RU2800938C2

RU2800938C2 - Мутанты гемагглютинина вируса гриппа

Info

Publication number: RU2800938C2
Application number: RU2020143519A
Authority: RU
Inventors: Пьер-Оливье Лавуа; Орельен ЛОРИН; Ален ДУСЕ; Марк-Андре Д'АУСТ; Манон КУТЮР
Original assignee: Медикаго Инк.
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2023-08-01

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описано производство модифицированных белков вируса гриппа в растениях. Белок гемагглютинин гриппа (НА) может содержать аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа. Кроме того, предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированный белок НА. Кроме того, также представлены способы получения подобной вирусу гриппа частицы (VLP) и способы увеличения выхода продукции подобной вирусу гриппа частицы (VLP) в растении, части растения или растительной клетке. Изобретение позволяет увеличить продукцию подобных вирусу гриппа частиц (VLP) в растениях, причем VLP содержат модифицированные вирусные белки гриппа, такие как модифицированный НА. 11 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 4 пр.

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к производству мутантных вирусных белков в растениях. Более конкретно, настоящее изобретение относится к производству и увеличению продукции подобных вирусу гриппа частиц в растениях.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[0002] Вирусы гриппа представляют собой оболочечные вирусы с одноцепочечной РНК семейства Orthomyxoviridae. Вирусы гриппа очень заразны и могут вызывать легкие или серьезные заболевания во всех возрастных группах.

[0003] Вакцинация остается наиболее эффективным способом предотвращения инфекции гриппа. Как правило, вакцинацию проводят с использованием живых аттенуированных или целых инактивированных форм вируса, которые вызывают иммунный ответ при введении пациенту. Чтобы исключить потенциальный риск того, что живые аттенуированные и целые инактивированные вирусы вновь приобретут способность к репликации и станут заразными, также использовались вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные белки, чтобы вызвать защитный иммунитет к инфекции гриппа.

[0004] Однако применение рекомбинантных вирусных белков в качестве иммуногенного компонента вакцин характеризуется рядом ограничений. Во-первых, в отсутствие полного набора вирусных белков и генетических компонентов, необходимых для оптимальной экспрессии и правильного сворачивания белков, выход рекомбинантных вирусных белков в стандартных системах экспрессии in vitro может быть недостаточным для цели производства вакцины. Во-вторых, вакцины с рекомбинантными вирусными белками могут проявлять низкую иммуногенность из-за неправильного сворачивания, плохой презентации антигена и/или генерации преимущественно гуморального иммунного ответа, который неэффективен для обеспечения длительного защитного иммунитета.

[0005] Существует четыре типа вируса гриппа: А, В, С и D, из которых грипп А и В являются возбудителями сезонных эпидемий заболеваний у людей.

[0006] Вирусы гриппа А дополнительно подразделяются на основе экспрессии подтипов гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) на поверхности вируса. Существует 18 различных подтипов НА (H1-H18).

[0007] НА представляет собой тримерный лектин, который облегчает связывание частицы вируса гриппа с содержащими сиаловую кислоту белками на поверхности клеток-мишеней и опосредует высвобождение вирусного генома в клетку-мишень. Белки НА содержат два структурных элемента: головку, которая представляет собой основную мишень серопротективных антител, и ножку. Публикация На et al. 2002 (EMBO J. 21:865-875), которая включена в настоящий документ посредством ссылки, иллюстрирует относительную ориентацию различных субдоменов кластера стеблевых доменов (SDC) и кластера головных доменов (HDC) у нескольких подтипов гриппа на основе рентгеновских кристаллографических структур.

[0008] НА транслируется как отдельный полипептид HA0 (собранный в виде тримеров), который должен расщепляться сериновой эндопротеазой между субдоменами НА1 (~40 кДа) и НА2 (~20 кДа). После расщепления два домена белка с дисульфидной связью принимают необходимую конформацию, необходимую для вирусной инфекционности. НА1 образует глобулярный головной домен, содержащий рудиментарные домены эстеразы Е1(и Е2 и рецептор-связывающий сайт (RBS), и RBS представляет собой наименее консервативный сегмент вируса гриппа. НА2 представляет собой однопроходный интегральный мембранный белок со слитым пептидом (FP), растворимым эктодоменом (SE), трансмембранным (ТМ) и цитоплазматическим хвостом (СТ) с соответствующей длиной приблизительно 25, 160, 25 и 10 остатков. НА2 вместе с N- и С-концевыми остатками НА1 образует домен «ножки», который включает в себя транс мембранную область и является относительно консервативным.

[0009] Были исследованы различные мутации в белках вируса гриппа, особенно в НА гриппа.

[0010] Например, Castelán-Vega et al. (Adv Appl Bioinform Chem. 2014;7:37-44) использовали алгоритм прогнозирования стабильности для сравнения 7479 полноразмерных аминокислотных последовательностей НА из вируса гриппа А (H1N1)pdm09 и идентифицировали, что мутации D104N, А259Т, S124N и E172K приводили к прогнозируемому повышению стабильности НА гриппа. Напротив, мутации S206T, K285E и E47K характеризовались предсказанным дестабилизирующим эффектом на НА.

[0011] При сравнении последовательностей исходного гриппа A (H1N1)pdm [A/California/7/2009] и более позднего штамма гриппа [A/Brisbane/10/2010], Cotter et al. (PLoS Pathog. 2014; 10(1):e1003831) идентифицировали, что мутация E47K в области ножки A/California/07/09 НА стабилизировала структуру тримера, понижала рН для слияния мембран и увеличивала термическую и кислотную стабильность вируса. Cotter et al. дополнительно наблюдали, что НА мутанта E47K A/California/7/2009 был более заразным для хорьков, чем его аналог дикого типа.

[0012] Antanasijevic et al. (J Biol Chem. 2014; 289(32):22237-45) исследовали структурно-функциональные свойства области «петли-на-стебле» НА Н5 посредством сайт-направленного мутагенеза в 14 различных положениях. Мутанты A/Vietnam/1203/04 (H5N1) экспрессировались в клетках HEK 293Т, и Antanasijevic сообщил, что большинство мутаций в области «петли-на-стебле» не нарушают экспрессию, протеолитический процессинг, сборку вируса или связывание рецептора. Однако Antanasijevic наблюдал, что мутанты HA1-D26K, HA1-M102L, HA2-V52A и HA2-I55A (на основе нумерации Н3) демонстрируют значительно сниженные уровни общего НА, что предполагает снижение экспрессии и/или сборки НА в вирусные частицы. Мутанты НА1-D26K, НА2-Т49А и HA2-M102L также проявляли более низкие титры гемагглютинации по сравнению с вирусом дикого типа. Antanasijevic дополнительно наблюдал, что все одиночные мутанты демонстрируют пониженное проникновение в клетки легких А549, причем наиболее выраженное нарушение проявляется у мутантов HA1-D26K и HA2-I55A. Antanasijevic также продемонстрировал, что мутант HA2-L99A был более чувствителен к ингибированию клеток легких А549 нейтрализующим антителом С179 по сравнению с вирусом дикого типа, предполагая, что мутация усиливает связывание антитела и/или способ нейтрализующего действия. Напротив, мутанты HA1-I28A, НА1-М31А, НА1-M31L, HA2-I45A и HA2-I55V оказались менее чувствительными к ингибированию проникновения нейтрализующим антителом С179.

[0013] В публикации международной заявки WO 2013/177444 и сопутствующей публикации Lu et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111(1): 125-30) сообщается о способе получения правильно свернутого домена стебля НА из A/California/05/2009 (H1N1) с использованием системы экспрессии бесклеточного белка на основе Escherichia coli и простого протокола рефолдинга. Для индукции тримеризации домена стебля НА либо хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (CAT), либо домен сборки сливали с С-концом НА. Для уменьшения вновь выявленной гидрофобности и/или образования пар межмолекулярных ионов, вызывающих агрегацию экспрессированного белка стебля НА, оценивали пять групп мутаций: M1 (I69T + I72E + I74T + С77Т); М2 (I69T + I72E + I74T + С77Т + F164D); М3 (I69T + I72E + I74T + С77Т + F164D + L174D); М4 (F164D) и М5 (F164D + L174D). Lu наблюдал, что мутации М5 (F164D + L174D) оказались наиболее влиятельными мутациями для улучшения растворимости белков стебля НА. Дополнительные делеции (от Н38 до С43 и от С49 до N61) и мутации С77Т были внесены в мутанты М5, чтобы избежать образования нежелательных дисульфидных связей, уменьшить гидрофобность поверхности и pI и избежать областей с неупорядоченной структурой.

[0014] В заявке США №13/838796 и сопутствующей публикации Holtz et al. (ВМС Biotechnology. 2014; 14:111) сообщается о повышенной стабильности и сохранении активности рекомбинантного НА за счет мутации остатков цистеина в карбоксиконцевой области белка НА, включая в себя трансмембранный (ТМ) и цитозольный домен (СТ). В частности, Holtz et al. демонстрируют мутации С539А, С546А, С549А, C524S и С528А в рекомбинантном НА Perth/16/2009 (H3N2). Мутация всех пяти остатков цистеина или различных их подмножеств приводила к выходам, чистоте, размеру частиц, активности гемагглютинации и термостабильности НА, сравнимым с рекомбинантным белком НА дикого типа. Напротив, мутации C64S и C76S приводили к значительному снижению экспрессии НА, что указывает на критическую роль этих остатков в собственном сворачивании НА. Используя анализ простой радиальной иммунодиффузии (SRID), Holtz et al. также показывают, что пять мутаций остатков цистеина улучшают активность рекомбинантного НА по сравнению с белком дикого типа, предотвращая перекрестное связывание дисульфидов в доменах ТМ и СТ. Мутантные белки НА сохраняют активность в течение по меньшей мере 12 месяцев при температуре 25°С, тогда как белок НА дикого типа проявлял активность менее 40% только через 50 дней после очистки.

[0015] В публикации международной заявки WO 2015/020913 сообщается о мутации конкретных остатков в одном или более положениях, выбранных из группы из 403, 406, 411, 422, 429, 432, 433 и 435 вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1), в тирозин. Эти мутации способствуют образованию дитирозиновых поперечных сшивок, которые стабилизируют или «блокируют» домен ножки НА гриппа в его нативной тримерной конформации.

[0016] В публикации международной заявки WO 2013/079473 раскрыт модифицированный НА гриппа, лишенный глобулярного головного домена. Полипептид, описанный в публикации международной заявки WO 2013/079473, содержит домен НА1, в котором аминокислоты с 53 по 620 (со ссылкой на нумерацию A/Brisbane/59/2007 [H1N1]) удалены и заменены ковалентно связанной последовательностью из 0-10 аминокислот, и домен НА2, где С-концевая аминокислота домена НА1 представляет собой аминокислоту, отличную от аргинина или лизина, и где одна или более аминокислот в положениях 406, 409, 413 и 416 мутированы в аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина, треонина, аспарагина, глутамина, аргинина, гистидина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и глицина.

[0017] В публикации международной заявки WO 2014/191435 аналогичным образом описан модифицированный НА гриппа, содержащий домен НА1, в котором удаленный сегмент заменен ковалентно связанной последовательностью от 0 до 50 аминокислот, и домен НА2, причем НА устойчив к расщеплению на стыке между НА1 и НА2 и причем одна или более аминокислот в положениях 337, 340, 352, 353, 402, 406, 409, 413 и/или 416 были мутированы.

[0018] Вирусоподобные частицы (VLP) представляют собой потенциальных кандидатов для включения в иммуногенные композиции. VLP очень похожи на зрелые вирионы, но они не содержат вирусного геномного материала. Следовательно, VLP нерепликативны по своей природе, что делает их безопасными для введения в качестве вакцины. Кроме того, VLP могут быть сконструированы для экспрессии вирусных гликопротеинов на поверхности VLP, которая является их наиболее естественной физиологической конфигурацией. Более того, поскольку VLP похожи на интактные вирионы и представляют собой поливалентные структуры в виде частиц, VLP могут быть более эффективными в индукции нейтрализующих антител к гликопротеину, чем антигены растворимых белков оболочки.

[0019] VLP были произведены в растениях (смотрите, например, публикации международных заявок WO 2009/076778; WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2010/006452; WO 2011/03522; WO 2010/148511 и WO 2014153674, которые включены в настоящий документ посредством ссылки).

[0020] В публикации международной заявки WO 2009/076778 описан способ получения VLP гриппа в растениях, предусматривающий введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей НА гриппа из гриппа типа А или типа В.

[0021] В публикации международной заявки WO 2009/009876 описан способ получения VLP НА гриппа в растениях, при котором НА гриппа самоорганизуется в VLP в клетках растений и почках из мембран растительных клеток.

[0022] В публикации международной заявки WO 2010/003225 раскрыт способ получения VLP НА гриппа в растениях, предусматривающий введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей НА гриппа из A/California/04/09 (H1N1).

[0023] В публикации международной заявки WO 2010/006452 сообщается о получении VLP, содержащих модифицированные белки НА гриппа, причем сайты гликозилирования в положениях 154, 165, 286 или их комбинации (со ссылкой на нумерацию A/Vietnam/1194/04 [H5N1]) были отменены путем мутации остатков в указанных положениях в аминокислоты, отличные от аспарагина. В публикации международной заявки WO 2010/006452 также сообщается, что аминокислоты в положениях 156, 167, 288 или их комбинации могут быть мутированы в остатки, отличные от серина или треонина, чтобы аналогичным образом отменить N-связанную триаду сигнала гликозилирования «N-X-S/Т». Путем избирательного удаления сайтов гликозилирования, расположенных в глобулярной головке белка НА, в публикации международной заявки WO 2010/006452 продемонстрировано, что полученный белок НА характеризуется повышенной антигенностью и более широкой перекрестной реактивностью.

[0024] В публикации международной заявки WO 2011/035422 сообщается о способе получения VLP растительного происхождения, предусматривающем: получение растения или растительного вещества, содержащего VLP, локализованные в апопласте; получение фракции протопласта/сферопласта и фракции апопласта; и выделение фракции апопласта, содержащей VLP растительного происхождения.

[0025] В публикации международной заявки WO 2010/148511 раскрыт способ получения VLP гриппа в растениях, причем VLP содержат химерные белки НА. Химерные белки НА содержат кластер домена стебля, содержащий субдомены F'1, F'2 и F; кластер головного домена, содержащий субдомены RB, Е1 и Е2; и кластер транс мембранного домена, содержащий транс мембранный домен и С-концевой хвостовой домен, причем по меньшей мере один субдомен происходит от первого штамма гриппа, а другие субдомены происходят от одного или более вторых штаммов гриппа.

[0026] В публикации международной заявки WO 2014/153674 сообщается о способе получения VLP вируса гриппа в растении, причем VLP содержат модифицированный НА гриппа, содержащий модифицированную протеолитическую петлю. Модифицированная протеолитическая петля содержит удаление сайта протеолитического расщепления между доменами НА1 и НА2 предшественника HA0. Таким образом, белок НА стабилизируется, и достигаются повышенные выходы белка по сравнению с нативным белком НА.

Сущность настоящего изобретения

[0027] Настоящее изобретение относится к производству модифицированных белков вируса гриппа в растениях. Более конкретно, настоящее изобретение относится к производству и увеличению продукции подобных вирусу гриппа частиц (VLP) в растениях, причем VLP содержат модифицированные вирусные белки гриппа, например, модифицированный белок гемагглютинин (НА).

[0028] Цель настоящего изобретения заключается в создании улучшенного способа увеличения производства VLP вируса гриппа в растениях.

[0029] В соответствии с настоящим изобретением предусмотрено следующее:

[0030] Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок гемагглютинина (НА) H1 вируса гриппа, причем белок НА содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа, причем указанная по меньшей мере одна замена представляет собой замену одной или более чем одной аминокислоты, соответствующей аминокислотам в положении 97, 374, 390 или 429 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0031] Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на не аспарагин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0032] Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на не лизин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на глутаминовую кислоту или консервативную замену глутаминовой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0033] Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на не фенилаланин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0034] Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на метионин или консервативную замену метионина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0035] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с заменой на не аспарагин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 380 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может содержать аминокислотную последовательность с заменой на аланин или консервативную замену аланина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 380 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0036] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не фенилаланин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА, и второй заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА, и второй заменой на метионин или консервативную замену метионина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0037] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не аспарагин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 H1 A/Michigan/45/15 НА, и второй заменой на не лизин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 H1 A/Michigan/45/15 НА, и второй заменой на глутаминовую кислоту или консервативную замену глутаминовой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0038] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не аспарагин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 H1 A/Michigan/45/15 НА, второй заменой на не фенилаланин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА, и третьей заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 H1 A/Michigan/45/15 НА, второй заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА, и третью замену на метионин или консервативную замену метионина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0039] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не лизин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 H1 A/Michigan/45/15 НА, второй заменой на не фенилаланин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА, и третьей заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на глутаминовую кислоту или консервативную замену глутаминовой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 H1 A/Michigan/45/15 НА, второй заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА, и третьей заменой на метионин или консервативную замену метионина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0040] Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на не аспарагин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 H1 A/Michigan/45/15 НА, второй заменой на не лизин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 H1 A/Michigan/45/15 НА, третьей заменой на не фенилаланин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА, и четвертой заменой на не лейцин по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА. Белок НА может дополнительно содержать аминокислотную последовательность с первой заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 H1 A/Michigan/45/15 НА, второй заменой на глутаминовую кислоту или консервативную замену глутаминовой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 H1 A/Michigan/45/15 НА, третьей заменой на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 НА, и четвертой заменой на метионин или консервативную замену метионина по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0041] Дополнительно предоставлен белок НА, кодируемый рекомбинантными нуклеиновыми кислотами, как описано выше, и вирусоподобная частица (VLP), содержащая белок НА, кодируемый рекомбинантными нуклеиновыми кислотами, как описано выше.

[0042] Таким образом, предусмотрен модифицированный белок гемагглютинин (НА) вируса гриппа H1, причем белок НА содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену, по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа, причем указанная по меньшей мере одна замена представляет собой замену на одну или более чем одну аминокислоту, соответствующую аминокислоте в положении 97, 374, 390 или 429 H1 A/Michigan/45/15 НА.

[0043] Кроме того, представлен способ получения вирусоподобной частицы (VLP) в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий:

a) введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты, как описано выше, в растение, часть растения или растительную клетку; а также

b) инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка НА, кодируемого рекомбинантной нуклеиновой кислотой, с получением VLP. Способ может дополнительно предусматривать стадию с) сбора растения, части растения или растительной клетки и очистки VLP.

[0044] Кроме того, представлен способ получения подобной вирусу гриппа частицы (VLP) в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий:

a) предоставление растения, части растения или растительной клетки, содержащих рекомбинантную нуклеиновую кислоту, как описано выше; а также

[0045] Кроме того, представлен способ увеличения выхода продукции вирусоподобных частиц (VLP) в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий: а) введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты в растение, часть растения или растительную клетку или предоставление растения, части растения или растительной клетки, содержащих рекомбинантную нуклеиновую кислоту; и b) инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка НА, кодируемого рекомбинантной нуклеиновой кислотой, тем самым производя VLP с более высоким выходом по сравнению с растением, частью растения или растительной клеткой, экспрессирующей немодифицированный белок НА гриппа. Способ может дополнительно предусматривать стадию с) сбора растения, части растения или растительной клетки и очистки VLP.

[0046] Способы могут дополнительно предусматривать введение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей белок протонного канала; причем растение, часть растения или растительную клетку инкубируют в условиях, которые допускают экспрессию белка протонного канала, кодируемого второй нуклеиновой кислотой. Белок протонного канала может представлять собой белок М2 подтипа А.

[0047] Кроме того, предусмотрена VLP, полученная описанным ниже способом.

[0048] VLP может содержать один или более липидов, полученных из растения, части растения или растительной клетки, специфические для растений N-гликаны, модифицированные N-гликаны или их комбинации.

[0049] Кроме того, представлен способ получения антитела или фрагмента антитела, предусматривающий введение описанной VLP субъекту или животному-хозяину, тем самым производя антитело или фрагмент антитела. Также предусмотрены антитела или фрагменты антител, полученные данным способом.

[0050] Кроме того, предусмотрено растение, часть растения или растительная клетка, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту или белок НА, кодируемый рекомбинантной нуклеиновой кислотой. Белок НА может образовывать VLP. Соответственно, также предусмотрено растение, часть растения или растительная клетка, содержащая VLP, содержащую белок НА, кодируемый рекомбинантной нуклеиновой кислотой.

[0051] Кроме того, предусмотрена композиция для индукции иммунного ответа, содержащая эффективную дозу VLP, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант, наполнитель или вспомогательное вещество. Также представлен способ индукции иммунитета к инфекции гриппа у субъекта, предусматривающий введение описанной VLP. VLP можно вводить субъекту перорально, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

[0052] Кроме того, предусмотрен модифицированный белок гемагглютинина (НА) гриппа, содержащий аминокислотную последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим от приблизительно 30% до приблизительно 100% по отношению к последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, при условии, что белок НА гриппа содержит по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способен образовывать VLP, индуцирует иммунный ответ при введении субъекту, индуцирует гемагглютинацию или их комбинацию.

[0053] Это краткое раскрытие настоящего изобретения не обязательно описывает все особенности настоящего изобретения.

