｒｏｓｓＦａｂ」分子の図。（Ｃ、Ｇ）「（Ｆａｂ＋ＣｒｏｓｓＦａｂ）－Ｆｃ－Ｆａｂ」分子の図。（Ｄ、Ｈ）「（Ｆａｂ＋ＣｒｏｓｓＦａｂ）－Ｆｃ－ＣｒｏｓｓＦａｂ」分子の図。黒点：ヘテロ二量体化を促進する、Ｆｃドメイン内の任意の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入されていてもよい反対の電荷のアミノ酸。ＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域およびＶＬ領域の交換を含むものとして示されているが、電荷修飾がＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入されない態様では、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの交換を代替的に含み得る。 抗ＰＤ１および抗ＴｆＲに特異的な結合ドメインの化学量論が２＋１である、本発明の二重特異性抗体の例示的な構成の概略図（３つのＦａｂ分子は、示されるようにペプチドリンカーを介して互いに共有結合的に結合されている）。異なる結合ドメインは、それらのパターンによって区別される。２回存在する結合ドメインは、抗ＰＤ１結合ドメインである。１回存在する結合ドメインは、ＴｆＲ結合ドメインである。融合分子の各構成について、ヘテロ二量体化を促進する電荷バリアント（＋＋または－－によって示される）の２つの可能な配向が示されており、１つは電荷がＦａｂ（上段）にあり、もう１つはＣｒｏｓｓＦａｂ（下段）にある。（Ａ、Ｅ）「（Ｆａｂ）２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｆ）「ＣｒｏｓｓＦａｂ－（Ｆａｂ）２」分子の図。（Ｃ、Ｇ）「（ＣｒｏｓｓＦａｂ）２－Ｆａｂ」の図。（Ｄ、Ｈ）「Ｆａｂ－（ＣｒｏｓｓＦａｂ）２」分子の図。＋＋、－－：ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入されていてもよい反対の電荷のアミノ酸。ＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域およびＶＬ領域の交換を含むものとして示されているが、電荷修飾がＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに導入されない態様では、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの交換を代替的に含み得る。 ＴｆＲおよびＰＤ１に対する結合ドメインを有する二重特異性１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂの概略図。 活性免疫細胞へのペイロード送達のために、ビオチンに特異的に結合する第３の結合ドメインを有する二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂの概略図。 実施例で使用した２＋１抗体（血液脳関門シャトル（ＢＢＢ）フォーマット）の概略図。電荷修飾（すなわち、ＰＤ１バインダーではＶＨ／ＶＬ交換、ＴｆＲバインダーでは電荷修飾：ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を有する「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＶＨ－ＶＬ、反転型」として、試験した２＋１フォーマット抗体分子８１５６および８１５８を産生した。（Ｂ～Ｅ）抗体を構築するための成分：抗ＰＤ１クロスオーバーＦａｂドメインの軽鎖（Ａ）、ＣＬに電荷修飾を有する抗ＴｆＲ Ｆａｂドメインの軽鎖（Ｂ）、Ｆｃ領域にホールとＰＧ ＬＡＬＡ変異とを有し、抗ＴｆＲ Ｆａｂ分子の重鎖のＮ末端がＦｃ領域にＣ末端結合している抗ＰＤ１クロスオーバーの重鎖（Ｈ）、抗ＰＤ１クロスオーバーＦａｂを有し、Ｆｃ領域にノブとＰＧ ＬＡＬＡ変異とを有する重鎖（Ｋ）。対照分子８１５８については、ＴｆＲ結合アームの軽鎖および重鎖の可変抗体領域を非結合配列（「Ｎａｄａ」）によって置き換えた。 実施例で使用した２＋１抗体（Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）フォーマット）の概略図。電荷修飾（すなわち、ＰＤ１バインダーではＶＨ／ＶＬ交換、ＴｆＲバインダーでは電荷修飾：ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を有する「２＋１（ＣｒｏｓｓＦａｂ）２－Ｆｃ－Ｆａｂ ＶＨ－ＶＬ」として、試験した抗体分子８１５７および８１５９を産生した。（Ｂ～Ｅ）。抗体を構築するための成分：抗ＰＤ１クロスオーバーＦａｂ分子の軽鎖（Ａ）、ＣＬに電荷修飾を有する抗ＴｆＲ Ｆａｂ分子の軽鎖（Ｂ）、Ｆｃ領域にホールとＰＧ ＬＡＬＡ変異とを有し、抗ＰＤ１クロスオーバーＦａｂ分子の重鎖のＣ末端が抗ＰＤ１ ＦａｂのＮ末端に結合している抗ＴｆＲ分子の重鎖（Ｈ）、Ｆｃ領域にノブとＰＧ ＬＡＬＡ変異とを有する抗ＰＤ１クロスオーバーの重鎖（Ｋ）。対照分子８１５９については、ＴｆＲ結合アームの軽鎖および重鎖の可変抗体領域を非結合配列（「Ｎａｄａ」）によって置き換えた。 共培養アッセイにおけるＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達のブロック。ＰＤ１発現Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１－ＮＦＡＴ細胞を抗体とともに３７℃で３０分間プレインキュベートし、培地を用いて１回洗浄し、次いで、アクチベーター細胞（一晩接着させたＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞）に５時間かけて加えた。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを加えた後の発光シグナルによって、ＰＤ１シグナル伝達によるＴＣＲ活性化の阻害を測定した（３回の独立した実験の代表）。 共培養アッセイにおけるＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達のブロック。抗体を加えた後のアッセイ中の細胞生存度。共培養アッセイにおける細胞生存度は、適用された濃度で任意の抗体を加えることによって影響を受けなかった。 三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂ分子（１１２９）および抗ＰＤ１抗Ｎａｄａ抗ビオチン対照分子（９９０４）のＳＰＲ曲線。 三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂのアビディティ増強結合はＰＤ１発現に依存する。フローサイトメトリーによって分析した、ＰＤ１形質導入ＮＦＡＴ－ｂｌａ Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＴｆＲおよびＰＤ１の発現レベル。 三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂのアビディティ増強結合はＰＤ１発現に依存する。ＰＤ１形質導入ＮＦＡＴ－ｂｌａ Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面に結合したＰＥ標識抗体の定量（ｎ＝３±平均値の標準誤差（ＳＥＭ））。 三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂのアビディティ増強結合はＰＤ１発現に依存する。ｂｉｏ－Ｃｙ５によって検出された、ＰＤ１形質導入ＮＦＡＴ－ｂｌａ Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＣｒｏｓｓＭａｂの結合（３つの独立した実験の代表）。三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂ １１２９および対照を、その表面上に異なるレベルのＰＤ１を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（野生型ＷＴ、ＰＤ１低、ＰＤ１高）とともにインキュベートした。抗体をビオチン化Ｃｙ５を使用して検出し、ＡＰＣ中央値を測定するフローサイトメトリーによって検出した。それらの細胞表面上に高レベルのＰＤ１を発現した細胞の方が結合が強かった。 活性化Ｔ細胞による抗ＰＤ１抗ＴｆＲ ＣｒｏｓｓＭａｂの内部移行。抗ＰＤ１抗ＴｆＲ二重特異性抗体８０１２、８０１３、８０１７および８０１８は、ＴｆＲ Ｎａｄａ対照抗体（８０１５、８０１６）と同様の内部移行を示す。ＰＤ１結合ドメインのみを有するがＴｆＲ結合ドメインを有しない抗体は、内部移行を示さない（ＰＤ１－０１０３－０３１２、８０１４、８０１９）。 活性化Ｔ細胞による抗ＰＤ１抗ＴｆＲ ＣｒｏｓｓＭａｂの内部移行。抗ＰＤ１抗ＴｆＲ二重特異性抗体８０１２、８０１３、８０１７および８０１８は、ＴｆＲ Ｎａｄａ対照抗体（８０１５、８０１６）と同様の内部移行を示す。ＰＤ１結合ドメインのみを有するがＴｆＲ結合ドメインを有しない抗体は、内部移行を示さない（ＰＤ１－０１０３－０３１２、８０１４、８０１９）。 ｍＥＧＦＰ－ＰＤ１形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるｍＥＧＦＰ－ＰＤ１およびＢｉｏ－Ｃｙ５ペイロードの内部移行および共局在化。ｍＥＧＦＰ－ＰＤ１ Ｊｕｒｋａｔを、Ｂｉｏ－Ｃｙ５と複合体化した１０ｎＭの抗ＴｆＲ／抗ＰＤ１／抗ビオチン三重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂまたは対照抗体と３時間インキュベートした。共焦点顕微鏡法によって、ＧＦＰ－ＰＤ１およびＢｉｏ－Ｃｙ５の局在化を評価した。 形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞へのｍＥＧＦＰ－ＰＤ１の内部移行。ｍＥＧＦＰ－ＰＤ１形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０ｎＭのペンブロリズマブ（二価抗ＰＤ１抗体）、抗ＴｆＲ／抗ＰＤ１二重特異性抗体または抗ＣＤ３３非結合対照抗体と６０分間インキュベートした。共焦点顕微鏡法によって、ｍＥＧＦＰ－ＰＤ１の局在化を評価した。 Ｊｕｒｋａｔ細胞における形質導入されたｍＥＧＦＰ－ＰＤ１の抗体媒介性の減少および回復。ｍＥＧＦＰ－ＰＤ１形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を１０ｎＭの三重特異性抗体または対照分子を用いて処理し、１、３、２４および４８時間後にそれらのＧＦＰ蛍光中央値について評価した。 Ｊｕｒｋａｔ細胞における形質導入されたｍＥＧＦＰ－ＰＤ１の抗体媒介性の減少および回復。細胞を１０ｎＭの三重特異性抗体を用いて２４時間処理して、最大ＧＦＰ－ＰＤ１ダウンレギュレーションを達成し、ＧＦＰシグナルを２４時間にわたってモニタリングした。 ビオチン化シュードモナス外毒素ＰＥ２５のアビディティ増強送達。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイによって測定した、ｂｉｏ－ＰＥ２５または毒素単独対照と複合体化した三重特異性抗体を用いて４８時間処理したＰＤ１形質導入ＮＦＡＴ－ｂｌａ Ｊｕｒｋａｔ細胞の生存度。 ビオチン化シュードモナス外毒素ＰＥ２５のアビディティ増強送達。ｂｉｏ－ＰＥ２５を有しない対照抗体を用いて４８時間処理した後のＰＤ１形質導入ＮＦＡＴ－ｂｌａ Ｊｕｒｋａｔ細胞の生存度。 活性化ヒトＴ細胞におけるアビディティ増強結合および内部移行。ビオチン化Ｃｙ５によって検出した、活性化Ｔ細胞に対する三重特異性抗体（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）の結合。約８０００分子／細胞に対してＰＤ１を定量し、約２００ ０００分子／細胞に対してＴｆＲを定量した。三重特異性抗体は、ビオチン化Ｃｙ５によって、対照抗体が活性化Ｔ細胞にほとんど結合を示さない濃度で検出された。 活性化ヒトＴ細胞におけるアビディティ増強結合および内部移行。ドナー２例から得られたビオチン化Ｃｙ５データに対する細胞表面上の抗ＩｇＧの相対蛍光（ｔ＝１時間対ｔ＝０時間）±標準偏差。０および１時間の時点でのＩｇＧの染色後を通して、内部移行は抗ＴｆＲ含有抗体では観察されたが、Ｎａｄａ／抗ＰＤ１抗体では観察されなかった。 移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のモデルにおけるＴ細胞上のＰＤ１およびＴｆＲの共発現、ならびに宿主浸潤Ｔ細胞のアビディティ増強殺傷。ヒトＰＢＭＣを移植されたマウスは、通常ＧｖＨＤを発症し、やがて死亡する。 移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のモデルにおけるＴ細胞上のＰＤ１およびＴｆＲの共発現、ならびに宿主浸潤Ｔ細胞のアビディティ増強殺傷。マウス脾臓由来の細胞をフローサイトメトリーによって分析し、単一のヒトＣＤ３細胞についてゲーティングした。ＴｆＲおよびＰＤ１の発現について、浸潤したヒトＣＤ４陽性細胞およびヒトＣＤ８陽性細胞を分析した。マウス脾臓細胞内で検出されたヒトＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を含む）の７０％超が、ＴｆＲおよびＰＤ１について二重陽性であった。 移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のモデルにおけるＴ細胞上のＰＤ１およびＴｆＲの共発現、ならびに宿主浸潤Ｔ細胞のアビディティ増強殺傷。ＰＥ２５と複合体化した抗ＰＤ１／ＴｆＲ抗体を用いた脾臓細胞の処理は、この細胞プール内のヒトＴ細胞の数を減少させる用量の１０～１０００倍の減少を示した。 実施例で使用した、ＰＤ１への二価結合を伴う二重特異性抗ＴｆＲ／抗ＰＤ１抗体の様々な２＋１フォーマット、および様々な対照コンストラクトの比較図。左から右に、それらは、（Ａ）分子８１５７、８１５６、（Ｂ）ＰＤ１－０１０３－０３１２、８１５９および８１５８に対応する。「Ｎ」は、抗Ｎａｄａ結合ドメインを示す。第１の２＋１フォーマット（抗ＰＤ１結合ドメインとヒンジ領域との間の抗ＴｆＲ結合ドメイン；「ＴＣＢフォーマット」；左側）は、ＩｇＧ構成の通常のＦａｂアームとして１つのＰＤ１結合実体と、ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体の他方の側のヒンジに先行するＴｆＲ結合ＣｒｏｓｓＦａｂの上部（すなわち、Ｎ末端）にある第２のＰＤ１結合Ｆａｂアームとを含有する。第２の２＋１フォーマット（ＦｃドメインのＣＨ３にｃ末端融合された抗ＴｆＲ結合ドメイン；「ＢＢＢフォーマット」；右側）は、ＰＤ１結合アームとしてＩｇＧの通常のＦａｂアームを含有し、ＴｆＲ結合Ｆａｂは、非対称（ノブ・イントゥー・ホール）ＣＨ３ドメインのＣ末端にＣｒｏｓｓＦａｂフォーマットとして結合している。 実施例で使用した、ＰＤ１への二価結合を伴う二重特異性抗ＴｆＲ／抗ＰＤ１抗体の様々な２＋１フォーマット、および様々な対照コンストラクトの比較図。左から右に、それらは、（Ａ）分子８１５７、８１５６、（Ｂ）ＰＤ１－０１０３－０３１２、８１５９および８１５８に対応する。「Ｎ」は、抗Ｎａｄａ結合ドメインを示す。左側には、「古典的な」二価のブロッキング抗ＰＤ１抗体（抗ＰＤ１－ＩｇＧ）が示されている。抗ＰＤ１抗体に対するＴｆＲ結合および内部移行の影響を比較するために、ＴｆＲを非抗原結合Ｆａｂ断片に置き換えた２つの対照（抗ＰＤ１結合ドメインとヒンジ領域との間の抗Ｎａｄａ結合ドメイン、およびＦｃドメインのＣＨ３にｃ末端融合された抗Ｎａｄａ結合ドメイン）を構築した。 抗ＰＤ１抗体および２つのＰＤ１ Ｎａｄａ対照抗体と比較した、二価様式でＰＤ１に結合し、一価様式でＴｆＲに結合する２つの二重特異性抗体、８１５６および８１５７（異なる２＋１フォーマット）の内部移行。二価様式でＰＤ１に結合するが、ＴｆＲバインダーを含有しない対照分子（抗ＰＤ１、８１５８、８１５９）は、かなり低い内部移行を示したが、二価様式でＰＤ１に結合し、一価様式でＴｆＲに結合する２つの２＋１二重特異性抗体フォーマット（８１５７、８１５６）は、著しく増加した内部移行率を示した。 同種異系成熟樹状細胞と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出に対する試験した抗体の効果（混合リンパ球反応）。抗ＰＤ１抗Ｔｆｒ二重特異性抗体８０１２および８０１３によって達成されるＥＣ５０値は、二価ＰＤ１－０１０３－０３１２バインダーによって達成されるＥＣ５０値と同等である。一価抗ＰＤ１コンストラクトＰＤ１－０１０３－０３１２／Ｎａｄａ（８０１４）およびペンブロリズマブ／Ｎａｄａ（８０１９）は、中程度のグランザイムＢ分泌をもたらしたに過ぎず、バインダーＮａｄａ／５１Ａ１６５（８０１５）およびＮａｄａ／１０２６（８０１６）による一価ＴｆＲ結合は、グランザイムＢ分泌を全く誘導しなかった。 同種異系成熟樹状細胞と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出に対する試験した抗体の効果（混合リンパ球反応）。抗ＰＤ１抗Ｔｆｒ二重特異性抗体８０１２および８０１３によって達成されるＥＣ５０値は、二価ＰＤ１－０１０３－０３１２バインダーによって達成されるＥＣ５０値と同等である。一価抗ＰＤ１コンストラクトＰＤ１－０１０３－０３１２／Ｎａｄａ（８０１４）およびペンブロリズマブ／Ｎａｄａ（８０１９）は、中程度のグランザイムＢ分泌をもたらしたに過ぎず、バインダーＮａｄａ／５１Ａ１６５（８０１５）およびＮａｄａ／１０２６（８０１６）による一価ＴｆＲ結合は、グランザイムＢ分泌を全く誘導しなかった。 同種異系成熟樹状細胞と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出に対する試験した抗体の効果（混合リンパ球反応）。ＴＣＢおよびＢＢＢフォーマット（８１５６および８１５７）は、二価の親抗ＰＤ１抗体よりも低いＥＣ５０値を示したほか、それぞれの対照（８１５８および８１５９）と比較して、グランザイムＢ分泌の増加、したがって、これらのフォーマットによって誘導されるＴ細胞エフェクター機能の増加をもたらした。 同種異系成熟樹状細胞と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出に対する試験した抗体の効果（混合リンパ球反応）。一価抗ＰＤ１抗Ｔｆｒ二重特異性抗体８０１２および８０１３によって達成されたＥＣ５０値は、二価ＰＤ１－０１０３－０３１２バインダーによって達成されたＥＣ５０値と同等であった。一方、一価抗ＰＤ１コンストラクトＰＤ１－０１０３－０３１２／Ｎａｄａ（８０１４）は、中程度のグランザイムＢ分泌をもたらしたに過ぎなかった。 同種異系成熟樹状細胞と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出に対する試験した抗体の効果（混合リンパ球反応）。一価抗ＰＤ１抗Ｔｆｒ二重特異性抗体８０１７および８０１８によって達成されたＥＣ５０値は、ペンブロリズマブによって達成されたＥＣ５０値と同等であった。一方、一価抗ＰＤ１コンストラクトペンブロリズマブ／Ｎａｄａ（８０１９）は、中程度のグランザイムＢ分泌をもたらしたに過ぎなかった。 同種異系成熟樹状細胞と共培養したヒトＣＤ４ Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出に対する試験した抗体の効果（混合リンパ球反応）。二価抗ＰＤ１抗Ｔｆｒ二重特異性抗体８１５７（ＴＣＢフォーマット）および８１５６（ＢＢＢフォーマット）によって達成されたＥＣ５０値は、ペンブロリズマブまたは二価ＰＤ１－０１０３－０３１２バインダーを用いて達成されたＥＣ５０値よりも低かった。一方、二価抗ＰＤ１コンストラクトＰＤ１－０１０３－０３１２／Ｎａｄａ ＴＣＢフォーマット（８１５９）およびＢＢＢフォーマット（８１５８）は、中程度のグランザイムＢ分泌をもたらしたに過ぎなかった。 マウスＴｆＲをその細胞表面に発現するＢＡ／Ｆ３細胞株（ＲＮＣＢアクセッションＩＤ：ＣＬ００３２０１）を使用して、抗ＰＤ１抗ＴｆＲマウス化分子の内部移行を試験した。ＴｆＲ結合ドメイン６７６８（ｍＴｆＲ－００１／ｈｕＰＤ１－４７８ ＴＣＢフォーマット）および６７９４（ｍＴｆＲ－００１／Ｎａｄａ ＴＣＢフォーマット）を含有する両分子は、３時間後に約７０％の良好な内部移行率を示したが、ｈｕＰＤ１／Ｎａｄａ（Ｐ１ＡＧ６７６９）は内部移行を示さない。 抗ＰＤ１抗ＴｆＲマウス化分子のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介シグナル伝達のブロックを共培養アッセイで試験した。抗ＰＤ１抗体ＰＤ１－０１０３－０３１２のような分子６７６８（ｍＴｆＲ－００１／ｈｕＰＤ１－４７８、ＴＣＢフォーマット）および６７６９（Ｎａｄａ／ｈｕＰＤ１－４７８、ＴＣＢフォーマット）は、二価抗ＰＤ１結合ドメインを含有する。これらの分子はいずれも、ＰＤ１－ＰＤＬ１シグナル伝達経路のブロックに関して同等の機能性を示した。抗ＰＤ１抗原結合ドメインを含有しない対照分子６７９４（ｍＴｆＲ－００１／Ｎａｄａ、ＴＣＢフォーマット）は、いかなるブロッキング機能性も示さなかった。
一態様では、本発明は、本発明の選択された抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体が、ＴｆＲおよびＰＤ１に結合し、それらの表面上にＴｆＲおよびＰＤ１を発現および提示する細胞内に内部移行する能力を有するという発見に部分的に基づく。
さらなる態様では、本発明は、抗ＴｆＲ抗ＰＤ１ ２＋１フォーマット抗体、すなわち、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が、単一特異性二価ＰＤ１抗体よりも改善された生物活性を示し、ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の良好な阻害をもたらすという発見に部分的に基づく。一態様では、これらの分子は、互いに共有結合的に結合されたＩｇＧクラスＦａｂ断片と任意にＩｇＧクラスＦｃ領域とを含み、本明細書に記載の異なる立体配座の２＋１フォーマット抗体をもたらす。
ＰＤ１およびＴｆＲを発現する細胞を本発明の抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体と接触させると、これらの細胞、特にＴ細胞の表面からＰＤ１が枯渇し、ひいては、これらの細胞の表面上のＰＤ１受容体へのＰＤ－Ｌ１の結合が妨げられることが見出された。抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介Ｔ細胞受容体シグナル伝達を阻害し、例えば、免疫調節サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマおよびグランザイムＢの放出／分泌）を増加させる。細胞表面からのＰＤ－１の枯渇によって達成される阻害は、抗ＰＤ１ブロッキング抗体の一過性の結合によって達成され得る阻害よりも効果的および／または恒久的である。本発明の抗体を使用することによって増加され得る他の免疫調節サイトカインは、例えば、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌およびＩＬ－１２である。本明細書で使用される場合、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、ＩＬ－１２などの用語は、ヒトサイトカインを指す。
Ｉ．定義
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されるヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはアミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性」は、分子の単一の結合ドメイン（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強さを指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。結合親和性を測定するための具体的な実例となる例示的な方法を以下に記載する。
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）に１つ以上の改変を有し、そのような改変によって抗原に対する抗体の親和性が改善される抗体を指す。
用語「抗ＴｆＲ抗体」および「ＴｆＲに特異的に結合する抗体または抗原結合ドメイン」は、抗体または抗原結合ドメインがＴｆＲを標的とする際の診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＴｆＲに結合することができる抗体または抗原結合ドメインを指す。一態様では、無関係な非ＴｆＲタンパク質に対する、ＴｆＲに特異的に結合する抗ＴｆＲ抗体または抗体または抗原結合ドメインの結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された場合、ＴｆＲへの抗ＴｆＲ抗体または抗原結合ドメインの結合の約１０％未満である。ある特定の態様では、ＴｆＲに結合する抗原結合ドメインを含む抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。抗体または抗原結合ドメインは、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、ＴｆＲに「特異的に結合する」と言われる。ある特定の態様では、抗ＴｆＲ抗体は、異なる種由来のＴｆＲ間で保存されている、ＴｆＲのエピトープに結合する。
用語「抗ＰＤ１抗体」および「ＰＤ１に特異的に結合する抗体または抗原結合ドメイン」は、抗体または抗原結合ドメインがＰＤ１を標的とする際の診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＰＤ１に結合することができる抗体または抗原結合ドメインを指す。一態様では、無関係な非ＰＤ１タンパク質に対する、ＰＤ１に特異的に結合する抗体または抗原結合ドメインの結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された場合、ＰＤ１への抗体または抗原結合ドメインの結合の約１０％未満である。ある特定の態様では、ＰＤ１に結合する抗体または抗原結合ドメインは、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。抗体または抗原結合ドメインは、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、ＰＤ１に「特異的に結合する」と言われる。ある特定の態様では、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体または抗体または抗原結合ドメインは、異なる種由来のＰＤ１間で保存されている、ＰＤ１のエピトープに結合する。本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、限定するものではないが、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む様々な抗体構造を包含する。以下を含む様々な特許出願は、抗ＰＤ１抗体の産生、ならびに／またはＰＤ－Ｌ１結合および／もしくはＰＤ１シグナル伝達に干渉する薬剤（抗ＰＤ１抗体を含む）を用いて免疫応答を増強する方法を開示している：米国特許第２００３／００３９６５３号、米国特許第２００４／０２１３７９５号、米国特許第２００６／０１１０３８３号、米国特許第２００７／００６５４２７号、米国特許第２００７／０１２２３７８号、米国特許第２０１２／２３７５２２号、国際公開第２００４／０７２２８６号、国際公開第２００６／１２１１６８号、国際公開第２００６／１３３３９６号、国際公開第２００７／００５８７４号、国際公開第２００８／０８３１７４号、国際公開第２００８／１５６７１２号、国際公開第２００９／０２４５３１号、国際公開第２００９／０１４７０８号、国際公開第２００９／１１４３３５号、国際公開第２０１０／０２７８２８号、国際公開第２０１０／０２７４２３号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０２９４３５号、国際公開第２０１０／０２９４３４号、国際公開第２０１０／０６３０１１号、国際公開第２０１０／０８９４１１号、国際公開第２０１１／０６６３４２号、国際公開第２０１１／１１０６０４号、国際公開第２０１１／１１０６２１号および国際公開第２０１２／１４５４９３号。
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、これらが結合する抗原の生物活性を阻害するかまたは低下させる抗体である。いくつかの実施形態では、ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。例えば、本発明の二重特異性抗体は、抗原刺激に対する機能不全状態から、Ｔ細胞による機能応答（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞死）を回復するように、ＰＤ１およびＰＤ－Ｌ１によるシグナル伝達をブロックする。
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体は、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合ドメインを有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗体が、例えば、異なる抗原に、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合している抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）との対によってそれぞれ形成された２つの結合ドメインを介して、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。本明細書では、このような二重特異性抗体は、１＋１フォーマットまたは１＋１フォーマット抗体とも呼ばれる。他の二重特異性抗体フォーマットは、本明細書では、２＋１フォーマットもしくは２＋１フォーマット抗体（第１の抗原またはエピトープに対する２つの結合ドメインと第２の抗原またはエピトープに対する１つの結合ドメインとを含む）または２＋２フォーマットもしくは２＋２フォーマット抗体（第１の抗原またはエピトープに対する２つの結合ドメインと第２の抗原またはエピトープに対する２つの結合ドメインとを含む）と呼ばれる。
用語「ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体」、「ＴｆＲおよびＰＤ１に特異的に結合する二重特異性抗体」、「ＴｆＲおよびＰＤ１に特異的な二重特異性抗原結合分子」および「抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体」は、本明細書では区別なく使用され、抗体がＴｆＲおよびＰＤ１を標的とする際の診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＴｆＲおよびＰＤ１に結合することができる二重特異性抗体を指す。
本出願で使用される用語「価数」は、抗原結合分子内の特定数の結合ドメインの存在を示す。したがって、用語「二価」、「四価」および「六価」は、抗原結合分子内のそれぞれ２つの結合ドメイン、４つの結合ドメインおよび６つの結合ドメインの存在を示す。本発明による二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」または「多価」（例えば、「四価」または「六価」）であってよい。特定の態様では、本発明の抗体は、２つ以上の結合ドメインを有し、二重特異性である。すなわち、２つよりも多い結合ドメインが存在する場合であっても（すなわち、抗体は三価または多価である）、抗体は二重特異性であってよい。特に、本発明は、特異的に結合する各抗原に対して１つまたは２つの結合ドメインを有する二重特異性二価抗体および三価抗体に関する。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書では区別なく使用される。「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００Ｄａ（ダルトン）のヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖とから構成される。本明細書に開示される抗体、抗体断片および抗体様分子を形成する個々のポリペプチド鎖は、本明細書では、「サブユニット」、例えば、Ｆａｂ断片のサブユニット、またはＦｃドメインのサブユニットと呼ばれることもある。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプのうちの１つに割り当てられてもよく、そのうちのいくつかは、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプにさらに分類されてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられてもよい。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定するものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。特定の抗体断片の概説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および米国特許第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合ドメインを有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照）。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインとともに構築することが可能な）またはＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合ドメインにＶＨドメインとともに構築することが可能な）単鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合特性を提供する。抗体断片は、限定するものではないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化、および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生を含め、様々な技術によって作製され得る。
インタクトな抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が生じ、これは、それぞれ重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインと、さらに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメインおよび定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指し、ＶＨ内に３つのＣＤＲ、およびＶＬ内に３つのＣＤＲを含む。用語「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ断片」、「Ｆａｂ分子」および「Ｆａｂドメイン」は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインと軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する抗体断片を指すために本明細書では区別なく使用される。
Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのいくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持するＦａｂ’断片である。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
用語「ＣｒｏｓｓＦａｂ」または「Ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。これらのＦａｂ断片バリアントに関して、および以下の段落で説明されるＦａｂ断片に関して、用語「断片」、「分子」および「ドメイン」も本明細書では区別なく使用される。クロスオーバーＦａｂ断片の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方で、Ｆａｂ重鎖およびＦａｂ軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ断片は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖およびＦａｂ軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ断片は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。本明細書にさらに記載されるように、異なるＦａｂ分子の重鎖および軽鎖の誤対合をさらに減少させ、ひいては、望ましい（二重特異性）抗体の純度および収率を増加させるために、反対の電荷を有する荷電アミノ酸が、第１の抗原（ＴｆＲ）に結合するＦａｂ分子または第２の抗原（ＰＤ１）に結合するＦａｂ分子のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメイン内の特定のアミノ酸位置に導入されてもよい。電荷修飾は、（二重特異性）抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（例えば、図１Ａ～Ｅ、図２Ａ～Ｄ、図３Ａ～Ｄ、図４Ａ～Ｄに示されているような）、または（二重特異性）抗体に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１Ｆ～Ｊ図２Ｅ～Ｈ、図３Ｅ～Ｈ、図４Ｅ～Ｈに示されているような）のいずれかに対して行われる（両方に対してではない）。
「単鎖Ｆａｂ断片」または「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメインおよび上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、またはｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し、上記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。上記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。加えて、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、カバット番号付けによれば、可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるであろう。
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」または「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメインおよび上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、およびｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し、ＶＨとＶＬとは、ある抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを一緒に形成し、上記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、カバット番号付けによれば、可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるであろう。
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリンまたはスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端と、ＶＬのＣ末端とが接続されていてもよく、または逆に接続されていてもよい。このタンパク質は、定常領域の除去、およびリンカーの誘導にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインとともに構築することが可能な）またはＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合ドメインにＶＨドメインとともに構築することが可能な）単鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合特性を提供する。
「足場抗原結合タンパク質」は当技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチンおよび設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されており、例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５（２００９）およびＳｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖または重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体ベータ－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマ－クリスタリンまたはユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマーおよびフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類され得る。ある特定の態様では、抗体はＩｇＧクラスのものである。ＩｇＧクラス抗体およびＩｇＧ様抗体分子は、一般に、大量に製造および精製することが容易であり、従来のＩｇＧ１の薬理的特性と同様の薬理的特性を有することが多い。ある特定の態様では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。ある特定の態様では、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるためのＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の態様では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプのものである。ある特定の態様では、抗体は、ＩｇＧ４抗体の安定性を改善するためにヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプのものである。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられてもよい。
本出願で使用される用語「ヒト起源由来の定常領域」または「ヒト定常領域」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域、および／または定常軽鎖カッパ領域もしくはラムダ領域を示す。そのような定常領域は当技術分野で公知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されている（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４－２１８；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１９７５）２７８５－２７８８も参照）。本明細書で別途指定されない限り、定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載されるように、ＥＵ番号付けシステム（カバットのＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
本明細書で使用される用語「枯渇」は、細胞を本発明の抗体と接触させた場合に、受容体分子を発現する細胞の表面に提示される受容体分子の数の顕著な減少を指す。枯渇は、本発明の抗体と接触しなかった対照細胞の表面上に存在する受容体分子の数と対比した細胞表面上の受容体分子の比として表される。受容体分子が細胞表面から枯渇した細胞は、未処理対照細胞と比較して、細胞の表面に提示される受容体分子の数が、好ましくは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超えて減少し、さらに好ましくは９５％、９８％または９９％パーセントを超えて減少する。これらの範囲は、本明細書に記載され当業者に公知の最新の方法によって決定され得る。
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「有効量」は、所望の治療結果または予防的結果を達成するために必要な投与量で、かつ期間にわたって有効な量を指す。
本明細書の用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有するＩｇＧクラス免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異Ｆｃ領域を含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで及ぶ。ただし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上の、特に１つまたは２つのアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって宿主細胞によって産生される抗体は、完全長重鎖を含み得るか、または完全長重鎖の切断されたバリアントを含み得る。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）およびリジン（Ｋ４４７、ＥＵ番号付けシステム）である場合に当てはまり得る。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）またはＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）およびリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても存在しなくてもよい。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、別途指示がない限り、本明細書ではＣ末端のグリシン－リジンジペプチドを伴わず示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で指定されたＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６およびＫ４４７、ＥＵ番号付けシステム）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で指定されたＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書で別途指定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４から一般になる。したがって、ＣＤＲ配列およびＦＲ配列は、ＶＨ（またはＶＬ）では、以下の配列で一般に現れる：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（ＣＤＲ－Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（ＣＤＲ－Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（ＣＤＲ－Ｌ３）－ＦＲ４。
カバット番号付けシステムによれば、本明細書で使用される場合、フレームワークおよびＣＤＲ領域は、可変ドメインの以下の領域に位置する：
Figure 2024528217000001
＊ＣＤＲ－Ｈ１には、本明細書では「３５ｃ」位、「３５ｄ」位および「３５ｅ」位と呼ばれる、３５ｂ位と３６位との間に追加のアミノ酸が存在し得る。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、または本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために、本明細書では区別なく使用される。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、区別なく使用され、外因性核酸が導入された細胞の子孫を含め、そのような細胞を指す。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫とが含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬフレームワーク配列またはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ配列またまたはヒト免疫グロブリンＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。一態様では、ＶＬについて、サブグループは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にあるようなサブグループカッパＩである。一態様では、ＶＨについて、サブグループは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にあるようなサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ＣＤＲの全部または実質的に全部が非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全部または実質的に全部がヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で使用される用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、抗原結合特異性を決定する抗体可変ドメインの各領域、例えば、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）を指す。
一般に、抗体は、６つのＣＤＲ、すなわち、ＶＨに３つ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、およびＶＬに３つ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。本明細書における例示的なＣＤＲには、以下が含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；ならびに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）および９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。
Figure 2024528217000002
