JP2016514674A - ヘマグルチニンの改善された安定性及び効能 - Google Patents

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Abstract

本発明は、組換えヘマグルチニン製剤、特に組換えインフルエンザヘマグルチニン(rHA)の安定性を改善し、効能を維持する方法に関する。特に、本出願人は、システイン残基を変異させることにより、又は還元剤及びクエン酸ナトリウムとともに製剤することにより、rHA製剤の安定性が著しく改善され得ることを示している。

Description

参照による組込み
関連出願及び参照による組込み
この出願は、2013年3月15日に出願された米国特許出願第13/838,796号、及び2012年4月13日に出願された米国特許仮出願第61/624,222号の優先権及び利益を主張する。
先の出願及びその明細書中又はその審査経過で引用された全ての文献(「出願引用文献」)及び出願引用文献で引用若しくは参照された全ての文献、並びに本明細書で引用又は参照された全ての文献(「本明細書引用文献」)及び本明細書引用文献で引用又は参照された全ての文献、加えて任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、及び本明細書又は本明細書に参照により組み込まれた任意の文献で言及された任意の製品の製品シートが、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において利用することができる。より詳細には、全ての参照文献が、個々の文献が具体的に個別に参照により組み込まれて示されているのと同程度に、参照により組み込まれる。
本発明は、組換えヘマグルチニン製剤、特に組換えインフルエンザヘマグルチニン(rHA)の安定性を改善し、効能を維持する方法に関する。
政府資金調達
この発明は、一部において、BARDA承認番号HHSO100200900106Cに基づく支援を受けた。連邦政府はこの発明に対して一定の権利を有し得る。
流行性インフルエンザは毎年発生し、世界的に重大な病気及び死の一因である。子供は最も攻撃を受け易く、共同体におけるインフルエンザウイルス伝染の大きな要因となる。高齢者及び健康に問題を持つ者は、インフルエンザ感染により合併症及び入院の危険が高まる。
インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)の2つの表面糖タンパク質で構成される高度に多形性の粒子である。HAは、ウイルスの宿主細胞への結合及びウイルスが細胞に侵入する間のウイルス-細胞膜融合を媒介する。インフルエンザウイルスゲノムは、8つの単鎖ネガティブセンスRNAセグメントからなり、このうち4番目に大きなセグメントがHA遺伝子をコードしている。インフルエンザウイルスは、抗原の差異に基づいてA型、B型及びC型に分類される。インフルエンザA型ウイルスは、例えばA/北京/353/89のように、亜型又は型、地理的起源、株番号及び分離年を含む名称で記述される。少なくとも13種のHA亜型(H1〜H13)と9種のNA亜型(N1〜N9)がある。亜型は全て鳥で見つかったものだが、H1〜H3及びN1〜N2だけは、ヒト、ブタ及びウマでも見つかっている[Murphy and Webster,「Orthomyxoviruses」, in Virology, ed. Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., 1091-1152(Raven Press, New York, (1990)]。
HAに対する抗体はウイルスを中和し、インフルエンザによる感染に対する自然免疫の基礎を形成する[Clements,「Influenza Vaccines」, in Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellis, 129-150頁, Butterworth-Heinemann, Stoneham, Mass. 1992]。HA分子の抗原変異は、インフルエンザが頻繁に発生すること及び免疫による感染症制御に限界があることの原因である。
HAの三次元構造及びその細胞受容体であるシアル酸との相互作用が集中的に研究されてきた[Wilsonら,「Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A.degree. resolution」Nature 289:366-378(1981);Weisら, 「Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid」Nature, 333:426-431(1988);Murphy and Webster, 1990]。HA分子は三量体としてビリオン内に存在している。各HAモノマー(HA0)は、単一のジスルフィド結合によって連結された2つの鎖HA1及びHA2として存在している。感染した宿主細胞は約85,000Daの分子量を有する前駆体グリコシル化ポリペプチド(HA0)を産生し、その後、生体内でHA1とHA2とに分解される。
インフルエンザHA特異的な中和IgG及びIgA抗体の存在が、感染症及び病気に対する抵抗性と関係している(Clements、1992)。不活性化全粒子ウイルス又は部分精製型(スプリットサブユニット)のインフルエンザワクチンは、各株由来のHAの量に対して標準化されている。インフルエンザワクチンは、通常3種のインフルエンザ株それぞれに由来する7〜25マイクログラムのHAを含んでいる。
多くの承認されたインフルエンザワクチンは、2種のインフルエンザA亜型(H1N1及びH3N2)及び1種のインフルエンザB亜型ウイルスに由来するホルマリン不活性化全又は化学的なスプリットサブユニットの調製物で構成される。各インフルエンザの流行期に先立って、米国食品医薬品局のワクチン及び関連生物学的製剤諮問委員会(U.S. Food and Drug Administration's Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee)は、来たる流行期に備えて3価インフルエンザワクチン組成物を推奨する。毎年インフルエンザの流行期の前に高リスク者にワクチン接種を行うことが、インフルエンザの影響を縮小させるための最も有効な手段である。現在利用可能なワクチンの限界として、低い利用率、高齢者及び小児での有効性不足、卵での生産(特に卵タンパク質に対してアレルギーを有する者に対して)、抗原変化及び副作用が挙げられる。
インフルエンザA型及びB型ワクチンのためのシードウイルスは、ニワトリの卵の尿膜腔液中に高力価で蓄積する天然株である。代替的には、インフルエンザA型構成成分のための株は、適正な表面抗原遺伝子を有する再集合ウイルスである。再集合ウイルスは、ウイルスゲノムの分節による各親株の特性を有するウイルスである。2以上のインフルエンザウイルス株が細胞に感染するとき、これらのウイルス区分が混合されて両方の親由来の遺伝子の様々な集合体を含む子ウイルスが生成される。
全粒子又はスプリットインフルエンザワクチンによる防御は短期間しか有効でなく、インフルエンザの流行株に抗原連続変異が生じるにつれて減少する。インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン分子にアミノ酸配列変化を有するウイルスの免疫選択の結果として抗原連続変異を生ずる。ワクチン株は、疾病を引き起こすインフルエンザウイルス株と一致していることが理想的である。しかしながら、現在のインフルエンザワクチンの製造プロセスにおいてウイルスの増殖には制限がある。例えば、全てのインフルエンザウイルス株が卵又は哺乳類細胞において十分複製するわけではなく、ウイルスの適合又はウイルス再集合体の構築が必要となる。卵で増殖されたインフルエンザウイルスのヘマグルチニンは、哺乳類細胞で増殖した感染個体由来の一次単離体と比較して、著しい異種性がある[Wangら、Virol. 171 :275-279(1989);Rajakumarら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4154-4158(1990)]。インフルエンザワクチンの選択及び製造の間のHA変化により、抗原的に別個のウイルスの部分集団の混合物となる場合がある。従って、ワクチン中のウイルスは、流行株内の変異型とは異なるものとなる可能性があり、保護レベルは最適以下となり得る。
組換えヘマグルチニン(rHA)に基づいたインフルエンザワクチンFlublok(商標)(例えば米国特許第5,762,939号参照)が、従来の卵由来インフルエンザワクチンの代替手段として米国で最近承認された。ウイルスの複数株由来のrHAは、バキュロウイルスで発現され、精製され、特性決定され、2〜8℃で保存されて、最終製剤となる。しかしながら通常、初期効能の喪失が観察される。この効能の喪失は、他のrHAタンパク質と比較してH3 rHAタンパク質で典型的に大きい。
米国特許第5,762,939号 米国特許第6,245,532号 米国特許第7,964,767号 米国特許第7,955,793号 米国特許第7,927,831号 米国特許第7,527,967号 米国特許第7,521,219号 米国特許第7,416,890号 米国特許第7,413,732号 米国特許第7,393,524号 米国特許第7,329,509号 米国特許第7,303,882号 米国特許第7,285,274号 米国特許第7,261,886号 米国特許第7,223,560号 米国特許第7,192,933号 米国特許第7,101,966号 米国特許第7,070,978号 米国特許第7,018,628号 米国特許第6,852,507号 米国特許第6,814,963号 米国特許第6,806,064号 米国特許第6,555,346号 米国特許第6,511,832号 米国特許第6,485,937号 米国特許第6,472,175号 米国特許第6,461,863号 米国特許第6,428,960号 米国特許第6,420,523号 米国特許第6,403,375号 米国特許第6,368,825号 米国特許第6,342,216号 米国特許第6,338,846号 米国特許第6,326,183号 米国特許第6,310,273号 米国特許第6,284,455号 米国特許第6,261,805号 米国特許第6,245,528号 米国特許第6,225,060号 米国特許第6,190,862号 米国特許第6,183,987号 米国特許第6,168,932号 米国特許第6,126,944号 米国特許第6,096,304号 米国特許第6,090,584号 米国特許第6,087,165号 米国特許第6,057,143号 米国特許第6,042,843号 米国特許第6,013,433号 米国特許第5,985,269号 米国特許第5,965,393号 米国特許第5,939,285号 米国特許第5,919,445号 米国特許第5,891,676号 米国特許第5,871,986号 米国特許第5,869,336号 米国特許第5,861,279号 米国特許第5,858,368号 米国特許第5,843,733号 米国特許第5,840,541号 米国特許第5,827,696号 米国特許第5,824,535号 米国特許第5,789,152号 米国特許第5,753,220号 米国特許第5,750,383号 米国特許第5,686,305号 米国特許第5,665,349号 米国特許第5,641,649号 米国特許第5,639,454号 米国特許第5,605,827号 米国特許第5,605,792号 米国特許第5,583,023号 米国特許第5,571,709号 米国特許第5,521,299号 米国特許第5,516,657号 米国特許第5,322,774号 米国特許第5,290,686号 米国特許第5,244,805号 米国特許第5,229,293号 米国特許第5,194,376号 米国特許第5,186,933号 米国特許第5,169,784号 米国特許第5,162,222号 米国特許第5,147,788号 米国特許第5,110,729号 米国特許第5,091,179号 米国特許第5,077,214号 米国特許第5,071,748号 米国特許第5,011,685号 米国特許第4,973,667号 米国特許第4,879,236号 米国特許第4,870,023号 米国特許第4,745,051号 米国特許第6,693,086号 米国特許第5,057,540号 米国特許第5,650,398号 米国特許第6,524,584号 米国特許第6,645,495号 米国特許第4,689,338号 米国特許第5,238,944号 WO01/095919 WO03/063899
Murphy and Webster,「Orthomyxoviruses」, in Virology, ed. Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., 1091-1152(Raven Press, New York, (1990) Clements,「Influenza Vaccines」, in Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellis, 129-150頁(Butterworth-Heinemann, Stoneham, Mass. 1992) Wilsonら,「Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A.degree. resolution」Nature 289:366-378(1981) Weisら,「Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid」Nature, 333:426-431(1988) Wangら、Virol. 171 :275-279(1989) Rajakumarら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4154-4158(1990) Matthews, E.E.ら, Thrombopoietin receptor activation: transmembrane helix dimerization, rotation, and allosteric modulation. FASEB J, 2011. 25(7): 2234-44頁 Kordyukova, L.V.ら, S acylation of the hemagglutinin of influenza viruses: mass spectrometry reveals site-specific attachment of stearic acid to a transmembrane cysteine. 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より大きな安定性、つまり効能がより長期間保持された代替インフルエンザワクチンが必要とされている。
本出願におけるいずれの文献の引用及び特定も、そのような文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認ではない。
本発明は、1つ又は複数のシステイン変異を含み得る単離された非天然組換えヘマグルチニン(rHA)タンパク質に関する。システイン変異は、rHAタンパク質のカルボキシ末端領域に存在することができ、この領域は膜貫通(TM)及び細胞質(CT)ドメインを含み得る。
本発明は、HAの安定性がジスルフィド架橋によって減少し、このことが効能喪失の主要機序であるらしいという出願人の発見に一部基づくものである。この論点に取り組むために、架橋に関与するシステイン残基を除去する変異を生成する方法と、架橋反応を阻害する製剤にする方法という2つの方法がある。
本出願人は特にH3タンパク質における変異により安定性が増加し、効能がより長く維持されることを実証した。本発明は、1つ又は複数のシステイン変異を含み得る単離された非天然組換えヘマグルチニン(rHA)タンパク質に関する。システイン変異は、rHAタンパク質のカルボキシ末端領域に存在してもよく、この領域が膜貫通(TM)及び細胞質(CT)ドメインを含んでもよい。いずれの制限にも拘束されないが、変異は免疫原性及び有効性に重要であり得る三量体の形成を破壊するものではないと考えられる。更に出願人は、還元剤及び酸化防止剤を関与させて、HAの保存寿命を顕著に改善することができる製剤的アプローチを実証した。
rHAタンパク質は任意のH3タンパク質であることができる。H3タンパク質は、ビクトリア株、パース株、ブリスベン株又はウィスコンシン株から単離されたものであることができる。ビクトリア株は、ビクトリア/361/2011株であってもよい。パース株は、パース/16/2009であってもよい。ブリスベン株は、ブリスベン/16/2007株であってもよく、ウィスコンシン株は、A/ウィスコンシン/67/05株であってもよい。
rHAタンパク質は任意のH1タンパク質であることができる。H1タンパク質は、カリフォルニア株又はソロモン株から単離されたものであることができる。カリフォルニア株は、カリフォルニア/07/2009株であってもよく、ソロモン株はソロモン諸島/03/2006株であってもよい。
別の実施形態では、rHAタンパク質は任意のH2、H5、H7及び/又はH9タンパク質であることができる。
rHAタンパク質は任意のBタンパク質であることができる。Bタンパク質は、ブリスベン株、フロリダ株、オハイオ株、江蘇株又は香港株から単離されたものであることができる。ブリスベン株は、ブリスベン/60/2008株であってもよい。フロリダ株は、フロリダ/04/2006株であってもよく、オハイオ株は、オハイオ/01/2005株であってもよく、江蘇株は、江蘇10/2003株であってもよく、香港株は、香港/330/2001株であってもよい。
本発明は、インフルエンザワクチンのHA抗原の安定性及び/又は効能を増強させるために、非システイン残基となるように変異させた膜貫通又は細胞質システイン残基を有する任意のHAタンパク質を包含する。更に本発明は、本明細書に開示された任意のタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びその発現を包含する。有利にはベクターはバキュロウイルスベクターであり得る。更に本発明は、本明細書に開示された任意のタンパク質並びに/又は本明細書に開示された任意のタンパク質を発現するヌクレオチド配列をコード及び発現するバキュロウイルスベクターを含み得るインフルエンザワクチンに関する。
更に本発明は、酸化防止剤と低毒性の還元剤及びそれらの製剤を添加する工程を含み得るタンパク質ワクチンの安定化方法に関する。一実施形態において、酸化防止剤はシトレートであることができる。酸化防止剤の濃度は、少なくとも約5mg/ml、少なくとも約10mg/ml、又は少なくとも約20mg/mlであることができる。別の実施形態において、還元剤は、チオグリコレート、例えばチオグリコール酸ナトリウム、又はチオグリセロール、例えばモノチオグリセロールであることができる。還元剤の濃度は約0.2mg/mlであることができる。
従って、本発明の目的は、本発明の範囲内に、任意の先行する既知の製品、製品の製造プロセス、及び製品の使用方法を包含するものでなく、出願人は、任意の先行する既知の製品、プロセス又は方法について、権利を留保し、本明細書に免責事項を開示する。更に本発明は、本発明の範囲内に、USPTO(米国特許法第112条第1項)又はEPO(EPC第83条)の記述要件及び実施可能要件に合致しない任意の製品、プロセス、製品の製造、又は製品の使用方法を包含する意図はなく、出願人は任意の前述の製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法について、権利を留保し、本明細書に免責事項を開示することに留意されたい。
本開示、特に請求項及び/又は項において、用語「含む(comprises)」、「含まれた(comprised)」、「含む(comprising)」等は米国特許法に従った意味を有し、例えばこれらの用語は「包含する(includes)」、「包含された(included)」、「包含する(including)」等を意味することができ、用語「から本質的に成る(consisting essentially of)」及び「から本質的に成る(consists essentially of)」等は米国特許法に従った意味を有し、例えば、これらの用語は明確に記載されていない要素を排除しないが、先行技術で見出される要素又は本発明の基本的若しくは新規な特徴に影響を与える要素は排除することに留意されたい。
これら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明によって開示され又は明白となり、包含される。
以下の詳細な説明は、例示として提供されたものであって、記述された特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものではなく、添付の図面と組み合わせることで最適に理解され得るものである。
