JP2021528972A - インフルエンザウイルスヘマグルチニン変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
B. 改変されたインフルエンザH3ヘマグルチニン(HA)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、このHAタンパク質は、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み、上記少なくとも1つの置換は、A/Hong Kong/4801/14 HAの位置382、384、392、431、524、525、526又は528のアミノ酸に対応する1以上のアミノ酸において存在する核酸。
a)A又はBで記載される上記組み換え核酸を上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞に導入する工程と、
b)上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を、上記組み換え核酸によってコードされるHAタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記VLPを産生する工程と
を備える方法が提供される。当該方法は、上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、上記VLPを精製する工程c)をさらに備えてもよい。
a)A又はBで記載される上記組み換え核酸を含む植物、植物の一部分、又は植物細胞を準備する工程と、
b)上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を、上記組み換え核酸によってコードされるHAタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記VLPを産生する工程と
を備える方法がさらに提供される。当該方法は、上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、上記VLPを精製する工程c)をさらに備えてもよい。
本明細書で使用する場合の用語「インフルエンザウイルス亜型」は、ヘマグルチニン(H又はHA)及びノイラミダーゼ(N)のウイルス表面タンパク質の種々の組み合わせによって特徴づけられるインフルエンザAウイルスバリアントを指す。本明細書によれば、インフルエンザウイルス亜型及びこのようなウイルス亜型由来のヘマグルチニン(HA)は、それらのH数によって、例えば「H3亜型のHA」、「H3 HA」又は「H3インフルエンザ」等と呼ばれてもよい。用語「亜型」は、具体的には、各亜型の中のすべての個々の「株」を含み、この個々の「株」は、通常は変異に由来し、異なる病原性プロファイルを示す可能性がある。そのような株は、ウイルス亜型の種々の「分離株」とも呼ばれてよい。従って、本明細書で使用する場合、用語「株」及び「分離株」はほとんど同義で使用されてもよい。
本明細書に記載されるように、HAタンパク質中の残基は、改変されたHAタンパク質又はHAタンパク質バリアントを生成するために、特定されて、改変、置換又は変異されてもよい。特定の位置における置換又は変異は、本明細書中に記載されるか又は実施例に与えられるアミノ酸置換に限定されない。例えば、HAバリアントは、記載されたアミノ酸置換の保存された置換又は保存的な置換を含んでもよい。
・疎水性の側鎖(脂肪族)を有するアミノ酸:アラニン(A、Ala)、イソロイシン(I、Ile)、ロイシン(L、Leu)、メチオニン(M、Met)及びバリン(V、Val);
・疎水性の側鎖(芳香族)を有するアミノ酸:フェニルアラニン(F、Phe)、トリプトファン(W、Trp)、チロシン(Y、Tyr);
・極性の中性の側鎖を有するアミノ酸:アスパラギン(N、Asn)、システイン(C、Cys)、グルタミン(Q、Gln)、セリン(S、Ser)及びトレオニン(T、Thr);
・電荷を帯びた側鎖(酸性)を有するアミノ酸:アスパラギン酸(D、Asp)、グルタミン酸(E、Glu);
・電荷を帯びた側鎖(塩基性)を有するアミノ酸:アルギニン(R、Arg);ヒスチジン(H、His);リジン(K、Lys)、グリシン(G、Gly)及びプロリン(P、Pro)。
改変されたインフルエンザH3 HAタンパク質及び植物における改変されたインフルエンザH3 HAタンパク質の産生方法が本明細書に記載される。亜型H3由来のHAタンパク質における特定のアミノ酸の改変は、野生型H3 HAタンパク質又は未改変H3 HAタンパク質と比べて改変H3 HAタンパク質の改善された特性をもたらすということが認められた。
1つの態様では、位置382(ナンバリングはA/Hong Kong/4801/14 HAナンバリング、配列番号92に従う)に改変された残基を有してもよいH3 HAが提供される。
別の態様では、位置384(A/Hong Kong/4801/14 HAナンバリング、配列番号92)に改変された残基を有してもよいH3 HAが提供される。
別の態様では、位置392(H3 A/Hong Kong/4801/14 HAナンバリング、配列番号92)に改変された残基を有してもよいH3 HAが提供される。
別の態様では、位置431(H3 A/Hong Kong/4801/14 HAナンバリング、配列番号92)に改変された残基を有してもよいH3 HAが提供される。
位置382、384、392、431及び/又は524〜528(「CysTM」)における改変
改変されたインフルエンザH3 HAタンパク質及び植物における改変されたインフルエンザH3 HAタンパク質の産生方法が本明細書に記載される。亜型H3由来のHAタンパク質における特定のアミノ酸の改変は、野生型H3 HAタンパク質又は未改変H3 HAタンパク質と比べて改変H3 HAタンパク質の改善された特性をもたらすということが認められた。
別の態様では、位置382に改変された残基を有してもよく、かつ位置524及び/又は528(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング、配列番号92)にシステイン残基を有するように改変されたものであってもよいH3 HAが提供される。さらには、位置525、526及び/又は527(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング)の残基も改変されてもよい。
別の態様では、位置384に改変された残基を有してもよく、かつ位置524及び528(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング、配列番号92)にシステイン残基を有さないように改変されてもよいH3 HAが提供される。さらには、位置525、526及び/又は527(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング)の残基も改変されてもよい。
