KR20170104595A - 식물에서 로타바이러스-유사 입자 생산 - Google Patents

식물에서 로타바이러스-유사 입자 생산 Download PDF

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메디카고 인코포레이티드
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Abstract

식물에서 로타바이러스-유사 입자 (RLP)를 생산하는 방법이 제공된다. 방법은 숙주 또는 숙주 세포, 예를 들어, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된, 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인, 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 하나 이상의 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다. 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열. 제1, 제2 및 제3은 로타바이러스 단백질 NSP4 및 VP2 또는 VP6 및 VP4 또는 VP7을 암호화한다. 숙주 또는 숙주 세포는 NSP4 및 VP2 또는 VP6 중 하나 및 VP4 또는 VP7 중 하나가 발현되도록, 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 인큐베이션되어, RLP를 생산한다. RLP를 포함하는 숙주, RLP를 포함하는 조성물 및 조성물의 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

식물에서 로타바이러스-유사 입자 생산
본 발명은 식물에서 로타바이러스-유사 입자의 생산에 관한 것이다.
로타바이러스 감염은 5살 미만의 아동들에게 주로 영향을 주는 세계적인 문제이다. 그것은 극심한 위장염(gastroenteritis) 및 최악의 경우에는 사망을 초래한다.
로타바이러스는 위장관계 및 기도에 영향을 주는 바이러스 (로타바이러스 속)의 레오비리대(Reoviridae) 과의 구성원이다. 명칭은 역상 대비 전자 현미경으로 보았을 때 비리온의 바퀴와 유사한 외관으로부터 유래된다. 로타바이러스는 보통 구형이고 그것의 외부 및 내부 쉘(shell) 또는 이중-쉘 캡시드 구조의 이름을 따서 명명된다. 각각 외부 캡시드는 직경이 약 70 nm이고, 내부 캡시드는 약 55 nm이다. 로타바이러스의 이중-쉘 캡시드는 내부 단백질 쉘 및 게놈을 포함하는 코어를 둘러싸고 있다. 로타바이러스의 게놈은 적어도 11개의 로타바이러스 단백질 - 바이러스 구조 단백질 (VP) 또는 비구조 단백질 (NSP; Desselberger, Virus Res 190: 75-96 (2014))을 암호화하는 이중 가닥 RNA 세그먼트로 구성된다.
dsRNA는 여섯 개의 구조 단백질 (VP) 및 여섯 개의 비-구조 단백질 (NSP)을 암호화한다. 구조 단백질은 VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 및 VP7을 포함한다. VP2, VP6 및 VP7의 조립에 의해 세 개의 동심층(concentric layer)이 형성되며, VP4는 바이러스 구조의 표면 상에 "스파이크(spike)"를 형성한다. VP4는 트립신에 의해 VP8* 및 VP5*로 절단된다. VP8* 및 VP5*는 VP4의 단백질 가수분해 생성물이다.
VP2는 102 kDa 단백질이고 바이러스 코어의 가장 풍부한 단백질이다. 그것은 가장 안쪽에 있는 구조 단백질 층을 형성하고 바이러스 코어의 구성요소와 전사 효소의 정확한 조립을 위한 스캐폴드(scaffold)를 제공한다 (Lawton, 2000). 125 kDa의 가장 큰 바이러스 단백질인 VP1은 로타바이러스에 대한 RNA-의존성 폴리머라제의 역할을 하여, 코어 복제 중간물을 생성하고, 그것의 20면체의 꼭지점에서 VP2와 회합한다 (Varani and Allain, 2002; Vende et al., 2002). 98 kDa 단백질인 VP3는 또한 바이러스 게놈과 직접적으로 회합되어, 5' 캡(cap) 구조를 바이러스 mRNA에 추가하는 mRNA 캡핑(capping) 효소의 역할을 한다. VP1 및 VP3는 함께 VP2 캡시드 층의 외부 5겹의 꼭지점에 부착된 복합체를 형성한다 (Angel, 2007). VP6은 바이러스 코어의 중간 쉘을 형성하는 42 kDa 단백질이고, 주요 캡시드 단백질이며 비리온의 총 단백질 질량의 50% 초과를 차지한다 (Gonzalez et al., 2004; Estes, 1996). 그것은 유전자 전사에 필요하고, 레오비리대 과의 또 다른 구성원인 블루텅 바이러스(bluetongue virus)에서 알 수 있는 바와 같이, 코어에서 VP1을 VP2에 고정시킴으로써 로타바이러스 RNA의 캡슐화하는 역할을 할 수도 있다. 그것은 또한 다섯 개의 군 (A 내지 E)으로 로타바이러스의 분류를 결정하며 A군은 가장 일반적으로 인간에게 영향을 미친다 (Palombo, 1999). 로타바이러스 A군의 VP6는 SG 특이적 에피토프, SG I, SG II, SG (I+II) 및 SG 비-(I+II)의 존재 또는 부재에 따라 적어도 네 개의 부분군 (SG)을 가진다. B군 및 C군은 공통 A군 항원이 결여되지만 또한 인간을 감염시키는 것으로 알려져 있는 한편 D군은 동물들, 예를 들어, 닭 및 소에게만 영향을 준다 (Thongprachum, 2010).
두 개의 외부 캡시드 단백질 VP7, 37 kDa 당단백질 (G) 및 87 kDa 프로테아제 민감성 VP4 (P)는 바이러스의 혈청형을 한정한다. 이들 두 개의 단백질들은 중화 항체 반응을 유도하고 따라서 G-P 항원 조합 (예를 들어, G1 P[8] 또는 G2 P[4])에 따라 로타바이러스 혈청형을 이중 명명 체계로 분류하는데 사용된다 (Sanchez-Padilla et al., 2009, Rahman et al., J Clin Microbiol 41: 2088-2095 (2003)). VP4 단백질은 다이머화하여 바이러스의 외부 쉘 상에 60개의 스파이크를 형성하며, 이것들은 숙주 세포 진입의 초기 스테이지에 직접적으로 수반된다. 스파이크 단백질은 아미노산 (aa) 위치 248에서 절단 부위를 함유한다. 감염시, 그것은 프로테아제 트립신에 의해 절단되어 VP5 (529 aa, 60 kDa) 및 VP8 (246 aa, 28 kDa)을 생산한다 (Denisova et al., 1999). 이 과정은 바이러스 감염성 (숙주 세포의 세포 부착 및 침입)을 향상시키고 스파이크 구조를 안정화시킨다 (Glass, 2006). VP7 당단백질은 바이러스의 제3의 또는 외부 층을 형성한다. 현재, 27 G 및 35 P 유전자형이 공지되어 있다 (Greenberg and Estes, 2009). VP4 및 VP7은 바이러스 중화에 수반되는 주요 항원이고 백신 개발을 위한 중요한 표적이다 (Dennehy, 2007).
비-구조 단백질 (NSP)은 감염된 세포에서 합성되고 복제 주기의 다양한 부분에서 기능하거나 숙주 단백질 중 일부와 상호작용하여 감염에 대한 발병기전 또는 면역 반응에 영향을 미친다 (Greenberg and Estes, 2009). 로타바이러스 비구조 단백질, NSP4는 소포체 (ER; Tian et al, 1995)로부터 칼슘의 방출; ER 막의 붕괴를 포함하는 다수의 기능을 가진 것으로 나타났고 바이러스 형태 형성(morphogenesis) 중에 버딩(budding) 입자로부터 일시적인 외피의 제거에서 중요한 역할을 하여 (도 1 참조); 미소관에 결합하는 능력으로 ER에서 골지 복합체로의 막 트래피킹(trafficking)에 영향을 주고 (Xu et al 2000); ER로의 서브바이러스 입자의 버딩을 돕기 위해 세포 내 수용기로서 기능할 수도 있다 (Tian et al 1996).
감염된 포유류 세포에서, 로타바이러스는 완전한 삼중층 VP2/6/4/7 바이러스 입자를 형성하기 위해 독특한 방식의 형태 형성을 거친다 (Lopez et al., 2005). 삼중층 캡시드는 분변-경구 경로 감염(faecal-oral transmission) 및 소장으로 융모의 끝 근처에서 비-분열 분화된 장세포를 감염시키는 바이러스의 전달을 가능하게 하는 매우 안정한 복합체이다 (Greenberg and Estes, 2009). 처음에, 온전한 바이러스는 바이러스 표면 상의 60개의 VP4 다이머 스파이크를 통해 시알산-독립적 수용기에 부착된다 (Lundgren and Svensson, 2001). 바이러스 표면 상의 60개의 VP4 다이머 스파이크는 바이러스를 이들 세포 수용기에 부착시킨다. VP4는 트립신에 의한 단백질 가수분해 절단에 민감하며 이것은 일련의 공수용기와의 상호작용을 위해 당단백질의 표면 상에서 추가적인 부착 부위를 노출하는 입체구조적 변화를 초래한다.
하지만, 다단계 부착 및 진입 과정이 명확하게 이해된 것은 아니지만 바이러스는 숙주의 원형질막을 거쳐 전달된다. 진입 과정에 또한 수반되는 VP7 외부 캡시드 쉘은 과정 중에 제거되고 이중층 입자 (DLP)는 소포에서 세포의 세포질로 전달된다 (도 1; 선행기술). DLP는 소포에서 빠져나와서 막 결합되지 않은 세포질 함유물로 들어간다. VP1에 의한 게놈의 초기 전사는 dsRNA가 세포질에 절대 노출되지 않도록 입자에서 시작한다. RNA 복제 및 코어 형성은 이들 막 결합되지 않은 세포질 함유물에서 일어난다. 그후 신생 (+) RNA는 세포질로 운반되어 바이러스 단백질 합성을 위한 주형의 역할을 한다. VP4는 시토졸에서 생산되어 조면 소포체 (RER)로 운반되고, VP7은 RER로 분비된다. VP2 및 VP6은 비로솜의 시토졸에서 생산되고 조립되고 그 이후 RER 구획으로 버딩되며, 과정 중에 일시적으로 막 외피를 받는다 (Lopez et al., 2005; Tian et al., 1996). RER에서, 바이러스 입자의 일시적 외피가 제거되어 VP4 및 VP7 단백질 모노머로 대체되며, 로타바이러스 당단백질 NSP4와 중요한 관련이 있다 (Tian et al., 1996; Lopez et al., 2005; Gonzalez et al., 2000). NSP4는 ER 막에서 세포 내 수용기로서 기능하고 새로 만들어진 서브바이러스 입자 및 아마도 또한 스파이크 단백질 VP4에 결합한다 (Tian et al., 1996). NSP4는 또한 인간에게 독성이고 설사의 원인 인자이다. 완전한, 성숙한 입자들은 그 이후 분비를 위해 RER에서 골지체를 통해 원형질막으로 이동된다 (Lopez et al., 2005).
다양한 혈청형의 로타바이러스로부터 인간 집단을 보호하기에 적합한 로타바이러스 백신을 생성하기 위해 다양한 다른 접근법이 취해졌다. 이 접근법들은 다양한 제너식(Jennerian) 접근법, 생 약독화된 바이러스의 사용, 면역원으로서 바이러스-유사 입자, 핵산 백신 및 바이러스 서브유닛의 사용을 포함한다. 현재 두 개의 경구용 백신이 시판 중이지만, 이것들은 균주의 변화로 인해 낮은 효율을 가진다.
미국 특허 번호 4,624,850, 4,636,385, 4,704,275, 4,751,080, 4,927,628, 5,474,773, 및 5,695,767, 각각은 다양한 로타바이러스 백신 및/또는 이 백신들의 제조 방법을 기술하며, 전체 바이러스 입자는 각각의 로타바이러스 백신을 생성하는데 사용된다.
로타바이러스-유사 입자의 생산은 하나 이상의 재조합 단백질의 합성 및 조립 둘 다가 필요하기 때문에 도전적인 일이다. 로타바이러스는 네 개의 다른 단백질의 1860개의 모노머에 의해 형성된 캡시드를 포함한다. RLP 생산을 위해서 두 개 내지 세 개의 재조합 단백질의 동시 발현 및 조립이 필요할 수도 있다. 예를 들어, VP2의 120개 분자의 내부 층, VP6의 780개 분자 (중간 층) 및 당단백질 VP7의 780개의 분자 및 60개의 VP4 다이머의 외부 층이 이중층 또는 삼중층 입자를 형성하였다 (Libersou et al. J. of Virology, Mar. 2008).
Crawford et al. (J Virol. 1994 September; 68(9): 5945-5952)은 바큘로바이러스(baculovirus) 발현 시스템에서 VP2, VP4, VP6, 및 VP7의 발현을 기술한다. 로타바이러스 주요 구조 단백질의 다른 조합의 동시-발현은 안정한 바이러스-유사 입자 (VLP)의 형성을 초래하였다. 단독으로 또는 VP4와 함께 VP2 및 VP6의 동시 발현은 이중층 로타바이러스 입자와 유사한 VP2/6 또는 VP2/4/6 VLP의 생산을 초래하였다. VP4가 있든 없든, VP2, VP6, 및 VP7의 동시 발현은 고유한 감염성 로타바이러스 입자와 유사한 삼중층 VP2/6/7 또는 VP2/4/6/7 VLP를 생산하였다. VLP는 입자의 전자 현미경 검사, VP4 및 VP7에서 비-중화 및 중화 에피토프의 존재, 및 VP2/4/6/7 VLP의 응집 활성에 의해 결정된 바와 같이, 고유한 입자의 구조적 및 기능적 특징을 유지하였다.
다른 단백질 조성물의 로타바이러스-유사 입자로부터 생성된 백신 후보물질은 서브유닛 백신으로서의 가능성을 나타냈다. O'Neal et al. (J. Virology, 1997, 71(11):8707-8717)은 VP2 및 VP6, 또는 VP2, VP6, 및 VP7을 함유하고, 콜레라(cholera) 독소를 추가하거나 추가하지 않으면서 마우스에게 투여된 VLP가 면역화된 마우스에서 보호 면역을 유도하였음을 나타낸다. 코어-유사 입자 (CLP) 및 VLP는 또한 수동 면역을 유도하는데 있어서 CLP보다 더 효과적인 VLP로 소를 면역화하는데 사용되었다. Fernandez, et al., (Vaccine, 1998, 16(5):507-516).
식물은 재조합 단백질의 대규모 생산에 점점 더 많이 사용되고 있다. 예를 들어, US 2003/0175303은 안정하게 형질전환된 토마토 식물에서 재조합 로타바이러스 구조 단백질 VP6, VP2, VP4 또는 VP7의 발현을 개시한다.
Saldana et al. (Viral Immunol. 19: 42-53 (2006))은 토마토 식물의 세포질에서 VP2 및 VP6을 발현시켰다. 전자 현미경 연구는 단백질의 작은 부분이 2/6 VLP로 조립되었음을 나타냈다. 마우스에서 보호 면역 반응이 검출되었고 이는 어느 정도로는 조립되지 않은 VP에 의해 기여되었을 수도 있다. 개개의 단백질은 VP8 및 VP6의 경우와 같이, 마우스에서 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다 (Rodriguez-Diaz et al. Biotechnol Lett. 2011, 33(6):1169-75, Zhou et al., Vaccine 28: 6021-6027 (2010)).
Matsumura et al., (Archives of Virology 147: 1263-1270 (2002))은 트랜스제닉(transgenic) 감자 식물에서 소 로타바이러스 A VP6 발현을 보고한다. VP6이 발현되고, 정제되고 면역원 연구가 수행되었다. 성체 마우스에서 면역 반응은 혈청 내 VP6 항체의 존재를 보여주었다. 하지만, 조립된 VP6 단백질의 증거는 제공되지 않았다. VP6의 모노머 또는 트리머가 면역 반응을 유도하는 원인이 되었을 수도 있었다. O'Brien et al. (2000, Virol. 270: 10444-10453)은 감자 바이러스 X (PVX) 벡터를 사용하여 니코티아나 벤타미아나 ( Nicotiana benthamiana )에서 VP6 조립을 보여준다. VP6 단백질의 20면체 VLP로의 조립은 VP6이 PVX 단백질 막대에 융합될 때만 관찰되었다. 절단 후 VP6이 20면체 VLP로 조립되었다.
코돈-최적화된 인간 로타바이러스 VP6은 비트 블랙 스코치 바이러스 (Beet black scorch virus; BBSV) 중재 발현 시스템을 사용하여 케노포디움 아마란티콜러 (Chenopodium amaranticolor )에서 성공적으로 발현되었다. 단백질은 BBSV의 코팅 단백질에 대한 대안으로서 조작되었다. 식물 기반 VP6 단백질로 암컷 BALB/c 마우스의 경구 면역화는 높은 역가의 항-VP6 점막 IgA 및 혈청 IgG를 유도하였다 (Zhou et al., Vaccine 28: 6021-6027 (2010)). 하지만, VP6 단백질이 VLP 또는 입자로 조립된다는 교시내용은 없었다.
로타바이러스 VP7은 감자 식물에서 발현되었고 마우스에서 중화 면역 반응을 생성하는 것으로 나타났다 (Yu and Langridge, 2001 Nature Biotechnol 19: 548-552). 트랜스제닉 감자 식물에서, VP7 유전자는 50세대에 걸쳐 안정하였으며, 50번째 세대의 VP7 단백질은 성체 마우스에서 보호 및 중화 항체 둘 다를 유도하였다 (Li et al., 2006, Virol 356:171-178).
Yang et al. (Yang Y M, Li X, Yang H, et al. Science China Life Science 54: 82-89 (2011))은 담배 식물에서 A군 RV (P[8]G1)의 세 개의 로타바이러스 캡시드 단백질 VP2, VP6 및 VP7을 동시-발현시켰고 이 단백질들의 발현 수준, 뿐 아니라 로타바이러스-유사 입자의 형성 및 면역원성이 연구되었다. VLP는 트랜스제닉 담배 식물로부터 정제되었고 전자 현미경 및 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 이 결과들은 식물 유래 VP2, VP6 및 VP7 단백질이 60-80 nm의 직경을 가지는 2/6 또는 2/6/7 로타바이러스 유사 입자로 자가-조립되었음을 나타낸다.
WO 2013/166609는 식물에서 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 동시-발현 및 칼슘의 존재 하에 결과로 생긴 RLP의 정제에 의한, 식물에서 로타바이러스-유사 입자 (RLP)의 생산을 기술한다.
로타바이러스 NSP4는 곤충 세포 (Tian et al. 1996, Arch Virol. 1996; Rodriguez-Diaz et al. Protein Expr. Purif. 2003) 및 대장균(E. coli) (Sharif et al. Medical Journal of the Islamic Republic of Iran 2003)으로부터 발현 및 정제되었다. NSP4는 또한 감자에서 콜레라 독소 B (CTB) 서브유닛을 가진 융합 단백질로서 발현되었다 (Arakawa et al., Plant Cell Report 20　: 343-348 (2001)).
본 발명은 식물에서 로타바이러스-유사 입자의 생산에 관한 것이다.
식물에서 로타바이러스-유사 입자를 생산하는 것이 본 발명의 목적이다.
식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 로타바이러스 유사 입자 (RLP)를 생산하기 위한 여러 방법들이 기술된다.
예를 들어, 숙주 또는 숙주 세포에서 로타바이러스 유사 입자 (RLP)를 생산하는 방법 (A)는 다음 단계를 포함할 수도 있다:
a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는, 단계;
b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, RLP를 생산하는 단계.
상기 기술된 방법 (A)에서, 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4 또는 VP7을 암호화하며 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP4 및 VP7 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
숙주 또는 숙주 세포에서 로타바이러스 유사 입자 (RLP)를 생산하기 위한 방법 (B)가 추가로 기술되며, 방법은 다음 단계를 포함할 수도 있다:
a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4, VP6 중 하나 및 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는, 단계;
b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, RLP를 생산하는 단계.
상기 기술된 방법 (B)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4, VP6 중 하나 및 로타바이러스 단백질 VP2, VP7 또는 VP4 중 두 개를 암호화하며 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP7 또는 VP4 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
상기 기술된 방법 (A) 및 (B)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하며 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
상기 기술된 방법 (A) 또는 (B)에서, 하나 이상의 핵산이 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열, 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합된 숙주 또는 숙주 세포가 제공되면, 하나 이상의 핵산은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수도 있거나, 또는 하나 이상의 핵산은, 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 및 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산의 두 개의 핵산을 포함할 수도 있거나, 또는 하나 이상의 핵산은, 예를 들어, 제1 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 및 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산의 두 개의 핵산을 포함할 수도 있거나, 또는 하나 이상의 핵산은, 예를 들어, 제1 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제3 및 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산의 세 개의 핵산을 포함할 수도 있거나, 또는 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 및 제3, 및 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산의 세 개의 핵산을 포함할 수도 있거나, 또는 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 및 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 및 제5 핵산의 네 개의 핵산을 포함할 수도 있거나, 또는 하나 이상의 핵산은, 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제5 핵산을 포함할 수도 있다.
상기 기술된 방법 (A) 또는 (B)는 다음 단계들을 더 포함할 수도 있다:
c) 숙주 또는 숙주 세포를 수확하는 단계, 및
d) 숙주 또는 숙주 세포로부터 RLP를 정제하는 단계로서, RLP는 크기가 70-100 nm의 범위에 있는 단계.
상기 기술된 방법 (A) 또는 (B)의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 발현 인핸서(enhancer)에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 게다가, 발현 인핸서는 CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다.
또한 본원에서는 다음 단계를 포함하는, 숙주 또는 숙주 세포에서 로타바이러스 유사 입자 (RLP)를 생산하는 방법이 기술된다:
a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 숙주 또는 숙주 세포로 도입하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는 단계;
b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, RLP를 생산하는 단계.
상기 기술된 방법 (C)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4 또는 VP7을 암호화하며 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP4 및 VP7 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
또한 본원에서는 다음 단계를 포함하는, 숙주 또는 숙주 세포에서 로타바이러스 유사 입자 (RLP)를 생산하는 방법 (D)가 기술된다:
a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 숙주 또는 숙주 세포로 도입하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4, VP6 중 하나 및 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는 단계;
b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, RLP를 생산하는 단계.
상기 기술된 방법 (D)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4, VP6 중 하나 및 로타바이러스 단백질 VP2, VP7 또는 VP4 중 두 개를 암호화하며 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP7 또는 VP4 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
상기 기술된 방법 (C) 및 (D)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하며 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
상기 기술된 방법 (C) 또는 (D)는 다음 단계를 더 포함할 수도 있다.
c) 숙주 또는 숙주 세포를 수확하는 단계, 및
d) 숙주 또는 숙주 세포로부터 RLP를 정제하는 단계로서, RLP는 크기가 70-100 nm의 범위에 있는 단계.
상기 기술된 방법 (C) 또는 (D)에서, 하나 이상의 핵산이 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열, 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합된 숙주 또는 숙주 세포가 제공되면, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 NSP4를 암호화하는 제1 핵산, 및 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화하는 제2 핵산의 두 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양의 비는 1:0.8 내지 1:2이다. 비는 또한 1:1일 수도 있다. 대안으로, 하나 이상의 핵산은 두 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 제3 내지 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 내지 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 기술된 방법 (C) 또는 (D)에서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 세 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 제1 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 제3 및 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제3 핵산은 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양의 비는 1:1:1이다.
대안으로, 상기 기술된 방법 (C) 또는 (D)에서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 세 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제3 핵산은 제3 내지 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 내지 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양의 비는 1:1:1이다.
게다가, 상기 기술된 방법 (C) 또는 (D)에서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 및 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산의 네 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양 대 제4 핵산의 양의 비는 1:1:1:1이다.
상기 기술된 방법 (C) 또는 (D)에서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제5 핵산의 다섯 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양 대 제4 핵산의 양 대 제5 핵산의 양의 비는 1:1:1:1:1이다.
상기 기술된 방법 (C) 또는 (D)의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 발현 인핸서에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 게다가, 발현 인핸서는 CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다.
로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함을 증가시키는 방법 (E)가 또한 기술되며, 방법은 다음 단계들을 포함한다:
a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는 단계;
b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, 이로써 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 숙주 또는 숙주 세포에 의해 생산된 VP4 또는 VP7의 수준과 비교하여 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계.
상기 기술된 방법 (E)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4 또는 VP7을 암호화하며 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP4 및 VP7 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함을 증가시키는 방법 (F)가 또한 기술되며, 방법은 다음 단계들을 포함한다:
a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4, VP6 중 하나 및 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는 단계;
b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, 이로써 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 숙주 또는 숙주 세포에 의해 생산된 VP4 또는 VP7의 수준과 비교하여 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계.
상기 기술된 방법 (F)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4, VP6 중 하나 및 로타바이러스 단백질 VP2, VP7 또는 VP4 중 두 개를 암호화하며 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP7 또는 VP4 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
상기 기술된 방법 (E) 및 (F)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하며 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
상기 기술된 방법 (E) 또는 (F)의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 발현 인핸서에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 게다가, 발현 인핸서는 CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다.
로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함을 증가시키는 방법 (G)가 또한 기술되며, 방법은 다음 단계들을 포함한다:
a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 숙주 또는 숙주 세포로 도입하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는 단계;
b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, 이로써 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 숙주 또는 숙주 세포에 의해 생산된 VP4 또는 VP7의 수준과 비교하여 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계.
상기 기술된 방법 (G)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4 또는 VP7을 암호화하며 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP4 및 VP7 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함을 증가시키는 방법 (H)가 또한 기술되며, 방법은 다음 단계들을 포함한다:
a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포로 도입하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4, VP6 중 하나 및 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는 단계;
b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, 이로써 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 숙주 또는 숙주 세포에 의해 생산된 VP4 또는 VP7의 수준과 비교하여 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계.
