ES2614527T3 - Sistema de expresión en plantas - Google Patents

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Abstract

Un sistema de expresión vegetal que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que comprende una región reguladora, ligada operativamente a uno o más de un potenciador de comovirus, una secuencia nucleotídica que codifica una hemaglutinina de influenza, en el que la hemaglutinina de influenza se selecciona entre hemaglutinina de influenza tipo B y hemaglutinina del subtipo H3 de influenza tipo A y uno o más de un elemento de amplificación de geminivirus, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una replicasa de geminivirus.

Description

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Sistema de expresion en plantas.
La presente invencion se refiere a la expresion de protemas de interes en las plantas. La presente invencion tambien proporciona metodos y composiciones para la produccion de protemas de interes en las plantas.
La influenza es la principal causa de muerte en humanos debido a un virus respiratorio. Los smtomas comunes incluyen fiebre, dolor de garganta, falta de aliento, y dolor muscular, entre otros. Durante la temporada de gripe, el virus de la influenza infecta al 10-20 % de la poblacion mundial, lo que conduce a 250-500.000 muertes anualmente. Las pandemias de influenza normalmente son causadas por los virus de la influenza altamente transmisibles y virulentos, y pueden conducir a niveles elevados de enfermedad y muerte en el mundo. La aparicion de nuevos subtipos de influenza A dio como resultado 4 pandemias importantes en el siglo 20, dando como resultado una mortalidad y trastorno economico significativos. Existe una creciente preocupacion de que el virus pueda llegar a ser altamente infeccioso para los seres humanos. El principal problema para la salud humana es el hecho de que los virus de la influenza son antigenicamente inestables, es decir, mutan rapidamente.
Los virus de influenza se clasifican en lo tipos A, B o C, basados en las nucleoprotemas y antfgenos de protema de matriz presentes. Los virus de la influenza tipo A se pueden dividir adicionalmente en subtipos de acuerdo con la combinacion de glicoprotemas de superficie de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) presentadas. La HA gobierna la capacidad del virus para unirse a y atravesar la celula huesped. La NA elimina los residuos de acido sialico terminal de cadenas de glicano sobre celula huesped y protemas de superficie vmca, que previene agregacion vmca y facilita la movilidad del virus.
El metodo actual para combatir la influenza en seres humanos es por medio de vacunacion anual. Cada ano, la Organizacion Mundial de la Salud selecciona ciertas cepas para su inclusion en la vacuna de la gripe anual, que se produce en huevos fertilizados. Sin embargo, el numero de dosis de vacuna producidas cada ano no es suficiente para vacuna a toda la poblacion mundial. Ademas, este metodo de produccion se enfrenta a varios inconvenientes posibles, incluyendo la posibilidad de contaminacion debido al uso de virus enteros, rendimientos variables dependientes de la cepa vmca, extensos requisitos de planificacion para obtener los huevos, riesgos de contaminacion debido a productos qmmicos usados en la purificacion, y largos tiempos de produccion. Ademas, las personas hipersensibles a las protemas del huevo pueden no ser aptas para recibir vacunas producidas a traves de este metodo.
Se han investigado metodos de produccion alternativos. Por ejemplo, el virus de la influenza se ha producido en cultivos celulares de mairnferos de, por ejemplo, en celulas MDCk o PERC.6, o similares. Otro enfoque es genetica inversa, en la cual los virus se producen por transformacion celular con genes virales. Estos metodos, sin embargo, tambien requieren el uso de virus completo, asf como metodos de elaboracion y entornos de cultivo espedficos.
Con el fin de proteger a la poblacion mundial de la influenza y para evitar futuras pandemias, los fabricantes de vacunas necesitaran desarrollar metodos rapidos y eficaces para producir dosis de vacunas. El uso actual de huevos fertilizados para producir vacunas es insuficiente e implica un proceso lento. Las tecnologfas recombinantes ofrecen enfoques prometedores para la produccion de antfgenos de influenza. Sin embargo, la produccion de hemaglutinina se ha limitado a la protema asociada a la membrana, que implica complejos procesos de extraccion con bajos rendimientos, o protemas solubles deficientemente inmunogenas.
Las plantas ofrecen un gran potencial como sistemas de produccion de protemas recombinantes. Un enfoque para producir protemas extranas en plantas es generar lmeas de plantas transgenicas estables. Sin embargo, este es un proceso que requiere mucho tiempo y trabajo. Una alternativa a las plantas transgenicas es el uso de vectores de expresion basados en virus vegetales. Los vectores basados en virus vegetales permiten una expresion transitoria rapida y de alto nivel de protemas en plantas.
Se han modificado muchos virus vegetales diferentes para funcionar como vectores de expresion. Por ejemplo, se ha utilizado el virus del mosaico del caupf (CPMV) para producir una diversidad de protemas (vease, por ejemplo, los documentos WO2007/135480; WO2009/087391; Sainsbury F. y col., 2008, Plant Physiology; 148: 121-1218; Sainsbury F. y col., 2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. y col., 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682-693).
Se ha propuesto un sistema basado en plantas derivado de geminivirus para la produccion de partmulas pseudovmicas (Huang y col., 2009, Biotechnology and Bioengineering, 103: 706-714). La co-administracion del vector derivado del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) y el vector que suministra Rep/RepA por
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agroinfiitracion de hojas de Nicotians benthamiana dio como resultado la amplificacion de replicon y la produccion de protefnas.
Los sistemas de expresion basados en plantas tienen preferiblemente una serie de propiedades tales como, por ejemplo, que contienen sitios de clonacion convenientes para genes de interes, pueden infectar facilmente plantas de una manera rentable y/o pueden causar una infeccion local/sistemica eficiente de las plantas inoculadas. Ademas, la infeccion debe proporcionar un buen rendimiento de material proteico util. A pesar de los avances logrados en la modificacion de virus para servir como sistemas de expresion en plantas, todavfa hay margen de mejora.
La presente invencion se refiere a la expresion de protefnas de interes en las plantas. La presente invencion tambien proporciona metodos y composiciones para la produccion de protefnas de interes en las plantas. Tambien se proporcionan acidos nucleicos y sistemas de expresion para producir protefnas de interes en las plantas. Los sistemas de expresion comprenden un casete de expresion basado en comovirus y un elemento de amplificacion basado en geminivirus. Tambien se proporcionan celulas vegetales, tejidos vegetales, plantas enteras, acidos nucleicos que comprenden construcciones genicas que codifican la protefna de interes, y metodos de expresion de protefnas de interes en las plantas.
La presente divulgacion tambien proporciona un sistema de expresion para expresar la protefna hemaglutinina en las plantas.
La presente invencion proporciona adicionalmente un sistema de expresion vegetal (A) que comprende una primera secuencia de acido nucleico que comprende una region reguladora, ligada operativamente a uno o mas de un potenciador de comovirus, una secuencia nucleotfdica de interes, y uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus, y un segundo acido nucleico que codifica una replicasa de geminivirus. La region reguladora puede seleccionarse entre un promotor de plastocianina, un promotor CaMV 35S, un promotor 2x CaMV35S, un promotor CAS, un promotor RbcS, un promotor Ubi, o un promotor de actina. Ademas, el uno o mas de un potenciador de comovirus puede ser una 5' UTR de comovirus, por ejemplo, una 5' UTR del virus del mosaico del caupf (CPMV), o la 5'UTR de CPMV puede comprender la secuencia nucleotfdica de la SEQ ID NO: 23. Ademas, el uno o mas de un potenciador de comovirus puede comprender una 3' UTR de comovirus, por ejemplo, una 3' UTR del virus del mosaico del caupf, y una 3' UTR de plastocianina. Ademas, el uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus puede seleccionarse entre una region intergenica larga del virus del enanismo amarillo de la judfa (BeYDV LIR), y una region intergenica corta del BeYDV (BeYDV SIR).
La presente invencion tambien proporciona el sistema de expresion vegetal (A) como se ha descrito anteriormente, en el que la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico puede situarse en la misma molecula de acido nucleico, o pueden situarse en diferentes moleculas de ADN.
El sistema de expresion vegetal (A), como se ha definido anteriormente, puede comprender adicionalmente una tercera secuencia de acido nucleico, codificando la tercera secuencia de acido nucleico un supresor de silenciamiento. El supresor de silenciamiento puede seleccionarse entre el grupo HcPro y p19. La tercera secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en la misma molecula, o la tercera secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en diferentes moleculas. El sistema de expresion vegetal tambien puede comprender una cuarta secuencia de acido nucleico, codificando la cuarta secuencia de acido nucleico una protefna chaperona. La protefna chaperona puede seleccionarse entre el grupo Hsp40 y Hsp70. La cuarta secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en la misma molecula, o la cuarta secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en diferentes moleculas de ADN.
La presente invencion proporciona el sistema de expresion vegetal (A) como se ha definido anteriormente, en el que la secuencia nucleotfdica de interes codifica una hemaglutinina de influenza. La hemaglutinina de influenza puede comprender una secuencia de peptido senal nativo, o un peptido senal no nativo. Ademas, la hemaglutinina de influenza se selecciona entre hemaglutinina de influenza tipo B y hemaglutinina del subtipo H3 de influenza tipo A.
La presente invencion tambien pertenece a un sistema de expresion vegetal (B) que comprende una secuencia de acido nucleico que comprende una secuencia reguladora ligada operativamente a uno o mas de un potenciador de comovirus; una secuencia nucleotfdica de interes; uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus, y una secuencia de acido nucleico que codifica una protefna replicasa de geminivirus. La region reguladora puede seleccionarse entre un promotor de plastocianina, un promotor CaMV 35S, un promotor 2x CaMV35S, un promotor CAS, un promotor RbcS, un promotor Ubi, o un promotor de actina. Ademas, el uno o mas de un potenciador de comovirus puede ser una 5' UTR de comovirus, por ejemplo, una 5' UTR del virus del mosaico del caupf (CPMV), o la 5'UTR de CPMV puede comprender la secuencia nucleotfdica de la SEQ ID NO: 23. Ademas, el uno o mas de un
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potenciador de comovirus pueden comprender una 3' UTR de comovirus, por ejemplo, una 3' UTR del virus del mosaico del caupf, y una 3' UTR de plastocianina. Ademas, el uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus pueden seleccionarse entre una region intergenica larga del virus del enanismo amarillo de la judfa (BeYDV LIR), y una region intergenica corta del BeYDV (BeYDV SIR).
El sistema de expresion vegetal (B) como se ha definido anteriormente, puede comprender adicionalmente una segunda secuencia de acido nucleico, codificando la segunda secuencia de acido nucleico un supresor de silenciamiento. El supresor de silenciamiento puede seleccionarse entre el grupo HcPro y p19. La segunda secuencia de acido nucleico y la secuencia de acido nucleico (que comprende la secuencia reguladora ligada operativamente a uno o mas de un potenciador de comovirus; la secuencia nucleotidica de interes; uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus, y la secuencia de acido nucleico que codifica una protema replicasa de geminivirus) pueden situarse en la misma molecula, o la segunda secuencia de acido nucleico y la secuencia de acido nucleico puede situarse en diferentes moleculas. El sistema de expresion vegetal tambien puede comprender una tercera secuencia de acido nucleico, la tercera secuencia de acido nucleico que codifica una protema chaperona. La protema chaperona puede seleccionarse entre el grupo Hsp40 y Hsp70. La tercera secuencia de acido nucleico y la secuencia de acido nucleico (que comprende la secuencia reguladora ligada operativamente a uno o mas de un potenciador de comovirus; la secuencia nucleotfdica de interes; uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus, y la secuencia de acido nucleico que codifica una protema replicasa de geminivirus) pueden situarse en la misma molecula, o la tercera secuencia de acido nucleico y la secuencia de acido nucleico pueden situarse en diferentes moleculas de ADN.
La presente invencion proporciona el sistema de expresion vegetal (B) como se ha definido anteriormente, en el que la secuencia nucleotidica de interes codifica una hemaglutinina de influenza. La hemaglutinina de influenza puede comprender una secuencia de peptido senal nativo, o un peptido senal no nativo. Ademas, la hemaglutinina de influenza se selecciona entre hemaglutinina de influenza tipo B y hemaglutinina del subtipo H3 de influenza tipo A.
La presente invencion tambien proporciona un metodo (A) para producir una partmula tipo virus de la influenza (VLP) en una planta o en una porcion de una planta, comprendiendo el metodo,
- introducir en la planta o en la porcion de una planta el sistema de expresion vegetal que comprende una primera secuencia de acido nucleico que comprende una region reguladora, ligada operativamente a uno o mas de un potenciador de comovirus, una secuencia nucleotidica de interes, codificando la secuencia nucleotidica de interes una hemaglutinina de influenza, y uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus,
- un segundo acido nucleico que codifica una replicasa de geminivirus, y
- incubar la planta o la porcion de una planta en condiciones que permiten la expresion de la secuencia nucleotidica que codifica la hemaglutinina de influenza, produciendo de esta manera la VLP de influenza.
La presente invencion tambien pertenece al metodo (A) como se ha descrito anteriormente, en el que, en la etapa de introduccion, la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico pueden situarse en la misma molecula, o la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico pueden situarse en diferentes moleculas. Si la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico se situan en diferentes moleculas, entonces las diferentes moleculas pueden introducirse en la planta o en la porcion de una planta al mismo tiempo, o las diferentes moleculas pueden introducirse en la planta o en la porcion de una planta en momentos diferentes, por ejemplo, por infiltracion sucesiva.
La presente invencion tambien proporciona el metodo (A) como se ha descrito anteriormente, en el que, en la etapa de incubacion, la expresion de la secuencia nucleotfdica que codifica la hemaglutinina de influenza es una expresion transitoria. Ademas, el metodo puede incluir una etapa de recolectar la planta o la porcion de una planta, obteniendo de esta manera una planta recolectada o porcion de una planta que contiene la VLP de influenza. El metodo puede comprender adicionalmente una etapa de aislamiento de la VLP de influenza de la planta recolectada o porcion de una planta que contiene la VLP de influenza, obteniendo de esta manera una VLP aislada de influenza.
La presente invencion proporciona el metodo (A) como se ha descrito anteriormente, en el que en la etapa de introduccion, el sistema de expresion vegetal comprende adicionalmente una tercera secuencia de acido nucleico, codificando la tercera secuencia de acido nucleico un supresor de la expresion de silenciamiento. La tercera secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en la misma molecula, o la tercera secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en diferentes moleculas. Si la tercera secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico se situan en diferentes moleculas, entonces las diferentes moleculas pueden introducirse en la planta o en la porcion de una planta al mismo tiempo. Ademas, en la etapa de introduccion, el sistema de expresion vegetal puede comprender adicionalmente una cuarta secuencia de acido nucleico, codificando la cuarta secuencia de acido nucleico una protema chaperona. La cuarta secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en la misma molecula, o la cuarta secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden
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situarse en diferentes moleculas. Si la cuarta secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico se situan en diferentes moleculas, entonces las diferentes moleculas pueden introducirse en la planta o en la porcion de una planta al mismo tiempo.
La presente invencion tambien proporciona un metodo (B) para producir una protefna de interes en una planta o en una porcion de una planta, comprendiendo el metodo,
- introducir en la planta o en la porcion de una planta el sistema de expresion vegetal que comprende una primera secuencia de acido nucleico que comprende una region reguladora, ligada operativamente a uno o mas de un potenciador de comovirus, una secuencia nucleotfdica de interes, y uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus, y un segundo acido nucleico que codifica una replicasa de geminivirus, y
- incubar la planta o la porcion de una planta en condiciones que permiten la expresion de la secuencia nucleotfdica que codifica la protefna de interes, produciendo de esta manera la protefna de interes.
