JP2023509215A - 抗ｔｉｇｉｔ抗体、それを含む多重特異性抗体及びその使用方法。 - Google Patents

抗ｔｉｇｉｔ抗体、それを含む多重特異性抗体及びその使用方法。 Download PDF

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Abstract

「ＩｇとＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）」に結合する、ＴＩＧＩＴと一つ又は複数の別の抗原に対して結合特異性を有する多重特異性抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体及びその使用方法を提供する。これらの抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体を含む。該一つ又は複数の別の抗原は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月１０日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７１３３６号の優先権を主張し、それの内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ＩｇとＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）」に結合する、ＴＩＧＩＴと一つ又は複数の別の抗原に対して結合特異性を有する多重特異性抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む抗体及びその使用方法に関するものである。いくつかの実施例において、該一つ又は複数の別の抗原は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）を含む。
ＩｇとＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）は、免疫細胞（例えば、活性化Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞））によって発現される免疫チェックポイント受容体であり、免疫阻害を媒介する。ＴＩＧＩＴのリガンドは、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）を含み、それはすでに樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ及び多くのヒト癌細胞から同定されており、ＴＩＧＩＴに結合した後に、Ｔ細胞の活性化とサイトカインの分泌をダウンレギュレートできることを示した。ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ相互作用の阻害は、免疫細胞の有効な抗腫瘍活性を媒介することができる。免疫チェックポイント調整におけるＴＩＧＩＴの重要な役割を考慮して、当分野において、依然として、ＴＩＧＩＴによって媒介される免疫細胞を調整するための免疫療法と癌治療用治療分子と方法を開発する必要がある。
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）は、活性化Ｔ細胞とＢ細胞によって発現され、免疫阻害を媒介する重要な免疫チェックポイント受容体である。それは、ＣＤ２８受容体ファミリーのメンバーであり、これらのメンバーは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ１及びＢＴＬＡを含む。ＰＤ１の二つの細胞表面糖タンパク質リガンドＰＤＬ１とＰＤＬ２が同定されており、それらは、抗原提示細胞及び多くのヒト癌で発現し、ＰＤ１に結合した後に、Ｔ細胞の活性化とサイトカインの分泌をダウンレギュレートすることを示した（Ｆｒｅｅｍａｎら，２０００、Ｌａｔｃｈｍａｎら，２００１）。ＣＴＬＡ－４と異なっており、ＰＤ１は、主に、外周組織において役割を果たし、そのうちの活性化Ｔ細胞は、腫瘍及び／又は間質細胞により発現される免疫阻害性ＰＤＬ１とＰＤＬ２リガンドに遭遇する可能性がある（Ｆｌｉｅｓら，２０１１、Ｔｏｐａｌｉａｎら，２０１２）。臨床前モデルにおいて、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用の阻害は、有効な抗腫瘍活性を媒介し（米国特許第８，００８，４４９と７，９４３，７４３号）、且つ臨床試験において、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用の抗体阻害剤の癌治療への用途を検討した。そのため、ＰＤＬ１を標的とする抗癌治療剤の開発を必要とする。
本開示は、高親和性でＴＩＧＩＴに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体を提供し、それは、ＴＩＧＩＴと一つ又は複数の別の標的に結合する多重特異性抗体を含む。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施例において、別の標的は、ＰＤ１である。本開示はさらに、抗体、免疫コンジュゲート及びこれらの抗体を含む薬物組成物を調製する方法、抗体、免疫コンジュゲート、及びこれらの抗体を含む薬物組成物を使用して、例えば疾患と病症（例えば、癌）の治療に用いる方法を提供する。本発明は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体と、ＴＩＧＩＴとＰＤ１の両者に結合する多重特異性抗体との発見に部分的に基づくものであり、これらの抗体は、免疫細胞における免疫応答を増加させ、改善した抗腫瘍効果を提供することができる。
本開示は、ＴＩＧＩＴとＰＤ１に結合する多重特異性抗体を提供する。いくつかの実施例において、本明細書に開示される多重特異性抗体は、ｉ）ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）ＰＤ１に結合する抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨを含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体又はＶＨＨは、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－７Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－８Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約３×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約２×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して、重鎖可変領域を含む参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体の重鎖可変領域は、
ａ）配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｂ）配列番号９８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１００に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｃ）配列番号１０２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１０４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号１０６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１０８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｅ）配列番号１１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１１２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｆ）配列番号１１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１１６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｇ）配列番号１１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１２０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｈ）配列番号１２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１２４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｉ）配列番号１２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１２８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｊ）配列番号１３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１３２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｋ）配列番号１３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１３６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｌ）配列番号１３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１４０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｍ）配列番号１４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１４４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｎ）配列番号１４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１４８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｏ）配列番号１５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１５２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｐ）配列番号１５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１５６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｑ）配列番号１５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１６０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｒ）配列番号１６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１６４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｓ）配列番号１６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１６８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｔ）配列番号１７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１７２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｕ）配列番号１７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１７６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｖ）配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｗ）配列番号１８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１８４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
ｘ）配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、又は、
ｙ）配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、
ａ）配列番号９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６及び１９０のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８３、１８７及び１９１のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８及び１９２のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ＣＤＲ１ドメインと、ＣＤＲ２ドメインと、ＣＤＲ３ドメインとを含み、ここでは、該ＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインは、それぞれ、参照重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインを含み、該参照重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号９８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１００に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１１３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１１７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１５３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１５７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１９３に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して、重鎖可変領域を含む参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体の重鎖可変領域は、
（ａ）配列番号１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｅ）配列番号１７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｆ）配列番号２１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｇ）配列番号２５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｈ）配列番号２９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｉ）配列番号３３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｊ）配列番号３７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｋ）配列番号４１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｌ）配列番号４５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｍ）配列番号４９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｎ）配列番号５３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｏ）配列番号５７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｐ）配列番号６１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｑ）配列番号６５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｒ）配列番号６９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｓ）配列番号７３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｔ）配列番号７７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、及び、
（ｕ）配列番号８１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、
（ａ）配列番号１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｅ）配列番号１７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｆ）配列番号２１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｇ）配列番号２５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｈ）配列番号２９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｉ）配列番号３３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｊ）配列番号３７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｋ）配列番号４１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｌ）配列番号４５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｍ）配列番号４９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｎ）配列番号５３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｏ）配列番号５７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｐ）配列番号６１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｑ）配列番号６５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｒ）配列番号６９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｓ）配列番号７３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｔ）配列番号７７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、及び、
（ｕ）配列番号８１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０及び８４からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ヒト化フレームワークを含む。
いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、参照抗ＰＤ１抗体と交差競合する抗ＰＤ１抗体を含み、該参照抗ＰＤ１抗体は、ａ）（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２１）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２２２）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２２３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２２４）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２２５）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２２６）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、ｂ）（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２９）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号２３０）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２３１）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＴＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２３２）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号２３３）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号２３４）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、ｃ）（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２３７）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２３８）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３９）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２４０）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４１）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２４２）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、又は、ｄ）（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２４５）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２４６）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２４７）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４８）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４９）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２５０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２１）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２２２）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２２３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２２４）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２２５）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２２６）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２９）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号２３０）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２３１）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２３２）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号２３３）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号２３４）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２３７）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２３８）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３９）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２４０）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４１）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２４２）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２４５）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２４６）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２４７）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４８）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４９）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２５０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、ヒト化抗体を含む。
いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ１抗体を含み、該抗ＰＤ１抗体は、二本の抗体重鎖と、二本の抗体軽鎖を含む。いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、二つ又はより多くの抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む。いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、二種の抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む。
いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの各本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの各本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの各本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの各本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。
いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、リンカーを介して第２の抗原結合部分に連結される。いくつかの実施例において、ｅリンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、配列番号１９５－２２０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分の抗ＰＤ１抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選ばれるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分の抗ＰＤ１抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選ばれるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むいくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）（１）配列番号２２９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２３０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２３１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２３２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２３３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２３４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）（１）配列番号２３７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２３８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２３９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２４０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２４１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２４２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）（１）配列番号２２１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２２２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２２３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２２４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２２５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２２６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）（１）配列番号２４５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２４６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２４７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２４８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２４９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２５０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号２５３に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２５４に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号２５５に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２５６に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号２５７に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２５８に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号２５９に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２６０に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む。
本開示は、治療剤に連結される、本明細書に開示される任意の多重特異性抗体を含む免疫コンジュゲートをさらに提供する。いくつかの実施例において、治療剤は、細胞毒素である。いくつかの実施例において、治療剤は、放射性同位体である。
本開示は、薬物組成物をさらに提供する。いくつかの実施例において、薬物組成物は、ａ）本明細書に開示される多重特異性抗体又は免疫コンジュゲートと、ｂ）薬学的に許容されるキャリア剤を含む。
本開示は、本明細書に開示される任意の多重特異性抗体をコードする核酸をさらに提供する。本開示は、本明細書に開示される任意の核酸を含むベクターをさらに提供する。本開示は、本明細書に開示される核酸又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
本開示は、本明細書に開示される多重特異性抗体を調製するための方法をさらに提供する。いくつかの実施例において、該方法は、本明細書に開示される宿主細胞において多重特異性抗体を発現し、宿主細胞から多重特異性抗体を単離することを含む。
本開示は、被験体の腫瘍負荷を軽減する方法をさらに提供する。いくつかの実施例において、該方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示される多重特異性抗体、免疫コンジュゲート又は薬物組成物を投与することを含む。
いくつかの実施例において、該方法は、腫瘍細胞の数を減らすいくつかの実施例において、該方法は、腫瘍サイズを小さくする。いくつかの実施例において、該方法は、被検体の腫瘍を根絶する。いくつかの実施例において、腫瘍は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、膠芽細胞腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本開示は、被験体の新生物の治療及び／又は予防方法をさらに提供する。いくつかの実施例において、該方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示される多重特異性抗体、免疫複合体又は薬物組成物を投与することを含む。
本開示は、新生物を有する被験体の生存期間を延長する方法をさらに提供する。いくつかの実施例において、該方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示される多重特異性抗体、免疫複合体又は薬物組成物を投与することを含む。
いくつかの実施例において、新生物は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、膠芽細胞腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本開示は、本明細書に開示される、薬物として用いられる多重特異性抗体をさらに提供する。本開示は、本明細書に開示される、癌の治療に用いられる多重特異性抗体をさらに提供する。本開示は、本明細書に開示される、薬物として用いられる薬物組成物をさらに提供する。本開示は、本明細書に開示される、癌の治療に用いられる薬物組成物をさらに提供する。いくつかの実施例において、癌は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、膠芽細胞腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本開示は、本明細書に開示される多重特異性抗体、免疫コンジュゲート、薬物組成物、核酸、ベクター又は宿主細胞を含むキットをさらに提供する。いくつかの実施例において、キットは、新生物を治療及び／又は予防するためのマニュアルを含む。
フローサイトメトリーアッセイによって決定される代表的なＶＨＨ二価抗体とヒトＴＩＧＩＴの全細胞結合を描画する。図１Ａは、参照抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体（参照Ａｂ １）に比べる測定を示す。図１Ｂは、他のＶＨＨ抗体を用いる異なる特定を示す。Ｙ軸は、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ ４８８の平均蛍光強度を表す。Ｘ軸は、ナノモル単位の抗体濃度を表す。２Ｂ７、１Ｇ１、１Ｃ１２、３Ｇ６、２Ｂ１０、３Ｇ７、３Ｇ１０、１３Ｈ１１及び１５Ａ５は、抗ヒトＴＩＧＩＴのＶＨＨクローンである。Ｐｒｉｓｍの非線形回帰方法を用いてＥＣ５０値を得て、表においてナノモルでこれらの値を示す。図１Ｃは、ＴＩＧＩＴ ＶＨＨ二価抗体の構造概略図である。 同上。 同上。 代表的な二価抗体のＴＩＧＩＴ活性遮断における効果を描画し、この活性は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによって決定される。代表的な抗ＴＩＧＩＴ二価抗体と低濃度のブドウ球菌エンテロ毒素が存在する場合、ヒトＴＩＧＩＴとＮＦＡＴレポーター遺伝子によって安定してトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）によって安定してトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞と共培養する。Ｙ軸は、相対発光単位でＮＦＡＴルシフェラーゼ活性を示す。Ｘ軸は、ナノモル単位の抗体濃度を表す。参照Ａｂ １は、参照抗ｈ－ＴＩＧＩＴ抗体である。２Ｂ７、１Ｇ１、１Ｃ１２、３Ｇ６、２Ｂ１０、３Ｇ７及び３Ｆ１０は、抗ｈ－ＴＩＧＩＴの代表的なクローンである。Ｐｒｉｓｍの非線形回帰方法を用いてＥＣ５０値を得て、表においてナノモルでこれらの値を示す。 同上。 フローサイトメトリーアッセイによって決定されるヒト化１Ｃ１２と１Ｇ１クローンと、ヒトＴＩＧＩＴと、の全細胞結合を描画する。１Ｃ１２ヒト化形式の代表的な結果は、図３Ａに示すとおりである。１Ｃ１２キメラ抗体は、１Ｃ１２クローンのＬｌａｍａ ＶＨＨ配列及びヒトＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３ドメインを有する抗体であり、１Ｃ１２（Ｆ－ＥＲＥＦ）、１Ｃ１２（Ｆ－ＥＲＥＷ）及び１Ｃ１２（Ｆ－ＧＬＥＷ）は、１Ｃ１２クローンのヒト化形式であり、差異は、フレームワーク２における突然変異である。１Ｇ１ヒト化形式の代表的な結果は、図３Ｂに示すとおりである。１Ｇ１キメラ抗体は、１Ｇ１クローンのＬｌａｍａ ＶＨＨ配列及びヒトＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３ドメインを有する抗体である。１Ｇ１（Ｆ－Ｇ－ＥＲＥＳ）、１Ｇ１（Ｆ－Ａ－ＥＲＥＳ）、１Ｇ１（Ｆ－Ａ－ＥＲＥＷ）及び１Ｇ１（Ｆ－Ａ－ＧＬＥＷ）は、フレームワーク２における、異なる突然変異を有するヒト化１Ｇ１クローンの四つの異なる形式である。Ｙ軸は、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ ４８８の平均蛍光強度値である。Ｘ軸は、ナノモル単位の抗体濃度の値である。 同上。 ヒト化１Ｃ１２と１Ｇ１クローンのＴＩＧＩＴ活性遮断における効果を記述し、この活性は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによって決定される。ＴＩＧＩＴ遮断ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおける１Ｃ１２ヒト化形式の代表的な結果は、図４Ａに示すとおりである。参照抗ｈ－ＴＩＧＩＴ抗体参照Ａｂ １に比べて、全てのクローンは、より有効である。１Ｇ１ヒト化形式の代表的な結果は、図４Ｂに示すとおりである。Ｙ軸は、ＮＦＡＴルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ、相対発光単位）を表す。Ｘ軸は、ナノモル単位の抗体濃度を表す。 同上。 代表的なクローンに対する、遮断ＥＬＩＳＡからのＩＣ５０値（ナノモル単位）と全細胞結合からのＥＣ５０値（ナノモル単位）との相関性を描画する。クローン名称は、添付図面においてマーキングされている。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して相関性を分析する。 代表的なクローン試験に対する熱安定性を描画する。ＶＨＨ抗体サンプルを２５℃から７０℃まで加熱し、６０分間継続する。ＥＬＩＳＡ又は全細胞結合を用いて、加熱されたサンプルとヒトＴＩＧＩＴとの結合を検査する。図６Ａは、ＥＬＩＳＡアッセイにおける代表的なクローンの加熱されたサンプルとｈ－ＴＩＧＩＴ ＥＣＤとの結合を示し、ここでは、添付図面の例においてクローン名称がマーキングされている。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡアッセイによって得られたＯＤ４５０を表す。Ｘ軸は、処理温度を表す。図６Ｂは、代表的なクローンの加熱されたサンプルと、フローサイトメトリーによって決定される、Ｊｕｒｋａｔ細胞において安定して発現するｈ－ＴＩＧＩＴと、の結合を示す。Ｙ軸は、ｈ－ＴＩＧＩＴとの結合の百分率を表す。Ｘ軸は、処理温度を表す。 同上。 ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ結合アッセイによって決定される２Ａ３－ＦｃとヒトＴＩＧＩＴとの結合のエピトープを描画する。ｈｉｓタグを有するヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ（２００ｎＭ）の組換えタンパク質をセンサにロードする。三種の異なる濃度の２Ａ３－Ｆｃを注射することで、結合を検出する。二回目の注射により、図７Ａに示される２Ａ３－Ｆｃについて追加の結合が検出されていないが、三種の異なる濃度の参照Ａｂ ２、一種の参照抗ＴＩＧＩＴ抗体（図７Ｂに示すように）又は参照Ａｂ １（図７Ｃに示すように）を注射することで、結合が検出されている。結果により、参照Ａｂ ２と参照Ａｂ １に比べて、２Ａ３クローンは、異なる結合エピトープを有する。 同上。 同上。 ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される２Ａ３－Ｆｃの、ヒト－、カニクイザル－及びマウス－ＴＩＧＩＴに対する交差結合活性を描画する。図８Ａは、２Ａ３－Ｆｃと組換えヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤとの結合を示す。参照Ａｂ ２は、抗ＴＩＧＩＴ参照抗体である。２Ａ３－Ｆｃと参照Ａｂ ２は、いずれも、類似する親和性でｈ－ＴＩＧＩＴに結合する。抗ＰＤＬ１は、ｈ－ＴＩＧＩＴに結合しない。図８Ｂは、２Ａ３－Ｆｃと組換えｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴとの結合を示す。２Ａ３－Ｆｃと参照Ａｂ ２は、いずれも、類似する親和性でｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴに結合する。抗ＰＤＬ１は、ｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴに結合しない。図８Ｃは、２Ａ３－Ｆｃと組換えマウスＴＩＧＩＴとの結合を示す。２Ａ３－Ｆｃと参照Ａｂ ２は、いずれも、マウスＴＩＧＩＴに結合していないが、抗マウスＴＩＧＩＴ参照抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）＃１４２１０１）とマウスＴＩＧＩＴは、高親和性で結合する。Ｙ軸は、ＯＤ４５０を表し、Ｘ軸は、μｇ／ｍｌ単位の抗体濃度を表す。 同上。 同上。 全細胞結合アッセイとヒトＴＩＧＩＴ遮断レポーター遺伝子アッセイにおける代表的なクローン２Ａ３－Ｆｃとホットスポット補正形式の２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃの効き目との比較を描画する。Ｙ軸は、上記添付図面において、平均蛍光強度を表し、下記添付図面において、相対発光単位換算でのＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を表す。Ｘ軸は、ナノモル単位の抗体濃度を表す。ホットスポット補正形式の２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃは、親クローン２Ａ３－Ｆｃと類似する効き目を有する。 ホットスポット補正形式の２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃと参照抗－ｈ－ＴＩＧＩＴ抗体参照Ａｂ ２の親和性の比較を描画する。図１０Ａは、全細胞結合におけるホットスポット補正形式の２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃと参照Ａｂ ２の効き目の比較を示す。Ｙ軸は、ＣｙｔｏＦｌｅｘを用いたフローサイトメトリーアッセイによって決定されるＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ ４８８の平均蛍光強度を表す。Ｘ軸は、ナノモル単位の抗体濃度を表す。示されるデータは、三つの異なる実験からの代表的な結果である。２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃとｈ－ＴＩＧＩＴの親和性は、参照Ａｂ ２の親和性よりも僅かに高い。図１０Ｂは、ＴＩＧＩＴ遮断ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイにおけるホットスポット補正式の２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃと参照Ａｂ ２の効き目の比較を示す。Ｙ軸は、相対発光単位換算でのＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を表す。Ｘ軸は、ナノモル単位の抗体濃度を表す。２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃは、参照Ａｂ ２と類似する効き目を有する。 同上。 ２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃのインビトロ抗腫瘍効き目を描画する。ＴＩＧＩＴ＋ Ｔ細胞とＰＶＲ＋樹状細胞（ＤＣ）を使用して、混合リンパ球反応測定（ＭＬＲ）を行う。４８時間共培養した後、培養上澄み液においてＴ細胞からのＩＬ－２分泌を測定する。抗ＰＤ１抗体は、陽性対照として用いられる。抗ＨＥＲ２抗体は、陰性対照として用いられる。 Ｏｃｔｅｔ結合アッセイによって決定される２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ野生型（ｗｔ）とＦｃ突然変異（ＤＬＥとＶＬＰＬＬ）と、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＢ及びマウスＦｃγＲＩＶと、の結合を描画する。センサにＦｃγＲＩＩＩＡ、人ＦｃγＲＩＩＢとマウスＦｃγＲＩＶのＥＣＤ組換えタンパク質がロードされており、ＦｏｒｔｅＢｉｏを用いて、５種の異なる濃度の２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ ｗｔ、ＤＬＥ又はＶＬＰＬＬ突然変異体の会合及び解離が検出されている。Ｙ軸は、会合、解離及びＲｍａｘを表す。Ｘ軸は、秒単位の時間を表す。