CZ308720B6 - Fúzní konstrukty a jejich použití pro přípravu protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k receptorům Fc a efektorovou funkcí - Google Patents

Fúzní konstrukty a jejich použití pro přípravu protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k receptorům Fc a efektorovou funkcí Download PDF

Info

Publication number
CZ308720B6
CZ308720B6 CZ2005490A CZ2005490A CZ308720B6 CZ 308720 B6 CZ308720 B6 CZ 308720B6 CZ 2005490 A CZ2005490 A CZ 2005490A CZ 2005490 A CZ2005490 A CZ 2005490A CZ 308720 B6 CZ308720 B6 CZ 308720B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
human
polypeptide
cells
antibodies
Prior art date
Application number
CZ2005490A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2005490A3 (cs
Inventor
Pablo Umana
Peter Bruenker
Claudia Ferrara
Tobias Suter
Original Assignee
Roche Glycart Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Glycart Ag filed Critical Roche Glycart Ag
Publication of CZ2005490A3 publication Critical patent/CZ2005490A3/cs
Publication of CZ308720B6 publication Critical patent/CZ308720B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01038—Beta-N-acetylglucosaminylglycopeptide beta-1,4-galactosyltransferase (2.4.1.38)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01094—Protein N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.94)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01114—2-Coumarate O-beta-glucosyltransferase (2.4.1.114)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01024—Alpha-mannosidase (3.2.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01114—Mannosyl-oligosaccharide 1,3-1,6-alpha-mannosidase (3.2.1.114)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/05—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a GOLGI retention signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01024—1,4-Alpha-glucan 6-alpha-glucosyltransferase (2.4.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01096—Hexosyltransferases (2.4.1) sn-Glycerol-3-phosphate 1-galactosyltransferase (2.4.1.96)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01144—Beta-1,4-mannosyl-glycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.144)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)

Abstract

Řešení se týká glykosylačního sestrojování proteinů a vztahuje se zejména k molekulám nukleových kyselin, včetně fúzních konstruktů, majícím katalytickou aktivitu a jejich použití v glykosylačním sestrojování hostitelských buněk pro generování polypeptidů se zlepšenými terapeutickými vlastnostmi, včetně protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k Fc receptorům a zvýšenou efektorovou funkcí. Izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu β(1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnT III) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Man II), tento fúzní polypeptid, expresní vektor, hostitelská buňka a způsob výroby fúzního polypeptidu.

