JP2014519336A - 植物中での狂犬病ウイルス様粒子の生成 - Google Patents
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Abstract
Description
a)天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、植物中で活性な第1の調節領域を含む第1の核酸を、植物または植物の一部中に導入するステップと、
b)核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部をインキュベートし、それによって狂犬病VLPを生成するステップと
を含む方法が提供される。
c)植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した第2の調節領域を含む第2の核酸を導入するステップ
をさらに含むことができる。
d)植物を収穫し、VLPを抽出するステップ
をさらに含むことができる。
a)1種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、植物中で活性な第1の調節領域を含む第1の核酸を含む植物または植物の一部を提供するステップと、
b)核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部をインキュベートし、それによって天然狂犬病VLPを生成するステップと
を含む方法も提供する。
d)植物を収穫し、VLPを抽出するステップ
をさらに含むことができる。
天然狂犬病ウイルス構造タンパク質またはポリペプチドは、ウイルスベースDNAまたはRNA発現系を含む発現系、例えば、それだけに限らないが、コモウイルスベース発現カセットおよびジェミニウイルスベース増幅エレメント内で発現され得る。
発現される天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の正確な折り畳みは、他の特徴の中でも、タンパク質の安定性、多量体の形成、VLPの形成、天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の機能、および抗体による天然狂犬病ウイルス構造タンパク質の認識にとって重要となり得る。タンパク質の折り畳みおよび蓄積は、1つまたは複数の要因、例えば、それだけに限らないが、タンパク質の配列、タンパク質の相対存在量、細胞内密集の程度、細胞コンパートメント内のpH、折り畳まれた、部分的に折り畳まれた、または折り畳まれていないタンパク質と結合し、または一過性に関連し得る補助因子の利用可能性、1種または複数のシャペロンタンパク質の存在などによって影響され得る。
本願での用語「調節領域」、「調節エレメント」、または「プロモーター」の使用は、DNAもしくはRNAのいずれか、またはDNAとRNAの両方から構成され得る、一般に、常にではないが、遺伝子のタンパク質コード領域の上流の核酸の一部を反映することを意味する。調節領域が活性であり、かつ目的の遺伝子と作動的に関連または作動的に連結しているとき、これは、目的の遺伝子の発現をもたらすことができる。調節エレメントは、器官特異性を媒介し、または発生的もしくは一時的な遺伝子活性化を制御することができる。「調節領域」は、プロモーターエレメント、基本プロモーター活性を呈するコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答して誘導性であるエレメント、負の調節エレメントまたは転写エンハンサーなどのプロモーター活性を媒介するエレメントを含むことができる。本明細書において使用される「調節領域」は、転写後に活性であるエレメント、例えば、遺伝子発現をモジュレートする調節エレメント、例えば、翻訳エンハンサーおよび転写エンハンサー、翻訳リプレッサーおよび転写リプレッサー、上流の活性化配列、ならびにmRNA不安定性決定因子なども含むことができる。これらの後半のエレメントのいくつかは、コード領域の近位に位置する場合がある。
A−2X35S/CPMV−HT/Rabies M/NOS(構築物番号1066)
狂犬病ウイルスERA株由来Mタンパク質をコードする配列を、以下のPCRベース法を使用して、Plasto_pro/P19/Plasto_ter発現カセットを含有するプラスミドで2X35S/CPMV−HT/NOS発現系内にクローニングした。完全なMタンパク質コード配列を含有する断片を、プライマーIF−RabM−S3.c(図4A、配列番号1)およびIF−RabM−S1−4.r(図4B、配列番号2)を使用して、鋳型として合成M遺伝子(GenBank受託番号FJ913470からのnt2496−3104に対応)(図4C、配列番号3)を使用して増幅させた。PCR産物を、In−Fusionクローニングシステム(Clontech、Mountain View、CA)を使用して、2X35S/CPMV−HT/NOS発現系内でクローニングした。構築物1191(図4D)をSacIIおよびStuI制限酵素で消化し、線状化プラスミドをIn−Fusion組み立て反応に使用した。構築物番号1191は、CPMV−HTベース発現カセット内で目的の遺伝子を「In Fusion」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下で、サイレンシングのTBSV P19サプレッサーを同時発現させるための遺伝子構築物も組み込んでいる。構築物番号1191の骨格は、pCAMBIAバイナリープラスミドであり、左t−DNA境界から右t−DNA境界までの配列を、図4E(配列番号4)に提示する。得られた構築物に番号1066を付けた(図4F、配列番号5)。狂犬病ウイルスERA株由来Mタンパク質のアミノ酸配列を、図4G(配列番号6)に提示する。プラスミド1066の描画を図4Hに提示する。