野生型に比べて、ＤＬＥとＶＬＰＬＬ突然変異体は、いずれも、強化した、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡとの結合親和性を有し、ＤＬＥ突然変異体も、強化した、ヒトＦｃγＲＩＩＢとの結合親和性を有するが、ＶＬＰＬＬ突然変異体について、ヒトＦｃγＲＩＩＢとの結合親和性が低下した。全ての形式は、いずれも、マウスＦｃγＲＩＶと類似する親和性を有する。 ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ ｗｔ、ＤＬＥ変異体による、ＴＩＧＩＴ活性とヒトＦｃγＲＩＩＩＡによって媒介される活性の遮断への影響をそれぞれ描画する。図１３Ａは、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用して決定されるＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ ｗｔ、ＤＬＥ突然変異体による、ＴＩＧＩＴ活性の遮断への影響を描画する。ヒトＴＩＧＩＴとＮＦＡＴレポーター遺伝子によって安定してトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を、ＰＶＲによって安定してトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞と共培養する。２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ ｗｔと突然変異体を加え、５時間培養する。ルシフェラーゼ活性によって、ＴＣＲによって媒介される活性を測定する。Ｙ軸は、相対発光単位でＮＦＡＴルシフェラーゼ活性を示す。Ｘ軸は、ナノモル単位の抗体濃度を表す。図１３Ｂは、ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ ｗｔ、ＤＬＥ突然変異体による、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡによって媒介される活性への影響を描画し、この活性は、ＦｃγＲＩＩＩＡによって媒介されるＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子活性によって決定される。異なる濃度の２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ ｗｔ、ＤＬＥ突然変異体が存在する場合、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡとＮＦＡＴによって安定してトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を、ヒトＴＩＧＩＴによって安定してトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞と５時間共培養する。ルシフェラーゼ活性を測定し、Ｙ軸には相対発光単位で表す。Ｘ軸は、ナノモル単位の抗体濃度を表す。 同上。 抗ＴＩＧＩＴ抗体のインビボ有効性に対する分析を描画する。ヒトＴＩＧＩＴノックインＣ５７ＢＬ／６マウスとＭＣ３８マウス結腸癌モデルにを用いた。治療の一週間前に、マウスにＭＣ３８腫瘍細胞を接種した。平均腫瘍サイズが約５１ｍｍ３に達した時、治療を開始し、腹膜内に１週間に二回投与し、２．５週間持続した。２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ抗体を一回当たり６ｍｇ／ｋｇ投与したか又は参照Ａｂ ２を一回当たり１１ｍｇ／ｋｇ（２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ抗体とは、ｍｏｌｅ／ｋｇで同じである）を投与した。図１４Ａは、ブランク対照、２Ａ３－Ｆｃ－ｗｔ、ＤＬＥ突然変異を有する２Ａ３－Ｆｃ及び参照Ａｂ ２で投与した、腫瘍を有するマウスの腫瘍増殖曲線を描画する。単一の腫瘍体積の結果は、図１４Ｂに示される。図１４Ｃは、研究において各実験群の体重の変化が著しくないことを示す。 同上。 同上。 抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１多重特異性抗体の複数種の構造を描画する。 Ｏｃｔｅｔ結合アッセイによって決定されるＢｓＡｂの、ｈ－ＴＩＧＩＴとｈ－ＰＤ１に対する二重結合能力を描画する。センサにＢｓＡｂがロードされており、そして、異なる濃度のｈ－ＰＤ１ ＥＣＤ組換えタンパク質（ｈｉｓタグを有する）を注入する。ＢｓＡｂとｈ－ＰＤ１ＥＣＤとを会合した後、センサに異なる濃度のｈ－ＴＩＧＩＴ ＥＣＤ組換えタンパク質（ｈｉｓタグを有する）を再び注入する。抗ＴＩＧＩＴ ｘ 抗ＰＤ１（ａＴＩＧＩＴ ｘ ａＰＤ１）－ＨＣＣ、ＨＣＮ、ＬＣＣ及びＬＣＮの結合曲線は、それぞれ、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示される。モノクローナル抗体ａＴＩＧＩＴ又はａＰＤ１の結合曲線は、（Ｅ）と（Ｆ）に示される。全てのＢｓＡｂは、いずれも、ｈ－ＰＤ１とｈ－ＴＩＧＩＴに対する二重結合能力を有する。Ｙ軸は、会合／解離とＲｍａｘを表す。Ｘ軸は、秒単位の時間を表す。 フローサイトメトリーを用いた全細胞結合アッセイによって決定される、ＢｓＡｂのｈ－ＴＩＧＩＴの単一腕への結合の親和性を示す。抗体をｈ－ＴＩＧＩＴでトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞と共にインキュベートし、Ｆｃ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされる抗ｈ－ＩｇＧ Ｆｃの第２の抗体を使用して抗体とｈ－ＴＩＧＩＴとの結合を決定する（フローサイトメトリーによって検出を行う）。Ｙ軸は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。Ｘ軸は、抗体の濃度を表す。抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂに比べて、ＢｓＡｂ ＨＣＮとＬＣＮ形式は、ｈ－ＴＩＧＩＴに対する結合親和性を保持したが、ＢｓＡｂのＨＣＣとＬＣＣ形式は、ｈ－ＴＩＧＩＴに対する結合親和性の低下を示した。 ＴＩＧＩＴ遮断ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによって測定された、ＴＩＧＩＴ遮断におけるＢｓＡｂの効き目を描画する。ＰＶＲによってトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞と低濃度のブドウ球菌エンテロ毒素が存在する場合、ｈ－ＴＩＧＩＴとＮＦＡＴレポーター遺伝子をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞を、抗体とインキュベートする。化学発光リーダーによって、ＴＣＲによって媒介されるＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定し、Ｙ軸に相対発光単位で示す。ＢｓＡｂのＨＣＮ形式は、ｈ－ＴＩＧＩＴを遮断するための最も有効なＢｓＡｂである。 フローサイトメトリーを用いた全細胞結合アッセイによって決定される、ＢｓＡｂのｈ－ＰＤ１単一腕への結合の親和性を示す。抗体をｈ－ＰＤ１でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞と共にインキュベートし、Ｆｃ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされる抗ｈ－ＩｇＧ Ｆｃの第２の抗体を使用して結合を決定する（それは、フローサイトメトリーによって検出を行う）。Ｙ軸は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。Ｘ軸は、抗体の濃度を表す。全てのＢｓＡｂは、いずれも、ｈ－ＰＤ１に対する類似する結合親和性を示し、モノクローナル抗ＰＤ１親対照に比べて、親和性は、やや低かった。 ＰＤ１遮断ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによって測定された、ＰＤ１単一腕の遮断におけるＢｓＡｂの効き目を描画する。ＰＤＬ１とＣＤ３によってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が存在する場合、ｈ－ＰＤ１とＮＦＡＴレポーター遺伝子によってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を用いて抗体インキュベートを行う。化学発光リーダーによって、ＴＣＲによって媒介されるＮＦＡＴルシフェラーゼ活性を測定し、Ｙ軸に相対発光単位で示す。親抗ＰＤ１ ｍＡｂに比べて、全てのＢｓＡｂは、いずれも、遮断能力を保持した。 ＴＩＧＩＴとＰＤ１遮断アッセイの組み合わせを使用して決定された、ＢｓＡｂがＴＩＧＩＴとＰＤ１とを二重遮断する効き目を描画する。ＰＶＲとＰＤＬ１によってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及び低濃度のブドウ球菌エンテロ毒素が存在する場合、ｈ－ＴＩＧＩＴ、ｈ－ＰＤ１及びＮＦＡＴＴレポーター遺伝子によってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞をｍＡｂ、ｍＡｂの組み合わせとＢｓＡｂと共にインキュベートする。化学発光リーダーによって、ＴＣＲによって媒介されるＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定し、Ｙ軸に相対発光単位で示す。抗ＴＩＧＩＴ（ａＴＩＧＩＴ）と抗ＰＤ１（ａＰＤ１）の組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ又は抗ＰＤ１ ｍＡｂよりも有効である。全てのＢｓＡｂは、いずれも、抗ＴＩＧＩＴ（ａＴＩＧＩＴ）と抗ＰＤ１（ａＰＤ１）との組み合わせよりも有効である。 ｈ－ＰＤ１とｈ－ＴＩＧＩＴダブルノックインＣ５７ＢＬ／６マウスを用いたＭＣ３８同遺伝子腫瘍モデルにおけるＢｓＡｂインビボ有効性を描画する。治療の一週間前に、マウスに０．５×１０６個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下接種した。一週間後に、平均腫瘍サイズが約４３ｍｍ３を達する時、マウスを６群にランダムに分け、各群７匹のマウスとし、媒体（ＰＢＳ）、抗ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ（ａＴＩＧＩＴ－Ｆｃ）、抗ＰＤ１（ａＰＤ１）、ａＴＩＧＩＴ－Ｆｃ ＋ ａＰＤ１及びＢｓＡｂ ＨＣＮの組みわせを指定の投与量で腹膜内（ＩＰ）に投与し、治療を行う。週に二回の（Ｂ．Ｉ．Ｗ．）により治療を行う。図２２Ａに示すように、腫瘍体積を二週ごとに測定し、Ｙ軸にｍｍ３で示したが、これは、ａＴＩＧＩＴ－ＦｃとａＰＤがいずれも腫瘍増殖を著しく低下させたことを示す。試験の２０日目に、全ての動物を安楽死させ、腫瘍組織を切除し、秤量した。各試験群の個体腫瘍重量（ＴＷ）を図２２Ｂに描画する。 同上。 抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体の複数の作用メカニズムを記述する。図２３Ａは、ＢｓＡｂがＰＤ１とＴＩＧＩＴ二重陽性又は単一陽性ＣＤ８＋ Ｔ細胞中の阻害信号を遮断することができ、且つＰＤＬ１とＰＶＲ二重陽性腫瘍細胞又はＰＶＲ単一陽性腫瘍細胞からの阻害信号を遮断することができることを示す。図２３Ｂは、ＢｓＡｂがＮＫ細胞における阻害シグナルとＴｒｅｇにおける刺激シグナルを遮断することができることを示す。 同上。
本開示は、高親和性でＴＩＧＩＴに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体を提供し、それは、ＴＩＧＩＴと一つ又は複数の別の標的に結合する多重特異性抗体を含む。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施例において、別の標的は、ＰＤ１である。本開示はさらに、抗体、免疫コンジュゲート及びこれらの抗体を含む薬物組成物を調製する方法、抗体、免疫コンジュゲート、及びこれらの抗体を含む薬物組成物を使用して、例えば疾患と病症（例えば、癌）の治療に用いる方法を提供する。本発明は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体と、ＴＩＧＩＴとＰＤ１の両者に結合する多重特異性抗体との発見に部分的に基づき、これらの抗体は、免疫細胞における免疫応答を増加させ、改善した抗腫瘍効果を提供することができる。
限定するものではなく、明確にするために、現在では開示されるテーマの具体的な実施形態は、以下のように分けられる。
１．定義、
２．抗体、
３．使用方法、
４．薬物製剤、及び
５．製品。
１．定義
本明細書において、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、且つ様々な抗体構造をカバーし、これらの抗体構造は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単一ドメイン抗体及び抗体断片を含むが、それらに限らず、それらは、必要な抗原結合活性を示せばよい。
「抗体断片」は、完全な全長抗体の抗原結合部分を含む分子を指し、この完全な全長抗体は、完全な抗体に結合する抗原に結合する。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、抗体断片で形成される多重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨナノ抗体、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体又は抗原に結合する抗体の任意の他の断片が挙げられるが、それらに限らない。「ＶＨＨ」は、ラクダ科動物から単離された単一ドメイン抗体を指す。いくつかの実施例において、ＶＨＨは、ラクダ重鎖抗体の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、ＶＨＨのサイズは、２５ｋＤａを超えない。いくつかの実施例において、ＶＨＨのサイズは、２０ｋＤａを超えない。いくつかの実施例において、ＶＨＨのサイズは、１５ｋＤａを超えない。
「全長抗体」は、二本の重鎖と、二本の軽鎖を含む抗体を指す。軽鎖と重鎖の可変領域は、抗原結合の役割を担当する。重鎖と軽鎖の可変領域は、それぞれ、「ＶＨ」と「ＶＬ」と呼ばれてもよい。二本の鎖における可変領域は、一般的には、三つの高度に可変なループを含み、これは、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣ－ＣＤＲ１と、ＬＣ－ＣＤＲ２と、ＬＣ－ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ、ＨＣ－ＣＤＲ１と、ＨＣ－ＣＤＲ２と、ＨＣ－ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ）と呼ばれる。本明細書に開示される抗体と抗原結合断片のＣＤＲ境界は、周知の慣例、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの慣例（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ １９９７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８５；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８９；Ｋａｂａｔ １９８７；Ｋａｂａｔ １９９１）によって定義又は同定されてもよい。重鎖又は軽鎖の三つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるフランキングセグメントの間に挿入され、それらは、ＣＤＲよりも保存性が高く、高可変ループを支持する足場を形成する。重鎖と軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、複数のエフェクター機能を示す。抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、抗体を分類する。抗体の五つの主要なクラス又はアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμ重鎖が存在することを特徴とする。いくつかの主要な抗体クラスは、サブクラス、例えば、ｌｇＧ１（γ１重鎖）、ｌｇＧ２（γ２重鎖）、ｌｇＧ３（γ３重鎖）、ｌｇＧ４（γ４重鎖）、ｌｇＡ１（α１重鎖）又はｌｇＡ２（α２重鎖）に分けられる。
参照抗体と「結合について交差競合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、競合アッセイにおいて、参照抗体は、抗体とその抗原との結合を５０％以上遮断する。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［抗体］、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ））において、例示的な競合アッセイが記載されている。
「Ｆｖ」は、最小抗体断片であり、それは、完全な抗原認識部位と、抗原結合部位とを含有する。この断片は、密に非共有結合した一つの重鎖可変領域と一つの軽鎖可変領域の二量体からなる。この二つのドメインの折り畳みから、六つの高可変ループ（重鎖と軽鎖のそれぞれの３つのループ）が放出され、この高可変ループは、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗原に対する抗体の結合特異性を付与する。しかしながら、完全な結合部位よりも低い親和性で行われる場合があっても、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異性を有する三つのＣＤＲのみを含む半分のＦｖ）でさえ、抗原を認識し、結合することができる。
「一本鎖Ｆｖ」（略語は「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」でもある）は、単一のポリペプチド鎖に連結されたＶＨとＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施例において、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、このポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖに関する概説は、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［モノクローナル抗体の薬理学］，第１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇとＭｏｏｒｅによる編集Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ［シュプラガー出版社］，ニューヨーク，ページ２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
本明細書の目的のために、「受容体ヒトフレームワーク」又は「ヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークに「由来」する受容体ヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、又は、アミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、又は２個以下であってもよい。いくつかの実施例において、ＶＬ受容体フレームワークとＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒト共有フレームワーク配列とは、配列の方面では同じである。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の総合の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書に使用されるように、「結合親和性」は、内部結合親和性を指し、それは、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）で表されてもよい。親和性は、当分野の既知の通常の方法（本明細書に記載のものを含む）で測定されてもよい。以下、結合親和性を測定するための具体的な説明と例示的な実施例を記述する。
「親和性が成熟した」抗体は、このような改変を有しない親抗体に比べて、一つ又は複数のＣＤＲ又は高可変領域（ＨＶＲ）において一つ又は複数の改変を有する抗体を指し、この改変は、抗原に対する抗体の改善した親和性を提供する。
本明細書に使用されるように、「ＩｇとＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体」又は「ＴＩＧＩＴ」は、任意の脊椎動物由来（哺乳動物（例えば、霊長類動物（例えば、ヒトとカニクイザル）を含む）からの任意の天然ＴＩＧＩＴポリペプチド、又はその任意の断片を指し、且つ多くとも一個、多くとも二個、多くとも三個、多くとも四個、多くとも五個、多くとも六個、多くとも七個、多くとも八個、多くとも九個又は多くとも十個のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を任意選択的に含んでもよい。この用語は、全長の未処理のＴＩＧＩＴ及び細胞における処理によって生成される任意の形式のＴＩＧＩＴをカバーする。この用語は、ＴＩＧＩＴの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体をさらにカバーする。本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体によって標的とされるヒトＴＩＧＩＴアミノ酸配列の非限定的な例は、以下のとおりである。
Figure 2023509215000001
「ＴＩＧＩＴのＥＣＤ」という用語は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインを指す。例えば、配列番号２６１に示す例示的なＴＩＧＩＴタンパク質のＥＣＤは、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2023509215000002
「抗ＴＩＧＩＴ抗体」と「ＴＩＧＩＴに結合する抗体」という用語は、ＴＩＧＩＴを標的とする診断剤及び／又は治療剤として使用することができるように、十分な親和性でＴＩＧＩＴに結合することができる抗体を指す。一実施例において、無関係な、非ＴＩＧＩＴタンパク質の抗ＴＩＧＩＴ抗体との結合の程度は、該抗体とＴＩＧＩＴとの結合の約１０％よりも小さく、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。いくつかの実施例において、ＴＩＧＩＴに結合する抗体は、＜約１μＭ、＜約１００ｎＭ、＜約１０ｎＭ、＜約１ｎＭ、＜約０．１ｎＭ、＜約０．０１ｎＭ又は＜約０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍから１０－１２Ｍ、例えば、１０－９Ｍから１０－１０Ｍ）という解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、異なる種からのＴＩＧＩＴに保存されたＴＩＧＩＴエピトープに結合する。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、タンパク質のＥＣＤにおけるＴＩＧＩＴ上のエピトープに結合する。
本明細書に使用されるように、「プログラム細胞死タンパク質１」又は「ＰＤ１」は、任意の脊椎動物由来（哺乳動物（例えば、霊長類動物（例えば、ヒトとカニクイザル）を含む）からの任意の天然ＰＤ１ポリペプチド、又はその任意の断片を指し、且つ多くとも一個又は多くとも二個又は多くとも三個のアミノ酸の置換、付加又は欠失を任意選択的に含んでもよい。この用語は、「全長」の未処理のＰＤ１及び細胞における処理によって生成される任意の形式のＰＤ１をカバーする。この用語は、ＰＤ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体をさらにカバーする。本開示の抗ＰＤ１抗体によって標的とされるヒトＰＤ１アミノ酸配列の非限定的な例として、ＮＰ＿００５００９．２、ＸＰ＿０１６８５９７８２．１、ＸＰ＿００６７１２６３６．１というＮＣＢＩ参照番号を有するポリペプチド、及びその任意の変異体、修正及び子孫が挙げられる。
「抗ＰＤ１抗体」と「ＰＤ１に結合する抗体」という用語は、ＰＤ１を標的とする診断剤及び／又は治療剤として使用することができるように、十分な親和性でＰＤ１に結合することができる抗体を指す。いくつかの実施例において、抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ ２０１７／０５０８５１（国際公開ＷＯ ２０１８／０５２８１８ Ａ１として開示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている任意の抗ＰＤ１抗体である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来するが、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。いくつかの実施例において、本明細書に開示されるキメラ抗体は、ラクダ科動物重鎖可変領域と、ヒトＦｃ領域を含む。
本明細書に使用されるように、「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び／又は軽鎖の可変領域内の不連続な抗原結合部位を指す。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［生化学雑誌］，２５２：６６０９－６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔら，米国衛生公共サービス部，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ［免疫学的意味を有するタンパク質配列］」（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］１９６：９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，２７３：９２７－９４８（１９９７）、ＭａｃＣａｌｌｕｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］２６２：７３２－７４５（１９９６）、ＡｂｈｉｎａｎｄａｎとＭａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］，４５：３８３２－３８３９（２００８）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．ら，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の発展と比較］，２７：５５－７７（２００３）、及びＨｏｎｅｇｇｅｒとＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，３０９：６５７－６７０（２００１）に記載されており、ここでは、相互比較の時、アミノ酸残基を含む重複又はサブセットが定義される。しかしながら、いずれか一つの定義を応用して抗体又は移植した抗体又はその変異体を指すＣＤＲは、本明細書で定義されて使用される用語の範囲内であることが意図される。上記各参照文献に定義されているＣＤＲをカバーするアミノ酸残基は、下記表１に入れられて比較に用いられる。ＣＤＲ予測アルゴリズムとインターフェースは、当分野の既知のものであり、例えば、ＡｂｈｉｎａｎｄａｎとＭａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］，４５：３８３２－３８３９（２００８）、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．［核酸研究］，３８：Ｄ３０１－Ｄ３０７（２０１０）、及びＡｄｏｌｆ－Ｂｒｙｆｏｇｌｅ Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．［核酸研究］，４３：Ｄ４３２－Ｄ４３８（２０１５）を含む。本章節において参照される参照文献の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれ、本明細書に用いられ、且つ本明細書の一つ又は複数の請求項に含まれる可能性がある。
Figure 2023509215000003
表現「例えば、Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」又は「例えば、Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置番号付け」及びその変異体は、上記Ｋａｂａｔらの抗体アセンブラの重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に対応するより少なく又は別のアミノ酸を有してもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔの残基５２ａに基づくものである）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔの残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなどに基づくものである）を含んでもよい。抗体配列を「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列と相同性領域で比較することによって、所与の抗体の残基のＫａｂａｔ番号付けを決定することができる。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体（例えば、本明細書に開示される単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体）のＣＤＲをカバーするアミノ酸残基は、上記のＬｅｆｒａｎｃらのＩＭＧＴ命名法に基づいて定義される。いくつかの実施例において、全長抗体（例えば、本明細書に開示される抗ＰＤ１抗体）のＣＤＲをカバーするアミノ酸残基は、上記のＫａｂａｔらのＫａｂａｔ命名法に基づいて定義される。いくつかの実施例において、免疫グロブリン重鎖、例えば、Ｆｃ領域における残基番号付けは、上記Ｋａｂａｔらに記載のＥＵインデックスの番号付けである。「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けである。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、本明細書で定義されるＣＤＲ残基以外のそれらの可変ドメイン残基を指す。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲ／ＨＶＲからのアミノ残基又はヒトＦＲからのアミノ酸残基のキメラ抗体を指す。いくつかの実施例において、ヒト化抗体は、基本的に少なくとも一つ、典型的に二つの可変ドメインの全てを含み、ここでは、ＨＶＲ／ＣＤＲの全て又は基本的に全ては、非ヒト抗体のものに対応し、且つＦＲの全て又は基本的に全ては、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含む。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形式」は、ヒト化した抗体を指す。
「ヒト抗体」は、アミノ酸配列を有する抗体を指し、このアミノ酸配列は、ヒトによって生成される抗体のアミノ酸配列に対応し、及び／又は、本明細書に開示されるヒト抗体の調製のための任意の技術によって調製された。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。当分野の既知の種々の技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を用いてヒト抗体を生成してもよい。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍとＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，２２２：５８１（１９９１）。モノクローナル抗体の調製にも使用可能であるものは、Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ［モノクローナル抗体と癌療法］，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ページ７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１４７（１）：８６－９５（１９９１）に記載の方法である。また、ｖａｎ Ｄｉｊｋとｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．［薬理学の新知見］，５：３６８－７４（２００１）を参照されたい。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答してそのような抗体を生成するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効になったトランスジェニック動物（例えば、免疫したｘｅｎｏｍｉｃｅ）に抗原を投与することによって調製され得る（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関わる米国特許第６，０７５，１８１号と第６，１５０，５８４号を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体は、さらに、例えば、Ｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］１０３：３５５７－３５６２（２００６）。
「本明細書によって同定されるポリペプチドと抗体配列に関わるアミノ酸酸配列同一性パーセント（％）」又は「相同性」を、配列の整列（配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮する）の後、候補配列における、比較されるポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同じであるアミノ酸残基のパーセントと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するという目的のために、当分野の技術における種々の方法で比較を実現させることができ、例えば、公衆に取得可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）又はＭＵＳＣＬＥソフトウェアを用いてもよい。当業者は、比較される配列の全長範囲内に最大比較を実現させる任意のアルゴリズムを含み、測定比較に用いられる適当なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、配列比較コンピュータプログラムＭＵＳＣＬＥを用いて、アミノ酸配列同一性％の値を生成する（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ［核酸研究］３２（５）：１７９２－１７９７，２００４；Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ［ＢＭＣ生物情報学］５（１）：１１３，２００４）。
「相同」は、二つのポリペプチド間又は二つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す。二つの比較配列の一つの位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有される時、例えば、二つのＤＮＡ分子のそれぞれの一つの位置がアデニンによって占有される時、この分子は、この位置で相同である。二つの配列間の相同性パーセントは、二つの配列が共有するマッチするか又は相同な位置の数を比較される位置の数で割って１００を掛けた関数である。例えば、二つの配列における１０個の位置のうちの６個は、マッチするか又は相同なものであれば、二つの配列は、６０％相同である。例えば、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を有する。通常、二つの配列が最大相同性を与えるように整列される時に、比較が行われる。
「定常ドメイン」という用語は、免疫グロブリン分子の一部を指し、それは、免疫グロブリンの別の部分、即ち可変ドメインに対して、保存性がより高いアミノ酸配列を有し、それは、抗原結合部位を含む。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（ＣＨと総称される）と、軽鎖のＣＬドメインを含む。
任意の哺乳動物種の抗体（例えば免疫グロブリン）の「軽鎖」は、いずれも、その定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、二つの明らかに異なるタイプのうちの一つとして指定することができ、それぞれｋａｐｐａ（「κ」）とｌａｍｂｄａ（「λ」）と呼ばれる。
「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも呼ばれる）は、通常、約アミノ酸１１８から約アミノ酸２１５（ＥＵ番号付けシステム）である。
「ヒンジ領域」は、通常、ＩｇＧにおける、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０に対応する領域と定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］２２：１６１－２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間のＳ－Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによってＩｇＧ１配列と整列させることができる。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域（「Ｃ２」ドメインとも呼ばれる）の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０である。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密にペアリングしていないため、ユニークである。代わりに、二つのＮ連結した分岐炭水化物鎖が、完全な天然ＩｇＧ分子の二つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。推測によれば、炭水化物は、ドメイン－ドメインペアリングした代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化に寄与することができる。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］，２２：１６１－２０６（１９８５）。
「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃ２」ドメインとも呼ばれる）は、ＣＨ２ドメインとＦｃ領域のＣ末端との残基（即ち、約アミノ酸残基３４１から抗体配列のＣ末端まで）を含み、通常、ＩｇＧのアミノ酸残基４４６又は４４７にある。
本明細書における「Ｆｃ領域」又は「断片結晶可能領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するためのものであり、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界が変化可能であるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域をＣｙｓ２２６位置でのアミノ酸残基又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル基末端まで延びるものと定義する。例えば、抗体の生産又は精製期間又は抗体重鎖をコードする核酸に対して組換えてエンジニアリングを行うことによって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムの残基４４７に基づくものである）を除去することができる。従って、完全な抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基を除去した抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群及びＫ４４７残基を付帯するか又は付帯しない抗体混合物を有する抗体群を含んでもよい。本明細書に記載の抗体に用いられる適切な天然配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述する。好ましいＦｃＲは、天然ヒトＦｃＲである。なお、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含むＦｃＲであり、対立遺伝子変異体又はこれらの変異体のスプライス形式を含み、ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）とＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、それは、類似するアミノ酸配列を有し、主な区別は、その細胞質ドメインにある。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシンに基づく阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の年度コメント］１５：２０３－２３４（１９９７）を参照されたい。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈとＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の年度コメント］，９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ［免疫方法］４：２５－３４（１９９４）、及びｄｅ Ｈａａｓら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．［実験と臨床医誌］１２６：３３０－４１（１９９５）に概説される。本明細書の「ＦｃＲ」という用語は、他のＦｃＲをカバーし、将来同定されるＦｃＲを含む。
本明細書に使用されるように、「エピトープ」という用語は、抗原又は抗原結合部分が結合する抗原上の特定の原子又はアミノ酸基を指す。二つの抗体又は抗原結合部分は、抗原に対して競合的結合を有すれば、それらは、抗原内の同じエピトープに結合できる。
本明細書に使用されるように、「特異的に結合」、「特異的に認識」及び「……に対して特異性を有する」という用語は、測定と再現が可能である相互作用を指し、例えば、標的と抗体又は抗体部分との結合であり、これは、ヘテロ分子（生体分子を含む）群が存在する時の標的の存在を決定する。例えば、標的（エピトープであってもよい）を特異的に認識する抗体又は抗体部分は、この標的に結合する抗体又は抗体部分であり、その親和性、結合性、レディー及び／又は持続時間は、他の標的との結合よりも長い。いくつかの実施例において、抗体と関係のない標的との結合程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される抗体と標的との結合程度よりも約１０％小さい。いくつかの実施例において、標的に特異的に結合する抗体の解離定数（ＫＤ）≦１０－５Ｍ、≦１０－６Ｍ、≦１０－７Ｍ、≦１０－８Ｍ、≦１０－９Ｍ、≦１０－１０Ｍ、≦１０－１１Ｍ、又は≦１０－１２Ｍである。いくつかの実施例において、抗体は、異なる種のタンパク質から保存されたタンパク質に対するエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施例において、排他的結合を含んでもよいが、これに限定しない。抗体又は抗原結合ドメインの結合特異性は、当分野の既知の方法で実験によって決定されてもよい。このような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ－、ＥＩＡ－、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）－テストとペプチド走査を含むが、それらに限らない。
「単離した」抗体（又は構築体）は、その生産環境の成分（例えば、天然又は組換え）から同定、単離及び／又は回収された抗体である。いくつかの実施例において、単離したポリペプチドは、生産環境において全ての他の成分に会合しないか又は基本的に会合しない。
本明細書に記載の構築体、抗体又はその抗原結合断片をコードする「単離した」核酸分子は、その生産環境において、通常、それに関連する少なくとも一つの汚染物核酸分子から同定されて単離された核酸分子である。いくつかの実施例において、単離した核酸は、生産環境に関連する全ての成分に会合しないか又はほとんど会合しない。本明細書に記載のポリペプチドと抗体をコードする単離した核酸分子の形式は、天然に存在する形式又はバックグラウンドと異なる。従って、単離した核酸分子は、細胞に天然に存在する本明細書に記載のポリペプチドと抗体をコードする核酸と異なる。単離した核酸は、核酸分子を通常、含む細胞に含まれるこの核酸分子を含むが、この核酸分子は、染色体外又はその天然染色体位置と異なる染色体位置に存在する。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において、操作可能に連結されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適用される制御配列は、プロモーター、任意選択的なオペロン配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞がプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸が別の核酸配列と機能的関係にある場合、核酸は「操作可能に連結されている」。例えば、プレ配列又は分泌リーダー配列のＤＮＡをポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現させる場合、このプレ配列又は分泌リーダー配列のＤＮＡは、このポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与える場合、このプロモーター又はエンハンサーは、この配列に操作可能に連結され、又は、リボソーム結合部位が翻訳に役立つように位置決めされる場合、このリボソーム結合部位は、コード配列に操作可能に連結される。通常、「操作可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、必ずしも連続的である必要はない。便利な制限部位で連結を行うことで、連結を実現させる。このような部位が存在しなければ、通常の実践に基づいて、合成したオリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを用いる。
本明細書に使用されるように、「ベクター」という用語は、それに連結される別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造とするベクター、及びそれが導入された宿主細胞ゲノムに組み込まれたベクターを含む。いくつかのベクターは、それに操作可能に連結される核酸の発現を指導することができる。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。
本明細書に使用されるように、「トランスフェクトした」又は「形質転換した」又は「形質導入した」という用語は、外来核酸を宿主細胞に転移又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトした」又は「形質転換した」又は「形質導入した」細胞は、外来核酸を用いて、トランスフェクト、形質転換又は形質導入した細胞であり、この細胞は、初代標的細胞及びその子孫を含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞系」及び「宿主細胞培養物」は、互換使用可能であり、外来核酸を導入した細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と、「形質転換細胞」とを含み、それは、初代形質転換細胞及びそれから派生する子孫を含むが、継代回数とは無関係である。子孫の核酸含有量は親細胞とは異なる可能性があり、且つ突然変異を含有する可能性がある。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択された機能又は生物学的活性と同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫が本明細書に含まれる。