Description

Fúzní konstrukty a jejich použití pro přípravu protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k receptorům Fc a efektorovou funkcí
Oblast techniky
Předmětný vynález se vztahuje ke glykozylačnímu sestrojování proteinů. Předmětný vynález se vztahuje zejména k molekulám nukleových kyselin, včetně fúzních konstruktů, majícím katalytickou aktivitu a jejich použití v glykozylačním sestrojování hostitelských buněk pro generování polypeptidů se zlepšenými terapeutickými vlastnostmi, včetně protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k Fc receptorům a zvýšenou efektorovou funkcí.
Dosavadní stav techniky
Glykoproteiny zprostředkovávají mnoho podstatných funkcí v lidských bytostech, jiných eukaryotických organizmech a v některých prokaryotech, včetně katalýzy signalizace, mezibuněčné komunikace a rozeznávání a asociace buněk. Tvoří většinu necytosolových proteinů v eukaryotických organizmech. (Lis et al., Eur. J. Biochem. 218:1-27 (1993)). Mnoho glykoproteinů bylo využito pro terapeutické účely, a během posledních dvou desetiletí byly rekombinantní verze vylučovaných glykoproteinů vyskytujících se v přírodě hlavním produktem biotechnologického průmyslu. Příklady zahrnují erythropoietin (EPO), terapeutické monoklonální protilátky (terapeutické mAbs), tkáňový aktivátor plazminogenu (tPA), interferon-β (IFN-β), faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF) a lidský chorionový gonádotropin (hCG). (Cumming etal., Glycobiology 1:115-130 (1991)).
Oligosacharidová komponenta může podstatně ovlivnit vlastnosti odpovědné za účinnost terapeutického glykoproteinů, včetně fyziologické stability, odolnosti proti ataku proteázy, interakce s imunitním systémem, farmakokinetiky a specifické biologické aktivity. Takové vlastnosti mohou záviset nejen na přítomnosti nebo nepřítomnosti oligosacharidů, ale také na specifických strukturách. Mohou se učinit některá zevšeobecnění mezi strukturou oligosacharidů a funkcí glykoproteinů. Například jisté oligosacharidové struktury zprostředkovávají rychlé odstranění glykoproteinů z krevního řečiště vlivem interakcí se specifickými proteiny vážícími se na karbohydráty, zatímco jiné mohou být vázány protilátkami a spouštět nežádoucí imunitní reakce. (Jenkins etal.,Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).
Savčí buňky jsou upřednostňovanými hostiteli pro produkci terapeutických glykoproteinů díky jejich schopnosti glykozylovat proteiny ve formě nej kompatibilnější pro humánní aplikace. (Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Baktérie glykozylují proteiny velmi zřídka, a stejně jako u jiných typů obecných hostitelů, jako kvasinky, vláknité houby, hmyzí a rostlinné buňky, jsou získané glykozylační modely spojené s rychlým odstraněním z krevního řečiště, nežádoucími imunitními reakcemi a v některých specifických příkladech se sníženou biologickou aktivitou. Mezi savčími buňkami se nejčastěji používají během posledních dvou desetiletí buňky z vaječníku čínského křečka (CHO). Navíc ktomu, že poskytují vhodné glykozylační modely, tyto buňky dovolují konzistentní generování geneticky stabilních, vysoce produktivních klonovaných buněčných linií. Mohou se kultivovat ve vysokých hustotách v jednoduchých bioreaktorech s použitím média bez obsahu séra a dovolují rozvoj bezpečných a reprodukovatelných bioprocesů. Jiné obecně používané zvířecí buňky zahrnují ledvinové buňky mláďat křečků a buňky myších myelomů NS0 a SP2/0. Nyní byla testována také produkce z transgenních zvířat. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).
Všechny protilátky obsahují karbohydrátové struktury na určitých pozicích v konstantních oblastech těžkého řetězce, s každým izotypem majícím rozdílné seskupení karbohydrátových struktur připojených k atomu N, které různě působí na skladbu proteinu, vylučování nebo funkční
- 1 CZ 308720 B6 aktivitu. (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). Struktura karbohydrátů připojených k atomu N se značně mění v závislosti na stupni zpracování, a může zahrnovat vysoce manózní, mnohonásobně větvené, stejně jako dvouvláknové komplexní oligosacharidy. (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). Typicky se jedná o heterogenní zpracování oligosacharidových struktur jádra připojených na konkrétním glykozylačním místě tak, že dokonce monoklonální protilátky existují jako více glykoforem. Podobně bylo ukázáno, že mezi buněčnými liniemi se vyskytují větší rozdíly v glykozylaci protilátek, a dokonce menší rozdíly jsou pozorovány pro danou buněčnou linii rostoucí za různých podmínek kultivace. (Lifely, M. R.et al., Glycobiology 5 (8):813-22 (1995)).
Nekonjugované monoklonální protilátky (mAbs) mohou být užitečnými léčivy pro léčení rakoviny, jak je demonstrováno schválením rituximabu (Rituxan™; IDEC Pharma-ceuticals, San Diego, CA, and Genentech Inc., San Francisco, CA) uděleném U. S. Food and Drug Administration pro léčení B-pozitivních buněk CD20, jiného než Hodgkinsova lymfomu nebo lymfomu nízkého stupně, trastuzumabu (Herceptin™; Genentech Inc,) pro léčení pokročilé rakoviny prsu (GrilloLopez, A.-J., et al., Semis.Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, Μ. Μ., Clin.Ther. 21:309-18 (1999)), gemtuzumabu (Mylotarg™, Celltech / Wyeth-Ayerst) pro léčení recidiv akutní myeloidní leukémie a alemtuzumabu (CAMPATH™, MilleniumPharmaceuticals / Schering AG) pro léčení chronické leukémie B-lymfocytů. Úspěch těchto produktů počítá nejenom s jejich účinností, ale i s jejich vynikajícími bezpečnostními profily (Grillo-Lopez,A.-J., et al., Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, Μ. Μ., Cliva. Ther. 21:309-18 (1999)). Navzdory úspěchům těchto léků je v současnosti velký zájem o získání specifičtější aktivity protilátek, než jakou typicky dovoluje nekonjugovaná terapie mAb.
Jednou cestou získání velkého vzrůstu potenciálu při požívání jednoduchého procesu výroby a možného vyvarování se podstatným nežádoucím vedlejším účinkům je zvýšení přirozené efektorové funkce mAbs zprostředkované buňkami sestrojením jejich oligosacharidové komponenty (Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Protilátky typu IgGl, protilátky nej obecněji používané při léčení rakoviny, jsou glykoproteiny, které mají zachované glykozylační místo připojené k atomu N na Asn297 v každé doméně CH2. Dva komplexní dvouvláknové oligosacharidy připojené k Asn297 jsou skryté mezi doménami CH2, tvořící extenzívní kontakty s polypeptidovou páteří, a jejich přítomnost je podstatná pro protilátku, aby zprostředkovávala efektorové funkce, jako je buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163:5976 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997)).
Současní původci vynálezu dříve ukázali, že nadměrná exprese β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII), glykozyltransferázy katalyzující tvorbu dělených oligosacharidů, v buňkách z vaječníku čínského křečka (CHO) podstatně zvyšuje aktivitu ADCC in vitro antineuroblastomové chimémí monoklonální protilátky (chCE7), produkované sestrojenými buňkami CHO. (Viz Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999), mezinárodní publikace č. WO 99/54342. Protilátka chCE7 patří k velké třídě nekonjugovaných mAbs, které mají vysokou afinitu a specificitu k nádoru, ale mají příliš malou sílu na to, aby byly klinicky užitečné, jestliže jsou produkovány ve standardních průmyslových buněčných liniích postrádajících enzym GnTIII (Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Tato studie byla první, která ukázala, že rozsáhlé zvýšení aktivity ADCC se může získat sestrojením buněk produkujících protilátky tak, aby exprimovaly GnTGIII, což také vedlo ke zvýšení podílu konstantní oblasti (Fc)-asociovaných dělených oligosacharidů, včetně dělených nefúkózylovaných oligosacharidů, nad hodnoty nalezené v přirozeně se vyskytujících protilátkách.
Výsledky četných studií svědčí o tom, že mechanismy závislé na Fc-receptorech podstatně přispívají k působení cytotoxických protilátek proti nádorům a ukazují, že optimální protilátka proti nádorům by se měla vázat přednostně na aktivaci receptorů Fc a minimálně na inhibičního partnera FcyRIIB. (Clynes, R. A., et al., Nature Medicine 6 (4):443-446 (2000); Kalergis, A. M.,
-2CZ 308720 B6 and Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195 (12):1653-1659 (June 2002)). Například výsledky přinejmenším jedné studie naznačují, že zejména receptor FcyRIIB je silně spojen s účinností terapie protilátkami. (Cartron, G., et al., Blood 99 (3):754-757 (February 2002)). Tato studie ukázala, že pacienti homozygotní k Fc/RIIB mají lepší odpověď na rituximab než heterozygotní pacienti. Autoři došli k závěru, že lepší odpověď byla způsobena lepším navázáním protilátky na FcyRIIB in vivo, což vedlo k lepší aktivitě ADCC proti buňkám lymfomu. (Cartron, G., et al., Blood 99 (3):754-757 (February 2002)).
Navíc kADCC úspěšné protirakovinné monoklonální protilátky často indukují přímý signální mechanizmus nezávislý na Fc, který reguluje přežití, proliferaci anebo smrt cílových buněk aktivací buněčných signálních kaskád nebo blokováním přístupu k růstovým faktorům. (Selenko, N., et al., J Clin. Immunol. 22 (3): 124-130 (2002)). Například se ukázalo, že léčení B-buněk CD20+ rituximabem indukovalo lýzi zprostředkovanou komplementem a indukci apoptózy indukovanou Mab stejně jako ADCC. (Selenko, N., et al., J Clin. Immunol. 22 (3): 124-130 (2002)). Navíc apoptóza buněk lymfomu indukovaná rituximabem nejen zabíjí buňky, ale také podporuje absorpci a křížové předávání peptidů odvozených z lymfatických buněk pomocí dendritických buněk (DC) předávajících antigeny, indukuje zrání DC, a dovoluje generování specifických T- lymfocytů (CTL).
Stručný popis vynálezu
Když byl rozpoznán obrovský terapeutický potenciál protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k receptoru Fc a zvýšenou efektorovou funkcí, byl vyvinut způsob výroby takových protilátek, které zahrnují sestrojení glykozylačního profilu oblasti Fc protilátky.
Předmětný vynález se týká izolovaného polynukleotidu obsahujícího sekvenci nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnT III) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil). Tento izolovaný polynukleotid obsahuje sekvenci nukleové kyseliny alespoň z 90 % identické se sekvencí nukleové kyseliny SEQ ID No: 12, jak je ukázáno na obr. 24.
Dále se vynález týká expresního vektoru, který obsahuje výše uvedený izolovaný polynukleotid.
Dále se vynález týká hostitelské buňky obsahující výše uvedený izolovaný polynukleotid nebo výše uvedený expresní vektor obsahující tento izolovaný polynukleotid.
Vynález dále popisuje fúzní polypeptid, mající aktivitu GnT III a obsahující Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil). Tento fúzní polypeptid obsahuje sekvenci aminokyseliny alespoň z 90 % identické se sekvencí aminokyseliny SEQ ID NO: 13.
Tento fúzní polypeptid obsahuje sekvenci aminokyseliny SEQ ID NO: 13, jak je ukázáno na obr. 24.
Dále vynález popisuje způsob výroby fúzního polypeptidu majícího aktivitu GnT III, přičemž zahrnuje kultivaci výše uvedené hostitelské buňky v médiu za podmínek, dovolujících expresi polynukleotidu kódujícího fúzní polypeptid a získání fúzního polypeptidu z výsledné kultury.
Hostitelská buňka je sestrojená tak, aby exprimovala výše uvedený izolovaný polynukleotid nebo výše uvedený expresní vektor v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je celá molekula protilátky.
Hostitelská buňka, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je IgG a hostitelská buňka, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je IgGl.
-3CZ 308720 B6
Hostitelskou buňkou podle vynálezu je buňka CHO, buňka BHK, buňka NSO, buňka SP2/0, myelomová buňka YO, buňka myšího myelomu P3X63, buňka PER a buňka PER.C6 nebo hybridomová buňka.
Dále je popsána hostitelská buňka, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je protilátka anti-CD20. Popsanou protilátkou anti-CD20 je IDECC2B8.
Dále je popsána hostitelská buňka, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je chimémí antihumánní monoklonální protilátka karcinomu renálních buněk chG250.
Dále je výše popsaná hostitelská buňka sestrojená tak, že polynukleotid exprimovaný hostitelskou buňkou je operativně připojená k prvku konstitutivního promotoru.
Výše uvedená hostitelská buňka je sestrojená tak, že dále obsahuje alespoň jednu transfekovanou nukleovou kyselinu kódující molekulu protilátky, přičemž alespoň jedna transfekovaná nukleová kyselina kóduje protilátku anti-CD20, chimémí antihumánní neuroblastomovou monoklonální protilátku chCE7, chimémí antihumánní monoklonální protilátku karcinomu renálních buněk chG250, chimémí antihumánní monoklonální protilátku karcinomu tlustého střeva, plic a prsu ING-1, humanizovanou antihumánní monoklonální protilátku antigenu 17-1A 3622W4, humanizovanou antihumánní monoklonální protilátku kolorektálního nádoru A3 3, antihumánní melanomovou protilátku R24 směrovanou proti gangliosidu GD3, chimémí antihumánní monoklonální protilátku karcinomu buněk dlaždicového epitelu SF-25, antihumánní protilátku EGFR, antihumánní protilátku EGFRvIII, antihumánní protilátku PSMA, antihumánní protilátku PSCA, antihumánní protilátku CD22, antihumánní protilátku CD30, antihumánní protilátku CD33, antihumánní protilátku CD38, antihumánní protilátku CD40, antihumánní protilátku CD45, antihumánní protilátku CD52, antihumánní protilátku CD 138, antihumánní variantní protilátku HLA-DR, antihumánní protilátku EpCAM, antihumánní protilátku CEA, antihumánní protilátku MUC1, antihumánní protilátku jádrového proteinu MUC1, antihumánní aberantně glykozylovanou protilátku MUC1, protilátku proti variantám lidského fibronektinu obsahující doménu ED-B nebo antihumánní protilátku HER2/neu.
Dále je popsán způsob produkce polypeptidu ve výše definované hostitelské buňce zahrnující:
a) kultivaci hostitelské buňky za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny skládající se z celé molekuly protilátky, kde fuzní polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a kde fuzní polypeptid obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního lidského Golgiho rezidentního polypeptidu, a
b) izolaci polypeptidu, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny sestávající z anti-CD20 protilátky, chimémí antihumánní neuroblastomové monoklonální protilátky chCE7, chimémí antihumánní monoklonální protilátky karcinomu renálních buněk chG250, chimémí antihumánní monoklonální protilátky karcinomu tlustého střeva, plic a prsu ING-1, humanizované antihumánní monoklonální protilátky antigenu 17-1A 3622W4, humanizované antihumánní monoklonální protilátky kolorektálního nádom A3 3, antihumánní melanomové protilátky R24 směrované proti gangliosidu GD3, chimémí antihumánní monoklonální protilátky karcinomu buněk dlaždicového epitelu SF-25, antihumánní protilátky EGFR, antihumánní protilátky EGFRvIII, antihumánní protilátky PSMA, antihumánní protilátky PSCA, antihumánní protilátky CD22, antihumánní protilátky CD30, antihumánní protilátky CD33, antihumánní protilátky CD38, antihumánní protilátky CD40, antihumánní protilátky CD45, antihumánní protilátky CD52, antihumánní protilátky CD 138, antihumánní variantní protilátky HLA-DR, antihumánní protilátky EpCAM, antihumánní protilátky CEA, antihumánní protilátky MUC1, antihumánní protilátky jádrového
-4CZ 308720 B6 proteinu MUC1, antihumánní aberantně glykozylované protilátky MUC1, protilátky proti variantám lidského fibronektinu obsahující doménu ED-B, antihumánní protilátky TAG-72 a antihumánní protilátky HER2/neu.
Dále popsaná provedení, pokud se netýkaj í předmětů vymezených nároky, j sou zde uvedena pouze pro ilustraci.
Předmětný vynález je tedy široce zaměřen na způsoby řízení hostitelských buněk, aby se změnil glykozylační profil jednoho nebo více polypeptidů produkovaných hostitelskou buňkou. Způsoby podle vynálezu se mohou použít k produkci terapeutických protilátek s modifikovanou glykozylací v oblasti Fc, včetně snížené fůkózylace, kde mají protilátky zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vaznost na receptor Fc jako důsledek modifikované . Protilátky s řízenou glykozylací podle předmětného vynálezu jsou zejména užitečné při terapeutickém ošetřování nádorů v pacientech. V jedněch provedeních hostitelské buňky podle předmětného vynálezu mají řízenou glykozylací, aby exprimovaly molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní protein s katalytickou aktivitou GnTIII nebo katalytickou aktivitou GalT. Ve výhodném provedení jsou fuzní konstrukty exprimovány společně s molekulou nukleové kyseliny kódující polypeptid, který má katalytickou aktivitu Manil a/nebo s molekulou nukleové kyseliny kódující polypeptid, který má katalytickou aktivitu GnTII. V ještě jiném provedení jsou polypeptidy s řízenou glykozylací podle předmětného vynálezu produkovány hostitelskou buňkou, aby měly zvýšenou expresi molekuly nukleové kyseliny kódující polypeptid, který má katalytickou aktivitu Manil.
Podle toho v jednom aspektu je vynález směrován na izolovanou nukleovou kyselinu, obsahující sekvenci kódující fuzní polypeptid, kde fuzní polypeptid má aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III („GnTIII“) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil). V jednom provedení fuzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III. Ve výhodném provedení obsahuje sekvence izolované nukleové kyseliny nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obr. 24. V jiném výhodném provedení sekvence izolované nukleové kyseliny kóduje polypeptid mající sekvenci znázorněnou na obr. 24. V ještě jiném výhodném provedení sekvence izolované nukleové kyseliny kóduje polypeptid mající sekvenci alespoň z 80 % identickou s aminokyselinovou sekvencí na obr. 24.
V jiném provedení je vynález směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci kódující fuzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu P(l,4)-galaktózyltransferázy („GalT“) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil). V jednom provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu P(l,4)-galaktózyltransferázy.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na expresní vektor obsahující izolovanou nukleovou kyselinu, obsahující sekvenci kódující fúzní polypeptid, kde fuzní polypeptid má aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a obsahuje Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil). V jednom provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu β( 1,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na expresní vektor obsahující izolovanou nukleovou kyselinu, obsahující sekvenci kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu P(l,4)-galaktózyltransferázy a obsahuje Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil). V jednom provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu P(l,4)-galaktózyltransferázy a Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil).
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na hostitelskou buňku obsahující výše popsaný expresní vektor.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fuzní polypeptid, mající aktivitu
-5CZ 308720 B6
P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III („GnTIII“) a obsahující Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil) v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky obsahující oblast Fc a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. V jednom provedení fúzní polypeptid mající aktivitu GnTIII obsahuje katalytickou doménu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fuzní polypeptid, mající aktivitu P(l,4)-galaktózyltransferázy („GalT“) a obsahující Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil) v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky obsahující oblast Fc a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. V jednom provedení fúzní polypeptid mající aktivitu GalT obsahuje katalytickou doménu P( 1,4)-galaktózyltransferázy.
Podle toho v jednom aspektu je vynález směrován na fúzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a obsahuje Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil). V jednom provedení fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu obsahuje katalytickou doménu P(l,4)-N-acetylglukózaminyl-transferázy III.
V jiném aspektu je předmětný vynález směrován na fúzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-galaktózyltransferázy a obsahuje Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil). V jednom provedení fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu obsahuje katalytickou doménu P( 1,4)-galaktózyltransferázy.
V jiném aspektu je vynález směrován na způsob produkce fúzního polypeptidu majícího aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a obsahující Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil), zahrnující kultivaci hostitelských buněk podle předmětného vynálezu v médiu za podmínek dovolujících expresi nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a získání fúzního polypeptidu z výsledné kultury. V jednom provedení fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu obsahuje katalytickou doménu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III.
V jiném aspektu je vynález směrován na způsob produkce fúzního polypeptidu majícího aktivitu P(l,4)-galaktózyltransferázy III a obsahující Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil), zahrnující kultivaci hostitelských buněk podle předmětného vynálezu v médiu za podmínek dovolujících expresi nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a získání fúzního polypeptidu z výsledné kultury. V jednom provedení fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu obsahuje katalytickou doménu P(l,4)-galaktózyltransferázy.
V dalším aspektu je vynález směrován na způsob modifikace glykozylačního profilu polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou zahrnující zavedení alespoň jedné nukleové kyseliny nebo expresního vektoru podle předmětného vynálezu do hostitelské buňky. Polypeptid je výhodně IgG nebo jeho fragment obsahující oblast Fc polypeptidu. Ve zvláště výhodném provedení je polypeptid výhodně IgG nebo jeho fragment obsahující oblast Fc polypeptidu. Alternativně je polypeptid fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc lidského IgG.
V jiném aspektu je vynález veden na způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, obsahující (a) kultivaci hostitelské buňky, sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III, nebo alternativně aktivitu P(l,4)-galaktózyltransferázy („GalT“) za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny obsahující celou molekulu protilátky, fragment protilátky
-6CZ 308720 B6 obsahující oblast Fc polypeptidu a fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství vhodném pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a (b) izolaci polypeptidu. Fúzní polypeptid výhodně obsahuje katalytickou doménu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III nebo P(l,4)-galaktózyltransferázy („GalT“). Ve výhodných provedeních má polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vaznost na receptor Fc jako výsledek modifikace. Ve zvláště výhodných provedeních je zvýšená efektorová funkce zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na monocyty, zvýšená vaznost na polymorfonukleámí buňky, zvýšená přímá apoptóza indukovaná signalizací, zvýšené zrání dendritických buněk a/nebo zvýšené zásobování T-buňkami, a zvýšená vaznost na receptor Fc je zvýšená vaznost na receptor aktivující Fc, jako je FcyRIIIA. Polypeptid vykazující zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vaznost na receptor Fc je výhodně protilátka, fragment protilátky nebo fúzní protein obsahující oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu a má zvýšený podíl nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc.
V ještě dalším aspektu vynález poskytuje hostitelskou buňku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu; a expresní vektor obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manil). Ve výhodných provedeních obsahuje fúzní polypeptid katalytickou doménu GnTIII.
V dalším aspektu je vynález veden na hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu GnTIII a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
V dalším provedení vynález poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GnTIII, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
V dalším aspektu poskytuje vynález hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
V dalším aspektu vynález poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
-7CZ 308720 B6
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, zahrnující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu GnTIII a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou; a izolaci polypeptidu.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, zahrnující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fuzní polypeptid, mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou; a izolaci polypeptidu.
V dalším aspektu poskytuje vynález způsob produkce polypeptidu mající zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc, zahrnující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde úroveň exprese GalT nebo Manil je postačující pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid má zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc jako výsledek modifikace; a izolaci polypeptidu majícího zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob produkce polypeptidu mající zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc, zahrnující (a) kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu amanózidázy II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid mající aktivitu a-manózidázy II je exprimován v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, a (b) izolaci polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou.
V jiném aspektu vynález poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid, mající aktivitu α-manózidázy II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid mající aktivitu α-manózidázy II je exprimován v množství postačujícím pro modifikování oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou.
V ještě dalším aspektu je předmětný vynález směrován na polypeptidy produkované takovou hostitelskou buňkou, zejména protilátky mající zvýšenou efektorovou fúnkci a/nebo zvýšenou vaznost k receptoru Fc jako výsledek modifikovaných oligosacharidů.
-8CZ 308720 B6
Objasnění výkresů
Obr. 1. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní nemodifikované (s nesestrojenými glykosidy) protilátky anti-CD IgGl produkované v BHK. Buňky byly transfekovány expresním vektorem protilátky pETR1502. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 2. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD IgGl se sestrojenými glykosidy produkované v BHK sestrojených s nukleovou kyselinou kódující divoký typ („wt“) GnTIII. Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTII, pETR1166. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 3. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD IgGl se sestrojenými glykosidy produkované v BHK sestrojených s nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid („Gl-GnTIII“) s aktivitou GnTIII a lokalizovanou přes Golgiho lokalizační doménu Golgiho a-manózidázy II. Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTIII, pETR1425. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 4. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD IgGl se sestrojenými glykosidy produkované v BHK sestrojených s nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid („M2-GnTIII“) s aktivitou GnTIII a lokalizovanou přes Golgiho lokalizační doménu Golgiho α-manózidázy II (Manil). Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTIII, pETR1506. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 5. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD IgGl se sestrojenými glykosidy produkované v buňkách HEK293-EBNA. Buňky byly transfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 6. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD IgGl se sestrojenými glykosidy produkované v HEK293-EBNA sestrojené s nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid („M2-GnTIII“) s aktivitou GnTIII a lokalizovanou přes Golgiho lokalizační doménu Golgiho α-manózidázy II (Manil). Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTIII, pETR1519. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, jak je popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1.
Obr. 7. Spektrum MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených z rekombinantní protilátky anti-CD IgGl se sestrojenými glykosidy produkované v HEK293-EBNA sestrojené s nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid („M2-GnTIII“) s aktivitou GnTIII a lokalizovanou přes Golgiho lokalizační doménu Golgiho α-manózidázy II (Manil). Buňky byly kotransfekovány protilátkovým expresním vektorem pETR1502 a expresním vektorem pro GnTIII, pETR1519. Protilátka se vyčistila z kultivačního média a oligosacharidy se připravily a analyzovaly tak, j ak j e popsáno v oddíle Materiály a metody v příkladu 1. (a) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázou F bez dalšího enzymatického působení, (b) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázou F dále rozložených pomocí Endo H.
-9CZ 308720 B6
Obr. 8. (a) Schematický popis digesce oligosacharidů katalyzovaného EndoH. EndoH může rozložit hybrid (a rozdělený hybrid), ale ne komplexní nebo komplexní rozdělené oligosacharidy. (b) Rozlišením mezi oligosacharidy komplexního a hybridního typu dovoluje působení pomocí Endo-H strukturální stanovení píků oligosacharidů, které mají stejné poměry m/z ve spektrech MALDI/TOF-MS, původně pocházející z působení PNGázy F.
Obr. 9. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) chimémích protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „Gl-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách BHK (baby hamster kidney). Produkční a glykozylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 3 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 1. Cílové buňky (T) byly lidské lymfoblastoidní buňky SKW6.4. Efektorové buňky (E) byly čerstvě izolované lidské PBMC. Poměr E : T - 25 : 1 se použil při 4hodinové inkubaci ve stanovení ADCC měřící cytotoxicitu uvolňováním laktátdehydrogenázy (LDH) ve vztahu ke kontrolám uvolňování (s použitím detergentu místo protilátky) a spontánnímu uvolňování (kultivační médium místo protilátky). Detaily stanovení j sou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 10. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) chimémích protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykozylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5. Cílové buňky (T) byly lidské lymfoblastoidní buňky SKW6.4. Efektorové buňky (E) byly čerstvě izolované lidské PBMC. Poměr E : T - 25 : 1 se použil při 4hodinové inkubaci ve stanovení ADCC měřící cytotoxicitu uvolňováním laktátdehydrogenázy (LDH) ve vztahu ke kontrolám uvolňování (s použitím detergentu místo protilátky) a spontánnímu uvolňování (kultivační médium místo protilátky). Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 11. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) chimémích protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s rekombinantními protilátkami se sestrojenými glykosidy „wt-GnTIII“ stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách BHK. Produkční a glykozylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy M2-GnTIII je znázorněn na obr. 4 a totéž pro protilátku se sestrojenými glykosidy wt-GnTIII na obr. 2. Cílové buňky (T) byly lidské lymfoblastoidní buňky SKW6.4. Efektorové buňky (E) byly čerstvě izolované lidské PBMC. Poměr E : T - 25 : 1 se použil při 4hodinové inkubaci ve stanovení ADCC měřící cytotoxicitu uvolňováním laktátdehydrogenázy (LDH) ve vztahu ke kontrolám uvolňování (s použitím detergentu místo protilátky) a spontánnímu uvolňování (kultivační médium místo protilátky). Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 12. Vazba chimémích protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu na receptor FcyRIIIa na buňkách NK. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykozylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1. Lidské buňky NK exprimující receptor FcyRIIIa na svém povrchu byly izolovány z donoru genotypu známého tím, že neprodukuje receptor FcyRIIc (tj. homozygotní pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci škodující sekvencí FcyRIIc). Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu antihumánní protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK. Vazba detekovaná v tomto stanovení je specifická k FcyRIIIa, jak je ukázáno použitím kompetitivního fragmentu protilátky specifické k FcyRIIIa (viz obr. 13).
- 10CZ 308720 B6
Obr. 13. Vazba chimémích protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s rekombinantními protilátkami se sestrojenými glykosidy „wt-GnTIII“ stejného typu na receptor Fc/RIIIa na buňkách NK. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykozylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1, ale při společné inkubaci čištěných buněk NK s rekombinantní protilátkou (vždy při konečné koncentraci 3 pg/ml) a se zvyšujícími se a měnícími koncentracemi (viz graf) kompetitivního fragmentu 3G8-Fab2 protilátky anti- Fc/RIIIa. Lidské buňky NK exprimující receptor Fc/RIIIa na svém povrchu byly izolovány od dárce genotypu známého tím, že neprodukuje receptor Fc/RIIc (tj. homozygotního pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci škodující sekvencí FcyRIIc). Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu antihumánní protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK.
Obr. 14. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených od rekombinantních protilátek IgGl „L19“ rozeznávajících izoformu fibronektinu ED-B+ a produkovaných v buňkách HEK293-EBNA. (a) Nemodifikovaná protilátka produkovaná v buňkách HEK293-EBNA transfekovaných protilátkovým expresním vektorem pETR1546. (b) protilátka se sestrojenými glykosidy M2-GnTIII produkovaná v buňkách HEK293-EBNA kotransfekovaných protilátkovým expresním vektorem pETR1546 a expresním vektorem GnTIII pETR1519. Obě protilátky byly vyčištěny od kultivačního média proteinovou afinitní chromatogafií A následovanou krokem gelové chromatografie na matrici Superex 200 (Amersham) vyměňující pufir na solný pufrovaný fosfátem (PBS). Oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 15. Vazba chimémích protilátek IgG proti fibronektinu ED-B+ se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu na receptor Fc/RIIc lidských buněk lymfomu Ráji. Produkční a glykozylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 14b a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 14a. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1. Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu antihumánní protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na B-buňky lymfomu Ráji.
Obr. 16. Vazba chimémích protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami IgGl stejného typu na receptor Fc/RIIIa na buňkách NK od různých dárců. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykozylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1. Lidské buňky NK exprimující receptor Fc/RIIIa na svém povrchu byly izolovány od dárce genotypu známého tím, že neprodukuje receptor Fc/RIIc (tj. homozygotního pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci s kódující sekvencí Fc/RIIc). U dvou dárců se zjistil fenotyp jako homozygotní varianta 158V-„vyšší afinita“ receptem Fc/RIIIa. U dalších dvou dárců se zjistil fenotyp jako homozygotní varianta 158V-„vyšší afinita“ a 158F-„nižší varianta“ receptem Fc/RIIIa Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu antihumánní protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK. Vazba detekovaná v tomto stanovení je specifická k Fc/RIIIa. jak je ukázáno použitím kompetitivního fragmentu protilátky specifické k Fc/RIIIa (viz obr. 13).
Obr. 17. Analýza FACS zkrácené exprese CD4 (tCD4) (a) BHK - 1502-28 (divoký typ) a (b) klonu stabilních buněčných linií BHK-1502-28-11 se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ produkujících protilátku anti-CD20 IgG. Exprese tCD4 je operativně připojená na expresi M2GnTIII přes element IRES v expresním vektoru pETR1537 GnTIII, a proto se používá jako
- 11 CZ 308720 B6 nepřímý marker exprese GnTIII. Průměr a geometrický průměr intenzit fluorescence byl 27,6 a 19,9 pro buněčné linie se sestrojenými glykosidy a 4,7 a 4,1 pro divoký typ.
Obr. 18. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů odvozených od rekombinantních protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy M2-GnTIII produkovaných buněčnou linií BHK-1502-28-11. Buněčná linie, čištění protilátky, příprava a analýza oligosacharidů jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 19. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, uvolněných PNGázou F a dále rozložených Endo H, odvozených od rekombinantních protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy M2-GnTIII produkovaných buněčnou linií BHK-1502-28-11. Buněčná linie, čištění protilátky, příprava a analýza oligosacharidů jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 20. Vazba chimémích protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami IgGl stejného typu, produkovaných stabilními buněčnými liniemi, na receptor Fc/RIIIa na buňkách NK. Glykozylační profil sestrojené protilátky je ukázán na obr. 18 a 19. Vazebné stanovení bylo prováděno jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1. Lidské buňky NK exprimující receptor Fc/RIIIa na svém povrchu byly izolovány od dárce genotypu známého tím, že neprodukuje receptor Fc/RIIc (tj. homozygotního pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci s kódující sekvencí Fc/RIIc). Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené FACS s použitím fragmentu antihumánní protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK. Vazba detekovaná v tomto stanovení je specifická k Fc/RIIIa. jak je ukázáno použitím kompetitivního fragmentu protilátky specifické k Fc/RIIIa (viz obr. 13).
Obr. 21. Lýze zprostředkovaná komplementem (CML) chimémích protilátek anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami IgGl stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykozylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 6 a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 5. Pro toto stanovení se použil lidský komplement. Lýze se měřila uvolňováním LDH. Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 22. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, odvozených z rekombinantních chimémích protilátek IgGl „C225“, rozeznávajících receptor lidského epidermálního růstového faktoru (EGFR), a produkovaných buňkami HEK-293-EBNA. (a) nemodifikovaná protilátka produkovaná v buňkách HEK-293-EBNA transfekovaných expresním vektorem protilátky pURSI28. (b) Protilátka se sestrojenými glykosidy M2-GnTIII produkovaná v buňkách HEK-293EBNA kotransfekovaných expresním vektorem protilátky pURSI28 expresním vektorem GnTIII pETR1519. Obě protilátky byly vyčištěny od kultivačního média proteinovou afinitní chromatografií A následovanou krokem gelové chromatografie na matrici Superex 200 (Amersham) vyměňující pufr na solný pufrovaný fosfátem (PBS). Oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 23. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) chimémích protilátek IgG anti-EGFR „C225“ se sestrojenými glykosidy „M2-GnTIII“ ve srovnání s nemodifikovanými rekombinantními protilátkami stejného typu. Oboje protilátky jsou produkovány v buňkách HEK293-EBNA. Produkční a glykozylační profil protilátky se sestrojenými glykosidy je znázorněn na obr. 22b a totéž pro nemodifikovanou protilátku na obr. 2. Cílové buňky (T) byly buňky lidského karcinomu dlaždicového epitelu A431 (ECACC No. 85090402). Efektorové buňky (E) byly čerstvě izolované lidské PBMC. Poměr E : T - 25 : 1 se použil při 4hodinové inkubaci ve stanovení ADCC měřící cytotoxicitu uvolňováním laktátdehydrogenázy (LDH) ve vztahu ke kontrolám uvolňování (s použitím detergentu místo protilátky) a spontánnímu uvolňování
- 12CZ 308720 B6 (kultivační médium místo protilátky). Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 24. Sekvence nukleové kyseliny a odpovídající aminokyselinová sekvence fuzního polypeptidu manózidázy II - GnTIII podle vynálezu.
Obr. 25. Sekvence nukleové kyseliny a odpovídající aminokyselinová sekvence fuzního polypeptidu GnTI - GnTIII.
Obr. 26. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, odvozených z nemodifikovaných rekombinantních chimémích protilátek IgGl C2B8 anti-CD20 („Cwt“), produkovaných buňkami HEK-293-EBNA transfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520. Protilátka byla vyčištěna od kultivačního média a oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 5.
Obr. 27. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, odvozených z nemodifikovaných rekombinantních chimémích protilátek IgGl se sestrojenými glykosidy C2B8 anti-CD20 („Cbrt“), produkovaných buňkami HEK-293-EBNA transfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520 a fuzním expresním vektorem polypeptidu GnTIII (pETR1519). Protilátka byla vyčištěna od kultivačního média a oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 5. (A) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázou F bez dalšího enzymatického působení. (B) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázou F dále rozložených Endo H.
Obr. 28. Spektra MALDI/TOF-MS neutrální směsi oligosacharidů, odvozených z nemodifikovaných rekombinantních chimémích protilátek IgGl se sestrojenými glykosidy C2B8 anti-CD20 („Cm“), produkovaných buňkami HEK-293-EBNA kotransfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520, fuzním expresním vektorem polypeptidu GnTIII (pETR1519) a expresním vektorem polypeptidu manózidázy II (pCLF9). Protilátka byla vyčištěna od kultivačního média a oligosacharidy byly připravovány a analyzovány, jak je popsáno v sekci Materiály a metody příkladu 5. (A) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázou F bez dalšího enzymatického působení. (B) Profil oligosacharidů uvolněných PNGázou F dále rozložených Endo H.
Obr. 29. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) zprostředkovaná chimémími protilátkami anti-CD20 s glykosidy sestrojenými expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid Manil-GnTIII v buňkách HEK293-EBNA, kde katalytická doména GnTIII je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, kde nukleová kyselina kódující ManlIGnTIII je exprimována buď samostatně (protilátka Cbrt), nebo koexprimována v buňkách produkujících protilátky společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm). Cwt je nemodifikovaná rekombinantní chimémí protilátka IgG C2B8 anti-CD20, produkovaná v buňkách HEK-EBNA, transfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520. Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1.
Obr. 30. Vazba receptem FcyRIIIa a chimémích protilátek anti-CD20 s glykosidy sestrojenými expresí nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid ManlI-GnTIII v buňkách HEK293-EBNA, kde katalytická doména GnTIII je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, kde nukleová kyselina kódující Manil-GnTIII je exprimována buď samostatně (protilátka Cbrt), nebo koexprimována v buňkách produkujících protilátky společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm). Cwt je nemodifikovaná rekombinantní chimémí protilátka IgG C2B8 anti-CD20, produkovaná v buňkách HEK-EBNA, transfekovaných expresním vektorem protilátky pETR1520. Detaily stanovení jsou popsány v sekci Materiály a metody příkladu 1. Lidské buňky NK exprimující receptor FcyRIIIa na svém povrchu byly izolovány od dárce genotypu známého tím, že neprodukuje receptor FcyRIIc (tj. homozygotního pro genovou variantu, která obsahuje stop kodón v rámci s kódující sekvencí FcyRIIc). Geometrický průměr intenzity fluorescence, měřené
- 13CZ 308720 B6
FACS s použitím fragmentu antihumánní protilátky IgG značené FITC, se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím rekombinantní protilátky navázané na buňky NK. Vazba detekovaná v tomto stanovení je specifická k Fc/RIIIa. jak je ukázáno použitím kompetitivního fragmentu protilátky specifické k Fc/RIIIa (viz obr. 13).
Obr. 31. Komplementem zprostředkovaná cytotoxicita chimémích protilátek anti-CD20 s glykosidy sestrojenými expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid ManlI-GnTIII v buňkách HEK293-EBNA, kde katalytická doména GnTIII je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, kde nukleová kyselina kódující ManlI-GnTIII je exprimována buď samostatně (protilátka Cbrt), nebo koexprimována v buňkách produkujících protilátky společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm). Cwt je nemodifikovaná rekombinantní chimémí protilátka IgG C2B8 anti-CD20, produkovaná v buňkách HEK-EBNA, transfekovaných expresním vektorem protilátky pETR.1520.
Obr. 32 (A-C). Expresní vektory pCLF9 (A), pETR1842 (B) a pETR1843 (C).
Obr. 33 (A a B). Expresní vektory pro fuzní protein ManlI-GalT (A) a GalT (B).
Obr. 34. Oligosacharidový profil monoklonální protilátky anti-CD20 produkované v přítomnosti manózidázy II a relativní procentické zastoupení nalezených struktur asociovaných k části protilátky Fc.
Obr. 35 (A a B). Oligosacharidový profil monoklonální protilátky anti-CD20 produkované v přítomnosti fuzního proteinu ManlI-GalT a relativní procentické zastoupení nalezených struktur asociovaných k oblasti protilátky Fc. Oligosacharidové profily po digesci PNGázou F (A) a Endo Η (B).
Obr. 36. protilátka produkovaná v přítomnosti manózidázy II (Manil) navázané na receptor Fc/RIIIA s větší afinitou než divoké typy protilátek.
Obr. 37. Celulámí cytotoxicita závislá na protilátce, zprostředkovaná chimémí anti-CD20 se sestrojenými glykosidy.
Detailní popis vynálezu
Termíny použité zde jsou obecně používané v oboru, pokud nejsou jinak definovány zde.
Jak je použito zde, termín protilátka je míněn tak, že zahrnuje celé molekuly protilátka, včetně monoklonálních, polyklonálních a multispecifických (tj. bispecifických) protilátek, stejně jako fragmenty protilátek majících oblast Fc a fuzní proteiny, které zahrnují region ekvivalentní k regionu Fc imunoglobulinu. Jsou zahrnuty rovněž humanizované a chimémí protilátky.
Jak je použito zde, termín oblast Fc je míněn tak, že odkazuje k C-terminální oblasti těžkého řetězce IgG. Ačkoliv ohraničení oblasti Fc těžkého řetězce IgG se mohou lehce měnit, oblast Fc těžkého řetězce lidského IgG je obvykle definována tak, že se táhne od aminokyselinového zbytku Cys226 ke karboxylovému konci.
Jak je použito zde, termín oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu je míněn tak, že zahrnuje přirozeně se vyskytující alelické varianty oblasti Fc imunoglobulinu, stejně jako varianty mající alterace které vznikají substitucemi, adicemi a delecemi, ale které podstatně nesnižují schopnost imunoglobulinu zprostředkovat efektorové funkce (jako celulámí cytotoxicitu zprostředkovanou protilátkou). Například jedna nebo více aminokyselin se může odstranit z N-konce nebo C-konce oblasti Fc imunoglobulinu bez podstatné ztráty biologické funkce. Takové varianty se mohou
- 14CZ 308720 B6 vybrat podle obecných pravidel známých ze stavu techniky tak, že mají minimální účinek na aktivitu. (Viz Bowie, J. U. et al., Science 247: 1306-10 (1990)).
Jak je použito zde, termín fúzní polypeptid „mající aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III odkazuje na fúzní polypeptidy, které jsou schopné katalyzovat adici skupiny N-acetylglukózaminu (GlcNAc) v připojení β-1-4 na β-připojený manózid v trimanozylovém jádru N-připojených oligosacharidů. To zahrnuje fúzní polypeptidy vykazující enzymatickou aktivitu podobnou, ale ne nutně identickou, aktivitě β(1,4)N—acetylglukózaminyltransferázy III, také známé jako β-l-4-manózylglykoprotein-4-βN—acetylglukózaminyltransferáza (E.C.2.4.1.144) podle Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), jak je změřeno v jednotlivém biologickém stanovení, se závislostí na dávce nebo bez ní. V případě, že závislost na dávce existuje, nemusí být identická se závislostí na dávce β(1,4)N—acetylglukózaminyltransferázy III (tj. kandidátský polypeptid bude vykazovat větší aktivitu nebo ne méně než 25krát menší, výhodně ne méně než desetkrát menší, nejvýhodněji ne méně než třikrát menší ve srovnání s β(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázou III.
Jak je použit zde, fúzní polypeptid „mající aktivitu β(l,4)galaktózyltransferázy“ nebo „mající aktivitu GalT“ se vztahuje k fúzním polypeptidům, které jsou schopné katalyzovat adici galaktózové skupiny z UDP galaktózy na neredukující terminál GlcNAc nacházející se v Npřipojených oligosacharidech. To zahrnuje fúzní polypeptidy vykazující enzymatickou aktivitu podobnou, ale ne nutně identickou, aktivitě β(l,4)galaktózyltransferázy, také známé jako UDPGakGlcNAc β-l,4-galaktózyltransferáza (E.C.2.4.1.38) podle Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), jak je měřeno v jednotlivém biologickém stanovení se závislostí na dávce nebo bez ní. V případě, že závislost na dávce existuje, nemusí být identická se závislostí na dávce β(l,4)galaktózyltransferázy (tj. kandidátský polypeptid bude vykazovat větší aktivitu nebo ne méně než 25krát menší, výhodně ne méně než desetkrát menší, nej výhodněji ne méně než třikrát menší ve srovnání s β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázou III).
