TW202016309A - 流感病毒血球凝集素突變體 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及在植物中經修飾的流感病毒蛋白質的生產。更具體地,本發明涉及在植物中生產和增加流感類病毒顆粒(VLP)的生產,其中VLP包含經修飾的流感病毒蛋白質,例如經修飾的流感血球凝集素(HA)。當與相應的野生型胺基酸序列比較時,該HA蛋白質可包含含有至少一個取代的胺基酸序列。還提供了編碼經修飾的HA蛋白質的核酸。此外,還提供了生產流感類病毒顆粒(VLP)的方法和增加植物、植物的一部分或植物細胞中流感類病毒顆粒(VLP)的生產的產量的方法。
Description
本發明有關於在植物中生產突變的病毒蛋白質。更特別地是,本發明有關於在植物中生產流感類病毒顆粒及增加流感類病毒顆粒生產。
用流感病毒為正黏液病毒科家族的有套膜、單股RNA病毒。流感病毒具高度接觸傳染性並可在所有年齡組導致輕微至嚴重疾病。
疫苗接種仍然是預防流感感染的最有效方法。常規地,使用病毒的活滅毒形式或完全失活形式完成疫苗接種,當投予患者時引發免疫反應。為了消除活滅毒和完全失活病毒重新獲得複製和傳染能力的潛在風險,包含重組病毒蛋白質的疫苗也被用於引發流感感染的保護性免疫。
然而,使用重組病毒蛋白質作為疫苗的免疫性成分受到許多限制。首先,在缺乏最佳表現和適當蛋白質折疊所需的遺傳成分和病毒蛋白的全部補體的情況下,標準體外表現系統中重組病毒蛋白質的產量可能不足以用於疫苗生產的目的。其次,重組病毒蛋白質疫苗可能表現出較差的免疫性,這是由於折疊不當,抗原呈現不良,及/或主要體液免疫反應的產生,這種反應在賦予持久的保護性免疫方面無效。
有四種類型的流感病毒:A、B、C和D,其中A型和B型流感是人類季節性疾病流行病的致病微生物。
基於病毒表面上血球凝集素(HA)和神經胺酸酶(NA)醣蛋白亞型的表現,進一步劃分A型流感病毒。有18種不同的HA亞型(H1-H18)。
HA是三聚體凝集素,其促進流感病毒顆粒與靶細胞表面上的含唾液酸的蛋白質的結合,並媒介病毒基因體釋放到靶細胞中。HA蛋白包含兩種結構部分:頭部(其是血清保護性抗體的主要靶標)和莖。Ha等人於2002年的出版物(EMBO J.21:865-875;其通過引用併入本文)示出了基於X射線晶體結構的幾種流感亞型中莖結構域簇(SDC)和頭結構域簇(HDC)的各種亞結構域的相對方向。
HA被轉譯為單個多肽HA0(組裝為三聚體),其必須被絲胺酸內切蛋白酶切割為HA1(~40kDa)和HA2(~20kDa)亞結構域。切割後,兩個雙硫鍵結合的蛋白質結構域採用病毒感染性所必需的必要構型。HA1形成含有殘留酯酶結構域E1’和E2以及受體結合位點(RBS)的球狀頭部結構域,並且RBS是流感病毒的最不具保留性的區段。HA2是單通道整合膜蛋白,其具有融合肽(FP)、可溶性胞外域(SE)、跨膜(TM)和細胞質尾部(CT),各自具有約25、160、25和10個殘基的長度。HA2與N和C端HA1殘基一起形成莖域(stalk domain),其包括跨膜區,並且相對具保留性。
已經研究了流感病毒蛋白質(特別是流感病毒HA)中的各種突變。
例如,Castelán-Vega等人(Adv Appl Bioinform Chem.
2014;7:37-44)使用穩定性預測演算法來比較A型流感(H1N1)pdm09病毒中HA的7,479個全長胺基酸序列,並鑑定出導致預測的流感HA穩定性增強的D104N、A259T、S124N和E172K 突變。相反地,S206T、K285E和E47K突變具有預測的對HA的去穩定作用。
在比較原始A型流感(H1N1) pdm [A/加州/7/2009]和後來出現的流感病毒株[A/布利斯班/10/2010]的序列時,Cotter等人(PLoS Pathog
. 2014;10(1):e1003831)鑑定了A/加州/7/2009 HA的莖部區中的E47K突變穩定了三聚體結構,降低了膜融合的pH,並增加了病毒的熱穩定性和酸穩定性。Cotter等人另外觀察到A/加州 /7/2009 E47K突變HA在雪貂中比其野生型對應物更具感染性。
Antanasijevic等人(J Biol Chem
. 2014;289(32):22237-45)藉由在14個不同位置的定點誘變研究了H5 HA莖環區的結構-功能特性。A/越南/1203/04(H5N1)突變體在HEK 293T細胞中表現,且Antanasijevic報導,莖環區域中的大多數突變不破壞表現、蛋白質水解加工、病毒組裝、或受體結合。然而,Antanasijevic觀察到HA1-D26K、HA1-M102L、HA2-V52A和HA2-I55A突變體(基於H3編號)表現出顯著降低的總HA量,暗示HA至病毒顆粒的降低表現及/或組裝。與野生型病毒相比,HA1-D26K、HA2-T49A和HA2-M102L突變體也表現出較低的血球凝集價。Antanasijevic另外觀察到所有單突變體表現出進入A549肺細胞的減少,HA1-D26K和HA2-I55A突變體中顯示最明顯的受損。Antanasijivec進一步證明,與野生型病毒相比,HA2-L99A突變體對C179中和抗體對A549肺細胞的抑制作用更敏感,暗示該突變增強了抗體結合及/或中和作用模式。相反地,HA1-I28A、HA1-M31A、HA1-M31L、HA2-I45A和HA2-I55V突變體對C179中和抗體對進入抑制的敏感性較低。
WO2013/177444及其配套出版物Lu等人(Proc Natl Acad Sci USA
. 2014;111(1):125-30)報導了一種使用基於大腸桿菌的無細胞蛋白質表現系統和簡單的再折疊步驟從A/加州/05/2009(H1N1)生產正確折疊的HA莖域的方法。為了誘導HA莖域的三聚化,將氯黴素乙醯轉移酶(CAT)或折疊結構域融合至HA的C端。為了減輕新暴露的疏水性及/或引起表現的HA莖蛋白的聚集的分子間離子配對,評估了五組突變:M1(I69T + I72E + I74T + C77T);M2(I69T + I72E + I74T + C77T + F164D);M3(I69T + I72E + I74T + C77T + F164D + L174D);M4(F164D);及M5(F164D + L174D)。Lu觀察到M5(F164D + L174D)突變體似乎是用於改善HA莖蛋白溶解度的最有影響的突變。對M5突變體進行額外的刪除(H38至C43以及C49至N61)和C77T突變,以避免形成不想要的雙硫鍵,降低表面疏水性和pI,並避免具有無序結構的區域。
美國申請號13/838,796及其Holtz等人的伴隨出版物(BMC Biotechnology
. 2014;14:111)藉由HA蛋白質(包括跨膜(TM)和細胞溶質結構域(CT))的羧基末端區域中半胱胺酸殘基的突變教導了重組HA的改善的穩定性和維持的效力。具體而言,Holtz等人證明了重組伯斯/16/2009 HA(H3N2)中的C539A、C546A、C549A、C524S和C528A突變。所有五個半胱胺酸殘基或其不同子集合的突變導致HA產量、純度、粒徑、血球凝集活性和熱穩定性與重組野生型HA蛋白質相當。相反地,C64S和C76S突變導致HA表現顯著降低,表明這些殘基在適當的HA折疊中的關鍵作用。藉由使用單向輻射狀免疫擴散法(SRID),Holtz等人也示出藉由防止TM和CT結構域中的雙硫鍵交聯,與野生型蛋白質相比,五個半胱胺酸殘基突變改善了重組HA的效力。突變HA蛋白質在25℃下維持效力至少12個月,而野生型HA蛋白質在純化後僅50天後表現出少於40%的效力。
WO2015/020913教導了在選自A型流感/波多黎各/8/1934(H1N1)的403、406、411、422、429、432、433和435的一或多個位置處的特定殘基突變為酪胺酸。這些突變促進二酪胺酸交聯的形成,所述二酪胺酸交聯將流感HA的莖域穩定或“鎖定”在其天然三聚體構型。
WO2013/079473揭露了缺乏球狀頭部結構域的經修飾的流感HA。 WO2013/079473中教導的多肽包含HA1結構域(其中胺基酸53至620(參考A/布利斯班/59/2007 [H1N1]編號)被刪除並以0至10個胺基酸的共價連接序列替換)以及HA2結構域,其中HA1結構域的C-端胺基酸是精胺酸或離胺酸以外的胺基酸,並且其中在406、409、413和416位置的一或多個胺基酸突變為選自由:絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸和甘胺酸所組成群組的胺基酸。
WO2014/191435類似地教導了經修飾的流感HA,其包含具有缺失片段的HA1結構域和HA2結構域,該缺失片段被0-50個胺基酸的共價連接序列取代,其中HA可抵抗在HA1和HA2之間的連接處的切割,且其中位置337、340、352、353、402、406、409、413及/或416處的一或多個胺基酸已經突變。
類病毒顆粒(VLP)是用於包含在免疫性組合物中的潛在候選物。VLP與成熟病毒粒子非常相似,但它們不含病毒基因體物質。因此,VLP本質上是非複製性的,這使得它們作為疫苗投予是安全的。此外,VLP可以被工程化以在VLP的表面上表現病毒醣蛋白,這是它們最天然的生理構型。此外,由於VLP類似於完整的病毒粒子並且是多價微粒結構,因此VLP在誘導對於醣蛋白的中和抗體方面可能比可溶性套膜蛋白質抗原更有效。
已經在植物中生產VLP(參見例如WO2009/076778;WO2009/009876; WO2009/076778;WO2010/003225;WO2010/003235;WO2010/006452;WO2011/03522;WO2010/148511;和 WO2014153674,其藉由引用併入本文)。
WO2009/076778教導了一種在植物中生產流感VLP的方法,包括引入具有在植物中有活性的調控區域的核酸,該調控區域操作性地連接於編碼來自A型或B型流感的流感HA的核苷酸序列。
WO2009/009876教導了一種在植物中生產流感HA VLP的方法,其中流感HA在植物細胞中自組裝成VLP並從植物細胞膜中出芽。
WO2010/003225揭露了一種在植物中生產流感HA VLP的方法,包括引入具有在植物中有活性的調控區域的核酸,其操作性地連接至編碼來自A/加州/04/09(H1N1)的流感HA的核苷酸序列。
WO2010/006452教導了包含經修飾的流感HA蛋白質的VLP的生產,其中位置154、165、286或其組合處的醣苷化位點(參考A/越南/1194/04 [H5N1]編號)已經藉由將所述位置的殘基突變為天冬醯胺以外的胺基酸來消除。WO2010/006452進一步教導了位置156、167、288或其組合處的胺基酸可以被突變為絲胺酸或蘇胺酸之外的殘基,以類似地消除N-連接的醣苷化信號三元組“N‑X‑S/T”。藉由選擇性地刪除位於HA蛋白質的球狀頭部中的醣苷化位點,WO2010/006452證明所得的HA蛋白質具有增加的抗原性和更廣泛的交叉反應。
WO2011/035422教導了一種製備植物衍生的VLP的方法,包括:獲得包含質外體定位的VLP的植物或植物物質;生產原生質體/球形質體部分和質外體部分;以及回收包含植物衍生的VLP的質外體部分。
WO2010/148511揭露了一種用於在植物中生產流感VLP的方法,其中VLP包含嵌合HA蛋白質。嵌合HA蛋白質包含具有F'1、F'2和F亞結構域的莖結構域簇;具有RB、E1和E2亞結構域的頭結構域簇;以及具有跨膜結構域和C端尾部結構域的跨膜結構域簇,其中至少一個亞結構域衍生自第一流感病毒株,而其他亞結構域衍生自一種或多種第二流感病毒株。
WO2014/153674教導了一種在植物中生產流感VLP的方法,其中VLP包含具有經修飾的蛋白水解環的經修飾的流感HA。修飾的蛋白水解環包括HA0前驅物的HA1和HA2結構域之間去除的蛋白水解切割位點。因此,與天然HA蛋白質相比,HA蛋白質穩定並且實現了增加的蛋白質產量。
根本發明有關於在植物中生產經修飾的流感病毒蛋白質。更具體地,本發明有關於在植物中生產和增加類流感病毒顆粒(VLP)的生產,其中VLP包含經修飾的流感病毒蛋白質,例如經修飾的血球凝集素(HA)蛋白質。
本發明的一個目的是提供一種增加植物中流感VLP生產的改進方法。
根據本發明,提供:
包含編碼經修飾的流感H1血球凝集素(HA)蛋白質的核苷酸序列的核酸,該HA蛋白質包含與相應的野生型胺基酸序列相比包含至少一個取代的胺基酸序列,該至少一個取代是位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97、374、390或429處的胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
HA蛋白質可包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97的胺基酸的胺基酸處具有非天冬醯胺取代。HA蛋白質可以包含胺基酸序列,其在對應於H1 A /密西根/45/15 HA的位置97的胺基酸的胺基酸處具有天冬胺酸取代或天冬胺酸的保留取代。
HA蛋白質可包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的胺基酸處具有非離胺酸取代。HA蛋白質可以包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的胺基酸處具有麩胺酸取代或麩胺酸的保留取代。
HA蛋白質可以包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有非苯丙胺酸取代。HA蛋白質可以包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有天冬胺酸取代或天冬胺酸的保留取代。
HA蛋白質可包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的胺基酸處被非白胺酸取代。HA蛋白質可以包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的胺基酸處具有甲硫胺酸取代或甲硫胺酸的保留取代。
HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置380處的胺基酸的胺基酸處被非天冬醯胺取代。HA蛋白質可包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置380處的胺基酸的胺基酸處具有丙胺酸取代或丙胺酸的保留取代。
HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有為非苯丙胺酸的第一取代,並且在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的胺基酸處具有為非白胺酸的第二取代。HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有取代為天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代的第一取代,並且在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的胺基酸處具有取代為甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代的第二取代。
HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非天冬醯胺的第一取代,並且在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非離胺酸的第二取代。HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的胺基酸處具有取代為天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代的第一取代,以及在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的胺基酸處具有取代為麩胺酸或麩胺酸的保留取代的第二取代。
HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非天冬醯胺的第一取代,並且在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非苯丙胺酸第二取代,以及在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非白胺酸的第三取代。HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的胺基酸處具有取代為天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代的第一取代,在對應於H1 A/ 密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有取代為天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代的第二取代,以及在對應於H1 A/密西根 /45/15 HA的位置429處的胺基酸的胺基酸處具有取代為甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代的第三取代。
HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非離胺酸的第一取代,在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非苯丙胺酸的第二取代,以及在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非白胺酸的第三取代。HA蛋白質可進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的胺基酸處具有取代為麩胺酸或麩胺酸的保留取代的第一取代,在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有取代為天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代的第二取代,以及在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的胺基酸處具有取代為甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代的第三取代。
HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的胺基酸處具有非天冬醯胺第一取代,在對應於H1 A /密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非離胺酸的第二取代,在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非苯丙胺酸的第三取代,以及在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的胺基酸處具有取代為非白胺酸的第四取代。HA蛋白質可以進一步包含胺基酸序列,其在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的胺基酸處具有取代為天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代的第一取代,在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的胺基酸處具有取代為麩胺酸或麩胺酸的保留取代的第二取代,在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的胺基酸處具有天冬胺酸或天冬胺酸的保留取代的第三取代,以及在對應於H1 A/密西根/45/15 HA 的位置429處的胺基酸的胺基酸處具有取代為甲硫胺酸或甲硫胺酸的保留取代的第四取代。
進一步提供了由如上所述的重組核酸編碼的HA蛋白質和包含由如上所述的重組核酸編碼的HA蛋白質的類病毒顆粒(VLP)。
因此,提供了一種經修飾的流感H1血球凝集素(HA)蛋白質,該HA蛋白質包含與相應的野生型胺基酸序列相比包含至少一取代的胺基酸序列,所述至少一取代是位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97、374、390或429處的胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
此外,提供了一種在植物、植物的一部分或植物細胞中生產流感類病毒顆粒(VLP)的方法,該方法包括:
a) 將如上所述的重組核酸引入該植物、該植物的一部分或植物細胞中;以及
b)在允許HA蛋白質表現的條件下培養該植物、該植物的一部分或植物細胞,該HA蛋白質由該重組核酸編碼,藉此生產該VLP。該方法還可包括收獲該植物、該植物的一部分或植物細胞並純化該VLP的步驟c)。
進一步提供了一種在植物、植物的一部分或植物細胞中生產流感類病毒顆粒(VLP)的方法,包括:
a) 提供包括如上所述的重組核酸的植物、植物的一部分或植物細胞;以及
b)在允許HA蛋白質表現的條件下培養該植物、該植物的一部分或植物細胞,該HA蛋白質由該重組核酸編碼,藉此生產該VLP。該方法還可包括收獲該植物、該植物的一部分或植物細胞並純化該VLP的步驟c)。
此外,提供了一種在植物、植物的一部分或植物細胞中增加流感類病毒顆粒(VLP)的生產的產量的方法,包括:a)將重組核酸引入植物、該植物的一部分或植物細胞中;或提供包含該重組核酸的植物、植物的一部分或植物細胞;以及b)在允許該HA蛋白質表現的條件下培養該植物、該植物的一部分或植物細胞,該HA蛋白質由該重組核酸編碼,藉此與表現未經修飾的流感HA蛋白質的植物、植物的一部分或植物細胞相比以更高的產率生產該VLP。該方法可以進一步包括收穫該植物、該植物的一部分或植物細胞並純化該VLP的步驟c)。
該方法可以進一步包括引入編碼質子通道蛋白質的第二核酸;其中該植物、該植物的一部分或植物細胞被培養在允許由第二核酸編碼的質子通道蛋白質表現的條件下。質子通道蛋白可以是A型流感病毒亞型M2蛋白質。
另外提供了一種由本文所述方法生產的VLP。
該VLP可包含一種或多於一種源自該植物、該植物的一部分或植物細胞的脂質、植物特異性N-聚醣、經修飾的N-聚醣或其組合。
此外,提供了一種生產抗體或抗體片段的方法,該方法包括將如上所述的VLP投予個體或宿主動物,從而生產抗體或抗體片段。還提供了藉由該方法生產的抗體或抗體片段。
此外,提供了一種植物、植物的一部分或植物細胞,其包含重組核酸或由重組核酸編碼的HA蛋白質。HA蛋白質可以形成VLP。因此,也提供了一種包含VLP的植物、植物的一部分或植物細胞,該VLP包含由重組核酸編碼的HA蛋白質。
此外,提供了一種用於誘發免疫反應的組合物,其包含有效劑量的如本文所述的VLP,以及藥學上可接受的載體(carrier)、佐劑、媒介物(vehicle)或賦形劑。還提供了一種在個體中誘發對流感感染的免疫性的方法,該方法包括投予如上所述的VLP。VLP可經由口服、鼻內、肌內、腹膜內、靜脈內或皮下投予個體。
此外,提供了一種經修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質,其包含與以下序列中的一序列具有約30%至約100%序列一致性或序列相似性的胺基酸序列:SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 149,條件是流感HA蛋白質包含如本文所述的至少一取代,並且能夠形成VLP,當投予個體時誘發免疫反應、誘發血球凝集或其組合。
本發明內容不一定描述本發明的所有特徵。
以下敘述為較佳具體實施例。
如本文所使用的,用語“包含”、“具有”、“包括”、“含有”及其語法變化是包含性的或開放式的,並且不排除另外的、未列舉的元件及/或方法步驟。當在本文中與產品、用途或方法結合使用時,用語“基本上由…組成”表示可以存在額外的元件及/或方法步驟,但是這些添加不會實質上影響所記載方法或用途作用的方式。當在本文中與產品、用途或方法結合使用時,用語“由…組成”排除了額外元件及/或方法步驟的存在。在某些實施方式中,本文描述為包含某些元件及/或步驟的產品、用途或方法也可以基本上由那些元件及/或步驟組成,並且在其他實施方式中由那些元件及/或步驟組成,無論這些實施方式是否具體被提及。另外,除非另有說明,否則單數的使用包括複數,且“或”表示“及/或”。除非本文另有定義,否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本領域具通常知識者通常理解的含義相同的含義。如本文所用的,用語“約”是指從給定值的約+/- 10%的變化。要理解的是,無論是否具體提及,這種變化總是包括在本文提供的任何給定值中。當在本文中結合用語“包含”使用時,用語“一(a)”或“一(an)”可以表示“一個”,但它也與“一或多個”、“至少一個” 以及“一個或多於一個”的含義一致。
如本文所使用的,術語“植物”、“植物的一部分”、“植物部分”、“植物物質”、“植物生物質”、“植物材料”、“植物萃取物”或“植物葉子”,可以包含能夠提供轉錄、轉譯和轉譯後機制的整個植物、組織、細胞或其任何部分、細胞內植物成分、細胞外植物成分、植物的液體或固體萃取物、或其組合,該機制用於表現本文所述的一種或多於一種核酸、及/或可以從中萃取和純化表現的蛋白質或VLP。植物可包括但不限於草本植物。此外,植物可包括但不限於農作物,包括例如油菜、甘藍、玉蜀黍、煙草(煙草)(例如圓葉煙草、黃花煙草、紅花煙草、翼柄煙草)、阿拉伯芥、苜蓿、馬鈴薯、甘藷(Ipomoea batatus
)、人參、豌豆、燕麥、米、大豆、小麥、大麥、向日葵、棉花、玉米、黑麥(Secale cereale
)、高粱(Sorghum bicolor 、 Sorghum vulgare
)、紅花(Carthamus tinctorius
))。
如本文所使用,術語“植物部分”是指植物的任何部分,包括但不限於葉、莖、根、花、果實、從葉、莖、根、花、果實獲得的植物細胞、從葉、莖、根、花、果實獲得的植物萃取物、或其組合。如本文所使用,術語“植物萃取物”是指在物理地(例如藉由冷凍然後在合適的緩衝液中萃取)、機械地(例如藉由研磨或均質化植物或植物的一部分,然後在合適的緩衝液中萃取)、酵素催化地(例如使用細胞壁分解酶)、化學地(例如使用一種或多種螯合劑或緩衝液)、或其組合處理植物、植物的一部分、植物細胞、或其組合之後獲得的植物衍生產物。可以進一步處理植物萃取物以除去不需要的植物成分,例如細胞壁碎片。可以獲得植物萃取物以幫助從植物、植物的一部分或植物細胞中回收一種或多種成分,例如來自植物、植物的一部分或植物細胞的蛋白質(包括蛋白質複合物、蛋白質超結構及/或VLP)、核酸、脂質、碳水化合物或其組合。如果植物萃取物包含蛋白質,則它可以稱為蛋白質萃取物。蛋白質萃取物可以是粗植物萃取物、部分純化的植物或蛋白質萃取物、或純化產物,其包含來自植物組織的一種或多種蛋白質、蛋白質複合物、蛋白質超結構及/或VLP。如果需要,可以使用本領域技術人員已知的技術部分地純化蛋白質萃取物或植物萃取物,例如,可以對萃取物進行鹽或pH沉澱、離心、梯度密度離心、過濾、層析法,例如,粒徑篩析層析、離子交換層析、親和層析、或其組合。還可以使用本領域技術人員已知的技術來純化蛋白質萃取物。
如本文所使用,術語“構築體”、“載體”或“表現載體”是指用於將外源核酸序列轉移到宿主細胞(例如植物細胞)中並引導外源核酸序列在宿主細胞中表現的重組核酸。 “表現卡匣”是指包含在適當的啟動子或其他調控因子的控制下、並與其可操作地(或操作性地)連接的感興趣的核酸的核苷酸序列,以用於在宿主細胞中轉錄感興趣的核酸。如本領域具通常知識者所理解的,表現卡匣可包含終止(終止子)序列,其是對植物宿主有活性的任何序列。例如,終止序列可以衍生自雙鏈RNA病毒的RNA-2基因體片段,例如,如果是豇豆嵌紋病毒,終止序列可以是NOS終止子,或終止子序列可以從苜蓿色素體藍素基因的3’UTR獲得。
