MX2014003776A

MX2014003776A - Aumentar el rendimiento de particulas similares a virus en plantas.

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Publication number: MX2014003776A
Application number: MX2014003776A
Authority: MX
Inventors: D Aoust Marc-Andre; Couture Manon; Vezina Louis-Philippe
Original assignee: Medicago Inc
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-08-21
Also published as: JP2014530006A; US20150104480A1; DK2760882T3; EP2760882A1; CN103930435A; EP2760882B1; RU2014116371A; BR112014007474A2; CN116218900A; EP3626733A1; AU2012315421C1; NZ622731A; CA2850407A1; JP6248040B2; ES2951259T3; AU2012315421B2; TW201329235A; IN2014CN03077A; KR101974017B1; MY184072A

Abstract

Se proporciona un método para producir una partícula similar a virus (VLP). El método comprende introducir un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico en la planta, o porción de la planta. El primer ácido nucleico comprende una primera región reguladora activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteína viral estructural. El segundo el ácido nucleico comprende una segunda región reguladora activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de canal, por ejemplo de manera enunciativa para una proteína de canal protónico. La planta o porción de la planta se incuban bajo condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, produciendo con esto la VLP.

Description

AUMENTAR EL RENDIMIENTO DE PARTÍCULAS SIMILARES A VIRUS EN PLANTAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con producir proteínas virales en plantas. Más. específicamente, la presente invención se relaciona con producir y aumentar la producción de partículas similares a virus en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La influenza se provoca por un virus de ARN de la familia Orthomyxoviridae. Existen tres tipos de estos virus y provocan tres diferentes tipos de influenza: tipo A, B y C. el virus de influenza tipo A infecta mamíferos (seres humanos, cerdos, hurones, caballos) y aves. Esto es muy importante para la humanidad, ya que este es el tipo de virus que ha provocado pandemias a nivel mundial. El virus de influenza tipo B (también conocido simplemente como influenza B) infecta únicamente a seres humanos. Ocasionalmente, provoca brotes locales de gripe. Los virus de influenza C también infectan únicamente a seres humanos. Infectan a la mayoría de las personas cuando son jóvenes y raramente provoca enfermedades graves.

La vacunación proporciona protección contra la enfermedad provocada por un agente similar al inducir a un sujeto a preparar una defensa antes de la infección. Convencionalmente, esto se ha llevado a, cabo a través del uso de formas atenuadas en vivo o inactivadas totalmente de los agentes infecciosos como inmunógenos. Para evitar el daño de utilizar el virus total (tales como, los virus exterminados o atenuados) como una vacuna, se han aplicado como vacunas proteínas virales recombinantes, por ejemplo, las subunidades. Tanto los péptidos como las vacunas subunitarias son sujeto de una serie de limitaciones potenciales. Las vacunas subunitarias pueden exhibir una deficiente inmunogenicidad, debido a un plegamiento incorrecto o una presentación deficiente de antígeno. Un problema principal es la dificultad de asegurar que la conformación de las proteínas modificadas genéticamente imite la de los antígenos en su ambiente natural. Los adyuvantes adecuados y, en el caso de los péptidos, las proteínas portadoras, se deben utilizar para reforzar la respuesta inmunitaria. Además, estas vacunas producen principalmente respuestas humorales, y de esta forma pueden fracasar en evocar una inmunidad efectiva. Las vacunas subunitarias con frecuencia son inefectivas para enfermedades en las cuales se ha demostrado que el virus inactivado total proporcione protección.

Las partículas similares a virus (VLP) son candidatos potenciales para inclusión en composiciones inmunogénicas . Las VLP se asemejan estrechamente a viriones maduros, aunque no contienen un material genómico viral. Por lo tanto, las VLP son no replicativas por naturaleza, lo cual las hace seguras para administración como una vacuna. Además, las VLP se pueden modificar genéticamente para que expresen glucoproteinas virales sobre la superficie de la VLP, lo cual es su configuración fisiológica más natural. Además, debido a que las VLP se asemejan a viriones intactos y son estructuras de macroparticulas multivalentes, las VLP pueden ser más efectivas para incluir anticuerpos neutralizantes a la glucoproteina que los antigenos de proteínas con envoltura soluble .

Las VLP se han producido en plantas ( O 2009/009876; WO 2009/076778, WO 2010/003225, WO 2010/003235, WO 2011/03522, WO 2010/148511, que se incorporan en la presente como referencia) , y en sistema de insecto y mamíferos (Noad, R. y Roy, P-, 2003, Trends Microbiol 11: 438-44; Neumann et al., 2000, J. Virol., 74, 547-551). Latham and Galarza (2001, J. Virol., 75, 6154-6165) reportaron la formación de VLP de influenza en células de insecto infectadas con baculovirus recombinante que co-expresa genes de hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), Mi, y M2. Este estudio demuestra que las proteínas con virión de influenza se auto-ensamblan con la co-expresión en células eucariotas y que se requirió la proteina matriz MI para la producción de la VLP. Sin embargo, Gómez-Puerta et al., (1999, J. Gen. Virol, 80, 1635-1645) también mostraron que la sobre-expresión de M2 bloqueo completamente la transmisión de CAT ARN a cultivos de MDCK.

M2 funciona como una proteina con canal iónico y se ha mostrado que, cuando esta proteina se sobre-expresa, el transporte intracelular de la HA co-expresada se inhibe y la acumulación de hemaglutinina (HA) en la membrana plasmática se reduce en un 75-80% (Sakaguchi et al., 1996; Henkel & Weisz, 1998) . Además, al sobre-expresar M2, la acumulación de las proteínas con membrana de virus en la membrana plasmática se reduce y por lo tanto existe una reducción drástica en el número de las VLP funcionales producidas.

La proteína M2 se expresa abundantemente en la superficie celular de las células infectadas con influenza A (Lamb et al. (1985) Cell, 40, 627 a 633). La proteína también se encontró en la membrana de la partícula del virus misma, aunque en cantidades mucho menores, 14 a 68 moléculas de M2 por virión (Zebedee and Lamb (1988) J. Virol. 62, 2762-72). La proteína M2 se modifica pos-traduccionalmente mediante la adición de un ácido palmítico sobre la cisteína en _a posición 50 (Sugrue et al. (1990) Virology 179, 51 a 56) .

La proteína 2 es un homotetrámero compuesto de dos dimeros enlazados con disulfuro, que se mantienen juntos mediante interacciones no covalentes (Sugrue and Hay (1991) Virology 180, 617 a 624) . La mutagénesis sitio-dirigida, Holsinger and Lamb, (1991) Virology 183, 32 a 43, demuestra que los residuos de cisteínas en las posiciones 17 y 19 están implicados en la formación de un puente disulfuro. Sólo la cisteína en la posición 17 está presente en todos los virus analizados. En las cadenas de virus donde también está presente la cisteína 19, no se sabe si se forma o no un segundo puente disulfuro en el mismo dímero (ya enlazado por Cys 17-Cys 17) o con el otro dímero.

Smith et al. (Solicitud de patente de los Estados Unidos 2010/0143393) y Song et al. (Píos ONE 2011 6(l):el4538) describen vacunas y VLPs que comprenden la proteína M2 de influenza. Las VLP comprenden al menos una proteína con núcleo viral tal como MI. Esta proteína con núcleo conduce a la gemación y liberación de las partículas provenientes de las células hospederas de insectos.

Szecsi et al. (Virology Journal, 2006, 3:70) ensamblaron las VLP sobre partículas con núcleo de replicacion defectuosa derivadas del virus de leucemia murina (MLV) . Las VLP de influenza modificada genéticamente se derivaron al co-expresar transitoriamente componentes de la superficie de células (HA, NA, M2 ) y virales internas (Gag, genoma marcador GFP) y que contienen en su superficie HA, HA y ya sea NA o M2, o la totalidad de tres proteínas derivadas del virus H7N1 o H5N1. De acuerdo con Szecsi et al., la expresión de 2 durante la producción de Flu-VLP no influyó en la incorporación de HA o NA sobre partículas virales (página 2, columna derecha, segundo párrafo, en Szecsi et al. ) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con 1 a producción de proteínas virales en plantas. Mas específicamente, la presente invención se relaciona con producir y aumentar la producción de partículas similares a virus en plantas.

Un objetivo de la invención es proporcionar un método mejorado para aumentar la producción de partículas similares a virus en plantas.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método (A) para producir una partícula similar a virus (VLP) en una planta que comprende; a) introducir un primer ácido nucleico que comprende una primer región reguladora activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína viral estructural en la planta, o porción de la planta, b) introducir un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de canal, c) incubar la planta o porción de la planta baje condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, produciendo con esto la VLP.

La primera región reguladora activa en la planta, y la segunda región reguladora activa en la planta pueden ser iguales o diferentes.

La proteína de canal del método (A) descrito anteriormente puede ser una proteína de canal protónico. La proteína de canal protónico se puede seleccionar de M2 o BM2. Además, la proteína de canal protónico puede comprender la secuencia de firma de canal protónico HXXX . La proteína 2 puede ser una proteína M2 obtenida de la influenza A/Puerto Rico/8/1934 (SEC ID NO: 14) o la influenza A/New Caledonia/20/1999 (SEC ID NO: 11) .

La presente invención también proporciona el método (A) como se describió anteriormente, en donde la proteína viral estructural comprende un dominio de trimerización . Además, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína viral estructural comprende una secuencia de nucleótidos quiméricos que codifica, en serie, para una proteína viral antigénica o un fragmento de la misma, un dominio transmembrana de influenza, y cola citoplásmica . La proteína viral estructural puede comprender una proteína HA de influenza. Además, se puede suprimir uno o más enlaces proteolíticos de la proteína HA de influenza.

La presente invención proporciona el método (A) como se describió anteriormente en donde, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína viral estructural se puede seleccionar del grupo que consiste de B HA, C, HA, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, y H16. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína viral estructural puede ser tipo B HA o H3. La secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína viral estructural puede ser, por ejemplo, HA proveniente ce influenza B/Brisbane/60/2008 , B/Malaysia/2506/2004 o B/Wisconsin/1/2010, o H3 proveniente de influenza A/Perth/16/2009 o A/Victoria/361/2011. Además, la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína viral estructural tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 23, 28, 43, 46, 51, 57 ó 61. La secuencia proveniente de la proteína viral estructural también puede comprender la secuencia proveniente de la SEC ID NO: 25, 30, 41, 48, 54, 58 ó 64.

La presente invención también incluye el método (?) como se describió anteriormente, en donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende la primera región reguladora enlazada funcionalmente con uno o más de un intensificador de comovirus, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteina viral estructural, y uno o más de un elemento de amplificación para geminivirus, y un tercer ácido nucleico que codifica una replicasa de geminivirus se introduce en la planta o porción de la planta. Uno o más de un intensificador de comovirus puede ser un comovirus UTR, por ejemplo, un Cowpea Mosaic Virus hipertraducible (CPMV-HT) UTR tal como el CPMV-HT 5' y/o 3' UTR. Uno o más de un elemento de amplificación de geminivirus se puede seleccionar de una región intergénica larga del Bean Yellow Dwarf Virus (BeYDV LIR) , y una región intergénica corta de BeYDV (BeYDV SIR) . Además, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina viral estructural puede ser HA o H3 tipo B, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina viral estructural que tenga al menos 70% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 23, 28, 43, 46, 51, 57 ó 61. La secuencia de la proteina viral estructural también pueden comprender la secuencia de la SEC ID NO: 25, 30, 41, 48, 54, 58 ó 64.

El método como se describió anteriormente (Método A) también puede implicar introducir otra secuencia de ácido nucleico que codifica para un supresor de lentificación, por ejemplo HCPro o PL9.

La presente invención también incluye el método (A; como se describió anteriormente, en donde en el paso de introducir (paso a) , el ácido nucleico se expresa transitoriamente en la planta. Alternativamente, en el paso de introducir (paso a) , el ácido nucleico se expresa establemente en la planta.

El método (A) como se describió anteriormente puede comprender además un paso de: d) cosechar la planta y purificar las VLP.

La presente invención también incluye el método (A) como se describió anteriormente, en donde la VLP no contiene una matriz viral o una proteina con núcleo.

La presente invención proporciona una VLP producida mediante el método (A) como se describió anteriormente. La VLP puede que comprende además uno o más de un lipido derivado de una planta. La VLP también puede estar caracterizada por no contener la proteina de canal. Además, la proteina viral estructural de la VLP puede ser una proteina HAO. Una o más proteina viral que comprende la VLP puede comprender N-glicanos planta-especificos , o N-glicanos modificados. La presente invención también proporciona un anticuerpo policlonal preparado utilizando la VLP.

La presente invención incluye una composición que comprende una dosis efectiva de la VLP como ya se describió para inducir una respuesta inmunitaria y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también incluye un método para inducir inmunidad hacia la infección por virus de influenza en un sujeto, que comprende administrar la VLP co o ya se describió al sujeto. La VLP se puede administrar a un sujeto por vía oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutáneamente.

La presente invención también proporciona una materia vegetal que comprende una VLP producida mediante el método (A) descrito anteriormente. La materia vegetal se puede utilizar para inducir inmunidad hacia una infección por el virus de influenza en un sujeto. La materia vegetal también puede estar combinad como un suplemento alimenticio.

La presente invención también proporciona un método (B) para producir una partícula similar a virus (VLP) que comprende; a) proporcionar una planta o una porción de la planta que comprende un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina viral estructural en la planta, o una porción de la planta, y un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y enlazado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina de canal, b) incubar la planta o porción de la planta baje condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, produciendo con esto la VLP.

La proteina de canal del método (B) descrito anteriormente puede ser una proteina de canal protónico. La proteina de canal protónico se puede seleccionar de 2 o BM2. Además, la proteina de canal protónico puede comprender la secuencia de firma de canal protónico HXXXW.

La presente invención también proporciona el método (B) como se describió anteriormente, en donde la proteina viral estructural comprende un dominio de trimerización . Además, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina viral estructural comprende una secuencia de nucleótidos quiméricos que codifica, en serie, para una proteina viral antigénica o un fragmento de la misma, un dominio transmembrana de influenza, y una cola citoplásmica . La proteína viral estructural puede comprender una proteína HA de influenza. Además, se pueden suprimir uno o más asas proteolíticas de la proteína HA de influenza.

La presente invención proporciona el método (B) como se describió anteriormente en donde, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína viral estructural se puede seleccionar del grupo que consiste de B HA, C, HA, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, y H16. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína viral estructural puede ser HA o H3 tipo B. La secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína viral estructural puede ser, por ejemplo, HA proveniente de influenza B/Brisbane/60/2008 , B/Malaysia/2506/2004 o B/Wisconsin/1/2010, o H3 proveniente de influenza A/Perth/16/2009 o A/Victoria/361/2011.

La presente invención también incluye el método (B) como se describió anteriormente, en donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende la primera región reguladora enlazada funcionalmente con uno o más de un intensificador de comovirus, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína viral estructural, y uno o más de un elemento de amplificación para geminivirus, y un tercer ácido nucleico que codifica una replicasa de geminivirus se introduce en la planta o porción de la planta. Uno o más de un intensificador de comovirus puede ser un comovirus UTR, por ejemplo, un Cowpea Mosaic virus hipertraducible (CPMV-HT) tal como el CPMV-HT 5' y/o 3' UTR. Adicionalmente, uno o más de un elemento de amplificación para geminivirus se puede seleccionar de una región intergénica larga del Bean Yellow Dwarf Virus (BeYDV LIR) , y una región intergénica corta BeYDV (BeYDV SIR) .

El método como se describió anteriormente (Método B) también puede implicar introducir otra secuencia de ácido nucleico que codifica para un supresor de lentificación, por ejemplo HCPro o P19.

La presente invención también incluye el método (B) como se describió anteriormente, en donde en el paso de introducir (paso a) , el ácido nucleico se expresa transitoriamente en la planta. Alternativamente, en el paso de introducir (paso a) , el ácido nucleico se expresa establemente en la planta.

El método (B) como se describió anteriormente puede comprender además un paso de: d) cosechar la planta y purificar las VLP.

La presente invención también incluye el método (B) como se describió anteriormente, en donde la VLP no contiene una matriz viral ni una proteina de núcleo.

La presente invención proporciona una VLP producida mediante el método (B) como se describió anteriormente. La VLP puede comprender además uno o más de un lapido derivado de la planta. La VLP también se puede caracterizare porque nc contiene la proteina de canal. Además, la proteina viral estructural de la VLP puede ser una proteina HAO . Una o más la proteina viral comprende la VLP que puede comprender los N-glicanos planta-especificos , o N-glicanos modificados. La presente invención también proporciona un anticuerpo policlonal preparado utilizando la VLP.

La presente invención incluye una composición que comprende una dosis efectiva de la VLP producida mediante el método (B) como ya se describió, para inducir una respuesta inmunitaria y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también incluye un método para inducir inmunidad hacia una infección por virus de influenza en un sujeto, que comprende administrar la VLP como ya se describió, al sujeto. La VLP se puede administrar a un sujeto por vía oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o subcutáneamente.

La presente invención también proporciona materia vegetal que comprende una VLP producida mediante el método (B) descrito anteriormente. La materia vegetal se puede utilizar para inducir inmunidad hacia una infección por virus de influenza en un sujeto. La materia vegetal también puede estar combinada como un suplemento alimenticio.

La presente invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 41 (PDISP/HA de influenza B/Brisbane/60/2008 con el asa proteolítica suprimida) , y una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la SEC ID NO: 41. La secuencia de ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 43. La presente invención proporciona una VLP que comprende el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 41. La VLP puede comprende además uno o más de un lipido derivado de una planta. La VLP también puede estar caracterizada por no contener la proteina de canal. La VLP puede comprender N-glicanos planta-específicos, o N-glicanos modificados. La presente invención proporciona una composición que comprenae una dosis efectiva de la VLP que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 41, para inducir una respuesta inmunitaria, y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también incluye un método para inducir inmunidad hacia una infección por el virus de influenza en un sujeto, que comprende administrar la VLP que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 41, al sujeto. La VLP se puede administrar a un sujeto por vía oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o subcutáneamente. La presente invención también proporciona materia vegetal que comprende una VLP que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 41. La materia vegetal se puede utilizar para inducir inmunidad hacia una infección por virus de influenza en un sujeto. La materia vegetal también puede estar combinada como un suplemento alimenticio.

Al co-expresar una proteina viral estructural junto con una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, se observó un rendimiento aumentado de la proteína viral estructural y las VLP. Se sabe que las HA experimentan un cambio conformacional dependiente de pH. Sin desear estar vinculados por la teoría, el pH dentro del aparato Golgi de las células productoras de HA durante la maduración y migración se puede ver influido por el plegamiento de HA, efectos de estabilidad y aumento de la degradación, o una combinación de los mismos, de la HA. Al co-expresar una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, junto con una HA, el pH dentro del aparato Golgi puede aumentar, y dar por resultado en un aumento en la estabilidad, reducción o degradación, o una combinación de los mismos, y aumentar el rendimiento de HA.

Este sumario de la invención no necesariamente describe todas las características de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Estas y otras características de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la cual se hace referencia a los dibujos anexos en donde: La figura 1A muestra el cebador IF-H5A-I-05. l+3c (SEC ID NO: 2). La figura IB muestra el cebador IF-H5dTm.r (SEC ID NO: 3) .La figura 1C muestra una representación esquemática de la estructura 1191. La figura ID muestra la estructura 1191 (SEC ID NO: 4) . La figura 1E muestra el cásete de expresión número 489 (SEC ID NO: 5) . La figura 1F muestra la secuencia de aminoácidos de H5 proveniente de la influenza A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (SEC ID NO: 6) . La figura 1G muestra una secuencia de nucleótidos que codifica para H5 proveniente de la influenza A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (SEC ID NO: 42) .

La figura 2A muestra el cebador IF-S1-M1+M2ANC . c (SEC ID NO: 7) . La figura 2B muestra el cebador IF-S1-4-M2ANC . r (SEC ID NO: 8). La figura 2C muestra la secuencia de nucleótidos para el gen M2 sintetizado (correspondiente a nt 1-26 unido a 715-982 del número de acceso Genbank DQ508860) (SEC ID NO: 9) . La figura 2D muestra el cásete de expresión número 1261 del promotor 2X35S hacia el terminador NOS. M2 proveniente de la influenza A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) está subrayado. (SEC ID NO: 10) . La figura 2E muestra la secuencia de aminoácidos de 2 proveniente de la influenza A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) (SEC ID NO: 11) .

La figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos del gen 2 sintetizado (correspondiente a nt 26-51 unido a nt 740-1007 del número de acceso Genbank EF467824) (SEC ID NO: 12) . La figura 3B muestra el cásete de expresión número 859 del promotor 2X35S hacia el terminador NOS. M2 proveniente de la Influenza A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) está subrayado. (SEC ID NO: 13). La figura 3C muestra la secuencia de aminoácidos de M2 proveniente de la influenza A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) (SEC ID NO: 14) .

La figura 4A muestra el cebador IF-H1A-C-09. s2+4c (SEC ID NO: 15) . La figura 4B muestra el cebador IF-HLA-C-09.sl-4r (SEC ID NO: 16). La figura 4C muestra la secuencia de nucleótidos del gen Hl sintetizado (número de acceso Genbank FJ966974) (SEC ID NO: 17). La figura 4D muestra una representación esquemática de la estructura 1192. Los sitios de la enzima de restricción SacII y Stul utilizados para La linearización de plásmidos se anotan en la representación. La figura 4E muestra la estructura 1192 de izquierda a derecha a las fronteras de ADN-t (subrayado) . 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS con el cásete de expresión inhibidora para lentificación de Plastocianina-P19-Plastocianina (SEC ID NO: 18) . La figura 4F muestra el número del cásete de expresión 484 desde el promotor 2X35S hasta el terminador NOS. PDISP/H1 proveniente de la influenza A/California/7/2009 (H1N1) está subrayado. (SEC ID NO: 19) . La figura 4G muestra la secuencia de aminoácidos de PDISP-Hl proveniente de la influenza A/California/7/2009 (H1N1) (SEC ID NO: 20) .