La presente invencion tambien pertenece al metodo (B) como se ha descrito anteriormente, en el que, en la etapa de introduccion, la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico pueden situarse en la misma molecula, o la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico pueden situarse en diferentes moleculas. Si la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico se situan en diferentes moleculas, entonces las diferentes moleculas pueden introducirse en la planta o en la porcion de una planta al mismo tiempo.
La presente invencion tambien proporciona el metodo (B) como se ha descrito anteriormente, en el que, en la etapa de incubacion, la expresion de la secuencia nucleotfdica que codifica la hemaglutinina de influenza es una expresion transitoria. Ademas, el metodo puede incluir una etapa de recolectar la planta o la porcion de una planta, obteniendo de esta manera una planta recolectada o porcion de una planta que contiene la protefna de interes. El metodo puede comprender adicionalmente una etapa de aislamiento de la protefna de interes de la planta recolectada o porcion de una planta que contiene la protefna de interes, obteniendo de esta manera una protefna aislada de interes.
La presente invencion proporciona el metodo (B) como se ha descrito anteriormente, en el que, en la etapa de introduccion, el sistema de expresion vegetal comprende adicionalmente una tercera secuencia de acido nucleico, codificando la tercera secuencia de acido nucleico un supresor de la expresion de silenciamiento. La tercera secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en la misma molecula, o la tercera secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en diferentes moleculas. Si la tercera secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico se situan en diferentes moleculas, entonces las diferentes moleculas pueden introducirse en la planta o en la porcion de una planta al mismo tiempo. Ademas, en la etapa de introduccion, el sistema de expresion vegetal puede comprender adicionalmente una cuarta secuencia de acido nucleico, codificando la cuarta secuencia de acido nucleico una protefna chaperona. La cuarta secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en la misma molecula, o la cuarta secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico pueden situarse en diferentes moleculas. Si la cuarta secuencia de acido nucleico y la primera secuencia de acido nucleico se situan en diferentes moleculas, entonces las diferentes moleculas pueden introducirse en la planta o en la porcion de una planta al mismo tiempo.
Este resumen no describe necesariamente todas las caracterfsticas de la invencion. Otros aspectos, caracterfsticas y ventajas de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica tras la revision de la siguiente descripcion de realizaciones especfficas de la invencion.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Estas y otras caracterfsticas de la invencion se haran mas evidente a partir de la siguiente descripcion en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 muestra las secuencias nucleotfdicas de varias construcciones descritas en la presente invencion. La figura 1A muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 972 (SEQ ID NO: 1) que comprende una secuencia del sitio PacI (negrita; aguas arriba del promotor) al sitio AscI (negrita; inmediatamente aguas bajo del terminador NOS), e incluye HA0 de tipo salvaje de H5 A/Indonesia/5/2005 (subrayado). La figura 1B muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 560 (SEQ ID NO: 2) que comprende una secuencia del sitio PacI (negrita; aguas arriba del promotor) al sitio AscI (negrita; inmediatamente aguas bajo del terminador NOS). Peptido senal PDI (PDISP)-HAO de H1 A/California/4/2009 (subrayado). La figura 1C muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 971 (SEQ ID NO: 3), que comprende una secuencia del sitio PacI (negrita; aguas arriba del promotor) al sitio AscI (negrita; inmediatamente aguas bajo del terminador NOS). PDISP-HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007 (subrayado). La figura 1D muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 973 (SEQ ID NO: 4), que comprende una secuencia del sitio PacI (negrita; aguas arriba del promotor) al sitio AscI (negrita; inmediatamente aguas bajo del terminador NOS). PDISP-HA0 de B/Florida/4/2006 (subrayado). La figura
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1E muestra la secuencia nucleotfdica de LIR-MCS-SIR+LIR (SEQ ID NO: 9). La secuencia de la LIR (region intergenica larga)-MCS (sitio de clonacion multiple)-region intergenica corta (SIR)+LIR de la construccion 849. La figura 1F muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 853 (SEQ ID NO: 10), que comprende una secuencia del sitio AscI (negrita; aguas arriba de la LIR) al sitio PmeI (negrita; aguas debajo de la SIR+LIR). PDISP-HA0 de B/Florida/4/2006 (subrayado). La figura 1G muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 561 (SEQ ID NO: 11) que comprende una secuencia del sitio AscI (negrita; aguas arriba de la LIR) al sitio PmeI (negrita; aguas abajo de la SIR+LIR). PDISP-HA0 de H1 A/California/4/2009 (subrayado). La figura 1H muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 851 (SEQ ID NO: 12) que comprende una secuencia del sitio AscI (aguas arriba de la LIR) al sitio PmeI (aguas abajo de la SIR+LIR). PDISP-HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007 (subrayado). La figura 1I muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 852 (SEQ ID NO: 13) que comprende una secuencia del sitio AscI (aguas arriba de la LIR) al sitio PmeI (aguas abajo de la SIR+LIR). Sp nativo con HA0 de H5 A/Indonesia/05/2005 (subrayado). La figura 1J muestra la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO: 14) de la secuencia LIR-MCS-SIR-Rep//casa-LIR de la construccion 848. La figura 1K muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 475 (SEQ ID NO: 15) que comprende los nucleotidos del sitio AscI (negrita; aguas arriba de la LIR) al sitio PmeI (negrita; aguas abajo de la SIR-C1/C2-LIR). PDISP-HA0 de B/Florida/4/2006 (subrayado). La figura 1L muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 471 (SEQ ID NO: 16) que comprende los nucleotidos del sitio AscI (negrita; aguas arriba de la LIR) al sitio PmeI (negrita; aguas abajo de la SIR-C1/C2-LIR). PDISP-HA0 de H1 A/California/4/2009 (subrayado). La figura 1M muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 473 (SEQ ID NO: 17) que comprende los nucleotidos del sitio AscI (negrita; aguas arriba de la LIR) al sitio PmeI (negrita; aguas abajo de la SIR- C1/C2-LIR). PDISP-HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007 (subrayado). La figura 1N muestra la secuencia nucleotfdica del casete de expresion 474 (SEQ ID NO: 18) del sitio AscI (negrita; aguas arriba de la LIR) al sitio PmeI (negrita; aguas abajo de la SIR-C1/C2-LIR). Sp nativo con HA0 de H5 A/Indonesia/05/2005 (subrayado).
La figura 2 muestra una representacion esquematica de varias construcciones que pueden usarse para la expresion transitoria de HA en N/cot/ana bentham/ana. La figura 2A muestra una construccion esquematica para construcciones basadas en CPMV-HT para la expresion de HA (construcciones numero 971, 972, 973 y 560). La figura 2B muestra una construccion esquematica basada en CPMV-HT + BeYDV para la expresion de HA (construcciones numero 851, 852, 853 y 561). La figura 2C muestra una construccion esquematica para la construccion de la expresion de replicasa del BeYDV (construccion numero 834). La figura 2D muestra una construccion esquematica para la construccion basada en CPMV-HT + BeYDV que comprende el gen replicasa (C1/C2) bajo el control de LIR para la expresion de HA (construcciones numero 471, 473, 474 y 475).
La figura 3 muestra una comparacion de la acumulacion de HA transitoria usando el sistema de expresion basado en CPMV-HT en solitario o un sistema de expresion basado en CPMV-HT junto con el sistema de amplificacion de BeYDV. La figura 3A muestra una comparacion de la acumulacion de HAB (de la cepa B/Florida/4/2006) en plantas usando un casete de expresion basado en CPMV-HT (construccion numero 973; veanse las figuras 1D y 2A), o junto con un sistema de amplificacion de BeYDV (construcciones numero 853 y 834 (proporcionando la expresion de replicasa vfrica); veanse las figuras 1F y 2B). Se analizaron tres plantas para cada construccion (1, 2 y 3). Se cargaron veinte microgramos de protefnas para cada extracto analizado. La figura 3B muestra una comparacion de la acumulacion de H3 (de la cepa A/Brisbane/10/2007) en plantas usando un casete de expresion basado en CPMV-HT en solitario (construccion numero 971; veanse las figuras 1C y 2A) o junto con un sistema de amplificacion de BeYDV (construccion numero 851; veanse las figuras 1H y 2B). Se analizaron tres placas para cada construccion (1, 2 y 3). Se cargaron veinte microgramos o cinco microorganismos de protefnas de plantas transformadas segun se indica. Se anadieron quince microgramos de protefnas de plantas no transformadas a las cargas de 5 pg. La figura 3C muestra una comparacion de la acumulacion de H5 (de la cepa A/Indonesia/05/05) en plantas usando un casete de expresion basado en CPMV-HT en solitario (construccion numero 972; veanse las figuras 1A y la figura 2A) o junto con un sistema de amplificacion de BeYDV (construccion numero 852 veanse las figuras 1I y 2B). Se agruparon las hojas de tres plantas antes de la extraccion. La cantidad de protefnas de las plantas transformadas se indica para cada carril. Para asegurar una carga equivalente, los extractos de las plantas transformadas se completaron hasta 4 pg con extracto de protefnas de plantas no transformadas. La figura 3D muestra una comparacion de la acumulacion de H1 (de la cepa A/California/04/2009) en las plantas usando un casete de expresion basado en CPMV-HT en solitario (construccion numero 560; veanse las figuras 1B y 2A) o junto con un sistema de amplificacion de BeYDV (construccion numero 561; veanse las figuras 1G y 2B). Para cada construccion, se recolectaron tres plantas los dfas 2, 3, 4 y 5 posteriores a la infiltracion (respectivamente indicados como d2, d3, d4 y d5). Se agruparon las hojas de tres plantas antes de la extraccion. Cinco microgramos de protefnas de plantas transformadas se mezclaron con 15 pg de protefnas de plantas no transformadas antes de la carga. La figura 4 muestra una comparacion de la acumulacion de HA transitoria en plantas usando varios casetes
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de expresion basados en CPMV-HT junto con un sistema de amplificacion de BeYDV y una replicasa proporcionada en un plasmido separado, o en el mismo plasmido bajo el control de la LIR. La figura 4A muestra una comparacion de acumulacion de HA (de la cepa B/Florida/4/2006) en plantas usando el casete de expresion basado en CPMV-HT junto con un sistema de amplificacion de BeYDV (construccion numero 853; veanse las figuras 1F y 2B; y Plastocianina-P19; construccion numero 472) con un gen replicasa en un plasmido separado, o en el mismo plasmido bajo el control de la LIR (construccion numero 475; veanse las figuras 1K y 2D; y Plastocianina-P19; construccion numero 472). Se analizaron tres plantas para cada construccion (1, 2 y 3). Se cargaron veinte microgramos de protefnas para cada extracto analizado. La figura 4B muestra una comparacion de la acumulacion de H3 (de la cepa A/Brisbane/10/2007) en plantas usando el casete de expresion basado en CPMV-HT junto con el sistema de amplificacion de BeYDV (construccion numero 851; veanse las figuras 1H y 2B; y Plastocianina-P19; construccion numero 472) con el gen replicasa en un plasmido separado, o en el mismo plasmido bajo el control de la LIR (construccion numero 473; veanse las figuras 1M y 2D; y Plastocianina-P19; construccion numero 472). Se analizaron tres plantas para cada construccion (1, 2 y 3). Medio microgramo de protefnas de plantas transformadas se mezclo con 10 pg de protefnas de plantas no transformadas antes de la carga. La figura 4C muestra una comparacion de la acumulacion de H5 (de la cepa A/Indonesia/05/05) en plantas usando el casete de expresion basado en CPMV-HT junto con el sistema de amplificacion de BeYDV (construccion numero 852; veanse las figuras 1I y 2B; y Plastocianina-P19; construccion numero 472) con el gen replicasa en un plasmido separado, o en el mismo plasmido bajo el control de la LIR (construccion numero 474; veanse las figuras 1N y 2D; y Plastocianina-P19; construccion numero 472). Se analizaron tres plantas para cada construccion (1, 2 y 3). La mitad de un microgramo de protefnas de plantas transformadas se mezclo con 10 pg de protefnas de plantas no transformadas antes de la carga. La figura 4D muestra una comparacion de la acumulacion de H1 (de la cepa A/California/04/2009) en plantas usando el casete de expresion basado en CPMV-HT junto con el sistema de amplificacion de BeYDV (construccion numero 561; vease la figura 1G y 2B; y Plastocianina-P19; construccion numero 472) con el gen replicasa en un plasmido separado, o en el mismo plasmido bajo el control de la LIR (construccion numero 471; vease la figura 1L y 2D; y Plastocianina-P19; construccion numero 472). Se analizaron tres plantas para cada construccion (1, 2 y 3). Dos microgramos y medio de protefnas de plantas transformadas se mezclaron con 10 pg de protefnas de plantas no transformadas antes de la carga.
DESCRIPCION DETALLADA
La presente invencion se refiere a acidos nucleicos y sistemas de expresion para producir protefnas de interes en las plantas. Los sistemas de expresion comprenden un casete de expresion basado en comovirus y un elemento de amplificacion basado en geminivirus. Tambien se proporcionan celulas vegetales, tejidos vegetales, plantas enteras, inoculo, acidos nucleicos (por ejemplo, construcciones genicas), que comprenden las protefnas de interes, y metodos de expresion de la protefna de interes en las plantas.
La presente invencion proporciona adicionalmente un sistema de expresion vegetal que comprende una primera secuencia de acido nucleico que comprende una region reguladora, ligada operativamente a uno o mas de un potenciador de comovirus, una secuencia nucleotfdica de interes, y uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus, y un segundo acido nucleico que codifica una replicasa de geminivirus. La primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico pueden situarse en la misma molecula de acido nucleico, o pueden situarse en diferentes moleculas de ADN. Por ejemplo, el sistema de expresion vegetal puede comprender una secuencia de acido nucleico que comprende una secuencia reguladora ligada operativamente a uno o mas de un potenciador de comovirus; una secuencia nucleotfdica de interes; uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus, y una secuencia de acido nucleico que codifica una protefna replicasa de geminivirus.
La presente invencion tambien proporciona un acido nucleico que comprende una secuencia promotora (region reguladora), una region reguladora de comovirus, una o mas secuencias que codifican una o mas protefnas de interes y un elemento de amplificacion de geminivirus, proporcionadas en el mismo o un acido nucleico diferente. El acido nucleico puede comprende adicionalmente una secuencia que codifica una replicasa de geminivirus, una region no traducida (UTR) 3' de comovirus o una 3' UTR de plastocianina, o una combinacion de una replicasa de geminivirus y una 3' UTR de comovirus y una 3' UTR de plastocianina.
En la siguiente descripcion se usan extensamente varios terminos, las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprension de los diversos aspectos de la invencion. El uso de los ejemplos en la memoria descriptiva, incluyendo los ejemplos de los terminos, es unicamente para fines ilustrativos y no pretende limitar el alcance y significado de las realizaciones de la invencion en el presente documento.
Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protefna" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a
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un polfmero de residuos de aminoacidos. Los terminos se aplican a polfmeros de aminoacidos de origen natural, asf como polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacido son un aminoacido que no existe de forma natural, es decir, un analogo aminoacfdico. Como se usa en el presente documento, los terminos abarcan cadenas de aminoacidos de cualquier longitud, incluyendo protefnas de longitud completa (es decir, antfgenos), en las que los restos de aminoacidos estan unidos por enlaces peptfdicos covalentes
Como se usa en el presente documento, el termino "derivado" en el contexto de un polipeptido o protefna, por ejemplo, un anticuerpo, se refiere a un polipeptido o una protefna que comprende una secuencia aminoacfdica que se ha alterado mediante la introduccion de sustituciones, deleciones o adiciones de residuos aminoacfdicos. El termino "derivado", como se usa en el presente documento, tambien se refiere a un polipeptido o una protefna que se ha modificado, es decir, mediante la union covalente de cualquier tipo de molecula al anticuerpo. Por ejemplo, un polipeptido o protefna puede modificarse, por ejemplo, mediante glicosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion, derivatizacion mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escision proteolftica, union a un ligando celular u otra protefna, etc. Pueden producirse derivados, polipeptidos o protefnas mediante modificaciones qufmicas usando tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitacion, escision qufmica especffica, acetilacion, formilacion, sfntesis metabolica de tunicamicina, etc. En algunas realizaciones, un derivado, un polipeptido o protefna posee una funcion similar o identica que el polipeptido o la protefna del que se derivo.