Nukleovou kyselinou nebo polynukleotidem majícím alespoň například „95 % identity“ s referenční nukleotidovou sekvencí podle předmětného vynálezu se míní, že nukleotidová sekvence polynukleotidu je identická s referenční sekvenci s výjimkou, že polynukleotidová sekvence má do pěti bodových mutací na 100 nukleotidů referenční nukleotidové sekvence. Jinými slovy, aby se získal polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci alespoň na 95 % identickou s referenční nukleotidovou sekvencí, až 5 % nukleotidů v referenční sekvenci může být eliminováno nebo substituováno jiným nukleotidem, nebo až 5 % celkového počtu nukleotidů v referenční sekvenci se může zavést do referenční sekvence. Sekvence, o kterou jde, může být celá sekvence ukázaná na obr. 24 nebo obr. 25.
Jako praktická záležitost, jestli je každá jednotlivá molekula nukleové kyseliny nebo polypeptidu alespoň na 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identická se sekvencí nukleové kyseliny nebo polypeptidu podle předmětného vynálezu, může být určeno konvenčně s použitím známých počítačových programů. Jako upřednostňovaný způsob pro určení nejlepší celkové shody mezi dotazovanou sekvencí (sekvencí podle předmětného vynálezu) a předmětnou sekvencí, také nazývanou globální sekvenční přiřazení, se může určit použitím počítačového programu FASTDB, založeném na algoritmu Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990). V sekvenčním řazení jsou dotazovaná a předmětná sekvence obě sekvence DNA. Sekvence RNA se mohou srovnat konverzí U na T. Výsledkem globálního sekvenčního přiřazení je procentická identita. Upřednostňovanými parametry používanými v přiřazení sekvencí DNA podle FASTDB při počítání procentické identity jsou: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch Penalty=l, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=l, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500 nebo délka předmětné nukleotidové sekvence, co je kratší.
- 15CZ 308720 B6
Jestliže je předmětná sekvence kratší než dotazovaná sekvence kvůli delecím na 5‘-konci nebo 3‘konci, ne kvůli interním delecím, musí se provést manuální korekce výsledků. To je proto, že program FASTDB nebere v úvahu delece na 5‘-konci nebo 3‘-konci předmětné sekvence, když kalkuluje procentickou identitu. Pro předmětné sekvence zkrácené na 5‘-konci nebo 3‘-konci ve vztahu k dotazované sekvenci se procentická identita koriguje spočítáním počtu bází dotazované sekvence, které jsou 5‘ a 3‘ předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené, jako procenta celkového počtu bází dotazované sekvence. Zda je nukleotid odpovídající/přiřazený, se určuje podle výsledků sekvenčního přiřazení FASTDB. Tato procenta se potom odečtou od procent identity, spočítaných výše uvedeným programem FASTDB s použitím specifických parametrů, aby se došlo ke konečnému výsledku procent identity. Tento korigovaný výsledek se použije pro účely podle předmětného vynálezu. Pouze báze mimo báze 5‘ a 3‘ předmětné sekvence, jak je ukázáno přiřazením FASTDB, které nejsou odpovídající/přiřazené k dotazované sekvenci, se počítají pro účely manuální úpravy výsledku procentuální identity.
Například předmětná sekvence s 90 bázemi se přiřazuje k dotazované sekvenci se 100 bázemi k určení procentuální identity. Delece se vyskytují na 5‘-konci předmětné sekvence a proto přiřazení pomocí FASTDB neukazuje prvních 10 odpovídajících/přiřazených bází na 5‘-konci. 10 nespárovaných bází představuje 10 % sekvence (počet bází na 5‘- a 3‘-koncích neodpovídá celkovému počtu bází v dotazované sekvenci), tak se odečte 10 % z výsledku procentuální identity vypočteného programem FASTDB. Jestliže zbývajících 90 bází perfektně odpovídá, finální procenta identity jsou 90 %. V jiném příkladě je předmětná sekvence s 90 bázemi srovnávána s dotazovanou sekvencí se 100 bázemi. Tentokrát jsou delece interními delecemi, takže nejsou žádné báze na pozicích 3‘ nebo 5‘ předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené s dotazem. V tomto případě se procenta identity spočítané FASTDB manuálně neopravují. Ještě j ednou, manuálně se opravuj e j en na základě bází na 5 ‘ a 3 ‘ konci předmětné sekvence, které nej sou odpovídající/přiřazené dotazované sekvenci. Žádné další manuální korekce se pro účely podle předmětného vynálezu nedělají.
Polypeptidem majícím aminokyselinovou sekvenci přinejmenším například na 95 % „identickou“ s dotazovanou aminokyselinovou sekvencí podle předmětného vynálezu se rozumí, že aminokyselinová sekvence předmětného polypeptidů je identická s dotazovanou sekvencí kromě toho, že předmětný polypeptid může zahrnovat do pěti záměn na každých 100 aminokyselin dotazované aminokyselinové sekvence. Jinými slovy, pro získání polypeptidů majícího aminokyselinovou sekvenci alespoň na 95 % identickou s dotazovanou aminokyselinovou sekvencí se může do 5 % aminokyselinových zbytků vložit, eliminovat nebo substituovat jinými aminokyselinami. Tyto změny referenční sekvence mohou nastat na amino- nebo karboxyterminálních pozicích referenční aminokyselinové sekvence nebo kdekoliv mezi těmito terminálními pozicemi, promísené buď jednotlivě mezi zbytky v referenční sekvenci, nebo v jedné nebo více spojitých skupinách uvnitř referenční sekvence.
Jako praktická záležitost se může určit konvenčně pomocí známých počítačových programů, zda je jakýkoliv jednotlivý polypeptid alespoň na 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identický s referenčním polypeptidem. Upřednostňovaným způsobem pro určení nej lepší celkové shody mezi dotazovanou sekvencí (sekvence podle předmětného vynálezu) a předmětnou sekvencí, také nazývanou globální sekvenční přiřazení, se může určit použitím počítačového programu FASTDB, založeném na algoritmu Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). V sekvenčním řazení jsou dotazovaná a předmětná sekvence, obě sekvence nukleotidové nebo obě sekvence aminokyselinové. Výsledkem globálního sekvenčního přiřazení je procentická identita. Upřednostňovanými parametry používanými v přiřazení sekvencí DNA podle FASTDB při počítání procentické identity jsou :Matrix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty=l, Joining Penalty=30, Randomization Group Uength=0, Cutoff Score=l, Window Size=délka sekvence, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0,05, Window Size=500 nebo délka předmětné aminokyselinové sekvence, co je kratší.
- 16CZ 308720 B6
Jestliže je předmětná sekvence kratší než dotazovaná sekvence kvůli delecím na N- konci nebo Ckonci, ne kvůli interním delecím, musí se provést manuální korekce výsledků. To je proto, že program FASTDB nebere v úvahu delece na N-konci nebo C-konci předmětné sekvence, když kalkuluje celkovou procentickou identitu. Pro předmětné sekvence zkrácené na N-konci nebo Ckonci ve vztahu k dotazované sekvenci se procentická identita koriguje spočítáním počtu bází dotazované sekvence, které jsou N- a C-koncové u předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené, jako procenta celkového počtu bází dotazované sekvence. Zdaje nukleotid odpovídající/přiřazený, se určuje podle výsledků sekvenčního přiřazení FASTDB. Tato procenta se potom odečtou od procent identity, spočítaných výše uvedeným programem FASTDB s použitím specifických parametrů, aby se došlo ke konečnému výsledku procent identity. Tento korigovaný výsledek je to, co se použije pro účely podle předmětného vynálezu. Pouze báze mimo N- a C-koncové báze předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené k dotazované sekvenci, se počítají pro účely manuální úpravy výsledku procentuální identity. To znamená pouze pozice dotazované sekvence mimo nevzdáleněj ších N- a C-koncových zbytků předmětné sekvence. Například předmětná sekvence s 90 aminokyselinami se přiřazuje k dotazované sekvenci se 100 zbytky k určení procentuální identity. Delece se vyskytují na N-konci předmětné sekvence a proto přiřazení pomocí FASTDB neukazuje prvních 10 odpovídajících/přiřazených aminokyselin naNkonci. 10 ne spárovaných zbytků představuje 10 % sekvence (počet zbytků na N- a C-koncích neodpovídá celkovému počtu zbytků v dotazované sekvenci), tak se odečte 10 % z výsledku procentuální identity vypočteného programem FASTDB. Jestliže zbývajících 90 zbytků perfektně odpovídá, finální procenta identity jsou 90 %. V jiném příkladě je předmětná sekvence s 90 zbytky srovnávána s dotazovanou sekvencí se 100 zbytky. Tentokrát jsou delece interními delecemi, takže nejsou žádné báze naN- a C-koncových pozicích předmětné sekvence, které nejsou odpovídající/přiřazené s dotazem. V tomto případě se procenta identity spočítané FASTDB manuálně neopravují. Ještě jednou, manuálně se opravují jen zbytky na pozicích mimo N- a Cterminální konce předmětné sekvence, jak je ukázáno v přiřazení FASTDB, které nejsou odpovídající/přiřazené dotazované sekvenci. Žádné další manuální korekce se pro účely podle předmětného vynálezu nedělají. Jak je použito zde, nukleová kyselina, která „hybridizuje za přísných podmínek“ k sekvenci nukleové kyseliny podle vynálezu, se vztahuje k polynukleotidu, který hybridizuje při inkubaci přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím 50 % formamidu, 5x SSC (750mM NaCl, 75mM citrátu sodného), 50mM fosforečnanu sodného (pH 7,6), 5x Denhardtův roztok, 10 % dextransulfátu a 20 pg/ml denaturovaného štěpeného lososího spermatu, následované promytím filtrů v 0,lx SSC při asi 65 °C. Jak je použito zde, nukleová kyselina, která „hybridizuje za přísných podmínek“ s nukleovou kyselinou podle předmětného vynálezu, se vztahuje k polynukleotidu, který hybridizuje při inkubaci přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím 50 % formamidu, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 nM citrátu sodného) 50 mM fosforečnanu sodného (pH 7,6), 5x Denhardtův roztok, 10 % sulfát dextranu, a 20 pg/ml denaturované, stříhané DNA z lososího spermatu, následované promytím filtrů 0,lx SSC při asi 65 °C.
Jak je použito zde, Golgiho lokalizační doména se vztahuje k aminokyselinové sekvenci Golgiho rezidentního polypeptidu, který je odpovědný za zakotvení se v umístění uvnitř Golgiho aparátu. Obecně lokalizační domény obsahují aminoterminální „ocasy“(segmenty, konce) enzymu.
Jak je použito zde, efektorová funkce se vztahuje k takovým biologickým aktivitám, přiřadíteIným k oblasti Fc (oblast Fc s přirozenou sekvencí nebo oblast Fc s pozměněnou aminokyselinovou sekvencí) protilátky. Příklady efektorových funkcí protilátky zahrnují, ale nejsou tím omezeny, vazebnou aktivitu receptoru Fc, celulámí cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC), celulámí fagocytózu závislou na protilátce (ADCP), sekreci cytokinů, absorpci antigenu buňkami prezentujícími antigen zprostředkovanou imunokomplexem, sníženou regulaci buněčných povrchových receptorů atd. Jak je použito zde, termíny sestrojený, sestrojování, sestrojování glykosidů zahrnují jakoukoliv manipulaci s glykozylačním vzorem přirozeně se vyskytujícího polypeptidu nebo jeho fragmentu. Sestrojování glykosidů zahrnuje metabolické sestrojování glykozylačního aparátu buňky, včetně genetických manipulací cest syntézy oligosacharidů, aby se dosáhla změněná glykozylace glykoproteinů exprimovaných v buňkách. Sestrojování glykosidů dále zahrnuje působení mutací a buněčného prostředí na glykozylaci.
- 17CZ 308720 B6
Jak je použito zde, termín hostitelská buňka pokrývá jakýkoliv druh buněčného systému, který se může sestrojit pro generování modifikovaných glykoforem proteinů, proteinových fragmentů nebo zajímavých peptidů, včetně protilátek, fragmentů protilátek a fúzních proteinů. Hostitelské buňky byly typicky manipulované, aby exprimovaly optimalizované úrovně GnTIII. Hostitelské buňky zahrnují kultivované buňky, tj. savčí kultivované buňky, jako buňky CHO, BHK, NSO, SP2/0, buňky myelomu YO, buňky myšího myelomu P3X63, buňky PER, PER.C6 nebo hybridomové buňky, kvasinky, hmyzí buňky a rostlinné buňky, aby se jmenovalo pouze několik, ale také buňky obsažené v transgenním zvířeti, transgenní rostlině nebo kulturní rostlině nebo zvířecí tkáni.
Jak je použito zde, termín buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc zahrnuje buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátce a buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou rozpustným fúzním proteinem Fc obsahujícím lidskou oblast Fc. Je to imunitní mechanizmus vedoucí k lýzi „buněk cílených protilátkou“ prostřednictvím „lidských imunoefektorových buněk“ kde: „Lidské imunoefektorové buňky“ je populace leukocytů, která vykazuje na povrchu receptory Fc, jejichž prostřednictvím se vážou na fúzní proteiny Fc a provádějí efektorovou funkci. Taková populace může zahrnovat, ale není tím omezena, mononukleámí buňky periferní krve (PBMC) a/nebo přirozené zabij ečské buňky (NK). „Buňky cílené protilátkou“ jsou buňky vázané protilátkami nebo fúzními proteiny Fc. Protilátky nebo fúzní proteiny Fc se vážou na cílové buňky proteinovou částí N-konce oblasti Fc.
Jak je použito zde, termín zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc je definován buď jako zvýšení počtu „buněk cílených protilátkou“, které jsou lýzovány v daném čase, dané koncentraci protilátky nebo fúzního proteinu Fc v médiu obklopujícím buňky mechanizmem buněčné cytotoxicity zprostředkovaným Fc definovaným výše, a/nebo snížením koncentrace protilátky nebo fúzního proteinu Fc v médiu obklopujícím buňky, požadované k dosažení lýze daného počtu „buněk cílených protilátkou“ v daném čase mechanizmem buněčné cytotoxicity zprostředkovaným Fc. Zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc je vztažena k buněčné cytotoxicitě zprostředkované toutéž protilátkou nebo fúzním proteinem Fc, produkovanou stejným typem hostitelských buněk s použitím stejné standardní produkce, čištění, formulace a skladovacích metod, které jsou známy odborníkům v oboru, ale které se nepoužily u hostitelských buněk sestrojených pro exprimaci glykozyltransferázy GnTIII metodami popsanými zde.
Protilátkou mající zvýšenou buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC) se míní protilátka mající zvýšenou ADCC, jak se určí jakoukoliv vhodnou metodou známou odborníkům v oboru a akceptovaná stanovení in vitro jsou následující:
1) Stanovení používá cílové buňky, o kterých je známo, že exprimují cílový antigen rozeznatelný oblastí protilátky vázající antigen;
2) stanovení používá lidské mononukleámí buňky periferní krve (PBMC), izolované z krve náhodně vybraného zdravého dárce, jako efektorové buňky;
3) stanovení se provádí podle následujícího protokolu:
i) PBMC se izolují s použitím standardních hustotních centrifugačních procedur a suspenduje se 5x106 buněk/ml v buněčném kultivačním médiu RPMI;
ii) cílové buňky se nechají růst s pomocí standardních tkáňových kultivačních metod, odeberou se za fáze exponenciálního růstu s životností větší než 90 %, promyjí se kultivačním médiem RPMI, označí se 100 μ-Curie 51Cr, promyjí dvakrát buněčným kultivačním médiem, a resuspendují se v buněčném kultivačním médiu při hustotě 105 buněk/ml;
iii) 100 μΐ finální suspenze cílových buněk uvedené výše se přenese do každé jamky 96jamkové mikrotitrační destičky;
- 18CZ 308720 B6 iv) protilátka se sériově ředí od 4000 ng/ml po 0,04 ng/ml v buněčném kultivačním médiu a 50 pl výsledných roztoků protilátky se přidá k cílovým buňkám v 96jamkové mikrotitrační destičce, a třikrát se testují různé koncentrace protilátek s pokrytím celého výše uvedeného rozsahu koncentrací;
v) pro kontroly maximálního uvolnění (MR) se do 3 dalších jamek v destičce obsahující značené cílové buňky přidá 50 μΐ 2% obj. vodného roztoku neionogenního detergentu (Nonidet, Sigma, St. Louis, USA) namísto roztoku protilátky (bod iv) výše);
vi) pro kontroly spontánního uvolnění (SR) se do 3 dalších jamek v destičce obsahující značené cílové buňky přidá 50 μΐ buněčného kultivačního média RPMI namísto roztoku protilátky (bod iv) výše);
vii) 96jamková mikrotitrační destička se poté centrifugu)e při 50 g po 1 minutu a inkubuje 1 hodinu při 4 °C;
viii) 50 μΐ suspenze PBMC (bod i) výše) se přidá do každé jamky, aby se získal poměr efektorových: cílových buněk 25:1 a destičky se umístí do inkubátoru pod atmosféru s 5 % CO2 při 37 °C po 4 hodiny;
ix) bezbuněčný supernatant se sebere z každé jamky a experimentem uvolněná radioaktivita (ER) se kvantifikuje s použitím γ čítače;
x) procentická hodnota specifické lýze se spočítá pro každou koncentraci protilátky podle vzorce (ER-MR)/(MR-SR)xl00, kde ER je průměrná radioaktivita kvantifikovaná (viz bod ix) výše) pro tuto koncentraci protilátky, MR je průměrná radioaktivita kvantifikovaná (viz bod ix) výše) pro kontroly MR (viz bod iv) výše), a SR je průměrná radioaktivita kvantifikovaná (viz bod ix) výše) pro kontroly SR (viz bod vi) výše);
4) „zvýšená ADCC“ se definuje buď jako zvýšení maximální procentické hodnoty specifické lýze pozorované uvnitř rozsahu koncentrace protilátky testovaného výše, a/nebo snížení koncentrace protilátky požadované pro dosažení poloviny maximální procentické hodnoty lýze pozorované uvnitř rozsahu koncentrací protilátky testovaného výše. Zvýšení ADCC je ve vztahu k ADCC, měřeno uvedeným stanovením, zprostředkovanou toutéž protilátkou, produkovanou stejným typem hostitelských buněk s použitím stejné standardní produkce, čištění, formulace a skladovacích metod, které jsou známy odborníkům v oboru, ale které se nepoužily u hostitelských buněk sestrojených pro zvýšenou exprimaci glykozyltransferázy GnTIII metodami popsanými zde.
Jak je použito zde, termín protilátka anti-CD20 se považuje za protilátku, která specificky rozpoznává neglykozylovaný fosfoprotein buněčného povrchu majícího molekulovou hmotnost 35 000, typicky označovaný jako lidský antigen omezené diferenciace B-lymfocytů Bp35, obecně označovaný jako CD20.
Předmětný vynález je založen na zjištění, že sestrojení buněk produkujících protilátku, aby exprimovaly nový fuzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII), nebo alternativně aktivitu P(l,4)-galaktózyltransferázy („GalT“) a obsahující Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu vede k protilátkám se zvýšenou vazebnou afinitou receptoru Fc a zvýšenou efektorovou funkcí. Protilátky se zvýšenou efektorovou funkcí a/nebo se zvýšenou vazebnou afinitou receptoru Fc se mohou alternativně získat sestrojením buněk produkujících protilátky tak, aby měly zvýšenou expresi molekuly nukleové kyseliny kódující polypeptid mající katalytickou aktivitu a-manózidázy II. V upřednostňovaných provedeních jsou fuzní konstrukty mající aktivitu GnTIII nebo GalT koexprimovány s molekulami nukleové kyseliny kódujícími Manil nebo GnTII.
- 19CZ 308720 B6
Podle toho je vynález v jednom provedení směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci kódující fuzní polypeptid, kde fuzní polypeptid má aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu. Ve výhodném provedení obsahuje fuzní polypeptid katalytickou doménu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III a Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména manózidázy II. V dalším provedení Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména GalT.
Izolovaná nukleová kyselina má výhodně sekvenci ukázanou na obr. 24 a SEQ ID NO: 12. V jiném výhodném provedení fuzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III a Golgiho lokalizační doména je lokalizační doména β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy I (GnTI). Nukleová kyselina má výhodně sekvenci ukázanou na obr. 25 a SEQ ID NO: 14. Alternativně se může použít Golgiho lokalizační doména jiného Golgiho rezidentního polypeptidu. V jiném výhodném provedení je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny skládající se z lokalizační domény β(l,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II, lokalizační domény manózidázy I a lokalizační domény a 1-6 jádrové fukózyltransferázy.
V jiném přednostním provedení je předmětný vynález směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci ukázanou na obr. 24 a SEQ ID NO: 13, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO: 15. Předmětný vynález také zahrnuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která hybridizuje za přísných podmínek na hybridizační sondu, jejíž nukleotidová sekvence se skládá z nukleotidové sekvence ukázané na obr. 24 a SEQ ID NO: 12, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO: 14. Vynález je dále směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která je alespoň na 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identická se sekvencí nukleotidu ukázanou na obr. 24 a SEQ ID NO: 13, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO: 15. V jiném přednostním provedení je předmětný vynález směrován na izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci alespoň na 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identickou s aminokyselinovou sekvencí na obr. 24 a SEQ ID NO: 13, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO: 15. Vynález také obsahuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci, která kóduje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci ukázanou na obr. 24 a SEQ ID NO: 15, nebo na obr. 25 a SEQ ID NO: 13 s konzervativními aminokyselinovými substitucemi.
V jiném provedení je předmětný vynález směrován na expresní vektor, který obsahuje izolovanou nukleovou kyselinu podle vynálezu, takovou, jak je popsána výše.
V dalším provedení je předmětný vynález směrován na fuzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III, nebo alternativně aktivitu β(l,4)-galaktózyltransferázy I (“GalT“), a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. Ve výhodných provedeních fúzní polypeptidy podle vynálezu obsahují katalytickou doménu β(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III. Ve zvláště výhodném provedení fuzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu manózidázy II nebo β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy I (GnTI). V alternativním provedení je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny skládající se z lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény doménu β(l,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény a 1-6 jádrové fukózyltransferázy. Fúzní polypeptid podle předmětného vynálezu se může připravit kultivací hostitelských buněk podle předmětného vynálezu v médiu za podmínek dovolujících expresi nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid a získání fuzního polypeptidu z výsledné kultury.
Předmětný vynález je dále směrován na způsob modifikace glykozylačního profilu polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou, obsahující zavedení nukleové kyseliny nebo vektoru podle vynálezu do hostitelské buňky. Modifikovaný polypeptid je výhodně IgG nebo jeho fragment obsahující oblast Fc. Nejvýhodněji je polypeptid výhodně IgGl nebo jeho fragment obsahující oblast Fc. V jiném výhodném provedení je modifikovaný polypeptid fúzní protein, který obsahuje oblast ekvivalentní oblasti Fc lidského IgG.
-20CZ 308720 B6
Předmětný vynález je dále směrován na hostitelskou buňku obsahující nukleové kyseliny a expresní vektory podle vynálezu. V jednom provedení je předmětný vynález směrován na hostitelskou buňku sestrojenou pro expresi alespoň jedné nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III, nebo alternativně aktivitu P(l,4)-galaktózyltransferázy I (“GalT“) v množství postačujícím pro modifikaci polysacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaném hostitelskou buňkou, kde polypeptid je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fuzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je ve výhodném provedení IgG nebo jeho fragment. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je nej výhodněji IgGl nebo jeho fragment. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je alternativně fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc lidského IgG, tj. IgGl.
Modifikované polypeptidy produkované hostitelskými buňkami podle vynálezu vykazují zvýšenou vazebnou afinitu receptoru Fc a/nebo zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek modifikace. Zvýšená vazebná afinita receptoru Fc je výhodně zvýšená vaznost na aktivující receptor Fcy, jako je receptor FcyRIIa. Zvýšená efektorová funkce je výhodně zvýšení v jednom nebo více z následujícího: zvýšená cytotoxicita závislá na protilátce, zvýšená fagocytóza závislá na protilátce (ADCP), zvýšená sekrece cytokinu, zvýšená absorpce antigenu buňkami prezentujícími antigen zprostředkovaná imunokomplexem, zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na polymorfonukleámí buňky (PMN), zvýšená vaznost na monocyty, zvýšené propojení protilátek vázaných cílem, zvýšená apoptóza indukovaná přímou signalizací, zvýšené dozrávání dendritických buněk a zvýšené zásobení T-buňkami.
Ve zvláště výhodném provedení je hostitelská buňka podle vynálezu buňka CHO, BHK, NSO, SP2/0, buňka myelomu YO, buňka myšího myelomu P3X63, buňka PER, PER.C6 nebo hybridomová buňka, a polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je protilátka anti-CD-20, jako je IDEC-C2B8. V jiném výhodném provedení je hostitelská buňka chimémí antihumánní monoklonální protilátka EGFR C225.
Navíc k obsahu nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid podle vynálezu může hostitelská buňka podle vynálezu dále obsahovat alespoň jednu transekovanou nukleovou kyselinu kódující molekulu protilátky, fragment protilátky obsahující funkční oblast Fc, nebo fuzní protein který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Ve výhodných provedeních alespoň jedna transekovaná nukleová kyselina kóduje protilátku anti-CD20, chimémí antihumánní neuroblastomovou monoklonální protilátku chCE7, chimémí antihumánní monoklonální protilátku proti karcinomu ledvinových buněk chG250, chimémí antihumánní monoklonální protilátku proti karcinomu tlustého střeva, plic a hmdníku ING-1, humanizovanou antihumánní monoklonální protilátku antigenu 17-1A 3622W94, humanizovanou antihumánní protilátku kolorektálního nádoru A3 3, antihumánní melanomovou protilátku směřovanou proti GD3 gangliosidu R24, chimémí antihumánní monoklonální protilátku squamous-cell karcinomu SF-25, antihumánní protilátku EGFR, antihumánní protilátku EGFRvIII, antihumánní protilátku PSMA, antihumánní protilátku PSCA, antihumánní protilátku CD22, antihumánní protilátku CD30, protilátku antiTAG72, protilátku antigenu asociovaného s melanomem o vysoké molekulové hmotnosti (HMWMAA), protilátku gangliosidu anti-GD3, protilátku gangliosidu anti-GD2, protilátku gangliosidu anti-GM2, antihumánní protilátku gangliosidu, protilátku anti-EGFRvIII, antiintegrinovou protilátku, protilátku anti-CD80, protilátku anti-LeY, anti-mucinovou protilátku, protilátku anti-MUC18, antihumánní protilátku CD33, antihumánní protilátku CD38, antihumánní protilátku CD40, antihumánní protilátku CD45, antihumánní protilátku CD52, antihumánní protilátku CD 138, antihumánní protilátku HLA-DR variant, antihumánní protilátku EpCAM, antihumánní protilátku CEA, antihumánní protilátku MUC1, antihumánní protilátku jaderného proteinu MUC1, antihumánní protilátku aberantně glykozylovaného MUC1, protilátku proti variantám lidského fibronektinu obsahující doménu ED-B nebo antihumánní protilátku HER2/neu.
-21 CZ 308720 B6
Předmětný vynález je také směrován na způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, obsahující (a) kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fuzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III, nebo alternativně aktivitu P(l,4)-galaktózyltransferázy I (“GalT“) za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky obsahujícího funkční oblast Fc a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid mající aktivitu GnTIII nebo alternativně aktivitu GalT je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci polysacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a (b) izolaci polypeptidu. Ve výhodném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III. Ve zvláště výhodném provedení fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu. Golgiho lokalizační doména je výhodně lokalizační doména manózidázy II nebo P(l,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I (GnTI). Alternativně je Golgiho lokalizační doména vybraná ze skupiny skládající se z lokalizační domény manózidázy I, lokalizační domény P(l,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II a lokalizační domény a 1-6 jádrové fúkózyltransferázy. Polypeptidy připravené způsoby podle předmětného vynálezu mají zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc a/nebo zvýšenou efektorovou funkci. Zvýšená efektorová funkce je výhodně jedno nebo více z následujícího: zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc (včetně zvýšené cytotoxicity závislé na protilátce), zvýšená fagocytóza závislá na protilátce (ADCP), zvýšená sekrece cytokinu, zvýšená absorpce antigenu buňkami prezentujícími antigen zprostředkovaná imunokomplexem, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na polymorfónukleámí buňky (PMN), zvýšená vaznost na monocyty, zvýšené propojení protilátek vázaných cílem, zvýšená apoptóza indukovaná přímou signalizací, zvýšené dozrávání dendritických buněk a zvýšené zásobení T-buňkami. Zvýšená afinita navázání receptoru Fc je výhodně zvýšené navázání na receptory aktivující Fc jako Fc/RIIIa.
V jiném provedení je předmětný vynález směrován na polypeptid produkovaný způsoby podle vynálezu, který má zvýšený podíl rozdělených/rozvětvených (bisected) oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu. V ještě jiném provedení má polypeptid produkovaný způsoby podle vynálezu zvýšený podíl nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc jako výsledek modifikace. Nefukózylované oligosacharidy mohou být hybridního nebo komplexního typu. Ve zvláště výhodném provedení polypeptid produkovaný hostitelskými buňkami a způsoby podle vynálezu, který má zvýšený podíl rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc. Rozdělené nefukózylované oligosacharidy mohou být buď hybridní nebo komplexní. Způsoby podle předmětného vynálezu se mohou použít pro produkci polypeptidů, ve kterých je alespoň 15 %, výhodněji alespoň 20 %, výhodněji alespoň 25 %, výhodněji alespoň 30 %, výhodněji alespoň 35 %, výhodněji alespoň 40 %, výhodněji alespoň 45 %, výhodněji alespoň 50 %, výhodněji alespoň 55 %, výhodněji alespoň 60 %, výhodněji alespoň 65 %, výhodněji alespoň 70 %, výhodněji alespoň 75 %, výhodněji alespoň 80 %, výhodněji alespoň 85 %, výhodněji alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %, výhodněji alespoň 96 %, výhodněji alespoň 97 %, výhodněji alespoň 98 %, výhodněji alespoň 99 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu nefukózylovaných. Způsoby podle vynálezu se také mohou použít pro produkci polypeptidů, ve kterých je alespoň 15 %, výhodněji alespoň 20 %, výhodněji alespoň 25 %, výhodněji alespoň 30 %, výhodněji alespoň 35 %, výhodněji alespoň 40 %, výhodněji alespoň 45 %, výhodněji alespoň 50 %, výhodněji alespoň 55 %, výhodněji alespoň 60 %, výhodněji alespoň 65 %, výhodněji alespoň 70 %, výhodněji alespoň 75 %, výhodněji alespoň 80 %, výhodněji alespoň 85 %, výhodněji alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %, výhodněji alespoň 96 %, výhodněji alespoň 97 %, výhodněji alespoň 98 %, výhodněji alespoň 99 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu rozdělených/rozvětvených (bisected). Ještě dále se způsoby podle vynálezu mohou použít pro produkci polypeptidů, ve kterých je alespoň 15 %, výhodněji alespoň 20 %, výhodněji alespoň 25 %, výhodněji alespoň 30 %, výhodněji alespoň 35 %, výhodněji alespoň 40 %, výhodněji alespoň 45 %, výhodněji alespoň 50 %, výhodněji alespoň 55 %, výhodněji alespoň 60 %, výhodněji alespoň 65 %, výhodněji alespoň 70 %, výhodněji alespoň 75 %, výhodněji alespoň
-22CZ 308720 B6 %, výhodněji alespoň 85 %, výhodněji alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %, výhodněji alespoň 96 %, výhodněji alespoň 97 %, výhodněji alespoň 98 %, výhodněji alespoň 99 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu rozdělených nefukózylovaných. Způsoby podle vynálezu se také mohou použít pro produkci polypeptidů, ve kterých je alespoň 15 %, výhodněji alespoň 20 %, výhodněji alespoň 25 %, výhodněji alespoň 30 %, výhodněji alespoň 35 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu rozdělených hybridních nefukózylovaných.
V jiném provedení je předmětný vynález veden na protilátku sestrojenou tak, aby měla zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc. Zvýšená efektorová funkce je výhodně jedno nebo více z následujícího: zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc (včetně zvýšené cytotoxicity závislé na protilátce), zvýšená fagocytóza závislá na protilátce (ADCP), zvýšená sekrece cytokinu, zvýšená absorpce antigenu buňkami prezentujícími antigen zprostředkovaná imunokomplexem, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na polymorfbnukleámí buňky (PMN), zvýšená vaznost na monocyty, zvýšené propojení protilátek vázaných cílem, zvýšená apoptóza indukovaná přímou signalizací, zvýšené dozrávání dendritických buněk a zvýšené zásobení T-buňkami. Zvýšená afinita navázání receptoru Fc je ve výhodném provedení zvýšené navázání na receptory aktivující Fc, nejvýhodněji Fc/RIIIa. Vynález je dále veden na fragmenty protilátky obsahující oblast Fc a fuzní proteiny, které obsahují oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Takové fragmenty protilátky a fuzní proteiny vykazují zvýšenou vazebnou afinitu k receptoru Fc a/nebo zvýšenou efektorovou funkci.
Předmětný vynález je dále veden na farmaceutické kompozice obsahující protilátky, fragmenty protilátek udržující i oblast Fc a fúzní proteiny mající oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu podle předmětného vynálezu a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
Předmětný vynález je dále veden na použití takových farmaceutických kompozic ve způsobech léčení rakoviny. Předmětný vynález je specificky veden na způsob léčení rakoviny obsahující podání terapeuticky účinného množství farmaceutické kompozice podle vynálezu.
Předmětný vynález je také veden na hostitelskou buňku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu; a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manil). Ve výhodných provedeních molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid a nukleová kyselina kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou na tomtéž nebo oddělených expresních vektorech. V jiném výhodném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu GnTIII. V dalším výhodném provedení je Golgiho lokalizační doména lokalizační doména Manil, β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy I, β(l,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy II, manózidázy I nebo a-l,6-N jaderné fúkózyltransferázy. V dalším výhodném provedení je hostitelská buňka vybraná ze skupiny, skládající se ze savčí buňky, kvasinky, hmyzí buňky a rostlinné buňky. Hostitelská buňka je výhodně buňka CHO, BHK, NSO, SP2/0, buňka myelomu YO, buňka myšího myelomu P3X63, buňka PER, PER.C6 nebo hybridomová buňka.
Vynález dále poskytuje hostitelskou buňku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)N—acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu, a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manil) a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,2)N—acetylglukózaminyltransferázy II (GnTII). Ve výhodných provedeních je molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném nebo oddělených expresních vektorech. Rovněž výhodné je to, že molekula nukleové kyseliny
-23CZ 308720 B6 kódující fuzní polypeptid je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném expresním vektoru. Rovněž výhodné je to, že molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném expresním vektoru. V jiném provedení je molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fůzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil jsou na stejném expresním vektoru.
V dalším aspektu je vynález veden na hostitelskou buňku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid, kde fůzní polypeptid má aktivitu β( 1,4)galaktózyltransferázy (GalT) obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidů; a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manil). Ve výhodných provedeních molekula nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid a nukleová kyselina kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II jsou na tomtéž nebo oddělených expresních vektorech. Fůzní polypeptid výhodně obsahuje katalytickou doménu GalT. V dalším provedení je Golgiho lokalizační doména lokalizační doména Manil, P(l,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy II, manózidázy I nebo a-l,6-N jaderné fůkózyltransferázy. Ve výhodném provedení je hostitelská buňka vybraná ze skupiny, skládající se ze savčí buňky, kvasinky, hmyzí buňky a rostlinné buňky. Hostitelská buňka je výhodně buňka CHO, BHK, NSO, SP2/0, buňka myelomu YO, buňka myšího myelomu P3X63, buňka PER, PER.C6 nebo hybridomová buňka.
V dalším aspektu je vynález veden na hostitelskou buňku obsahující expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fůzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)—galaktózyltransferázy (GalT) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidů; a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, kde polypeptid má aktivitu manózidázy II (Manil); a expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující fůzní polypeptid, kde polypeptid má aktivitu β(1,2)N—acetylglukózaminyltransferázy II (GnTII). Výhodně je každá nukleová kyselina na stejném expresním vektoru. V odděleném provedení je každá nukleová kyselina na oddělených expresních vektorech. Vynález dále poskytuje to, že molekula nukleové kyseliny kódující fůzní polypeptid je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném expresním vektoru. Vynález také poskytuje to, že molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII jsou na stejném expresním vektoru. Vynález také poskytuje to, molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu GnTII je na jednom expresním vektoru, a molekula nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid a molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid mající aktivitu Manil jsou na stejném expresním vektoru. V dalším výhodném provedení je Golgiho lokalizační doména lokalizační doména Manil, β(l,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy II, manózidázy I nebo a-l,6-N jaderné fůkózyltransferázy.
Vynález dále poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fuzní polypeptid mající aktivitu GnTIII, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidů produkovaného hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fuzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
-24CZ 308720 B6
Vynález také poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
V odděleném provedení vynález poskytuje hostitelskou buňku sestrojenou tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT, alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou výhodně vykazuje zvýšenou vazebnou afinitu receptoru Fc jako výsledek modifikace. V dalším výhodném provedení polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou vykazuje zvýšenou efektorovou fúnkci jako výsledek modifikace. Zvýšená efektorová funkce je výhodně jedno nebo více z následujícího: zvýšená buněčná cytotoxicita zprostředkovaná Fc, zvýšená vaznost na buňky NK, zvýšená vaznost na makrofágy, zvýšená vaznost na polymorfonukleámí buňky (PMN), zvýšená vaznost na monocyty, zvýšené propojení protilátek vázaných cílem, zvýšená apoptóza indukovaná přímou signalizací, zvýšené dozrávání dendritických buněk a/nebo zvýšené zásobení T-buňkami.
V dalším provedení je vynález veden na způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, obsahující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GnTIII a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a izolaci polypeptidu. Hostitelská buňka je dále výhodně sestrojena tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII. V dalším výhodném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu GnTIII. V dalším výhodném provedení fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. Golgiho lokalizační doména lokalizační je výhodně lokalizační doména Manil, P(l,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy II, manózidázy I nebo a-l,6-N jaderné fukózyltransferázy. Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má výhodně zvýšenou efektorovou fúnkci jako výsledek uvedené modifikace.
Vynález je dále veden na způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, obsahující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a izolaci polypeptidu. V dalším provedení je hostitelská buňka dále sestrojena tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTII. V dalším výhodném provedení fúzní polypeptid obsahuje katalytickou doménu GalT. V dalším výhodném provedení fúzní polypeptid dále obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. Golgiho lokalizační doména je výhodně lokalizační doména manózidázy II, β(l,2)-N-acetylglukózaminyltransferázy I, β(1,2)-Νacetylglukózaminyltransferázy II, manózidázy I nebo a-l,6-N jaderné fukózyltransferázy.
-25CZ 308720 B6
Polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má výhodně zvýšenou efektorovou funkci jako výsledek uvedené modifikace. Specificky ve výhodném provedení polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou má zvýšený podíl rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu. Rozdělené nefůkózylované oligosacharidy jsou výhodně hybridní. Rozdělené nefukózylované oligosacharidy jsou ještě výhodněji komplexní. Ve výhodném provedení je alespoň 10 % až 95 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu rozdělených nefukózylovaných. Zvláště výhodné je to, že asi 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu se sestrojenou glykozylací podle předmětného vynálezu je rozdělených nefukózylovaných.
V dalším výhodném provedení předmětný vynález poskytuje to, že protilátky sestrojené podle způsobů předmětného vynálezu mají zvýšenou efektorovou funkci.
V dalším výhodném provedení předmětný vynález dále poskytuje farmaceutické kompozice obsahující protilátky sestrojené podle způsobů předmětného vynálezu. Farmaceutické kompozice podle předmětného vynálezu výhodně obsahují farmaceuticky přijatelný nosič.
Vynález dále poskytuje způsob léčení rakovinných nádorů obsahující podání terapeuticky účinného množství farmaceutických kompozic podle předmětného vynálezu pacientovi v případě potřeby.
Vynález je dále veden na způsob produkce polypeptidu majícího zvýšenou buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou Fc v hostitelské buňce, obsahující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde úroveň exprese jedné nebo obou z GalT a Manil je postačující pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou a polypeptid má zvýšenou celulámí cytotoxicitu zprostředkovanou Fc jako výsledek modifikace; a izolaci polypeptidu majícího zvýšenou celulámí cytotoxicitu zprostředkovanou Fc. V dalším výhodném provedení úroveň exprese GalT produkuje molekulu protilátky nebo fragment protilátky, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu mající zvýšenou celulámí cytotoxicitu zprostředkovanou Fc.
Vynález je dále veden na způsob produkce polypeptidu majícího zvýšenou celulámí cytotoxicitu zprostředkovanou Fc v hostitelské buňce, obsahující kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu GalT a alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu Manil za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde úroveň exprese jedné nebo obou z GalT a Manil je postačující pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou a polypeptid má zvýšenou celulámí cytotoxicitu zprostředkovanou Fc jako výsledek modifikace; a izolaci polypeptidu majícího zvýšenou celulámí cytotoxicitu zprostředkovanou Fc. Ve výhodném provedení hostitelská buňka dále obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující GnTIII, kde GnTIII je exprimována v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou a kde polypeptid má zvýšenou celulámí cytotoxicitu zprostředkovanou Fc jako výsledek modifikace. Úroveň exprese jedné nebo více z GalT, Manil nebo GnTIII je výhodně postačující pro tvorbu rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu. Ještě výhodněji je podíl rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc k celkovým oligosacharidům v oblasti Fc alespoň asi 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 nebo 95 %. Výhodně je podíl rozdělených oligosacharidů v oblasti Fc k celkovým oligosacharidům v oblasti Fc alespoň 45 %. Ve výhodném provedení jsou rozdělené oligosacharidy komplexní nebo hybridní. Hostitelská buňka je výhodně savčí buňka, kvasinka, hmyzí buňka nebo rostlinná buňka. Ještě výhodněji je hostitelská buňka rostlinná buňka.
-26CZ 308720 B6
V jiném aspektu je předmětný vynález veden na způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, obsahující:
a. kultivaci hostitelské buňky sestrojené tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu manózidázy II za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny, skládající se z celé molekuly protilátky, fragmentu protilátky a fúzního proteinu, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, kde polypeptid mající aktivitu manózidázy II je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou;
b. a izolaci polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou.
Předmětný vynález je také veden na polypeptidy, zejména protilátky, které mají zvýšenou efektorovou funkci a/nebo zvýšenou vaznost na receptor Fc jako výsledek modifikovaných oligosacharidů stejně jako jejích použití v terapeutických kompozicích pro léčení nemocí, zejména nádorů.
Identifikace a generování nukleových kyselin kódujících protein, pro který je požadována modifikace glykozylačního modelu
Předmětný vynález poskytuje způsoby generování a použití systémů hostitelských buněk pro produkci glykoforem protilátek, fragmentů protilátek obsahujících oblast Fc a fúzních proteinů, které obsahují oblast ekvivalentní oblasti Fc, mající zvýšenou vazebnou afinitu na receptor Fc, výhodně na receptory aktivující Fc, a/nebo zvýšené efektorové funkce, včetně buněčné cytotoxicity závislé na protilátce. Identifikace cílových epitopů a generování protilátek majících potenciální terapeutickou hodnotu, pro které se požaduje modifikace glykozylačního modelu, a izolace příslušných kódujících sekvencí nukleových kyselin je v rámci vynálezu.
Různé procedury známé ve stavu techniky se mohou použít pro produkci protilátek na cílové epitopy zájmu. Takové protilátky zahrnují, ale nejsou tím omezeny, polyklonální, monoklonální, chimémí, humanizované, plně lidské, jednořetězcové, fragmenty Fab a fragmenty produkované ScFv, Fab, VH, expresní knihovnou IgG. Takové protilátky mohou být užitečné, tj. jako diagnostická nebo terapeutická činidla. Jako terapeutická činidla, neutralizující protilátky, tj. které soutěží o vazbu s ligandem, substrátem nebo molekulou adaptéru, jsou zvláště předmětem zájmu.
Pro produkci protilátek se imunizují různá hostitelská zvířata injekcí cílového proteinu předmětu zájmu včetně, ale ne tímto omezeno, králíků, myší, krys atd. Polyklonální protilátky se mohou získat ve zvířatech více subkutánními (sc) nebo intraperitonálními (ip) injekcemi odpovídajícího antigenu a přídavné látky. Pro zvýšení imunologické odpovědi se mohou použít různé přídavné látky v závislosti na hostitelském druhu, včetně, ale ne tímto omezeno, Freundovo adjuvans (kompletního nebo nekompletního), minerální gely jako hydroxid hlinitý, povrchově aktivní látky jako lysolecitin, pluronní polyoly, polyanionty, peptidy, saponin, olejové emulze, hemocyanin, dinitrofenol, a potenciálně užitečné lidské adjuvans jako BCG (bacil Calmet-Guerin) a Corynebacterium parvum. Zvířata se imunizují proti antigenu, imunogenním konjugátům nebo derivátům kombinováním 100 g nebo 5 g proteinu nebo konjugátu (jednotlivě pro králíky nebo myši) ve 3 objemech Freundova kompletního adjuvans a injekcí roztoku intradermálně na více místech. O měsíc později se zvířatům dávka oživí 1/5 až 1/10 původního množství peptidu nebo konjugátu ve Freundově adjuvans subkutánní injekcí na více místech. O 7 až 14 dní později se zvířatům odebere krev a sérum se zkoumá na titr protilátky. Zvířata se ošetřují/oživují, dokud se titr neustálí. Výhodně je zvíře oživeno/ošetřeno konjugátem téhož antigenu, ale konjugovaným na odlišný protein a/nebo prostřednictvím jiného zesíťujícího reagens. Konjugáty se také mohou dělat v rekombinantní buněčné kultuře jako proteinové fúze.
-27CZ 308720 B6
Monoklonální protilátky proti zajímavému cíli se mohou připravit s použitím jakékoliv techniky, která poskytuje produkci molekul protilátky kontinuálními buněčnými liniemi v kultuře. Ty zahrnují, ale nejsou tím omezeny, hybridomovou techniku původně popsanou Kohlerem a Milsteinem, Nature 256: 495-97 (1975), lidskou hybridomovou techniku B-buněk (Kosbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-30 (1983) hybridomovou techniku EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77-96 (Alan R. Liss, Inc., 1985)). Navíc se mohou použít techniky pro produkci chimémích protilátek (Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-55 (1984); Neubergeretal., Nature 312: 60408 (1984); Takeda et al., Nature 314: 452-54 (1985) svázáním genů z molekuly myší protilátky vhodné antigenní specificity společně s geny z molekuly lidské protilátky vhodné antigenní specificity. Tyto techniky se rovněž mohou použít pro produkci chimémích protilátek složených z molekul protilátek ostatních savců. Alternativně techniky popsané pro produkci jednořetězcových protilátek (patent US 4946778) se mohou adaptovat pro produkci jednořetězcových protilátek majících požadovanou specificitu. Vynález je dále veden na humanizované protilátky, které mají sestrojené glykosidy, podle způsobů předmětného vynálezu. Techniky pro generování humanizovaných protilátek jsou popsány například v patentu US 6180320 Qeenem et al., jehož celý obsah je zde začleněn ve své úplnosti.
