KR101745925B1 - 신규 인플루엔자 바이러스 면역화 에피토프 - Google Patents

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Abstract

식물 또는 식물의 일부분 내에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자(VLP)를 합성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 식물에서 신규 인플루엔자 HA 단백질을 발현하고, 그것을 정제하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 HA 단백질과 식물 지질을 포함하는 VLP에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개선된 인플루엔자 HA를 암호화하는 핵산과 벡터에 관한 것이다. VLP는 인플루엔자 백신을 조제하는데 사용될 수 있거나, 또는 기존 백신을 부화시키는데 사용될 수 있다.

Description

신규 인플루엔자 바이러스 면역화 에피토프{NEW INFLUENZA VIRUS IMMUNIZING EPITOPE}
본 발명은 바이러스-유사 입자의 제조에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인플루엔자 항원, 특히 다른 인플루엔자 균주들과의 광범한 교차-반응성을 가진 변형된 인플루엔자 항원을 포함하는 바이러스-유사 입자의 제조에 관한 것이다.
인플루엔자는 호흡기 바이러스로 인한 인간의 사망에 있어서 제일의 원인이다. 일반적인 증상은 특히 발열, 인후통, 숨가쁨 및 근육통을 포함한다. 독감 시즌에 인플루엔자 바이러스는 세계 인구의 10-20%를 감염시키고 사망자는 연간 250-500,000명에 이른다.
인플루엔자 바이러스는 감염된 포유동물 세포의 원형질막으로부터 발아하는 외피보유 바이러스이다. 이들은 존재하는 핵단백질 및 바탕질 단백질 항원에 기초하여 A, B 또는 C 타입으로 분류된다. 인플루엔자 A 타입 바이러스는 출현한 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA) 표면 당단백질의 조합에 따라서 서브타입들로 더 세분될 수 있다. HA는 숙주 세포에 결합하여 세포로 침투하는 바이러스의 능력을 좌우한다. NA는 숙주 세포 및 바이러스 표면 단백질 상의 글리칸 사슬로부터 말단 시알산 잔기를 제거하여 바이러스 응집을 방지하고 바이러스 이동을 촉진한다. 현재 16개의 HA(H1-H16)와 9개의 NA(N1-N9) 서브타입이 인정된다. 각 A 타입 인플루엔자 바이러스는 HA 중 1개 타입과 NA 당단백질 중 1개 타입을 제시한다. 일반적으로 각 서브타입은 종 특이성을 나타내는데, 예를 들어 모든 HA 및 NA 서브타입은 조류를 감염시킬 수 있는 것으로 알려져 있지만, 인간은 서브타입 H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 및 N7 만이 감염시킬 수 있는 것으로 나타났다(Horimoto 2006; Suzuki 2005). H5, H7 및 H9를 포함하는 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스의 가장 고도한 병원성 형태라고 생각되며, 앞으로 대유행을 일으킬 가능성이 크다.
인플루엔자의 대유행은 일반적으로 전염성과 바이러스성이 높은 인플루엔자 바이러스에 의해 일어나며, 전세계에서 질병 및 사망의 수준을 상승시킬 수 있다. 새로운 인플루엔자 A 서브타입의 출현은 20세기에 4번의 주요한 대유행을 초래하였다. 1918-1919년에 H1N1 바이러스에 의해 일어난 스페인 독감은 1917년과 1920년 사이에 전세계에서 5,000만 명 이상의 사망자를 냈다. 새로운 서브타입 출현에 대한 위험이나 동물에 특유한 서브타입이 사람에게 전염되는 것의 위험이 현재 항상 존재하고 있다. 특히 우려되는 것은 바이러스성이 매우 높은 형태의 조류 인플루엔자("조류독감"이라고도 한다)로서, 이것은 출현은 세계 각지에서 몇 세기 전부터 보고되었다. 많은 경우 이 조류독감은 48시간 내에 100%에 근접하는 사망률을 초래할 수 있다. 조류 인플루엔자 바이러스(H5N1)는 1997년에 홍콩에서 최초로 확인된 후, 야생 조류의 이주 패턴과 연계되어 다른 아시아 국가들과 유럽으로 전파되었다.
현재 인간이 인플루엔자와 싸우는 방법은 연례적인 예방접종이다. 일반적으로 백신은 다가오는 "독감 시즌"에서 유력한 균주일 것으로 예상되는 몇 가지 균주들의 조합이다. 이런 예상은 세계보건기구에 의해 조정된다. 일반적으로 매년 많은 백신 용량이 생산되지만 전세계 인구에 예방접종하기에는 충분하지 않다. 예를 들어, 캐나다와 미국은 인구의 약 1/3을 면역화할 수 있는 충분한 백신 용량을 획득하지만, 유럽연합에서는 인구의 단지 17%에만 예방접종할 수 있다. 현재 인플루엔자 백신의 세계적 생산은 전 세계적인 독감 대유행에 직면해서는 불충분함에 틀림없다. 해당하는 해에는 필요한 연간 생산량이 다소 충족될 수 있다 해도, 유력한 균주는 매년 변화하므로 당해에 필요성이 적을 때 비축하는 것은 비실용적이다. 효과적인 인플루엔자 백신의 경제적인 대규모 생산은 정부와 민간 사업자에게 똑같이 중요한 관심거리이다.
현재 백신에 사용되는 바이러스 스톡의 가장 중요한 공급원은 멸균된 난에서 생산된다. 바이러스 입자를 수거하여, 비활성화 바이러스 백신을 위해 세정제로 파괴하여 비활성화시킨다. 감독된 생백신은 저온 성장에 적합하게 된 인플루엔자 바이러스로 제조되는데, 이것은 정상 체온에서는 백신이 감독된다는 것을 의미한다. 5-49세의 개체에 사용하기 위한 이러한 백신은 미국에서 라이센스를 갖고 있다. 비활성화 전 바이러스 백신은 화학 제제를 사용한 비활성화에 의해서 무해하게 되며, 이들은 배아기 난이나 포유동물 세포 배양물에서 생산된다. 이런 모든 타입의 백신은 어떤 특정한 이점과 단점을 나타낸다. 전 바이러스로부터 유래하는 백신의 한 이점은 이러한 백신에 의해서 유도되는 면역성의 타입이다. 일반적으로 분할 백신은 강한 항체 반응을 유도하는데 비해, 전 바이러스로 만든 백신은 항체(체액성) 반응과 세포성 반응을 모두 유도한다. 백신에 의해 유도되는 방어력과 서로 관련되는 기능적 항체 반응이 라이센스를 얻기 위한 기준이지만, 인플루엔자 면역성에서 T-세포 반응 역시 중요하다는 증거가 점점 증가하고 있으며, 이것은 또한 노인층에서 더 나은 방어력을 제공할 수 있다.
세포성 면역반응을 유도하기 위해서 전 바이러스로 만든 백신이 개발되었다. 인플루엔자 균주(예를 들어, H5N1)의 높은 병원성으로 인해 이들 백신은 BL3+ 시설에서 생산된다. H5N1과 같은 병원성이 높은 인플루엔자 균주에 대해, 일부 제조자들은 인플루엔자 균주의 병원성이 감소하여 독성이 없어지고, 배아기 난이나 포유동물 세포 배양물에서 더 쉽게 생산될 수 있도록 헤마글루티닌 유전자 서열을 변형하였다. 또한, 헤마글루티닌과 뉴라미니다제 단백질의 유전자 서열을 고-수율 저 병원성 인플루엔자 도너 균주(A/PR/8/34; Quan F-S et al, 2007)에서 클로닝한 재배열 인플루엔자 균주를 사용하는 제조자들도 있다. 이런 방법들은 유용한 백신을 생산할 수는 있지만, 정상적인 해의 전 세계적 필요를 충족하는데 필요한 규모로서 백신의 고-용적, 저-비용 및 신속 생산에 대한 필요성의 해결책을 제공하지는 못하며, 대유행에 직면해서는 불충분하다는 것이 거의 확실하다.
이러한 역 유전자 기술을 사용하여 HA 단백질의 유전자 서열을 돌연변이시켜 독성을 없애는 것이 필요할 수도 있다. 병원성이 높은 인플루엔자 균주에 대한 전 바이러스 백신의 생산은 구속 과정을 요하거나, 또는 얻어진 백신이 순환 바이러스의 유전자 서열과 정확하게 일치하지 않기도 한다. 감독된 생백신의 경우에는 투여된 백신이 숙주의 인플루엔자 바이러스와 재조합되어 새로운 인플루엔자 바이러스를 유도할 수 있는 위험이 여전히 존재한다.
이 방법은 항원 에피토프 및 번역-후 변형을 유지하지만, 전 바이러스의 사용으로 인한 오염의 위험과 바이러스 균주에 따른 수율의 가변성을 비롯한 많은 단점이 있다. 바이러스를 난에 도입함으로 인한 바이러스에서의 유전자 이종성으로 인해 방어력이 최적 수준을 약간 밑돌 수 있다. 다른 단점은 난을 획득하기 위한 광범한 계획, 정제에 사용되는 화학물질에 의한 오염 위험, 및 긴 생산 시간을 포함한다. 또한, 난 단백질에 과민성인 사람은 백신을 맞기 위한 적격한 후보가 될 수 없다.
대유행의 경우, 분할 백신 제조는 난에서 성장하도록 균주를 개조해야 할 필요성과 달성되는 생산 수율이 가변적이라는 것 때문에 제한된다. 계절 백신의 제조를 위해 수년 동안 이 기술이 사용되었지만, 대유행에 시의적절하게 대응하는 것은 어려울 수 있으며, 전 세계적인 제조 용량도 제한적이다.
또한, 멕시코에서 최근 발생한 인플루엔자 타입 A H1N1의 출현은 새로 부상하는 균주들에 대한 백신 제조에 적합한 신속한 방법을 개발해야 할 긴급한 의학적 필요성을 강조한다.
난의 사용을 피하기 위해서 인플루엔자 바이러스는 또한 포유동물 세포 배양물, 예를 들어 MDCK 또는 PERC.6 세포 등에서 생산되었다. 또 다른 접근법은 바이러스 유전자를 사용한 세포 형질전환에 의해 바이러스를 생산하는 역 유전학이다. 그러나, 이런 방법들은 역시 전 바이러스의 사용을 요할 뿐만 아니라, 정교한 방법과 특수한 배양 환경이 필요하다.
재조합 인플루엔자 백신 후보로서 몇 가지 재조합 산물이 개발되었다. 이런 접근법은 인플루엔자 A 타입 HA 및 NA 단백질의 발현, 생산, 및 정제에 초점을 맞추고 있으며, 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포(Crawford et al, 1999; Johansson, 1999), 바이러스 벡터, 및 DNA 백신 구성물(Olsen et al., 1997)을 사용한 이들 단백질의 발현을 포함한다.
인플루엔자 바이러스 감염의 상세한 내용은 잘 알려져 있다. 간단히 말하자면, 시알산-함유 세포 수용체(당단백질 및 당지질)에 비리온 표면 HA 단백질이 부착됨으로써 감염 사이클이 개시된다. NA 단백질이 시알산 수용체의 프로세싱을 매개하며, 세포로의 바이러스 침투는 HA-의존성 수용체-매개 세포내이입에 좌우된다. 인플루엔자 비리온을 함유하는 내재화된 엔도솜의 산성 경계에서 HA 단백질이 입체형태적으로 변화되어 바이러스와 세포막이 융합되고, 뉴클레오캡시드-회합된 리보뉴클레오단백질(RNP)로부터 바이러스로 코팅되지 않은 MI 단백질이 M2-매개 방출되며, 이것이 세포핵으로 이동하여 바이러스 RNA가 합성된다. HA 단백질에 대한 항체는 바이러스 감염성을 중화함으로써 바이러스 감염을 방어하는 반면, NA 단백질에 대한 항체는 바이러스 복제의 초기 단계에서 이들의 효과를 매개한다.
Crawford 등(1999)은 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포에서 인플루엔자 HA의 발현을 개시한다. 발현된 단백질은 조류 H5 및 H7 인플루엔자 서브타입에 의해 야기되는 치명적인 인플루엔자 질환을 예방할 수 있는 것으로 설명된다. Johansson 등(1999)은 바쿨로바이러스-발현된 인플루엔자 HA 및 NA 단백질이 동물에서 종래의 백신에 의해 유도된 것보다 우수한 면역반응을 유도한다고 교시한다. 말 인플루엔자 바이러스의 바쿨로바이러스-발현된 헤마글루티닌의 면역원성 및 효능이 동종성 DNA 백신 후보와 비교되었다(Olsen et al., 1997). 종합적으로 이들 데이터는 다양한 실험 접근법을 사용했을 때 상이한 동물 모델에서 재조합 HA 또는 NA 단백질에 의해 인플루엔자 바이러스 시험감염에 대한 높은 정도의 방어력이 유도될 수 있음을 증명한다.
표면 인플루엔자 당단백질 HA 및 NA가 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 면역성을 유도하는데 있어서 일차 표적이며, M1이 인플루엔자에 대한 세포 면역성의 보존된 표적을 제공한다는 것이 이전 연구에서 밝혀졌기 때문에, 새로운 백신 후보는 단백질 거대분자 입자, 예를 들어 바이러스-유사 입자(VLP)로서 이들 바이러스 항원을 포함할 수 있다. 백신 제품으로서 VLP는 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 모두 자극할 수 있으며, 서브유닛이나 재조합 항원보다 더 면역원성이라는 이점을 제공한다(Grgacic and Anderson, 2006). 더욱이, 이들 인플루엔자 항원을 가진 입자는 다수의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 중화 항체들을 도출하는 입체형태적 에피토프를 나타낼 수 있다.
백신 목적을 위해 비-감염성 인플루엔자 바이러스 균주를 생산하는 것이 우연한 감염을 피하기 위한 한 방식이 된다. 대안으로서, 배양된 바이러스의 대용물로서 바이러스-유사 입자(VLP)가 조사되었다. VLP는 바이러스 캡시드의 구조를 모방하지만, 게놈을 결여하기 때문에 복제할 수 없거나 또는 이차 감염 수단을 제공할 수 없다.
재조합 인플루엔자 단백질이 포유동물 발현 플라스미드 또는 바쿨로바이러스 백터를 사용한 세포 배양물에서 VLP로 자체 회합된다는 것이 몇몇 연구에서 증명되었다(Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham and Galarza, 2001). Gomez-Puertas 등(1999)은 인플루엔자 VLP의 효과적인 형성이 몇 가지 바이러스 단백질의 발현 수준에 좌우된다는 것을 개시한다. Neumann 등(2000)은 클로닝된 cDNA로부터 전체적으로 감염성 인플루엔자 바이러스-유사 입자를 생성하기 위한 포유동물 발현 플라스미드-기반 시스템을 확립하였다. Latham and Galarza (2001)는 HA, NA, M1 및 M2 유전자를 공-발현하는 재조합 바쿨로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 인플루엔자 VLP의 형성을 보고했다. 이들 연구는 인플루엔자 비리온 단백질들이 진핵 세포에서 공-발현될 때 자체 회합될 수 있음을 증명하였다.
Gomez-Puertas 등(2000)은 헤마글루티닌(HA)에 더하여 인플루엔자 바이러스의 바탕질 단백질(M1)이 곤충 세포로부터 VLP가 발아되는데 필수적임을 교시한다. 그러나, Chen 등(2007)은 VLP 형성에 M1이 필요하지 않을 수도 있다고 교시하며, M1과 VLP의 효과적인 방출에는 HA 및 NA에 의해 제공된 시알리다제 활성의 존재가 필요했다는 것을 관찰했다. NA는 VLP를 생산하는 세포의 표면에서 당단백질의 시알산을 절단하여 VLP를 배지로 방출한다.
Quan 등(2007)은 바쿨로바이러스 발현 시스템(곤충 세포)에서 생산된 VLP 백신이 일부 인플루엔자 바이러스 균주(A/PR8/34(H1N1)에 대한 방어 면역성을 유도한다는 것을 교시한다. Quan에 의해 연구된 VLP는 원형질막으로부터 발아하는 것으로 관찰되었고, 포유동물 시스템(MDCK 세포)에서 얻어진 것들과 유사한 정확한 크기와 형태를 가진다고 생각되었다.
외피보유 바이러스는 감염된 세포로부터 "발아할" 때 지질 외피를 획득할 수 있으며, 원형질막으로부터, 또는 내부 소기관의 원형질막으로부터 막을 획득할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 입자 및 VLP는 숙주 세포의 원형질막으로부터 발아한다. 포유동물 또는 바쿨로바이러스 세포 시스템에서, 예를 들어 인플루엔자는 원형질막으로부터 발아한다(Quan et al., 2007).
단지 소수의 외피보유 바이러스만이 식물을 감염시킬 수 있다고 알려져 있다(예를 들어, 토포바이러스 및 랍도바이러스 류). 공지된 식물 외피보유 바이러스 중에서도 이들은 숙주 세포의 내부 막으로부터 발아하고, 원형질막으로부터는 발아하지 않는 것을 특징으로 한다. 소수의 재조합 VLP가 식물 숙주에서 생산되었지만, 어느 것도 원형질막으로부터 유래하지는 않았다.