「被験体」、「個体」及び「患者」という用語は、本明細書において、互換使用可能であり、哺乳動物を指し、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類動物又は霊長類動物を含むが、それらに限らない。いくつかの実施例において、被験体は、ヒトである。
薬剤の「有効量」は、必要な投与量と期間内に、必要な治療又は予防効果を効果的に達する量を指す。この特定の投与量は、選択された具体的な薬剤、後続の投与方案（他の化合物と組み合わせられるかどうかにかかわらず）、投与時間、結像した組織、及びこれを付帯する物理的伝達システムのうちの一つ又は複数に応じて変わってもよい。
本出願の物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療有効量」は、例えば、疾患状態、年齢、性別及び個体の体重及びこの物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストが個体において所望の応答を引き起こす能力などの要因に応じて変わってもよい。治療有効量はさらに、この物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの毒性又は有害作用のいずれもが治療上の有益な効果によって打ち消される量である。治療有効量は、一回または複数回の投与で送達することができる。
「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するのに必要な用量及び期間での有効量を指す。典型的には、必須ではなく、予防の投与量は、疾患の前又は初期に被験体において使用されるため、そのような予防有効量は、治療有効量よりも小さい。
本明細書に使用されるように、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ又はｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、有益又は所望の結果（臨床結果を含む）を得るための方法である。本出願の目的のために、有益又は所望の臨床結果は、疾患によって引き起こされる一つ又は複数の症状を軽減すること、疾患の程度を減少させること、疾患を安定させること（例えば、疾患の悪化を予防又は遅延させること）、疾患の伝播（例えば、移転）を予防又は遅延させること、疾患の再現を予防又は遅延させること、疾患の進行の速度を遅延又は緩めること、疾患状態を改善すること、疾患の軽減（一部又は全部）を提供すること、疾患の治療に必要な一つ又は複数の他の薬物の投与量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を増加又は改善すること、体重増加を増加させること及び／又は生存期間を延長することのうちの一つ又は複数を含むが、それらに限らない。「治療」は、癌の病理的結果（例えば、腫瘍体積）を減少させることをさらにカバーする。本出願の方法は、これらの治療の方面のうちのいずれか一つ又は複数を考慮する。「治療」は、治療される疾患が治癒されることを必ずしも意味しない。
理解すべきこととして、本明細書に記載の出願の実施例は、「……からなる」及び「基本的に……からなる」を含む。
本明細書に使用されるように、「約（ａｂｏｕｔ）」又は「大体（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定される特定値が許容される誤差範囲内にあることを意味し、これは、この値がどのように測定又は決定されるかによって部分的に決まり、即ち、測定システムによって制限される。いくつかの実施例において、「約」は、当分野の実践によれば、３つ又は３つを超える標準差内にあることを意味してもよい。いくつかの実施例において、「約」は、所定値の多くとも２０％（例えば、多くとも１０％、多くとも５％又は多くとも１％）の範囲を表すことができる。いくつかの実施例において、特に、生物学的システムと方法に対して、この用語は、ある値のオーダー内、例えば、５倍内又は２倍内にあることを意味してもよい。
本明細書に使用されるように、「調整」という用語は、正の方向又は負の方向に変化させることを指す。例示的な調整は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％又は約１００％の変化を含む。
本明細書に使用されるように、「増加」という用語は、正の方向に少なくとも約５％変化させることを指す。変化は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％又はより多くであってもよい。
本明細書に使用されるように、「減少」という用語は、負の方向に少なくとも約５％変化させることを指す。変化は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％又はひいては約１００％であってもよい。
本明細に用いられる「約Ｘ－Ｙ」という用語は、「約Ｘから約Ｙ」と同じ意味を有する。
本明細書と添付される請求項に用いられる時、単数形「一つ／種（ａ）」、「又は（ｏｒ）」及び「これら／この（ｔｈｅ）」は、文脈が他の状況を明確に示ない限り、複数の指示対象を含む。
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域によるそれらの生物学的活性を指し、これは、抗体のアイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合と補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の低減及びＢ細胞活性化が挙げられる。
「免疫コンジュゲート」は、一つ又は複数の異種分子（細胞毒性剤を含むが、それに限らない）にコンジュゲートされた抗体を指す。
「薬物製剤」という用語は、それに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを許容する形式にあり、かつ製剤が投与される被験体に対して許容されない毒性を有する他の成分を含有しない製剤である。
本明細書に使用されるように、「薬学的に許容されるキャリア剤」は、薬物製剤における活性成分以外の被験体に対して無毒である成分を指す。薬学的に許容されるキャリア剤は、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は防腐剤を含むが、それらに限らない。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指し、それは、抗体と抗原との結合に関与する。いくつかの実施例において、天然抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨとＶＬである）は、通常、類似する構造を有し、各ドメインは、四つの保存的フレームワーク領域（ＦＲ）と三つのＣＤＲを含む。（例えば、ＫｉｎｄｔらＫｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ［クビ免疫学］，第６１版，Ｗ．Ｈ．フーリエマン社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．），ページ９１（２００７）を参照されない。）単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分である。なお、ＶＨ又はＶＬドメインを用いて、抗原に結合する抗体から、特定の抗原に結合する抗体を単離させ、相補型ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１５０：８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されない。
２．抗体
いくつかの実施例において、本発明は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体の発見に部分的に基づき、これは、抗腫瘍治療に用いることができ、ここでは、前記抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体を選択的に阻害し、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の有益な免疫応答を誘導する。そのため、本開示は、抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体機能を阻害するアンタゴニスト抗体である。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体とリガンドとの相互作用を遮断する。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体からの免疫阻害シグナルを遮断する。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ科動物抗体又はＶＨＨ抗体を含む。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＩｇＧ、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ形式の従来の抗体に比べて、サイズが小さいため、改善した組織浸潤能力を有する。
本開示は、ＴＩＧＩＴとＰＤ１の両者に結合する抗ＰＤＬ１抗体と多重特異性抗体（本明細書において、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体と呼ばれる）をさらに提供する。いくつかの実施例において、本開示の抗体は、モノクローナル抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を含む）であってもよく、又はそれを含むものであってもよい。いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体は、ヒト化抗体を含む。いくつかの実施例において、抗体は、受容体ヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共有フレームワークを含む。
いくつかの実施例において、本開示の抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ又はＦ（ａｂ’）２断片であってもよい。いくつかの実施例において、抗体は、全長抗体、例えば、完全なＩｇＧ １抗体、又は本明細書において定義される他の抗体タイプ又はアイソタイプである。いくつかの実施例において、本開示の抗体は、本出願に記載のように、例えば、本明細書に詳細に記述された第２．１－２．１３節のように、任意の特徴が単独に又は組み合わせの形式で組み込まれてもよい。
本開示の抗体は、例えば、新生物又は癌の診断又は治療に用いることができる。いくつかの実施例において、本開示の抗体を用いることでその増殖を阻害することができる腫瘍形成及び癌は、通常、免疫療法に応答する腫瘍形成と癌を含む。いくつかの実施例において、腫瘍形成と癌は、乳癌（例えば、乳腺細胞癌）、卵巣癌（例えば、卵巣細胞癌）及び腎臓細胞癌（ＲＣＣ）を含む。本開示の方法で治療できる他の癌の例として、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳腫瘍、慢性又は急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫）、鼻咽癌，鼻咽癌、頭又は頸癌、皮膚癌又は眼内悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門領域癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外膣、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、乳腺傍癌（ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｂｒｅａｓｔ ｇｌａｎｄ）、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓癌又は尿管癌、乳癌、骨盤癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、腫瘍血管生成、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮様癌、扁平上皮癌、石綿（例えば中皮腫）によって誘導される癌を含む環境によって誘導される癌、及び上記癌の組み合わせが挙げられる。
２．１例示的な抗ＴＩＧＩＴ抗体
本開示は、ＴＩＧＩＴタンパク質に結合する単離した抗体を提供する。いくつかの実施例において、本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴのＥＣＤに結合する。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号２６２に示すアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴのＥＣＤに結合する。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体（例えば２Ａ３）と同じエピトープに結合する。
いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体のアンタゴニストとして用いられてもよい。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体の活性を少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％又は約９９．９％低下させることができる。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体の下流の免疫阻害シグナル伝達を遮断することができる。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）の免疫応答及び／又は抗腫瘍作用を増加させる。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いた治療は、試験者において、抗腫瘍の効果を示し、それにより腫瘍増殖を減少させ、及び／又は、被験体の生存期間を延長する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体は、全長抗体に比べて、小さい分子サイズを有し、その理由は、全長抗体のＦａｂドメインに比べて、単一ドメイン抗体のサイズが小さいことであり、このように、全長抗体に比べて、（例えば、腫瘍部位で）優れた組織浸潤を引き起こすことができる。いくつかの実施例において、全長抗ＴＩＧＩＴ抗体（例えば、参照Ａｂ １と参照Ａｂ ２）を用いた治療に比べて、抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いた治療は、より優れた抗腫瘍効果を示す。参照Ａｂ １は、Ｕ．Ｓ．２０１６／０１７６９６３ Ａ１に開示されているＢＭＳ ２２Ｇ２と同じアミノ酸配列を有し、参照Ａｂ ２は、Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂと同じアミノ酸配列を有し、その配列は、Ｕ．Ｓ．２０１７／００８８６１３ Ａ１に開示されている。
いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨを含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、Ｆｃ領域に連結される。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、Ｆｃ領域に連結されない。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－７Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－８Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約５×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－９Ｍから約１×１０－７ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－９Ｍから約１×１０－８ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約２×１０－９Ｍから約１×１０－８ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約２×１０－９Ｍから約５×１０－８ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－９Ｍから約５×１０－９ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号９８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１００に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１０２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１０６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ａ）配列番号９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６及び１９０のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、ｂ）配列番号９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８３、１８７及び１９１のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、ｃ）配列番号９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８及び１９２のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ＣＤＲ１ドメインと、ＣＤＲ２ドメインと、ＣＤＲ３ドメインとを含み、ここでは、このＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインは、それぞれ、参照重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインを含み、該参照重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号９８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１００に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１１３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１１７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１５３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１５７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１９３に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、重鎖可変領域に含まれる任意のアミノ酸配列は、多くとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸の置換は、保存的置換である。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号２１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号２５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号２９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号３３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号３７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号４１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号４５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号４９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号５３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号５７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号６１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号６５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号６９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号７３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号７７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号８１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号３３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号３７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号７３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号７７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号８１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０及び８４からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０及び８４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、重鎖可変領域に含まれる任意のアミノ酸配列は、多くとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸の置換は、保存的置換である。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２４に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号３２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号３６に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４０に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４４に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５６に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６０に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６４に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号７２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号７６に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号８０に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号８４に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ヒト化フレームワークを含む。いくつかの実施例において、ヒト化フレームワークは、配列番号８５－９３からなる群から選ばれる重鎖可変領域配列のフレームワーク配列を含む。いくつかの実施例において、ヒト化フレームワークは、配列番号８５－９３からなる群から選ばれる重鎖可変領域配列のＦＲ２配列を含む。
いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ領域を含まない。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選ばれるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選ばれるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を強化する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌの突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅの突然変異を含む。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１９４に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、重鎖可変領域は、リンカーを介してＦｃ領域に連結される。いくつかの実施例において、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、配列番号１９５－２２０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、二量体化可能である。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、一つ又は複数のジスルフィド結合により二量体化することができる。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、二つの二量体化した重鎖を含み、ここでは、各重鎖は、重鎖可変領域と、二量体化可能なＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、二つのジスルフィド結合を含む。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、三つのジスルフィド結合を含む。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、軽鎖を含まない。
いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、多価抗体であってもよい。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、二価、三価、四価、五価、六価、七価又は八価のものであってもよい。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、一価のものである。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、二価のものである。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、四価のものである。
いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体、全長免疫グロブリン、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合が安定したＦｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ＶＨＨ、Ｆｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合物、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又は任意のそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施例において、抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含み、それは、第２の抗原に特異的に結合する第２抗体部分を含む。
いくつかの実施例において、第２の抗原は、腫瘍に関わる抗原である。いくつかの実施例において、腫瘍に関わる抗原は、Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１、ｃ－Ｍｅｔ、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ１Ｘ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、上皮糖タンパク質（ＥＧＰ２）、栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、Ｌｅｗｉｓ Ａ（ＣＡ １．９．９）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ（ＬｅＹ）、ホスファチジルイノシトールプロテオグリカン－３（ＧＰＣ３）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ＮＧ２Ｄリガンド、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、封入タンパク質１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、腎芽細胞腫タンパク質（ＷＴ－１）、１型チロシンキナーゼ膜貫通型受容体（ＲＯＲ１）及びその任意の組み合わせからなる群から選ばれる。
いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、治療剤又はマ－カーにコンジュゲートされる。いくつかの実施例において、標識は、放射性同位体、蛍光色素及び酵素からなる群から選ばれる。
２．２例示的な抗ＰＤ１抗体
本開示は、抗ＰＤ１抗体をさらに提供する。いくつかの実施例において、本開示によって開示される抗ＰＤ１抗体は、高親和性でＰＤ１タンパク質に結合する。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、ＰＤＬ１とＰＤ１との相互作用を遮断する。いくつかの実施例において、抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ ２０１７／０５０８５１（国際公開ＷＯ ２０１８／０５２８１８ Ａ１として開示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている任意の抗ＰＤ１抗体である。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、参照抗ＰＤ１抗体と交差競合し、該参照抗ＰＤ１抗体は、ａ）（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２１）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２２２）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２２３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２２４）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２２５）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２２６）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、ｂ）（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２９）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号２３０）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２３１）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＴＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２３２）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号２３３）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号２３４）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、ｃ）（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２３７）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２３８）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３９）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２４０）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４１）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２４２）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、又は、ｄ）（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２４５）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２４６）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２４７）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４８）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４９）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２５０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２１）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２２２）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２２３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２２４）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２２５）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２２６）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２９）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号２３０）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２３１）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２３２）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号２３３）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号２３４）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２３７）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２３８）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３９）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２４０）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４１）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２４２）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２４５）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２４６）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２４７）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４８）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４９）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２５０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２２７、２３５、２４３及び２５１からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２８、２３６、２４４及び２５２からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２２７、２３５、２４３及び２５１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２８、２３６、２４４及び２５２からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２２７に示す配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２３５に示す配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２４３に示す配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２５１に示す配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施例において、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域に含まれる任意のアミノ酸配列は、多くとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸の置換は、保存的置換である。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選ばれる。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選ばれる。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を修飾する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を強化する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を低下させる一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、ヒト化抗体を含む。いくつかの実施例において、ヒトＰＤ１タンパク質のＥＣＤを含むポリペプチドを用いて、ヒトファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることで、抗ＰＤ１抗体を同定する。
２．３多重特異性抗体
本開示は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体をさらに提供する。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施例において、結合特異性の一つは、ＴＩＧＩＴ上に存在するエピトープに対するものであり、別の結合特異性は、任意の他の抗原に対するものである。いくつかの実施例において、結合特異性の一つは、ＰＤ１上に存在するエピトープに対するものであり、別の結合特異性は、任意の他の抗原に対するものである。いくつかの実施例において、本開示の多重特異性抗体は、ＴＩＧＩＴ上のエピトープに結合することができ、且つＰＤ１上のエピトープに結合することができる。いくつかの実施例において、本開示の多重特異性抗体は、全長抗体、抗体断片及び／又はその任意の組み合わせを含んでもよい。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ＴＩＧＩＴとＰＤ１に結合する。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、二重特異性抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体である。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる結合特異性を有し、例えば、米国特許第５，９２２，８４５号と第５，８３７，２４３号；Ｚｅｉｌｄｅｒ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１６３：１２４６－１２５２、Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ（１９９９）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［ヒト抗体］９：４７－５４、Ｋｅｌｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．［癌研究］５７：４００８－４０１４を参照されたい。例えば、本開示のテーマは、ＴＩＧＩＴ上に存在する第１のエピトープに対する抗原結合部分と、ＰＤＬｌ上に存在する第２のエピトープに対する第２の抗原結合部分を含む多重特異性抗体を提供するが、それに限らない。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、本明細書に開示される抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、本開示によって開示される抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ１抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体とＰＤ１／ＰＤＬ１シグナル伝達の両方のアンタゴニストとしてもよい。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の免疫チェックポイント阻害を遮断する。いくつかの実施例において、いかなる理論にも束縛されるものではないが、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体の抗ＰＤ１部分は、抗体を腫瘍部位に誘導及び／又は集中させることができ、それにより腫瘍部位付近の免疫細胞の抗腫瘍機能を強化し、及び／又は、末梢免疫細胞の毒性副作用を低下させる。いくつかの実施例において、いかなる理論にも束縛されるものではないが、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体は、ＰＤ１を発現する腫瘍細胞とＴＩＧＩＴを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を連結することができ、それにより免疫細胞を腫瘍部位に到達させ、腫瘍の根絶を促進する。いくつかの実施例において、単一特異性抗ＴＩＧＩＴ抗体及び／又は単一特異性抗ＰＤ１抗体を用いた治療に比べて、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体を用いた治療は、優れた抗腫瘍効果を示す。いくつかの実施例において、単一特異性抗ＴＩＧＩＴ抗体と単一特異性抗ＰＤ１抗体との組み合わせを用いた治療に比べて、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体を用いた治療は、優れた抗腫瘍効果を示す。
いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体は、第１の抗原結合部分と、第２の抗原結合部分とを含み、該第１の抗原結合部分は、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含み、該抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体を含み、該第２の抗原結合部分は、ＰＤ１に結合する抗ＰＤ１抗体を含む。
２．３．１第１の抗原結合部分
いくつかの実施例において、本明細書に開示される多重特異性抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体の第１の抗原結合部分は、本明細書に開示される抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む。いくつかの実施例において、本開示の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴのＥＣＤに結合する。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号２６２に示すアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴのＥＣＤに結合する。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体（例えば２Ａ３）と同じエピトープに結合する。
いくつかの実施例において、該抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、ＶＨＨを含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、Ｆｃ領域に連結される。
いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体のアンタゴニストとして用いられてもよい。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体の活性を少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％又は約９９．９％低下させることができる。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体の下流の免疫阻害シグナル伝達を遮断することができる。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）の免疫応答及び／又は抗腫瘍作用を増加させる。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いた治療は、試験者において、抗腫瘍の効果を示し、それにより腫瘍増殖を減少させ、及び／又は、被験体の生存期間を延長する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体は、全長抗体に比べて、小さい分子サイズを有し、その理由は、全長抗体のＦａｂドメインに比べて、単一ドメイン抗体のサイズが小さいことであり、このように、全長抗体に比べて、（例えば、腫瘍部位で）優れた組織浸潤を引き起こすことができる。いくつかの実施例において、全長抗ＴＩＧＩＴ抗体（例えば、参照Ａｂ １と参照Ａｂ ２）を用いた治療に比べて、抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いた治療は、優れた抗腫瘍効果を示す。参照Ａｂ １は、Ｕ．Ｓ．２０１６／０１７６９６３ Ａ１に開示されているＢＭＳ ２２Ｇ２と同じアミノ酸配列を有し、参照Ａｂ ２は、Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂと同じアミノ酸配列を有し、その配列は、Ｕ．Ｓ．２０１７／００８８６１３ Ａ１に開示されている。
いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨを含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、Ｆｃ領域に連結される。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、Ｆｃ領域に連結されない。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－７Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－８Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約５×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－９Ｍから約１×１０－７ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－９Ｍから約１×１０－８ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約２×１０－９Ｍから約１×１０－８ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約２×１０－９Ｍから約５×１０－８ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、約１×１０－９Ｍから約５×１０－９ＭのＫＤでＴＩＧＩＴに結合する。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号９８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１００に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１０２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１０６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ａ）配列番号９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６及び１９０のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、ｂ）配列番号９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８３、１８７及び１９１のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、ｃ）配列番号９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８及び１９２のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ＣＤＲ１ドメインと、ＣＤＲ２ドメインと、ＣＤＲ３ドメインとを含み、ここでは、このＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインは、それぞれ、参照重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインを含み、該参照重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号９８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１００に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１１３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１１７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１５３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１５７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７３に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７７に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８９に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１９３に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、重鎖可変領域に含まれる任意のアミノ酸配列は、多くとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸の置換は、保存的置換である。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号１７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号２１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号２５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号２９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号３３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号３７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号４１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号４５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号４９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号５３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号５７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号６１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号６５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号６９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号７３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号７７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体は、配列番号８１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号３３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号３７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号７３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号７７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号８１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０及び８４からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０及び８４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、重鎖可変領域に含まれる任意のアミノ酸配列は、多くとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸の置換は、保存的置換である。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２４に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号２８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号３２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号３６に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４０に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４４に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号５６に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６０に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６４に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号６８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号７２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号７６に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号８０に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号８４に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ヒト化フレームワークを含む。いくつかの実施例において、ヒト化フレームワークは、配列番号８５－９３からなる群から選ばれる重鎖可変領域配列のフレームワーク配列を含む。いくつかの実施例において、ヒト化フレームワークは、配列番号８５－９３からなる群から選ばれる重鎖可変領域配列のＦＲ２配列を含む。
２．３．２第２の抗原結合部分
いくつかの実施例において、本明細書に開示される多重特異性抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体の第２の抗原結合部分は、ＰＤ１に結合する抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、ＰＤ１とＰＤ１との相互作用を遮断する。いくつかの実施例において、抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ ２０１７／０５０８５１（国際公開ＷＯ ２０１８／０５２８１８ Ａ１として開示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている任意の抗ＰＤ１抗体である。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、参照抗ＰＤ１抗体と交差競合し、該参照抗ＰＤ１抗体は、ａ）（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２１）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２２２）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２２３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２２４）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２２５）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２２６）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、ｂ）（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２９）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号２３０）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２３１）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＴＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２３２）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号２３３）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号２３４）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、ｃ）（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２３７）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２３８）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３９）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２４０）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４１）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２４２）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、又は、ｄ）（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２４５）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２４６）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２４７）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４８）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４９）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２５０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２１）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２２２）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２２３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２２４）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２２５）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２２６）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２９）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号２３０）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２３１）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２３２）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号２３３）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号２３４）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２３７）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２３８）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３９）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２４０）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４１）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２４２）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２４５）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２４６）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２４７）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４８）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４９）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２５０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２２７、２３５、２４３及び２５１からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２８、２３６、２４４及び２５２からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２２７、２３５、２４３及び２５１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２８、２３６、２４４及び２５２からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２２７に示す配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２３５に示す配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２４３に示す配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２４４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、配列番号２５１に示す配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２５２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施例において、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域に含まれる任意のアミノ酸配列は、多くとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を含んでもよい。いくつかの実施例において、アミノ酸の置換は、保存的置換である。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選ばれる。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選ばれる。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を修飾する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を強化する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を低下させる一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む。
いくつかの実施例において、抗ＰＤ１抗体は、ヒト化抗体を含む。いくつかの実施例において、ヒトＰＤ１タンパク質のＥＣＤを含むポリペプチドを用いて、ヒトファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることで、抗ＰＤ１抗体を同定する。
２．３．３多重特異性抗体の特徴
いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１多重特異性抗体は、多価抗体であってもよい。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体は、二価、三価、四価、五価、六価、七価又は八価のものであってもよい。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体の第１と第２の抗原結合部分のそれぞれは、一価、二価、三価、四価、五価、六価、七価又は八価のものであってもよい。いくつかの実施例において、第１と第２の抗原結合部分のそれぞれは、一価のものである。いくつかの実施例において、第１と第２の抗原結合部分のそれぞれは、二価のものである。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１多重特異性抗体は、二価のものである。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１多重特異性抗体は、四価のものである。
いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ１抗体を含み、該抗ＰＤ１抗体は、二本の抗体重鎖と、二本の抗体軽鎖を含む。いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、二つ又はより多くの抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む。いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、二種の抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの各本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの各本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの各本のＣ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。いくつかの実施例において、二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの各本のＮ末端は、第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）（１）配列番号２２９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２３０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２３１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２３２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２３３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２３４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）（１）配列番号２３７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２３８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２３９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２４０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２４１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２４２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）（１）配列番号２２１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２２２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２２３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２２４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２２５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２２６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、ｉ）配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、ｉｉ）（１）配列番号２４５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２４６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２４７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２４８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２４９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２５０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む。
いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号２５３に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２５４に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号２５５に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２５６に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号２５７に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２５８に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む。いくつかの実施例において、多重特異性抗体は、配列番号２５９に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２６０に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む。
いくつかの実施例において、第１の抗原結合部分は、リンカーを介して第２の抗原結合部分に連結される。いくつかの実施例において、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約３０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、約４から約１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、ペプチドリンカーは、配列番号１９５－２２０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分の抗ＰＤ１抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選ばれるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、第２の抗原結合部分の抗ＰＤ１抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選ばれるＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を修飾する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を強化する一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞によって媒介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）を低下させる一つ又は複数の突然変異を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施例において、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む。
２．４抗体の親和性
いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体又は多重特異性抗体の抗原結合部分は、その標的抗原に対して高結合親和性を有する。いくつかの実施例において、抗体又は抗原結合部分は、約１×１０－７Ｍ又はより小さいＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗原結合部分は、約１×１０－８Ｍ又はより小さいＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗原結合部分は、約５×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗原結合部分は、約１×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗原結合部分は、約１×１０－９Ｍから約１×１０－７ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗原結合部分は、約１×１０－９Ｍから約１×１０－８ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗原結合部分は、約２×１０－９Ｍから約１×１０－８ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗原結合部分は、約２×１０－９Ｍから約５×１０－８ＭのＫＤで標的に結合する。いくつかの実施例において、抗体又は抗原結合部分は、約１×１０－９Ｍから約５×１０－９ＭのＫＤで標的に結合する。
抗体又は抗原結合部分のＫＤは、当分野の既知の方法で決定されてもよい。このような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ－、ＥＩＡ－、Ｏｃｔｅｔ－ ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－テストとペプチド走査を含むが、それらに限らない。
いくつかの実施例において、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いてＫＤを測定してもよい。例えば、固定した抗原ＣＭＳチップ上で、約１０個の応答単位（ＲＵ）、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州（ＮＪ））を用いて測定を行うが、それに限らない。いくつかの実施例において、サプライヤーのマニュアルに応じて、カルボキシメチル化デキストランシンターセンサチップ（ＣＭＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ社）に対して、Ｎ－エチル－Ｎ′－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化を行う。ｐＨ４．８の１０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて抗原を５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈し、そして、５μｌ／分の流速で注入して、コンジュゲートタンパク質の約１０個の応答単位（ＲＵ）を実現させる。抗原を注入した後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。動力学測定のために、２５℃で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳにおけるＦａｂの二倍の連続希釈液（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を約２５μｌ／ｍｉｎの流速で注入する。会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合と解離センサグラムを同時にフィッティングすることで計算される。平衡解離定数（ＫＤ）を比率ｋ０ｆｆｆｋｏｎとして計算してもよい。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される会合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）が１０６Ｍ－ｌｓ－１を超えると、蛍光消光技術によって会合速度を決定してもよく、この技術は、増加した抗原濃度（例えば、分光器、例えば、パスカット構成の分光光度計（アファフ機器）又は撹拌吸収プールを有する８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ社）により測定される）の存在で、２５℃でＰＢＳ（ｐＨ７．２）における２０ｎＭ抗－抗原抗体（Ｆａｂ形式）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加又は減少を測定する。
２．５抗体断片
いくつかの実施例において、本開示の抗体は、抗原結合断片又は抗体断片を含む。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖとｓｃＦｖ片段、及び以下に記載の他の断片を含むが、それらに限らない。いくつかの抗体断片の概説について、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．［自然医学］９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説について、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｔｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［モノクローナル抗体の薬理学］，第１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇとＭｏｏｒｅによる編集，（シュプラガー出版社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ），ニューヨーク），ページ２６９－３１ ５（１９９４）を参照されたく、さらに、ＷＯ ９３／１６１８５、及び米国特許第５，５７１，８９４号と第５，５８７，４５８を参照されたい。救済受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂとＦ（ａｂ）２断片に関する検討は、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
いくつかの実施例において、本開示の抗体は、ダイアボディであってもよい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ ４０４，０９７、ＷＯ １９９３／０１ １６１、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．［自然医学］９：１２９－１３４（２００３）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディとテトラボディはさらに、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．［自然医学］９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。
いくつかの実施例において、本開示の抗体は、単一ドメイン抗体を含んでもよい。単一ドメイン抗体は、抗体の全部又は一部の重鎖可変ドメイン、又は、全部又は一部の軽鎖可変ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ社，ワルサム（Ｗａｌｔｈａｍ），マサチューセッツ州（ＭＡ）；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂｌ号を参照されたい）である。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体、ラクダ科動物単一ドメイン抗体である。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨである。いくつかの実施例において、単一ドメイン抗体は、ヒト化したものである。
抗体断面は、複数種の技術によって調製されてもよく、これらの技術は、本明細書に記載のように、完全な抗体のタンパク質分解消化及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）の生産を含むが、それらに限らない。
２．６キメラ抗体とヒト化抗体
いくつかの実施例において、本開示の多重特異性抗体の抗原結合部分を含む抗体は、キメラ抗体である。いくつかのキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、とＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。いくつかの実施例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウスに由来する可変領域）と、ヒト定常領域を含む。いくつかの実施例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから改変した「クラス転換」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
いくつかの実施例において、本開示の多重特異性抗体の抗原結合部分を含む抗体は、ヒト化抗体であってもよい。通常、非ヒト抗体に対してヒト化を行い、ヒトに対する免疫原性を減少させると共に、親非ヒト抗体の特異性と親和性を残す。通常、ヒト化抗体は、一つ又は複数の可変ドメインを含み、ここでは、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）は、非ヒト抗体から派生し、ＦＲ（又はその任意の部分）は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部をさらに含んでもよい。いくつかの実施例において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基に由来する抗体）からの該当する残基によって置換され、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善する。
人化抗体及びその調製方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏとＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．［生物科学の最前線］１３：１６１９－１６３３（２００８）に記載されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３３２：３２３－３２９（１９８８）にさらに記載されており、Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７、７，５２７，７９１、６，９８２，３２１及び７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ［方法］３６：２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）移植が記載された）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］２８：４８９－４９８（１９９１）「（「表面の再修飾」が記載された）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ［方法］３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」が記載された）、Ｏｓｂｏｕｒｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ［方法］３６：６１－６８（２００５）とＫｌｉｍｋａら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ［イギリス癌雑誌］，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングの「指導選択」方法が記載された）に記載れている。
ヒト化に用いることができるヒトフレームワーク領域は、「最適フィッティング」方法で選択されるフレームワーク領域（例えば、ＳｉｍｓらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖又は重鎖可変領域の特定サブクラスのヒト抗体の共有配列に由来するフレームワーク領域（例えば、ＣａｒｔｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒトの成熟した（体細胞突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、ＡｌｍａｇｒｏとＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．［生物科学の最前線］１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）、及びＦＲライブラリーをスクリーニングすることで得られるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［生物化学雑誌］２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）とＲｏｓｏｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［生物化学雑誌］２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）を含むが、それらに限らない。
２．７ヒト抗体
いくつかの実施例において、本開示の抗体は、ヒト抗体（例えば、ヒトドメイン抗体又はヒトＤＡｂ）であってもよい。ヒト抗体は、当分野における既知の異なる技術を用いて生成されてもよい。ヒト抗体は、一般的には、ｖａｎ Ｄｉｊｋとｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．［薬理学の新知見］５：３６８－７４（２００１），Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の新知見］２０：４５０－４５９（２００８）、及びＣｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［分子免疫学］４７（４）：９１２－２１（２０１０）に記載されている。完全ヒト単一ドメイン抗体（又はＤＡｂ）を生成できるトランスジェニックマウス又はラットは、当分野の既知のものである。例えば、ＵＳ ２００９０３０７７８７ Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ ２０１５０２８９４８９ Ａ１、ＵＳ ２０１００１２２３５８ Ａ１、及びＷＯ ２００４０４９７９４を参照されたい。
抗原攻撃に応答して、完全ヒト抗体又はヒト可変領域を有する完全抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって、ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）を調製することができる。このような動物は、通常、全部又は一部のヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有し、それらが内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換しており、又は、染色体外に存在し、又は動物の染色体にランダムに組み込まれる。このようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説について、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．［自然生物技術］２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。さらに、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記述する米国特許第６，０７５，１８１と６，１５０，５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記述する米国特許第５，７７０，４２９、Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記述する米国特許第７，０４１，８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記述する米国特許第ＵＳ ２００７／００６１９００号を参照されたい。このような動物によって生成された完全抗体からのヒト可変領域は、（例えば、異なるヒト定常領域に結合することで）さらに修飾されてもよい。
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、ハイブリドーマに基づく方法で調製されてもよい。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫とマウスのヒト異種骨髄腫細胞株（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１３３： ３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［ヒトモノクローナル抗体の生産技術及び用途］，ページ５１－６３ マルセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク，１９８７）及びＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）が記載された。Ｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒトがさらに記載されている。別の方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からモノクローナルヒトＩｇＭ抗体を生産することが記載された）とＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ［現代免疫学］，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマが記述された）に記載のそれらの方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ技術）は、ＶｏｌｌｍｅｒｓとＢｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ［組織学と組織病理学］，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓとＢｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ［実験と臨床薬理学の方法と発見］，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載れている。