表は、H3パースの代表的なHA配列と三量体配置で起こり得る全ての可能な対称配向のアミノ酸残基を示している。 図面は、AからGで標識された7つの位置を有する三量体配置を図示している。 図面は、AからGで標識された7つの位置を有する三量体配置を図示しており、1つの可能な配向を示している。5つのシステインのうち3つが界面上にあり、一方で2つが他の三量体とのジスルフィド結合に利用可能となっていることに留意されたい。 H1、B及びH3ヒトインフルエンザ株に由来するヘマグルチニンタンパク質の配列アラインメントを示している。下記にヘマグルチニンタンパク質の膜貫通(TM)ドメイン及び細胞質テール(CT)ドメインの配列アラインメントを示している。システイン残基は黄色で強調している。 2007年〜2011年に生産された亜型B、H1及びH3による組換えヘマグルチニンの平均安定性の傾向と、2010年のH3/パースrHAについての安定性プロフィールを示している。グラフは、2007年〜2011年に製造された生産バッチ及び2010年の流行時に生産されたH3/パースのバッチについて、亜型に応じた時間の関数としての相対的効能を示している。2007年〜2011年の各流行時生産で製造されたrHAの1〜3個のバッチについての相対的効能データを使用して、各亜型についての傾向曲線を作成した。亜型は様々なインフルエンザ株に由来する複数のrHAタンパク質を表している。 H3 rHAタンパク質の精製度を示している。精製されたH3 rHAタンパク質は、1μg/レーン負荷での還元SDS-PAGEゲル分析によって100%の精製度を有する。SDS-PAGEによる精製度についての試験基準は≧85%である。 野生型H3 rHA及びCys変異体はトリプシン耐性があり、rHAタンパク質が適切に折り畳まれ、三量体であることを示している。全てのH3 rHAは分析の試験基準に適合し、HA1及びHA2のバンドが目視できる。 SRIDによる効能を示している。25℃で1カ月後に野生型H3 rHAタンパク質は最も大きな効能低下を示し、約40%の相対的効能で安定した。5Cys H3 rHAの相対的効能は約60%で安定した。3Cys H3 rHAの効能低下は20%未満であり、2Cys H3 rHAは効能低下を示さなかった。3つのCys H3 rHA変異体は全て28日目の相対的効能(RP)についての試験要件を満たしている。試験基準:28日RP変異体rHA≧28日RP野生型rHA 野生型H3 rHAタンパク質及びCys変異体rHAに対する0、7、14及び28日目の非還元及び還元SDS-PAGEプロフィールを示している。 図7Aの非還元SDS-PAGEゲルをCarestream社の分子イメージングソフトウェアを使用して分析した。イメージング分析から得られた強度プロフィールは、試験の0日目に対して示している。 デンシトメトリーを、非還元SDS-PAGEゲルで各時間点において各H3 rHAタンパク質について実施した。単量体rHAタンパク質(HA0)及びより高次の架橋形態のrHAタンパク質(凝集体)のバンド強度について測定した。凝集とHA0との比率を示している。 3Cys及び2Cys変異体についてのRP-HPLCプロフィールは同等であるが、野生型及び5Cys変異体とは異なっている。3Cys及び2Cys rHAは大部分が未架橋型であり、単一ピークとして溶出するが、野生型及び5Cys rHAの場合は様々な架橋タンパク質の集合体であることに基づき複数のピークとして溶出する。架橋rHAの集合体は疎水性の増加によりカラムに保持され、後で溶出される。 WTと変異型rHAについてのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析を示している。SECにおいて、全てのH3 rHAタンパク質が溶出する保持時間は、同じ保持時間である。外挿による分子量が2.4〜2.6MDaの範囲で野生型及び変異型H3 rHAタンパク質について観察された。約70kDaの近似のモノマーMWを使用すると粒子/ロゼットあたりのモノマー数は35〜38と推定される。 野生型H3 rHA及び3つのシステイン変異型rHAタンパク質の代表的な電子顕微鏡(EM)画像を示している。画像は全て各rHAタンパク質の135,000×拡大画像である。黒色バーは100nmを表す。rHAタンパク質サンプルはEM分析に先立っておよそ2カ月間25℃で保存した。野生型及び変異体H3 rHAタンパク質について同様のロゼットサイズ及び密度が観察される。 示差走査蛍光測定(differential scanning fiuorimetry、DSF)を使用したH3 rHA野生型及びシステイン変異体についての熱変性曲線を示している。融解温度(Tm)は、折り畳みが解かれた時に曝露されるタンパク質の疎水性部分に対して親和性を有する色素の蛍光度の増加によって測定される。蛍光強度は、全てのrHAタンパク質について温度の関数(A)としてプロットされ、二次導関数プロット(B)において転移点が更に明白に観察される。 示差走査蛍光測定(differential scanning fiuorimetry、DSF)を使用したH3 rHA野生型及びシステイン変異体についての熱変性曲線を示している。融解温度(Tm)は、折り畳みが解かれた時に曝露されるタンパク質の疎水性部分に対して親和性を有する色素の蛍光度の増加によって測定される。各rHAについての代表的な二次導関数熱変性曲線及び対応するTm値をプロットC〜Fに示す。 示差走査蛍光測定(differential scanning fiuorimetry、DSF)を使用したH3 rHA野生型及びシステイン変異体についての熱変性曲線を示している。融解温度(Tm)は、折り畳みが解かれた時に曝露されるタンパク質の疎水性部分に対して親和性を有する色素の蛍光度の増加によって測定される。各rHAについての代表的な二次導関数熱変性曲線及び対応するTm値をプロットC〜Fに示す。 ウサギ抗H3 rHA抗血清及びヒツジ抗H3 HA抗血清、並びに野生型及びシステイン変異型H3 rHAタンパク質を使用する赤血球凝集阻害(Hemagglutination Inhibition、HI)分析を示している。rHAタンパク質は、逆滴定(BT)の最初の4つのウェルの膠着に至る4HA単位/25μLを有するように標準化した。BTの終点は、列DとEの間の灰色実線として示している。各rHAについて標準化された量を、段階希釈されたウサギ及びヒツジ抗血清と、Ab標識したカラム中で混合した。HI終点はAbカラム中の灰色点線によって示している。完全に赤血球凝集を阻害する抗血清の希釈度がHI力価である。 H3 rHAについての遊離チオール及び遊離Cys-549(ペプチドマッピング)結果を示している。左側には、H3 rHAの異なる製剤についての28日試験における遊離チオール含量の変化を絶対尺度に対して(上図)及び0日目に対して(下図)示している。右側には、28日安定性試験での異なる製剤及び保存条件に対する549位の遊離システインの喪失を示している。 H3 rHAについての相対的な効能喪失及び相対的な遊離チオール喪失を示している。H3 rHAの様々な製剤について相対的効能喪失及び遊離チオール喪失を0日目の値に対してプロットしている。 H3 rHAについての相対的な効能喪失及び相対的な遊離Cys549喪失を示している。H3 rHAの様々な製剤について相対的効能喪失及び遊離Cys549喪失を0日目の値に対してプロットしている。 H1/ブリスベンSRIDの効能を示す。左のパネルは生の効能データ(±SD)であり、右のパネルは0日目に対する相対的な効能である。 H3/ブリスベンSRIDの効能を示す。左のパネルは生の効能データ(±SD)であり、右のパネルは0日目に対する相対的な効能である。 B/ブリスベンSRIDの効能を示す。左のパネルは生の効能データ(±SD)であり、右のパネルは0日目に対する相対的な効能である。 0日目の効能データを示す。 加速条件下での効能喪失を示す。効能喪失(%/日)は、21日間の相対的効能データ(時間の関数としての0日目の効能に対するパーセンテージ)の線形適合から算出した。従って、低い値はより安定であることを表し、高い値は効能喪失が急速であることを表す。上のパネルは、35℃で保存したサンプルによるもので、下のパネルは25℃で保存したサンプルによる。 SDS-PAGEの結果を示す。 効能データ-左のパネルは効能(μg/mL)を示し、右のパネルは、0日目の効能に対して相対的にプロットした効能を示す。トレースは次のとおりである:コントロール-0.035% Triton X-100、濃度0.05%、0.1%及び0.2%のTriton X-100、並びにSTG-シトレート。 SDS-PAGEの結果を0日目のゲルについて示す。各ゲルにおいて、非還元及び還元条件で、コントロール(0.035% Triton X-100)、0.05% Triton X-100(T05)、0.1% Triton X-100(T10)、0.2% Triton X-100(T20)、及びSTG-シトレート製剤について実施した。左側の数字は標準タンパク質の分子量であり、右側の数字は架橋オリゴマー、つまりHA0(単量体)、二量体、三量体等の大きさを表す。 SDS-PAGEの結果を14日目のゲルについて示す。各ゲルにおいて、非還元及び還元条件で、コントロール(0.035% Triton X-100)、0.05% Triton X-100(T05)、0.1% Triton X-100(T10)、0.2% Triton X-100(T20)、及びSTG-シトレート製剤について実施した。左側の数字は標準タンパク質の分子量であり、右側の数字は架橋オリゴマー、つまりHA0(単量体)、二量体、三量体等の大きさを表す。 DLSの結果を示す。コントロール及び0.2%のTriton X-100についての結果は0、7及び14日目の場合について示している。 log10尺度でプロットしたHAI力価の結果のプロットを示している。水平バーは個々のマウスについての力価の結果を示し、円は各グループの全8匹のマウスから計算した平均力価を示す。一部のバーは2以上のマウスについて示されていることに留意されたい。例えば、低用量コントロールでは、3匹のマウスが80の力価を有し、3匹のマウスが40の力価を有する。 HAIの散布図とELISAの結果を示している。各方法による結果を各試験動物の結果と比較してプロットしている。各点は直線に適合し、得られた等式及びR2を示している。 H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較する非還元及び還元SDS-PAGE分析を示している。レーン1は野生型H1 rHAを指し、レーン2は3Cys SDV H1 rHAを指す。 H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAを比較するRP-HPLC分析を示している。 H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAを比較するSEC-HPLC分析を示している。 H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較する示差走査蛍光測定(DSF)分析を示している。 H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較する5℃及び25℃でのrHAタンパク質の相対的効能を示している。 H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較する動的光散乱(dynamic light scattering、DLS)による粒度分析を示している。 B/マサチューセッツのWT rHAと2Cys SDV rHAとを比較する非還元及び還元SDS-PAGE分析を示す。レーン1は野生型B rHAを示し、レーン2は2Cys SDV B rHAを示している。 B/マサチューセッツのWT rHAと2Cys SDV rHAとを比較するRP-HPLC分析を示している。 B/マサチューセッツのWT rHAと2Cys SDV rHAとを比較する動的光散乱分析による粒度分析を示している。 B/マサチューセッツのWT rHAと2Cys SDV rHAとを比較する5℃及び25℃で保存されたrHAタンパク質の相対的効能を示している。
本発明は、一般にタンパク質ワクチンに適用することができる。有利には、タンパク質ワクチンはインフルエンザワクチンである。インフルエンザワクチンは、ヘマグルチニン製剤、有利には組換えヘマグルチニン製剤、特に組換えインフルエンザヘマグルチニン(rHA)を含み得る。特に有利な実施形態において、インフルエンザワクチンは、1価、2価、3価又は4価のワクチンであることができる。本明細書に開示のシステイン変異を有する米国特許第5,762,939号又は同第6,245,532号に記載のワクチンも企図される。一つの有利な実施形態において、ワクチンは、1つ又は複数のシステイン置換及び/又は変異を有する組換えrHAを含むことができる。
ヘマグルチニン(HA)分子は多くのシステインアミノ酸を含んでいる。本出願人の発明は、一部において、カルボキシ末端に位置するヘマグルチニン分子の膜貫通領域及び細胞質領域に存在するシステインに関する。
HAの膜貫通領域は細胞外ヘリックスと連続してαヘリックスを形成すると予測される。αへリックス膜貫通ドメイン(膜二分子層を貫くドメイン)に見出されるシステインは、膜二分子層が非酸化的環境にあることから、自発的には共有結合的ジスルフィド結合に関与しそうにない[Matthews, E.E.ら, Thrombopoietin receptor activation: transmembrane helix dimerization, rotation, and allosteric modulation. FASEB J, 2011. 25(7): 2234-44頁]。同様に、細胞内システインは細胞内の還元的環境に曝露されている。更に、3C-末端システインは、パルミトイル化されている場合がある[Kordyukova, L.V.ら, S acylation of the hemagglutinin of influenza viruses: mass spectrometry reveals site-specific attachment of stearic acid to a transmembrane cysteine. J Virol, 2008. 82(18): 9288-92頁, Kordyukova, L.V.ら, Site-specific attachment of palmitate or stearate to cytoplasmic versus transmembrane cysteines is a common feature of viral spike proteins. Virology, 2010. 398(1): 49-56頁及びSerebryakova, M.V.ら, Mass spectrometric sequencing and acylation character analysis of C -terminal anchoring segment from Influenza A hemagglutinin, Eur J Mass Spectrom(Chichester, Eng), 2006. 12(1): 51-62頁。従って、天然の折り畳まれた状態では、インフルエンザHAにおける膜貫通及び細胞内のシステインは、低レベルのジスルフィド架橋を示すと予測される。しかしながら、HAの発現及び精製プロセスにおいて、これらのシステインは、ジスルフィド架橋を促進する化学的環境に曝される可能性がある。
タンパク質の実際の一次配列にかかわらず、HA分子の膜貫通領域は、少なくとも三量倍で折り畳まれたαへリックスを形成すると予測されている(より高次のオリゴマーも、天然のタンパク質及び出願人のワクチンの両方に存在している)[Markovic, I.ら, Synchronized activation and refolding of influenza hemagglutinin in multimeric fusion machines. J Cell Biol, 2001. 155(5): 833-44頁]。αへリックス膜貫通領域は、例えばプログラムTMHMMで使用されるアルゴリズムで定義することができる[Krogh, A.ら, Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model:application to complete genomes. J Mol Biol, 2001. 305(3):567-80頁, Sonnhammer, E.L., G. von Heijne, and A. Krogh, A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol, 1998. 6: 175-82頁]。細胞内部分はαへリックスを伸長させることができる。図1は、H3パース由来の代表的なHA配列を示し、界面位置を有する7つの可能な対称的αへリックス三量体の立体配置をピンク色で強調している(A及びD)。3又は4のスペーシングを有するアミノ酸をαヘリックスの同じ面に見出すことができるが、これらの位置のシステインは、2つの隣接したヘリックス間でジスルフィド結合を形成することができ、従って共有結合的に連結したヘリックスを形成することができる。へリックスの外側のシステインは、より高次のオリゴマーの共有結合架橋に関与している。HAの膜貫通及び細胞質ドメインの修飾がHAの全体構造に影響を与えることが知られていることから[Kozerski, C.ら, Modification of the cytoplasmic domain of influenza virus hemagglutinin affects enlargement of the fusion pore. J Virol, 2000. 74(16): 7529-37頁, Melikyan, G.B.ら, Amino acid sequence requirements of the transmembrane and cytoplasmic domains of influenza virus hemagglutinin for viable membrane fusion. Mol Biol Cell, 1999. 10(6): 1821-36頁及びMelikyan, G.B.ら, A point mutation in the transmembrane domain of the hemagglutinin of influenza virus stabilizes a hemifusion intermediate that can transit to fusion. Mol Biol Cell, 2000. 11(11): 3765-75頁]、本出願人は、ジスルフィド架橋がHA分子の全体的な安定性及び構造、更にはHAワクチンの効能を変化させ得ることを提唱する。HAワクチンの製造中に生じるこの固有の(非生物学的)環境は、非天然架橋が生じることを可能にする。本明細書で提示される出願人の発見は、HAワクチンの製造及び保存における環境上の制約を克服するものである。
従って、本発明は一部において、rHAタンパク質を安定化させる方法であって、rHAタンパク質における1つ又は複数のシステイン残基を同定する工程と、前記1つ又は複数のシステイン残基を、システインではなく三量体形成を破壊しないアミノ酸残基に変異させる工程とを含むことができ、それによりrHAタンパク質を安定化させる、方法を包含する。システイン残基の同定及び変異、並びに得られた変異が三量体構成を破壊しないことの検証は、当業者にとって周知である。得られた変異タンパク質は、免疫原性及び有効性について試験してもよい。
1つの有利な実施形態において、本発明は、酸化防止剤と低毒性還元剤とを添加する工程を含み得る、タンパク質ワクチンの安定化方法に関する。
別の有利な実施形態において、ワクチンは、1つ又は複数のシステイン変異を有するrHAを含有及び発現する組換えベクターを含むことができる。特に有利な実施形態において、組換えベクターは、バキュロウイルスベクターであり得る。
バキュロウイルスは、バキュロウイルス科のDNAウイルスである。このウイルスは宿主の範囲が狭く、主に昆虫の鱗翅目の種(蝶及び蛾)に限定されていることが知られている。バキュロウイルスのオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus、AcMNPV)は、バキュロウイルスのプロトタイプになっており、感受性のある培養昆虫細胞内で効率的に複製される。AcMNPVは、約130,000塩基対の二重らせん構造の閉環DNAゲノムを有し、宿主域、分子生物学及び遺伝学に関して十分特徴づけられている。
AcMNPVを含む多くのバキュロウイルスが、感染細胞の核内に大きなタンパク質結晶包埋体を形成する。ポリヘドリンと称される単一ポリペプチドは、これらの包埋体のタンパク質質量のおよそ95%を占める。ポリヘドリン遺伝子は、AcMNPVウイルスゲノム中で単一コピーとして存在している。ポリヘドリン遺伝子は、培養細胞中のウイルス複製に必須ではないので、外来遺伝子を発現させるために容易に修飾することができる。外来遺伝子配列は、ポリヘドリンプロモータ配列のちょうど3'に、その遺伝子がポリヘドリンプロモータの転写制御下にあるように、AcMNPV遺伝子に挿入される。
外来遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルスDNAと対象遺伝子配列を含むキメラプラスミドとの間の相同組換えによって構築される。組換えウイルスは、異なったプラークモルホロジーによって検出することができ、均質にするためにプラーク精製することができる。
バキュロウイルスは、真核生物のクローニング及び発現ベクターとして使用するために特に良く適している。バキュロウイルスは、宿主範囲が狭く節足動物に限定されていることから、一般に安全である。米国環境保護庁(EPA)は、昆虫害虫の制御のために3種のバキュロウイルスの使用を認可している。AcMNPVは、EPAにより実験的使用の許可を受けており、作物に対して長年利用されている。
有利な実施形態において、野生型バキュロウイルスは、ベクター、例えば昆虫バキュロウイルスであるオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcMNPV)である[Li JA、Happ B、Schetter C、Oellig C、Hauser C、Kuroda K、Knebel-Morsdorf D、Klenk HD、Doerfler W、The expression of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus genome in insect cells. Vet Microbiol. 1990年6月;23(1-4):73-8]。
米国特許第7,964,767号、同第7,955,793号、同第7,927,831号、同第7,527,967号、同第7,521,219号、同第7,416,890号、同第7,413,732号、同第7,393,524号、同第7,329,509号、同第7,303,882号、同第7,285,274号、同第7,261,886号、同第7,223,560号、同第7,192,933号、同第7,101,966号、同第7,070,978号、同第7,018,628号、同第6,852,507号、同第6,814,963号、同第6,806,064号、同第6,555,346号、同第6,511,832号、同第6,485,937号、同第6,472,175号、同第6,461,863号、同第6,428,960号、同第6,420,523号、同第6,403,375号、同第6,368,825号、同第6,342,216号、同第6,338,846号、同第6,326,183号、同第6,310,273号、同第6,284,455号、同第6,261,805号、同第6,245,528号、同第6,225,060号、同第6,190,862号、同第6,183,987号、同第6,168,932号、同第6,126,944号、同第6,096,304号、同第6,090,584号、同第6,087,165号、同第6,057,143号、同第6,042,843号、同第6,013,433号、同第5,985,269号、同第5,965,393号、同第5,939,285号、同第5,919,445号、同第5,891,676号、同第5,871,986号、同第5,869,336号、同第5,861,279号、同第5,858,368号、同第5,843,733号、同第5,840,541号、同第5,827,696号、同第5,824,535号、同第5,789,152号、同第5,762,939号、同第5,753,220号、同第5,750,383号、同第5,686,305号、同第5,665,349号、同第5,641,649号、同第5,639,454号、同第5,605,827号、同第5,605,792号、同第5,583,023号、同第5,571,709号、同第5,521,299号、同第5,516,657号、同第5,322,774号、同第5,290,686号、同第5,244,
805号、同第5,229,293号、同第5,194,376号、同第5,186,933号、同第5,169,784号、同第5,162,222号、同第5,147,788号、同第5,110,729号、同第5,091,179号、同第5,077,214号、同第5,071,748号、同第5,011,685号、同第4,973,667号、同第4,879,236号、同第4,870,023号又は同第4,745,051号のバキュロウイルスベクターも本発明で企図されている。