狂犬病ウイルスERA株由来Mタンパク質をコードする配列を、以下のPCRベース法を使用して、Plasto_pro/P19/Plasto_ter発現カセットを含有するプラスミドでBeYDV+レプリカーゼ増幅系を含む2X35S/CPMV−HT/NOS発現系内にクローニングした。完全なMタンパク質コード配列を含有する断片を、プライマーIF−RabM−S3.c(図4A、配列番号1)およびIF−RabM−S1−4.r(図4B、配列番号2)を使用して、鋳型として合成M遺伝子(GenBank受託番号FJ913470からのnt2496−3104に対応)(図4C、配列番号3)を使用して増幅させた。PCR産物を、In−Fusionクローニングシステム(Clontech、Mountain View、CA)を使用して、2X35S/CPMV−HT/NOS発現系内でクローニングした。構築物1193(図5A、配列番号:B1)をSacIIおよびStuI制限酵素で消化し、線状化プラスミドをIn−Fusion組み立て反応に使用した。構築物番号1193は、BeYDV増幅系内にCPMV−HTベース発現カセット内で目的の遺伝子を「In Fusion」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下で、サイレンシングのTBSV P19サプレッサーを同時発現させるための遺伝子構築物も組み込んでいる。構築物番号1193の骨格は、pCAMBIAバイナリープラスミドであり、左t−DNA境界から右t−DNA境界までの配列を、図5B(配列番号7)に提示する。得られた構築物に番号1086を付けた(図5C、配列番号8)。狂犬病ウイルスERA株由来Mタンパク質のアミノ酸配列を、図4G(配列番号6)に提示する。プラスミド1086の描画を図5Dに提示する。
狂犬病ウイルスERA株由来Gタンパク質をコードする配列を、以下のPCRベース法を使用して、Plasto_pro/P19/Plasto_ter発現カセットを含有するプラスミドで2X35S−CPMV−HT−PDISP−NOS発現系内にクローニングした。その野生型シグナルペプチドを含まないGタンパク質コード配列を含有する断片を、プライマーIF−RabG−S2+4.c(図6A、配列番号9)およびIF−RabG−S1−4.r(図6B、配列番号10)を使用して、鋳型として合成G遺伝子(GenBank受託番号EF206707からのnt3317−4891に対応)(図6C、配列番号11)を使用して増幅させた。PCR産物を、In−Fusionクローニングシステム(Clontech、Mountain View、CA)を使用して、2X35S/CPMV−HT/NOS発現系内で、アルファルファPDIシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物1192(図6D)をSacIIおよびStuI制限酵素で消化し、線状化プラスミドをIn−Fusion組み立て反応に使用した。構築物番号1192は、CPMV−HTベース発現カセット内でアルファルファPDIシグナルペプチドとインフレームで目的の遺伝子を「In Fusion」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下で、サイレンシングのTBSV P19サプレッサーを同時発現させるための遺伝子構築物も組み込んでいる。構築物番号1192の骨格は、pCAMBIAバイナリープラスミドであり、左t−DNA境界から右t−DNA境界までの配列を、図6E(配列番号12)に提示する。得られた構築物に番号1071を付けた(図6F、配列番号13)。PDISP/狂犬病ウイルスERA株由来Gタンパク質のアミノ酸配列を、図6G(配列番号14)に提示する。プラスミド1071の描画を図6Hに提示する。
