TW202017937A - 流感病毒血球凝集素突變體 - Google Patents
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Abstract
本發明關於植物中修飾的流感病毒蛋白質的產生。更具體地,本發明關於在植物中產生和增加流感類病毒顆粒(VLP)的產生,其中VLP包括修飾的流感病毒蛋白質,例如修飾的流感血球凝集素(HA)。當與對應的野生型胺基酸序列相比時,HA蛋白質可包括含有至少一個取代的胺基酸序列。進一步提供了編碼修飾的HA蛋白質的核酸。此外,還提供了產生流感類病毒顆粒(VLP)的方法和增加在植物、植物的一部分或植物細胞中流感類病毒顆粒(VLP)的產生的產量的方法。
Description
本發明關於在植物中產生突變體病毒蛋白質。更特別地是,本發明關於在植物中產生及增加流感類病毒顆粒的產生。
流感病毒為正黏液病毒科家族的有套膜、單股RNA病毒。流感病毒具高度接觸傳染性並可跨越所有年齡群組導致輕微至嚴重的疾病。
疫苗接種仍然是預防流感感染的最有效方法。常規地,使用活滅毒的(live attenuated)或完全非活化的病毒形式來完成疫苗接種,其在投藥予患者時引發免疫反應。為了消除重新獲得複製和變成傳染能耐的活滅毒的和完全非活化的病毒的潛在風險,包括重組病毒蛋白質的疫苗也已被用於引發對於流感感染的保護性免疫。
然而,重組病毒蛋白質作為疫苗的免疫性成分的使用受到許多限制。第一,在缺乏最佳表現和適當蛋白質折疊(folding)所需的病毒蛋白質和遺傳成分的全部補體的情況下,在標準體外
表現系統中重組病毒蛋白質的產量可能不足以用於疫苗產生的目的。第二,重組病毒蛋白質疫苗可能表現不良的免疫性,這是由於不當折疊、不良抗原呈現、及/或主要體液免疫反應的生成,這種反應在賦予持久的保護性免疫無效。
有四種類型的流感病毒:A、B、C和D,其中A型和B型流感是在人類中對於季節性疾病流行病的致病生物。
基於病毒表面上血球凝集素(HA)以及神經胺糖酸酶(NA)醣蛋白質亞型的表現,進一步劃分A型流感病毒。有18種不同的HA亞型(H1-H18)。
HA是三聚體凝集素,其促進流感病毒顆粒與靶細胞表面上的含唾液酸的蛋白質的結合,並媒介病毒基因體到靶細胞中的釋放。HA蛋白質包括兩種結構元素:頭部(其是血清保護性抗體的主要靶);以及柄。HA被轉譯為單個多肽HA0(組裝為三聚體),其必須被HA1(~40 kDa)以及HA2(~20 kDa)亞域之間的絲胺酸內切蛋白質酶切割。切割後,兩個雙硫鍵鍵結的蛋白質域採用病毒感染性所必需的必要構形。HA1形成含有受體結合位點(RBS)的球狀頭部域,並且是流感病毒的最小保留的區段。HA2是單通道整合膜蛋白質,其具有融合肽(FP)、可溶性胞外域(SE)、跨膜(TM)以及細胞溶質尾(CT),其分別具有約25、160、25和10個殘基的分別長度。HA2與N和C末端HA1殘基一起形成柄域,其包含跨膜區域,並且是相對保留的。
已經研究了流感病毒蛋白質(特別是流感病毒HA)的各種突變。
例如,Castelán-Vega等人(Adv Appl Bioinform Chem.
2014;7:37-44)使用穩定性預測演算法來比較來自A型流感(H1N1)pdm09病毒的HA的7,479個全長胺基酸序列,並鑑定出D104N、A259T、S124N和E172K突變造成流感HA穩定性的預測增強。相反地,S206T、K285E和E47K突變具有對HA的預測的去穩定作用。
比較原始A型流感(H1N1)pdm [A/加利福尼亞/7/2009]和後來出現的流感菌株[A/布利斯班/10/2010]的序列,Cotter等人(PLoS Pathog.
2014;10(1):e1003831)鑑定了A/加利福尼亞/7/2009 HA的柄區域中的E47K突變穩定了三聚體結構、降低了膜融合的pH,並增加了病毒的熱和酸穩定性。Cotter等人另外觀察到A/加利福尼亞/7/2009 E47K突變HA在雪貂中比其野生型對應物(counterpart)更具感染性。
Antanasijevic等人(J Biol Chem.
2014;289(32):22237-45)藉由在14個不同位置的位點定向誘變研究了H5 HA莖環區域的結構-功能性質。A/越南/1203/04(H5N1)突變體在HEK 293T細胞中表現,且Antanasijevic報導,在莖環區域中的大多數突變不破壞表現、蛋白水解加工、病毒組裝、或受體結合。然而,Antanasijevic觀察到HA1-D26K、HA1-M102L、HA2-V52A和HA2-I55A突變體(基於H3編號)表現出顯著降低的總HA水準,表明了HA對病毒顆粒中的降低的表現及/或組裝。當與野生型病毒相比,HA1-D26K、HA2-T49A和HA2-M102L突變體也表現出較低的血球凝集力價。Antanasijevic另外觀察到所有單突變體表現出減少的對A549肺細胞中的進入,連同在HA1-D26K和HA2-I55A突變體中顯示最明顯的損傷。Antanasijivec進一步證明,當與野生型病毒相比,藉由C179中和抗體,HA2-L99A突變體對A549肺細胞的抑制作用更敏感,表明了該突變增強了抗體結合及/或中和行為的模式。相反地,HA1-I28A、HA1-M31A、HA1-M31L、HA2-I45A和HA2-I55V突變體藉由C179中和抗體對於進入抑制被給予較低敏感。
WO2013/177444及其伴生出版物Lu等人(Proc Natl Acad Sci USA.
2014;111(1):125-30)報導了一種使用基於大腸桿菌的無細胞蛋白質表現系統和簡單的再折疊協定用於從A/加利福尼亞/05/2009(H1N1)的適當折疊的HA莖域的方法。為了誘導HA莖域的三聚化,將氯黴素乙醯轉移酶(CAT)或折疊域融合至HA的C端。為了減輕新暴露的疏水性及/或引起表現的HA莖蛋白的聚集的分子間離子配對,評估了五群組的突變:M1(I69T + I72E + I74T + C77T);M2(I69T + I72E + I74T + C77T + F164D);M3(I69T + I72E + I74T + C77T + F164D + L174D);M4(F164D);及M5(F164D + L174D)。Lu觀察到M5(F164D + L174D)突變體似乎是用於改善HA莖蛋白溶解度的最有影響的突變。對於M5突變體所進行另外的刪除(H38至C43以及C49至N61)以及C77T突變以避免不想要的雙硫鍵的形成,降低表面疏水性和pI,並避免具有無序結構的區域。
美國申請號13/838,796及Holtz等人之其伴生出版物(BMC Biotechnology.
2014;14:111)教導了一種藉由HA蛋白質的羧基末端區域中半胱胺酸殘基的突變(其包含跨膜(TM)以及細胞溶質域(CT))的重組HA的改善的穩定性和維持的效力。具體而言,Holtz等人證明了在重組伯斯/16/2009 HA(H3N2)中的C539A、C546A、C549A、C524S和C528A突變。所有五個半胱胺酸殘基或其不同子集合的突變造成HA產量、純度、顆粒大小、血球凝集活性和熱穩定性與重組野生型HA蛋白質相當。相反地,C64S和C76S突變造成顯著降低的HA,這指出這些殘基在適當的HA折疊中的關鍵角色。藉由使用單個輻射狀免疫擴散測定法(SRID),Holtz等人也表示,藉由防止TM和CT域中的二硫化物交聯,當與野生型蛋白質相比,五個半胱胺酸殘基突變改善了重組HA的效力。突變HA蛋白質在25℃維持效力持續至少12個月,而野生型HA蛋白質在僅純化後50天之後表現出少於40%的效力。
WO2015/020913教導了一種對於酪胺酸在選自A型流感/波多黎各/8/1934(H1N1)的403、406、411、422、429、432、433和435之群組的一個或更多位置的特定殘基的突變。這些突變促進二酪胺酸交聯的形成,該二酪胺酸交聯將流感HA的柄域穩定或“鎖定”在其天然三聚體構型。
WO2013/079473揭露了一種缺乏球狀頭部域的修飾的流感HA。在WO2013/079473中教導的多肽包括HA1域,其中胺基酸53至620(參考A/布利斯班/59/2007 [H1N1]編號)被刪除並以0至10個胺基酸的共價連接序列替換,及HA2域,其中HA1域的C-末端胺基酸是精胺酸或離胺酸以外的胺基酸,並且其中在位置406、409、413和416的一個或更多胺基酸被突變至選自由以下組成之群組的胺基酸:絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸,麩醯胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、和甘胺酸。
WO2014/191435類似地教導了一種修飾的流感HA,其包括具有被刪除片段的HA1域和HA2域,該被刪除區段被0至50個胺基酸的共價連接序列取代,其中HA在HA1和HA2之間的接合處具有抗切割作用,且其中位置337、340、352、353、402、406、409、413及/或416的一個或更多胺基酸已經被突變。
類病毒顆粒(VLP)是用於包含在免疫性組合物中的潛在候選物。VLP與成熟病毒粒子非常相似,但它們不含有病毒基因體材料。因此,VLP本質上是非複製性的,這使得它們作為疫苗用於投藥是安全的。除此之外,VLP可以被工程化以在VLP的表面上表現病毒醣蛋白,這是它們最天然的生理構型。此外,由於VLP類似於完整的病毒粒子並且是多價微粒結構,因此VLP在誘導至醣蛋白質的中和抗體可能比可溶性套膜蛋白質抗原更有效。
VLP已經在植物中產生(參見例如WO2009/076778;WO2009/009876; WO2009/076778;WO2010/003225;WO2010/003235;WO2010/006452;WO2011/03522;WO2010/148511;和WO2014153674,其藉由引用併入本文)。
WO2009/076778教導了一種在植物中產生流感VLP的方法,其包括將具有在植物中活性的調節區域的核酸引入,其可操作地連接於編碼來自A型或B型流感的流感HA的核苷酸序列。
WO2009/009876教導了一種在植物中產生流感HA VLP的方法,其中流感HA在植物細胞中自組裝成VLP並從植物細胞膜中產生芽。
WO2010/003225揭露了一種在植物中產生流感HA VLP的方法,其包括將具有在植物中活性的調節區域的核酸引入,其可操作地連接至編碼來自A/加利福尼亞/04/09(H1N1)的流感HA的核苷酸序列。
WO2010/006452教導了一種包括修飾的流感HA蛋白質的VLP的產生,其中在位置154、165、286或其組合的醣苷化位點(參考A/越南/1194/04 [H5N1]編號)已經藉由將在該位置的殘基突變為天冬醯胺酸以外的胺基酸來消除。WO2010/006452進一步教導了在位置156、167、288或其組合的胺基酸可以被突變為絲胺酸或蘇胺酸之外的殘基,以類似地消除N-連接的醣苷化信號三元組“N‑X‑S/T”。藉由選擇性地刪除位於HA蛋白質的球狀頭部中的醣苷化位點,WO2010/006452證明所得的HA蛋白質具有增加的抗原性和更廣泛的交叉反應性。
WO2011/035422教導了一種製備植物衍生的VLP的方法,其包括:獲得包括質外體定位的VLP的植物或植物物質;產生原生質體/球形質體分部(fraction)以及質外體分部;以及回收包括植物衍生的VLP的質外體分部。
WO2010/148511揭露了一種用於在植物中產生流感VLP的方法,其中VLP包括嵌合HA蛋白質。嵌合HA蛋白質包括具有F’1、F’2和F亞域的莖域簇;具有RB、E1和E2亞域的頭部域簇;以及具有跨膜域和C末端尾部域的跨膜域簇,其中至少一個亞域衍生自第一流感株,而其他亞域衍生自一個或更多第二流感株。
WO2014/153674教導了一種在植物中產生流感VLP的方法,其中VLP包括具有修飾的蛋白水解環的修飾的流感HA。修飾的蛋白水解環包括HA0前驅物的HA1和HA2域之間蛋白水解切割位點的去除。因此,與天然HA蛋白質相比,HA蛋白質被穩定並且實現了增加的蛋白質產量。
本發明關於在植物中修飾的流感病毒蛋白質的產生。更具體地,本發明關於在植物中產生和增加流感類病毒顆粒(VLP)的產生,其中VLP包含修飾的流感病毒蛋白質,例如修飾的血球凝集素(HA)蛋白質。
本發明的一個目的是提供一種在植物中增加流感VLP的產生的改進方法。
根據本發明,提供了:
A. 一種核酸,其包括編碼一修飾的流感H3血球凝集素(HA)蛋白質的一核苷酸序列,該HA蛋白質包括當與一對應的野生型胺基酸序列相比時包括至少一個取代的一胺基酸序列,該至少一個取代是對應於在A/香港/4801/14 HA位置382、384、392或431的胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
HA蛋白質可包括在對應於在A/香港/4801/14 HA的位置382的胺基酸的胺基酸具有對於非天冬醯胺酸的取代的胺基酸序列。HA蛋白質可包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置382的胺基酸的胺基酸具有對於丙胺酸的取代、或丙胺酸的保留取代的胺基酸序列。
HA蛋白質可包括在對應於在A/香港/4801/14 HA的位置384的胺基酸的胺基酸具有對於非白胺酸的取代的胺基酸序列。HA蛋白質可包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置384的胺基酸的胺基酸具有對於纈胺酸取代的、或纈胺酸的保留取代的胺基酸序列。
HA蛋白質可包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置392的胺基酸的胺基酸具有對於非苯丙胺酸的取代的胺基酸序列。HA蛋白質可包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置392的胺基酸的胺基酸具有對於天冬胺酸的取代的、或天冬胺酸的保留取代的胺基酸序列。
HA蛋白質可包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置431的胺基酸的胺基酸具有對於非白胺酸的取代的胺基酸序列。HA蛋白質可包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置431的胺基酸的胺基酸具有對於甲硫胺酸的取代、或甲硫胺酸的取代的胺基酸序列。
進一步提供:
B.一種核酸,其包括編碼修飾的流感H3血球凝集素(HA)蛋白質的核苷酸序列, HA蛋白質包括當與對應的野生型胺基酸序列相比時包括至少一個取代的胺基酸序列,該至少一個取代是在對應於在A/香港/4801/14 HA位置382、384、392、431、524、525、526或528的胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA的位置382的胺基酸的胺基酸具有對於非天冬醯胺酸的第一取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置524的胺基酸的胺基酸具有對於非半胱胺酸的第二取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528的胺基酸的胺基酸具有對於非半胱胺酸的第三取代的胺基酸序列。HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA的位置382的胺基酸的胺基酸具有對於丙胺酸的第一取代或丙胺酸的保留取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置524的胺基酸的胺基酸具有對於絲胺酸的第二取代或絲胺酸的保留取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528之胺基酸的胺基酸的白胺酸的第三個取代或白胺酸的保留取代的胺基酸序列。
HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置384的胺基酸的胺基酸具有對於非白胺酸的第一取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置524的胺基酸的胺基酸具有對於非半胱胺酸的第二取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528的胺基酸的胺基酸的非半胱胺酸的第三取代的胺基酸序列。HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA的位置384的胺基酸的胺基酸具有對於纈胺酸的第一取代或纈胺酸的保留取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置524的胺基酸的胺基酸具有對於絲胺酸的第二取代或絲胺酸的保留取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528的胺基酸的胺基酸具有對於白胺酸的第三取代或白胺酸的保留取代的胺基酸序列。
HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置392的胺基酸的胺基酸具有對於非苯丙胺酸的第一取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置524的胺基酸的胺基酸具有對於非半胱胺酸的第二取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528的胺基酸具有對於非半胱胺酸的第三取代的胺基酸序列。HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置392的胺基酸的胺基酸具有對於天冬胺酸的第一取代或天冬胺酸的保留取代、在對應於A/香港/4801/14 HA位置524的胺基酸的胺基酸具有對於絲胺酸的第二取代或絲胺酸的保留取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528的胺基酸的胺基酸具有對於白胺酸的第三取代或白胺酸的保留取代的胺基酸序列。
HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置431的胺基酸的胺基酸具有對於非白胺酸的第一取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置524的胺基酸的胺基酸具有對於非半胱胺酸的第二取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528的胺基酸的胺基酸具有對於半胱胺酸的第三取代的胺基酸序列。HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置431的胺基酸的胺基酸具有對於甲硫胺酸的第一取代或甲硫胺酸的保留取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置524的胺基酸的胺基酸具有對於絲胺酸的第二取代或絲胺酸的保留取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528的胺基酸的胺基酸具有對於白胺酸的第三取代或白胺酸的保留取代的胺基酸序列。
HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置382的胺基酸的胺基酸具有對於非天冬醯胺酸的第一取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置384的胺基酸的胺基酸具有對於非白胺酸的第二取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置524的胺基酸的胺基酸具有對於非半胱胺酸的第三取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528的胺基酸的胺基酸具有對於非半胱胺酸的第四取代的胺基酸序列。HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置382的胺基酸的胺基酸具有對於丙胺酸的第一取代或丙胺酸的保留取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置384的胺基酸的胺基酸具有對於纈胺酸的第二取代或纈胺酸的保留取代、在對應於在A/香港/4801/14 HA位置 524的胺基酸的胺基酸具有對於絲胺酸的第三取代或絲胺酸的保留取代、以及在對應於在A/香港/4801/14 HA位置528的胺基酸的胺基酸具有對於白胺酸的第四位取代或白胺酸的保留取代的胺基酸序列。
HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置525、526或525和526的胺基酸的胺基酸具有取代的胺基酸序列,其中在位置525的胺基酸的取代是非苯丙胺酸,並且在位置526的胺基酸的取代是非白胺酸。HA蛋白質可進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA位置525、526或525和526之胺基酸的胺基酸具有取代的胺基酸序列,其中在位置525的胺基酸的取代是對於白胺酸或白胺酸的保留取代,並且在位置526的胺基酸的取代是對於纈胺酸或纈胺酸的保留取代。
進一步提供了由如A或B之下所描述的重組核酸所編碼的HA蛋白質以及包括由A或B之下所描述的重組核酸所編碼的HA蛋白質的類病毒顆粒(VLP)。
因此,進一步提供了修飾的HA蛋白質,其包括當與對應的野生型胺基酸序列相比時包括至少一個取代的胺基酸序列,該至少一個取代是在對應於在A/香港/4801/14 HA位置382、384、392或431的胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
在另一方面,提供了修飾的流感H3血球凝集素(HA)蛋白質, HA蛋白質包含當與對應的野生型胺基酸序列相比時包括至少一個取代的胺基酸序列,該至少一個取代是在對應於在A/香港/4801/14 HA位置382、384、392、431、524、525、526或528之胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
此外,提供了一種在植物、植物的一部分或植物細胞中產生流感類病毒顆粒(VLP)的方法,該方法包括:
a)將如A或B之下所描述的重組核酸引入植物、植物的一部分或植物細胞中;以及
b)在允許由重組核酸所編碼的HA蛋白質的表現的條件下孵育植物、植物的一部分或植物細胞,從而產生VLP。該方法可進一步包括收穫植物、植物的一部分或植物細胞以及純化VLP的步驟c)。
進一步提供了在植物、植物的一部分或植物細胞中產生流感類病毒顆粒(VLP)的方法,該方法包括:
a)提供包括如A或B之下所描述的重組核酸的植物、植物的一部分或植物細胞;以及
b)在允許由重組核酸所編碼的HA蛋白質的表現的條件下孵育植物、植物的一部分或植物細胞,從而產生VLP。該方法可進一步包括收穫植物、植物的一部分或植物細胞、以及純化VLP的步驟c)。
此外,提供了增加在植物、植物的一部分或植物細胞中流感類病毒顆粒(VLP)的產生的產量的方法,該方法包括:a)將A或B的重組核酸引入植物、植物的一部分或植物細胞中;或提供包括A或B的重組核酸的植物、植物的一部分或植物細胞;以及b)在允許由重組核酸所編碼的HA蛋白質的表現的條件下孵育植物、植物的一部分或植物細胞,從而與表現未修飾的流感HA蛋白質植物、植物的一部分或植物細胞相比在更高的產量產生VLP。該方法可進一步包括收穫植物、植物的一部分或植物細胞、以及純化VLP的步驟c)。
該方法可進一步包括引入編碼質子通道蛋白質的第二核酸;其中植物、植物的一部分或植物細胞在允許由第二核酸所編碼的質子通道蛋白質的表現的條件下孵育。質子通道蛋白質可以是A型流感亞型M2蛋白質。
進一步提供了由本文所描述的方法所產生的VLP。
VLP可包括一個或多於一個衍生於植物、植物的一部分或植物細胞的脂質、植物特定的N-多醣、修飾的N-多醣或其組合。
除了提供了產生抗體或抗體片段的方法之外,該方法包括將如上所描述的VLP投藥予受試者或宿主動物,從而產生抗體或抗體片段。還提供了由該方法所產生的抗體或抗體片段。
此外,提供了植物、植物的一部分或植物細胞,其包含由A或B的重組核酸所編碼的A或B或HA蛋白質的重組核酸。HA蛋白質可以形成VLP。由此,還提供了包括VLP的植物、植物的一部分或植物細胞,該VLP包括由A或B的重組核酸所編碼的HA蛋白質。
除此之外,提供了用於誘導免疫反應的組合物,其包括如本文所描述的VLP的有效劑量,以及藥學上可接受的攜載體、佐劑、載具或賦形劑。還提供了一種在受試者中用於對於流感感染誘導免疫的方法,該方法包括投藥如上所描述的VLP。VLP可以口服地、鼻內地、肌內地、腹膜內地、靜脈內地或皮下地投藥予受試者。