Fragmenty protilátek, které obsahují specifická vazebná místa zajímavých cílových proteinů se mohou generovat známými technikami. Takové fragmenty například zahrnují, ale nejsou tím omezeny, fragmenty F(ab‘)2, které se mohou produkovat rozložením molekuly protilátky pepsinem a fragmenty Fab, které se mohou generovat redukcí disulfidických můstků fragmentů F(ab‘)2. Expresní knihovny Fab se mohou alternativně konstruovat (Huse et al., Science 246: 127581 (1989)), aby se umožnila rychlá a snadná identifikace monoklonálních fragmentů Fab s požadovanou specificitou k cílovému proteinu.
Jestliže se pro protilátku nebo fragment protilátky identifikovalo, pro kterou modifikaci glykozylačního modeluje určena, je identifikována kódující sekvence nukleové kyseliny a izoluje se použitím technik dobře známých ve stavu techniky.
a. Generování buněčných linií pro produkci proteinů se změněným glykozylačním modelem
Předmětný vynález poskytuje expresní systémy hostitelských buněk pro generování buněčných linií majících modifikované glykozylační modely. Předmětný vynález poskytuje zejména systémy hostitelských buněk pro generování glykoforem proteinů majících zvýšenou terapeutickou hodnotu. Proto v jednom aspektu poskytuje vynález expresní systémy hostitelských buněk vybraných nebo sestrojených tak, aby exprimovaly fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. Takové expresní systémy hostitelských buněk se mohou sestrojit tak, aby obsahovaly molekulu rekombinantní nukleové kyseliny kódující takový fúzní polypeptid, operativně připojený ke konstitutivnímu nebo regulovanému systému promotoru. V jednom specifickém provedení poskytuje předmětný vynález hostitelskou buňku, která je se strojená tak, aby exprimovala alespoň jednu nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Ν—acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. V jednom aspektu je hostitelská buňka sestrojená s molekulou nukleové kyseliny obsahující alespoň jeden gen kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu.
Jakýkoliv typ kultivovaných buněčných linií se může obecně použít jako základ pro sestrojení hostitelských buněčných linií podle předmětného vynálezu. Ve výhodném provedení se použijí buňky CHO, BHK, NSO, SP2/0, buňky myelomu YO, buňky myšího myelomu P3X63, buňky PER, PER.C6 nebo hybridomové buňky, jiné savčí buňky, kvasinky, hmyzí buňky nebo rostlinné buňky jako základní buněčné linie pro generování sestrojených buněčných linií podle vynálezu.
-28CZ 308720 B6 (viz Ma, J. Κ.-C., et al., Nature Genetics 4:794-805 (říjen 2003) a reference tam citované) (jejichž celý obsah je tímto včleněn coby reference).
Vynález je zamýšlen tak, aby zahrnoval jakékoliv sestrojené hostitelské buňky exprimující fuzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu, jak je definován zde.
Jedna nebo několik nukleových kyselin kódujících fuzní polypeptid mající aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu se může exprimovat pod kontrolou konstitutivního promotoru, nebo alternativně regulovaného expresního systému. Vhodný regulovaný expresní systém zahrnuje, ale není tím omezen, expresní systém regulovaný tetracyklinem, expresní systém indukovatelný ekdosynem, expresní systém lac-switch, expresní systém indukovatelný glukokortikoidem, promotorový systém indukovatelný teplotou, a expresní systém indukovatelný kovovým metalothieninem. Jestliže v systému hostitelské buňky je obsaženo několik různých nukleových kyselin kódujících fuzní polypeptidy mající aktivitu β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu, některé z nich se mohou exprimovat pod kontrolou konstitutivního promotoru, zatímco jiné se exprimují pod kontrolou regulovaného promotoru. Maximální úroveň exprese se považuje za nejvyšší možnou úroveň stabilní exprese fúzního polypeptidu, která nemá podstatný nepříznivý efekt na poměr růstu buněk, a určí se rutinním experimentem. Úrovně exprese se určují metodami obecně známými ve stavu techniky, včetně analýzy western blot s použitím protilátky specifické pro polypeptid mající aktivitu GnTIII nebo protilátky specifické pro peptidový přívěsek připojený k polypeptidu majícím aktivitu GnTIII, analýzy northern blot s použitím sondy nukleové kyseliny specifické pro gen kódující polypeptid mající aktivitu GnTIII nebo sondy nukleové kyseliny specifické pro nukleovou kyselinu kódující peptidový přívěsek připojený k polypeptidu majícím aktivitu GnTIII, nebo měřením aktivity GnTIII. Alternativně se může použít lecitin, který selektivně váže biosyntetické produkty GnTIII, například lecitin E4-PHA. Alternativně se může použít funkční stanovení, které měří zvýšenou vaznost Fc nebo zvýšenou efektorovou funkci zprostředkovanou protilátkami produkovanými buňkami sestrojenými s nukleovou kyselinou kódující polypeptid s aktivitou GnTIII. V další alternativě se může nukleová kyselina operativně připojit k reportérovému genu; hodnoty exprese genu majícího aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu se určují měřením signálu korelovaného s expresní hodnotou reportérového genu. Reportérový gen se může transkribovat společně s nukleovou kyselinou (kyselinami) kódující fúzní polypeptid jako jednoduchá molekula mRNA; její jednotlivé kódující sekvence mohou být připojeny buď interním ribozomálním vstupním místem (IRES) nebo zesilovačem translace nezávislém na uzávěru (CITE). Reportérový gen se může přepisovat společně s alespoň jednou nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu takovou, že se tvoří jednoduchý řetězec polypeptidu. Nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptidy podle předmětného vynálezu mohou být operativně připojeny k reportérovému genu pod kontrolou jednoho promotoru tak, že nukleová kyselina kódující fúzní polypeptid a reportérový gen jsou transkribovány do molekuly RNA, která je popřípadě svázána do dvou separátních molekul messenger RNA (mRNA); jedna z výsledných mRNA je transkribována do reportérového proteinu, a druhá je transkribována do fúzního polypeptidu.
Jestliže je exprimováno několik různých nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu, mohou být sestaveny takovým způsobem, že jsou transkribovány jako jedna nebo několik molekul mRNA. Jestliže jsou transkribovány jako jedna molekula mRNA, jejichjednotlivé kódující sekvence mohou být spojeny
-29CZ 308720 B6 buď interním ribozomálním vstupním místem (IRES) nebo zesilovačem translace nezávislém na uzávěru (CITE). Mohou být transkribovány z jednoho promotoru do molekuly RNA, která je popřípadě svázaná do několika oddělených molekul messenger RNA (mRNA), které jsou poté transkribovány do jejich příslušně kódovaných fuzních polypeptidů.
V jiných provedeních poskytuje předmětný vynález expresní systémy hostitelských buněk pro generování terapeutických protilátek, majících zvýšenou afinitu receptoru Fc, zvláště vázajících se k aktivačním receptorům Fc, a zvýšenou efektorovou funkci, včetně buněčné cytotoxicity závislé na protilátce. Expresní systémy hostitelských buněk byly obecně sestrojeny a/nebo vybrány, aby exprimovaly nukleové kyseliny kódující protilátku, pro kterou je vyžadována pozměněná glykoforma, vedle alespoň jedné nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid mající aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu. V jednom provedení je systém hostitelských buněk transfekován alespoň jednou nukleovou kyselinou kódující takový fuzní polypeptid. Typicky jsou transfekované buňky vybrány tak, aby se identifikovaly a izolovaly klony, které stabilně exprimují fúzní polypeptidy podle vynálezu.
Jako podklad pro sestrojení linií hostitelských buněk podle předmětného vynálezu se může použít jakýkoliv typ kultivované buněčné linie. Ve výhodném provedení se mohou použít buňky CHO, BHK, NSO, SP2/0, buňky myelomu YO, buňky myšího myelomu P3X63, buňky PER, PER.C6 nebo hybridomové buňky, jiné savčí buňky, kvasinky, hmyzí buňky a rostlinné buňky. Takové buněčné linie jsou typicky sestrojeny tak, aby dále obsahovaly alespoň jednu transfekovanou nukleovou kyselinu kódující celou molekulu protilátky, fragment protilátky obsahující oblast Fc imunoglobulinu, nebo fúzní protein, který zahrnuje oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu. Takové buněčné linie produkující protilátku jsou typicky odvozeny z klonů produkujících a vylučujících protilátku při vysokých specifických produktivitách v rozsahu 20 až 120 pg/(buňka.den). V alternativním provedení se použije hybridomová buněčná linie exprimující jednotlivou protilátku, která je předmětem zájmu, jako podkladová buněčná linie pro generování hostitelských buněčných linií podle vynálezu.
V jednom provedení nukleové kyseliny kódující protilátku, fragment protilátky nebo fúzní polypeptid Fc se klonují do vektorů exprimujících protilátku a poté se transfekují do hostitelských buněčných linií a selektují se a zkoumají buněčné klony na vysokou stabilní specifickou produkcí protilátky. Takové selektované klony se poté transfekují expresním vektorem glykozyltransferázy modifikující glykoprotein obsahujícím například (a) fúzní polypeptid s aktivitou β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII), nebo (b) fúzní polypeptid s aktivitou β(1,4)-Νgalaktózyltransferázy (GalT), nebo (c) fúzní polypeptid s aktivitou Golgiho α-manózidázy II (Manil), nebo (c) fúzní polypeptid s aktivitou GnTIII a další polypeptid s aktivitou Manil, nebo (e) fúzní polypeptid s aktivitou GalT a další polypeptid s aktivitou Manil. Klony se poté selektují a zkoumají na stabilní expresi genů kódujících protilátku při úrovních vedoucích k vysokým produktivitám specifickým k protilátce, a se stabilní expresí genů glykozyltranferázy modifikující glykoprotein při expresních úrovních vedoucích modifikaci glykozylačního modelu oblasti Fc, včetně zvýšení podílu frakce nefúkózylovaných oligosacharidů, které mohou být rozdělené nebo nerozdělené a které dále mohou být komplexního nebo hybridního typu, který je spojen se zvýšením vaznosti receptoru Fc, zejména zvýšením vazebné afinity Fc-FcyRIII, a zvýšením efektorových funkcí zprostředkovaných receptorem Fc, včetně, ale ne tímto omezeno, buněčné cytotoxicity závislé na Fc. Způsoby selekce a zkoumání jsou popsány níže.
V jiném provedení se obrátí pořadí dvou transfekcí popsaných výše, jmenovitě transfekce expresních vektorů protilátky a transfekce expresních vektorů glykozyltranferázy modifikující glykoprotein, tj. hostitelské buňky se nejprve transfekují expresními vektory glykozyltranferázy modifikující glykoprotein a poté expresními vektory protilátky. Při takovém přístupu se klony z první transfekce mohou prověřit na přiměřeně stabilní úroveň exprese genů glykozyltransferázy jakoukoliv metodou popsanou níže, nebo se alternativně transientně transfekují replikáty takovýchto klonů expresními vektory protilátky a poté se aplikují zkušební metody popsané dále,
- 30CZ 308720 B6 aby se identifikovaly klony se stabilní úrovní exprese genů glykozyltransferázy při úrovních vedoucích k modifikaci glykozylačního modelu oblasti Fc a ke zvýšení na receptoru Fc, včetně receptoru Fc/RIII. vazebné afinity a zvýšení efektorových funkcí zprostředkovaných receptorem, včetně celulámí cytotoxicity závislé na Fc.
V dalším provedení se geny kódující protilátky a geny glykozyltranferázy transfekují společně v jednom kroku transfekce, buď v jednom expresním vektoru nebo v oddělených vektorech.
Alespoň jedna nukleová kyselina v sytému hostitelské buňky typicky kóduje fuzní polypeptid s aktivitou P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII), nebo popřípadě fuzní polypeptid s aktivitou P(l,4)-N-galaktózyltransferázy, a obsahuje Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu, nebo popřípadě kóduje polypeptid s aktivitou Golgiho a-manózidázy II.
Jedna nebo několik nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptid podle vynálezu se může exprimovat za řízení konstitutivním promotorem, nebo popřípadě regulovaným expresním systémem. Vhodné regulované expresní systémy zahrnují, ale nejsou tím omezeny, expresní systém regulovaný tetracyklinem, expresní systém indukovatelný ekdysonem, expresní systém lacswitch, expresní systém indukovatelný glukokortikoidem, promotorový systém indukovatelný teplotou a metalothieninový expresní systém indukovatelný kovem. Jestliže v systému hostitelské buňky je obsaženo několik nukleových kyselin kódujících fúzní polypeptid s aktivitou β(1,4)-Νacetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahujících Golgiho lokalizační doménu Golgiho rezidentního polypeptidu, některé z nich se mohou exprimovat za řízení konstitutivním promotorem, zatímco jiné se exprimují za řízení regulovaným promotorem. Za maximální úroveň exprese se považuje nejvyšší možná hodnota stabilní exprese fuzního polypeptidu, která nemá podstatný nepříznivý vliv na poměr růstu buněk, a určuje se s použitím rutinních pokusů. Úrovně exprese se určují způsoby obecně známými ve stavu techniky, včetně použití analýzy western blot, tj. protilátkově specifické vůči polypeptidu majícím aktivitu GnTIII nebo protilátkově specifické vůči peptidovému přívěsku připojeném k polypeptidu majícímu aktivitu GnTIII, analýzy northern blot používající sondu nukleové kyseliny specifickou pro nukleovou kyselinu kódující polypeptid mající aktivitu GnTIII nebo sondu nukleové kyseliny kódující specifickou pro nukleovou kyselinu kódující peptidový přívěsek připojený k polypeptidu majícímu aktivitu GnTIII, nebo měřením enzymatické aktivity GnTIII. Popřípadě se může použít lektin, který se váže na biosyntetické produkty GnTIII, například lektin E4-PHA. Popřípadě se může použít funkční stanovení, které měří zvýšenou vaznost receptoru Fc nebo zvýšenou efektovou funkci zprostředkovanou protilátkami produkovanými buňkami sestrojenými s nukleovou kyselinou kódující polypeptid s aktivitou GnTIII. V další alternativě může být nukleová kyselina operativně připojena k reportérovému genu; úrovně exprese fuzního polypeptidu podle vynálezu se určují měřením signálu korelovaného s úrovní exprese reportérového genu. Reportérový gen se může transkribovat společně s nukleovou kyselinou nebo kyselinami kódujícími glykozyltransferázu modifikující glykoprotein jako jedna molekula mRNA; její příslušné kódovací sekvence se mohou spojit buď interním ribozomálním vstupním místem (IRES) nebo zesilovačem translace nezávislém na uzávěru (CITE). Reportérový gen se může přepisovat společně s alespoň jednou nukleovou kyselinou kódující fúzní polypeptid mající aktivitu β(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu takovou, že se tvoří jednoduchý řetězec polypeptidu. Nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptidy podle předmětného vynálezu mohou být operativně připojeny k reportérovému genu pod kontrolou jednoho promotoru tak, že nukleová kyselina kódující fuzní polypeptid a reportérový gen jsou transkribovány do molekuly RNA, která je popřípadě svázána do dvou separátních molekul messenger RNA (mRNA); jedna z výsledných mRNA je translatována do reportérového proteinu, a druhá je translatována do fúzního polypeptidu.
Jestliže je exprimováno několik různých nukleových kyselin kódujících fuzní polypeptid mající aktivitu β(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu, mohou být sestaveny takovým
- 31 CZ 308720 B6 způsobem, že jsou transkribovány jako jedna nebo několik molekul mRNA. Jestliže jsou transkriboványjako jedna molekula mRNA, jejichjednotlivé kódující sekvence mohou být spojeny buď interním ribozomálním vstupním místem (IRES) nebo zesilovačem translace nezávislém na uzávěru/čepičce (CITE). Mohou být transkribovány z jednoho promotoru do molekuly RNA, která je popřípadě svázaná do několika oddělených molekul messenger RNA (mRNA), které jsou poté transkribovány do jejich příslušně kódovaných fuzních polypeptidů.
i. Expresní systémy
Způsoby, které jsou dobře známy odborníkovi v oboru, se mohou použít pro konstrukci expresních vektorů obsahujících kódující sekvenci proteinu podle zájmu a kódující sekvenci fuzního polypeptidu majícího aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahující Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu společně s vhodnými transkripčními/translačními řídicími signály. Tyto způsoby zahrnují rekombinantní techniky DNA in vitro, syntetické techniky a rekombinantní/genetické techniky in vivo. Viz například techniky popsané v Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989) a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y (1989).
Pro expresi kódující sekvence proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvence fuzního polypeptidu podle předmětného vynálezu, se mohou použít různé systémy hostitel-expresní vektor. Výhodně se jako systémy hostitelských buněk použijí savčí buňky transfekované rekombinantní plazmidovou DNA nebo kosmidové expresní vektory DNA obsahující kódující sekvenci proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvenci fuzního polypeptidu. Nej výhodněji se jako systém hostitelských buněk použijí buňky CHO, BHK, NS0, SP2/0, buňky myelomu YO, buňky myšího myelomu P3X63, buňky PER, PER.C6 nebo hybridomové buňky, kvasinky, hmyzí buňky nebo rostinné buňky. Některé příklady expresních systémů a selekčních metod jsou popsány v v následujících referencích, a v referencích uvedených v nich: Borth et al., Biotechnol. Bioen. 71 (4):266-73 (2000-2001), v Werner et al., Arzneimitteforschung/Drug Res.,. 48(8):870-80 (1998), v Andersen a Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), v Chadd a Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001), a v Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12:450-454 (2001). V alternativních provedeních se mohou uvažovat alternativní systémy eukaryotických hostitelských buněk, včetně kvasinek transformovaných kvasinkovými expresními vektory obsahujícími kódující sekvenci fuzního polypeptidu podle vynálezu; systémy hmyzích buněk infikované rekombinantními virovými expresními vektory (tj. baculovirem) obsahujícími kódující sekvenci proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvenci fuzního polypeptidu podle vynálezu; systémy rostlinných buněk infikované rekombinantními virovými expresními vektory (tj. virem mozaiky květáku, CaMV; virem tabákové mozaiky, TMV) nebo transformované rekombinantními plazmidovými expresními vektory (tj. plazmidem Ti) obsahujícími kódující sekvenci proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvenci fuzního polypeptidu podle vynálezu; nebo systémy savčích buněk infikované rekombinantními virovými expresními vektory (adenovirem, virem kravských neštovic) včetně buněčných linií sestrojených tak, aby obsahovaly více kopií DNA kódujících protein, který je předmětem zájmu, a kódujících sekvenci fuzního polypeptidu podle vynálezu buď stabilně amplifikovaných (CHO/dhfr), nebo nestabilně amplifikováných v dvojitých drobných chromozómech (tj. myší buněčné linie).
Pro způsoby podle tohoto vynálezu je obecně dává na přednost stabilní expresi před přechodnou expresí, protože ta typicky dosahuje reprodukovatelnějších výsledků a je přístupnější pro produkci ve velkém měřítku, tj. produkci protilátek podle předmětného vynálezu se sestrojenými glykosidy v buněčných liniích produkčního měřítka. Spíše než použití expresních vektorů, které obsahují replikace virového původu, se mohou hostitelské buňky transformovat odpovídající kódující nukleovou kyselinou řízenou vhodnými expresními řídicími prvky (tj. promotory, enhancery, sekvence, terminátory transkripce, polyadenylační místa atd.), a selektovatelné markéry. Po zavedení cizí DNA se sestrojené buňky nechají růst 1 až 2 dny v obohaceném médiu, a potom se přenesou do selektivního média. Selektovatelný marker v rekombinantním plazmidu udělí
-32CZ 308720 B6 odolnost k selekci a dovolí selekci buněk, které mají plazmid stabilně integrován do svých chromozómů a růst, aby vznikla ohniska, která se naopak mohou klonovat a rozšiřovat do buněčných linií.
Může se použít množství selekčních systémů, včetně, ale není tím omezeno, geny thymidinkinázy viru herpes simplex, (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferázy (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), a adenin-fosforibosyltransferázy (Lowy et al.,Cell 22:817 (1980)), které se mohou použít v buňkách tk, hgprt nebo aprt. Také se může použít genů rezistence k antimetabolitům jako základ pro selekci pro dhfr, který uděluje rezistenci k methotrexátu (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O'Hare et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527(1981)); pro gpt, který uděluje rezistenci ke kyselině mykofenolové (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); pro neo, který uděluje rezistenci k aminoglykosidu G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); a pro hygro, který uděluje rezistenci k hygromycinu (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). V současnosti byly popsány další selektovatelné geny, jmenovitě trpB, který dovoluje buňkám využít indol namísto tryptofanu; hisD, který dovoluje buňkám využít histinol místo histidinu (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); systém glutaminsyntázy; a ODC (omithindekarboxyláza) která uděluje rezistenci k inhibitoru omithindekarboxylázy, 2-(difluormethyl)-DL-omithinu, DFMO (McConlogue, in: Current Comunications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)).
ii. Identifikace transfektantů nebo transformantů, které exprimují protein mající modifikovaný model glykozylace
Hostitelská buňka, která obsahuje kódující sekvenci, a která exprimuje biologicky aktivní genové produkty, by se měla identifikovat alespoň čtyřmi obecnými přístupy: (a) hybridizací DNA - DNA nebo DNA - RNA; (b) přítomností nebo absencí „markerových“ genových funkcí; (c) zhodnocením úrovně transkripce, jak je změřena expresí příslušných transkriptů mRNA v hostitelské buňce; a (d) detekcí genového produktu, jak je změřeno imunoassayí nebo jeho biologickou aktivitou.
V prvním přístupu se může přítomnost kódující sekvence proteinu podle zájmu a kódující sekvence fúzního polypeptidu podle vynálezu vložená do expresního vektoru detekovat hybridizací DNA DNA nebo DNA - RNA s použitím sond obsahujících nukleotidové sekvence, které jsou homologní k příslušným kódujícím sekvencím, nebo jejich části nebo deriváty.
V druhém přístupu se může rekombinantní expresní vektor/hostitelský systém identifikovat a selektovat na základě přítomnosti nebo absence jistých „markerových“ genových funkcí (tj. aktivity thymidinkinázy, rezistence k antibiotikům, rezistence k methotrexátu, transformace fenotypu, okluzní tvorba těla baculoviru atd.). Například, jestliže kódující sekvence proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvence fúzního polypeptidu podle vynálezu se zavedou do sekvence markerového genu vektoru, rekombinanty obsahující příslušné kódující sekvence se mohou identifikovat absencí funkce markerového genu. Alternativně se může markerový gen umístit v tandemu s kódujícími sekvencemi pod kontrolu téhož nebo jiného promotoru, pro řízení exprese kódujících sekvencí. Exprese markéru v odpovědi na indukci nebo selekci indikuje expresi kódující sekvence fúzního polypeptidu.
Ve třetím přístupu se může transkripční aktivita pro kódující oblast proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvence fúzního polypeptidu podle vynálezu vyhodnotit hybridizačními stanoveními. Například se může izolovat RNA a analyzovat metodou northern blot s použitím sondy homologní ke kódujícím sekvencím proteinu, který je předmětem zájmu, a kódujícím sekvencím fúzního polypeptidu podle vynálezu, nebo jeho jednotlivým částem. Alternativně se mohou extrahovat a analyzovat celkové nukleové kyseliny hostitelské buňky na hybridizací k takovým sondám.
- 33CZ 308720 B6
Ve čtvrtém přístupu se imunologicky vyhodnocuje exprese proteinu, který je předmětem zájmu, a kódující sekvence fúzního polypeptidu majícího aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnTIII) a obsahujícího Golgiho lokalizační doménu heterologního Golgiho rezidentního polypeptidu, například analýzou western blot, imunoassayemi, jako je radioimunoprecipitace, imunoassayemi připojených enzymů a podobně. Rozhodující test úspěchu expresního systému však zahrnuje detekci biologicky aktivních genových produktů.
b. Generování a použití proteinů a proteinových fragmentů majících změněný glykozylační model
i. Generování a použití protilátek majících zvýšenou efektorovou funkci včetně celulámí cytotoxicity závislé na protilátce
Předmětný vynález poskytuje ve výhodných provedeních glykoformy protilátek a fragmenty protilátek majících zvýšenou vaznost receptoru Fc a/nebo efektorovou funkci včetně celulámí cytotoxicity závislé na protilátce.
Klinické zkoušky nekonjugováných monoklonálních protilátek (mAb) pro léčení některých typů rakoviny v současné době poskytly povzbudivé výsledky. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Chimémí nekonjugovaý IgGl byl schválen pro nízkostupňový nebo folikulární ne-Hodgkinsův lymfom Bbuněk. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997), zatímco jiná nekonjugovaná mAb, humanizovaný IgGl cílený na pevné nádory prsu, také ukázala slibné výsledky ve fázi III klinických zkoušek. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Antigeny těchto dvou mAb jsou vysoce exprimovány v jejich odpovídajících nádorových buňkách a protilátky zprostředkují mocnou destrukci tumoru efektorovými buňkami in vitro a in vivo. V protikladu k tomu mnoho jiných nekonjugovaných mAb s výbornými nádorovými specifitami nemohou spustit efektorové funkce dostatečné mohutnosti, aby byly klinicky užitečné. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). Pro některé z těchto slabších mAb se v současnosti testuje dodatečná cytokinová terapie. Přidání cytokinů může stimulovat celulámí cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC) zvýšením aktivity a počtu obíhajících lymfocytů. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfús et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). ADCC, lýzní atak na buňky cílené protilátkou, je spouštěn přes navázání leukocytových receptorů na konstantní oblast (Fc) protilátek. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997).
Odlišný, ale komplementární přístup ke zvýšení aktivity ADCC nekonjugovaných IgGl je sestrojení oblasti Fc protilátky. Studie sestrojování proteinů ukázaly, že FC/R interagují s oblastí spodního závěsu domény IgG CH2. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996). Avšak navázání FcyR také vyžaduje přítomnost oligosacharidů kovalentně připojených na zachovaný Asn 297 v oblasti CH2. . Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996); Wright a Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), navrhují, že buď oba, polysacharid a polypeptid, přímo přispívají k interakčnímu místu, nebo že je oligosacharid potřebný pro udržování aktivní konformace CH2. Modifikace oligosacharidové struktury může pak být vysvětlena jako prostředek zvýšení afinity interakce.
Molekula IgG nese dva oligosacharidy připojené přes N v oblasti Fc, jeden na každém těžkém řetězci. Jako každý glykoprotein je protilátka produkována jako populace glykoforem, které sdílejí tutéž polypeptidovou páteř, ale mají různé oligosacharidy připojené ke glykozylačním místům. Oligosacharidy, které se normálně nacházejí v oblasti Fc sérového IgG jsou komplexního dvouvláknového typu (Wormaid et al., Biochemistry 36:130-38 (1997)), s nízkou hladinou terminální kyseliny sialové a rozdělujícího N-acetylglukózaminu (GlcNAc), a s různým stupněm terminální galaktózylace a jádrové fukózylace. Některé studie navrhují, že minimální struktura karbohydrátu požadovaná pro navázání fcyR leží uvnitř oligosacharidového jádra. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996).
Buněčné linie odvozené od myší nebo křečků, používané v průmyslu a akademiích pro produkci nekonjugovaných mAb normálně připojují požadované oligosacharidové determinanty k místům
- 34CZ 308720 B6
Fc. IgG exprimované v těchto buněčných liniích však postrádají dělící GlcNAc, nalezený v malých množstvích v sérových IgG. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995).V kontrastu ktomu bylo v současné době pozorováno, že krysí humanizované IgGl produkované myelomem (CAMPATH-1H) nesl v některých svých glykoformách dělící GlcNAc. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). Krysí protilátky odvozené z buněk dosáhly maximální aktivitu podobnou ADCC in vitro jako protilátky CAMPATH-1H produkované ve standardních buněčných liniích, ale podstatně nižší koncentrace protilátek.
Antigen CAMPATH je normálně přítomen ve vysokých hladinách v lymfomových buňkách, a tato chimérická mAb má vysokou aktivitu ADCC v nepřítomnosti dělícího GlcNAc. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). Při glykozylační cestě připojením N je dělící GlcNAc přidán enzymem P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázou III (GnTIII). Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986).
Předešlé studie použily buněčné linie CHO produkující jednoduché protilátky, které byly předtím sestrojeny, aby exprimovaly externě regulovaným způsobem různé hladiny enzymu klonovaného genu GnTIII (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Tento přístup ustanovil poprvé rigorózní korelaci mezi expresí GnTIII a aktivitou ADCC modifikované protilátky.
Další protilátky podle vynálezu, mající zvýšenou vazebnou afinitu Fc a zvýšenou efektorovou funkci, zahrnují, ale nejsou tím omezeny, antihumánní neuroblastomovou monoklonální protilátku (chCE7) produkovanou způsoby podle vynálezu, chimémí antihumánní monoklonální protilátku karcinomu ledvinových buněk (ch-G250) produkovanou způsoby podle vynálezu, humanizovanou monoklonální protilátku anti-HER2 (tj. Trastuzumab (HERCEPTIN)) produkovanou způsoby podle vynálezu, chimémí antihumánní monoklonální protilátku karcinomu tlustého střeva, plic a prsu (ING-1) produkovanou způsoby podle vynálezu, humanizovanou antihumánní monoklonální protilátku antigenu 17-1A (3622W94) produkovanou způsoby podle vynálezu, humanizovanou antihumánní monoklonální protilátku kolorektálního tumoru (A3 3) produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní protimelanomovou protilátku (R24) namířenou proti gangliosidu GD3 produkovanou způsoby podle vynálezu, a chimémí antihumánní monoklonální protilátku karcinomu buněk dlaždicového epitelu (SF-25) produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku karcinomu malých buněk plic (BEC2, ImClone Systems, Merck KgaA) produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku ne-Hodgkinsova lymfomu (Bexxar (tositumomab, Coulter Pharmaceuticals), Oncolym (Techniclone, Alpha Therapeutic)), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku karcinomu squamous buněk hlavy a hrdla (C225, ImClone Systems) produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku karcinomu konečníku a tlustého střeva (Panorex (edrecolomab), Centocor, Glaxo Wellcome), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku karcinomu vaječníku (Theragyn, Antisoma), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku karcinomu akutní myelogenní leukémie (SmartM195, Protein Design Labs, Kanebo), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku maligního gliomu (Cotara, Techniclone, Cambridge Antibody Technology), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku ne-Hodgkinsova lymfomu B-buněk (IDEC-Y2B8, IDEC Pharmaceuticals), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku pevných tumorů (CEA-Cide, Immunomedics), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku kolorektálního karcinomu (Iodine 131-MN-14, Immunomedics), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku karcinomu vaječníku, ledvin, prsu a prostaty (MDX-210, Novartis) produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku kolorektálního a pankreasového karcinomu (TTMA, Pharmacie & Upjohn), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku karcinomu exprimujícího TAG-72 (MDX-447), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku anti-VEGF (Genentech), produkovanou způsoby podle vynálezu, antihumánní monoklonální protilátku karcinomu prsu, plic, prostaty a pankreatu a maligního melanomu (BrevaRex, AltaRex), produkovanou způsoby podle vynálezu,
- 35CZ 308720 B6 antihumánní monoklonální protilátku akutní myelogenní leukémie (Monoclonal Antibody Conjugate, Immunex), produkovanou způsoby podle vynálezu. Navíc je vynález směrován na fragment protilátky a fúzní proteiny obsahující oblast, která je ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu.
ii. Generování a použití fúzních proteinů obsahujících oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, které podporují cytotoxicitu zprostředkovanou Fc
Jak je diskutováno výše, předmětný vynález se vztahuje ke způsobu zvýšení vazebné afinity receptoru Fc a/nebo efektorové funkce terapeutických protilátek. Toho se dosahuje sestrojením glykozylačního modelu oblasti Fc takových protilátek, zejména sestrojením buněk produkujících protilátku, aby produkovaly polypeptidy s aktivitou GnTIII nebo GalT, nebo aktivitou Manil, které modifikují oligosacharidy připojené k oblasti Fc takových protilátek. Tato strategie se může aplikovat pro zvýšení celulámí cytotoxicity zprostředkované Fc proti nežádoucím buňkám zprostředkované jakoukoliv molekulou nesoucí oblast, která je ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu, nejen terapeutickými protilátkami, vzhledem ktomu, že změny zavedené sestrojením glykozylace působí pouze na oblast Fc a proto její interakce s receptory Fc na povrchu efektorových buněk jsou zahrnuty v mechanismu ADCC. Molekuly obsahující Fc, na které se mohou aplikovat současně uváděné metody se mohou aplikovat včetně, ale ne tímto omezeno, (a) na rozpustné fuzní proteiny vyrobené z cílící proteinové domény připojené k N-konci oblasti Fc (Chamov and Ashkenazi, Trends Biotech. 14:52 (1996) a (b) na fúzní proteiny zakotvené na plazmatické membráně vyrobené z transmembránové domény typu II, která lokalizuje na plazmatickou membránu, připojené na N-konec oblasti Fc (Stabila, P.F., Nature Biotech. 16:1357 (1998)).
V případě rozpustných fúzních proteinů (a) cílící doména směřuje navázání fúzního proteinu na nežádoucí buňky, jako jsou rakovinné buňky, tj. analogickým způsobem jako terapeutické protilátky. Aplikace nyní uvedeného způsobu na zvýšení efektorové funkce, včetně celulámí cytotoxicity zprostředkované Fc, zprostředkované těmito molekulami, by proto mohly být identické se způsobem aplikovaným na terapeutické protilátky.
V případě fúzních proteinů zakotvených na membránu (b) musí nežádoucí buňky exprimovat gen kódující fúzní protein. Toho se může dosáhnout buď přístupy genové terapie, tj. transfekováním buněk in vivo plazmidovým nebo virovým vektorem, který směruje expresi genu kódujícího fúzní protein na nežádoucí buňky, nebo implantací buněk geneticky sestrojených, aby exprimovaly fúzní protein na svém povrchu, do těla. Dmhé buňky se mohou normálně implantovat do těla uvnitř polymemí kapsle (buněčná terapie v kapslích), kde nemohou být zničeny mechanismem celulámí cytotoxicity zprostředkované Fc. Když uzavření v kapsli může selhat a uvolněné buňky se stanou nežádoucí, pak mohou být eliminovány celulámí cytotoxicitou zprostředkovanou Fc. (Stabila, P.F., Nature Biotech. 16:1357 (1998)). V tomto případě by se nyní uvedený způsob aplikoval buď zavedením další genové expresní kazety směrující adekvátní nebo maximální úrovně exprese fúzního polypeptidu podle vynálezu do vektoru genové terapie, nebo sestrojením buněk pro implantaci, aby exprimovaly adekvátní nebo maximální úroveň fúzního polypeptidu podle vynálezu.
Terapeutické aplikace protilátek, fragmentů protilátek a fúzních polypeptidů vyrobených podle způsobů vynálezu
Protilátky (tj. protilátky, fragmenty protilátek a fúzní proteiny obsahující oblast ekvivalentní oblasti Fc imunoglobulinu) podle předmětného vynálezu se mohou použít samostatně na zacílení a zabití nádorových buněk in vivo. Protilátky se také mohou použít ve spojení s vhodným terapeutickým činidlem pro léčení lidského karcinomu. Protilátky se mohou například použít v kombinaci se standardními nebo konvenčními léčebnými metodami, jako je chemoterapie, radiační terapie, nebo se mohou načasovat nebo spojit s léčivými drogami nebo toxiny, stejně jako s lymfokiny nebo faktory inhibice růstu tumoru pro podání terapeutického činidla do místa karcinomu.
- 36CZ 308720 B6
Techniky pro časování takových terapeutických činidel k protilátkám jsou dobře známy [viz Amon et al. /'Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (vyd.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, v Controlled Drug Delivery (2. vyd.), Robinson et al. (vyd.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, v Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (vyd.), str. 475-506 (1985); a Thorpe et al., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)].
Protilátka se sestrojenými glykosidy se může alternativně spojovat s ozářením paprsky o vysoké energii, tj. radioizotopem jako 131J, který, je-li lokalizován v místě nádoru, vede k zabití několika průměrů buněk [viz Order, Analysis, Results, and Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (vyd.), str. 303-16 (Academic Press 1985)]. Podle ještě jiného provedení se mohou protilátky podle vynálezu konjugovat s druhou protilátkou, aby se vytvořil heterokonjugát protilátky pro léčení nádorových buněk, jak je popsáno Segalem v patentu US 4676980.
Ještě jiné léčebné aplikace protilátek podle vynálezu zahrnují konjugaci nebo připojení rekombinantními technikami DNA k enzymu schopnému konverze proléčiva na cytotoxické léčivo a použití tohoto konjugátu protilátka - enzym v kombinaci s proléčivem pro konverzi proléčiva na cytotoxické činidlo na místě nádoru [viz Senter et al., Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-46 (1988); Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates, Cancer Research 49:5789-5792 (1989); a Senter, Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy, FASEB J. 4:188-193 (1990)].
Ještě jiné léčebné použití protilátek podle vynálezu zahrnuje použití, buď v přítomnosti komplementu nebo j ako část konj ugátu protilátka - léčivo nebo protilátka - toxin, aby se odstranily nádorové buňky z kostní dřeně pacientů s rakovinou. Podle tohoto přístupu se může autologní kostní dřeň očistit ex vivo léčením protilátkou a dřeň se vrátit infůzí do pacienta [viz Ramsay et al., Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies, J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)].
Chimémí protilátky, rekombinantní imunotoxiny a jiné rekombinantní konstrukty podle vynálezu obsahující specificitu oblasti vázající antigen požadované monoklonální protilátky se mohou dále použít terapeuticky. Například jednořetězcové imunotoxiny podle vynálezu se mohou použít pro léčení lidského karcinomu in vivo.
Podobně se fuzní protein obsahující alespoň jednu oblast vázající antigen protilátky podle vynálezu připojený alespoň k jedné funkčně aktivní části druhého proteinu majícího protinádorovou aktivitu, tj. lymfokinu nebo onkostatinu, může použít pro léčení lidského karcinomu in vivo. Rekombinantní techniky známé ve stavu techniky se dále mohou použít pro konstrukci bispecifických protilátek, kde jedna z vazebných specifik protilátky je směrována k antigenu specifickému pro nádor, zatímco druhá z vazebných specifik protilátky je ta, která pochází od molekuly jiné než antigenu specifického pro nádor.
Předmětný vynález poskytuje způsob pro selektivní zabíjení nádorových buněk exprimujících antigen, který se specificky váže k monoklonální protilátce podle předmětného vynálezu, nebo jejímu funkčnímu ekvivalentu. Tento způsob obsahuje zreagování protilátek se sestrojenými glykosidy podle předmětného vynálezu nebo imunokonjugátů (tj. imunotoxinů) obsahující tyto protilátky s nádorovými buňkami. Tyto nádorové buňky mohou být z lidského karcinomu.
- 37CZ 308720 B6
Navíc tento vynález poskytuje způsob pro léčení karcinomů (například lidských karcinomů) in vivo. Tento způsob obsahuje podání subjektu farmaceuticky účinného množství kompozice obsahující alespoň jednu z protilátek se sestrojenými glykosidy podle vynálezu nebo imunokonjugátů (tj. imunotoxinů) obsahujících protilátku.
V dalším aspektu je vynález směřován ke zlepšenému způsobu léčení autoimunitních chorob, produkovaných zcela nebo zčásti patogenními protilátkami, založenými na spotřebování B-buněk, zahrnující podání terapeuticky účinného množství protilátky mající zvýšenou ADCC, připravené v souhlasu se způsoby podle vynálezu. Ve výhodném provedení je protilátka protilátkou proti antiCD20. Příklady autoimunitních onemocnění nebo stavů zahrnují, ale nejsou tím omezeny, thrombocytopenic zprostředkované imunitou, jako akutní idiopathická trombocytopenická purpura a chronická idiopatická trombocytopenická purpura, dermatomyositóza, tanec sv. Víta, lupus nefritis, revmatická horečka, polyglandulamí syndromy, Henoch-Schonleinova purpura, poststreptokokální nefritida, bércové vředy, Takayasova arteritida, Addisonova choroba, multiformní erytém, polyarteritis nodosa, ankylosující spondylitis, Goodpasturův syndrom, tromboangitis ubiterans, primární žlučová cirhóza, Hashimotova tyroiditida, tyrotoxikóza, chronická aktivní hepatitida, polymyositóza/dermatomyositóza, polychondritida, pamphigus vulgaris, Wegenerova granulomatóza, membránová nefropatie, amyotrofická laterální skleróza, tabes dorsalis, polymyaglie, zhoubná anémie, rychlá progresivní glomerulonefritida a fibrózní alveolitida, zánětlivé odpovědi, jako zánětlivá kožní onemocnění včetně psoriázy a dermatitidy (tj. atopické dermatitidy); systémová skleroderma a skleróza; odpovědi spojené se zánětlivými onemocněními střev (jako Crohnova choroba a vředová kolitida); syndrom respirační úzkosti (včetně syndromu respirační úzkosti dospělých; ARDS); dermatitida; meningitida; encefalitida; uveitida; kolitida; glomerulonefritida; alergické stavy jako ekzém a astma a jiné stavy zahrnující infiltraci T-buněk a chronické zánětlivé odpovědi; ateroskleróza; nedostatečnost adheze leukocytů; revmatická artritida; systémová lupus erythematosus (SLE); diabetes mellitus (tj. diabetes mellitus 1. typu nebo diabetes mellitus závislá na inzulínu); rozptroušená skleróza; Reynaudův syndrom; autoimunitní thyroiditida; alergická encefalomyelitida; Sjorgenův syndrom; juvenilní počáteční diabetes; a imunitní odpovědi spojené s akutní a zpožděnou hypersenzitivitou zprostředkovanou cytokiny a T-lymfocyty které se typicky nacházejí při tuberkulóze, sarkoióza, polymyositida, granulomatóza a vaskulitida; zhoubná anémie (Addisonova choroba); choroby včetně diapedézy leukocytů; zánětlivé onemocnění centrálního nervového systému (CNS); syndrom poranění více orgánů; hemolytická anémie (včetně, ale ne omezeno na kryoglobinémii nebo Coombsovu pozitivní anémii); myasthenia gravis; choroby zprostředkované komplexem antigen-protilátka; antiglomerulámí choroba bazální membrány; antifosfolipidový syndrom; alergická neuritida; Grave sova choroba; Lambert-Eatonův myastenický syndrom; puchýře; autoimmunitní polyendokrinopatie; Reiterova choroba; syndrom ztuhlosti; Behcetova choroba; arteritida obrovských buněk; immunitní komplexní nefritida; IgA nefropatie; IgM polyneuropatie; imunitní thrombocytopenická purpura (ITP) nebo autoimunní trombocytopenie atd. V tomto aspektu vynálezu se používají protilátky podle vynálezu pro vyčerpání normálních B-buněk krve po delší dobu.
V souhlasu s praxí tohoto vynálezu může být subjektem člověk, kůň, prase, skot, hlodavec, kočka a pták. Jiná teplokrevná zvířata jsou rovněž zahrnuta v tomto vynálezu.
Předmětný vynález také poskytuje způsob léčení subjektu trpícího rakovinou. Subjekt může být člověk, pes, kočka, myš, krysa, králík, kůň, koza, ovce, kráva, kuře. Rakovina se může identifikovat jako rakovina prsu, močového měchýře, retinoblastom, papilámí cystadeokarcinom vaječníku, Wilmův nádor nebo karcinom malých buněk plic a je obecně charakterizován jako skupina buněk majících antigeny spojené s nádorem na buněčném povrchu. Tato metoda obsahuje podání množství protilátky zabíjející rakovinu subjektu, kde protilátka cílená proti nádoru je spojená s cytotoxickým činidlem. Obecně spojení protilátky cílené na nádor s cytotoxickým činidlem je učiněno za podmínek, které dovolují protilátce takto připojené vázat se na svůj cíl na povrchu buňky. Navázáním na cíl protilátka zacílená na nádor působí přímo nebo nepřímo a zapříčiňuje nebo přispívá k zabíjení buněk takto navázaných, čímž léčí subjekt.
- 38CZ 308720 B6
Také je poskytnuta metoda inhibice proliferace savčích nádorových buněk, která zahrnuje kontaktování savčích nádorových buněk s dostatečnou koncentrací protilátek se sestrojenými glykosidy podle vynálezu nebo imunokonjugátů obsahujících protilátku tak, aby byla inhibována proliferace savčích nádorových buněk.
Předmětný vynález dále poskytuje způsoby inhibice růstu lidských nádorových buněk, léčící nádor v subjektu, a léčící onemocnění proliferativního typu v subjektu. Tyto metody zahrnují podání subjektu efektivního množství kompozice podle vynálezu.
Je zřejmé, že předmětný vynález obsahuje farmaceutické kompozice, kombinace a způsoby léčení lidských karcinomů. Vynález například zahrnuje farmaceutické kompozice pro použití při léčení lidských karcinomů, obsahující farmaceuticky účinné množství protilátky podle předmětného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.
Kompozice mohou obsahovat protilátku nebo fragmenty protilátky, buď nemodifikované, nebo konjugované k terapeutickému činidlu (tj. léčivu, toxinu, enzymu nebo jiné protilátce), nebo v rekombinantní formě (tj. chimémí protilátky, fragmenty chimémích protilátek, bispecifické protilátky). Kompozice mohou navíc obsahovat jiné protilátky nebo konjugáty pro léčení karcinomů (tj. koktejl protilátek).
Kompozice protilátky, konjugátu protilátky a imunotoxinu podle vynálezu se mohou podávat s použitím konvenčních způsobů podávání, zahrnujících, ale nejsou tím omezeny, intravenózního, intraperitonálního a intralymfatického podávání a podávání přímo do nádoru. Přednost se dává intravenóznímu podávání.
Kompozice podle vynálezu mohou být v různých formách, které zahrnují, ale nejsou tím omezeny, kapalné roztoky nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, čípky, polymemí mikrokapsle nebo mikroměchýřky, lipozómy a roztoky pro injekce nebo infuze. Upřednostňovaná forma závisí na způsobu podávání a terapeutické aplikaci.
Kompozice podle vynálezu také výhodně zahrnuje konvenční farmaceuticky akceptovatelné nosiče a adjuvans známé ve stavu techniky, jako lidský sérový albumin, iontoměniče, oxid hlinitý, lecitin, pufrovací látky jako fosfáty, glycin, kyselina sorbová, sorban draselný, a soli a elektrolyty jako protaminsulfát.
Nej efektivnější způsob podávání a režim dávkování pro kompozice podle tohoto vynálezu závisí na vážnosti a průběhu choroby, zdraví pacienta a odpovědi na léčení a na úsudku ošetřujícího lékaře. Podle toho se mohou dávky kompozice titrovat individuálnímu subjektu.
Vzájemné vztahy dávek pro zvířata různé velikosti a druhu a lidmi, založené na mg/kg nebo ploše povrchu, je popsaná ve Freireich, E. J., etal. Cancer Chemother., Rep. 50 (4): 219-244 (1966). Má se udělat stanovení dávkovacího režimu, aby se optimalizovala odpověď inhibice růstu nádorových buněk a zabíjení buněk, tj. dávky se mají dělit a podávat na denním základě, nebo se snižovat proporcionálně v závislosti na situaci (tj. několik dělených dávek se má podávat denně, nebo proporcionálně snížené v závislosti na specifické terapeutické situaci).
Mělo by být jasné, že dávka kompozice podle vynálezu vyžadovaná k dosažení léčení může být dále snižována podle plánu optimalizace.
V souladu s praxí podle vynálezu může být farmaceutický nosič lipidový nosič. Lipidový nosič může být fosfolipid. Lipidový nosič může dále být mastná kyselina. Lipidový nosič také může být detergent. Jak je použito zde, detergent je jakákoliv látka, která mění povrchové napětí kapaliny, a obecně ho snižuje.
- 39CZ 308720 B6
V jednom příkladu podle vynálezu detergent může být neionogenní detergent. Příklady neionogenních detergentů zahrnují, ale nejsou tím omezeny, polysorbát 80 (také známý jako Tween 80 nebo (polyoxyethylensorbitan monooleát), Brij, a Triton (například Triton WR-1339 a Triton A-20).
Detergent může být alternativně ionogenní detergent. Příklad ionogenního detergentů zahrnuje, ale není tím omezen, alkyltrimethylamoniumbromid.
Navíc, v souhlasu s vynálezem, lipidový nosič může být lipozóm. Jak je použito v této přihlášce, „lipozóm“ je jakýkoliv měchýřek ohraničený membránou, který obsahuje jakékoliv molekuly podle vynálezu nebo jejich kombinace.
Příklad níže vysvětluje vynález detailněji. Následující přípravky a příklady jsou dány, aby umožnily odborníkovi v oboru jasněji porozumět a praktikovat předmětný vynález. Avšak předmětný vynález není omezen v rozsahu provedeními v příkladech, které jsou považovány pouze za ilustrace jednotlivých aspektů vynálezu, a způsoby, které jsou funkčně ekvivalentní, jsou uvnitř rozsahu vynálezu. Různé modifikace vynálezu navíc ktěm, které jsou popsány zde, budou rozhodně zřejmé odborníkovi v oboru z předchozího popisu a doprovodných obrázků.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Materiály a metody
1. Konstrukce expresních vektorů protilátky.
Expresní vektor pETR1502 protilátky anti-CD20
