JP6025214B2 - 植物発現系 - Google Patents
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Description
トランスジェニック植物の代替物は、植物ウイルス系発現ベクターを使用することである。植物ウイルス系ベクターは、植物中でのタンパク質の迅速で高レベルの一時的発現を可能にする。
・上記植物中または上記植物の1部中に、1種または2種以上のコモウイルスエンハンサーと操作可能に連結している調節領域、興味あるヌクレオチド配列であってインフルエンザ血球凝集素をコード化するヌクレオチド配列および1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分を含む第1核酸配列と、ジェミニウイルスレプリカーゼをコード化する第2核酸とを含む植物発現系を導入する工程;および、
・上記植物または上記植物の1部を、上記インフルエンザ血球凝集素をコード化する上記ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下にインキュベートし、それによって上記インフルエンザVLPを産生させる工程。
・上記植物中または上記植物の1部中に、1種または2種以上のコモウイルスエンハンサーと操作可能に連結している調節領域、興味あるヌクレオチド配列および1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分を含む第1核酸配列と、ジェミニウイルスレプリカーゼをコード化する第2核酸とを含む植物発現系を導入する工程;および、
・上記植物または上記植物の1部を、上記興味あるタンパク質をコード化する上記ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下にインキュベートし、それによって上記興味あるタンパク質を産生させる工程。
RNA‐2中の位置161における開始部位であり得る。位置161の開始コドン前後の変異は、例えば開始コドンの前後を分裂させることによって位置161の開始コドン自体の変異と同じまたは同様な効果を有し得、開始コドンがより頻繁にバイパス化されることを意味し得る。
RNA‐2がコード化する2つのカルボキシ共末端タンパク質の短い方(95Kタンパク質)の産生における開始部位として作用する位置512における開始部位とインフレームで存在する。
ササゲモザイクウイルスRNA‐2 (NC_003550)、ササゲ重度モザイクウイルスRNA‐2 (NC_003544)、スカッシュモザイクウイルスRNA‐2 (NC_003800)、スカッシュモザイクウイルス キンブル(Kimble)株RNA‐2 (AF059533)、スカッシュモザイクウイルス アリゾナ株RNA‐2 (AF059532)、レッド・クローバー斑葉病ウイルスRNA‐2 (NC_003738)、ビーンポッド斑点病ウイルスRNA‐2 (NC_003495)、ビーンポッド斑点病ウイルス K‐Hopkins1株RNA‐2 (AF394609)、ビーンポッド斑点病ウイルス K‐Hancock1株RNA‐2 (AF394607)、アンデスポテト斑点病ウイルス(Andean potato mottle virus) (APMoV: L16239)およびダイコンモザイクウイルス(RaMV;AB295644)。
また、ビーンルゴースモザイクウイルス(bean rugose mosaic virus) (BRMV、AF263548)およびコモウイルス属の暫定的メンバー、即ち、カブリングスポットウイルス(turnip ringspot virus) (EF191015)から入手し得る部分RNA‐2配列も存在する。また、コモウイルス科の他の属種由来の多くの配列も入手可能である。今日まで、研究されてきた全てのコモウイルスは、それらウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントに由来する2つのカルボキシ共末端ポリタンパク質の発現における2つの選択的開始コドンを有することが証明されている。特に、CPMV、CPSMV、BPMV、SqMVおよびRCMVのRNA‐2ゲノムセグメントは、2つのカルボキシ共末端ポリタンパク質の発現における2つの選択的開始コドンを含むことが知られている。
TATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTG
2008 Nucleic Acids Research 36: D497‐D503):biohealthbase.org/GSearch/home.do?decorator=Influenza;或いは、National Center for Biotechnology Informationが維持するデータベース (URL:ncbi.nlm.nih.gov参照)を参照されたい;両データベースは、参考として本明細書に合体させる)。