別途指示がない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って決定される。当業者であれば、ＣＤＲの表記はまた、上記のＣｈｏｔｈｉａ、上記のＭｃＣａｌｌｕｍ、または任意の他の科学的に認められた命名システムに従って決定され得ることを理解するであろう。
用語「細胞表面受容体」、「膜受容体」および「膜貫通型受容体」は、本明細書では区別なく使用される。細胞表面受容体は、細胞と細胞外空間との間の伝達を可能にする特殊な内在性膜タンパク質である。それらは、細胞の原形質膜に埋め込まれ、サイトカイン、増殖因子、細胞接着分子、ホルモン、神経伝達物質、栄養素などの細胞外分子に結合することによって、および内部シグナル伝達経路への一連の分子スイッチを介して細胞内で応答を誘発することによって、細胞シグナル伝達およびシグナルトランスダクションにおいて作用する。ＰＤ１およびＴｆＲは、そのような細胞表面受容体の例である。
「イムノコンジュゲート」は、限定するものではないが、細胞傷害性剤を含む１つ以上の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、限定するものではないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。ある特定の態様では、個体または対象はヒトである。
本明細書で使用される用語「内部移行」または「受容体内部移行」は、エンドサイトーシスとも呼ばれる生物学的プロセス、すなわち、細胞が分子（タンパク質など）を貪食することによってそれらを吸収し、細胞の外側から内側への分子の輸送をもたらすプロセスを指す。内部移行された分子は、細胞内区画、例えば、液胞、エンドソーム、リソソーム、小胞体、ゴルジ体内、またはサイトゾル内に配置され得る。「内部移行された」または「内部移行している」抗体は、例えば、トランスフェリン受容体などの内部移行細胞表面受容体に結合することによって、標的細胞の外側から内側に輸送され得る抗体を指す。
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）法によって決定された場合、９５％または９９％よりも高い純度まで精製される。抗体の純度を評価する方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
用語「リンカーペプチド」、「ペプチドリンカー」または「ペプチド性リンカー」は、区別なく使用され、好ましくは１０～約２５アミノ酸の短～中長ポリペプチドを指す。リンカーペプチドは、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリンまたはスレオニンが豊富である。「リンカーペプチド」、「ペプチドリンカー」または「ペプチド性リンカー」は、２つのポリペプチド配列を接続または連結する、例えば、２つのポリペプチドドメインを連結する合成アミノ酸配列を指す。本明細書で使用される場合、用語「合成」は、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。本発明のリンカーペプチドは、ペプチド結合を介して２つのアミノ酸配列を接続する。典型的には、リンカーペプチドは、生物学的に活性な部分を線状配列の第２の部分に接続する。ポリペプチドに関連して、「線状配列」または「配列」は、配列内で互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造内で近接する、アミノ末端からカルボキシル末端方向のポリペプチド内のアミノ酸の順序である。本明細書で使用される場合、用語「連結された」、「接続された」、「共有結合的に結合された」、「融合された」または「融合」は、区別なく使用される。一態様では、リンカーは、主にまたは完全にＧｌｙおよびＳｅｒからなる。さらなる態様では、リンカーは、配列番号１０８または配列番号１０９の配列を有する。
用語「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、具体的には、プリン塩基またはピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボースまたはリボース）、およびホスフェート基から構成される。多くの場合、核酸分子は、塩基の配列によって記載され、それにより、上記塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’に向かって表される。本明細書では、核酸分子という用語は、例えば、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびゲノムＤＮＡを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成型、ならびにこれらの分子のうちの２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線状でも環状でもよい。加えて、核酸分子という用語は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに一本鎖形態および二本鎖形態を含む。さらに、本明細書に記載の核酸分子は、天然ヌクレオチド、または天然に存在しないヌクレオチドを含有することができる。天然に存在しないヌクレオチドの例には、誘導体化された糖類もしくはホスフェート骨格連結を有する修飾ヌクレオチド塩基、または化学的に修飾された残基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主または患者では、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして好適なＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）ベクターまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、非修飾であり得るか、または修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性、および／またはコードされた分子の発現を増強するように化学的に修飾され得る（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １２ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６または欧州特許第２ １０１ ８２３号を参照）。
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子である。単離された核酸には、核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外に、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗ＴｆＲ抗体または抗ＰＤ１抗体をコードする単離された核酸」は、抗ＴｆＲ抗体または抗ＰＤ１抗体の重鎖および軽鎖（またはそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター内のそのような核酸分子を含み、そのような核酸分子は、宿主細胞内の１つ以上の位置に存在する。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、例えば、天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のあるバリアント抗体（例えば、そのようなバリアントは一般に微量で存在する）を除いて、集団を構成する個々の抗体は同一であり、および／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、限定するものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な手法によって作製され得、このような方法、およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的組成物中に存在してもよい。
「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、３つの定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）、続いて、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。
用語「添付文書」は、治療用製品の市販パッケージに通例含まれる説明書であって、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌および／または警告に関する情報を含有する説明書を指すために使用される。
本明細書で使用される場合、用語「ペイロード」は、標的（例えば、標的細胞）に作用し、エキソソームおよび／またはプロデューサー細胞に導入され得る任意の天然に存在するまたは人工的に合成された薬学的に活性な分子であり得る治療剤を指す。それには、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス粒子ならびに小分子などの治療剤が含まれる。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要であればギャップを導入した後の、アライメントのためにいかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない場合の、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアまたはＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたる最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性パーセントの値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成され得る。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
別途指示がない限り、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性パーセントの値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラム、またはその後のＢＬＯＳＵＭ５０比較行列を用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ” Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；およびＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって作成され、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌまたはｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公的に入手可能である。あるいは、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラムおよびデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバを使用して配列を比較して、ローカルではなくグローバルなアライメントを確実に行うことができる。アミノ酸同一性パーセントは、出力アライメントヘッダに与えられる。
用語「薬学的組成物」または「薬学的製剤」は、それに含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、薬学的組成物を投与され得る対象に対して許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって非毒性である、薬学的組成物または製剤中の活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定するものではないが、バッファー、添加物、安定剤または防腐剤が含まれる。
本明細書で使用される用語「ＴｆＲ」または「トランスフェリン受容体」は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然のＴｆＲまたはトランスフェリン受容体を指す。該用語は、「完全長」の未処理ＴｆＲ、および細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＴｆＲを包含する。該用語はまた、ＴｆＲの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＴｆＲのアミノ酸配列を表１０の配列番号６６に示す。
本明細書で使用される用語「ＰＤ１」または「プログラム細胞死タンパク質１」は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然のＰＤ１またはプログラム細胞死タンパク質１を指す。該用語は、「完全長」の未処理ＰＤ１、および細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＰＤ１を包含する。該用語はまた、ＰＤ１の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＰＤ１のアミノ酸配列を表１０の配列番号６５に示す。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（および「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法上の変化形）は、治療される個体の疾患の自然な経過を変化させる試みに対する臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理学の過程で行われ得る。治療の望ましい効果には、限定するものではないが、疾患の発生または再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行速度を遅らせること、病状の改善または緩和、および寛解、または予後の改善が含まれる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、または疾患の進行を遅らせるために使用される。
用語「がん」および「がん性」は、調節されていない細胞成長を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理的状態を指すか、または説明する。がんの態様には、固形腫瘍がんおよび非固形腫瘍がんが含まれる。がんの例には、限定するものではないが、癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ系腫瘍が挙げられる。このようながんのさらに具体的な例には、限定するものではないが、膀胱がん（例えば、尿路上皮癌（ＵＣ）、例えば、転移性ＵＣ（ｍＵＣ）；筋層浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）および筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ））；腎臓がんまたは腎がん（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、肺がん、例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌；尿路のがん、乳がん（例えば、ＨＥＲ２＋乳がんおよびトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、（これはエストロゲン受容体（ＥＲ－）、プロゲステロン受容体（ＰＲ－）およびＨＥＲ２（ＨＥＲ２－）陰性である）；前立腺がん、例えば、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）；腹膜のがん；肝細胞がん；胃がん、または胃のがん、例えば、胃腸がんおよび消化管間質がん；膵臓がん（例えば、膵管腺癌（ＰＤＡＣ））；膠芽細胞腫；子宮頸がん；卵巣がん；肝臓がん（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ））；肝がん；結腸がん；直腸がん；結腸直腸がん；子宮内膜癌または子宮癌；唾液腺癌；前立腺がん；外陰部がん；甲状腺がん；肝臓癌；肛門癌；陰茎癌；黒色腫、例えば、表在拡大型黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端部黒子黒色腫および結節性黒色腫；多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂性細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病（ＣＭＬ）；移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）；および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ならびにファコマトーシスと関連する異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、メイグス症候群、脳がん、頭頸部がん、および関連する転移が挙げられる。
本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、あらゆる腫瘍性細胞の成長および増殖、ならびにあらゆる前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」および「腫瘍」は、本明細書で言及される場合、相互排他的ではない。
用語「細胞増殖性疾患」および「増殖性疾患」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性疾患はがんである。別の実施形態では、細胞増殖性疾患は腫瘍である。
用語「Ｂ細胞増殖性疾患」または「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、ある程度の異常なＢ細胞増殖に関連し、例えば、リンパ腫、白血病、骨髄腫および骨髄異形成症候群を含む障害を指す。一実施形態では、Ｂ細胞増殖性疾患は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などのリンパ腫であり、例えば、ＤＬＢＣＬ（例えば、再発性または難治性のＤＬＢＣＬ）、ＦＬ（例えば、再発性または難治性のＦＬまたは形質転換ＦＬ）またはＭＣＬを含む。別の実施形態では、Ｂ細胞増殖性疾患は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの白血病である。さらに別の実施形態では、Ｂ細胞増殖性疾患は中枢神経系リンパ腫（ＣＮＳＬ）である。
膀胱がん
用語「膀胱がん」は、限定するものではないが、例えば、局所進行性または転移性であり得る尿路上皮癌（ＵＣ）を含む。本明細書に記載される方法は、局所進行性および／または転移性であるがんを含め、様々なステージのがんの治療に適している。がんの病期分類では、局所進行性は、局所領域から付近の組織および／またはリンパ節に広がったがんとして一般に定義される。ローマ数字の病期分類システムでは、局所進行性は、通常、ステージＩＩまたはＩＩＩに分類される。転移性であるがんは、がんが全身の離れた組織および器官に広がるステージ（ステージＩＶ）である。
用語「上部尿路ＵＣ」は、腎盂または尿管のＵＣを指す。上部尿路ＵＣは上部尿路転移性ＵＣであり得る。ＵＣの症例の少数（例えば、約５～１０％）が上部尿路ＵＣである。
用語「下部尿路ＵＣ」は、膀胱または尿道のＵＣを指す。下部尿路ＵＣは下部尿路転移性ＵＣであり得る。ＵＣの症例の大部分（例えば、約９０～９５％）が下部尿路ＵＣである。
本明細書で使用される場合、用語「手術不能」および「切除不能」は、外科的切除が不可能であるかまたは安全に行うことができないがん（例えば、膀胱がん（例えば、局所進行性ＵＣまたは転移性ＵＣを含むＵＣ））を指すために区別なく使用される。いくつかの実施形態では、膀胱がん（例えば、局所進行性ＵＣまたは転移性ＵＣを含むＵＣ）は、骨盤側壁もしくは隣接する内臓の浸潤（臨床病期Ｔ４ｂ）または巨大な結節性転移（Ｎ２～Ｎ３）のために手術不能である。
用語「白金系化学療法による治療に適格である」は、対象が、主治医の判断で、または当技術分野で公知の白金系化学療法の適格性に関する標準化された基準に従って、白金系化学療法による治療に適格であることを意味する。例えば、Ｇａｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．１２（３）：２１１－４，２０１１に記載の基準が、対象がシスプラチンに基づく化学療法に適格であるかどうかを決定するために使用され得る。Ｇａｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．は、以下のうちの少なくとも１つを満たす患者はシスプラチンに基づく化学療法に適さないと考えられる、転移性ＵＣ（ｍＵＣ）を有する患者のコンセンサス定義を記載している：（ｉ）世界保健協会（ＷＨＯ）もしくは米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）のパフォーマンスステータス２、またはカルノフスキー・パフォーマンス・ステータス６０～７０％；（ｉｉ）クレアチニンクリアランス（計算値または測定値）が１ｍＬ／ｓ未満；（ｉｉｉ）国立がん研究所（ＮＣＩ）有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０グレード≧２聴力損失；（ｉｖ）ＣＴＣＡＥ ｖ．４．０グレード≧２末梢神経障害；および／またはニューヨーク心臓病学会（ＮＹＨＡ）クラスＩＩＩ心不全。一例では、以下のうちの１つ以上を有する場合、患者はシスプラチンに基づく化学療法に適さないと考えられる：腎機能障害（例えば、糸球体濾過量（ＧＦＲ）＞３０であるが＜６０ｍＬ／分）；ＧＦＲは、直接測定（すなわち、クレアチニンクリアランスもしくはエチルジアミンテトラアセテート）によって、もしくは利用可能でない場合、血清／血漿クレアチニンからの計算（Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ－Ｇａｕｌｔ式）によって評価され得る；聴力損失（例えば、国立がん研究所（ＮＣＩ）有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０グレード≧２、２つの連続周波数で２５デシベルの聴力損失）；末梢神経障害（例えば、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ ｖ４．０グレード≧２末梢神経障害（すなわち、刺痛を含む感覚変化または知覚異常））；および／またはＥＣＯＧパフォーマンスステータス評価（Ｏｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．５：６４９－６５５，１９８２を参照）（例えば、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２）。いくつかの実施形態では、以下のうちの１つを有する対象がカルボプラチンに基づく化学療法に適格であり得る：腎機能障害（例えば、糸球体濾過量（ＧＦＲ）＞３０であるが＜６０ｍＬ／分）；ＧＦＲは、直接測定（すなわち、クレアチニンクリアランスもしくはエチルジアミンテトラアセテート）によって、もしくは利用可能でない場合、血清／血漿クレアチニンからの計算（Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ－Ｇａｕｌｔ式）によって評価され得る；聴力損失（例えば、２つの連続周波数で２５デシベルのＣＴＣＡＥ ｖ４．０グレード≧２聴力損失）；末梢神経障害（例えば、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ ｖ４．０グレード≧２末梢神経障害（すなわち、刺痛を含む感覚変化または知覚異常））；および／またはＥＣＯＧパフォーマンスステータス評価（例えば、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２）。
化学療法剤には、分子の不可欠な部分として白金を含有する有機化合物を含む「白金系」化学療法剤も含まれる。典型的には、白金系化学療法剤は、白金の配位錯体である。白金系化学療法剤は、当技術分野では「プラチン」と呼ばれることもある。白金系化学療法剤の例には、限定するものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、トリプラチンテトラニトレート、フェナントリプラチン、ピコプラチン、リポプラチンおよびサトラプラチンが挙げられる。白金系化学療法剤（例えば、シスプラチンまたはカルボプラチン）は、１つ以上の追加の化学療法剤、例えば、ヌクレオシドアナログ（例えば、ゲムシタビン）と組み合わせて投与され得る。
本明細書で使用される「白金系化学療法」は、白金系化学療法剤を含む化学療法レジメンを指す。例えば、白金系化学療法は、例えば、ヌクレオシドアナログ（例えば、ゲムシタビン）などの１つ以上の追加の化学療法剤と組み合わせて、白金系化学療法剤（例えば、シスプラチンまたはカルボプラチン）を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシドアナログ」は、核酸アナログと糖とを含むヌクレオシドを指す。ヌクレオシドアナログは、代謝拮抗剤として機能し得る。例示的なヌクレオシドアナログには、限定するものではないが、ゲムシタビン、シタラビン、フルダラビンおよびクラドリビンが含まれる。
乳がん
用語「乳がん」は、限定するものではないが、ＨＥＲ２＋乳がん、ならびにがん細胞がエストロゲン受容体（ＥＲ－）、プロゲステロン受容体（ＰＲ－）、およびＨＥＲ２（ＨＥＲ２－）に関して陰性である乳がんの形態であり、かつ局所進行性、切除不能、および／または転移性（例えば、転移性トリプルネガティブ乳がん（ｍＴＮＢＣ））であり得るトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）を含む。
本明細書で使用される場合、用語「早期ＴＮＢＣ」および「ｅＴＮＢＣ」は、ステージＩ～ステージＩＩＩのＴＮＢＣを含む早期ＴＮＢＣを指す。早期ＴＮＢＣは、あらゆる新規早期乳がん診断の１０％～２０％を占め、ネオアジュバントであるアントラサイクリンおよびタキサン療法による治療後の３年無事象生存率は７４％～７６％である。
本明細書で使用される場合、「病理学的完全寛解」または「ｐＣＲ」は、乳房およびリンパ節の両方から浸潤性腫瘍が消失したことを指す。ｐＣＲという用語は、非浸潤性乳管がんと関係なく乳房および腋窩リンパ節に浸潤がんがないこと（すなわち、ｙｐＴ０／ｉｓ ｙｐＮ０）；乳房および腋窩リンパ節に浸潤がんおよび上皮内がんがないこと（すなわち、ｙｐＴ０ ｙｐＮ０）；ならびに非浸潤性乳管がんまたはリンパ節転移と関係なく乳房に浸潤がんがないこと（すなわち、ｙｐＴ０／ｉｓ）を含む。特定の態様では、ｐＣＲは、非浸潤性乳管がん（すなわち、ｙｐＴ０／ｉｓ ｙｐＮ０）に関係なく、乳房および腋窩リンパ節に浸潤がんがないことを指す。
本明細書で使用される「タキサン」は、チューブリンに結合し、微小管集合および安定化を促進し、ならびに／または微小管解重合を防止し得る薬剤（例えば、ジテルペン）である。例示的なタキサンには、限定するものではないが、パクリタキセル（すなわち、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＣＡＳ＃３３０６９－６２－４）、ドセタキセル（すなわち、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ＣＡＳ＃１１４９７７－２８－５）、ラロタキセル、カバジタキセル、ミラタキセル、テセタキセル、および／またはオラタキセルが挙げられる。本明細書に含まれるタキサンには、タキソイド１０デアセチルバッカチンＩＩＩおよび／またはその誘導体も含まれる。いくつかの実施形態では、タキサンは、アルブミンコーティングされたナノ粒子（例えば、ナノ－アルブミン結合（ｎａｂ）－パクリタキセル、すなわち、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）および／またはｎａｂ－ドセタキセル、ＡＢＩ－００８）である。いくつかの実施形態では、タキサンは、ｎａｂ－パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、タキサンは、ＣＲＥＭＡＰＨＯＲ（登録商標）（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標））および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、例えば、ポリソルベート８０（例えば、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））に配合される。いくつかの実施形態では、タキサンは、リポソームに封入されたタキサンである。いくつかの実施形態では、タキサンは、タキサンのプロドラッグ形態および／またはコンジュゲート形態（例えば、パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメクス、および／または炭酸リノレイル－パクリタキセルに共有結合的にコンジュゲートされたＤＨＡ）である。いくつかの実施形態では、パクリタキセルは、実質的に界面活性剤を用いず（例えば、例えば、ＴＯＣＯＳＯＬ（登録商標）パクリタキセルのように、ＣＲＥＭＡＰＨＯＲ（登録商標）および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）の非存在下で）で製剤化される。
本明細書で使用される「アントラサイクリン」は、細胞傷害活性を示す抗生物質化合物のクラスを指す。アントラサイクリンは、ＤＮＡインターカレーション、トポイソメラーゼＩＩ媒介毒性、活性酸素種の生成、および／またはＤＮＡ付加物形成を介して細胞傷害性を引き起こし得る。例示的なアントラサイクリンには、限定するものではないが、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシンが含まれる。いくつかの態様では、アントラサイクリンは、ドキソルビシンまたはエピルビシンである。いくつかの具体的な態様では、アントラサイクリンはドキソルビシンである。他の具体的な態様では、アントラサイクリンはエピルビシンである。
本明細書で使用される「アルキル化剤」は、アルキル基をヌクレオチド、例えば、ＤＮＡに結合させる化学療法剤のクラスを指す。典型的には、アルキル基は、ＤＮＡのグアニン塩基に結合している。例示的なアルキル化剤には、限定するものではないが、ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファランまたはベンダムスチン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチンまたはストレプトゾシン）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）、トリアジン（例えば、ダカルバジンまたはテモゾロミド、およびエチレンイミン（例えば、アルトレタミンまたはチオテパ）が含まれる。
腎臓がん
いくつかの実施形態では、がんは腎臓がんである。特定の実施形態では、腎臓がんは、腎細胞癌（ＲＣＣ）（例えば、以前に治療されていないＲＣＣを含む進行性ＲＣＣまたは転移性ＲＣＣ（ｍＲＣＣ））である。いくつかの実施形態では、腎臓がんは、肉腫様腎臓がん（例えば、肉腫様ＲＣＣ（例えば、肉腫様進行性またはｍＲＣＣ））である。
用語「肉腫様」は、例えば、組織学によって評価されるように、肉腫様形態を特徴とするがん（例えば、腎臓がん（例えば、ＲＣＣ））を指す。肉腫様腎臓がん（例えば、肉腫様ＲＣＣ）は、悪性な性質および予後不良に関連している。いくつかの実施形態では、肉腫様腎臓がんは、非定型の紡錘形の細胞を含むか、もしくはそれからなり、および／または任意の肉腫の形態に類似している。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｌ Ｍｏｕａｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｕｒｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．３６：２６５－２７１，２０１８を参照されたい。肉腫様ＲＣＣは、淡明細胞型ＲＣＣ、嫌色素性ＲＣＣ、集合管癌、腎髄質癌、フマル酸ヒドラターゼ（ＦＨ）欠損ＲＣＣおよびコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）欠損ＲＣＣを含む、ＲＣＣの任意のサブタイプで発生する可能性がある。肉腫様ＲＣＣの発生率はサブタイプによって異なるが、通常、淡明細胞型ＲＣＣ（約５～８％）および嫌色素性ＲＣＣ（約８～１０％）では高くなる。肉腫様成分の組織学は可変であり得、線維肉腫様パターン、多形未分化肉腫様パターンまたは他の異種肉腫様パターン（例えば、骨肉腫様パターン、軟骨肉腫様パターンまたは横紋筋肉腫様パターン）を含み得る。壊死は、典型的には、大多数（約９０％）の症例に存在する。いくつかの実施形態では、個体の腎臓がんが肉腫様として分類されるための最小量または割合の肉腫様分化は存在しない。肉腫様ＲＣＣは、実施例１に記載されているように評価され得る。他の実施形態では、肉腫様ＲＣＣは、２０１２ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ＩＳＵＰ）Ｖａｎｃｏｕｖｅｒコンセンサス（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｒｉｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３７：１４６９－８９，２０１３を参照）によって記載されるように特徴付けられ得る。
用語「Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）リスクスコア」は、腎臓がん（例えば、ＲＣＣ、例えば、ｍＲＣＣ）患者の生存に関連する一連の予後因子に基づくスコアリングシステムを指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｏｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７（８）：２５３０－２５４０，１９９９およびＭｏｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１）：２８９－２９６，２００２を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＭＳＫＣＣリスクスコアは、実施例１に記載されているように、以下の因子に基づいて計算され得る：（ｉ）腎摘出術から治療（例えば、全身性治療）までの時間が１年未満、腎摘出術の欠如、もしくは転移性疾患の最初の診断、（ｉｉ）正常下限（ＬＬＮ）未満のヘモグロビンレベル（場合によっては、ヘモグロビンの正常範囲は、男性では１３．５～１７．５ｇ／ｄＬ、女性では１２～１５．５ｇ／ｄＬである）、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｄＬを超える補正血清カルシウムレベル（場合によっては、該補正血清カルシウムレベルは、血清カルシウムレベル（ｍｇ／ｄＬ）＋０．８（４－血清アルブミン（ｇ／ｄＬ））である）、（ｉｖ）正常上限（ＵＬＮ）の１．５倍を超える血清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベル（場合によっては、該ＵＬＮは１４０Ｕ／Ｌである）、および／または（ｖ）カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス（ＫＰＳ）スコアが８０未満。いくつかの実施形態では、個体が前述の特性を有しない場合、個体は好ましいＭＳＫＣＣリスクスコアを有する。いくつかの実施形態では、個体が前述の特性のうちの１つまたは２つを有する場合、個体は中程度のＭＳＫＣＣリスクスコアを有する。いくつかの実施形態では、個体が前述の特性のうちの３つ以上を有する場合、個体は不良なＭＳＫＣＣリスクスコアを有する。いくつかの実施形態では、個体のＭＳＫＣＣリスクスコアは、個体が抗がん治療、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）およびＰＤ－Ｌ１軸結合アンタゴニスト（例えば、アテゾリズマブなどの抗ＰＤ－Ｌ１抗体）を含む抗がん治療から利益を享受し得るかどうかを同定するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「無悪化率」または「ＤＦＲ」は、患者が、ある時間、例えば、治療の開始から、ＭＤアンダーソン症状評価票（ＭＤＡＳＩ）支障尺度のベースラインを超えて、患者の最初の２ポイント以上の増加までの時間の長さにおいて、臨床的に意味のある悪化を経験する確率を指す。
「ＭＤアンダーソン症状評価票（ＭＤＡＳＩ）支障尺度」は、がんおよびその治療に関連する複数の症状の重症度および影響を評価する、患者報告の転帰測定スコアリングシステムを指す（例えば、Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １３：３２５－３３４，２０１３；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ １２：４１－４９，２０１４；およびＳｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｐａｉｎ １５８：１１０８－１１１２，２０１７を参照）。ＭＤＡＳＩ支障尺度では、患者は、過去２４時間の間に、症状が生活の様々な面でどの程度の支障をきたしたかを評価する。各支障項目（仕事、一般的な活動、歩行、他者との関係、生活の楽しみ、および気分）は、０～１０の尺度で評価され、０は「支障なかった」を表し、１０は「完全に支障になった」を表す。
肝臓がん
本明細書で使用される場合、用語「切除不能」は、外科的切除が不可能であるかまたは安全に行うことができないがん（例えば、肝臓がん（例えば、局所進行性もしくは転移性および／または切除不能ＨＣＣを含むＨＣＣ））を指す。例えば、肝臓がんに関して、用語「切除不能」は、例えば、腫瘍が大きすぎて安全に除去することができない、腫瘍が除去を困難にする肝臓の部分に位置する（例えば、大きな血管の近くなど）、いくつかの腫瘍がある、もしくはがんが肝臓全体および／もしくは肝臓の外側に広がっている、ならびに／または対象が切除を不可能にする根本的な健康問題（例えば、肝硬変）を有するために、部分的肝切除によって、がんを安全に除去することができないことを示す。
本明細書で使用される場合、「Ｘ線無進行期間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）」（ＴＴＲＰ）は、最初の事象（例えば、臨床治験への無作為化、または治療レジメンの最初の用量の投与）と放射線医学によって評価される客観的進行との間の時間の長さを指す。いくつかの実施形態では、Ｘ線無進行は、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）基準、例えば、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１またはｍＲＥＣＩＳＴ（例えば、ＨＣＣ ｍＲＥＣＩＳＴ）に従って定義される。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、類似の構造を一般に有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照。）。抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインで十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体由来のＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的なＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングしてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
ＩＩ．組成物および方法
一態様では、本発明は、一方でＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、他方でＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを単一の二重特異性抗体内で組み合わせることにより、ＴｆＲおよびＰＤ１をその表面上に発現および／または提示する細胞と接触させた場合に、二重特異性抗体の内部移行がもたらされるという発見に部分的に基づく。そのような細胞は、例えば、活性化Ｔ細胞であり得る。さらなる態様では、本発明は、抗ＴｆＲ抗ＰＤ１ ２＋１フォーマット抗体、すなわち、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が、単一特異性二価ＰＤ１抗体よりも改善された生物活性を示し、ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用のさらに良好な阻害をもたらすという発見に部分的に基づく。一態様では、これらの分子は、互いに共有結合的に結合されて本明細書に開示される２＋１フォーマット抗体をもたらすＩｇＧクラスＦａｂ断片、および任意にＩｇＧクラスＦｃ領域も含む。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、これらの抗体がＴ細胞の表面からＰＤ１を枯渇させ、したがって、ＰＤ１に対する抗ＰＤ１ブロッキング抗体の単なる結合によって達成され得るよりも、腫瘍細胞の表面に位置するＰＤ１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）へのＰＤ１の結合を恒久的に妨害すると考える。したがって、本発明の抗体は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介シグナル伝達に対して、当技術分野で公知の抗ＰＤ１抗体よりも強力な阻害効果をもたらす。本明細書に記載の抗体の有用性は、それらの抗体が細胞表面上の２つの受容体ＴｆＲおよびＰＤ１と複合体を形成し、それにより、上記複合体の全体を細胞内に内部移行する能力に関連していると考えられる。
本発明による抗体はまた、ペイロードを抗体に直接コンジュゲートすることによって、または抗体に結合する追加の抗原結合ドメインを結合させることによって、ペイロードをＴ細胞に特異的に輸送するために使用され得、その後、抗体は、ペイロードに特異的に結合することができる。ある特定の態様では、ＰＤ１およびＴｆＲに結合する二重特異性抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、がん治療のためのＴ細胞への小分子またはＲＮＡなどの薬剤の送達に有用である。
別の態様では、本発明は、抗ＰＤ１および抗ＴｆＲを標的とする結合ドメインの化学量論が２＋１である二重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗体、すなわち、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が、抗ＰＤ１および抗ＴｆＲを標的とする結合ドメインの化学量論が１＋１である単一特異性抗ＰＤ１抗体または二重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗体、すなわち、ＴｆＲに特異的に結合する１つの抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合するただ１つの抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体と比較して、ＰＤ１の内部移行の増加をもたらすという発見に部分的に基づく。本発明の抗体は、例えば、個体における腫瘍細胞の成長を阻害するために、または腫瘍の診断もしくは治療のために有用である。本発明の抗体は、当技術分野で公知の抗ＰＤ１抗体が使用されているあらゆる種類の医療処置に使用され得る。
Ａ．ＴｆＲおよびＰＤ１に結合する例示的な二重特異性抗体
一態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む単離された二重特異性抗体が提供される。一態様では、本発明は、ＴｆＲおよびＰＤ１に特異的に結合する抗体を提供する。ある特定の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、細胞表面からのＰＤ１の枯渇を引き起こし、細胞内へのＰＤ１の内部移行を引き起こす。細胞は、好ましくはＴ細胞、さらに好ましくは活性化Ｔ細胞である。細胞内へのＰＤ１の内部移行は、そのリガンドへのＰＤ１の結合、好ましくはＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する。好ましくは、細胞内へのＰＤ１の内部移行によるＰＤ１とそのリガンドとの間の結合のこの阻害は、ＰＤ１への抗原結合ドメインの単なる結合によって達成されるブロックよりも長い持続性効果を有する。ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、好ましくは、
ｉ．ＴｆＲおよびＰＤ１に同時に結合し、
ｉｉ．ＴｆＲおよびＰＤ１に同時に結合することによって、二重特異性抗体、ＴｆＲおよびＰＤ１によって形成される複合体の細胞内への内部移行と、細胞表面からのＰＤ１の枯渇とをもたらし、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ１にアクセスすることを防止し、ならびに／または
ｉｉｉ．ＰＤ１に結合し、細胞表面からのＰＤ１枯渇を達成することによって、ＰＤ１－ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロックし、および／もしくはＰＤ１シグナル伝達を防止し、好ましくは、従来の抗ＰＤ１抗体よりもＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介シグナル伝達のさらに効果的および／もしくは恒久的な阻害をもたらすことができる。
一態様では、二重特異性抗体に含まれるＦａｂ断片、および任意にＩｇＧクラスＦｃ領域も互いに共有結合的に結合され、異なる立体配座の２＋１フォーマット抗体をもたらす。さらなる態様では、二重特異性抗体は、本質的にモノマー形態であり、すなわち、本発明の複数の二重特異性抗体を含むダイマーまたはマルチマー（例えば、ペンタマー）構造を形成しない。特定の態様では、抗体の少なくとも９０％、さらに具体的には少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、さらに好ましくは少なくとも９９％がモノマー形態である。
一態様では、本発明は、
Ａ）ａ．（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つ全部のＣＤＲ、または
ｂ．（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つ全部のＣＤＲ
を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）ａ．（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つ全部のＣＤＲ、または
ｂ．（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つ全部のＣＤＲ
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
一態様では、本発明は、
Ａ）ａ．（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列、または
ｂ．（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；および（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列
を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）ａ．（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；および（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列、または
ｂ．（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；および（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
一態様では、二重特異性抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む。一態様では、二重特異性抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む。
一態様では、二重特異性抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む。一態様では、二重特異性抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む。
別の態様では、二重特異性抗体は、
Ａ）ａ．配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、または
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）ａ．配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、または
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、および配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む。
さらなる態様では、抗体は、
Ａ）ａ．配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、および配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
または
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２
を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン
ならびに
Ｂ）ａ．配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
または
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインを含む。
さらなる態様では、抗体は、
Ａ）ａ．配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；および配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
または
ｂ．配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；および配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン
ならびに
Ｂ）ａ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、
