ES2826402T3 - Producción de partículas similares a rotavirus en plantas - Google Patents

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Abstract

Un método de producción de una partícula similar a rotavirus (RLP) en una planta, porción de una planta o célula vegetal que comprende: a-i) proporcionar la planta, porción de la planta o célula vegetal que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus, una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en la planta, porción de la planta o célula vegetal; la primera secuencia de nucleótidos codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP6, la tercera secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP2 y la cuarta secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP7; o a-ii) introducir en la planta, porción de la planta o célula vegetal mediante la transformación del uno o más ácidos nucleicos que comprenden la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, y la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en la planta, porción de la planta o célula vegetal; y la primera secuencia de nucleótidos codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP6, la tercera secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP2 y la cuarta secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP7; e b) incubar la planta, porción de la planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de NSP4, VP6, VP2 y VP7 se expresen, produciendo de este modo la RLP, la RLP comprende proteínas de rotavirus, las proteínas de rotavirus consisten en proteínas estructurales de rotavirus; y opcionalmente c) cosechar la planta, porción de la planta o célula vegetal, y d) purificar las RLP de la planta, porción de la planta o célula vegetal, en donde las RLP tienen un tamaño que varía de 70-100 nm.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de partículas similares a rotavirus en plantas
Campo de la invención
Esta invención se refiere a la producción de partículas similares a rotavirus en plantas.
Antecedentes de la invención
La infección por rotavirus es un problema mundial que afecta principalmente a los niños menores de cinco años. Esta da como resultado gastroenteritis grave y, en el peor de los casos, la muerte.
Los rotavirus son miembros de la familia Reoviridae de virus (género Rotavirus) que afectan el sistema gastrointestinal y el tracto respiratorio. El nombre se deriva de la apariencia similar a una rueda de los viriones cuando se ven por microscopía electrónica de contraste negativo. El rotavirus suele tener forma globular y recibe su nombre de las cubiertas exterior e interior o de la estructura de la cápside de doble cubierta del mismo. La cápside externa es de aproximadamente 70 nm y la cápside interna es de aproximadamente 55 nm de diámetro, respectivamente. La cápside de doble cubierta del rotavirus rodea el núcleo incluida la cubierta interna de proteínas y el genoma. El genoma del rotavirus consiste en segmentos de ARN bicatenario que codifican al menos 11 proteínas de rotavirus - ya sean proteínas virales estructurales (VP) o proteínas no estructurales (NSP; Desselberger, Virus Res 190: 75-96 (2014)).
El ARNbc codifica seis proteínas estructurales (VP) y seis proteínas no estructurales (NSP). Las proteínas estructurales comprenden VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 y VP7. Tres capas concéntricas se forman por el ensamblaje de VP2, VP6 y VP7 respectivamente, donde VP4 forma "picos" en la superficie de la estructura del virus. La tripsina escinde VP4 a VP8* y VP5*. VP8* y VP5* son productos proteolíticos de VP4.
VP2 es una proteína de 102 kDa y es la proteína más abundante del núcleo viral. Forma la capa de proteína estructural más interna y proporciona un andamio para el ensamblaje correcto de los componentes y las enzimas de transcripción del núcleo viral (Lawton, 2000). VP1, la proteína viral más grande de 125 kDa, actúa como una polimerasa dependiente de ARN para rotavirus, creando un intermediario de replicación nuclear y se asocia con VP2 en sus vértices icosaédricos (Varani y Allain, 2002; Vende y otros, 2002). La VP3, una proteína de 98 kDa, también se asocia directamente con el genoma viral, actuando como una enzima de protección de ARNm que añade una estructura de caperuza 5' a los ARNm virales. Juntos, VP1 y VP3 forman un complejo que se une a los vértices exteriores de 5 pliegues de la capa de la cápside VP2 (Angel, 2007). VP6 es una proteína de 42 kDa que forma la cubierta intermedia del núcleo viral, es la proteína de la cápside principal y representa más del 50 % de la masa total de proteínas del virión (González y otros, 2004; Estes, 1996). Es necesario para la transcripción de genes y puede tener un papel en la encapsulación del ARN de rotavirus al anclar VP1 a VP2 en el núcleo, como se ve en el virus de la lengua azul, otro miembro de la familia Reoviridae. También determina la clasificación de los rotavirus en cinco grupos (A a E) donde el grupo A afecta con mayor frecuencia a los seres humanos (Palombo, 1999). VP6 en el grupo de rotavirus A tiene al menos cuatro subgrupos (SG), que dependen de la presencia o ausencia de epítopos específicos de SG: SG I, SG II, SG (I+II) y SG no-(I+II). Los grupos B y C carecen de un antígeno común del grupo A, pero también se conoce que infectan a los seres humanos, mientras que el grupo D solo afecta a animales, por ejemplo, pollos y vacas (Thongprachum, 2010).
Las dos proteínas de la cápside externa VP7, una glicoproteína (G) de 37 kDa y la VP4 (P) sensible a proteasa de 87 kDa, definen los serotipos del virus. Estas dos proteínas inducen respuestas de anticuerpos neutralizantes y, por lo tanto, se usan para clasificar los serotipos de rotavirus en un sistema de nomenclatura doble, dependiendo de la combinación de antígenos G-P (por ejemplo, G1 P[8] o G2 P[4]) (Sanchez-Padilla y otros, 2009, Rahman y otros, J Clin Microbiol 41: 2088-2095 (2003)). La proteína VP4 se dimeriza para formar 60 picos en la cubierta exterior del virus, que están directamente implicados en las etapas iniciales de la entrada de la célula huésped. La proteína de picos contiene un sitio de escisión en la posición aminoacídica (aa) 248. Tras la infección, esta es escindida por la proteasa tripsina para producir VP5 (529 aa, 60 kDa) y VP8 (246 aa, 28 kDa) (Denisova y otros, 1999). Este proceso mejora la infectividad del virus (adhesión celular e invasión de la célula huésped) y estabiliza la estructura de pico (Glass, 2006). La glicoproteína VP7 forma la tercera capa o la capa externa del virus. En la actualidad, se conocen los genotipos 27 G y 35 P (Greenberg y Estes, 2009). VP4 y VP7 son los principales antígenos implicados en la neutralización del virus y son objetivos importantes para el desarrollo de vacunas (Dennehy, 2007).
Las proteínas no estructurales (NSP) se sintetizan en células infectadas y funcionan en varias partes del ciclo de replicación o interactúan con algunas de las proteínas del huésped para influir en la patogénesis o la respuesta inmunitaria a la infección (Greenberg y Estes, 2009). Se ha demostrado que la proteína no estructural de rotavirus, NSP4, tiene múltiples funciones que incluyen la liberación de calcio del retículo endoplásmico (ER; Tian y otros, 1995); la ruptura de las membranas del RE y puede desempeñar un papel importante en la eliminación de la envoltura transitoria de las partículas en gemación durante la morfogénesis viral (ver la Figura 1); afectación del tráfico de la membrana desde el RE al complejo de Golgi con su capacidad para unirse a los microtúbulos (Xu y otros 2000); y funcionan como un receptor intracelular para ayudar en la gemación de partículas subvirales en el RE (Tian y otros 1996).
En las células de mamíferos infectados, los rotavirus experimentan un modo único de morfogénesis para formar las partículas virales VP2/6/4/7 de triple capa completas (Lopez y otros, 2005). La cápside de triple capa es un complejo muy estable que permite la transmisión fecal-oral y el suministro del virus al intestino delgado donde infecta a los enterocitos diferenciados que no se dividen cerca de las puntas de las vellosidades (Greenberg y Estes, 2009). En primer lugar, el virus intacto se une a los receptores independientes del ácido siálico a través de 60 picos de dímero de VP4 en la superficie del virus (Lundgren y Svensson, 2001). Los 60 picos de dímero de VP4 en la superficie del virus permiten que el virus se una a estos receptores celulares. La VP4 es susceptible a la escisión proteolítica por la tripsina, lo que da como resultado un cambio conformacional que expone sitios de unión adicionales en la superficie de la glicoproteína para la interacción con una serie de correceptores.
Sin embargo, el proceso de unión y entrada de múltiples etapas no se comprende claramente, pero el virus se suministra a través de la membrana plasmática del huésped. La cubierta exterior de la cápside de VP7, que también está implicada en el proceso de entrada, se elimina en el proceso y las partículas de doble capa (DLP) se suministran al citoplasma celular en vesículas (Figura 1; técnica anterior). La DLP escapa de la vesícula y entra en inclusiones citoplasmáticas no unidas a la membrana. La transcripción temprana del genoma por VP1 comienza en partículas de manera que el ARNbc nunca se expone al citoplasma. La replicación del ARN y la formación del núcleo tienen lugar en estas inclusiones citoplasmáticas no unidas a la membrana. Los ARN (+) nacientes se transportan después al citoplasma y sirven como plantillas para la síntesis de proteínas virales. La VP4 se produce en el citosol y se transporta al retículo endoplasmático rugoso (RER), y la VP7 se secreta en el RER. VP2 y VP6 se producen y ensamblan en el citosol en virosomas y posteriormente geman en los compartimentos de RER, recibiendo una envoltura de membrana transitoria en el proceso (Lopez y otros, 2005; Tian y otros, 1996). En el RER, las envolturas transitorias de las partículas virales se eliminan y reemplazan por los monómeros de proteínas VP4 y VP7, con una implicación crítica de la glicoproteína rotaviral NSP4 (Tian y otros, 1996; Lopez y otros, 2005; Gonzalez y otros, 2000). NSP4 funciona como un receptor intracelular en la membrana del r E y se une a las partículas subvirales recién creadas y probablemente también a la proteína de pico VP4 (Tian y otros, 1996). La NSP4 también es tóxica para los seres humanos y es el agente causante de la diarrea. Las partículas maduras y completas se transfieren posteriormente desde el RER a través del aparato de Golgi a la membrana plasmática para su secreción (López y otros, 2005).
Se han adoptado una variedad de enfoques diferentes para generar una vacuna contra el rotavirus adecuada para proteger a las poblaciones humanas de los diversos serotipos de rotavirus. Estos enfoques incluyen diversos enfoques de Jenner, el uso de los virus vivos atenuados, el uso de partículas similares a virus, vacunas de ácidos nucleicos y subunidades virales como inmunógenos. En la actualidad existen dos vacunas orales disponibles en el mercado, sin embargo, estas tienen baja eficacia debido a la variación de cepas.
Las patentes de los Estados Unidos núms. 4,624,850, 4,636,385, 4,704,275, 4,751,080, 4,927,628, 5,474,773, y 5,695,767, cada uno describe una variedad de vacunas contra el rotavirus y/o métodos para preparar estas vacunas, donde las partículas virales completas se usan para crear cada una de las vacunas contra el rotavirus.
La producción de partículas similares a rotavirus es una tarea desafiante, ya que se requieren tanto la síntesis como el ensamblaje de una o más proteínas recombinantes. El rotavirus comprende una cápside formada por 1860 monómeros de cuatro proteínas diferentes. Para la producción de RLP puede requerirse la expresión y el ensamblaje simultáneos de dos o tres proteínas recombinantes. Por ejemplo, una capa interna que comprende 120 moléculas de VP2, 780 moléculas de VP6 (capa intermedia) y una capa externa de 780 moléculas de la glicoproteína VP7 y 60 dímeros de VP4, para formar una partícula de doble o triple capa (Libersou y otros J. of Virology, marzo de 2008).
Crawford y otros (J Virol. 1994 septiembre; 68(9): 5945-5952) describen la expresión de VP2, VP4, VP6 y VP7 en un sistema de expresión de baculovirus. La coexpresión de diferentes combinaciones de las principales proteínas estructurales del rotavirus dio como resultado la formación de partículas similares a virus (VLP) estables. La coexpresión de VP2 y VP6 solas o con VP4 dio como resultado la producción de VLP de VP2/6 o VP2/4/6, que eran similares a las partículas de rotavirus de doble capa. La coexpresión de VP2, VP6 y VP7, con o sin VP4, produjo las VLP VP2/6/7 o VP2/4/6/7 de triple capa, que eran similares a las partículas de rotavirus infecciosas nativas. Las VLP mantuvieron las características estructurales y funcionales de las partículas nativas, determinadas mediante el examen microscópico electrónico de las partículas, la presencia de epítopos neutralizantes y no neutralizantes en VP4 y VP7, y la actividad de hemaglutinación de las VLP VP2/4/6/7.
Los candidatos a vacunas generados a partir de partículas similares a rotavirus de diferentes composiciones de proteínas han mostrado potencial como vacunas de subunidades. O'Neal y otros (J. Virology, 1997, 71(11):8707-8717) muestran que las VLP que contienen VP 2 y VP6, o VP2, VP6 y VP7, y administradas a ratones con y sin la adición de toxina del cólera inducen inmunidad protectora en ratones inmunizados. También se han usado partículas similares a núcleos (CLP) y las VLP para inmunizar vacas con VLP más eficaces que las CLP para inducir inmunidad pasiva Fernandez, y otros, (Vaccine, 1998, 16(5):507-516).
Las plantas se usan cada vez más para la producción a gran escala de proteínas recombinantes. Por ejemplo, el documento US 2003/0175303 describe la expresión de la proteína estructural de rotavirus recombinante VP6, VP2, VP4 o VP7 en plantas de tomate transformadas de forma estable.
Saldana y otros (Inmunol viral. 19: 42-53 (2006)) expresaron VP2 y VP6 en el citoplasma de plantas de tomate. Los estudios de microscopía electrónica demostraron que una pequeña proporción de las proteínas se había ensamblado en las VLP 2/6. Se detectó una respuesta inmunitaria protectora en ratones y esto puede haber sido contribuido en cierta medida por los PV no ensamblados. Se ha demostrado que las proteínas individuales provocan respuestas inmunitarias en ratones, como en el caso de VP8 y VP6 (Rodríguez-Diaz y otros Biotechnol Lett. 2011, 33(6):1169-75, Zhou y otros, Vaccine 28: 6021-6027 (2010)).
Matsumura y otros, (Archives of Virology 147: 1263-1270 (2002)) informan la expresión de VP6 de rotavirus A bovino en plantas de patata transgénicas. La VP6 se expresó, se purificó y se realizaron estudios inmunogénicos. La respuesta inmunitaria en ratones adultos mostró la presencia de anticuerpos VP6 en el suero. Sin embargo, no se proporcionó ninguna evidencia de proteínas VP6 ensambladas. Pudiera ser que los monómeros o trímeros de VP6 fueran los responsables de provocar la respuesta inmunitaria. O'Brien y otros (2000, Virol. 270: 10444-10453) muestran el ensamblaje de VP6 en Nicotiana benthamiana con el uso de un vector del virus de la patata X(PVX). El ensamblaje de la proteína VP6 en VLP icosaédricas solo se observó cuando la VP6 se fusionó con las varillas de la proteína PVX. Después de la escisión, la VP6 se ensambló en las VLP icosaédricas.
El rotavirus humano VP6 optimizado en codones se ha expresado con éxito en Chenopodium amaranticolor con el uso de un sistema de expresión mediado por el virus de la quemadura negra de la remolacha (BBSV). La proteína se diseñó como un reemplazo de la proteína de cubierta de BBSV. La inmunización oral de ratones hembra BALB/c con la proteína VP6 basada en plantas indujo títulos altos de IgA mucosal e IgG sérica anti-VP6 (Zhou y otros, Vaccine 28: 6021-6027 (2010)). Sin embargo, no se enseñó que las proteínas VP6 se ensamblaran en las VLP o partículas.
La VP7 de rotavirus se ha expresado en plantas de papa y se ha demostrado que produce una respuesta inmunitaria neutralizante en ratones (Yu y Langridge, 2001 Nature Biotechnol 19: 548-552). En plantas de papa transgénicas, el gen de VP7 se mantuvo estable durante 50 generaciones, donde la proteína VP7 de la 50a generación indujo tanto anticuerpos protectores como neutralizantes en ratones adultos (Li y otros, 2006, Virol 356:171-178).
Yang y otros (Yang Y M, Li X, Yang H, y otros Science China Life Science 54: 82-89 (2011)) coexpresaron tres proteínas de cápside de rotavirus VP2, VP6 y VP7 del grupo A RV (P[8]G1) en plantas de tabaco y se estudiaron los niveles de expresión de estas proteínas, así como también la formación de partículas similares a rotavirus y la inmunogenicidad. Las VLP se purificaron a partir de plantas de tabaco transgénicas y se analizaron por microscopía electrónica y transferencia Western. Estos resultados indican que las proteínas VP2, VP6 y VP7 derivadas de plantas se autoensamblaron en partículas similares a rotavirus 2/6 o 2/6/7 con un diámetro de 60-80 nm.
El documento WO 2013/166609 describió la producción de partículas similares a rotavirus (RLP) en plantas, al coexpresar las proteínas estructurales de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7 en plantas y al purificar las RLP resultantes en presencia de calcio.
El rotavirus NSP4 se ha expresado y purificado a partir de células de insectos (Tian y otros 1996, Arch Virol. 1996; Rodriguez-Diaz y otros, Protein Expr. Purif. 2003) y en E. coli (Sharif y otros, Medical Journal of the Islamic Republic of Iran 2003). NSP4 también se ha expresado como una proteína de fusión con la subunidad de la toxina del cólera B (CTB) en la papa (Arakawa y otros, Plant Cell Report 20: 343-348 (2001)).
Resumen
La presente invención se refiere a la producción de partículas similares a rotavirus en plantas.
Es un objeto de la invención producir partículas similares a rotavirus en plantas. La presente invención proporciona un método para producir una partícula similar a rotavirus (RLP) en una planta, porción de una planta o célula vegetal que comprende: a-i) proporcionar la planta, porción de la planta o célula vegetal que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus, una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en la planta, porción de la planta o célula vegetal; la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural de rotavirus VP6 , la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural de rotavirus VP2 y la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural de rotavirus VP7; o a-ii) introducir en la planta, porción de la planta o célula vegetal el uno o más ácidos nucleicos que comprenden la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, y la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en la planta, porción de la planta o célula vegetal; y la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural de rotavirus VP6 , la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural de rotavirus VP2 y la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural de rotavirus VP7; y b) incubar la planta, porción de la planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de NSP4, VP6 , VP2 y VP7 se expresen, produciendo de este modo la RLP, la RLP que comprende proteínas de rotavirus, las proteínas de rotavirus que consisten en proteínas estructurales de rotavirus; y opcionalmente c) cosechar la planta, porción de la planta o célula vegetal, y d) purificar las RLP de la planta, porción de la planta o célula vegetal, en donde las RLP tienen un tamaño que varía de 70-100 nm.
Se describen varios métodos para producir una partícula similar a rotavirus (RLP) en una planta, porción de una planta o célula vegetal.
Por ejemplo, un método (A) para producir una partícula similar a rotavirus (RLP) en un huésped o una célula huésped puede comprender:
a) proporcionar un huésped o una célula huésped que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, donde la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP6 y la tercera secuencia de nucleótidos que codifica una de las proteínas de rotavirus VP7 o VP4;
b) incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de NSP4, VP6 y VP7 o VP4 se expresen, produciendo de este modo la RLP.
En el método (A) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP6 , y la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP2, VP4 o VP7 y en donde cada una de NSP4, VP6 y dos de VP2, VP4 y VP7 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
Se describe además un método (B) para producir una partícula similar a rotavirus (RLP) en un huésped o una célula huésped, el método puede comprender:
a) proporcionar un huésped o una célula huésped que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, donde la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus NSP4, VP6 y una de las proteínas de rotavirus VP7 o VP4;
b) incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de NSP4, VP6 y VP7 o VP4 se expresen, produciendo de este modo la RLP.
En el método (B) como se describió anteriormente, uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus NSP4, VP6 y dos de las proteínas de rotavirus VP2, VP7 o VP4 y en donde cada una de NSp4, VP6 y dos de VP2, VP7 o VP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
En los métodos (A) y (B) como se describieron anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus y una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera, cuarta y la quinta secuencia de nucleótidos estás unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 y en donde cada una de VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
En el método (A) o (B) como se describió anteriormente, si se proporciona un huésped o una célula huésped donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus, una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus y una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped, entonces el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, o el uno o más ácidos nucleicos puede comprender, por ejemplo, dos ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus y un segundo ácido nucleico que comprende la segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifica la segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, o el uno o más ácidos nucleicos puede comprender, por ejemplo, dos ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera y segunda secuencias de nucleótidos que codifica la primera y segunda proteínas de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende la tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifica la tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus o el uno o más ácidos nucleicos puede comprender, por ejemplo, tres ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera y segunda secuencias de nucleótidos que codifican la primera y segunda proteínas de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifica la tercera y cuarta proteína de rotavirus, y un tercer ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus o el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender, por ejemplo, tres ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, y un tercer ácido nucleico que comprende la tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifica la tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus o el uno o más ácidos nucleicos puede comprender, por ejemplo, cuatro ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, y un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifica la cuarta y quinta proteínas de rotavirus o el uno o más ácidos nucleicos puede comprender, por ejemplo, cinco ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido núcleo que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la cuarta proteína de rotavirus, y un quinto ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus.
Los métodos (A) o (B) como se describió anteriormente pueden comprender además las etapas de:
c) cosechar el huésped o la célula huésped, y
d) purificar las RLP del huésped o la célula huésped, en donde las RLP tienen un tamaño que varía de 70-100 nm.
La una o más secuencias de nucleótidos del método (A) o (B) como se describió anteriormente pueden estar unidas operativamente a uno o más potenciadores de la expresión. Además, el potenciador de la expresión puede seleccionarse del grupo que consiste en CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ y CPMV HT+.
Se describe además en la presente descripción un método (C) para producir una partícula similar a rotavirus (RLP) en un huésped o una célula huésped que comprende:
a) introducir en el huésped o la célula huésped uno o más ácidos nucleicos que comprenden
una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, donde la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP6 y la tercera secuencia de nucleótidos que codifica una de las proteínas de rotavirus VP7 o VP4;
b) incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos de manera que cada una de NSP4, VP6 y VP7 o VP4 se expresen, produciendo de ese modo la RLP.
En el método (C) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP6 , y la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP2, VP4 o VP7 y en donde cada una de NSP4, VP6 y dos de VP2, VP4 y VP7 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
También se describe en la presente descripción un método (D) para producir una partícula similar a rotavirus (RLP) en un huésped o una célula huésped que comprende:
a) introducir en el huésped o la célula huésped uno o más ácidos nucleicos que comprenden
una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, donde la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus NSP4, VP6 y una de las proteínas de rotavirus VP7 o VP4;
b) incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos de manera que cada una de NSP4, VP6 y VP7 o VP4 se expresen, produciendo de ese modo la RLP.
En el método (D) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus NSP4, VP6 y dos de las proteínas de rotavirus VP2, VP7 o VP4 y en donde cada una de NSp4, VP6 y dos de VP2, VP7 o VP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
En los métodos (C) y (D) como se describieron anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus y una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 y en donde cada una de VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
El método (C) o (D) como se describió anteriormente puede comprender además las etapas de:
c) cosechar el huésped o la célula huésped, y
d) purificar las RLP del huésped o la célula huésped, en donde las RLP tienen un tamaño que varía de 70-100 nm.
En el método (C) o (D) como se describió anteriormente, si se proporciona un huésped o una célula huésped donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus, una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus y una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped, después en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender dos ácidos nucleicos, con un primer ácido nucleico que codifica la NSP4, y un segundo ácido nucleico que codifica VP2, VP4, VP6 y VP7, la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto al segundo ácido nucleico que se introduce en la planta, porción de una planta o célula vegetal está entre 1:0,8 y 1:2. La relación también puede ser de 1:1. Alternativamente, el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender dos ácidos nucleicos, con un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus y la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende de la tercera a la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la tercera a la quinta proteína de rotavirus.
En el método (C) o (D) como se describió anteriormente, en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender tres ácidos nucleicos, con un primer ácido nucleico que comprende la primera y segunda secuencias de nucleótidos que codifica la primera y segunda proteínas de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifica la tercera y cuarta proteína de rotavirus, y un tercer ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus, y en donde la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto al segundo ácido nucleico y al tercer ácido nucleico que se introduce en la planta, la porción de la planta, o la célula vegetal, es 1 :1 :1.
Alternativamente, en el método (C) o (D) como se describió anteriormente, en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender tres ácidos nucleicos, con el primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica el primera proteína de rotavirus, el segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, y el tercer ácido nucleico que comprende la tercera a la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la tercera a la quinta proteína de rotavirus, y en donde la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto al segundo ácido nucleico y al tercer ácido nucleico que se introduce en la planta, la porción de la planta, o la célula vegetal, es 1 :1 :1.