El sistema de expresion como se describe en el presente documento, comprende un casete de expresion basado en un virus bipartito, o un virus con un genoma vipartita. Por ejemplo, los presentes virus bipartitos pueden ser de la familia de los Comoviridae. Los generos de la familia de los Comoviridae incluyen Comovirus, Nepovirus, Fabavirus, Cheravirus y Sadwavirus. Los Comovirus incluyen virus del mosaico del caupf (CPMV), virus del mosaico grave del caupf (CPSMV), virus del mosaico de la calabaza (SqMV), virus del moteado del trebol rojo (RCMV), virus del moteado de la vaina del frijol (BPMV), virus del mosaico del nabo (TuRSV), virus del mosaico verdadero del haba (BBtMV), virus de la mancha del haba (BBSV), virus del mosaico del rabano (RaMV). Los ejemplos de ARN-2 de comovirus que comprenden elementos potenciadores que pueden ser utiles para diversos aspectos de la invencion incluyen, pero sin limitacion: ARN-2 de CPMV (n.° de Acceso al GenBank NC_003550), ARN-2 de RCMV (n.° de Acceso al GenBank NC_003738), ARN-2 de BPMV (n.° de Acceso al GenBank NC_003495), ARN-2 de CPSMV (n.° de acceso al GenBank NC_003544), ARN-2 de SqMV (GenBank n.° de acceso NC_003800), ARN-2 de TuRSV (n.° de Acceso al GenBank NC_013219.1). ARN-2 de BBtMV (n.° de Acceso al GenBank GU810904), ARN-2 de BBSV (n.° de Acceso al GenBank FJ028650), RaMV (n.° de Acceso al GenBank NC_003800)
Los segmentos del genoma de ARN como vfrico bipartita se denominan como ARN-1 y ARN-2. ARN-1 codifica las protefnas implicadas en la replicacion, mientras que ARN-2 codifica las protefnas necesarias para un movimiento celula a celula en las dos protefnas capside. Puede usarse cualquier casete a base de comovirus adecuado, incluyendo, CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV o BPMV, por ejemplo, el casete de expresion puede basarse en CPMV.
"Casete de expresion" se refiere a una secuencia nucleotfdica que comprende un acido nucleico de interes bajo el control de, y operablemente (u operativamente) unido a, un promotor apropiado u otro elemento regulador para la transcripcion del acido nucleico de interes en una celula huesped.
Se ha mostrado que la transformacion de Nicotians benthamiana con copias de ADNc competente de replicacion de longitud completa de ambos ARN genomicos de CPMV puede dar como resultado una infeccion productiva (Liu y col., 2004, Virology 323, 37-48). Los ejemplos de casetes de expresion a base de CPMV se describen en los documentos WO2007/135480; WO2009/087391; y Sainsbury F. y col., (2008, Plant Physiology; 148: 1212-1218; Sainsbury F. y col., (2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. y col., 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682-693). Como un ejemplo, que no se considerara limitante, las regiones no traducidas (UTR) obtenidas a partir del ARN 2 genomico del virus del mosaico del caupf (CMV) en el que los dos primeros codones de inicio de traduccion encontrados en la secuencia lfder 5' se han eliminado, pueden usarse como se describe en el documento WO 2009/087391. Al combinarse con el promotor CaMV 35S y el terminador de nopalina sintasa (NOS), el CPMV UTR modificado potencio la traduccion de la region codificante flanqueante. El sistema de expresion basado en CPMV se denomino CPMV-HT (hipertraducible).
Como se usa en el presente documento, puede usarse una secuencia potenciadora de la expresion, cuya secuencia se obtiene a partir del (o comparte homologfa con) segmento de genoma de ARN-2 de un virus de ARN bipartito, tal como un comovirus, en el que un sitio de inicio diana se ha mutado, puede usarse para expresar una secuencia de acido nucleico de interes. La presente invencion proporciona adicionalmente procesos para aumentar la expresion, o actividad potenciadora traslacional, de una secuencia obtenida a partir de un segmento de genoma de ARN-2 de un virus bipartito, cuyos procesos comprenden mutar un sitio de inicio diana en el mismo.
Las secuencias "potenciadoras" (o elementos potenciadores), incluyen secuencias obtenidas a partir de (o que
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comparten homologfa con) el segmento de genoma de ARN-2 de un virus de ARN bipartite, tal como un comovirus, en el que se ha mutado un sitio de inicio diana. Dichas secuencias pueden potenciar la expresion aguas debajo de un ORF heterologo al que se unen. Sin limitacion, se cree que dichas secuencias, cuanto estan presentes en ARN transcrito, pueden potenciar la traduccion de un ORF heterologo al que estan unidas.
Un "sitio de inicio diana" como se hace referencia en el presente documento y en el contexto de una secuencia potenciadora, es el sitio de inicio (codon de inicio) de un segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre de un virus bipartito, por ejemplo, un comovirus, a partir del cual la secuencia potenciadora en cuestion se deriva. El sitio de inicio diana sirve como el sitio de inicio para la produccion (traduccion) de la protefna 105K, que es la mas larga de dos protefnas coterminales carboxi codificadas por el segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre. La produccion de la protefna 105K, se inicia en el sitio de inicio en la posicion 161 en el segmento del genoma de ARN- 1 de CPMV de tipo silvestre. Por lo tanto, un sitio de inicio diana en una secuencia potenciadora derivada del segmento de genoma de ARN-2 de CPMV puede ser el sitio de inicio en la posicion 161 en el ARN-2 de CPMV de tipo silvestre. Las mutaciones en torno al codon de inicio en la posicion 161 pueden tener el mismo efecto, o similar, que la mutacion del propio codon de inicio en la posicion 161, por ejemplo, alterando el contexto en torno al codon de inicio lo que puede significar que el codon de inicio se deriva con mas frecuencia.
La secuencia potenciadora puede comprender un sitio de inicio diana mutado indirectamente producido por la mutacion de uno o mas nucleotidos aguas arriba y/o aguas abajo del sitio de inicio diana, pero conservando el sitio de inicio diana de tipo silvestre. El efecto de la mutacion de los nucleotidos aguas arriba, aguas abajo, o tanto aguas arriba como aguas abajo, es el mismo, o similar, al efecto observado cuando el propio sitio de inicio diana se muta.
Dado que los sitios de inicio diana sirven como el sitio de inicio para la produccion de las mas largas de dos protefnas coterminales carboxi codificadas por un segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre, se desprende que los sitios de inicio diana estan en marco (en fase) con un segundo sitio de inicio en el mismo segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre, que sirve como el sitio de inicio para la produccion de las mas cortas de dos protefnas coterminales carboxi codificadas por el ARN-2 de tipo silvestre. Dos sitios de inicio estan en el marco si estan en el mismo marco de lectura en triplete. Por ejemplo, el sitio de inicio diana en una secuencia potenciadora derivada del segmento de genoma de ARN-2 de CPMV de tipo silvestre (el sitio de inicio en la posicion 161), esta en el marco con el sitio de inicio en la posicion 512, que sirve como el sitio de inicio para la produccion de la mas corta de las dos protefnas coterminales carboxi codificadas por ARN-2 de CPMV (la protefna 95K) en el segmento del genoma de ARN-1 de CPMV de tipo silvestre.
Por lo tanto, un sitio de inicio diana que se situa aguas arriba (5') de un segundo sitio de inicio en el segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre del cual se deriva la secuencia potenciadora, puede servir como el sitio de inicio para la produccion de la mas corta de dos poliprotefnas coterminales carboxi codificadas por el segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre. Ademas, un sitio de inicio diana tambien puede situarse aguas abajo (3') de un tercer sitio de inicio en el genoma de ARN-2 de tipo silvestre del cual se deriva la secuencia potenciadora. En el CPMV, el sitio de inicio diana en la posicion 161, se situa aguas arriba de un segundo sitio de inicio en la posicion 512 que sirve como el sitio de inicio para la produccion de la protefna 95K. Tambien esta presente un tercer sitio de inicio en la posicion 115. Por lo tanto, un sitio de inicio diana en una secuencia potenciadora derivada del segmento de genoma de ARN-2 de un virus bipartito es el primero de de dos sitios de inicio para la produccion de dos protefnas coterminales carboxi codificadas por el aRN-2 de tipo silvestre. "Primero" en este contexto, se refiere al sitio de inicio situado mas cercano al extremo 5' del segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre.
Puede mutarse mas de un sitio de inicio en la secuencia, si se desea. Por ejemplo, el "tercer" sitio de inicio en (o correspondiente a) la posicion 115 tambien puede suprimirse o alterarse. Se ha mostrado que la eliminacion de AUG 115, ademas de la eliminacion de AUG 161, potencia adicionalmente la expresion (Sainsbury y Lomonossoff, 2008, Plant Physiology; 148: 1212-1218). Por ejemplo, las secuencias potenciadoras de la presente invencion pueden basarse en secuencias modificadas de los segmentos de genoma de ARN-2 de virus de ARN bipartito.
Las secuencias de los segmentos de genoma de ARN-2 de estos comovirus y varias cepas especificas estan disponibles en la base de datos del NCBI con los numeros de acceso enumerados entre parentesis: ARN-2 del virus del mosaico del caupf (NC_003550), ARN-2 del virus del mosaico grave de caupf (NC_003544), ARN-2 del virus del mosaico de calabaza (NC_003800), ARN-2 de la cepa del virus del mosaico de la calabaza Kimble (AF059533), ARN-2 de la cepa del virus del mosaico de la calabaza Arizona (AF059532), ARN-2 del virus del moteado del trebol rojo (NC_003738), ARN-2 del virus del moteado de la vaina del frijol (NC_003495), ARN-2 de la cepa del virus del moteado de la vaina del frijol K-Hopkins1 (AF394609), ARN-2 de la cepa del virus del moteado de la vaina del frijol K-Hancock1 (AF394607), virus del moteado de la patata andina (APMoV: L16239) y virus del mosaico del rabano (RaMV; AB295644). Tambien existen secuencias de ARN-2 parciales disponibles para el virus del mosaico rugoso del frijol (BRMV; AF263548) y un miembro provisional del genero Comovirus, el virus del mosaico del nabo
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(EF191015). Tambien estan disponibles numerosas secuencias de los demas generos en la familia Comoviridae. Hasta la fecha, todos los comovirus que se han investigado han mostrado tener dos codones de inicio alternativos para la expresion de dos poliprotefnas coterminales carboxi a partir de sus segmentos de genoma de ARN-2. En particular, se sabe que los segmentos de genoma de ARN-2 de CPMV, CPSMV, BPMV, SqMV y RCMV comprenden dos codones de inicio alternativos para la expresion de dos poliprotefnas coterminales carboxi.
Los sitios de inicio diana en otros comovirus, que son equivalentes al sitio de inicio en la posicion 161 en el segmento de ARN-2 de tipo silvestre de CPMV pueden identificarse, por lo tanto, mediante metodos como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, una secuencia de interes puede alinearse, usando metodos estandar de alineamiento de secuencias tales como BLAST, o mediante alineamiento manual, con la de CMPV para determinar la ubicacion de un sitio de inicio equivalente correspondiente.
Como se usa en el presente documento, la secuencia potenciadora puede comprender, por ejemplo, nucleotidos de 1 a 512, o 1-509 del segmento del genoma de ARN-2 de CPMV, en la que el sitio de inicio diana en la posicion 161 se ha mutado. Como alternativa, la secuencia potenciadora puede comprender una secuencia equivalente de otro comovirus, en la que el sitio de inicio diana equivalente al codon de inicio en la posicion 161 del CPMV se ha mutado. El sitio de inicio diana puede mutarse por sustitucion, deletion o insertion. Por ejemplo, el sitio de inicio diana puede mutarse por una mutation puntual. El potenciador del CPMV puede comprender la SEQ NO: 23 como se expone a continuation (los ATG mutados - ATG 115 y 161 - estan subrayados):
T ATT AAA ATCTT AAT AGGTTTTGAT A AAAGCGA ACGTGGGG AA ACCCG AAC
C AA ACCTTCTTCT AA ACTCTCTCTCATCTCTCTT AAAGCAAACTTCTCTCTTG
TCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGT
ACAACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTA
GTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTT
GGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTT
ACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAG
GTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAA
ATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAA
AGATTGTT AAGCTTCTGTAT ATTCTGCCCA AATTTG
La presente secuencia potenciadora puede tener al menos el 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, o el 50 % de identidad con respecto a la secuencia de aRn-2 de CPMV, o cualquier cantidad entre las mismas, en la que el sitio de inicio diana correspondiente a la posicion 161 del segmento de genoma de ARN-2 de CPMV de tipo silvestre se ha mutado por sustitucion, delecion o insercion. Por ejemplo, la secuencia potenciadora puede tener de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 99 %, de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 99 %, o de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99 %, de identidad con respecto a la secuencia de ARN-2 de CPMV, o cualquier cantidad entre las mismas, en la que el sitio de inicio diana correspondiente a la posicion 161 del segmento de genoma de ARN-2 de CPMV de tipo silvestre se ha mutado por sustitucion, delecion o insercion.
Las expresiones "porcentaje de similitud", "porcentaje de identidad" y "porcentaje de homologfa" al hacer referencia a una secuencia particular se usan, por ejemplo, como se expone en el programa de software GCG de la University of Wisconsin. Los metodos de alineamiento de secuencias para su comparacion se conocen bien en la tecnica. El alineamiento optimo de secuencias para comparacion puede realizarse usando, por ejemplo, el algoritmo de Smith & Waterman, (1981, Adv. Appl. Math. 2: 482), mediante el algoritmo de alineamiento de Needleman & Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48: 443), mediante la busqueda del metodo de similitud de Pearson & Lipman, (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (por ejemplo: GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por alineamiento manual e inspection visual (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds. 1995 complemento).
Un ejemplo de un algoritmo adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col., (1977, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402) y Altschul y col., (1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410), respectivamente. Se usan BLAST y BLAST 2.0, con los parametros descritos en el presente documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los acidos nucleicos y protefnas de la invention. Por ejemplo, el programa BLAsTn (para secuencias nucleotfdicas) puede usar como predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparacion de ambas cadenas. Para las secuencias aminoacfdicas, el programa BlASTP puede usar como predeterminados una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y alineamientos de matriz de puntuacion
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BLOSUM62 (vease Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparacion de ambas cadenas. El software para realizar los analisis BLAST esta disponible para el publico a traves del National Center for Biotechnology Information (vease el sitio web: ncbi.nlm.nih.gov/).
Las secuencias potenciadoras tambien pueden hibridar, en condiciones rigurosas, con la secuencia complementaria del ARN-2 de CPMV, con la condicion de que el sitio de inicio diana correspondiente a la posicion 161 en el segmento de genoma de ARN-2 de CPMV de tipo silvestre se haya mutado.