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、ヒトファージディスプレイライブラリーから選ばれるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離させることで生成されてもよい。そして、このような可変ドメイン配列を必要なヒト定常ドメインに結合させてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術に関する記述は、以下のとおりである。
２．８ライブラリーによって派生される抗体
組み合わせライブラリーにおいて、必要な活性又は複数の活性を有する抗体をスクリーニングすることで、抗体部分を単離することができる。例えば、当分野において、ファージディスプレイライブラリーを生成し、このようなライブラリーにおける、必要な結合特性を有する抗体をスクリーニングする複数の方法が知られている。このような方法は、例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎらによる編集，Ｈｕｍａｎ出版社（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ），トトワ（Ｔｏｔｏｗａ），ニュージャージー州（ＮＪ），２００１）に記載されており、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３４８：５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］２２２：５８１－５９７（１９９２）、ＭａｒｋｓとＢｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］２４８：１６１－１７５（Ｌｏによる編集，Ｈｕｍａｎ出版社（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ），トトワ（Ｔｏｔｏｗａ），ニュージャージー州（ＮＪ），２００３）、Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］３３８（２）：２９９－３１０（２００４）、Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、及びＬｅｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ［免疫学方法雑誌］２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）の文献にさらに記載されている。単一ドメイン抗体ライブラリーを構築するための方法が記述されており、例えば、米国特許第７３７１８４９号を参照されたい。
いくつかのファージディスプレイ方法において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＶＨとＶＬ遺伝子ライブラリーをそれぞれクローニングし、ファージライブラリーにおいて、ランダムに組換えを行い、そして、Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の年度コメント］，１２：４３３－４５５（１９９４）における記載に応じて、抗原結合ファージをスクリーニングしてもよい。ファージは、通常、抗体断片をｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片としてディスプレイする。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築することなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供することができる。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，ＥＭＢＯ Ｊ［欧州分子生物学会誌］，１２：７２５－７３４（１９９３）に記載のように、自然ライブラリー（例えば、ヒトから得られる）を、いかなる免疫も必要とすることなくクローニングして、広範囲の非自己及び自己抗原に対する単一の抗体源を提供することができる。最後に、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍとＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載のように、細胞から再構成されていないＶ遺伝子断片をクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて高度に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を完了することによって、天然ライブラリーを合成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許出版物は、米国特許第５，７５０，３７３号と米国特許第２００５／００７９５７４、２００５／０１１９４５５、２００５／０２６６０００、２００７／０１１７１２６、２００７／０１６０５９８、２００７／０２３７７６４、２００７／０２９２９３６及び２００９／０００２３６０号を含む。
ヒト抗体ライブラリーから単離した抗体又は抗体断片は、本明細書において、ヒト抗体又はヒト抗体断片と考えられる。
２．９抗体変異体
現在の公開のテーマは、開示される抗体のアミノ酸配列変異体をさらに提供する。例えば、該抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性の改善を必要とする可能性がある。抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入するか又はペプチド合成を行うことによって、抗体のアミノ酸配列変異体を調製することができる。このような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含むが、それらに限らない。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行うことで、最終的な構築体を得ることができ、その条件は、最終的な（即ち、修飾した）抗体が必要な特性（例えば、抗原結合）を有することである。
２．９．１置換、挿入及び欠失変異体
いくつかの実施例において、一つ又は複数のアミノ酸の置換を有する抗体変異体を提供する。置換変異誘発の標的部位は、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）とＦＲを含む。保存的置換は、表２における「好ましい置換」というテーマの下に示される。表２において、「例示的な置換」というテーマの下では、より実質的な変化が提供され、且つ以下において、アミノ酸側鎖クラスを参照しながら、さらに記述される。アミノ酸の置換は、目的の抗体に導入され、所望の活性（例えば、保持／改善した抗原結合、低下した免疫原性、又は改善したＡＤＣＣ又はＣＤＣ）に対して、生成物をスクリーニングすることができる。
Figure 2023509215000004
アミノ酸は、一般的な側鎖の特性に従って、（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）アルカリ性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅにグループ化されてもよい。いくつかの実施例において、非保存的置換は、これらのクラスにおける一つのメンバーを別のクラスに交換する必要がある。
いくつかの実施例において、置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一つ又は複数の高可変領域残基の置換に係る。通常、更なる研究に用いられる、得られた変異体を選択し、親抗体に対して、いくつかの生物学的特性（例えば、増加した親和性、低下した免疫原性）で修飾（例えば、改善）し、及び／又は、親抗体のいくつかの生物学的特性を基本的に保持する。例示的な置換変異体は、親和性が成熟した抗体であり、該抗体は、生成しやく、例えばファージディスプレイに基づく、親和性が成熟した技術（例えば、本明細書に記載のもの）を用いる。簡単に言えば、一つ又は複数のＨＶＲ（又はＣＤＲ）残基に対して突然変異を行い、変異体抗体をファージにディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）に対してスクリーニングを行う。
ＨＶＲ（又はＣＤＲ）において、改変（例えば、置換）を行い、例えば、抗体親和性を改善することができる。このような改変は、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）「ホットポイント」（即ち、体細胞成熟過程期間に高頻度で突然変異したコドンによってコードされる残基）において行われ（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学的方法］２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において行われ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬの結合親和性を試験することができる。二次ライブラリーからの構築及び再選択による親和性成熟は、例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎらによる編集，Ｈｕｍａｎ出版社（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ），トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）， ニュージャージー州（ＮＪ），（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施例において、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のうちのいずれか一つによって、多様性を、成熟のために選択された可変遺伝子に導入する。そして、二次ライブラリーを生成する。そして、ライブラリーをスクリーニングし、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入する別の方法は、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）配向方法に関し、ここでは、若干のＨＶＲ（又はＣＤＲ）残基（例えば、一度に４－６個の残基）をランダム化する。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデル化を使用して、抗原結合に関与するＨＶＲ（又はＣＤＲ）残基を特異的に同定することができる。特に、ＣＤＲ－Ｈ３とＣＤＲ－Ｌ３は、常に標的となる。
いくつかの実施例において、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を基本的に低下させない限り、置換、挿入又は欠失は、一つ又は複数のＨＶＲ（又はＣＤＲ）内に発生してもよい。例えば、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）において、結合親和性を基本的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書による保存的置換）を行ってもよい。このような改変は、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）「ホットポイント」又はＣＤＲ外にある可能性がある。以上に提供される変異体ＶＨＨ配列のいくつかの実施例において、各ＨＶＲ（又はＣＤＲ）は、改変されてないものであるか、又は、一つ、二つ又は三つを超えるアミノ酸の置換を含むものである。
ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ［科学］，２４４：１０８１－１０８５に記載のように、標的変異誘発を行うことができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。このような方法において、ターゲットの残基又は残基群（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）を用いて置換を行うことで、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。アミノ酸の位置に別の置換を導入することで、初期置換に対する機能的感受性を実証することができる。代替的に又は付加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造は、抗体と抗原との接触点を同定するためのものである。このような接触残基と隣接残基は、置換候補として標的化又は排除されてもよい。変異体は、所望の属性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列の挿入は、長さが一つの残基から百個又はより多くの残基を含むポリペプチドの範囲内にあるアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合と、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端又はＣ末端と、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）又はポリペプチドとの融合を含む。
２．９．２グリコシル化変異体
いくつかの実施例において、構築体のグリコシル化の程度を増加又は減少させるために、抗体部分を改変する。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を改変して一つ又は複数のグリコシル化部位を生成又は除去することで、容易に実現可能である。
抗体部分にＦｃ領域（例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ）が含まれる場合、それに連結される炭水化物は、改変可能である。哺乳動物細胞によって生成される天然抗体は、通常、分岐型バイ接触角オリゴ糖を含み、それは、通常、Ｎ－結合によって、Ｆｃ領域ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に連結される。例えば、ＷｒｉｇｈｔらＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースとびシアル酸、及びバイ接触角オリゴ糖の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに付着したフコースを含んでもよい。いくつかの実施例において、抗体部分におけるオリゴ糖に対して修飾を行って、いくつかの改善した特性を有する抗体変異体を生成することができる。
いくつかの実施例において、抗体部分は、炭水化物構造を有し、この炭水化物構造は、（直接又は間接に）Ｆｃ領域に付着したフコースを欠く。例えば、このような抗体におけるフコースの含有量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％又は２０％から４０％であってもよい。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定されたＡｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体化、ヘテロ接合及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７糖鎖におけるフコースの平均量を計算することにより決定され、例えば、ＷＯ ２００８／０７７５４６に記載のとおりである。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位にあるアスパラギン残基（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号）を指し、しかしながら、抗体における微小配列変化のため、Ａｓｎ２９７は、位置２９７の約±３個のアミノ酸上流又は下流、即ち、位置２９４と３００の間に位置してもよい。このようなフコシル化変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を有してもよい。例えば、米国特許第ＵＳ ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、ＵＳ ２００４／００９３６２１（協和発酵工業株式会社（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ））を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠損型」抗体変異体に関わる出版物の例として、ＵＳ ２００３／０１５７１０８；ＷＯ ２０００／６１７３９、ＷＯ ２００１／２９２４６、ＵＳ ２００３／０１１５６１４、ＵＳ ２００２／０１６４３２８、ＵＳ ２００４／００９３６２１、ＵＳ ２００４／０１３２１４０、ＵＳ ２００４／０１１０７０４、ＵＳ ２００４／０１１０２８２、ＵＳ ２００４／０１０９８６５、ＷＯ ２００３／０８５１１９、ＷＯ ２００３／０８４５７０、ＷＯ ２００５／０３５５８６、ＷＯ ２００５／０３５７７８、ＷＯ ２００５／０５３７４２、ＷＯ ２００２／０３１１４０、ＯｋａｚａｋｉらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．［分子生物学雑誌］３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．［バイオテクノロジーと生物工学］８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を生成できる細胞株の例として、タンパク質フコシル化作用欠損型Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（ＲｉｐｋａらＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．［生物化学と生物物理学集刊］２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許第ＵＳ ２００３／０１５７１０８ Ａ１号，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ ２００４／０５６３１２ Ａ１，Ａｄａｍｓら）と、ノックアウト細胞株、例えば、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．［バイオテクノロジーと生物工学］８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．［バイオテクノロジーと生物工学］，９４（４）：６８０－６８８（２００６）とＷＯ ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。
いくつかの実施例において、抗体部分は、二等分されるオリゴ糖を有し、例えば、ここでは、抗体のＦｃ領域に付着したバイ接触角オリゴ糖は、ＧｌｃＮＡｃにより二等分される。このような抗体変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善したＡＤＣＣ機能を有してもよい。このような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）及びＵＳ ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。オリゴ糖においてＦｃ領域に連結される少なくとも一つのガラクトース残基を有する抗体変異体をさらに提供する。このような抗体変異体は、改善したＣＤＣ機能を有してもよい。このような抗体変異体は、例えば、ＷＯ １９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）、ＷＯ １９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ １９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
２．９．３Ｆｃ領域変異体
いくつかの実施例において、一つ又は複数のアミノ酸修飾を抗体部分のＦｃ領域（例えばｓｃＦｖ－Ｆｃ）に導入することによって、Ｆｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一つのヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでもよく、この配列は、一つ又は複数のアミノ酸位置にあるアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む。
いくつかの実施例において、Ｆｃ断片は、いくつかの（全部ではない）エフェクター機能を有し、このような機能により、この断片が応用に適する望ましい候補となり、前記応用において、インビボでの抗体部分の半減期が重要であるが、いくつかのエフェクター機能（例えば、補体とＡＤＣＣ）は、必要でないか又は有害である。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを実施することによって、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行うことにより、抗体がＦｃγＲ結合能力を有しない（従ってＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能を保持できることを保証することができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単核細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現は、ＲａｖｅｔｃｈとＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学の年度コメント］９：４５７－４９２（１９９１）のページ４６４の表２にまとめられている。米国特許第５，５００，３６２において、関心のある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例が記載されている（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，８３：７０５９－７０６３（１９８６））及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，８２：１４９９－１５０２（１９８５）、５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．［実験医学雑誌］，１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照されたい）。代替的に、非放射性アッセイ（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（細胞技術社（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ），カリフォルニア州、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ウィスコンシン州を参照されたい）を用いてもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的に又は付加的に、インビボで、例えば、動物モデル、例えばＣｌｙｎｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］］９５：６５２－６５６（１９９８）に記載のものにおいて、ターゲット分子のＡＤＣＣ活性を評価してもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイを行うことにより、抗体がＣ１ｑに結合できず、且つそのためＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、ＷＯ ２００６／０２９８７９とＷＯ ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑとＣ３ｃのＥＬＩＳＡへの結合を参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ［免疫学方法雑誌］２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｂｌｏｏｄ［血液］１０１：１０４５－１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．とＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ［血液］１０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。当分野の既知の方法で、ＦｃＲｎ結合とインビボクリアランス／半減期アッセイを行ってもよい（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［国際免疫学］１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照されたい）。
低下したエフェクター機能を有する抗体は、（米国特許第６，７３７，０５６号）Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの一つ又は複数の置換を有する抗体を含む。このようなＦｃ突然変異体は、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの二つ又はより多くの置換を有するＦｃ突然変異体を含み、残基２６５と２９７がアラニンによって置換されるいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む。
本明細書において、ＦｃＲへの結合性が向上又は低下したいくつかの抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［生物化学雑誌］９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照されたい。）
いくつかの実施例において、Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片である。いくつかの実施例において、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片は、Ｌ２３４Ａ突然変異及び／又はＬ２３５Ａ突然変異を含む。いくつかの実施例において、Ｆｃ断片は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４ Ｆｃ断片である。いくつかの実施例において、Ｆｃ断片は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ突然変異を含むＩｇＧ４ Ｆｃ断片である。
いくつかの実施例において、抗体部分は、一つ又は複数のアミノ酸の置換を有するＦｃ領域を含み、これらの置換（例えば、Ｆｃ領域内の位置２９８、３３３及び／又は３３４にある置換（残基のＥＵ番号））は、ＡＤＣＣを改善する。
いくつかの実施例において、Ｆｃ領域内に改変が発生することによって、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の改変（即ち、向上又は低下）を引き起こし、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ ９９／５１６４２及びＩｄｕｓｏｇｉｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載のとおりである。
いくつかの実施例において、抗体部分（例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ）変異体は、変異体Ｆｃ領域を含み、この変異体Ｆｃ領域は、半減期を改変し、及び／又は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を改変する一つ又は複数のアミノ酸の置換を含む。延長した半減期と新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善した結合を有する抗体は、母体ＩｇＧの胎児への転移を担当し（Ｇｕｙｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１１７：５８７（１９７６）とＫｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］２４：２４９（１９９４））、例えば、ＵＳ ２００５／００１４９３４Ａ１に記載（Ｈｉｎｔｏｎら）のとおりである。それらの抗体は、一つ又は複数のアミノ酸の置換を有するＦｃ領域を含み、ここでは、これらの置換は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改変する。このようなＦｃ変異体は、一つ又は複数のＦｃ領域残基において、置換（例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換）を有するそれらの変異体（米国特許第７，３７１，８２６号）を含む。
さらに、ＤｕｎｃａｎとＷｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＦｃ領域変異体の他の例に関わるＷＯ ９４／２９３５１を参照されたい。
２．９．４システインエンジニアリング抗体変異体
いくつかの実施例において、システインエンジニアリング抗体部分、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」の生成を必要とする可能性があり、ここでは、抗体の一つ又は複数の残基は、システイン残基によって置換される。いくつかの実施例において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。システイン残基を用いてそれらの残基を置換することで、反応性チオール基は、抗体のアクセス可能な部位に位置し、本明細書にさらに記載するように、他の部分、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分と抗体をカップリングして、免疫コンジュゲートを生成するために使用されてもよい。いくつかの実施例において、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号）と、重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号）とのうちのいずれか一つ又は複数の残基は、システイン残基によって置換されてもよい。システインエンジニアリング抗体部分は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載のように生成されてもよい。
２．１０抗体誘導体
いくつかの実施例において、本明細書に記載の抗体部分は、当分野に知られており且つ容易に得られる他の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗体誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーを含むが、それに限らない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）とデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール及びそれらの混合物が挙げられるが、それらに限らない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のために調製において優位性を有する可能性がある。このポリマーは、任意の分子量を有してもよく、且つ分岐状又は非分岐状であってもよい。抗体に連結されるポリマーの数は、変わってもよく、且つ連結されるポリマーが一種よりも多いと、それらは、同じ又は異なる分子であってもよい。一般的には、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、以下の考慮要因に基づいて決定されてもよく、それらの要因は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体を決定された診断条件のために使用するかどうか等が含まれるが、それらに限らない。
いくつかの実施例において、抗体部分は、一つ又は複数の生物活性タンパク質、ポリペプチド又はその断片を含むように、さらに修飾されてもよい。本明細書で互換的に使用されるように、「生物学的活性の」又は「生物学的活性を有する」は、特定の機能を果たすためにインビボで示される生物学的活性を指す。例えば、それは、特定の生物分子（例えば、タンパク質、ＤＮＡなど）に結合し、そして、このような生物分子の活性を促進又は阻害することを意味する可能性がある。いくつかの実施例において、生物学的活性タンパク質又はその断片は、活性薬物物質として患者に投与されるタンパク質又はポリペプチド、疾患又は病症の予防又は治療及び診断の目的のためのタンパク質とポリペプチド（例えば、診断試験又はインビトロアッセイに用いられる酵素）、及び疾患を予防するために患者に投与されるタンパク質とポリペプチド（例えば、ワクチン）を含む。
２．１１抗体の生産方法
当分野における任意の利用可能な又は既知の技術を用いて本明細書に開示される抗体を生成することができる。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組換え方法及び組成物を用いて抗体を生成することができるが、それに限らない。抗体を生成する詳細な工程は、以下の例に詳しく記述される。
本公開のテーマは、本明細書に開示される抗体をコードする単離した核酸をさらに提供する。例えば、単離した核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列、例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードすることができる。
いくつかの実施例において、核酸は、一つ又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）に存在してもよい。本明細書に使用されるように、「ベクター」という用語は、それに連結される別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、それは、別のＤＮＡセグメントをそのうちの環状二本鎖ＤＮＡループに連結することができる。一つのタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ここでは、別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。いくつかのベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、且つそれにより宿主ゲノムと共に複製する。また、いくつかのベクター発現ベクターは、それらが操作可能に連結された遺伝子の発現を指導することができる。一般的には、組換えＤＮＡ技術に用いられる発現ベクターは、常に、プラスミド（ベクター）形式である。しかしながら、開示されるテーマは、等価な機能を有する他の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含むことが意図される。
単一のポリシストロン性発現カセット、単一のベクターの複数の発現カセット又は複数のベクターにおいて、本明細書に開示される抗体の異なる部分を構築することができる。ポリシストロニック発現カセットを生成するエレメントの例として、様々なウイルス及び非ウイルス性内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ、例えば、ＦＧＦ－ｌ ＩＲＥＳ、ＦＧＦ－２ ＩＲＥＳ、ＶＥＧＦ ＩＲＥＳ、ＩＧＦ－ＩＩ ＩＲＥＳ、ＮＦ－ｋＢ ＩＲＥＳ、ＲＵＮＸ１ ＩＲＥＳ、ｐ５３ ＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、ピコルナニルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ及び脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ）、及び切断可能なリンカー（例えば、２Ａペプチド、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＦ２Ａペプチド）が挙げられるが、それらに限らない。レトロウイルスベクターと適切なパッケージング糸との組み合わせも好適であり、ここでは、カプシドタンパク質がヒト細胞に感染する機能を有する。様々な両性ウイルスを生成する細胞株は、知られており、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［分子細胞生物学］５：４３１－４３７）、ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［分子細胞生物学］６：２８９５－２９０２）、及びＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］８５：６４６０－６４６４）を含むが、それらに限らない。非両親媒性粒子も好適であり、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４又はＧＡＬＶエンベロープ及び当分野における任意の他の既知のシュードタイプ化粒子を用いる。
いくつかの実施例において、本開示の抗体をコードする核酸及び／又はこの核酸を含む一つ又は複数のベクターを宿主細胞に導入することができる。いくつかの実施例において、当分野の既知の任意の方法で、核酸を細胞に導入することができ、これらの方法は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルス又はファージベクターによる感染、細胞融合、染色体によって媒介される遺伝子転移、微小細胞によって媒介される遺伝子転移、スフェロプラスト融合などを含むが、それらに限らない。いくつかの実施例において、宿主細胞は、例えば、単一ドメイン抗体及び／又は単一ドメイン抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターによって形質転換された宿主細胞を含んでもよい。いくつかの実施例において、宿主細胞は、例えば、（１）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列と該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は、（２）該抗体のＶＬのアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び該抗体のＶＨのアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターによって形質転換された宿主細胞を含んでもよい。いくつかの実施例において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ、Ｓｐ２０細胞）である。
いくつかの実施例において、本開示によって開示される抗体を調製する方法は、抗体発現に適する条件で、抗体をコードする核酸が導入されている宿主細胞を培養することと、宿主細胞及び／又は宿主細胞培地から抗体を任意選択的に回収することとを含んでもよい。いくつかの実施例において、クロマトグラフィー技術により、宿主細胞から抗体を回収する。
本開示の抗体を組換え生成するために、上述した抗体をコードする核酸を単離させ、一つ又は複数のベクターに挿入し、宿主細胞において、さらに、クローニング及び／又は発現を行うことができる。従来の工程（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を用いて、このような核酸を容易に単離して配列決定することができる。抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核又は真核細胞を含む。例えば、特に、フコシル化とＦｃエフェクター機能を必要としない時、細菌において抗体を生成してもよい。細菌において抗体断片とポリペプチドを発現することについて、例えば、米国特許第５，６４８，２３７、５，７８９，１９９及び５，８４０，５２３号を参照されたい。（さらに、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，による編集，Ｈｕｍａｎ出版社（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ），トトワ（Ｔｏｔｏｗａ），ニュージャージー州（ＮＪ），２００３），ページ２４５－２５４に記載の大腸菌における抗体断片の発現をさらに参照されたい）発現した後、細菌細胞ペーストから可溶性画分の抗体を単離し、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、真核微生物（例えば糸状菌または酵母）も、抗体をコードするベクターに適したクローニング又は発現宿主であり、それは、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株と酵母株を含むことによって、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を生成する。Ｇｅｍｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．［自然生物技術］２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．［自然生物技術］２４：２１ ０－２１５（２００６）を参照されたい。グリコシル化抗体を発現するための適切な宿所細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）に由来するものであってもよい。無脊椎動物の例としては、植物と昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、これらは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施例において、植物細胞培養物は、宿主細胞として用いられてもよい。例えば、米国特許第５，９５９，１７７、６，０４０，４９８、６，４２０，５４８、７，１２５，９７８及び６，４１７，４２９（トランスジェニック植物において抗体を生成するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術が記載された）を参照されたい。
いくつかの実施例において、脊椎動物細胞は、宿主細胞として用いられてもよい。例えば、懸濁成長に適した哺乳動物細胞株が有用であり得るが、それらに限らない。有用な哺乳動物宿主細胞株の非限定な例として、ＳＹ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胎児腎株（２９３又は２９３細胞、例えば、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒａｌ．［普通ウイルス学誌］３６：５９（１９７７）に記載のもの）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４細胞、例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．［生殖生物学］２３：２４３－２５１（１９８０）に記載のもの）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローザレート（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ ０２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、例えばＭａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．［ニューヨーク科学院年刊］３８３：４４－６８（１９８２）に記載のもの、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞が挙げられる他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含み、ＤＨＦＫ ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］７７：４２ Ｉ６（１９８０））及び骨髄腫細胞株（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ及びＳｐ２／０）を含む。抗体の生成に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞株に関する概説は、例えば、ＹａｚａｋｉとＷｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏによる編集，Ｈｕｍａｎ出版社（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ），トトワ（Ｔｏｔｏｗａ），ニュージャージー州（ＮＪ）），ページ２５５－２６８（２００３）を参照されたい。
いくつかの実施例において、二重特異性及び／又は多重特異性抗体を調製するための技術は、同じ特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖ペアを組換えて発見し、そのうちの一方又は両方の重鎖又は軽鎖が異なる特異性を有する抗原結合部分（例えば、単一ドメイン抗体、例えば、ＶＨＨ）に融合されて、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖ペアの組換え共発現となる（Ｍｉｌｓｔｅｉ ｎとＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ［自然］３０５：５３７（１９８３））、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ ９３／０８８２９号及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ［欧州分子生物学会誌］１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）及び「杵臼構造）エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）を含むが、それに限らない。二重特異性抗体は、静電転向効果をエンジニアリングすることによって調製することによって、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子（ＷＯ ２００９／０８９００４Ａ１）を調製することもでき、二つ又はより多くの抗体又は断片を架橋し（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ［科学］，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体を生成し（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を調製し（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）を使用し、例えば、ＴｕｔｔらＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１４７：６０（１９９１）に記載のように、三重特異性抗体を調製する。