Краткое описание графических материалов

[0054] Эти и другие особенности настоящего изобретения станут более очевидными из следующего описания, в котором сделана ссылка на прилагаемые графические материалы, где:

[0055] На фиг. 1 показано выравнивание аминокислотных последовательностей гемагглютинина (НА) A/California/7/09 (H1N1) (SEQ ID NO: 130); A/Honduras/17734/16 (H1N1) (SEQ ID NO: 131); A/Darwin/11/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 132); A/Costa Rica/0513/16 (H1N1) (SEQ ID NO: 133); A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 134); A/Massachusetts/06/17 (H1N1) (SEQ ID NO: 135). Выделенные остатки совпадают с аминокислотами D97, Е374, F390 и L429 НА из штаммов вируса гриппа H1 (H1N1), например, A/California/7/09 (H1N1).

[0056] На фиг. 2А показаны титры гемагглютинации A/California/07/09 H1 дикого типа, мутанта L429M A/California/07/09 H1, мутанта N380A A/California/7/09 H1 и мутанта F390D A/California/7/09 H1. На фиг. 2В показаны титры гемагглютинации A/California/07/09 H1 дикого типа, мутанта F390D A/California/07/09 H1, мутанта L429M A/California/7/09 H1 и мутанта F390D + L429M A/California/07/09 H1, выраженные в процентах относительно A/California/07/09 дикого типа. На фиг. 2С показаны выходы VLP после градиента плотности для A/California/07/09 H1 дикого типа, мутанта N380A A/California/07/09 H1, мутанта L429M A/California/07/09 H1 и мутанта F390D A/California/07/09 H1.

[0057] На фиг. 3А показаны титры гемагглютинации для A/California/07/09 H1 дикого типа, A/Michigan/45/15 H1 дикого типа, мутанта K374E A/Michigan/45/15 H1 и мутанта N97D A/Michigan/45/15 H1. На фиг. 3В показаны титры гемагглютинации для A/California/07/09 H1 дикого типа, мутанта F390D A/California/07/09 H1, A/Michigan/45/15 H1 дикого типа, мутанта N97D A/Michigan/45/15 H1, мутанта K374E A/Michigan/45/15 H1, мутанта N380A A/Michigan/45/15 H1, мутанта F390D A/Michigan/45/15 H1, мутанта L429M A/Michigan/45/15 H1, мутанта N97D + K374E A/Michigan/45/15 H1, мутанта F390D + L429M A/Michigan/45/15 H1, мутанта F390D + N380A A/Michigan/45/15 H1, мутанта L429M + N380A A/Michigan/45/15 H1, мутанта K374E + F390D + L429M A/Michigan/45/15 H1, мутанта N97D + F390D + L429M A/Michigan/45/15 H1 и мутанта N97D + K374E + F390D + L429M A/Michigan/45/15 H1.

[0058] На фиг. 4A показаны титры гемагглютинации A/Michigan/45/15 H1 дикого типа, мутанта N97D A/Michigan/45/15 H1, мутанта K374E A/Michigan/45/15 H1, мутанта F390D A/Michigan/45/15 H1, мутанта L429M A/Michigan/45/15 H1, мутанта F390D + L429M A/Michigan/45/15 H1 и мутанта N97 + F390D + L429M A/Michigan/45/15 H1; титры гемагглютинации A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа, мутанта N97D A/Honduras/17734/16 H1, мутанта K374E A/Honduras/17734/16 H1, мутанта F390D A/Honduras/17734/16 H1, мутанта L429M A/Honduras/17734/16 H1, мутанта F390D + L429M A/Honduras/17734/16 H1 и мутанта N97D + F390D + L429M A/Honduras/17734/16 H1 и титры гемагглютинации A/Darwin/11/15 H1 дикого типа, мутанта N97D A/Darwin/11/15 H1, мутанта K374E A/Darwin/11/15 H1, мутанта F390D A/Darwin/11/15 H1, мутанта L429M A/Darwin/11/15 H1, мутанта F390D + L429M A/Darwin/11/15 H1 и мутанта N97D + F390D + L429M A/Darwin/11/15 H1. На фиг. 4B показаны титры гемагглютинации F390D + L429M A/Michigan/45/15, мутанта F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1, мутанта K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1, мутанта N97D + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1, и мутанта N97D + K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1; титры гемагглютинации мутанта F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1, мутанта K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1, мутанта N97D + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 и мутанта N97D + K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1. На фиг. 4C показаны титры гемагглютинации F390D + L429M A/Michigan/45/15, мутанта F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1, мутанта K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1, мутанта N97D + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 и мутанта N97D + K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1; титры гемагглютинации мутанта F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1, мутанта K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1, мутанта N97D + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 и мутанта N97D + K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1.

[0059] На фиг. 5 показаны титры гемагглютинации A/Indonesia/5/2005 Н5 дикого типа, A/Egypt/N04915/2014 Н5 дикого типа, мутанта F393D A/Indonesia/5/2005 Н5, мутанта F393D A/Egypt/N04915/2014 Н5, мутанта N383 A A/Indonesia/5/2005 Н5 и мутанта N383A A/Egypt/N04915/2014 Н5. Нумерация в соответствии с A/Indonesia/5/2005.

[0060] На фиг. 6А показано схематическое представление вектора 1314 (H1 A-Cal-7-2009). На фиг. 6В показано схематическое представление вектора 2980 (H1 A-Cal-7-09 (F390D)). На фиг. 6С показано схематическое представление вектора 2962 (H1 A-Cal-7-09 (L429M)). На фиг. 6D показано схематическое представление вектора 2995 (H1 A-Cal-7-09 (F390D + L429M)). На фиг. 6Е показано схематическое представление вектора 3640 (H1 A-Mich-45-2015). На фиг. 6F показано схематическое представление вектора 3774 (H1 А-Mich-45-2015 (N97D). На фиг. 6G показано схематическое представление вектора 3771 (H1 A-Mich-45-2015 (K374E)). На фиг. 6Н показано схематическое представление вектора 3641 (H1 A-Mich-45-2015 (F390D). На фиг. 6I показано схематическое представление вектора 3643 (H1 A-Mich-45-2015 (L429M)). На фиг. 6J показано схематическое представление вектора 3880 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D + K374E)). На фиг. 6K показано схематическое представление вектора 3703 (H1 A-Mich-45-2015 (F390D + L429M)). На фиг. 6L показано схематическое представление вектора 3879 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D + F390D + L429M)). На фиг. 6М показано схематическое представление вектора 3878 (H1 A-Mich-45-2015 (K374E + F390D + L429M)). На фиг. 6N показано схематическое представление вектора 3881 (H1 A-Mich-45-2015 (N97D + K374E + F390D + L429M)). На фиг. 6О показано схематическое представление вектора 4091 (H1 A-Mass-06-2017 (F390D + L429M). На фиг. 6Р показано схематическое представление вектора 4093 (H1 А-Ма SS-06-2017 (N97D + F390D + L429M)). На фиг. 6Q показано схематическое представление вектора 4092 (H1 A-Mass-06-2017 (K374E + F390D + L429M)). На фиг. 6R показано схематическое представление вектора 4094 (H1 A-Mass-06-2017 (N97D + K374E + F390D + L429M)). На фиг. 6S показано схематическое представление вектора 4715 (H1 А-CostaRica-0513-2016 (F390D + L429M)). На фиг. 6Т показано схематическое представление вектора 4717 (H1 A-CostaRica-0513-2016 (N97D + F390D + L429M)). На фиг. 6U показано схематическое представление вектора 4716 (H1 A-CostaRica-0513-2016 (K374E + F390D + L429M)). На фиг. 6V показано схематическое представление вектора 4718 (H1 A-CostaRica-0513-2016 (N97D + K374E + F390D + L429M)). На фиг. 6W показано схематическое представление вектора 3944 (H1 A-Hond-17734-16). На фиг. 6Х показано схематическое представление вектора 3950 (H1 A-Hond-17734-16 (N97D)). На фиг. 6Y показано схематическое представление вектора 3948 (H1 A-Hond-17734-16 (K374E)). На фиг. 6Z показано схематическое представление вектора 3945 (H1 A-Hond-17734-16 (F390D)). На фиг. 6АА показано схематическое представление вектора 3949 (H1 A-Hond-17734-16 (L429M)). На фиг. 6ВВ показано схематическое представление вектора 3946 (H1 A-Hond-17734-16 (F390D + L429M)). На фиг. 6СС показано схематическое представление вектора 3951 (H1 A-Hond-17734-16 (N97D + F390D + L429M)). На фиг. 6DD показано схематическое представление вектора 3984 (H1 A-Darw-11-15). На фиг. 6ЕЕ показано схематическое представление вектора 3990 (H1 A-Darw-11-15 (N97D)). На фиг. 6FF показано схематическое представление вектора 3988 (H1 A-Darw-11-15 (К374Е)). На фиг. 6GG показано схематическое представление вектора 3985 (H1 A-Darw-11-15 (F390D)). На фиг. 6НН показано схематическое представление вектора 3989 (H1 A-Darw-11-15 (L429M)). На фиг. 6II показано схематическое представление вектора 3986 (H1 А-Darw-11-15 (F390D + L429M)). На фиг. 6JJ показано схематическое представление вектора 3991 (H1 A-Darw-11-15 (N97D + F390D + L429M)). На фиг. 6KK показано схематическое представление вектора 3644 (H1 A-Mich-45-2015 (N380A)). На фиг. 6LL показано схематическое представление вектора 3704 (H1 A-Mich-45-2015 (F390D + N380A)). На фиг. 6ММ показано схематическое представление вектора 4765 (A/Paris/1227/17 (F390D + L429M)). На фиг. 6NN показано схематическое представление вектора 4766 (A/Paris/1227/17 (К374Е + F390D + L429M)). На фиг. 6OO показано схематическое представление вектора 4767 (A/Paris/1227/17 (N97D + F390D + L429M)). На фиг. 6РР показано схематическое представление вектора 4768 (A/Paris/1227/17 (N97D + K374E + F390D + L429M)). На фиг. 6QQ показано схематическое представление вектора 4775 (A/Norway/2147/17 (F390D + L429M)). На фиг. 6RR показано схематическое представление вектора 4776 (A/Norway/2147/17 (K374E + F390D + L429M)). На фиг. 6SS показано схематическое представление вектора 4777 (A/Norway/2147/17 (N97D + F390D + L429M)). На фиг. 6ТТ показано схематическое представление вектора 4778 (A/Norway/2147/17 (N97D + K374E + F390D + L429M)).

[0061] На фиг. 7А показано схематическое представление вектора 2295 (Н5 A-Indo-5-05). На фиг. 7В показано схематическое представление вектора 3680 (Н5 A-Indo-5-05 (F393D)). На фиг. 7С показано схематическое представление вектора 3645 (Н5 A-Egypt-N04915-14). На фиг. 7D показано схематическое представление вектора 3690 (Н5 A-Egypt-N04915-14 (F392D)).

[0062] На фиг. 8 показано схематическое представление вектора 1190 (вектор для клонирования In-Fusion в кассету экспрессии на основе CPMV 160).

Подробное описание настоящего изобретения

[0063] Следующее описание относится к предпочтительному варианту осуществления.

[0064] Используемые в настоящем документе термины «содержащий», «имеющий», «включающий в себя», «состоящий» и их грамматические вариации являются включающими или открытыми и не исключают дополнительные, непроцитированные элементы и/или стадии способа. Термин «состоящий по существу из», когда он используется в настоящем документе в связи с продуктом, применением или способом, означает, что могут присутствовать дополнительные элементы и/или стадии способа, но эти добавления не оказывают существенного влияния на способ, посредством которого функционирует изложенный способ или применения. Термин «состоящий из», когда он используется в настоящем документе в связи с продуктом, применением или способом, исключает присутствие дополнительных элементов и/или стадий способа. Продукт, применение или способ, описанные в настоящем документе как содержащие определенные элементы и/или стадии, могут также, согласно определенным вариантам осуществления, состоять по существу из этих элементов и/или стадий, а согласно другим вариантам осуществления состоять из этих элементов и/или стадий, независимо от того, упомянуты ли конкретные варианты осуществления. Кроме того, использование единственного числа включает в себя множественное число, а «или» означает «и/или», если не указано иное. Если в настоящем документе не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, характеризуются тем же значением, которое обычно понимается специалистом в настоящей области техники. Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» относится к отклонению приблизительно на + /- 10% от заданного значения. Следует понимать, что такое изменение всегда включается в любое данное значение, предоставленное в настоящем документе, независимо от того, упоминается ли оно конкретно или нет. Использование единственного числа при использовании в настоящем документе вместе с термином «содержащий» может означать «один», но это также согласуется со значением «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более чем один».

[0065] Термин «растение», «часть растения», «растительная часть», «растительное вещество», «растительная биомасса», «растительный материал», растительный экстракт» или «листья растения», как они используются в настоящем документе, может включать в себя все растение, ткань, клетки или любую их фракцию, внутриклеточные компоненты растений, внеклеточные компоненты растений, жидкие или твердые экстракты растений или их комбинацию, которые способны обеспечивать транскрипционный, трансляционный и посттрансляционный аппарат для экспрессии одной или более нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе, и/или из которых можно экстрагировать и очищать экспрессируемый белок или VLP. Растения могут включать в себя, без ограничения, травянистые растения. Кроме того, растения могут включать в себя, без ограничения, сельскохозяйственные культуры, включая в себя, например, канолу, виды Brassica, кукурузу, виды Nicotiana, (табак), например, Nicotiana benthamiana, Nicotiana rustica, Nicotiana, tabacum, Nicotiana alata, Arabidopsis thaliana, люцерну, картофель, сладкий картофель (Ipomoea batatus), женьшень, горох, овес, рис, сою, пшеницу, ячмень, подсолнечник, хлопок, кукурузу, рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), сафлор (Carthamus tinctorius).

[0066] Используемый в настоящем документе термин «часть растения» относится к любой части растения, включая в себя, без ограничения, листья, стебель, корень, цветы, плоды, растительную клетку, полученную из листьев, стебля, корня, цветов, плодов, растительный экстракт, полученный из листьев, стебля, корня, цветов, плодов, или их комбинации. Используемый в настоящем документе термин «растительный экстракт» относится к продукту растительного происхождения, который получают после обработки растения, части растения, растительной клетки или их комбинации физически (например, замораживанием с последующей экстракцией в подходящем буфере), механически (например, путем измельчения или гомогенизации растения или части растения с последующей экстракцией в подходящем буфере), ферментативно (например, с использованием ферментов, разрушающих клеточную стенку), химически (например, с использованием одного или более хелаторов или буферов) или их комбинации. Растительный экстракт можно дополнительно обработать для удаления нежелательных растительных компонентов, например, остатков клеточной стенки. Растительный экстракт может быть получен для помощи в извлечении одного или более компонентов из растения, части растения или растительной клетки, например, белка (включая в себя белковые комплексы, белковые поверхностные структуры и/или VLP), нуклеиновой кислоты, липида, углевода или их комбинации из растения, части растения или растительной клетки. Если растительный экстракт содержит белки, он может называться белковым экстрактом. Белковый экстракт может представлять собой неочищенный растительный экстракт, частично очищенный растительный или белковый экстракт или очищенный продукт, который содержит один или более белков, белковых комплексов, белковых супраструктур и/или VLP из растительной ткани. При желании белковый экстракт или растительный экстракт можно частично очистить с использованием технологий, известных специалистам в настоящей области техники, например, экстракт можно подвергнуть осаждению солью или рН, центрифугированию, центрифугированию в градиенте плотности, фильтрации, хроматографии, например, эксклюзионной хроматографии, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии или их комбинации. Белковый экстракт также можно очистить с использованием технологий, известных специалисту в настоящей области техники.

[0067] Используемый в настоящем документе термин «конструкция», «вектор» или «вектор экспрессии» относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте для переноса последовательностей экзогенных нуклеиновых кислот в клетки-хозяева (например, клетки растений) и направления экспрессии последовательности экзогенной нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах. «Кассета экспрессии» относится к нуклеотидной последовательности, содержащей представляющую интерес нуклеиновую кислоту, находящуюся под контролем и функционально (или оперативно) связанную с подходящим промотором или другими регуляторными элементами для транскрипции представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Как будет понятно специалисту в настоящей области техники, кассета экспрессии может содержать последовательность терминации (терминатор), которая представляет собой любую последовательность, которая активна для растения-хозяина. Например, последовательность терминации может происходить из сегмента генома РНК-2 двудольного РНК вируса, например, комовируса, последовательность терминации может представлять собой терминатор NOS, или последовательность терминатора может быть получена из 3'UTR гена пластоцианина люцерны.

[0068] Конструкции по настоящему раскрытию могут дополнительно содержать 3'-нетранслируемую область (UTR). 3'-нетранслируемая область содержит сигнал полиаденилирования и любые другие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования, как правило, характеризуется добавлением треков полиадениловой кислоты к 3'-концу предшественника мРНК. Сигналы полиаденилирования, как правило, распознаются по наличию гомологии с канонической формой 5(ААТААА-3', хотя вариации не являются редкостью. Неограничивающими примерами подходящих 3'-областей являются 3(транскрибируемые нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования индуцирующих опухоль плазмидных генов (Ti) Agrobacterium, таких как нопалинсинтаза (ген Nos), и генов растений, таких как гены запасного белка сои, ген рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы малой субъединицы (ssRUBISCO; US 4962028; который включен в настоящий документ посредством ссылки), промотора, используемого для регуляции экспрессии пластоцианина.

[0069] Под «регуляторной областью», «регуляторным элементом» или «промотором» подразумевается часть нуклеиновой кислоты, как правило, но не всегда, перед кодирующей белок областью гена, которая может состоять из ДНК или РНК, или как ДНК, так и РНК. Когда регуляторная область активна и функционально связана или оперативно связана с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, это может привести к экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности. Регуляторный элемент может быть способен опосредовать специфичность органа или контролировать активацию генов в процессе развития или во времени. «Регуляторная область» включает в себя элементы промотора, основные элементы промотора, проявляющие базальную промоторную активность, элементы, которые индуцируются в ответ на внешний стимул, элементы, которые опосредуют активность промотора, такие как негативные регуляторные элементы или усилители транскрипции. Используемая в настоящем документе «регуляторная область» также включает в себя элементы, которые активны после транскрипции, например, регуляторные элементы, которые модулируют экспрессию генов, такие как энхансеры трансляции и транскрипции, репрессоры трансляции и транскрипции, активирующие последовательности выше против хода транскрипции и детерминанты нестабильности мРНК. Некоторые из этих последних элементов могут быть расположены вблизи кодирующей области.

[0070] В контексте настоящего раскрытия термин «регуляторный элемент» или «регуляторная область», как правило, относится к последовательности ДНК, как правило, но не всегда, выше против хода транскрипции (5') от кодирующей последовательности структурного гена, который контролирует экспрессию кодирующей области, обеспечивая распознавание для РНК-полимеразы и/или других факторов, необходимых для начала транскрипции в конкретном сайте. Однако следует понимать, что другие нуклеотидные последовательности, расположенные внутри интронов, или 3(последовательности также могут вносить вклад в регуляцию экспрессии представляющей интерес кодирующей области. Примером регуляторного элемента, который обеспечивает распознавание для РНК-полимеразы или других факторов транскрипции для обеспечения инициации в конкретном сайте, является элемент промотора. Большинство, но не все эукариотические промоторные элементы содержат ТАТА-бокс, консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из аденозиновых и тимидиновых пар нуклеотидных оснований, как правило, расположенных приблизительно на 25 пар оснований выше против хода транскрипции от сайта начала транскрипции. Промоторный элемент может содержать базальный промоторный элемент, ответственный за инициацию транскрипции, а также другие регуляторные элементы, которые изменяют экспрессию гена.

[0071] Существует более типов регуляторных областей, включая в себя те, которые регулируются в процессе развития, индуцибельные или конститутивные. Регуляторная область, которая регулируется в процессе развития или контролирует дифференциальную экспрессию гена, находящегося под его контролем, активируется в определенных органах или тканях органа в определенные моменты времени во время развития этого органа или ткани. Однако некоторые регуляторные области, которые регулируются в процессе развития, могут предпочтительно быть активными в определенных органах или тканях на определенных стадиях развития, они также могут быть активными в рамках регулируемого в процессе развития способа или на базальном уровне в других органах или тканях растения. Примеры тканеспецифических регуляторных областей, например, специфических регуляторных областей, включают в себя промотор напина и промотор круциферина (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Пример специфического для листа промотора включает в себя промотор пластоцианина (смотрите патент США 7125978, который включен в настоящий документ посредством ссылки).

[0072] Индуцибельная регуляторная область представляет собой область, которая способна прямо или косвенно активировать транскрипцию одной или более последовательностей ДНК или генов в ответ на индуктор. В отсутствие индуктора последовательности ДНК или гены не будут транскрибироваться. Как правило, белковый фактор, который специфически связывается с индуцибельной регуляторной областью для активации транскрипции, может присутствовать в неактивной форме, которая затем прямо или косвенно превращается в активную форму посредством индуктора. Однако белковый фактор также может отсутствовать. Индуктор может представлять собой химическое средство, такое как белок, метаболит, регулятор роста, гербицид или фенольное соединение, или физиологический стресс, вызываемый непосредственно теплом, холодом, солью или токсическими элементами, или опосредованно через действие патогена или агента заболевания, такого как вирус. Растительная клетка, содержащая индуцибельную регуляторную область, может подвергаться действию индуктора путем внешнего воздействия индуктора на клетку или растение, например, путем опрыскивания, полива, нагревания или аналогичных способов. Индуцибельные регуляторные элементы могут происходить как из растительных, так и не растительных генов (например, Gatz, С.and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). Примеры потенциальных индуцибельных промоторов включают в себя, без ограничения, индуцируемый тетрациклином промотор (Gatz, С., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108), индуцируемый стероидом промотор (Aoyama, Т. and Chua, N.H.,1997, Plant J. 2, 397-404) и индуцируемый этанолом промотор (Salter, M.G., et al., 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al., 1998, Nature Biotech. 16, 177-180), индуцируемые цитокинином гены IB6 и CKI1 (Brandstatter, I. and Kieber, J.J.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, Т., 1996, Science 274, 982-985) и индуцируемый ауксином элемент DR5 (Ulmasov, Т., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971).