Además, en el método (C) o (D) descrito anteriormente, en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender cuatro ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende el primer ácido nucleico que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, y un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifica la cuarta y quinta proteínas de rotavirus, en donde la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto al segundo ácido nucleico, al tercer ácido nucleico y al cuarto ácido nucleico que se introduce en la planta, la porción de la planta o la célula vegetal es 1 :1 :1 :1.
En el método (C) o (D) como se describió anteriormente, en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender cinco ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la cuarta proteína de rotavirus, y un quinto ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus, y la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto al segundo ácido nucleico, al tercer ácido nucleico, al cuarto ácido nucleico y al quinto ácido nucleico que se introduce en la planta, la porción de la planta, o la célula vegetal, es 1 :1 :1 :1 :1.
La una o más secuencias de nucleótidos del método (C) o (D) como se describió anteriormente pueden estar unidas operativamente a uno o más potenciadores de la expresión. Además, el potenciador de la expresión puede seleccionarse del grupo que consiste en CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ y CPMV HT+.
También se describe un método (E) para aumentar la incorporación de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en una partícula similar a rotavirus (RLP), el método comprende:
a) proporcionar un huésped o una célula huésped que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, donde la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP6 y la tercera secuencia de nucleótidos que codifica una de las proteínas de rotavirus VP7 o VP4;
b) incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de NSP4, VP6 y VP7 o VP4 se expresen, produciendo de este modo la RLP con niveles mejorados de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 cuando se comparan con el nivel de VP4 o VP7 producido por un segundo huésped o célula huésped que expresa el uno o más ácidos nucleicos que no comprenden NSP4, en las mismas condiciones.
En el método (E) como se describió anteriormente, el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP6 , y la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP2, VP4 o VP7 y en donde cada una de NSP4, VP6 y dos de VP2, VP4 y VP7 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
También se describe un método (F) para incrementar la incorporación de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en una partícula similar a rotavirus (RLP), el método comprende:
a) proporcionar un huésped o una célula huésped que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, donde la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, la segunda y la tercera secuencia de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus NSP4, VP6 y una de las proteínas de rotavirus VP7 o VP4;
b) incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de NSP4, VP6 y VP7 o VP4 se expresen, produciendo de este modo la RLP con niveles mejorados de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 cuando se comparan con el nivel de VP4 o VP7 producido por un segundo huésped o célula huésped que expresa el uno o más ácidos nucleicos que no comprenden NSP4, en las mismas condiciones.
En el método (F) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus NSP4, VP6 y dos de las proteínas de rotavirus VP2, VP7 o VP4 y en donde cada una de NSp4, VP6 y dos de VP2, VP7 o VP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
En los métodos (E) y (F) como se describieron anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus y una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 y en donde cada una de VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
La una o más secuencias de nucleótidos del método (E) o (F) como se describió anteriormente puede estar unida operativamente a uno o más potenciadores de la expresión. Además, el potenciador de la expresión puede seleccionarse del grupo que consiste en CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ y CPMV HT+.
También se describe un método (G) para incrementar la incorporación de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en una partícula similar a rotavirus (RLP), el método comprende:
a) introducir en un huésped o célula huésped uno o más ácidos nucleicos que comprenden
una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, donde la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP6 y la tercera secuencia de nucleótidos que codifica una de las proteínas de rotavirus VP7 o VP4;
b) incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de NSP4, VP6 y VP7 o VP4 se expresen, produciendo de este modo la RLP con niveles mejorados de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 cuando se comparan con el nivel de VP4 o VP7 producido por un segundo huésped o célula huésped que expresa el uno o más ácidos nucleicos que no comprenden NSP4, en las mismas condiciones.
En el método (G) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP6 , y la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifica la proteína de rotavirus VP2, VP4 o VP7 y en donde cada una de NSP4, VP6 y dos de VP2, VP4 y VP7 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
También se describe un método (H) para incrementar la incorporación de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en una partícula similar a rotavirus (RLP), el método comprende:
a) introducir en un huésped o una célula huésped que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, donde la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus NSP4, VP6 y una de las proteínas de rotavirus VP7 o VP4;
b) incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de NSP4, VP6 y VP7 o VP4 se expresen, produciendo de este modo la RLP con niveles mejorados de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 cuando se comparan con el nivel de VP4 o VP7 producido por un segundo huésped o célula huésped que expresa el uno o más ácidos nucleicos que no comprenden NSP4, en las mismas condiciones.
En el método (H) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus NSP4, VP6 y dos de las proteínas de rotavirus VP2, VP7 o VP4 y en donde cada una de NSp4, VP6 y dos de VP2, VP7 o VP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
En los métodos (G) y (H) como se describieron anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus y una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 y en donde cada una de VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
En los métodos (G) y (H) como se describieron anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender además una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus y una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 y en donde cada una de VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
En el método (G) o (H) como se describió anteriormente, en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender dos ácidos nucleicos, con un primer ácido nucleico que codifica la NSP4, y un segundo ácido nucleico ácido que codifica VP2, VP4, VP6 y VP7, la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto al segundo ácido nucleico que se introduce en la planta, porción de una planta o célula vegetal está entre 1:0,8 y 1:2. La relación también puede ser de 1:1. Alternativamente, el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender dos ácidos nucleicos, con un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus y la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende de la tercera a la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la tercera a la quinta proteína de rotavirus.
En el método (G) o (H) como se describió anteriormente, en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender tres ácidos nucleicos, con un primer ácido nucleico que comprende la primera y segunda secuencias de nucleótidos que codifica la primera y segunda proteínas de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifica la tercera y cuarta proteína de rotavirus, y un tercer ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus, y en donde la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto al segundo ácido nucleico y al tercer ácido nucleico que se introduce en la planta, la porción de la planta, o la célula vegetal, es 1 :1 :1.
Alternativamente, en el método (G) o (H) como se describió anteriormente, en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender tres ácidos nucleicos, con el primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, el segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, y el tercer ácido nucleico que comprende la tercera a la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la tercera a la quinta proteína de rotavirus, y en donde la relación de una cantidad de la primera proteína de rotavirus ácido con respecto al segundo ácido nucleico y al tercer ácido nucleico que se introduce en la planta, la porción de la planta, o la célula vegetal, es 1 :1 :1.
Además, en el método (G) o (H) descrito anteriormente, en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender cuatro ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende el primer ácido nucleico que codifica el primer rotavirus proteína, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus y un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifica la cuarta y quinta proteínas de rotavirus, en donde la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto al segundo ácido nucleico, al tercer ácido nucleico y al cuarto ácido nucleico que se introduce en la planta, la porción de la planta o la célula vegetal es 1:1:1:1.
En el método (G) o (H) como se describió anteriormente, en la etapa de introducir (etapa a), el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender cinco ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la cuarta proteína de rotavirus, y un quinto ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus, y la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto al segundo ácido nucleico, al tercer ácido nucleico, al cuarto ácido nucleico y al quinto ácido nucleico que se introduce en la planta, la porción de la planta, o la célula vegetal, es 1:1:1:1:1.
La una o más secuencias de nucleótidos del método (G) o (H) como se describe anteriormente puede estar unida operativamente a uno o más potenciadores de la expresión. Además, el potenciador de la expresión puede seleccionarse del grupo que consiste en CPMV HT, CPM 160, CPMV 160+ y c Pm V HT+.
Los métodos (G) o (H) como se describió anteriormente pueden comprender además las etapas de:
c) cosechar el huésped o la célula huésped, y
d) purificar las RLP del huésped o la célula huésped, en donde las RLP tienen un tamaño que varía de 70-100 nm.
En el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente, el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender un ácido nucleico que comprende la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus.
En el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente, el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender dos ácidos nucleicos, por ejemplo, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende la segunda a la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la segunda a la quinta proteína de rotavirus. Alternativamente, el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender dos ácidos nucleicos, con un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus y la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende de la tercera a la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la tercera a la quinta proteína de rotavirus.
En el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente, el uno o más ácidos nucleicos también puede comprender tres ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus y la cuarta secuencia de nucleótidos que codifican la cuarta proteína de rotavirus, y un tercer ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus. Alternativamente, el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender tres ácidos nucleicos, con un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus y un tercer ácido nucleico que comprende la tercera a la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la tercera a la quinta proteína de rotavirus.
En el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos comprenden cuatro ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, y un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifica la cuarta y quinta proteínas de rotavirus.
Además, en el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender cinco ácidos nucleicos, con un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la cuarta proteína de rotavirus y un quinto ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus.
La una o más secuencia de nucleótidos del método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente pueden estar unidas operativamente a uno o más potenciadores de la expresión. Además, el potenciador de la expresión puede seleccionarse del grupo que consiste en CPMV HT, CPM 160, CPMV 160+ y CPMV HT+.
En el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente el huésped o la célula huésped puede comprender células de insecto, células de mamífero, planta, porción de una planta o células vegetales. La planta puede ser Nicotiana benthamiana.
Se describe además en la presente descripción una RLP producida por el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) descrito anteriormente, en donde la RLP es una RLP de triple capa que comprende una proteína de rotavirus, la proteína de rotavirus consiste en VP2, VP4, VP6 y VP7. La RLP puede no comprender NSp4.
Se describe además una composición que comprende una dosis eficaz de RLP para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, y un portador farmacéuticamente aceptable, y un método para inducir inmunidad a una infección por rotavirus en un sujeto, que comprende administrar la composición. En el método para inducir inmunidad, la composición puede administrarse a un sujeto por vía oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.
Se describe además en la presente descripción una materia vegetal que comprende una RLP producida por el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente.
En el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente, el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender un ácido nucleico que comprende la primera, la segunda y la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la primera, la segunda y la tercera proteína de rotavirus. Además, en el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender dos ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus y un segundo ácido nucleico que comprende la segunda y la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la segunda y la tercera proteína de rotavirus. Además, en el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender dos ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera y segunda secuencias de nucleótidos que codifica la primera y segunda proteínas de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus. Alternativamente, en el método (A), el método (B), el método (C), el método (D), el método (E), el método (F), el método (G) o el método (H) como se describió anteriormente el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender tres ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus y un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus.
La presente invención proporciona además el uso de la proteína de rotavirus NSP4 para aumentar la incorporación de la proteína estructural de rotavirus VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en la superficie de una partícula similar a rotavirus (RLP) producida en una planta, porción de una planta o células vegetales, la RLP que comprende proteínas de rotavirus, las proteínas de rotavirus que consisten en proteínas estructurales de rotavirus, en donde las proteínas estructurales de rotavirus comprenden VP2, VP6 y VP7 o VP2, VP6, VP4 y VP7. Como se describe en la presente descripción, al coexpresar NSP4 junto con VP6 y VP4 o VP7, en un huésped o una célula huésped, por ejemplo, una planta, porción de la planta o una célula vegetal, se observan RLP que comprenden niveles aumentados de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7, cuando se comparan con el nivel de VP4 y VP7 en las RLP producidas por un segundo huésped o célula huésped, por ejemplo, una planta, porción de una segunda planta, o segunda célula vegetal, que expresa el uno o más ácidos nucleicos que codifican VP6 y VP4 o VP7, y no codifica NSP4, el segundo huésped o la segunda célula huésped, por ejemplo, una segunda planta, la segunda porción de la planta o la segunda célula vegetal, incubada o cultivada, en las mismas condiciones que el huésped o la célula huésped, por ejemplo, una planta, una porción de la planta o una célula vegetal.
Este sumario de la invención no describe necesariamente todas las características de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Estas y otras características de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos en donde:
La Figura 1 muestra la entrada y la replicación de rotavirus en células. Cuando el rotavirus ingresa a una célula, VP4 y VP7 se pierden, formando una partícula de doble capa (DLP). La transcripción del ARNbc comienza dando como resultado la traducción de VP2, VP4, VP6 y VP7. Los núcleos de progenie con actividad replicasa se producen en fábricas de virus (también llamadas viroplasmas). La transcripción tardía ocurre en estos núcleos de progenie. En la periferia de las fábricas de virus, estos núcleos están recubiertos con VP6, formando DLP inmaduros que geman a través de la membrana del retículo endoplásmico, adquiriendo una membrana lipídica transitoria que se modifica con las glicoproteínas virales NSP4 y VP7 residentes en RE; estas partículas envueltas también contienen VP4. A medida que las partículas se mueven hacia el interior de las cisternas del RE, la membrana lipídica transitoria y la proteína no estructural NSP4 se pierden, mientras que las proteínas de la superficie del virus VP4 y VP7 se reorganizan para formar la capa de proteína más externa del virus, produciendo partículas infecciosas maduras de triple capa (ver Swiss Institute of Bioinformatics (ViralZone): viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html)
La Figura 2 muestra la purificación de partículas similares a rotavirus por ultracentrifugación en gradiente de densidad de iodixanol. La Figura 2A presenta el porcentaje de iodixanol y el volumen de cada capa del gradiente usado para la purificación de partículas similares a rotavirus. Después de la centrifugación, el gradiente se fraccionó en fracciones de 1 ml comenzando desde el fondo del tubo. La localización aproximada de las fracciones 1 a 13 se indica mediante flechas. La Figura 2B muestra un análisis SDS-PAGE teñido con Coomassie del contenido de proteína de las fracciones 1 a 10 a partir de una separación en gradiente de densidad de iodixanol aplicada a un extracto bruto de proteínas de hojas que expresan antígenos de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7.
La Figura 3 muestra la expresión de proteínas de rotavirus. La Figura 3A muestra un análisis SDS-PAGE teñido con Coomassie de las fracciones 2 y 3 de una separación en gradiente de densidad de iodixanol aplicado a extractos brutos de proteína de hojas que expresan VP2, VP4, VP6 , VP7 en presencia o ausencia de NSP4. Se expresaron las proteínas estructurales de rotavirus VP2, VP6 , VP7, VP4, panel izquierdo, con el uso de constructos individuales para cada antígeno estructural ("constructos génicos simples"), con NSP4 en un constructo separado; panel central, dos constructos, cada uno de los cuales tiene los genes de dos antígenos estructurales ("constructos génicos dobles"), con NSP4 en un constructo separado; o panel derecho, un constructo único para la coexpresión de los cuatro antígenos estructurales (constructos génicos cuádruples), con un constructo separado para la expresión de NSP4. La posición del antígeno de rotavirus VP2 y VP6 se muestra mediante flechas. La Figura 3B muestra un análisis de transferencia Western de la fracción F2 de los mismos tratamientos que en la Figura 3A con el uso de un anticuerpo anti- VP4 o VP7 de rotavirus como se especifica.
La Figura 4 muestra la expresión de proteínas de rotavirus en presencia de un potenciador de la expresión. La Figura 4A muestra un análisis SDS-PAGE teñido con Coomassie de las fracciones F2 y F3 a partir de un gradiente de densidad de iodixanol aplicado a extractos brutos de proteína de hojas que coexpresan VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4. Las proteínas estructurales de rotavirus VP2, VP6, VP7, VP4 se expresaron a partir de constructos génicos simples y un constructo que expresaba NSP4 (panel izquierdo), o de dos constructos génicos dobles y un constructo que expresaba NSP4 (panel central y derecho)). Cada constructo comprendía un potenciador de la expresión, ya sea CPMV HT (paneles izquierdo y medio) o CMPV 160 (panel derecho), excepto NSP4 que siempre comprendía el potenciador CPMV-HT. Las relaciones indican la proporción de las cepas de Agrobacterium en la suspensión bacteriana usada para la transformación: panel izquierdo - cinco constructos génicos simples (VP2, VP6, VP4, VP7 y NSP4; relación de 1:1:1:1:1); paneles central y derecho - constructos génicos dobles que codifican proteínas estructurales (VP6/2 y VP7/4) y el constructo que codifica proteínas no estructurales (NSP4; relación de 1:1:1). La Figura 4B muestra un análisis de transferencia Western de F2 de los mismos tratamientos que en la Figura 4A con el uso de un anticuerpo anti-VP4 o VP7 de rotavirus como se especifica. Las relaciones indican la proporción de las cepas de Agrobacterium en la suspensión bacteriana usada para la transformación: panel izquierdo - cinco constructos génicos simples (VP2, VP6 , VP4, VP7 y NSP4; relación de 1:1:1:1:1); paneles central y derecho - constructos génicos dobles que codifican proteínas estructurales (VP6/2 y VP7/4) y el constructo que codifica proteínas no estructurales (NSP4; relación de 1:1:1).
La Figura 5 muestra la expresión de proteínas de rotavirus. El panel superior muestra un análisis SDS-PAGE teñido con Coomassie de las fracciones F2 y F3 a partir de un gradiente de densidad de iodixanol aplicado a extractos brutos de proteína de hojas que coexpresan VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4, y el panel inferior muestra un análisis de transferencia Western de la fracción F2 correspondiente del panel superior. Las proteínas estructurales de rotavirus VP2, VP6 , VP7 y VP4 se expresaron dentro de un constructo génico cuádruple, y la proteína no estructural NSP4 se coexpresó a partir de un constructo génico simple distinto (carriles 1 y 2), o las proteínas estructurales VP2, VP6, VP7, VP4 y la proteína no estructural NSP4 se expresaron dentro de un constructo génico quíntuple (carril 3). Se indica la relación de agroinfiltración de los constructos. Una DO de 0,4 de cepas de Agrobacterium en la suspensión bacteriana se indica como 1. Una DO de 0,6 de cepas de Agrobacterium en la suspensión bacteriana se indica como 1,5.
La Figura 6 muestra un esquema general de un ejemplo de varias secuencias potenciadoras que pueden usarse en los constructos de la presente invención. La Figura 6A y la Figura 6B muestran un esquema general de las secuencias potenciadoras de CPMV HT y CPMV HT+ fusionadas a una secuencia de nucleótidos de interés (por ejemplo, que codifica una proteína estructural de rotavirus VP2, VP4, VP6 , VP7 o una proteína no estructural NSP4). No todos los elementos mostrados en las Figuras 5A o 5B pueden ser necesarios dentro de la secuencia potenciadora. Pueden incluirse elementos adicionales en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de interés que incluye una secuencia que codifica una región no traducida 3' de comovirus (CPMV 3' UTR) o una 3' UTR (3'UTR) de plastocianina. Las Figuras 6C y 6D muestran un esquema general de la secuencia potenciadora de CPMVX y CPMVX+ (que comprende CPMVX y un fragmento de relleno, que en este ejemplo no limitante, comprende un sitio de clonación múltiple y una secuencia de Kozak de plantas), como se describe en la presente descripción. CPMCX y CPMVX+ se muestran cada uno unidos operativamente a la región reguladora de plantas en sus extremos 5' y en sus extremos 3', en serie, una secuencia de nucleótidos de interés (que incluye un sitio de inicio ATG y un sitio de PARADA), una 3' UTR y una secuencia terminadora. Un ejemplo de constructo CPMVX como se describe en la presente descripción, es CPMV160. Un ejemplo de constructo CPMVX+ como se describe en la presente descripción, es CPMV160+.
La Figura 7 muestra los componentes de secuencia usados para preparar el constructo número 1710 (2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS. La Figura 7A muestra la secuencia de nucleótidos de IF-WA_VP2(opt).s1+3c (Se Q ID NO: 19). La Figura 7B muestra la secuencia de nucleótidos de IF-WA_VP2(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 20). La Figura 7C muestra la secuencia codificante optimizada de VP2 de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO: 21). La Figura 7D muestra la representación esquemática del constructo 1191. La Figura 7E muestra la secuencia de nucleótidos del constructo 1191 (SEQ ID NO: 22). La Figura 7F muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1710 (SEQ ID NO: 23). La Figura 7G muestra la secuencia de aminoácidos de VP2 de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO: 24). La Figura 7H muestra la representación esquemática del constructo número 1710.
La Figura 8 muestra los componentes de secuencia usados para preparar el constructo número 1713 (2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS). La Figura 8A muestra la secuencia de nucleótidos de IF-WA_VP6(opt).s1+3c (s Eq iD NO: 25). La Figura 8B muestra la secuencia de nucleótidos de IF-WA_VP6(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 26). La Figura 8C muestra la secuencia codificante optimizada de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO: 217. La Figura 8D muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1713 (SEQ ID NO: 28). La Figura 8E muestra la secuencia de aminoácidos de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO: 29).
La Figura 8F muestra la representación esquemática del constructo número 1713.
La Figura 9 muestra los componentes de secuencia usados para preparar el constructo número 1730 (2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS). La Figura 9A muestra la secuencia de nucleótidos de IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c (Se Q ID NO: 30). La Figura 9B muestra la secuencia de nucleótidos de IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 31). La Figura 9C muestra la secuencia codificante optimizada de VP4 de la cepa RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A (SEQ ID NO:32). La Figura 9D muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1730 (SEQ ID NO: 33). La Figura 9E muestra la secuencia de aminoácidos de VP4 de la cepa Rotarix de Rotavirus A (SEQ ID NO: 34). La Figura 9F muestra la representación esquemática del constructo número 1730.
La Figura 10 muestra los componentes de secuencia usados para preparar el constructo número 1734 (2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP7(Opt)/NOS). La Figura 10A muestra la secuencia de nucleótidos de IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c (SEQ ID No : 35). La Figura 10B muestra la secuencia de nucleótidos de IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r (SEQ ID NO: 36). La Figura 10C muestra la secuencia codificante optimizada de VP7 de la cepa RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A (SEQ ID NO: 37). La Figura 10D muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1734 (SEQ ID NO: 38). La Figura 10E muestra la secuencia de aminoácidos de TrSp-VP7 de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A (SEQ ID NO: 39). La Figura 10F muestra la representación esquemática del constructo número 1734.
La Figura 11 muestra los componentes de secuencia usados para preparar el constructo número 1706 (2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) NSP4/NOS). La Figura 11A muestra la secuencia de nucleótidos de IF-WA_NSP4.s1+3c (SEQ ID No : 40). La Figura 11B muestra la secuencia de nucleótidos de IF-WA_NSP4.s1-4r (SEQ ID NO: 41). La Figura 11C muestra la secuencia codificante de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO: 42). La Figura 11D muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1706 (SEQ ID NO: 43) . La Figura 11E muestra la secuencia de aminoácidos de NSP4 de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO: 44) . La Figura 11F muestra la representación esquemática del constructo número 1706.
La Figura 12 muestra los componentes de secuencia usados para preparar el constructo número 1108 (2X35S/CPMV-160/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS). La Figura 12A muestra la secuencia de nucleótidos de IF(C160)-WA_VP2(opt).c (SEQ ID NO: 45). La Figura 12B muestra una representación esquemática del constructo 1190. La Figura 12C muestra la secuencia de nucleótidos del constructo 1190 (SEQ ID NO: 46). La Figura 12D muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1108 (SEQ ID NO: 47). La Figura 12E muestra una representación esquemática del constructo número 1108.
La Figura 13 muestra los componentes de secuencia usados para preparar el constructo número 1128 (2X35S/CPMV-160/RVA(WA) VP6(opt)/NOS). La Figura 13A muestra la secuencia de nucleótidos de IF(C160)-WA_VP6(opt).c (SEQ ID NO: 48). La Figura 13B muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1128 (SEQ ID NO: 49). La Figura 13C muestra una representación esquemática del constructo número 1128.
La Figura 14 muestra los componentes de secuencia usados para preparar el constructo número 1178 (2X35S/CPMV-160/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS). La Figura 14A muestra la secuencia de nucleótidos de IF(C160)-Rtx_VP4(opt).c (SEQ ID NO: 50). La Figura 14B muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1178 (SEQ ID NO: 51). La Figura 14C muestra la representación esquemática del constructo número 1178.
La Figura 15 muestra los componentes de secuencia usados para preparar el constructo número 1199 (2X35S/CPMV-160/TrSp-RVA(Rtx) VP7(Opt)/NOS). La Figura 15A muestra la secuencia de nucleótidos de IF(C160)-TrSP+Rtx_VP7(opt).c (SEQ ID NO: 52). La Figura 15B muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1199 (SEQ ID NO: 53). La Figura 15C muestra la representación esquemática del constructo número 1199.
La Figura 16 muestra la representación esquemática del constructo número 1708 (constructo génico doble para la expresión de VP6 y VP2 bajo el casete de expresión CPMV-HT).
La Figura 17 muestra la representación esquemática del constructo número 1719 (constructo génico doble para la expresión de VP7 y VP4 bajo el casete de expresión CPMV-HT).
La Figura 18 muestra la representación esquemática del constructo número 2400 (constructo génico doble para la expresión de VP6 y VP2 bajo el casete de expresión CPMV-160).
La Figura 19 muestra la representación esquemática del constructo número 2408 (constructo génico doble para la expresión de VP7 y VP4 bajo el casete de expresión CPMV-160).
La Figura 20 muestra la representación esquemática del constructo número 1769 (constructo génico cuádruple para la expresión de VP7, VP4, VP6 y VP2 bajo el casete de expresión CPMV-HT).