(H6N1)株に由来し得る。また、上記核酸分子がコード化するH7タンパク質も、A/ウマ/プラハ/56 (H7N7)株に由来し得る。さらに、上記核酸分子がコード化するH9タンパク質は、A/香港/1073/99 (H9N2) 株に由来し得る。上記核酸がコード化するB型由来のHAタンパク質は、B/フロリダ/4/2006、B/マレーシア/2506/2004またはB/ブリスベン/60/08株に由来し得る。H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9サブタイプまたはB型由来のそのようなHAタンパク質をコード化する核酸分子の配列の例は、WO 2009/009876号、WO 2009/076778号、WO 2010/003225号に記載されているような配列がある(これらの文献は、参考として本明細書に合体させる)。上記核酸配列は、インフルエンザウイルスHAタンパク質H5インドネシアをコード化し得る。
Plant Physiol. 106: 459‐467)遺伝子、トウモロコシユビキチン1遺伝子(Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637‐646)、シロイヌナズナユビキチン1および6遺伝子(Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637‐646)、タバコ翻訳開始因子4A遺伝子(Mandel et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995‐1004)、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター、pCAS (Verdaguer等、1996年)、リブロース二リン酸カルボキシゲナーゼの小サブユニットのプロモーター、pRbcS: (Outchkourov et al., 2003)、pUbi (単子葉植物および双子葉植物における)がある。
TEV‐p1/HC‐Pro (タバコエッチ病ウイルスp1/HC‐Pro)、BYV‐p21、トマトブッシースタントウイルスのp19 (TBSV p19;p19 の構築は、WO 2010/0003225号に記載されている;この特許文献は、参考として本明細書に合体させる)、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質(TCV‐CP)、キュウリモザイクウイルスの2b (CMV‐2b)、ジャガイモウイルスXのp25 (PVX‐p25)、ジャガイモウイルスMのp11 (PVM‐p11)、ジャガイモウイルスSのp11 (PVS‐p11)、ブルーベリースコーチウイルスのp16 (BScV‐p16)、カンキツトリステザウイルスのp23 (CTV‐p23)、ブドウ葉巻随伴病ウイルス‐2 (Grapevine leafroll-associated virus‐2)のp24 (GLRaV‐2 p24)、ブドウ葉巻ウイルスA (Grapevine virus A)のp10, (GVA‐p10)、ブドウ葉巻ウイルスB (Grapevine virus B)のp14 (GVB‐p14)、ハナウド潜在ウイルス(Heracleum latent virus)のp10 (HLV‐p10)またはニンニク共通潜在ウイルス(Garlic common latent virus)のp16 (GCLV‐p16)。
Archives of Virology 152: 1237‐1240;この文献は、参考として本明細書に合体させる)に開示され、Gen Bank受託番号 DQ458791として寄託されている。C1:C2 遺伝子を含む核酸セグメントは、ヌクレオチド1310〜2400を含む。
・コモウイルス系発現カセット、1種以上のBeYDV増幅成分、プロモーター、興味あるタンパク質をコード化する核酸またはポリリンカー、および任意構成成分としてのターミネーターを含む1種以上の発現系。
・植物のような宿主生物体中での、本明細書において説明しているような1種以上の発現系またはベクターを使用しての興味あるタンパク質の発現方法。
本発明の1種以上の発現系またはベクター由来の興味あるタンパク質を発現する宿主細胞および生物体、および上記宿主および生物体の産出方法。
表1:配列リスト
VLPの産生において使用し得る構築物は、WO2009/009876号、WO2009/076778号およびWO2010/003225号、並びに米国仮出願第61/220,161号 (2009年6月24日に出願)に記載されている;これらの特許文献は、全て、本明細書に参考として合体させる。また、構築物の非限定的な例としては、下記の表2に載せている構築物があり得る。これらの構築物のアッセンブリは、WO2009/009876号、WO2009/076778号、WO2010/003225号およびUS61/220,161号に記載されている。しかしながら、限定するものではないが、表2に提示しているもののような既知のHAを含み、且つ同様なまたは異なる調節成分およびプロモーターと組合せた他の構築物も、本明細書において説明するようなVLPの産生において使用し得る。
表2:血球凝集素産生において使用する構築物の例
材料および方法(分子クローニング)
CaMV 2X35S‐CPMV HT‐系発現カセット
原生シグナルペプチドを含むH5 A/インドネシア/5/2005由来のHA0に対するコーディング領域をCMV 2X35S‐CPMV HT発現カセットの制御下に含む構築物番号972のアッセンブリは、以前に開示されている(WO2010/003225号;参考として本明細書に合体させる)。得られる発現カセットの配列は、図1Aに提示している(SEQ ID NO:1)。
