KR20210024625A - 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 돌연변이들 - Google Patents

인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 돌연변이들 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형된 인플루엔자 바이러스의 단백질을 식물에서 생산하는 것에 관한 것이다. 더욱 상세히는, 본 발명은 식물에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자 (VLP)를 생산하고 증가시키는 것에 관한 것이며, 상기 VLP는 변형된 인플루엔자 혈구응집 (HA)과 같은, 변형된 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함한다. 상기 HA 단백질은 상응하는 야생형 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 하나의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 변형된 HA 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 제공한다. 추가로, 인플루엔자 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생산하는 방법 및 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자 (VLP)의 생산 수율을 증가시키는 방법을 또한 제공한다.

Description

인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 돌연변이들
본 발명은 식물에서 돌연변이 바이러스 단백질을 생산하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식물에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자를 생산하고 증가시키는 것에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae family)의 외피 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 전염성이 높으며 모든 연령대에서 경미하거나 심각한 질병을 일으킬 수 있다.
백신 접종은 인플루엔자 감염을 예방하는 가장 효과적인 방법으로 남아있다. 통상적으로, 백신 접종은 약독화 또는 전체 불활성화 바이러스 형태를 사용하여 수행되며, 이는 환자에게 투여될 때 면역 반응을 유도한다. 약독화 및 전체 불활성화 바이러스가 복제 및 감염 능력을 다시 획득할 수 있는 잠재적 위험을 제거하기 위하여, 재조합 바이러스 단백질을 포함하는 백신들도 인플루엔자 감염에 대한 보호 면역을 유도하는데 사용된다.
그러나, 백신의 면역원 성분으로서 재조합 바이러스 단백질의 사용은 많은 제한을 받는다. 첫째, 최적의 발현 및 적절한 단백질 접힘(폴딩)에 필요한 바이러스 단백질 및 유전적 구성요소의 완전한 보완이 없는 경우, 백신 생산을 위해 요구되는 표준 in vitro 발현 시스템에서 재조합 바이러스 단백질의 수율은 백신 생산 목적에 충분하지 않을 수 있다. 둘째, 재조합 바이러스 단백질 백신들은 부적절한 접힘(폴딩), 불량한(poor) 항원 제시, 및/또는 장기간 지속되는 보호 면역을 부여하는데 효과적이지 못한 1차 체액성 면역 반응의 생성으로 인해 낮은 면역원성을 보일 수도 있다.
인플루엔자 바이러스에는 A, B, C 및 D의 4가지 유형이 있으며, 그 중 인플루엔자 A 및 B는 인간의 계절성 질병 전염병의 원인균이다.
인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 표면상의 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA) 당 단백질 아형의 발현에 기초하여 추가로 분류된다. 18개의 서로 다른 HA 아형 (H1-H18)이 있다.
HA는 인플루엔자 바이러스 입자가 표적 세포 표면의 시알산 함유 단백질에 결합하는 것을 촉진하고 바이러스 게놈이 표적 세포로 방출되는 것을 매개하는 삼량체의 렉틴이다. HA 단백질은 두 가지 구조적 요소 즉, 혈청보호 항체의 주요 타겟인 머리(head) 및 줄기로 구성된다. 2002년, Ha 등은 그들의 출판물(publication)(EMBO J. 21 : 865-875; 이는 본원에 참조로 포함됨)에서 X 선 결정학 구조에 기초한 심각한 인플루엔자 아형에서의 줄기 도메인 클러스터 (SDC) 및 머리(head) 도메인 클러스터 (HDC)의 다양한 하위 도메인의 상대적 방향을 설명한다.
HA는 HA1 (~ 40 kDa) 및 HA2 (~ 20 kDa) 하위 도메인 사이의 세린 엔도프로테아제에 의해 절단되어야 하는 단일 폴리펩티드인, HA0 (삼량체로 조립됨)로 번역된다. 절단 후, 두 개의 이황화-결합 단백질 도메인은 바이러스 감염에 필요한 필수 구조를 채택한다. HA1은 흔적 에스테라아제 도메인 E1' 및 E2와 수용체 결합 부위 (RBS)를 포함하는 구형 머리(head) 도메인을 형성한다. 그리고 RBS는 인플루엔자 바이러스의 가장 적게 보존된 부분이다. HA2는 융합 펩타이드 (FP), 가용성 엑토도메인 (SE), 막횡단 (TM) 및 세포질 꼬리 (CT)가 있는 단일관통 내재성 막 단백질(single-pass integral membrane protein) 이며, 각각의 길이는 약 25, 160, 25 및 10 잔기(residues)이다. HA2는 N 및 C 말단 HA1 잔기와 함께 막 관통 영역을 포함하는 줄기 도메인을 형성하며, 상대적으로 보존되어 있다.
인플루엔자 바이러스 단백질, 특히 인플루엔자 HA의 다양한 돌연변이들이 조사되었다.
예를 들어, Castelㅱn-Vega 등 (Adv Appl Bioinform Chem. 2014; 7 : 37-44)은 안정성 예측 알고리즘을 사용하여 인플루엔자 A (H1N1) pdm09 바이러스로부터 HA의 7,479 개의 전장 아미노산 서열을 비교하고 인플루엔자 HA 안정성의 예측된 향상을 초래하는 D104N, A259T, S124N 및 E172K 돌연변이들을 동정하였다. 대조적으로, S206T, K285E 및 E47K 돌연변이들은 HA에 대해 예측된 불안정화 효과를 가졌다.
원형의 인플루엔자 A (H1N1) pdm [A/California/7/2009]의 서열과 나중에 출현한 인플루엔자 균주 [A/Brisbane/10/2010]의 서열을 비교하여, Cotter 등(PLoS Pathog. 2014; 10 (1):e1003831)은 A/California/7/2009 HA의 줄기 영역에서의 E47K 돌연변이가 삼량체 구조를 안정화하고, 막 융합을 위해 pH를 낮추며, 바이러스의 열 및 산 안정성을 증가시켰음을 확인하였다. Cotter 등 은 또한 A/California/7/2009 E47K 돌연변이 HA가 야생형 대응물보다 흰담비에서 더욱 전염성이 있음을 관찰하였다.
Antanasijevic 등 (J Biol Chem. 2014; 289(32):22237-45)은 14 개의 다른 위치에서 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 H5 HA 줄기 루프(stem loop) 영역의 구조-기능 특성을 조사하였다. A/Vietnam/1203/04 (H5N1) 돌연변이들은 HEK 293T 세포에서 발현되었으며 Antanasijevic은 줄기 루프(stem loop) 영역의 대부분의 돌연변이가 발현, 단백질 분해 처리, 바이러스 어셈블리 또는 수용체 결합을 방해하지 않는다고 보고하였다. 그러나 Antanasijevic은 HA1-D26K, HA1-M102L, HA2-V52A 및 HA2-I55A 돌연변이들(H3 번호 매기기 기준)이 HA의 발현 및/또는 바이러스 입자로의 조립이 감소되었음을 시사하는, 전체 HA의 수준이 현저히 감소된 수준을 나타낸다는 것을 관찰하였다. HA1-D26K, HA2-T49A 및 HA2-M102L 돌연변이들은 또한 야생형 바이러스에 비해 더 낮은 혈구 응집 역가를 나타냈다. Antanasijevic은 추가로 모든 단일 돌연변이가 A549 폐 세포로의 진입 감소를 보이고, HA1-D26K 및 HA2-I55A 돌연변이에서 가장 두드러진 손상이 보이는 것을 관찰하였다. Antanasijivec은 HA2-L99A 돌연변이가 야생형 바이러스에 비해 C179 중화 항체에 의한 A549 폐 세포 억제에 더 민감하다는 것을 추가로 입증했으며, 이는 돌연변이가 항체 결합 및/또는 중화 작용 방식을 향상시킨다는 것을 시사한다. 대조적으로, HA1-I28A, HA1-M31A, HA1-M31L, HA2-I45A 및 HA2-I55V 돌연변이들은 C179 중화 항체에 의한 진입 억제에 덜 민감하게 되었다.
WO2013/177444 및 이의 동반 출판물 Lu 등(Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111(1): 125-30)은 대장균-기반 무세포(cell-free) 단백질 발현 시스템 및 간단한 재접힘(re-folding) 프로토콜을 사용하여 A/California/05/2009 (H1N1)의 적절하게 접힌 HA 줄기 도메인 생산방법을 보고하였다. HA 줄기 도메인의 삼량체화를 유도하기 위하여, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT) 또는 폴돈(foldon) 도메인을 HA의 C 말단에 융합시켰다. 발현된 HA 줄기 단백질의 응집을 유발하는 새롭게 노출된 소수성 및/또는 분자간 이온 쌍을 완화하기 위하여, 5개의 돌연변이 그룹을 평가하였다: M1 (I69T + I72E + I74T + C77T); M2 (I69T + I72E + I74T + C77T + F164D); M3 (I69T + I72E + I74T + C77T + F164D + L174D); M4 (F164D); 및 M5 (F164D + L174D). Lu는 M5 (F164D + L174D) 돌연변이들이 HA 줄기 단백질 용해도 개선을 위해서 가장 영향력 있는 돌연변이들로 보인다고 관찰하였다. 바람직하지 않은 이황화 결합의 형성을 방지하고, 표면 소수성 및 pI를 감소시키며, 무질서한 구조를 갖는 영역을 피하기 위하여 M5 돌연변이들에 추가 결실들 (H38 내지 C43 및 C49 내지 N61) 및 C77T 돌연변이가 생성되었다.
미국 출원 번호 13/838,796 및 Holtz 등에 의한 이의 동반 출판물 (BMC Biotechnology. 2014;14:111)은 막 횡단 (TM) 및 세포질 도메인 (CT)을 포함하는 HA 단백질의 카르복시 말단 영역에서의 시스테인 잔기 돌연변이에 의한 재조합 HA의 개선된 안정성 및 유지된 효능을 가르친다. 특히 Holtz 등은 재조합 Perth/16/2009 HA (H3N2)에서 C539A, C546A, C549A, C524S 및 C528A 돌연변이들을 증명하였다. 5개의 시스테인 잔기 모두 또는 이의 상이한 서브 세트의 돌연변이는 재조합 야생형 HA 단백질과 유사한 HA 수율, 순도, 입자 크기, 혈구 응집 활성 및 열 안정성을 가져왔다. 대조적으로, C64S 및 C76S 돌연변이들은 HA 발현을 상당히 감소시켰으며, 이는 적절한 HA 접힘(폴딩)에서 이들 잔기의 중요한 역할을 시사한다. 단일 방사형 면역-확산 분석 (SRID)을 사용하여, Holtz 등은 또한 5 개의 시스테인 잔기 돌연변이가 TM 및 CT 도메인에서 이황화 교차결합(cross-liking)을 방지함으로써, 야생형 단백질에 비해 재조합 HA의 효능을 향상시킨다는 것을 보였다. 돌연변이 HA 단백질은 25 ㅀC에서 최소 12 개월동안 효능을 유지하는 반면, 야생형 HA 단백질은 정제 후 불과 50일 후에 40 % 미만의 효능을 나타내었다.
WO2015/020913은 인플루엔자 A/푸에르토 리코(Puerto Rico)/8/1934 (H1N1)의 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 및 435 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 특정 잔기의 티로신으로의 돌연변이를 가르친다. 이러한 돌연변이들은 인플루엔자 HA의 줄기 도메인을 본래의 삼량체 형태로 안정화하거나 "잠금"하는 디-타이로신(di-tyrosine) 교차결합 형성을 촉진한다.
WO2013/079473은 구형 머리(head) 도메인이 없는 변형된 인플루엔자 HA를 개시한다. WO2013/079473에서 가르친 폴리펩티드는 아미노산 53 내지 620 (A/Brisbane/59/2007 [H1N1] 넘버링 참조)이 결실되고, 0 내지 10개 아미노산의 공유 결합된 서열로 대체되는 HA1 도메인 및 HA2 도메인을 포함하고, 상기 HA1 도메인의 C-말단 아미노산은 아르기닌 또는 리신 이외의 아미노산이고, 406, 409, 413 및 416 위치에서 하나 이상의 아미노산이 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산 및 글리신으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 돌연변이 되었다.
WO2014/191435는 유사하게 0 내지 50개의 아미노산의 공유 결합된 서열로 대체 된 결실된 세그먼트를 갖는 HA1 도메인 및 HA2 도메인을 포함하는 변형된 인플루엔자 HA를 가르치고, 상기 HA는 HA1과 HA2 사이의 접합부에서 절단에 내성이 있고, 337, 340, 352, 353, 402, 406, 409, 413 및/또는 416 위치에서 하나 이상의 아미노산이 돌연변이 되었다.
바이러스-유사 입자 (VLPs)는 면역원성 조성물에 포함될 잠재적 후보이다. VLPs는 성숙한 비리온과 매우 유사하지만, 바이러스 게놈 물질을 포함하지 않는다. 따라서, VLPs는 본질적으로 복제되지 않아서 백신으로 투여하기에 안전하다. 또한, VLPs는 가장 본질적인 생리학적 구성인 바이러스 당단백질을 VLP 표면에서 발현하도록 조작되어질 수 있다. 더욱이 VLPs는 온전한 비리온과 유사하고 다가 입자 구조이기 때문에, VLPs는 가용성 외피 단백질 항원보다 당단백질에 대한 중화 항체를 유도하는데 더 효과적일 수 있다.
VLPs는 식물에서 생산하였다 (예를 들어 WO2009/076778; WO2009/009876; WO 2009/076778; WO2010/003225; WO2010/003235; WO2010/006452; WO2011/03522; WO 2010/148511; 및 WO2014153674, 이는 본원에 참조로 포함됨).
WO2009/076778은 A형 또는 B형 인플루엔자로부터의 인플루엔자 HA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된, 식물에서 활성 조절 영역을 갖는 핵산을 도입하는 것을 포함하는, 식물에서 인플루엔자 VLPs를 생산하는 방법을 가르친다.
WO2009/009876은 식물에서 인플루엔자 HA VLPs를 생산하는 방법을 가르치며, 상기 인플루엔자 HA는 식물세포에서 VLPs로 자기 조립(self-assemble) 하고, 식물 세포막으로부터 분출(bud)한다.
WO2010/003225는 A/California/04/09(H1N1)로부터의 인플루엔자 HA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된, 식물에서 활성인 조절 영역을 갖는 핵산을 도입하는 것을 포함하는, 식물에서 인플루엔자 HA VLPs를 생산하는 방법을 개시한다.
WO2010/006452는 변형된 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 VLPs의 생산을 가르치며, 여기서 54, 165, 286 위치 또는 이들의 조합 (A/Vietnam/1194/04 [H5N1] 번호 매기기 참조)에서 글리코실화 부위(site)들은 상기 위치의 잔기를 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이시킴으로써 파괴(abolish)하였다. WO2010/006452는 156, 167, 288 위치 또는 이들 조합의 아미노산이 N-연결된 글리코실화 신호 트라이어드 "N X S/T"를 유사하게 폐지하기 위해 세린 또는 트레오닌 이외의 잔기로 돌연변이 될 수 있음을 추가로 가르친다. HA 단백질의 구형 머리(head)에 위치한 글리코실화 부위를 선택적으로 삭제함으로써, WO2010/ 006452는 생성된 HA 단백질이 증가된 항원성 및 더 넓은 교차 반응성을 가짐을 입증한다.
WO2011/035422는 다음 단계를 포함하는 식물-유래 VLPs의 준비(preparing) 방법을 가르친다: 아포플라스트(apoplast)-국재화된 VLPs를 포함하는 식물 또는 식물 물질을 수득하는 단계; 원형질체(protoplast)/스페로플라스트(spheroplast) 분획 및 아포플라스트(apoplast) 분획을 생성하는 단계; 및 식물-유래 VLPs를 포함하는 아포플라스트(apoplast) 분획을 회수하는 단계.
WO2010/148511은 식물에서 인플루엔자 VLPs를 생산하는 방법을 개시하며, 여기서 VLPs는 키메릭 HA 단백질을 포함한다. 키메릭 HA 단백질은 F'1, F'2 및 F 서브 도메인을 갖는 줄기 도메인 클러스터를 포함하고; RB, E1 및 E2 하위 도메인을 갖는 머리(head) 도메인 클러스터; 및 막횡단 도메인 및 C-말단 꼬리 도메인을 갖는 막횡단 도메인 클러스터를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 서브 도메인은 제 1 인플루엔자 균주로부터 유래되고 다른 서브 도메인은 하나 이상의 제 2 인플루엔자 균주로부터 유래된다.
WO2014/153674는 식물에서 인플루엔자 VLPs를 생산하는 방법을 가르치며, 여기서 VLPs는 변형된 단백질분해 고리(proteolytic loop)를 갖는 변형된 인플루엔자 HA를 포함한다. 변형된 단백질분해 고리(proteolytic loop)는 HA0 전구체의 HA1 및 HA2 도메인 사이의 단백질 분해 부위 제거로 구성된다. 따라서 HA 단백질이 안정화되고 천연(native) HA 단백질에 비해 단백질 수율이 증가된다.
본 발명은 식물에서 변형된 인플루엔자 바이러스 단백질의 생산에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식물에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자 (VLP)를 생산하고 증가시키는 것에 관한 것이며, 상기 VLPs는 변형된 인플루엔자 바이러스 단백질, 예를 들어 변형된 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 포함한다.
본 발명의 목적은 식물에서 인플루엔자 VLP 생산을 증가시키는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 다음이 제공된다.
변형된 인플루엔자 H1 헤마글루티닌 (Hemagglutinin: HA) 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 HA 단백질은 상응하는 야생형 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 하나의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 하나의 치환은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97, 374, 390 또는 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서 존재한다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-아스파라긴으로 치환된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 아스파르트산으로의 치환 또는 아스파르트산의 보존된 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-라이신으로 치환된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 글루탐산으로의 치환 또는 글루탐산의 보존된 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-페닐알라닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 아스파르트 산으로의 치환 또는 아스파르트산의 보존된 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-류신으로 치환된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 메티오닌으로의 치환 또는 메티오닌의 보존된 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 380 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에 비-아스파라긴으로 치환된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 380 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 알라닌으로의 치환 또는 알라닌의 보존된 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-페닐알라닌으로의 제 1 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-류신으로의 제 2 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존된 치환으로의 제 1 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 메티오닌 또는 메티오닌의 보존된 치환으로의 제 2 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-아스파라긴으로의 제 1 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-류신으로의 제 2 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존된 치환으로의 제 1 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 글루탐산으로의 치환 또는 글루탐산의 보존된 치환으로의 제 2 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-아스파라긴으로의 제 1 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-페닐알라닌으로의 제 2 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-류신으로의 제 3 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존된 치환으로의 제 1 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존된 치환으로의 제 2 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 메티오닌 또는 메티오닌의 보존된 치환으로의 제 3 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-류신으로의 제 1 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-페닐알라닌으로의 제 2 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-류신으로의 제 3 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 글루탐산으로의 치환 또는 글루탐산의 보존된 치환으로의 제 1 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존된 치환으로의 제 2 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 메티오닌 또는 메티오닌의 보존된 치환으로의 제 3 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-아스파라긴으로의 제 1 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-류신으로의 제 2 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-페닐알라닌으로의 제 3 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 비-류신으로의 제 4 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존된 치환으로의 제 1 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 글루탐산으로의 치환 또는 글루탐산의 보존된 치환으로의 제 2 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존된 치환으로의 제 3 치환 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 메티오닌 또는 메티오닌의 보존된 치환으로의 제 4 치환을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산에 의해 암호화 된 HA 단백질 및 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산에 의해 암호화 된 HA 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
따라서 변형된 인플루엔자 H1 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 제공하며, HA 단백질은 상응하는 야생형 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 하나의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 적어도 하나의 치환은 H1 A/Michigan/45/15HA의 97, 374, 390 또는 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서 존재한다.
또한, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자 (VLP)의 생산 방법을 제공하며, 방법은 다음 단계를 포함한다.
a) 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산을 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에 도입하는 단계; 및
b) 재조합 핵산에 의해 암호화 된 HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 배양하여, VLP를 생산하는 단계.
추가적으로 c) 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 수확하고 VLP를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
다음을 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자 (VLP)의 생산 방법을 추가로 제공한다 :
a) 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산을 포함하는 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 제공하는 단계; 및
b) 재조합 핵산에 의해 암호화 된 HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 배양하여, VLP를 생산하는 단계.
추가적으로 c) 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 수확하고 VLP를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, a) 재조합 핵산을 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에 도입; 또는 재조합 핵산이 포함된 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 제공하는 단계; 및 b) 재조합 핵산에 의해서 암호화된 HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 배양하여, 변형되지 않은 인플루엔자 HA 단백질을 발현하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에 비해 더 높은 수율로 VLP를 생산하는 방법으로 구성되는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자 (VLP)의 생산 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 수확하고 VLP를 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 방법은 양자 채널 단백질을 암호화하는 제 2의 핵산을 도입하고; 상기 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 제 2의 핵산에 의해 암호화 된 양자 채널 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 배양하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 양자 채널 단백질은 인플루엔자 A 아형 M2 단백질일 수 있다.
본 명세서에 설명된 방법에 의해 생성된 VLP를 추가로 제공한다.
VLP는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로부터 유래된 하나 이상의 지질, 식물 특이적 N-글리칸, 변형된 N-글리칸 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
추가로, 항체 또는 항체 단편을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 기재된 바와 같은 VLP를 대상체 또는 숙주 동물에게 투여하여 항체 또는 항체 단편을 생산하는 것을 포함한다. 상기 방법에 의해 생산된 항체들 또는 항체 단편들도 제공한다.
또한, 재조합 핵산 또는 재조합 핵산에 의해 암호화 된 HA 단백질을 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 제공한다. HA 단백질은 VLP를 형성할 수 있다. 따라서, 재조합 핵산에 의해 암호화 된 HA 단백질을 포함한 VLP를 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포 역시 제공한다.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 VLP의 유효 용량 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제(adjuvant), 비히클(vehicle) 또는 부형제(excipient)를 포함하는 면역 반응 유도용 조성물을 제공한다. 기재된 바와 같은 VLP를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 인플루엔자 감염에 대한 면역을 유도하는 방법을 또한 제공한다. VLP는 대상체에게 경구, 비강, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 또는 피하로 투여할 수 있다.
또한, 서열번호 18, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 4, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 72, 서열번호 77, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86, 서열번호 89, 서열번호 91, 서열번호 93, 서열번호 95, 서열번호 97, 서열번호 105, 서열번호 108, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 140, 서열번호 143, 서열번호 145, 서열번호 147, 서열번호 149 서열의 서열과 약 30% 내지 약 100 %, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형된 인플루엔자 혈구 응집소 (HA) 단백질을 제공한다. 단, 인플루엔자 HA 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 치환을 적어도 포함하고 VLP를 형성할 수 있으며, 대상체에 투여했을 때 면역 반응을 유도하고, 혈구 응집 또는 이들의 조합을 유도할 수 있다.
본 발명의 이 요약이 반드시 본 발명의 모든 특징을 기술하는 것은 아니다.
본 발명의 이들 및 다른 특징들은 첨부된 도면을 참조하는 다음 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1은 A/California/7/09(H1N1) (서열번호 130)A/Honduras/17734/16 (H1N1) (서열번호 131); A/Darwin/11/15 (H1N1) (서열번호 132); A/Costa Rica/0513/16 (H1N1) (서열번호 133); A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열번호 134); A/Massachusetts/06/17 (H1N1) (서열번호 135)의 헤마글루티닌 (HA)에 대한 아미노산 서열의 서열 정렬을 나타낸다. 윤곽이 있는 잔기는 인플루엔자 H1 균주 (H1N1), 예를 들어 A/California/7/09 (H1N1)의 HA의 아미노산 D97, E374, F390 및 L429와 정렬된다.
도 2A는 야생형 A/California/07/09 H1, L429M A/California/07/09 돌연변이 H1, N380A A/California/7/09 돌연변이 H1 및 F390D A/California/7/09 돌연변이 H1의 혈구응집 역가를 나타낸다. 도 2B는 야생형 A/California/07/09 H1, F390D A/California/07/09 돌연변이 H1, L429M A/California/07/09 돌연변이 H1 및 F390D + L429M A/California/07/09 돌연변이 H1의 야생형 A/California/07/09에 대한 백분율로 표현되는 혈구응집 역가를 나타낸다. 도 2C는 야생형 A/California/07/09 H1, N380A A/California/07/09 돌연변이 H1, L429M A/California/07/09 돌연변이 H1 및 F390D A/California/07/09 돌연변이 H1의 밀도후 구배(post-density gradient) VLP 수율을 나타낸다.
도 3A는 야생형 A/California/07/09 H1, 야생형 A/Michigan/45/15 H1, K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 및 N97D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1의 혈구응집 역가를 나타낸다. 도 3B는 야생형 A/California/07/09 H1, F390D A/California/07/09 돌연변이 H1, 야생형 A/Michigan/45/15 H1, N97D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, N380A A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, F390D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, N97D + K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, F390D + N380A A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, L429M + N380A A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, K374E + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, N97D + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 및 N97D + K374E + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1의 혈구응집 역가를 나타낸다.
