JP6297488B2 - 植物中での狂犬病ウイルス様粒子の生成 - Google Patents

Description

本発明は、植物中で天然ウイルスタンパク質を生成することに関する。より詳細には、本発明は、植物中で天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子を生成することにも関する。

ワクチン接種は、被験体に、感染前に防御を備えるように誘導することによって、感染性病原体によって引き起こされる疾患に対する保護をもたらす。従来、これは、免疫原として感染性病原体の生きた弱毒化形態または全不活化形態を使用することによって達成されてきた。ワクチンとして全ウイルス（死滅ウイルスまたは弱毒化ウイルスなど）を使用する危険を回避するために、組換えウイルスタンパク質、例えば、サブユニットが、ワクチンとして追究されている。ペプチドワクチンおよびサブユニットワクチンはともに、いくつかの潜在的制約を受けやすい。サブユニットワクチンは、不正確な折り畳みのために不十分な免疫原性、不十分な抗原提示、または炭水化物および脂質組成の差異を呈する場合がある。主要な問題は、作出されたタンパク質のコンホメーションが、抗原の自然環境における抗原のコンホメーションを模倣することを保証することが困難であることである。適当なアジュバント、およびペプチドの場合では担体タンパク質が、免疫応答をブーストするために使用されなければならない。さらに、これらのワクチンは、主に体液性応答を誘発し、したがって、有効な免疫を誘起することができない場合がある。サブユニットワクチンは、全不活化ウイルスが保護をもたらすことを実証することができる疾患に対して効果的でないことが多い。

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、免疫原性組成物中に含めるための潜在的候補である。ＶＬＰは、成熟ビリオンに酷似しているが、ウイルスゲノム材料を含有しない。したがって、ＶＬＰは、自然において非複製的であり、それにより、ＶＬＰがワクチンとして投与するのに安全になっている。さらに、ＶＬＰは、ＶＬＰの表面上にウイルス糖タンパク質を発現するように操作することができ、それは、その最も天然の生理的な構成である。さらに、ＶＬＰは、インタクトなビリオンに類似し、多価微粒子構造であるので、可溶性エンベロープタンパク質抗原より、糖タンパク質に対する中和抗体を誘導するのに有効となり得る。

これまで、ＶＬＰは、ヒトおよび他の動物に感染する３０超の異なるウイルスについて生成されている。この群の最も顕著な特徴の１つは、この群が個々のウイルスの構造に関して極めて多様であることである。これは、単一のカプシドタンパク質、複数のカプシドタンパク質を有するウイルス、ならびに脂質エンベロープを含むウイルスおよび含まないウイルスを含む。

脂質エンベロープを含むウイルスのＶＬＰの形成は、複数のカプシドを含むウイルスについて生成されるＶＬＰより異なるタイプの技術的課題を有する。これらのウイルスについては、発現系の選択が、ＶＬＰ形成の効率にとって重要となり得る。例えば、ハンターンウイルスは、ワクシニアウイルス系ベクターから哺乳動物細胞において発現されるとき、ＶＬＰを容易に形成するが、ＶＬＰ形成は、昆虫細胞において比較的効率的ではない（Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ Ｍら、１９９５年、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、３８巻、１１１〜１２４頁）。

狂犬病ウイルス（ＲＶ）は、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。この科のほとんどのメンバーと同様に、ＲＶは、非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは、５種のウイルスタンパク質、すなわち、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）、核タンパク質（Ｎ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、ウイルスタンパク質エンベロープの内側に位置するマトリックスタンパク質（Ｍ）、および外面糖タンパク質（Ｇ）をコードする（Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ Ｂら、１９９１年、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻：４２７〜４３９頁）。

狂犬病の細胞培養に基づくワクチンは、細胞培養でウイルスの不活化株を増殖させることに限られている。これらのワクチンは、細胞培養で増殖されたウイルスを含む。現在の生物工学手法は、アクティブワクチンとして展開され得る安全な組換えタンパク質を開発するために、狂犬病ウイルスのコートタンパク質遺伝子を発現させることを目指している。狂犬病ウイルス糖タンパク質の安定な発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞において示されている（Ｂｕｒｇｅｒら、１９９１年、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、２月；７２巻（第２部）：３５９〜６７頁）。ウイルス感染細胞から単離されたＧタンパク質と共移動した（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｅｄ）６７Ｋの全長グリコシル化タンパク質が得られた。

昆虫細胞中のバキュロウイルスベクターによる狂犬病糖タンパク質遺伝子の発現により、感染して４８時間後に、総細胞タンパク質の１８％程度のタンパク質収率が得られる。Ｐｒｅｈａｕｄ Ｄ Ｈら（１９８９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１２月；１７３巻（２号）：３９０〜９頁）は、ＡｃＮＰＶポリヘドリンプロモーターの制御下でＣＶＳ株のＧタンパク質をコードする配列を配置し、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系を使用して構築物を発現させることを記載している。昆虫由来タンパク質は、グリカン成分の差異に起因して、野生型と比較して電気泳動移動度の変化を呈した。

Ｒｕｐｐｒｅｃｈｔら（１９９３年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１１巻（９号）：９２５〜８頁）は、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞に由来する糖タンパク質（ＥＲＡ株）は、アライグマにおいて経口ワクチンとして効果的であったことを実証している。特許文献２では、３’ドメイン、ならびに狂犬病Ｎタンパク質および狂犬病Ｍタンパク質のさやに囲まれたフィラードメインを含むＲＮＡゲノムを含有するバキュロウイルス発現系におけるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成が教示されている。ＶＬＰは、狂犬病Ｇタンパク質の脂質エンベロープも含む。昆虫および哺乳動物細胞系の相対的に高いコストを考慮すると、これらは、狂犬病に対するワクチンを開発するストラテジーとしてのＧタンパク質発現に最適な系ではない。

ＭｃＧａｒｖｅｙら（１９９５年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３巻、１３号、１４８４〜１４８７頁）は、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ’プロモーターの制御下で、狂犬病ウイルス（ＥＲＡ株）の糖タンパク質Ｇをコードする全長ｃＤＮＡを使用するトマト子葉の形質転換を記載している。タンパク質は、トマト内で発現され、ＢＨＫ細胞内で増殖させたウイルス由来のＧタンパク質について観察された６６ｋＤａと比較して、免疫沈降後のウエスタンブロットにおいて６２ｋＤａおよび６０ｋＤａの分子量を有すると特徴付けられた。天然糖タンパク質と比較した分子量の差異は、タンパク質の翻訳後修飾（タンパク質分解的切断および／または改変グリコシル化）から生じることが示唆された。免疫沈降したＧタンパク質の量は、約１〜１０ｎｇ／ｍｇの可溶性タンパク質、すなわち、可溶性タンパク質の０．０００１％〜０．００１％であることが判明した。低発現レベルは、うまく設計されていない遺伝子を使用することに起因し得る。例えば、天然Ｇタンパク質コード遺伝子が、その天然シグナルペプチドとともに使用された。

ミンク腸炎および狂犬病などの疾患に対する植物由来免疫応答が、植物ウイルスの表面上でウイルスエピトープを発現させ、その後、組換え改変ウイルスで感受性宿主を感染させることによって報告されている（Ｍｏｄｅｌｓｋａら、１９９８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻：２４８１〜２４８５頁；Ｙｕｓｉｂｏｖら、２００２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０巻：３１５５〜３１６４頁）。ベクターウイルスの表面上に発現される抗原ポリペプチドのサイズは、３７アミノ酸に限定されており、抗原のエピトープマッピングを必要とした。抗原のこのような完全な知識は、特に、完全長タンパク質の発現が、唯一の選択肢であり得る新しく発見される疾患に対して、一般に利用可能でない。いくつかの場合では、病原性ウイルスによる攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する許容される保護を生じるのに複数のエピトープが必要とされる場合がある。さらに、特に、環境的に安定な植物ウイルス、例えば、タバコモザイクウイルスが使用される場合、封じ込めが、農業レベルで重要な問題と考えられ得る。

特許文献１では、植物において、狂犬病ウイルスまたは狂犬病ウイルスに関連したウイルスの糖タンパク質Ｇを生成するための方法が教示されている。構築物は、ウイルスタンパク質Ｇに天然に関連するもの以外のＮ末端シグナルペプチドを有する成熟ウイルスタンパク質Ｇを含むキメラＧタンパク質をコードする配列を含んでいた。糖タンパク質は、約６６ｋＤａの分子量を有し、非常に不溶性であった。ＳＤＳまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの洗剤が、糖タンパク質を抽出および可溶化するのに必要であった。著者らは、「不溶性」糖タンパク質は、糖タンパク質がワクチンとして使用される際の防御反応に重要であるＣ末端膜貫通ドメイン（糖タンパク質のカルボキシ末端の約４０〜６０アミノ酸に位置する領域）の存在に関係すると結論づけた。

エンベロープウイルスは、感染細胞から「出芽する」ときにその脂質エンベロープを得、原形質膜から、または内部細胞小器官の原形質膜から膜を得ることができる。例えば、ラブドウイルスにおける組み立てプロセスの間、Ｎ−Ｐ−Ｌ複合体は、マイナス鎖ゲノムＲＮＡを被包してＲＮＰコアを形成する。Ｍタンパク質は、ＲＮＰの周囲にカプセルまたはマトリックスを形成し、ＲＮＰ−Ｍ複合体は、糖タンパク質インサートを含有する原形質膜の範囲に移動する。Ｍタンパク質は、コイル化を開始し、Ｍ−ＲＮＰ複合体は、糖タンパク質と結合し、その結果、完成したウイルスが原形質膜から出芽する。

中枢神経系（ＣＮＳ）内で、原形質膜からの優先的なウイルス出芽がある。反対に、唾液腺内のウイルスは、細胞膜から腺房管腔内に主に出芽する。宿主動物における唾液腺内へのウイルス出芽、およびウイルスに誘導された攻撃的な噛み付き挙動（ｂｉｔｉｎｇ−ｂｅｈａｖｉｏｒ）により、新宿主のウイルス感染の機会が最大になる。例えば、哺乳動物またはバキュロウイルス細胞系において、狂犬病は、原形質膜から出芽する。ごく少数のエンベロープウイルスが、植物に感染することが公知である（例えば、トポウイルスおよびラブドウイルスのメンバー）。公知の植物エンベロープウイルスに関して、これらは、宿主細胞の細胞内膜からの出芽によって特徴付けられ、原形質膜からの出芽によって特徴付けられない。しかし、組換えＶＬＰが植物宿主内で原形質膜から生成された（特許文献３；これは、参考として本明細書に援用される）。

ラブドウイルス中の組み立て／出芽は、大部分はマトリックス（Ｍ）タンパク質によって駆動される。Ｍタンパク質は、ウイルス−細胞分離を促進するための細胞の液胞タンパク質ソーティング経路に連結した宿主タンパク質の動員を媒介する後期出芽ドメインを含有する。理論に束縛されることを望むわけではないが、細胞膜からのエンベロープウイルスの出芽は、細胞質ウイルス成分と相互作用する膜貫通型スパイクタンパク質の存在に依存すると考えられる。例えば、糖タンパク質Ｇ、またはＧ細胞質尾部が欠乏した狂犬病ウイルス突然変異体に感染した細胞は、スパイクレスラブドウイルス粒子を放出し、ウイルス表面タンパク質は、出芽プロセスを駆動するのに要求されないことを実証した（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ Ｔ．ら、１９９６年、Ｃｅｌｌ、３月２２日：８４巻（６号）：９４１〜５１頁）。対照的に、Ｍタンパク質欠乏狂犬病ウイルス突然変異体内で生成される感染性粒子は、主に細胞結合型であり、無細胞感染性ウイルスの収率は、５００，０００分の１もの量に低減された。これは、ウイルス出芽におけるＭタンパク質の重要な役割を実証する。Ｍ欠乏狂犬病ウイルスに感染した細胞からの上清は、一般的な弾丸形状のラブドウイルス粒子ではなく、長い杆状体ビリオンを含んでおり、ウイルス形成プロセスの障害をさらに確認した。プラスミドから発現したＭタンパク質で補完すると、ラブドウイルス形成がレスキューされた。したがって、Ｍタンパク質は、原形質膜にＲＮＰを濃縮および標的化すること、ならびに出芽ビリオンにＧタンパク質を取り込むことにおいて重要な役割を果たすようである（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ Ｔ．ら、１９９９年、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、１月；７３巻（１号）：２４２〜５０頁）。

国際公開第９７／４３４２８号 国際公開第１９９３／００１８３３号 国際公開第２０１１／０３５４２２号

本発明は、植物中で天然ウイルスタンパク質を生成することに関する。より詳細には、本発明は、植物中で天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子を生成することにも関する。

本発明によれば、植物中で狂犬病ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法（Ａ）であって、
ａ）天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、植物中で活性な第１の調節領域を含む第１の核酸を、植物または植物の一部中に導入するステップと、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部をインキュベートし、それによって狂犬病ＶＬＰを生成するステップと
を含む方法が提供される。

天然狂犬病ウイルス構造タンパク質は、糖タンパク質であってもよい。天然狂犬病ウイルス構造タンパク質がＭタンパク質でない場合、上述した方法（Ａ）は、
ｃ）植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した第２の調節領域を含む第２の核酸を導入するステップ
をさらに含むことができる。

第１もしくは第２のヌクレオチド配列、またはそれらの両方は、１種または１種より多い増幅エレメントをさらにコードするか、それらを含むか、またはそれらをコードし、かつ含むことができる。１種または１種より多い増幅エレメントは、１種または１種より多いジェミニウイルス増幅エレメントから選択することができる。１種または１種より多いジェミニウイルス増幅エレメントは、インゲン黄斑萎縮（ｂｅａｎ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ）ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＬＩＲ）、およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＳＩＲ）から選択することができる。