別の実施形態において、ベクターは更にグロビンターミネーターを含んでもよい[例えば、Mapendano CK Mol Cell. 2010年11月12日;40(3):410-22, Brennan SO Hemoglobin. 2010;34(4):402-5, Haywood A Ann Hematol. 2010年12月;89(12): 1215-21. Epub 2010年6月22日, Banerjee A PLoS One. 2009年7月9日;4(7):e6193, West S Mol Cell. 2009年2月13日;33(3):354-64, Eberle AB Nat Struct Mol Biol. 2009年1月;16(1):49-55. Epub 2008年12月7日, West S Mol Cell. 2008年3月14日;29(5):600-10, Tsang JC Clin Chem. 2007年12月;53(12):2205-9. Epub 2007年10月19日, Yingzhong Y Gene. 2007年11月15日;403(1-2): 118-24. Epub 2007年8月22日, Foulon K Hemoglobin. 2007年;31(1):31-7, Frischknecht H Haematologica. 2007年3月;92(3):423-4. Review, Wang J J Am Chem Soc. 2006年7月12日;128(27):8738-9, Gromak N Mol Cell Biol. 2006年5月;26(10):3986-96, West S RNA. 2006年4月;12(4): 655 -65, Chan AY Clin Chem. 2006年3月;52(3):536-7, Mo QH J Clin Pathol. 2005年9月;58(9):923-6, Plant KE Mol Cell Biol. 2005年4月;25(8):3276-85, Kynclova E Vnitr Lek. 1999年3月;45(3): 151-4. Czech, Zhang Z Mol Cell. 2004年11月19日;16(4):597-607, Harteveld CL Hemoglobin. 2004年8月;28(3):255-9, Ling J J Biol Chem. 2004年12月3日;279(49):51704-13. Epub 2004年10月1日, Wachtel C RNA. 2004年11月;10(11): 1740-50. Epub 2004年9月23日, Inacio A J Biol Chem. 2004年7月30日;279(31):32170-80. Epub 2004年5月25日, Harteveld CL,Am J Hematol. 2003年10月;74(2):99-103, Skabkina OV J Biol Chem. 2003年5月16日;278(20): 18191-8. Epub 2003年3月19日, Najmabadi H Haematologica. 2002年10月;87(10): 1113-4. 抄録なし, Viprakasit V Hemoglobin. 2002年5月;26(2): 155-62, Sgourou A Br J Haematol. 2002年8月;118(2):671-6, Moura G Yeast. 2002年6月30日;19(9):727-33, Villemure JF J Mol Biol. 2001年10月5日;312(5):963-74, Bozdayi AM J Clin Virol. 2001年4月;21(1):91-101, Harteveld CL Haematologica. 2001年1月;86(l):36-8, Romao L Blood. 2000年10月15日;96(8):2895-901, Gorman L J Biol Chem. 2000年11月17日;275(46):35914-9, Wang Z EMBO J. 2000年1月17日;19(2):295-305, Razin SV J Cell Biochem. 1999年7月1日;74(l):38-49, Dye MJ Mol Cell. 1999年3月;3(3):371-8, Chittum HS Biochemistry. 1998年8月4日;37(31): 10866-70, Thermann R EMBO J. 1998年6月15日:17(12): 3484-94, Norman JA Vaccine. 1997年6月;15(8):801-3, Oshima K Am J Hematol. 1996年5月;52(l):39-41, Yasunaga M Intern Med. 1995年12月;34(12): 1198-200, Carter MS J Biol Chem. 1995年12月1日;270(48):28995-9003, Kobayashi M Mol Cell Probes. 1995年6月;9(3): 175-82, Ellison J Biotechniques. 1994年10月;17(4):742-3, 746-7, 748-53, Angeloni SV Gene. 1994年8月19日;146(1): 133-4, Schull C Nucleic Acids Res. 1994年6月11日;22(11): 1974-80, Divoky V Hum Genet. 1994年1月;93(1):77-8, Tantravahi J Mol Cell Biol. 1993年1月;13(1):578-87, Bailey AD J Biol Chem. 1992年9月15日;267(26): 18398-406, Winichagoon P Biochim Biophys Acta. 1992年8月25日;1139(4):280-6, Roberts S Genes Dev. 1992年8月;6(8): 1562-74, Izban MG Genes Dev. 1992年7月;6(7): 1342-56, Lim SK Mol Cell Biol. 1992年3月;12(3): 1149-61, Safaya S Am J Hematol. 1992年3月;39(3): 188-93, Riley JH Toxicol Pathol. 1992年;20(3 Pt l):367-75, Ashfield R EMBO J. 1991年12月;10(13):4197-207, Enriquez-Harris P EMBO J. 1991年7月;10(7): 1833-42, Wiest DK Mol Cell Biol. 1990年11月;10(11):5782-95, Muller HP Somat Cell Mol Genet. 1990年7月;16(4):351-60, Briggs D Nucleic Acids Res. 1989年10月25日;17(20):8061-71, Lim S EMBO J. 1989年9月;8(9):2613-9, Losekoot M Hum Genet. 1989年8月;83(1):75-8, Fucharoen S J Biol Chem. 1989年5月15日;264(14):7780-3, Atweh GF J Clin Invest. 1988年8月;82(2):557-61, Logan J Proc Natl Acad Sci U S A. 1987年12月;84(23):8306-10, Nakamura T Blood. 1987年9月;70(3):809-13, Shehee WR J Mol Biol 1987年8月20日;196(4):757-67, Reines D J Mol Biol. 1987年7月20日;196(2):299-312, Stolle CA Blood. 1987年7月;70(1):293-300, Hess J J Mol Biol. 1985年7月5日;184(1):7-21, Falck-Pedersen E Cell. 1985年4月;40(4): 897-905, Weintraub H. Cell. 1983年4月;32(4): 1191-203, Kinniburgh AJ Nucleic Acids Res. 1982年9月25日;10(18):5421 -7, Tuite MF Mol Cell Biol. 1982年5月;2(5):490-7, Hansen JN J Biol Chem. 1982年1月25日;257(2): 1048-52, Tuite MF J Biol Chem. 1981年7月25日;256(14):7298-304, Bienz M Nucleic Acids Res. 1980年11月25日;8(22):5169-78, Chang JC Nature. 1979年10月18日;281(5732):602-3, Shaw RF J Mol Evol. 1977年5月13日;9(3):225-30及びGesteland RF Cell 1976年3月;7(3):381-90を参照]。
AcMNPV野生型及び組換えウイルスは、様々な昆虫細胞、例えばツマジロクサヨトウ、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)[鱗翅類(Lepidoptera)、ヤガ科(Noctuidae)]由来の継代細胞株で複製する。S.フルギペルダ(Sf)細胞は、18〜24時間の集団倍加時間を有し、単層又は遊離懸濁培養物中で増殖することができる。組換えバキュロウイルスからのタンパク質産生のために好ましい宿主細胞株は、expresSF+(SF+)(登録商標)である。SF+は、ツマジロクサヨトウ、スポドプテラ・フルギペルダ(鱗翅類、ヤガ科)に由来する非変形で非腫瘍原性の継代細胞株である。SF+は、二酸化炭素の補足無しに28±2℃で増殖する。SF+細胞のための好ましい培養培地は、塩類、ビタミン、糖及びアミノ酸の単純混合物であるPSFMである。ウシ胎仔血清は細胞増殖では使用されない。
[0051]SF+細胞は、18〜24時間の集団倍加時間を有し、遊離懸濁培養物中で増殖する。S.フルギペルダ細胞は、どの既知の哺乳類ウイルスの複製を支援することも報告されていない。
他の実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞株、例えば毛虫細胞であってもよい[例えば、Fung JCら J Ethnopharmacol. 2011年10月31日;138(1):201-11. Epub 2011年9月12日, Lapointe JFら J Invertebr Pathol. 2011年11月;108(3): 180-93. Epub 2011年8月30日, Micheloud GAら J Virol Methods. 2011年12月;178(1-2): 106-16. Epub 2011年8月30日, Nguyen Qら J Virol Methods. 2011年8月;175(2): 197-205. Epub 2011年5月17日, Luo Kら J Insect Sci. 2011;11:6, Marchbank Tら Br J Nutr. 2011年5月;105(9): 1303-10. Epub 2011年1月28日, Tettamanti Gら Methods Enzymol. 2008;451:685-709, Kim HGら Eur J Pharmacol. 2006年9月18日;545(2-3): 192-9. Epub 2006年6月28日, Lynn DE In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2006年5-6月;42(5-6): 149-52, Mao Wら Insect Mol Biol. 2006年4月;15(2): 169-79, Erlandson MAら Can J Microbiol. 2006年3月;52(3):266-71, Waterfield Nら Cell Microbiol. 2005年3月;7(3):373-82, McLean Hら Insect Biochem Mol Biol. 2005年1月;35(1):61-72, Wen Zら Insect Biochem Mol Biol. 2003年9月;33(9):937-47, Miyata Sら infect Immun. 2003年5月;71(5):2404-13, Goodman CLら In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2001年6月;37(6):374-9, Goodman CLら In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2001年6月;37(6):367-73, Yazaki Kら J Electron Microsc(Tokyo). 2000;49(5):663-8, Maruniak JEら Arch Virol. 1999;144(10): 1991-2006, Wittwer Dら Cytokine. 1999年9月;11(9):637-42, Hung CFら Insect Biochem Mol Biol. 1997年5月;27(5):377-85, Castro MEら J Invertebr Pathol. 1997年1月;69(1):40-5, Bozon Vら J Mol Endocrinol. 1995年6月;14(3):277-84, Jahagirdarら Biochem Int. 1991年4月;23(6): 1049-54, Klaiber Kら Neuron. 1990年8月;5(2):221-6及びEnnis TJら Can J Genet Cytol. 1976年9月;18(3):471-7を参照]。本発明は、AcMNPVにより感染され易い昆虫細胞に特に適用可能である。
特に有利な実施形態において、本発明のベクターはインフルエンザの外来遺伝子を発現する。インフルエンザ遺伝子は、ヘマグルチニン、有利には組換えヘマグルチニン、特に任意の組換えインフルエンザヘマグルチニン(rHA)を発現することができる。特に、rHAは、現行のインフルエンザワクチンに製剤されている株、例えば、H1 A/カリフォルニア/07/2009、H3 A/ビクトリア/361/2011、A/テキサス/50/2012、B/マサチューセッツ/2/2012、A/ビクトリア/361/2011及びB型のB/ウィスコンシン/1/2010様;B/湖北=代替物又は湖北様(=B/山形系統)、又はA/Cal/(インフルエンザH1/カリフォルニアヘマグルチニン)から取得することができる。rHAは、更に1価、2価、3価又は4価ワクチン、例えば、2つのB株、又はB/ビクトリア及びB/山形の各系統の代表株を含み得るワクチンの一部であってもよい。別の実施形態において、rHAは、1価、2価、3価又は4価の1部であり得、他の株、例えば、限定されないがH1、H2、H3、H5、H7及び/又はH9株との組み合わせを含んでもよい。
組換えヘマグルチニン抗原は、AcNPV-ヘマグルチニンベクターで感染されたS.フルギペルダ細胞において高レベルで発現する。主要な遺伝子産物は、プロセシングされていない完全長ヘマグルチニン(rHA0)であり、分泌されずに感染細胞の周辺膜に会合して存在する。この組換えHA0は、N-結合高マンノース型グリカンでグリコシル化された分子量68,000のタンパク質である。rHA0が翻訳後に三量体を形成し、これが細胞質膜に蓄積することが証拠づけられている。
感染後、rHA0は、AcNPV-ヘマグルチニン感染細胞の周辺膜から、例えば非変性非イオン系界面活性剤を用いて、又は昆虫細胞から組換えタンパク質を精製するための当業者に既知の他の方法により、例えば限定されないが、濾過及び/又はクロマトグラフィー、例えば親和性若しくは他のクロマトグラフィー、又は抗体結合により、選択的に抽出することができる。界面活性剤に可溶性のrHA0は、例えば、イオン交換及びレクチンアフィニティクロマトグラフィー、又は当業者に公知の他の等価な方法を使用して更に精製してもよい。
精製されたrHA0は、等張化緩衝溶液で再懸濁される。界面活性剤の除去後、rHAが機能的な場合には精製されたrHA0は効率的に赤血球細胞を膠着させる。
rHA0は少なくとも95%の精製度に精製することができる。rHA0はSDS-ポリアクリルアミドゲルにおいて68,000の分子量を有する単一の主ポリペプチドとして優先的に移動する。精製された組換えHA0抗原の四次構造を、電子顕微鏡法、トリプシン耐性、密度沈降分析及び赤血球細胞膠着能力によって検査した。これらのデータから、組換えHA0が三量体を形成し、ロゼット型に集まり得ることが示される。
精製rHA0が細胞を膠着させる定量的能力は、抗原のロット毎の一貫性の尺度として利用することができる。1つのヘマグルチニン単位は、赤血球を用いた標準ヘマグルチニン分析で50%膠着を達成するために必要な抗原の量として定義される。赤血球としては、限定されないが、ニワトリ、モルモット又はハムスターの赤血球が挙げられる。匹敵するデータは、精製rHA0抗原が、インフルエンザビリオン全体で観察される効率と匹敵する効率で赤血球を膠着させることを示す。
本発明は、いくつかのインフルエンザ株に由来する組換えインフルエンザヘマグルチニン(rHA)も発現することができ、例えばカリフォルニア株又はソロモン株(例えば、限定されないが、カリフォルニア/07/2009株又はソロモン諸島/03/2006株)から単離されるH1タンパク質、ブリスベン株、フロリダ株、オハイオ株、江蘇株又は香港株(例えば、限定されないが、ブリスベン/60/2008株、フロリダ/04/2006株、オハイオ/01/2005株、江蘇/10/2003株又は香港/330/2001株)から単離されるBタンパク質、又はビクトリア株、パース株、ブリスベン(Bristane)株又はウィスコンシン株(例えば、限定されないが、ビクトリア/361/2011株、パース/16/2009株、ブリスベン/16/2007株又はA/ウィスコンシン/67/05株)から単離されるH3タンパク質が挙げられる。更に本発明は、本明細書に開示されるシステイン変異を含む将来的インフルエンザ株由来の変異体rHAも企図している。
有利には、上記の参照タンパク質は1つ又は複数の変異を含む。特に、1つ又は複数の変異は、別の残基に変異されたシステイン残基である。特に有利な実施形態において、変異は、図2で強調されたシステイン残基の1つ又は複数の変異を含むことができる。
変異を生成する方法は、当業者において周知である。限定されないが特に有利な実施形態において、H3パースrHAタンパク質にC539A、C546A、C549A、C524A及びC528A変異を生成するためのプライマーとしては、フォワードプライマーとしてCCTTTGCCATATCAgcTTTTTTGCTTgcTGTTGCTTTGTTGGGG、及びリバースプライマーとしてCCCCAACAAAGCAACAgcAAGCAAAAAAgcTGATATGGCAAAGGを含むことができる。別の有利な実施形態において、H3パースrHAタンパク質にC539A、C546A及びC549A変異を生成するためのプライマーとしては、フォワードプライマーとしてGGGGTTCATCATGTGGGCCgcCCAAAAAGGCAACATTAGGgcCAACATTgcCATTTAAGTAAGTACCG及びリバースプライマーとしてCGGTACTTACTTAAATGgcAATGTTGgcCCTAATGTTGCCTTTTTGGgcGGCCCACATGATGAACCCCを含むことができる。別の有利な実施形態において、H3パースrHAタンパク質にC524S及びC528A変異を生成するためのプライマーとしては、フォワードプライマーとしてCCTTTGCCATATCATcTTTTTTGCTTgcTGTTGCTTTGTTGGGG及びリバースプライマーとしてCCCCAACAAAGCAACAgcAAGCAAAAAAgATGATATGGCAAAGGを含むことができる。
別の実施形態において、インフルエンザの外来遺伝子は、任意の他のインフルエンザタンパク質を含んでいてもよい。
他のインフルエンザ株の例としては、限定されないが、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/アイルランド/1378/83(H5N8)(例えば、Taylorら、1988b参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/イギリス/63(H7N3)(例えば、Alexanderら、1979;Rottら、1979;Horimotoら、2001参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/イギリス/66(H6N2)(例えば、Alexanderら、1979参照)、A/ターキー/イギリス/69(H7N2)(例えば、Alexanderら、1979;Horimotoら、2001参照)、A/ターキー/スコットランド/70(H6N2)(例えば、Banksら、2000;Alexanderら、1979参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/イギリス/N28/73(H5N2)(例えば、Alexanderら、1979参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/イギリス/110/77(H6N2)(例えば、Alexanderら、1979参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/イギリス/647/77(H1N1)(例えば、Alexanderら、1979;Karasinら、2002参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/オンタリオ/7732/66(H5N9)(例えば、Slemonsら、1972;Philpottら、1989参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/イギリス/199/79(H7N7)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/オンタリオ/7732/66(H5N9)(例えば、Horimotoら、2001;Panigrahyら、1996参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/アイルランド/1378/85(H5N8)(例えば、Horimotoら、2001;Walkerら、1993参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/イギリス/50-92/91(H5N1)(例えば、Horimotoら、2001;Howardら、2006参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/ウィスコンシン/68(H5N9)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/マサチューセッツ/65(H6N2)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/オレゴン71(H7N3)(例えば、Orlichら、1990参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/オンタリオ/6228/67(H8N4)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/ウィスコンシン/66(H9N2)、(例えば、Zakstel'skaiaら、1977参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/イギリス/647/77(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Alexanderら、1979参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/オンタリオ/6118/68(H8N4)(例えば、Blokら、1982参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/Tur/Ger 3/91(例えば、Zakay-Ronesら、1995参照)、ターキーインフルエンザウイルス株A/ターキー/ミネソタ/833/80(H4N2)(例えば、Gubarevaら、1997参照)ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/インドネシア/03(H5N1)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/FPV/ロストック/1934(例えば、Ohuchiら、1994参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/テキサス/298313/04(例えば、Leeら、2005参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/テキサス/167280-4-/02(例えば、Leeら、2005参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/香港/220/97(例えば、Perkinsら、2001参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/イタリア/8/98(例えば、Capuaら、1999参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ビクトリア/76(H7N7)(例えば、Zambon、2001;Nestorowiczら、1987参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ドイツ/79(H7N7)(例えば、Rohmら、1996参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/スコットランド/59(H5N1)(例えば、Horimotoら、2001;Deら、1988;Woodら、1993参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ペンシルバニア/1370/83(H5N2)(例えば、Beanら、1985;van der