도 4A는 야생형 A/Michigan/45/15 H1, N97D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, F390D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1, F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 및 N97 + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1의 혈구응집 역가; 야생형 A/Honduras/17734/16 H1, N97D A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1, K374E A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1, F390D A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1, L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1, F390D + L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1, 및 N97D + F390D + L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1의 혈구응집 역가; 및 야생형 A/Darwin/11/15 H1, N97D A/Darwin/11/15 돌연변이 H1, K374E A/Darwin/11/15 돌연변이 H1, F390D A/Darwin/11/15 돌연변이 H1, L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1 F390D + L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1 및 N97D + F390D + L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1의 혈구응집 역가를 나타낸다. 도 4B는 F390D + L429M A/Michigan/45/15, F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1, K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1, N97D + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1, and N97D + K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1의 혈구응집 역가; F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1, K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1, N97D + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1, 및 N97D + K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1의 혈구응집 역가를 나타낸다. 도 4C는 F390D + L429M A/Michigan/45/15, F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1, K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1, N97D + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1, 및 N97D + K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1의 혈구응집 역가; F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1, K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1, N97D + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1, and N97D + K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1의 혈구응집 역가를 나타낸다.
도 5는 야생형 A/Indonesia/5/2005 H5, 야생형 A/Egypt/N04915/2014 H5, F393D A/Indonesia/5/2005 돌연변이 H5, F393D A/Egypt/N04915/2014 돌연변이 H5, N383A A/Indonesia/5/2005 돌연변이 H5, 및 N383A A/Egypt/N04915/2014 돌연변이 H5의 혈구응집 역가를 나타낸다. 번호 매기기(numbering)는 A/Indonesia/5/2005에 따른다.
도 6A는 벡터 1314 (H1 A-Cal-7-2009)의 모식도를 나타낸다. 도 6B는 벡터 2980 (H1 A-Cal-7-09 (F390D))의 모식도를 나타낸다. 도 6C는 벡터 2962 (H1 A-Cal-7-09 (L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6D는 벡터 2995 (H1 A-Cal-7-09 (F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6E는 벡터 3640 (H1 A-Mich-45-2015)의 모식도를 나타낸다. 도 6F는 벡터 3774 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D))의 모식도를 나타낸다. 도 6G는 벡터 3771 (H1 A-Mich-45-2015 (K374E))의 모식도를 나타낸다. 도 6H는 벡터 3641 (H1 A-Mich-45-2015 (F390D)의 모식도를 나타낸다. 도 6I는 벡터 3643 (H1 A-Mich-45-2015 (L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6J는 벡터 3880 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D+K374E))의 모식도를 나타낸다. 도 6K는 벡터 3703 (H1 A-Mich-45-2015 (F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6L은 벡터 3879 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6M은 벡터 3878 (H1 A-Mich-45-2015 (K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6N은 벡터 3881 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D+K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6O는 벡터 4091 (H1 A-Mass-06-2017 (F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6P는 벡터 4093 (H1 A-Mass-06-2017 (N97D+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6Q는 벡터 4092 (H1 A-Mass-06-2017 (K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6R은 벡터 4094 (H1 A-Mass-06-2017 (N97D+K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6S는 벡터 4715 (H1 A-CostaRica-0513-2016 (F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6T는 벡터 4717 (H1 A-CostaRica-0513-2016 (N97D+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6U는 벡터 4716 (H1 A-CostaRica-0513-2016 (K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6V는 벡터 4718 (H1 A-CostaRica-0513-2016 (N97D+K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6W는 벡터 3944 (H1 A-Hond-17734-16)의 모식도를 나타낸다. 도 6X는 벡터 3950 (H1 A-Hond-17734-16 (N97D))의 모식도를 나타낸다. 도 6Y는 벡터 3948 (H1 A-Hond-17734-16 (K374E))의 모식도를 나타낸다. 도 6Z는 벡터 3945 (H1 A-Hond-17734-16 (F390D))의 모식도를 나타낸다. 도 6AA는 벡터 3949 (H1 A-Hond-17734-16 (L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6BB는 벡터 3946 (H1 A-Hond-17734-16 (F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6CC는 벡터 3951 (H1 A-Hond-17734-16 (N97D+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6DD는 벡터 3984 (H1 A-Darw-11-15)의 모식도를 나타낸다. 도 6EE는 벡터 3990 (H1 A-Darw-11-15 (N97D))의 모식도를 나타낸다. 도 6FF는 벡터 3988 (H1 A-Darw-11-15 (K374E))의 모식도를 나타낸다. 도 6GG는 벡터 3985 (H1 A-Darw-11-15 (F390D))의 모식도를 나타낸다. 도 6HH는 벡터 3989 (H1 A-Darw-11-15 (L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6II는 벡터 3986 (H1 A-Darw-11-15 (F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6JJ는 벡터 3991 (H1 A-Darw-11-15 (N97D+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6KK는 벡터 3644 (H1 A-Mich-45-2015 (N380A))의 모식도를 나타낸다. 도 6LL은 벡터 3704 (H1 A-Mich-45-2015 (F390D+N380A))의 모식도를 나타낸다. 도 6MM은 벡터 4765 (A/Paris/1227/17 (F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6NN은 벡터 4766 (A/Paris/1227/17 (K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6OO는 벡터 4767 (A/Paris/1227/17 (N97D+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6PP는 벡터 4768 (A/Paris/1227/17 (N97D+K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6QQ는 벡터 4775 (A/Norway/2147/17 (F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6RR은 벡터 4776 (A/Norway/2147/17 (K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6SS는 벡터 4777 (A/Norway/2147/17 (N97D+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다. 도 6TT는 벡터 4778 (A/Norway/2147/17 (N97D+K374E+F390D+L429M))의 모식도를 나타낸다.
도 7A는 벡터 2295 (H5 A-Indo-5-05)의 모식도를 나타낸다. 도 7B는 벡터 3680 (H5 A-Indo-5-05 (F393D))의 모식도를 나타낸다. 도 7C는 벡터 3645 (H5 A-Egypt-N04915-14)의 모식도를 나타낸다. 도 7D는 벡터 3690 (H5 A-Egypt-N04915-14 (F392D))의 모식도를 나타낸다.
도 8은 벡터 1190 (CPMV 160-기반 발현 카세트로의 In-Fusion 클로닝을 위한 벡터)의 모식도를 나타낸다.
다음의 설명은 바람직한 구체예(preferred embodiment)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)", "가진(having)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)", 및 이들의 문법적 변형은 포괄적이거나 개방적이며, 추가적인, 나열되지 않은 요소 및/또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "근본적으로 ~로 이루어진"은 산물, 용도 또는 방법에 관하여 본원에서 사용될 때, 추가적인 요소 및/또는 방법 단계가 존재할 수 있지만, 이들 추가된 것들은 나열된 방법 또는 용도가 기능하는 방식에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 용어 "~로 이루어진"은 산물, 용도 또는 방법에 관하여 본원에서 사용될 때, 추가적인 요소 및/또는 방법 단계의 존재를 배제한다. 특정 요소 및/또는 단계를 포함하는 것으로 본원에 기재된 산물, 용도 또는 방법은 또한, 특정 구체예에서는, 근본적으로 상기 요소 및/또는 단계로 이루어질 수 있고, 다른 구체예에서는, 이들 구체예가 구체적으로 언급되는지에 관계없이 상기 요소 및/또는 단계로 이루어질 수 있다. 또한, 달리 언급되지 않는 한, 단수형의 사용은 복수형을 포함하고, "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적인 용어들은 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 주어진 값으로부터 대략 +/-10% 차이를 지칭한다. 이러한 차이는 구체적으로 언급되는지에 관계없이 본원에서 제공된 임의의 주어진 값에 항상 포함되는 것으로 이해된다. 단어 "하나(a)" 또는 "하나(an)"의 사용은 용어 "포함하는"에 관하여 본원에서 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와도 일치한다.
용어 "식물", "식물의 일부", "식물 일부", "식물성 물질", "식물 바이오매스(biomass)", "식물성 재료", "식물 추출물' 또는 "식물의 잎"은 본원에 사용된 바와 같이, 전체 식물, 조직, 세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이들은 본원에서 기재된 하나 또는 그 이상의 핵산 발현을 위한 전사, 번역, 및 번역 후 기작(post-translational machinery)을 제공할 수 있고, 및/또는 이들로부터 발현된 단백질 또는 VLP가 추출되고 정제될 수 있다. 식물은, 제한된 것은 아니지만, 초본 식물(herbaceous plants)을 포함할 수 있다. 또한, 제한된 것은 아니지만, 식물은 예를 들어, 카놀라, 브라시카 종(Brassica spp.), 옥수수, 니코티아나 종(Nicotiana spp.), (담배) 예를 들어, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana), 니코티아나 러스티카(Nicotiana rustica), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), 니코티아나 알라타(Nicotiana alata), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 알팔파(alfalfa), 감자, 고구마 (이포뫼아 바타투스(Ipomoea batatus)), 인삼, 완두콩, 귀리, 쌀, 대두, 밀, 보리, 해바라기, 목화, 옥수수, 호밀 (세칼레 세레알레(Secale cereale)), 수수 (소루굼 비콜로르(Sorghum bicolor), 소루굼 불가레(Sorghum vulgare)), 잇꽃 (카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius))을 포함한 농작물을 포함할 수 있다.
용어 "식물 일부"는, 본원에 사용된 바와 같이, 제한되는 것은 아니지만, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 과실, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 과실로부터 얻어진 식물 세포, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 과실로부터 얻어진 식물 추출물, 또는 이들의 조합을 포함한 식물의 임의의 부분을 말한다. 용어 "식물 추출물"은, 본원에 사용된 바와 같이, 식물, 식물의 일부, 식물 세포, 또는 이들의 조합을, 물리적으로 (예를 들어, 냉동 후 적합한 완충액에서 추출하여), 기계적으로 (예를 들어, 식물 또는 식물의 일부를 갈거나 균질화한 후 적합한 완충액에서 추출하여), 효소적으로 (예를 들어, 세포벽 분해 효소를 사용하여), 화학적으로 (예를 들어, 하나 이상의 킬레이터 또는 완충액을 사용하여), 또는 이들의 조합으로 처리한 후 얻어지는 식물-유래 산물(product)를 말한다. 식물 추출물은 원치 않는 식물 구성요소, 예를 들어 세포벽 잔해(debris)를 제거하기 위하여 추가적으로 가공될 수 있다. 식물 추출물은 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포의 하나 이상의 구성요소, 예를 들어, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포의 단백질(단백질 복합체, 단백질 상부구조(surprastructures) 및/또는 VLPs 포함), 핵산, 지질, 탄수화물, 또는 이들 조합의 회수를 돕기 위해 얻어질 수 있다. 식물 추출물이 단백질을 포함하며, 그것은 단백질 추출물이라고 불릴 수도 있다. 단백질 추출물은 식물 조직으로부터 하나 또는 그 이상의 단백질, 단백질 복합체, 단백질 상부구조(surprastructures) 및/또는 VLPs를 포함하는 정제되지 않은 식물 추출물, 부분적으로 정제된 식물 또는 단백질 추출물, 또는 정제된 산물일 수 있다. 원하는 경우, 단백질 추출물 또는 식물 추출물은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 부분적으로 정제 될 수 있으며, 예를 들어, 추출물은 염 또는 pH 침전, 원심분리, 구배 밀도 원심분리, 여과, 크로마토그래피, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 이들의 조합이 실시될 수 있다. 단백질 추출물은 또한 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
용어 "구조물(construct)", "벡터" 또는 "발현 벡터"는, 본원에 사용된 바와 같이, 외인성 핵산 서열을 숙주 세포(예를 들어, 식물 세포)로 전달하고 숙주 세포에서 외인성 핵산 서열의 발현을 지시하기 위한 재조합 핵산을 말한다. "발현 카세트"는 적합한 프로모터 또는 숙주 세포에서 관심 있는 핵산 서열의 전사를 위한 조절 요소들의 통제 하에 있고, 이들에 작동가능하게(operably or operatively) 연결된 관심 있는 핵산을 포함하는 핵산 서열을 말한다. 당업자가 알 수 있듯이, 발현 카세트는 식물 숙주에서 활성화인 임의의 서열인 종결(터미네이터) 서열을 구성할 수 있다. 예를 들어, 종결 서열은 이분절(bipartite) RNA 바이러스, 예를 들어, 코모바이러스(comovirus)의 RNA-2 게놈 분절(segment)로부터 유래된 것 일 수 있거나, 종결 서열은 NOS 터미네이터일 수 있으며, 또는 터미네이터 서열은 알팔파(alfalfa) 플라시토시아닌(plastocyanin) 유전자의 3'UTR로부터 얻어질 수 있다.
본 명세서의 구조물(construct)은 추가로 3' 비번역 영역(UTR)을 구성할 수 있다. 3' 비번역 영역은 폴리아데닐레이션 신호 및 mRNA 가공(processing) 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 임의의 다른 조절 신호를 포함한다. 상기 폴리아데닐레이션 신호는 일반적으로 mRNA 전구체의 3' 말단 에폴리아데닐릭산 트랙(tracks)의 추가에 영향을 주는 것을 특징으로 한다. 일반적으로, 폴리아데닐화 신호는 전형적인 형태의 5'-AATAAA-3'에 대한 상동성의 존재에 의해 인식되지만, 변이가 흔하지 않은 것은 아니다. 적합한 3' 영역의 비제한적 예들은 아그로박테리음 종양 유도성(Ti) 플라즈미드 유전자, 예컨대 노팔린 신타아제(nopaline synthase)(Nos 유전자) 및 식물 유전자, 예컨대, 콩 저장 단백질 유전자, 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제 유전자의 소단위체(small subunit)(ssRUBISCO; US 4,962,028; 본원에 참조로 포함), 플라스토시아닌 발현 조절에 사용되는 프로모터의 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3' 전사된 비번역 영역이다.
"조절 영역" "조절 요소" 또는 "프로모터"는 DNA 또는 RNA, 또는 DNA 및 RNA 둘 다로 구성될 수 있으며, 전형적으로 유전자의 단백질 암호화 영역의 상류에 있는 핵산의 일부를 의미하지만, 항상 그런 것은 아니다. 조절 영역이 활성 상태이고, 관심 있는 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연관되거나, 또는 작동 가능하게 연결된 때, 이것은 관심있는 뉴클레오티드 서열의 발현을 초래할 수 있다. 조절 요소는 기관(장기) 특이성을 매개하거나, 또는 발달적 또는 시간적 유전자 활성화를 제어할 수 있다. "조절 영역"은 프로모터 요소, 기본 프로모터 활성을 나타내는 핵심 프로모터 요소, 외부 자극에 반응하여 유도할 수 있는 요소, 음성적 조절 요소 같은 프로모터 활성을 매개하는 요소 또는 전사 증강자(enhancer)를 포함한다. "조절 영역"은 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 전사 이후 활성화 요소, 예를 들어, 유전자 발현을 조절하는 조절 요소, 예컨대 번역 및 전사 증강자(enhancer), 번역 및 전사 억제 물질, 업스트립 활성화 서열, 및 mRNA 불안정성 결정요인을 포함한다. 이들 후자의 요소들 중 일부는 암호화 영역 가까이에 위치할 수 있다.
본 명세서의 맥락에서, 용어 "조절 요소" 또는 "조절 영역"은 일반적으로, 항상 그런 것은 아니지만, 보통 구조 유전자의 암호화 서열에 대한 업스트림(5') DNA 서열을 말하며, 이는 RNA 폴리머레이즈 및/또는 특정 위치에서 전사가 시작하기 위해 필요한 다른 요소들에 대한 인식을 제공하여 암호 영역의 발현을 조절한다. 그러나, 이것은 인트론에 또는 서열의 3' 위치한 다른 뉴클레오티드 서열 또한 관심 있는 암호화 영역의 발현 조절에 기여할 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 특정 부위에서 개시를 보장하기 위한 RNA 폴리머라아제 또는 다른 전사 인자에 대한 인식을 제공하는 조절 요소의 예는 프로모터 요소이다. 전부는 아니지만, 대부분의 진핵생물 프로모터 요소는 일반적으로 전사 시작 부위의 약 25개의 염기쌍 업스트림에 위치한 아데노신 및 티미닌 뉴클레오티드 염기쌍으로 구성된 보존된 핵산 서열인 TATA 박스를 포함한다. 프로모터 요소는 전사 개시를 담당하는 기본 프로모터 요소뿐만 아니라 유전자 발현을 변형시키는 다른 조절 요소를 포함할 수 있다.
발달 조절성, 유도성 또는 구성적 조절 영역을 포함하여, 여러 형태의 조절 영역들이 존재한다. 발달적으로 조절되거나, 제어 하에서 유전자의 차등적 발현을 제어하는 조절 영역은 특정 기관 또는 조직의 발달 중의 특정 시간에 상기 기관 또는 기관의 조직 내에서 활성화 된다. 그러나, 발달적으로 조절되는 일부 조절 영역은 특정 발달 단계에서 특정 기관 또는 조직 내에서 우선적으로 활성화 될 수 있으며, 또한 발달 조절 방식으로 활성화되거나, 식물 내의 다른 기관 또는 조직에서도 기저 수준에서 활성화 될 수 있다. 조직-특이적 조절 영역, 예를 들어 종자-특이적 (see-specific) 조절 영역의 예는 나핀(napin) 프로모터 및 크루시페린(cruciferin) 프로모터를 포함한다 (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). 잎-특이적 프로모터의 예는 플라스토시아닌(platocyanin) 프로모터를 포함한다 (본원에 참고로 포함된 US 7,125,978 참조).
유도성 조절 영역은 유도물질(inducer)에 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접 또는 간접적으로 활성화할 수 있는 영역이다. 유도물질이 없으면 DNA 서열 또는 유전자가 전사되지 않을 것이다. 전형적으로 전사를 활성화하기 위해 유도성 조절 영역에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 비활성 형태로 존재할 수 있으며, 이는 유도물질에 의해 직접 또는 간접적으로 활성 형태로 전환된다. 그러나 단백질 인자가 없을 수도 있다. 유도물질은 단백질, 대사물질, 성장 조절제, 제초제 또는 페놀 화합물과 같은 화학적 작용제 또는 열, 냉기, 염분 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 또는 바이러스 같은 병원체 또는 병인(disease agent) 작용을 통해 간접적으로 가해지는 생리적 스트레스일 수 있다. 유도성 조절 영역을 포함하는 식물 세포는 분무, 물주기, 가열 또는 유사한 방법과 같이, 세포 또는 식물에 외부적으로 유도물질을 적용함으로써 유도물질에 노출 될 수 있다. 유도성 조절 요소는 식물 또는 비식물 유전자에서 유래될 수 있다 (예 : Gatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). 잠재적인 유도성 프로모터의 예는, 이에 제한된 것은 아니나, 테트라사이클린-유도성 프로모터 (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108), 스테로이드 유도성 프로모터 (Aoyama, T. and Chua, N.H., 1997, Plant J. 2, 397-404) 및 에탄올-유도성 프로모터 (Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180) 사이토키닌 유도성 IB6 및 CKI1 유전자 (Brandstatter, I. and Kieber, J.J., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985) 및 옥신 유도성 요소, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971)가 있다.
구성적 조절 영역은 식물의 다양한 부분에 걸쳐 그리고 식물 발달 내내 지속적으로 유전자의 발현을 지시한다. 공지의 구성적 조절 요소의 예에는 CaMV 35S 전사체와 관련된 프로모터가 포함된다. (p35S; Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812; 이는 본원에 참고로 포함됨), 쌀 액틴 1 (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), 액틴 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121) 또는 tms 2 (US 5,428,147) 및 트라이오세포스페이트 아이소머라아제 1(triosephosphate isomerase 1) (Xu et al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467) 유전자, 옥수수 유비퀴틴 1 유전자 (Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), 아리비돕시스 유비퀴틴 1 및 6 유전자 (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), 담배 번역 개시 인자 4A 유전자 (Mandel et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004), Cassava Vein Mosaic 바이러스 프로모터, pCAS (Verdaguer et al., 1996); 리불로스 바이포스페이트 카르복실라제의 작은 서브 유닛의 프로모터, pRbcS : (Outchkourov et al., 2003), pUbi (단자엽 및 쌍자엽 용).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "구성적"은 구성적 조절 영역의 통제 하에서 뉴클레오티드 서열이 모든 세포 형태에서 동일한 수준으로 발현되지만, 비록 풍부함에서의 차이가 종종 관찰되더라도, 서열이 광범위한 세포 유형에서 발현된다는 것을 반드시 나타내는 것은 아니다.
발현 구조물(construct)은 상기 기재된 바와 같이 벡터에 존재할 수 있다. 벡터는 유기체 또는 숙주의 게놈으로의 발현 카세트의 전달 및 통합을 허용하는 경계 서열을 포함할 수 있다. 구조물(construct)은 식물 바이너리(binary) 벡터, 예를 들어, pPZP 기반의 바이너리(binary) 형질 전환 벡터 일 수 있다 (Hajdukiewicz, et al. 1994). 다른 예시의 구조물(construct)은 pBin19를 포함한다 (Frisch, D.A., L.W. Harris-Haller, et al. 1995, Plant Molecular Biology 27: 405-409 참조).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "천연의", "천연의 단백질" 또는 "천연의 도메인"은, 야생형과 동일한 1차 아미노산 서열을 가진 단백질 또는 도메인을 말한다. 천연의 단백질 또는 도메인은 야생형 서열에 대해 100% 서열 유사성을 가진 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 천연의 아미노산 서열은 또한 인간 코돈 (hCod) 최적화된 뉴클레오티드 서열 또는 야생형 뉴클레오티드 서열과 비교하여 증가된 GC 함량을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있으며, 단 hCod-뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 고유의 아미노산 서열과 100% 서열 동일성을 나타낸다.
"인간 코돈 최적화된" 또는 "hCod" 뉴클레오티드 서열인 뉴클레오티드 서열은 인간 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드 서열 내에서 일반적으로 발견되는 코돈 사용에 접근하는 올리고뉴클레오티드 서열 또는 그것의 단편의 합성을 위한 적절한 DNA 뉴클레오티드의 선택을 의미한다. "증가된 GC 함량"은 상응하는 천연의(native) 올리고뉴클레오티드 서열과 비교하여 올리고뉴클레오티드 서열의 암호화 부분의 길이보다, 예를 들어, 약 1 내지 약 30% 또는 그 사이의 임의의 양의 GC 함량의 증가를 포함하는 코돈 사용에 접근하기 위해 올리고뉴클레오티드 서열 또는 그것의 단편의 합성을 위한 적절한 DNA 뉴클레오타이들의 선택을 의미한다. 예를 들어, 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18. 20, 22, 24, 26, 28, 30% 또는 올리고뉴클레오티드 서열의 암호화 부분의 길이에 걸친 사이의 임의의 양. 하기 기재된 바와 같이, 인간 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열, 또는 증가된 GC 함량(야생형 뉴클레오티드 서열과 비교하여)을 포함하는 뉴클레오티드 서열은 비-인간 최적화된 (또는 더 적은 GC 함량) 뉴클레오티드 서열의 발현과 비교하여 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포 내에서 증가된 발현을 나타낸다.
변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 단백질 (변형된 HA 단백질, 변형된 인플루엔자 HA 단백질, 변형된 HA, 변형된 인플루엔자 HA, 돌연변이 HA, 인플루엔자 돌연변이 HA, 인플루엔자 HA 변이 또는 HA 변이로도 불림) 및 변형된 인플루엔자 HA의 식물에서의 생산 방법은 본 명세서에 기재되어 있다. 본 명세서에 개시된 변형된 인플루엔자 HA 단백질은 야생형 HA 또는 변형되지 않은 HA 단백질과 비교하여 개선된 HA 특성을 초래하는 것으로 밝혀진 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 변형된 인플루엔자 HA 단백질은 상응하는 야생형 아미노산 서열과 비교할 때 아미노산의 적어도 하나의 치환을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
변형된 HA 단백질의 개선된 특성의 예는 변형(들) 또는 돌연변이(들)를 포함하지 않는 인플루엔자의 동일한 균주 또는 아형의 야생형 또는 비변형 HA에 비해 식물 세포에서 발현될 때 증가된 HA 단백질 수율; 야생형 또는 비변형 HA 단백질과 비교할 때 변형된 HA 단백질의 개선된 혈구 응집 역가; 변형(들) 또는 돌연변이(들)를 포함하지 않는 야생형 HA를 포함하는 VLPs의 무결성(integrity), 안정성 또는 둘 모두에 비해 변형된 HA 단백질을 포함한 바이러스 유사 입자 (VLPs)의 향상된 무결성(integrity), 안정성 또는 무결성(integrity) 및 안정성 두 개 모두: 변형(들) 또는 돌연변이(들)을 포함하지 않은 VLP 생산의 야생형 수준에 비해 식물 세포에서 발현될 때 증가된 VLP 수율; 및 이들의 조합을 포함한다.
인플루엔자 아형 및 균주
본원에 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스 아형"은 헤마글루티닌 (H 또는 HA) 및 뉴라미다제 (N) 바이러스 표면 단백질의 다양한 조합을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 변이(variants)를 언급한다. 본 명세서에 따르면, 이러한 바이러스 아형으로부터의 인플루엔자 바이러스 아형 및 헤마글루티닌 (HA)은 예를 들어, "H1 아형의 HA", "H1 HA"또는 "H1 인플루엔자"와 같이 H 번호(number)로 언급될 수 있다." 용어 "아형"은 특히 각각의 아형 내의 모든 개별 "균주"를 포함하며, 이는 일반적으로 돌연변이로부터 발생하고 상이한 병원성 프로파일을 나타낼 수 있다. 이러한 균주는 또한 바이러스 아형의 다양한 "단리물(isolates)"로 언급될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "균주"및 "단리물(isolates)"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
전통적으로, 인플루엔자의 다른 균주들은 예를 들어 적혈구 (RBC 또는 에리쓰로사이트(erythrocytes))를 응집시키는 인플루엔자의 능력에 따라 분류 되었다. 특정 인플루엔자 균주에 특이적인 항체가 바이러스에 결합하여 이러한 응집을 방지할 수 있다. 이러한 억제에 기초한 균주 유형을 결정하는 분석은 일반적으로 혈구 응집 억제 분석 (HI 분석 또는 HAI 분석)으로 알려져 있으며 인플루엔자 균주를 특성화하는 표준 및 당업계에 잘 알려진 방법이다.
