KR20140035998A - 식물에서 광견병 바이러스 유사 입자 생성 - Google Patents

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Abstract

식물에서 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생성하는 방법이 제공된다. 방법은 제1 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계를 포함한다. 제 1 핵산은 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 하나 이상 증폭 요소를 더 포함할 수도 있다. 선택적으로, 제2 핵산은 식물, 또는 식물의 일부로 도입될 수도 있다. 제2 핵산은 매트릭스 단백질, 제한되지 않는 예로써, 광견병 매트릭스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함한다. 식물 또는 식물의 일부는 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 배양되여, VLP를 생성한다.

Description

식물에서 광견병 바이러스 유사 입자 생성{RABIES VIRUS LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PLANTS}
본 발명은 식물에서 천연 바이러스 단백질의 생성에 관한 것이다. 더 특이적으로, 본 발명은 또한 식물에서 천연 광견병 바이러스 (rabies virus) 구조 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자의 생성에 관한 것이다.
백신 접종은 감염 전에 대상체가 방어를 증가시키도록 유발함으로써 감염원에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 제공한다. 통상적으로, 이것은 면역원으로서 살아있는, 감쇠된 또는 완전히 불활성화된 형태의 감염원의 사용을 통해 성취되었다. 백신으로서 전체 바이러스 (예를 들어, 살해된 또는 감쇠된 바이러스)를 사용하는 것의 위험을 막기 위해, 재조합 바이러스 단백질, 예를 들어, 서브유닛은 백신으로서 추구되었다. 펩티드 및 서브유닛 백신 둘 다는 많은 잠재적 제한을 받는다. 서브유닛 백신은 부정확한 폴딩 (folding), 불량한 항원 제공, 또는 탄수화물 및 지질 조성의 차이 때문에, 불량한 면역원성을 나타낸다. 주요 문제는 조작된 단백질의 구조가 천연 환경에서 항원의 그것을 모방한다는 것의 보장의 어려움이다. 적합한 보조제 및, 펩티드의 경우에, 담체 단백질은 면역 반응을 촉진하기 위해 사용되어야 한다. 게다가 이들 백신은 주로 체액 반응을 유도하고, 따라서 효과적인 면역력을 일으키는데 실패할 수도 있다. 서브유닛 백신은 종종 질환에 대해 비효율적이며, 여기에서 완전히 불활성화된 바이러스가 보호를 제공하는 것으로 입증될 수 있다.
바이러스-유사 입자 (VLP)는 면역원성 조성물에서 통합되는 잠재적인 후보물질이다. VLP는 성숙한 비리온과 매우 유사하지만, 그것들은 바이러스 유전 물질을 함유하지 않는다. 그러므로, VLP는 자연에서 비복제형이며, 이것은 그것들을 백신으로서 투여에 안전하게 한다. 게다가, VLP는 VLP의 표면상에서 바이러스 당단백질을 발현하도록 조작될 수 있으며, 이것은 그것들의 가장 고유한 생리학적 구조이다. 게다가, VLP가 온전한 비리온과 유사하고 다원자가 미립자 구조이기 때문에, VLP는 항체를 당단백질로 중화를 유발하는데 있어서 가용성 외피 단백질 항원보다 더 효과적일 수도 있다.
지금까지, VLP는 사람 및 다른 동물을 감염시키는 30개 이상의 다른 바이러스에 대하여 생성되었다. 이 그룹의 가장 두드러지는 특징 중 하나는 그것이 개개의 바이러스의 구조에 관하여 매우 다양하다는 점이다. 그것은 단일 캡시드 (capsid) 단백질, 다중 캡시드 단백질을 갖는 바이러스, 및 지질 외피를 갖거나 갖지 않는 것들을 포함한다.
지질 외피를 갖는 바이러스에 대한 VLP의 형성은 다중 캡시드를 갖는 바이러스에 대하여 생성된 것들과 다른 타입의 기술적 도전을 갖는다. 이들 바이러스에 대하여, 발현 시스템의 선택은 VLP 형성의 효율에 중요할 수 있다. 예를 들어, 한탄 바이러스 (Hantaan virus)는 우두 바이러스 (vaccinia-virus)-기반 벡터의 포유동물 세포에서 발현될 때 VLP를 쉽게 형성하지만, VLP 형성은 곤충 세포에서 상대적으로 비효율적이다 (Betenbaugh M et al. 1995, Virus Res. 38, 111-124).
광견병 바이러스 (RV)는 패밀리 라브도비리대 (Rhabdoviridae)의 멤버이다. 이 패밀리의 대부분의 멤버와 유사하게, RV는 이것의 게놈이 다섯 개의 바이러스 단백질을 암호화하는 비-세그먼트화된, 음성 가닥 RNA 바이러스이다: RNA의존적 RNA 폴리머라제 (L); 핵단백질 (N); 지질화된 단백질 (P); 바이러스 단백질 외피의 내면에 위치한 매트릭스 단백질 (M); 및 외표면 당단백질 (G) (Dietzschold B et al., 1991, Crit. Rev. Immunol. 10: 427-439.).
광견병에 대한 세포-배양 기반 백신은 세포 배양액에서 바이러스의 불활성화된 균주를 성장시키는 것이 제한된다. 이들 백신은 세포 배양액에서 성장한 바이러스를 포함한다. 현재 생물공학적 접근법은 활성 백신으로서 배치될 수 있는 안전한 재조합 단백질을 개발하기 위해 피막 단백질 유전자를 발현하는 것을 목표로 한다. 광견병 바이러스 당단백질의 안정한 발현은 중국 햄스터 난소 세포에서 나타났다 (Burger et al., 1991, J Gen Virol., Feb; 72 (Pt 2):359-67). 바이러스-감염된 세포로부터 분리된 G-단백질과 함께 동시에 이동하는, 67 K의 전체 길이, 글리코실화된 단백질이 얻어졌다.
곤충 세포에서 바쿨로바이러스 (baculoviral) 벡터에 의한 광견병 당단백질 유전자의 발현은 감염 후 48시간에 총 세포 단백질의 18% 정도의 단백질 수득율을 제공한다. Prehaud D H et al, (1989, Virology, Dec; 173(2):390-9)은 AcNPV 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 CVS 균주의 G 단백질을 암호화하는 서열의 배치 및 스포도프테라 푸기페르다 (Spodoptera fugiperda) 세포주를 사용하여 구조의 발현을 설명한다. 곤충 유도된 단백질은 글리칸 성분의 차이로 인해 야생형과 비교하여 변화된 전기영동 이동성을 나타냈다.
Rupprecht et al (1993, Vaccine, 11 (9):925-8)은 재조합 바쿨로바이러스-감염된 곤충 세포로부터 유도된 당단백질 (ERA 균주)이 라쿤에서 경구 백신으로서 효과적이었다는 것을 입증한다. WO/1993/001833은 광견병 N 단백질 및 광견병 M 단백질의 시스 (sheath)로 둘러싸인 3' 도메인 및 필러 (filler) 도메인을 포함하는, RNA 게놈을 함유하는 바쿨로 바이러스 발현 시스템에서 바이러스 유사 입자 (VLP)의 생성을 교시한다. VLP는 또한 광견병 G 단백질의 지질 외피를 포함한다. 상대적으로 높은 비용의 곤충 및 포유동물 세포-시스템의 관점에서 이것은 광견병에 대한 백신을 개발하기 위한 전략으로서 G 단백질 발현에 대하여 선택된 시스템이 아니다.
McGarvey et al. (1995, Bio/Technology Vol. 13, No. 13, pp. 1484-1487)은 콜리플라워 모자이크 바이러스 (mosaic virus)의 35S' 프로모터의 조절 하에 광견병 바이러스 (ERA 균주)의 당단백질 G를 암호화하는 전체 길이 cDNA를 사용하는 토마토 떡잎의 형질전환을 설명한다. 단백질은 토마토에서 발현되었고 BH 세포에서 성장한 바이러스의 G 단백질에 대하여 관찰된 66 kDa와 비교하여, 면역 침강 후 웨스턴 블롯에서 62 및 60 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다. 천연 당단백질과 비교하여 분자량의 차이는 단백질의 번역 후 변형 (단백질 용해 분해 분열 및/또는 변형된 글리코실화)으로부터 발생하는 것으로 제안되었다. 면역 침강된 G 단백질의 양은 가용성 단백질 중 대략 1-10 ng/mg, 즉, 가용성 단백질의 0.0001% 내지 0.001%인 것으로 발견되었다. 낮은 발현 수준은 잘못 설계된 유전자를 사용했기 때문일 수도 있다. 예를 들어, 천연 G 단백질 암호화 유전자는 그것의 천연 신호 펩티드와 함께 사용되었다.
식물은 밍크 장염 (enteritis) 및 광견병과 같은 질환에 대한 식물 유도된 면역반응은 식물 바이러스의 표면상에서 바이러스 에피토프를 발현시킨 후 이어서, 재조합 변형된 바이러스로 민감성 숙주를 감염시킴으로써 보고되었다 (Modelska et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2481-2485; Yusibov et al., 2002, Vaccine 20:3155-3164). 벡터 바이러스의 표면상에 발현된 항원 폴리펩티드의 크기는 37개의 아미노산으로 제한되었고, 항원의 에피토프 매핑 (mapping)이 필요하였다. 항원의 이와 같은 철저한 지식은 일반적으로 전체 길이 단백질의 발현이 단지 옵션일 수도 있는 경우에, 특히 새로 발견된 질환에 이용 가능하지 않다. 일부 경우에, 다수의 에피토프가 병원성 바이러스에 의한 도전에 대하여 허용 가능한 보호를 제공하는데 필요할 수도 있다. 게다가, 방지는, 특히 환경적으로 안정한 식물 바이러스, 예를 들어, 담배 모자이크 바이러스 (Tobacco Mosaic Virus)가 사용될 때, 농업적 수준에서 상당한 문제로 간주될 수 있다.
WO 97/43428은, 식물에서, 광견병 바이러스의 당단백질 G 또는 광견병 바이러스와 관련된 바이러스를 생성하는 방법을 교시한다. 구조는 바이러스 단백질 G와 저절로 결합된 것들 이외의 N-말단 신호 펩티드와 함께 성숙한 바이러스 단백질 G를 포함하는 키메라 G 단백질을 암호화하는 서열을 포함하였다. 당단백질은 대략 66 kDa의 분자량을 갖고 매우 불용성이었다. 세제, 예를 들어, SDS, 또는 Triton X-100은 당단백질을 추출하고 가용화하기 위해 필수적이다. 저자는 당단백질이 백신으로 사용될 때 "불용성" 당단백질이 보호 반응에 중요한 C-말단 막관통 도메인 (당단백질의 카르복시 말단의 약 40 내지 60개의 아미노산이 위치한 영역)의 존재와 관련되었다는 결론을 내렸다.
외피 보유 바이러스는 감염된 세포로부터 '출아 (budding)'할 때 그것들의 지질 외피를 얻을 수도 있고 원형질막, 또는 내부 세포 기관의 그것으로부터 막을 얻을 수도 있다. 예를 들어, 라브도바이러스 (rhabdovirus)의 조립 과정 중에, N-P-L 복합체는 게놈 음성-가닥 게놈 RNA를 캡슐화하여 RNP 코어를 형성하였다. M 단백질은 RNP 주위에 캡슐, 또는 매트릭스를 형성하고, RNP-M 복합체는 당단백질 삽입물을 함유하는 원형질막의 영역으로 이동한다. M-단백질은 나선 형성을 개시하고, M-RNP 복합체는 당단백질과 결합하고, 그 위에 완성된 바이러스가 원형질막으로부터 출아한다.
중추 신경계 (CNS) 내에서, 원형질막으로부터 출아하는 바람직한 바이러스가 있다. 반대로, 침샘의 바이러스는 주로 세포막으로부터 소핵 루멘 (lumen)으로 출아한다. 숙주 동물에서 침샘으로 바이러스 출아 및 바이러스-유발된 공격적으로 물어뜯는 행동은 새로운 숙주의 바이러스 감염의 기회를 최대화한다. 포유동물 또는 바쿨로바이러스 세포 시스템에서, 예를 들어, 광견병은 원형질막으로부터 출아한다. 소수의 외피 보유 바이러스만이 식물을 감염시키는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 토포바이러스 (Topovirus) 및 라브도바이러스의 멤버). 알려진 식물 외피 보유 바이러스 중에, 그것들은 원형질막으로부터가 아니라, 숙주 세포의 내막으로부터의 출아를 특징으로 한다. 하지만, 재조합 VLP는 원형질막의 식물 숙주에서 생성되었다 (WO 2011/035422; 이것은 본원에 참고로 포함된다).
라브도바이러스의 조립/출아는 대부분 매트릭스 (M) 단백질에 의해 구동된다. M 단백질은 바이러스-세포 분리를 가능하게 하기 위해 세포의 바쿨로 단백질 분류 경로에 결합된 숙주 단백질의 모집을 매개하는 후반 출아 도메인을 함유한다. 어떤 이론에도 결부되지 않고, 세포막의 외피 보유 바이러스의 출아는 세포질 바이러스 성분과 상호작용하는 막관통 스파이크 단백질의 존재에 의존하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 당단백질 G, 또는 G 세포질 꼬리가 없는 광견병 바이러스 돌연변이에 감염된 세포는 스파이크가 없는 라브도바이러스 입자를 방출하였으며, 이것은 바이러스 표면 단백질이 출아 과정을 구동하는데 필요하지 않다는 것을 입증한다 (Mebatsion T. et al., 1996, Cell, Mar 22:84(6):941-51). 반대로, M-단백질이 없는 광견병 바이러스 돌연변이 내에서 생성된 감염성 입자는 주로 결합된 세포였고, 세포가 없는 감염성 바이러스의 수득율은 500,000배만큼 감소하였다. 이것은 바이러스 출아에서 M 단백질의 중요한 역할을 입증한다. M-결핍 광견병 바이러스에 감염된 세포의 상층액은 전형적인 총알 모양 라브도바이러스 입자 대신에, 길고, 막대 모양 비리온을 포함하였으며, 바이러스 형성 과정의 장애를 추가로 확인하였다. 플라스미드로부터 발현된 M 단백질과의 상보성은 라브도바이러스 형성을 구조하였다. 그러므로 M 단백질은 RNP를 원형질막으로 응축 및 표적화, 뿐만 아니라 출아 비리온에 G 단백질의 통합에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다 (Mebatsion T. et al, 1999, J Virol Jan; 73(1):242-50).
본 발명은 식물에서 천연 바이러스 단백질의 생성과 관련된다. 더 특이적으로, 본 발명은 또한 식물에서 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자의 생성과 관련된다.
본 발명에 따라 식물에서 다음을 포함하는, 광견병 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생성하는 방법 (A)가 제공된다
a) 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함하는 제1 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계
b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 광견병 VLP를 생성하는 단계.
천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 당단백질일 수도 있다. 천연 광견병 바이러스 구조 단백질이 M 단백질이 아니면, 상기 설명된 방법 (A)는 다음의 단계를 더 포함할 수도 있다:
c) 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하고 매트릭스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 핵산을 도입하는 단계.