此外,提供了一種修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質,其包括胺基酸序列,該胺基酸序列與SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:98的序列的一序列具有從約30%至約100%序列同一性(identity)、或序列相似性,若流感HA蛋白質包括至少如本文所描述的取代並且能夠形成VLP、當投藥予受試者時誘導免疫反應、誘導血球凝集或其組合。
本發明的概述不一定必需描述本發明的所有特徵。
以下敘述為較佳具體實施例。
如本文所使用的,用語“包括”、“具有”、“包含”、“含有”及其語法變化是包含性的或開放式的,並且不排除額外的、未列舉的元素及/或方法步驟。當在本文中與產品、用途或方法結合使用時,用語“基本上由…組成”表示可以存在額外的元素及/或方法步驟,但是這些添加不會實質上影響所記載方法或用途作用的方式。當在本文中與產品、用途或方法結合使用時,用語“由…組成”排除了額外元素及/或方法步驟的存在。在某些實施方式中,本文描述為包含某些元素及/或步驟的產品、用途或方法也可以基本上由那些元素及/或步驟組成,並且在其他實施方式中由那些元素及/或步驟組成,無論這些實施例是否具體被提及。另外,除非另有說明,否則單數的使用包括複數,且“或”表示“及/或”。除非本文另有定義,否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本領域具通常知識者通常理解的含義相同的含義。如本文所用的,用語“約”是指與給定值的約+/- 10%的變化。要理解的是,無論是否具體提及,這種變化總是包括在本文提供的任何給定值中。當在本文中結合用語“包含”使用時,用語“一(a)”或“一(an)”可以表示“一個”,但它也與“一個或更多”、“至少一個” 以及“一個或多於一個”的含義一致。
如本文所使用的,術語“植物”、“植物的一部分”、“植物一部分”、“植物物質”、“植物生物質”、“植物材料”、“植物萃取物”或“植物葉子”,可以包含能夠提供轉錄、轉譯、以及轉譯後機制的整個植物、組織、細胞或其任何分部、細胞內植物成分、細胞外植物成分、植物的液體或固體萃取物、或其組合,該機制用於表現本文所述的一個或多於一個核酸、及/或可以從中萃取和純化表現的蛋白質或VLP。植物可包含但不限於草本植物。此外,植物可包含但不限於農作物,包含例如油菜、甘藍、玉蜀黍、煙草(煙草)(例如、圓葉煙草、黃花煙草、紅花煙草、翼柄煙草)、阿拉伯芥、苜蓿、馬鈴薯、甘藷(Ipomoea batatus
)、人參、豌豆、燕麥、米、大豆、小麥、大麥、向日葵、棉花、玉米、黑麥(Secale cereale
)、高粱(Sorghum bicolor
、Sorghum vulgare
)、紅花(Carthamus tinctorius
)。
如本文所使用,術語“植物一部分”是指植物的任何部分,包含但不限於葉、莖、根、花、果實、從葉、莖、根、花、果實獲得的植物細胞、從葉、莖、根、花、果實獲得的植物萃取物、或其組合。如本文所使用,術語“植物萃取物”是指在物理地(例如藉由冷凍然後在合適的緩衝液中萃取)、機械地(例如藉由研磨或均質化植物或植物的一部分,然後在合適的緩衝液中萃取)、酵素催化地(例如使用細胞壁分解酶)、化學地(例如使用一個或更多螯合劑或緩衝液)、或其組合處理植物、植物的一部分、植物細胞、或其組合之後獲得的植物衍生產物。可以進一步處理植物萃取物以除去不需要的植物成分,例如細胞壁碎片。可以獲得植物萃取物以幫助從植物、植物的一部分或植物細胞中回收一個或更多成分,例如來自植物、植物的一部分或植物細胞的蛋白質(包含蛋白質複合物、蛋白質超結構及/或VLP)、核酸、脂質、碳水化合物或其組合。如果植物萃取物包括蛋白質,則它可以稱為蛋白質萃取物。蛋白質萃取物可以是粗植物萃取物、部分純化的植物或蛋白質萃取物、或純化產物,其包括來自植物組織的一個或更多蛋白質、蛋白質複合物、蛋白質超結構及/或VLP。如果需要,可以使用本領域技術人員已知的技術部分地純化蛋白質萃取物或植物萃取物,例如,可以對萃取物進行鹽或pH沉澱、離心、梯度密度離心、過濾、層析法,例如,粒徑篩析層析、離子交換層析、親和層析、或其組合。還可以使用本領域技術人員已知的技術來純化蛋白質萃取物。
如本文所使用,術語“構築體”、“載體”或“表現載體”是指用於將外源核酸序列轉移到宿主細胞(例如植物細胞)中並引導外源核酸序列在宿主細胞中表現的重組核酸。“表現卡匣”是指包括在適當的啟動子或其他調節元素的控制下、並與其可操作地(或操作性地)連接的受關注的核酸的核苷酸序列,以用於在宿主細胞中轉錄受關注的核酸。如本領域具通常知識者所理解的,表現卡匣可包括終止(終止子)序列,其是對植物宿主有活性的任何序列。例如,終止序列可以衍生自雙鏈RNA病毒(bipartite RNA virus)的RNA-2基因體區段,例如,豇豆嵌紋病毒(comovirus),終止序列可以是NOS終止子,或終止子序列可以從苜蓿色素體藍素基因的3’UTR獲得。
本揭露內容的構築體可以進一步包括3’非轉譯區(UTR)。3’非轉譯區含有聚腺苷酸化信號和能夠影響mRNA加工或基因表現的任何其他調節信號。聚腺苷酸化信號的特徵通常在於將聚腺苷酸軌道添加到mRNA前驅物的3’端的效應。儘管變異並不罕見,聚腺苷酸化信號通常藉由與經典形式5’ AATAAA-3’同源的存在來識別。合適的3’區域的非限制性實例是3’轉錄的非轉譯區,其含有農桿菌
腫瘤誘導的(Ti)質體基因的聚腺苷酸化信號,例如胭脂鹼合成酶(Nos基因)以及植物基因 (例如大豆貯藏蛋白基因、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶基因的小次單元(ssRUBISCO;US 4,962,028;其藉由引用併入本文))、用於調節色素體藍素表現的啟動子。
“調節區域”“調節元素”或“啟動子”是指核酸的一部分,通常但不總是在基因的蛋白質編碼區的上游,其可以由DNA或RNA,或DNA和RNA兩者組成。當調節區域有活性,且與受關注的核苷酸序列可操作地相關聯或可操作地連接時,這可造成受關注的核苷酸序列的表現。調節元素可能能夠媒介器官專一性、或控制發育或暫時性基因活化。“調節區域”包含啟動子元素、表現出基礎啟動子活性的核心啟動子元素、回應外部刺激而可誘導的元素、媒介啟動子活性的元素(如負調節元素或轉錄增強子)。如本文所使用,“調節區域”還包含轉錄後有活性的元素,例如調節基因表現的調節元素(例如轉譯和轉錄增強子、轉譯和轉錄抑制子、上游活化序列和mRNA不穩定性決定子)。這些後面的元素中的幾個可以位於編碼區域的近側。
在本揭露內容的上下文中,術語“調節元素”或“調節區域”通常是指DNA序列,通常但並非總是在結構基因的編碼序列的上游(5’),其藉由提供RNA聚合酶的識別及/或在特別位點開始轉錄所需的其他因子來控制編碼區域的表現。然而,應理解,位於內含子內或序列3’內的其他核苷酸序列也可有助於調節受關注的編碼區域的表現。提供識別RNA聚合酶或其他轉錄因子以確保在特別位點起始的調節元素的實例是啟動子元素。大多數(但不是全部)的真核啟動子元素含有TATA盒,其為由腺苷和胸腺嘧啶核苷核苷酸鹼基對組成的保留核酸序列,通常位於轉錄起始位點上游約25個鹼基對。啟動子元素可包括負責轉錄起始的基礎啟動子元素,以及修飾基因表現的其他調節元素。
存在幾種類型的調節區域,包含發育調節的、可誘導的或持續表現型的調節區域。發育調節的調節區域、或在其控制下控制基因的差異表現的調節區域,在某些器官或器官的組織內、在該器官或組織發育期間的特定時間被活化。然而,一些受發育調節的調節區域可能優先在特定發育階段的某些器官或組織內具有活性,它們也可以以發育調節的方式被活化(或者也可以在植物內的其他器官或組織處於基礎水準)。組織特定調節區域的實例,例如參見特定調節區域,包含napin啟動子和十字花科蛋白啟動子(Rask等人,1998,J. Plant Physiol. 152:595-599; Bilodeau等人,1994,Plant Cell 14:125-130)。葉特定啟動子的實例包含色素體藍素啟動子(參見US 7,125,978,其藉由引用併入本文)。
可誘導的調節區域是能夠回應誘導物而直接或間接活化一個或更多DNA序列或基因的轉錄的調節區域。在沒有誘導物的情況下,DNA序列或基因將不被轉錄。通常,與可誘導的調節區域特定結合以活化轉錄的蛋白質因子可以以不活化形式存在,然後藉由誘導物直接或間接地轉化為活化形式。然而,蛋白質因子也可能不存在。誘導物可以是化學試劑,例如蛋白質、代謝物、生長調節劑、除草劑或酚類化合物,或直接由熱、冷、鹽或有毒元素施加的生理壓力,或通過病原體或疾病因子(例如病毒)的作用間接施加的生理壓力。含有可誘導調節區域的植物細胞可以由外部將誘導物施加於細胞或植物,例如藉由噴霧、澆水、加熱或類似方法而暴露於誘導物。可誘導的調節元素可以源自植物或非植物基因(例如Gatz, C.和Lenk, I.R.P.,1998,Trends Plant Sci. 3, 352-358)。潛在的可誘導的啟動子的實例包含但不限於四環素可誘導的啟動子(Gatz, C.,1997,Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108)、類固醇可誘導的啟動子(Aoyama, T.和Chua, N.H.,1997,Plant J. 2, 397-404)以及乙醇可誘導的啟動子(Salter, M.G.等人,1998,Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X.等人,1998, Nature Biotech.16, 177-180)細胞分裂素可誘導的IB6和CKI1基因(Brandstatter, I.和Kieber, J.J.,1998,Plant Cell 10, 1009-1019;Kakimoto, T.,1996,Science 274, 982-985)以及生長素可誘導元素DR5(Ulmasov, T.等人,1997,Plant Cell 9, 1963-1971)。
持續表現型(constitutive)調節區域引導基因在植物的各個部分整個的表現,並在整個植物發育過程中持續引導基因的表現。已知的持續表現型調節元素的實例包含與CaMV 35S轉錄本相關聯的啟動子。(p35S;Odell等人,1985,Nature,313:810-812;其藉由引用併入本文)、水稻肌動蛋白1(Zhang等人,1991,Plant Cell,3:1155-1165)、肌動蛋白2(An等人,1996,Plant J.
,10:107-121)、或tms 2(US 5,428,147)、和磷酸三碳糖異構酶1(Xu等人,1994,Plant Physiol. 106:459-467)基因、玉蜀黍泛蛋白1基因(Cornejo等人,1993,Plant Mol. Biol. 29:637-646)、阿拉伯芥泛蛋白1和6基因(Holtorf等人,1995,Plant Mol. Biol. 29:637-646)、煙草轉譯起始因子4A基因(Mandel等人,1995 Plant Mol. Biol. 29:995-1004)、木薯葉脈嵌紋病毒啟動子,pCAS,(Verdaguer等人,1996);核酮糖二磷酸羧化酶小次單元的啟動子、pRbcS:( Outchkourov等人,2003)、pUbi(用於單子葉植物和雙子葉植物)。
如本文所使用的術語“持續表現型”不一定指出在持續表現型調節區域控制下的核苷酸序列在所有細胞類型中以相同水準表現,但即使經常觀察到豐富的變化,該序列在廣泛細胞類型中表現。
如上所述的表現構築體可以存在於載體中。載體可包括邊界序列,其允許表現卡匣轉移和整合到生物質或宿主的基因體中。構築體可以是植物二元載體,例如基於pPZP的二元轉化載體(Hajdukiewicz等人1994)。其他示例性構築體包含pBin19(參見Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller等人1995,Plant Molecular Biology
27:405-409)。
如本文所使用,術語“天然”、“天然蛋白質”或“天然域”是指具有與野生型相同的一級胺基酸序列的蛋白質或域。天然蛋白質或域可以由具有與野生型序列100%序列相似性的核苷酸序列編碼。當與野生型核苷酸序列比較時,天然胺基酸序列也可以由人類密碼子(hCod)最佳化的核苷酸序列或包括增加的GC含量的核苷酸序列編碼,條件是由hCod-核苷酸序列編碼的胺基酸序列展現與天然胺基酸序列100%的序列同一性。
藉由“人類密碼子最佳化的”或“hCod”核苷酸序列的核苷酸序列,意指選擇合適的DNA核苷酸用於合成接近通常在人類核苷酸序列的寡核苷酸序列中發現的密碼子使用的寡核苷酸序列或其片段。“增加的GC含量”是指當與相應的天然寡核苷酸序列比較時,選擇合適的DNA核苷酸用於合成寡核苷酸序列或其片段以接近包括GC含量的增加(例如,在寡核苷酸序列的編碼部分的長度上約1%至約30%,或其間任何量)的密碼子使用。例如,在寡核苷酸序列的編碼部分的長度上,從大約1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30%、或其間任何量。如下所述,人類密碼子最佳化的核苷酸序列或包括增加的GC含量的核苷酸序列(當與野生型核苷酸序列比較時)當與非人類最佳化的(或較低GC含量的)核苷酸序列之表現比較時,在植物、植物的一部分、或植物細胞中展現出增加的表現。
本文描述了修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質(也稱為修飾的HA蛋白質、修飾的流感HA蛋白質、修飾的HA、修飾的流感HA、突變HA、流感突變HA、流感HA變體或HA變體)以及在植物中產生修飾的流感HA蛋白質的方法。本文揭露的修飾的流感HA蛋白質包括已經發現與野生型HA或未修飾的HA蛋白質相比造成改善的HA特徵的修飾或突變。例如,當與相應的野生型胺基酸序列比較時,修飾的流感HA蛋白質可具有胺基酸序列,其具有至少一個胺基酸取代。
修飾的HA蛋白質的改善特徵的實例包含:與不包括修飾或突變相同的流感菌株或亞型的野生型或未修飾的HA相比,當在植物細胞中表現時增加的HA蛋白質產量;與野生型或未修飾的HA蛋白質相比,修飾的HA蛋白質的改良的血球凝集力價;與包括不包括修飾或突變之野生型HA的VLP的完整性、穩定性或兩者相比,包括修飾的HA蛋白質的類病毒顆粒(VLP)的改善完整性、穩定性、或完整性和穩定性兩者;與不包括修飾或突變的野生型VLP產生水準相比,當在植物細胞中表現時增加之VLP產量;及其組合。流感亞型與菌株
如本文所使用的術語“流感病毒亞型”是指A型流感病毒變體,其特徵在於血球凝集素(H或HA)以及神經胺酸酶(N)病毒表面蛋白質的各種組合。根據本說明書,來自這些病毒亞型的流感病毒亞型和血球凝集素(HA)可以由其H編號來指代,例如,“H3亞型的HA”、“H3 HA”或“H3流感”。術語“亞型”具體包含每個亞型內的所有個別“菌株”,其通常由突變造成並且可以顯示不同的致病概貌。此類菌株也可稱為病毒亞型的各種“分離株”。因此,如本文所使用,術語“菌株”和“分離株”可互換使用。
傳統上,基於例如流感凝集紅血球(RBC或紅細胞(erythrocyte))的能力,已經對不同的流感菌株進行了分類。對特別流感菌株具特定的抗體可以與病毒結合,從而防止這種凝集。基於此類抑制確定菌株類型的測定法通常稱為血球凝集素抑制測定法(HI測定法或HAI測定法),並且是本領域中用於表徵流感菌株的標準和眾所周知的方法。
然而,來自不同菌株的HA蛋白質在核酸和胺基酸水準上也顯示出顯著的序列相似性。當比較不同亞型的菌株時,這種相似性程度會變化,其中一些菌株清楚地顯示出比其他菌株更高的相似性程度(Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643)。胺基酸相似性程度在一種亞型的菌株和其他亞型的菌株之間變化(Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1981, 78:7643)。這種變化足以建立不同的亞型和不同菌株的演化系列,但不同菌株的DNA和胺基酸序列仍然易於使用傳統生物資訊學技術進行比對(Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643;Suzuki和Nei, Mol. Biol. Evol. 2002, 19:501)。
可以比對血球凝集素(HA)的多種核苷酸序列或相應多肽序列以確定亞型的“共通”或“共通序列”(參見第1圖)。
基於序列相似性,流感病毒亞型可以藉由參考它們的系譜(phylogenetic)群進一步分類。系譜分析(Fouchier等人,J Virol. 2005年3月;79(5):2814-22)已經證明了HA的細分,其分為兩個主要群組(Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643):尤其是系譜群1中的H1、H2、H5和H9亞型,尤其是系譜群2中的H3、H4和H7亞型。
藉由在HA蛋白質的胺基酸序列引入變化,該變化造成如上所描述的HA的改善的特徵,產生了新的流感HA蛋白質、HA修飾、HA蛋白質變體和突變體,其。編碼這種HA分子的核酸的分離是常規的,核酸的修飾以誘發胺基酸序列中的變化也是(例如通過定點誘變)。
本文描述了修飾的流感HA蛋白質和在植物中產生修飾的流感HA蛋白質的方法。已經觀察到,例如藉由在HA蛋白質(例如來自亞型H3的HA)中取代特定胺基酸的修飾造成修飾的HA蛋白質與野生型HA蛋白質或未修飾的HA蛋白質相比時改良的特徵。
如本文所描述的HA蛋白質的一個或多於一個修飾、突變或取代不位於HA蛋白質的球狀頭部域、不位於HA蛋白質的已知抗原決定區域中,這些修飾、突變或取代也不添加或移除HA蛋白質內的醣苷化位點。
如本文所描述的HA蛋白質、突變HA蛋白質或修飾的HA蛋白質被修飾並且在其胺基酸序列中在與A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92,參見第1圖)的胺基酸序列的位置382、384、392、431、524、525、526、527或528對應的任何一個或更多胺基酸的一個或超過一個突變或修飾對應的任何一個或更多胺基酸處包含一個或多於一個突變、修飾或取代。
藉由“對應於(correspond to)胺基酸”或“對應於(corresponding to)胺基酸的”,其意指胺基酸對應於與如下所描述的流感參考菌株比對的序列中的胺基酸。
HA的胺基酸殘基數目或殘基位置是按照流感參考菌株的HA的編號。例如,在流感H3的例子中,參考菌株可以是A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92;參見第1圖)。對應的胺基酸位置可以藉由將HA的序列(例如H3 HA)與它們各自的參考菌株的HA的序列比對來確定。用於比較的序列比對方法是本領域熟知的。用於比較的序列的最佳比對可以例如藉由Smith&Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同源性演算法、藉由Needleman&Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 的同源性比對演算法、藉由Pearson&Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) 的相似性方法的尋找、藉由這些演算法(威斯康辛遺傳學套裝軟體Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的電腦化實現、或者藉由手動比對和視覺檢查(參見,例如,Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編輯,1995補編))進行。幾種A型流感HA域的胺基酸序列比對(其將不被認為是限制性的)顯示於第1圖中。
當提及修飾、突變體或變體時,野生型胺基酸殘基(也簡稱為“胺基酸”)之後是殘基編號和新的或取代的胺基酸。例如,殘基中的丙胺酸(A,Ala)之天冬醯胺酸(N,Asn)的取代或位置382的胺基酸命名為N382A(參見表1)。382(N382A)
修飾的HA、HA突變體或變體例如修飾的H1 HA藉由使用野生型殘基的單字母胺基酸代碼、然後是其位置和替換殘基的單字母胺基酸代碼以相同的方式指定。多個突變體以斜線(/)或加號(+)分隔的成分單突變體表示。跨膜(TM)域或區域中的突變或修飾表示為(CysTM)。因此,例如H3 HA突變體N382A + L384V(CysTM)是丙胺酸(A,Ala)取代在殘基位置382的天冬醯胺酸(N,Asp)以及纈胺酸(V,Val)取代在殘基位置384的白胺酸(L,Leu)並且H3 HA突變體在跨膜域中具有進一步的突變的突變體。
當與相應的野生型胺基酸序列比較時,修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質可包含具有至少一個胺基酸取代的胺基酸序列。
藉由“胺基酸取代”或“取代”,其意指用不同的胺基酸取代蛋白質的胺基酸序列中的胺基酸。術語胺基酸、胺基酸殘基或殘基在本揭露內容中可互換使用。一個或更多胺基酸可以被不同於此位置的原始或野生型胺基酸的一個或更多胺基酸替換,而不改變蛋白質的胺基酸序列的總長度。藉由將編碼蛋白質的核苷酸序列中的密碼子序列改變為與原始或野生型胺基酸相比不同的胺基酸的密碼子序列,可以實驗性地誘導取代或置換。所得蛋白質是修飾的蛋白質,例如修飾的流感HA蛋白質。修飾的流感HA蛋白質不是天然發生的。
修飾的HA包括非天然發生的HA蛋白質,其具有對天然發生的HA的至少一種修飾,並且與天然發生的HA蛋白質相比具有改善的特徵,其中衍生了修飾的HA的胺基酸序列。修飾的HA蛋白質具有自然界中未發現的胺基酸序列,其藉由用一個或更多不同的胺基酸取代HA蛋白質的一個或更多胺基酸殘基而衍生。
因此,修飾的HA、突變體HA或重組HA是指編碼天然發生的HA的DNA序列被修飾以產生修飾的或突變體DNA序列的HA,該修飾的或突變體DNA序列編碼HA胺基酸序列中的一個或更多胺基酸的修飾、突變或取代。
所鑑定用於修飾、突變或取代的一些殘基對應於保留殘基,而其他殘基不是。在殘基不是被保留的情況下,一個或更多胺基酸的取代限於產生修飾的HA的取代,該修飾的HA具有與自然界中發現的胺基酸序列不對應的胺基酸序列。在保留殘基的情況下,這種修飾、取代或置換也不應造成天然發生的HA序列。保留式取代
如本文所描述,可以鑑定和修飾、取代或突變HA蛋白質中的殘基以產生修飾的HA蛋白質或HA蛋白質變體。特定位置的取代或突變不限於本文所述的或實施例中給出的胺基酸取代。例如,HA變體可含有描述胺基酸取代的保留或保留式取代。
如本文所使用,術語“保留取代”或“保留式取代”及其語法變化是指HA蛋白質的序列中存在的胺基酸殘基,其與該取代或該殘基不同但屬於同一類別的胺基酸(即,非極性殘基取代非極性殘基、芳香族殘基取代芳香族殘基、極性不帶電荷的殘基取代極性不帶電荷的殘基、帶電荷的殘基取代帶電荷的殘基)。另外,保留式取代可以包括具有相同符號,並且通常與替代野生型殘基的殘基相似的大小的介面疏水性值的殘基。
如本文所使用,術語“非極性殘基”是指甘胺酸(G,Gly)、丙胺酸(A,Ala)、纈胺酸(V,Val)、白胺酸(L,Leu)、異白胺酸(I,Ile)、 和脯胺酸(P,Pro);術語“芳香族殘基”是指苯丙胺酸(F,Phe)、酪胺酸(Y,Tyr)以及色胺酸(W,Trp);術語“極性不帶電荷的殘基”是指絲胺酸(S,Ser)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)、甲硫胺酸(M,Met)、天冬醯胺(N,Asn)以及麩醯胺酸(Q,Gln);術語“帶電荷的殘基”是指帶負電荷的胺基酸天冬胺酸(D,Asp)以及麩胺酸(E,Glu),以及帶正電荷的胺基酸離胺酸(K,Lys)、精胺酸(R,Arg) 和組胺酸(H,His)。其他胺基酸分類可能如下:
.具有疏水側鏈(脂肪族)的胺基酸:丙胺酸(A,Ala)、異白胺酸(I,Ile)、白胺酸(L,Leu)、甲硫胺酸(M,Met)以及纈胺酸(V,Val);
.具有疏水側鏈(芳香族)的胺基酸:苯丙胺酸(F,Phe)、色胺酸(W,Trp)、酪胺酸(Y,Tyr);
.具有極性中性側鏈的胺基酸:天冬醯胺(N,Asn)、半胱胺酸(C,Cys)、麩醯胺酸(Q,Gln)、絲胺酸(S,Ser)以及蘇胺酸(T,Thr);
.帶電荷側鏈的胺基酸(酸性):天冬胺酸(D,Asp)、麩胺酸(E,Glu);
.帶電荷側鏈的胺基酸(鹼性):精胺酸(R,Arg);組胺酸(H,His); 離胺酸(K,Lys)、甘胺酸G,Gly)以及脯胺酸(P,Pro)。
作為原始的取代或修飾,保留式胺基酸取代可能對所得的HA蛋白質變體或修飾的HA蛋白質的活性具有類似的作用。關於保留式取代的進一步資訊可以在例如Ben Bassat等人(J. Bacteriol,169:751-757, 1987)、O’Regan等人 (Gene,77:237-251, 1989)、Sahin-Toth等人 (Protein ScL,3:240-247, 1994)、Hochuli等人(Bio/Technology,6:1321-1325, 1988)以及廣泛使用的遺傳學和分子生物學教科書中找到。
