JP2024050651A - インフルエンザウイルスヘマグルチニン変異体 - Google Patents

インフルエンザウイルスヘマグルチニン変異体 Download PDF

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Abstract

【課題】植物におけるインフルエンザＶＬＰ産生を増大させるための改善された方法を提供する。
【解決手段】野生型インフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質のアミノ酸配列からなり、アミノ酸置換を含む改変型インフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質であって、前記アミノ酸置換は、特定のアミノ酸配列の位置３８２、３８４、５２４、５２５、５２６及び５２８に対応するアミノ酸置換、ならびに任意に前記特定のアミノ酸配列の位置３９２及び／又は４３１に対応するアミノ酸置換からなる、前記改変型インフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、前記改変されたインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生方法、並びに前記産生の収率を高める方法を提供する。
【選択図】図６Ｂ

Description

本発明は、植物中で変異体ウイルスタンパク質を産生することに関する。より具体的には、本発明は、植物中でインフルエンザウイルス様粒子を産生し、その産生を増大させることに関する。
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科のエンベロープ型の一本鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザウイルスは、非常に感染力が高く、すべての年齢層にわたって中等度から重症度の疾病を引き起こすことができる。
ワクチン接種は、インフルエンザ感染を予防するための最も有効な方法であり続けている。従来、ワクチン接種は、ウイルスの弱毒化した生の形態又は完全不活化形態を使用して成し遂げられ、これらのウイルスの形態は、患者に投与されたとき、免疫応答を誘発する。弱毒化した生のウイルス及び完全不活化ウイルスが再生して感染性となる適応力を再取得する潜在的なリスクを排除するために、組み換えウイルスタンパク質を含むワクチンも、インフルエンザ感染に対する防御免疫を誘発するために使用されてきた。
しかしながら、ワクチンの免疫原性成分としての組み換えウイルスタンパク質の使用はいくつかの制約を受ける。まず、ウイルスタンパク質並びに最適発現及び適正なタンパク質フォールディングのために必要な遺伝子成分が完全に揃わなければ、標準的なインビトロ発現系における組み換えウイルスタンパク質の収率はワクチン生産の目的のためには不十分である場合がある。第二に、組み換えウイルスタンパク質ワクチンは、不適正なフォールディング、低い抗原提示、及び／又は長く続く防御免疫をもたらすことには有効ではない主に液性の免疫応答の生成に起因して、低い免疫原性を示す可能性がある。
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの型のインフルエンザウイルスがあり、このうちでインフルエンザＡ及びＢは、ヒトにおける季節性の疾患流行の原因生物である。
インフルエンザＡウイルスは、ウイルスの表面上のヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質亜型の発現に基づいてさらに分類される。１８個の異なるＨＡ亜型（Ｈ１～Ｈ１８）がある。
ＨＡは、インフルエンザウイルス粒子が標的細胞の表面上のシアル酸含有タンパク質に結合することを容易にして、標的細胞へのウイルスゲノムの放出を媒介する三量体レクチンである。ＨＡタンパク質は２つの構造要素を含む：血清防御（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）抗体の一次標的である頭部；及び柄（茎）。ＨＡは、単一ポリペプチド、ＨＡ０（三量体として組み立てられる）として翻訳され、これは、ＨＡ１（約４０ｋＤａ）サブドメインとＨＡ２（約２０ｋＤａ）サブドメインとの間でセリンエンドプロテアーゼによって切断される必要がある。切断後、この２つのジスルフィド結合タンパク質ドメインは、ウイルス感染力に必要な必須の構造を採る。ＨＡ１は、受容体結合部位（ＲＢＳ）を含有する球状頭部ドメインを形成し、インフルエンザウイルスの最も保存されていないセグメントである。ＨＡ２は、それぞれ長さがおよそ２５残基、１６０残基、２５残基、及び１０残基である融合ペプチド（ＦＰ）、可溶性外部ドメイン（ＳＥ）、膜貫通部（ＴＭ）、及び細胞質側末端（ＣＴ）を有するシングルパス内在性膜タンパク質である。ＨＡ２は、Ｎ末端及びＣ末端のＨＡ１残基と一緒に柄ドメインを形成し、この柄ドメインは膜貫通領域を含み、比較的保存されている。
インフルエンザウイルスタンパク質、特にインフルエンザＨＡにおける種々の変異が検討されてきた。
例えば、Ｃａｓｔｅｌａｎ－Ｖｅｇａら（Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ Ｃｈｅｍ． ２０１４；７：３７－４４）は、安定性予測アルゴリズムを使用して、インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルス由来のＨＡの７，４７９全長アミノ酸配列を比較し、Ｄ１０４Ｎ、Ａ２５９Ｔ、Ｓ１２４Ｎ、及びＥ１７２Ｋの変異がインフルエンザＨＡ安定性を増強すると予測されるということを特定した。対照的に、Ｓ２０６Ｔ、Ｋ２８５Ｅ、及びＥ４７Ｋの変異は、ＨＡに対して不安定化効果を有すると予測された。
もとのインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ［Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９］及び後から出現したインフルエンザ株［Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０］の配列を比較して、Ｃｏｔｔｅｒら（ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ． ２０１４；１０（１）：ｅ１００３８３１）は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ ＨＡの柄領域のＥ４７Ｋ変異が三量体構造を安定化し、膜融合のためのｐＨを下げ、ウイルスの熱安定性及び酸安定性を高めるということを特定した。Ｃｏｔｔｅｒらはさらに、ケナガイタチにおいてＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｅ４７Ｋ変異体ＨＡはその野生型対照物よりも感染性が高いことを認めた。
Ａｎｔａｎａｓｉｊｅｖｉｃら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１４；２８９（３２）：２２２３７－４５）は、１４個の異なる位置における部位特異的変異誘発によりＨ５ ＨＡステムループ領域の構造機能特性を検討した。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）変異体がＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現され、Ａｎｔａｎａｓｉｊｅｖｉｃは、ステムループ領域におけるほとんどの変異は発現も、タンパク質分解処理も、ウイルス構築も、受容体結合も邪魔しないことを報告した。しかしながら、Ａｎｔａｎａｓｉｊｅｖｉｃは、ＨＡ１－Ｄ２６Ｋ、ＨＡ１－Ｍ１０２Ｌ、ＨＡ２－Ｖ５２Ａ及びＨＡ２－Ｉ５５Ａ変異体（Ｈ３ナンバリングに基づく）は、全ＨＡのレベルの著しい低下を呈することを認め、ＨＡの発現及び／又はウイルス粒子への集合が低下したことを示唆した。ＨＡ１－Ｄ２６Ｋ、ＨＡ２－Ｔ４９Ａ及びＨＡ２－Ｍ１０２Ｌ変異体も野生型ウイルスと比べて低い赤血球凝集価を呈した。Ａｎｔａｎａｓｉｊｅｖｉｃはさらに、すべての単一変異体はＡ５４９肺細胞への進入の減少を呈し、最も顕著な機能障害はＨＡ１－Ｄ２６Ｋ及びＨＡ２－Ｉ５５Ａ変異体で示されることを認めた。Ａｎｔａｎａｓｉｊｉｖｅｃはさらに、ＨＡ２－Ｌ９９Ａ変異体は、野生型ウイルスと比べてＣ１７９中和抗体によるＡ５４９肺細胞阻害に対する感受性が高いことを明らかにし、これは、この変異が抗体結合及び／又は中和作用のモードを高めるということを示唆する。対照的に、ＨＡ１－Ｉ２８Ａ、ＨＡ１－Ｍ３１Ａ、ＨＡ１－Ｍ３１Ｌ、ＨＡ２－Ｉ４５Ａ、及びＨＡ２－Ｉ５５Ｖ変異体は、Ｃ１７９中和抗体による進入阻害に対してさほど感受性が高くないとされた。
国際公開第２０１３／１７７４４４号パンフレット及びその関連刊行物のＬｕら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１４；１１１（１）：１２５－３０）は、大腸菌ベースの無細胞タンパク質発現系及び単純なリフォールディングプロトコルを使用するＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来の適正にフォールディングされたＨＡステムドメインの製造方法を報告した。ＨＡステムドメインの三量体化を誘導するために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）又はフォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）ドメインのいずれかがＨＡのＣ末端に融合された。発現されたＨＡステムタンパク質の凝集を引き起こす新しく現れる疎水性及び／又は分子間イオンペアリングを軽減すために、５つの群の変異が評価された：Ｍ１（Ｉ６９Ｔ＋Ｉ７２Ｅ＋Ｉ７４Ｔ＋Ｃ７７Ｔ）；Ｍ２（Ｉ６９Ｔ＋Ｉ７２Ｅ＋Ｉ７４Ｔ＋Ｃ７７Ｔ＋Ｆ１６４Ｄ）；Ｍ３（Ｉ６９Ｔ＋Ｉ７２Ｅ＋Ｉ７４Ｔ＋Ｃ７７Ｔ＋Ｆ１６４Ｄ＋Ｌ１７４Ｄ）；Ｍ４（Ｆ１６４Ｄ）；及びＭ５（Ｆ１６４Ｄ＋Ｌ１７４Ｄ）。Ｌｕは、Ｍ５（Ｆ１６４Ｄ＋Ｌ１７４Ｄ）変異が、ＨＡステムタンパク質の溶解性を向上させるために最も影響力がある変異であるようであるということを認めた。望ましくないジスルフィド結合の形成を回避し、表面疎水性及びｐＩを低下させ、乱れた構造を有する領域を回避するために、追加的な欠失（Ｈ３８～Ｃ４３及びＣ４９～Ｎ６１）及びＣ７７Ｔ変異がＭ５変異体に対して加えられた。
米国特許出願第１３／８３８，７９６号及びＨｏｌｔｚらによるその関連刊行物（ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１４；１４：１１１）は、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及びサイトゾルドメイン（ＣＴ）を含むＨＡタンパク質のカルボキシ末端領域におけるシステイン残基の変異により、組み換えＨＡの安定性が向上し効力が維持されることを教示する。具体的には、Ｈｏｌｔｚらは、組み換えＰｅｒｔｈ／１６／２００９ ＨＡ（Ｈ３Ｎ２）におけるＣ５３９Ａ、Ｃ５４６Ａ、Ｃ５４９Ａ、Ｃ５２４Ｓ及びＣ５２８Ａ変異を明らかにした。すべての５つのシステイン残基又はこの異なるサブセットの変異は、組み換え野生型ＨＡタンパク質に匹敵するＨＡ収率、純度、粒子サイズ、赤血球凝集反応活性、及び熱安定性をもたらした。対照的に、Ｃ６４Ｓ及びＣ７６Ｓ変異は著しく低下したＨＡ発現を生じ、適正なＨＡフォールディングにおけるこれらの残基の重要な役割が示された。一元（単純）放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）を使用することにより、Ｈｏｌｔｚらは、上記５つのシステイン残基の変異が、ＴＭドメイン及びＣＴドメインにおけるジスルフィド架橋を防ぐことにより、野生型タンパク質と比べて組み換えＨＡの効力を向上させるということも示す。この変異体ＨＡタンパク質は、２５℃で少なくとも１２か月効力を維持するのに対し、野生型ＨＡタンパク質は精製からわずか５０日後に４０％未満の効力を呈した。
国際公開第２０１５／０２０９１３号パンフレットは、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）の４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３及び４３５の群から選択される１以上の位置における特定の残基のチロシンへの変異を教示する。これらの変異は、インフルエンザＨＡの柄ドメインをその未変性の三量体構造で安定化又は「ロック」するジチロシン架橋の形成を容易にする。
国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットは、球状頭部ドメインを欠く改変されたインフルエンザＨＡを開示する。国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットで教示されるポリペプチドは、アミノ酸５３～６２０（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７［Ｈ１Ｎ１］ナンバリングを参照している）を欠失しており、０～１０個のアミノ酸の共有結合された配列で置き換えられたＨＡ１ドメインと、ＨＡ２ドメインとを含み、ＨＡ１ドメインのＣ末端アミノ酸がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸であり、位置４０６、４０９、４１３及び４１６における１以上のアミノ酸がセリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。
国際公開第２０１４／１９１４３５号パンフレットは、同様に、欠失したセグメントが０～５０個のアミノ酸の共有結合された配列で置き換えられたＨＡ１ドメインと、ＨＡ２ドメインとを含む改変されたインフルエンザＨＡであって、このＨＡはＨＡ１とＨＡ２との接合部における切断に抵抗性があり、位置３３７、３４０、３５２、３５３、４０２、４０６、４０９、４１３及び／又は４１６における１以上のアミノ酸が変異している改変されたインフルエンザＨＡを教示する。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、免疫原性組成物の封入のための有力な候補である。ＶＬＰは成熟したビリオンに非常によく似ているが、ウイルスゲノム物質を含有していない。それゆえ、ＶＬＰは、本質的に非複製的であり、このため、ワクチンとしての投与にとって安全なものとなっている。加えて、ＶＬＰは、その最も未変性の生理学的な構成である、ＶＬＰの表面上にウイルス糖タンパク質を発現するように操作することができる。さらに、ＶＬＰはインタクトのビリオンに似ておりかつ多価微粒子構造であるので、ＶＬＰは、糖タンパク質に対する中和抗体を誘導する上で、可溶性の外被タンパク質抗原よりも有効である可能性がある。
ＶＬＰは植物において生産されてきた（例えば国際公開第２００９／０７６７７８号パンフレット；国際公開第２００９／００９８７６号パンフレット；国際公開第２００９／０７６７７８号パンフレット；国際公開第２０１０／００３２２５号パンフレット；国際公開第２０１０／００３２３５号パンフレット；国際公開第２０１０／００６４５２号パンフレット；国際公開第２０１１／０３５２２号パンフレット；国際公開第２０１０／１４８５１１号パンフレット；及び国際公開第２０１４１５３６７４号パンフレットを参照。これらは参照により本明細書に援用したものとする）。
国際公開第２００９／０７６７７８号パンフレットは、植物におけるインフルエンザＶＬＰの産生方法であって、Ａ型又はＢ型のインフルエンザ由来のインフルエンザＨＡをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結された、その植物において活性な調節領域を有する核酸を導入する工程を備える方法を教示する。
国際公開第２００９／００９８７６号パンフレットは、植物におけるインフルエンザＨＡ ＶＬＰの産生方法であって、インフルエンザＨＡが植物細胞中でＶＬＰへと自己組織化し植物形質膜から発芽する方法を教示する。
国際公開第２０１０／００３２２５号パンフレットは、植物におけるインフルエンザＨＡ ＶＬＰの産生方法であって、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）由来のインフルエンザＨＡをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結された、その植物において活性な調節領域を有する核酸を導入する工程を備える方法を開示する。
国際公開第２０１０／００６４５２号パンフレットは、改変されたインフルエンザＨＡタンパク質を含むＶＬＰの産生であって、位置１５４、１６５、２８６、又はこれらの組み合わせ（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４［Ｈ５Ｎ１］ナンバリングを参照している）におけるグリコシル化部位が、上記位置における残基をアスパラギン以外のアミノ酸に変異させることにより消滅している産生を教示する。国際公開第２０１０／００６４５２号パンフレットはさらに、同様にＮ連結グリコシル化シグナルトライアド「Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ」を消滅させるために、位置１５６、１６７、２８８、又はこれらの組み合わせにおけるアミノ酸がセリン又はトレオニン以外の残基に変異されてもよいことを教示する。ＨＡタンパク質の球状頭部に位置するグリコシル化部位を選択的に欠失させることにより、国際公開第２０１０／００６４５２号パンフレットは、得られたＨＡタンパク質が高められた抗原性及びより広い交差反応性を有することを実証する。
国際公開第２０１１／０３５４２２号パンフレットは、植物由来のＶＬＰの調製方法であって、アポプラストに局在化したＶＬＰを含む植物又は植物体を得る工程と、プロトプラスト／スフェロプラスト画分及びアポプラスト画分を生成する工程と、植物由来のＶＬＰを含むアポプラスト画分を回収する工程とを備える方法を教示する。
国際公開第２０１０／１４８５１１号パンフレットは、植物におけるインフルエンザＶＬＰの産生方法であって、このＶＬＰがキメラＨＡタンパク質を含む方法を開示する。このキメラＨＡタンパク質は、Ｆ’１、Ｆ’２及びＦサブドメインを有するステムドメインクラスターと、ＲＢ、Ｅ１及びＥ２サブドメインを有する頭部ドメインクラスターと、膜貫通ドメイン及びＣ末端尾部ドメインを有する膜貫通ドメインクラスターとを含み、少なくとも１つのサブドメインが第１インフルエンザ株に由来し、他のサブドメインが１以上の第２インフルエンザ株に由来する。
国際公開第２０１４／１５３６７４号パンフレットは、植物におけるインフルエンザＶＬＰの産生方法であって、このＶＬＰは、改変されたタンパク質分解性ループを有する改変されたインフルエンザＨＡを含む方法を教示する。この改変されたタンパク質分解性ループは、ＨＡ０前駆体のＨＡ１ドメインとＨＡ２ドメインとの間のタンパク質分解性の切断部位の除去を含む。従って、このＨＡタンパク質は安定化されており、未変性のＨＡタンパク質と比べて増大したタンパク質の収率が成し遂げられる。
国際公開第２０１３／１７７４４４号パンフレット 国際公開第２０１５／０２０９１３号パンフレット 国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレット 国際公開第２０１４／１９１４３５号パンフレット 国際公開第２００９／０７６７７８号パンフレット 国際公開第２００９／００９８７６号パンフレット 国際公開第２０１０／００３２２５号パンフレット 国際公開第２０１０／００３２３５号パンフレット 国際公開第２０１０／００６４５２号パンフレット 国際公開第２０１１／０３５２２号パンフレット 国際公開第２０１０／１４８５１１号パンフレット 国際公開第２０１４／１５３６７４号パンフレット
Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ Ｃｈｅｍ． ２０１４；７：３７－４４ ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ． ２０１４；１０（１）：ｅ１００３８３１ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１４；２８９（３２）：２２２３７－４５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１４；１１１（１）：１２５－３０ ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１４；１４：１１１
本発明は、植物における改変されたインフルエンザウイルスタンパク質の産生に関する。より具体的には、本発明は、植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生すること及びその産生を増大させることに関し、このＶＬＰは、改変されたインフルエンザウイルスタンパク質、例えば改変ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を含む。
植物におけるインフルエンザＶＬＰ産生を増大させるための改善された方法を提供することが本発明の目的である。
本発明によれば、以下のものが提供される。
Ａ． 改変されたインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、このＨＡタンパク質は、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、上記少なくとも１つの置換は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２、３８４、３９２又は４３１のアミノ酸に対応する１以上のアミノ酸において存在する核酸。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２のアミノ酸に対応するアミノ酸における非アスパラギンへの置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるアラニン又はアラニンの保存的置換への置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８４のアミノ酸に対応するアミノ酸における非ロイシンへの置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８４のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるバリン又はバリンの保存的置換への置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３９２のアミノ酸に対応するアミノ酸における非フェニルアラニンへの置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３９２のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換への置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置４３１のアミノ酸に対応するアミノ酸における非ロイシンへの置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置４３１のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるメチオニン又はメチオニンの保存的置換への置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
以下のものがさらに提供される。
Ｂ． 改変されたインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、このＨＡタンパク質は、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、上記少なくとも１つの置換は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２、３８４、３９２、４３１、５２４、５２５、５２６又は５２８のアミノ酸に対応する１以上のアミノ酸において存在する核酸。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２のアミノ酸に対応するアミノ酸における非アスパラギンへの第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第２置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第３置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるアラニン又はアラニンの保存的置換への第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるセリン又はセリンの保存的置換への第２置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるロイシン又はロイシンの保存的置換への第３置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８４のアミノ酸に対応するアミノ酸における非ロイシンへの第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第２置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第３置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８４のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるバリン又はバリンの保存的置換への第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるセリン又はセリンの保存的置換への第２置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるロイシン又はロイシンの保存的置換への第３置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３９２のアミノ酸に対応するアミノ酸における非フェニルアラニンへの第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第２置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第３置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３９２のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換への第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるセリン又はセリンの保存的置換への第２置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるロイシン又はロイシンの保存的置換への第３置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置４３１のアミノ酸に対応するアミノ酸における非ロイシンへの第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第２置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第３置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置４３１のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるメチオニン又はメチオニンの保存的置換への第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるセリン又はセリンの保存的置換への第２置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるロイシン又はロイシンの保存的置換への第３置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２のアミノ酸に対応するアミノ酸における非アスパラギンへの第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８４のアミノ酸に対応するアミノ酸における非ロイシンへの第２置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第３置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における非システインへの第４置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるアラニン又はアラニンの保存的置換への第１置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８４のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるバリン又はバリンの保存的置換への第２置換、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるセリン又はセリンの保存的置換への第３置換、及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸におけるロイシン又はロイシンの保存的置換への第４置換を有するアミノ酸配列をさらに含んでもよい。
上記ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２５、５２６又は５２５及び５２６のアミノ酸に対応するアミノ酸における置換を有するアミノ酸配列であって、位置５２５のアミノ酸の置換は非フェニルアラニンへの置換であり、位置５２６のアミノ酸の置換は非ロイシンへの置換であるアミノ酸配列をさらに含んでもよい。このＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２５、５２６又は５２５及び５２６のアミノ酸に対応するアミノ酸における置換を有するアミノ酸配列であって、位置５２５のアミノ酸の置換はロイシン又はロイシンの保存的置換への置換であり、位置５２６のアミノ酸の置換はバリン又はバリンの保存的置換への置換であるアミノ酸配列をさらに含んでもよい。
Ａ又はＢで記載される上記組み換え核酸によってコードされるＨＡタンパク質、及びＡ又はＢで記載される上記組み換え核酸によってコードされるＨＡタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）がさらに提供される。
それゆえ、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列であって、この少なくとも１つの置換は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２、３８４、３９２又は４３１のアミノ酸に対応する１以上のアミノ酸において存在するアミノ酸配列を含む改変されたＨＡタンパク質がさらに提供される。
別の態様では、改変されたインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質であって、このＨＡタンパク質は、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、この少なくとも１つの置換は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２、３８４、３９２、４３１、５２４、５２５、５２６又は５２８のアミノ酸に対応する１以上のアミノ酸において存在するＨＡタンパク質が提供される。
さらには、植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生方法であって、
ａ）Ａ又はＢで記載される上記組み換え核酸を上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞に導入する工程と、
ｂ）上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を、上記組み換え核酸によってコードされるＨＡタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程と