La figura 5A muestra el cebador IF—S2+S4—H3 Per . c (SEC ID NO: 21) . La figura 5B muestra el cebador IF-Sla4-H3 Per.r (SEC ID NO: 22). La figura 5C muestra la secuencia de nucleótidos del gen H3 sintetizado (correspondiente a nt 26-1726 del número de acceso Genbank GQ293081) (SEC ID NO: 23) . La figura 5D muestra el número del cásete de expresión de 1019 desde el promotor 2X35S hasta el terminador NOS. PDISP/H3 proveniente de la influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) está subrayado. (SEC ID NO: 24). La figura 5E muestra la secuencia de aminoácidos de PDISP/H3 proveniente de la influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) (SEC ID NO: 25) .

La figura 6A muestra el cebador IF-S2+S4-B Bris.c (SEC ID NO: 26) . La figura 6B muestra el cebador IF-Sla4-B Bris.r (SEC ID NO: 27). La figura 6C muestra la secuencia de nucleótidos de gen HA B Brisbane sintetizado (correspondiente a nt 34-1791 del número de acceso Genbank FJ766840) (SEC ID NO: 28) . La figura 6D muestra la secuencia de nucleótidos del número de cásete de expresión 1029 desde el promotor 2X35S hasta el terminador NOS. PDISP/HA de influenza B/Brisbane/60/2008 está subrayado. (SEC ID NO: 29) . La figura 6E muestra la secuencia de aminoácidos de PDISP/HA de influenza B/Brisbane/60/2008 (SEC ID NO: 30) . La figura 6F muestra una representación esquemática de la estructura 1194. Los sitios de la enzima de restricción SacII y Stul para la linearización de plásmidos se anotan en la representación. La figura 6G muestra la estructura 1194 de derecha a izquierda c las fronteras de ADN-t (subrayado) . 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS en el sistema de amplificación para BeYDV + replicasa con el cásete de expresión inhibidora para lentificación de Plastocianina-P19-Plastocianina (SEC ID NO: 31) . La figura 6H muestra el número de cásete de expresión 1008 desde BeYDV izquierda LIR hasta BeYDV derecha LIR. PDISP/HA de influenza B/Brisbane/60/2008 está subrayado. (SEC ID NO: 32).

La figura 7A muestra el cebador dTmH5I-B Bris.r (SEC ID NO: 33) . La figura 7B muestra el cebador B Bris-dTmH5I.c (SEC ID NO: 34). La figura 7C muestra el cebador IF-SlaS4-dTmH5I. r (SEC ID NO: 35). La figura 7D muestra e] número de cásete de expresión 1009 a partir de BeYDV izquierda LIR hasta BeYDV derecha LIR. PDISP/HA B Brisbane/H5Indo TMCT está subrayado. (SEC ID NO: 36) . La figura 7E muestra la secuencia de aminoácidos de PDISP/HA P Brisbane/H5Indo TMCT (SEC ID NO: 37) .

La figura 8A muestra el cebador 1039+1059. r (SEC ID NO: 38). La figura 8B muestra el cebador 1039+1059. c (SEC IC NO: 39) . La figura 8C muestra el número de cásete de expresión 1059 de BeYDV izquierda LIR hasta BeYDV derecha LIR. PDISP/HA de influenza B/Brisbane/60/2008 con el asa proteolitica suprimida está subrayado. (SEC ID NO: 40) . La figura 8D muestra la secuencia de aminoácidos de PDISP/HA de influenza B/Brisbane/60/2008 con el asa proteolitica suprimida (SEC ID NO: 41) . La figura 8E muestra la secuencia de nucleótidos de PDISP/HA de influenza B/Brisbane/60/2008 con el asa proteolitica suprimida (SEC ID NO: 43) .

La figura 9 muestra el mapa de plásmidos del número de estructura 1008. El número de estructura 1008 dirige la expresión de HA tipo silvestre proveniente de la cepa de influenza B/Brisbane/60/2008. Esta estructura comprende elementos derivados de BeYDV para la amplificación de ADN.

La figura 10 muestra el mapa de plásmidos del número de estructura 1009. El número estructura 1009 dirige la expresión de una HA quimérica proveniente de la cepa de influenza B/Brisbane/60/2008 en la cual el dominio transmembrana y la cola citosólica se reemplazan con aquellos de H5 proveniente de la influenza A/Indonesia/05/2005. Esta estructura comprende elementos derivados de BeYDV para la amplificación del ADN.

La figura 11 muestra el mapa de plásmidos del número de estructura 1029. El número estructura 1029 dirige la expresión de la HA tipo silvestre proveniente de la cepa de influenza B/Brisbane/60/2008.

La figura 12 muestra el mapa de plásmidos del número de estructura 1059. El número de estructura 1059 dirige la expresión de una HA mutante proveniente de la cepa de influenza B/Brisbane/60/2008 con el asa proteolitica suprimida. Esta estructura comprende elementos derivados de BeYDV para la amplificación del ADN.

La figura 13 muestra el mapa de plásmidos del número de estructura 1019. El número de estructura 1019 dirige la expresión de la H3 tipo silvestre proveniente de la cepa de influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) .

La figura 14 muestra el mapa de plásmidos del número de estructura 484. El número de estructura 484 dirige la expresión de la Hl tipo silvestre proveniente de la cepa de influenza A/California/07/2009 (H1N1) .

La figura 15 muestra el mapa"" de plásmidos del número de estructura 489. El número de estructura 489 dirige la expresión de H5 tipo silvestre proveniente de la cepa de la influenza A/Indonesia/05/2005 (H5N1) .

La figura 16 muestra el mapa de plásmidos del número de estructura 1261. El número de estructura 1261 dirige la expresión de M2 tipo silvestre proveniente de la cepa de influenza A/New Caledonia/20/99 (H1N1) .

La figura 17 muestra el mapa de plásmidos del número de estructura 859. El número de estructura 859 dirige la expresión de M2 tipo silvestre proveniente de la cepa de influenza A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).

La figura 18 muestra un análisis de transferencia Western de la expresión de la proteina HA en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana. HA proveniente de B/Brisbane/60/2008 se co-expresa con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99. "C+": control positivo, virus semi-purificado de B/Brisbane/60/2008 proveniente de la Therapeutic Goods Administration, Australia; "C-": control negativo, plantas falsas infiltradas; "1008": expresión de HA tipo silvestre proveniente de B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) ; "1008+1261": coexpresión de HA tipo silvestre proveniente de. B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) con 2; "1009+1261": co-expresión de HA quimérica proveniente de B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) con M2, "1029": expresión de HA tipo silvestre proveniente de B/Brisbane/60/2008 en ausencia de elementos de amplificación (BeYDV) ; "1029+1261": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de B/Brisbane/60/2008 er ausencia de elementos de amplificación (BeYDV) con ?G proveniente de A/New Caledonia/20/99. Las proporciones indican la proporción de cultivos de Agrobacterium utilizados en experimentos de co-expresión.

La figura 19 muestra un análisis de transferencia Western de la expresión de la proteina HA en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana . Linea "C+": control positivo, virus A/Wisconsin/15/2009 (H3N2) semi-purificado proveniente de la Therapeutic Goods Administration Australia; "C-": control negativo, plantas falsas infiltradas; "1019": expresión de HA tipo silvestre proveniente de A/Perth/16/2009 (H3N2), "1019+1261": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de A/Perth/16/2009 (H3N2) con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99. La proporción indica la proporción de cultivos de Agrobacterium utilizados en experimentos de coexpresión .

La figura 20 muestra un análisis de transferencia Western de la expresión de la proteina HA en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana. Linea "C+": control positivo, A/California/7/2009 (H1N1) NYMC X-179A semipurificado proveniente del virus NIBSC (NIBSC código 09/146); "C-": control negativo, plantas falsas infiltradas; "484": expresión de HA tipo silvestre proveniente de A/California/7/2009 (H1N1), "484+1261": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de A/California/7/2009 (H1N1) con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99. La proporción indica la proporción de cultivos de Agrobacterium utilizados en experimentos de co-expresión.

La figura 21 muestra un análisis de transferencia Western de expresión de la proteina HA en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana. Linea "C+": control positivo, H5 recombinante purificada proveniente de A/Indonesia/05/2005, Inmune Technology Corporation (producto no, IT-003-052p . ) ; "C-": control negativo, plantas falsas infiltradas; "489": expresión de HA tipo silvestre proveniente de A/Indonesia/5/05 (H5N1), "489+1261": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de A/Indonesia/5/05 (H5N1) con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99.

La figura 22A muestra un análisis de transferencia Western de la expresión de la proteina HA en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana. "1008": expresión de HA tipo silvestre proveniente de B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) ; "1008+1261": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99; "1059": expresión de HA mutante proveniente de B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV); "1059+1261": co-expresión de HA mutante proveniente de B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99. Se analizaron plantas provenientes de tres infiltraciones separadas (A, B y C) . Los porcentajes indican la proporción de cultivos de Agrobacterium utilizados en experimentos de co-expresión. La figura 22B muestra una comparación de la capacidad de hemaglutinación de extractos de proteína cruda proveniente de plantas productoras de HA.

La figura 23 muestra un análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína HA en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana. Figura 23A: "1059": expresión de HA mutante proveniente B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV); "1059+1261": co-expresión de HA mutante proveniente de B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) con K2 proveniente de A/New Caledonia/20/99. "1059+859": coexpresión de HA mutante proveniente de B/Brisbane/60/2008 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) con ": proveniente de A/Puerto Rico/8/34. Se analizaron plantas provenientes de tres infiltraciones separadas (A, B y C) . Los porcentajes indican la proporción de cultivos de Agrobacterium utilizados en experimentos de co-expresión . Figura 23B: "1019": expresión de HA tipo silvestre proveniente de A/Perth/16/2009 (H3N2), "1019+1261": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de A/Perth/16/2009 (H3N2) con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99; "1019+859": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de A/Perth/16/2009 (H3N2) con M2 proveniente de A/Puerto Rico/8/34. Los porcentajes indican la proporción de cultivo? de Agrobacterium utilizados en experimentos de co-expresión.

La figura 24 muestra la alineación de secuencias de HAs proveniente de diversas cepas de influenza. El sitio de segmentación del precursor HAO se indica por una flecha.

La figura 25A muestra el cebador IF-H3V36111. S2+4c (SEC ID NO: 44). La figura 25B muestra el cebador IF-H3V36111. sl-4r (SEC ID NO: 45). La figura 25C muestra la secuencia de nucleótidos del gen H3 sintetizado (correspondiente a nt 25 a 1725 proveniente del aislado GISAID secuencia número EPI_ISL_101506 HA) (SEC ID NO: 46) . La figura 25D muestra la expresión de nucleótidos y el número de cásete de expresión 1391 desde el promotor 2X35S hasta el terminador NOS. PDISP/H3 proveniente de influenza A/Victoria/361/2011 (H3N2) está subrayado. (SEC ID NO: 47). La figura 25E muestra la secuencia de aminoácidos de PDISP-H3 proveniente de la influenza A/Victoria/361/2011 (H3N2) (SEC ID NO: 48) . La figura 25F muestra una representación esquemática de la estructura 1391.

La figura 26A muestra el cebador IF-HAB110. Sl+3c (SEC ID NO: 49) . La figura 26B muestra el cebador I -HAB110.sl-4r (SEC ID NO: 50). La figura 26C muestra la secuencia de nucleótidos de HA B Wisconsin sintetizada (número de acceso Genbank JN993010) (SEC ID NO: 51) . La figura 26D muestra una representación esquemática de la estructura 193. La figura 26E muestra la estructura 193 de izquierda a derecha fronteras de ADN-t (subrayados) . 2X35S/CPMV-HT/NOS en BeYDV (m) + sistema de amplificación Replicasa con un cásete de expresión inhibidora para lentificación de Plastocianina-P19-Plastocianina (SEC ID NO: 52) . La figura 26F muestra la secuencia de nucleótidos del cásete de expresión número 1462 desde el promotor 2X35S hasta el terminador NOS. HA de influenza B/Wisconsin/1/2010 está subrayada (SEC ID NO: 53) . La figura 26G muestra la secuencia de aminoácidos de HA de influenza B/Wisconsin/1/2010 (SEC ID NO: 54) . La figura 26H muestra una representación esquemática de la estructura 1462.

La figura 27A muestra el cebador HAB110 (PrL-) . r (SEC ID NO: 55) . La figura 27B muestra el cebador HAB110 (PrL-) . c (SEC ID NO: 56). La figura 27C muestra la secuencia de nucleótidos del cásete de expresión de número 1467 desde el promotor 2X35S hasta el terminador NOS. HA de influenza B/Wisconsin/1/2010 con el asa proteolitica suprimida está subrayada (SEC ID NO: 57). La figura 27D muestra la secuencia de aminoácidos de la influenza B/Wisconsin/1/2010 con el asa proteolitica suprimida (SEC ID NO: 58) .

La figura 27E muestra una representación esquemática de la estructura 1467.

La figura 28A muestra el cebador IF-HB-M-04. s2+4c (SEC ID NO: 59) . La figura 28B muestra el cebador IF-HB-M-04.sl-4r (SEC ID NO: 60). La figura 28C muestra la secuencia de nucleótidos de HA B Malasia sintetizada (correspondiente a nt 31-1743 de número de acceso Genbank EU124275) con las mutaciones T759C y C888G que están subrayadas. (SEC ID NO: 61) . La figura 28D muestra una representación esquemática de la estructura 194, con los sitios de enzimas de restricción SacII y Stul utilizados para la linealización de plásmidcs que se anotarán en la representación. La figura 28E muestra la estructura 194 de izquierda a derecha fronteras de ADNt (subrayados). 2X35S/CPMV-HT/NOS en BeYDV (m) tsistema de amplificación de replicasa con cásete de expresión inhibidora para lentificación de Plastocianina-P19-Plastocianina (SEC ID NO: 62). La figura 28F muestra la secuencia de nucleótidos del cásete de expresión número 1631 desde el promotor 2X35S hasta el terminador NOS. PDISP-HA de influenza B/Malaysia/2506/2004 está subrayado. (SEC ID NO: 63) . La figura 28G muestra la secuencia de aminoácidos de PDISP-HA d influenza B/Malaysia/2506/2004 (SEC ID NO: 64) . La figura 28H muestra una representación esquemática de la estructura 1631.

La figura 29 muestra un análisis de transferencia Western de la expresión de la proteina HA en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana. HA proveniente de B/Malaysia/2506/2004 está co-expresada con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99. Veinte microgramos de extracto de proteina se cargaron por linea. "C+": control positivo, Virus B/Malaysia/2506/2004 semipurificado proveniente del National Institute for Biological Standards and Control, Reino Unido; "1631": expresión de HA tipo silvestre proveniente de B/Malaysia/2506/2004 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) ; "1631+1261": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de B/Malaysia/2506/2004 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) con M2. Los porcentajes indican la proporción de cultivos de Agrobacterium utilizados en experimentos de co-expresión.

La figura 30A muestra un análisis de transferencia Western de la expresión de la proteina HA en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana. HA proveniente de B/Wisconsin/1/2010 está co-expresada con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99. Diez microgramos de extracto de proteina se cargaron por linea. "C+": control positivo, virus B/Wisconsin/1/2010 semipurificado del National Institute for Biological Standards and Control, Reino Unido; "1462": expresión de HA tipo silvestre de B/Wisconsin/1/2010 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) ; "1467": expresión de HA mutante proveniente de B/Wisconsin/1/2010 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV); "1462+1261": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de B/Wisconsin/1/2010 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) con M2; "1467+1261": co-expresión de la HA mutante proveniente de B/Wisconsin/1/2010 en presencia de elementos de amplificación (BeYDV) con M2. Los porcentajes indican la densidad óptica para cada cultivo de Agrobacterium utilizado en experimentos de expresión y co-expresión. La figura 30B muestra una comparación de la capacidad de hemaglutinación de los extractos de proteina cruda provenientes de plantas transformadas con AGL1/1462, AGL1/1467, AGL1/1462+AGL1/1261 y AGL1/1467+AGL1/1261.

La figura 31 muestra un análisis de transferencia Western de la expresión de la proteina HA en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana . HA proveniente de H3/Victoria/361/2011 está co-expresada con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99. Veinte microgramos de extracto de proteina se cargaron por linea. "C+": control positivo, virus H3/Wisconsin/15/2009 semipurificado proveniente de la Therapeutic Goods Administration, Australia, "1391": expresión de HA tipo silvestre proveniente de H3/Victoria/361/2011; "1391 1261": co-expresión de HA tipo silvestre proveniente de H3/Victoria/361/2011 con M2. Los porcentajes indican la densidad óptica para cada cultivo d Agrobacterium utilizado en experimentos de expresión y coexpresión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción es de una modalidad preferida .

La presente invención se relaciona con partículas similares a virus (VLPs) y métodos para producir y aumentar el rendimiento de VLP y la producción en plantas.

La presente invención proporciona, en partes, un método para producir una partícula similar a virus (VLP) en una planta, o una porción de la planta. El método implica introducir un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico en la planta. El primer ácido nucleico comprende una primera región reguladora activa en la planta o una porción de la planta, y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina viral estructural. El segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteina de canal, por ejemplo, de manera enunciativa a una proteina de canal protónico. La primera región reguladora y la segunda región reguladora pueden ser iguales o diferentes. La planta o una porción de la planta se incuba bajo condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, produciendo con esto la VLP. Si se desea, la planta o porción de la planta se puede cosechar y la VLP purificada. De preferencia, la VLP no contiene Mi, una matriz viral o una proteina núcleo. La presente invención también proporciona una VLP producida mediante este método. La VLt puede comprender uno o más de un lipido derivado de una planta. La VLP se puede utilizar para preparar una composición que comprenda una dosis efectiva de la VLP para inducir una respuesta inmunitaria, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona materia vegetal que comprende la VLP producida al expresar el primero y segundo ácidos nucleicos descritos anteriormente. La materia vegetal se puede utilizar para inducir inmunidad hacia una infección por el virus de influenza en un sujeto.

La materia vegetal también puede estar combinada como un suplemento alimenticio.

La VLP de la presente invención también se puede producir al proporcionar una planta o porción de la planta gue comprenda un primer ácido nucleico y un segundo ácidc nucleico como se definió anteriormente, e incubar la planta o porción de la planta bajo condiciones que permitan la expresión del primero y segundo ácidos nucleicos, produciendo con esto la VLP. La VLP puede comprender uno o más de un lipido derivado de una planta. La VLP se puede utilizar para preparar una composición gue comprenda una dosis efectiva de la VLP para inducir una respuesta inmunitaria, y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también proporciona materia vegetal gue comprende la VLP producida al expresar el primero y segundo ácidos nucleicos. La materia vegetal se puede utilizar para inducir inmunidad hacia una infección por el virus de influenza en un sujeto. La materia vegetal también puede estar combinada como un suplemento alimenticio .

Las VLP de la presente invención comprenden una o más proteínas virales. Por ejemplo, lo cual no se considerará limitante, una o más proteínas virales pueden ser una proteína viral estructural tal como hemaglutinina (HA) de influenza o una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa una proteína de canal protónico, tal como por ejemplo M2. La HA puede ser cualquier HA, por ejemplo una H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16 o HA tipo B como se describe en las WO 2009/009876; WO 2009/076778, WO 2010/003225, WO 2010/003235, WO 2011/03522; que se incorporan aquí como referencia) .

Como se describirá con mayor detalle más adelante, las VLP se pueden producir en una planta al co-expresar un primer ácido nucleico que codifica para una proteína viral con un segundo ácido nucleico que codifica para una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa para una proteína de canal protónico. El primero y segundo ácidos nucleicos se pueden introducir en la planta en el mismo pase, o se pueden introducir a la planta secuencialmente . El primero y segundo ácidos nucleicos se pueden introducir en la planta de una forma transitoria, o de una forma estable. Además, una planta que expresa un primer ácido nucleico que codifica para una proteína viral se puede transformar con una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, (segundo ácido nucleico) de tal forma que tanto el primero como el segundo ácidos nucleicos se co-expresen en la planta. Alternativamente, una planta que expresa una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa una proteína de canal protónico, (segundo ácido nucleico) se puede transformar con un primer ácido nucleico que codifica para una proteína viral de tal forma que tanto el primero como el segundo ácidos nucleicos se co-expresen en la planta. Adicionalmente, una primera planta que expresa el primer ácido nucleico que codifica para una proteína viral, se puede cruzar con una segunda planta que exprese el segundo ácido nucleico que codifica para la proteína de canal por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de cana] protónico, para producir una progenie de plantas que coexpresen el primer y segundo ácidos nucleicos que codifican para la proteína viral y la proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, respectivamente .