狂犬病ウイルスERA株由来Gタンパク質をコードする配列を、以下のPCRベース法を使用して、Plasto_pro/P19/Plasto_ter発現カセットを含有するプラスミドで、BeYDV+レプリカーゼ増幅系を含む2X35S/CPMV−HT/PDISP/NOS内にクローニングした。その野生型シグナルペプチドを含まない狂犬病Gタンパク質コード配列を含有する断片を、プライマーIF−RabG−S2+4.c(図6A、配列番号9)およびIF−RabG−S1−4.r(図6B、配列番号10)を使用して、鋳型として合成G遺伝子(GenBank受託番号EF206707からのnt3317−4891に対応)(図6C、配列番号11)を使用して増幅させた。PCR産物を、In−Fusionクローニングシステム(Clontech、Mountain View、CA)を使用して、BeYDV増幅系内に2X35S/CPMV−HT/NOS発現カセット内でアルファルファPDIシグナルペプチドとインフレームでクローニングした。構築物番号1194(図7A)をSacIIおよびStuI制限酵素で消化し、線状化プラスミドをIn−Fusion組み立て反応に使用した。構築物番号1194は、BeYDV増幅系内にCPMV−HTベース発現カセット内でアルファルファPDIシグナルペプチドとインフレームで目的の遺伝子を「In Fusion」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下で、サイレンシングのTBSV P19サプレッサーを同時発現させるための遺伝子構築物も組み込んでいる。構築物番号1194の骨格は、pCAMBIAバイナリープラスミドであり、左t−DNA境界から右t−DNA境界までの配列を、図7B(配列番号15)に提示する。得られた構築物に番号1091を付けた(図7C、配列番号16)。インフルエンザPDISP/狂犬病ウイルスERA株由来Gタンパク質のアミノ酸配列を、図6G(配列番号14)に提示する。プラスミド1091の描画を図7Dに提示する。
用語「バイオマス」および「植物物質」は、本明細書において、植物に由来する任意の材料を反映することを意味する。バイオマスまたは植物物質は、植物全体、組織、細胞、またはこれらの任意の画分を含むことができる。さらに、バイオマスまたは植物物質は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体抽出物、またはこれらの組合せを含むことができる。さらに、バイオマスまたは植物物質は、植物の葉、茎、果実、根、またはこれらの組合せからの植物、植物細胞、組織、液体抽出物、またはこれらの組合せを含むことができる。植物の一部が植物物質またはバイオマスを含む場合がある。
インキュベートした後、植物の地上部を収穫し、−80℃で凍結させ、砕いて破片にした。3容積の冷えた50mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、0.1% Triton X−100、および1mMフッ化フェニルメタンスルホニル中で、凍結粉砕した植物材料の各試料をホモジナイズすることによって(ポリトロン)、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイズした後、スラリーを10,000gで、4℃で10分間遠心分離し、これらの清澄化済み粗抽出物(上清)を分析のために保持した。
インキュベートした後、植物の地上部を収穫し、回転カッターで小片(3mmの正方形)に切断し、葉を砕かないように特別な注意を払った。2.5容積の200mMマンニトール、125mMシトレート、75mM NaPO4、500mM NaCl、25mMエチレンジアミン四酢酸、1%(v/v)Multifect CX CG(Genencor、カタログ番号A03140G190)、1%(v/v)Multifect CX B(Genencor、カタログ番号A03042G190)、および1%(v/v)Multifect Pectinase FE(Genencor、カタログ番号A02080G190)、pH6.5中で、21℃で、100〜200rpmで攪拌しながら15〜17時間、切断したバイオマスをインキュベートした。続いて消化したバイオマスをMiracloth(Calbiochem、カタログ475855)で濾過し、10,000gで、4℃で10分間遠心分離した。上清を清潔な管に移し、同じ条件下で再び遠心分離し、上清を分析用に保持した。
清澄化済み粗抽出物の全タンパク質含量を、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォードアッセイ(Bio−Rad、Hercules、CA)によって求めた。免疫検出のために、タンパク質をSDS−PAGEによって分離し、二フッ化ポリビニリデン(polyvinylene difluoride)(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation、Indianapolis、IN)上にエレクトロトランスファーした。イムノブロッティングの前に、5%脱脂乳およびTris緩衝食塩水中0.1% Tween−20(TBS−T)を用いて、4℃で16〜18時間、膜をブロックした。イムノブロッティングは、TBS−Tween20 0.1%中2%脱脂乳中で、0.25μg/μlのSanta Cruz SC−57995一次抗体とともにインキュベートすることによって実施した。化学発光検出は、TBS−Tween20 0.1%中2%脱脂乳中で、1:10,000に希釈したペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドヤギ抗マウス(JIR、115−035−146)二次抗体とともにインキュベートした後、実行した。免疫反応複合体は、基質としてルミノール(Roche Diagnostics Corporation)を使用して、化学発光によって検出した。