Expresní vektor pETR1502 protilátky C2B8 anti-CD20 se skládá ze čtyř nezávislých oddělených expresních kazet (jedna pro lehký řetězec protilátky C2B8, druhá pro těžký řetězec protilátky C2B8, jedna pro gen rezistence kneomycinu a pro myší gen dhfr). Všechny geny jsou pod kontrolou promotoru myeloproliferativního viru sarkomu (MPSV) a obsahují syntetický souhlasný polyadenylační signál, odvozený z polyadenylačního signálu králičího genu β-globinu.
CDNA kódující řetězce proměnného těžkého (VH) a proměnného lehkého (VL) řetězce protilátky C2B8 anti-CD20 jsou sestavené ze sady překrývajících se jednořetězcových oligonukleotidů v jednostupňovém procesu používajícím PCR (Kobayashi, N., et al., Biotechniques 23:500-503 (1997)). Původní sekvence kódující oblasti C2B8 VL a VH byly získány z publikované mezinárodní patentové přihlášky (Mezinárodní publikační číslo WO94/11026). Sestavené fragmenty cDNA VL a VH byly subklonovány do intopBluescriptlIKS (+) za vzniku plazmidů pBlue-C2B8VH a pBlue-C2B8VL a sekvenovány.
Proměnné řetězce C2B8 byly amplifikovány z odpovídajících plazmidů pBlue-C2B8VH a pBlueC2B8VLs použitím primerů, které zavádějí restrikční místo AscI na 5‘-konci a vhodná restrikční místa na křížení variabilní a konstantní oblasti (BsiWI pro lehký řetězec a Nhel pro těžký řetězec). Konstantní oblasti IgGI se amplifikovaly z knihovny cDNA lidského leukocytu (Quickclone, Clontech) s použitím primerů, které zaváděj í vhodná restrikční místa na 5 ‘ -konci a 3 ‘ -konci (BsiWI a BamHI pro konstantní lehký řetězec a Nhel a BamHI pro konstantní těžký řetězec).
Po potvrzení správných sekvencí DNA byl každý z lehkých a těžkých řetězců protilátky C2B8 kombinovány s promotorem MPSV a polyadenylačními signály. V prvním stupni byly konstruovány dva různé expresní vektory: jeden pro lehký řetězec C2B8 (pETR1315) a druhý pro těžký řetězec C2B8 (pETR1316). V druhém stupni se zavedla expresní kazeta rezistence k
-40CZ 308720 B6 neomycinu (gen rezistence k neomycinu, odvozený od transpozonu Tn5 a dán pod kontrolu minimálního promotoru MPSV) do vektoru pETR1315 za vzniku plazmidu pEIR1481. Expresní kazeta genu dhfr pod kontrolou promotoru MPSV se zavedla do vektoru pETR1316 za vzniku plazmidu pETR1328. Ve finálním kroku se oba expresní moduly (lehký řetězec C2B8 + neo a těžký řetězec C2B8 + dhfr) zkombinovaly do jednoho vektoru za vzniku plazmidu pETR1502.
Expresní vektor anti-cd20 pETR1520 pETR1520 kombinuje expresní vektor protilátky C2B8 anti-cd20 s původem replikace z viru Epstein-Barrové (oriP) pro replikaci epizomálního vektoru a zachování v buňkách produkujících nukleární antigen Epstein-Barrové (EBNA). Pro konstrukci expresního vektoru C2B8, pETR1520, se zavedl expresní modul C2B8 zpETR1416 jako fragment hinDIII do vektoru pETR1502 obsahujícího ori-P. Vektor pETR1406 je podobný pETR1502 s výjimkou toho, že v tomto plazmidu je gen rezistence proti neomycinu pod kontrolou plného namísto minimálního promotoru MPSV.
Anti-fibronektinový expresní vektor pETR1546
Tento vektor je stejný jako vektor pETR1520 kromě toho, že oblasti kódující proměnný lehký a těžký řetězec C2B8 protilátky anti-CD20 byly nahrazeny odpovídajícími kódujícími oblastmi protilátky L19, lidské protilátky rozeznávající doménu ED-B fibronektinu. Fragmenty kódující proměnnou oblast DNA se syntetizovaly metodou překrývajícího rozšíření PCR s použitím syntetických oligonukleotidů založených na sekvenci proměnné oblasti protilátky L19 (Pini, A. et al. J. Biol. Chem. 273 (34): 21769-76 (1998)).
Expresní vektor pURSI28 protilátky anti-EGFR (C225)
Tento vektor je stejný jako vektor pETR1520 kromě toho, že oblasti kódující proměnný lehký a těžký řetězec C2B8 protilátky anti-CD20 byly nahrazeny odpovídajícími kódujícími oblastmi protilátky C225, chimémí protilátky rozeznávající receptor lidského epidermálního růstového faktoru. Fragmenty kódující proměnnou oblast DNA se syntetizovaly metodou překrývajícího rozšíření PCR s použitím syntetických oligonukleotidů založených na sekvenci proměnné oblasti protilátky C225 (sekvence se mohou najít v publikované patentové přihlášce s mezinárodním publikačním číslem WO96/40210, obr. 16 a 17 patentové přihlášky, jednotlivě pro lehký a těžký řetězec).
2. Konstrukce GnTIII-fuzních expresních vektorů pETRl 166. Vektor pro konstitutivní expresi GnTIII
Pro konstrukci GnTIII expresního vektoru pETR1166 se amplifikovala krysí GnTIII z knihovny cDNA krysích ledvin (Clontech) pomocí PCR. C-terminál přívěsku epitopu c-myc se přidal bezprostředně po směru stop kodónu genu (aminokyselinová sekvence: PEQKLISEEDL pro pozdější vhodnou detekci GnTIII pomocí western blotu. Po potvrzení správné sekvence GnTIII se gen zavedl pod kontrolu promotoru MPSV a přidal se signál syntetické králičí β-globinové polyadenylace. Finální expresní vektor GnTIII také obsahuje oddělenou kazetu rezistence k puromycinu pro selekci s genem rezistence k puromycinu také pod kontrolou promotoru MPSV a signálu syntetické králičí β-globinové polyadenylace.
pETR1425: Náhrada prvních 76 aminokyselin GnTIII prvními 102 aminokyselinami lidské GnTI
Konstrukce tohoto hybridního genu glykozyltransferázy se provedla následnými překryvnými reakcemi PCR. V jedné reakci se amplifikuje kmenová oblast lidské GnTI za použití primerů GAB179 a GAB-180. Během této reakce PCR se také zavede Kozakova konsensuální sekvence a restrikční místo AscI na 5‘-konci. Výsledný fragment PCR má překryv 23 pb s GNTIII s počátkem
-41 CZ 308720 B6 na pozici 229. Ve druhé reakci PCR se amplifikuje oblast GnTIII od pozice 229 do 380 s primery GAB-177 a GAB-188, generující fragment PCR s jedinečným místem BstXI na 3‘-konci a překryvem 22 pb s kmenovou oblastí GnTI na 5‘-konci. Oba fragmenty PCR se vyčistí a použijí jako templáty ve třetí reakci PCR (primery GAB-179 a GAB-178). Výsledný fragment se vyčistí a štěpí se Asci a liguje se k vektoru pETRlOOl (stříhanému Asci a Smál), což vede kplazmidu pETR1404. Poté, co se sekvence inzertu potvrdí, přidá se prvek MPSV k pETR1404 jako fragment AscI (parciální štěpení)/PmeI a získá se plazmid pETR1423. Fragment SphI/BstXI z pETR1166, expresní vektor nesoucí původní gen GnTIII, se poté nahradí odpovídajícím fragmentem pETR1423, což vede k plazmidu pETR1425 obsahujícímu fůzi GnTI-GnTIII pod kontrolou promotoru MPSV a kazetou rezistence k puromycinu pro selekci.
Sekvence primerů:
GAB-177: GCGTGTGCCTGTGACCCCCGCGCCCCTGCTCCAGCCACTGTCCCC
GAB-178: GAAGGTTTCTCCAGCATCCTGGTACC
GAB-179: CTGAGGCGCGCCGCCACCATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGC
GAB-180: GGGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGCGCGGGGGTCACAGGCACACGCGGC pETR1506: Náhrada 76 N-terminálních aminokyselin GnTIII prvními 100 aminokyselinami lidské manózidázy II.
Konstrukce pETR1506 se provádí analogicky s konstrukcí pETR1425. Kmenová oblast genu lidské manózidázy II se amplifikuje primery GAB-252 a GAB-253 s použitím vektoru pBlue-man jako templátů. Během této PCR se zavede místo Fsel a Kozakova konsenzuální sekvence na 5‘konec. Výsledný fragment PCR překrývá gen GnTIII 23 pb s počátkem na pozici 229. V druhé reakci PCR se amplifikuje část genu GnTIII (pozice 229-460) primery GAB-254 a GAB-255. Tato reakce PCR generovaná fragmentem obsahujícím 43 pb se překrývá s genem manózidázy II na 5 konci a s jedinečným místem Stul na 3‘-konci. Oba fragmenty se vyčistí a použijí jako templáty ve třetí PCRs primery GAB-252 a GAB-255. Výsledný fragment se zavede do pIC19H, což dá vektor pETR1484. Poté, co se potvrdila správná sekvence, zkonstruoval se kompletní fuzní gen ligací fragmentu Fsel/Stul pETR1484 s fragmentem StuI/BamHI zpETR1166 ve vektoru pETR12177 (Fsel/BamHI). Výsledný plazmid (pETR1500) obsahuje hybridní gen GnTI-GnTIII (SEQ ID NO: 14) pod kontrolou promotoru MPSV. Pro selekci plazmidu v savčích buňkách se zavedla kazeta rezistence k puromycinu jako fragment Spěl z pETRl 166, za vzniku plazmidu pETR1506.
Sekvence primerů:
GAB-252: GCTAGGCCGGCCGCCACCATGAAGTTAAGCCGCCAGTTCACCGTGTTCGG GAB-25 3: GGGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGTGAGCCAGCACCTTGGCTGAAATTGCT TTGTGAACTTTTCGG
GAB254: TCCGAAAAGTTCACAAAGCAATTTCAGCCAAGGTGCTGGCTCACCCCTGCT C CAGCCACTGTCCCC
GAB-255: ATGCCGCARAGGCCTCCGAGCAGGCCCC pETR1519: Kombinace hybridního fúzního genu ManlI-GnTIII s replikačním původcem oriP z viru Epstein-Barrové.
S použitím primerů Gab-261 a GAB-262 se amplifíkoval 2 kb fragment obsahující oriP z plazmidu pCEP4 (Invitrogen). Během této reakce PCR se zavedly na obou koncích místa s fragmenty SspI a EcoRI. Pro sekvencování se zavedl fragment oriP do vektoru pIC19H. Poté, co se potvrdila správná sekvence, se orip zavedl jako fragment SspI do vektoru pETRlOOl (štěpený BsmBI a překrývající se 5‘-konce vyplněné s použitím Klenowovy polymerázy). Výsledný plazmid byl označen pETR1507. Expresní kazeta SphI/Nrul ManlI-GmtIII zpETR1520 se zavedla do pETR1507, štěpeného těmiž restrikčními endonukleázami, které poskytly plazmid pETR1519.
-42CZ 308720 B6
Sekvence primerů:
GAB-261: GCTAAATATTGAAATTCCCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGC
GAB-262: TAGCAATATTGAATTCGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGC pETR1537: Kombinace hybridního fúzního genu Manil-GnTIII a zkráceného markerového genu povrchu buňky CD4
Expresní vektor pETR1506 se modifikoval pro další expresi zkráceným markerovým genem povrchu buňky CD4. Stručně, hybridní fúzní genová expresní kazeta ManlI-GnTIII byla konvertována z monocistronové na bicistronovou expresní kazetu zavedením proti směru od stop kodónu fúze ManlI-GnTIII, prvek polioviru IRES, následovaný cDNA kódující zkrácený lidský protein CD4 (obsahující lidskou leader sekvenci CD4 pro sekreci následovanou transmembránovou a extracelulámí doménou).
3. Transfekce savčích buněk fúzním GnTIII a protilátkovým expresním vektorem
Transfekce buněk BHK
Exponenciálně rostoucí buňky (živost 90 až 95 %) byly naočkovány ve vhodném počtu baněk T75 při koncentraci 0,9 x 106 buněk/ml 24 hod. před elektroporací. Jako kultivační médium bylo použito Invitrus (Cell Culture Technologies, Švýcarsko), doplněné 10 % fetálního telecího séra (FCS). Buňky byly před elektroporací spočteny. 8 x 106 buněk bylo sklizeno centrifúgací (5 min., 200 x g) a supernatant byl odhozen. Buňky se resuspendovaly v v 800 μΐ média Invitrus a přenesly se do sterilní elektroporační kyvety (0,4 cm gap), již obsahující 8 pg cirkulámí plazmidové DNA a inkubovaly se 5 min. při teplotě místnosti. Buňky se elektroporovaly za použití Gene Pulser II (BoiRad) za následujících podmínek. 400V, 960 pF dvěmapulzy v 30 s intervalu. Po elektroporací se buňky ihned převedly do baněk T75, obsahujících 5 ml růstového média (Invitrus / 20 % hmota. FCS/ 1, 25 % hmota. DMSO) a inkubovaly se při 37 °C v inkubátoru s atmosférou 5 % CO2. Pro produkci nemodifikovaných protilátek (s nesestrojenými glykosidy) se buňky transfekovaly pouze expresními vektory protilátek. Pro produkci protilátek se sestrojenými glykosidy se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátek a druhým plazmidem exprese polypeptidu GnTIII (SEQ ID NO: 15) v poměru 3:1.
Transfekce buněk HEK293-EBNA
Exponenciálně rostoucí buňky HEK293-EBNA se transfekovaly kalciumfosfátovou metodou. Buňky se nechaly růst jako přilnuté jednovrstvé kultury v t-baňkách s použitím kultivačního média DMEM, doplněného 10 % FCS, a transfekovaly se, když byly na 50 až 80 % slité. Pro transfekci baňky T75 bylo naočkováno 8 miliónů buněk 24 hodin před transfekci v kultivačním médiu DMEM doplněném FCS (finálně 10 % hmota.), 250 pg/ml neomycinu a buňky byly umístěny při 37 °C v inkubátoru s 5 % CO2 přes noc. Pro každou baňku T75, která se měla transfekovat, se připravil roztok DNA, CaCh a vody smícháním 47 pg celkové plazmidové DNA, 235 pl 1M roztoku CaC12 a přidáním vody do celkového objemu 469 pl. K tomuto roztoku se přidalo 469 pl roztoku 50pM HEPES, 280mM NaCl, l,5mM Na2HPO4 při pH 7,05, ihned se míchalo 10 s a nechalo stát při teplotě místnosti 20 s. Suspenze se zředila 12 ml DMEM doplněným 2 % FCS, a přidala do T75 místo existujícího média. Buňky se inkubovaly při 37 °C, 5 % CO2 po asi 17 až 20 hodin, poté se médium nahradilo 12 ml DMEM, 10 % FCS. Pro produkci nemodifikovaných protilátek (s nesestrojenými glykosidy) se buňky transfekovaly pouze expresními vektory protilátek. Pro produkci protilátek se sestrojenými glykosidy se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátek a druhým plazmidem exprese polypeptidu GnTIII (SEQ ID NO: 15) v poměru 4:1. Pátý den po transfekci se supernatant sebral, centrifugoval 5 minut při 1200 ot/min, a poté se centrifugoval podruhé po 10 min při 4000 ot/min a skladoval při 4 °C.
Generování stabilní buněčné linie exprimující rekombinantní protilátku anti-CD20
-43CZ 308720 B6
Buňky BHK (BHK21-13c) se transfekovaly elektroporací s vektorem pETR1502 exprimujicim protilátku C2B8, který obsahuje expresní kazetu rezistence k neomycinu. Nejprve byly vybrány klony rezistentní k neomycinu, aby se získala sada klonů, které měly chromozomálně integrovaný DNA vektor pETR15 02. Klony se poté zkoumaly na produkci rekombinantní protilátky s použitím metody ELISA. Stručně, 24 hodin po elektroporací se spočítaly životaschopné buňky a účinnost transfekce se určila spočítáním fluoreskujících buněk paralelní kontrolní elektroporace s expresním vektorem pEYFP. Buňky se zředily v selekčním médiu Invitrus, obsahujícím 10 % FCS a 1 mg/ml neomycinu. Obvykle se naočkovalo osm 96jamkových destiček různými koncentracemi životaschopných transfekovaných buněk (lxl03,5xl02alxl02 buněk na jamku) a inkubovaly se při 37 °C, až se mohly identifikovat klony. Jakmile klony dorostly téměř do slévání, supematanty se analyzovaly metodou ELISA na produkci protilátek. Klony pozitivní na ELISA se expandovaly nejprve do 24jamkových a poté do ójamkových destiček a poté do baněk T25. Po pěti dnech růstu v baňkách T25 se finální titr protilátky určil pomocí metody ELISA. Za použití této elektroporační a selekční metody se izoloval buněčný klon BHK exprimující protilátku anti-CD20 C2B8, který produkoval 13 pg/ml protilátky za výše uvedených kultivačních podmínek.
Generování stabilní savčí buněčné linie exprimující rekombinantní protilátku anti-CD20 a fuzní GnTIII
Klon BHK-1502-28, konstitutivně exprimující geny monoklonální protilátky anti-CD20 a geny rezistence k neomycinu se transfekoval elektroporací expresním vektorem pETR1537. pETR1537 je vektor pro konstitutivní expresi genu Manil-GnTIII a zkrácené formy lidského CD4, který je exprimován v závislosti na IRES. Nejprve se selektovaly klony rezistentní na puromycin, aby se získala sada klonů, které chromozomálně integrovaly DNA vektor pETR1537. Klony se poté screenovaly na povrchovou expresi zkráceného CD4 (tCD4), který slouží jako marker pro úroveň exprese expresní jednotky bicistronického genu Manil-GnTIII+tCD4. Produkce rekombinantní protilátky selektovaných klonů se ověřila s použitím metody ELISA.
Stručně, vektor pETR1537 se linearizoval pomocí XmnI. Paralelně se provedla kontrolní transfekce expresním vektorem EYFP. Po 24 hodinách se určila účinnost transfekce spočítáním buněk exprimujících EYFP proti všem buňkám. Životaschopnost buněk byla 91 %. Jeden den po transfekci se buňky transfekované pETR1537 nebo pEYFP sériově zředily v poměru 1:100, 1:500, 1:1000 a 1:5000 a naočkovaly do 96jamkových destiček ve finálním objemu 0,2 ml selekčního média (Invitrus, 10 % FCS, 20 pg/ml puromycinu, 1 mg/ml neomycinu). Klony byly viditelné po dvou týdnech. Expandovaly se a screenovaly na expresi zkráceného CD4 (tCD4).
Pro screening expresní úrovně tCD4 se přibližně 500 000 buněk promylo pufrem FACS a inkubovalo se s 5 μΐ antihumánního CD4 FICS (Becton Dickinson, Švýcarsko) po 20 minut na ledu. Po dvou promytích se buňky re suspendovaly v 0,5 ml pufiru FACS a analyzovaly se FACS (obr. 17A-B). Izoloval se klon s dobrou expresí tCD4 (BHK-1502-28-11). Po 5 dnech růstu v baňce T75 produkoval protilátku anti-CD20 při finálním titru asi 17 pg/ml, jak se určilo pomocí ELISA.
4. Produkce a purifikace nemodifikovaných protilátek a se sestrojenými glykosidy
Sbírání kultivačního média
V případě buněk BHK transfekovaných expresním vektorem protilátky nebo kotransfekovaných expresním vektorem protilátky a fuzním expresním vektorem GnTIII se kultivační supernatant sbíral po kultivaci transfekovaných buněk 96 hod. po transfekci. V závislosti na očekávané produktivitě bylo pro tentýž vektor děláno několik (10 až 15) elektroporací.
V případě buněk HEK93-EBNA, transfekovaných expresním vektorem protilátky nebo kotransfekovaných expresním vektorem plus fuzním expresním vektorem se kultivační médium
-44CZ 308720 B6 nahradilo čerstvým kultivačním médiem přibližně 16 hod. po transfekci a druhé médium se poté sbíralo po kultivaci transfekovaných buněk po dalších 120 hod.
Pro stabilní buněčnou linii BHK-1502-28-11 byla kultura naočkována 500 000 buňkami/ml a supernatant se sbíral po 4 dnech kultivace, kdy hustota buněk byla 1,7 x 106 životaschopných buněk/ml a životaschopnost buněk 69 %.
Purifikace protilátky
Monoklonální protilátka se purifikovala z kultivačního supematantu s použitím dvou následných chromatografických kroků. První krok se skládal z chromatografie Protein A s použitím pHgradientové eluce, která efektivně separuje hovězí a lidské IgG. Poté následoval chromatografický krok na kationtovém iontoměniči, aby se vyměnil pufir vzorku za solný fosfátový pufr (PBS).
5. Analýza oligosacharidů
Oligosacharidy se enzymaticky uvolnily z protilátek odštěpením PNGázou F, s protilátkami buď imobilizovánými na membráně PVDF nebo v roztoku.
Výsledný roztok po štěpení, obsahující uvolněné oligosacharidy, se buď připravil přímo pro ananlýzu MALDI/TOF-MS, nebo se dále rozštěpil glykosidázou Endo H před přípravou vzorku pro analýzu MALDI/TOF-MS.
Způsob uvolnění oligosacharidů pro protilátky imobilizované na membráně PVDF
Jamky 96jamkové destičky, připravené s membránou PVDF (Imobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts, USA) se zvlhčily 100 μΐ methanolu a kapalina se protáhla přes membránu PVDF s použitím vakua aplikovaného na vakuové zařízení Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts, USA). Membrány PVDF se promyly třikrát 300 μΐ vody. Jamky se poté promyly 50 μΐ pufiru RCM (8M močovina, 360mM Tris, 3,2mM EDTA, pH 8,6). Mezi 30 až 40 pg protilátky se vložilo do jamky obsahující 10 μΐ pufiru RCM. Kapalina v jamce se protáhla přes membránu použitím vakua, a membrána se následně promyla dvakrát 50 μΐ pufiru RCM. Redukce disulfidických můstků se provedla přidáním 50 μΐ dithiothreitolu v RCM a inkubací při 37 °C po 1 hod.
Po redukci se použilo vakuum k odstranění roztoku dithiothreitolu z jamek. Jamky se promyly třikrát 300 μΐ vody před provedením karboxymethylace cysteinových skupin přidáním 50 μΐ 0,1Μ kyseliny jodoctové v pufiru RCM a inkubací při teplotě místnosti v temnu po 30 min.
Po karboxymethylaci se jamky protáhly vakuem a následně promyly třikrát 300 μΐ vody. Membrána PVDF se té poté blokovala, aby se zabránilo adsorpci endoglykosidázy, inkubací 100 μΐ 1% vodného roztoku polyvinylpyrolidonu 360 při teplotě místnosti po 1 hodinu. Blokovací činidlo se poté odstranilo jemným vakuem následovaným třemi promytími 300 μΐ vody.
N-připojené oligosacharidy se uvolnily adicí 2,5 mU peptid-N-glykosidázy F (recombinant NGlycanase, GLYKO, Novato, CA, USA) a 0,1 mU Sialidase (GLYKO, Novato, CA, USA) aby se uvolnily jakékoliv potenciálně nabité monosacharidové zbytky, v konečném objemu 25 μΐ v 20 mM NaHCCE, pH 7,0. Štěpení se provádělo po 3 hodiny při 37 °C.
Způsob uvolnění oligosacharidů pro protilátky v roztoku
Mezi 40 a 50 pg protilátky se smíchalo s 2,5 mU PNGázy F (GLYKO, USA) ve 2mM Tris, pH 7,0 ve finálním objemu 25 μΐ, a směs se inkubovalapo 3 hodiny při 37 °C.
-45CZ 308720 B6
Použití štěpení endoglykosidázou H na oligosacharidy uvolněné PNGázou F pro připsání hybridních rozdělených oligosacharidových struktur pro neutrální oligosacharidové píky MALDI/TOF-MS
Oligosacharidy uvolněné PNGázou F se následně rozštěpily endoglykosidázou H (EC 3.2.1.96). Pro štěpení EndoH se přidalo 15 mU Endo H (Roche, Švýcarsko) do výtažku PNGázy F (protilátka v roztokové metodě výše) do konečného objemu 30 pl, a směs se inkubovala 3 hodiny při 37 °C. Endo H štěpí mezi N-acetylglukózaminovými zbytky chitobiózového jádra Npřipojených oligosacharidů. Enzym může rozštěpit pouze oligomanózu a většinu glykanů hybridního typu, zatímco oligosacharidy komplexního typu se nehydrolyzují.
Příprava vzorku pro MALDI/TOF-MS
Enzymatické výtažky obsahující uvolněné oligosacharidy se inkubovaly po další 3 hodiny při teplotě místnosti po přidání kyseliny octové do konečné koncentrace 150mM, a následně byly prolity skrz 0,6 ml kationové iontoměničové pryskyřice (pryskyřice AG50W-X8, kyselá forma, 100 až 200 mesh, BioRad, Švýcarsko), naplněné v mikro-bio-spin chromatografické koloně (BioRad, Švýcarsko), aby se odstranily kationy a proteiny. Jeden mikrolitr výsledného vzorku se aplikoval na nerezovou cílovou destičku, a na destičce se smíchal s 1 μΐ matrice sDHB. Matrice sDHB se připravila rozpuštěním 2 mg kyseliny 2,5-dihydroxybenzoové a 0,1 mg kyseliny 5methoxysalicylové v 1 ml ethanol/10 mM vodný chlorid sodný 1 : 1 (obj./obj). Vzorky se vysušily na vzduchu, přidalo se 0,2 μΐ ethanolu, a vzorky se nechaly nakonec překrystalovat na vzduchu.
MALDI/TOF-MS
Hmotový spektrometr MALDI-TOF používaný k získání hmotových spekter byl Voyager Elite (Perspective Biosystems). Přístroj se provozoval v lineární konfiguraci, s akcelerací 20 kV a zpožděním 80 ns. Pro stanovení hmoty iontů se použila externí kalibrace s použitím oligosacharidových standardů. Spektra z 200 laserových záblesků se sečetla pro získání konečného spektra.
6. Příprava PBMC
Mononukleámí buňky periferní krve (PBMC) byly připraveny za použití Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178, USA) a podle instrukcí výrobce. Stručně, žilní krev se odebrala heparinizovanými stříkačkami od dobrovolníků, kteří byli požádáni o běh plnou silou po 1 minutu, aby se zvýšilo procentické zastoupení zabiječských buněk (NK) v krvi. Krev se zředila 1 : 0,75 až 1,3 PBS neobsahující Ca nebo mg a převrstvila se na Histopaque-1077. Gradient se centrifůgoval při 400 x g po 30 min při teplotě místnosti (RT) bez přerušení. Mezifáze obsahující PBMC se shromáždila a promyla PBS (50 ml na buňky ze dvou gradientů) a buňky se odstředily při 300 x g po 10 minut při teplotě místnosti. Po resuspendaci pelety v PBS se PBMS spočítaly a promyly podruhé centrifůgací při 200 x g po 10 minut při teplotě místnosti. Buňky se poté resuspendovaly ve vhodném médiu pro následné procedury.
7. Izolace buněk NK
Lidské buňky NK se izolovaly z PBMC aplikováním negativní selekční procedury s použitím magnetických tělísek nevázajících CD16- a CD56-pozitivní buňky (systém MACS od Miltenyi Biotec GmbH, 51429 Bergisch Gladbach, DE). PBMC se jednou promyly v ledovém pufiru MACS (PBS obsahujícím 2 % FCS a 2 mM EDTA), resuspendovaly se 2 milióny buněk na ml ve směsi FCS a pufiru MACS a inkubovaly se 10 min. při 4 °C. Buňky se poté poletovaly a resuspendovaly v 80 μΐ na 10 miliónů buněk s pufrem MACS obsahujícím 10 % FCS. Poté se přidalo 20 μΐ roztoku protilátky Hapten na 10 miliónů buněk. Buňky se inkubovaly po 10 minut při 4 °C s opakovaným kroužením zkumavkou. Po dvou promytích pufrem MACS v alespoň desetinásobku jmenovitého objemu se buňky resuspendovaly v pufiru MACS obsahujícím 10 % FCS při 10 miliónech buněk
-46CZ 308720 B6 na 80 μΐ a přidalo se 20 μΐ antihaptenových mikrotělísek na 10 miliónů buněk. Zkumavka se inkubovala 15 minut při 4 °C s opakovaným kroužením zkumavkou. Po jednom promytí pufrem MACS se buňky re suspendovaly v množství do 500 miliónů buněk v 500 μΐ MACS a nanesly na kolonu LS MACS, která byla umístěna v magnet MINI-MACS a ekvilibrována 3 ml pufru MACS. Kolona byla promyta 3 x 3 ml pufru MACS. Buňky v průtokové frakci se shromáždily a následně použily jako buňky NK. Čistota byla mezi 88 až 95 %, jak se určilo expresí CD56.
8. Stanovení ADCC
Připravily se PBMC nebo NK jako efektorové buňky, jak je popsáno výše. Poměr efektorových k cílovým byl 25 : 1 a 10 : 1 jednotlivě pro buňky PBMC a NK. Efektorové buňky se připravily v médiu AIM-V ve vhodné koncentraci, aby se přidalo 50 μΐ na jamku 96jamkové destičky s kulatými dny. Cílové buňky pro protilátky C2B8 byly B lymfomové buňky SKW6.4 nebo Namalwa, vyrostlé v DMEM obsahujícím 10 % FCS. Cílové buňky se promyly v PBS, spočítaly a resuspendovaly v AIM-V při 0,3 milionu na ml tak, aby se přidalo 30 000 buněk ve 100 μΐ na mikrojamku. Protilátky se rozpustily v AIM-V, přidaly v 50 μΐ k předem nadávkovaným cílovým buňkám a nechaly se navázat na cíle 10 minut při teplotě místnosti. Poté se přidaly efektorové buňky a destička se inkubovala 4 hod. při 37 °C ve vlhčené atmosféře obsahující 5 % CO2. Zabíjení cílových buněk se hodnotilo měřením uvolňování laktátdehydrogenázy (LDH) z poškozených buněk s použitím Cytotoxicity Detection Kit (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Švýcarsko). Po 4hodinové inkubaci se destičky centrifůgovaly při 800 x g. 100 μΐ supematantu z každé jamky se přeneslo na novou 96jamkovou destičku s plochým průhledným dnem. Přidalo se 100 μΐ pufru s barvícím substrátem z kitu na jamku. Hodnoty Vmax barevné reakce se určily čítačem ELISA při 490 nm po alespoň 10 min. s použitím softwaru SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Spontánní uvolňování LDH se měřilo pouze v jamkách, obsahujících cílové a efektorové buňky, ale žádné protilátky. Maximální uvolňování se určovalo z jamek obsahujících pouze cílové buňky a 1 % Tritonu X-100. Procentické zastoupení specifického zabíjení zprostředkovaného protilátkou se počítalo následovně: ((x- SR)/ (MR-SR)*100, kde x je sřední hodnota Vmax pro koncentraci specifické protilátky, SR je střední hodnota pro spontánní uvolňování a MR je střední hodnota pro Vmax maximálního uvolňování.
9. Navázání FcyRIIIA na buňky NK
Čerstvě izolované buňky NK se centrifůgovaly 5 minut při 200 x g a předpřipravily se 0,09 % (hmotn./obj.) roztoku kyseliny mléčné (140mM NaCl, 5mM KC1, pH 3,9) inkubací 3 x 105 buněk při teplotě místnosti po dobu 5 minut, aby se odstranily IgG asociované s buňkami. (De Haas M., J. Immunol. 156: 2948 (1996)).
Buňky se promyly dvakrát PBS, 0,1% BSA, 0,01 % azidu sodného a koncentrace se nastavila na 2 x 106 buněk/ml v PBS, 0,15 BSA, 0,01 % azidu sodného. 5 x 105 buněk se inkubovalo s 0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 pg/ml různých protilátek po 30 min při 4 °C. Buňky se poté promyly dvakrát a navázání protilátky se detekovalo inkubací s 1:200 kozí antihumánní protilátkou F(ab‘)2 konjugovanou s fluorescein-izothiokyanátem (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA) a antihumánní CD56-PE při 5 μ1/5 xlO5 buněk (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) po 30 minut při 4 °C. (Shields R. et al. J. Biol.Chem.277 (30): 26733-26740 (2002)).
Intenzita fluorescence týkající se variant navázané protilátky se určovala pro buňky CD56+ na přístroji FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA).
10. Navázání FcyRIIb na lymfomové buňky Ráji
Lidské B lymfomové buňky Ráji se promyly 20 minut při 37 °C v PBS (koncentrace 0,3 miliónu buněk/ml). Buňky se poté resuspendovaly 2,2 miliónu buněk/ml v PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN;. a 180 μΐ se přidalo do zkumavky FACS. Desetkrát zředěné protilátky (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 a 30 pg/ml) monoklonálních protilátek L19 nemodifikovaných a se sestrojenými glykosidy se
-47CZ 308720 B6 přidalo k buňkám Raji a inkubovalo při 4 °C 30 minut (finální koncentrace buněk 2 milióny buněk/ml). Po dvou promytích se k buňkám přidal kozí antihumánní IgG F(ab‘)2 konjugovaný s fluorescein-izothiokyanátem (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA) a inkuboval se při 4 °C 30 min. Po jednom promytí se buňky resuspendovaly v 0,5 ml PBS, 0,1% BSA, 0,1% NaN; a intenzita fluorescence odpovídající variantám navázané protilátky pro živé buňky se určila na přístroji FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA).
11. Stanovení cytotoxicity závislé na komplementu
Cílové buňky se spočítaly, promyly PBS, resuspendovaly v AIM-V (Invitrogen) při 1 miliónu buněk na ml. 50 pl buněk se naneslo do jamky 96jamkové destičky s plochým dnem. Zředění protilátek se připravily v AIM-V a přidalo se 50 μΐ k buňkám. Protilátky se nechaly navázat na buňky 10 minut při teplotě místnosti. Uidský sérový komplement (Quidel) se čerstvě rozmrazil, 3krát se zředil AIM-V a přidalo se 50 μΐ do jamek. Králičí komplement (Cedarlane Uaboratories) se připravil podle popisu výrobce, 3krát se zředil AIM-V a přidalo se 50 μΐ do jamek. Jako kontrola se zdroje komplementu zahřívaly na 56 °C 30 minut před přidáním do stanovení.
Destičky se stanovením se inkubovaly při 37 °C 2 hodiny. Zabíjení buněk se určilo měřením uvolňování UDH. Stručně, destičky se centrifugovaly při 300 x g 3 minuty. 50 μΐ supematantu na jamku se přeneslo na novou 96jamkovou destičku a přidalo se 50 μΐ testovacího činidla z Cytotoxicity Kit (Roche). Kinetické měření na čítači EUISA určilo Vmax odpovídající koncentraci LDH v supematantu. Maximální uvolňování se určilo inkubací buněk v přítomnosti 1% Tritonu X-100.
Výsledky a diskuze
Verze chimémí protilátky anti-CD20 IgG se sestrojenými glykosidy (chimémí protilátka C2B8, rovněž známá jako rituximab) se vyrobila kotransfekováním kultur savčích buněk pro expresi genů protilátky a vektory pro expresi genů kódujících různé polypeptidy s aktivitou GnTIII. Nemodifikovaná verze (s nesestrojenými glykosidy) téže protilátky se vyrobila transfekováním savčích buněk pouze vektorem pro expresi protilátky. Transfekované buňky se udržovaly v kultuře alespoň tři dny a vyloučené rekombinantní protilátky se vyčistily z kultivačního média afinitní chromatografií Protein A. Exprese genů kódujících polypeptidy s aktivitou GnTIII neměla podstatný efekt na životaschopnost buněk, růst buněk nebo produkci protilátek ve vztahu k buňkám neprodukujícím takové polypeptidy.
Vyčištěné protilátky se poté analyzovaly na jejich glykozylační modely. Tyto protilátky nesou Npřipojené oligosacharidy pouze ke zbytku Asp297 oblasti Fc lidského IgGl. Oligosacharidy se enzymaticky odstranily z protilátek působením PNGázy F a následně se analyzovaly MALDI/TOF-MS. S použitím této techniky je možné určit frakci různých druhů oligosacharidů uvnitř celé původní populace Fc-oligosacharidů, a je možné také připsat struktury různým pikům spektra (Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)).
Obrázek 1 ukazuje profily MALDI/TOF-MS neutrálních oligosacharidů z rekombinantních chimémích protilátek C2B8 anti-CD20 IgGl produkovaných v buňkách BHK. Tyto buňky byly transfekovány expresním vektorem protilátky pETR1502. Obrázky 2 až 4 ukazují odpovídající profily pro tutéž protilátku produkovanou buňkami BHK sestrojenými s nukleovými kyselinami kódujícími polypeptidy s aktivitou GnTIII. Profil na obrázku 2 je výsledkem použití nukleové kyseliny kódující divoký typ GnTIII exprimovaný z vektoru pETR1166. Profil na obrázku 3 je výsledkem použití nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid obsahující N-konec lokalizační domény GnTI připojený k C-konci katalytické domény GnTIII. Tento fúzní gen je exprimován z vektoru pETR1425. Profil na obrázku 4 je výsledkem použití nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, obsahující na N-konci lokalizační doménu Golgiho a-manózidázy II (Manil), připojenou ke katalytické doméně GnTIII. Tento fúzní gen byl exprimován z vektoru pETR1506.
-48CZ 308720 B6
Nemodifikovaná protilátka má typický oligosacharidový profil (obr. 1), s píky při poměrech m/z 1485, 1648 a 1810, které jsou konzistentní s dvouvláknovými, jádrově fukózylovanými komplexními oligosacharidy s 0, 1 a 2 galaktózovými zbytky. Podobné profily se nacházejí v oblasti Fc oligosacharidů nesestrojených protilátek IgGl produkovaných ve standardních savčích průmyslových buněčných liniích, jako jsou CHO a myší myelomové buňky (Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5:813-822 (1995)). Sestrojování buněk produkujících protilátku expresí GnTIII divokého typu vede převážně k rozděleným, jádrově fukózylovaným komplexním oligosacharidům (obr. 2), spiky při poměrech m/z 1689, 1851 a 2014, které jsou dvoudílným protějškem píků nedvoudílných oligosacharidů nacházejících se v nemodifikované protilátce. Sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid GnTI-GnTIII, kde katalytická doména GnTIII je lokalizovaná přes Golgiho katalytickou doménu GnTI, rovněž vede zejména k rozděleným komplexním oligosacharidům (povšimněte si píků 1689 a 1851 na obr. 3). Avšak v porovnání s divokým typem GnTIII použití fúze GnTI-GnTIII vede ke zvýšení podílu rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních struktur (porovnejte podíly píků s m/z 1664, 1810, 1826 a 1973 ve vztahu k celku mezi obr. 2 a 3). Syntéza rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních struktur je výsledkem kompetice, pro oligosacharidové substráty modifikované GnTI mezi rekombinantní katalytickou doménou GnTIII a (i) endogenním jádrem, a-l,6-fúkózyltransferázou, (ii) Golgiho a-manózidázou II (Manil) a (iii) GnTII, protože jestliže je oligosacharid jednou modifikován dělícím GlcNAc přidaném reakcí katalyzovanou GnTIII, tyto tři další enzymy nemohou dále působit při modifikaci rozdělených oligosacharidů. Proto blokovací působení manózidázy II přidáním rozdělujícího GLcNAc rovněž účinně blokuje GnTII, protože GnTII působí po směru od Manil v biosyntetické cestě Npřipojeného oligosacharidů. Píky při m/z 1664 a 1826 jsou nefukózylované, zatímco píky při m/z 1810 a 1973 jsou fúkózylované. Působení Endo H glykosidázy, která může rozlišovat mezi hybridními a komplexními oligosacharidy (obr. 8A), se použilo pro potvrzení toho, že zvýšení těchto píků je způsobeno zvýšením podílu Fc-připojených rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních oligosacharidů (viz níže).
V kontrastu k jiným nukleovým kyselinám použitým zde, kódujícím aktivitu GnTIII, sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid Manil-GnTIII (SEQ ID NO: 12) kde katalytická doména je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, vede hlavně k rozděleným nefúkózylovaným a rozděleným hybridním strukturám (povšimněte si píků s m/z 1664, 1810, 1826 a 1973 na obr. 4). Proto v porovnání s divokým typem GnTIII a s fúzí GnTI-GnTIII (SEQ ID NO: 14 a 15) fúze Manil-GnTIII je účinnější při syntéze Fc-připojených rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních oligosacharidů (porovnejte podíly píků s m/z 1664 a 1810 ve vztahu k celku mezi obr. 2, 3 a 4). Podíl rozdělených nefukózylovaných FColigosacharidů původem z exprese nukleových kyselin kódujících GnTIII divokého typu fúze GnTI-GnTIII a fúze ManlI-GnTIII byla přibližně 4, 13 a 33 %. Žádné rozdělené oligosacharidy nebyly detekovány v nemodifikované (nesestrojené) protilátce.
Zvýšení exprese fúzního konstruktu Manil-GnTIII v buňkách produkujících protilátku vede k dalším zvýšením v podílu rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů. To bylo demonstrováno expresí konstruktu ManlI-GnTIII z vektoru (pETR1512) s OriP pro epizomální replikaci v transfekovaných buňkách HEK293-EBNA. O tomto expresním systému je známo, že vede k vysokým úrovním exprese, a byl použit také pro expresi genů protilátky z vektoru pETR1520. Profil oligosacharidů z čištěné nemodifikované protilátky (s nesestrojenými glykosidy) exprimované na vysokých úrovních v tomto systému je ukázán na obr. 5, který opět ukazuje typický oligosacharidový profil s píky nerozdělených fúkózylovaných oligosacharidů, majících 0, 1 a 2 galaktózové zbytky (tj. porovnejte obr. 1 a 5, ukazující podobné oligosacharidové profily exprimované v buňkách BHK nebo při vyšších úrovních v buňkách HEH293-EBNA). Sestrojování buněk produkujících protilátku s nukleovou kyselinou kódující fúzi ManlI-GnTIII exprimované na vyšších úrovních v tomto systému vedlo k produkci protilátek, kde většina Fcoligosacharidů byla rozdělená nefúkózylovaná (viz obr. 6, kde rozdělené nefukózylované hybridní oligosacharidové píky při m/z 1664 a 1826 dohromady tvoří přes 90 % celkových oligosacharidů).
-49CZ 308720 B6
Jak je uvedeno výše, endoglykosidáza H (Endo H) se použila pro potvrzení určení rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních struktur různých oligosacharidových píků pozorovaných v profilech MALDL Na obr. 7 jsou ukázány profily MALDI/TOF-MS neutrálních oligosacharidů glykanů rozložených PNGázou F a PNGázou F + Endo H, odvozených od chimémí protilátky anti-CD20 IgGl, produkovaných buňkami HEK293 sestrojenými overexpresí GnTIII(M2) Pík při m/z 1664 se může připsat dvěma různým glykanům, jmenovitě nefukózylovanému hybridnímu rozdělenému nebo nefiikózylovanému komplexnímu nerozdělenému. Různé struktury vykazují tentýž poměr m/z z důvodu stejného složení monosacharidů (obr. 8b).
Štěpení glykanů, uvolněných PNGázou F, endoglykosidázou H generuje nové struktury s hlavním pikem posunutým od m/z 1664 na 1460 (obr. 7B). Rozdíl koresponduje s hmotností zbytku GlcNAc. Jak je uvedeno výše, Endo H nemůže štěpit oligosacharidy komplexního typu. Proto se hlavní pík u m/z 1664 může po rozštěpení endoglykosidázou H připsat nefiikózylovanému hybridnímu rozdělenému typu.
Jiné píky, které se mohou připsat komplexním nebo hybridním rozděleným glykanům.
U m/z 1810; po rozštěpení endoglykosidázou H pík zmizel, tak se mohou struktury připsat fůkózylovanému hybridnímu rozdělenému typu. Odečtením jednoho GlcNAc a jednoho fůkózového zbytku (z jádra a-l,6-fukózylovaného zbytku redukujícího konce GlcNAc) z píku s m/z 1810 generuje strukturu o m/z 1460. Zmizení píku u m/z 1502 rozštěpením EndoH (eliminace zbytku GlcNAc) a objevení píku u m/z 1298 demonstruje, že pík 1502 se může připsat nefukózylovanému hybridnímu rozdělenému typu. Zmizení píku u m/z 1647 po rozštěpení Endo H demonstruje, že tento pík je fukózylovaná hybridní rozštěpená struktura. Odstranění jednoho GlcNAc a jednoho fůkózového zbytku generuje strukturu o m/z 1298. Pík u m/z 1826, nefukózylovaný hybridní rozdělený typ, se rozštěpil Endo H. To generovalo strukturu o m/z 1622. Pík u m/z 1053 se po rozštěpení Endo H může připsat typu s vysokým obsahem manózy (m/z 1257), rozloženému EndoH. Pík u m/z 1689 (komplexní rozdělený) není ovlivněn štěpením EndoH, jak se očekávalo. Ve shrnutí dat získaných v tabulce 1 jsme získali závěr, že 88% oligosacharidových struktur nese rozdělující GlcNAc, z nichž 60 % jsou nefukózylované hybridní rozdělené struktury, 22 % fůkózylované hybridní rozdělené a 6 % fůkózylované komplexní rozdělené oligosacharidové struktury.
Tabulka 1. Určení oligosacharidů
m/z Možné struktury Relativní % před Endo H Očekávaný m/z po Endo H Pozorovaný m/z po Endo H Relativní % po Endo H Určení
1256 vysoká manóza 9 1053 1053 11 vysoká manóza (9%)
1502 nefuk. hybrid rozdělený nebo nefuk. komplex 7 1298 nebo1502 1298 13 nefuk. hybrid rozdělený (7 %)
1647 fuk. hybrid rozdělený nebo fuk. komplex 7 1298 nebo 1647 1298 13 fuk. hybrid rozdělený (7 %)
1664 nefuk. hybrid rozdělený nebo nefuk. komplex 49 1460 nebo 1644 1460 60 nefuk. hybrid rozdělený (49 %)
1689 fuk. komplex rozdělený 3 1689 1689 5 fuk. komplex rozdělený (3 %)
- 50CZ 308720 B6
1810 fuk. hybrid rozdělený nebo fuk. komplex 15 1460 nebo 1810 1460 1810 60 2 fúk. hybrid rozdělený (13 %) a fúk. komplex (2%)
1826 nefuk. hybrid rozdělený 4 1662 1662 7 nefuk. hybrid rozdělený (4 %)
1851 fúk. komplex rozdělený 3 1851 1851 2 fuk. komplex rozdělený (3 %)
1972 fuk. hybrid rozdělený 3 1662 1662 7 fúk. hybrid rozdělený (3 %)
Hmotnostní poměry (v molámích frakcích v %):
a) píky u m/z 1502 a 1647: 7 + 7% = 14% (očekáváno). Rozštěpení Endo H pro oba píky dalo m/z 1298 (zjištěno 13 % po Endo H)
b) píky u m/z 1664 a 1810: 49 + 13 % = 62 %. Endo H dala m/z 1460 (zjištěno 60 %)
c) píky u m/z 1826 a 1972: 4 + 3 % = 7 %. Endo H dala 1622 (7 %)
Shrnutí: Celkové relativní zastoupení struktur nesoucích rozdělující GlcNAc: 88 %
Nefukózylované hybridní rozdělené: 60 %
Fukózylované hybridní rozdělené: 22 %
Fukózylované komplexní rozdělené: 6 %
Výše uvedené údaje (obr. 1 až 6) ukazují, že úroveň exprese GnTIII i konkrétní lokalizační doména, která je použita k zacílení katalytické domény GnTIII na Golgiho aparát mají vliv na kompetici substrátů modifikovaných GnTI mezi rekombinantní katalytickou doménou GnTIII a endogenní jádrovou a-l,6-fukózyltransferázou a enzymy Manil a GnTII. V této kompetici převládá vyšší exprese GnTIII, což vede k vyšším úrovním rozdělených hybridních a rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů a k současnému snížení úrovní rozdělených komplexních a rozdělených fukózylovaných oligosacharidů. To bylo také zpozorováno dříve pro divoký typ GnTIII (Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Avšak navzdory tomu, že vede k podobným úrovním rozdělených oligosacharidů, lokalizace katalytické domény GnTIII přes lokalizační domény GnTI nebo Manil vedla k efektivnější kompetici v porovnání s divokým typem GnTIII pro oligosacharidové substráty modifikované GnTI, ve srovnání s enzymy endogenní jádrovou a-l,6-fukózyltransferázou, Manil a GnTII.
Vyšší efektivita fúze GnTI-GnTIII ve srovnání s divokým typem GnTIII pro syntézu rozdělených hybridních a rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů se může vysvětlit dřívější Golgiho distribucí, směru transportu glykoproteinového substrátu cis-trans od GnTI vzhledem k GnTIII. Výborné Golgiho distribuce GnTI a Manil byly určeny dříve kvantitativní imunoelektronovou mikroskopií (Rabouille, C. et al. J. Cell Sci. 108:1617-27 (1995)). Oba enzymy distribuují společně podél Golgiho aparátu, jsou lokalizovány hlavně ve středních a trans nádržkách Golgiho aparátu, s vyššími úrovněmi ve středních ve srovnání k trans nádržkám. Výborná kvantitativní prostorová distribuce a-1,6 jádrové fúkózyltransferázy, GnTII a a GnTIII divokého typu nebyla dosud zjištěna. Avšak výše uvedené nevysvětluje, proč je fúze ManlI-GnTIII podstatně efektivnější než fúze GnTI-GnTIII pro syntézu rozdělených hybridních a rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, ačkoliv jak Manil, tak GnTI mají identické prostorové distribuce podél Golgiho substruktur.
Vyšší efektivita fúze Manil-GnTIII ukazuje na existenci relativně organizovaných substruktur fúnkční glykozylační reakce uvnitř fýzických substruktur středních a trans Golgiho nádržek. O takzvaných „středových Golgiho glykozylačních enzymech“ GnTI, GnTII a Manil se věří, že existují v Golgiho aparátu jako komplexy o vysoké molekulární hmotnosti. Avšak jestliže lokalizační doména dovolí těmto enzymům tvořit část těchto komplexů, bylo by to stejné pro fúze GnTI- a ManlI-GnTIII. Exprese rekombinantní fúze GnTI-GnTIII nevede k přemístění
- 51 CZ 308720 B6 endogenního enzymu GnTI divokého typu v žádném rozsahu podstatném pro syntézu Fcoligosacharidů, protože všechny konstrukty GnTIII použité zde vedly k většině oligosacharidů modifikovaných zároveň reakcemi GnTI a GnTIII.
Naše údaje ukazují, že na základě lokalizačních domén Manil dochází k přesnějšímu funkčnímu párování mezi katalytickými doménami endogenní GnTI a rekombinantní fúzí Manil-GnTIII. O organizovaném párování enzymů katalyzujících následné reakce v biosyntetické cestě, v cestě, která upřednostňuje přenos produktu první reakce na druhé katalytické místo ve vztahu k difúzi takového enzymu pryč od enzymů, je známo., že k němu dochází v jiných biosyntetických cestách, jako je glykolýza a biosyntéza polyketidu. O GnTI a Manil bylo oznámeno, že tvoří „příbuzné oligomery“, přinejmenším když se jeden z těchto enzymů relokalizuje v endoplazmatickém retikulu (Nilsson, T. et al. EMBO J. 13 (3). 562-74 (1994)). O páru nabitých aminokyselinových zbytků v každé z kmenových oblastí těchto enzymů bylo zjištěno, že jsou kritické pro toto příbuzenské rozeznání. Zbytky GnTI mají opačný náboj než zbytky Manil. Identifikovali jsme podobné zbytky na ekvivalentních pozicích kmenových oblastí jiných Golgiho glykozylačních enzymů zahrnutých v této části biosyntetické cesty N-připojených oligosacharidů, jmenovitě v a1,6 jádrové fukózyl-transferáze, (stejné náboje jako v GnTI namísto komplementárních nábojů v případě Manil), Maní a GnTII. Identifikovali jsme také, že tyto zbytky jsou zachovány přes druhy. Ačkoliv bylo navrženo, že tyto zbytky nejsou podstatné pro inkorporaci do komplexů o vysoké molekulární hmotnosti tvořených enzymy nebo dokonce pro Golgiho lokalizaci (Opat, A. S. et al. J. Biol. Chem. 275 (16): 1836-45 (2000)), je možné, že jsou zahrnuty v jemnějším párování katalytických domén během biosyntézy oligosacharidů. Takové párování nemusí být ireverzibilní, ale může být zprostředkováno přechodnými dynamickými interakcemi mezi enzymy. Také mohou existovat další determinanty pro párování kdekoliv v kmeni katalytické oblasti. Avšak jakýkoliv příspěvek ke specifickému párování GnTI-ManlI z katalytické domény Manil by byl ztracen v rekombinantní fúzi nesoucí katalytickou doménu GnTIII.
Obrázky 9 až 11 ukazují zvýšenou cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC), která je výsledkem nadměrné exprese nukleových kyselin kódujících polypeptidy s aktivitou GnTIII, která je lokalizovaná ke Golgiho aparátu přes různé lokalizační domény v buňkách produkujících protilátku. Zvýšená ADCC, která je výsledkem exprese rekombinantního polypeptidů s aktivitou GnTIII a lokalizovaného v Golgiho aparátu přes Golgiho lokalizační doménu GnTI, je ukázána na obr. 9. Oligosacharidový profil kontrolní protilátky použité pro stanovení ADCC z obr. 9 je ukázán na obr. 1. Oligosacharidový profil protilátky se sestrojenými glykosidy použité pro stanovení ADCC z obr. 9 je ukázán na obr. 3. Zvýšená ADCC, která je výsledkem exprese rekombinantního polypeptidů s aktivitou GnTIII a lokalizovaného v Golgiho aparátu přes glykosidázu Manil, Golgiho lokalizační doména je ukázána na obr. 10. Oligosacharidový profil kontrolní protilátky použité pro stanovení ADCC na obr. 10 je ukázán na obr. 5. Oligosacharidový profil protilátky se sestrojenými glykosidy použité pro stanovení ADCC na obr. 10 je ukázán na obr. 6.
Obr. 11 ukazuje, že exprese rekombinantního polypeptidů s aktivitou GnTIII a lokalizovaného v Golgiho aparátu přes Golgiho lokalizační doménu vede ke zvýšené aktivitě ADCC ve vztahu k použití polypeptidů GnTIII divokého typu se svou vlastní lokalizační doménou GnTIII. Oligosacharidový profil protilátky s glykosidy sestrojenými expresí GnTIII divokého typu a použité pro stanovení ADCC na obr. lije ukázán na obr. 2. Oligosacharidový profil protilátky s glykosidy sestrojenými expresí fúzního polypeptidů s aktivitou GnTIII, lokalizovaného v Golgiho aparátu přes Golgiho lokalizační doménu, a použité pro stanovení ADCC na obr. lije ukázán na obr. 4. Tyto údaje také ukazují, že protilátky s rozdělenými oligosacharidy, včetně rozdělených hybridních a rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, mají zvýšenou aktivitu ADCC ve srovnání s protilátkami s komplexními fúkózylovanými nerozdělenými oligosacharidy. Mělo by se poznamenat, že všechny z těchto rozdělených oligosacharidů aktivnějších protilátek použitých ve stanovení ADCC na obr. 10 jsou rozdělené nefukózylované hybridní oligosacharidy. Jak bylo uvedeno dříve, použití fúzního polypeptidů s aktivitou GnTIII, lokalizovaného v Golgiho aparátu přes lokalizační doménu Manil, vede k efektivnější syntéze nefukózylovaných rozdělených oligosacharidů a obr. 11 ukazuje, že protilátky se zvýšenými úrovněmi těchto rozdělených
-52CZ 308720 B6 nefukózylovaných oligosacharidů jsou aktivnější v ADCC ve srovnání s protilátkami s nižšími úrovněmi těchto oligosacharidů. Zvyšování aktivity ADCC je v korelaci se zvyšováním frakce těchto rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů v populaci oligosacharidů spojených s Fc, a je pozorováno rozsáhlé zvýšení, jestliže je tato frakce vyšší než 15 až 20 %.
O zabiječských buňkách (NK) je známo, že jsou významnými zprostředkovateli ADCC. Buňky nesou na svém povrchu aktivující Fey receptor lila, rovněž známý jako CDlóa. Navázání oblasti Fc protilátek navázaných na cílové buňky na receptory Fc/RIII buněk NK je podstatné pro propojení těchto receptorů na buňkách NK a následnou indukci ADCC. Proto je důležité vyhodnotit navázání protilátek produkovaných zde popsanými způsoby na receptory Fc, zejména na receptory v jejich přirozené formě, ve které se projevují u lidských imunoefektorových buněk. Obrázek 12 ukazuje, že protilátky se sestrojenými glykosidy produkované expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid s aktivitou GnTIII v buňkách produkujících protilátky mají zvýšenou vazebnou afinitu na lidský aktivující receptor Fc/RIIIA. Jak je uvedeno výše pro stanovení ADCC, tyto protilátky mají zvýšenou úroveň rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, které vznikají expresí fúzního polypeptidu s aktivitou GnTIII v buňkách produkujících protilátku. Buňky NK použité v tomto stanovení byly z dárce genotypu, který neexprimoval receptor FcyRIIc ve svých buňkách NK (Metes, D. et al. J. Immunol. Methods 258 (1-2):85-95 (2001)). Proto jediný receptor Fc na povrchu těchto buněk je aktivující receptor Fc/RIIIA. Obr. 13 ukazuje, že vazebným stanovením se měří specifická vazebná afinita k tomuto receptoru. To je ukázáno kompeticí s fragmentem protilátky specificky blokujícím Fc/RIII (fragment 3G8 Fab2).