別の態様では、位置392に改変された残基を有してもよく、かつ位置524及び528(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング、配列番号92)にシステイン残基を有さなくてもよいH3 HAが提供される。さらには、位置525、526及び/又は527(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング)の残基も改変されてもよい。
別の態様では、位置431に改変された残基を有してもよく、かつ位置524及び528(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング、配列番号92)にシステイン残基を有さなくてもよいH3 HAが提供される。さらには、位置525、526及び/又は527(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング)の残基も改変されてもよい。
別の態様では、位置382及び384に改変された残基を有してもよく、かつ位置524及び528(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング、配列番号92)にシステイン残基を有さなくてもよいH3 HAが提供される。さらには、位置525、526及び/又は527(H3 A/Hongkong/4801/14ナンバリング)の残基も改変されてもよい。
インフルエンザA HAタンパク質は、A/Hong Kong/4801/14(H3N2、配列番号92)、A/Minnesota/40/15(H3N2、配列番号93)、A/South Australia/1/16(H3N2、配列番号94)、A/Bangkok/3007/15(H3N2、配列番号91)、A/Switzerland/9715293/13(H3N2、配列番号96)、A/Mississippi/16/16(H3N2、配列番号97)、及びA/Pennsylvania/09/2015(H3N2、配列番号95)由来のインフルエンザA HA配列と約30〜約100%、約40〜約100%、約50〜約100%、約60〜約100%、約70〜約100%、約80〜約100%、約85〜約100%、約90〜約100%、95〜約100%、若しくは約97〜約100%、約98〜約100%、若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性又は配列類似性を有するアミノ酸配列を含む任意のHAタンパク質を含むが、ただしこのインフルエンザHAタンパク質は、本明細書中に記載される少なくとも1つの置換を含み、VLPを形成することができ、対象に投与されたときに免疫応答を誘導し、赤血球凝集反応を誘導するか、又はこれらの組み合わせを行う。
CysTM A/Hong Kong/4801/14変異体H3(構築物番号3341、配列番号21)、N382A+L384V+CysTM A/Hong Kong/4801/14変異体H3(構築物番号3375、配列番号25);CysTM A/Minnesota/40/15変異体H3(構築物番号3914、配列番号27);N382A+L384V+CysTM A/Minnesota/40/15変異体H3(構築物番号3915、配列番号30);CysTM A/S.Australia/1/16変異体H3(構築物番号3924、配列番号33);N382A+L384V+CysTM A/S.Australia/1/16変異体H3(構築物番号3925、配列番号35);N382A+L384V+CysTM A/Bangkok/3007/15変異体H3(構築物番号3905、配列番号39);N382A A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3023、配列番号82);L384V A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3034、配列番号84);F392D A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3045、配列番号43;L431M A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3022、配列番号47);CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号2811、配列番号49);N382A+CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3063、配列番号53);L384V+CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3074、配列番号57);F392D+CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3085、配列番号59);及びL431M+CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3062、配列番号61)、CysTM A/Pennsylvania/09/2015変異体H3(構築物番号3313、配列番号86)、N382A+CysTM A/Pennsylvania/09/2015変異体H3(構築物番号3314、配列番号88)、及びL384V+CysTM A/Pennsylvania/09/2015変異体H3(構築物番号3315、配列番号90)。
「免疫応答」は、一般に、対象の適応免疫系の応答を指す。この適応免疫系は、一般に、体液性応答、及び細胞媒介性応答を含む。体液性応答は、Bリンパ球系の細胞(B細胞)で産生される分泌された抗体によって媒介される免疫の態様である。分泌された抗体は、進入する微生物(ウイルス又は細菌等)の表面の抗原に結合し、これは破壊のために微生物に目印を付ける。体液性免疫は、一般に、抗体産生及びこれに付随するプロセス、並びにTh2細胞活性化及びサイトカイン産生、記憶細胞生成、食作用のオプソニン促進、病原体脱離等を含む抗体のエフェクター機能を指すために使用される。用語「調節する」又は「調節」等は、一般に公知又は使用されるいくつかのアッセイのいずれかによって決定される特定の応答又はパラメータの増減を指し、このアッセイのうちのいくつかは本明細書中で例示される。