현재 인플루엔자 VLP 제조 기술은 복수 바이러스 단백질의 공-발현에 의존하며, 대유행 및 연례적인 유행 시기에는 백신접종에 있어서 대응시간이 중요하므로 이러한 의존성은 이들 기술의 단점으로 나타난다. 단지 하나의 바이러스 단백질의 발현에 의존하는 더 간단한 VLP 제조 시스템이 백신 개발을 가속하는데 바람직할 수 있다.
식물 기반 시스템에서 인플루엔자 HA VLP의 제조가 WO 2009/009876에 설명되었는데, 이것은 인플루엔자 HA가 식물 숙주 세포에서 자기 조립될 수 있고 바이러스-유사 입자로 원형질막으로부터 발아할 수 있다는 것을 본질적으로 나타냈다.
인플루엔자로부터 전세계 인구를 보호하고 앞으로의 대유행을 저지하기 위하여 백신 제조자들은 백신 용량을 생산하는 효과적이고 신속한 방법을 개발할 필요가 있을 것이다. 현재 백신 제조에 수정된 난을 사용하는 것으로는 불충분하며 긴 과정을 수반한다. 사용된 HA 단백질은 각 균주에 특정하고, 다른 균주와는 교차-반응하지 않아서 광범한 스펙트럼의 균주를 제공할 수 없으며, 따라서 새로운 균주가 확인된 경우에는 일정한 제조 및 짧은 대응 시간이 필요하다.
어떤 변형 및/또는 돌연변이가 VLP를 생산하는데 사용되는 HA 자생 단백질에 도입될 수 있으며, 이러한 변형은 단지 1회 투여 후에도 하나 이상의, 또는 몇 가지의 독감 균주에 대한 중화 항체를 유도할 수 있는 광범한 스펙트럼을 가진 헤마글루티닌 단백질을 야기한다.
본 발명의 한 양태는 개선된 인플루엔자 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 신규 인플루엔자 바이러스-유사 입자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 광범한 스펙트럼의 항체 반응을 제공하도록 변형된 헤마글루티닌 단백질을 제공한다.
본 발명은 바이러스 외피 N-결합 당단백질의 아미노산 잔기 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 잔기 서열을 가지며, 부분적으로 또는 전체적으로 N-결합 탄수화물이 없는(즉, 원래 자생 HA 서열과 비교했을 때 하나 이상의 글리코실화 부위가 파괴된) 폴리펩티드, 및 이 폴리펩티드의 제조 및 이용 방법을 고찰한다.
본 발명의 또 다른 양태는 HA1 도메인의 N-결합 글리코실화 부위 중 하나 이상이 변형/결실/돌연변이/제거/파괴되어 광범한 스펙트럼의 인플루엔자 백신을 제조하는데 적합한 인플루엔자 VLP를 생산하도록 한 HA 단백질을 제공한다.
특히, HA1 도메인은 균주 A/Vietnam/1194/04(SEQ ID NO: 34)에 따라서 넘버링했을 때 위치 1-331에 위치된 아미노산을 포함한다. 더욱 구체적으로, HA1 도메인은 단백질의 구상 머리 부분과 F'2 도메인을 포함하며, 이것은 균주 A/Vietnam/ 1194/04(SEQ ID NO: 34)에 따라서 넘버링했을 때 이 단백질의 위치 39-331의 아미노산에 상응한다. 특히, 파괴되는 글리코실화 부위는 원래 단백질의 구상 머리 부분에 존재하고, 특히 SEQ ID NO: 34의 위치 39-273에 위치된 아미노산에 상응한다. 더욱 구체적으로, 파괴되는 글리코실화 부위는 원래 단백질의 F'2 도메인에 위치되며, 특히 SEQ ID NO: 34의 위치 274-331에 위치된 아미노산에 상응한다.
본 발명은 HA의 항원성 및 면역원성을 변경할 수 있는, 인플루엔자 A의 헤마글루티닌(NA) 분자 내의 아미노산 치환을 제공한다. 이러한 치환은 수용체 특이성 및/또는 항체-항원 결합을 변경함으로써 항원 부위를 변경할 수 있다. 다양한 구체예에서, 치환으로 인한 증가된 항원성이 인플루엔자에 대해 광범한 교차-반응성을 가진 백신을 제조하는데 유용할 수 있다. 특히, 아미노산 치환은 수용체 결합-부위에 상응하는, 특히 위치 154 및/또는 165 및/또는 286(여기서 넘버링은 균주 A/Vietnam/1194/04; SEQ ID NO: 34에 따른다)에 상응하는 위치에 있는 HA 단백질의 비-아스파라긴 잔기의 아미노산 치환이 나타내는 특징적인 면역원성을 가진 분자를 만든다. 특정 구체예에서, 아미노산 치환은 글리코실화 부위를 제거/결실/파괴한다.
인플루엔자 바이러스 증가된 항원성 HA 분자는 H5 HA에서 위치 154 및/또는 165 및/또는 286에 상응하는 위치에 하나 이상의 글리코실화되지 않은 아미노산을 포함할 수 있으며, 이때 이들 글리코실화 부위들 중 어느 하나의 제거는 야생형 HA 분자를 가진 인플루엔자 바이러스에 노출된 동물로부터 유래된 항혈청과의 반응성을 증가시킨다.
글리코실화 부위를 파괴하기 위해서, 3원 신호 N-X-S/T(여기서 N은 Asn이고, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있고, S/T는 Ser이나 Thr일 수 있다)가 단백질 조작에 의해 변형될 수 있다. 사용되는 첫 번째 접근법은 Asn을 다른 아미노산으로 치환하는 것일 수 있다. 두 번째 접근법은 글리코실화될 아스파라긴에 대해 위치 n+2에 있는 S/T 아미노산을 어떤 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이다. 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌을 치환하는데 사용되는 적합한 아미노산은 알라닌이며, 다른 아미노산들도 사용될 수 있다. 예를 들어, Asn은 Leu, He, Val, Thr, Ser 또는 Ala로 치환될 수 있다. 또한, Ser 또는 Thr은 Ala, Val, Ile 또는 Leu로 치환될 수 있다.
특히, 인플루엔자 바이러스 증가된 항원성 HA 분자는 H5 HA에서 위치 154 및/또는 165 및/또는 286에 비-아스파라긴 아미노산을 포함할 수 있다.
인플루엔자 바이러스 증가된 항원성 HA 분자는 머리 부분에 N-결합 글리코실화 부위가 없는, 즉 3개 글리코실화 부위가 모두 파괴된 HA 단백질을 포함할 수 있다.
인플루엔자 바이러스 증가된 항원성 HA 분자는 제거된 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함할 수 있고, 이것은 N-154, N-165 및 N-286으로 구성되는 군으로부터 선택된다(여기서 넘버링은 균주 A/Vietnam/1194/04에 따른다).
본 발명은 상이한 인플루엔자 균주로부터의 변형된 헤마글루티닌(HA)을 제공한다.
또한, 본 발명은 비-시알릴화 숙주 유기체에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자(VLP)를 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 비-시알릴화 숙주 유기체 또는 그것의 일부분에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된, 상기 정의된 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 항원을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계; 및
b) 핵산의 발현을 허용하는 조건에서 숙주 또는 그것의 일부분을 인큐베이션하여 VLP를 생산하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 상기 방법에 있어서, 도입 단계(단계 a)에서 핵산을 숙주에서 일시적으로 발현시키거나, 또는 숙주에서 안정하게 발현시킬 수 있는 것을 포함한다. 또한, VLP는, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
추가로, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자(VLP)의 생산에 사용되는 비-시알릴화 숙주 유기체에 관한 것이다. 특히, VLP를 생산할 수 있는 적합한 숙주는, 예를 들어 식물 또는 그것의 일부, 식물 세포, 곤충 또는 그것의 일부분, 또는 곤충 세포, 또는 효모 또는 그것의 일부분 또는 효모 세포이다.
본 발명에 따라서, 비-시알릴화 숙주 유기체에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 정의된 변형된 인플루엔자 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 항원은 분자의 머리 부분에서 하나 이상의 N-결합 글리코실화 부위(자생 서열에 정상적으로 존재하는 항원성 부위)가 제거된 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)일 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에서 정의된 인플루엔자 바이러스 HA 단백질과 하나 이상의 숙주 지질을 포함하는 바이러스-유사 입자(VLP)를 제공한다. 숙주가 곤충일 경우, 바이러스-유사 입자(VLP)는 인플루엔자 바이러스 HA 단백질과 하나 이상의 곤충 지질을 포함할 수 있고, 또는 숙주가 효모일 경우, 바이러스-유사 입자(VLP)는 인플루엔자 바이러스 HA 단백질과 하나 이상의 효모 지질을 포함할 수 있고, 또는 숙주가 식물일 경우, 바이러스-유사 입자(VLP)는 인플루엔자 바이러스 HA 단백질과 하나 이상의 식물 지질을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 식물에서 생산됨으로써 하나 이상의 식물 기원 지질(일반적으로 '식물 지질'이라고 한다)을 함유하게 된 VLP를 제공한다.
또한, 본 발명은 곤충 세포의 원형질막 유래의 지질(일반적으로 '곤충 지질'이라고 한다)을 포함하는 곤충 세포에서 생산된 VLP를 제공한다.
또한, 본 발명은 효모 세포의 원형질막 유래의 지질(일반적으로 '효모 지질'이라고 한다)을 포함하는 효모에서 생산된 VLP를 제공한다.
또한, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 인플루엔자 바이러스 HA 단백질을 포함하는 VLP의 유효량과 비-시알릴화 숙주 생산 세포로부터 유래된 하나 이상의 지질을 포함하는 조성물을 포함한다. 제약학적으로 허용되는 담체는 경구, 피내, 비내, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 투여에 적합한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 애쥬번트의 존재하에 또는 부형제 없이 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 본원에서 정의된 VLP의 면역학적 유효량을 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 백신은 경구, 피내, 비내, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 경로로 투여될 수 있다. 특히, 백신은 애쥬번트를 사용하지 않고 투여된다.
또한, 본 발명은 피험자에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유도하는 방법을 제공하며, 이 방법은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 하나 이상의 숙주 지질, 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 바이러스 유사 입자를 피험자에게 투여하는 단계를 포하한다. 바이러스-유사 입자는 경구, 피내, 비내, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 경로로 피험자에게 투여될 수 있다.
본 발명은 본원에서 정의된 하나 이상의 VLP를 포함하는 백신의 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유도하는 방법에 관한 것이다.
상기 정의된 방법에 의해서 치료되는 피험자는 사람, 영장류, 말, 돼지, 새(조류), 물새, 철새, 메추라기, 오리, 거위, 가금류, 닭, 낙타, 개과, 개, 고양이과, 고양이, 호랑이, 표범, 사향고양이, 밍크, 담비, 족제비, 애완동물, 가축, 생쥐, 쥐, 바다표범, 고래 등을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, 피험자는 일반적으로 사람 환자나 새(물새, 철새, 메추라기, 오리, 거위, 칠면조, 닭 등의 가금류를 포함한다)일 수 있고, 특히 철새나 사람에 의해 소비되는 가금류(메추라기, 오리, 거위, 칠면조, 닭)일 수 있다.
또한, 본 발명은 주사기와 같은 용기와 이러한 용기를 포함하는 키트를 제공하며, 이들 모두는 본원에서 정의된 백신 조성물을 포함한다.
상술한 본 발명의 내용이 반드시 본 발명의 모든 양태를 설명하는 것은 아니다.
본 발명의 이러한 특징들과 그 밖의 다른 특징들이 첨부된 도면을 참조하여 이후의 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1a는 인플루엔자 바이러스 HA H5 A/Indonesia/5/05 상의 글리코실화 부위의 국소화를 도시한다. 아미노산 식별, 위치 및 소재는 A/Vietnam/1194/04; SEQ ID NO: 34의 구조에 대한 것과 유사하게 표시된다(PDB 파일: 21BX). 구상 머리에 위치된 글리코실화 부위 N154, N165, 및 N286을 파괴하여 삼중 돌연변이를 만들었다. Bright 등(2003)의 연구를 이용하여 잠재적 항원성 부위의 위치를 지정했다. HA H1, H3 및 H7에 대해 문헌에 기재된 내용에 기초하여 글리코실화 타입을 결정했다(Abe Y. et al. (2004); Vigerust DJ et al. (2007); 및 Kuroda et al. (1990);
도 1b는 HA 모노머의 서브도메인을 도시한다. F'1(A/Vietnam/1194/04; SEQ ID NO: 34에 따라서 넘버링했을 때 1-38), F'2(274-331) 및 F 서브도메인이 표시된다. 수용체 결합 부위와 에스테라제 서브도메인이 함께 구상 머리(39-273)를 형성한다. 융합 펩티드는 흰색 상자로 표시된다. 밝혀진 구조에서는 HA의 가용성 브로멜라민 산물만이 결정화되므로 TmD와 세포 꼬리는 어떤 HA 구조에서도 볼 수 없다;
도 2는 상이한 A 서브타입 유래의 HA의 모노머 구조를 나타낸다. 지방족 대응부와 극성 머리를 가진 지질 이중층이 같이 제시된다. Ha 등(Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002)에 의한 조류 H5의 구조;
도 3은 본 발명의 구체예에 따른 H1의 발현에 사용된 자주개자리 플라스토시아닌-기반 발현 카세트의 서열을 나타낸다(SEQ ID NO: 8). 단백질 이황화 이소머라제(PDI) 신호 펩티드에 밑줄이 쳐있다. 클로닝에 사용된 BgIII(AGATCT)와 SacI (GAGCTC) 제한 부위는 볼드체로 표시된다;
도 4는 A/Indonesia/5/05 유래의 야생형 HA 서브타입 H5의 발현을 위해 조립된 플라스미드 660의 도해이다;
도 5는 A/Indonesia/5/05 유래의 비-글리코실화 돌연변이 HA 서브타입 H5의 발현을 위해 조립된 플라스미드 680의 도해이다;
도 6은 1차 및 2차 투약 후 전 불활성화 바이러스(WIV)에 대한 항체 역가를 나타낸다. 야생형 VLP 또는 삼중 돌연변이 VLP(비-글리코실화)로 면역화된 래트의 혈청 반응성을 1차(14일) 또는 2차(35일) 면역화 후 평가했다. 몇 개의 H5N1 바이러스에 대한 면역반응성을 평가했다;
도 7은 1차 및 2차 투약 후 혈구응집반응-억제(HI) 항체 역가를 나타낸다. 야생형 VLP 또는 삼중 돌연변이 VLP(비-글리코실화)로 면역화된 래트의 HI 역가를 1차(제14일) 또는 2차(제35일) 면역화 후 14일째에 평가했다. 몇 개의 H5N1 바이러스와 1개의 H1N1 바이러스에 대한 면역반응성을 평가했다;
도 8은 인플루엔자 HA0의 서열 목록이다;
도 9는 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H2의 서열 목록이다;
도 10은 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H3의 서열 목록이다;
도 11은 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H4의 서열 목록이다;
도 12는 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H5의 서열 목록이다;
도 13은 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H6의 서열 목록이다;
도 14는 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H7의 서열 목록이다;
도 15는 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H8의 서열 목록이다;
도 16은 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H9의 서열 목록이다;
도 17은 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H10의 서열 목록이다;
도 18은 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H11의 서열 목록이다;
도 19는 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H12의 서열 목록이다;
도 20은 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H13의 서열 목록이다;
도 21은 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H14의 서열 목록이다;
도 22는 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H15의 서열 목록이다;
도 23은 인플루엔자 HA 단백질 서브타입 H16의 서열 목록이다;
도 24는 완전 야생형 H5 서열을 함유하는 660 pCAMBIA 발현 벡터의 서열 목록이다;
도 25a-j는 PCR 증폭에 사용된 프라이머들의 서열 목록이다.
도 26은 초기 ATG 바로 상류에 HindIII 부위와 중단(TAA) 코돈 바로 하류에SacI 부위가 측면 위치된 자생 신호 펩티드를 포함하는 완전 H5 코딩 영역을 함유하는, 생산된 단편의 서열 목록이다;
도 27은 초기 ATG 바로 상류에 HindIII 부위와 중단(TAA) 코돈 바로 하류에SacI 부위가 측면 위치된 자생 신호 펩티드를 포함하는, 3개 글리코실화 부위가 모두 제거되도록 변형된 완전 H5 코딩 영역을 함유하는, 생산된 단편의 서열 목록이다;
도 28a-d는 PCR 증폭용 프라이머들의 서열 목록이다;
도 29는 균주 A/Vietnam/1194/04 유래의 성숙 H5의 아미노산 서열이다;
도 30a-b는 각각 균주 B/Florida/4/2006 유래 성숙 HA의 핵산 서열 및 아미노산 서열이다.