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に関しては、生化学的に抽出したバイオマスからの上清を、70,000gで、4℃で20分間遠心分離することによって濃縮し、得られたペレットを、1/50容積の冷えた50mM Tris pH8.0、150mM NaCl中に再懸濁させた。32ml Sephacryl(商標)S−500高分解能ビーズ(S−500HR:GE Healthcare、Uppsala、スウェーデン、カタログ番号17−0613−10)のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを充填し、平衡/溶出緩衝液(50mM Tris pH8、150mM NaCl)で平衡化させた。濃縮抽出物1.5ミリリットルをカラムにロードし、続いて平衡/溶出緩衝液45mLで溶出ステップを行った。溶出物(elution)を1.5mLの画分で収集し、溶出画分の相対タンパク質含量を、画分10μLを希釈したBio−Radタンパク質染料試薬(Bio−Rad、Hercules、CA)200μLと混合することによってモニターした。各画分からの200マイクロリットルを、5容積の氷冷アセトンを添加し、続いて−20℃で一晩凍結させることによって沈殿させた。沈殿したタンパク質を、20000gで10分間(4℃)遠心分離することによってペレット化し、高温のSDS−PAGE試料ローディング緩衝液50μl中に再懸濁させた。2カラム容積の0.2N NaOH、続いて10カラム容積の50mM Tris pH8、150mM NaCl、20%エタノールでカラムを洗浄した。各分離の後に、Blue Dextran 2000(GE Healthcare Bio−Science Corp.、Piscataway、NJ、USA)を用いたカラムの較正を続けた。Blue Dextran 2000および宿主可溶性タンパク質の溶出プロファイルを各分離間で比較して、使用したカラム間の溶出プロファイルの均一性を保証した。
Nicotiana benthamiana植物を、異なる濃度のAGL1/1071(AGL1/1066とともに、もしくは伴わずに)またはAGL1/1091(AGL1/1086とともに、もしくは伴わずに)接種材料でアグロインフィルトレーションし、1071および1071+1066で浸潤した植物について浸潤後5日(DPI)に、または1091および1091+1086で浸潤した植物について3〜4DPIに葉を収穫した。形質転換植物からの葉タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析では、検出可能なGタンパク質蓄積レベルに到達するのにBeYDVエレメントを必要とすることが示された(図1で1071および1091で浸潤した植物を比較されたい)。最大蓄積レベルは、Mタンパク質(AGL1/1086)の同時発現を伴った、または伴わないAGL1/1091で浸潤した植物について3DPIで到達した(図1)。
植物からのRab−VLPの迅速精製
N.benthamiana植物を、例えば、参考として本明細書に援用されるWO/2011/035422に記載されているように、AGL1/1091でアグロインフィルトレーションした。Rab−VLP(NG−VLP、天然Gタンパク質VLP、G−VLP、またはGタンパク質VLPとも呼ばれる)の抽出に、上述したように始めた。簡単に言えば、葉を、浸潤後4日目に収集し、切断して約1cm2の破片にし、オービタルシェーカー内で、室温で15時間消化した。消化緩衝液は、1:2.5(w/v)のバイオマス:消化緩衝液比を使用して、1.0%(v/v)Multifect Pectinase FE、1.0%(v/v)Multifect CX CGおよび/または1.0%(v/v)Multifect CX B(すべてGenencor製)を、それぞれ200mMマンニトール、75mMシトレート、0.04%、500mM NaCl 亜硫酸水素ナトリウム、pH6.0緩衝液の溶液中に含有していた。
Rab−VLPの免疫原性をBalb/cマウスモデルにおいて評価した。簡単に言えば、雌BALB/cマウス(8〜10週齢;Charles River Laboratories、USA)の群に、様々な用量のRab−VLPワクチン(アジュバント有りまたは無しの1μgまたは5μg)を含有した合計0.1mlの注射される容積に対して、左右の後肢筋系の筋肉内に(i.m.)、各免疫化の日(試験日0、7、および28)に合計3回の注射(0.05mL/部位)でワクチン接種した。用量は、デンシトメトリーによる純度評価と組み合わせたビシンコニン酸(BCA)アッセイによって求めたGタンパク質濃度に基づいた。1%の最終濃度のAlhydrogel(登録商標)をアジュバントとして使用した。プラセボ群を、候補ワクチンと同じ経路およびレジメンによって免疫化した。試験に適切な統計的検出力をもたらすために、1群当たり15匹のマウスを使用した。血清試料を、ワクチン接種前(免疫前の血清)ならびに7、21、および44日目に収集した。迅速蛍光焦点抑制試験(RFFIT)を実施して血清中の防御抗体を評価するために、1群当たり5匹の動物を、7、21、および44日目に屠殺した。狂犬病ワクチンについて世界保健機関(WHO)によって確立された防御用量は、1ml当たり0.5国際単位(IU)である。図8bに示したように、アジュバント添加されていないRab−VLPワクチンは、1μgという低い用量で、WHOによって確立された標準的な力価より高い力価の達成を可能にする。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