本揭露內容的構築體可以進一步包含3’非轉譯區(UTR)。3’非轉譯區含有聚腺苷酸化信號和能夠影響mRNA加工或基因表現的任何其他調控信號。聚腺苷酸化信號的特徵通常在於將聚腺苷酸軌道添加到mRNA前驅物的3’端的效應。儘管變異並不罕見,聚腺苷酸化信號通常藉由與經典形式5’AATAAA-3’同源的存在來識別。合適的3’區域的非限制性實例是3’轉錄的非轉譯區,其含有農桿菌腫瘤誘導的(Ti)質體基因的聚腺苷酸化信號,例如胭脂鹼合成酶(Nos基因)和植物基因 (例如大豆貯藏蛋白基因、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶基因的小次單元(ssRUBISCO;US 4,962,028;其藉由引用併入本文))、用於調控色素體藍素表現的啟動子。
“調控區域”、“調控因子”或“啟動子”是指核酸的一部分,通常但不總是在基因的蛋白質編碼區的上游,其可以由DNA或RNA組成,或DNA和RNA兩者。當調控區域啟動,且與感興趣的核苷酸序列操作性相關聯或操作性地連接時,這可導致感興趣的核苷酸序列的表現。調控因子可能能夠媒介器官專一性、或控制發育或暫時性基因活化。 “調控區域”包括啟動子元件、表現出基礎啟動子活性的核心啟動子元件、響應外部刺激而可誘導的元件、媒介啟動子活性的元件(如負調控元件或轉錄增強子)。如本文所使用,“調控區域”還包括轉錄後有活性的元件,例如調節基因表現的調控元件(例如轉譯和轉錄增強子、轉譯和轉錄抑制子、上游活化序列和mRNA不穩定性決定子)。這些後面的元件中的幾個可以位於編碼區域的近側。
在本揭露內容的上下文中,術語“調控元件”或“調控區域”通常是指DNA序列,通常但並非總是在結構基因的編碼序列的上游(5’),其藉由提供RNA聚合酶的識別及/或在特定位點開始轉錄所需的其他因子來控制編碼區域的表現。然而,應理解,位於內含子內或序列3’內的其他核苷酸序列也可有助於調控感興趣的編碼區域的表現。提供識別RNA聚合酶或其他轉錄因子以確保在特定位點起始的調控因子的實例是啟動子元件。大多數(但不是全部)的真核啟動子元件含有TATA盒,其為由腺苷和胸腺嘧啶核苷核苷酸鹼基對組成的保留核酸序列,通常位於轉錄起始位點上游約25個鹼基對。啟動子元件可包含負責轉錄起始的基礎啟動子元件,以及修飾基因表現的其他調控因子。
存在幾種類型的調控區域,包括發育調控的、可誘導的或持續表現型的調控區域。發育調控的調控區域、或在其控制下控制基因的差異表現的調控區域,在某些器官或器官的組織內、在該器官或組織發育期間的特定時間被活化。然而,一些受發育調控的調控區域可能優先在特定發育階段的某些器官或組織內具有活性,它們也可以以發育調控的方式被活化,或者也可以在植物內的其他器官或組織處於基礎水準。組織特異性調控區域的實例,例如參見特異性調控區域,包括napin啟動子和十字花科蛋白啟動子(Rask等人,1998,J. Plant Physiol. 152:595-599;Bilodeau等人,1994,Plant Cell 14:125-130)。葉特異性啟動子的實例包括色素體藍素啟動子(參見US 7,125,978,其藉由引用併入本文)。
可誘導的調控區域是能夠響應誘導物而直接或間接活化一種或多種DNA序列或基因的轉錄的調控區域。在沒有誘導物的情況下,DNA序列或基因將不被轉錄。通常,與可誘導的調控區域特異性結合以活化轉錄的蛋白質因子可以以不活化形式存在,然後藉由誘導物直接或間接地轉化為活化形式。然而,蛋白質因子也可能不存在。誘導物可以是化學試劑,例如蛋白質、代謝物、生長調節劑、除草劑或酚類化合物,或直接由熱、冷、鹽或有毒元素施加的生理壓力,或經由病原體或疾病媒介(例如病毒)的作用間接施加的生理壓力。含有可誘導調控區域的植物細胞可以由外部將誘導物施加於細胞或植物,例如藉由噴霧、澆水、加熱或類似方法而暴露於誘導物。可誘導的調控因子可以源自植物或非植物基因 (例如Gatz, C.和Lenk, I.R.P.,1998,Trends Plant Sci. 3, 352-358)。潛在的可誘導的啟動子的實例包括但不限於四環素可誘導的啟動子 (Gatz, C.,1997,Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108)、類固醇可誘導的啟動子(Aoyama, T.和Chua, N.H.,1997,Plant J. 2, 397-404)和乙醇可誘導的啟動子(Salter, M.G.等人,1998,Plant Journal 16, 127-132;Caddick, M.X.等人,1998,Nature Biotech.16, 177-180)細胞分裂素可誘導的IB6和CKI1基因 (Brandstatter, I.和Kieber, J.J.,1998,Plant Cell 10, 1009-1019;Kakimoto, T.,1996,Science 274, 982-985)和生長素可誘導因子DR5 (Ulmasov, T.等人,1997,Plant Cell 9, 1963-1971)。
持續表現型調控區域引導基因在植物的各個部分中的表現,並在整個植物發育過程中持續引導基因的表現。已知的持續表現型調控因子的實例包括與CaMV 35S轉錄本相關聯的啟動子。(p35S;Odell等人,1985,Nature,313:810-812;其藉由引用併入本文),水稻肌動蛋白1(Zhang等人,1991,Plant Cell,3:1155-1165),肌動蛋白2(An等人,1996,Plant J.,10:107-121),或tms 2(US 5,428,147),和磷酸三碳糖異構酶1(Xu等人,1994,Plant Physiol. 106:459-467)基因,玉蜀黍泛蛋白1基因(Cornejo等人,1993,Plant Mol. Biol. 29:637-646),阿拉伯芥泛蛋白1和6基因(Holtorf等人,1995,Plant Mol. Biol. 29:637-646),煙草轉譯起始因子4A基因(Mandel等人,1995 Plant Mol. Biol. 29:995-1004),木薯葉脈嵌紋病毒啟動子pCAS,(Verdaguer等人,1996);核酮糖二磷酸羧化酶小次單元的啟動子pRbcS:(Outchkourov等人,2003),(用於單子葉植物和雙子葉植物的) pUbi。
如本文所使用的術語“持續表現型”不一定表示在持續表現型調控區域控制下的核苷酸序列在所有細胞類型中以相同水準表現,但即使經常觀察到豐富的變化,該序列在多種細胞類型中表現。
如上所述的表現構築體可以存在於載體中。載體可包含邊界序列,其允許表現卡匣轉移和整合到生物體或宿主的基因體中。構築體可以是植物二元載體,例如基於pPZP的二元轉化載體(Hajdukiewicz等人1994)。其他示例性構築體包括pBin19 (參見Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller等人1995,Plant Molecular Biology
27:405-409)。
如本文所使用,術語“天然”、“天然蛋白質”或“天然結構域”是指具有與野生型相同的一級胺基酸序列的蛋白質或結構域。天然蛋白質或結構域可以由與野生型序列具有100%序列相似性的核苷酸序列編碼。當與野生型核苷酸序列比較時,天然胺基酸序列也可以由人類密碼子(hCod)最佳化的核苷酸序列或包含增加的GC含量的核苷酸序列編碼,條件是由hCod-核苷酸序列編碼的胺基酸序列展現與天然胺基酸序列100%的序列一致性。
藉由核苷酸序列(其為“人類密碼子最佳化的”或“hCod”核苷酸序列),意指選擇合適的DNA核苷酸用於合成接近通常在人類核苷酸序列的寡核苷酸序列中發現的密碼子使用的寡核苷酸序列或其片段。“增加的GC含量”是指當與相應的天然寡核苷酸序列比較時、選擇合適的DNA核苷酸用於合成寡核苷酸序列或其片段以接近包含GC含量的增加(例如,在寡核苷酸序列的編碼部分的長度上約1%至約30%,或其間的任何量)的密碼子使用。例如,在寡核苷酸序列的編碼部分的長度上,從大約1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30%、或其間的任何量。如下所述,人類密碼子最佳化的核苷酸序列或包含增加的GC含量的核苷酸序列(當與野生型核苷酸序列比較時)當與非人類最佳化的(或較低GC含量的)核苷酸序列比較時,在植物、植物的一部分、或植物細胞中呈現出增加的表現。
本文描述了經修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質(也稱為經修飾的HA蛋白質、經修飾的流感HA蛋白質、經修飾的HA、經修飾的流感HA、突變HA、流感突變HA、流感HA變體或HA變體)和在植物中生產經修飾的流感HA蛋白質的方法。本文揭露的經修飾的流感HA蛋白質包含已經發現與野生型HA或未經修飾的HA蛋白質相比導致改善的HA特徵的修飾或突變。例如,當與相應的野生型胺基酸序列比較時,修飾的流感HA蛋白質可具有胺基酸序列,其具有至少一個胺基酸取代。
經修飾的HA蛋白質的改善特徵的實例包括:與不包含修飾或突變的相同的流感病毒株或亞型的野生型或未經修飾的HA相比,當在植物細胞中表現時增加的HA蛋白質產量;當與野生型或未經修飾的HA蛋白質相比,經修飾的HA蛋白質的改良的血球凝集價;與包含野生型HA(其不包含修飾或突變)的類病毒顆粒(VLP)的完整性、穩定性或兩者相比,包含經修飾的HA蛋白質的VLP的完整性、穩定性或完整性和穩定性兩者均得到改善;與不包含修飾或突變的野生型VLP生產水準相比,當在植物細胞中表現時VLP產量增加;及其組合。流感亞型與病毒株
如本文所使用的術語“流感病毒亞型”是指A型流感病毒變體,其特徵在於血球凝集素(H或HA)和神經胺酸酶(N)病毒表面蛋白質的各種組合。根據本說明書,流感病毒亞型和來自這些病毒亞型的血球凝集素(HA)可以由其H編號來指代,例如,“H1亞型的HA”、“H1 HA”或“H1流感”。術語“亞型”具體包括每個亞型內的所有個別“病毒株”,其通常由突變產生並且可以顯示不同的致病概貌。此類病毒株也可稱為病毒亞型的各種“分離株”。因此,如本文所使用,術語“病毒株”和“分離株”可互換使用。
傳統上,基於例如流感病毒凝集紅血球(RBC或紅血球)的能力,已經對不同的流感病毒株進行了分類。對特定流感病毒株具專一性的抗體可以與病毒結合,從而防止這種凝集。基於此類抑制確定病毒株類型的測定法通常稱為血球凝集素抑制測定法 (HI測定法或HAI測定法),並且是本領域中用於表徵流感病毒株的標準和眾所周知的方法。
然而,來自不同病毒株的HA蛋白質在核酸和胺基酸水準上也顯示出顯著的序列相似性。當比較不同亞型的病毒株時,這種相似性程度會變化,其中一些病毒株清楚地顯示出比其他病毒株更高的相似性程度(Air,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1981,78:7643)。胺基酸相似性程度在一種亞型的病毒株和其他亞型的病毒株之間變化(Air,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1981,78:7643)。這種變化足以建立不同的亞型和不同病毒株的演化系列,但不同病毒株的DNA和胺基酸序列仍然易於使用傳統生物資訊學技術進行比對(Air,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1981,78:7643;Suzuki和Nei,Mol. Biol. Evol. 2002,19:501)。
可以比對血球凝集素(HA)的多種核苷酸序列或相應多肽序列以確定亞型的“共通”或“共通序列”(參見第1圖)。
基於序列相似性,流感病毒亞型可以藉由參考它們的同源群進一步分類。親緣關係分析 (Fouchier等人,J Virol. 2005年3月;79(5):2814-22)已經證明了HA的細分,其分為兩個主要群組(Air,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1981,78:7643):尤其是同源群1中的H1、H2、H5和H9亞型,尤其是同源群2中的H3、H4和H7亞型。
藉由在HA蛋白質的胺基酸序列引入變化,該變化導致如上所述的HA的改善的特徵,產生了新的流感HA蛋白質、HA修飾、HA蛋白質變體和突變體。編碼這種HA分子的核酸的分離是常規的,例如藉由定點誘變,核酸的修飾以誘發胺基酸序列中的變化。
本文描述了經修飾的流感HA蛋白質和在植物中生產經修飾的流感HA蛋白質的方法。已經觀察到,例如藉由在HA蛋白質(例如來自亞型H1的HA)中取代特定胺基酸的修飾導致經修飾的HA蛋白質與野生型HA蛋白質或未經修飾的HA蛋白質相比改良的特性。
如本文所述的HA蛋白質的一種或多於一種修飾、突變或取代不位於HA蛋白質的已知抗原決定區域中,這些修飾、突變或取代也不添加或移除HA蛋白質內的醣苷化位點。
如本文所述的HA蛋白質、突變的HA蛋白質或經修飾的HA蛋白質被修飾並且在其胺基酸序列中在與A/密西根/45/15 HA (SEQ ID NO:134;參見第1圖)或A/加州/07/09 HA (SEQ ID NO:130;參見第1圖)的位置97、374、380、390或429處的胺基酸對應的任何一個或多個胺基酸處包含一個或多於一個突變、修飾或取代。
藉由“對應於胺基酸”或“對應於胺基酸的”,其意指胺基酸對應於與如下所述的流感參考病毒株比對的序列中的胺基酸。
HA的胺基酸殘基數目或殘基位置是按照流感參考病毒株的HA的編號。例如,在流感H1的例子中,參考病毒株可以是A/密西根/45/15 HA(SEQ ID NO:134;參見第1圖)或A/加州/07/09 HA (SEQ ID NO:130參見第1圖)。相應的胺基酸位置可以藉由將HA的序列(例如H1 HA)與它們各自的參考病毒株的HA的序列比對來確定。用於比較的序列比對方法是本領域熟知的。用於比較的序列的最佳比對可以例如藉由Smith&Waterman,Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同源性演算法、藉由Needleman&Wunsch,J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 的同源性比對演算法、藉由Pearson&Lipman,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) 的相似性方法的尋找、藉由這些演算法(威斯康辛遺傳學套裝軟體Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的電腦化實現、或者藉由手動比對和視覺檢查(參見,例如,Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編輯,1995補編))進行。幾種A型流感HA結構域的胺基酸序列比對(其將不被認為是限制性的)顯示於第1圖中。
當提及修飾、突變體或變體時,野生型胺基酸殘基(也簡稱為“胺基酸”)之後是殘基編號和新的或取代的胺基酸。例如,天冬胺酸(D,Asp)取代位置97處的殘基或胺基酸中的天冬醯胺 (N,Asn),命名為N97D(參見表1)。
經修飾的HA、HA突變體或變體(例如經修飾的H1 HA)藉由使用野生型殘基的單字母胺基酸代碼、然後是其位置和替換殘基的單字母胺基酸代碼以相同的方式指定。多個突變以利用斜線(/)或加號(+)分隔的多個構成的單突變表示。因此,例如H1 HA突變體N380A/L429M是二取代突變體,其中丙胺酸(A,Ala)取代殘基位置380處的天冬醯胺(N,Asp)並且甲硫胺酸(M,Met)取代殘基位置429處的白胺酸(L,Leu),以及H1 HA突變蛋白質N380A/F390D是二取代變體,其中丙胺酸(A,Ala)取代位置380處的天冬醯胺(N,Asn)且天冬胺酸 (D,Asp)取代H1 HA蛋白質中位置390處的苯丙胺酸 (F,Phe)。
當與相應的野生型胺基酸序列比較時,經修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質可包含具有至少一個胺基酸取代的胺基酸序列。
藉由“胺基酸取代”或“取代”,其意指用不同的胺基酸取代蛋白質的胺基酸序列中的胺基酸。術語胺基酸、胺基酸殘基或殘基在本揭露內容中可互換使用。一個或多個胺基酸可以被不同於此位置的原始或野生型胺基酸的一個或多個胺基酸替換,而不改變蛋白質的胺基酸序列的總長度。藉由將編碼蛋白質的核苷酸序列中的密碼子序列改變為與原始或野生型胺基酸相比不同的胺基酸的密碼子序列,可以實驗性地誘導取代或置換。所得蛋白質是經修飾的蛋白質,例如經修飾的流感HA蛋白質。經修飾的流感HA蛋白質不是天然存在的。
經修飾的HA包括非天然存在的HA蛋白質,其具有對天然存在的HA的至少一種修飾,並且與天然存在的HA蛋白質相比具有改善的特徵,其中衍生了經修飾的HA的胺基酸序列。經修飾的HA蛋白質具有自然界中未發現的胺基酸序列,其藉由用一種或多種不同的胺基酸取代HA蛋白質的一個或多個胺基酸殘基而衍生。
因此,經修飾的HA、突變體HA或重組HA是指其中編碼天然存在的HA的DNA序列被修飾以產生經修飾的或突變的DNA序列的HA,該經修飾的或突變的DNA序列編碼HA胺基酸序列中的一個或多個胺基酸的修飾、突變或取代。
識別用於修飾、突變或取代的一些殘基對應於保留殘基,而其他殘基不是。在殘基不是保留性的情況下,一個或多個胺基酸的取代限於產生經修飾的HA的取代,所述經修飾的HA具有與自然界中發現的胺基酸序列不對應的胺基酸序列。在保留殘基的情況下,這種修飾、取代或置換也不應導致天然存在的HA序列。保留式取代
如本文所述,可以識別和修飾、取代或突變HA蛋白質中的殘基以產生經修飾的HA蛋白質或HA蛋白質變體。特定位置的取代或突變不限於本文所述的或實施例中給出的胺基酸取代。例如,HA變體可含有描述胺基酸取代的保留或保留式取代。
如本文所使用,術語“保留取代”或“保留式取代”及其語法變化是指HA蛋白質的序列中存在胺基酸殘基,其與所述取代或所述殘基不同但屬於同一類別的胺基酸(即,非極性殘基取代非極性殘基、芳香族殘基取代芳香族殘基、極性不帶電荷的殘基取代極性不帶電荷的殘基、帶電荷的殘基取代帶電荷的殘基)。另外,保留式取代可以包括具有相同符號的界面疏水性值的殘基,並且通常具有與替代野生型殘基的殘基相似的量。
如本文所使用,術語“非極性殘基”是指甘胺酸(G,Gly)、丙胺酸(A,Ala)、纈胺酸(V,Val)、白胺酸(L,Leu)、異白胺酸(I,Ile)、 和脯胺酸(P,Pro);術語“芳香族殘基”是指苯丙胺酸(F,Phe)、酪胺酸(Y,Tyr)和色胺酸(W,Trp);術語“極性不帶電荷的殘基”是指絲胺酸(S,Ser)、蘇胺酸(T,Thr)、半胱胺酸(C,Cys)、甲硫胺酸(M,Met)、天冬醯胺(N,Asn)和麩醯胺酸(Q,Gln);術語“帶電荷的殘基”是指帶負電荷的胺基酸天冬胺酸(D,Asp)和麩胺酸(E,Glu),以及帶正電荷的胺基酸離胺酸(K,Lys)、精胺酸(R,Arg) 和組胺酸(H,His)。其他胺基酸分類可能如下:
• 具有疏水側鏈(脂肪族)的胺基酸:丙胺酸(A,Ala)、異白胺酸(I,Ile)、白胺酸(L,Leu)、甲硫胺酸(M,Met)和纈胺酸(V,Val);
• 具有疏水側鏈(芳香族)的胺基酸:苯丙胺酸(F,Phe)、色胺酸(W,Trp)、酪胺酸(Y,Tyr);
• 具有極性中性側鏈的胺基酸:天冬醯胺(N,Asn)、半胱胺酸(C,Cys)、麩醯胺酸(Q,Gln)、絲胺酸(S,Ser)和蘇胺酸(T,Thr);
• 帶電荷側鏈的胺基酸(酸性):天冬胺酸(D,Asp)、麩胺酸(E,Glu);
• 帶電荷側鏈的胺基酸(鹼性):精胺酸(R,Arg);組胺酸(H,His); 離胺酸(K,Lys)、甘胺酸G,Gly)和脯胺酸(P,Pro)。
作為原始的取代或修飾,保留式胺基酸取代可能對所得的HA蛋白質變體或經修飾的HA蛋白質的活性具有類似的作用。關於保留式取代的進一步資訊可以在例如Ben Bassat等人(J. Bacteriol,169:751-757, 1987)、O'Regan等人 (Gene,77:237-251,1989)、Sahin-Toth等人(Protein ScL,3:240-247,1994)、Hochuli等人(Bio/Technology,6:1321-1325,1988)和廣泛使用的遺傳學和分子生物學教科書中找到。
Blosum矩陣通常用於確定多肽序列的相關性。使用可信比對的大型資料庫(BLOCKS資料庫)建立Blosum矩陣,其中計數了藉由小於某個臨界值百分比一致性相關的成對序列比對(Henikoff等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 :10915-10919,1992)。對於BLOSUM90矩陣的高度保留的目標頻率,使用90%一致性的臨界值。對於BLOSUM65矩陣使用65%一致性的臨界值。Blosum矩陣中零和以上的分數在所選擇的百分比一致性被認為是“保留式取代”。下表顯示了示例性保留式胺基酸取代:表2。 表 2 示例性保留式胺基酸取代。
編碼經修飾的HA蛋白質的核苷酸序列可以針對人類密碼子使用、增加的GC含量或其組合進行最佳化。經修飾的HA蛋白質可以在植物、植物的一部分或植物細胞中表現。H1 HA 修飾
本文描述了經修飾的流感H1 HA蛋白質和在植物中生產經修飾的流感H1 HA蛋白質的方法。已經觀察到,與野生型H1 HA蛋白質或未經修飾的H1 HA蛋白質相比,來自亞型H1的HA蛋白質中特定胺基酸的修飾導致經修飾的H1 HA蛋白質的特性得到改善。
測試了總共42個單、雙及/或三重修飾以改善H1 HA蛋白質的特徵。如本文所述並如實施例中所示,僅在特定位置的修飾或修飾組合改善了H1 HA蛋白質的特徵。32位置或位置組合的修飾對H1 HA蛋白質的特徵具有負面影響(資料未顯示)。
H1 HA突變蛋白質的改善特徵的實例包括,與不包含該修飾或突變的流感相同病毒株或亞型的野生型或未經修飾的H1 HA相比,在植物細胞中表現時HA蛋白質產量或累積增加;與野生型或未經修飾的H1 HA蛋白質相比,經修飾或突變的HA蛋白質的血球凝集價得到改善;與包含野生型HA (其不包含突變)的VLP的完整性、穩定性或兩者相比,包含經修飾的H1 HA蛋白質的VLP的完整性、穩定性或完整性和穩定性兩者均得到改善;與不包含修飾或突變的野生型VLP生產水準相比,當在植物細胞中表現時VLP產量增加;及其組合。
如本文所述的經修飾的H1 HA蛋白質或突變H1 HA蛋白質被修飾並且在與A/加州/07/09 HA (SEQ ID NO:130;參見第1圖)的位置97、374、380、390及/或429比對的序列中的任何一個或多個殘基處包含一個或多於一個突變或修飾。因此,提供了流感H1 HA多肽、蛋白質及/或蛋白質複合物,例如類病毒顆粒(VLP),其在一個或多個胺基酸位置97、374、380、390及/或429處包含修飾或突變,其中這種胺基酸編號是基於如第1圖所示的H1 A/加州/07/09 HA的序列 (SEQ ID NO:130),或在與這些胺基酸位置相對應的胺基酸位置,例如藉由H1 HA胺基酸序列與SEQ ID NO:130的比對確定。包含一個或多個此類突變的流感H1 HA胺基酸序列的非限制性實例包括SEQ ID NO:131、132、133、134、135、138和139。
本文描述的經修飾的H1 HA蛋白質包括與編碼來自H1的HA的胺基酸序列 (SEQ ID NO:130、131、132、133、134、135、138或139)具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性的胺基酸序列的H1 HA蛋白質,其中胺基酸序列在與A/加州/07/09 HA (SEQ ID NO:130)的位置97、374、380、390和429比對的序列中的任何一個或多個殘基處具有一個或多於一個突變或修飾,並且其中表現時的HA蛋白質形成VLP。
此外,H1 HA蛋白質可以由與編碼來自H1的HA的核苷酸序列(SEQ ID NO:130、131、132、133、134、135、138或139)具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性的核苷酸序列編碼,其中H1 HA蛋白質具有在與A/加州 /07/09 HA的位置97、374、380、390和429比對的序列中任何一個或多個殘基處的一個或多於一個的突變或修飾,並且其中核苷酸序列編碼表現時形成VLP的HA蛋白質。
可以衍生H1 HA的病毒株的非限制性實例是A/加州/07/09 (H1N1,SEQ ID NO:130)、A/密西根/45/15 (H1N1,SEQ ID NO:134)、A/馬薩諸塞/06/17(H1N1,SEQ ID NO:135)、A/哥斯大黎加/0513/16 (H1N1,SEQ ID NO:133)、A/宏都拉斯/17734/16 (H1N1,SEQ ID NO:131)、A/達爾文/11/15(H1N1,SEQ ID NO:132)、A/巴黎/1227/2017(SEQ ID NO:138)、或A/挪威/2147/2017(SEQ ID NO:139)。
經修飾的或突變的H1 HA可以在位置97、374、380、390或429處的殘基處被單取代、二取代、三取代或四取代。在單取代的H1 HA中,一個殘基可以在位置97、374、380、390或429處突變。在二取代的H1 HA中,可以取代兩個殘基,例如位置380和429、97和374或390和429處的殘基可以被取代。在三取代的H1 HA突變體中,可以取代三個殘基。例如,位置97、390和429處的殘基或位置97、374和429處的殘基可以被取代。在四取代的H1 HA突變體中,可以取代四個殘基。例如,位置97、374、390和429處的殘基可以被取代。(所有H1 HA編號均按照與參考病毒株A/加州/07/09 HA的序列比對)。
當與H1 HA野生型序列比較時,經修飾的H1 HA蛋白質的非限制性實例包括HA序列中的以下修飾或突變 (編號按照A/加州/07/09 HA):
• 單取代H1 HA 突變體:N97D、K374E、F390D或L429M;
• 二取代H1 HA突變體:N390A/L429M、N97D/K374E或 N380/L429M;
• 三取代H1 HA突變體:N97D/F390D/L429M或 K374E/F390D/L429M;
• 四取代H1 HA突變體:N97D/K374E/F390D/L429M。
本文所述的一種或多種突變專一性地增加植物中的流感HA蛋白質生產和VLP產量。觀察到其他位置的突變顯著降低、或不顯著影響植物細胞中的流感HA蛋白質累積或VLP生產。單取代 H1 HA 位置 97 處的修飾
在本揭露內容的一個方面,經修飾的H1 HA可以至少具有經修飾的位置97處的殘基。該殘基不涉及HA的受體結合,並且已顯示該殘基位於HA的球狀頭部中的一個退化酯酶(VE)亞結構域中。X射線晶體學顯示該殘基埋在HA三聚體內。因此,該殘基不是抗原位點的一部分且不涉及抗原變化,也不被廣泛中和抗體識別。
在流感A (H1N1) pdm09中,已經預測該殘基涉及HA的穩定性 (參見Castelán-Vega等人2014)。然而,Castelán-Vega等人指出單點突變似乎對HA穩定性影響很小,並引用Yang等人的觀點 (Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins,J. Virol. 2014;88 (9):4828-4838)。Yang等人使用重組HA胞外域的粒徑排除層析分析來比較來自2009年早期大流行H1N1病毒的重組三聚體HA蛋白質(其解離為單體)與可以表現為三聚體的較近病毒HA的蛋白質的差異。Yang等人發現與檢測序列差異的其他四種A (H1N1) pdm09病毒株相比,A/Texas/1/2011 (Tex 11)在HA中具有獨特的Asp97Asn (D97N)取代。然而,自那時起進化的流感H1 HA病毒株在位置97處具有天冬醯胺 (N,Asn) (參見第1圖,H1的序列比對),暗示在該位置具有天冬醯胺 (N,Asn)的H1 HA病毒株具有演化優勢。因此,出乎意料的是,位置97處從天冬醯胺 (N,Asn)到非天冬醯胺的修飾導致如本文所述的H1 HA蛋白質的改善的特徵。