본 발명은 바이러스-유사 입자(VLP)의 제조에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인플루엔자 항원을 포함하는 바이러스-유자 입자의 제조에 관한 것이다.
다음의 설명은 특정 구체예이다.
1 - HA 단백질
본원에서 사용된 "단백질"은 일반적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 사슬을 말하며, 이것은 2차, 3차 또는 4차 구조로 폴딩되어 특정 형태를 달성할 수 있다. 또는 달리, 용어 폴리펩티드, 펩티드 또는 펩티드 단편이 유사한 상황에서 사용될 수 있다.
용어 "헤마글루티닌 도메인"은 HA0 전구체 폴리펩티드, 또는 HA1 및 HA2 도메인을 포함하는 펩티드를 말한다. 헤마글루티닌 도메인은 신호 펩티드, 막통과 도메인, 또는 자연 발생 단백질에서 발견된 세포질 꼬리를 포함하지 않는다.
인플루엔자 바이러스와 관련하여, 용어 "헤마글루티닌" 또는 "HA"는 본원에서 사용되었을 때 인플루엔자 바이러스 입자의 외부에서 발견되는 당단백질을 말한다. HA는 동종삼량체 막 타입 I 당단백질이며, 일반적으로 신호 펩티드, HA1 도메인, 및 C-말단에 있는 막에 걸쳐 있는 앵커 부위와 작은 세포질 꼬리를 포함하는 HA2 도메인을 포함한다(도 1B). HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 BioDefence 보건 베이스(인플루엔자 바이러스; URL: biohealthbase.org 참조), 또는 국립 생물공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information)(URL: ncbi.nlm.nih.gov 참조)에서 입수할 수 있다.
인플루엔자 HA 에 대한 구조 정보
HA 모노머는 2개의 뚜렷이 분리된 기능 도메인, 즉 구형 머리 도메인과 줄기 도메인으로 세분될 수 있다. HA의 1차 서열과 구조 사이에서 이들 도메인의 대응성이 도 1B 및 2에 도시된다. 줄기 도메인은 산성 pH에서 일어날 수 있는 평상시와는 다른 입체형태 변화를 통해 바이러스의 감염성 및 병원성에 관련된다. 또한, 4개의 서브도메인, 즉 융합 펩티드(저-pH 입체형태 상태에서 숙주 막과 융합을 일으키는 26개 아미노산의 소수성 스트레치); 줄기 도메인(2개의 매우 상이한 입체형태를 수용할 수 있다); 막통과 도메인(TmD)(지질 라프트에 대한 HA의 친화성을 결정한다); 세포질 꼬리(Ctail)(HA의 분비에 관련된다)로서 설명된다. 구형 머리는 2개의 서브도메인, 즉 수용체 결합(RB) 도메인과 퇴화된 에스테라제 도메인(E)으로 구분된다. 에스테라제 서브도메인은 단백질 표면에 묻혀 있으며, 따라서 HA에 대해 생기는 대부분의 항체는 수용체 결합 도메인(도 2에서 머리의 맨 윗부분에 표시된)과 결합한다.
용어 "동종삼량체" 또는 "동종삼량체의"는 3개의 HA 단백질 분자에 의해 형성된 올리고머를 말한다. 이론과 결부시키고 싶지는 않지만, HA 단백질은 약 75 kDa의 단량체 전구물질 단백질(HA0)로서 합성되고, 이것이 표면에서 삼량체 단백질로 길게 회합된다. 삼량체화가 일어나기 전에 전구물질 단백질이 보존성 활성화 절단 부위(융합 펩티드라고도 한다)에서 2개의 폴리펩티드 사슬 HA1 및 HA2(막통과 영역을 포함한다)로 절단되며, 이들은 이황화 결합에 의해 연결된다. HA1 세그먼트는 328개 아미노산 길이일 수 있고, HA2 세그먼트는 221개 아미노산 길이일 수 있다. 이 절단은 바이러스 감염성에는 중요할 수 있지만 단백질의 삼량체화에 필수적인 것은 아니다. 숙주 세포의 세포질세망(ER) 막 안으로 HA의 삽입, 신호 펩티드 절단 및 단백질 글리코실화가 동시 번역되는 사건이다. HA의 정확한 리폴딩에는 단백질의 글리코실화와 6개의 사슬내 이황화 결합의 형성이 필요하다. HA 삼량체는 시스- 및 트랜스-Golgi 복합체 내에서 회합되며, 막통과 도메인이 삼량체화 과정에서 어떤 역할을 한다. 막통과 도메인이 상실된 브로멜라인-처리된 HA 단백질의 결정 구조는 인플루엔자 균주들 중에서도 가장 보존성 구조를 나타냈다. 또한, HA는 감염 과정 동안 중요한 입체형태적 변화를 겪는다는 것이 입증되었으며, 이것에는 전구물질 HA0가 2개의 폴리펩티드 사슬 HA1 및 HA2로 절단되는 것이 필요하다. HA 단백질은 가공될 수도 있고(즉, HA1 및 HA2 도메인을 포함한다) 가공되지 않을 수도 있다(즉, HA0 단백질을 포함한다).
본 발명은 막통과 도메인을 포함하는 HA 단백질의 사용에 관한 것이며, HA1 및 HA2 도메인을 포함하는데, 예를 들어 HA 단백질은 HA0이거나, 또는 HA1 및 HA2를 포함하는 가공된 HA일 수 있다.
본 발명의 HA는 어떤 서브타입으로부터도 획득될 수 있다. 예를 들어, HA는 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H1O, H11, H12, H13, H14, H15, 또는 H16을 가질 수 있다.
본 발명은 변형된 N-글리칸을 가진 HA를 포함하는 VLP를 포함한다. 또한, 본 발명의 재조합 HA는 본 분야에 공지된 모든 헤마글루티닌 서열에 기초한 아미노산 서열을 포함할 수 있고 - 예를 들어, BioDefence 보건 베이스(Influenza Virus; URL: biohealthbase.org) 또는 국립 생물공학 정보센터(URL: ncbi.nlm.nih.gov) 참조, 이때 자생 N-결합 글리코실화 부위가 제거/돌연변이/결실/변형되어 펩티드 항원성 부위를 가리는 당 잔기가 제거될 수 있다.
더욱이, HA는 하나 이상의 출현해 있는 또는 새로 확인된 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 헤마글루티닌의 서열에 기초할 수 있다.
또한, HA 서브타입들의 조합을 포함하는 VLP가 제조될 수 있다. 예를 들어, VLP는 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 또는 이들의 조합으로부터 하나 이상의 HA를 포함할 수 있다. HA 조합의 선택은 VLP로부터 제조된 백신의 사용 용도에 따라서 결정될 수 있다. 예를 들어, 새에 접종하는데 사용되는 백신은 HA 서브타입들의 어떤 조합이라도 포함할 수 있지만, 사람을 접종하는데 유용한 VLP는 서브타입 H1, H2, H3 또는 H5 중 하나 이상에서 유래하는 서브타입을 포함할 수 있다. 그러나, 다른 HA 서브타입 조합되 VLP의 용도에 따라서 제조될 수 있다. HA 서브타입 조합을 포함하는 VLP를 제조하기 위해서, 바람직한 HA 서브타입이 동일한 세포, 예를 들어 식물 세포에서 공-발현될 수 있다.
특히, 본원에 설명된 대로 제조된 VLP는 뉴라미니다제(NA)를 포함하지 않는다. 그러나, HA와 NA를 포함하는 VLP를 원하는 경우에는 NA가 HA와 공-발현될 수 있다.
2 - 독감 서브타입
본 발명은 모든 종류의 사람 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 제한은 아니지만, 예를 들어, 매우 유행하는 A 서브타입, 및 덜 흔한 B 타입, 및 C 타입, 및 다른 인플루엔자 서브타입으로부터 얻어지는 HA들을 포함한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 서브타입으로부터 얻어진 HA를 포함하는 VLP를 포함한다. 예를 들어, VLP는 서브타입 H1(SEQ ID NO:1에 의해서 암호화), H2(SEQ ID NO: 2에 의해서 암호화), H3(SEQ ID NO: 3에 의해서 암호화), H4(SEQ ID NO: 4에 의해서 암호화), H5(SEQ ID NO: 5에 의해서 암호화), H6(SEQ ID NO: 6에 의해서 암호화), H7(SEQ ID NO: 7에 의해서 암호화), H8(SEQ ID NO: 8에 의해서 암호화), H9(SEQ ID NO: 9에 의해서 암호화), H1O(SEQ ID NO: 10에 의해서 암호화), H11(SEQ ID NO: 11에 의해서 암호화), H12(SEQ ID NO: 12에 의해서 암호화), H13(SEQ ID NO: 13에 의해서 암호화), H14(SEQ ID NO: 14에 의해서 암호화), H15(SEQ ID NO: 15에 의해서 암호화), H16(SEQ ID NO: 16에 의해서 암호화), 또는 이들의 조합으로부터 하나 이상의 HA를 포함할 수 있다. 하나 이상의 인플루엔자 서브타입으로부터의 하나 이상의 HA는 식물 또는 곤충 세포에서 공-발현될 수 있으며, 이로써 하나 이상의 HA가 합성된 결과로서 하나 이상의 인플루엔자 서브타입으로부터 획득된 HA들의 조합을 포함하는 VLP의 형성이 보장된다. HA 조합의 선택은 VLP로부터 제조된 백신의 사용 용도에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 사람을 접종하는데 사용되는 백신은 HA 서브타입의 어떤 조합, 특히 서브타입 H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 및 N7 중 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다. 특히, H1, H2, H3, H5.
그러나, 다른 HA 서브타입 조합들도 접종 용도에 따라 제조될 수 있다.
3 - 제조 방법
또한, 본 발명은 숙주에서 바이러스-유사 입자(VLP)를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 VLP, 및 단일 외피 단백질의 발현으로부터 숙주 발현 시스템에서 바이러스 VLP를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 숙주 또는 그것의 일부분에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 항원을 암호화하는 핵산을 도입하는 단계, 및 핵산의 발현을 허용하는 조건에서 숙주 또는 그것의 일부분을 인큐베이션하여 VLP를 제조하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 조절 요소는 형질전환, 또는 일시 발현을 행할 수 있는 일련의 숙주 유기체, 특히 식물, 곤충 또는 효모에서의 발현에 알맞은 관심의 코딩 영역과 조합될 수 있다.
특히, 이러한 유기체는 외떡잎식물과 쌍떡잎식물이며, 제한은 아니지만, 예를 들어, 옥수수, 곡식, 밀, 보리, 귀리, Nicotiana spp, Brassica spp, 대두, 콩, 완두콩, 자주개자리, 감자, 토마토, 인삼, 및 Arabidopsis을 포함한다.
이들 유기체의 안정한 형질전환, 및 재생 방법은 본 분야에 정립되어 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다. 형질전환되고 재생된 식물을 획득하는 방법은 본 발명에서 중요하지 않다.
"형질전환"은 유전형적으로, 표현형적으로 또는 양쪽 모두의 분명한 유전자 정보(뉴클레오티드 서열)의 안정한 종간 전달을 의미한다. 키메라 구성물로부터의 유전자 정보가 숙주로 종간 전달되는 것은 유전일 수 있고, 유전자 정보의 전달은 안정하다고 간주되거나, 또는 전달은 일시적일 수 있고, 유전자 정보의 전달은 유전이 아니다.
일시 발현 방법을 사용하여 본 발명의 구성물을 발현할 수 있다(본원에 참고로 포함되는 Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105: 343-348 참조). 대안으로서, Kapila 등(1997, 본원에 참고자료로 포함된다)에 의해 설명된 진공-기반 일시 발현 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 아그로-접종 또는 아그로-침윤의 방법을 포함할 수 있으며, 다른 일시 방법도 상기 주지된 대로 사용될 수 있다. 아그로-접종 또는 아그로-침윤에서는 원하는 핵산을 포함하는 아그로박테리아의 혼합물을 조직, 예를 들어 잎, 식물의 기생부(줄기, 잎 및 꽃을 포함), 다른 식물 부분(줄기, 뿌리, 꽃), 또는 전체 식물의 세포간 공간에 도입한다. 표피의 교차 후 아그로박테리움이 세포를 감염시켜 세포로 t-DNA 카피를 전달한다. t-DNA가 에피솜 전사되고 mRNA 번역되어 감염된 세포에서 관심의 단백질이 생산되며, t-DNA의 핵 내부 통과는 일시적이다.
4 - 숙주 유기체
본 발명의 VLP는 단백질을 시알릴화하는 능력을 결여한 것을 특징으로 하는, 예를 들어 시알리다제가 없는 숙주 세포, 예를 들어 식물 세포, 곤충 세포, 진균, 및 해면, 강장동물문, 환형동물문, 절지동물문, 연체동물문, 선형동물문, 트로켈민테스, 편충동물문, 모악동물문, 유촉수강, 클라미디아, 스피로헤타, 그람-양성 박테리아, 시아노박테리아, 고세균을 포함하는 다른 유기체들에서 생산될 수 있으며, 이들은 글리코포럼에서 확인되었다(URL: glycoforum.gr.jp/science/word/evolution /ES-AOSE.html 참조).
본원에 설명된 대로 제조된 VLP는 전형적으로 뉴라미니다제(NA)를 포함하지 않는다. 그러나, HA와 NA를 포함하는 VLP가 바람직하다면 NA가 HA와 함께 공-발현될 수 있다.
특히, 본 발명의 VLP는 식물 세포, 전체 식물 또는 그것의 일부분, 예를 들어 잎, 종자, 또는 어떤 다른 식물 물질에서 제조될 수 있다.
용어 "식물 물질"은 식물로부터 유래된 어떤 재료를 의미한다. 식물 물질은 전체 식물, 조직, 세포, 또는 이들의 어떤 단편을 포함할 수 있다. 또한, 식물 물질은 세포내 식물 성분, 세포외 식물 성분, 식물의 액체 또는 고체 추출물 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 식물 물질은 식물 잎, 줄기, 열매, 뿌리 또는 이들의 조합으로부터의 식물, 식물 세포, 조직, 액체 추출물 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 식물 물질은 어떤 가공 단계를 거치지 않는 식물 또는 식물의 일부분을 포함할 수 있다. 그러나, 식물 재료는 아래 정의된 최소한의 가공 단계, 또는 더 엄격한 가공을 거칠 수도 있다는 것이 또한 고려되며, 이것은 제한되는 것은 아니지만, 크로마토그래피, 전기영동 등을 포함하는 본 분야에 일반적으로 알려진 기술을 사용한 부분적 또는 실질적 단백질 정제를 포함한다.
용어 "최소 가공"은 식물 물질, 예를 들어 관심의 단백질을 포함하는 식물 또는 식물의 일부를 부분적으로 정제하여 식물 추출물, 균질물, 식물 균질물의 단편 등을 수득하는 것을 의미한다(즉, 최소한으로 가공). 부분적 정제는, 제한되는 것은 아니지만, 식물 세포의 구조를 파괴함으로써 가용성 식물 성분, 및 불용성 식물 성분을 포함하는 조성물을 만드는 것을 포함할 수 있으며, 불용성 식물 성분은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 원심분리, 여과 또는 이들의 조합에 의해 분리될 수 있다. 이와 관련하여, 잎이나 다른 조직의 세포외 공간 내에 분비된 단백질이 진공 또는 원심분리 추출을 사용하여 쉽게 획득될 수 있거나, 또는 롤러를 통해 통과시키거나 분쇄함으로써 가압하에 조직을 추출하여 세포외 공간 내로부터 자유 단백질을 압착하거나 유리시킬 수 있다. 또, 최소 가공은 가용성 단백질의 조 추출물의 제조를 수반할 수 있는데, 이들 제조에서 부수적인 식물 산물로부터의 오염은 무시할 만하다. 더욱이, 최소 가공은 잎으로부터 가용성 단백질을 수성 추출한 후 어떤 적합한 염으로 침전시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 방법은 대규모 침출과 즙 추출을 포함할 수 있으며, 이 추출물은 직접 사용할 수 있다.
식물 재료 또는 조직 형태의 식물 물질은 피험체에게 경구 송달될 수 있다. 식물 물질은 다른 음식과 함께 식이보충제의 일부로서, 또는 캡슐화되어 투여될 수 있다. 또한, 식물 물질 또는 조직은 식감을 개선하거나 증가시키기 위해 농축되거나, 또는 필요에 따라 다른 재료, 성분 또는 제약학적 부형제와 함께 제공될 수 있다.