상기 기술된 방법 (H)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4, VP6 중 하나 및 로타바이러스 단백질 VP2, VP7 또는 VP4 중 두 개를 암호화하며 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP7 또는 VP4 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
상기 기술된 방법 (G) 및 (H)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하며 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
상기 기술된 방법 (G) 및 (H)에서 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수도 있으며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하며 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4는 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
상기 기술된 방법 (G) 또는 (H)에서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 두 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 NSP4를 암호화하고, 제2 핵산은 VP2, VP4, VP6 및 VP7를 암호화하며, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양의 비는 1:0.8 내지 1:2이다. 비는 또한 1:1일 수도 있다. 대안으로, 하나 이상의 핵산은 두 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 제3 내지 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 내지 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 기술된 방법 (G) 또는 (H)에서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 세 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 제1 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 제3 및 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 및 제3 핵산은 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양의 비는 1:1:1이다.
대안으로, 상기 기술된 방법 (G) 또는 (H)에서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 세 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제3 핵산은 제3 내지 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 내지 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양의 비는 1:1:1이다.
게다가, 상기 기술된 방법 (G) 또는 (H)에서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 및 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산의 네 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양 대 제4 핵산의 양의 비는 1:1:1:1이다.
상기 기술된 방법 (G) 또는 (H)에서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제5 핵산의 다섯 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양 대 제4 핵산의 양 대 제5 핵산의 양의 비는 1:1:1:1:1이다.
상기 기술된 방법 (G) 또는 (H)의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 발현 인핸서에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 게다가, 발현 인핸서는 CPMV HT, CPM 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다.
상기 기술된 방법 (G) 또는 (H)는 다음 단계들을 더 포함할 수도 있다:
c) 숙주 또는 숙주 세포를 수확하는 단계, 및
d) 숙주 또는 숙주 세포로부터 RLP를 정제하는 단계로서, RLP는 크기가 70-100 nm의 범위에 있는 단계.
상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서, 하나 이상의 핵산은 제1, 제2, 제3, 제4, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 핵산을 포함할 수도 있다.
상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서, 하나 이상의 핵산은 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 및 제2 내지 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 내지 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산의 두 개의 핵산을 포함할 수도 있다. 대안으로, 하나 이상의 핵산은 두 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 제3 내지 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 내지 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서, 하나 이상의 핵산은 또한 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산의 세 개의 핵산을 포함할 수도 있다. 대안으로, 하나 이상의 핵산은 세 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제3 핵산은 제3 내지 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 내지 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 및 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산의 네 개의 핵산을 포함한다.
게다가, 상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서 하나 이상의 핵산은 다섯 개의 핵산을 포함할 수도 있으며, 제1 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제3 핵산은 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제5 핵산은 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 발현 인핸서에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 게다가, 발현 인핸서는 CPMV HT, CPM 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다.
상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서 숙주 또는 숙주 세포는 곤충 세포, 포유류 세포, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 포함할 수도 있다. 식물은 니코티아나 벤타미아나일 수도 있다.
또한 본원에서는 상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에 의해 생산된 RLP가 기술되며, RLP는 로타바이러스 단백질을 포함하는 삼중층 RLP이고, 로타바이러스 단백질은 VP2, VP4, VP6 및 VP7로 구성된다. RLP는 NSP4를 포함하지 않을 수도 있다.
대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 RLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물, 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 및 대상체에서 로타바이러스 감염에 대한 면역력을 유도하는 방법이 또한 기술된다. 면역력을 유도하는 방법에서, 조성물은 대상체에게 경구로, 피내로, 비강 내로, 근육 내로, 복강 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여될 수도 있다.
또한 본원에서는 상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에 의해 생산된 RLP를 포함하는 식물 물질이 기술된다.
상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서, 하나 이상의 핵산은 제1, 제2 및 제3, 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 핵산을 포함할 수도 있다. 게다가, 상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 및 제2 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산의 두 개의 핵산을 포함할 수도 있다. 게다가, 상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서 하나 이상의 핵산은 제1 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산의 두 개의 핵산을 포함할 수도 있다. 대안으로, 상기 기술된 방법 (A), 방법 (B), 방법 (C), 방법 (D), 방법 (E), 방법 (F), 방법 (G) 또는 방법 (H)에서 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산의 세 개의 핵산을 포함할 수도 있다.
본원에서 기술된 바와 같이, VP6 및 VP4 또는 VP7과 함께 NSP4를 동시-발현시킴으로써, 숙주 또는 숙주 세포, 예를 들어, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서, VP6 및 VP4 또는 VP7을 암호화하지만, NSP4를 암호화하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 숙주 또는 숙주 세포, 예를 들어, 식물, 제2 식물의 일부, 또는 제2 식물 세포에 의해 생산된 RLP 내 VP4 및 VP7의 수준과 비교하여 증가된 수준의 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다를 포함하는 RLP가 관찰되며, 제2 숙주 또는 제2 숙주 세포, 예를 들어, 제2 식물, 식물의 제2 일부, 또는 제2 식물 세포는 숙주 또는 숙주 세포, 예를 들어, 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포와 같은 조건 하에서 인큐베이션되거나 성장된다.
본 발명의 이 요약이 반드시 본 발명의 모든 특징들을 기술하는 것은 아니다.
본 발명의 이들 및 다른 특징들은 첨부된 도면에 대한 참조가 이루어지는 다음 설명으로부터 더 분명해질 것이다:
도 1은 로타바이러스 세포 진입 및 복제를 나타낸다. 로타바이러스가 세포에 들어가면, VP4 및 VP7이 손실되어, 이중층 입자 (DLP)를 형성한다. dsRNA의 전사가 시작되며 그 결과로서 VP2, VP4, VP6 및 VP7의 번역을 초래한다. 레플리카제 활성을 가진 자손 코어가 바이러스 공장 (바이로플라즘(viroplasm))에서 생산된다. 이 자손 코어들에서 후기 전사가 일어난다. 바이러스 공장의 주변에서, 이 코어들은 VP6으로 코팅되어, 소포체의 막을 가로질러 버딩하는 미성숙 DLP를 형성하고, ER 체류 바이러스 당단백질 NSP4 및 VP7로 변형된 일시적 지질막을 얻는다; 이 외피성 입자들은 또한 VP4를 함유한다. 입자가 ER 시스터네(cisternae)의 내부로 이동함에 따라, 일시적 지질막 및 비구조 단백질 NSP4가 손실되는 한편, 바이러스 표면 단백질 VP4 및 VP7은 최외곽 바이러스 단백질 층을 형성하도록 재배열되어, 성숙한 감염성 삼중층 입자를 수득한다 (Swiss Institute of Bioinformatics (ViralZone): viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html 참조).
도 2는 이오딕사놀 밀도 구배에서 초원심분리에 의한 로타바이러스-유사 입자 정제를 나타낸다. 도 2A는 로타바이러스-유사 입자의 정제에 사용된 구배의 각 층에 대한 이오딕사놀의 퍼센트 및 부피를 나타낸다. 원심분리 후, 구배는 튜브의 바닥에서 시작하여 1 ml 분획으로 분별화되었다. 분획 1 내지 13의 대략적인 위치는 화살표로 표시된다. 도 2B는 로타바이러스 VP2, VP4, VP6 및 VP7 항원을 발현하는 잎의 조 단백질 추출물에 적용된 이오딕사놀 밀도 구배 분리로부터 분획 1 내지 10의 단백질 함량의 쿠마시(Coomassie)-염색된 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 3은 로타바이러스 단백질 발현을 나타낸다. 도 3A는 NSP4의 존재 또는 부재 하에 VP2, VP4, VP6, VP7을 발현하는 잎의 조단백질 추출물에 적용된 이오딕사놀 밀도 구배 분리로부터 분획 2 및 3의 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP6, VP7, VP4는 왼쪽 패널에서는, 별도의 구조체 상의 NSP4와 함께, 각각의 구조적 항원에 대하여 개개의 구조체 ("단일 유전자 구조체")를 사용하여; 중간 패널에서는, 별도의 구조체 상의 NSP4와 함께, 각각 두 개의 구조적 항원의 유전자를 가지는 두 개의 구조체 ("2중 유전자 구조체"); 또는 오른쪽 패널에서는, NSP4의 발현을 위한 별도의 구조체와 함께, 네 개의 구조적 항원의 동시-발현을 위한 단일 구조체 (4중 유전자 구조체)를 사용하여 발현되었다. 로타바이러스 VP2 및 VP6 항원의 위치는 화살표로 나타난다. 도 3B는 명시된 바와 같이 항-로타바이러스 VP4 또는 VP7 항체를 사용한 도 3A에서와 같은 처리로부터 분획 F2의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 4는 발현 인핸서의 존재 하에 로타바이러스 단백질 발현을 나타낸다. 도 4A는 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 동시-발현하는 잎의 조단백질 추출물에 적용된 이오딕사놀 밀도 구배로부터 분획 F2 및 F3의 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP6, VP7, VP4는 단일 유전자 구조체, 및 NSP4를 발현하는 하나의 구조체 (왼쪽 패널), 또는 두 개의 이중 유전자 구조체 및 NSP4를 발현하는 하나의 구조체 (중간 및 오른쪽 패널))로부터 발현되었다. 항상 CPMV-HT 인핸서를 포함하는 NSP4를 제외하고, 각 구조체는 발현 인핸서, CPMV HT (왼쪽 및 중간 패널) 또는 CMPV 160 (오른쪽 패널)을 포함한다. 비는 형질전환에 사용된 박테리아 현탁액에서 아그로박테리움( Agrobacterium ) 균주의 비율을 나타낸다: 왼쪽 패널 - 다섯 개의 단일 유전자 구조체 (VP2, VP6, VP4, VP7 및 NSP4; 1:1:1:1:1의 비); 중간 및 오른쪽 패널 - 구조 단백질을 암호화하는 이중 유전자 구조체 (VP6/2 및 VP7/4) 및 비-구조 단백질을 암호화하는 구조체 (NSP4; 1:1:1의 비). 도 4B는 명시된 항-로타바이러스 VP4 또는 VP7 항체를 사용하여 도 4A에서와 같은 처치로부터 F2의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 비는 형질전환에 사용된 박테리아 현탁액에서 아그로박테리움 균주의 비율을 나타낸다: 왼쪽 패널 - 다섯 개의 단일 유전자 구조체 (VP2, VP6, VP4, VP7 및 NSP4; 1:1:1:1:1의 비); 중간 및 오른쪽 패널 - 구조 단백질을 암호화하는 이중 유전자 구조체 (VP6/2 및 VP7/4) 및 비-구조 단백질을 암호화하는 구조체 (NSP4; 1:1:1의 비).
도 5는 로타바이러스 단백질 발현을 나타낸다. 상부 패널은 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 동시-발현하는 잎의 조단백질 추출물에 적용된 이오딕사놀 밀도 구배로부터 분획 F2 및 F3의 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 분석을 나타내고, 하부 패널은 상부 패널의 대응 F2 분획의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP6, VP7 및 VP4는 4중 유전자 구조체 내에서 발현되었고, 비-구조 단백질 NSP4는 별개의 단일 유전자 구조체로부터 동시-발현되거나 (레인 1 및 2), 또는 구조 단백질 VP2, VP6, VP7, VP4 및 비-구조 단백질 NSP4는 5중 유전자 구조체 내에서 발현되었다 (레인 3). 구조체의 아그로인필트레이션(agroinfiltration)의 비가 표시된다. 박테리아 현탁액 중 아그로박테리움 균주의 0.4의 OD가 1로 표시된다. 박테리아 현탁액 중 아그로박테리움 균주의 0.6의 OD는 1.5로 표시된다.
도 6은 본 발명의 구조체에서 사용될 수도 있는 여러 인핸서 서열의 예의 일반적인 개략도를 나타낸다. 도 6A 및 도 6B는 원하는 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7, 또는 비-구조 단백질 NSP4를 암호화하는)에 융합된 CPMV HT 및 CPMV HT+ 인핸서 서열의 일반적인 개략도를 나타낸다. 도 5A 또는 5B에서 나타난 모든 요소들이 인핸서 서열 내에서 필요한 것은 아니다. 추가적인 요소들이 코모바이러스(comovirus) 3' 비번역 영역 (CPMV 3' UTR), 또는 플라스토시아닌 3' UTR (3'UTR)을 암호화하는 서열을 포함하는 원하는 뉴클레오타이드 서열의 3' 단부에 포함될 수도 있다. 도 6C 및 6D는 본원에서 기술된 바와 같이 CPMVX, 및 CPMVX+ (CPMVX, 및 이 비-제한 예에서, 다수의 클로닝 부위 및 식물 코자크(kozak) 서열을 포함하는 스터퍼 단편(stuffer fragment)을 포함함)의 인핸서 서열의 일반적인 개략도를 나타낸다. CPMVX 및 CPMVX+는 각각 그것들의 5' 단부, 및 그것들의 3' 단부의 식물 조절 영역, 연속적으로, 원하는 뉴클레오타이드 서열 (ATG 개시 부위 및 STOP 부위를 포함함), 3'UTR, 및 종결 서열에 작동 가능하게 결합된 것으로 보인다. 본원에서 기술된 구조체 CPMVX의 예는 CPMV160이다. 본원에서 기술된 구조체 CPMVX+의 예는 CPMV160+이다.
도 7은 구조체 번호 1710 (2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 7A는 IF-WA_VP2(opt).s1+3c의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다 (서열 번호: 19). 도 7B는 IF-WA_VP2(opt).s1-4r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 20)을 나타낸다. 도 7C는 균주 WA의 로타바이러스 A VP2의 최적화된 암호화 서열 (서열 번호: 21)을 나타낸다. 도 7D는 구조체 1191의 개략도를 나타낸다. 도 7E는 구조체 1191의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 22)을 나타낸다. 도 7F는 발현 카세트 번호 1710의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 23)을 나타낸다. 도 7G는 로타바이러스 A WA 균주의 VP2의 아미노산 서열 (서열 번호: 24)을 나타낸다. 도 7H는 구조체 번호 1710의 개략도를 나타낸다.
도 8은 구조체 번호 1713 (2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 8A는 IF-WA_VP6(opt).s1+3c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 25)을 나타낸다. 도 8B는 IF-WA_VP6(opt).s1-4r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 26)을 나타낸다. 도 8C는 균주 WA의 로타바이러스 A VP6의 최적화된 암호화 서열 (서열 번호: 217)을 나타낸다. 도 8D는 발현 카세트 번호 1713의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 28)을 나타낸다. 도 8E는 로타바이러스 A WA 균주의 VP6의 아미노산 서열 (서열 번호: 29)을 나타낸다. 도 8F는 구조체 번호 1713의 개략도를 나타낸다.
도 9는 구조체 번호 1730 (2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 9A는 IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 30)을 나타낸다. 도 9B는 IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 31)을 나타낸다. 도 9C는 균주 RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]의 로타바이러스 A VP4의 최적화된 암호화 서열 (서열 번호:32)을 나타낸다. 도 9D는 발현 카세트 번호 1730의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 33)을 나타낸다. 도 9E는 로타바이러스 A Rotarix 균주의 VP4의 아미노산 서열 (서열 번호: 34)을 나타낸다. 도 9F는 구조체 번호 1730의 개략도를 나타낸다.
도 10은 구조체 번호 1734 (2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP7(Opt)/NOS)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 10A는 IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 35)을 나타낸다. 도 10B는 IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 36)을 나타낸다. 도 10C는 균주 RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]의 로타바이러스 A VP7의 최적화된 암호화 서열 (서열 번호: 37)을 나타낸다. 도 10D는 발현 카세트 번호 1734의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 38)을 나타낸다. 도 10E는 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 TrSp-VP7의 아미노산 서열 (서열 번호: 39)을 나타낸다. 도 10F는 구조체 번호 1734의 개략도를 나타낸다.
도 11은 구조체 번호 1706 (2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) NSP4/NOS)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 11A는 IF-WA_NSP4.s1+3c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 40)을 나타낸다. 도 11B는 IF-WA_NSP4.s1-4r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 41)을 나타낸다. 도 11C는 균주 WA의 로타바이러스 A VP6의 암호화 서열 (서열 번호: 42)을 나타낸다. 도 11D는 발현 카세트 번호 1706의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 43)을 나타낸다. 도 11E는 로타바이러스 A WA 균주의 NSP4의 아미노산 서열 (서열 번호: 44)을 나타낸다. 도 11F는 구조체 번호 1706의 개략도를 나타낸다.
도 12는 구조체 번호 1108 (2X35S/CPMV-160/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 12A는 IF(C160)-WA_VP2(opt).c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 45)을 나타낸다. 도 12B는 구조체 1190의 개략도를 나타낸다. 도 12C는 구조체 1190의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 46)을 나타낸다. 도 12D는 발현 카세트 번호 1108의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 47)을 나타낸다. 도 12E는 구조체 번호 1108의 개략도를 나타낸다.
도 13은 구조체 번호 1128 (2X35S/CPMV-160/RVA(WA) VP6(opt)/NOS)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 13A는 IF(C160)-WA_VP6(opt).c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 48)을 나타낸다. 도 13B는 발현 카세트 번호 1128의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 49)을 나타낸다. 도 13C는 구조체 번호 1128의 개략도를 나타낸다.
도 14는 구조체 번호 1178 (2X35S/CPMV-160/RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 14A는 뉴클레오타이드 서열 of IF(C160)-Rtx_VP4(opt).c (서열 번호: 50)을 나타낸다. 도 14B는 발현 카세트 번호 1178의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 51)을 나타낸다. 도 14C는 구조체 번호 1178의 개략도를 나타낸다.
도 15는 구조체 번호 1199 (2X35S/CPMV-160/TrSp-RVA(Rtx) VP7(Opt)/NOS)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 15A는 IF(C160)-TrSP+Rtx_VP7(opt).c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 52)을 나타낸다. 도 15B는 발현 카세트 번호 1199의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 53)을 나타낸다. 도 15C는 구조체 번호 1199의 개략도를 나타낸다.
도 16는 구조체 번호 1708 (CPMV-HT 발현 카세트 하에 VP6 및 VP2의 발현을 위한 이중 유전자 구조체)의 개략도를 나타낸다.
도 17는 구조체 번호 1719 (CPMV-HT 발현 카세트 하에 VP7 및 VP4의 발현을 위한 이중 유전자 구조체)의 개략도를 나타낸다.
도 18은 구조체 번호 2400 (CPMV-160 발현 카세트 하에 VP6 및 VP2의 발현을 위한 이중 유전자 구조체)의 개략도를 나타낸다.
도 19는 구조체 번호 2408 (CPMV-160 발현 카세트 하에 VP7 및 VP4의 발현을 위한 이중 유전자 구조체)의 개략도를 나타낸다.
도 20은 구조체 번호 1769 (CPMV-HT 발현 카세트 하에 VP7, VP4, VP6 및 VP2의 발현을 위한 4중 유전자 구조체)의 개략도를 나타낸다.
도 21은 구조체 번호 2441 (CPMV-HT 발현 카세트 하에 VP4, VP7, NSP4, VP6 및 VP2의 발현을 위한 5중 유전자 구조체)의 개략도를 나타낸다.
다음 설명은 바람직한 구체예에 관한 것이다.
본 발명은 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자 (VLP) (즉, 로타바이러스 유사 입자, 로타바이러스 VLP 또는 RLP), 및 임의의 숙주에서, 특히 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 로타바이러스-유사 입자 (RLP)를 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 숙주들은, 예를 들어, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함할 수도 있다. 로타바이러스 유사 입자 (RLP)는 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질을 포함할 수도 있다. RLP는 삼중층으로 이루어질 수도 있다. RLP는 식물에서 로타바이러스 구조 및 비구조 단백질을 동시-발현시킴으로써 생산될 수도 있지만, RLP는 임의의 로타바이러스 비구조 단백질을 포함하지 않는다.
숙주 또는 숙주 세포는 식물, 균류, 박테리아, 곤충 및 동물을 포함한 임의의 공급원의 것일 수도 있다. 바람직한 구체예에서 숙주 또는 숙주 세포는 식물 또는 식물 세포이다.
본 발명은 부분적으로는 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 로타바이러스-유사 입자 (RLP)를 생산하는 방법을 더 제공한다. 방법은 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 활성인 조절 영역을 포함하는 하나 이상의 핵산을 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입하는 단계를 포함할 수도 있으며, 조절 영역은 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질 및 하나 이상의 로타바이러스 비구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된다. 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 인큐베이션함으로써, 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질을 포함하는 RLP를 생산하였다. 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 또는 VP7일 수도 있다. 로타바이러스 비구조 단백질은 NSP4일 수도 있다. RLP는 삼중층으로 이루어질 수도 있다. RLP는 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 포함할 수도 있고, 비구조 단백질 NSP4를 포함하지 않는다.
본 발명은 부분적으로는 숙주 또는 숙주 세포에서 로타바이러스 유사 입자 (RLP)를 생산하는 방법을 더 제공하며, 방법은 다음 단계들을 포함할 수도 있다:
제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 NSP4 및 로타바이러스 단백질 VP2 또는 VP6 중 하나 또는 두 개 및 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나 또는 두 개를 암호화하는 단계;
NSP4 및 VP2, VP4 및 VP7, 또는 VP2, VP6 및 VP7, 또는 VP2, VP6 및 VP4, 또는 VP6, VP4 및 VP7이 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, RLP를 생산하는 단계.
게다가, 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수도 있다. 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고; 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 뉴클레오타이드 서열, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, 또는 VP6, VP4 또는 VP7 및 NSP4를 암호화하며, NSP4 및 VP2 또는 VP6 및 VP4 또는 VP7은 하나 이상의 핵산으로부터 발현된다.
게다가, 본 발명은 부분적으로는 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 로타바이러스-유사 입자 (RLP) 백신 후보물질을 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 숙주, 예컨대 식물 또는 식물의 일부에서, 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 하나 이상의 핵산 (R1-R5)을 발현시키는 단계를 포함할 수도 있는데, 조절 영역은 뉴클레오타이드 서열 R1-R5에 작동 가능하게 결합되며, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, 뉴클레오타이드 서열 R2는 로타바이러스 단백질 X2를 암호화하고, 뉴클레오타이드 서열 R3는 로타바이러스 단백질 X3를 암호화하고, 뉴클레오타이드 서열 R4는 로타바이러스 단백질 X4를 암호화하고 뉴클레오타이드 서열 R5는 로타바이러스 단백질 X5를 암호화하고 각각의 X1-X5는 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 발현되도록 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된다 (표 1 참조). RLP는 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 포함할 수도 있다. RLP는 비구조 단백질 NSP4를 포함하지 않는다.
숙주, 예컨대 식물 또는 식물의 일부에서 로타바이러스 구조 단백질 및 로타바이러스 비-구조 단백질을 도입하고 동시-발현시킴으로써 생산되는 RLP의 수율이 조절될 수도 있다는 것이 발견되었다. 특히, 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 로타바이러스 비-구조 단백질 NSP4와 함께 로타바이러스 구조 단백질을 동시-발현시킴으로써, 같은 조건 하에 같은 로타바이러스 구조 단백질을 발현하지만 로타바이러스 비-구조 단백질은 발현하지 않는 제2 숙주, 예컨대 제2 식물, 제2 식물의 일부, 또는 제2 식물 세포에 의해 생산된 VP4 및 VP7의 수준과 비교하여, RLP로의 구조 단백질 VP4,VP7 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함이 증가될 수도 있다는 것이 발견되었다.
예를 들어, 로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함을 증가시키는 방법이 제공된다. 방법은 다음 단계들을 포함한다:
a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포를 제공하는 단계로서; 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7, VP4, NSP4 및 VP2 또는 VP6 중 하나를 암호화하는 단계;
b) 각각의 VP7, VP4, NSP4 및 VP2 또는 VP6이 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여,
이로써 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 숙주 또는 숙주 세포에 의해 생산된 VP4 또는 VP7의 수준과 비교하여 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계.
게다가, 로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4,VP7 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 생산을 증가시키는 대체 방법은 다음 단계들을 포함할 수도 있다;
a) 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 하나 이상의 핵산을 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입하는 단계로서, 하나 이상의 조절 영역은 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 활성이고, 제1 뉴클레오타이드 서열은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 제4 뉴클레오타이드 서열은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하고 제5 뉴클레오타이드 서열은 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 각각의 제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 뉴클레오타이드 서열은 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하는 단계, 및
b) 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 일시적으로 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 일시적 발현을 허용하는 조건 하에 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 인큐베이션하여, 이로써 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 식물, 제2 식물의 일부, 또는 제2 식물 세포에 의해 생산된 VP4 및 VP7의 수준과 비교하여 VP4 및 VP7의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계.
원하는 경우, 방법은 다음 단계들을 더 포함할 수도 있다:
c) 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 수확하는 단계, 및
d) 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로부터 RLP를 정제하는 단계로서, RLP는 크기가 70-100 nm의 범위에 있는 단계.
로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4,VP7 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 생산을 증가시키는 대체 방법이 또한 제공되며, 다음 단계들을 포함한다:
a) 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 제공하는 단계로서, 하나 이상의 조절 영역은 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 활성이며, 제1 뉴클레오타이드 서열은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 제4 뉴클레오타이드 서열은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하고 제5 뉴클레오타이드 서열은 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 각각의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하는 단계, 및
b) 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 인큐베이션하여, 이로써 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 식물, 제2 식물의 일부, 또는 제2 식물 세포에 의해 생산된 VP4 및 VP7의 수준과 비교하여 VP4 및 VP7의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계.