を備える方法が提供される。当該方法は、上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、上記ＶＬＰを精製する工程ｃ）をさらに備えてもよい。
植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生方法であって、
ａ）Ａ又はＢで記載される上記組み換え核酸を含む植物、植物の一部分、又は植物細胞を準備する工程と、
ｂ）上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を、上記組み換え核酸によってコードされるＨＡタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程と
を備える方法がさらに提供される。当該方法は、上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、上記ＶＬＰを精製する工程ｃ）をさらに備えてもよい。
さらには、植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生の収率を高める方法であって、ａ）Ａ若しくはＢの組み換え核酸を上記植物、上記植物の一部分、若しくは植物細胞に導入する工程、又はＡ若しくはＢの組み換え核酸を含む植物、植物の一部分、若しくは植物細胞を準備する工程と、ｂ）上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を、上記組み換え核酸によってコードされるＨＡタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより、未改変インフルエンザＨＡタンパク質を発現する植物、この植物の一部分、又は植物細胞と比べてより高い収率で上記ＶＬＰを産生する工程とを備える方法が提供される。当該方法は、上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、上記ＶＬＰを精製する工程ｃ）をさらに備えてもよい。
当該方法は、プロトンチャネルタンパク質をコードする第２核酸を導入する工程をさらに備えてもよく、上記植物、上記植物の一部分、又は植物細胞は、上記第２核酸によってコードされるプロトンチャネルタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションされる。このプロトンチャネルタンパク質はインフルエンザＡ亜型Ｍ２タンパク質であってもよい。
本明細書中に記載される方法によって産生されるＶＬＰがさらに提供される。
このＶＬＰは、上記植物、上記植物の一部分、若しくは植物細胞に由来する１以上の脂質、植物特異的Ｎ－グリカン、改変Ｎ－グリカン又はこれらの組み合わせを含んでもよい。
加えて、抗体又は抗体断片の産生方法であって、上記ＶＬＰを対象又は宿主動物に投与し、これにより上記抗体又は上記抗体断片を産生する工程を備える方法が提供される。当該方法によって産生される抗体又は抗体断片も提供される。
さらには、Ａ若しくはＢの組み換え核酸又はＡ若しくはＢの組み換え核酸によってコードされるＨＡタンパク質を含む植物、上記植物の一部分、又は植物細胞が提供される。このＨＡタンパク質はＶＬＰを形成してもよい。従って、Ａ又はＢの組み換え核酸によってコードされるＨＡタンパク質を含むＶＬＰを含む植物、上記植物の一部分、又は植物細胞も提供される。
加えて、免疫応答を誘導するための組成物であって、有効用量の本明細書中に記載されるＶＬＰと、薬学的に許容できる担体、アジュバント（佐剤）、ビヒクル（媒質）又は賦形剤とを含む組成物が提供される。対象においてインフルエンザ感染に対する免疫を誘導する方法であって、上記ＶＬＰを投与する工程を備える方法も提供される。上記ＶＬＰは、上記対象に経口で、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に又は皮下に投与されてもよい。
さらには、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９８の配列の配列と約３０％～約１００％の配列同一性又は配列類似性を有するアミノ酸配列を含む改変されたインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質であって、ただし、上記インフルエンザＨＡタンパク質は、本明細書中に記載される少なくとも１つの置換を含み、ＶＬＰを形成することができ、対象に投与されたときに免疫応答を誘導し、赤血球凝集反応を誘導するか、又はこれらの組み合わせを行う改変されたインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質が提供される。
本発明のこの要約は、必ずしも本発明のすべての特徴を記載しているわけではない。
本発明のこれら特徴の及び他の特徴は、添付の図面を参照する以下の説明からより明らかになる。
図１は、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９１）；Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９２）；Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９３）；Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９４）；Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／１５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９５）；Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９６）；Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１６／１６（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９７）のヘマグルチニン（ＨＡ）のアミノ酸配列の配列アラインメントを示し、囲んだ残基は、インフルエンザＨ３株（Ｈ３Ｎ２）、例えばＡ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４（Ｈ３Ｎ２）由来のＨＡ（配列番号９２）のアミノ酸Ｎ３８２、Ｌ３８４、Ｆ３９２、Ｌ４３１とアラインメントされている。 図１の続きである。 図２は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３、Ｎ３８２Ａ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｌ３８４Ｖ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｆ３９２Ｄ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３及びＬ４３１Ｍ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３の赤血球凝集価を示す。 図３は、野生型Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ Ｈ５、野生型Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０４９１５／２０１４ Ｈ５、Ｆ３９３Ｄ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５変異体Ｈ５、Ｆ３９３Ｄ Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０４９１５／２０１４変異体Ｈ５、Ｎ３８３Ａ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５変異体Ｈ５、及びＮ３８３Ａ Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０４９１５／２０１４変異体Ｈ５の赤血球凝集価を示す。ナンバリングはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に従う。 図４Ａは、ベクター３０４５（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３（Ｆ３９２Ｄ））の模式図を示す。 図４Ｂは、ベクター３０２２（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３（Ｌ４３１Ｍ））の模式図を示す。 図４Ｃは、ベクター３０２３（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３（Ｎ３８２Ａ））の模式図を示す。 図４Ｄは、ベクター３０３４（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３（Ｌ３８４Ｖ））の模式図を示す。 図５Ａは、ベクター３５５６（アルファルファプラストシアニンプロモーター及びターミネーターの制御下の、Ｍ２ヘルパータンパク質に加えてのＣＰＭＶ １６０ベースの発現カセットへのＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングのためのベクター）の模式図を示す。 図５Ｂは、ベクター１１９０（ＣＰＭＶ １６０ベースの発現カセットへのＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングのためのベクター）の模式図を示す。 図６Ａは、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３及びＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３の赤血球凝集価を示す。 図６Ｂは、野生型Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５ Ｈ３、及びＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３の赤血球凝集価を示す。 図７Ａは、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３、Ｎ３８２Ａ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｌ３８４Ｖ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｆ３９２Ｄ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｌ４３１Ｍ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、ＣｙｓＴＭ改変を有するＡ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３、Ｎ３８２Ａ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｆ３９２Ｄ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３及びＬ４３１Ｍ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３の赤血球凝集価を示す。 図７Ｂは、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３に対する百分率で表された、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｎ３８２Ａ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、Ｆ３９２Ｄ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、及びＬ４３１Ｍ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３の密度勾配後ＶＬＰ収率を示す。 図７Ｃは、野生型Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５ Ｈ３、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３、Ｎ３８２Ａ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３、及びＬ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３の赤血球凝集価を示す。 図７Ｄは、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６変異体Ｈ３及びＮ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６変異体Ｈ３の赤血球凝集価を示す。 図７Ｅは、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４変異体Ｈ３及びＮ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４変異体Ｈ３；ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５変異体Ｈ３及びＮ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５変異体Ｈ３；ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６変異体Ｈ３及びＮ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６変異体Ｈ３；ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５変異体Ｈ３及びＮ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５変異体Ｈ３；ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３、及びＬ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３；ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１６／１６変異体Ｈ３及びＮ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１６／１６変異体Ｈ３の赤血球凝集価を示す。 図８Ａは、ベクター３３４０（Ｈ３ Ａ－ＨＫ－４８０１－１４）の模式図を示す。 図８Ｂは、ベクター３３４１（Ｈ３Ａ－ＨＫ－４８０１－１４）の模式図を示す。 図８Ｃは、ベクター３３７５（Ｈ３ Ａ－ＨＫ－４８０１－１４（Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ））の模式図を示す。 図８Ｄは、ベクター３９１４（Ｈ３ Ａ－Ｍｉｎｎ－４０－１５）の模式図を示す。 図８Ｅは、ベクター３９１５（Ｈ３ Ａ－Ｍｉｎｎ－４０－１５（Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ））の模式図を示す。 図８Ｆは、ベクター３９２４（Ｈ３ Ａ－ＳＡｕｓ－１－１６）の模式図を示す。 図８Ｇは、ベクター３９２５（Ｈ３ Ａ－ＳＡｕｓ－１－１６（Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ））の模式図を示す。 図８Ｈは、ベクター３９０４（Ｈ３ Ａ－Ｂａｎｇ－３００７－１５）の模式図を示す。 図８Ｉは、ベクター３９０５（Ｈ３ Ａ－Ｂａｎｇ－３００７－１５（Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ））の模式図を示す。 図８Ｊは、ベクター２８０１（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３）の模式図を示す。 図８Ｋは、ベクター２８１１（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３）の模式図を示す。 図８Ｌは、ベクター３０６３（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３（Ｎ３８２Ａ））の模式図を示す。 図８Ｍは、ベクター３０７４（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３（Ｌ３８４Ｖ））の模式図を示す。 図８Ｎは、ベクター３０８５（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３（Ｆ３９２Ｄ））の模式図を示す。 図８Ｏは、ベクター３０６２（Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉ－９７１５２９３－１３（Ｌ４３１Ｍ））の模式図を示す。 図８Ｐは、ベクター３３１２（Ｈ３ Ａ－Ｐｅｎｎ－０９－１５）の模式図を示す。 図８Ｑは、ベクター３３１３（Ｈ３ Ａ－Ｐｅｎｎ－０９－１５）の模式図を示す。 図８Ｒは、ベクター３３１４（Ｈ３ Ａ－Ｐｅｎｎ－０９－１５（Ｎ３８２Ａ））の模式図を示す。 図８Ｓは、ベクター３３１５（Ｈ３ Ａ－Ｐｅｎｎ－０９－１５（Ｌ３８４Ｖ））の模式図を示す。 図９Ａは、ベクター２２９５（Ｈ５ Ａ－Ｉｎｄｏ－５－０５）の模式図を示す。 図９Ｂは、ベクター３６８０（Ｈ５ Ａ－Ｉｎｄｏ－５－０５（Ｆ３９３Ｄ））の模式図を示す。 図９Ｃは、ベクター３６４５（Ｈ５ Ａ－Ｅｇｙｐｔ－Ｎ０４９１５－１４）の模式図を示す。 図９Ｄは、ベクター３６９０（Ｈ５ Ａ－Ｅｇｙｐｔ－Ｎ０４９１５－１４（Ｆ３９２Ｄ））の模式図を示す。
以下の説明は、好ましい実施形態の説明である。
本明細書で使用する場合、用語「…を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「…を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「…を備える（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及びこれらの文法上の派生語は、包含的又はオープンエンド型の用語であり、追加の、記載されていない要素及び／又は方法工程を排除しない。物、使用又は方法に関連して本明細書で使用されるときの用語「実質的に…からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、追加の要素及び／又は方法工程が存在してもよいが、これらの追加したものは記載された方法又は使用が機能する様式に実質的な影響を及ぼさないことを表す。物、使用又は方法に関連して本明細書で使用されるときの用語「…からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は追加の要素及び／又は方法工程の存在を排除する。ある要素及び／又は工程を含む、備えると本明細書に記載される物、使用又は方法は、ある実施形態では、それらの要素及び／又は工程から実質的になってもよく、他の実施形態では、それらの要素及び／又は工程からなってもよく、このことは、これらの実施形態が具体的に言及されるか否かによらない。加えて、単数形の使用は複数形を包含し、「又は」、「若しくは」は、特段の記載がない限り「及び／又は」、「及び／若しくは」を意味する。本明細書中で特段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用する場合、用語「約」は、与えられた値からのおよそ±１０％の範囲を指す。そのような範囲は、具体的に言及されるか否かにかかわらず、本明細書に提示されるあらゆる与えられた値に常に含まれるということを理解されたい。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（…を含む、備える）」と併せて本明細書で使用されるときの語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「ｏｎｅ（１つの）」を意味してもよいが、一貫して「１以上の」、「少なくとも１つの」及び「１又は１より多くの」の意味も有している。
用語「植物」、「植物の一部分」、「植物部分」、「植物体」、「植物バイオマス」、「植物材料」、「植物抽出物」、又は「植物の葉」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載される１以上の核酸の発現のための転写、翻訳、及び翻訳後の機構を提供することができる、かつ／又は抽出及び精製されるタンパク質若しくはＶＬＰが発現されてもよい場所である、植物全体、組織、細胞、又はこれらの画分、細胞内植物成分、細胞外の植物成分、植物の液体若しくは固体の抽出物、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。植物としては、草本植物が挙げてもよいが、これに限定されない。さらには、植物としては、例えば、セイヨウアブラナ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の種、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属の種、（タバコ）例えば、ベンサミアナタバコ（ニコチアナ・ベンサミア、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・アラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ）、シロイヌナズナ（アラビドプシス・タリアナ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）、ジャガイモ、サツマイモ（イポメア・バタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ））、朝鮮人参、エンドウ、エンバク、イネ、大豆、小麦、大麦、ヒマワリ、綿花、トウモロコシ、ライ麦（セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、モロコシ（ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ヴルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））を含む農作物を挙げてもよいが、これらに限定されない。
用語「植物部分」は、本明細書で使用する場合、植物の任意の部分を指し、この例としては、葉、茎、根、花、果実、葉、茎、根、花、果実から得られる植物細胞、葉、茎、根、花、果実から得られる植物抽出物、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。用語「植物抽出物」は、本明細書で使用する場合、植物、植物の一部分、植物細胞、又はこれらの組み合わせを物理的に処理すること（例えば、凍結し、そのあと好適な緩衝液の中で抽出することにより）、機械的に処理すること（例えば、植物若しくは植物の一部分を粉砕若しくは均質化し、そのあと好適な緩衝液の中で抽出することにより）、酵素により処理すること（例えば、細胞壁を分解する酵素を使用して）、化学的に処理すること（例えば、１以上のキレート剤若しくは緩衝液を使用して）、又はこれらの組み合わせにより得られる植物由来の産物を指す。植物抽出物は、望まれない植物成分、例えば細胞壁壊片を除去するためにさらに処理されてもよい。植物、植物の一部分又は植物細胞に由来する１以上の成分、例えば、植物、植物の一部分、又は植物細胞に由来するタンパク質（タンパク質複合体、タンパク質上部構造及び／又はＶＬＰを含む）、核酸、脂質、炭水化物、又はこれらの組み合わせの回収を支援するために、植物抽出物が得られてもよい。この植物抽出物がタンパク質を含む場合、その植物抽出物はタンパク質抽出物と呼ばれてもよい。タンパク質抽出物は、植物組織由来の、１以上のタンパク質、タンパク質複合体、タンパク質上部構造及び／又はＶＬＰを含む粗製植物抽出物、部分的に精製された植物又はタンパク質抽出物、又は精製された産物であってもよい。所望に応じて、タンパク質抽出物、又は植物抽出物は、当業者に公知の技術を使用して部分的に精製されてもよく、例えば、上記抽出物は、塩析又はｐＨ沈殿、遠心分離、勾配密度遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又はこれらの組み合わせにかけられてもよい。タンパク質抽出物は、当業者に公知である技術を使用して精製されてもよい。
用語「構築物」、「ベクター」又は「発現ベクター」は、本明細書で使用する場合、外来の核酸配列を宿主細胞（例えば、植物細胞）に移してその宿主細胞の中でのこの外来の核酸配列の発現を導くための組み換え核酸を指す。「発現カセット」は、宿主細胞における目的の核酸の転写のための適切なプロモーター又は他の調節エレメントの制御下の、そしてそれに作動可能（又は作用可能）に連結された、目的の核酸を含むヌクレオチド配列を指す。当業者なら理解するように、この発現カセットは、植物宿主において活性である任意の配列である終止（ターミネーター）配列を含んでもよい。例えば、終止配列は、二分ＲＮＡウイルス、例えばコモウイルス、のＲＮＡ－２ゲノムセグメントに由来してもよく、終止配列はＮＯＳターミネーターであってもよく、又はターミネーター配列はアルファルファプラストシアニン遺伝子の３’ＵＴＲから得られてもよい。
本開示の構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含んでもよい。３’非翻訳領域は、ｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現をもたらすことができるポリアデニル化シグナル及び任意の他の制御シグナルを含有する。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラックの付加を行うことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは、一般に、限界構造５’ＡＡＴＡＡＡ－３’への相同性の存在によって認識されるが、バリエーションが稀であるということはない。好適な３’領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）等のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナル、大豆貯蔵タンパク質遺伝子等の植物遺伝子、リブロース－１，５－ビスホスフェートカルボキシラーゼ遺伝子（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；米国特許第４，９６２，０２８号明細書。これを参照により本明細書に援用したものとする）の小サブユニット、プラストシアニン発現を制御する際に使用されるプロモーターを含む３’転写非翻訳領域である。
「調節領域」、「調節エレメント」又は「プロモーター」は、常にではないが典型的にはＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれか、又はＤＮＡ及びＲＮＡの両方からなりうる遺伝子のタンパク質コード領域の上流の核酸の一部分を意味する。調節領域が活性であり、かつ目的のヌクレオチド配列と連動しているか、又は作用可能に連結されている場合、これは、目的のヌクレオチド配列の発現を生じてもよい。調節エレメントは、器官特異性を媒介するか、又は発生的又は一時的な遺伝子活性化を制御することができてもよい。「調節領域」は、プロモーターエレメント（プロモーター配列）、基本プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答して誘導可能であるエレメント、ネガティブ調節エレメント又は転写エンハンサー等のプロモーター活性を媒介するエレメントを含む。「調節領域」は、本明細書で使用する場合、転写後に活性になるエレメント、例えば翻訳及び転写のエンハンサー、翻訳及び転写のリプレッサー、上流活性化配列、及びｍＲＮＡ不安定性決定因子等の遺伝子発現を調節する調節エレメントも含む。これらの後者のエレメントのうちのいくつかは、コード領域の近位に位置してもよい。
本開示の文脈において、用語「調節エレメント」又は「調節領域」は、典型的には、常にではないが通常は構造遺伝子のコード配列の上流（５’）のＤＮＡの配列を指し、この配列は、転写が特定の部位で開始するために必要とされるＲＮＡポリメラーゼ及び／又は他の因子についての認識を提供することによりコード領域の発現を制御する。しかしながら、イントロン内、又は上記配列の３’に位置する他のヌクレオチド配列も関心コード領域の発現の調節に寄与しうるということを理解されたい。特定の部位での開始を確実にするためのＲＮＡポリメラーゼ又は他の転写因子についての認識を提供する調節エレメントの例は、プロモーターエレメントである。すべてではないがほとんどの真核生物のプロモーターエレメントは、通常は転写開始点のおよそ２５塩基対上流に位置するアデノシン及びチミジンのヌクレオチド塩基対を含む保存された核酸配列であるＴＡＴＡボックスを含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始を担う基本プロモーターエレメント、及び遺伝子発現を改変する他の調節エレメントを含んでもよい。
発生的に調節されるもの、誘導性のもの、又は構成的なものを含め、いくつかの種類の調節領域がある。発生的に調節されるか、又は自身の制御下で遺伝子の差次的発現変動を制御する調節領域は、所定の器官又は器官の組織内で、その器官又は組織の発生の間の特定の時期に活性化される。しかしながら、発生的に調節されるいくつかの調節領域は、特定の発生段階で所定の器官又は組織内で優先的に活性であってもよく、それらは発生的に調節される様式で、又はその植物内の他の器官若しくは組織における基底レベルで活性であってもよい。組織特異的調節領域、例えば種子特異的調節領域の例としては、ナピンプロモーター、及びクルシフェリンプロモーターが挙げられる（Ｒａｓｋら、１９９８、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １５２：５９５－５９９；Ｂｉｌｏｄｅａｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１２５－１３０）。葉特異的プロモーターの例としては、プラストシアニンプロモーター（米国特許第７，１２５，９７８号明細書を参照。この特許文献を参照により本明細書に援用したものとする）が挙げられる。
誘導性調節領域は、誘導因子に応答して１以上のＤＮＡ配列又は遺伝子の転写を直接的又は間接的に活性化することができる領域である。誘導因子の不存在下では、そのＤＮＡ配列又は遺伝子は転写されないことになる。典型的には、転写を活性化するために誘導性調節領域に特異的に結合するこのタンパク質因子は、不活性形態で存在してもよく、この不活性形態は、次いで誘導因子によって活性形態へと直接的又は間接的に変換される。しかしながら、このタンパク質因子は、存在しなくてもよい。誘導因子は、タンパク質、代謝産物、成長調節物質、除草剤若しくはフェノール系化合物等の化学薬剤又は熱、寒さ、塩若しくは毒性要素によって直接的に、若しくはウイルス等の病原体又は疾患因子の作用を通して間接的に課される生理的ストレスであることができる。誘導性調節領域を含有する植物細胞は、噴霧、灌水、加熱又は類似の方法による等で誘導因子を細胞又は植物に外的に与えることにより、誘導因子に曝露されてもよい。誘導性調節エレメントは、植物又は非植物の遺伝子のいずれに由来してもよい（例えば、Ｇａｔｚ，Ｃ．及びＬｅｎｋ，Ｉ．Ｒ．Ｐ．、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ３、３５２－３５８）。有望な誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｇａｔｚ，Ｃ．，１９９７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８、８９－１０８）、ステロイド誘導性プロモーター（Ａｏｙａｍａ，Ｔ．及びＣｈｕａ，Ｎ．Ｈ．、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２、３９７－４０４）及びエタノール誘導性プロモーター（Ｓａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｇ．ら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １６、１２７－１３２；Ｃａｄｄｉｃｋ，Ｍ．Ｘ．ら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６、１７７－１８０）、サイトカイニン誘導性ＩＢ６及びＣＫＩ１遺伝子（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ，Ｉ．及びＫｉｅｂｅｒ，Ｊ．Ｊ．，１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０、１００９－１０１９；Ｋａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、９８２－９８５）及びオーキシン誘導性要素、ＤＲ５（Ｕｌｍａｓｏｖ，Ｔ．ら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９、１９６３－１９７１）が挙げられるが、これらに限定されない。