植物中で活性な第１の調節領域、および植物中で活性な第２の調節領域は、同じであっても、異なっていてもよい。

上述した方法は、
ｄ）植物を収穫し、ＶＬＰを抽出するステップ
をさらに含むことができる。

本発明は、第１の核酸配列が、１種または１種より多いコモウイルスエンハンサーと作動的に連結された調節領域を含み、サイレンシングのサプレッサー、ジェミニウイルスレプリカーゼ、またはそれらの両方をコードする第３の核酸が、植物または植物の一部中に導入される、上述した方法（Ａ）も含む。または、１種または１種より多いコモウイルスエンハンサーと作動的に連結した調節領域を含む第１の核酸配列、植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した第２の調節領域を含む第２の核酸、およびサイレンシングのサプレッサー、ジェミニウイルスレプリカーゼ、またはそれらの両方をコードする第３の核酸を、植物または植物の一部中に導入してもよい。第３の核酸がサイレンシングのサプレッサーのみを含む場合、ジェミニウイルスレプリカーゼをコードする第４の核酸を、植物または植物の一部中に導入してもよい。１種または１種より多いコモウイルスエンハンサーは、コモウイルスＵＴＲ、例えば、ササゲモザイクウイルス（Ｃｏｗｐｅａ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）過剰翻訳性（ｈｙｐｅｒａｎｓｌａｔａｂｌｅ）（ＣＰＭＶ−ＨＴ）ＵＴＲ、例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴ５’および／または３’ＵＴＲなどとすることができる。

本発明は、導入のステップ（ステップａ）において、第１の核酸が、植物中で一過性に発現される、上述した方法（Ａ）も含む。または、導入のステップ（ステップａ）において、第１の核酸が、植物中で安定に発現される。

本発明は、狂犬病ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法（Ｂ）であって、
ａ）１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、植物中で活性な第１の調節領域を含む第１の核酸を含む植物または植物の一部を提供するステップと、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部をインキュベートし、それによって天然狂犬病ＶＬＰを生成するステップと
を含む方法も提供する。

植物中で活性な第１の調節領域、および植物中で活性な第２の調節領域は、同じであっても、異なっていてもよい。

方法（Ｂ）における天然狂犬病ウイルス構造タンパク質は、糖タンパク質であってもよい。天然狂犬病ウイルス構造タンパク質がＭ（マトリックス）タンパク質でない場合、上述した方法（Ｂ）において、植物は、植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した第２の調節領域を含む第２の核酸をさらに含むことができる。または、第１の核酸は、マトリックスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。

上述した方法（方法Ｂ）において、第１の核酸もしくは第２の核酸、またはそれらの両方は、１種または１種より多い増幅エレメントをさらにコードするか、それらを含むか、またはそれらをコードし、かつ含むことができる。１種または１種より多い増幅エレメントは、１種または１種より多いジェミニウイルス増幅エレメントから選択することができる。１種または１種より多いジェミニウイルス増幅エレメントは、インゲン黄斑萎縮ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＬＩＲ）、およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＳＩＲ）から選択することができる。

上述した方法（方法ＡまたはＢ）において、植物または植物の一部は、サイレンシングのサプレッサー、例えば、ＨｃＰｒｏもしくはｐ１９、ジェミニウイルスレプリカーゼ、またはそれらの両方をコードする別の核酸配列をさらに含むことができる。または、植物または植物の一部は、ジェミニウイルスレプリカーゼをコードするさらに別の核酸を含んでもよい。

本発明は、植物または植物の一部が第１の核酸を一過性に発現する、上述した方法（Ｂ）も含む。または、第１の核酸は、植物または植物の一部中で安定に発現される。

上述した方法（Ｂ）は、
ｄ）植物を収穫し、ＶＬＰを抽出するステップ
をさらに含むことができる。

本発明は、上述した方法（Ａ）および／または（Ｂ）によって生成されるＶＬＰを提供する。ＶＬＰは、植物に由来する１種または１種より多い脂質をさらに含んでもよい。ＶＬＰを構成する１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質は、植物特異的Ｎ−グリカン、または改変Ｎ−グリカンを含んでもよい。本発明は、ＶＬＰを使用して調製されるポリクローナル抗体も提供する。

本発明は、免疫応答を誘導するための、先ほど記載した方法（Ａ）または（Ｂ）によって作製される有効用量のＶＬＰ、および薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。

本発明は、被験体において狂犬病ウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、先ほど記載したＶＬＰを被験体に投与するステップを含む方法も含む。ＶＬＰは、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に、被験体に投与することができる。

本発明は、上述した方法（Ａ）および／または（Ｂ）によって生成されるＶＬＰを含む植物物質も提供する。植物物質は、被験体における狂犬病ウイルス感染に対する免疫を誘導するのに使用することができる。植物物質は、栄養剤として混ぜてもよい。

本発明の本概要は、本発明のすべての特徴を必ずしも記載するものではない。

本発明のこれらの特徴および他の特徴は、添付の図面を参照した以下の説明からより明らかとなるであろう。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
植物中で狂犬病ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、上記植物中で活性な調節領域を含む核酸を、上記植物または上記植物の一部中に導入するステップと、
ｂ）上記核酸の発現を可能にする条件下で上記植物または上記植物の一部をインキュベートし、それによって上記狂犬病ＶＬＰを生成するステップと
を含む、方法。
（項目２）
植物中で狂犬病ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、植物中で活性な調節領域を含む核酸を含む上記植物または上記植物の一部を提供するステップと、
ｂ）上記核酸の発現を可能にする条件下で上記植物または上記植物の一部をインキュベートし、それによって上記狂犬病ＶＬＰを生成するステップと
を含む、方法。
（項目３）
上記ヌクレオチド配列が、１種または１種より多い増幅エレメントをさらにコードするか、それらを含むか、またはそれらをコードしかつ含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記１種または１種より多い増幅エレメントが、ジェミニウイルス増幅エレメントである、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記１種または１種より多いジェミニウイルス増幅エレメントが、インゲン黄斑萎縮ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＬＩＲ）、およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＳＩＲ）から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質またはその断片をコードする第２のヌクレオチド配列に作動的に連結した第２の調節領域を含む第２の核酸が、上記植物または上記植物の一部中に導入され、ステップｂ）で上記植物または上記植物の一部をインキュベートしたとき発現される、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記植物または上記植物の一部が、上記植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質またはその断片をコードする第２のヌクレオチド配列に作動的に連結した第２の調節領域を含み、ステップｂ）で上記植物または上記植物の一部をインキュベートしたとき発現される第２の核酸をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目８）
上記天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が、狂犬病糖タンパク質（Ｇ）、または上記狂犬病Ｇタンパク質の断片である、項目１、２、６、および７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
マトリックスタンパク質が、狂犬病マトリックスタンパク質（Ｍ）、または上記Ｍタンパク質の断片である、項目６または７に記載の方法。
（項目１０）
上記導入するステップ（ステップａ）において、上記核酸が、上記植物中で一過性に発現される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記導入するステップ（ステップａ）において、上記核酸が、上記植物中で安定に発現される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
ｃ）上記植物を収穫するステップと、
ｄ）上記ＶＬＰを抽出するステップと
をさらに含む、項目１、２、６、および７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
上記ＶＬＰのサイズが４０〜３００ｎｍの範囲である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記ＶＬＰが、生化学的抽出によって抽出される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質またはその断片を含む植物由来ＶＬＰ。
（項目１６）
項目１、２、６、および７のいずれか一項に記載の方法によって生成されるＶＬＰ。
（項目１７）
植物に由来する１種または１種より多い脂質をさらに含む、項目１６に記載のＶＬＰ。
（項目１８）
１種または複数のウイルスタンパク質が、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変Ｎ−グリカンを含む、項目１６に記載のＶＬＰ。
（項目１９）
被験体において免疫応答を誘導するための有効用量の項目１５から１８のいずれか一項に記載のＶＬＰ、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目２０）
被験体において狂犬病ウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、項目１９に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目２１）
上記組成物が、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に、被験体に投与される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
項目１５から１８のいずれか一項に記載のＶＬＰを使用して調製されるポリクローナル抗体。
（項目２３）
項目１、２、６、および７のいずれか一項に記載の方法によって生成されるＶＬＰを含む植物物質。
（項目２４）
被験体において狂犬病ウイルス感染に対する免疫を誘導するのに使用するための項目２３に記載の植物物質。
（項目２５）
項目２４に記載の植物物質を含む栄養剤。
（項目２６）
サイレンシングのサプレッサー、ジェミニウイルスレプリカーゼ、またはそれらの両方をコードする追加の核酸配列を導入するステップをさらに含む、項目１または６に記載の方法。
（項目２７）
上記サイレンシングのサプレッサーおよび上記ジェミニウイルスレプリカーゼが、上記植物または上記植物の一部中に導入される２つの異なる追加の核酸配列によってコードされる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記サイレンシングのサプレッサーが、ＨｃＰｒｏおよびｐ１９の群から選択される、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９）
上記天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が、配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１、２、６、および７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
上記天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が、配列番号１４に示したアミノ酸配列を有する、項目１、２、６、および７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
上記マトリックスウイルスタンパク質が、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目６または７に記載の方法。
（項目３２）
上記マトリックスウイルスタンパク質が、配列番号６に示したアミノ酸配列を有する、項目６または７に記載の方法。
（項目３３）
上記調節領域を含む上記核酸配列が、１種または１種より多いコモウイルスエンハンサーとさらに作動的に連結されている、項目１、２、６、および７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
上記１種または１種より多いコモウイルスエンハンサーが、コモウイルスＵＴＲである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上記コモウイルスＵＴＲがササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＵＴＲである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
上記ＶＬＰが、ウイルスマトリックスもコアタンパク質も含有しない、項目１または２に記載の方法。