또, 본 발명의 키메라 유전자 구성물을 함유하는 트랜스제닉 식물, 식물 세포 또는 종자가 본 발명의 일부로서 고려된다. 또한, 식물 세포로부터 전체 식물을 재생하는 방법도 본 분야에 공지되어 있다. 일반적으로 형질전환된 식물 세포를 항생제와 같은 선택제를 함유할 수 있는 적합한 배지에서 배양하며, 이 경우 선택성 마커를 사용하여 형질전환된 식물 세포의 확인을 용이하게 한다. 일단 유합조직이 형성되면, 공지된 방법에 따라서 적합한 식물 호르몬을 사용하여 신초 형성을 촉진한 다음, 신초를 식물 재생용 발근 배지로 옮긴다. 다음에, 이 식물을 사용하여 종자로부터나 아니면 식물 증식기술을 사용해서 반복하여 세대를 확립할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 식물은 조직 배양을 사용하지 않고도 생성될 수 있다.
또한, 본 발명에 따라서, VLP 제조를 위한 재조합 HA0를 암호화하는 핵산을 포함하는 키메라 유전자 구성물을 함유하는 트랜스제닉 식물, 나무, 효모, 박테리아, 진균, 곤충 및 동물 세포가 본 발명의 일부분으로 고려된다.
관심의 단백질을 포함하거나, 또는 관심의 단백질을 포함하는 VLP를 발현하는 식물은 필요와 상황에 따라서 다양한 방식으로 피험자 또는 표적 생물에 투여될 수 있다. 예를 들어, 식물로부터 획득된 관심의 단백질은 사용하기 전에 조 형태, 부분 정제된 형태, 또는 정제된 형태로 추출될 수 있다. 단백질이 정제된다면, 그것은 식용이나 비식용 식물에서 생산될 수 있다. 또한, 단백질이 경구 투여될 경우, 식물 조직을 수거하여 피험자에게 직접 공급하거나, 또는 공급 전에 수거된 조직을 건조하거나, 또는 수거하지 않고 동물로 하여금 식물을 뜯어먹도록 할 수 있다. 또한, 수거된 식물 조직을 동물 사료의 식품보충제로서 제공하는 것이 본 발명의 범위로 고려된다. 거의 또는 전혀 더 가공하지 않고 식물 조직을 동물에 공급하는 경우, 투여되는 식물 조직은 식용인 것이 바람직하다.
전사-후 유전자 침묵화(PTGS)가 식물에서 트랜스젠의 발현을 제한하는데 관련될 수 있으며, 감자 바이러스 Y(HcPro)로부터 침묵화 억제인자를 공-발현시킴으로써 트랜스젠 mRNA의 특이적 변성을 상쇄할 수 있다(Brigneti et al., 1998). 다른 침묵화 억제인자들도 본 분야에 잘 공지되어 있고, 본원에 설명된 대로 사용될 수 있으며(Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14; 본원에 참고자료로 포함된다), 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 TEV-p1/HC-Pro(담배식각 바이러스-p1/HC-Pro), BYV-p21, 토마토 덤불위축 바이러스 p19(TBSV p19), 토마토 축엽 바이러스 캡시드 단백질(TCV-CP), 오이 모자이크 바이러스 2b(CMV-2b), 감자 바이러스 X p25(PVX-p25), 감자 바이러스 M p11(PVM-p11), 감자 바이러스 S p11(PVS-p11), 블루베리 스코치 바이러스 p16(BScV-p16), 감귤 트리스테자 바이러스 p23(CTV-p23), 포도나무 잎말림-관련 바이러스-2 p24(GLRaV-2 p24), 포도나무 바이러스 A p10(GVA-p1O), 포도나무 바이러스 B p14(GVB-p14), 어수리 잠복 바이러스 p10(HLV-p1O), 또는 마늘 공통 잠복 바이러스 p16(GCLV-p16)을 포함한다. 따라서, 침묵화 억제인자, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 HcPro, TEV-p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p29, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p1O, GCLV-p16 또는 GVA-p1O이 관심의 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 함께 공발현될 수 있으며, 이로써 식물에서 높은 수준의 단백질 생산이 보장된다.
외피보유 바이러스의 VLP는 일반적으로 이들이 발아한 막으로부터 이들의 외피를 획득한다. 식물 원형질막은 면역자극 효과를 가질 수 있는 피토스테롤 보체를 가진다. 이 가능성을 조사하기 위해 식물-제조 H5 VLP를 애쥬번트의 존재 또는 부재하에 동물에 투여하고 HAI(혈구응집 반응 억제 항체반응)을 측정했다(도 7).
식물에서 VLP의 생산은 곤충 세포 배양물에서 이들 입자를 제조하는 것에 비해 몇 가지 이점을 나타낸다. 식물 지질은 특정 면역세포를 자극하여 유도된 면역반응을 증진시킬 수 있다. 식물 막은 지질, 포스파티딜콜린(PC) 및 포스파티딜에탄올아민(PE)으로 이루어지며, 또한 식물 및 일부 박테리아와 원생동물에 특유한 글리코스핑고지질을 함유한다. 스핑고지질은 PC나 PE처럼 글리세롤의 에스테르가 아니라, 18개를 초과하는 탄소를 함유하는 지방산 사슬과 아미드 결합을 형성하는 장쇄 아미노 알코올로 구성된다는 점에서 일반적이지 않다. PC 및 PE뿐만 아니라 글리코스핑고지질도 수지상세포 및 대식세포와 같은 항원-제시 세포(APC) 및 흉선과 간의 B 및 T 림프구를 포함하는 다른 세포들과 마찬가지로 포유동물 면역세포에 의해서 발현된 CD1 분자와 결합할 수 있다(Tsuji M., 2006). 더욱이, 식물 지질 존재의 잠재적 애쥬번트 효과에 더하여, 항원-제시 세포에 의한 당단백질 항원의 포착을 촉진하는 식물 N-글리칸의 능력(Saint-Jore-Dupas, 2007)이 식물에서 VLP를 생산하는 것의 이점일 수 있다.
이론과 결부시키고 싶지는 않지만, 다른 생산/제조 시스템에서 제조된 VLP보다 식물-제조 VLP가 더 강한 면역반응을 유도할 것이며, 이들 식물-제조 VLP에 의해 유도된 면역반응은 생백신 또는 감독된 전 바이러스 백신에 의해 유도된 면역반응에 비하여 더 강할 것이라고 예상된다.
전 바이러스로 만든 백신과는 반대로, VLP는 비-감염성이라는 이점을 제공하며, 따라서 구속적인 생물학적 봉쇄가 감염성 전 바이러스를 사용하여 작업하는 경우처럼 중요한 문제는 아니며 생산에 필요하지도 않다. 식물-제조 VLP는 발현 시스템을 온실이나 야외에서 성장시킬 수 있다는 것을 또 다른 이점으로 제공하며, 따라서 상당히 더 경제적이고 대규모화에 적합하다.
이에 더하여, 식물은 시알산 잔기를 합성하거나 단백질에 시알산 잔기를 부가하는데 연루되는 효소를 포함하지 않는다. VLP는 뉴라미니다제(NA) 없이 생산될 수 있으며, NA의 공-발현이나, 또는 생산된 세포 또는 추출물을 시알리다제(뉴라미니다제)로 처리하는 것 없이도 식물에서 VLP 생산이 보장된다.
특히, 본 발명에 따라서 생산된 VLP는 RNA와 결합한다고 알려진 M1 단백질을 포함하지 않는다. RNA는 VLP 제제에서 오염물질이며, VLP 제품에 대해 규제당국의 승인을 얻는데 있어서 바람직하지 않다.
5 - 핵산
본 발명은 비-시알릴화 숙주 유기체에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명은, 예를 들어, 제한은 아니지만 숙주 발현 벡터에서 HA, 예를 들어, 제한은 아니지만 사람 인플루엔자 A 바이러스 HA를 암호화하는 핵산을 클로닝하고, 백신 제조에 적합한 그 숙주로부터 인플루엔자 VLP를 제조하는 것을 설명한다. 또한, VLP를 사용하여, 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 식물 세포 또는 곤충 세포에서 서브바이러스 인플루엔자 입자 및 인플루엔자 VLP를 포함하여, 기능성이며 면역원성인 동종타입 거대분자 단백질 구조로 자체 회합하는 재조합 인플루엔자 구조 단백질들로 이루어진 시약을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 뉴클레오티드 서열 H1(SEQ ID NO:1에 의해 암호화), H2(SEQ ID NO: 2에 의해서 암호화), H3(SEQ ID NO: 3에 의해서 암호화), H4(SEQ ID NO: 4에 의해서 암호화), H5(SEQ ID NO: 5에 의해서 암호화), H6(SEQ ID NO: 6에 의해서 암호화), H7(SEQ ID NO: 7에 의해서 암호화), H8(SEQ ID NO: 8에 의해서 암호화), H9(SEQ ID NO: 9에 의해서 암호화), H1O(SEQ ID NO: 10에 의해서 암호화), H11(SEQ ID NO: 11에 의해서 암호화), H12(SEQ ID NO: 12에 의해서 암호화), H13(SEQ ID NO: 13에 의해서 암호화), H14(SEQ ID NO: 14에 의해서 암호화), H15(SEQ ID NO: 15에 의해서 암호화), H16(SEQ ID NO: 16에 의해서 암호화)을 포함한다.
또한, 본 발명은 H1, H5 또는 H7로부터의 HA를 각각 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; 긴축 혼성화 조건에서 H1, H5 또는 H7로부터의 HA를 암호화하는 핵산과 각각 혼성화되는 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 긴축 혼성화 조건에서 H1, H5 또는 H7로부터의 HA를 암호화하는 핵산의 보체와 각각 혼성화되는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7을 포함하며, 이때 뉴클레오티드 서열은 발현되었을 때 VLP를 형성하는 헤마글루티닌 단백질을 암호화하고, 이 VLP는 항체의 생산을 유도한다. 예를 들어, 식물 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, 이 VLP를 사용하여 성숙한 HA, HA0, HA1 또는 HA2를 포함하는 HA와 결합할 수 있는 항체를 생산할 수 있다. 피험자에게 투여되었을 때 VLP는 면역반응을 유도한다.
긴축 혼성화 조건에서의 혼성화는 본 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 본원에 참고자료로 포함되는 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds. 1995 and supplements; Maniatis et al., Molecular Cloning(A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition 2001 참조). 한 이러한 긴축 혼성화 조건의 예는 65℃에서 4x SSC에서 약 16-20시간 혼성화한 후, 65℃에서 0.1x SSC에서 1시간 세척, 또는 65℃에서 0.1x SSC에서 각각 20분 또는 30분씩 2번 세척하는 것일 수 있다. 대안으로서, 전형적인 긴축 혼성화 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 4x SSC에서 하룻밤(16-20시간) 혼성화하고, 65℃에서 0.1x SSC에서 1시간, 또는 65℃에서 0.1x SSC에서 각각 20분 또는 30분씩 2번 세척하는 것, 또는 65℃에서 Church 수성 포스페이트 버퍼(7% SDS; 0.5M NaPO4 버퍼 pH 7.2; 10mM EDTA)에서 하룻밤(16-20시간) 혼성화하고, 50℃에서 0.1x SSC, 0.1% SDS에서 각각 20분 또는 30분씩 2번 세척하거나, 또는 65℃에서 2x SSC, 0.1% SDS에서 각각 20분 또는 30분씩 2번 세척하는 것일 수 있다.
추가하여, 본 발명은 H1(SEQ ID NO: 1), H5(SEQ ID NO: 5) 또는 H7(SEQ ID NO: 7)로부터의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이 사이의 임의의 값의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 갖는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 뉴클레오티드 서열은 발현되었을 때 VLP를 형성하는 헤마글루티닌 단백질을 암호화하며, 이 VLP는 항체의 생산을 유도한다. 예를 들어, 식물 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, 이 VLP를 사용하여 성숙한 HA, HA0, HA1 또는 HA2를 포함하는 HA와 결합할 수 있는 항체를 생산할 수 있다. 피험자에게 투여되었을 때 VLP는 면역반응을 유도한다.
서열 동일성 또는 서열 유사성은 뉴클레오티드 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 예를 들어 DNASIS(제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 파라미터로서 GAP 패널티 5, 상부 대각선의 수 5, 고정 GAP 패널티 10, k-tuple 2, 플로팅 갭 10, 및 창 크기 5를 사용한다)가 있다. 그러나, 비교를 위한 서열 정렬의 다른 방법들도 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 Smith & Waterman 알고리즘(1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman 알고리즘(1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), 및 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행(예를 들어, GAP, BESTFIT, FASTA, 및 BLAST), 또는 수동 정렬 및 육안 검사가 있다.
따라서, 본 발명은 안정한 또는 일시적 발현 시스템과 함께 사용하기 적합한 키메라 구성물을 포함하는 적합한 벡터를 더 포함한다. 또한, 하나 이상의 구성물에는 유전자 정보가 제공될 수 있다. 예를 들어, 관심의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 한 구성물에 도입될 수 있고, 관심의 단백질의 글리코실화를 변형하는 단백질을 암호화하는 제 2 뉴클레오티드 서열이 별도의 구성물을 사용하여 도입될 수 있다. 다음에, 이들 뉴클레오티드 서열이 식물에서 공-발현될 수 있다. 그러나, 관심의 단백질과 관심의 단백질의 글리코실화 프로파일을 변형하는 단백질을 둘 다 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구성물도 사용될 수 있다. 이 경우, 뉴클레오티드 서열은 프로모터 또는 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 관심의 단백질을 암호화하는 제 1 핵산 서열을 포함하는 제 1 서열, 및 프로모터 또는 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 관심의 단백질의 글리코실화 프로파일을 변형하는 단백질을 암호화하는 제 2 핵산 서열을 포함하는 제 2 서열을 포함할 것이다.
"공-발현"은 둘 이상의 뉴클레오티드 서열이 식물, 및 식물의 동일한 조직에서 대략 동시에 발현되는 것을 의미한다. 그러나, 뉴클레오티드 서열들이 정확히 동시에 발현될 필요는 없다. 오히려 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 암호화된 산물들이 상호작용할 기회를 가질 수 있는 방식으로 발현된다. 예를 들어, 관심의 단백질이 발현되는 시기 전에 또는 도중에 관심의 단백질의 글리코실화를 변형하는 단백질을 발현시킴으로써 관심의 단백질의 글리코실화의 변형이 일어날 수 있다. 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 일시 발현 시스템을 사용하여 공-발현될 수 있고, 이 경우 둘 이상의 서열은 두 서열이 모두 발현되는 조건하에 대략 동시에 식물에 도입된다. 대안으로서, 뉴클레오티드 서열 중 하나, 예를 들어 관심의 단백질의 글리코실화 프로파일을 변형하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플랫폼 식물이 관심의 단백질을 암호화하는 추가 서열과 함께 일시적으로 또는 안정한 방식으로 형질전환될 수 있다. 이 경우, 관심의 단백질의 글리코실화 프로파일을 변형하는 단백질을 암호화하는 서열은 원하는 발생 단계 동안 원하는 조직에서 발현될 수 있거나, 또는 그것의 발현은 유도성 프로모터를 사용하여 유도될 수 있고, 관심의 단백질을 암호화하는 추가 서열은 유사한 조건하에 동일한 조직에서 발현될 수 있으며, 이로써 뉴클레오티드 서열의 공-발현이 보장된다.
본 발명의 구성물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 마이크로인젝션, 전기천공 등을 사용하여 식물 세포에 도입될 수 있다. 이러한 기술에 관한 리뷰는, 예를 들어 Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463(1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); 및 Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579(1997)를 참조한다. 다른 방법은 직접 DNA 흡수, 리포솜의 사용, 원형질체를 사용하는 등의 전기천공, 마이크로인젝션, 마이크로프로젝타일 또는 휘스커, 및 진공 침윤을 포함한다. 예를 들어, Bilang, et al.(Gene 100: 247-250(1991), Scheid et al.(Mol. Gen. Genet. 228:104-112, 1991), Guerche et al.(Plant Science 52:111-116, 1987), Neuhause et al.(Theor. Appl Genet. 75:30 -36, 1987), Klein et al., Nature 327:70-73(1987); Howell et al.(Science 208: 1265, 1980), Horsch et al.(Science 227:1229-1231, 1985), DeBlock et al, Plant Physiology 91:694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff(J. Virol Meth, 105:343-348, 2002), U.S. 4,945,050; U.S 5,036,006; U.S. 5,100,792, 1995년 5월 10일 제출된 미국 특허출원 08/438,666, 및 1992년 9월 25일 제출된 07/951,715를 참조한다(모두 본원에 참고로 포함된다).
"조절 영역", "조절 요소" 또는 "프로모터"는 항상 그런 것은 아니지만 전형적으로 유전자의 단백질 코딩 영역의 상류에 있는 핵산의 일부분을 의미하며, 이것은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA와 RNA로 이루질 수 있다. 조절 영역이 활성이고, 관심의 유전자와 작동 가능하게 결합되거나, 또는 작동 가능하게 연결된 경우, 이것은 관심의 유전자의 발현을 가져올 수 있다. 조절 요소는 기관 특이성을 매개하거나, 또는 발생적 또는 시간적 유전자 활성화를 제어할 수 있다. "조절 영역"은 프로모터 요소, 기본적 프로모터 활성을 나타내는 코어 프로모터 요소, 외부 자극에 대한 반응으로서 유도될 수 있는 요소, 음성 조절 요소와 같은 프로모터 활성을 매개하는 요소 또는 전사 인핸서를 포함한다. 또한, "조절 영역"은 본원에서 사용되었을 때 전사 후 활성인 요소, 예를 들어 번역 및 전사 인핸서, 번역 및 전사 리프레서, 상류 활성화 서열, 및 mRNA 불안정성 결정소와 같은 유전자 발현을 조정하는 조절 요소를 포함한다. 이러한 후자의 요소들 중 몇 개는 코딩 영역 근처에 위치될 수 있다.