植物中で狂犬病ウイルス様粒子(VLP)を生成する方法であって、
a)天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、上記植物中で活性な調節領域を含む核酸を、上記植物または上記植物の一部中に導入するステップと、
b)上記核酸の発現を可能にする条件下で上記植物または上記植物の一部をインキュベートし、それによって上記狂犬病VLPを生成するステップと
を含む、方法。
(項目2)
植物中で狂犬病ウイルス様粒子(VLP)を生成する方法であって、
a)1種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、植物中で活性な調節領域を含む核酸を含む上記植物または上記植物の一部を提供するステップと、
b)上記核酸の発現を可能にする条件下で上記植物または上記植物の一部をインキュベートし、それによって上記狂犬病VLPを生成するステップと
を含む、方法。
(項目3)
上記ヌクレオチド配列が、1種または1種より多い増幅エレメントをさらにコードするか、それらを含むか、またはそれらをコードしかつ含む、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
上記1種または1種より多い増幅エレメントが、ジェミニウイルス増幅エレメントである、項目3に記載の方法。
(項目5)
上記1種または1種より多いジェミニウイルス増幅エレメントが、インゲン黄斑萎縮ウイルスの長い遺伝子間領域(BeYDV LIR)、およびBeYDVの短い遺伝子間領域(BeYDV SIR)から選択される、項目4に記載の方法。
(項目6)
上記植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質またはその断片をコードする第2のヌクレオチド配列に作動的に連結した第2の調節領域を含む第2の核酸が、上記植物または上記植物の一部中に導入され、ステップb)で上記植物または上記植物の一部をインキュベートしたとき発現される、項目1に記載の方法。
(項目7)
上記植物または上記植物の一部が、上記植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質またはその断片をコードする第2のヌクレオチド配列に作動的に連結した第2の調節領域を含み、ステップb)で上記植物または上記植物の一部をインキュベートしたとき発現される第2の核酸をさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目8)
上記天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が、狂犬病糖タンパク質(G)、または上記狂犬病Gタンパク質の断片である、項目1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
マトリックスタンパク質が、狂犬病マトリックスタンパク質(M)、または上記Mタンパク質の断片である、項目6または7に記載の方法。
(項目10)
上記導入するステップ(ステップa)において、上記核酸が、上記植物中で一過性に発現される、項目1に記載の方法。
(項目11)
上記導入するステップ(ステップa)において、上記核酸が、上記植物中で安定に発現される、項目1に記載の方法。
(項目12)
c)上記植物を収穫するステップと、
d)上記VLPを抽出するステップと
をさらに含む、項目1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
上記VLPのサイズが40〜300nmの範囲である、項目12に記載の方法。
(項目14)
上記VLPが、生化学的抽出によって抽出される、項目12に記載の方法。
(項目15)
1種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質またはその断片を含む植物由来VLP。
(項目16)
項目1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法によって生成されるVLP。
(項目17)
植物に由来する1種または1種より多い脂質をさらに含む、項目16に記載のVLP。
(項目18)
1種または複数のウイルスタンパク質が、植物特異的N−グリカンまたは改変N−グリカンを含む、項目16に記載のVLP。
(項目19)
被験体において免疫応答を誘導するための有効用量の項目15から18のいずれか一項に記載のVLP、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
(項目20)
