PL220281B1

PL220281B1 - Szczepionka DNA, sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej, przeciwciała specyficznie rozpoznające białko hemaglutyniny H5 wirusa grypy i zastosowanie szczepionki DNA

Info

Publication number: PL220281B1
Application number: PL396415A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Sirko; Anna Góra-Sochacka; Włodzimierz Wiktor Zagórski-Ostoja; Anna Stachyra; Róża Sawicka; Bogusław Szewczyk; Beata Gromadzka; Violetta Sączyńska; Katarzyna Florys; Marek Bednarczyk; Paweł Łakota; Zenon Minta; Krzysztof Śmietanka
Original assignee: Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2015-09-30
Also published as: PL396415A1; WO2013043067A3; WO2013043067A2; US9505806B2; US20140255343A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka DNA, sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej, przeciwciała specyficznie rozpoznające białko hemaglutyniny H5 wirusa grypy i zastosowanie szczepionki DNA. W rozwiązaniu według wynalazku stosuje się jedno- lub dwukrotną immunizację kur szczepionką DNA zawierającą cDNA kodujące zmodyfikowane białko H5 tj. z delecją miejsca cięcia pomiędzy podjednostkami (zapewnia to większe bezpieczeństwo szczepionki). Ponadto, proponowane jest zastosowanie zmienionego regionu kodującego w taki sposób, aby zapewnić maksymalną wydajność produkcji białka w komórkach ptaków. Najważniejszym elementem tych zmian jest zmiana kodonów na optymalne dla kury.

W ostatnich latach wyjątkową uwagę, ze względu na potencjalne skutki dla stanu zdrowia ludzi oraz znaczące konsekwencje ekonomiczne, zwrócił na siebie wirus grypy, a zwłaszcza wysoce zjadliwy wirus grypy ptaków. Grypa ptaków jest poważną i wysoce zaraźliwą chorobą drobiu i innych hodowanych ptaków spowodowaną różnymi rodzajami wirusów grypy. Wirusy te mogą również przechodzić na ssaki, w szczególności świnie, i na ludzi. Występuje wiele różnych szczepów wirusa grypy. Poziom zagrożenia, jakie stwarzają różne szczepy wirusów grypy dla zdrowia zwierząt i zdrowia publicznego jest bardzo zmienny i do pewnego stopnia nieprzewidywalny z powodu częstych mutacji punktowych i możliwości wymiany segmentów materiału genetycznego pomiędzy różnymi szczepami. Zakażenie niektórymi szczepami wirusów grypy pochodzących od ptaków może być przyczyną ogniska choroby wśród ptactwa domowego, przybierając proporcje epizootyczne i powodując śmiertelność i straty wśród drobiu na skalę, która może w szczególności zagrozić opłacalności całej hodowli drobiu. Wspólne badania epidemiologów i ornitologów pozwoliły na sformułowanie w 2005 roku wniosku, że za przenoszenie grypy ptaków jest odpowiedzialna przede wszystkim niezgodna z obwiązującymi przepisami sanitarno-weterynaryjnymi produkcja i handel drobiem, a w znacznie mniejszym stopniu migrujące ptaki. Wydaje się, że w chwili obecnej najefektywniejszą metodą przeciwdziałania przenoszeniu się wirusa grypy ptaków na ludzi (czego skutkiem mogłaby być pandemia grypy) oraz minimalizacji potencjalnych strat przemysłu drobiarskiego jest uodpornienie stad hodowlanych i zarodowych przeciwko zakażeniu wirusem grypy ptaków, a zwłaszcza jego wysoce zjadliwą formą H5N1. Warto dodać, że szczepienie niosek pozwoliłoby na ochronę piskląt we wczesnym okresie życia, poprzez matczyne przeciwciała obecne w żółtku jaj.

Dwa główne rodzaje konwencjonalnych szczepionek przeciwko grypie dopuszczone są do stosowania u ludzi. Klasyczna i wciąż najpowszechniej używana jest szczepionka inaktywowana, składająca się z unieczynnionych wirionów grypy. Po namnożeniu i oczyszczeniu, odpowiedniego wirusa poddaje się go inaktywacji chemicznej bądź fizycznej. Taki preparat stanowi materiał szczepionkowy. Drugim typem jest szczepionka żywa atenuowana (np. FluMyst), w której stosowane są reasortanty wirusów szczepionkowych z wirusem o fenotypie temperaturowo wrażliwym, tzw. cold adapted (A/Ann Arbor/6/60) namnażające się wyłącznie w temperaturze do 33°C, przy całkowicie zablokowanej replikacji w temperaturze 37°C panującej w dolnych partiach dróg oddechowych. Obecnie stosowane szczepionki konwencjonalne są trójwalentne. Przed każdym sezonem grypowym WHO podejmuje decyzję, jakie szczepy wirusów należy zastosować w szczepionce. Wybierany jest wirus A serotypu H3N2, H1N1 oraz wirus typu B. Zależnie od wieku i stanu zdrowia, efektywność szczepionek inaktywowanych wynosi od 30-90%, przy czym u osób najbardziej podatnych na wystąpienie komplikacji pogrypowych stwierdza się najniższy stopień protekcji. Szczepionki żywe atenuowane charakteryzują się wyższą efektywnością oraz szerszą odpowiedzią immunologiczną (humoralna, komórkowa, MALT).