La presente invención también proporciona un método para aumentar la expresión y rendimiento de una proteína viral en una planta al co-expresar un primer ácido nucleico que codifica para una proteína viral con un segundo ácido nucleico que codifica para un proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico. El primero y segundo ácidos nucleicos se pueden introducir a la planta en el mismo paso, o se pueden introducir a la planta secuencialmente . El primero y segundo ácidos nucleicos se pueden introducir en la planta de una forma transitoria, o de una forma estable. Además, una planta que exprese un primer ácido nucleico que codifica para una proteina viral se puede transformar con una proteina de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteina de canal protónico (segunde ácido nucleico) , de tal forma que tanto el primero como el segundo ácidos nucleicos se co-expresen en la planta. Alternativamente, una planta que exprese una proteina d.e canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteina de canal protónico (segundo ácido nucleico) se puede transformar con un primer ácido nucleico que codifica para una proteina viral de tal forma que tanto el primero como el segundo ácidos nucleicos se co-expresen en la planta. Adicionalmente, una primera planta que expresa el primer ácido nucleico que codifica para una proteina viral, se puede cruzar con una segunda planta que expresa el segundo ácido nucleico que codifica para la proteina de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteina de canal protónico, para producir una progenie plantas co-expresen el primero y segundo ácidos nucleicos que codifican para la proteina viral y la proteina de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteina de canal protónico, respectivamente.

Proteína de canal Por "proteina de canal" se debe entender una proteina que sea capaz de formar un canal a través de una membrana de fosfolipidos que permita el cruce de iones y/o pequeñas moléculas a través de la membrana. Las proteínas de canal pueden ser selectivas para tamaño y/o carga de los iones y/o pequeñas moléculas. Los ejemplos de proteínas de canal son una proteína de canal no específico que altera la permeabilidad de las membranas para permitir compuestos de bajo peso molecular y una proteína de canal iónico, tal como por ejemplo canal de cloruro, canal de potasio, canal de sodio, canal de calcio y canal protónico.

Por "proteína de canal protónico" se debe entender una proteína que sea capaz de formar un canal selectivo protónico a través de una bicapa de fosfolipidos. La proteína de canal protónico puede ser una proteína de membrana con paso individual con un dominio transmembrana (TM) flanqueado por dominios hidrofóbicos . El dominio TM del canal protónico puede comprender la secuencia HXXXW (SEC ID NO. 1) .

Después de la segmentación de HAO, la HA se torna sensible al pH, experimentando un cambio conformacional irreversible en el pH del endosoma (<pH 6.0). La conformación del precursor HAO es estable a pH bajo, aunque la forma HA1-HA2 segmentada, es metaestable (Bullough PA et. al., 1994, Nature Vol. 371:37-43). Estudios sobre el umbral de pH que induce cambios conformacionales en diferentes HAs, muestran que este umbral es aproximadamente pH 5.8-5.9 para las cepas B, mientras que es más ácido (pH 5.1 hasta 5.3) para HAs tipo A (Beyer EP et al, 1986, Archives Virol, vol 90:173). Durante la extracción de la biomasa vegetal (entre el pH 5-6) , también se puede llevar a cabo un cambio conformacional de HA1-HA2 con HA tipo B.

Sin desear estar vinculados por la teoría, el pH de un compartimento celular que comprende HA, incluyendo el aparato Golgi, por lo tanto, puede ser importante para el plegamiento, estabilidad y/o proteólisis de HA. Las proteínas de canal protónico, tales como por ejemplo la proteína 2 y B 2 de influenza pueden regular el pH en los compartimientos celulares. Por ejemplo, M2 regula la potenciación de la fusión de la membrana al regular los compartimentos intracelulares en las etapas tanto tardías como tempranas de la replicación viral de la influenza. Al inicio de la infección de nuevas células después de absorción endocítica de partículas virales, la activación de la actividad de canales protónicos M2 conduce a la acidificación del interior del virión durante el proceso para quitar recubrimiento. En la infección tardía durante la producción del virus, M2 actúa para aumentar el pH durante el tránsito a través de la red trans-Golgi y evita la inactivación inducida por un pH bajo de proteínas co-transportadas, tales como HA en el caso de la influenza. Al co-expresar una proteína viral estructural junto con una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, se observó un rendimiento aumentado de la proteína del virus estructural y las VLPs. Se sabe que las HA experimentan un cambio de conformación dependiente del pH. Sin desear estar vinculados por la teoría, el pH dentro del aparato Golgi de las células productoras de HA durante la maduración y migración puede influir en el plegamiento de HA, los efectos de estabilidad y aumentar la degradación, o una combinación de los mismos, de la HA. Al co-expresar una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, junto con una HA, puede aumentar el pH dentro del aparato Golgi, y dar por resultado en un aumento en la estabilidad, reducción de degradación, o una combinación de los mismos y aumentar los niveles de expresión y rendimiento de HA y/o VLP.

Al co-expresar una proteína viral estructural junto con una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, en una planta, se observó un rendimiento aumentado de la proteína viral estructural y/o VLP, en comparación con una planta que expresó la proteína viral estructural sin la co-expresión de la proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico.

Además, al co-expresar una proteína viral estructural tal como HA con una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, en una planta, la proteína de HA puede exhibir una actividad aumenta como se muestra por una mayor capacidad de hemaglutinación, en comparación con una proteína de HA que no se co-expresa con una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico. Por un aumento en la actividad, se debe entender un aumento en la capacidad de hemaglutinación de aproximadamente 2% hasta aproximadamente 100%, o cualquier cantidad entre las mismas según se determina utilizando técnicas estándar en este campo, por ejemplo, entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50% o cualquier valor entre los mismos, por ejemplo, aproximadamente 2, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100%, en comparación con la actividad de la misma proteína de HA producida en ausencia de una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico .

En el sentido en el que se utiliza en la presente, los términos "M2", "proteína 2", "secuencia M2" y "dominio M2" se refieren a la totalidad o una porción de una secuencia de la proteína M2 aislada de, con base o presente en cualquier cepa o aislado del virus de influenza producida natural o artificialmente. De esta forma, el término M2 y lo semejante incluyen variantes de la secuencia M2 de origen natural producidas mediante mutación durante el ciclo vital del virus o producidas en respuesta a una presión selectiva (por ejemplo, terapia con fármacos, expansión de tropismo o infectividad de células hospederas, etc. ) , así como las secuencias 2 producidas recombinante o sintéticamente. Los ejemplos de proteínas de canales que se pueden utilizar incluyen, de manera enunciativa proteínas de canal protónico, por ejemplo, aquellas listadas en la Tabla 1. Un ejemplo no limitante de las secuencias que se pueden utilizar con la presente invención incluyen M2 proveniente de A/Puerto Rico/8/1934 y M2 proveniente de A/New Caledonia/20/1999\ Una proteína M2 ilustrativa consiste de la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 11 ó 14.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, los términos "BM2," "proteína B 2", "secuencia BM2" y "dominio BM2" se refieren a la totalidad o una porción de una secuencia de la proteína BM2 aislada de, con base o presente en cualquier cepa o aislado del virus de influenza producidos natural o artificialmente. De esta forma, el término BM2 y lo semejante incluyen variantes de la secuencia BM2 de origen natural producidas mediante mutación durante el ciclo vital del virus o producidas en respuesta a una presión selectiva (por ejemplo, terapia con fármacos, expansión de tropismo o infectividad de células hospederas, etc.), así como las secuencias BM2 producidas recombinante o sintéticamente. Los ejemplos de proteínas de canal que se pueden utilizar incluyen, de manera enunciativa proteínas de canal protónico, como las listadas en la Tabla 2.

Las secuencias de proteínas de canal protónico ilustrativas adicionales consisten de las secuencias depositadas bajo los números de acceso GenBank mostrados en la Tabla 1 y la Tabla 2.

Tabla 1: Números de acceso para las proteínas de canal protónico M2 de las secuencias de aminoácidos Tabla 2: Números de acceso para las proteínas de canal protónico BM2 de las secuencias de aminoácidos Proteína viral estructural La proteína viral estructural (también denominada como proteína viral estructural) puede ser una proteína antigénica viral o un fragmento de la misma, por ejemplo, de manera enunciativa con una glucoproteína viral o una proteína con envoltura viral. La proteína viral estructural puede ser una proteína viral quimérica. La proteína viral puede existir como un monómero, un dímero, un trímero, o una combinación de los mismos. Un trímero es un complejo macromolecular formado por tres proteínas, por lo general proteínas unidas no covalentemente . Sin desear estar vinculados por la teoría, el dominio de trimerización de una proteína puede ser importante para la formación de estos trímeros. Por lo tanto, la proteína viral estructural o un fragmento de la misma puede comprender un dominio de trimerización. Un ejemplo no limitante de una proteína viral estructural es hemaglutinina (HA) de influenza, o un fragmento de HA. Los ejemplos no limitantes de HA, o los fragmentos de HA que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen aquellos descritos en O 2009/009876, WO 2009/076778, WO 2010/003225, WO 2010/003235, WO 2011/03522, WO 2010/006452, WO 2010/148511, WO 2011/035422 (que se incorporan en la presente como referencia) .

Además, la proteína viral estructural puede ser la proteína precursora no procesada de HA. La proteína HA se sintetiza como una proteína precursora (HA0) de aproximadamente 75 kDa, que ensambla en la superficie en una proteína trimérica alargada. La proteína precursora se segmenta en un sitio de segmentación de activación conservada en 2 cadenas de polipéptidos , HA1 y HA2 (que comprenden la región transmembrana), enlazada mediante un enlace disulfuro.

Modificación del asa proteolítica (sitio de segmentación) La proteína viral estructural puede ser una proteína de hemaglutinina de influenza B o hemaglutinina ae influenza A con una supresión o modificación del asa proteolítica (sitio de segmentación) dentro de la proteína de hemaglutinina. La supresión o modificación del asa proteolítica asegura que la molécula de HA se mantiene principalmente como un precursor de HAO .

Ha se sintetiza como una proteína precursora HAO, que experimenta procesamiento proteolítico en dos subunidades (HA1 y HA2) enlazadas conjuntamente mediante un puente disulfuro. Las cepas del virus de influenza aviar de mamíferos y apatogénicos provocan infecciones localizadas anatómicamente como resultado de la variación restringida de células que secretan una proteasa que puede segmentar el precursor HAO extracelularmente (Chen J, et . Al. 1998, Celi. Vol. 95:409-417). Las proteasas responsables de la segmentación de HAO en infecciones de influenza de seres humanos, se secretan por células del tracto respiratorio, o al co-infectar bacterias o micoplasmas, o se pueden producir en respuestas inflamatorias a las infecciones. Un candidato de proteasa principal es la triptasa Clara, que se produce mediante células Clara del epitelio bronquiolar, y tiene una distribución limitada de tejido (tracto respiratorio superior) . La proteasa es especifica para la secuencia monobásica Q/E-X-R encontrada en el sitio de segmentación de Hl, H2, H3 y H6. La HA proveniente de las cepas H9 y B muestran un sitio de segmentación monobásica ligeramente diferente con la secuencia SSR y ER respectivamente (véase la figura 24). No se ha identificado ninguna proteasa para la mayoría de virus de influenza que provoquen una infección entérica y respiratoria observada en aves acuáticas. En el laboratorio, la mayoría de líneas celulares no soportan una replicación multi-ciclo a menos que se agregue una proteasa exógena (por lo general la tripsina) .

Sin embargo, las cepas aviares bastante patogénicas, se segmentan por una familia de proteasas intracelulares más extendidas, dando por resultado en infecciones sistémicas. Esta diferencia de patogenicidad se correlaciona con las diferencias estructurales en el sitio de segmentación HAO . Las cepas patogénicas tienen insertos de aminoácidos polibásicos dentro, o después del sitio monobásico. La segmentación en este caso se presenta intracelularmente y las proteasas implicadas se han identificado como furina, y otras enzimas similares a subtilisina, encontradas en el aparato Golgi e implicadas en el procesamiento pos-traduccional de los precursores de factor hormonal y crecimiento. La secuencia para reconocimiento de furina R-X-R/K-R es una inserción frecuente del aminoácido en los sitios de segmentación HAO de H5 y FP (véase la figura 24). La distribución amplia de tejidos de la enzima, y la eficiencia de la segmentación intracelulai , contribuyen a una infección sistémica extendida y virulenta provocada por estos virus.

Horimoto T, et . al. (2006, Vaccine, Vol 24: 3669-3676) describen la supresión del sitio de segmentación polibásica de H5 (RERRRKKRJjG) en H5. Los mutantes seleccionados se sometieron a un estudio de inmunogenicidad en ratones, incluyendo un mutante con una supresión de los 4 primeros aminoácidos cargados (RERR) y una modificación para inactivar el sitio de segmentación polibásica (RKKR con TETR) . La supresión del sitio de segmentación no afecta las propiedades inmunogénicas del mutante H5. También se ha reportado la supresión del sitio polibásico (GERRRKKRJiG reemplazado por RETR) para producir el virus de referencia de influenza NIBSC 05/240 NIBSC mutante NIBG-23. Hoffman et. al. (2002, 2002, Vaccine, Vol. 20:3165-3170) reemplazó el sitio de segmentación polibásica de un H5 HA con el sitie monobásico de H6 para aumentar la expresión en huevos. Los primeros 4 residuos se suprimieron y reemplazaron los cuatro últimos aminoácidos del sitio polibásico mediante IETR (reemplazo de RERRRKKRJ¿G con IETRJ¿G) . Esta H5 mutante mostró un alto nivel de expresión, proteólisis potencial y cambio conformacional a un pH bajo, no se reportaron los datos de inmunogenicidad. Estos estudios muestran que la modificación del sitio de segmentación se puede emplear para disminuir la virulencia de la partícula viral (en los casos donde se replican virus verdaderos, permitiendo que el virus se replique sin exterminar al huevo hospedero. Sin estas mutaciones, los virus exterminan el huevo antes de que alcance altos títulos.

Durante el plegamiento de HA y la secreción a través del aparato Golgi, el sitio de segmentación del precursor de hemaglutinina, que se ubica en un asa en la superficie de HA, es bastante accesible para la proteólisis mediante proteasas. Sin desear estar vinculados por la teoría, si se presenta la proteólisis del precursor HAO en el sitio mono o polibásico durante el plegamiento de la HA en el ER, un cambio conformacional de la proteína se puede llevar a cabo en el aparato Golgi durante la secreción, debido a que el entorno de pH dentro del aparato Golgi de la planta y en el apoplasto es ligeramente ácido. Una HA conformación a pH bajo se puede producir, disminuyendo tanto el nivel de expresión como la estabilidad intrínseca de la partícula. De esta forma, principalmente la proteína precursora de HAO sin segmentar se podría gemar a partir de la membrana plasmática.

Por "asa proteolítica" o "sitio de segmentación" se debe entender la secuencia de consenso del sitio proteolítico que está implicado en la segmentación de HAO precursora. "De consenso" o "secuencia de consenso" en el sentido en el que se utiliza en la presente significa una secuencia (ya sea una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos) que comprende la variabilidad de secuencias o secuencias relacionadas con base en un análisis de alineación de múltiples secuencias, por ejemplo, los subtipos de una secuencia de HAO de influenza particular. La secuencia de consenso del sitio de segmentación de HAO de influenza puede incluir las secuencias de aminoácidos de hemaglutinina de consenso de la influenza A, incluyendo por ejemplo Hl de consenso a H3 de consenso o las secuencias de aminoácidos de hemaglutinina de consenso de la influenza B. en la figura 24 se muestra ejemplos nc limitantes de secuencias de consenso.

En la secuencia de aminoácidos de la HA, se ubica el asa proteolítica, antes del péptido de fusión que consiste de los 20 primeros aminoácidos de la parte de HA2. Se ha determinado la estructura cristalina de HAO proveniente de A/Hong Kong/68 (Chen, J., 1998. Cell 95:409-417; incorporada en la presente como referencia) . Los residuos que están expuestos a un solvente en general se cree que forman parte del sitio de segmentación que forma un asa de superficie bastante expuesta, extendida. A partir de esta secuencia especifica de péptidos, la secuencia de consenso se puede determinar en esta región seleccionada (Bianchi et al., 2005, Journal of Virology, 79:7380-7388; incorporada en la presente como referencia) .

Para suprimir el asa proteolitica, se examinó la estructura de una B HA. La supresión de sólo el sitio de segmentación proteolitica de la HA podría haber dejado la C-terminal de HAl y la N-terminal de HA2 aparte y podría ser necesario que se designe un enlazante largo. Sin embargo, suprimir parte del péptido de fusión junto con el sitio de segmentación proteolitica permitió eliminar el asa proteolitica completa y unir la secuencia de HAl y HA2 restante mediante un enlazante peptídico mínimo de 2 aminoácidos. En resumen, la variante B contiene una supresión de la secuencia ALKLLKER en el término C de HAl, además de la supresión de los aminoácidos en el término N GFFGAIAGFLEG de HA2. Los HA1-HA2 acortados se enlazaron conjuntamente mediante un enlazante GG.

Como se muestra en la figura 22B, al suprimir el asa proteolitica de HAO, la proteina HAO resultante exhibió una actividad aumentada como se muestra por una mayor capacidad de hemaglutinación, en comparación con una proteina HA que no tuvo su asa proteolitica eliminada. Por un aumento en la actividad, se debe entender un aumento en la capacidad de hemaglutinación entre aproximadamente 2% hasta aproximadamente 100%, o cualquier cantidad entre las mismas según se determina utilizando técnicas estándar en este campo, por ejemplo, entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50% o cualquier valor entre los mismos por ejemplo aproximadamente 2, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45 , 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ó 100%, en comparación con la actividad de la misma proteina HA a la que no se le habla retirado su asa proteolitica.

Por "proteina viral quimérica" o "polipéptido de virus quimérico", también denominada como "proteina quimérica" o "polipéptido quimérico", se debe entender una proteína o polipéptido que comprenda secuencias de aminoácidos de dos o más de dos fuentes, por ejemplo, de manera enunciativa dos o más tipos o subtipos de influenza, o influenza de un origen diferente, que se fusionan como un solo polipéptido. La proteína o polipéptido quimérico puede incluir un péptido señal que es igual o heterólogo con el resto del polipéptido o proteína. La proteína quimérica o polipéptido quimérico se pueden producir como una transcripción a partir de una secuencia de nucleótidos quiméricos, y la proteína quimérica o polipéptido quimérico segmentado después de la síntesis, y según se requiera, asociado para formar una proteína multimérica. Por lo tanto, una proteína quimérica o un polipéptido quimérico también incluye una proteína o polipéptido que comprenda subunidades que están asociadas vía puentes disulfuro (es decir, una proteína multimérica) . Por ejemplo, un polipéptido quimérico que comprende secuencias de aminoácidos de dos o más de dos fuentes se pueden procesar en subunidades, y las subunidades asociadas vía puentes disulfuro para producir una proteína quimérica o polipéptido quimérico. Una proteína viral quimérica también puede comprender una proteína antigénica c un fragmento de la misma de un primer virus de influenza, y un complejo de dominio transmembrana (TDC) a partir de una segunda HA de virus de influenza, incluyendo un dominio transmembrana y dominios de cola citosólica (TM/TC) . El polipéptido puede ser hemaglutinina (HA) , y cada una de las dos o más de dos secuencias de aminoácidos que constituyen el polipéptido se pueden obtener de diferentes HA para producir una HA quimérica, o una HA de influenza quimérica. Una HA quimérica también puede incluir una secuencia de aminoácidos que comprenda un péptido señal heterologo (una preproteina de HA quimérica) que se segmenta después o durante la síntesis de proteínas. De preferencia, el polipéptido quimérico, o la HA de influenza quimérica no se produce naturalmente. Un ácido nucleico que codifica para un polipéptido quimérico sf puede describir como un "ácido nucleico quimérico", o una "secuencia de nucleótidos quiméricos". Una partícula similar a virus que consta de HA quimérica se puede describir como una "VLP quimérica".

La proteína quimérica o polipéptido pueden incluir un péptido señal que es igual o heterologo con el resto del polipéptido o proteína. El término "péptido señal" es bien conocido en la técnica y se refiere en general a una secuencia corta (aproximadamente 5-30 aminoácidos) de aminoácidos, en general encontrada en el término N de un polipéptido que puede dirigir la translocación del polipéptido recién traducido a un orgánulo particular, o ayudar en la colocación de los dominios específicos de la cadena de polipéptido con relación a los otros. Como un ejemplo no limitante, el péptido señal puede dirigir la translocación de la proteína en el retículo endoplásmico y/o ayudar en la colocación del dominio próximo al término N con relación a un dominio de ancla de membrana del polipéptido naciente para ayudar en la segmentación y plegamiento de la proteina madura, por ejemplo, que no se considerará limitante, una proteina HA madura.

Ejemplos no limitantes de proteínas virales quimérico o ácidos nucleicos de virus quimérico que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención se describen en, WO 2009/076778, WO 2010/003235, o WO 2010/148511 (que se incorporan en la presente como referencia) .

Péptido señal Un péptido señal (SP) puede ser natural para la proteína antigénica o proteína viral, o un péptido señal puede ser heterólogo con respecto a la secuencia primaria de la proteína antigénica o proteínas virales que se expresarán. Una proteína antigénica o proteína viral puede comprender un péptido señal proveniente de un primer tipo, subtipo o cepa de influenza con el resto de la HA proveniente de uno o más de un tipo, subtipo o cepas de influenza diferentes. Per ejemplo, el péptido señal natural de los subtipos HA Hl, H2, H3, H5, H6, H7, H9 o el tipo B de influenza se pueden utilizar para expresar la proteína viral quimérica en un sistema vegetal. En algunas modalidades de la invención, el SP puede ser de un tipo B de influenza, Hl, H3 o H5; o del subtipo Hl/Bri, Hl/NC, H5/Indo, H3/Bri o B/Flo.