La Figura 21 muestra la representación esquemática del constructo número 2441 (constructo génico quíntuple para la expresión de VP4, VP7, NSP4, VP6 y VP2 bajo el casete de expresión CPMV-HT).
Descripción detallada
La presente solicitud proporciona la siguiente descripción.
La presente descripción se refiere a partículas similares a virus (VLP) que comprenden una o más proteínas estructurales de rotavirus (es decir, una partícula similar a rotavirus, VLP o RLP de rotavirus) y a métodos para producir partículas similares a rotavirus (RLP) en cualquier huésped, particularmente en plantas, una porción de una planta o una célula vegetal. Otros huéspedes pueden comprender, por ejemplo, células de insectos y células de mamíferos. La partícula similar a rotavirus (RLP) puede comprender una o más proteínas estructurales de rotavirus. La RLP puede ser de triple capa. La RLP puede producirse al coexpresar proteínas estructurales y no estructurales de rotavirus en plantas, sin embargo, la RLP no comprende ninguna proteína no estructural de rotavirus.
El huésped o la célula huésped puede ser de cualquier fuente incluidas plantas, hongos, bacterias, insectos y animales. El huésped o la célula huésped puede ser una planta o una célula vegetal.
La presente descripción en parte proporciona además un método para producir una partícula similar a rotavirus (RLP) en un huésped, tal como una planta, una porción de una planta o una célula vegetal. El método puede comprender introducir uno o más ácidos nucleicos que comprenden una región reguladora activa en el huésped, tal como una planta, una porción de una planta o una célula vegetal, la región reguladora unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus y una o más proteínas no estructurales de rotavirus en el huésped, tal como en una planta, porción de la planta o célula vegetal. Seguido de la incubación del huésped, tal como una planta, una porción de la planta o una célula vegetal en condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, produciendo de este modo la RLP que comprende una o más proteínas estructurales de rotavirus. La una o más proteínas estructurales de rotavirus puede ser la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6 o VP7. La proteína no estructural de rotavirus puede ser NSP4. La RLP puede ser de triple capa. La RLP puede comprender la proteína estructural de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7, y no comprende la proteína no estructural NSP4.
La presente descripción en parte proporciona además un método para producir una partícula similar a rotavirus (RLP) en un huésped o una célula huésped, el método puede comprender:
proporcionar un huésped o una célula huésped que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, donde la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, la segunda y la tercera secuencia de nucleótidos que codifican NSP4 y una o dos de la proteína de rotavirus VP2 o VP6 y una o dos de la proteína de rotavirus VP7 o VP4;
incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos, de manera que NSP4 y VP2, VP4 y VP7, o VP2, VP6 y VP7, o VP2, VP6 y VP4, o VP6, VP4 y VP7, se expresan, produciendo de este modo la RLP.
Además, el uno o más ácidos nucleicos pueden comprender una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus. La primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos está unida operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y la primera secuencia de nucleótidos, la segunda secuencia de nucleótidos, la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de rotavirus VP2, o VP6, VP4 o VP7 y NSP4, en donde NSP4 y en donde VP2 o VP6 y VP4 o VP7 se expresan a partir de uno o más ácidos nucleicos.
Además, la presente descripción proporciona en parte un método para producir un candidato vacunal de partículas similares a rotavirus (RLP) en un huésped, tal como una planta, una porción de la planta o una célula vegetal. El método puede comprender expresar en un huésped, tal como en una planta o una porción de una planta, uno o más ácidos nucleicos (R1-R5 ) que comprenden una o más regiones reguladoras activas en el huésped, tal como en la planta, porción de una planta, o célula vegetal, la región reguladora unida operativamente a las secuencias de nucleótidos R1-R5, en donde la secuencia de nucleótidos R1 codifica la proteína de rotavirus X1, la secuencia de nucleótidos R2 codifica la proteína de rotavirus X2, la secuencia de nucleótidos R3 codifica la proteína de rotavirus X3, la secuencia de nucleótidos R4 codifica la proteína de rotavirus X4 y la secuencia de nucleótidos R5 codifica la proteína de rotavirus X5 y cada una de X1-X5 se selecciona del grupo de proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, de manera que cada uno de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresen en el huésped, tal como en la planta, la porción de la planta o la célula vegetal (ver la Tabla 1). La RLP puede comprender las proteínas estructurales de rotavirus VP2, Vp4, VP6 y VP7. La RLP no comprende la proteína NSP4 no estructural.
Se ha descubierto que mediante la introducción y coexpresión de una proteína estructural de rotavirus y una proteína no estructural de rotavirus en el huésped, tal como una planta o una porción de la planta puede modularse el rendimiento de la RLP producida. En particular, se ha encontrado que al coexpresar proteínas estructurales de rotavirus junto con una proteína no estructural de rotavirus NSP4 en el huésped, tal como una planta, porción de la planta o célula vegetal, puede aumentarse la incorporación de la proteína estructural VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en la RLP, en comparación con el nivel de VP4 y VP7 producido por un segundo huésped, tal como una segunda planta, porción de una segunda planta o segunda célula vegetal que expresa las mismas proteínas estructurales de rotavirus pero que no expresa la proteína no estructural de rotavirus, en las mismas condiciones.
Por ejemplo, se proporciona un método para aumentar la incorporación de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en una partícula similar a rotavirus (RLP). El método comprende:
a) proporcionar un huésped o una célula huésped que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus, una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus; donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en el huésped o la célula huésped; y
la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifican una de las proteínas de rotavirus VP7, VP4, NSP4 y VP2 o VP6 ;
b) incubar el huésped o la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada uno de las VP7, VP4, NSP4 y VP2 o VP6 y se expresen, produciendo de este modo la RLP con niveles mejorados de VP4, VP7, o tanto VP4 como VP7 en comparación con el nivel de VP4 o VP7 producido por un segundo huésped o célula huésped que expresa el uno o más ácidos nucleicos que no comprenden NSP4, en las mismas condiciones.
Además, un método alternativo para aumentar la producción de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en una partícula similar a rotavirus (RLP) puede comprender:
a) introducir en una planta, porción de una planta o célula vegetal uno o más ácidos nucleicos que comprenden una o más regiones reguladoras unidas operativamente a una primera, una segunda, una tercera, una cuarta y una quinta secuencia de nucleótidos, la una o más regiones reguladoras activas en la planta, porción de la planta o de la célula vegetal, la primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus, la tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus y la quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, cada una de las primera, segunda, tercera, cuarta o quinta secuencia de nucleótidos que codifica una de VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, e
b) incubar la planta, porción de una planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión transitoria del uno o más ácidos nucleicos de manera que cada una de VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4 se expresen transitoriamente, produciendo de este modo la RLP con niveles mejorados de VP4 y VP7 cuando se comparan con el nivel de VP4 y VP7 producido por una segunda planta, porción de una segunda planta o segunda célula vegetal que expresa el uno o más ácidos nucleicos que no comprenden NSP4, en las mismas condiciones.
Si se desea, el método puede comprender además las etapas de:
c) cosechar la planta, porción de una planta o célula vegetal, y
d) purificar las RLP de la planta, porción de una planta o célula vegetal, en donde las RLP tienen un tamaño que varía de 70-100 nm.
Se proporciona además un método alternativo para aumentar la producción de VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en una partícula similar a rotavirus (RLP), el método que comprende:
a) proporcionar una planta, porción de una planta o célula vegetal que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una o más regiones reguladoras unidas operativamente a una primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos, la una o más regiones reguladoras activas en la planta, porción de la planta o la célula vegetal, la primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus, la tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus y la quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, cada una de la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifica una de VP2, VP4, VP6 , VP7 o NSP4, y
b) incubar la planta, porción de una planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de las VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresen, produciendo de este modo la RLP con niveles mejorados de VP4 y VP7 cuando se comparan con el nivel de VP4 y VP7 producido por una segunda planta, porción de una segunda planta o segunda célula vegetal que expresa uno o más ácidos nucleicos que no comprenden NSP4, en las mismas condiciones.
Se ha descubierto además que al modular la relación entre los constructos que comprenden ácidos nucleicos que codifican proteínas estructurales de rotavirus y la proteína no estructural NSP4 durante la expresión transitoria en el huésped, tal como una planta, porción de la planta o célula vegetal, puede mejorarse el rendimiento de la producción de RLP y la incorporación de proteínas estructurales VP4 y VP7 en la RLP.
Sin desear unirse a la teoría, la coexpresión de una proteína no estructural de rotavirus, por ejemplo, NSP4 junto con una o más proteínas estructurales de rotavirus, por ejemplo, VP2, VP4, VP6 y/o VP7 puede conducir a un aumento en la incorporación de VP4 y/o VP7 en las RLP. Este aumento de la incorporación de VP4 y/o VP7 en las RLP puede ocurrir a través de un aumento de la expresión o producción de las proteínas de rotavirus y/o debido a un aumento de la eficacia del ensamblaje de las RLP y/o un aumento del reclutamiento de las proteínas de rotavirus en el sitio de ensamblaje de RLP.
Como se muestra en la Figura 3A y 3B, la coexpresión de la proteína no estructural de rotavirus NSP4 junto con la proteína estructural de rotavirus VP2, VP6, VP4 y VP7 en plantas conduce a un aumento en la incorporación de VP4 y VP7 en las RLP, cuando se compara con la expresión de las proteínas estructurales VP2, VP6, VP4 y VP7 sin la presencia de NSP4 (ver la Figura 3B).
Las relaciones de los constructos que codifican las diversas proteínas estructurales y no estructurales que se expresan transitoriamente en el huésped, tal como una planta, porción de la planta o célula vegetal, pueden alterarse al proporcionar constructos que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas estructurales de rotavirus y la proteína no estructural NSP4 en dos, tres, cuatro o cinco constructos y al variar la cantidad de cada constructo durante la etapa de introducir el constructo en el huésped (con el uso de Agrobacterium en la planta, porción de la planta o célula vegetal). Por ejemplo, pueden cointroducirse en diversas proporciones cinco constructos separados, cada uno que codifica una proteína estructural y la proteína no estructural, dando como resultado la coexpresión de los ácidos nucleicos en diversas relaciones dentro de una planta, porción de la planta o célula vegetal. Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos pueden proporcionarse en diversas combinaciones en dos, tres o cuatro constructos y los constructos se cointroducen en la planta, porción de la planta o célula vegetal, en diversas relaciones, como se describe más adelante.
Además, las secuencias de ácidos nucleicos pueden proporcionarse en el mismo constructo.
"Proteína de rotavirus" puede referirse a una proteína estructural de rotavirus o proteínas no estructurales de rotavirus. Una "proteína estructural de rotavirus" puede referirse a toda o una porción de una proteína estructural de rotavirus aislada de rotavirus, presente en cualquier cepa o aislado de rotavirus de origen natural o una variante de cualquier cepa o aislado de rotavirus de origen natural. Por tanto, la expresión proteína estructural de rotavirus incluye una proteína estructural de rotavirus de origen natural o una variante de una proteína estructural de rotavirus que puede producirse por mutación durante el ciclo de vida del virus o producirse en respuesta a la presión selectiva (por ejemplo, terapia de fármacos, expansión de tropismo de la célula huésped o infectividad, etc.). Como apreciará un experto en la técnica, tales proteínas estructurales de rotavirus y variantes de las mismas también pueden producirse con el uso de técnicas recombinantes. Las proteínas estructurales de rotavirus pueden incluir proteínas de la cápside tales como, por ejemplo, VP2 y VP6, proteínas de superficie, por ejemplo, VP4, o una combinación de proteínas de la cápside y de la superficie. La proteína estructural puede incluir, además, por ejemplo, VP7.
Por "proteína no estructural" de rotavirus, "proteína no estructural", "proteína no estructural", "NSP" o "proteína de rotavirus no estructural" se entiende una proteína que está codificada por el genoma de rotavirus, pero no empaquetada en la partícula viral. Los ejemplos no limitantes de proteínas no estructurales de rotavirus son rotavirus NSP4.
Por "coexpresado" se entiende que dos, o más de dos, secuencias de nucleótidos se expresan aproximadamente al mismo tiempo dentro de la planta, dentro del mismo tejido de la planta y dentro de las mismas células de la planta. No es necesario que las secuencias de nucleótidos se expresen exactamente al mismo tiempo. Por el contrario, las dos o más secuencias de nucleótidos se expresan de tal manera que los productos codificados tengan la posibilidad de interactuar dentro de un compartimento celular deseado. Por ejemplo, la proteína no estructural puede expresarse preferentemente antes o durante el período en el que se expresan las proteínas estructurales. Las dos o más de dos secuencias de nucleótidos pueden coexpresarse con el uso de un sistema de expresión transitoria, donde las dos o más secuencias se introducen dentro de la planta aproximadamente al mismo tiempo, bajo condiciones en las que se expresan las dos o más secuencias. Las dos o más de dos secuencias pueden estar presentes en diferentes constructos, y la coexpresión requiere la introducción de cada uno de los constructos en la planta, porción de la planta o célula vegetal, o las dos o más de dos secuencias pueden estar presentes en un constructo y el constructo introducido en la planta, porción de la planta o célula vegetal.
La expresión "partícula similar a virus" (VLP), o "partículas similares a virus" o "VLP" se refiere a estructuras que se autoensamblan y comprenden una o más proteínas estructurales tales como, por ejemplo, proteína estructural de rotavirus, por ejemplo, pero no se limitan a VP2, VP4, VP6, VP7, o una combinación de las proteínas estructurales VP2, VP4, VP6, VP7. Las VLP que comprenden la proteína estructural de rotavirus también pueden denominarse "VLP de rotavirus", "partícula similar a rotavirus (RVLP)", "partícula similar a rotavirus (RLP)", "partícula similar a rotavirus", "RVLP" o "RLP". Generalmente las VLP o RLP son morfológicamente y antigénicamente similares a los viriones producidos en una infección, pero carecen de información genética suficiente para replicarse y, por lo tanto, no son infecciosas. Las VLP pueden producirse en células huésped eucariotas adecuadas incluidas las células huésped de plantas. Tras la extracción de la célula huésped y tras el aislamiento y posterior purificación en condiciones adecuadas, las VLP pueden purificarse como estructuras intactas. La RLP puede ser una RLP de una, doble o triple capa. Las RLP de triple capa pueden obtenerse mediante la expresión simultánea de tres o más proteínas estructurales de rotavirus y, como se describe en la presente descripción, la coexpresión con una o más proteínas no estructurales. Por ejemplo, la coexpresión de las proteínas estructurales VP2, VP6, VP7, VP4 y la proteína no estructural NSP4 da como resultado la producción de las RLP de triple capa.
La coexpresión de VP4, junto con VP2, VP6, VP7 y una o más proteínas no estructurales según sea necesario, da como resultado una partícula con picos que se asemeja al rotavirus nativo. VP4 puede procesarse o escindirse para producir VP5 y VP8. Este procesamiento puede tener lugar dentro del huésped con el uso de proteasas endógenas, o al coexpresar una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina. Alternativamente, VP4 puede procesarse para producir VP5 y VP8 al añadir una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una proteasa serina, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina durante cualquier etapa del procedimiento de extracción de RLP, o después de la purificación de r Lp .
Cada una de las proteínas estructurales de rotavirus tiene diferentes características y tamaño, y se requiere en diferentes cantidades para ensamblarse en la RLP. La expresión "VLP de rotavirus", "partícula similar al virus rotavirus (RVLP)", "partícula similar al virus rotavirus (RLP)", "partícula similar al virus rotavirus", "RVLP" o "RLP" se refiere a una partícula similar a virus (VLP) que comprende una o más proteínas estructurales de rotavirus. Los ejemplos de proteínas estructurales de rotavirus pueden incluir, pero no se limitan a, las proteínas estructurales VP2, VP4 (o VP5 y VP8), VP6 y VP7. La RLP puede no comprender proteínas no estructurales de rotavirus.
La presente descripción proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde uno o más ácidos nucleicos (N1-N5) que comprenden una o más regiones reguladoras activas en la planta están unidos operativamente a las secuencias de nucleótidos R1-R5, en donde la secuencia de nucleótidos R1 codifica la proteína de rotavirus X1, la secuencia de nucleótidos R2 codifica la proteína de rotavirus X2, la secuencia de nucleótidos R3 codifica la proteína de rotavirus X3 , la secuencia de nucleótidos R4 codifica la proteína de rotavirus X4 y la secuencia de nucleótidos R5 codifica la proteína de rotavirus X5 y en donde X1-X5 se seleccionan del grupo de proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, en donde VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se seleccionan cada uno una vez (ver la Tabla 1). El conjunto final, o combinación, de ácidos nucleicos usados para transformar el huésped da como resultado la expresión de cada proteína de rotavirus dentro del huésped lo que da como resultado la expresión de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 y la formación de una RLP.
Por ejemplo, con referencia a la Tabla 1, pueden usarse 2 ácidos nucleicos (N1 y N2 ) para transformar un huésped (ver el ejemplo # 2.1). En este caso N1 comprende la secuencia de nucleótidos R1 y R1 puede codificar una de VP2, VP4, VP6, VP7, o NSP4. El ácido nucleico N2 comprende cuatro secuencias R2 a R5, donde cada una de R2 a R5 codifica una de VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, pero no la proteína codificada por R1, de manera que cada una de las VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresan dentro del huésped, produciendo de este modo la RLP. Como ejemplo no limitante, N1 puede comprender R1 que puede codificar VP2 , y N2 puede comprender R2 a R5 que pueden codificar VP4, VP6, v P7 y NSP4 respectivamente.
La Tabla 1 proporciona una descripción general de las combinaciones, que no deben considerarse limitantes, de ácidos nucleicos (N) y secuencias de nucleótidos (R) que pueden expresarse o coexpresarse dentro de un huésped para producir una RLP que comprende VP2, VP4, VP6 y VP7.
Tabla 1
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*Para las combinaciones 1.1, 2.1, 2.2, 3.1, 3.2, 4.1 y 5: X i , X 2, X 3, X4 y X 5 tienen que ser cada uno una proteína de rotavirus diferente seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4. Para la combinación 1.3, 2.5 y 3.4: X 1, X 2 y X3 tienen que ser cada uno una proteína de rotavirus diferente seleccionada ya sea de VP4, VP6 y NSP4 o VP7, VP6 y NSP4.
Para la combinación 1.2, 2.3, 2.4, 3.3 y 4.2: X 1, X 2, X 3 y X 4 tienen que ser cada uno una proteína de rotavirus diferente seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, VP2, VP7, VP6 y NSP4 o VP4, VP7, VP6 y NSP4.
1. Un constructo
1.1 Constructo génico quíntuple
Como se describe en la presente descripción, se proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un ácido nucleico (N1; un primer ácido nucleico) que comprende una primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos (R1, R2 , R3, R4 , R5) que codifica una primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X1, X2 , X3 , X4, X5) se expresa en una planta o porción de una planta (Ver la Tabla 1, Combinación #1.1).
Por consiguiente, el ácido nucleico N1 comprende las secuencias de nucleótidos R1, R2, R3 , R4 y R5 , en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R2-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 y R3-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1, R2, R4 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4, y en donde R1 -R3 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X4 , donde X5 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 , VP7 y NSP4, y en donde R1 -R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X5, con el resultado de que una secuencia de nucleótidos que codifica para cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 está comprendida en el ácido nucleico Ni , permitiendo de este modo la expresión de cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 en el huésped transformado.
El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos Ri , en donde Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 y las secuencias de nucleótidos R2-R5, en donde R2-R5 codifica una proteína de rotavirus seleccionada de VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, y en donde la proteína de rotavirus no está codificada por Ri . Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP2 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP4, VP6, VP7 y NSP4, pero R2-R5 pueden no codificar VP2. En otro ejemplo que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus Vp4 y la secuencia de nucleótidos R2-R5 puede codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP6, VP7 y NSP4, pero R2-R5 puede no codificar Vp4. En otro ejemplo no limitante, la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP6 y la secuencia de nucleótidos R2-R5 puede codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP7 y NSP4, pero R2-R5 puede no codificar VP6. Aún en otro ejemplo que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP7 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4, pero R2-R5 pueden no codificar VP7. Aún en otro ejemplo que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus NSP4 y la secuencia de nucleótidos R2-R5 puede codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7 pero R2-R5 puede no codificar NSP4.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos (Ni ) comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP7, una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, proteína de rotavirus VP4, una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus NSP4, una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP6 y una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus, por ejemplo la proteína de rotavirus VP2.
En un ejemplo no limitante adicional, la secuencia de nucleótidos (Ni ) comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP4, una segunda secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP7, una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus NSP4, una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP6 y una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP2.
En un ejemplo no limitante adicional, la secuencia de nucleótidos (Ni ) comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP4, una segunda secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP7, una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP6, una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP2 y una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus NSP4.
En otro ejemplo no limitante, la secuencia de nucleótidos (Ni ) comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP7, una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo la proteína de rotavirus VP4, una tercera secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP6, una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP2 y una quinta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus NSP4. (ver la Figura 5) Una planta puede transformarse con un solo ácido nucleico (Ni ) que comprende una primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos (Ri , R2 , R3, R4 , R5) que codifican una primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, de manera que cada una de la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteína se expresan en la planta. Las proteínas de rotavirus se seleccionan del grupo de proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, de manera que cada una de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresan en la planta. El ácido nucleico único puede introducirse en la planta de manera transitoria o de manera estable.
La VP4 puede procesarse o escindirse para producir VP5 y VP8 dentro del huésped al coexpresar un ácido nucleico que codifica una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina. Alternativamente, VP4 puede procesarse durante cualquier etapa de extracción de RLP, o después de la purificación de RLP al añadir una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina.
i.2. Constructo génico cuádruple
2i
Como se describe en la presente descripción, se proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un ácido nucleico (Ni ; un primer ácido nucleico) que comprende una primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos (Ri , R2, R3, R4 ) que codifica una primera, segunda, tercera y cuarta proteína de rotavirus (Xi , X2 , X3, X4) se expresa en una planta o porción de una planta (Ver la Tabla 1, Combinación #1.2).
En consecuencia, el ácido nucleico Ni puede comprender secuencias de nucleótidos (Ri , R2, R3, R4), en donde Ri codifica la proteína de rotavirus X i , donde X i puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X i , donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde Ri y R3-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de Vp2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde Ri , R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde Ri -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que una secuencia de nucleótidos que codifica para cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4 está comprendida en el ácido nucleico Ni , lo que permite la expresión de cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4 en el huésped transformado.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos (Ni ) comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP6, una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP4, una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP2, y una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus NSP4.
Además, en consecuencia, el ácido nucleico Ni puede comprender secuencias de nucleótidos (Ri , R2, R3 , R4), en donde Ri codifica la proteína de rotavirus X i , donde X i puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X i , donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde Ri y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde Ri , R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde Ri -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que una secuencia de nucleótidos que codifica para cada proteína de rotavirus, VP2, VP7, VP6 y NSP4 está comprendida en el ácido nucleico Ni , lo que permite la expresión de cada proteína de rotavirus VP2, VP7, VP6 y NSP4 en el huésped transformado.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos (Ni ) comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP6, una segunda secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo la proteína de rotavirus VP7, una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP2, y una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus NSP4.
Además, en consecuencia, el ácido nucleico Ni puede comprender secuencias de nucleótidos (Ri , R2, R3 , R4), en donde Ri codifica la proteína de rotavirus X i , donde X i puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X i , donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP4, VP6 y NSP4, y en donde Ri y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP4, VP6 y NSP4, y en donde Ri , R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que es no X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP4, VP6 y NSP4, y en donde Ri -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que una secuencia de nucleótidos que codifica para cada proteína de rotavirus VP7, VP4, VP6 y NSP4 está comprendida en el ácido nucleico Ni , lo que permite la expresión de cada proteína de rotavirus VP7, VP4, VP6 y NSP4 en el huésped transformado.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos (Ni ) comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP6, una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP4, una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP7, y una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus NSP4.
i.3 Constructo génico triple
Como se describe en la presente descripción, se proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un ácido nucleico (Ni ; un primer ácido nucleico) que comprende una primera, segunda y tercera secuencia de nucleótidos (Ri , R2, R3) que codifican una primera, segunda y tercera proteína de rotavirus (Xi , X2 , X3 ) se expresa en una planta o porción de una planta (Ver la Tabla i, Combinación #i.3).
En consecuencia, el ácido nucleico Ni puede comprender secuencias de nucleótidos (Ri , R2, R3), en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4, y en donde R2-R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 R2 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, con el resultado de que una secuencia de nucleótidos que codifica para cada proteína de rotavirus VP4, VP6 y NSP4 está comprendida en el ácido nucleico N1, permitiendo de este modo la expresión de cada proteína de rotavirus VP4, VP6 y NSP4 en el huésped transformado.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos (N1) comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP6, una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP4, una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus.