本開示の二重特異性と多重特異性分子は、化学技術（例えば、Ｋｒａｎｚ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］７８：５８０７を参照されたい）、「ポリオーマ」技術（例えば、米国特許第４，４７４，８９３号）又は組換えＤＮＡ技術により調製されてもよい。当分野の既知の方法及び本明細書に記載の方法により、構成結合特異性、例えば、第１のエピトープと第２のエピトープ結合特異性をコンジュゲートすることによって、現在では開示されるテーマの二重特異性と多重特異性分子を調製してもよい。例えば、二重特異性と多重特異性分子の各結合特異性は、組換え融合タンパク質技術によって一緒に調製されるか、又は別々に調製され、次いで互いにコンジュゲートされるが、これに限らない。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、共有結合は、様々なカップリング剤又は架橋剤を使用して行われ得る。架橋剤の非制限的な例として、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．［実験医学雑誌］１６０：１６８６、Ｌｉｕ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］８２：８６４８を参照されたい）。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．［ベリン研究所の報告］（１９８５）第７８期，１１８－１３２、Ｂｒｅｎｎａｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ［科学］２２９：８１－８３）、Ｇｌｅｎｎｉｅ（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．［免疫学雑誌］１３９：２３６７－２３７５）に記載の方法を含む。結合特異性が抗体（例えば、二つのヒト化抗体）である場合、それらは、二本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のメルカプト結合によりコンジュゲートされてもよい。いくつかの実施例において、コンジュゲートの前に、ヒンジ領域は、奇数個（例えば、一個）のメルカプト残基を含むように修飾されてもよい。
いくつかの実施例において、二重特異性抗体の二つの結合特異性は、同一のベクターにおいてコードされ、同一の宿主細胞において発現と組み立てられてもよい。二重特異性と多重特異性分子がＭＡｂ ｘ ＭＡｂ、ＭＡｂ ｘ Ｆａｂ、Ｆａｂ ｘ Ｆ（ａｂ’）２又はリガンドｘ Ｆａｂ融合タンパク質である場合、該方法は、特に有用である。いくつかの実施例において、本開示の二重特異性抗体は、一本鎖分子、例えば、一本鎖二重特異性抗体、一つの一本鎖抗体と結合決定クラスターを含む一本鎖二重特異性分子又は二つの結合決定クラスターを含む一本鎖二重特異性分子であってもよい。二重特異性と多重特異性分子は、一本鎖分子であってもよく、又は、少なくとも二つの一本鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子と多重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号、米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。本明細書は、三つ又はより多くの機能的抗原結合部位（例えばエピトープ結合部位）を有するエンジニアリング抗体をさらに含み、「タコ抗体」（例えば、ＵＳ ２００６／００２５５７６ Ａ１を参照されたい）を含む。
いくつかの実施例において、動物系は、本開示の抗体の生成に用いることができる。ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。
マウスにおけるハイブリドーマの生成は、非常に完備に確立された手順である。融合のための免疫された脾細胞を単離するための免疫方案と技術は、当分野において既知のものである。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順も既知のものである（例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ［抗体実験室マニュアル］、ニューヨーク州 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ実験室出版社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい）。
２．１２アッセイ
本明細書によって提供される抗体について、当分野の既知のものと本明細書による複数のアッセイにより、その物理／化学的性質及び／又は生物学的活性に対して、同定、スクリーニングまたは特徴付けを行うことができる。
いくつかの実施例において、既知の方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又はウエスタンブロットアッセイ）によって、本開示の抗体の抗原結合活性を試験することができる。これらのアッセイのそれぞれは、通常、関心のある複合体に対して特異性を有する標識試薬（例えば、抗体）により、特に関心のあるタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。例えば、例えば抗体を認識してそれに特異的に結合する酵素結合抗体又は抗体断片により、抗体を検出することができる。代替的に、複数の他の免疫アッセイのうちのいずれか一つにより、抗体を検出してもよい。例えば、該抗体に対して放射性標識を行い、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）において用いる。（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ［放射性免疫アッセイの原則］、Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［放射性リガンド測定技術に関する七回目のトレーニングコース］、Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ［内分泌学会］，１９８６年３月を参照されたく、それを参照として本明細書に組み込む）。例えば、ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）カウンター又はシンチレーションカウンターを用いるか又はオートラジオグラフィーのような手段によって、放射性同位体を検出することができる。
いくつかの実施例において、競合アッセイは、本開示の抗体（例えば、１Ｃ１２、２Ａ３又は１Ｇ１）とＴＩＧＩＴへの結合に関して競合する抗体を同定するために用いられてもよい。いくつかの実施例において、このよう競合抗体は、１Ｃ１２、２Ａ３又は１Ｇ１によって結合される同じエピトープ（例えば、線形又は立体構造エピトープ）に結合する。Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［エピトープ位置決め方案］」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［分子生物学的方法］，第６６巻（Ｈｕｍａｎ出版社（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ），トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）， ニュージャージー州（ＮＪ））にいて、抗体に結合するエピトープを位置決めする詳細な例示的方法が提供されている。
競合アッセイの非限定的な例では、ＴＩＧＩＴに結合する第１の標識抗体（例えば、１Ｃ１２、２Ａ３又は１Ｇ１）と第２の非標識抗体を含む溶液において、固定したＴＩＧＩＴをインキュベートし、ＴＩＧＩＴへの結合に関して第１の抗体と競合する前記第２の非標識抗体の能力を試験することができる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上澄み液に存在してもよい。対照として、固定したＴＩＧＩＴを、第１の標識抗体を含むが、第２の未標識抗体を含まない溶液においてインキュベートする。第１の抗体とＴＩＧＩＴとの結合が許容される条件でインキュベートした後、過剰の未結合抗体を除去し、固定したＴＩＧＩＴに関わる標識物の量を測定する。対照サンプルに比べて、試験サンプルにおいて、固定したＴＩＧＩＴに関わる標識の量が大幅に減少すると、第２の抗体は、第１の抗体とＴＩＧＩＴへの結合に関して競合していることを表す。ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ［抗体実験室マニュアル］第１４章 ニューヨーク州 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ実験室出版社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
本開示は、生物学的活性を有する抗ＴＩＧＩＴ抗体を同定するためのアッセイを提供する。生物学的活性は、例えば、免疫細胞又は免疫活性化レポーター遺伝子（例えば、ＮＦＡＴレポーター遺伝子）の活性化を含んでもよい。インビボ及び／又はインビボでこのような生物学的活性を有する抗体をさらに提供する。
２．１３免疫コンジュゲート
本開示のテーマは、免疫コンジュゲートをさらに提供する。それは、一つ又は複数の検出プローブ及び／又は細胞毒性剤（例えば、化学治療剤又は薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はそれらの断片））、又は放射性同位体にコンジュゲートする本明細書に開示される抗体を含む。例えば、開示されるテーマの抗体又は抗原結合部分は、一つ又は複数の他の結合分子（例えば、別の抗体、抗体断片、ペプチド又は結合模倣体）に機能的に連結されてもよい（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合又は他の方式による）。
いくつかの実施例において、免疫コンジュゲートは、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であり、ここでは、抗体は、一つ又は複数の薬物にコンジュゲートし、薬物は、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０、５，４１６，０６４号と欧州特許ＥＰ ０ ４２５ ２３５）と、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥとＤＦ（ＭＭＡＥとＭＭＡＦ）のようなアウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（米国特許第５，６３５，４８３、５，７８０，５８８及び７，４９８，２９８号を参照されたい）と、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）と、カリスロマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４、５，７１４，５８６、５，７３９，１１６、５，７６７，２８５、５，７７０，７０１、５，７７０，７１０、５，７７３，００１及び５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．［癌研究］５３：３３３６－３３４２（１９９３）、及びＬｏｄｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．［癌研究］５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照されたい）と、ドノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）又はドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）などのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．［現代薬物化学］１３：４７７－５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ［生物有機化学と医薬化学通信］１６：３５８－３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．［生物共役化学］１６：７１７－７２１（２００５）、Ｎａｇｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国国家科学院刊］９７：８２９－８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ［生物有機化学と医薬化学通信］１２：１５２９－１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇら，Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．［医薬化学雑誌］４５：４３３６－４３４３（２００２）、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）と、メトトレキサートと、ビンデシンと、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキサン、チオタキサン及びオタタキサンのようなタキサンと、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）と、ＣＣ１０６５を含むが、それらに限らない。
いくつかの実施例において、免疫コンジュゲートは酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートする本明細書に記載の抗体を含み、前記酵素活性毒素又はその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α－スウェリン、アブリン、ジアンチン、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、ジャトロシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコスタチン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含むが、それらに限らない。
いくつかの実施例において、免疫コンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして、放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載の抗体を含む。複数種の放射性同位体は、放射性コンジュゲートの生産に用いられてもよい。非限定的な例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性コンジュゲートが検出に用いられる時、これは、シンチレーション研究に使用される放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍ又は１１２３、又は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージングとも呼ばれ、ＭＲＩ）に使用されるスピン標識、例えば、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでもよい。
様々な二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジンジメルカプト）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノスルファン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ジスアゾ化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、二重窒素誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリレン２，６－ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン））を使用して、抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートを調製することができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ［科学］，２３８：１０９８（１９８７）に記載のように、リシン免疫毒素を調製してもよい。炭素４－標識化１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン－五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドと抗体をコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞毒性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーを用いることができる（Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．［癌研究］５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい）。
本明細書の免疫コンジュゲート又はＡＤＣは、架橋剤を用いて調製されるようなコンジュゲートを明確にカバーするが、それらに限らず、市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）（例えば、米国イリノイ州ロスルフドのピアースバイオテク社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）からのもの）を含むが、それらに限らない。
３．使用方法
本開示のテーマは、開示される抗体（例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１多重特異性抗体）を使用する方法をさらに提供する。いくつかの実施例において、これらの方法は、現在で公開されている抗体の治療用途に係る。いくつかの実施例において、これらの方法は、現在で公開されている抗体の診断用途に係る。
３．１治療方法
本開示は、本明細書に開示される任意の抗体（例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１多重特異性抗体）を疾患と病症の治療又は免疫応答の強化に用いる方法と用途を提供する。いくつかの実施例において、抗体及び／又は本明細書に開示される抗体を含む薬物組成物を被験体（例えば、例哺乳動物（例えば、ヒト））に投与し、疾患と病症を治療するか又は免疫応答を増加させることができる。いくつかの実施例において、これらの疾患と病症は、免疫チェックポイント阻害及び／又は異常なＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１活性に係る。いくつかの実施例において、本明細書に開示される抗体により治療可能な疾患と病症は、腫瘍形成（例えば、癌）を含むが、それに限らない。
いくつかの実施例において、本開示は、薬物の調製に用いられる本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）を提供する。いくつかの実施例において、本開示は、癌の治療のための薬物の調製に用いられる本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）を提供する。いくつかの実施例において、本開示は、被験体の癌の治療に用いられる本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）を提供する。いくつかの実施例において、本開示は、被験体の癌の治療に用いられる本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）を含む薬物組成物を提供する。いくつかの実施例において、癌は、血液癌（例えば、白血病、白血病及び骨髄腫）、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、結腸癌、腸癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、膠芽腫、喉頭癌、黒色腫、神経芽細胞腫、腺癌、神経膠腫、軟組織肉腫、及び様々な癌（前立腺癌と小細胞肺癌を含む）であってもよい。適切な癌はさらに、腫瘍学の分野において任意の既知の癌を含み、これは、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起膠腫、上衣細胞腫、髄芽腫、原発性神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、膵管腺癌、小細胞と大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮細胞癌、気管支肺胞癌、上皮腺癌、及びそれらの肝転移、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝臓癌、胆管癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、基底細胞癌、汗腺腫、乳頭状癌、皮脂腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎仔癌、ウィルムス腫瘍、髄芽腫、髄咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、乳房腫瘍（例えば、導管腺癌と小葉腺癌）、子宮頸部扁平上皮癌と腺癌、子宮上皮癌と卵巣上皮癌、前立腺癌、膀胱移行性扁平上皮癌、ＢとＴリンパ腫（結節性及び分散性）、形質細胞腫、急性と慢性白血病、悪性黒色腫、軟部組織肉腫、及び平滑筋肉腫を含むが、それらに限らない。
いくつかの実施例において、癌は、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、頭頸癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、例えば、トリプルネガティブ乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、胆管癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫原発性縦隔Ｂ－細胞リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、又は甲状腺癌であってもよい。
いくつかの実施例において、治療されるべき被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト、非霊長類動物、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。いくつかの実施例において、被験体は、ヒトである。いくつかの実施例において、被験体は、癌を有することが疑われるか、又は癌を有するリスクがあるか、又は異常なＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１発現若しくは活性を有する癌又は任意の他の疾患と診断されている。
異常なＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１活性を示す多くの癌又は任意の他の疾患の診断方法及びこれらの疾患の臨床的説明は、当分野の既知のものである。このような方法は、例えば、免疫組織化学、ＰＣＲ、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含むが、それらに限らない。異常ＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１活性又は発現の診断方法に関する他の詳細は、例えば、Ｇｕｐｔａら，（２００９）Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ．［現代病理学］２２（１）：１２８－１３３、Ｌｏｐｅｚ－Ｒｉｏｓら（２０１３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．［臨床病理学雑誌］６６（５）：３８１－３８５、Ｅｌｌｉｓｏｎら（２０１３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ［臨床病理学雑誌］６６（２）：７９－８９；Ａｎｄ及びＧｕｈａら（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ［公共科学図書館・統合］８（６）：ｅ６７７８２に記載されている。
例えば、静脈内、筋肉内又は皮下を含む任意の適切な経路によって投与してもよい。いくつかの実施例において、本明細書による抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）及び／又は組成物は、第２、第３、又は第４の薬剤（例えば、抗腫瘍薬、増殖阻害剤、細胞毒性剤又は化学治療剤を含む）と併用投与され、異常なＴＩＧＩＴ／ＰＤ１活性に係る疾患又は障害を治療することができる。このような薬剤は、例えば、ドセタキセル、ゲフィチニブ、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、５－フルオロウラシル、及びフォリン酸）、イリノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）、ＦＯＬＦＯＸ－４、注入フルオロウラシル、フォリン酸とオキサリプラチン、アルファルチニブ、ゲムシタビン、カペシタビン、ペメトレキセド、テカルチニブ、エベロリムス、ＣｐＧ－ＯＤＮ、ラパマイシン、レナリドマイド、ベロフィニル、エンドスタチン、ラパチニブ、ＰＸ－８６６、Ｉｍｐｒｉｍｅ ＰＧＧ、及びイリノチニブを含む。いくつかの実施例において、抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）を別の薬剤にコンジュゲートする。
いくつかの実施例において、本明細書による抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）及び／又は組成物を一つ又は複数の他の療法（例えば、放射線療法、手術、化学療法及び／又は標的療法）と併用投与する。いくつかの実施例において、本明細書による抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）及び／又は組成物を放射線療法と併用投与する。いくつかの実施例において、本明細書による抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）及び／又は組成物は、放射線療法と併用されて、本明細書に開示される新生物又は癌の治療に用いる。
治療されるべき適応症及び当業者に周知の投与に関連する要因に応じて、本明細書による抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体又はその断片は、毒性と副作用を最小限に抑えながら、この適応症を治療するのに有効な用量で投与される。癌の治療に対して、典型的な投与量は、例えば、０．００１から１０００μｇの範囲内であってもよいが、この例示的な範囲よりも低いか又は高い投与量は、本発明の範囲内に含まれる。一日の投与量は、総体重の約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、総体重の約０．１μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ又は総体重の約１μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇであってもよい。上述したように、治療される患者を定期的に評価することで、治療又は予防効果をモニタリングすることができる。数日以上の繰り返し投与については、症状に応じて、所望の疾患症状の抑制が起こるまで繰り返し治療を行う。しかしながら、他の投与量方案は、有用である可能性があり、且つ本発明の範囲内にある。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与、組成物の複数回ボーラス投与、又は組成物の連続注入による投与によって送達されてもよい。
抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体又はその断片を含む薬物組成物は、１日１回、２回、３回又は４回投与されてもよい。組成物は、毎日の投与よりも低い頻度、例えば、毎週６回、毎週５回、毎週４回、毎週３回、毎週２回、毎週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、毎月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、又は６ヶ月毎に１回、投与されてもよい。組成物は、例えば、インプラントに徐放性製剤で投与されてもよく、このインプラントは、ある期間にわたって使用するためにこの組成物を徐々に放出し、且つこの組成物をより低い頻度、例えば、毎月１回、２－６ヶ月毎に１回、毎年１回、又はさらに単回投与することを許容する。徐放性装置（例えば、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノスフェア、ミクロスフェアなど）は、注射によって投与されてもよい。
抗体（又はその断片）は、１日１回の投与量で投与されてもよく、または１日の総投与量は、１日２回、３回、又は４回の分割投与量で投与されてもよい。組成物は、毎日の投与よりも低い頻度、例えば、毎週６回、毎週５回、毎週４回、毎週３回、毎週２回、毎週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、毎月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、又は６ヶ月毎に１回、投与されてもよい。抗体（又はその断片）は、例えば、インプラントに徐放性製剤で投与されてもよく、このインプラントは、ある期間にわたって使用するためにこの組成物を徐々に放出し、且つこの組成物をより低い頻度、例えば、毎月１回、２－６ヶ月毎に１回、毎年１回、又はさらに単回投与することを許容する。徐放性装置（例えば、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノスフェア、ミクロスフェアなど）は、注射又は種々の位置に外科的に埋め込むことで投与されてもよい。
例えば、腫瘍退縮、腫瘍重量又はサイズ縮小、進行時間、生存期間、無進行生存期間、全体の反応率、応答期間、生活の質、タンパク質発現及び／又は活性によって、癌の治療を評価してもよいが、それらに限らない。例えば、放射線画像化によって反応を測定することを含む、治療効果を決定する方法を用いることができる。
いくつかの実施例において、治療効果を腫瘍増殖阻害パーセント（％ＴＧＩ）として測定し、等式１００－（Ｔ／Ｃ ｘ１００）を使用して計算され、ここでは、Ｔは、治療される腫瘍の平均相対的腫瘍体積であり、且つＣは、未治療の腫瘍の平均相対的腫瘍体積である。いくつかの実施例は、％ＴＧＩは、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％）、約９４％）、約９５％であってもよく、又は９５％よりも多くてもよい。
３．２診断とイメージング方法
標識された抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体、その断片、及びその誘導体又は類似体は、ＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１の発現、異常な発現及び／又は活性に関わる疾患及び／又は障害を検出、診断又はモニタリングするように、診断に使用される。例えば、本明細書による抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）は、インサイチュ、インビボ、エクスビボ、及びインビトロ診断アッセイ又はイメージングアッセイに用いられてもよい。ＴＩＧＩＴポリペプチド発現を検出するための方法は、（ａ）本発明の一つ又は複数の抗体を用いて、個体の細胞（例えば、組織）又は体液におけるポリペプチドの発現を測定することと、（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的遺伝子発現レベルを比較することであって、標準的な発現レベルに比べて、測定される遺伝子発現レベルの増加又は減少が異常な発現を指示することを含む。
本明細書による別の実施例は、動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において、ＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１の発現又は異常な発現に関わる疾患又は障害を診断する方法を含む。これらの方法は、哺乳動物において、ＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１分子を検出することを含む。いくつかの実施例において、診断は、（ａ）哺乳動物に、有効量の標識された抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）を投与することと、（ｂ）投与後、ＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１分子を発現する被験体の部位で、標識された抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体の優先的な濃縮を可能にするために、一定の時間間隔を待つ（且つ未結合の標識された分子をバックグラウンドレベルまで除去する）ことと、（ｃ）バックグラウンドレベルを決定することと、（ｄ）被験体における標識された分子を検出し、バックグラウンドレベルよりも高いと検出された標識された分子に、被験体がＴＩＧＩＴ／ＰＤ１発現又は異常な発現に関わる特定の疾患又は障害を指示させることと、を含む。バックグラウンドレベルは、異なる方法で決定されてもよく、これらの方法は、検出された標識分子の量をこの前に一つの具体的なシステムに対して決定された標準値と比較することを含む。
本明細書による抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体（又はその断片）は、当業者に周知の古典的免疫組織学方法を用いて生物サンプルにおけるタンパク質レベルを測定することに用いられてもよい（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［細胞生物学雑誌］１０１：９７６－９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［細胞生物学雑誌］１０５：３０８７－３０９６（１９８７）を参照されたい）。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な、抗体に基づく他の方法は、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）と放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）を含む。適した抗体アッセイ標識は、当分野における既知のものであり、且つ酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）と、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕのような放射性同位体と、ルミノールと、蛍光標識（例えば、フルオレセイン及びローダミン及びビオチン）を含む。
当分野の既知の技術は、本明細による標識された抗体（又はその断片）に応用可能である。このような技術は、二官能性コンジュゲート（例えば、米国特許第５，７５６，０６５、５，７１４，６３１、５，６９６，２３９、５，６５２，３６１、５，５０５，９３１、５，４８９，４２５、５，４３５，９９０、５，４２８，１３９、５，３４２，６０４、５，２７４，１１９、４，９９４，５６０及び５，８０８，００３号を参照されたい）を用いることを含むが、それに限らない。
代替的に又は付加的に、細胞における、ＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１ポリペプチドをコードする核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定してもよく、例えば、ＥＧＦＲをコードする核酸又はその相補性配列に対応する核酸ベースのプローブを用いた蛍光インサイツハイブリダイゼーション、（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９を参照されたい）、ＤＮＡブロッティング、ＲＮＡブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いる。生体液（例えば、血清）における脱落した抗原を測定することで、ＴＩＧＩＴ及び／又はＰＤ１の過剰発現を研究することもでき、例えば、抗体に基づくアッセイを用いる（さらに、例えば、１９９０年６月１２日に開示された米国特許第４，９３３，２９４号、１９９１年４月１８日に開示されたＷＯ ９１／０５２６４、１９９５年３月２８日に開示された米国特許第５，４０１，６３８号、及びＳｉａｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ［免疫方法雑誌］１３２：７３－８０（１９９０）を参照されたい）。上記アッセイに加えて、当業者は、様々なインビボとエクスビボアッセイを得ることができる。例えば、哺乳動物体内の細胞を抗体に曝露し、該抗体として、検出可能な標識（例えば放射性同位体）で任意選択的に標識され、且つ、例えば、放射性の外部走査、又は、以前に抗体に曝露された哺乳動物から採取されたサンプル（例えば、生検又は他の生物学的サンプル）の分析によって、抗体と体細胞との結合を評価することができる。
４．薬物製剤
本公開のテーマは、本明細書に開示される一つ又は複数の抗体及び薬学的に許容されるキャリア剤を含む薬物製剤をさらに提供する。いくつかの実施例において、薬物組成物は、現在では開示されているテーマの複数（例えば、二つ又はより多くの）抗体及び／又はその抗原結合部分の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施例において、本開示の薬物組成物は、一つ又は複数の抗ＴＩＧＩＴ抗体又は一つ又は複数の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１多重特異性抗体を含んでもよい。
いくつかの実施例において、開示される薬物製剤は、所望の純度を有する抗体を、１つ又は複数の任意の薬学的に許容されるキャリア剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［レーミントン薬物科学］，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．による編集（１９８０））と組み合わせ、凍結乾燥製剤又は水溶液の形式で、調製されてもよい。例えば、凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８に記載されているが、それに限らない。いくつかの実施例において、水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号とＷＯ ２００６／０４４９０８に記載のものを含んでもよく、後者の製剤は、ヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。いくつかの実施例において、抗体は、約８０％よりも大きく、約９０％よりも大きく、約９１％よりも大きく、約９２％よりも大きく、約９３％よりも大きく、約９４％よりも大きく、９５％よりも大きく、約９６％よりも大きく、約９７％よりも大きく、約９８％よりも大きく、約９９％よりも大きく、約９９．１％よりも大きく、約９９．２％よりも大きく、約９９．３％よりも大きく、約９９．４％よりも大きく、約９９．５％よりも大きく、約９９．６％よりも大きく、約９９．７％よりも大きく、約９９．８％よりも大きく、又は、約９９．９％よりも大きい純度を有してもよい。
薬学的に許容されるキャリア剤は、通常、使用される投与量と濃度でレシピエントに対して無毒であり、且つ、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸）、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブタノール、又はベンジルアルコール、アルキルパラベン（例えば、メチル又はプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びメタクレゾール）、低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチドと、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン）、単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール）、塩を形成したカウンターイオン（例えば、ナトリウム）、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むが、それらに限らない。本明細書における例示的な薬学的に許容されるキャリア剤は、間葉系薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）をさらに含む。米国特許第２００５／０２６０１８６と２００６／０１０４９６８号において、ｒＨｕＰＨ２０を含むいくつかの例示的なｓＨＡＳＥＧＰと使用方法が記載されている。いくつかの実施例において、ｓＨＡＳＥＧＰは、一つ又は複数の別のグリコサミノグリカナーゼ（例えばコンドロイチナーゼ）と組み合わせられる。
キャリア剤は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄投与又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適してもよい。投与経路に応じて、活性化合物（即ち、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体又は抗ＴＩＧＩＴ抗体）を、酸及び化合物を不活性化し得る他の自然条件の影響からこの化合物を保護するために、材料にコーティングしてもよい。
本開示の薬物組成物は、併用治療に用いられてもよく、即ち、他の薬剤と併用投与されてもよい。いくつかの実施例において、本明細書に開示される薬物組成物は、一つ又は複数の活性成分をさらに含んでもよく、これは、治療される特定の適応症に対して必須なものであり、例えば、相補活性を有し且つ互いに不利な影響を発生しないものである。いくつかの実施例において、薬物製剤は、第１の治療剤によって治療される同じ疾患を治療するための第２の活性成分を含んでもよい。このような活性成分は、所望の目的に有効な量で適宜組み合わせられて存在する。例えば、本開示の製剤は、一つ又は複数の活性成分をさらに含んでもよいが、それらに限らない。これは、治療される特定の適応症に対して必須なものであり、好ましくは、相補活性を有し且つ互いに不利な影響を発生しないものである。例えば、同じ疾患を治療するための第２の治療剤をさらに提供することが望まれる可能性がある。このような活性成分は、所望の目的に有効な量で適宜組み合わせられて存在する。
本開示の組成物は、当分野の既知の様々な方法で投与されてもよい。投与経路及び／又は方式は、必要な結果によって決まる。これらの活性化合物は、迅速な放出から化合物を保護するキャリア剤、例えば、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を用いて調製することができる。生分解性と生体適合性を有するポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を用いてもよい。このような製剤を調製する多くの方法は、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ［徐放性と制御放出性薬物送達システム］，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，による編集，マルセルデッカー社，ニューヨーク，１９７８に記載されている。いくつかの実施例において、薬物組成物は、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の優れた製造規制（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ））条件で生産される。
開示される抗体を含有する徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例としては、抗体の固体疎水性ポリマーを含有する半透過性マトリックスが挙げられ、マトリックスは、成形品（例えば、フィルム又はマイクロカプセル）の形式である。いくつかの実施例において、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又は粗エマルジョンにおけるヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセルとポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、活性成分を包埋することができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［レーミントン薬物科学］，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．による編集（１９８０）に記載されている。
いくつかの投与経路によって本開示の抗体を投与するために、この化合物を、その不活性化を防止する材料で被覆するか、又はこの化合物と共に投与することを必要とする可能性がある。例えば、適切なキャリア剤（例えば、リポソーム）又は希釈剤において、化合物を被験体に投与してもよい。薬学的に許容される希釈剤は、生理食塩水と緩衝水溶液を含む。リポソームは、水中油中水型ＣＧＦエマルジョン及び従来のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎら（１９８４）Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．［神経免疫学雑誌］７：２７）を含む。
薬学的に許容されるキャリア剤は、無菌水溶液又は分散液及び滅菌注射可能溶液又は分散液の一時的な調製のための滅菌粉末を含む。このような媒体及び薬剤を薬学的活性のために使用する物質は、当分野において既知のものである。
任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物に対して適合性を有しない場合を除いて、それを本開示の薬物組成物に用いることを考慮してもよい。補足的な活性化合物を組成物にドープしてもよい。
治療用組成物は、通常、無菌で、基本的に等張性を有し、且つ生産及び貯蔵条件で安定したものでなければならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序構造として調合されてもよい。このキャリア剤は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、（例えば）コーティング（例えば、レシチン）の使用によって維持されてもよく、分散液の場合には所望の粒子サイズの維持によって維持され、且つ界面活性剤の使用によって、維持される。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリオール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウムが含まれることが好ましい。例えばモノステアレート及びゼラチンのような吸収遅延薬剤を組成物に含有させることによって、これらの注射用組成物の長期吸収を実現させることができる。
滅菌注射溶液は、所望の量の一つ又は複数の開示した抗体を、必要に応じて、適切な溶媒と上に列挙した成分の一つ又は複数との組合せと共にドープし、次いで、滅菌精密ろ過（例えば、滅菌ろ過膜によるろ過）を行うことによって調製されてもよい。通常、分散液は、以下の方式で調製される。
活性化合物を無菌媒体にドープし、この無菌媒体は、基本分散媒及び上に列挙したものからの他の所望の成分を含む。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥と凍結乾燥（凍乾）であり、前記方法は、その前の滅菌ろ過溶液から、活性成分と任意の他の所望の成分の粉末を生成する。
当分野の既知の医療装置を用いて治療性組成物を投与することもできる。
例えば、本発明の治療組成物は、針のない皮下注射装置、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、５，３８３，８５１号、５，３１２，３３５号、５，０６４，４１３号、４，９４１，８８０号、４，７９０，８２４号又は４，５９６，５５６号に開示されている装置と共に投与されてもよい。本開示に使用可能なインプラント及びモジュールの例としては、制御された速度で薬物を分配するための埋め込み型微小注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬物を投与するための治療装置を開示する米国特許第４，４８６，１９４号、正確な注入速度で薬物を送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬剤送達のための可変流量埋め込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、マルチチャンバコンパートメントを有する浸透性薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号、及び浸透性薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くのこのようなインプラント、送達システム及びモジュールが知られている。