그러나, 상이한 바이러스 균주로부터의 HA 단백질은 또한 핵산 및 아미노산 수준 모두에서 상당한 서열 유사성을 나타낸다. 이 유사성 수준은 다른 아형의 균주를 비교할 때 달라지며, 일부 균주는 다른 균주보다 더 높은 수준의 유사성을 명확하게 나타낸다 (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 7643). 아미노산 유사성의 수준은 한 아형의 바이러스 균주와 다른 아형의 바이러스 균주 사이에 다르다 (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 7643). 이 변이는 별개의 아형과 상이한 균주의 진화적 계통을 확립하기에 충분하지만, 상이한 균주의 DNA 및 아미노산 서열은 여전히 전통적인 생물 정보학 기술을 사용하여 쉽게 정렬된다 (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 7643; Suzuki and Nei, Mol. Biol. Evol. 2002, 19: 501).
헤마글루티닌 (HA)의 다수의 뉴클레오티드 서열, 또는 상응하는 폴리펩타이드 서열은 아형의 "합의(consensus)" 또는 "합의 서열"을 결정하기 위해 정렬될 수 있다 (도 1 참조).
서열 유사성에 기초하여, 인플루엔자 바이러스 아형은 그들의 계통발생 그룹을 참조하여 추가로 분류될 수 있다. 계통발생학적 분석 (Fouchier et al., J Virol. 2005 Mar;79 (5):2814-22)은 두 개의 주요 그룹에 속하는 HA의 세분화를 입증했다 (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78 : 7643): 그 중에서도 계통 발생 그룹 1의 H1, H2, H5 및 H9 아형 및 그 중에서도 계통 발생 그룹 2의 H3, H4 및 H7 아형.
새로운 인플루엔자 HA 단백질, HA 변형, HA 단백질 변이 및 돌연변이는 HA 단백질의 아미노산 서열에 변화를 도입함으로써 생성되며, 이는 전술한 바와 같이 HA의 개선된 특성을 야기한다. 이러한 HA 분자를 암호화하는 핵산의 분리는 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 아미노산 서열에 변화를 도입하기 위한 핵산의 변형과 같이 통상적이다.
변형된 인플루엔자 HA 단백질 및 식물에서 변형된 인플루엔자 HA 단백질을 생산하는 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 예를 들어 HA 단백질의 특정 아미노산 치환에 의한 변형, 예컨대, 아형 H1으로부터 HA가 야생형 HA 단백질 또는 변형되지 않은 HA 단백질과 비교할 때 변형된 HA 단백질의 개선된 특성을 야기하는 것으로 관찰되었다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 HA 단백질의 하나 이상의 변형, 돌연변이 또는 치환은 HA 단백질의 공지된 에피토프 영역에 위치하지 않으며, 이러한 변형, 돌연변이 또는 치환이 HA 단백질 내의 글리코실화 부위를 추가 또는 제거하지도 않는다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 HA 단백질, 돌연변이 HA 단백질 또는 변형된 HA 단백질은 변형되고 A/Michigan/45/15 HA (서열번호: 134; 도 1 참조) 또는 A/California/07/09 HA (서열번호: 130; 도 1 참조)의 97, 374, 380, 390 또는 429 번 위치의 아미노산에 상응하는 임의의 하나 이상의 아미노산에서 그의 아미노산 서열에 하나 이상의 돌연변이, 변형 또는 치환을 포함한다.
"아미노산에 상응함(correspond to)" 또는 "아미노산에 상응함(corresonding)"이란, 하기에 기술된 바와 같이 아미노산이 인플루엔자 표준 균주(reference strain)와 서열 정렬된 아미노산에 상응함을 의미한다.
HA의 아미노산 잔기의 수 또는 잔기 위치는 인플루엔자 표준 균주의 HA 번호 매기기(numbering)에 따른다. 예를 들어 인플루엔자 H1의 경우 표준 균주는 A/Michigan/45/15 HA (서열 번호: 134; 도 1 참조) 또는 A/California/07/09 HA (서열 번호: 130; 도 1 참조) 일 수 있다. 상응하는 아미노산 위치는 HA의 서열 (예컨대, H1 HA)을 각각의 표준 균주의 HA 서열과 정렬함으로써 결정될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국부(local) 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 검색을 위한 방법, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 구현 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 수동 정렬 및 시각적 검사 (예컨대, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement) 참조)에 의해서 수행할 수 있다. 제한된 것으로 간주되지는 않으나, 여러 인플루엔자 A HA 도메인의 아미노산 서열 정렬이 도 1에 나타낸다.
변형, 돌연변이 또는 변이를 언급할 때, 야생형 아미노산 잔기 (간단히 '아미노산'이라고도 함) 뒤에는 잔기 번호와 신규 또는 치환된 아미노산이 이어서 온다. 예를 들어, 97 위치의 잔기 또는 아미노산에서 아스파라긴 (N, Asn)에 대한 아스파르트 산 (D, Asp)의 치환은 N97D로 표시된다 (표 1 참조).
변형된 HA, HA 돌연변이 또는 변이, 예를 들어 변형된 H1 HA는 야생형 잔기에 대한 단일 문자 아미노산 코드 다음에 그 위치 및 대체 잔기의 단일 문자 아미노산 코드를 사용하여 동일한 방식으로 지정된다. 다중 돌연변이는 슬래시 (/) 또는 더하기 (+)로 구분된 구성요소 단일 돌연변이들로 표시된다. 따라서, 예컨대 H1 HA 돌연변이 N380A/L429M은 잔기 380 위치에서 Alanine (A, Ala)이 Asparagine (N, Asp)을 대체하고 잔기 429 위치에서 Methionine (M, Met)이 Leucine (L, Leu)을 대체하는 이중 치환 돌연변이이며, H1 HA 돌연변이 단백질 N380A/F390D는 380 위치에서 알라닌 (A, Ala)이 아스파라긴 (N, Asn)을 대체하고 H1 HA 단백질의 위치에서 아스파르트 산 (D, Asp)이 페닐알라닌 (F, Phe)을 대체하는 이중 치환된 변이이다.
HA의 변형 위치 및 인플루엔자 H1 및 H5의 표준 균주에서 상응하는 아미노산/잔기 위치. 예시된 변형은 괄호 안에 나타낸다.
HA의 변형 위치
(예시) 		H1 HA 1 H5 HA 2

97 (N97D) D97 D97
374 (K374E) E374 G377
382 (N382A) N380 N383
390 (F390D) F390 F393
429 (L429M) L429 M432
1A/Michigan/45/15 or A/California/07/092A/Indonesia /05/05
변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 단백질은 상응하는 야생형 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
"아미노산 치환" 또는 "치환"은 단백질의 아미노산 서열에 있는 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 용어 아미노산, 아미노산 잔기 또는 잔기는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 하나 이상의 아미노산은 단백질의 아미노산 서열의 전체 길이를 변경 없이, 이 위치에서 원래(original) 또는 야생형 아미노산과 다른 하나 이상의 아미노산으로 대체될 수 있다. 치환 또는 대체는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 코돈 서열을 원래 또는 야생형 아미노산과 비교하여 다른 아미노산의 코돈 서열로 변경함으로써 실험적으로 유도될 수 있다. 결과로 생성된 단백질은 변형된 단백질, 예컨대 변형된 인플루엔자 HA 단백질이다. 변형된 인플루엔자 HA 단백질은 자연적으로 발생하지 않는다.
변형된 HA는 자연적으로 발생하는 HA에 대한 적어도 하나의 변형을 갖고 변형된 HA의 아미노산 서열로부터 유래된 자연적으로 발생된 HA 단백질에 비해 개선된 특성을 갖는 비-자연적으로 발생한 HA 단백질을 포함한다. 변형된 HA 단백질은 하나 이상의 상이한 아미노산을 갖는 HA 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기의 대체에 의해 유도되는, 자연에서 발견되지 않는, 아미노산 서열을 갖는다.
따라서, 변형된 HA, 돌연변이 HA 또는 재조합 HA는 자연적으로 발생한 HA를 암호화하는 DNA 서열이 HA 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 변형, 돌연변이 또는 치환을 암호화하는 변형된 또는 돌연변이 DNA 서열을 생산하기 위해 변형되어진 HA를 의미한다.
변형, 돌연변이 또는 치환을 위해 확인된 일부 잔기는 보존된 잔기와 일치하는 반면 다른 잔기는 그렇지 않다. 보존되지 않은 잔기의 경우, 하나 이상의 아미노산의 대체는 자연에서 발견된 것과 일치하지 않는 아미노산 서열을 갖는 변형된 HA를 생성하는 치환으로 제한된다. 보존된 잔기의 경우, 그러한 변형, 치환 또는 대체는 또한 자연적으로-발생한 HA 서열을 야기해서는 안 된다.
보존적 치환
본 명세서에 기재된 바와 같이, HA 단백질의 잔기는 변형된 HA 단백질 또는 HA 단백질 변이를 생성하기 위해 확인될 수 있고, 변형, 치환 또는 돌연변이 될 수 있다. 특정 위치에서의 치환 또는 돌연변이는 여기에 기술된 또는 실시예에서 제공된 아미노산 치환에 제한되지 않는다. 예를 들어, HA 변이는 기재된 아미노산 치환(describes amino acid substitutions)의 보존된 또는 보존적 치환을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "보존된 치환"또는 "보존적 치환" 및 이의 문법적 변이는 HA 단백질의 서열에서 다르지만, 기술한 치환 또는 기술한 잔기로서 아미노산의 동일한 계열(class)에 속하는 아미노산 잔기의 존재를 의미한다 (예컨대, 비극성 잔기를 대체하는 비극성 잔기, 방향족 잔기를 대체하는 방향족 잔기, 극성-비하전된 잔기를 대체하는 극성-비하전된 잔기, 하전된 잔기를 대체하는 하전된 잔기). 또한, 보존적 치환은 야생형 잔기를 대체하는 잔기와 동일한 부호 및 일반적으로 유사한 크기의 계면 소수성 값(interfacial hydropathy value)을 갖는 잔기를 포함 할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "비극성 잔기"는 글리신 (G, Gly), 알라닌 (A, Ala), 발린 (V, Val), 류신 (L, Leu), 이소류신 (I, Ile), 및 프롤린 (P, Pro)을 의미하고; 용어 "방향족 잔기"는 페닐알라닌 (F, Phe), 티로신 (Y, Tyr) 및 트립토판 (W, Trp)을 의미하고; 용어 "극성 비하전 잔기"는 세린 (S, Ser), 트레오닌 (T, Thr), 시스테인 (C, Cys), 메티오닌 (M, Met), 아스파라긴 (N, Asn) 및 글루타민 (Q, Gln)을 의미하고; 용어 "하전된 잔기"는 음으로 하전된 아미노산 아스파르트 산 (D, Asp) 및 글루탐산 (E, Glu) 뿐만 아니라, 양으로 하전된 아미노산 리신 (K, Lys), 아르기닌 (R, Arg) 및 히스티딘 (H, His)을 의미한다. 아미노산의 다른 분류는 다음 같다:
■소수성 측쇄를 갖는 아미노산 (지방족): 알라닌 (A, Ala), 이소류신 (I, Ile), 류신 (L, Leu), 메티오닌 (M, Met) 및 발린 (V, Val);
■소수성 측쇄를 갖는 아미노산 (방향족): 페닐알라닌 (F, Phe), 트립토판 (W, Trp), 티로신 (Y, Tyr);
■극성 중성 측쇄를 갖는 아미노산: 아스파라긴 (N, Asn), 시스테인 (C, Cys), 글루타민 (Q, Gln), 세린 (S, Ser) 및 트레오닌 (T, Thr);
■전기적으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 (산): 아스파르트 산 (D, Asp), 글루타민산 (E, Glu);
■전기적으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 (염기): 아르기닌 (R, Arg); 히스티딘 (H, His); 라이신 (K, Lys), 글리신 G, Gly) 및 프롤린 (P, Pro).
보존적 아미노산 치환은 결과로 생성된 HA 단백질 변이 또는 변형된 HA 단백질의 활성에 대해 원래의 치환 또는 변형과 유사한 효과를 가질 가능성이 있다. 보존적 치환에 대한 추가 정보는, 예를 들어, Ben Bassat et al. (J. Bacteriol, 169:751-757, 1987), O'Regan et al. (Gene, 77:237-251, 1989), Sahin-Toth et al. (Protein ScL, 3:240-247, 1994), Hochuli et al (Bio/Technology, 6:1321-1325, 1988) 및 널리 사용되는 유전학 및 분자 생물학 교과서에서 찾을 수 있다.
Blosum 매트릭스는 폴리펩타이드 서열의 관련성을 결정하기 위해 일반적으로 사용된다. Blosum 매트릭스는 신뢰할 수 있는 정렬의 대규모 데이터베이스 (BLOCKS 데이터베이스)를 사용하여 생성되었으며, 여기서 일부 임계값 백분율 이하의 동일성과 관련된 쌍서열정렬(pairwise sequence alignments)이 계산되었다 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992). 90% 동일성 임계값은 BLOSUM90 매트릭스의 고도로 보존 된 표적 빈도에 사용되었다. 65% 동일성 임계값은 BLOSUM65 매트릭스에 사용되었다. Blosum 매트릭스에서 0 이상의 점수는 선택한 백분율 동일성에서 "보존적 치환"으로 간주된다. 다음 표는 보존적 아미노산 치환의 예를 나타낸다 : 표 2.대표적인 보존적 아미노산 치환
Figure pct00001
변형된 HA 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 코돈 사용빈도(codon usage), 증가된 GC 함량, 또는 이들의 조합에 최적화 될 수 있다. 변형된 HA 단백질은 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다.
H1 HA 변형
변형된 인플루엔자 H1 HA 단백질 및 식물에서 변형된 인플루엔자 H1 HA 단백질을 생산하는 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 아형 H1의 HA 단백질에서 특정 아미노산의 변형은 야생형 H1 HA 단백질 또는 변형되지 않은 H1 HA 단백질과 비교할 때 변형된 H1 HA 단백질의 개선된 특성을 이끌어 내는 것으로 관찰되었다.
H1 HA 단백질의 특성을 개선하기 위하여 총 42개의 단일, 이중 및/또는 삼중 변형을 테스트하였다. 본 명세서에서 기술되고 실시예에 나타낸 바와 같이, 특정 위치에서의 변형 또는 변형의 조합만이 H1 HA 단백질의 특성을 개선 시켰다. 32 위치 또는 위치 조합에서의 변형은 H1 HA 단백질의 특성에 부정적인 영향을 미쳤다 (데이터는 제공하지 않음).
H1 HA 돌연변이 단백질의 개선된 특성의 예는 변형(들) 또는 돌연변이(들)를 포함하지 않는 인플루엔자의 동일한 균주 또는 아형의 야생형 또는 비변형 H1 HA에 비해 식물 세포에서 발현될 때 증가된 HA 단백질 수율 또는 축적; 야생형 또는 비변형 H1 HA 단백질과 비교할 때 변형 또는 돌연변이 HA 단백질의 개선된 혈구응집 역가; 돌연변이(들)를 포함하지 않는 야생형 HA를 포함하는 VLP의 개선된 무결성, 안정성, 또는 무결성 및 안정성 둘 모두에 비해 변형된 H1 HA 단백질을 포함한 VLP의 개선된 무결성, 안정성, 또는 무결성 및 안정성 둘 모두; 변형(들) 또는 돌연변이(들)를 포함하지 않는 야생형 VLP 생산 수준에 비해 식물에서 발현될 때 증가된 VLP 수율; 및 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에 기재된 변형된 H1 HA 단백질 또는 돌연변이 H1 HA 단백질은 변형되고, A/California/07/09 HA (서열번호: 130; 도 1 참조)의 97, 374, 380, 390 및/또는 429 위치와 서열 정렬된 임의의 하나 이상의 잔기에서 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함한다. 따라서, 아미노산 위치 97, 374, 380, 390 및/또는 429 중 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형 또는 돌연변이를 포함하는 예를 들어 바이러스 유사 입자 (VLP) 같은 인플루엔자 H1 HA 폴리펩티드, 단백질 및/또는 단백질 복합체가 제공되며, 이러한 아미노산 번호는 도 1 (서열 번호 130)에 나타낸 H1 A/California/07/09 HA의 서열에 기초하거나, 예를 들어 이러한 아미노산 위치에 해당하는 아미노산 위치에서, 예컨대, 서열번호: 130에 대한 H1 HA 아미노산 서열 정렬에 의해 결정된다. 이러한 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 인플루엔자 H1 HA 아미노산 서열의 비-제한적인 예는 서열번호: 131, 132, 133, 134, 135, 138 및 139를 포함한다.
본 명세서에 기재된 변형된 H1 HA 단백질은 H1 (서열 번호: 130, 131, 132, 133, 134, 135, 138 또는 139)의 HA를 암호화하는 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양의 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 H1 HA 단백질을 포함한다. 상기 아미노산 서열은 A/California/07/09 HA (서열번호: 130; 도 1 참조)의 97, 374, 380, 390 및/또는 429 위치와 서열 정렬된 임의의 하나 이상의 잔기에서 하나 또는 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 가지며 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
또한, H1 HA 단백질은 H1 (서열 번호: 130, 131, 132, 133, 134, 135, 138 또는 139)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양의 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 될 수 있으며, 상기 H1 HA 단백질은 A/California/07/09 HA의 97, 374, 380, 390 및 429 위치와 서열 정렬된 임의의 하나 이상의 잔기에서 하나 또는 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 가지며 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
H1 HA가 유래될 수 있는 균주의 비-제한적인 예로는 A/California/07/09 (H1N1, 서열번호: 130), A/Michigan/45/15 (H1N1, 서열번호: 134), A/Massachusetts/06/17 (H1N1, 서열번호: 135), A/Costa Rica/0513/16 (H1N1, 서열번호: 133), A/Honduras/17734/16 (H1N1, 서열번호: 131), A/Darwin/11/15 (H1N1, 서열번호: 132), A/Paris/1227/2017 (서열번호: 138) 또는 A/Norway/2147/2017 (서열번호: 139)이 있다.
변형된 또는 돌연변이 H1 HA는 97, 374, 380, 390 또는 429 위치에 있는 잔기에서 단일(mono)-치환, 이중(di)-치환, 삼중(tri)-치환, 또는 사중(quadruple)-치환될 수 있다. 단일-치환된 H1 HA에서, 하나의 잔기가 97, 374, 380, 390 또는 429 위치에서 돌연변이 될 수 있다. 이중-치환된 H1 HA에서, 두 개의 잔기가 치환될 수 있으며, 예컨대, 380 및 429 위치, 97 및 374 위치, 또는 390 및 429 위치에서 잔기들이 치환될 수 있다. 삼중-치환된 H1 HA 돌연변이에서는, 세 개의 잔기가 치환될 수 있다. 예를 들어, 97, 390 및 429 위치의 잔기 또는 97, 374 및 429 위치의 잔기가 치환될 수 있다. 사중-치환된 H1 HA 돌연변이에서는 네 개의 잔기가 치환될 수 있다. 예를 들어, 97, 374, 390 및 429 위치의 잔기가 치환될 수 있다. (모든 H1 HA 번호 매기기(numbering)는 표준 균주 A/California/07/09 HA에 대한 서열 정렬에 따른다).
변형된 H1 HA 단백질의 비 제한적 예는 H1 HA 야생형 서열과 비교할 때 HA 서열의 다음 변형 또는 돌연변이를 포함한다 (번호매기기(numbering)는 A/California/07/09 HA에 따름) :
■단일-치환 H1 HA 돌연변이들: N97D, K374E, R390D 또는 L429M;
■이중-치환 H1 HA 돌연변이: N390A/L429M, N97D/K374E 또는 N380/L429M;
■삼중-치환 H1 HA 돌연변이: N97D/F390D/L429M 또는 K374E/F390D/L429M;
■사중-치환 H1 HA 돌연변이: N97D/K374E/F390D/L429M.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 돌연변이는 식물에서 인플루엔자 HA 단백질 생산 및 VLP 수율을 특이적으로 증가시킨다. 다른 위치의 돌연변이는 식물 세포에서 인플루엔자 HA 단백질 축적 또는 VLP 생산에 대해 유의하게 감소, 또는 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
단일-치환된 H1 HA
97 위치에서의 변형
본 발명의 한 측면에서, 변형된 H1 HA는 적어도 변형된 97 위치의 잔기를 가질 수 있다. 이 잔기는 HA의 수용체 결합에 관여하지 않으며, HA의 구형 머리(head)의 흔적 에스테라아제 (VE) 하위도메인(subdomain) 중 하나에 위치하는 것으로 밝혀졌다. Xray 결정학은 잔기가 HA 삼량체 내부에 묻혀 있음을 보여주었다. 따라서, 잔기는 항원 결합 부위의 일부가 아니며 항원 변화에 관여하지 않고, 광범위 중화 항체에 의해 인식되지 않는다.
인플루엔자 A (H1N1) pdm09에서, 이 잔기는 HA의 안정성에 관여하는 것으로 예측되었다 (Castelㅱn-Vega et al. 2014 참조). 그러나 Castelㅱn-Vega 등은 단일 점 돌연변이는 HA 안정성에 거의 영향을 미치지 않을 것 같다고 지적하고 Yang 등을 인용하였다. (인플루엔자 A (H1N1) pdm09 바이러스 혈구 응집소의 구조적 안정성, J. Virol. 2014;88(9): 4828-4838). Yang et al.은 재조합 HA 엑토 도메인의 크기 배제 크로마토 그래피 분석을 사용하여 모노머로 분리되는 2009년 초 유행성 H1N1 바이러스의 재조합 삼량체 HA 단백질과 삼량체로 발현할 수 있는 최신 바이러스 HA의 차이를 비교하였다. Yang et al.은 서열 차이를 조사한 4개의 다른 A(H1N1) pdm09 바이러스 균주와 비교하여 A/Texas/1/2011 (Tex 11)의 HA에서 고유한 Asp97Asn (D97N) 치환이 있음을 발견하였다. 그러나 그 이후로 진화한 인플루엔자 H1 HA 균주는 97 위치에 아스파라긴 (N, Asn)을 가지고 있고 (도 1, H1의 서열 정렬 참조), 이는 이 위치에 아스파라긴 (N, Asn)을 갖는 H1 HA 균주에 대한 진화적 이점을 제안한다. 따라서, 97 위치의 아스파라긴 (N, Asn)에서 비-아스파라긴으로의 변형이 본 명세서에 기재된, H1 HA 단백질의 개선된 특성을 야기한다는 것은 예상치 못한 일이었다.
도 3A, 3B, 4A 및 4B에 나타낸 바와 같이, 97 위치의 잔기를 갖는 H1 HA는, 예를 들어 이후 N97D로 지칭되는 아스파라긴 (N, Asn)에서 아스파르트산 (Asp; D)으로의 변경은 이 위치에 아스파라긴 (N, Asn)이 있는 H1 HA와 비교하여 혈구 응집 역가가 1200% 까지 증가한다 (표 5A 참조). 도 3A는 N97D 치환을 갖는 A/Michigan/45/15의 HA가 A/ Michigan/45/15 HA 야생형 (H1 Michigan으로도 지칭 됨)과 비교할 때 혈구 응집 역가에서 약 1100% 증가를 나타냄을 보여준다. N97D 치환을 갖는 A/Honduras/17734/16의 HA는 야생형 A/Honduras/17734/16 HA에 비해 혈구 응집 역가에서 약 375% 증가를 나타냈다 (도 4A 및 4B 참조). 뿐만 아니라, 도 4A 및 4B에 나타낸 바와 같이, N97D 치환을 갖는 A/Darwin/11/15의 HA는 야생형 A/Darwin/11/15 HA와 비교할 때 혈구 응집 역가에서 약 300 % 증가를 나타냈다.
따라서, 한 측면에서, H1 HA의 97 위치의 잔기 (A/California/07/09 HA 번호(numbering)에 따른 번호(numbering))는 비-천연으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생성하기 위하여, 97 위치의 하전된 아미노산을 97 위치의 극성 아미노산으로 대체하도록 변형될 수 있음이 제공된다. 예를 들어 H1 HA 단백질은 97 번 위치의 아스파르트산 (D, Asp) 또는 임의의 다른 극성 아미노산 (예 : 글루타민 (Q, Gln), 히스티딘 (H, His), 세린 (S, Ser), 트레오닌(T, Thr), 티로신 (Y, Tyr), 시스테인 (C, Cys) 또는 트립토판 (W, Trp))을 포함하도록 변형될 수 있다.