Además, en consecuencia, el ácido nucleico N1 puede comprender secuencias de nucleótidos (R1, R2, R3 ), en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 R2 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, con el resultado de que una secuencia de nucleótidos que codifica para cada proteína de rotavirus VP7, VP6 y NSP4 está comprendida en el ácido nucleico N1, permitiendo de este modo la expresión de cada proteína de rotavirus VP7, VP6 y NSP4 en el huésped transformado.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos (N1) comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP6, una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus VP7, una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína de rotavirus.
2. Dos constructos
2.1. Constructo génico cuádruple constructo génico simple
La presente descripción también proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5 ) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X2-X5) (ver la Tabla 1, Combinación #2.1), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos (R1-R5) se coexpresan en la planta.
En este ejemplo no limitante, N1 comprende la secuencia de nucleótidos (R1) y N2 comprende las secuencias de nucleótidos (R2, R3, R4, R5 ), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se codifica en la combinación de ambos constructos N1 y N2, y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 y en donde R2-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 y R3-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1, R2 , R4 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 -R3 y R5 codifican una proteína de rotavirus que es no X4 , donde X5 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 -R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X5, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en el huésped.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP2 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP4, VP6, VP7 y NSP4, pero R2-R5 pueden no codificar VP2. En otro ejemplo no limitante la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP4 y la secuencia de nucleótidos R2-R5 puede codificar en cualquier orden la proteína de rotavirus VP2, VP6, VP7 y NSP4, pero R2-R5 puede no codificar VP4. Aún en otro ejemplo no limitante la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP6 y la secuencia de nucleótidos R2-R5 puede codificar en cualquier orden la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP7 y NSP4, pero R2-R5 puede no codificar VP6. Aún en otro ejemplo que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP7 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4, pero R2-R5 pueden no codificar VP7. Aún en otro ejemplo no limitante la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus NSP4 y la secuencia de nucleótidos R2-R5 puede codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7, pero R2-R5 puede no codificar NSP4.
El primer ácido nucleico (N1) y el segundo ácido nucleico (N2) pueden introducirse en la planta en la misma etapa, o pueden introducirse en la planta secuencialmente.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo NSP4, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, VP7, VP4, VP6 y VP2, respectivamente (ver la Figura 5).
En otro ejemplo no limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, NSP4, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos secuenciales (R2-R5) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, VP4, VP7, VP6 y VP2, respectivamente. Aún en otro ejemplo no limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, NSP4, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos secuenciales (R2-R5) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, VP7, VP4, VP2 y VP6, respectivamente. En otro ejemplo no limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, NSP4, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos secuenciales (R2-R5 ) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, VP4, VP7, VP2 y VP6, respectivamente. Aún en otro ejemplo no limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, NSP4, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos secuenciales (R2-R5 ) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, VP6, VP2, VP4 y VP7, respectivamente. Aún en otro ejemplo no limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, NSP4, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos secuenciales (R2-R5 ) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, VP6, VP2, VP7 y VP4, respectivamente. Aún en otro ejemplo no limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, NSP4, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, VP2, VP4, VP6 y VP7, respectivamente. Aún en otro ejemplo no limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, NSP4, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos secuenciales (R2-R5 ) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, VP7, VP6, VP4 y VP2, respectivamente. Aún en otro ejemplo no limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, VP7, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, NSP4, VP2, VP6 y VP4, respectivamente. Aún en otro ejemplo no limitante, una primera secuencia de nucleótidos (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, VP4, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos secuenciales (R2-R5 ) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, NSP4, VP2, VP6 y v P7, respectivamente.
Una planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1), puede transformarse con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifica una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X2-X5 ), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. Además, una planta que expresa un primer ácido nucleico (N2 ) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5 ) que codifican una proteína de rotavirus X2-X5 puede transformarse con un segundo ácido nucleico (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una proteína de rotavirus (X1), de manera que la primera y segunda secuencias de nucleótidos R1-R5 se coexpresan en la planta. La proteína de rotavirus X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2 , VP4, VP6, VP7 y NSP4, y las proteínas de rotavirus X2-X5 pueden ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, pero no X1, de manera que se exprese cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4. Además, una planta puede cotransformarse simultáneamente con un primer ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifican una proteína de rotavirus X2-X5 , y con un segundo ácido nucleico (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una proteína de rotavirus (X1), de manera que la primera y segunda secuencias de nucleótidos R1-R5 se coexpresan en la planta. La proteína de rotavirus X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y las proteínas de rotavirus X2-X5 pueden ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, pero no la proteína seleccionada para X1, de manera que se exprese cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4. El primer ácido nucleico (Ni ) y el segundo ácido nucleico (N2) pueden introducirse en la planta de manera transitoria, o de manera estable.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, una planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1), por ejemplo NSP4, puede transformarse con un segundo ácido nucleico que codifica (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X2-X5 ), por ejemplo, VP7, VP4, VP6 y Vp2, de manera que NSP4, VP7, VP4, VP6 y Vp2 se coexpresan en la planta.
Una primera planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1), puede cruzarse con una segunda planta que expresa el segundo ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5 ) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X2-X5 ) para producir una planta progenie (tercera planta) que coexpresa la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X1-X5). Además, una primera planta que expresa un primer ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifican una proteína de rotavirus X2-X5 puede cruzarse con una segunda planta que expresa un segundo ácido nucleico (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una proteína de rotavirus (X1), de manera que las secuencias de nucleótidos R1-R5 se coexpresan en la planta progenie. La proteína de rotavirus puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de proteínas de rotavirus VP2 , VP4, VP6, VP7 y NSP4, en donde VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se seleccionan una vez, de manera que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresan en la planta progenie.
La VP4 puede procesarse o escindirse para producir VP5 y VP8 dentro del huésped al coexpresar un ácido nucleico que codifica una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina. Alternativamente, VP4 puede procesarse durante cualquier etapa de extracción de RLP, o después de la purificación de RLP al añadir una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina.
2.2 Constructo génico triple Constructo génico doble
La presente descripción también proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (N1) que comprende dos secuencias de nucleótidos (R1 y R2) que codifican una primera proteína de rotavirus (X1) y una segunda proteína de rotavirus (X2 ) respectivamente, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende tres secuencias de nucleótidos (R3-R5) que codifican una tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X3-X5 ) (ver la Tabla 1, Combinación #2.2), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta.
En un ejemplo no limitante, N1 comprende secuencias de nucleótidos (R1, R2 ) y N2 comprende secuencias de nucleótidos (R3 , R4 , R5), en donde cada una de las proteínas de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, Vp7 y NSP4 están codificadas y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R2-R5 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 y R3-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1, R2 , R4 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSp4, y en donde R1-R3 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X4 , donde X5 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionado del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 -R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X5, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en el huésped.
Por lo tanto, el primer ácido nucleico (N1) puede comprender una secuencia de nucleótidos R1, en donde R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 y una segunda secuencia de nucleótidos R2 que puede codificar cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, que no está codificada por R1. El segundo ácido nucleico (N2) puede comprender secuencias de nucleótidos R3-R5 , en donde R3-R5 codifican la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, pero no la proteína de rotavirus codificada por R1 o R2. Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP2 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP4, VP6, VP7 y NSP4, pero R2-R5 pueden no codificar VP2. En otro ejemplo no limitante, la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP4 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP6, VP7 y NSP4. Aún en otro ejemplo la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP6 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP7 y NSP4. Aún en otro ejemplo no limitante la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP7 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4. Aún en otro ejemplo no limitante la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus NSp4 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7.
Una planta que expresa un primer ácido nucleico (Ni ) que comprende una primera y una segunda secuencia de nucleótidos (Ri + R2 ) que codifican una primera y una segunda proteína de rotavirus (Xi + X2 ), puede transformarse con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende tres secuencias de nucleótidos (R3-R5 ) que codifican una tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X3-X5), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. El primer ácido nucleico (Ni ) y el segundo ácido nucleico (N2 ) pueden introducirse en la planta de manera transitoria, o de manera estable.
Además, una planta que expresa un primer ácido nucleico (N2 ) que comprende tres secuencias de nucleótidos (R3-R5 ) que codifican una primera, segunda y tercera proteína de rotavirus (X3-X5) puede transformarse con un segundo ácido nucleico (Ni ) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (Xi ) y una quinta proteína de rotavirus (X2) de manera que el primer y el segundo ácido nucleico Ri -R5 se coexpresan en la planta. La proteína de rotavirus X i puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, Vp6, VP7 y NSP4, y las proteínas de rotavirus X2-X5 pueden ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, pero no X i , de manera que se exprese cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4. Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, una planta que expresa un primer ácido nucleico (N2) que comprende tres secuencias de nucleótidos (R3-R5) que codifican una primera, segunda y tercera proteína de rotavirus (X3-X5 ), por ejemplo, VP7, VP4 y VP6 pueden transformarse con un segundo ácido nucleico que codifica (Ni ) que comprende una cuarta y una quinta secuencias de nucleótidos (Ri -R2) que codifican una cuarta y una quinta proteína de rotavirus (Xi--X2 ) por ejemplo, VP2 y NSP4, de manera que NSP4, VP7, VP4, VP6 y VP2 se coexpresan en la planta. Además, una planta puede cotransformarse simultáneamente con un primer ácido nucleico (Ni ) que comprende una primera y una segunda secuencia de nucleótidos (Ri + R2 ) que codifican una primera y una segunda proteína de rotavirus (Xi + X2), y un segundo ácido nucleico (N2) que comprende tres secuencias de nucleótidos (R3-R5 ) que codifican una tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X3-X5), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. El primer ácido nucleico (Ni ) y el segundo ácido nucleico (N2) pueden introducirse en la planta de manera transitoria, o de manera estable.
Una primera planta que expresa un primer ácido nucleico (Ni ) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus (Xi ) y una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2), puede cruzarse con una segunda planta que exprese el segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende tres secuencias de nucleótidos (R3-R5) que codifican una tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X3-X5) para producir una planta progenie (tercera planta) que coexpresa la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (Xi -X5 ). Además, una primera planta que expresa un primer ácido nucleico (N2) que comprende tres secuencias de nucleótidos (R3-R5 ) que codifican una proteína de rotavirus X3-X5 puede cruzarse con una segunda planta que expresa un segundo ácido nucleico (Ni ) que comprende una secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una proteína de rotavirus (Xi ) y una segunda secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2), de manera que las secuencias de nucleótidos Ri -R5 se coexpresan en la planta progenie. La proteína de rotavirus puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, en donde VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se seleccionan una vez, de manera que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresan en la planta progenie.
2.3. Constructo génico triple Constructo génico simple
La presente descripción también proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (Ni ) que comprende una secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus (Xi ) se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende tres secuencias de nucleótidos (R2-R4) que codifican una segunda, tercera y cuarta proteínas de rotavirus (X2-X4), de manera que la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta (Ver la Tabla i, Combinación #2.3).
En un ejemplo no limitante, Ni comprende la secuencia de nucleótidos (Ri ) y N2 comprende las secuencias de nucleótidos (R2 , R3 , R4), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4 es codificada y en donde Ri codifica la proteína de rotavirus X i , en donde X i puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X i , donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde Ri y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde Ri , R2 , y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de Vp2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde Ri -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
En otro ejemplo no limitante adicional, Ni comprende la secuencia de nucleótidos (Ri ) y N2 comprende las secuencias de nucleótidos (R2 , R3, R4 ), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4 está codificada y en donde Ri codifica la proteína de rotavirus X i , en donde X i puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, Vp6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X i , donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde Ri y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde Ri , R2 , y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2 , VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP7, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
Aún en otro ejemplo no limitante adicional, N1 comprende la secuencia de nucleótidos (R1) y N2 comprende las secuencias de nucleótidos (R2 , R3 , R4), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4 está codificada y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1-R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4 , con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP4, VP7, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
2. 4 Dos constructos génicos dobles
La presente descripción también proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (N1) que comprende secuencias de nucleótidos (R1-R2 ) que codifican una primera y una segunda proteína de rotavirus (X1-X2), se coexpresan con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende dos secuencias de nucleótidos (R3-R4) que codifican una tercera y cuarta proteínas de rotavirus (X3-X4), de manera que la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta (Ver la Tabla 1, Combinación #2.4).
En un ejemplo no limitante, N1 comprende secuencias de nucleótidos (R1, R2 ) y N2 comprende secuencias de nucleótidos (R3 , R4), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4 está codificada y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
En otro ejemplo no limitante adicional, N1 comprende secuencias de nucleótidos (R1, R2) y N2 comprende secuencias de nucleótidos (R3 , R4), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4 está codificada y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP7, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
Aún en otro ejemplo no limitante adicional, N1 comprende secuencias de nucleótidos (R1, R2) y N2 comprende secuencias de nucleótidos (R3, R4), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4 está codificada y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP4, VP7, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
2.5 Constructo génico doble Constructo génico simple
La presente descripción también proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (N1) que comprende secuencias de nucleótidos (R1-R2 ) que codifican una primera y una segunda proteína de rotavirus (X1-X2 ), se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ), de manera que la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta (Ver la Tabla 1, Combinación #2.5).
En un ejemplo no limitante, Ni comprende secuencias de nucleótidos (Ri , R2 ) y N2 comprende una secuencia de nucleótidos (R3), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4 está codificada y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4, y en donde R2-R3 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R2 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP4, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
En un ejemplo no limitante adicional, N1 comprende secuencias de nucleótidos (R1, R2 ) y N2 comprende la secuencia de nucleótidos (R3), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4 está codificada y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R2 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP7, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
3. Tres constructos
3.1 Dos constructos génicos dobles un Constructo génico simple
La presente descripción también proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) y una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2), se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ) y una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4) y un tercer ácido nucleico (N3) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5) (ver la Tabla 1, Combinación #3.1) de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta.
En este ejemplo no limitante, N1 comprende (R1, R2), N2 comprende (R3, R4) y N3 comprende (R5), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se codifican una vez y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R2-R5 codifica un proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 y R3-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1, R2, R4 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 -R3 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X4 , donde X5 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 -R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X5, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en el huésped.
Por ejemplo, el primer ácido nucleico (N1) puede comprender una secuencia de nucleótidos R1, en donde R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 y una segunda secuencia de nucleótidos R2 que pueden codificar cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 que no está codificada por R1. La segunda secuencia de nucleótidos puede comprender las secuencias de nucleótidos R3 y R4, en donde R3 codifica la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, pero no una proteína de rotavirus que están codificadas por R1 o R2 , y R4 codifica las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, pero no una proteína de rotavirus que está codificada por R1, R2 o R3. La tercera secuencia de nucleótidos puede comprender las secuencias de nucleótidos R5, en donde R5 codifica la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, pero no una proteína de rotavirus que está codificada por R1, R2 , R2 o R4, de manera que cada uno de VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 se expresa en un huésped.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP2 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP4, VP6, VP7 y NSP4, pero R2-R5 pueden no codificar VP2. En otro ejemplo la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP4 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP6, VP7 y NSP4. Aún en otro ejemplo la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP6 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP7 y NSP4. Aún en otro ejemplo no limitante la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP7 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4. Aún en otro ejemplo no limitante la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus NSP4 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, un primer ácido nucleico (Ni ) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, VP6 y una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína rotavirus, por ejemplo, VP2, se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, VP7 y una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, VP4 y un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus, por ejemplo, NSP4. (ver las Figuras 2 y 3).
Una planta que expresa un primer ácido nucleico (Ni ) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus (Xi ) y una segunda proteína de rotavirus (X2), puede transformarse con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ) y una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4 ). La planta puede transformarse adicionalmente con un tercer ácido nucleico (R3) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5 ), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. Las proteínas de rotavirus X i -X5 pueden seleccionarse del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, en donde VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se seleccionan una vez, de manera que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en la planta. Además, una planta puede cotransformarse simultáneamente con un primer ácido nucleico (Ni ) que comprende una primera y una segunda secuencia de nucleótidos (Ri + R2 ) que codifican una primera y una segunda proteína de rotavirus (Xi + X2), un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una tercera y una cuarta secuencia de nucleótidos (R3 + R4) que codifica una tercera y una cuarta proteína de rotavirus (X3 + X4 ), y un tercer ácido nucleico (N3) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. El primer ácido nucleico (Ni ), el segundo ácido nucleico (N2 ) y el tercer ácido nucleico (N3) pueden introducirse en la planta de forma transitoria o de forma estable.
3.2 Dos Constructos génicos simples un Constructo génico triple
También se proporciona un método alternativo para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (Ni ) que comprende una secuencia de nucleótidos (Ri ) que codifica una primera proteína de rotavirus (Xi ) se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2) y un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3), una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4 ) y una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5) (ver la Tabla i, Combinación #3.2) de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta.
En un ejemplo alternativo, Ni comprende (Ri ), N2 comprende (R2 ) y N3 comprende (R3, R4, R5 ), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se codifica una vez y en donde Ri codifica la proteína de rotavirus X i , en donde X i puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R2-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X i , donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde Ri y R3-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde Ri , R2, R4 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde Ri -R3 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X4 , donde X5 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde Ri -R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X5 , con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en el huésped.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, el primer ácido nucleico (Ni ) puede comprender una secuencia de nucleótidos Ri , en donde Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 y una segunda secuencia de nucleótidos R2 que puede codificar cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 que no está codificada por Ri . La segunda secuencia de nucleótidos puede comprender las secuencias de nucleótidos R3 y R4, en donde R3 codifica la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, pero no una proteína de rotavirus que está codificada por Ri o R2 y R4 codifica la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, pero no una proteína de rotavirus que está codificada por Ri R2 o R3. La tercera secuencia de nucleótidos puede comprender las secuencias de nucleótidos R5 , en donde R5 codifica la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4, pero no una proteína de rotavirus que está codificada por Ri , R2, R3 o R4 , y en donde VP2, VP4, VP6, VP7 o NSP4 se codifican una vez. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP2 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden la proteína de rotavirus VP4, VP6, VP7 y NSP4, pero R2-R5 puede no codificar VP2. En otro ejemplo la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP4 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP6, VP7 y NSP4. Aún en otro ejemplo la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP6 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP7 y NSP4. Aún en otro ejemplo, la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP7 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4. Aún en otro ejemplo, la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus NSP4 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7.
Una planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) puede transformarse con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2). La planta puede transformarse adicionalmente con un tercer ácido nucleico (N3) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3), una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4 ) y una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5 ), de manera que la primera segunda, tercera cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. La proteína de rotavirus X1-X5 puede seleccionarse del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, en donde VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se seleccionan una vez, de manera que cada proteína de rotavirus VP2,
VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en la planta. Además, una planta puede cotransformarse simultáneamente con un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1), un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2), y un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera, una cuarta y una quinta secuencia de nucleótidos (R3-R5) que codifican una tercera, una cuarta y una quinta proteína de rotavirus
(X3-X5), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. El primer ácido nucleico (N1), el segundo ácido nucleico (N2) y el tercer ácido nucleico (N3) pueden introducirse en la planta de forma transitoria o de forma estable.
Por ejemplo, una primera planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera, segunda y tercera secuencia de nucleótidos (R1, R2 y R3) que codifica una primera, segunda y tercera proteína de rotavirus (X1,
X2 , y X3) puede cruzarse con una segunda planta que expresa un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4 ) para producir una planta progenie (tercera planta). La tercera planta puede cruzarse con una cuarta planta que expresa un tercer ácido nucleico
(N3 ) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5) para producir una planta progenie que coexpresa la primera, la segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X1-X5 ). Además, una primera planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) puede cruzarse con una segunda planta que expresa un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una proteína de rotavirus (X2) para producir una planta progenie (tercera planta). La tercera planta puede cruzarse con una cuarta planta que expresa un tercer ácido nucleico (N3) que comprende una tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos (R3, R4 y R5 ) que codifica una tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X3 , X4 y X5 ) para producir una planta progenie que coexpresa la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X1-X5 ). Las proteínas de rotavirus X1-X5 pueden seleccionarse del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, de manera que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se exprese en la planta.
3.3 Dos Constructos génicos simples un Constructo génico doble
También se proporciona un método alternativo para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico
(N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2) y un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ), y un cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4), de manera que la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta (Ver la Tabla 1, Combinación #3.3).
Como un ejemplo no limitante, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2 ) y N3 comprende (R3 , proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4 se codifica una vez y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4,
VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
Como otro ejemplo no limitante, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2) y N3 comprende (R3 , R4), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4 se codifica una vez y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7,
VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, donde X4 puede ser cualquier proteína
de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde Ri -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en el huésped.
Como otro ejemplo no limitante, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2) y N3 comprende (R3 , R4), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6, y NSP4 se codifica una vez y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifican una proteína de rotavirus que es no X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP4, VP7, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
3.4 Tres constructos génicos simples
También se proporciona un método alternativo para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2) y un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ), de manera que la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta (Ver la Tabla 1, Combinación #3.4).
Como un ejemplo no limitante, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2) y N3 comprende (R3 ), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4 se codifica una vez y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4, y en donde R2-R3 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP6, y NSP4, y en donde R1 y R2 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP4, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
Como un ejemplo no limitante adicional, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2 ) y N3 comprende (R3 ), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4 se codifica una vez y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R3 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R2 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP7, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
4. Cuatro constructos
4.1. Tres constructos génicos simples un constructo génico doble
También se proporciona en la presente descripción un método para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (N1 ) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1 ) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1 ) se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2), un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ), y cuarto ácido nucleico (N4) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4 ) y una quinta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5) (ver la Tabla 1, Combinación #4.1) de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta.
En este ejemplo, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2 ), N3 comprende (R3) y N4 comprende (R4 y R5), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 está codificado, y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R2-R5 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 y R3-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1, R2, R4 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 -R3 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X4 , donde X5 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 -R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X5, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en el huésped.
Los cuatro ácidos nucleicos pueden introducirse en una planta en cualquier orden. Por ejemplo, lo que no se considera limitante, una planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) puede transformarse con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2). La planta puede transformarse adicionalmente con un tercer ácido nucleico (N3) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ). A continuación, la planta puede transformarse adicionalmente con un cuarto ácido nucleico (N4) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4 ) y una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. Además, una planta puede cotransformarse simultáneamente con un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1), un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2 ), un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ) y un cuarto ácido nucleico (N4 ) que comprende una cuarta y una quinta secuencia de nucleótidos (R4-R5 ) que codifican una cuarta y una quinta proteína de rotavirus (X4-X5) de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. El primer ácido nucleico (N1), el segundo ácido nucleico (N2 ), el tercer ácido nucleico (N3) y el cuarto ácido nucleico (N4) pueden introducirse en la planta de forma transitoria o de forma estable.
Además, una planta que expresa un primer ácido nucleico (N4 ) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una primera proteína de rotavirus (X4 ) y una segunda secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X5 ) puede transformarse con un segundo ácido nucleico (N1) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X1). La planta puede transformarse adicionalmente con un tercer ácido nucleico (N2 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X3 ). La planta entonces puede transformarse adicionalmente con un cuarto ácido nucleico (N3) que comprende una secuencia de quinta nucleótidos (R3) que codifica una quinta proteína de rotavirus y una quinta secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X3 ), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. Las proteínas de rotavirus X1-X5 pueden seleccionarse del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, en donde VP2, VP4, v P6, VP7 y NSP4 se seleccionan una vez, de manera que cada proteína de rotavirus Vp2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en la planta. El primer ácido nucleico (N4 ), el segundo ácido nucleico (N1), el tercer ácido nucleico (N2) y el cuarto ácido nucleico (N3 ) pueden introducirse en la planta de forma transitoria o de forma estable.
Una primera planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1), puede cruzarse con una segunda planta que expresa un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2) para producir una planta progenie (tercera planta). La tercera planta puede cruzarse con una cuarta planta que expresa un tercer ácido nucleico (N3) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ) para producir una planta progenie (quinta planta). La quinta planta puede cruzarse con una sexta planta que expresa un cuarto ácido nucleico (N4) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4) y una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5 ) para producir una planta progenie que coexpresa la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X1-X5 ).
Además, una primera planta que expresa un primer ácido nucleico (N4 ) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una primera proteína de rotavirus (X4 ) y una segunda secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X5) puede cruzarse con una segunda planta que expresa un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X1) para producir una planta progenie (tercera planta). La tercera planta puede cruzarse con una cuarta planta que expresa un tercer ácido nucleico (N2) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X2 ) para producir una planta progenie (quinta planta). La quinta planta puede cruzarse con una sexta planta que expresa una quinta secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X3) para producir una planta progenie que coexpresa la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X1-X5 ). Las proteínas de rotavirus X1-X5 pueden seleccionarse del grupo de VP2, VP4, Vp6, VP7 y NSP4, en donde VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se seleccionan una vez, de manera que cada proteína de rotavirus Vp2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en la planta.
4.2 Cuatro constructos génicos simples
También se proporciona en la presente descripción un método para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2), un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3), y un cuarto ácido nucleico (N4 ) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4 ), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta (Ver la Tabla 1, Combinación #4.2).