Silný důkaz účinku zesílených interakcí Fc-FcR na výsledek protinádorové terapie pochází z korelace, zjištěné u lymfomových pacientů užívajících rituximab, mezi účinností a genotypem receptoru Fc/RIIIa se zvýšenou afinitou (Cartron, G. et al. Blood 99 (3):754-8 (2002)). To byl jediný parametr nalezený pro korelaci s obrovsky zesílenou mírou objektivní odpovědi a zvýšeným podílem molekulárních odpovědí. Zvýšená účinnost díky zvýšeným interakcím Fc/RIIIA-Fc se může odvodit z funkcí vykonávaných různými typy imunitních buněk, včetně zabij ečských buněk (NK), makrofágů, monocytů a dendritických buněk. Propojení aktivujících receptorů Fc/RIIIA na buňkách NK, makrofágách a monocytech může vést k lýzi nádorových buněk ADCC (dalece se očekává, že se jedná o hlavní zabíječský mechanismus závislý na FcR in vivo) (Maloney, D. G. et al.Semin. Oncol. 29(1 Suppl. 2):2-9 (2002), Amigorena S., JExp. Med. 195(1): Fl-3 (2002)) ataké k buněčné fagocytóze závislé na protilátce (Hazenbos, W. L. et al. J. Immunol. 161(6):302632(1998), Reff, Μ. E. a Heard, C. Crit Rev Oncol Hematol. 40(1):25-35 (2001)) a k uvolňování cytokinů v blízkosti nádorových buněk (Carson, W. E. et al. Eur. J. Immunol. 31:3016-3025 (2001)). Tyto cytokiny mohou naopak vést k přímým cytotoxickým účinkům na nádorových buňkách, k antiangiogenním účinkům, které inhibují růst nádorů zbavením kyslíku a živin, a ke zvýšené prezentaci nádorových antigenů jako část imunitní odpovědi zprostředkované T-buňkami proti nádorovým buňkám. Dendritické buňky jsou rozhodující pro prezentaci antigenů T-buňkám, a propojení FcvRIIIA na jejich povrchu (tj. z umírajících buněk s navázaným antigenem původně atakovaných in vivo ADCC) může vést ke zvýšenému dozrávání dendritických buněk, absorpci antigenů a prezentaci T-buňkám, a ke zkříženému vyzbrojení cytotoxických T-buněk, které jsou potenciálně velmi účinným mechanismem pro aktivaci protinádorové imunity (Amigorena S., J. Exp. Med. 195(l):Fl-3(2002), Kalergis, A. M. a Ravetch, J. V. J. Exp. Med. 195 (12):1653-1659 (2002), Selenko, N. et al. J. Clin. Immunol. 22(3):124-130 (2002)). Propojení protilátek navázaných na cílové buňky s receptory Fc na imunoefektorových buňkách může také vést ke zvýšenému přímému zabíjení cílových buněk, například apoptózou indukovanou propojením molekul cíl-antigen zprostředkované molekulami protilátky (Reff, Μ. E. a Heard, C. Crit Rev Oncol Hematol. 40(1):25-35 (2001), Cragg, M. S. et al. Blood 101 (3): 1045-1052 (2003)). Ze všech těchto imunoefektorových buněk pouze buňky NK mají na svém povrchu samotné aktivující receptory Fcy. U jiných typů buněk je aktivující Fc/RIII přítomen společně s inhibujícím receptorem Fc/RIIb. a indukce protinádorových efektorových fimkcí je výsledkem pozitivní bilance aktivujících signálů nad inhibičními.
- 53CZ 308720 B6
Obr. 15 ukazuje, že zvýšená vaznost receptoru Fc je selektivní pro aktivující receptor ve srovnání s inhibujícím Fc/RIIb. Taková selektivita je důležitá pro efektorové funkce prováděné imunitními buňkami jinými, než jsou buňky NK, jak je vysvětleno výše. Navíc zvýšení vaznosti dosažené sestrojením glykosidů v oblasti Fc protilátky, za použití metod popsaných zde, je větší než to, které je pozorováno přirozeně pro homozygotní pacienty/donory s genotypem vysoké afinity Fc/RIIIA. kteří dostali standardní nemodifikovanou protilátku (obr. 16), aktéři již přišli do styku se zvýšenou účinností protirakovinných protilátek (Cartron, G. et al. Blood 99 (3): 754-8 (2002)). Vazebná doména aktivujícího receptoru Fc/RIIIB je téměř identická s doménou Fc/RIIIA. Proto výše uvedené údaje také ukazují, že protilátky se sestrojenými glykosidy popsané zde mohou vést ke zvýšeným efektorovým funkcím zprostředkovaným efektorovými buňkami vykazujícími Fc/RIIIB. jako jsou polymorfonukleámí buňky (PMN), včetně uvolnění toxických produktů a fagocytózy (Reff, Μ. E. a Heard, C. Crit Rev Oncol Henaatol. 40 (1):25-35 (2001), Daeron, FM. Annu. Rev. Immu7701. 15:203-34 (1997), Ravetch, J. V. a Bolland S. Annu. Rev. Immunol. 19:275-90 (2001)).
Obr. 18 ukazuje oligosacharidový profil protilátky anti-CD20 produkované buňkami BHK rostoucími v suspenzi a sestrojenými pro konstitutivní expresi vysoké úrovně jak rekombinantní protilátky, tak fúzního polypeptidu s aktivitou GnTIII. Oligosacharidový profil vykazuje zvýšené úrovně rozdělených nefukózylovaných a rozdělených hybridních oligosacharidů pro protilátku z buněk sestrojených s fúzní GnTIII (viz také tab. 2). Tyto struktury se nenalézají v protilátkách s nesestrojenými glykosidy, produkovanými BHK buňkami s nesestrojenými glykosidy (viz obr. 1). Sestrojené buňky exprimující vykazovaly normální růst v suspenzi a dobrou produktivitu protilátek.
Relativní procentické zastoupení oligosacharidů v monoklonální protilátce se sestrojenými glykosidy, produkovaných stabilní buněčnou linií BHK-1502-28-11 je ukázána v tab. 2.
Tabulka 2: Relativní procentické zastoupení píků získaných pomocí MALDI/TOF-MS
Pík (m/z) Procentické zastoupení
1 1257 2,5 %
2 1486 2,8 %
3 1647 6%
4 1664 22,30 %
5 1680 2,5 %
6 1689 4,8 %
7 1705 3 %
8 1810 27,8 %
9 1826 10%
10 1851 7,5 %
11 1972 9%
12 2012 1,75 %
Celkové rozdělené: 88,6 % (4+5+6+7+8+9+10+11+12)
Celkové nefúkózylované rozdělené: 37,8 % (4+5+7+9)
Celkové fúkózylované rozdělené: 50,8 % (6+8+10+11+12)
Komplexní rozdělené: 17 % (6+7+10+12)
Hybridní rozdělené: 71,6 % (4+5+8+9+11)
Analýza oligosacharidů ukázala, že 88,6 % struktur nese rozdělující zbytek GlcNAc, 50,8 % je fúkózylováno a 37,8 % není fukózylováno. Rozštěpení oligosacharidů uvolněných PNGázou F pomocí endoglykosidázy H ukázalo, že většina získaných píků je hybridního rozděleného typu (obr. 19). Obr. 20 ukazuje zvýšenou vazebnou afinitu protilátky se sestrojenými glykosidy,
- 54CZ 308720 B6 produkované buněčnou linií BHK-1502-28-11, k aktivujícímu receptoru Fc Fc/RIIIA na lidských buňkách NK. Buněčné linie rostoucí v suspenzi a s konstitutivní stabilní expresí jak genů protilátky, tak fúzního polypeptidu GnTIII, jsou ideální pro produkci terapeutických protilátek ve velkém měřítku. S použitím standardních způsobů sestrojování buněk, sestrojování glykosidů se může implementovat buď introdukcí fúzního genu GnTIII do buněčné linie obsahující geny protilátky, nebo zavedením genů protilátky do buňky obsahující fúzní gen GnTIII (produkční buněčná linie s předem sestrojenými glykosidy) nebo zavedením genu protilátky a fúzního genu GnTIII zároveň.
Protilátka anti-CD20 produkovaná v buňkách sestrojených pro expresi nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid s aktivitou GnTIII a lokalizované v Golgiho aparátu přes lokalizační doménu Manil s vysokou úrovní se testovala také na lýzi zprostředkovanou komplementem (CML), odlišnou efektorovou fúnkci, která není závislá na receptorech Fc imunoefektorových buněk. Obrovská většina oligosacharidů této protilátky se sestrojenými glykosidy je rozděleného hybridního nefúkózylovaného typu. Snížená aktivita CML byla pozorována pro tuto protilátku anti-CD20 ve srovnání s nemodifikovanou protilátkou (obr. 21). Protilátky se zvýšenou ADCC, ale se sníženou CML, mohou být vhodné pro některé aplikace, například pro snížení vedlejších účinků, například zánětu cév v místě nádoru, zprostředkovaném CML. Byly pozorovány jiné významné vedlejší účinky zprostředkované CML pro terapii protilátkami anti-CD20 (van der Kolk L.E. et al. Br J Hematol. 115(4):807-11(2001)). Avšak výše uvedené oligosacharidové profily také ukazují, že je také možné sestrojit buňky produkující protilátky pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII na střední úrovni exprese, který vede ke středním úrovním rozdělených hybridních nefukózylovaných oligosacharidů (vyšším než 15%), ale s podstatnou frakcí komplexních oligosacharidů uvnitř populace oligosacharidů Fc protilátky se sestrojenými glykosidy. Takové komplexní oligosacharidy jsou spojeny s normální neredukovanou úrovní CML. Proto údaje ukazují, že protilátky se zvýšenou ADCC mohou být produkovány tímto způsobem, který může zachovat velmi podobné úrovně aktivity CML ve srovnání s protilátkami s nesestrojenými glykosidy.
Druhá chimémí protilátka IgG, C225, rovněž známá jako cetuximab, která rozpoznává lidský receptor faktoru epidermálního růstu (EGFR), byla vyrobena se sestrojenými glykosidy způsoby popsanými zde. Obr. 22 ukazuje profily oligosacharidů nemodifikované protilátky anti-EGFR C225 a verzi se sestrojenými glykosidy téže protilátky. Druhá verze byla produkována v buňkách exprimujících nukleovou kyselinu kódující fúzní polypeptid s aktivitou GnTIII a lokalizovanou v Golgiho aparátu přes lokalizační doménu Manil. Obr. 23 ukazuje zvýšenou ADCC protilátky anti-EGFR, pocházející z tohoto sestrojování glykosidů. Protilátky se sestrojenými glykosidy vyrobené způsoby popsanými zde a mající zvýšenou ADCC a zvýšenou vazebnou afinitu pro aktivaci receptorů Fc jsou slibné molekuly po léčení rakoviny a autoimunitních chorob protilátkami, protože by měly vést ke zvýšené efektivitě těchto terapií, vztaženo k odpovídající nemodifikované verzi (s nesestrojenými glykosidy) těchto protilátek. Navíc by mělo být možné snížit terapeutické dávky pro protilátky se sestrojenými glykosidy ve srovnání s nemodifikovanými, a to by pozitivně ovlivnilo ekonomiku výroby protilátek.
Příklad 2
Léčení trombocytopénie zprostředkované imunitou v pacientovi s chronickou chorobou štěp versus hostitel
Autoimunitní trombocytopénie u chronické choroby štěp versus hostitel představuje příklad disregulace B-buněk, vedoucí ke klinické chorobě. Pro léčení trombocytopénie zprostředkované imunitou v subjektu s chronickou chorobou štěp versus hostitel se subjektu podává chimémí monoklonální protilátka anti-CD20 připravená způsoby podle předmětného vynálezu a mající zvýšenou ADCC, jak je popsáno v publikaci Ratanatharathom, V. et al., Ann. Intern. Med. 133 (4): 275-79 (2000) (jejíž celý obsah je zde zahrnut svým odkazem). Konkrétně se podává subjektu
- 55CZ 308720 B6 týdenní infúze protilátky 375 mg/m2 po čtyři týdny. Protilátková terapie způsobuje zřetelné vyčerpání B-buněk v periferní krvi a snížené úrovně protilátky spojené s destičkami.
Příklad 3
Léčení kritické aplasie čistě červených buněk zprostředkované imunitou a hemolytické anémie
Získaná aplasie čistě červených buněk (PRCA) zprostředkovaná imunitou je vzácná choroba, často spojená sjinými autoimunitními jevy. Pro léčení získané aplasie čistě červených buněk zprostředkované imunitou v subjektu se subjektu podává chimémí monoklonální protilátka antiCD20 připravená způsoby podle předmětného vynálezu a mající zvýšenou ADCC, jak je popsáno v publikaci Zecca, M. et al., Blood 12: 3995-97 (1997) (jejíž celý obsah je zde zahrnut svým odkazem). Konkrétně se podávají subjektu s PRCA a hemolytickou anémií dvě dávky protilátky 375 mg/m2 týdně. Po terapii protilátkami se započne dodatečné léčení intravenózním imunoglobulinem. Toto léčení způsobuje zřetelné vyčerpání B-buněk a podstatné snížení počtu retikulocytů doprovázené zvýšenými úrovněmi hemoglobinu.
Příklad 4
Materiály a metody
1. Konstrukce fúzních expresních vektorů GalT
Vektor pro konstitutivní expresi GalT
Pro konstrukci expresního vektoru GalT se amplifikuje cDNA GalT z knihovny cDNA (Clontech) pomocí PCR. C-koncový epitopový přívěsek c-myc se přidá bezprostředně po směru stop kodonu genu (aminokyselinová sekvence: PEQKLISEEDL) pro pozdější vhodnou detekci GalT pomocí western blot. Po potvrzení správné sekvence GalT se gen vloží pod kontrolu promotoru MPSV a přidá se syntetický králičí β-globinový polyadenylační signál. Finální expresní vektor GalT rovněž obsahuje separátní rezistenci na puromycin pro selekci, s genem rezistence na puromycin také pod kontrolou promotoru MPSV a syntetického králičího β-globinového polyadenylačního signálu.
Náhrada aminokyselin kódujících lokalizační doménu GalT aminokyselinami kódujícími lokalizační doménu lidské GnTI
Konstrukce tohoto hybridního genu galaktózyltransferázy se provádí například překrýváním reakcí PCR, vedoucím k plazmidu obsahujícímu fůzi GnTI-GalT pod kontrolou promotoru MPSV a kazety rezistence k puromycinu pro selekci.
Náhrada aminokyselin kódujících lokalizační doménu GalT aminokyselinami kódujícími lokalizační doménu lidské manózidázy II
Provede se konstrukce expresního genu GalT. Výsledný plazmid obsahuje hybridní gen ManlIGalT pod kontrolou promotoru MPSV.
Kombinace hybridního fuzního genu Manil-GalT s replikačním zdrojem oriP z viru EpsteinBarrové
Fragment DNA s oriP se subklonuje, jak je popsáno výše v příkladu 1, do hybridního expresního vektoru Manil-GalT popsaného výše.
Kombinace hybridního fuzního genu ManlI-GalT a zkráceného markerového genu buněčného povrchu
- 56CZ 308720 B6
Expresní vektor se modifikuje pro dodatečnou expresi zkráceného markerového genu buněčného povrchu. Stručně se expresní kazeta hybridního fúzního genu ManlI-GalT konvertuje z monocistronické na bicistronickou expresní kazetu zavedením prvku polioviru IRES po směru od stop kodonu fúze ManlI-GalT, následovaným cDNA kódující zkrácený lidský protein CD4 (obsahující lidskou leader sekvenci pro sekreci, následovanou transmembránovou a extracelulámí doménou).
3. Transfekce savčích buněk expresními vektory fúzním GalT a protilátky
Transfekce buněk BHK
Exponenciálně rostoucí buňky (životaschopnost 90 až 95 %) se kultivovaly, sklidily a následně transfekovaly, jak je popsáno v příkladu 1. Pro produkci protilátek se sestrojenými glykosidy se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátky a druhým pro expresi fúzního polypeptidu GalT v poměru 3:1.
Transfekce buněk HEK293-EBNA
Exponenciálně rostoucí buňky HEK293-EBNA se transfekují, jak je popsáno v příkladu 1. Pro produkci protilátek se sestrojenými glykosidy se buňky kotransfekují dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátky a druhým pro expresi fúzního polypeptidu GalT v poměru 4:1. Pátý den po transfekci se supernatant sebere, centrifúguje se 5 minut při 1200 ot/min, následováno druhou centrifúgací 10 min. při 4000 ot/min a skladuje se při 4 °C.
Generování stabilní savčí buněčné linie exprimující rekombinantní protilátku anti-CD20 a fúzní GalT
Klon BHK-1502-28, konstitutivně exprimující geny monoklonální protilátky anti-CD20 a geny rezistence k neomycinu, se transfekuje expresním vektorem elektroporací. Vektor dovoluje konstitutivní expresi genu ManlI-GalT a zkrácenou formu lidského CD4, který je exprimován v závislosti na IRES. Vektor dovoluje konstitutivné expresi genu ManlI-GalT a zkrácené formy lidského CD4, jehož exprese je závislá na IRES. Vektor také obsahuje genovou expresní kazetu rezistence k puromycinu. Nejprve se selektují klony rezistentní na puromycin, aby se získala sada klonů, které chromozomálně integrovaly vektorovou DNA. U klonů se poté zjistí povrchová exprese zkrácené CD4 (tCD4), která slouží jako marker úrovně exprese expresní jednotky bicistronického genu Manil-GalT+CD4. Produkce rekombinantní protilátky selektovaných klonů se ověří použitím stanovení ELISA.
Transfekce a následné stanovení úrovně exprese tCD4 se provede tak, jak je popsáno v příkladu 1.
4. Produkce apurifikace nemodifikované protilátky a protilátky se sestrojenými glykosidy
V případě buněk BHK, transfekovaných expresním vektorem protilátky, nebo kotransfekovaných expresním vektorem protilátky plus fúzním expresním vektorem GalT, se sbírá kultivační supernatant po kultivaci transfekovaných buněk 96 hodin po transfekci. V závislosti na očekávané produktivitě se pro stejný vektor provede několik (10 až 15) elektroporací.
V případě buněk HEK293-EBNA transfekovaných expresním vektorem protilátky, nebo kotransfekovaných expresním vektorem protilátky plus fúzním expresním vektorem GalT, se kultivační médium nahradí čerstvým kultivačním médiem přibližně 16 hodin po transfekci a druhé médium se poté sbírá po kultivaci transfekovaných buněk po dalších 120 hodin.
Pro stabilní buněčnou linii BHK-1502-28-11 se kultivační médium naočkuje 500 000 buněk/ml a supernatant se sbírá po 4 dnech kultivace.
- 57CZ 308720 B6
Purifikace protilátky
Monoklonální protilátka se purifikuje z kultivačního supematantu s použitím dvou následných chromatografických stupňů, chromatografíe Protein A a kationtové iontoměničové chromatografíe, jak je popsáno v příkladu 1.
5. Analýza oligosacharidů
Oligosacharidy se enzymaticky odštěpí z protilátek rozkladem PNGázou F, kde se protilátky buď imobilizují na membráně PVDF, nebo v roztoku.
Výsledný roztok po štěpení, obsahující uvolněné oligosacharidy, se buď připraví přímo pro analýzu MALDI/TOF-MS, nebo se dále štěpí glykosidázou Endo H před přípravou vzorku na analýzu MALDI/TOF-MS. Způsob uvolnění oligosacharidů pro protilátky imobilizované na membráně PVDF a způsob uvolnění oligosacharidů pro protilátky v roztoku se prováděly tak, jak je popsáno v příkladu 1.
Použití štěpení endoglykosidázou H na oligosacharidy uvolněné PNGázou F pro určení struktur hybridních galaktózylovaných oligosacharidů vzhledem k neutrálním oligosacharidovým pikům MALDI/TOF-MS
Oligosacharidy uvolněné PNGázou F se následně štěpí endoglykosidázou H (EC 3.2.1.96), jak je popsáno v příkladu 1.
MALDI/TOF-MS
Vzorky obsahující enzymatické výtažky, obsahující uvolněné oligosacharidy, se připravily a následně analyzovaly na hmotovém spektrometru MALDI/TOF-MS, jak je popsáno v příkladu 1.
Příprava a izolace buněk
Mononukleámí buňky periferní krve (PBMC) se připravily pomocí Hisopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178, USA) v podstatě podle instrukcí výrobce a protokolu popsaného v příkladu 1.
Lidské buňky NK se izolují z PBMC aplikací negativní selekční procedury, jak je popsána v příkladu 1.
8. Stanovení ADCC
PBMC nebo NKjako efektorové buňky se připraví jak je popsáno výše a stanoví se jejich schopnost zprostředkovat cytotoxicitu ve stanovení celulámí cytotoxicity závislé na protilátce (ADCC), jak je popsáno v příkladu 1.
9. Navázání FcyRIIIA na buňky NK a navázání FcyRIIb na lymfomové buňky Ráji
Navázání FcyRIIIA na čerstvě izolované buňky NK a navázání FcyRIIb na lymfomové buňky Ráji se určí, jak je popsáno v příkladu 1.
10. Stanovení cytotoxicity závislé na komplementu
Stanovení cytotoxicity závislé na komplementu se provádějí s použitím zředění protilátek, jak je popsáno v příkladu 1.
Výsledky a diskuze
- 58CZ 308720 B6
Stanovení se provádějí tak, aby se demonstroval vliv exprese polypeptidů kódovaných geny s aktivitou GalT na životaschopnost buněk, růst buněk nebo produkci protilátek ve vztahu k buňkám neprodukujícím takové polypeptidy.
Vyčištěné protilátky se analyzují na jejich glykozylační profil pomocí MALDI/TOF-MS, jak je popsáno v příkladu 1. S použitím této techniky je možné určit podíl různých druhů oligosacharidů z celku, původní populaci oligosacharidů Fc, a je také možné přiřadit struktury různým pikům ve spektru (Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)).
Určí se oligosacharidový profil nemodifikované protilátky. Specificky se určí, jestli sestrojení buněk produkujících protilátku expresí GalT divokého typu vede zejména ke galaktózylovaným, v jádru fůkózylovaným komplexním dvouvláknovým oligosacharidům. Určí se také, jestli sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid GnTI-GalT, kde katalytická doména GalT je lokalizované přes Golgiho doménu GnTI, vede hlavně ke galaktózylovaným komplexním dvouvláknovým oligosacharidům ve vztahu k divokému typu GalT. Jestliže se syntetizují galaktózylované nefůkózylované agalaktózylované hybridní struktury, mohou být výsledkem kompetice mezi GalT a jinými galaktózyltransferázami nebo glykosidázami. Očekává se, že jakmile je oligosacharid modifikován galaktózou reakcí katalyzovanou GalT, pak nemohou a-l,6-fůkózyltransferáza, Golgiho a-manózidáza II (Manil) a GnTII dále působit modifikaci galaktózylovaných oligosacharidů.
Štěpení glykosidázou Endo H, které může rozlišit mezi hybridními a komplexními oligosacharidy, se používá pro vyhodnocení podílu galaktózylovaných nefůkózylovaných a galaktózylovaných hybridních oligosacharidů, připojených k Fc.
Prováděly se testy, aby se určilo sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid Manil-GalT, kde katalytická doména GalT je lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, což vede zejména ke galaktózylovaným nefůkózylovaným a galaktózylovaným hybridním oligosacharidům. Určovalo se specificky, zda fuze ManlI-GalT je účinnější v syntéze galaktózylovaných nefůkózylovaných a galaktózylovaných hybridních oligosacharidů, připojených k Fc, vzhledem ke GalT divokého typu a k fúzi GnTI-GalT.
Jak je uvedeno výše, endoglykosidáza H (Endo H) se používá pro potvrzení stanovení galaktózylovaných nefůkózylovaných a galaktózylovaných hybridních struktur různých píků oligosacharidů, pozorovaných v profilech MALDI. Určují se procentická zastoupení struktur oligosacharidových galaktózových zbytků, které jsou nefůkózylované hybridní struktury, fúkózylované hybridní a fúkózylované komplexní oligosacharidové struktury.
Určuje se vliv úrovně exprese GalT a konkrétní lokalizační domény, která se používá k zacílení katalytické domény GalT ke Golgiho aparátu a konkrétní katalytické domény, která se použije k zacílení katalytické domény ke Golgiho aparátu, na kompetici pro oligosacharidové substráty modifikované GnTI mezi rekombinantní katalytickou doménou GalT a enzymy endogenní jádrovou a-l,6-fukózyltransferázou, Manil a GnTII. Určuje se úroveň buněčné cytotoxicity závislé na protilátce (ADCC), která je výsledkem nadměrné exprese nukleové kyseliny kódující polypeptid s aktivitou GalT, který je lokalizován v Golgiho aparátu v buňkách produkujících protilátku přes různé lokalizační domény.
Určuje se také, jestli protilátky se sestrojenými glykosidy produkované expresí nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid s aktivitou GalT v buňkách produkujících protilátku zvýšily vazebnou afinitu k lidskému aktivujícímu receptoru Fc Fc/RIIIA nebo inhibujícímu Fc/RIIb.
Konstrukty GalT zkompletují aktivitu endogenní a-1,6 jádrové fúkózyltransferázy, sestrojení glykosidů oblasti Fc protilátky, a následně zvýšení ADCC.
- 59CZ 308720 B6
Určuje se oligosacharidový profil protilátky anti-CD20, produkované z buněk BHK rostoucích v suspenzi a sestrojených pro konstitutivní expresi vysoké úrovně jak rekombinantní protilátky, tak fúzního polypeptidu s aktivitou GalT. Určuje se také relativní procentické zastoupení oligosacharidů monoklonální protilátky se sestrojenými glykosidy produkované stabilní buněčnou linií BHK-1502-28-11.
Příklad 5
Materiály a metody
1. Konstrukce expresních vektorů Manil a GnTII
Pro konstrukci expresního vektoru Manil se subklonovala cDNA lidské manózidázy II (SEQ ID NO: 17) do plazmidu expresního vektoru po směru od promotoru MPSV a proti směru od syntetického králičího β-globinového polyadenylačního signálu. Pro expresi GnTII se použije plazmid expresního vektoru s lidskou cDNA GnTII, subklonovanou po směru od lidského promotoru/enhanceru CMV a proti směru od hovězího polyadenanylačního signálu růstového hormonu.
Kombinace expresních vektorů s oriP replikačního původu z viru Epstein-Barrové
Fragment DNA s oriP se subklonoval, jak je popsáno v příkladu 1, do expresního vektoru Manil popsaného výše za vzniku expresního vektoru pCLF9. Fragment DNA s oriP se subklonoval, jak je popsáno v příkladu 1, do expresního vektoru GnTII popsaného výše za vzniku expresního vektoru GnTII pGnTII.
2. Transfekce buněk HEK293-EBNA
Exponenciálně rostoucí buňky HEK293-EBNA se transfekovaly, jak je popsáno v příkladu 1. Pro produkci nemodifikované protilátky „Cwt“ se buňky transfekovaly expresním vektorem (pETR1520) protilátky. Pro produkci protilátky „Cbrt“ se sestrojenými glykosidy se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETRl520) a druhým pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII (pETR1519) v poměru 4:1. Pro produkci protilátky se sestrojenými glykosidy „Cm“ se buňky kotransfekovaly třemi plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520), druhým pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII (pETR1519) a třetím pro expresi manózidázy II (pCLF9) v poměru 3:1:1. Pro produkci protilátky se sestrojenými glykosidy „Cmg“ se buňky kotransfekovaly čtyřmi plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520), druhým pro expresi fúzního polypeptidu GnTIII (pETR1519), třetím pro expresi manózidázy II (pCLF9) a čtvrtým pro expresi GnTII (pGnTII) v poměru 4: 0,33:0,33:0,33.
3. Produkce a purifikace protilátek nemodifikovaných a se sestrojenými glykosidy
Kultivační médium transfekovaných buněk uvedených výše se nahradilo čerstvým kultivačním médiem přibližně 16 hodin po transfekci a druhé médium se poté sbíralo po kultivaci transfekovaných buněk po dalších 120 hodin. Sebrané supematanty se centrifugovaly 5 minut při 1200 ot/min, následováno druhou centrifugací 10 min při 4000 ot/min a skladovaly se při 4 °C.
Purifikace protilátky
Monoklonální protilátky se purifikovaly z kultivačních supematantů za použití dvou postupných chromatografických stupňů, chromatografie Protein A a kationtové iontoměničové chromatografie, jak je popsáno v příkladu 1. Pro protilátky cwt7, cbrt5 a cml se dodatečně použil stupeň gelové chromatografie s použitím kolony Sephadex 200 (Amersham Pharmacia) a přidal se solný fosfátový pufr po kationtovém iontoměničovém stupni, a shromažďoval se pík monomemí protilátky.
-60CZ 308720 B6
4. Analýza oligosacharidů
Oligosacharidy se enzymaticky uvolnily z protilátek v roztoku štěpením PNGázou, jak je popsáno v příkladu 1.
Použití štěpení oligosacharidů uvolněných PNGázou F pomocí endoglykosidázy H pro přiřazení hybridních rozdělených oligosacharidových struktur neutrálním oligosacharidovým pikům MALDI/TOF-MS
Oligosacharidy uvolněné PNGázou F se následně rozštěpily endoglykosidázou H (EC 3.2.1.96), jak je popsáno v příkladu 1.
MALDI/TOF-MS
Vzorky obsahující enzymatické výtažky obsahující uvolněné oligosacharidy se připravily a následně změřily na hmotovém spektrometru MALDI/TOF, jak je popsáno v příkladu 1.
5. Příprava buněk a izolace
Mononukleámí buňky periferní krve (PBMC) se připravily pomocí Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178, USA) v podstatě podle instrukcí výrobce a protokolu popsaného v příkladu 1.
6. Izolace buněk NK
Lidské buňky NK se izolují z PBMC aplikací negativní selekční procedury, jak je popsána v příkladu 1.
7. Stanovení ADCC
PBMC nebo NKjako efektorové buňky se připraví jak je popsáno výše a stanoví se jejich schopnost zprostředkovat cytotoxicitu ve stanovení celulámí cytotoxicity závislé na protilátce (ADCC), jak je popsáno v příkladu 1.
8. Navázání FcyRIIIA na buňky NK
Navázání FcyRIIIA na čerstvě izolované buňky NK a navázání FcyRIIb se určí, jak je popsáno v příkladu 1.
9. Stanovení cytotoxicity závislé na komplementu
Stanovení cytotoxicity závislé na komplementu se provádějí s použitím zředění protilátek způsobem popsaným v příkladu 1, s následující modifikací pro přípravu zdroje lidského komplementu. Stměné řečeno, připraví se normální lidské sérum (NHS) z krve zdravých dobrovolníků. Krev se ponechá srážet 1 hodinu a poté se centrifůguje při 1200 g po 12 min. Bezbuněčné supematantní sérum se rozdělí a skladuje při -80 °C. NHS se použije při 20 % konečného objemu stanovení.
Výsledky a diskuze
Verze chimémí protilátky anti-CD20 se sestrojenými glykosidy (chimémí protilátka C2B8, rovněž známá jako rituximab) se vyrobila kotransfekováním kultur savčích buněk vektory pro expresi genů protilátky a vektory pro expresi genů kódujících polypeptidy s aktivitou GnTIII a manózidázy II. Další verze protilátky se sestrojenými glykosidy se rovněž připravily kontransfekováním kultur
-61 CZ 308720 B6 savčích buněk vektory pro expresi genů protilátky, kódujícími polypeptidy s aktivitou GnTIII, manózidázy II a GnTII. Pro protilátku se sestrojenými glykosidy „Cbrt“ se buňky kotransfekovaly dvěma plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520) a druhým pro expresi fuzního polypeptidu GnTIII (pETR1519). Pro protilátku se sestrojenými glykosidy „Cm“ se buňky kotransfekovaly třemi plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520), druhým pro expresi fuzního polypeptidu GnTIII (pETR1519) a třetím pro expresi manózidázy II (pCLF9). Pro protilátku se sestrojenými glykosidy „Cmg“ se buňky kotransfekovaly čtyřmi plazmidy, jedním pro expresi protilátky (pETR1520), druhým pro expresi fuzního polypeptidu GnTIII (pETR1519), třetím pro expresi manózidázy II (pCLF9) a čtvrtým pro expresi GnTII (pGnTII). Nemodifikovaná verze (s nesestrojenými glykosidy) téže protilátky „Cwt“ se vyrobila transfekováním savčích buněk pouze vektorem genu pro expresi protilátky. Transfekované buňky se kultivovaly pět dní a vyloučené rekombinantní protilátky se vyčistily od kultivačního média. Exprese genů kódujících polypeptidy s aktivitou GnTIII a Manil nemělo podstatný účinek na životaschopnost buněk, růst buněk nebo produkci protilátky ve vztahu k buňkám neprodukujícím takovéto polypeptidy glykozyltransferázy nebo glykosidázy.
Vyčištěné protilátky se poté analyzovaly na jejich glykozylační model. Protilátky nesou Npřipojené oligosacharidy připojené pouze ke zbytku Asn297 oblasti Fc lidského IgGl. Oligosacharidy se enzymaticky odstranily z protilátek štěpením PNGázou F a následně se analyzovaly MALDI/TOF-MS. Použitím této techniky je možné určit podíly různých druhů oligosacharidů na celkové populaci původních oligosacharidů Fc, a je rovněž možné připsat struktury jednotlivým pikům ve spektru (Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180(1999))
Obrázek 26 ukazuje profil MALDI/TOF-MS neutrálního oligosacharidů z nemodifikované rekombinantní protilátky IgGl anti-CD20 C2B8 Cwt. Jak bylo předtím popsáno pro nemodifikovanou protilátku v příkladu 1, obrázek 5, Cwt měla typický oligosacharidový profil, s píky při poměrech m/z 1485, 1648 a 1810, které jsou konzistentní s dvouvláknovými, v jádře fůkózylovanými komplexními oligosacharidy s 0, 1 a 2 galaktózovými zbytky. Sestrojení buněk produkujících protilátku expresí nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid ManlI-GnTIII, kde je katalytická doména GnTIII lokalizované přes Golgiho lokalizační doménu Manil, vede k produkci protilátky (Cbrt), kde je většina oligosacharidů Fc rozdělených nefůkózylovaných hybridních (viz obr. 27). Jak je popsáno v příkladu 1, endoglykosidáza H (Endo H) se použila pro připsání rozdělené nefůkózylované a rozdělené hybridní struktury různým pikům oligosacharidů, pozorovaným v profilech MALDI.
Sestrojení buněk produkujících protilátku koexpresí nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid ManlI-GnTIII, kde je katalytická doména GnTIII lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, a nukleové kyseliny kódující Manil, vede k produkci protilátky (Cm), kde většina oligosacharidů Fc byla rozdělených nefůkózylovaných hybridních (viz obr. 28). Sestrojení buněk produkujících protilátku koexpresí nukleové kyseliny kódující fůzní polypeptid ManlI-GnTIII, kde je katalytická doména GnTIII lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil, nukleové kyseliny kódující Manil a nukleové kyseliny kódující GnTII, vede k produkci protilátky (Cmg), kde většina oligosacharidů Fc je rozdělených nefůkózylovaných komplexních, s podílem rozdělených nefůkózylovaných komplexních oligosacharidů připojených k Fc dokonce vyšším než u protilátky Cm.
Obrázek 29 ukazuje údaje, demonstrující zvýšenou cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC), která je výsledkem exprese nukleové kyseliny kódující fůzní polypeptid ManlI-GnTIII, kde je katalytická doména GnTIII lokalizovaná přes Golgiho lokalizační doménu Manil v buňkách produkujících protilátku, kde je nukleová kyselina kódující ManlI-GnTIII exprimována buď samotná (protilátka Cbrt), nebo koexprimovaná v buňkách produkujících protilátku společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm). Proto zvýšená úroveň rozdělených nefůkózylovaných oligosacharidů buď hybridního nebo komplexního typu v oblasti Fc protilátek se sestrojenými glykosidy vede ke zvýšené aktivitě ADCC.
-62CZ 308720 B6
O zabíječských buňkách (NK) je známo, že jsou významnými mediátory ADCC. Tyto buňky nesou na svém povrchu aktivující receptor Fc/RIIIA. rovněž známý jako CD16A. Navázání oblasti Fc protilátek navázaných na cílové buňky k receptorům Fc/RIIIA na buňkách NK je podstatné pro propojení těchto receptorů na buňce NK a následné indukci ADCC. Proto je důležité vyhodnotit navázání protilátek vyrobených způsoby popsanými zde na receptory Fc, zejména na receptory v jejich přirozené formě, ve které se projevují na lidských imunoefektorových buňkách. Obrázek 30 ukazuje, že protilátky se sestrojenými glykosidy produkované expresí nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid s aktivitou GnTIII v buňkách produkujících protilátky, exprimované buď samotné (protilátka Cbrt), nebo koexprimované v buňkách produkujících protilátky společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (Cm), mají zvýšenou vazebnou afinitu k lidskému aktivujícímu receptorů Fc Fc/RIIIA. Jak je uvedeno výše pro stanovení ADCC, tyto protilátky mají zvýšené úrovně rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, které jsou výsledkem exprese fúzního polypeptidů s aktivitou GnTIII v buňkách produkujících protilátku.
Proto zvýšení úrovně rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů buď hybridního, nebo komplexního typu v oblasti Fc protilátek se sestrojenými glykosidy vede ke zvýšené aktivitě ADCC. Buňky NK použité v tomto stanovení byly z dárce genotypu, který neexprimuje receptor Fc/RIIc v jeho buňkách NK (Metes, D. et al. J. Immunol. Methods 258(1-2):85-95(2001)). Proto jediným receptorem Fc na povrchu těchto buněk je aktivující receptor Fc/RIIIA.
Vazebná doména aktivujícího receptorů Fc/RIIIB je téměř identická s vazebnou doménou Fc/RIIIA. Proto výše uvedené údaje také ukazují, že protilátky se sestrojenými glykosidy zde popsané mohou vést ke zvýšeným efektorovým fúnkcím, zprostředkovaným efektorovými buňkami projevujícími Fc/RIIIB. jako polymorfonukleámí buňky (PMN), včetně uvolnění toxických produktů a fagocytózy (Reff, M. E.a Heard, C. Crit Rev Oncol Hematol. 40(1):2535(2001), Daeron, F. M. Annu. Rev. Immunol. 15:203-34(1997), Ravtech, J. V. a Boland S. Annu. Rev. Immunol. 19:275-90(2001)).
Cbrt, protilátka anti-CD20, produkovaná v buňkách sestrojených pro expresi nukleové kyseliny, kódující fůzní polypeptid s aktivitou GnTIII a lokalizovaný v Golgiho aparátu přes lokalizační doménu Manil, se také testovala na lýzi zprostředkovanou komplementem (CML), odlišnou efektorovou funkci, která není závislá na receptorech Fc imunoefektorových buněk. Velká většina oligosacharidů této protilátky se sestrojenými glykosidy byla rozděleného nefúkózylovaného typu. Pro protilátku Cbrt byla pozorována snížená aktivita CML ve srovnání s nemodifikovanou protilátkou Cwt (obrázek 31). Pro některé aplikace mohou být vhodné protilátky za zvýšenou ADCC, ale se sníženou CML, například pro snížení vedlejších účinků, jako je zánět cév v místě nádoru zprostředkovaný CML. Byly pozorovány další významné vedlejší účinky zprostředkované CML pro léčbu protilátkami anti-CD20 (van der Kolk L. E. etal. Br J Haematol. 115 (4):807-11 (2001)). Avšak je možné produkovat protilátky se sestrojenými glykosidy se zvýšenou aktivitou ADCC a vazností na Fc/RIII. ale bez podstatně snížené aktivity CML relativně k nemodifikované protilátce, jako je to v případě protilátky Cm (obr. 31). Takové protilátky by byly žádoucí pro aplikace, kde maximální eliminace cílových buněk vyžaduje jak vysokou aktivitu ADCC, tak vysokou aktivitu komplementu a aktivitu CML. Oligosacharidové profily popsané výše ukazují, že je možné sestrojit buňky tak, aby produkovaly protilátky, kde většina oligosacharidů připojených k Fc je rozděleného nefúkózylovaného komplexního typu namísto hybridního typu, koexprimací fúzního polypeptidů GnTIII společně s nukleovou kyselinou kódující Manil (protilátka Cm), nebo společně s nukleovou kyselinou kódující Manil a nukleovou kyselinou kódující GnTII (protilátka Cmg). Protilátky se sestrojenými glykosidy mají zvýšenou aktivitu ADCC a sníženou vazebnou afinitu k Fc/RIII. která je v korelaci s jejich zvýšenou úrovní rozdělených nefukózylovaných oligosacharidů, zatímco jejich aktivita CML je zvýšená tak, jak podíl komplexních oligosacharidů ve vztahu k podílu hybridních oligosacharidů.
Tento a předchozí příklady popisovaly expresi nukleových kyselin kódujících fůzní polypeptidy, kde fůzní polypeptid je lokalizován ke Golgiho aparátu a má katalytickou doménu, která soutěží
-63CZ 308720 B6 s endogenními fukózyltransferázami o oligosacharidové akceptory předtím modifikované přes reakce katalyzované GnTI. Rekombinantní glykoproteiny produkované takto sestrojenými hostitelskými buňkami mají zvýšenou úroveň nefukózylovaných oligosacharidů. Tento příklad demonstruje, že koexprese nukleových kyselin kódujících Manil a/nebo GnTII společně s nukleovou kyselinou kódující výše uvedený fúzní polypeptid v takových hostitelských buňkách vede ke zvýšení biosyntetického proudu směrem ke komplexním namísto hybridním oligosacharidům a proto k syntéze glykoproteinů se zvýšenou úrovní nefukózylovaných komplexních oligosacharidů ve vztahu ke glykoproteinům produkovaným v buňkách nekoexprimujících nukleové kyseliny kódující Manil a/nebo GnTII.
Příklad 6
Overexprese a-manózidázy
Molekulární klonování
Lidská a-manózidáza 2
Gen kódující lidskou a-manózidázu II („hManlI“) (E.C.3.2.1.114) (SEQ ID NO: 17) pod kontrolou promotoru MPSV se klonoval do expresního vektoru obsahujícího prvek OriP. Výsledný expresní vektor pCLF9 je ukázán na obrázku 32A. Expresní vektory kódující lehký a těžký řetězec monoklonální protilátky anti-CD20 byly jednotlivě pETR1842 apETR1843 (obrázky 32B a 32C).
Fúzní protein ManlI-GalT
Fúzní protein (SEQ ID NO:20), obsahující Manil CTS a katalytickou doménu β1,4—galaktózyltranferázy (M22921, aminokyseliny 126-397) se zkonstruovaly, jak je uvedeno níže. Oblast hManlI CTS se amplifikovala pomocí PCR z pETR1484 (CF33, GAB252). Katalytická doména GalT (aminokyseliny 196-397) se amplifikovala s použitím CF31 a CF35 z pBlueGalT. HManlI CTS se kombinovala s katalytickou doménou GalT, aby se získal fúzní protein kontrolovaný promotorem MPSV (pCLF24). Celý gen GalT se získal z pBlueGalT. Gen kódující GalT se sekvencoval (SEQ ID NO: 16):
MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSRLPQLVGVST PLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPV PHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKV AIIIPFRNRQELHKYWLYYLHPVLQRQQLDYGYIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALK DYDYCFVSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFL TINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFD RIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS
5‘ konec GalT se amplifikoval CF32/CF38 a před gen se přidalo restrikční místo Fsel. Sekvence byla ověřena sekvencováním jako správná a vyměněna v pCLF24 štěpením Fsel/DralII (pCLF26). K pCLF24 apCLF26 se přidal oriP, aby se generovaly jednotlivě pCLF25 apCLF27 (obrázky 33A a33B).
Exprese α-manózidázy a ManlI-GalT v buňkách HEK293-EBNA
Buňky Hek293-EBNA se transfekovaly kalciumfosfátovou metodou. Stručně, pro transfekci TI50 se naočkovalo 15 miliónů buněk 24 hodin před transfekci do 28 ml DMEM, 10 % FCS, 250 pg/ml neomycinu a inkubovaly se při 37 °C, 5 % CO2 přes noc.
Pro každou baňku TI50, která měla být transfekována, se připravil roztok DNA, CaC12 a vody mícháním 94 pg celkové DNA, 469 μΐ 1 M roztoku CaC12, a přidáním vody do celkového objemu 938 μΐ. K tomuto roztoku se přidalo 938 μΐ roztoku 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM
-64CZ 308720 B6
Na2HPO4 při pH 7,04 a míchalo se okamžitě 10 s a nechalo stát při teplotě místnosti 20 s. Suspenze se zředila 24 ml DMEM doplněným 2 % FCS a přidalo se do T150 namísto existujícího média. Buňky se inkubovaly při 37 °C, 5 % CO2 17 až 20 hodin a médium se nahradilo 30 ml DMEM, 10% FCS.
Pro testování účinku a-manózidázy II na kompetici s jádrovou fůkózyltransferázou se buňky transfekovaly pETR1842, pETR1843 apCLF9 v poměru 2:2: 1. Pátý den po transfekci se sebral supernatant, centrifůgoval se 5 min. při 1200 ot/min, následováno druhou centrifiigací po 10 min. při 4000 ot/min, zfiltroval se a skladoval při 4 °C.
Purifikace monoklonální protilátky anti-CD20
Monoklonální protilátka se purifikovala z 30 ml supematantu dvoustupňovou chromatografií, zahrnující první stupeň chromatografíe Protein A, aby se oddělila monoklonální protilátka od hovězí protilátky přítomné v séru, následováno kationtovou iontoměničovou chromatografií, aby se ve vzorku zaměnil pufr za PBS.
Analýza oligosacharidů
Štěpení PNGázou F
Vzorek monoklonální protilátky (50 pg) se inkuboval s N-glykosidázou F (rekombinantní, Roche, Švýcarsko) při 0,1 mU/μΙ. Štěpení se provádělo v 2mM pufru Tris, pH 7,0 po 3 hodiny při 37 °C. Uvolněné neutrální oligosacharidy se pak inkubovaly v 150 mM kyselině octové po 3 hodiny při teplotě místnosti. Vzorky se poté odsolily pomocí 0,6 ml kationtového iontoměniče (AG 50 WX8, kyselá forma, 100-200 mesh, BioRad, Hercules, CA, USA), plněném do chromatografické mikrokolony bio-spin (BioRad, CA, USA).
Digesce Endo H
Oligosacharidy uvolněné PNGázou F se štěpily endoglykosidázou H (EC 3.2.1.96, Roche, Švýcarsko) enzymem štěpícím mezi N-acetylglukózaminovými zbytky chitobiózového jádra Npřipojených oligosacharidů, před působením kyselinou octovou. Enzym štěpí oligomanózu a většinu glykanů hybridního typu, zatímco oligosacharidy komplexního typu nejsou hydrolyzovány.
Oligosacharidy byly štěpeny pomocí 0,2 mU/ml endoglykosidázy H v 2mM Tris, pH 7,0. Štěpení se provádělo při 37 °C po 3 hodiny. Oligosacharidy se inkubovaly 3 hodiny při teplotě místnosti ve 150mM kyselině octové, a následně se odsolily pomocí 0,6 ml kationtového iontoměniče (AG 50 W-X8, kyselá forma, 100-200 mesh, BioRad, Hercules, CA, USA), plněném do chromatografické mikrokolony bio-spin (BioRad, CA, USA).
Příprava matrice a vzorku
Matrice kyseliny 2,5-dihydroxybenzoové (sDHB) se připravila rozpuštěním 2 mg kyseliny 2,5dihydroxybenzoové + 0,1 mg kyseliny 5-methoxysalicylové v 1 ml ethanol/10 mM vodný chlorid sodný 1 : 1 (obj.). 1 pl vzorku se nanesl na terčík z nerezové oceli a smíchal se s 1 μΐ matrice sDHB. Vzorky se vysušily na vzduchu a naneslo se 0,2 μΐ ethanolu.
Analýza MALDI/TOF
Hmotový spektrometr MALDI/TOF, použitý k získání hmotových spekter, byl Voyager Elite (Perspective Biosystems), vybavený zpožděnou extrakcí. Přístroj byl provozován v reflexním módu. Pozitivní ionty se akcelerovaly na 20 kV po zpoždění 75 ns. Pro získání konečného spektra
-65CZ 308720 B6 se zkombinovalo pět spekter po 40 záběrech (200 záběrů). Pro přiřazení hmot iontů se použila externí kalibrace používající oligosacharidové standardy.
Oligosacharidový profil
Oligosacharidový profil protilátky anti-CD 20, produkované v přítomnosti Manil, je ukázán na obr. 34. Nalezené oligosacharidy připojené k části Fc protilátky jsou komplexní struktury, z nichž 48 % postrádá jádrovou fůkózu. a-manózidáza II soutěží s jádrovou fůkózyltransferázou, čímž generuje 48 % nefukózylovaných oligosacharidových struktur. V nepřítomnosti a-manózidázy II jsou oligosacharidy části Fc protilátky složeny pouze z fukózylovaných struktur (protilátka divokého typu).
Oligosacharidový profil protilátky anti-CD20, produkované v přítomnosti fúzního proteinu ManlIGalT, jsou ukázány na obrázku 35 A-B. Jak pro a-manózidázu II, tak v případě fúzního proteinu ManlI-GalT, se množství nefukózylovaných oligosacharidových struktur zvyšuje. Vysoké procentické zastoupení nefukózylovaných struktur spočívá ve strukturách s vysokým obsahem manózy (m/z 1256, 1419 a 1581). K těmto 67 % nefukózylovaných cukrů bylo nalezeno dalších 30 % hybridních nefukózylovaných struktur (m/z 1622). Proto vzorek produkovaný v přítomnosti fúzního proteinu ManlI-GalT vykazuje téměř 100 % nefukózylovaných struktur.
Biologická aktivita protilátek produkovaných v přítomnosti α-manózidázy II nebo fúzního proteinu ManlI-GalT
Aby se určil účinek působení enzymů α-manózidázy II a ManlI-GalT vkompetici s jádrovou fůkózyltransferázou, provedla se odpovídající biologická stanovení. Vzorky se testovaly in vitro na buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátce (ADCC) a na navázání receptoru CD 16, exprimovaného na povrchu sestrojené buněčné linie CHO (CHO-1708-37).
Vazba IgG na CHO-1708-37
Buněčná linie CHO-1708-37 exprimuje na svém povrchu receptor Fc/RIIIA (CD16) a řetězec γ receptoru Fc/RI. Exprese receptoru Fc/RIIIA (CD 16) se určila analýzou FACS s použitím monoklonální protilátky 3G8-FITC (obrázek 36). Buňky CHO-1708-37 se inkubovaly při 1 mil. buněk/ml v PBS, 0,1 % BSA s různými variantami protilátek při různých koncentracích (10, 3, 1, 0,3, 0,1 pg/ml) a třikrát. Buňky se inkubovaly 30 min. při 4 °C a následně se promyly PBS, 0,1 % BSA. Navázání protilátky se detekovalo inkubací s 1 : 200 kozím antihumánním IgG, konjugovaným s fluorescein-izothiokyanátem fluoresceinem F(ab‘)2 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) po 30 min. při 4 °C. Intenzita fluorescence vztahující se k navázaným variantám protilátky se určila na přístroji FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), přičemž se vycházelo z živých buněk.
V pokusu stanovení vaznosti byly zahrnuty následující varianty protilátek:
Cwt8 (divoký typ 1)
Manil (α-manózidáza II)
Protilátky produkované v přítomnosti α-manózidázy II (Manil) se váží na receptor Fc/RIIIA s vyšší afinitou než divoké typy protilátek.
Celulámí cytotoxicita závislá na protilátce (ADCC) in vitro
Mononukleámí buňky periferní krve (PBMC) se připravily s použitím Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA) a následováním instrukcí výrobce. Stměné, žilní krev se odebrala heparinizovanými stříkačkami od dobrovolníků, kteří byli požádáni, aby běželi 1
-66CZ 308720 B6 minutu plnou silou, aby se zvýšilo procentické zastoupení zabiječských buněk (NK) v krvi. Krev se zředila 1 : 0,75 až 1,3 PBS neobsahujícím Ca nebo mg a navrstvila na Histopaque-1077. Gradient se centrifúgoval při 400 x g po 30 minut při teplotě místnosti bez přerušení. Mezifáze obsahující PBS se shromáždila a promyla PBS (50 ml na buňky ze dvou gradientů) a odstředila se při 300 x g po 10 minut při teplotě místnosti. Po resuspendaci pelety s PBS se PBMC spočítaly a promyly podruhé centrifůgací při 200 x g po 10 minut pň teplotě místnosti. Buňky se poté resuspendovaly ve vhodném médiu pro následné procedury.
Cílové buňky Ráji se promyly v PBS, spočítaly a resuspendovaly v DMEM, 10 % FCS, 1 % Glutamax při 1 miliónu buněk v ml. K nim se přidal calcein 1 : 100 a buňky se inkubovaly 30 min. při 37 °C. Buňky se poté promyly v PBS, spočítaly a resuspendovaly v AIM-V při 0,3 miliónu na ml. 100 pl této buněčné suspenze se přidalo na jamku 96jamkové destičky s kulatými dny. Protilátky se zředily v AIM-V, přidaly se v 50 μΐ k cílovým buňkám na destičce a ponechaly se navázat na cíle po 10 min. při teplotě místnosti. PBMC jako efektorové buňky se připravily, jak je popsáno výše. Poměr efektorů k cíli byl 25 : 1. Efektorové buňky se připravily při 15 miliónech v ml v médiu AIM-V a 50 μΐ se přidalo na jamku. Destička se inkubovala 4 hod. při 37 °C ve vlhčené atmosféře obsahující 5 % CO2. Buňky se promyly dvakrát v PBS a přidalo se 200 μΐ borátového roztoku. Zabíjení cílových buněk se vyhodnocovalo měřením kalceinu uvolněného v médiu po lýzi s borátovým roztokem (obr. 37).
Spontánní uvolňování se změřilo z jamek obsahujících pouze cílové a efektorové buňky, ale žádné protilátky. Maximální uvolňování se určilo z jamek obsahujících pouze cílové buňky a 1 % Triton X-100. Procentické zastoupení specifického zabíjení zprostředkovaného protilátkou se spočítalo následovně: ((x-SR)/(MR-SR)*100, kde x je střední hodnota Vmax při určité koncentraci protilátky, SR je střední hodnota Vmax spontánního uvolňování a MR je střední hodnota Vmax maximálního uvolňování.
Příklad 7
Použití monoklonální protilátky anti-EGFR se sestrojenými glykosidy pro léčení psoriázy
Lidští pacienti s psoriázou mohou být léčeni monoklonální protilátkou anti-EGFR se sestrojenými glykosidy, vyprodukovanou způsobem podle vynálezu. Pacienti dostávají zejména týdenní infúze protilátky se sestrojenými glykosidy v zátěžové dávce 400 mg/m2. Udržovací dávka 250 mg/m2 se podává na týdenní bázi, dokud není dosaženo úplné odpovědi.
Příklad 8
Použití protilátky anti-ErbB2 se sestrojenými glykosidy pro léčení rakoviny prostaty s metastázemi, rakoviny prsu s metastázemi, kolorektální rakoviny s metastázemi, a rakoviny plic jiných než malých buněk ve stadiu Illb nebo IV
RhuMAb 2C4 je humanizovaná monoklonální protilátka plné délky (produkovaná v buňkách CHO), směrovaná proti ErbB2. RhuMAb 2C4 blokuje propojení ErbB2 s ostatními členy skupiny ErbB, čímž inhibuje intracelulámí signalizaci cestou ErbB. RhuMAb 2C4 nejen inhibuje růst nádorů nadexprimujících ErbB2, ale také blokuje růst nádorů, které vyžadují signalizaci závislou na ligandu ErbB.
Forma RhuMAb 2C4 se sestrojenými glykosidy vyrobená způsobem podle předloženého vynálezu se může použít jako jediné činidlo pro léčení pacientů s rakovinou prostaty odolávající hormonům (nezávislou na androgenech), pacientů s rakovinou prsu s metastázemi, pacientů s kolorektální rakovinou s metastázemi a pacientů s rakovinou plic jiných než malých buněk ve stadiu Illb nebo IV. Konkrétně RhuMAb 2C4 se sestrojenými glykosidy se podává intravenózně (IV) týdně nebo každé tři týdny v jednotlivé dávce 2 až 4 mg/kg, dokud se pokrok choroby nezastaví. Protilátka se
-67CZ 308720 B6 podává jako vícedávková kapalná formulace (20 ml náplň při koncentraci 20 mg/ml nebo vyšší koncentraci).
Je jasné, že vynález se může praktikovat jinak, než je jednotlivě popsáno v předchozích popisech 5 a příkladech. Jsou možné četné modifikace a variace předmětného vynálezu ve světle výše uvedených sdělení a proto uvnitř rámce připojených nároků.
Celé odhalení všech publikací (včetně patentů, patentových přihlášek, časopiseckých článků, laboratorních manuálů, knih nebo jiných dokumentů) citovaných zde je tímto začleněno odkazem.

