BR112020026537A2 - Mutantes de hemaglutinina do vírus influenza - Google Patents

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Aurélien Lorin
Alain Doucet
Marc-André D'Aoust
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Abstract

mutantes de hemaglutinina do vírus influenza. a presente invenção refere-se à produção de proteínas virais de influenza modificadas em plantas. mais especificamente, a presente invenção se refere à produção e aumento da produção de partículas semelhantes ao vírus da gripe (vlp) em plantas, em que as vlps compreendem as proteínas virais da gripe modificadas, como a hemaglutinina da gripe modificada (ha). a proteína ha pode compreender uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição quando comparada a uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente. além disso, são fornecidos ácidos nucleicos que codificam a proteína ha modificada. além disso, métodos de produção de uma partícula semelhante ao vírus da influenza (vlp) e métodos de aumento do rendimento de produção de uma partícula semelhante ao vírus da influenza (vlp) em uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal também são fornecidos.

Description

MUTANTES DE HEMAGLUTININA DO VÍRUS INFLUENZA CAMPO DE INVENÇÃO
[0001] A presente invenção se refere à produção de proteínas virais mutantes em plantas. Mais especificamente, a presente invenção se refere à produção e ao aumento da produção de partículas semelhantes ao vírus Influenza em plantas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Os vírus Influenza são vírus de RNA de fita simples envelopados da Família Orthomyxoviridae. Os vírus Influenza são altamente contagiosos e podem causar doenças leves a graves em todas as faixas etárias.
[0003] A vacinação continua sendo o método mais eficaz para prevenir a infecção por Influenza. Convencionalmente, a vacinação é realizada usando formas vivas atenuadas ou totalmente inativadas do vírus, que induzem uma resposta imune quando administradas a um paciente. Para eliminar o risco potencial de vírus vivos atenuados e totalmente inativados adquirindo competência para se replicar e se tornarem infecciosos, vacinas que compreendem proteínas virais recombinantes também têm sido utilizadas para induzir imunidade protetora à infecção por Influenza.
[0004] No entanto, o uso de proteínas virais recombinantes como o componente imunogênico de vacinas está sujeito a uma série de limitações. Em primeiro lugar, na ausência do complemento total de proteínas virais e componentes genéticos necessários para a expressão ideal e dobramento de proteína adequado, o rendimento de proteínas virais recombinantes em sistemas de expressão in vitro padrão pode ser insuficiente para o propósito de produção de vacina. Em segundo lugar, as vacinas de proteína viral recombinante podem exibir baixa imunogenicidade, devido ao dobramento impróprio, má apresentação de antígeno e / ou a geração de uma resposta imune principalmente humoral que é ineficaz em conferir imunidade protetora de longa duração.
[0005] Existem quatro tipos de vírus Influenza: A, B, C e D, dos quais Influenza A e B são os organismos causadores de epidemias de doenças sazonais em humanos.
[0006] Os vírus da Influenza A são ainda divididos com base na expressão de subtipos de glicoproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) na superfície do vírus. Existem 18 subtipos HA diferentes (H1-H18).
[0007] HA é uma lectina trimérica que facilita a ligação da partícula do vírus Influenza a proteínas contendo ácido siálico na superfície das células alvo e medeia a liberação do genoma viral na célula alvo. As proteínas HA compreendem dois elementos estruturais: a cabeça, que é o alvo primário dos anticorpos seroprotetores; e o talo. HA é traduzido como um único polipeptídeo, HA0 (montado como trímeros), que deve ser clivado por uma serina endoprotease entre os subdomínios HA1 (~ 40 kDa) e HA2 (~ 20 kDa). Após a clivagem, os dois domínios de proteína com ligações dissulfeto adotam a conformação necessária para a infecciosidade viral. HA1 forma o domínio da cabeça globular contendo o local de ligação ao receptor (RBS) e é o segmento menos conservado do vírus Influenza. HA2 é uma proteína de membrana integral de passagem única com peptídeo de fusão (FP), ectodomínio solúvel (SE), transmembrana (TM) e cauda citoplasmática (CT) com respectivos comprimentos de aproximadamente 25, 160, 25 e 10 resíduos. HA2 juntamente com os resíduos HA1 terminais N e C formam um domínio da haste, o qual inclui a região transmembranar, e, é relativamente conservado.
[0008] Várias mutações nas proteínas do vírus Influenza, particularmente, Influenza HA, foram investigadas.
[0009] Por exemplo, Castelan-Vega ef al. (AdvAppl Bioinform Chem. 2014; 7: 37-44) usou um algoritmo de predição de estabilidade para comparar 7.479 sequências de aminoácidos de comprimento total de HA do vírus Influenza A (HlNl) pdm09 e identificou que mutações D104N, A259T, S124N e E172K resultou em um aumento previsto da estabilidade do HA contra Influenza. Em contraste, as mutações S206T, K285E e E47K tiveram um efeito desestabilizador previsto no HA.
[0010] Ao comparar as sequências do vírus Influenza A original (HlNl) pdm [A / Califomia / 7/2009] e uma cepa de Influenza emergente [A / Brisbane / 10 / 20l0], Cotter et al. (PLoS Pathog. 20l4; 10 (l): el00383l) identificou que uma mutação E47K na região do caule de A / Califomia / 7/2009 HA estabilizou a estrutura do trímero, baixou o pH para a fusão da membrana e aumentou a estabilidade térmica e ácida do vírus. Cotter et al. além disso, observaram que mutante A / Califbmia / 7/2009 E47K de HA era mais infeccioso em furões do que sua contraparte de tipo selvagem.
[0011] Antanasijevic et al. (J Biol Chem. 2014; 289 (32): 22237-45) investigou as propriedades de estrutura-
função da região do caule do H5 HA por mutagênese dirigida ao local em 14 posições diferentes. Os mutantes A / Vietnam / 1203/04 (H5N1) foram expressos em células HEK 293T e Antanasijevic relatou que a maioria das mutações na região da alça do caule não interrompeu a expressão, o processamento proteolítico, a montagem viral ou a ligação ao receptor. No entanto, Antanasijevic observou que HA1- D26K, HA1-M102L, HA2-V52A e HA2-I55A mutantes (com base na numeração de H3) exibiram níveis significativamente reduzidos de HA total, sugerindo expressão reduzida e / ou montagem de HA em partículas virais. Os mutantes HA1-D26K, HA2-T49A e HA2-M102L também exibiram títulos de hemaglutinação mais baixos em comparação com o vírus do tipo selvagem. Antanasijevic observou adicionalmente que todos os mutantes individuais exibiam entrada diminuída nas células pulmonares A549, com o comprometimento mais pronunciado mostrado nos mutantes HA1-D26K e HA2-I55A. Antanasijivec demonstrou ainda que o mutante HA2-L99A era mais sensível à inibição das células pulmonares A549 pelo anticorpo neutralizante C179 em comparação com o vírus do tipo selvagem, sugerindo que a mutação aumenta a ligação do anticorpo e / ou o modo de ação neutralizante. Em contraste, os mutantes HA1-I28A, HA1-M31A, HA1-M31L, HA2- I45A e HA2-I55V foram tornados menos sensíveis à inibição de entrada pelo anticorpo neutralizante C179.
[0012] o Documento WO 2013/177444 e sua publicação complementar Lu et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111 (1): 125-30) relatou um método para a produção de domínio- tronco HA adequadamente dobrado de A / California / 05/2009
(H1N1) usando uma Escherichia coli isenta de células sistema de expressão de proteínas e um protocolo de redobragem simples. Para induzir a trimerização do domínio da haste de HA, um cloranfenicol acetiltransferase (CAT) ou um domínio dobron foi fundido ao terminal C do HA. Para mitigar a hidrofobicidade recentemente exposta e / ou o emparelhamento de íons intermolecular causando agregação da proteína-tronco HA expressa, cinco grupos de mutações foram avaliados: M1 (I69T + I72E + I74T + C77T); M2 (I69T + I72E + I74T + C77T + F164D); M3 (I69T + I72E + I74T + C77T + F164D + L174D); M4 (F164D); e M5 (F164D + L174D). Lu observou que as mutações M5 (F164D + L174D) pareciam ser as mutações mais influentes para melhorar a solubilidade da proteína-tronco HA. Deleções adicionais (H38 para C43 e C49 para N61) e uma mutação C77T foram feitas para mutantes M5 para evitar a formação de ligações dissulfeto indesejáveis, reduzir a hidrofobicidade de superfície e pI e evitar regiões com estrutura desordenada.
[0013] O Pedido US No. 13/838,796 e sua publicação complementar por Holtz et al. (BMC Biotechnology. 20l4; 14: 111) ensinam a estabilidade melhorada e a potência mantida de HA recombinante pela mutação de resíduos de cisteína na região carboxi terminal da proteína HA, incluindo a transmembrana (TM) e o domínio citosólico (CT). Especificamente, Holtz et al. demonstrar mutações C539A, C546A, C549A, C524S e C528A em HA recombinante Perth / l 6/2009 (H3N2). A mutação de todos os cinco resíduos de cisteína, ou diferentes subconjuntos dos mesmos, resultou em rendimentos de HA, purezas, tamanho de partícula,
atividade de hemaglutinação e termoestabilidade comparável à proteína HA recombinante de tipo selvagem. Em contraste, as mutações C64S e C76S resultaram em expressão de HA significativamente reduzida, indicando o papel crítico desses resíduos no dobramento de HA adequado. Usando um único ensaio de imunodifusão radial (SRID), Holtz et al. também mostram que as mutações de cinco resíduos de cisteína melhoram a potência de HA recombinante em comparação com a proteína de tipo selvagem, evitando a reticulação de dissulfeto nos domínios TM e CT. As proteínas HA mutantes mantêm a potência por pelo menos 12 meses a 25 ° C, enquanto a proteína HA de tipo selvagem exibia menos de 40% de potência após apenas 50 dias após a purificação.
[0014] O documento W02015/020913 ensina a mutação de resíduos específicos em uma ou mais posições selecionadas do grupo de 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 e 435 de Influenza A / Puerto Rico / 8/1934 (H1N1) à tirosina. Essas mutações facilitam a formação de reticulações de di- tirosina que estabilizam ou "bloqueiam" o domínio do pedúnculo da Influenza HA em sua conformação trimérica nativa.
[0015] O documento WO 2013/079473 divulga um HA de Influenza modificado sem um domínio de cabeça globular. O polipeptídeo ensinado no WO 2013/079473 compreende um domínio HA1 onde os aminoácidos 53 a 620 (com referência à numeração A / Brisbane / 59/2007 [H1N1]) são excluídos e substituídos por uma sequência ligada covalentemente de 0 a 10 aminoácidos, e um Domínio HA2, em que o aminoácido C-
terminal do domínio HA1 é um aminoácido diferente de arginina ou lisina, e em que um ou mais aminoácidos na posição 406, 409, 413 e 416 são mutados para um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: serina, treonina, asparagina, glutamina, arginina, histidina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico e glicina.
[0016] O documento WO 2014/191435 da mesma forma ensina um HA de Influenza modificado compreendendo um domínio HA1 tendo um segmento deletado substituído por uma sequência ligada covalentemente de 0 a 50 aminoácidos e um domínio HA2, em que o HA é resistente à clivagem na junção entre HA1 e HA2 e em que um ou mais aminoácidos nas posições 337, 340, 352, 353, 402, 406, 409, 413 e / ou 416 foram mutados.
[0017] Partículas semelhantes a vírus (VLPs) são candidatos potenciais para inclusão em composições imunogênicas. As VLPs se parecem muito com os vírions maduros, mas não contêm material genômico viral. Portanto, as VLPs são de natureza não replicativa, o que as torna seguras para administração como vacina. Além disso, as VLPs podem ser projetadas para expressar glicoproteínas virais na superfície da VLP, que é sua configuração fisiológica mais nativa. Além disso, uma vez que as VLPs se assemelham a vírions intactos e são estruturas particuladas multivalentes, as VLPs podem ser mais eficazes na indução de anticorpos neutralizantes para a glicoproteína do que os antígenos de proteína de envelope solúvel.
[0018] VLPs foram produzidos em plantas (ver, por exemplo, W0 2009/076778; W0 2009/009876; WO 2009/076778; WO
2010/003225; WO 2010/003235; WO 2010/006452; WO 2011/03522; WO 2010/148511; e WO 2014/153674, os quais são aqui incorporados por referência).
[0019] o documento W0 2009/076778 ensina um método de produção de VLPs de Influenza em plantas que compreende a introdução de um ácido nucleico com uma região reguladora ativa na planta operativamente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica um HA de Influenza de uma Influenza tipo A ou tipo B.
[0020] O documento W0 2009/009876 ensina um método de produção de VLPs de HA de Influenza em plantas, em que HA de Influenza se auto-monta em VLPs em células vegetais e botões de membranas de células vegetais.
[0021] O documento W0 2010/003225 divulga um método de produção de VLPs de HA de Influenza em plantas que compreende a introdução de um ácido nucleico com uma região reguladora ativa na planta, operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica um HA de Influenza de A / Califomia / 04/09 (H1N1)
[0022] O documento WO 2010/006452 ensina a produção de VLPs compreendendo proteínas HA de Influenza modificadas, em que locais de glicosilação nas posições 154, 165, 286 ou suas combinações (com referência à numeração A / Vietnam / 1194/04 [H5N1]), foram abolidas por mutação dos resíduos nas referidas posições em aminoácidos diferentes da asparagina. O documento WO 2010/006452 ensina ainda que os aminoácidos nas posições 156, 167, 288, ou combinações dos mesmos, podem ser mutados para resíduos diferentes de serina ou treonina para abolir de forma semelhante a tríade de sinal de glicosilação ligada a "N-X-S/T". Ao deletar seletivamente os locais de glicosilação localizados na cabeça globular da proteína HA, o documento WO 2010/006452 demonstra que a proteína HA resultante aumentou a antigenicidade e a reatividade cruzada mais ampla.
[0023] O documento WO 2011/035422 ensina um método de preparação de VLPs derivadas de plantas compreendendo: a obtenção de uma planta ou matéria vegetal compreendendo VLPs localizadas no apoplasto; produzir uma fração de protoplasto / esferoplasto e uma fração de apoplasto; e recuperar a fração de apoplasto compreendendo as VLPs derivadas de plantas.
[0024] O documento WO 2010/148511 divulga um método para a produção de VLPs de Influenza em plantas, em que as VLPs compreendem proteínas HA quiméricas. As proteínas quiméricas HA compreendem um agrupamento de domínio de haste tendo um subdomínio F'1, F'2 e F; um cluster de domínio principal tendo um subdomínio RB, E1 e E2; e um agrupamento de domínio transmembranar tendo um domínio transmembranar e um domínio de cauda C-terminal, em que pelo menos um subdomínio é derivado de uma primeira cepa de Influenza e os outros subdomínios são derivados de uma ou mais segundas cepas de Influenza.
[0025] O documento WO2014 / 153674 ensina um método de produção de VLPs de Influenza em uma planta, em que as VLPs compreendem HA de Influenza modificado com uma alça proteolítica modificada. A alça proteolítica modificada compreende a remoção do local de clivagem proteolítica entre os domínios HA1 e HA2 do precursor HA0. A proteína HA é, assim, estabilizada e rendimentos de proteína aumentados são alcançados em comparação com a proteína HA nativa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0026] A presente invenção se refere à produção de proteínas virais de Influenza modificadas em plantas. Mais especificamente, a presente invenção se refere à produção e ao aumento da produção de partículas semelhantes ao vírus da Influenza (VLP) em plantas, em que as VLPs compreendem as proteínas virais da Influenza modificadas, por exemplo, uma proteína hemaglutinina (HA) modificada.
[0027] É um objetivo da invenção fornecer um método melhorado para aumentar a produção de VLP de Influenza em plantas.
[0028] De acordo com a presente invenção, é fornecido:
[0029] A. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína hemaglutinina (HA) de Influenza H3 modificada, a proteína HA compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição quando comparada a uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente, sendo que pelo menos uma sendo a substituição em um ou mais aminoácidos correspondentes aos aminoácidos nas posições 382, 384, 392 ou 431 da A/Hong Kong/480l/14 HA.
[0030] A proteína HA pode compreender uma sequência de aminoácidos com uma substituição por uma não asparagina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 382 da A/Hong Kong/480l/14 HA. A proteína HA pode compreender uma sequência de aminoácidos com uma substituição por uma alanina ou uma substituição conservada de alanina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 382 da A/Hong Kong/480l/14 HA.
[0031] A proteína HA pode compreender uma sequência de aminoácidos com uma substituição por uma não-leucina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 384 da A/Hong Kong/480l/14 HA. A proteína HA pode compreender uma sequência de aminoácidos com uma substituição por uma valina ou uma substituição conservada de valina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 384 da A/Hong Kong/480l/14 HA.
[0032] A proteína HA pode compreender uma sequência de aminoácidos com uma substituição por uma não fenilalanina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 392 da A/Hong Kong/480l/14 HA. A proteína HA pode compreender uma sequência de aminoácidos com uma substituição por um ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 392 da A/Hong Kong/480l/l4 HA.
[0033] A proteína HA pode compreender uma sequência de aminoácidos com uma substituição por uma não-leucina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 431 da A/Hong Kong/480l/14 HA. A proteína HA pode compreender uma sequência de aminoácidos com uma substituição por uma metionina ou uma substituição conservada de metionina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 431 da A/Hong Kong/480l/14 HA.
[0034] É ainda fornecido: B. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína hemaglutinina (HA)
de Influenza H3 modificada, a proteína HA compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição quando comparada a uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente, disse pelo menos estando uma substituição em um ou mais do que um aminoácido correspondente aos aminoácidos nas posições 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526 ou 528 da A/Hong Kong/480l/14 HA.
[0036] A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição para uma não asparagina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 382 da A/Hong Kong/480l/14 HA, uma segunda substituição para um não -cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 da A/Hong Kong/480l/14 HA e uma terceira substituição por uma não cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 da A/Hong Kong/480l/l4 HA. A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição por uma alanina ou uma substituição conservada de alanina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 382 da A/Hong Kong/480l/14 HA,
[0037] A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição para um não-leucina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 384 da A/Hong Kong/4801/14 HA, uma segunda substituição para um não-cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 de A/Hong Kong/4801/14 HA e uma terceira substituição para uma não cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 da A/Hong Kong /4801/14 HA.
A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição para uma valina ou uma substituição conservada de valina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 384 da A/Hong Kong/4801/14 HA, uma segunda substituição para um serina ou uma substituição conservada de serina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 da A/Hong Kong/4801/14 HA e uma terceira substituição em uma leucina ou uma substituição conservada de leucina no aminoácido correspondente ao aminoácido em posição 528 da A/Hong Kong/4801/14 HA. [0038] A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição para um não fenilalanina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 392 da A/Hong Kong/4801/14 HA, uma segunda substituição para um não-cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 da A/Hong Kong/4801/14 HA e uma terceira substituição para uma não cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 da A/Hong Kong/4801 / 14 HA.
A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição por um ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 392 da A/Hong Kong/4801/14 HA, uma segunda substituição a uma serina ou uma substituição conservada de serina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 da A/Hong Kong/4801/14 HA e uma terceira substituição para uma leucina ou uma substituição conservada de leucina no aminoácido correspondente ao amino ácido na posição 528 da A/Hong Kong/4801/14 HA.
[0039] A proteína HA pode ainda compreender uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição para não-leucina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 431 da A/Hong Kong/480l/14 HA, uma segunda substituição para um não-cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 da A/Hong Kong/480l/14 HA e uma terceira substituição para uma não cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 da A/Hong Kong/480l/l4 HA. A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição por uma metionina ou uma substituição conservada de metionina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 431 da A/Hong Kong/480l/14 HA,
[0040] A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição para uma não asparagina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 382 da A/Hong Kong/480l/14 HA, uma segunda substituição para um não-leucina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 384 da A/Hong Kong/480l/l4 HA, uma terceira substituição para uma não cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 da A/Hong Kong/480l/14 HA e uma quarta substituição por uma não cisteína no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 da A/Hong Kong/480l/14 HA. A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma primeira substituição por uma alanina ou uma substituição conservada de alanina no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 382 da A/Hong Kong/480l/14 HA,
[0041] A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma substituição nos aminoácidos correspondentes aos aminoácidos nas posições 525, 526 ou 525 e 526 da A/Hong Kong/480l/14 HA, em que a substituição do aminoácido na posição 525 é para uma não- fenilalanina e a substituição do aminoácido na posição 526 é para uma não-leucina. A proteína HA pode compreender ainda uma sequência de aminoácidos com uma substituição nos aminoácidos correspondentes aos aminoácidos nas posições 525, 526 ou 525 e 526 da A/Hong Kong/480l/14 HA, em que a substituição do aminoácido na posição 525 é para uma leucina ou uma substituição conservada de leucina e a substituição do aminoácido na posição 526 é para uma valina ou uma substituição conservada de valina.
[0042] Além disso, são fornecidas proteínas HA codificadas pelos ácidos nucleicos recombinantes conforme descrito em A ou B e partícula semelhante a vírus (VLP) compreendendo a proteína HA codificada pelos ácidos nucleicos recombinantes conforme descrito em A ou B.
[0043] Portanto, é ainda fornecida uma proteína HA modificada compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição quando comparada a uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente, sendo a referida pelo menos uma substituição em um ou mais de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos na posição 382, 384, 392 ou 431 da A/Hong Kong/480l/14 HA.
[0044] Em outro aspecto, é fornecida uma proteína hemaglutinina (HA) de Influenza H3 modificada, a proteína HA compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição quando comparada a uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente, a referida pelo menos uma substituição sendo uma ou mais do que um aminoácido correspondendo aos aminoácidos nas posições 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526 ou 528 da A/Hong Kong/480l/14 HA.
[0045] Além disso, é fornecido um método de produção de uma partícula semelhante ao vírus Influenza (VLP) em uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal, o método compreendendo: a) introdução do ácido nucleico recombinante conforme descrito em A ou B na planta, porção da planta ou célula vegetal; e b) incubar a planta, porção da planta ou célula vegetal sob condições que permitem a expressão da proteína HA codificada pelo ácido nucleico recombinante, produzindo assim a VLP. O método pode compreender ainda uma etapa c) de colheita da planta, porção da planta ou célula vegetal e purificação da VLP.
[0046] É ainda fornecido um método de produção de uma partícula semelhante ao vírus Influenza (VLP) em uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal, compreendendo: a) fornecer uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal compreendendo o ácido nucleico recombinante conforme descrito em A ou B; e b) incubar a planta, porção da planta ou célula vegetal sob condições que permitem a expressão da proteína HA codificada pelo ácido nucleico recombinante, desse modo produzindo o VLP. O método pode compreender ainda uma etapa c) de colheita da planta, porção da planta ou célula vegetal e purificação da VLP.
[0047] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento da produção de uma partícula semelhante ao vírus Influenza (VLP) em uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal, compreendendo: a) a introdução do ácido nucleico recombinante de A ou B na planta, porção da planta ou célula vegetal; ou fornecer uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal compreendendo o ácido nucleico recombinante de A ou B; e b) incubar a planta, porção da planta ou célula vegetal sob condições que permitem a expressão da proteína HA codificada pelo ácido nucleico recombinante, produzindo assim a VLP com um rendimento mais alto em comparação com a planta, porção da planta ou planta célula que expressa uma proteína HA de Influenza não modificada. O método pode compreender ainda uma etapa c) de colheita da planta, porção da planta ou célula vegetal e purificação da VLP.
[0048] Os métodos podem compreender ainda a introdução de um segundo ácido nucleico que codifica uma proteína de canal de prótons; em que a planta, porção da planta ou célula vegetal é incubada sob condições que permitem a expressão da proteína do canal de prótons codificada pelo segundo ácido nucleico. A proteína do canal de prótons pode ser uma proteína do subtipo M2 da Influenza A.
[0049] É ainda fornecido uma VLP produzida pelo método conforme descrito neste relatório descritivo.
[0050] A VLP pode compreender um ou mais de um lipídeo derivado da planta, porção da planta ou célula vegetal, N- glicanos específicos de plantas, N-glicanos modificados ou uma combinação dos mesmos.
[0051] Além disso, é fornecido um método de produção de um anticorpo ou fragmento de anticorpo, o método compreendendo a administração da VLP conforme descrito a um sujeito, ou um animal hospedeiro, produzindo assim o anticorpo ou fragmento de anticorpo. Os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos produzidos pelo método também são fornecidos.
[0052] Além disso, é fornecida uma planta, porção da planta ou célula vegetal compreendendo o ácido nucleico recombinante de A ou B ou a proteína HA codificada pelo ácido nucleico recombinante de A ou B. A proteína HA pode formar VLP. Assim, uma planta, porção da planta ou célula vegetal compreendendo VLP compreendendo a proteína HA codificada pelo ácido nucleico recombinante de A ou B também são fornecidos.
[0053] Além disso, é fornecida uma composição para induzir uma resposta imune que compreende uma dose eficaz da VLP conforme descrito neste relatório descritivo, e um transportador, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um método para induzir imunidade a uma infecção por Influenza em um sujeito, o método compreendendo a administração de VLP conforme descrito também é fornecido. A VLP pode ser administrada ao sujeito por via oral, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.
[0054] Além disso, é fornecida uma proteína hemagglutinina (HA) de Influenza modificada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo de cerca de 30% a cerca de 100% de identidade de sequência ou similaridade de sequência com uma sequência das sequências de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 98, desde que a proteína HA da Influenza compreenda pelo menos na substituição conforme descrito aqui e seja capaz de formar VLPs, induzir uma resposta imune quando administrado a um sujeito, induzir hemaglutinação ou uma combinação dos mesmos.
[0055] Este sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0056] Estas e outras características da invenção se tornarão mais evidentes a partir da seguinte descrição, na qual é feita referência aos desenhos anexos, em que:
[0057] A Figura 1 mostra um alinhamento de sequência das sequências de aminoácidos de hemaglutinina (HA) de A / Bangkok / 3007/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 91); A / Hong Kong / 4801 / l 4 (H3N2) (SEQ ID NO: 92); A / Minnesota / 40/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 93); A / South Australia / l / l6 (H3N2) (SEQ ID NO: 94); A / Pennsylvania / 09/15 (H3N2) (SEQ ID
NO: 95); A / Suíça / 97l5293 / 13 (H3N2) (SEQ ID NO: 96); A / Mississippi / 16/16 (H3N2) (SEQ ID NO: 97); Os resíduos delineados se alinham com os aminoácidos N382, L384, F392, L43lof HA de cepas de Influenza H3 (H3N2), por exemplo A / Hongkong / 4801 / l 4 (H3N2) (SEQ ID NO: 92).
[0058] A Figura 2 mostra os títulos de hemaglutinação de tipo selvagem de A / Suíça / 9715293/13 H3, N382A A / Suíça / 9715293/13 mutante H3, L384V A / Suíça / 9715293/13 mutante H3, F392D A / Suíça / 9715293/13 mutante H3 e L431M A / Suíça / 97l5293 / l3 mutante H3.
[0059] A Figura 3 mostra os títulos de hemaglutinação do tipo selvagem A / Indonésia / 5/2005 H5, tipo selvagem A / Egito / N049l5 / 20l4 H5, F393D A / Indonésia / 5/2005 mutante H5, F393D A / Egito / N049l5 / 20l4 mutante H5, N383A A / Indonésia / 5/2005 mutante H5, e N383A A / Egito / N049l5 / 20l4 mutante H5. A numeração está de acordo com A/Indonesia/5/2005.
[0060] A Figura 4A mostra uma representação esquemática do vetor 3045 (H3 A-Swi-9715293-13 (F392D)). A Figura 4B mostra uma representação esquemática do vetor 3022 (H3 A-Swi-9715293- 13 (L431M)). A Figura 4C mostra uma representação esquemática do vetor 3023 (H3 A-Swi-97l5293- 13 (N382A)). A Figura 4D mostra uma representação esquemática do vetor 3034 (H3 A-Swi-97l5293-l3 (L384V)).