Gootら、2002参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ケレタロ-19/95(H5N2)(例えば、Horimotoら、2001;Garciaら、1998参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ケレタロ-20/95(H5N2)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/香港/258/97(H5N1)(例えば、Horimotoら、2001;Webster、1998参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株Aニワトリ/イタリア/1487/97(H5N2)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ライプツィヒ/79(H7N7)(例えば、Horimotoら、2001;Rohmら、1996参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ビクトリア/85(H7N7)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ビクトリア/92(H7N3)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/クイーンズランド/95(H7N3)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/パキスタン/1369/95(H7N2)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/パキスタン/447-4/95(H7N3)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/HK/G9/97(H9N2)(例えば、Lenevaら、2001参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ナコーン-パトム/タイ/CU-K2/2004(H5N1)(例えば、Anwarら、2006;Viseshakulら、2004参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/香港/31.2/2002(H5N1)、(例えば、Anwarら、2006参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ベトナム/C58/04(H5N1)、(例えば、Anwarら、2006参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ベトナム/38/2004(H5N1)、(例えば、Anwarら、2006参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/アラバマ/7395/75(H4N8)、(例えば、Swayneら、1994参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ドイツ/N/49(H10N7)、(例えば、Yamaneら、1981参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/北京/1/94(H9N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/香港/G23/97(H9N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/ペンシルバニア/8125/83(H5N2)(例えば、Karasinら、2002;Shortridgeら、1998参照)、ニワトリインフルエンザウイルス株A/ニワトリ/香港/97(H5N1)(例えば、Chenら、2003参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/安陽/AVL-1/01(例えば、Tumpeyら、2002参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/ニューヨーク/17542-4/86(H9N1)(例えば、Banksら、2000参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/アルバータ/28/76(H4N6)(例えば、Blokら、1982参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/南昌/4-165/2000(H4N6)(例えば、Liuら、2003参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/ドイツ/49(H10N7)(例えば、Blokら、1982参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/黒ガンガモ(Black Duck)/オーストラリア/702/78(H3N8)(例えば、Blokら、1982参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/ベトナム/11/2004(H5N1)、(例えば、Anwarら、2006参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/アルバータ/60/76(H12N5)、(例えば、Baezら、1981参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/香港/196/77(H1)(例えば、Karasinら、2002;Kanegaeら、1994参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/ウィスコンシン/1938/80(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/バイエルン/2/77(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Ottisら、1980参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/バイエルン/1/77(H1N1)(例えば、Ottisら、1980参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/オーストラリア/749/80(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/香港/Y280/97(H9N2)(例えば、Karasinら、2002;Guanら、2000参照)、アヒルインフルエンザウイルス株A/アヒル/アルバータ/35/76 H1N1)(例えば、Austinら、1990参照)、トリインフルエンザウイルス株A/マガモ/グルジェブ(Gurjev)/263/82(H14N5)、(例えば、Kawaokaら、1990参照)、トリインフルエンザウイルス株A/マガモ/PA/10218/84(H5N2)(例えば、Smirnovら、2000参照)、トリインフルエンザウイルス株A/マガモ/アストラハン/244/82(H14N6)(例えば、Karasinら、2002参照)、ガチョウインフルエンザウイルス株A/ガチョウ/広東/1/96(例えば、Xuら、1999参照)、ガチョウインフルエンザウイルス株A/ガチョウ/ライプツィヒ/137-8/79(H7N7)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ガチョウインフルエンザウイルス株A/ガチョウ/香港/W222/97(H6N7)(例えば、Chinら、2002参照)、ガチョウインフルエンザウイルス株A/ガチョウ/ライプツィヒ/187-7/79(H7N7)(例えば、Horimotoら、2001参照)、ガチョウインフルエンザウイルス株A/ガチョウ/ライプツィヒ/192-7/79(H7N7)(例えば、Horimotoら、2001参照)、トリインフルエンザウイルス株A/Env/HK/437-4/99(例えば、Cauthenら、2000参照)、トリインフルエンザウイルス株A/Env/HK/437-6/99(例えば、Cauthenら、2000参照)、トリインフルエンザウイルス株A/Env/HK/437-8/99(例えば、Cauthenら、2000参照)、トリインフルエンザウイルス株A/Env/HK/437-10/99、(例えば、Cauthenら、2000参照)、トリインフルエンザウイルス株A/トリペスト(Fowl plague)ウイルス株/オランダ/27(H7N7)(例えば、Horimotoら、2001;Carterら、1982参照)、トリインフルエンザウイルス株A/トリペストウイルス株/ドブソン/27(H7N7)(例えば、Horimotoら、2001参照)、トリインフルエンザウイルス株A/トリペストウイルス株/ロストック/34(H7N1)(例えば、Horimotoら、2001;Takeuchiら、1994参照)、トリインフルエンザウイルス株A/トリペストウイルス株/エジプト/45(H7N1)(例えば、Horimotoら、2001参照)、トリインフルエンザウイルス株A/トリペストウイルス株/ウェーブリッジ(H7N7)(例えば、Tonewら、1982参照)、トリインフルエンザウイルス株A/アジサシ/南アフリカ61(H5N3)(例えば、Horimotoら、2001;Perkinsら、2002;Walkerら、1992参照)、トリインフルエンザウイルス株A/アジサシ/オーストラリア/G70C/75(H11N9)(例えば、Pruettら、1998参照)、トリインフルエンザウイルス株A/ウズラ/ベトナム/36/O4(H5N1)、(例えば、Anwarら、2006参照)、トリインフルエンザウイルス株A/カモメ/メリーランド/704/77(H13N6)、(例えば、lamnikovaら、1989参照)、トリインフルエンザウイルス株A/ユリカモメ/スウェーデン/5/99(H16N3)(例えば、Fouchierら、2005参照)、トリインフルエンザウイルス株A/セグロカモメ/DE/677/88(H2N8)(例えば、Saitoら、1993参照)、トリインフルエンザウイルス株A/ハクチョウ/イタリア/179/06(H5N1)(例えば、Terreginoら、2006参照)、トリインフルエンザウイルス株A/香港/156/97(A/HK/156/97)(例えば、Lenevaら、2001;Claasら、1998;Cauthenら、2000参照)、トリインフルエンザウイルス株A/ウズラ/HK/G1/97(H9N2)(例えば、Lenevaら、2001参照)、トリインフルエンザウイルス株A/ウズラ/香港/AF157/93(H9N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、トリインフルエンザウイルス株A/コガモ/HK/W312/97(H6N1)(例えば、Lenevaら、2001参照)、トリインフルエンザウイルス株A/ミズナギドリ/西オーストラリア/2576/79(H15N9)(例えば、Rohmら、1996参照)、トリインフルエンザウイルス株A/ミズナギドリ/オーストラリア/72(H6N5)(例えば、Harleyら、1990参照)、トリインフルエンザウイルス株A/香港/212/03(例えば、Shinyaら、2005参照)、トリインフルエンザウイルス株A/イギリス/321/77(H3N2)(例えば、Hauptmannら、1983参照)、トリ起源のトリパンデミックインフルエンザA型ウイルス(例えば、Audsleyら、2004参照)トリH5N1インフルエンザウイルス、トリH7N1インフルエンザ株(例えば、Foniら、2005参照)、トリH9N2インフルエンザウイルス(例えば、Lenevaら、2001参照)、及びトリインフルエンザウイルス低温適応(ca)及び温度感受性(ts)マスタードナー株、A/レニングラード/134/17/57(H2N2)(例えば、Youilら、2004参照)が挙げられ、これらの開示は参照により組み込まれる。
本発明の方法で使用し得る他のインフルエンザ株としては、限定されないが、ウマインフルエンザウイルス(A/Equi 2(H3N8)、ニューマーケット1/93)(例えば、Mohlerら、2005;Nayakら、2005参照)、ウマ-2インフルエンザウイルス(EIV;亜型H3N8)(例えば、Linら、2001参照)、ウマ-2インフルエンザウイルス、A/ウマ/ケンタッキー/1/91(H3N8)(例えば、Youngnerら、2001参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ベルリン/2/91(H3N8)(例えば、Ilobiら、1998参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ケンブリッジ/1/63(H7N7)(例えば、Gibsonら、1992参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/プラハ/1/56(H7N7)(例えば、Karasinら、2002;Appletonら、1989参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Eq/ケンタッキー/98(例えば、Crouchら、2004参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Equi 2(ケンタッキー81)(例えば、Shortら、1986;Hornerら、1988参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ケンタッキー/1/81(Eq/Ky)(例えば、Breathnachら、2004参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ケンタッキー/1/81(H3N8)(例えば、Olsenら、1997;Morleyら、1995;Ozakiら、2001;Sugiuraら、2001;Gotoら、1993参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ケンタッキー/1/91(H3N8)(例えば、Youngnerら、2001参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ケンタッキー/1277/90(Eq/ケンタッキー)(例えば、Websterら、1993参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ケンタッキー/2/91(H3N8)(例えば、Donofrioら、1994参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ケンタッキー/79(H3N8)(例えば、Donofrioら、1994参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ケンタッキー/81(例えば、Sugiuraら、2001参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ケンタッキー/91(H3N8)(例えば、Grossら、1998参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ-2/ケンタッキー/95(H3N8)(例えば、Heldensら、2004参照)及びウマインフルエンザウイルス株A/ウマ-2/ケンタッキー/98(例えば、Chambersら、2001参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Eq/ニューマーケット/1/77(例えば、Lindstromら、1998参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Eq/ニューマーケット/5/03(例えば、Edlund Toulemondeら、2005参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Equi 2(H3N8)、ニューマーケット 1/93(例えば、Mohlerら、2005;Nayakら、2005参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Equi-2/ニューマーケット-1/93(例えば、Heldensら、2002参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ニューマーケット/2/93(例えば、Wattrangら、2003参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ニューマーケット/79(H3N8)(例えば、Duhautら、2000;Nobleら、1994;Duhautら、1998;Hannantら、1989;Hannantら、1989;Hannantら、1988;Richardsら、1992;Heldensら、2004参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ニューマーケット/1/77(H7N7)(例えば、Gotoら、1993;Sugiuraら、2001参照)及びウマインフルエンザウイルス株A/ウマ-2/ニューマーケット-2/93(例えば、Heldensら、2004参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Eq/マイアミ/63(H3N8)(例えば、van Maanenら、2003参照)、A/Equi/1(プラハ株)(例えば、Hornerら、1988;Shortら、1986参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Equi 2(マイアミ)(例えば、Shortら、1986参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Equi-1/プラハ/56(Pr/56)(例えば、Heldensら、2002参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Equi-2/サフォーク/89(Suf/89)(例えば、Heldensら、2002参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ2/サセックス/89(H3N8)(例えば、Mumfordら、1994参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/サセックス/89(例えば、Wattrangら、2003参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ-2/サスカツーン/90(例えば、Chambersら、2001参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/プラハ/1/56(H7N7)(例えば、Donofrioら、1994;Morleyら、1995参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/マイアミ/1/63(H3N8)(例えば、Morleyら、1995;Ozakiら、2001;Thomsonら、1977;Mumfordら、1988;Donofrioら、1994;Mumfordら、1983参照)、A/愛知/2/68(H3N2)(例えば、Ozakiら、2001参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/東京/2/71(H3N8)(例えば、Gotoら、1993参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Eq/ラプラタ1/88(例えば、Lindstromら、1998参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/吉林/1/89(Eq/吉林)(例えば、Websterら、1993参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/アラスカ/1/91(H3N8)(例えば、Websterら、1993参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/サスカツーン/1/91(H3N8)(例えば、Morleyら、1995参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ローマ/5/91(H3N8)(例えば、Sugiuraら、2001参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ラプラタ/1/93(H3N8)(例えば、Ozakiら、2001参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/ウマ/ラプラタ/1/93(LP/93)(例えば、Sugiuraら、2001参照)、ウマインフルエンザウイルス株A/Eq/ホラント/1/95(H3N8)(例えば、van Maanenら、2003参照)及びウマインフルエンザウイルス株A/Eq/ホラント/2/95(H3N8)(例えば、van Maanenら、2003参照)、ヒトインフルエンザウイルスA(H3N2)単離体(例えば、Abedら、2002参照)、ヒトインフルエンザウイルスA/メンフィス/1/71(H3N2)(例えば、Suzukiら、1996参照)、ヒトインフルエンザウイルスA/南昌/933/95(H3N2)ウイルス(例えば、Scholtissekら、2002参照)、ヒトインフルエンザウイルスA/PR/8/34(H1N1)ウイルス(例えば、Scholtissekら、2002参照)、ヒトインフルエンザウイルスA/シンガポール/57(H2N2)ウイルス(例えば、Scholtissekら、2002参照)、インフルエンザウイルスA/(例えば、Chareら、2003参照)、インフルエンザウイルスA/HK/213/03(例えば、Guanら、2004;Anwarら、2006参照)、インフルエンザウイルス株A/HK/483/97(例えば、Cheungら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/HK/486/97(例えば、Cheungら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/タイ/5(KK-494)/2004(H5N1)(例えば、Anwarら、2006参照)、インフルエンザウイルス株A PR/8/34(PR8)ウイルス株(H1N1亜型)(例えば、Mantaniら、2001参照)、インフルエンザウイルス株A/愛知/2/68(H3N2)(例えば、Miyamotoら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/アナーバー/6/60低温適応ウイルス株(例えば、Treanorら、1994参照)、インフルエンザウイルス株A/北京32/92(H3N2)(例えば、Zakay-Ronesら、1995参照)、インフルエンザウイルス株A/シャーロッツビル/31/95(H1N1)(例えば、Gubarevaら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/川崎/86(H1N1)ウイルス株(例えば、Staschkeら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/韓国/82(H3N2)(例えば、Treanorら、1994参照)、インフルエンザウイルス株A/レニングラード/134/57(例えば、Egorovら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/NWS/33(H1N1)(例えば、Sidwellら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/PR/8/34(H1N1)(例えば、Miyamotoら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/PR8/34(例えば、Nunes-Correiaら、1999;Treeら、2001参照)、インフルエンザウイルス株A/プエルトリコ(PR)/8/34(例えば、Egorovら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/プエルトリコ/8-マウントサイナイ(例えば、Mazanecら、1995参照)、インフルエンザウイルス株A/山東(Shangdong)9/93(H3N2)(例えば、Zakay-Ronesら、1995;Sidwellら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/シンガポール(Shingapol)/1/57(H2N2)(例えば、Miyamotoら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/シンガポール 