[0073] Конститутивная регуляторная область направляет экспрессию гена в различных частях растения и непрерывно на протяжении всего развития растения. Примеры известных конститутивных регуляторных элементов включают в себя промоторы, связанные с транскриптом 35S CaMV (p35S; Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812; который включен в настоящий документ посредством ссылки), актин 1 риса (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), актин 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121) или tms 2 (US 5428147), и гены триозофосфат-изомеразы 1 (Xu et. AL, 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), ген убиквитина 1 кукурузы (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), гены убиквитина 1 и 6 Arabidopsis (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), ген фактора инициации трансляции табака 4А (Mandel et al., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004), промотор вируса мозаики прожилок виноградного листа, pCAS (Verdaguer et al., 1996); промотор малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы, pRbcS: (Outchkourov et al., 2003), pUbi (для однодольных и двудольных).

[0074] Используемый в настоящем документе термин «конститутивный» не обязательно означает, что нуклеотидная последовательность, находящаяся под контролем конститутивной регуляторной области, экспрессируется на одном уровне во всех типах клеток, но что последовательность экспрессируется в широком диапазоне типов клеток, хотя часто наблюдается колебание численности.

[0075] Конструкции экспрессии, как описано выше, могут присутствовать в векторе. Вектор может содержать граничные последовательности, которые позволяют переносить и интегрировать кассету экспрессии в геном организма или хозяина. Конструкция может представлять собой растительный бинарный вектор, например, бинарный вектор трансформации на основе pPZP (Hajdukiewicz, et al. 1994). Другие иллюстративные конструкции включают в себя pBinl9 (смотрите Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller, et al. 1995, Plant Molecular Biology 27: 405-409).

[0076] Используемый в настоящем документе термин «нативный», «нативный белок» или «нативный домен» относится к белку или домену, имеющему первичную аминокислотную последовательность, идентичную дикому типу. Нативные белки или домены могут кодироваться нуклеотидными последовательностями, характеризующимися 100% сходством последовательности с последовательностью дикого типа. Нативная аминокислотная последовательность также может кодироваться нуклеотидной последовательностью, оптимизированной для кодонов человека (hCod), или нуклеотидной последовательностью, содержащей повышенное содержание GC по сравнению с нуклеотидной последовательностью дикого типа при условии, что аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью hCod, проявляет 100% идентичность последовательности по отношению к природной аминокислотной последовательности.

[0077] Под нуклеотидной последовательностью, которая является «оптимизированной кодонами человека» или нуклеотидной последовательностью «hCod», подразумевается выбор подходящих нуклеотидов ДНК для синтеза олигонуклеотидной последовательности или ее фрагмента, который приближается к частоте использования кодонов, как правило, встречающемуся в олигонуклеотидной последовательности нуклеотидной последовательности человека. Под «повышенным содержанием GC» подразумевается выбор соответствующих нуклеотидов ДНК для синтеза олигонуклеотидной последовательности или ее фрагмента, чтобы приблизиться к частоте использования кодона, которое по сравнению с соответствующей природной олигонуклеотидной последовательностью характеризуется увеличением содержания GC в отношении, например, от приблизительно 1 до приблизительно 30% или любого числа между ними, длины кодирующей части олигонуклеотидной последовательности. Например, приблизительно от 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30% или любого числа между ними по длине участка кодирования олигонуклеотидной последовательности. Как описано ниже, нуклеотидная последовательность с оптимизированным кодоном человека или нуклеотидная последовательность, содержащая увеличенный контакт GC (по сравнению с нуклеотидной последовательностью дикого типа), демонстрирует повышенную экспрессию в растении, части растения или растительной клетке по сравнению с экспрессией отличной от человеческой оптимизированной (или с более низким содержанием GC) нуклеотидной последовательности.

[0078] Модифицированные белки гемагглютинина (НА) гриппа (также называемые модифицированным белком НА, модифицированным белком НА гриппа, модифицированным НА, модифицированным НА гриппа, мутантным НА, мутантным НА гриппа, вариантами НА гриппа или вариантами НА) и способы получения модифицированных белков НА гриппа в растениях описаны в настоящем документе. Описанные в настоящем документе модифицированные белки НА гриппа содержат модификации или мутации, которые, как было обнаружено, приводят к улучшенным характеристикам НА по сравнению с НА дикого типа или немодифицированными белками НА. Например, модифицированный белок НА гриппа может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере с одной заменой аминокислоты по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа.

[0079] Примеры улучшенных характеристик модифицированного белка НА включают в себя повышенный выход белка НА при экспрессии в растительных клетках по сравнению с НА дикого типа или немодифицированным НА того же штамма или подтипа гриппа, который не содержит модификацию(и) или мутацию(и); улучшенный титр гемагглютинации модифицированного белка НА по сравнению с белком НА дикого типа или немодифицированным белком НА; улучшенную целостность, стабильность или как целостность, так и стабильность вирусоподобных частиц (VLP), которые состоят из модифицированных белков НА, по сравнению с целостностью, стабильностью или и тем и другим VLP, содержащими НА дикого типа, которые не содержат модификацию(и) или мутацию(и); повышенный выход VLP при экспрессии в растительных клетках по сравнению с уровнем продукции VLP дикого типа, который не содержит модификацию(и) или мутацию(и); и их комбинация.

Подтипы и штаммы гриппа

[0080] Используемый в настоящем документе термин «подтип вируса гриппа» относится к вариантам вируса гриппа А, которые характеризуются различными комбинациями вирусных поверхностных белков гемагглютинина (Н или НА) и нейрамидазы (N). В соответствии с настоящим описанием подтипы вируса гриппа и гемагглютинин (НА) из таких подтипов вируса могут упоминаться по их номеру Н, например, «НА подтипа Н1», «НА H1» или «грипп Н1». Термин «подтип», в частности, включает в себя все индивидуальные «штаммы» внутри каждого подтипа, которые обычно возникают в результате мутаций и могут проявлять различные патогенные профили. Такие штаммы можно также называть различными «изолятами» вирусного подтипа. Соответственно, в контексте настоящего описания термины «штаммы» и «изоляты» могут использоваться взаимозаменяемо.

[0081] Традиционно различные штаммы гриппа классифицируются на основании, например, способности гриппа агглютинировать красные клетки крови (RBC или эритроциты). Антитела, специфические для определенных штаммов гриппа, могут связываться с вирусом и, таким образом, предотвращать такую агглютинацию. Анализы, определяющие типы штаммов на основе такого ингибирования, как правило, известны как анализы ингибирования гемагглютинина (анализы H1 или анализы HAI), и они представляют собой стандартные и хорошо известные способы для характеристики штаммов гриппа.

[0082] Однако белки НА из разных штаммов вирусов также демонстрируют значительное сходство последовательностей как на уровне нуклеиновой кислоты, так и на уровне аминокислот. Этот уровень сходства варьируется при сравнении штаммов разных подтипов, причем некоторые штаммы явно демонстрируют более высокие уровни сходства, чем другие (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643). Уровни аминокислотного сходства варьируются между вирусными штаммами одного подтипа и вирусными штаммами других подтипов (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643). Этой вариации достаточно для установления дискретных подтипов и эволюционного происхождения различных штаммов, но ДНК и аминокислотные последовательности разных штаммов все еще легко выравниваются с использованием обычных способов биоинформатики (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643; Suzuki and Nei, Mol. Biol. Evol. 2002, 19:501).

[0083] Множественные нуклеотидные последовательности или соответствующие полипептидные последовательности гемагглютинина (НА) могут быть выровнены для определения «консенсуса» или «консенсусной последовательности» подтипа (смотрите фиг.1).

[0084] Основываясь на сходстве последовательностей, подтипы вируса гриппа могут быть дополнительно классифицированы по их филогенетической группе. Филогенетический анализ (Fouchier et al., J Virol. 2005 Mar;79(5):2814-22) продемонстрировал подразделение НА, которое представляет собой деление на две основные группы (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7643): среди прочего, подтипы H1, Н2, Н5 и Н9 в филогенетической группе 1 и, среди прочего, подтипы Н3, Н4 и Н7 в филогенетической группе 2.

[0085] Новые белки НА гриппа, модификации НА, варианты и мутанты белка НА создаются путем внесения изменений в аминокислотную последовательность белка НА, что приводит к улучшенным характеристикам НА, как описано выше. Выделение нуклеиновых кислот, кодирующих такие молекулы НА, является обычным делом, как и модификация нуклеиновой кислоты для внесения изменений в аминокислотную последовательность, например, посредством сайт-направленно го мутагенеза.

[0086] В настоящем документе описаны модифицированные белки НА гриппа и способы получения модифицированных белков НА гриппа в растениях. Было замечено, что модификация, например, путем замены определенных аминокислот в белках НА, например, НА из подтипа H1, приводит к улучшенным характеристикам модифицированного белка НА по сравнению с белком НА дикого типа или немодифицированным белком НА.

[0087] Одна или более модификаций, мутаций или замен белка НА, как описано в настоящем документе, не расположены в известных эпитопных областях белка НА, и эти модификации, мутации или замены не добавляют или не удаляют сайты гликозилирования в белке НА.

[0088] Белок НА, мутантный белок НА или модифицированный белок НА, как описано в настоящем документе, модифицирован и содержит одну или более мутаций, модификаций или замен в своей аминокислотной последовательности в любой одной или более аминокислотах, которые соответствуют аминокислотам в положениях 97, 374, 380, 390 или 429 A/Michigan/45/15 НА (SEQ ID NO: 134; смотрите фиг. 1) или НА A/California/07/09 (SEQ ID NO: 130; смотрите фиг.1).

[0089] Под «соответствовать аминокислоте» или «соответствующей аминокислоте» подразумевается, что аминокислота соответствует аминокислоте в выравнивании последовательности с эталонным штаммом гриппа, как описано ниже.

[0090] Номер аминокислотного остатка или положение остатка НА соответствует нумерации НА эталонного штамма гриппа. Например, в случае гриппа H1 эталонным штаммом может быть A/Michigan/45/15 НА (SEQ ID NO: 134; смотрите фиг. 1) или A/California/07/09 НА (SEQ ID NO: 130 смотрите фиг. 1). Соответствующие аминокислотные положения могут быть определены путем выравнивания последовательностей НА (например, H1 НА) с последовательностью НА их соответствующего эталонного штамма. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в настоящей области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма выравнивания гомологии Needleman & Wunsch a, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), способом поиска сходства Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или путем ручного выравнивания и визуальной проверки (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995, приложение)). Выравнивание аминокислотных последовательностей нескольких доменов НА вируса гриппа А, которые не следует рассматривать как ограничивающие, показано на фиг. 1.

[0091] При упоминании модификаций, мутантов или вариантов за аминокислотным остатком дикого типа (также называемым просто «аминокислотой») следует номер остатка и новая или замещенная аминокислота. Например, замена аспарагина (N, Asn) на аспарагиновую кислоту (D, Asn) в остатке или аминокислоте в положении 97 обозначается как N97D (смотрите таблицу 1).

[0092] Модифицированные НА, мутанты или варианты НА, например, модифицированные H1 НА, обозначаются таким же образом с использованием однобуквенного аминокислотного кода для остатка дикого типа, за которым следует его положение и однобуквенный аминокислотный код остатка замены. Множественные мутанты обозначены компонентными одиночными мутантами, разделенными косой чертой (/) или плюсом ( + ). Так, например, мутант N380A/L429M НА H1 представляет собой дизамещенный мутант, в котором аланин (A, Ala) заменяет аспарагин (N, Asp) в положении остатка 380, а метионин (М, Met) заменяет лейцин (L, Leu) в положении остатка 429, а мутантный белок N380A/F390D НА H1 представляет собой дизамещенный вариант, в котором аланин (A, Ala) заменяет аспарагин (N, Asn) в положении 380, а аспарагиновая кислота (D, Asp) заменяет фенилаланин (F, Phe) в положении в белке НА H1.

[0094] Модифицированный белок гемагглютинин (НА) гриппа может содержать аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа.

[0095] Под «аминокислотной заменой» или «заменой» подразумевается замена аминокислоты в аминокислотной последовательности белка другой аминокислотой. Термины «аминокислота», «аминокислотный остаток» или «остаток» используются в настоящем раскрытии как взаимозаменяемые. Одна или более аминокислот могут быть замещены одной или более аминокислотами, которые отличаются от исходной аминокислоты или аминокислоты дикого типа в этом положении, без изменения общей длины аминокислотной последовательности белка. Замена или замещение могут быть экспериментально индуцированы изменением последовательности кодона в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, на последовательность кодона другой аминокислоты по сравнению с исходной аминокислотой или аминокислотой дикого типа. Полученный белок представляет собой модифицированный белок, например, модифицированный белок НА гриппа. Модифицированный белок НА гриппа не встречается в природе.

[0096] Модифицированный НА включает в себя не встречающийся в природе белок НА, содержащий по меньшей мере одну модификацию природного НА и обладающий улучшенными характеристиками по сравнению с природным белком НА, от которого происходит аминокислотная последовательность модифицированного НА. Модифицированные белки НА содержат аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе, которая образована замещением одного или более аминокислотных остатков белка НА одной или более различными аминокислотами.

[0097] Соответственно, модифицированный НА, мутантный НА или рекомбинантный НА относится к НА, в котором последовательность ДНК, кодирующая природный НА, модифицирована для получения модифицированной или мутантной последовательности ДНК, которая кодирует модификацию, мутацию или замену одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности НА.

[0098] Некоторые из остатков, идентифицированных для модификации, мутации или замены, соответствуют консервативным остаткам, тогда как другие нет. В случае остатков, которые являются неконсервативными, замещение одной или более аминокислот ограничивается заменами, которые производят модифицированный НА, аминокислотная последовательность которого не соответствует обнаруженной в природе. В случае консервативных остатков такая модификация, замена или замещения также не должны приводить к природным последовательностям НА.

Консервативные замены

[0099] Как описано в настоящем документе, остатки в белках НА могут быть идентифицированы и модифицированы, заменены или мутированы для получения модифицированного белка НА или вариантов белка НА. Замены или мутации в конкретных положениях не ограничиваются аминокислотными заменами, описанными в настоящем документе или приведенными в примерах. Например, варианты НА могут содержать консервативные замены описанных аминокислотных замен.

[00100] Используемый в настоящем документе термин «консервативная замена» и его грамматические вариации относятся к присутствию аминокислотного остатка в последовательности белка НА, который отличается, но принадлежит к тому же классу аминокислоты в качестве описанной замены или описанного остатка (т.е. неполярный остаток, заменяющий неполярный остаток, ароматический остаток, заменяющий ароматический остаток, полярно-незаряженный остаток, заменяющий полярно-незаряженный остаток, заряженный остаток, заменяющий заряженный остаток). Кроме того, консервативные замены могут охватывать остаток, имеющий значение межфазной гидропатии того же знака и, как правило, такой же величины, что и остаток, заменяющий остаток дикого типа.

[00101] Используемый в настоящем документе термин «неполярный остаток» относится к глицину (G, Gly), аланину (A, Ala), валину (V, Val), лейцину (L, Leu), изолейцину (I, Не) и пролину (Р, Pro); термин «ароматический остаток» относится к фенилаланину (F, Phe), тирозину (Y, Tyr) и триптофану (W, Trp); термин «полярный незаряженный остаток» относится к серину (S, Ser), треонину (Т, Thr), цистеину (С, Cys), метионину (М, Met), аспарагину (N, Asn) и глутамину (Q, Gln); термин «заряженный остаток» относится к отрицательно заряженным аминокислотам аспарагиновой кислоте (D, Asp) и глутаминовой кислоте (Е, Glu), а также к положительно заряженным аминокислотам лизину (K, Lys), аргинину (R, Arg) и гистидину (Н, His). Другая классификация аминокислот может быть следующей:

(аминокислоты с гидрофобной боковой цепью (алифатические): аланин (А, Ala), изолейцин (I, Не), лейцин (L, Leu), метионин (М, Met) и валин (V, Val);

(аминокислоты с гидрофобной боковой цепью (ароматические): фенилаланин (F, Phe), триптофан (W, Trp), тирозин (Y, Tyr);

(аминокислоты с полярно-нейтральной боковой цепью: аспарагин (N, Asn), цистеин (С, Cys), глутамин (Q, Gin), серин (S, Ser) и треонин (Т, Thr);

(аминокислоты с электрически заряженными боковыми цепями (кислотные): аспарагиновая кислота (D, Asp), глутаминовая кислота (Е, Glu);

(аминокислоты с электрически заряженными боковыми цепями (основные): аргинин (R, Arg); гистидин (Н, His); лизин (К, Lys), глицин (G, Gly) и пролин (Р, Pro).

[00102] Консервативные аминокислотные замены, вероятно, будут иметь такой же эффект на активность полученного варианта белка НА или модифицированного белка НА, как и исходная замена или модификация. Дополнительную информацию о консервативных заменах можно найти, например, в Ben Bassat et al. (J. Bacteriol, 169:751-757, 1987), O'Regan et al. (Gene, 77:237-251, 1989), Sahin-Toth et al. (Protein ScL, 3:240-247, 1994), Hochuli et al (Bio/Technology, 6:1321-1325, 1988) и в широко используемых учебниках генетики и молекулярной биологии.

[00103] Матрицы Blosum, как правило, используются для определения родства полипептидных последовательностей. Матрицы Blosum были созданы с использованием большой базы данных надежных выравниваний (база данных BLOCKS), в которой подсчитывались попарные выравнивания последовательностей, связанные с идентичностью менее некоторого порогового процента (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992). Для высококонсервативных целевых частот матрицы BLOSUM90 использовали порог идентичности 90%. Для матрицы BLOSUM65 использовали порог идентичности 65%. Баллы от нуля и выше в матрицах Blosum считаются «консервативными заменами» при выбранной процентной идентичности. В следующей таблице показаны примеры консервативных аминокислотных замен: таблица 2.

[00104] Нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный белок НА, может быть оптимизирована для частоты использования кодонов человека, для увеличения содержания GC или их комбинации. Модифицированный белок НА может быть экспрессирован в растении, части растения или растительной клетке.

МОДИФИКАЦИИ H1 НА

[00105] Модифицированные белки НА гриппа H1 и способы получения модифицированных белков НА гриппа H1 в растениях описаны в настоящем документе. Было замечено, что модификация специфических аминокислот в белках НА из подтипа H1 приводит к улучшенным характеристикам модифицированного белка H1 НА по сравнению с белком H1 НА дикого типа или немодифицированным белком H1 НА.

[00106] Всего было исследовано 42 одинарных, двойных и/или тройных модификаций для улучшения характеристик белка H1 НА. Как описано ниже и как показано в примерах, только модификации или комбинации модификаций в определенных положениях улучшают характеристики белка H1 НА. Модификации в 32 положениях или комбинациях положений отрицательно влияли на характеристики белка H1 НА (данные не показаны).

[00107] Примеры улучшенных характеристик мутантного белка H1 НА включают в себя повышенный выход или накопление белка НА при экспрессии в растительных клетках по сравнению с H1 НА дикого типа или немодифицированным H1 НА того же штамма или подтипа гриппа, который не содержит модификацию(и) или мутацию(и); улучшенный титр гемагглютинации модифицированного или мутированного белка НА по сравнению с белком H1 НА дикого типа или немодифицированным H1 НА; улучшенную целостность, стабильность или как целостность, так и стабильность VLP, которые состоят из модифицированных белков H1 НА, по сравнению с целостностью, стабильностью или и тем и другим VLP, содержащими НА дикого типа, которые не содержат мутацию(и); повышенный выход VLP при экспрессии в растительных клетках по сравнению с уровнем продукции VLP дикого типа, которая не содержит модификацию(и) или мутацию(и); и их комбинацию.

[00108] Модифицированный белок H1 НА или мутантный белок H1 НА, как описано в настоящем документе, модифицирован и содержит одну или более мутаций или модификаций в любом одном или более остатках при выравнивании последовательностей с положениями 97, 374, 380, 390 и/или 429 из A/California/07/09 НА (SEQ ID NO: 130; смотрите фиг. 1). Поэтому предусмотрены полипептиды, белки и/или белковые комплексы НА гриппа H1, такие как, например, вирусоподобные частицы (VLP), которые содержат модификации или мутации в одном или более положениях аминокислот 97, 374, 380, 390 и/или 429, причем такая нумерация аминокислот основана на последовательности H1 A/California/07/09 НА, как показано на фиг. 1 (SEQ ID NO: 130), или в положениях аминокислот, которые соответствуют таким положениям аминокислот, например, как определено выравниванием аминокислотной последовательности H1 НА с SEQ ID NO: 130. Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей НА гриппа H1, которые содержат одну или более таких мутаций, включают в себя SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135, 138 и 139.