제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열 또는 둘 다는 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소를 더 암호화하거나, 포함하거나, 암호화하고 포함할 수도 있다. 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소는 하나 또는 하나 이상의 제미니바이러스 (geminivirus) 증폭 요소로부터 선택될 수도 있다. 하나 또는 하나 이상의 제미니바이러스 증폭 요소는 강낭콩 황고병 바이러스 (Bean Yellow Dwarf Virus) 긴 유전자간 영역 (BeYDV LIR), 및 BeYDV 짧은 유전자간 영역 (BeYDV SIR)으로부터 선택될 수도 있다.
식물에서 활성인 제1 조절 영역, 및 식물에서 활성인 제2 조절 영역은 같거나 다를 수도 있다.
상기 설명된 바와 같이 방법은 다음의 단계를 더 포함할 수도 있다:
d) 식물을 수확하고 VLP를 추출하는 단계.
본 발명은 상기 설명된 방법 (A)를 또한 포함하며, 제1 핵산 서열은 하나 또는 하나 이상 코모바이러스 (comovirus) 인핸서 (enhancer)와 작동 가능하게 결합된 조절 영역을 포함하고, 침묵 억제자, 제미니바이러스 레플리카제, 또는 둘 다를 암호화하는 제3 핵산은 식물 또는 식물의 일부에 도입된다. 대안으로, 제1 핵산 서열은 하나 또는 하나 이상의 코모바이러스 인핸서와 작동 가능하게 결합된 조절 영역을 포함하고, 제2 핵산은 식물에서 활성이고 매트릭스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 조절 영역을 포함하고, 침묵 억제자, 제미니바이러스 레플리카제, 또는 둘 다를 암호화하는 제3 핵산은 식물 또는 식물의 일부에 도입될 수도 있다. 제3 핵산이 침묵 억제자 만을 포함하면, 제미니바이러스 레플리카제를 암호화하는 제4 핵산이 식물 또는 식물의 일부에 도입될 수도 있다. 하나 또는 하나 이상의 코모바이러스 인핸서는 코모바이러스 UTR, 예를 들어, CPMV-HT 5' 및/또는 3'UTR과 같은 동부 모자이크 바이러스 (Cowpea Mosaic Virus) 과번역 가능 (CPMV-HT) UTR일 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (A)를 포함하며, 도입 단계 (단계 a)에서, 제1 핵산은 식물에서 일시적으로 발현된다. 대안으로, 도입 단계 (단계 a)에서, 제1 핵산은 식물에서 안정하게 발현된다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 광견병 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생성하는 방법 (B)를 제공한다
a) 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함하는 제1 핵산을 포함하는 식물 또는 식물의 일부를 제공하는 단계,
b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 천연 광견병 VLP를 생성하는 단계.
식물에서 활성인 제1 조절 영역, 및 식물에서 활성인 제2 조절 영역은 같거나 다를 수도 있다.
방법 (B)에서 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 당단백질일 수도 있다. 천연 광견병 바이러스 구조 단백질이 M (매트릭스) 단백질이 아니면, 이후 상기 설명된 방법 (B)에서 식물은 식물에서 활성이고 매트릭스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 조절 영역을 포함하는 제2 핵산을 더 포함할 수도 있다. 대안으로, 제1 핵산은 매트릭스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
상기 설명된 방법 (방법 B)에서 제1 핵산 또는 제2 핵산 또는 둘 다는 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소를 더 암호화하거나, 포함하거나, 암호화하고 포함할 수도 있다. 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소는 하나 또는 하나 이상 제미니바이러스 증폭 요소로부터 선택될 수도 있다. 하나 또는 하나 이상 제미니바이러스 증폭 요소는 강낭콩 황고병 바이러스 긴 유전자간 영역 (BeYDV LIR), 및 BeYDV 짧은 유전자간 영역 (BeYDV SIR)으로부터 선택될 수도 있다.
상기 설명된 방법 (방법 A 또는 B)에서 식물 또는 식물의 일부는 침묵 억제자, 예를 들어, HcPro 또는 p19, 제미니바이러스 레플리카제 또는 둘 다를 암호화하는 또 다른 핵산 서열을 더 포함할 수도 있다. 대안으로, 식물 또는 식물의 일부는 제미니바이러스 레플리카제를 암호화하는 또 다른 핵산을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (B)를 포함하며, 식물 또는 식물의 일부는 일시적으로 제1 핵산을 발현하였다. 대안으로, 제1 핵산은 식물 또는 식물의 일부에서 안정하게 발현된다.
상기 설명된 방법 (B)는 다음 단계를 더 포함할 수도 있다:
d) 식물을 수확하고 VLP를 추출하는 단계.
본 발명은 상기 설명된 방법 (A) 및/또는 (B)에 의해 생성된 VLP를 제공한다. VLP는 식물에서 유도된 하나 또는 하나 이상의 지질을 더 포함할 수도 있다. 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 식물-특이적 N-글리칸, 또는 변형된 N-글리칸을 포함할 수도 있는 VLP로 구성된다. 본 발명은 또한 VLP를 사용하여 제조된 다클론성 항체를 제공한다.
본 발명은 상기 설명된 방법 (A) 또는 (B)에 의해 만들어진, 면역 반응을 유발하기 위한 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 광견병 바이러스 감염에 대한 면역력을 유발하는 방법을 포함하며, 상기 설명된 VLP를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. VLP는 경구, 피내 (intradermal), 비강, 근육, 복강, 정맥, 또는 피하 대상체에 투여될 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (A) 및/또는 (B)에 의해 생성된 VLP를 포함하는 식물성 물질을 제공한다. 식물성 물질은 대상체에서 광견병 바이러스 감염에 대한 면역력을 유발하는데 사용될 수도 있다. 식물성 물질은 또한 식품 보충제로서 혼합될 수도 있다.
본 발명의 본 개요는 반드시 본 발명의 모든 특징을 설명하는 것은 아니다.
본 발명의 이들 및 다른 특징은 참조가 첨부된 도면으로 구성되는 다음 설명으로부터 더 분명해질 것이다.
도 1은 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana)에서 일시적인 광견병 G 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 광견병 G 단백질은 (1091)이 있거나 (1071) BeYDV-기반 DNA 증폭 시스템이 없이 CPMV-HT의 조절 하에 발현되었다 (구조에 대한 실시예의 표 2 참조). 괄호 안의 수는 박테리아 접종물의 제조에 사용된 아그로박테리움 (Agrobacterium) 배양물의 양을 밀리미터 단위로 나타낸다. AGL1/1091로 침투된 식물은 침투 후 3 또는 4일 (DPI)에 수확되었다. 침투된 식물의 잎은 수확되었고 기계로 추출하였다. 단백질 추출물은 SDS-PAGE로 분리되었고 항-광견병 G 마우스 단클론성 항체 (Santa-Cruz SC-57995)를 사용하는 웨스턴 블롯으로 분석되었다.
도 2는 광견병 G 단백질에 대한 생화학적 및 기계적 추출 방법의 단백질 추출물에서 G 단백질 함량의 비교를 나타낸다. 단백질 추출물은 SPS-PAGE로 분리되었고 항-광견병 G 마우스 단클론성 항체 (Santa-Cruz SC-57995)를 사용하는 웨스턴 블롯으로 분석되었다. 괄호 안의 수는 박테리아 접종물의 제조에 사용된 아그로박테리움 배양물의 양을 밀리미터로 나타낸다 (구조에 대하여 표 2 참조).
도 3A는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해, AGL1/1091로 침투된 식물로부터 농축된 단백질 추출물의 분리 후 광견병 G 단백질 함량의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. SEC의 용출 분획은 SDS-PAGE로 분리되었고 항-광견병 단백질 G 마우스 단클론성 항체 (Santa-Cruz SC-57995)를 사용하는 웨스턴 블롯으로 분석되었다. 도 3B는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해, AGL1/1091 + AGL1/1086으로 침투된 식물로부터 농축된 단백질 추출물의 분리 후 광견병 G 단백질 함량의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. SEC의 용출 분획은 SDS-PAGE로 분리되었고 항-광견병 단백질 G 마우스 단클론성 항체 (Santa-Cruz SC-57995)를 사용하는 웨스턴 블롯으로 분석되었다.
도 4A는 프라이머 IF-RabM-S3.c (SEQ ID NO: 1)를 나타낸다. 도 4B는 프라이머 IF-RabM-Sl-4.r (SEQ ID NO: 2)을 나타낸다. 도 5C는 합성된 M 단백질 암호화 서열 (Genbank 수납 번호 FJ913470의 nt 2496-3104에 해당함) (SEQ ID NO. 3)을 나타낸다. 도 4D는 구조 번호 1191의 개략적 도식을 나타낸다. 플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위는 설명에 주석이 달려있다. 도 4E는 왼쪽에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 구조 번호 1191을 나타낸다 (밑줄 그어짐). 2X35S/CPMV-HT/NOS (SEQ ID NO: 4)는 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 발현 카세트 (침묵 억제자)를 갖는다. 도 4F는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자로 발현 카세트 번호 1066을 나타낸다. 광견병 바이러스 ERA 균주의 M 단백질의 오픈 리딩 프레임은 밑줄 그어져 있다 (SEQ ID NO: 5). 도 4G는 광견병 바이러스 ERA 균주의 M 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다 (SEQ ID NO: 6). 도 4H는 구조 번호 1066의 개략적 도식을 나타낸다.
도 5A는 구조 번호 1193의 개략적 도식을 나타낸다. 플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위는 설명에 주석이 달려있다. 도 5B는 왼쪽에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 구조 번호 1193을 나타낸다 (밑줄 그어짐). 플라스토시아닌-TBSV P19-플라스토시아닌 발현 카세트 (침묵 억제자)를 갖는 2X35S/CPMV-HT/NOS into BeYDV+레플리카제 증폭 시스템 (SEQ ID NO:7). 도 5C는 BeYDV 왼쪽 LIR에서 BeYDV 오른쪽 LIR로 발현 카세트를 나타낸다. 광견병 바이러스 ERA 균주의 PDISP/G 단백질의 오픈 리딩 프레임은 밑줄 그어져 있다 (SEQ ID NO: 8). 도 5D는 구조 번호 1086의 개략적 도식을 나타낸다.
도 6A는 프라이머 IF-RabG-S2+4.c (SEQ ID NO: 9)를 나타낸다. 도 6B는 프라이머 IF-RabG-S1-4.r (SEQ ID NO: 10)을 나타낸다. 도 6C는 합성된 광견병 G 단백질 암호화 서열을 나타낸다 (Genbank 수납 번호 EF206707의 nt 3317-4891에 해당함) (SEQ ID NO: 11). 도 6D는 구조 번호 1192의 개략적 도식을 나타낸다. 플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위는 설명에 주석이 달려있다. 도 6E는 왼쪽부터 오른쪽 t-DNA 보더로의 구조 번호 1192를 나타낸다 (밑줄 그어짐). 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 발현 카세트 (침묵 억제자)를 갖는 2X3. 도 6F는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자로의 발현 카세트 번호 1071을 나타낸다. 광견병 바이러스 ERA 균주의 PDISP/G 단백질의 오픈 리딩 프레임은 밑줄 그어져 있다 (SEQ ID NO: 13). 도 6G는 광견병 바이러스 ERA 균주의 PDISP-G 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다 (SEQ ID NO: 14). 도 6H는 구조 번호 1071의 개략적 도식을 나타낸다.
도 7A는 구조 번호 1194의 개략적 도식을 나타낸다. 플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위는 설명에 주석이 달려 있다. 도 7B는 왼쪽에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 구조 번호 1194를 나타낸다 (밑줄 그어짐). 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 발현 카세트 (침묵 억제자)를 갖는 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS into BeYDV+레플리카제 증폭 시스템 (SEQ ID NO: 15). 도 7C는 BeYDV 왼쪽 LIR에서 BeYDV 오른쪽 LIR로의 발현 카세트 번호 1091을 나타낸다. 광견병 바이러스 ERA 균주의 PDISP/G 단백질의 오픈 리딩 프레임은 밑줄 그어져 있다 (SEQ ID NO: 16). 도 7D는 구조 번호 1091의 개략적 도식을 나타낸다.
도 8a는 G 단백질 VLP 조제물을 나타내는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE (BioRad의 Precast 4-12%)를 나타낸다. 1) Rab-VLP 조제물, 2) 분자량 마커. 도 8b는 보조제 (알히드로겔 (Alhy))가 있거나 없이 NG-VLP (천연 G 단백질 VLP) 백신의 0.1 ml의 세 번의 투여 (D0, D7 및 D28)로 근육 내로 (i.m.) 면역화된 마우스의 그룹 (그룹 당 5 마리)에서 항체를 중화하는 반응 (IU/ml)을 나타낸다. 혈액 샘플은 제44 일, 세 번째 투여 후 16일에 채취되었다. 사용된 테스트 방법: RFFIT 테스트 (급속 형광 포커스 억제 테스트 (rapid fluorescent focus inhibition test)): 각 동물에 대하여 얻은 개개의 값을 사용하여 기하학적 평균 역가 (Geometric Mean Titer; GMT)가 계산되었고, 양성 반응자가 표시된다. 막대는 95% CI의 GMT를 나타낸다. Anova는 모든 처리 그룹 사이에서 수행되었고 통계적으로 유의한 차이가 보고되지 않았다.
다음 설명은 바람직한 구체예이다.
본 발명은 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자 (VLP), 및 식물에서 광견병 VLP를 생성하는 방법에 관한 것이다. 광견병 VLP는 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 당단백질, 하나 이상의 매트릭스 단백질, 또는 둘 다를 포함할 수도 있다. VLP는 식물 바이러스의 바이러스 단백질을 포함하지 않는다.
본 발명은 부분적으로 식물에서 광견병 바이러스 유사 입자를 생성하는 방법을 제공한다. 방법은 천연 광견병 바이러스 구조 단백질 및 하나 또는 하나 이상 증폭 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 식물에서 활성인 조절 영역을 포함하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계를 포함할 수도 있다. 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하였여, VLP를 생성한다.
천연 광견병 구조 바이러스 단백질 (천연 광견병 구조 바이러스 단백질로도 불림)은 어떤 자연 발생한 또는 변이체 광견병 바이러스 균주 또는 분리체에 존재하는, 광견병 바이러스로부터 분리된 천연 광견병 바이러스 구조 단백질 서열 모두 또는 일부를 나타낼 수도 있다. 따라서, 용어 천연 광견병 바이러스 구조 단백질 등은 바이러스 생활 주기 중에 돌연변이에 의해 생성되거나 선택적 압력 (예를 들어, 약물 치료, 숙주 세포 굴성 또는 감염성의 확대)에 반응하여 생성된 자연 발생한 천연 광견병 바이러스 구조 단백질 서열 변이체를 포함한다. 당업자가 인정한 바와 같이, 이러한 천연 광견병 바이러스 구조 단백질 서열 및 이들의 변이체는 또한 재조합 기술을 사용하여 생성될 수도 있다. 천연 광견병 구조 바이러스 단백질은 키메라 단백질을 포함하지 않으며, 예를 들어, 막관통 도메인 및/또는 세포질 꼬리는 천연 광견병 구조 바이러스 단백질에 관하여 이종 기원의 막관통 도메인 및/또는 세포질 꼬리로 대체되었다.