如第3A圖、第3B圖、第4A圖和第4B圖所示,具有位置97處從例如天冬醯胺(N,Asn)變為天冬胺酸(Asp;D)的殘基的H1 HA,下文稱為N97D,顯示出與在該位置具有天冬醯胺(N,Asn)的H1 HA相比增加達到1200%的血球凝集價 (也參見表5A)。第3A圖顯示,與A/密西根/45/15 HA野生型(也稱為H1 密西根)相比,來自A/密西根/45/15的具有N97D取代的HA表現出增加約1100%的血球凝集價。與野生型A/宏都拉斯/17734/16 HA相比,來自A/宏都拉斯/17734/16的具有N97D取代的HA顯示增加約375%的血球凝集價 (參見第4A圖和第4B圖)。此外,如第4A圖和第4B圖所示,與野生型A/達爾文/11/15 HA相比,來自A/達爾文/11/15的具有N97D取代的HA表現出增加約300%的血球凝集價。
因此,在一個方面,假設H1 HA的位置97處(按照A/加州/07/09 HA編號而編號)的殘基可被修飾以用位置97處的極性胺基酸取代位置97處的帶電胺基酸,以產生具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。例如,H1 HA蛋白質可以被修飾為含有位置97處的天冬胺酸 (D,Asp)或任何其他極性胺基酸,例如麩醯胺酸 (Q,Gln)、組胺酸 (H,His)、絲胺酸 (S,Ser)、蘇胺酸 (T,Thr)、酪胺酸 (Y,Tyr)、半胱胺酸 (C,Cys)或色胺酸 (W,Trp)。
可以修飾H1 HA以在位置97處用非天冬醯胺替換位置97處的天冬醯胺 (N,Asn)。例如,HA蛋白質可以突變為在位置97處含有天冬胺酸 (D,Asp)或是不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)保留取代。保留取代可以是例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)。此外,可以修飾H1 HA以在位置97處用天冬胺酸 (D,Asp) 或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代替換非天冬胺酸 (D,Asp)。天冬胺酸的保留取代可以是例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有胺基酸序列,其與來自H1的HA的胺基酸序列 (SEQ ID NO:134)具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中胺基酸序列在位置97處具有天冬胺酸 (D,Asp)、或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代,例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
本說明書還提供了核酸,其包含編碼經修飾的H1 HA且操作性地連接至在植物中有活性的調控區域的核苷酸序列,經修飾的H1 HA在如上所述的位置97處具有取代。
例如,核苷酸序列與編碼來自H1的HA的核苷酸序列 (SEQ ID NO:134) 可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性、或者序列相似性,其中所述核苷酸序列編碼在位置97處具有天冬胺酸 (D,Asp)或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代(例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser) )的經修飾的H1 HA蛋白質,其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
核苷酸序列與SEQ ID NO:136的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基97的核苷酸密碼子編碼天冬胺酸 (D,Asp)、或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代,例如在位置97處的麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser),並且其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的。
例如,經修飾的H1 HA可以具有一個或多個修飾;其中至少H1 HA的殘基97如本文所述進行修飾。例如,經修飾的H1 HA可以是單取代、二取代、三取代或四取代的H1 HA,其中至少位置97處的殘基被修飾。在非限制性實例中,經修飾的H1 HA可以具有位置97處的取代殘基以及位置374、390、429或其組合處的一個或多個取代,其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的。
此外,提供了一種生產VLP的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其在植物中如上所述在位置97處具有取代。該方法涉及將編碼在位置97處具有取代的經修飾H1 HA的核酸引入植物或植物的一部分(該核酸操作性地連接至植物中具有活性的調控區域),以及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
此外,提供了一種增加VLP產量的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其在植物中如上所述在位置97處具有取代。該方法涉及將編碼在位置97處具有取代的經修飾的H1 HA的核酸引入植物或植物的一部分(該核酸操作性地連接至植物中具有活性的調控區域),以及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
本說明書進一步提供了一種包含H1 HA的VLP,其在位置97處具有取代。該VLP可以藉由本揭露內容提供的方法生產。與包含未經修飾的H1 HA蛋白質的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。 位置 374 處的修飾
在本揭露內容的一個方面,H1 HA中位置374處的殘基 (編號按照A/加州/07/09 HA編號)可被取代。此殘基位於H1的HA的莖部。
Cotter等人(PLoS Pathog
. 2014;10(1):e1003831)識別了A/加州/7/2009 HA的莖域中的E47K (HA2編號)突變穩定了三聚體結構,降低了膜融合的pH,並增加了病毒的熱穩定性和酸穩定性。在Cotter中H1N1的HA2莖域的位置47相當於本揭露內容中的位置374 (A/加州/7/2009的HA0編號)。Cotter等人另外觀察到A/加州/7/2009 E47K突變體HA在雪貂中比其野生型對應物更具感染性。Yang等人於2014年獲得了類似的結果 (J. Virol. May 2014 vol. 88 no. 94828-4838),他們表示藉由在位置374處將麩胺酸改為離胺酸而在位置374處引入基本側變化,可能在相鄰鏈上形成跨越單體界面至Glu 21的新鹽橋,因而改善了較低pH下的穩定性。Yang等人發現位置374處離胺酸的存在增強了突變體Tex09胞外域三聚體抵抗熱和酸度變化的能力,達到與Wash11 recHA相當的水準。
然而,出乎意料地發現在流感H1 密西根 (A/密西根/45/15 (H1N1))的HA位置374處 (K374E)例如用麩胺酸 (E,Glu)取代離胺酸 (K,Lys),與來自表現H1 HA野生型的植物的提取物相比,導致血球凝集價增加約1200% (參見第3A圖、第3B圖、第4A圖、第4B圖和表5A)。
因此,在一個方面,假設H1 HA的位置374處 (按照A/加州/07/09 HA編號的編號)的殘基可以在位置374處被修飾以用麩胺酸 (E,Glu)替代非麩胺酸,以產生具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。可以用麩胺酸 (E,Glu)或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)保留取代替換非麩胺酸來修飾H1 HA,麩胺酸的保留取代例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser)。此外,位置374處的離胺酸 (K,Lys)可以在位置374處被非離胺酸取代,以產生具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。例如,位置374處的離胺酸 (K,Lys)可以被麩胺酸 (E,Glu)、或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)保留取代來取代,例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser)。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有胺基酸序列,其與來自H1 密西根 (A/密西根/45/15,SEQ ID NO:134)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中胺基酸序列在位置374處具有麩胺酸 (E,Glu) 、或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)的保留取代,例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的並且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
本說明書還提供了一種核酸,其包含編碼H1 HA且操作性地連接至植物中具有活性的調控區域的核苷酸序列,該H1 HA在位置374處具有取代。
例如,核苷酸序列與編碼來自H1 密西根 (A/密西根/ 45/15,SEQ ID NO:136)的HA的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或者序列相似性,其中該核苷酸序列編碼在位置374處具有麩胺酸 (E,Glu)、或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)的保留取代的血球凝集素蛋白質,麩胺酸 (E,Glu)的保留取代例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的並且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
該核苷酸序列與SEQ ID NO:136的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中編碼胺基酸殘基374的核苷酸密碼子編碼麩胺酸 (E,Glu)、或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)的保留取代,例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
例如,經修飾的H1 HA可以具有一個或多個修飾;其中至少H1 HA的殘基374如本文所述進行修飾。例如,經修飾的H1 HA可以是單取代的、二取代的、三取代的或四取代的H1 HA,其中至少位置374處的殘基被修飾。在非限制性實例中,經修飾的H1 HA可以在位置374處具有取代的殘基並且在位置97、390、429或其組合處具有一個或多個取代,其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的。
此外,本說明書提供了一種在植物中生產VLP的方法,所述VLP包含位置374處具有取代的經修飾的H1 HA。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA且操作性地連接至在植物中具有活性的調控區域的核酸引入植物或植物的一部分(該經修飾的H1 HA在位置374處具有取代),並在允許表現核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其在位置374處具有如上所述的取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA(其在位置374處具有取代)且操作性地連接至在植物中具有活性的調控區域的核酸引入植物或植物的一部分,並在允許表現核酸條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
本說明書進一步提供了一種包含在位置374處具有取代的H1 HA的VLP。該VLP可以藉由本說明書提供的方法生產。與包含未經修飾的H1 HA蛋白質的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。 位置 390 處的修飾
在本揭露內容的一個方面,可以取代H1 HA中位置390處的殘基(根據A/加州/07/09 HA編號而編號)。
WO2013/177444及其伴隨出版物Lu等人 (Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111(1):125-30)報導了一種使用基於大腸桿菌的無細胞蛋白質表現系統和簡單的重新折疊計畫書從A/加州/05/2009 (H1N1)生產正確折疊的HA莖結構域的方法。為了誘發HA莖結構域的三聚化,將氯黴素乙醯轉移酶(CAT)或折疊結構域融合至HA的C端。為了減輕引起表現的HA莖蛋白的聚集的新暴露的疏水性及/或分子間離子配對,評估了五組突變:M1(I69T + I72E + I74T + C77T);M2(I69T + I72E + I74T + C77T + F164D);M3(I69T + I72E + I74T + C77T + F164D + L174D);M4(F164D);和M5(F164D + L174D)。Lu注意到突變體的可溶產率低並且形成了不溶的包涵體。Lu進一步指出,突變體M3和M5比野生型其他變體產生更少的聚集體,因此進一步開發了突變體M5(F164D + L174D)。Lu觀察到M5(F164D + L174D)突變似乎是改善HA莖蛋白溶解度的最有影響的突變。Lu的位置164相當於本揭露內容中的位置390。Lu的M4(F164D)突變顯示出與測試的其他突變相比沒有優勢,並且實際上不如突變M3(I69T + I72E + I74T + C77T + F164D + L174D)和M5(F164D + L174D)。
當位置390處的苯丙胺酸(F,Phe)和位置400處的白胺酸(L,Leu)(H1 HA編號)(對應於Lu的M5 (F164D + L174D)的位置164處的苯丙胺酸和位於的位置174處的白胺酸) 在本揭露內容的H1 HA中被改變時,未觀察到VLP產量增加,並且H1 F390D + L400D突變體顯示出血球凝集活性的完全喪失(資料未顯示)。因此,Lu中M5突變體的等同突變不會導致在植物中表現的H1 HA特徵的改善。
出乎意料地發現,當H1 HA中位置390處的疏水性胺基酸被帶電荷的胺基酸取代時,當與已經用野生型構築體滲入的植物比較時,從表現在位置390處具有取代的H1 HA的植物中觀察到碘克沙醇 (iodixanol)梯度純化後VLP產率增加約60% (參見第3B圖、第4A圖、第4B圖、表5A、5B)。另外,如表5C所示,全部流程產率增加至226%。然而,來自H5 (F393D)的HA中的等同修飾導致血球凝集價的降低(參見第5圖、表6)。
因此,在一個方面,假設H1 HA的位置390處 (按照A/加州/07/09 HA編號而編號)的殘基可以被修飾,以利用位置390處帶電荷的胺基酸替換位置390處的疏水性胺基酸來產生具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。例如,可以修飾H1 HA蛋白質以在位置390處含有天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代。天冬胺酸的保留取代可以是例如天冬醯胺(N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)或絲胺酸(S,Ser)。
可以修飾H1 HA以利用位置390處的天冬胺酸(D,Asp)或在天冬胺酸(D,Asp)的保留取代替換非天冬胺酸。天冬胺酸的保留取代可以例如天冬醯胺(N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)或絲胺酸(S,Ser)。此外,可以修飾H1 HA以在位置390處用非苯丙胺酸替換位置390處的苯丙胺酸(F,Phe)。例如,HA蛋白質可以被修飾為在位置390處含有天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代。天冬胺酸的保留取代可以是例如天冬醯胺(N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)或絲胺酸(S,Ser)。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有與來自H1 A/密西根/ 45/15 (SEQ ID NO:134)的HA的胺基酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性的胺基酸序列,其中該胺基酸序列在位置390處具有天冬胺酸(D,Asp)、或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺(N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)或絲胺酸(S,Ser)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
本揭露內容還提供了一種核酸,其包含編碼經修飾的H1 HA的核苷酸序列,該經修飾的H1 HA在位置390處具有如上所述的取代,該核苷酸序列與植物中有活性的調控區域操作性地連接。
例如,該核苷酸序列與編碼來自H1 A/密西根/45/15 (SEQ ID NO:136)的HA的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中所述核苷酸序列編碼經修飾的H1 HA蛋白質,其在位置390處具有天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺(N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)或絲胺酸(S,Ser)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
該核苷酸序列與SEQ ID NO:136的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基390的核苷酸密碼子,在位置390處編碼天冬胺酸(D,Asp)、或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺(N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)或絲胺酸(S,Ser)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
例如,經修飾的H1 HA可以具有一個或多個修飾;其中至少H1 HA的殘基390如本文所述進行修飾。例如,經修飾的H1 HA可以是單取代的、二取代的、三取代的或四取代的H1 HA,其中至少位置390處的殘基被修飾。在非限制性實例中,經修飾的H1 HA可具有在位置390處的取代的殘基以及在位置97、374、380、429或其組合處的一個或多個取代。
此外,提供了一種在植物中生產VLP的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置390處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA(其在位置390處具有取代)且的核酸引入植物或植物的一部分(該核酸操作性地連接至在植物中有活性的調控區域),以及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置390處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA(其在位置390處具有取代)的核酸引入植物或植物的一部分(該核酸連接至在植物中有活性的調控區域),以及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種包含H1 HA的VLP,該H1 HA在位置390處具有取代。該VLP可以藉由本說明書提供的方法生產。與包含未經修飾的H1 HA蛋白質的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。 位置 429 處的修飾
在本揭露內容的一個方面,可以修飾H1 HA中位置429處的殘基(按照H1 A/密西根/45/15(SEQ ID NO:134)編號)。
Antanasijevic等人 (J Biol Chem
. 2014;289 (32):22237-45)藉由在14個不同位置的定點誘變研究了H5 HA莖環區的結構-功能特性。Antanasijevic觀察到(基於H3編號的)HA1-D26K、HA1-M102L、HA2-V52A和HA2-I55A突變體表現出顯著降低的總HA水準,暗指HA表現降低及/或HA至病毒顆粒的組裝降低。與野生型病毒相比,HA1-D26K、HA2-T49A和HA2-M102L突變體也表現出較低的血球凝集價。Antanasijevic的H5的HA中的位置102對應於目前說明書的H1 HA中的位置429。
當H1的HA被修飾以在V19I (HA1-I28V)、L20M (HA1-M31L)、T368A (HA2-T41A)、N380A (HA2-N53A)或L429M (HA2-M102L)處引入改變時,與H1 A/加州野生型HA相比,發現T368A導致完全喪失活性,發現V19I和L20M具有較低的活性,而N380A和L429M顯示出更高的活性。
因此,似乎Antanasijevic識別的對H5的HA的表現及/或組裝或血球凝集價具有重要意義的大多數殘基不會轉化為來自H1的HA中的類似重要性。
然而,如第2A圖、第2B圖、第2C圖、第3B圖、第4A圖和第4B圖所示,當H1 HA中的殘基429從白胺酸(L,Leu)突變為甲硫胺酸 (M,Met)時,與野生型H1 HA相比,經修飾的H1 HA顯示出增加的血球凝集價(100-160%)(也參見表5A)。此外,如第2C圖所示,與利用野生型構築體滲入的植物相比,表現在位置429處具有取代的H1 HA的植物在蔗糖梯度純化後顯示VLP產量增加約30% (也參見表5B)。另外,如表5C所示,全部流程產率增加至260%。
此外,與未經修飾的H1 HA相比,二取代的H1 HA(其中位置390處的苯丙胺酸被修飾為天冬胺酸且位置429處的白胺酸被修飾為甲硫胺酸)表現出血球凝集價增加約60% (見第2B圖)。
因此,在一個方面,假設H1 HA的位置429處 (按照H1 A/ 密西根/45/15胺基酸序列 (SEQ ID NO:134)編號)的殘基可以被修飾為利用不是白胺酸 (L,Leu)的另一種疏水性胺基酸取代位置429處的白胺酸,以生產具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。例如,可以修飾H1 HA蛋白質以在位置429處含有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe) )。
此外,可以修飾H1 HA以利用位置429處的非白胺酸替換位置429處的白胺酸 (L,Leu)。例如,HA蛋白質可以突變為在位置429處含有甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)保留取代。甲硫胺酸的保留取代可以是例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)。此外,H1 HA可以被修飾以利用位置429處的甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)保留取代替換位置429處的非甲硫胺酸。甲硫胺酸的保留取代可以是例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有胺基酸序列,其與來自H1 密西根 (A/密西根/45/15 (H1N1),SEQ ID NO:134)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中胺基酸序列在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
本揭露內容還提供了一種核酸,其包含編碼經修飾的H1 HA的核苷酸序列,該經修飾的H1 HA如上所述在位置429處具有取代,該核苷酸序列操作性地連接至在植物中有活性的調控區域。
例如,該核苷酸序列與編碼來自H1 A/密西根/45/15 (SEQ ID NO:136)的HA的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性、或者序列相似性,其中所述核苷酸序列編碼經修飾的H1 HA蛋白質,其在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
該核苷酸序列與SEQ ID NO:136的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基429的核苷酸密碼子編碼位置429處的甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
例如,經修飾的H1 HA可以具有一個或多個修飾;其中至少H1 HA的殘基429如本文所述進行修飾。例如,經修飾的H1 HA可以是單取代的、二取代的、三取代的或四取代的H1 HA,其中至少位置429處的殘基被修飾。在非限制性實例中,經修飾的H1 HA可具有位置429處的取代殘基和位置97、374、380、390或其組合處的一個或多個取代。
此外,提供了一種在植物中生產VLP的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA的核酸引入植物或植物的一部分,該經修飾的H1 HA在位置429處具有取代,該核酸操作性地連接至在植物中有活性的調控區域,並且該方法涉及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA的核酸引入植物或植物的一部分,該經修飾的H1 HA在位置429處具有取代,該核酸操作性地連接至在植物中有活性的調控區域,並且該方法涉及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而產生VLP。
本說明書進一步提供了一種包含在位置429處具有取代的H1 HA的VLP。該VLP可以藉由本說明書提供的方法生產。與包含未經修飾的H1 HA蛋白質的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。二取代的 H1 HA