治療用組成物について、本開示の製剤は、経口、経鼻、局所（頬側と舌下を含む）、直腸、膣内及び／又は非経口投与に適したそれらの製剤を含む。これらの製剤は、単位剤形で好都合に存在してもよく、且つ薬学分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。単一剤形を生成するためにキャリア剤材料と組み合わせることができる抗体の量は、治療される被験体と特定の投与方式に応じて変わる。単一剤形を生成するためにキャリア剤材料と組み合わせることができる抗体の量は、通常、治療効果をもたらす組成物の量である。通常、この量は、パーセンテージで、約０．０１％から約９９％、約０．１％から約７０％、又は約１％から約３０％の活性成分である。
本開示の組成物の局所投又は経皮投与のための剤形としては、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液、パッチ剤及び吸入剤を含む。活性化合物を、滅菌条件で、薬学的に許容されるキャリア剤及び必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝液又は推進剤と混合してもよい。
「非経口投与」と「非経口による投与」という語句は、通常、注射による、経腸投与と局所投与以外の投与モードを指し、且つ静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内の注射と注入を含むが、それらに限らない。
これらの薬物組成物は、補助剤、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順によって、及び様々な抗菌剤と抗真菌剤、例えばパラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによって、確保され得る。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等をこれらの組成物に含ませることも望ましい場合がある。さらに、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムとゼラチンを含むことによって、注射可能な薬物形式の持続的な吸収を引き起こすことができる。
いくつかの実施例において、本開示の抗体をヒト及び動物に薬物として投与する場合、それらは、単独で、又は医薬的に許容されるキャリア剤と組み合わせて、薬物組成物として投与することができ、前記薬物組成物は、例えば、約０．０１％から約９９．５％（又は約０．１％から９０％）の本明細書に記載の抗体を含む。
５．製品
本開示のテーマは、上記疾患の治療、予防及び／又は診断に用いられる材料を含む製品をさらに提供する。
いくつかの実施例において、製品は、容器と、容器上の又は容器に関連するラベル又は包装インサートを含む。好適な容器の非限定的な例としては、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、様々な材料（例えば、ガラス又はプラスチック）により形成されてもよい。容器は、（それ自体、又は別の組成物との組み合わせで）疾患を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。
いくつかの実施例において、組成物における少なくとも一つの活性剤は、本開示のテーマの抗体である。ラベル又は包装インサートは、組成物が選択された病症の治療に使用されることを指示することができる。
いくつかの実施例において、この製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が入れられた第１の容器と、（ｂ）他の細胞毒性又は治療剤を含む組成物が入れられた第２の容器とを含んでもよい。いくつかの実施例において、前記製品は、前記組成物が特定の病症の治療に使用され得ることを指示する包装インサートをさらに含んでもよい。
代替的に又は付加追加的に、製品は、別の容器、例えば、第２又は第３の容器をさらに含んでもよく、それは、薬学的に許容される緩衝剤、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含むが、それらに限らない。この製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
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以下の例は、本開示のテーマに関する説明だけであり、いかなる方式で限定のためのものと見なされるべきではない。
例
例１．免疫化、抗ヒトＴＩＧＩＴ ＶＨＨ抗体の生成と苗頭抗体の発見
組み換えヒトＴＩＧＩＴ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質の抗原は、Ａｒｃｏ Ｂｉｏ社から購入された。当分野の既知の方案に応じて、ラマを用いてＴＩＧＩＴの免疫化を行った。ＥＬＩＳＡアッセイにより、血清抗体の力価を測定した。３回の免疫化を行った後、高力価（１：１００，０００）が観察されたそして、全血を収集し、ＰＢＭＣを単離した。そして、ＰＢＭＣからＲＮＡを単離した。
当分野の既知の方案において、ＶＨＨ抗体遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、ＤＮＡアガロースゲルにより精製し、ファージベクターｐＡＤＬ－２３ｃ（抗体設計実験室（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ））に構築し、ＴＧ１誘導性受容細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ社から）に形質転換した。形質転換されたＴＧ１細胞をＹ２Ｔ培地で培養した。ヘルパーファージを添加して一晩共培養することにより、標的ＶＨＨを有するファージを生産することができる。培養上澄み液におけるファージを遠心分離により回収し、ビオチン化したｈ－ＴＩＧＩＴ又はｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴ ＥＣＤでコーティングしたストレプトアビジン結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いて、ヒト－ＴＩＧＩＴ（ｈ－ＴＩＧＩＴ）又はカニクイザル－ＴＩＧＩＴ（ｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴ）抗原に対する結合剤のパニングを行った。三回のパニングの後、ｈ－ＴＩＧＩＴ又はｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴの結合物が溶出され、それをＳＳ３２０細胞の感染に使用した。ＳＳ３２０細胞のコロニーを選択し、Ｙ２Ｔ培地で培養し、ＩＰＴＧを添加してＶＨＨ抗体を分泌した。ｈ－ＴＩＧＩＴ ＥＣＤでコーティングされたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡ分析によって、ＶＨＨ抗体を有する上澄み液をスクリーニンした。陽性ｈ－ＴＩＧＩＴ結合剤を選択して、配列決定を行った。配列の異なる２９個のクローンを選択した。さらに、ＥＬＩＳＡによって、ｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴに対するＶＨＨ抗体の結合能力を調べた。配列表（配列番号１－８４）に、最初の２１種の結合剤及びＣＤＲとＶＨが示された。
さらに、遮断ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ、ＣＤ１５５とも呼ばれる）とＴＩＧＩＴとの結合の遮断に対するＶＨＨ抗体クローンの影響を決定した。さらに、ＰＶＲとｈ－ＴＩＧＩＴとの結合に対して９０％以上の阻害作用を有する９個のクローン（クローン名称：２Ｂ７、１Ｇ１、１Ｃ１２、３Ｇ６、２Ｂ１０、３Ｇ７、３Ｆ１０、１３Ｈ１１、及び１５Ａ５）を選択した。
例２－ＴＩＧＩＴ ＶＨＨ抗体の特徴付けと選択
図１Ｃに示すヒト定常重鎖２（ＣＨ２）と定常重鎖３（ＣＨ３）ドメインを加えることによって、例１から同定された抗体クローンを構築して、二価抗体を調製した。構築した二価ＶＨＨ抗体をＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現させ、上澄み液におけるタンパク質を回収し、タンパク質Ａにより精製した。
フローサイトメトリーアッセイにより、ヒトＴＩＧＩＴによってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞に対する二価クローンの結合親和性を確認した。ヒトＴＩＧＩＴとＮＦＡＴレポーター遺伝子を安定して発現するＪｕｒｋａｔ細胞を確立した。具体的には、エレクトロポレーションにより、ヒトＴＩＧＩＴ発現ベクターでＪｕｒｋａｔ細胞をトランスフェクトし、細胞培養期間に１ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて、ヒトＴＩＧＩＴを安定して発現する細胞を選択した。代表的な抗体クローンを、９６ウェルプレートにおいて１００ｕｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液（１．５％のＦＢＳを含有するＰＢＳ）で、様々な濃度で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（０．２×１０６／ｍｌ）を安定して発現するｈ－ＴＩＧＩＴと共に３０分間インキュベートした。洗浄後、Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ４８８にカップリングした抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異性、ジャクソン実験室（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）、１：５００希釈）を添加し、３０分間インキュベートした。洗浄後、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（ベックマンコールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて、ゲーティングした生存細胞集団により平均蛍光強度を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて結合親和性を計算した。代表的な結果を図１Ａと１Ｂに示す。参照Ａｂ１（ＵＳ２０１６／０１７６９６３ Ａ１に開示された参照抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体は、開示された配列に従って合成される）に比べて、試験した抗体の全ては、ヒトＴＩＧＩＴを発現する細胞に対して高い結合親和性を示した。
さらに、エレクトロポレーションを用いて、ＮＦＡＴレポーター遺伝子により、ヒトＴＩＧＩＴを安定して発現するＪｕｒｋａｔ細胞をトランスフェクトした。ＮＦＡＴレポーター遺伝子を発現する細胞を、培地における３００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンにより選択した。さらに、Ｒａｊｉ細胞をヒトＰＶＲで安定してトランスフェクトし、培地において、ハイグロマイシンを用いて１２５ｕｇ／ｍｌで、トランスフェクトした細胞を選択した。そして、ブドウ球菌エンテロ毒素（ＳＥＥ、０．０１ｎｇ／ｍｌ）の存在で、ヒトＰＶＲを発現するＲａｊｉ細胞、ヒトＴＩＧＩＴ及びＮＦＡＴレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、５時間共インキュベートすることにより、ＰＶＲによって媒介されるＴＣＲ誘導性ＮＦＡＴレポーター遺伝子活性の阻害に対する抗体の効果を測定した。基質（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を有するＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ緩衝液を加え、プレートリーダーを用いて化学発光活性によりルシフェラーゼ活性を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓの非線形回帰法を用いて、ＴＩＧＩＴ活性を遮断する抗体の能力を計算した。代表的な結果は、図２に示すとおりである。参照Ａｂ １に比べて、３Ｆ１０以外の全ての試験クローンは、いずれも、類似するＴＩＧＩＴ遮断作用を示した。
例３－抗ＴＩＧＩＴ抗体のヒト化
二つの代表的なクローン１Ｇ１と１Ｃ１２を選択し、それらのフレームワークをヒト化した。簡単に言えば、２つのクローン配列を用いてＩｇｂｌａｓｔを行うことで、ヒト生殖系列遺伝子のデータベースを検索した。望ましい生殖系列配列を選択し、フレームワーク配列に対して突然変異を行い、フレームワーク配列をラマからヒトに変化させた。１Ｃ１２クローンについて、ヒト生殖系列ＩＧＨＶ－３－３０＊１０を使用し、三つの形式のヒト化１Ｃ１２（１Ｃ１２－ＥＲＥＦ、１Ｃ１２－ＥＲＥＷ及び１Ｃ１２－ＧＬＥＷ）を作成した。１Ｇ１クローンについて、ヒト生殖系列ＩＧＨＶ－３－３０＊０１を使用し、六つの形式のヒト化１Ｇ１（１Ｇ１－Ｆ－Ｇ－ＥＲＥＳ、１Ｇ１－Ｆ－Ａ－ＥＲＥＳ、１Ｇ１－Ｆ－Ａ－ＥＲＥＷ、１Ｇ１－Ｆ－Ａ－ＧＬＥＷ、１Ｇ１－Ｆ－Ａ－ＧＲＥＬと１Ｇ１－Ｆ－Ａ－ＧＲＥＳ）を作成した。構築体を発現ベクターにクローニングし、ＥｘｐｉＣＨＯの瞬時トランスフェクションによって抗体タンパク質を生成し、タンパク質Ａによって精製した。
ヒトＴＩＧＩＴに対するヒト化二価抗体の結合親和性は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上で安定して発現されるｈ－ＴＩＧＩＴの全細胞に結合することによって決定された。簡単に言えば、抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液において、ｈ－ＴＩＧＩＴによってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（１００μｌの０．２ｘ１０６／ウェル）と共に３０分間インキュベートした。細胞を一回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（１：５００）と共にインキュベートした。図３Ａに示すように、ＣｙｔｏＦｌｅｘにより平均蛍光強度を決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０を用いて非線形回帰を行い、ｈ－ＴＩＧＩＴに対する抗体の結合親和性を計算した。キメラ親クローンに比べて、類似する結合親和性が、１Ｃ１２クローンの３つの形式の全てについて観察された。１Ｇ１クローンでは、キメラクローンに比べて、二つのヒト化形式フォームＦ－Ｇ－ＥＲＥＳとＦ－Ａ－ＥＲＥＳは、ｈ－ＴＩＧＩＴに対して類似する親和性を示したが、二つの形式（Ｆ－Ａ－ＥＲＥＷとＦ－Ａ－ＧＬＥＷ）は、図３Ｂに示されるように、ｈ－ＴＩＧＩＴに対して結合親和性を失った。
前述した方法を用いて、ＴＣＲによって媒介されるＮＦＡＴレポーター遺伝子の活性に対するＰＶＲ媒介性阻害を遮断するヒト化抗体の活性を決定する。簡単に言えば、ＰＶＲによってトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞と低濃度のブドウ球菌エンテロ毒素（ＳＥＥ、０．０１ｎｇ／ｍｌ）の存在で、ヒトＴＩＧＩＴとＮＦＡＴレポーター遺伝子によってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を、様々な濃度の抗体と共に５時間インキュベートした。基質（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を有するＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ緩衝液を添加し、ルシフェラーゼ活性を測定した。代表的な結果を図４Ａと４Ｂに示す。キメラ親クローンと参照抗ｈ－ＴＩＧＩＴ抗体参照Ａｂ１に比べて、１Ｃ１２クローンの全てのヒト化形式は、ＴＩＧＩＴの遮断の方面では、類似する効き目を有する。二つの形式１Ｇ１－（Ｆ－Ａ－ＥＲＥＷ）と１Ｇ１－（Ｆ－Ａ－ＧＬＥＷ）が遮断効果を失ったことを除き、１Ｇ１の全てのヒト化形式は、ＴＩＧＩＴの遮断の方面では、キメラ親クローンと類似する効き目を有する。
例４－親和性成熟、選択及び修正
１Ｇ１－Ｆ－Ａ－ＥＲＥＳクローンに対して親和性成熟を行った。各ＣＤＲ領域のアミノ酸を単一突然変異させるためのプライマーを設計した。アセンブルＰＣＲを用いて突然変異ライブラリーを調製し、ファージベクターにクローニングする。形質転換されたＴＧ１細胞とクローンのＤＮＡ配列決定によって、ライブラリーの品質を測定した。ヘルパーファージを用いてファージ生成を行い、ビオチン化したｈ－ＴＩＧＩＴ ＥＣＤ又はｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴ ＥＣＤでコーティングしたストレプトアビジン結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いてファージのパニングを行った。２回のパニングの後、パニング生成物を、ＳＳ３２０細胞の感染のために溶出させ、コロニーを取り出し、ＩＰＴＧを有するＹ２Ｔ培地で培養した。ＥＬＩＳＡアッセイにより上澄み液におけるＶＨＨ抗体を検査した。ｈ－とｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴに対する陽性クローンを選択し、ｈ－とｃｙｎｏ－ＴＩＧＩＴを安定して発現する細胞と全細胞結合した。選択されたクローンはまた、ＰＶＲ遮断ＥＬＩＳＡとヒトＴＩＧＩＴ遮断ＮＦＡＴレポーター遺伝子の検出を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ５０又はＩＣ５０値を計算した。配列表（配列番号９４－１７７）に、最初の２５種の結合剤及びＣＤＲとＶＨＨが示された。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、全細胞結合と遮断ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＥＣ５０／ＩＣ５０の相関をプロットし、代表的なデータを図５Ａ－５Ｃに示した。２Ａ３が最も高い親和性と効き目を有すると同定された。
２５℃から７０℃の温度で６０分間熱処理することによって、１２個の代表的なクローンの熱安定性を試験し、そして、ＥＬＩＳＡと全細胞結合フローサイトメトリーを使用して、処理されたサンプルとヒトＴＩＧＩＴとの結合を検出し、その結果を図６Ａと６Ｂに示した。他のクローンに比べて、クローン２Ａ３は、より高い熱安定性を有する。
ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２とＣＨ３ドメインを用いて、二価２Ａ３抗体（２Ａ３－Ｆｃ）を構築した。抗体をＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現させ、タンパク質Ａカラムにより精製した。抗ＴＩＧＩＴ参照抗体参照Ａｂ１と参照Ａｂ２（Ｕ．Ｓ．２０１７／００８８６１３Ａ１に開示されたＴｉｒａｇｏｌｕｍａｂ配列に従って合成された、Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂと同じアミノ酸配列を有する参照抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体）に比べて、Ｏｃｔｅｔ結合アッセイを用いて、ヒトＴＩＧＩＴに結合する２Ａ３－Ｆｃエピトープを研究した。図７Ａ－７Ｃに示すように、参照Ａｂ １と参照Ａｂ ２に比べて、２Ａ３クローンは、異なる結合エピトープに結合した。
ヒト、カニクイザル及びマウスＴＩＧＩＴに対する２Ａ３－Ｆｃの種間結合活性をＥＬＩＳＡアッセイによって測定し、その結果を図８Ａ－ ８Ｃに示した。２Ａ３－Ｆｃは、ヒト、カニクイザルに結合するが、マウスＴＩＧＩＴに結合しなかった。
２Ａ３のＣＤＲ領域の分析は、二つのホットスポット、即ちＣＤＲ２におけるメチオニン及びＣＤＲ３におけるアスパラギン酸、そしてセリンを決定した。メチオニンをロイシン及びイソロイシンに、アスパラギン酸をスレオニン及びグルタミン酸に突然変異させた。修飾した抗体（２Ａ３ ＭＬ、２Ａ３ ＭＩ、２Ａ３ ＭＬ＿ＤＴ（２Ａ３ ＬＴとも呼ばれる）及び２Ａ３ ＭＬ＿ＤＥ）のＣＤＲとＶＨを配列表に示す（配列番号１７８－１９３）。全細胞結合とＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子検出において、修飾形式を試験したところ、親２Ａ３クローンに比べて、これらの修飾した抗体はすべて、類似する特性を示した。図９は、２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃの代表的なデータを示し、ここでは、ＭはＬに変化し、ＤはＴ（２Ａ３ ＭＬ ＤＴ）に変化し、ここでは、親２Ａ３－Ｆｃに比べて、全細胞結合アッセイでは類似するヒトＴＩＧＩＴ結合親和性が観察され、ＮＦＡＴレポーターアッセイでは類似する効き目が観察された。
２Ａ３－Ｆｃの親和性と効力を、参照抗ＴＩＧＩＴ抗体参照Ａｂ２と比較した。２Ａ３－Ｆｃは、参照Ａｂ２よりもはるかに高い親和性を示した。全細胞結合アッセイでは、２Ａ３－ＦｃのＥＣ５０値は０．３２±０．０６ｎＭであるが、参照Ａｂ２（ｎ＝３）は０．６１±１０．１３ｎＭである（図１０Ａ）。参照Ａｂ ２に比べて、２Ａ３－Ｆｃは、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子検出においても、ＴＩＧＩＴを遮断する類似する効き目を示した。２Ａ３－ＦｃのＥＣ５０値は、０．４８±１０．１８ｎＭであるが、参照Ａｂ ２（ｎ＝３）は０．７２±０．４２ｎＭである（図１０Ｂ）。
例５－インビトロ抗腫瘍効き目の研究
抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍効果をインビトロでさらに検査した。腫瘍微小環境において、ＴＩＧＩＴ＋ Ｔ細胞をＰＶＲ＋樹状細胞（ＤＣ）と接触させると、ＤＣで発現されるＰＶＲは、Ｔ細胞で発現されるＴＩＧＩＴに結合し、それによって、Ｔ細胞の抗腫瘍活性、例えば、抗腫瘍サイトカイン分泌を阻害することができる。有効な抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いた治療は、ＴＩＧＩＴとＰＶＲとの間の相互作用を遮断し、それによってＴ細胞の抗腫瘍活性を強化することができる。
混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）は、腫瘍微小環境におけるこの現象の模倣に用いられる。健常ドナーＰＢＭＣから単離されたＣＤ１４＋単球を、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４と５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦと共に７日間（４日目に培地を交換して）ＲＰＭＩで培養し、ＤＣに分化させた。７日目に、ＤＣと１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳをＲＰＭＩで更に１日培養することによって、成熟ＤＣを得た。天然ＤＣは、ＣＤ１１ｃ（成熟ＤＣバイオマーカー）、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（ＣＤ２８リガンド）、及びＰＶＲ（ＴＩＧＩＴリガンド）を安定して発現した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｔ細胞単離キットを使用して別の健常ドナーのＰＢＭＣからＣＤ３＋ Ｔ細胞を単離し、一晩培養した。次に、ＣＤ３＋ Ｔ細胞（２００，０００個）と成熟ＤＣ（１０，０００個）を、１０％ＦＢＳ－ＨＩを有するＲＰＭＩ１６４０培地で混合し、抗ＴＩＧＩＴ抗体又は対照抗体を様々な濃度で添加した。３７℃、５．０％ＣＯ２で４８時間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ＡｌｐｈａＬｉｓａヒトＩＬ－２キット：カタログ番号ＡＬ２２１Ｃ）によって、培養上澄み液において、Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ－２を測定した。抗ＰＤ１抗体は、陽性対照として用いられる。抗ＨＥＲ２抗体は、陰性対照として用いられる。
図１１に示すように、２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃは、抗ＰＤ１抗体と同等の投与量性方式で、Ｔ細胞のＩＬ－２分泌を強化した。対照的に、参照Ａｂ２（Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ類似体）は、ＩＬ－２分泌を強化しなかった。ＩＬ－２は重要な抗腫瘍サイトカインであるため、抗ＴＩＧＩＴ抗体２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃは、腫瘍微小環境におけるＴ細胞抗腫瘍活性を著しく強化することができ、且つＴｉｒａｇｏｌｕｍａｂ類似体よりも優れた抗腫瘍効果を示すことが示された。
例６－Ｆｃエンジニアリング
免疫機能と抗腫瘍活性を強化する抗ＴＩＧＩＴ抗体の役割メカニズムは、ＴＩＧＩＴに対する遮断作用だけでなく、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と有効Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）との間の結合作用、ＡＰＣ上のＦｃγＲＩＩＩＡを介した抗体Ｆｃ領域への結合、及び有効Ｔ細胞上のＶＨＨドメインのＴＩＧＩＴへの結合にも係る。このようなメカニズムを利用するために、２つの異なるＦｃ強化形式、即ち、ＤＬＥ突然変異を有するもの（Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ）と、ＶＬＰＬＬ突然変異を有するもの（Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ）とを作製した。Ｆｃ変異体と、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢと、の結合は、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢのＥＣＤを用いた組換えタンパク質のＯｃｔｅｔ結合アッセイによって検査し、その結果を図１２に示した。ＤＬＥとＶＬＰＬＬ突然変異体はいずれも、強化した、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合親和性を有する。ＤＬＥ突然変異体は、強化した、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性をさらに有するが、ＶＰＶＬＬ突然変異体は、低下した、ヒトＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性を有する。
さらに、Ｆｃ突然変異体のＴＩＧＩＴ遮断活性を検査し、ここでは、ＤＬＥ突然変異体は、図１３Ａに示すように、低下したＴＩＧＩＴ遮断機能を示した。
また、抗体可変領域がその特異的抗原に結合する時、そのＦｃ領域はＦｃγＲＩＩＩＡを架橋し、下流シグナル伝達を誘発することができる。このような作用方式で、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡとＮＦＡＴレポーター遺伝子によってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞及びＴＩＧＩＴを過剰発現する２９３Ｔ細胞を用いて、ＦｃγＲＩＩＩＡによって媒介される活性に対するＦｃ突然変異体の影響を検査した。このアッセイ系において、図１３Ｂに示すように、野生型Ｆｃ形式に比べて、ＤＬＥ突然変異体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡによって媒介されるＮＦＡＴレポーター遺伝子活性を著しく増加させる。
Figure 2023509215000013
Figure 2023509215000014
例７－インビボでの有効性の検討
ヒトＴＩＧＩＴノックインＣ５７ＢＬ／６マウスとＭＣ３８マウス結腸癌モデルを利用して、２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ ｗｔ、２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ－ＤＬＥの有効性を評価し、参照Ａｂ２と比較した。治療の一週間前に、マウスにＭＣ３８腫瘍細胞を接種した。平均腫瘍サイズが約５１ｍｍ３に達した時、治療を開始し、腹膜内に１週間に二回投与し、２．５週間持続した。２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ抗体を一回当たり６ｍｇ／ｋｇ投与したか又は参照Ａｂ ２を一回当たり１１ｍｇ／ｋｇ（２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ抗体とは、ｍｏｌｅ／ｋｇで同じである）を投与した。治療１６日後、複数の対照群のマウスにおいて腫瘍サイズが上限（２０００ｍｍ３）に達した。そのため、治療１６日後が分析のデータ終点となる。対照群では、平均腫瘍体積は、治療１６日後に１５４８．７６±１９１ｍｍ３（平均値±標準誤差）である。対照群に比べて、２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ ｗｔ、２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ－ＤＬＥを用いた治療は、腫瘍増殖を著しく減少し、順に３８％と５０％のＴＧＩ（腫瘍阻害）、及び順に９８５．０５±１２３ｍｍ３と８０２．２０±１２６ｍｍ３の腫瘍体積をもたらした（ブランク対照に比べて、マンホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定により検定されたＰ値は、順に０．０３７と０．００７である）。参照抗体を用いた治療も、腫瘍増殖を減少させたが、該抗体による減少は、対照群に比べて統計的に著しくなく、そのＴＧＩは、２６％であり、腫瘍体積は、１１５６．１６±１９５ｍｍ３である（図１４Ａ、表５）。単一の腫瘍体積の結果は、図１４Ｂに示される。これらの結果によれば、２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃと２Ａ３－ＬＴ－Ｆｃ－ＤＬＥは、いずれも、参照Ａｂ ２よりも有効である。試験において、各実験群の体重変化は、著しくなく（図１４Ｃ）、治療が良好な耐性を得たことを示した。
Figure 2023509215000015
例８－抗ＴＩＧＩＴ ｘ 抗ＰＤ１二重特異性抗体
ヒト化と親和性成熟が行われた抗ＴＩＧＩＴクローン２Ａ３と、ヒト化と親和性成熟が行われた抗ＰＤ１抗体（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５０８５１（国際公開ＷＯ２０１８／０５２８１８ Ａ１として公開された）とを用いて二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を構築した。四つの異なる形式を作製し、ここでは、ＶＨＨ２Ａ３が抗ＰＤ１抗体重鎖のＮ末端やＣ末端に、または抗ＰＤ１抗体軽鎖のＮ末端やＣ末端に融合された（それぞれＨＣＮ、ＨＣＣ、ＬＣＮ、ＬＣＣと命名される）。ＢｓＡｂ構造は、図１５に示され、配列は、配列表における配列番号２５３－２６０に示された。ＢｓＡｂの生産は、ＥｘｐｉＣＨＯの瞬時トランスフェクションによって生産され、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムによって精製された。
ＢｓＡｂとＰＤ１又はＴＩＧＩＴとの二重結合は、ｏｃｔｅｔ結合アッセイによって確認された。簡単に言えば、センサにＢｓＡｂがロードされており、そして、異なる濃度のｈ－ＰＤ１ ＥＣＤ組換えタンパク質（ｈｉｓタグを有する）を注入した。ＢｓＡｂとｈ－ＰＤ１ ＥＣＤとを会合した後、センサに異なる濃度のｈ－ＴＩＧＩＴ ＥＣＤ組換えタンパク質（ｈｉｓタグを有する）を再び注入した。図１６Ａから図１６Ｆに示すように、親ｍＡｂ抗ＰＤ１と抗ＴＩＧＩＴ（２Ａ３－Ｆｃ）に比べて、ｈ－ＴＩＧＩＴとｈ－ＰＤ１に結合する全てのＢｓＡｂは、いずれも、類似する親和性を有する。
ヒトＴＩＧＩＴによってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を用いて、全細胞結合アッセイにおいて、ＴＩＧＩＴに対する親和性をさらに検査した。抗体をｈ－ＴＩＧＩＴでトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞と共にインキュベートし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされる抗ヒト－ＩｇＧ Ｆｃの第２の抗体を使用して抗体とｈ－ＴＩＧＩＴとの結合を決定した（それは、フローサイトメトリーによって検出を行う）。図１７に示すように、親ｍＡｂ ２Ａ３－Ｆｃに比べて、ＢｓＡｂのＨＣＮとＬＣＮ形式は、ＴＩＧＩＴに対して類似する親和性を保持したが、２Ａ３－Ｆｃに比べて、ＨＣＣとＬＣＣ形式は、いずれも、発現に対する細胞上のＴＩＧＩＴとの親和性の低下を示した。
さらに、ＢｓＡｂを用いて、細胞に基づくＴＩＧＩＴ遮断ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを行った。ＰＶＲによってトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞と低濃度のブドウ球菌エンテロ毒素が存在する場合、ｈ－ＴＩＧＩＴとＮＦＡＴレポーター遺伝子をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞を、抗体と共培養する。化学発光リーダーによって、ＴＣＲによって媒介されるＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定した。図１８に示すように、親抗ＴＩＧＩＴ ２Ａ３－Ｆｃに比べて、ＨＣＮ形式は、類似する効き目を示したが、２Ａ３－Ｆｃに比べて、全ての他の三つの形式のＢｓＡｂは、低下した効き目を示した。
さらに、ヒトＰＤ１によってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を用いた全細胞結合アッセイによって、ＢｓＡｂとヒトＰＤ１との結合親和性を決定した。抗体をｈ－ＰＤ１でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞と共にインキュベートし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされる抗ｈ－ＩｇＧ Ｆｃの第２の抗体を使用して結合を決定した（それは、フローサイトメトリーによって検出を行う）。図１９に示すように、全てのＢｓＡｂの親和性は、いずれも、親抗ＰＤ１抗体よりもやや低かった。
ＰＤ１遮断レポーター遺伝子アッセイによって、ＰＤ１によって媒介される阻害作用を遮断するＢｓＡｂの効き目を決定した。ＰＤＬ１とＣＤ３によってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞が存在する場合、ｈ－ＰＤ１とＮＦＡＴレポーター遺伝子によってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を抗体と共培養した。化学発光リーダーによって、ＴＣＲによって媒介されるＮＦＡＴルシフェラーゼ活性を測定した。図２０に示すように、親和性と同様に、ＢｓＡｂの全てがモノクローナル抗ＰＤ１抗体よりもやや低い効き目でＰＤ１を遮断した。
上記の測定された効き目は、単一標的（ＴＩＧＩＴ又はＰＤ１）に対するＢｓＡｂの作用のみを示すため、併用遮断アッセイ（二重遮断アッセイ）を使用して、二つの標的に対するＢｓＡｂの効き目を検査した。図２１に示すように、ＰＶＲとＰＤＬ１をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞及び低濃度のブドウ球菌エンテロトキシンの存在で、ｍＡｂ、ｍＡｂの組み合わせ及びＢｓＡｂを、ｈ－ＴＩＧＩＴ、ｈ－ＰＤ１及びＮＦＡＴレポーター遺伝子をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞と共に培養した。化学発光リーダーによって、ＴＣＲによって媒介されるＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定し、Ｙ軸に相対発光単位で示した。抗ＴＩＧＩＴと抗ＰＤ１の組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ又は抗ＰＤ１ ｍＡｂよりも有効であった。抗ＴＩＧＩＴ（ａＴＩＧＩＴ）と抗ＰＤ１（ａＰＤ１）の組み合わせに比べて、全てのＢｓＡｂの効き目はより高く、ここでは、ＬＣＣ形式は、最も有効なＢｓＡｂであり、次いでＨＣＮとＬＣＮ形式であった。
ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル、ＳＥＣ及びＤＬＳ分析によって、四つの形式のＢｓＡｂの開発可能性を評価した。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルの結果は、ＬＣＣとＬＣＮ形式が分解した軽鎖及びペアリングしていない軽鎖対を有することを示した。ＳＥＣデータはさらに、ＬＣＣ又はＬＣＮ形式のＢｓＡｂに対して、モノマーのパーセントが８４％未満であり、低分子量のパーセントが１５％よりも高いことを示し、二つのＢｓＡｂの安定性と開発可能性がいずれも低いことを示した。さらに、ＤＬＳアッセイにおいて、ＬＣＣとＬＣＮの立ち上がり温度（Ｔｏｎｓｅｔ）がいずれも６０℃よりも低く、これは、その熱安定性が低いことを示した。ＤＬＳ結果は、ＨＣＣ形式の半径が他の形式のＢｓＡｂよりもはるかに高いことを示し、これは、このような形式が凝集しやすいことを示した。まとめ結果は、表４に示される。ＨＣＮ形式のＢｓＡｂは、他の三つの形式よりも優れた特性を有する。
Figure 2023509215000016
インビトロ実験結果と開発可能性評価に基づいて、ＢｓＡｂのＨＣＮ形式を選択してインビボ有効性研究に用い、ｈ－ＴＩＧＩＴとｈ－ＰＤ１ダブルノックインＣ５７ＢＬ／６マウスとＭＣ３８腫瘍モデルを用いた。治療の一週間前に、ＭＣ３８腫瘍細胞を移植した。腫瘍体積が約４３ｍｍ３に達した時点で治療を開始し、ここでは、薬物を腹腔内で週２回、合計３週間投与し、投与量は、図２２に示すとおりである。試験の１８日目に、対照群における動物の腫瘍体積（ＴＶ、平均値±ＳＥＭ）は、１７０６．１５±１３５．８６ｍｍ３であった。投与量が低いため、媒体対照に比べて、抗ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ単剤療法は、著しい抗腫瘍効果（ＴＧＩ：８．４０％、Ｐ＝０．６２８２）を示していなかったが、全ての他の三つの治療群は、いずれも、著しい抗腫瘍効果を示し、これにより、１８日目に、それぞれ、抗ＰＤ１単剤療法、抗ＰＤ１ ＋抗ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ組み合わせ及びＢｓＡｂ ＨＣＮ形式を用いた治療群の％ＴＧＩがそれぞれ５２．５６、６１．１４と６６．６０であり，ここでは、ＴＶ（平均値 ±ＳＥＭ）はそれぞれ８３１．８３±１０３．７５ｍｍ３（Ｐ＝０．００１２）、６８９．３０±１２８．９３ｍｍ３（Ｐ＝０．００１２）及び５９８．５３±９５．４２ｍｍ３（Ｐ＝０．０００６）（マンホイットニー検定）であった。ＢｓＡｂ ＨＣＮを用いることで、実験終点腫瘍重量は、媒体対照に比べて、著しい低下（Ｐ＝０．０００６、マンホイットニー検定）を示しただけでなく、抗ＰＤ１単剤療法に比べても、著しい低下（Ｐ＜０．０３、マンホイットニー検定）を示した。試験全体において、各群間の体重変化が著しくなく、治療耐性が良好であることを示した。
Figure 2023509215000017
Figure 2023509215000018
ＴＩＧＩＴは、ＰＤ１及びＣＴＬＡ４と類似する免疫チェックポイント阻害剤であるが、異なる発現形式を有する。ＰＤ１は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞において高レベルで発現されるが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）においては低発現であることが知られている。逆に、ＴＩＧＩＴは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＴｒｅｇにおいて高レベルで発現された。ＰＤ１とＴＩＧＩＴは、いずれも、腫瘍組織の腫瘍浸潤リンパ球において著しくにアップレギュレートされており、これら二つの免疫チェックポイント阻害剤は、いずれも、腫瘍免疫回避に寄与する免疫阻害に寄与することを表した。二重特異性抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１抗体は、単剤療法又は併用療法が有していないメカニズムによって優れた治療利益を提供することができる。例えば、図２３Ａに示すように、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１ ＢｓＡｂは、ＰＤ１とＴＩＧＩＴ二重陽性と単一陽性ＣＤ８＋ Ｔ細胞における阻害シグナルを遮断することができる。また、ＢｓＡｂは、ＰＤＬ１とＰＶＲ二重陽性腫瘍細胞とＰＶＲ単一陽性腫瘍細胞によってトリガーされる阻害シグナルを遮断することができる。
また、図２３Ｂに示すように、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ１ ＢｓＡｂは、ＮＫ細胞における阻害シグナルを遮断し、Ｔｒｅｇにおける刺激シグナルを遮断することができる。腫瘍細胞又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現されるＰＶＲは、ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴに結合することもでき、それは、シグナル阻害を誘導し、ＮＫ細胞の機能を阻害する。ＢｓＡｂによるＴＩＧＩＴへのＰＶＲの結合の遮断は、阻害作用を低下させることによって、ＮＫ細胞の抗腫瘍機能を強化することができる。腫瘍細胞及びＡＰＣ上のＰＶＲは、Ｔｒｅｇ細胞上のＴＩＧＩＴに結合することもでき、それは、刺激シグナルを誘導し、Ｔｒｅｇ機能を増強することによって、抗腫瘍活性を阻害する。ＢｓＡｂによりＴｒｅｇ上のＴＩＧＩＴを遮断することにより、Ｔｒｅｇの機能を低下させ、抗腫瘍活性を高めることができる。
図示及び特許請求された様々な実施例に加えて、開示されたテーマは、本明細書によって開示されて特許請求された特徴の他の組み合わせを有する他の実施例をさらに対象とする。このように、本明細書で提示される特定の特徴は、開示されるテーマが本明細書に開示される特徴の任意の適切な組み合わせを含むように、開示されるテーマの範囲内で他の方法で互いに組み合わせられてもよい。開示されたテーマの具体的な実施例の上記の説明は、例示及び説明の目的で提供されている。上記の説明は、網羅的であること、又は開示されたテーマを開示されたそれらの実施例に限定することを意図していない。
開示されたテーマの精神又は範囲から逸脱することなく、開示されたテーマの構成と方法に対する様々な修正と変更を行うことができることは、当業者には明らかであろう。従って、開示されたテーマは、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある修正と変更を含むことが意図される。
様々な刊行物、特許、及び特許出願が、本明細書に引用され、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (124)

  1. ＴＩＧＩＴ及びＰＤ１に結合する多重特異性抗体であって、
    ｉ）ＴＩＧＩＴに結合する単一ドメイン抗体を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、
    ｉｉ）ＰＤ１に結合する抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む、多重特異性抗体。
  2. 該単一ドメイン抗体は、ＶＨＨを含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。
  3. 該単一ドメイン抗体又はＶＨＨは、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１又は２に記載の多重特異性抗体。
  4. 該単一ドメイン抗体は、１×１０－７Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  5. 該単一ドメイン抗体は、１×１０－８Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  6. 該単一ドメイン抗体は、３×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  7. 該単一ドメイン抗体は、２×１０－９Ｍ又はより小さいＫＤでＴＩＧＩＴに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  8. 該単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して、重鎖可変領域を含む参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体の重鎖可変領域は、