[00109] Модифицированный белок H1 НА, описанный в настоящем документе, включает в себя белок H1 НА с аминокислотными последовательностями, которые характеризуются идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности, кодирующей НА из H1 (SEQ ID NO: 130, 131, 132, 133, 134, 135, 138 или 139), причем аминокислотная последовательность содержит одну или более мутаций или модификаций в любом одном или более остатках при выравнивании последовательностей с положениями 97, 374, 380, 390 и 429 A/California/07/09 НА (SEQ ID NO: 130) и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00110] Кроме того, белок H1 НА может кодироваться нуклеотидной последовательностью, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 (SEQ ID NO: 130, 131, 132, 133, 134, 135, 138 или 139), причем белок H1 НА содержит одну или более чем одну мутацию или модификацию в любом одном или более остатках при выравнивании последовательностей с положениями 97, 374, 380, 390 и 429 A/California/07/09 НА и причем нуклеотидная последовательность кодирует белки НА, которые при экспрессии образуют VLP.

[00111] Неограничивающими примерами штаммов, из которых может происходить H1 НА, являются A/California/07/09 (H1N1, SEQ ID NO: 130), A/Michigan/45/15 (H1N1, SEQ ID NO: 134), A/Massachusetts/06/17 (H1N1, SEQ ID NO: 135), A/Costa Rica/0513/16 (H1N1, SEQ ID NO: 133), A/Honduras/17734/16 (H1N1, SEQ ID NO: 131), A/Darwin/11/15 (H1N1, SEQ ID NO: 132), A/Paris/1227/2017 (SEQ ID NO: 138) или A/Norway/2147/2017 (SEQ ID NO: 139)

[00112] Модифицированный или мутантный H1 НА может быть монозамещенным, дизамещенным, тризамещенным или четырехзамещенным по остаткам в положении 97, 374, 380, 390 или 429. В монозамещенном H1 НА один остаток может быть мутирован в положении 97, 374, 380, 390 или 429. В дизамещенном H1 НА могут быть заменены два остатка, например, остатки в положении 380 и 429, 97 и 374 или 390 и 429 могут быть заменены. В тризамещенном мутанте H1 НА могут быть заменены три остатка. Например, могут быть заменены остатки в положениях 97, 390 и 429 или остатки в положениях 97, 374 и 429. В четырехзамещенном мутанте H1 НА могут быть заменены четыре остатка. Например, могут быть заменены остатки в положении 97, 374, 390 и 429. (Вся нумерация H1 НА соответствует выравниванию последовательностей с эталонным штаммом НА A/California/07/09).

[00113] Неограничивающие примеры модифицированных белков H1 НА включают в себя следующие модификации или мутации в последовательности НА при сравнении с последовательностью H1 НА дикого типа (нумерация в соответствии с A/California/07/09 НА):

a. монозамещенные мутанты H1 НА: N97D, K374E, F390D или L429M;

b. дизамещенный мутант H1 НА: N390A/L429M, N97D/K374E или N380/L429M;

c. тризамещенный мутант H1 НА: N97D/F390D/L429M или K374E/F390D/L429M;

d. четырехзамещенный мутант H1 НА: N97D/K374E/F390D/L429M.

Одна или более описанных в настоящем документе мутаций специфически увеличивают продукцию белка НА гриппа и выход VLP у растений. Было замечено, что мутации в других положениях значительно снижали или не оказывали значительного влияния на накопление белка НА гриппа или продукцию VLP в растительных клетках.

Монозамещенный H1 НА

Модификация в положении 97

[00114] Согласно одному аспекту настоящего раскрытия модифицированный H1 НА может содержать по меньшей мере модифицированный остаток в положении 97. Этот остаток не участвует в рецепторном связывании НА, и было показано, что этот остаток расположен в одном из субдоменов рудиментарной эстеразы (VE) в глобулярной головке НА. Рентгеновская кристаллография показала, что остаток находится внутри тримера НА. Следовательно, остаток не представляет собой часть антигенных сайтов и не участвует в антигенных изменениях, а также не распознается широко нейтрализующими антителами.

[00115] У гриппа A (H1N1)pdm09 этот остаток, как предполагалось, участвует в стабильности НА (смотрите Castelan-Vega et al., 2014). Однако Castelan-Vega et al. указывает на то, что единичные точечные мутации, по-видимому, мало влияют на стабильность НА, и цитирует Yang et al. (Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins, J. Virol. 2014; 88(9):4828-4838). Yang et al. использовали гель-хроматографический анализ рекомбинантного эктодомена НА для сравнения различий между рекомбинантными тримерными белками НА из пандемических вирусов H1N1 начала 2009 г., которые диссоциируют на мономеры, с таковыми из НА более поздних вирусов, которые могут быть экспрессированы в виде тримеров. Yang et al. обнаружили, что A/Texas/1/2011 (Тех 11) содержит уникальную замену Asp97Asn (D97N) в НА по сравнению с четырьмя другими штаммами вируса A (H1N1)pdm09, которые были исследованы на предмет различий в последовательностях. Однако штаммы НА гриппа H1, которые развились с тех пор, содержат аспарагин (N, Asn) в положении 97 (смотрите фиг.1, выравнивание последовательностей H1), что предполагает эволюционное преимущество штаммов H1 НА, содержащих аспарагин (N, Asn) в этом положении. Соответственно, было неожиданным, что модификация аспарагина (N, Asn) в положении 97 на не аспарагин привела к улучшенным характеристикам белка H1 НА, как описано в настоящем документе.

[00116] Как показано на фиг.3А, 3В, 4А и 4В, H1 НА, содержащий остаток в положении 97, измененный, например, с аспарагина (N, Asn) на аспарагиновую кислоту (Asp; D), далее обозначаемый как N97D, показал увеличение титра гемагглютинации до 1200% по сравнению с H1 НА, который содержит аспарагин (N, Asn) в этом положении (смотрите также таблицу 5А). На фиг. 3А показано, что НА из A/Michigan/45/15 с заменой N97D демонстрирует приблизительно 1100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с A/Michigan/45/15 НА дикого типа (также обозначаемого как H1 Michigan). НА из A/Honduras/17734/16 с заменой N97D продемонстрировал приблизительно 375%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с A/Honduras/17734/16 НА дикого типа (смотрите фиг.4А и 4В). Кроме того, как показано на фиг.4А и 4В, НА из A/Darwin/11/15 с заменой N97D демонстрирует приблизительно 300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с A/Darwin/11/15 НА дикого типа.

[00117] Таким образом, согласно одному аспекту предусмотрено, что остаток в положении 97 (нумерация в соответствии с нумерацией A/California/07/09 НА) H1 НА может быть модифицирован для замещения заряженной аминокислоты в положении 97 полярной аминокислотой в положении 97 для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, белок H1 НА может быть модифицирован для содержания аспарагиновой кислоты (D, Asp) или любой другой полярной аминокислоты, например, глутамина (Q, Gln), гистидина (Н, His), серина (S, Ser), треонина (Т, Thr), тирозина (Y, Tyr), цистеина (С, Cys) или триптофана (W, Trp), в положении 97.

[00118] H1 НА может быть модифицирован для замещения аспарагина (N, Asn) в положении 97 на не аспарагин в положении 97. Например, белок НА может быть мутирован, чтобы содержать аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn) в положении 97. Консервативная замена может, например, представлять собой глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серин (S, Ser). Кроме того, H1 НА может быть модифицирован для замещения не аспарагиновой кислоты (D, Asp) аспарагиновой кислотой (D, Asp) или консервативной заменой аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn) в положении 97. Консервативная замена аспарагиновой кислоты может, например, представлять собой глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серин (S, Ser).

[00119] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 (SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность содержит аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серин (S, Ser), в положении 97, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00120] В настоящем описании также представлена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный H1 НА с заменой в положении 97, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00121] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 (SEQ ID NO: 134), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок H1 НА, который содержит аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серин (S, Ser), в положении 97, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00122] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, кодирующий аминокислотный остаток 97 модифицированного H1 НА, кодирует аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), например, глутаминовую кислота (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серин (S, Ser), в положении 97, и причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе.

[00123] Например, модифицированный H1 НА может содержать одну или более модификаций; причем по меньшей мере остаток 97 H1 НА модифицирован, как описано в настоящем документе. Например, модифицированный H1 НА может представлять собой монозамещенный, дизамещенный, тризамещенный или четырехзамещенный H1 НА, в котором модифицирован по меньшей мере остаток в положении 97. В неограничивающих примерах модифицированный H1 НА может содержать замещенный остаток в положении 97 и одну или более замен в положениях 374, 390, 429 или их комбинацию, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе.

[00124] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положении 97, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положении 97, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00125] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положении 97, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положении 97, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00126] Настоящее описание дополнительно предусматривает VLP, содержащую H1 НА с заменой в положении 97. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим раскрытием. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

Модификация в положении 374

[00127] Согласно одному аспекту настоящего раскрытия остаток в положении 374 в H1 НА (нумерация в соответствии с нумерацией A/California/07/09 НА) может быть замещен. Этот остаток расположен в части стебля H1 НА.

[00128] Cotter et al. (PLoS Pathog. 2014; 10(1): e1003831) идентифицировали, что мутация E47K (нумерация НА2) в области ножки A/California/07/09 НА стабилизировала структуру тримера, понижала рН для слияния мембран и увеличивала термическую и кислотную стабильность вируса. Положение 47 области ножки НА2 H1N1 в Cotter эквивалентно положению 374 (нумерация НАО в A/California/7/2009) в настоящем раскрытии. Cotter et al. дополнительно наблюдали, что мутант E47K A/California/7/2009 НА был более заразен для хорьков, чем его аналог дикого типа. Подобные результаты были получены Yang et al. 2014 г. (J. Virol. May 2014 vol. 88 no. 94828-4838), который показал, что введение основного бокового изменения в положении 374 путем замены глутаминовой кислоты на лизин в этом положении потенциально образует новый солевой мостик на границе раздела мономеров с Glu 21 на соседней цепи и, таким образом, улучшает стабильность при более низком рН. Yang et al. обнаружили, что присутствие лизина в положении 374 увеличивает способность мутантного тримера эктодомена Тех09 противостоять изменениям как тепла, так и кислотности до уровней, эквивалентных уровням Wash 11 recHA.

[00129] Однако неожиданно было обнаружено, что замещение, например, лизина (K, Lys) глутаминовой кислотой (Е, Glu) в положении 374 (K374E) НА вируса гриппа H1 Michigan (A/Michigan/45/15 (H1N1)) приводит к приблизительно 1200%-ному увеличению титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений, экспрессирующих H1 НА дикого типа (смотрите фиг. 3А, 3В, 4А, 4В и таблицу 5А).

[00130] Таким образом, согласно одному аспекту предусмотрено, что остаток в положении 374 (нумерация в соответствии с нумерацией A/California/07/09 НА) H1 НА может быть модифицирован для замещения не глутаминовой кислоты глутаминовой кислотой (Е, Glu) в положении 374 для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. H1 НА может быть модифицирован для замещения не глутаминовой кислоты глутаминовой кислотой (Е, Glu) или консервативной заменой глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновой кислотой (D, Asp), глутамином (Q, Gln), аргинином (R, Arg), аспарагином (N, Asn), гистидином (Н, His) или серином (S, Ser). Кроме того, лизин (K, Lys) в положении 374 может быть заменен на не лизин в положении 374 для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, лизин (K, Lys) в положении 374 может быть заменен глутаминовой кислотой (Е, Glu) или консервативной заменой глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновой кислотой (D, Asp), глутамином (Q, Gln), аргинином (R, Arg), аспарагином (N, Asn), гистидином (Н, His) или серином (S, Ser).

[00131] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 Michigan (A/Michigan/45/15, SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность содержит глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), в положении 374, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00132] В настоящем описании также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую H1 НА с заменой в положении 374, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00133] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 Michigan (A/Michigan/45/15, SEQ ID NO: 136), причем нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинина, который содержит глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), в положении 374, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00134] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, кодирующий аминокислотный остаток 374, кодирует глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00135] Например, модифицированный H1 НА может содержать одну или более модификаций; причем по меньшей мере остаток 374 H1 НА модифицирован, как описано в настоящем документе. Например, модифицированный H1 НА может представлять собой монозамещенный, дизамещенный, тризамещенный или четырехзамещенный H1 НА, в котором модифицирован по меньшей мере остаток в положении 374. В неограничивающих примерах модифицированный H1 НА может содержать замещенный остаток в положении 374 и одну или более замен в положениях 97, 390, 429 или их комбинацию, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе.

[00136] Кроме того, в настоящем описании представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положении 374, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положении 374, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00137] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положении 374, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положении 374, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00138] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая H1 НА с заменой в положении 374. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

Модификация в положении 390

[00139] Согласно одному аспекту настоящего раскрытия остаток в положении 390 в H1 НА (нумерация в соответствии с нумерацией A/California/07/09 НА) может быть заменен.

[00140] В публикации международной заявки WO 2013/177444 и сопутствующей публикации Lu et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111(1): 125-30) сообщили о способе получения правильно свернутого домена стебля НА из A/California/05/2009 (H1N1) с использованием бесклеточной системы экспрессии белка на основе Escherichia coli и простого протокола рефолдинга. Для индукции тримеризации домена стебля НА либо хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (CAT), либо домен сборки сливали с С-концом НА. Для уменьшения подвергшейся новому воздействию гидрофобности и/или образования пар межмолекулярных ионов, вызывающих агрегацию экспрессированного белка стебля НА, оценивали пять групп мутаций: M1 (I69T + I72E + I74T + С77Т); М2 (I69T + I72E + I74T + С77Т + F164D); М3 (I69T + I72E + I74T + С77Т + F164D + L174D); М4 (F164D) и М5 (F164D + L174D). Lu отмечает, что выход растворимых мутантов был низким и что образовывались нерастворимые тельца включения. Lu также отмечает, что мутанты М3 и М5 производили гораздо меньше агрегатов, чем другие варианты дикого типа, и поэтому дополнительно разрабатывали мутант М5 (F164D + L174D). Lu наблюдал, что мутации М5 (F164D + L174D) оказались наиболее влиятельными мутациями для улучшения растворимости белков стебля НА. Положение 164 Lu эквивалентно положению 390 в настоящем раскрытии. Мутация Lu М4 (F164D) не показала никаких преимуществ по сравнению с другими испытанными мутациями и фактически уступала мутациям М3 (I69T + I72E + I74T + С77Т + F164D + L174D) и М5 (F164D + L174D).

[00141] Когда фенилаланин (F, Phe) в положении 390 и лейцин (L, Leu) в положении 400 (нумерация H1 НА), который соответствует фенилаланину в положении 164 и лейцину в положении 174 М5 (F164D + L174D) Lu, были изменены в H1 НА настоящего раскрытия, никакого увеличения выхода VLP не наблюдалось, и мутант F390D + L400D H1 показал полную потерю активности гемагглютинации (данные не показаны). Следовательно, эквивалентная мутация мутанта М5 в Lu не привела к улучшению характеристик H1 НА, который экспрессировался в растениях.

[00142] Неожиданно было обнаружено, что когда гидрофобная аминокислота в положении 390 в H1 НА была заменена заряженной аминокислотой, приблизительно 60%-ное увеличение выхода VLP после очистки градиентом йодиксанола наблюдалось у растений, экспрессирующих H1 НА с заменой в положении 390 по сравнению с растениями, которые были инфильтрированы конструкцией дикого типа (смотрите фиг. 3В, 4А, 4В, таблицы 5А, 5В). Кроме того, как показано в таблице 5С, полный технологический выход увеличился до 226%. Однако эквивалентная модификация НА из Н5 (F393D) приводит к снижению титра гемагглютинации (смотрите фиг. 5, таблицу 6).

[00143] Таким образом, согласно одному аспекту предусмотрено, что остаток в положении 390 (нумерация в соответствии с нумерацией A/California/07/09 НА) H1 НА может быть модифицирован для замены гидрофобной аминокислоты в положении 390 заряженной аминокислотой в положении 390 для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, белок H1 НА может быть модифицирован для содержания аспарагиновой кислоты (D, Asp) или консервативной замены аспарагиновой кислоты (D, Asp) в положении 390. Консервативная замена аспарагиновой кислоты может, например, представлять собой аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser).

[00144] H1 НА может быть модифицирован для замены не аспарагиновой кислоты на аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp) в положении 390. Консервативная замена аспарагиновой кислоты может, например, представлять собой аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser). Кроме того, H1 НА может быть модифицирован для замены фенилаланина (F, Phe) в положении 390 на не фенилаланин в положении 390. Например, белок НА может быть модифицирован для содержания аспарагиновой кислоты (D, Asp) или консервативной замены аспарагиновой кислоты (D, Asp) в положении 390. Консервативная замена аспарагиновой кислоты может, например, представлять собой аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser).

[00145] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность содержит аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 390, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00146] В настоящем раскрытии также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный H1 НА с заменой в положении 390, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00147] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 136), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок H1 НА, который содержит аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 390, причем модифицированная последовательность НА H1 не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00148] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 390 модифицированного H1 НА, кодирует аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 390, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00149] Например, модифицированный H1 НА может содержать одну или более модификаций; причем по меньшей мере остаток 390 H1 НА модифицирован, как описано в настоящем документе. Например, модифицированный H1 НА может представлять собой монозамещенный, дизамещенный, тризамещенный или четырехзамещенным H1 НА, в котором модифицирован по меньшей мере остаток в положении 390. В неограничивающих примерах модифицированный H1 НА может содержать замещенный остаток в положении 390 и одну или более замен в положениях 97, 374, 380, 429 или их комбинацию.

[00150] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положении 390, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положении 390, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые делают возможной экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00151] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положении 390, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положении 390, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00152] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая H1 НА с заменой в положении 390. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

Модификация в положении 429

[00153] Согласно одному аспекту настоящего раскрытия остаток в положении 429 в H1 НА (нумерация в соответствии с H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)) может быть модифицирован.

[00154] Antanasijevic et at. (J Biol Chem. 2014; 289(32): 22237-45) исследовали структурно-функциональные свойства области петля-на-стебле НА Н5 посредством сайт-направленного мутагенеза в 14 различных положениях. Antanasijevic обнаружил, что мутанты HA1-D26K, HA1-M102L, HA2-V52A и HA2-I55A (на основании нумерации Н3) демонстрируют значительно сниженные уровни общего НА, что предполагает снижение экспрессии и/или сборки НА в вирусные частицы. Мутанты HA1-D26K, НА2-Т49А и HA2-M102L также проявляли более низкие титры гемагглютинации по сравнению с вирусом дикого типа. Положение 102 в НА Н5 Antanasijevic соответствует положению 429 в H1 НА текущего описания.

[00155] Когда H1 НА был модифицирован для внесения изменений в V19I (НА1-I28V), L20M (HA1-M31L), Т368А (НА2-Т41А), N380A (HA2-N53A) или L429M (НА2-M102L), было обнаружено, что это приводит к полной потере активности Т368А, V19I и L20M обладают более низкой активностью, тогда как N380A и L429M проявляют более высокую активность, чем НА H1 A/California дикого типа.

[00156] Таким образом, кажется, что большинство остатков, идентифицированных Antanasijevic как важные для экспрессии и/или сборки или титра гемагглютинации НА из Н5, не транслируются в аналогичное значение в НА из H1.

[00157] Однако, как показано на фиг. 2А, 2В, 2С, 3В, 4А и 4В, когда остаток 429 в H1 НА был мутирован из лейцина (L, Leu) в метионин (М, Met), модифицированный H1 НА проявлял увеличение титра гемагглютинации (100-160%) по сравнению с НА H1 дикого типа (также смотрите таблицу 5А). Кроме того, как видно на фиг. 2С, растения, экспрессирующие H1 НА с заменой в положении 429, показывают приблизительно 30%-ное увеличение выхода VLP после очистки в градиенте сахарозы по сравнению с растениями, инфильтрованными конструкцией дикого типа (также смотрите таблицу 5В). Кроме того, как показано в таблице 5С, полный технологический выход увеличился до 260%.

[00158] Кроме того, дизамещенный H1 НА, в котором фенилаланин в положении 390 был модифицирован до аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 был модифицирован до метионина, демонстрировал приблизительно 60%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с немодифицированным H1 НА (смотрите фиг. 2В).

[00159] Согласно одному аспекту, следовательно, предусмотрено, что остаток в положении 429 (нумерация в соответствии с аминокислотной последовательностью H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)) H1 НА может быть модифицирован для замены лейцина (L, Leu) в положении 429 на другую гидрофобную аминокислоту, которая не представляет собой лейцин, для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, белок H1 НА может быть модифицирован, чтобы содержать метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), который не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429.

[00160] Кроме того, H1 НА может быть модифицирован для замены лейцина (L, Leu) в положении 429 на не лейцин в положении 429. Например, белок НА может быть мутирован, чтобы содержать метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не является лейцином (L, Leu), в положении 429. Консервативной заменой метионина может быть, например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe). Кроме того, H1 НА может быть модифицирован для замены не метионина в положении 429 на метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), в положении 429. Консервативная замена метионина может, например, представлять собой изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe).

[00161] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 Michigan (A/Michigan/45/15 (H1N1), SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность содержит метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00162] Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный H1 НА с заменой в положении 429, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00163] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 136), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок H1 НА, который содержит метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00164] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 429 модифицированного H1 НА, кодирует метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая представляет собой не лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность НА H1 не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00165] Например, модифицированный H1 НА может содержать одну или более модификаций; причем по меньшей мере остаток 429 H1 НА модифицирован, как описано в настоящем документе. Например, модифицированный H1 НА может представлять собой монозамещенный, дизамещенный, тризамещенный или четырехзамещенный H1 НА, причем модифицирован по меньшей мере остаток в положении 429. В неограничивающих примерах модифицированный H1 НА может содержать замещенный остаток в положении 429 и одну или более замен в положениях 97, 374, 380, 390 или их комбинацию.