[0061] A Figura 5A mostra uma representação esquemática do vetor 3556 (Vetor para clonagem In-Fusion no cassete de expressão baseado em CPMV 160, além da proteína auxiliar M2 sob o controle do promotor e terminador de plastocianina de alfafa). A Figura 5B mostra uma representação esquemática do vetor 1190 (Vetor para clonagem In-Fusion em Cassete de expressão baseado em CPMV 160).
[0062] A Figura 6A mostra os títulos de hemaglutinação de tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 e CysTM A / Suíça / 97l5293 / 13 mutante H3.
[0063] A Figura 6B mostra os títulos de hemaglutinação do tipo selvagem A / Pennsylvania / 09 / 20l5 H3, e CysTM A / Pennsylvania / 09 / 20l5 mutante H3.
[0064] A Figura 7A mostra os títulos de hemaglutinação de tipo selvagem A / Suíça / 9715293/13 H3, N382A A / Suíça / 9715293/13 mutante H3, L384V A / Suíça / 9715293/13 mutante H3, F392D A / Suíça / 9715293/13 mutante H3, L431M A / Suíça / 97l5293 / l3 mutante H3, A / Suíça / 97l5293 / l3 H3 com modificação CysTM, N382A + CysTM A / Suíça / 97l5293 / l3 mutante H3, L384V + CysTM A / Suíça / 97l5293 / l3 mutante H3, F392D + CysTM A / Suíça / 97l5293 / l3 mutante H3 e L431M + CysTM A / Suíça / 97l5293 / l3 mutante H3. A Figura 7B mostra os rendimentos de VLP de gradiente pós-densidade de CysTM A / Suíça / 97l5293 / l3 mutante H3, N382A + CysTM A / Suíça / 9715293/13 mutante H3, L384V + CysTM A / Suíça / 9715293/13 mutante H3, F392D + CysTM A / Suíça / 9715293/13 mutante H3, e L431M + CysTM A / Suíça / 9715293/13 mutante H3 expresso como porcentagens em relação ao mutante CysTM A / Suíça / 97l5293 / l3 H3. A Figura 7C mostra os títulos de hemaglutinação de tipo selvagem A / Pennsylvania / 09 / 20l5 H3, CysTM A / Pennsylvania / 09 / 20l5 mutante H3, N382A + CysTM A / Pennsylvania / 09 / 20l5 mutante H3 e L384V + CysTM A / Pennsylvania / 09 / 20l5 mutante H3. A Figura 7D mostra os títulos de hemaglutinação de CysTM A / S. Austrália / l / l6 mutante H3 e N382A + L384V + CysTM A / S. Austrália / l / l6 mutante H3. A Figura 7E mostra os títulos de hemaglutinação de CysTM A/Hong Kong/480l/14 mutante H3 e N382A + L384V + CysTM A/Hong Kong/480l/14 mutante H3; CysTM A / Minnesota / 40 / l5 mutante H3 e N382A + L384V + CysTM A / Minnesota / 40/15 mutante H3; CysTM A / S. Austrália / l / l6 mutante H3 e N382A + L384V + CysTM A / S. Austrália / 1/16 mutante H3; CysTM A / Bangkok / 3007/15 mutante H3 e N382A + L384V + CysTM A / Bangkok / 3007/15 mutante H3; CysTM A / Suíça / 9715293/13 mutante H3, e L384V + CysTM A / Suíça / 97l5293 / 13 mutante H3; CysTM A / Mississippi / 16/16 mutante H3 e N382A + L384V + CysTM A / Mississippi / 16/16 mutante H3.
[0065] A Figura 8A mostra uma representação esquemática do vetor 3340 (H3 A-HK-4801-14). A Figura 8B mostra uma representação esquemática do vetor 3341 (H3 A- HK-4801-14). A Figura 8C mostra uma representação esquemática do vetor 3375 (H3 A-HK-4801-14 (N382A + L384V)). A Figura 8D mostra uma representação esquemática do vetor 3914 (H3 A-Minn-40-15). A Figura 8E mostra uma representação esquemática do vetor 3915 (H3 A-Minn-40-l5 (N382A + L384V)). A Figura 8F mostra uma representação esquemática do vetor 3924 (H3 A-SAus-l-16). A Figura 8G mostra uma representação esquemática do vetor 3925 (H3 A- SAus-l-16 (N382A + L384V)). A Figura 8H mostra uma representação esquemática do vetor 3904 (H3 A-Bang-3007- 15). A Figura 81 mostra uma representação esquemática do vetor 3905 (H3 A-Bang-3007-l5 (N382A + L384V)). A Figura 8J mostra uma representação esquemática do vetor 2801 (H3 A- Swi-9715293- 13). A Figura 8K mostra uma representação esquemática do vetor 2811 (H3 A-Swi-9715293- 13). A Figura 8L mostra uma representação esquemática do vetor 3063 (H3 A-Swi-97l5293-l3 (N382A)). A Figura 8M mostra uma representação esquemática do vetor 3074 (H3 A-Swi-9715293- 13 (L384V)). A Figura 8N mostra uma representação esquemática do vetor 3085 (H3 A-Swi-97l5293-l3 (F392D)). A Figura 80 mostra uma representação esquemática do vetor 3062 (H3 A-Swi-9715293-13 (L431M)). A Figura 8P mostra uma representação esquemática do vetor 3312 (H3 A-Penn-09- 15). A Figura 8Q mostra uma representação esquemática do vetor 3313 (H3 A-Penn-09-15). A Figura 8R mostra uma representação esquemática do vetor 3314 (H3 A-Penn-09-15 (N382A)). A Figura 8S mostra uma representação esquemática do vetor 3315 (H3 A-Penn-09-15 (L384V)).
[0066] A Figura 9A mostra uma representação esquemática do vetor 2295 (H5 A-Indo-5-05). A Figura 9B mostra uma representação esquemática do vetor 3680 (H5 A- Indo-5-05 (F393D)). A Figura 9C mostra uma representação esquemática do vetor 3645 (H5 A-Egypt-N04915-14). A Figura 9D mostra uma representação esquemática do vetor 3690 (H5 A-Egypt-N049l5-14 (F392D)).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0067] A seguinte descrição é de uma concretização preferencial.
[0068] Tal como aqui utilizado, os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo", "contendo" e variações gramaticais dos mesmos são inclusivos ou abertos e não excluem elementos e / ou etapas adicionais de métodos não recitados. O termo "consistindo essencialmente em' quando usado neste relatório descritivo em conexão com um produto, uso ou método, denota que elementos adicionais e / ou etapas do método podem estar presentes, mas que essas adições não afetam materialmente a maneira pela qual o método ou uso recitado funções. O termo "consistindo em' quando usado neste documento em conexão com um produto, uso ou método, exclui a presença de elementos adicionais e / ou etapas do método. Um produto, uso ou método aqui descrito como compreendendo certos elementos e / ou etapas também pode, em certas concretizações, consistir essencialmente nesses elementos e / ou etapas, modalidades são especificamente referidas. Além disso, o uso do singular inclui o plural e "ou" significa "e / ou", a menos que indicado de outra forma. A menos que definido de outra forma neste documento, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um técnico versado no assunto. Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "cerca de" se refere a uma variação de aproximadamente +/- 10% de um determinado valor. Deve ser entendido que tal variação está sempre incluída em qualquer valor fornecido aqui, seja ou não especificamente referido. O uso da palavra "um" ou "uma" quando usado neste documento em conjunto com o termo "compreendendo" pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e “Um ou mais de um”.
[0069] O termo "planta", "parte de uma planta", "parte da planta'," matéria da planta", "biomassa da planta", "material da planta", extrato da planta" ou "folhas da planta", conforme usado neste relatório descritivo pode compreender uma planta inteira, tecido, células ou qualquer fração dos mesmos, componentes intracelulares de plantas, componentes extracelulares de plantas, extratos líquidos ou sólidos de plantas, ou uma combinação dos mesmos, que são capazes de fornecer a maquinaria de transcrição, tradução e pós-tradução para a expressão de um ou mais de um ácido nucleico aqui descrito e / ou a partir do qual uma proteína expressa ou VLP pode ser extraída e purificada. As plantas podem incluir, mas não estão limitadas a, plantas herbáceas. Além disso, as plantas podem incluir, mas não estão limitadas a, safras agrícolas incluindo, por exemplo, canola, Brassica spp., Milho, Nicotiana spp., (Tabaco), por exemplo, Nicotiana benthamiana, Nicotiana rustica, Nicotiana, tabacum, Nicotiana alata, Arabidopsis thaliana, alfafa, batata, batata doce (Ipomoea batatus), ginseng, ervilha, aveia, arroz, soja, trigo, cevada, girassol, algodão, milho, centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), cártamo (Carthamus tinctorius).
[0070] O termo "parte da planta", tal como aqui utilizado, se refere a qualquer parte da planta, incluindo, mas não se limitando a folhas, caule, raiz, flores, frutos, uma célula vegetal obtida de folhas, caule, raiz, flores, frutos, um extrato vegetal obtido de folhas, caule, raiz, flores, frutos ou uma combinação dos mesmos. O termo "extrato vegetal", tal como aqui utilizado, se refere a um produto derivado de planta que é obtido após o tratamento de uma planta, uma porção de uma planta, uma célula vegetal ou uma combinação dos mesmos, fisicamente (por exemplo, por congelamento seguido de extração em um tampão adequado), mecanicamente (por exemplo, por trituração ou homogeneização da planta ou porção da planta seguida pela extração em um tampão adequado), enzimaticamente (por exemplo, usando enzimas degradantes da parede celular), quimicamente (por exemplo, usando um ou mais quelantes ou tampões), ou uma combinação dos mesmos.
Um extrato de planta pode ser posteriormente processado para remover componentes indesejáveis da planta, por exemplo, resíduos da parede celular.
Um extrato de planta pode ser obtido para auxiliar na recuperação de um ou mais componentes da planta, porção da planta ou célula vegetal, por exemplo, uma proteína (incluindo complexos de proteínas, supraestruturas de proteínas e / ou VLPs), um ácido nucleico, um lipídio, um carboidrato ou uma combinação dos mesmos da planta, porção da planta ou célula vegetal.
Se o extrato da planta compreende proteínas, então pode ser referido como um extrato de proteína.
Um extrato de proteína pode ser um extrato de planta bruto, uma planta parcialmente purificada ou extrato de proteína, ou um produto purificado, que compreende uma ou mais proteínas, complexos de proteínas, supraestruturas de proteínas e / ou VLPs do tecido vegetal.
Se desejado, um extrato de proteína, ou um extrato de planta, pode ser parcialmente purificado usando técnicas conhecidas por um versado na técnica, por exemplo, o extrato pode ser submetido a precipitação de sal ou pH, centrifugação, centrifugação de densidade de gradiente, filtração, cromatografia, por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade ou uma combinação das mesmas. Um extrato de proteína também pode ser purificado, usando técnicas que são conhecidas por um versado na técnica.
[0071] O termo "construção", "vetor" ou "vetor de expressão", tal como aqui utilizado, se refere a um ácido nucleico recombinante para transferir sequências de ácido nucleico exógenas para células hospedeiras (por exemplo, células vegetais) e dirigir a expressão do ácido nucleico exógeno sequências nas células hospedeiras. "Cassete de expressão" se refere a uma sequência de nucleotídeos compreendendo um ácido nucleico de interesse sob o controle de, e operacionalmente (ou operativamente) ligado a, um promotor apropriado ou outros elementos reguladores para a transcrição do ácido nucleico de interesse em uma célula hospedeira. Como um versado na técnica apreciaria, o cassete de expressão pode compreender uma sequência de terminação (terminadora) que é qualquer sequência que é ativa na planta hospedeira. Por exemplo, a sequência de terminação pode ser derivada do segmento do genoma do RNA-2 de um vírus de RNA bipartido, p.e., um comovírus, a sequência de terminação pode ser um terminador NOS, ou a sequência terminadora pode ser obtida a partir do 3’UTR do gene da plastocianina da alfafa.
[0072] As construções da presente divulgação podem compreender ainda uma região 3' não traduzida (UTR). Uma região 3' não traduzida contém um sinal de poliadenilação e quaisquer outros sinais reguladores capazes de efetuar o processamento de mRNA ou a expressão gênica. O sinal de poliadenilação é geralmente caracterizado por efetuar a adição de trilhas de ácido poliadenílico à extremidade 3 'do precursor de mRNA. Os sinais de poliadenilação são comumente reconhecidos pela presença de homologia com a forma canônica 5 'AATAAA-3', embora variações não sejam incomuns. Exemplos não limitativos de regiões 3' adequadas são as regiões 3' transcritas não traduzidas contendo um sinal de poliadenilação de genes de plasmídeo indutor de tumor de Agrobacterium (Ti), como a nopalina sintase (gene Nos) e genes de plantas, como a proteína de armazenamento de soja genes, a pequena subunidade do gene da ribulose- 1,5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO; US 4,962,028; o qual é incorporado aqui por referência), o promotor usado na regulação da expressão de plastocianina.
[0073] Por "região reguladora", "elemento regulador" ou "promotor" entende-se uma porção do ácido nucleico tipicamente, mas nem sempre, a montante da região de codificação da proteína de um gene, que pode ser composta por DNA ou RNA, ou DNA e RNA. Quando uma região reguladora está ativa, e em associação operativa, ou ligada operativamente, com uma sequência de nucleotídeos de interesse, isso pode resultar na expressão da sequência de nucleotídeos de interesse. Um elemento regulador pode ser capaz de mediar a especificidade do órgão ou controlar a ativação do gene no desenvolvimento ou temporal. Uma "região reguladora" inclui elementos promotores, elementos promotores centrais exibindo uma atividade promotora basal,
elementos que são indutíveis em resposta a um estímulo externo, elementos que medeiam a atividade promotora, como elementos reguladores negativos ou potencializadores de transcrição. "Região reguladora", tal como aqui utilizado, também inclui elementos que são ativos após a transcrição, por exemplo, elementos reguladores que modulam a expressão gênica, tais como potencializadores de tradução e transcrição, repressores de tradução e transcrição, sequências de ativação a montante e determinantes de instabilidade de mRNA. Vários destes últimos elementos podem estar localizados próximos à região de codificação.
[0074] No contexto desta divulgação, o termo "elemento regulador" ou "região reguladora" normalmente se refere a uma sequência de DNA, geralmente, mas nem sempre, a montante (5') da sequência de codificação de um gene estrutural, que controla a expressão da região de codificação, fornecendo o reconhecimento para a RNA polimerase e / ou outros fatores necessários para a transcrição começar em um determinado local. No entanto, deve ser entendido que outras sequências de nucleotídeos, localizadas dentro dos íntrons, ou 3' da sequência, também podem contribuir para a regulação da expressão de uma região de codificação de interesse. Um exemplo de um elemento regulador que fornece o reconhecimento para a RNA polimerase ou outros fatores de transcrição para garantir a iniciação em um determinado local é um elemento promotor. A maioria, mas não todos, os elementos promotores eucarióticos contêm uma caixa TATÁ, uma sequência de ácido nucleico conservada composta por pares de bases de nucleotídeo de adenosina e timidina geralmente situada aproximadamente 25 pares de bases a montante de um local de início da transcrição. Um elemento promotor pode compreender um elemento promotor basal, responsável pela iniciação da transcrição, bem como outros elementos reguladores que modificam a expressão gênica.
[0075] Existem vários tipos de regiões reguladoras, incluindo aquelas que são reguladas pelo desenvolvimento, induzíveis ou constitutivas. Uma região reguladora que é regulada no desenvolvimento, ou controla a expressão diferencial de um gene sob seu controle, é ativada em certos órgãos ou tecidos de um órgão em momentos específicos durante o desenvolvimento desse órgão ou tecido. No entanto, algumas regiões regulatórias que são reguladas pelo desenvolvimento podem preferencialmente estar ativas em certos órgãos ou tecidos em estágios específicos de desenvolvimento, elas também podem estar ativas em uma forma regulada pelo desenvolvimento, ou em um nível basal em outros órgãos ou tecidos dentro da planta. Exemplos de regiões regulatórias específicas de tecido, por exemplo, ver região regulatória específica, incluem o promotor de napina e o promotor de cruciferina (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al, 1994, Plant Cell 14: 125-130). Um exemplo de um promotor específico de folha inclui o promotor de plastocianina (ver US 7.125.978, que é aqui incorporado por referência).
[0076] Uma região reguladora induzível é aquela que é capaz de ativar direta ou indiretamente a transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor.
Na ausência de um indutor, as sequências de DNA ou genes não serão transcritos.
Normalmente, o fator de proteína que se liga especificamente a uma região reguladora induzível para ativar a transcrição pode estar presente em uma forma inativa, que é então direta ou indiretamente convertida na forma ativa pelo indutor.
No entanto, o fator de proteína também pode estar ausente.
O indutor pode ser um agente químico, como uma proteína, metabólito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente por calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente por meio da ação de um patógeno ou agente de doença, como um vírus.
Uma célula vegetal contendo uma região reguladora induzível pode ser exposta a um indutor aplicando externamente o indutor à célula ou planta, tal como por pulverização, rega, aquecimento ou métodos semelhantes.
Os elementos reguladores induzíveis podem ser derivados de genes vegetais ou não vegetais (por exemplo, Gatz, C. e Lenk, IRP, 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). Exemplos de potenciais promotores indutíveis incluem, mas não se limitam a, promotor indutível por tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann.
Rev.
Plant Physiol.
Plant Mol.
Biol. 48, 89- 108), promotor induzível por esteróide (Aoyama, T. e Chua, NH, 1997, Plant J. 2, 397-404) e promotor indutível por etanol (Salter, MG, et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, MX, et al, l998, Nature Biotech. 16, 177-180) genes indutíveis de citocinina IB6 e CKI1 (Brandstatter, I. e Kieber, JJ, l998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T.,
1996, Science 274, 982-985) e o elemento indutível de auxina, DR5 (Ulmasov, T., et al, 1997, Plant Cell 9, 1963- 1971).
[0077] Uma região reguladora constitutiva direciona a expressão de um gene em todas as partes de uma planta e continuamente ao longo do desenvolvimento da planta. Exemplos de elementos reguladores constitutivos conhecidos incluem promotores associados ao transcrito CaMV 35S. (p35S; Odell et al, 1985, Nature, 313: 810-812; que é incorporado aqui por referência), a actina 1 de arroz (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An et al., 1996, Plant J, 10: 107-121), ou tms 2 (US
5.428.147), e triosefosfato isomerase 1 (Xu et. Al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467) genes, o gene da ubiquitina 1 de milho (Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637- 646), os genes da ubiquitina 1 e 6 de Arabidopsis (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), o gene 4A do fator de iniciação da tradução do tabaco (Mandel et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004), o promotor do vírus do mosaico da veia da mandioca, pCAS, (Verdaguer et al, 1996); o promotor da pequena subunidade da ribulose bifosfato carboxilase, pRbcS: (Outchkourov et al, 2003), o pUbi (para monocotiledôneas e dicotiledôneas).
[0078] O termo "constitutivo", tal como aqui utilizado, não indica necessariamente que uma sequência de nucleotídeos sob controle da região reguladora constitutiva é expressa no mesmo nível em todos os tipos de células, mas que a sequência é expressa em uma ampla gama de tipos de células embora a variação na abundância seja freqüentemente observada.
[0079] As construções de expressão, conforme descrito acima, podem estar presentes em um vetor. O vetor pode compreender sequências limítrofes que permitem a transferência e integração do cassete de expressão no genoma do organismo ou hospedeiro. A construção pode ser um vetor binário de planta, por exemplo, um vetor de transformação binário baseado em pPZP (Hajdukiewicz, et al. 1994). Outros exemplos de construção incluem pBinl9 (ver Frisch, DA, LW Harris-Haller, et al. 1995, Plant Molecular Biology 27: 405-409).
[0080] O termo "nativo", "proteína nativa" ou "domínio nativo", tal como aqui utilizado, se refere a uma proteína ou domínio com uma sequência de aminoácidos primária idêntica ao tipo selvagem. Proteínas ou domínios nativos podem ser codificados por sequências de nucleotídeos tendo 100% de similaridade de sequência com a sequência de tipo selvagem. Uma sequência de aminoácidos nativa também pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos otimizada de códon humano (hCod) ou uma sequência de nucleotídeos compreendendo um conteúdo de GC aumentado em comparação com a sequência de nucleotídeos de tipo selvagem, desde que a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos de hCod exiba 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos nativa.
[0081] Por uma sequência de nucleotídeos que é "otimizada para códon humano" ou uma sequência de nucleotídeos "hCod", entende-se a seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para a síntese de uma sequência de oligonucleotídeo ou fragmento desta que se aproxima do uso de códon geralmente encontrado dentro sequência de oligonucleotídeo de uma sequência de nucleotídeo humana. Por "conteúdo de GC aumentado" entende-se a seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para a síntese de uma sequência de oligonucleotídeo ou fragmento da mesma, a fim de abordar o uso de códon que, quando comparado com a sequência de oligonucleotídeo nativa correspondente, compreende um aumento do conteúdo de GC, para exemplo, de cerca de 1 a cerca de 30%, ou qualquer quantidade entre eles, ao longo do comprimento da porção de codificação da sequência de oligonucleotídeo. Por exemplo, de cerca de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30%, ou qualquer quantidade entre eles, ao longo do comprimento da porção de codificação da sequência de oligonucleotídeo. Conforme descrito abaixo, uma sequência de nucleotídeos otimizada por códon humano ou uma sequência de nucleotídeos compreendendo um contato GC aumentado (quando comparado com a sequência de nucleotídeos de tipo selvagem) exibe expressão aumentada dentro de uma planta, porção de uma planta ou uma célula vegetal, quando comparada com expressão da sequência de nucleotídeos otimizada não humana (ou menor teor de GC).
[0082] Proteínas de hemaglutinina (HA) de Influenza modificadas (também denominadas proteína HA modificada, proteína HA de Influenza modificada, HA modificada, HA de Influenza modificada, HA mutante, HA mutante de Influenza, variantes de HA de Influenza ou variantes de HA) e métodos de produção de HA de Influenza modificado proteínas em plantas são aqui descritas. As proteínas HA de Influenza modificadas aqui divulgadas compreendem modificações ou mutações que resultaram em características de HA melhoradas em comparação com HA de tipo selvagem ou proteínas HA não modificadas. Por exemplo, a proteína HA de Influenza modificada pode ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de um aminoácido quando comparada a uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente.
[0083] Exemplos de características melhoradas da proteína HA modificada incluem aumento do rendimento da proteína HA quando expressa em células vegetais em comparação com o tipo selvagem ou HA não modificado da mesma cepa ou subtipo de Influenza que não compreende a (s) modificação (ões) ou mutação (s); título de hemaglutinação melhorado da proteína HA modificada em comparação com o tipo selvagem ou proteína HA não modificada; integridade, estabilidade ou integridade e estabilidade melhoradas de partículas semelhantes a vírus (VLPs) que são compostas pelas proteínas HA modificadas em comparação com a integridade, estabilidade ou ambas as VLPs que compreendem HA de tipo selvagem que não compreende a (s) modificação (ões) ou mutação (ões); aumento do rendimento de VLP quando expresso em células vegetais em comparação com o nível de produção de VLP de tipo selvagem que não compreende a (s) modificação (ões) ou mutação (ões); e uma combinação dos mesmos. Cepas e Subtipos de Influenza
[0084] O termo "subtipo de vírus Influenza", tal como aqui utilizado, se refere às variantes do vírus Influenza A que são caracterizadas por várias combinações das proteínas de superfície viral hemaglutinina (H ou HA) e neuramidase (N). De acordo com o presente relatório descritivo, subtipos de vírus Influenza e hemaglutinina (HA) de tais subtipos de vírus podem ser referidos por seu número H, tal como, por exemplo, "HA do subtipo H3", "H3HA" ou "Influenza H3". O termo "subtipo" inclui especificamente todas as "cepas" individuais dentro de cada subtipo, que geralmente resultam de mutações e podem mostrar diferentes perfis patogênicos. Essas cepas também podem ser referidas como vários "isolados" de um subtipo viral. Consequentemente, conforme usado neste relatório descritivo, os termos "cepas" e "isolados" podem ser usados alternadamente.
[0085] Tradicionalmente, diferentes cepas de Influenza têm sido categorizadas com base, por exemplo, na capacidade da Influenza de aglutinar os glóbulos vermelhos (RBCs ou eritrócitos). Anticorpos específicos para determinadas cepas de Influenza podem se ligar ao vírus e, assim, prevenir tal aglutinação. Os ensaios que determinam os tipos de cepas com base em tal inibição são tipicamente conhecidos como ensaios de inibição da hemaglutinina (ensaios HI ou ensaios HAI) e são métodos padrão e bem conhecidos na técnica para caracterizar cepas de Influenza.
[0086] No entanto, as proteínas HA de diferentes cepas de vírus também mostram similaridade de sequência significativa em ambos os níveis de ácido nucleico e aminoácido. Este nível de similaridade varia quando cepas de subtipos diferentes são comparadas, com algumas cepas exibindo claramente níveis mais altos de similaridade do que outras (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 7643). Os níveis de semelhança de aminoácidos variam entre as estirpes de vírus de um subtipo e as estirpes de vírus de outros subtipos (Air, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1981, 78: 7643). Esta variação é suficiente para estabelecer subtipos discretos e a linhagem evolutiva das diferentes cepas, mas as sequências de DNA e de aminoácidos de diferentes cepas ainda estão prontamente alinhadas usando técnicas convencionais de bioinformática (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 7643; Suzuki e Nei, Mol. Biol. Evol. 2002, 19: 501).
[0087] Múltiplas sequências de nucleotídeos, ou sequências polipeptídicas correspondentes de hemaglutinina (HA), podem ser alinhadas para determinar um "consenso" ou "sequência de consenso" de um subtipo (ver Figura 1).
[0088] Com base nas semelhanças de sequência, os subtipos de vírus Influenza podem ainda ser classificados por referência ao seu grupo filogenético. A análise filogenética (Fouchier et al., J Virol. 2005 Mar; 79 (5): 28l4-22) demonstrou uma subdivisão de HAs que cai em dois grupos principais (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 7643): entre outros, os subtipos Hl, H2, H5 e H9 no grupo filogenético 1 e, inter alia, o H3, H4 e Subtipos H7 no grupo filogenético 2.
[0089] Novas proteínas HA de Influenza, modificações de HA, variantes de proteína HA e mutantes são criadas pela introdução de alterações na sequência de aminoácidos da proteína HA que resulta em uma característica melhorada de
HA como descrito acima. O isolamento de ácidos nucleicos que codificam tais moléculas de HA é rotineiro, assim como a modificação do ácido nucleico para introduzir mudanças na sequência de aminoácidos, por exemplo, por mutagênese dirigida ao local.
[0090] Proteínas HA de Influenza modificadas e métodos de produção de proteínas HA de Influenza modificadas em plantas são descritos neste documento. Foi observado que a modificação, por exemplo, por substituição de aminoácidos específicos em proteínas HA, por exemplo HA do subtipo H3, resulta em características melhoradas da proteína HA modificada quando comparada com a proteína HA de tipo selvagem ou proteína HA não modificada.
[0091] A uma ou mais de uma modificação, mutação ou substituição da proteína HA, conforme descrito neste relatório descritivo, não estão localizadas no domínio da cabeça globular da proteína HA, não estão localizadas em regiões epitópicas conhecidas da proteína HA, nem essas modificações, mutações ou substituições adicionam ou removem locais de glicosilação dentro da proteína HA.
[0092] A proteína HA, proteína HA mutante ou proteína HA modificada, conforme descrito neste relatório descritivo, é modificada e compreende uma ou mais de uma mutação, modificação ou substituição em sua sequência de aminoácidos em qualquer um ou mais aminoácidos que correspondem a um ou mais de uma mutação, ou modificação, em qualquer um ou mais aminoácidos que correspondem às posições 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526 , 527 ou 528 da sequência de aminoácidos da A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO:
92; ver Figura 1).
[0093] Por "corresponder a um aminoácido" ou "correspondendo a um aminoácido", entende-se que um aminoácido corresponde a um aminoácido em um alinhamento de sequência com uma cepa de referência da Influenza, conforme descrito abaixo.