천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 비-제한 예는 광견병 당단백질 (G) 단백질, G 단백질의 단편, 매트릭스 (M) 단백질, M 단백질의 단편, 또는 이들의 조합이다. 본 발명에 따라 사용될 수도 있는 G 단백질, 또는 G 단백질의 단편의 비-제한 예는 광견병 ERA 균주의 상기 G 단백질을 포함한다. G 단백질의 예는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열에서 제시되며, 이를 제한하는 것으로 생각되지 않는다. 게다가, 천연 광견병 구조 바이러스 단백질은 SEQ ID NO: 14에 제시된 서열, 또는 그것과 적어도 약 90-100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수도 있으며, 이들 범위 내 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것과 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성도 포함한다.
아미노산 서열 유사성 또는 동일성은 BLAST (기본적 지역 정렬 검색 도구) 2.0 알고리즘을 이용하는 BLASTP 및 TBLASTN를 사용함으로써 컴퓨터로 계산될 수도 있다. 아미노산 서열 유사성 또는 동일성을 컴퓨터로 계산하는 기술은 당업자들에게 잘 알려져 있고, BLAST 알고리즘의 사용은 ALTSCHUL et al. (1990, J Mol. Biol. 215: 403-410) 및 ALTSCHUL et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)에 설명된다.
천연 구조 바이러스 단백질은 모노머, 다이머, 트리머, 또는 이들의 조합으로서 존재할 수도 있다. 트리머는 세 개의 보통 비-공유 결합으로 결합된 단백질에 의해 형성된 거대 분자 복합체이다. 어떤 이론에도 결부되지 않고, 단백질의 트리머화 도메인은 이러한 트리머의 형성에 중요할 수도 있다. 그러므로 바이러스 단백질 또는 이들의 단편은 트리머화 도메인을 포함할 수도 있다.
"매트릭스 단백질" (바이러스 코어 단백질로도 불림)은 비리온 구조를 조직하고 유지하는 단백질을 의미한다. 바이러스 매트릭스 단백질은 보통 세포막과 직접적으로 상호작용하고 출아 과정에 수반될 수 있다. 바이러스 코어 단백질은 뉴클레오캡시드의 일부를 구성하고 전형적으로 바이러스 핵산과 직접적으로 결합되는 단백질이다. 바이러스 매트릭스 또는 코어 단백질의 예는 광견병 M 단백질, 인플루엔자 M1, RSV M 및 레트로바이러스 알 단백질이다. 여기에 설명된 바와 같이 사용될 수도 있는 매트릭스 단백질의 예는 광견병 M 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명과 함께 사용될 수도 있는 서열의 비-제한 예는 광견병 바이러스 ERA 균주의 M 단백질을 포함한다. 전형적인 M 단백질은 SEQ ID NO: 6에 나타난 아미노산 서열로 구성된다. 게다가, 천연 광견병 구조 바이러스 단백질은 SEQ ID NO: 6에 제시된 서열 또는 그것과 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 갖는 서열을 포함할 수도 있으며, 이들 범위 내에 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것과 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성도 포함한다.
수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus; 라브도바이러스 유사 광견병) 및 단순 헤르페스 바이러스 (Herpes Simplex virus; 헤르페스 바이러스와 유사한 수두-대상포진 바이러스 (varicella-zoster virus)) 둘 다는 VSP4-의존적 방식으로 출아한다 (Taylor et al. J. Virol 81: 13631-13639, 2007; Crump et al., J. Virol 81:7380-7387, 2007).
VSP4가 매트릭스 단백질의 후반 도메인과 상호작용하기 때문에, 이것은 매트릭스 단백질이 출아 및, 그 결과로서, VLP 생성에 필요하다는 것을 제안한다. 하지만, 여기에 설명된 바와 같이, 천연 광견병 VLP는 매트릭스 단백질의 동시 발현과 함께 또는 없이 식물 내에서 생성될 수도 있다. 그러므로, 본 발명에 따라, 바이러스 유도된 천연 구조 단백질의 식물에서 생성된 천연 광견병 VLP는 바이러스 매트릭스 (또는 바이러스 코어) 단백질을 포함할 수도 있거나 아닐 수도 있다.
본 발명은 또한 식물에서 광견병 바이러스 유사 단백질 VLP를 생성하는 방법을 제공하며, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질, 예를 들어 광견병 G 단백질을 암호화하는 핵산 (제1 핵산)은 바이러스 매트릭스 단백질, 제한되지 않는 예로써, 광견병 매트릭스 단백질을 암호화하는 제2 핵산과 동시 발현된다. 핵산, 및 제2 핵산은 같은 단계에서 식물로 도입될 수도 있거나, 순차적으로 식물로 도입될 수도 있다.
하기 더 상세히 설명된 바와 같이, VLP는 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질, 예를 들어 광견병 G 단백질을 암호화하는 핵산 (제1 핵산)을 발현함으로써 식물에서 생성될 수도 있다.
매트릭스 단백질, 제한되지 않는 예로써, 광견병 매트릭스 단백질을 암호화하는 제2 핵산은 식물에서 동시 발현될 수도 있다. 핵산 및 제2 핵산은 같은 단계에서 식물로 도입될 수도 있거나, 순차적으로 식물로 도입될 수도 있다. 핵산 및 제2 핵산은 일시적인 방식, 또는 안정한 방식으로 식물에서 도입될 수도 있다.
게다가, 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질, 예를 들어, 광견병 G 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 발현하는 식물은 제1 및 제2 핵산이 식물에서 동시 발현되도록, 매트릭스 단백질, 제한되지 않는 예로써, 광견병 매트릭스 단백질 (제2 핵산)로 형질전환될 수도 있다. 대안으로, 예를 들어, 광견병 매트릭스 단백질, (제2 핵산)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 매트릭스 단백질을 발현하는 식물은 제1 및 제2 핵산이 식물에서 동시 발현되도록, 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질, 예를 들어, 광견병 G 단백질을 암호화하는 제1 핵산으로 형질전환될 수도 있다.
추가적으로, 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질, 예를 들어, 광견병 G 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 발현하는 제1 식물은 각각 천연 광견병 바이러스 구조 단백질 및 매트릭스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 핵산을 동시 발현하는 자손 식물을 생산하기 위해, 매트릭스 단백질, 제한되지 않는 예로써, 광견병 매트릭스 단백질을 암호화하는 제2 핵산을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다.
본 발명은 또한 식물에서 활성인 조절 여역에 작동 가능하게 결합된 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산, 및 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소를 식물 또는 식물의 일부로 도입하는 단계를 수반하는, 식물에서 광견병 바이러스 VLP를 생성하는 방법을 제공한다. 식물 또는 식물의 일부는 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 배양되여, 광견병 바이러스 VLP를 생성한다. 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 하나 이상의 광견병 G 단백질, G 단백질의 단편, 하나 이상의 M 단백질, M 단백질의 단편, 또는 이들의 조합일 수도 있다.
본 발명은 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질,제한되지 않는 예로써, 하나 이상의 광견병 바이러스 당단백질, 하나 이상의 매트릭스 단백질 또는 둘 다를 포함하는 VLP를 더 제공한다. VLP는 본 발명에 의해 제공된 방법에 의해 생성될 수도 있다.
용어 "바이러스 유사 입자" (VLP), 또는 "바이러스-유사 입자" 또는 "VLP"는 자체 조립하고 천연 광견병 바이러스 구조 단백질, 제한되지 않는 예로써, 광견병 G 단백질과 같은 하나 이상의 구조 단백질을 포함하는 구조를 나타낸다. VLP는 일반적으로 감염시 생성된 비리온과 형태학적으로 및 항원에 관하여 유사하지만, 복제하기에 충분한 유전 정보가 없고 따라서 비-감염성이다. VLP는 식물 숙주 세포를 포함하는 적합한 숙수 세포에서 생성될 수도 있다. 숙주 세포로부터 추출 후 및 적합한 조건 하에 분리 및 추가로 정제시, VLP는 온전한 구조로서 정제될 수도 있다.
상기-한정된 LP의 크기 (즉, 지름)은 예를 들어, 동적 광 산란 (dynamic light scattering; DLS) 또는 전자 현미경 (EM) 기술에 의해 측정할 수도 있고, 보통 40 내지 300 nm, 또는 그 사이의 어떤 값도 된다. 일부 구체예에서, 온전한 VLP 구조의 크기는 약 40 nm 내지 약 300 nm, 또는 그 사이의 어떤 값, 예를 들어, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 1 10 nm, 120 nm, 130 nm, 140 nm, 150 nm, 160 nm, 170 nm, 180 nm, 190 nm, 200 nm, 210 nm, 220 nm, 230 nm, 240 nm, 250 nm, 260 nm, 270 nm 또는 280 nm, 또는 그 사이의 어떤 크기의 범위일 수도 있다. 구체예에서, 온전한 VLP 구조의 크기는 약 170 nm 내지 약 200 nm 또는 그 사이의 어떤 크기, 예를 들어, 175 nm, 180 nm, 185 nm, 190 nm, 195 nm 또는 그 사이의 어떤 크기의 범위일 수도 있다.
본 발명은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 결합된 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 추가로 제공한다. 게다가 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 예를 들어, 하나 이상의 광견병 G 단백질, 하나 이상의 M 단백질, 또는 둘 다일 수도 있다.
본 발명에서 나타난 핵산 서열은 서열, 또는 핵산 서열이 하나 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 잡종화하는 서열의 상보 또는 엄중 잡종화 조건 하에 여기에서 한정된 핵산 서열의 상보와 "실질적으로 상동성" 또는 "실질적으로 유사하다". 서열은 뉴클레오티드의 적어도 약 70%, 또는 70 내지 100% 사이, 또는 그 사이의 어떤 양, 예를 들어 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100%, 또는 그 사이의 어떤 양이 뉴클레오티드의 한정된 길이와 일치할 때 "실질적으로 상동성", "실질적으로 유사하며", 이러한 상동성 서열은 서열의 속성 중 하나 또는 ?하나 이상, 또는 여기에 설명된 암호화된 생성물을 나타낸다는 것을 제공한다. 단백질의 올바른 폴딩은 단백질의 안정성, 멀티머의 형성, VLP의 형성 및 기능에 중요할 수도 있다. 단백질의 폴딩은 단백질의 서열, 단백질의 상대적 풍부함, 세포내 군집의 정도, 폴딩되거나, 부분적으로 폴딩되거나 폴딩되지 않은 단백질과 결합할 수도 있거나 일시적으로 결합될 수도 있는 보조인자의 이용 가능성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 인자에 의해 영향을 받을 수도 있다.
이러한 서열 유사성은 뉴클레오티드 서열 비교 프로그램, 예를 들어, DNASIS 내에 제공된 것들을 사용하여 결정될 수도 있다 (예를 들어 다음 파라미터를 사용하지만, 이에 제한되지 않음: GAP 패널티 5, 대각선 상단 5의 #, 고정된 GAP 패널티 10, k-투플 2, 유동적 갭 10, 및 윈도우 크기 5). 하지만, 비교되는 서열의 정렬의 다른 방법, 예를 들어, Smith & Waterman의 알고리즘 (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)의 알고리즘은 업계에 잘 알려져 있고, 이들 알고리즘 (GAP, BESTFIT, FASTA, and BLAST, available through the NIH.)의 컴퓨터에 의한 실행에 의한, 또는 수동적 정렬 및 시각적 조사에 의한 것이거나 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement를 참고하면 된다), 서던 또는 노던 잡종화를 사용 (Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982를 참고하면 된다)하는 것이다. 바람직하게, 실질적으로 상동성인 서열은 분자의 한정된 길이와 적어도 약 80% 및 가장 바람직하게 적어도 약 90% 서열 유사성을 나타낸다.
하나의 이러한 엄중 잡종화 조건의 예는 65 ℃에서 4X SSC에서 하룻밤 동안 (약 16-20시간) 잡종화 후 이어서, 65 ℃에서 0.1X SSC에서 1시간 동안 세척하거나, 65 ℃에서 0.1X SSC에서 각각 20 또는 30분 동안 두 번 세척하는 것일 수도 있다. 대안으로, 전형적인 엄중 잡종화 조건은 42 ℃에서 50% 프롬아미드, 4X SSC에서 하룻밤 동안 후 이어서, 65 ℃에서 0.1X SSC에서 한 시간 동안 세척하거나, 또는 65 ℃에서 0.1X SSC에서 각각 20분 또는 30분 동안 두 번, 또는 하룻밤 동안 (16-20시간) 세척하거나, 65 ℃에서 처치 수용성 인산염 버퍼 (Church aqueous phosphate 버퍼; 7% SDS; 0.5M NaP04 완충액 pH 7.2; 10 mM EDTA)에서 잡종화 후, 50 ℃에서 0.1 X SSC, 0.1% SDS에서 각각 20 또는 30분 동안 두 번 세척하거나, 65 ℃에서 2 X SSC, 0.1% SDS에서 독특한 서열 영역에 대하여 각각 20 또는 30분 동안 두 번 세척하는 것일 수 있다.
천연 광견병 구조 폴리펩티드 또는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 핵산은 "광견병 핵산", "광견병 뉴클레오티드 서열", "천연 광견병 핵산", 또는 "천연 광견병 뉴클레오티드 서열"로 설명될 수도 있다. 예를 들어, 제한적인 것으로 생각되지 않는, 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질 또는 천연 광견병 바이러스 구조 폴리펩티드를 포함하는 바이러스-유사 입자는 "광견병 VLP" 또는 "천연 광견병 VLP"로 설명될 수도 있다.
천연 광견병 바이러스 구조 단백질 또는 폴리펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질의 나머지와 같거나, 또는 이와 상동성인 신호 펩티드를 포함할 수도 있다. 용어 "신호 펩티드"는 업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 특정 세포 기관으로 새로 번역된 폴리펩티드의 위치 이동을 지시할 수도 있거나 서로에 관하여 폴리펩티드 사슬의 특이적 도메인의 위치 결정에 도움을 줄 수도 있는 폴리펩티드의 N-말단에서 발견되는, 일반적으로 아미노산의 짧은 (약 5-30개의 아미노산) 서열을 나타낸다. 비-제한 예로서, 신호 펩티드는 소포체로 단백질의 위치 이동을 표적화할 수도 있고 및/또는, 예를 들어, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 제한하는 것으로 생각되어서는 안 되는 성숙한 단백질의 분열 및 폴딩에 도움을 주기 위해 발생기 폴리펩티드의 막-고정 도메인에 관하여 N-말단 근위 도메인의 위치 결정에 도움을 줄 수도 있다.