[00166] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положении 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положении 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00167] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положении 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положении 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00168] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая H1 НА с заменой в положении 429. VLP может быть получена способом, предусмотренным в настоящем описании. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

Дизамещенный H1 НА

[00169] Кроме того, предусмотрены белки H1 НА, которые содержат по меньшей мере дизамещение или димодификацию. Соответственно, белок H1 НА содержит по меньшей мере две модификации по сравнению с белком H1 НА дикого типа. Например, H1 НА может содержать любые две комбинации следующих модифицированных остатков: 97, 374, 380, 390 и 429 (нумерация в соответствии с H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)).

Модификация положений 380 и 429

[00170] Согласно одному аспекту описания модифицированный H1 НА может содержать по меньшей мере модифицированные остатки в положениях 380 и 429.

[00171] Как показано на фиг. 3В, H1 НА, содержащий остаток в положении 380, модифицированный из аспарагина в аланин, и остаток в положении 429, модифицированный из лейцина в метионин, демонстрирует приблизительно 800%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с H1 НА дикого типа (также смотрите таблицу 5 А).

[00172] Таким образом, согласно одному аспекту предусмотрено, что остатки в положениях 380 и 429 (нумерация в соответствии с H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)) H1 НА могут быть модифицированы для замещения аспарагина (N, Asn) в положении 380 на не аспарагин в положении 380 и для замещения лейцина (L, Leu) в положении 429 на не лейцин в положении 429 для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, H1 НА может быть модифицирован для замещения полярной аминокислоты в положении 380 гидрофобной аминокислотой в положении 380 и для замещения лейцина (L, Leu) в положении 429 другой гидрофобной аминокислотой, которая не представляет собой лейцин, для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью.

[00173] Например, белок H1 НА может быть модифицирован таким образом, чтобы он содержал аланин (A, Ala) или консервативную замену аланина в положении 380. Консервативная замена аланина может, например, представлять собой серии (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val). Кроме того, белок H1 НА может быть модифицирован, чтобы содержать метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429.

[00174] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность содержит аланин или консервативную замену аланина, например, серии (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val), в положении 380, и аминокислотная последовательность содержит метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00175] В настоящем описании также представлена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный H1 НА с заменой в положениях 380 и 429, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00176] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 136), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок H1 НА, который содержит аланин или консервативную замену аланина, например, серии (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val), в положении 380, и метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00177] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 380 модифицированного H1 НА, кодирует аланин или консервативную замену аланина, например, серии (S, Ser), глицин (G, Gly), треонин (Т, Thr), цистеин (С, Cys) или валин (V, Val), а нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 429 модифицированного H1 НА, кодирует метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00178] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 380 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положениях 380 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые допускают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00179] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 380 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положениях 380 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые допускают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00180] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая H1 НА с заменой в положениях 380 и 429. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

Модификация положений 390 и 429

[00181] Согласно одному аспекту настоящего описания модифицированный H1 НА может содержать по меньшей мере модифицированные остатки в положениях 390 и 429.

[00182] Как показано на фиг. 2В, 3В, 4А, 4В и в таблице 5А, H1 НА, содержащий остаток в положении 390, модифицированный из фенилаланина в аспарагиновую кислоту, и остаток в положении 429, модифицированный из лейцина в метионин, демонстрировал приблизительно 400-1200%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с H1 НА дикого типа. Кроме того, как показано в таблице 5С, полный технологический выход увеличился до 633%.

[00183] Таким образом, согласно одному аспекту предусмотрено, что остатки в положениях 390 и 429 (нумерация в соответствии с H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)) H1 НА могут быть модифицированы для замещения фенилаланина (F, Phe) в положении 390 на не фенилаланин в положении 390 и для замещения лейцина (L, Leu) в положении 429 на не лейцин в положении 429 для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, H1 НА может быть модифицирован для замещения гидрофобной аминокислоты в положении 390 заряженной аминокислотой в положении 390 и для замещения лейцина (L, Leu) в положении 429 другой гидрофобной аминокислотой, которая не представляет собой лейцин, для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью.

[00184] Например, белок H1 НА может быть модифицирован для содержания аспарагиновой кислоты (D, Asp) или консервативной замены аспарагиновой кислоты (D, Asp) в положении 390. Консервативной заменой может быть, например, аспарагин (N, Asn), глутаминовая кислота (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser). Кроме того, белок H1 НА может быть модифицирован, чтобы содержать метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429.

[00185] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность содержит аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 390, и аминокислотная последовательность содержит метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00186] В настоящем описании также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный H1 НА с заменой в положениях 390 и 429, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00187] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 136), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок H1 НА, который содержит аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 390, и метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00188] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 390 модифицированной H1 НА, кодирует аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), а нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 429 модифицированного H1 НА, кодирует метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00189] Например, модифицированный H1 НА может содержать одну или более модификаций; причем по меньшей мере остатки 390 и 429 H1 НА модифицированы, как описано в настоящем документе. Например, модифицированный H1 НА может представлять собой дизамещенный, тризамещенный или четырехзамещенный H1 НА, причем по меньшей мере остатки в положениях 390 и 429 модифицированы. В неограничивающих примерах модифицированный H1 НА может содержать замещенный остаток в положениях 390 и 429 и одну или более замен в положениях 97, 374, 380 или их комбинацию.

[00190] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 390 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный НА H1 с заменой в положениях 390 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые допускают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00191] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 390 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный НА H1 с заменой в положениях 390 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00192] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая H1 НА с заменой в положениях 390 и 429. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

Модификация положений 97 и 374

[00193] Согласно одному аспекту настоящего раскрытия модифицированный H1 НА может содержать по меньшей мере модифицированные остатки в положениях 97 и 374.

[00194] Как показано на фиг. 3В и в таблице 5А, H1 НА, содержащий остаток в положении 97, модифицированный из аспарагина в аспарагиновую кислоту, и остаток в положении 374, модифицированный из лизина в глутаминовую кислоту, демонстрируют приблизительно 1200%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с H1 НА дикого типа.

[00195] Таким образом, согласно одному аспекту предусмотрено, что остатки в положениях 97 и 374 (нумерация в соответствии с H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)) H1 НА могут быть модифицированы для замещения аспарагина (N, Asn) в положении 97 на не аспарагин в положении 97 и для замещения лизина (K, Lys) в положении 374 на не лизин в положении 374 для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, H1 НА может быть модифицирован для замещения заряженной аминокислоты в положении 97 на полярную аминокислоту в положении 97 и для замещения заряженной аминокислоты в положении 374 на другую заряженную аминокислоту, которая не представляет собой лизин (K, Lys), для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью.

[00196] Например, белок H1 НА может быть модифицирован для содержания аспарагиновой кислоты (D, Asp) или консервативной замены аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не находится в положении 97 аспарагина (N, Asn). Консервативная замена может, например, представлять собой глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser). Кроме того, белок H1 НА может быть модифицирован для содержания глутаминовой кислоты (Е, Glu) или консервативной замены глутаминовой кислоты (Е. Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновой кислоты (D, Asp), глутамина (Q, Gln), аргинином (R, Arg), аспарагина (N, Asn), гистидина (Н, His) или серина (S, Ser), в положении 374.

[00197] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность в положении 97 содержит аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn); например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 97, и аминокислотная последовательность содержит в положении 374 глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00198] В настоящем описании также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97 и 374, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00199] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 136), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок НА H1, который содержит в положении 97 аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn); например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), и аминокислотная последовательность содержит в положении 374 глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (H, His) или серии (S, Ser), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00200] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, кодирующий аминокислотный остаток 97 модифицированного H1 НА, кодирует аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn); например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), и нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 374 модифицированного H1 НА, кодирует глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00201] Например, модифицированный H1 НА может содержать одну или более модификаций; причем по меньшей мере остатки 97 и 374 H1 НА модифицированы, как описано в настоящем документе. Например, модифицированный H1 НА может представлять собой дизамещенный, тризамещенный или четырехзамещенный H1 НА, причем по меньшей мере остатки в положениях 97 и 374 модифицированы. В неограничивающих примерах модифицированный H1 НА может содержать замещенный остаток в положениях 97 и 374 и одну или более замен в положениях 380, 390 и 429 или их комбинацию.

[00202] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97 и 374, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97 и 374, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые допускают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00203] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97 и 374, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97 и 374, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые допускают экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00204] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая H1 НА с заменой в положениях 97 и 374. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

Тризамещенный H1 НА

Модификация в положениях 97, 390 и 429

[00205] Кроме того, предусмотрены белки H1 НА, которые содержат по меньшей мере три-замену или три-модификацию. Соответственно, белок H1 НА содержит по меньшей мере три модификации по сравнению с белком НА дикого типа. Например, H1 НА может содержать любые три комбинации следующих модифицированных остатков: 97, 374, 390 и 429 (нумерация в соответствии с H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)).

[00206] Согласно одному аспекту настоящего описания модифицированный H1 НА может содержать модифицированные остатки по меньшей мере в положениях 97, 390 и 429.

[00207] Как показано, например, на фиг. 3В, 4А и 4В, H1 НА, содержащий остаток в положении 97, модифицированный из аспарагина в аспарагиновую кислоту, остаток в положении 390, модифицированный из фенилаланина в аспарагиновую кислоту, и остаток 429, модифицированный из лейцина в метионин, проявляет приблизительно 2600%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с H1 НА дикого типа. Кроме того, как показано в таблице 5С, полный технологический выход увеличился до 647%.

[00208] Таким образом, согласно одному аспекту предусмотрено, что остатки в положениях 97, 390 и 429 (нумерация в соответствии с H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)) H1 НА могут быть модифицированы для замещения аспарагина (N, Asn) в положении 97 на не аспарагин, фенилаланина (F, Phe) в положении 390 на не фенилаланин и замещения лейцина в положении 429 на не лейцин (L, Leu) для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, H1 НА может быть модифицирован для замещения полярной аминокислоты на заряженную аминокислоту в положении 97, гидрофобной аминокислоты в положении 390 на заряженную аминокислоту и замещения лейцина в положении 429 на другую гидрофобную аминокислоту, которая не представляет собой лейцин, для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью.

[00209] Например, белок H1 НА может быть модифицирован для содержания аспарагиновой кислоты (D, Asp) или консервативной замены аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), в положении 97. Консервативной заменой аспарагиновой кислоты может быть, например, глутаминовая кислота (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser). Модифицированный H1 НА может дополнительно содержать аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp) в положении 390. Консервативной заменой аспарагиновой кислоты может быть, например, аспарагин (N, Asn), глутаминовая кислота (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser). Кроме того, белок H1 НА может быть модифицирован, чтобы содержать метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429.

[00210] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность содержит в положении 97 аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), аминокислотная последовательность содержит в положении 390 аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), и аминокислотная последовательность содержит в положении 429 метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), который не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00211] В настоящем раскрытии также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97, 390 и 429, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00212] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 136), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок H1 НА, который содержит аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 97, аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 390, и метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), который не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00213] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 97 модифицированного H1 НА, кодирует аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая представляет собой не аспарагин (N, Asn), например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 390 модифицированного H1 НА, кодирует аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), и нуклеотидный кодон который кодирует аминокислотный остаток 429 модифицированного H1 НА, кодирует метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), который не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00214] Например, модифицированный H1 НА может содержать одну или более модификаций; причем по меньшей мере остатки 97, 390 и 429 H1 НА модифицированы, как описано в настоящем документе. Например, модифицированный H1 НА может представлять собой тризамещенный или четырехзамещенный H1 НА, в котором модифицированы остатки по меньшей мере в положениях 97, 390 и 429. В неограничивающих примерах модифицированный H1 НА может содержать замещенные остатки в положениях 97, 390, 429 и 374.

[00215] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97, 390 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменами в положениях 97, 390 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00216] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97, 390 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97, 390 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00217] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая H1 НА с заменой в положениях 97, 390 и 429. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

Модификация положений 374, 390 и 429

[00218] Согласно одному аспекту настоящего изобретения модифицированный H1 НА может содержать модифицированные остатки по меньшей мере в положениях 374, 390 и 429.

[00219] Как показано, например, на фиг. 3В, H1 НА, содержащий остаток в положении 374, модифицированный из лизина в глутаминовую кислоту, остаток в положении 390, модифицированный из фенилаланина в аспарагиновую кислоту, и остаток 429, модифицированный из лейцина в метионин, показал приблизительно 2500%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с НА H1 дикого типа. Кроме того, как показано в таблице 5С, полный технологический выход увеличился до 689%.

[00220] Таким образом, согласно одному аспекту предусмотрено, что остатки в положениях 374, 390 и 429 (нумерация в соответствии с H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)) H1 НА могут быть изменены для замещения лизина (K, Lys) в положении 374 на не лизин, фенилаланина (F, Phe) в положении 390 на не фенилаланин и замещение лейцина в положении 429 на не лейцин для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, H1 НА может быть модифицирован для замещения лизина заряженной аминокислотой, которая не представляет собой лизин, в положении 374, гидрофобной аминокислоты в положении 390 заряженной аминокислотой и для замещения лейцина (L, Leu) в положении 429 другой гидрофобной аминокислотой, которая не представляет собой лейцин, для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью.

[00221] Например, белок H1 НА может быть модифицирован для содержания глутаминовой кислоты (Е, Glu) или консервативной замены глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновой кислоты (D, Asp), глутамина (Q, Gln), аргинина (R, Arg), аспарагина (N, Asn), гистидина (Н, His) или серина (S, Ser), в положении 374. Модифицированный H1 НА может дополнительно содержать аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp) в положении 390. Консервативной заменой может быть, например, аспарагин (N, Asn), глутаминовая кислота (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser). Кроме того, белок H1 НА может быть модифицирован, чтобы содержать метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429.

[00222] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность содержит в положении 374 глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), аминокислотная последовательность содержит в положении 390 аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), и аминокислотная последовательность содержит в положении 429 метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00223] В настоящем описании также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный НА H1 с заменой в положениях 374, 390 и 429, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00224] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 136), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок H1 НА, который содержит глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), в положении 374, аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 390, и метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), который не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429, причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00225] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 374 модифицированного H1 НА, кодирует глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая представляет собой не лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 390 модифицированного H1 НА, кодирует аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), и нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 429 модифицированного H1 НА, кодирует метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая представляет собой не лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00226] Например, модифицированный H1 НА может содержать одну или более модификаций; причем по меньшей мере остатки 374, 390 и 429 H1 НА модифицированы, как описано в настоящем документе. Например, модифицированный H1 НА может представлять собой тризамещенный или четырехзамещенный H1 НА, в котором по меньшей мере остатки в положениях 374, 390 и 429 модифицированы. В неограничивающих примерах модифицированный H1 НА может содержать замещенные остатки в положениях 374, 390, 429 и 97.

[00227] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 374, 390 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменами в положениях 374, 390 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00228] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 374, 390 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положениях 374, 390 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00229] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая H1 НА с заменой в положениях 374, 390 и 429. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

Четырехзамещенный H1 НА

Модификация в положениях 97, 374, 390 и 429

[00230] Кроме того, предусмотрены белки H1 НА, которые содержат по меньшей мере четыре замены или четыре модификации. Соответственно, белок H1 НА содержит по меньшей мере четыре модификации по сравнению с белком НА H1 дикого типа. Например, H1 НА может содержать модификации в положениях 97, 374, 390 и 429 (нумерация в соответствии с H1 A/Michigan/45/15 (SEQ ID NO: 134)).

[00231] Соответственно, согласно одному аспекту настоящего описания модифицированный H1 НА может содержать модифицированные остатки по меньшей мере в положениях 97, 374, 390 и 429.

[00232] Как показано, например, на фиг. 3В, H1 НА, содержащий остаток в положении 97, модифицированный из аспарагина в аспарагиновую кислоту, остаток в положении 374, модифицированный из лизина в глутаминовую кислоту, остаток в положении 390, модифицированный из фенилаланина в аспарагиновую кислоту, и остаток в положении 429, модифицированный из лейцина в метионин, продемонстрировал приблизительно 3300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с H1 НА дикого типа.

[00233] Таким образом, согласно одному аспекту предусмотрено, что остатки в положениях 97, 374, 390 и 429 (нумерация в соответствии с A/California/07/09 НА) H1 НА могут быть модифицированы для замещения аспарагина (N, Asn) в положении 97 на не аспарагин, лизина в положении 374 на не лизин, фенилаланина (F, Phe) в положении 390 на не фенилаланин и замещения лейцина в положении 429 на не лейцин для получения модифицированного H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью. Например, H1 НА может быть модифицирован, чтобы заменить полярную аминокислоту заряженной аминокислотой в положении 97, заменить лизин заряженной аминокислотой, которая не представляет собой лизин, в положении 374, заменить гидрофобную аминокислоту в положении 390 заряженной аминокислотой и заменить лейцин (L, Leu) в положении 429 другой гидрофобной аминокислотой, которая не представляет собой лейцин, чтобы получить модифицированный H1 НА с не встречающейся в природе последовательностью.

[00234] Например, белок НА H1 может быть модифицирован для содержания аспарагиновой кислоты (D, Asp) или консервативной замены аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), в положении 97. Консервативной заменой аспарагиновой кислоты может быть, например, глутаминовая кислота (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser). Кроме того, белок H1 НА может быть модифицирован для содержания глутаминовой кислоты (Е, Glu) или консервативной замены глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновой кислоты (D, Asp), глутамина (Q, Gln), аргинина (R, Arg), аспарагина (N, Asn), гистидина (Н, His) или серина (S, Ser), в положении 374. Модифицированный H1 НА может дополнительно содержать аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp) в положении 390. Консервативной заменой аспарагиновой кислоты может быть, например, аспарагин (N, Asn), глутаминовая кислота (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser). Кроме того, белок H1 НА может быть модифицирован, чтобы содержать метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), в положении 429.

[00235] Например, модифицированный белок H1 НА может содержать аминокислотную последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к аминокислотной последовательности НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 134), причем аминокислотная последовательность содержит в положении 97 аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), аминокислотная последовательность содержит в положении 374 глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), аминокислотная последовательность содержит в положении 390 аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), и аминокислотная последовательность содержит в положении 429 метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00236] В настоящем описании также предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97, 374, 390 и 429, как описано выше, функционально связанную с регуляторной областью, активной в растении.

[00237] Например, нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей НА из H1 A/Michigan/45/15 (H1N1) (SEQ ID NO: 136), причем нуклеотидная последовательность кодирует модифицированный белок H1 НА, который содержит аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 97, глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (Н, His) или серии (S, Ser), в положении 374, аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), в положении 390, и метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00238] Нуклеотидные последовательности могут характеризоваться идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим приблизительно 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое число между ними, по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 136, причем нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 97 модифицированного H1 НА, кодирует аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), которая не представляет собой аспарагин (N, Asn), например, глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 374 модифицированного H1 НА, кодирует глутаминовую кислоту (Е, Glu) или консервативную замену глутаминовой кислоты (Е, Glu), которая не представляет собой лизин (K, Lys), например, аспарагиновую кислоту (D, Asp), глутамин (Q, Gln), аргинин (R, Arg), аспарагин (N, Asn), гистидин (H, His) или серии (S, Ser), в положении 374, нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 390 модифицированного H1 НА, кодирует аспарагиновую кислоту (D, Asp) или консервативную замену аспарагиновой кислоты (D, Asp), например, аспарагин (N, Asn), глутаминовую кислоту (Е, Glu), глутамин (Q, Gln) или серии (S, Ser), и нуклеотидный кодон, который кодирует аминокислотный остаток 429 модифицированного H1 НА кодирует метионин (М, Met) или консервативную замену метионина (М, Met), которая не представляет собой лейцин (L, Leu), например, изолейцин (I, Не), глутамин (Q, Gln), валин (V, Val) или фенилаланин (F, Phe), причем модифицированная последовательность H1 НА не встречается в природе и причем белки НА при экспрессии образуют VLP.

[00239] Например, модифицированный H1 НА может содержать одну или более модификаций; причем по меньшей мере остатки 97, 374, 390 и 429 H1 НА модифицированы, как описано в настоящем документе. Например, модифицированный H1 НА может представлять собой четырехзамещенный H1 НА, в котором модифицированы остатки в положениях 97, 374, 390 и 429.

[00240] Кроме того, представлен способ получения VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97, 374, 390 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменами в положениях 97, 374, 390 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00241] Кроме того, представлен способ увеличения выхода VLP, которые содержат модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97, 374, 390 и 429, как описано выше, в растении. Способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный H1 НА с заменой в положениях 97, 374, 390 и 429, функционально связанной с регуляторной областью, активной в растении, в растение или часть растения, и инкубацию растения или части растения в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновой кислоты, тем самым производя VLP.

[00242] В настоящем описании дополнительно предусмотрена VLP, содержащая H1 НА с заменой в положениях 97, 374, 390 и 429. VLP может быть получена способом, предусмотренным настоящим описанием. VLP, содержащие модифицированный H1 НА, демонстрируют улучшенные характеристики по сравнению с VLP, которые содержат немодифицированный белок H1 НА.