Blosum矩陣通常用於確定多肽序列的相關性。使用可信比對的大型資料庫(BLOCKS資料庫)建立Blosum矩陣,其中計數了藉由小於某個臨界值百分比同一性相關的成對序列比對(Henikoff等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 :10915-10919, 1992)。對於BLOSUM90矩陣的高度保留的目標頻率,使用90%同一性的臨界值。對於BLOSUM65矩陣使用65%同一性的臨界值。Blosum矩陣中零和以上的分數在所選擇的百分比同一性被認為是“保留式取代”。下表顯示了示例性保留式胺基酸取代:表2。表 2. 示例性保留式胺基酸取代。
編碼修飾的HA蛋白質的核苷酸序列可以針對人類密碼子使用、增加的GC含量或其組合進行最佳化。修飾的HA蛋白質可以在植物、植物的部分或植物細胞中表現。A. H3 HA 修飾 I
本文描述了修飾的流感H3 HA蛋白質和在植物中產生修飾的流感H3 HA蛋白質的方法。已經觀察到,與野生型H3 HA蛋白質或未修飾的H3 HA蛋白質相比,來自亞型H3的HA蛋白質中特定胺基酸的修飾造成修飾的H3 HA蛋白質的特徵得到改善。
對於不是HA跨膜(TM)以及細胞溶質域(CT)的部分的殘基的總共33個單、雙及/或三重修飾及/或對於HA的跨膜(TM)以及細胞溶質域(CT)之部分之殘基的修飾被測試以改善H3 HA蛋白質的特徵。如本文所描述並如實例中所顯示,僅在特定位置的修飾或修飾組合改善了H3 HA蛋白質的特徵。在13個位置或位置組合的修飾對H3 HA蛋白質的特徵具有負面影響(資料未顯示)。
H3 HA突變或修飾H3 HA蛋白質的改善特徵的實例包含:當與不包括該修飾或突變流感相同菌株或亞型的野生型或未修飾的HA相比,在植物細胞中表現時增加的HA蛋白質產量或累積;當與野生型或未修飾的HA蛋白質相比,修飾或突變HA蛋白質的改善的血球凝集力價;當與包括不包含突變野生型HA的VLP的完整性、穩定性或兩者相比,包括修飾的HA蛋白的VLP的改善的完整性、穩定性或完整性和穩定性兩者;當與不包括修飾或突變、及其組合的野生型水準的VLP產生相比,當在植物細胞中表現時的增加的VLP產量;及其組合。
如本文所描述的修飾的H3 HA蛋白質或突變體H3 HA蛋白質被修飾並且包括比對於參考菌株A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92;參見第1圖)的位置382、384、392及/或431的序列中的任何一個或更多殘基的一個或多於一個突變或修飾。因此,提供了一種流感H3 HA多肽、蛋白質及/或蛋白質複合物(諸如例如類病毒顆粒(VLP),其包括在一個或更多胺基酸位置382、384、392和431的修飾或突變),其中此種胺基酸編號是基於如第1圖(SEQ ID NO:92)所顯示的A/香港/4801/14的序列、或在對應於此等胺基酸位置的胺基酸位置(例如藉由HA胺基酸序列對於SEQ ID NO:92的比對所確定的)。包括一個或更多此等突變之流感H3 HA胺基酸序列的非限制性實例包含SEQ ID NO:91、92、93、94、95、96和97。
本文所描述的修飾的H3 HA蛋白質包含H3 HA蛋白質,其具有胺基酸序列,該胺基酸序列具有與編碼來自H3的HA的胺基酸序列(SEQ ID NO:91-97)約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中在比對於A/香港/4801/14 HA(SEQ ID NO:92)的位置382、384、392和431的序列中的任何一個或更多殘基,該胺基酸序列具有一個或多於一個突變或修飾。
此外,H3 HA蛋白質可以由核苷酸序列來編碼,核苷酸序列具有與編碼來自H3的HA的核苷酸序列(SEQ ID NO:91-97)約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中在比對於A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)HA的位置382、384、392和431之序列中的任何一個或更多殘基,H3 HA蛋白質具有一個或多於一個突變或修飾,並且其中核苷酸序列編碼在表現時形成VLP的血球凝集素蛋白質。
菌株(H3 HA可以從其被衍生)的非限制性實例是A/曼谷/3007/15(H3N2)(SEQ ID NO:91);A/香港/4801/14(H3N2)(SEQ ID NO:92);A/明尼蘇達/40/15(H3N2)(SEQ ID NO:93);A/南澳大利亞/1/16(H3N2)(SEQ ID NO:94);A/賓夕法尼亞/09/15(H3N2)(SEQ ID NO:95);A/瑞士/9715293/13(H3N2)(SEQ ID NO:96)以及A/密西西比/16/16(H3N2)(SEQ ID NO:97)。 在位置 382 的修飾
在一方面,提供了一種可以具有在位置382處之修飾的殘基(根據A/香港/4801/14 HA編號來編號,SEQ ID NO:92)的H3 HA。
Antanasijevic等人(J Biol Chem.
2014; 289(32):22237-45)藉由在14個不同位置的定點誘變研究了H5 HA莖環區域的結構-功能性質。HA2的突變位置Thr41
、Gln42
、Ile45
、Asn53
以及Leu99
是高度保留的並且被設計用於測定這些殘基對HA功能的重要性。Antanasijevic觀察到在位置HA1-I28V、HA2-T41A、HA2-T49A、HA2-N53A以及HA2-D57E的保留突變破壞了病毒的進入。在小分子MBX2329之進入抑制的突變效果的情況下,對於外部面的HA2-Ile45
、HA2-Val52
、HA2-Asn53
以及HA2-Ser54
與內部面的HA2-Leu99
的取代具有最大的效果。這些殘基在第1組HA中(例如H1和H5)是高度保留的。Antanasijevic的H5的HA中的位置53對應於當前揭露的在H1 HA中的位置380和在H3 HA中的位置382。
意外地發現,當與野生型H1 HA相比,從天冬醯胺酸到丙胺酸在H1 HA中位置380的保留殘基的修飾導致修飾的H1 HA的在血球凝集力價中大約80%降低(資料未顯示)。來自H5的HA中的等同修飾也導致血球凝集力價的降低(參見第3圖,表7)。然而,當與野生型H3 HA相比,從天冬醯胺酸到丙胺酸的H3(N382A)的HA中的等同位置的修飾導致在血球凝集力價中大約130%的增加(參見第2圖,表5)。
由此,在H3 HA的位置382殘基可以被修飾為非天冬醯胺酸。例如,在位置382的殘基可以被修飾為疏水性胺基酸,例如丙胺酸或丙胺酸的保留取代,例如絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸( C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。
例如修飾的H3 HA蛋白質可具有胺基酸序列,該胺基酸序列具有與來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)的HA的胺基酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該胺基酸序列具有在位置382的丙胺酸(A,Ala)或者丙胺酸(A,Ala)的保留取代,並且其中該序列不天然發生的。丙胺酸的保留取代可以例如是絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。
本說明書還提供了一種核酸,其包括編碼具有在位置382的取代的修飾的H3 HA的核苷酸序列(如上所描述可操作地連接至植物中有活性的調節區域)。
例如,核苷酸序列可具有與編碼來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:102)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼具有在位置382的丙胺酸(A,Ala)或丙胺酸(A,Ala)的保留取代的修飾的H3 HA蛋白質,並且其中該序列不是天然發生的。保留取代可以例如是絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。
核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:102的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、96、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼具有在位置382的丙胺酸(A,Ala)或丙胺酸(A,Ala)的保留取代的修飾的H3 HA蛋白質,並且其中序列不是天然發生的。保留取代可以例如是絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。
除了在位置382的殘基之外,在位置384、524、525、526、527、528或其任何組合的殘基可以在H3 HA中被修飾。
此外,提供了一種在植物中產生VLP的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,其具有至少在位置382和任選地在位置384、524、525、526、527、528或其任何組合的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入至植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至在植物中有活性的調節區域),並且在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物一部分,從而產生VLP。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,其具有至少在位置382取代並且任選地在位置384、524、525、526、527、528或其任何組合的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入至植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並且在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種VLP,該VLP包括H3 HA,其具有至少在位置382取代並且任選地在位置384、524、525、526、527、528或其任何組合的取代。該VLP可以藉由如本說明書所提供的方法來產生。當與包括未修飾的H3 HA蛋白質的VLP相比時,包括修飾的H3 HA的VLP顯示改善的特徵。 在位置 384 的修飾
在另一方面,提供了一種H3 HA,其可以在位置384具有修飾的殘基(A/香港/4801/14 HA編號,SEQ ID NO:92)。
如在第2圖和表5中所顯示,當與野生型H3 HA相比,具有在位置384從白胺酸被修飾成纈胺酸的殘基導致在血球凝集力價中大約200%的增加。
由此,在H3 HA之位置384的殘基可以被修飾為非白胺酸。例如,在位置384的殘基可以被修飾為例如纈胺酸或非白胺酸的纈胺酸的保留取代,例如異白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。
例如,修飾的H3 HA蛋白質可具有胺基酸序列,該胺基酸序列具有與來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)的HA的胺基酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該胺基酸序列具有在位置384纈胺酸(V,Val)或不是白胺酸的纈胺酸的保留取代,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA蛋白質當表現時形成VLP。纈胺酸的保留取代可以是例如異白胺酸,甲硫胺酸,丙胺酸或蘇胺酸。
本說明書還提供了核酸,其包含編碼修飾的H3 HA的核苷酸序列,其在如上所述的位置384處具有與植物中活性的調節區域可操作地連接之取代。
例如,核苷酸序列可具有與編碼來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:102)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或者序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾H3 HA蛋白質,該H3 HA蛋白質具有在位置384纈胺酸(V,Val)或不是白胺酸的纈胺酸(V,Val)的保留取代,其中該序列不是天然發生的,並且其中核苷酸序列編碼當表現時形成VLP的HA蛋白質。纈胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。
核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:102的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、96、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置384纈胺酸(V,Val)或不是白胺酸的纈胺酸(V,Val)的保留取代,其中該序列不是天然發生的,並且其中該核苷酸序列編碼當表現時形成VLP的HA蛋白質。纈胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。
除了在位置384的殘基之外,在位置382、524、525、526、527、528或其任何組合的殘基可以在H3 HA中修飾。
此外,提供了一種在植物中產生VLP的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,其具有至少在位置384的取代以及任選地在位置382、524、525、526、527、528或其任何組合的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入至植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
此外,提供了一種如上所述在植物中增加VLP產量的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,其具有至少在384的取代以及任選地在位置382、524、525、526、527、528或其任何組合的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入至植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種VLP,該VLP包括H3 HA,其具有至少在位置384的取代以及任選地在位置382、524、525、526、527、528或其任何組合的取代。VLP可以如藉由如本說明書所提供的方法來產生。當與包括未修飾的H3 HA蛋白質的VLP相比時,包括修飾的H3 HA的VLP顯示改善的特徵。 在位置 392 的修飾
在另一方面,提供了一種H3 HA,其可以具有在位置392的修飾的殘基(H3 A/香港/4801/14 HA編號,SEQ ID NO:92)。
如第2圖和表5中所顯示,當與野生型H3 HA相比,具有在位置392的殘基從苯丙胺酸被修飾成天冬胺酸導致在血球凝集力價中大約140%的增加。
由此,H3 HA的在位置392的殘基可以被修飾為非苯丙胺酸。例如,在位置392的殘基可以被修飾為例如天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代,例如麩胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸或絲胺酸。
例如,修飾的H3 HA蛋白質可具有胺基酸序列,該胺基酸序列具有與來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)的HA的胺基酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該胺基酸序列具有天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代,例如在位置392的麩胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸或絲胺酸,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA蛋白質當表現時形成VLP。天冬胺酸的保留取代可以是例如麩胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸或絲胺酸。
本說明書還提供了一種核酸,其包括編碼修飾的H3 HA的核苷酸序列,該修飾的H3 HA具有在如上所描述可操作地連接至在植物中有活性的調節區域的位置392的取代。
例如,核苷酸序列可具有與編碼來自H3A/香港/4801/14(SEQ ID NO:102)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或編碼序列相似性,其中該核苷酸序列編碼具有在位置392的天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代的修飾的H3 HA蛋白質,其中該序列不是天然發生的,並且其中該核苷酸序列編碼當表現時形成VLP的HA蛋白質。天冬胺酸的保留取代可以例如是麩胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸或絲胺酸。
核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:102的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼具有在位置392的天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代的修飾的H3 HA蛋白質,其中該序列不是天然發生的,且其中該核苷酸序列編碼當表現時形成VLP的HA蛋白質。天冬胺酸的保留取代可以例如是麩胺酸,天冬醯胺酸,麩醯胺酸或絲胺酸。
此外,提供了一種在植物中產生VLP的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,其具有至少如上所描述的位置392的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入至植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
除此之外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,其具有至少如上所描述在位置392的取代,該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入至植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了包括H3 HA的VLP,該H3 HA具有至少在位置392的取代。VLP可以藉由如本說明書所提供的方法產生。當與包括未修飾的H3 HA蛋白質的VLP相比時,包括修飾的H3 HA的VLP顯示出改善的特徵。 在位置 431 的修飾
在另一方面,提供了一種H3 HA,其可以具有在位置431的修飾的殘基(H3 A/香港/4801/14 HA編號,SEQ ID NO:92)。
如第2圖和表5中所顯示,當與野生型H3 HA相比,具有在位置431從白胺酸被修飾成甲硫胺酸的殘基導致在血球凝集力價中大約170%的增加。
由此,在H3 HA的位置431的殘基可以被修飾為非白胺酸。例如,在位置431的殘基可以被修飾為例如甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代,例如白胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。
例如,修飾的H3 HA蛋白質可具有與來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)的HA的胺基酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性的胺基酸序列,其中該胺基酸序列具有在位置431的甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA蛋白質當表現時形成VLP。甲硫胺酸的保留取代可以例如是白胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。
本說明書還提供了一種核酸,其包括編碼修飾的H3 HA的核苷酸序列,該修飾的H3 HA具有在如上所描述可操作地連接至在植物中有活性的調節區域的位置431的取代。
例如,該核苷酸序列可具有與編碼來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:102)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置431的甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代,其中該序列不是天然發生的,並且其中該核苷酸序列編碼當表現時形成VLP的HA蛋白質。甲硫胺酸的保留取代可以例如是白胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。
該核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:102的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置431的甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代,其中該序列不是天然發生的,並且其中該核苷酸序列編碼HA當表現時形成VLP的蛋白質。天冬胺酸的保留取代可以例如是白胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。
此外,提供了一種在植物中產生VLP的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少如上所描述在位置431的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入至植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
除此之外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少如上所描述在位置431的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入至植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種VLP,該VLP包括H3 HA,該H3 HA具有至少在位置431的取代。該VLP可以藉由如本說明書所提供的方法產生。當與包括未修飾的H3 HA蛋白質的VLP相比時,包括修飾的H3 HA的VLP顯示出改善的特徵。B. H3 HA 修飾 II 在位置 382 、 384 、 392 、 431 及 / 或 524-528 的修飾( “CysTM” )
本文描述了一種修飾的流感H3 HA蛋白質和在植物中產生修飾的流感H3 HA蛋白質的方法。已經觀察到,當與野生型H3 HA蛋白質或未修飾的H3 HA蛋白質相比,來自亞型H3的HA蛋白質中特定胺基酸的修飾造成修飾的H3 HA蛋白質的改善的特徵。
在一方面,在位置524及/或528的半胱胺酸殘基(H3 A/香港/4801/14編號,SEQ ID NO:92)或如藉由比對所確定的與這些位置等同的殘基可以取代在這些位置的非半胱胺酸殘基。此外,在位置525、526及/或527(H3 A/香港/4801/14 HA編號)的殘基還可以被修飾。這些修飾或取代可稱為“CysTM修飾”、“CysTM”、“CysTM突變”、“CysTM取代”或“CysTM置換”或文法等同表現。
美國申請號13/838,796及其由Holtz等人的伴生出版物(BMC Biotechnology.