[0094] O número de resíduo de aminoácido ou posição de resíduo de HA está de acordo com a numeração de HA de uma cepa de referência de Influenza. Por exemplo, no caso da Influenza H3, a cepa de referência pode ser A / Hong Kong / 480l / l4 [SEQ ID NO: 92 ver Figura 1]. As posições de aminoácidos correspondentes podem ser determinadas alinhando as sequências de HA (por exemplo H3 HA) com a sequência de HA de sua respectiva cepa de referência. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Matemática. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e visual inspeção (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et ak, eds. suplemento de 1995)). Um alinhamento de sequência de aminoácidos de vários domínios HA de Influenza A, que não devem ser considerados limitantes, é mostrado na Figura
1.
[0095] Quando se refere a modificações, mutantes ou variantes, o resíduo de aminoácido de tipo selvagem (também referido simplesmente como 'aminoácido') é seguido pelo número do resíduo e o aminoácido novo ou substituído. Por exemplo, a substituição de Asparagina (N, Asn) por Alanina (A, Ala) no resíduo ou aminoácido na posição 382 é denominada N382A (ver Tabela 1). 382 (N382A)
[0096] A HA modificada, mutantes de HA ou variantes, por exemplo, H3 de HA modificada, são designados da mesma maneira usando o código de aminoácido de uma única letra para o resíduo de tipo selvagem seguido por sua posição e o código de aminoácido de uma única letra da substituição resíduo. Múltiplos mutantes são indicados por mutantes únicos componentes separados por barras (/) ou sinais de mais (+). Mutações ou modificações no domínio ou região transmembranar (TM) são indicados como (CysTM). Assim, por exemplo, o mutante H3 HA N382A + L384V (CysTM) é um mutante em que Alanina (A, Ala) substitui Asparagina (N, Asp) na posição do resíduo 382 e Valina (V, Val) substitui Leucina (L, Leu) em posição de resíduo 384 e o mutante H3 de HA tem outras mutações no domínio transmembranar.
[0097] Tabela 1. Posições de modificação em HA e a posição de aminoácido / resíduo correspondente nas cepas de referência de Influenza H3 e H5. A modificação exemplificada é mostrada entre colchetes.
Posição da Modificação na HA H H (exemplificativo) 3 HA1 5 HA2 382 (N382A) N N 382 383 384 (L384V) L I 384 385 392 (F392D) F F 392 393 431(L431M) L M 431 432 524 (C524S) C S 524 526 525 (F525L) F L 525 527 526 (L526V) L A 526 528 527 L L 527 529 528 (C528L) C A 528 530 1A/Hong Kong/4801/14 2A / Indonésia / 05/05
[0097] A proteína hemaglutinina (HA) de Influenza modificada pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente.
[0098] Por "substituição de aminoácido" ou "substituição" entende-se a substituição de um aminoácido na sequência de aminoácidos de uma proteína por um aminoácido diferente. Os termos aminoácido, resíduo de aminoácido ou resíduo são usados indistintamente na divulgação. Um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um ou mais aminoácidos que são diferentes do aminoácido original ou de tipo selvagem nesta posição, sem alterar o comprimento total da sequência de aminoácidos da proteína. A substituição ou substituição pode ser induzida experimentalmente pela alteração da sequência de códons em uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína para a sequência de códons de um aminoácido diferente em comparação com o aminoácido original ou de tipo selvagem. A proteína resultante é uma proteína modificada, por exemplo, uma proteína HA modificada de Influenza.
[00100] A HA modificada inclui a proteína HA de ocorrência não natural, tendo pelo menos uma modificação no HA de ocorrência natural e tendo características melhoradas em comparação com a proteína HA de ocorrência natural da qual a sequência de aminoácidos do HA modificada é derivada. As proteínas HA modificadas têm uma sequência de aminoácidos, não encontrada na natureza, que é derivada pela substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de uma proteína HA por um ou mais aminoácidos diferentes.
[00101] Por conseguinte, HA modificada, HA mutante ou HA recombinante se refere a um HÁ, em que a sequência de DNA que codifica a HA de ocorrência natural é modificada para produzir uma sequência de DNA modificada ou mutante que codifica a modificação, mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos HA.
[00102] Alguns dos resíduos identificados para modificação, mutação ou substituição correspondem a resíduos conservados, enquanto outros não. No caso de resíduos não conservados, a substituição de um ou mais aminoácidos é limitada às substituições que produzem um HA modificada que possui uma sequência de aminoácidos que não corresponde à encontrada na natureza. No caso de resíduos conservados, tal modificação, substituição ou substituições também não deve resultar em sequências de HA de ocorrência natural. Substituições conservativas
[00103] Conforme descrito neste relatório descritivo, os resíduos nas proteínas HA podem ser identificados e modificados, substituídos ou mutados para produzir a proteína HA modificada ou variantes da proteína HA. As substituições ou mutações em posições específicas não estão limitadas às substituições de aminoácidos aqui descritas ou como fornecidas nos exemplos. Por exemplo, as variantes de HA podem conter substituições conservadas ou conservativas de substituições de aminoácidos descritas.
[00104] Tal como aqui utilizado, o termo "substituição conservada" ou "substituição conservativa" e variações gramaticais dos mesmos, se refere à presença de um resíduo de aminoácido na sequência da proteína HA que é diferente, mas está na mesma classe de aminoácido como a substituição descrita ou resíduo descrito (isto é, um resíduo não polar substituindo um resíduo não polar, um resíduo aromático substituindo um resíduo aromático, um resíduo polar não carregado substituindo um resíduo polar não carregado, um resíduo carregado substituindo um resíduo carregado). Além disso, as substituições conservativas podem abranger um resíduo com um valor de hidropatia interfacial do mesmo sinal e geralmente de magnitude semelhante ao resíduo que está substituindo o resíduo de tipo selvagem.
[00105] Tal como aqui utilizado, o termo "resíduo não polar" se refere a glicina (G, Gly), alanina (A, Ala), valina (V, Val), leucina (L, Leu), isoleucina (I, II e) e prolina (P, Pro); o termo "resíduo aromático" se refere a fenilalanina (F, Phe), tirosina (Y, Tyr) e triptofano (W, Trp); o termo "resíduo polar não carregado" se refere a serina (S, Ser), treonina (T, Thr), cisteína (C, Cys), metionina (M, Met), asparagina (N, Asn) e glutamina (Q, Gln) ; o termo "resíduo carregado" se refere aos aminoácidos carregados negativamente, ácido aspártico (D, Asp) e ácido glutâmico (E, Glu), bem como aos aminoácidos carregados positivamente lisina (K, Lys), arginina (R, Arg) e histidina (H, His). Outra classificação de aminoácidos pode ser a seguinte: • aminoácidos com cadeia lateral hidrofóbica (alifática): Alanina (A, Ala), Isoleucina (I, IIe), Leucina (L, Leu), Metionina (M, Met) e Valina (V, Val); • aminoácidos com cadeia lateral hidrofóbica (aromático): Fenilalanina (F, Phe), Triptofano (W, Trp), Tirosina (Y, Tyr); • aminoácidos com cadeia lateral neutra polar: Asparagina (N, Asn), Cisteína (C, Cys), Glutamina (Q, Gln),
Serina (S, Ser) e Treonina (T, Thr); · Aminoácidos com cadeias laterais eletricamente carregadas (ácido): ácido aspártico (D, Asp), ácido glutâmico (E, Glu); • aminoácidos com cadeias laterais eletricamente carregadas (básico): Arginina (R, Arg); Histidina (H, His); Lisina (K, Lys), Glicina G, Gly) e Prolina (P, Pro).
[00106] É provável que as substituições conservativas de aminoácidos tenham um efeito semelhante na atividade da variante da proteína HA resultante ou da proteína HA modificada, como a substituição ou modificação original. Mais informações sobre substituições conservativas podem ser encontradas, por exemplo, em Ben Bassat et al. (J. Bacteriol, 169: 751-757, 1987), O'Regan et al. (Gene, 77: 237-251, 1989), Sahin-Toth et al. (Protein ScL, 3: 240-247, 1994), Hochuli et al (Bio / Technology, 6: 1321-1325, 1988) e em livros de texto amplamente usados de genética e biologia molecular.
[00107] As matrizes de Blosum são comumente usadas para determinar o parentesco de sequências polipeptídicas. As matrizes Blosum foram criadas usando um grande banco de dados de alinhamentos confiáveis (o banco de dados BLOCKS), no qual alinhamentos de sequência em pares relacionados por menos do que alguma identidade de porcentagem de limiar foram contados (Henikoff et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992). Um limite de 90% de identidade foi usado para as frequências alvo altamente conservadas da matriz BLOSUM90. Um limite de 65%
de identidade foi usado para a matriz BLOSUM65. Pontuações de zero e acima nas matrizes Blosum são consideradas "substituições conservativas" na identidade de porcentagem selecionada. A tabela a seguir mostra substituições conservativas de aminoácidos exemplares: Tabela 2. Tabela 2. Exemplos de substituições conservativas de aminoácidos. Resíduo Substituições Substituições altamente Substituições conservadas (da Matrix Blossum original altamente conservadas (da Matrix Blossum 65) conservadas 90
[00108] A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína HA modificada pode ser otimizada para uso de códon humano, para maior teor de GC ou uma combinação dos mesmos. A proteína HA modificada pode ser expressa em uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal. A. MODIFICAÇÕES H3 HA
[00109] Proteínas H3 HA de Influenza modificadas e métodos de produção de proteínas H3 HA de Influenza modificadas em plantas são descritos neste documento. Foi observado que a modificação de aminoácidos específicos em proteínas HA do subtipo H3 resulta em características melhoradas da proteína H3 HA modificada em comparação com a proteína H3 HA de tipo selvagem ou proteína H3 HA não modificada.
[00110] Um total de 33 modificações simples, duplas e / ou triplas em resíduos que não fazem parte do HA transmembranar (TM) e domínio citosólico (CT) e / ou modificações em resíduos que fazem parte da transmembrana (TM) e domínio citosólico (CT) de HA foram testados para melhorar as características da proteína H3 HA. Conforme descrito aqui e conforme mostrado nos Exemplos, apenas modificações ou combinações de modificações em posições específicas melhoraram as características da proteína H3 HA. Modificações em 13 posições ou combinações de posições tiveram efeitos negativos sobre as características da proteína H3 HA (dados não mostrados).
[00111] Exemplos de características melhoradas do mutante H3 HA ou da proteína H3 HA modificada incluem, aumento do rendimento ou acúmulo de proteína HA quando expresso em células vegetais em comparação com o tipo selvagem ou HA não modificado da mesma cepa ou subtipo de Influenza que não compreende a (s) modificação (ões) ou mutação (ões); título de hemaglutinação melhorado da proteína HA modificada ou mutada em comparação com a proteína HA de tipo selvagem ou não modificada; integridade, estabilidade ou integridade e estabilidade melhoradas de VLPs que são compostas pelas proteínas HA modificadas em comparação com a integridade, estabilidade ou ambas as VLPs que compreendem HA de tipo selvagem que não compreende a (s) mutação (ões); aumento do rendimento de VLP quando expresso em células vegetais em comparação com o nível de produção de VLP de tipo selvagem que não compreende a (s) modificação (ões) ou mutação (ões); e uma combinação dos mesmos.
[00112] A proteína H3 HA modificada ou proteína H3 HA mutante, conforme descrito neste relatório descritivo, é modificada e compreende uma ou mais de uma mutação, ou modificação, em qualquer um ou mais resíduos no alinhamento de sequência com as posições 382, 384, 392 e / ou 431 da cepa de referência A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92; ver Figura 1). É, portanto, fornecido polipeptídeos de Influenza H3 HA, proteínas e / ou complexos de proteínas, tais como, por exemplo, partículas semelhantes a vírus (VLP) que compreendem modificações ou mutações em uma ou mais das posições de aminoácidos 382, 384, 392 e 431, onde tal a numeração de aminoácidos é baseada na sequência da A / Hong Kong / 480l / l4 como mostrado na Figura 1 (SEQ ID NO: 92), ou em posições de aminoácidos que correspondem a tais posições de aminoácidos, por exemplo, conforme determinado pelo alinhamento de uma sequência de aminoácidos HA para SEQ ID NO: 92.
[00113] A proteína H3 HA modificada aqui descrita inclui a proteína H3 HA com sequências de aminoácidos que têm cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos que codifica HA de H3 (SEQ ID NO: 91-97), em que a sequência de aminoácidos tem um ou mais do que uma mutação ou modificação em qualquer um ou mais resíduos no alinhamento de sequência com as posições 382, 384, 392 e 431 da A/Hong Kong/480l/14 HA (SEQ ID NO: 92).
[00114] Além disso, a proteína H3 HA pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 (SEQ ID NO: 91-97), em que a proteína H3 HA tem uma ou mais de uma mutação, ou modificação, em qualquer uma ou mais resíduos no alinhamento de sequência com as posições 382, 384, 392 e 431 da A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92) HA e em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína hemaglutinina que, quando expressa, forma uma VLP.
[00115] Exemplos não limitativos de cepas das quais o H3 HA pode ser derivado são A / Bangkok / 3007/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 91); A / Hong Kong / 4801/14 (H3N2) (SEQ ID NO: 92); A / Minnesota / 40/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 93); A / South Austrália / l / 16 (H3N2) (SEQ ID NO: 94); A / Pennsylvania / 09/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 95); A / Suíça / 9715293/13 (H3N2) (SEQ ID NO: 96) e A / Mississippi / 16/16 (H3N2) (SEQ ID NO: 97). Modificação na posição 382
[00116] Em um aspecto, é fornecido um H3 HA que pode ter resíduo modificado na posição 382 (numeração de acordo com A/Hong Kong/480l/14 HA numeração, SEQ ID NO: 92).
[00117] Antanasijevic et al. (J Biol Chem. 20l4; 289 (32): 22237-45) investigou as propriedades de estrutura-
função da região do caule do H5 HA por mutagênese dirigida ao local em 14 posições diferentes. Posições mutadas Thr41, Gln42, Ile45, Asn53 e Leu99 de HA2 são altamente conservados e foram concebidos para avaliar a importância desses resíduos para a função de HA. Antanasijevic observou que mutações conservadas nas posições HA1-I28V, HA2-T41 A, HA2- T49A, HA2-N53A e HA2-D57E interrompeu a entrada do vírus. No caso do efeito mutacional na inibição de entrada pela molécula pequena MBX2329, substituições para HA2-Ile45, HA2-Val52, HA2-Asn53 e HA2-Ser54 da face externa e HA2-Leu99 da face interna tiveram os maiores efeitos. Esses resíduos são altamente conservados no Grupo 1 HA (por exemplo, Hl e H5). A posição 53 no HA de H5 de Antanasijevic corresponde à posição 380 em Hl HA e a posição 382 em H3 HA da divulgação atual.
[00118] Foi descoberto inesperadamente que a modificação do resíduo conservado na posição 380 em Hl HA de uma asparagina para alanina levou a uma diminuição de aproximadamente 80% no título de hemaglutinação do Hl HA modificada quando comparado ao Hl HA de tipo selvagem (dados não mostrados). A modificação equivalente em HA de H5 também leva a uma diminuição no título de hemaglutinação (ver Figura 3, Tabela 7). No entanto, a modificação da posição equivalente em HA de H3 (N382A) de uma asparagina em relação à alanina leva a um aumento de aproximadamente 130% no título de hemaglutinação quando comparado ao H3 HA de tipo selvagem (ver Figura 2, Tabela 5).
[00119] Por conseguinte, o resíduo na posição 382 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não asparagina. Por exemplo, o resíduo na posição 382 pode ser modificado para ser um aminoácido hidrofóbico, por exemplo, Alanina ou uma substituição conservada de Alanina, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val).
[00120] Por exemplo, a proteína H3 HA modificada pode ter uma sequência de aminoácidos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre elas, identidade de sequência ou semelhança de sequência, com a sequência de aminoácidos de HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92), em que a sequência de aminoácidos tem uma Alanina (A, Ala) ou uma substituição conservada de Alanina (A, Ala) na posição 382, e em que a sequência não ocorre naturalmente. A substituição conservada de Alanina pode ser, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val).
[00121] O presente relatório descritivo também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um H3 HA modificada com uma substituição nas posições 382, conforme descrito acima, operacionalmente ligado a uma região reguladora ativa em uma planta.
[00122] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência, ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 102), em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem uma Alanina (A, Ala) ou uma conservada substituição de Alanina (A, Ala) na posição 382, e em que a sequência não ocorre naturalmente. A substituição conservada pode ser, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val).
[00123] As sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 102, em que a sequência de nucleotídeos codifica um H3 modificado Proteína HA que tem uma Alanina (A, Ala) ou uma substituição conservada de Alanina (A, Ala) na posição 382, e em que a sequência não ocorre naturalmente. A substituição conservada pode ser, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val).
[00124] Além do resíduo na posição 382, resíduos nas posições 384, 524, 525, 526, 527, 528 ou qualquer combinação dos mesmos pode ser modificada no H3 HA.
[00125] Além disso, é fornecido um método de produção de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos na posição 382 e, opcionalmente, na posição 384, 524, 525, 526, 527, 528 ou qualquer combinação dos mesmos em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00126] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos na posição 382 e, opcionalmente, substituições nas posições 384, 524, 525, 526, 527, 528 ou qualquer combinação das mesmas em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00127] O presente relatório descritivo fornece ainda uma VLP que compreende um H3 HA com uma substituição pelo menos na posição 382 e, opcionalmente, substituições nas posições 384, 524, 525, 526, 527, 528 ou qualquer combinação das mesmas. O VLP pode ser produzido pelo método fornecido pelo presente relatório descritivo. As VLPs que compreendem a H3 HA modificada apresentam características melhoradas quando comparadas às VLPs que compreendem a proteína H3 HA não modificada. Modificação na posição 384
[00128] Em outro aspecto, é fornecido um H3 HA que pode ter um resíduo modificado na posição 384 (numeração A/Hong Kong/480l/14 HA, SEQ ID NO: 92).
[00129] Como mostrado, por exemplo, na Figura 2 e na Tabela 5, tendo o resíduo na posição 384 modificado de Leucina para Valina, levou a um aumento de aproximadamente 200% no título de hemaglutinação em comparação com H3 HA de tipo selvagem.
[00130] Por conseguinte, o resíduo na posição 384 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não-leucina. Por exemplo, o resíduo na posição 384 pode ser modificado para ser, por exemplo, Valina ou uma substituição conservada de Valina que não é Leucina, por exemplo, Isoleucina, Metionina, Alanina ou Treonina.
[00131] Por exemplo, a proteína H3 HA modificada pode ter uma sequência de aminoácidos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos de HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92), em que a sequência de aminoácidos tem uma Valina (V, Val) ou uma substituição conservada de Valina que não é Leucina na posição 384, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que a proteína HA quando expressa forma VLP. A substituição conservada de Valina pode ser, por exemplo, Isoleucina, Metionina, Alanina ou Treonina.
[00132] O presente relatório descritivo também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um H3 HA modificada com uma substituição nas posições 384, conforme descrito acima, operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[00133] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 A / Hong Kong / 480l / l4 (SEQ ID NO: 102), em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem uma Valina (V, Val) ou uma substituição conservada de Valina (V, Val) que não é Leucina na posição 384, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que a sequência de nucleotídeos codifica a proteína HA que, quando expressa, forma VLP. A substituição conservada de Valina pode ser, por exemplo, Isoleucina, Metionina, Alanina ou Treonina.
[00134] As sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 102, em que a sequência de nucleotídeos codifica um H3 modificado Proteína HA que possui uma Valina (V, Val) ou uma substituição conservada de Valina (V, Val) que não é Leucina na posição 384, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que a sequência de nucleotídeo codifica a proteína HA que, quando expressa, forma VLP. A substituição conservada de Valina pode ser, por exemplo, Isoleucina, Metionina, Alanina ou Treonina.
[00135] Além do resíduo na posição 384, os resíduos nas posições 382, 524, 525, 526, 527, 528 ou qualquer combinação dos mesmos podem ser modificados no H3 HA.
[00136] Além disso, é fornecido um método de produção de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos nas posições 384 e, opcionalmente, substituições nas posições 382, 524, 525, 526, 527, 528 ou qualquer combinação das mesmas em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00137] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição de pelo menos 384 e, opcionalmente, substituições nas posições 382, 524, 525, 526, 527, 528 ou qualquer combinação das mesmas, conforme descrito acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00138] O presente relatório descritivo fornece ainda uma VLP que compreende um H3 HA com uma substituição pelo menos na posição 384 e, opcionalmente, substituições nas posições 382, 524, 525, 526, 527, 528 ou qualquer combinação das mesmas. O VLP pode ser produzido pelo método fornecido pelo presente relatório descritivo. As VLPs que compreendem a H3 HA modificada apresentam características melhoradas quando comparadas às VLPs que compreendem a proteína H3 HA não modificada. Modificação na posição 392
[00139] Em outro aspecto, é fornecido um H3 HA que pode ter resíduo modificado na posição 392 (H3 A/Hong
Kong/480l/14 HA numeração, SEQ ID NO: 92).
[00140] Como mostrado, por exemplo, na Figura 2 e na Tabela 5 tendo o resíduo na posição 392 modificado de Fenilalanina para Ácido Aspártico conduzindo a um aumento de aproximadamente 140% no título de hemaglutinação em comparação com H3 HA de tipo selvagem.
[00141] Por conseguinte, o resíduo na posição 392 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não fenilalanina. Por exemplo, o resíduo na posição 392 pode ser modificado para ser, por exemplo, ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico, por exemplo, ácido glutâmico, asparagina, glutamina ou serina.
[00142] Por exemplo, a proteína H3 HA modificada pode ter uma sequência de aminoácidos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos de HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92), em que a sequência de aminoácidos tem um ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico, por exemplo, ácido glutâmico, asparagina, glutamina ou serina na posição 392, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que a proteína HA quando expressa forma VLP. A substituição conservada de ácido aspártico pode ser, por exemplo, ácido glutâmico, asparagina, glutamina ou serina.
[00143] O presente relatório descritivo também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um H3 HA modificada com uma substituição nas posições 392, conforme descrito acima, operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[00144] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 102), em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem um ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico na posição 392, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que a sequência de nucleotídeos codifica Proteína HA que, quando expressa, forma VLP. A substituição conservada de ácido aspártico pode ser, por exemplo, ácido glutâmico, asparagina, glutamina ou serina.
[00145] As sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 102, em que a sequência de nucleotídeos codifica um H3 modificado Proteína HA que tem um ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico na posição 392, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que a sequência de nucleotídeos codifica a proteína HA que, quando expressa, forma VLP. A substituição conservada de ácido aspártico pode ser, por exemplo, ácido glutâmico, asparagina, glutamina ou serina.
[00146] Além disso, é fornecido um método de produção de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos nas posições 392 conforme descrito acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00147] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição de pelo menos 392, conforme descrito acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00148] O presente relatório descritivo fornece ainda uma VLP que compreende um H3 HA com uma substituição pelo menos na posição 392. O VLP pode ser produzido pelo método conforme fornecido pelo presente relatório descritivo. As VLPs que compreendem a H3 HA modificada apresentam características melhoradas quando comparadas às VLPs que compreendem a proteína H3 HA não modificada. Modificação na posição 431
[00149] Em outro aspecto, é fornecido um H3 HA que pode ter resíduo modificado na posição 431 (H3 A/Hong Kong/480l/14 HA numeração, SEQ ID NO: 92).
[00150] Como mostrado, por exemplo, na Figura 2 e na
Tabela 5, tendo o resíduo na posição 431 modificado de Leucina para Metionina levando a um aumento de aproximadamente 170% no título de hemaglutinação em comparação com H3 HA de tipo selvagem.
[00151] Consequentemente, o resíduo na posição 431 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não-leucina. Por exemplo, o resíduo na posição 431 pode ser modificado para ser, por exemplo, metionina ou uma substituição conservada de metionina, por exemplo, leucina, isoleucina, glutamina, valina ou fenilalanina.
[00152] Por exemplo, a proteína H3 HA modificada pode ter uma sequência de aminoácidos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos de HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92), em que a sequência de aminoácidos tem Metionina ou uma substituição conservada de Metionina na posição 431, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que a proteína HA quando expressa forma VLP. A substituição conservada de Metionina pode ser, por exemplo, Leucina, Isoleucina, Glutamina, Valina ou Fenilalanina.
[00153] O presente relatório descritivo também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um H3 HA modificada com uma substituição nas posições 431, conforme descrito acima, operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[00154] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80,85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 102), em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem metionina ou uma substituição conservada de metionina na posição 431, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que a sequência de nucleotídeos codifica a proteína HA que quando expressa forma VLP. A substituição conservada de Metionina pode ser, por exemplo, Leucina, Isoleucina, Glutamina, Valina ou Fenilalanina.
[00155] As sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 102, em que a sequência de nucleotídeos codifica um H3 modificado Proteína HA que tem Metionina ou uma substituição conservada de Metionina na posição 431, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que a sequência de nucleotídeos codifica a proteína HA que, quando expressa, forma VLP. A substituição conservada de ácido aspártico pode ser, por exemplo, leucina, isoleucina, glutamina, valina ou fenilalanina.
[00156] Além disso, é fornecido um método de produção de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos nas posições 431 conforme descrito acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00157] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição de pelo menos 431, conforme descrito acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00158] O presente relatório descritivo fornece ainda uma VLP que compreende um H3 HA com uma substituição pelo menos na posição 431. O VLP pode ser produzido pelo método conforme fornecido pelo presente relatório descritivo. O VLP compreendendo a H3 HA modificada mostra características melhoradas quando comparado a VLPs que compreendem a proteína H3 HA não modificada. B. MODIFICAÇÕES H3 HA Modificação na posição 382, 384, 392, 431 e / ou 524- 528 (“CysTM”)
[00159] Proteínas H3 HA de Influenza modificadas e métodos de produção de proteínas H3 HA de Influenza modificadas em plantas são descritos neste documento. Foi observado que a modificação de aminoácidos específicos em proteínas HA do subtipo H3 resulta em características melhoradas da proteína H3 HA modificada em comparação com a proteína H3 HA de tipo selvagem ou proteína H3 HA não modificada.
[00160] Em um aspecto, os resíduos de cisteína na posição 524 e / ou 528 (numeração H3 A/Hong Kong/4801/14, SEQ ID NO: 92) ou resíduos equivalentes a essas posições, conforme determinado pelo alinhamento, podem ser substituídos por resíduos não cisteína nessas posições. Além disso, os resíduos nas posições 525, 526 e / ou 527 (numeração H3A/Hong Kong/480l/14 HA) também podem ser modificados. Esta modificação ou substituição pode ser referida como a “modificação CysTM”, “CysTM”, “mutação CysTM”, “substituição CysTM” ou “substituição CysTM” ou expressões gramaticalmente equivalentes.
[00161] Pedido US No. 13/838,796 e sua publicação complementar por Holtz et al. (BMC Biotechnology. 20l4; 14: 111) ensinam a estabilidade melhorada e a potência mantida de HA recombinante pela mutação de resíduos de cisteína na região carboxi terminal da proteína HA, incluindo a transmembrana (TM) e o domínio citosólico (CT). Especificamente, Holtz et al. Demonstram mutações C539A, C546A, C549A, C524S e C528A em HA recombinante Perth / l 6/2009 (H3N2). A mutação de todos os cinco resíduos de cisteína, ou diferentes subconjuntos dos mesmos, resultou em rendimentos de HA, purezas, tamanho de partícula, atividade de hemaglutinação e termoestabilidade comparável à proteína HA recombinante de tipo selvagem. Em contraste, as mutações de um par de resíduos de cisteína conservados no ectodomínio conhecido por formar uma ligação dissulfeto (C64S e C76S) resultaram em expressão de HA significativamente reduzida, indicando o papel crítico desses resíduos no dobramento de HA adequado. Usando um único ensaio de imunodifusão radial (SRID), Holtz et al. também mostram que as mutações de cinco resíduos de cisteína melhoram a potência de HA recombinante em comparação com a proteína de tipo selvagem, evitando a reticulação de dissulfeto nos domínios TM e CT. As proteínas HA mutantes mantêm a potência por pelo menos 12 meses a 25 ° C, enquanto a proteína HA de tipo selvagem exibiu menos de 40% de potência após apenas 50 dias após a purificação.