[00243] В настоящем документе также представлены способы увеличения производства или выхода VLP, содержащих мутантные НА гриппа, в растениях. Например, способ может предусматривать введение нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный НА гриппа, как описано в настоящем документе, в растение, часть растения или растительную клетку. Нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный НА гриппа, может быть оптимизирована в отношении частоты использования кодонов человека, повышенного содержания GC или их комбинации. Один или более чем один мутантный белок НА гриппа может быть экспрессирован в растении, части растения или растительной клетке, чтобы производить VLP, содержащую один или более чем один мутантный белок НА гриппа. Альтернативно, способ может предусматривать получение растения, части растения или растительной клетки, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный белок НА гриппа, для получения VLP, содержащей один или более чем один мутантный белок НА гриппа.

[00244] Способы получения VLP, содержащей мутантный НА гриппа, могут дополнительно предусматривать стадию введения второй последовательности нуклеиновой кислоты в растение, часть растения или растительную клетку, причем вторая нуклеиновая кислота кодирует белок протонного канала, который коэкспрессируется с мутантным НА гриппа. Например, белок протонного канала может представлять собой белок М2 подтипа гриппа А, такой как A/New Caledonia/20/99 М2. Коэкспрессия белка протонного канала может приводить к повышенному накоплению мутантного белка НА гриппа и/или VLP, содержащих мутантный белок НА гриппа, как, например, описано в публикации международной заявки WO 2013/044390, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

[00245] Кроме того, мутантный НА гриппа может дополнительно содержать модифицированную протеолитическую петлю или сайт расщепления, как описано в публикациях международных заявок WO 2013/044390 и WO 2014/153674 и которые включены в настоящий документ посредством ссылки.

[00246] Под «коэкспрессией» подразумевается введение и экспрессия двух или более нуклеотидных последовательностей, причем каждая из двух или более нуклеотидных последовательностей кодирует представляющий интерес белок или фрагмент представляющего интерес белка, в растении, части растения или растительной клетке. Две или более нуклеотидных последовательностей могут быть введены в растение, часть растения или растительную клетку в одном векторе, так что каждая из двух или более нуклеотидных последовательностей находится под контролем отдельной регуляторной области (например, содержащей двойную конструкцию). Альтернативно, две или более нуклеотидных последовательностей могут быть введены в растение, часть растения или растительную клетку в отдельных векторах (например, содержащих одиночные конструкции), и каждый вектор содержит соответствующие регуляторные области для экспрессии соответствующей нуклеиновой кислоты. Например, две нуклеотидные последовательности, каждая в отдельном векторе и введенная отдельным хозяевам Agrobacterium tumefaciens, могут быть совместно экспрессированы путем смешивания суспензий каждого хозяина A. tumefaciens в желаемом объеме (например, равный объем или соотношении каждого хозяина A. tumefaciens может быть изменено) перед вакуумной инфильтрацией. Таким образом, совместная инфильтрация множества суспензий А. tumifaciens позволяет коэкспрессию множества трансгенов.

[00247] Нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный НА гриппа, как описано в настоящем документе, может дополнительно содержать последовательности, которые усиливают экспрессию мутантного НА гриппа в растении, части растения или растительной клетке. Последовательности, которые усиливают экспрессию, могут включать в себя энхансерный элемент вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей мутантный белок НА гриппа.

[00248] Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок гемагглютинин (НА) гриппа, как описано в настоящем документе, может дополнительно содержать последовательности, которые усиливают экспрессию белка НА в растении, части растения или растительной клетке. Последовательности, которые усиливают экспрессию, могут включать в себя элемент энхансера CPMV или энхансер экспрессии растительного происхождения в функциональной связи с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный белок гемагглютинин гриппа (НА). Последовательность, кодирующая модифицированный гемагглютинин (НА) гриппа, также может быть оптимизирована в отношении частоты использования кодонов человека, повышенного содержания GC или их комбинации.

[00249] Используемый в настоящем документе термин «энхансерный элемент CPMV» относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей 5'UTR, регулирующую полипептид RNA2 вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) или модифицированную последовательность CPMV, как известно в настоящей области техники. Например, энхансерный элемент CPMV или энхансер экспрессии CPMV включает в себя нуклеотидную последовательность, как описано в публикации международной заявки WO 2015/14367; WO 2015/103704; WO 2007/135480; WO 2009/087391; Sainsbury F., and LomonossofF G.P., (2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218), каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Последовательность энхансера CPMV может усиливать экспрессию гетерологичной открытой рамки считывания (ORF) ниже по ходу транскрипции, к которой они присоединены. Энхансер экспрессии CPMV может включать в себя CPMV НТ, CPMVX (где X=160, 155, 150, 114), например, CPMV 160, CPMVX + (где X=160, 155, 150, 114), например, CPMV 160+, CPMV-HT+, CPMV HT+[WT115] или CPMV НТ+[511] (публикации международной заявки WO 2015/143567; WO 2015/103704, которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Энхансер экспрессии CPMV можно использовать в системе экспрессии растений, содержащей регуляторную область, которая функционально связана с последовательностью энхансера экспрессии CPMV и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.

[00250] Используемый в настоящем документе термин «энхансерный элемент CPMV» относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей 5'UTR, регулирующую полипептид RNA2 вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) или модифицированную последовательность CPMV, как известно в настоящей области техники. Например, энхансерный элемент CPMV или энхансер экспрессии CPMV включает в себя нуклеотидную последовательность, как описано в публикации международной заявки WO 2015/14367; WO 2015/103704; WO 2007/135480; WO 2009/087391; Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., (2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218), каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Последовательность энхансера CPMV может усиливать экспрессию гетерологичной открытой рамки считывания (ORF) ниже по ходу транскрипции, к которой они присоединены. Энхансер экспрессии CPMV может включать в себя CPMV НТ, CPMVX, CPMVX+, CPMV-HT+, CPMV HT+[WT115] или CPMV НТ+[511] (публикации международной заявки WO 2015/14367; WO 2015/103704, которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Энхансер экспрессии CPMV можно использовать в системе экспрессии растений, содержащей регуляторную область, которая функционально связана с последовательностью энхансера экспрессии CPMV и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.

[00251] Термин «5'UTR» или «5'-нетранслируемая область», или «5'-лидерная последовательность» относится к участкам мРНК, которые не транслируются. 5'UTR, как правило, начинается в сайте старта транскрипции и заканчивается непосредственно перед сайтом инициации трансляции или стартовым кодоном кодирующей области. 5'-UTR может модулировать стабильность и/или трансляцию транскрипта мРНК.

[00252] Используемый в настоящем документе термин «энхансер экспрессии растительного происхождения» относится к нуклеотидной последовательности, полученной из растения, нуклеотидной последовательности, кодирующей 5'UTR. Примеры энхансера экспрессии растительного происхождения описаны в предварительной заявке на патент США №62/643053 (поданной 14 марта 2018 г.; которая включена в настоящий документ посредством ссылки) или в публикации Diamos A.G. et al. (2016, Front Pit Sci. 7: 1-15; которая включена в настоящий документ посредством ссылки). Энхансер экспрессии растительного происхождения может быть выбран из nbMT78, nbATL75, nbDJ46, nbCHP79, nbEN42, atHSP69, atGRP62, atPK65, atRP46, nb30S72, nbGT61, nbPV55, nbPPI43, nbPM64 и nbH2A, как описано в US 62/533A). Энхансер экспрессии растительного происхождения может использоваться в системе экспрессии растений, содержащей регуляторную область, которая функционально связана с последовательностью энхансера экспрессии растительного происхождения и представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.

[00253] Под «функционально связанными» подразумевается, что конкретные последовательности взаимодействуют либо прямо, либо опосредованно для выполнения намеченной функции, такой как опосредование или модуляция экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Взаимодействие функционально связанных последовательностей может, например, опосредоваться белками, которые взаимодействуют с функционально связанными последовательностями.

[00254] Когда один или более чем один мутантный белок НА гриппа экспрессируется в растении, части растения или растительной клетке, один или более чем один мутантный белок НА гриппа самособирается в VLP. Растение, часть растения или растительную клетку можно собирать в подходящих условиях экстракции и очистки для поддержания целостности VLP, и VLP, содержащие один или более чем один мутантный НА гриппа, можно очищать.

[00255] В настоящем изобретение также предусмотрено применение мутантного НА гриппа или VLP, содержащей мутантный НА гриппа, как описано в настоящем документе, для индукции иммунитета к инфекции гриппа у субъекта. В настоящем документе также раскрыто антитело или фрагмент антитела, полученные путем введения мутантного НА гриппа или VLP, содержащего мутантный НА гриппа, субъекту или животному-хозяину. Кроме того, предусмотрена композиция, содержащая эффективную дозу мутантного НА гриппа или VLP, содержащей мутантный НА гриппа, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант, наполнитель или вспомогательное вещество для индукции иммунного ответа у субъекта. Также предусмотрена вакцина для индукции иммунного ответа у субъекта, которая содержит эффективную дозу мутантного НА гриппа.

[00256] В настоящем документе также представлены способы индукции иммунитета к инфекции гриппа у субъекта, предусматривающие введение субъекту мутантного НА гриппа или VLP, содержащей мутантный НА гриппа, перорально, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

[00257] Используемый в настоящем документе термин «вирус гриппа» относится к штамму оболочечных вирусов семейства Orthomyxoviridae, который характеризуется геномом отрицательно направленной одноцепочечной РНК. Геном вируса гриппа содержит восемь генных сегментов, кодирующих 12-14 белков в зависимости от штамма.

[00258] Существует четыре типа вируса гриппа: А, В, С и D, из которых грипп А и В являются возбудителями сезонных эпидемий заболеваний у людей. Грипп А дополнительно классифицируется на основе экспрессии подтипов гликопротеинов НА и нейраминидазы (NA).

[00259] Используемый в настоящем документе термин «гемагглютинин» или «НА» относится к тримерному лектину, который облегчает связывание частицы вируса гриппа с белками, содержащими сиаловую кислоту, на поверхности клеток-мишеней и опосредует высвобождение вирусного генома в клетку-мишень. Существует 18 различных подтипов НА (Н1-Н18). Белки НА состоят из двух структурных элементов: головки, которая является основной мишенью серопротекторных антител; и ножки. НА транслируется как единый полипептид, HA0 (собранный в виде тримеров), который должен расщепляться сериновой эндопротеазой между субдоменами НА1 (~40 кДа) и НА2 (~20 кДа). После расщепления два домена белка с дисульфидной связью принимают необходимую конформацию, необходимую для вирусной инфекционности.

[00260] Белки НА гриппа А или модифицированные белки НА гриппа А, как раскрыто в настоящем документе, включают в себя любые известные белки НА, полученные из любого известного штамма гриппа А, а также модификации известных штаммов гриппа А, которые развиваются с течением времени. Например, НА гриппа может происходить из A/California/07/09 (H1N1), A/Michigan/45/15 (H1N1), A/Massachusetts/06/17 (H1N1), A/Costa Rica/0513/16 (H1N1), A/Honduras/17734/16 (H1N1) или A/Darwin/11/15 (H1N1). НА гриппа А может включать в себя НА, полученный из штаммов, где НА характеризуется идентичностью аминокислотной последовательности, составляющей приблизительно 30-100% или любое число между ними, по отношению к любому НА, полученному из штаммов гриппа А, перечисленных выше, при условии, что белок НА гриппа содержит по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способен образовывать VLP, индуцирует иммунный ответ при введении субъекту, индуцирует гемагглютинацию или их комбинацию.

[00261] Например, белки НА гриппа могут характеризоваться идентичностью аминокислотной последовательности (сходством последовательности, процентом идентичности, процентом сходства), составляющим 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100% или любое число между ними, по отношению к любым НА, полученным из перечисленных выше штаммов гриппа А, и содержать по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способны образовывать VLP, индуцировать иммунный ответ при введении субъекту, индуцировать гемагглютинацию или их комбинацию. Выравнивание аминокислотных последовательностей нескольких доменов НА гриппа А, которые не следует рассматривать как ограничивающие, показано на фиг. 1.

[00262] Термины «процент сходства», «сходство последовательностей», «процент идентичности» или «идентичность последовательностей», когда они относятся к конкретной последовательности, используются, например, как изложено в программном обеспечении GCG Университета Висконсина, или путем выравнивания вручную и визуального осмотра (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995, приложение). Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в настоящей области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с использованием алгоритма локальной гомологии Smith & Waterman, (1981, Adv. Appl. Math. 2: 482), с помощью алгоритма выравнивания гомологии Needleman & Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48: 443), способом поиска сходства Pearson & Lipman, (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (например, GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.).

[00263] Примером алгоритма, подходящего для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al., (1977, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402) и Altschul et al. (1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410), соответственно. BLAST и BLAST 2.0 используются с параметрами, описанными в настоящем документе, для определения процента идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и белков по настоящему изобретению. Например, программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) может использовать по умолчанию длину слова (W), равную 11, математическое ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP может использовать по умолчанию длину слова 3 и математическое ожидание (Е) 10, а также оценочную матрицу BLOSUM62 (смотрите Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) выравнивания (В) 50, математическое ожидание (Е) 10, М=5, N=-4, и сравнение обеих цепей. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (смотрите URL: ncbi.nlm.nih.gov/).

[00264] Используемый в настоящем документе термин «вирусоподобная частица», VLP, «вирусоподобные частицы» или «VLP» относится к частицам вируса гриппа, которые содержат один или более чем один белок НА гриппа и которые самособираются в нереплицирующиеся, неинфекционные структуры вирусного капсида, лишенные всех частей генома гриппа.

Производство белка НА гриппа в растениях

Белок НА гриппа А включает в себя любой белок НА, содержащий аминокислотную последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим от приблизительно 30 до приблизительно 100%, от приблизительно 40 до приблизительно 100%, от приблизительно 50 до приблизительно 100%, от приблизительно 60 до приблизительно 100%, от приблизительно 70 до приблизительно 100%, от приблизительно 80 до приблизительно 100%, от приблизительно 85 до приблизительно 100%, от приблизительно 90 до приблизительно 100%, от 95 до приблизительно 100% или от приблизительно 97 до приблизительно 100%, от приблизительно 98 до приблизительно 100% или любое число между ними, по отношению к последовательности НА гриппа А из A/California/07/09 (H1N1, SEQ ID NO: 130), A/Michigan/45/15 (H1N1, SEQ ID NO: 134), A/Massachusetts/06/17 (H1N1, SEQ ID NO: 135), A/Costa Rica/0513/16 (H1N1, SEQ ID NO: 133), A/Honduras/17734/16 (H1N1, SEQ ID NO: 131), A/Darwin/11/15 (H1N1, SEQ ID NO: 132), A/Paris/1227/2017 (SEQ ID NO: 138) и A/Norway/2147/2017 (SEQ ID NO: 139), при условии, что белок НА гриппа содержит по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способен образовывать VLP, вызывает иммунный ответ при введении субъекту, вызывает гемагглютинацию или их комбинацию.

[00265] Кроме того, модифицированный белок НА гриппа включает в себя любой белок НА, содержащий аминокислотную последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности или сходством последовательности, составляющим от приблизительно 30% до приблизительно 100%, от приблизительно 40% до приблизительно 100%, от приблизительно 50% до приблизительно 100%, от приблизительно 60%. до приблизительно 100%, от приблизительно 70% до приблизительно 100%, от приблизительно 80% до приблизительно 100%, от приблизительно 85% до приблизительно 100%, от приблизительно 90% до приблизительно 100%, от 95% до приблизительно 100% или от приблизительно 97% до приблизительно 100%, от приблизительно 98% до приблизительно 100% или любое число между ними, по отношению к последовательности из последовательностей SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, при условии, что белок НА гриппа содержит по меньшей мере одну замену, как описано в настоящем документе, и способен образовывать VLP, вызывает иммунный ответ при введении субъекту, индуцирует гемагглютинацию или их комбинацию.

[00266] Как описано в настоящем документе, одна или более специфических мутаций или модификаций НА гриппа приводит к повышенному накоплению белка НА и увеличению продукции VLP в растениях по сравнению с НА гриппа дикого типа.

[00267] Примеры мутантных белков НА гриппа А, характеризующихся повышенной продукцией НА и/или VLP вируса гриппа в растениях, включают в себя, без ограничения, следующие:

мутант F390D A/California/07/09 H1 (конструкция №2980, SEQ ID NO: 18); мутант L429M A/California/07/09 H1 (конструкция №2962, SEQ ID NO: 22); мутант F390D + L429M A/California/07/09 H1 (конструкция №2995, SEQ ID NO: 24); мутант N380A A/Michigan/45/15 H1 (конструкция №3644, SEQ ID NO: 105); мутант F390D + N380A H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3704, SEQ ID NO: 108); мутант N97D H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3774, SEQ ID NO: 28); мутант K374E H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3771, SEQ ID NO: 32); мутант F390D H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3641, SEQ ID NO: 36); мутант L429M H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3643, SEQ ID NO: 39); мутант N97D + K374E H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3880, SEQ ID NO: 41); мутант F390D + L429M H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3703, SEQ ID NO: 43); мутант N97D + F390D + L429M H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3879, SEQ ID NO: 45); мутант K374E + F390D + L429M H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3878, SEQ ID NO: 47); мутант N97D + K374E + F390D + L429M H1 A/Michigan/45/15 (конструкция №3881, SEQ ID NO: 49); мутант F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1 (конструкция №4091, SEQ ID NO: 51); мутант N97D + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1 (конструкция №4093, SEQ ID NO: 53); мутант K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1 (конструкция №4092, SEQ ID NO: 55); мутант N97D + K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1 (конструкция №4094, SEQ ID NO: 57); мутант F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 (конструкция №4715, SEQ ID NO: 59); мутант N97D + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 (конструкция №4717, SEQ ID NO: 61); мутант K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 (конструкция №4716, SEQ ID NO: 63); мутант N97D + K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 (конструкция №4718, SEQ ID NO: 65); мутант N97D A/Honduras/17734/16 H1 (конструкция №3950, SEQ ID NO: 68); мутант K374E A/Honduras/17734/16 H1 (конструкция №3948, SEQ ID NO: 72); мутант F390D A/Honduras/17734/16 H1 (конструкция №3945, SEQ ID NO: 75); мутант L429M A/Honduras/17734/16 H1 (конструкция №3949, SEQ ID NO: 80); мутант F390D + L429M A/Honduras/17734/16 H1 (конструкция №3946, SEQ ID NO: 82); мутант N97D + F390D + L429M A/Honduras/17734/16 H1 (конструкция №3951, SEQ ID NO: 84); мутант N97D A/Darwin/11/15 H1 (конструкция №3990, SEQ ID NO: 86); мутант K374E A/Darwin/11/15 H1 (конструкция №3988, SEQ ID NO: 89); мутант F390D A/Darwin/11/15 H1 (конструкция №3985, SEQ ID NO: 91); мутант L429M A/Darwin/11/15 H1 (конструкция №3989, SEQ ID NO: 93); мутант F390D + L429M A/Darwin/11/15 H1 (конструкция №3986, SEQ ID NO: 95); мутант N97D + F390D + L429M A/Darwin/11/15 H1 (конструкция №3991, SEQ ID NO: 97); мутант F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 (конструкция №4765, SEQ ID NO: 124), мутант K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 (конструкция №4766, SEQ ID NO: 126), мутант N97D + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 (конструкция №4767, SEQ ID NO: 128), мутант N97D + K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 (конструкция №4768, SEQ ID NO: 140); мутант F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 (конструкция №4775, SEQ ID NO: 142), мутант K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 (конструкция №4776, SEQ ID NO: 144), мутант N97D + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 (конструкция №4777, SEQ ID NO: 146) и мутант N97D + K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 (конструкция №4778, SEQ ID NO: 148).

Индукция иммунитета против инфекции гриппа

[00268] «Иммунный ответ», как правило, относится к ответу адаптивной иммунной системы субъекта. Адаптивная иммунная система, как правило, включает в себя гуморальный ответ и клеточно-опосредованный ответ. Гуморальный ответ представляет собой аспект иммунитета, который опосредуется секретируемыми антителами, производимыми клетками линии В-лимфоцитов (В-клетками). Секретируемые антитела связываются с антигенами на поверхности вторгающихся микробов (таких как вирусы или бактерии), что указывает на их уничтожение. Гуморальный иммунитет, как правило, используется для обозначения производства антител и процессов, которые его сопровождают, а также эффекторных функций антител, включая в себя активацию Th2-клеток и продукцию цитокинов, образование клеток памяти, опсониновую стимуляцию фагоцитоза, элиминацию патогенов и т.п. Термины «модулировать» или «модуляция» или подобные относятся к увеличению или уменьшению конкретного ответа или параметра, как определено любым из нескольких общеизвестных или используемых анализов, некоторые из которых приведены в настоящем документе в качестве примеров.

[00269] Клеточно-опосредованный ответ представляет собой иммунный ответ, который не включает в себя антитела, а скорее включает в себя активацию макрофагов, естественных клеток-киллеров (NK), антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождение различных цитокинов в ответ на антиген. Клеточно-опосредованный иммунитет, как правило, используется для обозначения некоторой активации Th-клеток, активации Тс-клеток и опосредованных Т-клетками ответов. Клеточный иммунитет может иметь особое значение в ответ на вирусные инфекции.