단일 펩티드 (SP)는 단백질 또는 바이러스 단백질에 고유할 수도 있거나, 신호 펩티드는 발현되는 단백질 또는 바이러스 단백질의 1차 서열에 관하여 이종 기원일 수도 있다. 예를 들어 천연 광견병 G 단백질 또는 천연 광견병 M 단백질의 천연 신호 펩티드는 식물계에서 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 발현하기 위해 사용될 수도 있다.
신호 펩티드는 또한 비-고유할 수도 있으며, 예를 들어, 바이러스 단백질 이외의 바이러스, 예를 들어, 식물, 동물 또는 박테리아 폴리펩티드의 단백질, 바이러스 단백질 또는 천연 구조 단백질의 것일 수도 있다. 사용될 수도 있는 신호 펩티드의 비-제한 예는 알팔파 (alfalfa) 단백질 이황화 이소머라제의 것이다 (PDI SP; 수납 번호 Z11499의 뉴클레오티드 32-103)
그러므로 본 발명은 천연, 또는 비-천연 신호 펩티드를 포함하는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질, 및 이러한 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다.
증폭 요소
천연 광견병 바이러스 구조 단백질 또는 폴리펩티드는, 예를 들어, 코모바이러스-기반 발현 카세트 및 제미니바이러스-기반 증폭 요소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 바이러스 기반, DNA 또는 RNA, 발현 시스템을 포함하는 발현 시스템에서 발현될 수도 있다.
여기에 설명된 발현 시스템은 이낭성 (bipartite) 바이러스, 또는 이낭성 게놈을 갖는 바이러스에 기초한 발현 카세트를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 이낭성 바이러스는 코모비리대 (Comoviridae) 패밀리 중 하나일 수도 있다. 코모비리대 패밀리의 속은 코모바이러스, 네포바이러스 (Nepovirus), 파바바이러스 (Fabavirus), 체라바이러스 (Cheravirus) 및 사드와바이러스 (Sadwavirus)를 포함한다. 코모바이러스는 동부 모자이크 바이러스 (CPMV), 동부콩 중증 모자이크 바이러스 (Cowpea severe mosaic virus; CPSMV), 스쿼시 모자이크 바이러스 (Squash mosaic virus; SqMV), 붉은 클로버 반점 바이러스 (Red clover mottle virus; RCMV), 콩껍질 반점 바이러스 (Bean pod mottle virus; BPMV), 순무 원형반점 바이러스 (Turnip ringspot virus; TuRSV), 잠두 트루 모자이크 바이러스 (Broad bean true mosaic virus; BBtMV), 잠두 염색 바이러스 (Broad bean stain virus; BBSV), 무 모자이크 바이러스 (Radish mosaic virus; RaMV)를 포함한다. 본 발명의 다양한 양태에 유용할 수도 있는 인핸서 요소를 포함하는 코모바이러스 RNA-2 서열의 예는 CPMV RNA-2 (GenBank 수납 번호 NC_003550), RCMV RNA-2 (GenBank 수납 번호 NC 003738), BPMV RNA-2 (GenBank 수납 번호 NC_003495), CPSMV RNA-2 (GenBank 수납 번호NC_003544), SqMV RNA-2 (GenBank 수납 번호NC_003800), TuRSV RNA-2 (GenBank 수납 번호 NC 013219.1). BBtMV RNA-2 (GenBank 수납 번호 GU810904), BBSV RNA2 (GenBank 수납 번호 FJ028650), RaMV (GenBank 수납 번호 NC 003800)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이낭성 코모바이러스 RNA 게놈의 세그먼트는 RNA-1 및 RNA-2로 나타난다. RNA-1은 복제에 수반된 단백질을 암호화하는 한편, RNA-2는 세포-대-세포 이동에 필요한 단백질 및 두 개의 캡시드 단백질을 암호화한다. CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV, 또는 BPMV를 포함하는 어떤 적합한 코모바이러스-기반 카세트도 사용될 수 있으며, 예를 들어, 발현 카세트는 CPMV에 기초할 수도 있다.
"발현 카세트"는 적절한 프로모터 또는 숙주 세포에서 원하는 핵산의 전사를 위한 다른 조절 요소의 조절하에 원하는 핵산을 포함하고, 이에 작동 가능하게 (또는 작동 가능하게) 결합된 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
발현 시스템은 또한 제미니바이러스의 증폭 요소, 예를 들어, 강낭콩 황고병 바이러스 (BeYDV)의 증폭 요소를 포함할 수도 있다. BeYDV는 쌍자엽 식물에 적응된 매스트레바이러스 속에 속한다. 단일 가닥 순환 DNA 게놈을 갖는 BeYDV는 일낭성이고 회전환 메카니즘에 의해 매우 높은 카피 수로 복제될 수 있다. BeYDV-유래 DNA 레플리콘 벡터 시스템은 식물에서 신속한 고수득율 단백질 생성에 사용되었다.
여기에 사용된 바와 같이, 구절 "증폭 요소"는 제미니바이러스 게놈의 하나 이상의 긴 유전자간 영역 또는 긴 유전자간 반복 (LIR) 중 적어도 일부를 포함하는 핵산 세그먼트를 나타낸다. 여기에 사용된 바와 같이, "긴 유전자간 영역" 또는 "긴 유전자간 반복"은 제미니바이러스 Rep 단백질에 의한 절제 및 복제를 조절할 수 있는 rep 결합 부위를 함유하는 긴 유전자간 영역을 나타낸다. 일부 양태에서, 하나 이상의 LIR을 포함하는 핵산 세그먼트는 제미니바이러스 게놈의 짧은 유전자간 영역 또는 작은 유전자간 영역 (SIR)을 더 포함할 수도 있다. 여기에 사용된 바와 같이, "짧은 유전자간 영역" 또는 "작은 유전자간 영역"은 상보성 가닥 (매스트레바이러스의 짧은 IR (SIR))을 나타낸다. 어떤 적합한 제미니바이러스-유래 증폭 요소도 여기에 사용될 수도 있다. 예를 들어, WO2000/20557; WO2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al.(2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17)을 참고하면 되며, 본원에 참고로 포함된다. 하나 이상의 LIR, 예를 들어, 두 개의 LIR이 구조에 사용되면, 프로모터, 원하는 CMPV-HT 영역 및 핵산 서열 및 종결자는 두 개의 LIR 각각에 의해 괄호로 묶인다. 게다가, 증폭 요소는 예를 들어, Halley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240에 개시된 바와 같이, Gen Bank 수납 번호 DQ458791 하에 기탁된 서열로부터 유래할 수도 있으며, 본원에 참고로 포함된다. LIR을 포함하는 핵산 세그먼트는 결합된 뉴클레오티드 2401 내지 2566 및 1 내지 128이다. SIR을 포함하는 핵산 세그먼트는 뉴클레오티드 1154 내지 1212이다.
여기에 설명된 바와 같이, 니코티아나 벤타미아나 잎의 아그로박테리움의 침투 (agroinfiltration)에 의한 강낭콩 황고병 바이러스 (BeYDV)-유래 벡터 및 Rep/RepA-공급 벡터의 동시 전달은 효과적인 레플리콘 증폭 및 활발한 단백질 생성을 일으킨다.
코모바이러스-기반 발현 카세트 및 제미니바이러스-유래 증폭 요소는 별도의 벡터 상에 포함될 수도 있거나, 구성 요소는 하나의 벡터에 포함될 수도 있다. 두 개의 벡터가 사용되면, 제1 및 제2 벡터는 식물 세포에 동시에, 또는 별도로 도입될 수도 있다.
바이러스 레플리카제는 원하는 핵산의 발현을 증가시키기 위해 여기에 설명된 발현 시스템에 포함될 수도 있다. 레플리카제의 비-제한 예는 BeYDV Rep 및 RepA를 암호화하는 BeYDV 레플리카제 (pREP110)이다 (C2/C1; Huang et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714; 이것은 본원에 참고로 포함된다). 레플리카제의 또 다른 비-제한 예는 Halley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240에 개시되고, Gen Bank 수납 번호 DQ458791 하에 기탁되며, 이것은 본원에 참고로 포함된다. C1:C2 유전자를 포함하는 핵산 세그먼트는 뉴클레오티드 1310 내지 2400이다.
"동시 발현됨"은 둘 또는 둘 이상의 뉴클레오티드 서열이 식물 내에서, 및 식물의 같은 조직 내에서 거의 동시에 발현된다는 것을 의미한다. 하지만, 뉴클레오티드 서열은 정확히 동시에 발현될 필요는 없다. 오히려, 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 암호화된 생성물이 상호작용할 기회를 갖는 방식으로 발현된다. 둘 또는 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 둘 이상의 서열이 두 개의 서열이 발현되는 조건 하에 동시에 식물 내에 도입되는 경우, 일시적인 발현 시스템을 사용하여 거의 동시 발현될 수 있다. 대안으로, 뉴클레오티드 서열 중 하나를 포함하는 플랫폼 (platform) 식물은 안정한 방식으로 형질전환될 수도 있으며, 원하는 단백질을 암호화하는 추가적인 서열, 예를 들어, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 일시적인 방식으로 플랫폼 식물에 도입된다.
샤페론
발현된 천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 올바른 폴딩은 다른 특징들 중에, 단백질의 안정성, 멀티머의 형성, VLP의 형성, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 기능 및 항체에 의한 천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 인식에 중요할 수도 있다. 단백질의 폴딩 및 축적은 폴딩되거나, 부분적으로 폴딩되거나 폴딩되지 않은 단백질과 결합할 수도 있거나 일시적으로 결합될 수도 있는 보조인자의 이용 가능성, 하나 이상의 샤페론 단백질의 존재, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 인자에 의해 영향을 받을 수도 있다.
열 충격 단백질 (Hsp) 또는 스트레스 단백질은 샤페론 단백질의 예이며, 이것은 단백질 합성, 세포내 트래피킹 (trafficking), 미스폴딩 (misfolding)의 방지, 단백질 응집체의 방지, 단백질 복합체의 조립체 및 분해체, 단백질 폴딩, 및 단백질 분해를 포함하는 다양한 세포 과정에 참여할 수도 있다. 이러한 샤페론 단백질의 예는 Hsp60, Hsp65, Hsp 70, Hsp90, Hsp100, Hsp20-30, Hsp10, Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, TF55, FKBPs, 시클로필린, ClpP, GrpE, 유비퀴틴, 칼넥신, 및 단백질 이황화 이소머라제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Macario, A. J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993); 미국 특허 번호 5,232,833을 참고하면 된다). 여기에 설명된 바와 같이, 샤페론 단백질, 제한되지 않는 예로써, Hsp40 및 Hsp70은 광견병 바이러스 단백질의 폴딩을 확인하기 위해 사용될 수도 있다.
Hsp70의 예는 포유동물 세포의 Hsp72 및 Hsc73, 박테리아, 특히 미코박테리움 레프래 (Mycobacterium leprae), 미코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 및 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis)와 같은 미코박테리아의 DnaK (예를 들어, 바실-칼메테 구에린 (Bacille-Calmette Guerin); 여기에서 Hsp71로 불림), 대장균 (Escherichia coli), 효모 및 다른 원핵생물의 DnaK, 및 애기장대 (A. thaliana)와 같은 진핵 생물의 BiP 및 Grp78을 포함한다. Hsp70의 특정 예는 애기장대 Hsp70이다 (Genbank 참조번호: AY120747.1에 의해 암호화됨). Hsp70은 ATP, 뿐만 아니라 폴딩되지 않은 폴리펩티드 및 펩티드에 특이적으로 결합하며, 그로 인해 단백질 폴딩 및 미스폴딩, 뿐만 아니라 단백질 복합체의 조립체 및 분해체에 참여할 수 있다.
Hsp40의 예는 대장균 및 미코박테리아와 같은 원핵생물의 DnaJ, 알팔파와 같은 진핵생물의 HSJ1, HDJ1 및 Hsp40을 포함한다 (Frugis et al., 1999. Plant Molecular Biology 40:397-408). Hsp40의 특정 예는 엠. 사티바 (M. sativa) MsJ1이다 (Genbank 참조번호: AJ000995.1). Hsp40은 다른 세포 활성 중에, 단백질 폴딩, 열내성 및 DNA 복제에서 분자 샤페론의 역할을 한다.
Hsps, Hsp70 및 그것의 공통-샤페론 중에서, Hsp40은 합성이 완료되기 전 번역 및 새로 합성된 폴리펩티드의 안정화에 수반된다. 어떤 이론에도 결부되지 않고, Hsp40은 폴딩되지 않은 (발생기 또는 새로 전송된) 폴리펩티드의 소수성 패치에 결합하고, 따라서 폴리펩티드와 Hsp70-ATP 복합체의 상호작용을 가능하게 한다. ATP 가수분해는 폴리펩티드, Hsp70 및 ADP 사이에서 안정한 복합체의 형성, 및 Hsp40의 방출로 이어진다. 폴리펩티드의 소수성 패치와 Hsp70-ADP 복합체의 결합은 다른 소수성 패치와 그것들의 상호작용을 방지하며, 올바르지 않는 폴딩 및 다른 단백질로 응집체 형성을 방지한다 (Hartl, FU. 1996. Nature 381:571-579에서 재논의됨).
천연 샤페론 단백질은 낮은 수준의 재조합 단백질의 올바른 폴딩을 가능하게 할 수도 있지만, 발현 수준이 증가하기 때문에, 천연 샤페론의 풍부함은 제한 인자가 될 수도 있다. 아그로박테리움 침투된 잎에서 천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 높은 수준의 발현은 세포질에서 천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 축적, 및 Hsp70, Hsp40 또는 둘 다와 같은 하나 또는 하나 이상의 샤페론 단백질의 동시 발현으로 이어질 수도 있다. Hsp70 및 Hsp40은 미스폴딩되거나 응집된 단백질의 수준을 감소시킬 수도 있고, 바이러스--유사 입자의 형성을 허용하는 3차 및 4차 구조의 특징을 나타내는 단백질의 수를 증가시킬 수도 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 식물에서 광견병 VLP를 생성하는 방법을 제공하며, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 샤페론을 암호화하는 제2 핵산과 동시 발현된다. 제1 및 제2 핵산은 같은 단계에서 식물로 도입될 수도 있거나, 순차적으로 식물에 도입될 수도 있다.
조절 요소
본 출원에서 용어 "조절 영역", "조절 요소" 또는 "프로모터"의 사용은 항상은 아니지만, 전형적으로 유전자의 단백질 암호화 영역의 업스트림에서 핵산의 일부를 반영하는 것을 의미하며, 이것은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA 및 RNA 둘 다로 구성될 수도 있다. 조절 영역이 활성화되고, 원하는 유전자와 작동 가능하게 연결되거나, 작동 가능하게 결합될 때, 이것은 원하는 유전자의 발현을 일으킬 수도 있다. 조절 요소는 기관 특이성을 매개하거나 발달하거나 일시적인 유전자 활성화를 조절할 수도 있다. "조절 영역"은 프로모터 요소, 기본 프로모터 활성을 나타내는 코어 프로모터 요소, 외부 자극에 반응하여 유발 가능한 요소, 음성 조절 요소 또는 전사 인핸서와 같은 프로모터 활성을 매개하는 요소를 포함할 수도 있다. 여기에 사용된 바와 같이, "조절 영역"은 또한 전사 후 활성인 요소, 예를 들어, 번역 및 전사 인핸서, 번역 및 전사 억제자, 업스트림 활성화 서열, 및 mRNA 불안정성 결정요인을 포함할 수도 있다. 이들 후자의 요소 중 다수는 암호화 영역의 근위에 위치할 수도 있다.