2014; 14:111)教導了重組HA之改善的穩定性和維持的效力,其藉由HA蛋白質的羧基末端區域中的半胱胺酸殘基的突變(包含跨膜(TM)以及細胞溶質域(CT))。具體而言,Holtz等人證明了在重組Perth/16/2009 HA(H3N2)中的C539A、C546A、C549A、C524S和C528A突變。所有五個半胱胺酸殘基(或其不同亞組)的突變造成HA產量、純度、顆粒尺寸、血球凝集活性、以及熱穩定性(與重組野生型HA蛋白質相當)。相反地,已知形成雙硫鍵(C64S和C76S)的胞外域中的一對保留半胱胺酸殘基的突變造成顯著降低的HA表現,這指出這些殘基在適當的HA折疊中的關鍵角色。藉由使用單個輻射狀免疫擴散測定法(SRID),Holtz等人還顯示,當與野生型蛋白質相比,藉由防止在TM和CT域中的雙硫交聯,五個半胱胺酸殘基突變改善了重組HA的效力。突變HA蛋白質維持效力在25℃持續至少12個月,而野生型HA蛋白質在純化後僅50天之後表現出小於40%效力。
Xu等人(Virus Genes(2013)47:20-26)顯示,具有一個或兩個TM半胱胺酸(C540/544)之突變的突變體H3 HAs可以在細胞中適當地表現,然而,與野生型H3 HA蛋白質相比,突變體表現出較低的耐熱性和增強的融合活性。
總共33種單、雙或三重修飾結合於如本文所描述的跨膜(TM)的修飾(“CysTM修飾”)而被測試,以改善H3 HA蛋白質的特徵。如本文所描述以及如實例中所顯示,僅在某些位置的修飾或修飾組合改善了H3 HA蛋白質的特徵。在13個位置或位置組合的修飾在H3 HA蛋白質的特徵上具有負面影響(資料未顯示)。
H3 HA突變體蛋白質的改善特徵的實例包含:當與不包括修飾或突變之流感的相同菌株或亞型的野生型或未修飾的HA相比,當在植物細胞中表現時增加的HA蛋白質產量;當與野生型或未修飾的HA蛋白質相比,修飾的或突變HA蛋白質的改善的血球凝集力價;當與包括不包含突變之野生型HA的VLP的完整性、穩定性或兩者相比,包括修飾的HA蛋白質的VLP的改善完整性,穩定性或完整性和穩定性;當與不包括修飾或突變的野生型水準的VLP產生相比,當在植物細胞中表現時增加的VLP產量;及其組合。
在一方面,提供了一種修飾的H3 HA,其具有在位置524及/或528的半胱胺酸殘基(A/香港/4801/14編號)或等同於藉由取代在這些位置的非半胱胺酸殘留物的比對所確定的這些位置的殘基。例如,在位置524的半胱胺酸殘基可以被代之以絲胺酸(S,Ser)或者絲胺酸的保留取代或在位置528的半胱胺酸可以被白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代所取代。
此外,在位置524和528的兩個半胱胺酸之間的序列(A/香港/4801/14編號,SEQ ID NO:92)還可以被修飾。例如,在序列“C524
X525
X526
X527
C528
”中,C524
(位置524)可以被絲胺酸(S,Ser)或絲胺酸的保留取代所取代;如果X525
(位置525)不是白胺酸,殘基X525
可以被白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代所取代;如果X526
(位置526)不是纈胺酸,則X526
可以是替換的纈胺酸(V,Val)或纈胺酸的保留取代;如果X527
(位置527)不是白胺酸,在位置X527
的殘基可以被白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代所替換,並且C528
(位置528)可以被白胺酸(L,Leu)或白胺酸之保留取代所取代。例如,在一個實施方案中,在位置524至528的序列“CFLLC”可以被序列“SLVLL”(SEQ ID NO:98)所取代。
來自除了H3流感的其他菌株的HA蛋白質(其具有在位置524及/或528的半胱胺酸殘基或等同於藉由比對所確定的這些位置的殘基)也可以如本文所描述者而被修飾。例如,來自B型流感菌株的HA蛋白質(其具有在等同於H3 HA的位置524及/或528的位置的半胱胺酸殘基)可以修飾成如本文所描述的非半胱胺酸殘基。
除了如本文所描述的跨膜域的突變之外,修飾的H3 HA蛋白質還可以包括在位置382、384、392及/或431的一個或多於一個胺基酸的取代,這造成改善的修飾HA 3蛋白質或使用該修飾的HA蛋白質產生的VLP的特徵。應當理解,改善的特徵不限於在特定位點取代特定胺基酸,因為本領域具有通常知識者將理解具有相似性質的胺基酸可以取代在所鑑定位置的胺基酸。
由此,如本文所描述的修飾的H3 HA蛋白質或突變體H3 HA蛋白質可包括在與參考菌株H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92;參見第1圖)的位置382、384、392、431、524、525、526、527或528之序列比對中在任何一個或更多殘基的一個或多於一個突變或修飾。因此提供了流感H3 HA多肽、蛋白質及/或蛋白質複合物(例如包括在一個或更多胺基酸位置382、384、392、431、524、525、526、527或528的修飾或突變類病毒顆粒(VLP)),其中此種的胺基酸編號是基於如第1圖(SEQ ID NO:92)所顯示的H3 A/香港/4801/14的序列、或在對應於此種胺基酸位置的胺基酸位置,例如藉由HA胺基酸序列比對於SEQ ID NO:92所確定者。包括一個或更多此種突變流感H3 HA胺基酸序列的非限制性實例含SEQ ID NO:91、92、93、94、95、96以及97。
本文描述的修飾H3 HA蛋白質包含具有胺基酸序列的H3 HA蛋白質,該胺基酸序列具有與編碼來自H3的HA的胺基酸序列(SEQ ID NO:91-97)約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中在與A/香港/4801/14 HA(SEQ ID NO:92)的位置382、384、392、431、524、525、526、527或528的序列比對中的任何一個或更多殘基,該胺基酸序列具有一個或多於一個突變或修飾。
此外,H3 HA蛋白質可以被核苷酸序列編碼,該核苷酸序列具有與編碼來自H3的HA的核苷酸序列(H3菌株的SEQ ID NO:91-97序列)約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中在與H3 A/香港/4801/14 HA(SEQ ID NO:92)的位置382、384、392、431、524、525、526、527或528的序列比對中任何一個或更多殘基,H3 HA蛋白質具有一個或多於一個突變或修飾,並且其中核苷酸序列編碼當表現時形成VLP的血球凝集素蛋白質。
菌株(H3 HA可以從其被衍生)的非限制性實例是A/曼谷/3007/15(H3N2)(SEQ ID NO:91);A/香港/4801/14(H3N2)(SEQ ID NO:92)、A/明尼蘇達/40/15(H3N2)(SEQ ID NO:93);A/南澳大利亞/1/16(H3N2)(SEQ ID NO:94);A/賓夕法尼亞/09/15(H3N2)(SEQ ID NO:95);A/瑞士/9715293/13(H3N2)(SEQ ID NO:96)以及A/密西西比/16/16(H3N2)(SEQ ID NO:97)。 在位置 524-528 ( CysTM )以及 382 的修飾
在另一方面,提供了一種H3 HA,其具有可以在位置382的修飾的殘基,並且可已被修飾為具有在位置524及/或528的半胱胺酸殘基(H3 A/香港/4801/14編號,SEQ ID NO:92)。此外,在位置525、526及/或527(H3 A/香港/4801/14編號)的殘基還可以被修飾。
如例如在第7A圖、第7B圖和第7C圖中所顯示,當與野生型H3 HA相比,具有在位置524和528被修飾為非半胱胺酸的半胱胺酸殘基並且具有在位置382從天冬醯胺酸被修飾成丙胺酸的殘基的H3 HA導致在血球凝集力價中大約260%的增加。
由此,提供了修飾的H3 HA蛋白質,其包括在位置524、525、526、527或528的一個或多於一個修飾以及在位置382的修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA具有至少在位置382、524和528的修飾。
在H3 HA的位置382的殘基可以被修飾為非天冬醯胺酸。例如,在位置382的殘基可以被修飾為疏水性胺基酸,例如丙胺酸或丙胺酸的保留取代,例如絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸( C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。在位置524的殘基可以被修飾為非半胱胺酸、絲胺酸或絲胺酸(S,Ser)的保留取代,且在位置528的殘基可以被修飾為非半胱胺酸、白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代。
例如,修飾的H3 HA蛋白質可具有與來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性的胺基酸序列,其中該胺基酸序列具有丙胺酸(A,Ala)或在位置382的丙胺酸(A,Ala)的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA當表現時形成VLP。丙胺酸的保留取代可以例如是絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。在位置524的非半胱胺酸可以是絲胺酸(S,Ser)或絲胺酸的保留取代,並且在位置528的非半胱胺酸可以是白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代。絲胺酸(Se,Ser)的保留取代可以是例如蘇胺酸(T,Thr)、丙胺酸(A,Ala)、天冬醯胺酸(N,Asn)、天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、甘胺酸(G,Gly)、麩胺酸(E,Glu)或離胺酸(L,Lys)。白胺酸的保留取代可以是例如異白胺酸(I,Ile)、纈胺酸(V,Val)、甲硫胺酸(M,Met)、苯丙胺酸(F,Phe)或纈胺酸(V,Val)。
本說明書還提供了一種核酸,其包括編碼修飾的H3 HA的核苷酸序列,該修飾的H3 HA具有在如上所描述的位置382、524以及528的可操作地連接至植物中有活性的調節區域的取代。
例如,核苷酸序列可具有與編碼來自H3A/香港/4801/14(SEQ ID NO:102)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼具有丙胺酸(A,Ala)或在位置382的丙胺酸(A,Ala)的保留取代的修飾的H3 HA蛋白質,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,並且其中當表現時HA形成VLP。丙胺酸的保留取代可以是例如絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。在位置524的非半胱胺酸可以是絲胺酸(S,Ser)或絲胺酸的保留取代,並且在位置528的非半胱胺酸可以是白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代。絲胺酸(Se,Ser)的保留取代可以例如是蘇胺酸(T,Thr)、丙胺酸(A,Ala)、天冬醯胺酸(N,Asn)、天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、甘胺酸(G,Gly)、麩胺酸(E,Glu)或離胺酸(L,Lys)。白胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸(I,Ile)、纈胺酸(V,Val)、甲硫胺酸(M,Met)、苯丙胺酸(F,Phe)或纈胺酸(V,Val)。
核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:102的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置382之丙胺酸(A,Ala)或丙胺酸(A,Ala)的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA在表現時形成VLP。丙胺酸的保留取代可以例如是絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。
除了在位置382、524和528的殘基之外,修飾的H3 HA還可以具有被修飾的進一步殘基。例如,在位置384、525、526和527的一個或多於一個殘基可以被修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA可具有在位置382、524、528的取代的殘基以及在位置384、525、526、527的一個或更多取代或其組合。
此外,提供了一種以上在植物中產生VLP的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置382、524和528的取代,並且任選地在位置384、525、526、527的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
除此之外,提供了一種如上所描述在一個植物中增加VLP產量的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置382、524和528的取代和任選地在位置384、525、526、527的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種VLP,其包括H3 HA,該H3 HA具有至少在位置382、524和528的取代以及在任選地在位置384、525、526、527的取代。該VLP可以藉由如本說明書所提供的方法產生。當與包括未修飾的H3 HA蛋白質的VLP相比時,包括修飾的H3 HA的VLP顯示改善的特徵。 在位置 524-528 ( CysTM )以及 384 的修飾
在另一方面,提供了一種H3 HA,其可以具有在位置384的修飾的殘基,並且可以被修飾成不具有在位置524和528的半胱胺酸殘基(H3 A/香港/4801/14編號,SEQ ID NO: 92)。此外,在位置525、526及/或527(H3 A/香港/4801/14編號)的殘基還可以被修飾。
如例如在第7A圖、第7B圖和第7C圖中所顯示,當與野生型H3 HA相比,具有在位置524和528被修飾為非半胱胺酸殘基的半胱胺酸殘基並且具有在位置384從白胺酸被修飾成纈胺酸的殘基的H3 HA導致在血球凝集力價中大約270%的增加。
由此,提供了一種修飾的H3 HA蛋白質,其包括在位置524、525、526、527或528的一個或多於一個修飾,以及在位置384的修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA具有至少在位置384、524和528的修飾。
在H3 HA之位置384的殘基可以被修飾為非白胺酸。例如,在位置384的殘基可以被修飾為另一種疏水性胺基酸,例如纈胺酸或纈胺酸的保留取代,例如異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。
例如,修飾的H3 HA蛋白質可具有與來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性的胺基酸序列,其中該胺基酸序列具有在位置384的纈胺酸或纈胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA當表現時形成VLP。纈胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。
本說明書還提供了一種核酸,其包括編碼修飾的H3 HA的核苷酸序列,該修飾的H3 HA具有在位置384、524和528如上所述可操作地連接至植物中有活性的調節區域的取代。
例如,核苷酸序列可具有與編碼來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:102)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置384的纈胺酸或纈胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,並且其中該序列不是天然發生的。該保留取代可以例如是異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。
核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:102的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置384的纈胺酸或纈胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,且其中HA當表現時形成VLP。纈胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。
除了在位置384、524和528的殘基之外,修飾的H3 HA還可以具有被修飾的進一步殘基。例如,在位置382、525、526和527的一個或多於一個殘基可以被修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA可具有在位置384、524、528的取代殘基和在位置382、525、526、527的一個或更多取代或其組合。
此外,提供了一種以上在植物中產生VLP的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置384、524和528的取代,以及任選地在位置382、525、526、527的取代。該方法包括涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的條件下孵育表現植物或植物的一部分,從而產生VLP。
除此之外,提供了一種如上所述在植物中增加VLP產量的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置384、524和528的取代和任選地在位置382、525、526、527的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種VLP,其包括H3 HA,該H3 HA至少具有在位置384、524和528的取代和任選地在位置382、525、526、527的取代。VLP可以藉由如本說明書所提供的方法產生。當與包括未修飾的H3 HA蛋白質的VLP相比時,包括修飾的H3 HA的VLP顯示改善的特徵。 在位置 524-528 ( CysTM )以及 392 的修飾
在另一方面,提供了一種H3 HA,其可以具有在位置392的修飾的殘基,並且可以不具有在位置524和528的半胱胺酸殘基(H3 A/香港/4801/14編號,SEQ ID NO:92)。此外,在位置525、526及/或527(H3 A/香港/4801/14編號)的殘基還可以被修飾。
如例如在第7A圖和第7B圖中所顯示,當與野生型H3 HA相比,具有在位置524和528被修飾為無半胱胺酸的半胱胺酸殘基並且具有在位置392從苯丙胺酸被修飾成天冬胺酸的殘基的H3 HA導致在血球凝集力價中200%至270%的增加。
由此,提供了一種修飾的H3 HA蛋白質,其包括在位置524、525、526、527或528的一個或多於一個修飾以及在位置392的修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA具有至少在位置392、524和528的修飾。
在H3 HA位置392的殘基可以被修飾為非苯丙胺酸。例如,在位置392的殘基可被修飾為帶電荷的胺基酸,例如天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代,例如麩醯胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或絲胺酸。
例如,修飾的H3 HA蛋白質可具有與來自H3A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性的胺基酸序列,其中該胺基酸序列具有在位置392的天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA當表現時形成VLP。天冬胺酸的保留取代可以例如是麩醯胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或絲胺酸。在位置524的非半胱胺酸可以是絲胺酸(S,Ser)或絲胺酸的保留取代,並且在位置528的非半胱胺酸可以是白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代。絲胺酸(Se,Ser)的保留取代可以是例如蘇胺酸(T,Thr)、丙胺酸(A,Ala)、天冬醯胺酸(N,Asn)、天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、甘胺酸(G,Gly)、麩胺酸(E,Glu)或離胺酸(L,Lys)。白胺酸的保留取代可以是例如異白胺酸(I,Ile)、纈胺酸(V,Val)、甲硫胺酸(M,Met)、苯丙胺酸(F,Phe)或纈胺酸(V,Val)。
本說明書還提供了一種核酸,其包括編碼修飾的H3 HA的核苷酸序列,該修飾的H3 HA具有如上所描述在位置392、524和528與在植物中有活性的調節區域可操作地連接的取代。
例如,核苷酸序列可具有與編碼來自H3A/香港/4801/14(SEQ ID NO:102)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有天冬胺酸或在位置392的天冬胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA當表現時形成VLP。保留取代可以是例如麩醯胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或絲胺酸。
核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:102的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置392的天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA當表現時形成VLP。保留取代可以是例如麩醯胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或絲胺酸。
除了在位置392、524和528的殘基之外,修飾的H3 HA還可以具有被修飾的進一步殘基。例如,在位置525、526和527的一個或多於一個殘基可以被修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA可具有在位置392、524、528的取代殘基和在位置525、526、527的一個或更多取代或其組合。
此外,提供了一種如上在植物中產生VLP的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置392、524和528的取代,並且任選地在位置525、526、527的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
除此之外,提供了一種如上所描述在植物中增加VLP產量的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置392、524和528的取代以及任選地在位置525、526、527的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種VLP,其包括H3 HA,該H3 HA具有至少在位置392、524和528的取代以及任選地在位置525、526、527的取代。該VLP可以藉由如本說明書所提供的方法產生。當與包括未修飾的H3 HA蛋白質的VLP相比時,包括修飾的H3 HA的VLP顯示改善的特徵。 在位置 524-528 ( CysTM )以及 431 的修飾
在另一方面,提供了一種H3 HA,其可以具有在位置431的修飾的殘基,並且在位置524和528可以沒有半胱胺酸殘基(H3 A/香港/4801/14編號,SEQ ID NO:92)。此外,在位置525、526及/或527(H3 A/香港/4801/14編號)的殘基還可以被修飾。