Un péptido señal también puede ser no natural, por ejemplo, proveniente de una proteina antigénica, una proteina viral o hemaglutinina de un virus distinto a la proteina viral, o proveniente de un polipéptido vegetal, animal c bacteriano. Un ejemplo no limitante de un péptido señal que se puede utilizar es aquel de la isomerasa de disulfuro de la proteina de alfalfa ("PDISP"; nucleótidos 32-103 de acceso No. Z11499, también véase las O 2009/076778, WO 2010/148511, o WO 2010/003235, que se incorporan en la presente como referencia) . Por lo tanto, la presente invención proporciona una proteina viral quimérica que comprende un péptido señal natural o no natural, y los ácidos nucleicos que codifican para estas proteínas virales quiméricas.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para producir una VLP quimérica en una planta, en donde un primer ácido nucleico que codifica para una proteína viral quimérica se co-expresa con un segundo ácido nucleico que codifica para una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa para una proteína de canal protónico. El primero y segundo ácidos nucleicos se pueden introducir a la planta en el mismo paso, o se pueden introducir a la planta secuencialmente .

HA Con referencia al virus de influenza, el término "hemaglutinina" o "HA" en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a una glucoproteina encontrada en la parte externa de las partículas virales de influenza. HA es una glucoproteina tipo I con membrana homotrimérica, que comprende en general un péptido señal, un dominio HAl, HA2 y un dominio que comprende un sitio de ancla que abarca la membrana en el término C y una pequeña cola citoplásmica . Las secuencias de nucleótidos que codifican para HA son bien conocidos y están disponibles -véase, por ejemplo, la base BioDefence Public Healt (virus de influenza, véase la URL: biohealthbase.org) o National Center for Biotechnology Information (véase la URL: ncbi.nlm.nih.gov), ambas se incorporan en la presente como referencia.

El término "homotrímero" u "homotrimérico" indica que un oligómero está formado por tres moléculas de la proteína HA. Sin desear estar vinculados por la teoría, la proteína HA se sintetiza como una proteína precursora monomérica (HAO) de aproximadamente 75 kDa en células animales, que se ensambla en la superficie en una proteína trimérica alargada. Antes de que se presente la trimerización, la proteína precursora se segmenta en un sitio de segmentación de activación conservada (también denominado como péptido de fusión) en 2 cadenas de polipéptidos, HA1 y HA2 (que comprenden la región transmembrana) , enlazadas mediante un enlace disulfuro. El segmento HA1 puede ser de 328 aminoácidos de longitud, y el segmento HA2 puede ser de 221 aminoácidos de longitud. Aunque esta segmentación puede ser importante para la infectividad del virus, puede no ser esencial para la trimerización de la proteína. La inserción de HA dentro de la membrana del retículo endoplasmático (ER) de la célula hospedera, la segmentación del péptido señal y la glucosilación proteínica son eventos co-traduccionales . El replegamiento correcto de HA requiere la glucosilación de la proteína y la formación de 6 enlaces disulfuro intra-cadena . El trímero HA se ensambla dentro del complejo cis- y trans-Golgi, el dominio transmembrana desempeña una función en el proceso de trimerización. La estructura cristalina de las-proteínas HA tratadas con bromelaína, que carecen del dominio transmembrana, han mostrado una estructura bastante conservada entre las cepas de influenza. También se ha establecido que HA experimenta cambios conformacionales principales durante el proceso de infección, lo cual requiere que el precursor HAO se segmente en 2 cadenas polipeptídicas HAl y HA2. La proteína HA se puede procesar (es decir, comprende los dominios HAl y HA2), o puede estar sin procesar (es decir, comprende el dominio HAO) . La proteína HA se puede utilizar en la producción o formación de las VLP utilizando una planta, o célula vegetal, un sistema de expresión.

La HA de la presente invención se puede obtener a partir de cualquier subtipo. Por ejemplo, la HA puede ser del subtipo H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, o la HA del tipo B de influenza. La HA recombinante de la presente invención también puede comprender una secuencia de aminoácidos basada en la secuencia de cualquier hemaglutinina conocida en la técnica -véase, por ejemplo, la base BioDefence Public Healt (virus de influenza, véase la URL: biohealthbase.org) o National Center for Biotechnology Information (véase la URL: ncbi.nlm.nih.gov). Además, la HA se puede basar en la secuencia de una hemaglutinina que está aislada de uno o más virus de influenza emergentes o recién identificados.

Los ejemplos no limitantes de HA, o fragmentos de AH que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen aquellos descritos en las WO 2009/009876, WO 2009/076778; WO 2010/003225, WO 2010/003235, WO 2010/006452, WO 2011/035422 o WO 2010/148511 (que se incorporan en este documento por referencia) .

Como se muestra en la figura 18, la HA proveniente de B/Brisbane/60/2008 se expresa deficientemente en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana (véanse las líneas "1008" o "1029") . Sin embargo, la co-expresión del tipo B de HA con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99, da por resultado en un aumento significativo en la expresión de HA (véanse las lineas "1008+1261", "1009+1261" y "1029+1261") . El aumento en la expresión de HA se observó en ambas HA tipo B natural o un tipo B de HA quimérica. La expresión de HA se observó en presencia o ausencia de elementos de amplificación (BeYDV) y a través de diversas diluciones de Agrobacterium . Se observó un aumento similar en la expresión de H3 cuando H3 proveniente de A/Perth/16/2009 se co-expresó con M2 proveniente A/New Caledonia/20/99 (figura 19; comparar la linea "1019" H3 sola con "1019 1261" H3 co-expresada con 2 ) .

VLP El término "partícula similar a virus" (VLP) , o "partículas similares a virus" o "VLP" se refieren a estructuras que se auto-ensamblan y comprenden diversas proteínas virales por ejemplo una proteína viral estructural tal como la proteína HA de influenza o una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, tal como M2 o una combinación de esas proteínas. Las VLP en general son similares morfológica y antigénicamente a los viriones producidos en una infección, pero carecen de la información genética suficiente para replicarse y de esta forma son no infecciosas. En algunos ejemplos, las VLP pueden comprender una sola especie de proteínas, o más de una especie de protexna. Para las VLP que comprenden más de una especie de proteína, la especie de proteina puede provenir de la misma especie de virus, o pueden comprender una proteína proveniente de una especie diferente, género, subfamilia o familia de virus (según se designe por la nomenclatura ICTV) . En otros ejemplos, una o más de las especies de proteínas que comprenden una VLP se pueden modificar a partir de la secuencia de origen natural. Las VLP se pueden producir en células hospederas adecuadas, que incluyen células hospederas de plantas e insectos. Después de la extracción de la célula hospedera y con el aislamiento y purificación adicional bajo condiciones adecuadas, las VLP se pueden purificar como estructuras intactas .

Además, se pueden producir VLP que comprendan una combinación de subtipos de HA. Por ejemplo, las VLP pueden comprender uno o más de una HA a partir del subtipo H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, el subtipo B HA o una combinación de los mismos. La selección de la combinación de las HA se puede determinar mediante el use destinado de la vacuna preparada a partir de la VLP. Por ejemplo, una vacuna para utilizarse en inoculación de aves puede comprender cualquier combinación de subtipos de HA, mientras que las VLP útiles para inocular a seres humanos pueden comprender los subtipos de uno o más de uno de los subtipos H2, H3, H4, H6, H7 , H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, el subtipo B HA. Sin embargo, se pueden preparar otras combinaciones del subtipos HA dependiendo del uso de la VLP. Para producir las VLP que comprenden combinaciones de los subtipos HA, el subtipo HA deseado se puede co-expresar dentro de la misma célula, por ejemplo una célula vegetal.

Como se describe con mayor detalle más adelante, la expresión de un tipo B HA o H3 proveniente de B/Brisbane/60/2008 en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana se aumenta cuando se co-expresada 2 proveniente de A/New Caledonia/20/99 (véanse las figuras 18 y 19) . No se observa un aumento similar cuando Hl o H5 se co-expresa con M2, ya que se observan altos niveles de la expresión de Hl o H5 en presencia o ausencia de 2 (figuras 20 y 21, respectivamente) . Se sabe que HA se procesará de una forma dependiente del pH (véase Reed M. L. et . al. Journal of Virology, Febrero 2010, p. 1527-1535, Vol. 84, No. 3), y para experimentar un cambio de confirmación dependiente del pH (Skehel J.J. et . al. 1982, PNAS79: 968-972). Hl y H5 exhiben un cambio conformacional a un pH menor que el observado con ya sea H3 y el tipo B HA. Sin desear estar vinculados por la teoría, el pH dentro del aparato Golgi durante la maduración y migración puede no tener un efecto sobre el plegamiento de Hl o H5, sin embargo, un pH bajo dentro del aparato Golgi puede efectuar el plegamiento de H3 y el tipo B HA. Al co-expresar una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, junto con H3 o el tipo B HA, el pH dentro del aparato Golgi puede aumentar y dar por resultado en un plegamiento de HA que conduzca a un rendimiento aumentado de HA. Además, Hl y H5 pueden ser más estables a un pH menor, que H3 y el tipo B HA. Por lo tanto, la co-expresión de una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, junto con H3 o el tipo B HA, menos HA se degrada dentro del aparate Golgi .

Las VLP producidas a partir de proteínas derivadas de influenza, de acuerdo con la presente invención no comprenden la proteína MI. Se sabe que la proteína MI se une al ARN (Wakefield and Brownlee, 1989) que es un contaminante de la preparación VLP. La presencia de ARN no se desea cuando se obtiene la aprobación reguladora para el producto de VLP, por lo tanto, puede ser ventajosa una preparación de VLP que carezca de ARN.

Las VLP producidas como se describe en la presente no comprenden típicamente neuraminidasa (NA) . Sin embargo, la NA se puede co-expresar con HA, se debe desear que las VLP comprendan HA y NA.

La invención también incluye, de manera enunciativa, virus derivados de las VLP que obtienen una envoltura lipidica proveniente de la membrana plasmática de la célula en la cual se expresan las proteínas VLP. Por ejemplo, si la VLP se expresa en un sistema de base vegetal, la VLP puede obtener una envoltura lipidica a partir de la membrana plasmática de la célula.

En general, el término "lípido" se refiere a moléculas de origen natural solubles en grasa (lipofílicas ) . El término también se utiliza más específicamente para hacer referencia a ácidos grasos -y sus derivados (incluyendo tri-, di-, y monoglicéridos y fosfolípidos ) , así como otros metabolitos o esteróles que contiene esterol soluble en grasa. Los fosfolípidos son un componente principal de todas las membranas biológicas, junto con glucolípidos, esteróles y proteínas. Los ejemplos de fosfolípidos incluyen fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol , fosfatidilserina, y lo semejante. Los ejemplos de esteróles incluyen zoosteroles (por ejemplo, colesterol) y fitosteroles . Se han identificado más de 200 fitoesteroles en diversas especies vegetales, las más comunes serán campesterol, estigmasterol , ergosterol, brasicasterol , delta- 7-estigmasterol, delta-7-avenasterol, daunosterol, sitosterol, 24-metilcolesterol, colesterol o beta-sitosterol . Como alguien con experiencia en la técnica podría entender, la composición lipídica de la membrana plasmática de una célula puede variar con el cultivo o las condiciones de crecimiento de la célula u organismo a partir del cual se obtiene la célula.

Las membranas celulares en general comprenden bicapas lipídicas, así como proteínas para diversas funciones. Las concentraciones localizadas de lipidos particulares se pueden encontrar en la bicapa lipídica, denominada como "balsas lipídicas". Sin desear estar vinculados por la teoría, las balsas lipídicas pueden tener funciones significativas en endo y exocitosis, ingreso c egreso de virus u otros agentes infecciosos, transducción de señal inter-celular, interacción con otros componentes estructurales de la célula u organismo, tal como matrices intracelulares y extracelulares .

En plantas, la VLP de influenza se geman a partir de la membrana plasmática, por lo tanto la composición lipídica de las VLP refleja su origen. Las VLP producidas de acuerdo con la presente invención comprenden una HA de uno c más de un tipo o subtipo de influenza, complejados con lipidos derivados de vegetales. Los lipidos vegetales pueden estimular células inmunes especificas y mejorar la respuesta inmunitaria inducida. Las membranas vegetales se producen de lípidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE), y también contienen glucoesfingolipidos, saponinas, v fitosteroles . Adicionalmente, también se encuentran balsas lipidicas en membranas de plasma vegetal -estos microdominios están enriquecidos en esfingolipidos y esteróles. En las plantas, se sabe que se presenta una variedad de fitosteroles, incluyendo estigmasterol , sitosterol, 24-metilcolesterol y colesterol (Mongrand et al., 2004).

PC y PE, asi como los glucoesfingolipidos se pueden unir a moléculas de CD1 expresadas por células inmunitarias de mamíferos, tales como las células presentadoras de antígeno (APCs) similares a células dendriticas y macrófagos y otras células que incluyen linfocitos B y T en el timo e hígado (Tsuji M, . 2006) . Las moléculas CD1 son estructuralmente similares a las principales moléculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) de la clase I y su función es presentar antígenos de glucolípidos para células NKT (linfocitos T citolíticos naturales) . Con la activación, las células NKT activan células inmunes innatas tales como las células NK y las células dendriticas, y también activan células inmunes adaptativas similares a los linfocitos B y linfocitos T productores de anticuerpos.

En una membrana plasmática se puede encontrar una variedad de fitoesteroles -el complemento específico puede variar dependiendo de la especie, condiciones de crecimiento, recursos de nutrientes o estado patogénico, por nombrar unos cuantos factores. En general, el beta-sitosterol es el fitosterol más abundante.

Los fitosteroles presentes en una VLP de influenza complejada con una bicapa lipídica, tal como una envoltura derivada de una membrana plasmática pueden proporcionar una composición de vacuna ventajosa. Sin desear estar vinculados por la teoría, las VLP producidas a partir de plantas complejadas con una bicapa lipídica, tal como una envoltura derivada de una membrana plasmática, puede inducir una reacción inmune más fuerte que las VLP producidas en otros sistemas de expresión, y pueden ser similares a la reacción inmune inducida por vacunas de virus total vivas o atenuadas.

Por lo tanto, en algunas modalidades, la invención proporciona una VLP complejada con una bicapa de lípido derivado de vegetales. En algunas modalidades, la bicapa de lípido derivado de vegetales puede comprender la envoltura de la VLP. Los lípidos derivados de vegetales pueden comprender componentes lipidíeos de la membrana plasmática de la planta donde la VLP se produce, incluyendo, de manera enunciativa fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), glucoesfingolípidos, fitosteroles o una combinación de los mismos. Un lipido derivado de vegetales alternativamente se puede denominar como un "lipido vegetal". Los ejemplos de fitosteroles se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, estigmasterol, sitosterol, 24-metilcolesterol y colesterol -véase, por ejemplo, Mongrand et al., 2004.

Las VLP se pueden evaluar por estructura y tamaño, mediante, por ejemplo, un análisis de hemaglutinación, microscopía electrónica, o cromatografía por exclusión de tamaño.

Para la cromatografía por exclusión de tamaño, el total de proteínas solubles se puede extraer de un tejido vegetal mediante una muestra para homogeneización (Polytron) de un material vegetal triturado congelado en tampón de extracción, y el material insoluble eliminado mediante centrifugación. Se puede utilizar precipitación con PEG. La proteína soluble se cuantifica, y el extracto se hace pasar a través de una matriz por exclusión de tamaño, por ejemplo, de manera enunciativa SephacrylMR. Después de la cromatografía, las fracciones se pueden analizar adicionalmente mediante una inmunotransferencia para determinar el complemento proteínico de la fracción.

Sin desear estar vinculados por la teoría, la capacidad de la HA para unirse a RBC proveniente de diferentes animales se conduce mediante la afinidad de la HA para ácidos siálicos oc2 , 3 o oc2 , 3 y la presencia de estos ácidos siálicos sobre la superficie de RBC. La HA equina y aviar proveniente de los virus de influenza aglutina eritrocitos provenientes de todas las diversas especies, incluyendo pavos, pollos, patos, cobayos, seres humanos, ovejas, caballos y vacas; mientras que las HA humanas se unirán a los eritrocitos para pavos, pollos, patos, cerdos, cobayos, seres humanos y ovejas (véase también Ito T. et al, 1997 , Virology, vol 227 , P493 - 4 99 ; y Medeiros R et al, 2001, Virology, vol 289 p.74 - 85 ) .

Plegamiento (Chaperón) El plegamiento correcto de la proteina viral expresada puede ser importante para la estabilidad de la proteina, la formación de multimeros, la formación de la VLP, la función de la proteina viral y el reconocimiento de la proteina viral mediante un anticuerpo, entre otras características. El plegamiento y la acumulación de una proteína se pueden influir por uno o más factores, incluyendo, de manera enunciativa, la secuencia proveniente de la proteína, la abundancia relativa de la proteína, el grado de aglomeración intracelular, el pH en un compartimento celular, la disponibilidad de cofactores que se puedan unir c se asocien transitoriamente con la proteina plegada, parcialmente plegada o sin plegar, la presencia de una o más proteínas chaperonas o lo semejante.

Las proteínas de choque térmico (Hsp) o proteínas de estrés son ejemplos de proteínas chaperonas, que pueden participar en diversos procesos celulares, entre los que se incluyen la síntesis de proteínas, el tráfico intracelular , la prevención de calza de plegamiento, la prevención de agregación de proteínas, el ensamble y desemsamble de complejos proteínicos, el plegamiento de proteínas, y el desglose de proteínas. Los ejemplos de estas proteínas chaperonas incluyen, de manera enunciativa, Hsp60, Hsp65, Hsp70, Hsp90, HsplOO, Hsp20-30, HsplO, HsplOO-200, HsplOO, Hsp90, Lon, TF55, FKBPs, ciclofilinas , ClpP, GrpE , ubiquitina, calnexina, e isomerasas de disulfuro en proteínas (véase, por ejemplo, Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993); patente de los Estados Unidos No. 5,232, 833). Como se describe en la presente, las proteínas chaperonas, por ejemplo, de manera enunciativa para Hsp40 y Hsp70 se pueden utilizar para asegurar el plegamiento de una proteína viral.

Los ejemplos de Hsp70 incluyen Hsp72 y Hsc73 provenientes de células de mamífero, DnaK provenientes de bacterias, en particular micobacterias tales come Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, y Mycobacterium bovis (tales como Bacille-Calmette Guerin: denominada en la presente como Hsp71) . DnaK proveniente de Escherichia coli, levaduras y otras procariotas, y BiP y Grp78 proveniente de eucariotas, tales como A. thaliana (Lin et al. 2001 (Cell Strees and Chaperones 6:201-208). Un ejemplo particular de una Hsp70 es A. thaliana Hsp70 (codificada por Genbank, ref: AY 120747.1). Hsp70 es capaz de unirse específicamente a ATP así como a polipéptidos y péptidos no plegados, participando con esto en el plegamientc y desplegamiento de proteínas, así como el ensamble y desensamble de complejos proteínicos.

Los ejemplos de Hsp40 incluyen DnaJ proveniente de procariotas tales como E. coli y micobacterias, y HSJ1, HDJ1 y Hsp40, tales como alfalfa (Frugis et al., 1999. Plant Molecular Biology 40:397-408). Un ejemplo particular de una Hsp40 es M. sativa MsJl (GenBank Ref: AJ000995.1). Hsp40 desempeña una función como una chaperona molecular en ei plegamiento de proteínas, la termotolerancia y replicación de ADN, entre otras actividades celulares.

Entre las Hsp, Hsp70 y su co-chaperona , Hsp40, están implicadas en la estabilización de la traducción y polipéptidos recién sintetizados antes de que se complete la síntesis. Sin desear estar vinculados por la teoría, la Hsp40 se une a los parches hidrofobicos de polipéptidos no plegados (nacientes o recién transferidos) , facilitando con esto la interacción del complejo de Hsp70-ATP con el polipéptido. La hidrólisis de ATP conduce a la formación de un complejo estable entre el polipéptido, Hsp70 y ADP, y la liberación de Hsp40. La asociación del complejo de Hsp70-ADP con los parches hidrofobicos del polipéptido evita su interacción con otros parches hidrofobicos, evitando el plegamiento incorrecto y la formación de agregados con otras proteínas (revisado en Hartl, FU. 1996. Nature 381:571-579).

Las proteínas chaperonas naturales pueden ser capaces de facilitar el plegamiento correcto de bajos niveles de la proteína recombinante, aunque aumenten los niveles de expresión, la abundancia de las chaperonas naturales se puede convertir en un factor limitante. Altos niveles de expresión de la proteína viral en las hojas agroinfiltradas puede conducir a la acumulación de la proteína viral en el citosol, y la co-expresión de uno o más de las proteínas chaperonas tales como Hsp70, Hsp40 o tanto Hsp70 como Hsp40 pueden reducir el nivel de proteínas no plegadas o agregadas, y aumentar el número de proteínas que exhiban características estructurales terciarias y cuaternarias que permiten la formación de partículas similares a virus.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para producir VLP de proteínas virales en una planta, en donde un primer ácido nucleico que codifica para una proteína viral se co-expresa con un segundo ácicic nucleico que codifica para una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico, y un tercer ácido nucleico que codifica para una chaperona. El primero, segundo y tercer ácidos nucleicos se pueden introducir a la planta en el mismo paso, o se pueden introducir a la planta secuencialmente .

N-glicanos La VLP producida dentro de una planta puede incluir una proteína viral que comprende N-glicanos planta-específicos. Por lo tanto, esta invención también proporciona una VLP que comprende la proteína viral que tiene N-glicanos planta-específicos .