または
ｂ．配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；および配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、
Ａ）ａ．（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列、または
ｂ．（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列
を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）ａ．（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列、または
ｂ．（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
一態様では、二重特異性抗体は、
Ａ）ａ．（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、または
ｂ．（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）ａ．（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、または
ｂ．（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む。
別の態様では、本発明の二重特異性抗体は、
Ａ）ａ．（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメイン
または
ｂ．（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメイン
を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）ａ．（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメイン
または
ｂ．（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメイン
を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む。
別の態様では、本発明は、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、
Ｃ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む第１の抗原結合ドメインと、
Ｄ）（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、
Ｅ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む第１の抗原結合ドメインと、
Ｆ）（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、
Ｇ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む第１の抗原結合ドメインと、
Ｈ）（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
本明細書に提供される態様のいずれかでは、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体がヒト化される。一態様では、抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはアミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下または２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号７のＶＨのＣＤＲ配列のうちの１つ以上と、配列番号２３のＶＨのＣＤＲ配列のうちの１つ以上とを含む。別の実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号８のＶＬのＣＤＲ配列のうちの１つ以上と、配列番号２４のＶＬのＣＤＲ配列のうちの１つ以上とを含む。別の実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号７のＶＨのＣＤＲ配列、および配列番号８のＶＬのＣＤＲ配列、および配列番号２３のＶＨのＣＤＲ配列、および配列番号２４のＶＬのＣＤＲ配列を含む。
別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号７のＶＨのＣＤＲ配列のうちの１つ以上と、配列番号３１のＶＨのＣＤＲ配列のうちの１つ以上とを含む。別の実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号８のＶＬのＣＤＲ配列のうちの１つ以上と、配列番号３２のＶＬのＣＤＲ配列のうちの１つ以上とを含む。別の実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号７のＶＨのＣＤＲ配列、および配列番号８のＶＬのＣＤＲ配列、および配列番号３１のＶＨのＣＤＲ配列、および配列番号３２のＶＬのＣＤＲ配列を含む。
別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号１５のＶＨのＣＤＲ配列のうちの１つ以上と、配列番号２３のＶＨのＣＤＲ配列のうちの１つ以上とを含む。別の実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号１６のＶＬのＣＤＲ配列のうちの１つ以上と、配列番号２４のＶＬのＣＤＲ配列のうちの１つ以上とを含む。別の実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号１５のＶＨのＣＤＲ配列、および配列番号１６のＶＬのＣＤＲ配列、および配列番号２３のＶＨのＣＤＲ配列、および配列番号２４のＶＬのＣＤＲ配列を含む。
別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号１５のＶＨのＣＤＲ配列のうちの１つ以上と、配列番号３１のＶＨのＣＤＲ配列のうちの１つ以上とを含む。別の実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号１６のＶＬのＣＤＲ配列のうちの１つ以上と、配列番号３２のＶＬのＣＤＲ配列のうちの１つ以上とを含む。別の実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号１５のＶＨのＣＤＲ配列、および配列番号１６のＶＬのＣＤＲ配列、および配列番号３１のＶＨのＣＤＲ配列、および配列番号３２のＶＬのＣＤＲ配列を含む。
さらなる態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号７のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列、ならびに配列番号８のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列、ならびに配列番号２３のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列、ならびに配列番号２４のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号７のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列、ならびに配列番号８のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列、ならびに配列番号３１のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列、ならびに配列番号３２のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号１５のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列、ならびに配列番号１６のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列、ならびに配列番号２３のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列、ならびに配列番号２４のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、配列番号１５のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列、ならびに配列番号１６のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列、ならびに配列番号３１のＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３アミノ酸配列、ならびに配列番号３２のＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列を含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号７のＶＨドメインの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つ以上、および配列番号７のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号２３のＶＨドメインの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つ以上、および配列番号２３のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１抗体に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号７のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号７のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号２３のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２３のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号７のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号７のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号２３のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２３のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号７のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２３のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号７のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２３のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号７のＶＨドメインの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つ以上、および配列番号７のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号３１のＶＨドメインの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つ以上、および配列番号３１のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１抗体に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号７のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号７のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号３１のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号３１のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号７のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号７のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号３１のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号３１のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号７のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号７のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号３１のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号３１のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号１５のＶＨドメインの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つ以上、および配列番号１５のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号２３のＶＨドメインの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つ以上、および配列番号２３のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１抗体に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号１５のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１５のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号２３のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２３のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号１５のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１５のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号２３のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２３のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号１５のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１５のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号２３のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２３のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号１５のＶＨドメインの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つ以上、および配列番号１５のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号３１のＶＨドメインの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つ以上、および配列番号３１のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号１５のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１５のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号３１のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号３１のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号１５のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１５のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号３１のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号３１のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ａ）配列番号１５のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１５のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークと、ｂ）配列番号３１のＶＨドメインの３つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号３１のＶＨドメインのフレームワークアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、ならびに配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、ならびに配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインとを含む。
一態様では、第１のＶＨドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、第２のＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。一態様では、第１のＶＬドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、第２のＶＬドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、ならびに配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、ならびに配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインとを含む。
一態様では、第１のＶＨドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、第２のＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。一態様では、第１のＶＬドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、第２のＶＬドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
Ａ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、ならびに配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、ならびに配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインとを含む。
一態様では、第１のＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、第２のＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。一態様では、第１のＶＬドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、第２のＶＬドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
Ａ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、ならびに配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、ならびに配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインとを含む。
一態様では、第１のＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、第２のＶＨドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。一態様では、第１のＶＬドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、第２のＶＬドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
Ａ）配列番号７および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、
Ｂ）配列番号２３および配列番号３１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列とを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
Ａ）配列番号７および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、
Ｂ）配列番号２３および配列番号３１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列とを含む。
ある特定の態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、その配列を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ＴｆＲおよび／またはＰＤ１に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３および／または配列番号３１では、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）内で起こる。任意に、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号７および配列番号１５からなる群から選択される第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、配列番号２３および配列番号３１からなる群から選択される第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列とを含む。
別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
Ａ）配列番号８および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、
Ｂ）配列番号２４および配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
Ａ）配列番号８および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、
Ｂ）配列番号２４および配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む。
ある特定の態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、その配列を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、ＴｆＲおよび／またはＰＤ１に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４および／または配列番号３２では、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）内で起こる。任意に、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号８および配列番号１６からなる群から選択される第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、ならびに配列番号２４および配列番号３２からなる群から選択される第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列。
別の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、上に提供された態様のいずれかにあるようなＶＨ配列と、上に提供された態様のいずれかにあるようなＶＬ配列とを含む二重特異性抗体が提供される。一態様では、二重特異性抗体は、
それらの配列の翻訳後修飾をそれぞれ含む、
Ａ）ａ．配列番号７および配列番号８、または
ｂ．配列番号１３および配列番号１４
におけるＶＨ配列およびＶＬ配列を含む、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、
Ｂ）ａ．配列番号２３および配列番号２４、または
ｂ．配列番号３１および配列番号３２
におけるＶＨ配列およびＶＬ配列を含む、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインとを含む。
本発明のさらなる態様では、上記の態様のいずれかによる、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、少なくとも１つの抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片を含む。
別の態様では、抗体は、完全長抗体、例えば、本明細書で定義されるインタクトなＩｇＧ１抗体または他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。ある特定の態様では、抗体はＩｇＧクラスのものである。別の態様では、抗体のＦａｂ断片および／またはＦｃ領域はＩｇＧクラスのものである。ある特定の態様では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。別の態様では、抗体のＦａｂ断片および／またはＦｃ領域はＩｇＧ１アイソタイプのものである。
さらなる態様では、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ／サブクラスのものであり、配列番号６９もしくは配列番号７０の定常重鎖ドメイン、または配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９もしくは配列番号４１の重鎖アミノ酸配列の定常部分を含む。一態様では、さらに、Ｃ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）が存在する。一態様では、さらに、Ｃ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）およびＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在する。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、配列番号３５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗体に関する。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、配列番号３７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号３９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗体に関する。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、配列番号３５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号４１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗体に関する。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、配列番号３７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号４１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号４２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗体に関する。
別の態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、
配列番号５９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖（鎖Ｈ）と、配列番号６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖（鎖Ｋ）と、配列番号５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖（鎖Ａ）と、配列番号５８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖（鎖Ｂ）とを含む二重特異性抗体に関する。
さらなる態様では、本発明は、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、
配列番号６１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖（鎖Ｈ）と、配列番号６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖（鎖Ｋ）と、配列番号５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖（鎖Ａ）と、配列番号５８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖（鎖Ｂ）とを含む二重特異性抗体に関する。
さらなる態様では、上記の態様のいずれかによる、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、以下のセクション１～８に記載されるように、特徴のいずれかを単独でまたは組み合わせて組み込み得る。
１．抗体親和性
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
一態様では、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するアッセイは、約１０反応単位（ＲＵ）で固定化されている抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で行われる。一態様では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、供給業者の指示に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化される。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流量で注入して、約１０反応単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。動力学測定のために、Ｆａｂの二倍段階希釈物（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に２５℃で約２５μｌ／分の流量で注入する。会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に適合させることによって、単純な一対一Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして平衡解離定数（ＫＤ）を計算する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ－１ ｓ－１を超える場合、会合速度は、流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定された場合、漸増濃度の抗原の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）（ｐＨ７．２）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ、放出＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用して決定され得る。
別の方法では、ＫＤは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一態様では、ＲＩＡは、目的の抗体およびその抗原のＦａｂバージョンを用いて行われる。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系列の存在下で、Ｆａｂを最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体でコートされたプレートを用いて、結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）によって一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを用いて２～５時間にわたって室温（約２３℃）でブロックする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号＃２６９６２０）内で、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［１２５Ｉ］－抗原を、目的のＦａｂの段階希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３－４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ－１２の評価と一致する）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートする。ただし、インキュベーションは、平衡状態に達したことを確認するためにさらに長時間（例えば、約６５時間）にわたって継続してもよい。その後、この混合物を捕捉プレートに移し、室温でインキュベートする（例えば、１時間）。次いで、溶液を除去し、ＰＢＳ中の０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））を用いてプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて１０分間計測する。２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度が、競合結合アッセイに使用するために選択される。
２．抗体断片
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は抗体断片である。
一態様では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、またはＦ（ａｂ’）２断片、特にＦａｂ断片である。インタクトな抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が生じ、これは、ＶＨ内の３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、およびＶＬ内の３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）を含め、それぞれ重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）と、さらに軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、用語「Ｆａｂ断片」は、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖断片とを含む抗体断片を指す。「Ｆａｂ’断片」は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における残基の付加によりＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合ドメイン（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。一態様では、Ｆａｂ断片はＩｇＧクラスのものである。
一態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディである。「ダイアボディ」は、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合ドメインを有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）にも記載されている。
さらなる態様では、抗体断片は単鎖Ｆａｂ断片である。「単鎖Ｆａｂ断片」または「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメインおよび上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の順序、すなわち、ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１またはｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有する。特に、上記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。上記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。加えて、これらの単鎖Ｆａｂ断片は、システイン残基の挿入（例えば、カバット番号付けによれば、可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるであろう。
別の態様では、抗体断片は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、ペプチド性リンカーによって接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは、１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが、かつ溶解度のためにセリンまたはスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、またはこの逆のいずれかで、接続させることができる。このタンパク質は、定常領域の除去、およびリンカーの誘導にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および米国特許第５，５８７，４５８号も参照されたい。
別の態様では、抗体断片は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。
抗体断片は、限定するものではないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化、および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌）による組換え産生を含め、様々な技術によって作製され得る。
３．キメラ抗体およびヒト化抗体
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化させられた「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある特定の態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させるかまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基によって置換される。
ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号および米国特許第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」手法を記載）にさらに記載されている。
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、限定するものではないが、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）が含まれる。
４．ヒト抗体
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。
ヒト抗体は、抗原曝露に応答して、インタクトなヒト抗体、またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれたヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を典型的に含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号および米国特許第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号、ならびにＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい）。そのような動物により生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾され得る。
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択される可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。次いで、そのような可変ドメイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
５．ライブラリー由来の抗体
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、ライブラリーから得られる。本発明の抗体は、単数または複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）に概説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成し、所望の結合特性を有する抗体のそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知られている。このような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．ｉｎ ｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）およびＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）ならびにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）およびＭａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）に概説されている。
特定のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）に記載されているように、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換え、次いでこれを抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはＦａｂ断片として、抗体断片を典型的に提示する。免疫化された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．ｉｎ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２：７２５－７３４（１９９３）によって記載されるように、ナイーブなレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、免疫化することなく、非自己およびさらには自己抗原の広範囲に対する単一の抗体源を得ることができる。さらに、ナイーブなライブラリーはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ ｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）によって記載されるように、再整列していないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、およびランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再整列を達成することによって、合成的に作製され得る。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公開には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号；米国特許第７，９８５，８４０号；米国特許第７，７８５，９０３号および米国特許第８，６７９，４９０号ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、米国特許公開第２００７／０１１７１２６号、米国特許公開第２００７／０２３７７６４号および米国特許公開第２００７／０２９２９３６号が含まれる。
単数または複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当技術分野で公知の方法のさらなる例には、リボソームおよびｍＲＮＡディスプレイ、ならびに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞または酵母細胞における抗体ディスプレイおよび選択のための方法が挙げられる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）およびＣｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）ならびにＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）に概説されている。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）およびＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ｉｎ ＰＮＡＳ ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載されている。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と考えられる。
６．多重特異性抗体
いくつかの態様では、本明細書に提供される二重特異性抗体は、多重特異性抗体、例えば、三重特異性抗体または四重特異性抗体である。「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープ、または同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。ある特定の態様では、結合特異性のうちの１つはＴｆＲに対するものであり、結合特異性のうちの１つはＰＤ１に対するものであり、第３の特異性は任意の他の抗原に対するものである。ある特定の態様では、二重特異性抗体は、ＴｆＲおよび／またはＰＤ１の２つ（またはそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を使用して、細胞傷害性剤または細胞をＰＤ１および／またはＴｆＲを発現する細胞に局在化してもよい。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定するものではないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照）、および「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、およびＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照）が含まれる。多重特異性抗体は、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照）を作製するための静電気操縦（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を操作すること、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）、および国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）、軽鎖のミスペアリングの問題を回避するために共通の軽鎖技術を使用すること（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照）、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）、および単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）、および例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製されてもよい。
例えば、「オクトパス抗体」を含め、３つ以上の抗原結合ドメインを有する操作抗体、またはＤＶＤ－Ｉｇもまた本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号および国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合ドメインを有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号および国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。二重特異性抗体またはその抗原結合断片はまた、ＴｆＲに結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１および別の異なる抗原、またはＴｆＲおよび／もしくはＰＤ１の２つの異なるエピトープに結合する第２の抗原結合ドメインとを含む「二重作用性ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許第２００８／００６９８２０号および国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照）。