図１は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける一過性の狂犬病Ｇタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。狂犬病Ｇタンパク質は、ＢｅＹＤＶベースＤＮＡ増幅系を用いた（１０９１）または用いない（１０７１）ＣＰＭＶ−ＨＴの制御下で発現された（構築物の実施例における表２を参照）。括弧内の数値は、細菌接種材料の調製において使用した、ミリリットルでのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養液の量を指す。ＡＧＬ１／１０９１が浸潤した植物を、浸潤後３日または４日（ＤＰＩ）で収穫した。浸潤された植物の葉を収穫し、機械的に抽出した。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗狂犬病Ｇマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ ＳＣ−５７９９５）を使用して、ウエスタンブロットによって分析した。 図２は、狂犬病Ｇタンパク質の生化学的および機械的抽出法からのタンパク質抽出物中の狂犬病Ｇタンパク質含量の比較を示す。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗狂犬病Ｇマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ ＳＣ−５７９９５）を使用して、ウエスタンブロットによって分析した。括弧内の数値は、細菌接種材料の調製において使用した、ミリリットルでのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養液の量を指す（構築物についての表２を参照）。 図３Ａは、ＡＧＬ１／１０９１が浸潤した植物由来の濃縮タンパク質抽出液のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による、分離後の狂犬病Ｇタンパク質含量のウエスタンブロット分析を示す。ＳＥＣからの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗狂犬病タンパク質Ｇマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ ＳＣ−５７９９５）を使用して、ウエスタンブロットによって分析した。図３Ｂは、ＡＧＬ１／１０９１＋ＡＧＬ１／１０８６が浸潤した植物由来の濃縮タンパク質抽出液のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による、分離後の狂犬病Ｇタンパク質含量のウエスタンブロット分析を示す。ＳＥＣからの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗狂犬病タンパク質Ｇマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ ＳＣ−５７９９５）を使用して、ウエスタンブロットによって分析した。 図４Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ３．ｃ（配列番号１）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号２）を示す。図４Ｃは、合成Ｍタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ９１３４７０からのｎｔ２４９６−３１０４に対応）（配列番号３）を示す。図４Ｄは、構築物番号１１９１の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図４Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９１を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号４）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０６６を示す。狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号５）。図４Ｇは、狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図４Ｈは、構築物番号１０６６の略図を示す。 図４Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ３．ｃ（配列番号１）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号２）を示す。図４Ｃは、合成Ｍタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ９１３４７０からのｎｔ２４９６−３１０４に対応）（配列番号３）を示す。図４Ｄは、構築物番号１１９１の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図４Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９１を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号４）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０６６を示す。狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号５）。図４Ｇは、狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図４Ｈは、構築物番号１０６６の略図を示す。 図４Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ３．ｃ（配列番号１）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号２）を示す。図４Ｃは、合成Ｍタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ９１３４７０からのｎｔ２４９６−３１０４に対応）（配列番号３）を示す。図４Ｄは、構築物番号１１９１の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図４Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９１を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号４）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０６６を示す。狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号５）。図４Ｇは、狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図４Ｈは、構築物番号１０６６の略図を示す。 図４Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ３．ｃ（配列番号１）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号２）を示す。図４Ｃは、合成Ｍタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ９１３４７０からのｎｔ２４９６−３１０４に対応）（配列番号３）を示す。図４Ｄは、構築物番号１１９１の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図４Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９１を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号４）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０６６を示す。狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号５）。図４Ｇは、狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図４Ｈは、構築物番号１０６６の略図を示す。 図４Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ３．ｃ（配列番号１）を示す。図４Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号２）を示す。図４Ｃは、合成Ｍタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ９１３４７０からのｎｔ２４９６−３１０４に対応）（配列番号３）を示す。図４Ｄは、構築物番号１１９１の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図４Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９１を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号４）。図４Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０６６を示す。狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号５）。図４Ｇは、狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図４Ｈは、構築物番号１０６６の略図を示す。 図５Ａは、構築物番号１１９３の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図５Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９３を示す（下線を引いている）。プラストシアニン−ＴＢＳＶ Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号７）。図５Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０８６を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号８）。図５Ｄは、構築物番号１０８６の略図を示す。 図５Ａは、構築物番号１１９３の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図５Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９３を示す（下線を引いている）。プラストシアニン−ＴＢＳＶ Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号７）。図５Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０８６を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号８）。図５Ｄは、構築物番号１０８６の略図を示す。 図５Ａは、構築物番号１１９３の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図５Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９３を示す（下線を引いている）。プラストシアニン−ＴＢＳＶ Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号７）。図５Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０８６を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号８）。図５Ｄは、構築物番号１０８６の略図を示す。 図５Ａは、構築物番号１１９３の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図５Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９３を示す（下線を引いている）。プラストシアニン−ＴＢＳＶ Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号７）。図５Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０８６を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号８）。図５Ｄは、構築物番号１０８６の略図を示す。 図５Ａは、構築物番号１１９３の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図５Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９３を示す（下線を引いている）。プラストシアニン−ＴＢＳＶ Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号７）。図５Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０８６を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号８）。図５Ｄは、構築物番号１０８６の略図を示す。 図６Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（配列番号９）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号１０）を示す。図６Ｃは、合成狂犬病Ｇタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ２０６７０７からのｎｔ３３１７−４８９１に対応）（配列番号１１）を示す。図６Ｄは、構築物番号１１９２の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図６Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９２を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１２）。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０７１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１３）。図６Ｇは、ＰＤＩＳＰ−狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。図６Ｈは、構築物番号１０７１の略図を示す。 図６Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（配列番号９）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号１０）を示す。図６Ｃは、合成狂犬病Ｇタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ２０６７０７からのｎｔ３３１７−４８９１に対応）（配列番号１１）を示す。図６Ｄは、構築物番号１１９２の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図６Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９２を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１２）。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０７１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１３）。図６Ｇは、ＰＤＩＳＰ−狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。図６Ｈは、構築物番号１０７１の略図を示す。 図６Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（配列番号９）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号１０）を示す。図６Ｃは、合成狂犬病Ｇタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ２０６７０７からのｎｔ３３１７−４８９１に対応）（配列番号１１）を示す。図６Ｄは、構築物番号１１９２の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図６Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９２を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１２）。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０７１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１３）。図６Ｇは、ＰＤＩＳＰ−狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。図６Ｈは、構築物番号１０７１の略図を示す。 図６Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（配列番号９）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号１０）を示す。図６Ｃは、合成狂犬病Ｇタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ２０６７０７からのｎｔ３３１７−４８９１に対応）（配列番号１１）を示す。図６Ｄは、構築物番号１１９２の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図６Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９２を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１２）。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０７１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１３）。図６Ｇは、ＰＤＩＳＰ−狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。図６Ｈは、構築物番号１０７１の略図を示す。 図６Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（配列番号９）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号１０）を示す。図６Ｃは、合成狂犬病Ｇタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ２０６７０７からのｎｔ３３１７−４８９１に対応）（配列番号１１）を示す。図６Ｄは、構築物番号１１９２の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図６Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９２を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１２）。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０７１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１３）。図６Ｇは、ＰＤＩＳＰ−狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。図６Ｈは、構築物番号１０７１の略図を示す。 図６Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（配列番号９）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号１０）を示す。図６Ｃは、合成狂犬病Ｇタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ２０６７０７からのｎｔ３３１７−４８９１に対応）（配列番号１１）を示す。図６Ｄは、構築物番号１１９２の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図６Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９２を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１２）。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０７１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１３）。図６Ｇは、ＰＤＩＳＰ−狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。図６Ｈは、構築物番号１０７１の略図を示す。 図６Ａは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（配列番号９）を示す。図６Ｂは、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ１−４．ｒ（配列番号１０）を示す。図６Ｃは、合成狂犬病Ｇタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ２０６７０７からのｎｔ３３１７−４８９１に対応）（配列番号１１）を示す。図６Ｄは、構築物番号１１９２の略図を示す。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図６Ｅは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９２を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１２）。図６Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０７１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１３）。図６Ｇは、ＰＤＩＳＰ−狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。図６Ｈは、構築物番号１０７１の略図を示す。 図７Ａは、構築物番号１１９４の略図を示す図である。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図７Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９４を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１５）。図７Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０９１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１６）。図７Ｄは、構築物番号１０９１の略図を示す。 図７Ａは、構築物番号１１９４の略図を示す図である。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図７Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９４を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１５）。図７Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０９１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１６）。図７Ｄは、構築物番号１０９１の略図を示す。 図７Ａは、構築物番号１１９４の略図を示す図である。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図７Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９４を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１５）。図７Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０９１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１６）。図７Ｄは、構築物番号１０９１の略図を示す。 図７Ａは、構築物番号１１９４の略図を示す図である。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図７Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９４を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１５）。図７Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０９１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１６）。図７Ｄは、構築物番号１０９１の略図を示す。 図７Ａは、構築物番号１１９４の略図を示す図である。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図７Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９４を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１５）。図７Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０９１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１６）。図７Ｄは、構築物番号１０９１の略図を示す。 図７Ａは、構築物番号１１９４の略図を示す図である。プラスミド線状化に使用したＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を、描画上で注釈している。図７Ｂは、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの構築物番号１１９４を示す（下線を引いてある）。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含むＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内への２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ（サイレンシングのサプレッサー）（配列番号１５）。図７Ｃは、ＢｅＹＤＶ左ＬＩＲからＢｅＹＤＶ右ＬＩＲまでの発現カセット番号１０９１を示す。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のオープンリーディングフレームに下線を引いてある（配列番号１６）。図７Ｄは、構築物番号１０９１の略図を示す。 図８Ａは、Ｇタンパク質ＶＬＰ調製物を示す、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（プレキャスト４〜１２％、ＢｉｏＲａｄ製）を示す。１）Ｒａｂ−ＶＬＰ調製物、２）分子量マーカー。図８Ｂは、アジュバント（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ａｌｈｙ））を用いて、または用いずにＮＧ−ＶＬＰ（天然Ｇタンパク質ＶＬＰ）ワクチン０．１ｍｌを３回の投与で（Ｄ０、Ｄ７、およびＤ２８）筋肉内に（ｉ．ｍ．）免疫化されたマウスの群（１群当たり５匹）における中和抗体の応答（ＩＵ／ｍｌ）を示す。血液試料を、４４日目、すなわち３回目の投与後１６日に採取した。使用した試験法：ＲＦＦＩＴ試験（迅速蛍光焦点抑制試験）：幾何平均力価（ＧＭＴ）を各動物について得た個々の値を使用して計算した。陽性応答物が示されている。バーは、９５％のＣＩを有するＧＭＴを表す。Ａｎｏｖａをすべての処置群間で実施し、統計的に有意な差異は、報告されなかった。 図８Ａは、Ｇタンパク質ＶＬＰ調製物を示す、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（プレキャスト４〜１２％、ＢｉｏＲａｄ製）を示す。１）Ｒａｂ−ＶＬＰ調製物、２）分子量マーカー。図８Ｂは、アジュバント（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ａｌｈｙ））を用いて、または用いずにＮＧ−ＶＬＰ（天然Ｇタンパク質ＶＬＰ）ワクチン０．１ｍｌを３回の投与で（Ｄ０、Ｄ７、およびＤ２８）筋肉内に（ｉ．ｍ．）免疫化されたマウスの群（１群当たり５匹）における中和抗体の応答（ＩＵ／ｍｌ）を示す。血液試料を、４４日目、すなわち３回目の投与後１６日に採取した。使用した試験法：ＲＦＦＩＴ試験（迅速蛍光焦点抑制試験）：幾何平均力価（ＧＭＴ）を各動物について得た個々の値を使用して計算した。陽性応答物が示されている。バーは、９５％のＣＩを有するＧＭＴを表す。Ａｎｏｖａをすべての処置群間で実施し、統計的に有意な差異は、報告されなかった。

以下の説明は、好適な実施形態のものである。

本発明は、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および植物中で狂犬病ＶＬＰを生成する方法に関する。狂犬病ＶＬＰは、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質、例えば、１種または複数の糖タンパク質、１種または複数のマトリックスタンパク質、またはそれらの両方を含むことができる。ＶＬＰは、植物ウイルス由来のウイルスタンパク質を含まない。

本発明は、植物中で狂犬病ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法を一部分において提供する。本方法は、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、植物中で活性な調節領域、および１種または１種より多い増幅エレメントを含む核酸を、植物または植物の一部中に導入するステップを含むことができる。その後、核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部をインキュベートし、それによってＶＬＰを生成するステップが続く。

天然狂犬病構造的ウイルスタンパク質（ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（天然狂犬病構造的ウイルスのタンパク質（ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれる）は、任意の天然に存在する、またはバリアント狂犬病ウイルス株もしくは分離株中に存在する、狂犬病ウイルスから単離された天然狂犬病ウイルス構造タンパク質配列のすべてまたは一部を指す場合がある。したがって、用語の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質などは、ウイルスライフサイクルの間の突然変異によって生成され、または選択圧（例えば、薬物療法、宿主細胞指向性もしくは感染性の拡大など）に応答して生成される天然に存在する天然狂犬病ウイルス構造タンパク質配列バリアントを含む。当業者が理解するように、このような天然狂犬病ウイルス構造タンパク質配列およびそのバリアントは、組換え技法を使用しても生成され得る。天然狂犬病構造的ウイルスタンパク質は、例えば、天然狂犬病構造的ウイルスタンパク質に関して、膜貫通ドメインおよび／または細胞質尾部が、異種膜貫通ドメインおよび／または細胞質尾部で置きかえられたキメラタンパク質を含まない。

天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の非限定例は、狂犬病糖タンパク質（Ｇ）タンパク質、Ｇタンパク質の断片、マトリックス（Ｍ）タンパク質、Ｍタンパク質の断片、またはこれらの組合せである。本発明によって使用することができるＧタンパク質、またはＧタンパク質の断片の非限定例としては、狂犬病ＥＲＡ株由来のＧタンパク質がある。Ｇタンパク質の一例は、限定的とみなされるべきでなく、配列番号１４のアミノ酸配列に示されている。さらに、天然狂犬病構造的ウイルスタンパク質は、配列番号１４に示した配列、またはこれと少なくとも約９０〜１００％の配列類似性、これらの範囲内の任意のパーセント類似性、例えば、これと９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列類似性を含めた配列類似性を有する配列を含み得る。

アミノ酸配列類似性または同一性は、ＢＬＡＳＴ（基本ローカルアラインメント検索ツール）２．０アルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用することによって計算することができる。アミノ酸配列類似性または同一性を計算するための技法は、当業者に周知であり、ＢＬＡＳＴアルゴリズムの使用は、ＡＬＴＳＣＨＵＬら（１９９０年、Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁）およびＡＬＴＳＣＨＵＬら（１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁）に記載されている。

天然構造的ウイルスタンパク質は、単量体、二量体、三量体、またはこれらの組合せとして存在し得る。三量体は、通常非共有結合的に結合した３つのタンパク質によって形成された巨大分子複合体である。理論に束縛されることを望むわけではないが、タンパク質の三量体形成ドメインは、このような三量体の形成に重要となり得る。したがって、ウイルスタンパク質またはその断片は、三量体形成ドメインを含む場合がある。

「マトリックスタンパク質」（ウイルスコアタンパク質とも呼ばれる）とは、ビリオン構造を組織化および維持するタンパク質を意味する。ウイルスマトリックスタンパク質は、通常、細胞膜と直接相互作用し、出芽プロセスに関与し得る。ウイルスコアタンパク質は、ヌクレオカプシド（ｎｕｃｅｌｏｃａｐｓｉｄ）の一部を構成するタンパク質であり、一般に、ウイルス核酸に直接関連している。ウイルスマトリックスまたはコアタンパク質の例は、狂犬病Ｍタンパク質、インフルエンザＭ１、ＲＳＶ Ｍ、およびレトロウイルスｇａｇタンパク質である。本明細書で記載するように使用され得るマトリックスタンパク質の例としては、それだけに限らないが、狂犬病Ｍタンパク質がある。本発明で使用され得る配列の非限定例としては、狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質がある。例示的なＭタンパク質は、配列番号６に示したアミノ酸配列からなる。さらに、天然狂犬病構造的ウイルスタンパク質は、配列番号６に示した配列、またはこれと少なくとも約９０〜１００％の配列類似性、これらの範囲内の任意のパーセント類似性、例えば、これと９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列類似性を含めた配列類似性を有する配列を含み得る。

水疱性口内炎ウイルス（ラブドウイルス、狂犬病など）および単純ヘルペスウイルス（ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルスなど）はともに、ＶＳＰ４依存様式で出芽する（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ、８１巻：１３６３１〜１３６３９頁、２００７年；Ｃｒｕｍｐら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ、８１巻：７３８０〜７３８７頁、２００７年）。ＶＳＰ４は、マトリックスタンパク質の後期ドメインと相互作用するので、これは、マトリックスタンパク質が出芽に、および当然の結果として、ＶＬＰ生成に必要とされることを示唆する。しかし、本明細書で記載するように、天然狂犬病ＶＬＰは、マトリックスタンパク質を同時発現しても、しなくても植物内で生成することができる。したがって、本発明によるウイルス由来天然構造タンパク質から植物中で生成される天然狂犬病ＶＬＰは、ウイルスマトリックス（またはウイルスコア）タンパク質を含んでも、含んでいなくてもよい。