[00162] Xu et al. (Virus Genes (2013) 47: 20-26) mostraram que HAs H3 mutantes com mutações de uma ou duas das cisteínas TM (C540 / 544) poderiam ser expressas adequadamente nas células, no entanto, o mutante exibiu menor resistência térmica e maior atividade de fusão em comparação com proteínas H3 HA de tipo selvagem. [00163] Um total de 33 modificações simples, duplas ou triplas em combinação com modificações na transmembrana (TM) como aqui descrito ("modificação CysTM") foram testadas para melhorar as características da proteína H3 HA. Conforme descrito aqui e conforme mostrado nos Exemplos, apenas modificações ou combinações de modificações em certas posições melhoraram as características da proteína H3 HA. Modificações em 13 posições ou combinações de posições tiveram efeitos negativos sobre as características da proteína H3 HA (dados não mostrados).
[00164] Exemplos de características melhoradas da proteína H3 HA mutante incluem, aumento do rendimento da proteína HA quando expressa em células vegetais em comparação com o tipo selvagem ou HA não modificado da mesma cepa ou subtipo de influenza que não compreende a (s) modificação (ões) ou mutação (ões); título de hemaglutinação melhorado da proteína HA modificada ou mutada em comparação com a proteína HA de tipo selvagem ou não modificada; integridade, estabilidade ou integridade e estabilidade melhoradas de VLPs que são compostas pelas proteínas HA modificadas em comparação com a integridade, estabilidade ou ambas as VLPs que compreendem HA de tipo selvagem que não compreende a (s) mutação (ões); aumento do rendimento de VLP quando expresso em células vegetais em comparação com o nível de produção de VLP de tipo selvagem que não compreende a (s) modificação (ões) ou mutação (ões); e uma combinação dos mesmos.
[00165] Em um aspecto, é fornecido um H3 HA modificada com resíduos de cisteína na posição 524 e / ou 528 (numeração A / Hong Kong / 480l / l4) ou resíduos equivalentes a essas posições, conforme determinado pelo alinhamento substituído por não cisteína resíduos nessas posições. Por exemplo, um resíduo de cisteína na posição 524 pode ser substituído por uma serina (S, Ser) ou uma substituição conservada de serina ou uma cisteína na posição 528 pode ser substituída por uma leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de leucina.
[00166] Além disso, a sequência entre as duas cisteínas na posição 524 e 528 (numeração A/Hong Kong/480l/14, SEQ ID NO: 92) também pode ser modificada. Por exemplo, na sequência
“C524X525X526X527C528”, C524 (posição 524) pode ser substituído por uma Serina (S, Ser) ou uma substituição conservada de Serina; se X 525 (posição 525) não for Leucina, o resíduo X525 pode ser substituído por Leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de Leucina; se X 526 (posição 526) não for Valina, X 526 pode ser substituído por Valina (V, Val) ou uma substituição conservada de Valina; se X 527 (posição 527) não for Leucina, o resíduo na posição X527 pode ser substituído por Leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de Leucina e C 528(posição 528) pode ser substituída por uma Leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de Leucina. Por exemplo, em uma modalidade, a sequência "CFLLC" na posição 524 a 528 pode ser substituída pela sequência "SLVLL" (SEQ ID NO: 98).
[00167] As proteínas HA de outras cepas além da Influenza H3 que têm resíduos de cisteína na posição 524 e / ou 528 ou resíduos equivalentes a essas posições, conforme determinado pelo alinhamento, também podem ser modificadas conforme descrito aqui. Por exemplo, proteínas HA de cepas de Influenza B que têm resíduos de cisteína em posições que são equivalentes à posição 524 e / ou 528 de H3 HA podem ser modificadas para resíduos de não cisteína conforme descrito aqui.
[00168] Além da mutação do domínio transmembranar, como aqui descrito, as proteínas H3 HA modificadas podem compreender ainda uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 382, 384, 392 e / ou 431, que resultou em característica melhorada da proteína HA3 modificada, ou VLP produzida usando a proteína HA modificada. Deve ser entendido que a característica melhorada não está limitada à substituição do aminoácido específico nos locais especificados, como um versado na técnica entenderia que os aminoácidos com propriedades semelhantes podem ser substituídos pelos aminoácidos nas posições identificadas.
[00169] Por conseguinte, a proteína H3 HA modificada ou a proteína H3 HA mutante, conforme descrito neste relatório descritivo, pode compreender uma ou mais de uma mutação, ou modificação, em qualquer um ou mais resíduos no alinhamento de sequência com as posições 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526, 527 ou 528 da cepa de referência H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92; ver Figura 1). É, portanto, fornecido polipeptídeos de Influenza H3 HA, proteínas e / ou complexos de proteínas, como, por exemplo, partículas semelhantes a vírus (VLP) que compreendem modificações ou mutações em uma ou mais das posições de aminoácidos 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526, 527 ou 528, onde tal numeração de aminoácidos é baseada na sequência de H3 A/Hong Kong/480l/14 como mostrado na Figura 1 (SEQ ID NO: 92), ou nas posições de aminoácidos que correspondem a tais posições de aminoácidos, por exemplo, conforme determinado pelo alinhamento de uma sequência de aminoácidos HA com a SEQ ID NO: 92. Exemplos não limitativos de sequências de aminoácidos HA da Influenza H3 que compreendem uma ou mais dessas mutações incluem SEQ ID NOs: 91, 92, 93, 94, 95, 96 e 97.
[00170] A proteína H3 HA modificada aqui descrita inclui a proteína H3 HA com sequências de aminoácidos que têm cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos que codifica HA de H3 (SEQ ID NO: 91-97), em que a sequência de aminoácidos tem um ou mais do que uma mutação ou modificação em qualquer um ou mais resíduos no alinhamento de sequência com as posições 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526, 527 ou 528 da A/Hong Kong/480l/14 HA (SEQ ID NO: 92).
[00171] Além disso, a proteína H3 HA pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 (SEQ ID NO: 91-97 sequências de cepas de H3), em que a proteína H3 HA tem uma ou mais de uma mutação ou modificação, em qualquer um ou mais resíduos em alinhamento de sequência com as posições 382, 384, 392, 431, 524,525, 526, 527 ou 528 de H3 A/Hong Kong/480l/14 HA (SEQ ID NO: 92) e em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína hemaglutinina que, quando expressa, forma uma VLP.
[00172] Exemplos não limitativos de cepas das quais o H3 HA pode ser derivado são A / Bangkok / 3007/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 91); A / Hong Kong / 4801/14 (H3N2) (SEQ ID NO: 92); A / Minnesota / 40/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 93); A / South Austrália / l / 16 (H3N2) (SEQ ID NO: 94); A / Pennsylvania / 09/15 (H3N2) (SEQ ID NO: 95); A / Suíça / 9715293/13 (H3N2) (SEQ ID NO: 96) e A / Mississippi / 16/16
(H3N2) (SEQ ID NO: 97). Modificação na posição 524-528 (CysTM) e 382
[00173] Em outro aspecto, é fornecido um H3 HA que pode ter um resíduo modificado na posição 382 e pode ter sido modificado para ter um resíduo de cisteína nas posições 524 e / ou 528 (numeração H3 A/ Hong kong /480l/l4, SEQ ID NO: 92). Além disso, os resíduos nas posições 525, 526 e / ou 527 (numeração H3 A/Hong Kong/480l/14) também podem ser modificados.
[00174] Como mostrado, por exemplo, na Figura 7A, 7B e 7C, um H3 HA tendo resíduos de cisteína nas posições 524 e 528 modificados para ser não cisteína e tendo resíduo na posição 382 modificado de Asparagina para Alanina levou a um aumento de aproximadamente 260% no título de hemaglutinação em comparação com o tipo selvagem H3 HA.
[00175] Por conseguinte, é fornecida uma proteína H3 HA modificada que compreende uma ou mais de uma modificação na posição 524, 525, 526, 527 ou 528 e uma modificação na posição 382. Em um exemplo não limitativo, o H3 HA modificada tem modificações pelo menos nas posições 382, 524 e 528.
[00176] O resíduo na posição 382 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não asparagina. Por exemplo, o resíduo na posição 382 pode ser modificado para ser um aminoácido hidrofóbico, por exemplo, Alanina ou uma substituição conservada de Alanina, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val). O resíduo na posição 524 pode ser modificado para uma não cisteína, uma serina ou uma substituição conservada de serina (S, Ser) e o resíduo na posição 528 pode ser modificado para uma não cisteína, leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de Leucina.
[00177] Por exemplo, a proteína H3 HA modificada pode ter uma sequência de aminoácidos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos de HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92), em que a sequência de aminoácidos tem uma Alanina (A, Ala) ou uma substituição conservada de Alanina (A, Ala) na posição 382, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada de Alanina pode ser, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val). A não cisteína na posição 524 pode ser uma serina (S, Ser) ou uma substituição conservada de serina e a não cisteína na posição 528 pode ser leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de leucina. A substituição conservada de Serina (Se, Ser) pode ser, por exemplo, Treonina (T, Thr), Alanina (A, Ala), Asparagina (N, Asn), Ácido Aspártico (D, Asp), Glutamina (Q, Gln), Glicina (G, Gly), Ácido glutâmico (E, Glu) ou lisina (L, Lys). A substituição conservada de Leucina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, IIe), Valina (V, Val), Metionina (M, Met), Fenilalanina (F, Phe) ou Valina (V, Val).
[00178] O presente relatório descritivo também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um H3 HA modificada com uma substituição nas posições 382, 524 e 528, conforme descrito acima, operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[00179] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 A / Hong Kong / 480l / l4 (SEQ ID NO: 102), em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem uma Alanina (A, Ala) ou uma substituição conservada de Alanina (A, Ala) na posição 382, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada para Alanina pode ser, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val). A não cisteína na posição 524 pode ser uma serina (S, Ser) ou uma substituição conservada de serina e a não cisteína na posição 528 pode ser leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de leucina. A substituição conservada de Serina (Se, Ser) pode ser, por exemplo, Treonina (T, Thr), Alanina (A, Ala), Asparagina (N, Asn), Ácido Aspártico (D, Asp), Glutamina (Q, Gln), Glicina (G, Gly), ácido glutâmico (E, Glu) ou lisina (L, Lys). A substituição conservada de Leucina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, IIe), Valina (V, Val), Metionina (M, Met), Fenilalanina (F, Phe) ou Valina (V, Val).
[00180] As sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 102, em que a sequência de nucleotídeos codifica um H3 modificado Proteína HA que possui uma alanina (A, Ala) ou uma substituição conservada de alanina (A, Ala) na posição 382, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP . A substituição conservada de Alanina pode ser, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val).
[00181] Além dos resíduos nas posições 382, 524 e 528, o H3 HA modificado pode ter mais resíduos modificados. Por exemplo, um ou mais resíduos nas posições 384, 525, 526 e 527 podem ser modificados. Em um exemplo não limitativo, o H3 HA modificada pode ter resíduos substituídos na posição 382, 524, 528 e uma ou mais substituições nas posições 384, 525, 526, 527 ou uma combinação dos mesmos.
[00182] Além disso, é fornecido um método de produção de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos nas posições 382, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 384, 525, 526, 527 acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00183] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos na posição 382, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 384, 525, 526, 527, conforme descrito acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00184] O presente relatório descritivo fornece ainda uma VLP que compreende um H3 HA com uma substituição pelo menos na posição 382, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 384, 525, 526, 527. O VLP pode ser produzido pelo método conforme fornecido pelo presente relatório descritivo. As VLPs que compreendem a H3 HA modificada apresentam características melhoradas quando comparadas às VLPs que compreendem a proteína H3 HA não modificada. Modificação na posição 524-528 (CysTM) e 384
[00185] Em outro aspecto, é fornecido um H3 HA que pode ter resíduo modificado na posição 384 e pode ser modificado para não ter resíduo de cisteína nas posições 524 e 528 (numeração H3 A / Hong kong/480l/l4, SEQ ID NO: 92). Além disso, os resíduos nas posições 525, 526 e / ou 527 (numeração H3 A/Hong Kong/480l/14) também podem ser modificados.
[00186] Como mostrado, por exemplo, na Figura 7A, 7B e 7C, um H3 HA tendo resíduos de cisteína nas posições 524 e 528 modificados para serem resíduos de não cisteína e tendo resíduo na posição 384 modificado de Leucina para Valina, leva a um aproximadamente 270 % de aumento no título de hemaglutinação em comparação com H3 HA de tipo selvagem.
[00187] Por conseguinte, é fornecida uma proteína H3 HA modificada que compreende uma ou mais de uma modificação na posição 524, 525, 526, 527 ou 528 e uma modificação na posição 384. Em um exemplo não limitativo, o H3 HA modificada tem modificações pelo menos nas posições 384, 524 e 528.
[00188] O resíduo na posição 384 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não-leucina. Por exemplo, o resíduo na posição 384 pode ser modificado para outro aminoácido hidrofóbico, por exemplo, Valina ou uma substituição conservada de Valina, por exemplo, Isoleucina, Leucina, Metionina, Alanina ou Treonina.
[00189] Por exemplo, a proteína H3 HA modificada pode ter uma sequência de aminoácidos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos de HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92), em que a sequência de aminoácidos tem uma Valina ou uma substituição conservada de Valina na posição 384, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada de Valina pode ser, por exemplo, Isoleucina, Leucina, Metionina, Alanina ou Treonina.
[00190] O presente relatório descritivo também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um H3 HA modificada com uma substituição nas posições 384, 524 e 528, conforme descrito acima, operativamente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[00191] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer valor entre eles, identidade de sequência, ou semelhança de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 102), em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem uma Valina ou uma substituição conservada de Valina na posição 384, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528 e em que a sequência não ocorre naturalmente. A substituição conservada pode ser, por exemplo, Isoleucina, Leucina, Metionina, Alanina ou Treonina.
[00192] As sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 102, em que a sequência de nucleotídeos codifica um H3 modificado Proteína HA que possui uma Valina ou uma substituição conservada de Valina na posição 384, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada de Valina pode ser, por exemplo, Isoleucina, Leucina, Metionina, Alanina ou Treonina.
[00193] Além dos resíduos nas posições 384, 524 e 528, o H3 HA modificado pode ter mais resíduos modificados. Por exemplo, um ou mais resíduos na posição 382, 525, 526 e 527 podem ser modificados. Em um exemplo não limitativo, o H3 HA modificada pode ter resíduos substituídos na posição 384, 524, 528 e uma ou mais substituições nas posições 382, 525, 526, 527 ou uma combinação dos mesmos.
[00194] Além disso, é fornecido um método de produção de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos nas posições 384, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 382, 525, 526, 527 acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00195] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos na posição 384, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 382, 525, 526, 527, conforme descrito acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00196] O presente relatório descritivo fornece ainda uma VLP que compreende um H3 HA com uma substituição pelo menos na posição 384, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 382, 525, 526, 527. A VLP pode ser produzida pelo método conforme fornecido pelo presente relatório descritivo. As VLPs que compreendem a H3 HA modificada apresentam características melhoradas quando comparadas às VLPs que compreendem a proteína H3 HA não modificada. Modificação na posição 524-528 (CysTM) e 392
[00197] Em outro aspecto, é fornecido um H3 HA que pode ter resíduo modificado na posição 392 e pode não ter resíduo de cisteína nas posições 524 e 528 (numeração H3 A / Hong kong/480l/l4, SEQ ID NO: 92). Além disso, os resíduos nas posições 525, 526 e / ou 527 (numeração H3 A/Hong Kong/480l/14) também podem ser modificados.
[00198] Como mostrado, por exemplo, na Figura 7A e 7B, um H3 HA tendo resíduos de cisteína nas posições 524 e 528 modificados para não ser cisteína e tendo resíduo na posição 392 modificado de fenilalanina para ácido aspártico, leva a 200% a 270% aumento no título de hemaglutinação em comparação com H3 HA de tipo selvagem.
[00199] Por conseguinte, é fornecida uma proteína H3 HA modificada que compreende uma ou mais de uma modificação na posição 524, 525, 526, 527 ou 528 e uma modificação na posição 392. Em um exemplo não limitativo, o H3 HA modificada tem modificações pelo menos nas posições 392,
524 e 528.
[00200] O resíduo na posição 392 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não fenilalanina. Por exemplo, o resíduo na posição 392 pode ser modificado para um aminoácido carregado, por exemplo, ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico, por exemplo, glutamina, asparagina, ácido glutâmico ou serina.
[00201] Por exemplo, a proteína H3 HA modificada pode ter uma sequência de aminoácidos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos de HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92), em que a sequência de aminoácidos tem um ácido aspártico ou uma substituição conservada de Ácido aspártico na posição 392, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada de ácido aspártico pode ser, por exemplo, glutamina, asparagina, ácido glutâmico ou serina. A não cisteína na posição 524 pode ser uma serina (S, Ser) ou uma substituição conservada de serina e a não cisteína na posição 528 pode ser leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de Leucina. A substituição conservada de Serina (Se, Ser) pode ser, por exemplo, Treonina (T, Thr), Alanina (A, Ala), Asparagina (N, Asn), Ácido Aspártico (D, Asp), Glutamina (Q, Gln), Glicina (G, Gly), ácido glutâmico (E, Glu) ou lisina (L, Lys). A substituição conservada de Leucina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, II e), Valina
(V, Val), Metionina (M, Met), Fenilalanina (F, Phe) ou Valina (V, Val).
[00202] O presente relatório descritivo também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um H3 HA modificada com uma substituição nas posições 392, 524 e 528, conforme descrito acima, operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[00203] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 A / Hong Kong / 480l / l4 (SEQ ID NO: 102), em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico na posição 392, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada pode ser, por exemplo, Glutamina, Asparagina, Ácido Glutâmico ou Serina.
[00204] As sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, sequência identidade, ou semelhança de sequência, com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 102, em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico na posição 392, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada pode ser, por exemplo, Glutamina, Asparagina, Ácido Glutâmico ou Serina.
[00205] Além dos resíduos nas posições 392, 524 e 528, a H3 HA modificada pode ter mais resíduos modificados. Por exemplo, um ou mais resíduos nas posições 525, 526 e 527 podem ser modificados. Num exemplo não limitativo, o H3 HA modificada pode ter resíduos substituídos na posição 392, 524, 528 e uma ou mais substituições nas posições 525, 526, 527 ou uma combinação das mesmas.
[00206] Além disso, é fornecido um método de produção de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos nas posições 392, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 525, 526, 527 acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00207] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos na posição 392, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 525, 526, 527, conforme descrito acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta,
e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00208] O presente relatório descritivo fornece ainda um VLP compreendendo um H3 HA com uma substituição pelo menos na posição 392, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 525, 526, 527. O VLP pode ser produzido pelo método fornecido pelo presente relatório descritivo. As VLPs que compreendem a H3 HA modificada apresentam características melhoradas quando comparadas às VLPs que compreendem a proteína H3 HA não modificada. Modificação na posição 524-528 (CysTM) e 431
[00209] Em outro aspecto, é fornecido um H3 HA que pode ter um resíduo modificado na posição 431 e pode não ter nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528 (numeração H3 A / Hong Kong / 480l / l4, SEQ ID NO: 92). Além disso, os resíduos nas posições 525, 526 e / ou 527 (numeração H3 A/Hong Kong/480l/14) também podem ser modificados.
[00210] Como mostrado, por exemplo, na Figura 7A e 7B, um H3 HA tendo resíduos de cisteína nas posições 524 e 528 modificados para não ser cisteína e tendo resíduo na posição 431 modificado de Leucina para Metionina, leva a um aumento de aproximadamente 250% no título de hemaglutinação em comparação com H3 HA de tipo selvagem.
[00211] Por conseguinte, é fornecida uma proteína H3 HA modificada que compreende uma ou mais de uma modificação na posição 524, 525, 526, 527 ou 528 e uma modificação na posição 431. Em um exemplo não limitativo, o H3 HA modificada tem modificações pelo menos nas posições 431, 524 e 528.
[00212] O resíduo na posição 431 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não-leucina. Por exemplo, o resíduo na posição 431 pode ser modificado ser metionina ou uma substituição conservada de metionina, por exemplo, leucina, isoleucina, Glutamina, Valina ou Fenilalanina.
[00213] Por exemplo, a proteína H3 HA modificada pode ter uma sequência de aminoácidos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos de HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92), em que a sequência de aminoácidos tem uma Metionina ou uma substituição conservada de Metionina na posição 431, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada de Metionina pode ser, por exemplo, Leucina, Isoleucina, Glutamina, Valina ou Fenilalanina. A não cisteína na posição 524 pode ser uma serina (S, Ser) ou uma substituição conservada de serina e a não cisteína na posição 528 pode ser leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de Leucina. A substituição conservada de Serina (Se, Ser) pode ser, por exemplo, Treonina (T, Thr), Alanina (A, Ala), Asparagina (N, Asn), Ácido Aspártico (D, Asp), Glutamina (Q, Gln), Glicina (G, Gly), ácido glutâmico (E, Glu) ou lisina (L, Lys). A substituição conservada de Leucina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, IIe), Valina (V, Val), Metionina
(M, Met), Fenilalanina (F, Phe) ou Valina (V, Val).
[00214] O presente relatório descritivo também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um H3 HA modificada com uma substituição nas posições 431, 524 e 528, conforme descrito acima, operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[00215] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 A / Hong Kong / 480l / l4 (SEQ ID NO: 102), em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem metionina ou uma substituição conservada de metionina na posição 431, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada pode ser, por exemplo, Leucina, Isoleucina, Glutamina, Valina ou Fenilalanina.
[00216] As sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou sequência similaridade, com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 102, em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem Metionina ou uma substituição conservada de Metionina na posição 431, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528, em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o
HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada pode ser, por exemplo, Leucina, Isoleucina, Glutamina, Valina ou Fenilalanina.
[00217] Além dos resíduos nas posições 431, 524 e 528, a H3 HÁ modificada pode ter mais resíduos modificados. Por exemplo, um ou mais resíduos nas posições 525, 526 e 527 podem ser modificados. Num exemplo não limitativo, o H3 HA modificada pode ter resíduos substituídos na posição 431, 524, 528 e uma ou mais substituições nas posições 525, 526, 527 ou uma combinação das mesmas.
[00218] Além disso, é fornecido um método de produção de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos nas posições 431, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 525, 526, 527 acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00219] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos na posição 431, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 525, 526, 527, conforme descrito acima em um plantar. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00220] O presente relatório descritivo fornece ainda um VLP compreendendo um H3 HA com uma substituição pelo menos na posição 431, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 525, 526, 527. O VLP pode ser produzido pelo método conforme fornecido pelo presente relatório descritivo. As VLPs que compreendem a H3 HA modificada apresentam características melhoradas quando comparadas às VLPs que compreendem a proteína H3 HA não modificada. Modificação na posição 524-528 (CysTM), 382 e 384
[00221] Em outro aspecto, é fornecido um H3 HA que pode ter resíduos modificados nas posições 382 e 384 e pode não ter nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528 (numeração H3 A/Hong kong/480l/l4, SEQ ID NO: 92). Além disso, os resíduos nas posições 525, 526 e / ou 527 (numeração H3 A/Hong Kong/480l/14) também podem ser modificados.
[00222] Como mostrado, por exemplo, na Figura 7E, um H3 HA tendo resíduos de cisteína nas posições 524 e 528 modificados para ser não cisteína e tendo resíduo na posição 382 modificado de Asparagina para Alanina e resíduo na posição 384 modificados de Leucina para Valina, levam a um aumento de aproximadamente 400% a 500% no título de hemaglutinação em comparação com H3 HA de tipo selvagem.
[00223] Por conseguinte, é fornecida uma proteína H3 HA modificada que compreende uma ou mais de uma modificação na posição 524, 525, 526, 527 ou 528 e uma modificação na posição 382 e 384. Em um exemplo não limitativo, o H3 modificado HA tem modificações pelo menos nas posições 382, 384, 524 e 528.
[00224] O resíduo na posição 382 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não Asparagina. Por exemplo, o resíduo na posição 382 pode ser modificado para ser um aminoácido hidrofóbico, por exemplo, Alanina ou uma substituição conservada de Alanina, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína ( C, Cys) ou Valina (V, Val). O resíduo na posição 384 de H3 HA pode ser modificado para ser uma não-leucina. Por exemplo, o resíduo na posição 384 pode ser modificado para outro aminoácido hidrofóbico, por exemplo, Valina ou uma substituição conservada de Valina, por exemplo, Isoleucina, Leucina, Metionina, Alanina ou Treonina.
[00225] Por exemplo, a proteína H3 HA modificada pode ter uma sequência de aminoácidos que tem cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de aminoácidos de HA de H3 A/Hong Kong/480l/14 (SEQ ID NO: 92), em que a sequência de aminoácidos tem uma Alanina (A, Ala) ou uma substituição conservada de Alanina (A, Ala) na posição 382, uma Valina ou uma substituição conservada de Valina na posição 384, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528 e em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP . A substituição conservada de Alanina pode ser, por exemplo,
Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val). A substituição conservada de Valina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, II e), Leucina (L, Leu), Metionina (M, Met), Alanina A, Ala) ou Treonina (T, Thr). A não cisteína na posição 524 pode ser uma serina (S, Ser) ou uma substituição conservada de serina e a não cisteína na posição 528 pode ser leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de leucina. A substituição conservada de Serina (Se, Ser) pode ser, por exemplo, Treonina (T, Thr), Alanina (A, Ala), Asparagina (N, Asn), Ácido Aspártico (D, Asp), Glutamina (Q, Gln), Glicina (G, Gly), ácido glutâmico (E, Glu) ou lisina (L, Lys). A substituição conservada de Ser) pode ser, por exemplo, Treonina (T, Thr), Alanina (A, Ala), Asparagina (N, Asn), Ácido Aspártico (D, Asp), Glutamina (Q, Gln), Glicina (G, Gly), Glutâmico ácido (E, Glu) ou lisina (L, Lys). A substituição conservada de Ser) pode ser, por exemplo, Treonina (T, Thr), Alanina (A, Ala), Asparagina (N, Asn), Ácido Aspártico (D, Asp), Glutamina (Q, Gln), Glicina (G, Gly), Glutâmico ácido (E, Glu) ou lisina (L, Lys). A substituição conservada de leucina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, II e), Valina (V, Val), Metionina (M, Met), Fenilalanina (F, Phe) ou Valina (V, Val).
[00226] O presente relatório descritivo também fornece um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um H3 HA modificada com uma substituição nas posições 382, 384, 524 e 528, conforme descrito acima, operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[00227] Por exemplo, as sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos que codifica HA de H3 A/Hong Kong/480l/l4 (SEQ ID NO: 102), em que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína H3 HA modificada que tem uma Alanina (A, Ala) ou uma substituição conservada de Alanina (A, Ala) na posição 382, uma Valina ou uma substituição conservada de Valina na posição 384, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528 e em que a sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP.
A substituição conservada de Alanina pode ser, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val). A substituição conservada de Valina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, II e), Leucina (L, Leu), Metionina (M, Met), Alanina A, Ala) ou Treonina (T, Thr). A não cisteína na posição 524 pode ser uma serina (S, Ser) ou uma substituição conservada de serina e a não cisteína na posição 528 pode ser leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de leucina.
A substituição conservada de Serina (Se, Ser) pode ser, por exemplo, Treonina (T, Thr), Alanina (A, Ala), Asparagina (N, Asn), Ácido Aspártico (D, Asp), Glutamina (Q, Gln), Glicina (G, Gly), Ácido glutâmico (E, Glu) ou lisina (L, Lys). A substituição conservada de Leucina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, IIe), Valina (V, Val), Metionina (M, Met), Fenilalanina (F, Phe) ou Valina (V, Val).