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ以上の結合アームにドメインクロスオーバーを有する非対称の形態で、すなわち、ＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号および国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）または完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、また、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１、およびＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照）を交換することによって提供され得る。一態様では、多重特異性抗体は、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片を含む。用語「ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域１（ＣＨ１）から構成されるポリペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるポリペプチド鎖とを含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電または非荷電アミノ酸変異をドメイン接触面に導入して正しいＦａｂペアリングを導くことによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照されたい。
多重特異性抗体に対する様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で公知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照）。
この目的のために有用であり得る二重特異性抗体フォーマットの例には、限定するものではないが、２つのｓｃＦｖ分子が可撓性リンカーによって融合された、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１号および国際公開第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９，２９９－３０５（１９９６））およびその誘導体、例えば、タンデム型ダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、さらに安定化させるためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、ならびに全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３６，４５８－４６７（２０１０）に概説されている）が挙げられる。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
ａ）ＴｆＲに特異的に結合する完全長抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と、
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する完全長抗体の第２の（修飾された）軽鎖および第２の（修飾された）重鎖であって、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられており、ならびに／または定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている、第２の（修飾された）軽鎖および第２の（修飾された）重鎖とを含み、
ｃ）１つまたは２つのさらなる抗原（すなわち、第３および／または第４の抗原）に特異的に結合する１～４つの抗原結合ドメインが、ａ）および／またはｂ）の軽鎖または重鎖のＣ末端またはＮ末端にペプチド性リンカーを介して融合されている、三重特異性抗体または四重特異性抗体である。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、
ａ）ＰＤ１に特異的に結合する完全長抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と、
ｂ）ＴｆＲに特異的に結合する完全長抗体の第２の（修飾された）軽鎖および第２の（修飾された）重鎖であって、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられており、ならびに／または定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている、第２の（修飾された）軽鎖および第２の（修飾された）重鎖とを含み、
ｃ）１つまたは２つのさらなる抗原（すなわち、第３および／または第４の抗原）に特異的に結合する１～４つの抗原結合ドメインが、ａ）および／またはｂ）の軽鎖または重鎖のＣ末端またはＮ末端にペプチド性リンカーを介して融合されている、三重特異性抗体または四重特異性抗体である。
ａ）の抗体は、ｂ）で報告されている修飾を含有せず、ａ）の重鎖および軽鎖は、単離された鎖である。
一態様では、三重特異性抗体または四重特異性抗体は、ｃ）では、１つまたは２つのさらなる抗原に特異的に結合する１つまたは２つの抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片およびｓｃＦａｂ断片の群から選択される。一態様では、抗原結合ドメインはＦａｂ断片である。一態様では、抗原結合ドメインはｓｃＦｖ断片である。一態様では、抗原結合ドメインはｓｃＦａｂ断片である。
一態様では、抗原結合ドメインは、ａ）および／またはｂ）の重鎖のＣ末端に融合されている。
一態様では、三重特異性抗体または四重特異性抗体は、ｃ）では、１つのさらなる抗原に特異的に結合する１つまたは２つの抗原結合ドメインを含む。
一態様では、三重特異性抗体または四重特異性抗体は、ｃ）では、第３の抗原に特異的に結合する２つの同一の抗原結合ドメインを含む。好ましい一実施形態では、そのような２つの同一の抗原結合ドメインは、同じペプチド性リンカーを介して、ａ）およびｂ）の重鎖のＣ末端にともに融合されている。好ましい一実施形態では、２つの同一の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片またはｓｃＦａｂ断片のいずれかである。
一態様では、三重特異性抗体または四重特異性抗体は、ｃ）では、第３および第４の抗原に特異的に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、上記２つの抗原結合ドメインは、同じペプチド接続部を介して、ａ）およびｂ）の重鎖のＣ末端にともに融合されている。好ましい一実施形態では、上記２つの抗原結合ドメインは、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片またはｓｃＦａｂ断片のいずれかである。
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する（２つのＦａｂ断片を含む）、抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する、抗体の２つの追加のＦａｂ断片であって、ペプチド性リンカーを介してａ）の重鎖のＣ末端またはＮ末端のいずれかにともに融合されている２つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性四価抗体であり、
ここで、Ｆａｂ断片では、以下の修飾が行われた
（ｉ）ａ）の両Ｆａｂ断片では、もしくはｂ）の両Ｆａｂ断片では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、互いに置き換えられており、ならびに／もしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられているか、または
（ｉｉ）ａ）の両Ｆａｂ断片では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂ断片では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、互いに置き換えられているか、もしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられているか、または
（ｉｉｉ）ａ）の両Ｆａｂ断片では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、互いに置き換えられているか、もしくは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂ断片では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、互いに置き換えられており、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられているか、または
（ｉｖ）ａ）の両Ｆａｂ断片では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂ断片では、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられているか、または
（ｖ）ａ）の両Ｆａｂ断片では、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられており、ｂ）の両Ｆａｂ断片では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、互いに置き換えられている。
一態様では、上記追加のＦａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端に、またはａ）の重鎖のＮ末端のいずれかにともに融合されている。
一態様では、上記追加のＦａｂ断片は、ペプチド性リンカーを介して、ａ）の重鎖のＣ末端のいずれかにともに融合されている。
一態様では、上記追加のＦａｂ断片は、ペプチド接続部を介して、ａ）の重鎖のＮ末端にともに融合されている。
一態様では、Ｆａｂ断片では、以下の修飾が行われる：ａ）の両Ｆａｂ断片では、またはｂ）の両Ｆａｂ断片では、可変ドメインＶＬおよびＶＨは、互いに置き換えられており、かつ／または定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられている。
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ－ＣＨ１ドメイン対を含む第１の抗体の（修飾された）重鎖であって、上記重鎖のＣ末端に、上記第１の抗体の第２のＶＨ－ＣＨ１ドメイン対のＮ末端がペプチド性リンカーを介して融合されている第１の抗体の（修飾された）重鎖と、
ｂ）ａ）の上記第１の抗体の２つの軽鎖と、
ｃ）第２の抗原に特異的に結合し、第１のＶＨ－ＣＬドメイン対を含む第２の抗体の（修飾された）重鎖であって、上記重鎖のＣ末端に、上記第２の抗体の第２のＶＨ－ＣＬドメイン対のＮ末端がペプチド性リンカーを介して融合されている第２の抗体の（修飾された）重鎖と、
ｄ）ＣＬ－ＣＨ１ドメイン対をそれぞれ含む、ｃ）の上記第２の抗体の２つの（修飾された）軽鎖とを含む四価抗体である。
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１の完全長抗体の重鎖および軽鎖と、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の完全長抗体の重鎖および軽鎖であって、重鎖のＮ末端がペプチド性リンカーを介して軽鎖のＣ末端に接続されている第２の完全長抗体の重鎖および軽鎖とを含む。
ａ）の抗体は、ｂ）で報告されている修飾を含有せず、重鎖および軽鎖は、単離された鎖である。
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体と、
ｂ）ＶＨ２ドメインおよびＶＬ２ドメインを含む、第２の抗原に特異的に結合するＦｖ断片であって、両ドメインがジスルフィド架橋を介して互いに接続されているＦｖ断片とを含み、
ＶＨ２ドメインまたはＶＬ２ドメインのいずれか一方のみが、ペプチド性リンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する完全長抗体の重鎖または軽鎖に融合されている。
二重特異性抗体では、ａ）の重鎖および軽鎖は、単離された鎖である。
一態様では、ＶＨ２ドメインまたはＶＬ２ドメインのうち他方は、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原に特異的に結合する完全長抗体の重鎖または軽鎖に融合されていない。
いくつかの態様では、第１の軽鎖は、ＶＬドメインとＣＬドメインとを含み、第１の重鎖は、ＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む。
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する２つのＦａｂ断片、
ｂ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとが互いに交換されている、第２の抗原に特異的に結合する１つのＣｒｏｓｓＦａｂ断片、
ｃ）第１のＦｃ領域重鎖および第２のＦｃ領域重鎖を含む１つのＦｃ領域を含む三価抗体であって、
２つのＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端が、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続されており、ＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端が、Ｆａｂ断片のうちの１つのＶＨドメインのＣ末端に接続されている、三価抗体である。
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する１つのＦａｂ断片、
ｂ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとが互いに交換されている、第２の抗原に特異的に結合する２つのＣｒｏｓｓＦａｂ断片、
ｃ）第１のＦｃ領域重鎖および第２のＦｃ領域重鎖を含む１つのＦｃ領域を含む三価抗体であって、
Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端が、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのうちの１つのＮ末端に接続されており、２つのＣｒｏｓｓＦａｂ断片のうちの１つのＣＬドメインのＣ末端が、他方の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続されており、２つのＣｒｏｓｓＦａｂ断片のうちの他方のＣＨ１ドメインのＣ末端が、Ｆａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に、またはＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に接続されている、三価抗体である。
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる二価完全長抗体と、
ｂ）重鎖断片および軽鎖断片を含むＶＨ２ドメインおよびＶＬ２ドメインを含む、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂ断片であって、軽鎖断片内で、可変軽鎖ドメインＶＬ２が、上記抗体の可変重鎖ドメインＶＨ２によって置き換えられており、重鎖断片内で、可変重鎖ドメインＶＨ２が、上記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬ２によって置き換えられているＦａｂ断片とを含み、
重鎖Ｆａｂ断片は、完全長抗体の重鎖のうちの１つのＣＨ１ドメインと完全長抗体のそれぞれのＦｃ領域との間に挿入され、軽鎖Ｆａｂ断片のＮ末端は、重鎖Ｆａｂ断片が挿入された完全長抗体の重鎖と対になっている、完全長抗体の軽鎖のＣ末端にコンジュゲートしている。
一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる二価完全長抗体と、
ｂ）重鎖断片および軽鎖断片を含むＶＨ２ドメインおよびＶＬ２ドメインを含む、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂ断片であって、軽鎖断片内で、可変軽鎖ドメインＶＬ２が、上記抗体の可変重鎖ドメインＶＨ２によって置き換えられており、重鎖断片内で、可変重鎖ドメインＶＨ２が、上記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬ２によって置き換えられているＦａｂ断片とを含み、Ｆａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、完全長抗体の重鎖のうちの１つのＮ末端にコンジュゲートしており、Ｆａｂ断片の軽鎖断片のＣ末端は、Ｆａｂ断片の重鎖断片がコンジュゲートしている、完全長抗体の重鎖と対になっている、完全長抗体の軽鎖のＮ末端にコンジュゲートしている。
特定の一態様では、
ａ）ＴｆＲに特異的に結合する１つのＦａｂ断片、
ｂ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとが互いに交換されている、ＰＤ１に特異的に結合する２つのＣｒｏｓｓＦａｂ断片、
ｃ）第１のＦｃ領域重鎖および第２のＦｃ領域重鎖を含む１つのＦｃ領域を含む三価抗体である二重特異性抗体が提供され、
Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのうちの１つのＮ末端に接続されており、第１のＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、他方の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続されており、第２のＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、Ｆａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に、またはＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＶＬドメインのＮ末端に接続されている。追加の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ ＦｃドメインまたはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。特定の態様では、二重特異性抗体の重鎖は、γ型（ＩｇＧ）、特にγ１型のものである。別の特定の態様では、二重特異性抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）および／またはラムダ（λ）サブタイプのものである。
特定の一態様では、
ａ）ＶＬドメインとＶＨドメインとが互いに交換されている、ＰＤ１に特異的に結合する２つのＣｒｏｓｓＦａｂ断片、
ｂ）ＴｆＲに特異的に結合する１つのＦａｂ断片、
ｃ）第１のＦｃ領域重鎖および第２のＦｃ領域重鎖を含む１つのＦｃ領域を含む三価抗体である二重特異性抗体が提供され、
第１のＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのうちの１つのＮ末端に接続されており、Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、他方の重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドのＮ末端に接続されており、第２のＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、ＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＶＬドメインのＮ末端に、またはＦａｂ断片のＶＨドメインのＮ末端に接続されている。追加の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ ＦｃドメインまたはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。特定の態様では、二重特異性抗体の重鎖は、γ型（ＩｇＧ）、特にγ１型のものである。別の特定の態様では、二重特異性抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）および／またはラムダ（λ）サブタイプのものである。
一態様では、
ａ）ＰＤ１に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、軽鎖内で、可変軽鎖ドメインＶＬが、上記抗体の可変重鎖ドメインＶＨによって置き換えられており、重鎖断片内で、可変重鎖ドメインＶＨが、上記抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによって置き換えられている完全長抗体と、
ｂ）ＴｆＲに特異的に結合するＦａｂ断片とを含む三価抗体である二重特異性抗体が提供され、
重鎖Ｆａｂ断片のＮ末端は、完全長抗体の２つの重鎖のうちの１つのＣ末端にコンジュゲートしている。追加の態様では、抗体および／またはＦａｂ断片は、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。特定の態様では、二重特異性抗体の重鎖は、γ型（ＩｇＧ）、特にγ１型のものである。別の特定の態様では、二重特異性抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）および／またはラムダ（λ）サブタイプのものである。
一態様では、
ａ）ＰＤ１に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体と、
ｂ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとが互いに交換されている、ＴｆＲに特異的に結合するＣｒｏｓｓＦａｂ断片とを含む三価抗体である二重特異性抗体が提供され、
重鎖ＣｒｏｓｓＦａｂ断片のＮ末端は、完全長抗体の２つの重鎖のうちの１つのＣ末端にコンジュゲートしている。
７．抗体バリアント
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を変化させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製されてもよい。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、最終的なコンストラクトが、所望の特色、例えば、抗原結合を有する限り、最終的なコンストラクトに到達するように行うことができる。
ａ）置換バリアント、挿入バリアントおよび欠失バリアント
ある特定の態様では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＣＤＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下に表１に示されている。さらに実質的な変化は、「例示的な置換」という見出しの下に表２に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される通りである。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、その産物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングしてもよい。
Figure 2024528217000003
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴う。
ある種の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる試験のために選択される得られたバリアントは、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）の修飾（例えば、改善）を有し、および／または親抗体の実質的に保持された特定の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、親和性成熟抗体は、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に生成され得る。要約すると、１つ以上。ＣＤＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
例えば、抗体親和性を改善するために、ＣＤＲに対して変更（例えば、置換）が行われ得る。そのような変更は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）、および／または抗原と接触する残基に対して行われ得、得られたバリアントＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）．）に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指定突然変異）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、このライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６残基）をランダム化するＣＤＲ指向性手法を伴う。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデル化を使用して特異的に同定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。
ある特定の態様では、置換、挿入または欠失は、そのような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＣＤＲ内で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）が、ＣＤＲに対して行われてもよい。そのような変更は、例えば、ＣＤＲ内の抗原接触残基の外側であってよい。上に提供された特定のバリアントＶＨ配列およびバリアントＶＬ配列では、各ＣＤＲは、変更されていないか、または１つ、２つもしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
突然変異誘発の標的となり得る、抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性の、または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換が、初期置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。代替的に、または追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点を同定してもよい。そのような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。バリアントは、所望の特性を含有するかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントには、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ療法）のための）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
ｂ）グリコシル化バリアント
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体を変化させて、抗体がグリコシル化される程度を増加または低下させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって簡便に達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合したオリゴ糖を変化させてもよい。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合された分枝状の二分岐オリゴ糖を典型的に含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースおよびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作成するために行われ得る。
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、すなわち、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠くオリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化された」オリゴ糖とも呼ばれる）は、特に、二分岐オリゴ糖構造の幹の第１のＧｌｃＮＡｃに結合したフコース残基を欠くＮ－結合型オリゴ糖である。一態様では、天然抗体または親抗体と比較して、Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加した抗体バリアントが提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、またはさらには約１００％（すなわち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であり得る。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定された場合、Ａｓｎ２９７に結合した全オリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）と比較した、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域内の約２９７位（ＥＵ番号付けのＦｃ領域残基）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列差異に起因して、２９７位から上流または下流に±３アミノ酸、すなわち２９４位から３００位の間に位置する場合もある。Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したそのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合および／または改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許第２００３／０１５７１０８号、米国特許第２００４／００９３６２１号を参照されたい。
フコシル化が低減した抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許第２００３／０１５７１０８号；および国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、およびノックアウト細胞株、例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；および国際公開第２００３／０８５１０７号）、またはＧＤＰ－フコース合成もしくは輸送体タンパク質の活性が低減もしくは消失した細胞（例えば、米国特許第２００４２５９１５０号、米国特許第２００５０３１６１３号、米国特許第２００４１３２１４０号、米国特許第２００４１１０２８２号を参照）が挙げられる。
さらなる態様では、抗体バリアントには、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分されたオリゴ糖が提供される。そのような抗体バリアントは、上記のように、低減されたフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号；国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号に記載されている。
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、国際公開第１９９８／５８９６４号および国際公開第１９９９／２２７６４号に記載されている。
ｃ）Ｆｃ領域バリアント
ある特定の態様では、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによって、Ｆｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
ある特定の態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）など）が不必要または有害である用途に対して望ましい候補にする、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体バリアントを企図する。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルを対象に評価され得る。抗体がＣ１ｑに結合することができず、ひいてはＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを行ってもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も、当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照）。
エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうちの１つ以上の置換を含むものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体（アラニンへの残基２６５および２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む）が含まれる。
ＦｃＲに対する結合が改善または減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照。）
ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３および／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。
ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃγＲ結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２３４および２３５位（残基のＥＵ番号付け）を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。ある特定の態様では、抗体バリアントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域に、Ｄ２６５Ａおよび／またはＰ３２９Ｇをさらに含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）である。（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照）。別の態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）である。
いくつかの態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変化（すなわち、改善または減少のいずれか）をもたらす変更がＦｃ領域に対して行われる。
半減期が増加し、胎児への母体ＩｇＧの移行を担う新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換をＦｃ領域内に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基：２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうちの１つ以上に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６）２３５１４－２３５２４を参照）。
マウスＦｃ－マウスＦｃＲｎ相互作用にとって重要なＦｃ領域残基は、部位特異的突然変異誘発によって同定されている（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９（２００２）５１７１－５１８０を参照）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４およびＨ４３５（残基のＥＵ番号付け）が相互作用に関与する（Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１９９６）２５３３；Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）５４２）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０およびＨ４３５が、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に重要であることが見出された（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２８１９）。ヒトＦｃ－ヒトＦｃＲｎ複合体の試験では、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５およびＹ４３６が相互作用に重要であることが示されている（Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７－７６７１）では、残基２４８～２５９、および３０１～３１７、および３７６～３８２、および４２４～４３７の様々な変異体が報告され、調査されている。
ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５３位および／または３１０位および／または４３５位（残基のＥＵ番号付け）に置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の態様では、抗体バリアントは、２５３、３１０および４３５位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａである。例えば、Ｇｒｅｖｙｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４（２０１５）５４９７－５５０８を参照されたい。
ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の３１０位および／または４３３位および／または４３６位（残基のＥＵ番号付け）に置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の態様では、抗体バリアントは、３１０位、４３３位および４３６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＨ３１０Ａ、Ｈ４３３ＡおよびＹ４３６Ａである。（例えば、国際公開第２０１４／１７７４６０号を参照）。
ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５２位および／または２５４位および／または２５６位（残基のＥＵ番号付け）に置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の態様では、抗体バリアントは、２５２、２５４および２５６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅである。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；および国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
本明細書に報告されるような抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうちの１つまたは２つが除去された、短縮されたＣ末端であり得る。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、短縮されたＣ末端で終わるＰＧである。本明細書に報告される全態様のうちの一態様では、本明細書で指定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを含む（Ｇ４４６およびＫ４４７、アミノ酸位置のＥＵインデックス番号付け）。本明細書に報告される全態様のうちの一態様では、本明細書で指定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、アミノ酸位置のＥＵインデックス番号付け）。
ｄ）システイン操作抗体バリアント
ある特定の態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基によって置換されているＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作成することが望ましい場合がある。特定の態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインによって置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、抗体を薬物部分またはリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを作成するために使用され得る。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、第８，３０，９３０号、第７，８５５，２７５号、第９，０００，１３０号または国際公開第２０１６０４０８５６号に記載されているように生成され得る。
ｅ）抗体誘導体
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、当技術分野で公知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分には、限定するものではないが、水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造時に有利であり得る。該ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状であっても、分枝状でなくてもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、複数のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／またはタイプは、限定するものではないが、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で治療に使用されるかどうかなどを含む考慮事項に基づいて決定され得る。
８．イムノコンジュゲート
本発明はまた、本明細書では、細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはその断片）または放射性同位体などの１つ以上の治療剤にコンジュゲートされた（化学的に結合された）、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一態様では、イムノコンジュゲートは、上記の治療剤のうちの１つ以上に抗体がコンジュゲートしている抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は、リンカーを使用して、治療剤のうちの１つ以上に典型的にコンジュゲートしている。治療剤および薬物およびリンカーの例を含め、ＡＤＣ技術の概説が、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。
別の態様では、イムノコンジュゲートは、限定するものではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む酵素活性毒素またはその断片にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体を含む。
別の態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。放射性コンジュゲートの生成には、様々な放射性同位体が利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートは、検出のために使用される場合、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくは、Ｉ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識、ここでも、例えば、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含み得る。
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を促進する「開裂性リンカー」であってよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本明細書のイムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、限定するものではないが、市販の（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ製）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含む架橋試薬を用いて調製されたそのようなコンジュゲートを明確に企図するが、これらに限定されない。
Ｂ．組換え方法および組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法および組成物を使用して産生され得る。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸が提供される。
天然抗体または天然抗体断片の場合、２つの核酸が必要とされ、１つは、軽鎖またはその断片用であり、もう１つは、重鎖またはその断片用である。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上にあっても、異なる発現ベクター上にあってもよい。
ヘテロ二量体重鎖を有する二重特異性抗体の場合、４つの核酸が必要とされ、１つは第１の軽鎖用、１つは第１のヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第１の重鎖用、１つは第２の軽鎖用、１つは第２のヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第２の重鎖用である。４つの核酸は、１つ以上の核酸分子または発現ベクターに含まれ得る。このような核酸は、第１のＶＬを含むアミノ酸配列、および／または第１のヘテロモノマーＦｃ領域を含む第１のＶＨを含むアミノ酸配列、および／または第２のＶＬを含むアミノ酸配列、および／または抗体の第２のヘテロモノマーＦｃ領域を含む第２のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の第１および／もしくは第２の軽鎖ならびに／または第１および／もしくは第２の重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上にあっても、異なる発現ベクター上にあってもよく、通常、これらの核酸は、２つまたは３つの発現ベクター上に位置し、すなわち、１つのベクターがこれらの核酸のうちの複数を含むことができる。これらの二重特異性抗体の例は、ＣｒｏｓｓＭａｂである（例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１１８７－１１９１を参照）。例えば、ＥＵインデックス番号付けによれば、ヘテロモノマー重鎖のうちの１つは、いわゆる「ノブ変異」（Ｔ３６６Ｗ、および任意にＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃのうち１つ）を含み、他方は、いわゆる「ホール変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ、ならびに任意にＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照）。
一態様では、本明細書に報告される方法で使用される抗体をコードする単離された核酸が提供される。
一態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を作製する方法が提供され、方法は、抗体の発現に適した条件下で、上に提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意に、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培地）から回収することを含む。
ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の組換え産生のために、例えば、上記のような抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内のさらなるクローニングおよび／または発現のために１つ以上のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定され得るか、または組換え方法によって産生され得るか、または化学合成によって得られ得る。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のための好適な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされていない場合、抗体は細菌内で産生されてもよい。細菌内の抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号および米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい。（大腸菌内の抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照。）発現後、抗体は、可溶型画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製され得る。
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌株および酵母株を含む糸状菌または酵母などの有用真核微生物も、抗体をコードするベクターのための好適なクローニング宿主または発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９－１４１４；およびＬｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０－２１５．を参照されたい。