이 개시의 맥락에서, 용어 "조절 요소" 또는 "조절 영역"은 전형적으로 항상은 아니지만, 보통 구조 유전자의 암호화 서열에 대한 업스트림 (5')의 DNA의 서열을 나타내며, 이것은 RNA 폴리머라제 및/또는 특정 부위에서 시작하는 전사에 필요한 다른 인자에 대한 인식을 제공함으로써 암호화 영역의 발현을 조절한다. 하지만, 인트론 내에, 또는 서열의 3'에 위치한 다른 뉴클레오티드 서열이 또한 원하는 암호화 유전자의 발현의 조절에 기여할 수도 있다는 것으로 생각되어야 한다. RNA 폴리머라제 또는 특정 부위에서 시작을 보장하는 다른 전사 인자에 대한 인식을 제공하는 조절 요소의 예는 프로모터 요소이다. 모두는 아니지만, 대부분의 진핵세포 프로모터 요소는 TATA 박스, 전사 시작 부위의 대략 25개의 염기쌍 업스트림에 보통 위치한 아데노신 및 티미딘 뉴클레오티드 염기쌍으로 구성된 보존된 핵산 서열을 함유한다. 프로모터 요소는 전사의 시작의 원인이 되는 기본 프로모터 요소, 뿐만 아니라 유전자 발현을 변형시키는 다른 조절 요소 (상기 나열됨)를 포함한다.
발전적으로 조절되거나 유발성이거나 구성적인 것을 포함하는, 여러 타입의 조절 영역이 있다. 발전적으로 조절되거나 그것의 조절 하에 유전자의 차등 발현을 조절하는 조절 영역은 상기 기관 또는 조직의 발달 중의 특정 시간에 특정 기관 또는 기관의 조직 내에서 활성화된다. 하지만, 발전적으로 조절되는 일부 조절 영역은 바람직하게 특정 발달 단계의 특정 기관 또는 조직 내에서 활성일 수도 있고, 그것들은 또한 발전적으로 조절되는 방식으로, 또는 식물 내 다른 기관 또는 조직에서 기본 수준으로 활성일 수도 있다. 조직-특이적 조절 영역, 예를 들어, 시각-특이적 (see-specific) 조절 영역의 예는 나핀 프로모터, 및 크루시페린 프로모터를 포함한다 (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al, 1994, Plant Cell 14: 125-130). 잎-특이적 프로모터의 예는 p1 아스토시아닌 프로모터를 포함한다 (US 7,125,978을 참고하면 되고, 이것은 본원에 참고로 포함된다).
유발성 조절 영역은 유도물질에 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접적으로 또는 간접적으로 활성화할 수 있는 것이다. 유도물질의 부재시 DNA 서열 또는 유전자는 전사되지 않을 것이다. 전형적으로 전사를 활성화하기 위해 유발성 조절 영역에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재할 수도 있으며, 이것은 유도물질에 의해 활성 형태로 직접적으로 또는 간접적으로 전환된다. 하지만, 단백질 인자가 또한 없을 수도 있다. 유도물질은 단백질, 대사산물, 성장 조절자, 제초제 또는 페놀 화합물 또는 열, 추위, 염, 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 또는 바이러스와 같은 병원체 또는 질병 인자 (disease agent)의 작용을 통해 간접적으로 도입된 생리학적 스트레스와 같은 화학작용제일 수 있다. 유발성 조절 영역을 함유하는 식물 세포는 유도물질에 노출될 수도 있다. 유발성 조절 요소는 식물 또는 비-식물 유전자로부터 유도될 수도 있다 (예를 들어 Gatz, C. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; 이것은 참고로 포함된다). 잠재적 유발성 프로모터의 예는
테트라시클린-유발성 프로모터 (Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48,89-108; 이것은 참고로 포함된다), 스테로이드 유발성 프로모터 (Aoyama. T. and Chua, N.H.,1997, Plant 1. 2, 397-404; 이것은 참고로 포함된다) 및 에탄올 유발성 프로모터 (Salter, M.G., et al, 1998, Plant 10urnal 16, 127- 132; Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180, 이것은 참고로 포함된다), 시토키닌 유발성 IB6 및 CKI 1 유전자 (Brandstatter, I. and K.ieber, 1.1.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985; 이것은 참고로 포함된다) 및 옥신 유발성 요소, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; 이것은 참고로 포함된다)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
구성적 조절 영역은 식물의 다양한 부분을 통해 및 지속적으로 식물 발달을 통해 유전자의 발현을 지시한다. 알려진 구성적 조절 요소의 예는 CaMV 25S 전사물과 결합된 프로모터 (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), 쌀 액틴 1 (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), 액틴 2 (An et al, 1996, Plant J., 10: 107-121), 또는 tins 2 (U.S. 5,428,147, 이것은 본원에 참고로 포함된다), 및 트리오세포스페이트 이소머라제 1 (Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467) 유전자, 옥수수 유비퀴틴 1 유전자 (Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), 애기장대 유비퀴틴 1 및 6 유전자 (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), 및 담배 번역 시작 인자 4A 유전자 (Mandel et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004)를 포함한다.
용어 "구성적"은 여기에 사용된 바와 같이 구성적 조절 영역의 조절 하에 유전자가 모든 세포 타입에서 같은 수준으로 발현되지만, 풍부함의 차이가 종종 관찰되지만 유전자는 다양한 세포 타입에서 발현된다는 것을 반드시 나타내지 않는다. 보존적 조절 요소는 그것들이 작동 가능하게 결합된 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 더 향상시키기 위해 다른 서열과 커플링될 수도 있다. 예를 들어, CPMV-HT 시스템은 동부 모자이크 바이러스 (CPMV)의 비번역 영역으로부터 유도되고 결합된 암호화 서열의 향상된 번역을 입증한다. "고유"는 핵산 또는 아미노산 서열이 자연 발생하거나, "야생형"인 것을 의미한다. "작동 가능하게 결합된"은 특정 서열, 예를 들어, 원하는 조절 요소 및 암호화 영역이 의도된 기능, 예를 들어, 유전자 발현의 매개 또는 조절을 수행하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용한다는 것을 의미한다. 작동 가능하게 결합된 서열의 상호작용은, 예를 들어, 작동 가능하게 결합된 서열과 상호작용하는 단백질에 의해 매개될 수도 있다.
본 발명은 또한 VLP가 발현되는 세포의 원형질막으로부터 지질 외피를 얻는 VLP를 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질이 식물-기반 시스템에서 발현되면, 결과의 VLP는 식물 세포의 원형질막으로부터 지질 외피를 얻을 수도 있다.
일반적으로, 용어 "지질"은 지용성 (친유성)인, 자연 발생한 분자를 나타낸다. 본 발명으 LDIDXODP 따라 식물에서 생성된 VLP는 식물-유래 지질과 복합체를 형성할 수도 있다. 식물-유래 지질은 지질 이중층의 형태일 수도 있고, VLP를 둘러싼 외피를 추가로 포함할 수도 있다. 식물-유래 지질은 VLP가 생성되는 경우, 인지질, 트리-, 디- 및 모노글리세리드, 뿐만 아니라 지용성 스테롤 또는 스테롤을 포함하는 대사산물을 포함하는, 식물의 원형질막의 지질 성분을 포함할 수도 있다. 예는 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 글리코스핑고리피드, 피토스테롤 또는 이들의 조합을 포함한다. 식물-유래 지질은 대안으로 '식물 지질'로 나타날 수도 있다. 피토스테롤의 예는 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 브라시카스테롤, 델타-7-스티그마스테롤, 델타-7-아벤나스테롤, 다우노스테롤, 시토스테롤, 24-메틸 콜레스테롤, 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤을 포함한다 - 예를 들어, Mongrand et ai., 2004를 참고하면 된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 세포의 원형질막의 지질 조성물은 세포 또는 유기체의 배양 또는 성장 조건, 또는 세포가 얻어진 종에 따라 다를 수도 있다. 일반적으로, 베타-시토스테롤은 가장 풍부한 피토스테롤이다.
세포막은 일반적으로 지질 이중층, 뿐만 아니라 다양한 기능을 위한 단백질을 포함한다. 특정 지질의 국소화된 농도는 지질 이중층에서 발견될 수도 있으며, '지질 뗏목 (lipid raft)로 불린다. 이들 지질 뗏목 미크로도메인은 스핑고리피드 및 스테롤에서 풍부할 수도 있다. 어떤 이론에도 결부되지 않고, 지질 뗏목은 세포 내 섭취 (endocytosis) 및 세포 외 유출 (exocytosis), 바이러스 또는 다fms 감염원의 유입 또는 배출, 세포간 신호 전달, 세포 또는 유기체의 다른 구조적 구성요소, 예를 들어, 세포 내 및 세포 외 매트릭스와 상호작용에서 중요한 역할을 할 수도 있다.
식물 내에서 생성된 VLP는 식물-특이적 N-글리칸을 포함하는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 유발할 수도 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 식물 특이적 N-글리칸을 갖는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 포함하는 VLP를 제공한다.
게다가, 식물에서 N-글리칸의 변형이 알려져 있고 (예를 들어 U.S. 60/944,344를 참고하면 된다; 이것은 본원에 참고로 포함된다) 변형된 N-글리칸을 갖는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질이 생성될 수도 있다. 변형된, 예를 들어, 감소된 푸코실화된, 자일로실화된, 또는 둘 다 된 글리코실화 패턴을 포함하는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 얻어질 수도 있거나, 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질이 얻어질 수도 있으며, 단백질이 푸코실화, 자일로실화, 또는 둘 다가 없고, 증가된 갈라토실화를 포함한다. 게다가, 번역 후 변형의 조절, 예를 들어, 말단 갈락토스의 추가는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 발현하는 야생형 식물과 비교할 때 발현된 천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 푸코실화 및 자일로실화의 감소를 일으킬 수도 있다.
제한하는 것으로 생각되어서 안 되는 예로써, 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 합성은 베타-1.4 갈락토실트랜스퍼라제 (GalT), 제한되지 않는 예로써, 포유동물 GalT, 또는 사람 GalT를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 함께 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 동시 발현함으로써 성취될 수도 있지만 또 다른 근원의 GalT도 사용될 수 있다.
GalT의 촉매 도메인은 또한 GNT1-GalT 히브리드 (hybrid) 효소를 생성하기 위해, N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 (GNT1)의 CTS 도메인 (즉, 세포질 꼬리, 막관통 도메인, 줄기 영역)에 융합될 수도 있고, 히브리드 효소는 천연 고아견병 바이러스 구조 단백질과 동시 발현될 수도 있다. 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 또한 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnT-III), 제한되지 않는 예로써, 포유동물 GnT-III 또는 사람 GnT-III를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 함께 동시 발현될 수도 있지만, 다른 공급원의 GnT-III이 또한 사용될 수도 있다. 추가적으로, GnT-III에 융합된 GNT1의 CTS를 포함하는 GNT1-GnT-III 히브리드 효소도 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 또한 변형된 N-글리칸을 갖는 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 포함하는 VLP를 제공한다.
어떤 이론에도 결부되지 않고, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질에서 식물 N-글리칸의 존재는 항원 제공 세포에 의한 천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 결합을 촉진함으로써 면역 반응을 자극할 수도 있다. 식물 N 글리칸을 사용하는 면역 반응의 자극은 Saint-Jore-Dupas et al. (2007)에 의해 제안되었다. 게다가, VLP의 구조는 항원의 제공에 이로울 수도 있고, 식물 유도된 지질 이중층과 복합체를 형성할 때 VLPDML 보조 효과를 향상시킬 수도 있다
VLP의 발생은 어떤 적합한 방법, 예를 들어, 수크로스 구배, 또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용해서도 검출될 수 있다. VLP는, 예를 들어, 전자 현미경, 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 구조 및 크기에 대하여 평가될 수도 있다.
크기 배제 크로마토그래피에 대하여, 총 가용성 단백질은 추출 버퍼에서 냉동-분쇄된 식물 재료의 샘플을 균질화 (Polytron)함으로써 식물 조직으로부터 추출될 수도 있고 불용성 재료는 원심분리에 의해 제거된다. 차가운 아세톤 또는 PEG로 침전이 또한 유익할 수도 있다. 가용성 단백질은 정량되고 추출물은 Sephacryl™ 컬럼, 예를 들어, Sephacryl™ S500 컬럼을 통과하였다. Blue Dextran 2000은 보정 표준으로 사용될 수도 있다. 크로마토그래피 후에, 분획은 분획의 단백질 상보를 결정하기 위해 면역블롯에 의해 추가로 분석될 수도 있다.
분리된 분획은 예를 들어, 상층액 (원심분리되거나, 침강되거나, 침전되면), 또는 여과물 (여과되면)일 수도 있고,
단백질, 또는 상기구조, 예를 들어, 로제트 (rosette)-유사 구조 또는 고차원, 고분자량 단백질, VLP와 같은 입자에 대하여 풍부하다. 별도의 분획, 단백질, 또는 상기구조 단백질은, 예를 들어, 추가적인 원심분리 단계, 침전, 크로마토그래피 단계 (예를 들어 크기 배제, 이온 교환, 친화도 크로마토그래피), 접선 유동 여과 (tangential flow filtration), 또는 이들의 조합에 의해 분리하거나, 정제하거나, 농축하거나 이들의 조합으로 더 가공될 수도 있다. 정제된 단백질, 또는 상기구조 단백질의 존재는 예를 들어, 적절한 검출 항체, 모세관 전기영동, 전자 현미경, 또는 당업자에게 명백한 어떤 다른 방법을 사용하는 천연 또는 SDS-PAGE, 웨스턴 분석에 의해 확인될 수도 있다.
도 3A 및 도 3B는 VLP를 포함하는 식물 추출물의 크기 배제 크로마토그래피의 용출 프로파일의 예를 나타낸다. 이 경우에, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 포함하는 VLP는 8 내지 대략 11을 용출하거나, 로제트 및 고분자량 구조는 대략 분획 12 내지 대략 14를 용출하거나, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질의 가용성 형태는 대략 15 내지 대략 17의 분획에서 용출한다.