6/86(H1N1)(例えば、Zakay-Ronesら、1995参照)、インフルエンザウイルス株A/シンガポール/1/57(H2N2)(例えば、Bantiaら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/テキサス/36/91(H1N1)(例えば、Zakay-Ronesら、1995参照)、インフルエンザウイルス株A/テキサス/36/91(H1N1)ウイルス株(例えば、Gubarevaら、2001;Halperinら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/テキサス/36/91(H1N1)(例えば、Haydenら、1994参照)、インフルエンザウイルス株A/ウドン/72ウイルス感染(例えば、Shimizuら、1999参照)、インフルエンザウイルスA/ビクトリア/3/75(H3N2)(例えば、Sidwellら、1998参照)、インフルエンザウイルスA/バージニア/88(H3N2)(例えば、Haydenら、1994参照)、インフルエンザウイルスA/WSN/33(H1N1)(例えば、Luら、2002参照)、インフルエンザウイルスA/WSN/33(例えば、Gujuluvaら、1994参照)、インフルエンザウイルスB(例えば、Chareら、2003参照)、インフルエンザウイルスB/アナーバー 1/86(例えば、Zakay-Ronesら、1995参照)、インフルエンザウイルスB/ハルビン/7/94(例えば、Halperinら、1998参照)、インフルエンザウイルスB/香港/5/72(例えば、Sidwellら、1998参照)、インフルエンザウイルスB/リー/40(例えば、Miyamotoら、1998参照)、インフルエンザウイルスB/ビクトリア群(例えば、Nakagawaら、1999参照)、インフルエンザウイルスB/山形/16/88(例えば、Zakay-Ronesら、1995参照)、インフルエンザウイルスB/山形群(例えば、Nakagawaら、1999参照)、インフルエンザウイルスB/山梨/166/98(例えば、Hoffmannら、2002参照)、インフルエンザウイルスC(例えば、Chareら、2003参照)、インフルエンザウイルス株A/Equi/2/キルデア/89(例えば、Quinlivanら、2004参照)、インフルエンザウイルスB型/パナマ 45/90(例えば、Zakay-Ronesら、1995参照)、生、低温適応、温度感受性(ca/ts)ロシアインフルエンザAワクチン(例えば、Palkerら、2004参照)、ブタH1及びH3インフルエンザウイルス(例えば、Gambaryanら、2005参照)、ブタインフルエンザAウイルス(例えば、Landoltら、2005参照)、ブタインフルエンザウイルス(SIV)(例えば、Clavijoら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルスA/Sw/Ger 2/81(例えば、Zakay-Ronesら、1995参照)、ブタインフルエンザウイルスA/Sw/Ger 8533/91(例えば、Zakay-Ronesら、1995参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/125/97(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Karasinら、2006参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/136/97(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/163/97(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/164/97(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/166/97(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/168/97(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/235/97(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Olsenら、2000参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/238/97(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Ayora-Talaveraら、2005参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/457/98(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/458/98(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Karasinら、2006参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/464/98(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Karasinら、2006参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/インディアナ/1726/88(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Macklinら、1998参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/インディアナ/9K035/99(H1N2)(例えば、Karasinら、2002;Karasinら、2000参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ネブラスカ/1/92(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ケベック/91(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ケベック/81(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ニュージャージー/11/76(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/愛媛/1/80(H1N2)(例えば、Karasinら、2002;Neromeら、1985参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/イギリス/283902/93(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイ
ルス株A/ブタ/イギリス/195852/92(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Brownら、1993参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ドイツ/8533/91(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ドイツ/2/81(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ネブラスカ/209/98(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、A/ブタ/アイオワ/533/99(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/アイオワ/569/99(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ミネソタ/593/99(H3N2)(例えば、Karasinら、2002;Ayora-Talaveraら、2005参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/アイオワ/8548-1/98(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ミネソタ/9088-2/98(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/テキサス/4199-2/98(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/オンタリオ/41848/97(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ノースカロライナ/35922/98(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、/ブタ/コロラド/1/77(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/香港/3/76(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/香港/13/77(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/長崎/1/90(H1N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/長崎/1/89(H1N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/1915/88(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/アイオワ/17672/88(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/テネシー/24/77(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/オンタリオ/2/81(H1/N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/ウィスコンシン/1/67(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/イタリア/1521/98(H1N2)(例えば、Marozinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/イタリア/839/89(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、ブタインフルエンザウイルス株A/ブタ/香港/126/82(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/アイダホ/4/95(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/ヨハネスブルグ/33/94(H3N2)(例えば、Karasinら、2002;Johanssonら、1998参照)、インフルエンザウイルス株A/バンコク/1/79(H3N2)(例えば、Karasinら、2002;Nelsonら、2001参照)、インフルエンザウイルス株A/ウドン/72(H3N2)(例えば、Karasinら、2002;Markoffら、1982参照)、インフルエンザウイルス株A/北海道/2/92(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/タイ/KAN-1/04(例えば、Puthavathanaら、2005;Amonsinら、2006参照)、インフルエンザウイルス株A/イギリス/1/53(例えば、Govorkova EAら、1995参照)、インフルエンザウイルス株A/ベトナム/3046/2004(H5N1)、(例えば、Anwarら、2006参照)、インフルエンザウイルス株A/ベトナム/1203/2004(H5N1)、(例えば、Anwarら、2006;Gaoら、2006参照)、インフルエンザウイルス株A/トラ/タイ/SPB-1(H5N1)、(例えば、Anwarら、2006参照)、インフルエンザウイルス株A/日本/305/57(H2N2)(例えば、Naeveら、1990;Brownら、1982参照)、インフルエンザウイルス株A/足立/2/57(H2N2)(例えば、Gethingら、1980参照)、インフルエンザウイルス株A/ラクダ/モンゴル/82(H1N1)(例えば、Yamnikovaら、1993参照)、インフルエンザウイルス株A/RI/5/57(H2N2)(例えば、Ellemanら、1982参照)、インフルエンザウイルス株A/クジラ/メイン/1/84(H13N9)(例えば、Airら、1987参照)、インフルエンザウイルス株A/台湾/1/86(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Brown、1988参照)、インフルエンザウイルス株A/バイエルン/7/95(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/USSR/90/77(H1N1)(例えば、Karasinら、2002;Iftimoviciら、1980参照)、インフルエンザウイルス株A/武漢/359/95(H3N2)(例えば、Karasinら、2002;Hardyら、2001参照)、インフルエンザウイルス株A/香港/5/83(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/メンフィス/8/88(H3N2)(例えば、Karasinら、2002;Hattaら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/北京/337/89(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/上海/6/90(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/秋田/1/94(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/秋田/1/95(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/メンフィス/6/90(H3N2)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株A/ウドン/307/72(H3N2)(例えば、Karasinら、2002;Iuferovら、1984参照)、インフルエンザウイルス株A/シンガポール/1/57(H2N2)(例えば、Karasinら、2002;Zhukovaら、1975参照)、インフルエンザウイルス株A/オハイオ/4/83(H1N1)(例えば、Karasinら、2002参照)、インフルエンザウイルス株メイディンダービーイヌ腎臓(Madin Darby Canine Kidney、MDCK)由来細胞株(例えば、Halperinら、2002参照)、マウス適応インフルエンザウイルス株A/貴州/54/89(H3N2亜型)(例えば、Nagaiら、1995参照)、マウス適応インフルエンザウイルスA/PR/8/34(A/PR8)(例えば、Nagaiら、1995参照)、マウス適応インフルエンザウイルスB/茨城/2/85(例えば、Nagaiら、1995参照)、ロシア弱毒生インフルエンザワクチンドナー株A/レニングラード/134/17/57、A/レニングラード(Leningad)/134/47/57及びB/USSR/60/69(例えば、Audsleyら、2005参照)が挙げられ、これらの開示は参照により組み込まれる。
本発明は、酸化防止剤と低毒性還元剤とを添加する工程を含み得る、タンパク質ワクチンの安定化方法に関する。
一実施形態において、酸化防止剤は有利にはシトレートであり得る。シトレートは、1つ、2つ又は3つの陽性対イオン、つまりカチオンを有する塩の形態であることができる。カチオンは単原子であっても多原子であってもよい。シトレートに対して適切なカチオンの例としては、限定されないが、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類金属カチオン、遷移金属カチオン及びアンモニウムカチオンが挙げられる。適切なアルカリ金属カチオンの例としては、限定されないが、Na+、K+、Li+等が挙げられる。適切なアルカリ土類金属カチオンの例としては、限定されないが、Ca2+、Mg2+等が挙げられる。適切な遷移金属カチオンの例としては、限定されないが、Fe3+、Zn2+等が挙げられる。シトレート中の対イオンは同一であっても異なっていてもよい。例えば、シトレートは、アンモニウム(NH4 -)カチオン及び第二鉄(Fe3+)カチオンを有してもよく、例えばアンモニウム第二鉄シトレートであってもよい。シトレートは、クエン酸(C3H5O(COO)3 3-)の共役塩基を指す場合もあり、クエン酸のエステルを指す場合もある。シトレートは、塩、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム又はクエン酸三ナトリウムのような塩であり得る。シトレートは食品添加物E331であってもよい。別の実施形態では、シトレートはエステル、例えばクエン酸トリエチルであってもよい。
一般に、本発明において企図される酸化防止剤は、任意の還元剤、例えば、チオール、アスコルビン酸、若しくはポリフェノール又はそれらの任意の誘導体であり得る。例えば、酸化防止剤は、限定されないが、アスコルベート、トコフェロール、カロテノイド、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)又はラクテートであり得る。
チオグリコレートはチオグリコール酸HSCH2CO2Hの共役塩基である。チオグリコレートは、少なくとも1つの陽性対イオン、つまりカチオンを有する塩の形態であることができる。カチオンは単原子であっても多原子であってもよい。チオグリコレートに対する適切なカチオンの例としては、限定されないが、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類金属カチオン、遷移金属カチオン及びアンモニア(NH4 +)カチオンが挙げられる。適切なアルカリ金属カチオンの例としては、限定されないが、Na+、K+、Li+等が挙げられる。適切なアルカリ土類金属カチオンの例としては、限定されないが、Ca2+、Mg2+等が挙げられる。適切な遷移金属カチオンの例としては、限定されないが、Fe3+、Zn2+等が挙げられる。
本発明で企図されるチオール還元剤としては、限定されないが、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスリトール(DTE)、システイン、N-アセチルシステイン、2-メルカプトエタノール、メチルチオグリコレート、3-メルカプト-1,2-プロパンジオール(モノチオグリセロール)、3-メルカプトプロピオン酸、チオグリコール酸、トリチオグリセロール(1,2,3-トリメルカプトプロパン)、1,2-ジチオグリセロール(ジメルカプロール)、グルタチオン、ジチオブチルアミン、チオ酢酸、メソ-2,3-ジメルカプトコハク酸又は2,3-ジメルカプトプロパン-1-スルホン酸が挙げられる。
酸化防止剤の濃度は、少なくとも約0.5mg/ml、少なくとも約1mg/ml、少なくとも約2mg/ml、少なくとも約3mg/ml、少なくとも約4mg/ml、少なくとも約5mg/ml、少なくとも約6mg/ml、少なくとも約7mg/ml、少なくとも約8mg/ml、少なくとも約9mg/ml、少なくとも約10mg/ml、少なくとも約11mg/ml、少なくとも約12mg/ml、少なくとも約13mg/ml、少なくとも約14mg/ml、少なくとも約15mg/ml、少なくとも約16mg/ml、少なくとも約17mg/ml、少なくとも約18mg/ml、少なくとも約19mg/ml、少なくとも約20mg/ml、少なくとも約21mg/ml、少なくとも約22mg/ml、少なくとも約23mg/ml、少なくとも約24mg/ml、少なくとも約25mg/ml、少なくとも約26mg/ml、少なくとも約27mg/ml、少なくとも約28mg/ml、少なくとも約29mg/ml、少なくとも約30mg/ml、少なくとも約31mg/ml、少なくとも約32mg/ml、少なくとも約33mg/ml、少なくとも約34mg/ml、少なくとも約35mg/ml、少なくとも約36mg/ml、少なくとも約37mg/ml、少なくとも約38mg/ml、少なくとも約39mg/ml、少なくとも約40mg/ml、少なくとも約41mg/ml、少なくとも約42mg/ml、少なくとも約43mg/ml、少なくとも約44mg/ml、少なくとも約45mg/ml、少なくとも約46mg/ml、少なくとも約47mg/ml、少なくとも約48mg/ml、少なくとも約49mg/ml、少なくとも約50mg/ml、少なくとも約55mg/ml、少なくとも約60mg/ml、少なくとも約65mg/ml、少なくとも約70mg/ml、少なくとも約75mg/ml、少なくとも約80mg/ml、少なくとも約85mg/ml、少なくとも約90mg/ml、少なくとも約95mg/ml、少なくとも約100mg/ml、少なくとも約110mg/ml、少なくとも約120mg/ml、少なくとも約130mg/ml、少なくとも約140mg/ml、少なくとも約150mg/ml、少なくとも約160mg/ml、少なくとも約170mg/ml、少なくとも約180mg/ml、少なくとも約190mg/ml又は少なくとも約200mg/mlであることができる。有利には、前記濃度は、少なくとも約5mg/ml、少なくとも約10mg/ml、又は少なくとも約20mg/mlである。
別の実施形態において、還元剤は、チオグリコール酸ナトリウム又はモノチオグリセロールであることが有利であり得る。還元剤は、チオグリコール酸、その誘導体又はその塩、例えばチオグリコール酸カルシウム、チオグリコール酸ナトリウム又はチオグリコール酸アンモニウムであり得る。
還元剤の濃度は、約0.02mg/ml、約0.03mg/ml、約mg/ml、約0.04mg/ml、約0.05mg/ml、約0.06mg/ml、約0.07mg/ml、約0.08mg/ml、約0.09mg/ml、約0.1mg/ml、約0.11mg/ml、約0.12mg/ml、約0.13mg/ml、約mg/ml、約0.14mg/ml、約0.15mg/ml、約0.16mg/ml、約0.17mg/ml、約0.18mg/ml、約0.19mg/ml、約0.2mg/ml、約0.21mg/ml、約0.22mg/ml、約0.23mg/ml、約mg/ml、約0.24mg/ml、約0.25mg/ml、約0.26mg/ml、約0.27mg/ml、約0.28mg/ml、約0.29mg/ml、約0.3mg/ml、0.31mg/ml、約0.32mg/ml、約0.33mg/ml、約mg/ml、約0.34mg/ml、約0.35mg/ml、約0.36mg/ml、約0.37mg/ml、約0.38mg/ml、約0.39mg/ml、約0.4mg/ml、約0.41mg/ml、約0.42mg/ml、約0.43mg/ml、約mg/ml、約0.44mg/ml、約0.45mg/ml、約0.46mg/ml、約0.47mg/ml、約0.48mg/ml、約0.49mg/ml又は約0.5mg/mlであり得る。有利には、濃度は約0.2mg/mlである。
更に本発明は、界面活性剤を添加する工程を含み得る、タンパク質ワクチンの安定化方法に関する。