La hibridacion en condiciones de hibridacion rigurosas se conoce en la tecnica (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds. 1995 y complementos; Maniatis y col., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook y Russell, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion 2001). Un ejemplo de una de tales condiciones de hibridacion rigurosas puede ser una hibridacion de aproximadamente 16-20 horas en 4 X SSC a 65 °C, seguido de lavado en 0,1 x SSC a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en 0,1 x SSC a 65 °C cada 20 o 30 minutos. Como alternativa, una condicion de hibridacion rigurosa ejemplar puede ser durante una noche (16-20 horas) en formamida al 50 %, 4 x SSC a 42 °C, seguido de lavado en 0,1 x sSc a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en 0,1 x SSC a 65 °C cada 20 o 30 minutos, o durante una noche (16-20 horas), o hibridacion en tampon fosfato acuoso Church (SDS al 7 %; tampon NaPO4 0,5 M pH 7,2; EDTA 10 mM) a 65 °C, con 2 lavados a 50 °C en 0,1 x SSC, SDS al 0,1 % durante 20 o 30 minutos cada uno, o 2
lavados a 65 °C en 2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 20 o 30 minutos cada uno.
Un sitio de inicio diana en una secuencia potenciadora de la invencion puede mutarse por delecion, insercion o sustitucion, de tal forma que ya no funcione como un sitio de inicio de la traduccion. Por ejemplo, puede hacerse una mutacion puntual en la posicion del sitio de inicio diana en la secuencia potenciadora. Como alternativa, el sitio de inicio diana en la secuencia potenciadora puede eliminarse parcialmente o en su totalidad. Por ejemplo, puede hacerse una delecion que abarque el sitio de inicio diana en la secuencia potenciadora. Las deleciones que abarcan el sitio de inicio pueden tener aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleotidos de largo, en comparacion con la secuencia del segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre de la que se deriva la secuencia potenciadora, con la condicion de que la delecion abarque el sitio de inicio.
Sin desear quedar ligando a la teorfa, se cree que la mutacion del codon de inicio en la posicion 161 en el CPMV conduce a la inactivacion de un supresor traduccional, lo que da como resultado un inicio potenciado de la
traduccion de los codones de inicio situados aguas debajo del supresor traduccional inactivado. Por lo tanto, la
secuencia potenciadora para su uso como se describe en el presente documento puede obtenerse a partir de un segmento de genoma de ARN-2 de un virus bipartite, en el que la secuencia potenciadora comprende una secuencia supresora traduccional inactivada.
Una secuencia supresora traduccional puede ser una secuencia en el segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre del virus bipartite (por ejemplo, un comovirus) de la que se deriva la secuencia potenciadora en cuestion, que comprende, o consiste en, el sitio de inicio para la produccion (traduccion) de la mayor de dos protefnas coterminales carboxi codificadas por el segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre. Las secuencias de supresor traduccional en las secuencias potenciadoras derivadas del segmento de genoma de ARN-2 de CPMV, son secuencias que comprenden, o que consisten en, el sitio de inicio diana que se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, las secuencias supresoras traduccionales comprenden, o consisten en, un sitio de inicio diana como se ha definido anteriormente, y pueden inactivarse por mutagenesis como se ha descrito anteriormente.
La presente divulgacion proporciona un acido nucleico aislado que comprende una secuencia potenciadora de expresion como se ha descrito anteriormente. "Acido nucleico" o una "molecula de acido nucleico" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molecula de ADN o ARN, mono o bicatenaria y, si es monocatenaria, la molecula de su secuencia complementaria en forma lineal o circular. En el analisis de las moleculas de acido nucleico, una secuencia o estructura de una molecula de acido nucleico particular puede describirse en el presente documento de acuerdo con la convencion normal de proporcionar la secuencia en la direccion 5' a 3'. Con referencia a los acidos nucleicos de la invencion, se usa a veces la expresion "acido nucleico aislado". Este termino, cuando se aplica al ADN, se refiere a una molecula de ADN que se separa de las secuencias con las que esta inmediatamente contiguo en el genoma de origen natural del organismo en el que se origino. Por ejemplo, un "acido nucleico aislado" puede comprender una molecula de ADN insertada en un vector, tal como un vector plasmfdico o vfrico, o integrada en el ADN genomico de una celula procariota o eucariota u organismo huesped. Cuando se aplica al ARN, la expresion "acido nucleico aislado" se refiere principalmente a una molecula de ARN codificada por una molecula de aDn aislada como se ha definido anteriormente. Como alternativa, la expresion puede referirse a una molecula de ARN que se ha separado lo suficiente de otros acidos nucleicos con los que se asociara en su estado natural (es decir, en celulas o tejidos). Un "acido nucleico aislado" (ADN o ARN) puede representar adicionalmente una
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molecula producida directamente por medios biologicos o sinteticos y separada de otros componentes presentes durante su produccion.
Por lo tanto, el acido nucleico puede comprender una porcion, o fragmento, del segmento de genoma de ARN-2 del virus de ARN bipartite del que se deriva el potenciador. Por ejemplo, el acido nucleico puede no comprender ni siquiera una porcion de la region codificante del segmento de genoma de ARN-2 de la que se deriva. La region codificante puede ser la region del segmento de genoma de ARN-2 que codifica la mas corta de dos protefnas coterminales carboxi. El acido nucleico puede comprender la porcion de un segmento de genoma de ARN-2 de un virus bipartite que se extiende desde el extremo 5' del segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre al sitio de inicio del que se inicia la produccion (traduccion) de la mas corta de dos protefnas coterminales carboxi codificadas por el segmento de genoma de ARN-2 de tipo silvestre.
Como se usa en el presente documento, se proporciona uno o mas sistemas de expresion que comprenden una secuencia potenciadora como se ha descrito anteriormente. El sistema de expresion tambien puede comprender un acido nucleico de interes que codifica una protefna de interes insertada aguas debajo de la secuencia potenciadora. Por "gen de interes", "secuencia nucleotfdica (o de acido nucleico) de interes", o "region codificante de interes", se refiere a cualquier gen, secuencia nucleotfdica, o region codificante (estas expresiones se usan de forma intercambiable) que se expresara dentro de un organismo huesped, por ejemplo una planta, y puede producir una protefna de interes. Tal secuencia nucleotfdica de interes puede incluir, pero sin limitacion, un gen o region codificante cuyo producto es una enzima industrial, un complemento proteico, un nutraceutico, un producto de valor anadido, o un fragmento de los mismos para piensos, alimentos, o uso tanto en piensos como alimentos. Una secuencia nucleotfdica, o region codificante de interes tambien puede incluir un gen que codifica una protefna farmaceuticamente activa, por ejemplo, factores de crecimiento, reguladores del crecimiento, anticuerpos, antfgenos, y fragmentos de los mismos, o sus derivados utiles para la inmunizacion o vacunacion y similares. Dichas protefnas incluyen, pero sin limitacion, interleucinas, por ejemplo, una o mas de una de IL-1 a IL-24, IL-26 e IL-27, citocinas, eritropoyetina (EPO), insulina, G-CSF, GM-CSF, hpG-CSF, M-CSF o combinaciones de los mismos, interferones, por ejemplo, interferon-alfa, interferon-beta, interferon-gama, factores de coagulacion de la sangre, por ejemplo, Factor VIII, Factor IX, o tPA hGH, receptores, agonistas de receptores, anticuerpos, neuropolipeptidos, insulina, vacunas, factores de crecimiento, por ejemplo, pero sin limitacion, factor del crecimiento epidermico, factor del crecimiento queratinocftico, factor del crecimiento de transformacion, reguladores del crecimiento, antfgenos, autoantfgenos, fragmentos de los mismos, o combinaciones de los mismos.
La protefna de interes tambien puede incluir una hemaglutinina de influenza (HA; vease el documento WO 2009/009876). HA es una glucoprotefna de tipo I de membrana homotrimerica, que comprende generalmente un peptido senal, un dominio HA1, y un dominio HA2 que comprende un sitio de anclaje de membrana en el extremo C y una pequena cola citoplasmatica. Las secuencias nucleotfdicas que codifican HA se conocen bien y estan disponibles (vease, por ejemplo, la BioDefense and Public Health Database (ahora Influenza Research Database; Squires y col., 2008 Nucleic Acids Research 36: D497-D503) en el sitio web:
biohealthbase.org/GSearch/home.do?decorator=Influenza; o las bases de datos mantenidas por el National Center for Biotechnology Information (vease el sitio web: ncbi.nlm.nih.gov).
Se desvelan protefnas de HA de una influenza de tipo A, una influenza de tipo B, o un subtipo de HA de influenza de tipo Ha seleccionado entre el grupo de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16. La HA puede proceder de una influenza del tipo A, seleccionada entre el grupo H1, H2, H3, H5, H6, H7 y H9. Los fragmentos de las HA que se han enumerado anteriormente tambien pueden considerarse una protefna de interes. Ademas, los dominios de un tipo o subtipo de HA que se han enumerado anteriormente pueden combinarse para producir HA quimericas (vease, por ejemplo, el documento WO2009/076778). Los ejemplos de subtipos que comprenden protefnas HA incluyen A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/New York/1995, A/gaviota argentea/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/anade real/MN/33/00,
A/pato/Shanghai/1/2000, A/anade rabudo/TX/828189/02, A/pavo/Ontario/6118/68(H8N4), A/pato
cuchara/Iran/G54/03, A/pollo/Germany/N/1949(H10N7), A/pato/England/56(H11N6), A/pato/Alberta/60/76(H12N5), A/gaviota/Maryland/704/77(H13N6), A/anade real/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota reidora/Sweden/5/99(H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburg/66, A/PuertoRico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapore/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (HSN1), A/cerceta/HongKong/W312/97 (H6N1), A/equino/Prague/56 (H7N7), A/HongKong/1073/99 (H9N2)).
La protefna HA puede ser un subtipo H1, H2, H3, H5, H6, H7 o H9. Por ejemplo, la protefna H1 puede proceder de la cepa A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/PuertoRico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1), A/California/04/2009 (H1N1) o A/California/07/2009 (H1N1). La protefna H3 tambien puede proceder de la cepa A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) o A/Perth/16/2009 (H3N2). En un aspecto adicional de la invencion, la protefna H2 puede ser de la cepa A/Singapore/1/57 (H2N2). La protefna H5 puede ser de la cepa A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), o A/Indonesia/5/2005. En un aspecto de la
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invencion, la protefna H6 puede proceder de la cepa A/cerceta/HongKong/W312/97 (H6N1). La protefna H7 puede proceder de la cepa A/Equino/Prague/56 (H7N7). En un aspecto de la invencion, la protefna H9 procede de la cepa A/HongKong/1073/99 (H9N2). En un aspecto mas de la invencion, la protefna HA puede proceder de un virus de influenza que puede ser un virus de tipo B, incluyendo B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006 o B/Brisbane/60/08. Los ejemplos de secuencias aminoacfdicas de las protefnas Ha de los subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 o B incluyen secuencias como se describe en el documento WO 2009/009876, WO 2009/076778, WO 2010/003225). La protefna HA del virus de influenza puede ser Indonesia H5.
La HA puede comprender un peptido nativo, o un peptido senal no nativo; el peptido senal no nativo puede ser de origen vegetal. Por ejemplo, el peptido senal puede ser un peptido senal de isomerasa de disulfuro de protefna. El peptido senal nativo puede corresponder al de la hemaglutinina que se expresa, o puede corresponder a una segunda hemaglutinina.
Se desvelan moleculas de acido nucleico que comprenden secuencias que codifican una protefna HA. Las moleculas de acido nucleico pueden comprender adicionalmente una o mas regiones reguladoras unidas operativamente a la secuencia que codifica una protefna HA. Las moleculas de acido nucleico pueden comprender una secuencia que codifica una H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o HA de influenza de tipo B. Por ejemplo, la protefna HA codificada por la molecula de acido nucleico puede ser un subtipo de H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 y HA del tipo B. La protefna H1 codificada por la molecula de acido nucleico puede proceder de la cepa A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/PuertoRico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1), A/California/04/2009 (H1N1) o A/California/07/2009 (H1N1). La protefna H3 codificada por la molecula de acido nucleico puede proceder de la cepa A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) o A/Perth/16/2009 (H3N2). La protefna H2 codificada por la molecula de acido nucleico puede proceder de la cepa A/Singapore/1/57 (H2N2). La protefna H5 codificada por la molecula de acido nucleico tambien puede proceder de la cepa A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), o A/Indonesia/5/2005. La protefna H6 codificada por la molecula de acido nucleico puede proceder de la cepa A/cerceta/HongKong/W312/97 (H6N1). La protefna H7 codificada por la molecula de acido nucleico tambien puede proceder de la cepa A/Equino/Prague/56 (H7N7). Adicionalmente, la protefna H9 codificada por la molecula de acido nucleico puede proceder de la cepa A/HongKong/1073/99 (H9N2). La protefna HA del tipo B codificad por el acido nucleico puede proceder de la cepa B/Florida/4/2006, B/Malaysia/2506/2004 o B/Brisbane/60/08. Los ejemplos de secuencias de moleculas de acido nucleico que codifican dichas protefnas HA de los subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 o tipo B incluyen secuencias como se describe en los documentos WO 2009/009876, WO 2009/076778, WO 2010/003225. La secuencia de acido nucleico puede codificar la protefna HA del virus de influenza H5 Indonesia.
Si la secuencia de acido nucleico de interes codifica un producto que es directa o indirectamente toxico para la planta, entonces dicha toxicidad puede reducirse expresando selectivamente la secuencia nucleotfdica de interes en un tejido deseado o en una fase deseada del desarrollo de la planta.
La region codificante de interes o la secuencia nucleotfdica de interes puede expresarse en cualquier huesped vegetal adecuado que se transforma o comprende las secuencias nucleotfdicas, o moleculas de acidos nucleicos, o construcciones geneticas, o vectores de la presente invencion. Los ejemplos de huespedes adecuados incluyen, pero sin limitacion, Arabidopsis, cultivos agrfcolas, incluyendo, por ejemplo, colza, Brassica spp., mafz, Nicotiana spp., (tabaco), por ejemplo, Nicotiana benthamiana, alfalfa, patata, batata (Ipomoea batatars), ginseng, guisante, avena, arroz, soja, trigo, cebada, girasol, algodon, mafz, centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), cartamo (Carthamus tinctorius).
Por lo tanto, como se describe en el presente documento, se proporciona un sistema de expresion que comprende: (a) una secuencia potenciadora como se ha descrito anteriormente; y (b) una secuencia nucleotfdica que codifica hemaglutinina de influenza tipo B o hemaglutinina del subtipo H3 de influenza tipo A, en la que la secuencia nucleotfdica se situa aguas abajo de la secuencia potenciadora.
Por "region reguladora", "elemento regulador" o "promotor", se refiere a una porcion de acido nucleico, tfpicamente, pero no siempre, aguas arriba de la protefna que codifica la region de un gen, que puede estar comprendida por ADN o ARN, o tanto ADN como ARN. Cuando una region reguladora esta activa, y en asociacion operativa, o unida operativamente, con un gen de interes, esto puede dar como resultado la expresion del gen de interes. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad de los organos, o controlar la activacion genica del desarrollo o temporal. Una "region reguladora" incluye elementos promotores, elementos promotores centrales que muestran una actividad de promotor basal, elementos que son inducibles en respuesta a un estfmulo externo, elementos que median la actividad promotora, tales como elementos reguladores negativos o potenciadores de la transcripcion. "Region reguladora", como se usa en el presente documento, tambien incluye elementos que estan activos tras la transcripcion, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresion genica, tales como potenciadores de la traduccion y la transcripcion, represores de la traduccion y la transcripcion, secuencias de activacion aguas arriba, y determinantes de la inestabilidad del ARNm. Varios de estos ultimos elementos pueden situarse proximos a la region codificante.