本発明は、植物中で狂犬病ウイルス様タンパク質ＶＬＰを生成する方法であって、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質、例えば、狂犬病Ｇタンパク質をコードする核酸（第１の核酸）が、ウイルスマトリックスタンパク質、例えば、それだけに限らないが、狂犬病マトリックスタンパク質をコードする第２の核酸と同時発現される、方法も提供する。核酸および第２の核酸は、同じステップ内で植物に導入してもよく、または逐次的に植物に導入してもよい。

以下でより詳細に記載するように、ＶＬＰは、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質、例えば、狂犬病Ｇタンパク質をコードする核酸（第１の核酸）を発現させることによって植物中で生成することができる。マトリックスタンパク質、例えば、それだけに限らないが、狂犬病マトリックスタンパク質をコードする第２の核酸を、植物中で同時発現させてもよい。核酸および第２の核酸は、同じステップ内で植物に導入してもよく、または逐次的に植物に導入してもよい。核酸および第２の核酸は、一過性の様式または安定な様式で植物に導入することができる。

さらに、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質、例えば、狂犬病Ｇタンパク質をコードする第１の核酸を発現する植物は、マトリックスタンパク質、例えば、それだけに限らないが、狂犬病マトリックスタンパク質（第２の核酸）で形質転換することができ、その結果、第１および第２の核酸はともに、植物中で同時発現される。または、マトリックスタンパク質、例えば、それだけに限らないが、狂犬病マトリックスタンパク質（第２の核酸）を発現する植物は、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質、例えば、狂犬病Ｇタンパク質をコードする第１の核酸で形質転換することができ、その結果、第１および第２の核酸はともに、植物中で同時発現される。

さらに、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質、例えば、狂犬病Ｇタンパク質をコードする第１の核酸を発現する第１の植物を、マトリックスタンパク質、例えば、それだけに限らないが、狂犬病マトリックスタンパク質をコードする第２の核酸を発現する第２の植物と交雑させて、それぞれ天然狂犬病ウイルス構造タンパク質およびマトリックスタンパク質をコードする第１および第２の核酸を同時発現する子孫植物を生成することができる。

本発明は、植物中で活性な調節領域に作動的に連結した１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードする１種または複数の核酸、および１種または１種より多い増幅エレメントを植物または植物の一部中に導入するステップを伴う、植物中で狂犬病ウイルスＶＬＰを生成する方法も提供する。続いて植物または植物の一部は、１種または複数の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートされ、それによって、狂犬病ウイルスＶＬＰが生成される。１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質は、１種または複数の狂犬病Ｇタンパク質、Ｇタンパク質の断片、１種または複数のＭタンパク質、Ｍタンパク質の断片、またはこれらの組合せとすることができる。

本発明はさらに、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質、例えば、それだけに限らないが、１種または複数の狂犬病ウイルス糖タンパク質、１種または複数のマトリックスタンパク質、またはそれらの両方を含むＶＬＰを提供する。ＶＬＰは、本発明によって提供される方法によって生成することができる。

用語「ウイルス様（ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ）粒子」（ＶＬＰ）」、または「ウイルス様（ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ）粒子」、または「ＶＬＰ」は、自己組織化し、１種または複数の構造タンパク質、例えば、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質、例えば、それだけに限らないが、狂犬病Ｇタンパク質などを含む構造体を指す。ＶＬＰは一般に、感染で生成されるビリオンと形態学的および抗原的に同様であるが、複製するのに十分な遺伝子情報を欠いており、したがって非感染性である。ＶＬＰは、植物宿主細胞を含めた適当な宿主細胞内で生成することができる。宿主細胞から抽出した後、適当な条件下で単離し、さらに精製すると、ＶＬＰは、インタクトな構造体として精製され得る。

上記に定義したＶＬＰのサイズ（すなわち、直径）は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）または電子顕微鏡（ＥＭ）技法によって測定することができ、通常４０〜３００ｎｍの間、またはその間の任意のサイズである。いくつかの実施形態では、インタクトなＶＬＰ構造体のサイズは、約４０ｎｍ〜約３００ｎｍ、あるいはその間の任意のサイズ、例えば、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、２１０ｎｍ、２２０ｎｍ、２３０ｎｍ、２４０ｎｍ、２５０ｎｍ、２６０ｎｍ、２７０ｎｍ、もしくは２８０ｎｍ、またはその間の任意のサイズなどの範囲となり得る。一実施形態では、インタクトなＶＬＰ構造体のサイズは、約１７０ｎｍ〜約２００ｎｍ、またはその間の任意のサイズ、例えば、１７５ｎｍ、１８０ｎｍ、１８５ｎｍ、１９０ｎｍ、１９５ｎｍ、もしくはその間の任意のサイズなどの範囲となり得る。

本発明はさらに、植物中で活性な調節領域に作動的に連結した１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらに、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質は、１種または１種より多い増幅エレメントに作動的に連結されている場合がある。１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質は、例えば、１種または複数の狂犬病Ｇタンパク質、１種または複数のＭタンパク質、またはそれらの両方であり得る。

本発明で参照する核酸配列は、核酸配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で１つもしくは１つを超えるヌクレオチド配列または本明細書で定義された核酸配列の相補体とハイブリダイズする場合、一配列またはその配列の相補体と「実質的に相同」または「実質的に類似」であり得る。配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７０％、あるいは７０〜１００％の間、またはその間の任意の量、例えば、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００％、もしくはその間の任意の量が、ヌクレオチド配列の規定長にわたってマッチするとき、「実質的に相同」または「実質的に類似」であり、ただしそのような相同配列は、配列、または本明細書に記載のコードされる生成物の特性の１つまたは１つより多くを呈する。タンパク質の正確な折り畳みは、タンパク質の安定性、多量体の形成、ＶＬＰの形成、および機能にとって重要となり得る。タンパク質の折り畳みは、１つまたは複数の要因、例えば、それだけに限らないが、タンパク質の配列、タンパク質の相対存在量、細胞内密集の程度、折り畳まれた、部分的に折り畳まれた、または折り畳まれていないタンパク質と結合し、または一過性に関連し得る補助因子の利用可能性などによって影響され得る。

そのような配列類似性は、ＤＮＡＳＩＳ内で提供されるものなどのヌクレオチド配列比較プログラムを使用して（例えば、それだけに限らないが、以下のパラメータ、すなわち、ギャップペナルティー５、トップダイアゴナル数５、固定ギャップペナルティー１０、ｋ−タプル２、フローティングギャップ１０、およびウィンドウサイズ５を使用して）求めることができる。しかし、比較のための配列のアラインメントの他の方法、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１年、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２巻：４８２頁）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁、１９７０年）、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁）のアルゴリズム、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピュータ化実行によるもの（ＮＩＨを通じて入手可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＢＬＡＳＴ）、または手動アラインメントおよび目視検査によるもの（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年、増補を参照）、またはストリンジェントな条件下でのサザンもしくはノーザンハイブリダイゼーションを使用するもの（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２年におけるＭａｎｉａｔｉｓらを参照）が当技術分野で周知である。好ましくは、実質的に相同である配列は、分子の規定長にわたって少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％の配列類似性を呈する。

１つのそのようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、６５℃で４×ＳＳＣ中での一晩（約１６〜２０時間）のハイブリダイゼーション、その後６５℃で１時間の０．１×ＳＳＣ中での洗浄、または６５℃でそれぞれ２０分もしくは３０分の０．１×ＳＳＣ中での２回の洗浄とすることができる。代わりに、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ユニークな配列領域について、４２℃で５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中で一晩（１６〜２０時間）、その後６５℃で１時間の０．１×ＳＳＣ中での洗浄、または６５℃でそれぞれ２０分もしくは３０分間の０．１×ＳＳＣ中での２回の洗浄、あるいは５０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、それぞれ２０分もしくは３０分間の２回の洗浄、または６５℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、それぞれ２０分もしくは３０分間の２回の洗浄のいずれかを伴った、６５℃でＣｈｕｒｃｈリン酸緩衝水溶液（７％ＳＤＳ；０．５Ｍ ＮａＰＯ_４緩衝液 ｐＨ７．２；１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中での一晩（１６〜２０時間）またはハイブリダイゼーションとすることができる。

天然狂犬病構造ポリペプチドまたは天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードする核酸は、「狂犬病核酸」、「狂犬病ヌクレオチド配列」、「天然狂犬病核酸」、または「天然狂犬病ヌクレオチド配列」と記述することができる。例えば、限定的とみなされるべきでないが、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質または天然狂犬病ウイルス構造ポリペプチドを含むウイルス様粒子は、「狂犬病ＶＬＰ」または「天然狂犬病ＶＬＰ」と記述することができる。

天然狂犬病ウイルス構造タンパク質またはポリペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質の残りと同じであり、またはそれとは異種であるシグナルペプチドを含むことができる。用語「シグナルペプチド」は、当技術分野で周知であり、新しく翻訳されるポリペプチドのトランスロケーションを特定の小器官に向け、またはポリペプチド鎖の特定のドメインを他のドメインに対して位置決めすることに役立つことができるポリペプチドのＮ末端に一般に見出される、アミノ酸の短い（約５〜３０アミノ酸）配列を一般に指す。非限定例として、シグナルペプチドは、成熟タンパク質、例えば、限定的とみなされるべきでないが、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の切断および折り畳みに役立つように、タンパク質の小胞体へのトランスロケーションを標的にし、かつ／または新生ポリペプチドの膜−アンカードメインに対してＮ末端近位ドメインを位置決めするのを助けることができる。

シグナルペプチド（ＳＰ）は、タンパク質またはウイルスタンパク質に固有であってもよく、シグナルペプチドは、発現されるタンパク質またはウイルスタンパク質の一次配列に関して異種であってもよい。例えば、天然狂犬病Ｇタンパク質または天然狂犬病Ｍタンパク質の天然シグナルペプチドを使用して、植物系内で天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を発現させることができる。

シグナルペプチドは、非天然である、例えば、タンパク質、ウイルスタンパク質、もしくはウイルスタンパク質以外のウイルスの天然構造タンパク質由来、または植物、動物、もしくは細菌のポリペプチド由来であってもよい。使用することができるシグナルペプチドの非限定例は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド（ＰＤＩ ＳＰ；受託番号Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２−１０３）である。

したがって、本発明は、天然または非天然のシグナルペプチドを含む天然狂犬病ウイルス構造タンパク質、およびそのような狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードする核酸を提供する。

増幅エレメント
天然狂犬病ウイルス構造タンパク質またはポリペプチドは、ウイルスベースＤＮＡまたはＲＮＡ発現系を含む発現系、例えば、それだけに限らないが、コモウイルスベース発現カセットおよびジェミニウイルスベース増幅エレメント内で発現され得る。

本明細書に記載の発現系は、二部分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ウイルス、または二部分ゲノムを有するウイルスに基づく発現カセットを含むことができる。例えば、二部分ウイルスは、Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ科のものであってもよい。Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ科の属としては、コモウイルス、ネポウイルス（Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ）、ファバウイルス（Ｆａｂａｖｉｒｕｓ）、チェラウイルス（Ｃｈｅｒａｖｉｒｕｓ）、およびサドワウイルス（Ｓａｄｗａｖｉｒｕｓ）がある。コモウイルスとしては、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ササゲシビアモザイクウイルス（Ｃｏｗｐｅａ ｓｅｖｅｒｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＣＰＳＭＶ）、カボチャモザイクウイルス（Ｓｑｕａｓｈ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＳｑＭＶ）、アカツメクサ斑紋ウイルス（Ｒｅｄ ｃｌｏｖｅｒ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）（ＲＣＭＶ）、ビーンポッド斑紋ウイルス（Ｂｅａｎ ｐｏｄ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）（ＢＰＭＶ）、カブ輪斑ウイルス（Ｔｕｒｎｉｐ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）（ＴｕＲＳＶ）、ソラマメトゥルーモザイクウイルス（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ ｔｒｕｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＢＢｔＭＶ）、ソラマメステインウイルス（Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ ｓｔａｉｎ ｖｉｒｕｓ）（ＢＢＳＶ）、ダイコンモザイクウイルス（Ｒａｄｉｓｈ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＲａＭＶ）がある。本発明の様々な態様に有用となり得るエンハンサーエレメントを含むコモウイルスＲＮＡ−２配列の例としては、それだけに限らないが、ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３５５０）、ＲＣＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３７３８）、ＢＰＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３４９５）、ＣＰＳＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３５４４）、ＳｑＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３８００）、ＴｕＲＳＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１３２１９．１）、ＢＢｔＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ８１０９０４）、ＢＢＳＶ ＲＮＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ０２８６５０）、ＲａＭＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３８００）がある。

二部分コモウイルスＲＮＡゲノムのセグメントは、ＲＮＡ−１およびＲＮＡ−２と呼ばれる。ＲＮＡ−１は、複製に関与するタンパク質をコードし、一方、ＲＮＡ−２は、細胞間移動に必要なタンパク質および２種のカプシドタンパク質をコードする。ＣＰＭＶ、ＣＰＳＭＶ、ＳｑＭＶ、ＲＣＭＶ、またはＢＰＭＶを含めた任意の適当なコモウイルスベースカセットを使用することができ、例えば、発現カセットは、ＣＰＭＶに基づいてもよい。

「発現カセット」は、宿主細胞内の目的の核酸の転写に適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下であり、これらに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）（または作動的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ））連結した目的の核酸を含むヌクレオチド配列を指す。

発現系は、ジェミニウイルス由来の増幅エレメント、例えば、インゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来の増幅エレメントも含むことができる。ＢｅＹＤＶは、双子葉植物に適合したマストレウイルス（Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ）属に属する。ＢｅＹＤＶは、単鎖環状ＤＮＡゲノムを有する単部分（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）のものであり、ローリングサークル機構によって非常に高いコピー数まで複製することができる。ＢｅＹＤＶ由来ＤＮＡレプリコンベクター系は、植物中の迅速高収率タンパク質生成に使用されている。