Además, se conoce la modificación de N-glicanos en plantas (véase, por ejemplo las WO 2008/151440, WO 2010/006452; o patente de los Estados Unidos No. 60/944,344; que se incorporan en la presente como referencia) y se puede producir una proteína viral que tenga N-glicanos modificados. Se puede obtener una proteína viral que comprenda un patrón modificado de glucosilación, por ejemplo, con N-glicanos reducidos fucosilados, xilosilados, o tanto, fucosilados como xilosilados, o se puede obtener una proteina viral que tenga un patrón modificado de glucosilación, en donde la proteína carece de fucosilación, xilosilación, o ambos, y comprende galactosilación aumentada. Además, la modulación de las modificaciones pos-traduccionales, por ejemplo, la adición de galactosa terminal puede dar por resultado en una reducción de fucosilación y xilosilación de la proteína viral expresada en comparación con una planta tipo silvestre que exprese una proteína viral.

Por ejemplo, lo cual no se considera limitante, se puede alcanzar la síntesis de una proteína viral que tenga un patrón modificado de glucosilación al co-expresar la proteina de interés junto con una secuencia de nucleótidos que codifique para una beta-1.4galactosiltransferasa (GALT) , por ejemplo, de manera enunciativa una GalT de mamífero, o una GalT humana sin embargo, también se puede utilizar la GalT proveniente de otras fuentes. El dominio catalítico de la GalT también se puede fusionar a un dominio CTS (es decir, la cola citoplásmica, el dominio transmembrana, la región troncal) de la N-acetilglucosaminiltransferasa (GNT1), para producir una enzima híbrida de GNTl-GalT, y la enzima híbrida se puede co-expresar con la proteína viral. La proteína viral también se puede co-expresar junto con una secuencia de nucleotidos que codifica para N-acetilglucosaminiltrasnferasa III (GnT-III), por ejemplo, de manera enunciativa con una GnT-III de mamífero o una GnT-III de humano, también se puede utilizar una GnT-III proveniente de otras fuentes. Adicionalmente, también se puede utilizar una enzima híbrida de GNTl-GnT-III, que comprende la CTS o la GNTl fusionada a GnT-III.

Por lo tanto, la presente invención también incluye las VLP que comprenden una o más proteínas virales que tengan N-glicanos modificados.

Secuencias Un ejemplo no limitante de secuencias que se pueden utilizar con la presente invención incluyen: La proteína H2 codificada por la molécula de ácido nucleico puede provenir de la cepa A/Singapore/1/57 (H2N2) ; La proteína H3 codificada por la molécula de ácido nucleico puede provenir de la cepa A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/ isconsin/67/2005 (H3N2), A/Victoria/361/2011 (H3N2) o A/Perth/16/2009 (H3N2); La proteína H6 codificada por la molécula de ácido nucleico puede provenir de la cepa A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1) ; La proteína H7 codificada por la molécula de ácidc nucleico también puede provenir de la cepa A/Equine/Prague/56 (H7N7) ; La proteína H9 codificada por la molécula de ácido nucleico puede provenir de la cepa A/HongKong/1073/99 (H9N2); La proteína HA proveniente del subtipo B codificado por el ácido nucleico puede provenir de la cepa B/Florida/4/2006, B/Malaysia/2506/2004 , B/Wisconsin/1/2010 , o B/Brisbane/60/2008.

Un ejemplo no limitante de secuencias que se pueden utilizar con la presente invención también incluye aquellas descritas en las WO 2009/009876, WO 2009/076778, WO 2010/003225, WO 2010/148511, WO 2010/003235, WO 2010/006.452, que se incorporan en la presente como referencia) . Los ejemplos de secuencias de moléculas de aminoácidos que codifican para estas proteínas HA provenientes de H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16 y la HA tipo B, que se conocen en la técnica. Por ejemplo H3 o los subtipos B incluyen las SEC ID NO: 25 ó 30. La secuencia que codifica para la proteína viral estructural puede ser, por ejemplo, la HA de influenza B/Brisbane/60/2008, B/Malaysia/2506/2004 o B/Wisconsin/1/2010 o H3 proveniente de la influenza A/Perth/16/2009 o A/Victoria/361/2011. Otros ejemplos incluyen secuencias de moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas HA, en donde el asa proteolítica de la proteína HA se ha suprimido tal como por ejemplo, de manera enunciativa la secuencia definida por la SEC ID NO: 41.

La presente invención también incluye, de manera enunciativa, secuencias de nucleótidos que codifican para la HA proveniente de, por ejemplo, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16 o la HA tipo B. Por ejemplo las SEC ID NO: 28, 43, 23, que codifica para una HA proveniente de B, B con el asa proteolítica suprimida o H3, respectivamente, una secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con las SEC ID NO: 28, 43, 23, o una secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con un complemente de las SEC ID NO: 28, 43, 23, en donde la secuencia de nucleótidos codifica para una proteína de hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce a la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula vegetal forma una VLP, y la VLP se puede utilizar para producir un anticuerpo que sea capaz de unirse a HA, incluyendo la HA madura proveniente de B o H3. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria. La secuencia de nucleótidos también se puede co-expresar con una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa, las secuencias de nucleótidos SEC ID NO: 9, 12, una secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación cor, las SEC ID NO: 9, 12, o una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con un complemento de las SEC ID NO: 9, 12, en donde la segunda secuencia de nucleótidos codifica para una proteína de canal protónico forma una VLP. De preferencia, la VLP induce la producción de un anticuerpo y la VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria.

Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula vegetal forma una VLP, y la VLP se pueden utilizar para producir un anticuerpo que sea capaz de unirse a una proteína viral tal como por ejemplo la HA, incluyendo de manera enunciativa a HAO, la proteína HAO con su asa proteolítica suprimida o modificada, HAl o HA2 de uno o más tipos o subtipos de influenza, tales como por ejemplo, de manera enunciativas a los subtipos H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, HA subtipo B. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria.

La hibridación bajo condiciones rigurosas de hibridación se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds . 1995 y suplementos; Maniatis et al., en Molecular Cloning (P Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook and Russell, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición 2001; cada una de las mismas se incorpora en la presente como referencia) . Un ejemplo de una de estas condiciones rigurosas de hibridación puede ser una hibridación de aproximadamente 16-20 horas en 4 X SSC a 65°C, seguida por lavado en 0.1 X SSC a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en 0.1 X SSC a 65°C cada 20 ó 30 minutos. Alternativamente, una condición rigurosa de hibridación ilustrativa podría ser durante la noche (16-20 horas) en 50* de formamida, 4 X SSC a 42 °C, seguida por lavado en 0.1 X SSC a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en 0.1 X SSC a 65 °C cada uno durante 20 ó 30 minutos, o durante la noche (16-2C horas) , o la hibridación en tampón de fosfato acuoso Church (7% de SDS; 0.5 M NaP04 tampón pH 7.2; EDTA 10 mM) a 65°C, con 2 lavados, ya sea a 50 °C en 0.1 X SSC, 0.1% de SDS durante 20 ó 30 minutos cada uno, o 2 lavados a 65°C en 2 X SSC, 0.1% de SDS durante 20 ó 30 minutos cada uno.

Adicionalmente, la presente invención incluye secuencias de ácido nucleico que se caracterizan porque tienen aproximadamente 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%) o cualquier cantidad entre las mismas, una identidad de secuencia, o una similitud de secuencia, con la secuencia de nucleótidos que codifica para HA proveniente de B (SEC ID NO: 28), B con el asa proteolitica suprimida o modificada (SEC ID NO: 43), H3 (SEC ID NO: 23) , o una HA codificada por cualquiera de uno o más de las SEC ID NO: 23, 28, 43, 46, 51, 57, o 61, en donde la secuencia de nucleótidos codifica para una proteína de hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y esa VLF induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula vegetal forma una VLP, y la VLP se puede utilizar para producir un anticuerpo que sea capaz de unirse a HA, incluyendo la HA sin procesar y/o madura proveniente de B o H3, o la HA sin procesar y/o madura en donde se ha suprimido el asa proteolitica. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.

La presente invención también incluye secuencias de nucleótidos que se caracterizan porque tienen aproximadamente 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% o cualquier cantidad entre las mismas, una identidad de secuencia, o una similitud de secuencia, con la secuencia de nucleótidos que codifica para 2 (SEC ID NO: 9, 12), en donde la secuencia de nucleótidos codifica para una proteína de-canal, por ejemplo, de manera enunciativa para una proteína de canal protónico, que cuando se co-expresa con una proteína viral estructural forma una VLP. De preferencia, la VLP induce la producción de un anticuerpo y la VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.

La identidad de secuencia o la similitud de secuencia se puede determinar utilizando un programa para comparación de secuencias de nucleótidos, tal como el proporcionado dentro de DNASIS (por ejemplo, utilizando, de manera enunciativa, los siguientes parámetros: penalidad GAP 5, # de las diagonales superiores 5, penalidad GAP fija 10, k-tuple 2, espacio flotante 10, y tamaño de ventana 5) . Sin embargo, son bien conocidos en la técnica otros métodos para alineación de secuencias para comparación, por ejemplo, el algoritmos de Smith & aterman (1981, Adv. Appl . ath. 2:482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol . 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), y mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y BLAST), o mediante la alineación manual e inspección visual. Un ejemplo de la alineación de secuencias de las HA proveniente de diferentes cepas de influenza se puede encontrar en la figura 24.

Una "respuesta inmunitaria" en general se refiere a una respuesta del sistema inmunitario adaptativo. El sistema inmunitario adaptativo en general comprende una respuesta humoral, una respuesta producida por células. La respuesta humoral es el aspecto de inmunidad que se produce por anticuerpos secretados, producidos en las células del linaje de linfocitos B (linfocito B) . Los anticuerpos secretados se unen a antigenos sobre las superficies de microbios invasores (tales como virus o bacterias), que los señala para destrucción. La inmunidad humoral se utiliza en general para hacer referencia a la producción de anticuerpos y los procesos que lo acompañan, asi como las funciones efectoras de los anticuerpos, incluyendo la activación de células Th2 y la producción de citoquinas, la generación de células de la memoria, la promoción de opsonina de fagocitosis, la eliminación de patógenos y lo semejante. Los términos "modular" o "modulación" o lo semejante se refiere a un aumento o disminución en una respuesta o parámetro particular, según se determina mediante cualquiera de los diversos ensayos en general conocidos o utilizados, algunos de los cuales se ejemplifican en la presente.

Una respuesta producida por células es una respuesta inmunitaria que no implica anticuerpos, sino que en su lugar implica la activación de macrófagos, células citoliticas naturales (NK) , linfocitos T citotóxicos antigeno-especificos, y la liberación de diversas citoquinas en respuesta a un antigeno. La inmunidad producida por células se utiliza en general para hacer referencia a alguna activación de células Th, la activación de células Te y las respuestas producidas por linfocitos T. la inmunidad producida por células es de particular importancia para responder a infecciones virales.

Por ejemplo, la inducción de linfocitos T CD8 positivos antigeno-especificos se puede medir utilizando un ensayo ELISPOT, la estimulación de linfocitos T CD4 positivos se puede medir utilizando un ensayo de proliferación. Los títulos de anticuerpos anti-influenza se pueden cuantificar utilizando un ensayo ELISA; los isotipos de anticuerpos antigeno-especificos o de reactivad cruzada también se pueden medir utilizando anticuerpos anti-isotípicos (por ejemplo, anti-IgG, IgA, IgE o IgM) . Los métodos y técnicas para realizar estos ensayos son bien conocidos en la técnica.

Los títulos de HAI con reactividad cruzada también se pueden utilizar para demostrar la eficacia en uva respuesta inmunitaria a otras cepas de virus relacionados con el subtipo de vacuna. Por ejemplo, el suero proveniente de un sujeto inmunizado con una composición de vacuna de una primera cepa (por ejemplo, las VLP de A/Indonesia 5/05) se puede utilizar en un ensayo HAI con una segunda cepa de virus completo o partículas de virus (por ejemplo, A/Vietnam/1194/2004 ) , y el título HAI determinado.

La presencia o niveles de citoquinas también se pueden cuantificar. Por ejemplo, una respuesta de linfocitos T auxiliares (Thl/Th2) se caracterizará por la medición de células secretoras de IFN-? e IL-4 mediante ELISA (por ejemplo, kits de BD Biosciences OptEIA) . Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o esplenocitos obtenidos de un sujeto se pueden cultivar, y se analiza el sobrenadante. Los linfocitos T también se pueden cuantificar mediante clasificación celular activada por fluorescenc a (FACS), utilizando marcas fluorescentes marcador-especificas y métodos como se sabe en la técnica.

También se puede conducir un ensayo de microneutralización para caracterizar una respuesta inmunitaria en un sujeto, véanse, por ejemplo, los métodos de Rowe et al., 1973. Los títulos para neutralización de virus se pueden obtener de varias formas, incluyendo: 1; enumeración de placas de lisis (ensayo de placas) siguiendo fijación/coloración de violeta cristalina de células; 2) observación microscópica de la lisis celular en cultivo; 3) ELISA y detección espectrofotométrica de una proteína viral NP (correlación con la infección viral de células hospederas) .

Estructuras La presente invención se dirige además a una estructura génica que comprende un ácido nucleico que codifica para una proteina de canal, por ejemplo, de manera enunciativa para una proteina de canal protónico o una proteina viral estructural, como se describió anteriormente, enlazada funcionalmente a un elemento regulador que es funcional en una planta. Los ejemplos de elementos reguladores funcionales en una célula vegetal y que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen de manera enunciativa una región reguladora de plastocianina (patente de los Estados Unidos No. 7,125,978; que se incorpora en la presente como referencia), o una región reguladora de Ribulosa 1, 5-biofosfato-carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO; patente de los Estados Unidos No. 4,962,028; que se incorpora en la presente como referencia) , proteina de unión a clorofila a/b (CAB; Leutwiler et al; 1986, que se incorpora en la presente como referencia) ST-LS1 (asociada con eJ. complejo para desprendimiento de oxigeno del fotosistema II y descrito por Stockhaus et al. 1987, 1989; que se incorpora en la presente como referencia) .

Elementos reguladores El uso de los términos "región reguladora", "elemento regulador" o "promotor" en la presente solicitud significa que refleja una porción de ácido nucleico típicamente, aunque no siempre, en la dirección 5' de la región codificante de la proteína de un gen, que puede comprender ya sea ADN o ARN, o tanto ADN como ARN. Cuando una región reguladora está activa, y en asociación funcional, o enlazada funcionalmente, con un gen de interés, esto puede dar por resultado en la expresión del gen de interés. Un elemento regulador puede ser capaz de producir una especificidad orgánica, o controlar el desarrollo o la activación génica temporal. Una "región reguladora" puede incluir elementos promotores, elementos promotores de núcleo que exhiben una actividad promotora basal, elementos que son inducibles en respuesta a un estímulo externo, elementos que producen una actividad promotora, tales como los elementos reguladores negativos o intensificadores transcripcionales . "Región reguladora", en el sentido en el que se utiliza en la presente, también incluye elementos que son activos después de la transcripción, por ejemplo, los elementos reguladores que modulan la expresión génica, tales como los intensificadores traduccionales y transcripcionales, represores traduccionales y transcripcionales, secuencias de activación en la dirección 5', y determinantes de inestabilidad del ARNm. Diversos de estos últimos elementos se pueden ubicar próximos a la región codificante.

En el contexto de esta descripción, el término "elemento regulador" o "región reguladora" típicamente se refiere a una secuencia de ADN, por lo general, aunque no siempre, en la dirección 5' (5' ) de la secuencia codificante de un gen estructural, que controla la expresión de la región codificante al proporcionar el reconocimiento de la polimerasa de ARN y/u otros factores requeridos para iniciar la transcripción en un sitio particular. Sin embargo, se debe entender que otras secuencias de nucleótidos, ubicadas dentrc de los intrones, o la 3' de la secuencia también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento para la polimerasa de ARN u otros factores transcripcionales para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayoría, aunque no todos los elementos promotores eucariotas contienen una secuencia TATA, una secuencia de ácido nucleico conservada que consta de pares de bases nucleotídicos ae adenosina y timidina por lo general situados aproximadamente a 25 pares de bases en la dirección 5' de un sitio para inicio transcripcional . Un elemento promotor comprende un elemento promotor basal, responsable del inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores (como se listó anteriormente) que modifican la expresión génica.

Existen diversos tipos de regiones reguladoras, incluyendo aquellos que se regulan inducibles o constitutivos por desarrollo. Una región reguladora que se regula por desarrollo, o controla la expresión diferencial de un gen bajo su control, se activa dentro de ciertos órganos o tejidos de un órgano en momentos específicos durante el desarrollo de ese órgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que se regulan en el desarrollo de preferencia se pueden activar dentro de ciertos órganos o tejidos en etapas específicas del desarrollo, también se pueden activar de una forma regulada en el desarrollo, o a ur¡ nivel basal en otros órganos o tejidos dentro de la planta. Los ejemplos de regiones reguladoras tejido-específicas, por ejemplo una región reguladora, incluyen el promotor de napina, y el promotor de cruciferina (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Un ejemplo de promotor hoja-específico incluye el promotor de plastocianina (véase la patente de los Estados Unidos No. 7,125,978, que se incorpora en la presente como referencia) .

Una región reguladora inducible es una que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En la ausencia de un inductor las secuencias de ADN o genes nc se transcribirán. Típicamente, el factor proteínico que se une específicamente a una región reguladora inducible para activar la transcripción puede estar presente en una forma inactiva, que luego se convierte directa o indirectamente a la forma activa mediante el inductor. Sin embargo, el factor proteínico también puede estar ausente. Este inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador del crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal, o elementos tóxicos o indirectamente a través de la acción de un patógeno o agente de enfermedad tal como un virus. Una célula vegetal que contiene una región reguladora inducible se puede exponer a un inductor al aplicar externamente el inductor a la célula o planta tal como al rociar, mojar, calentar o métodos similares. Los elementos reguladores inducibles se pueden derivar de genes ya sea vegetales o no vegetales (por ejemplo, Gatz, C. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; que se incorpora en la presente como referencia) . Los ejemplos de promotores inducibles potenciales incluyen de manera enunciativa el promotor inducible por tetraciclina (Gatz, C, 1997, Ann . Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol . 48, 89-108; que se incorpora como referencia) , el promotor inducible por esteroides (Aoyama. T. and Chua, N.H., 1997, Plant 1. 2, 39^-404; que se incorpora como referencia) y el promotor inducible por etanol (Salter, M.G., et al, 1998, Plant lOurnal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, que se incorporan como referencia) genes IB6 y CKI 1 inducibles por citoquinina (Brandstatter , I. and K.ieber, 1.1. ,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985; que se incorporan corro referencia) y el elemento inducible de auxina, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; que se incorpora como referencia) .

Una región reguladora constitutiva dirige la expresión de un gen a todo lo largo de las diversas porciones de una planta y a todo lo largo continuamente del desarrollo de la planta. Los ejemplos de elementos reguladores constitutivos conocidos incluyen promotores asociados con la transcripción CaMV 35S (Odell et al, 1985, Nature, 313: 810-812.), la actina 1 de arroz (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), la actina 2 (An et al., 1996, Plant J. , 10: 107-121), o tms 2 (U.S. 5, 428, 147, que se incorpora en la presente como referencia), y genes de isomerasa triosafosfato 1 (Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), el gen de ubiquitina 1 de maíz (Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. Biol . 29: 637-646), los genes de ubiquitina 1 y 6 de Arabidopsis (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), y gen del factor 4A para iniciación de traducción del tabaco (Mandel et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004) .

El término "constitutivo", en el sentido en el que se utiliza en la presente no necesariamente indica que un gen bajo el control de la región reguladora constitutiva se expresa al mismo nivel en todos los tipos celulares, sino que el gen se expresa en una amplia gama de tipos celulares, incluso aunque se observe con frecuencia una variación en la abundancia. Los elementos reguladores constitutivos pueden estar acoplados con otras secuencias para mejorar adicionalmente la transcripción y/o traducción de la secuencia de nucleótidos a la cual están enlazados funcionalmente . Por ejemplo, el sistema CPMV-HT se deriva de las regiones sin traducir del virus Cowpea mosaic (CPMV) ·. demuestra una traducción mejorada de la secuencia codificante asociada. Por "natural" se debe entender que el ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico es de origen natura] , o "tipo silvestre". Por "enlazado funcionalmente" se debe entender que las secuencias particulares, por ejemplo, un elemento regulador y una región codificante de interés, interactúan ya sea directa o indirectamente para llevar cabo una función destinada, tal como la producción o modulación de una expresión génica. La interacción de las secuencias enlazadas funcionalmente, por ejemplo, se puede producir mediante proteínas que interactúan con las secuencias enlazadas funcionalmente .

Una o más proteína virales tales como la proteína viral estructural o la proteína de canal, por ejemplo, de manera enunciativa con una proteína de canal protónico se pueden expresar en un sistema de expresión que comprende un sistema de expresión de ADN o ARN, de base viral, por ejemplo de manera enunciativa, un cásete de expresión a base de comovirus y un elemento de amplificación a base de geminivirus .