    ａ）配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｂ）配列番号９８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１００に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｃ）配列番号１０２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１０４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｄ）配列番号１０６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１０８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｅ）配列番号１１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１１２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｆ）配列番号１１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１１６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｇ）配列番号１１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１２０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｈ）配列番号１２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１２４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｉ）配列番号１２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１２８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｊ）配列番号１３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１３２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｋ）配列番号１３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１３６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｌ）配列番号１３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１４０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｍ）配列番号１４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１４４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｎ）配列番号１４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１４８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｏ）配列番号１５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１５２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｐ）配列番号１５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１５６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｑ）配列番号１５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１６０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｒ）配列番号１６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１６４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｓ）配列番号１６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１６８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｔ）配列番号１７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１７２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｕ）配列番号１７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１７６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｖ）配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｗ）配列番号１８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１８４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    ｘ）配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、又は、
    ｙ）配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  9. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、
    ａ）配列番号９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６及び１９０のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８３、１８７及び１９１のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８及び１９２のうちいずれか一つのアミノ酸配列、又は、約３つまでのアミノ酸の置換を有するその変異体を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  10. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、ＣＤＲ１ドメインと、ＣＤＲ２ドメインと、ＣＤＲ３ドメインとを含み、ここでは、該ＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインは、それぞれ、参照重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン及びＣＤＲ３ドメインを含み、該参照重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  11. 該単一ドメイン抗体は、配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  12. 該単一ドメイン抗体は、配列番号９８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１００に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  13. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１０２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  14. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１０６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１０７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１０８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  15. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  16. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１１６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  17. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  18. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  19. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１２８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  20. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  21. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１３６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  22. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  23. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  24. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１４８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  25. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  26. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１５６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  27. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  28. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  29. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１６８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  30. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  31. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１７６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  32. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  33. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  34. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  35. 該単一ドメイン抗体は、配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  36. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９及び１９３からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  37. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号９７に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  38. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  39. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０５に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  40. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１０９に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  41. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１１３に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  42. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１１７に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  43. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  44. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２５に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  45. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１２９に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  46. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３３に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  47. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１３７に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  48. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  49. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  50. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１４９に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  51. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１５３に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  52. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１５７に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  53. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  54. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  55. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１６９に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  56. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７３に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  57. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１７７に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  58. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  59. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  60. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１８９に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  61. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号１９３に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  62. 該単一ドメイン抗体は、ＴＩＧＩＴへの結合に関して、重鎖可変領域を含む参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体と交差競合し、該参照抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体の重鎖可変領域は、
    （ａ）配列番号１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｂ）配列番号５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｃ）配列番号９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号１３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｅ）配列番号１７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｆ）配列番号２１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｇ）配列番号２５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｈ）配列番号２９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｉ）配列番号３３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｊ）配列番号３７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｋ）配列番号４１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｌ）配列番号４５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｍ）配列番号４９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｎ）配列番号５３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｏ）配列番号５７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｐ）配列番号６１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｑ）配列番号６５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｒ）配列番号６９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｓ）配列番号７３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｔ）配列番号７７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、及び、
    （ｕ）配列番号８１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  63. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、
    （ａ）配列番号１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｂ）配列番号５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｃ）配列番号９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号１３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｅ）配列番号１７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｆ）配列番号２１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｇ）配列番号２５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｈ）配列番号２９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｉ）配列番号３３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｊ）配列番号３７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｋ）配列番号４１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号４３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｌ）配列番号４５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号４６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号４７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｍ）配列番号４９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｎ）配列番号５３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｏ）配列番号５７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号５９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｐ）配列番号６１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号６３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｑ）配列番号６５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号６７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｒ）配列番号６９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｓ）配列番号７３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
    （ｔ）配列番号７７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、及び、
    （ｕ）配列番号８１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号８３に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１～６２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  64. 該単一ドメイン抗体は、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０及び８４からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～６３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  65. 該単一ドメイン抗体は、ヒト化フレームワークを含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  66. 該第２の抗原結合部分は、参照抗ＰＤ１抗体と交差競合する抗ＰＤ１抗体を含み、該参照抗ＰＤ１抗体は、
    ａ）（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２１）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２２２）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２２３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２２４）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２２５）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２２６）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、
    ｂ）（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２９）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号２３０）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２３１）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＴＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２３２）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号２３３）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号２３４）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、
    ｃ）（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２３７）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２３８）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３９）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２４０）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４１）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２４２）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列、又は、
    ｄ）（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２４５）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２４６）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２４７）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４８）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４９）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２５０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、請求項１～６５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  67. 該第２の抗原結合部分は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２１）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２２２）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２２３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２２４）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２２５）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２２６）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  68. 該第２の抗原結合部分は、（１）アミノ酸配列ＦＲＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２２９）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＡＹ（配列番号２３０）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＴＳＹＹＹＧＩＤＦ（配列番号２３１）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２３２）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＬＲＨＴ（配列番号２３３）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＧＩＰＷＴ（配列番号２３４）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  69. 該第２の抗原結合部分は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２３７）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２３８）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＶＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２３９）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＫＱＤＶＴＴＡＶＡ（配列番号２４０）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４１）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＷＩＰＷＴ（配列番号２４２）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  70. 該第２の抗原結合部分は、（１）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＹＧＭＳ（配列番号２４５）含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）アミノ酸配列ＴＩＳＧＧＧＳＮＩＹ（配列番号２４６）を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）アミノ酸配列ＳＳＹＹＹＧＩＤＬ（配列番号２４７）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、及び（１）アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＴＮＡＶＡ（配列番号２４８）を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号２４９）を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）アミノ酸配列ＱＱＨＹＴＩＰＷＴ（配列番号２５０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  71. 該抗ＰＤ１抗体は、ヒト化抗体を含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  72. 該第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ１抗体を含み、該抗ＰＤ１抗体は、二本の抗体重鎖と、二本の抗体軽鎖を含む、請求項１～７１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  73. 該第１の抗原結合部分は、二つ又はより多くの抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む、請求項１～７２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  74. 該第１の抗原結合部分は、二つの抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む、請求項１～７３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  75. 該二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される、請求項１～７４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  76. 該二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの各本のＣ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される、請求項７５に記載の多重特異性抗体。
  77. 該二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される、請求項１～７６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  78. 該二本の抗ＰＤ１軽鎖のうちの各本のＮ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される、請求項７７に記載の多重特異性抗体。
  79. 該二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの少なくとも一本のＣ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される、請求項１～７８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  80. 該二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの各本のＣ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される、請求項７９に記載の多重特異性抗体。
  81. 該二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの少なくとも一本のＮ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される、請求項１～８０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  82. 該二本の抗ＰＤ１重鎖のうちの各本のＮ末端は、該第１の抗原結合部分の抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される、請求項８１に記載の多重特異性抗体。
  83. 該第１の抗原結合部分は、リンカーを介して該第２の抗原結合部分に連結される、請求項１～８２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  84. 該リンカーは、ペプチドリンカーである、請求項８３に記載の多重特異性抗体。
  85. 該ペプチドリンカーは、約４から約３０個のアミノ酸を含む、請求項８４に記載の多重特異性抗体。
  86. 該ペプチドリンカーは、配列番号１９５－２２０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項８４又は８５に記載の多重特異性抗体。
  87. 該第２の抗原結合部分の抗ＰＤ１抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域からなる群から選ばれるＦｃ領域を含む、請求項１～８６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  88. 該第２の抗原結合部分の抗ＰＤ１抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群から選ばれるＦｃ領域を含む、請求項１～８７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  89. 該Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域を含む、請求項８７又は８８に記載の多重特異性抗体。
  90. 該Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  91. 該Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  92. 該ＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む、請求項９１に記載の多重特異性抗体。
  93. 該多重特異性抗体は、二重特異性抗体である、請求項１～９２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  94. 該多重特異性抗体は、
    ｉ）配列番号９４に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号９５に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号９６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、
    ｉｉ）（１）配列番号２２９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２３０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２３１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２３２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２３３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２３４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む、請求項１～９３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  95. 該多重特異性抗体は、
    ｉ）配列番号１７８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１７９に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、
    ｉｉ）（１）配列番号２３７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２３８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２３９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２４０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２４１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２４２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分 を含む、請求項１～９３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  96. 該多重特異性抗体は、
    ｉ）配列番号１８６に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１８７に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１８８に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、
    ｉｉ）（１）配列番号２２１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２２２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２２３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２２４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２２５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２２６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む、請求項１～９３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  97. 該多重特異性抗体は、
    ｉ）配列番号１９０に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、配列番号１９１に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、配列番号１９２に示す配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む第１の抗原結合部分と、
    ｉｉ）（１）配列番号２４５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（２）配列番号２４６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（３）配列番号２４７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、（１）配列番号２４８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（２）配列番号２４９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（３）配列番号２５０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＰＤ１抗体を含む第２の抗原結合部分を含む、請求項１～９３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  98. 該多重特異性抗体は、配列番号２５３に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２５４に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む、請求項１～９７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  99. 該多重特異性抗体は、配列番号２５５に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２５６に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む、請求項１～９７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  100. 該多重特異性抗体は、配列番号２５７に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２５８に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む、請求項１～９７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  101. 該多重特異性抗体は、配列番号２５９に示すアミノ酸配列を含む抗ＰＤ１抗体重鎖と、配列番号２６０に示すアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体に連結される抗ＰＤ１抗体軽鎖を含む、請求項１～９７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  102. 免疫コンジュゲートであって、治療剤に連結される請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を含む、免疫コンジュゲート。
  103. 該治療剤は、細胞毒素である、請求項１０２に記載の免疫コンジュゲート。
  104. 該治療剤は、放射性同位体である、請求項１０２に記載の免疫コンジュゲート。
  105. 薬物組成物であって、ａ）請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートと、ｂ）薬学的に許容されるキャリア剤を含む、薬物組成物。
  106. 核酸であって、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、核酸。
  107. ベクターであって、請求項１０６に記載の核酸を含む、ベクター。
  108. 宿主細胞であって、請求項１０６に記載の核酸又は請求項１０７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  109. 請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を調製する方法であって、請求項１０８に記載の宿主細胞において該多重特異性抗体を発現し、該宿主細胞から該多重特異性抗体を単離することを含む、方法。
  110. 被験体の腫瘍負荷を軽減する方法であって、該被験体に、有効量の請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート又は請求項１０５に記載の薬物組成物を投与することを含む、方法。
  111. 該方法は、腫瘍細胞の数を減らす、請求項１１０に記載の方法。
  112. 該方法は、腫瘍サイズを小さくする、請求項１１０又は１１１に記載の方法。
  113. 該方法は、該被験体の腫瘍を根絶する、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 該腫瘍は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、膠芽細胞腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 新生物の治療及び／又は予防方法であって、被験体に、有効量の請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート又は請求項１０５に記載の薬物組成物を投与することを含む、方法。
  116. 新生物を有する被験体の生存期間を延長する方法であって、該被験体に、有効量の請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート又は請求項１０５に記載の薬物組成物を投与することを含む、方法。
  117. 該新生物は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、膠芽細胞腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項１１５又は１１６に記載の方法。
  118. 薬物として用いられる、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  119. 癌の治療に用いられる、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
  120. 薬物として用いられる、請求項１０５に記載の薬物組成物。
  121. 癌の治療に用いられる、請求項１０５に記載の薬物組成物。
  122. 該癌は、中皮腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌、胸膜腫瘍、膠芽細胞腫、食道癌、胃癌、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃腫瘍、胆管癌、頭頸癌、血液癌及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項１１９に記載の多重特異性抗体又は請求項１２１に記載の薬物組成物。
  123. キットであって、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、請求項１０５に記載の薬物組成物、請求項１０６に記載の核酸、請求項１０７に記載のベクター、又は請求項１０８に記載の宿主細胞を含む、キット。
  124. 該キットは、新生物を治療及び／又は予防するためのマニュアルを含む、請求項１２３に記載のキット。
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