本明細書において、語句「増幅エレメント」は、ジェミニウイルスゲノムの１つまたは複数の長い遺伝子間領域または長い遺伝子間リピート（ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＬＩＲ）の少なくとも一部を含む核酸セグメントを指す。本明細書において、「長い遺伝子間領域」または「長い遺伝子間リピート」は、ジェミニウイルスＲｅｐタンパク質による切除および複製を媒介することができるｒｅｐ結合部位を含有する長い遺伝子間領域の一領域を指す。いくつかの態様では、１つまたは複数のＬＩＲを含む核酸セグメントは、ジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域または小さい遺伝子間領域（ＳＩＲ）をさらに含む場合がある。本明細書において、「短い遺伝子間領域」または「小さい遺伝子間領域」は、相補鎖（マストレウイルスの短いＩＲ（ＳＩＲ））を指す。任意の適当なジェミニウイルス由来増幅エレメントを本明細書で使用することができる。例えば、ＷＯ２０００／２０５５７；ＷＯ２０１０／０２５２８５；Ｚｈａｎｇ Ｘ．ら（２００５年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９３巻、２７１〜２７９頁）、Ｈｕａｎｇ Ｚ．ら（２００９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０３巻、７０６〜７１４頁）、Ｈｕａｎｇ Ｚ．ら（２００９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０６巻、９〜１７頁）を参照；これらは、参考として本明細書に援用される）。１つを超えるＬＩＲ、例えば、２つのＬＩＲが構築物中に使用される場合、プロモーター、ＣＭＰＶ−ＨＴ領域、および目的の核酸配列、およびターミネーターは、２つのＬＩＲのそれぞれによって一括りにされる。さらに、増幅エレメントは、例えば、Ｈａｌｌｅｙ−Ｓｔｏｔｔら（２００７年）Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５２巻：１２３７〜１２４０頁に開示され、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号ＤＱ４５８７９１の下で寄託された配列が起源である場合がある。この文献は、参考として本明細書に援用される。ＬＩＲを含む核酸セグメントは、つながったヌクレオチド２４０１〜２５６６および１〜１２８である。ＳＩＲを含む核酸セグメントは、ヌクレオチド１１５４〜１２１２である。

本明細書で記載するように、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のアグロインフィルトレーション（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって、インゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来ベクターおよびＲｅｐ／ＲｅｐＡ供給ベクターを共送達すると、効率的なレプリコン増幅およびロバストなタンパク質生成がもたらされる。

コモウイルスベース発現カセットおよびジェミニウイルス由来増幅エレメントは、別個のベクター上に含まれる場合があり、または成分部分を１つのベクター中に含めてもよい。２つのベクターが使用される場合、第１および第２のベクターは、同時に、または別個に植物細胞内に導入することができる。

ウイルスレプリカーゼも、目的の核酸の発現を増大させるために、本明細書に記載の発現系内に含めることができる。レプリカーゼの非限定例は、ＢｅＹＤＶ ＲｅｐおよびＲｅｐＡをコードするＢｅＹＤＶレプリカーゼ（ｐＲＥＰ１１０）である（Ｃ２／Ｃ１；Ｈｕａｎｇら、２００９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．、１０３巻、７０６〜７１４頁；これは、参考として本明細書に援用される）。レプリカーゼの別の非限定例は、Ｈａｌｌｅｙ−Ｓｔｏｔｔら、（２００７年）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５２巻：１２３７〜１２４０頁に開示され、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号ＤＱ４５８７９１の下で寄託されている。この文献は、参考として本明細書に援用される。Ｃ１：Ｃ２遺伝子を含む核酸セグメントは、ヌクレオチド１３１０〜２４００である。

「同時発現される」とは、２種または２種より多いヌクレオチド配列が、植物内、および植物の同じ組織内でほぼ同時に発現されることを意味する。しかし、ヌクレオチド配列は、正確に同時に発現される必要はない。どちらかと言えば、２種またはそれより多いヌクレオチド配列は、コードされる生成物が相互作用する機会を有する様式で発現される。２種または２種より多いヌクレオチド配列は、一過性の発現系を使用して同時発現させることができ、この場合、２種またはそれより多い配列は、両配列が発現される条件下でほぼ同時に植物内に導入される。または、ヌクレオチド配列の１つを含むプラットフォーム植物は、安定な様式で形質転換することができ、目的のタンパク質、例えば、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードする追加の配列は、一過性の様式でプラットフォーム植物内に導入される。

シャペロン
発現される天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の正確な折り畳みは、他の特徴の中でも、タンパク質の安定性、多量体の形成、ＶＬＰの形成、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の機能、および抗体による天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の認識にとって重要となり得る。タンパク質の折り畳みおよび蓄積は、１つまたは複数の要因、例えば、それだけに限らないが、タンパク質の配列、タンパク質の相対存在量、細胞内密集の程度、細胞コンパートメント内のｐＨ、折り畳まれた、部分的に折り畳まれた、または折り畳まれていないタンパク質と結合し、または一過性に関連し得る補助因子の利用可能性、１種または複数のシャペロンタンパク質の存在などによって影響され得る。

熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質の例であり、これらは、タンパク質合成、細胞内移動、誤った折り畳みの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体の組み立ておよび解体、タンパク質折り畳み、ならびにタンパク質脱凝集を含めた様々な細胞プロセスに関与することができる。このようなシャペロンタンパク質の例としては、それだけに限らないが、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０−３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、サイクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼがある（例えば、Ｍａｃａｒｉｏ， Ａ．Ｊ．Ｌ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓ．、２５巻：５９〜７０頁、１９９５年；Ｐａｒｓｅｌｌ， Ｄ．Ａ． ＆ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ， Ｓ．、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．、２７巻：４３７〜４９６頁（１９９３年）；米国特許第５，２３２，８３３号を参照）。本明細書で記載するように、シャペロンタンパク質、例えば、それだけに限らないが、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０は、狂犬病ウイルスタンパク質の折り畳みを保証するのに使用することができる。

Ｈｓｐ７０の例には、哺乳動物細胞由来のＨｓｐ７２およびＨｓｃ７３、細菌、特にマイコバクテリア、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓなど（カルメット−ゲラン桿菌など：Ｈｓｐ７１と本明細書で呼ぶ）由来のＤｎａＫ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、酵母、および他の原核生物由来のＤｎａＫ、ならびにＡ．ｔｈａｌｉａｎａなどの真核生物由来のＢｉＰおよびＧｒｐ７８が含まれる（Ｌｉｎら、２００１年、（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ、６巻：２０１〜２０８頁）。Ｈｓｐ７０の特定の例は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ Ｈｓｐ７０（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号：ＡＹ１２０７４７．１によってコードされる）である。Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰ、ならびに折り畳まれていないポリペプチドおよびペプチドに特異的に結合することができ、それによってタンパク質折り畳みおよびアンフォールディング、ならびにタンパク質複合体の組み立ておよび解体に関与する。

Ｈｓｐ４０の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテリアなどの原核生物由来のＤｎａＪ、ならびにアルファルファなどの真核生物由来のＨＳＪ１、ＨＤＪ１、およびＨｓｐ４０がある（Ｆｒｕｇｉｓら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４０巻：３９７〜４０８頁）。Ｈｓｐ４０の特定の例は、Ｍ．ｓａｔｉｖａ ＭｓＪ１（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号：ＡＪ０００９９５．１）である。Ｈｓｐ４０は、他の細胞活動の中でもタンパク質折り畳み、熱耐性、およびＤＮＡ複製における分子シャペロンとしての役割を果たす。

Ｈｓｐの中で、Ｈｓｐ７０およびそのコシャペロンであるＨｓｐ４０は、合成が完了する前の新しく合成されるポリペプチドの翻訳の安定化に関与する。理論に束縛されることを望むわけではないが、Ｈｓｐ４０は、折り畳まれていない（発生期の、または新しく移される）ポリペプチドの疎水性パッチに結合し、こうしてＨｓｐ７０−ＡＴＰ複合体とポリペプチドとの相互作用を促進する。ＡＴＰが加水分解すると、ポリペプチド、Ｈｓｐ７０およびＡＤＰの間で安定な複合体が形成され、Ｈｓｐ４０が放出される。Ｈｓｐ７０−ＡＤＰ複合体がポリペプチドの疎水性パッチと会合すると、他の疎水性パッチとのこれらの相互作用が防止され、不正確な折り畳み、および他のタンパク質との凝集体の形成が防止される（Ｈａｒｔｌ， ＦＵ．、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ、３８１巻：５７１〜５７９頁に総説されている）。

天然シャペロンタンパク質は、低レベルの組換えタンパク質の正確な折り畳みを促進することができるが、発現レベルが増大するにつれて、豊富な天然シャペロンは、制限因子となり得る。アグロインフィルトレーションされた葉内で天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が高レベルに発現すると、細胞質ゾル内で天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が蓄積され得、１種または１種より多いシャペロンタンパク質、例えば、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、またはＨｓｐ７０とＨｓｐ４０の両方などが同時発現すると、誤って折り畳まれたタンパク質または凝集タンパク質のレベルが低減し、ウイルス様粒子の形成を可能にする三次および四次構造的特徴を呈するタンパク質の数が増加し得る。

したがって、本発明は、植物内で狂犬病ＶＬＰを生成する方法であって、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードする第１の核酸が、シャペロンをコードする第２の核酸と同時発現される、方法も提供する。第１および第２の核酸は、同じステップ内で植物に導入してもよく、または逐次的に植物に導入してもよい。

調節エレメント
本願での用語「調節領域」、「調節エレメント」、または「プロモーター」の使用は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡとＲＮＡの両方から構成され得る、一般に、常にではないが、遺伝子のタンパク質コード領域の上流の核酸の一部を反映することを意味する。調節領域が活性であり、かつ目的の遺伝子と作動的に関連または作動的に連結しているとき、これは、目的の遺伝子の発現をもたらすことができる。調節エレメントは、器官特異性を媒介し、または発生的もしくは一時的な遺伝子活性化を制御することができる。「調節領域」は、プロモーターエレメント、基本プロモーター活性を呈するコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答して誘導性であるエレメント、負の調節エレメントまたは転写エンハンサーなどのプロモーター活性を媒介するエレメントを含むことができる。本明細書において使用される「調節領域」は、転写後に活性であるエレメント、例えば、遺伝子発現をモジュレートする調節エレメント、例えば、翻訳エンハンサーおよび転写エンハンサー、翻訳リプレッサーおよび転写リプレッサー、上流の活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性決定因子なども含むことができる。これらの後半のエレメントのいくつかは、コード領域の近位に位置する場合がある。

本開示の文脈において、用語「調節エレメント」または「調節領域」は、一般に、常にではないが、通常、構造遺伝子のコード配列の上流（５’）のＤＮＡの配列を指し、これは、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または転写が特定部位で開始するのに必要とされる他の因子に対する認識をもたらすことによって、コード領域の発現を制御する。しかし、イントロン、または配列の３’内に位置する他のヌクレオチド配列も、目的のコード領域の発現の調節に寄与し得ることが理解されるべきである。ＲＮＡポリメラーゼ、または特定部位での開始を保証する他の転写因子に対する認識をもたらす調節エレメントの例は、プロモーターエレメントである。すべてではないがほとんどの真核生物プロモーターエレメントは、ＴＡＴＡボックス、すなわち、転写開始部位の約２５塩基対上流に通常位置する、アデノシンとチミジンのヌクレオチド塩基対から構成される保存された核酸配列を含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始を担う基本プロモーターエレメント、および遺伝子発現を改変する他の調節エレメント（上記に列挙した）を含む。

発生的に調節されたもの、誘導性のもの、または構成的なものを含めて、いくつかのタイプの調節領域がある。発生的に調節された、またはその制御下で遺伝子の差次的発現を制御する調節領域は、ある特定の器官または器官の組織内で、その器官または組織の発生の間の特定の時間に活性化される。しかし、発生的に調節されたいくつかの調節領域は、ある特定の器官または組織内で、特定の発生段階で優先的に活性である場合があり、これらはまた、発生的に調節された様式で、または植物内の他の器官もしくは組織における基礎レベルにおいても同様に活性であり得る。組織特異的調節領域、例えば、種子（ｓｅｅ）特異的調節領域の例としては、ナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーター、およびクルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）プロモーターがある（Ｒａｓｋら、１９９８年、Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５２巻：５９５〜５９９頁；Ｂｉｌｏｄｅａｕら、１９９４年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１４巻：１２５〜１３０頁）。葉特異的なプロモーターの例には、プラストシアニンプロモーターが含まれる（参考として本明細書に援用される米国特許第７，１２５，９７８号を参照）。