Do produkcji szczepionek konwencjonalnych niezbędna jest dostępność technologii otrzymywania wirusa w dużej ilości. Najbardziej klasyczną metodą jest hodowla wirusa grypy w wolnych od patogenów zarodkach kurzych. Po namnożeniu wirus jest izolowany wraz z płynem owodniowym. Technika ta ma jednak poważne wady. Na przykład, podczas wielokrotnych pasaży w zarodkach kurzych, glikoproteiny wirusa szczepionkowego, w szczególności HA, ulegają stopniowym mutacjom co prowadzi do zmienionego profilu antygenowego szczepionki w porównaniu z zakładanym. Otrzymywane szczepionki na bazie zarodków kurzych są również źródłem białek jaja kurzego, stanowiących silny alergen. Inną metodą namnażania wirusów grypy na dużą skalę jest produkcja z użyciem hodowli komórkowej na dobrze scharakteryzowanych i akredytowanych liniach komórkowych takich jak Vero czy MDCK. W porównaniu z hodowlą na zarodkach w kulturach komórkowych nie pojawia się problem mutacji genów glikoprotein w trakcie hodowli oraz wyeliminowane zostaje alergenne działanie składniPL 220 281 B1 ków jaja kurzego. Ale z uwagi na przylegający charakter hodowli, stosuje się tu bioreaktory typu microcarrier o pojemności dochodzącej do 10000 litrów. Z uwagi na wysokie koszty oraz czasochłonność produkcji (~6 miesięcy) poszukuje się alternatywy dla szczepionek konwencjonalnych.

Szczepionki nowej generacji powinny być łatwe i tanie w produkcji oraz proste w aplikacji. Takie cechy mogą wykazywać szczepionki podjednostkowe, składające się z najsilniejszych, ściśle zdefiniowanych antygenów wirusa lub ich najbardziej immunogennych fragmentów. Składniki szczepionki podjednostkowej mogą być izolowane bezpośrednio z organizmów patogennych, ale podejście to wymaga hodowli patogenów na dużą skalę, co jest niebezpieczne i zazwyczaj kosztowne. Inną metodą uzyskania immunogennych podjednostek jest zastosowanie technologii rekombinowanego DNA. Technologia ta pozwala łączyć korzyści wynikające ze stosowania podjednostkowych szczepionek z możliwością otrzymania jej składników w niepatogennym systemie ekspresyjnym np. komórkach bakteryjnych, drożdżowych, ssaczych lub roślinnych, co czyni produkcję antygenów bezpieczniejszą i wydajniejszą.

Kolejną grupą szczepionek nowej generacji są szczepionki DNA. Metodę szczepionek DNA zastosowano po raz pierwszy do immunizacji zwierząt kilkanaście lat temu. Pierwsze opublikowane prace dotyczyły genów kodujących nukleoproteinę NP i hemaglutyninę wirusa grypy, genów wirusa HIV oraz wirusa HBV wywołującego wirusowe zapalenie wątroby typu B. Od tego czasu, szczepionki DNA (lub szczepionki genetyczne), które bywają czasem nazywane szczepionkami trzeciej generacji, były intensywnie badane, szczególnie przy użyciu modelu myszy laboratoryjnych. Doświadczenia z wielu laboratoriów wykazują, że wstrzyknięcie „wolnego” DNA w formie plazmidu lub w formie liniowej może stymulować odpowiedź immunologiczną przeciwko białkom kodowanym przez stosowaną szczepionkę genetyczną. Wykazano skuteczność tego typu podejścia eksperymentalnego w modelach następujących chorób i patogenów: grypa typu B, HBV, malaria, gruźlica, wirusy SIV and HIV typu 1 oraz różne nowotwory. Szczepionki DNA posiadają wiele zalet, z których dwie wydają się być najważniejsze: (a) możliwość szybkiego zaprojektowania i skonstruowania szczepionki pozwalająca na uniknięcie długoterminowej i skomplikowanej procedury wyrażania białek w systemach ekspresyjnych i ich oczyszczania oraz (b) uzyskanie antygenu o strukturze identycznej z wersją powstającą w trakcie infekcji, tj. zawierającego post-translacyjne modyfikacje właściwe dla gospodarza, ponieważ produkcja białka zachodzi in vivo, w wyniku ekspresji DNA w komórkach immunizowanego zwierzęcia.