또한 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 일시적 발현 중에 로타바이러스 구조 단백질 및 비-구조 단백질 NSP4를 암호화하는 핵산을 포함하는 구조체들 간의 비를 조절함으로써, RLP 생산의 수율 및 RLP로의 구조 단백질 VP4 및 VP7의 포함이 향상될 수도 있다는 것이 발견되었다.
어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질, 예를 들어, VP2, VP4, VP6 및/또는 VP7과 함께 로타바이러스 비-구조 단백질, 예를 들어, NSP4의 동시-발현은 RLP로의 VP4 및/또는 VP7의 포함의 증가로 이어질 수도 있다. RLP로의 VP4 및/또는 VP7의 포함의 이 증가는 로타바이러스 단백질의 발현 또는 생산의 증가를 통해 및/또는 RLP 조립 부위에서 RLP의 조립 효율의 증가 및/또는 로타바이러스 단백질의 모집의 증가 때문에 일어날 수도 있다.
도 3A 및 3B에서 나타난 바와 같이, 식물에서 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP6, VP4 및 VP7과 함께 로타바이러스 비-구조 단백질 NSP4의 동시-발현은 NSP4의 존재 없이 구조 단백질 VP2, VP6, VP4 및 VP7의 발현과 비교하여, RLP로의 VP4 및 VP7의 포함의 증가로 이어진다 (도 3B 참조).
두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 구조체 상에서 로타바이러스 구조 단백질 및 비-구조 단백질 NSP4를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 구조체를 제공함으로써 및 숙주에서 구조체를 도입하는 단계 (아그로박테리움을 사용하여 식물, 식물 일부 또는 식물 세포로) 중에 각 구조체의 양을 변화시킴으로써 숙주, 예컨대 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 일시적으로 발현되는 다양한 구조 및 비-구조 단백질을 암호화하는 구조체의 비는 달라질 수도 있다. 예를 들어, 각각 하나의 구조 단백질 및 비-구조 단백질을 암호화하는 다섯 개의 별개의 구조체들은 다양한 비로 동시-도입되어 식물, 식물 일부, 또는 식물 세포 내에서 다양한 비로 핵산의 동시-발현을 초래할 수도 있다. 대안으로, 핵산 서열은 하기 기술된 바와 같이, 두 개, 세 개 또는 네 개의 구조체 상에 다양한 조합으로 제공될 수도 있으며 구조체는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서, 다양한 비로, 동시-도입된다.
추가적으로, 핵산 서열은 같은 구조체 상에 제공될 수도 있다.
"로타바이러스 단백질"은 로타바이러스 구조 단백질 또는 로타바이러스 비구조 단백질을 나타낼 수도 있다. "로타바이러스 구조 단백질"은 임의의 자연 발생한 로타바이러스 균주 또는 분리체, 또는 임의의 자연 발생한 로타바이러스 균주 또는 분리체의 변이체로 존재하는 로타바이러스로부터 분리된 로타바이러스 구조 단백질 모두 또는 일부를 나타낼 수도 있다. 따라서, 용어 로타바이러스 구조 단백질은 자연 발생한 로타바이러스 구조 단백질, 또는 바이러스 생활 주기 동안 돌연변이에 의해 생산되거나 또는 선택압 (예를 들어, 약물 요법, 숙주 세포 굴성(tropism)의 확장, 또는 감염성, 등)에 반응하여 생산될 수도 있는 로타바이러스 구조 단백질의 변이체를 포함한다. 당업자는 이러한 로타바이러스 구조 단백질 및 이것의 변이체가 또한 재조합 기술을 사용하여 생산될 수도 있음을 알고 있다. 로타바이러스 구조 단백질은 캡시드 단백질, 예를 들어, VP2 및 VP6, 표면 단백질, 예를 들어 VP4, 또는 캡시드 및 표면 단백질의 조합을 포함할 수도 있다. 구조 단백질은, 예를 들어, VP7을 더 포함할 수도 있다.
로타바이러스 "비 구조 단백질(non structural protein)", "비구조 단백질(nonstructural protein)", "비-구조 단백질(non-structural protein)", "NSP" 또는 "비구조 로타바이러스 단백질(nonstructural rotavirus protein)"은 로타바이러스 게놈에 의해 암호화되지만 바이러스 입자로 포장되지 않는 단백질을 의미한다. 로타바이러스 비구조 단백질의 비-제한 예는 로타바이러스 NSP4이다.
"동시-발현된"은 두 개, 또는 두 개 이상의 뉴클레오타이드 서열이 식물 내에서, 식물의 같은 조직 내에서 및 식물의 같은 세포 내에서 거의 동시에 발현됨을 의미한다. 뉴클레오타이드 서열은 정확하게 동시에 발현될 필요는 없다. 대신에, 둘 이상의 뉴클레오타이드 서열은 암호화된 생성물이 원하는 세포 구획 내에서 상호작용할 기회를 가지는 방식으로 발현된다. 예를 들어, 비-구조 단백질은 바람직하게는 구조 단백질이 발현되기 전에 또는 구조 단백질이 발현되는 기간 중에 발현될 수도 있다. 둘 이상의 서열이 발현되는 조건 하에 둘 이상의 서열이 거의 동시에 식물 내로 도입되는 경우, 두 개 또는 둘 이상의 뉴클레오타이드 서열은 일시적 발현 시스템을 사용하여 동시-발현될 수 있다. 두 개 또는 둘 이상의 서열은 다른 구조체 상에 존재할 수도 있으며, 동시-발현은 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 각각의 구조체의 도입을 필요로 하거나, 또는 두 개 또는 둘 이상의 서열은 한 구조체 상에 존재할 수도 있으며, 구조체는 식물 또는 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입된다.
용어 "바이러스-유사 입자" (VLP), 또는 "바이러스-유사 입자들" 또는 "VLP"는 자가-조립하고 하나 이상의 구조 단백질, 예컨대, 예를 들어, VP2, VP4, VP6, VP7, 또는 VP2, VP4, VP6, VP7, 구조 단백질의 조합에 제한되는 것이 아니라, 예를 들어, 로타바이러스 구조 단백질을 포함하는 구조를 말한다. 로타바이러스 구조 단백질을 포함하는 VLP는 또한 "로타바이러스 VLP", "로타바이러스 -유사 입자 (RVLP)", "로타바이러스-유사 입자 (RLP)", "로타바이러스-유사 입자", "RVLP" 또는 "RLP"라고 불릴 수도 있다. VLP 또는 RLP는 일반적으로 감염시 생산되는 비리온과 형태상으로 및 항원성으로 유사하지만, 복제하기에 충분한 유전 정보가 없어서 비-감염성이다. VLP는 식물 숙주 세포를 포함하는 적합한 진핵 숙주 세포에서 생산될 수도 있다. 적합한 조건 하에 숙주 세포로부터 추출 이후 및 분리 및 추가의 정제시 VLP는 온전한 구조로 회수될 수도 있다. RLP는 단층, 이중층, 또는 삼중층 RLP일 수도 있다. 삼중층 RLP는 셋 이상의 로타바이러스 구조 단백질의 동시 발현, 및 본원에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 비-구조 단백질과의 동시-발현에 의해 얻어질 수도 있다. 예를 들어, 구조 단백질 VP2, VP6, VP7, VP4 및 비구조 단백질 NSP4의 동시-발현은 삼중층 RLP의 생산을 초래한다.
VP2, VP6, VP7, 및 필요에 따라 하나 이상의 비-구조 단백질과 함께, VLP4의 동시 발현은 고유한 로타바이러스와 유사한 스파이크를 가진 입자를 생성한다. VP4는 VP5 및 VP8을 생산하도록 가공 또는 절단될 수도 있다. 이 가공은 내인성 프로테아제를 사용하여, 또는 적합한 프로테아제, 예를 들어, 트립신, 트립신-유사 프로테아제, 세린 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 서브틸리신을 동시-발현시킴으로써 숙주 내에서 일어날 수도 있다. 대안으로, VP4는 RLP 추출 과정의 임의의 단계 중에, 또는 RLP 정제 후에 적합한 프로테아제, 예를 들어, 트립신, 트립신-유사 프로테아제, 세린 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 서브틸리신을 첨가함으로써 VP5 및 VP8을 생산하도록 가공될 수도 있다.
각각의 로타바이러스 구조 단백질은 다른 특징 및 크기를 가지고 있으며, RLP로의 조립에 다른 양이 필요하다. 용어 "로타바이러스 VLP", "로타바이러스 바이러스-유사 입자 (RVLP)", "로타바이러스 바이러스-유사 입자 (RLP)", "로타바이러스 바이러스-유사 입자", "RVLP" 또는 "RLP"는 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자 (VLP)를 말한다. 로타바이러스 구조 단백질의 예는 VP2, VP4 (또는 VP5 및 VP8) VP6 및 VP7 구조 단백질을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. RLP는 로타바이러스 비구조 단백질을 포함하지 않을 수도 있다.
본 발명은 식물에서 RLP를 생산하는 방법을 제공하는데, 식물에서 활성인 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 하나 이상의 핵산 (N1-N5)은 뉴클레오타이드 서열 R1-R5에 작동 가능하게 결합되고, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, 뉴클레오타이드 서열 R2는 로타바이러스 단백질 X2를 암호화하고, 뉴클레오타이드 서열 R3은 로타바이러스 단백질 X3을 암호화하고, 뉴클레오타이드 서열 R4는 로타바이러스 단백질 X4를 암호화하고 뉴클레오타이드 서열 R5는 로타바이러스 단백질 X5를 암호화하고 X1-X5는 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택되고, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4는 각각 한 번 선택된다 (표 1 참조). 숙주를 형질전환시키는데 사용된 핵산의 최종 세트, 또는 조합은 숙주 내 각각의 로타바이러스 단백질의 발현을 초래하여 그 결과 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 발현되고 RLP가 형성된다.
예를 들어, 표 1을 참조하여, 2개의 핵산 (N1 및 N2)은 숙주를 형질전환시키는데 사용될 수도 있다 (실시예 # 2.1 참조). 이 경우에 N1은 R1 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 R1은 VP2, VP4, VP6, VP7, 또는 NSP4 중 하나를 암호화할 수도 있다. 핵산 N2는 네 개의 서열 R2 내지 R5를 포함하며, 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 숙주 내에서 발현되도록, R2 내지 R5 각각은 R1에 의해 암호화된 단백질이 아닌, VP2, VP4, VP6, VP7, 또는 NSP4 중 하나를 암호화하여, RLP를 생산한다. 비-제한 예로서, N1은 VP2를 암호화할 수도 있는 R1을 포함할 수도 있고, N2는 각각 VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있는 R2 내지 R5를 포함할 수도 있다.
표 1은 VP2, VP4, VP6, 및 VP7를 포함하는 RLP를 생산하기 위해서 숙주 내에서 발현되거나 동시-발현될 수도 있는 핵산 (N), 및 뉴클레오타이드 서열 (R)의 조합의 개요를 제공하며, 이것은 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
Figure pct00001
*조합 1.1, 2.1, 2.2, 3.1, 3.2, 4.1 및 5에 대하여: X 1 , X 2 , X 3 , X 4 및 X 5 은 각각 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 다른 로타바이러스 단백질이어야 한다.
조합 1.3, 2.5 및 3.4에 대하여: X 1 , X 2 및 X 3 은 각각 VP4, VP6 및 NSP4 또는 VP7, VP6 및 NSP4로부터 선택된 다른 로타바이러스 단백질이어야 한다.
조합 1.2, 2.3, 2.4, 3.3 및 4.2에 대하여: X 1 , X 2 , X 3 및 X 4 는 각각 VP2, VP4, VP6 및 NSP4 , VP2, VP7, VP6 및 NSP4 또는 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 다른 로타바이러스 단백질이어야 한다.
1. 하나의 구조체
1.1 5중 유전자 구조체
본원에서 기술된 바와 같이, 식물에서 RLP를 생산하는 방법이 제공되는데, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X1, X2, X3, X4, X5)을 암호화하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, R3, R4, R5)을 포함하는 핵산 (N1; 제1 핵산)이 식물 또는 식물의 일부에서 발현된다 (표 1, 조합 #1.1 참조).
따라서, 핵산 N1은 뉴클레오타이드 서열 R1, R2, R3, R4 및 R5를 포함하는데, X1이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R5는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R5는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, R4, 및 R5는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X5가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1-R3 및 R5는 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1-R4는 X5가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 핵산 N1 상에 포함되며, 이로 인해 형질전환된 숙주에서 각 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 발현이 허용된다.
핵산은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화할 수도 있는 뉴클레오타이드 서열 R1 및 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4로부터 선택된 로타바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 R2-R5를 포함할 수도 있으며, 로타바이러스 단백질은 R1에 의해 암호화되지 않는다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP2를 암호화하지 않을 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아닌 또 다른 예에서, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP4를 암호화하지 않을 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP6을 암호화하지 않을 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아닌 또 다른 예에서, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP7을 암호화하지 않을 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아닌 또 다른 예에서, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 NSP4를 암호화하지 않을 수도 있다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4), 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함한다.
추가의 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함한다.
추가의 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함한다.
추가의 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함한다 (도 5 참조). 식물은 각각의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 단백질이 식물에서 발현되도록 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, R3, R4, R5)을 포함하는 단일 핵산 (N1)으로 형질전환될 수도 있다. 로타바이러스 단백질은 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 식물에서 발현되도록 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된다. 단일 핵산은 일시적 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다.
VP4는 적합한 프로테아제, 예를 들어, 트립신, 트립신-유사 프로테아제, 세린 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 서브틸리신을 암호화하는 핵산을 동시-발현시킴으로써 숙주 내에서 VP5 및 VP8을 생산하도록 가공 또는 절단될 수도 있다. 대안으로, VP4는 RLP 추출의 임의의 단계 중에, 또는 RLP 정제 후에 적합한 프로테아제, 예를 들어, 트립신, 트립신-유사 프로테아제, 세린 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 서브틸리신을 첨가함으로써 가공될 수도 있다.
1.2. 4중 유전자 구조체
본원에서 기술된 바와 같이, 식물에서 RLP를 생산하는 방법이 제공되는데, 제1, 제2, 제3 및 제4 로타바이러스 단백질 (X1, X2, X3, X4)을 암호화하는 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, R3, R4)을 포함하는 핵산 (N1; 제1 핵산)이 식물 또는 식물의 일부에서 발현된다 (표 1, 조합 #1.2 참조).
따라서, 핵산 N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, R3, R4)을 포함할 수도 있는데, X1이 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1, R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 핵산 N1 상에 포함되며, 이로 인해 형질전환된 숙주에서 각 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 발현이 허용된다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 및 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함한다.
또한 따라서, 핵산 N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, R3, R4)을 포함할 수도 있는데, X1이 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP7, VP6 및 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 핵산 N1 상에 포함되며, 이로 인해 형질전환된 숙주에서 각 로타바이러스 단백질 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 발현이 허용된다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 및 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함한다.
또한 따라서, 핵산 N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, R3, R4)을 포함할 수도 있는데, X1이 VP7, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP7, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP7, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP7, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP7, VP4, VP6 및 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 핵산 N1 상에 포함되며, 이로 인해 형질전환된 숙주에서 각 로타바이러스 단백질 VP7, VP4, VP6 및 NSP4의 발현을 허용한다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 및 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함한다.
1. 3 삼중 유전자 구조체
본원에서 기술된 바와 같이, 식물에서 RLP를 생산하는 방법이 제공되는데, 제1, 제2 및 제3 로타바이러스 단백질 (X1, X2, X3)을 암호화하는 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, R3)을 포함하는 핵산 (N1; 제1 핵산)이 식물 또는 식물의 일부에서 발현된다 (표 1, 조합 #1.3 참조).
따라서, 핵산 N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, R3)을 포함할 수도 있는데, X1이 VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R3은 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3은 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1, R2는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP4, VP6 및 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 핵산 N1 상에 포함되며, 이로 인해 형질전환된 숙주에서 각 로타바이러스 단백질 VP4, VP6 및 NSP4의 발현을 허용한다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함한다.
또한 따라서, 핵산 N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, R3)을 포함할 수도 있는데, X1이 VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R3은 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3은 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1, R2는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP7, VP6 및 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 핵산 N1 상에 포함되며, 이로 인해 형질전환된 숙주에서 각 로타바이러스 단백질 VP7, VP6 및 NSP4의 발현을 허용한다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함한다.
1. 두 개의 구조체
2.1. 4중 유전자 구조체 + 단일 유전자 구조체
본 발명은 또한 식물에서 RLP를 생산하는 방법을 제공하는데, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 식물에서 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열 (R1-R5)이 동시-발현되도록, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X2-X5)을 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다 (표1, 조합 #2.1 참조).
이 비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R2, R3, R4, R5)을 포함하는데, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질은 구조체 N1 및 N2 둘 다의 조합으로 암호화되고, X1이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R5는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R5는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, R4, 및 R5는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X5가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 -R3 및 R5는 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R4는 X5가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP2를 암호화하지 않을 수도 있다. 추가의 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP4를 암호화하지 않을 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP6을 암호화하지 않을 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아닌 또 다른 예에서, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP7을 암호화하지 않을 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 NSP4를 암호화하지 않을 수도 있다.
제1 핵산 (N1) 및 제2 핵산 (N2)은 같은 단계에서 식물로 도입될 수도 있거나, 또는 순차적으로 식물에 도입될 수도 있다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP7, VP4, VP6 및 VP2를 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다 (도 5 참조).
추가의 비-제한 예에서, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP4, VP7, VP6 및 VP2를 암호화하는 네 개의 순차적인 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP7, VP4, VP2 및 VP6을 암호화하는 네 개의 순차적인 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP4, VP7, VP2 및 VP6을 암호화하는 네 개의 순차적인 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP6, VP2, VP4 및 VP7을 암호화하는 네 개의 순차적인 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP6, VP2, VP7 및 VP4를 암호화하는 네 개의 순차적인 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화하는 네 개의 순차적인 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP7, VP6, VP4 및 VP2를 암호화하는 네 개의 순차적인 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP7을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4, VP2, VP6 및 VP4를 암호화하는 네 개의 순차적인 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다. 또 다른 비-제한 예에서, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (N1)은 각각 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어 NSP4, VP2, VP6 및 VP7을 암호화하는 네 개의 순차적인 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다.
제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X2-X5)을 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)으로 형질전환될 수도 있다. 게다가, 로타바이러스 단백질 X2-X5를 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제1 핵산 (N2)을 발현하는 식물은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열 R1-R5가 식물에서 동시-발현되도록 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제2 핵산 (N1)으로 형질전환될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1은 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있고, 로타바이러스 단백질 X2-X5는 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 발현되도록, X1이 아닌, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있다. 게다가, 식물은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열 R1-R5가 식물에서 동시-발현되도록 로타바이러스 단백질 X2-X5를 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제1 핵산 (N2), 및 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제2 핵산 (N1)과 동시에 동시-발현될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1은 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있고, 로타바이러스 단백질 X2-X5는 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 발현되도록, X1에 대하여 선택된 단백질이 아닌, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있다. 제1 핵산 (N1) 및 제2 핵산 (N2)은 일시적 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질 (X1), 예를 들어, NSP4를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 식물은 NSP4, VP7, VP4, VP6 및 VP2가 식물에서 동시-발현되도록, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X2-X5), 예를 들어 VP7, VP4, VP6 및 VP2를 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)으로 형질전환될 수도 있다.
제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 제1 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X1-X5)을 동시-발현하는 자손 식물 (제3 식물)을 생산하기 위해서 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X2-X5)을 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다. 게다가, 로타바이러스 단백질 X2-X5를 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제1 핵산 (N2)을 발현하는 제1 식물은 뉴클레오타이드 서열 R1-R5가 자손 식물에서 동시-발현되도록, 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제2 핵산 (N1)을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다. 로타바이러스 단백질은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있으며, 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 자손 식물에서 발현되도록 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 선택된다.
VP4는 적합한 프로테아제, 예를 들어, 트립신, 트립신-유사 프로테아제, 세린 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 서브틸리신을 암호화하는 핵산을 동시-발현시킴으로써 숙주 내에서 VP5 및 VP8을 생산하도록 가공 또는 절단될 수도 있다. 대안으로, VP4는 RLP 추출의 임의의 단계 중에, 또는 RLP 정제 후에 적합한 프로테아제, 예를 들어, 트립신, 트립신-유사 프로테아제, 세린 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 서브틸리신을 첨가함으로써 가공될 수도 있다.
2.2 삼중 유전자 구조체 + 이중 유전자 구조체
본 발명은 또한 식물에서 RLP를 생산하는 방법을 제공하는데, 각각 제1 로타바이러스 단백질 (X1) 및 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 두 개의 뉴클레오타이드 서열 (R1 및 R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X3-X5)을 암호화하는 세 개의 뉴클레오타이드 서열 (R3-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #2.2 참조).
비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R3, R4, R5)을 포함하는데, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 R1은 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R5는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R5는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, R4, 및 R5는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X5가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 -R3 및 R5는 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R4는 X5가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
그러므로, 제1 핵산 (N1)은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화할 수도 있는 뉴클레오타이드 서열 R1 및 R1에 의해 암호화된 것이 아닌, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질을 암호화할 수도 있는 제2 뉴클레오타이드 서열 R2를 포함할 수도 있다. 제2 핵산 (N2)은 R1 또는 R2에 의해 암호화되는 로타바이러스 단백질이 아닌, 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 R3-R5를 포함할 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP2를 암호화하지 않을 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화할 수도 있다.
제1 및 제2 로타바이러스 단백질 (X1 + X2)을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열 (R1 + R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X3-X5)을 암호화하는 세 개의 뉴클레오타이드 서열 (R3-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)으로 형질전환될 수도 있다. 제1 핵산 (N1) 및 제2 핵산 (N2)은 일시적 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다.
게다가, 제1, 제2 및 제3 로타바이러스 단백질 (X3-X5)을 암호화하는 세 개의 뉴클레오타이드 서열 (R3-R5)을 포함하는 제1 핵산 (N2)을 발현하는 식물은 제1 및 제2 핵산 R1-R5가 식물에서 동시-발현되도록, 제4 로타바이러스 단백질 (X1) 및 제5 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제2 핵산 (N1)으로 형질전환될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1은 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있고, 로타바이러스 단백질 X2-X5는 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 발현되도록, X1이 아닌, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 제1, 제2 및 제3 로타바이러스 단백질 (X3-X5), 예를 들어, VP7, VP4 및 VP6을 암호화하는 세 개의 뉴클레오타이드 서열 (R3-R5)을 포함하는 제1 핵산 (N2)을 발현하는 식물은 NSP4, VP7, VP4, VP6 및 VP2가 식물에서 동시-발현되도록, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X1-X2), 예를 들어, VP2 및 NSP4를 암호화하는 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열 (R1 -R2)을 포함하는 제2 핵산 (N1)으로 형질전환될 수도 있다. 게다가, 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제1 및 제2 로타바이러스 단백질 (X1 + X2)을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열 (R1 + R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1), 및 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X3-X5)을 암호화하는 세 개의 뉴클레오타이드 서열 (R3-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)으로 동시에 동시-형질전환될 수도 있다. 제1 핵산 (N1) 및 제2 핵산 (N2)은 일시적 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다.
제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1) 및 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 제1 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X1-X5)을 동시-발현하는 자손 식물 (제3 식물)을 생산하기 위해, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X3-X5)을 발현하는 세 개의 뉴클레오타이드 서열 (R3-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다. 게다가, 로타바이러스 단백질 X3-X5를 암호화하는 세 개의 뉴클레오타이드 서열 (R3-R5)을 포함하는 제1 핵산 (N2)을 발현하는 제1 식물은 뉴클레오타이드 서열 R1-R5가 자손 식물에서 동시-발현되도록, 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1) 및 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N1)을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다. 로타바이러스 단백질은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있으며, 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 자손식물에서 발현되도록, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 선택된다.
2.3. 삼중 유전자 구조체 + 단일 유전자 구조체
본 발명은 또한 식물에서 RLP를 생산하는 방법을 제공하는데, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 하나의 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제2, 제3 및 제4 로타바이러스 단백질 (X2-X4)을 암호화하는 세 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R4)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #2.3 참조).
비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R2, R3, R4)을 포함하는데, VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고, X1이 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
추가의 비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R2, R3, R4)을 포함하는데, VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP7, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
추가의 비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R2, R3, R4)을 포함하는데, VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP4, VP7, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
2. 4 두 개의 이중 유전자 구조체
본 발명은 또한 식물에서 RLP를 생산하는 방법을 제공하는데, 제1 및 제2 로타바이러스 단백질 (X1-X2)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1-R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제3 및 제4 로타바이러스 단백질 (X3-X4)을 암호화하는 두 개의 뉴클레오타이드 서열 (R3-R4)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #2.4 참조).
비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R3, R4)을 포함하는데, VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
추가의 비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R3, R4)을 포함하는데, VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP7, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
추가의 비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R3, R4)을 포함하는데, VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고 R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP4, VP7, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
2.5 이중 유전자 구조체 + 단일 유전자 구조체
본 발명은 또한 식물에서 RLP를 생산하는 방법을 제공하는데,
제1 및 제2 로타바이러스 단백질 (X1-X2)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1-R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제2 핵산 (N2)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #2.5 참조).
비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는데, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R3은 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3은 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 및 R2는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP4, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
추가의 비-제한 예에서, N1은 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2)을 포함하고 N2는 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는데, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R3은 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3은 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 및 R2는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP7, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
1. 세 개의 구조체
3.1 두 개의 이중 유전자 구조체 + 하나의 단일 유전자 구조체
본 발명은 또한 식물에서 RLP를 생산하는 방법을 제공하는데, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1) 및 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3) 및 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제2 핵산 (N2) 및 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제3 핵산 (N3)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #3.1 참조).