H1 HA는 97 위치의 아스파라긴 (N, Asn)을 97 위치의 비-아스파라긴으로 대체하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, HA 단백질은 아스파르트산 (D, Asp) 또는 97 위치에서 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환을 포함하여 돌연변이될 수 있다. 보존된 치환은 예컨대, 글루타민산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)일 수 있다. 또한, H1 HA는 비-아스파르트산 (D, Asp)을 아스파라긴산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환으로 대체하도록 변형될 수 있다. 아스파르트산의 보존된 치환은 예컨대, 글루타민산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 일 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 (서열 번호: 134)의 HA를 암호화하는 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 97 위치에 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌, 예컨대, 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)인 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환이며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 97 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 (서열 번호: 134)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖을 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 97 위치에 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌, 예컨대, 글루타민산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)인 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환이며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 97 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 97 위치에 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌, 예컨대, 글루타민산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)인 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않는다.
예를 들어, 변형된 H1 HA는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다; 상기에서 H1 HA의 적어도 97 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 변형된 H1 HA는 단일-치환, 이중-치환, 삼중-치환 또는 사중-치환된 H1 HA일 수 있으며, 상기 적어도 97 위치의 잔기는 변형된다. 비-제한적인 예에서, 변형된 H1 HA는 97 위치에서 치환된 잔기 및 374, 390, 429 위치에서 하나 이상의 치환 또는 이들의 조합을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않는다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 97 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 97 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 97 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 97 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 97 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
374 위치에서의 변형
본 발명의 한 측면에서, H1 HA의 374 (A/California/07/09 HA 번호 매기기(numbering)에 따른 번호(numbering)) 위치에 있는 잔기는 치환될 수 있다. 이 잔기는 H1의 HA 줄기 부분에 위치한다.
Cotter 등 (PLoS Pathog. 2014;10(1):e1003831)은 A/California/7/2009 HA의 줄기 영역에서 E47K (HA2 넘버링) 돌연변이가 삼량체 구조를 안정화하고, 막 융합을 위해 pH를 낮추고, 바이러스의 열 및 산 안정성을 증가시킨다는 것을 확인하였다. Cotter 논문에서의 H1N1의 HA2 줄기(stalk) 영역의 47 위치는 본 발명에서의 374 (A/California/7/2009 의 HA0 넘버링) 위치와 동일하다. Cotter 등은 또한 A/California/7/2009 E47K 돌연변이 HA가 야생형 대응물보다 흰담비에서 더 전염성이 있음을 관찰하였다. 유사한 결과가 2014년 Yang 등 (J. Virol. May 2014 vol. 88 no. 94828-4838)에 의해 얻어졌으며, Yang 등은 374 위치에서 Glutamic Acid를 Lysine으로 변경하여 이 위치에서 염기성 측면 변화를 도입하였고, 잠재적으로 인접한 사슬(chain)의 Glu21에 대한 단량체 계면을 가로질러 새로운 염 다리를 형성하여, 낮은 pH에서의 안정성을 향상시킴을 보였다. Yang 등은 374 위치에서의 라이신 존재가 돌연변이 Tex09 엑토 도메인 삼량체의 열과 산도 모두의 변화를 견디는 능력을 Wash11 recHA의 그것과 동등한 수준으로 향상시킨다는 것을 발견하였다.
그러나, 인플루엔자 H1 Michigan (A/Michigan/45/15 (H1N1))의 HA의 대체 (예를 들어 374 (K374E)위치에서 라이신(K, Lys)을 글루탐산 (E. Glu)으로)가 H1 HA 야생형을 발현하는 식물로부터의 추출물에 비해 혈구응집 역가를 약 1200% 증가한다는 것을 예기치 않게 발견하였다 (도 3A, 3B, 4A, 4B 및 표 5A 참조).
따라서, 한 측면에서 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여 H1 HA의 374 위치 (A/California/07/09 HA 번호 매기기(numbering) 따른 번호(numbering))잔기는 374 위치에서 비-글루탐산을 글루탐산(E, Glu)으로 대체하여 변형될 수 있다. H1 HA는 비-글루탐산을 글루탐산 (E, Glu), 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존된 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)으로 대체하여 변형될 수 있다.
또한, 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생성하기 위하여, 374 위치의 라이신 (K, Lys)은 374 위치의 비-라이신으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 374 위치의 라이신 (K, Lys)은 글루탐산 (E, Glu), 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존된 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)으로 대체할 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 Michigan (A/Michigan/45/15 (H1N1))의 HA를 암호화하는 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 374 위치에 글루탐산(E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)인 글루탐산(E, Glu)의 보존된 치환이며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 Michigan (A/Michigan/45/15, 서열 번호: 136)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖을 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 374 위치에 글루탐산(E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)인 글루탐산(E, Glu)의 보존된 치환을 갖는 헤마글루티닌 단백질을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 374 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 글루탐산(E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)인 글루탐산(E, Glu)의 보존된 치환을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
예를 들어, 변형된 H1 HA는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다; 상기에서 H1 HA의 적어도 374 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 변형된 H1 HA는 단일-치환, 이중-치환, 삼중-치환 또는 사중-치환된 H1 HA일 수 있으며, 상기 적어도 374 위치의 잔기는 변형된다. 비-제한적인 예에서, 변형된 H1 HA는 374 위치에서 치환된 잔기 및 97, 390, 429 위치에서 하나 이상의 치환 또는 이들의 조합을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않는다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 374 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
390 위치에서의 변형
본 발명의 한 측면에서, H1 HA의 390 (A/California/07/09 HA 번호 매기기(numbering)에 따른 번호(numbering)) 위치에 있는 잔기는 치환될 수 있다.
WO2013/177444 및 이의 동반 출판물 Lu 등(Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111(1): 125-30)은 대장균-기반 무세포(cell-free) 단백질 발현 시스템 및 간단한 재접힘(re-folding) 프로토콜을 사용하여 A/California/05/2009 (H1N1)의 적절하게 접힌 HA 줄기 도메인 생산방법을 보고하였다. HA 줄기 도메인의 삼량체화를 유도하기 위하여, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT) 또는 폴돈(foldon) 도메인을 HA의 C 말단에 융합시켰다. 발현된 HA 줄기 단백질의 응집을 유발하는 새롭게 노출된 소수성 및/또는 분자간 이온 쌍을 완화하기 위하여, 5개의 돌연변이 그룹을 평가하였다: M1 (I69T + I72E + I74T + C77T); M2 (I69T + I72E + I74T + C77T + F164D); M3 (I69T + I72E + I74T + C77T + F164D + L174D); M4 (F164D); 및 M5 (F164D + L174D). Lu는 돌연변이의 추출 수율(soluble yield)이 낮았고, 응집체(inclusion body)가 형성되었다고 보고하였다. Lu는 또한 돌연변이 M3 및 M5들이 다른 변이들의 야생형보다 훨씬 적은 응집체를 생산하여 돌연변이 M5 (F164D + L174D)를 추가로 개발했다고 보고하였다. Lu는 M5 (F164D + L174D) 돌연변이가 HA 줄기 단백질 용해도 개선을 위해서 가장 영향력 있는 돌연변이로 보인다고 관찰하였다. Lu의 164 위치는 본 발명에서의 390 위치와 동일하다. Lu의 M4(F164D) 돌연변이는 테스트된 다른 돌연변이에 비해 이점이 없었으며 실제로 돌연변이 M3 (I69T + I72E + I74T + C77T + F164D + L174D) 및 M5 (F164D + L174D)보다 열등하였다.
Lu의 M5 (F164D + L174D)의 164 위치의 페닐알라닌 및 174 위치의 류신에 해당하는 (H1 HA 넘버링) 390 위치의 페닐알라닌 (F, Phe) 및 400 위치의 류신 (L, Leu)이 본 발명의 H1 HA에서 변경되었을 때, VLP 수율의 증가는 관찰되지 않았고 H1 F390D + L400D 돌연변이는 혈구응집 활성의 완전한 손실을 보였다 (데이터는 제공하지 않음). 따라서, Lu의 M5 돌연변이에 대한 등가 돌연변이는 식물에서 발현된 H1 HA의 특성을 개선시키지 못하였다.
뜻밖에, H1 HA의 390 위치에 있는 소수성 아미노산이 하전된 아미노산으로 치환되었을 때, 야생형 구조물로 침투한 식물과 비교했을 때, 390 위치에서 치환된 H1 HA를 발현하는 식물에서 이오딕사놀(iodixanol) 구배 정제 후 VLP 수율이 약 60% 증가하는 것을 발견하였다 (도 3B, 4A, 4B, 표 5A, 5B 참조). 또한, 표 5C에 나타난 바와 같이, 전체 공정 수율이 226%로 증가하였다. 그러나, H5 (F393D)의 HA에서 등가 변형은 혈구응집 역가를 감소시켰다 (도 5, 표 6 참조).
따라서, 한 측면에서, 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여 H1 HA의 390 위치 (A/California/07/09 HA 번호(numbering) 따른 번호(numbering)) 잔기는 390 위치에서 소수성 아미노산을 390 위치에서 하전된 아미노산으로 대체하여 변형될 수 있다. 예를 들어, H1 HA 단백질은 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 아스파르트산의 보존적 치환은 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린(S, Ser)일 수 있다.
H1 HA는 390 위치에서 비-아스파르트산을 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환으로 대체하여 변형할 수 있다. 아스파르트산의 보존적 치환은 예를 들어, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린(S, Ser)일 수 있다. 또한(furthermore), H1 HA는 390 위치의 페닐알라닌 (F, Phe)을 390 위치에서 비-페닐알라닌으로 대체하여 변형할 수 있다. 예를 들어, HA 단백질은 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 아스파르트산의 보존적 치환은 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린(S, Ser)일 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 Michigan (A/Michigan/45/15, 서열 번호: 134)의 HA를 암호화하는 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 390 위치에 아스파르트산 (D, Asp) 또는 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)인 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환이며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 390 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 Michigan (A/Michigan/45/15, 서열 번호: 136)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖을 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 390 위치에 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 390 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
예를 들어, 변형된 H1 HA는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다; 상기에서 H1 HA의 적어도 390 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 변형된 H1 HA는 단일-치환, 이중-치환, 삼중-치환 또는 사중-치환된 H1 HA일 수 있으며, 상기 적어도 390 위치의 잔기는 변형된다. 비-제한적인 예에서, 변형된 H1 HA는 390 위치에서 치환된 잔기 및 97, 374, 380, 429 위치에서 하나 이상의 치환 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 390 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 390 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 390 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
429 위치에서의 변형
본 발명의 한 측면에서, H1 HA의 429 (H1 A/Michigan/45/15 (서열번호:134)에 따른 번호 매기기(numbering)) 위치에 있는 잔기는 변형될 수 있다.
Antanasijevic 등 (J Biol Chem. 2014; 289(32):22237-45)은 14 개의 다른 위치에서 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 H5 HA 줄기 루프(stem loop) 영역의 구조-기능 특성을 조사하였다. Antanasijevic은 HA1-D26K, HA1-M102L, HA2-V52A 및 HA2-I55A 돌연변이들(H3 번호 매기기 기준) HA의 발현 및/또는 바이러스 입자로의 조립이 감소되었음을 시사하는, 전체 HA의 수준이 현저히 감소된 수준을 나타낸다는 것을 관찰하였다. HA1-D26K, HA2-T49A 및 HA2-M102L 돌연변이들은 또한 야생형 바이러스에 비해 더 낮은 혈구 응집 역가를 나타냈다. Antanasijevic의 H5 HA의 102 위치는 본 발명의 H1 HA의 429 위치와 일치한다.
H1의 HA가 V19I (HA1-I28V), L20M (HA1-M31L), T368A (HA2-T41A), N380A (HA2-N53A) 또는 L429M (HA2-M102L)에서 변형을 도입하도록 변형되었을 때, T368A는 활성의 완전한 손실을 초래하고, V19I 및 L20M은 낮은 활성을 갖는 반면 N380A 및 L429M은 H1 A/California 야생형 HA보다 높은 활성을 나타냄을 발견하였다.
따라서, H5 HA의 발현 및/또는 조립 또는 혈구응집 역가에 중요한 것으로 Antanasijevic에 의해 확인된 잔기의 대부분은 H1 HA에서 유사한 중요성으로 해석되지 않는 것 같다.
그러나, 도 2A, 2B, 2C, 3B, 4A 및 4B에 나타낸 바와 같이, H1 HA의 429 잔기가 류신 (L, Leu)에서 메티오닌 (M, Met)으로 돌연변이 되었을 때, 변형된 H1 HA는 야생형 H1 HA와 비교하여 혈구 응집 역가 (100-160 %)의 증가를 나타냈다 (표 5A 참조). 또한, 도 2C에서 볼 수 있듯이, 429 위치에서 치환된 H1 HA를 발현하는 식물은 야생형 구조물을 침투 시킨 식물과 비교하여, 자당(sucrose) 구배 정제 후 VLP 수율이 약 30% 증가한 것을 보였다 (표 5B도 참조). 또한, 표 5C에서 볼 수 있듯이, 전체 공정 수율은 260% 증가하였다.
또한, 390 위치의 페닐알라닌이 아스파르트 산으로 변형되고 429 위치의 류신이 메티오닌으로 변형된 이중-치환된 H1 HA는 변형되지 않은 H1 HA와 비교하였을 때, 혈구응집 역가가 약 60% 증가하였다 (도 2B 참조).
따라서, 한 측면에서, H1 HA의 429 (H1 A/Michigan/45/15 아미노산에 따른 번호 매기기(numbering) (서열번호:134)) 위치에 있는 잔기는 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여, 429 위치의 류신 (L, Leu)이 류신이 아닌 다른 소수성 아미노산으로 대체하여 변형할 수 있다. 예를 들어, H1 HA 단백질은 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 429 위치에 류신 (I, Ile), 글루타민 (Q , Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 포함하도록 변형될 수 있다.
또한, H1 HA는 429 위치의 류신 (L, Leu)을 429 위치에서 비-류신으로 대체하여 변형할 수 있다. 예를 들어, HA 단백질은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환으로 돌연변이 될 수 있다. 메티오닌의 보존된 치환은 예를 들어 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)일 수 있다. 또한, H1 HA는 429 위치에서 비-메티오닌을 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환으로 대체하여 변형할 수 있다. 메티오닌의 보존된 치환은 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe) 일 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 Michigan (A/Michigan/45/15(H1N1), 서열 번호: 134)의 HA 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 가지며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 136)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 가질 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 429 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
예를 들어, 변형된 H1 HA는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다; 상기에서 H1 HA의 적어도 429 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 변형된 H1 HA는 단일-치환, 이중-치환, 삼중-치환 또는 사중-치환된 H1 HA일 수 있으며, 상기 적어도 429 위치의 잔기는 변형된다. 비-제한적인 예에서, 변형된 H1 HA는 429 위치에서 치환된 잔기 및 97, 374, 380, 390 위치에서 하나 이상의 치환 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 429 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
이중-치환된 H1 HA
적어도 이중-치환 또는 이중-변형을 포함하는 H1 HA 단백질이 추가로 제공된다. 따라서, H1 HA 단백질은 야생형 H1 HA 단백질로부터 적어도 두 개의 변형을 갖는다. 예를 들어, H1 HA는 변형된 하기 잔기들의 임의의 두 개의 조합을 가질 수 있다: 97, 374, 380, 390 및 429 (H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 134)에 따른 번호 매기기(numbering)).
380 및 429 위치에서의 변형
본 발명의 한 측면에서, 변형된 H1 HA는 적어도 380 및 429 위치에서 변형된 잔기를 가질 수 있다.
도 3B에 나타낸 바와 같이, 아스파라긴에서 알라닌으로 변형된 380 위치의 잔기 및 류신에서 메티오닌으로 변형된 429 위치의 잔기를 갖는 H1 HA는 야생형 H1 HA에 비해 혈구 응집 역가에서 약 800% 증가를 나타냈다 (표 5A 참조).
따라서, 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여, H1 HA의 380 및 429 (H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 134)에 따른 번호 매기기(numbering)) 위치에 있는 잔기들은 380 위치에서 아스파라긴 (N, Asn)이 380 위치에서 비-아스파라긴으로 대체되고, 429 위치에서 류신 (L, Leu)이 429 위치에서 비-류신으로 대체하도록 변형될 수 있다는 것이 한 측면에서 제공된다. 예를 들어, H1 HA는 비-자연적으로 발생한 서열을 가진 변형된 H1 HA를 생산하기 위해, 380 위치에서 극성 아미노산을 380 위치에서 소수성 아미노산으로 대체하고, 429 위치에서 류신 (L, Leu)을 429 위치에서 류신이 아닌 다른 소수성 아미노산으로 대체하여 변형할 수 있다.
예를 들어, H1 HA 단백질은 380 위치에서 알라닌 (A, Ala) 또는 380 위치에서 알라닌의 보존적 치환을 포함하여 변형될 수 있다. 알라닌의 보존적 치환은 예를 들어, 세린(S, Ser), 글리신 (G, Gly), 트레오닌 (T, Thr), 시스테인 (C, cys) 또는 발린 (V, Val) 일 수 있다. 또한(furthermore), H1 HA 단백질은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존적 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 포함하는 변형일 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 134)의 HA 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 380 위치에서 알라닌 또는 알라닌의 보존적 치환, 예컨대, 세린(S, Ser), 글리신 (G, Gly), 트레오닌 (T, Thr), 시스테인 (C, cys) 또는 발린 (V, Val)을 가지며, 및 아미노산 서열은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 가지며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 380 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 136)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 가질 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 380 위치에서 알라닌 또는 알라닌의 보존적 치환, 예컨대, 세린(S, Ser), 글리신 (G, Gly), 트레오닌 (T, Thr), 시스테인 (C, cys) 또는 발린 (V, Val) 및 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 380 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 알라닌 또는 알라닌의 보존적 치환, 예컨대, 세린(S, Ser), 글리신 (G, Gly), 트레오닌 (T, Thr), 시스테인 (C, cys) 또는 발린 (V, Val)을 암호화하며, 및 상기 변형된 H1 HA의 429 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 380 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 380 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 380 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 380 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 380 및 429 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
390 및 429 위치에서의 변형
본 발명의 한 측면에서, 변형된 H1 HA는 적어도 390 및 429 위치에서 변형된 잔기를 가질 수 있다.
도 2B, 3B, 4A, 4B 및 표 5A에 나타낸 바와 같이, 페닐알라닌에서 아스파르트산으로 변형된 390 위치의 잔기 및 류신에서 메티오닌으로 변형된 429 위치의 잔기를 갖는 H1 HA는 야생형 H1 HA에 비해 혈구 응집 역가에서 약 400-1200% 증가를 나타냈다. 또한, 표 5C에 나타낸 바와 같이, 전체 공정 수율이 633%로 증가하였다.
따라서, 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여, H1 HA의 390 및 429 (H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 134)에 따른 번호 매기기(numbering)) 위치에 있는 잔기들은 390 위치에서 페닐알라닌 (F, Phe)이 390 위치에서 비-페닐알라닌으로 대체하고, 429 위치에서 류신 (L, Leu)이 429 위치에서 비-류신으로 대체하도록 변형될 수 있다는 것이 한 측면에서 제공된다. 예를 들어, H1 HA는 비-자연적으로 발생한 서열을 가진 변형된 H1 HA를 생산하기 위해, 390 위치에서 소수성 아미노산을 390 위치에서 하전된 아미노산으로 대체하고, 429 위치에서 류신 (L, Leu)을 429 위치에서 류신이 아닌 다른 소수성 아미노산으로 대체하여 변형할 수 있다.
예를 들어, H1 HA 단백질은 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 390 위치에서 아스파르트산의 보존적 치환을 포함하여 변형될 수 있다. 보존적 치환은 예를 들어, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 일 수 있다. 또한, H1 HA 단백질은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존적 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 포함하는 변형일 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 134)의 HA 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 가지며, 및 아미노산 서열은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 가지며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 136)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 가질 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 및 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 갖는 변형된 H1 HA 단백질을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 390 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 및 상기 변형된 H1 HA의 429 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
예를 들어, 변형된 H1 HA는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다; 상기에서 H1 HA의 적어도 390 및 429 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 변형된 H1 HA는 이중-치환, 삼중-치환 또는 사중-치환된 H1 HA일 수 있으며, 상기 적어도 390 및 429 위치의 잔기는 변형된다. 비-제한적인 예에서, 변형된 H1 HA는 390 및 429 위치에서 치환된 잔기 및 97, 374, 380 위치에서 하나 이상의 치환 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
97 및 374 위치에서의 변형
본 발명의 한 측면에서, 변형된 H1 HA는 적어도 97 및 374 위치에서 변형된 잔기를 가질 수 있다.
도 3B 및 표 5A에 나타낸 바와 같이, 아스파라긴에서 아스파르트산으로 변형된 97 위치의 잔기 및 라이신에서 글루탐산으로 변형된 374 위치dmld 잔기를 갖는 H1 HA는 아생형 H1 HA에 비해 혈구 응집 역가에서 약 1200% 증가를 나타냈다.
따라서, 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여, H1 HA의 97 및 374 (H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 134)에 따른 번호 매기기(numbering)) 위치에 있는 잔기들은 97 위치에서 아스파라긴 (N, Asn)이 97 위치에서 비-아스파라긴으로 대체하고, 374 위치에서 라이신 (K, Lys)이 374 위치에서 비-라이신으로 대체하도록 변형될 수 있다는 것이 한 측면에서 제공된다. 예를 들어, H1 HA는 비-자연적으로 발생한 서열을 가진 변형된 H1 HA를 생산하기 위해, 97 위치에서 하전된 아미노산을 97 위치에서 극성 아미노산으로 대체하고, 327 위치에서 하전된 아미노산을 374 위치에서 라이신(K, Lys)이 아닌 다른 하전된 아미노산으로 대체하여 변형할 수 있다.
예를 들어, H1 HA 단백질은 97 위치에서 아스파라긴(N, Asn)이 아닌, 아스파르트산 (D, Asp) 및 아스파르트산의 보존적 치환을 포함하여 변형될 수 있다. 보존적 치환은 예를 들어, 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 일 수 있다. 또한, H1 HA 단백질은 374 위치에서 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)을 포함하는 변형일 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 134)의 HA 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 97 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 가지며, 및 아미노산 서열은 327 위치에서 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)을 가지며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 97 및 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 136)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 가질 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 97 위치에서 97 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 및 327 위치에서 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 97 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 및 상기 변형된 H1 HA의 374 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
예를 들어, 변형된 H1 HA는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다; 상기에서 H1 HA의 적어도 97 및 374 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 변형된 H1 HA는 이중-치환, 삼중-치환 또는 사중-치환된 H1 HA일 수 있으며, 상기 적어도 97 및 374 위치의 잔기는 변형된다. 비-제한적인 예에서, 변형된 H1 HA는 97 및 374 위치에서 치환된 잔기 및 380, 390 및 429 위치에서 하나 이상의 치환 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 97 및 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 97 및 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 97 및 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 97 및 374 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 97 및 374 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
삼중-치환된 H1 HA
97, 390 및 429 위치에서의 변형
적어도 삼중-치환 또는 삼중-변형을 포함하는 H1 HA 단백질이 추가로 제공된다. 따라서, H1 HA 단백질은 야생형 H1 HA 단백질로부터 적어도 세 개의 변형을 갖는다. 예를 들어, H1 HA는 변형된 하기 잔기들의 임의의 세 개의 조합을 가질 수 있다: 97, 374, 390 및 429 (H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 134)에 따른 번호 매기기(numbering)).
본 발명의 한 측면에서, 변형된 H1 HA는 적어도 97, 390 및 429 위치에서 변형된 잔기를 가질 수 있다.
도 3B, 4A 및 4B에 나타낸 바와 같이, 아스파라긴에서 아스파르트산으로 변형된 97 위치의 잔기, 페닐알라닌에서 아스파르트산으로 변형된 390 위치의 잔기 및 류신에서 메티오닌으로 변형된 429 위치의 잔기를 갖는 H1 HA는 야생형 H1 HA에 비해 혈구 응집 역가에서 약 2600% 증가를 나타냈다. 또한, 표 5C에 나타낸 바와 같이, 전체 공정 수율이 647%로 증가하였다.
따라서, 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여, H1 HA의 97, 390 및 429 (H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 134)에 따른 번호 매기기(numbering)) 위치에 있는 잔기들은 97 위치에서 아스파라긴(N, Asn)이 비-아스파라긴으로, 390 위치에서 페닐알라닌 (F, Phe)이 비-페닐알라닌으로, 429 위치에서 류신이 429 위치에서 비-류신 (L, Leu)으로 대체하도록 변형될 수 있다는 것이 한 측면에서 제공된다. 예를 들어, H1 HA는 비-자연적으로 발생한 서열을 가진 변형된 H1 HA를 생산하기 위해, 97 위치에서 극성 아미노산을 하전된 아미노산으로, 390 위치에서 소수성 아미노산을 하전된 아미노산으로, 429 위치에서 류신 (L, Leu)을 류신이 아닌 다른 소수성 아미노산으로 대체하여 변형할 수 있다.