En el contexto de esta divulgacion, la expresion "elemento regulador" o "region reguladora" se refiere tfpicamente a
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una secuencia de ADN, normalmente, pero no siempre, aguas arriba (5') con respecto a la secuencia codificante de un gen estructural, que controla la expresion de la region codificante proporcionando el reconocimiento de la ARN polimerasa y/o otros factores requeridos para el comienzo de la transcripcion en un sitio particular. Sin embargo, se entendera que otras secuencias nucleotfdicas, situadas en los intrones, o 3' de la secuencia, tambien pueden contribuir a la regulacion de la expresion de una region codificante de interes. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento del ARN polimerasa u otros factores transcripcionales para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayor parte de, aunque no todos, los elementos promotores eucariotas contienen una caja TATA, una secuencia de acido nucleico conservado compuesta por pares de bases de nucleotidos de adenosina y timidina situados normalmente aproximadamente 25 pares de bases aguas arriba de un sitio de inicio de transcripcion. Un elemento promotor puede comprender un elemento promotor basal, responsable del inicio de la transcripcion, asf como otros elementos reguladores (como se ha enumerado anteriormente) que modifican la expresion genica.
Existen varios tipos de regiones reguladoras, incluyendo aquellas que se regulan con respecto al desarrollo, inducibles o constitutivas. Una region reguladora que se regula con respecto al desarrollo, o controla la expresion diferencial de un gen bajo su control, se activa en ciertos organos o tejidos de un organo en momentos especfficos durante el desarrollo de ese organo o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que se regulan con respecto al desarrollo pueden estar activas preferiblemente en ciertos organos o tejidos en fases de desarrollo especfficas, tambien pueden estar activas de una manera regulada con respecto al desarrollo, o a un nivel basal tambien en otros organos o tejidos en la planta. Los ejemplos de regiones reguladoras especfficas de tejido, por ejemplo, vease especffica de una region reguladora, incluyen el promotor de napina, y el promotor de cruciferina (Rask y col., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau y col., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Un ejemplo de un promotor especffico de la hoja incluye el promotor de plastocianina (vease el documento US 7.125.978).
Una region reguladora inducible es aquella que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripcion de una o mas secuencias o genes de ADN en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias o genes de ADN no seran transcritos. Tfpicamente, el factor de protefna que se une especfficamente a una region reguladora inducible para activar la transcripcion puede presentarse en una forma activa, que es luego directa o indirectamente convertida a la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor de protefna tambien puede estar ausente. El inductor puede ser un agente qufmico tal como una protefna, metabolito, regulador de crecimiento, herbicida o compuesto fenolico o un estres fisiologico impuesto directamente por calor, frfo, sal o elementos toxicos o indirectamente mediante la accion de un patogeno o agente infeccioso tal como un virus. Una celula vegetal que contiene una region reguladora inducible puede ser expuesta a un inductor aplicando externamente el inductor a la celula o planta por ejemplo por aspersion, riego, calentamiento o metodos similares. Los elementos reguladores inducibles pueden derivarse ya sea de genes de la planta o que no son de la planta (por ejemplo, Gatz, C. y Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). Los ejemplos de promotores inducibles potenciales incluyen, pero sin limitacion, un promotor inducible de tetraciclina (Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108), un promotor inducible por esteroides (Aoyama, T. y Chua, N.H.,1997, Plant J. 2, 397-404) y un promotor inducible por etanol (Salter, M.G., y col., 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., y col., 1998, Nature Biotech. 16, 177180) genes IB6 y CK11 inducibles por citoquinina (Brandstatter, I. y Kieber, J.J.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985) y el elemento inducible por auxina, DR5 (Ulmasov, T., y col., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971).
Una region reguladora constitutiva dirige la expresion de un gen a traves de las diferentes partes de una planta y continuamente durante todo el desarrollo de la planta. Los ejemplos de elementos reguladores constitutivos conocidos incluyen promotores asociados con el transcripto 35S de CaM (p35S; Odell y col., 1985, Nature, 313: 810812), la actina del arroz 1 (Zhang y col., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An y col., 1996, Plant J., 10: 107121), o tms 2 (U.S. 5.428.147), y los genes para la triosafosfato isomerasa 1 (Xu y col., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), el gen de la ubiquitina 1 de mafz (Cornejo y col., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), los genes 1 y 6 de ubiquitina de Arabidopsis (Holtorf y col., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), y el gen del factor 4A de inicio de la traduccion de tabaco (Mandel y col., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004). El promotor del virus del mosaico de la mandioca, pCAS, (Verdaguer y col., 1996); el promotor de la pequena subunidad de ribulosa bifosfato carboxilasa, pRbcS: (Outchkourov y col., 2003), pUbi (para monocotiledoneas y dicotiledoneas).
Como se usa en el presente documento, se ha descubierto que los promotores que comprenden las secuencias potenciadoras con eficiencia demostrada en la expresion de la hoja, son eficaces en la expresion transitoria. Sin desear quedar ligando a la teorfa, la union de los elementos reguladores aguas debajo de un gen fosfosintetico por la union a la matriz nuclear puede mediar una fuerte expresion. Por ejemplo, pueden usarse hasta -784 del sitio de inicio de la traduccion del gen de plastocianina del guisante para mediar la expresion fuerte del gen indicador.
El termino “constitutivo” como se usa en el presente documento no necesariamente indica que un gen bajo control de la region reguladora constitutiva se expresa al mismo nivel en todos los tipos de celulas, sino que el gen se expresa en un amplio rango de tipos celulares aun cuando a menudo se observa una variacion en abundancia.
Por "unido operativamente" se refiere a que las secuencias particulares, por ejemplo, un elemento regulador y una region codificante de interes, interaction directa o indirectamente para realizar una funcion pretendida, tal como la mediacion o modulacion de una expresion genica. La interaccion de las secuencias unidas operativamente puede
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mediarse, por ejemplo, por protefnas que interactuan con las secuencias unidas operativamente.
La una o mas de una secuencia nucleotfdica de la presente invencion puede expresarse en cualquier huesped vegetal adecuado que se transforme por la secuencia nucleotfdica, o construcciones, o vectores de la presente invencion. Los ejemplos de huespedes adecuados incluyen, pero sin limitacion, Arabidopsis, cultivos agrfcolas, incluyendo, por ejemplo, colza, Brassica spp., mafz, Nicotiana spp., (tabaco), por ejemplo, Nicotiana benthamiana, alfalfa, patata, batata (Ipomoea batatars), ginseng, guisante, avena, arroz, soja, trigo, cebada, girasol, algodon, mafz, centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), cartamo (Carthamus tinctorius).
La una o mas construcciones de la presente invencion puede comprender adicionalmente una region no traducida 3'. Una region no traducida 3' se refiere a esa posicion de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una senal de poliadenilacion y cualquier otra senal reguladora capaz de realizar el procesamiento del ARNm o la expresion genica. La senal de poliadenilacion se caracteriza normalmente realizando la adicion de rastros de acido poliadenflico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las senales de poliadenilacion se reconocen comunmente por la presencia de homologfa con la forma canonica 5' AATAAA-3' aunque no son infrecuentes las variaciones. Una o mas de las construcciones geneticas quimericas de la presente invencion pueden tambien incluir potenciadores adicionales, ya sea potenciadores de traduccion o de transcripcion, segun se requiera. Estas regiones potenciadoras se conocen bien por los expertos en la tecnica, y pueden incluir el codon de inicio ATG y las secuencias adyacentes. El codon de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificacion para asegurar la traduccion de la secuencia completa.
Los ejemplos no limitantes de regiones 3' adecuadas son las regiones 3' no traducidas, transcritas que contienen una senal de poliadenilacion de genes del plasmido que inducen tumor (Ti) de Agrobacterium, tal como los genes de plantas y de nopalina sintasa (gen Nos) tal como los genes de protefna de almacenamiento de soja, la subunidad pequena del gen de ribulosa-1, 5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBlSCO; documento US 4.962.028), el promotor utilizado en la regulacion de la expresion de la plastocianina (Pwee y Gray, 1993). La secuencia de terminacion (terminadora) tambien puede ser una secuencia determinacion derivada del segmento de genoma de ARN-2 de un a virus de ARN bipartite, por ejemplo, un comovirus. Por ejemplo, la secuencia de terminacion puede derivarse del mismo virus de ARN bipartite del que se deriva la secuencia potenciadora. La secuencia de terminacion puede comprender un codon de terminacion. La secuencia de terminacion tambien puede estar seguida de senales de poliadenilacion.
Los sistemas de expresion como se describen en el presente documento, pueden unirse operativamente las secuencias promotoras y terminadoras. Por lo tanto, un sistema de expresion puede comprender adicionalmente una secuencia de terminacion y el gen que codifica una protefna de interes puede situarse entre la secuencia potenciadora y la secuencia de terminacion, es decir, aguas abajo (3') de la secuencia potenciadora y aguas arriba (5') de la secuencia de terminacion. Por lo tanto, la divulgacion proporciona adicionalmente un casete de expresion que comprende: (i) un promotor, unido operativamente a (ii) una secuencia potenciadora como se ha descrito anteriormente (iii) una secuencia nucleotfdica de interes, y (iv) una secuencia terminadora.
Los casetes de expresion, las construcciones de expresion y los sistemas de expresion de la invencion tambien pueden comprender una region no traducida (UTR). La UTR puede situarse aguas arriba de una secuencia terminadora presente en el casete de expresion (construccion de la expresion genica o sistema de expresion genica). Cuando el casete de expresion (construccion de la expresion genica o sistema de expresion genica) comprende un acido nucleico que codifica una protefna de interes, la UTR puede situarse aguas abajo del acido nucleico de interes (3'UTR). Por lo tanto, la UTR puede situarse entre un acido nucleico que codifica una protefna de interes y una secuencia terminadora. La UTR puede derivarse de un virus de ARN bipartite, por ejemplo, del segmento de genoma de ARN-2 de un virus de ARN bipartite. La UTR puede ser la 3' UTR del mismo segmento de genoma de ARN-2 del que se deriva la secuencia potenciadora presente en el casete de expresion (construccion de expresion o sistema de expresion genica). Preferiblemente, la UTR es la 3' UTR de un segmento de genoma de aRN-2 comoviral, por ejemplo, la 3' UTR del segmento de genoma de ARN-2 de CPMV.
Las construcciones de expresion, como se han descrito anteriormente, pueden estar presentes en un vector. El vector puede comprender secuencias borde que permiten la transferencia e integracion del casete de expresion en el genoma del organismo o huesped. La construccion puede ser un vector binario vegetal, por ejemplo, un vector de transformacion binario basado en pPZP (Hajdukiewicz, y col. 1994). Otras construcciones ejemplares incluyen pBin19 (vease, Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller, y col. 1995, Plant Molecular Biology 27: 405-409).
Si se desea, las construcciones de esta invencion pueden manipularse adicionalmente para incluir marcadores seleccionables. Sin embargo, esto puede no ser necesario. Los marcadores seleccionables utiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a productos qufmicos, tales como un antibiotico, por ejemplo, gentamicina, higromicina, kanamicina o herbicidas, tales como fosfinotricina, glifosato, clorosulfurona, y similares. De forma similar, pueden usarse enzimas que proporcionan la produccion de un compuesto identificable por el cambio de color, tal como GUS (beta-glucuronidasa), o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP.
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Un ejemplo de un vector que puede usarse como se describe en el presente documento es un vector pEAQ que permitir la clonacion directa mediante el uso de un polienlazador entre las 5' lider y 3' UTR de un casete de expresion. Este vector tambien puede incluir un potenciador traduccional como se describe en el presente documento, situado en un T-DNA que tambien contiene un supresor del silenciamiento genico y NPTII. El polienlazador tambien puede codificar uno o dos conjuntos de 6 x residuos de histidina para permitir la inclusion de etiquetas His N o C-terminales en la protefna de interes para facilitar la purificacion de protefnas.
El silenciamiento genetico posterior a la transcripcion (PTGS) puede estar involucrado en la limitacion de la expresion de transgenes en plantas, y puede utilizarse la coexpresion de un supresor de silenciamiento del virus Y de patata (HcPro) para contrarrestar la degradacion especffica de los ARNm transgenicos (Brigneti y col., 1998, EMBO J. 17, 6739-6746). Los supresores alternativos de silenciamiento son bien conocidos en la tecnica y pueden utilizarse como se describe en el presente documento (Chiba y col., 2006, Virology 346: 7-14), por ejemplo, pero sin limitacion, TEV-p1/HC-Pro (virus del grabado del tabaco-pl/HC-Pro), BYV -p21, p19 del virus de enanismo arbustivo del tomate (TBSV p19; la construccion de p19 se describe en el documento descrito en el documento WO 2010/0003225), protefna de la capside del virus de rizadura del tomate (TCV-CP), 2b del virus del mosaico del pepino; CMV-2b), p25 del virus X de la patata (PVX-p25), p11 del virus M de la patata (PVM-p11), p11 del virus S de la patata (PVS-p11), p16 del virus de quemadura del arandano, (BScV-p16), p23 del virus de la tristeza de los cftricos (CTV-p23), p24 del virus-2 asociado con el enrollamiento de hoja de la vid, (GLRaV-2 p24), p10 del virus A de la vid, (GVA-p10), p14 del virus B de la vid (GVB-p14), p10 del virus latente de Heracleum (HLV-p10) o p16 del virus latente comun del ajo (GCLV-p16).
Por lo tanto, uno o mas supresores de silenciamiento, por ejemplo, pero sin limitacion, HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV- p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, rgscam, protefna B2 de FHV, la pequena protefna de cubierta de CPMV, y la protefna de cubierta de TCV, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV- p10, GCLV-p16, o GVA-p10, pueden coexpresarse junto con el casete de expresion basado en comovirus, el elemento de amplificacion derivado de geminivirus, y la secuencia de acido nucleico que codifica la protefna de interes para asegurar ademas altos niveles de produccion de protefna dentro de una planta.
Los sistemas de expresion tambien pueden comprender elementos de amplificacion de un geminivirus, por ejemplo, un elemento de amplificacion del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV). BeYDV pertenece al genero de Mastrevirus adaptado a las plantas dicotiledoneas. BeYDV es un monopartido que tiene un genoma de ADN circular monocatenario y puede replicarse con numeros de copias muy elevados mediante un mecanismo en cfrculo rodante. Los sistemas de vectores de replicon de ADN derivado de BeYDV se han usado para una rapida produccion de protefnas de alto rendimiento en plantas.
Como se usa en el presente documento, la expresion "elementos de amplificacion" se refiere a un segmento de acido nucleico que comprende al menos una porcion de una o mas regiones intergenicas largas (o repeticion intergenica larga; LIR) de un genoma de geminivirus. Como se usa en el presente documento, "region intergenica larga", "repeticion intergenica larga", o "LIR", se refiere a una region de una region intergenica larga que contiene un sitio de union rep capaz de mediar la escision y la replicacion por una protefna Rep de geminivirus. En algunos aspectos, el segmento de acido nucleico que comprende una o mas LIR, puede comprender adicionalmente una region intergenica corta (o una region pequena intergenica; SIR) de un genoma de geminivirus. Como se usa en el presente documento, la "region intergenica corta", "pequena region intergenica" o "SIR", se refiere a la cadena complementaria (la IR corta (SIR) de un Mastrevirus). Cualquier elemento de amplificacion derivado de geminivirus adecuado puede usarse en el presente documento. Vease, por ejemplo, los documentos WO2000/20557; WO2010/025285; Zhang X. y col. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. y col. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. y col. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17). Como se muestra en las figuras 2B y 2D, si se usa mas de una LIR en la construccion, por ejemplo, dos LIR, entonces el promotor, las regiones CMPV-HT y la secuencia de acido nucleico de interes y el terminador se enmarcan por cada una de las dos LIR. Ademas, el elemento de amplificacion, por ejemplo, puede originarse a partir de la secuencia como se desvela en Halley-Stott y col. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240, depositada en Gen Bank numero de acceso DQ458791. El segmento de acido nucleico que comprende las LIR y las SIR puede determinarse alineando la secuencia deseada con las secuencias proporcionadas en el presente documento para BeYDV. Por ejemplo, el segmento de acido nucleico que comprende las LIR de la secuencia, Gen Bank DQ458791, comprende los nucleotidos 2401 a 2566 y de 1 a 128. El segmento de acidos nucleicos que comprende las SIR son los nucleotidos 1154 a 1212.