이 비-제한 예에서, N1은 (R1, R2)를 포함하고, N2는 (R3, R4)를 포함하고 N3는 (R5)를 포함하는데, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R5는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R5는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, R4, 및 R5는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X5가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 -R3 및 R5는 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R4는 X5가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
예를 들어, 제1 핵산 (N1)은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화할 수도 있는 뉴클레오타이드 서열 R1 및 R1에 의해 암호화되지 않는 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질을 암호화할 수도 있는 제2 뉴클레오타이드 서열 R2를 포함할 수도 있다. 제2 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 R3 및 R4를 포함할 수도 있는데, R3은 R1 또는 R2에 의해 암호화되는 로타바이러스 단백질이 아닌, 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화하고, R4는 R1, R2 또는 R3에 의해 암호화되는 로타바이러스 단백질이 아닌, 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화한다. 제3 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 R5를 포함할 수도 있는데, R5는 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4가 숙주에서 발현되도록, R1, R2, R2 또는 R4에 의해 암호화되는 로타바이러스 단백질이 아니라, 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화한다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP2를 암호화하지 않을 수도 있다. 또 다른 예에서, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화할 수도 있다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP6을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1) 및 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP2를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어, VP7을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3) 및 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP4를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제2 핵산 (N2) 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어, NSP4를 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제3 핵산 (N3)과 동시-발현된다 (도 2 및 3 참조).
제1 로타바이러스 단백질 (X1) 및 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 식물은 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3) 및 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제2 핵산 (N2)으로 형질전환될 수도 있다. 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제3 핵산 (R3)으로 추가로 형질전환될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1-X5는 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택될 수도 있으며, 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 식물에서 발현되도록, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 선택된다. 게다가, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 식물은 제1 및 제2 로타바이러스 단백질 (X1 + X2)을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열 (R1 + R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1), 제3 및 제4 로타바이러스 단백질 (X3 + X4)을 암호화하는 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열 (R3 + R4)을 포함하는 제2 핵산 (N2), 및 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제3 핵산 (N3)으로 동시에 동시-형질전환될 수도 있다. 제1 핵산 (N1), 제2 핵산 (N2) 및 제3 핵산 (N3)은 일시적 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다.
3.2 두 개의 단일 유전자 구조체 + 하나의 삼중 유전자 구조체
식물에서 RLP 생산의 대체 방법이 또한 제공되는데, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2) 및 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제3 핵산 (N3)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #3.2 참조).
대안의 예에서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고 N3은 (R3, R4, R5)를 포함하는데, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R5는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R5는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, R4, 및 R5는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X5가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 -R3 및 R5는 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R4는 X5가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 제1 핵산 (N1)은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화할 수도 있는 뉴클레오타이드 서열 R1 및 R1에 의해 암호화되는 것이 아닌 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질을 암호화할 수도 있는 제2 뉴클레오타이드 서열 R2를 포함할 수도 있다. 제2 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 R3 및 R4를 포함할 수도 있는데, R3은 R1 또는 R2에 의해 암호화되는 로타바이러스 단백질이 아닌, 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화하고 R4는 R1, R2 또는 R3에 의해 암호화되는 로타바이러스 단백질이 아닌, 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화한다. 제3 뉴클레오타이드 서열은 R1, R2, R3 또는 R4에 의해 암호화되는 로타바이러스 단백질이 아니라, 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 R5를 포함할 수도 있으며, VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4가 암호화된다. 예를 들어 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP2를 암호화하지 않을 수도 있다. 또 다른 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화할 수도 있다.
제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 식물은 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2)으로 형질전환될 수도 있다. 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 식물은 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제3 핵산 (N3)으로 추가로 형질전환될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1-X5는 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택될 수도 있으며, 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 식물에서 발현되도록, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 선택된다. 게다가, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 식물은 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1), 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2), 및 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X3-X5)을 암호화하는 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열 (R3-R5)을 포함하는 제3 핵산 (N3)으로 동시에 동시-형질전환될 수도 있다. 제1 핵산 (N1), 제2 핵산 (N2) 및 제3 핵산 (N3)은 일시적 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다.
예를 들어, 제1, 제2 및 제3 로타바이러스 단백질 (X1, X2, 및 X3)을 암호화하는 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열 (R1, R2, 및 R3)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 제1 식물은 자손 식물 (제3 식물)을 생산하기 위해 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다. 제3 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X1-X5)을 동시-발현하는 자손 식물을 생산하기 위해 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제3 핵산 (N3)을 발현하는 제4 식물과 교배될 수도 있다. 게다가, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 제1 식물은 자손 식물 (제3 식물)을 생산하기 위해 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다. 제3 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X1-X5)을 동시-발현하는 자손 식물을 생산하기 위해 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X3, X4, 및 X5)을 암호화하는 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열 (R3, R4 및 R5)을 포함하는 제3 핵산 (N3)을 발현하는 제4 식물과 교배될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1-X5는 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 식물에서 발현되도록, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택될 수도 있다.
3.3 두 개의 단일 유전자 구조체 + 하나의 이중 유전자 구조체
식물에서 RLP 생산의 대체 방법이 또한 제공되는데, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2) 및 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3), 및 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제3 핵산 (N3)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #3.3 참조).
비-제한 예로서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고 N3은 (R3, R4)를 포함하는데, VP2, VP4, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP2, VP4, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
또 다른 비-제한 예로서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고 N3은 (R3, R4)를 포함하는데, VP2, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP2, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP6, VP7 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
추가의 비-제한 예로서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고 N3은 (R3, R4)를 포함하는데, VP4, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP4, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP4, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP4, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP4, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP4, VP7, VP6, 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
3.4 세 개의 단일 유전자 구조체
식물에서 RLP 생산의 대체 방법이 또한 제공되는데, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2) 및 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #3.4 참조).
비-제한 예로서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고 N3은 (R3)을 포함하는데, VP4, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암화화되고 X1이 VP4, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP4, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R3은 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP4, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3은 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 및 R2는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP4, VP6, 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
추가의 비-제한 예로서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고 N3은 (R3)을 포함하는데, VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고 X1이 VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R3은 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP7, VP6, 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3은 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 및 R2는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP7, VP6, 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
1. 네 개의 구조체
4.1. 세 개의 단일 유전자 구조체 + 하나의 이중 유전자 구조체
또한 본원에서는 식물에서 RLP를 생산하는 방법이 제공되는데, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2), 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3), 및 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제4 핵산 (N4)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #4.1 참조).
이 예에서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고, N3은 (R3)을 포함하고, N4는 (R4, 및 R5)를 포함하는데, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고, X1이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R5는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R5는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, R4, 및 R5는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X5가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 -R3 및 R5는 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R4는 X5가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
네 개의 핵산이 임의의 순서로 식물로 도입될 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것은 아니지만, 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 식물은 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2)으로 형질전환될 수도 있다. 식물은 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3)으로 추가로 형질전환될 수도 있다. 그 이후 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제4 핵산 (N4)으로 추가로 형질전환될 수도 있다. 게다가, 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1), 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2), 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3), 및 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X4-X5)을 암호화하는 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열 (R4-R5)을 포함하는 제4 핵산 (N4)으로 동시에 동시-형질전환될 수도 있다. 제1 핵산 (N1), 제2 핵산 (N2), 제3 핵산 (N3) 및 제4 핵산 (N4)은 일시적 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다.
게다가, 제1 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제2 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제1 핵산 (N4)을 발현하는 식물은 제3 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제2 핵산 (N1)으로 형질전환될 수도 있다. 식물은 제4 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제3 핵산 (N2)으로 추가로 형질전환될 수도 있다. 그 이후 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R3) 및 제5 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제4 핵산 (N3)으로 추가로 형질전환될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1-X5는 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택될 수도 있으며, 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 식물에서 발현되도록, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 선택된다. 제1 핵산 (N4), 제2 핵산 (N1), 제3 핵산 (N2) 및 제4 핵산 (N3)은 일시적 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다.
제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 제1 식물은 자손 식물 (제3 식물)을 생산하기 위해 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다. 제3 식물은 자손 식물 (제5 식물)을 생산하기 위해 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3)을 발현하는 제4 식물과 교배될 수도 있다. 제5 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X1-X5)을 동시-발현하는 자손 식물을 생산하기 위해 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제4 핵산 (N4)을 발현하는 제6 식물과 교배될 수도 있다.
게다가, 제1 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R4) 및 제2 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제1 핵산 (N4)을 발현하는 제1 식물은 자손 식물 (제3 식물)을 생산하기 위해 제3 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다. 제3 식물은 자손 식물 (제5 식물)을 생산하기 위해 제4 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제3 핵산 (N2)을 발현하는 제4 식물과 교배될 수도 있다. 제5 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X1-X5)을 동시-발현하는 자손 식물을 생산하기 위해 제5 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 발현하는 제6 식물과 교배될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1-X5는 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택될 수도 있으며, 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 식물에서 발현되도록, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 선택된다.
4.2 네 개의 단일 유전자 구조체
또한 본원에서는 식물에서 RLP를 생산하는 방법이 제공되는데, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2), 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3), 및 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제4 핵산 (N4)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #4.2 참조).
비-제한 예에서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고, N3은 (R3)을 포함하고, N4는 (R4)를 포함하는데, VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고, X1이 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
추가의 비-제한 예에서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고, N3은 (R3)을 포함하고, N4는 (R4)를 포함하는데, VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고, X1이 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP7, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
추가의 비-제한 예에서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고, N3은 (R3)을 포함하고, N4는 (R4)를 포함하는데, VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 각각의 로타바이러스 단백질이 암호화되고, X1이 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R4는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R4는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP4, VP7, VP6 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, 및 R4는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R3은 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP4, VP7, VP6 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
1. 다섯 개의 구조체
5. 다섯 개의 단일 유전자 구조체
본 발명은 또한 식물에서 RLP를 생산하는 방법을 제공하는데, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2) 및 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3) 및 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제4 핵산 (N4) 및 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제5 핵산 (R5)과 동시-발현된다 (표 1, 조합 #5 참조).
이 비-제한 예에서, N1은 (R1)을 포함하고, N2는 (R2)를 포함하고, N3은 (R3)을 포함하고, N4는 (R4)를 포함하고 N5는 (R5)를 포함하는데, 각각의 로타바이러스 단백질은 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택되고, X1이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1은 로타바이러스 단백질 X1을 암호화하고, X2가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R2-R5는 X1이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X3이 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 및 R3-R5는 X2가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X4가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 R2, R4, 및 R5는 X3이 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, X5가 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택된 임의의 로타바이러스 단백질일 수도 있는 경우, R1 -R3 및 R5는 X4가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하고, R1 -R4는 X5가 아닌 로타바이러스 단백질을 암호화하며, 그 결과 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 숙주에서 발현된다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP2를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP4, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있지만, R2-R5는 VP2를 암호화하지 않을 수도 있다. 추가의 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP6, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP7 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것은 아니지만, 또 다른 예에서, 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 VP7을 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 NSP4를 암호화할 수도 있다. 또 다른 비-제한 예에서 뉴클레오타이드 서열 R1은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화할 수도 있고 뉴클레오타이드 서열 R2-R5는 임의의 순서로 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화할 수도 있다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP2를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)은 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP6을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어, VP4를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3), 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어 VP7을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제4 핵산 (N4) 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어, NSP4를 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제5 핵산 (N5)과 동시-발현된다 (도 3 참조).
다섯 개의 핵산은 임의의 순서로 식물로 도입될 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 식물은 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2)으로 형질전환될 수도 있다. 식물은 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3)으로 추가로 형질전환될 수도 있다. 그 이후 식물은 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제4 핵산 (N4)으로 추가로 형질전환될 수도 있다. 그 이후 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제4 로타바이러스 단백질 (X5)를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제5 핵산 (N5)으로 추가로 형질전환될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1-X5는 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택될 수도 있으며, 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 식물에서 발현되도록, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 선택된다. 게다가, 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열이 식물에서 동시-발현되도록, 제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1), 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2), 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3), 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제4 핵산 (N4), 및 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제5 핵산 (N5)과 동시에 동시-형질전환될 수도 있다. 제1 핵산 (N1), 제2 핵산 (N2), 제3 핵산 (N3), 제4 핵산 (N4) 및 제5 핵산 (N5)은 일시적 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다.
제1 로타바이러스 단백질 (X1)을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 발현하는 제1 식물은 자손 식물 (제3 식물)을 생산하기 위해 제2 로타바이러스 단백질 (X2)을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다. 제3 식물은 자손 식물 (제5 식물)을 생산하기 위해 제3 로타바이러스 단백질 (X3)을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3)을 발현하는 제4 식물과 교배될 수도 있다. 제5 식물은 자손 식물 (제7 식물)을 생산하기 위해 제4 로타바이러스 단백질 (X4)을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제4 핵산 (N4)을 발현하는 제6 식물과 교배될 수도 있다. 제7 식물은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질 (X1-X5)을 동시-발현하는 자손 식물을 생산하기 위해 제5 로타바이러스 단백질 (X5)을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제5 핵산 (N5)을 발현하는 제8 식물과 교배될 수도 있다. 로타바이러스 단백질 X1-X5는 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4의 군으로부터 선택될 수도 있으며, 각각의 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 식물에서 발현되도록, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4가 선택된다.
숙주를 형질전환하는데 사용된 핵산 (N)의 비
도 5에서 도시된 바와 같이, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 RLP 축적의 수준은 식물에서 발현되는 로타바이러스 구조 및 비구조 단백질을 암호화하는 핵산의 비에 영향을 받을 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 식물로 도입되는 핵산 (N)의 비는, 각각의 아그로박테리움이 상기 표 1 (및 첨부된 텍스트)에서 제시된 핵산 (N)을 포함하는 구조체를 포함하는 경우, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에 침투하는데 사용된, 다른 양의 아그로박테리 움을 제공함으로써 변경될 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것은 아니지만, 예를 들어, 구조 단백질-함유 아그로박테리움 대 비구조 단백질-함유 아그로박테리움의 비는, 예를 들어, 약 0.8:1 내지 약 2.5:1.5 (구조 단백질: 비구조 단백질)의 범위에 있을 수도 있거나, 또는 그 사이의 임의의 양, 예를 들어, 약 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:0.5, 2:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.5:1.1, 2.5:1.2, 2.5:1.3, 2.5:1.4, 2.5:1.5 (구조 단백질: 비구조 단백질), 또는 그 사이의 임의의 양일 수도 있다.
예를 들어, 하기 기술된 바와 같이, 구조 로타바이러스 단백질 대 비구조 단백질의 비는, 예를 들어, 로타바이러스 구조 및 비-구조 단백질 (X)을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 (R)을 포함하는 하나 이상의 핵산 (N)을 함유하는, 다른 비의 아그로박테리움을 숙주, 예를 들어 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입함으로써 달라질 수도 있다. 예를 들어, 박테리아 현탁액에서 아그로박테리움 균주의 흡광도 또는 광학 밀도 (OD)는 구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움 균주 대 비구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움 균주의 비를 확립하기 위한 측정값으로서 사용될 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것은 아니지만, 예를 들어, OD는, 예를 들어, 약 0.2:0.4 내지 약 1:0.6 (박테리아 현탁액 중 아그로박테리움 균주 함유 구조 단백질: 아그로박테리움 균주 함유 비구조 단백질)의 범위에 있을 수도 있거나 또는 그 사이의 임의의 양, 예를 들어 약 0.2:0.4, 0.3:0.4, 0.4:0.4, 0.5:0.4, 0.6:0.4, 0.7:0.4, 0.8:0.4, 0.9:0.4, 1:0.4, 0.2:0.5, 0.3:0.5, 0.4:0.5, 0.5:0.5, 0.6:0.5, 0.7:0.5, 0.8:0.5, 0.9:0.5, 1:0.5, 0.2:0.6, 0.3:0.6, 0.4:0.6, 0.5:0.6, 0.6:0.6, 0.7:0.6, 0.8:0.6, 0.9:0.6, 1:0.6, 0.3:0.4, 0.3:0.5, 0.3:0.6, 0.4:0.4, 0.4:0.5, 0.4:0.6, 0.5:0.4, 0.5:0.5, 0.5:0.6, 0.6:0.4, 0.6:0.5, 0.6:0.6, 0.7:0.4, 0.7:0.5, 0.7:0.6, 0.8:0.4, 0.8:0.5, 0.8:0.6, 0.9:0.4, 0.9:0.5, 0.9:0.6, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6 (박테리아 현탁액에서 아그로박테리움 균주 함유 구조 단백질: 아그로박테리움 균주 함유 비구조 단백질) 또는 그 사이의 임의의 양일 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것은 아니지만, 예를 들어, 박테리아 현탁액에서 아그로박테리움 균주의 0.4의 OD는 1의 기준으로 지정될 수도 있다. 그러므로 구조 단백질 대 비 구조 단백질의 1.5:1의 비는 구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움 균주의 0.6의 OD 대 박테리아 현탁액에서 비 구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움 균주의 0.4의 OD를 사용함으로써 달성될 수도 있다.
로타바이러스 구조 단백질 대 비구조 단백질의 비는 로타바이러스 구조 및 비-구조 단백질 (X)을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 (R)을 포함하는 하나 이상의 핵산 (N)을 함유하는, 다른 비의 아그로박테리움을 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입함으로써 달라질 수도 있다. 대안으로, 로타바이러스 구조 단백질 및 비구조 단백질이 같은 구조체 상에 존재하고, 그러므로 하나의 아그로박테리움을 사용하여 식물, 식물 일부 또는 식물 세포로 도입되면, 그것들은 원하는 비의 로타바이러스 구조 단백질 및 비구조 단백질이 얻어지도록 적합한 프로모터를 사용하여 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서 차등적으로 발현될 수도 있다.
그러므로 본원에서 기술된 바와 같이, 로타바이러스 구조 단백질 (X)을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 (R)을 포함하는 하나 이상의 핵산 (N) 대 로타바이러스 비구조 단백질 (X)을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 (R)을 포함하는 하나 이상의 핵산 (N)의 비를 조절함으로써 RLP 생산 수율을 증가시키거나, VP4 및 VP7 수율을 증가시키거나, 또는 RLPS 및 VP4 및 VP7 수율 둘 다를 증가시키는 방법이 제공된다.
예를 들어, 로타바이러스 비구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트는 식물, 식물 일부 또는 식물 세포에 침투하기 위한 아그로박테리움 사용의 총량의 20% 내지 60% 또는 그 사이의 임의의 양일 수도 있다. 예를 들어, 로타바이러스 비구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트 비율은 식물, 식물 일부 또는 식물 세포에 침투하기 위한 총 아그로박테리움 사용의 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 또는 그 사이의 임의의 양일 수도 있다. 유사하게, 침투된 아그로박테리움의 총량 내에서 구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트는 식물, 식물 일부 또는 식물 세포에 침투하기 위한 총 아그로박테리움 사용의 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41% 또는 40% 또는 그 사이의 임의의 양일 수도 있다.
예를 들어, 로타바이러스 구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움 대 비구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트 비는 70%:30%, 60%:40%, 50%:50%, 40%:60% 또는 그 사이의 임의의 퍼센트 비의 양일 수도 있다. 예를 들어, 구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움 대 비구조 단백질을 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트 비는 50%:50%, 51%:49%, 52%:48%, 53%:47%, 54%:46%, 55%:45%, 56%:44%, 57%:43%, 58%:42%, 59%: 41%, 60%:40%, 또는 그 사이의 임의의 퍼센트 피일 수도 있다.
하기 기술된 바와 같이, 로타바이러스 구조 단백질 대 로타바이러스 비구조 단백질의 비는 예를 들어 로타바이러스 구조 단백질 및 로타바이러스 비구조 단백질을 차등적으로 발현시킴으로써 더 달라질 수도 있다. 발현은, 예를 들어, 로타바이러스 구조 단백질, 로타바이러스 비구조 단백질, 또는 로타바이러스 구조 단백질 및 로타바이러스 비구조 단백질 둘 다의 복제, 전사, 번역, 또는 이것들의 조합을 조절함으로써 달라질 수도 있다. 예를 들어, 프로모터를 포함하는 다른 조절 요소, 증폭 요소, 인핸서 또는 이것들의 조합은 상기 기술된 바와 같이 침투된 로타바이러스 구조 단백질-함유 아그로박테리움 대 로타바이러스 비구조 단백질-함유 아그로박테리움의 비를 달라지게 하는 것 이외에도 사용될 수 있다.
조절 요소의 제1 세트 또는 조합은 로타바이러스 구조 단백질을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산의 복제, 전사 또는 이것들의 조합을 조절하는데 사용될 수도 있고 조절 요소의 제2 세트 또는 조합은 로타바이러스 비구조 단백질을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 복제, 전사 또는 이것들의 조합을 조절하는데 사용될 수도 있다. 조절 요소의 제1 세트 또는 조합은 조절 요소의 제2 세트 또는 조합과는 다르며 생체 내에서 로타바이러스 구조 단백질:로타바이러스 비구조 단백질의 비의 조절을 허용하기 위해 로타바이러스 구조 단백질을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 및 로타바이러스 비구조 단백질을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산의 차등적 발현을 허용한다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 조절 요소의 하나의 세트 또는 조합, 예를 들어, 제1 세트는 인핸서 요소, 예를 들어, CPMV로부터 얻어진 요소, 예컨대 CPMV HT, 또는 CPMV 160을 포함할 수도 있다 (도 6 참조). CMPV HT는 US 61/971,274 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술되고 CPMV 160은 US 61/925,852 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다. 인핸서 요소, 예를 들어, CPMV로부터 얻어진 것들, 예를 들어 CPMV HT 또는 CPMV 160 (도 6; 각각 US 61/971,274, 및 US 61/925,852 참조)은 조절 요소의 다른 세트 또는 조합, 예를 들어, 제2 세트에 없을 수도 있다. 대안으로, 제2 세트는 인핸서 요소 (예를 들어, CPMV로부터 얻어진 요소, (예를 들어 CPMV HT 또는 CPMV 160)를 포함할 수도 있지만, 증폭 요소 (예를 들어, CPMV로부터 얻어진 요소, 예를 들어 CPMV HT 또는 CPMV 160)는 조절 요소의 제1 세트 또는 조합에 없을 수도 있다. 유사한 방식으로, 로타바이러스 비구조 단백질에 대한 로타바이러스 구조 단백질 간의 차등적 발현이 생체 내에서 달성되도록, 프로모터의 강도가 조절 요소의 제1 및 제2 세트 또는 조합 간에 다를 수도 있거나, 또는 프로모터들 중 하나는 유도성이고, 다른 하나는 구성성일 수도 있다.
예를 들어, 로타바이러스 구조 단백질 대 비구조 단백질의 비는, 예를 들어, 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 로타바이러스 비구조 단백질 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 함유하는 아그로 박테리움 대 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 임의의 순서로 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 함유하는 아그로박테리움의 다른 비를 도입함으로써 달라질 수도 있다. 예를 들어, 로타바이러스 비구조 단백질 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)을 함유하는 아그로박테리움 대 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 함유하는 아그로박테리움의 비는 0.8:1 및 1:2 (N1을 함유하는 아그로박테리움 대 N2를 함유하는 아그로박테리움) 또는 그 사이의 임의의 양, 예를 들어, 1:1.5 (N1을 함유하는 아그로박테리움 대 N2를 함유하는 아그로박테리움)일 수도 있다.
게다가, 로타바이러스 구조 단백질 대 비구조 단백질의 비는 인핸서 요소를 사용하여 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서 로타바이러스 구조 단백질 및 비구조 단백질을 별도로 발현시킴으로써 달라질 수도 있다. 예를 들어, 로타바이러스 구조 단백질 대 비구조 단백질의 비는, 예를 들어, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 비구조 단백질 NSP4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1)과 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 임의의 순서로 로타바이러스 구조 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7을 암호화하는 네 개의 뉴클레오타이드 서열 (R2-R5)을 포함하는 제2 핵산 (N2)을 동시-발현시킴으로써 달라질 수도 있으며, 하기 기술된 바와 같이, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 인핸서 서열, 예를 들어, CPMV HT, CPM 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+에 작동 가능하게 결합된다 (각각 US 61/971,274, 및 US 61/925,852에서 기술되며, 본원에서 참조로 포함된다). 또 다른 예에서, 로타바이러스 구조 단백질 대 비구조 단백질의 비는, 예를 들어, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP6 또는 VP7을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1) 및 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP2 또는 VP4를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제1 핵산 (N1), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP7 또는 VP6을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3) 및 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP4 또는 VP2를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제2 핵산 (N2) 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 비구조 단백질 NSP4를 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제3 핵산 (N3)을 동시-발현시킴으로써 달라질 수도 있으며, 하기 기술된 바와 같이, 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 인핸서 서열, 예를 들어, CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+에 작동 가능하게 결합된다.
또 다른 예에서, 로타바이러스 구조 단백질 대 비구조 단백질의 비는, 예를 들어, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP6 또는 VP7을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1) 및 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP2 또는 VP4를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP7 또는 VP6을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3) 및 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP4 또는 VP2를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4), 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 비구조 단백질 NSP4을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 하나 이상의 핵산을 동시-발현시킴으로써 달라질 수도 있으며, 하기 기술된 바와 같이 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 인핸서 서열, 예를 들어, CPM 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+에 작동 가능하게 결합되고 하기 기술된 바와 같이 제5 뉴클레오타이드 서열은 CPMV HT에 작동 가능하게 결합된다.