El sistema de expresión, como se describe en la presente, puede comprender un cásete de expresión con base en un virus bipartita, o un virus con un genoma bipartita. Por ejemplo, los virus bipartitas pueden ser de la familia de Comoviridae. Los géneros de la familia de Comoviridae incluyen Comovirus, Nepovirus, Fabavirus, Cheravirus y Sadwavirus . Los Comovirus incluyen virus de Cowpea mosaic (CPMV) , virus de Cowpea mosaic severo (CpSMV) , virus de Squash mosaic (SqMV) , virus de Red clover mottle (RCMV) , virus de Bean pod mottle (BPMV) , virus de Turnip ringspot (TuRSV) , virus de Broad bean true mosaic (BBtMV) , virus cié Broad bean stain (BBSV) , virus de Radish mosaic (RaMV) . Los ejemplos de secuencias de ARN-2 de comovirus que comprender: elementos intensificadores que pueden ser útiles para los diversos aspectos de la invención incluyen de manera enunciativa: CPMV ARN-2 (número de acceso GenBank NC_003550), RCMV AR -2 (número de acceso GenBank NC_003738), BPMV ARN-2 (número de acceso GenBank NC_003495), CPSMV ARN-2 (número de acceso GenBank NC_003544), SqMV AR -2 (número de acceso GenBank NC_003800), TuRSV ARN-2 (número de acceso GenBank NC_013219.1) . BBtMV ARN-2 (número de acceso GenBank GU810904), BBSV ARN2 (número de acceso GenBank FJ028650), RAMV (número de acceso GenBank NC_003800) .

Los segmentos del genoma de ARN comoviral bipartita se denominan como ARN-1 y ARN-2. ARN-1 codifican para las proteínas implicadas en la replicación, mientras el ARN-2 codifica para las proteínas necesarias para el movimiento célula a célula y las dos proteínas cápside. Se puede utilizar cualquier cásete adecuado basado en comovirus incluyendo CPMV, CpSMV, SqMV, RCMV, o BPMV, por ejemplo, el cásete de expresión se puede basar en CPMV.

"Cásete de expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende un ácido nucleico de interés bajo el control de, y enlazado funcionalmente (o funcionalmente ) a un promotor adecuado u otros elementos reguladores para la transcripción del ácido nucleico de interés en una célula hospedadora .

Se ha mostrado que la transformación de Nicotiana benthamiana con copias de ADNc de replicación competente o:e longitud total tanto de ambos ARN genómicos de CPMV puede dar por resultado en una infección productiva (Liu et al., 2004, Virology 323, 37-48, incorporado en la presente como referencia) . Los ejemplos de casetes de expresión a base de CPMV se describen en las WO 2007/135480; WO 2009/087391; y Sainsbury F. et al., (2008, Plant Physiology; 148: 1212-1218; Sainsbury F. et al., (2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. et al., 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682-693; los documentos se incorporan en la presente como referencia) . Como un ejemplo, que no se considerará limitante, las regiones sin traducir (UTRs) obtenidas del ARN genómico 2 del virus Co pea Mosaic (CPMV) en el cual los dos primeros codones para inicio de traducción encontrados en la secuencia líder 5' , se han suprimido, se pueden utilizar como se describe en la WO 2009/087391. Cuando se combina con el promotor CaMV 35S y el terminador de sintasa de nopalina (NOS) , los UTR de CPMV modificados mejoraron la traducción de la región codificante de flanqueo. El sistema de expresión a base de CPMV se denominó CPMV-HT (hipertraducible) . Los casetes de expresión, las estructuras de expresión y los sistemas de expresión de la invención por lo tanto, también pueden comprender un sistema de expresión a base de CPMV tal como por ejemplo un sistema de expresión CPMV-HT.

En el sentido en el que se describe en la presente, una secuencia intensificadora de expresión, la secuencia se deriva de (o comparte homología con) el segmento del genoma ARN-2 de un virus de ARN bipartita, tal como un comovirus, en el cual se ha mutado un sitio para inicio blanco, se puede utilizar para expresar una secuencia de ácido nucleico de interés. La presente invención proporciona además proceses para aumentar la expresión, o actividad para mejoramiento traduccional, de una secuencia derivada de un segmento del genoma ARN-2 de un virus bipartita, el proceso comprende mutar un sitio de inicio blanco en el mismo.

Secuencias "intensificadoras" (o elementos intensificadores) , incluyen secuencias derivadas de (o que comparte homología con) el segmento del genoma de ARN-2 de un virus de ARN bipartita, tal como un comovirus, en el cual se ha mutado un sitio de inicio blanco. Estas secuencias pueden intensificar la expresión en la dirección 3' de un ORF heterólogo al cual se unen. Sin limitación, se cree que estas secuencias, cuando está presente el ARN transcrito, pueden intensificar la traducción de un ORF heterólogo al cual se unen .

Los sistemas de expresión también pueden comprender elementos de amplificación provenientes de un geminivirus por ejemplo, un elemento de amplificación proveniente del virus Bean Yellow Dwarf (BeYDV) . BeYDV pertenece al género de Mastrevirus adaptado a plantas dicotiledóneas. BeYDV es monopartita teniendo un genoma de ADN circular de cadena individual y se pueden replicar a números muy altos de copia mediante un mecanismo de circulo rodante. Los sistemas del vector replicón de ADN derivados de BeYDV se han utilizado para la rápida producción de proteínas de alto rendimiento en plantas .

En el sentido en el que se describe en la presente, la frase "elementos de amplificación" se refiere a un segmento de ácido nucleico que comprende al menos una porción de una o más regiones intergénicas largas (LIR) de un genoma de geminivirus. En el sentido en el que se describe en la presente, una "región intergénica larga" se refiere a una región de una región intergénica larga que contiene un sitie de unión para Rep capaz de producir escisión y replicación mediante una proteína de Rep de geminivirus. En algunos aspectos, el segmento de ácido nucleico que comprende uno o más LIR, puede comprender además una región intergénica corta (SIR) de un genoma de geminivirus. En el sentido en el que se describe en la presente, "región intergénica corta" se refiere a la cadena complementaria (la IR corta (SIR) de un Mastrevirus) . En la presente se puede utilizar cualquier elemento de amplificación derivado de geminivirus. Véase, por ejemplo, las O 2000/20557; WO 2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17); que se incorporan en la presente como referencia) . Si se utiliza más de una LIR en la estructura, por ejemplo dos LIR, entonces el promotor, las regiones CMPV-HT y la secuencia de ácido nucleico de interés y el terminador se colocarán entre corchetes mediante cada una de las dos LIR.

En el sentido en el que se describe en la presente, co-suministro del vector derivado del virus de bean yellow dwarf (BeYDV) y un vector para suministro de Rep/RepA, mediante la agroinfiltración de hojas de Nicotiana benthamiana da por resultado en una amplificación eficiente de replicones y una producción fuerte de proteínas.

Un cásete de expresión a base de comovirus y un elemento de amplificación derivado del geminivirus puede constar de un primero y segundo vectores, o las partes componentes pueden estar incluidas en un vector. Si se utilizan dos vectores, el primero y segundo vectores se pueden introducir en una célula vegetal simultáneamente o por separado .

También puede estar incluida una replicasa viral en el sistema de expresión como se describe en la presente para aumentar la expresión del ácido nucleico de interés. Un ejemplo no limitante de una replicasa es una replicasa BeYDV (pREPUO) que codifica para BeYDV Rep y RepA (C2/C1; Huang et al.. 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714; que se incorpora en la presente como referencia) .

Puede estar implicada una lentificación del gen pos-transcripcional (PTGS) para limitar la expresión de transgenes en plantas, y se puede utilizar la co-expresión de un supresor de lentificación proveniente del P19 del virus de Tomato bushy Stunt (TBSV P19) o el virus Y de papa (HCPro) para contrarrestar la degradación específica de los ARNir transgénicos (Brigneti et al., 1998).

Supresores alternativos de lentificación son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar como se describe en la presente (Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14; que se incorpora en la presente como referencia) , por ejemplo de manera enunciativa, TEV -pl/HC-Pro (Tobacco etch virus-pl/HC-Pro) , BYV -p21, proteína cápside del virus de Tomato crinkle (TCV -CP), 2b del virus de Cucumber mosaic; CMV-2b) , p25 del virus X de papa (PVX-p25), pll del virus M de papa (PVM-pll), pll del virus S de papa (PVS-pll), pl6 del virus de Blueberry scorch, (BScV -pl6) , p23 del virus de Citrus tristexa (CTV-p23) , p24 del virus-2 asociado con Grapevine leafroll (GLRaV-2 p24), plO del virus A de Grapevine, (GVA-plO), pl4 del virus B de Grapevine (GVB-pl4), plO del virus latente de Heracleum (HLV-plO), o pl6 del virus latente común de Garlic (GCLV-pl6) . Por lo tanto, un supresor de lentificación, por ejemplo, de manera enunciativa, HcPro, TEV -pl/HC-Pro, BYV-p21, TBSV pl9, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-pll, PVS-pll, BScV-pl6, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-pl4, HLV-plO, GCLV-pl6 or GVA-plO, se puede co-expresar junto con la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteina de interés para asegurar adicionalmente altos niveles de producción de proteínas dentro de una planta.

Por "co-expresado" se debe entender que dos, o más de dos, secuencias de ácido nucleico se expresan en aproximadamente al mismo tiempo dentro de la planta, y dentro del mismo tejido de la planta. Sin embargo, no es necesario que las secuencias de nucleótidos se expresen exactamente al mismo tiempo. En lugar de esto, las dos o más secuencias de nucleótidos se expresan de tal forma que los productos-codificados tengan una oportunidad de interactuar. Por ejemplo, la proteína que modifica la glucosilación de la proteína de interés se puede expresar ya sea antes o durante el período cuando la proteína de interés se expresa de tal forma que la modificación de glucosilación de la proteína de interés se lleva a cabo. Las dos o más de dos secuencias de nucleótidos se pueden co-expresar utilizando un sistema de expresión transitoria, donde las dos o más secuencias se introducen dentro de la planta aproximadamente al mismo tiempo bajo condiciones en las que se expresan ambas secuencias. Alternativamente, una planta plataforma que comprende una de las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, la secuencia que codifica para la proteína que modifica e] perfil de glucosilación de la proteína de interés, se puede transformar, ya sea transitoriamente o de una forma estable, con una secuencia adicional que codifica para la proteína de interés. En este caso, la secuencia que codifica para la proteína que modifica el perfil de glucosilación de la proteína de interés se puede expresar dentro de un tejido deseado, durante una etapa de desarrollo deseada, o su expresión se puede inducir utilizando un promotor inducible, y la secuencia adicional que codifica para la proteína de interés se puede expresar bajo condiciones similares y en el mismo tejido, para asegurar que se co-expresan las secuencias de nucleótidos.

Una o más proteínas virales se pueden producir como una transcripción a partir de una secuencia de nucleótidos, y la proteína segmentada después de la síntesis, y según se requiera, asociada para formar una proteina multimérica. Por lo tanto, una o más de las proteínas virales también incluye una proteína o polipéptido que comprende subunidades que están asociadas vía puentes de disulfuro (es decir, una proteína multimérica) . Por ejemplo, una proteína que comprende secuencias de aminoácidos provenientes de dos o más de dos fuentes se pueden procesar en subunidades, y las subunidades asociadas vía puentes disulfuro para producir una proteína .

Una o más secuencias de ácido nucleico o de estructuras genéticas de la presente invención se pueden expresar en cualquier planta hospedera adecuada que se transforma mediante la secuencia de nucleótidos, o las estructuras, o vectores de la presente invención. Los ejemplos de hospederos adecuados incluyen, de manera enunciativa, cosechas agrícolas, entre las que se incluyen alfalfa, cañóla, Brassica spp., maíz, Nicotiana spp., papa, ginseng, guisantes, avena, arroz, soya, trigo, cebada, girasol, algodón y lo semejante.

Una o más de las estructuras genéticas de la presente invención pueden comprender además una región sin traducir 3' . Una región sin traducir 3' se refiere a aquella porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualesquiera otras señales reguladoras capaces de llevar a cabo el procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación por lo general se caracteriza por llevar a cabo la adición de rastros de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación comúnmente se reconocen por la presencia de homología con la forma canónica 5' AATAAA-3' aunque son comunes variaciones. Ejemplos nr: limitantes de regiones 3' adecuadas son las regiones Retraducidas transcritas 3' que contienen una señal de poliadenilación del tumor de Agrobacterium que induce genes del plásmido (Ti), tal como el gen de sintasa de nopalina (NOS) , los genes de plantas tales como los genes para proteína de almacenamiento de soya, la subunidad pequeña del gen de carboxilasa 5-bifosfato ribulosa-I, (SsRUBISCO; patente de los Estados Unidos No. 4,962,028; que se incorpora en la presente como referencia) , el promotor utilizado para regular la expresión de plastocianina, descrito en la patente de los Estados Unidos No. 7,125,978 (que se incorpora en la presente como referencia) .

Una o más de las estructuras genéticas de ia presente invención también pueden incluir intensificadores adicionales, intensificadores ya para traducción c transcripción, según se pueda requerir. Los intensificadores pueden estar ubicados en 5' o 3' con la secuencia que será transcrita. Las regiones intensificadoras son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden incluir un codón de iniciación ATG, secuencias adyacentes o lo semejante. El codón de inicio, si está presente, puede estar en fase con la trama de lectura ("en trama") de la secuencia codificante para proporcionar una traducción correcta de la secuencia transcrita .

Por "transformación" se debe entender la transferencia interespecifica de la información genética (secuencia de nucleótidos) que se manifiesta genotipica, fenotipicamente o ambos. La transferencia interespecifica de la información genética de una estructura hacia un hospedero puede ser transitoria y se puede transferir de la informaciór: genética no sea heredable o la transferencia puede ser heredable y la transferencia de la información genética considera estable.

Las estructuras de la presente invención se pueden introducir en células vegetales utilizando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores virales de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de estas técnicas véase, por ejemplo, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2a Ed. (1988); y Miki and Iyer, Fundamentáis of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2a Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997). Otros métodos incluyen la absorción directa de ADN, el uso de liposomas, electroporación, por ejemplo, utilizando protoplastos, microinyección, microproyectiles o filamentos, e infiltración al vacio. Véase, por ejemplo, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet . 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology ( eissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), patente de los Estados Unidos Nos. 4,945,050; 5,036,006; y 5,100,792, solicitudes de patente de los Estados Unidos No. de serie 08/438,666, presentada el 10 de mayo de 1995, y 07/951,715, presentada el 25 de septiembre de 1992, (todas se incorporan en la presente come referencia) .

Como se describirá más adelante, los métodos ce expresión transitoria se pueden utilizar para expresar las estructuras de la presente invención (véase Liu ano. Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348; que se incorpora en la presente como referencia). Alternativamente, se puede utilizar un método para expresión transitoria por vacio, como se describe por Kapila et al., 1997, que se incorpora en la presente como referencia). Estos métodos pueden incluir, por ejemplo, de manera enunciativa, un método de agro-inoculación o agro-infiltración, infiltración por jeringa, sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos transitorios como se observo anteriormente. Con la agro-inoculación, agro-infiltración, o infiltración por jeringa, una mezcla de agrobacterias que comprende el ácido nucleico deseado ingresa a los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo las hojas, la porción aérea de la planta (incluyendo tallo, hojas y flor), otra porción de la planta (tallo, raíz, flor) , o la planta completa. Después de cruzar la epidermis la Agrobacteria infecta y transfiere copias de ADN-t en las células. El ADN-t se transcribe epxsomalmente y el ARNm traducido, conduciendo a la producción de la proteina de interés en células infectadas, sin embargo, el paso del ADN-t dentro del núcleo es transitorio.

Para ayudar a identificar las células vegetales transformadas, las estructuras de esta invención se pueden manipular adicionalmente para que incluyan marcadores seleccionar/les vegetales. Los marcadores selecciónateles o útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a químicos tales como un antibiótico, por ejemplo, gentamicina, higromicina, kanamicina, o herbicidas tales como fosfinotricina, glifosato, clorosulfuron, y lo semejante. Similarmente, se pueden utilizar enzimas que proporcionan la producción de un compuesto identificable por cambio de color tal como GUS (beta-glucuronidasa) , o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP.

Por el término "materia vegetal", se debe entender cualquier material derivado de una planta. La materia vegetal puede comprender una planta completa, tejido, células, o cualquier fracción de los mismos. Además, la materia vegetal puede comprender componentes intracelulares de una planta, componentes extracelulares de una planta, extractos líquidos o sólidos de plantas, o una combinación de los mismos. Además, la materia vegetal puede comprender plantas, células vegetales, tejido, un extracto líquido, o una combinación de los mismos, provenientes de hojas de plantas, tallos, frutas, raíces o una combinación de los mismos. La materia vegetal puede comprender una planta o porción de la misma que no se haya sometido a ninguno de los pasos de procesamiento. Sin embargo, se contempla que el material vegetal se puede someter a pasos mínimos de procesamiento como se definirá más adelante, o un procesamiento más riguroso, incluyendo una purificación parcial o sustancial de proteínas utilizando técnicas comúnmente conocidas dentro este campo, incluyendo, de manera enunciativa cromatografía, electroforesis y le seme ante .

Por el término "procesamiento mínimo" se debe entender que la materia vegetal, por ejemplo, una planta c porción de la misma que comprende una proteína de interés que se purifica parcialmente para producir un extracto vegetal, homogeneizado, fracción de homogeneizado vegetal o lo semejante (es decir procesado mínimamente) . La purificación parcial puede comprender, de manera enunciativa interrupción de las estructuras celulares de la planta creando con esto una composición que comprende componentes vegetales solubles, y componentes vegetales insolubles que se pueden separar por ejemplo, de manera enunciativa, mediante centrifugación, filtración o una combinación de las mismas. Con respecto a esto, las proteínas secretadas dentro del espacio extracelular de la hoja u otros tejidos se podrían obtener fácilmente utilizando un vacío o extracción por centrífuga, r los tejidos se pueden extraer bajo presión mediante el paso a través de rodillos o molido o lo semejante para exprimir o liberar la proteína libre desde el interior del espacie extracelular . El procesamiento mínimo también podría implicar la preparación de extractos crudos de proteínas solubles, ya que estas preparaciones podrían tener una contaminación insignificante a partir de los productos vegetales secundarios. Además, el procesamiento mínimo puede implicar una extracción acuosa de proteína soluble proveniente de las hojas, seguida por precipitación con cualquier sal adecuada. Otros métodos pueden incluir maceración a gran escala y extracción de jugos para permitir el uso directo del extracto .

La materia vegetal, en la forma de material c tejido vegetal se pueden suministrar oralmente a un sujeto. La materia vegetal se puede administrar como parte de un suplemento dietético, junto con otros alimentos, c encapsulada. La materia o tejido vegetal también se puede concentrar para mejorar o aumentar la palatabilidad, o se puede proporcionar junto con otros materiales, ingredientes o excipientes farmacéuticos, según se requiera.

Se contempla que una planta que comprende la proteína de interés, o que expresa la VLP que comprende la proteína de interés se puede administrar a un sujeto u organismo blanco, en una variedad de formas que dependen de la necesidad y la situación. Por ejemplo, la proteína de interés obtenida de la planta se puede extraer antes de su uso, ya sea en una forma cruda, parcialmente purificada, c purificada. Si la proteina será purificada, entonces se puede producir en plantas comestibles o no comestibles. Además, su la proteina se administra oralmente, el tejido vegetal se puede cosechar y alimentar directamente al sujeto, o el tejido cosechado se puede deshidratar antes de la alimentación, o se puede permitir que un animal paste sobre la planta antes de que se lleve a cabo la cosecha. También se considera que queda dentro del alcance de esta invención los tejidos vegetales cosechados que se proporcionarán como un suplemento alimenticio dentro de una alimentación para animales. Si el tejido vegetal se alimentará a un sujeto o un animal con poco o ningún procesamiento adicional, se prefiere que el tejido vegetal administrado sea comestible.

Las VLP producidas de acuerdo con la presente invención se pueden purificar, purificar parcialmente a partir de una planta, porción de una planta o materia vegetal, o se pueden administrar como una vacuna oral, utilizando métodos conocidos por un experto en la técnica. La purificación puede incluir la producción de una fracción de apoplasto como se describe en la O 2011/035422 (que se incorpora en la presente como referencia) . Para una cromatografía por exclusión de tamaño preparativa, se puede obtener una composición que comprende las VLP y el material insoluble retirado mediante centrifugación. La precipitación con PEG también se puede utilizar. La proteina recuperada se puede cuantificar utilizando métodos convencionales (por ejemplo, ensayo Bradford, BCA) , y el extracto se hace pasar a través de una columna por exclusión de tamaño, utilizando por ejemplo SephacrylMR, SephadexMR, o un medio similar, y las fracciones se recolectan. Como un estándar de calibración se puede utilizar Blue Dextran 2000 o una proteina adecuada. El extracto también se puede hacer pasar a través de una columna de intercambio catiónico y se recolectan las fracciones activas. Después de la cromatografía, las fracciones se pueden analizar adicionalmente mediante electroforesis de proteínas, inmunotransferencia, o ambas, para confirmar la presencia de las VLP y el complemento proteínico de la fracción .

También se consideran parte de esta invención las plantas transgénicas , células vegetales, semillas o cualquier fracción de las mismas que contengan las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Los métodos para regenerar plantas completas a partir de células vegetales también se conocen en la técnica. En general, las células vegetales transformadas se cultivan en un medio adecuado, que puede contener agentes selectivos tales como antibióticos, donde se utilizan marcadores seleccionadles para facilitar la identificación de células vegetales transformadas. Una vez que se forme el tallo, la formación de retoño se puede fomentar al emplear las hormonas vegetales adecuadas de acuerdo con los métodos conocidos y los brotes transferidos a un medio de enraizamiento para la regeneración de plantas. Las plantas luego se pueden utilizar para establecer generaciones repetitivas, ya sea a partir de semillas o utilizando técnicas de propagación vegetativa. Las plantas transgénicas también se pueden generar sin utilizar cultivos de tejidos.