본 명세서의 맥락에서, 전형적으로 용어 "조절 요소" 또는 "조절 영역"은 항상 그런 것은 아니지만 일반적으로 구조 유전자의 코딩 서열에 대해 상류(5')에 있는 DNA의 서열을 말하며, 이것은 RNA 폴리머라제 및/또는 특정 부위에서 전사가 시작되는데 필요한 다른 인자들에 대한 인식을 제공함으로써 코딩 영역의 발현을 제어한다. 그러나, 서열의 인트론 내에, 또는 서열의 3'에 위치한 다른 뉴클레오티드 서열도 관심의 코딩 영역의 발현의 조절에 기여할 수 있다. RNA 폴리머라제 또는 다른 전사 인자들에 대한 인식을 제공함으로써 특정 부위에서의 개시를 보장하는 조절 요소의 예는 프로모터 요소이다. 전부 그런 것은 아니지만 대부분의 진핵 프로모터 요소는 일반적으로 전사 시작 부위에서 대략 25개 염기쌍 상류에 위치한 아데노신과 티미딘 뉴클레오티드 염기쌍으로 이루어진 보존성 핵산 서열인 TATA 상자를 함유한다. 프로모터 요소는 전사의 개시를 책임진 기본적 프로모터 요소뿐만 아니라, 유전자 발현을 변형하는 다른 조절 요소들(상기 열거된)도 포함한다.
발생적으로 조절되는, 유도성 또는 구성성인 것들을 포함하여, 몇 가지 타입의 조절 영역이 있다. 발생적으로 조절되거나, 또는 조절 영역의 제어하에 유전자의 차등 발현을 제어하는 조절 영역은 해당 기관 또는 조직의 발생 도중의 특정 시기에 어떤 기관 또는 기관의 조직에서 활성화된다. 그러나, 발생적으로 조절되는 일부 조절 영역은 특정 발생 단계에서 어떤 기관 또는 조직에서 우선적으로 활성화될 수 있으며, 이들 역시 발생학적으로 조절되는 방식으로 활성화되거나, 또는 식물의 다른 기관 또는 조직에서도 기본적 수준으로는 활성화될 수 있다. 조직-특이적 조절 영역, 예를 들어 종자-특이적 조절 영역의 예는 나핀 프로모터, 및 크루시페린 프로모터를 포함한다(Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). 잎-특이적 프로모터의 예는 플라스토시아닌 프로모터를 포함한다(도 3; US 7,125,978, 본원에 참고로 포함된다).
유도성 조절 영역은 유도제에 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접 또는 간접적으로 활성화할 수 있는 것이다. 유도제가 없으면 DNA 서열 또는 유전자는 전사되지 않을 것이다. 전형적으로 유도성 조절 영역과 특이적으로 결합하여 전사를 활성화하는 단백질 인자는 비활성화 형태로 존재할 수 있으며, 이것이 이후 유도제에 의해 활성 형태로 직접 또는 간접적으로 전환된다. 그러나, 단백질 인자는 없을 수도 있다. 유도체는 단백질, 대사산물, 성장 조절제, 제초제 또는 페놀계 화합물과 같은 화학제제 또는 가열, 냉각, 염, 또는 독성 원소에 의해 직접적으로, 또는 바이러스와 같은 병원체 또는 질환 인자의 작용을 통해 간접적으로 부여되는 생리학적 스트레스일 수 있다. 유도성 조절 영역을 함유하는 식물 세포는 분무, 물주기, 가열 또는 유사한 방법에 의해 세포 또는 식물에 유도체를 외부적으로 적용함으로써 유도제에 노출될 수 있다. 유도성 조절 요소는 식물 또는 비-식물 유전자로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 Gatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358 참조). 잠재적인 유도성 프로모터의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 테트라시클린-유도성 프로모터(Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; 본원에 참고로 포함된다), 스테로이드 유도성 프로모터(Aoyama, T. and Chua, N.H., 1997, Plant J. 2, 397-404; 본원에 참고로 포함된다) 및 에탄올-유도성 프로모터(Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, 본원에 참고로 포함된다), 사이토키닌 유도성 IB6 및 CKI1 유전자(Brandstatter, I. and Kieber, J.J., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985; 본원에 참고로 포함된다) 및 아우신 유도성 요소 DR5(Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; 본원에 참고로 포함된다)를 포함한다.
구성성 조절 영역은 식물의 발생 도중에 계속해서 식물의 여러 부분을 아울러서 유전자의 발현을 지시한다. 공지된 구성성 조절 요소의 예는 CaMV 35S 전사체(Odell et al., 1985, Nature, 313:810-812), 쌀 액틴 1(Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3:1155-1165), 액틴 2(An et al., 1996, Plant J., 10:107-121), 또는 tms 2(본원에 참고자료로 포함된 U.S. 5,428,147), 및 트리오스포스페이트 이소머라제 1(Xu et al., 1994, Plant Physiol. 106:459-467) 유전자, 옥수수 유비퀴틴 1 유전자(Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29:637-646), Arabidopsis 유비퀴틴 1 및 6 유전자(Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-646), 및 담배 번역 개시 인자 4A 유전자(Mandel et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:995-1004)와 관련된 프로모터를 포함한다. 용어 "구성성"은 본원에서 사용되었을 때 구성성 조절 영역의 제어하에 유전자가 모든 세포 타입에서 동일한 수준으로 발현된다는 것을 반드시 의미하지는 않으며, 유전자는 광범한 세포 타입에서 발현되기는 하지만 대체로 변이도 풍부하게 관찰된다.
"작동 가능하게 연결된"은 특정 서열, 예를 들어 조절 요소 및 관심의 코딩 영역이 직접 또는 간접적으로 상호작용하여 유전자 발현의 매개 또는 조정과 같은 의도된 기능을 수행한다는 것을 의미한다. 작동 가능하게 연결된 서열들의 상호작용은, 예를 들어 작동 가능하게 연결된 서열들과 상호작용하는 단백질에 의해 매개될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 또는 구성물, 또는 벡터에 의해 형질전환된 어떤 적합한 식물 숙주에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 자주개자리, 캐놀라, 옥수수, Brassica spp, Nicotiana spp, 자주개자리, 감자, 인삼, 완두콩, 귀리, 쌀, 대두, 밀, 보리, 해바라기, 목화 등을 포함하는 농작물을 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 키메라 유전자 구성물은 3' 미번역 영역을 더 포함할 수 있다. 3' 미번역 영역은 폴리아데닐화 신호 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현을 행할 수 있는 어떤 다른 조절 신호를 함유하는 DNA 세그먼트를 포함하는 유전자의 일부분을 말한다. 폴리아데닐화 신호는 일반적으로 mRNA 전구물질의 3' 단부에 폴리아데닐산 트랙의 부가를 행하는 것을 특징으로 한다. 폴리아데닐화 신호는 통상 정규 형태인 5'-AATAAA-3'에 대한 상동체의 존재에 의해 인식되며, 변이도 드물지는 않다. 또한, 본 발명의 키메라 유전자 구성물 중 하나 이상은 필요에 따라서 번역 인핸서든 전사 인핸서든 인핸서를 더 포함할 수 있다. 이러한 인핸서 영역은 당업자에게 잘 알려져 있으며, ATG 개시 코돈과 인접 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈은 코딩 서열의 리딩 프레임과 동일 위상이어야 하며, 그래야 전체 서열의 번역이 보장된다.
적합한 3' 영역의 비제한적 예는 아그로박테리움 종양 유도(Ti) 플라스미드 유전자, 예를 들어 노팔린 신타제(Nos 유전자) 및 식물 유전자, 예를 들어 대두 저장 단백질 유전자, 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제(ssRUBISCO; US 4,962,028; 본원에 참고자료로 포함된다) 유전자의 작은 서브유닛, 플라스토시아닌 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터(Pwee and Gray 1993; 본원에 참고자료로 포함된다)의 폴리아데닐화 신호를 함유하는 3'-전사된 미번역 영역이다. 플라스토시아닌 프로모터의 예는 US 7,125,978(본원에 참고자료로 포함된다)에 설명된다.
본원에 설명된 대로, 잎 발현에서 효능이 증명된 인핸서 서열을 포함하는 프로모터가 일시 발현에 효과적인 것으로 판명되었다. 이론과 결부시키고 싶지는 않지만, 핵 바탕질에의 부착에 의한 광합성 유전자의 상류 조절 요소의 부착이 강한 발현을 매개할 수 있다. 예를 들어, 완두콩 플라스토시아닌 유전자의 번역 시작 부위로부터 -784까지를 사용하여 강한 리포터 유전자 발현을 매개할 수 있다.
광합성 유전자 유래의 조절 영역, 예를 들어, 제한은 아니지만, 플라스토시아닌 조절 영역((US 7,125,978; 본원에 참고로 포함된다), 또는 리불로오스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제의 조절 영역(RuBisCO; US 4,962,028; 본원에 참료로 포함된다), 클로로필 a/b 결합 단백질(CAB; Leutwiler et al., 1986; 본원에 참고로 포함된다), ST-LS1(광계 II의 산소-방출 복합체와 결합, Stockhaus et al., 1987, 1989; 본원에 참고로 포함된다)이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
형질전환된 식물 세포의 확인을 돕기 위해서 본 발명의 구성물은 식물 선택성 마커를 포함하도록 더 조작될 수 있다. 유용한 선택성 마커는 항생제, 예를 들어 젠타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 또는 제초제, 예를 들어 포스피노트리신, 글리포세이트, 클로로술푸론 등과 같은 화학물질에 대한 내성을 제공하는 효소를 포함한다. 유사하게, GUS(베타-글루쿠로니다제), 또는 루시페라제나 GFP 등의 발광물질과 같은 색 변화에 의해 확인가능한 화합물의 생산을 제공하는 효소가 사용될 수 있다.
이들 유전자의 결과의 cDNA 카피들은 숙주 발현 시스템에 의해 필요에 따라 적합한 발현 벡터에서 클로닝될 수 있다. 식물에서 적합한 발현 벡터의 예가 아래 설명되며, 또는 바쿨로바이러스 발현 벡터, 예를 들어 pFastBacl(InVitrogen)를 사용해서도 공지된 방법 및 제조자의 설명서에 제공된 정보에 따라서 pFastBacl-기반 플라스미드를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 식물에서 작동가능한 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 상기 설명된 HA를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 구성물에 관한 것이다. 식물 세포에서 작동 가능하고 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 조절 요소의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 플라스토시아닌 조절 영역((US 7,125,978; 본원에 참고로 포함된다), 또는 리불로오스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제의 조절 영역(RuBisCO; US 4,962,028; 본원에 참고로 포함된다), 클로로필 a/b 결합 단백질(CAB; Leutwiler et al., 1986; 본원에 참고로 포함된다), ST-LS1(광계 II의 산소-방출 복합체와 결합, Stockhaus et al., 1987, 1989; 본원에 참고로 포함된다)를 포함한다. 만일 구성물이 곤충 세포에서 발현되는 경우, 곤충 세포에서 작동가능한 조절 요소의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 폴리헤드린 프로모터, gp64 프로모터 등을 포함한다.
더욱이, 본 발명은 HA, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 사람 인플루엔자 A/Indonesia/5/05 바이러스 HA(H5N1)를 암호화하는 핵산을 식물, 효모 또는 곤충 발현 벡터(예를 들어, 바쿨로바이러스 발현 벡터)에서 클로닝하고, 형질전환된 식물 세포 또는 형질전환된 곤충 세포에서, 서브바이러스 인플루엔자 입자 및 인플루엔자 VLP를 포함하여, 기능적이며 면역원성인 동종타입 거대분자 단백질 구조로 자체 회합하는 재조합 인플루엔자 구조 단백질들로 이루어진 인플루엔자 백신 후보 또는 시약을 제조하는 것을 제공한다.
HA, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 사람 인플루엔자 A/New Caledonia/ 20/99(H1N1) 바이러스 HA, 또는 사람 인플루엔자 A/Indonesia/5/05 바이러스 HA 유전자를 암호화하는 핵산이, 예를 들어 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 적합한 셀라인에서, 예를 들어 Spodoptera frugiperda 세포(예를 들어, Sf-9 셀라인; ATCC PTA-4047)에서 발현될 수 있다. 또한, 다른 곤충 셀라인도 사용될 수 있다.
대안으로서, HA를 암호화하는 핵산은 식물 세포 또는 식물에서 발현될 수 있다. HA를 암호화하는 핵산은 HA RNA를 사용한 역전사와 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의해 합성될 수 있다. 예로서, 사람 인플루엔자 A/New Caledonia/20/99(H1N1) 바이러스 또는 사람 인플루엔자 A/Indonesia/5/05(H5N1) 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포로부터 RNA가 분리될 수 있다. 역전사와 PCR에 있어서, HA RNA, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 사람 인플루엔자 A/New Caledonia/20/ 99(H1N1) 바이러스 HA 유전자 또는 사람 인플루엔자 A/Indonesia/5/05(H5N1) 바이러스 HA0 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용될 수 있다. 추가하여, HA를 암호화하는 핵산은 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
6 - 단백질
또한, 본 발명은 H1, H5 또는 H7로부터의 HA를 각각 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; 긴축 혼성화 조건에서 H1, H5 또는 H7로부터의 HA를 암호화하는 핵산과 각각 혼성화되는 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 긴축 혼성화 조건에서 H1, H5 또는 H7로부터의 HA를 암호화하는 핵산의 보체와 각각 혼성화되는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7에 의해 암호화된 하나 이상의 HA 단백질을 포함하며, 이때 뉴클레오티드 서열은 발현되었을 때 VLP를 형성하는 헤마글루티닌 단백질을 암호화하고, 이 VLP는 항체의 생산을 유도한다.
유사하게, 본 발명은 서브타입 H1(SEQ ID NO:1에 의해서 암호화), H2(SEQ ID NO: 2에 의해 암호화), H3(SEQ ID NO: 3에 의해서 암호화), H4(SEQ ID NO: 4에 의해서 암호화), H5(SEQ ID NO: 5에 의해서 암호화), H6(SEQ ID NO: 6에 의해서 암호화), H7(SEQ ID NO: 7에 의해서 암호화), H8(SEQ ID NO: 8에 의해 암호화), H9(SEQ ID NO: 9에 의해서 암호화), H1O(SEQ ID NO: 10에 의해서 암호화), H11(SEQ ID NO: 11에 의해서 암호화), H12(SEQ ID NO: 12에 의해서 암호화), H13(SEQ ID NO: 13에 의해서 암호화), H14(SEQ ID NO: 14에 의해서 암호화), H15(SEQ ID NO: 15에 의해서 암호화), H16(SEQ ID NO: 16에 의해서 암호화); 및 H1(SEQ ID NO:1에 의해서 암호화), H2(SEQ ID NO: 2에 의해 암호화), H3(SEQ ID NO: 3에 의해 암호화), H4(SEQ ID NO: 4에 의해서 암호화), H5(SEQ ID NO: 5에 의해서 암호화), H6(SEQ ID NO: 6에 의해서 암호화), H7(SEQ ID NO: 7에 의해서 암호화), H8(SEQ ID NO: 8에 의해서 암호화), H9(SEQ ID NO: 9에 의해서 암호화), H1O(SEQ ID NO: 10에 의해 암호화), H11(SEQ ID NO: 11에 의해 암호화), H12(SEQ ID NO: 12에 의해서 암호화), H13(SEQ ID NO: 13에 의해서 암호화), H14(SEQ ID NO: 14에 의해서 암호화), H15(SEQ ID NO: 15에 의해서 암호화), H16(SEQ ID NO: 16에 의해서 암호화)과 60-100% 또는 그 사이의 임의의 값의 서열 동일성, 특히 70-100% 또는 그 사이의 임의의 값의 동일성, 또는 80-100% 또는 그 사이의 임의의 값, 90-100% 또는 그 사이의 임의의 값의 동일성, 또는 95-100% 또는 그 사이의 임의의 값의 동일성을 가진 뉴클레오티드 서열과 관련된 HA를 포함하며, 이때 뉴클레오티드 서열은 발현되었을 때 VLP를 형성하는 헤마글루티닌 단백질을 암호화하고, 이 VLP는 항체의 생산을 유도한다. 예를 들어, 식물 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, 이 VLP를 사용하여 성숙한 HA, HA0, HA1 또는 HA2를 포함하는 HA와 결합할 수 있는 항체를 생산할 수 있다. 피험자에게 투여되었을 때 VLP는 면역반응을 유도한다.