Dokładny mechanizm działania szczepionek genetycznych jest znany od stosunkowo niedawna. Uważa się, że białka syntetyzowane w komórkach gospodarza w wyniku ekspresji genu drobnoustroju chorobotwórczego obecnego w szczepionce DNA „udają” białka produkowane w trakcie infekcji. Białka te są trawione za pomocą wewnątrzkomórkowego kompleksu proteolitycznego, peptydy transportowane są do retikulum endoplazmatycznego (ER), gdzie następuje ich asocjacja z cząsteczkami MHCI oraz β2-mikroglobulinami. Takie potrójne kompleksy są następnie transportowane na powierzchnię komórki, gdzie rozpoznawane są przez limfocyty typu T, które po napotkaniu potrójnego kompleksu (antygen- MHCI- β2-mikroglobulina) nabywają właściwości toksycznych. Pobieranie rozpuszczalnych białek przez wyspecjalizowane prezentujące antygen komórki umożliwia z kolei prezentację antygenu poprzez kompleksy MHCII. Podsumowując, szczepionka DNA w wielu przypadkach indukuje oba typy odpowiedzi immunologicznej, komórkową (typu Th1) oraz humoralną (typu Th2). Bardzo często dodatkowym elementem stymulującym odpowiedź immunologiczną jest obecność sekwencji CpG w plazmidowym DNA użytym do immunizacji. Szczegóły dotyczące dotychczasowych badań nad szczepionkami genetycznymi można znaleźć w kilku artykułach przeglądowych.

Niedawno (maj 2006) firma Vical Incorporated (http://www.vical.com) ogłosiła, że wyprodukowana przez nią trzy-składnikowa szczepionka DNA zawierająca sekwencje kodujące antygen H5, nukleoproteinę (NP) oraz białko M2, podawana łącznie z opatentowanym przez firmę adiuwantem Vaxfectin (TM) chroni 100% myszy i fretki przed infekcją wirusem grypy H5N1. Szczepionka również zapewnia wysoki stopień protekcji przed infekcją innymi szczepami grypy.

Znaczące zwiększenie immunogenności szczepionki DNA można uzyskać w przypadku użycia zmienionej sekwencji kodującej HA zawierającej optymalny zestaw kodonów dla danego gospodarza np. myszy, człowieka. Istnieje zatem możliwość poprawienia efektywności szczepionek DNA poprzez dostosowanie sekwencji nukleotydowej do immunizowanego gospodarza.

Podstawowe mechanizmy odpowiedzi immunologicznej u ptaków są podobne do odpowiedzi ssaków. Ptaki również mają zdolność do indukcji odpowiedzi typu Th1 i Th2 oraz podobne szlaki ich indukcji. Jednakże typ oraz lokacja wczesnej odpowiedzi immunologicznej na szczepionkę DNA może być inna u ptaków z powodu obecności innych organów limfatycznych. Promotor wirusa CMV jest

PL 220 281 B1 w komórkach ptaków wystarczająco aktywny, aby zapewnić skuteczne wyrażanie kontrolowanych przez siebie genów, a najbardziej typowe drogi podania szczepionki to iniekcja domięśniowa (IM) oraz podskórna. Droga IM wydaje sie być najbardziej skuteczna. Szczepionki DNA podawane są ptakom tą drogą najczęściej bez dodatkowych adiuwantów, ale stosowane były również cytokiny takie jak IL-2,

IL-8, IL-6 oraz interferon γ (IFNy). Wszystkie opublikowane dotychczas prace na temat szczepionki DNA stosowanej w drobiu pokazały pozytywne efekty w postaci odpowiedzi komórkowej, humoralnej albo ochronnej. Co więcej, u ptaków, u których nie wykazano obecności specyficznych przeciwciał, wykrywano odpowiedź ochronną co sugerowałoby pojawienie się po immunizacji raczej odpowiedzi komórkowej niż humoralnej. Ponadto, niedawno ukazała się praca demonstrująca immunostymulację odpowiedzi ptaków na szczepionkę DNA przeciwko antygenowi wirusa IBDV poprzez dodatkową inokulację plazmidu kodującego kurzą IL-2 (Park et al., 2009).

Szczepionki DNA zawierające cDNA kodujące HA z różnych wirusów ptasiej grypy testowane były także w drobiu. W wielu przypadkach autorzy nie stwierdzali obecności przeciwciał anty-HA ale demonstrowali skuteczną ochronę przed infekcją śmiertelnymi dawkami wirusa. Testowane były różne sposoby podania szczepionek, z czego najbardziej skuteczne okazało się stosowanie strzelby genowej.

Przykłady publikacji opisujących zastosowanie cDNA kodującego HA do immunizacji drobiu: (Fynan et al., 1993a; Fynan et al., 1993b; Robinson et al., 1993; Kodihalli et al., 2000; Rao et al., 2008; Swayne, 2009).