本発明の構築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的なDNA形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔などを使用して植物細胞に導入されてもよい。そのような技術についての総説として、例えば、Weissbach及びWeissbach、Methods for Plant Molecular Biology、Academy Press、New York VIII、421−463頁(1988);Geierson及びCorey、Plant Molecular Biology、第2版(1988);並びにPlant Metabolism、第2版 DT.Dennis、DH Turpin、DD Lefebrvre、DB Layzell(編)、Addison Wesly、Langmans Ltd. London、561−579頁(1997)のMiki及びIyer、Fundamentals of Gene Transfer in Plantsを参照。他の方法としては、直接的なDNA取り込み、リポソームの使用、例えばプロトプラスト、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル又はウィスカーを使用する電気穿孔、及び減圧インフィルトレーション法が挙げられる。例えば、Bilangら(1991、Gene 100:247−250)、Scheidら(1991、Mol.Gen.Genet. 228:104−112)、Guercheら(1987、Plant Science 52:111−116)、Neuhauseら(1987、Theor.Appl Genet. 75:30−36)、Kleinら(2987、Nature 327:70−73);Freemanら(1984、Plant Cell Physiol. 29:1353)、Howellら(1985、Science 227:1229−1231)、DeBlockら(1989、Plant Physiology 91:694−701)、Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach及びWeissbach編、Academic Press Inc.、1988)、Methods in Plant Molecular Biology(Schuler及びZielinski編、Academic Press Inc.、1989)、国際公開第92/09696号パンフレット、国際公開第94/00583号パンフレット、欧州特許出願公開第331083号明細書、欧州特許出願公開第175966号明細書、Liu及びLomonossoff(2002、J Virol Meth、105:343−348)、欧州特許出願公開第290395号明細書;国際公開第8706614号パンフレット;米国特許第4,945,050号明細書;米国特許第5,036,006号明細書;及び米国特許第5,100,792号明細書、1995年5月10日出願の米国特許出願第08/438,666号、及び1992年9月25日出願の米国特許出願第07/951,715号を参照(これらのすべてを、参照により本明細書に援用する)。
インフルエンザHA構築物を、当該技術分野で周知の技術を使用して製造した。例えば、野生型H3 A−Switzerland/9715293/13 HA、N382A A/Switzerland/9715293/13 H3 HA及びCysTM A−Switzerland−9715293−13を後述するようにクローニングした。他のH3 HA変異体を、同様の技術を使用して得た。HA配列プライマー、鋳型及び産物を実施例3(植物におけるインフルエンザHA及びVLPの産生)及び表4に記載する。
2X35S/CPMV 160/PDISP−HA0 H3 A−Switzerland−9715293−13/NOS(構築物番号2801)
アルファルファPDI分泌シグナルペプチド(PDISP)に融合したH3 A/Switzerland/9715293/13由来のインフルエンザHAからの成熟HA0をコードする配列を、以下のPCRベースの方法を使用して2X35S/CPMV 160/NOS発現系にクローニングした。PDISP−H3 A/Switzerland/9715293/13コード配列を含有する断片を、PDISP−H1 A/Switzerland/9715293/13遺伝子配列(配列番号9)を鋳型として使用して、プライマーIF−CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(配列番号15)及びIF−H3A−Ala.r(配列番号17)を使用して増幅した。PCR産物を、In−Fusionクローニングシステム(Clontech(クロンテック)、マウンテンビュー(Mountain View)、カリフォルニア州)を使用して、2X35S/CPMV 160/NOS発現系にクローニングした。構築物番号1190(図5B)をSacII及びStuI制限酵素を用いて消化し、直線化プラスミドをIn−Fusion組立反応のために使用した。構築物番号1190は、2X35S/CPMV 160/NOSベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「In Fusion」クローニングを意図したアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーター及びターミネーター下のサイレンシングのTBSV P19サプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。骨格(主鎖)はpCAMBIAバイナリープラスミドであり、左から右t−DNA境界の配列を配列番号62に提示する。得られた構築物を番号2801(配列番号103)とした。アルファルファPDI分泌シグナルペプチド(PDISP)に融合したA/Switzerland/9715293/13由来のインフルエンザHAからの成熟HA0のアミノ酸配列を配列番号10に提示する。プラスミド2801の表示を図8Jに提示する。
アルファルファPDI分泌シグナルペプチド(PDISP)に融合したA/Switzerland/9715293/13(N382A)由来のインフルエンザHAからの成熟HA0をコードする配列を、以下のPCRベースの方法を使用して2X35S/CPMV 160/NOS発現系にクローニングした。PCRの第1ラウンドで、変異したN382Aアミノ酸を有するPDISP−H3 A/Switzerland/9715293/13を含有する断片を、PDISP−H3 A/Switzerland/9715293/13遺伝子配列(配列番号9)を鋳型として使用して、プライマーIF−CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(配列番号15)及びH3_Swi(N382A).r(配列番号50)を使用して増幅した。H3 A/Switzerland/9715293/13の残部と共にN382A変異を含有する第2断片を、PDISP−H3 A/Switzerland/9715293/13遺伝子配列(配列番号9)を鋳型として使用して、H3_Swi(N382A).c(配列番号51)及びIF−H3A−Ala.r(配列番号17)を使用して増幅した。次いで、両方の増幅からのPCR産物を混合し、IF−CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(配列番号15)及びIF−H3A−Ala.r(配列番号17)をプライマーとして使用する増幅の第2ラウンドのための鋳型として使用した。最終のPCR産物を、In−Fusionクローニングシステム(Clontech、マウンテンビュー、カリフォルニア州)を使用して、2X35S/CPMV 160/NOS発現系にクローニングした。構築物番号1190(図5B)をSacII及びStuI制限酵素を用いて消化し、直線化プラスミドをIn−Fusion組立反応のために使用した。構築物番号1190は、2X35S/CPMV 160/NOSベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「In Fusion」クローニングを意図したアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーター及びターミネーター下のサイレンシングのTBSV P19サプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。骨格はpCAMBIAバイナリープラスミドであり、左から右t−DNA境界の配列を配列番号62に提示する。得られた構築物を番号3023(配列番号104)とした。変異PDISP−H3 A−Switzerland−9715293−13(N382A)のアミノ酸配列を配列番号82に提示する。プラスミド3023の表示を図4Cに提示する。