一実施形態では、界面活性剤は、有利にはSpan、Tween及び/又はTriton(例えば、限定されないが、Triton X-100、Triton N-101、Triton 720及び/又はTriton X-200等)であり得る。親水性ポリエチレンオキシド基と炭化水素系親油性又は疎水性基を有する両イオン性界面活性剤も本発明において企図され得る。エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのトリブロックコポリマーを含み得る任意のプルロニック界面活性剤も本発明で企図される。酸化防止剤の濃度は、少なくとも約0.005%(v/v)、少なくとも約0.01%(v/v)、少なくとも約0.02%(v/v)、少なくとも約0.03%(v/v)、少なくとも約0.04%(v/v)、少なくとも約0.05%(v/v)、少なくとも約0.06%(v/v)、少なくとも約0.07%(v/v)、少なくとも約0.08%(v/v)、少なくとも約0.09%(v/v)、少なくとも約0.1%(v/v)、少なくとも約0.11%(v/v)、少なくとも約0.12%(v/v)、少なくとも約0.13%(v/v)、少なくとも約0.14%(v/v)、少なくとも約0.15%(v/v)、少なくとも約0.16%(v/v)、少なくとも約0.17%(v/v)、少なくとも約0.18%(v/v)、少なくとも約0.19%(v/v)、少なくとも約0.2%(v/v)、少なくとも約0.21%(v/v)、少なくとも約0.22%(v/v)、少なくとも約0.23%(v/v)、少なくとも約0.24%(v/v)、少なくとも約0.25%(v/v)、少なくとも約0.26%(v/v)、少なくとも約0.27%(v/v)、少なくとも約0.28%(v/v)、少なくとも約0.29%(v/v)、少なくとも約0.3%(v/v)、少なくとも約0.31%(v/v)、少なくとも約0.32%(v/v)、少なくとも約0.33%(v/v)、少なくとも約0.34%(v/v)、少なくとも約0.35%(v/v)、少なくとも約0.36%(v/v)、少なくとも約0.37%(v/v)、少なくとも約0.38%(v/v)、少なくとも約0.39%(v/v)、少なくとも約0.40%(v/v)、少なくとも約0.41%(v/v)、少なくとも約0.42%(v/v)、少なくとも約0.43%(v/v)、少なくとも約0.44%(v/v)、少なくとも約0.45%(v/v)、少なくとも約0.46%(v/v)、少なくとも約0.47%(v/v)、少なくとも約0.48%(v/v)、少なくとも約0.49%(v/v)、少なくとも約0.5%(v/v)、少なくとも約0.55%(v/v)、少なくとも約0.6%(v/v)、少なくとも約0.65%(v/v)、少なくとも約0.7%(v/v)、少なくとも約0.75%(v/v)、少なくとも約0.8%(v/v)、少なくとも約0.85%(v/v)、少なくとも約0.9%(v/v)、少なくとも約0.95%(v/v)、少なくとも約1%(v/v)、少なくとも約1.1%(v/v)、少なくとも約1.2%(v/v)、少なくとも約1.3%(v/v)、少なくとも約1.4g/ml、少なくとも約1.5%(v/v)、少なくとも約1.6%(v/v)、少なくとも約1.7%(v/v)、少なくとも約1.8%(v/v)、少なくとも約1.9%(v/v)又は少なくとも約2%(v/v)であり得る。有利には、前記濃度は、少なくとも約0.05%(v/v)、少なくとも約0.1%(v/v)、又は少なくとも約0.2%(v/v)である。
本発明の有効性はいくつかの方法で試験することができる。様々な分析技術を利用して、タンパク質分子の化学的分解の検出、観察及び特性決定をすることができる(Pharm Biotechnol、2002;13:1-25)。例えば、非還元条件下の硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)は、タンパク質の質量及びジスルフィド架橋の大きな変化を検出することができる。逆相及びイオン交換クロマトグラフィー方法は、酸化及び脱アミドを決定するためにそれぞれ有用である。質量分析をタンパク質化学分野に適用することは、タンパク質分子の化学的変化を検知するために非常に貴重な技術であることがわかった(Free Radical Biology & Medicine. 2006;41:1507-1520及びProtein Science. 2000;9:2260-2268)。ペプチドマッピングと質量分析との組み合わせは、特定のアミノ酸残基の化学修飾を検出、特性決定するために、製薬産業において一般に使用されている。タンパク質は、最初に一次配列の切断部位に基づいて特定のセットのペプチドを生産するように、1つ又は複数の酵素を用いて分解される。これらのペプチドは、質量分析によって直接(つまりマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF))、又はクロマトグラフィー分離後の質量分析(つまり液体クロマトグラフィー-質量分析、LC-MS)によって分析することができる。ペプチドの質量電荷比(m/z)の変化は、化学的修飾の指標であることができ、他の分析技術、例えばタンデム質量分析(MS/MS)(Biotechniques. 2006;40:790-798)によって更に精査することもできる。
rHAは、インフルエンザワクチンに関する分野において当業者に公知の方法及び材料を使用して、単独で又は他のインフルエンザ抗原と組み合わせて、製剤又はパッケージすることができる。好ましい実施形態においては、2種のA株及び1種のB株由来のHAタンパク質を組み合わせて多価ワクチンを形成する。
特に好ましい実施形態において、HAは、HAタンパク質に対する免疫原の応答を増強させるために有効な量のアジュバントと組み合わされる。ここでヒトにおいて広く使用されている唯一のアジュバントは、ミョウバン(リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)である。研究及び獣医学的用途で使用されているサポニン及びその精製構成成分Quil A、フロインド完全アジュバント並びに他のアジュバントは、毒性があり、ヒトワクチンでの使用可能性は制限されている。しかしながら、新たに化学的に定義された調製物、例えばムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質A、参照により本明細書に組み込まれるGoodman-Snitkoffら、J.Immunol. 147:410-415(1991)に記載されるようなリン脂質コンジュゲート、参照により本明細書に組み込まれるMillerら、J. Exp. Med. 176: 1739-1744(1992)に記載されるプロテオリポソーム内のタンパク質のカプセル化、及びNOVASOME(商標)脂質ベシクル(Micro Vescular Systems社、Nashua、N.H.)等の脂質ベシクル内のタンパク質のカプセル化等も有用である。
好ましい実施形態において、ワクチンは、非経口(つまり、筋肉内、皮内又は皮下)投与又は鼻咽頭(つまり、鼻腔内)投与による免疫化のための単一投薬形態でパッケージされる。有効な投薬量は以下の実施例に記載されるように決定される。担体は、通常、保存料を伴った又は伴わない水又は緩衝生理食塩水である。抗原は、凍結乾燥されて投与時に再懸濁化されてもよく、又は溶液形態であってもよい。
担体はポリマー徐放システムであってもよい。合成ポリマーは、抗原の制御放出を有効にするワクチンの製剤に特に役立つ。この初期の例には、Kreuter、J.、Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology、M. Donbrow(Ed). CRC Press、125-148頁により報告されたものがあり、メタクリル酸メチルを直径1ミクロン未満のペレットに重合させていわゆるナノ粒子を形成した。抗体反応並びにインフルエンザウイルスによる感染に対する防御は、抗原が水酸化アルミニウムと一緒に投与されたときに顕著に良好となった。他の粒子の実験により、これらのポリマーのアジュバント効果が、粒径と疎水性に依存することが実証されている。
マイクロカプセル化は、制御放出を可能にするマイクロカプセル化医薬品の注射に適用されてきた。多くの因子が、マイクロカプセル化のための特定のポリマーの選択に関係する。ポリマー合成及びマイクロカプセル化プロセスの再現性、マイクロカプセル化材料及びプロセスの費用、毒性学的プロフィール、様々な放出動態要件、並びにポリマー及び抗原の物理化学的適合性は全て考慮しなければならない因子である。有用なポリマーの例としては、キトサン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ポリオルトエステル及びポリアミド、特に生物分解性のポリマーである。
医薬品、及びより最近では抗原のために頻繁に選択される担体は、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)であり得る。この生分解性ポリマーは、浸食性縫合材、骨プレート及び他の一時的な補綴剤として長い医学的使用の歴史を有しており、何らの毒性も示されていない。ペプチドと抗原を含む種々様々な医薬品が、PLGAマイクロカプセルへ製剤されてきた。例えば、Eldridge、J. H.ら Current Topics in Microbiology and Immunology. 1989、146:59-66で調査されているように、抗原の制御放出のためのPLGAの適応に関して一群のデータが蓄積されてきた。直径1〜10ミクロンのPLGAマイクロスフェアに抗原を捕捉させることで、経口投与したときに顕著なアジュバント効果が奏されることが示されている。PLGAマイクロカプセル化プロセスは、油中水型乳剤の相分離を使用する。対象の化合物は水溶液として調製し、PLGAは適切な有機溶媒、例えば塩化メチレン及び酢酸エチルに溶解する。これらの2つの非混和性溶液を高速撹拌により共乳化する。次いで、ポリマーに対する非溶剤を添加し、水滴の周辺にポリマーを析出させ、胚性マイクロカプセルを形成する。マイクロカプセルを回収し、各種の薬剤[ポリビニルアルコール(PVA)、ゼラチン、アルギネート、ポリビニルピロリドン(PVP)、メチルセルロース]の1つで安定化し、真空乾燥又は溶媒抽出により溶媒を除去する。
本発明の組成物は、注射可能な懸濁液、溶液、スプレー、凍結乾燥粉末、シロップ、エリキシル等であってもよい。任意の適切な形態の組成物を使用することができる。そのような組成物を調製するために、所望の精製度を有する本発明のタンパク質製剤を、1つ又は複数の薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤と混合する。担体と賦形剤とは、組成物の他の構成成分と適合性を有するという意味において「許容される」ものでなければならない。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性なものであり、例えば限定されないが、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール、又はそれらの組み合わせ;緩衝剤、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、メチオニン;保存料(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン;単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース或いはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えばZn-タンパク質複合体)及び/又は非イオンの界面活性剤、例えばTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)又はポリエチレングリコール(PEG)を挙げることができる。
免疫原性又は免疫学的組成物も、水中油型エマルジョンの形態で製剤することができる。水中油型エマルジョンは、例えば、軽質流動パラフィン油(欧州薬局方タイプ);イソプレノイド油、例えばスクアラン、スクアレン、EICOSANE(商標)又はテトラテトラコンタン;アルケンのオリゴマー化により得られる油、例えばイソブテン又はデセン、直鎖アルキル基を含有する酸又はアルコールのエステル、例えば植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ(カプリレート/カプレート)、グリセリルトリ(カプリレート/カプレート)又はプロピレングリコールジオレエート、分岐脂肪酸又はアルコールのエステル、例えばイソステアリン酸エステルに基づくことができる。油は、有利には、エマルジョンを形成する乳剤と組み合わせて使用される。乳化剤は、非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンエステル、マンニド(例えば無水マンニトールオレエート)、グリセリン、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸(場合によりエトキシル化されている)、及びポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマー、Pluronic(登録商標)製品、例えばL121等であり得る。アジュバントは、乳化剤、ミセル発泡剤及び油の混合物、例えば、名称Provax(登録商標)で市販されているアジュバント(IDEC Pharmaceuticals社、San Diego、CA)であり得る。
本発明の免疫原性組成物は、ワクチンの有効性を増強させるために、更なる物質、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、緩衝剤又はアジュバントを含むことができる[Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、(ed.) 1980]。
アジュバントを含めてもよい。アジュバントとしては、限定されないが、無機塩[例えば、AlK(S04)2、AlNa(S04)2、AlNH(S04)2、シリカ、ミョウバン、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、カオリン又は炭素]、免疫刺激複合体を伴った又は伴わないポリヌクレオチド(ISCOM)[例えば、CpGオリゴヌクレオチド、例えばChuang、T.H.ら、(2002) J. Leuk. Biol. 71(3): 538-44; Ahmad-Nejad、P.ら(2002) Eur. J. Immunol. 32(7): 1958-68に記載されているもの];ポリIC又はポリAU酸、CpGを伴った又は伴わないポリアルギニン[当該技術分野においてIC31として公知;Schellack、C.ら(2003) Proceedings of the 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology;Lingnau,Kら(2002) Vaccine 20(29-30): 3498-508参照)、JuvaVax(商標)(米国特許第6,693,086号)]、一定の天然物質[例えば、:マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)由来のワックスD、コリネバクテリウム・パルヴム(Cornyebacterium parvum)、ボルデテラ・パーツシス(Bordetella pertussis)、又はブルセラ(Brucella)属のメンバーで見出される物質]、フラジェリン[トール様受容体5リガンド;McSorley、S.J.ら(2002) J. Immunol. 169(7): 3914-9参照]、サポニン、例えばQS21、QS17及びQS7(米国特許第5,057,540号、同第5,650,398号;同第6,524,584号;同第6,645,495号)、モノホスホリル脂質A、特に3-脱-O-アセチル化モノホスホリル脂質A(3D-MPL)、イミキモド[当該技術分野でIQMとして公知であり、Aldara(登録商標)として市販;米国特許第4,689,338号;同第5,238,944号;Zuber、A.K.ら(2004) 22(13-14): 1791-8)、及びCCR5阻害剤CMPD167(Veazey、R.S.ら(2003) J. Exp. Med. 198: 1551-1562参照]が挙げられる。
水酸化アルミニウム又はリン酸塩(ミョウバン)は、一般にリン酸緩衝生理食塩水中0.05〜0.1%溶液として使用される。特にDNAワクチンと共に使用することができる他のアジュバントは、コレラ毒素、特にCTA1-DD/ISCOM(Mowat、A.M.ら(2001) J. Immunol. 167(6): 3398-405参照)、ポリホスファゼン[Allcock、H.R.(1998) App. Organometallic Chem. 12(10-11): 659-666;Payne、L.G.ら(1995) Pharm. Biotechnol. 6: 473-93]、サイトカイン、例えば限定されないが、IL-2、IL-4、GM-CSF、IL-12、IL-15、IGF-1、IFN-α、IFN-β、及びIFN-γ[Boyerら、(2002) J. Liposome Res. 121 : 137-142;WO01/095919]、免疫調節タンパク質、例えばCD40L(ADX40;例えば、WO03/063899参照)、及び天然キラー細胞のCD1aリガンド[CRONY又はα-ガラクトシルセラミドとして知られる;Green,T.D.ら、(2003) J. Virol. 77(3): 2046-2055参照]、免疫刺激融合タンパク質、例えば免疫グロブリンのFcフラグメントに融合されたIL-2(Barouchら、Science 290:486-492、2000)及び共刺激分子B7.1及びB7.2(Boyer)であり、これらは全てタンパク質として又はDNAの形態で、本発明の抗原をコードするベクターと同じ発現ベクターで又は別個の発現ベクターで投与することができる。
免疫原性組成物は、rHAを所望の部位に導入し、適切で制御可能な速度で放出することができる。制御放出製剤を調製するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、制御放出調製物は、ポリマーを使用して、免疫原及び/又は免疫原性組成物を複合体化又は吸収するために製造することができる。制御放出製剤は、所望の制御放出特性又は放出プロフィールを提供することが知られている適切なマクロ分子(例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、酢酸エチレンビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又は硫酸プロタミン)を使用して調製することができる。制御放出調製による作用期間を制御するための他の可能な方法は、活性成分をポリマー物質の粒子に、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、これらの酸のコポリマー又はエチレン酢酸ビニルコポリマー等に組み込むことである。或いは、これらの活性成分をポリマー粒子に組み入れる代わりに、これらの物質を調製されたマイクロカプセルに、例えばコアセルベーション技術又は界面重合技術によって、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、それぞれコロイド薬物送達システム(例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)中で又はマクロエマルジョン中で捕捉させることが可能である。そのような技術は、New Trends and Developments in Vaccines、Vollerら(eds.)、University Park Press、Baltimore、Md.、1978及びRemington's Pharmaceutical Sciences、第16版に開示されている。
本発明の方法は、予防ワクチン接種として疾患を防御するために、又は治療用ワクチン接種として疾患を処置するために適切に利用することができる。
本発明のワクチンは、単独で又は免疫学的組成物の一部として動物に投与することができる。
記述されているヒトワクチン以外に、本発明の方法は、家畜動物を免役化するために使用することができる。動物という用語は、ヒトを含む全ての動物を意味する。動物の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、七面鳥、アヒル、ニワトリ等が挙げられる。全ての脊椎動物の免疫系が同様に作動することから、記載される用途は、全ての脊椎動物系において実施することができる。
本発明とその利点を詳細に記述したが、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変更、置換及び改変がなされ得ることが理解されるべきである。
本発明を、以下の実施例で更に説明するが、これらの実施例は例示を目的とするものにすぎず、いかなる意味でも本発明を制限することを意図するものではない。
(実施例1)
H3 rHA効能喪失の機序-システイン変異生成
この実施例では、H3 rHAの効能喪失に対する特定のCys残基の重要性を決定することを計画した。HA配列中の最後のCys残基は、H3パースrHA及びH3ビクトリアrHAの効能喪失に関係していた。しかしながら、H3ヒトインフルエンザ株由来のHAタンパク質は、更にH1及びBヒトインフルエンザ株(図2)と比較して、膜貫通ドメイン(TM)ドメインに更に2つの追加的なCys残基を含んでいる。HAタンパク質のTM中のCys残基はヒトインフルエンザ株中に保存されておらず、2つの更なる残基がH3N2株のTMドメインにある。
この実施例では、rHA H3パースのシステイン残基が、セリン又はアラニンで置換されている。この実施例で調製されたH3 A/パース/16/2009 rHAの3つの構築物をTable 1(表1)に列挙する。
Figure 2016514674
構築物は、膜貫通ドメイン(TM)及び細胞質テール(CT)に変異を含んでいる。HAモノマー中のTM及びCTドメインのシステイン残基はホモ三量体で互いに緊密に相関しており、rHAのロゼット構造を形成する能力があると考えられ、結果的にジスルフィド架橋rHA多量体が容易に形成され得る。更に、CTドメインにおけるシステイン残基は、昆虫細胞においてアシル化されており、この改変がタンパク質の安定性に影響を与えている可能性がある。構築物1ではTM及びCTドメインにおける5つのシステイン残基全てが変異されており、構築物2ではCTドメインにおける3つのシステイン残基が変異されていた。TMドメイン中のH3 HAタンパク質に特有の2つの更なるシステイン残基は、構築物3において、ヒト及び動物起源の両方に由来するHAタンパク質で一般に観察される残基に変異していた。
Cys残基は524位を除く全ての位置でアラニンに変異していた。
選択した試験を、Table 2(表2)に示す。
Figure 2016514674
(実施例2)
rHAの安定性に対するシステイン残基の効果
Flublok(商標)の組換えヘマグルチニンについての安定性データに基づくと、ジスルフィド媒介架橋は、バルクの老化とともに増加し、効能喪失と関係している。一般に、H3 rHAタンパク質は、2007年〜2011年に生産されたバッチの製造のためのリアルタイム安定性データ(図3)に基づいてH1及びB rHAタンパク質よりも安定性が低いと考えられる。SRID分析における迅速な効能喪失に基づき(図3)、H3/パース/16/2009(H3/パース)rHAをタンパク質モデルとして使用して安定性を改善させる方法を開発し、効能喪失の機序を調べた。既存の製剤に、シトレートと還元剤であるチオグリコール酸ナトリウムとを添加すると、このタンパク質の安定性は改善され、非架橋状態が保存された。これらの理由により、システイン残基はrHAの安定性に重要な役割を果たすと考えられる。
H3/パースrHAについて3つの異なるプラスミドDNA構築物を調製した[実施例1のTable 1(表1)]。H3/パースrHA構築物は、コーディング領域に、特定のシステイン残基をセリン又はアラニンのいずれかに置換した点変異を含んでいる。具体的には、タンパク質の膜貫通ドメイン(TM)及び細胞質テール(CT)のシステイン残基を標的とした。
構築物1&2:これらの構築物は、膜貫通ドメイン(TM)、細胞質テール(CT)に変異を含んでいる。HAモノマー中のTM及びCTドメインのシステイン残基はホモ三量体で互いに緊密に相関しており、rHAのロゼット構造を形成する能力があると考えられ、結果として容易に架橋を形成し得る。更に、CTドメインにおけるシステイン残基は、昆虫細胞においてアシル化されている可能性があり、この改変がタンパク質の安定性に影響している可能性があった。構築物1ではTM及びCTドメインにおける5つのシステイン残基全てを変異させ、構築物2ではCTドメインにおける3つのシステイン残基を変異させる。