[00270] Например, индукцию антигенспецифических CDS-положительных Т-лимфоцитов можно измерить с помощью анализа ELISPOT; стимуляцию CD4-положительных Т-лимфоцитов можно измерить с помощью анализа пролиферации. Титры антител к НА гриппа можно количественно определить с помощью анализа ELISA; изотипы антигенспецифических или перекрестно-реактивных антител также можно измерить с использованием антиизотипических антител (например, к IgG, IgA, IgE или IgM). Способы и технологии проведения таких анализов хорошо известны в настоящей области техники.

[00271] Присутствие или уровни цитокинов также могут быть определены количественно. Например, ответ Т-хелперных клеток (Th1/Th2) будет охарактеризован путем измерения клеток, секретирующих IFN-β и IL-4, с использованием ELISA (например, наборов BD Biosciences OptEIA). Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или спленоциты, полученные от субъекта, можно культивировать, а супернатант анализировать. Т-лимфоциты также могут быть количественно определены с помощью сортировки активируемых флуоресценцией клеток (FACS) с использованием маркерных флуоресцентных меток и способов, известных в настоящей области техники.

[00272] Анализ микронейтрализации также может быть проведен для характеристики иммунного ответа у субъекта, смотрите, например, способы Rowe et al., 1973. Титры нейтрализации вируса могут быть определены количественно несколькими способами, включая в себя: подсчет гемолитических бляшек лизиса (анализ бляшкообразования) после фиксации/окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым; исследование под микроскопом лизиса клеток в культуре in vitro и 2) ELISA и спектрофотометрическое определение вируса гриппа.

[00273] Используемый в настоящем документе термин «эпитоп» или «эпитопы» относится к структурной части антигена, с которой специфически связывается антитело.

[00274] Иммунные ответы, вызванные в ответ на введение белков НА гриппа дикого типа или VLP или мутантных белков НА гриппа или VLP растительного происхождения, могут, например, наблюдаться у мышей Balb/C. Образцы сыворотки крови, взятой у животных, могут быть проанализированы с помощью ELISA на HI-специфические общие антитела IgG и IgA. Мыши, иммунизированные белками НА гриппа дикого типа или мутантными белками НА гриппа растительного происхождения, могут проявлять титры НА-специфических антител IgG в сыворотках для каждой группы лечения.

[00275] Экспрессия в растениях

[00276] Конструкции по настоящему изобретению могут быть введены в клетки растений с использованием плазмид Ti, плазмид Ri, векторов растительных вирусов, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропорации и т.д. Для обзоров таких способов смотрите, например, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988) и Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrvre, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997). Другие способы предусматривают прямое поглощение ДНК, использование липосом, электропорацию, например, с использованием протопластов, микроинъекцию, микрочастицы или нитевидные кристаллы и вакуумную инфильтрацию. Смотрите, например, Bilang, et al. (1991, Gene 100: 247-250), Scheid et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 228: 104-112), Guerche et al. (1987, Plant Science 52: 111-116), Neuhause et al. (1987, Theor. Appl Genet. 75: 30-36), Klein et al. (2987, Nature 327: 70-73); Freeman et al. (1984, Plant Cell Physiol. 29: 1353), Howell et al. (1985, Science 227: 1229-1231), DeBlock et al. (1989, Plant Physiology 91: 694-701), Способы молекулярной биологии растений (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Способы в молекулярной биологии растений (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), публикации международной заявки WO 92/09696, WO 94/00583, Европейские патенты ЕР 331083, ЕР 175966, Liu and Lomonossoff (2002, J Virol Meth, 105: 343-348), Европейский патент ЕР 290395; публикацию международной заявки WO 8706614; патенты США №4945050; 5036006 и 5100792, заявку на патент США №08/438666, поданную 10 мая 1995 г., и 07/951715, поданную 25 сентября 1992 г. (все они включены в настоящий документ посредством ссылки).

[00277] Способы временной экспрессии могут быть использованы для экспрессии конструкций по настоящему изобретению (смотрите публикации D'Aoust et al., 2009, Methods in molecular biology, Vol 483, pages 41-50; Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348, которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Альтернативно, способ временной экспрессии на основе вакуума, как описано в публикации Kapila et al. (1997, Plant Sci. 122, 101-108; которая включена в настоящий документ посредством ссылки) или публикациях международных заявок WO 00/063400, WO 00/037663 (которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Эти способы могут включать в себя, например, без ограничения, способ агроинокуляции или агроинфильтрации, шприцевой инфильтрации, однако, как указано выше, могут также использоваться другие временные способы. При агроинокуляции, агроинфильтрации или шприцевой инфильтрации смесь агробактерий, содержащая желаемую нуклеиновую кислоту, проникает в межклеточные пространства ткани, например, в листья, надземную часть растения (включая в себя стебель, листья и цветок), другие часть растения (стебель, корень, цветок) или все растение. После пересечения эпидермиса агробактерий инфицируют и переносят копии т-ДНК в клетки. т-ДНК транскрибируется эписомально, а мРНК транслируется, что приводит к производству представляющего интерес белка в инфицированных клетках, однако прохождение т-ДНК внутри ядра является временным.

[00278] Также рассматриваемой частью настоящего изобретения являются трансгенные растения, растительные клетки или семена, содержащие генную конструкцию по настоящему изобретению, которые можно использовать в качестве платформенных растений, подходящих для описанной в настоящем документе временной экспрессии белка. Способы регенерации целых растений из растительных клеток также известны в настоящей области техники (например, смотрите Guerineau and Mullineaux (1993, Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy PvRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148). Как правило, трансформированные растительные клетки культивируют в подходящей среде, которая может содержать селективные средства, такие как антибиотики, причем селектируемые маркеры используются для облегчения идентификации трансформированных растительных клеток. После образования каллуса образование побегов можно стимулировать с помощью соответствующих гормонов растений в соответствии с известными способами, и побеги переносят в среду для укоренения для регенерации растений. Затем растения можно использовать для создания повторяющихся поколений либо из семян, либо с использованием способов вегетативного размножения. Трансгенные растения также могут быть получены без использования культуры ткани. Способы стабильной трансформации и регенерации этих организмов известны в настоящей области техники и известны специалисту в настоящей области техники. Доступные способы рассмотрены в Vasil et al. (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984) и Weissbach and Weissbach (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989). Способ получения трансформированных и регенерированных растений не является критическим для настоящего изобретения.

[00279] Если растения, части растений или растительные клетки должны быть трансформированы или котрансформированы двумя или более конструкциями нуклеиновых кислот, конструкция нуклеиновой кислоты может быть введена в Agrobacterium за один этап трансфекции, так что нуклеиновые кислоты объединяются и бактериальные клетки трансфицируются. В качестве альтернативы конструкции можно вводить серийно. В этом случае первую конструкцию вводят в Agrobacterium, как описано, клетки выращивают в селективных условиях (например, в присутствии антибиотика), где могут расти только однократно трансформированные бактерии. После этого первого этапа отбора в Agrobacterium вводят вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, как описано, и клетки выращивают в условиях двойной селекции, при которых могут расти только дважды трансформированные бактерии. Затем дважды трансформированные бактерии могут быть использованы для трансформации растения, части растения или растительной клетки, как описано в настоящем документе, или могут быть подвергнуты дополнительной стадии трансформации для размещения третьей конструкции нуклеиновой кислоты.

[00280] Альтернативно, если растения, части растений или растительные клетки должны быть трансформированы или котрансформированы двумя или более конструкциями нуклеиновых кислот, конструкция нуклеиновой кислоты может быть введена в растение путем совместной инфильтрации смеси клеток Agrobacterium растения, части растения или растительной клетки, каждая клетка Agrobacterium может содержать одну или более конструкций для введения в растение. Для изменения относительных уровней экспрессии в растении, части растения или растительной клетке представляющей интерес нуклеотидной последовательности внутри конструкции во время стадии инфильтрации можно варьировать концентрацию различных популяций Agrobacteria. содержащих желаемые конструкции.

[00281] Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Конструкции НА гриппа

[00282] Конструкции НА гриппа получали с использованием способов, хорошо известных в настоящей области техники. Например, A-California-07-09 НА дикого типа, F390D A-California-07-09 НА и F390D + L429M A-California-07-09 НА клонировали, как описано ниже. Других мутантов H1 получали с использованием аналогичных способов, и праймеры, матрицы и продукты последовательностей НА описаны в примере 3 (производство НА и VLP гриппа в растениях) и в таблице 4.

[00283] Краткое описание белков НА дикого типа и мутантов, праймеров, матриц и продуктов представлено в таблице 4 ниже.

А. Модификация H1 НА 2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 H1 A-California-07-09/NOS (конструкция номер 1314)

[00284] Последовательность, кодирующую зрелый HA0 из НА гриппа из A/California/07/09, слитую с сигнальным пептидом секреции PDI люцерны (PDISP), клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием следующего способа на основе ПЦР. Фрагмент, содержащий кодирующую последовательность PDISP-A/California/07/09, амплифицировали с использованием праймеров IF-CPMV (fl5'UTR)_SpPDI.c (SEQ ID NO: 13) и IF-H1cTMCT.S1-4r (SEQ ID NO: 14), используя последовательность гена A/California/7/09 PDISP-H1 (SEQ ID NO: 1) в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в системе экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкцию номер 1190 (фиг. 8) расщепляли рестрикционными эндонуклеазами SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки m-Fusion. Конструкция номер 1190 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования «In Fusion» представляющих интерес генов в кассете экспрессии на основе 2X35S/CPMV 160/NOS. Она также включает в себя генную конструкцию для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, а последовательность от левой границы к правой границе т-ДНК представлена в SEQ ID NO: 98. Полученной конструкции был присвоен номер 1314 (SEQ ID NO: 99). Аминокислотная последовательность зрелого НАО из НА гриппа из A/California/07/09, слитого с сигнальным пептидом секреции PDI люцерны (PDISP), представлена в SEQ ID NO: 2. Представление плазмиды 1314 представлено на фиг. 6А.

2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 H1 A-California-07-09 (F390DYNOS (конструкция номер 2980)

[00285] Последовательность, кодирующую зрелый НАО из НА гриппа из A/California/07/09 (F390D), слитую с сигнальным пептидом секреции PDI люцерны (PDISP), клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием следующего способа на основе ПЦР. В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий PDISP-H1 A/California/07/09 с мутированной аминокислотой F390D, амплифицировали с использованием праймеров IF-CPMV (fl5'UTR)_SpPDI.c (SEQ ID NO: 13) и HICa1 (F390D).r (SEQ ID NO: 15), используя последовательность гена PDISP-H1 A/California/7/09 (SEQ ID NO: 1) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий мутацию F390D с оставшейся частью A/California/07/09 HI, амплифицировали с использованием HlCal(F390D).c (SEQ ID NO: 16) и IF-H1cTMCT.S1-4r (SEQ ID NO: 14), используя последовательность гена PDISP-H1 A/California/07/09 (SEQ ID NO: 1) в качестве матрицы. Затем продукты ПЦР из обеих амплификации смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с использованием IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c (SEQ ID NO: 13) и IF-H1cTMCT.S1-4r (SEQ ID NO: 14) в качестве праймеров. Конечный продукт ПЦР клонировали в системе экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкцию номер 1190 (фиг. 8) расщепляли рестрикционными эндонуклеазами SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкция номер 1190 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования «In Fusion» представляющих интерес генов в кассете экспрессии на основе 2X35S/CPMV 160/NOS. Она также включает в себя генную конструкцию для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, а последовательность от левой границы к правой границе т-ДНК представлена в SEQ ID NO: 98. Полученной конструкции был присвоен номер 2980 (SEQ ID NO: 100). Аминокислотная последовательность мутированного PDISP-HA из A/California/07/09 (F390D) представлена в SEQ ID NO: 18. Представление плазмиды 2980 представлено на фиг. 6В.

2X35S/CPMV 160/PDISP-HA0 H1 A-California-07-09 (F390D + L429MYNOS (конструкция номер 2995)

[00286] Последовательность, кодирующую зрелый HA0 из НА гриппа из A/California/07/09 (F390D + L429M), слитую с сигнальным пептидом секреции PDI люцерны (PDISP), клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием следующего основанного на ПЦР способа. В первом раунде ПЦР фрагмент, содержащий PDISP-H1 A/California/07/09 с мутированными аминокислотами F390D и L429M, амплифицировали с использованием праймеров IF-CPMV(f15'UTR) SpPDI.c (SEQ ID NO: 13) и HlCal(L429M).r (SEQ ID NO: 19), используя последовательность гена PDISP-H1 A/California/7/09 (F390D) (SEQ ID NO: 17) в качестве матрицы. Второй фрагмент, содержащий мутацию L429M с оставшейся частью A/California/07/09 H1 амплифицировали с использованием H1Cal(L429M).c (SEQ ID NO: 20) и IF-H1cTMCT.S1-4r (SEQ ID NO: 14), последовательностью гена A/California/7/09 PDISP-H1 (F390D) (SEQ ID NO: 17) в качестве матрицы. Затем продукты ПЦР из обеих амплификации смешивали и использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с использованием IF-CPMV(fl5'UTR)_SpPDI.c (SEQ ID NO: 13) и IF-H1cTMCT.S1-4r (SEQ ID NO: 14) в качестве праймеров. Конечный продукт ПЦР клонировали в системе экспрессии 2X35S/CPMV 160/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкцию номер 1190 (фиг. 8) расщепляли рестрикционными эндонуклеазами SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкция номер 1190 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования «In Fusion» представляющих интерес генов в кассете экспрессии на основе 2X35S/CPMV 160/NOS. Она также включает в себя генную конструкцию для совместной экспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, а последовательность от левой границы к правой границе т-ДНК представлена в SEQ ID NO: 98. Полученной конструкции был присвоен номер 2995 (SEQ ID NO: 101). Аминокислотная последовательность мутированного PDISP-HA из A/California/07/09 (F390D + L429M) представлена в SEQ ID NO: 24. Представление плазмиды 2995 представлено на фиг. 6D.

Пример 2: Способы

Трансфекция Agrobacterium tumefaciens

[00287] Штамм AGL1 Agrobacterium tumefaciens трансфицировали электропорацией векторами экспрессии НА гриппа дикого типа или мутантного НА гриппа с использованием способов, описанных D'Aoust et al., 2008 (Plant Biotech. J. 6:930-40). Трансфицированные Agrobacterium выращивали в среде YEB с добавлением 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 20 мкМ ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл карбенициллина с рН 5,6 до OD₆₀₀ от 0,6 до 1,6. Суспензии Agrobacterium перед использованием центрифугировали и ресуспендировали в среде для инфильтрации (10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MES рН 5,6).

Приготовление растительной биомассы, инокулята и агроинфильтрация

[00288] Растения N. benthamiana выращивали из семян на ровных поверхностях, заполненных коммерческим субстратом из торфяного мха. Растениям позволяли расти в теплице при фотопериоде 16/8 и температурном режиме 25°С днем/20°С ночью. Через три недели после посева собирали отдельные ростки, пересаживали в горшки и оставляли для роста в теплице еще на три недели при тех же условиях окружающей среды.

[00289] Агробактерии, трансфицированные каждым экспрессирующим вектором НА гриппа дикого типа или мутантным НА гриппа, выращивали в среде YEB с добавлением 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 20 мкМ ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкМ мкг/мл карбенициллина рН 5,6 до тех пор, пока они не достигали OD₆₀₀ от 0,6 до 1,6. Суспензии Agrobacterium центрифугировали перед использованием и ресуспендировали в среде для инфильтрации (10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MES рН 5,6) и хранили в течение ночи при температуре 4°С. В день инфильтрации партии культур разводили в 2,5 объемах культур и давали нагреться перед использованием. Целые растения N. benthamiana помещали вверх дном в бактериальную суспензию в герметичный резервуар из нержавеющей стали под вакуумом 20-40 мм рт.ст. на 2 мин. Растения возвращали в теплицу на 6 или 9 дней инкубационного периода до сбора урожая.

Сбор листьев и экстракция общего белка

[00290] Белки экстрагировали из свежей биомассы, разрезанной на части размером ~1 см², путем ферментативной экстракции в течение ночи при комнатной температуре с использованием орбитального шейкера. Затем суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр с большими порами для удаления грубой нерасщепленной растительной ткани.

[00291] Для получения «полных технологических выходов» суспензию центрифугировали для удаления протопластов и внутриклеточных загрязнений. Супернатант очищали глубокой фильтрацией. Осветленную фракцию затем загружали через катионообменную колонку со стадией ступенчатого элюирования с увеличивающимися концентрациями NaCl. Очищенные VLP концентрировали с помощью TFF, подвергали диафильтрации против буфера для состава и пропускали через фильтр. Содержание белка в очищенных VLP анализировали с помощью анализа ВСА, а активность анализировали с помощью анализа гемагглютинации. Относительные выходы получали путем сравнения выходов белков из новой конструкции и нативной конструкции, использованной в качестве контроля.

[00292] Для получения «выходов после градиента плотности» суспензию центрифугировали для удаления протопластов и внутриклеточных загрязнений. Супернатант дополнительно центрифугировали для удаления дополнительных частиц. Супернатант осветляли глубокой фильтрацией с использованием стекловолоконного фильтра. Затем осветленную фракцию загружали в прерывистый градиент плотности йодиксанола. Центрифугирование в градиенте плотности разделения выполняли следующим образом: готовили пробирки объемом 38 мл, содержащие прерывистый градиент плотности йодиксанола в Трис-буфере (последовательные слои из 35%, 30%. 25%, 20%, 15, 10% и 5%), которые покрывали осветленным экстрактом. Градиенты центрифугировали при 120000 g в течение 2 часов (4°С). После центрифугирования первые 5 мл, собранные снизу вверх, отбрасывали, а следующие 5 мл собирали для анализа содержания белка (ВСА), измерения активности (анализ гемагглютинации) и измерения интенсивности полосы HA0 на ДСН-ПААГ в восстановленных условиях (денситометрия). Относительные выходы получали путем сравнения интенсивности полосы HA0 от новой конструкции с нативной конструкцией, использованной в качестве контроля.

Анализ гемагглютинации

[00293] Анализ гемагглютинации основывался на способе, описанном Nayak and Reichl (2004). Вкратце, последовательные двойные разведения исследуемых образцов (100 мкл) проводили в 96-луночных микротитрационных планшетах с V-образным дном, содержащих 100 мкл PBS, оставляя 100 мкл разбавленного образца на лунку. В каждую лунку добавляли сто микролитров 0,25% суспензии эритроцитов индейки (для H1) (Bio Link Inc., Сиракузы, Нью-Йорк), и планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Обратную величину наивысшего разведения, показывающую полную гемагглютинацию, регистрировали как активность НА. Параллельно, рекомбинантный стандарт НА (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Мериден, Коннектикут) разводили в PBS и использовали в качестве контроля на каждом планшете.

Анализ белков и иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг выполняли при первой инкубации с первичным моноклональным антителом, разведенным 1/500 в 2% обезжиренном молоке в 0,1% TBS-Tween 20. Конъюгированные с пероксидазой козьи антитела к мышиным (Jackson bnmunoresearch, номер по каталогу 115-035-146), разведенные 1/10000, использовали в качестве вторичных антител для обнаружения хемилюминесценции в 2% обезжиренном молоке в TBS-Tween 20 0,1%. Иммунореактивные комплексы определяли хемилюминесценцией с использованием люминола в качестве субстрата (Roche Diagnostics Corporation). Конъюгацию человеческого антитела IgG с ферментом пероксидазой хрена проводили с использованием набора для конъюгации активированной пероксидазы EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, Ill.).

Пример 3: Производство НА и VLP гриппа в растениях

А. Модификация H1 НА

[00294] Конструкции НА гриппа получали с использованием способов, хорошо известных в настоящей области техники (смотрите пример 1). Краткое описание белков НА дикого типа и мутировавших белков НА, праймеров, матриц и продуктов представлено в таблице 4 ниже. Используемые последовательности представлены в примере 4 и в списке последовательностей.

Мутант F390D A/California/07/09 H1

[00295] Мутант F390D A/California/07/09 H1 конструировали путем мутации остатка фенилаланина в положении 390 A/California/07/09 H1 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №2980). Как показано на фиг. 2А и 2В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №2980, показали приблизительно 60%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами из растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/California/07/09 H1 дикого типа (конструкция №1314). Кроме того, как видно на фиг. 2С, растения N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №2980, демонстрировали приблизительно 60%-ное увеличение выхода VLP после очистки в градиенте йодиксанола по сравнению с растениями, инфильтрованными конструкцией дикого типа.

Мутант L429M A/California/07/09 Н1

[00296] Мутант L429M A/California/07/09 H1 конструировали путем мутации остатка лейцина в положении 429 A/California/07/09 H1 дикого типа в метионин (конструкция №2962). Как показано на фиг. 2А и 2В, очищенные экстракты растений N. benthamiana. агроинфильтрованные с использованием конструкции №2962, показали приблизительно 20%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами из растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/California/07/09 H1 дикого типа (конструкция №1314). Кроме того, как видно на фиг. 2С, растения N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №2962, демонстрировали приблизительно 30%-ное увеличение выхода VLP после очистки в градиенте йодиксанола по сравнению с растениями, инфильтрованными конструкцией дикого типа.

Мутант F390D + L429M A/California/07/09 H1

[00297] Мутант F390D + L429M A/California/07/09 H1 конструировали путем введения двойной мутации в последовательность A/California/07/09 H1 дикого типа, причем фенилаланин в положении 390 был мутирован в аспарагиновую кислоту и лейцин в положении 429 был мутирован в метионин (конструкция №2995). Как показано на фиг. 2 В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №2995, показали приблизительно 60%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/California/07/09 H1 дикого типа (конструкция №1314).