如例如在第7A圖和第7B圖中所顯示,當與野生型H3 HA相比,具有在位置524和528被修飾為無半胱胺酸的半胱胺酸殘基並且具有在位置431從白胺酸修飾成甲硫胺酸的殘基的H3 HA,導致在血球凝集力價中大約250%的增加。
由此,提供一種修飾的H3 HA蛋白質,其包括在位置524、525、526、527或528的一個或多於一個修飾,以及在位置431的修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA具有至少在位置431、524以及528的修飾。
在H3 HA的位置431的殘基可以被修飾為非白胺酸。例如,在位置431的殘基可以被修飾為甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代,例如白胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。
例如,修飾的H3 HA蛋白質可具有與來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性的胺基酸序列,其中該胺基酸序列具有在位置431的甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA當表現時形成VLP。甲硫胺酸的保留取代可以例如是白胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。在位置524的非半胱胺酸可以是絲胺酸(S,Ser)或絲胺酸的保留取代,並且在位置528的非半胱胺酸可以是白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代。絲胺酸(Se,Ser)的保留取代可以是例如蘇胺酸(T,Thr)、丙胺酸(A,Ala)、天冬醯胺酸(N,Asn)、天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、甘胺酸(G,Gly)、麩胺酸(E,Glu)或離胺酸(L,Lys)。白胺酸的保留取代可以是例如異白胺酸(I,Ile)、纈胺酸(V,Val)、甲硫胺酸(M,Met)、苯丙胺酸(F,Phe)或纈胺酸(V,Val)。
本說明書還提供了一種核酸,其包括編碼修飾的H3 HA的核苷酸序列,該修飾的H3 HA具有如上所述在位置431、524和528與植物中有活性的調節區域可操作地連接的取代。
例如,核苷酸序列可具有與編碼來自H3A/香港/4801/14(SEQ ID NO:102)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置431的甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,並且其中HA當表現時形成VLP。保留取代可以是例如白胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。
核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:102的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置431甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,其中該序列不是天然發生的,其中HA當表現時形成VLP。保留取代可以例如是白胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。
除了在位置431、524和528的殘基之外,修飾的H3 HA還可以具有被修飾的進一步殘基。例如,在位置525、526和527的一個或多於一個殘基可以被修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA可具有在位置431、524、528的取代殘基和在位置525、526、527的一個或更多取代或其組合。
此外,提供了一種在植物中產生VLP的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置431、524和528的取代,並且任選地在位置525、526、527的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
此外,提供了一種如上所描述在植物中增加VLP產量的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置431、524和528的取代,並且任選地在位置525、526、527的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種VLP,其包括H3 HA,該H3 HA具有至少在位置431、524和528的取代和任選地在位置525、526、527的取代。該VLP可以藉由如本說明書所提供的方法產生。當與包括未修飾的H3 HA蛋白質的VLP相比時,包括修飾的H3 HA的VLP顯示改善的特徵。 在位置 524-528 ( CysTM )、 382 以及 384 的修飾
在另一方面,提供了一種H3 HA,其可以具有在位置382和384的修飾的殘基,並且在位置524和528可以沒有半胱胺酸殘基(H3 A/香港/4801/14編號,SEQ ID NO:92)。此外,在位置525、526及/或527(H3 A/香港/4801/14編號)的殘基還可以被修飾。
如例如在第7E圖中所顯示,當與野生型H3 HA相比,具有在位置524和528被修飾成非半胱胺酸的半胱胺酸殘基並且具有在位置382從天冬醯胺酸修飾成丙胺酸的殘基以及具有在位置384從白胺酸被修飾成纈胺酸的殘基的H3 HA導致在血球凝集力價中大約400%至500%的增加。
由此,提供了一種修飾的H3 HA蛋白質,其包括在位置524、525、526、527或528的一個或多於一個修飾,以及在位置382和384的修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA具有至少在位置382、384、524和528的修飾。
在H3 HA之位置382的殘基可以被修飾為非天冬醯胺酸。例如,在位置382的殘基可以被修飾為疏水性胺基酸,例如丙胺酸或丙胺酸的保留取代,例如絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。在H3 HA之位置384的殘基可以被修飾為非白胺酸。例如,在位置384的殘基可以被修飾為另一種疏水性胺基酸,例如纈胺酸或纈胺酸的保留取代,例如異白胺酸、白胺酸v甲硫胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。
例如,修飾的H3 HA蛋白質可具有與來自H3 A/香港/4801/14(SEQ ID NO:92)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性的胺基酸序列,其中該胺基酸序列具有在位置382的丙胺酸(A,Ala)或丙胺酸(A,Ala)保留取代、在位置384的纈胺酸或纈胺酸的保留取代,在位置524和528無半胱胺酸殘基,且其中該序列不是天然發生的,及其中HA當表現時形成VLP 。丙胺酸的保留取代可以例如是絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。纈胺酸的保留取代可以是例如異白胺酸(I,Ile)、白胺酸(L,Leu)、甲硫胺酸(M,Met)、丙胺酸(A,Ala)或蘇胺酸(T,Thr)。在位置524的非半胱胺酸可以是絲胺酸(S,Ser)或絲胺酸的保留取代,並且在位置528的非半胱胺酸可以是白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代。絲胺酸(Se,Ser)的保留取代可以是例如蘇胺酸(T,Thr)、丙胺酸(A,Ala)、天冬醯胺酸(N,Asn)、天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、甘胺酸(G,Gly)、麩胺酸(E,Glu)或離胺酸(L,Lys)。白胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸(I,Ile)、纈胺酸(V,Val)、甲硫胺酸(M,Met)、苯丙胺酸(F,Phe)或纈胺酸(V,Val)。
本說明書還提供了一種核酸,其包括編碼修飾的H3 HA的核苷酸序列,該修飾的H3 HA如上所述具有在位置382、384、524和528與植物中有活性的調節區域可操作地連接的取代。
例如,核苷酸序列可具有與編碼來自H3A/香港/4801/14(SEQ ID NO:102)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置382的丙胺酸(A,Ala)或丙胺酸(A,Ala)的保留取代、在位置384的纈胺酸或纈胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,並且其中該序列不是天然發生的,並且其中HA當表現時形成VLP。丙胺酸的保留取代可以例如是絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。纈胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸(I,Ile)、白胺酸(L,Leu)、甲硫胺酸(M,Met)、丙胺酸(A,Ala)或蘇胺酸(T,Thr)。在位置524的非半胱胺酸可以是絲胺酸(S,Ser)或絲胺酸的保留取代,以及在位置528的非半胱胺酸可以是白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代。絲胺酸(Se,Ser)的保留取代可以例如是蘇胺酸(T,Thr)、丙胺酸(A,Ala)、天冬醯胺酸(N,Asn)、天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、甘胺酸(G,Gly)、麩胺酸(E,Glu)或離胺酸(L,Lys)。白胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸(I,Ile)、纈胺酸(V,Val)、甲硫胺酸(M,Met)、苯丙胺酸(F,Phe)或纈胺酸(V,Val)。
核苷酸序列可具有與SEQ ID NO:102的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼修飾的H3 HA蛋白質,該修飾的H3 HA蛋白質具有在位置382的丙胺酸(A,Ala)或丙胺酸(A,Ala)的保留取代、在位置384的纈胺酸或者纈胺酸的保留取代,在位置524和528沒有半胱胺酸殘基,並且其中該序列不是天然發生的,並且其中HA當表現時形成VLP。丙胺酸的保留取代可以例如是絲胺酸(S,Ser)、甘胺酸(G,Gly)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)或纈胺酸(V,Val)。纈胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸(I,Ile)、白胺酸(L,Leu)、甲硫胺酸(M,Met)、丙胺酸(A,Ala)或蘇胺酸(T,Thr)。在位置524的非半胱胺酸可以是絲胺酸(S,Ser)或絲胺酸的保留取代,以及在位置528的非半胱胺酸可以是白胺酸(L,Leu)或白胺酸的保留取代。絲胺酸(Se,Ser)的保留取代可以例如是蘇胺酸(T,Thr)、丙胺酸(A,Ala)、天冬醯胺酸(N,Asn)、天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、甘胺酸(G,Gly)、麩胺酸(E,Glu)或離胺酸(L,Lys)。白胺酸的保留取代可以例如是異白胺酸(I,Ile)、纈胺酸(V,Val)、甲硫胺酸(M,Met)、苯丙胺酸(F,Phe)或纈胺酸(V,Val)。
除了在位置382、384、524和528的殘基之外,修飾的H3 HA還可以具有被修飾的進一步殘基。例如,在位置525、526和527的一個或多於一個殘基可以被修飾。在非限制性實例中,修飾的H3 HA可以具有在位置382、384、524、528的取代的殘基,以及具有在位置525、526、527的一個或更多取代或其組合。
此外,提供了一種以上在植物中產生VLP的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置382、384、524和528的取代、以及任選地在位置525、526、527的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
除此之外,提供了如上所描述在植物中增加VLP產量的方法,該VLP包括修飾的H3 HA,該修飾的H3 HA具有至少在位置382、384、524和528的取代、以及任選地在位置525、526、527的取代。該方法涉及將編碼修飾的H3 HA的核酸引入植物或植物的一部分中(該修飾的H3 HA可操作地連接至植物中有活性的調節區域),並在允許核酸的表現的條件下孵育植物或植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種VLP,其包括H3 HA,該H3 HA具有至少在位置382、384、524和528的取代以及任選地在位置525、526、527的取代。該VLP可以藉由如本說明書所提供的方法產生。當與包括未修飾的H3 HA蛋白質的VLP相比,包括修飾的H3 HA的VLP顯示改善的特徵。
本文還提供了一種在植物中增加VLP的產生或產量的方法,該VLP包括突變體流感HA。例如,如本文所描述,方法可以涉及將編碼突變體流感HA的核酸引入植物、植物的一部分或植物細胞中。編碼突變體流感HA的核酸可以針對人密碼子使用、增加的GC含量、或其組合進行最佳化。一個或多於一個突變體流感HA蛋白質可以在植物、植物的一部分或植物細胞中表現,以便產生包括一個或多於一個突變體流感HA蛋白質的VLP。替代地,該方法可包括提供包括編碼突變體流感HA蛋白質的核酸的植物、植物的一部分或植物細胞,以便產生包括一個或多於一個突變體流感HA蛋白質的VLP。
產生包括突變體流感HA的VLP的方法可進一步包括將第二核酸序列引入植物、植物的一部分或植物細胞中的步驟,其中第二核酸編碼與突變體流感HA共表現的質子通道蛋白質。例如,質子通道蛋白質可以是A型流感亞型M2蛋白質,諸如A/新喀里多尼亞/20/99 M2。質子通道蛋白質的共表現可導致突變體流感HA蛋白質及/或包括該突變體流感HA蛋白質的VLP的增加累積,如例如在WO 2013/044390中所描述者,其藉由引用併入本文。
此外,該突變體流感HA可進一步包括修飾的蛋白分解環或切割位點,如WO 2013/044390和WO 2014/153674中所描述者,並且藉由引用併入本文。
藉由“共表現”,其是指兩個或更多核苷酸序列的引入和表現,兩個或更多核苷酸序列中的每一個編碼受關注的蛋白質、或在植物、植物的一部分或植物細胞中受關注的蛋白質的片段。兩個或更多核苷酸序列可以在一個載體中被引入至植物、植物的一部分或植物細胞中,使得兩個或更多核苷酸序列中的每一個為在各別的調節區域的控制下(例如包括雙重構築體)。替代地,兩個或更多核苷酸序列可以在各別的載體(例如包括單個構築體)中被引入至植物、植物的一部分或植物細胞中,並且每個載體包括用於對應核酸的表現的適當調節區域。例如,兩個核苷酸序列(每個在各別的載體上並且被引入各別的農桿菌宿主),可以藉由混合每個農桿菌宿主的懸浮液以所需體積(例如,等體積或每個農桿菌宿主的比例可被變更)在真空浸潤之前被共表現。以這種方式,多個農桿菌懸浮液的共浸潤允許多個轉基因的共表現。
如本文所描述的編碼突變體流感HA的核酸可進一步包括在植物、植物的一部分或植物細胞中增強突變體流感HA的表現的序列。增強表現的序列可包含與編碼突變體流感HA蛋白質的核酸操作關聯的豇豆嵌紋病毒(CPMV)增強子元素。
如本文所描述,包括編碼修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質的核苷酸序列的核酸可進一步包括在植物、植物的一部分或植物細胞中增強HA蛋白質表現的序列。增強表現的序列可包含與編碼修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質的核酸操作關聯的CPMV增強子元素、或衍生於植物的表現增強子。編碼修飾的流感血球凝集素(HA)的序列還可以對於人密碼子使用、增加的GC含量、或其組合而被最佳化。
如本文所使用,術語“CPMV增強子元素”是指編碼調節豇豆嵌紋病毒(CPMV)RNA2多肽的5’UTR的核苷酸序列或如本領域中已知的修飾的CPMV序列。例如,CPMV增強子元素或CPMV表現增強子包含如在WO2015/14367、WO2015/103704、WO2007/135480、WO2009/087391、Sainsbury F.以及Lomonossoff G.P.,(2008,Plant Physiol. 148:pp.1212-1218)中所描述的核苷酸序列,其各自藉由引用併入本文。CPMV增強子序列可以增強它們所附著的下游異源開讀框(ORF)的表現。CPMV表現增強子可包含CPMV HT、CPMVX(其中X=160、155、150、114),例如CPMV 160、CPMVX+(其中X=160、155、150、114),例如CPMV 160+、CPMV-HT+、CPMV HT+[WT115]、或CPMV HT+[511](WO2015/143567;WO2015/103704,其藉由引用併入本文)。CPMV表現增強子可以被使用於植物表現系統中,該植物表現系統包括被可操作地連接於CPMV表現增強子序列和受關注的核苷酸序列的調節區域。
如本文所使用,術語“CPMV增強子元素”是指編碼調節豇豆嵌紋病毒(CPMV)RNA2多肽的5’UTR的核苷酸序列或如本領域中已知的修飾的CPMV序列。例如,CPMV增強子元素或CPMV表現增強子包含如WO2015/14367、WO2015/103704、WO2007/135480、WO 2009/087391、Sainsbury F.和Lomonossoff G.P.,(2008,Plant Physiol. 148:pp.1212-1218)中所描述的核苷酸序列,其各自藉由引用併入本文。CPMV增強子序列可以增強它們所附著的下游異源開讀框(ORF)的表現。CPMV表現增強子可包含CPMV HT、CPMVX、CPMVX+、CPMV-HT+、CPMV HT+[WT115]、或CPMV HT+[511](WO2015/14367、WO2015/103704,其藉由引用併入本文)。CPMV表現增強子可以被使用於植物表現系統中,該植物表現系統包括被可操作地連接於CPMV表現增強子序列和受關注的核苷酸序列的調節區域。
術語“5’UTR”或“5’非轉譯區域”或“5’前導序列”是指未轉譯的mRNA區域。5’UTR典型地在轉錄開始位點起動,並在編碼區域的轉譯起始位點或起動密碼子恰好之前結束。5’UTR可以調控mRNA轉錄的穩定性及/或轉譯。
如本文所使用,術語“衍生自植物的表現增強子”是指從植物獲得的核苷酸序列,該核苷酸序列編碼5’UTR。衍生自植物的表現增強子的實例被描述於美國臨時專利申請No.62/643,053(提交於2018年3月14日;其藉由引用併入本文)或在Diamos A.G.等人(2016,Front Plt Sci. 7:1-15;其藉由引用併入本文)。衍生自植物的表現增強子可以選自nbMT78、nbATL75、nbDJ46、nbCHP79、nbEN42、atHSP69、atGRP62、atPK65、atRP46、nb30S72、nbGT61、nbPV55、nbPPI43、nbPM64以及nbH2A86,如US 62/643,053中所描述。衍生自植物的表現增強子可以被使用於植物表現系統中,該植物表現系統包括被可操作地連接於衍生自植物的表現增強子序列和受關注的核苷酸序列調節區域。
藉由“可操作地連接”,其是指特別序列直接或間接地相互作用以實現打算的功能,諸如核酸序列的表現的調解或調控。可操作地連接的序列的相互作用可以例如由與可操作地連接的序列相互作用的蛋白質來調解。
當一個或多於一個突變體流感HA蛋白質在植物、植物的一部分或植物細胞中被表現時,該一個或多於一個突變體流感HA蛋白質自組裝至VLP中。該植物、植物的一部分或植物細胞可以在合適的萃取和純化條件下被收穫以維持VLP的完整性,並且包含一個或多於一個突變體流感HA的該VLP可以被純化。
本發明還提供了如本文所描述的一種用於在受試者中誘導針對流感感染的免疫力的突變體流感HA或包括突變體流感HA的VLP的用途。本文還揭露了一種藉由將突變體流感HA或包括突變體流感HA的VLP投藥予受試者或宿主動物所製備的抗體或抗體片段。還提供了如本文所描述的一種突變體流感HA或包括突變體流感HA的VLP的有效劑量的組合物,以及藥學上可接受的攜載體、佐劑、載具或賦形劑,用於在受試者中誘導免疫反應。還提供了一種用於在受試者中誘導免疫反應的疫苗,其中該疫苗包括突變體流感HA的有效劑量。
本文還提供了一種用於在受試者中誘導針對流感感染的免疫力的方法,其包括將突變體流感HA或包括突變體流感HA或VLP經口服地、鼻內地、肌內地、腹膜內地、靜脈內地或皮下地投藥予受試者。
如本文所使用,術語“流感病毒”是指正黏液病毒科家族的有套膜的病毒菌株,其特徵在於具有負向單股RNA基因體。流感病毒基因體包括為了取決於菌株的12-14個蛋白質的編碼的8個基因區段。
有四種類型的流感病毒:A、B、C和D,其中A或B型流感是人類中季節性疾病流行病的致病生物。A型流感基於HA和神經胺糖酸酶(NA)醣蛋白質亞型的表現被進一步分類。
如本文所使用,術語“血球凝集素”或“HA”是指三聚凝集素,其在靶細胞的 表面上促進流感病毒顆粒對於含唾液酸的蛋白質的結合,並調解病毒基因體對靶細胞的釋放。有18種不同的HA亞型(H1-H18)。HA蛋白質包括兩種結構元素:頭部(其是血清保護性抗體的主要靶);以及柄。HA被轉譯為單個多肽HA0(組裝為三聚體),其必須被HA1(~40 kDa)以及HA2(~20 kDa)亞域之間的絲胺酸內切蛋白質酶切割。切割後,兩個雙硫鍵結的蛋白質域採用病毒感染性所必需的必要構形。
如本文所揭露的A型流感HA蛋白質或修飾的A型流感HA蛋白質包含衍生自任何已知A型流感菌株的任何已知HA蛋白質,但也包含隨時間發展的已知A型流感菌株的修飾。例如,流感HA可能衍生自A/香港/4801/14(H3N2)、A/明尼蘇達/40/15(H3N2)、A/南澳大利亞/1/16(H3N2)、A/曼谷/3007/15(H3N2)、A/瑞士/9715293/13(H3N2)、A/密西西比/16/16(H3N2)、或A/賓夕法尼亞/09/2015(H3N2)。A型流感HA可以包含衍生自菌株的HA(其中HA具有約30-100%或其間任何量)、衍生自以上所列出的A型流感菌株的任何HA的胺基酸序列同一性,假若流感HA蛋白質包括如本文所描述的至少一個取代並且能夠形成VLP、當投藥予受試者時誘導免疫反應、誘導血球凝集或其組合。
例如,流感HA蛋白質可具有與衍生自以上所列出的A型流感菌株的任何HA 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%或其間任何量的胺基酸序列同一性(序列相似性、百分比同一性、百分比相似性)、並且包括如本文所述的至少一個取代、並且能夠形成VLP、當投藥予受試者時誘導免疫反應、誘導血球凝集或其組合。幾種A型流感HA域的胺基酸序列比對(其不被認為是限制性的)如第1圖所顯示。
當提及特別序列時,術語“百分比相似性”、“序列相似性”,“百分比同一性”或“序列同一性”被使用於例如威斯康辛大學GCG軟體程式中所記載,或藉由手動比對和目視檢查(參見,例如,Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等,eds.1995補充)。用於比較的序列比對的方法是本領域熟知的。用於比較的序列的最佳化比對可以使用例如Smith&Waterman的演算法(1981,Adv. Appl. Math. 2:482),藉由Needleman & Wunsch的比對演算法(1970,J. Mol. Biol. 48:443)、藉由對於Pearson & Lipman的相似性方法的搜索(1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)、藉由這些演算法(例如:GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA在威斯康辛遺傳學軟體程式包中,Genetics Computer Group(GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis)的電腦化施行所引導。