（グリコシル化）抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、これらは、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用され得る。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号および米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物内で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児由来腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４に記載されているような２９３細胞または２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２に記載されているようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載されているような）；ＭＲＣ ５細胞；およびＦＳ４細胞がある。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が含まれる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），ｐｐ．２５５－２６８を参照されたい。
一態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
Ｃ．アッセイ
本明細書に提供される、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的特性および／または生物活性について同定、スクリーニングまたは特徴付けされ得る。
１．結合アッセイおよび他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどのような公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＴｆＲへの結合についてマウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体１２８．１（可変領域配列については、国際公開第９３／０１８１９号ならびに配列番号６４および６５を参照）と競合する抗体を同定してもよい。ある特定の態様では、そのような競合抗体は、マウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体１２８．１によって結合される同じエピトープ（例えば、線状エピトープまたは立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
例示的な競合アッセイでは、固定化されたＴｆＲが、ＴｆＲに結合する第１の標識化抗体（例えば、マウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体１２８．１）と、ＴｆＲへの結合について第１の抗体と競合する能力について試験されている第２の非標識化抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化されたＴｆＲは、第１の標識化抗体を含むが第２の非標識化抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。ＴｆＲへの第１の抗体の結合を許容する条件下でインキュベーションした後、過剰の未結合抗体が除去され、固定化されたＴｆＲに関連する標識の量が測定される。固定化されたＴｆＲに関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体がＴｆＲへの結合について第１の抗体と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＰＤ１への結合について、例えば、ニボルマブまたはペンブロリズマブと競合する抗体を同定してもよい。ある特定の態様では、そのような競合抗体は、例えば、ニボルマブまたはペンブロリズマブによって結合される同じエピトープ（例えば、線状エピトープまたは立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
例示的な競合アッセイでは、固定化されたＰＤ１が、ＰＤ１に結合する第１の標識化抗体（例えば、ニボルマブまたはペンブロリズマブ）と、ＰＤ１への結合について第１の抗体と競合する能力について試験されている第２の非標識化抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化されたＰＤ１は、第１の標識化抗体を含むが第２の非標識化抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。ＰＤ１への第１の抗体の結合を許容する条件下でインキュベーションした後、過剰の未結合抗体が除去され、固定化されたＰＤ１に関連する標識の量が測定される。固定化されたＰＤ１に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体がＰＤ１への結合について第１の抗体と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
別の態様では、二重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗体のアビディティ増強結合の評価を可能にするＪｕｒｋａｔ細胞アッセイが提供される。そのために、ＰＤ１を様々なレベルで発現するＮＦＡＴ－ｂｌａ Ｊｕｒｋａｔ細胞が、レンチウイルスによってＰＤ１発現コンストラクトをそれらに形質導入することによって生成される。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、二重特異性抗体と接触させられ、標識される。結合がＰＤ１発現レベルに依存するかどうかを評価するために、フローサイトメトリーが使用される。このアッセイは、実施例５にさらに詳細に記載される。
２．活性アッセイ
一態様では、生物活性を有する、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、様々な免疫細胞、特にＴ細胞の活性化および／もしくは増殖を増強する能力、ＩＦＮγもしくはＴＮＦ－アルファなどの免疫調節サイトカインの分泌、ＰＤ１経路のブロック、または腫瘍細胞の殺傷が含まれ得る。ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有する抗体も提供される。
ある特定の態様では、本発明の抗体は、そのような生物活性について試験される。一態様では、１つの個体（ドナーＸ）由来のリンパ球から、別の個体（ドナーＹ）由来のリンパ球までの活性化を測定する免疫細胞アッセイが提供される。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、リンパ球エフェクター細胞に対するＰＤ１経路をブロックする効果を示すことができる。アッセイ中のＴ細胞を、本発明の二重特異性抗体の存在下または非存在下での細胞傷害性グランザイムＢ放出によって測定される活性化について試験した。このアッセイは、実施例１３にさらに詳細に記載される。
別の態様では、ＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞とＰＤ１発現Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１－ＮＦＡＴ細胞との間のＴＣＲシグナル伝達のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介阻害のブロックを測定するＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１ブロック共培養アッセイが提供される。ＰＤ１シグナル伝達によるＴＣＲ活性化の阻害は、レポーター遺伝子の発現の検出によって測定される。このアッセイは、実施例４にさらに詳細に記載される。
別の態様では、細胞内への二重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗体の内部移行を決定することを可能にする、活性化Ｔ細胞に基づく内部移行アッセイが提供される。そのために、ＣＤ３およびＣＤ２８活性化ＣＤ４ Ｔ細胞を４℃で抗体に最初に曝露し、その後、３７℃でインキュベートして内部移行を可能にし、続いて、細胞を染色および固定する。対照として、各試料の半分を直ちに洗浄し、抗体への４℃曝露後に染色および固定する（４℃での内部移行は無視できる）。次いで、二重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗体に特異的に結合する蛍光標識抗体を使用して、両条件（４℃および３７℃）の細胞を染色する。フローサイトメトリーを使用して蛍光を検出する。次いで、細胞と対照細胞との間で、幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）、および蛍光標識ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を比較する。以下の式を用いて、内部移行の割合を計算する：
内部移行％＝１００－（（ＧＭＦＩ蛍光性ＣＤ４＋Ｔ 細胞 ３７℃÷ＧＭＦＩ蛍光性ＣＤ４＋Ｔ細胞 ４℃）＊１００）
このアッセイは、実施例６にさらに詳細に記載される。
Ｄ．診断および検出のための方法および組成物
ある特定の態様では、本明細書に提供される、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体のいずれかが、生物学的試料中のＴｆＲまたはＰＤ１の存在を検出するために有用である。本明細書で使用される用語「検出する」は、定量的または定性的な検出を包含する。ある特定の態様では、生物学的試料は、免疫細胞浸潤物もしくはＴ細胞浸潤物などの細胞もしくは組織、または腫瘍組織を含む。
一態様では、診断または検出の方法に使用するための、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中の、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の存在を検出する方法が提供される。ある特定の態様では、方法は、ＴｆＲおよび／またはＰＤ１への、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１抗体に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の結合を許容する条件下で、生物学的試料と、本明細書に記載される、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１抗体に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体とを接触させること、ならびにＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＴｆＲおよび／またはＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ ｖｉｖｏ法であってよい。
ある特定の態様では、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む標識された二重特異性抗体が提供される。標識には、限定するものではないが、直接検出される標識または部分（蛍光性、発色団、高電子密度、化学発光および放射性標識など）、および例えば、酵素反応または分子相互作用によって間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が含まれる。例示的な標識には、限定するものではないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン類、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、色素前駆体、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定したフリーラジカルなどを酸化するために過酸化水素を使用する酵素とカップリングされた複素環式オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼが含まれる。
Ｅ．薬学的組成物
さらなる態様では、例えば、以下の治療方法のいずれかに使用するための、本明細書に提供される抗体のいずれかを含む薬学的組成物が提供される。一態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、薬学的組成物は、例えば、以下に記載されるように、本明細書に提供される抗体のいずれかと、少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
本明細書に記載される、ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体の薬学的組成物は、所望の純度を有するそのような抗体を、凍結乾燥組成物または水溶液の形態で、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定するものではないが、バッファー、例えば、ヒスチジン、ホスフェート、シトレート、アセテートおよび他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体には、間質性（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤、例えば、可溶型中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｈａｌｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶型ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号および米国特許公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わされる。
例示的な凍結乾燥された抗体組成物は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体組成物には、米国特許第６，１７１，５８６号および国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが含まれ、後者の組成物はヒスチジン－アセテートバッファーを含む。
本明細書の薬学的組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な複数の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。ある特定の態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化因子、またはアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。好ましい態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、または抗血管新生剤である。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに封入され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
徐放性用の薬学的組成物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、これらのマトリクスは、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に使用される薬学的組成物は、一般に滅菌されている。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。
Ｆ．治療方法および投与経路
本明細書に提供される抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体のいずれかは、治療方法に使用され得る。
一態様では、医薬として使用するための抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体が提供される。さらなる態様では、がんの治療における使用のための抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体が提供される。ある特定の態様では、治療方法に使用するための抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体が提供される。ある特定の態様では、本発明は、有効量の抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法に使用するための抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を提供する。他の態様では、本発明は、有効量の抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を個体に投与することを含む、感染性疾患、好ましくは、慢性または急性感染症、例えば、慢性または急性ウイルス感染症を有する個体を治療する方法に使用するための抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を提供する。さらに別の態様では、本発明は、有効量の抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を個体に投与することを含む、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する個体を治療する方法に使用するための抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を提供する。そのような一態様では、方法は、例えば、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの追加の治療剤）を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、免疫賦活剤として使用するための、またはインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）もしくは腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌を刺激するための抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、免疫刺激のための、またはインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ））もしくは腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌を刺激するための有効量の抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を個体に投与することを含む、個体における免疫刺激方法、またはインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）もしくは腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌を刺激する方法に使用するための抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造または調製における抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は、がんの治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、がんを治療する方法に使用するためのものである。そのような一態様では、方法は、例えば、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、医薬は、がん細胞の細胞媒介性溶解を誘導するためのものである。さらなる態様では、医薬は、がん細胞内でアポトーシスを誘導するための／またはがん細胞増殖を阻害するための有効量の医薬を個体に投与することを含む、個体においてがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導する方法に使用するためのものである。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる態様では、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一態様では、方法は、そのようながんを有する個体に、有効量の抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を投与することを含む。そのような一態様では、方法は、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。
上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる態様では、本発明は、個体における免疫刺激のための方法、またはインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）もしくは腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌を刺激する方法を提供する。一態様では、方法は、免疫刺激のために、またはインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）もしくは腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌を刺激するために有効量の抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体を個体に投与することを含む。一態様では、「個体」はヒトである。
さらなる態様では、本発明は、例えば、上記の治療方法のいずれかに使用するための、本明細書に提供される抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体のうちのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、薬学的組成物は、例えば、以下に記載されるように、本明細書に提供される抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体のいずれかと、少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
本発明の抗体は、単独で投与され得るか、または併用療法に使用され得る。例えば、併用療法は、本発明の抗体を投与すること、および少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの追加の治療剤）を投与することを含む。ある特定の態様では、併用療法は、本発明の抗体を投与すること、および少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化因子、またはアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増加させる薬剤を投与することを含む。好ましい態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、または抗血管新生剤である。
上述されたそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同じまたは別個の薬学的組成物に含まれる場合）および別個の投与を包含し、この場合、本発明の抗体の投与は、単数または複数の追加の治療剤の投与前、投与と同時および／または投与後に行われ得る。一態様では、抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体の投与と追加の治療剤の投与とは、互いの約１ヶ月以内、または約１、２もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５もしくは６日以内に行われる。一態様では、抗体および追加の治療剤は、治療の１日目に患者に投与される。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
本発明の抗体（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内および鼻腔内、ならびに局所治療のために所望であれば病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与され得る。非経口点滴には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短時間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路、例えば、注射、例えば、静脈内注射または皮下注射によるものであり得る。本明細書では、限定するものではないが、単回投与、または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス点滴を含む様々な投薬スケジュールが企図される。
本発明の抗体は、医学行動規範と一致した様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療施術者に公知の他の要因が含まれる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに処方される。このような他の薬剤の有効量は、薬学的組成物中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、および上述した他の要因に依存する。このような他の薬剤の有効量は、本明細書に記載されているのと同じ投与量で、かつ投与経路によって、または本明細書に記載の投与量の約１～９９％で、または適切であると経験的に／臨床的に決定された任意の投与量で、かつ任意の経路によって一般に使用される。
疾患の予防または治療について、本発明の抗体の適切な投与量は（単独で、または１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴および抗体への応答、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は、好適には、患者に一度にまたは一連の治療にわたって投与される。疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体を、例えば、１回以上の別個の投与によるか、または連続的注入によるかにかかわらず、患者に投与するための初期候補投与量とすることができる。１つの典型的な１日投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日間またはそれ以上にわたる反復投与の場合、治療は、状態に応じて、病徴の所望の抑制が生じるまで一般に持続される。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組合せ）の１つ以上の用量が、患者に投与され得る。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間ごとに（例えば、患者が約２～約２０回、または例えば、約６回の用量の抗体を投与されるように）投与され得る。初回高負荷用量、続いて、１回以上のそれよりも低い用量を投与してもよい。例示的な投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量、続いて、約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持量を投与することを含む。ただし、他の投与レジメンが有用であってよい。この治療法の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
Ｇ．製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防および／または診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書とを備える。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、組成物をそれ自体で、または状態を治療、予防および／もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を収容する第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞傷害性剤または他の治療剤を含む組成物を収容する第２の容器とを備え得る。本発明のこの態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに備えてもよい。代替的に、または追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液、およびデキストローズ溶液を含む第２の（または第３の）容器をさらに備えてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含め、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
以下に、本発明の特定の実施形態を列挙する：
１．ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体。
２．細胞の表面に提示されたＴｆＲおよびＰＤ１に結合し、細胞内に内部移行される、実施形態１の二重特異性抗体。
３．細胞が、ＴｆＲおよびＰＤ１を発現し、それらをその表面に提示する、実施形態２の二重特異性抗体。
４．細胞の表面に提示されたＴｆＲおよびＰＤ１に二重特異性抗体が結合すると、細胞の表面からＰＤ１が枯渇する、実施形態２または３の二重特異性抗体。
５．第３の抗原結合ドメインを含み、第３の抗原結合ドメインが、ＰＤ１に特異的に結合する、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
６．第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ断片、好ましくはＩｇＧ由来Ｆａｂ断片である、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
７．第１および第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
８．第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン、好ましくはＩｇＧ由来Ｆｃドメインを含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
９．Ｆａｂ断片のうちの１つ以上が、Ｆｃドメインに融合されている、実施形態８の二重特異性抗体。
１０．Ｆａｂ断片のうちの１つ以上が、ペプチド性リンカーを介してＦｃドメインに融合されている、実施形態７から９のいずれか１つの二重特異性抗体。
１１．ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および存在する場合、第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、抗体が、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合ドメインが、存在する場合、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、二重特異性抗体。
１２．ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１、第２および第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、抗体が、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、
第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、
第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、
第３の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＮ末端で、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、二重特異性抗体。
１３．Ｆｃドメインが、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ ＦｃドメインまたはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、実施形態８から１２のいずれか１つの二重特異性抗体。
１４．少なくとも２つの重鎖を含み、二重特異性抗体の重鎖がγ型（ＩｇＧ）、特にγ１型のものである、実施形態１から１３のいずれか１つの二重特異性抗体。
１５．二重特異性抗体が、少なくとも２つの軽鎖を含み、二重特異性抗体の軽鎖が、カッパ（κ）および／またはラムダ（λ）サブタイプから選択される、実施形態１から１４のいずれか１つの二重特異性抗体。
１６．Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態８から１５のいずれか１つの二重特異性抗体。
１７．Ｆｃドメインが、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、実施形態８から１６のいずれか１つの二重特異性抗体。
１８．Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む、実施形態８から１７のいずれか１つの二重特異性抗体。
１９．ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、実施形態８から１８のいずれか１つの二重特異性抗体。
２０．Ｆｃドメインの第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（カバットＥＵインデックスによる番号付け）を含む、実施形態８から１９のいずれか１つの二重特異性抗体。
２１．ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、Ｆａｂ断片のうちの１つでは、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられている、実施形態６から２０のいずれか１つの二重特異性抗体。
２２．ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂ断片および／または、存在する場合、第３のＦａｂ断片では、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられている、実施形態６から２１のいずれか１つの二重特異性抗体。
２３．定常ドメインＣＬ内のＦａｂ断片のうちの１つでは、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１では、１４７位および２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態６から２２のいずれか１つの二重特異性抗体。
２４．ＴｆＲ定常ドメインＣＬに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂ断片では、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１では、１４７位および２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されている（カバットＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態６から２３のいずれか１つの二重特異性抗体。
２５．Ｊ鎖を含まない、実施形態１から２４のいずれか１つの二重特異性抗体。
２６．ハイブリッドＩｇＡ／ＩｇＧ抗体配列および／またはハイブリッドＩｇＭ／ＩｇＧ抗体配列を含まない、実施形態１から２５のいずれか１つの二重特異性抗体。
２７．モノマーである、実施形態１から２６のいずれか１つの二重特異性抗体。
２８．ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＴｆＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第１のＦａｂ断片と、ＰＤ１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＦａｂ断片および、存在する場合、第３のＦａｂ断片とを含み、Ｆａｂ断片が、Ｆｃドメインに融合されている、二重特異性抗体。
２９．ＴｆＲに特異的に結合する正確に１つの（一価）抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する正確に２つの（一価）抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、二重特異性抗体が、Ｆｃドメインと、ＴｆＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＦａｂ断片と、ＰＤ１に特異的に結合する１つの抗原結合ドメインをそれぞれ含む２つのＦａｂ断片とを含み、３つのＦａｂ断片のうちの少なくとも２つが、Ｆｃドメインに融合されており、３つのＦａｂ断片のうちの１つが、他のＦａｂ断片のうちの１つに任意に融合されている、二重特異性抗体。
３０．ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および存在する場合、第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、抗体が、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、
（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、または
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、二重特異性抗体。
３１．ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の、および任意に第３の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、第１、第２および第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、抗体が、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、
第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、
第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、
第３の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＮ末端で、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、二重特異性抗体。
３２．ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
ｉ．ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、または
ｉｉ．ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
３３．ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、
ｉ．ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）または
ｉｉ．ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
３４．ｉ．ＴｆＲに特異的に結合する上記第１の抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬドメイン、または
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬドメインを含み、
かつ
ｉｉ．ＰＤ１に特異的に結合する上記第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、上記第３の抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬドメイン、または
ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨドメインおよび配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、
先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
３５．ｉ．ＴｆＲに特異的に結合する上記第１の抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
かつ
ｉｉ．ＰＤ１に特異的に結合する上記第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、上記第３の抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または
ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、
先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
３６．モノクローナル抗体である、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
３７．ヒト化抗体またはキメラ抗体である、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
３８．配列番号３５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号３９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列４０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
３９．配列番号３７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号３９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列４０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４０．配列番号３５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号４１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列４２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４１．配列番号３７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、
配列番号４１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列４２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４２．配列番号５９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列５８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４３．配列番号６１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号６０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号５７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列５８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４４．ｎＭ～サブｎＭの範囲の親和性でＴｆＲおよびＰＤ１の両方に結合する、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４５．多重特異性抗体である、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４６．配列番号３７の第１の重鎖、および配列番号３８の第１の軽鎖、配列番号３９の第２の重鎖、および配列番号４０の第２の軽鎖を含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４７．配列番号３５の第１の重鎖、および配列番号３６の第１の軽鎖、配列番号３９の第２の重鎖、および配列番号４０の第２の軽鎖を含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４８．配列番号３５の第１の重鎖、および配列番号３６の第１の軽鎖、配列番号４１の第２の重鎖、および配列番号４２の第２の軽鎖を含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
４９．配列番号３７の第１の重鎖、および配列番号３８の第１の軽鎖、配列番号４１の第２の重鎖、および配列番号４２の第２の軽鎖を含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
５０．配列番号５９の第１の重鎖と配列番号６０の第２の重鎖と、配列番号５７の第１の軽鎖と、配列番号５８の第２の軽鎖とを含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
５１．配列番号６１の第１の重鎖と配列番号６０の第２の重鎖と、配列番号５７の第１の軽鎖と、配列番号５８の第２の軽鎖とを含む、先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体。
５２．先行する実施形態のうちの１つの二重特異性抗体と細胞傷害性剤とを含むイムノコンジュゲート。
５３．細胞傷害性剤が、シュードモナス外毒素Ａまたはアマトキシンである、実施形態５２によるイムノコンジュゲート。
５４．第３の標的に特異的に結合するさらなる結合ドメインが、二重特異性抗体のＣ末端に融合されている、実施形態１から５１のいずれか１つの二重特異性抗体を含む三重特異性抗体。
５５．実施形態１から５１のいずれかの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態４８の三重特異性抗体をコードする単離された核酸。
５６．実施形態５５の核酸を含む宿主細胞。
５７．実施形態１から５１のいずれかの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体を産生する方法であって、抗体の発現に適した条件下で、実施形態５６の宿主細胞を培養することを含む方法。
５８．宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む、実施形態５７の方法。
５９．実施形態５７または５８の方法によって産生される二重特異性抗体。
６０．実施形態１から５１のいずれかの二重特異性抗体または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲートまたは実施形態５４の三重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
６１．追加の治療剤をさらに含む、実施形態６０の薬学的組成物。
６２．医薬として使用するための、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物。
６３．移植片対宿主病を治療するのに使用するための、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物。
６４．ｉ．免疫応答の調節、例えば、Ｔ細胞活性の回復、
ｉｉ．免疫応答または機能の刺激、
ｉｉｉ．感染症の治療、
ｉｖ．がんの治療、
ｖ．がんの進行の遅延、
ｖｉ．がんに罹患している患者の生存期間の延長
に使用するための、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物。
６５．がんの予防または治療における使用のための、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物。
６６．二重特異性抗体が、化学療法剤、照射、および／またはがん免疫療法に使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの予防または治療における使用のための、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物。
６７．個体における腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物の有効量を個体に投与して、腫瘍細胞の成長を阻害することを含む方法。
６８．ｉ．移植片対宿主病、
ｉｉ．感染症または
ｉｉｉ．がん
の治療のための医薬の製造における、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物の使用。
６９．ｉ．免疫応答の調節、例えば、Ｔ細胞活性の回復
ｉｉ．免疫応答もしくは機能の刺激
ｉｉｉ．がんの進行の遅延、および／または
ｉｖ．生存期間の延長、もしくはがんに罹患している患者
のための医薬の製造における、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物の使用。
７０．移植片対宿主病を有する個体を治療する方法であって、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む方法。
７１．追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む、実施形態６７または７０の方法。
７２．追加の治療剤が、化学療法剤、照射、および／またはがん免疫療法に使用するための他の薬剤からなる群から選択される、実施形態７１の方法。
７３．個体におけるＰＤ１機能を阻害する方法であって、実施形態１から５１もしくは５９のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態５２もしくは５３のイムノコンジュゲート、または実施形態５４の三重特異性抗体、または実施形態６０もしくは６１のいずれか１つの薬学的組成物の有効量を個体に投与して、ＰＤ１機能を阻害することを含む方法。
アミノ酸配列の説明
Figure 2024528217000004