Claims (21)

1. Izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptid, kde fúzní polypeptid má aktivitu P(l,4)-N-acetylglukózaminyltransferázy III (GnT III) a obsahuje Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II-ManII.
2. Izolovaný polynukleotid podle nároku 1, kde izolovaný polynukleotid obsahuje sekvenci nukleové kyseliny alespoň z 90 % identické se sekvencí nukleové kyseliny SEQ ID No: 12, jak ukázáno na obr. 24.
3. Izolovaný polynukleotid podle nároku 2, kde izolovaný polynukleotid obsahuje sekvenci nukleové kyseliny SEQ ID NO: 12, jak ukázáno na obr. 24.
4. Expresní vektor obsahující izolovaný polynukleotid podle některého z nároků 1 až 3.
5. Hostitelská buňka obsahující izolovaný polynukleotid podle některého z nároků 1 až 3 nebo expresní vektor podle nároku 4.
6. Fúzní polypeptid, mající aktivitu GnT III a obsahující Golgiho lokalizační doménu lidské manózidázy II (Manil).
7. Fúzní polypeptid podle nároku 6, kde fúzní polypetid obsahuje sekvenci aminokyseliny alespoň alespoň z 90 % identické se sekvencí aminokyseliny SEQ ID NO: 13.
8. Fúzní polypeptid podle nároku 7, kde fúzní polypetid obsahuje sekvenci aminokyseliny SEQ ID NO: 13. jak ukázáno na obr. 24.
9. Způsob výroby fúzního polypeptidu majícího aktivitu GnT III, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 5 v médiu za podmínek, dovolujících expresi polynukleotidu kódujícího fúzní polypeptid a získání fúzního polypeptidu z výsledné kultury.
10. Hostitelská buňka sestrojená tak, aby exprimovala izolovaný polynukleotid podle některého z nároků 1 až 3 nebo expresní vektor podle nároku 4 v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je celá molekula protilátky.
11. Hostitelská buňka podle nároku 10, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou j e IgG.
12. Hostitelská buňka podle nároku 11, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou j e IgG 1.
13. Hostitelská buňka podle nároku 10, kde hostitelská buňka je buňka CHO, buňka BHK, buňka NSO, buňka SP2/0, myelomová buňka YO, buňka myšího myelomu P3X63, buňka PER a buňka PER.C6 nebo hybridomová buňka.
14. Hostitelská buňka podle nároku 10, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je protilátka anti-CD20.
15. Hostitelská buňka podle nároku 14, kde protilátka anti-CD20 j e IDECC2B 8.
16. Hostitelská buňka podle nároku 10, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je chimémí antihumánní monoklonální protilátka karcinomu renálních buněk chG250.
17. Hostitelská buňka podle nároku 10, kde polynukleotid exprimovaný hostitelskou buňkou je operativně připojený k prvku konstitutivního promotoru.
-69CZ 308720 B6
18. Hostitelská buňka podle nároku 10, dále obsahující alespoň jednu transfekovanou nukleovou kyselinu kódující molekulu protilátky
19. Hostitelská buňka podle nároku 18, kde alespoň jedna transfekovaná nukleová kyselina kóduje protilátku anti-CD20, chimémí antihumánní neuroblastomovou monoklonální protilátku chCE7, chimémí antihumánní monoklonální protilátku karcinomu renálních buněk chG250, chimémí antihumánní monoklonální protilátku karcinomu tlustého střeva, plic a prsu ING-1, humanizovanou antihumánní monoklonální protilátku antigenu 17-1A 3622W4, humanizovanou antihumánní monoklonální protilátku kolorektálního nádoru A3 3, antihumánní melanomovou protilátku R24 směrovanou proti gangliosidu GD3, chimémí antihumánní monoklonální protilátku karcinomu buněk dlaždicového epitelu SF-25, antihumánní protilátku EGFR, antihumánní protilátku EGFRvIII, antihumánní protilátku PSMA, antihumánní protilátku PSCA, antihumánní protilátku CD22, antihumánní protilátku CD30, antihumánní protilátku CD33, antihumánní protilátku CD38, antihumánní protilátku CD40, antihumánní protilátku CD45, antihumánní protilátku CD52, antihumánní protilátku CD 138, antihumánní variantní protilátku HLA-DR, antihumánní protilátku EpCAM, antihumánní protilátku CEA, antihumánní protilátku MUC1, antihumánní protilátku jádrového proteinu MUC1, antihumánní aberantně glykozylovanou protilátku MUC1, protilátku proti variantám lidského fibronektinu obsahující doménu ED-B nebo antihumánní protilátku HER2/neu.
20. Způsob produkce polypeptidu v hostitelské buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje:
a) kultivaci hostitelské buňky podle nároku 10 za podmínek, které dovolují produkci polypeptidu vybraného ze skupiny skládající se z celé molekuly protilátky, kde fúzní polypeptid je exprimován v množství postačujícím pro modifikaci oligosacharidů v oblasti Fc polypeptidu produkovaného hostitelskou buňkou; a kde fúzní polypeptid obsahuje Golgiho lokalizační doménu heterologního lidského Golgiho rezidentního polypeptidu, a
b) izolaci polypeptidu.
21. Způsob podle nároku 20, kde polypeptid produkovaný hostitelskou buňkou je vybraný ze skupiny sestávající z anti-CD20 protilátky, chimémí antihumánní neuroblastomové monoklonální protilátky chCE7, chimémí antihumánní monoklonální protilátky karcinomu renálních buněk chG250, chimémí antihumánní monoklonální protilátky karcinomu tlustého střeva, plic a prsu ING-1, humanizované antihumánní monoklonální protilátky antigenu 17-1A 3622W4, humanizované antihumánní monoklonální protilátky kolorektálního nádom A3 3, antihumánní melanomové protilátky R24 směrované proti gangliosidu GD3, chimémí antihumánní monoklonální protilátky karcinomu buněk dlaždicového epitelu SF-25, antihumánní protilátky EGFR, antihumánní protilátky EGFRvIII, antihumánní protilátky PSMA, antihumánní protilátky PSCA, antihumánní protilátky CD22, antihumánní protilátky CD30, antihumánní protilátky CD33, antihumánní protilátky CD38, antihumánní protilátky CD40, antihumánní protilátky CD45, antihumánní protilátky CD52, antihumánní protilátky CD 138, antihumánní variantní protilátky HLA-DR, antihumánní protilátky EpCAM, antihumánní protilátky CEA, antihumánní protilátky MUC1, antihumánní protilátky jádrového proteinu MUC1, antihumánní aberantně glykozylované protilátky MUC1, protilátky proti variantám lidského fibronektinu obsahující doménu ED-B, antihumánní protilátky TAG-72 a antihumánní protilátky HER2/neu.
CZ2005490A 2003-01-22 2004-01-22 Fúzní konstrukty a jejich použití pro přípravu protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k receptorům Fc a efektorovou funkcí CZ308720B6 (cs)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44130703P 2003-01-22 2003-01-22
US2003441307 2003-01-22
US49125403P 2003-07-31 2003-07-31
US2003491254 2003-07-31
US49514203P 2003-08-15 2003-08-15
US2003495142 2003-08-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2005490A3 CZ2005490A3 (cs) 2006-02-15
CZ308720B6 true CZ308720B6 (cs) 2021-03-24