7 - VLP
따라서, 본 발명은 하나 이상의 HA 타입 또는 서브타입을 포함하는 VLP에 관한 것이다.
용어 "바이러스-유사 입자"(VLP) 또는 "바이러스-유사 입자들" 또는 "VLPs"는 자체 회합하며 인플루엔자 HA 단백질과 같은 구조 단백질을 포함하는 구조를 말한다. 일반적으로 VLP는 감염시 생산되는 비리온과 형태적으로도 항원적으로도 유사하지만, 복제에 필요한 유전자 정보가 충분하지 않기 때문에 비감염성이다. 일부 예에서, VLP는 단일 단백질 종을 포함하거나, 또는 1개를 초과하는 단백질 종을 포함할 수 있다. 1개를 초과하는 단백질 종을 포함하는 VLP에 대해서, 단백질 종은 동일한 바이러스 종으로부터 유래할 수도 있고, 상이한 종, 속, 아과 또는 과의 바이러스(ICTV 명명법에 의해 지정된다)로부터 유래하는 단백질을 포함할 수도 있다. 다른 예에서, VLP를 포함하는 단백질 종들 중 하나 이상은 자연 발생 서열로부터 변형될 수 있다. VLP는 식물 및 곤충 숙주 세포를 포함하는 적합한 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 숙주 세포로부터 추출하여 분리하고 적합한 조건에서 더 정제한 후, VLP는 무손상 구조로서 정제될 수 있다.
또한, 제한되는 것은 아니지만, 본 발명은 VLP 단백질이 발현되는 세포의 원형질막으로부터 지질 외피를 획득하는 인플루엔자 유래 VLP를 포함한다. 예를 들어, VLP가 식물-기반 시스템에서 발현된다면, VLP는 그 세포의 원형질막으로부터 지질 외피를 획득할 수 있다.
일반적으로 용어 "지질"은 지용성(친지질성) 자연 발생 분자를 말한다. 또한, 이 용어는 더 구체적으로 지방산과 그 유도체들(트리-, 디- 및 모노글리세리드 및 인지질)을 말할 뿐만 아니라, 다른 지용성 스테롤-함유 대사산물 또는 스테롤을 말하는데도 사용된다. 인지질은 당지질, 스테롤 및 단백질과 함께 모든 생물학적 막의 주요 성분이다. 인지질의 예는 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린 등을 포함한다. 스테롤의 예는 주스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 피토스테롤을 포함한다. 다양한 식물 종에서 200개 이상의 피토스테롤이 확인되었으며, 가장 흔한 것은 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 브라시카스테롤, 델타-7-스티그마스테롤, 델타-7-아베나스테롤, 다우노스테롤, 시토스테롤, 24-메틸콜레스테롤, 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤이다. 당업자는 세포의 원형질막의 지질 조성이 세포 또는 세포가 얻어진 유기물의 배양 또는 성장 조건에 따라서 변할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
세포막은 일반적으로 지질 이중층뿐만 아니라 다양한 기능의 단백질을 포함한다. 특정한 지질이 국부적으로 농축되어 있는 것이 지질 이중층에서 발견될 수 있는데, 이것을 '지질 라프트'라고 한다. 이론과 결부시키고 싶지는 않지만, 지질 라프트는 세포내이입 및 세포외유출, 바이러스 또는 다른 감염성 인자의 진입 또는 유출, 세포간 신호 변환, 세포내 및 세포외 바탕질과 같은 세포 또는 유기물의 다른 구조 성분과의 상호작용에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다.
본 발명에 따라서 인플루엔자 유래 단백질로부터 생산된 VLP는 M1 단백질을 포함하지 않는다. M1 단백질은 VLP 제제의 오염물질인 RNA와 결합하는 것으로 알려져 있다(Wakefield and Brownlee, 1989). RNA의 존재는 VLP 제품에 대해 규제당국의 승인을 얻을 때 바람직하지 않으며, 따라서 RNA가 없는 VLP 제제가 유리할 수 있다.
본 발명의 어떤 양태에 따라서 식물에서 생산된 VLP는 식물-유래 지질과 복합체를 이룰 수 있다. VLP는 HA0, HA1 또는 HA2 펩티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 식물-유래 지질은 지질 이중층의 형태일 수 있으며, VLP를 둘러싼 외피를 더 포함할 수 있다. 식물-유래 지질은 VLP가 생산되는 식물의 원형질막의 지질 성분을 포함할 수 있으며, 하나 이상의 식물-유래 지질, 예를 들어, 제한은 아니지만, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 글리코스핑고지질, 피토스테롤 또는 이들의 조합을 포함한다. 식물-유래 지질은 "식물 지질"이라고도 할 수 있다.
식물에서 인플루엔자 VLP는 원형질막으로부터 발아하며, 따라서 VLP의 지질 조성은 그것의 기원을 반영한다. 본 발명에 따라서 제조된 VLP는 식물 유래 지질과 복합체를 이룬 HA를 포함한다. 식물 지질은 특정 면역세포를 자극하여 유도된 면역반응을 증진시킬 수 있다. 식물의 막은 지질, 포스파티딜콜린(PC) 및 포스파티딜에탄올아민(PE)로 이루어지며, 또한 글리코스핑고지질, 사포닌 및 피토스테롤을 함유한다. 추가로, 식물 원형질막에서는 지질 라프트가 또한 발견된다 - 이러한 미세 도메인에는 스핑고지질 및 스테롤이 풍부하다. 식물에서는 여러 가지의 피토스테롤이 발생한다고 알려져 있으며, 이것은 스티그마스테롤, 시토스테롤, 24-메틸콜레스테롤 및 콜레스테롤을 포함한다(Mongrand et al., 2004).
PC 및 PE뿐만 아니라 글리코스핑고지질도 수지상세포 및 대식세포와 같은 항원-제시 세포(APC) 및 흉선과 간에 존재하는 B 및 T 림프구를 포함하는 다른 세포들과 마찬가지로 포유동물 면역세포에 의해 발현되는 CD1 분자와 결합할 수 있다 (Tsuji M., 2006). CD1 분자는 제I류에 속하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 구조적으로 유사하며, 이들의 역할은 NKT 세포(자연살상 T 세포)에 대한 당지질 항원을 제시하는 것이다. 활성화되면 NKT 세포는 NK 세포 및 수지상세포와 같은 선천적 면역세포를 활성화하며, 또 항체-생산 B 세포 및 T 세포 같은 후천적 면역세포도 활성화한다.
여러 가지 피토스테롤이 원형질막에서 발견될 수 있다 - 특정 보체는 몇 가지 요인으로 말하자면 종, 성장 조건, 영양물 기원 또는 병원성 상태에 따라서 다양할 수 있다. 일반적으로 베타-시토스테롤이 가장 풍부한 피토스테롤이다.
원형질막 유래 외피와 같은 지질 이중층과 복합체를 이룬 인플루엔자 VLP에 존재하는 피토스테롤은 유리한 백신 조성물을 제공할 수 있다. 이론과 결부시키고 싶지는 않지만, 원형질막 유래 외피와 같은 지질 이중층과 복합체를 이룬 식물-제조 VLP는 다른 발현 시스템에서 제조된 VLP보다 더 강한 면역반응을 유도할 수 있으며, 생 바이러스 백신 또는 감독된 전 바이러스 백신에 의해 유도되는 면역반응과 유사할 수 있다.
따라서, 어떤 구체예에서, 본 발명은 식물-유래 지질 이중층과 복합체를 이룬 VLP를 제공한다. 어떤 구체예에서, 식물-유래 지질 이중층은 VLP의 외피를 포함할 수 있다.
8 - 조성물
따라서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 유효 용량, 하나 이상의 식물 지질, 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 H5 Indonesia일 수 있다. 또한, 피험자에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유도하는 방법이 제공된다. 이 방법은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 하나 이상의 식물 지질, 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 바이러스-유사 입자를 투여하는 것을 포함한다. 바이러스-유사 입자는 경구, 피내, 비내, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 경로로 피험자에게 투여될 수 있다.
9 - 치료 방법
본 발명은 본원에 정의된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 피험자에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유도하거나, 또는 이러한 감염에 대한 "면역반응을 자극하는" 방법을 제공한다.
"면역반응"은 일반적으로 후천적 면역 시스템의 반응을 말한다. 후천적 면역 시스템은 일반적으로 체액성 반응 및 세포-매개 반응을 포함한다. 체액성 반응은 B 림프구 계통의 세포(B 세포)에서 생산되어 분비된 항체에 의해 매개되는 면역성의 양태이다. 분비된 항체는 침입한 세균(바이러스 또는 박테리아 같은)의 표면에 존재하는 항원과 결합하여 이들을 파괴하라는 신호를 보낸다. 체액성 면역성은 일반적으로 항체 생산 및 항체 생산을 수반하는 과정을 말할 때 사용될 뿐만 아니라, Th2 세포 활성화 및 사이토카인 생산, 기억 세포 생성, 포식작용의 옵소닌 촉진, 병원체 제거 등을 포함하는 항체의 이펙터 기능을 말할 때도 사용된다.
세포-매개 반응은 항체가 수반되는 것이 아니라, 자연살상세포(NK), 대식세포, 항원-특이적 세포독성 T-림프구의 활성화, 및 항원에 대한 반응으로 다양한 사이토카인의 방출을 수반하는 면역반응이다. 세포-매개 면역성은 일반적으로 어떤 Th 세포 활성화, Tc 세포 활성화 및 T-세포 매개 반응을 말할 때 사용된다. 세포-매개 면역성은 바이러스 감염에 대한 반응에서 특히 중요하다.
본 발명의 재조합 HA VLP는 기존 인플루엔자 백신과 함께 사용될 수 있으며, 이로써 백신을 보충하고, 백신을 더 효과적으로 만들고, 필요한 투여량을 줄일 수 있다. 당업자에게 알려진 대로, 백신은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스에 대해 작용할 수 있다. 적합한 백신의 예는, 제한되는 것은 아니지만, Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, Medlmmune, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi-Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals 등으로부터 상업적으로 입수가능한 것들을 포함한다.
원한다면, 본 발명의 VLP는 당업자에게 알려진 적합한 애쥬번트와 함께 혼합될 수 있다. 더욱이, VLP는 상기 정의된 표적 유기체의 치료를 위한 VLP의 유효 용량을 포함하는 백신 조성물에 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따라서 제조된 VLP는 상이한 인플루엔자 단백질, 예를 들어 뉴라미니다제(NA)를 사용하여 얻어진 VLP와 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 VLP를 포함하는 백신의 유효 용량을 투여하는 것을 포함하는 동물 또는 표적 유기체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유도하는 방법을 제공한다. 백신은 경구, 피내, 비내, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 경로로 투여될 수 있다.
도 6 및 7에 도시된 대로, 시험관내 분석은 돌연변이된 A/Indonesia/5/05 H5 VLP 및 A/Veitnam/1203/04; A/Anhui/1/05 및 A/Turkey/582/06(모두 H5N1 균주)와 같은 다른 인플루엔자 균주에 대해 항체 교차-반응성이 발생했음을 나타내지만, 시험된 유일한 H1N1에 대해서는 헤마글루티닌 반응성이 더 적은 것으로 나타났다(도 7).
유의하게, 돌연변이된 H5N1(비-글리코실화된 H5 단백질)의 1회 투약 후 생산된 항체는 야생형 H5에 대해 생산된 항체보다 14일 후에 시험된 모든 H5 균주에 대해 더 큰 반응을 유도했으며, 이것은 이 비-글리코실화된 면역원이 야생형보다 더 빠른 반응을 제공할 수 있음을 시사한다.
따라서, 이들 데이터는 N-결합 탄수화물을 결여한 돌연변이된 H5 헤마글루티닌 바이러스 단백질을 포함하는 식물-제조 인플루엔자 VLP가 병원성 인플루엔자 균주에 특이적인 면역반응을 유도하며, 이 반응은 교차 반응이고, 1회 투약 후에 빠르게 유도될 수 있다는 것을 증명한다.
10 - 피험자
본 발명의 VLP가 투여될 수 있는 피험자나 표적 유기체의 예는, 제한은 아니지만, 사람, 영장류, 새, 물새, 철새, 메추라기, 오리, 거위, 가금류, 칠면조, 닭, 돼지, 양, 말과, 말, 낙타, 개과, 개, 고양이과, 고양이, 호랑이, 표범, 사향고양이, 밍크, 담비, 족제비, 애완동물, 가축, 토끼, 생쥐, 쥐, 기니아피그 또는 다른 설치류, 바다표범, 고래 등을 포함한다. 이러한 표적 유기체는 예시이며 본 발명의 적용 및 용도를 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
또한, 본 발명은 다른 포유류 또는 숙주 동물, 예를 들어 사람, 영장류, 말, 돼지, 새, 조류, 물새, 철새, 메추라기, 오리, 거위, 가금류, 칠면조, 닭, 낙타, 개과, 개, 고양이과, 고양이, 호랑이, 표범, 사향고양이, 밍크, 담비, 족제비, 애완동물, 가축, 생쥐, 쥐, 바다표범, 고래 등을 감염시킬 수 있는 인플루엔자 바이러스에 관한 것이다.
특히, 상기 정의된 방법에 의해서 치료되는 피험자는 사람, 영장류, 말, 돼지, 새(조류), 물새, 철새, 메추라기, 오리, 거위, 닭, 개, 고양이, 족제비, 가축 등을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, 피험자는 일반적으로 사람 환자 또는 새(물새, 철새, 메추라기, 오리, 거위, 칠면조, 닭 등의 가금류를 포함한다)일 수 있고, 특히 물새 또는 사람이 소비하는 가금류(메추라기, 오리, 거위, 칠면조, 닭)일 수 있다. 더욱 구체적으로, 피험자는 사람이다.
11 - 용기, 주사기, 및 키트 등
또한, 본 발명은 본원에서 정의된 조성물을 포함하는 용기를 제공한다. 특히, 용기는 보존제와 함께 단일 단위 용량 또는 복수 개의 제형을 함유한다. 더욱 구체적으로, 용기는 본원에서 정의된 조성물 또는 백신으로 미리 채워진 "바로 사용할 수 있는" 주사기이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 또한 본원에서 정의된 백신 또는 조성물을 포함하는 용기와 상기 조성물/백신의 사용/투여 방법에 대한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 이제 다음의 비제한적 실시예를 참조하여 상세히 설명될 것이다.
실시예 1
재료 및 방법
1. 돌연변이된 비- 글리코실화 H5 를 얻기 위한 A/ Indonesia /5/05( SEO ID NO : 17) 유래의 야생형 H5 의 돌연변이유발
야생형 HA의 구형 머리에 위치된 글리코실화 부위 N154, N165 및 N286을 제거함으로써, 더 구체적으로는 글리코실화 서열 패턴 N-X-T/S에 둘러싸인 Thr 또는 Ser을 Ala 잔기로 치환하여 삼중 돌연변이체를 만들었다. 따라서, 삼중 돌연변이체는 다음 3개 아미노산 치환을 함유했다: T156A, T167A 및 S288A(출발 SEQ ID NO: 17에 따라서 넘버링). 3개 아미노산 치환은 주형으로서 야생형 HA 발현 벡터(660 구성물, 도 4)를 사용하여 Darveau 등(1995)에 제시된 PCR-기반 라이게이션 방법에 의해 수행되었다.
간단히 말해서, 주형 660 pCAMBIA 발현 벡터 상에서 3개의 상이한 프라이머 쌍을 사용하여 3번의 PCR 증폭을 병행하여 수행했다:
1) Plato-443c(SEQ ID NO: 18) 및 HA5-T156A.r(SEQ ID NO: 19);
2) HA5-T167A.c(SEQ ID NO: 20) 및 HA5-S288A.r(SEQ ID NO: 21); 및
3) HA5-S288A.c(SEQ ID NO: 22) 및 HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO: 23).
3번의 반응으로부터 얻어진 증폭 산물을 함께 혼합하고, 이 혼합물을 프라이머로서 Plato-443c(SEQ ID NO: 18) 및 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO: 23)을 사용하는 4번째 반응(조립 반응)의 주형으로서 사용했다. 결과의 단편을 BamHI(플라스토시아닌 프로모터 내에 위치)와 SacI(단편의 3' 단부)로 절단하고, 같은 효소로 미리 절단해 둔 pCAMBIAPlasto에서 클로닝했다. 680으로 명명한 결과의 플라스미드를 도 5(SEQ ID NO: 29)에 나타낸다.