예를 들어, H1 HA 단백질은 97 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환,을 포함하도록 변형될 수 있다. 아스파르트산의 보존적 치환은, 예컨대, 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln), 또는 세린 (S, Ser)일 수 있다. 상기 변형된 H1 HA는 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환을 추가적으로 포함할 수 있다. 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환은 예를 들어, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 일 수 있다. 또한, 상기 H1 HA 단백질은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존적 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 포함하여 변형될 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 134)의 HA 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 97 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 가지며, 아미노산 서열은 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 가지며, 및 아미노산 서열은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 가지며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 97, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 136)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 가질 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 97 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln), 또는 세린 (S, Ser), 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 및 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 갖는 변형된 H1 HA 단백질을 암호화 하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 97 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환, 예컨대, 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln), 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA의 390 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 및 상기 변형된 H1 HA의 429 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
예를 들어, 변형된 H1 HA는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다; 상기에서 H1 HA의 적어도 97, 390 및 429 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 변형된 H1 HA는 삼중-치환 또는 사중-치환된 H1 HA일 수 있으며, 상기 적어도 97, 390 및 429 위치의 잔기는 변형된다. 비-제한적인 예에서, 변형된 H1 HA는 97, 390, 429 및 374 위치에서 치환된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 97, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 97, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 97, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 97, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 97, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
374, 390 및 429 위치에서의 변형
본 발명의 한 측면에서, 변형된 H1 HA는 적어도 374, 390 및 429 위치에서 변형된 잔기를 가질 수 있다.
도 3B에 나타낸 바와 같이, 라이신에서 글루탐산으로 변형된 374 위치의 잔기, 페닐알라닌에서 아스파르트산으로 변형된 390 위치의 잔기 및 류신에서 메티오닌으로 변형된 429 위치의 잔기를 갖는 H1 HA는 야생형 H1 HA에 비해 혈구 응집 역가에서 약 2500% 증가를 나타냈다. 또한, 표 5C에 나타낸 바와 같이, 전체 공정 수율이 689%로 증가하였다.
따라서, 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여, H1 HA의 374, 390 및 429 (H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 134)에 따른 번호 매기기) 위치에 있는 잔기들은 374 위치에서 라이신(K, Lys)이 비-라이신으로, 390 위치에서 페닐알라닌 (F, Phe)이 비-페닐알라닌으로, 429 위치에서 류신이 비-류신 (L, Leu)으로 대체하도록 변형될 수 있다는 것이 한 측면에서 제공된다. 예를 들어, H1 HA는 비-자연적으로 발생한 서열을 가진 변형된 H1 HA를 생산하기 위해, 374 위치에서 라이신을 비-라이신으로, 390 위치에서 페닐알라닌 (F, Phe)을 비-페닐알라닌으로, 429 위치에서 류신 (L, Leu)을 비-류신으로 대체하여 변형할 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생하지 않는 서열을 가진 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여, H1 HA는 374 위치에서 라이신을 라이신이 아닌 하전된 아미노산으로, 390 위치에서 소수성 아미노산을 하전된 아미노산으로, 429 위치에서 류신(L, Leu)을 류신이 아닌 다른 소수성 아미노산으로 대체하여 변형될 수 있다.
예를 들어, H1 HA 단백질은 374 위치에서 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)일을 포함하도록 변형될 수 있다. 상기 변형된 H1 HA는 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환을 추가적으로 포함할 수 있다. 보존적 치환은 예를 들어, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 일 수 있다. 또한, 상기 H1 HA 단백질은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존적 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 포함하여 변형될 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 134)의 HA 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 374 위치에서 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)을 가지며, 상기 아미노산 서열은 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 가지며, 및 상기 아미노산 서열은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 가지며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 136)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 가질 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 374 위치에서 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser), 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 및 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 갖는 변형된 H1 HA 단백질을 암호화 하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 374 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신 (L, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존된 치환, 예컨대, 글아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA의 390 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 및 상기 변형된 H1 HA의 429 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
예를 들어, 변형된 H1 HA는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다; 상기에서 H1 HA의 적어도 374, 390 및 429 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 변형된 H1 HA는 삼중-치환 또는 사중-치환된 H1 HA일 수 있으며, 상기 적어도 374, 390 및 429 위치의 잔기는 변형된다. 비-제한적인 예에서, 변형된 H1 HA는 374, 390, 429 및 97 위치에서 치환된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
사중-치환된 H1 HA
97, 374, 390 및 429 위치에서의 변형
적어도 사중-치환 또는 사중-변형을 포함하는 H1 HA 단백질이 추가로 제공된다. 따라서, H1 HA 단백질은 야생형 H1 HA 단백질로부터 적어도 네 개의 변형을 갖는다. 예를 들어, H1 HA는 97, 374, 390 및 429 (H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 134)에 따른 번호(numbering)) 위치에서 변형을 가질 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 변형된 H1 HA는 적어도 97, 374, 390 및 429 위치에서 변형된 잔기를 가질 수 있다.
도 3B에 나타낸 바와 같이, 아스파라긴에서 아스파르트산으로 변형된 97 위치의 잔기, 라이신에서 글루탐산으로 변형된 374 위치의 잔기, 페닐알라닌에서 아스파르트산으로 변형된 390 위치의 잔기 및 류신에서 메티오닌으로 변형된 429 위치의 잔기를 갖는 H1 HA는 야생형 H1 HA에 비해 혈구 응집 역가에서 약 3300% 증가를 나타냈다.
따라서, 비-자연적으로 발생한 서열을 갖는 변형된 H1 HA를 생산하기 위하여, H1 HA의 97, 374, 390 및 429 (H1 A/Michigan/45/15 (서열 번호: 134)에 따른 번호 매기기) 위치에 있는 잔기들은 97 위치에서 아스파라긴(N, Asn)이 비-아스파라긴으로, 374 위치에서 라이신이 비-라이신으로, 390 위치에서 페닐알라닌 (F, Phe)이 비-페닐알라닌으로, 429 위치에서 류신이 429 위치에서 비-류신으로 대체하도록 변형될 수 있다는 것이 한 측면에서 제공된다. 예를 들어, H1 HA는 비-자연적으로 발생한 서열을 가진 변형된 H1 HA를 생산하기 위해, 97 위치에서 극성 아미노산을 하전된 아미노산으로, 374 위치에서 라이신을 라이신이 아닌 하전된 아미노산으로, 390 위치에서 소수성 아미노산을 하전된 아미노산으로, 429 위치에서 류신 (L, Leu)을 류신이 아닌 다른 소수성 아미노산으로 대체하여 변형할 수 있다.
예를 들어, H1 HA 단백질은 97 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 아스파르트산의 보존적 치환은, 예컨대, 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln), 또는 세린 (S, Ser)일 수 있다. 또한, 상기 H1 HA 단백질은 374 위치에서 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신(K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser)을 포함하여 변형될 수 있다. 상기 변형된 H1 HA는 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환을 추가적으로 포함할 수 있다. 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환은 예를 들어, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 일 수 있다. 또한, 상기 H1 HA 단백질은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존적 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 포함하여 변형될 수 있다.
예를 들어, 변형된 H1 HA 단백질은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 134)의 HA 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 아미노산 서열은 97 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 가지며, 상기 아미노산 서열은 374 위치에서 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신 (K, Lys)이 아닌 글루탐산(E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His) 또는 세린 (S, Ser), 상기 아미노산 서열은 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 가지며, 및 상기 아미노산 서열은 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 가지며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
본 명세서는 또한 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 상기 기재된 바와 같은, 97, 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (서열 번호: 136)의 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 임의의 양, 서열 상동성, 또는 서열 유사성을 가질 수 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 97 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln), 또는 세린 (S, Ser), 374 위치에서, 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신(K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His), 또는 세린 (S, Ser), 390 위치에서 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Gue), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser) 및 429 위치에서 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 갖는 변형된 H1 HA 단백질을 암호화 하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
뉴클레오티드 서열은 서열번호: 136과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 이들 사이의 임의의 양, 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있으며, 상기 변형된 H1 HA의 97 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파라긴 (N, Asn)이 아닌 아스파르트산 (D, Asp)의 보존된 치환, 예컨대, 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln), 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA의 374 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 글루탐산 (E, Glu) 또는 라이신(K, Lys)이 아닌 글루탐산 (E, Glu)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파르트산 (D, Asp), 글루타민 (Q, Gln), 아르기닌 (R, Arg), 아스파라긴 (N, Asn), 히스티딘 (H, His), 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA의 390 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 아스파르트산 (D, Asp) 또는 아스파르트산 (D, Asp)의 보존적 치환, 예컨대, 아스파라긴 (N, Asn), 글루탐산 (E, Glu), 글루타민 (Q, Gln) 또는 세린 (S, Ser)을 암호화하며, 및 상기 변형된 H1 HA의 429 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 코돈은 메티오닌 (M, Met) 또는 류신 (L, Leu)이 아닌 메티오닌 (M, Met)의 보존된 치환, 예컨대, 이소류신 (I, Ile), 글루타민 (Q, Gln), 발린 (V, Val) 또는 페닐알라닌 (F, Phe)을 암호화하며, 상기 변형된 H1 HA 서열은 자연적으로 발생하지 않고, 상기 HA 단백질은 발현될 때 VLP를 형성한다.
예를 들어, 변형된 H1 HA는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다; 상기에서 H1 HA의 적어도 97, 374, 390 및 429 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 예를 들어, 변형된 H1 HA는 사중-치환된 H1 HA일 수 있으며, 상기 97, 374, 390 및 429 위치의 잔기는 변형된다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 97, 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP를 식물에서 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 97, 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
또한, 상기에서 언급한 바와 같이, 식물에서, 97, 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 97, 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 변형된 H1 HA를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하고, 상기 식물 및 식물의 일부를 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 VLP를 생산하는 것을 포함한다.
본 명세서는 또한 97, 374, 390 및 429 위치에서 치환을 갖는 H1 HA를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 본 명세서에 의해 제공된 방법에 의해 생산될 수 있다. 변형된 H1 HA를 포함하는 VLP는 변형되지 않은 H1 HA 단백질을 포함하는 VLP와 비교할 때 개선된 특성을 보인다.
또한, 본원에서는 식물에서 돌연변이 인플루엔자 HA를 포함하는 VLP의 생산 또는 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 방법은 돌연변이 인플루엔자 HA를 암호화하는 핵산을 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 돌연변이 인플루엔자 HA를 암호화하는 핵산은 인간 코돈 사용, 증가된 GC 함량 또는 이들의 조합으로 최적화될 수 있다. 하나 이상의 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 VLP를 생산하기 위하여, 하나 이상의 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질은 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 대안적으로, 방법은 하나 이상의 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 VLP를 생산하기 위하여, 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
돌연변이 인플루엔자 HA를 포함하는 VLP를 생산하는 방법은 제 2 핵산 서열을 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 제 2 핵산은 돌연변이 인플루엔자 HA와 공동-발현하는 양성자 채널 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 양성자 채널 단백질은 A/New Caledonia/20/99 M2 같은 인플루엔자 A 아형 M2 단백질 일 수 있다. 양성자 채널 단백질의 공동-발현은 예를 들어 본원에 참조로 포함된 WO2013/044390에 기재된 바와 같이, 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질 및/또는 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 VLP의 축적 증가를 유도할 수 있다.
또한, 돌연변이 인플루엔자 HA는 본원에 참조로 포함된 WO2013/044390 및 WO2014/153674에 기재된 바와 같이, 변형된 단백질분해 루프(proteolytic loop) 또는 절단 부위를 추가로 포함할 수 있다.
"공동-발현"은 둘 이상의 뉴클레오티드 서열의 도입 및 발현을 의미하며, 둘 이상의 뉴클레오티드 서열 각각은, 관심 단백질 또는 관심 단백질의 단편을 식물, 식물의 일부 또는 식물세포 내에서 암호화한다. 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 둘 이상의 뉴클레오티드 서열이 각각 별개의 조절 영역 (예를 들어, 이중 구조물을 포함)의 제어 하엣 있도록 하나의 벡터 내에서 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입될 수 있다. 대안으로, 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 별개의 벡터 (예컨대, 단일 구조물을 포함) 내에서 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입될 수 있고, 각각의 벡터는 상응하는 핵산의 발현을 위해 적절한 조절 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 각각 별개의 벡터 상에 있고 별개의 아크로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 숙주로 도입된 두 개의 뉴클레오티드 서열은 진공 침투 전에 원하는 부피 (예를 들어, 동일한 부피, 또는 각각의 아크로박테리움 튜메파시엔스 숙주의 비율이 변화될 수 있다)로 각각의 아크로박테리움 튜메파시엔스 숙주의 현탁액을 혼합함으로써 공동-발현될 수 있다. 이 방식으로, 다수의 아크로박테리움 튜메파시엔스 현탁액의 공동-발현은 다수의 전이 유전자의 공동-발현을 허용한다.
본 명세서에 기재된 돌연변이 인플루엔자 HA를 암호화하는 핵산은 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 돌연변이 인플루엔자 HA의 발현을 향상시키는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 발현을 향상시키는 서열은 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질을 암호화하는 핵산과 작동적으로 연관되어 있는 동부 모자이크 바이러스(Cowpea Mosaic Virus) (CPMV) 증강자 요소를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 HA 단백질의 발현을 향상시키는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 발현을 향상시키는 서열은 변형된 인플루엔자 혈구 응집소 (HA) 단백질을 암호화하는 핵산과 작동적으로 연관되는 CPMV 증강자 요소, 또는 식물-유래 발현 증강자를 포함할 수 있다. 변형된 인플루엔자 혈구 응집소 (HA)를 암호화하는 서열은 또한 인간 코돈 사용, 증가된 GC 함량 또는 이들의 조합으로 최적화 될 수 있다.
본 명세서에 사용된. 용어 "CPMV 증강자 요소"는 당업계에 공지된 바와 같이 동부 모자이크 바이러스 (CPMV) RNA2 폴리펩티드 또는 변형된 CPMV 서열을 조절하는 5'UTR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, CPMV 증강자 요소 또는 CPMV 발현 증강자는 각각이 본원에 참조로 포함된 WO2015/14367, WO2015/103704; WO2007/135480; WO2009/087391; Sainsbury F. 및 Lomonossoff G.P., (2008, Plant Physiol. 148:pp. 1212-1218)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. CPMV 증강자 서열은 이들이 부착되는 하류영역(downstream) 이종 개방형 해독틀 (ORF)의 발현을 향상시킬 수 있다. CPMV 발현 증강자는 CPMV HT, CPMVX (상기 X=160, 155, 150, 114), 예를 들어 CPMV 160, CPMVX+ (상기 X=160, 155, 150, 114), 예를 들어 CPMV 160+, CPMV-HT+, CPMV HT+[WT115], 또는 CPMV HT+[511]를 포함할 수 있다 (WO2015/143567; WO2015/103704 이들은 본원에 참조로 포함됨). CPMV 발현 증강자는 CPMV 발현 증강자 서열 및 관심 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 조절 영역을 포함하는 식물 발현 시스템 내에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 용어 "CPMV 증강자 요소"는 당업계에 공지된 바와 같이 동부 모자이크 바이러스 (CPMV) RNA2 폴리펩티드 또는 변형된 CPMV 서열을 조절하는 5'UTR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, CPMV 증강자 요소 또는 CPMV 발현 증강자는 각각이 본원에 참조로 포함된 WO2015/14367, WO2015/103704; WO2007/135480; WO2009/087391; Sainsbury F. 및 Lomonossoff G.P., (2008, Plant Physiol. 148:pp. 1212-1218)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. CPMV 증강자 서열은 이들이 부착되는 하류영역(downstream) 이종 개방형 해독틀 (ORF)의 발현을 향상시킬 수 있다. CPMV 발현 증강자는 CPMV HT, CPMVX, CPMVX+ CPMV-HT+, CPMV HT+[WT115], 또는 CPMV HT+[511]를 포함할 수 있다 (WO2015/143567; WO2015/103704 이들은 본원에 참조로 포함됨). CPMV 발현 증강자는 CPMV 발현 증강자 서열 및 관심 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 조절 영역을 포함하는 식물 발현 시스템 내에서 사용될 수 있다.
용어 "5'UTR" 또는 "5' 비번역 영역"또는 "5' 선도 서열"은 번역되지 않는 mRNA의 영역을 지칭한다. 5'UTR은 일반적으로 전사 시작 부위에서 시작하여 번역 개시 부위 또는 암호화(코딩) 영역의 시작 코돈 직전에 끝난다. 5'UTR은 mRNA 전사물의 안정성 및/또는 번역을 조절할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 용어 "식물-유래 발현 증강자"는 식물로부터 얻어진 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 뉴클레오티드 서열은 5'UTR을 코딩한다. 식물 유래 발현 증강자의 예는 미국 임시 특허 출원 번호 62/643,053 (2018 년 3 월 14 일 출원됨; 이는 본원에 참고로 포함됨) 또는 Diamos A.G. 등 (2016, Front Plt Sci. 7:1-15; 이는 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 식물-유래 발현 증강자는 US 62/643,053에 기재된 바와 같이 nbMT78, nbATL75, nbDJ46, nbCHP79, nbEN42, atHSP69, atGRP62, atPK65, atRP46, nb30S72, nbGT61, nbPV55, nbPPI43, nbPM64 및 nbH2A86에서 선택될 수 있다. 식물 유래 발현 증강자는 식물-유래 발현 증강자 서열 및 관심 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 조절 영역을 포함하는 식물 발현 시스템 내에서 사용될 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"은 특정 서열이 의도된 기능, 예컨대, 핵산 서열의 발현의 매개 또는 조절을 수행하도록 직접적 또는 간접적으로 상호 작용하는 것을 의미한다. 작동 가능하게 연결된 서열의 상호 작용은 예를 들어 작동 가능하게 연결된 서열과 상호 작용하는 단백질에 의해 매개될 수 있다.
하나 이상의 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질이 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 발현 될 때, 하나 이상의 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질은 VLP로 자가-조립된다. 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포는 VLP의 온전성(integrity)을 유지하기 위해 적절한 추출 및 정제 조건 하에서 수확될 수 있고, 하나 이상의 돌연변이 인플루엔자 HA를 포함하는 VLP는 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에 인플루엔자 감염에 대한 면역을 유도하기 위한, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 돌연변이 인플루엔자 HA, 또는 돌연변이 인플루엔자 HA를 포함하는 VLP의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 돌연변이 인플루엔자 HA 또는 돌연변이 인플루엔자 HA를 포함하는 VLP를 대상체 또는 숙주 동물에 투여함으로써 제조된 항체 또는 항체 단편을 개시한다. 또한, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 인플루엔자 HA 및 제약상 허용되는 담체(carrier), 보조제(adjuvant), 비히클(vehicle), 또는 부형제(excipient)를 포함하는 돌연변이 인플루엔자 HA 또는 VLP의 유효량을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 대상체에서 면역 반응을 유도하기위한 백신이 제공되며, 여기서 백신은 유효량의 돌연변이 인플루엔자 HA를 포함한다.
또한, 본 발명은 돌연변이 인플루엔자 HA 또는 돌연변이 인플루엔자 HA를 포함하는 VLP를 대상체에게 경구, 비강 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 또는 피하 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 인플루엔자 감염에 대한 면역을 유도하기 위한 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된, 용어 "인플루엔자 바이러스"는 음성 센스 단일-가닥 RNA 게놈을 갖는 것으로 특징으로 하는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)의 외피 바이러스 균주를 지칭한다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 균주에 따라 12-14 개의 단백질을 암호화하는 8개의 유전자 세그먼트로 구성된다.
인플루엔자 바이러스에는 A, B, C 및 D의 4 가지 유형이 있으며, 그중 인플루엔자 A 및 B는 인간의 계절성 전염병의 원인 유기체이다. 인플루엔자 A는 HA 및 뉴라미니다제 (NA) 당단백질 아형의 발현에 따라 추가로 분류된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "헤마글루티닌" 또는 "HA"는 표적 세포 표면상의 시알산-함유 단백질에 대한 인플루엔자 바이러스 입자의 결합을 촉진하고, 바이러스 게놈의 표적 세포로의 방출을 매개하는 삼량체성 렉틴을 지칭한다. 18 개의 서로 다른 HA 아형 (H1-H18)이 있다. HA 단백질은 두 가지 구조적 요소: 혈청 보호 항체의 주요 표적인 머리; 및 줄기로 구성된다. HA는 HA1 (~ 40kDa) 및 HA2 (~ 20kDa) 하위 도메인 사이가 세린 엔도프로테아제(endoprotease)에 의해 절단되어야 하는 단일 폴리펩티드, HA0 (삼량체로 조립 됨)으로 번역된다. 절단 후, 두 개의 이황화-결합 단백질 도메인은 바이러스 감염에 필요한 필수 구조를 채택한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은, 인플루엔자 A HA 단백질 또는 변형된 인플루엔자 A HA 단백질은 임의의 공지된 인플루엔자 A 균주로부터 유도된 임의의 공지된 HA 단백질을 포함하지만, 또한 시간이 지남에 따라 발생하는 공지된 인플루엔자 A 균주에 대한 변형도 포함한다. 예를 들어 인플루엔자 HA는 A/California/07/09 (H1N1), A/Michigan/45/15 (H1N1), A/Massachusetts/06/17 (H1N1), A/Costa Rica/0513/16 (H1N1), A/Honduras/17734/16 (H1N1) 또는 A/Darwin/11/15 (H1N1)에서 유래될 수 있다. 인플루엔자 A HA는 상기 열거된 인플루엔자 A 균주로부터 유래된 임의의 HA와 약 30-100%, 또는 그 사이의 임의의 양의 아미노산 서열 상동성을 갖는 균주로부터 유래된 HA를 포함할 수 있으며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 치환을 포함하고, VLP를 형성할 수 있고, 대상체에 투여될 때 면역 반응을 유도하고, 혈구 응집 또는 이들의 조합을 유도하는 인플루엔자 HA 단백질을 제공한다.
예를 들어, 인플루엔자 HA 단백질은 상기 나열된 인플루엔자 A 균주로부터 유래된 임의의 HA과 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100%, 또는 그 사이의 임의의 양의 아미노산 서열 동일성 (서열 유사성, 백분율 동일성, % 유사성)을 가지며, 상기 기재된 바와 같이 적어도 하나의 치환을 포함하고, VLP를 형성할 수 있고, 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유도하고, 혈구응집 또는 이들의 조합을 유도한다. 여러 인플루엔자 A HA 영역의 아미노산 서열 정렬은, 제한적으로 간주되지는 않으나, 도 1에 나타내었다.
특정 서열을 언급할 때, 용어 "백분율 유사성", "서열 유사성", "백분율 동일성"또는 "서열 동일성"은, 예를 들어, University of Wisconsin GCG 소프트웨어 프로그램에 제시된 바와 같이, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement)에 의해 사용된다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어, Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482)의 알고리즘을 사용하여, Needleman & Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48:443)의 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman(1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)의 유사성 방법 검색, 이러한 알고리즘의 전산화 구현(예컨대, GAP, BESTFIT, FASTA), and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.)에 의해 실행될 수 있다.
백분율 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 Altschul 등 (1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402) 및 Altschul 등 (1990, J. Mol. Biol. 215 : 403-410)에 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0 은 본 명세서에 기재된 매개 변수(파라미터)를 이용하여 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 백분율 서열 동일성을 결정하는데 사용된다. 예를 들어, BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대해)은 초기 설정(default)으로 11의 단어 길이 (W), 10의 예상값 (E), M=5, N=4 및 두 가닥의 비교를 사용할 수 있다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 초기 설정으로 3단어 길이, 10의 예상값 (E), 및 BLOSUM62 scoring matrix (Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 참조), 50의 정렬값 (B), 10의 예상값 (E), M=5, N=4 및 두 가닥의 비교를 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 생물공학 정보센터 (National Center for Biotechnology Information (URL : ncbi.nlm.nih.gov/ 참조))를 통해 공개적으로 이용 가능하다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "바이러스-유사 입자", "VLP", "바이러스 유사 입자", 또는 "VLPs"는 하나 이상의 인플루엔자 HA 단백질을 포함하고, 인플루엔자 게놈의 모든 부분이 결여된 비-복제성, 비-감염성 바이러스 캡시드 구조로 자가-조립되는 인플루엔자 입자를 의미한다.
■ 식물에서 인플루엔자 HA 단백질 생산
인플루엔자 A HA 단백질은 A/California/07/09 (H1N1, 서열 번호: 130), A/Michigan/45/15 (H1N1, 서열 번호: 134), A/Massachusetts/06/17 (H1N1, 서열 번호: 135), A/Costa Rica/0513/16 (H1N1, 서열 번호 133), A/Honduras/17734/16 (H1N1, 서열 번호: 131), A/Darwin/11/15 (H1N1, 서열 번호 132), A/Paris/1227/2017 (서열 번호: 138), 및 A/Norway/2147/ 017 (서열 번호: 139)로부터의 인플루엔자 A HA 서열과 약 30 내지 약 100 %, 약 40 내지 약 100 %, 약 50 내지 약 100 %, 약 60 내지 약 100 %, 약 70 내지 약 100 %, 약 80 내지 약 100 %, 약 85 내지 약 100 %, 약 90 내지 약 100 %, 95 내지 약 100 %, 또는 약 97 내지 약 100 % 약 98 내지 약 100 %, 또는 그 사이의 임의의 양의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 임의의 HA 단백질을 포함하며, 단, 인플루엔자 HA 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 치환을 포함하고, VLP를 형성할 수 있고, 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유도하고, 혈구 응집 또는 이들의 조합을 유도하는 인플루엔자 HA 단백질을 제공한다.