進一步提供了一種包含至少二取代或二修飾的H1 HA蛋白質。因此,H1 HA蛋白質具有來自野生型H1 HA蛋白質的至少兩種修飾。例如,H1 HA可具有以下修飾的殘基的任何兩種組合:97、374、380、390和429 (按照H1 A/密西根/45/15 (SEQ ID NO:134)編號)。 位置 380 及 429 的修飾
在本說明書的一個方面,經修飾的H1 HA可至少具有位置380及429處經修飾的殘基。
如第3B圖所示,具有在位置380處從天冬醯胺修飾為丙胺酸的殘基、以及在位置429處從白胺酸修飾為甲硫胺酸的殘基的H1 HA,與野生型H1 HA相比表現出血球凝集價增加約800%。 (也參見表5A)。
因此,在一個方面假設H1 HA的位置380和429處 (按照H1 A/密西根/45/15 (SEQ ID NO:134)編號)的殘基可以被修飾為利用位置380處的非天冬醯胺取代位置380處的天冬醯胺 (N,Asn)、並且利用位置429處的非白胺酸取代位置429處的白胺酸 (L,Leu),以生產具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。例如,H1 HA可被修飾為利用位置380處的疏水性胺基酸取代位置380處的極性胺基酸、並利用不是白胺酸的另一種疏水性胺基酸取代位置429處的白胺酸 (L,Leu),以生產具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。
例如,可以修飾H1 HA蛋白質以在位置380處含有丙胺酸 (A,Ala)或丙胺酸的保留取代。丙胺酸的保留取代可以是例如絲胺酸 (S,Ser)、甘胺酸 (G,Gly)、蘇胺酸 (T,Thr)、半胱胺酸 (C,Cys)或纈胺酸 (V,Val)。此外,H1 HA蛋白質可以被修飾為在位置429處含有甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe))。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有胺基酸序列,其與來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO:134)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中該胺基酸序列在位置380處具有丙胺酸或丙胺酸的保留取代 (例如絲胺酸 (S,Ser)、甘胺酸 (G,Gly)、蘇胺酸 (T,Thr)、半胱胺酸 (C,Cys)或纈胺酸 (V,Val)),且該胺基酸序列在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
本說明書還提供了一種核酸,其包含編碼經修飾的H1 HA的核苷酸序列,該經修飾的H1 HA如上所述的在位置380和429處具有取代,該核苷酸序列操作性地連接至在植物中有活性的調控區域。
例如,該核苷酸序列與編碼來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO:136)的HA的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性、或序列相似性,其中所述核苷酸序列編碼經修飾的H1 HA蛋白質,該經修飾的H1 HA蛋白質在位置380處具有丙胺酸或丙胺酸的保留取代 (例如絲胺酸 (S,Ser)、甘胺酸 (G,Gly)、蘇胺酸 (T,Thr)、半胱胺酸 (C,Cys)或纈胺酸 (V,Val))、以及在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
該核苷酸序列與SEQ ID NO:136的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基380的核苷酸密碼子編碼丙胺酸、或丙胺酸的保留取代,例如絲胺酸 (S,Ser)、甘胺酸 (G ,Gly)、蘇胺酸 (T,Thr)、半胱胺酸 (C,Cys)或纈胺酸 (V,Val),且編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基429的核苷酸密碼子編碼甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met) 保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
此外,提供了一種在植物中生產VLP的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,該經修飾的H1 HA如上所述在位置380和429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA的核酸引入植物或植物的一部分,該經修飾的H1 HA在位置380和429處具有取代,該核酸可操作地連接至在該植物中有活性的調控區域,並且該方法涉及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置380和429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA的核酸引入植物或植物的一部分,該經修飾的H1 HA在位置380和429處具有取代,該核酸操作性地連接至在該植物中有活性的調控區域,並且該方法涉及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
本說明書進一步提供了一種包含H1 HA的VLP,該H1 HA在位置380和429處具有取代。該VLP可以藉由本說明書提供的方法生產。與包含未經修飾的H1 HA蛋白質的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。位置 390 及 429 的修飾
在本揭露內容的一個方面,經修飾的H1 HA至少可具有位置390和429處經修飾的殘基。
如第2B圖、第3B圖、第4A圖、第4B圖和表5A所示,具有在位置390處從苯丙胺酸修飾為天冬胺酸的殘基、以及在位置429處從白胺酸修飾為甲硫胺酸的殘基的H1 HA,與野生型H1HA相比,顯示出大約400-1200%的血球凝集價增加。另外,如表5C所示,全流程產率增加至633%。
因此,在一個方面假設H1 HA的位置390和429處 (按照H1 A/密西根/45/15 (SEQ ID NO:134)編號)的殘基可以被修飾,以利用在位置390處的非苯丙胺酸取代位置390處的苯丙胺酸 (F,Phe),並且利用位置429處的非白胺酸替換位置429處的白胺酸 (L,Leu)以產生具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。例如,H1 HA可被修飾以利用位置390處的帶電荷胺基酸取代位置390處的疏水性胺基酸,並利用不是白胺酸的另一種疏水性胺基酸取代位置429處的白胺酸 (L,Leu)以產生具有非天然存在的序列的經修飾的H1 HA。
例如,可以修飾H1 HA蛋白質以在位置390處含有天冬胺酸 (D,Asp)或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代。該保留取代可以例如是天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)。此外,H1 HA蛋白質可以被修飾為在位置429處含有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe))。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有胺基酸序列,其與來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO:134)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中該胺基酸序列在位置390處具有天冬胺酸 (D,Asp)、或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser))以及該胺基酸序列在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,的Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
本說明書還提供了一種包含編碼經修飾的H1 HA的核苷酸序列的核酸,該經修飾的H1 HA在如上所述的位置390和429處具有取代,該核酸操作性地連接至在植物中有活性的調控區域。
例如,該核苷酸序列與編碼來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1)的HA的核苷酸序列 (SEQ ID NO:136)可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性、或者序列相似性,其中所述核苷酸序列編碼經修飾的H1 HA蛋白質,其在位置390處具有天冬胺酸 (D,Asp)、或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser))以及在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe) ),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
該核苷酸序列與SEQ ID NO:136的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性、或序列相似性,其中編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基390的核苷酸密碼子編碼天冬胺酸 (D,Asp)、或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)),以及編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基429的核苷酸密碼子編碼位置429處的甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
例如,經修飾的H1 HA可以具有一個或多個修飾;其中至少H1 HA的殘基390和429如本文所述進行修飾。例如,經修飾的H1 HA可以是二取代的、三取代的或四取代的H1 HA,其中至少位置390和429處的殘基被修飾。在非限制性實例中,經修飾的H1 HA可在位置390和429處具有取代的殘基,且在位置97、374、380或其組合處具有一個或多個取代。
此外,提供了一種在植物中生產VLP的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置390和429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA(其在位置390和429處具有取代)且操作性地連接至在植物中有活性的調控區域的核酸引入植物或植物的一部分,並在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置390和429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA(其在位置390和429處具有取代)且操作性地連接至在植物中有活性的調控區域的核酸引入植物或植物的一部分,並在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
本說明書進一步提供了一種包含H1 HA的VLP,該H1 HA在位置390和429處具有取代。該VLP可以藉由本說明書提供的方法生產。與包含未經修飾的H1 HA蛋白質的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。位置 97 和 374 的修飾
在本揭露內容的一個方面,經修飾的H1 HA至少可具有位置97及374處經修飾的殘基。
如第3B圖和表5A中所示,與野生型H1 HA相比,在位置97處具有從天冬醯胺修飾為天冬胺酸的殘基和在位置374處具有從離胺酸修飾至麩胺酸的殘基的H1 HA顯示血球凝集價增加約1200%。
因此,在一個方面,假設H1 HA的位置97和374處 (按照H1 A/密西根/45/15 (SEQ ID NO:134)編號)的殘基可以被修飾以利用位置97處的非天冬醯胺取代位置97處的天冬醯胺 (N,Asn),並且利用位置374處的非離胺酸替換位置374處的離胺酸 (K,Lys),以產生具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。例如,H1 HA可被修飾以利用位置97處的極性胺基酸取代位置97處的帶電荷胺基酸,並利用不是離胺酸 (K,Lys)的另一個帶電荷胺基酸取代位置374處的帶電荷的胺基酸,以生產具有非天然序列的經修飾的H1 HA。
例如,H1 HA蛋白質可以被修飾為在位置97處含有天冬胺酸 (D,Asp)或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)保留取代。保留取代可以是,例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)。此外,H1 HA蛋白質可以被修飾為在位置374處含有麩胺酸 (E,Glu)或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)的保留取代 (例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 ( Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser))。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有胺基酸序列,其與來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO:134)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中胺基酸序列在位置97處具有天冬胺酸 (D,Asp)、或非天冬醯胺(N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代;例如,位置97處的麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser),以及胺基酸序列在位置374處具有麩胺酸 (E,Glu)、或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)的保留取代 (例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
本說明書還提供了一種核酸,其包含編碼經修飾的H1 HA的核苷酸序列,該經修飾的H1 HA如上所述的在位置97和374處具有取代,該核苷酸序列操作性地連接至在植物中有活性的調控區域。
例如,該核苷酸序列與編碼來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO:136)的HA的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性、或者序列相似性,其中所述核苷酸序列編碼經修飾的H1 HA蛋白質,其在位置97處具有天冬胺酸 (D,Asp)、或非天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代;例如,麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser),以及該胺基酸序列在位置374處具有麩胺酸 (E,Glu)、或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸(E,Glu)的保留取代(例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
該核苷酸序列與SEQ ID NO:136的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性、或序列相似性,其中編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基97的核苷酸密碼子編碼天冬胺酸 (D,Asp)、或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代;例如,麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser),以及編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基374的核苷酸密碼子編碼麩胺酸 (E,Glu)、或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)的保留取代 (例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
例如,經修飾的H1 HA可以具有一個或多個修飾;其中至少H1 HA的殘基97和374如本文所述進行修飾。例如,經修飾的H1 HA可以是二取代的、三取代的或四取代的H1 HA,其中至少位置97和374處的殘基被修飾。在非限制性實例中,經修飾的H1 HA可以在位置97和374處具有取代的殘基並且在位置380、390和429或其組合處具有一個或多個取代。
此外,提供了一種在植物中生產VLP的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置97和374處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA的核酸引入植物或植物的一部分,該經修飾的H1 HA在位置97和374處具有取代,該核酸操作性地連接至在該植物中有活性的調控區域,並且該方法涉及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置97和374處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA的核酸引入植物或植物的一部分,該經修飾的H1 HA在位置97和374處具有取代,該核酸操作性地連接至在該植物中有活性的調控區域,並且該方法涉及在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
本說明書進一步提供了一種包含在位置97和374處具有取代的H1 HA的VLP。該VLP可以藉由本說明書提供的方法生產。與包含未經修飾的H1 HA蛋白質的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。三取代的 H1 HA 位置 97 、 390 及 429 處的修飾
進一步提供了至少包含三取代或三修飾的H1 HA蛋白質。因此,H1 HA蛋白質具有不同於野生型H1 HA蛋白質的至少三種修飾。例如,H1 HA可具有以下修飾的殘基的任何三種組合:97、374、390和429 (按照H1 A/密西根 /45/15 (SEQ ID NO:134)編號)。
在本說明書的一個方面,經修飾的H1 HA至少在位置97、390及429處可具有修飾的殘基。
如例如第3B圖、第4A圖和第4B圖中所示,與野生型H1 HA相比,在位置97處具有從天冬醯胺修飾為天冬胺酸的殘基、在位置390處具有從苯丙胺酸修飾為天冬胺酸的殘基、在位置429處具有從白胺酸修飾為甲硫胺酸的殘基的H1 HA顯示增加約2600%的血球凝集價。另外,如表5C所示,全流程產率增加至647%。
因此,在一個方面假設H1 HA的位置97、390和429處 (按照H1 A/密西根/45/15 (SEQ ID NO:134)編號)的殘基可以被修飾為利用非天冬醯胺替換位置97處的天冬醯胺(N,Asn)、利用非苯丙胺酸替換位置390處的苯丙胺酸(F,Phe)、並利用非白胺酸 (L,Leu)替換位置429處的白胺酸以產生具有非天然序列的經修飾的 H1 HA。例如,H1 HA可以被修飾為在位置97處利用帶電荷的胺基酸取代極性胺基酸、在位置390處利用帶電荷的胺基酸取代疏水性胺基酸、並在位置429處利用不是白胺酸的另一種疏水性胺基酸取代白胺酸,以產生具有非天然序列的經修飾的H1 HA。
例如,H1 HA蛋白可以被修飾為在位置97處含有天冬胺酸 (D,Asp)或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代。天冬胺酸的保留取代可以是例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)。經修飾的H1 HA還可以在位置390處含有天冬胺酸 (D,Asp)或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代。天冬胺酸的保留取代可以是例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)。 此外,H1 HA蛋白質可以被修飾為在位置429處含有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe))。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有胺基酸序列,其與來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO:134)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致或序列相似性,其中該胺基酸序列在位置97處具有天冬胺酸 (D,Asp)或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)),該胺基酸序列在位置390處具有天冬胺酸 (D,Asp)、或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代,例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser),以及該胺基酸序列在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
本揭露內容還提供了一種核酸,其包含編碼經修飾的H1 HA且操作性地連接至在植物中有活性的調控區域的核苷酸序列,該經修飾的H1 HA如上所述的在位置97、390和429處具有取代。
例如,該核苷酸序列與編碼來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO:136)的HA的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性、或序列相似性,其中所述核苷酸序列編碼經修飾的H1 HA蛋白質,其在位置97處具有天冬胺酸 (D,Asp)或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)保留取代 (例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)),在位置390處具有天冬胺酸 (D,Asp)、或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)),以及在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
該核苷酸序列與SEQ ID NO:136的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基97的核苷酸密碼子編碼天冬胺酸 (D,Asp)或不是天冬醯胺 (N,Asn)的天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)),編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基390的核苷酸密碼子編碼天冬胺酸 (D,Asp)、或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)),以及編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基429的核苷酸密碼子編碼位置429處的甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
例如,經修飾的H1 HA可以具有一個或多個修飾;其中至少H1 HA的殘基97、390和429如本文所述進行修飾。例如,經修飾的H1 HA可以是三取代的或四取代的H1 HA,其中至少在位置97、390和429處的殘基被修飾。在非限制性實例中,經修飾的H1 HA可以在位置97、390、429和374處具有取代的殘基。
此外,提供了一種在植物中生產VLP的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置97、390和429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA(其在位置97、390和429處具有取代)且操作性地連接至在該植物中有活性的調控區域的核酸引入植物或植物的一部分,並在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置97、390和429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA(其在位置97、390和429處具有取代)且操作性地連接至在該植物中有活性的調控區域的核酸引入植物或植物的一部分,並在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
本說明書進一步提供了一種包含H1 HA的VLP,該H1 HA在位置97、390和429處具有取代。該VLP可以藉由本說明書提供的方法生產。與包含未經修飾的H1 HA蛋白質的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。 位置 374 、 390 及 429 的修飾
在本揭露內容的一個方面,經修飾的H1 HA可至少在位置374、390及429處具有修飾的殘基。
如第3B圖中的實例所示,與野生型H1 HA相比,在位置374處具有從離胺酸修飾為麩胺酸的殘基、在位置390處具有從苯丙胺酸修飾為天冬胺酸的殘基、在位置429處具有從白胺酸修飾為甲硫胺酸的殘基的H1 HA,顯示出約2500%的血球凝集價增加。另外,如表5C所示,全流程產率增加至689%。
因此,在一個方面假設H1 HA的位置374、390和429(按照H1 A/密西根/45/15 (SEQ ID NO:134)編號)的殘基可以修飾為利用非離胺酸替換位置374處的離胺酸 (K,Lys)、利用非苯丙胺酸替換位置390處的苯丙胺酸 (F,Phe)、並且利用非白胺酸取代位置429處的白胺酸,以產生具有非自然發生的序列的經修飾H1 HA。例如,H1 HA可以被修飾為在位置374處利用不是離胺酸的帶電荷的胺基酸替換離胺酸、利用帶電荷的胺基酸替換位置390處的疏水性胺基酸、以及利用不是白胺酸的另一個疏水性胺基酸替換位置429處的白胺酸 (L,Leu),以產生具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。