Como se usa en el presente documento, la co-administracion del vector derivado del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) y un vector que suministra Rep/RepA, por agroinfiltracion de hojas de Nicotians benthamiana da como resultado una amplificacion de replicon eficiente y una fuerte produccion de protefnas.
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Un casete de expresion basado en comovirus y un elemento de amplificacion derivado de geminivirus pueden estar comprendidos en los vectores primero y segundo respectivos, o las partes constitutivas pueden incluirse en un vector. Si se usan dos vectores, el primer y segundo vectores pueden introducirse en una celula vegetal simultaneamente o por separado.
Una replicasa vfrica tambien puede incluirse en el sistema de expresion como se describe en el presente documento para aumentar la expresion del acido nucleico de interes. Un ejemplo no limitante de una replicasa es una replicasa de BeYDV (pREP110) que codifica Rep y RepA de BeYDV (C2/C1; Huang y col., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714). Otro ejemplo no limitante de una replicasa se desvela en Halley-Stott y col. (2007, Archives of Virology 152: 1237-1240), y se deposita en Gen Bank numero de acceso DQ458791. El segmento de acido nucleico que comprende el gen C1:C2 comprende los nucleotidos 1310 a 2400.
Por “coexpresado" se entiende que dos o mas de dos secuencias de nucleotidos se expresan aproximadamente al mismo tiempo dentro de la planta, y dentro del mismo tejido de la planta. Sin embargo, las secuencias de nucleotidos no necesitan expresarse exactamente al mismo tiempo. Mas bien, las dos o mas secuencias de nucleotidos se expresan en una forma tal que los productos codificados tengan una oportunidad de interactuar. Las dos o mas de dos secuencias de nucleotidos pueden coexpresarse utilizando un sistema de expresion transitorio, donde las dos o mas secuencias se introducen dentro de la planta aproximadamente al mismo tiempo bajo condiciones tales que se expresen ambas secuencias. Como alternativa, una planta de plataforma que comprende una de las secuencias de nucleotidos puede transformarse en una forma estable, con una secuencia adicional que codifica la protefna de interes introducida en la planta de plataforma de manera transitoria.
Las construcciones de la presente invencion pueden introducirse en las celulas de la planta utilizando plasmidos Ti, plasmidos Ri, vectores virales de la planta, transformacion directa de ADN, microinyeccion, electroporacion, etc. Para la revision de tales tecnicas vease, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, Nueva York VIII, pags. 421-463 (1988); Geierson y Corey, Plant Molecular Biology, 2a Ed. (1988); y Miki e Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2a Ed. DT. Dennis, DH Turpin, dD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. Londres, pags. 561-579 (1997). Otros metodos incluyen la incorporacion directa de ADN, el uso de liposomas, electroporacion, por ejemplo, utilizando protoplastos, microinyeccion, microproyectiles o bigotes e infiltracion al vacfo. Vease, por ejemplo, Bilang, y col. (1991, Gene 100: 247-250), Scheid y col. (1991, Mol. Gen. Genet. 228: 104-112), Guerche y col. (1987, Plant Science 52: 111-116), Neuhause y col. (1987, Theor. Appl Genet. 75: 30-36), Klein y col., (2987, Nature 327: 70-73); Freeman y col. (1984, Plant Cell Physiol. 29: 1353), Howell y col. (1980, Science 208: 1265), Horsch y col. (1985, Science 227: 1229-1231), DeBlock y col., (1989, Plant Physiology 91: 694-701), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler y Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), documentos WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Liu y Lomonossoff (2002, J Virol Meth, 105: 343-348), EP 290395; WO 8706614; Pat. de Estados Unidos N.° 4.945.050; 5.036.006; y 5.100.792, solicitudes de patente de Estados Unidos n.° de serie 08/438.666, presentada el 10 de mayo de 1995, y 07/951.715, presentada el 25 de septiembre de 1992.
Pueden utilizarse metodos de expresion transitoria para expresar las construcciones de la presente invencion (vease D'Aoust y col., 2009, Methods in Molecular biology, Vol 483, paginas 41-50; Liu y Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105: 343-348). Como alternativa, puede utilizarse un metodo de expresion transitoria con base en vacfo, como se describe por Kapila y col., (1997, Plant Sci. 122, 101-108), o los documentos WO 00/063400, WO 00/037663. Estos metodos pueden incluir, por ejemplo, pero sin limitacion, un metodo de Agroinoculacion o Agroinfiltracion, filtracion con jeringa, sin embargo, tambien se pueden utilizar otros metodos transitorios como se ha indicado anteriormente. Con la Agroinoculacion, la Agroinfiltracion o la infiltracion con jeringa, una mezcla de Agrobacterias que comprende el acido nucleico deseado ingresa a los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo, las hojas, la porcion aerea de la planta (incluyendo tallo, hojas y flores), otra porcion de la planta (tallo, rafz, flor) o la planta completa. Despues de cruzar la epidermis el Agrobacterium infecta y transfiere copias de ADN-t dentro de las celulas. El ADN-t se transcribe en forma episomal y se traduce el ARNm, conduciendo a la produccion de la protefna de interes en celulas infectadas, sin embargo, el paso del ADN-t dentro del nucleo es transitorio.
Tambien se consideran parte de esta invencion las plantas transgenicas, celulas vegetales o semillas que contienen la construccion genica quimerica de la presente invencion que pueden usarse como una planta de plataforma adecuada para la expresion de protefnas transitoria que se describe en el presente documento. Los metodos de regeneracion de plantas enteras a partir de celulas vegetales tambien se conocen en la tecnica (por ejemplo, vease, Guerineau y Mullineaux (1993, Plant transformation and expression vectors. En: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pags. 121-148). En general, las celulas vegetales transformadas se cultivan en un medio apropiado, que puede contener agentes selectivos tales como antibioticos, donde se usan marcadores seleccionables para facilitar la identificacion de las celulas vegetales transformadas. Una vez se forma el callo, se puede estimular la formacion de brotes empleando las hormonas apropiadas de plantas de acuerdo con
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metodos conocidos y se transfieren los brotes al medio de enraizamiento para regeneracion de las plantas. Las plantas pueden utilizarse entonces para establecer generaciones repetitivas, ya sea a partir de semillas o utilizando tecnicas de propagacion vegetativas. Tambien pueden generarse plantas transgenicas sin usar cultivo tisular. Los metodos para una transformacion estable, y la regeneracion de estos organismos se establecen en la tecnica y se conocen por un experto en la tecnica. Las tecnicas disponibles se revisan en Vasil y col., (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984), y Weissbach y Weissbach, (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989). El metodo para obtener plantas transformadas y regeneradas no es importante para la presente invencion.
Si las plantas, porcion vegetal, o celula vegetales se van a transformar o cotransformar mediante dos o mas construcciones de acido nucleico, la construccion de acido nucleico puede introducirse en el Agrobacterium en un evento de transfeccion individual, los acidos nucleicos se agrupan, y las celulas bacterianas se transfectan como se describe. Como alternativa, las construcciones pueden introducirse en serie. En este caso, se introduce una primera construccion a la Agrobacterium como se describe, las celulas se cultivan en condiciones selectivas (por ejemplo, en presencia de un antibiotico), donde unicamente la bacteria transformada individualmente puede crecer. Tras la primera etapa de seleccion, se introduce una segunda construccion de acido nucleico a la Agrobacterum como se describe, y las celulas crecen en condiciones doblemente selectivas, donde unicamente las bacterias doblemente transformadas pueden crecer. Despues, las bacterias doblemente transformadas pueden usarse para transformar una planta, porcion de planta o celula vegetal como se describe en el presente documento, o pueden someterse a una etapa de transformacion adicional para alojar una tercera construccion de acido nucleico.
La presente divulgacion proporciona adicionalmente una planta transgenica que comprende el presente sistema de expresion, en la que el acido nucleico heterologo de interes en el casete se expresa a un nivel potenciado en comparacion con otros sistemas de expresion analogos que carecen de uno o mas componentes del sistema de expresion como se describe en el presente documento.
La presente divulgacion comprende adicionalmente un metodo para generar una protefna de interes, que comprende las etapas de proporcionar una planta, o una parte de planta, que expresa el sistema de expresion como se describe en el presente documento, cosechar, al menos, un tejido en el que la protefna de interes se ha expresado, y opcionalmente, aislar la protefna de interes del tejido.
Por lo tanto, en diversos aspectos, y sin limitacion, la invencion proporciona:
- uno o mas sistemas de expresion que comprenden un casete de expresion basado en comovirus, uno o
mas elementos de amplificacion de more BeYDV, un promotor, un acido nucleico que codifica una protefna
de interes, o un polienlazador, y opcionalmente un terminador.
- metodos de expresion de una protefna de interes, en un organismo huesped, tal como una planta, usando
uno o mas sistemas de expresion o vectores como se describe en el presente documento.
Tabla 1: Listas de secuencias
SEQ ID NO:
Descripcion Figura n.°
1
972 - HA0 de tipo silvestre de H5 A/Indonesia/5/2005 1A
2
560 - PDISP-HA0 de H1 A/California/4/2009 1B
3
971 - PDISP-HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007 1C
4
973 - PDISP-HA0 de B/Florida/4/2006 1D
5
cebador - MfeI-MluI-AscI-LIR.c -
6
cebador - SbfI-AflII-Hind III-LIR.r -
7
cebador - SacI-EcoRI-SIR.c -
8
cebador - SpeI-FseI-LIR.r -
9
849 - LIR-MCS-SIR+LIR 1E
10
853 - LIR - PDISP-HA0 de B/Florida/4/2006 - SIR+LIR 1F
11
561 - LIR - PDISP-HA0 de H1 A/California/4/2009 - SIR+LIR 1G
12
851 - LIR - PDISP-HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007 - SIR+LIR 1H
13
852 - LIR - Sp nativo con HA0 de H5 A/Indonesia/05/2005 - SIR+LIR 1I
14
848 - LIR-MCS-SIR-replicasa-LIR 1J
15
475 - LIR- PDISP-HA0 de B/Florida/4/2006 - SIR-C1/C2-LIR 1K
16
471 - LIR - PDISP-HA0 de H1 A/California/4/2009 - SIR-C1/C2-LIR 1L
17
473 - LIR - PDISP-HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007 - SIR-C1/C2-LIR 1M
18
474 - LIR - Sp nativo con HA0 de H5 A/Indonesia/05/2005 - SIR-C1/C2-LIR 1N
19
Cebador - Plasto-443c -
20
Cebador - supP19-plasto.r -
21
Cebador-supP19-1c -
22
Cebador - SupP19-SacI.r
23
Secuencia potenciadora de CPMV -
La presente invencion se describira adicionalmente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, se entiende que estos ejemplos son unicamente para fines ilustrativos, y no deben usarse para limitar el alcance de la presente invencion de ninguna manera.
5
Conjunto de casetes de expresion
Las construcciones que pueden usarse para la produccion de VLP se describen en los documentos WO 2009/009876, WO 2009/076778 y WO2010/003225, y la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 61/220.161 10 (presentada el 24 de junio de 2009. Los ejemplos no limitantes de construcciones tambien pueden incluir los enumerados en la Tabla 2. El ensamblaje de estas construcciones se describe en los documentos WO 2009/009876, WO 2009/076778, WO2010/003225 y US 61/220.161. Sin embargo, pueden usarse otras construcciones que comprenden HA conocidas, incluyendo, pero sin limitacion, las proporcionadas en la Tabla 2, y combinadas con elementos reguladores y promotores similares o diferentes, para la produccion de VLP como se describe en el 15 presente documento.
Tabla 2: Ejemplos de construcciones usadas para la produccion de hemaglutinina.
Numero de casete
HA correspondiente Abreviatura de HA
540
SpPDI-H1 de la cepa A/New Caledonia/20/99 (H1N1) H1/NC
560
SpPDI-H1 A/California/4/2009 en casete de expresion de 2X35S/CPMV-HT H1/Cal WT
580
SpPDI-H1 A/New Caledonia/20/99 en casete de expresion de 2x35S/CPMV-HT H1/NC
660
H5 de la cepa A/Indonesia/5/2005 (H5N1) H1/Indo
663
H5 A/Indonesia/5/2005 H1/Indo
685
H5 A/Indonesia/5/2005 en casete de expresion de CPMV-HT H1/Indo
686
SpPDI-H5 A/Indonesia/5/2005 en casete de expresion CPMV-HT H1/Indo
690
Dominio de union al receptor de H1 A/Brisbane/59/07 (RB) en la cadena H1/Bris
principal de H5 A/Indonesia/5/05
691
H1 A/Brisbane/59/07 esterasa y dominios de union a receptor (E1-RB-E2) en la H1/Bris
cadena principal de H5 A/Indonesia/5/05
696
Dominio de union al receptor de H5 A/Indonesia/5/05 (RB) en la cadena H1/Indo
principal de H1 A/New Caledonia/20/99
732
H1 A/Brisbane/59/2007 en casete de expresion de CPMV-HT H1/Bris
733
SpPDI-H1 A/Brisbane/59/2007 en casete de expresion de CPMV-HT H1/Bris
734
Dominio de union a receptor de H1 A/Brisbane/59/07 (RB) en cadena principal de H5 A/Indonesia/5/05 en casete de expresion de CPMV-HT H1/Bris
735
H3 A/Brisbane/10/2007 en casete de expresion de CPMV-HT H3/Bris
736
SpPDI-H3 A/Brisbane/10/2007 en casete de expresion de CPMV-HT H3/Bris
737
Ensamblaje de SpPDI-H3 A/Brisbane/10/2007 quimerico (ectodominio) + H5 A/Indonesia/5/2005 (TmD + Cola Cyto) en casete de expresion de CpMv-HT H3/Bris-H5/Indo quimera
738
HA B/Florida/4/2006 en casete de expresion de CPMV-HT B/Flo
739
SpPDI-HA B/Florida/4/2006 en casete de expresion de CPMV-HT B/Flo
745
SpPDI-HA B/Florida/4/2006 (ectodominio) + H5 A/Indonesia/5/2005 (TmD + Cola Cyto) en casete de expresion de CPMV-HT B/Flo
747
SpPDI-HA B/Florida/4/2006+ H5 A/Indonesia/5/2005 (TmD + Cola Cyto) en casete de expresion de 2X35S-CPMV-HT B/Flo
774
HA de A/Brisbane/59/2007 (H1N1) H1/Bris
775
HA de A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1) H1/Solomon
776
HA de A/Brisbane 10/2007 (H3N2) H3/Bris
777
HA de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) H3/Wisc
778
HA de B/Malaysia/2506/2004 B/Malaysia
779
HA de B/Florida/4/2006 B/Flo
780
HA de A/Singapore/1/57 (H2N2) H2/Sing
781
HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) H5/Anhui
782
HA de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) H5/Vietnam
783
HA de A/Cerceta/HongKong/W312/97 (H6N1) H6/HongKong
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
784
HA de A/Equino/Prague/56 (H7N7) H7/Prague
785
HA de A/HongKong/1073/99 (H9N2) H9/HongKong
787
H1 A/Brisbane/59/2007 H1/Bris
790
H3 A/Brisbane/10/2007 H3/Bris
798
HA B/Florida/4/2006 B/Flo
Ejemplos
Materiales y metodos - Clonacion molecular
Casetes de expresion basados en CaMV 2X35S-CPMV HT
2X35S-CPMV HT -Sp Nativo-HA0 H5 A/Indonesia/5/2005 (construccion numero 972; SEQ ID NO: 1; figura 1A). El ensamblaje de la construccion numero 972, que comprende la region codificante para HA0 de H5 A/Indonesia/5/2005 con su peptido senal nativo bajo el control del casete de expresion CaMV 2X35S-CPMV HT se ha descrito previamente (documento WO2010/003225). La secuencia del casete de expresion resultante se presenta en la figura 1A (SEQ ID NO: 1).