En un ejemplo no limitante, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2), N3 comprende (R3) y N4 comprende (R4 ), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4 están codificadas, y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3, donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada de la grupo de VP2, VP4, VP6 y NSP4, y en donde R1 -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4, con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
En otro ejemplo no limitante, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2 ), N3 comprende (R3 ) y N4 comprende (R4 ), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4 está codificada, y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifican un proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada de la grupo de VP2, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4 , con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP7, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
En un ejemplo no limitante adicional, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2), N3 comprende (R3 ) y N4 comprende (R4 ), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4 están codificadas, y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R2-R4 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 y R3-R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X2, donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1, R2 y R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP4, VP7, VP6 y NSP4, y en donde R1 -R3 codifican una proteína de rotavirus que no es X4 , con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP4, VP7, VP6 y NSP4 se expresa en el huésped.
5. Cinco constructos
5. Cinco constructos génicos simples
La presente descripción también proporciona un método para producir las RLP en una planta, en donde un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2) y un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3) y un cuarto ácido nucleico (N4) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4) y un quinto ácido nucleico (R5) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5) (ver la Tabla 1, Combinación #5) de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta.
En este ejemplo no limitante, N1 comprende (R1), N2 comprende (R2), N3 comprende (R3 ), N4 comprende (R4) y N5 comprende (R5 ), en donde cada proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 codifica la proteína de rotavirus X1, en donde X1 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y donde R2-R5 codifica una proteína de rotavirus que no es X1, donde X2 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 y R3-R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X2 , donde X3 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1, R2, R4 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X3 , donde X4 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 -R3 y R5 codifican una proteína de rotavirus que no es X4 , donde X5 puede ser cualquier proteína de rotavirus seleccionada del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, y en donde R1 -R4 codifican una proteína de rotavirus que no es X5 , con el resultado de que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en el huésped.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP2 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP4, VP6, VP7 y NSP4, pero R2-R5 pueden no codificar VP2. En otro ejemplo no limitante, la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP4 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP6, VP7 y NSP4. Aún en otro ejemplo no limitante, la secuencia de nucleótidos Ri puede codificar la proteína de rotavirus VP6 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP7 y NSP4. Aún en otro ejemplo no limitante que no debe considerarse limitante, la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus VP7 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y NSP4. Aún en otro ejemplo no limitante la secuencia de nucleótidos R1 puede codificar la proteína de rotavirus NSP4 y las secuencias de nucleótidos R2-R5 pueden codificar en cualquier orden las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, VP2 se coexpresa con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo VP6, un tercer ácido nucleico (N3) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo VP4, un cuarto ácido nucleico (N4) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, VP7 y un quinto ácido nucleico (N5) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus, por ejemplo NSP4 (ver la Figura 3).
Los cinco ácidos nucleicos pueden introducirse en una planta en cualquier orden. Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, una planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1) puede transformarse con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2 ). La planta puede transformarse adicionalmente con un tercer ácido nucleico (N3) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ). La planta después puede transformarse adicionalmente con un cuarto ácido nucleico (N4) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4). A continuación, la planta puede transformarse adicionalmente con un quinto ácido nucleico (N5 ) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X5), de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. Las proteínas de rotavirus X1-X5 pueden seleccionarse del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, en donde VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se seleccionan una vez, de manera que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en la planta. Además, una planta puede cotransformarse simultáneamente con un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1), un segundo ácido nucleico (N2) que comprende un segundo nucleótido secuencia (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2), un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3 ) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3 ), un cuarto ácido nucleico (N4 ) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta y una quinta proteína de rotavirus (X4), y un quinto ácido nucleico (N5) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5 ) de manera que la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos se coexpresan en la planta. El primer ácido nucleico (N1), el segundo ácido nucleico (N2), el tercer ácido nucleico (N3), el cuarto ácido nucleico (N4 ) y el quinto ácido nucleico (N5 ) pueden introducirse en la planta de forma transitoria, o de forma estable.
Una primera planta que expresa un primer ácido nucleico (N1) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus (X1), puede cruzarse con una segunda planta que expresa un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus (X2) para producir una planta progenie (tercera planta). La tercera planta puede cruzarse con una cuarta planta que expresa un tercer ácido nucleico (N3) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus (X3) para producir una planta progenie (quinta planta). La quinta planta puede cruzarse con una sexta planta que expresa un cuarto ácido nucleico (N4) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus (X4 ) para producir una planta progenie (séptima planta). La séptima planta puede cruzarse con una octava planta que expresa un quinto ácido nucleico (N5) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus (X5) para producir una planta progenie que coexpresa la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus (X1-X5). Las proteínas de rotavirus X i -X5 pueden seleccionarse del grupo de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4, en donde VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se seleccionan una vez, de manera que cada proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresa en la planta.
Relación de ácidos nucleicos (N) usados para transformar un huésped
Como puede verse en la Figura 5, el nivel de acumulación de RLP en la planta, porción de la planta o célula vegetal, puede estar influenciado por la relación de ácidos nucleicos que codifican proteínas estructurales y no estructurales de rotavirus que se expresan en una planta. Por ejemplo, lo que no debe considerarse limitante, la relación de ácidos nucleicos (N) que se introducen en una planta puede modificarse al proporcionar diferentes cantidades de Agrobacterium, que se usan para infiltrar la planta, porción de la planta o célula vegetal, donde cada Agrobacterium comprende un constructo que comprende un ácido nucleico (N) como se establece en la Tabla 1 (y el texto adjunto) anterior. Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la relación de Agrobacterium que contiene proteína estructural con respecto al que contiene proteína no estructural puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,8:1 a aproximadamente 2,5:1,5 (proteína estructural : proteína no estructural), o cualquier cantidad intermedia, por ejemplo de aproximadamente 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1,2:0,5, 2:1,2,2:1,2,3:1, 2,4:1,2,5:1,2,5:1,1,2,5:1,2, 2,5:1,3, 2,5:1,4, 2,5:1,5 (proteína estructural : proteína no estructural), o cualquier cantidad intermedia.
Por ejemplo, como se describe a continuación, la relación de proteína de rotavirus estructural con respecto a proteína no estructural puede variarse, por ejemplo, al introducir diferentes relaciones de Agrobacterium que contiene el uno o más ácidos nucleicos (N) que comprenden una o más secuencias de nucleótidos (R) que codifican las proteínas estructurales y no estructurales de rotavirus (X) en un huésped, por ejemplo, una planta, porción de la planta o célula vegetal. Por ejemplo, la absorbancia o densidad óptica (DO) de las cepas de Agrobacterium en la suspensión bacteriana puede usarse como medida para establecer una relación entre las cepas de Agrobacterium que contienen la proteína estructural y las cepas de Agrobacterium que contienen la proteína no estructural. Por ejemplo, que no se considera limitante, la DO puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,2:0,4 a aproximadamente 1:0,6 (cepas de Agrobacterium que contienen proteína estructural : cepas de Agrobacterium que contienen proteína no estructural en la suspensión bacteriana) o cualquier cantidad intermedia, por ejemplo de aproximadamente 0,2:0,4, 0,3:0,4, 0,4:0,4, 0,5:0,4, 0,6:0,4, 0,7:0,4, 0,8:0,4, 0,9:0,4, 1:0,4, 0,2:0,5, 0,3:0,5, 0,4:0,5, 0,5:0,5, 0,6:0,5, 0,7:0,5, 0,8:0,5, 0,9:0,5, 1:05, 0,2:0,6, 0,3:0,6, 0,4:0,6, 0,5:0,6, 0,6:0,6, 0,7:0,6, 0,8:0,6, 0,9:0,6, 1:06, 0,3:0,4, 0,3:0,5, 0,3:0,6, 0,4:0,4, 0,4:0,5, 0,4:0,6, 0,5:0,4, 0,5:0,5, 0,5:0,6, 0,6:0,4, 0,6:0,5, 0,6:0,6, 0,7:0,4, 0,7:0,5, 0,7:0,6, 0,8:0,4, 0,8:0,5, 0,8:0,6, 0,9:0,4, 0,9:0,5, 0,9:0,6, 1:0,4, 1:0,5, 1:0,6 (cepas de Agrobacterium que contienen proteína estructural : cepas de Agrobacterium que contienen proteína no estructural en la suspensión bacteriana) o cualquier cantidad intermedia.
Por ejemplo, que no se considera limitante, una DO de 0,4 de cepas de Agrobacterium en la suspensión bacteriana puede designarse como una referencia de 1. Por lo tanto, puede lograrse una relación de 1,5:1 de proteína estructural con respecto a no estructural al usar una DO de 0,6 de cepa de Agrobacterium que contiene proteína estructural a una
DO de 0,4 de cepa de Agrobacterium que contiene proteína no estructural en suspensión bacteriana.
La relación de proteína estructural con respecto a proteína no estructural de rotavirus puede variarse, por ejemplo, al introducir diferentes proporciones de Agrobacterium que contiene el uno o más ácidos nucleicos (N) que comprenden una o más secuencias de nucleótidos (R) que codifican las proteínas estructurales y no estructurales de rotavirus (X) en la planta, porción de la planta o célula vegetal. Alternativamente, si las proteínas estructurales y las proteínas no estructurales de rotavirus están presentes en el mismo constructo y, por lo tanto, se introducen en la planta, porción de la planta o célula vegetal, con el uso de un Agrobacterium, pueden expresarse de forma diferencial dentro de la planta, porción de la planta o célula vegetal con el uso de promotores adecuados de manera que se obtenga la relación deseada de proteínas estructurales y proteínas no estructurales de rotavirus.
Por lo tanto, como se describe en la presente descripción, se proporciona un método para aumentar el rendimiento de producción de RLP, aumentar el rendimiento de VP4 y VP7, o aumentar el rendimiento tanto de RLPS como de VP4 y VP7, al modular la relación entre el uno o más ácidos nucleicos (N) que comprenden una o más secuencias de nucleótidos (R) que codifican las proteínas estructurales de rotavirus (X) y el uno o más ácidos nucleicos (N) que comprenden una o más secuencias de nucleótidos (R) que codifican las proteínas no estructurales de rotavirus (x ).
Por ejemplo, el porcentaje del Agrobacterium que contiene proteína no estructural de rotavirus puede estar entre el 20
% y el 60 % o cualquier cantidad intermedia, de la cantidad total de Agrobacterium usado para infiltrar la planta, porción de la planta o célula vegetal. Por ejemplo, la relación porcentual de Agrobacterium que contiene proteína no estructural de rotavirus puede ser 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34
%, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 4 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 % o cualquier cantidad intermedia del Agrobac infiltrar la planta, porción de la planta o célula vegetal. De manera similar, el porcentaje de Agrobacterium que contiene proteína estructural dentro de la cantidad total de Agrobacterium infiltrado puede ser 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %,
75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 69 %, 68 %, 67 %, 66 %, 65 %, 64 %, 63 %, 62 %, 61 % %, 56 %, 55 %, 54 %, 53 %, 52 %, 51 %, 50 %, 49 %, 48 %, 47 %, 46 %, 45 %, 44 %, 43 %, 42 %, 41 % o 40 % o cualquier cantidad intermedia, del Agrobacterium total usado para infiltrar la planta, porción de la planta o célula vegetal.
Por ejemplo, la relación porcentual de Agrobacterium que contiene proteína estructural de rotavirus con respecto a Agrobacterium que contiene proteína no estructural puede ser 70 %:30 %, 60 %:40 %, 50 %:50 %, 40 %:60 % o cualquier relación porcentual intermedia. Por ejemplo, la relación porcentual entre Agrobacterium que contiene proteína estructural y Agrobacterium que contiene proteína no estructural puede ser 50 %:50 %, 51 %:49 %, 52 %:48
%, 53 %:47 %, 54 %:46 %, 55 %:45 %, 56 %:44 %, 57 %:43 %, 58 %:42 %, 59 %: 41 %, 60 %:40 % o cualquier relación porcentual intermedia.
Como se describe a continuación, la relación de proteína estructural con respecto a proteína no estructural de rotavirus de rotavirus puede variarse adicionalmente, por ejemplo, al expresar de forma diferencial la proteína estructural de rotavirus y la proteína no estructural de rotavirus. La expresión puede variarse al modular, por ejemplo, la replicación, transcripción, traducción, o una combinación de estas, de la proteína estructural de rotavirus, la proteína no estructural de rotavirus o tanto la proteína estructural de rotavirus como la proteína no estructural de rotavirus. Por ejemplo, diferentes elementos reguladores, incluidos promotores, elementos de amplificación, potenciadores o una combinación de estos, puede usarse además de la variación de la relación del Agrobacterium que contiene proteína estructural de rotavirus con respecto a Agrobacterium que contiene proteína no estructural de rotavirus infiltrado como se describió anteriormente. Puede usarse un primer conjunto o combinación de elementos reguladores para regular la replicación, transcripción o una combinación de estos, del uno o más ácidos nucleicos que comprenden una o más secuencias de nucleótidos que codifican la proteína estructural del rotavirus y puede usarse un segundo conjunto o combinación de elementos reguladores para regular la replicación, transcripción o una combinación de estos, de la una o más secuencias de nucleótidos que codifican la proteína no estructural de rotavirus. El primer conjunto o combinación de elementos reguladores es diferente del segundo conjunto o combinación de elementos reguladores y permite la expresión diferencial del uno o más ácidos nucleicos que comprenden una o más secuencias de nucleótidos que codifican la proteína estructural de rotavirus y el uno o más ácidos nucleicos que comprenden una o más secuencias de nucleótidos que codifica la proteína no estructural de rotavirus para permitir modular la relación de proteína estructural de rotavirus:proteína no estructural de rotavirus in vivo.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, un conjunto o combinación de elementos reguladores, por ejemplo, el primer conjunto, puede incluir un elemento potenciador, por ejemplo, elementos obtenidos de CPMV, tales como CPMV HT o CPMV 160 (ver la Figura 6). CMPV HT se describe en el documento US 61/971,274 y CPMV 160 se describe en el documento US 61/925,852. El elemento potenciador, por ejemplo, los obtenidos de CPMv , por ejemplo, CPMV HT o CPMV 160 (ver la Figura 6; US 61/971,274, y US 61/925,852, respectivamente) pueden estar ausentes en el otro conjunto o combinación de elementos reguladores, por ejemplo, el segundo conjunto. Alternativamente, el segundo conjunto puede incluir un elemento potenciador (por ejemplo, elementos obtenidos de CPMV, (por ejemplo, CPMV HT o CPMV 160), mientras que el elemento de amplificación (por ejemplo, elementos obtenidos de CPMV, (por ejemplo, CPMV HT o CPMV 160) puede estar ausente en el primer conjunto o combinación de elementos reguladores. De manera similar, la fuerza de un promotor puede diferir entre el primer y el segundo conjunto o combinación de elementos reguladores, o uno de los promotores puede ser inducible y el otro constitutivo, de manera que la expresión diferencial entre la proteína estructural del rotavirus con respecto a la proteína no estructural de rotavirus se logra in vivo.
Por ejemplo, la relación de proteína estructural con respecto a proteína no estructural de rotavirus puede variarse, por ejemplo, al introducir diferentes relaciones de Agrobacterium que contiene un primer ácido nucleico (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica la primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína NSP4 no estructural de rotavirus con respecto a Agrobacterium que contiene un segundo ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, en cualquier orden proteínas estructurales de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7. Por ejemplo, la relación de Agrobacterium que contiene un primer ácido nucleico (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica la proteína no estructural de rotavirus NSP4 con respecto a Agrobacterium que contiene un segundo ácido nucleico (N2) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifican las proteínas estructurales de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7 pueden ser 0,8:1 y 1:2 (Agrobacterium que contiene N1 a N2 ) o cualquier cantidad intermedia, por ejemplo, 1:1,5 (Agrobacterium que contiene N1 a N2).
Además, la relación de proteína estructural con respecto a proteína no estructural de rotavirus puede variarse al expresar de forma diferencial dentro de la planta, porción de la planta o célula vegetal la proteína estructural de rotavirus con respecto a la proteína no estructural con el uso de elementos potenciadores. Por ejemplo, la relación de proteína estructural con respecto a proteína no estructural de rotavirus puede variarse, por ejemplo, al coexpresar dentro de la planta, porción de la planta o célula vegetal un primer ácido nucleico (N1) que comprende una secuencia de nucleótidos (R1) que codifica un primera proteína de rotavirus, por ejemplo, una proteína no estructural NSP4 con un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende cuatro secuencias de nucleótidos (R2-R5) que codifican una segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, por ejemplo, en cualquier orden proteínas estructurales de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7, en donde la segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una secuencia potenciadora, por ejemplo CPMV HT, CPM 160, CPMV 160+ y CPMV HT+ (descritas en los documentos US 61/971,274, y US 61/925,852, respectivamente), como se describe más abajo. En otro ejemplo, la relación de proteína estructural con respecto a proteína no estructural de rotavirus puede variarse, por ejemplo, al coexpresar dentro de la planta, porción de la planta o célula vegetal un primer ácido nucleico (N1) que comprende la primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP6 o VP7 y la segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP2 o VP4, el segundo ácido nucleico (N2) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP7 o VP6 y una cuarta secuencia de nucleótidos (R4) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP4 o VP2 y un tercer ácido nucleico (N3) que comprende la quinta secuencia de nucleótidos (R5) que codifica una quinta proteína de rotavirus, por ejemplo, proteína no estructural NSP4, en donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una secuencia potenciadora, por ejemplo, CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ y CPMV HT+, como se describe más adelante.
En otro ejemplo, la relación de proteína estructural con respecto a proteína no estructural de rotavirus puede variarse, por ejemplo, al coexpresar dentro de la planta, porción de la planta o célula vegetal uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP6 o VP7 y una segunda secuencia de nucleótidos (R2) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP2 o VP4, una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP7 o VP6 y una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica la cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP4 o VP2, y una quinta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína no estructural NSP4, en donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos está unida operativamente a una secuencia potenciadora, por ejemplo, CPM 160, CPMV 160+ y CPMV HT+, como se describe más adelante y la quinta secuencia de nucleótidos está unida operativamente a CPMV HT como se describe más adelante.
En otro ejemplo, la relación de proteína estructural con respecto a proteína no estructural de rotavirus puede variarse, por ejemplo, al coexpresar dentro de la planta, porción de la planta o célula vegetal un primer ácido nucleico (N1) que comprende la primera secuencia de nucleótidos (R1) que codifica una primera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP6 o VP7, un segundo ácido nucleico (N2 ) que comprende una segunda secuencia de nucleótidos (R2 ) que codifica una segunda proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP2 o VP4, un tercer ácido nucleico (N3 ) que comprende una tercera secuencia de nucleótidos (R3) que codifica una tercera proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP7 o VP6, un cuarto ácido nucleico (N4) que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos (R4 ) que codifica una cuarta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína estructural VP4 o VP2 y una quinta secuencia de ácidos nucleicos (N5) que comprende una quinta secuencia de nucleótidos (R5 ) que codifica una quinta proteína de rotavirus, por ejemplo, la proteína no estructural NSP4, en donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una secuencia potenciadora, por ejemplo, CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ y CPMV HT+, como se describe más adelante.
Elementos de amplificación y elementos potenciadores/Elementos reguladores
La proteína o polipéptido de rotavirus puede expresarse en un sistema de expresión que comprende un sistema de expresión de ADN o ARN, basado en virus, por ejemplo, pero no se limita a, un casete de expresión basado en comovirus y un elemento de amplificación basado en geminivirus.
Pueden usarse elementos potenciadores para lograr un alto nivel de expresión transitoria de las proteínas estructurales y no estructurales de rotavirus. Los elementos potenciadores pueden basarse en virus de plantas de ARN, incluidos los comovirus, tales como el virus del mosaico del caupí (CPMV; ver, por ejemplo, los documentos WO2007/135480; WO2009/087391; US 2010/0287670, Sainsbury F. y otros, 2008, Plant Physiology; 148: 121-1218; Sainsbury F. y otros, 2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. y otros, 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682­ 693; Sainsbury F. y otros, 2009, Methods in Molecular Biology, Recombinant Proteins From Plants, vol. 483: 25-39).
CPMV 160 (CPMVX) y CPMV 160+ (CPMVX+)
Los Elementos potenciadores pueden ser "CPMVX" (también denominado "CPMV 160") y/o "CPMVX+" (también denominado "CPMV 160+") y se describen en el documento US 61/925,852.
El potenciador de la expresión "CPMVX" comprende una región no traducida (UTR) 5' de comovirus como el virus del mosaico del caupí (CPMV). La 5'UTR de los nucleótidos 1-160 de la secuencia de A r N -2 del CPMV (SEQ ID NO: 1), comienza en el sitio de inicio de la transcripción hasta el primer codón de inicio en marco (en la posición 161), que sirve como el sitio de inicio para la producción de la más larga de dos proteínas carboxi coterminales codificadas por un segmento de genoma de comovirus de tipo silvestre. Además, un “tercer” sitio de iniciación en (o correspondiente a) la posición 115 en la secuencia genómica de ARN-2 del CPMV también puede estar mutado, eliminado o alterado de otra manera. Se ha demostrado que la eliminación de AUG 115 además de la eliminación de AUG 161 mejora la expresión cuando se combina con una proteína M incompleta (Sainsbury y Lomonossoff, 2008, Plant Physiology; 148: 1212-1218; documento WO 2009/087391).
CPMVX comprende X nucleótidos de la SEQ ID NO:1, donde X=160, 155, 150 o 114 de la SEQ ID NO:1, o una secuencia que comprende entre 80 % a 100 % de similitud de secuencia con CPMVX, donde X=160, 155, 150 o 114 de la SEQ ID NO:93. Este potenciador de la expresión generalmente se denomina CPMVX (ver la Figura 6c).
El potenciador de la expresión CPMVX, donde X=160, consiste en los nucleótidos 1-160 de la SEQ ID NO: 1:
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca (SEQ ID NO:l)
La secuencia potenciadora CPMVX puede fusionarse adicionalmente a una secuencia de relleno, en donde el CMPVX comprende X nucleótidos de la SEQ ID NO:1, donde X=160, 155, 150 o 114 de la SEQ ID NO:1, o una secuencia que comprende entre 80 a 100 % de similitud de secuencia con CPMVX, donde X=160, 155, 150 o 114 de la SEQ ID NO:1, y la secuencia de relleno comprende de 1-100 nucleótidos fusionados al extremo 3' de la secuencia de CMPVX. Por ejemplo, la secuencia de relleno puede comprender aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 nucleótidos, o cualquier número de nucleótidos intermedio.
Si la secuencia CMPVX comprende un fragmento de relleno, entonces este potenciador de la expresión puede denominarse CPMVX+ (ver la Figura 6d), donde X=160, 155, 150, 114 de la SEQ ID NO:1, también puede denominarse CMPVX que comprende una secuencia de relleno, o puede denominarse CPMV160+; CPMV155+; CPMV150+; CPMV114+, cuando X-160, 155, 150 o 114, respectivamente. Los constructos que comprenden CPMVX que no comprenden una secuencia de relleno pueden denominarse CPMVX+, donde X=160, 155, 150, 114 de la SEQ ID NO:1, y donde la secuencia de relleno tiene 0 nucleótidos de longitud.
La secuencia de relleno puede modificarse por truncamiento, deleción o reemplazo de la secuencia nativa de 5'UTR de CMPV que se encuentra 3' al nucleótido 160. La secuencia de relleno modificada puede eliminarse, reemplazarse, truncarse o acortarse en comparación con la secuencia de relleno inicial o no modificada (es decir, nativa) asociada con la 5'UTR (como se describe en Sainsbury F., y Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: págs. 1212-1218). La secuencia de relleno puede comprender uno o más sitios de restricción (polienlazador, sitio de clonación múltiple, uno o más sitios de clonación), una o más secuencias Kozak de plantas, una o más secuencias enlazadoras, uno o más sitios de recombinación, o una combinación de estos. Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, una secuencia de relleno puede comprender en serie, un sitio de clonación múltiple de una longitud deseada, fusionado a una secuencia de Kozak de plantas. La secuencia de relleno no comprende una secuencia de nucleótidos de la secuencia 5'UTR nativa que se coloca 3' al nucleótido 160 de la 5'UTR nativa de CPMV, por ejemplo, los nucleótidos 161 al 512 como se muestra en la Figura 1 de Sainsbury F. y Lomonossoff G.P. (2008, Plant Physiol. 148: págs. 1212-1218), o los nucleótidos 161-509 de la secuencia de CPMV HT de la técnica anterior. Es decir, la proteína M incompleta presente en la secuencia de CPMV HT de la técnica anterior (Figura 1; de Sainsbury F. y Lomonossoff G.P., 2008) se elimina de la 5'UTR.
Las secuencias consenso de Kozak en plantas son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Rangan y otros, Mol. Biotechnol., 2008, julio 39(3), págs. 207-213). Tanto las secuencias Kozak sintéticas como las naturales pueden usarse en el potenciador de la expresión o pueden fusionarse con la secuencia de nucleótidos de interés como se describe en la presente descripción.