또 다른 예에서, 로타바이러스 구조 단백질 대 비구조 단백질의 비는, 예를 들어, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서 제1 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP6 또는 VP7을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 (R1)을 포함하는 제1 핵산 (N1), 제2 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP2 또는 VP4를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 (R2)을 포함하는 제2 핵산 (N2), 제3 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP7 또는 VP6을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 (R3)을 포함하는 제3 핵산 (N3), 제4 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 단백질 VP4 또는 VP2를 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열 (R4)을 포함하는 제4 핵산 (N4) 및 제5 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 비구조 단백질 NSP4를 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열 (R5)을 포함하는 제5 핵산 (N5)을 동시-발현시킴으로써 달라질 수도 있으며, 하기 기술된 바와 같이 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 인핸서 서열, 예를 들어, CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+에 작동 가능하게 결합된다.
증폭 요소 및 인핸서 요소/조절 요소
로타바이러스 단백질 또는 폴리펩타이드는 바이러스 기반의 DNA 또는 RNA 발현 시스템, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 코모바이러스-기반 발현 카세트 및 제미니바이러스(geminivirus)-기반 증폭 요소를 포함하는 발현 시스템에서 발현될 수도 있다.
인핸서 요소는 로타바이러스 구조 및 비구조 단백질의 일시적인 높은 수준의 발현을 달성하는데 사용될 수도 있다. 인핸서 요소는 코모바이러스, 예컨대 동부 모자이크 바이러스(Cowpea mosaic virus; CPMV; 예를 들어, WO2007/135480; WO2009/087391; US 2010/0287670, Sainsbury F. et al., 2008, Plant Physiology; 148: 121-1218; Sainsbury F. et al., 2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. et al., 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682-693; Sainsbury F. et al. 2009, Methods in Molecular Biology, Recombinant Proteins From Plants, vol. 483: 25-39 참조)를 포함한 RNA 식물 바이러스를 기반으로 할 수도 있다.
CPMV 160 ( CPMVX ) 및 CPMV 160+ ( CPMVX +)
한 구체예에서 인핸서 요소는 "CPMVX" ("CPMV 160"로도 불림) 및/또는 "CPMVX+" ("CPMV 160+"로도 불림)이고 US 61/925,852 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다.
발현 인핸서 "CPMVX"는 코모바이러스 동부 모자이크 바이러스 (CPMV) 5' 비번역 영역 (UTR)을 포함한다. CPMV RNA -2 서열 (서열 번호: 1)의 뉴클레오타이드 1-160의 5'UTR은 전사 시작 부위에서 제1 인 프레임(in frame) 개시 시작 코돈 (위치 161)으로 시작하며, 이것은 야생형 코모바이러스 게놈 세그먼트에 의해 암호화된 두 개의 카르복시 공통 말단(coterminal) 단백질 중 더 긴 것의 생산을 위한 개시 부위의 역할을 한다. 게다가 CPMV RNA-2 게놈 서열의 위치 115에서 (또는 이것에 상응하는)'제3' 개시 부위가 또한 돌연변이되거나, 결실되거나 또는 다르게 변할 수도 있다. AUG 161의 제거 외에도 AUG 115의 제거는 불완전 M 단백질과 조합될 때 발현을 향상시키는 것으로 나타났다 (Sainsbury and Lomonossoff, 2008, Plant Physiology; 148: 1212-1218; WO 2009/087391; 이것은 본원에 참조로 포함됨).
CPMVX는 X=서열 번호:1의 160, 155, 150, 또는 114인 경우, 서열 번호:1의 X 뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 X=서열 번호:93의 160, 155, 150, 또는 114인 경우, CPMVX와 80% 내지 100% 서열 유사성을 포함하는 서열을 포함한다. 이 발현 인핸서는 일반적으로 CPMVX라고 불린다 (도 6c 참조).
X=160인 경우, 발현 인핸서 CPMVX는 서열 번호: 1의 뉴클레오타이드 1-160으로 구성된다:
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca (서열 번호:1)
CPMVX 인핸서 서열은 스터퍼(stuffer) 서열에 더 융합될 수도 있으며, CMPVX는 X=서열 번호:1의 160, 155, 150, 또는 114인 경우, 서열 번호:1의 X 뉴클레오타이드, 또는 X=서열 번호:1의 160, 155, 150, 또는 114인 경우, CPMVX와 80 내지 100 % 서열 유사성을 포함하는 서열을 포함하고, 스터퍼 서열은 CMPVX 서열의 3' 단부에 융합된 1-100개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 스터퍼 서열은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 뉴클레오타이드, 또는 그 사이의 임의의 개수의 뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다.
CMPVX 서열이 스터퍼 단편을 포함하면, 이 발현 인핸서는 CPMVX+라고 불릴 수도 있으며 (도 6d 참조), X=서열 번호:1의 160, 155, 150, 114인 경우, 그것은 또한 스터퍼 서열을 포함하는 CMPVX로 불릴 수도 있거나, 또는 X=160, 155, 150, 또는 114일 때, 각각 CPMV160+; CPMV155+; CPMV150+; CPMV114+로 불릴 수도 있다. 스터퍼 서열을 포함하지 않는 CPMVX를 포함하는 구조체는 X=서열 번호:1의 160, 155, 150, 114인 경우, CPMVX+라고 불릴 수도 있으며, 스터퍼 서열은 길이가 0개의 뉴클레오타이드이다.
스터퍼 서열은 뉴클레오타이드 160에 대하여 3'에 위치한 고유한 CMPV5'UTR 서열의 절단, 결실, 또는 대체에 의해 변형될 수도 있다. 변형된 스터퍼 서열은 5'UTR과 회합된 초기의 또는 비변형된 (즉, 고유한) 스터퍼 서열과 비교할 때 제거되거나, 대체되거나, 절단되거나 또는 짧아질 수도 있다 (Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218 참조에서 기술됨). 스터퍼 서열은 하나 이상의 제한 부위 (폴리링커(polylinker), 다중 클로닝 부위, 하나 이상의 클로닝 부위), 하나 이상의 식물 코자크 서열, 하나 이상의 링커 서열, 하나 이상의 재조합 부위, 또는 이것들의 조합을 포함할 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 스터퍼 서열은 연속적으로, 식물 코자크 서열에 융합된 원하는 길이의 다중 클로닝 부위를 포함할 수도 있다. 스터퍼 서열은 고유한 CPMV 5'UTR의 뉴클레오타이드 160에 대하여 3'에 위치한 고유한 5'UTR 서열의 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, Sainsbury F., 및 Lomonossoff G.P. (2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218; 이것은 본원에 참조로 포함됨)의 도 1에서 도시된 뉴클레오타이드 161 내지 512, 또는 선행 기술 CPMV HT 서열의 뉴클레오타이드 161-509를 포함하지 않는다. 즉, 선행 기술 CPMV HT 서열 (Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008의 도 1)에 존재하는 불완전 M 단백질은 본 발명의 5'UTR로부터 제거된다.
식물 코자크 공통 서열은 업계에 공지되어 있다 (예를 들어 Rangan et al. Mol. Biotechnol., 2008, July 39(3), pp. 207-213 참조). 자연 발생 및 합성 코자크 서열 둘 다는 발현 인핸서에서 사용될 수도 있거나 또는 본원에서 기술된 바와 같이 원하는 뉴클레오타이드 서열에 융합될 수도 있다.
식물 코자크 서열은 제한되는 것은 아니지만, 다음 식물 공통 서열을 포함하는 임의의 공지된 식물 코자크 서열일 수도 있다 (예를 들어 L. Rangan et. al. Mol. Biotechnol.2008 참조):
caA(A/C)a (서열 번호:2; 식물계)
aaA(A/C)a (서열 번호:3; 쌍떡잎식물)
aa(A/G)(A/C)a (서열 번호:4; 애기장대(arabidopsis))
식물 코자크 서열은 또한 다음의 군으로부터 선택될 수도 있다:
AGAAA (서열 번호: 5)
AGACA (서열 번호: 6)
AGGAA (서열 번호: 7)
AAAAA (서열 번호: 8)
AAACA (서열 번호: 9)
AAGCA (서열 번호: 10)
AAGAA (서열 번호: 11)
AAAGAA (서열 번호: 12)
AAAGAA (서열 번호: 13)
(A/-)A(A/G)(A/G)(A/C)A. (서열 번호: 14; 공통 서열)
식물 숙주 내에서 원하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하기 위해, 발현 인핸서 CPMVX, 또는 CPMVX+는 인핸서 서열의 5' 단부에서 식물에서 활성인 조절 영역과 작동 가능하게 결합되고, 발현 인핸서의 3' 단부에서 원하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합될 수도 있다 (도 6c).
CPMV HT+, CPMV HT+[WT115], CPMV HT+ [511]
또 다른 구체예에서 인핸서 요소는 US 61/971,274 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 "CPMV HT+"이다. 발현 인핸서 "CPMV HT+" (도 6b 참조)는 코모바이러스 5' 비번역 영역 (UTR) 및 변형되거나, 길어지거나, 또는 절단된 스터퍼 서열을 포함한다.
본원에서 기술된 하나 또는 그 이상의 발현 인핸서 (예를 들어, CPMV HT+, CPMV HT+[WT115], CPMV HT+ [511])와 작동 가능하게 결합된 조절 영역, 및 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 포함하는 식물 발현 시스템이 또한 제공된다. 게다가, 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열에 융합된 식물 코자크 서열과 함께 프로모터 (조절 영역) 서열, 코모바이러스 5'UTR을 포함하는 발현 인핸서 (예를 들어, CPMV HT+ 또는 CPMV HT+[WT115]) 및 스터퍼 서열을 포함하는 핵산이 기술된다. 핵산은 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 코모바이러스 3' 비번역 영역 (UTR), 플라스토시아닌 3' UTR, 또는 다른 3'UTR 서열의 업스트림에 삽입되도록, 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (도 6a에서 원하는 뉴클레오타이드로 불림)의 3' 단부에 작동 가능하게 결합된, 코모바이러스 3' 비번역 영역 (UTR), 예를 들어, 플라스토시아닌 3' UTR, 또는 식물에서 활성인 다른 3'UTR, 및 종결 서열, 예를 들어, NOS 종결자를 포함하는 서열을 더 포함할 수도 있다.
서열 번호:15는 선행 기술에서 공지된 바와 같이 (예를 들어, Sainsbury and Lomonossoff 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218의 도 1; 이것은 본원에 참조로 포함됨) "CPMV HT" 발현 인핸서를 포함한다. CPMV HT는 위치 115 (cgt)에서 변형된 뉴클레오타이드를 가지고 있는 서열 번호:15의 뉴클레오타이드 1-160의 5'UTR 서열, 및 위치 162 (acg)에서 변형된 뉴클레오타이드를 가지는 불완전 M 단백질을 포함하고, 식물 코자크 서열 (5'UTR: 뉴클레오타이드 1-160; 밑줄 친 불완전 M 단백질, 뉴클레오타이드 161 - 509)이 없다. 서열 번호:15는 또한 선행 기술 CPMV HT 서열에 존재하지 않는 다중 클로닝 부위 (이탤릭체, 뉴클레오타이드 510-528)를 포함한다:
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acg ttttctt tcactgaagc
181 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc
241 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc
301 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt
361 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa
421 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt
481 taagcttctg tatattctgc ccaaatttg t cgggccc 서열 번호: 15
식물 코자크 공통 서열을 가지고 있는 CPMV HT+가 서열 번호:16에서 제공된다 (뉴클레오타이드 1-160, 5'UTR, 위치 115 (GTG)에서 변형된 ATG를 포함, 소문자, 볼드체 및 이탤릭체; 밑줄 친 불완전 M 단백질을 포함하는 스터퍼 단편, 뉴클레오타이드 161 - 509, 162 (ACG)에서 뉴클레오타이드가 변형됨; 다중 클로닝 부위, 이탤릭체, 뉴클레오타이드 510-528; 및 공통 식물 코자크 서열, 대문자 및 볼드체, 뉴클레오타이드 529-534).
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgc gtg agc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acg ttttctt tcactgaagc
181 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc
241 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc
301 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt
361 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa
421 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt
481 taagcttctg tatattctgc ccaaatttg t tcgggcccaa taccgcgg( A/-)A(A/G)
(A/G)(A/C)A (서열 번호:16)
서열 번호:17 ("CPMV HT+ 511")은 뉴클레오타이드 1-154의 CPMV RNA 2 게놈의 고유한 서열의 세그먼트를 포함한다. 서열 번호:17의 뉴클레오타이드 1-511의 5'UTR 서열은 위치 115 ("a" 대신에 "g"; 이탤릭체, 볼드체) 및 162 ("t" 대신에 "c"; 이탤릭체, 볼드체)에서 변형된 "atg" 서열, 및 뉴클레오타이드 161 - 511의 불완전 M 단백질 (밑줄 친)을 포함한다. CPMV HT+ 511은 고유한 M 단백질 코자크 공통 서열 (뉴클레오타이드 508-511; 볼드체)을 포함한다:
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgc gtg agc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acg ttttctt tcactgaagc
181 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc
241 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc
301 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt
361 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa
421 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt
481 taagcttctg tatattctgc ccaaatt tga a. 서열 번호: 17
CPMV HT+ 인핸서 서열의 또 다른 비-제한 예는 서열 번호:18의 서열 (CPMV HT+[WT115])에 의해 제공된다. CPMV HT+를 포함하고 서열 번호: 18의 발현 인핸서 서열과 작동 가능하게 회합된 식물 조절 영역 및 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합된 3' 단부에서 전사 시작 부위 (ATG)를 포함하는 식물 조절 영역을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터는 또한 본 발명의 일부이다.
서열 번호: 18 (CPMV HT+[WT115]) 뉴클레오타이드 1-160, 5'UTR, 위치 115-117에서 ATG를 가짐, 소문자 볼드체; 밑줄 친 불완전 M 단백질을 포함하는 스터퍼 단편, 뉴클레오타이드 161 - 509; 위치 161-153에서 변형된 ATG 소문자 볼드체, 및 밑줄쳐짐, 다중 클로닝 부위, 이탤릭체, 뉴클레오타이드 510-528; 및 식물 코자크 서열, 대문자 및 볼드체, 뉴클레오타이드 529-534)
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgc atg agc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acg ttttctt tcactgaagc
181 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc
241 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc
301 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt
361 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa
421 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt
481 taagcttctg tatattctgc ccaaatttg t tcgggcccaa taccgcgg AG AAAA
(서열 번호:18)
서열 번호:18의 식물 코자크 서열은 제한되는 것은 아니지만, 서열 번호: 2-14의 서열 중 하나를 포함하는 임의의 식물 코자크 서열일 수도 있다.
본원에서 기술된 하나 또는 그 이상의 발현 인핸서 (예를 들어, CPMV HT+, CPMV HT+[WT115], CPMV HT+ [511])와 작동 가능하게 결합된 조절 영역을 포함하는 제1 핵산 서열, 및 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물 발현 시스템이 또한 제공된다. 게다가, 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열에 융합된 식물 코자크 서열과 함께 프로모터 (조절 영역) 서열, 코모바이러스 5'UTR을 포함하는 발현 인핸서 (예를 들어, CPMV HT+ 또는 CPMV HT+[WT115]) 및 스터퍼 서열을 포함하는 핵산이 기술된다. 핵산은 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 코모바이러스 3' 비번역 영역 (UTR), 플라스토시아닌 3' UTR, 또는 다른 3'UTR 서열의 업스트림에 삽입되도록, 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (도 6a에서 원하는 뉴클레오타이드로도 불림)의 3' 단부에 작동 가능하게 결합된, 코모바이러스 3' 비번역 영역 (UTR), 예를 들어, 플라스토시아닌 3' UTR, 또는 식물에서 활성인 다른 3'UTR, 및 종결 서열, 예를 들어, NOS 종결자를 포함하는 서열을 더 포함할 수도 있다.
본원에서 기술된 방법을 사용하여 생산된 RLP의 발생은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 밀도 구배 원심분리 또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 검출될 수도 있다. RLP는, 예를 들어, 전자 현미경, 크기 배제 크로마토그래피, 또는 당업자에게 분명한 다른 기술에 의해 구조 및 크기에 대하여 평가될 수도 있다.
크기 배제 크로마토그래피를 위해, 전체 가용성 단백질은 추출 버퍼에서 냉동-파쇄된 식물 재료의 샘플을 균질화함으로써 (Polytron) 식물 조직으로부터 추출될 수도 있고, 불용성 재료는 원심분리에 의해 제거된다. 매우 차가운 아세톤 또는 PEG를 이용한 침전이 또한 유익할 수도 있다. 가용성 단백질이 정량화되고, 추출물은 SephacrylTM 컬럼, 예를 들어, SephacrylTM S500 컬럼을 통과되었다. 보정 표준으로서 Blue Dextran 2000이 사용될 수도 있다. 크로마토그래피 후, 분획은 분획의 단백질 보체를 결정하기 위해 면역블롯에 의해 더 분석될 수도 있다.
분리된 분획은, 예를 들어, 상층액 (원심분리, 침강, 또는 침전되면), 또는 여과물 (여과되면)일 수도 있고, 단백질, 또는 상부 구조 단백질이 풍부하고, 더 높은 분자량의 입자, 예컨대 단일층 (sl), 이중층 (dl) 또는 삼중층 (tl) RLP을 포함한다.
분리된 분획은, 예를 들어, 추가적인 원심분리 단계, 침전, 크로마토그래피 단계 (예를 들어, 크기 배제, 이온 교환, 친화도 크로마토그래피), 접선 유동 여과, 또는 이것들의 조합에 의해 단백질, 상부 구조 단백질 또는 고차 입자를 단리시키거나, 정제하거나, 농축하거나 또는 이것들의 조합을 행하도록 추가로 가공될 수도 있다. 정제된 단백질, 상부 구조 단백질 또는 고차 입자, 예컨대 RLP의 존재는, 예를 들어, 고유한 또는 SDS-PAGE, 적절한 검출 항체를 사용한 웨스턴 분석, 모세관 전기영동, 전자 현미경, 또는 당업자에게 분명한 임의의 다른 방법에 의해 확인될 수도 있다.
본 발명에 따라 생산된 RLP는 식물, 식물의 일부 또는 식물 물질로부터 정제되거나, 부분적으로 정제될 수도 있거나, 또는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 경구용 백신으로서 투여될 수도 있다.
RLP 정제는 구배 원심분리를 수반할 수도 있으며, 예를 들어, 수크로스, 이오딕사놀, OptiPrep™ 또는 염화 세슘 (CsCl) 밀도 구배는 형질전환된 식물 바이오매스로부터 RLP를 정제하거나 또는 부분적으로 정제하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 도 4에서 나타난 바와 같이, 이오딕사놀 단계 구배 또는 이오딕사놀 연속 구배는 RLP 및/또는 발현된 로타바이러스 구조 단백질을 정제하는데 사용될 수도 있다.
칼슘 (Ca2+) 농도는 삼중층 입자 (TLP)에 있어서 이중층 입자 (DLP) 형질전환에 중요한 것으로 나타났으며 균주 의존적이다 (예를 들어, Martin et al. Journal of Virology, Jan 2002 참조, 이것은 본원에 참조로 포함됨). TLP로부터 외부-캡시드 단백질의 완전한 손실 (TLP 탈캡시드화)은 나노몰 범위의 [Ca2+]에서 일어난다. 그러므로 RLP의 추출 및/또는 정제는 칼슘의 존재 하에 수행될 수도 있고, 구배 원심분리의 단계는 칼슘의 존재 하에, 예를 들어, CaCl2의 존재 하에 수행될 수도 있다. CaCl2의 농도는, 예를 들어, 1 mM 내지 1000 mM, 또는 그 사이의 임의의 양, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 50, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 mM 또는 그 사이의 임의의 양일 수도 있다.
식물, 또는 식물 단편은 최소한으로 가공될 수도 있다. 용어 "최소 가공"은 원하는 단백질 및/또는 RLP를 포함하는 식물 물질, 예를 들어, 식물 또는 그 일부가 식물 추출물, 균질액, 식물 균질액의 분획 등을 수득하기 위해 부분적으로 정제 (즉, 최소한으로 가공)됨을 의미한다. 부분적 정제는 식물 세포 구조를 붕괴시켜 가용성 식물 구성요소, 및 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 원심분리, 여과 또는 이것들의 조합에 의해 분리될 수도 있는 불용성 식물 구성요소를 포함하는 조성물을 생성하는 것을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 점에 있어서, 잎 또는 다른 조직의 세포 외 공간 내에서 분비된 단백질은 진공 또는 원심분리 추출을 사용하여 쉽게 얻어질 수 있거나, 또는 조직은 압력 하에 단백질을 세포 외 공간 내에서부터 짜내거나 자유롭게 해방시키기 위해 롤러를 통과시키거나 그라인딩 등에 의해 추출될 수 있다. 최소 가공은 또한 가용성 단백질의 조 추출물의 제조를 수반할 수 있는데, 이 제조가 2차적인 식물 생산물로부터의 미량의 오염을 갖기 때문이다. 또한, 최소 가공은 잎으로부터 가용성 단백질의 수성 추출, 이어서 임의의 적합한 염을 이용한 침전을 수반할 수도 있다. 다른 방법들은 추출물의 직접적인 사용을 허용하기 위해서 대규모 매서레이션(maceration) 및 착즙을 포함할 수도 있다. RLP는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 기계적 또는 생화학적 추출을 사용하여 정제 또는 추출될 수도 있다.
하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질은 식물 생중량(fresh weight)의 킬로그램 당 최대 2 g의 양으로 합성될 수도 있다. 예를 들어, 합성된 구조 단백질의 양은 생중량의 킬로그램 당 1 내지 2 g, 또는 그 사이의 임의의 양, 예컨대 생중량의 킬로그램 당 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2 g 또는 그 사이의 임의의 양일 수도 있다. 예를 들어, 구조 단백질은 식물 생중량의 킬로그램 당 최대 1.54 g의 양으로 합성될 수도 있다.
상기 한정된 RLP의 크기 (즉, 직경)는, 예를 들어, 동적 광 산란 (DLS) 또는 전자 현미경 (EM) 기술에 의한 측정값일 수도 있으며, 보통 50 내지 110 nm, 또는 그 사이의 임의의 크기이다. 예를 들어, 온전한 RLP 구조의 크기는 약 70 nm 내지 약 110 nm의 범위에 있거나, 또는 그 사이의 임의의 크기, 예컨대 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm 또는 그 사이의 임의의 크기일 수도 있다.
뉴클레오타이드 서열
본 발명은 식물에서 활성인 조절 영역에 작동 가능하게 결합된 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 추가로 제공한다. 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 인간 코돈 사용 또는 식물 코돈 사용에 최적화될 수도 있다. 게다가 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질은 하나 또는 그 이상의 증폭 요소에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 이에 더하여 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질은 하나 또는 그 이상의 구획을 표적화하는 서열에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질은, 예를 들어, VP2, VP4, VP6 또는 VP7일 수도 있다. 게다가 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질은, 예를 들어, 임의의 로타바이러스 A군 내지 G군의 것일 수도 있지만, 더 바람직하게는 로타바이러스 A군의 것일 수도 있다. 게다가, 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질은 제한되는 것이 아니라, G1P[8], G2P[4], G2P[8], G3P[8], G4P[8], G9P[6], G9P[8], 로타바이러스 A WA 균주, 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주 또는 로타바이러스 SA11 균주를 포함하는, G1 내지 G27 및 P1 내지 P34, 및 더 바람직하게는 G1 내지 G19 및 P1 내지 P27의 G- 및 P-형의 임의의 조합의 유전자형을 가지는 임의의 로타바이러스 균주의 것일 수도 있다.
본 발명에서 언급된 핵산 서열은 서열, 또는 핵산 서열이 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열에 잡종화되면 서열의 상보체 또는 엄중 잡종화(hybridization) 조건 하에 본원에서 한정된 핵산 서열의 상보체와 "실질적으로 상동성"이거나, "실질적으로 유사"하거나 또는 "실질적으로 동일"할 수도 있다. 서열은 뉴클레오타이드의 적어도 약 70%, 또는 70 내지 100%, 또는 그 사이의 임의의 양, 예를 들어 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100%, 또는 그 사이의 임의의 양이 뉴클레오타이드 서열의 한정된 길이에 걸쳐 일치할 때 "실질적으로 상동성"이거나 "실질적으로 유사"하거나 "실질적으로 동일"하며 단 이러한 상동성 서열은 본원에서 기술된 바와 같이 서열의 성질, 또는 암호화된 생성물 중 하나 또는 그 이상을 나타낸다.
예를 들어, 본 발명은, 예를 들어, 서열 번호: 21, 27, 32, 37 또는 42에서 한정된 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 100% 또는 그 사이의 임의의 양만큼 동일한 하나 이상의 로타바이러스 단백질, 예를 들어, 구조 또는 비구조 로타바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 업계에 공지된 방법 중 임의의 것에 의해 최적화된 인간 코돈일 수도 있다. 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 서열 번호: 24, 29, 34, 39 또는 44의 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 100% 또는 그 사이의 임의의 양만큼 동일한 로타바이러스 단백질을 암호화할 수도 있다.
게다가, 본 발명은, 예를 들어, 서열 번호: 21, 27, 32, 37 또는 42에서 한정된 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 100% 또는 그 사이의 임의의 양만큼 동일한 핵산에 의해 암호화되는 로타바이러스 구조 단백질을 포함하는 RLP를 제공한다.