[00228] As sequências de nucleotídeos podem ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 102, em que a sequência de nucleotídeos codifica um H3 modificado Proteína HA que tem uma Alanina (A, Ala) ou uma substituição conservada de Alanina (A, Ala) na posição 382, uma Valina ou uma substituição conservada de Valina na posição 384, nenhum resíduo de cisteína nas posições 524 e 528 e em que o sequência não ocorre naturalmente e em que o HA quando expresso forma VLP. A substituição conservada de Alanina pode ser, por exemplo, Serina (S, Ser), Glicina (G, Gly), Treonina (T, Thr), Cisteína (C, Cys) ou Valina (V, Val). A substituição conservada de Valina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, Ile), Leucina (L, Leu), Metionina (M, Met), Alanina A, Ala) ou Treonina (T, Thr). A não cisteína na posição 524 pode ser uma serina (S, Ser) ou uma substituição conservada de serina e a não cisteína na posição 528 pode ser leucina (L, Leu) ou uma substituição conservada de leucina. A substituição conservada de Serina (Se, Ser) pode ser, por exemplo, Treonina (T, Thr), Alanina (A, Ala), Asparagina (N, Asn), Ácido Aspártico (D, Asp), Glutamina (Q, Gln), Glicina (G, Gly), ácido glutâmico (E, Glu) ou Lisina (L, Lys). A substituição conservada de Leucina pode ser, por exemplo, Isoleucina (I, Ile), Valina (V, Val), Metionina (M, Met), Fenilalanina (F, Phe) ou Valina (V, Val).
[00229] Além dos resíduos nas posições 382, 384, 524 e
528, a H3 HA modificada pode ter mais resíduos modificados. Por exemplo, um ou mais resíduos nas posições 525, 526 e 527 podem ser modificados. Num exemplo não limitativo, o H3 HA modificada pode ter resíduos substituídos nas posições 382, 384, 524, 528 e uma ou mais substituições nas posições 525, 526, 527 ou uma combinação das mesmas.
[00230] Além disso, é fornecido um método de produção de VLPs que compreendem uma H3 HA modificada com uma substituição pelo menos nas posições 382, 384, 524 e 528, e, opcionalmente, substituições nas posições 525, 526, 527 acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00231] Além disso, é fornecido um método para aumentar o rendimento de VLPs que compreendem um H3 HA modificada com uma substituição pelo menos na posição 382, 384, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 525, 526, 527, conforme descrito acima em uma planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um H3 HA modificada operativamente ligado a uma região reguladora ativa na planta, na planta, ou porção da planta, e incubar a planta ou porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo assim as VLPs.
[00232] O presente relatório descritivo fornece ainda uma VLP que compreende uma H3 HA com uma substituição pelo menos na posição 382, 384, 524 e 528 e, opcionalmente, substituições nas posições 525, 526, 527. O VLP pode ser produzido pelo método conforme fornecido pelo presente relatório descritivo. As VLPs que compreendem a H3 HA modificada apresentam características melhoradas quando comparadas às VLPs que compreendem a proteína H3 HA não modificada.
[00233] Também são fornecidos aqui métodos para aumentar a produção ou rendimento de VLPs compreendendo HAs de Influenza mutante em plantas. Por exemplo, um método pode envolver a introdução de um ácido nucleico que codifica um HA de Influenza mutante, conforme descrito neste relatório descritivo, na planta, porção da planta ou célula vegetal. O ácido nucleico que codifica a HA de Influenza mutante pode ser otimizado para uso de códon humano, conteúdo de GC aumentado ou uma combinação dos mesmos. Uma ou mais de uma proteína HA de Influenza mutante pode ser expressa em uma planta, porção da planta ou célula vegetal, a fim de produzir uma VLP compreendendo uma ou mais de uma proteína HA de Influenza mutante. Alternativamente, o método pode compreender o fornecimento de uma planta, parte da planta,
[00234] Os métodos de produção de uma VLP compreendendo um HA de Influenza mutante podem compreender ainda uma etapa de introdução de uma segunda sequência de ácido nucleico na planta, porção da planta ou célula vegetal, em que o segundo ácido nucleico codifica uma proteína do canal de prótons que é co-expresso com o mutante da Influenza HA. Por exemplo, a proteína do canal de prótons pode ser uma proteína do subtipo M2 da Influenza A, como A / Nova Caledônia / 20/99 M2. A co-expressão da proteína do canal de prótons pode levar a um aumento do acúmulo de proteína HA da Influenza mutante e / ou VLP compreendendo a proteína HA da Influenza mutante como, por exemplo, descrito no documento WO 2013/044390, o qual é incorporado aqui por referência.
[00235] Além disso, a HA de Influenza mutante pode compreender ainda uma alça proteolítica modificada ou local de clivagem, conforme descrito nos documentos WO 2013/044390 e WO 2014/153674 e os quais são incorporados neste relatório descritivo por referência.
[00236] Por "co-expressão", entende-se a introdução e expressão de duas ou mais sequências de nucleotídeos, cada uma das duas ou mais sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de interesse ou um fragmento de uma proteína de interesse dentro de uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal. As duas ou mais sequências de nucleotídeos podem ser introduzidas na planta, porção da planta ou célula da planta dentro de um vetor, de modo que cada uma das duas ou mais sequências de nucleotídeos esteja sob o controle de uma região reguladora separada (por exemplo, compreendendo uma construção dupla ) Alternativamente, as duas ou mais sequências de nucleotídeos podem ser introduzidas na planta, porção da planta ou célula da planta dentro de vetores separados (por exemplo, compreendendo construções únicas), e cada vetor compreendendo regiões regulatórias apropriadas para a expressão do ácido nucleico correspondente. Por exemplo, duas sequências de nucleotídeos, cada uma em um vetor separado e introduzidas em hospedeiros separados de Agrobacterium tumefaciens, podem ser coexpressas misturando suspensões de cada hospedeiro A. tumefaciens em um volume desejado (por exemplo, um volume igual ou as proporções de cada (hospedeiro A. tumefaciens pode ser alterado) antes da infiltração a vácuo. Desta forma, a co-infiltração de múltiplas suspensões de A. tumifaciens permite a co- expressão de múltiplos transgenes.
[00237] O ácido nucleico que codifica uma HA de Influenza mutante, conforme descrito neste relatório descritivo pode compreender ainda sequências que aumentam a expressão da HA de Influenza mutante em uma planta, porção da planta ou célula vegetal. As sequências que aumentam a expressão podem incluir um elemento potencializador do vírus do mosaico do feijão-caupi (CPMV) em associação operativa com o ácido nucleico que codifica a proteína HA da Influenza mutante.
[00238] O ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína hemaglutinina (HA) de Influenza modificada, conforme descrito neste relatório descritivo, pode compreender ainda sequências que aumentam a expressão da proteína HA na planta, porção da planta ou célula vegetal. As sequências que aumentam a expressão podem incluir um elemento intensificador de CPMV ou um intensificador de expressão derivado de planta, em associação operativa com o ácido nucleico que codifica a proteína hemaglutinina (HA) da Influenza modificada. A sequência que codifica a hemaglutinina de Influenza modificada (HA) também pode ser otimizada para uso de códon humano, conteúdo de GC aumentado ou uma combinação dos mesmos.
[00239] O termo "elemento intensificador de CPMV", tal como aqui utilizado, se refere a uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo RNA2 do vírus do mosaico do feijão-caupi (CPMV) regulando 5'UTR ou uma sequência de CPMV modificada como é conhecido no estado da técnica. Por exemplo, um elemento intensificador de CPMV ou um intensificador de expressão de CPMV, inclui uma sequência de nucleotídeos como descrito nos documentos WO 2015/14367; W0 2015/ 103704; W0 2007/135480; W0 2009/087391; Sainsbury F., e Lomonossoff GP, (2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218), cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Uma sequência intensificadora de CPMV pode aumentar a expressão de uma estrutura de leitura aberta heteróloga (ORF) a jusante à qual estão ligados. O intensificador de expressão de CPMV pode incluir CPMV HT, CPMVX (onde X = l60, 155, 150, 114), por exemplo CPMV 160, CPMVX + (onde X = l60, 155, 150, 114), por exemplo CPMV 160+, CPMV- HT +, CPMV HT + [WTl 15] ou CPMV HT + [511] (WO 2015/143567; W0 2015/103704, os quais são aqui incorporados por referência). O intensificador de expressão de CPMV pode ser usado dentro de um sistema de expressão de planta compreendendo uma região reguladora que está operacionalmente ligada à sequência de intensificador de expressão de CPMV e uma sequência de nucleotídeos de interesse.
[00240] O termo "elemento potencializador de CPMV", tal como aqui utilizado, se refere a uma sequência de nucleotídeos que codifica o 5'UTR que regula o polipeptídeo RNA2 ou uma sequência de CPMV modificada do vírus do mosaico do feijão-caupi (CPMV) como é conhecido no estado da técnica. Por exemplo, um elemento intensificador de CPMV ou um intensificador de expressão de CPMV, inclui uma sequência de nucleotídeos como descrito em WO 2015/14367; W0 2015/103704; W0 2007/135480; W0 2009/087391; Sainsbury F., e Lomonossoff GP, (2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218), cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Uma sequência intensificadora de CPMV pode aumentar a expressão de um quadro de leitura aberta heterólogo (ORF) a jusante à qual estão ligados. O intensificador de expressão de CPMV pode incluir CPMV HT, CPMVX, CPMVX +, CPMV-HT +, CPMV HT + [WTl 15], ou CPMV HT +
[511] (WO2015 / 14367; W0 2015/103704, os quais são aqui incorporados por referência). O intensificador de expressão de CPMV pode ser usado dentro de um sistema de expressão de planta compreendendo uma região reguladora que está operacionalmente ligada à sequência de intensificador de expressão de CPMV e uma sequência de nucleotídeos de interesse.
[00241] O termo "5'UTR" ou "região 5 'não traduzida" ou "sequência líder 5'" se refere a regiões de um mRNA que não são traduzidas. O 5'UTR normalmente começa no local de início da transcrição e termina imediatamente antes do local de iniciação da tradução ou códon de início da região de codificação. A 5 'UTR pode modular a estabilidade e / ou tradução de um transcrito de mRNA.
[00242] O termo "intensificador de expressão derivado de planta", tal como aqui utilizado, se refere a uma sequência de nucleotídeos obtida de uma planta, a sequência de nucleotídeos que codifica um 5'UTR. Exemplos de um intensificador de expressão derivado de planta são descritos no Pedido de Patente Provisório US No.62 /
643.053 (Arquivado em 14 de março de 2018; que é aqui incorporado por referência) ou em Diamos AG et al. (2016, Front Plt Sci. 7: 1-15; que é aqui incorporado por referência). O intensificador de expressão derivado de planta pode ser selecionado a partir de nbMT78, nbATL75, nbDJ46, nbCHP79, nbEN42, atHSP69, atGRP62, atPK65, atRP46, nb30S72, nbGT6l, nbPV55, nbPPI43, nbPM64 / 643H86A descrito em 62,053H86).
[00243] Por "operativamente ligado", entende-se que as sequências particulares interagem direta ou indiretamente para realizar uma função pretendida, tal como mediação ou modulação da expressão de uma sequência de ácido nucleico. A interação de sequências ligadas operacionalmente pode, por exemplo, ser mediada por proteínas que interagem com as sequências ligadas operacionalmente.
[00244] Quando uma ou mais de uma proteína HA da Influenza mutante é expressa em uma planta, porção da planta ou célula vegetal, uma ou mais proteínas HA da Influenza mutante se automontam em VLPs. A planta, porção da planta ou célula vegetal pode ser colhida sob condições de extração e purificação adequadas para manter a integridade da VLP, e a VLP que compreende um ou mais de um HA de Influenza mutante pode ser purificada.
[00245] A presente invenção também fornece o uso de uma HA da Influenza mutante ou VLP compreendendo a HA mutante de Influenza, conforme descrito neste relatório descritivo, para induzir imunidade a uma infecção por Influenza em um sujeito. Também é divulgado neste documento um anticorpo ou fragmento de anticorpo, preparado pela administração de HA ou VLP de Influenza mutante compreendendo a HA de Influenza mutante, a um sujeito ou animal hospedeiro. É fornecida ainda uma composição que compreende uma dose eficaz de um HA de Influenza mutante ou VLP compreendendo a HA de Influenza mutante, como aqui descrito, e um transportador, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável para induzir uma resposta imune em um sujeito. Também é fornecida uma vacina para induzir uma resposta imune em um sujeito, em que a vacina compreende uma dose eficaz da HA de Influenza mutante.
[00246] Também são fornecidos neste relatório descritivo, métodos para induzir imunidade a uma infecção por Influenza em um sujeito que compreende a administração de HA ou VLP de Influenza mutante que compreende a HA de Influenza mutante, a um sujeito por via oral, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.
[00247] O termo "vírus Influenza", tal como aqui utilizado, se refere a uma cepa viral com envelope da família Orthomyxoviridae que é caracterizada como tendo um genoma de RNA de fita simples de sentido negativo. O genoma do vírus Influenza compreende oito segmentos gênicos que codificam para 12-14 proteínas, dependendo da cepa.
[00248] Existem quatro tipos de vírus Influenza: A, B, C e D, dos quais Influenza A ou B são o organismo causador de epidemias de doenças sazonais em humanos. A Influenza A é ainda classificada com base na expressão dos subtipos de glicoproteína HA e neuraminidase (NA).
[00249] O termo "hemaglutinina" ou "HA", tal como aqui utilizado, se refere a uma lectina trimérica que facilita a ligação da partícula do vírus da Influenza a proteínas contendo ácido siálico na superfície das células alvo e medeia a liberação do genoma viral em a célula- alvo. Existem 18 subtipos HA diferentes (H1-H18). As proteínas HA compreendem dois elementos estruturais: a cabeça, que é o alvo primário dos anticorpos seroprotetores; e o talo. HA é traduzido como um único polipeptídeo, HA0 (montado como trímeros), que deve ser clivado por uma endoprotease de serina entre HA1 (~ 40 kDa) e HA2 (~ 20 kDa) subdomínios. Após a clivagem, os dois domínios de proteína com ligações dissulfeto adotam a conformação necessária para a infecciosidade viral.
[00250] As proteínas HA da Influenza A ou proteínas HA modificadas da Influenza A, conforme divulgado neste documento, incluem quaisquer proteínas HA conhecidas derivadas de qualquer cepa de Influenza A conhecida, mas também modificações em cepas de Influenza A conhecidas que se desenvolvem ao longo do tempo. Por exemplo, a Influenza HA pode ser derivada da A / Hong Kong / 480l / l4 (H3N2), A / Minnesota / 40 / l5 (H3N2), A / South Australia / l / l6
(H3N2), A / Bangkok / 3007 / 15 (H3N2), A / Suíça / 9715293/13 (H3N2), A / Mississippi / 16/16 (H3N2) ou A / Pensilvânia / 09 / 20l5 (H3N2). Influenza A HA pode incluir HA derivado de cepas, em que HA tem cerca de 30-100%, ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência de aminoácidos com qualquer HA derivado das cepas de Influenza A listadas acima, desde que a proteína HA de Influenza compreenda pelo menos uma substituição conforme descrita neste relatório descritivo e seja capaz de formar VLPs,
[00251] Por exemplo, as proteínas HA da Influenza podem ter 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 , 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100% ou qualquer quantidade entre eles, identidade de sequência de aminoácidos (similaridade de sequência, porcentagem de identidade, similaridade percentual) com qualquer HA derivado das cepas de Influenza A listadas acima e compreende pelo menos uma substituição conforme descrito neste relatório descritivo e é capaz de formar VLPs, induz uma resposta imune quando administrada a um sujeito, induz hemaglutinação ou uma combinação das mesmas. Um alinhamento de sequência de aminoácidos de vários domínios HA de Influenza A, que não devem ser considerados limitantes, é mostrado na Figura 1.
[00252] Os termos "porcentagem de similaridade", "similaridade de sequência", "porcentagem de identidade" ou "identidade de sequência", quando se referem a uma sequência particular, são usados, por exemplo, conforme estabelecido no programa de software GCG da Universidade de
Wisconsin, ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. suplemento de 1995). Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, usando, por exemplo, o algoritmo de Smith & Waterman, (1981, Adv. Appl. Math. 2: 482), pelo algoritmo de alinhamento de Needleman & Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48: 443), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman, (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444), por implementação computadorizada desses algorítimos (por exemplo: GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA pelo Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.).
[00253] Um exemplo de um algoritmo adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST
2.0, que são descritos em Altschul et al., (1977, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402) e Altschul et al., (1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são usados, com os parâmetros aqui descritos, para determinar a percentagem de identidade de sequência para os ácidos nucleicos e proteínas da invenção. Por exemplo, o programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) pode usar como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP pode usar como padrão um comprimento de palavra de 3 e expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver
Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as vertentes. O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (ver URL: ncbi.nlm.nih.gov/).
[00254] O termo "partícula semelhante a vírus", VLP, "partículas semelhantes a vírus" ou "VLPs", tal como aqui utilizado, se refere a partículas de Influenza que compreendem uma ou mais de uma proteína HA de Influenza, e que se auto-montam em estruturas do capsídeo viral não replicantes e não infecciosas sem todas as partes do genoma da Influenza. Produção de Proteína HA da Influenza em Plantas
[00255] A proteína HA da Influenza A inclui qualquer proteína HA compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo de cerca de 30 a cerca de 100%, de cerca de 40 a cerca de 100%, de cerca de 50 a cerca de 100%, de cerca de 60 a cerca de 100%, de cerca de 70 a cerca de 100%, de cerca de 80 a cerca de 100%, de cerca de 85 a cerca de 100%, de cerca de 90 a cerca de 100%, de 95 a cerca de 100%, ou de cerca de 97 a cerca de 100% de cerca de 98 a cerca de 100% ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência com a sequência HA do Influenza A da A/Hong Kong/480l/14 (H3N2, SEQ ID NO: 92), A / Minnesota / 40 / l5 (H3N2, SEQ ID NO: 93), A / South Australia / l / l6 (H3N2, SEQ ID NO: 94), A / Bangkok / 3007 / l5 (H3N2, SEQ ID NO: 91 ), A / Suíça / 9715293/13 (H3N2, SEQ ID NO: 96), A / Mississippi / 16/16
(H3N2, SEQ ID NO: 97), e A / Pennsylvania / 09 / 20l5 (H3N2, SEQ ID NO: 95), desde que a proteína HA da Influenza compreenda pelo menos uma substituição conforme descrito neste relatório descritivo e seja capaz de formar VLPs, induz uma resposta imune quando administrada a um sujeito, induz hemaglutinação ou uma combinação dos mesmos.
[00255] Além disso, a proteína HA modificada da Influenza inclui qualquer proteína HA compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo de cerca de 30% a cerca de 100%, de cerca de 40% a cerca de 100%, de cerca de 50% a cerca de 100%, de cerca de 60% a cerca de 100%, de cerca de 70% a cerca de 100%, de cerca de 80% a cerca de 100%, de cerca de 85% a cerca de 100%, de cerca de 90% a cerca de 100%, de 95% a cerca de 100%, ou de cerca de 97% a cerca de 100% de cerca de 98% a cerca de 100%, ou qualquer quantidade entre as mesmas, identidade de sequência ou similaridade de sequência com uma sequência das sequências de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, desde que a proteína HA da Influenza compreenda pelo menos uma substituição conforme descrito neste relatório descritivo e seja capaz de formar VLPs, induz uma resposta imune quando administrada a um sujeito, induz hemaglutinação ou uma combinação das mesmas.
[00256] Conforme descrito neste relatório descritivo, uma ou mais de uma mutação ou modificação específica no HA da Influenza resulta no aumento do acúmulo de proteína HA e no aumento da produção de VLP em plantas, em comparação com a HA de Influenza de tipo selvagem.
[00257] Exemplos de proteínas HA de Influenza A mutantes com produção aumentada de HA e / ou VLP de Influenza em plantas incluem, mas não estão limitados ao seguinte: CysTM A/Hong Kong/480l/14 Mutante H3 (Construção # 3341, SEQ ID NO: 21), N382A + L384V + CysTM A/Hong Kong/480l/14 Mutante H3 (Construção # 3375, SEQ ID NO: 25); CysTM A / Minnesota / 40 / l5 Mutante H3 (Construção # 3914, SEQ ID NO: 27); N382A + L384V + CysTM A / Minnesota / 40/15 mutante H3 (Construção # 3915, SEQ ID NO: 30); CysTM A / S. Austrália / l / 16 mutante H3 (Construção # 3924, SEQ ID NO: 33); N382A + L384V + CysTM A / S. Austrália / 1/16 Mutante H3 (Construção # 3925, SEQ ID NO: 35); N382A + L384V + CysTM A / Bangkok / 3007/15 mutante H3 (Construção # 3905, SEQ ID NO: 39); N382A A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3 (Construção # 3023, SEQ ID NO: 82); L384V A / Switzerland / 9715293/13 Mutante H3 (Construção # 3034, SEQ ID NO: 84); F392D A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3 (Construção # 3045, SEQ ID NO: 43; L431M A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3 (Construção # 3022, SEQ ID NO: 47); CysTM A / Suíça / 9715293 / 13 Mutante H3 (Construção # 2811, SEQ ID NO: 49); N382A + CysTM A / Suíça / 9715293/13 H3 mutante (Construção # 3063, SEQ ID NO: 53); L384V + CysTM A / Switzerland / 9715293/13 Mutante H3 (Construção # 3074, SEQ ID NO: 57); F392D + CysTM A / Switzerland / 9715293/13 Mutante H3 (Construção # 3085, SEQ ID NO: 59); e L431M + CysTM A / Switzerland / 97l5293 / l3 Mutante H3 (Construção # 3062, SEQ ID NO: 61), CysTM A / Pennsylvania
/ 09 / 20l5 mutante H3 (Construção # 3313, SEQ ID NO: 86), N382A + CysTM A / Pennsylvania / 09 / 20l5 mutante H3 (Construção # 3314, SEQ ID NO: 88), e L384V + CysTM A / Pennsylvania / 09/2015 mutante H3 (Construção # 3315, SEQ ID NO: 90). Indução de imunidade contra a infecção por Influenza
[00258] Uma "resposta imune" geralmente se refere a uma resposta do sistema imune adaptativo de um sujeito. O sistema imune adaptativo geralmente compreende uma resposta humoral e uma resposta mediada por células. A resposta humoral é o aspecto da imunidade que é mediado por anticorpos secretados, produzidos nas células da linhagem de linfócitos B (células B). Anticorpos secretados ligam-se a antígenos na superfície de micróbios invasores (como vírus ou bactérias), o que os sinaliza para destruição. A imunidade humoral é geralmente usada para se referir à produção de anticorpos e os processos que a acompanham, bem como as funções efetoras de anticorpos, incluindo ativação de células Th2 e produção de citocinas, geração de células de memória, promoção de opsonina de fagocitose, eliminação de patógenos e semelhantes. Os termos “modular” ou "Modulação" ou semelhantes referem-se a um aumento ou diminuição em uma resposta ou parâmetro específico, conforme determinado por qualquer um dos vários ensaios geralmente conhecidos ou usados, alguns dos quais são exemplificados neste relatório descritivo.
[00259] Uma resposta mediada por células é uma resposta imune que não envolve anticorpos, mas envolve a ativação de macrófagos, células natural killer (NK),
linfócitos T citotóxicos específicos de antígeno e a liberação de várias citocinas em resposta a um antígeno. A imunidade mediada por células é geralmente usada para se referir a alguma ativação de células Th, ativação de células Tc e respostas mediadas por células T. A imunidade mediada por células pode ser de particular importância na resposta a infecções virais.
[00260] Por exemplo, a indução de linfócitos T positivos CD8 específicos para antígeno pode ser medida usando um ensaio ELISPOT; a estimulação de linfócitos T CD4 positivos pode ser medida usando um ensaio de proliferação. Os títulos de anticorpos HA anti-Influenza podem ser quantificados usando um ensaio ELISA; Os isotipos de anticorpos específicos para antígenos ou de reação cruzada também podem ser medidos usando anticorpos anti- isotipos (por exemplo, anti -IgG, IgA, IgE ou IgM). Métodos e técnicas para realizar tais ensaios são bem conhecidos na técnica.
[00261] A presença ou os níveis de citocinas também podem ser quantificados. Por exemplo, uma resposta de célula T auxiliar (Thl / Th2) será caracterizada pela medição de células secretoras de IFN-g e IL-4 usando ELISA (por exemplo, kits OptEIA da BD Biosciences). As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou esplenócitos obtidos de um sujeito podem ser cultivados e o sobrenadante analisado. Os linfócitos T também podem ser quantificados por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), usando marcadores fluorescentes específicos e métodos como são conhecidos no estado da técnica.
[00262] Um ensaio de microneutralização também pode ser conduzido para caracterizar uma resposta imune em um sujeito, ver, por exemplo, os métodos de Rowe et al, 1973. Os títulos de neutralização de vírus podem ser quantificados de várias maneiras, incluindo: enumeração de placas de lise (ensaio de placa) após cristal violento fixação / coloração de células; observação microscópica da lise celular em cultura in vitro; e 2) ELISA e detecção espectrofotométrica do vírus Influenza.
[00263] O termo "epítopo" ou "epítopos", tal como aqui utilizado, se refere a uma parte estrutural de um antígeno ao qual um anticorpo se liga especificamente.
[00264] Respostas imunes desencadeadas em resposta à administração de proteínas HA ou VLPs de Influenza de tipo selvagem produzidas em plantas, ou proteínas HA de Influenza mutantes ou VLPs pode, por exemplo, ser observada em ratos Balb / C. As amostras de soro de sangue coletado de animais podem ser analisadas por ELISA para anticorpos IgG e IgA totais específicos de H3. Os camundongos imunizados com HA de Influenza de tipo selvagem produzida em plantas ou proteínas HA de Influenza mutantes podem exibir títulos de anticorpos IgG específicos para HA em soro para cada grupo de tratamento. Expressão em planta
[00265] As construções da presente invenção podem ser introduzidas em células vegetais usando plasmídeos Ti, plasmídeos Ri, vetores de vírus de plantas, transformação direta de DNA, microinjeção, eletroporação, etc. Para revisões de tais técnicas, ver, por exemplo, Weissbach e
Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson e Corey, Biologia Molecular Vegetal, 2d Ed. (1988); e Miki e Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. Em Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrvre, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997). Outros métodos incluem a absorção direta de DNA, o uso de lipossomas, eletroporação, por exemplo, usando protoplastos, microinjeção, microprojéteis ou bigodes e infiltração a vácuo. Ver, por exemplo, Bilang, et al. (1991, Gene 100: 247-250), Scheid et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 228: 104-112), Guerche et al. (1987, Plant Science 52: 111-116), Neuhause et al. (1987, Theor. Appl Genet. 75: 30-36), Klein et al. (2987, Nature 327: 70- 73); Freeman et al. (1984, Plant Cell Physiol. 29: 1353), Howell et al. (1985, Science 227: 1229-1231), DeBlock et al. (1989, Plant Physiology 91: 694-701), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach e Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Liu e Lomonossoff (2002, J Virol Meth, 105: 343-348), EP 290395; WO 8706614; Patente US Nos. 4.945.050; 5.036.006; e
5.100.792, pedido de patente US Ser. Nos. 08/438,666, depositado em 10 de maio de 1995 e 07/951,715, depositado em 25 de setembro de 1992, (todos os quais são aqui incorporados por referência).
[00266] Os métodos de expressão transitória podem ser usados para expressar as construções da presente invenção
(ver D'Aoust et al., 2009, Methods in molecular biology, Vol 483, páginas 41-50; Liu e Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105: 343-348; que é aqui incorporado por referência). Alternativamente, um método de expressão transiente baseado em vácuo, conforme descrito por Kapila et al. (1997, Plant Sci. 122, 101-108; que é aqui incorporado por referência), ou WO 00/063400, WO 00/037663 (que são aqui incorporados por referência) podem ser usados. Estes métodos podem incluir, por exemplo, mas não estão limitados a, um método de Agro-inoculação ou Agro- infiltração, infiltração de seringa, no entanto, outros métodos transitórios também podem ser usados como observado acima. Com Agroinoculação, Agroinfiltração ou infiltração de seringa, uma mistura de Agrobacteria compreendendo o ácido nucleico desejado entra nos espaços intercelulares de um tecido, por exemplo, as folhas, parte aérea da planta (incluindo caule, folhas e flor), outros parte da planta (caule, raiz, flor) ou a planta inteira. Depois de cruzar a epiderme, as Agrobacteria infectam e transferem cópias de t-DNA para as células. O t-DNA é transcrito epissomalmente e o mRNA traduzido, levando à produção da proteína de interesse nas células infectadas, porém, a passagem do t- DNA para o interior do núcleo é transitória.