構築物3:H3ヒトインフルエンザ株由来のHAタンパク質は、H1及びBヒトインフルエンザ株(図2)と比較して、TMドメインに更に2つのシステイン残基を含んでいる。H3/パースrHA(C524及びC528)中の2つの更なるシステイン残基は、構築物3において、ヒト及び動物起源の両方に由来するHAタンパク質で一般に観察される残基に変異している。
実施例1及び2は、H3 A/パース/16/2009(H3パース)rHAタンパク質の変異体をコードする3つの異なるプラスミドDNA構築物を含んでいる。プラスミドDNA構築物をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって調製する。アミノ酸残基の変化は、ヌクレオチドのセンス変異を含む2つの相補的な部位特異的変異誘発(SDM)によって導入される。SDMで使用したプライマーについて下記のTable 3(表3)を参照。H3パースrHAタンパク質に対する野生型HA遺伝子を含むトランスファーベクターpPSC12 LICは、PCRにおいて構築物2及び3に対する鋳型として使用される。変異生成構築物2プラスミドDNAは、PCRにおいて構築物1に対する鋳型として使用される。
Figure 2016514674
PCR増幅産物には、合成された変異プラスミドが含まれる。PCR反応は、メチル化されている場合にのみ、その認識部位を切断する酵素、制限エンドヌクレアーゼDpnIによって処理される。DpnIを用いた処理により、鋳型プラスミドDNAは分解されるが、一方、PCRで合成されたプラスミドDNAは環状のままである。次いでDpnI処理したPCR反応物を使用して大腸菌を形質転換する。
5〜10のプラスミドDNAサンプルを、HA特異的プライマーを使用する配列決定にかけて、標的アミノ酸残基のみのSDMを検証する。クローニングされたrHA遺伝子とトランスファープラスミドのフランキング領域とを有する配列を、ほぼ300ヌクレオチド毎に間隔をあけたプライマーを使用して配列決定する。配列決定反応は、MWG-Operon社(Huntsville、AL)によって実施する。得られた配列データは、DNASTAR社(Madison、WI)のSeqManソフトウェア又はVector NTI(Invitrogen社)を使用して構築する。各クローンについて実行した個々の配列決定からのデータを単一の連続配列に組み立て、次いで参照配列(野生型)と比較して、クローンによって正しいタンパク質がコードされ、所望の変異が導入されているかを確かめる。
Figure 2016514674
バキュロウイルス生成及びスケールアップ。組換えバキュロウイルスを、相同組換えと、昆虫細胞へのトランスフェクションとによって調製する。マスターウイルスバンク由来のAcMNPVバキュロウイルスDNAをBsu 36Iで分解してポリヘドリン遺伝子及びオープンリーディングフレーム(ORF)1629の一部を除去する。線形化された親AcMNPV DNAと、対象のrHA遺伝子を含有するpPSC12 LICトランスファープラスミドDNAとを組み合わせ、リポソームトランスフェクション試薬、1:2モル比のジメチルジデシル臭化アンモニウム(DDAB)とl,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)に添加する。室温でインキュベーションした後、トランスフェクション溶液を、125mLの振盪フラスコ内に新たに播種したexpresSF+細胞の培養物に添加する。トランスフェクションを、約5日間、22〜28℃で撹拌しながらインキュベートする。細胞直径が>21μmになったらすぐに、トランスフェクションを遠心分離によって回収し、上清をプラーク精製のために単離する。
トランスフェクションからのウイルス上清を使用して、昆虫細胞の単層に感染させ、更なるスケールアップのために組換えプラークを精製して単離する。対数初期から中期のSF+細胞の単層を、トランスフェクション上清の連続希釈液とともに接種する。2×PSFM/アガロースオーバーレイをプレートに適用する。5〜10日後に26〜28℃で十分に単離された組換えプラークを、低倍率の顕微鏡評価により多角体遺伝子発現野生型バキュロウイルスプラークのコントロールと比較して同定する。組換えプラークをアガロースから回収し、細胞培養物をスケールアップのためにウイルス継代1(P1)に移す。トランスフェクション及び組換えプラーク単離工程を、以下のTable 5(表5)に示す承認基準に従って評価する。
Figure 2016514674
プラーク精製組換えバキュロウイルスを、無血清条件下でウイルス継代1(P1)をSF+細胞中の継代3(P3)に増殖することによって、継代3(P3)ワーキングウイルスバンク(WVB)に増幅させる。単離した組換えプラークを使用して、対数初期から中期の125mL振盪フラスコ中のSF+細胞の培養物に感染させる。感染した培養物を26〜28℃で少なくとも5日間、撹拌しながらインキュベートし、細胞密度と生存性の基準が適合(細胞密度>20μm;細胞生存性<80%)した後で遠心分離によって回収する。P1ウイルス含有上清を使用して継代2(P2)ウイルスを調製する。P1ウイルスのアリコート由来のDNAを単離し、PCRを使用して正確な遺伝子生成物について試験する。下記Table 6(表6)を参照。
継代2及び継代3については、SF+細胞培養物を1.0×106細胞/mLの密度で播種し、26〜28℃で18〜24時間インキュベートして、1.3〜1.7×106細胞/mLの感染細胞密度に到達させて、P1又はP2のウイルス上清に感染させる。感染培地を26〜28℃で撹拌しながらインキュベートし、24時間後、P2(細胞密度増加;細胞生存率40〜70%)及びP3(細胞密度増加;細胞生存率<70%)の基準に適合した後で遠心分離により回収する。上清中のP3ウイルスに、ウイルス滴定分析を使用してその力価を決定し、HA遺伝子挿入を確認するための試験を行う。下記Table 7(表7)を参照。P2及びP3の培養物の回収から取得した細胞ペレットを、1×PBSに再懸濁し、SDS-PAGEゲル電気泳動及びウェスタンブロットで分析して、rHAタンパク質の発現を確認する。下記Table 6(表6)を参照。
ワーキングウイルスバンクスケールアップを、下記Table 6(表6)に示す承認基準に従って評価する。
Figure 2016514674
P3ワーキングウイルスバンクを、ウイルス上清にDMSO(10%)を添加した後、少なくとも2年間、液体窒素中で凍結して保存する。代替的に、P3ワーキングウイルスバンクを2〜8℃で最大8週間保存する。
P5スケールアップ及び発酵。発酵物を、P3ワーキンググウイルスバンクで更に増殖させることにより生成したP5ウイルスに感染させる。P4及びP5ウイルスについては、SF+細胞培養物を、1.0×106細胞/mLの密度で振盪フラスコに播種し、26〜28℃で18〜24時間インキュベートして1.3〜1.7×106細胞/mLの感染細胞密度に到達させる。P4培養物をP3ワーキングウイルスバンクで感染させ、P5をP4ウイルス上清で感染させる。P4及びP5ウイルス上清を、P4(35%〜70%の細胞生存率)及びP5(35%〜70%の細胞生存率)ウイルスについての基準が満たされた後に培養物を遠心分離することによって単離する。得られたP4ウイルス及びP5ウイルスを、2〜8℃でそれぞれ8及び4週間保存する。P4及びP5の培養物から回収して取得した細胞ペレットを、1×PBSに再懸濁し、SDS-PAGEゲル電気泳動/ウェスタンブロットで分析して、rHAタンパク質の発現を確認する。
ワーキングウイルスバンクをP5までスケールアップし、下記Table 7(表7)に記載の承認基準に従って評価する。
Figure 2016514674
この実施例における野生型及び変異体rHAタンパク質を、10Lのワーキング体積を有する15Lのバイオリアクターで製造する。SF+細胞の培養物を、PSFM培地中にSF+細胞で播種する。培養物は、特定の撹拌速度で26〜28℃にて維持する。バイオリアクターに空気オーバーレイを装備し、指定された溶存酸素濃度にする。培養物が十分な生存率を有して既定の密度に達したとき、P5ワーキングウイルスバンクで感染させる。発酵物をサンプリングし、光顕微鏡により400×拡大倍率で細菌又は真菌の混入について試験する。細胞の生存率が40%〜80%の範囲内になったとき、発酵物を回収する。
発酵物は遠心分離によって回収する。10Lの発酵液を、滅菌した1Lの瓶に約1Lのアリコートで汲み出し、Sorvall RC3C水平型遠心分離機を使用して2〜8℃で遠心分離する。細胞はペレットされて回収され、一方で発酵物からの使用済み培地を含む上清は廃棄される。ペレットはすぐに精製するか、又は更に精製するまで≦20℃で凍結して保存する。
タンパク質精製。rHAタンパク質の精製は、4L又は10Lのスケールで、それぞれ約4L又は約10Lの発酵液から得られた細胞ペレットを使用して行う。細胞ペレットを、回収直後又は-20℃で保存した後に精製する。凍結したペレットは精製前に2〜8℃で完全に解凍する。この実施例における小規模操作を各精製工程について以下に記載する。精製は次の工程を含む:抽出、IEXクロマトグラフィー、HICクロマトグラフィー、Q濾過、限外濾過、製剤及び最終濾過。処理工程及び/又は製品(処理中間物)品質に関する基準は各操作単位で示す。
抽出。この工程において、rHAタンパク質を、Triton X-100界面活性剤を使用して細胞膜から溶解し、更なる精製のために緩衝液に放出する。
この工程は2〜8℃で実施する。予冷(2〜8℃)したTriton(登録商標)X-100抽出緩衝液を、遠心分離によって得られた細胞ペレットに添加し、撹拌棒で撹拌プレートに混合させる。最小期間の混合後、懸濁物(粗製抽出物)のアリコートをサンプリングし、遠心分離する。上清を単離し、試験して初期収率を決定する。得られた粗製抽出物は、保存せずに直ちに処理する。
Figure 2016514674
深層濾過。深層濾過は、細胞残屑及び懸濁固形物を除去し、混濁度を低減するために実施する。細胞残屑と微粒子を含むフィルタを廃棄し、濾過液でrHAを回収する。
濾過工程では、PUWで洗浄し、rHA特異的抽出緩衝液で予め平衡化した単一レンズ形深層フィルタを使用する。濾過を22〜28℃で実施し、一方で粗抽出物を混合してフィルタ負荷中に細胞ペレット残屑が沈殿するのを防止する。プロセス中間物、つまり深層濾過物は、次の工程で直ちに処理する。
IEXクロマトグラフィー。イオン交換(IEX)クロマトグラフィー工程では、SP BBカチオン交換カラムを使用して、深層濾過液中のrHAタンパク質を捕捉して濃縮する。カラムに結合しない混入タンパク質は、通過及び洗浄により除去される。
IEXカラムをpH及び導電性要件に適合するまで平衡化する。IEX-負荷物を、平衡化したIEXカラム上に汲み込む。負荷の後、溶出に先立って、rHA特異的緩衝液を使用してカラムを洗浄し、余剰/残余混入物を除去する。rHAを、均一濃度条件下で塩化ナトリウムを用いたカラムで溶出し、UV280吸光度ピーク物を回収する。吸光度ピークのアリコートを試験用に回収し、IEX溶出液中の約65kDタンパク質の存在及び収率を確認する。IEX-溶出液を回収し、<24時間で更に処理する。
Figure 2016514674
HICクロマトグラフィー。疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)工程では、IEX溶出液中のrHAタンパク質を精製するためにフェニルHPクロマトグラフィーカラムを使用する。
HICカラムを水で洗浄し、pH及び導電性要件に適合するまで平衡化緩衝液で平衡化する。IEX-溶出液を、等体積の界面活性剤不含緩衝液で希釈してカラム負荷を調整し、CHAPS界面活性剤を10%の界面活性剤原液を使用して添加する。負荷の後、カラムをrHA特異的緩衝液で洗浄し、通過画分及び洗液中のタンパク質混入物を破棄する。rHAを溶出緩衝液で溶出し、全UV280吸収ピークを画分で回収する。
rHA内容物がSDS-PAGEによって確認されるまで溶出画分を保存し、次いでrHAを含有する溶出画分をプールする。得られたrHAプールをHIC-溶出液と称する。HIC-溶出液を回収し、プールし、<24時間、更に処理する。
Figure 2016514674
Q膜濾過。Q膜濾過を、rHAからDNAを除去するためにPall Mustang Qコインフィルタを使用して実施する。
Q膜濾過を22〜28℃で実施し、フィルタを殺菌し、洗浄し、使用のための予備調節を行う。pH及び導電性の仕様に適合するまで、カプセルをrHA特異的緩衝液で平衡化する。先の工程からのHIC溶出液を、1MのNaCl原液を使用してQ膜濾過のために調節する。調整したHIC-溶出液を、Q負荷液と称する。Q負荷液をポンプによってカプセルに通して濾過し、UV吸収性物質(280nm)を回収する。UV吸光度が基線に戻るまで、QカプセルをrHA緩衝液で洗浄する。回収物質、つまり濾過液と洗液をQ濾過液と称する。Q濾過液を、全タンパク質濃度を決定する試験のためにサンプリングする。Q濾過液は、直ちに処理するか、次の処理まで2〜8℃で<24時間保存する。
Figure 2016514674
限外濾過。rHAタンパク質の緩衝液交換のための限外濾過を、公称上50kDの分子量限界(NMWL)を有する平面プレートポリエーテルスルホン(PES)膜のPall Minimateタンジェンシャルフローフィルトレーション(Tangential Flow Filtration、TFF)カプセルを使用して、22〜28℃で実施する。使用に先立って、フィルタをPUWでフラッシュし、緩衝液で平衡化する。Q濾過液をシステムに再循環して膜を更に調節する。再循環の後、10倍の最低限の緩衝液交換を、rHA緩衝液を使用して一定体積モードで実施する。
透析から得られた保持液を秤量して質量を決定し、全タンパク質濃度及び全タンパク質収率決定試験のためにサンプリングする。
Figure 2016514674
製剤及び最終濾過。この実施例において、保持液の精製rHAのタンパク質濃度の合計は400〜600μg/mLでなければならない。必要であれば、保持液を更にTFFで濃縮してもよく、又はこの濃度を達成するために透析緩衝液で希釈してもよい。
この実施例におけるrHAタンパク質のための製剤は、10mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、0.005%のTween-20、pH6.8〜7.2である。この製剤を達成するために、Tween20を、10%のTween-20原液を使用して、Tween-20の最終濃度が0.005%になるように保持液に添加する。得られた中間体は製剤保持液である。
この実施例において試験用の1価バルクrHAを生成するために、製剤保持液を0.2μmフィルタに通して同時に濾過し、製剤コンテナから保存用の生物プロセスコンテナへ移す。
保存性及び安定性。rHAタンパク質についての試験。製剤及び充填が完了した後、野生型及び変異体rHAを含むBPCを、22〜28℃で28日加速安定性条件に置く。BCA、トリプシン耐性及び凝集分析を0日目に実施する。他の全ての試験は各時間点で実施する。試験は予定試験日の+/-1日以内で完了する。研究室のスケジュール又は実験観察の適応のために、スケジュールに対する調整が行われる場合がある。
承認基準。安定性データは、精製度、収率、安定性プロフィール、凝集プロフィール、及び野生型rHAタンパク質の対応するrHA変異型への折り畳みを比較することによって評価する。RP-HPLC分析は、情報取得のみを目的とし、野生型及び変異型rHAタンパク質のRP-HPLCプロフィールの任意の差異を示す。
精製度は、SDS-PAGEによって決定する。
収率は、精製度に対して調整したBCAによって決定する。
安定性は、SRIDによって測定される効能に対する結果によって示す。
凝集と架橋は、還元及び非還元SDS-PAGEゲルによって評価する。
適切な折り畳みは、トリプシン耐性及び赤血球凝集によって評価する。
Figure 2016514674
(実施例3)
システイン変異生成
クローニング - 野生型 H3 A/パース/16/2009 rHAタンパク質との比較のために3つの異なる構築物H3 A/パース/16/2009 rHAタンパク質を調製した。これらの構築物では、rHAタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールドメインの中の特定のシステイン残基を置換した。これらの構築物中の変異を下記に示す。
Figure 2016514674
H3 rHAタンパク質について、構築物、ウイルスバンク、及び発酵物を調製した。H3 rHAタンパク質を精製し、実施例2のプロトコルに従って特性決定した。H3 パースrHAに対する結果を以下に示す。
初期rHAクローンスクリーニング-小規模発酵物(300mL)を、H3 rHA変異型について調製し、初期収率を野生型H3 rHAとの比較のために測定した。全てのH3 rHA変異体が、一つを除いて収率基準を満たしていた。
Figure 2016514674
初期収率 - 3つのCys H3 rHA変異型をスケールアップ(10L)して、野生型H3 rHAと比較して(4L規模)精製する。10Lの発酵スケールにおいて、3つのCys変異型に対する初期収率は、野生型コントロールの初期収率と本質的に同等以上であり、試験基準に適合している。
Figure 2016514674
精製度 - 精製されたH3 rHAタンパク質は、1μg/レーン負荷を使用する還元SDS-PAGEゲル分析によって100%の精製度を有する。精製度についての試験基準は、SDS-PAGEに基づいて≧85%である(図4)。
最終収率 - 3つのCys H3 rHA変異型についての最終精製収率は、野生型コントロールの最終精製収率に対して本質的に同等以上である。
Figure 2016514674
トリプシン耐性 - 野生型H3 rHA及びCys変異体はトリプシン耐性があり、rHAタンパク質が適切に折り畳まれ、三量体であることを示している。H3 rHAは全て分析についての試験基準を満たし、HA1及びHA2のバンドが目視できる(図5)。
赤血球凝集分析 - 野生型H3パースrHA及びCys変異体は、赤血球凝集活性が陽性で、試験基準を満たし、rHAタンパク質が適切に折り畳まれていることを示している。試験基準:赤血球の膠着陽性。
Figure 2016514674
SRIDによる効能 - 25℃で1カ月後、野生型H3 rHAタンパク質は最も大きな効能低下を示し、約40%の相対的効能で安定化した。5Cys H3 rHAについての相対的効能は約60%で安定化した。3Cys H3 rHAについての効能低下は20%未満であり、2Cys H3 rHAは効能低下を示さなかった。3つのCys H3 rHA変異体は全て28日目で相対的効能(RP)についての試験要件を満たしている(図6)。
SDS-PAGE - 野生型H3 rHAタンパク質及び3つの異なるCys変異体rHAについての非還元及び還元SDS-PAGEプロフィールを図7Aに示す。0日目において、野生型と5Cys変異体の非還元SDS-PAGEプロフィールは同等であるが、全てのその後の時間点において、rHA架橋は、野生型rHAの方が5Cys変異体よりも多く観察される。3Cys及び2Cysの変異体は、0日目でほとんど又は全く架橋がなく、3Cys変異体のみわずかに増加する。試験基準である変異体rHAの凝集バンド強度<野生型rHAの凝集バンド強度に適合した。
非還元SDS - PAGEゲルを走査し、分子イメージングソフトウェアを使用して分析した。イメージング分析からの強度プロフィールは、試験の0日目に対する値として図7Bに示す。
デンシトメトリーを、非還元SDS-PAGEゲル上で各時間点で各H3 rHAタンパク質に対して実施した。単量体rHAタンパク質(HA0)及びより高次の架橋形態のrHAタンパク質(凝集体)のバンド強度を決定した。各H3 rHAについてHA0の強度に対する凝集強度の比率を以下にプロットした。この方法においてrHA架橋は2Cys<3Cys<5Cys<野生型の順序で増加する(図7C)。
3Cys及び2Cys変異型についてのRP-HPLCプロフィールは同等であるが、野生型及び5Cys変異体とは異なっている(図8)。3Cys及び2Cys rHAは大部分が非架橋型であり、単一ピークとして溶出するが、野生型及び5Cys rHAはタンパク質の様々な架橋集合体により複数のピークとして溶出する。架橋rHA集合体は、疎水性の増加のためにカラムに保持され、後で溶出する。
SRID-BCA比率 - 3Cys及び2Cys変異体は、野生型及び5Cys変異体よりもSRID/BCA比率が高い。3Cys及び2Cys H3 rHAタンパク質の比率が高いほど、これらの変異体における抗体親和性の変化又は架橋の低下を反映している可能性がある。
Figure 2016514674
追加試験 - 動的光散乱(DLS)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)及び電子顕微鏡(EM)分析は、プロトコルに含まれていないが、H3 rHAタンパク質の粒径を特徴づけるために実施した。示差走査蛍光測定(DSF)も実施してH3 rHAタンパク質の熱的安定性を比較し、赤血球凝集阻害(HI)分析を実施してH3 rHAタンパク質の抗原性を比較した。
DLS - DLSによるrHAタンパク質の粒径はロゼット構造に特徴的な範囲30〜50nmに入っている。DLSによるおよその転移温度は全てのH3 rHAタンパク質で非常に類似し、57〜59℃である。
Figure 2016514674
SEC - SECによってH3 rHAタンパク質は本質的に同じ保持時間で溶出する。2.4〜2.6MDaの範囲の推定された分子量がH3 rHAタンパク質について観察された。約70kDaのモノマーに対する近似のMWを使用して、粒子/ロゼットあたりのモノマーの数は35〜38と推定される(図9参照)。
EM - 電子顕微鏡検査を野生型及びシステイン変異体H3 rHAタンパク質について実施した。野生型及び変異体rHAタンパク質は、およそ30〜40nmのサイズで多量体ロゼット様構造を形成する。同じ倍率及び同じタンパク質濃度を使用したEM分析のもとで、ロゼット粒子の密度はサンプル中で定性的に類似しているようである。分析結果によると、高次構造はシステイン変異生成によって影響を受けていない。
DSF - H3/パースrHA野生型及びシステイン変異体(2Cys、3Cys及び5Cys)を、分子ローター色素(ProteoStat、Enzo Life Scienes社)の存在下、25℃〜99℃で示差走査蛍光測定(DSF)により分析した。蛍光測定は温度の関数として観察され、単一の大規模で協同的に折り畳みが解かれる事象が各タンパク質について観察された。データは、H3/パースrHAシステイン変異体の全てが野生型H3 rHAよりもわずかに熱的安定性が大きいことを示しており、rHAタンパク質の膜貫通及び/又は細胞質領域におけるシステイン残基の変異がそれらの安定性を改善させ得ることを示唆している。
Figure 2016514674
H3 rHA野生型及びシステイン変異タンパク質を、赤血球凝集阻害(HI)検定を使用した抗原性試験で特性決定した。課題は、H3抗原に向けられた抗血清と特異的に結合するrHAタンパク質の能力の差異を識別することであった。H3 rHAを、分析において逆滴定(BT)の最初の4つのウェルの膠着に至る4HA単位/25μLの赤血球凝集力価を有するように標準化した。各rHAの標準化した量を段階希釈した抗血清と混合し、赤血球を添加してrHA分子に対する抗体の特異的抗体結合を測定した。H3 A/ウィスコンシン/15/2009-X-183ウイルスから精製されたHAに対するヒツジで産生した抗血清、及び、野生型H3 A/パース/16/2009 rHAタンパク質を使用してウサギで産生した抗血清を使用して野生型及び変異体H3 A/パース/16/2009 rHAタンパク質を評価した。システイン変異rHAを使用して得られたHI力価は、ヒツジ又はウサギ抗血清を用いた分析において野生型H3 rHAを使用して得られたHI力価の2倍以内であった。結果は、野生型及び変異H3 rHAタンパク質に関する抗原提示部位が同様であることを支持する。
(実施例4)
効能喪失の機序
この実施例はモデルシステムとしてH3 rHAタンパク質を使用して効能喪失の機序を決定するために確立した。リアルタイム安定性試験を、新たに精製したH3 A/ビクトリア/361/2011(H3ビクトリア)rHAを使用して実施した。
28日安定性試験をH3 A/ビクトリア/361/2011(H3ビクトリア)rHAタンパク質の3つの製剤と2つの異なる保存温度を使用して実施した。
Figure 2016514674
製剤は、効能についてはSRID分析で評価し、遊離チオール含量については蛍光に基づく分析法を使用して、遊離Cysについてはペプチドマッピングを使用して評価した。