誘導性調節領域は、誘導因子に応答して１つまたは複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接または間接的に活性化することができるものである。誘導因子の非存在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。一般に、転写を活性化するために誘導性調節領域に特異的に結合するタンパク質因子は、不活性形態で存在することができ、続いてこれは、誘導因子によって活性形態に直接または間接的に変換される。しかし、タンパク質因子は、存在しない場合もある。誘導因子は、化学的因子、例えば、タンパク質、代謝産物、成長調節因子、除草剤、もしくはフェノール化合物など、あるいは熱、冷気、塩、もしくは毒性元素によって直接、またはウイルスなどの病原体もしくは病因物質の作用によって間接的に付与される生理的ストレスであり得る。誘導性調節領域を含有する植物細胞は、噴霧、散水、加熱、または同様の方法などにより細胞または植物に誘導因子を外部から施すことによって誘導因子に曝露され得る。誘導性調節エレメントは、植物遺伝子に由来しても、非植物遺伝子に由来してもよい（例えば、Ｇａｔｚ， Ｃ．およびＬｅｎｋ， ＬＲ．Ｐ．、１９９８年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、３巻、３５２〜３５８頁；これは、参照により組み込まれている）。潜在的な誘導プロモーターの例としては、それだけに限らないが、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｇａｔｚ， Ｃ．、１９９７年、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻、８９〜１０８頁；これは、参照により組み込まれている）、ステロイド誘導プロモーター（Ａｏｙａｍａ． Ｔ．およびＣｈｕａ， Ｎ．Ｈ．、１９９７年、Ｐｌａｎｔ １．、２巻、３９７〜４０４頁；これは、参照により組み込まれている）、ならびにエタノール誘導プロモーター（Ｓａｌｔｅｒ， Ｍ．Ｇ．ら、１９９８年、Ｐｌａｎｔ １０ｏｕｒｎａｌ、１６巻、１２７〜１３２頁；Ｃａｄｄｉｃｋ， Ｍ．Ｘ．ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６巻、１７７〜１８０頁、これらは、参照により組み込まれている）、サイトカイニン誘導性ＩＢ６およびＣＫＩ１遺伝子（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ， Ｉ．およびＫ．ｉｅｂｅｒ， １．１．、１９９８年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１０巻、１００９〜１０１９頁；Ｋａｋｉｍｏｔｏ， Ｔ．、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻、９８２〜９８５頁；これらは、参照により組み込まれている）、ならびにオーキシン誘導性エレメント、ＤＲ５（Ｕｌｍａｓｏｖ， Ｔ．ら、１９９７年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、９巻、１９６３〜１９７１頁；これは、参照により組み込まれている）がある。

構成的調節領域は、植物の様々な部分全体にわたって、かつ植物の発達全体にわたって連続的に遺伝子の発現を指示する。公知の構成的調節エレメントの例としては、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写物に関連するプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１３巻：８１０〜８１２頁）、イネアクチン１（Ｚｈａｎｇら、１９９１年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３巻：１１５５〜１１６５頁）、アクチン２（Ａｎら、１９９６年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１０巻：１０７〜１２１頁）、またはｔｍｓ２（米国特許第５，４２８，１４７号、これは、参考として本明細書に援用される）、ならびにトリオースリン酸イソメラーゼ１（Ｘｕら、１９９４年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０６巻：４５９〜４６７頁）遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏら、１９９３年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９巻：６３７〜６４６頁）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチン１および６遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆら、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９巻：６３７〜６４６頁）、ならびにタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌら、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９巻：９９５〜１００４頁）がある。

本明細書において使用される用語「構成的な」は、構成的調節領域の制御下の遺伝子は、すべての細胞型において同じレベルで発現されることを必ずしも示唆するのではなく、しかしその遺伝子は、存在量の変動が観察されることが多くても、広範囲の細胞型において発現されることを示唆する。構成的調節エレメントは、他の配列とカップリングして、これらが作動的に連結したヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をさらに増強することができる。例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴ系は、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の非翻訳領域に由来し、関連するコード配列の翻訳の増強を示す。「天然の」とは、核酸またはアミノ酸配列が天然に存在する、または「野生型」であることを意味する。「作動的に連結した」とは、特定の配列、例えば、調節エレメントと目的のコード領域が、意図された機能、例えば、遺伝子発現の媒介または調節などを実行するために直接または間接的に相互作用することを意味する。作動的に連結した配列の相互作用は、例えば、作動的に連結した配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。

本発明は、細胞の原形質膜から脂質エンベロープを得るＶＬＰであって、細胞内でＶＬＰが発現されるＶＬＰも提供する。例えば、１種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が植物ベース系内で発現される場合、得られるＶＬＰは、植物細胞の原形質膜から脂質エンベロープを得ることができる。

一般に、用語「脂質」は、脂肪可溶性の（親油性の）天然に存在する分子を指す。本発明のいくつかの態様によって植物内で生成されるＶＬＰは、植物由来脂質と複合体形成することができる。植物由来脂質は、脂質二重層の形態であることができ、ＶＬＰを囲むエンベロープをさらに含む場合がある。植物由来脂質は、リン脂質、トリ−、ジ−、およびモノグリセリド、ならびに脂肪可溶性ステロールまたはステロールを含む代謝産物を含めた、ＶＬＰが生成される植物の原形質膜の脂質成分を含むことができる。例としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、グリコスフィンゴリピド、フィトステロール、またはこれらの組合せがある。植物由来脂質は、「植物脂質」と代替的に呼ばれる場合がある。フィトステロールの例としては、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、δ−７−スチグマステロール、δ−７−アベナステロール、ダウノステロール（ｄａｕｎｏｓｔｅｒｏｌ）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロール、またはβ−シトステロールがある。例えば、Ｍｏｎｇｒａｎｄら、２００４年を参照。当業者が理解するように、細胞の原形質膜の脂質組成は、細胞、または細胞が得られる生物もしくは種の培養条件または成長条件によって変化し得る。一般に、β−シトステロールが最も豊富なフィトステロールである。

細胞膜は一般に、脂質二重層、および様々な機能に関するタンパク質を含む。局在的な濃度の特定の脂質は、脂質二重層内に見出すことができ、「脂質ラフト」と呼ばれる。これらの脂質ラフトミクロドメインは、スフィンゴ脂質およびステロールが豊富である場合がある。理論に束縛されることを望むわけではないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の感染性病原体の侵入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞または生物の他の構造成分、例えば、細胞内および細胞外マトリックスなどとの相互作用において重要な役割を有し得る。

植物内で生成されるＶＬＰは、植物特異的Ｎ−グリカンを含む天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を誘導することができる。したがって、本発明は、植物特異的Ｎ−グリカンを有する天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を含むＶＬＰも提供する。

さらに、植物中のＮ−グリカンの改変は公知であり（例えば、Ｕ．Ｓ．６０／９４４，３４４を参照；これは、参考として本明細書に援用される）、改変Ｎ−グリカンを有する天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を生成することができる。改変グリコシル化パターンを含む、例えば、フコシル化、キシロシル化（ｘｙｌｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、もしくはフコシル化とキシロシル化の両方が低減したＮ−グリカンを伴った天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を得ることができ、またはタンパク質がフコシル化、キシロシル化、もしくは両方を欠き、増大したガラトシル化（ｇａｌａｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を含む、改変グリコシル化パターンを有する天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を得ることができる。さらに、翻訳後修飾を調節すると、例えば、末端ガラクトースを付加すると、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を発現する野生型植物と比較した場合、発現される天然狂犬病ウイルス構造タンパク質のフコシル化およびキシロシル化を低減することができる。

例えば、限定的であるとみなされるべきではないが、改変グリコシル化パターンを有する天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の合成は、β−１．４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、例えば、それだけに限らないが、哺乳動物ＧａｌＴ、またはヒトＧａｌＴ（しかし、別の供給源に由来するＧａｌＴも使用することができる）をコードするヌクレオチド配列とともに天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を同時発現させることによって実現することができる。ＧａｌＴの触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＮＴ１）のＣＴＳドメイン（すなわち、細胞質尾部、膜貫通ドメイン、ステム領域）に融合して、ＧＮＴ１−ＧａｌＴハイブリッド酵素を生成することもでき、ハイブリッド酵素は、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質とともに同時発現され得る。天然狂犬病ウイルス構造タンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）、例えば、それだけに限らないが、哺乳動物ＧｎＴ−ＩＩＩまたはヒトＧｎＴ−ＩＩＩ（他の供給源に由来するＧｎＴ−ＩＩＩも使用することができる）をコードするヌクレオチド配列とともに同時発現させることもできる。さらに、ＧｎＴ−ＩＩＩに融合したＧＮＴ１のＣＴＳを含むＧＮＴ１−ＧｎＴ−ＩＩＩハイブリッド酵素も使用することができる。

したがって本発明は、改変Ｎ−グリカンを有する天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を含むＶＬＰも提供する。

理論に束縛されることを望むわけではないが、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質上に植物Ｎ−グリカンが存在すると、抗原提示細胞による天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の結合を促進することによって、免疫応答を刺激することができる。植物Ｎグリカンを使用する免疫応答の刺激は、Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓら（２００７年）によって提案されている。さらに、ＶＬＰのコンホメーションは、抗原の提示に有利となり得、植物由来脂質層と複合体形成した場合、ＶＬＰのアジュバント効果を増強することができる。

ＶＬＰの存在は、任意の適当な方法、例えば、スクロース勾配、またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して検出することができる。ＶＬＰは、例えば、電子顕微鏡法によって、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって構造およびサイズについて評価することができる。

サイズ排除クロマトグラフィーに関して、全可溶性タンパク質は、抽出緩衝液中の凍結粉砕した植物材料、および遠心分離によって取り出した不溶性材料の試料をホモジナイズする（ポリトロン）ことによって植物組織から抽出することができる。氷冷アセトンまたはＰＥＧを用いた沈殿も有益となり得る。可溶性タンパク質は、定量化され、抽出物は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）カラム、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ５００カラムに通される。Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００を較正標準として使用することができる。クロマトグラフィーの後、画分を免疫ブロットによってさらに分析して、画分のタンパク質補体を求めることができる。

分離される画分は、例えば、上清（遠心分離、沈降、もしくは沈殿される場合）、または濾液（濾過される場合）とすることができ、タンパク質、または超構造（ｓｕｐｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）タンパク質、例えば、ロゼット様構造もしくはＶＬＰなどのより高い次数、より高い分子量の粒子などに富む。分離された画分は、例えば、追加の遠心分離ステップ、沈殿、クロマトグラフィーステップ（例えば、サイズ排除、イオン交換、親和性クロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、またはこれらの組合せによって、タンパク質、または超構造タンパク質を単離、精製、濃縮、またはこれらの組合せを行うためにさらに処理することができる。精製タンパク質または超構造タンパク質の存在は、例えば、未変性ＰＡＧＥもしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、適切な検出抗体を使用するウエスタン分析、キャピラリー電気泳動、電子顕微鏡法、または当業者に明白である任意の他の方法によって確認することができる。

図３Ａおよび図３Ｂは、ＶＬＰを含む植物抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー分析の溶出プロファイルの例を示す。この場合、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質を含むＶＬＰは、画分８〜約１１中で溶出し、ロゼットおよび高分子量構造体は、画分約１２〜約１４で溶出し、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質のより低分子量または可溶性形態は、約１５〜約１７の画分中に溶出する。

ＶＬＰは、任意の適当な方法、例えば、化学的または生化学的抽出を使用して精製または抽出することができる。ＶＬＰは、乾燥、熱、ｐＨ、界面活性剤、および洗剤に対して比較的感受性である。したがって、収率を最大にし、ＶＬＰ画分の細胞タンパク質での汚染を最小限にし、タンパク質、またはＶＬＰ、および要求される場合、関連する脂質エンベロープまたは膜の完全性を維持する方法、タンパク質、またはＶＬＰを放出するために細胞壁をほぐす方法を使用することが有用であり得る。例えば、プロトプラストおよび／またはスフェロプラストを生成する方法を使用して（例えば、参考として本明細書に援用されるＷＯ２０１１／０３５４２２を参照）、本明細書に記載のＶＬＰを得ることができる。洗浄性または界面活性剤、例えば、ＳＤＳまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの使用を最小限にし、または排除すると、ＶＬＰ抽出物の収率を改善するのに有益となり得る。続いてＶＬＰを、例えば、電子顕微鏡法によって、または上述したサイズ排除クロマトグラフィーによって、構造およびサイズについて評価することができる。

本発明の１種または１種より多い遺伝子構築物は、本発明のヌクレオチド配列、または構築物、またはベクターによって形質転換された任意の適当な植物宿主において発現され得る。適当な宿主の例としては、それだけに限らないが、アルファルファ、アブラナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ種、トウモロコシ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ種、アルファルファ、ジャガイモ、ニンジン、エンドウマメ、カラスムギ、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、コットンなどを含めた農作物がある。

本発明の１つまたは複数の遺伝子構築物は、３’非翻訳領域をさらに含むことができる。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現を生じさせることができる任意の他の調節シグナルを含有するＤＮＡセグメントを含む遺伝子の一部を指す。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸トラック（ｔｒａｃｋ）の付加をもたらすことによって特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルは、バリエーションが珍しくないものの、標準形５’ＡＡＴＡＡＡ−３’との相同性の存在によって一般に認識される。適当な３’領域の非限定例は、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子などのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子などの植物遺伝子、リブロース−Ｉ，５−二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；これは、参考として本明細書に援用される）、ＵＳ７，１２５，９７８（これは、参考として本明細書に援用される）に記載のプラストシアニン発現を調節するのに使用されるプロモーターのポリアデニル化シグナルを含有する３’転写非翻訳領域である。

本発明の遺伝子構築物の１つまたは複数は、必要に応じて、さらなるエンハンサー、すなわち翻訳または転写エンハンサーのいずれかも含むことができる。エンハンサーは、転写される配列の５’または３’に位置することができる。エンハンサー領域は、当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドン、隣接配列などを含む場合がある。開始コドンは、存在する場合、転写配列を正確に翻訳するために、コード配列のリーディングフレームと同相（「インフレーム」）であり得る。