인플루엔자 A HA 단백질은 서열 번호:18, 서열 번호:22, 서열 번호:24, 서열 번호:4, 서열 번호:28, 서열 번호:32, 서열 번호:36, 서열 번호:39, 서열 번호:41, 서열 번호:43, 서열 번호:45, 서열 번호:47, 서열 번호:49, 서열 번호:51, 서열 번호:53, 서열 번호:55, 서열 번호:57, 서열 번호:59, 서열 번호:61, 서열 번호:63, 서열 번호:65, 서열 번호:68, 서열 번호:72, 서열 번호:76, 서열 번호:80, 서열 번호:82, 서열 번호:84, 서열 번호:86, 서열 번호:89, 서열 번호:91, 서열 번호:93, 서열 번호:95, 서열 번호:97, 서열 번호:105, 서열 번호:108, 서열 번호:124, 서열 번호:126, 서열 번호:128, 서열 번호:140, 서열 번호:142, 서열 번호:144, 서열 번호:146, 서열 번호:148 서열에 대한 서열과 약 30 내지 약 100 %, 약 40 내지 약 100 %, 약 50 내지 약 100 %, 약 60 내지 약 100 %, 약 70 내지 약 100 %, 약 80 내지 약 100 %, 약 85 내지 약 100 %, 약 90 내지 약 100 %, 95 내지 약 100 %, 또는 약 97 내지 약 100 % 약 98 내지 약 100 %, 또는 그 사이의 임의의 양의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 임의의 HA 단백질을 포함하며, 단, 인플루엔자 HA 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 치환을 포함하고, VLP를 형성할 수 있고, 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유도하고, 혈구 응집 또는 이들의 조합을 유도하는 인플루엔자 HA 단백질을 제공한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 인플루엔자 HA에서 하나 이상의 특정 돌연변이 또는 변형은 야생형 인플루엔자 HA와 비교하여, 식물에서 HA 단백질의 증가된 축적 및 증가 된 VLP 생산을 야기한다.
식물에서 향상된 인플루엔자 HA 및/또는 VLP 생산을 갖는 돌연변이 인플루엔자 A HA 단백질의 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
F390D A/California/07/09 돌연변이 H1(구조물 #2980, 서열 번호:18); L429M A/California/07/09 돌연변이 H1 (구조물 #2962, 서열 번호:22); F390D + L429M A/California/07/09 돌연변이 H1 (구조물 #2995, 서열 번호:24); N380A A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3644, 서열 번호:105); F390D+N380A A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3704, 서열 번호:108); N97D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3774, 서열 번호:28); K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3771, 서열 번호:32); F390D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3641, 서열 번호:36); L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3643, 서열 번호:39); N97D + K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3880, 서열 번호:41); F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3703, 서열 번호:43); N97D + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3879, 서열 번호:45); K374E + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3878, 서열 번호:47); N97D +K374E + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1 (구조물 #3881, 서열 번호:49); F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1 (구조물 #4091, 서열 번호:51); N97D + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1 (구조물 #4093, 서열 번호:53); K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1 (구조물 #4092, 서열 번호:55); N97D + K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1 (구조물 #4094, 서열 번호:57); F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1 (구조물 #4715, 서열 번호:59); N97D + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1 (구조물 #4717, 서열 번호:61); K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1 (구조물 #4716, 서열 번호:63); N97D + K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1 (구조물 #4718, 서열 번호:65); N97D A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1 (구조물 #3950, 서열 번호:68); K374E A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1 (구조물 #3948, 서열 번호:72); F390D A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1 (구조물 #3945, 서열 번호:75); L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1 (구조물 #3949, 서열 번호:80); F390D + L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1 (구조물 #3946, 서열 번호:82 ); N97D + F390D + L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1 (구조물 #3951, 서열 번호:84); N97D A/Darwin/11/15 돌연변이 H1 (구조물 #3990, 서열 번호:86); K374E A/Darwin/11/15 돌연변이 H1 (구조물 #3988, 서열 번호:89); F390D A/Darwin/11/15 돌연변이 H1 (구조물 #3985, 서열 번호:91); L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1 (구조물 #3989, 서열 번호:93); F390D + L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1 (구조물 #3986, 서열 번호:95); N97D + F390D + L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1 (구조물 #3991, 서열 번호:97); F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1 (구조물 #4765, 서열 번호:124), K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1 (구조물 #4766, 서열 번호:126), N97D + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1 (구조물 #4767, 서열 번호:128), N97D + K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1(구조물 #4768, 서열 번호:140); F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1 (구조물 #4775, 서열 번호:142), K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1 (구조물 #4776, 서열 번호:144), N97D + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1 (구조물 #4777, 서열 번호: 146), and N97D + K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1 (구조물 #4778, 서열 번호: 148).
인플루엔자 감염에 대한 면역 유도
"면역 반응"은 일반적으로 대상체의 적응성 면역 시스템의 반응을 말한다. 적응성 면역 시스템은 일반적으로 체액성 반응, 및 세포-매개된 반응을 포함한다. 체액성 반응은 B 림프구 계통의 세포 (B 세포)에서 생산된, 분비된 항체에 의해 매개되는 면역의 한 측면이다. 분비된 항체는 침입한 미생물(바이러스 또는 박테리아 같은)의 표면에 있는 항원에 결합하며, 이는 파괴하기 위해서 이들을 표시한다. 체액성 면역은 일반적으로 항체 생산 및 그에 수반되는 과정, Th2 세포 활성화를 포함하는 항체의 이펙터 기능 및 사이토카인 생산, 기억 세포 생성, 식균 작용의 옵소닌 촉진, 병원체 제거 등을 지칭한다. 용어 "조절하다" 또는 "조절" 등은 일반적으로 공지되거나 사용되는 여러 분석법 중 어느 하나에 의해 결정된 특정 반응 또는 매개 변수(파라미터)의 증가 또는 감소를 지칭하며, 그 중 일부는 본 명세서에 예시된다.
세포-매개 반응은 항체를 포함하지 않으며, 대신에 대식세포, 자연 살해 세포 (NK), 항원-특이적 세포 독성 T-림프구의 활성화 및 항원에 반응하는 다양한 사이토카인의 방출을 수반하는 면역 반응이다. 세포-매개 면역은 일반적으로 일부 Th 세포 활성화, Tc 세포 활성화 및 T-세포 매개 반응을 지칭하는데 사용된다. 세포 매개 면역은 바이러스 감염에 반응하는데 특히 중요할 수 있다.
예를 들어, 항원 특이적 CD8 양성 T 림프구의 유도는 ELISPOT 분석을 사용하여 측정될 수 있고; CD4 양성 T-림프구의 자극은 증식 분석(proliferation assay)을 사용하여 측정될 수 있다. 항-인플루엔자 항체 역가는 ELISA 분석을 사용하여 정량화될 수 있고; 항원-특이적 또는 교차 반응성 항체의 아이소타입은 또한 항-아이소타입 항체 (예컨대, 항-IgG, IgA, IgE 또는 IgM)를 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 분석을 수행하기 위한 방법 및 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
사이토카인 존재 또는 수준도 또한 정량화될 수 있다. 예를 들어, 보조 T(T-helper) 세포 반응 (Th1/Th2)은 ELISA (예컨대, BD Biosciences OptEIA 키트)를 사용한 IFN-γ 및 IL-4 분비 세포의 측정을 특징으로 할 수 있다. 대상체로부터 얻어진 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 또는 비장세포가 배양되고, 상층액이 분석될 수 있다. T 림프구는 또한 당업계에 공지된 마커 특이적 형광 라벨 및 방법을 사용하여 유세포 분석기 (FACS)에 의해 정량화될 수 있다.
대상체에서 면역 반응을 특성화하기 위해 미세중화법(microneutralization assay)이 또한 실행될 수 있으며, 예를 들어, Rowe 등., 1973의 방법을 참조하면 된다. 바이러스 중화 역가는, 세포의 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 고정/착색 후 용해 플라크(plaque)의 계산 (플라크 측정법); 시험관 내 배양에서 세포 용해의 현미경 관찰, 및 2) 인플루엔자 바이러스의 ELISA 및 분광 광도 검출을 포함한, 다양한 방법으로 정량화할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "에피토프" 또는 "에피토프들"은 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 구조적 부분을 말한다.
식물-생산된 야생형 인플루엔자 HA 단백질 또는 VLP, 또는 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질 또는 VLP의 투여에 반응하여 유도된 면역 반응은 예를 들어 Balb/C 마우스에서 관찰될 수 있다. 동물에서 채취한 혈액으로 부터의 혈청 샘플은 H1-특이적 총 IgG 및 IgA 항체에 대한 ELISA에 의해 분석될 수 있다. 식물에서 생산된 야생형 인플루엔자 HA 또는 돌연변이 인플루엔자 HA 단백질로 면역화된 마우스는 각 처리 그룹에 대해 혈청에서 HA- 특이적 IgG 항체 역가를 나타낼 수 있다.
식물 발현
본 발명의 구조물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 형질 전환, 미세주입, 전기천공 등을 사용하여 식물 세포에 도입될 수 있다. 이러한 기술에 대한 검토는, 예를 들어 Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); 및 Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrvre, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997). 다른 방법들은 직접적인 DNA 흡수, 리포좀 사용, 전기천공, 예를 들어, 원형질체 사용, 미세주입, 미세발사체(microprojectiles) 또는 위스커(whiskers), 및 진공 침투를 포함한다. 예를 들어, Bilang, et al. (1991, Gene 100:247-250), Scheid et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 228:104-112), Guerche et al. (1987, Plant Science 52 : 111-116), Neuhause et al. (1987, Theor. Appl Genet. 75 : 30-36), Klein et al. (2987, Nature 327:70-73); Freeman et al. (1984, Plant Cell Physiol. 29:1353), Howell et al. (1985, Science 227:1229-1231), DeBlock et al. (1989, Plant Physiology 91:694-701), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Liu and Lomonossoff (2002, J Virol Meth, 105:343-348), EP 290395; WO 8706614; 미국 특허 번호 4,945,050; 5,036,006; 및 5,100,792, 1995년 5월 10일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 08/438,666 및 1992년 9월 25일에 출원된 07/951,715 (이들 모두는 본 명세서에 참조로 포함됨)를 참조하면 된다.
일시적 발현 방법을 사용하여 본 발명의 구조물을 발현할 수 있다 (D' Aoust et al., 2009, Methods in Molecular Biology, Vol 483, pages 41-50; Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods 105:343-348 참조; 이는 본 명세서에 참조로 포함됨). 다른 방법으로는, Kapila et al. (1997, Plant Sci. 122, 101-108; 이는 본 명세서에 참고로 포함됨)또는 WO 00/063400, WO 00/037663 (본 명세서에 참고로 포함됨)에 의해 기재된 바와 같이 진공-기반 일시적 발현 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 아그로접종(Agro-inoculation) 또는 아그로박테리움 침투법(Agro-infiltration), 주사기 침투의 방법을 포함할 수 있지만, 상기 언급된 바와 같이 다른 일시적 방법도 사용될 수 있다. 아그로접종(Agro-inoculation) 또는 아그로박테리움 침투법(Agro-infiltration), 주사기 침투를 이용하여, 원하는 핵산을 포함하는 아그로박테리아의 혼합물이 조직의 세포사이 공간, 예를 들어, 잎, 식물의 지상부 (줄기, 잎 및 꽃 포함), 기타 식물의 일부 (줄기, 뿌리, 꽃) 또는 전체 식물로 들어간다. 표피를 통과한 후, 아그로박테리아는 t-DNA 사본을 감염시키고 그것을 세포로 전달한다. t-DNA는 에피솜에 의해 전사되고 mRNA는 번역되어, 감염된 세포에서 관심 단백질의 생산으로 이어지지만, 핵 내부의 t-DNA의 통과는 일시적이다.
또한 본 발명의 일부로 간주되는 것은 본 명세서에 기재된 일시적 단백질 발현에 적합한 플랫폼 식물로서 사용될 수 있는 본 발명의 유전자 구조물을 함유하는 형질전환식물(transgenic plant), 식물 세포 또는 종자이다. 식물 세포로부터 전체 식물을 재생하는 방법은 당업계에 또한 공지되어 있다 (예를 들어 Guerineau and Mullineaux (1993, Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148 참조). 일반적으로, 형질 전환된 식물 세포는 항생제와 같은 선택(selective) 제제를 포함할 수 있는 적절한 배지에서 배양되며, 여기서는 형질 전환된 식물 세포의 확인을 용이하게 하기 위해 선택가능 마커가 사용된다. 일단 캘러스가 형성되면, 공지된 방법에 따라 적절한 식물 호르몬을 사용하고, 식물 재생을 위해 싹을 발근 배지로 옮겨 싹 형성을 촉진할 수 있다. 이어서, 식물은 종자에서 또는 영양 번식 기술을 사용하여 반복적인 세대를 확립하는데 사용할 수 있다. 또한 형질전환식물은 조직 배양을 사용하지 않고도 생성될 수 있다. 이들 유기체의 안정적인 형질 전환 및 재생방법은 당업계에 확립되어 있으며 당업자에게 공지되어 있다. 이용 가능한 기술은 Vasil et al. (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, VoI I, Il and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984), 및 Weissbach and Weissbach (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989)에서 검토된다. 형질 전환 및 재생된 식물을 얻는 방법은 본 발명에서 중요하지 않다.
식물, 식물의 일부 또는 식물 세포가 둘 이상의 핵산 구조물로 형질전환되거나 공동-형질전환되어야 하는 경우, 핵산 구조물은 한번의 형질주입 사건(single transfection event)으로 아그로박테리움으로 도입되고, 그 결과 핵산이 모아지고(pooling) 박테리아 세포들이 형질감염 된다. 또한, 구조물은 연속적으로 도입될 수 있다. 이 경우, 제 1 구조물은 기재된 바와 같이 아그로박테리움으로 도입되고, 세포는 단독으로 형질전환된 박테리아만이 성장할 수 있는 선택 조건(예컨대, 항생제 존재시) 하에서 성장한다. 제 1 선택 단계 이후, 제 2 핵산 구조물이 기재된 바와 같이, 아그로박테리움으로 도입되고, 세포는 이중-선택 조건 하에서 성장하며, 이중-형질전환된 박테리아만이 성장할 수 있다. 이어서 이중-형질전환된 박테리아는 본 명세서에 기재된 바와 같이 식물, 식물 일부 또는 식물 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있거나, 또는 제 3 핵산 구조체를 수용하도록 추가의 형질전환 단계를 거칠 수 있다.
대안으로, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포가 둘 이상의 핵산 구초제로 형질전환되거나 공동-형질전환되어야 하는 경우, 핵산 구조물은 아그로박테리움 세포의 혼합물을 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 동시-침투시킴으로써, 식물로 도입될 수 있고, 각각의 아그로박테리움 세포는 식물 내에 도입될 하나 이상의 구조물을 포함할 수 있다. 침투 단계 중에 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서의 구조물 내 관심있는 뉴클레오티드 서열의 상대적인 발현 수준을 변화시키기 위하여, 원하는 구조물을 포함하는 다양한 아그로박테리아 집단의 농도가 달라질 수 있다.
서열번호 및 서열 설명
서열번호: 서열설명
서열번호: 1 PDI-H1 Cal DNA
서열번호: 2 PDI-H1 Cal AA
서열번호: 3 PDI-H1 Mich DNA
서열번호: 4 PDI-H1 Mich AA
서열번호: 5 PDI-H1 Mass DNA
서열번호: 6 PDI-H1 Mass AA
서열번호: 7 PDI-H1 CostaR DNA
서열번호: 8 PDI-H1 CostaR AA
서열번호: 9 PDI-H1 Hond DNA
서열번호: 10 PDI-H1 Hond AA
서열번호: 11 PDI-H1 Darw DNA
서열번호: 12 PDI-H1 Darw AA
서열번호: 13 IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c
서열번호: 14 IF-H1cTMCT.S1-4r
서열번호: 15 H1Cal(F390D).r
서열번호: 16 H1Cal(F390D).c
서열번호: 17 PDI-H1 Cal-F390D DNA
서열번호: 18 PDI-H1 Cal-F390D AA
서열번호: 19 H1Cal(L429M).r
서열번호: 20 H1Cal(L429M).c
서열번호: 21 PDI-H1 Cal-L429M DNA
서열번호: 22 PDI-H1 Cal-L429M AA
서열번호: 23 PDI-H1 Cal-F390D+L429M DNA
서열번호: 24 PDI-H1 Cal-F390D+L429M AA
서열번호: 25 H1Mich(N97D).r
서열번호: 26 H1Mich(N97D).c
서열번호: 27 PDI-H1 Mich-N97D DNA
서열번호: 28 PDI-H1 Mich-N97D AA
서열번호: 29 H1Mich(K374E).r
서열번호: 30 H1Mich(K374E).c
서열번호: 31 PDI-H1 Mich-K374E DNA
서열번호: 32 PDI-H1 Mich-K374E AA
서열번호: 33 H1Mich(F390D).r
서열번호: 34 H1Mich(F390D).c
서열번호: 35 PDI-H1 Mich-F390D DNA
서열번호: 36 PDI-H1 Mich-F390D AA
서열번호: 37 H1Mich(L429M).c
서열번호: 38 PDI-H1 Mich-L429M DNA
서열번호: 39 PDI-H1 Mich-L429M AA
서열번호: 40 PDI-H1 Mich-N97D+K374E DNA
서열번호: 41 PDI-H1 Mich-N97D+K374E AA
서열번호: 42 PDI-H1 Mich-F390D+L429M DNA
서열번호: 43 PDI-H1 Mich-F390D+L429M AA
서열번호: 44 PDI-H1 Mich-N97D+F390D+L429M DNA
서열번호: 45 PDI-H1 Mich-N97D+F390D+L429M AA
서열번호: 46 PDI-H1 Mich-K374E+F390D+L429M DNA
서열번호: 47 PDI-H1 Mich-K374E+F390D+L429M AA
서열번호: 48 PDI-H1 Mich-N97D+K374E+F390D+L429M DNA
서열번호: 49 PDI-H1 Mich-N97D+K374E+F390D+L429M AA
서열번호: 50 PDI-H1 Mass-F390D+L429M DNA
서열번호: 51 PDI-H1 Mass-F390D+L429M AA
서열번호: 52 PDI-H1 Mass-N97D+F390D+L429M DNA
서열번호: 53 PDI-H1 Mass-N97D+F390D+L429M AA
서열번호: 54 PDI-H1 Mass-K374E+F390D+L429M DNA
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본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이다.
■ 실시예 1: 인플루엔자 HA 구조물
인플루엔자 HA 구축물은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 생산하였다. 예를 들어, 야생형 A-California-07-09 HA, F390D A-California-07-09 HA 및 F390D+L429M A-California-07-09 HA는 하기 설명된 바대로 클로닝 하였다. 다른 H1 돌연변이는 유사한 기술을 사용하여 얻었으며, HA 서열 프라이머, 주형 및 산물은 실시예 3 (식물에서 인플루엔자 HA 및 VLP 생산) 및 표 4에 설명하였다.
야생형 및 돌연변이 단백질, 프라이머, 주형 및 산물은 하기 표 4에 제공하였다.
A. H1 HA 변형
2X35S/CPMV 160/ PDISP-HA0 H1 A-California-07-09/ NOS (구조물 번호 1314)
알팔파 PDI 분비 신호 펩티드 (PDISP)에 융합된 A/California/07/09의 인플루엔자 HA로부터 성숙한 HA0을 코딩하는 서열을 다음의 PCR-기반 방법을 사용하여 2X35S/CPMV 160/NOS 발현 시스템으로 클로닝 하였다. PDISP-A/California/07/09 암호화 서열을 포함하는 단편은 프라이머 IF-CPMV (fl5'UTR)_SpPDI.c (서열 번호: 13) 및 IF-H1cTMCT.S1-4r (서열 번호: 14)을 사용하고, 주형으로 PDISP-H1 A/California/7/09 유전자 서열 (서열 번호: 1)을 사용하여 증폭하였다. PCR 산물은 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV 160/NOS 발현 시스템으로 클로닝 하였다. 구조물 번호 1190 (도 8)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1190은 2X35S/CPMV 160/NOS-기반 발현 카세트에 관심 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체(acceptor) 플라스미드이다. 또한 알팔파 플라스토시아닌(Plastocyanin) 유전자 프로모터 및 터미네이터 하에서 침묵의 TBSV P19 억제제의 공동-발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 이원(binary) 플라스미드이고 왼쪽에서부터 오른쪽 t-DNA 경계로의 서열은 서열번호: 98에 제공된다. 결과로 생성된 구조물에 번호 1314 (서열 번호: 99)가 주어졌다. 알팔파 PDI 분비 신호 펩티드 (PDISP)에 융합된 A/California/07/09의 인플루엔자 HA로부터의 성숙 HA0의 아미노산 서열은 서열 번호: 2에 제공된다. 플라스미드 1314의 대표도는 도 6A에 제공된다.
2X35S/CPMV 160/ PDISP-HA0 H1 A-California-07-09 (F390D)/ NOS (구조물 번호 2980)
알팔파 PDI 분비 신호 펩티드 (PDISP)에 융합된 A/California/07/09 (F390D)의 인플루엔자 HA로부터 성숙한 HA0을 코딩하는 서열을 다음의 PCR-기반 방법을 사용하여 2X35S/CPMV 160/NOS 발현 시스템으로 클로닝 하였다. PCR의 제 1 라운드에서, 돌연변이 된 F390D 아미노산을 갖는 PDISP-H1 A/California/07/09를 포함하는 단편을 프라이머 IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c (서열 번호: 13) 및 H1Cal(F390D).r (서열 번호: 15)를 사용하고, 주형으로 PDISP-H1 A/Californi/7/09 유전자 서열 (서열 번호: 1)을 사용하여 증폭하였다. H1 A/California/07/09의 나머지와 함께 F390D 돌연변이를 포함하는 제 2 단편은 H1Cal (F390D).c (서열 번호: 16) 및 IF-H1cTMCT.S1-4r (서열 번호: 14)를 사용하고, 주형으로 PDISP-H1 A/California/07/09 유전자 서열 (서열 번호: 1) 사용하여 증폭하였다. 제 2 라운드 증폭을 위하여, 두 증폭의 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 프라이머로 IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c (서열 번호: 13) 및 IF-H1cTMCT.S1-4r (서열 번호: 14)을 사용하였다. 최종 PCR 산물은 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV 160/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 구조물 번호 1190 (도 8)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1190은 2X35S/CPMV 160/NOS-기반 발현 카세트에 관심 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체(acceptor) 플라스미드이다. 또한 알팔파 플라스토시아닌(Plastocyanin) 유전자 프로모터 및 터미네이터 하에서 침묵의 TBSV P19 억제제의 공동-발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 이원(binary) 플라스미드이고 왼쪽에서부터 오른쪽 t-DNA 경계로의 서열은 서열번호: 98에 제공된다. 결과로 생성된 구조물에 번호 2980 (서열 번호: 100)가 주어졌다. A/California/07/09 (F390D)로부터의 돌연변이 된 PDISP-HA의 아미노산 서열은 서열 번호: 18에 제공된다. 플라스미드 2980의 대표도는 도 6B에 제공된다.
2X35S/CPMV 160/ PDISP-HA0 H1 A-California-07-09 (F390D+L429M)/NOS (구조물 번호 2995)
알팔파 PDI 분비 신호 펩티드 (PDISP)에 융합된 A/California/07/09 (F390D+L429M)의 인플루엔자 HA로부터 성숙한 HA0을 코딩하는 서열을 다음의 PCR-기반 방법을 사용하여 2X35S/CPMV 160/NOS 발현 시스템으로 클로닝 하였다. PCR의 제 1 라운드에서, 돌연변이 된 F390D 및 L429M 아미노산을 갖는 PDISP-H1 A/California/07/09를 포함하는 단편을 프라이머 IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c (서열 번호: 13) 및 H1Cal(L429M).r (서열 번호: 19)를 사용하고, 주형으로 PDISP-H1 A/Californi/7/09 (F390D) 유전자 서열 (서열 번호: 17)을 사용하여 증폭하였다. H1 A/California/07/09의 나머지와 함께 L429M 돌연변이를 포함하는 제 2 단편은 H1Cal(L429M).c (서열 번호: 20) 및 IF-H1cTMCT.S1-4r (서열 번호: 14)를 사용하고, 주형으로 PDISP-H1 A/California/07/09 (F390D) 유전자 서열 (서열 번호: 17)을 사용하여 증폭하였다. 제 2 라운드 증폭을 위하여, 두 증폭의 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 프라이머로 IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c (서열 번호: 13) 및 IF-H1cTMCT.S1-4r (서열 번호: 14을 사용하였다. 최종 PCR 산물은 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV 160/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 구조물 번호 1190 (도 8)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1190은 2X35S/CPMV 160/NOS-기반 발현 카세트에 관심 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체(acceptor) 플라스미드이다. 또한 알팔파 플라스토시아닌(Plastocyanin) 유전자 프로모터 및 터미네이터 하에서 침묵의 TBSV P19 억제제의 공동-발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 이원(binary) 플라스미드이고 왼쪽에서부터 오른쪽 t-DNA 경계로의 서열은 서열번호: 98에 제공된다. 결과로 생성된 구조물에 번호 2995서열 번호: 101가 주어졌다. A/California/07/09 (F390D+L429M) 돌연변이 된 PDISP-HA의 아미노산 서열은 서열 번호: 24에 제공된다. 플라스미드 2995의 대표도는 도 6D에 제공된다.
■ 실시예 2: 방법
아그로박테리움 투메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens ) 형질감염(transfection)
아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 AGL1을 D'Aoust 등, 2008 (Plant Biotech. J. 6:930-40)에 기재된 방법을 사용하여 야생형 인플루엔자 HA 또는 돌연변이 인플루엔자 HA 발현 벡터로 전기 천공에 의해 형질 감염하였다. 형질 감염된 아그로박테리움을 10mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES), 20μM 아세토시린곤, 50μg/ml 카나마이신 및 25μg/ml 카르베니실린 pH5.6으로 첨가된 YEB 배지에서 0.6~1.6 사이의 OD600으로 성장 시켰다. 아그로박테리움 현탁액을 사용하기 전에 원심 분리하고 침투 배지 (10mM MgCl2 및 10mM MES pH 5.6)에 재현탁하였다.