例如,H1 HA蛋白質可以被修飾為在位置374處含有麩胺酸 (E,Glu)或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)的保留取代 (例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser))。經修飾的H1 HA可進一步在位置390處含有天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代。保留取代可以是例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser)。此外,H1 HA蛋白質可以被修飾為在位置429處含有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe))。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有胺基酸序列,其與來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO:134)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中該胺基酸序列在位置374處具有麩胺酸 (E,Glu)或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)的保留取代 (例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser)),該胺基酸序列在位置390處具有天冬胺酸 (D,Asp)、或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser))以及該胺基酸序列在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸(M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,I le)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
本說明書還提供了一種核酸,其包含編碼經修飾的H1 HA的核苷酸序列,其如上所述在位置374、390和429處具有取代,該核苷酸序列操作性地連接至在植物中有活性的調控區域。
例如,該核苷酸序列與編碼來自H1 A/密西根/45/15 (H1N1)的HA的核苷酸序列 (SEQ ID NO:136)可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性、或者序列相似性,其中所述核苷酸序列編碼經修飾的H1 HA蛋白質,其在位置374處具有麩胺酸 (E,Glu)或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)保留取代 (例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser)),在位置390處具有天冬胺酸 (D,Asp)、或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser))以及在位置429處具有甲硫胺酸 (M,Met)或非白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質在表現時形成VLP。
該核苷酸序列與SEQ ID NO:136的核苷酸序列可具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任何量的序列一致性或序列相似性,其中編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基374的核苷酸密碼子編碼麩胺酸 (E,Glu)或不是離胺酸 (K,Lys)的麩胺酸 (E,Glu)的保留取代 (例如天冬胺酸 (D,Asp)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、精胺酸 (R,Arg)、天冬醯胺 (N,Asn)、組胺酸 (H,His)或絲胺酸 (S,Ser) ),編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基390的核苷酸密碼子編碼天冬胺酸 (D,Asp)、或天冬胺酸 (D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸 (S,Ser))以及編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基429的核苷酸密碼子編碼甲硫胺酸 (M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸 (I,Ile)、麩醯胺酸 (Q,Gln)、纈胺酸 (V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的且其中HA蛋白質表現時形成VLP。
例如,經修飾的H1 HA可以具有一個或多個修飾;其中至少H1 HA的殘基374、390和429如本文所述進行修飾。例如,經修飾的H1 HA可以是三取代的或四取代的H1 HA,其中至少位置374、390和429處的殘基被修飾。在非限制性實例中,經修飾的H1 HA可以在位置374、390、429和97處具有取代的殘基。
此外,提供了一種在植物中生產VLP的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置374、390和429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA的核酸引入植物或植物的一部分(該經修飾的H1 HA在位置374、390和429處具有取代,該核酸操作性地連接至在該植物中有活性的調控區域),並在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產量的方法,所述VLP包含經修飾的H1 HA,其如上所述在位置374、390和429處具有取代。該方法涉及將編碼經修飾的H1 HA(其在位置374、390和429處具有取代)的核酸引入植物或植物的一部分(該核酸可操作地連接到在植物中有活性的調控區域),並在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而生產VLP。
本說明書進一步提供了一種包含H1 HA的VLP,該H1 HA在位置374、390和429處具有取代。該VLP可以藉由本說明書提供的方法生產。與包含未經修飾的H1 HA蛋白的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。四取代 H1 HA 在位置 97 、 374 、 390 以及 429 處的修飾
進一步提供了H1 HA蛋白,其包含至少四取代或四修飾。因此,H1 HA蛋白質始於野生型H1 HA蛋白質具有至少四個修飾。例如,H1 HA可以具有在位置97、374、390以及429處(根據H1 A/密西根/45/15(SEQ ID NO:134)編號)的修飾。
因此,在本說明書的一個方面,經修飾的H1 HA可以具有至少在位置97、374、390以及429處修飾的殘基。
如第3B圖中的實例所示,與野生型H1 HA相比,在位置97處具有從天冬醯胺修飾為天冬胺酸的殘基、在位置374處具有從離胺酸修飾為麩胺酸的殘基、在位置390處具有從苯丙胺酸修飾為天冬胺酸的殘基、以及在位置429處具有從白胺酸修飾為甲硫胺酸的殘基的H1 HA表現出大約3300%的血球凝集價的增加。
因此,在一個方面,規定H1 HA的位置97、374、390以及429處(根據A /加利福尼亞/07/09 HA編號)的殘基可以被修飾,在位置97處以非天冬醯胺取代天冬醯胺(N,Asn),在位置374處以非離胺酸取代離胺酸(F,Phe),在位置390處以非苯丙胺酸取代苯丙胺酸,在位置429處以非白胺酸取代白胺酸,以產生具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。例如,可以修飾H1 HA,在位置97處利用帶電荷的胺基酸取代極性胺基酸,在位置374處以非離胺酸的帶電胺基酸取代離胺酸,在位置390處以帶電胺基酸取代疏水性的胺基酸,在位置429處用另一種非白胺酸的疏水性胺基酸取代白胺酸(L,Leu),以產生具有非天然存在序列的經修飾的H1 HA。
例如,H1 HA蛋白可以被修飾為在位置97處含有天冬胺酸(D,Asp)或不是天冬醯胺(N,Asn)的天冬胺酸(D,Asp)的保留取代。天冬胺酸的保留取代可以是例如麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)或絲胺酸(S,Ser)。此外,H1 HA蛋白可以被修飾為在位置374處含有麩胺酸(E,Glu)或不是離胺酸(K,Lys)的麩胺酸(E,Glu)的保留取代 (例如天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、精胺酸(R,Arg)、天冬醯胺(N,Asn)、組胺酸(H,His)、或絲胺酸(S,Ser))。經修飾的H1 HA還可以在位置390處含有天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代。例如,天冬胺酸的保留取代可以為天冬醯胺 (N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸 (Q,Gln)或絲胺酸(S,Ser)。再者,H1 HA蛋白質可以被修飾為在位置429處包含甲硫胺酸(M,Met)或不是白胺酸 (L,Leu)的甲硫胺酸 (M,Met)的保留取代 (例如異白胺酸(I,Ile)、麩醯胺酸(Q,Gln)、纈胺酸(V,Val)或苯丙胺酸 (F,Phe))。
例如,經修飾的H1 HA蛋白質可具有一胺基酸序列,該胺基酸序列相對於來自H1 A/密西根/45/15(H1N1)(SEQ ID NO:134)的HA的胺基酸序列具有約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間的任何數的序列一致性或序列相似性,其中該胺基酸序列在位置97處具有天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代(其不是天冬醯胺(N,Asn),例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)或絲胺酸(S,Ser)),該胺基酸序列在位置374處具有麩胺酸(E,Glu)或麩胺酸(E,Glu)的保留取代(其不是離胺酸(K,Lys),例如天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、精胺酸(R,Arg)、天冬醯胺(N,Asn)、組胺酸(H,His)、或絲胺酸(S,Ser)),該胺基酸序列在位置390處具有天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺(N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)、或絲胺酸(S,Ser)),以及該胺基酸序列在位置429處具有甲硫胺酸(M,Met)或甲硫胺酸(M,Met)的保留取代(其不是白胺酸(L,Leu),例如異白胺酸(I,Ile)、麩醯胺酸(Q,Gln)、纈胺酸(V,Val)、或苯丙胺酸(F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的,並且其中當經修飾的H1 HA序列表現時HA蛋白質形成VLP。
本說明書還提供了一種核酸,其包含編碼經修飾的H1 HA且操作性地連接至在植物中有活性的調控區域的核苷酸序列,該經修飾的H1 HA在如上所述的位置97、374、390以及429處具有取代。
例如,該核苷酸序列可具有相對於來自H1 A/密西根/45/15(H1N1)(SEQ ID NO:136)的HA的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間的任何數的序列一致性或序列相似性,其中該核苷酸序列編碼經修飾的H1 HA蛋白質,該經修飾的H1 HA蛋白質在位置97處具有天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代(其不是天冬醯胺(N,Asn),例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)、或絲胺酸(S,Ser)),在位置374處具有麩胺酸(E,Glu)或麩胺酸(E,Glu)的保留取代(其不是離胺酸(K,Lys),例如天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、精胺酸(R,Arg)、天冬醯胺(N,Asn)、組胺酸(H,His)、或絲胺酸(S,Ser)),在位置390處具有天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺(N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)、或絲胺酸(S,Ser)),以及在位置429處具有甲硫胺酸(M,Met)或甲硫胺酸(M,Met)的保留取代(其不是白胺酸(L,Leu),例如異白胺酸(I,Ile)、麩醯胺酸(Q,Gln)、纈胺酸(V,Val)、或苯丙胺酸(F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的,並且其中當經修飾的H1 HA序列表現時HA蛋白質形成VLP。
該核苷酸序列可具有相對於SEQ ID NO:136的核苷酸序列約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間的任何數的序列一致性或序列相似性,其中編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基97的核苷酸密碼子編碼天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代(其不是天冬醯胺(N,Asn),例如麩胺酸 (E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)、或絲胺酸(S,Ser)),編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基374的核苷酸密碼子編碼位置374處的麩胺酸(E,Glu)或麩胺酸(E,Glu)的保留取代(其不是離胺酸(K,Lys),例如天冬胺酸(D,Asp)、麩醯胺酸(Q,Gln)、精胺酸(R,Arg)、天冬醯胺(N,Asn)、組胺酸(H,His)、或絲胺酸(S,Ser)),編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基390的核苷酸密碼子編碼天冬胺酸(D,Asp)或天冬胺酸(D,Asp)的保留取代 (例如天冬醯胺(N,Asn)、麩胺酸(E,Glu)、麩醯胺酸(Q,Gln)、或絲胺酸(S,Ser)),以及編碼經修飾的H1 HA的胺基酸殘基429的核苷酸密碼子編碼甲硫胺酸(M,Met)或甲硫胺酸(M,Met)的保留取代(其不是白胺酸(L,Leu),例如異白胺酸(I,Ile)、麩醯胺酸(Q,Gln)、纈胺酸(V,Val)、或苯丙胺酸(F,Phe)),其中經修飾的H1 HA序列不是天然存在的,並且其中當經修飾的H1 HA序列表現時HA蛋白質形成VLP。
例如,經修飾的H1 HA可以具有一個或多個修飾;其中H1 HA的至少殘基97、374、390以及429如本文所述進行修飾。例如,經修飾的H1 HA可以是四取代的H1 HA,其中位置97、374、390以及429處的殘基被修飾。
此外,提供了一種在植物中產生VLP的方法,該VLP包含如上所述在位置97、374、390以及429處具有取代的經修飾的H1 HA。該方法涉及將核酸引入植物或植物的一部分、並且在允許表現該核酸的條件下培養該植物或植物的該部分,從而產生VLP,該核酸編碼在位置97、374、390以及429處具有取代的經修飾的H1 HA且操作性地連接至在植物中有活性的調控區域。
此外,提供了一種在植物中增加VLP產率的方法,該VLP包含如上所述在位置97、374、390以及429處具有取代的經修飾的H1 HA。該方法涉及將核酸引入植物或植物的一部分、並且在允許表現該核酸的條件下培養該植物或該植物的一部分,從而產生VLP,該核酸編碼在位置97、374、390以及429處具有取代的經修飾的H1 HA且操作性地連接至在植物中有活性的調控區域。
本說明書進一步提供了一種包含在位置97、374、390以及429處具有取代的H1 HA的VLP。該VLP可以藉由本說明書提供的方法生產。當與包含未經修飾的H1 HA蛋白質的VLP相比,包含經修飾的H1 HA的VLP顯示出改善的特徵。
本文還提供了在植物中增加包含突變流感HA的VLP的生產或產率的方法。例如,方法可以涉及將編碼如本文所述的突變流感HA的核酸引入植物、植物的一部分、或植物細胞中。編碼突變流感HA的核酸可以針對人類密碼子使用、增加的GC含量、或其組合進行最佳化。可以在植物、植物的一部分、或植物細胞中表現一種或多種突變流感HA蛋白質,以產生包含一種或多種突變流感HA蛋白質的VLP。或者,該方法可包括提供包含編碼突變流感HA蛋白質的核酸的植物、植物的一部分、或植物細胞,以產生包含一種或多種突變流感HA蛋白質的VLP。
產生包含突變流感HA的VLP的方法可以進一步包括將第二核酸序列引入植物、植物的一部分、或植物細胞中的步驟,其中該第二核酸編碼質子通道蛋白,該質子通道蛋白與突變流感HA共同表現。例如,質子通道蛋白可以是A型流感M2亞型蛋白質,例如A/新喀里多尼亞/20/99 M2。質子通道蛋白質的共同表現可導致突變型流感HA蛋白質及/或包含突變型流感HA蛋白質的VLP的累積增加,例如WO2013 / 044390中所述,其藉由引用併入本文。
此外,突變流感HA可以進一步包含經修飾的蛋白水解環或切割位點,如WO 2013/044390以及WO 2014/153674中所述,並且其藉由引用併入本文。
“共同表現”是指兩個或更多個核苷酸序列在植物、植物的一部分或植物細胞中的引入以及表現,兩個或更多個核苷酸序列中的每一個編碼感興趣的蛋白質、或感興趣的蛋白質片段。可以在一個載體內將兩個或更多個核苷酸序列引入植物、植物的一部分或植物細胞中,使得該兩個或更多個核苷酸序列中的每一個在單獨的調控區域的控制下(例如包含雙重構築體)。或者,可以在分開的載體(例如包含單一構築體)內將兩個或更多個核苷酸序列引入植物、植物的一部分或植物細胞中,並且每個載體包含用於表現相應核酸的適當調控區域。例如,可以在真空浸潤之前藉由將每個農桿菌(根癌農桿菌)宿主的懸浮液以所需體積(例如,等體積或可以改變每個農桿菌宿主的比例)混合,而共同表現兩個核苷酸序列(每個核苷酸序列在單獨的載體上並被引入分開的農桿菌宿主中)。以這種方式,多個農桿菌懸浮液的共浸潤允許多個轉基因的共同表現。
編碼如本文所述的突變流感HA的核酸可以進一步包含增強突變流感HA在植物、植物的一部分或植物細胞中表現的序列。增強表現的序列可包括豇豆嵌紋病毒(CPMV)強化元件,豇豆嵌紋病毒(CPMV)強化元件與編碼突變流感HA蛋白質的核酸操作性連接。
如本文所述,包含編碼經修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質的核苷酸序列的核酸可進一步包含增強植物、植物的一部分或植物細胞中HA蛋白質表現的序列。增強表現的序列可包括CPMV強化元件、或衍生自植物的表現增強子,其與編碼經修飾的流感血球凝集素(HA)蛋白質的核酸操作性連接。編碼修飾的流感血球凝集素(HA)的序列也可以針對人類密碼子使用、增加的GC含量或其組合進行最佳化。
如本文所用的術語“CPMV強化元件”是指編碼調節豇豆嵌紋病毒(CPMV)RNA2多肽的5'UTR的核苷酸序列或本領域已知的經修飾的CPMV序列。例如,CPMV強化元件或CPMV表現增強子包括如WO2015/14367;WO2015/103704;WO2007/135480;WO2009/087391;Sainsbury F.以及Lomonossoff G.P.,(2008,Plant Physiol. 148:pp.1212-1218)中描述的核苷酸序列,其各自經由引用併入本文。CPMV增強子序列可以增強它們所附著的下游異源開讀框(ORF)的表現。CPMV表現增強子可包括CPMV HT、CPMVX(其中X = 160、155、150、114)、例如CPMV 160、CPMVX+(其中X = 160、155、150、114)、例如CPMV 160+、CPMV-HT+、CPMV HT+[WT115]、或CPMV HT+[511](WO2015/143567;WO2015/103704,其藉由引用併入本文)。CPMV表現增強子可以在植物表現系統中使用,該植物表現系統包含與CPMV表現增強子序列以及感興趣的核苷酸序列操作性地連接的調控區域。
如本文所用的術語“CPMV強化元件”是指編碼調節豇豆嵌紋病毒(CPMV)RNA2多肽的5'UTR的核苷酸序列或本領域已知的經修飾的CPMV序列。例如,CPMV強化元件或CPMV表現增強子包括如WO2015/14367;WO2015/103704;WO2007/135480;WO2009/087391;Sainsbury F.以及Lomonossoff G.P.,(2008,Plant Physiol. 148:pp.1212-1218)中描述的核苷酸序列,其各自經由引用併入本文。CPMV增強子序列可以增強它們所附著的下游異源開讀框(ORF)的表現。CPMV表現增強子可包括CPMV HT、CPMVX、CPMVX+、CPMV-HT+、CPMV HT+[WT115]、或CPMV HT+ [511] (WO2015/14367;WO2015/103704,其經由引用併入本文)。CPMV表現增強子可以在植物表現系統中使用,該植物表現系統包含與CPMV表現增強子序列以及感興趣的核苷酸序列操作性地連接的調控區域。
術語“5'UTR”或“5'非轉譯區”或“5'前導序列”是指未轉譯的mRNA區域。5'UTR通常在轉錄起始位點開始,並在編碼區的轉譯起始位點或起始密碼子之前結束。5'UTR可以調節mRNA轉錄本的穩定性及/或轉譯。
如本文所用的術語“衍生自植物的表現增強子”是指從植物獲得的核苷酸序列,該核苷酸序列編碼5'UTR。衍生自植物的表現增強子的實例描述於美國臨時專利申請No. 62/643,053(於2018年3月14日申請;其藉由引用併入本文)或Diamos A.G. 等人(2016,Front Plt Sci. 7:1-15;其藉由引用併入本文)。衍生自植物的表現增強子可以選自nbMT78、nbATL75、nbDJ46、nbCHP79、nbEN42、atHSP69、atGRP62、atPK65、atRP46、nb30S72、nbGT61、nbPV55、nbPPI43、nbPM64以及nbH2A86,如US 62 / 643,053中所述。衍生自植物的表現增強子可用於植物表現系統中,該植物表現系統包含與該衍生自植物的表現增強子序列以及感興趣的核苷酸序列操作性地連接的調控區域。
藉由“操作性地連接”,是指特定序列直接或間接相互作用以實現預期的功能,例如核酸序列的表現的中介或調節。操作性地連接的序列的相互作用可以例如由與操作性地連接的序列相互作用的蛋白質介導。
當在植物、植物的一部分、或植物細胞中表現一種或超過一種突變流感HA蛋白質時,該一種或超過一種突變流感HA蛋白質自組裝成VLP。可以在合適的萃取以及純化條件下收穫植物、植物的一部分、或植物細胞,以維持VLP的完整性,並且可以純化包含該一種或超過一種突變流感HA的VLP。
本發明還提供如本文所述的突變流感HA、或包含突變流感HA的VLP在個體中誘導對流感感染的免疫的用途。本文還揭露了藉由向個體或宿主動物投予突變流感HA、或包含該突變流感HA的VLP而製備的抗體或抗體片段。還提供了一組合物,該組合物包含如本文所述有效劑量的突變流感HA或包含該突變流感HA的VLP、以及藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物(vehicle)、或賦形劑,用於在個體中誘導免疫反應。還提供了用於在個體中誘導免疫反應的疫苗,其中該疫苗包含有效劑量的突變流感HA。
本文還提供了用於在個體中誘導針對流感感染的免疫的方法,該方法包括將突變流感HA、或包含該突變流感HA的VLP經口服、鼻內、肌肉內、腹膜內、靜脈內或皮下投予個體。
如本文所用的術語“流感病毒”是指正黏液病毒科的有套膜病毒株,其特徵在於具有負鏈單股RNA基因組。流感病毒基因組包含8個基因區段,該8個基因區段取決於病毒株而編碼12-14個蛋白質。
流感病毒有四種類型:A、B、C以及D,其中A型以及B型流感是人類中季節性疾病流行病的致病微生物。基於HA以及神經胺酸酶(NA)醣蛋白亞型的表現進一步對A型流感進行分類。
如本文所用的術語“血球凝集素”或是“HA”是指三聚體凝集素,其促進流感病毒顆粒與靶細胞表面上的含唾液酸的蛋白質的結合,並介導病毒基因組釋放到靶細胞中。有18種不同的HA亞型(H1-H18)。HA蛋白質包含兩種結構元件:頭部,其是血清保護性抗體的主要靶標;以及莖部。HA被轉譯為單個多肽HA0(組裝為三聚體),其必須被HA1(~40kDa)以及HA2(~20kDa)子結構域之間的絲胺酸內切蛋白酶切割。切割後,兩個二硫鍵鍵結的蛋白質結構域採取病毒感染性所需的必要構型。
如本文所揭露的A型流感 HA蛋白質或經修飾的A型流感HA蛋白質包括衍生自任何已知A型流感病毒株的任何已知HA蛋白質,但也包括隨時間發展的已知A型流感病毒株的修飾。例如,流感HA可能衍生自A/加州/07/09(H1N1)、A/密西根/45/15(H1N1)、A/馬薩諸塞/06/17(H1N1)、A/哥斯大黎加/0513/16(H1N1)、A/宏都拉斯/17734/16(H1N1)、或A/達爾文/11/15(H1N1)。A型流感HA可以包括源自病毒株的HA,其中該HA相對於源自上文列出的A型流感病毒株的任何HA具有約30-100%或其間的任何數的胺基酸序列一致性,條件是該流感HA蛋白質包含如本文所述的至少一取代並且能夠形成VLP、當投予個體時誘導免疫反應、誘導血球凝集、或其組合。
例如,對於來自上文列出的A型流感病毒株的任何HA,流感HA蛋白質可具有30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%、或其間的任何數的胺基酸序列一致性(序列相似性、一致性百分比、相似性百分比)、以及包含至少一個如本文所述的取代並且能夠形成VLP、當投予個體時誘導免疫反應、誘導血球凝集、或其組合。幾種A型流感HA結構域的胺基酸序列比對(其不被認為是限制性的)顯示於第1圖中。
當提及特定序列時,術語“相似性百分比”、“序列相似性”、“ 一致性百分比”、或“序列一致性”用於例如威斯康辛大學GCG軟體程式中所闡述的、或藉由手動比對以及目視檢查(參見,例如,Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel 等人編輯,1995年補篇)。用於比較的序列比對方法是本領域熟知的。用於比較的序列的最佳比對可以使用例如Smith&Waterman的演算法(1981,Adv. Appl. Math. 2:482)、藉由Needleman&Wunsch的比對演算法,(1970,J. Mol. Biol. 48:443)、藉由檢索Pearson&Lipman的相似性方法,(1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)、藉由這些演算法的計算化實現(例如:GAP,BESTFIT,FASTA以及威斯康辛遺傳學套裝軟體中的TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575 Science Dr.,Madison,Wis.)而進行。