H1 A/カリフォルニア/4/2009由来のHA0にCaMV 2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチド(SpPDI)をコード化するヌクレオチド配列を含む構築物番号 560のアッセンブリは、以前に開示されている(WO2010/003225号)。得られる発現カセットの配列は、図1Bに提示している(SEQ ID NO:2)。
H3 A/ブリスベン/10/2007由来のHA0に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、以下のようにして、CaMV 2X35S‐CPMV‐HT調節成分中に組込んだ。構築物番号736は、以前に開示されている(PCT公開WO 2010/003225号を、アッセンブリおよび配列について参照されたい);要するに、構築物736を制限酵素ApaI (ATGの直ぐ上流)およびStuI (停止コドンの直ぐ下流)によって消化して、H3 A/ブリスベン/10/2007由来のHA0に融合させたSpPDIをコード化するフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、ApaIおよびStuIで前以って消化した構築物972 (SEQ ID NO:1;図1A)中にクローニングした。得られた構築物に番号971を付した(SEQ ID NO:3;図1C)。
B/フロリダ/4/2006由来のHA0に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、以下のようにして、CaMV 2X35S‐CPMV‐HT中に組込んだ。構築物番号739は、以前に開示されている(PCT公開WO 2010/003225号を、アッセンブリおよび配列について参照されたい);要するに、構築物739を制限酵素ApaI(ATGの直ぐ上流)およびStuI (停止コドンの直ぐ下流直)によって消化して、B/フロリダ/4/2006に由来のHA0に融合させたSpPDIをコード化するフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、ApaIおよびStuIで前以って消化した構築物 972中にクローニングした。得られた構築物に番号973を付した(SEQ ID NO:4、図1D)。
インゲン黄萎病ウイルス (BeYDV)由来の長遺伝子間領域(LIR)と短遺伝子間領域(SIR)を、以下のようにして、pCAMBIA二成分ベクター中に挿入した。BeYDV LIR配列を含有する第1PCRフラグメントを、MfeI‐MluI‐AscI‐LIR.c (SEQ ID NO:5):CAATTGACGCGTGGCGCGCCCTAGCAGAAGGCATGTTGTTGTGACTCCGAGGと、SbfI‐AflII‐HindIII‐LIR.r (SEQ ID NO:6):CCTGCAGGCTTAAGAAGCTTGTACGAATAATTCGTATCCGACGGAAとをプライマーと使用して増幅した。構築物pBYGFPの2963 pb BglII制限フラグメント(アリゾナ州立大学のHugh Mason博士から親切に贈与された)をゲル抽出し、第1PCR反応におけるテンプレートとして使用した。ベクターpBYGFPは、Huang等(Biotechnology and Bioengineering 103:706‐714 (2009))において以前に開示されている。得られたフラグメントをSbfIで消化し、HindIIIで前以って消化したpCAMBIA2300 (Cambia社;オーストラリアのキャンベラ)中にクローニングし、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を生じさせ、最後にSbfIで消化した。得られたプラスミドをpCAMBIA‐LIRと命名した。BeYDV LIRおよびSIR配列を含有する第2フラグメントを、SacI‐EcoRI‐SIR.c (SEQ ID NO:7):TACCGAGCTCGAATTCCGAGTGTACTTCAAGTCAGTTGGAAATCと、SpeI‐FseI‐LIR.r (SEQ ID NO:8):ACTAGTGGCCGGCCGTACGAATAATTCGTATCCGACGGAAATACCTGAとをプライマーとして、また、2116 pb BglII制限pBYGFPフラグメントをテンプレートとして使用して増幅した。得られたフラグメントをSacIで消化し、EcoRIで前以って消化したpCAMBIA‐LIR中にクローニングし、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を生じさせ、最後にSacIで消化した。得られたプラスミドをpCAMBIA‐LIR‐MCS‐SIR+LIRと命名した。T‐DNA境界の配向に対するLIR‐MCS‐SIR+LIR配列の配向を変化させるために、pCAMBIA‐LIR‐MCS‐SIR+LIRを、MluIおよびSpeI制限酵素で消化し、得られたフラグメントを、T4 DNAポリメラーゼを使用して平滑末端化し、再連結反応させた。この連結反応産生物の形質転換から得られたクローンを配向についてスクリーニングし、LIR‐MCS‐SIR+LIR成分が左から右のT‐DNA配向にあるクローンを選択し、アクセプター構築物849として保った。注釈LIR‐MCS‐SIR+LIR配列は、SEQ ID NO:9に提示している(図1E)。