被験体において狂犬病ウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、項目19に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
(項目21)
上記組成物が、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に、被験体に投与される、項目20に記載の方法。
(項目22)
項目15から18のいずれか一項に記載のVLPを使用して調製されるポリクローナル抗体。
(項目23)
項目1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法によって生成されるVLPを含む植物物質。
(項目24)
被験体において狂犬病ウイルス感染に対する免疫を誘導するのに使用するための項目23に記載の植物物質。
(項目25)
項目24に記載の植物物質を含む栄養剤。
(項目26)
サイレンシングのサプレッサー、ジェミニウイルスレプリカーゼ、またはそれらの両方をコードする追加の核酸配列を導入するステップをさらに含む、項目1または6に記載の方法。
(項目27)
上記サイレンシングのサプレッサーおよび上記ジェミニウイルスレプリカーゼが、上記植物または上記植物の一部中に導入される2つの異なる追加の核酸配列によってコードされる、項目26に記載の方法。
(項目28)
上記サイレンシングのサプレッサーが、HcProおよびp19の群から選択される、項目26または27に記載の方法。
(項目29)
上記天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が、配列番号14と少なくとも90%の配列同一性を有する、項目1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
上記天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が、配列番号14に示したアミノ酸配列を有する、項目1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
上記マトリックスウイルスタンパク質が、配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有する、項目6または7に記載の方法。
(項目32)
上記マトリックスウイルスタンパク質が、配列番号6に示したアミノ酸配列を有する、項目6または7に記載の方法。
(項目33)
上記調節領域を含む上記核酸配列が、1種または1種より多いコモウイルスエンハンサーとさらに作動的に連結されている、項目1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
上記1種または1種より多いコモウイルスエンハンサーが、コモウイルスUTRである、項目33に記載の方法。
(項目35)
上記コモウイルスUTRがササゲモザイクウイルス(CPMV)UTRである、項目34に記載の方法。
(項目36)
上記VLPが、ウイルスマトリックスもコアタンパク質も含有しない、項目1または2に記載の方法。
Claims (36)
- 植物中で狂犬病ウイルス様粒子(VLP)を生成する方法であって、
a)天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、前記植物中で活性な調節領域を含む核酸を、前記植物または前記植物の一部中に導入するステップと、
b)前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部をインキュベートし、それによって前記狂犬病VLPを生成するステップと
を含む、方法。 - 植物中で狂犬病ウイルス様粒子(VLP)を生成する方法であって、
a)1種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した、植物中で活性な調節領域を含む核酸を含む前記植物または前記植物の一部を提供するステップと、
b)前記核酸の発現を可能にする条件下で前記植物または前記植物の一部をインキュベートし、それによって前記狂犬病VLPを生成するステップと
を含む、方法。 - 前記ヌクレオチド配列が、1種または1種より多い増幅エレメントをさらにコードするか、それらを含むか、またはそれらをコードしかつ含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記1種または1種より多い増幅エレメントが、ジェミニウイルス増幅エレメントである、請求項3に記載の方法。
- 前記1種または1種より多いジェミニウイルス増幅エレメントが、インゲン黄斑萎縮ウイルスの長い遺伝子間領域(BeYDV LIR)、およびBeYDVの短い遺伝子間領域(BeYDV SIR)から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質またはその断片をコードする第2のヌクレオチド配列に作動的に連結した第2の調節領域を含む第2の核酸が、前記植物または前記植物の一部中に導入され、ステップb)で前記植物または前記植物の一部をインキュベートしたとき発現される、請求項1に記載の方法。