Wynalazek opisywany w zgłoszeniu patentowym WO 2008145129 (opubl. 2008-12-04) oraz zgłoszeniu patentowym US 20100160421 (opubl. 2010-06-24) dotyczy szczepionek i użycia cząsteczki nagiego DNA i/lub RNA kodującej hemaglutyninę (HA) z pandemicznych szczepów grypy takich jak np. wirus grypy A H1N1 z 1918 roku i/lub H2N2, 1957 i/lub H3N2, 1968 i/lub wysokopatogenny szczep ptasi ATV (A/buzzard/Denmark/6370/06(H5N1)) i/lub niskopatogenny szczep wirusa ptasiej grypy (ATV) H5N7, 2001 (A/Mallard/Denmark/64650/03(H5N7)) lub wysokopatogenny szczep AIV, marzec, 2006, Dania H5N1(A/buzzard/Denmark/6370/06(H5N1)) lub 2008 (A/duck/Denmark/53-147-8/08 (H7N1)) lub 2004 (A/widegeon/Denmark/66174/G 18/04 (H2N3)) jako składnika szczepionki przeciwko obecnym, jak i przyszłym infekcjom grypą A podtypu H1, H2, H3, H5, H7, N1, N2, N3 u ludzi i/lub świń opcjonalnie wraz z cząsteczką nagiego DNA i/lub RNA kodującego neuramidynazę (NA) i/lub białko matrix (M) i/lub nukleoproteinę (NP) z pandemicznego wirusa grypy. W przypadku, gdy składniki są używane jako szczepionki DNA lub RNA razem lub bez odpowiadających im białek, kodony mogą być „humanizowane” poprzez użycie preferowanych kodonów z wysokoeksprymowanych genów ssaków a podawanie tej szczepionki DNA można przeprowadzić jako iniekcję nagiego DNA lub RNA w buforowanym lub niebuforowanym roztworze soli fizjologicznej lub iniekcję plazmidowego DNA lub zlinearyzowanych fragmentów DNA. W zgłoszeniu patentowym ujawniono także dodatek białka M (M) i/lub nukleoproteiny (NP) lub kodującego je DNA pochodzącego ze szczepu grypy 1918.

W zgłoszeniu patentowym US 20090291472 (opubl. 2009-11-26) opisano kwasy nukleinowe ze zoptymalizowanymi kodonami kodujące polipeptydy grypy oraz ich zastosowanie w celu indukowania odpowiedzi immunologicznej.

W zgłoszeniu patentowym WO 2009092038 (opubl. 2009-07-23) opisano szczepionkę DNA przeciwko grypie i sposoby jej zastosowania. Utrzymujące się epidemie spowodowane wysokopatogennym wirusem ptasiej grypy (HPAl) H5N1 u ptaków zwiększają ryzyko reasortacji i adaptacji do ludzi. Możliwość ograniczenia jego rozprzestrzeniania się u ptaków zredukowałaby to niebezpieczeństwo oraz pomogła utrzymać możliwość produkcji szczepionek w zarodkach kurzych. Podczas gdy szczepionki oferują potencjał zwalczania ptasiej choroby, głównym problemem jest ich nieskuteczność w ochronie przeciwko zmieniającym się/ewoluującym wirusom grypy. Szczepionki DNA kodujące białka hemaglutyniny (HA) z różnych serotypów HPAl H5N1 chronią przed homologicznym i heterologicznym szczepem HPAl H5N1 u zwierząt. Szczepionki te indukują przeciwciała, które neutralizują różne serotypy HPAl H5N1, w przypadku, gdy są podawane w kombinacjach zawierających do 10 typów HA. Poziom odpowiedzi zależy od zastosowanej dawki a zakres ochrony od wybranego typu HA wirusa grypy w szczepionce. Monowalentne i 3-walentne immunogeny HA i/lub szczepionki chronią myszy przed infekcją śmiertelnym szczepem H5N1 A/Vietnam/1203/2004 w teście prowokacji 68 tygodni po szczepieniu. U kurczaków całkowitą ochronę przed heterologicznym szczepem HPAl H5N1 uzyskano po szczepieniu 3-walentną szczepionką DNA serotypu H5 dawką 5 pg DNA podawaną dwukrotnie przez domięśniową iniekcję igłową lub przyrządem bezigłowym.

PL 220 281 B1

W zgłoszeniu patentowym EP 2023952 (opubl. 2009-02-18) opisano sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej na wirusa grypy przy zastosowaniu mieszaniny/ kompozycji polipeptydowych i kwasów nukleinowych. Zgłoszenie to ujawnia polinukleotydy i polipeptydy zdolne do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej u ludzi w celu ochrony przed zakażeniem wirusem grypy poprzez podanie in vivo do tkanki ludzkiej przynajmniej jednego polinukleotydu zawierającego co najmniej jeden region kodujący białko wirusa grypy albo jego fragment, wariant lub pochodną, bądź przynajmniej jeden polipeptyd przez niego kodowany. Zgłoszenie to odnosi się również do identyfikacji i otrzymywania epitopów wirusa grypy, jak również do polinukleotydów i polipeptydów zawierających takie epitopy wirusa grypy. Dokument ten dotyczy również składu ewentualnej szczepionki oraz sposobów zastosowania w zapobieganiu oraz leczeniu infekcji wirusem grypy.

Pomimo intensywnych badań oraz licznych danych literaturowych stan techniki nie jest jeszcze wystarczający do stworzenia ekonomicznej szczepionki dla drobiu, która byłaby łatwa w aplikacji i równocześnie zapewniałaby skuteczną ochronę oraz możliwość odróżnienia kur immunizowanych od tych zainfekowanych wirusem. Nieoczekiwanie okazało się, że proponowane rozwiązanie według wynalazku ma szansę zapełnić tę lukę.