La secuencia de Kozak de plantas puede ser cualquier secuencia de Kozak conocida de plantas (véase, por ejemplo, L. Rangan y otros, Mol. Biotechnol.2008), incluidas, entre otras, las siguientes secuencias consenso en plantas:
caA(A/C)a (SEQ ID NO:2; reino vegetal)
aaA(A/C)a (SEQ ID NO:3; dicotiledóneas)
aa(A/G)(A/C)a (SEQ ID NO:4; arabidopsis)
La secuencia de Kozak de plantas también se puede seleccionar del grupo de:
AGAAA (SEQ ID NO: 5)
AGACA (SEQ ID NO: 6)
AGGAA (SEQ ID NO: 7)
AAAAA (SEQ ID NO: 8)
AAACA (SEQ ID NO: 9)
AAGCA (SEQ ID NO: 10)
AAGAA (SEQ ID NO: 11)
AAAGAA (SEQ ID NO: 12)
AAAGAA (SEQ ID NO: 13)
(A/-)A(A/G)(A/G)(A/C)A. (SEQ ID NO: 14; Secuencia consenso)
El potenciador de la expresión CPMVX, o CPMVX+, puede unirse operativamente en el extremo 5' de la secuencia potenciadora con una región reguladora que es activa en una planta, y unirse operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés en el extremo 3' del potenciador de la expresión (Figura 6c), para conducir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés dentro de una planta huésped.
CPMV HT+, CPMV HT+WT115], CPMV HT+ [511]
Los elementos potenciadores pueden ser "CPMV HT+" que se describe en el documento US 61/971,274. El potenciador de la expresión "CPMV HT+" (ver la Figura 6b) comprende una región no traducida (UTR) 5' de comovirus y una secuencia de relleno modificada, alargada o truncada.
Se proporciona, además, un sistema de expresión en plantas que comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que comprende una región reguladora, unida operativamente con uno o más de un potenciador de la expresión como se describe en la presente descripción (por ejemplo, CPMV HT+, CPMV HT+[WT115], CPMV HT+ [511]) y una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas estructurales o no estructurales de rotavirus. Se describe, además, un ácido nucleico que comprende una secuencia promotora (región reguladora), un potenciador de la expresión (por ejemplo, CPMV HT+ o CPMV HT+[WT115]) que comprende una 5'UTR de comovirus y una secuencia de relleno con una secuencia de Kozak de plantas fusionada a una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína estructural o no estructural de rotavirus. El ácido nucleico puede comprender, además, una secuencia que comprende una región no traducida (UTR) 3' de comovirus, por ejemplo, una 3' UTR de plastocianina, u otra 3'UTR activa en una planta, y una secuencia terminadora, por ejemplo un terminador NOS, unido operativamente al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica proteínas estructurales o no estructurales de rotavirus (denominada secuencia de nucleótidos de interés en la Figura 6a), de manera que la secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas estructurales o no estructurales de rotavirus se inserta corriente arriba desde la región no traducida (UTR) 3' de comovirus, 3' UTR de plastocianina u otra secuencia 3'UTR.
La SEQ ID NO:15 comprende un potenciador de la expresión "CPMV HT" como se conoce en la técnica anterior (por ejemplo, la Figura 1 de Sainsbury y Lomonossoff 2008, Plant Physiol. 148: págs. 1212-1218). CPMV HT incluye la secuencia 5'UTR de los nucleótidos 1-160 de SEQ ID NO: 15 con nucleótidos modificados en la posición 115 (cgt), y una proteína M incompleta con un nucleótido modificado en la posición 162 (acg), y carece de una secuencia de Kozak de plantas (5'UTR: nucleótidos 1-160; proteína M incompleta subrayada, nucleótidos 161 - 509). La SEQ ID NO:15 incluye, además, un sitio de clonación múltiple (cursiva, nucleótidos 510-528) que no está presente en la secuencia de CPMV HT de la técnica anterior:
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
€1 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgrttttctt tcactgaagc
181 qaaatcaaaq atctctttqt qgacacgtag tqcqgcqcca ttaaataacg tqtacttqtc
241 ctattcttqt cqqtqtqqtc ttqqqaaaaq aaaqcttqct qqaqqctqct qttcaqcccc
301 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt
361 qacqaqqtat tqttqcctqt acttctttct tcttcttctt qctqattgqt tctataaqaa
421 atctaqtatt ttctttqaaa caqaqttttc ccqtqqtttt cqaacttqqa qaaaqattqt
481 taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt cgggccc (SEQ ID NO; 15)
Se proporciona CPMV HT+ con una secuencia consenso de Kozak de plantas en la SEQ ID NO:16 (nucleótido 1-160, 5'UTR, incluido ATG modificado en las posiciones 115 (GTG) en minúscula, negrita y cursiva; fragmento de relleno que comprende: una proteína M incompleta subrayada, nucleótidos 161 - 509, con nucleótido modificado en 162 (ACG); un sitio de clonación múltiple, cursiva, nucleótidos 510-528; y una secuencia consenso Kozak de plantas, mayúsculas y negrita, nucleótidos 529-534).
1 t a t t a a a a t c t t a a t a g g t t t tg a ta a a a g cgaacgtggg gaaacccgaa c c a a a c c t tc
61 t t c t a a a c t c t c t c t c a t c t c t c t t a a a g c a a a c t t c t c t c t t g t c t t t c t t g c g tg a g c
121 g a tc t t c a a c g t t q t c a q a t c q tq c t t c q q caccag taca a c g t t t t c t t tc a c tq a a q c
181 qaaatcaaaq a t c t c t t t q t qqacacq tag tgcqqcqcca t ta a a ta a c q t q t a c t t q t c
241 C t a t t c t t q t c g g tg tg q tc t tq q q a a a a q a a a q c t tg c t q q a q q c tq c t q t tc a q c c c c
301 a t a c a t t a c t t q t t a c q a t t c t q c t q a c t t tc q q c q q q tq c a a t a t c t c t a c t t c t q c t t
g acg ag g ta t t g t t g c c t g t a c t t c t t t c t t c t t c t t c t t g c t g a t t g g t t c ta ta a g a a
421 a t c t a g t a t t t t c t t t g a a a c a q a g t t t t c c c q t q q t t t t cq a a c t tq q a q a a a q a t tq t
481 t a a g c t t c t g t a t a t t c t g c c c a a a t t t g t t cgggcccaa taccgcgg ( A / - ) A (A /G )
( A / G ) ( A / C I A (SEQ ID NO: 16)
La SEQ ID NO:17 ("CPMV HT+ 511") comprende un segmento de la secuencia nativa del genoma de ARN 2 de CPMV de los nucleótidos 1-154. La secuencia 5'UTR de los nucleótidos 1-511 de la SEQ ID NO:17 comprende secuencias "atg" modificadas en las posiciones 115 ("g" en lugar de "a"; cursiva en negrita) y 162 ("c" en lugar de "t"; cursiva en negrita), y una proteína M incompleta (subrayada) de los nucleótidos 161 - 511. CPMV HT+ 511 comprende una secuencia consenso de Kozak de la proteína M nativa (nucleótidos 508-511; negrita):
1 t a t t a a a a t c t t a a t a g g t t t t g a ta a a a g cgaacg tggg gaaacccgaa c c a a a c c t t c
61 t t c t a a a c t c t c t c t c a t c t c t c t t a a a g c a a a c t t c t c t c t t g t c t t t c t t g c g t g a g c
121 g a t c t t c a a c q t t g t c a g a t c q t q c t t c q q ca cca g ta ca a c g t t t t c t t tc a c tg a a g c
181 gaaa tcaaag a t c t c t t t g t g gacacg tag tg c g g c g c c a t t a a a t a a c g t g t a c t t g t c
241 c t a t t c t t g t c g g t g t g g t c t tg g g a a a a g a a a g c t t g c t g g a g g c tg c t g t t c a g c c c c
301 a t a c a t t a c t t q t t a c q a t t c t g c t q a c t t t c g q c g g g tq c a a t a t c t c t a c t t c t q c t t
361 q a c q a q g ta t t q t t q c c t g t a c t t c t t t c t t c t t c t t c t t q c t q a t t q q t t c ta ta a q a a
421 a t c t a g t a t t t t c t t t g a a a c a g a g t t t t c c c q t q q t t t t c q a a c t tq q a g a a a g a t tg t
481 t a a g c t t c t g t a t a t t c t g c c c a a a t t t g a a... (SEQ ID NO:17)
Otro ejemplo de una secuencia potenciadora de CPMV HT+ es proporcionado por la secuencia de SEQ ID NO:18 (CPMV h T+[WT115]). Los casetes o vectores de expresión que comprenden CPMV HT+ y que incluyen una región reguladora de plantas en asociación operativa con la secuencia potenciadora de la expresión de la SEQ ID NO: 18, y el sitio de inicio de la transcripción (ATG) en el extremo 3' fusionado a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural y no estructural de rotavirus son también parte de la presente descripción.
SEQ ID NO: 18 (CPMV HT+[WT115]) nucleótidos 1-160, 5'UTR, con un ATG en la posición 115-117, minúscula en negrita; fragmento de relleno que comprende: una proteína M incompleta subrayada, nucleótidos 161 - 509; con un ATG modificado en la posición 161-153 minúscula en negrita y subrayado, un sitio de clonación múltiple, cursiva, nucleótidos 510-528; y una secuencia de Kozak de plantas, mayúsculas y negrita, nucleótidos 529-534).
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La secuencia de Kozak de plantas de la SEQ ID NO:18 puede ser cualquier secuencia de Kozak de plantas, que incluye, pero no se limita a, una de las secuencias de las SEQ ID NO: 2-14.
Se proporciona, además, un sistema de expresión en plantas que comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que comprende una región reguladora, unida operativamente con uno o más de un potenciador de la expresión como se describe en la presente descripción (por ejemplo, CPMV HT+, CPMV HT+[WT115], CPMV HT+ [511]) y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o no estructural de rotavirus. Se describen, además, un ácido nucleico que comprende una secuencia promotora (región reguladora), un potenciador de la expresión (por ejemplo, CPMV HT+ o CPMV HT+[WT115]) que comprende una 5'UTR de comovirus y una secuencia de relleno con una secuencia de Kozak de plantas fusionada a una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína estructural o no estructural de rotavirus. El ácido nucleico puede comprender, además, una secuencia que comprende una región no traducida (UTR) 3' de comovirus, por ejemplo, una 3' UTR de plastocianina, u otra 3'UTR activa en una planta, y una secuencia terminadora, por ejemplo un terminador NOS, unido operativamente al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural o no estructural de rotavirus (denominada secuencia de nucleótidos de interés en la Figura 6a), de manera que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural o no estructural de rotavirus se inserta corriente arriba desde la región no traducida (UTR) 3' de comovirus, 3'UTR de plastocianina u otra secuencia 3'UTR.
La aparición de las RLP producidas con el uso de los métodos descritos en la presente descripción puede detectarse con el uso de cualquier método adecuado, por ejemplo, centrifugación en gradiente de densidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Las RLP pueden evaluarse en cuanto a estructura y tamaño, por ejemplo, por microscopía electrónica, cromatografía de exclusión por tamaño u otras técnicas que serían evidentes para un experto en la técnica.
Para la cromatografía de exclusión por tamaño, las proteínas solubles totales pueden extraerse del tejido vegetal al homogeneizar (Polytron) una muestra de material vegetal congelado triturado en tampón de extracción, y el material insoluble se elimina por centrifugación. La precipitación con acetona helada o PEG también puede ser beneficiosa. Se cuantifica la proteína soluble y el extracto se pasa a través de una columna SephacrylTM, por ejemplo, una columna SephacrylTM S500. Se puede usar azul dextrano 2000 como estándar de calibración. Después de la cromatografía, las fracciones pueden analizarse adicionalmente por inmunotransferencia para determinar el complemento proteico de la fracción.
La fracción separada puede ser, por ejemplo, un sobrenadante (si se centrifuga, sedimenta o precipita), o un filtrado (si se filtra), y está enriquecida en proteínas o proteínas de superestructura, e incluye partículas de mayor peso molecular, como las RLP de una capa única (sl), doble capa (dl) o triple capa (tl).
La fracción separada puede procesarse adicionalmente para aislar, purificar, concentrar o una combinación de estas, las proteínas, proteínas de supraestructura o partículas de orden superior, por ejemplo, mediante etapas adicionales de centrifugación, precipitación, etapas cromatográficas (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, de intercambio iónico, de afinidad), filtración de flujo tangencial o una combinación de estos. La presencia de proteínas purificadas, proteínas de supraestructura o partículas de orden superior, tales como las RLP, puede confirmarse, por ejemplo, por SDS-PAGE nativa o, análisis Western con el uso de un anticuerpo de detección apropiado, electroforesis capilar, microscopía electrónica o cualquier otro método como sería evidente para un experto en la técnica.
Las RLP producidas de acuerdo con la presente descripción pueden purificarse, purificarse parcialmente a partir de una planta, porción de una planta o materia vegetal, o pueden administrarse como una vacuna oral, con el uso de métodos conocidos para un experto en la técnica.
La purificación de RLP puede implicar la centrifugación en gradiente, por ejemplo, pueden usarse gradientes de densidad de sacarosa, iodixanol, OptiPrep™ o cloruro de cesio (CsCl) para purificar o purificar parcialmente las RLP de la biomasa vegetal transformada. Como se muestra, por ejemplo, en la Figura 4, podría usarse un gradiente en etapas de iodixanol o un gradiente continuo de iodixanol para purificar la RLP y/o las proteínas estructurales de rotavirus expresadas.
Se ha demostrado que la concentración de calcio (Ca2 ) es importante para la transformación de partículas de triple capa (TLP) a partículas de doble capa (DLP) y depende de la cepa (ver, por ejemplo, Martin y otros Journal of Virology, enero de 2002). La pérdida completa de las proteínas de la cápside externa de las TLP (decapsidación de TLP) tiene lugar en el rango nanomolar de [Ca2+]. Por tanto, la extracción y/o purificación de RLP puede realizarse en presencia de calcio, y la etapa de centrifugación en gradiente puede realizarse en presencia de calcio, por ejemplo, en presencia de CaCl2. La concentración de CaCl2 puede estar entre, por ejemplo, 1 mM y 1000 mM, o cualquier cantidad intermedia, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 50, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 mM o cualquier cantidad intermedia.
Las plantas o fragmentos de plantas pueden procesarse mínimamente. Por la expresión "procesamiento mínimo" se entiende materia vegetal, por ejemplo, una planta o porción de la misma que comprende una proteína de interés y/o la RLP que se purifica parcialmente para producir un extracto vegetal, homogeneizado, fracción de homogeneizado vegetal o similar (es decir, mínimamente procesado). La purificación parcial puede comprender, pero no se limita a romper las estructuras celulares de la planta para crear así una composición que comprende componentes vegetales solubles y componentes vegetales insolubles que pueden separarse, por ejemplo, pero sin limitarse a, por centrifugación, filtración o una combinación de los mismos. En este sentido, las proteínas secretadas dentro del espacio extracelular de la hoja u otros tejidos podrían obtenerse fácilmente con el uso de vacío o extracción centrífuga, o los tejidos podrían extraerse bajo presión mediante el paso a través de rodillos o trituración o similares para exprimir o liberar la proteína libre dentro del espacio extracelular. El procesamiento mínimo también podría implicar la preparación de extractos crudos de proteínas solubles, ya que estas preparaciones tendrían una contaminación insignificante de productos vegetales secundarios. Además, el procesamiento mínimo puede implicar la extracción acuosa de proteína soluble de las hojas, seguida de la precipitación con cualquier sal adecuada. Otros métodos pueden incluir la maceración a gran escala y la extracción de jugo para permitir el uso directo del extracto. Las RLP pueden purificarse o extraerse con el uso de cualquier método adecuado, por ejemplo, extracción mecánica o bioquímica.
La proteína estructural de uno o más rotavirus puede sintetizarse en una cantidad de hasta 2 g por kilogramo de peso fresco de la planta. Por ejemplo, la cantidad de proteína estructural sintetizada puede estar entre 1 y 2 g por kilogramo de peso fresco, o cualquier cantidad entre, tal como 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 g por kilogramo de peso fresco o cualquier cantidad intermedia. Por ejemplo, la proteína estructural puede sintetizarse en una cantidad de hasta 1,54 g por kilogramo de peso fresco de la planta.
El tamaño (es decir, el diámetro) de las RLP definidas anteriormente, tal vez medidas, por ejemplo, por técnicas de dispersión dinámica de luz (DLS) o de microscopio electrónico (EM), suele estar entre 50 y 110 nm, o cualquier tamaño intermedio. Por ejemplo, el tamaño de la estructura de RLP intacta puede variar entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 110 nm, o cualquier tamaño intermedio, tal como 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm o cualquier tamaño intermedio.
Secuencias de nucleótidos
La presente descripción proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus unidas operativamente a una región reguladora activa en una planta. La secuencia de nucleótidos puede optimizarse, por ejemplo, para el uso de codones en humanos o el uso de codones en plantas. Además, una o más proteínas estructurales de rotavirus pueden unirse operativamente a uno o más de un elemento de amplificación. Además, una o más proteínas estructurales de rotavirus pueden unirse operativamente a una o más de una secuencia de direccionamiento a compartimentos. La una o más proteínas estructurales de rotavirus codificada por la secuencia de nucleótidos puede ser, por ejemplo, VP2, VP4, VP6 o VP7. Además, la una o más proteína estructural de rotavirus codificada por la secuencia de nucleótidos puede ser, por ejemplo, de cualquier grupo de rotavirus A a G, pero con mayor preferencia del grupo de rotavirus A. Además, la una o más proteína estructural de rotavirus codificada por la secuencia de nucleótidos puede ser de cualquier cepa de rotavirus que tiene un genotipo de cualquiera de las combinaciones de tipos G y P de G1 a G27 y de P1 a P34, y con mayor preferencia de G1 a G19 y de P1 a P27, incluidos, pero no se limitan a, g 1p [8], G2P[4], G2P[8], G3P[8], g 4p [8], G9P[6], G9P[8], cepa WA de rotavirus A, cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de rotavirus A o cepa SA11 de rotavirus.
Una secuencia de ácidos nucleicos a la que se hace referencia en la presente descripción puede ser "sustancialmente homóloga", "sustancialmente similar" o "sustancialmente idéntica" a una secuencia, o un complemento de la secuencia si la secuencia de ácidos nucleicos se hibrida con uno o más de una secuencia de nucleótidos o un complemento de la secuencia de ácidos nucleicos como se define en la presente descripción en condiciones rigurosas de hibridación. Las secuencias son "sustancialmente homólogas" "sustancialmente similares" "sustancialmente idénticas" cuando al menos aproximadamente el 70 %, o entre el 70 y el 100 %, o cualquier cantidad intermedia, por ejemplo 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 %, o cualquier cantidad intermedia, de los nucleótidos coinciden en una longitud definida de la secuencia de nucleótidos siempre que tales secuencias homólogas exhiban una o más de una de las propiedades de la secuencia, o el producto codificado como se describe en la presente descripción.
Por ejemplo, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas de rotavirus, por ejemplo, una proteína de rotavirus estructural o no estructural, que es al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 100 % o cualquier cantidad intermedia idéntica a secuencias como se define, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 21, 27, 32, 37 o 42. El polinucleótido puede ser un codón humano optimizado por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. La secuencia de nucleótidos puede incluir, por ejemplo, una proteína de rotavirus que es al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 100 % o cualquier cantidad intermedia idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39 o 44.
Además, la presente descripción proporciona las RLP que comprenden proteínas estructurales de rotavirus que, por ejemplo, están codificadas por ácidos nucleicos que son al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %., 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 100 % o cualquier cantidad intermedia idénticos a las secuencias definidas, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 21, 27, 32, 37 o 42.
Tal similitud o identidad de secuencia puede determinarse con el uso de un programa de comparación de secuencias de nucleótidos, tal como el proporcionado dentro de DNASIS (que usa, por ejemplo, pero sin limitarse a, los siguientes parámetros: penalización por INTERRUPCIÓN 5, # de diagonales superiores 5, penalización por INTERRUPCIÓN fija 10, tupla k 2, interrupción flotante 10 y tamaño de ventana 5). Sin embargo, otros métodos de alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, los algoritmos de Smith y Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), y por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y BLAST, disponibles a través del NIH.), o por alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros, eds. Suplemento de 1995), o con el uso de hibridación Southern o Northern en condiciones rigurosas (ver Maniatis y otros, en Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Preferentemente, las secuencias que son sustancialmente homólogas exhiben al menos aproximadamente 80 % y con la máxima preferencia al menos aproximadamente 90 % de similitud de secuencia en una longitud definida de la molécula.
Un ejemplo de tales condiciones de hibridación rigurosas puede ser hibridación durante la noche (de aproximadamente 16-20 horas) en SSC 4 X a 65 °C, seguido de lavado en Ss C 0,1 X a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en SSC 0,1 X a 65 °C cada uno durante 20 o 30 minutos. Alternativamente, una condición de hibridación rigurosa ilustrativa podría ser durante la noche (16-20 horas) en formamida al 50 %, SSC 4 X a 42 °C, seguido de lavado en SSC 0,1 X a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en SSC 0,1 X a 65 °C cada uno durante 20 o 30 minutos, o durante la noche (16-20 horas), o hibridación en tampón de fosfato acuoso Church (SDS al 7 %; tampón de NaPO40,5 M pH 7,2; EDTA 10 mM) a 65 °C, con 2 lavados ya sea a 50 °C en SSC 0,1 X, SDS al 0,1 % durante 20 o 30 minutos cada uno, o 2 lavados a 65 °C en SSC 2 X, SDS al 0,1 % durante 20 o 30 minutos cada uno para regiones de secuencia únicas.
Un ácido nucleico que codifica un polipéptido estructural de rotavirus puede describirse como un "ácido nucleico de rotavirus", una "secuencia de nucleótidos de rotavirus", un "ácido nucleico de rotavirus" o una "secuencia de nucleótidos de rotavirus". Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, una partícula similar a virus que comprende una o más proteína estructural de rotavirus o polipéptido estructural de rotavirus, puede describirse como una "VLP de rotavirus", "RVLP" o "RLP".
Muchos organismos muestran un sesgo por el uso de codones particulares para codificar la inserción de un aminoácido particular en una cadena de péptidos en crecimiento. La preferencia de codones o el sesgo de codones, las diferencias en el uso de codones entre organismos, se deben a la degeneración del código genético y están bien documentadas entre muchos organismos. El sesgo de codones frecuentemente se correlaciona con la eficacia de la traducción del ARN mensajero (ARNm), que a su vez se cree que depende, entre otras cosas, de las propiedades de los codones que se traducen y de la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares. El predominio de los ARNt seleccionados en una célula es generalmente un reflejo de los codones usados con más frecuencia en la síntesis de péptidos. En consecuencia, los genes pueden adaptarse para una expresión génica óptima en un organismo dado basándose en la optimización de codones. El proceso de optimización de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína expresada de forma heteróloga puede ser una etapa importante para mejorar los rendimientos de expresión. Los requisitos de optimización pueden incluir las etapas para mejorar la capacidad del huésped para producir la proteína extraña.
La "optimización en codones" se define como la modificación de una secuencia de ácidos nucleicos para mejorar la expresión en las células de interés mediante la sustitución de al menos uno, más de uno o un número significativo, de codones de la secuencia nativa con codones que pueden ser usados con mayor frecuencia o con la máxima frecuencia en los genes de otro organismo o especie. Diversas especies exhiben un sesgo particular para ciertos codones de un aminoácido particular.
La presente descripción incluye secuencias polinucleotídicas sintéticas que se han optimizado en codones, por ejemplo, las secuencias se han optimizado para el uso de codones en humanos o el uso de codones en plantas. Las secuencias polinucleotídicas optimizadas en codones pueden expresarse después en plantas. Más específicamente, las secuencias optimizadas para el uso de codones en humanos o el uso de codones en plantas pueden expresarse en plantas. Sin pretender unirse a ninguna teoría, se cree que las secuencias optimizadas para el codón humano aumentan el contenido de guanina-citosina (contenido de GC) de la secuencia y mejoran los rendimientos de expresión en plantas.
Existen diferentes técnicas de optimización de codones conocidas en la técnica para mejorar la cinética de traducción de regiones codificantes de proteínas de traducción no eficiente. Estas técnicas se basan principalmente en la identificación del uso de codones para un determinado organismo huésped. Si un determinado gen o secuencia debe expresarse en este organismo, la secuencia codificante de tales genes y secuencias se modificará entonces de manera que se reemplacen los codones de la secuencia de interés por codones del organismo huésped usados con mayor frecuencia.