適用於確定序列一致性百分比以及序列相似性的演算法的實例是BLAST以及BLAST 2.0演算法,其分別描述於Altschul 等人(1977,Nuc. Acids Res. 25:3389-3402)以及 Altschul 等人(1990,J. Mol. Biol. 215:403-410)。以本文所述的參數使用BLAST以及BLAST 2.0,以確定本發明的核酸以及蛋白質的序列一致性百分比。例如,BLASTN程式(對於核苷酸序列)可以使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M = 5、N = -4、以及雙股的比較作為默認值。對於胺基酸序列,BLASTP程式可以使用以下默認值:字長為3和期望值(E)為10以及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff&Henikoff,1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比對(B)為50、期望值(E)為10、M = 5、N = -4、以及雙股的比較。用於進行BLAST分析的軟體可經由國家生物技術資訊中心揭露獲得(參見URL:ncbi.nlm.nih.gov/)。
如本文所用的術語“類病毒顆粒(virus-like particle)”、VLP、“類病毒顆粒(virus like particle)”、或“VLP”是指包含一個或超過一個流感HA蛋白質且自組裝成非複製性、非感染性病毒殼結構的流感顆粒,該非複製性、非感染性病毒殼結構缺乏流感基因組的所有部分。植物中的流感 HA 蛋白質生產
A型流感HA蛋白質包括任何含有一胺基酸序列的HA蛋白質,相對於來自A/加州/07/09(H1N1,SEQIDNO:130)、A/密西根/45/15(H1N1,SEQIDNO:134)、A/馬薩諸塞/06/17(H1N1,SEQIDNO:135)、A/哥斯大黎加/0513/16(H1N1,SEQIDNO:133)、A/宏都拉斯/17734/16(H1N1,SEQIDNO:131)、A/達爾文/11/15(H1N1,SEQIDNO:132)、A/巴黎/1227/2017(SEQ ID NO:138)、以及A/挪威/2147/2017(SEQ ID NO:139)的A型流感HA序列,該胺基序列具有約30至約100%、約40至約100%、約50至約100%、約60至約100%、約70至約100%、約80至約100%、約85至約100%、約90至約100%、95至約100%、或約97至約100%、約98至約100%、或其間的任何數的序列一致性或序列相似性,條件是流感HA蛋白質包含如本文所述的至少一取代並且能夠形成VLP、當投予個體時誘導免疫反應、誘導血球凝集、或其組合。
再者,經修飾的流感HA蛋白質包括含有一胺基酸序列的任何HA蛋白質,該胺基酸序列相對於SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、 SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148序列中的一序列具有約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約85%至約100%、約90%至約100%、95%至約100%、或約97%至約100%、約98%至約100%、或其間任何數的序列一致性或序列相似性,條件是該流感HA蛋白質包含如本文所述的至少一取代並且能夠形成VLP、當投予個體時誘導免疫反應、誘導血球凝集、或其組合。
如本文所述,與野生型流感HA相比,流感HA中的一個或超過一個特異性突變或修飾導致植物中HA蛋白質的累積增加以及VLP生產增加。
在植物中具有提高的流感HA及/或VLP生產的突變A型流感HA蛋白質的實例包括但不限於以下:
F390D A/加州/07/09突變H1(構築體#2980,SEQ ID NO:18);L429M A/加州/07/09突變H1(構築體#2962,SEQ ID NO:22);F390D + L429M A/加州/07/09突變H1(構築體#2995,SEQ ID NO:24);N380A A/密西根/45/15突變H1(構築體#3644,SEQ ID NO:105);F390D+N380A A/密西根/45/15突變H1(構築體#3704,SEQ ID NO:108);N97D A/密西根/45/15突變H1(構築體#3774,SEQ ID NO:28);K374E A/密西根/45/15突變H1(構築體#3771,SEQ ID NO:32);F390D A/密西根/45/15突變H1(構築體#3641,SEQ ID NO:36);L429M A/密西根/45/15突變H1(構築體#3643,SEQ ID NO:39);N97D + K374E A/密西根/45/15突變H1(構築體#3880,SEQ ID NO:41);F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1(構築體#3703,SEQ ID NO:43);N97D + F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1(構築體#3879,SEQ ID NO:45);K374E + F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1(構築體#3878,SEQ ID NO:47);N97D +K374E + F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1(構築體#3881,SEQ ID NO:49);F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1(構築體#4091,SEQ ID NO:51);N97D + F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1(構築體#4093,SEQ ID NO:53);K374E + F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1(構築體#4092,SEQ ID NO:55);N97D + K374E + F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1(構築體#4094,SEQ ID NO:57);F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16突變H1(構築體#4715,SEQ ID NO:59);N97D + F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16突變H1(構築體#4717,SEQ ID NO:61);K374E + F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16突變H1(構築體#4716,SEQ ID NO:63);N97D + K374E + F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16突變H1(構築體#4718,SEQ ID NO:65);N97D A/宏都拉斯/17734/16突變H1(構築體#3950,SEQ ID NO:68);K374E A/宏都拉斯/17734/16突變H1(構築體#3948,SEQ ID NO:72);F390D A/宏都拉斯/17734/16突變H1(構築體#3945,SEQ ID NO:75);L429M A/宏都拉斯/17734/16突變H1(構築體#3949,SEQ ID NO:80);F390D + L429M A/宏都拉斯/17734/16突變H1(構築體#3946,SEQ ID NO:82);N97D + F390D + L429M A/宏都拉斯/17734/16突變H1(構築體#3951,SEQ ID NO:84);N97D A/達爾文/11/15突變H1(構築體#3990,SEQ ID NO:86);K374E A /達爾文/11/15突變H1(構築體#3988,SEQ ID NO:89);F390D A/達爾文/11/15突變H1(構築體#3985,SEQ ID NO:91);L429M A/達爾文/11/15突變H1(構築體#3989,SEQ ID NO:93);F390D + L429M A/達爾文/11/15突變H1(構築體#3986,SEQ ID NO:95);N97D + F390D + L429M A/達爾文/11/15突變H1(構築體#3991,SEQ ID NO:97);F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1(構築體#4765,SEQ ID NO:124)、K374E + F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1(構築體#4766,SEQ ID NO:126)、N97D + F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1(構築體#4767,SEQ ID NO:128)、N97D + K374E + F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1(構築體#4768,SEQ ID NO:140);F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1(構築體#4775,SEQ ID NO:142)、K374E + F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1(構築體#4776,SEQ ID NO:144)、 N97D + F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1(構築體#4777,SEQ ID NO:146)、以及N97D + K374E + F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1(構築體#4778,SEQ ID NO:148)。對流感感染的免疫的誘導
“免疫反應”通常是指個體的適應性免疫系統的反應。適應性免疫系統通常包括體液反應以及細胞介導的反應。體液反應是由B淋巴細胞譜系的細胞(B細胞)中所產生、由所分泌抗體介導的免疫方面。分泌的抗體與入侵微生物(例如病毒或細菌)表面上的抗原結合,抗體標記它們以進行破壞。體液免疫通常用於指抗體產生及其伴隨的過程、以及抗體的效應物功能,包括Th2細胞活化以及細胞介素產生、記憶細胞產生、吞噬作用的助噬素促進、病原體消除等。術語“調節(modulate)”或“調節(modulation)”等是指特定反應或參數的增加或減少,如藉由通常已知或使用的幾種測定中的任一種所確定的,其中一些在本文中舉例說明。
細胞介導的反應是不涉及抗體的免疫反應,而是涉及回應於抗原,巨噬細胞、天然殺手細胞(NK)、抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的活化及各種細胞介素的釋放。細胞介導的免疫通常用於指一些Th細胞活化、Tc細胞活化、以及T細胞介導的反應。細胞介導的免疫在回應病毒感染中可能特別重要。
例如,可以使用ELISPOT測定法來測量抗原特異性CD8陽性T淋巴細胞的誘導;可以使用增殖測定法來測量CD4陽性T淋巴細胞的刺激。可以使用ELISA測定法來定量抗流感HA抗體力價;也可以使用抗種類抗體(anti-isotype antibodies)(例如抗-IgG、IgA、IgE、或IgM)來測量抗原特異性或交叉反應性抗體的種類。用於進行此類測定的方法以及技術是本領域熟知的。
細胞介素的存在或水準也可以量化。 例如,T輔助細胞反應(Th1 / Th2)的特徵在於藉由使用ELISA(例如BD Biosciences OptEIA套組)進行IFN-γ以及IL-4分泌細胞的測量。可以培養從個體獲得的末梢血液單核細胞(PBMC)或脾細胞,並分析上清液。還可以使用本領域已知的標記物特異性螢光標記以及方法,藉由螢光激發細胞分選(FACS)來定量T淋巴細胞。
還可以進行微量中和測定以表徵個體中的免疫反應,參見例如Rowe 等人1973年的方法。病毒中和力價可以以多種方式來定量,包括:細胞的結晶紫固定/著色後的溶菌斑的計數(溶菌斑檢定);體外培養中細胞溶解的顯微鏡觀察;以及2)流感病毒的ELISA以及分光光度檢測。
如本文所用的術語“抗原決定位”或“多個抗原決定位”是指抗體特異性結合的抗原的結構部分。
回應於植物產生的野生型流感HA蛋白質或VLP、或突變型流感HA蛋白質或VLP的投予所引發的免疫反應可例如在Balb/C小鼠中觀察到。可以藉由ELISA分析收集自動物的血液的血清樣品的H1特異性總IgG以及IgA抗體。以植物產生的野生型流感HA或突變型流感HA蛋白質免疫的小鼠可針對每個處理組在血清中表現出HA特異性IgG抗體力價。
植物表現
可以使用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿孔等將本發明的構築體引入植物細胞中。對於這些技術的回顧,參見例如Weissbach以及Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academy Press,New York VIII,pp.421-463(1988); Geierson以及Corey,Plant Molecular Biology,第2版(1988);以及Miki以及Iyer,Fundamentals of Gene Transfer in Plants。Plant Metabolism,2d Ed. DT. Dennis、DH Turpin、DD Lefebrvre、DB Layzell (eds),Addison Wesly,Langmans Ltd. London,pp.561-579(1997)。其他方法包括直接DNA攝取、脂質體的使用、電穿孔(例如使用原生質體)、微注射、粒子槍或晶鬚、以及真空浸潤。參見例如,Bilang等人(1991,Gene 100:247-250)、Scheid等人 (1991,Mol. Gen. Genet. 228:104-112)、Guerche等人(1987,Plant Science 52:111-116),Neuhause等人(1987,Theor. Appl Genet. 75:30-36)、Klein 等人(2987,Nature 327:70-73);Freeman等人(1984,Plant Cell Physiol. 29:1353)、Howell等人(1985,Science 227:1229-1231)、DeBlock等人(1989,Plant Physiology 91:694-701)、Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach,eds.,Academic Press Inc.,1988)、Methods in Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski,eds.,Academic Press Inc.,1989)、WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Liu以及Lomonossoff(2002,J Virol Meth,105:343-348)、EP 290395;WO 8706614;美國專利號4,945,050;5,036,006;以及5,100,792,1995年5月10日提交的美國專利申請序號08/438,666以及1992年9月25日提交的美國專利申請序號07/951,715(所有這些文獻併入本文以供參考)。
短暫表現方法可用於表現本發明的構築體(參見D’Aoust等人,2009,Methods in molecular biology,Vol 483,pages 41-50;Liu以及Lomonossoff,2002,Journal of Virological Methods,105:343-348;併入本文以供參考)。或者,可以使用基於真空的短暫表現方法,如Kapila等人(1997,Plant Sci. 122,101-108;其藉由引用併入本文)、或WO 00/063400、WO 00/037663(其藉由引用併入本文)所述。例如,這些方法可以包括但不限於農桿菌接種法或農桿菌浸潤法、注射浸潤法(syringe infiltration),然而,如上所述,也可以使用其他短暫方法。用農桿菌接種法、農桿菌浸潤法、或注射浸潤法,包含所需核酸的農桿菌混合物進入組織(例如植物的葉子、地上部分(包括莖、葉子以及花)、植物的其他部分(莖、根、花)、或整株植物)的細胞間隙。在穿過表皮後,農桿菌感染並將t-DNA複製(t-DNA copies)轉移到細胞中。t-DNA被游離轉錄並且mRNA被轉譯,導致經感染細胞中感興趣的蛋白質的產生,然而,細胞核內t-DNA的傳遞是短暫的。
還認為本發明的一部分是包含本發明的基因構築體的基因轉殖植物、植物細胞、或種子,其可以用作適合於本文所述的短暫蛋白質表現的平台植物。從植物細胞再生完整植物的方法也是本領域已知的(例如參見Guerineauu以及Mullineaux(1993,Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD ed)Oxford,BIOS Scientific Publishers,pp 121-148)。通常,轉化的植物細胞在合適的培養基中培養,該培養基可含有選擇性試劑,例如抗生素,其中可選擇的標記用於促進轉化的植物細胞的鑑定。一旦癒傷組織形成,可以根據已知方法藉由使用適當的植物激素來促進芽形成,並將芽轉移到生根培養基中以再生植物。接著,該植物可以被用以從種子或使用營養繁殖技術建立重複世代。也可以在不使用組織培養的情況下產生基因轉殖植物。用於穩定轉化以及再生這些生物體的方法在本領域中已經確立並且是本領域技術人員已知的。Vasil等人(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,VoI I、Il及III,Laboratory Procedures and Their Applications,Academic Press,1984)、以及Weissbach和Weissbach(Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989)綜述了可用的技術。獲得經轉化以及再生的植物的方法對本發明並不是至關重要的。
如果要以兩個或更多個核酸構築體來轉化或共轉化植物、植物的一部分、或植物細胞,可以在單個轉染事件中將核酸構築體引入農桿菌中以使核酸匯集,及使細菌細胞被轉染。或者,構築體可以被連續地引入。在這種情況下,如所述將第一構築體引入農桿菌中,細胞在選擇條件下(例如在抗生素的存在下)生長,其中只有各別轉化的細菌可以生長。在此第一選擇步驟之後,如所述將第二核酸構築體引入農桿菌中,並且細胞在雙重選擇條件下生長,其中只有雙重轉化的細菌可以生長。接著,可以將雙重轉化的細菌用於轉化如本文所述的植物、植物的一部分、或植物細胞,或者可以進行進一步的轉化步驟以容納第三核酸構築體。
或者,如果植物、植物的一部分、或植物細胞將被兩個或更多個核酸構築體轉化或共轉化,該核酸構築體可以藉由將農桿菌細胞的混合物與植物、植物的一部分、或植物細胞共同浸潤而引入植物中,每個農桿菌細胞可以包含一個或多個將被引入植物中的構築體。為了改變植物、植物的部分或植物細胞內構築體內感興趣的核苷酸序列的相對表現量,在浸潤步驟期間,包含所需構築體的各種農桿菌群體的濃度是可以改變的。表 3 :
SEQ ID NO以及序列的描述
在以下實例中將進一步說明本發明。
實例1:流感HA構築體
使用本領域熟知的技術來生產流感HA構築體。例如,如下所述選殖的野生型A-加州-07-09 HA、F390D A-加州-07-09 HA以及F390D + L429M A-加州-07-09 HA。使用類似技術獲得其他H1突變體,且HA序列引子、模板以及產物描述於實例3(植物中的流感HA及VLP生產)以及表4中。
下表4中提供了野生型以及突變的HA蛋白質、引子、模板以及產物的概述。A. H1 HA 的修飾
2X35S/CPMV 160/ PDISP-HA0 H1 A-加州-07-09/NOS (構築體號碼1314)
使用以下基於PCR的方法將編碼來自A/加州/07/09融合至苜蓿PDI分泌訊息肽(PDISP)的流感HA的成熟HA0的序列選殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。使用PDISP-H1 A/加州/7/09基因序列(SEQ ID NO:1)作為模板,使用引子IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:13)以及IF-H1cTMCT.S1-4r(SEQ ID NO:14)來擴增含有PDISP-A/加州/07/09編碼序列的片段。使用內融合(In-Fusion)選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將PCR產物選殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。用SacII以及StuI限制酶消化構築體號碼1190(第8圖),並且線性化質體被用於內融合組裝反應。構築體號碼1190是受體質體,其意欲用於基於2X35S/CPMV160/NOS的表現卡匣中的感興趣基因的“內融合”選殖。它還併入一個基因構築體,用於共同表現在苜蓿色素體藍素基因啟動子以及終止子下沉默的TBSV P19抑制子。骨架是pCAMBIA二元質體,並且從左至右t-DNA邊界的序列被示於SEQ ID NO:98中。所得的構築體被編號為1314(SEQ ID NO:99)。來自A/加州/07/09融合至苜蓿PDI分泌信息肽(PDISP)的流感HA的成熟HA0的胺基酸序列示於SEQ ID NO:2中。質體1314的表現示於第6A圖中。
2X35S/CPMV 160/ PDISP-HA0 H1 A-加州-07-09 (F390D)/ NOS (構築體號碼2980)
編碼來自流感HA(其來自被融合至苜蓿PDI分泌訊息肽(PDISP)的A/加州/07/09(F390D))的成熟HA0的序列是使用以下基於PCR的方法被選殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。在PCR的第一輪中,含有具有突變的F390D胺基酸的PDISP-H1 A/加州/07/09的片段是使用引子IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:13)以及H1Cal(F390D).r(SEQ ID NO:15)、及使用PDISP-H1 A/加州/7/09基因序列(SEQ ID NO:1)作為模板而被擴增。含有具有H1 A/加州/07/09的剩餘的F390D突變的第二片段是使用H1Cal(F390D).c(SEQ ID NO:16)以及IF-H1cTMCT.S1-4r(SEQ ID NO:14)、及使用PDISP-H1 A/加州/07/09基因序列(SEQ ID NO:1)作為模板而被擴增。然後,來自兩種擴增的PCR產物被混合並且使用作為模板,以用於使用IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:13)以及IF-H1cTMCT.S1-4r(SEQ ID NO:14)作為引子的第二輪的擴增。最終的PCR產物使用內融合選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)被選殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。構築體編號1190(第8圖)被以SacII以及StuI限制酶消化,並且線性化質體被使用於內融合組裝反應。構築體號碼1190是受體質體,其意欲用於基於2X35S/CPMV160/NOS的表現卡匣中的感興趣基因的“內融合”選殖。它還併入一個基因構築體,用於共同表現在苜蓿色素體藍素基因啟動子以及終止子下沉默的TBSV P19抑制子。骨架是pCAMBIA二元質體,並且從左至右t-DNA邊界的序列被示於SEQ ID NO:98中。所得的構築體被編號為2980(SEQ ID NO:100)。來自A/加州/07/09 (F390D)的經突變PDISP-HA的胺基酸序列被示於SEQ ID NO:18中。質體2980的表現示於第6B圖中。
2X35S/CPMV 160/ PDISP-HA0 H1 A-加州-07-09 (F390D+L429M)/NOS(構築體號碼2995)
編碼來自流感HA(其來自被融合至苜蓿PDI分泌訊息肽(PDISP)的A/加州/07/09 (F390D+L429M))的成熟HA0的序列是使用以下基於PCR的方法被選殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。在PCR的第一輪中,含有具有突變的F390D以及L429M胺基酸的PDISP-H1 A/加州/07/09的片段是使用引子IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:13)以及H1Cal(L429M).r(SEQ ID NO:19)、及使用PDISP-H1 A/加州/7/09(F390D)基因序列(SEQ ID NO:17)作為模板而被擴增。含有具有H1 A/加州/07/09的剩餘的L429M突變的第二片段是使用H1Cal(L429M).c(SEQ ID NO:20)以及IF-H1cTMCT.S1-4r (SEQ ID NO:14)、及使用PDISP-H1 A/加州/7/09(F390D)基因序列(SEQ ID NO:17)作為模板而被擴增。然後,來自兩種擴增的PCR產物被混合並且使用作為模板,以用於使用IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:13)以及IF-H1cTMCT.S1-4r(SEQ ID NO:14)作為引子的第二輪的擴增。最終的PCR產物使用內融合選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)被選殖到2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。構築體編號1190(第8圖)被以SacII以及StuI限制酶消化,並且線性化質體被使用於內融合組裝反應。構築體號碼1190是受體質體,其意欲用於基於2X35S/CPMV 160/NOS的表現卡匣中的感興趣基因的“內融合”選殖。它還併入一個基因構築體,用於共同表現在苜蓿色素體藍素基因啟動子以及終止子下沉默的TBSV P19抑制子。骨架是pCAMBIA二元質體,並且從左至右t-DNA邊界的序列被示於SEQ ID NO:98中。所得的構築體被編號為2995(SEQ ID NO:101)。來自A/加州/07/09(F390D+L429M)的經突變PDISP-HA的胺基酸序列被示於SEQ ID NO:24中。質體2995的表現示於第6D圖中。
實例 2:方法根癌農桿菌轉染
根癌農桿菌菌株AGL1是使用由D’Aoust等人,2008(Plant Biotech. J.