構成的調節領域は、植物の種々の部分全体にわたって、かつ連続的に植物発生全体にわたって遺伝子の発現を導く。公知の構成的調節エレメントの例としては、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写物と関連するプロモーター（ｐ３５Ｓ；Ｏｄｅｌｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０－８１２；この文献を、参照により本明細書に援用したものとする）、イネアクチン１（Ｚｈａｎｇら、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３：１１５５－１１６５）、アクチン２（Ａｎら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１０：１０７－１２１）、又はｔｍｓ２（米国特許第５，４２８，１４７号明細書）、及びトリオースリン酸イソメラーゼ１（Ｘｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０６：４５９－４６７）遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９：６３７－６４６）、アラビドプシスユビキチン１及び６遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９：６３７－６４６）、タバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌら、１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９：９９５－１００４）、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター、ｐＣＡＳ、（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９６）；リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーター、ｐＲｂｃＳ：（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖら、２００３）、ｐＵｂｉ（単子葉類及び双子葉類について）が挙げられる。
本明細書で使用する場合の用語「構成的」は、構成的調節領域の制御下のヌクレオチド配列がすべての細胞型で同レベルで発現されることを必ずしも意味しないが、その配列が、存在量のばらつきはしばしば観察されるが、広い範囲の細胞型で発現されることを意味する。
上記の発現構築物は、ベクターに存在してもよい。このベクターは、生物又は宿主のゲノムへの発現カセットの移転及び組み込みを許容する境界配列を含んでもよい。この構築物は、植物バイナリーベクター、例えば、ｐＰＺＰに基づくバイナリー形質転換ベクター（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら、１９９４）であってもよい。他の例示の構築物としては、ｐＢｉｎ１９（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．、Ｌ．Ｗ．Ｈａｒｒｉｓ－Ｈａｌｌｅｒら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７：４０５－４０９を参照）が挙げられる。
本明細書で使用する場合の用語「未変性の」、「未変性のタンパク質」又は「未変性のドメイン」は、野生型と同一の一次アミノ酸配列を有するタンパク質又はドメインを指す。未変性のタンパク質又はドメインは、野生型配列に対して１００％配列類似性を有するヌクレオチド配列によってコードされてもよい。未変性のアミノ酸配列は、ヒトコドン（ｈＣｏｄ）に最適化済みのヌクレオチド配列又は野生型ヌクレオチド配列と比べて増加したＧＣ含有量を含むヌクレオチド配列によってコードされてもよいが、ただしこのｈＣｏｄ－ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は未変性のアミノ酸配列と１００％配列同一性を呈する。
「ヒトコドンに最適化済み」又は「ｈＣｏｄ」ヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列は、ヒトのヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチド配列の中で一般に見出されるコドン使用頻度に近づく、オリゴヌクレオチド配列又はその断片の合成のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を意味する。「増加したＧＣ含有量」は、対応する未変性のオリゴヌクレオチド配列と比べて、オリゴヌクレオチド配列のコード部分の長さにわたって例えば約１～約３０％、又はこれらの間の任意の量のＧＣ含有量の増加を含むコドン使用頻度に近づくための、オリゴヌクレオチド配列又はその断片の合成のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を意味する。例えば、オリゴヌクレオチド配列のコード部分の長さにわたって約１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、又はこれらの間の任意の量。後述するように、ヒトコドンに最適化済みのヌクレオチド配列、又は（野生型ヌクレオチド配列と比べて）増加したＧＣ接触を含むヌクレオチド配列は、ヒトコドンに最適化されていない（すなわちより低いＧＣ含有量の）ヌクレオチド配列の発現と比べて、植物、植物の一部分、又は植物細胞の中で増加した発現を呈する。
改変されたインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質（改変されたＨＡタンパク質、改変されたインフルエンザＨＡタンパク質、改変されたＨＡ、改変されたインフルエンザＨＡ，変異体ＨＡ、インフルエンザ変異体ＨＡ、インフルエンザＨＡバリアント又はＨＡバリアントとも呼ばれる）及び植物における改変されたインフルエンザＨＡタンパク質の産生方法が本明細書に記載される。本明細書中に開示される改変されたインフルエンザＨＡタンパク質は、野生型ＨＡ又は未改変ＨＡタンパク質と比べて改善されたＨＡ特性を生じることが見出された改変又は変異を含む。例えば、当該改変されたインフルエンザＨＡタンパク質は、対応する野生型アミノ酸配列と比べてアミノ酸の少なくとも１つの置換を有するアミノ酸配列を有してもよい。
改変されたＨＡタンパク質の改善された特性の例としては、植物細胞で発現されたときの、同じ株の野生型若しくは未改変ＨＡ又は改変（１若しくは複数）若しくは変異（１若しくは複数）を含まないインフルエンザの亜型と比べて増加したＨＡタンパク質の収率；野生型又は未改変ＨＡタンパク質と比べて、改変されたＨＡタンパク質の向上した赤血球凝集価；改変（１若しくは複数）又は変異（１若しくは複数）を含まない野生型ＨＡを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の完全性、安定性又はその両方と比べて、上記改変されたＨＡタンパク質からなるＶＬＰの向上した完全性、安定性、若しくは完全性及び安定性の両方；植物細胞で発現されたときの、改変（１若しくは複数）又は変異（１若しくは複数）を含まない野生型のＶＬＰ産生レベルと比べて増加したＶＬＰ収率；並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
インフルエンザの亜型及び株
本明細書で使用する場合の用語「インフルエンザウイルス亜型」は、ヘマグルチニン（Ｈ又はＨＡ）及びノイラミダーゼ（Ｎ）のウイルス表面タンパク質の種々の組み合わせによって特徴づけられるインフルエンザＡウイルスバリアントを指す。本明細書によれば、インフルエンザウイルス亜型及びこのようなウイルス亜型由来のヘマグルチニン（ＨＡ）は、それらのＨ数によって、例えば「Ｈ３亜型のＨＡ」、「Ｈ３ ＨＡ」又は「Ｈ３インフルエンザ」等と呼ばれてもよい。用語「亜型」は、具体的には、各亜型の中のすべての個々の「株」を含み、この個々の「株」は、通常は変異に由来し、異なる病原性プロファイルを示す可能性がある。そのような株は、ウイルス亜型の種々の「分離株」とも呼ばれてよい。従って、本明細書で使用する場合、用語「株」及び「分離株」はほとんど同義で使用されてもよい。
伝統的に、インフルエンザの異なる株は、例えば、赤血球細胞（ＲＢＣ又は赤血球）を凝集させるインフルエンザの能力に基づいて分類されてきた。特定のインフルエンザ株に特異的な抗体は、ウイルスに結合してもよく、従ってそのような凝集を防止してもよい。そのような阻害に基づいて株の型を決定するアッセイは、典型的にはヘマグルチニン阻害アッセイ（ＨＩアッセイ又はＨＡＩアッセイ）として知られており、インフルエンザ株を特徴づけるための標準的で当該技術分野で周知の方法である。
しかしながら、異なるウイルス株由来のＨＡタンパク質も核酸及びアミノ酸の両方のレベルで顕著な配列類似性を示す。このレベルの類似性は、異なる亜型の株が比較されるときに変わり、いくつかの株は他よりも高いレベルの類似性を明らかに呈する（Ａｉｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８１、７８：７６４３）。アミノ酸類似性のレベルは１つの亜型のウイルス株と他の亜型のウイルス株との間で変わる（Ａｉｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８１、７８：７６４３）。このばらつきは、個別の亜型及び異なる株の進化系統を確立するのに十分であるが、異なる株のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、従来のバイオインフォーマティクス技術を使用して、依然として容易に配列比較される（Ａｉｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８１、７８：７６４３；Ｓｕｚｕｋｉ及びＮｅｉ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ． ２００２、１９：５０１）。
亜型の「コンセンサス」又は「コンセンサス配列」を決定するために、ヘマグルチニン（ＨＡ）の複数のヌクレオチド配列、又は対応するポリペプチド配列が配列比較されてもよい（図１を参照）。
配列類似性に基づいて、インフルエンザウイルス亜型は、その発生系統群を参照してさらに分類することができる。系統発生解析（Ｆｏｕｃｈｉｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００５ Ｍａｒ；７９（５）：２８１４－２２）は、２つの主要群（Ａｉｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８１、７８：７６４３）に分かれるＨＡの細分化を明らかにした：発生系統群１におけるとりわけＨ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ９亜型、並びに発生系統群２におけるとりわけＨ３、Ｈ４及びＨ７亜型。
新しいインフルエンザＨＡタンパク質、ＨＡ改変物、ＨＡタンパク質バリアント及び変異体は、上記のとおりのＨＡの改善された特徴をもたらすＨＡタンパク質のアミノ酸配列に変化を導入することにより作成される。そのようなＨＡ分子をコードする核酸の単離は、例えば部位特異的変異誘発により、アミノ酸配列に変化を導入するための核酸の改変のように、日常的なものである。
改変されたインフルエンザＨＡタンパク質及び植物における改変されたインフルエンザＨＡタンパク質の産生方法が本明細書に記載される。例えば、ＨＡタンパク質、例えば亜型Ｈ３由来のＨＡの中の特定のアミノ酸の置換による改変が、野生型ＨＡタンパク質又は未改変ＨＡタンパク質と比べて、改変されたＨＡタンパク質の改善された特性をもたらすということが認められた。
本明細書に記載されるＨＡタンパク質の１以上の改変、変異又は置換は、ＨＡタンパク質の球状頭部ドメインには位置せず、ＨＡタンパク質の公知のエピトープ領域には位置せず、これらの改変、変異又は置換はＨＡタンパク質内のグリコシル化部位の付加も除去もしない。
本明細書に記載されるＨＡタンパク質、変異体ＨＡタンパク質又は改変されたＨＡタンパク質は、改変されており、そのアミノ酸配列において、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４のアミノ酸配列（配列番号９２；図１を参照）の位置３８２、３８４、３９２、４３１、５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８に対応する任意の１以上のアミノ酸における１以上の変異、又は改変に対応する任意の１以上のアミノ酸における１以上の変異、改変、又は置換を含む。
「アミノ酸に対応する」は、あるアミノ酸が、後述するインフルエンザ基準株との配列アラインメントにおいてあるアミノ酸に対応することを意味する。
ＨＡのアミノ酸残基番号又は残基位置は、インフルエンザ基準株のＨＡのナンバリングに従う。例えば、インフルエンザＨ３の場合、基準株はＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４［配列番号９２、図１を参照］であってよい。対応するアミノ酸位置は、ＨＡ（例えば、Ｈ３ ＨＡ）の配列をそれらのそれぞれの基準株のＨＡの配列とアラインメント（配列比較）することによって決定されてもよい。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装品（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は手作業によるアラインメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）により実施することができる。いくつかのインフルエンザＡ ＨＡドメインのアミノ酸配列アラインメントが図１に示されるが、これは限定するものと考えられるべきではない。
改変物、変異体又はバリアントを参照するとき、野生型アミノ酸残基（単に「アミノ酸」とも呼ばれる）の後に、残基番号及び新しいアミノ酸又は置換アミノ酸が続く。例えば、位置３８２の残基又はアミノ酸におけるアスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）からアラニン（Ａ、Ａｌａ）への置換はＮ３８２Ａと称される（表１を参照）。３８２（Ｎ３８２Ａ）
改変されたＨＡ、ＨＡ変異体又はバリアント、例えば改変されたＨ３ ＨＡは、野生型残基についての１文字アミノ酸コードに続くその位置及び置換残基の１文字アミノ酸コードを使用して同様に表される。複数の変異体は、スラッシュ（／）又はプラス（＋）で分離された単一変異体というコンポーネントによって示される。膜貫通（ＴＭ）のドメイン又は領域における変異又は改変は（ＣｙｓＴＭ）として示される。従って、例えば、Ｈ３ ＨＡ変異体Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ（ＣｙｓＴＭ）は、残基位置３８２でアスパラギン（Ｎ、Ａｓｐ）がアラニン（Ａ、Ａｌａ）で置換され、残基位置３８４でロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）がバリン（Ｖ、Ｖａｌ）で置換されている変異体であり、このＨ３ ＨＡ変異体は、膜貫通ドメインにさらなる変異を有する。
Figure 2024050651000002
改変されたインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質は、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
「アミノ酸置換」又は「置換」は、タンパク質のアミノ酸配列の中のアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味する。アミノ酸、アミノ酸残基又は残基という用語は、本開示においてはほとんど同義で使用される。１以上のアミノ酸が、タンパク質のアミノ酸配列の全長を変えることなく、この位置でもとのアミノ酸又は野生型アミノ酸とは異なる１以上のアミノ酸で置き換えられてもよい。置換又は置き換えは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列におけるコドン配列を、もとのアミノ酸又は野生型アミノ酸と比べて異なるアミノ酸のコドン配列へと変更することにより、実験的に誘導されてもよい。得られたタンパク質は、改変されたタンパク質、例えば改変されたインフルエンザＨＡタンパク質である。この改変されたインフルエンザＨＡタンパク質は天然には存在しない。
当該改変されたＨＡは、天然に存在するＨＡに対する少なくとも１つの改変を有して、改変されたＨＡのアミノ酸配列が由来する天然に存在するＨＡタンパク質と比べて改善された特性を有する、天然に存在しないＨＡタンパク質を含む。改変されたＨＡタンパク質は、ＨＡタンパク質の１以上のアミノ酸残基を１以上の異なるアミノ酸で置き換えることにより誘導される、天然では見出されないアミノ酸配列を有する。
従って、改変されたＨＡ、変異体ＨＡ又は組み換えＨＡは、天然に存在するＨＡをコードするＤＮＡ配列がＨＡアミノ酸配列の中の１以上のアミノ酸の改変、変異又は置換をコードする改変されたＤＮＡ配列又は変異ＤＮＡ配列を生成するように改変されているＨＡを指す。
改変、変異又は置換について特定される残基のうちのいくつかは、保存された残基に相当するが、そうではないものもある。保存されていない残基の場合、１以上のアミノ酸の置き換えは、天然で見出されるものに相当しないアミノ酸配列を有する改変されたＨＡを生成する置換に限定される。保存された残基の場合も、そのような改変、置換又は置き換えは天然に存在するＨＡ配列を生じないはずである。
保存的な置換
本明細書に記載されるように、ＨＡタンパク質中の残基は、改変されたＨＡタンパク質又はＨＡタンパク質バリアントを生成するために、特定されて、改変、置換又は変異されてもよい。特定の位置における置換又は変異は、本明細書中に記載されるか又は実施例に与えられるアミノ酸置換に限定されない。例えば、ＨＡバリアントは、記載されたアミノ酸置換の保存された置換又は保存的な置換を含んでもよい。
本明細書で使用する場合、用語「保存された置換」又は「保存的な置換」及びその文法上の派生語は、記載された置換又は記載された残基とは異なるが同じ種類のアミノ酸である（すなわち、非極性の残基を置き換える非極性の残基、芳香族残基を置き換える芳香族残基、極性の電荷を帯びていない残基を置き換える極性の電荷を帯びていない残基、電荷を帯びた残基を置き換える電荷を帯びた残基）ＨＡタンパク質の配列の中のアミノ酸残基の存在を指す。加えて、保存的な置換は、野生型残基を置き換える残基と同じ符号及び一般には同じ大きさの界面ヒドロパシー（疎水性親水性指標）値を有する残基を包含することができる。
本明細書で使用する場合、用語「非極性の残基」はグリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、及びプロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）を指し、用語「芳香族残基」はフェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）、及びトリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）を指し、用語「極性の電荷を帯びていない残基」はセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）及びグルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）を指し、用語「電荷を帯びた残基」は負に帯電したアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）、並びに正に帯電したアミノ酸であるリジン（Ｋ、Ｌｙｓ）、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、及びヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）を指す。アミノ酸の他の分類は、以下のとおりであってもよい。
・疎水性の側鎖（脂肪族）を有するアミノ酸：アラニン（Ａ、Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）及びバリン（Ｖ、Ｖａｌ）；
・疎水性の側鎖（芳香族）を有するアミノ酸：フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；
・極性の中性の側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）及びトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；
・電荷を帯びた側鎖（酸性）を有するアミノ酸：アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；
・電荷を帯びた側鎖（塩基性）を有するアミノ酸：アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）及びプロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）。
保存的なアミノ酸置換は、得られるＨＡタンパク質バリアント又は改変されたＨＡタンパク質の活性に対して、もとの置換又は改変と類似の効果を有する可能性が高い。保存的な置換についてのさらなる情報は、例えばＢｅｎ Ｂａｓｓａｔら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：７５１－７５７、１９８７）、Ｏ’Ｒｅｇａｎら（Ｇｅｎｅ、７７：２３７－２５１、１９８９）、Ｓａｈｉｎ－Ｔｏｔｈら（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＳｃＬ、３：２４０－２４７、１９９４）、Ｈｏｃｈｕｌｉら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１３２１－１３２５、１９８８）に、及び遺伝学及び分子生物学の広く使われている教科書に見出すことができる。
Ｂｌｏｓｕｍマトリクスは、ポリペプチド配列の関連性を決定するために一般に使用される。このＢｌｏｓｕｍマトリクスは、信頼できるアラインメントの大データベース（ＢＬＯＣＫＳデータベース）を使用して作成されたものであり、いくつかの閾値百分率同一性未満によって関連づけられた対での配列アラインメントがカウントされた（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５－１０９１９、１９９２）。９０％同一性という閾値が、ＢＬＯＳＵＭ９０マトリクスの高度に保存された標的頻度のために使用された。６５％同一性という閾値が、ＢＬＯＳＵＭ６５マトリクスのために使用された。Ｂｌｏｓｕｍマトリクスにおけるゼロ以上というスコアは、選択された百分率同一性において「保存的な置換」と考えられる。以下の表は、例示的な保存的なアミノ酸置換を示す：表２。
Figure 2024050651000003
改変されたＨＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ヒトのコドン使用頻度、増加したＧＣ含有量、又はこれらの組み合わせについて最適化されてもよい。改変されたＨＡタンパク質は、植物、植物の一部分、又は植物細胞において発現されてもよい。
Ａ． Ｈ３ ＨＡ改変Ｉ
改変されたインフルエンザＨ３ ＨＡタンパク質及び植物における改変されたインフルエンザＨ３ ＨＡタンパク質の産生方法が本明細書に記載される。亜型Ｈ３由来のＨＡタンパク質における特定のアミノ酸の改変は、野生型Ｈ３ ＨＡタンパク質又は未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質と比べて改変Ｈ３ ＨＡタンパク質の改善された特性をもたらすということが認められた。
Ｈ３ ＨＡタンパク質の特徴を向上させるために、全部で３３個の単一、二重及び／又は三重の、ＨＡ膜貫通ドメイン（ＴＭ）及びサイトゾル（細胞基質）ドメイン（ＣＴ）の一部ではない残基への改変、並びに／又はＨＡの膜貫通ドメイン（ＴＭ）及びサイトゾルドメイン（ＣＴ）の一部である残基への改変を試験した。本明細書中に記載され、実施例で示されるように、特定の位置における改変又は改変の組み合わせだけが、Ｈ３ ＨＡタンパク質の特徴を向上させた。１３個の位置又は位置の組み合わせにおける改変は、Ｈ３ ＨＡタンパク質の特徴に対して負の効果を与えた（データは示さず）。
Ｈ３ ＨＡ変異体又は改変Ｈ３ ＨＡタンパク質の改善された特性の例としては、植物細胞で発現されたときの、同じ株の野生型若しくは未改変ＨＡ又は改変（１若しくは複数）若しくは変異（１若しくは複数）を含まないインフルエンザの亜型と比べて増加したＨＡタンパク質の収率又は蓄積；野生型又は未改変ＨＡタンパク質と比べて、改変ＨＡタンパク質又は変異ＨＡタンパク質の向上した赤血球凝集価；上記変異（１若しくは複数）を含まない野生型ＨＡを含むＶＬＰの完全性、安定性若しくはその両方と比べて、上記改変されたＨＡタンパク質からなるＶＬＰの向上した完全性、安定性、若しくは完全性及び安定性の両方；植物細胞で発現されたときの、改変（１若しくは複数）又は変異（１若しくは複数）を含まない野生型のＶＬＰ産生レベルと比べて増加したＶＬＰ収率；並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書に記載される改変Ｈ３ ＨＡタンパク質又は変異体Ｈ３ ＨＡタンパク質は、改変されており、基準株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４（配列番号９２；図１を参照）の位置３８２、３８４、３９２及び／又は４３１との配列アラインメントにおける任意の１以上の残基において１以上の変異、又は改変を含む。それゆえ、例えば、アミノ酸位置３８２、３８４、３９２及び４３１のうちの１以上（このようなアミノ酸ナンバリングは、図１に示されるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４の配列（配列番号９２））に基づく）において、又は、例えばＨＡアミノ酸配列を配列番号９２に対してアラインメントすることによって決定される場合のそのようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において改変又は変異を含むインフルエンザＨ３ ＨＡポリペプチド、タンパク質、及び／又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）等のタンパク質複合体が提供される。このような変異のうちの１以上を含むインフルエンザＨ３ ＨＡアミノ酸配列の非限定的な例としては、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７が挙げられる。
本明細書中に記載される改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３由来のＨＡをコードするアミノ酸配列（配列番号９１～配列番号９７）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を持つＨ３ ＨＡタンパク質を含み、このアミノ酸配列は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡ（配列番号９２）の位置３８２、３８４、３９２及び４３１との配列アラインメントにおける任意の１以上の残基において１以上の変異、又は改変を有する。
さらには、このＨ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３由来のＨＡ（配列番号９１～配列番号９７）をコードするヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するヌクレオチド配列によってコードされてもよく、このＨ３ ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４（配列番号９２）ＨＡの位置３８２、３８４、３９２及び４３１との配列アラインメントにおける任意の１以上の残基において１以上の変異、又は改変を有し、上記ヌクレオチド配列は、発現されたときにＶＬＰを形成するヘマグルチニンタンパク質をコードする。
上記Ｈ３ ＨＡが由来してもよい株の非限定的な例は、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９１）；Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９２）；Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９３）；Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９４）；Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／１５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９５）；Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９６）及びＡ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１６／１６（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９７）である。
位置３８２における改変
１つの態様では、位置３８２（ナンバリングはＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡナンバリング、配列番号９２に従う）に改変された残基を有してもよいＨ３ ＨＡが提供される。
Ａｎｔａｎａｓｉｊｅｖｉｃら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１４；２８９（３２）：２２２３７－４５）は、１４個の異なる位置における部位特異的変異誘発によりＨ５ ＨＡステムループ領域の構造機能特性を検討した。ＨＡ２の変異した位置Ｔｈｒ４１、Ｇｌｎ４２、Ｉｌｅ４５、Ａｓｎ５３、及びＬｅｕ９９は、高度に保存されており、ＨＡ機能にとってのこれらの残基の重要性をアッセイするために設計された。Ａｎｔａｎａｓｉｊｅｖｉｃは、位置ＨＡ１－Ｉ２８Ｖ、ＨＡ２－Ｔ４１Ａ、ＨＡ２－Ｔ４９Ａ、ＨＡ２－Ｎ５３Ａ、及びＨＡ２－Ｄ５７Ｅにおける保存された変異がウイルスの進入を邪魔することを認めた。小分子ＭＢＸ２３２９による進入阻害に対する変異効果の場合に、外面のＨＡ２－Ｉｌｅ４５、ＨＡ２－Ｖａｌ５２、ＨＡ２－Ａｓｎ５３、及びＨＡ２－Ｓｅｒ５４並びに内面のＨＡ２－Ｌｅｕ９９への置換は、最大の効果を有していた。これらの残基はグループ１のＨＡ（例えば、Ｈ１及びＨ５）において高度に保存されている。ＡｎｔａｎａｓｉｊｅｖｉｃのＨ５のＨＡの位置５３は本開示のＨ１ ＨＡにおける位置３８０及びＨ３ ＨＡにおける位置３８２に対応する。
Ｈ１ ＨＡの位置３８０におけるアスパラギンからアラニンへの保存された残基の改変は、野生型Ｈ１ ＨＡと比べて改変Ｈ１ ＨＡの赤血球凝集価のおよそ８０％低下につながる（データは示さず）ということが予想外にも見出された。Ｈ５由来のＨＡにおける等価な改変も、赤血球凝集価の減少につながる（図３、表７を参照）。しかしながら、アスパラギンからアラニンへの、Ｈ３由来のＨＡにおける等価な位置の改変（Ｎ３８２Ａ）は、野生型Ｈ３ ＨＡと比べて赤血球凝集価のおよそ１３０％上昇につながる（図２、表５を参照）。
従って、Ｈ３ ＨＡの位置３８２の残基は、非アスパラギンであるように改変されてもよい。例えば、位置３８２の残基は、疎水性アミノ酸、例えばアラニン又はアラニンの保存的置換、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であるように改変されてもよい。