Como se muestra en la figura 18, HA proveniente de B/Brisbane/60/2008 se expresa deficientemente en hojas agroinfiltradas de Nicotiana benthamiana (véanse las líneas "1008" o "1029") . Sin embargo, la co-expresión del tipo B de HA con M2 proveniente de A/New Caledonia/20/99, da por resultado en un aumento significativo en la expresión de HA (véanse las líneas "1008+1261", "1009+1261" y "1029+1261"', El aumento en la expresión de HA se observó con el tipo B natural de HA o un tipo B de HA quimérica. La expresión de HA se observó en presencia o ausencia de elementos de amplificación (BeYDV) , y a través de diversas diluciones de Agrobacterium. Se observó un aumento similar en la expresión de H3 cuando H3 proveniente del A/Perth/16/2009 se co-expresó con M2 proveniente de A/Ne Caledonia/20/99 (figura 19; comparar la línea "1019" H3 sola, con "1019+1261" H3 coexpresada con M2) .

La presente invención incluye secuencias de nucleótidos como se establece en la Tabla 3: Tabla 3. Lista de números de identificación de secuencias La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos.

E emplos Material y Métodos: Asamblea de los casetes de expresión con una proteina de influenza A-2X35S/CPMV-HT/H5 Indonesia/NOS (Número estructura 489) Se clonó una secuencia que codifica para H5 proveniente de influenza A/Indonesia/5/2005 (H5N1) en un sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en un plásmido que contuvo el cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter utilizando el siguiente método basado en PCR. Un fragmento que contuvo la secuencia codificante de H5 completa se amplificó utilizando los cebadores IF-H5A-I-05. l+3c (figura 1A, SEC ID NO: 2) y IF-H5dTm.r (figura IB, SEC ID NO: 3, utilizando el número de estructura 972 (véase la figura 94, SEC ID NO: 134 de la O 2010/003225, que se incorpora en la presente como referencia, para la secuencia del número de estructura 972) como molde. El producto PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CP V-HT/NOS utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 1191 (figura ID, SEC ID NO: 4) se digirió con la enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó el plásmidc linealizado para la reacción de ensamble In-Fusion. El número de estructura 1191 es un plásmido aceptor destinado para la clonación de genes "In-Fusion" de interés en un cásete de expresión a base de CPMV-HT. También se incorporó una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador génico de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmidc binario de pCAMBIA y. la secuencia de fronteras de ADN-t de izquierda a derecha está presente en la figura IB (SEC ID NO: 4). A la estructura resultante se le proporcionó el número 489 (figura 1E, SEC ID NO: 5) . La secuencia de aminoácidos de H5 proveniente de influenza A/Indonesia/5/2005 (H5N1) se presenta en la figura 1F (SEC ID NO: 6) . En la figura 15 se presenta una representación del plásmido 489.

B-2X35S/CPMV-HT/M2 New Caledonia/NOS (Número de estructura 1261) Se clonó una secuencia que codifica para M2 proveniente de influenza A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) en un sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en un cásete de expresión que contuvo un plásmido Plasto_pro/Pl9/Plasto_ter utilizando el siguiente método a base de PCR. Un fragmento que contuvo la secuencia codificante M2 completa se amplificó utilizando los cebadores IF-S1- 1+ 2ANC . c (figura 2A, SEC ID NO: 7) y IF-S1-4-M2ANC . r (figura 2B, SEC ID NO: 8) utilizandc el gen M2 sintetizado (correspondiente a nt 1-26 unido a nt 715 a 982 a partir del número de acceso GenBank DQ508860) (figura 2C, SEC ID NO: 9) como molde. El producto PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CP V-HT/NOS utilizandc el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 1191 (figura 1C) se digirió con la enzima de restricción SacII y Stul y el plásmido linealizado se utilizó para la reacción de ensambla In-Fusion. El número de estructura 1191 es un plásmido aceptor destinados para la clonación "In-Fusion" de los genes de interés en un cásete de expresión a base CPMV HT. También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura ID (SEC ID NO: 4) . A la estructura resultante se le proporcionó el número 1261 (figura 2D, SEC ID NO: 10) . La secuencia de aminoácidos de M2 proveniente de influenza A/New Caledonia/20/1999 (HlNl) se presenta en la figura 2E (SEC ID NO: 11). En la figura 16 se presenta una representación del plásmido 1261.

C-2X35S/CPMV-HT/M2 Puerto Rico/NOS (Número de estructura 859) Se clonó una secuencia que codifica para h'2 proveniente de la influenza A/Puerto Rico/8/1934 (HlNl) en un sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente método a base de PCR. Un fragmente que contuvo la secuencia codificante 2 completa se amplificó utilizando los cebadores IF-S1-M1+M2ANC . c (figura 2A, SEC ID NO: 7) y IF-S1-4-M2ANC . r (figura 2B, SEC ID NO: 8), utilizando un gen M2 sintetizado (correspondiente a nt 26-51 unido a nt 740-1007 a partir del número de acceso Genbank EF467824) (figura 3A, SEC ID NO: 12) como molde. El producto PCR se clonó en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NCS utilizando un sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 1191 (figura 1C) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó e plásmido linealizado para la reacción de ensamble In-Fusion. El número de estructura 1191 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In-Fusion" de los genes de interés en un cásete de expresión a base de CPMV-HT. También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. El vector es un plásmido binaric pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADM-t de izquierda a derecha se presenta en la figura ID (SEC ID NO: 4). La estructura resultante se le proporcionó el número 859 (figura 3B, SEC ID NO: 13) . La secuencia de aminoácidos-de M2 proveniente de la influenza A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) se presenta en la figura 3C (SEC ID NO: 14) . En la figura 17 Se presenta una representación del plásmido 859.

D-2X35S/CPMV-HT/PDISP/H1 California 1/NOS (Número de estructura 484) Se clonó una secuencia que codifica para Hl proveniente de la influenza A/California/7/2009 (H1N1) en el sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente PCR. Un fragmento que contuvo la secuencia codificante Hl sin su péptido señal tipo silvestre se amplificó utilizando los cebadores IF-H1A-C-09. s2+4c (figura 4A, SEC ID NO: 15) y IF-H1A-C-09. sl-4r (figura 4B, SEC ID NO: 16), utilizando el gen Hl sintetizado (número de acceso Genbank FJ966974) (figura 4C, SEC ID NO: 17) come molde. El producto PCR se clonó en trama con el péptido señal PDI de alfalfa en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 1192 (figura 4D) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó el plásmido linealizado para la reacción de ensamble In-Fusior. El número estructura 1192 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In-Fusion" de los genes de interés en la trama con un péptido señal PDI de alfalfa en un cásete de expresión a base CPMV-HT. También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 ae lentificación bajo el promotor y terminador del gen ae Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura 4F (SEC ID NO: 18) . La estructura resultante se le proporcionó el número 484 (figura 4F, la SEC ID NO: 19) . En la figura 4G (SEC ID NO: 20) se presenta la secuencia de aminoácidos de PDISP/H1 proveniente de la influenza A/California/7/200í (H1N1) . En la figura 14 se presenta una representación del plásmido 484.

E-2X35S/CPMV-HT/PDISP/H3 Perth/NOS (Número de estructura 1019) Se clonó una secuencia que codifica para H? proveniente de la influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) en un sistema de expresión 2X35S/CP V-HT/PDISP/NOS en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente método a base de PCR. Un fragmente que contuvo la secuencia codificante H3 sin su péptido señal-tipo silvestre se amplificó utilizando los cebadores IF-S2+S4-H3 Per.c (figura 5A, SEC ID NO: 21) y IF-Sla4-H3 Per.r (figura 5B, SEC ID NO: 22), utilizando el gen H3 sintetizado (correspondiente a nt 26-1726 del número de acceso Genbank GQ293081) (figura 5C, SEC ID NO: 23) como molde. El producto PCR se clonó en trama con el péptido señal PDI de alfalfa en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 1192 (figura 4D) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó el plásmido linealizade para la reacción de ensamble In-Fusion. El número estructura 1192 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In-Fusion" de genes de interés en la trama con un péptido señal PDI de alfalfa en un cásete de expresión a base CPMV-HT. También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura 4E (SEC ID NO: 18) . A la estructura resultante se le proporcionó el número de 1019 (figura 5D, SEC ID NO: 24) . En la figura 5E (SEC ID NO: 25) se presenta la secuencia de aminoácidos de PDISP/H3 proveniente de influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) . En la figura 13 se presenta una representación del plásmido 1019.

F-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B Brisbane/NOS (Número de estructura 1029) Se clonó una secuencia que codifica para HA. proveniente de influenza B/Brisbane/60/2008 en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente método a base de PCR. Un fragmento que contiene la secuencia codificante HA B Brisbane sin su péptido señal tipo silvestre se amplificó utilizando los cebadores IF- S2+S4-B Bris.c (figura 6A, SEC ID NO: 26) y IF-Sla4-B Bris.r (figura 6B, SEC ID NO: 27), utilizando el gen HA B Brisbane sintetizado (correspondiente a nt 34-1791 a partir del número de acceso Genbank FJ766840) (figura 6C, SEC ID NO: 28) como molde. El producto PCR se clonó en trama con el péptido señal PDI alfalfa en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 1192 (figura 4D) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y el plásmidc linealizado se utilizó para la reacción de ensamble In-Fusion. El número de estructura 1192 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In-Fusion" de los genes de interés en trama con un péptido señal PDI de alfalfa en un cásete de expresión a base CPMV-HT. También incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura 4E (SEC ID NO: 18) . A la estructura resultante se le proporcionó el número de 1029 (figura 6D, SEC ID NO: 29) . En la figura 5E (SEC ID NO: 30) se presenta la secuencia de aminoácidos de PDISP/HA de influenza B/Brisbane/60/2008. En la figura 11 se presenta una representación del plásmido 1029.

G-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B Brisbane/NOS en el sistema de amplificación con BeYDV+Replicasa (estructura de número 1008) Se clonó una secuencia que codifica para HA de influenza B/Brisbane/60/2008 en 2X35S/CP V-HT/PDISP/NOS que comprende el sistema de amplificación con BeYDV + replicasa en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente método a base de PCR. Un fragmento que contuvo la secuencia de codificación HA. B Brisbane sin su péptido señal tipo silvestre se amplificó utilizando los cebadores IF-S2+S4-B Bris.c (figura 6A, SEC ID NO: 26) y IF-Sla4-B Bris.r (figura 6B, SEC ID NO: 27), utilizando el gen HA B Brisbane sintetizado (correspondiente a nt 34-1791 a partir del número de acceso Genbank FJ766840) (figura 6C, SEC ID NO: 28) como molde. El producto PCR se clonó en tramas con el péptido señal PDI de alfalfa en el cásete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en el sistema de amplificación BeYDV utilizando el sistema de clonación In-Fusión (Clontech, ountain View, CA) . La estructura 1194 (véanse las Figuras 6F y 6G) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó el plásmido linealizadc para la reacción de ensamble In-Fusion. El número estructura 1194 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In- Fusión" de los genes de interés en tramas con un péptido señal PDI de alfalfa en un cásete de expresión a base de CPMV-HT en el sistema de amplificación BeYDV. También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor \ terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura 6G (SEC ID NO: 31) . A la estructura resultante se le proporcionó el número de 1008 (figura 6H, SEC ID NO: 32' . En la figura 6E (SEC ID NO: 30) se presenta la secuencia de aminoácidos PDISP/HA de influenza de B/Brisbane/60/08. En la figura 9 se presenta una representación del plásmido 1008.

H-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B Brisbane/H5 Indonesia dominio transmembrana y cola citoplasmática (H5Indo TMCT)/NOS en el sistema de amplificación con BeYDV + Replicasa (Numere de estructura 1009) Se clonó una secuencia que codifica para de HA proveniente de influenza B/Brisbane/60/2008 ectodomini c fusionado a la transmembrana y dominios citosólicos de H5 proveniente de A/Indonesia/5/2005 (H5N1) en 2X35/CPMV-HT/PDISP/NOS que comprende el sistema de amplificación con BeYDV + replicasa en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido como sigue utilizando el método de ligación a base de PCR presentado por Darveau et al. (Methods in Neurociencia 26: 77-85 (1995)). En una primera ejecución de PCR, un fragmento que contuvo la secuencia codificante del ectodominio de HA B Brisbane sin el péptido señal natural, los dominios transmembrana y citoplasmáticos se amplificó utilizando los cebadores IF-S2 + S4-B Bris.c (figura 6A, SEC ID NO: 26) y dTmH5I-B Bris.r (figura 7A, SEC ID NO: 33) , utilizando el gen HA B Brisbane sintetizado (correspondiente a nt 34-1791 a partir del número de acceso Genbank FJ766840) (figura 6C, SEC ID NO: 28) como molde. Un segundo fragmento que contuvo los dominios transmembrana y citoplásmicos de H5 Indonesia se amplificó utilizando los cebadores B Bris-dTmH5I . c (figura 7B, SEC ID NO: 34) y IF-SlaS4-dTmH5I . r (figura 7C, SEC ID NO: 35'), utilizando el número de estructura 489 (véase la figura IE, SEC ID NO: 5) como molde. Los productos PCR provenientes de ambas amplificaciones luego se mezclaron y se utilizaron come molde para una segunda ejecución de amplificación utilizando IF-S2 + S4-B Bris.c (figura 6A, SEC ID NO: 26) y IF-H5dTm.r (figura 7C, SEC ID NO: 34) como cebadores. El fragmento resultante se clonó en trama con el péptido señal PDI de-alfalfa en el cásete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en el sistema de amplificación BeYDV utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . la estructura 1194 (figuras 6F y 6G) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó el plásmidc linealizado para la reacción de ensamble In-Fusion. El número de estructura 1194 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In-Fusion" de los genes de interés en trama con una señal de péptido PDI alfalfa en un cásete de expresión a base en CP V HT en el sistema de amplificación BeYDV. También se incorporó una estructura génica para la co-expresión de: supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente ole las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura 6G (SEC ID NO: 31) . A la estructura resultante se le proporcionó el número de 1009 (figura 7D, SEC ID NO: 36) . En la figura 7E (SEC ID NO: 37) se presenta la secuencia de aminoácidos de PDISP/HA B Brisbane/H5indo TMCT. En la figura 10 se presenta una representación del plásmido 1009.

I-2X35S/CPMV-HT/PDISP-B HA Brisbane con el asa proteolítica suprimida en el sistema de amplificación con BeYDV + Replicasa (número de estructura 1059) Se clonó una secuencia que codifica para HA proveniente de influenza B/Brisbane/60/2008 con el asa proteolítica suprimida en 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS que comprende el sistema de amplificación con BeYDV + replicase en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente método de ligación a base de PCR presentado por Darveau et al., (Methods in Neurociencia 26: 77-85 (1995)). En una primera ejecución de PCR, un fragmento que contuvo la secuencia codificante de HA B Brisbane a partir de nt 46 hasta nt 106b se amplificó utilizando los cebadores IF-S2+S4-B Bris.c (figura 6A, SEC ID NO: 26) y 103+1059. r (figura 8A, SEC ID NO: 38), utilizando el gen HA B Brisbane sintetizado (correspondiente a nt 34-1791 a partir del número de acceso Genbank FJ766840) (figura 6C, SEC ID NO: 28) como molde. Un segundo fragmento, que contuvo la secuencia codificante de HA B Brisbane a partir de nt 1123 hasta nt 1758, se amplifico utilizando los cebadores 1039+1059c (figura 8B, SEC ID NO: 39) y IF-Sla4-B Bris.r (figura 6B, SEC ID NO: 27), utilizando el gen HA B Brisbane sintetizado (correspondiente a nt 34-1791 a partir del número de acceso Genbank FJ766840) (figura 6C, SEC ID NO: 28) como molde. Los productos PCR provenientes de ambas amplificaciones luego se mezclaron y se utilizaron como moldes para una segunda ejecución de amplificación utilizando IF-S2+S4-B Bris.c (figura 6A, SEC ID NO: 26) y IF-H5dTm.r IF-S14-B Bris.r (figura 6B, SEC ID NO: 27) como cebadores. El fragmento resultante (que codifica para B HA/Brisbane/60/2008 Aa.a. 356-374 con un enlazante GG entre los fragmentos) se clonó en trama con el péptido señal PDI de alfalfa en el cásete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS que comprende el sistema de amplificación BeYDV utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 1194 (figura 6F y 6G) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó el plásmido linealizado para la reacción de ensamble In-Fusion. El número de estructura 1194 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In-Fusion" de los genes de interés en trama con un péptido señal PDI de alfalfa en un cásete de expresión a base de CPMV-HT en el sistema de amplificación BeYDV. También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura 6G (SEC ID NO: 31) . A la estructura resultante se le proporcionó el número de 1059 (figura 8C, SEC ID NO: 40) . En la figura 8D (SEC ID NO: 41) se presenta la secuencia de aminoácidos de PDISP-B HA/Brisbane/60/2008 con el asa proteolitica suprimida. En la figura 12 se presenta una representación del plásmido 1059.

A-2X35 S/CPM V-HT/PDI SP/H3 Victoria/NOS (Número de estructura 1391) Se clonó una secuencia que codifica para H3 proveniente de influenza A/Victoria/361/2011 (H3N2) en sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente método a base de PCR. Un fragmento que contuvo la secuencia codificante de H3 sin su péptidc señal tipo silvestre se amplificó utilizando los cebadores IF-H3V36111.S2+4C (figura 25A, SEC ID NO: 44) y IF-H3V36111.S1-4R (figura 25B, SEC ID NO: 45), utilizando el ger H3 sintetizado (correspondiente a nt 25 hasta 1725 de GISAID PAI_ISL_101506 proveniente de la secuencia HA aislada) (figura 25C, SEC ID NO: 46) como molde. El producto PCR se clonó en trama con el péptido señal PDI de alfalfa en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 1192 (figura 4D) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó el plásmido linealizado para la reacción de ensamble In-Fusion. El número de estructura 1192 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In-Fusion" de los genes de interés en trama con un péptido señal PDI de alfalfa en un cásete de expresión a base CPMV-HT. También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura 4E (SEC ID NO: 18) . A la estructura resultante se le proporcionó el número 1391 (figura 25D, SEC ID NO: 47). En la figura 25E (SEC ID NO: 48) se presenta la secuencia de aminoácidos de PDISP/H3 proveniente de la influenza A/Victoria/361/2011 (H3N2) . En la figura 25F se presenta una representación del plásmido 1391.

B-2X35S/CPMV-HT/HA B isconsin/NOS en el sistema de amplificación con BeYDV (m) +Replicasa (Número estructura 1462) Se clonó una secuencia que codifica para HA de influenza B/Wisconsin/1/2010 en 2X35 S/CPMV-HT/NO S que comprende el sistema de amplificación con BeYDV (m) treplicasa en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente método a base de PCR. Un fragmento que contuvo la secuencia codificante de HA B isconsin completa se amplificó utilizando los cebadores IF-HAB110.Sl+3c (figura 26A, SEC ID NO: 49) y IF-HAB110. sl-4r (figura 26B, SEC ID NO: 50), utilizando el gen de la HA B Wisconsin sintetizado (Número de Acceso GenBank JN993010) (figura 26C, SEC ID NO: 51) como molde. El producto de PCR se clonó en el cásete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en el sistema de amplificación BeYDV(m) utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 193 (figura 26D) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó el plásmido linealizado para la reacción de ensamble In-Fusion. El número de estructura 193 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In-Fusion" de los genes de interés en un cásete de expresión a base CPMV-HT en el sistema de amplificación BeYDV(m) . También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura 26E (SEC ID NO: 52) . A la estructura resultante se le proporcionó el número de 1462 (figura 26F, SEC ID NO: 53). En la figura 26G (SEC ID NO: 54) se presenta la secuencia de aminoácidos de PDISP/HA de influenza B/ isconsin/1/2010. En la figura 26H se presenta una representación del plásmido 1462.

C-2X35S/CP V-HT/HA B Wisconsin con asa proteolítica suprimida en el sistema de amplificación con BeYDV (m) +Replicasa (Número estructura 1467) Se clonó una secuencia que codifica para HA de influenza B/Wisconsin/1/2010 con asa proteolítica suprimida en 2X35S/CPMV-HT/NOS que comprende el sistema de amplificación con BeYDV (m) +replicasa en un cásete de expresión Plasto_pro/Pl9/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente método de ligación a base de PCR presentado por Darveau et al. (Methods in Neurociencia 26: ? p -85 (1995) ) . En una primera ejecución de PCR, un fragmento que contuvo la secuencia codificante HA B Wisconsin a partir de nt 1 hasta nt 1062 se amplificó utilizando los cebadores IF-HAB110.S1+3C (figura 26A, SEC ID NO: 49) y HAB110 (PrL-).r (figura 27A, SEC ID NO: 55), utilizando el gen HA B Wisconsin sintetizado (número de acceso Genbank JN993010) (figura 26C, SEC ID NO: 51) como molde. Un segundo fragmento, que contuvo la secuencia codificante HA B Wisconsin de nt 1120 hasta nt 1755, se amplificó utilizando los cebadores HAB110 ( PrL- ) . c (figura 27B, SEC ID NO: 56) y IF-HAB110. sl-4r (figura 26B, SEC ID NO: 50), utilizando el gen HA B Wisconsin sintetizado (número de acceso Genbank JN993010) (figura 26C, SEC ID NO: 51) como molde. Los productos de PCR de ambas amplificaciones luego se mezclaron y se utilizaron como molde para una segunda ejecución de amplificación utilizando IF-HAB110. Sl+3c (figura 26A, SEC ID NO: 49) y IF-HAB110. Sl-4r (figura 26B, SEC ID NO: 50) como cebadores. El fragmento resultante (que codifica para HA B/Wisconsin/1/2010 Aa.a. 340-358 con un enlazante GG entre los fragmentos se clonó en el cásete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS que comprende el sistema de amplificación BeYDV(m) utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 193 (figura 26D) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y se utilizó el plásmido linealizado para la reacción de ensamble In-Fusion. El número de estructura 193 es un plásmido aceptor destinado para la clonación ,In-Fusion" de los genes de interés en un cásete de expresión a base de CPMV-HT en el sistema de amplificación BeYDV(m). También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen de Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmido binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la figura 26E (SEC ID NO: 52) . A la estructura resultante se le proporcionó el número de 1467 (figura 27C, SEC ID NO: 57). En la figura 27D (SEC ID NO: 58) se presenta la secuencia de aminoácidos de HA de influenza B/Wisconsin/1/2010 con el asa proteolítica suprimida. En la figura 27E se presenta una representación del plásmido 1467.