6:930-40)描述的方法,以野生型流感HA或突變流感HA表現載體藉由電穿孔所轉染。經轉染的農桿菌生長在以10 mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ ml康黴素以及25 μg/ ml卡本西林補充的pH 5.6的YEB培養基中,直至OD600
介於0.6及1.6之間。在使用前將農桿菌懸浮液離心並重新懸浮於浸潤培養基(10 mM MgCl2
以及10 mM MES,pH 5.6)中。
植物生物質、接種物以及農桿菌浸潤的製備
圓葉菸草(N. benthamiana
)植物是從以商業泥炭蘚基質所填充的平板(flat)中的種子所生長。該植物被允許在16/8光週期以及日間25℃/夜間20℃的溫度境況下在溫室中生長。播種後三週,個別小植物被挑出、被移植到盆中並且在相同的環境條件下在溫室中被留置生長持續額外三週。
以每種野生型流感HA或突變型流感HA表現載體所轉染的農桿菌在以10 mM 2-(N-嗎啉基) 乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ ml康黴素以及25 μg/ ml卡本西林補充的pH 5.6的YEB培養基中生長,直至它們達到介於0.6及1.6之間的OD600
。在使用前將農桿菌懸浮液離心並重新懸浮於浸潤培養基(10 mM MgCl2
以及10 mM MES,pH 5.6)中,並在4℃下儲存過夜。在浸潤當天,將培養物分批稀稀釋成2.5倍培養體積,並允許在使用前回溫。在20-40托的真空下,將圓葉煙草的整株植物倒置在氣密的不銹鋼罐中的細菌懸浮液中2分鐘。將植物送回溫室中持續6或9天的培養週期直至收穫。
葉片收穫以及總蛋白質萃取
使用軌道振盪器在室溫下藉由過夜酵素性萃取而從被切成約1 cm2
片段的新鮮生物質中萃取蛋白質。然後將漿液經過大孔尼龍過濾器過濾以除去粗的未消化植物性組織。
為了獲得“全部流程產率”,將漿液離心以除去原生質體以及胞內污染物。上清液藉由深度過濾而澄清。接著,澄清的餾分被裝載到陽離子交換管柱以逐漸增加的NaCl濃度進行逐步溶析步驟。將純化的VLP藉由TFF濃縮、對配方緩衝液透析並通過過濾器。純化的VLP的蛋白質含量藉由BCA分析法分析,並且活性是藉由血球凝集測定法來分析。相對產率是藉由比較來自新構築體的蛋白質產率與被使用作為對照的天然構築體來獲得。
為了獲得“密度梯度後產率”,將漿液離心以除去原生質體以及胞內污染物。將上清液進一步離心以除去額外的殘渣。使用玻璃纖維過濾器藉由深度過濾而澄清上清液。接著,將澄清的餾分裝載到不連續碘克沙醇密度梯度上。分離密度梯度離心如下實行:包含於托立斯緩衝液(Tris buffer)中的不連續碘克沙醇密度梯度(35%、30%、25%、20%、15%、10%以及5%的連續層)的38 ml試管被製備並且以澄清萃取物覆蓋。將梯度以120000 g離心2小時(4℃)。離心後,從底部到頂部收集的前5 mL被丟棄,而下一個5 mL被收集以用於獲得蛋白質含量分析(BCA)、活性測量(血球凝集測定)、以及在還原的SDS-PAGE上的HA0條帶的強度測量(密度測定法)。相對產率是藉由比較來自新構築體的HA0條帶強度與被使用作為對照的天然構築體來獲得。
血球凝集測定
血球凝集測定是基於由Nayak以及Reichl(2004)所描述的方法。簡而言之,測試樣品(100 μL)的連續雙倍稀釋是在含有100 μL PBS的V形底96孔微滴定盤中進行,每孔留下100 μL稀釋的樣品。一百微升0.25%火雞(用於H1)紅血球懸浮液(Bio Link Inc.,Syracuse,NY)被加入每個孔,並將微滴定盤在室溫下培養2小時。顯示完全血球凝集的最高稀釋的倒數被記錄為HA活性。平行地,重組HA標準品(A/越南/1203/2004 H5N1)(蛋白質科學公司,梅里(Meriden),CT)在PBS中稀釋,並且在每個盤上運行作為對照。
蛋白質分析以及免疫印漬術
免疫印漬術是利用一級mAb(其在TBS-聚山梨醇酯20 0.1%中的2%脫脂乳中被稀釋為1/500)以第一次培養來執行。以被稀釋為1/10000的過氧化酶接合的山羊抗小鼠(Jackson Immunoresearch,cat#115-035-146)被使用作為二級抗體,用於在0.1%TBS-聚山梨醇酯20中的2%脫脂乳中的化學發光檢測。使用發光胺作為基質(羅氏診斷公司)藉由化學發光性來檢測免疫反應性複合物。人體IgG抗體的山葵過氧化酶接合作用是藉由使用EZ-LinkPlus®活化的過氧化酶接合套組(Pierce,Rockford,III.)來進行。
實例 3:在植物中流感HA以及VLP生產A. H1 HA 的修飾
流感HA構築體是使用本領域熟知的技術產生(參見實例1)。下表4中提供了野生型以及突變HA蛋白質、引子、模板以及產物的概述。所使用的序列在實例4以及在序列表中提供。F390D A/ 加州 /07/09 突變 H1
藉由將野生型A/加州/07/09 H1的位置390處的苯丙胺酸殘基突變成天冬胺酸而構築F390D A/加州/07/09突變H1(構築體#2980)。如第2A圖以及第2B圖所顯示,與用野生型A/加州/07/09 H1(構築體#1314)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#2980農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約60%的增加。再者,如第2C圖所見,與用野生型構築體浸潤的植物相比,以構築體#2980農桿菌浸潤的圓葉煙草植物在碘克沙醇梯度純化後,在VLP產率上表現出大約60%的增加。L429M A/ 加州 /07/09 突變 H1
藉由將野生型A/加州/07/09 H1的位置429處的白胺酸殘基突變為甲硫胺酸來構築L429M A/加州/07/09突變H1(構築體#2962)。如第2A及2B圖所顯示,與用野生型A/加州/07/09 H1(構築體#1314)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,用構築體#2962農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約20%的增加。此外,如第2C圖所顯示,在碘克沙醇梯度純化後,與用野生型構築體浸潤的植物相比,用構築體#2962農桿菌浸潤的圓葉煙草植物在VLP產率上表現出約30%的增加。F390D + L429M A/ 加州 /07/09 突變 H1
藉由將雙重突變引入A/加州/07/09 H1的野生型序列而構築F390D + L429M A/加州/07/09突變H1(構築體#2995),其中位置390處的苯丙胺酸被突變成天冬胺酸,以及位置429處的白胺酸被突變成甲硫胺酸。如第2B圖所顯示,與用野生型A/加州/07/09 H1(構築體#1314)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,用構築體#2995農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約60%的增加。N97D A/ 密西根 /45/15 突變 H1
藉由將野生型A/密西根/45/15 H1的位置97處的天冬醯胺殘基突變為天冬胺酸來構築N97D A/密西根/45/15 突變H1(構築體#3774)。如第3A及3B圖所顯示,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,用構築體#3774農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約1100%的增加。K374E A/ 密西根 /45/15 突變 H1
藉由將野生型A/密西根/45/15 H1的位置374處的離胺酸殘基突變為麩胺酸來構築K374E A/密西根/45/15 突變H1(構築體#3771)。如第3A以及3B圖所顯示,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3771農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約1100%的增加。F390D A/ 密西根 /45/15 突變 H1
藉由將野生型A/密西根/45/15 H1的位置390處的苯丙胺酸殘基突變為天冬胺酸來構築F390D A/密西根/45/15 突變H1(構築體#3641)。如第3B圖所顯示,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3641農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出相似的活性。然而,當測量具有H1的經純化VLP的全部製程產率時,觀察到與野生型相比增加至172%(參見表5C)。L429M A/ 密西根 /45/15 突變 H1
藉由將野生型A/密西根/45/15 H1的位置429處的白胺酸殘基突變為天冬胺酸來構築L429M A/密西根/45/15 突變H1(構築體#3643)。如第3B圖所顯示,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,用構築體#3643農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約500%的增加。N97D + K374E A/ 密西根 /45/15 突變 H1
藉由將雙重突變引入野生型A/密西根/45/15的野生型序列來構築N97D + K374E A/密西根/45/15 突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被替換為天冬胺酸殘基,以及位置374處的離胺酸被替換為麩胺酸殘基(構築體#3880)。如第3B圖所顯示,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3880農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約1100%的增加。F390D + L429M A/ 密西根 /45/15 突變 H1
藉由將雙重突變引入野生型A/密西根/45/15的野生型序列來構築F390D + L429M A/密西根/45/15 突變H1,其中位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#3703)。如第3B圖所顯示,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3703農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約1100%的增加。N97D + F390D + L429M A/ 密西根 /45/15 突變 H1
藉由將三重突變引入野生型A/密西根/45/15的野生型序列來構築N97D + F390D + L429M A/密西根/45/15 突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#3879)。如第3B圖所顯示,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3879農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約2300%的增加。K374E + F390D + L429M A/ 密西根 /45/15 突變 H1
藉由將三重突變引入野生型A/密西根/45/15的野生型序列來構築K374E + F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1,其中位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#3878)。如第3B圖所顯示,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3878農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約2500%的增加。N97D + K374E + F390D + L429M A/ 密西根 /45/15 突變 H1
藉由將四重突變引入野生型A/密西根/45/15的野生型序列來構築N97D +K374E + F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#3881)。如第3B圖所顯示,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3881農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約3300%的增加。N97D + F390D + L429M A/ 馬薩諸塞 /06/17 突變 H1
藉由將三重突變引入野生型A/馬薩諸塞/06/17的野生型序列來構築N97D + F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4093)。如第4B圖所顯示,與用雙重突變構築體F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1(構築體#4091)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4093農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約40%的增加。K374E + F390D + L429M A/ 馬薩諸塞 /06/17 突變 H1
藉由將三重突變引入野生型A/馬薩諸塞/06/17的野生型序列來構築K374E + F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1,其中位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4092)。如第4B圖所顯示,與用雙重突變構築體F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1(構築體#4091)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4092農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約50%的增加。N97D + K374E + F390D + L429M A/ 馬薩諸塞 /06/17 突變 H1
藉由將四重突變引入野生型A/密西根/45/15的野生型序列來構築N97D + K374E + F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4094)。如第4B圖所顯示,與用雙重突變構築體F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1(構築體#4091)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4094農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約70%的增加。N97D + F390D + L429M A/ 哥斯大黎加 /0513/16 突變 H1
藉由將三重突變引入野生型A/哥斯大黎加/0513/16的野生型序列來構築N97D + F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4717)。如第4B圖所顯示,與用雙重突變構築體F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變H1(構築體#4715)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4717農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約100%的增加。K374E + F390D + L429M A/ 哥斯大黎加 /0513/16 突變 H1
藉由將三重突變引入野生型A/哥斯大黎加/0513/16的野生型序列來構築K374E + F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變H1,其中位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4716)。如第4B圖所顯示,與用雙重突變構築體F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變H1(構築體#4715)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4716農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約10%的增加。N97D + K374E + F390D + L429M A/ 哥斯大黎加 /0513/16 突變 H1
藉由將四重突變引入野生型A/哥斯大黎加/0513/16的野生型序列來構築N97D + K374E + F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4718)。如第4B圖所顯示,與用雙重突變構築體F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變H1(構築體#4715)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4718農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約140%的增加。N97D A/ 宏都拉斯 /17734/16 突變 H1
藉由將野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1的位置97處的天冬醯胺殘基突變為天冬胺酸來構築N97D A/宏都拉斯/17734/16 突變H1(構築體#3950)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1(構築體#3944)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3950農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約300%的增加。K374E A/ 宏都拉斯 /17734/16 突變 H1
藉由將野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1的位置374處的離胺酸殘基突變為麩胺酸來構築K374E A/宏都拉斯/17734/16突變H1(構築體#3948)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1(構築體#3944)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3948農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約100%的增加。F390D A/ 宏都拉斯 /17734/16 突變 H1
藉由將野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1的位置390處的苯丙胺酸殘基突變為天冬胺酸來構築F390D A/宏都拉斯/17734/16 突變H1(構築體#3945)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1(構築體#3944)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3945農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約30%的增加。L429M A/ 宏都拉斯 /17734/16 突變 H1
藉由將野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1的位置429處的白胺酸殘基突變為甲硫胺酸來構築L429M A/宏都拉斯/17734/16 突變H1(構築體#3949)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1(構築體#3944)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3949農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約400%的增加。F390D + L429M A/ 宏都拉斯 /17734/16 突變 H1
藉由將雙重突變引入野生型A/宏都拉斯/17734/16的野生型序列來構築F390D + L429M A/宏都拉斯/17734/16突變H1,其中位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#3946)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1(構築體#3944)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3946農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約300%的增加。N97D + F390D + L429M A/ 宏都拉斯 /17734/16 突變 H1
藉由將三重突變引入野生型A/宏都拉斯/17734/16的野生型序列來構築N97D + F390D + L429M A/宏都拉斯/17734/16突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#3951)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1(構築體#3944)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3951農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約600%的增加。N97D A/ 達爾文 /11/15 突變 H1
藉由將野生型A/達爾文/11/15 H1的位置97處的天冬醯胺殘基突變為天冬胺酸來構築N97D A/達爾文/11/15 突變H1(構築體#3990)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/達爾文/11/15 H1(構築體#3984)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3990農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約200%的增加。K374E A/ 達爾文 /11/15 突變 H1
藉由將野生型A/達爾文/11/15 H1的位置374處的離胺酸殘基突變為麩胺酸來構築K374E A/達爾文/11/15 突變H1(構築體#3988)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/達爾文/11/15 H1(構築體#3984)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3988農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約300%的增加。F390D A/ 達爾文 /11/15 突變 H1
藉由將野生型A/達爾文/11/15 H1的位置390處的苯丙胺酸殘基突變為天冬胺酸來構築F390D A/達爾文/11/15 突變H1(構築體#3985)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/達爾文/11/15 H1(構築體#3984)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3985農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約50%的增加。L429M A/ 達爾文 /11/15 突變 H1
藉由將野生型A/達爾文/11/15 H1的位置429處的白胺酸殘基突變為甲硫胺酸來構築L429M A/達爾文/11/15 突變H1(構築體#3989)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/達爾文/11/15 H1(構築體#3984)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3989農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約500%的增加。F390D + L429M A/ 達爾文 /11/15 突變 H1
藉由將雙重突變引入野生型A/達爾文/11/15的野生型序列來構築F390D + L429M A/達爾文/11/15 突變H1,其中位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#3986)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/達爾文/11/15 H1(構築體#3984)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3986農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約300%的增加。N97D + F390D + L429M A/ 達爾文 /11/15 突變 H1
藉由將三重突變引入野生型A/達爾文/11/15的野生型序列來構築N97D + F390D + L429M A/達爾文/11/15 突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#3991)。如第4A圖所顯示,與用野生型A/達爾文/11/15 H1(構築體#3984)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3991農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約1100%的增加。F390D + L429M A/ 巴黎 /1227/2017 突變 H1
藉由將雙重突變引入野生型A/巴黎/1227/2017的野生型序列來構築F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1,其中位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4765)。如第4C圖所顯示,與用F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1(構築體#4091)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4765農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約117%的增加。K374 + F390D + L429M A/ 巴黎 /1227/2017
藉由將三重突變引入野生型A/巴黎/1227/2017的野生型序列來構築K374E + F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1,其中位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4766)。如第4C圖所顯示,與用F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1(構築體#4765)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4766農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約127%的增加。N97D + F390D + L429M A/ 巴黎 /1227/2017
藉由將三重突變引入野生型A/巴黎/1227/2017的野生型序列來構築N97D + F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4767)。如第4C圖所顯示,與用F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1(構築體#4765)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4767農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約171%的增加。N97D + K374E + F390D + L429M A/ 巴黎 /1227/2017
藉由將四重突變引入野生型A/巴黎/1227/2017的野生型序列來構築N97D + K374E + F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4768)。如第4C圖所顯示,與用F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變H1(構築體#4765)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4768農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約230%的增加。F390D + L429M A/ 挪威 /2147/2017 突變 H1
藉由將雙重突變引入野生型A/挪威/2147/2017的野生型序列來構築F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1,其中位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4775)。如第4C圖所顯示,與用F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17突變H1(構築體#4091)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4775農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約112%的增加。K374 + F390D + L429M A/ 挪威 /2147/2017
藉由將三重突變引入野生型A/挪威/2147/2017的野生型序列來構築K374E + F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1,其中位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4776)。如第4C圖所顯示,與用F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1(構築體#4775)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4776農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約128%的增加。N97D + F390D + L429M A/ 挪威 /2147/2017
藉由將三重突變引入野生型A/挪威/2147/2017的野生型序列來構築N97D + F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變 H1
,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4777 )。如第4C圖所顯示,與用F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1(構築體#4775)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4777農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約200%的增加。N97D + K374E + F390D + L429M A/ 挪威 /2147/2017
藉由將四重突變引入野生型A/挪威/2147/2017的野生型序列來構築N97D + K374E + F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1,其中位置97處的天冬醯胺被突變為天冬胺酸殘基,位置374處的離胺酸被突變為麩胺酸殘基,位置390處的苯丙胺酸被突變為天冬胺酸殘基,以及位置429處的白胺酸被替換為甲硫胺酸殘基(構築體#4778)。如第4C圖所顯示,與用F390D + L429M A/挪威/2147/2017突變H1(構築體#4775)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#4778農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約213%的增加。N380A A/ 密西根 /45/15
藉由將野生型A/密西根/45/15 H1的位置380處的天冬醯胺突變為丙胺酸殘基來構築N380A A/密西根/45/15 突變H1(構築體#3644)。如第3B以及3C圖所見,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3644農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約80%的降低。N380A + F390D A/ 密西根 /45/15
N380A + F390D A/密西根/45/15 突變H1也被構築,其中藉由將位置380處的天冬醯胺以丙胺酸殘基取代,以及將位置390處的苯丙胺酸以天冬胺酸殘基取代,而將雙重突變引入野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3704)。如第3B圖所見,與用野生型A/密西根/45/15 H1(構築體#3640)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3704農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約50%的降低。鑑於利用N380A A /密西根/ 45/15突變H1觀察到的降低的血球凝集價,這些結果表明,位置380處天冬醯胺殘基的突變會對在植物中流感HA蛋白質的穩定性及/或流感HA蛋白質的表現產生負面影響。
本文所述的一種或超過一種突變特異性地增加植物中的流感HA蛋白質產生以及VLP產率。觀察到在其他位置處的突變顯著降低植物細胞中的流感HA蛋白質累積或VLP產生、或對植物細胞中的流感HA蛋白質累積或VLP產生沒有顯著影響。
還觀察到使用包含本文所述的一種或超過一種突變的流感HA蛋白質實現的增加的血球凝集價對流感H1 HA具有專一性。在用來自非H1病毒株的編碼突變型流感HA的構築體進行農桿菌浸潤的植物中未觀察到類似的增強。
例如,藉由將野生型A/印尼/5/2005 H5的位置393處的苯丙胺酸突變為天冬胺酸來構築F393D A/印尼/5/2005突變H5(構築體#3680)。如第5圖所顯示,與用野生型A/印尼/5/2005 H5(構築體#2295)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以構築體#3680農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約98%的降低。
類似地,與用野生型A/埃及/N04915/2014 H5(構築體#3645)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的萃取物相比,以F392D A/埃及/N04915/2014 突變 H5(構築體#3690)農桿菌浸潤的圓葉煙草植物的經純化萃取物在血球凝集價上表現出大約99%的降低(參見第5圖以及表6)。
本文所述的一種或超過一種的突變特異性地增加植物中的流感HA蛋白質產生以及VLP產率。觀察到在其他位置處的突變顯著降低植物細胞中的流感HA蛋白質累積或VLP產生、或對植物細胞中的流感HA蛋白質累積或VLP產生沒有顯著影響。
表4:如本文所述製備的構築體的實例。序列在實例4以及序列列表中提供。 實例 3 :血球凝集價、密度梯度後產率、以及全部流程產率
表5A中給出了所測量的血球凝集價的概述。如實例2中所述來測量血球凝集價。藉由比較經突變或經修飾的HA蛋白質的血球凝集價與野生型HA的血球凝集價,而獲得相對血球凝集價(表5A)。
表5B中給出了所測量的密度梯度後產率的概述。如實例2中所述來測量密度梯度後產率。藉由比較來自經突變或經修飾的HA蛋白質的HA0條帶強度與野生型HA的HA0條帶強度,而獲得相對產率(表5B)。
表5C中給出了所測量的全部流程產率的概述。如實例2中所述來獲得全部流程產率。藉由比較來自經突變或經修飾的HA蛋白質的蛋白質產率與野生型HA的蛋白質產率,而獲得相對產率(表5C)。表 5A :
H1的相對血球凝集價的概述。編號是根據A/密西根/45/15 HA。 表 5 B:
H1的相對密度梯度後產率的概述。編號是根據A/密西根/45/15 HA。 表 5 C:
H1的相對全部流程產率的概述。編號是根據A/密西根/45/15 HA。 表 6 :
H5的相對血球凝集價的概述。編號是根據H5 A/印尼/5/2005。 實例 4 :序列 實例 4 :序列
下列序列被使用(亦參見表4):
PDI-H1 Cal DNA(SEQ ID NO:1)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCTGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACACCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGACTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Cal AA(SEQ ID NO:2)
MAKNVAIFGLLFSLLVLVPSQIFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
PDI-H1 Mich DNA(SEQ ID NO:3)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTGGAAGACAAGCATAACGGAAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGTTCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAATTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCAATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCACGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAACTTGATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTTAACCAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTGTGGGGCATTCACCATCCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGACATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAACAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCACAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCGAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAGTATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTTCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTCGGGGCCATTGCCGGCTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAAAATGCCATTGACAAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTGGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATCTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTATCACGATTCAAATGTGAAGAACTTGTATGAAAAAGTAAGAAACCAGTTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAAAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Mich AA(SEQ ID NO:4)
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PDI-H1 Mass DNA(SEQ ID NO:5)
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PDI-H1 Mass AA(SEQ ID NO:6)
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PDI-H1 CostaR DNA(SEQ ID NO:7)
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PDI-H1 CostaR AA(SEQ ID NO:8)
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PDI-H1 Hond DNA(SEQ ID NO:9)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTACCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAACCACTCTCCACAGCAAGTTCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCAATTATGAGGAGCTAAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAGAGATTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACAGCAGCATGTCCTCACGCTGGGGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCCAATCCTACATTAATGATAAAGGAAAAGAAGTCCTCGTGCTGTGGGGCATTCACCATCCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGACATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCACAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCGAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGGAAATGTCCAAAGTATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCATCTATTCAATCTAGAGGCCTATTCGGGGCGATTGCCGGCTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCAGAAGAGCACACAAAGTGCCATTGACAAAATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTGGGTAAAGAGTTCAACCACTTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGCTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGACTCAAATGTGAAGAACTTGTATGAAAAGGTAAGAAACCAGTTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAAAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Hond AA(SEQ ID NO:10)
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PDI-H1 Darw DNA(SEQ ID NO:11)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCACAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAACCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGTTCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCAATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGATTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCACGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAACTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCCAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAATCCTCGTGCTGTGGGGCATTCACCATCCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGACATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCAGGTGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCACAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCGAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAGTATGTGAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCATCTATTCAATCTAGAGGCCTATTCGGGGCCATTGCCGGCTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGGTATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAAAATGCCATTGACAAAATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTGGGTAAAGAGTTCAACCACTTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGCTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTGTATGAAAAGGTAAGAAACCAGTTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAATGGTTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGGGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAAAAATAGAAGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGAATTTACCAAATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Darw AA(SEQ ID NO:12)