식물 바이오매스, 접종 및 아그로박테리움 침투법의 준비
N. benthamiana 식물은 상업용 피트 모스(peat moss) 기질로 채워진 평지에서 종자로부터 재배되었다. 식물은 16/8 광주기 및 25 ℃ 낮 / 20 ℃ 밤의 온도 체제 하에 온실에서 재배하였다. 파종 후 3 주 후, 개별 묘목을 골라서 화분에 이식하고 동일한 환경 조건 하에서 추가로 3 주 동안 온실에 재배하였다.
각 야생형 인플루엔자 HA 또는 돌연변이 인플루엔자 HA 발현 벡터로 형질 감염된 아그로박테리아를 10 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES), 20 μM 아세토시린곤, 50 μg/ml 카나마이신 및 25 μg/ml 카르베니실린 pH 5.6이 첨가된 YEB 배지에서 OD600이 0.6 내지 1.6 에 도달할 때까지 성장시켰다. 아그로박테리움 현탁액을 사용 전에 원심 분리하고 침투 배지 (10mM MgCl2 및 10mM MES pH 5.6)에 재현탁하고 4 ℃에서 밤새 저장하였다. 침투 당일, 배양 배치를 2.5 배양 부피로 희석하고 사용 전에 가온하였다. N. benthamiana의 전체 식물을 2 분 동안 20-40 Torr의 진공 하에 밀폐된 스테인리스 강 탱크에 있는 박테리아 현탁액에 거꾸로 배치하였다. 식물은 수확 때까지 6 일 또는 9 일의 배양 기간 동안 온실로 되돌려 놓았다.
잎 수확 및 전체 단백질 추출
단백질은 회전식 진탕기를 사용하여 실온에서 밤새 효소 추출에 의해 ~ 1 cm2 조각으로 절단된 신선한 바이오 매스로부터 추출하였다. 그리고 나서, 슬러리를 큰 구멍의 나일론 필터를 통해 여과하여 굵고 소화되지 않은 식물 조직을 제거하였다.
"전체 공정 수율"을 얻기 위해, 슬러리를 원심 분리하여 원형질체 및 세포 내 오염물을 제거하였다. 상층액은 심층 여과(depth-filtration)에 의해 정화하였다. 그리고 나서, 정화된 분획은 NaCl의 농도가 증가하는 단계-용리 단계를 통해 양이온 교환 컬럼에 적재하였다. 정제된 VLP를 TFF로 농축하고, 제형 완충액에 대해 정용 여과(diafiltered)하고 필터를 통과시켰다. 정제된 VLP의 단백질 함량은 BCA 법으로 분석하고 활성은 혈구응집법으로 분석하였다. 상대적 수율은 새로운 구조물의 단백질 수율을 대조군으로 사용된 천연(native) 구조물과 비교하여 얻었다.
"밀도 후 구배 수율"을 얻기 위해, 슬러리를 원심 분리하여 원형질체 및 세포 내 오염물을 제거하였다. 상층액을 추가로 원심 분리하여 추가 파편을 제거하였다. 상층액은 유리 섬유 필터를 사용한 심층-여과에 의해 정화하였다. 그리고 나서, 정화된 분획은 불연속 아이오딕사놀 밀도 구배에 적재하였다. 분리 밀도 구배 원심 분리는 다음과 같이 수행하였다: Tris 완충액 (35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15, 10 % 및 5 %의 연속적인 층)에 불연속 아이오딕사놀 밀도 구배를 포함하는 38ml 튜브를 준비하고 정화된 추출물을 덮었다. 구배는 2 시간 동안(4 ℃) 120,000g에서 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 아래에서 위로 수집된 최초 5mL은 버리고, 다음 5mL는 단백질 함량 분석 (BCA), 활성 측정 (혈구응집 분석) 및 감소된 SDS-PAGE에서 HA0 밴드의 강도 측정을 위해 수집하였다 (농도 측정). 상대적 수율은 새로운 구조물로부터의 HA0 밴드 강도를 대조군으로 사용된 천연(native) 구조물과 비교하여 얻었다.
혈구응집 분석
혈구응집 분석은 Nayak and Reichl (2004)에 의해 기재된 방법에 기초하였다. 간단히, 100 μL PBS를 포함하는 V-바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트(V-bottomed 96-well microtiter plate)에서 테스트 샘플 (100 μL)의 연속 이중 희석을 만들어 웰당 100 μL의 희석 된 샘플을 남겼다. 0.25 % 칠면조 (H1 용) 적혈구 현탁액 (Bio Link Inc., Syracuse, NY)의 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 완전한 혈구 응집을 나타내는 가장 높은 희석의 역수를 HA 활성으로 기록하였다. 동시에, 재조합 HA 표준 (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT)을 PBS에 희석하고 각 플레이트에서 대조군으로 실행하였다.
단백질 분석 및 면역블롯팅
면역블롯팅은 TBS-Tween 20 0.1 %에 포함된 2 % 탈지유에서 1/500으로 희석된 1 차 mAb와의 제 1 배양으로 수행하였다. TBS-Tween 20 0.1 %에 포함된 2 % 탈지유에서 1/10000로 희석된 퍼옥시다제-컨쥬게이션된(Peroxydase-conjugated) 염소 항-마우스(goat anti-mouse) (Jackson Immunoresearch, cat #115-035-146)를 화학 발광 검출을 위한 2 차 항체로 사용하였다. 면역 반응 복합체는 루미놀 (Roche Diagnostics Corporation)을 사용하여 화학 발광에 의해 검출되었다. 인간 IgG 항체의 홀스래디쉬 퍼옥시다제-효소 컨쥬게이션을 EZ-Link Plusㄾ Activated Peroxidase conjugation kit (Pierce, Rockford, Ill.)를 사용하여 수행하였다.
■ 실시예 3: 식물에서 인플루엔자 HA 및 VLP 생산
A. H1 HA 변형
인플루엔자 HA 구조물을 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 생산하였다 (실시 예 1 참조). 야생형 및 돌연변이 HA 단백질, 프라이머, 주형 및 산물의 요약을 하기 표 4에 제공하였다. 사용된 서열은 실시예 4 및 서열 목록에 제공하였다.
F390D A/California/07/09 돌연변이 H1
F390D A/California/07/09 돌연변이 H1은 야생형 A/California/07/09 H1의 390 위치에서 페닐알라닌 잔기를 아스파르트산로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 2980). 도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 2980으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/California/07/09 H1 (구조물 # 1314)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 60 % 증가한 것으로 나타났다. 또한, 도 2C에서 보여지듯이, 구조물# 2980으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물은 야생형 구조물로 침투된 식물과 비교하여, 아이오딕사놀 구배 정제 후 VLP 수율에서 대략 60 % 증가를 나타냈다.
L429M A/California/07/09 돌연변이 H1
L429M A/California/07/09 돌연변이 H1은 야생형 A/California/07/09 H1의 429 위치에서 류신 잔기를 메티오닌으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 2962). 도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 2962로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/California/07/09 H1 (구조물 # 1314)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 20 % 증가한 것으로 나타났다. 또한, 도 2C에서 보여지듯이, 구조물# 2962로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물은 야생형 구조물로 침투된 식물과 비교하여, 아이오딕사놀 구배 정제 후 VLP 수율에서 대략 30 % 증가를 나타냈다.
F390D + L429M A/California/07/09 돌연변이 H1
F390D + L429M A/California/07/09 돌연변이 H1은 야생형 A/California/07/09 H1의 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산으로 돌연변이 시키고, 429 위치에서 류신을 메티오닌으로 돌연변이 시킨, 이중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 2995). 도 2B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 2995로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/California/07/09 H1 (구조물 # 1314)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 60 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1
N97D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Michigan/45/15 H1의 97 위치에서 아스파라긴 잔기를 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3774). 도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3774로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 1100 % 증가한 것으로 나타났다.
K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1
K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Michigan/45/15 H1의 374 위치에서 라이신 잔기를 글루탐산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3771). 도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3771로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 1100 % 증가한 것으로 나타났다.
F390D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1
F374D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Michigan/45/15 H1의 390 위치에서 페닐알라닌 잔기를 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3641). 도 3B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3641로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물과 비교하여 유사한 활성의 혈구 응집 역가를 나타났다. 그러나, H1을 포함하는 정제된 VLPs의 전체 공정 수율을 측정하였을 때 야생형에 비해 172% 까지 증가하는 것이 관찰되었다 (도 5C 참조).
L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1
L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Michigan/45/15 H1의 429 위치에서 류신 잔기를 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3643). 도 3B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3643으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 500 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1
N97D + K374E A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Michigan/45/15 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 대체시키고, 374 위치에서 라이신을 글루탐산 잔기로 대체시킨, 이중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 3880). 도 3B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3880으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 1100 % 증가한 것으로 나타났다.
F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1
F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Michigan/45/15 H1의 야생형 서열에, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 이중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 3703). 도 3B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3703으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 1100 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1
N97D + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Michigan/45/15 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 3879). 도 3B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3879로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 2300 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + K374E + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1
N97D + K374E + F390D + L429M A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Michigan/45/15의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 374 위치에서 라이신을 글루탐산으로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 사중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 3881). 도 3B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3881로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 3300 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1
N97D + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1은 야생형 A/Massachusetts/06/17 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4093). 도 4B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4093으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 이중 돌연변이 구조물, F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1 (구조물# 4091)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 40 % 증가한 것으로 나타났다.
K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1
K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1은 야생형 A/Massachusetts/06/17 H1의 야생형 서열에, 374 위치에서 라이신을 글루탐산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4092). 도 4B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4092로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 이중 돌연변이 구조물, F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1 (구조물# 4091)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 50 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1
N97D + K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1은 야생형 A/Massachusetts/06/17 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 374 위치에서 라이신을 글루탐산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 사중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4094). 도 4B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4094로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 이중 돌연변이 구조물, F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1 (구조물# 4091)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 70 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1
N97D + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1은 야생형 A/Costa Rica/0513/16 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4717). 도 4B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4717로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 이중 돌연변이 구조물, F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1 (구조물# 4715)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 100 % 증가한 것으로 나타났다.
K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1
K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1은 야생형 A/Costa Rica/0513/16 H1의 야생형 서열에, 374 위치에서 라이신을 글루탐산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4716). 도 4B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4716으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 이중 돌연변이 구조물, F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1 (구조물# 4715)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 10 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1
N97D + K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1은 야생형 A/Costa Rica/0513/16 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 374 위치에서 라이신을 글루탐산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 사중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4718). 도 4B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4718로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 이중 돌연변이 구조물, F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 돌연변이 H1 (구조물# 4715)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 140 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1
N97D A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1의 97 위치에서 아스파라긴 잔기를 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3950). 도 4A 나타낸 바와 같이, 구조물# 3950으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1 (구조물# 3944)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 300 % 증가한 것으로 나타났다.
K374E A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1
K374E A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1의 374 위치에서 라이신 잔기를 글루탐산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3948). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3948로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1 (구조물# 3944)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 100 % 증가한 것으로 나타났다.
F390D A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1
F374D A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1의 390 위치에서 페닐알라닌 잔기를 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3945). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3945로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1 (구조물# 3944)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 30 % 증가한 것으로 나타났다.
L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1
L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1의 429 위치에서 류신 잔기를 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3949). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3949로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1 (구조물# 3944)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 400 % 증가한 것으로 나타났다.
F390D + L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1
F390D + L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1의 야생형 서열에, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 이중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 3946). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3946으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1 (구조물# 3944)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 300 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + F390D + L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1
N97D + F390D + L429M A/Honduras/17734/16 돌연변이 H1은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 3951). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3951로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Honduras/17734/16 H1 (구조물# 3944)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 600 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D A/Darwin/11/15 돌연변이 H1
N97D A/Darwin/11/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Darwin/11/15 H1의 97 위치에서 아스파라긴 잔기를 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3990). 도 4A 나타낸 바와 같이, 구조물# 3990으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Darwin/11/15 H1 (구조물# 3984)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 200 % 증가한 것으로 나타났다.
K374E A/Darwin/11/15 돌연변이 H1
K374E A/Darwin/11/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Darwin/11/15 H1의 374 위치에서 라이신 잔기를 글루탐산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3988). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3988로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Darwin/11/15 H1 (구조물# 3984)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 300 % 증가한 것으로 나타났다.
F390D A/Darwin/11/15 돌연변이 H1
F374D A/Darwin/11/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Darwin/11/15 H1의 390 위치에서 페닐알라닌 잔기를 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3985). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3985로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Darwin/11/15 H1 (구조물# 3984)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 50 % 증가한 것으로 나타났다.
L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1
L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Darwin/11/15 H1의 429 위치에서 류신 잔기를 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3989). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3989로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Darwin/11/15 H1 (구조물# 3984)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 500 % 증가한 것으로 나타났다.
F390D + L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1
F390D + L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Darwin/11/15 H1의 야생형 서열에, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 이중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 3986). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3986으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Darwin/11/15 H1 (구조물# 3984)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 300 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + F390D + L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1
N97D + F390D + L429M A/Darwin/11/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Darwin/11/15 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 3991). 도 4A에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3991로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Darwin/11/15 H1 (구조물# 3984)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 1100 % 증가한 것으로 나타났다.
F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1
F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1은 야생형 A/Paris/1227/2017 H1의 야생형 서열에, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 이중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4765). 도 4C에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4765로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1 (구조물# 4091)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 117 % 증가한 것으로 나타났다.
K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017
K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1은 야생형 A/Paris/1227/2017 H1의 야생형 서열에, 374 위치에서 라이신을 글루탐산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4766). 도 4C에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4766으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1 (구조물# 4765)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 127 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + F390D + L429M A/Paris/1227/2017
N97D + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1은 야생형 A/Paris/1227/2017 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4767). 도 4C에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4767로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1 (구조물# 4765)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 171 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017
N97D + K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1은 야생형 A/Paris/1227/2017 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 374 위치에서 라이신을 글루탐산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 사중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4768). 도 4C에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4768로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 이중 돌연변이 구조물, F390D + L429M A/Paris/1227/2017 돌연변이 H1 (구조물# 4765)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 230 % 증가한 것으로 나타났다.
F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1
F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1은 야생형 A/Norway/2147/2017 H1의 야생형 서열에, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 이중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4775). 도 4C에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4775로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 돌연변이 H1 (구조물# 4091)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 112 % 증가한 것으로 나타났다.
K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017
K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1은 야생형 A/Norway/2147/2017 H1의 야생형 서열에, 374 위치에서 라이신을 글루탐산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4776). 도 4C에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4776으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1 (구조물# 4775)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 128 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + F390D + L429M A/Norway/2147/2017
N97D + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1은 야생형 A/Norway/2147/2017 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 삼중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4777). 도 4C에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4777로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1 (구조물# 4775)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 200 % 증가한 것으로 나타났다.
N97D + K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017
N97D + K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1은 야생형 A/Norway/2147/2017 H1의 야생형 서열에, 97 위치에서 아스파라긴을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 374 위치에서 라이신을 글루탐산 잔기로 돌연변이 시키고, 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 돌연변이 시키고, 및 429 위치에서 류신을 메티오닌 잔기로 대체시킨, 사중 돌연변이를 도입함으로써 구축되었다 (구조물# 4778). 도 4C에 나타낸 바와 같이, 구조물# 4778로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 이중 돌연변이 구조물, F390D + L429M A/Norway/2147/2017 돌연변이 H1 (구조물# 4775)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 213 % 증가한 것으로 나타났다.
N380A A/Michigan/45/15
N380A A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은 야생형 A/Michigan/45/15 H1의 380 위치에서 아스파라긴을 알라닌 잔기로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3644). 도 3B 및 3C에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3644로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 80 % 증가한 것으로 나타났다.
N380A + F390D A/Michigan/45/15
N380A + F390D A/Michigan/45/15 돌연변이 H1은, 380 위치에서 아스파라긴을 알라닌 잔기로 대체하고, 및 390 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산 잔기로 대체함으로써, 야생형 A/Michigan/45/1 H1에 이중 돌연변이를 도입함으로써 구축하였다 (구조물# 3704). 도 3B에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3704로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Michigan/45/15 H1 (구조물# 3640)으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 약 50 % 증가한 것으로 나타났다. N380A A/Michigan/45/15 돌연변이 H1에서 관찰된 감소된 혈구 응집 역가를 고려할 때, 이러한 결과는 380 위치에서 아스파라긴 잔기의 돌연변이가 식물에서 인플루엔자 HA 단백질의 발현 및/또는 인플루엔자 HA 단백질의 안정성에 부정적인 영향을 미친다는 것을 시사한다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 돌연변이는 식물에서 인플루엔자 HA 단백질 생산 및 VLP 수율을 특이적으로 증가시킨다. 다른 위치에서의 돌연변이는 식물 세포에서 인플루엔자 HA 단백질 축적 또는 VLP 생산에 대해 유의하게 감소하거나 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 인플루엔자 HA 단백질로 성취한(achived) 증가된 혈구 응집 역가는 또한 인플루엔자 H1 HA에 특이적인 것으로 관찰되었다. 유사한 향상은 비-H1(non-H1) 균주로부터 유래된 돌연변이 인플루엔자 HA를 암호화하는 구조물로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) 식물에서는 관찰되지 않았다.
예를 들어, F393D A/Indonesia/5/2005 돌연변이 H5는 야생형 A/Indonesia/5/2005 H5의 393 위치에서 페닐알라닌을 아스파르트산으로 돌연변이시킴으로써 구축되었다 (구조물# 3680). 도 5에 나타낸 바와 같이, 구조물# 3680으로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 정제된 추출물은 야생형 A/Indonesia/5/2005 H5로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 대략 98 % 감소한 것으로 나타났다 (구조물# 2295).
유사하게, F392D A/Egypt/N04915/2014 돌연변이 H5 (구조물# 3690)로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물로부터 정제된 추출물은 야생형 A/Egypt/N04915/2014 H5로 아그로박테리움-침투된(agroinfiltrated) N. benthamiana 식물의 추출물에 비해 혈구 응집 역가가 대략 99 % 감소한 것으로 나타났다. 야생형 A/Egypt/N04915/2014 H5 (구조물 # 3645) (도 5, 표 6 참조).
표 4: 본 원에 기재된 바와 같이 제조된 구출물의 예. 서열은 실시예 4 및 서열 목록에 제공함.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 3: 혈구 응집 역가, 밀도 후 구배 수율 및 전체 공정 수율
측정된 혈구 응집 역가의 요약은 표 5A에 제공한다. 혈구 응집 역가는 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하였다. 상대적인 혈구 응집 역가는 돌연변이 된 또는 변형된 HA 단백질의 혈구 응집 역가를 야생형 HA와 비교함으로써 얻었다 (표 5A).
측정된 밀도 후 구배 수율의 요약은 표 5B에 제공한다. 밀도 후 구배 수율을 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하였다. 상대적인 수율은 돌연변이 된 또는 변형된 HA 단백질의 HA0 밴드 강도를 야생형 HA의 HA0 밴드 강도와 비교함으로써 얻었다 (표 5B).
측정된 전체 공정 수율은 표 5C에 제공한다. 전제 공정 수율은 실시예 2에 기재된 바와 같이 획득하였다. 상대적인 수율은 돌연변이 된 또는 변형된 HA 단백질로 부터의 단백질 수율은 야생형 HA의 단백질 수율과 비교함으로써 얻었다 (표 5C).
표 5A: H1의 상대적인 혈구 응집 역가 요약. 번호 매기기(Numbering)는 A/Michigan/45/15 HA에 따른다.
[표 5A]
Figure pct00005
표 5B: H1의 상대적인 밀도 후 구배 수율 요약. 번호 매기기(Numbering)는 A/Michigan/45/15 HA에 따른다.
[표 5B]
Figure pct00006
표 5C: H1의 상대적인 전체 공정 수율 요약. 번호 매기기(Numbering)는 A/Michigan/45/15 HA에 따른다.
[표 5C]
Figure pct00007
표 6: H5의 상대적인 혈구 응집 역가 요약. 번호 매기기(Numbering)는 H5 A/Indonesia/5/2005에 따른다.
[표6]
Figure pct00008
실시예 4: 서열
하기 서열들이 사용되었다 (표 4 참조).