アルファルファPDI分泌シグナルペプチド(PDISP)に融合したA/Switzerland/9715293/13(CysTM)由来のインフルエンザHAからの成熟HA0をコードする配列を、以下のPCRベースの方法を使用して2X35S/CPMV 160/NOS発現系にクローニングした。PCRの第1ラウンドで、変異したCysTMアミノ酸を有するPDISP−H3 A/Switzerland/9715293/13を含有する断片を、PDISP−H3 A/Switzerland/9715293/13遺伝子配列(配列番号9)を鋳型として使用して、プライマーIF−CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(配列番号15)及びH3_Swi_SLVLL.r(配列番号18)を使用して増幅した。H3 A/Switzerland/9715293/13の残部と共にCysTm変異を含有する第2断片を、PDISP−H3 A/Switzerland/9715293/13遺伝子配列(配列番号9)を鋳型として使用して、H3_Swi_SLVLL.c(配列番号19)及びIF−H3A−Ala.r(配列番号17)を使用して増幅した。次いで、両方の増幅からのPCR産物を混合し、IF−CPMV(fl5’UTR)_SpPDI.c(配列番号15)及びIF−H3A−Ala.r(配列番号17)をプライマーとして使用する増幅の第2ラウンドのための鋳型として使用した。最終のPCR産物を、In−Fusionクローニングシステム(Clontech、マウンテンビュー、カリフォルニア州)を使用して、2X35S/CPMV 160/NOS発現系にクローニングした。構築物番号1190(図5B)をSacII及びStuI制限酵素を用いて消化し、直線化プラスミドをIn−Fusion組立反応のために使用した。構築物番号1190は、2X35S/CPMV 160/NOSベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「In Fusion」クローニングを意図したアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーター及びターミネーター下のサイレンシングのTBSV P19サプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。骨格はpCAMBIAバイナリープラスミドであり、左から右t−DNA境界の配列を配列番号62に提示する。得られた構築物を番号2811(配列番号105)とした。変異PDISP−H3 A−Switzerland−9715293−13(CysTM)のアミノ酸配列を配列番号49に提示する。プラスミド2811の表示を図8Kに提示する。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス形質移入
アグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1を、D’Aoustら、2008(Plant Biotech.J. 6:930−40)によって記載されている方法を使用して、野生型インフルエンザHA又は変異体インフルエンザHA発現ベクターを用いて電気穿孔によって形質移入した。形質移入したアグロバクテリウムを、10mM 2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、20μM アセトシリンゴン、50μg/ml カナマイシン及び25μg/mlのカルベニシリン、pH5.6を添加したYEB培地の中で0.6〜1.6のOD600まで増殖させた。使用前にアグロバクテリウム懸濁液を遠心分離し、インフィルトレーション培地(10mM MgCl2及び10mM MES、pH5.6)に再懸濁した。
ベンサミアナタバコ植物を、市販のピートモス基材を満たした床において種子から成長させた。この植物を、16/8光周期及び25℃日中/20℃夜間の温度体制の下で温室中で成長させた。播種から3週間後、個々の小植物を取り上げ、植木鉢に移植し、同じ環境条件下でさらに3週間、温室中で成長させた。
タンパク質を、約1cm2片に切った新しいバイオマスから、オービタルシェーカーを使用する、室温での一晩の酵素による抽出により抽出した。次いで、スラリーを大口径ナイロン(登録商標)フィルターで濾過し、粗い未消化の植物組織を取り除いた。
赤血球凝集反応アッセイは、Nayak及びReichl(2004)によって記載された方法に基づいた。手短に言えば、試験試料(100μL)の段階二重希釈を、100μLのPBSを含むV底96穴マイクロタイタープレート中で作製し、1ウェル当たり100μLの希釈された試料にした。100μLの0.5%モルモット赤血球細胞懸濁液(Bio Link Inc.(バイオリンク)、シラキュース(Syracuse)、ニューヨーク州)を各ウェルに添加し、プレートを室温で2時間インキュベーションした。完全赤血球凝集反応を示す最も高い希釈の逆数をHA活性として記録した。並行して、組み換えHA標品(A/Vietnam/1203/2004 H5N1)(Protein Science Corporation(プロテイン・サイエンス・コーポレーション)、メリデン(Meriden)、コネチカット州)をPBSで希釈し、各プレートで対照として実施した。
免疫ブロット法を、TBS−Tween20 0.1%中の2%スキムミルクの中で1/500に希釈した一次mAbを用いて第1インキュベーションによって実施した。1/10000に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス(Jackson Immunoresearch(ジャクソン・イムノリサーチ)、カタログ番号115−035−146)を、TBS−Tween20 0.1%中の2%スキムミルクの中での化学発光検出のための二次抗体として使用した。免疫反応性複合体を、ルミノールを基質(Roche Diagnostics Corporation(ロシュ・ダイアグノスティックス・コーポレーション))として使用して化学発光によって検出した。ヒトIgG抗体のセイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素結合を、EZ−Link Plus(登録商標)Activated Peroxidase結合キット(Pierce(ピアース)、Rockford(ロックフォード)、イリノイ州)を使用して実施した。