合適用於確定百分比序列同一性和序列相似性的演算法的實例是BLAST和BLAST 2.0演算法,其在Altschul等人(1977,Nuc. Acids Res. 25:3389-3402)以及Altschul等人(1990,J.Mol.Biol.215:403-410)中分別描述。BLAST和BLAST 2.0被使用,其具有本文所描述的參數,以確定對於本發明的核酸和蛋白質的百分比序列同一性。例如,BLASTN程式(對於核苷酸序列)可以使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4以及兩股的比較作為預設。對於胺基酸序列,BLASTP程式可以使用字長為3、期望值(E)為10、以及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff & Henikoff,1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比對(B)為50、期望值(E)為10、M=5、N=-4、以及兩股的比較作為預設。用於實行BLAST分析的軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnolog Information)公開地取得(參見URL:ncbi.nlm.nih.gov/)。
如本文所使用,術語“類病毒顆粒”,VLP,“多個類病毒顆粒”或“多個VLP”是指流感顆粒,其包括一個或多於一個流感HA蛋白質,並且自組裝成非複製性、非感染性病毒的缺乏流感基因體的所有部分的殼體結構。
在植物中的流感HA蛋白質產生
A型流感HA蛋白質包含任何HA蛋白質,其包括胺基酸序列,該胺基酸序列具有與來自A/香港/4801/14(H3N2,SEQ ID NO:92)、A/明尼蘇達/40/15(H3N2,SEQ ID NO: 93)、A/南澳大利亞/1/16(H3N2,SEQ ID NO:94)、A/曼谷/3007/15(H3N2,SEQ ID NO:91)、A/瑞士/9715293/13(H3N2,SEQ ID NO:96)、A/密西西比/16/16(H3N2,SEQ ID NO:97)、以及A/賓夕法尼亞/09/2015(H3N2,SEQ ID NO:95)的流感A HA序列從約30至約100%、從約40至約100%、從約50至約100%、從約60至約100%、從約70至約100%、從約80至約100%、從約85至約100%、從約90至約100%、從95至約100%、或從約97至約100%、從約98至約100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,假若該流感HA蛋白質包括如本文所述的至少一個取代並且能夠形成VLP、當投藥予受試者時誘導免疫反應、誘導血球凝集或其組合。
此外,修飾的流感HA蛋白質包含包括HA胺基酸序列的任何HA蛋白質,該胺基酸序列具有與SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、 SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90的序列從約30%至約100%、從約40%至約100%、從約50%至約100%、從約60%至約100%、從約70%至約100%、從約80%至約100%、從約85%至約100%、從約90%至約100%、從約95%至約100%、或從約97%至約100%、從約98%至約100%或其間任何量的序列同一性或序列相似性,假若流感HA蛋白質包括如本文所描述的至少一個取代並且能夠形成VLP、當投藥予受試者時誘導免疫反應、誘導血球凝集或其組合。
如本文所描述,當與野生型流感HA相比,在流感HA中的一個或多於一個特定突變或修飾造成HA蛋白質增加的累積和在植物中增加的VLP產生。
在植物中具有增強的流感HA及/或VLP產生的突變體A型流感HA蛋白質的實例包含但不限於以下:
CysTM A/香港/4801/14突變體H3(構築體#3341,SEQ ID NO:21)、N382A + L384V + CysTM A/香港/4801/14突變體H3(構築體#3375,SEQ ID NO:25);CysTM A/明尼蘇達/40/15突變體H3(構築體#3914,SEQ ID NO:27);N382A + L384V + CysTM A/明尼蘇達/40/15突變體H3(構築體#3915,SEQ ID NO:30);CysTM A/S.澳大利亞/1/16突變體H3(構築體#3924,SEQ ID NO:33);N382A + L384V + CysTM A/S.澳大利亞/1/16突變體H3(構築體#3925,SEQ ID NO:35);N382A + L384V + CysTM A/曼谷/3007/15突變體H3(構築體#3905,SEQ ID NO:39);N382A A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3023,SEQ ID NO:82);L384V A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3034,SEQ ID NO:84);F392D A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3045,SEQ ID NO:43;L431M A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3022,SEQ ID NO:47);CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#2811,SEQ ID NO:49);N382A + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3063,SEQ ID NO:53);L384V + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3074,SEQ ID NO:57);F392D + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3085,SEQ ID NO:59);以及L431M + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3062,SEQ ID NO:61)、CysTM A/賓夕法尼亞/09/2015突變體H3(構築體#3313,SEQ ID NO:86)、N382A + CysTM A/賓夕法尼亞/09/2015突變體H3(構築體#3314,SEQ ID NO:88)、以及L384V + CysTM A/賓夕法尼亞/09/2015突變體H3(構築體#3315,SEQ ID NO:90)。
抵抗流感感染的免疫的誘導
“免疫反應”通常是指受試者的適應性免疫系統的反應。適應性免疫系統通常包括體液反應和細胞調解的面向。體液反應是由在B淋巴細胞譜系(B細胞)的細胞中產生所分泌的抗體所調解的免疫反應。所分泌的抗體結合至入侵微生物(諸如病毒或細菌)的表面上的抗原,其標記它們以進行破壞。體液免疫性通常被使用於指抗體產生及其伴隨的程序,以及抗體的效應物功能,包含Th2細胞活化和細胞介素產生、記憶細胞生成、吞噬作用的調理素促進、病原體消除及類似者。術語“調控(modulate)或(modulatation)” 或類似者是指在特別反應或參數的增加或減少,如藉由通常已知或使用的幾種測定法中的任一者所確定的,其中一些在本文中被舉例。
細胞調解的反應是不涉及抗體而是涉及巨噬細胞、自然殺手細胞(NK)、抗原特定細胞毒性的T淋巴細胞的活化的免疫反應、以及回應於抗原的各種細胞介素的釋放。細胞調解的免疫通常被使用於指一些Th細胞活化、Tc細胞活化以及T細胞調解的反應。細胞調解的免疫在回應於病毒感染中可能特別重要。
例如,抗原特定的CD8陽性T淋巴細胞的誘導可以使用ELISPOT測定法來測量;CD4陽性T淋巴細胞的刺激可以使用增生測定法來測量。抗流感HA抗體力價可以使用ELISA測定法來定量;抗原特定的或交叉反應性的抗體的同型還可以使用抗同型抗體(例如抗-IgG、IgA、IgE或IgM)來測量。用於進行此類測定法的方法和技術是本領域熟知的。
細胞介素存在或水準還可以被量化。例如,T輔助細胞反應(Th1/Th2)其特徵在於使用藉由ELISA(例如BD Biosciences OptEIA套件)的和IL-4分泌細胞的測量。從受試者獲得的周邊血液單核細胞(PBMC)或脾細胞可以被培養,並且上澄液可以被分析。T淋巴細胞還可以使用如本領域已知的標記物特定的螢光標示和方法藉由螢光流式細胞分選(fluorescence-activated cell sorting,FACS)來定量。
微中和測定法還可以被執行以特徵化在受試者中的免疫反應,參見例如1973年Rowe等人的方法。病毒中和力價可以以多種方式來定量,包括:晶體劇烈固定/細胞的著色後的裂解溶菌斑的計數(斑塊測定法)、體外培養中細胞裂解的顯微鏡觀察;以及2)流感病毒的ELISA和分光光度檢測。
如本文所使用,術語“表位”或“多個表位”是指抗體特定地結合至的抗原的結構部分。
回應於植物產生的野生型流感HA蛋白質或VLP、或突變體流感HA蛋白質或VLP的投藥而誘發的免疫反應可例如在Balb/C小鼠中觀察到。可以藉由ELISA對於H3特定的總IgG和IgA抗體來分析從動物收集的血液的血清樣品。以植物產生的野生型流感HA或突變體流感HA蛋白質被免疫的小鼠可以在用於每個處理群組的血清中呈現HA特定的IgG抗體力價。
植物表現
本發明的構築體可以使用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿孔等而被引入植物細胞中。對於此等技術的回顧,參見例如Weissbach和Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology
, Academy Press, New York VIII, pp.421-463(1988);Geierson和Corey,Plant Molecular Biology
, 2d Ed.(1988);以及Miki和Iyer, Fundamentls of Gene Transfer in Plants。在Plant Metabolism
, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrvre, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997)中。其他方法包含直接DNA攝取、脂質體的使用、電穿孔、例如使用原生質體、微注射、微拋體或鬚晶、以及真空浸潤。參見,例如,Bilang等人(1991,Gene
100: 247-250)、Scheid等人(1991,Mol. Gen. Genet
. 228: 104-112)、Guerche等人(1987,Plant Science
52: 111-116)、Neuhause等人(1987,Theor. Appl Genet
. 75: 30-36)、Klein等人 (2987,Nature
327: 70-73);Freeman等人 (1984,Plant Cell Physiol
. 29: 1353)、Howell等人(1985,Science
227: 1229-1231)、DeBlock等人(1989,Plant Physiology
91: 694-701)、Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988)、Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989)、WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Liu and Lomonossoff (2002,J Virol Meth
, 105:343-348)、EP 290395、WO 8706614;U.S. Pat. Nos. 4,945,050;5,036,006;以及5,100,792、1995年5月10日提交的Ser. No. 08/438,666以及1992年9月25日提交的07/951,715之U.S.專利申請(所有這些專利在此藉由引用併入本文)。
暫態表現方法可被使用於表現本發明的構築體(參見D'Aoust等人,2009,Methods in molecular biology
, Vol 483, pages41-50;Liu and Lomonossoff, 2002,Journal of Virological Methods
, 105:343-348,其藉由引用併入本文)。替換地,一種基於真空的暫態表現方法(如Kapila等人(1997,Plant Sci. 122
101-108,其藉由引用併入本文)、或WO 00/063400、3WO 00/037663(其藉由引用併入本文)所描述)可以被使用。這些方法可包含,例如,但不限於,農業接種或農業浸潤方法、注射器浸潤,然而,如上所述,其他暫態方法也可使用。以農業接種、農業浸潤、或注射器浸潤,包括所需核酸的農桿菌的混合物進入組織的細胞間空間,例如葉子、植物的空中的部分(aerial portion)(包括莖、葉和花)、植物的其他部分(莖,根,花)、或整株植物。在穿過表皮後,農桿菌感染並將t-DNA複製品轉移到細胞中。t-DNA被游離基因體地(episomally)轉錄並且mRNA被轉譯,導致在感染細胞中受關注的蛋白質的產生,然而,在核內t-DNA的通過是暫態的。
本發明還考慮的部分是含有本發明基因構築體的轉基因植物、植物細胞或種子,其可以被使用作為適合於本文所描述的暫態蛋白質表現的平台植物。從植物細胞再生整株植物的方法也是本領域已知的(例如參見Guerineau和Mullineaux(1993,Plant transformation and expression vectorss. In: Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD ed)Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121- 148)。一般而言,轉化的植物細胞在適當的培養基中培養,該培養基可能含有選擇性試劑,諸如抗生素,其中選擇標記被使用於促進轉化植物細胞的鑑定。一旦癒傷組織形成,枝的形成可以藉由運用根據已知方法的適當的植物激素所激勵並且枝被轉移到生根培養基中用於植物的再生。然後植物可以被使用以從種子或使用營養繁殖(vegetative propagation)技術建立重複的世代。轉基因植物也可以不使用組織培養而被生成。穩定轉化和這些生物再生的方法在本領域中建立而且為本領域具有通常知識者已知。可用的技術在Vasil等人(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, VoI, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984)、以及Weissbach and Weissbach (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989)中被回顧。獲得轉化和再生的植物的方法對本發明並不關鍵。
如果植物、植物部分或植物細胞藉由兩個或更多核酸構築體將被轉化或共轉化,核酸構築體可以在單個轉染事件中被引入農桿菌中以便核酸被匯集以及細菌細胞被轉染。替換地,構築體可以連續地被引入。在這種情況下,如所描述將第一種構築體引入農桿菌中,細胞在選擇性條件下(例如在抗生素存在下)生長,其中只有被單一轉化的細菌可以生長。在該第一選擇步驟之後,如所描述將第二核酸構築體引入農桿菌中,並且細胞在雙重選擇性條件下生長,其中只有雙重轉化的細菌可以生長。然後雙重轉化的細菌可以被使用於轉化如本文所描述的植物、植物的部分或植物細胞,或者可以經受進一步的轉化步驟以容許第三核酸構築體。
替換地,如果植物、植物部分或植物細胞將藉由兩個或更多核酸構築體被轉化或共轉化,該核酸構築體可以藉由共浸潤農桿菌細胞與植物、植物的一部分或植物細胞之混合物而被引入植物中,每個農桿菌細胞可包含一個或更多構築體被引入在植物內。為了改變在構築體內受關注的核苷酸序列的在植物、植物部分或植物細胞內的相對表現水準,在浸潤步驟期間,包括所需構築體的各種農桿菌族群的濃度可以被改變。表 3 :
SEQ ID NO和序列的描述
在以下實例中將進一步說明本發明。
實例1:流感HA構築體
流感HA構築體是使用本領域熟知的技術來產生。例如,野生型H3 A-瑞士/9715293/13 HA、N382A A/瑞士/9715293/13 H3 HA和CysTM A-瑞士-9715293-13如以下所描述而被選殖。其他H3 HA突變體是使用類似技術來獲得,並且HA序列引子、模板和產物被描述於實例3(植物中的流感HA和VLP產生)以及表4中。
野生型和突變HA蛋白質、引子、模板和產物的概述在以下表4中被提供。對於被轉殖到1190轉殖載體中而無M2的除了H3 A/瑞士/9715293/13 HA蛋白質以外的流感H3構築體,被使用的轉殖載體整合了在苜蓿色素體藍素啟動子和終止子控制下(還有2X35S啟動子/CPMV 160 + 基於CPMV 3’UTR/NOS的表現卡匣)的流感M2離子通道基因。質體號3556(SEQ ID NO:66;第5A圖)被SacII和StuI限制酶消化並用被使於內融合(In-Fusion)反應。H3 HA 的修飾
2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 H3 A-瑞士-9715293-13/NOS(構築體號2801)
編碼來自從被融合至苜蓿PDI分泌信號肽(PDISP)的H3 A/瑞士/9715293/13的流感HA的成熟HA0的序列使用以下基於PCR的方法被轉殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。使用引子IF-CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:15)以及IF-H3A-Ala.r(SEQ ID NO:17)、使用PDISP-H1 A/瑞士/9715293/13基因序列(SEQ ID NO:9)作為模板,將含有PDISP-H3 A/瑞士/9715293/13編碼序列的片段擴增。使用內融合轉殖系統(Clontech,Mountain View,CA),將PCR產物轉殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。構築體編號1190(第5B圖)以SacII和StuI限制酶被消化,並且線性化質體被使用於內融合組裝反應。構築體編號1190是打算用於在基於2X35S/CPMV160/NOS的表現卡匣中受關注的基因的“內融合”轉殖的受體質體。它還併入用於在苜蓿色素體藍素基因啟動子和終止子下緘默化的TBSV P19抑制因子的共表現的基因構築體。骨幹是pCAMBIA二元質體,且從左至右t-DNA邊界的序列被呈現於SEQ ID NO:62中。所得構築體被給予編號2801(SEQ ID NO:103)。來自流感HA(來自融合至苜蓿PDI分泌信號肽(PDISP)之A/瑞士/9715293/13)的成熟HA0的胺基酸序列被呈現於SEQ ID NO:10中。質體2801的呈現被呈現於第8J圖中。
2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 H3 A-瑞士-9715293-13(N382A)/NOS(構築體編號3023)
編碼來自被融合至苜蓿PDI分泌信號肽(PDISP)的A/瑞士/9715293/13(N382A)的流感HA的成熟HA0的序列是使用以下基於PCR的方法被轉殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。在第一輪(round)PCR中,含有具有突變N382A胺基酸的PDISP-H3A/瑞士/9715293/13的片段是使用引子IF-CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:15)以及H3_Swi(N382A).r(SEQ ID NO:50)被擴增(使用PDISP-H3 A/瑞士/9715293/13基因序列(SEQ ID NO:9)作為模板)。含有具有H3 A/瑞士/9715293/13的剩餘的N382A突變之第二片段是使用H3_Swi(N382A).c(SEQ ID NO:51)以及IF-H3A-Ala.r(SEQ ID NO:17)而被擴增(使用PDISP-H3 A/瑞士/9715293/13基因序列(SEQ ID NO:9)作為模板)。然後來自兩種擴增的PCR產物被混合及使用作為用於第二輪擴增的模板(使用IF-CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:15)以及IF-H3A-Ala.r(SEQ ID NO:17)作為引子)。最終的PCR產物使用內融合轉殖系統(Clontech,Mountain View,CA)被轉殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。構築體編號1190(第5B圖)以SacII和StuI限制酶被消化,並且線性化質體被使用於內融合組裝反應。構築體編號1190是受體質體,其被打算用於在基於2X35S/CPMV 160/NOS的表現卡匣中受關注的基因的“內融合”轉殖。它還併入用於在苜蓿色素體藍素基因啟動子和終止子下緘默化的TBSV P19抑制因子的共表現的基因構築體。骨幹是pCAMBIA二元質體,並且從左至右t-DNA邊界的序列被呈現於SEQ ID NO:62中。得到的構築體被給予編號3023(SEQ ID NO:104)。突變PDISP-H3 A-瑞士-9715293-13(N382A)的胺基酸序列被呈現於SEQ ID NO:82中。質體3023的表示被呈現於第4C圖中。
2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 H3 A-瑞士-9715293-13(CysTM)/NOS(構築體編號2811)
編碼來自被融合至苜蓿PDI分泌信號肽(PDISP)的A/瑞士/9715293/13(CysTM)的流感HA的成熟HA0的序列是使用以下基於PCR的方法被轉殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。在第一輪PCR中,含有具有突變CysTM胺基酸的PDISP-H3 A/瑞士/9715293/13的片段是使用引子IF-CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:15)以及H3_Swi_SLVLL.r(SEQ ID NO:18)而被擴增(使用PDISP-H3 A/瑞士/9715293/13基因序列(SEQ ID NO:9)作為模板)。含有具有H3 A/瑞士/9715293/13的剩餘的CysTm突變之第二片段是使用H3_Swi_SLVLL.c(SEQ ID NO:19)以及IF-H3A-Ala.r(SEQ ID NO:17)而被擴增(使用PDISP-H3 A/瑞士/9715293/13基因序列(SEQ ID NO:9)作為模板)。然後來自兩種擴增的PCR產物被混合及使用作為用於第二輪擴增的模板(使用IF-CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:15)以及IF-H3A-Ala.r(SEQ ID NO:17)作為引子)。最終的PCR產物是使用內融合轉殖系統(Clontech,Mountain View,CA)而被轉殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。構築體編號1190(第5B圖)是以SacII和StuI限制酶而被消化,並且線性化質體被使用於內融合組裝反應。構築體編號1190是受體質體,其被打算用於在基於2X35S/CPMV 160/NOS的表現卡匣中受關注的基因的“內融合”轉殖。它還併入用於在苜蓿色素體藍素基因啟動子和終止子下緘默化的TBSV P19抑制因子的共表現的基因構築體。骨幹是pCAMBIA二元質體,並且從左至右t-DNA邊界的序列被呈現於SEQ ID NO:62中。所得構築體被給予編號2811(SEQ ID NO:105)。突變PDISP-H3 A-瑞士-9715293-13(CysTM)的胺基酸序列被呈現在SEQ ID NO:49中。質體2811的表示被呈現於第8K圖中。
實例2:方法根癌農桿菌
轉染
根癌農桿菌
菌株AGL1是使用由D’Aoust等人,2008(Plant Biotech.J.