[00267] Também são consideradas parte desta invenção as plantas transgênicas, células vegetais ou sementes contendo a construção do gene da presente invenção que podem ser usados como uma planta de plataforma adequada para a expressão transiente de proteínas aqui descritas. Métodos de regeneração de plantas inteiras a partir de células vegetais também são conhecidos na técnica (por exemplo, ver Guerineau e Mullineaux (1993, Plant transformação e vetores de expressão. Em: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121- 148). Em geral, as células vegetais transformadas são cultivadas em um meio apropriado, que pode conter agentes seletivos, como antibióticos, onde marcadores selecionáveis são usados para facilitar a identificação de células vegetais transformadas. Uma vez que o calo se forma, a formação de rebentos pode ser incentivada empregando o hormônios vegetais apropriados de acordo com métodos conhecidos e os brotos transferidos para meio de enraizamento para regeneração de plantas. As plantas podem então ser usadas para estabelecer gerações repetitivas, seja a partir de sementes ou usando técnicas de propagação vegetativa. Plantas transgênicas também podem ser geradas sem o uso de cultura de tecidos. Métodos para transformação estável e regeneração desses organismos são estabelecidos na técnica e conhecido por um especialista na técnica. As técnicas disponíveis são revisadas em Vasil et al. (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, VoI I, Il e III, Laboratory Procedures and their Applications, Academic Press, 1984) e Weissbach e Weissbach (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989). O método de obtenção de plantas transformadas e regeneradas não é crítico para a presente.
[00268] Se as plantas, porções de plantas ou células de plantas devem ser transformadas ou co-transformadas por dois ou mais construções de ácido nucleico, a construção de ácido nucleico pode ser introduzida na Agrobacterium em um único evento de transfecção, de modo que os ácidos nucleicos sejam agrupados, e as células bacterianas transfectadas. Alternativamente, as construções podem ser introduzidas em série. Neste caso, uma primeira construção é introduzida na Agrobacterium conforme descrito, as células são cultivadas sob condições seletivas (por exemplo, na presença de um antibiótico) onde apenas as bactérias transformadas individualmente podem crescer. Seguindo esta primeira etapa de seleção, uma segunda construção de ácido nucleico é introduzida na Agrobacterium como descrito, e as células são cultivadas em condições duplamente seletivas, onde apenas as bactérias duplamente transformadas podem crescer. A bactéria duplamente transformada pode então ser usada para transformar uma planta, porção da planta ou célula vegetal, conforme descrito neste relatório descritivo, ou pode ser submetida a uma etapa de transformação adicional para acomodar uma terceira construção de ácido nucleico.
[00269] Alternativamente, se as plantas, porções de plantas ou células de plantas devem ser transformadas ou co-transformadas por duas ou mais construções de ácido nucleico, a construção de ácido nucleico pode ser introduzida na planta por co-infiltração de uma mistura de células de Agrobacterium com a planta, porção da planta ou célula da planta, cada célula de Agrobacterium pode compreender uma ou mais construções a serem introduzidas na planta. A fim de variar os níveis de expressão relativa dentro da planta, porção da planta ou célula vegetal, de uma sequência de nucleotídeos de interesse dentro de uma construção, durante a etapa de infiltração, a concentração das várias populações de Agrobacteria compreendendo as construções desejados pode ser variada.
Tabela 3: SEQ ID NOs e Descrição das Sequências SEQ ID NO: Descrição da Sequência
SEQ ID NO: 1 PDI-H3 HK DNA SEQ ID NO: 2 PDI-H3 HK AA SEQ ID NO: 3 PDI-H3 Minn DNA SEQ ID NO: 4 PDI-H3 Minn AA SEQ ID NO: 5 PDI-H3 SAus DNA SEQ ID NO: 6 PDI-H3 SAus AA SEQ ID NO: 7 PDI-H3 Bang DNA SEQ ID NO: 8 PDI-H3 Bang AA SEQ ID NO: 9 PDI-H3 Switz DNA SEQ ID NO: 10 PDI-H3 Switz AA SEQ ID NO: 11 PDI-H3 Miss DNA SEQ ID NO: 12 PDI-H3 Miss AA SEQ ID NO: 13 PDI-H3 Penn DNA SEQ ID NO: 14 PDI-H3 Penn AA SEQ ID NO: 15 IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c SEQ ID NO: 16 IF-H1cTMCT.S1-4r SEQ ID NO: 17 IF-H3A-Ala.r SEQ ID NO: 18 H3_Swi_SLVLL.r SEQ ID NO: 19 H3_Swi_SLVLL.c SEQ ID NO: 20 PDI-H3 HK-CysTm DNA SEQ ID NO: 21 PDI-H3 HK-CysTm AA SEQ ID NO: 22 H3_HK480114(N382A+L384V).r
SEQ ID NO: Descrição da Sequência
SEQ ID NO: 23 H3_HK480114(N382A+L384V).c SEQ ID NO: 24 PDI-H3 HK-N382A+L384V-CysTm DNA SEQ ID NO: 25 PDI-H3 HK-N382A+L384V-CysTm AA SEQ ID NO: 26 PDI-H3 Minn-CysTm DNA SEQ ID NO: 27 PDI-H3 Minn-CysTm AA SEQ ID NO: 28 H3Minn(N382A+L384V).r SEQ ID NO: 29 H3Minn(N382A+L384V).c SEQ ID NO: 30 PDI-H3 Minn-N382A+L384V-CysTm DNA SEQ ID NO: 31 PDI-H3 Minn-N382A+L384V-CysTm AA SEQ ID NO: 32 PDI-H3 SAus-CysTm DNA SEQ ID NO: 33 PDI-H3 SAus-CysTm AA SEQ ID NO: 34 PDI-H3 SAus-N382A+L384V-CysTm DNA SEQ ID NO: 35 PDI-H3 SAus-N382A+L384V-CysTm AA SEQ ID NO: 36 PDI-H3 Bang-CysTm DNA SEQ ID NO: 37 PDI-H3 Bang-CysTm AA SEQ ID NO: 38 PDI-H3 Bang-N382A+L384V-CysTm DNA SEQ ID NO: 39 PDI-H3 Bang-N382A+L384V-CysTm AA SEQ ID NO: 40 H3_Swi(F392D).r SEQ ID NO: 41 H3_Swi(F392D).c SEQ ID NO: 42 PDI-H3 Switz-F392D DNA SEQ ID NO: 43 PDI-H3 Switz-F392D AA SEQ ID NO: 44 H3_Swi(L431M).r SEQ ID NO: 45 H3_Swi(L431M).c SEQ ID NO: 46 PDI-H3 Switz-L431M DNA SEQ ID NO: 47 PDI-H3 Switz-L431M AA SEQ ID NO: 48 PDI-H3 Switz-CysTm DNA
SEQ ID NO: Descrição da Sequência
SEQ ID NO: 49 PDI-H3 Switz-CysTm AA SEQ ID NO: 50 H3_Swi(N382A).r SEQ ID NO: 51 H3_Swi(N382A).c SEQ ID NO: 52 PDI-H3 Switz-N382A-CysTm DNA SEQ ID NO: 53 PDI-H3 Switz-N382A-CysTm AA SEQ ID NO: 54 H3_Swi(L384V).r SEQ ID NO: 55 H3_Swi(L384V).c SEQ ID NO: 56 PDI-H3 Switz-L384V-CysTm DNA SEQ ID NO: 57 PDI-H3 Switz-L384V-CysTm AA SEQ ID NO: 58 PDI-H3 Switz-F392D-CysTm DNA SEQ ID NO: 59 PDI-H3 Switz-F392D-CysTm AA SEQ ID NO: 60 PDI-H3 Switz-L431M-CysTm DNA SEQ ID NO: 61 PDI-H3 Switz-L431M-CysTm AA Vetor de clonagem 1190 do esquerdo SEQ ID NO: 62 para o direito T-DNA Construção 1314 a partir de 2X35S SEQ ID NO: 63 prom to NOS term Construção 2980 a partir de 2X35S SEQ ID NO: 64 prom to NOS term Construção 2995 a partir de 2X35S SEQ ID NO: 65 prom to NOS term Vetor de clonagem 3556 do esquerdo SEQ ID NO: 66 ara o direito T-DNA SEQ ID NO: 67 IF-H5ITMCT.s1-4r SEQ ID NO: 68 PDI-H5 Indo DNA SEQ ID NO: 69 PDI-H5 Indo AA SEQ ID NO: 70 H5Ind(F393D).r SEQ ID NO: 71 H5Ind(F393D).c
SEQ ID NO: Descrição da Sequência
SEQ ID NO: 72 PDI-H5 Indo-F393D DNA SEQ ID NO: 73 PDI-H5 Indo-F393D AA SEQ ID NO: 74 IF-H5_Egy.r SEQ ID NO: 75 PDI-H5 Egypt DNA SEQ ID NO: 76 PDI-H5 Egypt AA SEQ ID NO: 77 H5Egy(F392D).r SEQ ID NO: 78 H5Egy(F392D).c SEQ ID NO: 79 PDI-H5 Egypt-F392D DNA SEQ ID NO: 80 PDI-H5 Egypt-F392D AA SEQ ID NO: 81 PDI-H3 Switz-N382A DNA SEQ ID NO: 82 PDI-H3 Switz-N382A AA SEQ ID NO: 83 PDI-H3 Switz-L384V DNA SEQ ID NO: 84 PDI-H3 Switz-L384V AA SEQ ID NO: 85 PDI-H3 Penn-CysTm DNA SEQ ID NO: 86 PDI-H3 Penn-CysTm AA SEQ ID NO: 87 PDI-H3 Penn-N382A-CysTm DNA SEQ ID NO: 88 PDI-H3 Penn-N382A-CysTm AA SEQ ID NO: 89 PDI-H3 Penn-L384V-CysTm DNA SEQ ID NO: 90 PDI-H3 Penn-L384V-CysTm AA SEQ ID NO: 91 A/Bangkok/3007/15 (H3N2) (aa) SEQ ID NO: 92 A/Hongkong/4801/14 (H3N2) (aa) SEQ ID NO: 93 A/Minnesota/40/15 (H3N2) (aa) SEQ ID NO: 94 A/South Australia/1/16 (H3N2) (aa) SEQ ID NO: 95 A/Pennsylvania/09/15 (H3N2) (aa) A/Switzerland/9715293/13 (H3N2) SEQ ID NO: 96 (aa) SEQ ID NO: 97 A/Mississippi/16/16 (H3N2) (aa)
SEQ ID NO: Descrição da Sequência SEQ ID NO: 98 Mutação CysTM (aa) SEQ ID NO: 99 wt CysTM (aa) SEQ ID NO: 100 Mutação CysTM (nt) SEQ ID NO: 101 wt CysTM (nt) SEQ ID NO: 102 A/Hong Kong/4801/14 (nt) SEQ ID NO: 103 Construção No. 2801 (nt) SEQ ID NO: 104 Construção No. 3023 (nt) SEQ ID NO: 105 Construção No. 2811 (nt)
[00270] A presente invenção será ainda ilustrada nos exemplos a seguir. Exemplo 1: Construções de HÁ da Influenza
[00271] As construções de HA para Influenza foram produzidas usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, o tipo selvagem H3 A-Suíça / 97l5293 / 13 HA, N382A A / Suíça / 9715293/13 H3 HA e CysTM A- Suíça-9715293-13 foram clonados como descrito abaixo. Outros mutantes H3 HA foram obtidos usando técnicas semelhantes e os iniciadores, modelos e produtos de sequências HA são descritos no Exemplo 3 (HA de Influenza e produção de VLP em plantas) e na Tabela 4.
[00272] Um resumo das proteínas HA de tipo selvagem e mutadas, iniciadores, modelos e produtos é fornecido na Tabela 4 abaixo. Para construções de Influenza H3 diferentes das proteínas H3 A / Suíça / 97l5293 / l3 HA que foram clonadas dentro do vetor de clonagem 1190 sem M2, o vetor de clonagem usado integra um gene de canal de íon M2 de Influenza sob o controle do promotor e terminador de alfafa plastocianina, além do promotor 2X35S / CPMV 160 +
CPMV 3'UTR / cassete de expressão baseada em NOS. O plasmídeo número 3556 (SEQ ID NO: 66; Figuras 5A) foi digerido com as enzimas de restrição SacII e Stul e usado para a reação In-Fusion. Modificação de HA H3 2X35S / CPMV 160 / PDISP-HAO H3 A-Switzerland-97l5293-l3 / NOS (Construção número 2801)
[00273] Uma sequência que codifica HA0 maduro de Influenza HA de H3 A / Switzerland / 97l5293 / 13 fundido com o peptídeo sinal de secreção PDI de alfafa (PDISP) foi clonado no sistema de expressão 2X35S / CPMV 160 / NOS usando o seguinte método baseado em PCR. Um fragmento contendo a sequência de codificação PDISP-H3 A / Suíça / 97l5293 / l3 foi amplificado usando os iniciadores IF-CPMV (fl5'UTR) _SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) e IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17), usando PDISP-H1 A / Switzerland / 97l5293 / 13 sequência do gene (SEQ ID NO: 9) como modelo. O produto de PCR foi clonado no sistema de expressão 2X35S / CPMV 160 / NOS usando sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). A construção número 1190 (Figura 5B) foi digerida com as enzimas de restrição SacII e Stul e o plasmídeo linearizado foi usado para a reação de montagem In-Fusion. A construção número 1190 é um plasmídeo aceitador destinado à clonagem "In Fusion" de genes de interesse em um cassete de expressão baseado em 2X35S / CPMV l60 / NOS. Também incorpora uma construção de gene para a co-expressão do supressor de silenciamento de TBSV P19 sob o promotor e terminador do gene da plastocianina da alfafa. A estrutura é um plasmídeo binário pCAMBIA e a sequência da borda esquerda para a direita do t-DNA é apresentada na SEQ ID NO: 62. A construção resultante recebeu o número 2801 (SEQ ID NO: 103). 2X35S / CPMV 160 / PDISP-HAO H3 A-Switzerland-97l5293-l3 (N382AV NOS (Construção número 3023)
[00274] Uma sequência que codifica HA0 maduro de influenza HA de A / Switzerland / 9715293/13 (N382A) fundido ao peptídeo sinal de secreção de PDI de alfafa (PDISP) foi clonado no sistema de expressão 2X35S / CPMV 160 / NOS usando o seguinte método baseado em PCR. Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento contendo o PDISP-H3 A / Switzerland / 9715293/13 com o aminoácido N382A mutado foi amplificado usando os iniciadores IF-CPMV (fl5'UTR) _SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) e H3_Swi (N382A) .r (SEQ ID NO: 50), usando a sequência do gene PDISP-H3 A / Switzerland / 9715293/13 (SEQ ID NO: 9) como modelo. Um segundo fragmento contendo a mutação N382A com o restante do H3 A / Switzerland / 9715293/13 foi amplificado usando H3_Swi (N382A) .c (SEQ ID NO: 51) e IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17 ), usando a sequência do gene PDISP-H3 A / Suíça / 9715293/13 (SEQ ID NO: 9) como modelo. Os produtos de PCR de ambas as amplificações foram então misturados e usados como modelo para uma segunda rodada de amplificação usando IF-CPMV (fl5'UTR) _SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) e IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO : 17) como primers. O produto de PCR final foi clonado no sistema de expressão 2X35S / CPMV 160 / NOS usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). A construção número 1190 (Figura 5B) foi digerida com as enzimas de restrição SacII e StuI e o plasmídeo linearizado foi usado para a reação de montagem In-Fusion. O construto número 1190 é um plasmídeo aceptor destinado à clonagem “In Fusion” de genes de interesse em um cassete de expressão baseado em 2X35S / CPMV 160 / NOS. Ele também incorpora uma construção de gene para a co-expressão do supressor de silenciamento TBSV P19 sob o promotor e terminador do gene da plastocianina da alfafa. A estrutura é um plasmídeo binário pCAMBIA e a sequência da borda esquerda para a direita do t-DNA é apresentada em SEQ ID NO: 62. A construção resultante recebeu o número 3023 (SEQ ID NO: 104). A sequência de aminoácidos de PDISP-H3 A- Switzerland-9715293-13 (N382A) mutado é apresentada na SEQ ID NO: 82. Uma representação do plasmídeo 3023 é apresentada na Figura 4C. 2X35S / CPMV 160 / PDISP-HAO H3 A-Switzerland-97l5293-l3 (CvsTMV NOS (Construção número 2811)
[00275] Uma sequência que codifica HA0 maduro de influenza HA de A / Switzerland / 9715293/13 (CysTM) fundido ao peptídeo sinal de secreção PDI de alfafa (PDISP) foi clonado no sistema de expressão 2X35S / CPMV 160 / NOS usando o seguinte método baseado em PCR. Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento contendo o PDISP-H3 A / Switzerland / 9715293/13 com os aminoácidos CysTM mutados foi amplificado usando os iniciadores IF-CPMV (fl5'UTR) _SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) e H3_Swi_SLVLL.r (SEQ ID NO: 18), usando a sequência do gene PDISP-H3 A / Switzerland / 9715293/13 (SEQ ID NO: 9) como modelo. Um segundo fragmento contendo as mutações CysTm com o restante do H3 A / Switzerland / 9715293/13 foi amplificado usando
H3_Swi_SLVLL.c (SEQ ID NO: 19) e IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17), usando PDISP- sequência do gene H3 A / Switzerland / 9715293/13 (SEQ ID NO: 9) como modelo. Os produtos de PCR de ambas as amplificações foram então misturados e usados como modelo para uma segunda rodada de amplificação usando IF-CPMV (fl5'UTR) _SpPDI.c (SEQ ID NO: 15) e IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO : 17) como primers. O produto de PCR final foi clonado no sistema de expressão 2X35S / CPMV 160 / NOS usando o sistema de clonagem In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). A construção número 1190 (Figura 5B) foi digerida com as enzimas de restrição SacII e StuI e o plasmídeo linearizado foi usado para a reação de montagem In-Fusion. O construto número 1190 é um plasmídeo aceptor destinado à clonagem “In Fusion” de genes de interesse em um cassete de expressão baseado em 2X35S / CPMV 160 / NOS. Ele também incorpora uma construção de gene para a co- expressão do supressor de silenciamento TBSV P19 sob o promotor e terminador do gene da plastocianina da alfafa. A estrutura é um plasmídeo binário pCAMBIA e a sequência da borda esquerda para a direita do t-DNA é apresentada na SEQ ID NO: 62. A construção resultante recebeu o número 2811 (SEQ ID NO: 105). A sequência de aminoácidos de PDISP-H3 A- Switzerland-9715293-13 mutado (CysTM) é apresentada na SEQ ID NO: 49. Uma representação do plasmídeo 2811 é apresentada na Figura 8K. Exemplo 2: Métodos Transfecção de Agrobacterium tumefaciens
[00276] A cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens foi transfectada por eletroporação com HA do tipo selvagem de de Influenza ou vetores de expressão de HA de Influenza mutante usando os métodos descritos por D'Aoust et al, 2008 (Plant Biotech. J. 6: 930-40). Agrobacterium transfectadas foram cultivadas em meio YEB suplementado com 10 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico (MES), 20 mM de acetosiringona, 50 pg / ml de canamicina e 25 pg / ml de carbenicilina pH 5,6 a um OD600 entre 0,6 e 1,6. As suspensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes do uso e ressuspensas em meio de infiltração (MgCh 10 mM e MES 10 mM pH 5,6). Preparação de Biomassa Vegetal, Inóculo e Agroinfiltração
[00277] Plantas de N. benthamiana foram cultivadas a partir de sementes em espaços preenchidos com um substrato comercial de musgo de turfa. As plantas foram cultivadas em casa de vegetação sob fotoperíodo de 16/8 e regime de temperatura de 25 ° C dia / 20 ° C à noite. Três semanas após a semeadura, as plântulas individuais foram colhidas, transplantadas em vasos e deixadas para crescer na estufa por mais três semanas nas mesmas condições ambientais.
[00278] Agrobacterium transfectadas com cada HA de Influenza de tipo selvagem ou vetor de expressão de HA de Influenza mutante foram cultivadas em um meio YEB suplementado com 10 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico (MES), 20 pM de acetosiringona, 50 pg / ml de canamicina e 25 pg / ml de carbenicilina pH 5,6 até atingirem um ODeoo entre 0,6 e 1,6. As suspensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes do uso e ressuspensas em meio de infiltração (MgCh 10 mM e MES 10 mM pH 5,6) e armazenadas durante a noite a 4° C. No dia da infiltração, os lotes de cultura foram diluídos em 2,5 volumes de cultura e deixados aquecer antes do uso. Plantas inteiras de N. benthamiana foram colocadas de cabeça para baixo na suspensão bacteriana em um tanque de aço inoxidável hermético sob vácuo de 20-40 Torr por 2 min. As plantas foram devolvidas à estufa por um período de incubação de 6 ou 9 dias até a colheita. Colheita de folhas e extração de proteína total
[00279] As proteínas foram extraídas da biomassa fresca cortada em pedaços de ~ 1 cm 2 por uma extração enzimática durante a noite em temperatura ambiente usando um agitador orbital. A lama foi então filtrada através de um filtro de náilon de poro grande para remover tecido vegetal grosseiro não digerido.
[00280] Para obter os "rendimentos do processo completo", a pasta foi centrifugada para remover protoplastos e contaminantes intracelulares. O sobrenadante foi clarificado por filtração em profundidade. A fração clarificada foi então carregada em uma coluna de troca catiônica com uma etapa de eluição em etapas com concentrações crescentes de NaCl. As VLPs purificadas foram concentradas por TFF, diafiltradas contra um tampão de formulação e passadas através de um filtro. O conteúdo de proteína de VLP purificado foi analisado por ensaio BCA e atividade foi analisada por um ensaio de hemaglutinação. Os rendimentos relativos foram obtidos comparando os rendimentos da proteína da nova construção com a construção nativa (ou para CysTM para as cepas H3) usada como controle.
[00281] Para obter os "rendimentos de gradiente pós- densidade", a pasta foi centrifugada para remover protoplastos e contaminantes intracelulares. O sobrenadante foi centrifugado adicionalmente para remover detritos adicionais. O sobrenadante foi clarificado por filtração em profundidade usando filtro de fibra de vidro. A fração clarificada foi então carregada em um gradiente de densidade de iodixanol descontínuo. A centrifugação de gradiente de densidade de separação foi realizada da seguinte forma: tubos de 38 ml contendo gradiente de densidade de iodixanol descontínuo em tampão Tris (camadas sucessivas de 35%, 30%, 25%, 20%, 15, 10% e 5%) foram preparados e revestidos com clarificado extrair. Os gradientes foram centrifugados a 120 000 g durante 2 horas (4 ° C). Após a centrifugação, os primeiros 5 mL coletados de baixo para cima foram descartados enquanto os próximos 5 mL foram coletados para análise de conteúdo de proteína (BCA), medição da atividade (ensaio de hemaglutinação) e medição da intensidade da banda HA0 em um SDS-PAGE reduzido (densitometria). Os rendimentos relativos foram obtidos comparando a intensidade da banda HA0 da nova construção com a construção nativa (ou CysTM para cepas H3) usada como controle. Ensaio de hemaglutinação
[00282] O ensaio de hemaglutinação foi baseado em um método descrito por Nayak e Reichl (2004). Resumidamente, diluições duplas em série das amostras de teste (100 pL) foram feitas em placas de microtitulação de 96 poços com fundo em V contendo 100 pL de PBS, deixando 100 pL de amostra diluída por poço. Cem microlitros de suspensão de glóbulos vermelhos de porquinho-da-índia a 0,5% (Bio Link Inc., Syracuse, NY) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante 2h à temperatura ambiente. O recíproco da diluição mais alta mostrando hemaglutinação completa foi registrado como atividade de HA. Em paralelo, um padrão HA recombinante (A / Vietnam / l203 / 2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT) foi diluído em PBS e executado como um controle em cada placa. Análise de proteínas e imunoblotting
[00283] O immunoblotting foi realizado com uma primeira incubação com um mAh primário, diluído 1/500 em 2% de leite desnatado em TBS-Tween 20 0,1%. Anti-camundongo de cabra conjugado com peroxidase (Jackson Immunoresearch, cat # 115-035-146) diluído 1/10000 foi usado como anticorpo secundário para detecção de quimioluminescência em 2% de leite desnatado em complexos TBS-Tween 20 imunorreativos a 0,1% foram detectados por quimioluminescência usando luminol como substrato (Roche Diagnostics Corporation). A conjugação de peroxidase-enzima de rábano silvestre de anticorpo IgG humano foi realizada usando o kit de conjugação de Peroxidase Ativada EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, Ill). Exemplo 3: Produção de HA de Influenza e VLP em Plantas Modificação de HA H3
[00284] As construções de HA para Influenza foram produzidas usando técnicas bem conhecidas na técnica (ver Exemplo 1). Um resumo das proteínas HA de tipo selvagem e mutadas, iniciadores, modelos e produtos é fornecido na
Tabela 4 abaixo. As sequências utilizadas são fornecidas no Exemplo 4 e na listagem de sequências. N382A A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3
[00284] N382A A / Suíça / 97l5293 / 13 O mutante H3 (Construção # 3023) foi construído por mutação da asparagina na posição 382 do tipo selvagem / Suíça / 97l5293 / 13H3 para alanina. Conforme mostrado na Figura 2, extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltrado com a construção # 3023 exibiram um aumento de aproximadamente 30% no título de hemaglutinação em comparação com os extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com o tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 (construção # 2801). L384V A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3
[00285] L384V A / Switzerland / 97l5293 / l3 Mutante H3 (Construção # 3034) foi construída por mutação da leucina na posição 384 do tipo selvagem / Suíça / 97l5293 / 13 H3 para valina. Como mostrado na Figura 2, os extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3034 exibiram um aumento de aproximadamente 100% no título de hemaglutinação em comparação com os extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / l3 H3 (construção # 2801). F392D A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3
[00286] F392D A / Suíça / 97l5293 / 13 O mutante H3 foi construído por mutação da fenilalanina na posição 392 do tipo selvagem A / Suíça / 9715293/13 H3 para ácido aspártico (Construção # 3045). Como mostrado na Figura 2, os extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3045 exibiram um aumento de aproximadamente 40% no título de hemaglutinação em comparação com os extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / l3 H3 (construção # 2801). L431M A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3
[00287] L431M A / Suíça / 97l5293 / 13 O mutante H3 foi construído por mutação da leucina na posição 431 do tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 para metionina (Construção # 3022). Como mostrado na Figura 2, extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3022 exibiram um aumento de aproximadamente 70% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com o tipo selvagem A / Suíça / 9715293/13 H3 (construção # 2811).
[00288] Uma ou mais mutações aqui descritas aumentam especificamente a produção de proteína HA de Influenza e o rendimento de VLP em plantas. Foi observado que as mutações em outras posições reduziram significativamente, ou não tiveram efeito significativo, no acúmulo de proteína HA da Influenza ou na produção de VLP em células vegetais.
[00289] Os títulos de hemaglutinação aumentados alcançados com proteínas HA de Influenza compreendendo uma ou mais de uma mutação aqui descrita também foram observadas como sendo específicas para HAs de Influenza H3. Melhorias semelhantes não foram observadas em plantas agroinfiltradas com construções que codificam HAs de Influenza mutantes derivados de cepas não H3.
[00290] Por exemplo, F393D A / Indonésia / 5/2005
Mutante H5 foi construído pela mutação da fenilalanina na posição 393 da A / Indonesia / 5/2005 H5 do tipo selvagem para ácido aspártico (Construção # 3680). Como mostrado na Figura 3, os extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3680 exibiram uma redução de aproximadamente 98% no título de hemaglutinação em comparação com os extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltrados com tipo selvagem A / Indonésia / 5/2005 H5 (Construção # 2295).