B/フロリダ/4/2006由来のHA0にCaMV 2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、BeYDV増幅成分中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号973 (SEQ ID NO:4;図1D)を、SbfI (CaMV 2X35Sプロモーターの上流)およびXbaI (NOSターミネーターの下流)によって消化し、2X35S‐CPMV HT‐SpPDI‐HA0 B/フロリダ/4/2006発現カセット全体を含有するフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、前以ってSbfIおよびXbaIで消化した構築物番号849 (SEQ ID NO:9;図1E)中にクローニングした。得られた構築物に番号853を付した(SEQ ID NO:10;図1F)。
H1 A/カリフォルニア/4/2009由来のHA0にCaMV 2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、BeYDV増幅成分中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号560 (SEQ ID NO:2;図1B)を、SbfI (CaMV 2X35Sプロモーターの上流)およびStuI(停止コドンの下流)によって消化して、2X35S‐CPMV HT‐SpPDI‐H1 A/カリフォルニア/4/2009発現カセットを含有し、NOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、前以ってSbfIおよびStuI(NOSターミネーターを含有する)で消化した構築物番号 853 (SEQ ID NO:10;図1F)中にクローニングした。得られた構築物に番号561を付した(SEQ ID NO:11;図1G)。
H3 A/ブリスベン/10/2007由来のHA0にCaMV 2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、BeYDV増幅成分中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号971 (SEQ ID NO:3、図1C)を、SbfI (CaMV 2X35Sプロモーターの上流)およびStuI (停止コドンの下流)によって消化して、2X35S‐CPMV HT‐SpPDI‐H3 A/ブリスベン/10/2007発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuI (NOSターミネーターを含有する)によって前以って消化した構築物番号 853 (SEQ ID NO:10、図1F)中にクローニングした。得られた構築物に番号851を付した(SEQ ID NO:12、図1H)。
原生シグナル中のH5 A/インドネシア/5/2005由来のHA0をCaMV 2X35S‐CPMV‐HTの制御下にコード化する配列を、BeYDV増幅成分中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号 972 (SEQ ID NO:1、図1A)を、SbfI (CaMV 2X35Sプロモーターの上流)およびStuI (停止コドンの下流)によって消化して、2X35S‐CPMV HT‐原生Sp‐HA0 H5 A/インドネシア/5/2005発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuI (NOS末端を含有する)によって前以って消化した構築物番号 853 (SEQ ID NO:10、図1F)中にクローニングした。得られた構築物に番号852を付した(SEQ ID NO:13、図1I)。
BeYDVレプリカーゼの発現用の構築物を担持するプラスミドは、Hugh Mason博士(アリゾナ州立大学)から親切に贈与された。構築物番号834は、Huang等(2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706‐714)に記載されているプラスミドpREP110に相当する。
BeYDVレプリカーゼ (イントロン欠落C1/C2)を、以下のようにして、BeYDV SIRおよびLIR繰返しの間に挿入した。PCRフラグメントを、SacI‐EcoRI‐SIR.c (SEQ ID NO:7)およびSpeI‐FseI‐LIR.r (SEQ ID NO:8)をプライマーとして使用して増幅した。構築物pBYGFP.R (アリゾナ州立大学のHugh Mason博士から親切に贈与された)の2180 pb SacI‐FseI制限フラグメントをゲル抽出し、PCR反応におけるテンプレートとして使用した。ベクターpBYGFP.Rは、Huang等(Biotechnology and Bioengineering 103: 706‐714 (2009))に以前に開示されている。得られたフラグメントをSacIで消化し、MfeIによって前以って消化した構築物 849 (SEQ ID NO:9:図1E)中にクローニングし、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を生じさせ、最後にSacIによって消化した。得られたアクセプター構築物に番号848を付した(SEQ ID NO:14、図1J)。