PDI-H1 Cal DNA (서열 번호: 1)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCTGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACACCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGACTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Cal AA (서열 번호: 2)
MAKNVAIFGLLFSLLVLVPSQIFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
PDI-H1 Mich DNA (서열 번호: 3)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTGGAAGACAAGCATAACGGAAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGTTCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAATTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCAATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCACGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAACTTGATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTTAACCAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTGTGGGGCATTCACCATCCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGACATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAACAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCACAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCGAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAGTATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTTCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTCGGGGCCATTGCCGGCTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAAAATGCCATTGACAAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTGGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATCTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTATCACGATTCAAATGTGAAGAACTTGTATGAAAAAGTAAGAAACCAGTTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAAAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Mich AA (서열 번호: 4)
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PDI-H1 Mass DNA (서열 번호: 5)
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PDI-H1 Mass AA (서열 번호: 6)
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PDI-H1 CostaR DNA (서열 번호: 7)
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PDI-H1 CostaR AA (서열 번호: 8)
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PDI-H1 Hond DNA (서열 번호: 9)
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PDI-H1 Hond AA (서열 번호: 10)
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PDI-H1 Darw DNA (서열 번호: 11)
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PDI-H1 Darw AA (서열 번호: 12)
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IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c (서열 번호: 13)
TCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCT
IF-H1cTMCT.S1-4r (서열 번호: 14)
ACTAAAGAAAATAGGCCTTTAAATACATATTCTACACTGTAGAGAC
H1Cal(F390D).r (서열 번호: 15)
CTCTTTACCTACTGCTGTGTCCTGTGTATTCATCTTTTCAATAACAGAATTTA
H1Cal(F390D).c (서열 번호: 16)
TTATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAAC
PDI-H1 Cal-F390D DNA sequence (서열 번호: 17)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACACCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGACTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAA
PDI-H1 Cal-F390D AA sequence (서열 번호: 18)
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H1Cal(L429M).r (서열 번호: 19)
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H1Cal(L429M).c (서열 번호: 20)
CGAACTGTTGGTTCTAATGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGA
PDI-H1 Cal-L429M DNA sequence (서열 번호: 21)
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PDI-H1 Cal-L429M AA sequence (서열 번호: 22)
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PDI-H1 Cal-F390D+L429M DNA sequence (서열 번호: 23)
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PDI-H1 Cal-F390D+L429M AA sequence (서열 번호: 24)
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H1Mich(N97D).r (서열 번호: 25)
TAGCTCCTCATAATCGATGAAATCTCCTGGGTAACACGTTCCATTGTCTGAA
H1Mich(N97D).c (서열 번호: 26)
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PDI-H1 Mich-N97D DNA (서열 번호: 27)
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H1Mich(F390D).r (서열 번호: 33)
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H1Mich(F390D).c (서열 번호: 34)
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PDI-H1 Mich-K374E+F390D+L429M DNA (서열 번호: 46)
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PDI-H1 Mich-K374E+F390D+L429M AA (서열 번호: 47)
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PDI-H1 Mich-N97D+K374E+F390D+L429M DNA (서열 번호: 48)
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PDI-H1 Mich-N97D+K374E+F390D+L429M AA (서열 번호: 49)
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PDI-H1 Mass-F390D+L429M DNA (서열 번호: 50)
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PDI-H1 Mass-F390D+L429M AA (서열 번호: 51)
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PDI-H1 Mass-N97D+F390D+L429M DNA (서열 번호: 52)
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PDI-H1 Mass-N97D+F390D+L429M AA (서열 번호: 53)
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PDI-H1 Mass-K374E+F390D+L429M DNA (서열 번호: 54)
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PDI-H1 CR-N97D+F390D+L429M AA (서열 번호: 61)
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PDI-H1 CR-K374E+F390D+L429M DNA (서열 번호: 62)
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PDI-H1 CR-N97D+K374E+F390D+L429M DNA (서열 번호: 64)
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PDI-H1 CR-N97D+K374E+F390D+L429M AA (서열 번호: 65)
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PDI-H1 Hond-N97D DNA (서열 번호: 67)
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PDI-H1 Hond-N97D AA (서열 번호: 68)
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H1Hond(K374E).r (서열 번호: 69)
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H1Hond(K374E).c (서열 번호: 70)
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PDI-H1 Hond-K374E DNA (서열 번호: 71)
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PDI-H1 Hond-F390D+L429M DNA (서열 번호: 81)
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PDI-H1 Hond-F390D+L429M AA (서열 번호: 82)
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PDI-H1 Hond-N97D+F390D+L429M DNA (서열 번호: 83)
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PDI-H1 Hond-N97D+F390D+L429M AA (서열 번호: 84)
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PDI-H1 Darw-N97D DNA (서열 번호: 85)
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PDI-H1 Darw-N97D AA (서열 번호: 86)
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H1Darw(K374E).r (서열 번호: 87)
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PDI-H1 Darw-K374E DNA (서열 번호: 88)
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PDI-H1 Darw-F390D DNA (서열 번호: 90)
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PDI-H1 Darw-N97D+F390D+L429M DNA (서열 번호: 96)
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PDI-H1 Darw-N97D+F390D+L429M AA (서열 번호: 97)
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Cloning vector 1190 from left to right T-DNA (서열 번호: 98)
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Construct 1314 from 2X35S prom to NOS term (서열 번호: 99)
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Construct 2980 from 2X35S prom to NOS term (서열 번호: 100)
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Construct 2995 from 2X35S prom to NOS term (서열 번호: 101)
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PDI-H1 Mich-N380A AA (서열 번호: 105)
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H1Mich(N380A+F390D).r (서열 번호: 106)
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PDI-H1 Mich-F390D+N380A DNA (서열 번호: 107)
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PDI-H1 Mich-F390D+N380A AA (서열 번호: 108)
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IF-H5ITMCT.s1-4r (서열 번호: 109)
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PDI-H5 Indo DNA (서열 번호: 110)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCCGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAATTCAACAGAGCAGGTTGACACAATCATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTAAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGGAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTACCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAACCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAGTTTCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAAATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCGATCATGAAGCCTCATCAGGAGTTAGCTCAGCATGTCCATACCTGGGAAGTCCCTCCTTTTTTAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAGAAAAGCTACAATAATACCAACCAAGAGGATCTTTTGGTACTGTGGGGAATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAGGCTATATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCATTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAAAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCTAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCAACAGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGCAGAAGAAAAAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCAATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAATAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTTCTAGATGTCTGGACTTATAATGCCGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTTAAGAACCTCTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTATAAGAAACGGAACGTACAACTATCCGCAGTATTCAGAAGAAGCAAGATTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGGGTAAAATTGGAATCAATAGGAACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGATGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGATCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA
PDI-H5 Indo AA (서열 번호: 111)
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H5Ind(F393D).r (서열 번호: 112)
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H5Ind(F393D).c (서열 번호: 113)
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PDI-H5 Indo-F393D DNA (서열 번호: 114)
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PDI-H5 Indo-F393D AA (서열 번호: 115)
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IF-H5_Egy.r (서열 번호: 116)
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PDI-H5 Egypt DNA (서열 번호: 117)
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PDI-H5 Egypt AA (서열 번호: 118)
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H5Egy(F392D).r (서열 번호: 119)
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H5Egy(F392D).c (서열 번호: 120)
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PDI-H5 Egypt-F392D DNA (서열 번호: 121)
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PDI-H1 Par-F390D+L429M (aa) (서열 번호: 124)
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PDI-H1 Par-K374E+F390D+L429M (nt) (서열 번호: 125)
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PDI-H1 Par-N97D+K374E+F390D+L429M (nt) (서열 번호: 129)
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A/California/7/09 (H1N1) (aa) (서열 번호: 130) GenBank: FJ969540.1
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A/Honduras/17734/16 (H1N1) (aa) (서열 번호: 131)
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A/Darwin/11/15 (H1N1) (aa) (서열 번호: 132)
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A/Costa Rica/0513/16 (H1N1) (aa) (서열 번호: 133)
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A/Michigan/45/15 (H1N1) (aa) (서열 번호: 134) GenBank: KY117023.1
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A/Massachusetts/06/17 (H1N1) (aa) (서열 번호: 135)
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A/Michigan/45/15 (H1N1) (nt) (서열 번호: 136) GenBank: KY117023.1
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A/Norway/2147/2017 (H1N1) (aa) (서열 번호: 139)
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PDI-H1 Par-N97D+K374E+F390D+L429M (aa) (서열 번호: 140)
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모든 인용은 여기에(hereby) 참조로 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 실시예와 관련하여 설명되었다. 그러나, 청구 범위에 정의 된 바와 같이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다수의 변형 및 수정이 이루어질 수있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
<110> MEDICAGO INC. <120> Influenza Virus Hemagglutinin Mutants <130> V811304WO <150> US 62/690,780 <151> 2018-06-27 <160> 148 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1722 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDI-H1 Cal DNA <400> 1 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg ctgacacatt atgtataggt tatcatgcga acaattcaac agacactgta 120 gacacagtac tagaaaagaa tgtaacagta acacactctg ttaaccttct agaagacaag 180 cataacggga aactatgcaa actaagaggg gtagccccat tgcatttggg taaatgtaac 240 attgctggct ggatcctggg aaatccagag tgtgaatcac tctccacagc aagctcatgg 300 tcctacattg tggaaacacc tagttcagac aatggaacgt gttacccagg agatttcatc 360 gattatgagg agctaagaga gcaattgagc tcagtgtcat catttgaaag gtttgagata 420 ttccccaaga caagttcatg gcccaatcat gactcgaaca aaggtgtaac ggcagcatgt 480 cctcatgctg gagcaaaaag cttctacaaa aatttaatat ggctagttaa aaaaggaaat 540 tcatacccaa agctcagcaa atcctacatt aatgataaag ggaaagaagt cctcgtgcta 600 tggggcattc accatccatc tactagtgct gaccaacaaa gtctctatca gaatgcagat 660 gcatatgttt ttgtggggtc atcaagatac agcaagaagt tcaagccgga aatagcaata 720 agacccaaag tgagggatca agaagggaga atgaactatt actggacact agtagagccg 780 ggagacaaaa taacattcga agcaactgga aatctagtgg taccgagata tgcattcgca 840 atggaaagaa atgctggatc tggtattatc atttcagata caccagtcca cgattgcaat 900 acaacttgtc aaacacccaa gggtgctata aacaccagcc tcccatttca gaatatacat 960 ccgatcacaa ttggaaaatg tccaaaatat gtaaaaagca caaaattgag actggccaca 1020 ggattgagga atatcccgtc tattcaatct agaggactat ttggggccat tgccggtttc 1080 attgaagggg ggtggacagg gatggtagat ggatggtacg gttatcacca tcaaaatgag 1140 caggggtcag gatatgcagc cgacctgaag agcacacaga atgccattga cgagattact 1200 aacaaagtaa attctgttat tgaaaagatg aatacacagt tcacagcagt aggtaaagag 1260 ttcaaccacc tggaaaaaag aatagagaat ttaaataaaa aagttgatga tggtttcctg 1320 gacatttgga cttacaatgc cgaactgttg gttctattgg aaaatgaaag aactttggac 1380 taccacgatt caaatgtgaa gaacttatat gaaaaggtaa gaagccagct aaaaaacaat 1440 gccaaggaaa ttggaaacgg ctgctttgaa ttttaccaca aatgcgataa cacgtgcatg 1500 gaaagtgtca aaaatgggac ttatgactac ccaaaatact cagaggaagc aaaattaaac 1560 agagaagaaa tagatggggt aaagctggaa tcaacaagga tttaccagat tttggcgatc 1620 tattcaactg tcgccagttc attggtactg gtagtctccc tgggggcaat cagtttctgg 1680 atgtgctcta atgggtctct acagtgtaga atatgtattt aa 1722 <210> 2 <211> 573 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDI-H1 Cal AA <400> 2 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His 20 25 30 Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val 35 40 45 Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys 50 55 60 Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn 65 70 75 80 Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly 100 105 110 Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln 115 120 125 Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile 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cgattgcaat 900 acaacttgtc agacacccga gggtgctata aacaccagcc tcccatttca gaatatacat 960 ccgatcacaa ttggaaaatg tccaaagtat gtgaaaagca caaaattgag actggccaca 1020 ggattgagga atgtcccatc tattcaatct agaggcctat tcggggccat tgccggcttc 1080 attgaagggg ggtggacagg gatggtagat ggatggtacg gttatcacca tcaaaatgag 1140 caggggtcag ggtatgcagc cgacctgaag agcacacaaa atgccattga caaaattact 1200 aacaaagtaa attctgttat tgaaaagatg aatacacagt tcacagcagt gggtaaagag 1260 ttcaaccact tggaaaaaag aatagagaat ttaaataaaa aagttgatga tggtttcctg 1320 gacatttgga cttacaatgc cgaactgctg gttctattgg aaaatgaaag aactttggac 1380 taccacgatt caaatgtgaa gaacttgtat gaaaaggtaa gaaaccagtt aaaaaacaat 1440 gccaaggaaa ttggaaatgg ttgctttgaa ttttaccaca aatgcgataa cacgtgcatg 1500 gaaagtgtca aaaatgggac ttatgactac ccaaaatact caggggaagc aaaattaaac 1560 agagaaaaaa tagaaggggt aaagctggaa tcaacaagaa tttaccaaat tttggcgatc 1620 tattcaactg tcgccagttc attggtactg gtagtctccc tgggggcaat cagcttctgg 1680 atgtgctcta atgggtctct acagtgtaga atatgtattt aa 1722 <210> 12 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gtaaaaagca caaaattgag actggccaca 1020 ggattgagga atatcccgtc tattcaatct agaggactat ttggggccat tgccggtttc 1080 attgaagggg ggtggacagg gatggtagat ggatggtacg gttatcacca tcaaaatgag 1140 caggggtcag gatatgcagc cgacctgaag agcacacaga atgccattga cgagattact 1200 aacaaagtaa attctgttat tgaaaagatg aatacacagt tcacagcagt aggtaaagag 1260 ttcaaccacc tggaaaaaag aatagagaat ttaaataaaa aagttgatga tggtttcctg 1320 gacatttgga cttacaatgc cgaactgttg gttctaatgg aaaatgaaag aactttggac 1380 taccacgatt caaatgtgaa gaacttatat gaaaaggtaa gaagccagct aaaaaacaat 1440 gccaaggaaa ttggaaacgg ctgctttgaa ttttaccaca aatgcgataa cacgtgcatg 1500 gaaagtgtca aaaatgggac ttatgactac ccaaaatact cagaggaagc aaaattaaac 1560 agagaagaaa tagatggggt aaagctggaa tcaacaagga tttaccagat tttggcgatc 1620 tattcaactg tcgccagttc attggtactg gtagtctccc tgggggcaat cagtttctgg 1680 atgtgctcta atgggtctct acagtgtaga atatgtattt aa 1722 <210> 22 <211> 573 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDI-H1 Cal-L429M AA sequence <400> 22 Met Ala Lys Asn Val Ala 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caaaattgag actggccaca 1020 ggattgagga atatcccgtc tattcaatct agaggactat ttggggccat tgccggtttc 1080 attgaagggg ggtggacagg gatggtagat ggatggtacg gttatcacca tcaaaatgag 1140 caggggtcag gatatgcagc cgacctgaag agcacacaga atgccattga cgagattact 1200 aacaaagtaa attctgttat tgaaaagatg aatacacagg acacagcagt aggtaaagag 1260 ttcaaccacc tggaaaaaag aatagagaat ttaaataaaa aagttgatga tggtttcctg 1320 gacatttgga cttacaatgc cgaactgttg gttctaatgg aaaatgaaag aactttggac 1380 taccacgatt caaatgtgaa gaacttatat gaaaaggtaa gaagccagct aaaaaacaat 1440 gccaaggaaa ttggaaacgg ctgctttgaa ttttaccaca aatgcgataa cacgtgcatg 1500 gaaagtgtca aaaatgggac ttatgactac ccaaaatact cagaggaagc aaaattaaac 1560 agagaagaaa tagatggggt aaagctggaa tcaacaagga tttaccagat tttggcgatc 1620 tattcaactg tcgccagttc attggtactg gtagtctccc tgggggcaat cagtttctgg 1680 atgtgctcta atgggtctct acagtgtaga atatgtattt aa 1722 <210> 24 <211> 573 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDI-H1 Cal-F390D+L429M AA sequence <400> 24 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile 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1380 tatcacgatt caaatgtgaa gaacttgtat gaaaaagtaa gaaaccagtt aaaaaacaat 1440 gccaaggaaa ttggaaacgg ctgctttgaa ttttaccaca aatgcgataa cacgtgcatg 1500 gaaagtgtca aaaatgggac ttatgactac ccaaaatact cagaggaagc aaaattaaac 1560 agagaaaaaa tagatggggt aaagctggaa tcaacaagga tttaccagat tttggcgatc 1620 tattcaactg tcgccagttc attggtactg gtagtctccc tgggggcaat cagcttctgg 1680 atgtgctcta atgggtctct acagtgtaga atatgtattt aa 1722 <210> 32 <211> 573 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDI-H1 Mich-K374E AA <400> 32 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His 20 25 30 Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val 35 40 45 Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys 50 55 60 Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn 65 70 75 80 Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val Glu Thr Ser Asn 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taattcagac aatggaacgt gttacccagg agatttcatc 360 aattatgagg agctaagaga gcaattgagc tcagtgtcat catttgaaag gtttgagata 420 ttccccaaga caagttcatg gcccaatcat gactcgaaca aaggtgtaac ggcagcatgt 480 cctcacgctg gagcaaaaag cttctacaaa aacttgatat ggctagttaa aaaaggaaat 540 tcatacccaa agcttaacca atcctacatt aatgataaag ggaaagaagt cctcgtgctg 600 tggggcattc accatccatc tactactgct gaccaacaaa gtctctatca gaatgcagat 660 gcatatgttt ttgtggggac atcaagatac agcaagaagt tcaagccgga aatagcaaca 720 agacccaaag tgagggatca agaagggaga atgaactatt actggacact agtagagccg 780 ggagacaaaa taacattcga agcaactgga aatctagtgg taccgagata tgcattcaca 840 atggaaagaa atgctggatc tggtattatc atttcagata caccagtcca cgattgcaat 900 acaacttgtc agacacccga gggtgctata aacaccagcc tcccatttca gaatgtgcat 960 ccgatcacaa ttggaaaatg tccaaagtat gtaaaaagca caaaattgag actggccaca 1020 ggattgagga atgttccgtc tattcaatct agaggcctat tcggggccat tgccggcttc 1080 attgaagggg ggtggacagg gatggtagat ggatggtacg gttatcacca tcaaaatgag 1140 caggggtcag gatatgcagc cgacctgaag 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Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Asp Thr Ala 405 410 415 Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn 420 425 430 Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu 435 440 445 Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 450 455 460 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Asn Gln Leu Lys Asn Asn 465 470 475 480 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 485 490 495 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 500 505 510 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys 515 520 525 Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val 530 535 540 Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp 545 550 555 560 Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 570 <210> 147 <211> 1722 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDI-H1 Nor-N97D+K374E+F390D+L429M (nt) <400> 147 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg cggacacatt atgtataggt tatcatgcga acaattcaac agacactgta 120 gacacagtac tagaaaagaa tgtaacagta acacactctg ttaaccttct ggaagacaag 180 cataacggaa aactatgcaa actaagaggg gtagccccat tgcatttggg taaatgtaac 240 attgctggct ggatcctggg aaatccagag tgtgaatcac tctccacagc aagatcatgg 300 tcctacattg tggaaacatc taattcagac aatggaacgt gttacccagg agatttcatc 360 gattatgagg agctaagaga gcaattgagc tcagtgtcat catttgaaag gtttgagata 420 ttccccaaga caagttcatg gcccaatcat gactcgaaca aaggtgtaac ggcagcatgt 480 cctcacgctg gagcaaaaag cttctacaaa aacttgatat ggctagttaa aaaaggaaat 540 tcatacccaa agcttaacca atcctacatt aatgataaag ggaaagaagt cctcgtgctg 600 tggggcattc accatccatc tactactgct gaccaacaaa gtctctatca gaatgcagat 660 gcatatgttt ttgtggggac atcaagatac agcaagaagt tcaagccgga aatagcaaca 720 agacccaaag tgagggatca agaagggaga atgaactatt actggacact agtagagccg 780 ggagacaaaa taacattcga agcaactgga aatctagtgg taccgagata tgcattcaca 840 atggaaagaa atgctggatc tggtattatc atttcagata caccagtcca ggattgcaat 900 acaacttgtc agacacccga gggtgctata aacaccagcc tcccatttca gaatgtgcat 960 ccgatcacaa ttggaaaatg tccaaagtat gtaaaaagca caaaattgag actggccaca 1020 ggattgagga atgttccgtc tattcaatct agaggcctat tcggggccat tgccggcttc 1080 attgaagggg ggtggacagg gatggtagat ggatggtacg gttatcacca tcaaaatgag 1140 caggggtcag gatatgcagc cgacctgaag agcacacaaa atgccattga cgagattact 1200 aacaaagtaa attctgttat tgaaaagatg aatacacagg acacagcagt gggtaaagag 1260 ttcaaccacc tggaaaaaag aatagagaat ctaaataaaa aagttgatga tggtttcctg 1320 gacatttgga cttacaatgc cgaactgttg gttctaatgg aaaatgaaag aactttggac 1380 tatcacgatt caaatgtgaa gaacttgtat gaaaaagtaa gaaaccagtt aaaaaacaat 1440 gccaaggaaa ttggaaacgg ctgctttgaa ttttaccaca aatgcgataa cacgtgcatg 1500 gaaagtgtca aaaatgggac ttatgactac ccaaaatact cagaggaagc aaaattaaac 1560 agagaaaaaa tagatggggt aaagctggaa tcaacaagga tttaccagat tttggcgatc 1620 tattcaactg tcgccagttc attggtactg gtagtctccc tgggggcaat cagcttctgg 1680 atgtgctcta atgggtctct acagtgtaga atatgtattt aa 1722 <210> 148 <211> 573 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDI-H1 Nor-N97D+K374E+F390D+L429M (aa) <400> 148 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His 20 25 30 Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val 35 40 45 Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys 50 55 60 Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn 65 70 75 80 Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Ser Tyr Ile Val Glu Thr Ser Asn Ser Asp Asn Gly 100 105 110 Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln 115 120 125 Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr 130 135 140 Ser Ser Trp Pro Asn His Asp Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys 145 150 155 160 Pro His Ala Gly Ala Lys Ser Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val 165 170 175 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Asn Gln Ser Tyr Ile Asn Asp 180 185 190 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr 195 200 205 Thr Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe 210 215 220 Val Gly Thr Ser Arg Tyr Ser Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Thr 225 230 235 240 Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr 245 250 255 Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu 260 265 270 Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe Thr Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly 275 280 285 Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro Val Gln Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln 290 295 300 Thr Pro Glu Gly Ala Ile Asn Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His 305 310 315 320 Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu 325 330 335 Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly 340 345 350 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 355 360 365 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 370 375 380 Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr 385 390 395 400 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Asp Thr Ala 405 410 415 Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn 420 425 430 Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu 435 440 445 Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 450 455 460 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Asn Gln Leu Lys Asn Asn 465 470 475 480 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 485 490 495 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 500 505 510 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys 515 520 525 Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val 530 535 540 Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp 545 550 555 560 Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 570

Claims (43)

  1. 변형된 인플루엔자 H1 헤마글루티닌 (Hemagglutinin: HA) 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 HA 단백질은 상응하는 야생형 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 하나의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 하나의 치환은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97, 374, 390 또는 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서 있는 것을 특징으로 하는 핵산.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산의 적어도 하나가 비-아스파라긴으로 치환하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산의 적어도 하나가 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산의 적어도 하나가 비-라이신으로 치환하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산의 적어도 하나가 글루탐산 또는 글루탐산의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산의 적어도 하나가 비-페닐알라닌으로 치환하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산의 적어도 하나가 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산의 적어도 하나가 비-류신으로 치환하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산의 적어도 하나가 메티오닌 또는 메티오닌의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  10. 제 8 항 내지 제 9 항에 있어서, 상기 핵산이 제 2 치환을 추가로 포함하며, 상기 제 2 치환은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 380 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산이며, 상기 제 2 치환은 비-아스파라긴으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 H1 A/Michigan/45/15 HA의 380 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산의 제 2 치환은 알라닌 또는 알라닌의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  12. 제 1 항에 있어서, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 1 치환, 상기 치환이 비-페닐알라닌으로의 치환, 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 2 치환, 상기 치환이 비-류신으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 제 1 치환은 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존적 치환으로의 치환, 및 제 2 치환은 메티오닌 또는 메티오닌의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  14. 제 1 항에 있어서, H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 1 치환, 상기 치환이 비-아스파라긴으로의 치환, 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 374위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 2 치환, 상기 치환이 비-라이신으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 제 1 치환은 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존적 치환으로의 치환, 및 제 2 치환은 글루탐산 또는 글루탐산의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  16. 제 1 항에 있어서, H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 1 치환, 상기 치환이 비-아스파라긴으로의 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 2 치환, 상기 치환이 비-페닐알라닌으로의 치환, 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 2 치환, 상기 치환이 비-류신으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 제 1 치환은 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존적 치환으로의 치환, 제 2 치환은 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존적 치환으로의 치환, 및 제 3 치환은 메티오닌 또는 메티오닌의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  18. 제 1 항에 있어서,
    H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 1 치환, 상기 치환이 비-라이신으로의 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 2 치환, 상기 치환이 비-페닐알라닌으로의 치환, 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 2 치환, 상기 치환이 비-류신으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 제 1 치환은 글루탐산 또는 글루탐산의 보존적 치환으로의 치환, 제 2 치환은 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존적 치환으로의 치환, 및 제 3 치환은 메티오닌 또는 메티오닌의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  20. 제 1 항에 있어서, H1 A/Michigan/45/15 HA의 97 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 1 치환, 상기 치환이 비-아스파라긴으로의 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 374 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 2 치환, 상기 치환이 비-라이신으로의 치환, H1 A/Michigan/45/15 HA의 390 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 3 치환, 상기 치환이 비-페닐알라닌으로의 치환, 및 H1 A/Michigan/45/15 HA의 429 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산에서 제 4 치환, 상기 치환이 비-류신으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 제 1 치환은 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존적 치환으로의 치환, 제 2 치환은 글루탐산 또는 글루탐산의 보존적 치환으로의 치환, 제 3 치환은 아스파르트산 또는 아스파르트산의 보존적 치환으로의 치환, 및 제 4 치환은 메티오닌 또는 메티오닌의 보존적 치환으로의 치환인 것을 특징으로 하는 핵산.
  22. 제 3 항, 제 7 항, 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항, 제 19 항 또는 제 21 항의 어느 한 항에서, 상기 아스파르트산의 보존적 치환은 글루탐산, 글루타민, 또는 세린인 것을 특징으로 하는 핵산.
  23. 제 5 항, 제 15 항, 제 19 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 글루탐산의 보존적 치환은 아스파르트산, 글루타민, 아르기닌, 아스파라긴, 히스티딘, 또는 세린인 것을 특징으로 하는 핵산.
  24. 제 9 항, 제 13 항, 제 17 항, 제 19 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 메티오닌의 보존적 치환은 이소류신, 글루타민, 발린 또는 페닐알라닌인 것을 특징으로 하는 핵산.
  25. 제 11 항에 있어서, 상기 알라닌의 보존적 치환은 세린, 글리신, 트레오닌, 시스테인, 또는 발린인 것을 특징으로 하는 핵산
  26. 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항의 핵산에 의해 암호화되는 변형된 인플루엔자 H1 헤마글루티닌 (HA) 단백질.
  27. 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항의 핵산에 의해 암호화되는 변형된 인플루엔자 H1 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자 (VLP)
  28. 다음을 단계를 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생산하는 방법:
    a) 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항의 핵산을 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입하는 단계: 및
    b) 핵산에 의해 암호화된 HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 배양하여, VLP를 생산하는 단계.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 방법은 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 수확하고, VLP를 정제하는 c) 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 다음을 단계를 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생산하는 방법:
    a) 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항의 핵산을 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 제공하는 단계: 및
    b) 핵산에 의해 암호화된 HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 배양하여, VLP를 생산하는 단계.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 방법은 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 수확하고, VLP를 정제하는 c) 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제 28 항 내지 제 31 항의 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된 VLP.
  33. 제 32 항에 있어서, 식물, 식물의 일부, 식물세포로부터 유래된 하나 이상의 지질, 식물-특이적 N-글리칸, 변형된 N-글리칸 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 VLP.
  34. 제 27 항, 제 32 항, 또는 제 33 항의 어느 한 항의 VLP를 대상체, 또는 숙주 동물에게 투여하여 항체 또는 항체 단편을 생산하는 단계를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 방법.
  35. 청구항 34의 방법에 의해 생산된 항체.
  36. 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항의 핵산을 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포.
  37. 제 26 항의 HA 단백질 또는 제 27 항 내지 제 32 항의 VLP를 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포.
  38. 제 27 항, 제 32 항 , 또는 제 33 항의 어는 한 항의 VLP의 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제(adjuvant), 비히클(vehicle) 또는 부형제(excipient)를 포함하는 면역 반응 유도용 조성물.
  39. 대상체에게 인플루엔자 감염에 대한 면역을 유도하기 위한 방법으로서, 제 27 항, 제 32 항 , 또는 제 33 항의 어느 한 항의 VLP를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 VLP는 대상체에게 경구로, 비강내로, 근육내로, 복강내로, 정맥내로 또는 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 다음을 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자 (VLP)의 생산 수율을 증가시키는 방법:
    a) 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항의 핵산을 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입하는 단계; 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항의 핵산을 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 제공하는 단계; 및
    b) 핵산에 의해 암호화된 HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 배양하여, VLP를 변형되지 않은 HA 단백질을 발현하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에 비해 높은 수율로 생산하는 단계.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 방법은 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 수확하고, VLP를 정제하는 c) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 변형된 인플루엔자 H1 혈구응집 (HA) 단백질로서, 야생형 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 하나의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 하나의 치환은 H1 A/Michigan/45/15 HA의 97, 374, 390 또는 429 위치의 아미노산에 상응하는 하나 이상의 아미노산에 존재하는 것을 특징으로 하는 HA 단백질.
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