MAKNVAIFGLLFSLLVLVPSQIFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSSDNGTCYPGDFINYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLTKKGNSYPKLSQSYINDKGKEILVLWGIHHPSTTADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFTMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPEGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSGEAKLNREKIEGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c(SEQ ID NO:13)
TCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCT
IF-H1 cTMCT.S1-4r(SEQ ID NO:14)
ACTAAAGAAAATAGGCCTTTAAATACATATTCTACACTGTAGAGAC
H1Cal(F390D).r(SEQ ID NO:15)
CTCTTTACCTACTGCTGTGTCCTGTGTATTCATCTTTTCAATAACAGAATTTA
H1Cal(F390D).c(SEQ ID NO:16)
TTATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAAC
PDI-H1 Cal-F390D DNA序列(SEQ ID NO:17)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACACCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGACTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Cal-F390D AA序列(SEQ ID NO:18)
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H1Cal(L429M).r(SEQ ID NO:19)
GTTCTTTCATTTTCCATTAGAACCAACAGTTCGGCATTGTAAGTCCAA
H1Cal(L429M).c(SEQ ID NO:20)
CGAACTGTTGGTTCTAATGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGA
PDI-H1 Cal-L429M DNA序列(SEQ ID NO:21)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACACCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGACTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTAATGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Cal-L429M AA序列(SEQ ID NO:22)
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PDI-H1 Cal-F390D + L429M DNA序列(SEQ ID NO:23)
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PDI-H1 Cal-F390D + L429M AA序列(SEQ ID NO:24)
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H1Mich(N97D).r(SEQ ID NO:25)
TAGCTCCTCATAATCGATGAAATCTCCTGGGTAACACGTTCCATTGTCTGAA
H1Mich(N97D).c(SEQ ID NO:26)
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PDI-H1 Darw-N97D+F390D+L429M AA(SEQ ID NO:97)
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選殖載體1190從左至右T-DNA(SEQ ID NO:98)
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構築體1314從2X35S啟動子至NOS終止子(SEQ ID NO:99)
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構築體2980從2X35S啟動子至NOS終止子(SEQ ID NO:100)
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H1Mich (N380A + F390D).r(SEQ ID NO:106)
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PDI-H1 Mich-F390D+N380A AA(SEQ ID NO:108)
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PDI-H5 Indo AA(SEQ ID NO:111)
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H5Ind(F393D).r(SEQ ID NO:112)
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H5Ind(F393D).c(SEQ ID NO:113)
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PDI-H5 Indo-F393D AA(SEQ ID NO:115)
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IF-H5_Egy.r(SEQ ID NO:116)
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PDI-H5 埃及 DNA(SEQ ID NO:117)
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PDI-H5 埃及 AA(SEQ ID NO:118)
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H5Egy(F392D).r(SEQ ID NO:119)
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PDI-H5 埃及-F392D AA(SEQ ID NO:122)
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PDI-H1 Par-F390D+L429M(nt)(SEQ ID NO:123)
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PDI-H1 Par-F390D+L429M(aa)(SEQ ID NO:124)
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A/哥斯大黎加/0513/16(H1N1)(aa)(SEQ ID NO:133)
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A/密西根/45/15(H1N1)(nt)(SEQ ID NO:136)基因庫:KY117023.1
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ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTGGAAGACAAGCATAACGGAAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGATCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAATTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCAATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCACGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAACTTGATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTTAACCAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTGTGGGGCATTCACCATCCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGACATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAACAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCACAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCAGGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCGAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATGTGCATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAGTATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTTCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTCGGGGCCATTGCCGGCTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAAAATGCCATTGACAAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTGGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATCTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTAATGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTATCACGATTCAAATGTGAAGAACTTGTATGAAAAAGTAAGAAACCAGTTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAAAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Nor-F390D+L429M(aa)(SEQ ID NO:142)
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PDI-H1 Nor-K374E+F390D+L429M(nt)(SEQ ID NO:143)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTGGAAGACAAGCATAACGGAAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGATCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAATTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCAATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCACGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAACTTGATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTTAACCAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTGTGGGGCATTCACCATCCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGACATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAACAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCACAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCAGGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCGAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATGTGCATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAGTATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTTCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTCGGGGCCATTGCCGGCTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAAAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTGGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATCTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTAATGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTATCACGATTCAAATGTGAAGAACTTGTATGAAAAAGTAAGAAACCAGTTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAAAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Nor-K374E+F390D+L429M(aa)(SEQ ID NO:144)
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PDI-H1 Nor-N97D+F390D+L429M(nt)(SEQ ID NO:145)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTGGAAGACAAGCATAACGGAAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGATCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAATTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCACGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAACTTGATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTTAACCAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTGTGGGGCATTCACCATCCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGACATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAACAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCACAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCAGGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCGAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATGTGCATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAGTATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTTCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTCGGGGCCATTGCCGGCTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAAAATGCCATTGACAAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTGGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATCTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTAATGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTATCACGATTCAAATGTGAAGAACTTGTATGAAAAAGTAAGAAACCAGTTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAAAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Nor-N97D+F390D+L429M(aa)(SEQ ID NO:146)
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PDI-H1 Nor-N97D+K374E+F390D+L429M(nt)(SEQ ID NO:147)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTGGAAGACAAGCATAACGGAAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGATCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAATTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCACGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAACTTGATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTTAACCAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTGTGGGGCATTCACCATCCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGACATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAACAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCACAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCAGGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCGAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATGTGCATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAGTATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTTCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTCGGGGCCATTGCCGGCTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAAAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTGGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATCTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTAATGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTATCACGATTCAAATGTGAAGAACTTGTATGAAAAAGTAAGAAACCAGTTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAAAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Nor-N97D+K374E+F390D+L429M(aa)(SEQ ID NO:148)
MAKNVAIFGLLFSLLVLVPSQIFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTARSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLNQSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTTADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIATRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFTMERNAGSGIIISDTPVQDCNTTCQTPEGAINTSLPFQNVHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQDTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLMENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREKIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI*
所有引用文獻均在此併入作為參考。
已經就一個或多個實施方式描述了本發明。然而,對於本領域技術人員顯而易見的是,在不脫離申請專利範圍所限定的本發明的範圍的情況下,可以進行許多變化以及修飾。
無。
本發明的這些與其他特徵將由參考所附圖式的下列描述而變得更明顯,其中:第 1 圖
顯示A/加州/7/09 (H1N1) (SEQ ID NO:130);A/宏都拉斯/17734/16 (H1N1) (SEQ ID NO:131);A/達爾文/11/15 (H1N1) (SEQ ID NO:132);A/哥斯大黎加/0513/16 (H1N1) (SEQ ID NO:133);A/密西根/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO:134);A/馬薩諸塞/06/17 (H1N1) (SEQ ID NO:135) 的血球凝集素(HA)的胺基酸序列的序列比對。略述的殘基與來自例如A/加州/7/09 (H1N1)的流感H1病毒株(H1N1)的HA的胺基酸D97、E374、F390和L429對齊。第 2A 圖
顯示野生型A/加州/07/09 H1、L429M A/加州/07/09突變 H1、N380A A/加州/7/09突變H1及F390D A/加州/7/09突變H1的血球凝集價。第 2B 圖
顯示野生型A/加州/07/09 H1、表現為相對於野生型A/加州/07/09的百分比的F390D A/加州/07/09突變H1、L429M A/加州/7/09突變H1、及F390D + L429M A/加州/07/09突變H1的血球凝集價。第 2C 圖
顯示野生型A/加州/07/09 H1、N380A A/加州/07/09 突變H1、L429M A/加州/07/09突變H1、及F390D A/加州/07/09突變H1的密度梯度後VLP產率。第 3A 圖
顯示野生型 A/加州/07/09 H1、野生型A/密西根/45/15 H1、K374E A/密西根/45/15突變H1及N97D A/密西根/45/15突變H1的血球凝集價。第 3B 圖
顯示野生型A/加州/07/09 H1、F390D A/加州/07/09突變H1、野生型A/密西根/45/15 H1、N97D A/密西根/45/15突變H1、K374E A/密西根/45/15突變H1、N380A A/密西根/45/15突變H1、F390D A/密西根/45/15突變H1、L429M A/密西根/45/15突變H1、N97D + K374E A/密西根/45/15突變H1、F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1、F390D + N380A A/密西根/45/15突變H1、L429M + N380A A/密西根/45/15突變H1、K374E + F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1、N97D + F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1及N97D + K374E + F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1的血球凝集價。第 4A 圖
顯示野生型A/密西根/45/15 H1、N97D A/密西根/45/15突變H1、K374E A/密西根/45/15突變H1、F390D A/密西根/45/15突變H1、L429M A/密西根/45/15突變H1、F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1及N97 + F390D + L429M A/密西根/45/15突變H1的血球凝集價;野生型A/宏都拉斯/17734/16 H1、N97D A/宏都拉斯/17734/16突變H1、K374E A/宏都拉斯/17734/16突變H1、F390D A/宏都拉斯/17734/16突變H1、L429M A/宏都拉斯/17734/16突變H1、F390D + L429M A/宏都拉斯/17734/16突變H1、及N97D + F390D + L429M A/宏都拉斯/17734/16突變H1的血球凝集價;以及野生型A/達爾文/11/15 H1、N97D A/達爾文/11/15突變H1、K374E A/達爾文/11/15突變H1、F390D A/達爾文/11/15 突變 H1、L429M A/達爾文/11/15 突變 H1 F390D + L429M A/達爾文/11/15 突變 H1以及N97D + F390D + L429M A/達爾文/11/15 突變 H1的血球凝集價。第 4B 圖
顯示F390D + L429M A/密西根/45/15、F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17 突變 H1、K374E + F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17 突變 H1、N97D + F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17 突變 H1、及N97D + K374E + F390D + L429M A/馬薩諸塞/06/17 突變 H1的血球凝集價;F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變 H1、K374E + F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變 H1、N97D + F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變 H1、及N97D + K374E + F390D + L429M A/哥斯大黎加/0513/16 突變 H1的血球凝集價。第 4C 圖
顯示F390D + L429M A/密西根/45/15、F390D + L429M A/巴黎/1227/2017 突變 H1、K374E + F390D + L429M A/巴黎/1227/2017 突變 H1、N97D + F390D + L429M A/巴黎/1227/2017突變 H1、及N97D + K374E + F390D + L429M A/巴黎/1227/2017 突變 H1的血球凝集價;F390D + L429M A/挪威/2147/2017 突變 H1、K374E + F390D + L429M A/挪威/2147/2017 突變 H1、N97D + F390D + L429M A/挪威/2147/2017 突變 H1、及N97D + K374E + F390D + L429M A/挪威/2147/2017 突變 H1的血球凝集價。第 5 圖
顯示野生型A/印尼/5/2005 H5、野生型 A/埃及/N04915/2014 H5、F393D A/印尼/5/2005 突變 H5、F393D A/埃及/N04915/2014 突變 H5、N383A A/印尼/5/2005 突變 H5、及N383A A/埃及/N04915/2014 突變 H5的血球凝集價。編號是按照A/印尼/5/2005。第 6A 圖
顯示載體1314 (H1 A-Cal-7-2009)的示意性表示。第 6B 圖
顯示載體 2980 (H1 A-Cal-7-09 (F390D)) 的示意性表示。第 6C 圖
顯示載體2962 (H1 A-Cal-7-09 (L429M))的示意性表示。第 6D 圖
顯示載體2995 (H1 A-Cal-7-09 (F390D+L429M))的示意性表示。第 6E 圖
顯示載體3640 (H1 A-Mich-45-2015)的示意性表示。第 6F 圖
顯示載體3774 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D)的示意性表示。第 6G 圖
顯示載體3771 (H1 A-Mich-45-2015 (K374E)的示意性表示。第 6H 圖
顯示載體3641 (H1 A-Mich-45-2015 (F390D)的示意性表示。第 6I 圖
顯示載體3643 (H1 A-Mich-45-2015 (L429M))的示意性表示。第 6J 圖
顯示載體3880 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D+K374E))的示意性表示。第 6K 圖
顯示載體3703 (H1 A-Mich-45-2015 (F390D+L429M))的示意性表示。第 6L 圖
顯示載體3879 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D+F390D+L429M))的示意性表示。第 6M 圖
顯示載體3878 (H1 A-Mich-45-2015 (K374E+F390D+L429M))的示意性表示。第 6N 圖
顯示載體3881 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D+K374E+F390D+L429M))的示意性表示。第 6O 圖
顯示載體4091 (H1 A-Mass-06-2017 (F390D+L429M)的示意性表示。第 6P 圖
顯示載體4093 (H1 A-Mass-06-2017 (N97D+F390D+L429M))的示意性表示。第 6Q 圖
顯示載體4092 (H1 A-Mass-06-2017 (K374E+F390D+L429M))的示意性表示。第 6R 圖
顯示載體4094 (H1 A-Mass-06-2017 (N97D+K374E+F390D+L429M))的示意性表示。第 6S 圖
顯示載體4715 (H1 A-哥斯大黎加-0513-2016 (F390D+L429M)) 的示意性表示。第 6T 圖
顯示載體4717 (H1 A-哥斯大黎加-0513-2016 (N97D+F390D+L429M))的示意性表示。第 6U 圖
顯示載體4716 (H1 A-哥斯大黎加-0513-2016 (K374E+F390D+L429M))的示意性表示。第 6V 圖
顯示載體4718 (H1 A-哥斯大黎加-0513-2016 (N97D+K374E+F390D+L429M))的示意性表示。第 6W 圖
顯示載體3944 (H1 A-Hond-17734-16) 的示意性表示。第 6X 圖
顯示載體3950 (H1 A-Hond-17734-16 (N97D))的示意性表示。第 6Y 圖
顯示載體3948 (H1 A-Hond-17734-16 (K374E))的示意性表示。第 6Z 圖
顯示載體3945 (H1 A-Hond-17734-16 (F390D))的示意性表示。第 6AA 圖
顯示載體3949 (H1 A-Hond-17734-16 (L429M))的示意性表示。第 6BB 圖
顯示載體3946 (H1 A-Hond-17734-16 (F390D+L429M))的示意性表示。第 6CC 圖
顯示載體3951 (H1 A-Hond-17734-16 (N97D+F390D+L429M))的示意性表示。第 6DD 圖
顯示載體3984 (H1 A-Darw-11-15) 的示意性表示。第 6EE 圖
顯示載體3990 (H1 A-Darw-11-15 (N97D))的示意性表示。第 6FF 圖
顯示載體3988 (H1 A-Darw-11-15 (K374E)) 的示意性表示。第 6GG 圖
顯示載體3985 (H1 A-Darw-11-15 (F390D)) 的示意性表示。第 6HH 圖
顯示載體3989 (H1 A-Darw-11-15 (L429M))的示意性表示。第 6II 圖
顯示載體3986 (H1 A-Darw-11-15 (F390D+L429M))的示意性表示。第 6JJ 圖
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顯示載體4765 (A/巴黎/1227/17 (F390D+L429M))的示意性表示。第 6NN 圖
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顯示載體4775 (A/挪威/2147/17 (F390D+L429M))的示意性表示。第 6RR 圖
顯示載體4776 (A/挪威/2147/17 (K374E+F390D+L429M))的示意性表示。第 6SS 圖
顯示載體4777 (A/挪威/2147/17 (N97D+F390D+L429M))的示意性表示。第 6TT 圖
顯示載體4778 (A/挪威/2147/17 (N97D+K374E+F390D+L429M))的示意性表示。第 7A 圖
顯示載體2295 (H5 A-Indo-5-05)的示意性表示。第 7B 圖
顯示載體3680 (H5 A-Indo-5-05 (F393D))的示意性表示。第 7C 圖
顯示載體3645 (H5 A-埃及-N04915-14)的示意性表示。第 7D 圖
顯示載體3690 (H5 A-埃及-N04915-14 (F392D))的示意性表示。第 8 圖
顯示載體1190 (用於內融合選殖進入以CPMV 160為基礎的表現卡匣的載體)的示意性表示。
Claims (43)
- 一種核酸,包括編碼一經修飾的流感H1血球凝集素(HA)蛋白質的一核苷酸序列,該HA蛋白質包含一胺基酸序列,該胺基酸序列與一相應的野生型胺基酸序列相比包含至少一取代,該至少一取代是位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97、374、390或429處的胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,其中對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的該胺基酸的該至少一取代被取代為一非天冬醯胺。
- 如申請專利範圍第2項所述的核酸,其中對應於H1 A /密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的該胺基酸的至少一取代被取代為一天冬胺酸或一天冬胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,其中對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的該胺基酸的該至少一取代被取代為一非離胺酸。
- 如申請專利範圍第4項所述的核酸,其中對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的該胺基酸的該至少一取代被取代為一麩胺酸或一麩胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,其中對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的該胺基酸的該至少一取代被取代為一非苯丙胺酸。
- 如申請專利範圍第6項所述的核酸,其中對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的該胺基酸的該至少一取代被取代為一天冬胺酸或一天冬胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,其中對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的該胺基酸的該至少一取代被取代為一非白胺酸。
- 如申請專利範圍第8項所述的核酸,其中對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的該胺基酸的該至少一取代被取代為一甲硫胺酸或一甲硫胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第8項或第9項所述的核酸,更包括一第二取代,該第二取代是位在對應於H1 A/密西根/45/ 15 HA的位置380處的胺基酸的一胺基酸,該第二取代被取代為一非天冬醯胺。
- 如申請專利範圍第10項所述的核酸,其中對應於H1 A/密西根/45/ 15 HA的位置380處的胺基酸的該胺基酸的該第二取代被取代為一丙胺酸或一丙胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括 一第一取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非苯丙胺酸,以及 一第二取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非白胺酸。
- 如申請專利範圍第12項所述的核酸,其中 該第一取代被取代為一天冬胺酸或一天冬胺酸的保留取代,以及 該第二取代被取代為一甲硫胺酸或一甲硫胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括 一第一取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非天冬醯胺,以及 一第二取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非離胺酸。
- 如申請專利範圍第14項所述的核酸,其中 該第一取代被取代為一天冬胺酸或一天冬胺酸的保留取代,以及 該第二取代被取代為一麩胺酸或一麩胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括 一第一取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非天冬醯胺, 一第二取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非苯丙胺酸,以及 一第三取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非白胺酸。
- 如申請專利範圍第16項所述的核酸,其中 該第一取代被取代為一天冬胺酸或一天冬胺酸的保留取代, 該第二取代被取代為一天冬胺酸或一天冬胺酸的保留取代,以及 該第三取代被取代為一甲硫胺酸或一甲硫胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括 一第一取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非離胺酸, 一第二取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非苯丙胺酸,以及 一第三取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非白胺酸。
- 如申請專利範圍第18項所述的核酸,其中 該第一取代被取代為一麩胺酸或一麩胺酸的保留取代, 該第二取代被取代為一天冬胺酸或一天冬胺酸的保留取代,以及 該第三取代被取代為一甲硫胺酸或一甲硫胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第1項所述的核酸,包括 一第一取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非天冬醯胺, 一第二取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置374處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非離胺酸, 一第三取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置390處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非苯丙胺酸,以及 一第四取代,其位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置429處的胺基酸的該胺基酸處,該取代被取代為一非白胺酸。
- 如申請專利範圍第20項所述的核酸,其中 該第一取代被取代為一天冬胺酸或一天冬胺酸的保留取代, 該第二取代被取代為一麩胺酸或一麩胺酸的保留取代, 該第三取代被取代為一天冬胺酸或一天冬胺酸的保留取代,以及 該第四取代被取代為一甲硫胺酸或一甲硫胺酸的保留取代。
- 如申請專利範圍第3項、第7項、第13項、第15項、第17項、第19項或第21項中任一項所述的核酸,其中該天冬胺酸的保留取代為麩胺酸、麩醯胺酸或絲胺酸。
- 如申請專利範圍第5項、第15項、第19項或第21項所述的核酸,其中該麩胺酸的保留取代為天冬胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、天冬醯胺、組胺酸或絲胺酸。
- 如申請專利範圍第9項、第13項、第17項、第19項或第21項所述的核酸,其中該甲硫胺酸的保留取代為異白胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸。
- 如申請專利範圍第11項所述的核酸,其中該丙胺酸的保留取代為絲胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸或纈胺酸。
- 一種經修飾的流感H1血球凝集素(HA)蛋白質,其由申請專利範圍第1項至第25項中任一項所述的核酸編碼。
- 一種類病毒顆粒(VLP),其包括由申請專利範圍第1項至第25項中任一項所述的核酸編碼的經修飾的流感H1血球凝集素(HA)蛋白質。
- 一種在一植物、一植物的一部分或一植物細胞中生產一流感類病毒顆粒(VLP)的方法,包括: a) 將申請專利範圍第1項至第25項中任一項所述的核酸引入該植物、該植物的一部分或植物細胞中;以及 b) 在允許該HA蛋白質表現的條件下培養該植物、該植物的一部分或植物細胞,該HA蛋白質由該核酸編碼,藉此生產該VLP。
- 如申請專利範圍第28項所述的方法,其中該方法更包括步驟c),收獲該植物、該植物的一部分或植物細胞並純化該VLP。
- 一種在一植物、一植物的一部分或一植物細胞中生產流感類病毒顆粒(VLP)的方法,包括: a) 提供包括申請專利範圍第1項至第25項中任一項所述的核酸的一植物、一植物的一部分或植物細胞;以及 b) 在允許該HA蛋白質表現的條件下培養該植物、該植物的一部分或植物細胞,該HA蛋白質由該核酸編碼,藉此生產該VLP。
- 如申請專利範圍第30項所述的方法,其中該方法更包括步驟c),收獲該植物、該植物的一部分或植物細胞並純化該VLP。
- 一種由申請專利範圍第28項至第31項中任一項所述的方法生產的VLP。
- 如申請專利範圍第32項所述的VLP,更包括一種或多於一種源自該植物、該植物的一部分或植物細胞的脂質、植物特異性N-聚醣、經修飾的N-聚醣或其組合。
- 一種生產一抗體或抗體片段的方法,包括將申請專利範圍第27項、第32項或第33項中任一項所述的VLP投予一個體或一宿主動物,從而生產該抗體或該抗體片段。
- 一種由申請專利範圍第34項所述的方法生產的抗體。
- 該植物的一部分或植物細胞,包括申請專利範圍第1至第25項中任一項所述的核酸。
- 該植物的一部分或植物細胞,包括申請專利範圍第26項所述的HA蛋白質或申請專利範圍第27項或第32項所述的VLP。
- 一種用於誘發一免疫反應的組合物,包含一有效劑量的申請專利範圍第27項、第32項或第33項中任一項所述的VLP,以及一藥學上可接受的載體(carrier)、佐劑、媒介物(vehicle)或賦形劑。
- 一種在一個體中誘發對一流感感染的免疫性的方法,該方法包括將申請專利範圍第27項、第32項或第33項中任一項所述的VLP投予該個體。
- 如申請專利範圍第39項所述的方法,其中該VLP經由口服、鼻內、肌內、腹膜內、靜脈內或皮下投予該個體。
- 一種在一植物、一植物的一部分或一植物細胞中增加一流感類病毒顆粒(VLP)的生產的產量的方法,包括: a) 將申請專利範圍第1項至第25項中任一項所述的核酸引入該植物、該植物的一部分或植物細胞中;或提供包含申請專利範圍第1項至第25項中任一項所述的核酸的一植物、一植物的一部分或植物細胞;以及 b) 在允許該HA蛋白質表現的條件下培養該植物、該植物的一部分或植物細胞,該HA蛋白質由該核酸編碼,藉此與表現一未經修飾的HA蛋白質的植物、植物的一部分或植物細胞相比以一更高的產率生產該VLP。
- 如申請專利範圍第41項所述的方法,其中該方法更包括步驟c),收穫該植物、該植物的一部分或植物細胞並純化該VLP。
- 一種經修飾的流感H1血球凝集素(HA)蛋白質,該HA蛋白質包含與一相應的野生型胺基酸序列相比包含至少一取代的一胺基酸序列,所述至少一取代是位在對應於H1 A/密西根/45/15 HA的位置97、374、390或429處的胺基酸的一個或多於一個胺基酸。
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