B/フロリダ/4/2006由来のHA0にCaMV 2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、レプリカーゼ増幅系を含むBeYDV中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号 973 (SEQ ID NO:4、図1D)をSbfI (CaMV 2X35Sプロモーターの上流)およびXbaI (NOSターミネーターの下流)によって消化して、2X35S‐CPMV HT‐SpPDI‐HA0 B/フロリダ/4/2006発現カセット全体を含有するフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびXbaIによって前以って消化した構造番号 848 (SEQ ID NO:14、図1J)中にクローニングした。得られた構築物に番号 475を付した(SEQ ID NO:15、図1K)。
H1 A/カリフォルニア/4/2009由来のHA0にCaMV 2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドコード化する配列を、レプリカーゼ増幅系を含むBeYDV中に、以下のようにして組込んだ。構造番号 560 (SEQ ID NO:2、図1B)をSbfI (CaMV 2X35Sプロモーターの上流)およびStuI (停止コドンの下流)によって消化して、2X35S‐CPMV HT‐SpPDI‐H1 A/カリフォルニア/4/2009発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuI (NOSターミネーターを含有する)によって前以って消化した構築物番号475 (SEQ ID NO:15、図1K)中にクローニングした。得られた構築物に番号471を付した(SEQ ID NO:16図1L)。
H3 A/ブリスベン/10/2007由来のHA0にCaMV 2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、レプリカーゼ増幅系を有するBeYDV中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号 971 (SEQ ID NO:3、図1C)をSbfI (CaMV 2X35Sプロモーターの上流)およびStuI (停止コドンの下流)によって消化して、2X35S‐CPMV HT‐SpPDI‐H3 A/ブリスベン/10/2007発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuI (NOSターミネーターを含有する)によって前以って消化した構築物番号 853 (SEQ ID NO:10、図1F)中にクローニングした。得られた構築物に番号473を付した(SEQ ID NO:17、図1M)。
原生シグナル内のH5 A/インドネシア/5/2005由来のHA0をCaMV 2X35S‐CPMV‐HTの制御下にコード化する配列を、レプリカーゼ増幅系を含むBeYDV中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号 972 (SEQ ID NO:1、図1A)を、SbfI (CaMV 2X35Sプロモーターの上流)およびStuI (停止コドンの下流)によって消化して、2X35S‐CPMV HT‐原生Sp‐HA0 H5 A/インドネシア/5/2005発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuI (NOSターミネーターを含有する)によって前以って消化した構築物番号 853 (SEQ ID NO:10、図1F)中にクローニングした。得られた構築物に番号474を付した(SEQ ID NO:18、図1N)。
p19の構築は、WO 2010/0003225号に記載されている (この特許文献は、参考として本明細書に合体させる)。簡潔に述べれば、トマトブッシースタントウイルス(TBSV)のp19タンパク質のコーディング配列を、アルファルファプラストシアニン発現カセットに、Darveau等(Methods in Neuroscience 26: 77‐85(1995))に提示されているPCR系連結反応法によって連結させた。PCR第1ラウンドにおいて、プラストシアニンプロモーターのセグメントを、プライマーPlasto‐443c (SEQ ID NO:19):GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTCとsupP19‐plasto.r (SEQ ID NO:20):CCTTGTATAGCTCGTTCCATTTTCTCTCAAGATGとをテンプレートとしての構築物660 (WO 2010/0003225号に記載されいる;この特許文献は、参考として本明細書に合体させる)と一緒に使用して増幅させた。