2X35S-CPMV HT -SpPDI-HA0 H1 A/California/4/2009 (construccion numero 560; SEQ ID NO: 1 2; figura 1B). El ensamblaje de la construccion numero 560, que comprende la secuencia nucleotfdica que codifica el peptido senal PDI de alfalfa (SpPDI) condensado a HA0 de H1 A/California/4/2009 bajo el control de CaMV 2X35S-CPMV-HT se ha descrito previamente (documento WO2010/003225). La secuencia del casete de expresion resultante se presenta en la figura 1B (SEQ ID NO: 2).
2X35S-CPMV HT-SpPDI-HA0 H3 A/Brisbane/10/2007 (construccion numero 971; SEQ ID NO: 3; figura 1C). Una secuencia que codifica el peptido senal PDI de alfalfa condensado a HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007 se ensamblo en elementos reguladores de CaMV 2X35S-CPMV-HT como se indica a continuacion. La construccion numero 736 se ha descrito previamente (vease la Publicacion PCT n.° WO 2010/003225 para el ensamblaje y la secuencia) - en resumen, la construccion 736 se digirio con las enzimas de restriccion ApaI (inmediatamente aguas arriba del ATG) y StuI (inmediatamente aguas abajo del codon de terminacion) para eliminar un fragmento que codifica SpPDI condensado a HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007. El fragmento resultante se clono en la construccion 972 (SEQ ID NO: 1'; figura 1A) digerida previamente con ApaI y StuI. A la construccion resultante se le dio el numero 971 (SEQ ID NO: 3, figura 1C).
2X35S-CPMV HT -SpPDI-HA0 B/Florida/4/2006 (construccion numero 973; SEQ ID NO:4; figura 1D). Una secuencia que codifica un peptido senal PDI de alfalfa condensado a HA0 de B/Florida/4/2006 se ensamblo en CaMV 2X35S- CPMV-HT como se indica a continuacion. La construccion numero 739 se ha descrito previamente (vease la Publicacion PCT n.° WO 2010/003225 para el ensamblaje y la secuencia) - en resumen, la construccion 739 se digirio con enzimas de restriccion ApaI (inmediatamente aguas arriba del ATG) y StuI (inmediatamente aguas abajo del codon de terminacion) para eliminar un fragmento que codifica SpPDI condensado a HA0 de B/Florida/4/2006. El fragmento resultante se clono en la construccion 972 digerida previamente con ApaI y StuI. A la construccion resultante se le dio el numero 973 (SEQ ID NO: 4, figura 1D).
Casetes basados en CaMV 2X35S-CPMV HT con elementos de amplificacion de BeYDV
Plasmido aceptor que contiene un sitio de clonacion de multiples LIR (MCS)-SIR+LIR en un vector basado en pCAMBIA (construccion 849; SEQ ID NO: 9; figura 1E). Las regiones intergenicas largas (LIR) y la region intergenica corta (SIR) del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) se insertaron en un vector binario pCAMBIA como se indica a continuacion. Un primer fragmento PCR que contenfa la secuencia BeYDV LIR se amplifico usando MfeI- MIuI-AscI-LIR.c (SEQ ID NO: 5):
CAATTGACGCGTGGCGCGCCCTAGCAGAAGGCATGTTGTTGTGACTCCGAGG y SbfI-AfIII-HindIII-LIR.r (SEQ ID NO: 6):
CCTGCAGGCTTAAGAAGCTTGTACGAATAATTCGTATCCGACGGAA
como cebadores. El fragmento de restriccion BglII de 2963 pb de la construccion pBYGFP (proporcionada amablemente por el Dr. Hugh Mason, Arizona State University) se extrajo en gel y se uso como plantilla para la primera reaccion por PCR. El vector pBYGFP se habfa descrito previamente en Huang y col. (Biotechnology and Bioengineering 103: 706-714 (2009)). El fragmento resultante se digirio con SbfI y se clono en pCAMBIA2300 (Cambia, Canberra, Australia) digerido previamente con HindIII, se trato con T4 ADN polimerasa para crear un extremo romo y finalmente se digirio con SbfI. El plasmido resultante se nombro pCAMBIA-LIR. Un segundo fragmento que contiene las secuencias BeYDV LIR y SIR se amplifico usando SacI-EcoRI-SIR.c (SEQ ID NO: 7)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
TACCGAGCTCGAATTCCGAGTGTACTTCAAGTCAGTTGGAAATC y Spel-Fsel-LIR.r (SEQ ID NO: 8) ACTAGTGGCCGGCCGTACGAATAATTCGTATCCGACGGAAATACCTGA como cebadores y el fragmento pBYGFP de restriccion de Bglll de 2116 pb como plantilla. El fragmento resultante se digirio con Sacl y se clono en pCAMBIA- LIR digerido previamente con EcoRl, se trato con T4 ADN polimerasa para crear un extremo romo y finalmente se digirio con Sacl. El plasmido resultante se nombro pCAMBlA-LlR-MCS-SlR+LlR. Con el fin de cambiar la orientacion de la secuencia LIR-MCS-SIR+LIR con respecto a la orientacion de los bordes de T-DNA, pCAMBlA-LlR-MCS- SIR+LIR se digirio con las enzimas de restriccion Mlul y Spel y los fragmentos resultantes se terminaron romos usando T4 ADN polimerasa y se ligaron de nuevo. Los clones obtenidos de la transformacion de este producto de ligacion se exploraron para determinar la orientacion y un clon en el que los elementos LIR-MCS-SIR+LIR estan en una orientacion T-DNA de izquierda a derecha, se selecciono y se mantuvo como construccion de aceptor 849. Se presenta una secuencia LIR-MCS-SIR+LIR anotada en la SEQ ID NO: 9 (figura 1E).
2X35S-CPMV HT-SpPDI-HAO B/Florida/4/2006 en elementos de amplificacion de BeYDV (construccion numero 853; SEQ ID NO: 10; figura 1F). Una secuencia que codifica un peptido senal PDI de alfalfa condensado a HA0 de B/Florida/4/2006 bajo el control de CaMV 2X35S-CPMV-HT en los elementos de amplificacion de BeYDV se ensamblo como se indica a continuacion. La construccion numero 973 (SEQ ID NO: 4, figura 1D) se digirio con Sbfl (aguas arriba del promotor CaMV 2X35S) y Xbal (aguas abajo del terminador NOS) para eliminar un fragmento que contenfa todo el casete de expresion de 2X35S-CPMV HT-SpPDl-HA0 B/Florida/4/2006. El fragmento resultante se clono en la construccion numero 849 (SEQ ID NO: 9, figura 1E) digerido previamente con Sbfl y Xbal. A la construccion resultante se le dio el numero 853 (SEQ ID NO: 10, figura 1F).
2X35S-CPMV HT -SpPDl-HA0 H1 A/California/4/2009 en elementos de amplificacion de BeYDV (construccion numero 561; SEQ ID NO: 11, figura 1G). Una secuencia que codifica un peptido senal PDI de alfalfa condensado a HA0 de H1 A/California/4/2009 bajo el control de CaMV 2X35S-CPMV-HT en los elementos de amplificacion de BeYDV se ensamblo como se indica a continuacion. La construccion numero 560 (SEQ ID NO: 2, figura 1B) se digirio con Sbfl (aguas arriba del promotor CaMV 2X35S) y Stul (aguas abajo del codon de terminacion) para eliminar un fragmento que contenfa el casete de expresion de 2X35S-CPMV HT-SpPDl-H1 A/California/4/2009 sin el terminador NOS. El fragmento resultante se clono en la construccion numero 853 (SEQ ID NO: 10, figura 1F) digerido previamente con Sbfl y Stul (que contenfa el terminador NOS). A la construccion resultante se le dio el numero 561 (SEQ ID NO: 11, figura 1G).
2X35S-CPMV HT -SpPDl-HA0 H3 A/Brisbane/10/2007 en elementos de amplificacion de BeYDV (construccion numero 851; SEQ ID NO: 12, figura 1H). Una secuencia que codifica un peptido senal PDI de alfalfa condensado a HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007 bajo el control de CaMV 2X35S-CPMV-HT en los elementos de amplificacion de BeYDV se ensamblo como se indica a continuacion. La construccion numero 971 (SEQ ID NO: 3, figura 1C) se digirio con Sbfl (aguas arriba del promotor CaMV 2X35S) y Stul (aguas abajo del codon de terminacion) para eliminar un fragmento que contenfa el casete de expresion de 2X35S-CPMV HT -SpPDl-H3 A/Brisbane/10/2007 sin el terminador NOS. El fragmento resultante se clono en la construccion numero 853 (SEQ ID NO: 10, figura 1F) digerido previamente con Sbfl y Stul (que contenfa el terminador NOS). A la construccion resultante se le dio el numero 851 (SEQ ID NO: 12, figura 1H).
2X35S-CPMV HT -Sp nativo-HA0 H5 A/lndonesia/5/2005 en elementos de amplificacion de BeYDV (construccion numero 852; SEQ ID NO: 13, figura 11). Una secuencia que codifica HA0 de H5 A/lndonesia/5/2005 con su senal nativa bajo el control de CaMV 2X35S-CPMV-HT en los elementos de amplificacion de BeYDV se ensamblo como se indica a continuacion. La construccion numero 972 (SEQ ID NO: 1; figura 1A) se digirio con Sbfl (aguas arriba del promotor CaMV 2X35S) y Stul (aguas abajo del codon de terminacion) para eliminar un fragmento que contenfa el casete de expresion de 2X35S-CPMV HT - Sp nativo-HA0 H5 A/lndonesia/5/2005 sin el terminador NOS. El fragmento resultante se clono en la construccion numero 853 (SEQ ID NO: 10, figura 1F) digerido previamente con Sbfl y Stul (que contenfa el terminador NOS). A la construccion resultante se le dio el numero 852 (SEQ ID NO: 13, figura 11).
Construction de expresion de replicasa
Construccion de expresion de replicasa (construccion numero 834). El plasmido que lleva la construccion para la expresion de replicasa de BeYDV se proporciono amablemente por el Dr. Hugh Mason (Arizona State University). La construccion numero 834 corresponde al plasmido pREP110 descrito en Huang y col. (2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714).
Casetes basados en CaMV 2X35S-CPMV HT con elementos de amplification de BeYDV y gen replicasa bajo el control de LIR
5
10
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Plasmido aceptor que contiene un sitio de clonacion de multiples LIR (MCS)-SIR-replicasa-LIR en el vector basado en pCAMBIA (construccion 848; SEQ ID NO: 14, figura 1J). La replicasa de BeYDV (C1/C2 con intron suprimido) se inserto entre BeYDV SIR y LIR y se repitio como se indica a continuacion. Un fragmento de PCR se amplifico usando SacI-EcoRI-SIR.c (SEQ iD NO: 7) y SpeI-FseI-LIR.r (SEQ ID NO: 8) como cebadores. El fragmento de restriccion de SacI-FseI de 2180 pb de la construccion pBYGFP.R (proporcionada amablemente por el Dr. Hugh Mason, Arizona State University) se extrajo en gel y se uso como plantilla para la reaccion por pCr. El vector pBYGFP.R se ha descrito previamente en Huang y col. (Biotechnology and Bioengineering 103: 706-714 (2009)). El fragmento resultante se digirio con SacI y se clono en la construccion 849 (SEQ ID NO: 9, figura 1E) digerida previamente con Mfel, se trato con T4 ADN polimerasa para crear un extremo romo y finalmente se digirio con SacI. A la construccion de aceptor resultante se le dio el numero 848 (SEQ ID NO: 14; figura 1J).
2X35S-CPMV HT -SpPDI-HAO B/Florida/4/2006 en el sistema de amplificacion de BeYDV + replicasa (construccion numero 475; SEQ ID NO: 15, figura 1K). Una secuencia que codifica un peptido senal PDI de alfalfa condensado a HA0 de B/Florida/4/2006 bajo el control de CaMV 2X35S-CPMV-HT en el BeYDV con sistema de amplificacion de replicasa se ensamblo como se indica a continuacion. La construccion numero 973 (SEQ ID NO: 4, figura 1D) se digirio con Sbfl (aguas arriba del promotor CaMV 2X35S) y Xbal (aguas abajo del terminador NOS) para eliminar un fragmento que contenfa todo el casete de expresion de 2X35S-CPMV HT -SpPDI-HA0 B/Florida/4/2006. El fragmento resultante se clono en la construccion numero 848 (SEQ ID NO: 14, figura 1J) digerido previamente con Sbfl y Xbal. A la construccion resultante se le dio el numero 475 (SEQ ID NO: 15, figura 1K).
2X35S-CPMV HT -SpPDI-HAO H1 A/California/4/2009 en sistema de amplificacion de BeYDV + replicasa (construccion numero 471; SEQ ID N0:16, figura 1L). Una secuencia que codifica un peptido senal PDI de alfalfa condensado a HA0 de H1 A/California/4/2009 bajo el control de CaMV 2X35S-CPMV-HT en el BeYDV con un sistema de amplificacion de replicasa se ensamblo como se indica a continuacion. La construccion numero 560 (SEQ ID NO: 2, figura 1B) se digirio con Sbfl (aguas arriba del promotor CaMV 2X35S) y Stul (aguas abajo del codon de terminacion) para eliminar un fragmento que contenfa el casete de expresion de 2X35S-CPMV HT-SpPDI-H1 A/California/4/2009 sin el terminador NOS. El fragmento resultante se clono en la construccion numero 475 (SEQ ID NO: 15, figura 1K) digerido previamente con Sbfl y Stul (que contenfa el terminador NOS). A la construccion resultante se le dio el numero 471 (SEQ ID NO: 16, figura 1L).
2X35S-CPMV HT -SpPDI-HAO H3 A/Brisbane/10/2007 en sistema de amplificacion de BeYDV + replicasa (construccion numero 473; SEQ ID NO: 17, figura 1M). Una secuencia que codifica un peptido senal PDI de alfalfa condensado a HA0 de H3 A/Brisbane/10/2007 bajo el control de CaMV 2X35S-CPMV-HT en el BeYDV con sistema de amplificacion de replicasa se ensamblo como se indica a continuacion. La construccion numero 971 (SEQ ID NO: 3, figura 1C) se digirio con Sbfl (aguas arriba del promotor CaMV 2X35S) y Stul (aguas abajo del codon de terminacion) para eliminar un fragmento que contenfa el casete de expresion de 2X35S-CPMV HT -SpPDI-H3 A/Brisbane/10/2007 sin el terminador NOS. El fragmento resultante se clono en la construccion numero 853 (SEQ ID NO: 10, figura 1F) digerido previamente con Sbfl y Stul (que contenfa el terminador NOS). A la construccion resultante se le dio el numero 473 (SEQ ID NO: 17, figura 1M).