[00291] Da mesma forma, os extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltrados com F392D A / Egypt / N049l5 / 20l4 mutante H5 (Construção # 3690), exibiram uma redução de aproximadamente 99% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltrados com A / Egypt / N049l5 / 20l4 H5 tipo selvagem (Construção # 3645) (ver Figura 3, Tabela 7). Modificação de H3 HA CysTM A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3
[00292] CysTM A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3 (Construção # 2811) foi construído substituindo a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) do tipo selvagem A / Suíça / 9715293/13 H3 para “SLVLL” (SEQ ID NO: 98). Como mostrado na Figura 6A, os extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 2811 exibiram um aumento de aproximadamente 60% no título de hemaglutinação em comparação com os extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 (construção # 2801).
CysTM A / Pennsylvania / 09/2015 Mutant H3
[00293] CysTM A / Pennsylvania / 09 / 20l5 Mutante H3 (Construção # 3313) foi construído substituindo a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) do tipo selvagem A / Pennsylvania / 09/2015 H3 para “SLVLL” (SEQ ID NO: 98). Como mostrado na Figura 7C, os extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3313 exibiram um aumento de aproximadamente 100% no título de hemaglutinação em comparação com os extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / 09 / 20l5 H3 (construção # 3312). N382A + CysTM A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3
[00294] N382A + CysTM A / Suíça / 97l5293 / l3 Mutante H3 (Construção # 3063) foi construído através da mutação da asparagina na posição 382 do tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 para alanina e substituindo a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) para "SLVLL" (SEQ ID NO: 98). Conforme mostrado na Figura 7A, os extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3063 exibiram um aumento de aproximadamente 160% no título de hemaglutinação em comparação com os extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 (Construção # 2801). Conforme mostrado na Figura 7B, plantas de N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3063 exibiram um aumento de aproximadamente 30% no rendimento de VLP após purificação de gradiente de iodixanol, em comparação com plantas infiltradas com CysTM A / Switzerland / 97l5293 / l3 mutante H3 (construção #
2811) N382A + CysTM A / Pensilvânia / 09/2015 Mutante H3
[00295] N382A + CysTM A / Pennsylvania / 09 / 20l5 Mutante H3 (Construção # 3314) foi construído por mutação da asparagina na posição 382 do tipo selvagem A / Pennsylvania / 09 / 20l5 H3 para alanina e substituindo a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) para "SLVLL" (SEQ ID NO: 98). Como mostrado na Figura 7C, extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3314 exibiram um aumento aproximado de 300% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / Pennsylvania / 09 / 20l5 H3 (construção # 3312). L384V + CysTM A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3
[00296] L384V + CysTM A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3 (Construção # 3074) foi construído por mutação da leucina na posição 384 do tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 para valina e substituindo a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) para "SLVLL" (SEQ ID NO: 98). Conforme mostrado na Figura 7C, extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltrados com a construção # 3074 exibiu um aumento aproximado de 380% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 (construção # 2801). Além disso, como mostrado na Figura 7B, as plantas de N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3074 exibiram um aumento aproximado de 50% no rendimento de VLP após a purificação de gradiente de sacarose, em comparação com as plantas infiltradas com CysTM A / Switzerland / 97l5293 / l3 mutante H3 (construção # 2811). L384V + CysTM A / Pennsylvania / 09/2015 Mutant H 3
[00297] L384V + CysTM A / Pennsylvania / 09 / 20l5 Mutante H3 (Construção # 3315) foi construído por mutação da leucina na posição 384 do tipo selvagem A / Pennsylvania / 09 / 20l5 H3 para valina e substituindo a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) para "SLVLL" (SEQ ID NO: 98). Conforme mostrado na Figura 7C, extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltrados com a construção # 3315 exibiu um aumento de aproximadamente 380% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / Pennsylvania / 09/2015 H3 (Construção # 3312). F392D + CysTM A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3
[00298] F392D + CysTM A / Suíça / 97l5293 / l3 Mutante H3 (Construção # 3085) foi construído por mutação da fenilalanina na posição 392 do tipo selvagem / Suíça / 97l5293 / 13 H3 para ácido aspártico e substituindo a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) para "SLVLL" (SEQ ID NO: 98). Como mostrado na Figura 7A, os extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3085 exibiram um aumento de aproximadamente 170% no título de hemaglutinação em comparação com os extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltrados com tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 (Construção # 2801).
L431M + CysTM A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3
[00299] L431M + CysTM A / Suíça / 9715293/13 Mutante H3 (Construção # 3062) foi construído por mutação da leucina na posição 431 do tipo selvagem / Suíça / 97l5293 / l3 H3 para metionina e substituindo a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) para "SLVLL" (SEQ ID NO: 98). Como mostrado na Figura 7A, extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3062 exibiu um aumento aproximado de 150% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / Suíça / 97l5293 / 13 H3 (construção # 2801). N382A + L384V + CysTM A / Hong Kong / 4801/14 Mutante H3
[00300] N382A + L384V + CysTM A / Hong Kong / 480l / l4 Mutante H3 (Construção # 3375) foi construído por mutação da asparagina na posição 382 do tipo selvagem A/Hong Kong/480l/14 em um resíduo de alanina, a leucina na posição 384 em um resíduo de valina e a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) para “SLVLL” (SEQ ID NO: 98). Como mostrado na Figura 7E, extratos purificados de plantas de N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3375 exibiram um aumento de aproximadamente 300% no título de hemaglutinação em comparação com os extratos das plantas N. benthamiana agroinfiltradas com CysTM A / Hong Kong / 480l / l4 mutante H3 (construção # 3341). N382A + L384V + CysTM A / Minnesota / 40/15 Mutante H3
[00301] N382A + L384V + CysTM A / Minnesota / 40 / l5 Mutante H3 (Construção # 3915) foi construído por mutação da asparagina na posição 382 do tipo selvagem A / Minnesota / 40/15 para um resíduo de alanina, a leucina na posição 384 para um resíduo de valina e a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) a “SLVLL” (SEQ ID NO: 98). Como mostrado na Figura 7E, extratos purificados de N. as plantas benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3915 exibiram um aumento de aproximadamente 400% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com CysTM A / Minnesota / 40 / l5 mutante H3 (construção # 3914). N382A + L384V + CysTM A / S. Austrália / 1/16 Mutante H3
[00302] N382A + L384V + CysTM A / S. Austrália / l / l6 Mutante H3 (Construção # 3925) foi construído por mutação da asparagina na posição 382 do tipo selvagem A / S. Austrália / l / l6 para um resíduo de alanina, a leucina na posição 384 para um resíduo de valina e a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) para "SLVLL" (SEQ ID NO: 98). Conforme mostrado na Figura 7D e 7E, extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com Construção # 3925 exibiram um aumento de aproximadamente 400% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com CysTM A / S. Austrália / l / 16 Mutante H3 (Construção # 3924). N382A + L384V + CysTM A / Bangkok / 3007/15 Mutante H3
[00303] N382A + L384V + CysTM A / Bangkok / 3007/15 Mutante H3 (Construção # 3905) foi construído por mutação da asparagina na posição 382 do tipo selvagem A / Bangkok / 3007/15 para um resíduo de alanina, a leucina na posição
384 para um resíduo de valina e a sequência "CFLLC" nas posições 524-528 (SEQ ID NO: 99) a “SLVLL” (SEQ ID NO: 98). Como mostrado na Figura 7E, extratos purificados de de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com a construção # 3905 exibiram um valor aproximado aumentado de 400% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com CysTM A / Bangkok / 3007/15 Mutant H3 (Construção # 3904).
[00304] A uma ou mais mutações aqui descritas aumentam especificamente a produção de proteína HA de Influenza e o rendimento de VLP em plantas. Foi observado que as mutações em outras posições reduziram significativamente, ou não tiveram efeito significativo, no acúmulo de proteína HA da Influenza ou na produção de VLP em células vegetais.
[00305] Os títulos de hemaglutinação aumentados alcançados com as proteínas HA de Influenza compreendendo uma ou mais de uma mutação aqui descrita também foram observadas como sendo específicas para HAs de Influenza H3. Melhorias semelhantes não foram observadas em plantas agroinfiltradas com construções que codificam HAs de Influenza mutantes derivados de cepas não H3.
[00306] Por exemplo, F393D A / Indonésia / 5/2005 Mutante H5 foi construído por mutação da fenilalanina na posição 393 de A / Indonesia / 5/2005 H5 do tipo selvagem para ácido aspártico (Construção # 3680). Conforme mostrado na Figura 3, extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltrados com a construção # 3680 exibiram uma redução de aproximadamente 98% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltradas com tipo selvagem A / Indonésia / 5/2005 H5 (Construção # 2295).
[00307] Da mesma forma, os extratos purificados de plantas N. benthamiana agroinfiltrados com F392D A / Egypt / N049l5 / 20l4 mutante H5 (Construção # 3690), exibiram uma redução de aproximadamente 99% no título de hemaglutinação em comparação com extratos de plantas N. benthamiana agroinfiltrados com tipo selvagem A / Egypt / N049l5 / 20l4 H5 (Construção # 3690) (ver Figura 3). Tabela 4: Exemplos de construções que foram preparadas conforme descrito neste relatório descritivo. As sequências são fornecidas no Exemplo 4 e na lista de sequências. Nome da Construção Primer Primer Primer Molde Gene Proteína TMCT Fig Primer 4 Construção # 1 2 3 para PCR resultante resultante H3 A-HK- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: - 3340 8A - - 4801-14 NO: 15 NO: 17 NO: 1 1 2 H3 A-HK- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTm 3341 8B 4801-14 NO: 15 NO: 18 NO: 19 NO: 17 NO: 1 20 21 H3 A-HK- 4801-14 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTm 3375 8C (N382A+L384 NO: 15 NO: 22 NO: 23 NO: 17 NO: 20 24 25 V) H3 A-Minn- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTM 3914 8D 40-15 NO: 15 NO: 18 NO: 19 NO: 17 NO: 3 26 27 H3 A-Minn- 40-15 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTM 3915 8E (N382A+L384 NO: 15 NO: 28 NO: 29 NO: 17 NO: 26 30 31 V) H3 A-SAus-1- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTM 3924 8F 16 NO: 15 NO: 18 NO: 19 NO: 17 NO: 5 32 33 H3 A-SAus-1- 16 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTM 3925 8G (N382A+L384 NO: 15 NO: 28 NO: 29 NO: 17 NO: 32 34 35 V) H3 A-Bang- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTM 3904 8H 3007-15 NO: 15 NO: 18 NO: 19 NO: 17 NO: 7 36 37 H3 A-Bang- 3007-15 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTM 3905 8I (N382A+L384 NO: 15 NO: 22 NO: 23 NO: 17 NO: 36 38 39 V)
Nome da Construção Primer Primer Primer Molde Gene Proteína TMCT Fig Primer 4 Construção # 1 2 3 para PCR resultante resultante
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: Wt 2801 8J - - 9715293-13 NO: 15 NO: 17 NO: 9 9 10
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9715293-13 Wt 3045 4A NO: 15 NO: 40 NO: 41 NO: 17 NO: 9 42 43 (F392D)
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9715293-13 Wt 3022 4B NO: 15 NO: 44 NO: 45 NO: 17 NO: 9 46 47 (L431M)
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTM 2811 8K 9715293-13 NO: 15 NO: 18 NO: 19 NO: 17 NO: 9 48 49
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9715293-13 CysTM 3063 8L NO: 15 NO: 50 NO: 51 NO: 17 NO: 48 52 53 (N382A)
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9715293-13 CysTM 3074 8M NO: 15 NO: 54 NO: 55 NO: 17 NO: 48 56 57 (L384V)
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9715293-13 CysTM 3085 8N NO: 15 NO: 40 NO: 41 NO: 17 NO: 48 58 59 (F392D)
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9715293-13 CysTM 3062 8O NO: 15 NO: 44 NO: 45 NO: 17 NO: 48 60 61 (L431M)
H5 A-Indo-5- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: Wt 2295 9A - - 05 NO: 15 NO: 67 NO: 68 68 69
H5 A-Indo-5- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: Wt 3680 9B 05 (F393D) NO: 15 NO: 70 NO: 71 NO: 67 NO: 68 72 73
H5 A-Egypt- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: Wt 3645 9C - - N04915-14 NO: 15 NO: 74 NO: 75 75 76
H5 A-Egypt- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: N04915-14 Wt 3690 9D NO: 15 NO: 77 NO: 78 NO: 74 NO: 75 79 80 (F392D)
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9715293-13 Wt 3023 4C NO: 15 NO: 50 NO: 51 NO: 17 NO: 9 81 82 (N382A)
H3 A-Swi- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9715293-13 Wt 3034 4D NO: 15 NO: 54 NO: 55 NO: 17 NO: 9 83 84 (L384V)
H3 A-Penn- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: Wt 3312 8P - - 09-15 NO: 15 NO: 17 NO: 13 13 14
H3 A-Penn- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: CysTM 3313 8Q 09-15 NO: 15 NO: 18 NO: 19 NO: 17 NO: 13 85 86
H3 A-Penn- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 09-15 CysTM 3314 8R NO: 15 NO: 50 NO: 51 NO: 17 NO: 85 87 88 (N382A)
Nome da Construção Primer Primer Primer Molde Gene Proteína TMCT Fig Primer 4 Construção # 1 2 3 para PCR resultante resultante H3 A-Penn- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: 09-15 CysTM 3315 8S NO: 15 NO: 54 NO: 55 NO: 17 NO: 85 89 90 (L384V) Exemplo 3: Título de hemaglutinação. Rendimentos de gradiente de pós-densidade e rendimentos de processo completo
[00308] Um resumo do título de hemaglutinação medido é dado nas Tabelas 5 e 6A. O título de hemaglutinação foi medido conforme descrito no Exemplo 2. O título de hemaglutinação relativo foi obtido comparando o título de hemaglutinação da proteína HA mutada ou modificada com HA de tipo selvagem (Tabela 5) ou a proteína HA mutante CysTM (Tabela 6A).
[00309] Um resumo dos rendimentos de gradiente de pós- densidade medidos é dado nas tabelas A5B e C5B. Os rendimentos de gradiente de pós-densidade foram medidos conforme descrito no Exemplo 2. Os rendimentos relativos foram obtidos comparando a intensidade da banda HA0 da proteína HA mutada ou modificada com a intensidade da banda HA0 do tipo selvagem HA (Tabela A 5B) ou a intensidade da banda HA0 de Proteína HA mutante CysTM (Tabela 6B).
[00310] Um resumo do rendimento total do processo medido é dado na tabela 6C. O rendimento total do processo foi obtido como descrito acima no Exemplo 2. Os rendimentos relativos foram obtidos comparando o rendimento da proteína da proteína HA mutada ou modificada com o rendimento da proteína de HA de tipo selvagem ou o rendimento da proteína da proteína HA mutante CysTM (Tabela 6C).
Tabela 5: Resumo do título de hemaglutinação relativo para H3. Numeração está de acordo com a H3 A/Hongkong/4801/14.
WT N382A L384V F392D L431M H3 100% 130% 200% 140% 170% A/Switzerland/9715293/13 Tabela 6A: Resumo do título de hemaglutinação relativo para H3. A numeração está de acordo com H3 A / Hong kong/480l/l4. L431 N382A L384V F392D N382A M + WT CysTM + + + +L384V CysT CysTM CysTM CysTM +CysTM
M H3 A/Hongkong/4 100% 400% 801/14 H3 A/Minnesota/ 100% 500% 40/15 H3 300- 100% A/S.Aus/1/16 500% H3 A/Bangkok/30 100% 500% 07/15 H3 200- A/Switzerlan 100% 160% 260% 270% 250% 480% 270% d/9715293/13 H3 A/Mississipp 100% 100% i/16/16 Tabela 6B: Resumo dos rendimentos de gradiente pós- densidade para H3 (expresso em%). A numeração está de acordo com H3 A / Hong kong/480l/l4.
N382A L384V F392D L431M WT CysTM + + + + CysTM CysTM CysTM CysTM H3 93% 100% 129% 150% 100% 100% A/Switzerland/9715293/13 Tabela 6C: Resumo do rendimento do processo total relativo para H3. A numeração está de acordo com H3 A / Hong kong/480l/l4. N382A L384V N382A WT CysTM + + +L384V CysTM CysTM +CysTM H3 A/Hongkong/4801/14 100% 135% 135% 150% H3 A/Minnesota/40/15 100% 280% H3 A/S.Aus/1/16 100% 395% H3 100% 196% A/Switzerland/9715293/13 H3 A/Mississippi/16/16 100% 152% Tabela 7 Resumo do título de hemaglutinação relativo para H5. Numeração de acordo com H5 A / Indonésia / 5/2005 WT N383A F393D H5 A/Indonesia/5/2005 100% 50% 2% H5 A/Egypt/N04915/2014 100% 50% 1% Exemplo 4: Sequências
[00310] As seguintes sequências foram usadas (também consulte a Tabela 4) PDI-H3 HK DNA (SEQ ID NO:1)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTC TCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTG GGCATCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAA GTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCC TCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTC AGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTAC AGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTC ATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACG GAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGG TTGACCCACTTAAACTACACATACCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAATGAACA ATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCT TCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCT GTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCAT CTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAA TTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGAT GCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGA CAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGC ATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGC ATATTTGGTGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTG GTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCA CTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAAC GAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAATTCAGGACCT TGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTG TTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTT GAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAA AATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGGAACTTATGACC ACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTG AAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCT TTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCA
ACATTTGCATTTGA PDI-H3 HK AA (SEQ ID NO: 2)
MAKNVAIFGLLFSLLVLVPSQIFAQKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIE VTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAY SNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSSSSFFSRLNW LTHLNYTYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQA VIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSD APIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKHSTLKLATGMRNVPEKQTRG IFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTN EKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLF EKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHNVYRDEALNNRFQIKGVEL
KSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI PDI-H3 Minn DNA (SEQ ID NO: 3)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTC TCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTG GGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACAAATGACCGAATTGAA GTTACTAATGCTACTGAGTTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCC TCATCAGATCCTTGATGGAGAGAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTC AGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTAC AGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTC ATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACG GAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGG TTGACCCACTTAAACTACACATATCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAAGGAACA ATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCT TCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCT GTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCAT CTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAA TTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGAT GCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGA CAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGC ATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGC ATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTG GTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCA CTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGGTTGATCGGGAAAACCAAC GAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAGTTCAAGACCT TGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTG TTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTT GAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGAAATGGTTGTTTCAA AATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGAAACTTATGACC ACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTG AAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCT TTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGATGCA
ACATTTGCATTTGA PDI-H3 Minn AA (SEQ ID NO: 4)
MAKNVAIFGLLFSLLVLVPSQIFAQKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIE VTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAY SNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSSSSFFSRLNW LTHLNYTYPALNVTMPNKEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQA VIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSD APIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKHSTLKLATGMRNVPEKQTRG IFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTN EKFHQIEKEFSEVEGRVQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLF EKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNETYDHNVYRDEALNNRFQIKGVEL
KSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI PDI-H3 SAus DNA (SEQ ID NO: 5)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTC TCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTG GGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACAAATGACCGAATTGAA GTTACTAATGCTACTGAGTTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCC TCATCAGATCCTTGATGGAGAGAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTC AGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTAC AGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTC ATCCGGCACACTGGAGTTTAAAAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACG GAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGG TTGACCCACTTAAACTACACATATCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAAGGAACA ATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCT TCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCT GTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCAT CTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAA TTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGAT GCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGA CAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGC ATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGC ATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTG GTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCA CTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGGTTGATCGGGAAAACCAAC GAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAGTTCAAGACCT TGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTG TTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTT GAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGAAATGGTTGTTTCAA AATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGAAACTTATGACC ACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTG AAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCT TTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGATGCA
ACATTTGCATTTGA PDI-H3 SAus AA (SEQ ID NO: 6)
MAKNVAIFGLLFSLLVLVPSQIFAQKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIE VTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAY SNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFKNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSSSSFFSRLNW LTHLNYTYPALNVTMPNKEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQA VIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSD APIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKHSTLKLATGMRNVPEKQTRG IFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTN EKFHQIEKEFSEVEGRVQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLF EKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNETYDHNVYRDEALNNRFQIKGVEL
KSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI PDI-H3 Bang DNA (SEQ ID NO: 7)
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ACATTTGCATTTGA PDI-H3 Bang AA (SEQ ID NO: 8)
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KSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI PDI-H3 Switz DNA (SEQ ID NO: 9)
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ACATTTGCATTTGA PDI-H3 Switz AA (SEQ ID NO: 10)
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ACATTTGCATTTGA PDI-H3 Miss AA (SEQ ID NO: 12)
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ACATTTGCATTTGA PDI-H3 Penn AA (SEQ ID NO: 14)
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ACTAAAGAAAATAGGCCTTTAAATACATATTCTACACTGTAGAGAC IF-H3A-Ala.r (SEQ ID NO: 17)
ACTAAAGAAAATAGGCCTTCAAATGCAAATGTTGCACCTAATGTTGCCCTTTTGG H3_Swi_SLVLL.r (SEQ ID NO: 18)
AGCAACTAACAGTACAAGGGATGATATGGCAAAGGAAATCCATAGGATCCA H3_Swi_SLVLL.c (SEQ ID NO: 19)
TCCTTTGCCATATCATCCCTTGTACTGTTAGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCAT PDI-H3 HK-CysTm DNA (SEQ ID NO: 20)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTC TCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTG GGCATCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAA GTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCC TCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTC AGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTAC AGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTC ATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACG GAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGG TTGACCCACTTAAACTACACATACCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAATGAACA ATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCT TCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCT GTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCAT CTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAA TTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGAT GCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGA CAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGC ATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGC ATATTTGGTGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTG GTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCA CTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAAC GAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAATTCAGGACCT TGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTG TTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTT GAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAA AATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGGAACTTATGACC ACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTG AAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATCCCTTGTACT GTTAGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCA
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ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTC TCAGATCTTCGCGCAAAAAATTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTG GGCATCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAA GTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCC TCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTC AGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTAC AGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTC ATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACG GAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGAGATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGG TTGACCCACTTAAACTACACATACCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAATGAACA ATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCT TCCTGTATGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCT GTAATCCCAAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCAT CTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAA TTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGAT GCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGA CAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGC ATAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGC ATATTTGGTGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTG GTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCA CTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGGCTCGAGTGATCGGGAAAACCAAC GAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAATTCAGGACCT TGAGAAATATGTTGAGGACACTAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTG TTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTT GAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAA AATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATAAGAAATGGAACTTATGACC ACAATGTGTACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTG AAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATCCCTTGTACT GTTAGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCA ACATTTGCATTTGA
PDI-H3 HK-N382A+L384V-CysTm AA (SEQ ID NO: 25)
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ACATTTGCATTTGA PDI-H3 Minn-CysTm AA (SEQ ID NO: 27)
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EKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNETYDHNVYRDEALNNRFQIKGVEL KSGYKDWILWISFAISSLVLLVALLGFIMWACQKGNIRCNICI* H3Minn(N382A+L384V).r (SEQ ID NO: 28)
GTTGGTTTTCCCGATCACCCGAGCCAGCTTCCCATTGATTTGATCGATTGCTGCTTGAG
T H3Minn(N382A+L384V).c (SEQ ID NO: 29)
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CTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTA Construção 1314 a partir de 2X35S prom para NOS term (SEQ ID NO: 63)
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTC AGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCG GATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGC TCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGA CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTT GTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTT TCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACT TTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAA GGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACC CACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATT GATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGAC CCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTT TTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATC TCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAG ATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTT CTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCTGACACATTATGTATAGGTTATCAT GCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACA CTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAG CCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGT GAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACACCTAGTTCAGACAA TGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCT CAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCAT GACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAA AAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACA TTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGT GCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAG ATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAG GGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCA ACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGG TATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGG GTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGT CCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATATCCCGTC TATTCAATCTAGAGGACTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAG GGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCA GCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGT TATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAA AAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTAC AATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAA TGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTG GAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAA AATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAAT AGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTG TCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCT AATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTT ACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGT TTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCA AGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGA TATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATT GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGC ATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGA GTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGA
TAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT Construção 2980 a partir de 2X35S prom para NOS term (SEQ ID NO: 64)
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTC AGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCG GATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGC TCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGA CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTT GTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTT TCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACT TTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAA GGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACC CACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATT GATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGAC CCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTT TTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATC TCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAG ATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTT CTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCAT GCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACA CTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAG CCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGT GAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACACCTAGTTCAGACAA TGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCT CAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCAT GACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAA AAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACA TTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGT GCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAG ATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAG GGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCA ACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGG TATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGG GTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGT CCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATATCCCGTC TATTCAATCTAGAGGACTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAG GGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCA GCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGT TATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAA AAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTAC AATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAA TGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTG GAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAA AATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAAT AGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTG TCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCT AATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTT ACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGT TTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCA AGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGA TATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATT GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGC ATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGA GTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGA
TAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT Construção 2995 a partir de 2X35S prom para NOS term (SEQ ID NO: 65)
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTC AGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCG GATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGC TCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGA CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTT GTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTT TCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACT TTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAA GGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACC CACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATT GATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGAC CCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTT TTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATC TCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAG ATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTT CTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGGACACATTATGTATAGGTTATCAT GCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACA CTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAG CCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGT GAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACACCTAGTTCAGACAA TGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCT CAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCAT GACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAA AAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACA TTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGT GCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAG ATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAG GGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCA ACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGG TATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGG GTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGT CCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATATCCCGTC TATTCAATCTAGAGGACTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAG GGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCA GCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGT TATTGAAAAGATGAATACACAGGACACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAA AAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTAC AATGCCGAACTGTTGGTTCTAATGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAA TGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTG GAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAA AATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAAT AGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTG TCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCT AATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTT ACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGT TTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCA AGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGA TATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATT GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGC ATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGA GTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGA
TAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT Vetor de clonagem 3556 a partir do esquerdo para o direito T-DNA (SEQ ID NO: 66)
TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGC GGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGT CAAATAACTCAAAAACCATAAAAGTTTAAGTTAGCAAGTGTGTACATTTTTACTTGAAC AAAAATATTCACCTACTACTGTTATAAATCATTATTAAACATTAGAGTAAAGAAATATG GATGATAAGAACAAGAGTAGTGATATTTTGACAACAATTTTGTTGCAACATTTGAGAAA ATTTTGTTGTTCTCTCTTTTCATTGGTCAAAAACAATAGAGAGAGAAAAAGGAAGAGGG AGAATAAAAACATAATGTGAGTATGAGAGAGAAAGTTGTACAAAAGTTGTACCAAAATA GTTGTACAAATATCATTGAGGAATTTGACAAAAGCTACACAAATAAGGGTTAATTGCTG TAAATAAATAAGGATGACGCATTAGAGAGATGTACCATTAGAGAATTTTTGGCAAGTCA TTAAAAAGAAAGAATAAATTATTTTTAAAATTAAAAGTTGAGTCATTTGATTAAACATG TGATTATTTAATGAATTGATGAAAGAGTTGGATTAAAGTTGTATTAGTAATTAGAATTT GGTGTCAAATTTAATTTGACATTTGATCTTTTCCTATATATTGCCCCATAGAGTCAGTT AACTCATTTTTATATTTCATAGATCAAATAAGAGAAATAACGGTATATTAATCCCTCCA AAAAAAAAAAACGGTATATTTACTAAAAAATCTAAGCCACGTAGGAGGATAACAGGATC CCCGTAGGAGGATAACATCCAATCCAACCAATCACAACAATCCTGATGAGATAACCCAC TTTAAGCCCACGCATCTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCACACATTCTTCCACACA TCTGAGCCACACAAAAACCAATCCACATCTTTATCACCCATTCTATAAAAAATCACACT TTGTGAGTCTACACTTTGATTCCCTTCAAACACATACAAAGAGAAGAGACTAATTAATT AATTAATCATCTTGAGAGAAAATGGAACGAGCTATACAAGGAAACGACGCTAGGGAACA AGCTAACAGTGAACGTTGGGATGGAGGATCAGGAGGTACCACTTCTCCCTTCAAACTTC CTGACGAAAGTCCGAGTTGGACTGAGTGGCGGCTACATAACGATGAGACGAATTCGAAT CAAGATAATCCCCTTGGTTTCAAGGAAAGCTGGGGTTTCGGGAAAGTTGTATTTAAGAG ATATCTCAGATACGACAGGACGGAAGCTTCACTGCACAGAGTCCTTGGATCTTGGACGG GAGATTCGGTTAACTATGCAGCATCTCGATTTTTCGGTTTCGACCAGATCGGATGTACC TATAGTATTCGGTTTCGAGGAGTTAGTATCACCGTTTCTGGAGGGTCGCGAACTCTTCA GCATCTCTGTGAGATGGCAATTCGGTCTAAGCAAGAACTGCTACAGCTTGCCCCAATCG AAGTGGAAAGTAATGTATCAAGAGGATGCCCTGAAGGTACTCAAACCTTCGAAAAAGAA AGCGAGTAAGTTAAAATGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGGTTTGTTATTGTTAA TTTTGTTCTTGTAGAAGAGCTTAATTAATCGTTGTTGTTATGAAATACTATTTGTATGA GATGAACTGGTGTAATGTAATTCATTTACATAAGTGGAGTCAGAATCAGAATGTTTCCT CCATAACTAACTAGACATGAAGACCTGCCGCGTACAATTGTCTTATATTTGAACAACTA AAATTGAACATCTTTTGCCACAACTTTATAAGTGGTTAATATAGCTCAAATATATGGTC AAGTTCAATAGATTAATAATGGAAATATCAGTTATCGAAATTCATTAACAATCAACTTA ACGTTATTAACTACTAATTTTATATCATCCCCTTTGATAAATGATAGTACACCAATTAG GAAGGAGCATGCTCGCCTAGGAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTGCAAGCTGCTCT AGCCGTGTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGGAATTACTAGCGCGTG TCGACACGCGTGGCGCGCCCTGGTATATTTATATGTTGTCAAATAACTCAAAAACCATA AAAGTTTAAGTTAGCAAGTGTGTACATTTTTACTTGAACAAAAATATTCACCTACTACT GTTATAAATCATTATTAAACATTAGAGTAAAGAAATATGGATGATAAGAACAAGAGTAG TGATATTTTGACAACAATTTTGTTGCAACATTTGAGAAAATTTTGTTGTTCTCTCTTTT CATTGGTCAAAAACAATAGAGAGAGAAAAAGGAAGAGGGAGAATAAAAACATAATGTGA GTATGAGAGAGAAAGTTGTACAAAAGTTGTACCAAAATAGTTGTACAAATATCATTGAG GAATTTGACAAAAGCTACACAAATAAGGGTTAATTGCTGTAAATAAATAAGGATGACGC ATTAGAGAGATGTACCATTAGAGAATTTTTGGCAAGTCATTAAAAAGAAAGAATAAATT ATTTTTAAAATTAAAAGTTGAGTCATTTGATTAAACATGTGATTATTTAATGAATTGAT GAAAGAGTTGGATTAAAGTTGTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTCAAATTTAATTTGAC ATTTGATCTTTTCCTATATATTGCCCCATAGAGTCAGTTAACTCATTTTTATATTTCAT AGATCAAATAAGAGAAATAACGGTATATTAATCCCTCCAAAAAAAAAAAACGGTATATT 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DKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKL ESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI* PDI-H3 Switz-N382A DNA (SEQ ID NO: 81)
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EKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVEL KSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI* PDI-H3 Penn-CysTm DNA (SEQ ID NO: 85)
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ACATTTGCATTTGA PDI-H3 Penn-CysTm AA (SEQ ID NO: 86)
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EKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVEL KSGYKDWILWISFAISSLVLLVALLGFIMWACQKGNIRCNICI* PDI-H3 Penn-N382A-CysTm DNA (SEQ ID NO: 87)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTC TCAGATCTTCGCGCAAAAACTTCCTGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTG GGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAA GTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCC TCATCAGATCCTTGATGGAAAAAACTGCACTCTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTC AGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAGATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTAC AGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTC ATCCGGCACACTGGAGTTTAACGATGAAAGCTTCAATTGGGCTGGAGTCACTCAAAACG GAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGGGATCTAATAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGG TTGACCCACTCAAACTTCAAATACCCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAATGAACA ATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGGGTACAGACAAGGACCAAATCT TCCTGTACGCTCAATCATCAGGAAGAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCT GTAATCCCGAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGAATATCCCTAGCAGAATAAGCAT CTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAA TTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACAAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGAT GCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGA CAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGC AAAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGC ATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGAAGGATGGTTG GTACGGTTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCA CTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGGCTCGATTGATCGGGAAAACCAAC GAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGGAGAATTCAGGACCT TGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTG TTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTT GAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAA AATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATCAGAAATGGAACTTATGACC ACGATGTATACAGGGATGAAGCTTTAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTG AAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATCCCTTGTACT GTTAGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCA
ACATTTGCATTTGA PDI-H3 Penn-N382A-CysTm AA (SEQ ID NO: 88)
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ACATTTGCATTTGA PDI-H3 Penn-L384V-CysTm AA (SEQ ID NO: 90)
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LGFIMWACQKGNIRCNICI A/Hongkong/4801/14 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 92)
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LGFIMWACQKGNIRCNICI A/Minnesota/40/15 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 93)
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LGFIMWACQKGNIRCNICI A/South Australia/1/16 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 94)
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LGFIMWACQKGNIRCNICI A/Pennsylvania/09/15 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 95)
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LGFIMWACQKGNIRCNICI A/Switzerland/9715293/13 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 96)
QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQIL DGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTL EFNNESFNWAGVTQNGTSSSCIRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPALNVTMPNNEQFDKL YIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTI VKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQ NVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPERQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFR HQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYV EDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHK CDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVAL
LGFIMWACQKGNIRCNICI A/Mississippi/16/16 (H3N2) (aa) (SEQ ID NO: 97)
QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQIL DGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSRAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTL EFNNESFNWAGVTQNGTSSSCIRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPALNVTMPNNEQFDKL YIWGVHHPGTDKDQIFLYAKPSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTI VKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQ NVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPERQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFR HQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYV EDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHK CDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVAL
LGFIMWACQKGNIRCNICI Sequência CysTM (aa) (SEQ ID NO: 98)
SLVLL TMCT nativa (aa) SEQ ID NO: 99)
CFLLC Sequência CysTM (nt) (SEQ ID NO: 100)
TCCCTTGTACTGTTA TMCT nativa (nt) SEQ ID NO: 101)
TGTTTTTTGCTTTGT A/Hong Kong/4801/14 (H3N2 (nt) – (acesso Epiflu no EPI539576) (SEQ ID NO: 102)
ATGAAGACTATCATTGCTTTGAGCTACATTCTATGTCTGGTTTTCGCTCAAAAAATTCC TGGAAATGACAATAGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAA CGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTT CAGAATTCCTCAATAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAA CTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGA AATGGGACCTTTTTGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTG CCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAA TGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTGCTTGCATAAGGA GATCTAGTAGTAGTTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTACACATAC CCAGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGG GGTTCACCACCCGGGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCTCAATCATCAGGAA GAATCACAGTATCTACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCAAATATCGGATCTAGA CCCAGAATAAGGGATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGG AGACATACTTTTGATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAA TACGAAGTGGGAAAAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCT GAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAG GATCACATACGGGGCCTGTCCCAGATATGTTAAGCATAGCACTCTGAAATTGGCAACAG GAATGCGAAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTC ATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGTTTCAGGCATCAAAATTC TGAGGGAAGAGGACAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCA ATGGGAAGCTGAATCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAA GAATTCTCAGAAGTAGAAGGAAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACTAA AATAGATCTCTGGTCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAA TTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGG GAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGC CTGCATAGGATCAATAAGAAATGGAACTTATGACCACAATGTGTACAGGGATGAAGCAT TAAACAACCGGTTCCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATC CTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCAT
CATGTGGGCCTGCCAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGA Construção 2801 a partir de 2X35S prom para NOS term (SEQ ID NO: 103)
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTC AGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCG GATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGC TCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGA CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTT GTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTT TCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACT TTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAA GGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACC CACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATT GATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGAC CCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTT TTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATC TCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAG ATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTT CTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAACTTCCTGGAAATGACAAT AGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAAC AATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAA TAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATA GATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTT TGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCT CCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAAT TGGGCTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTTCTTGCATAAGGGGATCTAATAGTAG TTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTCCAAATACCCAGCATTAAACG TGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCG GGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCACAATCATCAGGAAGAATCACAGTATC TACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCGAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGG ATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTG ATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAA AAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTC CAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGG GCCTGTCCCAGATATGTTAAGCAAAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGT ACCAGAGAGACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTT GGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGCTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGA CAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAA TCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAG TAGAAGGGAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAATAGATCTCTGG TCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGA CTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGG ATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCA ATCAGAAATGGAACTTATGACCACGATGTATACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTT CCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCT TTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGC CAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAA TTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTG TGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCA GCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATT CGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAG ATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTA AGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATT AGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTA
GGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT Construção 3023 a partir de 2X35S prom para NOS term (SEQ ID NO: 104)
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTC AGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCG GATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGC TCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGA CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTT GTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTT TCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACT TTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAA GGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACC CACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATT GATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGAC CCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTT TTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATC TCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAG ATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTT CTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAACTTCCTGGAAATGACAAT AGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAAC AATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAA TAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATA GATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTT TGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCT CCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAAT TGGGCTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTTCTTGCATAAGGGGATCTAATAGTAG TTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTCCAAATACCCAGCATTAAACG TGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCG GGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCACAATCATCAGGAAGAATCACAGTATC TACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCGAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGG ATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTG ATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAA AAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTC CAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGG GCCTGTCCCAGATATGTTAAGCAAAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGT ACCAGAGAGACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTT GGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGCTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGA CAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGGC TCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAG TAGAAGGGAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAATAGATCTCTGG TCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGA CTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGG ATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCA ATCAGAAATGGAACTTATGACCACGATGTATACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTT CCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCT TTGCCATATCATGTTTTTTGCTTTGTGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGC CAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAA TTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTG TGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCA GCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATT CGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAG ATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTA AGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATT AGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTA
GGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT Construção 2811 a partir de 2X35S prom para NOS term (SEQ ID NO: 105)
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTC AGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCG GATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGC TCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGA CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTT GTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTT TCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACT TTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAA GGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACC CACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATT GATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGAC CCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTT TTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATC TCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAG ATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTT CTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCGCAAAAACTTCCTGGAAATGACAAT AGCACGGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAAC AATCACGAATGACCGAATTGAAGTTACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAATTCCTCAA TAGGTGAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAGAAAACTGCACACTAATA GATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTTCAAAATAAGAAATGGGACCTTTT TGTTGAACGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCT CCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAAT TGGGCTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGTTCTTCTTGCATAAGGGGATCTAATAGTAG TTTCTTTAGTAGATTAAATTGGTTGACCCACTTAAACTCCAAATACCCAGCATTAAACG TGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCG GGTACGGACAAGGACCAAATCTTCCTGTATGCACAATCATCAGGAAGAATCACAGTATC TACCAAAAGAAGCCAACAAGCTGTAATCCCGAATATCGGATCTAGACCCAGAATAAGGG ATATCCCTAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTG ATTAACAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCTAGGGGTTACTTCAAAATACGAAGTGGGAA AAGCTCAATAATGAGATCAGATGCACCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACTC CAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCATTCCAAAATGTAAACAGGATCACATACGGG GCCTGTCCCAGATATGTTAAGCAAAGCACTCTGAAATTGGCAACAGGAATGCGAAATGT ACCAGAGAGACAAACTAGAGGCATATTTGGCGCAATAGCGGGTTTCATAGAAAATGGTT GGGAGGGAATGGTGGATGGTTGGTACGGCTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGAAGAGGA CAAGCAGCAGATCTCAAAAGCACTCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGCTGAA TCGATTGATCGGGAAAACCAACGAGAAATTCCATCAGATTGAAAAAGAATTCTCAGAAG TAGAAGGGAGAATTCAGGACCTTGAGAAATATGTTGAGGACACAAAAATAGATCTCTGG TCATACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGA CTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGG ATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCA ATCAGAAATGGAACTTATGACCACGATGTATACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTT CCAGATCAAGGGAGTTGAGCTGAAGTCAGGGTACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCT TTGCCATATCATCCCTTGTACTGTTAGTTGCTTTGTTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGC CAAAAGGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAA TTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTG TGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCA GCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATT CGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAG ATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTA AGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATT AGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTA GGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
[00312] Todas as citações são aqui incorporadas por referência.
[00313] A presente invenção foi descrita em relação a uma ou mais concretizações. No entanto, será evidente para os técnicos versados no assunto que uma série de variações e modificações podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção, conforme definido nas reivindicações.

Claims (40)

REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína hemaglutinina (HA) de Influenza H3 modificada, a proteína HA compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição quando comparada com uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente, sendo a referida pelo menos uma substituição em um ou mais de um aminoácido correspondente aos aminoácidos nas posições 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526 ou 528 de A/Hong Kong/4801/14 HA.
2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 382 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA, sendo a referida substituição para uma não-asparagina, uma segunda substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA, a referida substituição sendo para uma não-cisteína e uma terceira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 de A / Hong Kong / 480l / l4 HA, sendo a referida substituição por uma não-cisteína.
3. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a primeira substituição é para uma alanina ou uma substituição conservada de alanina, a segunda substituição é para uma serina ou uma substituição conservada de serina e a terceira substituição é para uma leucina ou uma substituição conservada de leucina.
4. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 384 de A /Hong Kong/480l/14 HA, sendo a referida substituição para um não-leucina, uma segunda substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA, a referida substituição sendo para uma não-cisteína e uma terceira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 de A / Hong Kong / 480l / l4 HA, sendo a referida substituição por uma não-cisteína.
5. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a primeira substituição é para uma valina ou uma substituição conservada de valina, a segunda substituição é para uma serina ou uma substituição conservada de serina, e, a terceira substituição é para uma leucina ou uma substituição conservada de leucina.
6. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 392 de A/Hong Kong/480l/14 HA, sendo a referida substituição para uma não-fenilalanina, uma segunda substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 de A/Hong Kong/480l/14 HA, a referida substituição sendo para uma não-cisteína e uma terceira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 de A / Hong Kong / 480l / l4 HA, sendo a referida substituição por uma não-cisteína.
7. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a primeira substituição é por um ácido aspártico ou uma substituição conservada de ácido aspártico, a segunda substituição é para uma serina ou uma substituição conservada de serina e a terceira substituição é para uma leucina ou uma substituição conservada de leucina.
8. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 431 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA, sendo a referida substituição para um não-leucina, uma segunda substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA, a referida substituição sendo para uma não-cisteína e uma terceira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 de A / Hong Kong / 480l / l4 HA, sendo a referida substituição por uma não-cisteína.
9. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a primeira substituição é por uma metionina ou uma substituição conservada de metionina, a segunda substituição é para uma serina ou uma substituição conservada de serina e a terceira substituição é para uma leucina ou uma substituição conservada de leucina.
10. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 382 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA, sendo a referida substituição para uma não-asparagina, uma segunda substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 384 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA, sendo a referida substituição para um não-leucina, uma terceira substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 524 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA, sendo a referida substituição para uma não-cisteína e uma quarta substituição no aminoácido correspondente ao aminoácido na posição 528 de A / Hong Kong / 480l / l4 HA, sendo a referida substituição por uma não-cisteína.
11. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a primeira substituição é para uma alanina ou uma substituição conservada de alanina, a segunda substituição é para uma valina ou uma substituição conservada de valina, a terceira substituição é para uma serina ou uma substituição conservada de serina e a quarta substituição é para uma leucina ou uma substituição conservada da leucina.
12. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a proteína HA compreende ainda uma substituição nos aminoácidos correspondentes aos aminoácidos nas posições 525, 526 ou 525 e 526 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA, em que a substituição do aminoácido na posição 525 é por uma não-fenilalanina e a substituição do aminoácido na posição 526 é por uma não-leucina.
13. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a substituição do aminoácido na posição 525 é por uma leucina ou uma substituição conservada de leucina e a substituição do aminoácido na posição 526 é por uma valina ou uma substituição conservada de valina.
14. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3 ou 11, caracterizado pelo fato de que a substituição conservada de alanina é serina, glicina, treonina, cisteína ou valina.
15. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5, 11 e 13, caracterizado pelo fato de que a substituição conservada de valina é isoleucina, metionina, alanina ou treonina.
16. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a substituição conservada do ácido aspártico é ácido glutâmico, glutamina ou serina.
17. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a substituição conservada da metionina é isoleucina, glutamina, valina ou fenilalanina.
18. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 5, 7, 9 e 11, caracterizado pelo fato de que a substituição conservada da serina é treonina, alanina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, glicina, ácido glutâmico ou lisina.
19. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 5, 7, 9, 11 e 13, caracterizado pelo fato de que a substituição conservada da leucina é isoleucina, valina, metionina, fenilalanina ou valina.
20. Proteína hemaglutinina (HA) de influenza H3 modificada caracterizada pelo fato de que é codificada pelo ácido nucleico conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
21. Partícula semelhante a vírus (VLP) caracterizada pelo fato de que compreende a proteína HA codificada pelo ácido nucleico conforme definido por qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
22. Método de produção de uma partícula semelhante ao vírus Influenza (VLP) em uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal caracterizado pelo fato de que compreende: a) introduzir o ácido nucleico conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 19 na planta, porção da planta ou célula vegetal; e b) incubar a planta, porção da planta ou célula vegetal sob condições que permitem a expressão da proteína HA codificada pelo ácido nucleico, produzindo, assim, a VLP.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende ainda introduzir de um segundo ácido nucleico que codifica uma proteína de canal de prótons; e a etapa b) compreende ainda incubar a planta, porção da planta ou célula vegetal sob condições que permitem a expressão da proteína do canal de prótons codificada pelo segundo ácido nucleico.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 23, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a etapa c), colher a planta, porção da planta ou célula vegetal e purificar a VLP.
25. Método de produção de uma partícula semelhante ao vírus Influenza (VLP) em uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal compreendendo o ácido nucleico conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 19; e b) incubar a planta, porção da planta ou célula vegetal sob condições que permitem a expressão da proteína HA codificada pelo ácido nucleico, produzindo, assim, a VLP.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a planta, porção da planta ou célula vegetal da etapa a) compreende ainda um segundo ácido nucleico que codifica uma proteína de canal de prótons; e, em que a etapa b) compreende ainda incubar a planta, porção da planta ou célula vegetal sob condições que permitem a expressão da proteína do canal de prótons codificada pelo segundo ácido nucleico.
27. Método, de acordo com a reivindicação 23 ou 26, caracterizado pelo fato de que a proteína do canal de prótons é uma proteína do subtipo M2 da influenza A.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a etapa c), colher a planta, porção da planta ou célula vegetal e purificar o VLP.
29. VLP caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método conforme definido por qualquer uma das reivindicações 22 a 28.
30. VLP, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais de um lipídeo derivado da planta, porção da planta ou célula vegetal, N- glicanos específicos de plantas, N-glicanos modificados ou uma combinação dos mesmos.
31. Método de produção de um anticorpo ou fragmento de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da VLP, conforme definido pela reivindicação 21, 29 ou 30, a um sujeito ou animal hospedeiro, produzindo, assim o anticorpo ou fragmento de anticorpo.
32. Anticorpo caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método conforme definido pela reivindicação 31.
33. Planta, porção da planta ou célula vegetal, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico recombinante conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
34. Planta, porção da planta ou célula vegetal, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína HA, conforme definido pela reivindicação 13, ou a VLP, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 21, 29 ou 30.
35. Composição para induzir uma resposta imune, caracterizada pelo fato de que compreende uma dose eficaz de
VLP, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 21, 29 ou 30, e um transportador, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
36. Método para induzir imunidade a uma infecção por influenza em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração da VLP conforme definido por qualquer uma das reivindicações 21, 29 ou 30 ao sujeito.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a VLP é administrada ao sujeito por via oral, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.
38. Método para aumentar o rendimento da produção de uma partícula semelhante ao vírus Influenza (VLP) em uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal caracterizado pelo fato de que compreende: a) introduzir o ácido nucleico conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 19 na planta, porção da planta ou célula vegetal ou fornecer uma planta, porção de uma planta ou célula vegetal compreendendo o ácido nucleico conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 19; e b) incubar a planta, porção da planta ou célula vegetal sob condições que permitem a expressão da proteína HA modificada da influenza codificada pelo ácido nucleico, produzindo, assim, a VLP com um rendimento mais alto em comparação com a planta, porção da planta ou planta célula que expressa uma proteína HA de influenza não modificada.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38,
caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a etapa c), colher a planta, porção da planta ou célula vegetal e purificar a VLP.
40. Proteína hemaglutinina (HA) modificada de influenza H3, caracterizada pelo fato de que a proteína HA compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma substituição quando comparada com uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem correspondente, sendo a referida pelo menos uma substituição em um ou mais de um aminoácido correspondente para aminoácidos nas posições 382, 384, 392, 431, 524, 525, 526 ou 528 de A / Hong Kong / 480l / 14 HA. # -
HA0_A-Bang-3007-15_H3N2 QKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILD 60 HA0_A-HK-4801-14_H3N2 QKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILD 60 HA0_A-Minn-40-15_H3N2 QKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILD 60 HA0_A-SAus-1-16_H3N2 QKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILD 60 HA0_A-Penn-09-15_H3N2 QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILD 60 HA0_A-Switz-9715293-13_H3N2 QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILD 60 HA0_A-Miss-16-16_H3N2 QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILD 60 **:*********************************************************
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 11/777 HA0_A-Bang-3007-15_H3N2 GENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF 120 HA0_A-HK-4801-14_H3N2 GENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF 120 HA0_A-Minn-40-15_H3N2 GENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF 120 HA0_A-SAus-1-16_H3N2 GENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF 120 HA0_A-Penn-09-15_H3N2 GKNCTLIDALLGDPQCDGFQNKRWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF 120 HA0_A-Switz-9715293-13_H3N2 GENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF 120 HA0_A-Miss-16-16_H3N2 GENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSRAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF 120 *:********************:********:****************************
HA0_A-Bang-3007-15_H3N2 NNESFNWTGVTQNGTSSACIRKSSSSFFSRLNWLTHLNYTYPALNVTVPNNEQFDKLYIW 180 HA0_A-HK-4801-14_H3N2 NNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSSSSFFSRLNWLTHLNYTYPALNVTMPNNEQFDKLYIW 180 HA0_A-Minn-40-15_H3N2 NNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSSSSFFSRLNWLTHLNYTYPALNVTMPNKEQFDKLYIW 180 HA0_A-SAus-1-16_H3N2 KNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSSSSFFSRLNWLTHLNYTYPALNVTMPNKEQFDKLYIW 180 HA0_A-Penn-09-15_H3N2 NDESFNWAGVTQNGTSSACIRGSNSSFFSRLNWLTHSNFKYPALNVTMPNNEQFDKLYIW 180 1/21
HA0_A-Switz-9715293-13_H3N2 NNESFNWAGVTQNGTSSSCIRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPALNVTMPNNEQFDKLYIW 180
Figura 1 HA0_A-Miss-16-16_H3N2 NNESFNWAGVTQNGTSSSCIRGSNSSFFSRLNWLTHLNSKYPALNVTMPNNEQFDKLYIW 180 ::*****:*********:*** *.************ * .*******:**:*********
HA0_A-Bang-3007-15_H3N2 GVHHPGTDKDQIFLYARSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPG 240 HA0_A-HK-4801-14_H3N2 GVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPG 240 HA0_A-Minn-40-15_H3N2 GVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPG 240 HA0_A-SAus-1-16_H3N2 GVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPG 240 HA0_A-Penn-09-15_H3N2 GVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPG 240 HA0_A-Switz-9715293-13_H3N2 GVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPG 240 HA0_A-Miss-16-16_H3N2 GVHHPGTDKDQIFLYAKPSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRDIPSRISIYWTIVKPG 240 ****************: **************************:***************
HA0_A-Bang-3007-15_H3N2 DILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI 300 HA0_A-HK-4801-14_H3N2 DILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI 300 HA0_A-Minn-40-15_H3N2 DILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI 300 HA0_A-SAus-1-16_H3N2 DILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI 300 HA0_A-Penn-09-15_H3N2 DILLINSTGNLIAPRGYFKIQSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI 300 HA0_A-Switz-9715293-13_H3N2 DILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI 300 HA0_A-Miss-16-16_H3N2 DILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI 300 ********************:***************************************
Figura 1 - continuação
Títulos de HA (1/diluição máx.)
Figura 2 Título de HA (1/diluição máx.)
Figura 3
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 14/777 4/21
Figura 4A: Representação Figura 4B: Representação esquemática do vetor 3045 esquemática do vetor 3022
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 15/777 5/21
Figura 4C: Representação Figura 4D: Representação esquemática do Vetor 3023 esquemática do vetor 3034
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 16/777 Proteína rep pVS1 6/21
Figura 5A: Representação Figura 5B: Representação esquemática do vetor 3556 esquemática do vetor 1190
Títulos de HA (1/diluição máx.) TMCT nativa
Figura 6A Título de HA (1/diluição máx.)
Nativa
Figura 6B
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 18/777 Títulos de HA (1/diluição máx.) Aumento % Figura 7A Figura 7B
TMCT nativa Título de HA (1/diluição máx.) Título de HA (1/diluição máx.) Nativa Figura 7C Figura 7D 8/21 somente para H3 Switz) Título de HA (1/diluição máx.)
Figura 7E
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 20/777 10/21
UTR 3’ CPMV
Figura 8A: Representação Figura 8B: Representação esquemática do vetor 3340 esquemática do vetor 3341
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 21/777 11/21
UTR 3’ CPMV
Figura 8C: Representação Figura 8D: Representação esquemática do vetor 3375 esquemática do vetor 3914
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 22/777 12/21
UTR 3’ CPMV
Figura 8E: Representação esquemática do vetor 3915 Figura 8F: Representação esquemática do vetor 3924
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 23/777 13/21
Figura 8G: Representação Figura 8H: Representação esquemática do vetor 3925 esquemática do vetor 3904
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 24/777 14/21
T-DNA Direita
Figura 8I: Representação Figura 8J: Representação esquemática do vetor 3905 esquemática do 2801
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 25/777 15/21
T-DNA Direita
Figura 8K: Representação Figura 8L: Representação esquemática do vetor 2811 esquemática do vetor 3063
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 26/777 16/21
T-DNA Direita T-DNA Direita
Figura 8M: Representação Figura 8N: Representação esquemática do vetor 3074 esquemática do vetor 3085
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 27/777 Parada* 17/21
T-DNA Direita
UTR 3’CPMV
Figura 8O: Representação Figura 8P: Representação esquemática do vetor 3062 esquemática do vetor 3312
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 28/777 Parada* 18/21
UTR 3’CPMV
Figura 8Q: Representação esquemática do vetor 3313
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 29/777 19/21
Figura 8R: Representação Figura 8S: Representação esquemática do vetor 3314 esquemática do vetor 3315
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 30/777 20/21
T-DNA Direita T-DNA Direita
Figura 9B: Representação Figura 9A: Representação esquemática do vetor 3680 esquemática do vetor 2295
Petição 870200160810, de 23/12/2020, pág. 31/777 21/21
T-DNA Direita
T-DNA Direita
Figura 9C: Representação Figura 9D: Representação esquemática do vetor 3645 esquemática do vetor 3690
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