Family

ID=32777012

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2005490A CZ308720B6 (cs) 2003-01-22 2004-01-22 Fúzní konstrukty a jejich použití pro přípravu protilátek se zvýšenou vazebnou afinitou k receptorům Fc a efektorovou funkcí

Country Status (18)

Country Link
US (2) US8367374B2 (cs)
EP (4) EP2264151B1 (cs)
JP (4) JP5425365B2 (cs)
KR (2) KR101292000B1 (cs)
CN (1) CN103540600B (cs)
AT (1) ATE475708T1 (cs)
AU (2) AU2004205802B2 (cs)
CA (1) CA2513797C (cs)
CZ (1) CZ308720B6 (cs)
DE (1) DE602004028337D1 (cs)
ES (3) ES2574993T3 (cs)
IL (2) IL169805A (cs)
MX (1) MXPA05007781A (cs)
NO (1) NO339270B1 (cs)
NZ (5) NZ567320A (cs)
PL (7) PL222221B1 (cs)
SG (2) SG2013005590A (cs)
WO (1) WO2004065540A2 (cs)

Families Citing this family (255)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
EP1071700B1 (en) 1998-04-20 2010-02-17 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP3528611B2 (ja) * 1998-07-16 2004-05-17 Ｊｆｅスチール株式会社 結束材の切断方法及びその装置
NZ531219A (en) 2001-08-03 2007-07-27 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ATE475708T1 (de) 2003-01-22 2010-08-15 Glycart Biotechnology Ag Fusionskonstrukte und deren verwendung zur produktion von antikörpern mit erhöhter fc rezeptor bindungsaffinität und effektorfunktion
JPWO2004087761A1 (ja) * 2003-03-31 2006-07-27 麒麟麦酒株式会社 ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製
CN102373214B (zh) 2003-11-05 2014-07-09 罗氏格黎卡特股份公司 具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体
TW200539855A (en) * 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
AU2004224925C1 (en) * 2004-08-30 2011-07-21 Biotest Ag Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
SI1871805T1 (sl) * 2005-02-07 2020-02-28 Roche Glycart Ag Antigen vezavne molekule, ki vežejo EGFR, vektorji, ki te kodirajo in uporabe le-teh
CA2598561C (en) * 2005-02-18 2014-01-21 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against cd30 lacking in fucosyl residues
CN101146909A (zh) * 2005-03-25 2008-03-19 格黎卡特生物技术股份公司 针对MCSP的并且具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的抗原结合分子
AU2006298519A1 (en) * 2005-05-09 2007-04-12 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules having modified Fc regions and altered binding to Fc receptors
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
US9580506B2 (en) 2005-07-21 2017-02-28 Genmab A/S Potency assays for antibody drug substance binding to an Fc receptor
EP1931712B1 (en) 2005-08-26 2018-12-05 Roche Glycart AG Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity
ATE509033T1 (de) 2006-03-20 2011-05-15 Univ California Manipulierte anti-prostatastammzellenantigen (psca)-antikörper für krebs-targeting
JP5298007B2 (ja) * 2006-03-21 2013-09-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド アルファ５ベータ１アンタゴニストを含むコンビナトリアル療法
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
WO2008008482A2 (en) * 2006-07-13 2008-01-17 Genentech, Inc. Altered br3-binding polypeptides
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
UA106194C2 (ru) 2006-10-12 2014-08-11 Чугей Сейяку Кабусики Кайся Диагностика и лечение рака с применением антитела к ereg
JP2010519930A (ja) * 2007-03-07 2010-06-10 グライコフィ， インコーポレイテッド 糖タンパク質の修飾フコシル化を用いる産生
EP1995309A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
CA2795379A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Centre National De La Recherche Scientifique Modifying glycoprotein production in plants
WO2009032949A2 (en) 2007-09-04 2009-03-12 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection
AU2008295140A1 (en) 2007-09-05 2009-03-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with type I and type II anti-CD20 antibodies
MX2010003581A (es) 2007-10-01 2010-08-02 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos humanos que se adhieren a mesotelina, y usos de los mismos.
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US20090169550A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
US9446146B2 (en) * 2007-12-26 2016-09-20 Biotest Ag Methods and agents for improving targeting of CD138 expressing tumor cells
AR069981A1 (es) * 2007-12-26 2010-03-03 Biotest Ag Los "anticuerpo modificado geneticamente que reconocen cd138".
AR069979A1 (es) * 2007-12-26 2010-03-03 Biotest Ag Metodo para disminuir los efectos secundarios citotoxicos y mejorar la eficacia de los inmunoconjugados
MX2010007102A (es) * 2007-12-26 2011-07-01 Biotest Ag Inmunoconjugados dirigidos contra cd138 y sus usos.
EP2235061A1 (en) * 2008-01-15 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Afucosylated antibodies against ccr5 and their use
KR101054362B1 (ko) * 2008-07-03 2011-08-05 재단법인 목암생명공학연구소 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법
JP5813505B2 (ja) 2008-07-18 2015-11-17 メディカゴ インコーポレイテッド 新規インフルエンザウイルス免疫エピトープ
EP2349327A4 (en) * 2008-10-23 2012-11-28 Massachusetts Inst Technology COMMITMENT DIRECTED FC RECEIVERS ACTIVATORS
ES2712732T3 (es) 2009-02-17 2019-05-14 Cornell Res Foundation Inc Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico
AR075982A1 (es) 2009-03-31 2011-05-11 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo afucosilado y una o mas de las citoquinas seleccionadas de gm- csf humano, m -csf humano y/o il-3 humano y composicion
CA2754646A1 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Roche Glycart Ag Treatment of cancer with a humanized anti-egfr igg1 antibody and irinotecan
RU2598248C2 (ru) 2009-04-02 2016-09-20 Роше Гликарт Аг Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab
CN102361884A (zh) 2009-04-07 2012-02-22 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗-ErbB-2/抗-c-Met抗体
CA2757931C (en) 2009-04-07 2019-03-26 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
KR20110124369A (ko) 2009-04-07 2011-11-16 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항­ｅｒｂｂ­3／항­ｃ­ｍｅｔ 항체
NZ596807A (en) * 2009-05-06 2013-09-27 Biotest Ag Uses of immunoconjugates targeting cd138
WO2010136172A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
JP5808052B2 (ja) 2009-05-29 2015-11-10 中外製薬株式会社 Ｅｇｆファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
MA33470B1 (fr) 2009-08-14 2012-07-03 Hoffmann La Roche Polythérapie à base d'un anticorps afucosylé anti-cd20 et de fludarabine et/ou mitoxantrone
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
TWI412375B (zh) 2009-08-28 2013-10-21 Roche Glycart Ag 人類化抗ｃｄｃｐ１抗體
TW201113037A (en) 2009-08-28 2011-04-16 Hoffmann La Roche Antibodies against CDCP1 for the treatment of cancer
SG178567A1 (en) 2009-08-31 2012-04-27 Roche Glycart Ag Affinity-matured humanized anti cea monoclonal antibodies
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
RU2573915C2 (ru) 2009-09-16 2016-01-27 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применение
KR102319842B1 (ko) 2009-10-26 2021-11-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
EP2506876B1 (en) 2009-12-02 2016-10-12 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
NZ600262A (en) 2009-12-22 2013-06-28 Roche Glycart Ag Anti-her3 antibodies and uses thereof
EP2519262A2 (en) 2009-12-29 2012-11-07 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody formulation
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
BR112012026707A2 (pt) 2010-04-27 2017-03-14 Roche Glycart Ag uso de um anticorpo anti-cd20 afucosilado, composição que compreende um anticorpo anti-cd20 afucosilado e método de tratamento de pacientes que sofrem de câncer por meio da administração de um anticorpo anti-cd20 afucosilado
WO2012009705A1 (en) 2010-07-15 2012-01-19 Zyngenia, Inc. Ang-2 binding complexes and uses thereof
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
WO2012018771A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Genentech, Inc. Chronic lymphocytic leukemia (cll) biomarkers
KR101780131B1 (ko) 2010-08-13 2017-09-19 로슈 글리카트 아게 항-fap 항체 및 이의 사용 방법
CA2806640A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Roche Glycart Ag Anti-tenascin-c a2 antibodies and methods of use
TW201208703A (en) 2010-08-17 2012-03-01 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated CD20 antibody with an anti-VEGF antibody
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
CA2819436A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mdm2 inhibitor
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
WO2012105699A1 (ja) * 2011-02-03 2012-08-09 株式会社イーベック 補体依存性生物活性の高い抗体の産生法
WO2012107416A2 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Roche Glycart Ag Improved immunotherapy
US9266938B2 (en) 2011-02-10 2016-02-23 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
WO2012116927A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
ES2549638T3 (es) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteínas de unión a antígeno
PL2681244T3 (pl) 2011-03-02 2018-04-30 Roche Glycart Ag Przeciwciała przeciwko antygenowi rakowo-płodowemu
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
AU2012258637B2 (en) 2011-05-24 2017-07-20 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
FR2976811A1 (fr) 2011-06-22 2012-12-28 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un anticorps anti-cd20 a haute adcc pour le traitement de la maladie de waldenstrom
US9309306B2 (en) 2011-08-23 2016-04-12 Roche Glycart Ag Anti-MCSP antibodies
LT2748202T (lt) 2011-08-23 2018-09-25 Roche Glycart Ag Bispecifinės antigeną surišančios molekulės
EP2758435A1 (en) 2011-09-23 2014-07-30 Roche Glycart AG Bispecific anti-egfr/anti igf-1r antibodies
JP6356605B2 (ja) 2011-10-19 2018-07-11 ロシュ グリクアート アーゲー フコシル化抗体の分離法
US20130302274A1 (en) 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
CN104302324A (zh) 2011-12-08 2015-01-21 生物测试股份公司 靶向cd138的免疫偶联物的用途
TWI593705B (zh) * 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
WO2013113641A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Roche Glycart Ag Use of nkp46 as a predictive biomarker for cancer treatment with adcc- enhanced antibodies
WO2013119966A2 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Genentech, Inc. Single-chain antibodies and other heteromultimers
MX2014010379A (es) 2012-03-02 2015-05-15 Roche Glycart Ag Biomarcador predictivo para tratamiento de cancer con anticuerpos mejorados en adcc.
US9751942B2 (en) 2012-03-29 2017-09-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-LAMP5 antibody and utilization thereof
EP2852610B1 (en) 2012-05-23 2018-07-11 Glykos Finland Oy Production of fucosylated glycoproteins
EP2855531A1 (en) 2012-05-24 2015-04-08 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
EP3795215A1 (en) 2012-05-30 2021-03-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Target tissue-specific antigen-binding molecule
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
WO2014013019A1 (en) * 2012-07-18 2014-01-23 Glycotope Gmbh Novel therapeutic treatments with anti-her2 antibodies having a low fucosylation
EP3434695B1 (en) 2012-08-07 2020-12-02 Roche Glycart AG Improved immunotherapy
EP2912060B1 (en) 2012-10-29 2019-12-25 The University of North Carolina at Chapel Hill Compositions and methods for inhibiting pathogen infection
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
WO2014067642A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Mab Discovery Gmbh Method for the production of multispecific antibodies
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
EP3557260B1 (en) 2012-12-21 2022-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
US9180185B2 (en) 2013-01-11 2015-11-10 Hoffman-La Roche Inc. Combination therapy of anti-HER3 antibodies
WO2014114595A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Roche Glycart Ag Predictive biomarker for cancer treatment with adcc-enhanced antibodies
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
CN104968682A (zh) 2013-02-05 2015-10-07 英格玛布股份公司 针对CD3ε和BCMA的双特异性抗体
US20140242083A1 (en) 2013-02-26 2014-08-28 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
JP6511609B2 (ja) 2013-03-13 2019-05-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体製剤
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
JPWO2014208482A1 (ja) 2013-06-24 2017-02-23 中外製薬株式会社 ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤
RU2016115866A (ru) 2013-10-11 2017-11-16 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифические антитела с обменянными доменами и одинаковыми вариабельными доменами легкой цепи
WO2015082446A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-cdcp1 antibody and a taxane
CA2931296C (en) 2013-12-04 2024-04-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
KR20160089532A (ko) 2013-12-17 2016-07-27 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 항-cd20 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
JP6827319B2 (ja) 2014-05-08 2021-02-10 中外製薬株式会社 Ｇｐｃ３標的治療剤療法が有効である患者に投与されるｇｐｃ３標的治療剤
CA2950577A1 (en) * 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Fucosidase from bacteroides and methods using the same
EP3148581B1 (en) 2014-05-30 2019-10-09 Henlius Biotech Co., Ltd. Anti-epidermal growth factor receptor (egfr) antibodies
CA2954974A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
JP7072384B2 (ja) 2014-09-15 2022-05-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体製剤
RS60349B8 (sr) 2014-09-23 2022-10-31 Hoffmann La Roche Postupak upotrebe anti-cd79b imunokonjugata
PL3221355T3 (pl) 2014-11-20 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapia skojarzona składająca się z dwuswoistych aktywujących limfocyty T cząsteczek wiążących antygen CD3 i receptor folianowy 1 (FolR1) oraz antagonistów wiązania osi PD-1
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
JP6867955B2 (ja) 2015-05-07 2021-05-12 アジェナス インコーポレイテッド 抗ｏｘ４０抗体及びその使用方法
EP4450524A3 (en) 2015-05-11 2025-05-14 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
JP7021955B2 (ja) 2015-06-24 2022-03-03 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｅｒ２及び血液脳関門受容体に特異的な三重特異性抗体及び使用方法
JP7114460B2 (ja) 2015-06-26 2022-08-08 サノフィ・バイオテクノロジー モノクローナル抗ＩＬ－１ＲＡｃＰ抗体
EP3313885A1 (en) 2015-06-29 2018-05-02 H. Hoffnabb-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody for use in organ transplantation
BR112018001955B1 (pt) 2015-08-03 2021-05-11 Engmab Sárl anticorpo monoclonal que se liga às células b humanas (bcma), composição farmacêutica e seu uso
AU2016304764C1 (en) 2015-08-07 2023-06-01 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
ES2768957T3 (es) 2015-09-24 2020-06-24 Abvitro Llc Composiciones de anticuerpos contra el VIH y métodos de uso
CN108290954B (zh) 2015-12-09 2022-07-26 豪夫迈·罗氏有限公司 Ii型抗cd20抗体用于降低抗药物抗体形成
WO2017148879A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Obinutuzumab and rituximab variants having reduced adcp
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
WO2017194441A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified anti-tenascin antibodies and methods of use
CA3059010A1 (en) 2016-06-02 2018-12-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3257866A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 Academisch Medisch Centrum Modified anti-tnf antibody and use thereof in the treatment of ibd
CN110167964B (zh) 2016-11-02 2023-12-01 百时美施贵宝公司 组合用于治疗多发性骨髓瘤的针对bcma和cd3的双特异性抗体和免疫药物
WO2018106864A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
BR112019018767A2 (pt) 2017-04-03 2020-05-05 Hoffmann La Roche anticorpos, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um ou mais polinucleotídeos isolados, um ou mais vetores, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, usos, método para tratar uma doença em um indivíduo e invenção
HRP20221141T1 (hr) 2017-04-05 2022-11-25 F. Hoffmann - La Roche Ag Anti-lag3 protutijela
NZ759517A (en) 2017-04-27 2025-02-28 Tesaro Inc Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
WO2019020606A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag POLYTHERAPY WITH BET INHIBITOR, BCL-2 INHIBITOR AND ANTI-CD20 ANTIBODY
CA3070774A1 (en) 2017-08-25 2019-02-28 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-h4 antibodies and methods of use thereof
AU2018388529A1 (en) * 2017-12-18 2020-06-18 The General Hospital Corporation Glycoengineering
CA3084105A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a2/wt1
JP7436365B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-21 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗ｖｅｇｆ抗体及び使用の方法
WO2019139987A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Elstar Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered t cells for the treatment of diseases
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
MX2020008730A (es) 2018-02-21 2020-12-07 Five Prime Therapeutics Inc Regímenes de dosificación de anticuerpo b7-h4.
EP3755720A1 (en) 2018-02-21 2020-12-30 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-h4 antibody formulations
WO2019169212A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-h4 antibodies and methods of use thereof
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CA3091231A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Genentech, Inc. Modulating lactogenic activity in mammalian cells
US11555071B2 (en) 2018-06-03 2023-01-17 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against CEACAM5 and CD47
JP7554742B2 (ja) 2018-07-03 2024-09-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
EP3853249A4 (en) 2018-09-21 2022-06-22 The University of North Carolina at Chapel Hill Synthetic binding agents for limiting permeation through mucus
MX2021004226A (es) 2018-10-15 2021-07-15 Five Prime Therapeutics Inc Terapia combinada contra el cáncer.
WO2020117257A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Genentech, Inc. Combination therapy of diffuse large b-cell lymphoma comprising an anti-cd79b immunoconjugates, an alkylating agent and an anti-cd20 antibody
MY194642A (en) 2018-12-21 2022-12-09 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
CA3123503A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf and il-1beta and methods of use
CN119039441A (zh) 2019-02-21 2024-11-29 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
AU2020226893B2 (en) 2019-02-21 2025-02-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
JP7601758B2 (ja) 2019-03-19 2024-12-17 中外製薬株式会社 Ｍｔａ依存的に抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子及び当該抗原結合ドメイン取得用ライブラリ
EP3968993A1 (en) 2019-05-14 2022-03-23 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat follicular lymphoma
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
MY206610A (en) 2019-07-31 2024-12-26 F Hoffmann La Roche Ag Antibodies binding to gprc5d
EP4004045A1 (en) 2019-07-31 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to gprc5d
CA3146616A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 Matthew Dominic CASCINO Compositions and methods of treating lupus nephritis
CA3150999A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 James Thomas Koerber Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
CN118557750A (zh) 2019-10-18 2024-08-30 基因泰克公司 使用抗CD79b免疫缀合物治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的方法
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
WO2021122875A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a2/mage-a4
JP2023516080A (ja) 2020-03-06 2023-04-17 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｃｄ４４抗体およびその使用
HUE065039T2 (hu) 2020-03-26 2024-04-28 Univ Vanderbilt Emberi monoklonális ellenanyagok súlyos akut légzõszervi szindrómát okozó koronavírus 2 (SARS-COV-2) ellen
EP4127153A2 (en) 2020-03-26 2023-02-08 Genentech, Inc. Modified mammalian cells having reduced host cell proteins
UY39174A (es) * 2020-04-17 2021-10-29 Janssen Biotech Inc Poblaciones de glicoproteínas biosintéticas
TW202206111A (zh) 2020-04-24 2022-02-16 美商建南德克公司 使用抗ｃｄ７９ｂ免疫結合物之方法
MX2022014422A (es) 2020-05-17 2022-12-07 Astrazeneca Uk Ltd Anticuerpos contra el sars-cov-2 y metodos de seleccion y uso de los mismos.
MX2022015206A (es) 2020-06-08 2023-01-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hbv y metodos de uso.
CR20220628A (es) 2020-06-19 2023-01-24 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3
AR122656A1 (es) 2020-06-19 2022-09-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 / folr1
TWI811703B (zh) 2020-06-19 2023-08-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｃｄ３及ｃｄ１９結合之抗體
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
CN115943158A (zh) 2020-06-24 2023-04-07 基因泰克公司 抗细胞凋亡的细胞系
CA3187277A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
CN116406377A (zh) 2020-07-17 2023-07-07 基因泰克公司 抗notch2抗体及其使用方法
US20220041694A1 (en) 2020-08-10 2022-02-10 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies for treatment and prevention of covid-19
KR20230056766A (ko) 2020-08-28 2023-04-27 제넨테크, 인크. 숙주 세포 단백질의 CRISPR/Cas9 다중 녹아웃
KR20230061458A (ko) 2020-09-04 2023-05-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 Vegf-a 및 ang2에 결합하는 항체 및 사용 방법
WO2022086957A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Genentech, Inc. Peg-conjugated anti-mertk antibodies and methods of use
CN116685325A (zh) 2020-10-20 2023-09-01 豪夫迈·罗氏有限公司 Pd-1轴结合拮抗剂和lrrk2抑制剂的组合疗法
CA3206466A1 (en) 2021-01-12 2022-07-21 Christian Klein Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
CA3204291A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
JP2024512324A (ja) 2021-03-05 2024-03-19 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｃｄ４４抗体およびその使用
JP2024512377A (ja) 2021-03-12 2024-03-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｋｌｋ７抗体、抗ｋｌｋ５抗体、多重特異性抗ｋｌｋ５／ｋｌｋ７抗体、及び使用方法
AU2022238526A1 (en) 2021-03-15 2023-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods of treating lupus nephritis
WO2022225880A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Genentech, Inc. Modified mammalian cells
JP2024514281A (ja) 2021-04-23 2024-04-01 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｎｋ細胞係合剤関連の有害作用の防止または軽減
CA3213632A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
EP4329800A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 F. Hoffmann-La Roche AG Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody
CN118593725A (zh) 2021-05-12 2024-09-06 基因泰克公司 使用抗cd79b免疫缀合物治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法
EP4341385A1 (en) 2021-05-21 2024-03-27 Genentech, Inc. Modified cells for the production of a recombinant product of interest
BR112023025738A2 (pt) 2021-06-09 2024-02-27 Hoffmann La Roche Combinação de um inibidor de braf e um antagonista de ligação ao eixo pd-1, uso de uma combinação de um inibidor de braf e um antagonista de ligação ao eixo pd-1, método para o tratamento ou profilaxia de câncer, composição farmacêutica e invenção
WO2023288182A1 (en) 2021-07-12 2023-01-19 Genentech, Inc. Structures for reducing antibody-lipase binding
US12240910B2 (en) 2021-07-14 2025-03-04 Genentech, Inc. Anti-C-C motif chemokine receptor 8 (CCR8) antibodies and methods of use
KR20240036570A (ko) 2021-07-22 2024-03-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 이종이량체 Fc 도메인 항체
WO2023012147A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies and methods of use
EP4380604A1 (en) 2021-08-05 2024-06-12 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
US20240336697A1 (en) 2021-08-07 2024-10-10 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
AU2022339819A1 (en) 2021-09-03 2024-04-11 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
JP2024536722A (ja) 2021-09-03 2024-10-08 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｃｍｅｔ抗体およびその使用
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
CN118284625A (zh) 2021-11-26 2024-07-02 豪夫迈·罗氏有限公司 抗tyrp1/抗cd3双特异性抗体与tyrp1特异性抗体的组合疗法
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023141445A1 (en) 2022-01-19 2023-07-27 Genentech, Inc. Anti-notch2 antibodies and conjugates and methods of use
TW202342510A (zh) 2022-02-18 2023-11-01 英商Ｒｑ生物科技有限公司 抗體
AU2023238766A1 (en) 2022-03-23 2024-07-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
TWI882313B (zh) 2022-04-13 2025-05-01 美商建南德克公司 治療性蛋白質之醫藥組成物及使用方法
KR20250004776A (ko) 2022-04-13 2025-01-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체의 약학 조성물 및 사용 방법
AU2023262192A1 (en) 2022-04-29 2024-12-05 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
AR129268A1 (es) 2022-05-11 2024-08-07 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a e il6 y métodos de uso
WO2024062074A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sanofi Biotechnology Humanized anti-il-1r3 antibody and methods of use
CN119998323A (zh) 2022-10-07 2025-05-13 基因泰克公司 使用抗c-c基序趋化因子受体8(ccr8)抗体治疗癌症的方法
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024100170A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a*02/foxp3
JP2025528316A (ja) 2022-12-08 2025-08-28 ナンジン、バザイム、バイオテック、カンパニー、リミテッド Ｒｓｖに特異的に結合する抗体
US20240360229A1 (en) 2023-01-18 2024-10-31 Genentech, Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
WO2024156672A1 (en) 2023-01-25 2024-08-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to csf1r and cd3
TW202448960A (zh) 2023-02-07 2024-12-16 美商Ｇｏ治療公司 包括抗醣MUC4抗體及MIC蛋白α1-α2結構域之抗體融合蛋白及其用途
WO2024191785A1 (en) 2023-03-10 2024-09-19 Genentech, Inc. Fusions with proteases and uses thereof
TW202446789A (zh) 2023-03-31 2024-12-01 美商建南德克公司 抗αｖβ８整合素抗體及使用方法
WO2024231320A1 (en) 2023-05-08 2024-11-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Targeted interferon alpha fusion proteins and methods of use
WO2024238537A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Pd-1 -regulated il-2 immunocytokine and uses thereof
WO2024263761A1 (en) 2023-06-22 2024-12-26 Genentech, Inc. Antibodies and uses thereof
WO2025021838A1 (en) 2023-07-26 2025-01-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
TW202517673A (zh) 2023-09-25 2025-05-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與Ｃ３ｂＢｂ結合之抗體
WO2025099120A1 (en) 2023-11-09 2025-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies with conditional activity
WO2025125118A1 (en) 2023-12-11 2025-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease activatable fc domain binding molecules
WO2025125386A1 (en) 2023-12-14 2025-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies that bind to folr1 and methods of use
WO2025132503A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to ceacam5
WO2025133290A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Temper Bio Protein for immune regulation
WO2025133042A2 (en) 2023-12-22 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Activatable fusion proteins and methods of use
WO2025149633A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Laigo Bio B.V. Bispecific antigen binding proteins

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001029242A2 (en) * 1999-10-21 2001-04-26 Monsanto Company Post-translational modification of recombinant proteins produced in plants

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
RO118524B1 (ro) 1992-11-13 2003-06-30 Idec Pharmaceuticals Corp San Metoda pentru tratarea unei tulburari legata de celulele b
WO1996040210A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US6180320B1 (en) 1998-03-09 2001-01-30 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Method of manufacturing a semiconductor device having a fine pattern, and semiconductor device manufactured thereby
EP1071700B1 (en) * 1998-04-20 2010-02-17 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
MXPA02004142A (es) * 1999-10-26 2003-08-20 Plant Res Int Bv Glucosilacion tipo mamifero en plantas.
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
EP2339013B1 (en) 2000-06-28 2014-07-02 GlycoFi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US20030003097A1 (en) 2001-04-02 2003-01-02 Idec Pharmaceutical Corporation Recombinant antibodies coexpressed with GnTIII
CA2819867A1 (en) * 2002-03-19 2003-09-25 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Gntiii (udp-n-acetylglucosamine:beta-d mannoside beta (1,4)-n-acetylglucosaminyltransferase iii) expression in plants
ATE475708T1 (de) * 2003-01-22 2010-08-15 Glycart Biotechnology Ag Fusionskonstrukte und deren verwendung zur produktion von antikörpern mit erhöhter fc rezeptor bindungsaffinität und effektorfunktion

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001029242A2 (en) * 1999-10-21 2001-04-26 Monsanto Company Post-translational modification of recombinant proteins produced in plants

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sburlati, Adriana R., et al. "Synthesis of Bisected Glycoforms of Recombinant IFN‐β by Overexpression of β‐1, 4‐N‐Acetylglucosaminyltransferase III in Chinese Hamster Ovary Cells." Biotechnology progress 14.2 (1998): 189-192, ISSN: 8756-7938 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL393646A1 (pl) 2011-06-06
EP2264152A3 (en) 2011-05-18
ES2543734T3 (es) 2015-08-21
JP5425365B2 (ja) 2014-02-26
WO2004065540A2 (en) 2004-08-05
JP2015142590A (ja) 2015-08-06
EP2264151B1 (en) 2016-04-20
EP2248892B1 (en) 2015-04-22
NO20053872D0 (no) 2005-08-18
NO20053872L (no) 2005-10-21
US20040241817A1 (en) 2004-12-02
PL222220B1 (pl) 2016-07-29
AU2010200408C1 (en) 2012-11-01
PL393645A1 (pl) 2011-06-06
AU2004205802A1 (en) 2004-08-05
NO339270B1 (no) 2016-11-21
EP2248892A3 (en) 2011-03-16
KR20130048269A (ko) 2013-05-09
PL393641A1 (pl) 2011-06-06
PL224787B1 (pl) 2017-01-31
DE602004028337D1 (de) 2010-09-09
CA2513797C (en) 2016-05-03
AU2004205802B2 (en) 2009-11-05
JP2010233578A (ja) 2010-10-21
HK1089205A1 (zh) 2006-11-24
AU2010200408A1 (en) 2010-02-25
EP2248892A2 (en) 2010-11-10
EP2264152A2 (en) 2010-12-22
EP2264151A2 (en) 2010-12-22
CZ2005490A3 (cs) 2006-02-15
PL393647A1 (pl) 2011-06-06
IL169805A (en) 2013-11-28
EP1587921B1 (en) 2010-07-28
CA2513797A1 (en) 2004-08-05
PL377967A1 (pl) 2006-02-20
KR20050095867A (ko) 2005-10-04
EP2264151A3 (en) 2012-10-03
CN103540600A (zh) 2014-01-29
MXPA05007781A (es) 2005-09-30
NZ567320A (en) 2009-11-27
US8367374B2 (en) 2013-02-05
PL222219B1 (pl) 2016-07-29
CN103540600B (zh) 2017-12-01
KR101498588B1 (ko) 2015-03-05
NZ591970A (en) 2012-11-30
EP1587921A2 (en) 2005-10-26
EP2264152B1 (en) 2015-05-20
PL222221B1 (pl) 2016-07-29
PL222206B1 (pl) 2016-07-29
US8859234B2 (en) 2014-10-14
PL224786B1 (pl) 2017-01-31
NZ582315A (en) 2011-01-28
ES2574993T3 (es) 2016-06-23
JP2006516893A (ja) 2006-07-13
PL222222B1 (pl) 2016-07-29
KR101292000B1 (ko) 2013-08-01
IL203402A (en) 2016-05-31
PL415463A1 (pl) 2016-04-25
JP2013233151A (ja) 2013-11-21
SG179292A1 (en) 2012-04-27
PL393644A1 (pl) 2011-06-06
AU2010200408B2 (en) 2012-05-17
ES2542885T3 (es) 2015-08-12
NZ541503A (en) 2008-09-26
NZ603037A (en) 2014-05-30
WO2004065540A3 (en) 2005-03-24
SG2013005590A (en) 2015-06-29
US20140073005A1 (en) 2014-03-13
ATE475708T1 (de) 2010-08-15
JP5953271B2 (ja) 2016-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2264151B1 (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased FC receptor binding affinity and effector function
CN1761746B (zh) 融合构建体及其用来生产Fc受体结合亲和性和效应子功能提高的抗体的用途
RU2623167C2 (ru) КОНСТРУКЦИИ СЛИЯНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ С ПОВЫШЕННЫМИ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
AU2012213963B2 (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function
HK1089205B (en) Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20240122