Figure 2024528217000005

Figure 2024528217000006

Figure 2024528217000007

Figure 2024528217000008

Figure 2024528217000009

Figure 2024528217000010

Figure 2024528217000011

Figure 2024528217000012

Figure 2024528217000013

Figure 2024528217000014

Figure 2024528217000015

Figure 2024528217000016

Figure 2024528217000017
ＩＩＩ．
以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施形態が実施され得ることが理解される。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用した。全種類の細胞培養および細胞アッセイに、１０％ＦＢＳおよび２．５ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ培地を使用した。形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞用の培地には、５０μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎと、１．５μｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎとをさらに含有させた。以下の二重特異性抗体および多重特異性抗体を生成するために、Ｒｅｇｕｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，３１（７－８）：２８９－２９９に記載されているように、ＣＨ３／ＣＨ３接触面でノブ・イントゥー・ホール技術と組み合わせて、ＶＨ／ＶＬが一方の抗体アームで交換され、他方の抗体アームのＣＨ１／ＣＬ接触面が電荷修飾によって修飾されてヘテロ二量体化を促進する、国際公開第２０１６／０１６２９９号に記載されているＣｒｏｓｓＭａｂ技術を使用した。
ＰＤ１－０１０３－０３１２の生成および完全長抗体配列は、例えば、国際公開第２０１７／５５４４３号に記載されている。ペンブロリズマブの生成および完全長配列は、例えば、国際公開第２００８／１５６７１２号に記載されている。
実施例１：ＴｆＲおよびＰＤ１に結合する二重特異性抗原結合分子の製造
ノブ・イントゥー・ホール変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（ホール）およびＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ（ノブ）を使用して、ＴｆＲ（通常のＦａｂ）およびＰＤ１（ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ）を標的とするいくつかの二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂを操作した（図５Ａ；表８と組み合わせて表１２に示す完全長配列）。ＰＤ１結合ドメインを含むアームには、以下でＰＤ１－０１０３－０３１２と呼ばれる、国際公開第２０１７／５５４４３号に記載されている抗ＰＤ１抗体の可変領域アミノ酸配列（重鎖可変ドメイン配列番号２３および軽鎖可変ドメイン配列番号２４）、またはがんの治療のために承認され、例えば、国際公開第２００８／１５６７１２号に記載されている二価抗ＰＤ１抗体である抗ＰＤ１抗体ペンブロリズマブの可変領域アミノ酸配列（重鎖可変ドメイン配列番号３１および軽鎖可変ドメイン配列番号３２）のいずれかを含有させた。ＴｆＲ結合ドメインを含むアームには、以下で１０２６と呼ばれる、国際公開第２０１６／２０７２４０号に記載されている抗ＴｆＲ抗体の可変領域アミノ酸配列（重鎖可変ドメイン配列番号７および軽鎖可変ドメイン配列番号８）、または以下で５１Ａ１６５と呼ばれる、未公開の抗ＴｆＲ抗体の可変領域アミノ酸配列（重鎖可変ドメイン配列番号１５および軽鎖可変ドメイン配列番号１６）のいずれかを含有させた。ＬＡＬＡ ＰＧ変異を使用して、免疫エフェクター機能を無効にした（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ；Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ．２９ ｎｏ．１０，ｐｐ．４５７－４６６）。