例えば、当該改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は、位置３８２にアラニン（Ａ、Ａｌａ）又はアラニン（Ａ、Ａｌａ）の保存的置換を有し、この配列は天然には存在しない。アラニンの保存的置換は、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってもよい。
本明細書は、植物において活性な調節領域に作用可能に連結された、上記のとおりの位置３８２の置換を有する改変Ｈ３ ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
例えば、上記ヌクレオチド配列は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８２にアラニン（Ａ、Ａｌａ）又はアラニン（Ａ、Ａｌａ）の保存的置換を有する改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在しない。この保存的置換は、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってもよい。
上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０２のヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８２にアラニン（Ａ、Ａｌａ）又はアラニン（Ａ、Ａｌａ）の保存的置換を有する改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在しない。この保存的置換は、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってもよい。
位置３８２の残基に加えて、位置３８４、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８又はこれらのいずれかの組み合わせの残基が、Ｈ３ ＨＡにおいて改変されてもよい。
さらには、少なくとも位置３８２における、及び任意に位置３８４、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８又はこれらのいずれかの組み合わせにおける置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における産生方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、その植物又は植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
加えて、少なくとも位置３８２における置換、及び任意に位置３８４、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８又はこれらのいずれかの組み合わせにおける置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における収率を高める方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、その植物又は植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
本明細書は、少なくとも位置３８２における置換、及び任意に位置３８４、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８又はこれらのいずれかの組み合わせにおける置換を有するＨ３ ＨＡを含むＶＬＰをさらに提供する。このＶＬＰは、本明細書によって提供される方法によって産生されてもよい。上記改変Ｈ３ ＨＡを含む当該ＶＬＰは、未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質を含むＶＬＰと比べて改善された特性を示す。
位置３８４における改変
別の態様では、位置３８４（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡナンバリング、配列番号９２）に改変された残基を有してもよいＨ３ ＨＡが提供される。
例えば、図２及び表５に示されるように、位置３８４の残基がロイシンからバリンに改変されていることで、野生型Ｈ３ ＨＡと比べて赤血球凝集価のおよそ２００％上昇につながる。
従って、Ｈ３ ＨＡの位置３８４の残基は、非ロイシンであるように改変されてもよい。例えば、位置３８４の残基は、例えば、バリン、又はロイシンではないバリンの保存的置換、例えばイソロイシン、メチオニン、アラニン、又はトレオニンであるように改変されてもよい。
例えば、当該改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は位置３８４にバリン（Ｖ、Ｖａｌ）、又はロイシンではないバリンの保存的置換を有し、この配列は天然には存在せず、このＨＡタンパク質は発現されたときにＶＬＰを形成する。バリンの保存的置換は、例えば、イソロイシン、メチオニン、アラニン、又はトレオニンであってもよい。
本明細書は、植物において活性な調節領域に作用可能に連結された、上記のとおりの位置３８４の置換を有する改変Ｈ３ ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
例えば、上記ヌクレオチド配列は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８４にバリン（Ｖ、Ｖａｌ）、又はロイシンではないバリン（Ｖ、Ｖａｌ）の保存的置換を有する改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このヌクレオチド配列は、発現されたときにＶＬＰを形成するＨＡタンパク質をコードする。このバリンの保存的置換は、例えば、イソロイシン、メチオニン、アラニン、又はトレオニンであってもよい。
上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０２のヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８４にバリン（Ｖ、Ｖａｌ）、又はロイシンではないバリン（Ｖ、Ｖａｌ）の保存的置換を有する改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このヌクレオチド配列は、発現されたときにＶＬＰを形成するＨＡタンパク質をコードする。バリンの保存的置換は、例えば、イソロイシン、メチオニン、アラニン、又はトレオニンであってもよい。
位置３８４の残基に加えて、位置３８２、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８又はこれらのいずれかの組み合わせの残基が、Ｈ３ ＨＡにおいて改変されてもよい。
さらには、少なくとも位置３８４における置換、及び任意に位置３８２、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８又はこれらのいずれかの組み合わせにおける置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における産生方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
加えて、上記のとおり少なくとも３８４における置換、及び任意に位置３８２、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８又はこれらのいずれかの組み合わせにおける置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における収率を高める方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
本明細書は、少なくとも位置３８４における置換、及び任意に位置３８２、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８又はこれらのいずれかの組み合わせにおける置換を有するＨ３ ＨＡを含むＶＬＰをさらに提供する。このＶＬＰは、本明細書によって提供される方法によって産生されてもよい。上記改変Ｈ３ ＨＡを含む当該ＶＬＰは、未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質を含むＶＬＰと比べて改善された特性を示す。
位置３９２における改変
別の態様では、位置３９２（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡナンバリング、配列番号９２）に改変された残基を有してもよいＨ３ ＨＡが提供される。
例えば、図２及び表５に示されるように、位置３９２の残基がフェニルアラニンからアスパラギン酸に改変されていることで、野生型Ｈ３ ＨＡと比べて赤血球凝集価のおよそ１４０％上昇につながる。
従って、Ｈ３ ＨＡの位置３９２の残基は、非フェニルアラニンであるように改変されてもよい。例えば、位置３９２の残基は、例えば、アスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換、例えばグルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、又はセリンであるように改変されてもよい。
例えば、当該改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は位置３９２にアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換、例えばグルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、又はセリンを有し、この配列は天然には存在せず、このＨＡタンパク質は発現されたときにＶＬＰを形成する。アスパラギン酸の保存的置換は、例えばグルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、又はセリンであってもよい。
本明細書は、植物において活性な調節領域に作用可能に連結された、上記のとおりの位置３９２の置換を有する改変Ｈ３ ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
例えば、上記ヌクレオチド配列は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３９２にアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換を有する改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このヌクレオチド配列は、発現されたときにＶＬＰを形成するＨＡタンパク質をコードする。アスパラギン酸の保存的置換は、例えばグルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、又はセリンであってもよい。
上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０２のヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３９２にアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換を有する改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このヌクレオチド配列は、発現されたときにＶＬＰを形成するＨＡタンパク質をコードする。アスパラギン酸の保存的置換は、例えば、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、又はセリンであってもよい。
さらには、上記のとおりの少なくとも位置３９２の置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における産生方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
加えて、上記のとおり少なくとも３９２における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における収率を高める方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
本明細書は、少なくとも位置３９２の置換を有するＨ３ ＨＡを含むＶＬＰをさらに提供する。このＶＬＰは、本明細書によって提供される方法によって産生されてもよい。上記改変Ｈ３ ＨＡを含む当該ＶＬＰは、未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質を含むＶＬＰと比べて改善された特性を示す。
位置４３１における改変
別の態様では、位置４３１（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡナンバリング、配列番号９２）に改変された残基を有してもよいＨ３ ＨＡが提供される。
例えば、図２及び表５に示されるように、位置４３１の残基がロイシンからメチオニンに改変されていることで、野生型Ｈ３ ＨＡと比べて赤血球凝集価のおよそ１７０％上昇につながる。
従って、Ｈ３ ＨＡの位置４３１の残基は、非ロイシンであるように改変されてもよい。例えば、位置４３１の残基は、例えば、メチオニン又はメチオニンの保存的置換、例えばロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン又はフェニルアラニンであるように改変されてもよい。
例えば、当該改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は位置４３１にメチオニン又はメチオニンの保存的置換を有し、この配列は天然には存在せず、このＨＡタンパク質は、発現されたときにＶＬＰを形成する。メチオニンの保存的置換は、例えば、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン又はフェニルアラニンであってもよい。
本明細書は、植物において活性な調節領域に作用可能に連結された、上記のとおりの位置４３１の置換を有する改変Ｈ３ ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
例えば、上記ヌクレオチド配列は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置４３１にメチオニン又はメチオニンの保存的置換を有する改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このヌクレオチド配列は、発現されたときにＶＬＰを形成するＨＡタンパク質をコードする。メチオニンの保存的置換は、例えば、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン又はフェニルアラニンであってもよい。
上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０２のヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置４３１にメチオニン又はメチオニンの保存的置換を有する改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このヌクレオチド配列は、発現されたときにＶＬＰを形成するＨＡタンパク質をコードする。アスパラギン酸の保存的置換は、例えば、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン又はフェニルアラニンであってもよい。
さらには、上記のとおりの少なくとも位置４３１の置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における産生方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
加えて、上記のとおりの少なくとも４３１における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における収率を高める方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
本明細書は、少なくとも位置４３１の置換を有するＨ３ ＨＡを含むＶＬＰをさらに提供する。このＶＬＰは、本明細書によって提供される方法によって産生されてもよい。上記改変Ｈ３ ＨＡを含む当該ＶＬＰは、未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質を含むＶＬＰと比べて改善された特性を示す。
Ｂ． Ｈ３ ＨＡ改変ＩＩ
位置３８２、３８４、３９２、４３１及び／又は５２４～５２８（「ＣｙｓＴＭ」）における改変
改変されたインフルエンザＨ３ ＨＡタンパク質及び植物における改変されたインフルエンザＨ３ ＨＡタンパク質の産生方法が本明細書に記載される。亜型Ｈ３由来のＨＡタンパク質における特定のアミノ酸の改変は、野生型Ｈ３ ＨＡタンパク質又は未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質と比べて改変Ｈ３ ＨＡタンパク質の改善された特性をもたらすということが認められた。
１つの態様では、位置５２４及び／又は５２８（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング、配列番号９２）のシステイン残基又はアラインメントによって決定されるこれらの位置に等価な残基は、これらの位置において非システイン残基に置換されてもよい。さらには、位置５２５、５２６及び／又は５２７（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡナンバリング）の残基も改変されてもよい。これらの改変又は置換は、「ＣｙｓＴＭ改変」、「ＣｙｓＴＭ」、「ＣｙｓＴＭ変異」、「ＣｙｓＴＭ置換」若しくは「ＣｙｓＴＭ置き換え」又は文法的に等価な表現と呼ばれることがある。
米国特許出願第１３／８３８，７９６号及びＨｏｌｔｚらによるその関連刊行物（ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１４；１４：１１１）は、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及びサイトゾルドメイン（ＣＴ）を含むＨＡタンパク質のカルボキシ末端領域におけるシステイン残基の変異により、組み換えＨＡの安定性が向上し効力が維持されることを教示する。具体的には、Ｈｏｌｔｚらは、組み換えＰｅｒｔｈ／１６／２００９ ＨＡ（Ｈ３Ｎ２）におけるＣ５３９Ａ、Ｃ５４６Ａ、Ｃ５４９Ａ、Ｃ５２４Ｓ及びＣ５２８Ａ変異を明らかにした。すべての５つのシステイン残基又はこの異なるサブセットの変異は、組み換え野生型ＨＡタンパク質に匹敵するＨＡ収率、純度、粒子サイズ、赤血球凝集反応活性、及び熱安定性をもたらした。対照的に、ジスルフィド結合を形成することが知られている外部ドメインの一対の保存されたシステイン残基の変異（Ｃ６４Ｓ及びＣ７６Ｓ）は、著しく低下したＨＡ発現を生じ、適正なＨＡフォールディングにおけるこれらの残基の重要な役割が示された。一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）を使用することにより、Ｈｏｌｔｚらは、上記５つのシステイン残基の変異が、ＴＭドメイン及びＣＴドメインにおけるジスルフィド架橋を防ぐことにより、野生型タンパク質と比べて組み換えＨＡの効力を向上させるということも示す。この変異体ＨＡタンパク質は、２５℃で少なくとも１２か月効力を維持するのに対し、野生型ＨＡタンパク質は精製からわずか５０日後に４０％未満の効力を呈した。
Ｘｕら（Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ（２０１３） ４７：２０－２６）は、ＴＭシステイン（Ｃ５４０／５４４）のうちの１つ又は２つの変異を有する変異体Ｈ３ ＨＡは、細胞において適正に発現されうるが、しかしながらこの変異体は野生型Ｈ３ ＨＡタンパク質と比較してより低い耐熱性及び高められた融合活性を呈するということを示した。
Ｈ３ ＨＡタンパク質の特徴を向上させるために、本明細書に記載される膜貫通型（ＴＭ）への改変（「ＣｙｓＴＭ改変」）と組み合わせた全部で３３個の単一、二重及び／又は三重の改変を試験した。本明細書中に記載され、実施例で示されるように、特定の位置における改変又は改変の組み合わせだけが、Ｈ３ ＨＡタンパク質の特徴を向上させた。１３個の位置又は位置の組み合わせにおける改変は、Ｈ３ ＨＡタンパク質の特徴に対して負の効果を与えた（データは示さず）。
Ｈ３ ＨＡ変異体タンパク質の改善された特性の例としては、植物細胞で発現されたときの、同じ株の野生型若しくは未改変ＨＡ又は改変（１若しくは複数）若しくは変異（１若しくは複数）を含まないインフルエンザの亜型と比べて増加したＨＡタンパク質の収率；野生型又は未改変ＨＡタンパク質と比べて、改変ＨＡタンパク質又は変異ＨＡタンパク質の向上した赤血球凝集価；上記変異（１若しくは複数）を含まない野生型ＨＡを含むＶＬＰの完全性、安定性若しくはその両方と比べて、上記改変されたＨＡタンパク質からなるＶＬＰの向上した完全性、安定性、若しくは完全性及び安定性の両方；植物細胞で発現されたときの、改変（１若しくは複数）又は変異（１若しくは複数）を含まない野生型のＶＬＰ産生レベルと比べて増加したＶＬＰ収率；並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
１つの態様では、位置５２４及び／又は５２８（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング）のシステイン残基又はアラインメントによって決定されるこれらの位置に等価な残基がこれらの位置において非システイン残基に置換されている改変Ｈ３ ＨＡが提供される。例えば、位置５２４のシステイン残基はセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）又はセリンの保存的置換で置換されていてもよく、又は位置５２８のシステインはロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換で置換されていてもよい。
さらには、位置５２４及び５２８（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング、配列番号９２）の２つシステイン間の配列も改変されてもよい。例えば、配列「Ｃ５２４Ｘ５２５Ｘ５２６Ｘ５２７Ｃ５２８」において、Ｃ５２４（位置５２４）はセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）又はセリンの保存的置換で置換されてもよく、Ｘ５２５（位置５２５）がロイシンではない場合、残基Ｘ５２５はロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換で置き換えられてもよく、Ｘ５２６（位置５２６）がバリンではない場合、Ｘ５２６はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）又はバリンの保存的置換で置き換えられてもよく、Ｘ５２７（位置５２７）がロイシンではない場合、位置Ｘ５２７の残基はロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換置き換えられてもよく、Ｃ５２８（位置５２８）はロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換で置換されてもよい。例えば、１つの実施形態では、位置５２４～５２８の配列「ＣＦＬＬＣ」は配列「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）で置き換えられてもよい。
位置５２４及び／若しくは５２８のシステイン残基又はアラインメントによって決定されるこれらの位置に等価な残基を有するＨ３インフルエンザ以外の他の株由来のＨＡタンパク質も、本明細書中に記載されるように改変されてよい。例えば、Ｈ３ ＨＡの位置５２４及び／又は５２８に等価な位置にシステイン残基を有するインフルエンザＢ株由来のＨＡタンパク質は、本明細書中に記載される非システイン残基へと改変されてもよい。
本明細書に記載される膜貫通ドメインの変異に加えて、改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、位置３８２、３８４、３９２、及び／又は４３１におけるアミノ酸の１以上の置換をさらに含んでもよく、この置換は、上記改変されたＨＡ３タンパク質、又は改変されたＨＡタンパク質を使用して産生されたＶＬＰの改善された特徴をもたらした。類似の特性を持つアミノ酸がその同一の位置のそのアミノ酸の代わりに用いられてもよいと当業者なら理解するとおり、この改善された特徴は特定された部位における特定のアミノ酸を置換することに限定されないということを理解されたい。
従って、本明細書に記載される改変Ｈ３ ＨＡタンパク質又は変異体Ｈ３ ＨＡタンパク質は、基準株Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４（配列番号９２；図１を参照）の位置３８２、３８４、３９２、４３１、５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８との配列アラインメントにおける任意の１以上の残基において１以上の変異、又は改変を含んでもよい。それゆえ、アミノ酸位置３８２、３８４、３９２、４３１、５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８のうちの１以上（このようなアミノ酸ナンバリングは図１に示されるＨ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４の配列（配列番号９２）に基づく）において、又は、例えばＨＡアミノ酸配列を配列番号９２に対してアラインメントすることによって決定される場合のそのようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において改変又は変異を含むインフルエンザＨ３ ＨＡポリペプチド、タンパク質、及び／又は例えばウイルス様粒子（ＶＬＰ）等のタンパク質複合体が提供される。このような変異のうちの１以上を含むインフルエンザＨ３ ＨＡアミノ酸配列の非限定的な例としては、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７が挙げられる。
本明細書中に記載される改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３由来のＨＡをコードするアミノ酸配列（配列番号９１～配列番号９７）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を持つＨ３ ＨＡタンパク質を含み、このアミノ酸配列は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡ（配列番号９２）の位置３８２、３８４、３９２、４３１、５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８との配列アラインメントにおける任意の１以上の残基において１以上の変異、又は改変を有する。
さらには、このＨ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３由来のＨＡ（Ｈ３株の配列番号９１～配列番号９７の配列）をコードするヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するヌクレオチド配列によってコードされてもよく、このＨ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡ（配列番号９２）の位置３８２、３８４、３９２、４３１、５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８との配列アラインメントにおける任意の１以上の残基において１以上の変異、又は改変を有し、上記ヌクレオチド配列は、発現されたときにＶＬＰを形成するヘマグルチニンタンパク質をコードする。
上記Ｈ３ ＨＡが由来してもよい株の非限定的な例は、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９１）；Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９２）；Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９３）；Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９４）；Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／１５（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９５）；Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９６）及びＡ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１６／１６（Ｈ３Ｎ２）（配列番号９７）である。
位置５２４～５２８（ＣｙｓＴＭ）及び３８２における改変
別の態様では、位置３８２に改変された残基を有してもよく、かつ位置５２４及び／又は５２８（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング、配列番号９２）にシステイン残基を有するように改変されたものであってもよいＨ３ ＨＡが提供される。さらには、位置５２５、５２６及び／又は５２７（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング）の残基も改変されてもよい。
例えば、図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃに示されるように、位置５２４及び５２８のシステイン残基が非システインであるように改変され、位置３８２の残基がアスパラギンからアラニンへと改変されているＨ３ ＨＡは、野生型Ｈ３ ＨＡと比べて赤血球凝集価のおよそ２６０％上昇を導く。
従って、位置５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８における１以上の改変及び位置３８２における改変を含む改変Ｈ３ ＨＡタンパク質が提供される。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、少なくとも位置３８２、５２４及び５２８における改変を有する。
Ｈ３ ＨＡの位置３８２の残基は、非アスパラギンであるように改変されてもよい。例えば、位置３８２の残基は、疎水性アミノ酸、例えばアラニン又はアラニンの保存的置換、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であるように改変されてもよい。位置５２４の残基は非システイン、セリン又はセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）の保存的置換へと改変されてもよく、位置５２８の残基は非システイン、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換へと改変されてもよい。
例えば、上記改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は、位置３８２にアラニン（Ａ、Ａｌａ）又はアラニン（Ａ、Ａｌａ）の保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さず、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。アラニンの保存的置換は、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってもよい。位置５２４の非システインはセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）又はセリンの保存的置換であってよく、位置５２８の非システインはロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換であってよい。セリン（Ｓｅ、Ｓｅｒ）の保存的置換は、例えばトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）又はリジン（Ｌ、Ｌｙｓ）であってよい。ロイシンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってよい。