Celem wynalazku jest stworzenie szczepionki DNA zawierającej zmodyfikowane cDNA kodujące białko hemaglutyniny H5, opracowanie sposobu indukowania odpowiedzi immunologicznej, a także otrzymanie przeciwciał specyficznie rozpoznających białko hemaglutyniny H5 wirusa grypy i zastosowanie szczepionki DNA do otrzymywania przeciwciał specyficznie rozpoznających białko hemaglutyniny H5 wirusa grypy.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z zapewnieniem skutecznej ochrony i możliwości odróżnienia kur immunizowanych od tych zainfekowanych wirusem, przy jednocześnie łatwej aplikacji zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku. W rozwiązaniu według wynalazku stosuje się jedno- lub dwukrotną immunizację kur szczepionką DNA zawierającą cDNA kodujące zmodyfikowane białko H5 tj. z delecją miejsca cięcia pomiędzy podjednostkami (zapewnia to większe bezpieczeństwo szczepionki). Ponadto, proponowane jest zastosowanie zmienionego regionu kodującego w taki sposób, aby zapewnić maksymalną wydajność produkcji białka w komórkach ptaków. Najważniejszym elementem tych zmian jest zmiana kodonów na optymalne dla kury. Stosując rozwiązanie według wynalazku uzyskano odpowiedź immunologiczną typu humoralnego (produkcja specyficznych przeciwciał) u immunizowanego drobiu już po jedno- lub dwukrotnej immunizacji. Surowica immunizowanych ptaków dała wynik pozytywny w teście inhibicji hemaglutynacji, co pozwala założyć, że uzyskane przeciwciała mogłyby neutralizować wirusa grypy czyli skutecznie chronić przed infekcją. Poza tym, w przypadku niektórych grup obserwowano efekt wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przez dodatkowe podanie plazmidu zapewniającego ekspresję cDNA dla kurzej interleukiny 2.

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka DNA zawierająca zmodyfikowane cDNA kodujące białko hemaglutyniny H5, charakteryzująca się tym, że zawiera delecję regionu kodującego aminokwasy w miejscu cięcia proteolitycznego pomiędzy podjednostkami HA1 i HA2 oraz kodony zmienione na optymalne dla kur w celu zapewnienia maksymalnej wydajności produkcji białka H5 w komórkach ptaków.

Korzystnie, gdy szczepionka zawiera sekwencję określoną jako SEQ. ID nr 2.

Korzystnie, gdy delecja obejmuje między 15 a 21 par zasad kodujących aminokwasy w miejscu cięcia pomiędzy podjednostkami HA1 i HA2, korzystnie 18 par zasad.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego, w którym wytwarzane są specyficzne przeciwciała u immunizowanego drobiu rozpoznające białko hemaglutyniny H5, charakteryzujący się tym, że stosuje się szczepionkę DNA określoną powyżej.

Korzystnie, gdy odpowiedź immunologiczną wzmacnia się poprzez podanie plazmidu zapewniającego ekspresję cDNA dla kurzej interleukiny 2 określonego sekwencją SEQ. ID nr 3.

Korzystnie, gdy pierwsza dawka szczepionki podawana jest in ovo na 3 doby przed wykluciem.

Korzystnie, gdy pierwsza dawka szczepionki podawana jest do 8-ej doby po wykłuciu.

Korzystnie, gdy sposób obejmuje przygotowanie plazmidów ekspresyjnych oraz preparatów do immunizacji z wykorzystaniem do tego celu lipidowych nośników.

Kolejnym przedmiotem wynalazku są przeciwciała specyficznie rozpoznające białko hemaglutyniny H5 wirusa grypy, charakteryzujące się tym, że są uzyskane przez zastosowanie szczepionki określonej powyżej.

PL 220 281 B1

Korzystnie, gdy przeciwciała są aktywne bądź nie w teście inhibicji hemaglutynacji z wykorzystaniem antygenu H5 wirusa grypy.

Korzystnie, gdy przeciwciała neutralizują wirusa grypy bądź są niezdolne do neutralizacji wirusa grypy.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku na rysunku:

figura 1 przedstawia wykrycie obecności przeciwciał anty HA w surowicach w 35 dobie życia kurcząt za pomocą techniki Western blot (A) lub w 33 dobie życia kurcząt za pomocą techniki dot blot (B). Membrana zawiera antygen kontrolny, w tym przypadku białko HA (A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05; Immune Technology) w ilości 100 ng, które zostało rozdzielone elektroforetycznie w żelu i poddane transferowi na membranę łącznie z pokazanymi po lewej i prawej stronie markerami wielkości (A) lub nakroplone bezpośrednio na membranę (B); Każdy fragment membrany zawierający antygen kontrolny inkubowano z surowicami od kurcząt z oznaczonych grup (A1-A6, B1-B11), a związane przeciwciała wykrywano przeciwciałami drugorzędowymi; K+ - kontrola pozytywna, otrzymana z Państwowego Instytutu Weterynarii w Puławach surowica kurza (HI AIV H5 - pozytywna). Numery grup (A1-A6 oraz B1-B11) podano przy odpowiednim wyniku testu; opis grup podano w tabeli 1 A i B;

figura 2 przedstawia zestawienie wyników z testów ELISA dla poszczególnych kurcząt z badanych grup z obu schematów immunizacji (A lub B) oraz dwóch terminów oznaczeń. Numery badanych grup wyjaśniono w Fig. 1, K+ - surowica pozytywna uzyskana z Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie (surowica od kurcząt immunizowanych preparatem uzyskanym z frakcji błonowej rekombinowanego bakulowirusa AcMNPV niosącego gen HA o pełnej długości);