並行して、上記p19のコーディング配列を含有するもう1つのフラグメントを、プライマーsupP19‐1c (SEQ ID NO:21):ATGGAACGAGCTATACAAGGおよびSupP19‐SacI.r (SEQ ID NO:22):AGTCGAGCTCTTACTCGCTTTCTTTTTCGAAGとによって、Voinnet等(2003, The Plant Journal 33: 949‐956)に記載されているような構築物35S:p19をテンプレートとして使用して増幅させた。その後、増幅産生物を混合し、プライマーPlasto‐443cおよびSupP19‐SacI.rによる第2ラウンドの増幅(組込み反応)におけるテンプレートとして使用した。得られたフラグメントを、BamHI (プラストシアニンプロモーター中の)およびSacI (p19コーディング配列末端の)によって消化し、同じ制限酵素によって前以って消化した構築物番号660中にクローニングして、構築物番号 R472を得た。上記プラスミドを使用して、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacteium tumefaciens) (AGL1;ATCC、米国マナッサスVA 20108)を、エレクトロポレーション(Mattanovich et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17 , 6747)によって形質転換した。全てのA. ツメファシエンス株の完全性を、制限マッピングによって確認した。R472を含むA. ツメファシエンス株を“AGL1/R472”と命名した。
ベンサミアナタバコの苗を、市販のピートモス基材を充たしたフラット(薄い木箱)内で種子から栽培した。苗を、温室内で、16/8光周期および昼25℃/夜20℃の温度管理下に繁殖させた。播種の3週間後に、個々の胚を摘出し、鉢に移植し、温室内でさらに3週間同じ環境条件下に繁殖させた。
培養後、苗の地上部分を収穫し、−80℃で凍結し、断片に粉砕した。総可溶性タンパク質を、各凍結粉砕植物材料サンプルを3容量の低温50mMのTris pH8.0、0.15MのNaCl、0.1%のTriton X‐100および1mMのフッ化フェニルメタンスルホニル中で均質化する(Polytron)ことによって抽出した。均質化後、スラリーを10,000gで4℃にて10分間遠心分離し、これらの浄化粗抽出物 (上清)を分析のために保存した。
浄化粗抽出物の全タンパク質含有量を、ウシ血清アルブミンを参照標準として使用するブラッドフォード(Bradford)アッセイ(Bio‐Rad社、カリフォルニア州ヘラクレス)によって測定した。タンパク質をSDS‐PAGEによって分離し、免疫検出のためのポリビニレンジフルオリド (PVDF)膜 (Roche Diagnostics Corporation社、インディアナ州インディアナポリス)上に電気移動させた。免疫ブロッティングの前に、上記膜をトリス緩衝食塩水(TBS‐T)中の5%スキムミルクおよび0.1%のTween‐20によって16〜18時間4℃で遮断した。
表3:発現タンパク質の免疫ブロットのための電気泳動状況、抗体および希釈
SainsburyとLomonossoffは、植物中での組換えタンパク質発現用の効率的な系を開発している(2008, Plant Physiology 148, 1212‐1218)。WO 2009/087391号において教示しているように、上記の系は、5’リーダー配列中に見出される2つの最初の翻訳開始コドンが欠落しているところのササゲモザイクウイルス(CPMV)のゲノムRNA 2の非翻訳領域(UTR)を使用している。CaMV 35Sプロモーターおよびノパリンシンターゼ(NOS)ターミネーターに結合させたとき、変性CPMV UTRが隣接コーディング領域の翻訳を増進させることを証明した。該CPMV系発現系をCPMV‐HTと命名した(HT:hypertranslatable即ち、高翻訳可能)。
WO 2010/025285号は、単一ベクター中に組込んだBeYDV系DNA増幅系の使用を教示している。この系においては、レプリカーゼ遺伝子 (C1およびC2)は、ウイルスLIRプロモーターの制御下にある。提示した結果は、単一ベクターBeYDV系が、別々のプラスミド上にレプリカーゼ遺伝子を含むBeYDV系と等価であることを示していた。本発明者等は、CPMV‐HT+BeYDV発現系が、単一ベクター上に組込んだときにHA発現において有効であるかどうかを試験した。HAおよびレプリカーゼ発現用の単一ベクターの略図を図2Dに示している。試験した全ての例において、上記ウイルスLIRプロモーターの制御下にC1/C2遺伝子 (即ち、シス形のレプリカーゼ)を担持する単一ベクター系は、レプリカーゼ遺伝子が別々のプラスミド上に存在する2重ベクター(トランス形のレプリカーゼ)よりも多いHAを産生していた。結果は、図4A〜4Dに示している。
さらにまた、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するためにも使用し得る。