本明細書は、植物において活性な調節領域に作用可能に連結された、上記のとおりの位置３８２、５２４及び５２８に置換を有する改変Ｈ３ ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
例えば、上記ヌクレオチド配列は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８２にアラニン（Ａ、Ａｌａ）又はアラニン（Ａ、Ａｌａ）の保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。アラニンの保存的置換は、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってもよい。位置５２４の非システインはセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）又はセリンの保存的置換であってよく、位置５２８の非システインはロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換であってよい。セリン（Ｓｅ、Ｓｅｒ）の保存的置換は、例えばトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）又はリジン（Ｌ、Ｌｙｓ）であってよい。ロイシンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってよい。
上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０２のヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８２にアラニン（Ａ、Ａｌａ）又はアラニン（Ａ、Ａｌａ）の保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。アラニンの保存的置換は、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってもよい。
位置３８２、５２４及び５２８の残基に加えて、上記改変Ｈ３ ＨＡは、さらなる残基が改変されていてもよい。例えば、位置３８４、５２５、５２６及び５２７における１以上の残基が改変されてもよい。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、位置３８２、５２４、５２８における置換された残基及び位置３８４、５２５、５２６、５２７又はこれらの組み合わせにおける１以上の置換を有してもよい。
さらには、上記の少なくとも位置３８２、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置３８４、５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における産生方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
加えて、上記のとおりの少なくとも位置３８２、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置３８４、５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における収率を高める方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
本明細書は、少なくとも位置３８２、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置３８４、５２５、５２６、５２７における置換を有するＨ３ ＨＡを含むＶＬＰをさらに提供する。このＶＬＰは、本明細書によって提供される方法によって産生されてもよい。上記改変Ｈ３ ＨＡを含む当該ＶＬＰは、未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質を含むＶＬＰと比べて改善された特性を示す。
位置５２４～５２８（ＣｙｓＴＭ）及び３８４における改変
別の態様では、位置３８４に改変された残基を有してもよく、かつ位置５２４及び５２８（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング、配列番号９２）にシステイン残基を有さないように改変されてもよいＨ３ ＨＡが提供される。さらには、位置５２５、５２６及び／又は５２７（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング）の残基も改変されてもよい。
例えば、図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃに示されるように、位置５２４及び５２８のシステイン残基が非システイン残基であるように改変され、位置３８４の残基がロイシンからバリンへと改変されているＨ３ ＨＡは、野生型Ｈ３ ＨＡと比べて赤血球凝集価のおよそ２７０％上昇を導く。
従って、位置５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８における１以上の改変及び位置３８４における改変を含む改変Ｈ３ ＨＡタンパク質が提供される。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、少なくとも位置３８４、５２４及び５２８における改変を有する。
Ｈ３ ＨＡの位置３８４の残基は、非ロイシンであるように改変されてもよい。例えば、位置３８４の残基は、別の疎水性アミノ酸、例えばバリン又はバリンの保存的置換、例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン又はトレオニンに改変されてもよい。
例えば、上記改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は、位置３８４にバリン又はバリンの保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さず、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。バリンの保存的置換は、例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン又はトレオニンであってもよい。
本明細書は、植物において活性な調節領域に作用可能に連結された、上記のとおりの位置３８４、５２４及び５２８に置換を有する改変Ｈ３ ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
例えば、上記ヌクレオチド配列は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８４にバリン又はバリンの保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在しない。上記保存的置換は、例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン又はトレオニンであってもよい。
上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０２のヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８４にバリン又はバリンの保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。バリンの保存的置換は、例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン又はトレオニンであってもよい。
位置３８４、５２４及び５２８の残基に加えて、上記改変Ｈ３ ＨＡは、さらなる残基が改変されていてもよい。例えば、位置３８２、５２５、５２６及び５２７における１以上の残基が改変されてもよい。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、位置３８４、５２４、５２８における置換された残基及び位置３８２、５２５、５２６、５２７又はこれらの組み合わせにおける１以上の置換を有してもよい。
さらには、上記の少なくとも位置３８４、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置３８２、５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における産生方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
加えて、上記のとおりの少なくとも位置３８４、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置３８２、５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における収率を高める方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
本明細書は、少なくとも位置３８４、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置３８２、５２５、５２６、５２７における置換を有するＨ３ ＨＡを含むＶＬＰをさらに提供する。このＶＬＰは、本明細書によって提供される方法によって産生されてもよい。上記改変Ｈ３ ＨＡを含む当該ＶＬＰは、未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質を含むＶＬＰと比べて改善された特性を示す。
位置５２４～５２８（ＣｙｓＴＭ）及び３９２における改変
別の態様では、位置３９２に改変された残基を有してもよく、かつ位置５２４及び５２８（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング、配列番号９２）にシステイン残基を有さなくてもよいＨ３ ＨＡが提供される。さらには、位置５２５、５２６及び／又は５２７（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング）の残基も改変されてもよい。
例えば、図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、位置５２４及び５２８のシステイン残基がシステインではないように改変され、位置３９２の残基がフェニルアラニンからアスパラギン酸へと改変されているＨ３ ＨＡは、野生型Ｈ３ ＨＡと比べて赤血球凝集価の２００％～２７０％上昇を導く。
従って、位置５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８における１以上の改変及び位置３９２における改変を含む改変Ｈ３ ＨＡタンパク質が提供される。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、少なくとも位置３９２、５２４及び５２８における改変を有する。
Ｈ３ ＨＡの位置３９２の残基は、非フェニルアラニンであるように改変されてもよい。例えば、位置３９２の残基は、電荷を帯びたアミノ酸、例えばアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換、例えばグルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はセリンに改変されてもよい。
例えば、上記改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は、位置３９２にアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さず、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。アスパラギン酸の保存的置換は、例えばグルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はセリンであってよい。位置５２４の非システインはセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）又はセリンの保存的置換であってよく、位置５２８の非システインはロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換であってよい。セリン（Ｓｅ、Ｓｅｒ）の保存的置換は、例えばトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）又はリジン（Ｌ、Ｌｙｓ）であってよい。ロイシンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってよい。
本明細書は、植物において活性な調節領域に作用可能に連結された、上記のとおりの位置３９２、５２４及び５２８に置換を有する改変Ｈ３ ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
例えば、上記ヌクレオチド配列は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３９２にアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。上記保存的置換は、例えばグルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はセリンであってよい。
上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０２のヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３９２にアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。上記保存的置換は、例えばグルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はセリンであってよい。
位置３９２、５２４及び５２８の残基に加えて、上記改変Ｈ３ ＨＡは、さらなる残基が改変されていてもよい。例えば、位置５２５、５２６及び５２７における１以上の残基 が改変されてもよい。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、位置３９２、５２４、５２８における置換された残基及び位置５２５、５２６、５２７又はこれらの組み合わせにおける１以上の置換を有してもよい。
さらには、上記の少なくとも位置３９２、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における産生方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
加えて、上記のとおりの少なくとも位置３９２、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における収率を高める方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
本明細書は、少なくとも位置３９２、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置５２５、５２６、５２７における置換を有するＨ３ ＨＡを含むＶＬＰをさらに提供する。このＶＬＰは、本明細書によって提供される方法によって産生されてもよい。上記改変Ｈ３ ＨＡを含む当該ＶＬＰは、未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質を含むＶＬＰと比べて改善された特性を示す。
位置５２４～５２８（ＣｙｓＴＭ）及び４３１における改変
別の態様では、位置４３１に改変された残基を有してもよく、かつ位置５２４及び５２８（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング、配列番号９２）にシステイン残基を有さなくてもよいＨ３ ＨＡが提供される。さらには、位置５２５、５２６及び／又は５２７（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング）の残基も改変されてもよい。
例えば、図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、位置５２４及び５２８のシステイン残基がシステインではないように改変され、位置４３１の残基がロイシンからメチオニンへと改変されているＨ３ ＨＡは、野生型Ｈ３ ＨＡと比べて赤血球凝集価のおよそ２５０％上昇を導く。
従って、位置５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８における１以上の改変及び位置４３１における改変を含む改変Ｈ３ ＨＡタンパク質が提供される。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、少なくとも位置４３１、５２４及び５２８における改変を有する。
Ｈ３ ＨＡの位置４３１の残基は、非ロイシンであるように改変されてもよい。例えば、位置４３１の残基は、メチオニン又はメチオニンの保存的置換、例えばロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン、又はフェニルアラニンであるように改変されてもよい。
例えば、上記改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は、位置４３１にメチオニン又はメチオニンの保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さず、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。メチオニンの保存的置換は、例えばロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン、又はフェニルアラニンであってよい。位置５２４の非システインはセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）又はセリンの保存的置換であってよく、位置５２８の非システインはロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換であってよい。セリン（Ｓｅ、Ｓｅｒ）の保存的置換は、例えばトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）又はリジン（Ｌ、Ｌｙｓ）であってよい。ロイシンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってよい。
本明細書は、植物において活性な調節領域に作用可能に連結された、上記のとおりの位置４３１、５２４及び５２８に置換を有する改変Ｈ３ ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
例えば、上記ヌクレオチド配列は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置４３１にメチオニン又はメチオニンの保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。上記保存的置換は、例えばロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン、又はフェニルアラニンであってよい。
上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０２のヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置４３１にメチオニン又はメチオニンの保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。上記保存的置換は、例えばロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン、又はフェニルアラニンであってよい。
位置４３１、５２４及び５２８の残基に加えて、上記改変Ｈ３ ＨＡは、さらなる残基が改変されていてもよい。例えば、位置５２５、５２６及び５２７における１以上の残基が改変されてもよい。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、位置４３１、５２４、５２８における置換された残基及び位置５２５、５２６、５２７又はこれらの組み合わせにおける１以上の置換を有してもよい。
さらには、上記の少なくとも位置４３１、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における産生方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
加えて、上記のとおりの少なくとも位置４３１、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における収率を高める方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
本明細書は、少なくとも位置４３１、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置５２５、５２６、５２７における置換を有するＨ３ ＨＡを含むＶＬＰをさらに提供する。このＶＬＰは、本明細書によって提供される方法によって産生されてもよい。上記改変Ｈ３ ＨＡを含む当該ＶＬＰは、未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質を含むＶＬＰと比べて改善された特性を示す。
位置５２４～５２８（ＣｙｓＴＭ）、３８２及び３８４における改変
別の態様では、位置３８２及び３８４に改変された残基を有してもよく、かつ位置５２４及び５２８（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング、配列番号９２）にシステイン残基を有さなくてもよいＨ３ ＨＡが提供される。さらには、位置５２５、５２６及び／又は５２７（Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４ナンバリング）の残基も改変されてもよい。
例えば図７Ｅに示されるように、位置５２４及び５２８のシステイン残基が非システインであるように改変され、位置３８２の残基がアスパラギンからアラニンへと改変され、位置３８４の残基がロイシンからバリンへと改変されているＨ３ ＨＡは、野生型Ｈ３ ＨＡと比べて赤血球凝集価のおよそ４００％～５００％上昇を導く。
従って、位置５２４、５２５、５２６、５２７又は５２８における１以上の改変並びに位置３８２及び３８４における改変を含む改変Ｈ３ ＨＡタンパク質が提供される。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、少なくとも位置３８２、３８４、５２４及び５２８における改変を有する。
Ｈ３ ＨＡの位置３８２の残基は、非アスパラギンであるように改変されてもよい。例えば、位置３８２の残基は、疎水性アミノ酸、例えばアラニン又はアラニンの保存的置換、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であるように改変されてもよい。Ｈ３ ＨＡの位置３８４の残基は、非ロイシンであるように改変されてもよい。例えば、位置３８４の残基は、別の疎水性アミノ酸、例えばバリン又はバリンの保存的置換、例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン又はトレオニンに改変されてもよい。
例えば、上記改変Ｈ３ ＨＡタンパク質は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡのアミノ酸配列（配列番号９２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有するアミノ酸配列を有してもよく、このアミノ酸配列は、位置３８２にアラニン（Ａ、Ａｌａ）又はアラニン（Ａ、Ａｌａ）の保存的置換、位置３８４にバリン又はバリンの保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さず、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。アラニンの保存的置換は、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってもよい。バリンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）又はトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）であってよい。位置５２４の非システインはセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）又はセリンの保存的置換であってよく、位置５２８の非システインはロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換であってよい。セリン（Ｓｅ、Ｓｅｒ）の保存的置換は、例えばトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）又はリジン（Ｌ、Ｌｙｓ）であってよい。ロイシンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってよい。
本明細書は、植物において活性な調節領域に作用可能に連結された、上記のとおりの位置３８２、３８４、５２４及び５２８に置換を有する改変Ｈ３ ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
例えば、上記ヌクレオチド配列は、Ｈ３ Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／４８０１／１４由来のＨＡをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８２にアラニン（Ａ、Ａｌａ）又はアラニン（Ａ、Ａｌａ）の保存的置換、位置３８４にバリン又はバリンの保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。アラニンの保存的置換は、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってもよい。バリンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）又はトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）であってよい。位置５２４の非システインはセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）又はセリンの保存的置換であってよく、位置５２８の非システインはロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換であってよい。セリン（Ｓｅ、Ｓｅｒ）の保存的置換は、例えばトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）又はリジン（Ｌ、Ｌｙｓ）であってよい。ロイシンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってよい。
上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０２のヌクレオチド配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性、又は配列類似性を有してもよく、このヌクレオチド配列は、位置３８２にアラニン（Ａ、Ａｌａ）又はアラニン（Ａ、Ａｌａ）の保存的置換、位置３８４にバリン又はバリンの保存的置換を有し、位置５２４及び５２８にシステイン残基を有さない改変Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードし、この配列は天然には存在せず、このＨＡは、発現されたときにＶＬＰを形成する。アラニンの保存的置換は、例えばセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってもよい。バリンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）又はトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）であってよい。位置５２４の非システインはセリン（Ｓ、Ｓｅｒ）又はセリンの保存的置換であってよく、位置５２８の非システインはロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）又はロイシンの保存的置換であってよい。セリン（Ｓｅ、Ｓｅｒ）の保存的置換は、例えばトレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）又はリジン（Ｌ、Ｌｙｓ）であってよい。ロイシンの保存的置換は、例えばイソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、又はバリン（Ｖ、Ｖａｌ）であってよい。
位置３８２、３８４、５２４及び５２８の残基に加えて、上記改変Ｈ３ ＨＡは、さらなる残基が改変されていてもよい。例えば、位置５２５、５２６及び５２７における１以上の残基が改変されてもよい。非限定的な例では、この改変Ｈ３ ＨＡは、位置３８２、３８４、５２４、５２８における置換された残基及び位置５２５、５２６、５２７又はこれらの組み合わせにおける１以上の置換を有してもよい。
さらには、上記の少なくとも位置３８２、３８４、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における産生方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
加えて、上記のとおりの少なくとも位置３８２、３８４、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置５２５、５２６、５２７における置換を有する改変Ｈ３ ＨＡを含むＶＬＰの、植物における収率を高める方法が提供される。当該方法は、上記植物において活性な調節領域に作用可能に連結された改変Ｈ３ ＨＡをコードする核酸を、上記植物、又は上記植物の一部分に導入する工程と、上記植物又は上記植物の一部分を、上記核酸の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより上記ＶＬＰを産生する工程とを伴う。
本明細書は、少なくとも位置３８２、３８４、５２４及び５２８における置換、並びに任意に位置５２５、５２６、５２７における置換を有するＨ３ ＨＡを含むＶＬＰをさらに提供する。このＶＬＰは、本明細書によって提供される方法によって産生されてもよい。上記改変Ｈ３ ＨＡを含む当該ＶＬＰは、未改変Ｈ３ ＨＡタンパク質を含むＶＬＰと比べて改善された特性を示す。
植物における変異体インフルエンザＨＡを含むＶＬＰの産生又は収率を増加させる方法も本明細書に提示される。例えば、１つの方法は、本明細書に記載される変異体インフルエンザＨＡをコードする核酸を、その植物、植物の一部分、又は植物細胞に導入する工程を伴ってよい。この変異体インフルエンザＨＡをコードする核酸は、ヒトのコドン使用頻度、増加したＧＣ含有量、又はこれらの組み合わせについて最適化されてもよい。１以上の変異体インフルエンザＨＡタンパク質を含むＶＬＰを産生するために、１以上の変異体インフルエンザＨＡタンパク質が、植物、植物の一部分、又は植物細胞において発現されてもよい。あるいは、この方法は、１以上の変異体インフルエンザＨＡタンパク質を含むＶＬＰを産生するために、変異体インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸を含む植物、植物の一部分、又は植物細胞を準備する工程を含んでもよい。