이러한 서열 유사성 또는 동일성은 뉴클레오타이드 서열 비교 프로그램, 예컨대 DNASIS 내에서 제공된 것 (제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 다음 파라미터를 사용함: GAP 패널티 5, 상부 대각선의 # 5, 고정된 GAP 패널티 10, k 투플 2, 플로팅 갭(floating gap) 10, 및 창 크기 5)을 사용하여 결정될 수도 있다. 하지만, 비교를 위한 서열 정렬의 다른 방법, 예를 들어, Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)의 알고리즘, 및 이 알고리즘의 컴퓨터에 의한 구현 (GAP, BESTFIT, FASTA, 및 BLAST, NIH를 통해 이용 가능함), 또는 수동 정렬 및 시각적 검사 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement 참조), 또는 엄중 조건 하에 서던 또는 노던 잡종화의 사용 (Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 참조)이 업계에 널리 공지되어 있다. 바람직하게는, 실질적으로 상동성인 서열들은 분자의 한정된 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 유사성을 나타낸다.
이러한 엄중 잡종화 조건의 하나의 예는 밤새도록 (약 16-20시간) 65℃에서 4 X SSC에서 잡종화, 이어서 1시간 동안 65℃에서 0.1 X SSC에서 세척, 또는 각각 20 또는 30분 동안 65℃에서 0.1 X SSC에서 2회 세척일 수도 있다. 대안으로 전형적인 엄중 잡종화 조건은 고유 서열 영역에 대하여 밤새도록 (16-20시간) 42℃에서 50% 포름아미드, 4 X SSC에서, 이어서 1시간 동안 65℃에서 0.1 X SSC에서 세척, 또는 각각 20 또는 30분 동안, 또는 밤새도록 (16-20시간) 65℃에서 0.1 X SSC에서 2회 세척, 또는 65℃에서 처치 수성 포스페이트 버퍼(Church aqueous phosphate buffer) (7% SDS; 0.5M NaPO4 버퍼 pH 7.2; 10 mM EDTA)에서 잡종화, 각각 20 또는 30분 동안 50℃에서 0.1 X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척, 또는 각각 20 또는 30분 동안 65℃에서 2 X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척일 수 있다.
로타바이러스 구조 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 "로타바이러스 핵산", "로타바이러스 뉴클레오타이드 서열", "로타바이러스 핵산", 또는 "로타바이러스 뉴클레오타이드 서열"로서 기술될 수도 있다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 하나 이상의 로타바이러스 구조 단백질 또는 로타바이러스 구조 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스-유사 입자는 "로타바이러스 VLP", "RVLP" 또는 "RLP"로서 기술될 수도 있다.
많은 유기체들은 성장하는 펩타이드 사슬에서 특정 아미노산의 삽입을 암호화하기 위한 특정 코돈의 사용에 대한 편향을 나타낸다. 코돈 선호 또는 코돈 편향, 유기체들 간의 코돈 사용의 차이는 유전 암호의 퇴보에 의해 제공되며, 많은 유기체들 사이에서 잘 기록되어 있다. 코돈 편향은 종종 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 연관성이 있는데, 이는 결국, 그 중에서도, 번역되는 코돈의 성질 및 특정 운반 RNA (tRNA) 분자의 이용 가능성에 의존적인 것으로 생각된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현에 맞춰 조정될 수 있다. 이종 기원 방식으로 발현된 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 최적화하는 공정은 발현 수율을 개선하는데 중요한 단계일 수 있다. 최적화 요건은 숙주가 외래 단백질을 생산하는 능력을 개선하기 위한 단계를 포함할 수도 있다.
"코돈 최적화"는 고유한 서열의 적어도 하나, 하나 이상, 또는 유의한 수의 코돈을 또 다른 유기체 또는 종의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용될 수도 있는 코돈으로 대체함으로써 원하는 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 것으로 한정된다. 다양한 종들은 특정 아미노산의 특정한 코돈에 대하여 특정 편향을 나타낸다.
본 발명은 코돈 최적화된, 예를 들어, 서열이 인간 코돈 사용 또는 식물 코돈 사용에 최적화된 합성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 그 이후 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열이 식물에서 발현될 수도 있다. 더 구체적으로 인간 코돈 사용 또는 식물 코돈 사용에 최적화된 서열이 식물에서 발현될 수도 있다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 인간 코돈에 최적화된 서열은 서열의 구아닌-시토신 함량 (GC 함량)을 증가시키고 식물에서 발현 수율을 개선하는 것으로 생각된다.
번역적으로 비효율적인 단백질 암호화 영역의 번역 역학을 개선하기 위한 다른 코돈-최적화 기술들이 업계에 공지되어 있다. 이 기술들은 주로 특정한 숙주 유기체에 대한 코돈 사용을 식별하는 것에 의존한다. 특정한 유전자 또는 서열이 이 유기체에서 발현되어야 하는 경우, 이러한 유전자 또는 서열의 암호화 서열은 원하는 서열의 코돈을 숙주 유기체의 더 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하도록 변형될 것이다.
아미노산 서열
로타바이러스 구조 단백질의 비-제한 예는 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6 및 VP7, 및 VP2, VP4, VP6 및 VP7의 단편이다. 본 발명에 따라 사용될 수도 있는 VP2, VP4, VP6 및 VP7, 또는 VP2, VP4, VP6 및 VP7 단백질의 단편의 비-제한 예는 로타바이러스 균주 G9 P[6], 로타바이러스 A WA 균주, 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주 및 로타바이러스 SA11 균주의 상기 VP2, VP4 VP6 및 VP7 단백질을 포함한다. 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, Rotarix-A41CB052A: VP4 (등록 # JN849113), VP7: (등록 # JN849114), 로타바이러스 A WA 균주: VP2 (등록 # X14942), VP4: (등록 #L34161), VP6 (등록 # K02086), VP7: (등록 # GU723327), NSP4 (등록 # K02032), 로타바이러스 SA11 균주: VP2 (등록 # NC_011506), VP4 (등록 # NC_011510), VP6 (등록 # NC_011509), VP7 (등록 # NC_011503) 및 NSP4 (등록 # NC_011504).
제한하는 것으로 고려되는 것은 아니지만, VP2 구조 단백질의 예는 서열 번호: 24의 아미노산 서열에서 제시된다. 게다가, VP2 구조 단백질은 서열 번호: 24에서 제시된 서열, 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가지는 서열을 포함할 수도 있다. 이에 더하여, VP2 구조 단백질은 서열 번호:21에서 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 80-100% 서열 유사성을 가지는 서열에 의해 암호화될 수도 있다.
제한하는 것으로 고려되는 것은 아니지만, VP4 구조 단백질의 예는 서열 번호: 34의 아미노산 서열에서 제시된다. 게다가, VP4 구조 단백질은 서열 번호: 34에서 제시된 서열, 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가지는 서열을 포함할 수도 있다. 이에 더하여, VP4 구조 단백질은 서열 번호: 32에서 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 80-100% 서열 유사성을 가지는 서열에 의해 암호화될 수도 있다.
제한하는 것으로 고려되는 것은 아니지만, VP6 구조 단백질의 예는 서열 번호: 29의 아미노산 서열에서 제시된다. 게다가, VP6 구조 단백질은 서열 번호: 29에서 제시된 서열, 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가지는 서열을 포함할 수도 있다. 이에 더하여, VP6 구조 단백질은 서열 번호: 27에서 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 80-100% 서열 유사성을 가지는 서열에 의해 암호화될 수도 있다.
제한하는 것으로 고려되는 것은 아니지만, VP7 구조 단백질의 예는 서열 번호: 39의 아미노산 서열에서 제시된다. 게다가, VP7 구조 단백질은 서열 번호: 39에서 제시된 서열, 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가지는 서열을 포함할 수도 있다. 이에 더하여, VP7 구조 단백질은 서열 번호: 37에서 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 80-100% 서열 유사성을 가지는 서열에 의해 암호화될 수도 있다.
제한하는 것으로 고려되는 것은 아니지만, NSP4 구조 단백질의 예는 서열 번호: 44의 아미노산 서열에서 제시된다. 게다가, NSP4 비구조 단백질은 서열 번호: 34에서 제시된 서열, 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가지는 서열을 포함할 수도 있다. 이에 더하여, NSP4 비구조 단백질은 서열 번호: 42에서 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 그것에 대하여 이 범위 내의 임의의 퍼센트 유사성, 예컨대 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 유사성을 포함한, 그것에 대하여 적어도 약 80-100% 서열 유사성을 가지는 서열에 의해 암호화될 수도 있다.
아미노산 서열 유사성 또는 동일성은 BLAST (기본 국소 정렬 검색 도구; basic local alignment search tool) 2.0 알고리즘을 이용하는 BLASTP 및 TBLASTN 프로그램을 사용하여 산출될 수도 있다. 아미노산 서열 유사성 또는 동일성을 산출하기 위한 기술들은 당업자에게 널리 공지되어 있고, BLAST 알고리즘의 사용은 ALTSCHUL et al. (1990, J Mol. Biol. 215: 403- 410) 및 ALTSCHUL et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)에서 기술되어 있다.
어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 다른 로타바이러스 구조 단백질의 단백질 농도 및 비는 RLP의 조립 효율에 중요한 것일 수도 있다. 그러므로 감염의 다중도 및 시간은 식물에서 RLP의 단백질 농도 및 전체적인 조립 효율을 조작하는데 중요할 수도 있다.
본 발명의 구조체는 식물 또는 식물의 일부에서 일시적으로 발현될 수도 있다. 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 재조합 아그로박테리움 투메파시엔 스(Agrobacterium tumefaciens )의 에피염색체(epichromosomal) 발현에 의존적인 일시적 발현 시스템은 다양한 세포 구획 또는 부분구획에 표적화된 로타바이러스 구조 단백질을 발현하는데 사용될 수도 있다. 일시적 발현 시스템은 높은 생산 속도를 허용한다. 게다가, 식물에서 재조합 아그로박테리움의 침투 후 수일 내에 대량의 단백질이 얻어질 수 있다 (Rybicki, 2010; Fischer et al., 1999). 또한
긴 유전자 서열을 발현하고 같은 세포에서 동시에 발현된 하나 이상의 유전자를 갖는 것이 가능해서 멀티머 단백질의 효율적인 조립을 허용한다 (Lombardi et al., 2009).
로타바이러스 구조 단백질 및 비구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 (표 1 및 첨부된 텍스트에서 기술됨)를 사용하여 식물 숙주로 옮겨질 수도 있다.
일시적 발현 중에 전사 후 유전자 침묵은 식물에서 이종 기원 단백질의 발현을 제한할 수도 있다. 침묵 억제자, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 토마토 반점 위조 바이러스(tomato spotted wilt virus)의 Nss의 동시-발현은 전이 유전자 mRNA의 특이적 분해에 대응하기 위해 사용될 수도 있다 (Brigneti et al., 1998). 대안의 침묵 억제자, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, HcPro, TEV-p1/HC-Pro (토마토 식각 바이러스(Tobacco etch virus)-p1/HC-Pro), BYV-p21, 토마토 덤불 성장 위축 바이러스(tomato bushy stunt virus)의 p19 (TBSV p19), 토마토 주름 바이러스(tomato crinkle virus)의 캡시드 단백질 (TCV-CP), 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus)의 2b (CMV-2b), 감자 바이러스 X의 p25 (PVX-p25), 감자 바이러스 M의 p11 (PVM-p11), 감자 바이러스 S의 p11 (PVS-p11), 블루베리 스코치 바이러스(Blueberry scorch virus)의 p16 (BScV-p16), 감귤 트리스텍사 바이러스(Citrus tristexa virus)의 p23 (CTV-p23), 포도덩굴 잎말이병-관련 바이러스(Grapevine leafroll-associated virus)-2의 p24 (GLRaV-2 p24), 포도덩굴 바이러스 A의 p10 (GVA-p10), 포도덩굴 바이러스 B의 p14 (GVB-p14), 헤라클레움 잠복 바이러스(Heracleum latent virus)의 p10 (HLV-p10), 또는 마늘 공통 잠복 바이러스(Garlic common latent virus)의 p16 (GCLV-p16)은 업계에 널리 공지되어 있으며 본원에서 기술된 바와 같이 사용될 수도 있다 (Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14; 이것은 본원에 참조로 포함됨). 그러므로, 침묵 억제자, 예를 들어, HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 또는 GVA-p10은 식물 또는 식물의 일부 내에서 높은 수준의 단백질 생산을 더 보장하기 위해 하나 이상의 로타바이러스 구조 또는 비구조 단백질, 예를 들어, VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4 또는 이것들의 조합과 함께 동시-발현될 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 방법을 제공하는데, 추가적인 (제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6) 뉴클레오타이드 서열은 식물 내에서 발현되고, 침묵 억제자를 암호화하는 추가적인 (제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6) 뉴클레오타이드 서열은 식물에서 활성인 추가적인 (제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6) 조절 영역에 작동 가능하게 결합된다. 침묵 억제자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 Nss, HcPro, TEV-p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 또는 GVA-p10일 수도 있다.
하기 기술된 바와 같이, 일시적 발현 방법은 본 발명의 구조체를 발현시키는데 사용될 수도 있다 (Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348 참조; 이것은 본원에 참조로 포함됨). 대안으로, Kapila et al., 1997 (이것은 본원에 참조로 포함됨)에 의해 기술된 진공-기반 일시적 발현 방법이 사용될 수도 있다. 이 방법들은, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 아그로-이노큘레이션(Agro-inoculation) 또는 아그로-인필트레이션, 주사기 침투의 방법을 포함할 수도 있지만, 상기 언급된 바와 같이 다른 일시적 방법들 또한 사용될 수 있다. 아그로-이노큘레이션, 아그로-인필트레이션, 또는 주사기 침투를 이용하여, 원하는 핵산을 포함하는 아그로박테리아(agrobacteria)의 혼합물은 조직, 예를 들어, 잎, 식물의 기생(aerial) 부분 (줄기, 잎 및 꽃 포함), 다른 식물의 일부 (줄기, 뿌리, 꽃), 또는 전체 식물의 세포 내 공간으로 들어간다. 표피를 통과한 후 아그로박테리아가 감염되고 세포로 t-DNA 카피를 옮긴다. t-DNA는 에피솜에 의해 전사되고 mRNA가 번역되어, 감염된 세포에서 원하는 단백질의 생산으로 이어지지만, 핵 내부에서 t-DNA의 통과는 일시적이다.
형질전환된 식물 세포의 식별을 돕기 위해, 본 발명의 구조체는 식물 선택 가능한 마커를 포함하도록 더 조작될 수도 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 화학물질, 예컨대 항생물질, 예를 들어, 겐타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 또는 제초제, 예컨대 포스피노트리신, 글리포세이트, 클로로설푸론, 등에 대한 저항성을 제공하는 효소를 포함한다. 유사하게, 색 변화에 의해 식별 가능한 화합물, 예컨대 GUS (베타-글루쿠로니다제), 또는 발광에 의해 식별 가능한 화합물, 예컨대 루시퍼라제 또는 GFP의 생산을 제공하는 효소가 사용될 수도 있다.
또한 본원에서 기술된 구조체를 함유하는 트랜스제닉 식물, 식물 세포 또는 종자가 본 발명의 일부로 간주된다. 식물 세포로부터 전체 식물을 재생시키는 방법이 또한 업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 형질전환된 식물 세포는 적절한 배지에서 배양되며, 이것은, 선택 가능한 마커가 형질전환된 식물 세포의 식별을 용이하게 하는데 사용되는 경우, 항생 물질과 같은 선택적 작용제를 함유할 수도 있다. 캘러스(callus)가 형성되면, 공지된 방법에 따라 적절한 식물 호르몬을 이용하여 신초(shoot) 형성이 촉진될 수 있고 신초는 식물 재생을 위한 발근 배지(rooting medium)로 옮겨진다. 그 이후 식물은 종자로부터 또는 식물 번식 기술을 사용하여 반복적 세대를 확립하는데 사용될 수도 있다. 트랜스제닉 식물은 또한 조직 배양을 사용하지 않고 생성될 수 있다.
본 출원에서 용어 "조절 영역", "조절 요소" 또는 "프로모터"의 사용은 항상 그러한 것은 아니지만, 전형적으로는, DNA 또는 RNA, 또는 DNA 및 RNA 둘 다로 구성될 수도 있는, 유전자의 단백질 암호화 영역의 업스트림에서 핵산의 일부를 반영하는 것을 의미한다. 조절 영역이 활성이고, 원하는 유전자와 작동 가능하게 회합되거나, 작동 가능하게 결합될 때, 원하는 유전자의 발현을 초래할 수도 있다. 조절 요소는 장기 특이성을 중재하거나, 또는 발생적 또는 일시적 유전자 활성화를 제어하는 것이 가능할 수도 있다. "조절 영역"은 프로모터 요소, 기초 프로모터 활성을 나타내는 코어 프로모터 요소, 외부 자극에 반응하여 유도 가능한 요소, 프로모터 활성을 중재하는 요소, 예컨대 음성 조절 요소 또는 전사 인핸서를 포함할 수도 있다. "조절 영역"은 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 전사 후 활성인 요소, 예를 들어, 유전자 발현을 조절하는 조절 요소, 예컨대 번역 및 전사 인핸서, 번역 및 전사 억제자, 업스트림 활성화 서열, 및 mRNA 불안정성 결정요인을 포함할 수도 있다. 이 후자의 요소들 중 다수는 암호화 영역의 가까이에 위치할 수도 있다.
이 개시물의 내용에서, 용어 "조절 요소" 또는 "조절 영역"은 전형적으로, 항상 그러한 것은 아니지만, 일반적으로는, 구조 유전자의 암호화 서열에 대한 업스트림 (5')에서의 DNA 서열을 말하며, 이것은 RNA 폴리머라제 및/또는 특정 부위에서 전사가 시작되는데 필요한 다른 인자에 대한 인식을 제공함으로써 암호화 영역의 발현을 제어한다. 하지만, 인트론 내부에 또는 서열의 3'에 위치한 다른 뉴클레오타이드 서열은 또한 원하는 암호화 영역의 발현의 조절에 기여할 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 특정 부위에서의 개시를 보장하기 위해 RNA 폴리머라제 또는 다른 전사 인자에 대한 인식을 제공하는 조절 요소의 예는 프로모터 요소이다. 전부는 아니지만, 대부분의 진핵생물 프로모터 요소는 TATA 상자, 일반적으로 전사 시작 부위의 업스트림에서 대략 25개의 염기쌍에 위치한 아데노신 및 티미딘 뉴클레오타이드 염기쌍으로 구성된 보존된 핵산 서열을 함유한다. 프로모터 요소는 전사 개시의 원인이 되는 기초 프로모터 요소, 뿐만 아니라 유전자 발현을 변형시키는 다른 조절 요소 (상기 나열됨)를 포함한다.
발생적으로 조절되거나, 유발성 또는 구성성인 것들을 포함한, 여러 유형의 조절 영역이 있다. 발생적으로 조절되거나, 또는 제어 하에 유전자의 차등적 발현을 제어하는 조절 영역은 특정한 장기 또는 장기의 조직 내에서 상기 장기 또는 조직의 발달 중의 특정 시간에 활성화된다. 하지만, 발생적으로 조절되는 일부 조절 영역은 바람직하게는 특정 발생 단계에서 특정한 장기 또는 조직 내에서 활성일 수도 있으며, 그것들은 또한 식물 내 다른 장기 또는 조직에서 발생적으로 조절되는 방식으로, 또는 기저 수준으로 활성일 수도 있다. 조직-특이적 조절 영역의 예, 예를 들어, 종자-특이적 조절 영역은 나핀 프로모터, 및 크루시페린 프로모터을 포함한다 (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). 잎-특이적 프로모터의 예는 플라스토시아닌 프로모터를 포함한다 (US 7,125,978 참조, 이것은 본원에 참조로 포함됨).
유발성 조절 영역은 인듀서(inducer)에 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접적으로 또는 간접적으로 활성화시킬 수 있는 것이다. 인듀서의 부재 하에 DNA 서열 또는 유전자는 전사되지 않을 것이다. 전형적으로 전사를 활성화시키기 위해 유발성 조절 영역에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 비활성 형태로 존재할 수도 있으며, 이것은 인듀서에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 활성 형태로 전환될 수도 있다. 하지만, 단백질 인자는 또한 없을 수도 있다. 인듀서는 화학작용제, 예컨대 단백질, 대사산물, 성장 조절 물질, 제초제 또는 페놀성 화합물 또는 열, 냉기, 염, 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 또는 병원체 또는 질병 인자, 예컨대 바이러스의 작용을 통해 간접적으로 부과된 생리학적 스트레스일 수 있다. 유발성 조절 영역을 함유한 식물 세포는 인듀서를 세포 또는 식물에 외부로부터 적용함으로써, 예컨대 분무, 살수, 가열 또는 유사한 방법에 의해 인듀서에 노출될 수도 있다. 유발성 조절 요소는 식물 또는 비-식물 유전자로부터 유도될 수도 있다 (예를 들어, Gatz, C. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; 이것은 참조로 포함됨). 잠재적인 유발성 프로모터의 예는 테트라사이클린-유발성 프로모터 (Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. BioI. 48,89-108; 이것은 참조로 포함됨), 스테로이드 유발성 프로모터 (Aoyama. T. and Chua, N.H.,1997, Plant 1. 2, 397-404; 이것은 참조로 포함됨) 및 에탄올-유발성 프로모터 (Salter, M.G., et aI, 1998, Plant 10urnal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180, 이것은 참조로 포함됨), 사이토키닌 유발성 IB6 및 CKI 1 유전자 (Brandstatter, I. and K.ieber, 1.1.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985; 이것은 참조로 포함됨) 및 옥신 유발성 요소, DR5 (Ulmasov, T., et aI., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; 이것은 참조로 포함됨)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
구성성 조절 영역은 식물의 다양한 부분에 걸쳐 및 식물 발달 전반에 걸쳐 지속적으로 유전자의 발현을 지시한다. 공지된 구성성 조절 요소의 예는 CaMV 35S 전사물과 회합된 프로모터 (Odell et aI., 1985, Nature, 313: 810-812), 쌀 액틴 1 (Zhang et aI, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), 액틴 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121), 또는 tms 2 (U.S. 5,428,147, 이것은 본원에 참조로 포함됨), 및 트리오스포스페이트 아이소머라제 1 (Xu et. aI., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467) 유전자, 옥수수 유비퀴틴 1 유전자 (Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. BioI. 29: 637-646), 애기장대 유비퀴틴 1 및 6 유전자 (Holtorf et aI, 1995, Plant Mol. BioI. 29: 637-646), 및 담배 번역 개시 인자 4A 유전자 (Mandel et aI, 1995, Plant Mol. BioI. 29: 995-1004)를 포함한다.
용어 "구성성"은 본원에서 사용된 바와 같이 유전자는 구성성 조절 영역의 제어 하에 모든 세포 유형에서 같은 수준으로 발현되지만, 종종 풍부함의 차이가 관찰됨에도 불구하고 넓은 범위의 세포 유형에서 발현된다는 것을 반드시 나타내는 것은 아니다. 구성성 조절 요소는 작동 가능하게 결합되는 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 번역을 더 향상시키기 위해 다른 서열과 커플링될 수도 있다. 예를 들어, CPMV-HT 시스템은 동부 모자이크 바이러스 (CPMV)의 비번역 영역으로부터 유도되고 회합된 암호화 서열의 향상된 번역을 입증한다. "고유한"은 핵산 또는 아미노산 서열이 자연 발생하거나, "야생형"임을 의미한다. "작동 가능하게 결합된"은 특정 서열, 예를 들어, 원하는 조절 요소 및 암호화 영역이 유전자 발현의 중재 또는 조절과 같은 의도된 기능을 수행하도록 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용함을 의미한다. 작동 가능하게 결합된 서열의 상호작용은, 예를 들어, 작동 가능하게 결합된 서열과 상호작용하는 단백질에 의해 중재될 수도 있다.
식물 내에서 생산된 RLP는 식물-특이적 N-글리칸을 포함하는 로타바이러스 VP7 구조 단백질을 생산할 수도 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 식물 특이적 N-글리칸을 가지는 VP7을 포함하는 RLP를 제공한다.
게다가, 식물에서 N-글리칸의 변형이 공지되어 있으며 (예를 들어, U.S. 60/944,344 참조; 이것은 본원에 참조로 포함됨) 변형된 N-글리칸을 가지는 VP7이 생산될 수도 있다. 변형된 글리코실화 패턴을 포함하는, 예를 들어, 푸코실화되거나, 자일로실화되거나, 또는 푸코실화 및 자일로실화된 N-그리칸 둘 다가 감소된 VP7이 얻어질 수도 있거나, 또는 단백질이 푸코실화, 자일로실화, 또는 둘 다가 없고, 갈락토실화가 증가되는, 변형된 글리코실화 패턴을 가지는 VP7이 얻어질 수도 있다. 게다가, 번역 후 변형의 조절, 예를 들어, 말단 갈락토스의 첨가는 VP7을 발현하는 야생형 식물과 비교할 때 발현된 VP7의 푸코실화 및 자일로실화의 감소를 초래할 수도 있다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아니라, 예를 들어, 변형된 글리코실화 패턴을 가진 VP7의 합성은 베타-1.4 갈락토실트랜스퍼라제 (GalT), 제한되는 것이 아니라, 예를 들어, 포유류 GalT, 또는 인간 GalT를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 함께 VP7을 동시-발현시킴으로써 달성될 수도 있지만 또 다른 공급원의 GalT가 또한 사용될 수도 있다. GalT의 촉매 도메인은 또한 GNT1-GalT 하이브리드(hybrid) 효소를 생산하기 위해 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 (GNT1)의 CTS 도메인 (즉, 세포질 꼬리, 막관통 도메인, 줄기 영역)에 융합될 수도 있고, 하이브리드 효소는 VP7과 동시-발현될 수도 있다. VP7은 또한 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 III (GnT-III), 제한되는 것이 아니라, 예를 들어, 포유류 GnT-III 또는 인간 GnT-III을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 함께 동시-발현될 수도 있지만, 다른 공급원의 GnT-III이 또한 사용될 수도 있다. 추가적으로, GnT-III에 융합된 GNT1의 CTS를 포함하는 GNT1-GnT-III 하이브리드 효소가 또한 사용될 수도 있다.