2. 발현 카세트 조립
모든 조작은 Sambrook and Russell(2001; 본원에 참고로 포함된다)의 일반 분자생물학 프로토콜에 따라서 수행되었다. 첫 번째 클로닝 단계는 자주개자리 플라스토시아닌 유전자의 상류 및 하류 조절 요소를 함유하는 수용체 플라스미드를 조립하는 것이었다. 플라스토시아닌 프로모터와 5'UTR 서열을 올리고뉴클레오티드 프라이머 Xmal-pPlas.c(SEQ ID NO: 24) 및 SacI-ATG-pPlas.r(SEQ ID NO: 25)를 사용하여 자주개자리 게놈 DNA로부터 증폭했다. 결과의 증폭 산물을 XmaI와 SacI로 절단하고, 같은 효소로 미리 절단해 둔 pCAMBIA2300(Cambia, 호주 캔버라)에 라이게이션하여 pCAMBIApromoPlasto를 만들었다. 유사하게, 플라스토시아닌 유전자의 3'UTR 서열 및 터미네이터를 프라이머 SacI-PlasTer.c(SEQ ID NO: 26) 및 EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO: 27)를 사용하여 자주개자리 게놈 DNA로부터 증폭하고, 그 산물을 SacI와 EcoRI로 절단 후 pCAMBIApromoPlasto의 동일 부위에 삽입하여 pCAMBIA Plasto를 만들었다.
3. H5 발현 카세트의 조립
인플루엔자 균주 A/Indonesia/5/05(H5N1; Ace. No. LANL ISDN 125873)로부터의 헤마글루티닌을 암호화하는 단편을 Epoch Biolabs(Sugar Land, TX, USA)에 의해 합성했다. 초기 ATG의 바로 상류의 HindIII 부위와 중단(TAA) 코돈의 바로 하류의 SacI 부위가 측면 위치된 자생 신호 펩티드를 포함해서 완전한 H5 코딩 영역(SEQ ID NO: 17)을 함유하는 생산된 단편을 SEQ ID NO: 28(및 돌연변이체 H5의 경우에는 SEQ ID NO: 29)에 나타낸다. H5 코딩 영역을 Darveau 등(1995)에 제시된 PCR-기반 라이게이션 방법에 의해 플라스토시아닌-기반 발현 카세트에서 클로닝했다. 간단히 말해서, 프라이머로서 Plato-443c(SEQ ID NO: 30) 및 SpHA(Ind)-Plasto.r(SEQ ID NO: 31)와 주형으로서 CAMBIApromoPlasto를 사용하여 첫 번째 PCR 증폭 산물을 얻었다. 병행하여, 프라이머로서 Plasto-SpHA(Ind).c(SEQ ID NO: 6) 및 HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO: 32)와 주형으로서 H5 코딩 단편을 사용하여 두 번째 증폭을 수행했다. 두 반응에서 얻어진 증폭 산물을 함께 혼합하고, 이 혼합물을 프라이머로서 Plato-443c(SEQ ID NO: 4) 및 HA(Ind)- Sac.r(SEQ ID NO: 33)을 사용하는 세 번째 반응(조립 반응)의 주형으로서 사용했다. 결과의 단편을 BamHI(플라스토시아닌 프로모터 내)와 SacI(단편의 3' 단부)로 절단하고, 같은 효소로 미리 절단해 둔 pCAM BIAPlasto에서 클로닝했다. 결과의 플라스미드는 660으로 명명하여 도 5에 나타내고, "돌연변이된" H5 단백질로부터 얻어진 플라스미드는 680으로 명명했다.
HcPro 구성물(35HcPro)을 Hamilton 등(2002)에 설명된 대로 제조했다. 모든 클론을 서열화하여 구성물의 완정성을 확인했다. 이 플라스미드를 사용하여 전기천공(Mattanovich et al. , 1989)에 의해 Agrobacterium tumefaciens(AGL1 ; ATCC, Manassas, VA 20108, USA)를 형질전환했다. 모든 A. tumefaciens 균주의 완전성을 제한 지도화에 의해 확인했다.
4. 식물 바이오매스의 준비, 접종, 아그로-침윤, 및 수거
시판 피트모스 용토로 채운 플랫에서 Nicotiana benthamiana 식물을 종자로부터 성장시켰다. 식물은 16/8 광주기 및 25℃ 주/20℃ 야의 온도 체제의 온실에서 성장시켰다. 파종 3주 후에 각 묘목을 선별하여 화분에 옮겨 심고 온실에서 동일한 환경 조건하에 3주 더 성장시켰다. 형질전환 전에 하기 나타낸 여러 시점에서 식물로부터 싹을 잘라내거나 식물을 화학적으로 처리하여 정아와 액아를 제거하였다.
구성물 660 또는 680을 10mM 2-[N-모르폴리노]에탄올술폰(MES), 20μM 아세토시링곤, 50μg/ml 카나마이신 및 25μg/ml 카르베니실린 pH 5.6으로 보충한 YEB 배지에서 OD600이 0.6 내지 1.6에 도달할 때까지 성장시켰다. 사용하기 전에 Agrobacterium 현탁액을 원심분리한 다음, 침윤 배지(10mM MgCl2 및 10mM MES pH 5.6)에 다시 현탁시켰다. 주사기-침윤을 Liu and Lomonossoff(2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348)에 의해 설명된 대로 수행했다. 진공-침윤시에는 A. tumefaciens 현탁액을 원심분리하고 침윤 배지에 다시 현탁시킨 다음, 4℃에서 하룻밤 보관했다. 침윤일에 배양물 배치를 2.5 배양물 부피로 희석하고 가온하여 사용하였다. N. benthamiana 전체 식물을 20-40 Torr의 진공 기밀 스테인리스 스틸 탱크 안의 박테리아 현탁액 중에 2분간 거꾸로 두었다. 주사기 또는 진공 침윤 후 식물을 온실로 다시 보내서 4-5일간 인큐베이션한 다음 수거하였다.
5. 잎 표본채취 및 총 단백질 추출
인큐베이션 후, 식물의 기생부를 수거하고 -80℃에서 냉동시켜 조각으로 분쇄했다. 차가운 50mM Tris pH 7.4, 0.15M NaCl 및 1mM 불화 페닐메탄술포닐 3 부피 중에서 냉동-분쇄된 식물 재료의 각 샘플을 균질화(Polytron)하여 총 가용성 단백질을 추출했다. 균질화 후, 슬러리를 4℃에서 20분간 20,000g로 원심분리하고, 맑은 조 추출물(상청액)을 분석용으로 간수했다. 맑은 조 추출물의 총 단백질 함량을 기준물질로서 소 혈청 알부민을 사용하는 Bradford 분석(Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 측정했다.
6. 단백질 분석 및 면역블롯팅
BCA 단백질 분석(Pierce Biochemicals, Rockport, IL)에 의해 단백질 농도를 측정했다. 단백질을 환원 조건하에 SDS-PAGE로 분리하고 코마시 블루로 염색했다. 염색된 겔을 스캔하고, ImageJ Software(NIH)를 사용하여 농도계 분석을 수행했다.
SEC 용출 분획으로부터의 단백질을 아세톤을 사용하여 침전시키고(Bollag et al, 1996), 평형화/용출 버퍼 1/5 부피에 다시 현탁시켜 환원 조건하에 SDS-PAGE로 분리한 다음, 이불화 폴리비닐렌(PVDF) 멤브레인(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) 위에 전기전달하여 면역검출하였다. 면역블로팅 전에 멤브레인을 4℃에서 5% 탈지유 및 Tris-완충 식염수 중의 0.5% Tween-20(TBS-T)으로 16-18시간 차단시켰다
다음 항체와 함께 인큐베이션하여 면역블로팅을 수행했다: H1 검출용 마우스 항-인플루엔자 A 단클론 항체(Fitzgerald Industries International, Concord, MA, USA, Cat. No. 10-150)(2μg/mL, TBS-Tween 20 0.1% 중 2% 탈지유 중), 및 TBS-Tween 20 0.1% 중 2% 탈지유 중 1/4000 희석된 H5 검출용 토끼 항-H5(Vietnam) 항체. 퍼옥시다제-콘쥬게이션 염소 항-마우스 IgG(H+L) 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA, Cat. No. 115-035-146)(TBS-Tween 20 0.1% 중 2% 탈지유 중 1/12000 희석)를 2차 항체로 사용했다. 루미놀(Roche Diagnostics Corporation)을 기질로서 사용한 화학발광에 의해서 면역반응성 복합체가 검출되었다. EZ-Link Plus® 활성화 퍼옥시다제 콘쥬게이션 키트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 인간 IgG 항체의 양고추냉이 퍼옥시다제-효소 콘쥬게이션을 수행했다.
H5에 대한 혈구응집 반응 분석은 Nayak. and Reichl(2004)의 방법을 기초로 하였다. 간단히 말해서, 100μL PBS를 함유하는 V-바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 웰 당 희석된 샘플이 100μL 남도록 시험 샘플(100μL)의 연속 2배 희석물을 제조했다. 0.25% 칠면조 적혈구 현탁액(Bio Link Inc., Syracuse, NY) 100μL를 각 웰에 가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 인큐베이션했다. 완전한 혈구응집을 보인 최고 희석값의 역수를 HA 활성으로 기록했다. 병행해서 재조합 HA 표준물질(A/Vietnam/1203/2004 H5N1)(Protein Science Corporation, Meriden, CT)을 PBS에 희석하여 각 플레이트에서 대조군으로 사용했다.
7. H5 VLP 정제
N. benthamiana의 660- 또는 680침윤된 냉동 잎을 시판 블렌더를 사용하여 50mM Tris pH 8, NaCl 150mM 및 0.04% 나트륨 메타-바이술파이트 1.5 부피 중에서 균질화하였다. 얻어진 추출물을 1mM PMSF로 보충하고 1M 아세트산으로 pH 6으로 조정한 다음, 42℃에서 5분간 가열했다. 열처리된 추출물에 규조토(DE)를 가하여 pH 이동과 열처리로 인해 침전된 오염물질을 흡착시키고, 슬러리를 Whatman 종이 필터로 여과했다. 얻어진 맑은 추출물을 실온에서 10분간 10,000g로 원심분리하여 잔류 DE를 제거하고, 0.8/0.2μm Acropack 20 필터를 통과시키고, 페투인-아가로오스 친화성 칼럼(Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA)에 로딩했다. 400mM NaCl, 25mM Tris pH 6에서 세척한 후, 결합된 단백질을 1.5M NaCl, 50mM MES pH 6을 사용하여 용출시켰다. 용출된 VLP를 최종 농도 0.0005%(v/v)로 Tween-80으로 보충했다. VLP를 100 kDa MWCO Amicon 멤브레인 상에서 농축하고 4℃에서 30분간 10,000g로 원심분리한 다음, 0.01% Tween-80 및 0.01% 티메로살을 함유한 PBS pH 7.4에 다시 현탁시켰다. 사용하기 전에 현탁된 VLP를 여과 멸균했다.
8. 동물 연구
6-8주 된 암컷 BALB/c 래트(Charles River Laboratories)를 사용하여 인플루엔자 VLP 투여에 따른 면역반응에 관한 연구를 수행했다. 30마리의 래트를 대조군은 3마리, 식물-제조된 VLP H5 야생형 백신(660)과 돌연변이체(680) 백신 그룹은 5마리씩 배정하여 세 그룹으로 무작위로 나누었다. 8개 그룹은 근육내 면역화에 사용했고, 6개 그룹은 비내 투여 경로를 시험하는데 사용했다. 모든 그룹은 2회-용량 섭생으로 면역화했고, 추가 면역화는 1차 면역화 후 제14일에 수행했다.
뒷다리에 근육내 투여하는 것에 있어서, 식물-제조 VLP H5 백신(15μg), 백신의 식물-제조 VLP H5 돌연변이체 또는 PBS로 마취하지 않는 래트를 면역화했다.
모든 항원 제조물은 면역화 전에 1:! 부피비로 최종 농도 1%(명반; Accurate Chemical and Scientific Corporation, Wesbury, NY, US)로 Alhydrogel과 혼합되었다.
혈액 채취, 폐 및 코 세척 및 비장 수거
1차 면역화 후 제14일과 2차 면역화 후 제14일에 마취하지 않은 동물에서 외측 복재 정맥혈을 채취했다. 10분간 8,000g으로 원심분리하여 혈청을 수집했다.
2차 면역화 후 제3주에 래트를 이산화탄소 가스로 마취하고, 종결 즉시 심장을 천공하여 혈액을 채취했다.
래트에서 비장을 수집했다. 수거한 비장을 젠타마이신으로 보충된 RPMI에 넣고, 10mL 주사기로부터 플런저가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣어 짓이겼다. 짓이겨진 비장을 2번 행구고, 5분간 2000rpm에서 원심분리한 후, 실온에서 5분간 ACK 세포용해 버퍼에 재현탁했다. 비장세포를 PBS-젠타마이신으로 세척하고, 5% RPMI에 재현탁한 다음 계수했다. 비장세포를 증식 분석에 사용했다.
항체 역가
혈청의 항-인플루엔자 항체 역가를 1차 면역화 후 제14일과 2차 면역화 후 제21일에 측정했다. 불활성화 바이러스 A/Indonesia/5/05를 코팅 항원으로서 사용하여 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 역가를 결정했다. 종말점 역가는 음성 대조군 샘플보다 적어도 0.1 더 높은 OD 값에 도달했던 최고 희석값의 역수로서 표시하였다.
항체 부류 결정(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM)을 위해서 앞서 설명된 대로 ELISA에 의해 역가를 평가했다.
혈구응집 반응 억제( HI ) 역가
앞서 설명된 대로 2차 면역화 후 제14일 및 제35일에 혈청의 혈구응집 억제(HI) 역가를 측정했다(WHO 2002; Kendal 1982). 균주 A/Indonesia/5/05; A/Anhui /1/05(H5N1); A/turkey/Turkey/1/05(H5N1) 또는 A/Vietnam/1203/2004로부터의 불활성화된 바이러스 제제를 사용하여 래트 혈청 샘플을 HI 활성에 대해서 시험했다. Vibrio cholerae로부터 제조된 수용체-파괴 효소 II(RDE II)(Denka Seiken Co., 일본 도쿄)로 혈청을 전처리했다(Kendal 1982). 0.5% 말 적혈구를 사용하여 HI 분석을 수행했다. HI 항체 역가는 완전한 응집 억제를 야기한 최고 희석값의 역수로서 정의하였다.
결과
야생형 VLP 또는 돌연변이 VLP로 면역화된 래트의 혈청의 반응성을 1차(제14일) 또는 2차 면역화(제35일) 후 제14일에 평가했다. 모든 래트는 명반과 함께 조제된 항원 15μg으로 면역화했다. clade 1(A/Vietnam/1203/04), clade 2.1(A/ Indonesia/5/05), clade 2.2(A/turkey/Turkey/1/05) 및 clade 2.3(A/Anhui/1/05)의 H5N1 바이러스에 대한 면역반응성을 평가했다. 1차 투약 후, 돌연변이 VLP는 시험된 모든 H5N1 균주에서 야생형보다 더 높은 항체 반응을 유도했다(도 6). 조류 균주 A/turkey/Turkey/1/05에 대한 면역반응성은 1차 투약 후 통계적으로 유의했다(p < 0.05). 추가 주사 후 면역반응성을 나타낸 H1N1 바이러스(A/New Caledonia/20/ 99)에 대한 면역반응성도 평가했다. GMT: 기하 평균 역가. 값들은 그룹당 5마리 래트의 상호 종점 역가의 GMT(ln)이다. 막대는 평균 편차를 표시한다. * 야생형 VLP와 비교하여 p< 0.05.
야생형 또는 돌연변이 VLP로 면역화된 래트의 HI 역가를 1차(제14일) 또는 2차(제35일) 면역화 후 제14일에 평가했다. HI 항체 반응을 불활성화된 전 H5N1 바이러스를 사용하여 측정했다.
1차 면역화 후, 돌연변이 VLP는 시험된 모든 H5N1 바이러스에 대해 야생형 VLP보다 더 높은 HI 항체 반응을 유도한다(도 7). A/Indonesia/5/05 및 A/turkey/ Turkey/1/05 인플루엔자 균주에서 통계적 유의성에 도달했다. GMT: 기하 평균 역가. 값들은 그룹당 5마리 래트의 상호 종점 역가의 GMT(ln)이다. 막대는 평균 편차를 표시한다. * 야생형 VLP와 비교하여 p< 0.05.
이들 데이터는 "돌연변이된" 비-글리코실화 H5 단백질이 광범위하고 신속한 활성의 독감 백신으로서 VLP를 제조하는데 있어서 자생 H5 단백질에 대한 매우 흥미로운 대안이라는 것을 강력히 시사한다.
모든 인용문헌은 본원에 참고자료로 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 구체예에 관하여 설명되었다. 그러나, 청구항에 한정 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 다수의 변화 및 변형이 만들어질 수 있다는 것이 당업자에게 분명할 것이다.