H3 HAの改変I
インフルエンザHA構築物を、当該技術分野で周知の技術を使用して製造した(実施例1を参照)。野生型及び変異HAタンパク質、プライマー、鋳型及び産物のまとめを下記表4に提供する。使用した配列を実施例4及び配列表に提供する。
N382A A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3023)を、野生型/Switzerland/9715293/13 H3の位置382のアスパラギンをアラニンへ変異させることにより構築した。図2に示すように、構築物番号3023を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3(構築物番号2801)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ30%上昇を呈した。
L384V A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3034)を、野生型/Switzerland/9715293/13 H3の位置384のロイシンをバリンへ変異させることにより構築した。図2に示すように、構築物番号3034を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3(構築物番号2801)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ100%上昇を呈した。
F392D A/Switzerland/9715293/13変異体H3を、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3の位置392のフェニルアラニンをアスパラギン酸へ変異させることにより構築した(構築物番号3045)。図2に示すように、構築物番号3045を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3(構築物番号2801)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ40%上昇を呈した。
L431M A/Switzerland/9715293/13変異体H3を、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3の位置431のロイシンをメチオニンへ変異させることにより構築した(構築物番号3022)。図2に示すように、構築物番号3022を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3(構築物番号2811)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ70%上昇を呈した。
CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3
CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号2811)を、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3の位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)に置き換えることにより構築した。図6Aに示すように、構築物番号2811を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3(構築物番号2801)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ60%上昇を呈した。
CysTM A/Pennsylvania/09/2015変異体H3(構築物番号3313)を、野生型A/Pennsylvania/09/2015 H3の位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)に置き換えることにより構築した。図7Cに示すように、構築物番号3313を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Pennsylvania/09/2015 H3(構築物番号3312)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ100%上昇を呈した。
N382A+CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3063)を、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3の位置382のアスパラギンをアラニンへ変異させ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)に置き換えることにより構築した。図7Aに示すように、構築物番号3063を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3(構築物番号2801)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ160%上昇を呈した。図7Bにさらに示すように、構築物番号3063を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物は、CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号2811)を用いてインフィルトレーションした植物と比較して、イオジキサノール勾配精製後のVLP収率のおよそ30%上昇を呈した。
N382A+CysTM A/Pennsylvania/09/2015変異体H3(構築物番号3314)を、野生型A/Pennsylvania/09/2015 H3の位置382のアスパラギンをアラニンへ変異させ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)に置き換えることにより構築した。図7Cに示すように、構築物番号3314を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Pennsylvania/09/2015 H3(構築物番号3312)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ300%上昇を呈した。
L384V+CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3074)を、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3の位置384のロイシンをバリンへ変異させ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)に置き換えることにより構築した。図7Cに示すように、構築物番号3074を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3(構築物番号2801)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ380%上昇を呈した。さらには、図7Bに示すように、構築物番号3074を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物は、CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号2811)を用いてインフィルトレーションした植物と比較して、スクロース勾配精製後のVLP収率のおよそ50%上昇を呈した。