figura 3 przedstawia wyniki testu HI dla wybranych grup kurcząt immunizowanych wg schematu A (A) lub wg schematu B (B). K+ - kontrola pozytywna (HI antiserum for Al H5N2; GD Deventer, Holandia);

figura 4 przedstawia Porównanie odpowiedzi kurcząt na immunizację szczepionką zawierającą cDNA zmodyfikowane (HA-opt) oraz cDNA bez modyfikacji (HA-nopt). A - wynik uzyskany metodą dot blot pokazujący obecność przeciwciał anty-HA w połączonych surowicach pochodzących od wszystkich kurcząt z badanej grupy; B- wynik testu HI dla indywidualnych (oznaczonych odpowiednio numerami) osobników z obu grup; K+ kontrola pozytywna; liczby nad słupkami podają najniższe rozcieńczenie surowic dające pozytywną odpowiedź.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawiono przykład owe rozwiązania.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d I. Przygotowanie plazmidów ekspresyjnych oraz preparatów do immunizacji

Fragment cDNA zawierającą pełnej długości ramkę odczytu dla hemaglutyniny uzyskano metodą odwrotnej transkrypcji a następnie amplifikacji (RT-PCR) na matrycy RNA polskiego szczepu wirusa grypy z 2006 r. (A/swan/Poland/305-1 35V08/2006; EpiFlu Database Acc No EPI156789; http://platform.gisaid.org: (Gromadzka et al., 2008)). W oparciu o przedstawioną sekwencję nukleotydową (SEQ ID nr 1), otrzymano przewidywaną sekwencję aminokwasową białka hemaglutyniny, a następnie zsyntetyzowano zmodyfikowane cDNA z delecją obejmującą 18 par zasad, kodujących aminokwasy 341-346 (RRRKKR, w miejscu cięcia pomiędzy podjednostkami HA1 i HA2. Uzyskana sekwencja zawierała kodony zoptymalizowane dla organizmu kury (Gallus gallus) oraz posiadała 100% homologii na poziomie aminokwasowym i 76% na poziomie nukleotydowym z wyjściową sekwencją hemaglutyniny (uwzględniając wyżej opisaną delecję 18 par zasad). Po wklonowaniu fragmentu DNA o długości 1689 par zasad kodującym białko odpowiadające aminokwasom 1-568 w białku HA (z delecją odcinka odpowiadającego aminokwasom 341-346 pomiędzy miejsca restrykcyjne Mlul i SalI wektora pCI (Promega) uzyskano plazmid K3. Rekombinowany plazmid został sprawdzony poprzez trawienia restrykcyjne i analizę sekwencji nukleotydowej. Sekwencję nukleotydową zmodyfikowanego fragmentu cDNA kodującego hemaglutyninę przedstawiono jako SEQ ID nr 2. W analogiczny sposób przygotowano oraz zweryfikowano plazmid pIL2, zawierający cDNA kurzej interleukiny 2, która miała w zamierzeniu funkcjonować jako adiuwant. Do konstrukcji plazmidu wykorzystano klon nr pat.pk0036.g8 (GenBank nr AF017645) uzyskany z U.D. chick EST database [http://www.chickest.udel.edu] oraz wspomniany powyżej wektor ekspresyjny pCI, zawierający promotor CMV. Sekwencję cDNA kodującą kurzą interleukinę 2 przedstawiono jako SEQ ID nr 3.

Klonowanie oraz namnażanie plazmidu przeprowadzono w komórkach bakterii Escherichia coli szczepu DH5a. Izolację i oczyszczenie plazmidowego DNA przeznaczonego do immunizacji kur przeprowadzono przy użyciu NoEndo Jetstar 2.0 Plasmid Giga Purification Kit (Genomed) gwarantującym

PL 220 281 B1 bardzo niski poziom bakteryjnych endotoksyn w preparacie (< 0,001 UE/pg). Koncentracja i czystość uzyskanych preparatów była sprawdzana spektrofotometrycznie (OD260) oraz przez elektroforezę w żelu agarozowym. Dawki szczepionek przygotowywano mieszając preparaty DNA z roztworem odczynnika do transfekcji Lipofectin (Invitrogen) przygotowywanym i stosowanym zgodnie z zaleceniami producenta. Preparaty plazmidowe zostały zmieszane z przygotowanym preparatem Lipofectin w stosunku 6:1 (ig DNA: il przygotowanego preparatu Lipofectin) w przypadku immunizacji jednym plazmidem lub 12:1.

P r z y k ł a d II. Immunizacja kurcząt oraz pobranie próbek do analizy

Immunizacja kurcząt prowadzona zgodnie ze schematami A i B (Tabela 1).