그러므로 본 발명은 또한 변형된 N-글리칸을 가지는 VP7을 포함하는 RLP를 제공한다.
어떤 이론에도 결부되지 않으면서, VP7 상에 식물 N-글리칸의 존재는 항원 제공 세포에 의한 VP7의 결합을 촉진함으로써 면역 반응을 자극할 수도 있다. 식물 N 글리칸을 사용한 면역 반응의 자극은 Saint-Jore-Dupas et al. (2007)에 의해 제안되었다.
표 2는 본 발명의 다양한 구체예에서 제공된 서열을 나열한다.
서열 번호 설명 페이지/도
1 발현 인핸서 CPMVX
2 식물계 코자크 공통 서열
3 쌍떡잎식물 코자크 공통 서열
4 애기장대 코자크 공통 서열
5-13 식물 코자크 서열
14 코자크 공통 서열
15 CPMV HT
16 CPMV HT+
17 CPMV HT+ 511
18 CPMV HT+[WT115]
19 IF-WA_VP2(opt).s1+3c 도 7A
20 IF-WA_VP2(opt).s1-4r 도 7B
21 균주 WA의 로타바이러스 A VP2의 최적화된 암호화 서열 도 7C
22 구조체 1191 도 7E
23 발현 카세트 번호 1710 도 7F
24 로타바이러스 A WA 균주의 VP2의 아미노산 서열 도 7G
25 IF-WA_VP6(opt).s1+3c 도 8A
26 IF-WA_VP6(opt).s1-4r 도 8B
27 균주 WA의 로타바이러스 A VP6의 최적화된 암호화 서열 도 8C
28 발현 카세트 번호 1713 도 8D
29 로타바이러스 A WA 균주의 VP6의 아미노산 서열 도 8E
30 IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c 도 9A
31 IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r 도 9B
32 균주 RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]의 로타바이러스 A VP4의 최적화된 암호화 서열 도 9C
33 발현 카세트 번호 1730 도 9D
34 로타바이러스 A Rotarix 균주의 VP4의 아미노산 서열 도 9E
35 IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c 도 10A
36 IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r 도 10B
37 균주 RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]의 로타바이러스 A VP7의 최적화된 암호화 서열 도 10C
38 발현 카세트 번호 1734 도 10D
39 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 TrSp-VP7의 아미노산 서열 도 10E
40 IF-WA_NSP4.s1+3c 도 11A
41 IF-WA_NSP4.s1-4r 도 11B
42 균주 WA의 로타바이러스 A NSV4의 암호화 서열 도 11C
43 발현 카세트 번호 1706 도 11D
44 로타바이러스 A WA 균주의 NSP4의 아미노산 서열 도 11E
45 IF(C160)-WA_VP2(opt).c 도 12A
46 구조체 1190 도 12C
47 발현 카세트 번호 1108 도12D
48 IF(C160)-WA_VP6(opt).c 도 13A
49 발현 카세트 번호 1128 도 13B
50 IF(C160)-Rtx_VP4(opt).c 도 14A
51 발현 카세트 번호 1178 도 14B
52 IF(C160)-TrSP+Rtx_VP7(opt).c 도 15A
53 발현 카세트 번호 1199 도 15B
본 발명은 다음 실시예에서 추가로 예시될 것이다.
실시예
실시예 1 재료 및 방법
구조체
구조체 # 설명 도 구조체 # 설명 도
1108 160-VP2 3A/3B 1706 CPMV-HT NSP4 3A/3B 4A/4B
1128 160-VP6 3A/3B 1708 CPMV-HT VP6/2 3A/3B
4A/4B
1178 160-VP4 3A/3B 2408 160-VP7/4 3A/3B
4A/4B
1199 160-VP7 3A/3B 1769 CPMV-HT VP7/4/6/2 3A/3B/5
1710 CPMV-HT VP2 4A/4B 2441 CPMV-HT VP4/7/NSP4/6/2 5
1713 CPMV-HT VP6 4A/4B 2400 160-VP6/2 4A/4B
1730 CPMV-HT VP4 4A/4B 1719 CPMV-HT VP7/4 4A/4B
1734 CPMV-HT VP7 4A/4B
1. 2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS (구조체 번호 1710)
로타바이러스 A WA 균주의 VP2를 암호화하는 최적화된 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S-CPMV-HT-NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. VP2 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-WA_VP2(opt).s1+3c (도 7a, 서열 번호: 19) 및 IF-WA_VP2(opt).s1-4r (도 7B, 서열 번호: 20)을 사용하고, 주형으로서 최적화된 VP2 유전자 서열 (도 7C, 서열 번호:21)를 사용하여 증폭시켰다. 서열 최적화를 위해서, VP2 단백질 서열 (Genbank 등록 번호 CAA33074)을 역번역하여 인간 코돈 사용, GC 함량 및 mRNA 구조에 대하여 최적화하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조체 번호 1191 (도 7D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조체 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파(alfalfa) 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 아래에서 TBSV P19 침묵 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조체를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 이성분 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 경계에서 오른쪽 t-DNA 경계까지의 서열은 도 7E (서열 번호: 22)에서 제공된다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1710 (도 7F, 서열 번호: 23)이 주어졌다. 로타바이러스 A 균주 WA의 VP2의 아미노산 서열은 도 7G (서열 번호: 24)에서 제공된다. 플라스미드 1710의 도면은 도 7H에서 제공된다.
2. 2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS (구조체 번호 1713)
로타바이러스 A WA 균주의 VP7을 암호화하는 최적화된 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S-CPMV-HT-NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. VP6 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-WA_VP6(opt).s1+3c (도 8A, 서열 번호: 25) 및 IF-WA_VP6(opt).s1-4r (도 8B, 서열 번호: 26)을 사용하고, 주형으로서 최적화된 VP6 유전자 서열 (도 8C, 서열 번호:27)을 사용하여 증폭시켰다. 서열 최적화를 위해서, VP6 단백질 서열 (Genbank 등록 번호 AAA47311)을 역번역하여 인간 코돈 사용, GC 함량 및 mRNA 구조에 대하여 최적화하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조체 번호 1191 (도 7D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조체 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 아래에서 TBSV P19 침묵 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조체를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 이성분 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 경계에서 오른쪽 t-DNA 경계까지의 서열은 도 7E (서열 번호: 22)에서 제공된다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1713 (도 8D, 서열 번호: 28)이 주어졌다. 로타바이러스 A 균주 WA의 VP6의 아미노산 서열은 도 8E (서열 번호: 29)에서 제공된다. 플라스미드 1713의 도면은 도 8F에서 제공된다.
3. 2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS (구조체 번호 1730)
로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 VP4를 암호화하는 최적화된 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S/CPMV-HT/NOS로 클로닝하였다. VP4 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c (도 9A, 서열 번호: 30) 및 IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (도 9B, 서열 번호: 31)을 사용하고, 주형으로서 최적화된 VP4 유전자 서열 (도 9C, 서열 번호: 32)을 사용하여 증폭시켰다. 서열 최적화를 위해서, VP4 단백질 서열 (Genbank 등록 번호 AEX30660)을 역번역하여 인간 코돈 사용, GC 함량 및 mRNA 구조에 대하여 최적화하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에 클로닝하였다. 구조체 번호 1191 (도 7D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조체 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 아래에서 TBSV P19 침묵 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조체를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 이성분 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 경계에서 오른쪽 t-DNA 경계까지의 서열은 도 7E (서열 번호: 22)에서 제공된다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1730 (도 9D, 서열 번호: 33)이 주어졌다. 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]의 VP4의 아미노산 서열은 도 9E (서열 번호: 34)에서 제공된다. 플라스미드 1730의 도면은 도 9F에서 제공된다.
4. 2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (구조체 번호 1734)
로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 고유한 신호 펩타이드의 절단된 버젼을 가진 VP7을 암호화하는 최적화된 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S-CPMV-HT-NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. VP7 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c (도 10A, 서열 번호: 35) 및 IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (도 10B, 서열 번호: 36)을 사용하고, 주형으로서 최적화된 VP7 유전자 서열 (도 10C의 nt 88-891에 해당함, 서열 번호: 37)을 사용하여 증폭시켰다. 서열 최적화를 위해서, VP7 단백질 서열 (Genbank 등록 번호 AEX30682)을 역번역하여 인간 코돈 사용, GC 함량 및 mRNA 구조에 대하여 최적화하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조체 번호 1191 (도 7D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조체 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 아래에서 TBSV P19 침묵 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조체를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 이성분 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 경계에서 오른쪽 t-DNA 경계까지의 서열은 도 7E (서열 번호: 22)에서 제공된다. 결과의 구조체에는 번호 1734 (도 10D, 서열 번호: 38)가 주어졌다. 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 절단된 신호 펩타이드를 가진 VP7의 아미노산 서열은 도 10E (서열 번호: 39)에서 제공된다. 플라스미드 1734의 도면은 도 10F에서 제공된다.
5. 2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) NSP4/NOS (구조체 번호 1706)
로타바이러스 A WA 균주의 NSP4를 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S-CPMV-HT-NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. NSP4 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-WA_NSP4.s1+3c (도 11A, 서열 번호: 40) 및 IF-WA_NSP4.s1-4r (도 11B, 서열 번호: 41)을 사용하고, 주형으로서 합성된 NSP4 유전자 (GenBank 등록 번호 K02032의 nt 42-569에 해당함) (도 11C, 서열 번호: 42)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조체 번호 1191 (도 7D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조체 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 아래에서 TBSV P19 침묵 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조체를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 이성분 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 경계에서 오른쪽 t-DNA 경계까지의 서열은 도 7E (서열 번호: 22)에서 제공된다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1706 (도11D, 서열 번호: 43)이 주어졌다. 로타바이러스 A 균주 WA의 NSP4의 아미노산 서열은 도 11E (서열 번호: 44)에서 제공된다. 플라스미드 1706의 도면은 도 11F에서 제공된다.
6. 2X35S/CPMV-160/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS (구조체 번호 1108)
로타바이러스 A WA 균주의 VP2를 암호화하는 최적화된 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S/CPMV-160/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. VP2 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF(C160)-WA_VP2(opt).c (도 12A, 서열 번호: 45) 및 IF-WA_VP2(opt).s1-4r (도 7B, 서열 번호: 20)을 사용하고, 주형으로서 최적화된 VP2 유전자 서열 (도 7C, 서열 번호: 21)을 사용하여 증폭시켰다. 서열 최적화를 위해서, VP2 단백질 서열 (Genbank 등록 번호 CAA33074)을 역번역하여 인간 코돈 사용, GC 함량 및 mRNA 구조에 대하여 최적화하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-160/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조체 번호 1190 (도 12B)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조체 번호 1190은 CPMV-160-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 아래에서 TBSV P19 침묵 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조체를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 이성분 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 경계에서 오른쪽 t-DNA 경계까지의 서열은 도 12C (서열 번호: 46)에서 제공된다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1108 (도 12D, 서열 번호: 47)이 주어졌다. 로타바이러스 A 균주 WA의 VP2의 아미노산 서열은 도 7G (서열 번호: 24)에서 제공된다. 플라스미드 1108의 도면은 도 12E에서 제공된다.
7. -2X35S/CPMV-160/RVA(WA) VP6(opt)/NOS (구조체 번호 1128) -
로타바이러스 A WA 균주의 VP6을 암호화하는 최적화된 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S/CPMV-160/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. VP6 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF(C160)-WA_VP6(opt).c (도 13A, 서열 번호: 48) 및 IF-WA_VP6(opt).s1-4r (도 8B, 서열 번호: 26)을 사용하고, 주형으로서 최적화된 VP6 유전자 서열 (도 8C, 서열 번호: 27)을 사용하여 증폭시켰다. 서열 최적화를 위해서, VP6 단백질 서열 (Genbank 등록 번호 AAA47311)을 역번역하여 인간 코돈 사용, GC 함량 및 mRNA 구조에 대하여 최적화하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-160/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조체 번호 1190 (도 11B, 서열 번호:40)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조체 번호 1190은 CPMV-160-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 아래에서 TBSV P19 침묵 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조체를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 이성분 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 경계에서 오른쪽 t-DNA 경계까지의 서열은 도 11C (서열 번호: 41)에서 제공된다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1128 (도 13B, 서열 번호: 49)이 주어졌다. 로타바이러스 A 균주 WA의 VP6의 아미노산 서열은 도 8E (서열 번호: 28)에서 제공된다. 플라스미드 1128의 도면은 도 13C에서 제공된다.
8. X35S/CPMV-160/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS (구조체 번호 1178)
로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 VP4를 암호화하는 최적화된 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S/CPMV-160/NOS로 클로닝하였다. VP4 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF(C160)-Rtx_VP4(opt).c (도 14A, 서열 번호: 50) 및 IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (도 9B, 서열 번호: 30)을 사용하고, 주형으로서 최적화된 VP4 유전자 서열 (도 9C, 서열 번호: 31)을 사용하여 증폭시켰다. 서열 최적화를 위해서, VP4 단백질 서열 (Genbank 등록 번호 AEX30660)을 역번역하여 인간 코돈 사용, GC 함량 및 mRNA 구조에 대하여 최적화하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-160/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조체 번호 1190 (도 11B, 서열 번호: 40)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조체 번호 1190은 CPMV-160-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 아래에서 TBSV P19 침묵 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조체를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 이성분 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 경계에서 오른쪽 t-DNA 경계까지의 서열은 도 11C (서열 번호: 41)에서 제공된다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1178 (도 H2, 서열 번호: H2)이 주어졌다. 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]의 VP4의 아미노산 서열은 도 9E (서열 번호: 33)에서 제공된다. 플라스미드 1178의 도면은 도 14C에서 제공된다.
9. 2X35S/CPMV-160/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (구조체 번호 1199)
로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 고유한 신호 펩타이드의 절단된 버젼을 가진 VP7을 암호화하는 최적화된 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S/CPMV-160/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. VP7 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF(C160)-TrSP+Rtx_VP7(opt).c (도 15A, 서열 번호: 52) 및 IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (도 10B, 서열 번호: 35)을 사용하고, 주형으로서 최적화된 VP7 유전자 서열 (도 10C의 nt 88-891에 해당함, 서열 번호: 36)을 사용하여 증폭시켰다. 서열 최적화를 위해서, VP7 단백질 서열 (Genbank 등록 번호 AEX30682)을 역번역하여 인간 코돈 사용, GC 함량 및 mRNA 구조에 대하여 최적화하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-160/NOS 발현 시스템에 클로닝하였다. 구조체 번호 1190 (도 11B, 서열 번호: 40)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조체 번호 1190은 CPMV-160-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수용체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 아래에서 TBSV P19 침묵 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조체를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 이성분 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 경계에서 오른쪽 t-DNA 경계까지의 서열은 도 11C (서열 번호: 41)에서 제공된다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1199 (도 15B, 서열 번호: 53)가 주어졌다. 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 절단된 신호 펩타이드를 가진 VP7의 아미노산 서열은 도 10E (서열 번호: 38)에서 제공된다. 플라스미드 1199의 도면은 도 15C에서 제공된다.
10. CPMV-HT 발현 카세트 하에서 VP6 및 VP2의 발현을 위한 이중 유전자 구조체 (구조체 번호 1708)
CPMV-HT 발현 시스템의 제어 하에 로타바이러스 A WA 균주의 VP6 및 로타바이러스 A WA 균주의 VP2의 동시-발현을 위한 단일 벡터를 다음 제한 효소/리가제-기반 방법을 사용하여 조립하였다. 공여체 플라스미드 DNA (구조체 번호 1710; 2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS)(도 7F, 서열 번호: 23)를 AvrII (2X35S 프로모터 앞에 위치함) 및 AscI (located after the NOS 종결자) 제한 효소로 분해하였고 2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS 발현 카세트에 해당하는 단편을 겔-정제하였다. 그 이후 이 단편을 XbaI 및 AscI 제한 효소 (두 부위 모두 VP6 발현 카세트의 NOS 종결자 뒤에 위치함)를 사용하여 선형화된 수용체 구조체 번호 1713 (2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS)(도 8D, 서열 번호: 28)으로 삽입하였다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1708이 주어졌다. 플라스미드 1708의 도면은 도 16에서 제공된다.
11. CPMV-HT 발현 카세트 하에서 VP7 및 VP4의 발현을 위한 이중 유전자 구조체 (구조체 번호 1719)
CPMV-HT 발현 시스템의 제어 하에 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 고유한 신호 펩타이드의 절단된 버젼을 가진 VP7 및 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 VP4의 동시-발현을 위한 단일 벡터를 다음 제한 효소/리가제-기반 방법을 사용하여 조립하였다. 공여체 플라스미드 DNA (구조체 번호 1730; 2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS)(도 9D, 서열 번호: 32)를 AvrII (2X35S 프로모터 앞에 위치함) 및 AscI (NOS 종결자 뒤에 위치함) 제한 효소로 분해하였고 2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS 발현 카세트에 해당하는 단편을 겔-정제하였다. 그 이후 이 단편을 XbaI 및 AscI 제한 효소 (두 부위 모두 VP7 발현 카세트의 NOS 종결자 뒤에 위치함)를 사용하여 선형화된 수용체 구조체 번호 1734 (2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS)(도 10D, 서열 번호: 37)로 삽입하였다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1719가 주어졌다. 플라스미드 1719의 도면은 도 17에서 제공된다.
12. CPMV-160 발현 카세트 하에서 VP6 및 VP2의 발현을 위한 이중 유전자 구조체 (구조체 번호 2400)
CPMV-160 발현 시스템의 제어 하에 로타바이러스 A WA 균주의 VP6 및 로타바이러스 A WA 균주의 VP2의 동시-발현을 위한 단일 벡터를 다음 제한 효소/리가제-기반 방법을 사용하여 조립하였다. 공여체 플라스미드 DNA (구조체 번호 1108; 2X35S/CPMV-160/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS)(도 12D, 서열 번호: 47)를 AvrII (2X35S 프로모터 앞에 위치함) 및 AscI (NOS 종결자 뒤에 위치함) 제한 효소로 분해하였고 2X35S/CPMV-160/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS 발현 카세트에 해당하는 단편을 겔-정제하였다. 그 이후 이 단편을 XbaI 및 AscI 제한 효소 (두 부위 모두 VP6 발현 카세트의 NOS 종결자 뒤에 위치함)를 사용하여 선형화된 수용체 구조체 번호 1128 (2X35S/CPMV-160/RVA(WA) VP6(opt)/NOS)(도 13B, 서열 번호: 49)로 삽입하였다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 2400이 주어졌다. 플라스미드 2400의 도면은 도 18에서 제공된다.
13. CPMV-160 발현 카세트 하에서 VP7 및 VP4의 발현을 위한 이중 유전자 구조체 (구조체 번호 2408)
CPMV-160 발현 시스템의 제어 하에 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 고유한 신호 펩타이드의 절단된 버젼을 가진 VP7 및 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 VP4의 동시-발현을 위한 단일 벡터를 다음 제한 효소/리가제-기반 방법을 사용하여 조립하였다. 공여체 플라스미드 DNA (구조체 번호 1178; 2X35S/CPMV-160/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS)(도 14B, 서열 번호: 51)를 AvrII (2X35S 프로모터 앞에 위치함) 및 AscI (NOS 종결자 뒤에 위치함) 제한 효소로 분해하였고 2X35S/CPMV-160/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS 발현 카세트에 해당하는 단편을 겔-정제하였다. 그 이후 이 단편을 XbaI 및 AscI 제한 효소 (두 부위 모두 VP7 발현 카세트의 NOS 종결자 뒤에 위치함)를 사용하여 선형화된 수용체 구조체 번호 1199 (2X35S/CPMV-160/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS)(도 15B, 서열 번호: 53)로 삽입하였다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 2408이 주어졌다. 플라스미드 2408의 도면은 도 19에서 제공된다.
14. CPMV-HT 발현 카세트 하에서 VP7, VP4, VP6 및 VP2의 발현을 위한 4중 유전자 구조체 (구조체 번호 1769)
CPMV-HT 발현 시스템의 제어 하에 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 고유한 신호 펩타이드의 절단된 버젼을 가진 VP7, 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 VP4, 로타바이러스 A WA 균주의 VP6 및 로타바이러스 A WA 균주의 VP2의 동시-발현을 위한 단일 벡터를 다음 제한 효소/리가제-기반 방법을 사용하여 조립하였다. 공여체 플라스미드 DNA (구조체 번호 1730; 2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS)(도 9D, 서열 번호: 32)를 AvrII (2X35S 프로모터 앞에 위치함) 및 AscI (NOS 종결자 뒤에 위치함) 제한 효소로 분해하였고 2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS 발현 카세트에 해당하는 단편을 겔-정제하였다. 그 이후 이 단편을 XbaI 및 AscI 제한 효소 (두 부위 모두 VP7 발현 카세트의 NOS 종결자 뒤에 위치함)를 사용하여 선형화된 수용체 구조체 번호 1734 (2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS)(도 10D, 서열 번호: 37)로 삽입하였다. AvrII 및 XbaI에 의해 생산된 부착 말단의 결찰은 제2 발현 카세트의 NOS 종결자의 단부에서 (왼쪽 T-DNA에서 오른쪽 T-DNA로) 같은 독특한 XbaI 및 AscI 제한 효소 부위를 가진 임시의 수용체 벡터를 생산하는 원래의 제한 부위를 파괴하였다. 그 이후 CPMV-HT 발현 시스템 하에서 발현된 VP6 (구조체 번호 1713; 도 8D, 서열 번호: 28) 및 VP2 (구조체 번호 1710; 도 7F, 서열 번호: 23)를 같은 분해 계획을 사용하여 결과로 생긴 임시의 수용체 벡터에 순차적으로 삽입하여 최종 VP7/VP4/VP6/VP2 구조체를 제공하였다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 1769가 주어졌다. 플라스미드 1769의 도면은 도 20에서 제공된다.
15. CPMV-HT 발현 카세트 하에서 VP4, VP7, NSP4, VP6 및 VP2의 발현을 위한 5중 유전자 구조체 (구조체 번호 2441)
CPMV-HT 발현 시스템의 제어 하에 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 VP4, 로타바이러스 A 백신 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 균주의 고유한 신호 펩타이드의 절단된 버젼을 가진 VP7, 로타바이러스 A WA 균주의 NSP4, 로타바이러스 A WA 균주의 VP6 및 로타바이러스 A WA 균주의 VP2의 동시-발현을 위한 단일 벡터를 다음 제한 효소/리가제-기반 방법을 사용하여 조립하였다. 공여체 플라스미드 DNA (구조체 번호 1734; 2X35S/CPMV-HT/ TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/ NOS)(도 10D, 서열 번호: 37)를 AvrII (2X35S 프로모터 앞에 위치함) 및 AscI (NOS 종결자 뒤에 위치함) 제한 효소로 분해하였고 2X35S/CPMV-HT/ TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/ NOS 발현 카세트에 해당하는 단편을 겔-정제하였다. 그 이후 이 단편을 XbaI 및 AscI 제한 효소 (두 부위 모두 VP4 발현 카세트의 NOS 종결자 뒤에 위치함)를 사용하여 선형화된 수용체 구조체 번호 1730 (2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS)(도 9D, 서열 번호: 32)으로 삽입하였다. AvrII 및 XbaI에 의해 생산된 부착 말단의 결찰은 제2 발현 카세트의 NOS 종결자의 단부에서 (왼쪽 T-DNA에서 오른쪽 T-DNA로) 같은 독특한 XbaI 및 AscI 제한 효소 부위를 가진 임시의 수용체 벡터를 생산하는 원래의 제한 부위를 파괴하였다. 그 이후 CPMV-HT 발현 시스템 하에서 발현된 NSP4 (구조체 번호 1706; 도 11D, 서열 번호: 42), VP6 (구조체 번호 1713; 도 8D, 서열 번호: 28) 및 VP2 (구조체 번호 1710; 도 7F, 서열 번호: 23)를 같은 분해 계획을 사용하여 결과로 생긴 임시의 수용체 벡터에 순차적으로 삽입하여 최종 VP4/VP7/NSP4/VP6/VP2 구조체를 제공하였다. 결과로 생긴 구조체에는 번호 2441이 주어졌다. 플라스미드 2441의 도면은 도 21에서 제공된다.