Secuencias de aminoácidos
Los ejemplos no limitantes de la proteína estructural de rotavirus son las proteínas de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7, y un fragmento de VP2, VP4, v P6 y VP7. Los ejemplos no limitantes de VP2, VP4, VP6 y VP7, o fragmentos de las proteínas VP2, VP4, VP6 y VP7 que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen las proteínas VP2, VP4, VP6 y VP7 de la cepa G9 P[6] de rotavirus, cepa WA de rotavirus A, cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de rotavirus A y cepa SA11 de rotavirus. Por ejemplo, pero no limitado a Rotarix-A41CB052A: VP4 (número de acceso JN849113), VP7: (número de acceso JN849114), cepa WA de rotavirus A: VP2 (número de acceso X14942), VP4: (número de acceso L34161), VP6 (número de acceso K02086), VP7: (número de acceso GU723327), NSP4 (número de acceso K02032), cepa SA11 de rotavirus: VP2 (número de acceso NC_011506), VP4 (número de acceso NC_011510), VP6 (número de acceso NC_011509), VP7 (número de acceso NC_011503) y NSP4 (número de acceso NC_011504).
Un ejemplo de una proteína estructural VP2, que no debe considerarse limitante, se expone en la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 24. Además, la proteína estructural VP2 puede comprender la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 24, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90-100 % de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma. Además, una proteína estructural VP2 puede ser codificada por una secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO:21 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 80-100 % de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma.
Un ejemplo de una proteína estructural VP4, que no debe considerarse limitante, se expone en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34. Además, la proteína estructural VP4 puede comprender la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 34, o una secuencia que tenga al menos aproximadamente un 90-100 % de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma. Además, una proteína estructural VP4 puede ser codificada por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 32 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80-100 % de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma.
Un ejemplo de una proteína estructural VP6, que no debe considerarse limitante, se expone en la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 29. Además, la proteína estructural VP6 puede comprender la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 29, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90-100 % de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma. Además, una proteína estructural VP6 puede ser codificada por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 27 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 80-100 % de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma.
Un ejemplo de una proteína estructural VP7, que no debe considerarse limitante, se expone en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. Además, la proteína estructural VP7 puede comprender la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 39, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90-100 % de similitud con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 91, 92, 93, 94., 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma. Además, una proteína estructural VP7 puede ser codificada por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 37 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 80-100 % de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma.
Un ejemplo de una proteína estructural NSP4, que no debe considerarse limitante, se expone en la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 44. Además, la proteína no estructural NSP4 puede comprender la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 44, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90-100 % de similitud con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma. Además, una proteína no estructural NSP4 puede ser codificada por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 42 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80-100 % de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de similitud de secuencia con la misma.
La similitud o identidad de la secuencia de aminoácidos puede calcularse con el uso de los programas BLASTP y TBLASTN que emplean el algoritmo BLAST 2.0 (herramienta básica de búsqueda de alineación local). Las técnicas para calcular la similitud o identidad de secuencias de aminoácidos son bien conocidas por los expertos en la técnica, y el uso del algoritmo BLAST se describe en ALTSCHUL y otros (1990, J Mol. Biol. 215: 403-410) y ALTSCHUL y otros (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
Sin desear estar unido a la teoría, la concentración de proteína y la relación de las diferentes proteínas estructurales de rotavirus pueden ser importantes para la eficiencia de ensamblaje de las RLP. Por lo tanto, la multiplicidad y el tiempo de infección pueden ser importantes para manipular la concentración de proteínas y la eficiencia general de ensamblaje de las RLP en las plantas.
El constructo de la presente descripción puede expresarse transitoriamente en una planta o porción de una planta. Puede usarse un sistema de expresión transitoria que se basa en la expresión epicromosómica de Agrobacterium tumefaciens recombinante en una planta, porción de una planta o célula vegetal para expresar la proteína estructural de rotavirus, dirigida a varios compartimentos o subcompartimentos celulares. Un sistema de expresión transitoria permite una alta velocidad de producción. Además, pueden obtenerse grandes cantidades de proteína en unos pocos días después de la infiltración de Agrobacterium recombinante en plantas (Rybicki, 2010; Fischer y otros, 1999). También es posible expresar secuencias genéticas largas y tener más de un gen expresado simultáneamente en la misma célula, lo que permite un ensamblaje eficiente de proteínas multiméricas (Lombardi y otros, 2009).
Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas estructurales del rotavirus y las proteínas no estructurales pueden transferirse a la planta huésped con el uso de 1,2, 3, 4 o 5 cepas de Agrobacterium tumefaciens transformadas (como se describe en la Tabla 1 y el texto adjunto
Durante la expresión transitoria, el silenciamiento génico postranscripcional puede limitar la expresión de las proteínas heterólogas en las plantas. La coexpresión de un supresor del silenciamiento, por ejemplo, pero sin limitarse a Nss del virus de la marchitez manchada del tomate, puede usarse para contrarrestar la degradación específica de los ARNm transgénicos (Brigneti y otros, 1998). Los supresores de silenciamiento alternativos son bien conocidos en la técnica y pueden usarse como se describe en la presente descripción (Chiba y otros, 2006, Virology 346:7-14), por ejemplo, pero no se limitan a, HcPro, TEV -p1/HC-Pro (virus del grabado del tabaco-pl/HCPro), BYV -p21, p19 del virus del enanismo ramificado del tomate (TBSV p19), proteína de cápside del virus del arrugamiento del tomate (TCV -CP), 2b del virus del mosaico del pepino; CMV-2b), p25 del virus X de la patata (PVX-p25), p11 del virus M de la patata (PVM-p11), p11 del virus S de la patata (PVS-p11), p16 del virus de la quemazón del arándano (BScV -p16), p23 del virus de la tristeza de los cítricos (CTV-p23), p24 del virus-2 asociado al enrollamiento de la hoja de vid, (GLRaV-2 p24), p10 del virus de la vid A, (GVA-p10), p14 del virus de la vid B (GVB-p14), p10 del virus latente de Heracleum (HLV-p10) o p16 del virus latente común del ajo (GCLV-p16). Por lo tanto, un supresor de silenciamiento, por ejemplo HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSVp19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10, puede coexpresarse junto con una o más proteínas estructurales o no estructurales de rotavirus, por ejemplo, VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 o una combinación de las mismas, para asegurar además altos niveles de producción de proteínas dentro de una planta o porción de una planta.
La presente descripción también proporciona un método como se describió anteriormente, en donde una secuencia de nucleótidos adicional (segunda, tercera, cuarta, quinta o sexta) se expresa dentro de la planta, la secuencia de nucleótidos adicional (segunda, tercera, cuarta, quinta o sexta) que codifica un supresor de silenciamiento está unida operativamente con una región reguladora adicional (segunda, tercera, cuarta, quinta o sexta) que está activa en la planta. La secuencia de nucleótidos que codifica un supresor de silenciamiento puede ser, por ejemplo, Nss, HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSVp19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10.
Como se describe a continuación, pueden usarse métodos de expresión transitoria para expresar los constructos de la presente descripción (ver Liu y Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348). Alternativamente, puede usarse un método de expresión transitoria basado en vacío, como se describe en Kapila y otros, 1997. Estos métodos pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, un método de agroinoculación o agroinfiltración, infiltración con jeringa, sin embargo, también pueden usarse otros métodos transitorios como se indicó anteriormente. Con agroinoculación, agroinfiltración o infiltración con jeringa, una mezcla de Agrobacterias que comprende el ácido nucleico deseado se introduce en los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo, las hojas, la parte aérea de la planta (que incluye el tallo, las hojas y la flor), otra porción de la planta (tallo, raíz, flor) o la planta completa. Después de cruzar la epidermis, las Agrobacterias infectan y transfieren
de manera episomal y el ARNm se traduce, lo que conduce a la producción de la proteína de interés en las células infectadas, sin embargo, el paso del ADN-t dentro del núcleo es transitorio.
Para ayudar en la identificación de células vegetales transformadas, las constructos de esta descripción pueden manipularse adicionalmente para incluir marcadores seleccionables de plantas. Los marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a productos químicos tales como antibióticos, por ejemplo, gentamicina, higromicina, kanamicina, o herbicidas tales como fosfinotricina, glifosato, clorosulfuron y similares. De manera similar, pueden usarse enzimas que proporcionan la producción de un compuesto identificable por cambio de color, tal como GUS (beta-glucuronidasa), o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP.
También se consideran parte de esta descripción las plantas transgénicas, las células vegetales o las semillas que contienen los constructos descritos en la presente descripción. También se conocen en la técnica los métodos para regenerar plantas enteras a partir de células vegetales. En general, las células vegetales transformadas se cultivan en un medio apropiado, que puede contener agentes de selección tales como antibióticos, donde se usan marcadores de selección para facilitar la identificación de las células vegetales transformadas. Una vez que se forma el callo, se puede fomentar la formación de brotes con el empleo de las hormonas vegetales apropiadas de acuerdo con métodos conocidos y los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento para la regeneración de las plantas. Las plantas pueden usarse después para establecer generaciones repetitivas, ya sea a partir de semillas o con el uso de técnicas de propagación vegetativa. Las plantas transgénicas también pueden generarse sin usar cultivos de tejidos.
El uso de las expresiones "región reguladora", "elemento regulador" o "promotor" en la presente solicitud pretende reflejar una porción de ácido nucleico típicamente, pero no siempre, corriente arriba de la región codificante de proteínas de un gen, que puede estar compuesto por ADN o ARN, o tanto ADN como ARN. Cuando una región reguladora está activa, y en asociación operativa, o unida operativamente, con un gen de interés, esta puede dar como resultado la expresión del gen de interés. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad en un órgano o controlar la activación de genes por el desarrollo o temporal. Una "región reguladora" puede incluir elementos promotores, elementos promotores centrales que exhiben una actividad promotora basal, elementos que son inducibles en respuesta a un estímulo externo, elementos que median la actividad promotora tales como elementos reguladores negativos o potenciadores de la transcripción. "Región reguladora", como se usa en la presente descripción, también incluye elementos que son activos después de la transcripción, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresión génica tales como potenciadores de la transcripción y la traducción, represores de la transcripción y la traducción, secuencias de activación corriente arriba y determinantes de inestabilidad del ARNm. Varios de estos últimos elementos pueden ubicarse próximos a la región codificante.
En el contexto de esta descripción, la expresión "elemento regulador" o "región reguladora" típicamente se refiere a una secuencia de ADN, generalmente, pero no siempre, corriente arriba (5') a la secuencia codificante de un gen estructural, que controla la expresión de la región codificante al proporcionar el reconocimiento para la ARN polimerasa y/u otros factores necesarios para que la transcripción comience en un sitio particular. Sin embargo, debe entenderse que otras secuencias de nucleótidos, ubicadas dentro de los intrones, o 3' de la secuencia también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento de la ARN polimerasa u otros factores de transcripción para garantizar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayoría, pero no todos, los elementos promotores eucariotas contienen una caja TATA, una secuencia de ácidos nucleicos conservada compuesta por pares de bases de nucleótidos de adenosina y timidina, generalmente situados aproximadamente a 25 pares de bases corriente arriba de un sitio de inicio de la transcripción. Un elemento promotor comprende un elemento promotor basal, responsable del inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores (como se enumeró anteriormente) que modifican la expresión génica.
Hay varios tipos de regiones reguladoras, incluidas aquellas que son reguladas por el desarrollo, inducibles o constitutivas. Una región reguladora que es regulada por el desarrollo, o controla la expresión diferencial de un gen bajo su control, se activa dentro de ciertos órganos o tejidos de un órgano en momentos específicos durante el desarrollo de ese órgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que son reguladas por el desarrollo pueden estar activas preferentemente dentro de ciertos órganos o tejidos en etapas específicas del desarrollo, también pueden ser activas de una manera regulada por el desarrollo, o también a un nivel basal en otros órganos o tejidos dentro de la planta. Los ejemplos de regiones reguladoras específicas de tejido, por ejemplo, una región reguladora específica, incluyen el promotor de napina y el promotor de cruciferina (Rask y otros, 1998, J. Plant Physiol. 152: 595­ 599; Bilodeau y otros, 1994, Plant Cell 14: 125-130). Un ejemplo de un promotor específico de la hoja incluye el promotor de plastocianina (ver el documento US 7,125,978).
Una región reguladora inducible es una que es capaz de activar directamente o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o los genes no se transcribirán. Típicamente, el factor proteico que se une específicamente a una región reguladora inducible para activar la transcripción puede estar presente en una forma inactiva, que después se convierte directamente o indirectamente en la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor proteico también puede estar ausente. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador del crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos o indirectamente a través de la acción de un patógeno o agente patógeno tal como un virus. Una célula vegetal que contiene una región reguladora inducible puede exponerse a un inductor al aplicar externamente el inductor a la célula o planta tal como por pulverización, riego, calentamiento o métodos similares. Los elementos reguladores inducibles pueden derivarse de genes ya sea vegetales o no vegetales (por ejemplo, Gatz, C. y Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). Los ejemplos de promotores inducibles potenciales incluyen, pero no se limitan a, promotor inducible por tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. BioI. 48,89-108), promotor inducible por esteroides (Aoyama. T. y Chua, N.H., 1997, Planta 1. 2, 397-404) y promotor inducible por etanol (Salter, M.G., y otros, 1998, Plant 10urnal 16, 127-132; Caddick, M.X., y otros, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180) IB6 inducible por citoquinina y genes CKI 1 (Brandstatter, I. y K.ieber, 1.1., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982­ 985) y el elemento inducible por auxina, DR5 (Ulmasov, T., y otros, 1997, Plant Cell 9, 1963-1971).
Una región reguladora constitutiva dirige la expresión de un gen a través de las diversas partes de una planta y de manera continua a lo largo del desarrollo de la planta. Los ejemplos de elementos reguladores constitutivos incluyen promotores asociados con el transcrito CaMV 35S (Odell y otros, 1985, Nature, 313: 810-812), el gen de actina de arroz 1 (Zhang y otros, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An y otros, 1996, Plant J., 10: 107-121), o tms 2 (documento U.S. 5,428,147) y triosafosfato isomerasa 1 (Xu y otros, 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), el gen de ubiquitina del maíz 1 (Cornejo y otros, 1993, Plant Mol. BioI. 29: 637-646), los genes de ubiquitina 1 y 6 de Arabidopsis (Holtorf y otros, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), y el gen del factor de iniciación de la traducción 4A del tabaco (Mandel y otros, 1995, Plant Mol. Biol. 29, 995-1004).
La expresión "constitutivo", como se usa en la presente descripción, no indica necesariamente que un gen bajo el control de la región reguladora constitutiva se expresa al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que el gen se expresa en una amplia variedad de tipos de células aun cuando a menudo se observa variación en la abundancia. Los elementos reguladores constitutivos pueden acoplarse con otras secuencias para mejorar aún más la transcripción y/o la traducción de la secuencia de nucleótidos a la que están unidos operativamente. Por ejemplo, el sistema CPMV-HT se deriva de las regiones no traducidas del virus del mosaico del caupí (CPMV) y demuestra una traducción mejorada de la secuencia codificante asociada. Por "nativo" se entiende que el ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos es de origen natural o "de tipo silvestre". Por "unido operativamente" se entiende que las secuencias particulares, por ejemplo, un elemento regulador y una región codificante de interés, interactúan directamente o indirectamente para llevar a cabo una función prevista, tal como la mediación o la modulación de la expresión génica. La interacción de secuencias unidas operativamente puede, por ejemplo, estar mediada por proteínas que interactúan con las secuencias unidas operativamente.
La RLP producida dentro de una planta puede producir una proteína estructural VP7 de rotavirus que comprende N-glicanos específicos de la planta. Por tanto, esta descripción también proporciona una RLP que comprende VP7 que tiene N-glicanos específicos de plantas.
Además, se conoce la modificación de N-glicano en las plantas (ver, por ejemplo, el documento U.S. 60/944,344) y puede producirse VP7 que tiene N-glicanos modificados. Puede obtenerse VP7 que comprende un patrón de glicosilación modificado, por ejemplo, con N-glucanos con reducción de fucosilación, xilosilación, o ambas, fucosilación y xilosilación, o puede obtenerse VP7 que tiene un patrón de glicosilación modificado, en donde la proteína carece de fucosilación, xilosilación, o ambos, y comprende un aumento de la galactosilación. Además, la modulación de modificaciones postraduccionales, por ejemplo, la adición de galactosa terminal puede dar como resultado una reducción de la fucosilación y la xilosilación de la VP7 expresada en comparación con una planta de tipo silvestre que expresa VP7.
Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, la síntesis de VP7 que tiene un patrón de glicosilación modificado puede lograrse al coexpresar VP7 junto con una secuencia de nucleótidos que codifica beta-1.4 galactosiltransferasa (GalT), por ejemplo, pero sin limitarse a GalT de mamífero o GalT humana, sin embargo, también puede usarse GalT de otras fuentes. El dominio catalítico de GalT también puede fusionarse con un dominio CTS (es decir, la cola citoplasmática, dominio transmembrana, región del tallo) de N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1), para producir una enzima híbrida GNT1-GalT, y la enzima híbrida puede coexpresarse con VP7. La VP7 también puede coexpresarse junto con una secuencia de nucleótidos que codifica N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT-III), por ejemplo, pero no se limita a GnT-III de mamífero o GnT-III humana, también puede usarse GnT-III de otras fuentes.
Adicionalmente, también puede usarse una enzima híbrida GNT1-GnT-III, que comprende el CTS de GNT1 fusionado a GnT-III.
Por lo tanto, la presente descripción también proporciona las RLP que comprenden VP7 que tiene N-glicanos modificados.
Sin desear estar unido a ninguna teoría, la presencia de N-glicanos vegetales en VP7 puede estimular la respuesta inmunitaria al promover la unión de VP7 por las células presentadoras de antígeno. Saint-Jore-Dupas y otros han propuesto la estimulación de la respuesta inmunitaria con el uso de N glucano vegetal (2007).
La Tabla 2 enumera las secuencias a las que se hace referencia en la presente descripción.
Tabla 2:
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La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1 Materiales y métodos
Tabla 3: Constructos
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1. 2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS (constructo número 1710)
Una secuencia optimizada que codifica VP2 de la cepa WA de Rotavirus A se clonó en el sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter con el uso del siguiente método basado en PCR. Se amplificó un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP2 con el uso de los cebadores IF-WA_VP2(opt).s1+3c (Figura 7a, SEQ ID NO: 19) e IF-WA_VP2(opt).s1-4r (Figura 7B, SEQ ID NO: 20), con el uso de la secuencia optimizada del gen de VP2 (Figura 7C, SEQ ID NO: 21) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP2 (número de acceso de Genbank CAA33074) se sometió a traducción inversa y se optimizó para el uso de codones en humanos, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS con el uso del sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). El constructo número 1191 (Figura 7D) se digirió con las enzimas de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. El constructo número 1191 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora un constructo génico para la coexpresión del supresor de silenciamiento de TBSV P19 bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de la alfalfa. La cadena principal es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia desde el límite izquierdo al derecho del ADN-t se presenta en la Figura 7E (SEQ ID NO: 22). El constructo resultante recibió el número 1710 (Figura 7F, SEQ ID NO: 23). La secuencia de aminoácidos de VP2 de la cepa WA de Rotavirus A se presenta en la Figura 7G (SEQ ID NO: 24). Una representación del plásmido 1710 se presenta en la Figura 7H.
2. 2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS (Constructo número 1713)
Se clonó una secuencia optimizada que codifica VP6 de la cepa WA de Rotavirus A en el sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter con el uso del siguiente método basado en PCR. Se amplificó un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP6 con el uso de los cebadores IF-WA_VP6(opt).s1+3c (Figura 8A, SEQ ID NO: 25) e IF-WA_VP6(opt).s1-4r (Figura 8B, SEQ ID NO: 26), con el uso de la secuencia optimizada del gen de VP6 (Figura 8C, SEQ ID NO: 27) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP6 (número de acceso de Genbank AAA47311) se sometió a traducción inversa y se optimizó para el uso de codones en humanos, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS con el uso del sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). El constructo número 1191 (Figura 7D) se digirió con las enzimas de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. El constructo número 1191 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora un constructo génico para la coexpresión del supresor de silenciamiento de TBSV P19 bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de la alfalfa. La cadena principal es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia desde el límite izquierdo al derecho del ADN-t se presenta en la Figura 7E (SEQ ID NO: 22). El constructo resultante recibió el número 1713 (Figura 8D, SEQ ID NO: 28). La secuencia de aminoácidos de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A se presenta en la Figura 8E (SEQ ID NO: 29). Una representación del plásmido 1713 se presenta en la Figura 8F.
3. 2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS (Constructo número 1730)
Se clonó una secuencia optimizada que codifica VP4 de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A en 2X35S/CPMV-HT/NOS en un plásmido que contenía Plasto_pro/P19/Plasto_ter en un casete de expresión con el uso del siguiente método basado en PCR. Se amplificó un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP4 con el uso de los cebadores IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c (Figura 9A, SEQ ID NO: 30) e IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (Figura 9B, SEQ ID NO: 31), con el uso de la secuencia optimizada del gen de VP4 (Figura 9C, SEQ ID NO: 32) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP4 (número de acceso de Genbank AEX30660) se sometió a traducción inversa y se optimizó para el uso de codones en humanos, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en el casete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS con el uso del sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). El constructo número 1191 (Figura 7D) se digirió con las enzimas de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. El constructo número 1191 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora un constructo génico para la coexpresión del supresor de silenciamiento de TBSV P19 bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de la alfalfa. La cadena principal es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia desde el límite izquierdo al derecho del ADN-t se presenta en la Figura 7E (SEQ ID NO: 22). El constructo resultante recibió el número 1730 (Figura 9D, SEQ ID NO: 33). La secuencia de aminoácidos de VP4 de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A se presenta en la Figura 9E (SEQ ID NO: 34). Una representación del plásmido 1730 se presenta en la Figura 9F.
4. 2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (Constructo número 1734)
Se clonó una secuencia optimizada que codifica VP7 con una versión truncada del péptido señal nativo de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A en el sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-n Os en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter con el uso del siguiente método basado en PCR. Se amplificó un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP7 con el uso de los cebadores IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c (Figura 10A, SEQ ID NO: 35) e IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (Figura 10B, SEQ ID NO: 36), con el uso de la secuencia optimizada del gen de VP7 (correspondiente a nt 88-891 de la Figura 10C, SEQ ID NO: 37) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP7 (número de acceso de Genbank AEX30682) se sometió a traducción inversa y se optimizó para el uso de codones en humanos, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS con el uso del sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). El constructo número 1191 (Figura 7D) se digirió con las enzimas de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. El constructo número 1191 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora un constructo génico para la coexpresión del supresor de silenciamiento de TBSV P19 bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de la alfalfa. La cadena principal es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia desde el límite izquierdo al derecho del ADN-t se presenta en la Figura 7E (s Eq ID NO: 22). El constructo resultante recibió el número 1734 (Figura 10D, SEQ ID NO: 38). La secuencia de aminoácidos de VP7 con péptido señal truncado de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A se presenta en la Figura 10E (SEQ ID NO: 39). Una representación del plásmido 1734 se presenta en la Figura 10F.
5. 2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) NSP4/NOS (Constructo número 1706)
Una secuencia que codifica NSP4 de la cepa WA de Rotavirus A se clonó en el sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter con el uso del siguiente método basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de NSP4 completa se amplificó con el uso de los cebadores IF-WA_NSP4.s1+3c (Figura 11A, SEQ ID NO: 40) e IF-WA_NSP4.s1-4r (Figura 11B, SEQ ID NO: 41), con el uso del gen de NSP4 sintetizado (correspondiente a nt 42-569 del número de acceso de Genbank K02032) (Figura 11C, SEQ ID NO: 42) como plantilla. El producto de PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS con el uso del sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). El constructo número 1191 (Figura 7D) se digirió con las enzimas de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. El constructo número 1191 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora un constructo génico para la coexpresión del supresor de silenciamiento de TBSV P19 bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de la alfalfa. La cadena principal es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia desde el límite izquierdo al derecho del ADN-t se presenta en la Figura 7E (SEQ ID NO: 22). El constructo resultante recibió el número 1706 (Figura 11D, SEQ ID NO: 43). La secuencia de aminoácidos de NSP4 de la cepa WA de Rotavirus A se presenta en la Figura 11E (SEQ ID NO: 44). Una representación del plásmido 1706 se presenta en la Figura 11F.