上記変異体インフルエンザＨＡを含むＶＬＰの産生方法は、第２核酸配列を上記植物、植物の一部分、又は植物細胞に導入する工程であって、この第２核酸は、上記変異体インフルエンザＨＡとともに共発現されるプロトンチャネルタンパク質をコードする工程をさらに備えてもよい。例えば、このプロトンチャネルタンパク質は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ Ｍ２等のインフルエンザＡ亜型Ｍ２タンパク質であってもよい。プロトンチャネルタンパク質の共発現は、例えば参照により本明細書に援用したものとする国際公開第２０１３／０４４３９０号パンフレットに記載されるように、変異体インフルエンザＨＡタンパク質及び／又はこの変異体インフルエンザＨＡタンパク質を含むＶＬＰの蓄積の増加につながる可能性がある。
さらには、この変異体インフルエンザＨＡは、参照により本明細書に援用したものとする国際公開第２０１３／０４４３９０号パンフレット及び国際公開第２０１４／１５３６７４号パンフレットに記載されているような改変されたタンパク質分解性ループ又は切断部位をさらに含んでもよい。
「共発現」は、２以上のヌクレオチド配列の導入及び発現であって、その２以上のヌクレオチド配列の各々が植物、植物の一部分又は植物細胞の中で目的のタンパク質、又は目的のタンパク質の断片をコードすることを意味する。この２以上のヌクレオチド配列は、１つのベクター内で植物、植物の一部分又は植物細胞に導入されてもよく、この場合、この２以上のヌクレオチド配列の各々は別々の調節領域（例えば、二重構築物を含む）の制御下にある。あるいは、この２以上のヌクレオチド配列は、各ベクターが対応する核酸の発現のための適切な調節領域を含む別々のベクター（例えば、単一の構築物を含む）内で植物、植物の一部分又は植物細胞に導入されてもよい。例えば、各々が別々のベクター上にあり別々のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主に導入される２つのヌクレオチド配列が、減圧インフィルトレーション法の前に各Ａ．ツメファシエンス宿主の懸濁液を所望の体積（例えば、等体積、又は各Ａ．ツメファシエンス宿主の比は変えられてもよい）で混合することにより、共発現されてもよい。このようにして、複数のＡ．ツメファシエンス懸濁液の共インフィルトレーションにより、複数の導入遺伝子の共発現が可能にされる。
本明細書に記載される変異体インフルエンザＨＡをコードする核酸は、植物、植物の一部分、又は植物細胞における上記変異体インフルエンザＨＡの発現を高める配列をさらに含んでもよい。発現を高める配列は、変異体インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸と連動しているササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）エンハンサーエレメントを含んでもよい。
本明細書に記載される、改変されたインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるＨＡタンパク質の発現を高める配列をさらに含んでもよい。発現を高める配列は、改変されたインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードする核酸と連動しているＣＰＭＶエンハンサーエレメント、又は植物由来の発現エンハンサーを含んでもよい。改変されたインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）をコードする配列は、ヒトのコドン使用頻度、増加したＧＣ含有量、又はこれらの組み合わせについても最適化されてよい。
用語「ＣＰＭＶエンハンサーエレメント」は、本明細書で使用する場合、当該技術分野で公知のように、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２ポリペプチド又は改変ＣＰＭＶ配列を調節する５’ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列を指す。例えば、ＣＰＭＶエンハンサーエレメント又はＣＰＭＶ発現エンハンサーは、国際公開第２０１５／１４３６７号パンフレット；国際公開第２０１５／１０３７０４号パンフレット；国際公開第２００７／１３５４８０号パンフレット；国際公開第２００９／０８７３９１号パンフレット；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．、及びＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．、（２００８、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４８：１２１２－１２１８頁）に記載されるヌクレオチド配列を含む。これらの文献の各々は、参照により本明細書に援用したものとする。ＣＰＭＶエンハンサー配列は、それらが結合する下流の異種性のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を高めることができる。ＣＰＭＶ発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ ＨＴ、ＣＰＭＶＸ（Ｘ＝１６０、１５５、１５０、１１４である）、例えば、ＣＰＭＶ １６０、ＣＰＭＶＸ＋（Ｘ＝１６０、１５５、１５０、１１４である）、例えば、ＣＰＭＶ １６０＋、ＣＰＭＶ－ＨＴ＋、ＣＰＭＶ ＨＴ＋［ＷＴ１１５］、又はＣＰＭＶ ＨＴ＋［５１１］（参照により本明細書に援用したものとする国際公開第２０１５／１４３５６７号パンフレット；国際公開第２０１５／１０３７０４号パンフレット）を含んでもよい。ＣＰＭＶ発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ発現エンハンサー配列及び目的のヌクレオチド配列と作用可能に連結されている調節領域を含む植物発現系内で使用されてもよい。
用語「ＣＰＭＶエンハンサーエレメント」は、本明細書で使用する場合、当該技術分野で公知のように、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２ポリペプチド又は改変ＣＰＭＶ配列を調節する５’ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列を指す。例えば、ＣＰＭＶエンハンサーエレメント又はＣＰＭＶ発現エンハンサーは、国際公開第２０１５／１４３６７号パンフレット；国際公開第２０１５／１０３７０４号パンフレット；国際公開第２００７／１３５４８０号パンフレット；国際公開第２００９／０８７３９１号パンフレット；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．、及びＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．、（２００８、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４８：１２１２－１２１８頁）に記載されるヌクレオチド配列を含む。これらの文献の各々は、参照により本明細書に援用したものとする。ＣＰＭＶエンハンサー配列は、それらが結合する下流の異種性のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を高めることができる。ＣＰＭＶ発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ ＨＴ、ＣＰＭＶＸ、ＣＰＭＶＸ＋、ＣＰＭＶ－ＨＴ＋、ＣＰＭＶ ＨＴ＋［ＷＴ１１５］、又はＣＰＭＶ ＨＴ＋［５１１］（参照により本明細書に援用したものとする国際公開第２０１５／１４３６７号パンフレット；国際公開第２０１５／１０３７０４号パンフレット）を含んでもよい。ＣＰＭＶ発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ発現エンハンサー配列及び目的のヌクレオチド配列と作用可能に連結されている調節領域を含む植物発現系内で使用されてもよい。
用語「５’ＵＴＲ」又は「５’非翻訳領域」又は「５’リーダー配列」は、翻訳されないｍＲＮＡの領域を指す。５’ＵＴＲは、典型的には転写開始点で始まり、コード領域の翻訳開始部位又は開始コドンの直前で終わる。５’ＵＴＲは、ｍＲＮＡ転写物の安定性及び／又は翻訳を調節してもよい。
用語「植物由来の発現エンハンサー」は、本明細書で使用する場合、植物から得られるヌクレオチド配列であって、５’ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列を指す。植物由来の発現エンハンサーの例は、米国仮特許出願第６２／６４３，０５３号（２０１８年３月１４日出願。この出願を参照により本明細書に援用したものとする）又はＤｉａｍｏｓ Ａ．Ｇ．ら（２０１６、Ｆｒｏｎｔ Ｐｌｔ Ｓｃｉ． ７：１－１５；この文献を参照により本明細書に援用したものとする）に記載されている。この植物由来の発現エンハンサーは、米国仮特許出願第６２／６４３，０５３号に記載されるｎｂＭＴ７８、ｎｂＡＴＬ７５、ｎｂＤＪ４６、ｎｂＣＨＰ７９、ｎｂＥＮ４２、ａｔＨＳＰ６９、ａｔＧＲＰ６２、ａｔＰＫ６５、ａｔＲＰ４６、ｎｂ３０Ｓ７２、ｎｂＧＴ６１、ｎｂＰＶ５５、ｎｂＰＰＩ４３、ｎｂＰＭ６４、及びｎｂＨ２Ａ８６から選択されてもよい。この植物由来の発現エンハンサーは、植物由来の発現エンハンサー配列及び目的のヌクレオチド配列と作用可能に連結されている調節領域を含む植物発現系内で使用されてもよい。
「作用可能に連結された」は、上記特定の配列が、核酸配列の発現の媒介又は調節等の意図された機能を実行するために、直接的又は間接的に相互作用することを意味する。作用可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作用可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介されてもよい。
１以上の変異体インフルエンザＨＡタンパク質が植物、植物の一部分、又は植物細胞において発現されるとき、その１以上の変異体インフルエンザＨＡタンパク質はＶＬＰへと自己組織化する。この植物、植物の一部分、又は植物細胞は、ＶＬＰの完全性を維持するための好適な抽出及び精製の条件下で回収されてもよく、この１以上の変異体インフルエンザＨＡを含むＶＬＰは精製されてもよい。
本発明は、対象においてインフルエンザ感染への免疫を誘導するための本明細書に記載される変異体インフルエンザＨＡ、又はこの変異体インフルエンザＨＡを含むＶＬＰの使用も提供する。その変異体インフルエンザＨＡ又は変異体インフルエンザＨＡを含むＶＬＰを対象又は宿主動物に投与することにより調製される抗体又は抗体断片も本明細書に開示される。対象において免疫応答を誘導するための、有効用量の本明細書に記載される変異体インフルエンザＨＡ又は変異体インフルエンザＨＡを含むＶＬＰと、薬学的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル、又は賦形剤とを含む組成物がさらに提供される。対象において免疫応答を誘導するためのワクチンであって、有効用量の上記変異体インフルエンザＨＡを含むワクチンも提供される。
対象においてインフルエンザ感染に対する免疫を誘導する方法であって、上記変異体インフルエンザＨＡ又は変異体インフルエンザＨＡを含むＶＬＰを対象に、経口で、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、又は皮下に投与する工程を備える方法も本明細書に提示される。
用語「インフルエンザウイルス」は、本明細書で使用する場合、マイナス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを有することを特徴とするオルソミクソウイルス科のエンベロープ型のウイルス株を指す。インフルエンザウイルスゲノムは、株に応じて１２～１４個のタンパク質をコードする８個の遺伝子セグメントを含む。
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つの型のインフルエンザウイルスがあり、このうちでインフルエンザＡ又はＢは、ヒトにおける季節性の疾患流行の原因生物である。インフルエンザＡは、ＨＡ及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質亜型の発現に基づいてさらに分類される。
用語「ヘマグルチニン」又は「ＨＡ」は、本明細書で使用する場合、インフルエンザウイルス粒子が標的細胞の表面上のシアル酸含有タンパク質に結合することを容易にして、標的細胞へのウイルスゲノムの放出を媒介する三量体レクチンを指す。１８個の異なるＨＡ亜型（Ｈ１～Ｈ１８）がある。ＨＡタンパク質は２つの構造要素を含む：血清防御抗体の一次標的である頭部；及び柄（茎）。ＨＡは、単一ポリペプチド、ＨＡ０（三量体として集合する）として翻訳され、これは、ＨＡ１（約４０ｋＤａ）サブドメインとＨＡ２（約２０ｋＤａ）サブドメインとの間でセリンエンドプロテアーゼによって切断される必要がある。切断後、この２つのジスルフィド結合タンパク質ドメインは、ウイルス感染力に必要な必須の構造を採る。
本明細書に開示されるインフルエンザＡ ＨＡタンパク質又は改変されたインフルエンザＡ ＨＡタンパク質には、任意の公知のインフルエンザＡ株由来の任意の公知のＨＡタンパク質が含まれるが、経時的に発生する公知のインフルエンザＡ株への改変物も含まれる。例えば、インフルエンザＨＡは、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１６／１６（Ｈ３Ｎ２）、又はＡ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）に由来してもよい。インフルエンザＡ ＨＡは、株に由来するＨＡであって、上に列挙されたインフルエンザＡ株に由来する任意のＨＡに約３０～１００％、又はこれらの間の任意の量のアミノ酸配列同一性を有するＨＡを含んでもよいが、ただしこのインフルエンザＨＡタンパク質は、本明細書中に記載される少なくとも１つの置換を含み、ＶＬＰを形成することができ、対象に投与されたときに免疫応答を誘導し、赤血球凝集反応を誘導するか、又はこれらの組み合わせを行う。
例えば、インフルエンザＨＡタンパク質は、上に列挙されたインフルエンザＡ株由来の任意のＨＡと３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、１００％、又はこれらの間の任意の量のアミノ酸配列同一性（配列類似性、パーセント同一性、パーセント類似性）を有してよく、かつ本明細書中に記載される少なくとも１つの置換を含み、ＶＬＰを形成することができ、対象に投与されたときに免疫応答を誘導し、赤血球凝集反応を誘導するか、又はこれらの組み合わせを行う。いくつかのインフルエンザＡ ＨＡドメインのアミノ酸配列アラインメントが図１に示されるが、これは限定するものと考えられるべきではない。
特定の配列に言及するとき、用語「パーセント類似性」、「配列類似性」、「パーセント同一性」、又は「配列同一性」は、例えば、ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ＧＣＧソフトウェアプログラムに示されるように、又は手作業によるアラインメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを参照）により使用される。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野で周知である。比較のための最適の配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２）を使用して、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアラインメントアルゴリズム（１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３）により、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法（１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４）により、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装品（例えば：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により実施することができる。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９７７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２）及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０は、本発明の核酸及びタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載されるパラメータを用いて使用される。例えば、（ヌクレオチド配列についての）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、１１のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４及び両方の鎖の比較を使用してよい。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ、及び１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）、及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照）アラインメント（Ｂ）、１０のｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用してよい。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照）を通して公的に入手可能である。
用語「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」は、本明細書で使用する場合、１以上のインフルエンザＨＡタンパク質を含み、かつインフルエンザゲノムのすべての部分を欠く複製しない非感染性のウイルスカプシド構造へと自己組織化するインフルエンザ粒子を指す。
植物におけるインフルエンザＨＡタンパク質の産生
インフルエンザＡ ＨＡタンパク質は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４（Ｈ３Ｎ２、配列番号９２）、Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５（Ｈ３Ｎ２、配列番号９３）、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６（Ｈ３Ｎ２、配列番号９４）、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５（Ｈ３Ｎ２、配列番号９１）、Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３（Ｈ３Ｎ２、配列番号９６）、Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１６／１６（Ｈ３Ｎ２、配列番号９７）、及びＡ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５（Ｈ３Ｎ２、配列番号９５）由来のインフルエンザＡ ＨＡ配列と約３０～約１００％、約４０～約１００％、約５０～約１００％、約６０～約１００％、約７０～約１００％、約８０～約１００％、約８５～約１００％、約９０～約１００％、９５～約１００％、若しくは約９７～約１００％、約９８～約１００％、若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性又は配列類似性を有するアミノ酸配列を含む任意のＨＡタンパク質を含むが、ただしこのインフルエンザＨＡタンパク質は、本明細書中に記載される少なくとも１つの置換を含み、ＶＬＰを形成することができ、対象に投与されたときに免疫応答を誘導し、赤血球凝集反応を誘導するか、又はこれらの組み合わせを行う。
さらには、上記改変されたインフルエンザＨＡタンパク質は、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０の配列の配列と約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、９５％～約１００％、若しくは約９７％～約１００％、約９８％～約１００％、若しくはこれらの間の任意の量の配列同一性又は配列類似性を有するアミノ酸配列を含む任意のＨＡタンパク質を含むが、ただしこのインフルエンザＨＡタンパク質は、本明細書中に記載される少なくとも１つの置換を含み、ＶＬＰを形成することができ、対象に投与されたときに免疫応答を誘導し、赤血球凝集反応を誘導するか、又はこれらの組み合わせを行う。
本明細書に記載されるように、インフルエンザＨＡにおける１以上の特定の変異又は改変は、野生型インフルエンザＨＡと比べて植物におけるＨＡタンパク質の増加した蓄積及び増加したＶＬＰ産生をもたらす。
植物における高められたインフルエンザＨＡ及び／又はＶＬＰ産生を有する変異体インフルエンザＡ ＨＡタンパク質の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４変異体Ｈ３（構築物番号３３４１、配列番号２１）、Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４変異体Ｈ３（構築物番号３３７５、配列番号２５）；ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５変異体Ｈ３（構築物番号３９１４、配列番号２７）；Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５変異体Ｈ３（構築物番号３９１５、配列番号３０）；ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６変異体Ｈ３（構築物番号３９２４、配列番号３３）；Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６変異体Ｈ３（構築物番号３９２５、配列番号３５）；Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５変異体Ｈ３（構築物番号３９０５、配列番号３９）；Ｎ３８２Ａ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０２３、配列番号８２）；Ｌ３８４Ｖ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０３４、配列番号８４）；Ｆ３９２Ｄ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０４５、配列番号４３；Ｌ４３１Ｍ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０２２、配列番号４７）；ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号２８１１、配列番号４９）；Ｎ３８２Ａ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０６３、配列番号５３）；Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０７４、配列番号５７）；Ｆ３９２Ｄ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０８５、配列番号５９）；及びＬ４３１Ｍ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０６２、配列番号６１）、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３（構築物番号３３１３、配列番号８６）、Ｎ３８２Ａ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３（構築物番号３３１４、配列番号８８）、及びＬ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３（構築物番号３３１５、配列番号９０）。
インフルエンザ感染に対する免疫の誘導
「免疫応答」は、一般に、対象の適応免疫系の応答を指す。この適応免疫系は、一般に、体液性応答、及び細胞媒介性応答を含む。体液性応答は、Ｂリンパ球系の細胞（Ｂ細胞）で産生される分泌された抗体によって媒介される免疫の態様である。分泌された抗体は、進入する微生物（ウイルス又は細菌等）の表面の抗原に結合し、これは破壊のために微生物に目印を付ける。体液性免疫は、一般に、抗体産生及びこれに付随するプロセス、並びにＴｈ２細胞活性化及びサイトカイン産生、記憶細胞生成、食作用のオプソニン促進、病原体脱離等を含む抗体のエフェクター機能を指すために使用される。用語「調節する」又は「調節」等は、一般に公知又は使用されるいくつかのアッセイのいずれかによって決定される特定の応答又はパラメータの増減を指し、このアッセイのうちのいくつかは本明細書中で例示される。
細胞媒介性応答は、抗体が関与せず、抗原に応答したマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球の活性化、及び種々のサイトカインの放出を伴う免疫応答である。細胞媒介性免疫は、いくつかのＴｈ細胞活性化、Ｔｃ細胞活性化及びＴ細胞媒介性応答を指すために一般に使用される。細胞媒介性免疫は、ウイルス感染への応答において特に重要である可能性がある。
例えば、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘導は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定されてもよく、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の刺激は、増殖アッセイを使用して測定されてもよい。抗インフルエンザＨＡ抗体価は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して数量化されてよく、抗原特異的又は交差反応性の抗体のアイソタイプも抗アイソタイプ抗体（例えば、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＥ又は抗ＩｇＭ）を使用して測定されてよい。このようなアッセイを実施するための方法及び技法は当該技術分野で周知である。
サイトカインの存在又はレベルも数量化されてよい。例えば、Ｔヘルパー細胞応答（Ｔｈ１／Ｔｈ２）は、ＥＬＩＳＡ（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＯｐｔＥＩＡキット）を使用するＩＦＮ－γ及びＩＬ－４分泌細胞の測定によって特徴づけられる。対象から得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又は脾細胞が培養されてもよく、上清が分析されてもよい。Ｔリンパ球も、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって、当該技術分野で公知のマーカー特異的な蛍光標識及び方法を使用して数量化されてもよい。
対象における免疫応答を特徴づけるためにマイクロ中和アッセイも行われてよい。例えば、Ｒｏｗｅら、１９７３の方法を参照。ウイルス中和価は、細胞のクリスタルバイオレット固定／着色後の溶菌斑の列挙（プラークアッセイ）；インビトロ培養物における細胞溶解の微視的な観察；及び２）インフルエンザウイルスのＥＬＩＳＡ及び分光光度法的な検出を含めたいくつかの方法で数量化されてもよい。
用語「エピトープ」（複数可）は、本明細書で使用する場合、抗体が特異的に結合する抗原の構造部分を指す。
植物が産生する野生型インフルエンザＨＡタンパク質若しくはＶＬＰ、又は変異体インフルエンザＨＡタンパク質若しくはＶＬＰの投与に応答して誘発される免疫応答は、例えばＢａｌｂ／Ｃマウスで観察されてもよい。動物から採取された血液に由来する血清試料が、Ｈ３特異的総ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体についてＥＬＩＳＡによって分析されてもよい。植物が産生した野生型インフルエンザＨＡ又は変異体インフルエンザＨＡタンパク質のいずれかで免疫されたマウスは、各処置群について血清においてＨＡ特異的ＩｇＧ抗体価を呈する可能性がある。
植物発現
本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的なＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔などを使用して植物細胞に導入されてもよい。そのような技術についての総説として、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＶＩＩＩ、４２１－４６３頁（１９８８）；Ｇｅｉｅｒｓｏｎ及びＣｏｒｅｙ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８８）；並びにＰｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第２版 ＤＴ．Ｄｅｎｎｉｓ、ＤＨ Ｔｕｒｐｉｎ、ＤＤ Ｌｅｆｅｂｒｖｒｅ、ＤＢ Ｌａｙｚｅｌｌ（編）、Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｙ、Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ． Ｌｏｎｄｏｎ、５６１－５７９頁（１９９７）のＭｉｋｉ及びＩｙｅｒ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓを参照。他の方法としては、直接的なＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、例えばプロトプラスト、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル又はウィスカーを使用する電気穿孔、及び減圧インフィルトレーション法が挙げられる。例えば、Ｂｉｌａｎｇら（１９９１、Ｇｅｎｅ １００：２４７－２５０）、Ｓｃｈｅｉｄら（１９９１、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２２８：１０４－１１２）、Ｇｕｅｒｃｈｅら（１９８７、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２：１１１－１１６）、Ｎｅｕｈａｕｓｅら（１９８７、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ７５：３０－３６）、Ｋｌｅｉｎら（２９８７、Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０－７３）；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９８４、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２９：１３５３）、Ｈｏｗｅｌｌら（１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９－１２３１）、ＤｅＢｌｏｃｋら（１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９１：６９４－７０１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９８８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ及びＺｉｅｌｉｎｓｋｉ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９８９）、国際公開第９２／０９６９６号パンフレット、国際公開第９４／００５８３号パンフレット、欧州特許出願公開第３３１０８３号明細書、欧州特許出願公開第１７５９６６号明細書、Ｌｉｕ及びＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（２００２、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ、１０５：３４３－３４８）、欧州特許出願公開第２９０３９５号明細書；国際公開第８７０６６１４号パンフレット；米国特許第４，９４５，０５０号明細書；米国特許第５，０３６，００６号明細書；及び米国特許第５，１００，７９２号明細書、１９９５年５月１０日出願の米国特許出願第０８／４３８，６６６号、及び１９９２年９月２５日出願の米国特許出願第０７／９５１，７１５号を参照（これらのすべてを、参照により本明細書に援用する）。