D-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B Malasia/NOS en el sistema de amplificación con BeYDV (m) +Replicasa (Número estructura 1631) Se clonó una secuencia que codifica para HA de influenza B/Malaysia/2506/2004 en 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS que comprende el sistema de amplificación con BeYDV (M) +replicasa en un cásete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter que contuvo el plásmido utilizando el siguiente método a base de PCR. Un fragmento que contuvo la secuencia que codifica para HA B Malasia sin su péptido señal tipo silvestre se amplificó utilizando los cebadores IF-HB-M-0 . s2+4c (figura 28A, SEC ID NO: 59) y IF-HB-M-04. sl-4r (figura 28B, SEC ID NO: 60), utilizando el gen HA B Malasia sintetizado (Correspondiente a nt 31-1743 a partir del número de acceso Genbank EU124275. Mutaciones lentificadoras T759C y C888G se insertaron en la secuencia sintetizada para modificar los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción DralII y BamHI) (figura 28C, SEC ID NO: 61) como molde. El producto PCR se clonó en trama con el péptido señal PDI de alfalfa en el cásete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en el sistema de amplificación BeYDV (m) utilizando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA) . La estructura 194 (figura 28D) se digirió con una enzima de restricción SacII y Stul y el plásmido linealizado se utilizó para la reacción de ensamble In-Fusion. El número de estructura 194 es un plásmido aceptor destinado para la clonación "In-Fusion" de los genes de interés en trama con un péptido señal PDI de alfalfa en un cásete de expresión a base de CPMV-HT en el sistema de amplificación BeYDV(m). También se incorpora una estructura génica para la co-expresión del supresor TBSV P19 de lentificación bajo el promotor y terminador del gen Plastocianina de alfalfa. La estructura es un plásmidc binario pCAMBIA y la secuencia proveniente de las fronteras de ADN-t de izguierda a derecha se presenta en la figura 28E (SEC ID NO: 62) . A la estructura resultante se le proporcionó el número de 1631 (figura 28F, SEC ID NO: 63) . En la figura 28G (SEC ID NO: 64) se presenta la secuencia de aminoácidos de PDISP/HA de influenza B/Malaysia/2506/2004. En la figura 28H se presenta una representación del plásmido 1631.

Transfección Agrobacterium La cepa AGL1 de Agrobacterium se transfectó mediante electroporación con las estructuras de ADN utilizando los métodos descritos por D'Aoust et al 2008 (Plant Biotechnology Journal 6:930-940). La Agrobacterium transfectadas se desarrollaron en medio YEB suplementado con ácido 2- (N-morfolin) etansulfónico (MES) 10 mM, acetosiringona 20 µ , 50 g/ml de kanamicina y 25 g/ml de carbenicilina, pH 5.6 a un ??d?? entre 0.6 y 1.6. Las suspensiones de Agrobacterium se sometieron a centrifugación antes de utilizarse y se volvieron a suspender en medio de infiltración (MgCl2 10 mM y MES 10 mM pH 5.6) .

Preparación de la biomasa vegetal, inoculo y agroinfiltración Los términos "biomasa" y "materia vegetal" en el sentido en el que se utilizan en la presente significan que reflejan cualquier material derivado de una planta. La biomasa o materia vegetal puede comprender una planta entera, tejido, células o cualquier fracción de la misma. Además, la biomasa o materia vegetal pueden comprender componentes vegetales intracelulares, componentes vegetales extracelulares, extractos líquidos o sólidos de plantas, o una combinación de los mismos. Además, la biomasa o materia vegetal pueden comprender plantas, células de plantas, tejido, un extracto líquido, o una combinación de los mismos, provenientes de hojas, tallos, fruto, raíces o una combinación de los mismos. Una porción de una planta puede comprender materia vegetal o biomasa.

Se hicieron crecer plantas de Nicotiana benthamiana a partir de semillas en superficies planas rellenas con un sustrato de musgo de turba comercial. Las plantas se dejaron crecer en el invernadero bajo un fotoperiodo de 16/8 a un régimen de temperatura de 25°C día/20°C noche. Tres semanas después del sembrado, se eligieron plántulas individuales, se trasplantaron en macetas y se dejaron crecer en el invernadero durante tres semanas adicionales bajo las mismas condiciones ambientales.

Agrobacterias transíectadas con cada estructura se hicieron crecer en un medio YEB suplementado con ácido 2- (N-morfolin) etansulfónico (MES) 10 mM, acetosiringona 20 µ?, 50 mg/ml de kanamicina y 25 mg/ml de carbenicilina pH 5.6, hasta que alcanzaron un OD6oo entre 0.6 y 1.6. Las suspensiones de Agrobacterium se sometieron a centrifugaron antes de utilizarse y se volvieron a suspender en medio de infiltración ( gCl2 10 mM y MES 10 mM pH 5.6) y se almacenaron durante la noche a 4°C. En el día de la infiltración, se diluyeron lotes de cultivo en 2.5 volúmenes de cultivo y se dejaron calentar antes de utilizarse. Las plantas completas de N. benthamiana se colocaron boca abajo en la suspensión bacteriana en un depósito de acero inoxidable hermético bajo un vacio de 20-40 Torr durante 2 min. Las plantas se regresaron al invernadero para un periodo de incubación de 2-6 dias hasta la cosecha.

Cosecha de hojas y extracción total de proteínas Después de la incubación, se cosechó la parte aérea de las plantas, se congeló a -80°C y se trituró en trozos. Se extrajeron las proteínas solubles totales mediante homogeneización (Polytron) cada muestra de material vegetal triturado congelado en 3 volúmenes de Tris 50 mM frío pH 8.0, NaCl 0.15 M, 0.1% de Tritón X-100 y fluoruro de fenilmetansulfonilo 1 mM. Después de la homogeneización, las suspensiones se sometieron a centrifugaron a 10,000 g durante 10 min a 4°C y estos extractos crudos clarificados (sobrenadante) se conservaron para análisis.

Análisis de proteínas e inmunotransferencia El contenido total de proteína de extractos crudos clarificados se determinó mediante el ensayo Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando albúmina de suero bovino como el estándar de referencia. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se electrotransfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinileno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para inmunodetección . Antes de la inmunotransferencia, las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% y Tween-20 al 0.1% en solución salina amortiguada con Tris (TBS-T) durante 16-18h a 4°C.

La inmunotransferencia se realizó con una primera incubación con un anticuerpo primario (la Tabla 4 presenta los anticuerpos y condiciones utilizados para la detección de cada HA) , en 2 g/ml en leche descremada al 2% en TBS-Tween 20 al 0.1%. Los anticuerpos secundarios utilizados para detección de quimioluminiscencia fueron como se indica en la Tabla 4, se diluyeron como se indica en leche descremada al 2% en TBS-Tween 20 al 0.1%. Los complejos inmunorreactivos se detectaron mediante quimioluminiscencia utilizando luminol como el sustrato (Roche Diagnostics Corporation) . La conjugación con enzimas de peroxidasa de rábano picante del anticuerpo IgG humano se llevó a cabo al utilizar el kit para conjugación de peroxidasa activado EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, IL) .

Tabla 4: Condiciones de electroforesis, anticuerpos y diluciones para la inmunotransferencia proteínas expresadas 5 JIR: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA; CBER: Center for Biologics Evaluation and Research, Rockville, D, USA.

Sino: Sino Biological inc, Beijing, China.

TGA: Therapeutic Goods Administration, Australia.

NIBSC: National Institute for Biological Standards and Control, Reino Unido Ensayo de hemaglutinación El ensayo de hemaglutinación se basó en un método descrito por Nayak and Reichl (2004) . En resumen, se realizaron diluciones dobles en serie de las muestras de prueba (100 ]i ) en placas microtituladoras de 96 pocilios con fondo en V que contuvieron 100 \i de PBS, dejando 100 pL de la muestra diluida por pocilio. A cada cavidad se agregaron cien microlitros de una suspensión al 0.25% de lóbulos rojos de pavo (Bio Link Inc., Syracuse, NY) las placas se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. El reciproco de la mayor dilución que muestra una hemaglutinación completa se registró como la actividad HA. En paralelo, un estándar de HA recombinante (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT) se diluyó en PBS y se ejecutó como un control en cada placa.

Ejemplo 1: Efecto de la co-expresión de influenza M2 sobre el nivel de acumulación de V HA y H3 El efecto de la co-expresión de la influenza M2 sobre el nivel de acumulación de HA a partir de diferentes cepas de influenza se analizó al co-transfectar estructuras que conducen la expresión de HA con una estructura de la expresión de M2 proveniente de la influenza A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) en el sistema de transformación transitoria a base de agroinfiltración .

Los análisis de transferencia Western de los extractos de proteina provenientes de plantas transformadas con las estructuras génicas que conducen la expresión de la influenza B HA (proveniente de B/Brisbane/60/2008 ) (estructuras Nos. 1008, 1009 y 1029) en presencia o ausencia de la estructura de expresión con M2 (estructura No. 1261) mostraron que la co-expresión de M2 da por resultado en una acumulación aumentada de la influenza B HA (figura 18). Similarmente, la expresión de M2 con H3 proveniente de la influenza A/Perth/16/2009 (estructura No. 1019+1261) dio por resultado en una acumulación aumentada de H3 en plantas transformadas en comparación con plantas transformadas con la estructura de expresión de H3 solamente (estructura No. 1019) como se muestra en la figura 19.

El análisis de transferencia Western de los extractos de proteina provenientes de plantas que co-expresan 2 con Hl proveniente de la influenza A/California/07/2009 mostraron que la co-expresión de M2 con Hl dio por resultado en una ligera disminución en el nivel de acumulación de Hl (figura 20, 484 contra 484+1261) . La co-expresión de M2 con H5 proveniente de la influenza A/Indonesia/05/2005 también dio por resultado en una acumulación reducida de H5 en comparación con H5 expresada sola (figura 21, 489 contra 489+1261) .

La co-expresión de M2 se evaluó a.dicionalmente por su impacto sobre el nivel de acumulación de una influenza B HA modificada. La estructura No. 1059 codifica para una influenza B HA en la cual se reemplaza el asa proteolitica mediante un enlazante de 2 aminoácidos (GG en lugar de aa 341-359) . Los resultados a partir del análisis de transferencia Western presentados en la figura 22A muestran que la eliminación del asa proteolitica da por resultado en un nivel de acumulación aumentado de influenza B HA (comparar 1008 con 1059) y que la co-expresión de M2 con la influenza B HA modificada aumenta adicionalmente el nivel de acumulación de HA (figura 22A, 1059 contra 1059+1261) . Un análisis de la actividad de hemaglutinación sobre los extractos de proteína cruda provenientes de plantas transformadas con la influenza B HA con o sin modificación y con o sin la co-expresión de M2 confirmó el efecto positivo de la co-expresión de M2 sobre el nivel de acumulación de la influenza B HA natural (figura 22B, 1008 contra 1008+1261) y la influenza B HA modificada (figura 22B, 1059 contra 1059+1261).

La eficacia de M2 proveniente de la influenza A/Puerto Rico/8/1934 para aumentar la acumulación de influenza B HA modificada y H3 se comparó con la de M2 proveniente de la influenza A/New Caledonia/20/1999. Para la influenza B HA modificada, la comparación se llevó a cabo mediante análisis de transferencia Western de extractos proteinicos provenientes de plantas transformadas con las estructuras 1059, 1059+1261 y 1059+859. Para H3, se realizó una comparación similar sobre los extractos proteinicos provenientes de plantas transformadas con 1019, 1019+1261 y 1019+859. Los resultados obtenidos demuestran que la coexpresión de M2 proveniente de la influenza A/Puerto Rico/8/1934 (codificada por la estructura No. 859) fue tan eficiente como la co-expresión de M2 proveniente de la influenza A/New Caledonia/20/1999 (codificada por la estructura No. 1261) para aumentar la acumulación tanto de la influenza B HA modificada (figura 23A) como H3 (figura 23B) .

Ejemplo 2: Efecto de la co-expresión proveniente de la influenza M2 sobre el nivel de acumulación de diferentes cepas de B HA y H3 Los análisis de transferencia Western de extractos proteinicos provenientes de plantas transformadas con las estructuras génicas que conducen la expresión de la influenza B HA (proveniente de B/Malaysia/2506/2004 ) (estructura No. 1631) en presencia o ausencia de la estructura de expresión con M2 (estructura No. 1261) mostraron que la co-expresión de M2 dio por resultado en una acumulación aumentada de la influenza B HA (figura 29) .

Los análisis de transferencia Western de los extractos proteinicos provenientes de plantas transformadas con las estructuras génicas que conducen la expresión de la influenza B HA (proveniente de B/ isconsin/1/2010 ) (estructura No. 1462) en presencia o ausencia de la estructura de expresión de 2 (estructura No. 1261) mostraron que la co-expresión de M2 dio por resultado en una acumulación aumentada de la influenza B HA (figura 30) .

La co-expresión de M2 se evaluó adicionalmente por su impacto sobre el nivel de acumulación de una influenza B HA modificada. La estructura No. 1467 codifica para una influenza B HA en la cual se reemplaza el asa proteolitica mediante un enlazante de 2 aminoácidos (GG en lugar de aa 341-359) . Los resultados del análisis de transferencia Western presentados las figuras 30A muestran que la eliminación del asa proteolitica dio por resultado en un nivel de acumulación aumentado de la influenza B HA (comparar 1462 con 1467) y que la co-expresión de M2 con la influenza B HA modificada aumentó adicionalmente el nivel de acumulación de HA (figura 30A, 1467 contra 1467+1261) . Un análisis de la actividad de hemaglutinación sobre los extractos de proteina cruda provenientes de plantas transformadas con la influenza B HA con o sin modificación y con o sin la co-expresión de M2 confirmó el efecto positivo de la co-expresión de M2 sobre el nivel de acumulación de la influenza B HA natural (figura 30B, 1462 contra 1462+1261) y la influenza B HA modificada (figura 26B, 1467 contra 1467+1261) .

Los análisis de transferencia Western de los extractos proteinicos provenientes de plantas transformadas con las estructuras génicas que conducen la expresión de la influenza H3 (proveniente de H3/Victoria/361/2011 ) (estructura No. 1391) en presencia o ausencia de ia estructura de expresión de M2 (estructura No. 1261) mostró que la co-expresión de 2 dio por resultado en una acumulación aumentada de la influenza H3 (figura 31).

Todas las citas se incorporan en la presente como referencia .

La presente invención se ha descrito con respecto a una o más modalidades. Sin embargo, será evidente para los expertos en la técnica que se puede realizar una serie de variaciones y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Un método para producir una partícula similar a virus (VLP) en una planta caracterizado porque comprende: a) introducir un primer ácido nucleico que comprende una primera región regulador activa en la planta o enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de hemaglutinina (HA) de influenza seleccionada del grupo que consiste de B y H3 en la planta, c una porción de la planta; b) introducir un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucelótidos que codifica para una proteína de canal protónico; c) incubar la planta o porción de la planta bajo condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, produciendo con esto la VLP.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de canal protónico se selecciona de M2 o BM2.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina de canal protónico comprende la secuencia de firma de canal protónico HXXXW.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se ha suprimido una o más asas proteoliticas de la proteina de la influenza HA.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la influenza B HA proviene de la influenza B/Brisbane/60/2008, B/Malaysia/2506/2004 o B/Wisconsin/1/2010.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque se ha suprimido una o más asas proteoliticias proveniente de la proteina de influenza B HA.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la influenza H3 proviene de la influenza A/Perth/16/2009 o proviene de la influenza A/Victoria/361/2011.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 28, la SEC ID NO: 51 y la SEC ID NO: 61.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza es como se mostró en al menos una de la SEC ID NO: 30, la SEC ID NO: 54 y la SEC ID NO: 64.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucelótidos que codifica para la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza tiene al menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 43 y la porción subrayada de la SEC ID NO: 57.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza es como se muestra en al menos una de la SEC ID NO: 41 y la SEC ID NO: 58.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucelótidos que codifica para la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 23 y la SEC ID NO: 46.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de la proteína de hemaglutinina (HA) de influenza es como se muestra en al menos una de la SEC ID NO: 25 y la SEC ID NO: 48.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera secuencia de ácido nucleico comprende la primera región reguladora enlazada funcionalmente con uno o más de un intensificador de comovirus, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza, y uno o más de un elemento de amplificación de geminivirus, y un tercer ácido nucleico que codifica para una replicasa de geminivirus se introduce en la planta o porción de la planta.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque uno o más de un intensificador de comovirus es un comovirus UTR.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el comovirus UTR es un virus Cowpea Mosaico (CPMV) .

17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque uno o más de un elemento de amplificación se selecciona de una región intergénica larga del Virus Bean Yellow Dwarf (BeYDV LIR) , y una región intergénica corta de BeYDV (BeYDV SIR) .

18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza tiene al menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 28, la SEC ID NO: 51 y la SEC ID NO: 61.

19. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia de la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza es como se muestra en al menos uno de la SEC ID NO: 30, la SEC ID NO: 54 y la SEC ID NO: 64.

20. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina hemaglutinina (HA) de influenza tiene al menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 43 y la porción subrayada de la SEC ID NO: 57.

21. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia de la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza es como se muestra en al menos una de la SEC ID NO: 41 y la SEC ID NO: 58.

22. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 23 y la SEC ID NO: 46.

23. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia de la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza es como se muestra en al menos una de la SEC ID NO: 25 y la SEC ID NO: 48.

24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de introducir (paso a) , el ácido nucleico se expresa transitoriamente en la planta.

25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de introducir (paso a) , el ácido nucleico se expresa establemente en la planta.

26. El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque comprende un paso de: d) cosechar la planta y purificar las VLP.

27. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la VLP no contiene una matriz viral, una proteina núcleo o una proteina de canal.

28. Un método para producir una partícula similar a virus (VLP) caracterizado porque comprende: a) proporcionar una planta o una porción de la planta que comprende un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de hemaglutinina (HA) de influenza seleccionada del grupo que consiste de B y H3, y un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de canal protónico b) incubando la planta o porción de la planta bajo condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, produciendo con esto la VLP.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la proteina de canal protónico se selecciona de M2 o BM2.

30. Una VLP producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 1.

31. Una VLP producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 28.

32. La VLP de conformidad con la reivindicación 30 ó 31, caracterizada además porque comprende uno o más de un lipido derivado de una planta.

33. La VLP de conformidad con la reivindicación 30 ó 31, caracterizada porque una o más proteínas virales comprende N-glicanos planta-específicos, o N-glicanos modificados .

34. Una composición caracterizada porque comprende una dosis efectiva de la VLP de conformidad con la reivindicación 30 ó 31, para inducir una respuesta inmunitaria, y un portador farmacéuticamente aceptable.

35. Un método para inducir inmunidad hacia una infección por virus de influenza en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar la VLP de conformidad con la reivindicación 30 ó 31.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la VLP se administra a un sujeto, oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o subcutáneamente.

37. Un anticuerpo policlonal preparado utilizando la VLP como se describe en la reivindicación 30 ó 31.

38. Una materia vegetal caracterizada porque comprende una VLP producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 1 ó 28.

39. La materia vegetal de conformidad con la reivindicación 38, para utilizarse en inducir inmunidad hacia una infección por el virus de influenza en un sujeto.

40. Un suplemento alimenticio caracterizado porque comprende la materia vegetal de conformidad con la reivindicación 39.

41. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende introducir una tercera secuencia de ácido nucleico, la tercera secuencia de ácido nucleico que codifica para un supresor de lentificación .

42. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende introducir una cuarta secuencia de ácido nucleico, la cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica para un supresor de lentificación .

43. El método de conformidad con la reivindicación 41 ó 42 caracterizado porque el supresor de lentificación se selecciona del grupo de HcPro y pl9.

44. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 28, caracterizado porque la VLP no contiene la proteina de canal protónico.

45. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 28, caracterizado porque la proteina de hemaglutinina (HA) de influenza es una proteina de HAO.

46. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteina de M2 se selecciona del grupo que comprende influenza A/Puerto Rico/8/1934 e influenza A/New Caledonia/20/1999.

47. Un polipéptido caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 41 y la SEC ID NO: 58.

48. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 47.

49. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 43 y la porción subrayada de la SEC ID NO: 57.

50. Un método para producir una partícula similar a virus (VLP) en una planta caracterizado porque comprende: a) introducir un primer ácido nucleico que comprende una primera región regulador activa en la planta y enlazada funcionalmente a una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de hemaglutinina (HA) de influenza en la planta, o porción una porción de la planta, en donde se han suprimido una o más asas proteolíticas de la proteína HA de influenza; b) incubar la planta o porción de la planta baje condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, produciendo con esto la VLP.