T a b e l a 1. Schematy immunizacji kur poprzez podskórne podanie preparatu. Schemat A

	In ovo (-3 doba)	Szczepienie przypominające	Liczba kurcząt
	Dawka
Nr grapy	Preparat	Dawka	Preparat	8 doba	22 doba
A1	K3	60 pg	K3	250 pg	250 pg	7
A2	K3 + IL2	60 pg + 60 pg	K3 + IL2	250 pg + 250 pg	250 pg +250 pg	7
A3	PBS	-	-	-	-	8
A4	-	-	K3	250 pg	250 pg	7
A5	-	-	K3+IL2	250 pg + 250 pg	250 pg + 250 pg	7
A6	-	-	-	-	-	10
Schemat B
Nr grapy	Preparat	Immunizacja (3 doba)	Szczepienie przypominające (17 doba)	Liczba kurcząt
Dawka	Dawka
B1	K3	250 pg	250 pg		7
B2	K3	125 pg	125 pg		7
B3	K3 + IL2	125 pg + 125 pg	125 pg + 125 pg		7
B4	K3	62,5 pg	62,5 pg		7
B5	K3 + IL2	62,5 pg + 125 pg	62 pg + 125 pg		7
B6	K3	31,25 pg	31,25 pg		7
B7	K3 + IL2	31,25 pg + 125 pg	31,25 pg + 125 pg		7
B8	pCi	250 pg	250 pg		7
B9	IL-2	125 pg	125 pg		7
B10	lipofectin	-	-		7
B11	K3(-lipofectin)	250 pg	250 pg		7

Kurom immunizowanym zgodnie ze schematem A podawano szczepionkę zarówno in ovo (jedna dawka) jak i po wykluciu (dwie dawki), natomiast kury immunizowane zgodnie ze schematem B otrzymywały szczepionkę (dwie dawki) jedynie po wykluciu.

Immunizacja wg schematu A, losowo wybrane jaja wylęgowe (Ross 308) inkubowano w komercyjnym zakładzie wylęgowym w inkubatorze Petersime (typ vision). W 18 dobie lęgu jaja losowo rozdzielono do grup doświadczalnych i grupy kontrolnej. Przed iniekcją jaja były prześwietlane w celu eliminacji jaj niezapłodnionych i zamarłych zarodków. Jedna dawka szczepionki do immunizacji in ovo zawierała 60 ig (szczepienie jednym plazmidem) lub 2 x 60 ig DNA (szczepienie dwoma plazmidami). Iniekcji roztworu o objętości 0.2 ml dokonywano ręcznie, z użyciem igły o średnicy 0.2 mm. Iniekcja ta musi być przeprowadzona wystarczająco głęboko (około 1.5-2.0 cm) aby osiągnąć worek owo8

PL 220 281 B1 dniowy (płyn owodniowy lub ciało zarodka). Po iniekcji otwór w skorupie jaja zaklejono taśmą samoprzylepną, a inkubację jaj kontynuowano do wylęgu (21 doba lęgu).

Po wykluciu, kurczętom podawano szczepionki w 8 oraz w 22 dobie życia podskórnie (w kark).

Jedna dawka szczepionki do immunizacji zwierząt po wykluciu zawierała 250 μg DNA (szczepienie jednym plazmidem) lub 500 μg DNA (szczepienie dwoma plazmidami) w 400 μΐ preparatu. Grupy nieimmunizowane oraz immunizowane pustym wektorem pCI służyły jako kontrole negatywne. W 35 dniu kurczęta zostały zważone ale nie zauważono znaczących statystycznie różnic pomiędzy grupami. Próbki krwi do analiz zostały pobrane z żyły skrzydłowej w 21 oraz w 35 dobie życia. Krew była pozostawiona do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 h a następnie trzymana w 4°C przez noc. Skrzep był odwirowywany przy 5000 x g przez 10 min w 4°C. Otrzymana surowica była przechowywana w -20°C.

Immunizacja wg schematu B, szczepionkę podawano podskórnie (w kark) w 3 i w 17 dobie życia. Podawano następujące dawki szczepionki DNA (250; 125; 62,5 oraz 31 μg). Szczepionka podawana była w stałej objętości 400 μl preparatu. Każdą testowaną dawkę szczepionki podawano w dwóch wariantach, łącznie z plazmidem kodującym interleukinę 2 oraz bez tego plazmidu. Jako kontrole negatywne służyły grupy, którym podawano pusty wektor (250 μg), plazmid kodujący interleukinę 2 (125 μg), plazmid K3 bez lipofektin oraz wyłącznie lipofektin (bez DNA). Próbki krwi do analiz zostały pobrane z żyły skrzydłowej w 16 oraz w 33 dobie życia. Surowice przygotowywano identycznie jak opisano powyżej dla schematu A.