遊離チオール含量は、2〜8℃及び22〜28℃で保存した前処理保持液及び2〜8℃で保存した1価バルクにおいて低下していた(図13)。製剤中のSTGの干渉による妨害により、STG-シトレート製剤で分析を行うことはできなかった。ペプチドマッピングは、549位の遊離システイン(NEM標識システイン)の喪失を示し、同じ製剤の遊離チオールの結果と合致する。対照的に549位の遊離システインのレベルは、最も安定な製剤であるSTG-シトレート製剤と同様である。
遊離チオールの数は小さく、0日目のrHAの分子1個あたりより小さいが、試験経過を通しての遊離チオール含量の相対的喪失は大きい。研究の最後に、初期遊離チオール総量は、22〜28℃で保存された前処理保持液の90%まで低下し、2〜8℃で保存した前処理保持液及び1価バルクサンプルのおよそ70%まで低下する。同様に、549位の利用可能な遊離システインの総量は、前処理保持液及び1価バルクサンプルのおよそ20%であり、研究終了までにこれらの製剤においてほとんど完全に消失(<5%)した。対照的に、遊離Cys549の開始レベルはSTG-シトレート製剤の方が大きく(約30%)、保存中に変化しない。
遊離チオール及びペプチドマッピングによるCys549の喪失についての結果は試験における製剤全ての効能喪失と相関する。効能喪失の速度、並びに、遊離チオールの喪失及びCys549の喪失の速度は、22〜28℃で保存された前処理保持液が最も大きく、次いで2〜8℃で保存された前処理保持液及び1価バルクサンプルが大きい。製剤に関する相対的効能値を、図14では遊離チオール含量の相対的変化に従ってプロットし、図15では遊離Cys549の相対的変化に従ってプロットする。
(実施例5)
シトレート及びSTGを含む製剤
この実施例は、有望な製剤であるシトレートとチオグリコール酸ナトリウム(STG)とを含む製剤に着目して計画した。課題は、低濃度のSTGの製剤についての最適なシトレート濃度を特定することと、シトレート又はSTG単独で製剤の安定性が改善されるかを判断することであった。この試験で使用したrHAは、B/ブリスベン(45-09018)、H1/ブリスベン(45-09012)並びにH3/ブリスベン(45-09023及び45-09025)を使用したプロセスバリデーションロットから取得した。このロットは、Hospira One-2-One社(McPherson、KS)で充填され、「PV2」又はHospira番号「CM0-119」と呼称される。無菌技術(フードHD 016)を使用して、400バイアルのCM0-119医薬品を滅菌ボトル中にプールした。このプールした材料を分割し、濃縮した賦形剤を添加して改変し、所望の製剤を得た[Table23(表23)]。
Figure 2016514674
サンプルを、35℃、25℃及び5℃に設定し、通常1週間間隔で抜き取りを設定した。35℃のサンプルについては追加的に2日間の抜き取りを設定し、5℃のサンプルについてはより早い時間点を設定し、保存サンプルについては妥当であれば長い時間点を設定した。SRID効能の測定の焦点はH1/ブリスベンrHAであったが、H3/ブリスベンとB/ブリスベンについても高頻度で測定した。
SRID効能測定をTable23(表23)〜Table25(表25)に列挙し、これらのデータを図16〜18にプロットする。
Figure 2016514674
Figure 2016514674
Figure 2016514674
t=0でこれらの製剤について測定された効能は、賦形剤が、SRIDによって測定するときのB/ブリスベンの見かけの効能に影響を与えなかったことを示した。賦形剤は、H1/ブリスベンについてはわずかな影響があり、H1/ブリスベンについては穏やかな影響があった(図19)。STGのみのサンプルについて測定された効能と、STG及びシトレートを加えたサンプルについて測定された効能とが等価だった事実に基づくと、効果は還元剤の存在によると考えられる。還元剤が分析に直接影響を与えるか、又はrHAの立体構造がSRID試薬とよりよく一致するように変化するかどうかは未だ明らかでない。
H1、H3及びBの全てについて、安定性は、シトレート及びSTGによって改善されたが、いずれかの賦形剤個別では改善しなかった。STGのみを用いた製剤は安定性が最も低く、安定性曲線(時間の関数としての相対的効能)の傾斜は、3つの保存条件で60%を超えていたことを示した(図20)。STGを有するシトレート含有サンプルの傾斜は、一貫した濃度依存性を示さなかったが、全てが製剤の安定性における著しい改善を反映していた。コントロール(A)の傾斜のシトレート+STG製剤の平均傾斜に対する比率は、少なくとも1.6で、ほぼ4.4であった。
SDS-PAGEの結果を図21に示す。0日目のデータは、全ての製剤が最初に等価であったことを示す。21日目までに、STGとシトレートの両方を含む製剤における凝集がより少ないことは明らかである。試験最終日(52日目)において、いくらかの凝集が、STGとシトレートの両方を含む製剤で目視できるようになったが、主要なバンドはHA0である。なぜ全体的強度が低めに見えるかは明らかでないが、H1についてのSRID効能はなお0日目の値のおよそ80%であった。これらの測定において、SRID効能の喪失は、前述の研究のように、非還元SDS-PAGEで観察された凝集物の蓄積と関連している。
この実施例では、先導賦形剤を含有する3価製剤中の各rHAの効能を観察するように設計した。粒径(DLSによる)及び凝集(非還元SDS-PAGEによる)も測定したが、これらのパラメータは全てのrHAに関する平均値であって、特定の株由来のrHAに特異的なものではない。試験した賦形剤は、シトレート及びチオグリコール酸ナトリウムであった。内部ジスルフィド還元を最小にするために、STGは非常に低い濃度(0.2mg/mL)で使用した。全体的結論は次のとおりである:
安定性は、シトレートとSTGの両方を含めた製剤の3つのrHA(H1/ブリスベン、H3/ブリスベン、及びB/ブリスベン)全てで改善されていた。シトレート単独(20mg/mL)では安定性を改善しない。STG単独では安定性に負の効果を与える。試験した最も高い濃度(5mg/mL)では安定性に不利な影響を与える(データ示さず)。低い濃度は、有効である場合も有効でない場合もある。
シトレート及びSTGの両方が存在する場合に、rHAの凝集は最少になる。凝集度は、0日目に観察されるよりも低くは低下しなかった。
(実施例6)
0.035%のTriton X-100を加えたH3パースについての初期相安定性試験
この実施例は、(a)0.035%のTriton X-100を含むように製剤されたH3パースの安定性を評価すること、(b)安定性試験での多量のH3/ウィスコンシンの予想外に高い安定性をよりよく理解すること、及び(c)STGシトレート製剤の安定性を高濃度のTriton X-100を含む製剤の安定性と比較することを計画した。遡及試験から、このロットがおよそ0.2%の通常でなく高いTriton X-100濃度を有していたことが示された。この試験において、H3パースは、Triton X-100濃度が0.035%になるように製剤した。このロットでは、製剤開発試験で使用する濃度0.05%をシミュレートするために、及びH3/ウィスコンシンで観察された安定性の増加が高濃度のTriton X-100(0.1%、0.2%)によるものであるという仮説を検証するために、計画した濃度でTriton X-100を補足した。別の製剤を、1%クエン酸ナトリウム及び0.02%のチオグリコール酸ナトリウムを補足したロットで調製した。
試験した製剤をTable27(表27)に示す。Triton X-100原液を初期製剤に従って添加し、いくつかの希釈液を生じさせ、但しTriton濃度は最高でも1.6%とした。STG-シトレート製剤の希釈度は9.4%であった。全てのサンプルは25℃で保存した。
Figure 2016514674
加速条件下で保存されたサンプルについてのSRIDの結果をTable6(表6)に列挙し、図22にプロットする。これらの結果は、コントロール試料(0.35% Triton X-100)について、効能が、0日目の効能のおよそ2分の1に急速に低下することを示している。より高レベルのTriton X-100では、効能はよりゆっくり減少し、それほど減少しない。安定性は、0.05%のTriton X-100よりも0.1%又は0.2%のTriton X-100を存在させる方が良いが、0.1%及び0.2%のTriton X-100間での差異は無視できる程度である。STG-シトレート製剤の効能は、2週間の加速安定性期間でほとんど変わらず、92日間、元の効能の80%超を維持していた。
Figure 2016514674
SDS-PAGEの結果を図23A〜図23Bに示す。初期パターンは、ほとんどのrHAが単量体(HA0)の形態であり、一部に架橋された二量体及び三量体が存在していることを示している。本質的にタンパク質が全てHA0であることを還元ゲルが示していることから、タンパク質はジスルフィド結合により架橋しているようである。25℃で2週間以内に単量体rHAの量は著しく減少し、一部の架橋二量体は非還元性であった。より高濃度のTriton X-100を有する製剤は、コントロール(0.035%のTriton X-100)より架橋が少なかった。シトレートとSTGとを有する製剤中のジスルフィド架橋は、2週間ほとんど変化せず、非還元性架橋の証拠は示されなかった。
図23に示すデータは、Triton X-100がH3パースrHAの安定性を改善するが、0.035%のTriton X-100は0.05%の場合ほど改良をもたらさなかったことを示す。0.1%において、Triton X-100は更に安定性を改善し、更に0.2%までの増加は漸増的に安定性の改善をもたらした。先の結果は0.05%、0.08%又は0.15%のTriton X-100を有する製剤について同等の安定性を示していたことから、これは予想外の結果であった。
0日目のDLS結果は、Triton X-100濃度の増加により、平均粒径が減少したことを示している。図24は、14日間の試験を通して差異は最小であるが、Triton X-100を高濃度で存在させると平均粒径が著しく減少することを示している。
(実施例7)
rHAの免疫原性はSTG-シトレート製剤によって影響を受けない
この実施例では、rHAの免疫性に対してSTG-シトレート製剤の効果を評価することを課題とした。H1カリフォルニア/07/2009を使用して、rHA濃度が120μg/mLの2つの製剤を調製した。コントロール製剤は、Flublok(10mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、0.005% Tween-20、pH6.8〜7.2)を製剤緩衝液に使用した。第2の製剤は、0.02%のチオグリコール酸ナトリウム(STG)と1%のクエン酸ナトリウムを製剤に添加した以外は同一であった。これらの製剤を、2つの用量3μg及び0.3μgで6〜8週齢のBalb/cマウスに筋肉内投与した。3μg用量については各製剤について25μL用量として投与し、0.3μg用量については各製剤について1:10の希釈で25μL用量として投与した。マウスには0日目及び21日目に投与した。8匹のマウスを、高用量コントロール、高用量STG、低用量コントロール及び低用量STGの4つのコホート各々で使用した。血液サンプルを、投与前0日目、21日目、及び42日目に採取した。血液サンプルを凝血させ、次いで遠心分離し、得られた血清を-20℃で保存した。血清サンプルを赤血球凝集阻害(HAI)及びELISAを使用して抗体力価について試験した。
HAI力価をTable29(表29)及び図25に示す。これらの結果は、STG-シトレート製剤が、H1カリフォルニアrHAの免疫原性に重要な影響を及ぼしていないことを示す。
Figure 2016514674
42日目の血清について決定したELISA力価をTable30(表30)に示す。これらの値は、各マウスについて0日目(非免役化)のELISA応答に対してデータを正規化して計算した。これらの結果は、STG及びコントロール製剤についてのELISA力価に有意な差異がないことを示す。図26は、ELISAとHAIの結果が比例していることを示す。2つの方法を使用して得られた力価を散布図としてプロットしている。ELISA及びHAIの結果は、STG-シトレート製剤がrHAの免疫原性に影響しないことを実証する。
Figure 2016514674
(実施例8)
H1 A/カリフォルニア/07/20009についてのデータ
図27は、H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較する非還元及び還元SDS-PAGE分析を示す。レーン1は野生型H1 rHAを指し、レーン2は3Cys SDV H1 rHAを指す。
野生型H1 rHAで観察されたジスルフィド媒介架橋は、5℃と25℃の両方で3カ月保存後において、3Cys SDV H1 rHAで阻止されている。
図28は、H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較するRP-HPLC分析を示す。
3Cys SDV rHAは単一ピークとして溶出する一方、野生型は複数ピークとして溶出し、3Cys SDV rHAがWT rHAと比較して均一であることを示す。3Cys SDVと野生型とのRP-HPLCプロフィールは、いずれの保存温度でも長期的に有意な変化はない。
図29は、H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較するSEC-HPLC分析を示す。
WTとSDVのrHAのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析。SECによって、両方のH1 rHAタンパク質は同じ保持時間で溶出する。
図30は、H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較する示差走査蛍光測定(DSF)分析を示す。
示差走査蛍光測定(DSF)で観察された蛍光強度を、WT rHA及び3Cys SDV rHAタンパク質の両方について温度の関数としてプロットする。転移点が、上記の二次導関数プロットで観察される。各rHAについての代表的な二次導関数熱変性プロットを5℃及び25℃で0日目及び2カ月目において示す。
Figure 2016514674
図31は、H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較する5℃及び25℃でのrHAタンパク質の相対的効能を示す。
3Cys SDVの相対的効能は5℃と25℃で1カ月保存後において野生型より高い。
図32は、H1 A/カリフォルニアのWT rHAと3Cys SDV rHAとを比較する動的光散乱(DLS)による粒度分析を示す。
野生型H1 rHAロゼット及び3Cys SDV H1 rHAロゼットの体積平均径はDLSによって決定するとき、3カ月保存後の5℃及び25℃の両方において同等である。
(実施例9)
B/マサチューセッツ/2/2012 rHAについてのデータについてのデータ
図33は、B/マサチューセッツのWT rHAと2Cys SDV rHAとを比較する非還元及び還元SDS-PAGE分析を示す。レーン1は野生型B rHAを指し、レーン2は2Cys SDV B rHAを指す。
野生型B rHAで観察されたジスルフィド媒介架橋は、0日目の精製直後の2Cys SDV B rHAにおいて阻止される。1カ月保存後25℃と35℃の両方で、ジスルフィド媒介架橋は、同様の条件下で保存した野生型と比較して、2Cys SDVに対して顕著に減少する。
図34は、B/マサチューセッツのWT rHAと2Cys SDV rHAとを比較するRP-HPLC分析を示す。
B/マサチューセッツの2Cys SDV rHAは、単一ピークとして溶出されたが、野生型は複数ピークとして溶出され、Cys SDV rHAがより均質であることを示す。2Cys SDVと野生型とのRP-HPLCプロフィールは、いずれの保存温度でも長期的に有意な変化はない。
図35は、B/マサチューセッツのWT rHAと2Cys SDV rHAとを比較する動的光散乱分析による粒度分析を示す。
野生型B rHAロゼットと2Cys SDV B rHAロゼットの体積平均径はDLSによって決定するとき同等である。1カ月のWT及び2Cys SDVの保存は25℃と35℃の両方において、ロゼット直径のわずかな増加をもたらす。
図36は、B/マサチューセッツのWT rHAと2Cys SDV rHAとを比較する5℃及び25℃で保存されたrHAタンパク質の相対的効能を示す。
B/マサチューセッツ2Cys SDVの相対的効能は25℃と35℃で1カ月後において野生型より高い。
本発明を以下の番号付けした項で更に記述する。
項1. 1つ又は複数のシステイン変異を含む、単離された非天然組換えヘマグルチニン(rHA)タンパク質。
項2. rHAタンパク質が、H1タンパク質である、項1に記載のタンパク質。
項3. H1タンパク質が、カリフォルニア株又はソロモン株から単離されたものである、項1に記載のタンパク質。
項4. カリフォルニア株が、カリフォルニア/07/2009株である、項3に記載のタンパク質。
項5. ソロモン株が、ソロモン諸島/03/2006株である、項3に記載のタンパク質。
項6. システイン変異がカルボキシ末端領域にある、項2〜5のいずれか1項に記載のタンパク質。
項7. システイン変異が膜貫通領域又は細胞質領域にある、項2〜6のいずれか1項に記載のタンパク質。
項8. rHAタンパク質が、Bタンパク質である、項1に記載のタンパク質。
項9. Bタンパク質が、ブリスベン株、フロリダ株、オハイオ株、江蘇株又は香港株から単離されたものである、項8に記載のタンパク質。
項10. ブリスベン株が、ブリスベン/60/2008株である、項9に記載のタンパク質。
項11. フロリダ株が、フロリダ/04/2006株である、項9に記載のタンパク質。
項12. オハイオ株が、オハイオ/01/2005株である、項9に記載のタンパク質。
項13. 江蘇株が、江蘇/10/2003株である、項9に記載のタンパク質。
項14. 香港株が、香港/330/2001株である、項9に記載のタンパク質。
項15. システイン変異が、膜貫通(TM)ドメイン及び細胞質(CT)ドメインを含むカルボキシ末端領域にある、項8〜14のいずれか1項に記載のタンパク質。
項16. rHAタンパク質が、H3タンパク質である,項1に記載のタンパク質。
項17. H3タンパク質が、ビクトリア株、パース株、ブリスベン株又はウィスコンシン株から単離されたものである、項16に記載のタンパク質。
項18. ビクトリア株が、ビクトリア/361/2011株である、項17に記載のタンパク質。
項19. パース株が、パース/16/2009株である、項17に記載のタンパク質。
項20. 変異が、C524S及び/又はC528Aである、項19に記載のタンパク質。
項21. 変異が、C524A、C528A、C539A、C546A及び/又はC549Aである、項19に記載のタンパク質。
項22. 変異が、C539A、C546A及び/又はC549Aである、項19に記載のタンパク質。
項23. ブリスベン株が、ブリスベン/16/2007株である、項17に記載のタンパク質。
項24. ウィスコンシン株が、A/ウィスコンシン/67/05株である、項17に記載のタンパク質。
項25. システイン変異が膜貫通領域にある、項16〜24のいずれか1項に記載のタンパク質。
項26. システイン変異がカルボキシ末端領域にある、項16〜24のいずれか1項に記載のタンパク質。
項27. 項1〜26のいずれか1項に記載のタンパク質を発現するヌクレオチド配列をコード及び発現するバキュロウイルスベクター。
項28. 項1〜26のいずれか1項に記載のタンパク質を含むインフルエンザワクチン。
項29. 項27に記載のバキュロウイルスベクターを含むインフルエンザワクチン。
項30. rHAタンパク質を安定化させる方法であって、rHAタンパク質における1つ又は複数のシステイン残基を同定する工程と、前記1つ又は複数のシステイン残基をシステインではなく三量体形成を破壊しないアミノ酸残基に変異させる工程とを含み、それによりrHAタンパク質を安定化させる、方法。
項31. タンパク質が、項1〜26のいずれか1項に記載のタンパク質である、項30に記載の方法。
項32. (a)タンパク質と、(b)シトレートと、(c)チオグリコレート又はチオグリセロールとを含む安定化されたタンパク質製剤。
項33. シトレートとチオグリコレート又はチオグリセロールとを製剤に添加する工程を含む、タンパク質製剤の安定化方法。
項34. チオグリコレートが、チオグリコール酸ナトリウムである、項32又は33に記載の製剤又は方法。
項35. チオグリセロールがモノチオグリセロールである、項32又は33に記載の製剤又は方法。
項36. シトレートの濃度が少なくとも約1mg/mlである、項32〜35のいずれか1項に記載の製剤又は方法。
項37. シトレートの濃度が少なくとも約5mg/mlである、項32〜36のいずれか1項に記載の製剤又は方法。
項38. シトレートの濃度が少なくとも約10mg/mlである、項32〜37のいずれか1項に記載の製剤又は方法。
項39. チオグリコレート又はチオグリセロールの濃度が約0.2mg/mlである、項32〜38のいずれか1項に記載の製剤又は方法。
項40. 製剤がワクチンである、項32〜39のいずれか1項に記載の製剤又は方法。
項41. ワクチンがインフルエンザワクチンである、項40に記載の製剤又は方法。
項42. インフルエンザワクチンが3価ワクチンである、項41に記載の製剤又は方法。
本発明の好ましい実施形態を詳細に記述してきたが、上記の項によって定義される本発明は、上記で述べた特定の詳細に制限するものではなく、その多くの明白な変形が本発明の趣旨又は範囲を逸脱することなく可能であることが理解されるべきである。

Claims (26)

1つ又は複数のシステイン変異を含む、単離された非天然組換えヘマグルチニン(rHA)タンパク質。
rHAタンパク質がH1、H2、H3、H5、H7又はH9タンパク質である、請求項1に記載のタンパク質。
システイン変異がカルボキシ末端領域にある、請求項2に記載のタンパク質。
システイン変異が膜貫通領域にある、請求項2に記載のタンパク質。
システイン変異が細胞質領域にある、請求項2に記載のタンパク質。
rHAタンパク質がBタンパク質である、請求項1に記載のタンパク質。
システイン変異が、膜貫通(TM)ドメイン及び細胞質(CT)ドメインを含むカルボキシ末端領域にある、請求項6に記載のタンパク質。
請求項1に記載のタンパク質を発現するヌクレオチド配列をコード及び発現するバキュロウイルスベクター。
請求項1に記載のタンパク質を含むインフルエンザワクチン。
請求項8に記載のバキュロウイルスベクターを含むインフルエンザワクチン。
rHAタンパク質を安定化させる方法であって、rHAタンパク質における1つ又は複数のシステイン残基を同定する工程と、前記1つ又は複数のシステイン残基を、システインではなく三量体形成を破壊しないアミノ酸残基に変異させる工程とを含み、それによりrHAタンパク質を安定化させる、方法。
rHAタンパク質がH1、H2、H3、H5、H7又はH9タンパク質である、請求項11に記載の方法。
システイン変異がカルボキシ末端領域にある、請求項12に記載の方法。
システイン変異が膜貫通領域にある、請求項12に記載の方法。
システイン変異が細胞質領域にある、請求項12に記載の方法。
rHAタンパク質がBタンパク質である、請求項11に記載の方法。
システイン変異がカルボキシ末端領域にある、請求項16に記載の方法。
(a)タンパク質と、(b)シトレートと、(c)チオグリコレート又はチオグリセロールとを含む安定化タンパク質製剤。
シトレートとチオグリコレート又はチオグリセロールとを製剤に添加する工程を含む、タンパク質製剤の安定化方法。
チオグリコレートがチオグリコール酸ナトリウムである、請求項18又は19に記載の製剤又は方法。
チオグリセロールがモノチオグリセロールである、請求項18又は19に記載の製剤又は方法。
シトレートの濃度が少なくとも約1mg/mlである、請求項18又は19に記載の製剤又は方法。
チオグリコレート又はチオグリセロールの濃度が約0.2mg/mlである、請求項18又は19に記載の製剤又は方法。
製剤がワクチンである、請求項18又は19に記載の製剤又は方法。
ワクチンがインフルエンザワクチンである、請求項24に記載の製剤又は方法。
インフルエンザワクチンが3価ワクチンである、請求項25に記載の製剤又は方法。
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