L384V+CysTM A/Pennsylvania/09/2015変異体H3(構築物番号3315)を、野生型A/Pennsylvania/09/2015 H3の位置384のロイシンをバリンへ変異させ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)に置き換えることにより構築した。図7Cに示すように、構築物番号3315を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Pennsylvania/09/2015 H3(構築物番号3312)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ380%上昇を呈した。
F392D+CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3085)を、野生型/Switzerland/9715293/13 H3の位置392のフェニルアラニンをアスパラギン酸へ変異させ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)に置き換えることにより構築した。図7Aに示すように、構築物番号3085を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3(構築物番号2801)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ170%上昇を呈した。
L431M+CysTM A/Switzerland/9715293/13変異体H3(構築物番号3062)を、野生型/Switzerland/9715293/13 H3の位置431のロイシンをメチオニンへ変異させ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)に置き換えることにより構築した。図7Aに示すように、構築物番号3062を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型A/Switzerland/9715293/13 H3(構築物番号2801)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ150%上昇を呈した。
N382A+L384V+CysTM A/Hong Kong/4801/14変異体H3(構築物番号3375)を、野生型A/Hong Kong/4801/14の位置382のアスパラギンをアラニン残基へ、位置384のロイシンをバリン残基へ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)へ変異させることにより構築した。図7Eに示すように、構築物番号3375を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、CysTM A/Hong Kong/4801/14変異体H3(構築物番号3341)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ300%上昇を呈した。
N382A+L384V+CysTM A/Minnesota/40/15変異体H3(構築物番号3915)を、野生型A/Minnesota/40/15の位置382のアスパラギンをアラニン残基へ、位置384のロイシンをバリン残基へ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)へ変異させることにより構築した。図7Eに示すように、構築物番号3915を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、CysTM A/Minnesota/40/15変異体H3(構築物番号3914)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ400%上昇を呈した。
N382A+L384V+CysTM A/S.Australia/1/16変異体H3(構築物番号3925)を、野生型A/S.Australia/1/16の位置382のアスパラギンをアラニン残基へ、位置384のロイシンをバリン残基へ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)へ変異させることにより構築した。図7D及び図7Eに示すように、構築物番号3925を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、CysTM A/S.Australia/1/16変異体H3(構築物番号3924)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ400%上昇を呈した。
N382A+L384V+CysTM A/Bangkok/3007/15変異体H3(構築物番号3905)を、野生型A/Bangkok/3007/15の位置382のアスパラギンをアラニン残基へ、位置384のロイシンをバリン残基へ、かつ位置524〜528の「CFLLC」配列(配列番号99)を「SLVLL」(配列番号98)へ変異させることにより構築した。図7Eに示すように、構築物番号3905を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、CysTM A/Bangkok/3007/15変異体H3(構築物番号3904)を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ400%上昇を呈した。
測定した赤血球凝集価のまとめを表5及び表6Aに与える。赤血球凝集価は、実施例2に記載したように測定した。相対赤血球凝集価は、変異HAタンパク質又は改変HAタンパク質の赤血球凝集価を野生型HA(表5)又はCysTM変異体HAタンパク質(表6A)のいずれかと比較することにより得た。
Claims (40)
- 改変されたインフルエンザH3ヘマグルチニン(HA)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記HAタンパク質は、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み、前記少なくとも1つの置換は、A/Hong Kong/4801/14 HAの位置382、384、392、431、524、525、526又は528のアミノ酸に対応する1以上のアミノ酸において存在する核酸。