- 前記植物または前記植物の一部が、前記植物中で活性であり、かつマトリックスタンパク質またはその断片をコードする第2のヌクレオチド配列に作動的に連結した第2の調節領域を含み、ステップb)で前記植物または前記植物の一部をインキュベートしたとき発現される第2の核酸をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が、狂犬病糖タンパク質(G)、または前記狂犬病Gタンパク質の断片である、請求項1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
- マトリックスタンパク質が、狂犬病マトリックスタンパク質(M)、または前記Mタンパク質の断片である、請求項6または7に記載の方法。
- 前記導入するステップ(ステップa)において、前記核酸が、前記植物中で一過性に発現される、請求項1に記載の方法。
- 前記導入するステップ(ステップa)において、前記核酸が、前記植物中で安定に発現される、請求項1に記載の方法。
- c)前記植物を収穫するステップと、
d)前記VLPを抽出するステップと
をさらに含む、請求項1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記VLPのサイズが40〜300nmの範囲である、請求項12に記載の方法。
- 前記VLPが、生化学的抽出によって抽出される、請求項12に記載の方法。
- 1種または複数の天然狂犬病ウイルス構造タンパク質またはその断片を含む植物由来VLP。
- 請求項1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法によって生成されるVLP。
- 植物に由来する1種または1種より多い脂質をさらに含む、請求項16に記載のVLP。
- 1種または複数のウイルスタンパク質が、植物特異的N−グリカンまたは改変N−グリカンを含む、請求項16に記載のVLP。
- 被験体において免疫応答を誘導するための有効用量の請求項15から18のいずれか一項に記載のVLP、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 被験体において狂犬病ウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、請求項19に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
- 前記組成物が、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に、被験体に投与される、請求項20に記載の方法。
- 請求項15から18のいずれか一項に記載のVLPを使用して調製されるポリクローナル抗体。
- 請求項1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法によって生成されるVLPを含む植物物質。
- 被験体において狂犬病ウイルス感染に対する免疫を誘導するのに使用するための請求項23に記載の植物物質。
- 請求項24に記載の植物物質を含む栄養剤。
- サイレンシングのサプレッサー、ジェミニウイルスレプリカーゼ、またはそれらの両方をコードする追加の核酸配列を導入するステップをさらに含む、請求項1または6に記載の方法。
- 前記サイレンシングのサプレッサーおよび前記ジェミニウイルスレプリカーゼが、前記植物または前記植物の一部中に導入される2つの異なる追加の核酸配列によってコードされる、請求項26に記載の方法。
- 前記サイレンシングのサプレッサーが、HcProおよびp19の群から選択される、請求項26または27に記載の方法。
- 前記天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が、配列番号14と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記天然狂犬病ウイルス構造タンパク質が、配列番号14に示したアミノ酸配列を有する、請求項1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マトリックスウイルスタンパク質が、配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記マトリックスウイルスタンパク質が、配列番号6に示したアミノ酸配列を有する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記調節領域を含む前記核酸配列が、1種または1種より多いコモウイルスエンハンサーとさらに作動的に連結されている、請求項1、2、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1種または1種より多いコモウイルスエンハンサーが、コモウイルスUTRである、請求項33に記載の方法。
- 前記コモウイルスUTRがササゲモザイクウイルス(CPMV)UTRである、請求項34に記載の方法。
- 前記VLPが、ウイルスマトリックスもコアタンパク質も含有しない、請求項1または2に記載の方法。
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