VLP는 어떤 적합한 방법을 사용하여서도 정제되거나 추출, 예를 들어, 화학적 또는 생화학적 추출될 수 있다. VLP는 건조, 열, pH, 계면활성제 및 세제에 상대적으로 민감하다. 그러므로 수득율을 최대화하고, 세포의 단백질로 VLP 분획의 오염을 최소화하고, 단백질, 또는 VLP, 및, 필요한 경우, 결합된 지질 외피 또는 막의 온전함을 유지하는 방법, 단백질, 또는 VLP를 방출하기 위해 세포벽을 느슨하게 하는 방법을 사용하는 것이 유용할 수도 있다. 예를 들어, 원생동물 및/또는 스페로플라스트 (spheroplast)를 생산하는 방법은 여기에 설명된 VLP를 얻기 위해 사용될 수도 있다 (예를 들어 WO 2011/035422를 참고하면 되고, 이것은 본원에 참고로 포함된다). 세제 또는 계면활성제, 예를 들어, SDS 또는 Triton X-100의 사용을 최소화하거나 제거하는 것은 는 VLP 추출의 수득율을 개선하는데 유익할 수도 있다. VLP는, 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이 전자 현미경, 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 구조 및 크기에 대하여 평가될 수도 있다.
본 발명의 하나 또는 하나 이상의 유전적 구조는 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 또는 구조, 또는 벡터에 의해 형질전환된 어떤 적합한 식물 숙주에서도 발현될 수 있다. 적합한 숙주의 예는 알팔파, 카놀라, 브라시카 종 (Brassica spp.), 옥수수, 니코티아나 종 (Nicotiana spp.), 알팔파, 감자, 인삼, 완두콩, 귀리, 쌀, 대두, 밀, 보리, 해바라기, 목화 등을 포함하는 농작물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 유전적 구조는 3' 비번역된 영역을 더 포함할 수 있다. 3' 비번역된 영역은 폴리아데닐화 신호 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 어떤 다른 조절 신호를 함유하는 DNA 세그먼트를 포함하는 유전자의 상기 일부를 나타낸다. 폴리아데닐화 신호는 보통 mRNA 전구체의 3' 끝에 폴리아데닐산의 추가에 영향을 미친다. 폴리아데닐화 신호는 보통 기본형 5' AATAAA-3'에 대한 상동성의 존재에 의해 인식되지만 변형은 드문 일은 아니다. 적합한 3' 영역의 비-제한 예는 아그로박테리움 종양 유발 (Ti) 플라스미드 유전자, 예를 들어, 노팔린 합성효소 (NOS) 유전자, 식물 유전자, 예를 들어, 대두 저장 단백질 유전자, 리불로스-I, 5-비스포스페이트 카르복실라제 유전자의 작은 서브유닛 (ssRUBISCO; US 4,962,028; 이것은 본원에 참고로 포함된다), US 7,125,978에 설명된, 플라스토시아닌 발현을 조절하는데 사용된 프로모터 (이것은 본원에 참고로 포함된다)의 폴리아데닐화 신호를 함유하는, 3' 전사된 비번역된 영역이다.
본 발명의 유전적 구조 중 하나 이상은, 필요할 수도 있는, 또한 인핸서, 번역 또는 전사 인핸서를 더 포함할 수도 있다. 인핸서는 전사되는 서열의 5' 또는 3'에 위치할 수도 있다. 인핸서 영역은 당업자에게 잘 알려져 있고, ATG 시작 코돈, 보조 서열 등을 포함한다. 시작 코돈은, 존재하면, 전사된 서열의 올바른 번역을 제공하기 위해 암호화 서열의 리딩 프레임 ("인 프레임 (in frame"))과 같은 단계에 있을 수도 있다.
본 발명의 구조는 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 형질전환, 미세주입, 전기천공, 등을 사용하여 식물 세포에 도입될 수 있다. 이러한 기술의 재논의를 위해, 예를 들어 Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); 및 Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997)을 참고하면 된다. 다른 방법은 직접적인, 예를 들어, 원생동물, 미세주입, 미세투사물 또는 위스커 (whisker), 및 진공 침투를 사용하는, DNA 흡수, 리포솜의 사용, 전기천공을 포함한다. 예를 들어, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al, Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), 미국 특허 번호 4,945,050; 5,036,006; 및 5,100,792, 1995년 5월 10일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 08/438,666, 및 1992년 9월 25일에 출원된 07/951,715를 참고하면 된다 (이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다).
하기 설명된 바와 같이, 일시적인 발현 방법은 본 발명의 구조를 발현하기 위해 사용될 수 있다 (Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348을 참고하면 된다; 이것은 본원에 참고로 포함된다). 대안으로는, Kapila et al., 1997에 의해 설명된 바와 같이 진공-기반 일시적인 발현 방법이 사용될 수도 있다 (이것은 본원에 참고로 포함된다). 이들 방법은 아그로-접종 또는 아그로-침투, 주사기 침투를 포함하지만, 이에 제한되지 않을 수도 있고, 하지만, 다른 일시적인 방법이 또한 상기 지적된 바와 같이 사용될 수도 있다. 아그로-접종, 아그로-침투, 또는 주사기 침투로, 원하는 핵산을 포함하는 아그로박테리아의 혼합물은 조직의 세포간 공간, 예를 들어, 잎, 식물의 공기중 부분 (줄기, 잎, 및 꽃 등), 식물의 다른 부분 (줄기, 뿌리, 꽃), 또는 전체 식물에 들어간다. 표피를 거친 후 아그로박테리아는 t-DNA 카피를 감염시키고 세포로 전송한다. t-DNA는 에피솜에 의해 전사되고 mRNA는 번역되며, 감염된 세포에서 원하는 단백질의 생성으로 이어지지만, 핵 안의 t-DNA의 통로는 일시적이다.
형질전환된 식물 세포의 확인을 지원하기 위해, 본 발명의 구조는 식물 선택 마커를 포함하도록 추가로 제작될 수도 있다. 유용한 선택 마커는 화학물질, 예를 들어, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신과 같은 항생제, 또는 포스피노트리신, 글리포세이트, 클로로술푸론, 등과 같은 제초제에 대한 저항성을 제공하는 효소를 포함한다. 유사하게, GUS (베타-글루쿠로니다제)와 같이 색깔 변화에 의해, 또는 루시퍼라제 또는 GFP와 같이 발광에 의해 확인 가능한 화합물의 생산을 제공하는 효소가 사용될 수도 있다.
또한 본 발명의 일부분은 본 발명의 유전자 구조를 함유하는 형질전환 식물, 식물 세포 또는 종자이다. 식물 세포로부터 전체 식물을 재생시키는 방법이 또한 업계에 알려져 있다. 일반적으로, 형질전환된 식물 세포는 적절한 배지에서 배양되며, 선택 마커가 형질전환된 식물 세포의 확인을 가능하게 하는데 사용되는 경우 이것은 항생제와 같은 선택적 약제를 함유할 수도 있다. 캘러스가 형성되면, 순의 형성은 알려진 방법에 따라 적절한 식물 호르몬을 이용함으로써 촉진될 수 있고 순은 식물의 재생을 위해 발근 (rooting) 배지로 옮겨졌다. 식물은 종자로부터 또는 영양 번식 기술을 사용하여 반복적 발생를 확립하는데 사용될 수도 있다. 형질전환 식물은 또한 조직 배양을 사용하지 않고 발생될 수 있다.
본 발명은 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
표 1. 서열 식별 번호의 목록
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명은 다음 실시예에서 추가로 설명될 것이다.
실시예
구조
표 2. 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 구조
Figure pct00003
실시예 1: 광견병 단백질을 갖는 발현 카세트의 조립체
A-2 X35S / CPMV - HT / Rabies M/ NOS (구조 번호 1066)
광견병 바이러스 ERA 균주의 M 단백질을 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_terexpression 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 완벽한 M 단백질 암호화 서열을 함유하는 단편을 주형으로서 합성된 M 유전자 (Genbank 수납 번호 FJ913470의 nt 2496-3104에 해당) (도 4C, SEQ ID NO: 3)를 사용하는 프라이머 IF-RabM-S3.c (도 4A, SEQ ID NO: 1) 및 IF-RabM-S1-4.r (도 4B, SEQ ID NO: 2)을 사용하여 증폭하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech,Mountain View, CA)을 사용하는 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조 1191 (도 4D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시 발현을 위한 유전자를 포함한다. 구조 번호 1191의 백본은 pCAMBIA 2분법 플라스미드이고 왼쪽에서 오른쪽 t-DNA 경계로의 서열은 도 4E에 제공된다 (SEQ ID NO:4). 결과의 구조는 특정 번호 1066이었다 (도 4F, SEQ ID NO: 5). 광견병 바이러스 ERA 균주의 M 단백질의 아미노산 서열은 도 4G에 제공된다 (SEQ ID NO: 6). 플라스미드 1066의 대표는 도 4H에 제공된다.
B-2 X35S / CPMV - HT / Rabies M/ NOS intoBeYDV +레플리카제 증폭 시스템으로 (구조 번호 1086)
광견병 바이러스 ERA 균주의 M 단백질을 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 BeYDV+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 서열을 암호화하는 완벽한 M 단백질을 함유하는 단편을 주형으로서 합성된 M 유전자 (Genbank 수납 번호 FJ913470의 nt 2496-3104에 해당) (도 4C, SEQ ID NO: 3)를 사용하는 프라이머 IF-RabM-S3.c (도 4A, SEQ ID NO: 1) 및 IF-RabM-Sl-4.r (도 4B, SEQ ID NO: 2)를 사용하여 증폭하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조 1193 (도 5A, SEQ ID NO: B1)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1193은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 BeYDV 증폭 시스템으로 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시 발현을 위한 유전자를 포함한다. 구조 번호 1193의 백본은 pCAMBIA 2분법 플라스미드이고 왼쪽에서 오른쪽 t-DNA 경계로의 서열은 도 5B에 제공된다 (SEQ ID NO:7). 결과의 구조는 특정 번호 1086이었다 (도 5C, SEQ ID NO: 8). 광견병 바이러스 ERA 균주의 M 단백질의 아미노산 서열은 도 4G에 제공된다 (SEQ ID NO: 6). 플라스미드 1086의 대표는 도 5D에 제공된다.
C-2 X35S / CPMV - HT / PDISP / Rabies G/ NOS (구조 번호 1071)
광견병 바이러스 ERA 균주의 M 단백질을 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 야생형 신호 펩티드가 없는 서열을 암호화하는 G 단백질을 함유하는 단편을 주형으로서 합성된 M 유전자 (Genbank 수납 번호 EF206707의 nt 3317-4891에 해당) (도 6C, SEQ ID NO: 11)를 사용하는 프라이머 IF-RabG-S2+4.c (도 6A, SEQ ID NO:9) 및 IF-RabG-S1-4.r (도 6B, SEQ ID NO: 10)를 사용하여 증폭하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에 알팔파 PDI 신호 펩티드와 함께 인-프레임 클로닝하였다. 구조 1192 (도 6D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1192는 CPMV-HT-기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드와 함께 원하는 유전자의 인 프레임 "In Fusion" 클로닝을 위한 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 구조 1192의 백본은 pCAMBIA 2분법 플라스미드이고 왼쪽에서 오른쪽 t-DNA 경계로의 서열은 도 6E에 제공된다 (SEQ ID NO: 12). 결과의 구조는 특정 번호 1071이었다 (도 6F, SEQ ID NO: 13). PDISP/Rabies 바이러스 ERA 균주의 G 단백질의 아미노산 서열은 도 6G에 제공된다 (SEQ ID NO: 14). 플라스미드 1071의 대표는 도 6H에 제공된다.
D-2 X35S / CPMV - HT / PDISP / Rabies G/ NOSintoBeYD V+레플리카제 증폭 시스템 (구조 번호 1091)
광견병 바이러스 ERA 균주의 M 단백질을 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S-CPMV-HT-PDISP/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 야생형 신호 펩티드가 없는 서열을 암호화하는 G 단백질을 함유하는 단편을 주형으로서 합성된 M 유전자 (Genbank 수납 번호 EF206707의 nt 3317-4891에 해당) (도 6C, SEQ ID NO: 11)를 사용하는 프라이머 IF-RabG-S2+4.c (도 6A, SEQ ID NO:9) 및 IF-RabG-S1-4.r (도 6B, SEQ ID NO: 10)를 사용하여 증폭하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에 알팔파 PDI 신호 펩티드와 함께 BeYDV 증폭 시스템으로 인-프레임 클로닝하였다. 구조 1194 (도 7A)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1194는 CPMV-HT-기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드와 함께 원하는 유전자의 인 프레임 "In Fusion" 클로닝을 위한 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 구조 1194의 백본은 pCAMBIA 2분법 플라스미드이고 왼쪽에서 오른쪽 t-DNA 경계로의 서열은 도 7B에 제공된다 (SEQ ID NO: 15). 결과의 구조는 특정 번호 1091이었다 (도 7C, SEQ ID NO: 16). 인플루엔자 PDISP/Rabies 바이러스 ERA 균주의 G 단백질의 아미노산 서열은 도 6G에 제공된다 (SEQ ID NO: 14). 플라스미드 1091의 대표는 도 7D에 제공된다.
실시예 2: 식물 바이오매스 (biomass), 접종물 및 아그로 침투의 제조
여기에 사용된 바와 같이 용어 "바이오매스" 및 "식물성 물질"는 식물로부터 유도된 어떤 물질도 반영한다는 것을 의미한다. 바이오매스 또는 식물성 물질은 전체 식물, 조직, 세포, 또는 이들의 어떤 분획도 포함할 수 있다. 게다가, 바이오매스 또는 식물성 물질은 세포내 식물 성분, 세포외 식물 성분, 식물의 액체 또는 고체 추출물, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 게다가, 바이오매스 또는 식물성 물질은 식물 잎, 줄기, 과실, 뿌리 또는 이들의 조합의 식물, 식물 세포, 조직, 액체 추출물, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 식물의 일부는 식물성 물질 또는 바이오매스를 포함할 수도 있다.
니코티아나 벤타미아나 식물을 상업적 피트 모스 (peat moss) 기질로 채워진 평면에서 종자로부터 성장하였다. 식물이 16/8 광주기 및 25 ℃ 낮/20 ℃ 밤의 온도 요법 하에 온실에서 성장하도록 허용하였다. 파종 3주 후에, 개개의 묘목을 뽑았고 화분에 옮겨심었고 같은 환경 조건 하에 추가로 3주 동안 온실에서 성장하도록 두었다.
각각의 구조물로 트랜스펙션된 아그로박테리아를 그것들이 0.6 및 1.6 사이의 OD600에 도달할 때까지 10 mM 2-(N-모폴리노)에탄술폰산 (MES), 20 μM 아세토시린곤, 50 μg/ml 카나마이신 및 25 μg/ml의 카르베니실린 pH 5.6으로 보충된 YEB 배지에서 성장시켰다. 아그로박테리움 현탁액을 사용 전에 원심분리하였고 침투 배지 (10 mM MgCl2 및 10 mM MES pH 5.6)에서 재현탁하였고 4 ℃에서 하룻밤 동안 저장하였다. 침투의 날에, 배양물 배치 (batch)를 2.5배 배양물에 희석하였고 사용 전에 따뜻하게 하였다. 엔. 벤타미아나 (N. benthamiana)의 전체 식물을 2분 동안 20-40 토르 (Torr)의 진공 하에 밀폐 스테인리스 강 (stainless steel) 탱크 내의 박테리아 현탁액에 거꾸로 배치하였다. 식물을 수확까지 2-6일의 배양 기간 동안 온실에 되돌려 놓았다.