6. 2X35S/CPMV-160/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS (Constructo número 1108)
Una secuencia optimizada que codifica VP2 de la cepa WA de Rotavirus A se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-160/NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter con el uso del siguiente método basado en p Cr . Se amplificó un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP2 con el uso de los cebadores IF(C160)-WA_VP2(opt).c (Figura 12A, SEQ ID NO: 45) e IF-WA_VP2(opt).s1-4r (Figura 7B, SEQ ID NO: 20), con el uso de la secuencia optimizada del gen de VP2 (Figura 7C, SEQ ID NO: 21) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP2 (número de acceso de Genbank CAA33074) se sometió a traducción inversa y se optimizó para el uso de codones en humanos, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-160/NOS con el uso del sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). El constructo número 1190 (Figura 12B) se digirió con las enzimas de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. El constructo número 1190 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-160. También incorpora un constructo génico para la coexpresión del supresor de silenciamiento de TBSV P19 bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de la alfalfa. La cadena principal es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia desde el límite izquierdo al derecho del ADN-t se presenta en la Figura 12C (SEQ ID NO: 46). El constructo resultante recibió el número 1108 (Figura 12D, SEQ ID NO: 47). La secuencia de aminoácidos de VP2 de la cepa WA de Rotavirus A se presenta en la Figura 7G (SEQ ID NO: 24). Una representación del plásmido 1108 se presenta en la Figura 12E.
7. -2X35S/CPMV-160/RVA(WA) VP6(opt)/NOS (Constructo número 1128) -
Una secuencia optimizada que codifica VP6 de la cepa WA de Rotavirus A se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-160/NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter con el uso del siguiente método basado en p Cr . Se amplificó un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP6 con el uso de los cebadores IF(C160)-WA_VP6(opt).c (Figura 13A, SEQ ID NO: 48) e IF-WA_VP6(opt).s1-4r (Figura 8B, SEQ ID NO: 26), con el uso de la secuencia optimizada del gen de VP6 (Figura 8C, SEQ ID NO: 27) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP6 (número de acceso de Genbank AAA47311) se sometió a traducción inversa y se optimizó para el uso de codones en humanos, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-160/NOS con el uso del sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). El constructo número 1190 (Figura 11B, SEQ ID NO:40) se digirió con las enzimas de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. El constructo número 1190 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-160. También incorpora un constructo génico para la coexpresión del supresor de silenciamiento de TBSV P19 bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de la alfalfa. La cadena principal es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia desde el límite izquierdo al derecho del ADN-t se presenta en la Figura 11C (Se Q ID NO: 41). El constructo resultante recibió el número 1128 (Figura 13B, SEQ ID NO: 49). La secuencia de aminoácidos de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A se presenta en la Figura 8E (SEQ ID NO: 28). Una representación del plásmido 1128 se presenta en la Figura 13C.
8. X35S/CPMV-160/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS (Constructo número 1178)
Se clonó una secuencia optimizada que codifica VP4 de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A en 2X35S/CPMV-160/NOS en un plásmido que contiene el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter con el uso del siguiente método basado en p Cr . Se amplificó un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP4 con el uso de los cebadores IF(C160)-Rtx_VP4(opt).c (Figura 14A, SEQ ID NO: 50) e IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (Figura 9B, SEQ ID NO: 30), con el uso de la secuencia optimizada del gen de VP4 (Figura 9c , SEQ ID NO: 31) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP4 (número de acceso de Genbank AEX30660) se sometió a traducción inversa y se optimizó para el uso de codones en humanos, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-160/NOS con el uso del sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). El constructo número 1190 (Figura 11B, SEQ ID NO: 40) se digirió con las enzimas de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. El constructo número 1190 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-160. También incorpora un constructo génico para la coexpresión del supresor de silenciamiento de TBSV P19 bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de la alfalfa. La cadena principal es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia desde el límite izquierdo al derecho del ADN-t se presenta en la Figura 11C (SEQ ID NO: 41). El constructo resultante recibió el número 1178 (Figura H2, SEQ ID NO: H2). La secuencia de aminoácidos de Vp4 de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A se presenta en la Figura 9E (SEQ ID NO: 33). Una representación del plásmido 1178 se presenta en la Figura 14C.
9. 2X35S/CPMV-160/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (Constructo número 1199)
Se clonó una secuencia optimizada que codifica VP7 con una versión truncada del péptido señal nativo de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-160/n Os en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter con el uso del siguiente método basado en PCR. Se amplificó un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP7 con el uso de los cebadores IF(C160)-TrSP+Rtx_VP7(opt).c (Figura 15A, SEQ ID NO: 52) e IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (Figura 10B, SEQ ID NO: 35), con el uso de la secuencia optimizada del gen de VP7 (correspondiente a nt 88-891 de la Figura 10C, SEQ ID NO: 36) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP7 (número de acceso de Genbank AEX30682) se sometió a traducción inversa y se optimizó para el uso de codones en humanos, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-160/NOS con el uso del sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). El constructo número 1190 (Figura 11B, SEQ ID NO: 40) se digirió con las enzimas de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. El constructo número 1190 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-160. También incorpora un constructo génico para la coexpresión del supresor de silenciamiento de TBSV P19 bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de la alfalfa. La cadena principal es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia desde el límite izquierdo al derecho del ADN-t se presenta en la Figura 11C (SEQ ID NO: 41). El constructo resultante recibió el número 1199 (Figura 15B, SEQ ID NO: 53). La secuencia de aminoácidos de VP7 con péptido señal truncado de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A se presenta en la Figura 10E (SEQ ID NO: 38). Una representación del plásmido 1199 se presenta en la Figura 15C.
10. El constructo génico doble para la expresión de VP6 y VP2 bajo el casete de expresión CPMV-HT (constructo número 1708)
Se ensambló un vector único para la coexpresión de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A y de VP2 de la cepa WA de Rotavirus A bajo el control del sistema de expresión CPMV-HT con el uso del siguiente método basado en enzimas de restricción/ligasas. El ADN del plásmido donante (constructo número 1710; 2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS) (Figura 7F, SEQ ID NO: 23) se digirió con las enzimas de restricción AvrII (sitio ubicado antes del promotor 2X35S) y AscI (sitio ubicado después del terminador NOS) y el fragmento correspondiente al casete de expresión 2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS se purificó en gel. Este fragmento se insertó después en el constructo aceptor número 1713 (2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS) (Figura 8D, SEQ ID NO: 28) linealizado con el uso de las enzimas de restricción XbaI y AscI (ambos sitios se ubican después del terminador NOS del casete de expresión de VP6). El constructo resultante recibió el número 1708. Una representación del plásmido 1708 se presenta en la Figura 16.
11. Constructo génico doble para la expresión de VP7 y VP4 bajo el casete de expresión CPMV-HT (constructo número 1719)
Se ensambló un vector único para la coexpresión de VP7 con una versión truncada del péptido señal nativo de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A y VP4 de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A bajo el control del sistema de expresión CPMV-HT con el uso del siguiente método basado en enzimas de restricción/ligasas. El ADN del plásmido donante (constructo número 1730; 2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS) (Figura 9D, SEQ ID NO: 32) se digirió con las enzimas de restricción AvrII (sitio ubicado antes del promotor 2X35S) y AscI (sitio ubicado después del terminador NOS) y el fragmento correspondiente al casete de expresión 2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS se purificó en gel. Este fragmento se insertó después en el constructo aceptor número 1734 (2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS) (Figura 10D, SEQ ID NO: 37) linealizado con el uso de las enzimas de restricción XbaI y AscI (ambos sitios se ubican después del terminador NOS del casete de expresión de VP7). El constructo resultante recibió el número 1719. Una representación del plásmido 1719 se presenta en la Figura 17.
12. Constructo génico doble para la expresión de VP6 y VP2 bajo el casete de expresión CPMV-160 (constructo número 2400)
Se ensambló un vector único para la coexpresión de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A y VP2 de la cepa WA de Rotavirus A bajo el control del sistema de expresión CPMV-160 con el uso del siguiente método basado en enzimas de restricción/ligasas. El ADN del plásmido donante (constructo número 1108; 2X35S/CPMV-160/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS) (Figura 12D, SEQ ID NO: 47) se digirió con las enzimas de restricción AvrII (sitio ubicado antes del promotor 2X35S) y AscI (sitio ubicado después del terminador NOS) y el fragmento correspondiente al casete de expresión 2X35S/CPMV-160/ RVA(WA) VP2(opt) se purificó en gel. Este fragmento se insertó después en el constructo aceptor número 1128 (2X35S/CPMV-160/RVA(WA) VP6(opt)/NOS) (Figura 13B, SEQ ID NO: 49) linealizado con el uso de las enzimas de restricción XbaI y AscI (ambos sitios se ubican después del terminador NOS del casete de expresión VP6). El constructo resultante recibió el número 2400. Una representación del plásmido 2400 se presenta en la Figura 18.
13. Constructo génico doble para la expresión de VP7 y VP4 bajo el casete de expresión CPMV-160 (constructo número 2408)
Se ensambló un vector único para la coexpresión de VP7 con una versión truncada del péptido señal nativo de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A y VP4 de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A bajo el control del sistema de expresión Cp MV-160 con el uso del siguiente método basado en enzimas de restricción/ligasas. El ADN del plásmido donante (constructo número 1178; 2X35S/CPMV-160/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS) (Figura 14B, SEQ ID NO: 51) se digirió con las enzimas de restricción AvrII (sitio ubicado antes del promotor 2X35S) y AscI (sitio ubicado después del terminador NOS) y el fragmento correspondiente al casete de expresión 2X35S/CPMV-160/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS se purificó en gel. Este fragmento se insertó después en el constructo aceptor número 1199 (2X35S/CPMV-160/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS) (Figura 15B, SEQ ID NO: 53) linealizado con el uso de las enzimas de restricción XbaI y AscI (ambos sitios se ubican después del terminador NOS del casete de expresión de VP7). El constructo resultante recibió el número 2408. Una representación del plásmido 2408 se presenta en la Figura 19.
14. Constructo génico cuádruple para la expresión de VP7, VP4, VP6 y VP2 bajo el casete de expresión CPMV-HT (constructo número 1769)
Se ensambló un vector único para la coexpresión de VP7 con una versión truncada del péptido señal nativo de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A, VP4 de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A, VP6 de la cepa WA de Rotavirus A y VP2 de la cepa WA de Rotavirus A bajo el control del sistema de expresión CPMV-HT con el uso del siguiente método basado en enzimas de restricción/ligasas. El ADN del plásmido donante (constructo número 1730; 2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS) (Figura 9D, SEQ ID NO: 32) se digirió con las enzimas de restricción AvrII (sitio ubicado antes del promotor 2X35S) y AscI (sitio ubicado después del terminador NOS) y el fragmento correspondiente al casete de expresión 2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/ NOS se purificó en gel. Este fragmento se insertó después en el constructo aceptor número 1734 (2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS) (Figura 10D, SEQ ID NO: 37) linealizado con el uso de las enzimas de restricción XbaI y AscI (ambos sitios se ubican después del terminador NOS del casete de expresión de VP7). La ligación de los extremos cohesivos producidos por AvrII y XbaI destruyó los sitios de restricción originales produciendo un vector aceptor temporal con los mismos sitios únicos de las enzimas de restricción XbaI y AscI al final del terminador NOS de los segundos casetes de expresión (de izquierda a derecha del ADN-T). VP6 (constructo número 1713; Figura 8D, SEQ ID NO: 28) y VP2 (constructo número 1710; Figura 7F, SEQ ID NO: 23) expresadas bajo el sistema de expresión CPMV-HT se insertaron después secuencialmente en el vector aceptor temporal resultante con el uso de la misma estrategia de digestión para dar el constructo VP7/VP4/VP6/VP2 final. El constructo resultante recibió el número 1769. Una representación del plásmido 1769 se presenta en la Figura 20.
15. Constructo génico quíntuple para la expresión de VP4, VP7, NSP4, VP6 y VP2 bajo el casete de expresión CPMV-HT (constructo número 2441)
Se ensamblaron un vector único para la coexpresión de VP4 de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A, VP7 con una versión truncada del péptido señal nativo de la cepa vaccine USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de Rotavirus A, NSP4 de la cepa WA de Rotavirus A, VP6 de la cepa WA de Rotavirus A y VP2 de la cepa WA de Rotavirus A bajo el control del sistema de expresión CPMV-HT con el uso del siguiente método basado en enzimas de restricción/ligasas. El ADN de plásmido donante (constructo número 1734; 2X35S/CPMV-HT/ TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/ NOS) (Figura 10D, SEQ ID NO: 37) se digirió con las enzimas de restricción AvrII (sitio ubicado antes del promotor 2X35S) y AscI (sitio ubicado después del terminador NOS) y el fragmento correspondiente al casete de expresión 2X35S/CPMV-HT/ TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/ NOS se purificó en gel. Este fragmento se insertó después en el constructo aceptor número 1730 (2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS)(Figure 9D, SEQ ID NO: 32) linealizado con el uso de las enzimas de restricción XbaI y AscI (ambos sitios se ubican después del terminador NOS del casete de expresión VP4). La ligación de los extremos cohesivos producidos por AvrII y XbaI destruyó los sitios de restricción originales produciendo un vector aceptor temporal con los mismos sitios únicos de las enzimas de restricción XbaI y AscI al final del terminador NOS de los segundos casetes de expresión (de izquierda a derecha del ADN-T). NSP4 (constructo número 1706; Figura 11D, SEQ ID NO: 42), VP6 (constructo número 1713; Figura 8D, SEQ ID NO: 28) y VP2 (constructo número 1710; Figura 7F, SEQ ID NO: 23) expresados bajo el sistema de expresión CPMV-HT se insertaron después secuencialmente en el vector aceptor temporal resultante con el uso de la misma estrategia de digestión para dar el constructo VP4/VP7/NSP4/VP6/VP2 final. El constructo resultante recibió el número 2441. Una representación del plásmido 2441 se presenta en la Figura 21.
Ejemplo 2 La coexpresión de NSP4 aumenta la incorporación de VP4 y VP4 en las RLP
Los antígenos estructurales de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7 se coexpresaron transitoriamente en plantas de Nicotiana benthamiana en presencia o ausencia de un constructo de expresión de NSP4 con el uso de agroinfiltración como se describió en el ejemplo 1. Los extractos brutos de proteína de plantas productoras de RLP contienen grandes cantidades de proteína huésped como se muestra por el patrón de bandas en la SDS-PAGE teñida con Coomassie (Figura 2B, carga). Las partículas similares a rotavirus pueden separarse de las proteínas vegetales por ultracentrifugación en un gradiente de densidad de iodixanol. Después de la centrifugación, el análisis de las fracciones del gradiente de densidad de iodixanol mostró que las RLP migraron a la fracción de iodixanol al 35 % (F2 y F3 en la Figura 2B) mientras que la mayoría de las proteínas del huésped permanecieron en las fracciones de iodixanol al 25­ 30 % (F4-F10 en la Figura 2B). Las RLP de plantas que coexpresan antígenos estructurales de rotavirus se purificaron en gradientes de densidad de iodixanol y el análisis de las fracciones que contienen RLP (F2 y F3) mostró que las RLP pueden producirse de manera eficiente, independientemente del número de genes por constructo como se muestra en la figura 3A con constructos génicos simples, dobles y cuádruples. Los resultados obtenidos también mostraron que la coexpresión de NSP4 redujo la expresión de RLP (comparar las fracciones bajo -NSP4 y NSP4 en la figura 3A). Debe tenerse en cuenta que se cargaron volúmenes iguales de cada fracción en el gel para comparar el contenido de RLP por volumen.
La fracción 2 que contenía RLP de los mismos experimentos se analizó por transferencia Western para evaluar el impacto de la coexpresión de NSP4 en la incorporación de VP4 y VP7. Para esa comparación, se cargaron cantidades iguales de RLPS en el gel. Los resultados de la transferencia Western obtenidos mostraron señales más fuertes para VP4 y VP7 en las RLP producidas en presencia de NSP4 (Figura 3B, comparar carriles bajo -NSP4 y NSP4). Estos resultados indican claramente que la coexpresión de NSP4 aumentó la incorporación de VP4 y VP7 en la superficie de las RLP.
Los genes que codifican los cuatro antígenos de rotavirus y la proteína no estructural NSP4 se clonaron en CPMV-HT y CPMV160 para la comparación de la expresión. Los estudios de coexpresión seguidos de extracción y purificación por ultracentrifugación en gradiente de densidad de iodixanol mostraron que ambas expresiones producían RLP de manera eficiente, como lo demuestra la cantidad de VP6 en las fracciones 2 y 3 del gradiente (Figura 4A), y la cantidad de VP4 y VP7 en la fracción 2 de los mismos tratamientos (Figura 4B). Este estudio también mostró que, cuando se usa el sistema CPMV-HT para la expresión de las proteínas de rotavirus, los constructos génicos simples produjeron tanto las RLP como los constructos génicos dobles (Figura 4A, panel izquierdo frente a panel central) y dieron como resultado una cobertura similar con los antígenos de superficie, VP4 y VP7 (Figura 4B, panel izquierdo frente al panel central).
Se ha evaluado un constructo génico quíntuple (que comprende 5 genes en el mismo plásmido) para la coexpresión de los cuatro antígenos estructurales con NSP4. Como se muestra en la figura 5, el uso del constructo génico quíntuple dio como resultado un nivel de producción de RLP similar al del uso de un constructo génico cuádruple con el gen de NSP4 en un plásmido separado (Figura 5, panel superior), así como también niveles comparables de incorporación de VP4 y VP7 (Figura 5, panel inferior).
Transformación de Agrobacterium
Todos los plásmidos se usaron para transformar Agrobacterium tumefaciens (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, Estados Unidos) por electroporación (Mattanovich y otros, 1989, Nucleic Acid Res. 17:6747) alternativamente, puede usarse choque térmico con el uso de células competentes preparadas con CaCl2 (XU y otros, 2008, Plant Methods 4). La integridad de los plásmidos en las cepas de A. tumefaciens creadas se confirmó por mapeo de restricción.
Preparación de biomasa, inóculo, agroinfiltración y cosecha vegetal
Las plantas de Nicotiana benthamiana se cultivaron a partir de semillas en bandejas llenas con un sustrato de turba comercial. Se permitió que las plantas crecieran en el invernadero con un fotoperiodo de 16/8 y un régimen de temperaturas de 25 °C de día/20 °C de noche. Tres semanas después de la siembra, se escogieron plántulas individuales, se trasplantaron en macetas y se dejaron crecer en el invernadero durante tres semanas adicionales en las mismas condiciones ambientales.
Las agrobacterias transfectadas con cada constructo se cultivaron en un medio LB de origen vegetal y se suplementaron con ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) 10 mM y 50 pg/ml de kanamicina pH 5,6 hasta que alcanzaron una DO600 entre 0,6 y 2,5. Se mezclaron suspensiones de Agrobacterium para alcanzar la relación apropiada para cada constructo y se llevaron a una DO6002,5X con medio de infiltración (MgCl2 10 mM y MES 10 mM pH 5,6). Las suspensiones de A. tumefaciens se almacenaron durante la noche a 4 °C. El día de la infiltración, los lotes de cultivo se diluyeron con medio de infiltración y se permitió que se calentaran antes de su uso. Las plantas completas de N. benthamiana se colocaron al revés en la suspensión bacteriana en un tanque de acero inoxidable

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un método de producción de una partícula similar a rotavirus (RLP) en una planta, porción de una planta o célula vegetal que comprende:
    a-i)proporcionar la planta, porción de la planta o célula vegetal que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de rotavirus, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de rotavirus, una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína de rotavirus, y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en la planta, porción de la planta o célula vegetal; la primera secuencia de nucleótidos codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP6, la tercera secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP2 y la cuarta secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP7;
    o
    a-ii) introducir en la planta, porción de la planta o célula vegetal mediante la transformación del uno o más ácidos nucleicos que comprenden la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, y la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la cuarta proteína de rotavirus, donde la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en la planta, porción de la planta o célula vegetal; y la primera secuencia de nucleótidos codifica la proteína de rotavirus NSP4, la segunda secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP6, la tercera secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP2 y la cuarta secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP7;
    e
    b) incubar la planta, porción de la planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos, de manera que cada una de NSP4, VP6, VP2 y VP7 se expresen, produciendo de este modo la RLP, la RLP comprende proteínas de rotavirus, las proteínas de rotavirus consisten en proteínas estructurales de rotavirus;
    y opcionalmente
    c) cosechar la planta, porción de la planta o célula vegetal, y
    d) purificar las RLP de la planta, porción de la planta o célula vegetal, en donde las RLP tienen un tamaño que varía de 70-100 nm.
    El método de la reivindicación 1, en donde, el uno o más ácidos nucleicos comprenden además una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína de rotavirus, la quinta secuencia de nucleótidos codifica la proteína estructural de rotavirus VP4, donde la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a una o más regiones reguladoras activas en la planta, porción de la planta o célula vegetal; y en donde cada una de VP2, VP4, VP6, VP7 y NSP4 se expresan a partir del uno o más ácidos nucleicos.
    El método de la reivindicación 2, en donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden:
    i) un ácido nucleico que comprende la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus;
    ii) dos ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende la segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus;
    iii) dos ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera y segunda secuencias de nucleótidos que codifican la primera y segunda proteínas de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende la tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus;
    iv) tres ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera y segunda secuencias de nucleótidos que codifican la primera y segunda proteínas de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifican la tercera y cuarta proteína de rotavirus, y un tercer ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus;
    v) tres ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, y un tercer ácido nucleico que comprende la tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus;
    vi) cuatro ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, y un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la cuarta y quinta proteínas de rotavirus;
    o
    vii) cinco ácidos nucleicos, un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la cuarta proteína de rotavirus, y un quinto ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus.
    El método de la reivindicación 1, reivindicación 2 o reivindicación 3, en donde la planta es Nicotiana benthamiana.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la una o más secuencias de nucleótidos están unidas operativamente a uno o más potenciadores de la expresión, CPMV HT, CPMV 160, CPMV 160+ o CPMV HT+.
    El método de la reivindicación 2, en donde en la etapa de introducir (etapa a-ii), el uno o más ácidos nucleicos comprenden:
    A) dos ácidos nucleicos:
    i) un primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende la segunda, tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus; o
    ii) un primer ácido nucleico que comprende la primera y segunda secuencias de nucleótidos que codifican la primera y segunda proteínas de rotavirus, y un segundo ácido nucleico que comprende la tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican una tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, y
    en donde la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto a la cantidad del segundo ácido nucleico que se introduce en la planta, porción de la planta o célula vegetal está entre 1:0,8 y 1:2;
    B) tres ácidos nucleicos:
    i) el primer ácido nucleico que comprende la primera y segunda secuencias de nucleótidos que codifican la primera y segunda proteínas de rotavirus, el segundo ácido nucleico que comprende la tercera y cuarta secuencias de nucleótidos que codifican la tercera y cuarta proteína de rotavirus, y un tercer ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína del rotavirus, o
    ii) el primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, el segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, y el tercer ácido nucleico que comprende la tercera, cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus, en donde la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto a la cantidad del segundo ácido nucleico y a la cantidad del tercer ácido nucleico que se introduce en la planta, porción de la planta o célula vegetal es de 1:1:1;
    C) cuatro ácidos nucleicos,
    el primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus y un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta y quinta secuencias de nucleótidos que codifican la cuarta y quinta proteínas de rotavirus, en donde la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto a la cantidad del segundo ácido nucleico, a la cantidad del tercer ácido nucleico y a la cantidad del cuarto ácido nucleico que se introduce en la planta, porción de la planta o célula vegetal es de 1:1:1:1: o
    D) cinco ácidos nucleicos,
    el primer ácido nucleico que comprende la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la segunda proteína de rotavirus, un tercer ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos que codifica la tercera proteína de rotavirus, un cuarto ácido nucleico que comprende la cuarta secuencia de nucleótidos que codifica la cuarta proteína de rotavirus, y un quinto ácido nucleico que comprende la quinta secuencia de nucleótidos que codifica la quinta proteína de rotavirus, y la relación de una cantidad del primer ácido nucleico con respecto a la cantidad del segundo ácido nucleico, a la cantidad del tercer ácido nucleico, a la cantidad del cuarto ácido nucleico y a la cantidad del quinto ácido nucleico que se introduce en la planta, porción de la planta o célula vegetal es de 1:1:1:1:1.
    7. El método de la reivindicación 6, en donde la primera proteína de rotavirus es NSP4, y la segunda, tercera, cuarta y quinta proteínas de rotavirus son VP2, VP4, VP6 y VP7.
    8. Uso de la proteína de rotavirus NSP4 para aumentar la incorporación de la proteína estructural de rotavirus VP4, VP7 o tanto VP4 como VP7 en la superficie de una partícula similar a rotavirus (RLP) producida en una planta, porción de una planta o células vegetales, la RLP comprende proteínas de rotavirus, las proteínas de rotavirus consisten en proteínas estructurales de rotavirus, en donde las proteínas estructurales de rotavirus comprenden VP2, VP6 y VP7 o VP2, VP6, VP4 y VP7.
    9. El método de la reivindicación 1, en donde las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas estructurales de rotavirus VP2, VP6 y VP7 se obtienen a partir de una cepa de rotavirus que tiene un genotipo seleccionado de uno de G1 y G27.
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