- A/Hong Kong/4801/14 HAの位置382のアミノ酸に対応するアミノ酸における第1置換であって、この置換は非アスパラギンへの置換である第1置換、
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置524のアミノ酸に対応するアミノ酸における第2置換であって、この置換は非システインへの置換である第2置換、及び
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置528のアミノ酸に対応するアミノ酸における第3置換であって、この置換は非システインへの置換である第3置換
を含む請求項1に記載の核酸。 - 前記第1置換がアラニン又はアラニンの保存的置換への置換であり、
前記第2置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
前記第3置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項2に記載の核酸。 - A/Hong Kong/4801/14 HAの位置384のアミノ酸に対応するアミノ酸における第1置換であって、この置換は非ロイシンへの置換である第1置換、
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置524のアミノ酸に対応するアミノ酸における第2置換であって、この置換は非システインへの置換である第2置換、及び
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置528のアミノ酸に対応するアミノ酸における第3置換であって、この置換は非システインへの置換である第3置換
を含む請求項1に記載の核酸。 - 前記第1置換がバリン又はバリンの保存的置換への置換であり、
前記第2置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
前記第3置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項4に記載の核酸。 - A/Hong Kong/4801/14 HAの位置392のアミノ酸に対応するアミノ酸における第1置換であって、この置換は非フェニルアラニンへの置換である第1置換、
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置524のアミノ酸に対応するアミノ酸における第2置換であって、この置換は非システインへの置換である第2置換、及び
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置528のアミノ酸に対応するアミノ酸における第3置換であって、この置換は非システインへの置換である第3置換
を含む請求項1に記載の核酸。 - 前記第1置換がアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換への置換であり、
前記第2置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
前記第3置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項6に記載の核酸。 - A/Hong Kong/4801/14 HAの位置431のアミノ酸に対応するアミノ酸における第1置換であって、この置換は非ロイシンへの置換である第1置換、
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置524のアミノ酸に対応するアミノ酸における第2置換であって、この置換は非システインへの置換である第2置換、及び
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置528のアミノ酸に対応するアミノ酸における第3置換であって、この置換は非システインへの置換である第3置換
を含む請求項1に記載の核酸。 - 前記第1置換がメチオニン又はメチオニンの保存的置換への置換であり、
前記第2置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
前記第3置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項8に記載の核酸。 - A/Hong Kong/4801/14 HAの位置382のアミノ酸に対応するアミノ酸における第1置換であって、この置換は非アスパラギンへの置換である第1置換、
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置384のアミノ酸に対応するアミノ酸における第2置換であって、この置換は非ロイシンへの置換である第2置換、
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置524のアミノ酸に対応するアミノ酸における第3置換であって、この置換は非システインへの置換である第3置換、及び
A/Hong Kong/4801/14 HAの位置528のアミノ酸に対応するアミノ酸における第4置換であって、この置換は非システインへの置換である第4置換
を含む請求項1に記載の核酸。 - 前記第1置換がアラニン又はアラニンの保存的置換への置換であり、
前記第2置換がバリン又はバリンの保存的置換への置換であり、
前記第3置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
前記第4置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項10に記載の核酸。 - 前記HA タンパク質が、A/Hong Kong/4801/14 HAの位置525、526又は525及び526のアミノ酸に対応するアミノ酸における置換をさらに含み、位置525のアミノ酸の前記置換が非フェニルアラニンへの置換であり、位置526のアミノ酸の前記置換が非ロイシンへの置換である請求項1から請求項11のいずれか1項に記載の核酸。
- 位置525のアミノ酸の前記置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換であり、位置526のアミノ酸の前記置換がバリン又はバリンの保存的置換への置換である請求項12に記載の核酸。
- 前記アラニンの保存的置換がセリン、グリシン、トレオニン、システイン、又はバリンである請求項3又は請求項11に記載の核酸。
- 前記バリンの保存的置換がイソロイシン、メチオニン、アラニン、又はトレオニンである請求項5、請求項11及び請求項13のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記アスパラギン酸の保存的置換がグルタミン酸、グルタミン、又はセリンである請求項7に記載の核酸。
- 前記メチオニンの保存的置換がイソロイシン、グルタミン、バリン又はフェニルアラニンである請求項9に記載の核酸。