全ての実施態様、修正および変形を包含する。当業者にとっては、多くの変形および修正を、特許請求の範囲において定義したような本発明の範囲から逸脱することなくなし得ることは明白であるであろう。そのような修正の例としては、本発明のあらゆる局面における、同じ結果を実質的に同じ方法で達成するための既知の等価物の置き換えがある。
Claims (21)
- 1種または2種以上のコモウイルスエンハンサーと操作可能に連結している調節領域、インフルエンザ血球凝集素をコード化するヌクレオチド配列(前記インフルエンザ血球凝集素は、インフルエンザB型血球凝集素、インフルエンザA型サブタイプH3血球凝集素、およびインフルエンザA型サブタイプH5血球凝集素から選ばれる)および1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分を含む第1核酸配列と、ジェミニウイルスレプリカーゼをコード化する第2核酸配列とを含む植物発現系。
- 前記調節領域が、プラストシアニンプロモーター、CaMV 35Sプロモーター、2x CaMV35Sプロモーター、CASプロモーター、RbcSプロモーター、Ubiプロモーター、およびアクチンプロモーターから選ばれる、請求項1記載の植物発現系。
- 前記1種または2種以上のコモウイルスエンハンサーが、コモウイルスゲノムRNA 2の5’非翻訳領域(UTR)である、請求項1記載の植物発現系。
- 前記5’UTRが、ササゲモザイクウイルス(CPMV) ゲノムRNA 2由来の5’UTRである、請求項3記載の植物発現系。
- 前記5’UTRが、SEQ ID NO:23のヌクレオチド配列を含む、請求項4記載の植物発現系。
- 前記第1核酸配列が、さらに、コモウイルスゲノムRNA 2の3’非翻訳領域(UTR)を含む、請求項3記載の植物発現系。
- 前記3’UTRが、ササゲモザイクウイルス(CPMV) ゲノムRNA 2由来の 3’UTRおよびプラストシアニン3’ UTRから選ばれる、請求項6記載の植物発現系。
- 前記第1核酸配列と第2核酸配列が同じ核酸分子上に配置されているか、或いは、これらの第1核酸配列および第2核酸配列が異なるDNA分子上に配置されている、請求項1記載の植物発現系。
- 前記1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分が、インゲンマメ黄萎縮ウイルス長遺伝子間領域(BeYDV LIR)である、請求項1記載の植物発現系。
- 前記インフルエンザ血球凝集素が、原生シグナルペプチド配列または非原生シグナルペプチドを含む、請求項1記載の植物発現系。
- 第3核酸配列をさらに含み、該第3核酸配列がサイレンシングのサプレッサーをコード化する、請求項1記載の植物発現系。
- サイレンシングの前記サプレッサーが、群HcProおよびp19から選ばれる、請求項11記載の植物発現系。
- 第4核酸配列をさらに含み、該第4核酸配列がシャペロンタンパク質をコード化する、請求項11記載の植物発現系。
- 前記シャペロンタンパク質が、群Hsp40およびHsp70から選ばれる、請求項13記載の植物発現系。
- インフルエンザ血球凝集素またはインフルエンザの粒子様ウイルス(VLP)の植物中または植物の1部中での産生方法であって、前記植物中または前記植物の1部中に請求項1記載の植物発現系を導入する工程;および、前記植物または前記植物の1部を、前記インフルエンザ血球凝集素をコード化する前記ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下にインキュベートし、それによって前記インフルエンザ血球凝集素または前記インフルエンザVLPを産生させる工程を含むことを特徴とする前記産生方法。
- 前記導入工程において、前記第1核酸配列と前記第2核酸配列を同じ分子上に配置するか、或いは、前記第1核酸配列と前記第2核酸配列を異なる分子上に配置する、請求項15記載の方法。
- 前記第1核酸配列と前記第2核酸配列を異なる分子上に配置し、そして、これらの異なる分子を、前記植物中または前記植物の1部中に同時に導入する、請求項16記載の方法。
- 前記インキュベート工程において、前記インフルエンザ血球凝集素をコード化する前記ヌクレオチド配列の発現が一時的発現である、請求項15記載の方法。
- 前記植物または前記植物の1部を収穫し、それによって前記インフルエンザVLPを含有する収穫植物または収穫植物の1部を得る工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
- 前記インフルエンザVLPを、前記インフルエンザVLPを含有する前記収穫植物または収穫植物の1部から分離し、それによって分離インフルエンザVLPを得る工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
- 前記1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分が、BeYDV短遺伝子間領域(BeYDV SIR)をさらに含む、請求項9記載の方法。
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