여기에 설명된 바와 같이 다양한 구조를 포함하는 에이. 투메파시엔스 (A. tumefaciens) 균주를 "AGL1" 접두사를 사용하여 나타낸다. 예를 들어, 구조 번호 1091을 포함하는 에이. 투머파시엔스는 "AGL1/1091"로 불린다.
잎 수확 및 총 단백질 추출 (기계적 추출)
배양 후, 식물의 공기중 부분을 수확하였고, -80 ℃에서 얼렸고 조각으로 분쇄하였다. 총 가용성 단백질을 3배의 차가운 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 및 1 mM 페닐메탄술포닐 플로라이드에서 냉동-분쇄된 식물 재료의 각 샘플을 균질화 (Polytron)함으로써 추출하였다. 균질화 후, 슬러리를 4 ℃에서 10분 동안 10,000 g로 원심분리하였고 이들 정화된 조추출물 (상층액)을 분석을 위해 보관하였다.
잎 수확 및 총 단백질 추출 (생화학적 추출)
배양 후, 식물의 공기중 부분을 수확하였고, 롤링 커터 (rolling cutter)로 작은 조각 (3 mm 사각형)으로 잘랐고 잎이 부서지지 않도록 특별히 주의하였다. 컷 바이오매스 (cut biomass)를 21 ℃에서 100-200 rpm으로 회전 하에 2.5배 부피의 200 mM 만니톨, 125 mM 시트레이트, 75 mM NaP04, 500 mM NaCl, 25 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 1 부피% Multifect CX CG (Genencor, 제품 번호 A03140G190), 1 부피% Multifect CX B (Genencor, 제품 번호 A03042G190) 및 1 부피% Multifect Pectinase FE (Genencor, 제품 번호 A02080G190) pH 6.5에서 15-17시간 동안 배양하였다. 분해된 바이오매스를 Miracloth (Calbiochem, 제품 번호 475855)에서 여과하였고 4 ℃에서 10분 동안 10,000 g로 원심분리하였다. 상층액을 깨끗한 튜브로 옮겼고 같은 조건 하에 다시 원심분리하였고 상층액을 분석을 위해 보관하였다.
단백질 분석 및 면역블롯팅
정화된 조추출물의 총 단백질 함량을 참고 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하여 Bradford 검정 (Bio-Rad, Hercules, CA)으로 결정하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하였고 면역검출을 위해 폴리비닐렌 디플로라이드 (PVDF) 막 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)으로 전기 이동시켰다. 면역블롯팅 전에, 막을 4 ℃에서 16-18시간 동안 Tris-완충된 식염수 (TBS-T) 중의 5% 탈지유 및 0.1 % Tween-20으로 차단하였다. 면역블롯팅을 TBS-Tween 20 0.1% 중의 2% 탈지유 중에 0.25 μg/μl Santa Cruz SC-57995 1차 항체로 배양에 의해 수행하였다. 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 (conjugated) 염소 항 마우스 (JIR, 115-035-146), TBS-Tween 20 0.1% 중의 2% 탈지유에서 1:10,000으로 희석된 2차 항체로 배양 후 화학발광 검출을 수행하였다. 면역반응성 복합체를 기질로서 루미놀 (Roche Diagnostics Corporation)을 사용하는 화학발광법으로 검출하였다.
단백질 추출물의 크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 위해, 생화학적으로 추출된 바이오매스의 상층액을 4 ℃에서 20분 동안 70,000 g로 원심분리에 의해 농축하였고 결과의 펠렛을 1/50배의 차가운 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl에 재현탁하였다. 32 ml Sephacryl™ S-500 고 해상도 비드 (S-500 HR: GE Healthcare, Uppsala, Sweden, 제품 번호 17-0613-10)의 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 포장하였고 평형화/용출 버퍼 (50 mM Tris pH8, 150 mM NaCl)로 평형화하였다. 1.5 밀리리터의 농축된 추출물을 컬럼에 로딩한 후 이어서 45 mL의 평형화/용출 버퍼로 용출 단계를 수행하였다. 용출액을 1.5 mL의 분획으로 수거하였고 용출된 분획의 상대적 단백질 함량을 200 μL의 희석된 Bio-Rad 단백질 염색 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA)과 10 μL의 분획을 혼합함으로써 관찰하였다. 각 분획의 200 미크로리터를 5배의 차가운 아세톤의 추가로 침전시킨 후 이어서 -20 ℃에서 하룻밤 동안 냉동하였다. 침전된단백질을 20,000 g로 10분 동안 (4 ℃) 원심분리에 의해 펠렛화하였고 뜨거운 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼 50 μl에 재현탁하였다. 컬럼을 2 컬럼 부피의 0.2N NaOH로 세척한 후 이어서 10 컬럼 부피의 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 20% 에탄올로 세척하였다. 각각 분리후 이어서 Blue Dextran 2000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, USA)로 컬럼을 보정하였다. Blue Dextran 2000 및 숙주 가용성 단백질의 용출 프로파일을 사용된 컬럼 사이에서 용출 프로파일의 균일성을 확인하기 위해 각각의 분리를 비교하였다.
실시예 3: 광견병 G 단백질 발현의 평가 및 동시 발현 계획
니코티아나 벤타미아나 식물에 AGL1/1071 (AGL1/1066이 있거나 없음) 또는 AGL1/1091 (AGL1/1086이 있거나 없음) 접종물을 다른 농도로 아그로-침투시켰고 1071- 및 1071 +1066-침투된 식물에 대하여 침투 후 5일 (DPI) 또는 1091- 및 1091+1086-침투된 식물에 대하여 3 내지 4 DPI에 수확하였다. 형질전환된 식물의 잎 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 BeYDV 요소가 검출 가능한 G 단백질 축적 수준에 도달하기 위해 필요하다는 것을 나타냈다 (도 1에서 1071- 및 1091-침투된 식물). 최대 축적 수준은 M 단백질 (AGL1/1086)을 동시 발현하거나 발현하지 않으면서 AGL1/1091을 침투시킨 식물에 대하여 3 DPI에 도달하였다 (도 1).
생화학적 추출 방법을 형질전환된 식물의 잎으로부터 광견병 G 단백질을 방출시키는 그것의 능력에 대하여 기계적 추출과 비교하였다. 1091- 및 1091+1086-침투된 식물에 대하여 생화학적 추출 및 기계적 추출에 의해 얻어진 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 생화학적 추출의 단백질 추출물이 기계적 추출의 추출물보다 훨씬 더 많은 G 단백질을 함유한다는 것을 나타냈다 (도 2).
1091- 및 1091+1086-침투된 식물의 단백질 추출물은 고분자량 구조로 그것들의 조립체를 평가하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 받았다. 용출 분획을 수거하였고 각 분획의 앨리쿼트를 아세톤 침전으로 농축하였고 웨스턴 블롯에 의해 단백질 G 함량을 분석하였다. 도 3A에 나타난 바와 같이, 단백질 G 함량은 외피로 둘러싸인 VLP가 발견될 것으로 예상되는 경우, 컬럼의 허공 용적 (void volume)에 해당하는, SEC 용출 분획 8 내지 10에서 피크였다. 유사한 용출 프로파일을, SEC에 의해, 단백질 M (1091+1086-침투된 식물, 도 3B)와 함께 광견병 단백질 G를 발현하는 식물의 단백질 추출물을 분리할 때 얻었다.
실시예 4: 동물 연구
식물로부터 Rab - VLP 의 신속한 정제
예를 들어, WO/2011/035422에 설명된 바와 같이, 엔. 벤타미아나 식물에 AGL1/1091을 침투시켰으며 이것은 본원에 참고로 포함된다. 상기 설명된 바와 같이 Rab-VLP (NG-VLP, 천연 G 단백질 VLP, G-VLP 또는 G 단백질 VLP로도 나타남)의 추출에 착수하였다. 간략히 말하면, 잎을 침투 후 4일에 수거하였고 ~1 cm2 조각으로 잘랐고, 오비탈 쉐이커 (orbital shaker)에서 상온에서 15시간 동안 분해시켰다. 분해 버퍼는 1:25 (중량비)의 바이오매스:분해 버퍼 비율을 사용하는 200 mM 만니톨, 75 mM 시트레이트, 0.04%, 500 mM NaCl 나트륨 비술피트 pH 6.0 버퍼 중의 1.0 부피% Multifect Pectinase FE, 1.0 부피% Multifect CX CG 및/또는 1.0 부피% Multifect CX B (모두 Genencor)를 함유하였다.
분해 후, 아포플라스틱 (apoplastic) 분획을 굵은 분해되지 않은 식물 조직 (시작 바이오매스의 <5%)을 제거하기 위해 400 μm 나일론 필터를 통해 여과하였다. 여과된 추출물을 원생동물 및 세포내 오염물질 (단백질, DNA, 막, 소낭, 색소, 등)을 제거하기 위해 상온에서 15분 동안 5000 x g로 원심분리하였다. 그 다음, 크로마토그래피를 받기 전에, 상층액을 1.2 μm 유리 섬유 필터 (Sartorius Stedim) 및 0.45/0.2 μm 필터 (Sartorium Stedim)를 사용하여 심층 여과하였다 (정화를 위해).
크로마토그래피를 준비하기 위해, 추출물을 업계에 알려진 적합한 방법으로 농축할 수도 있는데, 예를 들어, 추출물을 원심분리하여 펠렛을 적절한 버퍼 및 부피에 재현탁할 수도 있고 추출물을 농축하여 크로마토그래피 배지에 로딩하기 전에 적절한 막이 장착된, 접선 유동 여과 (TFF) 시스템으로 정용 여과 (diafiltrate)할 수도 있다.
막은 평평한 시트 또는 유공 섬유일 수도 있고, 공극 크기는 100, 300, 500, 750 kDa 또는 1 μ 분자량 컷-오프 (cut-off) 사이의 범위일 수도 있다. 루멘 크기를 제품의 공급 라인에 따라 선택할 수도 있고, 보통 0.75 내지 1 mm 루멘 크기가 바람직하다. 전단 속도를 적절한 농축 및 침투 유동 속도로 2000 s-1 내지 10000 s-1 사이로 조정할 수도 있다.
정화된 아포플라스틱 분획을 평형화/용출 버퍼 (50 mM NaPC-4, 100 mM NaCl, 0.005% Tween 80 pH 6.0)로 평형화된 양이온 교환 컬럼 (Poros HS Applied Biosystems)에 로딩하였다. UV가 0으로 돌아가면, 추출물을 증가하는 농도의 NaCl (500 mM)을 함유하는 평형화/용출 버퍼로 단계-용출하였다. 필요하면, 크로마토그래피 분획을 10 kDa MWCO가 장착된 Amicon™ 장치를 사용하여 10번 농축하였다. 단백질 분석을 상기 실시예에 설명된 바와 같이 수행하였다.
마지막으로, 최종 조제 접근법을 업계에 알려진 방법에 의해, 마지막 후보 백신으로 버퍼 교환하기 위해 이용하였다. 상기 설명된 바와 같이, 예를 들어, 원심분리 또는 TFF 단계를 이러한 목적으로 사용할 수도 있다.
상기와 같이 설명된 조건 하에, 면역원성 연구를 위해 충분한 질과 함께 Rab-VLP 백신 조제물에 대한 75% 이상의 순도를 얻었다. 도 8a에 설명된 바와 같이, G 단백질은 음극 55 kDa의 예상된 분자량으로 이동한다. Rab-VLP의 크기는 동적 광 산란 (Zeta sizer 90, Malvern instrument)에 의해 175-190 nm 사이, 광견병 바이러스에 대하여 설명된 그것과 유사한 입자 크기인 것으로 측정되었다.
마우스의 면역화 연구
Rab-VLP의 면역원성을 Balb/c 마우스 모델에서 평가하였다. 간략히 말하면, 암컷 BALB/c 마우스 (8-10주령; Charles River Laboratories, USA) 그룹을 각 면역화 날 (연구일 0, 7 및 28)에 다양한 투여량의 Rab-VLP 백신 (보조제와 함께 또는 없이 1 또는 5 g)을 함유한, 주사된 총 0.1 ml 부피를 왼쪽 및 오른쪽 뒷다리 근육계 근육 내 (i.m.)에 총 세 번의 주사 (0.05 mL/부위)로 백신 접종하였다. 투여량은 밀도 측정법에 의한 순도 평가와 함께 G 단백질 농도가 결정된 바이비신코닉산 (BCA) 검정에 기초하였다. 1%의 최종 농도의 Alhydrogel®을 보조제로서 사용하였다. 플라세보 (placebo) 그룹을 후보 백신과 같은 경로 및 요법으로 면역화하였다. 그룹 당 15마리의 마우스를 연구에 대하여 충분한 통계학적 검증력을 제공하기 위해 사용하였다. 혈청 샘플을 백신 접종 전에 및 7, 21 및 44일에 수거하였다 (전-면역 혈청). 그룹 당 5마리의 동물을 혈청의 보호적 항체를 평가하는 급속 형광 포커스 억제 테스트 (RFFIT)를 수행하기 위해 희생시켰다. 광견 병 백신에 대하여 세계 보건 기구 (World Health Organization; WHO)에서 확립된 보호적 투여량은 ml 당 0.5 국제 단위 (IU)이다. 도 8b에 나타난 바와 같이, 1 μg 정도로 낮은 투여량의, 보조제가 없는 Rab-VLP 백신은 WHO에 의해 확립된 표준 역가보다 더 높은 역가에 도달하는 것을 허용한다.