실시예 2 NSP4의 동시 발현은 VP4 및 RLP로의 VP4 포함을 증가시킨다
로타바이러스 VP2, VP4, VP6 및 VP7 구조 항원을 실시예 1에서 기술된 바와 같이 아그로인필트레이션을 사용하여 NSP4 발현 구조체의 존재 또는 부재 하에 니코티아나 벤타미아나 식물에서 일시적으로 동시-발현시켰다. RLP 생산 식물의 조 단백질 추출물은 쿠마시-염색된 SDS-PAGE에서 줄무늬 패턴으로 나타난 바와 같이 대량의 숙주 단백질을 함유한다 (도 2B, load). 로타바이러스-유사 입자는 이오딕사놀 밀도 구배에서 초원심분리에 의해 식물 단백질로부터 분리될 수도 있다. 원심분리 후, 이오딕사놀 밀도 구배의 분획의 분석은 RLP가 35% 이오딕사놀 분획으로 이동하는 한편 (도 2B에서 F2 및 F3) 대부분의 숙주 단백질은 25-30% 이오딕사놀 분획에 남아있음 (도 2B에서 F4-F10)을 나타냈다. 로타바이러스 구조 항원을 동시-발현하는 식물의 RLP를 이오딕사놀 밀도 구배에서 정제하였고 RLP 함유 분획 (F2 및 F3)의 분석은, 단일, 이중 및 4중 유전자 구조체로 도 3A에서 나타난 바와 같이, RLP가 구조체 당 유전자의 수에 상관없이, 효율적으로 생산될 수 있다는 것을 나타냈다. 얻어진 결과는 또한 NSP4의 동시-발현이 RLP 발현을 감소시킨다는 것을 나타냈다 (도 3A에서 -NSP4 및 +NSP4 하에 분획을 비교함). 부피 당 RLP 함량을 비교하기 위해 동일한 부피의 각 분획을 겔에 로딩하였다.
VP4 및 VP7 포함에 대한 NSP4 동시-발현의 영향을 평가하기 위해 RLP-함유 분획 2를 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 비교를 위해, 동일한 양의 RLP를 겔에 로딩하였다. 얻어진 웨스턴 블롯 결과들은 NSP4의 존재 하에 생산된 RLP에서 VP4 및 VP7에 대하여 더 강한 신호를 나타냈다 (도 3B, -NSP4 및 +NSP4 하에 레인들을 비교함). 이 결과들은 NSP4의 동시-발현이 RLP의 표면에서 VP4 및 VP7 포함을 증가시켰음을 분명하게 나타낸다.
네 개의 로타바이러스 항원 및 비-구조 단백질 NSP4를 암호화하는 유전자를 발현의 비교를 위해 CPMV-HT 및 CPMV160으로 클로닝하였다. 동시 발현 연구에 이은 이오딕사놀 밀도 구배에서 초원심분리에 의한 추출 및 정제는, 구배의 분획 2 및 3에서 VP6의 양 (도 4A) 및 같은 처리의 분획 2에서 VP4 및 VP7의 양 (도 4B)에 의해 입증된 바와 같이, 두 발현 모두가 RLP를 효율적으로 생산했음을 나타냈다. 이 연구는 또한 로타바이러스 단백질의 발현을 위해 CPMV-HT 시스템을 사용할 때, 단일 유전자 구조체가 이중 유전자 구조체만큼의 RLP를 생산하고 (도 4A, 왼쪽 패널 vs 중간 패널) 표면 항원, VP4 및 VP7과 유사한 커버리지를 초래한다는 것을 나타냈다 (도 4B, 왼쪽 패널 vs 중간 패널).
5중 유전자 구조체 (같은 플라스미드 상에 5개의 유전자를 포함함)를 네 개의 구조 항원과 NSP4의 동시-발현에 대하여 평가하였다. 도 5에서 나타난 바와 같이, 5중 유전자 구조체의 사용은 별도의 플라스미드 상에 NSP4 유전자를 가진 4중 유전자 구조체의 사용과 유사한 RLP 생산 수준 (도 5, 상단 패널), 뿐만 아니라 VP4 및 VP7 포함의 비슷한 수준 (도 5, 하단 패널)을 초래하였다.
아그로박테리움 형질전환
아그로박테리움 투메파시엔스 (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, USA) by 전기천공법으로 아그로박테리움 투메파시엔스 (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, USA)를 형질전환하기 위해 모든 플라스미드를 사용하였다 (Mattanovich et al., 1989, Nucleic Acid Res. 17:6747). 대안으로, CaCl2-제조된 컴피턴트(competent) 세포를 사용한 열 충격법이 사용될 수도 있다 (XU et al., 2008, Plant Methods 4). 생성된 아그로박테리움 투메파시엔스 균주에서 플라스미드의 온전성을 제한효소 맵핑(mapping)으로 확인하였다.
식물 바이오매스의 제조, 접종, 아그로인필트레이션 , 및 수확
니코티아나 벤타미아나 식물을 종자에서부터 상업적인 초탄(peat moss) 기질로 채워져 있는 평지에서 키웠다. 식물을 온실에서 16/8 광 주기 및 25℃ 낮/20℃ 밤의 온도 체계 하에 키웠다. 파종 3주 후, 개개의 묘목을 골라, 화분에 옮겨 심었고 온실에서 같은 환경 조건 하에서 추가로 3주 동안 키웠다.
각 구조체가 트랜스펙션된 아그로박테리아를 식물 기원이고 10 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES) 및 50 μg/ml 카나마이신 pH 5.6이 보충된 LB 배지에서 0.6 내지 2.5의 OD600에 도달할 때까지 키웠다. 아그로박테리움 현탁액을 각 구조체에 대하여 적절한 비율에 도달할 때까지 혼합하였고 침투 배지 (10 mM MgCl2 및 10 mM MES pH 5.6)로 2.5X OD600로 가져왔다. 아그로박테리움 투메파시 엔스 현탁액을 4℃에서 밤새도록 저장하였다. 침투일에, 배양 배치(batch)를 침투 배지로 희석하였고 사용 전에 가온하였다. 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)의 전체 식물을 20-40 Torr의 진공 하에 2분 동안 기밀성 스테인리스 강 탱크 내에서 박테리아 현탁액에 거꾸로 배치하였다. 침투 후, 식물을 수확할 때까지 9일 인큐베이션 기간 동안 온실에 되돌려 놓았다. 수확된 바이오매스를 입자의 정제에 사용할 때까지 냉동 보관하였다 (-80℃).
로타바이러스-유사 입자의 초원심분리에 의한 추출 및 스크리닝
단백질을 2배 부피의 추출 버퍼 (TNC: 10 mM Tris pH 7.4, 140 mM NaCl, 10 mM CaCl2)가 들어있는 블렌더에서 기계적 추출에 의해 냉동된 바이오매스로부터 추출하였다. 슬러리를 대기공 나일론 필터를 통과시켜 큰 데브리(debris)를 제거하고 4℃에서 5분 동안 5000 g로 원심분리하였다. 상층액을 수거한 다음 다시 5000 g로 30분 동안 원심분리하여 (4℃) 추가의 데브리를 제거하였다. 그 이후 상층액을 불연속적 이오딕사놀 밀도 구배에 로딩하였다.
분석적 밀도 구배 원심분리를 다음과 같이 수행하였다. TNC 버퍼 (45%의 이오딕사놀 1.2 ml, 35%의 이오딕사놀 2 ml, 30%의 이오딕사놀 5 ml 및 25%의 이오딕사놀 5 ml)에서 불연속적 이오딕사놀 밀도 구배를 함유하는 38 ml 튜브를 제조하였고 로타바이러스-유사 입자를 함유하는 추출물 25 ml로 덮었다. 구배를 120 000 g로 4시간 동안 원심분리하였다 (4℃). 원심분리 후, 1 ml 분획을 아래에서 위로 수거하였고 분획 2 및 3 (35% 이오딕사놀에 해당함)을 단백질 염색 또는 웨스턴 블롯과 조합된 SDS-PAGE로 분석하였다.
SDS-PAGE 및 면역블롯팅
BCA 단백질 검정 (Pierce Biochemicals, Rockport, IL)으로 단백질 농도를 결정하였다. 환원성 조건 하에서 Criterion™ TGX Stain-Free™ precast gels (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용한 SDS-PAGE로 단백질을 분리하였고 Gel Doc™ EZ 이미지화 시스템 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)으로 단백질을 가시화하였다.
면역블롯팅을 위해서, 전기영동된 단백질을 폴리비닐렌 디플루오라이드 (PVDF) 막 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)으로 전기이동시켰다. 면역블롯팅 전에, 막을 Tris-완충된 식염수 (TBS-T) 중 5% 탈지유 및 0.1% Tween-20으로 4℃에서 16-18h 동안 차단하였다.
TBS-Tween 20 0.1% 중 2% 탈지유에서 적합한 항체 (표 4)와 함께 인큐베이션하여 면역블롯팅을 수행하였다. 화학발광 검출에 사용된 2차 항체는 표 4에서 나타난 바와 같으며, TBS-Tween 20 0.1% 중 2% 탈지유에서 나타난 바와 같이 희석하였다. 면역반응성 복합체를 기질로서 루미놀 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)을 사용한 화학발광으로 검출하였다.
로타바이러스 항원의 면역블롯팅을 위한 전기영동 조건, 항체, 및 희석배수
로타바이러스 항원 전기영동 조건 1차 항체 희석배수 2차 항체 희석배수
VP4 환원성 재조합 VP4로 면역화된 토끼 (자체 제조)의 토끼 혈청 1:30 000 염소 항-토끼
(JIR 111-035-144)		 1:10 000
VP7 환원성 재조합 VP7로 면역화된 토끼 (자체 제조)의 토끼 혈청 1:50 000 염소 항-토끼
(JIR 111-035-144)		 1:10 000
모든 인용문은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 구체예에 관하여 기술되었다. 하지만, 청구범위에서 한정된 바와 같이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Medicago Inc. <120> ROTAVIRUS-LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PLANTS <130> V87566WO <150> 62/106,941 <151> 2015-01-23 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 160 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Expression enhancer CPMVX <400> 1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 60 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 120 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca 160 <210> 2 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plant kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> a or c <400> 2 caana 5 <210> 3 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dicot kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> a or c <400> 3 aaana 5 <210> 4 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arabidopsis kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> a or g <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> a or c <400> 4 aanna 5 <210> 5 <211> 5 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aaaccaatcc acatctttat cacccattct 960 ataaaaaatc acactttgtg agtctacact ttgattccct tcaaacacat acaaagagaa 1020 gagactaatt aattaattaa tcatcttgag agaaaatgga acgagctata caaggaaacg 1080 acgctaggga acaagctaac agtgaacgtt gggatggagg atcaggaggt accacttctc 1140 ccttcaaact tcctgacgaa agtccgagtt ggactgagtg gcggctacat aacgatgaga 1200 cgaattcgaa tcaagataat ccccttggtt tcaaggaaag ctggggtttc gggaaagttg 1260 tatttaagag atatctcaga tacgacagga cggaagcttc actgcacaga gtccttggat 1320 cttggacggg agattcggtt aactatgcag catctcgatt tttcggtttc gaccagatcg 1380 gatgtaccta tagtattcgg tttcgaggag ttagtatcac cgtttctgga gggtcgcgaa 1440 ctcttcagca tctctgtgag atggcaattc ggtctaagca agaactgcta cagcttgccc 1500 caatcgaagt ggaaagtaat gtatcaagag gatgccctga aggtactcaa accttcgaaa 1560 aagaaagcga gtaagttaaa atgcttcttc gtctcctatt tataatatgg tttgttattg 1620 ttaattttgt tcttgtagaa gagcttaatt aatcgttgtt gttatgaaat actatttgta 1680 tgagatgaac tggtgtaatg taattcattt acataagtgg agtcagaatc agaatgtttc 1740 ctccataact aactagacat gaagacctgc cgcgtacaat tgtcttatat ttgaacaact 1800 aaaattgaac atcttttgcc acaactttat aagtggttaa tatagctcaa atatatggtc 1860 aagttcaata gattaataat ggaaatatca gttatcgaaa ttcattaaca atcaacttaa 1920 cgttattaac tactaatttt atatcatccc ctttgataaa tgatagtaca ccaattagga 1980 aggagcatgc tcgcctagga gattgtcgtt tcccgccttc agtttgcaag ctgctctagc 2040 cgtgtagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg gaattactag cgcgtgtcga 2100 caagcttgca tgccggtcaa catggtggag cacgacacac ttgtctactc caaaaatatc 2160 aaagatacag tctcagaaga ccaaagggca attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcc 2220 ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact ttattgtgaa gatagtggaa 2280 aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat 2340 gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa 2400 gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgataacat ggtggagcac 2460 gacacacttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggcaatt 2520 gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc 2580 tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc 2640 gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc 2700 ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg 2760 gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa 2820 gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga ggtattaaaa tcttaatagg 2880 ttttgataaa agcgaacgtg gggaaacccg aaccaaacct tcttctaaac tctctctcat 2940 ctctcttaaa gcaaacttct ctcttgtctt tcttgcgtga gcgatcttca acgttgtcag 3000 atcgtgcttc ggcaccagta caacgttttc tttcactgaa gcgaaatcaa agatctcttt 3060 gtggacacgt agtgcggcgc cattaaataa cgtgtacttg tcctattctt gtcggtgtgg 3120 tcttgggaaa agaaagcttg ctggaggctg ctgttcagcc ccatacatta cttgttacga 3180 ttctgctgac tttcggcggg tgcaatatct ctacttctgc ttgacgaggt attgttgcct 3240 gtacttcttt cttcttcttc ttgctgattg gttctataag aaatctagta ttttctttga 3300 aacagagttt tcccgtggtt ttcgaacttg gagaaagatt gttaagcttc tgtatattct 3360 gcccaaattt gtcgggcccg cggatggcga aaaacgttgc gattttcggc ttattgtttt 3420 ctcttcttgt gttggttcct tctcagatct 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tgcccgtgag gaactggaca 180 ttcgatttcg gcctgctggg cacgactctc cttaatctcg atgcaaatta tgtagaaaac 240 gccagaacga ttatcgagta ctttatcgat ttcattgata acgtttgtat ggatgagatg 300 gcccgcgagt cacaacggaa cggagttgct ccacagtccg aggcccttcg gaaactcgcc 360 ggcattaagt tcaagcgtat taatttcgac aactcctccg aatatataga gaactggaac 420 ttgcagaatc gtcgacagag aaccggcttc gtgttccata aacctaatat ctttccgtat 480 agcgcctcat tcaccctgaa taggagtcag cccatgcacg acaacctcat gggtacaatg 540 tggctgaatg cggggagtga aatacaggtc gccgggttcg attactcctg tgccattaat 600 gcacccgcaa acatccagca gttcgaacat atcgtgcaac taagacgggc tctcacgacc 660 gcgacaatta cactcctgcc cgacgccgag cgcttctcct ttccccgcgt aatcaactca 720 gctgatggcg ccaccacttg gttcttcaac cctgttatat tgcgccctaa caacgtagag 780 gtggagtttc tcttaaacgg acagatcatc aatacctacc aagccaggtt cggcacgatt 840 attgcaagaa atttcgacgc tatcaggctg ctcttccaac tgatgaggcc ccccaatatg 900 actcccgctg tgaacgcttt gtttccgcag gctcagcctt tccagcacca cgccaccgtc 960 ggcttgactc ttcgaataga gagcgcggtc tgcgaatcag tgctggcaga 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Sequence <220> <223> Optimized coding sequence of Rotavirus A VP7 <400> 37 atgtacggca tcgagtatac aacaatttta attttcctga tttccatcat tctgttaaac 60 tacatcctta agtccgtgac cagaattatg gattatatta tctatcgtag cctcctcatc 120 tacgtggccc tttttgccct gaccagggcc cagaactatg gcctgaactt accaatcacc 180 ggttcaatgg ataccgttta cgctaattcc actcaagagg ggatatttct gacaagtacc 240 ctgtgcctgt attatccaac agaagcctct acccagatca atgatgggga gtggaaggat 300 agtctctcac agatgttcct aaccaagggc tggcccaccg gttccgtcta cttcaaggaa 360 tactctagta ttgtcgactt ctcagttgac ccccagcttt attgcgacta caacctggta 420 cttatgaaat acgaccagaa cctggagctg gatatgtccg agctggctga cctgatcctc 480 aatgagtggc tgtgcaaccc catggacatc acattatatt actaccagca gtctggagaa 540 tccaacaagt ggatcagtat gggctcaagt tgcaccgtga aggtgtgtcc cttgaacacc 600 caaatgctgg gcattggttg tcagacaact aatgtggatt cgtttgaaat ggtagccgaa 660 aacgagaagc tggctatagt ggacgtagtc gatgggatta accacaagat caatctgact 720 accaccactt gtaccatcag aaactgtaaa aagctcggcc cccgggagaa cgtcgccgtg 780 atccaggtgg 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gatatgtcga aggaattcaa tcagaaaaac atcaaaacgc tagatgaatg 1740 ggagagtgga aaaaatccat atgaaccgtc agaagtgact gcatccatgt gaaggcctat 1800 tttctttagt ttgaatttac tgttattcgg tgtgcatttc tatgtttggt gagcggtttt 1860 ctgtgctcag agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca 1920 ggtcgtccct tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 agaccgggaa ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa 2040 agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 2100 aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 2160 tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 2220 gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagat 2268 <210> 44 <211> 175 <212> PRT <213> Rotavirus <400> 44 Met Asp Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Ser Val Ile Thr Ser 1 5 10 15 Met Asn Asp Thr Leu His Ser Ile Ile Gln Asp Pro Gly Met Ala Tyr 20 25 30 Phe Leu Tyr Ile Ala Ser Val Leu Thr Val Leu Phe Thr Leu His Lys 35 40 45 Ala Ser Ile Pro Thr Met Lys Ile Ala Leu 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atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagat 2277

Claims (38)

  1. 숙주 또는 숙주 세포에서 로타바이러스 유사 입자 (RLP)를 생산하는 방법으로서
    a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는, 단계;
    b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, RLP를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4 또는 VP7을 암호화하고 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP4 및 VP7 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하고 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4는 하나 이상의 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 및 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산의 두 개의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제1 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 및 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산의 두 개의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제1 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제3 및 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산의 세 개의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제3 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 및 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산의 세 개의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제3 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 및 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산의 네 개의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제3 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제5 핵산의 다섯 개의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1 항에 있어서, 숙주 또는 숙주 세포는 곤충 세포, 포유류 세포, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11 항에 있어서, 숙주 또는 숙주 세포는 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, 식물은 니코티아나 벤타미아나인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 발현 인핸서에 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14 항에 있어서, 발현 인핸서는 CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ 및 CPMV HT+로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) 숙주 또는 숙주 세포를 수확하는 단계, 및
    d) 숙주 또는 숙주 세포로부터 RLP를 정제하는 단계로서, RLP는 크기가 70-100 nm의 범위에 있는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 숙주 또는 숙주 세포에서 로타바이러스 유사 입자 (RLP)를 생산하는 방법으로서
    a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 숙주 또는 숙주 세포로 도입하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는 단계;
    b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, RLP를 생산하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4 또는 VP7을 암호화하고 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP4 및 VP7 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하고 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4는 하나 이상의 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19 항에 있어서,
    도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은
    i) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 및 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산; 또는
    ii) 제1 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 및 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산
    의 두 개의 핵산을 포함하며,
    숙주 또는 숙주 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양의 비는 1:0.8 내지 1:2인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20 항에 있어서, 제1 로타바이러스 단백질은 NSP4이고, 제2, 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질은 VP2, VP4, VP6 및 VP7인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20 항에 있어서, 비는 1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제19 항에 있어서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은
    i) 제1 및 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제3 및 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 또는
    ii) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 및 제3, 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산
    의 세 개의 핵산을 포함하며,
    숙주 또는 숙주 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양의 비는 1:1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제19 항에 있어서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 및 제4 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산의 네 개의 핵산을 포함하며, 숙주 또는 숙주 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양 대 제4 핵산의 양의 비는 1:1:1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제19 항에 있어서, 도입 단계 (단계 a)에서, 하나 이상의 핵산은 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산, 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4 핵산, 및 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제5 핵산의 다섯 개의 핵산을 포함하며, 숙주 또는 숙주 세포로 도입되는 제1 핵산의 양 대 제2 핵산의 양 대 제3 핵산의 양 대 제4 핵산의 양 대 제5 핵산의 양의 비는 1:1:1:1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제3 항 또는 제19 항의 방법에 의해 생산된 RLP로서, RLP는 로타바이러스 단백질을 포함하는 삼중층 RLP이며, 로타바이러스 단백질은 VP2, VP4, VP6 및 VP7로 구성되는 RLP.
  27. 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 제26 항의 RLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  28. 대상체에서 로타바이러스 감염에 대한 면역력을 유도하는 방법으로서, 대상체에게 제27 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제28 항에 있어서, 조성물은 대상체에게 경구로, 피내로, 비강 내로, 근육 내로, 복강 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 RLP를 포함하는 식물 물질.
  31. 제17 항 내지 제19 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 RLP를 포함하는 식물 물질.
  32. 로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함을 증가시키는 방법으로서
    a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는 단계; 및
    b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 숙주 또는 숙주 세포에 의해 생산된 VP4 또는 VP7의 수준과 비교하여 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  33. 로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함을 증가시키는 방법으로서
    a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 숙주 또는 숙주 세포로 도입하는 단계로서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7 또는 VP4 중 하나를 암호화하는 단계;
    b) 각각의 NSP4, VP6 및 VP7 또는 VP4가 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, 이로써 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 숙주 또는 숙주 세포에 의해 생산된 VP4 또는 VP7의 수준과 비교하여 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  34. 제32 항 또는 제33 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 NSP4를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP6을 암호화하고, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4 또는 VP7을 암호화하며 각각의 NSP4, VP6 및 VP2, VP4 및 VP7 중 두 개는 하나 이상의 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제32 항 또는 제33 항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 제5 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제5 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP2, VP4, VP6, VP7 또는 NSP4 중 하나를 암호화하고 각각의 VP2, VP4, VP6, VP7 및 NSP4는 하나 이상의 핵산으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제32 항 내지 제35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) 숙주 또는 숙주 세포를 수확하는 단계, 및
    d) 숙주 또는 숙주 세포로부터 RLP를 정제하는 단계로서, RLP는 크기가 70-100 nm의 범위에 있는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 곤충 세포, 포유류 세포, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 생산된 로타바이러스 유사 입자 (RLP)의 표면에서 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함을 증가시키기 위한 NSP4의 사용.
  38. 로타바이러스 유사 입자 (RLP)에서 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 포함을 증가시키는 방법으로서
    a) 제1 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 제3 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제4 로타바이러스 단백질을 암호화하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포를 제공하는 단계로서; 제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 숙주 또는 숙주 세포에서 활성인 하나 이상의 조절 영역에 작동 가능하게 결합되고;
    제1, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 서열은 로타바이러스 단백질 VP7, VP4, NSP4 및 VP2 또는 VP6 중 하나를 암호화하는 단계;
    b) 각각의 VP7, VP4, NSP4 및 VP2 또는 VP6이 발현되도록, 하나 이상의 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 인큐베이션하여, 이로써 같은 조건 하에서 NSP4를 포함하지 않는 하나 이상의 핵산을 발현하는 제2 숙주 또는 숙주 세포에 의해 생산된 VP4 또는 VP7의 수준과 비교하여 VP4, VP7, 또는 VP4 및 VP7 둘 다의 수준이 향상된 RLP를 생산하는 단계.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115867662A (zh) * 2020-04-22 2023-03-28 浦项工科大学校产学协力团 形成三聚体的新型冠状病毒肺炎(covid-19)重组刺突蛋白、在植物中大量产生重组刺突蛋白的方法和基于其制备疫苗组合物的方法
CN112251461B (zh) * 2020-10-22 2022-08-23 植链(上海)生物科技有限公司 一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
EP0152295B1 (en) 1984-02-09 1991-03-20 Royal Children's Hospital Research Foundation Live attenuated human rotavirus vaccine and preparation thereof
US4636385A (en) 1985-02-15 1987-01-13 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Vaccine, method for its preparation, and use thereof in vaccinating humans against rotavirus infection
US4704275A (en) 1985-08-26 1987-11-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases
US4751080A (en) 1985-08-26 1988-06-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases
US4927628A (en) 1987-09-21 1990-05-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases and method of preparing same
DK0557427T3 (da) 1990-11-16 1998-10-26 Childrens Hosp Medical Center Human rotavira, vacciner og fremgangsmåder
US20050186219A1 (en) * 1997-10-07 2005-08-25 Langridge William H. Transgenic plant-based vaccines
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
US6867353B2 (en) 2000-02-12 2005-03-15 Exploregen Inc. Production method of recombinant rotavirus structural proteins and vaccine composition
FR2806087B1 (fr) 2000-03-07 2002-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Particules pseudovirales de rotavirus et leur utilisation pour vectoriser des proteines ou des acides nucleiques
WO2002036172A2 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 Baylor College Of Medicine Rotavirus enterotoxin nsp4 and methods of using same
JP5215865B2 (ja) 2005-11-22 2013-06-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド ノロウイルス抗原およびサポウイルス抗原
CA2651907C (en) 2006-05-22 2016-12-20 Plant Bioscience Limited Bipartite system, method and composition for the constitutive and inducible expression of high levels of foreign proteins in plants
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
CN103122354B (zh) 2007-11-27 2018-03-23 麦迪卡格公司 表达血凝素之转基因植物中生产的重组流感病毒样颗粒(vlp)
GB0800272D0 (en) 2008-01-08 2008-02-13 Plant Bioscience Ltd Protein expression systems
WO2009148964A2 (en) 2008-05-29 2009-12-10 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Expression and assembly of human group c rotavirus-like particles and uses thereof
ES2614527T3 (es) 2010-11-04 2017-05-31 Medicago Inc. Sistema de expresión en plantas
MY166220A (en) * 2011-06-13 2018-06-22 Medicago Inc Rabies virus like particle production in plants
CA2872803C (en) * 2012-05-11 2016-10-11 Medicago Inc. Rotavirus-like particle production in plants

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