本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的なＤＮＡ形質転換、微量注入、電気穿孔などを使用して植物細胞内に導入することができる。このような技法の総説については、例えば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＶＩＩＩ、４２１〜４６３頁（１９８８年）；ＧｅｉｅｒｓｏｎおよびＣｏｒｅｙ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２版（１９８８年）；ならびにＭｉｋｉおよびＩｙｅｒ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ． Ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２版、ＤＴ． Ｄｅｎｎｉｓ、ＤＨ Ｔｕｒｐｉｎ、ＤＤ Ｌｅｆｅｂｒｖｅ、ＤＢ Ｌａｙｚｅｌｌ（編）、Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｙ、Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ、５６１〜５７９頁（１９９７年）を参照。他の方法としては、直接的なＤＮＡ取込み、リポソームの使用、電気穿孔、例えば、プロトプラスト、微量注入、微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）またはウィスカー、および真空浸潤の使用がある。例えば、Ｂｉｌａｎｇら（Ｇｅｎｅ、１００巻：２４７〜２５０頁（１９９１年）、Ｓｃｈｅｉｄら（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．、２２８巻：１０４〜１１２頁、１９９１年）、Ｇｕｅｒｃｈｅら（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、５２巻：１１１〜１１６頁、１９８７年）、Ｎｅｕｈａｕｓｅら（Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．、７５巻：３０〜３６頁、１９８７年）、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：７０〜７３頁（１９８７年）；Ｈｏｗｅｌｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０８巻：１２６５頁、１９８０年）、Ｈｏｒｓｃｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７巻：１２２９〜１２３１頁、１９８５年）、ＤｅＢｌｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、９１巻：６９４〜７０１頁、１９８９年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９８８年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＳｃｈｕｌｅｒおよびＺｉｅｌｉｎｓｋｉ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９８９年）、ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ、１０５巻：３４３〜３４８頁、２００２年）、米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，０３６，００６号、ならびに同第５，１００，７９２号、１９９５年５月１０日に出願された米国特許出願第０８／４３８，６６６号、１９９２年９月２５日に出願された同第０７／９５１，７１５号を参照（これらのすべては、参考として本明細書に援用される）。

以下に記載するように、一過性発現法を、本発明の構築物を発現させるのに使用することができる（ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５巻：３４３〜３４８頁を参照；これは、参考として本明細書に援用される）。または、参考として本明細書に援用されるＫａｐｉｌａら、１９９７年に記載の真空ベース一過性発現法を使用してもよい。これらの方法として、例えば、それだけに限らないが、アグロイノキュレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）またはアグロインフィルトレーション、シリンジ浸潤の方法を挙げることができるが、上記に言及した他の一過性の方法も使用することができる。アグロイノキュレーション、アグロインフィルトレーション、またはシリンジ浸潤を用いて、所望の核酸を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａの混合物は、組織の細胞間空間、例えば、植物の葉、地上部分（ａｅｒｉａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）（茎、葉、および花を含む）、植物の他の部分（茎、根、花）、または植物全体に入る。表皮を通過した後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａは、細胞に感染し、ｔ−ＤＮＡコピーを移す。ｔ−ＤＮＡは、エピソームとして転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、感染細胞内で目的のタンパク質が生成されるが、核内部のｔ−ＤＮＡの継代は、一過性である。

形質転換植物細胞の同定を助けるため、本発明の構築物をさらに操作して、植物選択可能マーカーを含めてもよい。有用な選択可能マーカーは、化学物質、例えば、抗生物質、例えば、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｙｃｉｎ）、グリフォセート、クロロスルフロンなどの除草剤などに対して耐性をもたらす酵素を含む。同様に、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）などの色変化によって、またはルシフェラーゼもしくはＧＦＰなどの発光によって識別可能な化合物の生成をもたらす酵素を使用することができる。

本発明の遺伝子構築物を含有するトランスジェニック植物、植物細胞、または種子も本発明の一部とみなされる。植物細胞から植物全体を再生する方法も当技術分野で公知である。一般に、形質転換植物細胞は、適切な培地中で培養され、培地は、抗生物質などの選択的作用物質を含有する場合があり、この場合、形質転換植物細胞の同定を促進するために選択可能マーカーが使用される。カルスが形成すると、公知方法に従って適切な植物ホルモンを使用することによって、苗条の形成を促すことができ、苗条は、植物を再生するために発根培地に移される。続いてこの植物は、種子から、または栄養繁殖技法を使用して、反復性世代を確立するために使用することができる。トランスジェニック植物は、組織培養を使用することなく生成することもできる。

本発明は、ヌクレオチド配列を含む：

本発明を以下の実施例でさらに例示する。

構築物

実施例１：狂犬病タンパク質を含む発現カセットの組み立て
Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｒａｂｉｅｓ Ｍ／ＮＯＳ（構築物番号１０６６）
狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質をコードする配列を、以下のＰＣＲベース法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミドで２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系内にクローニングした。完全なＭタンパク質コード配列を含有する断片を、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ３．ｃ（図４Ａ、配列番号１）およびＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ１−４．ｒ（図４Ｂ、配列番号２）を使用して、鋳型として合成Ｍ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ９１３４７０からのｎｔ２４９６−３１０４に対応）（図４Ｃ、配列番号３）を使用して増幅させた。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系内でクローニングした。構築物１１９１（図４Ｄ）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ組み立て反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベース発現カセット内で目的の遺伝子を「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下で、サイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーを同時発現させるための遺伝子構築物も組み込んでいる。構築物番号１１９１の骨格は、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの配列を、図４Ｅ（配列番号４）に提示する。得られた構築物に番号１０６６を付けた（図４Ｆ、配列番号５）。狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のアミノ酸配列を、図４Ｇ（配列番号６）に提示する。プラスミド１０６６の描画を図４Ｈに提示する。

ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内へのＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／Ｒａｂｉｅｓ Ｍ／ＮＯＳ（構築物番号１０８６）
狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質をコードする配列を、以下のＰＣＲベース法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミドでＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系内にクローニングした。完全なＭタンパク質コード配列を含有する断片を、プライマーＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ３．ｃ（図４Ａ、配列番号１）およびＩＦ−ＲａｂＭ−Ｓ１−４．ｒ（図４Ｂ、配列番号２）を使用して、鋳型として合成Ｍ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ９１３４７０からのｎｔ２４９６−３１０４に対応）（図４Ｃ、配列番号３）を使用して増幅させた。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系内でクローニングした。構築物１１９３（図５Ａ、配列番号：Ｂ１）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ組み立て反応に使用した。構築物番号１１９３は、ＢｅＹＤＶ増幅系内にＣＰＭＶ−ＨＴベース発現カセット内で目的の遺伝子を「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下で、サイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーを同時発現させるための遺伝子構築物も組み込んでいる。構築物番号１１９３の骨格は、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの配列を、図５Ｂ（配列番号７）に提示する。得られた構築物に番号１０８６を付けた（図５Ｃ、配列番号８）。狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｍタンパク質のアミノ酸配列を、図４Ｇ（配列番号６）に提示する。プラスミド１０８６の描画を図５Ｄに提示する。

Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／Ｒａｂｉｅｓ Ｇ／ＮＯＳ（構築物番号１０７１）
狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質をコードする配列を、以下のＰＣＲベース法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミドで２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＮＯＳ発現系内にクローニングした。その野生型シグナルペプチドを含まないＧタンパク質コード配列を含有する断片を、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（図６Ａ、配列番号９）およびＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ１−４．ｒ（図６Ｂ、配列番号１０）を使用して、鋳型として合成Ｇ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ２０６７０７からのｎｔ３３１７−４８９１に対応）（図６Ｃ、配列番号１１）を使用して増幅させた。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系内で、アルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物１１９２（図６Ｄ）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ組み立て反応に使用した。構築物番号１１９２は、ＣＰＭＶ−ＨＴベース発現カセット内でアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームで目的の遺伝子を「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下で、サイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーを同時発現させるための遺伝子構築物も組み込んでいる。構築物番号１１９２の骨格は、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの配列を、図６Ｅ（配列番号１２）に提示する。得られた構築物に番号１０７１を付けた（図６Ｆ、配列番号１３）。ＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のアミノ酸配列を、図６Ｇ（配列番号１４）に提示する。プラスミド１０７１の描画を図６Ｈに提示する。

ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系内へのＤ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／Ｒａｂｉｅｓ Ｇ／ＮＯＳ（構築物番号１０９１）
狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質をコードする配列を、以下のＰＣＲベース法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含有するプラスミドで、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳ内にクローニングした。その野生型シグナルペプチドを含まない狂犬病Ｇタンパク質コード配列を含有する断片を、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（図６Ａ、配列番号９）およびＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ１−４．ｒ（図６Ｂ、配列番号１０）を使用して、鋳型として合成Ｇ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ２０６７０７からのｎｔ３３１７−４８９１に対応）（図６Ｃ、配列番号１１）を使用して増幅させた。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ＢｅＹＤＶ増幅系内に２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセット内でアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物番号１１９４（図７Ａ）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ組み立て反応に使用した。構築物番号１１９４は、ＢｅＹＤＶ増幅系内にＣＰＭＶ−ＨＴベース発現カセット内でアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームで目的の遺伝子を「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下で、サイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーを同時発現させるための遺伝子構築物も組み込んでいる。構築物番号１１９４の骨格は、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界までの配列を、図７Ｂ（配列番号１５）に提示する。得られた構築物に番号１０９１を付けた（図７Ｃ、配列番号１６）。インフルエンザＰＤＩＳＰ／狂犬病ウイルスＥＲＡ株由来Ｇタンパク質のアミノ酸配列を、図６Ｇ（配列番号１４）に提示する。プラスミド１０９１の描画を図７Ｄに提示する。

実施例２：植物バイオマスの調製、接種材料およびアグロインフィルトレーション
用語「バイオマス」および「植物物質」は、本明細書において、植物に由来する任意の材料を反映することを意味する。バイオマスまたは植物物質は、植物全体、組織、細胞、またはこれらの任意の画分を含むことができる。さらに、バイオマスまたは植物物質は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体抽出物、またはこれらの組合せを含むことができる。さらに、バイオマスまたは植物物質は、植物の葉、茎、果実、根、またはこれらの組合せからの植物、植物細胞、組織、液体抽出物、またはこれらの組合せを含むことができる。植物の一部が植物物質またはバイオマスを含む場合がある。

Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、市販のピートモス基質で満たされた浅い平箱内で種子から成長させた。この植物を、１６／８明期および日中２５℃／夜間２０℃の温度レジーム下で、温室内で成長させた。播種して３週間後に、個々の小植物を掘り出し、鉢に移植し、同じ環境条件下で、追加の３週間にわたって温室内で成長させた。

各構築物をトランスフェクトしたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを、１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および２５μｇ／ｍｌカルベニシリン、ｐＨ５．６を補充したＹＥＢ培地中で、これらが０．６〜１．６の間のＯＤ_６００に到達するまで増殖させた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を、使用前に遠心分離し、浸潤培地（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．６）中に再懸濁させ、４℃で一晩貯蔵した。浸潤の日に、培養バッチを２．５培養液容積中に希釈し、加温させた後使用した。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を、２０〜４０トルの真空下で２分間、気密ステンレス鋼タンク内の細菌懸濁液中に逆さまに置いた。植物を、収穫するまで２〜６日のインキュベーション期間にわたって温室に戻した。

本明細書に記載の様々な構築物を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株を、「ＡＧＬ１」の接頭辞を使用して参照する。例えば、構築物番号１０９１を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを、「ＡＧＬ１／１０９１」と呼ぶ。

葉の収穫および全タンパク質抽出（機械的抽出）
インキュベートした後、植物の地上部を収穫し、−８０℃で凍結させ、砕いて破片にした。３容積の冷えた５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル中で、凍結粉砕した植物材料の各試料をホモジナイズすることによって（ポリトロン）、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイズした後、スラリーを１０，０００ｇで、４℃で１０分間遠心分離し、これらの清澄化済み粗抽出物（上清）を分析のために保持した。

葉の収穫および全タンパク質抽出（生化学的抽出）
インキュベートした後、植物の地上部を収穫し、回転カッターで小片（３ｍｍの正方形）に切断し、葉を砕かないように特別な注意を払った。２．５容積の２００ｍＭマンニトール、１２５ｍＭシトレート、７５ｍＭ ＮａＰＯ_４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ ＣＧ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、カタログ番号Ａ０３１４０Ｇ１９０）、１％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ Ｂ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、カタログ番号Ａ０３０４２Ｇ１９０）、および１％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ ＦＥ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、カタログ番号Ａ０２０８０Ｇ１９０）、ｐＨ６．５中で、２１℃で、１００〜２００ｒｐｍで攪拌しながら１５〜１７時間、切断したバイオマスをインキュベートした。続いて消化したバイオマスをＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ４７５８５５）で濾過し、１０，０００ｇで、４℃で１０分間遠心分離した。上清を清潔な管に移し、同じ条件下で再び遠心分離し、上清を分析用に保持した。

タンパク質分析およびイムノブロッティング
清澄化済み粗抽出物の全タンパク質含量を、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって求めた。免疫検出のために、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、二フッ化ポリビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＶＤＦ）膜（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）上にエレクトロトランスファーした。イムノブロッティングの前に、５％脱脂乳およびＴｒｉｓ緩衝食塩水中０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を用いて、４℃で１６〜１８時間、膜をブロックした。イムノブロッティングは、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％中２％脱脂乳中で、０．２５μｇ／μｌのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＳＣ−５７９９５一次抗体とともにインキュベートすることによって実施した。化学発光検出は、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％中２％脱脂乳中で、１：１０，０００に希釈したペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドヤギ抗マウス（ＪＩＲ、１１５−０３５−１４６）二次抗体とともにインキュベートした後、実行した。免疫反応複合体は、基質としてルミノール（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、化学発光によって検出した。

タンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に関しては、生化学的に抽出したバイオマスからの上清を、７０，０００ｇで、４℃で２０分間遠心分離することによって濃縮し、得られたペレットを、１／５０容積の冷えた５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁させた。３２ｍｌ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−５００高分解能ビーズ（Ｓ−５００ＨＲ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン、カタログ番号１７−０６１３−１０）のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを充填し、平衡／溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化させた。濃縮抽出物１．５ミリリットルをカラムにロードし、続いて平衡／溶出緩衝液４５ｍＬで溶出ステップを行った。溶出物（ｅｌｕｔｉｏｎ）を１．５ｍＬの画分で収集し、溶出画分の相対タンパク質含量を、画分１０μＬを希釈したＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質染料試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）２００μＬと混合することによってモニターした。各画分からの２００マイクロリットルを、５容積の氷冷アセトンを添加し、続いて−２０℃で一晩凍結させることによって沈殿させた。沈殿したタンパク質を、２００００ｇで１０分間（４℃）遠心分離することによってペレット化し、高温のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料ローディング緩衝液５０μｌ中に再懸濁させた。２カラム容積の０．２Ｎ ＮａＯＨ、続いて１０カラム容積の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％エタノールでカラムを洗浄した。各分離の後に、Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いたカラムの較正を続けた。Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００および宿主可溶性タンパク質の溶出プロファイルを各分離間で比較して、使用したカラム間の溶出プロファイルの均一性を保証した。

実施例３：狂犬病Ｇタンパク質発現および同時発現ストラテジーの評価
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、異なる濃度のＡＧＬ１／１０７１（ＡＧＬ１／１０６６とともに、もしくは伴わずに）またはＡＧＬ１／１０９１（ＡＧＬ１／１０８６とともに、もしくは伴わずに）接種材料でアグロインフィルトレーションし、１０７１および１０７１＋１０６６で浸潤した植物について浸潤後５日（ＤＰＩ）に、または１０９１および１０９１＋１０８６で浸潤した植物について３〜４ＤＰＩに葉を収穫した。形質転換植物からの葉タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析では、検出可能なＧタンパク質蓄積レベルに到達するのにＢｅＹＤＶエレメントを必要とすることが示された（図１で１０７１および１０９１で浸潤した植物を比較されたい）。最大蓄積レベルは、Ｍタンパク質（ＡＧＬ１／１０８６）の同時発現を伴った、または伴わないＡＧＬ１／１０９１で浸潤した植物について３ＤＰＩで到達した（図１）。

生化学的抽出法を、形質転換植物の葉から狂犬病Ｇタンパク質を放出するその能力について、機械的抽出と比較した。１０９１および１０９１＋１０８６で浸潤した植物に対して生化学的抽出および機械的抽出によって得た抽出物のウエスタンブロット分析では、生化学的抽出からのタンパク質抽出物は、機械的抽出からの抽出物より有意に多いＧタンパク質を含有することが示された（図２）。

１０９１および１０９１＋１０８６で浸潤した植物からのタンパク質抽出物を、サイズ排除クロマトグラフィーにかけて、高分子量構造へのこれらの組み立てを評価した。溶出画分を収集し、各画分のアリコートをアセトン沈殿によって濃縮し、ウエスタンブロットによってタンパク質Ｇ含量について分析した。図３Ａに示したように、タンパク質Ｇ含量は、ＳＥＣ溶出画分８〜１０でピークとなり、エンベロープを持ったＶＬＰが見つかることが予期されるカラムの空隙容量に対応した。タンパク質Ｍとともに狂犬病タンパク質Ｇを発現する植物からタンパク質抽出物をＳＥＣによって分離したとき、同様の溶出プロファイルが得られた（１０９１＋１０８６で浸潤した植物、図３Ｂ）。

実施例４：動物試験
植物からのＲａｂ−ＶＬＰの迅速精製
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、例えば、参考として本明細書に援用されるＷＯ／２０１１／０３５４２２に記載されているように、ＡＧＬ１／１０９１でアグロインフィルトレーションした。Ｒａｂ−ＶＬＰ（ＮＧ−ＶＬＰ、天然Ｇタンパク質ＶＬＰ、Ｇ−ＶＬＰ、またはＧタンパク質ＶＬＰとも呼ばれる）の抽出に、上述したように始めた。簡単に言えば、葉を、浸潤後４日目に収集し、切断して約１ｃｍ^２の破片にし、オービタルシェーカー内で、室温で１５時間消化した。消化緩衝液は、１：２．５（ｗ／ｖ）のバイオマス：消化緩衝液比を使用して、１．０％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ ＦＥ、１．０％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ ＣＧおよび／または１．０％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ Ｂ（すべてＧｅｎｅｎｃｏｒ製）を、それぞれ２００ｍＭマンニトール、７５ｍＭシトレート、０．０４％、５００ｍＭ ＮａＣｌ 亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．０緩衝液の溶液中に含有していた。

消化した後、アポプラスト画分を４００μｍナイロンフィルターに通して濾過し、粗い未消化の植物性組織（出発バイオマスの５％未満）を除去した。続いて濾過した抽出物を、室温で１５分間、５０００×ｇで遠心分離して、プロトプラストおよび細胞内混入物（タンパク質、ＤＮＡ、膜、小胞、色素など）を取り出した。次に、１．２μｍガラス繊維フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）および０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｍ Ｓｔｅｄｉｍ）を使用して上清を深濾過（ｄｅｐｔｈ−ｆｉｌｔｅｒ）した後（清澄化のため）、クロマトグラフィーにかけた。

クロマトグラフィーを調製するために、クロマトグラフ媒体にロードする前に、抽出物を当技術分野で公知の適当な方法によって濃縮することができ、例えば、抽出物を遠心分離し、ペレットを適切な緩衝液および容積中に再懸濁させることができ、または、抽出物を、適切な膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムで濃縮およびダイアフィルトレートすることができる。膜は、平坦なシートであっても中空繊維であってもよく、孔サイズは、１００、３００、５００、７５０ｋＤａ、または１μの分子量カットオフの間の範囲とすることができる。管腔サイズは、生成物のサプライヤーラインによって選ぶことができ、通常０．７５〜１ｍｍの管腔サイズが好ましい。せん断速度は、適切な保持液および透過液の流量を用いて、２０００ｓ^−１〜１００００ｓ^−１に調整することができる。

清澄化済みアポプラスト画分を、平衡／溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ ＨＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードした。ＵＶがゼロに戻った後、漸増濃度のＮａＣｌ（５００ｍＭ）を含有する平衡／溶出緩衝液を用いて抽出物を段階溶出した。必要な場合、１０ｋＤａのＭＷＣＯを備えたＡｍｉｃｏｎ（商標）デバイスを使用して、クロマトグラフィー画分を１０倍に濃縮した。タンパク質分析を、先の実施例に記載したように実施した。

最後に、当技術分野で公知の方法によって、最終候補ワクチンを緩衝液交換するために最終的な製剤手法を使用することができる。例えば、上述したように、遠心分離またはＴＦＦステップをこのような目的のために使用することができる。

上述した条件下で、免疫原性試験にとって十分な品質を伴って、Ｒａｂ−ＶＬＰワクチン調製物について７５％以上の純度を得ることができる。図８Ａに例示したように、Ｇタンパク質は、約５５ｋＤａの予期される分子量に移動する。Ｒａｂ−ＶＬＰのサイズは、動的光散乱（Ｚｅｔａ ｓｉｚｅｒ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって、１７５〜１９０ｎｍの間であり、狂犬病ウイルスについて記載したものと同様の粒径であることが推定される。

マウスにおける免疫化試験
Ｒａｂ−ＶＬＰの免疫原性をＢａｌｂ／ｃマウスモデルにおいて評価した。簡単に言えば、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）の群に、様々な用量のＲａｂ−ＶＬＰワクチン（アジュバント有りまたは無しの１μｇまたは５μｇ）を含有した合計０．１ｍｌの注射される容積に対して、左右の後肢筋系の筋肉内に（ｉ．ｍ．）、各免疫化の日（試験日０、７、および２８）に合計３回の注射（０．０５ｍＬ／部位）でワクチン接種した。用量は、デンシトメトリーによる純度評価と組み合わせたビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって求めたＧタンパク質濃度に基づいた。１％の最終濃度のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）をアジュバントとして使用した。プラセボ群を、候補ワクチンと同じ経路およびレジメンによって免疫化した。試験に適切な統計的検出力をもたらすために、１群当たり１５匹のマウスを使用した。血清試料を、ワクチン接種前（免疫前の血清）ならびに７、２１、および４４日目に収集した。迅速蛍光焦点抑制試験（ＲＦＦＩＴ）を実施して血清中の防御抗体を評価するために、１群当たり５匹の動物を、７、２１、および４４日目に屠殺した。狂犬病ワクチンについて世界保健機関（ＷＨＯ）によって確立された防御用量は、１ｍｌ当たり０．５国際単位（ＩＵ）である。図８ｂに示したように、アジュバント添加されていないＲａｂ−ＶＬＰワクチンは、１μｇという低い用量で、ＷＨＯによって確立された標準的な力価より高い力価の達成を可能にする。

すべての引用は、参考として本明細書に援用される。

本発明を１つまたは複数の実施形態に関して説明してきた。しかし、いくつかのバリエーションおよび改変を、特許請求の範囲に定義した本発明の目的から逸脱することなく行うことができることが当業者に明らかとなるであろう。

Claims (20)

1. 植物中で狂犬病ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
   ａ）天然狂犬病糖タンパク質（Ｇ）をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、前記植物中で活性な調節領域を含む核酸を、前記植物または前記植物の一部中に導入するステップであって、前記ヌクレオチド配列が、１種または１種より多い増幅エレメントをさらにコードするか、それらを含むか、またはそれらをコードしかつ含み、前記１種または１種より多い増幅エレメントが、ジェミニウイルスゲノムの１つまたは複数の長い遺伝子間領域または長い遺伝子間リピートを含む、ステップと、
   ｂ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部をインキュベートし、それによって前記狂犬病ＶＬＰを生成するステップと、
   ｃ）前記植物を収穫するステップと、
   ｄ）前記ＶＬＰを抽出するステップと、
   を含み、ここで、前記ＶＬＰのサイズが４０〜３００ｎｍの範囲であり、かつ前記ＶＬＰは、前記植物の原形質膜から得られた脂質を含み、前記ＶＬＰは、ウイルスマトリックスもコアタンパク質も含有しない、
   方法。
2. 植物中で狂犬病ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成する方法であって、
   ａ）１種または複数の天然狂犬病糖タンパク質（Ｇ）をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、前記植物中で活性な調節領域を含む核酸を含む前記植物または前記植物の一部を提供するステップであって、前記ヌクレオチド配列が、１種または１種より多い増幅エレメントをさらにコードするか、それらを含むか、またはそれらをコードしかつ含み、前記１種または１種より多い増幅エレメントが、ジェミニウイルスゲノムの１つまたは複数の長い遺伝子間領域または長い遺伝子間リピートを含む、ステップと、
   ｂ）前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部をインキュベートし、それによって前記狂犬病ＶＬＰを生成するステップと、
   ｃ）前記植物を収穫するステップと、
   ｄ）前記ＶＬＰを抽出するステップと、
   を含み、ここで、前記ＶＬＰのサイズが４０〜３００ｎｍの範囲であり、かつ前記ＶＬＰは、前記植物の原形質膜から得られた脂質を含み、前記ＶＬＰは、ウイルスマトリックスもコアタンパク質も含有しない、
   方法。
3. 前記１種または１種より多い増幅エレメントが、インゲン黄斑萎縮ウイルス由来である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸が、前記植物中で一過性に発現される、請求項１に記載の方法。
5. 前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸が、前記植物中で安定に発現される、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＶＬＰが、生化学的抽出によって抽出される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. １種または複数の天然狂犬病糖タンパク質（Ｇ）を含む植物由来ＶＬＰであって、前記ＶＬＰは、前記植物の原形質膜から得られた脂質を含み、前記ＶＬＰは、ウイルスマトリックスもコアタンパク質も含有しない、植物由来ＶＬＰ。
8. １種または複数の糖タンパク質（Ｇ）が、植物特異的Ｎ−グリカンまたは改変Ｎ−グリカンを含む、請求項７に記載のＶＬＰ。
9. 被験体において免疫応答を誘導するための有効用量の請求項７または８に記載のＶＬＰ、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
10. 被験体において狂犬病ウイルス感染に対する免疫を誘導するための、請求項９に記載の組成物。
11. 前記組成物が、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に、前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
12. 請求項７または８に記載のＶＬＰを含む栄養剤。
13. サイレンシングのサプレッサー、ジェミニウイルスレプリカーゼ、またはそれらの両方をコードする追加の核酸配列を導入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記サイレンシングのサプレッサーおよび前記ジェミニウイルスレプリカーゼが、前記植物または前記植物の一部中に導入される２つの異なる追加の核酸配列によってコードされる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記サイレンシングのサプレッサーが、ＨｃＰｒｏおよびｐ１９からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
16. 前記天然狂犬病糖タンパク質（Ｇ）が、配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の方法。
17. 前記天然狂犬病糖タンパク質（Ｇ）が、配列番号１４に示したアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の方法。
18. 前記調節領域を含む前記核酸配列が、１種または１種より多いコモウイルスエンハンサーとさらに作動的に連結されている、請求項１または２に記載の方法。
19. 前記１種または１種より多いコモウイルスエンハンサーが、コモウイルスＵＴＲである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記コモウイルスＵＴＲがササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＵＴＲである、請求項１９に記載の方法。