2X35S-CPMV HT-Sp nativo-HAO H5 A/Indonesia/5/2005 en sistema de amplificacion de BeYDV + replicasa (construccion numero 474; SEQ ID NO: 18, figura 1N). Una secuencia que codificaba HA0 de H5 A/Indonesia/5/2005 con su senal nativa bajo el control de CaMV 2X35S-CPMV-HT en el BeYDV con sistema de amplificacion de replicasa se ensamblo como se indica a continuacion. La construccion numero 972 (SEQ ID NO: 1, figura 1A) se digirio con Sbfl (aguas arriba del promotor CaMV 2X35S) y Stul (aguas abajo del codon de terminacion) para eliminar un fragmento que contenfa el casete de expresion de 2X35S-CPMV HT - Sp nativo-HAO H5 A/Indonesia/5/2005 sin el terminador NOS. El fragmento resultante se clono en la construccion numero 853 (SEQ ID NO: 10, figura 1F) digerido previamente con Sbfl y Stul (que contenfa el terminador NOS). A la construccion resultante se le dio el numero 474 (SEQ ID NO: 18, figura 1N).
Plastocianina-P19 (construccion numero R472). La construccion de p19 se describe en el documento WO 2010/0003225. En resumen, la secuencia codificante de la protefna p19 del virus del enanismo ramificado del tomate (TBSV) se unio al casete de expresion de plastocianina de alfalfa mediante el metodo de ligacion basado en PCR presentado en Darveau y col. (Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995)). En una primera ronda de PCR, un segmento del promotor de plastocianina se amplifico usando los cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 19):
GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC
y supP19-plasto.r (SEQ ID NO: 20)
CCTTGTATAGCTCGTTCCATTTTCTCTCAAGATG
con la construccion 660 (que se describe en el documento WO 2010/0003225) como plantilla. En paralelo, otro
5
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15
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25
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35
40
45
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55
60
fragmento que contenfa la secuencia codificante de p19 se amplified con los cebadores supP19-1c (SEQ ID NO: 21):
ATGGAACGAGCTATACAAGG y SupP19-SacI.r (SEQ ID NO: 22):
AGTCGAGCTCTTACTCGCTTTCTTTTTCGAAG
usando la construccion 35S:p19 como se describe en Voinnet y col. (2003, The Plant Journal 33: 949-956) como plantilla. Despues, los productos de amplificacion se mezclan y se usan como plantilla para una segunda ronda de amplificacion (reaccion de ensamblaje) con los cebadores Plasto-443c y SupP19-SacI.r. El fragmento resultante se digirio con BamHI (en el promotor de plastocianina) y SacI (en el extremo de la secuencia codificante de p19) y se clono en la construccion numero 660, digerida previamente con las mismas enzimas de restriccion para dar la construccion numero R472. Los plasmidos se usaron para transformar Agrobacterium tarmefaciens (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, Estados Unidos) por electroporacion (Mattanovich y col., 1989, Nucleic Acids Res. 17,6747). La integridad de todas las cepas de A. tarmefaciens se confirmo mediante cartograffa de restriccion. La cepa de A. tarmefaciens que comprende R472 se denomina "AGL1/R472".
Preparacion de biomasa vegetal, inoculo, agroinfiltracion y recogida
Se cultivaron plantas de Nicotiana benthamiana a partir de semillas en suelos cargados con un sustrato de musgo de turbera comercial. Las plantas se dejaron crecer en el invernadero en un fotoperiodo de 16/8 y un regimen de temperatura de 25 °C dfa/20 °C noche. Tres semanas despues del sembrado, se recogieron plantulas individuales, se transplantaron en macetas y se dejaron crecer en el invernadero durante tres semanas mas en las mismas condiciones ambientales.
Se cultivaron Agrobacteria transfectadas con cada construccion en un medio YEB complementado con acido 2-(N- morfolino)etanosulfonico 10 mM (MES), acetosiringona 20 pM, 50 pg/ml de kanamicina y 25 pg/ml de carbenicilina pH 5,6 hasta que alcanzaron una DO600 entre 0,6 y 1,6. Las suspensiones de Agrobacterium se centrifugaron antes de su uso y se suspendieron de nuevo en medio de infiltracion (MgCl2 10 mM y MES 10 mM pH 5,6) y se almacenaron durante una noche a 4 °C. El dfa de la infi ltracion, los lotes de cultivo se diluyeron en 2,5 volumenes de cultivo y se dejaron calentar antes de su uso. Las plantas enteras de N. benthamiana se pusieron invertidas en la suspension bacteriana en un deposito de acero inoxidable estanco a un vacfo de 20-40 Torr durante 2 min. Las plantas se devolvieron al invernadero durante un periodo de incubacion de 2-6 dfas hasta la cosecha. A menos que se especifique otra cosa, todas las infiltraciones se realizaron como co-infiltracion con la cepa AGL1/R472 en una relacion 1:1 o 1:1:1 al co-infiltrarse con AGL1/834 para la co-expresion de la replicasa de BeYDV.
Las cepas de A. tarmefaciens que comprenden las diversas construcciones como se describe en el presente documento se denominan usando un prefijo de "AGL1". Por ejemplo, la construccion numero 972 que comprende A. tarmefaciens (figura 1A), se denomina "AGL1/972".
Muestreo de hoja y extraccion total de proteinas
Tras la incubacion, la parte aerea de las plantas se cosecha, se congela a -80 °C, se tritura en piezas. Las proteinas solubles totales se extrajeron homogeneizacion (Polytron) de cada muestra de material vegetal congelado- machacado en 3 volumenes de Tris 50 mM frio pH 8,0, NaCl 0,15 M, Triton X-100 al 0,1 % y fluoruro de fenilmetanosulfonilo 1 mM. Despues de la homogeneizacion, las suspensiones de centrifugaron a 10.000 g durante 10 min a 4 °C y estos extractos en bruto depurados (sobrenadante) se guardaron para los analisis.
Analisis de proteinas e inmunotransferencia
El contenido de protefna total de los extractos en bruto depurados se determino por el ensayo Brad ford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albumina serica bovina como el patron de referencia. Las proteinas se separaron por SDS- PAGE y se electrotransfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinileno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para la inmunodeteccion. Antes de la inmunotransferencia, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5 % y Tween-20 al 0,1 % en una solucion salina tamponada con Tris (TBS-T) durante 16-18 h a 4 °C.
La inmunotransferencia se realizo por incubacion con un anticuerpo primario adecuado (Tabla 3), en 2 pg/ml en leche desnatada al 2 % en TBS-Tween 20 al 0,1 %. Los anticuerpos secundarios usados para la deteccion quimioluminiscente fueron como se indica en la Tabla 3, diluidos como se indica en la leche desnatada al 2 % en TBS-Tween 20 al 0,1 %. Los complejos inmunorreactivos se detectaron por quimioluminiscencia usando luminol como el sustrato (Roche Diagnostics Corporation). La conjugacion de enzima de peroxidasa de rabano picante del
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anticuerpo IgG humano se realizo usando el kit de conjugacion de peroxidasa activada EZ-Link Plus® (Pierce, Rock ford, IL).
Tabla 3: Condiciones de electroforesis, anticuerpos y diluciones para la inmunotransferencia de las ________________________________proteinas expresadas. ___________________________
Subtipo de HA
Cepa de influenza Condicion de electroforesis Anticuerpo primario Dilucion Anticuerpo secundario Dilucion
H1
A/California/04 /09 (H1N1) Reductora FII 10-I50F 4 pg/ml Anti-raton de cabra (JIR 115-035-146) 1:10 000
H3
A/Brisbane/10/ 2007(H3N2) No reductora TGA AS393 1:4000 Anti-oveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H5
A/Indonesia/5/ 2005 (H5N1) Reductora ITC IT -003005V 1:4000 Anti-raton de cabra (JIR 111-035-144) 1:10 000
B
B/Florida/4/200 6 No reductora NIBSC 07/356 1:2000 Anti-oveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
FII: Fitzgerald Industries International, Concord, MA, Estados Unidos; NIBSC: National Institute for Biological Standards and Control; JIR: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Estados Unidos; ITC: Immune Technology Corporation, Woodside, NY, Estados Unidos; TGA: Therapeutic Goods Administration, Australia.
Ejemplo 1 - Combination del sistema de expresion CPMV-HT con el sistema de amplification de BeYDV.
Sainsbury y Lomonossoff han desarrollado un sistema eficiente para la expresion de proteinas recombinantes en plantas (2008, Plant Physiology 148, 1212-1218). Como se indica en el documento WO 2009/087391, el sistema usa regiones no traducidas (UTR) del ARN 2 genomico del virus del mosaico del caupi (CPMV) en las que los dos primeros codones de inicio de la traduccion que se encuentran en la secuencia lider 5' se han eliminado. Al combinarse con el promotor CaMV 35S y el terminador de nopalina sintasa (NOS), las CPMV UTR modificadas se mostraron para potenciar la traduccion de la region codificante flanqueante. El sistema de expresion basado en CPMV se nombro CPMV-HT (hipertraducible).
El documento WO 2010/025285 indica que el sistema de amplificacion de ADN basado en la maquinaria de reaplicacion del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) aumenta eficientemente el nivel de expresion transitoria de proteinas recombinantes en las plantas.
Se descubrio que el sistema de expresion de CPMV-HT para la produccion de hemaglutinina de influenza (HA) por agroinfiltracion en Nicotiana benthamiana producfa altos niveles de acumulacion de HA en varias, sino todos los tipos de HA que se ensayaron (datos no mostrados). Tambien se observo que el nivel de acumulacion de HA expresable puede potenciarse reemplazando el promotor CaMV 35S por una version modificada, denominada promotor CaMV 35S doble que tiene una duplicacion del elemento regulador aguas arriba (datos no mostrados).
Para potenciar adicionalmente los niveles de acumulacion de HA, se prepararon construcciones de ADN que combinaron el sistema de expresion de CPMV-HT con el sistema de amplificacion de BeYDV. El ensamblaje de las construcciones se describe en la seccion de materiales y metodos (anteriormente; vease la figura 1A-1M y la Tabla 1). Una representacion esquematica de las construcciones ensayadas se presenta en la figura 2. Las construcciones resultantes se compararon con sus homologas basadas en CPMV-HT para determinar su eficacia para impulsar un alto nivel de acumulacion de HA en plantas agroinfiltradas. Las plantas que produjeron HA bajo el control de CPMV- HT se cosecharon y se congelaron 5-6 dfas posteriores a la infiltracion, mientras que las plantas que produjeron HA bajo el control de CPMV-HT + BeYDV se cosecharon y se congelaron 3-4 dfas posteriores a la infiltracion. El dfa del analisis, las proteinas solubles totales se extrajeron de biomasas congeladas y el nivel de acumulacion de HA se analizo por Western blot como se ha descrito anteriormente.
El analisis de Western del nivel de acumulacion de HA en la biomasa mostro que se detecto un ato nivel de HA del virus de tipo B (de influenza B/Florida/4/2006) en las plantas transformadas con construcciones que combinan el sistema de amplificacion de BeYDV con el sistema de expresion de CPMV-HT (AGL1/853; vease la figura 1F + AGL1/834 + AGL1/R472), frente a la expresion no detectable de de la misma HA del virus de influenza B al usar el sistema CPMV-HT en solitario (AGL1/973; vease la figura 1D + AGL1/R472; figura 3A). Una comparacion de las mismas estrategias de expresion para H3 (A/Brisbane/10/2007; H3N2) indica que, aunque CPMV-HT en solitario impulsa una expresion detectable de H3 (AGL1/971; vease la figura 1C+ AGL1/R472), la combinacion del sistema de amplificacion de BeYDV con CPMV-HT aumento adicionalmente el nivel de acumulacion de H3 (AGL1/851; vease la figura 1H + AGL1/834 + AGL1/R472; figura 3B).

Claims (15)

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    1. Un sistema de expresion vegetal que comprende una primera secuencia de acido nucleico que comprende una region reguladora, ligada operativamente a uno o mas de un potenciador de comovirus, una secuencia nucleotfdica que codifica una hemaglutinina de influenza, en el que la hemaglutinina de influenza se selecciona entre hemaglutinina de influenza tipo B y hemaglutinina del subtipo H3 de influenza tipo A y uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus, y una segunda secuencia de acido nucleico que codifica una replicasa de geminivirus.
  2. 2. El sistema de expresion vegetal de la reivindicacion 1, en el que la region reguladora se selecciona entre un promotor de plastocianina, un promotor CaMV 35S, un promotor 2x CaMV35S, un promotor CAS, un promotor RbcS, un promotor Ubi, y un promotor de actina.
  3. 3. El sistema de expresion vegetal de la reivindicacion 1 o 2, en el que el uno o mas de un potenciador de comovirus es una 5' UTR de comovirus, una 5' UTR del virus del mosaico del caupf (CPMV), o comprende la secuencia nucleotfdica de la SEQ ID NO: 23.
  4. 4. El sistema de expresion vegetal de una cualquiera de la reivindicacion 1-3, en el que la primera secuencia de acido nucleico comprende adicionalmente una 3' UTR del virus del mosaico del caupf o una 3' UTR de plastocianina.
  5. 5. El sistema de expresion vegetal de una cualquiera de la reivindicacion 1-4, en el que la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico se situan en la misma molecula de acido nucleico, o se situan en diferentes moleculas de ADN.
  6. 6. El sistema de expresion vegetal de una cualquiera de la reivindicacion 1-5, en el que el uno o mas de un elemento de amplificacion de geminivirus se selecciona entre una region intergenica larga del virus del enanismo amarillo de la judfa (BeYDV LIR), y una region intergenica corta del BeYDV (BeYDV SIR).
  7. 7. El sistema de expresion vegetal de una cualquiera de la reivindicacion 1-6, en el que la hemaglutinina de influenza comprende una secuencia de peptido serial nativo, o un peptido serial no nativo.
  8. 8. El sistema de expresion vegetal de una cualquiera de la reivindicacion 1-7, que comprende adicionalmente una tercera secuencia de acido nucleico, codificando la tercera secuencia de acido nucleico un supresor de silenciamiento, en el que el supresor de silenciamiento es HcPro o pa19.
  9. 9. El sistema de expresion vegetal de la reivindicacion 8, que comprende adicionalmente una cuarta secuencia de acido nucleico, codificando la cuarta secuencia de acido nucleico una protefna chaperona, en el que la protefna chaperona es Hsp40 o Hsp70.
  10. 10. Un metodo para producir una hemaglutinina de influenza o una partfcula tipo virus de la influenza (VLP) en una planta o en una porcion de una planta, comprendiendo el metodo la introduccion en la planta o en la porcion de una planta del sistema de expresion vegetal de la reivindicacion 1, e incubar la planta o la porcion de una planta en condiciones que permiten la expresion de la secuencia nucleotfdica que codifica la hemaglutinina de influenza, produciendo de esta manera la hemaglutinina de influenza o la VLP de influenza.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, en el que en la etapa de introduccion, la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico se situan en la misma molecula, o la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico se situan en diferentes moleculas.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que la primera secuencia de acido nucleico y la segunda secuencia de acido nucleico se situan en diferentes moleculas, y las diferentes moleculas se introducen en la planta o en la porcion de una planta al mismo tiempo.
  13. 13. El metodo de una cualquiera de la reivindicacion 10-12, en el que, en la etapa de incubacion, la expresion de la secuencia nucleotfdica que codifica la hemaglutinina de influenza es una expresion transitoria.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion una cualquiera de la reivindicacion 10-13, que comprende adicionalmente una etapa de recolectar la planta o la porcion de una planta, obteniendo de esta manera una planta recolectada o porcion de una planta que contiene la VLP de influenza.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 14, que comprende adicionalmente una etapa de aislar la VLP de
    influenza de la planta recolectada o porcion de una planta que contiene la VLP de influenza, obteniendo de esta manera una VLP aislada de influenza.
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