참고문헌
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Figure 112011008484763-pct00002
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gtggtcatac aatgctgaat tgctagtagc actagagaat cagcacacaa 1380 tagatgtcac agactccgaa atgaacaagc tttttgaaag agtaagaagg caattaagag 1440 agaatgcaga agatcaaggc aacggttgtt tcgagatatt ccatcagtgt gacaacaatt 1500 gtatagaaag cattagaaac ggaacttatg accacaacat ctacagggat gaagccatca 1560 acaatcgaat caaaataaat cctgtcactt tgacgatggg gtacaaggac ataatcctgt 1620 ggatttcttt ctccatgtca tgctttgtct tcgtggcact gattctggga tttgttctat 1680 gggcttgtca aaacgggaat atccgatgcc aaatctgtat ataaagaaaa aacacccttg 1740 tttctactc 1749 <210> 15 <211> 1762 <212> DNA <213> Influenza A virus, subtype H15 <400> 15 agcaaaagca ggggatacaa aatgaacact caaatcatcg tcattctagt cctcggactg 60 tcgatggtga gatctgacaa gatttgtctc gggcaccatg ccgtagcaaa tgggacaaaa 120 gtcaacacac taactgagaa aggagtggaa gtggtcaatg ccacggagac agtggagatt 180 acaggaataa ataaagtgtg cacaaaaggg aagaaagcgg tggacttggg atcttgtgga 240 atactgggaa ctatcattgg gcctccacaa tgtgactctc atcttaaatt caaagctgat 300 ctgataatag aaagaagaaa ttcaagtgac atctgttacc cagggaaatt cactaatgag 360 gaagcactga gacaaataat cagagaatct ggtggaattg acaaagagcc aatgggattt 420 agatattcag gaataaaaac agacggggca accagtgcgt gtaagagaac agtgtcctct 480 ttctactcag aaatgaaatg gcttttatcc agcaaggcta accaggtgtt cccacaactg 540 aatcagacat acaggaacaa cagaaaagaa ccagccctaa ttgtttgggg agtacatcat 600 tcaagttcct tggatgagca aaataagcta tatggagctg ggaacaagct gataacagta 660 ggaagctcaa aataccaaca atcgttttca ccaagtccag gggacaggcc caaagtgaat 720 ggtcaggccg ggaggatcga ctttcattgg atgctattgg acccagggga tacagtcact 780 tttaccttca atggtgcatt catagcccca gatagagcca cctttctccg ctctaatgcc 840 ccatcgggag ttgagtacaa tgggaagtca ctgggaatac agagtgatgc acaaattgat 900 gaatcatgtg aaggggaatg cttctacagt ggagggacaa taaacagccc tttgccattt 960 caaaacatcg atagttgggc tgtcggaagg tgccccagat atgtaaagca atcaagcctg 1020 ccgctggcct taggaatgaa aaatgtacca gagaaaatac atactagggg actgttcggt 1080 gcaattgcag gattcatcga gaatggatgg gaaggactca ttgatggatg gtatggattt 1140 aggcatcaaa atgcacaggg gcagggaaca gctgctgact acaagagtac tcaggctgca 1200 attgaccaga taacagggaa acttaataga ttaattgaaa aaaccaacac acagtttgaa 1260 ctcatagaca atgagttcac tgaagtggag cagcagatag gcaatgtaat aaactggaca 1320 agggactcct tgactgagat ctggtcatac aatgctgaac ttctagtagc aatggaaaat 1380 cagcatacaa ttgaccttgc agattctgaa atgaacaaac tctatgagag agtgagaaga 1440 cagctaaggg agaatgccga ggaggatgga actggatgtt ttgagatttt ccaccgatgt 1500 gacgatcaat gtatggagag catacgaaat aatacttaca atcacactga atatcgacag 1560 gaagccttac agaataggat aatgatcaat ccggtaaagc ttagtggtgg gtacaaagat 1620 gtgatactat ggtttagctt cggggcatca tgtgtaatgc ttctagccat tgctatgggt 1680 cttattttca tgtgtgtgaa aaacgggaat ctgcggtgca ctatctgtat ataattattt 1740 gaaaaacacc cttgtttcta ct 1762 <210> 16 <211> 1760 <212> DNA <213> Influenza A virus, subtype H16 <400> 16 agcaaaagca ggggatattg tcaaaacaac agaatggtga tcaaagtgct ctactttctc 60 atcgtattgt taagtaggta ttcgaaagca gacaaaatat gcataggata tctaagcaac 120 aacgccacag acacagtaga cacactgaca gagaacggag ttccagtgac cagctcagtt 180 gatctcgttg aaacaaacca cacaggaaca tactgctcac tgaatggaat cagcccaatt 240 catcttggtg actgcagctt tgagggatgg atcgtaggaa acccttcctg tgccaccaac 300 atcaacatca gagagtggtc gtatctaatt gaggacccca atgcccccaa caaactctgc 360 ttcccaggag agttagataa taatggagaa ttacgacatc tcttcagcgg agtgaactct 420 tttagcagaa cagaattaat aagtcccaac aaatggggag acattctgga tggagtcacc 480 gcttcttgcc gcgataatgg ggcaagcagt ttttacagaa atttggtctg gatagtgaag 540 aataaaaatg gaaaataccc tgtcataaag ggggattaca ataacacaac aggcagagat 600 gttctagtac tctggggcat tcaccatccg gatacagaaa caacagccat aaacttgtac 660 gcaagcaaaa acccctacac attagtatca acaaaggaat ggagcaaaag atatgaacta 720 gaaattggca ccagaatagg tgatggacag agaagttgga tgaaactata ttggcacctc 780 atgcgccctg gagagaggat aatgtttgaa agcaacgggg gccttatagc gcccagatac 840 ggatacatca ttgagaagta cggtacagga cgaattttcc aaagtggagt gagaatggcc 900 aaatgcaaca caaagtgtca aacatcatta ggtgggataa acaccaacaa aactttccaa 960 aacatagaga gaaatgctct tggagattgc ccaaagtaca taaagtctgg acagctgaag 1020 cttgcaactg ggctgagaaa tgtcccatcc gttggtgaaa gaggtttgtt tggtgcaatt 1080 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ataccaacca agaggatctt ttggtactgt ggggaattca ccatcctaat 600 gatgcggcag agcagacaag gctatatcaa aacccaacca cctatatttc cattgggaca 660 tcaacactaa accagagatt ggtaccaaaa atagctacta gatccaaagt aaacgggcaa 720 agtggaagga tggagttctt ctggacaatt ttaaaaccta atgatgcaat caacttcgag 780 agtaatggaa atttcattgc tccagaatat gcatacaaaa ttgtcaagaa aggggactca 840 gcaattatga aaagtgaatt ggaatatggt aactgcaaca ccaagtgtca aactccaatg 900 ggggcgataa actctagtat gccattccac aacatacacc ctctcaccat cggggaatgc 960 cccaaatatg tgaaatcaaa cagattagtc cttgcaacag ggctcagaaa tagccctcaa 1020 agagagagca gaagaaaaaa gagaggacta tttggagcta tagcaggttt tatagaggga 1080 ggatggcagg gaatggtaga tggttggtat gggtaccacc atagcaatga gcaggggagt 1140 gggtacgctg cagacaaaga atccactcaa aaggcaatag atggagtcac caataaggtc 1200 aactcaatca ttgacaaaat gaacactcag tttgaggccg ttggaaggga atttaataac 1260 ttagaaagga gaatagagaa tttaaacaag aagatggaag acgggtttct agatgtctgg 1320 acttataatg ccgaacttct ggttctcatg gaaaatgaga gaactctaga ctttcatgac 1380 tcaaatgtta agaacctcta 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552 <212> PRT <213> HA from Influenza, H5 from A/Vietnam/1194/04 <400> 34 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 115 120 125 Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 305 310 315 320 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 325 330 335 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 340 345 350 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 355 360 365 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 370 375 380 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 385 390 395 400 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 405 410 415 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 420 425 430 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 435 440 445 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 450 455 460 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 465 470 475 480 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 485 490 495 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 500 505 510 Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 515 520 525 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 530 535 540 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 545 550 <210> 35 <211> 1752 <212> DNA <213> HA from Influenza, strain B/Florida/4/2006 <400> 35 atgaaggcaa taattgtact actcatggta gtaacatcca atgcagatcg aatctgcact 60 ggaataacat cttcaaactc acctcatgtg gtcaaaacag ccactcaagg ggaggtcaat 120 gtgactggtg tgataccact aacaacaaca ccaacaaaat cttattttgc aaatctcaaa 180 ggaacaagga ccagagggaa actatgccca gactgtctca actgcacaga tctggatgtg 240 gctttgggca gaccaatgtg tgtggggacc acaccttcgg cgaaggcttc aatactccac 300 gaagtcaaac ctgttacatc cgggtgcttt cctataatgc acgacagaac aaaaatcagg 360 caactaccca atcttctcag aggatatgaa aatatcaggc tatcaaccca aaacgtcatc 420 gatgcggaaa aggcaccagg aggaccctac agacttggaa cctcaggatc ttgccctaac 480 gctaccagta agagcggatt tttcgcaaca atggcttggg ctgtcccaaa ggacaacaac 540 aaaaatgcaa cgaacccact aacagtagaa gtaccataca tttgtacaga aggggaagac 600 caaatcactg tttgggggtt ccattcagat aacaaaaccc aaatgaagaa cctctatgga 660 gactcaaatc ctcaaaagtt cacctcatct gctaatggag taaccacaca ctatgtttct 720 cagattggca gcttcccaga tcaaacagaa gacggaggac taccacaaag cggcaggatt 780 gttgttgatt acatgatgca aaaacctggg aaaacaggaa caattgtcta ccaaagaggt 840 gttttgttgc ctcaaaaggt gtggtgcgcg agtggcagga gcaaagtaat aaaagggtcc 900 ttgcctttaa ttggtgaagc agattgcctt catgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc 960 aagccttact acacaggaga acatgcaaaa gccataggaa attgcccaat atgggtgaaa 1020 acacctttga agctcgccaa tggaaccaaa tatagacctc ctgcaaaact attaaaggaa 1080 aggggtttct tcggagctat tgctggtttc ctagaaggag gatgggaagg aatgattgca 1140 ggctggcacg gatacacatc tcacggagca catggagtgg cagtggcggc ggaccttaag 1200 agtacgcaag aagctataaa caagataaca aaaaatctca attctttgag tgagctagaa 1260 gtaaagaatc ttcaaagact aagtggtgcc atggatgaac tccacaacga aatactcgag 1320 ctggatgaga aagtggatga tctcagagct gacactataa gctcgcaaat agaacttgca 1380 gtcttgcttt ccaacgaagg aataataaac agtgaagatg agcatctatt ggcacttgag 1440 agaaaactaa agaaaatgct gggtccctct gctgtagaga taggaaatgg atgcttcgaa 1500 accaaacaca agtgcaacca gacctgctta gacaggatag ctgctggcac ctttaatgca 1560 ggagaatttt ctctccccac ttttgattca ctgaacatta ctgctgcatc tttaaatgat 1620 gatggattgg ataaccatac tatactgctc tattactcaa ctgctgcttc tagtttggct 1680 gtaacattga tgctagctat ttttattgtt tatatggtct ccagagacaa cgtttcatgc 1740 tccatctgtc ta 1752 <210> 36 <211> 569 <212> PRT <213> Mature HA from Influenza, strain B/Florida/4/2006 <400> 36 Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val 1 5 10 15 Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu 20 25 30 Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Arg 35 40 45 Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp 50 55 60 Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys 65 70 75 80 Ala Ser Ile Leu His Glu Val Lys Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro 85 90 95 Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg 100 105 110 Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asp Ala Glu 115 120 125 Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro 130 135 140 Asn Ala Thr Ser Lys Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val 145 150 155 160 Pro Lys Asp Asn Asn Lys Asn Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val 165 170 175 Pro Tyr Ile Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe 180 185 190 His Ser Asp Asn Lys Thr Gln Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn 195 200 205 Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val 210 215 220 Ser Gln Ile Gly Ser Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro 225 230 235 240 Gln Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Met Gln Lys Pro Gly Lys 245 250 255 Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Val Leu Leu Pro Gln Lys Val 260 265 270 Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu 275 280 285 Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys 290 295 300 Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys 305 310 315 320 Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr 325 330 335 Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His 355 360 365 Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu 370 375 380 Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser 385 390 395 400 Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met 405 410 415 Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp 420 425 430 Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu 435 440 445 Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu 450 455 460 Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu Ile Gly 465 470 475 480 Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp 485 490 495 Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr 500 505 510 Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu 515 520 525 Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu 530 535 540 Ala Val Thr Leu Met Leu Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg 545 550 555 560 Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu 565

Claims (81)

  1. HA1 도메인을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로서, HA1 도메인은
    a. 비-아스파라긴을 암호화하도록 위치 154를 변형시키거나, 비-세린 또는 비-트레오닌을 암호화하도록 위치 156을 변형시키거나, 또는 둘 다를 변형;
    b. 비-아스파라긴을 암호화하도록 위치 165를 변형시키거나, 비-세린 또는 비-트레오닌을 암호화하도록 위치 167을 변형시키거나, 또는 둘 다를 변형; 및
    c. 비-아스파라긴을 암호화하도록 위치 286을 변형시키거나, 비-세린 또는 비-트레오닌을 암호화하도록 위치 288을 변형시키거나, 또는 둘 다를 변형,
    에 의해 위치 154, 165 및 286에서 N-결합 글리코실화 부위를 갖지 않도록 변형되고,
    여기서 넘버링은 균주 A/Vietnam/1194/04에 따르며, 상기 뉴클레오티드 서열은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결되는 핵산.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조절 영역이 플라스토시아닌 조절 영역, 나핀 프로모터, 크루시페린 프로모터, 리불로오스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제(RuBisCO) 조절 영역, 클로로필 a/b 결합 단백질 조절 영역, ST-LS, 폴리헤드론 프로모터, 및 gp64 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 핵산.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 17의 서열에 따라서 정의되며, 여기서 위치 154, 165 및 286에서 아미노산을 암호화하는 잔기는 비-아스파라긴을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 17의 서열에 따라서 정의되며, 여기서 위치 156, 167 및 288에서 아미노산을 암호화하는 잔기는 비-세린 및 비-트레오닌 또는 알라닌을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 29의 서열에 따라서 정의되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)을 암호화하며, 여기서 위치 154, 165 및 286에서 아미노산은 비-아스파라긴을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  7. 제 6 항에 있어서, 위치 156, 167 및 288에서 아미노산은 비-세린 및 비-트레오닌 또는 알라닌을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  8. 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자(virus like particle; VLP)를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 제 1 항의 핵산을 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에 도입하는 단계; 및
    b) 핵산의 발현을 허용하는 조건에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 인큐베이션하여 VLP를 생산하는 단계로서, 여기서 상기 핵산은 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 일시적으로 발현되거나, 또는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 안정하게 발현되는 단계;
    c) 선택적으로 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 수거하고, VLP를 정제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  9. 제 1 항의 핵산에 의해서 암호화된 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 분자를 포함하는 바이러스-유사 입자(VLP).
  10. 제 8 항의 방법에 의해서 생산된 바이러스-유사 입자(VLP).
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 글리코실화 부위는 글리코실화 인식 삼원(triad) N-X-S/T로 구성되고, 여기서 N은 아스파라긴, X는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산, S는 세린 및 T는 트레오닌이거나, 또는 아스파라긴 잔기는 비-아스파라긴 아미노산으로 치환되거나, 또는 글리코실화 인식 삼원 N-X-S/T에 포함된 트레오닌 잔기는 비-세린 및 비-트레오닌 아미노산으로 치환되거나, 또는 그들의 조합인 것을 특징으로 하는 바이러스-유사 입자(VLP).
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)은 타입 A 또는 타입 B의 것이거나, 또는 상기 HA가 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및 H16으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 A 서브타입에서 유래하는 것을 특징으로 하는 바이러스-유사 입자(VLP).
  13. 제 9 항에 있어서, 대상에서 바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신으로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 바이러스-유사 입자(VLP).
  14. 제 9 항에 따른 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는, 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 대상에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역 유도용 조성물.
  15. 제 1 항에 따른 핵산으로 일시적으로 또는 안정하게 형질전환된, 제 1 항의 핵산을 함유하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 글리코실화 부위는 글리코실화 인식 삼원(triad) N-X-S/T로 구성되고, 여기서 N은 아스파라긴, X는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산, S는 세린 및 T는 트레오닌이거나, 또는 아스파라긴 잔기는 비-아스파라긴 아미노산으로 치환되거나, 또는 글리코실화 인식 삼원 N-X-S/T에 포함된 트레오닌 잔기는 비-세린 및 비-트레오닌 아미노산으로 치환되거나, 또는 그들의 조합인 것을 특징으로 하는 바이러스-유사 입자(VLP).
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)은 타입 A 또는 타입 B의 것이거나, 또는 상기 HA가 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및 H16으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 A 서브타입에서 유래하는 것을 특징으로 하는 바이러스-유사 입자(VLP).
  18. 제 10 항에 있어서, 대상에서 바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신으로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 바이러스-유사 입자(VLP).
  19. 제 10 항에 따른 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는, 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 대상에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역 유도용 조성물.
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