Мутант N97D H1 A/Michigan/45/15

[00298] Мутант N97D H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем мутации остатка аспарагина в положении 97 H1 A/Michigan/45/15 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3774). Как показано на фиг. 3А и 3В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3774, показали приблизительно 1100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640).

Мутант К374ЕН1 A/Michigan/45/15

[00299] Мутант K374E H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем мутации остатка лизина в положении 374 H1 A/Michigan/45/15 дикого типа в глутаминовую кислоту (конструкция №3771). Как показано на фиг. 3А и 3В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3771, показали приблизительно 1100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640).

Мутант F390D H1 A/Michigan/45/15

[00300] Мутант F390D H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем мутации остатка фенилаланина в положении 390 H1 A/Michigan/45/15 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3641). Как показано на фиг. 3В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3641, проявляли аналогичную активность в отношении титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованными с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640). Однако, когда был измерен полный технологический выход для очищенных VLP с H1, наблюдалось увеличение до 172% по сравнению с диким типом (смотрите таблицу 5С).

Мутант L429MH1 A/Michigan/45/15

[00301] Мутант L429M H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем мутации остатка лейцина в положении 429 H1 A/Michigan/45/15 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3643). Как показано на фиг. 3В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3643, показали приблизительно 500%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640).

Мутант N97D + K374EH1 A/Michigan/45/15

[00302] Мутант N97D + K374E H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем введения двойной мутации в последовательность дикого типа A/Michigan/45/15, причем аспарагин в положении 97 замещали остатком аспарагиновой кислоты, а лизин в положении 374 замещали остатком глутаминовой кислоты (конструкция №3880). Как показано на фиг. 3В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3880, показали приблизительно 1100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640).

Мутант F390D + L429MH1 A/Michigan/45/15

[00303] Мутант F390D + L429M H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем введения двойной мутации в последовательность A/Michigan/45/15 дикого типа, причем фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №3703). Как показано на фиг. 3В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3703, показали приблизительно 1100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana. агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640).

Мутант N97D + F390D + L429MH1 A/Michigan/45/15

[00304] Мутант N97D + F390D + L429M H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Michigan/45/15 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №3879). Как показано на фиг. 3В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3879, продемонстрировали приблизительно 2300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640).

Мутант K374E + F390D + L429MH1 A/Michigan/45/15

[00305] Мутант K374E + F390D + L429M H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Michigan/45/15 дикого типа, причем лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №3878). Как показано на фиг. 3В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3878, показали приблизительно 2500%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640).

Мутант N97D + K374E + F390D + L429MH1 A/Michigan/45/15

[00306] Мутант N97D + K374E + F390D + L429M H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем введения четверной мутации в последовательность A/Michigan/45/15 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №3881). Как показано на фиг. 3В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3881, демонстрировали приблизительно 3300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640).

Мутант N97D + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1

[00307] Мутант N97D + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Massachusetts/06/17 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4093). Как показано на фиг. 4В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4093, показали приблизительно 40%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием двойной мутантной конструкции, мутант F390D + L429M A/Massachusetts/17.06 H1 (конструкция # 4091).

Мутант K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1

[00308] Мутант K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Massachusetts/06/17 дикого типа, причем лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4092). Как показано на фиг. 4В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4092, показали приблизительно 50%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием двойной мутантной конструкции, мутант F390D + L429M A/Massachusetts/17.06 H1 (конструкция # 4091).

Мутант N97D + K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1

[00309] Мутант N97D + K374E + F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1 конструировали путем введения четверной мутации в последовательность A/Massachusetts/06/17 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4094). Как показано на фиг. 4В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4094, показали приблизительно 70%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием двойной мутантной конструкции, мутант F390D + L429M A/Massachusetts/17.06 H1 (конструкция №4091).

Мутант N97D + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1

[00310] Мутант N97D + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Costa Rica/0513/16 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4717). Как показано на фиг. 4В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4717, показали приблизительно 100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием двойной мутантной конструкции, мутант F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 (конструкция №4715).

Мутант K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1

[00311] Мутант K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Costa Rica/0513/16 дикого типа, причем лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4716). Как показано на фиг. 4В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4716, показали приблизительно 10%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием двойной мутантной конструкции, мутант F390D + L429M A/Costa Rica./0513/16 H1 (конструкция №4715).

Мутант N97D + K374E + F390D + L429MA/Costa Rica/0513/16 H1

[00312] Мутант N97D + K374E + F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 конструировали путем введения четверной мутации в последовательность A/Costa Rica/0513/16 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4718). Как показано на фиг. 4В, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4718, показали приблизительно 140%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием двойной мутантной конструкции, мутант F390D + L429M A/Costa Rica/0513/16 H1 (конструкция №4715).

Мутант N97D A/Honduras/17734/16 H1

[00313] Мутант N97D A/Honduras/17734/16 H1 конструировали путем мутации остатка аспарагина в положении 97 A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3950). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3950, демонстрировали приблизительно 300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа (конструкция №3944).

Мутант K374E A/Honduras/17734/16 H1

[00314] Мутант K374E A/Honduras/17734/16 H1 конструировали путем мутации остатка лизина в положении 374 A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа в глутаминовую кислоту (конструкция №3948). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3948, демонстрировали приблизительно 100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа (конструкция №3944).

Мутант F390D A/Honduras/17734/16 H1

[00315] Мутант F390D A/Honduras/17734/16 H1 конструировали путем мутации остатка фенилаланина в положении 390 A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3945). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3945, демонстрировали приблизительно 30%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа (конструкция №3944).

Мутант L429M A/Honduras/17734/16 H1

[00316] Мутант L429M A/Honduras/17734/16 H1 конструировали путем мутации остатка лейцина в положении 429 A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа в метионин (конструкция №3949). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3949, демонстрировали приблизительно 400%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа (конструкция №3944).

Мутант F390D + L429M A/Honduras/17734/16 H1

[00317] Мутант F390D + L429M A/Honduras/17734/16 H1 конструировали путем введения двойной мутации в последовательность A/Honduras/17734/16 дикого типа, причем фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №3946). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3946, демонстрировали приблизительно 300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа (конструкция №3944).

Мутант N97D + F390D + L429M A/Honduras/17734/16Н1

[00318] Мутант N97D + F390D + L429M A/Honduras/17734/16 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Honduras/17734/16 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №3951). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3951, демонстрировали приблизительно 600%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Honduras/17734/16 H1 дикого типа (конструкция №3944).

Мутант N97D A/Darwin/11/15 H1

[00319] Мутант N97D A/Darwin/11/15 H1 конструировали путем мутации остатка аспарагина в положении 97 A/Darwin/11/15 H1 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3990). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3990, показали приблизительно 200%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Darwin/11/15 H1 дикого типа (конструкция №3984).

Мутант K374EA/Darwin/11/15 H1

[00320] Мутант К374Е A/Darwin/11/15 H1 конструировали путем мутации остатка лизина в положении 374 A/Darwin/11/15 H1 дикого типа в глутаминовую кислоту (конструкция №3988). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3988. демонстрировали приблизительно 300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Darwin/11/15 H1 дикого типа (конструкция №3984).

Мутант F390D A/Darwin/11/15 H1

[00321] Мутант F390D A/Darwin/11/15 H1 конструировали путем мутации остатка фенилаланина в положении 390 A/Darwin/11/15 H1 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3985). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3985. демонстрировали приблизительно 50%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Darwin/11/15 H1 дикого типа (конструкция №3984).

Мутант L429M A/Darwin/11/15 H1

[00322] Мутант L429M A/Darwin/11/15 H1 конструировали путем мутации остатка лейцина в положении 429 A/Darwin/11/15 H1 дикого типа в метионин (конструкция №3989). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3989, демонстрировали приблизительно 500%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Darwin/11/15 H1 дикого типа (конструкция №3984).

Мутант F390D + L429MA/Darwin/11/15 H1

[00323] Мутант F390D + L429M A/Darwin/11/15 H1 конструировали путем введения двойной мутации в последовательность A/Darwin/11/15 дикого типа, причем фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №3986). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3986, демонстрировали приблизительно 300%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с помощью A/Darwin/11/15 H1 дикого типа (конструкция №3984).

Мутант N97D + F390D + L429MA/Darwin/11/15 H1

[00324] Мутант N97D + F390D + L429M A/Darwin/11/15 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Darwin/11/15 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №3991). Как показано на фиг. 4А, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3991, демонстрировали приблизительно 1100%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Darwin/11/15 H1 дикого типа (конструкция №3984).

Мутант F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1

[00435] Мутант F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 конструировали путем введения двойной мутации в последовательность A/Paris/1227/2017 дикого типа, причем фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция # 4765). Как показано на фиг. 4С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4765, показали приблизительно 117%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1 (конструкция №4091).

K374 + F390D + L429MA/Paris/1227/2017

[00325] Мутант K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Paris/1227/2017 дикого типа, причем лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4766). Как показано на фиг. 4С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4766, показали приблизительно 127%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 (конструкция №4765).

N97D + F390D + L429M A/Paris/1227/2017

[00326] Мутант N97D + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Paris/1227/2017 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4767). Как показано на фиг. 4С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4767, показали приблизительно 171%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 (конструкция №4765).

N97D + K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017

[00327] Мутант N97D + K374E + F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 конструировали путем введения четверной мутации в последовательность A/Paris/1227/2017 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4768). Как показано на фиг. 4С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4768, показали приблизительно 230%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта F390D + L429M A/Paris/1227/2017 H1 (конструкция №4765).

Мутант F390D + L429MA/Norway/2147/2017 H1

Мутант F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 конструировали путем введения двойной мутации в последовательность A/Norway/2147/2017 дикого типа, причем фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4775). Как показано на фиг. 4С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4775, показали приблизительно 112%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта F390D + L429M A/Massachusetts/06/17 H1 (конструкция №4091).

K374 + F390D + L429MA/Norway/2147/2017

[00328] Мутант K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Norway/2147/2017 дикого типа, причем лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4776). Как показано на фиг. 4С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4776, продемонстрировали приблизительно 128%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 (конструкция №4775).

N97D + F390D + L429M A/Norway/2147/2017

[00329] Мутант N97D + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 конструировали путем введения тройной мутации в последовательность A/Norway/2147/2017 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4777). Как показано на фиг. 4С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4777, показали приблизительно 200%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 (конструкция №4775).

N97D + K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017

[00330] Мутант N97D + K374E + F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 конструировали путем введения четверной мутации в последовательность A/Norway/2147/2017 дикого типа, причем аспарагин в положении 97 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, лизин в положении 374 был мутирован в остаток глутаминовой кислоты, фенилаланин в положении 390 был мутирован в остаток аспарагиновой кислоты, а лейцин в положении 429 замещали остатком метионина (конструкция №4778). Как показано на фиг. 4С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №4778, показали приблизительно 213%-ное увеличение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием мутанта F390D + L429M A/Norway/2147/2017 H1 (конструкция №4775).

N380A A/Michigan/45/15

[00331] Мутант N380A H1 A/Michigan/45/15 конструировали путем мутации аспарагина в положении 380 H1 A/Michigan/45/15 дикого типа в остаток аланина (конструкция №3644). Как видно на фиг. 3В и 3С, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3644, показали приблизительно 80%-ное снижение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640).

N380A + F390D A/Michigan/45/15

[00332] Также конструировали мутант N380A + F390D H1 A/Michigan/45/15, в котором двойную мутацию вводили в H1 A/Michigan/45/15 дикого типа путем замещения аспарагина в положении 380 остатком аланина и замещения фенилаланина в положении 390 остатком аспарагиновой кислоты (конструкция №3704). Как видно на фиг. 3В. очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3704, показали приблизительно 50%-ное снижение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием H1 A/Michigan/45/15 дикого типа (конструкция №3640). Принимая во внимание сниженный титр гемагглютинации, наблюдаемый с мутантом N380A H1 A/Michigan/45/15, эти результаты предполагают, что мутация остатка аспарагина в положении 380 отрицательно влияет на экспрессию белка НА гриппа и/или стабильность белка НА гриппа в растениях.

[00333] Одна или более описанных в настоящем документе мутаций специфически увеличивают производство белка НА гриппа и выход VLP у растений. Было замечено, что мутации в других положениях значительно снижали или не оказывали значительного влияния на накопление белка НА гриппа или производство VLP в растительных клетках.

[00334] Повышенные титры гемагглютинации, достигнутые с белками НА гриппа, содержащими одну или более описанных в настоящем документе мутаций, также наблюдались как специфические для НА гриппа H1. Подобное увеличение не наблюдалось у растений, агроинфильтрованных конструкциями, кодирующими мутантные НА гриппа, полученные из штаммов, не относящихся к H1.

[00335] Например, мутант F393D A/Indonesia/5/2005 Н5 конструировали путем мутации фенилаланина в положении 393 A/Indonesia/5/2005 Н5 дикого типа в аспарагиновую кислоту (конструкция №3680). Как показано на фиг. 5, очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием конструкции №3680, демонстрировали приблизительно 98%-ное снижение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Indonesia/5/2005 Н5 дикого типа (конструкция №2295).

[00336] Точно так же очищенные экстракты растений N. benthamiana, агроинфильтрованные с использованием мутанта F392D A/Egypt/N04915/2014 Н5 (конструкция №3690), демонстрировали приблизительно 99%-ное снижение титра гемагглютинации по сравнению с экстрактами растений N. benthamiana, агроинфильтрованных с использованием A/Egypt/N04915/2014 Н5 дикого типа (конструкция №3645) (смотрите фиг. 5, таблицу 6).

[00337] Одна или более описанных в настоящем документе мутаций специфически увеличивают производство белка НА гриппа и выход VLP у растений. Было замечено, что мутации в других положениях значительно снижали или не оказывали значительного влияния на накопление белка НА гриппа или производство VLP в растительных клетках.

Пример 3: Титр гемагглютинации, выходы после градиентов плотности и полные технологические выходы

[00338] Сводная информация измеренного титра гемагглютинации представлена в таблице 5А. Титр гемагглютинации измеряли, как описано в примере 2. Относительный титр гемагглютинации получали путем сравнения титра гемагглютинации мутированного или модифицированного белка НА с НА дикого типа (таблицы 5А).

[00339] Сводная информация измеренных выходов после градиентов плотности приведена в таблице 5В. Выходы после градиентов плотности измеряли, как описано в примере 2. Относительные выходы получали путем сравнения интенсивности полосы НА0 от мутированного или модифицированного белка НА с интенсивностью полосы НА0 НА дикого типа (таблица 5В).

[00340] Сводная информация измеренного полного технологического выхода приведена в таблице 5С. Полный технологический выход получали, как описано выше в примере 2. Относительные выходы получали путем сравнения выхода белка из мутированного или модифицированного белка НА с выходом белка из НА дикого типа (таблица 5С).

Пример 4: Последовательности

Использовали следующие последовательности (смотрите также таблицу 4):

Все цитаты включены в настоящий документ посредством ссылки.

[00341] Настоящее изобретение было описано в отношении одного или более вариантов осуществления. Однако специалистам в настоящей области техники будет очевидно, что можно сделать ряд вариаций и модификаций, не выходя за пределы объема настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения.

Claims

1. Модифицированный белок гемагглютинин (НА) гриппа H1 для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем модифицированный белок НА гриппа H1 содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну замену по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью дикого типа, причем указанная по меньшей мере одна замена представляет собой замену одной или более чем одной аминокислот, соответствующих аминокислоте в положении 390, 429, 97 или 374 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134.

2. Модифицированный белок НА гриппа H1 по п. 1, причем

(i) по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 97 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, представляет собой замену на не аспарагин, например на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты;

(ii) по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 374 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, представляет собой замену на не лизин, например на глутаминовую кислоту или консервативную замену глутаминовой кислоты;

(iii) по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 390 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, представляет собой замену на не фенилаланин, например на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты; и/или

(iv) по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 429 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, представляет собой замену на не лейцин, например на метионин или консервативную замену метионина.

3. Модифицированный белок НА гриппа H1 по п. 2, причем по меньшей мере одна замена аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 429 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, представляет собой замену на не лейцин, например на метионин или консервативную замену метионина,

причем модифицированный белок НА гриппа H1 дополнительно содержит вторую замену, указанная вторая замена относится к аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 380 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, указанная вторая замена представляет собой замену на не аспарагин, например на аланин или консервативную замену аланина.

4. Модифицированный белок НА гриппа H1 по п. 1, содержащий

первую замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не фенилаланин, например на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты, и

вторую замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не лейцин, например на метионин или консервативную замену метионина.

5. Модифицированный белок НА гриппа H1 по п. 1, содержащий

первую замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не аспарагин, например на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты, и

вторую замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не лизин, например на глутаминовую кислоту или консервативную замену глутаминовой кислоты.

6. Модифицированный белок НА гриппа H1 по п. 1, содержащий

первую замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 97 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не аспарагин, например на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты;

вторую замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не фенилаланин, например на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты, и

третью замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не лейцин, например на метионин или консервативную замену метионина.

7. Модифицированный белок НА гриппа H1 по п. 1, содержащий

первую замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не лизин, например на глутаминовую кислоту или консервативную замену глутаминовой кислоты;

8. Модифицированный белок НА гриппа H1 по п. 1, содержащий

вторую замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 374 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не лизин, например на глутаминовую кислоту или консервативную замену глутаминовой кислоты;

третью замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 390 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не фенилаланин, например на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты, и

четвертую замену по аминокислоте, соответствующей аминокислоте в положении 429 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем указанная замена представляет собой замену на не лейцин, например на метионин или консервативную замену метионина.

9. Модифицированный белок НА гриппа H1 по любому из пп. 2-8, причем:

консервативная замена аспарагиновой кислоты представляет собой глутаминовую кислоту, глутамин или серин;

консервативная замена глутаминовой кислоты представляет собой аспарагиновую кислоту, глутамин, аргинин, аспарагин, гистидин или серин;

консервативная замена метионина представляет собой изолейцин, глутамин, валин или фенилаланин; и/или

консервативная замена аланина представляет собой серин, глицин, треонин, цистеин или валин.

10. Нуклеиновая кислота для получения модифицированного белка НА гриппа H1, причем нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок НА гриппа H1 по любому из пп. 1-9.

11. Вирусоподобная частица (VLP) для индукции иммунного ответа к инфекции гриппа у субъекта, причем VLP содержит модифицированный белок гемагглютинин (HA) гриппа H1 по любому из пп. 1-9.

12. Способ получения вирусоподобной частицы (VLP) гриппа в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий:

a) i) введение нуклеиновой кислоты по п. 10 в растение, часть растения или растительную клетку; или

ii) предоставление растения, части растения или растительной клетки, содержащих нуклеиновую кислоту по п. 10;

b) инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка НА, кодируемого нуклеиновой кислотой, тем самым производя VLP; и

с) необязательно, сбор растения, части растения или растительной клетки и очистку VLP.

13. VLP, полученная способом по п. 12 для индукции иммунного ответа к инфекции гриппа у субъекта, причем VLP содержит модифицированный белок HA гриппа H1 по любому из пп. 1-9 и необязательно содержит один или более чем один липид, полученный из растения, части растения или растительной клетки, специфические для растений N-гликаны, модифицированные N-гликаны или их комбинацию.

14. Растение или часть растения для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем растение или часть растения содержит нуклеиновую кислоту по п. 10, модифицированный белок НА гриппа H1 по любому из пп. 1-9 или VLP по п. 11 или 13.

15. Растительная клетка для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем растительная клетка содержит нуклеиновую кислоту по п. 10, модифицированный белок НА гриппа H1 по любому из пп. 1-9 или VLP по п. 11 или 13.

16. Композиция для индукции иммунного ответа к инфекции гриппа у субъекта, причем композиция содержит эффективную дозу VLP по п. 11 или 13 и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант, наполнитель или вспомогательное вещество.

17. Применение VLP по п. 11 или 13 для индукции иммунитета к инфекции гриппа у субъекта, необязательно причем VLP применяют субъекту перорально, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

18. Способ увеличения выхода продукции вирусоподобных частиц (VLP) гриппа в растении, части растения или растительной клетке, предусматривающий:

а) i) введение нуклеиновой кислоты по п. 10 в растение, часть растения или растительную клетку; или

ii) предоставление растения, части растения или растительной клетки, содержащих нуклеиновую кислоту по п. 10; а также

b) инкубацию растения, части растения или растительной клетки в условиях, которые допускают экспрессию белка НА, кодируемого нуклеиновой кислотой, тем самым производя VLP с более высоким выходом по сравнению с растением, частью растения или растительной клеткой, экспрессирующей немодифицированный белок НА, и

19. Белок гемагглютинин (НА) гриппа H1 для получения вирусоподобной частицы (VLP), причем НА содержит:

аминокислотную замену, соответствующую положению 390 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем аминокислотная замена представляет собой замену на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты;

аминокислотную замену, соответствующую положению 429 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем аминокислотная замена представляет собой замену на метионин или консервативную замену метионина;

аминокислотную замену, соответствующую положению 97 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем аминокислотная замена представляет собой замену на аспарагиновую кислоту или консервативную замену аспарагиновой кислоты; и/или

аминокислотную замену, соответствующую положению 374 эталонной последовательности SEQ ID NO: 134, причем аминокислотная замена представляет собой замену на глутаминовую кислоту или консервативную замену глутаминовой кислоты.