모든 인용문은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 구체예에 관하여 설명되었다. 하지만, 청구항에 의해 한정된 바와 같이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 많은 변이 및 변형이 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDICAGO INC. D'AOUST, Marc-Andre LAVOIE, Pierre-Olivier VEZINA, Louis-Philippe MANON, COUTURE <120> Rabies Virus Like Production in Plants <130> V83990WO <150> US 61/496,371 <151> 2011-06-13 <150> US 61/578,787 <151> 2011-12-21 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IF-RabM-S3.c <400> 1 aaatttgtcg ggcccatgaa ctttctacgt aagatag 37 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IF-RabM-S1-4.r <400> 2 actaaagaaa ataggccttt attctagaag cagagagga 39 <210> 3 <211> 609 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized M protein coding sequence <400> 3 atgaactttc tacgtaagat agtgaaaaat tgcagggacg aggacactca aaaaccctct 60 cccgtgtcag cccctctgga tgacgatgac ttgtggcttc caccccctga atacgtcccg 120 ctgaaagaac ttacaagcaa gaagaacatg aggaactttt gtatcaacgg aggggttaaa 180 gtgtgtagcc cgaatggtta ctcgttcagg atcctgcggc acattctgaa atcattcgac 240 gagatatatt ctgggaatca taggatgatc gggttagtca aagtagttat tggactggct 300 ttgtcaggat ctccagtccc 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gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 540 aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 600 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 660 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca 720 cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga 780 cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 840 actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 900 aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 960 ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 1020 gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 1080 cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggta ttaaaatctt aataggtttt 1140 gataaaagcg aacgtgggga aacccgaacc aaaccttctt ctaaactctc tctcatctct 1200 cttaaagcaa acttctctct tgtctttctt gcgtgagcga tcttcaacgt tgtcagatcg 1260 tgcttcggca ccagtacaac gttttctttc actgaagcga aatcaaagat ctctttgtgg 1320 acacgtagtg cggcgccatt aaataacgtg tacttgtcct 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caacttaata acacattgcg 60 gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120 aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180 aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240 ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300 gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360 aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420 aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720 tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960 accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020 gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080 aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140 gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200 actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260 aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320 gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380 tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440 agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500 tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560 tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620 ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680 tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740 ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800 cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860 gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920 tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980 ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040 ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100 cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca agcttgcatg ccggtcaaca tggtggagca 2160 cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 2220 tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 2280 ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 2340 cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 2400 cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 2460 ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga 2520 tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa 2580 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tgctcaggag tagcggtgtc ttctacctac tgctccacta accacgatta 1860 caccatttgg atgcccgaga atccgagact agggatgtct tgtgacattt ttaccaatag 1920 tagagggaag agagcatcca aagggagtga gacttgcggc tttgtagatg aaagaggcct 1980 atataagtct ttaaaaggag catgcaaact caagttatgt ggagttctag gacttagact 2040 tatggatgga acatgggtcg cgatgcaaac atcaaatgaa accaaatggt gccctcccga 2100 tcagttggtg aacctgcacg actttcgctc agacgaaatt gagcaccttg ttgtagagga 2160 gttggtcagg aagagagagg agtgtctgga tgcactagag tccatcatga caaccaagtc 2220 agtgagtttc agacgtctca gtcatttaag aaaacttgtc cctgggtttg gaaaagcata 2280 taccatattc aacaagacct tgatggaagc cgatgctcac tacaagtcag tcagaacttg 2340 gaatgagatc ctcccttcaa aagggtgttt aagagttggg gggaggtgtc atcctcatgt 2400 gaacggggtg tttttcaatg gtataatatt aggacctgac ggcaatgtct taatcccaga 2460 gatgcaatca tccctcctcc agcaacatat ggagttgttg gaatcctcgg ttatccccct 2520 tgtgcacccc ctggcagacc cgtctaccgt tttcaaggac ggtgacgagg ctgaggattt 2580 tgttgaagtt caccttcccg atgtgcacaa tcaggtctca ggagttgact tgggtctccc 2640 gaactggggg aagtatgtat tactgagtgc aggggccctg actgccttga tgttgataat 2700 tttcctgatg acatgttgta gaagagtcaa tcgatcagaa cctacgcaac acaatctcag 2760 agggacaggg agggaggtgt cagtcactcc ccaaagcggg aagatcatat cttcatggga 2820 atcacacaag agtgggggtg agaccagact gtgaaggcct attttcttta gtttgaattt 2880 actgttattc ggtgtgcatt tctatgtttg gtgagcggtt ttctgtgctc agagtgtgtt 2940 tattttatgt aatttaattt ctttgtgagc tcctgtttag caggtcgtcc cttcagcaag 3000 gacacaaaaa gattttaatt ttattaaaaa aaaaaaaaaa aaagaccggg aattcgatat 3060 caagcttatc gacctgcaga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat 3120 cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta 3180 ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg 3240 caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 3300 tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat 3330 <210> 14 <211> 529 <212> PRT <213> Rabies virus <400> 14 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile 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acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720 tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960 accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020 gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080 aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140 gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200 actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260 aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta 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ccagctatct gtcactttat tgtgaagata 3000 gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt 3060 gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg 3120 gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact 3180 gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga 3240 agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt tttgataaaa gcgaacgtgg 3300 ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc tctcttaaag caaacttctc 3360 tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga tcgtgcttcg gcaccagtac 3420 aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg tggacacgta gtgcggcgcc 3480 attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt cttgggaaaa gaaagcttgc 3540 tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat tctgctgact ttcggcgggt 3600 gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg tacttctttc ttcttcttct 3660 tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa acagagtttt cccgtggttt 3720 tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg cccaaatttg tcgggcccat 3780 ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt 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tcaagcttat cgacctgcag atcgttcaaa 4680 catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 4740 ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 4800 tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 4860 caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 4920 tctctagagt ctcaagcttg gcgcggggta ccgagctcga attccgagtg tacttcaagt 4980 cagttggaaa tcaataaaat gattatttta tgaatatatt tcattgtgca agtagataga 5040 aattacatat gttacataac acacgaaata aacaaaaaaa cacaatccaa aacaaacacc 5100 ccaaacaaaa taacactata tatatcctcg tatgaggaga ggcacgttca gtgactcgac 5160 gattcccgag caaaaaaagt ctccccgtca cacatatagt gggtgacgca attatcttca 5220 aagtaatcct tctgttgact tgtcattgat aacatccagt cttcgtcagg attgcaaaga 5280 attatagaag ggatcccacc ttttattttc ttcttttttc catatttagg gttgacagtg 5340 aaatcagact ggcaacctat taattgcttc cacaatggga cgaacttgaa ggggatgtcg 5400 tcgatgatat tataggtggc gtgttcatcg tagttggtga agtcgatggt cccgttccag 5460 tagttgtgtc gcccgagact tctagcccag 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gtccagattt aaagtagaaa 240 agttcccgcc cactagggtt aaaggtgttc acactataaa agcatatacg atgtgatggt 300 atttgataaa gcgtatattg tatcaggtat ttccgtcgga tacgaattat tcgtacaagc 360 ttcttaagcc ggtcaacatg gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag 420 atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa 480 acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 540 aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 600 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 660 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca 720 cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga 780 cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 840 actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 900 aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 960 ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 1020 gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 1080 cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggta ttaaaatctt aataggtttt 1140 gataaaagcg aacgtgggga aacccgaacc aaaccttctt ctaaactctc tctcatctct 1200 cttaaagcaa acttctctct tgtctttctt gcgtgagcga tcttcaacgt tgtcagatcg 1260 tgcttcggca ccagtacaac gttttctttc actgaagcga aatcaaagat ctctttgtgg 1320 acacgtagtg cggcgccatt aaataacgtg tacttgtcct attcttgtcg gtgtggtctt 1380 gggaaaagaa agcttgctgg aggctgctgt tcagccccat acattacttg ttacgattct 1440 gctgactttc ggcgggtgca atatctctac ttctgcttga cgaggtattg ttgcctgtac 1500 ttctttcttc ttcttcttgc tgattggttc tataagaaat ctagtatttt ctttgaaaca 1560 gagttttccc gtggttttcg aacttggaga aagattgtta agcttctgta tattctgccc 1620 aaatttgtcg ggcccatggc gaaaaacgtt gcgattttcg gcttattgtt ttctcttctt 1680 gtgttggttc cttctcagat cttcgccaaa ttccctattt acacgatacc agacaagctt 1740 ggtccctgga gcccgattga catacatcac ctcagctgcc caaacaattt ggtagtggag 1800 gacgaaggat gcaccaacct gtcagggttc tcctacatgg aacttaaagt tggatacatc 1860 ttagccataa aaatgaacgg gttcacttgc acaggcgttg tgacggaggc tgaaacctac 1920 actaacttcg ttggttatgt cacaaccacg ttcaaaagaa agcatttccg cccaacacca 1980 gatgcatgta gagccgcgta caactggaag atggccggtg accccagata tgaagagtct 2040 ctacacaatc cgtaccctga ctaccgctgg cttcgaactg taaaaaccac caaggagtct 2100 ctcgttatca tatctccaag tgtggcagat ttggacccat atgacagatc ccttcactcg 2160 agggtcttcc ctagcgggaa gtgctcagga gtagcggtgt cttctaccta ctgctccact 2220 aaccacgatt acaccatttg gatgcccgag aatccgagac tagggatgtc ttgtgacatt 2280 tttaccaata gtagagggaa gagagcatcc aaagggagtg agacttgcgg ctttgtagat 2340 gaaagaggcc tatataagtc tttaaaagga gcatgcaaac tcaagttatg tggagttcta 2400 ggacttagac ttatggatgg aacatgggtc gcgatgcaaa catcaaatga aaccaaatgg 2460 tgccctcccg atcagttggt gaacctgcac gactttcgct cagacgaaat tgagcacctt 2520 gttgtagagg agttggtcag gaagagagag gagtgtctgg atgcactaga gtccatcatg 2580 acaaccaagt cagtgagttt cagacgtctc agtcatttaa gaaaacttgt ccctgggttt 2640 ggaaaagcat ataccatatt caacaagacc ttgatggaag ccgatgctca ctacaagtca 2700 gtcagaactt ggaatgagat cctcccttca aaagggtgtt taagagttgg 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gtttttatga 3600 ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 3660 aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tctctagagt ctcaagcttg 3720 gcgcggggta ccgagctcga attccgagtg tacttcaagt cagttggaaa tcaataaaat 3780 gattatttta tgaatatatt tcattgtgca agtagataga aattacatat gttacataac 3840 acacgaaata aacaaaaaaa cacaatccaa aacaaacacc ccaaacaaaa taacactata 3900 tatatcctcg tatgaggaga ggcacgttca gtgactcgac gattcccgag caaaaaaagt 3960 ctccccgtca cacatatagt gggtgacgca attatcttca aagtaatcct tctgttgact 4020 tgtcattgat aacatccagt cttcgtcagg attgcaaaga attatagaag ggatcccacc 4080 ttttattttc ttcttttttc catatttagg gttgacagtg aaatcagact ggcaacctat 4140 taattgcttc cacaatggga cgaacttgaa ggggatgtcg tcgatgatat tataggtggc 4200 gtgttcatcg tagttggtga agtcgatggt cccgttccag tagttgtgtc gcccgagact 4260 tctagcccag gtggtctttc cggtacgagt tggtccgcag atgtagaggc tggggtgtct 4320 gaccccagtc cttccctcat cctggttaga tcggccatcc actcaaggtc agattgtgct 4380 tgatcgtagg agacaggatg tatgaaagtg taggcatcga tgcttacatg 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gttcacacta 5280 taaaagcata tacgatgtga tggtatttga tggagcgtat attgtatcag gtatttccgt 5340 cggatacgaa ttattcgtac 5360

Claims (36)

  1. a) 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 식물에서 활성인 조절 영역을 포함하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계, 및
    b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 광견병 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생성하는 단계를 포함하는,
    식물에서 광견병 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생성하는 방법.
  2. a) 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 식물에서 활성인 조절 영역을 포함하는 핵산을 포함하는 식물 또는 식물의 일부를 제공하는 단계, 및
    b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 광견병 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생성하는 단계를 포함하는,
    식물에서 광견병 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생성하는 방법.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소를 더 암호화하거나, 포함하거나, 암호화할 뿐 아니라 압축도 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3 항에 있어서, 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소는 제미니바이러스 증폭 요소인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4 항에 있어서, 하나 또는 하나 이상 제미니바이러스 증폭 요소는 강낭콩 황고병 바이러스 긴 유전자간 영역 (Bean Yellow Dwarf Virus long intergenic region, BeYDV LIR), 및 BeYDV 짧은 유전자간 영역 (Bean Yellow Dwarf Virus short intergenic region, BeYDV SIR)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 항에 있어서, 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하고 매트릭스 단백질 또는 이들의 단편을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 핵산은, 식물, 또는 식물의 일부로 도입되고 단계 b)에서 식물 또는 식물의 일부를 배양할 때 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2 항에 있어서, 식물 또는 식물의 일부는 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하고 매트릭스 단백질 또는 이들의 단편을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 핵산을 더 포함하고, 단계 b)에서 식물 또는 식물의 일부를 배양할 때 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항, 제2 항, 제6 항 및 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 광견병 당단백질 (G), 또는 광견병 G 단백질의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6 항 또는 제7 항에 있어서, 매트릭스 단백질은 광견병 매트릭스 단백질 (M), 또는 M 단백질의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1 항에 있어서, 도입 단계 (단계 a)에서 핵산은 식물에서 일시적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1 항에 있어서, 도입 단계 (단계 a)에서 핵산은 식물에서 안정하게 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1 항, 제2 항, 제6 항 및 제7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) 식물을 수확하는 단계, 및
    d) VLP를 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, VLP는 크기가 40-300 nm의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12 항에 있어서, VLP는 생화학적 추출에 의해 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 하나 이상의 천연 광견병 바이러스 구조 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 식물-유래 VLP.
  16. 제1 항, 제2 항, 제6 항 및 제7 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 VLP.
  17. 제16 항에 있어서, 하나 또는 하나 이상의 식물 유래 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 VLP.
  18. 제16 항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 식물-특이적 N-글리칸, 또는 변형된 N-글리칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 VLP.
  19. 대상체의 면역 반응을 유발하는 제15 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 따른 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  20. 제19 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 광견병 바이러스 감염에 대한 면역력을 유발하는 방법.
  21. 제20 항에 있어서, 조성물은 대상체에 경구, 피내 (intradermal), 비강, 근육, 복강, 정맥, 또는 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제15 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 따른 VLP를 사용하여 제조된 다클론성 항체.
  23. 제1 항, 제2 항, 제6 항 및 제7 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 VLP를 포함하는 식물성 물질.
  24. 제23 항에 있어서, 대상체의 광견병 바이러스 감염에 대한 면역력을 유발하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 식물성 물질.
  25. 제24 항의 식물성 물질을 포함하는 식품 보충제.
  26. 제1 항 또는 제6 항에 있어서, 침묵 억제자, 제미니바이러스 레플리카제 또는 둘 다를 암호화하는 추가 핵산 서열을 도입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26 항에 있어서, 침묵 억제자와 제미니바이러스 레플리카제는 식물, 또는 식물의 일부로 도입된 두 개의 상이한 추가 핵산 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26 항 또는 제27 항에 있어서, 침묵 억제자는 그룹 HcPro 및 p19로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1 항, 제2 항, 제6 항 및 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 SEQ ID NO: 14와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1 항, 제2 항, 제6 항 및 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 광견병 바이러스 구조 단백질은 SEQ ID NO: 14에 나타난 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제6 항 또는 제7 항에 있어서, 매트릭스 바이러스 단백질은 SEQ ID NO: 6과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제6 항 또는 제7 항에 있어서, 매트릭스 바이러스 단백질은 SEQ ID NO: 6에 나타난 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1 항, 제2 항, 제6 항 및 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 조절 영역을 포함하는 핵산 서열은 하나 또는 하나 이상의 코모바이러스 인핸서와 추가로 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33 항에 있어서, 하나 또는 하나 이상의 코모바이러스 인핸서는 코모바이러스 UTR인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34 항에 있어서, 코모바이러스 UTR은 동부 모자이크 바이러스 (Cowpea-Mosaic Virus; CPMV) UTR인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, VLP는 바이러스 매트릭스 또는 코어 단백질을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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