Figure 2024528217000018
抗体のＤＮＡ配列を社内ツールを用いて最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔまたはＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに注文した。表１２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を確立された発現ベクターにクローニングし、これをＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を使用してＨＥＫ２９３懸濁細胞にトランスフェクトし、８％ＣＯ２の加湿インキュベーター内、３７℃で培養した。６～７日後に３５００ｇでの遠心分離によって上清を回収し、０．２２μｍフィルターユニット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通して上清を濾過した。プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞上清から抗体を精製した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐｓおよび質量分析によって、抗体の抗体分子量を検証した。
実施例２：ビオチン化細胞傷害性剤にペイロードとして結合することができる三重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂの構築
ペイロードの送達のために実施例１に記載の二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ ８０１８のＣ末端に第３の結合実体としての抗ビオチンｓｃＦＶを融合することによって、ＴｆＲ（通常のＦａｂ）、ＰＤ１（ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ）およびビオチンを標的とする、別名１１２９を有する三重特異性ＣｒｏｓｓＭＡｂを操作した。抗ビオチンｓｃＦｖは、Ｑ４４ＣおよびＱ１００Ｃにシステイン結合を含有し、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介してＣｒｏｓｓＭａｂのＣ末端に融合させた。実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞内で三重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ １１２９（配列については、表８と組み合わせて表１２を参照）を組換え産生した。抗体１１２９の概略図を図５Ｂに示す。
対照分子として、ＴｆＲ結合アーム（表１２の抗体９９０４）またはＰＤ１結合アーム（表１２の抗体９９０３）のいずれかの軽鎖および重鎖の可変抗体領域内の結合配列が非結合配列（以下では用語「Ｎａｄａ」で表す）によって置き換えられた抗体を操作した。ＰＤ１にもＴｆＲにも結合しない実体によって両アームが置き換えられた二重非結合対照として、Ｃ末端に結合した抗ビオチンｓｃＦｖを有する抗ＣＤ３３抗体を使用した（「抗ＣＤ３３抗ＣＤ３３抗ビオチン」；表１２の抗体０７８４）。Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲによって、実施例２の三重特異性ＣｒｏｓｓＭＡｂ分子の結合親和性が、１つのＮａｄａ ｆａｂを有する対応する対照分子と同等であることを確認した（実施例４の表１４を参照）。
実施例３：二価様式でＰＤ１に結合し、一価様式でＴｆＲに結合する（２＋１フォーマット）２つの異なるＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体の構築
図６および図７に示すように、二価様式でＰＤ１を標的とし、一価様式でＴｆＲを標的とする２つのＣｒｏｓｓＭＡｂ（抗体８１５６および８１５７、表１３に示す配列）を操作した。
第１の標的に結合する１つの結合ドメインと第２の標的に結合する２つの結合ドメインとを含む複合抗体フォーマットは、本明細書では２＋１フォーマットと呼ばれる。ＰＤ１に２回およびＴｆＲに１回結合する複合抗体フォーマットを、一過性発現によって２つの異なる２＋１フォーマットで生成し、実施例１および２に記載したのと同じ方法を適用して精製した。これらの分子の組成は、図６および図７に概略的に示されている。完全長配列を表９と組み合わせて表１２に示す。
第１の２＋１フォーマットは、ＩｇＧのアームとして２つのＰＤ１結合ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨおよびＶＬが互いに置き換えられたＦａｂ）を含み、ＴｆＲ結合Ｆａｂは、そのＶＨのＮ末端を介して非対称（ノブ・イントゥー・ホール）ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合している（抗体８１５６、図６）。このフォーマットは、本明細書ではＢＢＢフォーマットとも呼ばれる。
第２の２＋１フォーマットは、ＩｇＧ構成のＣｒｏｓｓＦａｂアームとしての１つのＰＤ１結合実体、およびＦａｂアームとしての１つのＴｆＲ結合実体、ならびにノブ・イントゥー・ホールＦｃヘテロ二量体（抗体８１５７、図７）の他方の側のヒンジに先行するＴｆＲ結合Ｆａｂの上部にある（すなわち、Ｎ末端に結合している）第２のＰＤ１結合ＣｒｏｓｓＦａｂアームを含む。このフォーマットは、本明細書ではＴＣＢフォーマットとも呼ばれる。
ノブ・イントゥー・ホール変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（ホール）およびＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ（ノブ）を使用して、両フォーマットのＦｃドメインを操作した。ＬＡＬＡ ＰＧ変異を使用して、免疫エフェクター機能を無効にした（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ；Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記）。
２つの複合抗体フォーマットの各々は、図６および図７に概略的に示され、鎖Ａ、Ｂ、Ｈ（「ホール」変異を有する重鎖）およびＫ（「ノブ」変異を有する重鎖）として表記される４つの異なるアミノ酸鎖によって形成される。これらのアミノ酸鎖の個々のアミノ酸配列は、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１として列挙されている。
対照分子は、対照分子ではＴｆＲ結合ドメインの可変領域が非結合配列（Ｎａｄａ’と呼ばれる）に交換されたことを除いて、同じフォーマットおよび組成で生成した（抗体８１５８および８１５９、表１３に示す配列）。これらの分子の個々のアミノ酸配列は、配列番号５７、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４として列挙されている。
実施例１に記載されるように、二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ ８１５６、８１５７、８１５８および８１５９をＨＥＫ２９３細胞内で組換え産生した。

Figure 2024528217000019
実施例４：三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂ分子のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介シグナル伝達および結合親和性のブロック
ブロッキング抗体ペンブロリズマブと同様に、三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂ １１２９は、共培養アッセイでは、ＴＣＲシグナル伝達のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介阻害をブロックした。ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１ブロックバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）では、エフェクター細胞は、ヒトＰＤ１を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞、およびＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーター系であった。ＮＦＡＴ－ＲＥ活性化は、ＴＣＲ活性化時に誘導される。ヒトＰＤ１（エフェクター細胞）とＰＤ－Ｌ１（標的細胞）との間の相互作用は、ＴＣＲ下流シグナルを妨害し、ＮＦＡＴ－ＲＥ活性化を妨げる。ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１のいずれかがブロックされると、阻害性シグナルが除去され、ＮＦＡＴ－ＲＥが活性化され、発光読出しがもたらされる。
設定のために、５，０００個のＰＤ－Ｌ１発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞を９６ウェルプレートに一晩かけて播種した。５０，０００個のＰＤ１発現Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１－ＮＦＡＴ細胞を抗体とともに３７℃で３０分間プレインキュベートし、培地を用いて１回洗浄し、次いで、アクチベーター細胞に５時間かけて加えた。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを加えた後の発光シグナルによって、ＰＤ１シグナル伝達によるＴＣＲ活性化の阻害を測定した。抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチン抗体１１２９（「αＴｆＲ／αＰＤ１」）は、抗Ｎａｄａ抗ＰＤ１抗ビオチン対照抗体９９０４（「Ｎａｄａ／αＰＤ１」）と比較して、ＰＤ１の有意に増加した阻害（１０ｎＭで２倍を超える増加）を示したが、同じＦａｂ濃度に設定したこの５時間で高濃度でさらに高いブロックを示したペンブロリズマブほど高くはなかった（図８Ａ）。
抗Ｎａｄａ抗ＰＤ１抗ビオチン対照抗体と比較して、抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチン抗体を使用したＰＤ１の阻害の増加は、標的結合の差によるものではなかったことも、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲによって測定された同等のＫＤ値、ｋａ値およびｋｄ値によって裏付けられる（図９および表１４）。両分子は、３つ全部のパラメータに関して極めて同様に機能し、ＰＤ１阻害の差がＴｆＲバインダーの存在または非存在に起因するはずであることを示唆している。
Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲの場合、捕捉系の約１６，０００個の共鳴単位（ＲＵ）（２０μｇ／ｍｌの抗ＰＧＬＡＬＡ Ａｂ（ｍＡｂ＜ＰＧ ＬＡＬＡ＞Ｍ－１７．２４－ＩｇＧ、社内で製造）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されたアミンカップリングキットを使用して、ｐＨ５．０で、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ－１００５－３０）にカップリングさせた。試料および系バッファーは、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に設定し、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーを用いて２回プライミングした。５ｎＭ溶液を１０μｌ／分の流量で３０秒間注入することによって、適切な抗体を捕捉した。
１：３希釈中４００ｎＭから開始して０．５ｎＭまで、３０μｌ／分の流量で１５０秒間にわたって、溶液中に様々な濃度のＰＤ１を注入することによって、会合を測定した。解離段階を最大７５０秒間モニタリングし、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによって開始させた。３０μｌ／分の流量で１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて４０秒間洗浄することによって、表面を再生した。抗ＰＧＬＡＬＡ Ａｂ表面から得られた応答を差し引くことによって、バルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。見かけのＫＤおよび他の速度論的パラメータの計算には、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを使用した。得られたＫＤ値、ｋａ値およびｋｄ値を表１４に示す。