6:930-40)描述的方法,藉由以野生型流感HA或突變體流感HA表現載體的電穿孔所轉染。被轉染的農桿菌在以10mM 2-(N-啉基)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素和25 μg/ml卡本西林pH5.6所補充的YEB培養基中生長至0.6和1.6之間的OD600
。在使用前將農桿菌懸浮液離心並於浸潤培養基(10mM MgCl2
和10mM MES pH 5.6)中重懸浮。
植物生物質、接種物和農桿菌浸潤的製備
圓葉菸草(N. benthamiana
)植物從以商業泥炭蘚基質所填充的平板(flat)中的種子生長。該植物被允許在溫室中在16/8光週期和日間25℃/夜間20℃的溫度境況內生長。播種後三週,個別小植物被挑出、被移植到盆中並且在相同的環境條件下在溫室中被留置生長持續額外三週。
以每種野生型流感HA或突變體流感HA表現載體所轉染的農桿菌在以10 mM 2-(N-啉基)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素和25 μg/ml卡本西林pH5.6所補充的YEB培養基中生長直至它們達到0.6和1.6之間的OD600。在使用前將農桿菌懸浮液離心並於浸潤培養基(10mM MgCl2
和10mM MES pH 5.6)中重懸浮並在4℃下儲存過夜。在浸潤當天,將培養物分批在2.5倍培養體積中稀釋並允許在使用前回溫。將圓葉煙草的整株植物倒置在氣密的不銹鋼罐中的細菌懸浮液中在20-40托的真空下持續2分鐘。將植物送回溫室中持續6或9天的孵育週期直至收穫。
葉片收穫和總蛋白質萃取
蛋白質使用軌道搖動器在室溫下藉由過夜酶萃取從被切成約 ~1 cm2
片的新鮮生物質中萃取。然後將漿液經過大孔尼龍過濾器過濾以除去粗的未消化植物性組織。
為了獲得“全過程產量”,將漿液離心以除去原生質體和胞內污染物。上澄液藉由深度過濾而澄清。然後澄清的分部被裝載(透過陽離子交換管柱,以增加之NaCl的濃度進行逐步溶析步驟)。純化的VLP藉由TFF濃縮、對配方緩衝液被透析過濾(diafiltered)並通過過濾器。純化的VLP的蛋白質含量藉由BCA測定法分析,以及活性是藉由血球凝集測定法來分析。相對產量是藉由比較來自新構築體的蛋白質產量與被使用作對照的天然構築體(或用於H3菌株的CysTM)來獲得。
為了獲得“密度後梯度產量”,將漿液離心以除去原生質體和胞內污染物。將上澄液進一步離心以除去額外的碎屑。上澄液使用玻璃纖維過濾器藉由深度過濾而澄清。然後在不連續碘克沙醇(iodixanol)密度梯度將澄清的分部裝載。分離密度梯度離心如下實行:在托立斯緩衝液(Tris buffer)中含有不連續碘克沙醇密度梯度的38 ml管(35%、30%、25%、20%、15%、10%和5%的連續層)被製備並且以澄清萃取物覆蓋。將梯度以120000 g離心持續2小時(4℃)。離心後,從底部到頂部收集的前5 mL被丟棄,而下一個5 mL被收集用於蛋白質含量分析(BCA)、活性測量(血球凝集測定法)以及在還原的SDS-PAGE上的HA0帶的強度測量(密度測定法)。相對產量藉由比較來自新構築體的HA0帶強度與被使用作為對照的天然構築體(或用於H3菌株的CysTM)來獲得。
血球凝集測定法
血球凝集測定法是基於由Nayak和Reichl(2004)所描述的方法。簡而言之,測試樣品(100 μL)的連續雙倍稀釋是在含有100μL PBS的V形底96孔微滴定盤中進行,每孔留下100 μL稀釋的樣品。100微升0.5%天筑鼠紅血球懸浮液(Bio Link Inc.,Syracuse,NY)被加入每個孔,並將盤在室溫下孵育持續2小時。顯示完全血球凝集的最高稀釋的倒數被記錄為HA活性。平行地,重組HA標準品(A/越南/1203/2004 H5N1)(Protein Science Corporation,Meriden,CT)在PBS中稀釋,並且運行作為在每個盤上的對照。
蛋白質分析和免疫印漬術
免疫印漬術是以一級mAb在TBS-Tween 20 0.1%中的2%脫脂乳中被稀釋1/500以第一次孵育來實行。被稀釋1/10000的過氧化酶接合的(Peroxydase-conjugated)山羊抗小鼠(Jackson Immunoresearch,cat#115-035-146)被使用作為用於在TBS-Tween 20 0.1%中的2%脫脂乳中的化學發光檢測的二級抗體。免疫反應性複合物是使用發光胺作為基質(Roche Diagnostics Corporation)藉由化學發光性來檢測。人體IgG抗體的山葵過氧化酶接合作用是藉由使用EZ-LinkPlus®活化過氧化酶接合套件(Pierce, Rockford, Ill.)來進行。
實例3:在植物中流感HA和VLP產生H3 HA I 的修飾
流感HA構築體是使用本領域熟知的技術產生(參見實例1)。在下表4中提供了野生型和突變HA蛋白質、引子、模板和產物的概述。所使用的序列在實例4以及在序列表中提供。N382A A/ 瑞士 /9715293/13 突變體 H3
N382A A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3023)藉由將野生型 /瑞士/ 9715293/13 H3的在位置382的天冬醯胺突變為丙胺酸而構建。如第2圖所顯示,當與來自以野生型A/瑞士/9715293/13 H3(構築體# 2801)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,來自以構築體#3023農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中約30%增加。L384V A/ 瑞士 /9715293/13 突變體 H3
L384V A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3034)藉由將野生型/瑞士/9715293/13 H3在位置384的白胺酸突變為纈胺酸而構建。如第2圖所顯示,當與從以野生型A/瑞士/9715293/13 H3(構築體# 2801)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3034農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中約100%增加。F392D A/ 瑞士 /9715293/13 突變體 H3
F392D A/瑞士/9715293/13突變體H3藉由將野生型A/瑞士/9715293/13 H3在位置392的苯丙胺酸突變為天冬胺酸而構建(構築體#3045)。如第2圖所顯示,當與從以野生型A/瑞士/9715293/13 H3(構築體#2801)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3045農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約40%增加。L431M A/ 瑞士 /9715293/13 突變體 H3
A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3022)藉由將野生型A/瑞士/9715293/13 H3在位置431的白胺酸突變為甲硫胺酸而構建。如第2圖所顯示,當與從以野生型A/瑞士/9715293/13 H3(構築體#2811)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3022農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約70%增加。
本文所述的一個或多於一個突變具體地增加在植物中流感HA蛋白質產生和VLP產量。觀察到在其他位置的突變顯著降低、或對於在植物細胞中流感HA蛋白質累積或VLP產生沒有顯著影響。
以包括本文所述的一個或多於一個突變的流感HA蛋白質所達成的增加的血球凝集力價還被觀察到為特定於流感H3 HA。類似的增強在以編碼從非H3菌株所衍生的突變流感HA的構築體而農桿菌浸潤的植物中未被觀察到。
例如,F393D A/印度尼西亞/5/2005突變體H5藉由將野生型A/印度尼西亞/5/2005 H5在位置393的苯丙胺酸突變為天冬胺酸而構建(構築體#3680)。如第3圖所顯示,當與從以野生型A/印度尼西亞/5/2005 H5(構築體# 2295)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3680農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約98%降低。
類似地,當與從以野生型A/埃及/N04915/2014 H5(構築體#3645)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以F392D A/埃及/N04915/2014突變體H5(構築體#3690)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約99%降低(見第3圖,表7)。H3 HA II 的修飾 CysTM A/ 瑞士 /9715293/13 突變體 H3
CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#2811)藉由將野生型A/瑞士/9715293/13 H3之位置524-528(SEQ ID NO:99)的“CFLLC”序列替換為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第6A圖所顯示,當與從以野生型A/瑞士/9715293/13 H3(構築體# 2801)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#2811農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約60%增加。CysTM A/ 賓夕法尼亞 /09/2015 突變體 H3
CysTM A/賓夕法尼亞/09/2015突變體H3(構築體#3313)藉由將野生型A/賓夕法尼亞/09/2015 H3在位置524-528(SEQ ID NO:99)的“CFLLC”序列替換為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如7C圖所顯示,當與從以野生型A/賓夕法尼亞州/09/2015 H3(建築物#3312)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3313農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約100%增加。N382A + CysTM A/ 瑞士 /9715293/13 突變體 H3
N382A + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3063)藉由將野生型A/瑞士/9715293/13 H3在位置382的天冬醯胺酸突變為丙胺酸並且將在位置524-528(SEQ ID NO:99)之“CFLLC”序列替換為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7A圖所顯示,當與從以野生型A/瑞士/9715293/13 H3(構築體#2801)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3063農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約160%增加。如第7B圖中進一步所顯示,與以CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#2811)浸潤的植物相比,以構築體#3063農桿菌浸潤的圓葉煙草植物表現出在碘克沙醇梯度純化後在VLP產量中約30%增加。N382A + CysTM A/ 賓夕法尼亞 /09/2015 突變體 H3
N382A + CysTM A/賓夕法尼亞/09/2015突變體H3(構築體#3314)藉由將野生型A/賓夕法尼亞/09/2015 H3在位置382的天冬醯胺酸突變為丙胺酸並且將在位置524-528的“CFLLC”序列(SEQ ID NO:99)替換為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7C圖所顯示,當與從以野生型A/賓夕法尼亞/09/2015 H3(建築物#3312)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3314農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約300%增加。L384V + CysTM A/ 瑞士 /9715293/13 突變體 H3
L384V + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3074)藉由將野生型A/瑞士/9715293/13 H3在位置384的白胺酸突變為纈胺酸並將在位置524-528 “CFLLC”序列(SEQ ID NO:99)替換為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7C圖所顯示,當與從以野生型A/瑞士/9715293/13 H3(構築體# 2801)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3074農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約380%增加。此外,如第7B圖所顯示,與以CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體# 2811)浸潤的植物相比,以構築體#3074農桿菌浸潤的圓葉煙草植物表現出在蔗糖梯度純化後在VLP產量中約50%增加。L384V + CysTM A/ 賓夕法尼亞 /09/2015 突變體 H3
L384V + CysTM A/賓夕法尼亞/09/2015突變體H3(構築體#3315)藉由將野生型A/賓夕法尼亞/09/2015 H3在位置384的白胺酸突變為纈胺酸並且將在位置524-528(SEQ ID NO:99)的“CFLLC”序列替換為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7C圖所顯示,當與從以野生型A/賓夕法尼亞/09/2015 H3(構建#3312)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3315農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約380%增加。F392D + CysTM A/ 瑞士 /9715293/13 突變體 H3
F392D + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3085)藉由將野生型/瑞士/9715293/13 H3在位置392的苯丙胺酸突變為天冬胺酸並且將在位置524-528的“CFLLC”序列(SEQ ID NO:99)替換為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7A圖所顯示,當與從以野生型A/瑞士/9715293/13 H3(構築體# 2801)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3085農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物顯示出在血球凝集力價中大約170%增加。L431M + CysTM A/ 瑞士 /9715293/13 突變體 H3
L431M + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3(構築體#3062)藉由將野生型/瑞士/9715293/13 H3在位置431的白胺酸突變為甲硫胺酸並且將在位置524-528的 “CFLLC”序列(SEQ ID NO:99)替換為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7A圖所顯示,當與從以野生型A/瑞士/9715293/13 H3(構築體# 2801)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3062農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約150%增加。N382A + L384V + CysTM A/ 香港 /4801/14 突變體 H3
N382A + L384V + CysTM A/香港/4801/14突變體H3(構築體#3375)藉由將野生型A/香港/4801/14在位置382的天冬醯胺酸突變為丙胺酸殘基、將在位置384的白胺酸突變為纈胺酸殘基、並且將在位置524-52的“CFLLC”序列(SEQ ID NO:99)突變為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7E圖所顯示,當與從以用CysTM A/香港/4801/14突變體H3(構築體#3341)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3375農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約300%增加。N382A + L384V + CysTM A/ 明尼蘇達 /40/15 突變體 H3
N382A + L384V + CysTM A/明尼蘇達/40/15突變體H3(構築體#3915)藉由將野生型A/明尼蘇達/40/15在位置382的天冬醯胺酸突變為丙胺酸殘基、將在位置384的白胺酸突變為纈胺酸殘基、並且將在位置524-528的“CFLLC”序列(SEQ ID NO:99)突變為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7E圖所顯示,當與從用CysTM A/明尼蘇達/40/15突變體H3(構築體#3914)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3915農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約400%增加。N382A + L384V + CysTM A/S. 澳大利亞 /1/16 突變體 H3
N382A + L384V + CysTM A/S.澳大利亞/1/16突變體H3(構築體#3925)藉由野生型A/S.澳大利亞/1/16在位置382的天冬醯胺酸突變為丙胺酸殘基、將在位置384的白胺酸突變為纈胺酸殘基、以及將在位置524-528的“CFLLC”序列(SEQ ID NO:99)突變為“SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7D和7E圖所顯示,當與從以CysTM A/S. 澳大利亞/1/16突變體H3(構建#3924)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3925農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約400%增加。N382A + L384V + CysTM A/ 曼谷 /3007/15 突變體 H3
N382A + L384V + CysTM A/曼谷/3007/15突變體H3(構築體#3905)藉由將野生型A/曼谷/3007/15在位置382的天冬醯胺酸突變為丙胺酸殘基、將在位置384的白胺酸突變為纈胺酸殘基、以及將在位置524-528的“CFLLC”序列(SEQ ID NO:99)突變為SLVLL”(SEQ ID NO:98)而構建。如第7E圖所顯示,當與從以CysTM A/曼谷/3007/15突變體H3(構築體#3904)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3905農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約400%增加。
本文所述的一種或多於一個突變具體性地增加在植物中流感HA蛋白質產生和VLP產量。觀察到在其他位置的突變顯著地降低、或對於在植物細胞中的流感HA蛋白質累積或VLP產生沒有顯著的效果。
以包括本文所述的一個或多於一個突變的流感HA蛋白質所實現的增加的血球凝集力價還被觀察到特定於流感H3 HA。類似的增強在以編碼衍生自非H3菌株的突變體流感HA的構築體農桿菌浸潤的植物中未被觀察到。
例如,F393D A/印度尼西亞/5/2005突變體H5藉由將野生型A/印度尼西亞/5/2005 H5位置393的苯丙胺酸突變為天冬胺酸而構建(構築體#3680)。如第3圖所顯示,當與從以野生型A/印度尼西亞/5/2005 H5(構築體#2295)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以構築體#3680農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約98%降低。
類似地,當與從以野生型A/埃及/N04915/2014 H5(構築體#3690)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,從以F392D A/埃及/N04915/2014突變體H5(構築體#3690)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的純化萃取物表現出在血球凝集力價中大約99%降低(見第3圖)。表 4 :
如本文所述製備的構築體的實例。序列在實例4和序列表中提供。
實例3:血球凝集力價、密度後梯度產量以及全過程產量
所測量的血球凝集力價的概述在表5和6A中給出。血球凝集力價如在實例2中所描述而測量。相對血球凝集力價藉由比較突變或修飾的HA蛋白質的血球凝集力價與野生型HA(表5)或CysTM突變體HA蛋白質(表6A)而獲得。
所測量的密度後梯度產量的概述在表A 5B和C5B中給出。密度後梯度產量如實例2中所描述而測量。相對產量藉由比較來自突變或修飾的HA蛋白質的HA0帶強度與野生型HA的HA0帶強度(表A 5B)或CysTM突變體HA蛋白質的HA0帶強度(表6B)而獲得。
所測量的全過程產量的概述在表6C中給出。全過程產量是如上實例2中所描述而獲得。相對產量藉由比較來自突變的或修飾的HA蛋白質的蛋白質產量與野生型HA的蛋白質產量或CysTM突變體HA蛋白質的蛋白質產量而獲得(表6C)。表 5 :
H3的相對血球凝集力價的概述。編號是根據H3 A/香港/4801/14。 表 6A :
對於H3的相對血球凝集力價的概述。編號是根據H3 A/香港/4801/14。 表 6B :
對於H3的密度後梯度產量的概述(以%表示)。編號是根據H3 A/香港/4801/14。 表 6C :
對於H3的相對全過程產量的概述。編號是根據H3 A/香港/4801/14。 表 7
對於H5的相對血球凝集力價的概述。編號是根據H5 A/印尼/5/2005 實例 4 : 序列
以下序列被使用(也參見表4):
PDI-H3 HK DNA (SEQ ID NO:1)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCATCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTACACATACCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGCATATTTGGTGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGGAACTTATGACCACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGA
PDI-H3 HK AA (SEQ ID NO: 2)
MAKNVAIFGLLFSLLVLVPSQIFAQKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSSSSFFSRLNWLTHLNYTYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKHSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHNVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
PDI-H3 Minn DNA (SEQ ID NO: 3)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACAAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGTTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAGAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTACACATATCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAAGGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGGTTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAGTTCAAGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGAAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGAAACTTATGACCACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGATGCAACATTTGCATTTGA
PDI-H3 Minn AA (SEQ ID NO: 4)
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PDI-H3 SAus DNA (SEQ ID NO: 5)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACAAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGTTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAGAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAAAAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTACACATATCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAAGGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGGTTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAGTTCAAGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGAAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGAAACTTATGACCACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGATGCAACATTTGCATTTGA
PDI-H3 SAus AA (SEQ ID NO: 6)
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PDI-H3 Bang DNA (SEQ ID NO: 7)
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PDI-H3 Bang AA (SEQ ID NO: 8)
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PDI-H3 Switz DNA (SEQ ID NO: 9)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAACTTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGGCTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTTCTTGCATAAGGGGATCTAATAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTCCAAATACCCAGCATTAAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCACAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCGAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCAAAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAGACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGCTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGGAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATCAGAAATGGAACTTATGACCACGATGTATACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGA
PDI-H3 Switz AA (SEQ ID NO: 10)
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PDI-H3 Miss DNA (SEQ ID NO: 11)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAACTTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAGAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGGCTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTTCTTGCATAAGGGGATCTAATAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTCCAAATACCCAGCATTAAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCAAAACCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCGAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCAAAACACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAGACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGCTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGGAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATCAGAAATGGAACTTATGACCACGATGTATACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGA
PDI-H3 Miss AA (SEQ ID NO: 12)
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PDI-H3 Penn DNA (SEQ ID NO: 13)
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PDI-H3 Penn AA (SEQ ID NO: 14)
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IF-CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c (SEQ ID NO: 15)
TCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCT
IF-H1cTMCT.S1-4r (SEQ ID NO: 16)
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IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17)
ACTAAAGAAAATAGGCCTTCAAATGCAAATGTTGCACCTAATGTTGCCCTTTTGG
H3_Swi_SLVLL.r (SEQ ID NO: 18)
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H3_Swi_SLVLL.c (SEQ ID NO: 19)
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PDI-H3 HK-CysTm DNA (SEQ ID NO: 20)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCATCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTACACATACCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGCATATTTGGTGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGGAACTTATGACCACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATCCCTTGTACTGTTAGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGA
PDI-H3 HK-CysTm AA (SEQ ID NO: 21)
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H3_HK480114(N382A+L384V).r (SEQ ID NO: 22)
TTGGTTTTCCCGATCACTCGAGCCAGCTTCCCATTGATTTGATCGATT
H3_HK480114(N382A+L384V).c (SEQ ID NO: 23)
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PDI-H3 HK-N382A+L384V-CysTm DNA (SEQ ID NO: 24)
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PDI-H3 Minn-CysTm DNA (SEQ ID NO: 26)
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PDI-H3 Minn-CysTm AA (SEQ ID NO: 27)
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H3Minn(N382A+L384V).r (SEQ ID NO: 28)
GTTGGTTTTCCCGATCACCCGAGCCAGCTTCCCATTGATTTGATCGATTGCTGCTTGAGT
H3Minn(N382A+L384V).c (SEQ ID NO: 29)
AATCAATGGGAAGCTGGCTCGGGTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGA
PDI-H3 Minn-N382A+L384V-CysTm DNA (SEQ ID NO: 30)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACAAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGTTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAGAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTACACATATCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAAGGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGGCTCGGGTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAGTTCAAGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGAAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGAAACTTATGACCACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATCCCTTGTACTGTTAGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGATGCAACATTTGCATTTGA
PDI-H3 Minn-N382A+L384V-CysTm AA (SEQ ID NO: 31)
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PDI-H3 SAus-N382A+L384V-CysTm DNA (SEQ ID NO: 34)
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PDI-H3 SAus-N382A+L384V-CysTm AA (SEQ ID NO: 35)
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PDI-H3 Switz-L431M-CysTm AA (SEQ ID NO: 61)
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選殖載體1190從左至右T-DNA (SEQ ID NO: 62)
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構築體1314從2X35S 啟動子至NOS終止子 (SEQ ID NO: 63)
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構築體2980從2X35S 啟動子至NOS終止子 (SEQ ID NO: 64)
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構築體2995從2X35S啟動子至NOS終止子(SEQ ID NO: 65)
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選殖載體3556從左至右T-DNA (SEQ ID NO: 66)
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IF-H5ITMCT.s1-4r (SEQ ID NO: 67)
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PDI-H5 Indo DNA (SEQ ID NO: 68)
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H5Ind(F393D).c (SEQ ID NO: 71)
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PDI-H5 Indo-F393D DNA (SEQ ID NO: 72)
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PDI-H5 Indo-F393D AA (SEQ ID NO: 73)
MAKNVAIFGLLFSLLVLVPSQIFADQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYLGSPSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRESRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQDEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESIRNGTYNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI*
IF-H5_Egy.r (SEQ ID NO: 74)
ACTAAAGAAAATAGGCCTTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAGCGATCCATT
PDI-H5 埃及 DNA (SEQ ID NO: 75)
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PDI-H5 埃及 AA (SEQ ID NO: 76)
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H5Egy(F392D).r (SEQ ID NO: 77)
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H5Egy(F392D).c (SEQ ID NO: 78)
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PDI-H5 埃及-F392D DNA (SEQ ID NO: 79)
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PDI-H5 埃及-F392D AA (SEQ ID NO: 80)
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PDI-H3 Switz-N382A DNA (SEQ ID NO: 81)
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PDI-H3 Switz-N382A AA (SEQ ID NO: 82)
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PDI-H3 Switz-L384V DNA (SEQ ID NO: 83)
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PDI-H3 Switz-L384V AA (SEQ ID NO: 84)
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A/曼谷/3007/15 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 91)
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A/香港/4801/14 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 92)
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A/明尼蘇達/40/15 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 93)
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A/南澳大利亞/1/16 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 94)
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A/賓夕法尼亞/09/15 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 95)
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A/瑞士/9715293/13 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 96)
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A/密西西比/16/16 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 97)
QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSRAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSSCIRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAKPSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPERQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
CysTM 序列 (aa) (SEQ ID NO: 98)
SLVLL
天然 TMCT (aa) SEQ ID NO: 99)
CFLLC
CysTM 序列 (nt) (SEQ ID NO: 100)
TCCCTTGTACTGTTA
天然 TMCT (nt) SEQ ID NO: 101)
TGTTTTTTGCTTTGT
A/香港/4801/14 (H3N2 (nt) – (Epiflu accession no EPI539576) (SEQ ID NO: 102)
ATGAAGACTATCATTGCTTTGAGCTACATTCTATGTCTGGTTTTCGCTCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTACACATACCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGGAACTTATGACCACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGA
構築體 2801從2X35S 啟動子至NOS終止子 (SEQ ID NO: 103)
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAACTTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGGCTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTTCTTGCATAAGGGGATCTAATAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTCCAAATACCCAGCATTAAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCACAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCGAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCAAAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAGACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGCTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGGAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATCAGAAATGGAACTTATGACCACGATGTATACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
構築體 3023從2X35S 啟動子至NOS終止子 (SEQ ID NO: 104)
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAACTTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGGCTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTTCTTGCATAAGGGGATCTAATAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTCCAAATACCCAGCATTAAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCACAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCGAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCAAAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAGACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGCTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGGCTCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGGAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATCAGAAATGGAACTTATGACCACGATGTATACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
構築體 2811從2X35S 啟動子至NOS終止子 (SEQ ID NO: 105)
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAACTTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGGCTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTTCTTGCATAAGGGGATCTAATAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTCCAAATACCCAGCATTAAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCACAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCGAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCAAAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAGACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGCTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGGAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATCAGAAATGGAACTTATGACCACGATGTATACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATCCCTTGTACTGTTAGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
所有引用藉由參考在此引入。
本發明已經關於一個或更多實施例而被描述。然而,對於本領域具有通常知識者顯而易見的是,在不脫離如申請專利範圍所定義的本發明的範圍的情況下,許多變化和修飾可以被進行。
無
本發明的這些和其他特徵將從以下參考附圖的描述中變得更加明顯,其中:第 1 圖
顯示A/曼谷/3007/15(H3N2)(SEQ ID NO:91);A/香港/4801/14(H3N2)(SEQ ID NO:92);A/明尼蘇達/40/15(H3N2)(SEQ ID NO:93);A/南澳大利亞/1/16(H3N2)(SEQ ID NO:94);A/賓夕法尼亞/09/15(H3N2)(SEQ ID NO:95);A/瑞士/9715293/13(H3N2)(SEQ ID NO:96);A/密西西比/16/16(H3N2)(SEQ ID NO:97)的血球凝集素(HA)的胺基酸序列的序列比對。概述的殘基比對於來自例如A/香港/4801/14(H3N2)(SEQ ID NO:92)的流感H3菌株(H3N2)的HA的胺基酸N382、L384、F392、L431。第 2 圖
顯示野生型A/瑞士/9715293/13 H3、N382A A/瑞士/9715293/13突變體H3、L384V A/瑞士/9715293/13突變體H3、F392D A/瑞士/9715293/13突變體H3以及L431M A/瑞士/9715293/13突變體H3的血球凝集力價(hemagglutination titer)。第 3 圖
顯示野生型A/印度尼西亞/5/2005 H5、野生型A/埃及/N04915/2014 H5、F393D A/印度尼西亞/5/2005突變體H5、F393D A/埃及/N04915/2014突變體H5、N383A A/印度尼西亞/5/2005突變體H5以及N383A A/埃及/N04915/2014突變體H5的血球凝集力價。編號是根據A/印尼/5/2005。第 4A 圖
顯示載體3045(H3 A-Swi-9715293-13(F392D))的示意呈現。第 4B 圖
顯示載體3022(H3 A-Swi-9715293-13(L431M))的示意呈現。第 4C 圖
顯示載體3023(H3 A-Swi-9715293-13(N382A))的示意呈現。第 4D 圖
顯示載體3034(H3 A-Swi-9715293-13(L384V))的示意呈現。第 5A 圖
顯示載體3556的示意呈現(用於轉殖到基於CPMV 160的表現卡匣中的內融合的載體(還有在苜蓿色素體藍素啟動子和終止子的控制下的M2輔助型蛋白質)。第 5B 圖
顯示載體1190(用於轉殖到基於CPMV 160的表現卡匣中的內融合的載體)的示意呈現。第 6A 圖
顯示野生型A/瑞士/9715293/13 H3和CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3的血球凝集力價。第 6B 圖
顯示野生型A/賓夕法尼亞/09/2015 H3和CysTM A/賓夕法尼亞/09/2015突變體H3的血球凝集力價。第 7A 圖
顯示野生型A/瑞士/9715293/13 H3、N382A A/瑞士/9715293/13突變體H3、L384V A/瑞士/9715293/13突變體H3、F392D A/瑞士/9715293/13突變體H3、L431M A/瑞士/9715293/13突變體H3,具有CysTM修飾的A/瑞士/9715293/13 H3、N382A + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3、L384V + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3、F392D + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3以及L431M + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3的血球凝集力價。第 7B 圖
顯示被表現為相對於CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3的百分比的CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3、N382A + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3、L384V + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3、F392D + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3、以及L431M + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H31的後密度梯度VLP產量。第 7C 圖
顯示野生型A/賓夕法尼亞/09/2015 H3、CysTM A/賓夕法尼亞/09/2015突變體H3、N382A + CysTM A/賓夕法尼亞/09/2015突變體H3、以及L384V + CysTM A/賓夕法尼亞/09 2015突變體H3的血球凝集力價。第 7D 圖
顯示CysTM A/S澳大利亞/1/16突變體H3以及N382A + L384V + CysTM A/S.澳大利亞/1/16突變體H3的血球凝集力價。第 7E 圖
顯示CysTM A/香港/4801/14突變體H3和N382A + L384V + CysTM A/香港/4801/14突變體H3;CysTM A/明尼蘇達/40/15突變體H3和N382A + L384V + CysTM A/明尼蘇達/40/15突變體H3;CysTM A/S.澳大利亞/1/16突變體H3和N382A + L384V + CysTM A/S.澳大利亞/1/16突變體H3;CysTM A/曼谷/3007/15突變體H3和N382A + L384V + CysTM A/曼谷/3007/15突變體H3;CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3;和L384V + CysTM A/瑞士/9715293/13突變體H3;CysTM A/密西西比/16/16突變體H3和N382A + L384V + CysTM A/密西西比/16/16突變體H3的血球凝集力價。第 8A 圖
顯示載體3340(H3 A-HK-4801-14)的示意呈現。第 8B 圖
顯示載體3341(H3 A-HK-4801-14)的示意呈現。第 8C 圖
顯示載體3375(H3 A-HK-4801-14(N382A + L384V))的示意呈現。第 8D 圖
顯示載體3914(H3 A-Minn-40-15)的示意呈現。第 8E 圖
顯示載體3915(H3 A-Minn-40-15(N382A + L384V))的示意呈現。第 8F 圖
顯示載體3924(H3 A-SAus-1-16)的示意呈現。第 8G 圖
顯示載體3925(H3A-SAus-1-16(N382A + L384V))的示意呈現。第 8H 圖
顯示載體3904(H3A-Bang-3007-15)的示意呈現。第 8I 圖
顯示載體3905(H3 A-Bang-3007-15(N382A + L384V))的示意呈現。第 8J 圖
顯示載體2801(H3 A-Swi-9715293-13)的示意呈現。第 8K 圖
顯示載體2811(H3 A-Swi-9715293-13)的示意呈現。第 8L 圖
顯示載體3063(H3 A-Swi-9715293-13(N382A))的示意呈現。第 8M 圖
顯示載體3074(H3 A-Swi-9715293-13(L384V))的示意呈現。第 8N 圖
顯示載體3085(H3 A-Swi-9715293-13(F392D))的示意呈現。第 8O 圖
顯示載體3062(H3 A-Swi-9715293-13(L431M))的示意呈現。第 8P 圖
顯示載體3312(H3 A-Penn-09-15)的示意呈現。第 8Q 圖
顯示載體3313(H3A-Penn-09-15)的示意呈現。第 8R 圖
顯示載體3314(H3 A-Penn-09-15(N382A))的示意呈現。第 8S 圖
顯示載體3315(H3 A-Penn-09-15(L384V))的示意呈現。第 9A 圖
顯示載體2295(H5 A-Indo-5-05)的示意呈現。第 9B 圖
顯示載體3680(H5 A-Indo-5-05(F393D))的示意呈現。第 9C 圖
顯示載體3645(H5 A-埃及-N04915-14)的示意呈現。第 9D 圖
顯示載體3690(H5A -埃及-N04915-14(F392D))的示意呈現。
Claims (40)
- 一種包括編碼一修飾的流感H3血球凝集素(HA)蛋白質的一核苷酸序列之核酸,當與一對應的野生型胺基酸序列相比時該HA蛋白質包括一胺基酸序列,該胺基酸序列包括至少一個取代,該至少一個取代是在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置382、384、392、431、524、525、526或528的胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括: 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置382的胺基酸的該胺基酸的一第一取代,該取代是對一非天冬醯胺酸, 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置524的胺基酸的該胺基酸的一第二取代,該取代是對一非半胱胺酸,以及 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置528的胺基酸的該胺基酸的一第三取代,該取代是對一非半胱胺酸。
- 如申請專利範圍第2項所述的核酸,其中: 該第一取代是對一丙胺酸或丙胺酸的一保留取代, 該第二取代是對一絲胺酸或絲胺酸的一保留取代,以及 該第三取代是對一白胺酸或白胺酸的一保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括: 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置384的胺基酸的該胺基酸的一第一取代,該取代是對一非白胺酸, 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置524的胺基酸的該胺基酸的一第二取代,該取代是對一非半胱胺酸,以及 在對應於在A/香港/4801/14 HA在位置528的胺基酸的該胺基酸的一第三取代,該取代是對一非半胱胺酸。
- 如申請專利範圍第4項所述的核酸,其中: 該第一取代是對一纈胺酸或纈胺酸的一保留取代, 該第二取代是對一絲胺酸或絲胺酸的一保留取代,以及 該第三取代是對一白胺酸或白胺酸的一保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括: 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置392的胺基酸的該胺基酸的一第一取代,該取代是對一非苯丙胺酸, 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置524的胺基酸的該胺基酸的一第二取代,該取代是對一非半胱胺酸,以及 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置528的胺基酸的該胺基酸的一第三取代,該取代是對一非半胱胺酸。
- 如申請專利範圍第6項所述的核酸,其中: 該第一取代是對一天冬胺酸或天冬胺酸的一保留取代, 該第二取代是對一絲胺酸或絲胺酸的一保留取代,以及 該第三取代是對一白胺酸或白胺酸的一保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括: 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置431的胺基酸的該胺基酸的一第一取代,該取代是對一非白胺酸, 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置524的胺基酸的該胺基酸的一第二取代,該取代是對一非半胱胺酸,以及 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置528的胺基酸的該胺基酸的一第三取代,該取代是對一非半胱胺酸。
- 如申請專利範圍第8項所述的核酸,其中: 該第一取代是對一甲硫胺酸或甲硫胺酸的一保留取代, 該第二取代是對一絲胺酸或絲胺酸的一保留取代,以及 該第三取代是對一白胺酸或白胺酸的一保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括: 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置382的胺基酸的該胺基酸的一第一取代,該取代是對一非天冬醯胺酸, 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置384的胺基酸的該胺基酸的一第二取代,該取代是對一非白胺酸, 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置524的胺基酸的該胺基酸的一第三取代,該取代是對一非半胱胺酸,以及 在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置528的胺基酸的該胺基酸的一第四取代,該取代是對一非半胱胺酸。
- 如申請專利範圍第10項所述的核酸,其中: 該第一取代是對一丙胺酸或丙胺酸的一保留取代, 該第二取代是對一纈胺酸或纈胺酸的一保留取代, 該第三取代是對一絲胺酸或絲胺酸的一保留取代,以及 該第四取代是對一白胺酸或白胺酸的一保留取代。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述的核酸,其中該HA蛋白質進一步包括在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置525、526或525及526的胺基酸的胺基酸的取代,其中在位置525的該胺基酸的該取代是對一非苯丙胺酸,並且在位置526的該胺基酸的該取代是對一非白胺酸。
- 如申請專利範圍第12項所述的核酸,其中在位置525的該胺基酸的該取代是對一白胺酸或白胺酸的一保留取代,並且在位置526的該胺基酸的該取代是對一纈胺酸或纈胺酸的一保留取代。
- 如申請專利範圍第3項或第11項所述的核酸,其中丙胺酸的該保留取代是絲胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、或纈胺酸。
- 如申請專利範圍第5項、第11項及第13項中任一項所述的核酸,其中纈胺酸的該保留取代是異白胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、或蘇胺酸。
- 如申請專利範圍第7項所述的核酸,其中天冬胺酸的該保留取代是麩胺酸、麩醯胺酸、或絲胺酸。
- 如申請專利範圍第9項所述的核酸,其中甲硫胺酸的該保留取代是異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。
- 如申請專利範圍第3項、第5項、第7項、第9項及第11項中任一項所述的核酸,其中絲胺酸的該保留取代是蘇胺酸、丙胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、麩胺酸或離胺酸。
- 如申請專利範圍第3項、第5項、第7項、第9項、第11項及第13項中任一項所述的核酸,其中白胺酸的該保留取代是異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸或纈胺酸。
- 一種由如申請專利範圍第1項至第19項中任一項所述的核酸所編碼的修飾的流感H3血球凝集素(HA)蛋白質。
- 一種類病毒顆粒(VLP),包括由如申請專利範圍第 1項至第19項中任一項所述的核酸所編碼的該HA蛋白質。
- 一種在一植物、一植物的部分或一植物細胞中產生一流感類病毒顆粒(VLP)的方法,該方法包括: a)將如申請專利範圍第1項至第19項中任一項所述的核酸引入該植物、該植物的部分、或植物細胞中;以及 b)在允許被該核酸編碼的該HA蛋白質的表現的條件下孵育該植物、該植物的部分或植物細胞,從而產生該VLP。
- 如申請專利範圍第22項所述的方法,其中步驟a)進一步包括引入編碼一質子通道蛋白質的一第二核酸;以及步驟b)進一步包括在允許被該第二核酸編碼的該質子通道蛋白質的表現的條件下孵育該植物、該植物的部分或植物細胞。
- 如申請專利範圍第22項至第23項中任一項所述的方法,其中該方法進一步包括步驟c)收穫該植物、該植物之部分、或植物細胞,並且純化該VLP。
- 一種在一植物、一植物的一部分或一植物細胞中產生一流感類病毒顆粒(VLP)的方法,該方法包括: a)提供包括如申請專利範圍第1項至第19項中任一項所述的核酸的一植物,一植物之部分或植物細胞;以及 b)在允許被核酸編碼的HA蛋白質的表現的條件下孵育該植物、該植物的部分、或植物細胞,從而產生該VLP。
- 如申請專利範圍第25項所述的方法,其中步驟a)的該植物、該植物的部分或植物細胞進一步包括編碼一質子通道蛋白質的一第二核酸;以及其中步驟b)進一步包括在允許被該第二核酸編碼的該質子通道蛋白質的表現的條件下孵育該植物、該植物的部分或植物細胞。
- 如申請專利範圍第23項或第26項所述的方法,其中該質子通道蛋白質是一A型流感亞型M2蛋白質。
- 如申請專利範圍第25項至第27項中任一項所述的方法,其中該方法進一步包括步驟c)收穫該植物、該植物的部分或植物細胞,並且純化該VLP。
- 一種由如申請專利範圍第22項至第28項中任一項所述的方法所產生的VLP。
- 如申請專利範圍第29項所述的VLP,進一步包括衍生自該植物、該植物的部分或植物細胞的一個或多於一個脂質、植物特定的N-多醣、修飾的N-多醣或其一組合。
- 一種產生一抗體或抗體片段的方法,該方法包括將如申請專利範圍第21項、第29項或第30項所述的VLP投藥予一受試者或一宿主動物,從而產生該抗體或該抗體片段。
- 一種由如申請專利範圍第31項所述的方法所產生的抗體。
- 一種包括如申請專利範圍第1項至第19項中任一項所述的核酸的植物,該植物的部分或植物細胞。
- 一種包括如申請專利範圍第13項所述的HA蛋白質或如申請專利範圍第21項、第29項或第30項中任一項所述的VLP的植物、該植物的部分或植物細胞。
- 一種用於誘導一免疫反應的組合物,包括如申請專利範圍第21項、第29項或第30項中任一項所述的VLP的一有效劑量、以及一藥學上可接受的攜載體、佐劑、載具或賦形劑。
- 一種用於在一受試者中對一流感感染誘導免疫的方法,該方法包括將如申請專利範圍第21項、第29項或第30項中任一項所述的VLP投藥予該受試者。
- 一種如申請專利範圍第36項所述的方法,其中該VLP是口服地、鼻內地、肌內地、腹膜內地、靜脈內地或皮下地投藥予該受試者。
- 一種在一植物、一植物的部分或一植物細胞中的一流感類病毒顆粒(VLP)的產生的提高的產量的方法,該方法包括: a)將如申請專利範圍第1項至第19項中任一項所述的核酸引入該植物、該植物的部分或植物細胞中;或提供包括如申請專利範圍第1項至第19項中任一項所述的核酸的一植物、一植物的部分、或植物細胞;以及 b)在允許由該核酸所編碼的該修飾的流感HA蛋白質的表現的條件下該孵育植物、該植物的部分、或植物細胞,從而與表現一未修飾的流感HA蛋白質的植物、該植物的部分或植物細胞相比在一更高的產量來產生該VLP。
- 如申請專利範圍第38項所述的方法,其中該方法進一步包括步驟c)收穫該植物、該植物的部分或植物細胞,並且純化該VLP。
- 一種修飾的流感H3血球凝集素(HA)蛋白質,該HA蛋白質包括一胺基酸序列,該胺基酸序列當與一對應的野生型胺基酸序列相比時包括至少一個取代,該至少一個取代是在對應於在A/香港/4801/14 HA之位置382、384、392、431、524、525、526或528的胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
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