- 前記セリンの保存的置換がトレオニン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、グルタミン酸又はリジンである請求項3、請求項5、請求項7、請求項9及び請求項11のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記ロイシンの保存的置換がイソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン又はバリンである請求項3、請求項5、請求項7、請求項9、請求項11及び請求項13のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項1から請求項19のいずれか1項に記載の核酸によってコードされる改変されたインフルエンザH3ヘマグルチニン(HA)タンパク質。
- 請求項1から請求項19のいずれか1項に記載の核酸によってコードされるHAタンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)。
- 植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子(VLP)の産生方法であって、
a)請求項1から請求項19のいずれか1項に記載の核酸を前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞に導入する工程と、
b)前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記核酸によってコードされるHAタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより前記VLPを産生する工程と
を備える方法。 - 工程a)が、プロトンチャネルタンパク質をコードする第2核酸を導入する工程をさらに備え、工程b)が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記第2核酸によってコードされる前記プロトンチャネルタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションする工程をさらに備える請求項22に記載の方法。
- 前記方法が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、前記VLPを精製する工程c)をさらに備える請求項22又は請求項23に記載の方法。
- 植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子(VLP)の産生方法であって、
a)請求項1から請求項19のいずれか1項に記載の核酸を含む植物、植物の一部分、又は植物細胞を準備する工程と、
b)前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記核酸によってコードされるHAタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより前記VLPを産生する工程と
を備える方法。 - 工程a)の前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞が、プロトンチャネルタンパク質をコードする第2核酸をさらに含み、工程b)が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記第2核酸によってコードされる前記プロトンチャネルタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションする工程をさらに備える請求項25に記載の方法。
- 前記プロトンチャネルタンパク質がインフルエンザA亜型M2タンパク質である請求項23又は請求項26に記載の方法。
- 前記方法が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、前記VLPを精製する工程c)をさらに備える請求項25から請求項27のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項22から請求項28のいずれか1項に記載の方法によって産生されるVLP。
- 前記植物、前記植物の一部分、若しくは植物細胞に由来する1以上の脂質、植物特異的N−グリカン、改変N−グリカン又はこれらの組み合わせをさらに含む請求項29に記載のVLP。
- 抗体又は抗体断片の産生方法であって、請求項21、請求項29又は請求項30に記載のVLPを対象又は宿主動物に投与し、これにより前記抗体又は前記抗体断片を産生する工程を備える方法。
- 請求項31に記載の方法によって産生される抗体。
- 請求項1から請求項19のいずれか1項に記載の組み換え核酸を含む植物、前記植物の一部分、又は植物細胞。
- 請求項13に記載のHAタンパク質又は請求項21、請求項29若しくは請求項30に記載のVLPを含む植物、前記植物の一部分、又は植物細胞。
- 免疫応答を誘導するための組成物であって、有効用量の請求項21、請求項29又は請求項30に記載のVLPと、薬学的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル又は賦形剤とを含む組成物。
- 対象においてインフルエンザ感染に対する免疫を誘導する方法であって、請求項21、請求項29又は請求項30に記載のVLPを前記対象に投与する工程を備える方法。
- 前記VLPが、前記対象に経口で、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に又は皮下に投与される請求項36に記載の方法。
- 植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子(VLP)の産生の収率を高める方法であって、
a)請求項1から請求項19のいずれか1項に記載の核酸を前記植物、前記植物の一部分、若しくは植物細胞に導入する工程、又は請求項1から請求項19のいずれか1項に記載の核酸を含む植物、植物の一部分、若しくは植物細胞を準備する工程と、
b)前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記核酸によってコードされる改変されたインフルエンザHAタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより、未改変インフルエンザHAタンパク質を発現する植物、この植物の一部分、又は植物細胞と比べてより高い収率で前記VLPを産生する工程と
を備える方法。 - 前記方法が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、前記VLPを精製する工程c)をさらに備える請求項38に記載の方法。
- 改変されたインフルエンザH3ヘマグルチニン(HA)タンパク質であって、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み、前記少なくとも1つの置換は、A/Hong Kong/4801/14 HAの位置382、384、392、431、524、525、526又は528のアミノ酸に対応する1以上のアミノ酸において存在する改変されたインフルエンザH3ヘマグルチニン(HA)タンパク質。
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