Figure 2024528217000020
共培養アッセイにおける細胞生存度は、適用された濃度で任意の抗体を加えることによって影響を受けなかった（図８Ｂ）。
実施例５：三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂのアビディティ増強結合はＰＤ１発現に依存する
三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂ １１２９のアビディティ増強結合をＪｕｒｋａｔ細胞アッセイによって評価した。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＨＴＸ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、レンチウイルスによってＰＤ１をＮＦＡＴ－ｂｌａ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質導入した。ヒトＰＤ１を低レベルおよび高レベルで発現する単一クローンを生成した（低い発現レベルは、約３，０００個の結合した抗ＰＤ１抗体／細胞に相当し、高い発現レベルは約２０，０００個の結合した抗ＰＤ１抗体／細胞に相当した）。対照として、形質導入されていない野生型Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した。
ＰＥ標識抗体ＰＥ抗ヒトＰＤ１（Ｃｌｏｎｅ ＮＡＴ１０５）およびＰＥ抗ヒトＴｆＲ（Ｃｌｏｎｅ ＣＹ１Ｇ４）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）とフローサイトメトリー（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）とを使用して、ＰＤ１およびＴｆＲの発現を測定した。無関係な抗原に結合するＰＥ標識マウスＩｇＧ１をアイソタイプ対照（Ｉｓｏ）として使用した。低いおよび高い表面発現でＰＤ１を形質導入されたＮＦＡＴ－ｂｌａ Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、ＴｆＲの同様の発現を示した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。
Ｊｕｒｋａｔ細胞への三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂ １１２９の結合がＰＤ１発現レベルに依存するかどうかを評価するために、野生型、ＰＤ１低Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＰＤ１高Ｊｕｒｋａｔ細胞のそれぞれ２５０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、抗体１１２９または対照抗体９９０３もしくは９９０４とともに氷上で２時間インキュベートした。ビオチン化Ｃｙ５（ｂｉｏ－Ｃｙ５、自社製）を２００ｎＭで１０分間かけて加えた後、氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄した。フローサイトメトリーによって、フルオロフォア結合について細胞を分析した。抗体１１２９は、細胞表面上に高レベルのＰＤ１を発現したＪｕｒｋａｔ細胞上では（ビオチン化Ｃｙ５によって）高い程度まで検出された（図１０Ｃ、左上）。この効果は、細胞表面上に低レベルのＰＤ１を発現し、抗体１１２９の結合が少ない細胞によって証明されるように、細胞表面上のＰＤ１発現と相関した。対照的に、１つのＮａｄａドメインを有する対照抗体９９０４および９９０３は、試験した最高濃度であっても、細胞表面への結合をほとんど示さなかった（図１０Ｃ、右上および左下）。
実施例６：抗ＰＤ１抗ＴｆＲ二重特異性抗体は活性化Ｔ細胞によって内部移行される
トランスフェリン受容体を介して誘導される内部移行の機構は、Ｔ細胞表面からＰＤ１受容体を除去するために、抗ＰＤ１抗ＴｆＲ二重特異性抗体にとって重要である。したがって、３日間ポリクローナル活性化した（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞に二重特異性抗Ｔｆｒ抗ＰＤ１抗体８０１２、８０１３もしくは８０１４、または対照抗体８０１５、８０１６、８０１７、８０１８もしくは８０１９（配列については表１２を参照）が結合した際に、フローサイトメトリーによって、ＰＤ１受容体内部移行を評価した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を４℃で３０分間様々な分子に曝露した後、抗ＬＡＬＡＰＧ ＰＥコンジュゲート抗体によって染色し、続いて、固定するか、または３７℃でさらに３時間インキュベートして分子の内部移行を可能にした。４℃での内部移行は無視できるため、４℃でインキュベートしたＣＤ４ Ｔ細胞を参照として使用する。
そのために、健常ドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０４５－１０１）、ＣＤ３（１μｇ／ｍｌプレート結合）およびＣＤ２８（１ｍｇ／μｌ可溶型）の存在下で３日間ポリクローナル活性化した。細胞を、表１２に示す分子８０１２～８０１９とともに４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、２つの群に分けた。１つの群は、固定（ＢＤ Ｃｅｌｌ ｆｉｘ）の前に、二次抗ＬＡＬＡＰＧ ＰＥコンジュゲート抗体によって直ちに染色する。第２の群を培地に再懸濁し、３７℃で３時間インキュベートした後、抗ＬＡＬＡＰＧ－ＰＥ染色および固定を行った。細胞をＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、分析をＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて行った。
次いで、幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）とＰＥ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度とを２つの群間で比較し、以下の式を用いて内部移行の割合を計算する：
内部移行％＝１００－（（ＧＭＦＩ ＰＥ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞 ３７℃÷ＧＭＦＩ ＰＥ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞 ４℃）＊１００）
対応する対照と比較して、抗ＰＤ１抗ＴｆＲ二重特異性抗体８０１２（ＰＤ１－０１０３－０３１２／ＴｆＲ（５１Ａ１６５））および８０１８（Ｐｅｍｂｒｏ／ＴｆＲ（５１Ａ１６５））（図１１Ａ）および８０１３（ＰＤ１－０１０３－０３１２／ＴｆＲ（１０２６））および８０１７（Ｐｅｍｂｒｏ／ＴｆＲ（１０２６））（図１１Ｂ）を示す図１１Ａおよび図１１Ｂは、二価抗ＰＤ１抗体（ＰＤ１－０１０３－０３１２）も対応する一価対照抗ＰＤ１／抗Ｎａｄａ抗体（８０１４および８０１９）も内部移行されていないことを実証したのに対して、ＰＤ１－０１０３－０３１２由来二重特異性抗体８０１２および８０１３ならびにペンブロリズマブ由来二重特異性抗体８０１７および８０１８は、ＰＤ１結合ドメインを有しない一価ＴｆＲコンストラクト８０１５および８０１６と同様に、内部移行を示す。
実施例７：ペイロードが結合した三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭＡｂはＪｕｒｋａｔ細胞内に内部移行する
細胞に対する三重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂの局在化を評価するために、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＨＴＸ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、レンチウイルスによって、ＮＦＡＴ－ｂｌａ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にモノマー増強（ｍＥ）ＧＦＰ－（Ｇ４Ｓ）２－ＰＤ１融合タンパク質を形質導入した。生細胞イメージングのために、１０％ＦＣＳを含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地中、５０，０００細胞／ウェルの密度で、ｍＥＧＦＰ－ＰＤ１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を８ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に播種した。
膜染色のために、生細胞を製造者の指示書（ＰＫＨ２６ＧＬ－１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に従ってＰＫＨ２６とともにプレインキュベートした。要約すると、１×１０６個の細胞をペレット化し、２００μｌの希釈剤に再懸濁し、０．４μｌのＰＫＨ２６色素を含有する２００μｌの希釈剤と混合した。２～３分後、２００μｌのＦＣＳを加えることによって標識反応を停止させ、細胞を再びペレット化し、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。抗体の内部移行を追跡するために、１０ｎＭの三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチン抗体１１２９、対照抗体９９０３（ＴｆＲ／Ｎａｄａ／抗ビオチン）、９９０４（Ｎａｄａ／ペンブロリズマブ／抗ビオチン）および０７８４（抗ＣＤ３３－抗Ｂｉｏ）を、ＰＢＳ中３７℃で３０分間かけて、５０ｎＭビオチン化Ｃｙ５（Ｂｉｏ－Ｃｙ５）と複合体化した。複合体を細胞に加え、３時間内部移行させた。
ＰＤ１－ＧＦＰおよび抗体の内部移行の後、６３×／１．２ＮＡ水浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ）を使用してＬｅｉｃａ ＳＰ８レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡検査を行った。段上部インキュベーションチャンバー（Ｏｋｏ－ｔｏｕｃｈ、Ｏｋｏｌａｂ）を使用して、温度、ＣＯ２レベルおよび湿度を３７℃および５％ＣＯ２に維持した。７倍ズームと２倍の線平均（３８４ｐｘ×３８４ｐｘ、画素サイズ：６９ｎｍ）とを用いて、６００Ｈｚで連続走査を行った（双方向走査）。ステップサイズ３５０ｎｍでＺスタックを取得した。４８８ｎｍ、５６１ｎｍおよび６３３ｎｍで励起するために白色光レーザーを使用した。ＨｙＤ検出器を使用して、４９５～５６０ｎｍ（ＧＦＰ）および６４３～７１５ｎｍ（Ｃｙ５）で蛍光放出を検出した。Ｌｅｉｃａ ＬＡＳ ＡＦソフトウェアの３Ｄビューアを用いて画像を処理した。
ｍＥＧＦＰ－ＰＤ１形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞および共焦点顕微鏡法を使用すると、三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭＡｂ（「αＴｆＲ／αＰＤ１」）がビオチン化Ｃｙ５を細胞内に送達することを示すことができた。さらに、ペイロードはＰＤ１とともにベシクルに共局在化した。２つのＮａｄａ（「Ｎａｄａ／αＰＤ１」および「αＴｆＲ／Ｎａｄａ」）および抗ＣＤ３３（「αＣＤ３３」）対照分子については、極めて限られた量のビオチン化Ｃｙ５またはＰＤ１のみが細胞内に見出された（図１２）。
実施例８：形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞と三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭＡｂとの接触後のベシクルｍＥＧＦＰ－ＰＤ１蓄積
ベシクルｍＥＧＦＰ－ＰＤ１蓄積がＰＤ１およびＴｆＲの同時結合に依存するかどうかを試験するために、三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭＡｂ（「αＴｆＲ／αＰＤ１」）をペンブロリズマブと比較した。三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭＡｂとは対照的に、ＰＤ１は、ペンブロリズマブによる処理後に細胞表面に残る（図１３）。
ｍＥＧＦＰ－ＰＤ１を形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリーによって、三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭＡｂによるＰＤ１内部移行をさらに確認した。ｍＥＧＦＰシグナルは、三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭＡｂ（「αＴｆＲ／αＰＤ１」）を加えた後２４時間かけて４０％に低下し、抗体を溶液中に放置した場合、少なくとも最大４８時間このレベルのままであった（図１４Ａ）。一価Ｎａｄａ／抗ＰＤ１ ＣｒｏｓｓＭＡｂ（「Ｎａｄａ／αＰＤ１」）は、２４時間後にＰＤ１レベルを約８０％に低下させたが、二価ペンブロリズマブは、４８時間後にわずか８５％までのゆっくりした低下を示した。興味深いことに、この形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞株上のｍＥＧＦＰ－ＰＤ１シグナルは、三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭＡｂ抗体がさらに２４時間以内に約８０％まで除去されるといつでもかなり迅速に回復した（図１４Ｂ）。
実施例９：切断型シュードモナス外毒素（ＰＥ２５）のアビディティ増強送達
このプラットフォームを使用した細胞内送達を確認するために、細胞傷害性を明らかにするためにエンドソーム／リソソーム送達を必要とする切断型シュードモナス外毒素ＰＥ２５を使用した。国際公開第２０１５１０１５８９号に切断型シュードモナス外毒素誘導体について以前に記載された方法によって、ＰＥ２５を大腸菌内で産生し、精製した。次いで、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示書に従って、２０倍過剰のＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎを使用して、切断型シュードモナス外毒素をビオチン化した。ウエスタンブロットによって毒素のビオチン化の成功を検証した。ビオチン化ＰＥ２５を、三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭＡｂ １１２９または対照抗体９９０３もしくは９９０４とＰＢＳ中で１０分間かけて複合体化し、野生型、ＰＤ１低Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＰＤ１高Ｊｕｒｋａｔ細胞と４８時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ生存性発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって細胞生存性を評価した。
予測されるように、ビオチン化ＰＥ２５自体は、適用された濃度では毒性ではない（図１５Ａ）。抗ＰＤ１／Ｎａｄａ抗体９９０４（「αＰＤ１／Ｎａｄａ＋ｂｉｏ ＰＥ２５」）を介して送達された場合、細胞生存度は漸増濃度に伴って低下し、この効果は高ＰＤ１発現ではさらに顕著である。ただし、顕著な細胞傷害性を達成するためには１００ｎＭの抗体が必要とされる。ＴｆＲの迅速な内部移行性質に起因して、Ｎａｄａ／抗ＴｆＲ抗体（「Ｎａｄａ／αＴｆＲ＋ｂｉｏ ＰＥ２５」）は毒素を送達し、細胞生存度を用量依存的に低下させた。この効果は、三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂ（「αＰＤ１／αＴｆＲ＋ｂｉｏ ＰＥ２５」）についても見ることができたが、Ｎａｄａ／抗ＴｆＲ抗体とは対照的に、三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂは、抗体を１０ｎＭ未満の濃度で加えた場合、抗ＴｆＲ／Ｎａｄａの最大１００分の１の濃度で高ＰＤ１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞生存度を低下させた。ビオチン化ＰＥ２５を用いない場合、いずれの抗体も、４８時間のアッセイ時間枠にわたって、適用された濃度でいかなる毒性も示さなかった（図１５Ｂ）。
実施例１０：活性化ヒトＴ細胞における三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂのアビディティ増強結合および内部移行
初代ヒトＴ細胞との相互作用について、抗体をさらに評価した。Ｔ細胞の単離のために、製造者の推奨に従ってＦｉｃｏｌｌ（登録商標）Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と、Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（商標）遠心管（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ）とを使用して、健康なヒトドナー由来の新鮮な血液を処理した。プレートに結合した抗ＣＤ３および可溶型抗ＣＤ２８を用いてヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を活性化し、これにより、Ｔ細胞表面上に約２００，０００分子のＴｆＲおよび約８，０００分子のＰＤ１の発現がもたらされた。
三重特異性抗ＰＤ１抗ＴｆＲ抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂ １１２９（「αＴｆＲ／αＰＤ１」）は、ビオチン化Ｃｙ５（Ｃｙ５色素はＡＰＣ（アロフィトシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｔｏｃｙａｎｉｎ））とスペクトル的に等価であるため、フローサイトメーターのＡＰＣチャネルを使用してＣｙ５を検出することができる）によって、対照抗体９９０３（「αＴｆＲ／Ｎａｄａ」）および９９０４（「Ｎａｄａ／αＰＤ１」）が活性化Ｔ細胞への結合をほとんど示さない濃度で検出された（図１６Ａ）。０時間および１時間の時点でＡＦ４８８標識二次抗体を使用して細胞表面上のＩｇＧを染色した後を通して、２つの抗ＴｆＲ含有抗体１１２９（「αＴｆＲ／αＰＤ１」）および（程度は低いが）９９０３（「αＴｆＲ／Ｎａｄａ」）では有意な内部移行が観察されたが、Ｎａｄａ／抗ＰＤ１抗体９９０４（「Ｎａｄａ／αＰＤ１」）では観察されなかった（図１６Ｂ）。
実施例１１：移植片対宿主病における活性化Ｔ細胞のアビディティ媒介殺傷
治療用途として移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を調査した。高度に活性化された宿主Ｔ細胞の短期間の根絶は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に顕著な影響を及ぼし得る。ＰＢＭＣを２０日間かけて移植し、通常はやがてＧｖＨＤで死亡する腫瘍担持マウス由来の脾臓Ｔ細胞を評価した（図１７Ａ）。この目的のために、ヒトリンパ球分離管（ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｏｌｌ、ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示書に従って使用して、健康なボランティアドナー由来のヒトＰＢＭＣを単離した。ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；ＪＡＸストック＃００５５５７）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに注文した。腫瘍担持マウスに、１００μＬのＰＢＳ中の１０７個のヒトＰＢＭＣを尾静脈を介して静脈内接種した。２０日後、脾臓を解剖し、７０μｍの抑制剤によって細胞を分離した。細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ１およびＴｆＲについて染色し、フローサイトメトリーによって分析して、浸潤したヒトＴ細胞上のＴｆＲおよびＰＤ１の発現を評価した。
マウス脾臓細胞内で検出されたヒトＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を含む）の７０％超が、ＴｆＲ（ここでは「ＣＤ７１」と表記する）およびＰＤ１について二重陽性であった（図１７Ｂ）。
ＰＥ２５と複合体化した三重特異性抗ＴｆＲ抗ＰＤ１抗ビオチンＣｒｏｓｓＭａｂ（「ａＰＤ１／αＴｆＲ＋ＰＥ」）を用いたこれらの脾臓細胞の処理は、この細胞プール内のヒトＴ細胞の数を減少させるのに必要な用量の１０～１０００倍の減少を示した（図１７Ｃ）。
実施例１２：二価様式でＰＤ１に結合し、一価様式でＴｆＲに結合する（２＋１フォーマット）二重特異性抗体の増強された内部移行
がん治療に現在適用されているＰＤ１結合抗体は、典型的には二価分子であり、すなわち、ＰＤ１に対する２つの結合ドメインを有する。ＴｆＲ結合二重特異性抗体を、ＰＤ１の二価結合を可能にするフォーマットで試験して、それらが増強された内部移行と、それによる増強された力価とを付与するかどうかを調べた。ここで試験した抗体は、実施例３に記載されるように生成した。
試験分子の組成は、図１８Ａに概略的に示されている。第１の２＋１フォーマットは、ＩｇＧ構成のＣｒｏｓｓＦａｂアームとしての１つのＰＤ１結合実体と、ノブ・イントゥー・ホールＦｃヘテロ二量体（抗体８１５７）の第２のサブユニットのヒンジに融合されたＴｆＲ結合Ｆａｂの上部にある（すなわち、Ｎ末端に結合している）第２のＰＤ１結合ＣｒｏｓｓＦａｂアームとを有する。第２の２＋１フォーマットは、ＩｇＧのアームとして２つのＰＤ１結合ＣｒｏｓｓＦａｂアームを有し、ＴｆＲ結合Ｆａｂは、非対称（ノブ・イントゥー・ホール）ＣＨ３ドメイン（抗体８１５６）の「ホール」サブユニットのＣ末端に結合している。対照分子は、それらではＴｆＲバインダーの可変領域が「Ｎａｄａ」と呼ばれる非結合配列に交換されたことを除いて、同じフォーマットおよび組成で生成した（図１８Ｂ）。さらなる対照は、別のバインダー（図１８Ｂ、左側）を加えない親二価ＰＤ１結合ＩｇＧ（ＰＤ１－０１０３－０３１２）であった。
二価様式でＰＤ１に結合し、一価様式でＴｆＲに結合する二重特異性抗体を内部移行アッセイに使用した。実験装置は実施例６と同じであった。結果を図１９に示す。二価様式でＰＤ１に結合するがＴｆＲバインダーを担持しない３つの対照分子はいずれも、それらのフォーマットにかかわらず、かなり低い内部移行を示した。対照的に、二価様式でＰＤ１に結合し、一価様式でＴｆＲに結合する二重特異性抗体フォーマットは、著しく増加した内部移行率を示した。
図１９の試験した全コンストラクトは、同じ親二価抗ＰＤ１抗体に基づく。親抗ＰＤ１抗体ＰＤ１－０１０３－０３１２およびＮａｄａ配列含有分子（８１５９および８１５８）は、内部移行に対する増加した傾向を示さなかった。一方、抗体８１５６および８１５７は、３時間後に強い内部移行の程度を示した。
実施例１３：親二価抗ＰＤ１抗体と比較して一価様式（１＋１フォーマット）でＰＤ１およびＴｆＲに結合する二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂの等しいＴ細胞エフェクター機能
最小混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）を使用して、同種異系環境における抗ＴｆＲ抗ＰＤ１二重特異性抗体の効果、特に様々な分子に曝露した際の同種特異的Ｔ細胞の細胞傷害性に対する効果を評価した。この設定は、同種異系単球由来の成熟樹状細胞（ｍＤＣ）と５日間共培養した、新たに単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞からなった。
ｍＤＣの生成は、単球からの未成熟樹状細胞形成を誘導するために、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０５０－２０１）を介した単球の単離、続いて、ＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ４（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中での５日間の培養を必要とした。ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）をさらに２日間かけて加えて、ＤＣ成熟を誘導した。
ｍＭＬＲの１日目に、非血縁ドナー由来のＣＤ４ Ｔ細胞を、製造者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０４５－１０１）に従ってＣＤ４ビーズによる陽性選択によって精製し、５μＭのカルボキシ－フルオレセイン－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて標識した後、同種異系ｍＤＣと共培養した。次いで、ＣＤ４ Ｔ細胞およびｍＤＣを、ウェル当たり１０５個のＣＤ４ Ｔ細胞および２×１０４個の同種異系ｍＤＣとともに５：１の比で９６ウェルプレートに播種した。二価抗ＰＤ１抗体ＰＤ１－０１０３．０３１２、二重特異性抗Ｔｆｒ抗ＰＤ１抗体８０１２、８０１３および８０１４、ならびに対照抗体８０１５、８０１６、８０１７、８０１８および８０１９の７段階希釈系列を加え、最高濃度は１０μｇ／ｍｌ、最低濃度は１０ｐｇ／ｍｌであった。
５日間の共培養後、上清の半分を除去し、ゴルジ輸送阻害剤、Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）およびＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｓｉｎ）を含有する新鮮な培地と交換し、続いて、３７℃でさらに５時間インキュベートして、細胞質へのサイトカイン蓄積を可能にした。次いで、細胞を洗浄し、抗ヒトＣＤ４（ＢＶ６０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｙｅ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定／透過処理した。最後に、グランザイムＢ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）の細胞内染色を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４．２ソフトウェア内の曲線下面積分析による用量応答（刺激）分析：ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ）およびＡＵＣに基づいて、ＥＣ５０の値を計算する。
混合リンパ球反応の結果は、グランザイムＢ産生としてＴ細胞エフェクター機能を示した（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。バインダーＮａｄａ／５１Ａ１６５（８０１５）およびＮａｄａ／１０２６（８０１６）による一価ＴｆＲ結合はグランザイムＢ分泌を誘導しなかったのに対して、一価抗ＰＤ１コンストラクトＰＤ１－０１０３－０３１２／Ｎａｄａ（８０１４）およびペンブロリズマブ／Ｎａｄａ（８０１９）は中程度のグランザイムＢ分泌をもたらしたが、二価ＰＤ１－０１０３－０３１２によって達成されるＥＣ５０値には達しなかった。
ＰＤ１－０１０３－０３１２／ＴｆＲ二重特異性抗体（８０１２、８０１３）およびペンブロリズマブ／ＴｆＲ二重特異性抗体（８０１７、８０１８）はＰＤ１に一価でのみ結合しているが、グランザイムＢの分泌を引き起こす際の二価抗ＰＤ１ブロッキング抗体ＰＤ１－０１０３－０３１２と力価に関して同じ範囲にあり、同等のエフェクターＴ細胞機能性をもたらした（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。表１５および表１６は、対応する対照分子と比較した活性（ＥＣ５０値によって測定される）の改善を示す（対照分子と対比した倍率変化として表される）。表１５および表１６から分かるように、１つの二重特異性抗体における１つのＰＤ１結合実体と１つのＴｆＲ結合実体との組合せは、対応する一価対照（抗ＰＤ１抗Ｎａｄａ）と比較して、抗体活性を約１００～５０００倍改善した。
Figure 2024528217000021
実施例１４：二価抗ＰＤ１抗体と比較した、ＴＣＢおよびＢＢＢフォーマット二重特異性２＋１抗体フォーマットによって誘導される増強されたＴ細胞エフェクター機能
実験装置は実施例１３と同じであり、ＰＤ１－０１０３－０３１２および抗体８１５６～８１５９の６段階希釈系列を用い、最高濃度は１０μｇ／ｍｌ、最低濃度は１００ｐｇ／ｍｌであった。
ＴＣＢおよびＢＢＢフォーマット（８１５６および８１５７）によって処理した際の混合リンパ球反応の結果は、二価の親抗ＰＤ１抗体の約７分の１のＥＣ５０値を示したほか、それぞれの対照（８１５８および１８１５９）と比較して低下したＥＣ５０値を示し、グランザイムＢ分泌の増加、したがって、これらのフォーマットによって誘導されるＴ細胞エフェクター機能の増加をもたらした（図２１）。表１７および表１８は、対応する対照分子と比較した活性の改善（測定したＥＣ５０値に基づく）を示す。
Figure 2024528217000022
表１７および表１８から分かるように、単一の２＋１フォーマット二重特異性抗体における２つのＰＤ１結合実体と１つのＴｆＲ結合実体との組合せは、二価の親抗ＰＤ１抗体と比較して約７～８倍、および対応する２＋１対照（抗ＰＤ１：抗Ｎａｄａ＝２：１）と比較して約４、５～１６倍だけ抗体活性を改善した。
実施例１５：２＋１および１＋１フォーマット二重特異性抗体によって誘導されたＴ細胞エフェクター機能の比較
観察された結果間の直接的な比較を可能にするために、ＰＤ１－０１０３－０３１２、ペンブロリズマブならびに抗体８０１２～８０１４、８０１７～８０１９、および８１５６～８１５９の６段階希釈系列を用いて、実施例１３からの実験装置を１回の実験で繰り返し、最高濃度は１０μｇ／ｍｌ、最低濃度は１００ｐｇ／ｍｌであった。
混合リンパ球反応の結果は、Ｔ細胞エフェクター機能の代理としてグランザイムＢ産生を示す。可読性を良くするために、結果は、３つの異なる図に分割されているが、１つの実験から得られた（図２２Ａ～Ｃ）。一価１＋１フォーマット（８０１２、８０１３、８０１７、８０１８）による処理後、Ｔ細胞によるグランザイムＢ分泌は、それぞれの二価抗ＰＤ１抗体ＰＤ１－０１０３－０３１２（図２２Ａ）およびペンブロリズマブ（図２２Ｂ）によって達成されるものと同等の範囲にある。
Ｔ細胞を２＋１フォーマット（８１５６、８１５８）によって処理した場合、グランザイムＢ分泌は、ペンブロリズマブおよびＰＤ１－１０３－０３１２によって引き起こされる分泌と比較して増加し、これらのフォーマットによって誘導されるさらに増強されたＴ細胞エフェクター機能が示された（図２２Ｃ）。２つのＰＤ－１結合ドメインおよび１つのＮａｄａ結合ドメインを有する２つの対照分子８１５８および８１５９は、二価ＰＤ１バインダーＰＤ１－０１０３－０３１２およびペンブロリズマブと同等のグランザイムＢ分泌を示した。
Figure 2024528217000023
全試験分子のＥＣ５０値を示す表１９から分かるように、分子８１５７は、ＰＤ１－０１０３－０３１２またはそれぞれの対照分子８１５９の約９～１０倍強力であることが見出されたが、分子８１５６は、Ｔ細胞エフェクター機能の増強に関して、２つの対照分子ＰＤ１－０１０３－０３１２および８１５８の４倍の力価を達成することに成功した。８１５６および８１５７も、ペンブロリズマブの数倍強力であった。
実施例１６：マウス化抗ＰＤ１－ＴｆＲコンストラクトおよび対照の内部移行
ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、マウス化された代理抗ＰＤ１抗ＴｆＲ二重特異性抗体および対照分子を生成する（配列については、表２０を参照）。
Figure 2024528217000024
ｉｎ ｖｉｖｏ実験の前に、細胞に基づくアッセイで、分子６７６８および６７９４が細胞内に内部移行する能力を試験した。実験装置は、本質的に実施例６に記載される通りであった。分子６７６９をネガティブコントロールとした。マウス化分子はマウスＴｆＲに結合するため、ここでは、マウスＴｆＲを発現するＢＡ／Ｆ３細胞株（ＲＮＣＢアクセッション番号：ＣＬ００３２０１）によって活性化ヒトＣＤ４細胞を置換した。
検出のために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲート抗ＤＡＰＧ抗体を使用した。次いで、幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）、およびＡＦ６４７＋ＢＡ／Ｆ３細胞の頻度を、それぞれの分子とともに４℃で３０分間インキュベートした直後に染色および固定した群と、３７℃でさらに３時間インキュベートした群との間で比較し、以下の式を用いて内部移行の割合を計算した：
内部移行％＝１００－（（ＧＭＦＩ ＡＦ６４７＋ＢＡ／Ｆ３細胞 ３７℃÷ＧＭＦＩ ＡＦ６４７＋ＢＡ／Ｆ３細胞 ４℃）＊１００）
図２３に示すように、生物学的機能性に関して、６７６８（ｍＴｆＲ－００１／ｈｕＰＤ１－４７８ ＴＣＢフォーマット）および６７９４（ｍＴｆＲ－００１／Ｎａｄａ ＴＣＢフォーマット）を含有する両分子は、３時間後に約７０％の良好な内部移行率を示したが、６７６９（ｈｕＰＤ１／Ｎａｄａ）は内部移行を示さず、代わりに細胞表面に蓄積したと述べることができる。
実施例１７：マウス化ＰＤ１－ＴｆＲ分子がＰＤ１／ＰＤＬ１媒介シグナル伝達をブロックする能力
マウス化分子６７６８および６７６９（表２０を参照）がＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介シグナル伝達をブロックする能力を試験した。分子６７９４をネガティブコントロールとして使用し、抗ＰＤ１抗体０１０３－０３１２をポジティブコントロールとして使用した。マウス化コンストラクト６７６８および６７６９は抗ヒトＰＤ１抗原結合ドメインを含有するため、実施例４に記載されるのと同じ実験装置を使用して、ＰＤ１－ＰＤＬ１シグナル伝達経路ブロックに関するそれらの機能性を決定した。
図２４に見られるように、抗ＰＤ１抗原結合ドメインを含有しない対照分子６７９４（ｍＴｆＲ－００１／Ｎａｄａ、ＴＣＢフォーマット）は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介シグナル伝達のブロックを示さなかった。分子６７６８（ｍＴｆＲ－００１／ｈｕＰＤ１－４７８、ＴＣＢフォーマット）および６７６９（Ｎａｄａ／ｈｕＰＤ１－４７８、ＴＣＢフォーマット）は、抗ＰＤ１抗体ＰＤ１－０１０３－０３１２のような二価抗ＰＤ１結合ドメインを含有し、ＰＤ１－ＰＤＬ１経路のブロックに関して同等の機能性を示した。
実施例１８：マウス皮下結腸直腸同系モデルの確立
皮下結腸直腸同系モデルを使用して、ＣＲＯ Ａｎｔｉｎｅｏ（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）で、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるｍｕＰＤ１およびｍｕＰＤ－１－ＮＡＤＡと比較して、ｍｕＰＤ１－ＴｆＲ ２＋１フォーマット化合物のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価する。試験に使用するマウス化代理分子の配列を表２０に示す。この皮下モデルの読出しは、腫瘍増殖阻害である。要約すると、６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、皮下注射された５×１０５個のＭＣ３８細胞を接種する。ガイドラインに従って継続的な健康モニタリングを用いて、特定の病原体がない条件下でマウスを維持する。
マウスを様々な処置群に無作為化し、皮下モデルではノギスによって測定した場合に腫瘍が平均１００ｍｍ３の体積に達した際に治療を開始する。処置はいずれも静脈内投与し、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量のｍｕＰＤ１－ＴｆＲ、ｍｕＰＤ１、およびｍｕＰＤ－１－ＮＡＤＡを調査する。腫瘍体積をノギスを使用して測定し、以下の式を用いて計算する：
腫瘍体積＝長さ×幅×深さ×４／３π
腫瘍増殖阻害を読出しとして使用し、多重比較の群平均の有意差を試験するために、Ｄｕｎｎｅｔｔの方法とともに標準的な分散分析（一方向ＡＮＯＶＡ）を使用する。分析には、ＪＭＰ統計ソフトウェアプログラムを使用する。
先述の発明は、理解を明瞭にする目的で説明および例示によりある程度詳細に記載されたが、それら記載および例示は本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に引用されるすべての特許および科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に援用される。

Claims (15)

  1. ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体。
  2. ＰＤ１に特異的に結合する第３の抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインがＦａｂ断片である、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
  4. 第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、Ｆａｂ断片のうちの１つ以上が、Ｆｃドメインに融合されており、Ｆｃドメインが、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ ＦｃドメインまたはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、請求項３に記載の二重特異性抗体。
  5. 第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および存在する場合、第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、抗体が、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合ドメインが、存在する場合、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 第１、第２および第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ断片であり、抗体が、第１および第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、
    第１の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、
    第２の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、
    第３の抗原結合ドメインが、そのＦａｂ重鎖のＮ末端で、Ｆｃドメインの第１または第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、請求項２から４のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体であって、二重特異性抗体は、
    ａ）ＴｆＲおよびＰＤ１を発現する細胞の表面上のＴｆＲおよびＰＤ１に結合し、二重特異性抗体が前記細胞内に内部移行され、かつ／または
    ｂ）二重特異性抗体が前記細胞の表面に提示されたＴｆＲおよびＰＤ１に結合すると、前記細胞の表面からＰＤ１が枯渇する、二重特異性抗体。
  8. 少なくとも２つの重鎖と少なくとも２つの軽鎖とを含み、
    ａ）二重特異性抗体の重鎖が、γ型（ＩｇＧ）、特にγ１型のものであり、かつ／または
    ｂ）二重特異性抗体の軽鎖が、カッパ（κ）および／もしくはラムダ（λ）サブタイプから選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  9. Ｆｃドメインが、
    ｉ．Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換、および／または
    ｉｉ．Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む、請求項４から８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  10. ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、Ｆａｂ断片のうちの１つでは、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられている、請求項３から９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  11. ＴｆＲに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが、
    ｉ．ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
    ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
    ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
    ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
    ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
    ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
    を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
    または
    ｉｉ．ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
    ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
    ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
    ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
    ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
    ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
    を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  12. ＰＤ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、
    ｉ．ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
    ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
    ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
    ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
    ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
    ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
    を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
    または
    ｉｉ．ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
    ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
    ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに
    ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
    ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
    ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
    を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  13. ｉ．ＴｆＲに特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または
    ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
    かつ
    ｉｉ．ＰＤ１に特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインおよび／または、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または
    ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  15. がんの予防または治療における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または請求項１４に記載の薬学的組成物。
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