本発明の構築物を発現するために一過性発現の方法が使用されてもよい（Ｄ’Ａｏｕｓｔら、２００９、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、第４８３巻、４１－５０頁；Ｌｉｕ及びＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、２００２、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５：３４３－３４８を参照。これらを参照により本明細書に援用したものとする）。あるいは、Ｋａｐｉｌａら（１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １２２、１０１－１０８；これを参照により本明細書に援用したものとする）、又は国際公開第００／０６３４００号パンフレット、国際公開第００／０３７６６３号パンフレット（これらを参照により本明細書に援用したものとする）によって記載されている減圧に基づく一過性発現方法が使用されてもよい。これらの方法として、例えば、アグロイノキュレーション法（Ａｇｒｏ－ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）又はアグロインフィルトレーション法（Ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、シリンジインフィルトレーション法を挙げてもよいが、これらに限定されない。しかしながら、上記のように他の一過性の方法も使用されてよい。アグロイノキュレーション法、アグロインフィルトレーション法、又はシリンジインフィルトレーション法を用いると、所望の核酸を含むアグロバクテリウムの混合物は組織の細胞間隙、例えば葉、植物の地上部（茎、葉及び花を含む）、植物の他の部分（茎、根、花）、又は植物全体に入る。表皮を横切った後、アグロバクテリウムは、感染してｔ－ＤＮＡコピーを細胞に移す。このｔ－ＤＮＡはエピソームにより転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、感染細胞における目的のタンパク質の産生につながるが、しかしながら、核内部のｔ－ＤＮＡの継代は一過性である。
同じく本発明の一部と考えられるのは、本明細書に記載される一過性のタンパク質発現に好適なプラットフォーム植物として使用されてもよい、本発明の遺伝子構築物を含有する遺伝子導入の植物、植物細胞又は種子である。植物細胞から全体植物を再生する方法も当該技術分野で公知である（例えば、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ及びＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｆａｘ（Ｃｒｏｙ ＲＲＤ編） Ｏｘｆｏｒｄ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１２１－１４８頁のＰｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓを参照）。一般に、形質転換された植物細胞は適切な培地で培養され、この培地は抗生物質等の選択的な薬剤を含有してもよく、その場合は、形質転換された植物細胞の特定を容易にするために選択マーカーが使用される。カルスが形成すると、公知の方法に従って適切な植物ホルモンを用いることにより新芽形成を促進することができ、この新芽は植物の再生のための発根培地に移される。次いで、この植物は、種子から又は栄養繁殖技術を使用するかのいずれかによって、反復世代を確立するために使用されてもよい。遺伝子導入植物は、組織培養を使用しなくても生成することができる。安定的な形質転換、及びこれらの生物の再生のための方法は、当該技術分野で確立されており、当業者に公知である。利用できる技術は、Ｖａｓｉｌら（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、第Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ巻、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８４）、及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に総説されている。形質転換され再生された植物を得る方法は、本発明にとっては重要ではない。
植物、植物部分又は植物細胞が２以上の核酸構築物によって形質転換又は同時形質転換される場合、その核酸構築物は、核酸がプールされ、バクテリア細胞が形質移入されるように、単独の形質移入事象でアグロバクテリウムに導入されてもよい。あるいは、この構築物は連続的に導入されてもよい。この場合、第１の構築物が上記のようにアグロバクテリウムに導入され、この細胞が、単一に形質転換された細菌だけが成長できる選択的な条件下で（例えば、抗生物質の存在下で）増殖する。この第１の選択工程の後に、第２の核酸構築物が上記のアグロバクテリウムに導入されて、この細胞が、二重に形質転換された細菌だけが成長できる二重選択的な条件下で増殖する。二重に形質転換された細菌は、次いで、本明細書に記載されるように植物、植物の一部分又は植物細胞を形質転換するために使用されてもよいし、又は第３の核酸構築物を受け入れるためのさらなる形質転換工程に供されてもよい。
あるいは、植物、植物部分、又は植物細胞が２以上の核酸構築物によって形質転換又は同時形質転換される場合、その核酸構築物は、アグロバクテリウム細胞の混合物を植物、植物部分、又は植物細胞と同時インフィルトレーションすることにより植物に導入されてもよく、各アグロバクテリウム細胞は、その植物内に導入されるべき１以上の構築物を含んでもよい。インフィルトレーションの工程の間の植物、植物部分又は植物細胞の中での、構築物内の目的のヌクレオチド配列の相対的な発現レベルを変えるために、所望の構築物を含む種々のアグロバクテリウム個体群の濃度が変えられてもよい。
Figure 2024050651000004
Figure 2024050651000005
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。
実施例１：インフルエンザＨＡ構築物
インフルエンザＨＡ構築物を、当該技術分野で周知の技術を使用して製造した。例えば、野生型Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ ＨＡ、Ｎ３８２Ａ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３ ＨＡ及びＣｙｓＴＭ Ａ－Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ－９７１５２９３－１３を後述するようにクローニングした。他のＨ３ ＨＡ変異体を、同様の技術を使用して得た。ＨＡ配列プライマー、鋳型及び産物を実施例３（植物におけるインフルエンザＨＡ及びＶＬＰの産生）及び表４に記載する。
野生型及び変異型のＨＡタンパク質、プライマー、鋳型及び産物のまとめを下記表４に提供する。Ｍ２なしで１１９０クローニングベクターにクローニングしたＨ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ ＨＡタンパク質以外のインフルエンザＨ３構築物については、使用したクローニングベクターは、２Ｘ３５Ｓプロモーター／ＣＰＭＶ １６０＋ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセットに加えて、アルファルファプラストシアニンプロモーター及びターミネーターの制御下のインフルエンザＭ２イオンチャネル遺伝子を組み込む。プラスミド番号３５５６（配列番号６６；図５Ａ）は、ＳａｃＩＩ及びＳｔｕＩ制限酵素を用いて消化し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応のために使用した。
Ｈ３ ＨＡの改変
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＰＤＩＳＰ－ＨＡ０ Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ－９７１５２９３－１３／ＮＯＳ（構築物番号２８０１）
アルファルファＰＤＩ分泌シグナルペプチド（ＰＤＩＳＰ）に融合したＨ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３由来のインフルエンザＨＡからの成熟ＨＡ０をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＮＯＳ発現系にクローニングした。ＰＤＩＳＰ－Ｈ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３コード配列を含有する断片を、ＰＤＩＳＰ－Ｈ１ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３遺伝子配列（配列番号９）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ－ＣＰＭＶ（ｆｌ５’ＵＴＲ）＿ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号１５）及びＩＦ－Ｈ３Ａ－Ａｌａ．ｒ（配列番号１７）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クロンテック）、マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）、カリフォルニア州）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号１１９０（図５Ｂ）をＳａｃＩＩ及びＳｔｕＩ制限酵素を用いて消化し、直線化プラスミドをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ組立反応のために使用した。構築物番号１１９０は、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＮＯＳベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングを意図したアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーター及びターミネーター下のサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。骨格（主鎖）はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ－ＤＮＡ境界の配列を配列番号６２に提示する。得られた構築物を番号２８０１（配列番号１０３）とした。アルファルファＰＤＩ分泌シグナルペプチド（ＰＤＩＳＰ）に融合したＡ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３由来のインフルエンザＨＡからの成熟ＨＡ０のアミノ酸配列を配列番号１０に提示する。プラスミド２８０１の表示を図８Ｊに提示する。
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＰＤＩＳＰ－ＨＡ０ Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ－９７１５２９３－１３（Ｎ３８２Ａ）／ＮＯＳ（構築物番号３０２３）
アルファルファＰＤＩ分泌シグナルペプチド（ＰＤＩＳＰ）に融合したＡ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３（Ｎ３８２Ａ）由来のインフルエンザＨＡからの成熟ＨＡ０をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＮＯＳ発現系にクローニングした。ＰＣＲの第１ラウンドで、変異したＮ３８２Ａアミノ酸を有するＰＤＩＳＰ－Ｈ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３を含有する断片を、ＰＤＩＳＰ－Ｈ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３遺伝子配列（配列番号９）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ－ＣＰＭＶ（ｆｌ５’ＵＴＲ）＿ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号１５）及びＨ３＿Ｓｗｉ（Ｎ３８２Ａ）．ｒ（配列番号５０）を使用して増幅した。Ｈ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３の残部と共にＮ３８２Ａ変異を含有する第２断片を、ＰＤＩＳＰ－Ｈ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３遺伝子配列（配列番号９）を鋳型として使用して、Ｈ３＿Ｓｗｉ（Ｎ３８２Ａ）．ｃ（配列番号５１）及びＩＦ－Ｈ３Ａ－Ａｌａ．ｒ（配列番号１７）を使用して増幅した。次いで、両方の増幅からのＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ－ＣＰＭＶ（ｆｌ５’ＵＴＲ）＿ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号１５）及びＩＦ－Ｈ３Ａ－Ａｌａ．ｒ（配列番号１７）をプライマーとして使用する増幅の第２ラウンドのための鋳型として使用した。最終のＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号１１９０（図５Ｂ）をＳａｃＩＩ及びＳｔｕＩ制限酵素を用いて消化し、直線化プラスミドをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ組立反応のために使用した。構築物番号１１９０は、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＮＯＳベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングを意図したアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーター及びターミネーター下のサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ－ＤＮＡ境界の配列を配列番号６２に提示する。得られた構築物を番号３０２３（配列番号１０４）とした。変異ＰＤＩＳＰ－Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ－９７１５２９３－１３（Ｎ３８２Ａ）のアミノ酸配列を配列番号８２に提示する。プラスミド３０２３の表示を図４Ｃに提示する。
２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＰＤＩＳＰ－ＨＡ０ Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ－９７１５２９３－１３（ＣｙｓＴＭ）／ＮＯＳ（構築物番号２８１１）
アルファルファＰＤＩ分泌シグナルペプチド（ＰＤＩＳＰ）に融合したＡ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３（ＣｙｓＴＭ）由来のインフルエンザＨＡからの成熟ＨＡ０をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＮＯＳ発現系にクローニングした。ＰＣＲの第１ラウンドで、変異したＣｙｓＴＭアミノ酸を有するＰＤＩＳＰ－Ｈ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３を含有する断片を、ＰＤＩＳＰ－Ｈ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３遺伝子配列（配列番号９）を鋳型として使用して、プライマーＩＦ－ＣＰＭＶ（ｆｌ５’ＵＴＲ）＿ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号１５）及びＨ３＿Ｓｗｉ＿ＳＬＶＬＬ．ｒ（配列番号１８）を使用して増幅した。Ｈ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３の残部と共にＣｙｓＴｍ変異を含有する第２断片を、ＰＤＩＳＰ－Ｈ３ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３遺伝子配列（配列番号９）を鋳型として使用して、Ｈ３＿Ｓｗｉ＿ＳＬＶＬＬ．ｃ（配列番号１９）及びＩＦ－Ｈ３Ａ－Ａｌａ．ｒ（配列番号１７）を使用して増幅した。次いで、両方の増幅からのＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ－ＣＰＭＶ（ｆｌ５’ＵＴＲ）＿ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号１５）及びＩＦ－Ｈ３Ａ－Ａｌａ．ｒ（配列番号１７）をプライマーとして使用する増幅の第２ラウンドのための鋳型として使用した。最終のＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号１１９０（図５Ｂ）をＳａｃＩＩ及びＳｔｕＩ制限酵素を用いて消化し、直線化プラスミドをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ組立反応のために使用した。構築物番号１１９０は、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ １６０／ＮＯＳベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングを意図したアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーター及びターミネーター下のサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ－ＤＮＡ境界の配列を配列番号６２に提示する。得られた構築物を番号２８１１（配列番号１０５）とした。変異ＰＤＩＳＰ－Ｈ３ Ａ－Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ－９７１５２９３－１３（ＣｙｓＴＭ）のアミノ酸配列を配列番号４９に提示する。プラスミド２８１１の表示を図８Ｋに提示する。
実施例２：方法
アグロバクテリウム・ツメファシエンス形質移入
アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１を、Ｄ’Ａｏｕｓｔら、２００８（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ． ６：９３０－４０）によって記載されている方法を使用して、野生型インフルエンザＨＡ又は変異体インフルエンザＨＡ発現ベクターを用いて電気穿孔によって形質移入した。形質移入したアグロバクテリウムを、１０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭ アセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌ カナマイシン及び２５μｇ／ｍｌのカルベニシリン、ｐＨ５．６を添加したＹＥＢ培地の中で０．６～１．６のＯＤ６００まで増殖させた。使用前にアグロバクテリウム懸濁液を遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．６）に再懸濁した。
植物バイオマスの調製、接種及びアグロインフィルトレーション
ベンサミアナタバコ植物を、市販のピートモス基材を満たした床において種子から成長させた。この植物を、１６／８光周期及び２５℃日中／２０℃夜間の温度体制の下で温室中で成長させた。播種から３週間後、個々の小植物を取り上げ、植木鉢に移植し、同じ環境条件下でさらに３週間、温室中で成長させた。
各野生型インフルエンザＨＡ又は変異体インフルエンザＨＡ発現ベクターで形質移入したアグロバクテリウムを、１０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭ アセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌ カナマイシン及び２５μｇ／ｍｌのカルベニシリン、ｐＨ５．６を添加したＹＥＢ培地の中で、それらが０．６～１．６のＯＤ６００に到達するまで増殖させた。使用前にアグロバクテリウム懸濁液を遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．６）に再懸濁し、４℃で一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養物バッチを２．５倍培養量中に希釈し、使用前に暖めた。ベンサミアナタバコの植物全体を、２０～４０Ｔｏｒｒの減圧下で、２分間にわたって気密のステンレス鋼タンクの中で菌液の中に逆さまに置いた。収穫まで植物を、６日間又は９日間のインキュベーション期間にわたり、温室に戻した。
葉の収穫及び総タンパク質抽出
タンパク質を、約１ｃｍ２片に切った新しいバイオマスから、オービタルシェーカーを使用する、室温での一晩の酵素による抽出により抽出した。次いで、スラリーを大口径ナイロン（登録商標）フィルターで濾過し、粗い未消化の植物組織を取り除いた。
「全プロセス収率」を得るために、スラリーを遠心分離して、プロトプラスト及び細胞内混入物質を取り除いた。上清をデプス濾過によって粗濾過した（清澄にした）。次いで、粗濾過した画分を、ＮａＣｌの濃度を高めながら段階溶出工程を用いてカチオン交換カラムにロードした。精製したＶＬＰをＴＦＦによって濃縮し、処方緩衝液に対して透析濾過し、フィルターに通した。精製したＶＬＰのタンパク質含有量をＢＣＡアッセイによって分析し、活性を赤血球凝集反応アッセイによって分析した。新しい構築物由来のタンパク質の収率を対照として使用した未変性の構築物と（又はＨ３株についてはＣｙｓＴＭと）比較することにより、相対収率を得た。
「密度勾配後収率」を得るために、スラリーを遠心分離して、プロトプラスト及び細胞内混入物質を取り除いた。上清を遠心分離して、さらなる壊片をさらに取り除いた。上清を、ガラス繊維フィルターを使用してデプス濾過によって粗濾過した。次いで、粗濾過した画分を不連続なイオジキサノール密度勾配にロードした。分離密度勾配遠心分離法を以下のとおりに行った：Ｔｒｉｓ緩衝液中の不連続なイオジキサノール密度勾配（３５％、３０％、２５％、２０％、１５、１０％及び５％の連続層）を含む３８ｍｌチューブを調製し、これの上に粗濾過した抽出物を置いた。この勾配を１２００００ｇで２時間（４℃）遠心分離した。遠心分離後、底から上部へと集めた最初の５ｍＬを捨て、次の５ｍＬを、タンパク質含有量分析（ＢＣＡ）、活性測定（赤血球凝集反応アッセイ）、及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥでのＨＡ０バンドの強度測定（濃度測定）のために集めた。新しい構築物由来のＨＡ０バンド強度を対照として使用した未変性の構築物と（又はＨ３株についてはＣｙｓＴＭと）比較することにより、相対収率を得た。
赤血球凝集反応アッセイ
赤血球凝集反応アッセイは、Ｎａｙａｋ及びＲｅｉｃｈｌ（２００４）によって記載された方法に基づいた。手短に言えば、試験試料（１００μＬ）の段階二重希釈を、１００μＬのＰＢＳを含むＶ底９６穴マイクロタイタープレート中で作製し、１ウェル当たり１００μＬの希釈された試料にした。１００μＬの０．５％モルモット赤血球細胞懸濁液（Ｂｉｏ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ．（バイオリンク）、シラキュース（Ｓｙｒａｃｕｓｅ）、ニューヨーク州）を各ウェルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベーションした。完全赤血球凝集反応を示す最も高い希釈の逆数をＨＡ活性として記録した。並行して、組み換えＨＡ標品（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（プロテイン・サイエンス・コーポレーション）、メリデン（Ｍｅｒｉｄｅｎ）、コネチカット州）をＰＢＳで希釈し、各プレートで対照として実施した。
タンパク質分析及び免疫ブロット法
免疫ブロット法を、ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％中の２％スキムミルクの中で１／５００に希釈した一次ｍＡｂを用いて第１インキュベーションによって実施した。１／１００００に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（ジャクソン・イムノリサーチ）、カタログ番号１１５－０３５－１４６）を、ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％中の２％スキムミルクの中での化学発光検出のための二次抗体として使用した。免疫反応性複合体を、ルミノールを基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ロシュ・ダイアグノスティックス・コーポレーション））として使用して化学発光によって検出した。ヒトＩｇＧ抗体のセイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素結合を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合キット（Ｐｉｅｒｃｅ（ピアース）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ（ロックフォード）、イリノイ州）を使用して実施した。
実施例３：植物におけるインフルエンザＨＡ及びＶＬＰの産生
Ｈ３ ＨＡの改変Ｉ
インフルエンザＨＡ構築物を、当該技術分野で周知の技術を使用して製造した（実施例１を参照）。野生型及び変異ＨＡタンパク質、プライマー、鋳型及び産物のまとめを下記表４に提供する。使用した配列を実施例４及び配列表に提供する。
Ｎ３８２Ａ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３
Ｎ３８２Ａ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０２３）を、野生型／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３の位置３８２のアスパラギンをアラニンへ変異させることにより構築した。図２に示すように、構築物番号３０２３を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３（構築物番号２８０１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ３０％上昇を呈した。
Ｌ３８４Ｖ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３
Ｌ３８４Ｖ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０３４）を、野生型／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３の位置３８４のロイシンをバリンへ変異させることにより構築した。図２に示すように、構築物番号３０３４を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３（構築物番号２８０１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ１００％上昇を呈した。
Ｆ３９２Ｄ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３
Ｆ３９２Ｄ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３を、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３の位置３９２のフェニルアラニンをアスパラギン酸へ変異させることにより構築した（構築物番号３０４５）。図２に示すように、構築物番号３０４５を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３（構築物番号２８０１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ４０％上昇を呈した。
Ｌ４３１Ｍ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３
Ｌ４３１Ｍ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３を、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３の位置４３１のロイシンをメチオニンへ変異させることにより構築した（構築物番号３０２２）。図２に示すように、構築物番号３０２２を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３（構築物番号２８１１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ７０％上昇を呈した。
本明細書に記載される１以上の変異は、植物におけるインフルエンザＨＡタンパク質産生及びＶＬＰ収率を特異的に増大させる。他の位置における変異は、植物細胞におけるインフルエンザＨＡタンパク質蓄積若しくはＶＬＰ産生を著しく低下させるか、又は植物細胞におけるインフルエンザＨＡタンパク質蓄積若しくはＶＬＰ産生に対して顕著な効果を及ぼさないということが認められた。
本明細書に記載される１以上の変異を含むインフルエンザＨＡタンパク質を用いて成し遂げられる高められた赤血球凝集価がインフルエンザＨ３ ＨＡに特有であることも認められた。同様の高まりは、非Ｈ３株由来の変異体インフルエンザＨＡをコードする構築物を用いてアグロインフィルトレーションした植物では認められなかった。
例えば、Ｆ３９３Ｄ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５変異体Ｈ５を、野生型Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ Ｈ５の位置３９３のフェニルアラニンをアスパラギン酸へ変異させることにより構築した（構築物番号３６８０）。図３に示すように、構築物番号３６８０を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ Ｈ５（構築物番号２２９５）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ９８％低下を呈した。
同様に、Ｆ３９２Ｄ Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０４９１５／２０１４変異体Ｈ５（構築物番号３６９０）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０４９１５／２０１４ Ｈ５（構築物番号３６４５）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ９９％低下を呈した（図３、表７を参照）。
Ｈ３ ＨＡの改変ＩＩ
ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３
ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号２８１１）を、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３の位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）に置き換えることにより構築した。図６Ａに示すように、構築物番号２８１１を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３（構築物番号２８０１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ６０％上昇を呈した。
ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３
ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３（構築物番号３３１３）を、野生型Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５ Ｈ３の位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）に置き換えることにより構築した。図７Ｃに示すように、構築物番号３３１３を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５ Ｈ３（構築物番号３３１２）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ１００％上昇を呈した。
Ｎ３８２Ａ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３
Ｎ３８２Ａ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０６３）を、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３の位置３８２のアスパラギンをアラニンへ変異させ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）に置き換えることにより構築した。図７Ａに示すように、構築物番号３０６３を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３（構築物番号２８０１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ１６０％上昇を呈した。図７Ｂにさらに示すように、構築物番号３０６３を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物は、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号２８１１）を用いてインフィルトレーションした植物と比較して、イオジキサノール勾配精製後のＶＬＰ収率のおよそ３０％上昇を呈した。
Ｎ３８２Ａ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３
Ｎ３８２Ａ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３（構築物番号３３１４）を、野生型Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５ Ｈ３の位置３８２のアスパラギンをアラニンへ変異させ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）に置き換えることにより構築した。図７Ｃに示すように、構築物番号３３１４を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５ Ｈ３（構築物番号３３１２）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ３００％上昇を呈した。
Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３
Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０７４）を、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３の位置３８４のロイシンをバリンへ変異させ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）に置き換えることにより構築した。図７Ｃに示すように、構築物番号３０７４を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３（構築物番号２８０１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ３８０％上昇を呈した。さらには、図７Ｂに示すように、構築物番号３０７４を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物は、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号２８１１）を用いてインフィルトレーションした植物と比較して、スクロース勾配精製後のＶＬＰ収率のおよそ５０％上昇を呈した。
Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３
Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５変異体Ｈ３（構築物番号３３１５）を、野生型Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５ Ｈ３の位置３８４のロイシンをバリンへ変異させ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）に置き換えることにより構築した。図７Ｃに示すように、構築物番号３３１５を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ／０９／２０１５ Ｈ３（構築物番号３３１２）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ３８０％上昇を呈した。
Ｆ３９２Ｄ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３
Ｆ３９２Ｄ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０８５）を、野生型／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３の位置３９２のフェニルアラニンをアスパラギン酸へ変異させ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）に置き換えることにより構築した。図７Ａに示すように、構築物番号３０８５を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３（構築物番号２８０１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ１７０％上昇を呈した。
Ｌ４３１Ｍ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３
Ｌ４３１Ｍ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３変異体Ｈ３（構築物番号３０６２）を、野生型／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３の位置４３１のロイシンをメチオニンへ変異させ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）に置き換えることにより構築した。図７Ａに示すように、構築物番号３０６２を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／１３ Ｈ３（構築物番号２８０１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ１５０％上昇を呈した。
Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４変異体Ｈ３
Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４変異体Ｈ３（構築物番号３３７５）を、野生型Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４の位置３８２のアスパラギンをアラニン残基へ、位置３８４のロイシンをバリン残基へ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）へ変異させることにより構築した。図７Ｅに示すように、構築物番号３３７５を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４変異体Ｈ３（構築物番号３３４１）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ３００％上昇を呈した。
Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５変異体Ｈ３
Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５変異体Ｈ３（構築物番号３９１５）を、野生型Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５の位置３８２のアスパラギンをアラニン残基へ、位置３８４のロイシンをバリン残基へ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）へ変異させることにより構築した。図７Ｅに示すように、構築物番号３９１５を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／４０／１５変異体Ｈ３（構築物番号３９１４）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ４００％上昇を呈した。
Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６変異体Ｈ３
Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６変異体Ｈ３（構築物番号３９２５）を、野生型Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６の位置３８２のアスパラギンをアラニン残基へ、位置３８４のロイシンをバリン残基へ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）へ変異させることにより構築した。図７Ｄ及び図７Ｅに示すように、構築物番号３９２５を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１／１６変異体Ｈ３（構築物番号３９２４）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ４００％上昇を呈した。
Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５変異体Ｈ３
Ｎ３８２Ａ＋Ｌ３８４Ｖ＋ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５変異体Ｈ３（構築物番号３９０５）を、野生型Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５の位置３８２のアスパラギンをアラニン残基へ、位置３８４のロイシンをバリン残基へ、かつ位置５２４～５２８の「ＣＦＬＬＣ」配列（配列番号９９）を「ＳＬＶＬＬ」（配列番号９８）へ変異させることにより構築した。図７Ｅに示すように、構築物番号３９０５を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、ＣｙｓＴＭ Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／３００７／１５変異体Ｈ３（構築物番号３９０４）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ４００％上昇を呈した。
本明細書に記載される１以上の変異は、植物におけるインフルエンザＨＡタンパク質産生及びＶＬＰ収率を特異的に増大させる。他の位置における変異は、植物細胞におけるインフルエンザＨＡタンパク質蓄積若しくはＶＬＰ産生を著しく低下させるか、又は植物細胞におけるインフルエンザＨＡタンパク質蓄積若しくはＶＬＰ産生に対して顕著な効果を及ぼさないということが認められた。
本明細書に記載される１以上の変異を含むインフルエンザＨＡタンパク質を用いて成し遂げられる高められた赤血球凝集価がインフルエンザＨ３ ＨＡに特有であることも認められた。同様の高まりは、非Ｈ３株由来の変異体インフルエンザＨＡをコードする構築物を用いてアグロインフィルトレーションした植物では認められなかった。
例えば、Ｆ３９３Ｄ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５変異体Ｈ５を、野生型Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ Ｈ５の位置３９３のフェニルアラニンをアスパラギン酸へ変異させることにより構築した（構築物番号３６８０）。図３に示すように、構築物番号３６８０を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ Ｈ５（構築物番号２２９５）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ９８％低下を呈した。
同様に、Ｆ３９２Ｄ Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０４９１５／２０１４変異体Ｈ５（構築物番号３６９０）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の精製した抽出物は、野生型Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０４９１５／２０１４ Ｈ５（構築物番号３６９０）を用いてアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ植物由来の抽出物と比べて赤血球凝集価のおよそ９９％低下を呈した（図３参照）。
実施例３：赤血球凝集価、密度勾配後収率及び全プロセス収率
測定した赤血球凝集価のまとめを表５及び表６Ａに与える。赤血球凝集価は、実施例２に記載したように測定した。相対赤血球凝集価は、変異ＨＡタンパク質又は改変ＨＡタンパク質の赤血球凝集価を野生型ＨＡ（表５）又はＣｙｓＴＭ変異体ＨＡタンパク質（表６Ａ）のいずれかと比較することにより得た。
測定した密度勾配後収率のまとめを表Ａ５Ｂ及び表Ｃ５Ｂに与える。密度勾配後収率は、実施例２に記載したように測定した。相対収率は、変異ＨＡタンパク質又は改変ＨＡタンパク質からのＨＡ０バンド強度を野生型ＨＡのＨＡ０バンド強度（表Ａ５Ｂ）又はＣｙｓＴＭ変異体ＨＡタンパク質のＨＡ０バンド強度（表６Ｂ）のいずれかと比較することにより得た。
測定した全プロセス収率のまとめを表６Ｃに与える。全プロセス収率は、上記の実施例２に記載したように測定した。相対収率は、変異ＨＡタンパク質又は改変ＨＡタンパク質からのタンパク質の収率を野生型ＨＡのタンパク質収率又はＣｙｓＴＭ変異体ＨＡタンパク質のタンパク質収率のいずれかと比較することにより得た（表６Ｃ）。
Figure 2024050651000007
Figure 2024050651000008
Figure 2024050651000009
Figure 2024050651000010
Figure 2024050651000011
実施例４：配列
以下の配列を使用した（表４も参照）。
Figure 2024050651000012
Figure 2024050651000013
Figure 2024050651000014
Figure 2024050651000015
Figure 2024050651000016
Figure 2024050651000017
Figure 2024050651000018
Figure 2024050651000019
Figure 2024050651000020
Figure 2024050651000021
Figure 2024050651000022
Figure 2024050651000023
Figure 2024050651000024
Figure 2024050651000025
Figure 2024050651000026
Figure 2024050651000027
Figure 2024050651000028
Figure 2024050651000029
Figure 2024050651000030
Figure 2024050651000031
Figure 2024050651000032
Figure 2024050651000033
Figure 2024050651000034
Figure 2024050651000035
Figure 2024050651000036
Figure 2024050651000037
Figure 2024050651000038
すべての引用文献は、参照により本明細書に援用する。
本発明が１以上の実施形態に関して記載された。しかしながら、特許請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱せずにいくつかの変更及び変形がなされうるということは当業者には明らかであろう。

Claims (40)

  1. 改変されたインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ＨＡタンパク質は、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、前記少なくとも１つの置換は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２、３８４、３９２、４３１、５２４、５２５、５２６又は５２８のアミノ酸に対応する１以上のアミノ酸において存在する核酸。
  2. Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２のアミノ酸に対応するアミノ酸における第１置換であって、この置換は非アスパラギンへの置換である第１置換、
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における第２置換であって、この置換は非システインへの置換である第２置換、及び
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における第３置換であって、この置換は非システインへの置換である第３置換
    を含む請求項１に記載の核酸。
  3. 前記第１置換がアラニン又はアラニンの保存的置換への置換であり、
    前記第２置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
    前記第３置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項２に記載の核酸。
  4. Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８４のアミノ酸に対応するアミノ酸における第１置換であって、この置換は非ロイシンへの置換である第１置換、
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における第２置換であって、この置換は非システインへの置換である第２置換、及び
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における第３置換であって、この置換は非システインへの置換である第３置換
    を含む請求項１に記載の核酸。
  5. 前記第１置換がバリン又はバリンの保存的置換への置換であり、
    前記第２置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
    前記第３置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項４に記載の核酸。
  6. Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３９２のアミノ酸に対応するアミノ酸における第１置換であって、この置換は非フェニルアラニンへの置換である第１置換、
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における第２置換であって、この置換は非システインへの置換である第２置換、及び
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における第３置換であって、この置換は非システインへの置換である第３置換
    を含む請求項１に記載の核酸。
  7. 前記第１置換がアスパラギン酸又はアスパラギン酸の保存的置換への置換であり、
    前記第２置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
    前記第３置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項６に記載の核酸。
  8. Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置４３１のアミノ酸に対応するアミノ酸における第１置換であって、この置換は非ロイシンへの置換である第１置換、
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における第２置換であって、この置換は非システインへの置換である第２置換、及び
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における第３置換であって、この置換は非システインへの置換である第３置換
    を含む請求項１に記載の核酸。
  9. 前記第１置換がメチオニン又はメチオニンの保存的置換への置換であり、
    前記第２置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
    前記第３置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項８に記載の核酸。
  10. Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２のアミノ酸に対応するアミノ酸における第１置換であって、この置換は非アスパラギンへの置換である第１置換、
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８４のアミノ酸に対応するアミノ酸における第２置換であって、この置換は非ロイシンへの置換である第２置換、
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２４のアミノ酸に対応するアミノ酸における第３置換であって、この置換は非システインへの置換である第３置換、及び
    Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２８のアミノ酸に対応するアミノ酸における第４置換であって、この置換は非システインへの置換である第４置換
    を含む請求項１に記載の核酸。
  11. 前記第１置換がアラニン又はアラニンの保存的置換への置換であり、
    前記第２置換がバリン又はバリンの保存的置換への置換であり、
    前記第３置換がセリン又はセリンの保存的置換への置換であり、
    前記第４置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換である請求項１０に記載の核酸。
  12. 前記ＨＡ タンパク質が、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置５２５、５２６又は５２５及び５２６のアミノ酸に対応するアミノ酸における置換をさらに含み、位置５２５のアミノ酸の前記置換が非フェニルアラニンへの置換であり、位置５２６のアミノ酸の前記置換が非ロイシンへの置換である請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の核酸。
  13. 位置５２５のアミノ酸の前記置換がロイシン又はロイシンの保存的置換への置換であり、位置５２６のアミノ酸の前記置換がバリン又はバリンの保存的置換への置換である請求項１２に記載の核酸。
  14. 前記アラニンの保存的置換がセリン、グリシン、トレオニン、システイン、又はバリンである請求項３又は請求項１１に記載の核酸。
  15. 前記バリンの保存的置換がイソロイシン、メチオニン、アラニン、又はトレオニンである請求項５、請求項１１及び請求項１３のいずれか１項に記載の核酸。
  16. 前記アスパラギン酸の保存的置換がグルタミン酸、グルタミン、又はセリンである請求項７に記載の核酸。
  17. 前記メチオニンの保存的置換がイソロイシン、グルタミン、バリン又はフェニルアラニンである請求項９に記載の核酸。
  18. 前記セリンの保存的置換がトレオニン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、グルタミン酸又はリジンである請求項３、請求項５、請求項７、請求項９及び請求項１１のいずれか１項に記載の核酸。
  19. 前記ロイシンの保存的置換がイソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン又はバリンである請求項３、請求項５、請求項７、請求項９、請求項１１及び請求項１３のいずれか１項に記載の核酸。
  20. 請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の核酸によってコードされる改変されたインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質。
  21. 請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の核酸によってコードされるＨＡタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
  22. 植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生方法であって、
    ａ）請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の核酸を前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞に導入する工程と、
    ｂ）前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記核酸によってコードされるＨＡタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより前記ＶＬＰを産生する工程と
    を備える方法。
  23. 工程ａ）が、プロトンチャネルタンパク質をコードする第２核酸を導入する工程をさらに備え、工程ｂ）が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記第２核酸によってコードされる前記プロトンチャネルタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションする工程をさらに備える請求項２２に記載の方法。
  24. 前記方法が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、前記ＶＬＰを精製する工程ｃ）をさらに備える請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
  25. 植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生方法であって、
    ａ）請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の核酸を含む植物、植物の一部分、又は植物細胞を準備する工程と、
    ｂ）前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記核酸によってコードされるＨＡタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより前記ＶＬＰを産生する工程と
    を備える方法。
  26. 工程ａ）の前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞が、プロトンチャネルタンパク質をコードする第２核酸をさらに含み、工程ｂ）が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記第２核酸によってコードされる前記プロトンチャネルタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションする工程をさらに備える請求項２５に記載の方法。
  27. 前記プロトンチャネルタンパク質がインフルエンザＡ亜型Ｍ２タンパク質である請求項２３又は請求項２６に記載の方法。
  28. 前記方法が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、前記ＶＬＰを精製する工程ｃ）をさらに備える請求項２５から請求項２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 請求項２２から請求項２８のいずれか１項に記載の方法によって産生されるＶＬＰ。
  30. 前記植物、前記植物の一部分、若しくは植物細胞に由来する１以上の脂質、植物特異的Ｎ－グリカン、改変Ｎ－グリカン又はこれらの組み合わせをさらに含む請求項２９に記載のＶＬＰ。
  31. 抗体又は抗体断片の産生方法であって、請求項２１、請求項２９又は請求項３０に記載のＶＬＰを対象又は宿主動物に投与し、これにより前記抗体又は前記抗体断片を産生する工程を備える方法。
  32. 請求項３１に記載の方法によって産生される抗体。
  33. 請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の組み換え核酸を含む植物、前記植物の一部分、又は植物細胞。
  34. 請求項１３に記載のＨＡタンパク質又は請求項２１、請求項２９若しくは請求項３０に記載のＶＬＰを含む植物、前記植物の一部分、又は植物細胞。
  35. 免疫応答を誘導するための組成物であって、有効用量の請求項２１、請求項２９又は請求項３０に記載のＶＬＰと、薬学的に許容できる担体、アジュバント、ビヒクル又は賦形剤とを含む組成物。
  36. 対象においてインフルエンザ感染に対する免疫を誘導する方法であって、請求項２１、請求項２９又は請求項３０に記載のＶＬＰを前記対象に投与する工程を備える方法。
  37. 前記ＶＬＰが、前記対象に経口で、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に又は皮下に投与される請求項３６に記載の方法。
  38. 植物、植物の一部分、又は植物細胞におけるインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生の収率を高める方法であって、
    ａ）請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の核酸を前記植物、前記植物の一部分、若しくは植物細胞に導入する工程、又は請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の核酸を含む植物、植物の一部分、若しくは植物細胞を準備する工程と、
    ｂ）前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を、前記核酸によってコードされる改変されたインフルエンザＨＡタンパク質の発現を許容する条件下でインキュベーションし、これにより、未改変インフルエンザＨＡタンパク質を発現する植物、この植物の一部分、又は植物細胞と比べてより高い収率で前記ＶＬＰを産生する工程と
    を備える方法。
  39. 前記方法が、前記植物、前記植物の一部分、又は植物細胞を収穫し、前記ＶＬＰを精製する工程ｃ）をさらに備える請求項３８に記載の方法。
  40. 改変されたインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質であって、対応する野生型アミノ酸配列と比べて少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、前記少なくとも１つの置換は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／１４ ＨＡの位置３８２、３８４、３９２、４３１、５２４、５２５、５２６又は５２８のアミノ酸に対応する１以上のアミノ酸において存在する改変されたインフルエンザＨ３ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質。
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