P r z y k ł a d III Analiza odpowiedzi immunologicznej za pomocą testów Western blot i dot blot

Analiza kurcząt immunizowanych wg schematu A: Obecności przeciwciał anty-HA badano w surowicach uzyskanych z kurcząt za pomocą metody Western blot. Taką samą objętość surowic pochodzących od wszystkich kurcząt z badanej grupy łączono, następnie rozcieńczano 1:200 i inkubowano przez 1 godzinę z membraną nitrocelulozową zawierającą rozdzielone elektroforetycznie białko HA (A/Bar-headd Goose/Qinghai/12/05; Immune Technology) w ilości 100 μg/kieszonkę. Jako przeciwciała drugorzędowe używano anti-chicken-IgY-AP. Wyznakowane AP przeciwciała drugorzędowe wykrywano substratem alkalicznej fosfatazy (Roche). Western blot potraktowano jako test jakościowy. Analiza western blot wykazała obecność przeciwciał anty-HA w surowicach z grup immunizowanych konstruktem K3 lub K3 w obecności plazmidu pIL2. Silne prążki były obserwowane w próbkach pobranych 14 dni po drugiej dawce przypominającej w 35 dobie życia kurcząt. W próbkach pobranych 14 dni po pierwszej dawce przypominającej (w 21 dobie życia kurcząt) prążki były bardzo słabe (wynik nie pokazany). Różnice w poziomie odpowiedzi między pozytywnymi grupami były trudne do określenia na podstawie wyników uzyskanych z zastosowaniem metody western blot (Fig. 1A).

Analiza kurcząt immunizowanych wg schematu B: Obecności przeciwciał anty-HA badano w surowicach uzyskanych z kurcząt za pomocą metody dot blot. Analiza ta była podobna do analizy grup A z wyjątkiem wykluczenia etapu elektroforetycznego rozdzielenia antygenu kontrolnego, który w obu przypadkach był identyczny (A/Barheaded Goose/Qinghai/12/05; Immune Technology). Taką samą objętość surowic pochodzących od wszystkich kurcząt z badanej grupy łączono, następnie rozcieńczano 1:200 i inkubowano przez 1 godzinę z membraną nitrocelulozową zawierającą nakroplone białko antygenu kontrolnego w ilości 100 ng/kroplę. Jako przeciwciała drugorzędowe używano anti-chicken-IgY-AP. Wyznakowane AP przeciwciała drugorzędowe wykrywano substratem alkalicznej fosfatazy (Roche). Analiza dot blot wykazała obecność przeciwciał anty-HA w surowicach kurcząt ze wszystkich grup immunizowanych konstruktem K3 lub K3 w obecności plazmidu pIL2. Intensywność wiązania wydawała się wprost proporcjonalna do dawki plazmidowego DNA otrzymanej przez kurczęta. Obecność plazmidu pIL2 wzmacniała intensywność specyficznej odpowiedzi immunologicznej (anty-HA) ale jedynie w przypadku niskich dawek plazmidowego DNA (Grupy B4-B7), które otrzymały 31,2-62,5 μg plazmidu K3 (Fig. 1B).

P r z y k ł a d IV. Analiza odpowiedzi immunologicznej za pomocą testu ELISA

Obecność przeciwciał anty-HA w badanych surowicach wykrywano pośrednim testem ELISA. Płytki (MaxiSorp, Nunc) zostały opłaszczone rekombinowanym antygenem kontrolnym (A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05) o stężeniu 3 μg/ml w buforze PBS. Jako kontrole niespecyficznego tła zastosowano płytki nieopłaszczone antygenem (potraktowane buforem PBS). Opłaszczenie płytek prowadzono przez noc w 4°C. Surowice były rozcieńczane 1:100 oraz 1:50 w buforze PBSS (PBS + NaCl), a do detekcji stosowano mysie anti-chicken IgY (γ-chain specific) jako przeciwciała drugorzędowe, a naPL 220 281 B1 stępnie przeciwciała kozie anti-mouse IgG-HRP. Jako substrat reakcji barwnej dla peroksydazy chrzanowej stosowany był TMB (Sigma). Po 30 min inkubacji w temperaturze pokojowej reakcja była zatrzymywana 0,5 M H2SO4. Próbki uznawano za pozytywne jeśli wartość OD450 była dwukrotnie wyższa od wartości średniej grup kontrolnych.

W grupach kurcząt immunizowanych plazmidem K3 wykrywano silną odpowiedź immunologiczną anty-HA (Fig. 2). Odpowiedź ta była wprost proporcjonalna do dawki plazmidowego DNA. Wynik ten zgadza się z wynikami Western blot oraz dot blot (Fig. 1) uzyskanymi wcześniej dla grup immunizowanych plazmidem K3. Pozytywne wyniki obserwowano już w próbkach z wcześniejszego pobrania krwi (14 dni po pierwszej dawce przypominającej wg schematu A czyli 21 doba życia kurcząt oraz po pierwszej dawce immunizacji wg schematu B czyli w 18 dobie życia kurcząt). Miano przeciwciał było jednak w tym okresie dość niskie i przeciwciała nie były wykrywane u wszystkich kurcząt. Natomiast w próbkach z drugiego pobrania krwi wyniki były pozytywne dla 100% kurcząt w grupach immunizowanych największą dawką plazmidowego DNA a miano przeciwciał było bardzo wysokie.

Analiza wyników uzyskanych dla kurcząt immunizowanych wg schematu A (Fig. 2A) nie pozwala jednoznacznie odpowiedzieć na pytanie dotyczące znaczenia immunizacji in ovo oraz znaczenia podania plazmidu pIL2 dla odpowiedzi immunologicznej uzyskanej w przypadku szczepionki zawierającej plazmid K3. Wysoką odpowiedź immunologiczną (szczególnie 14 dni po ostatniej dawce) uzyskano zarówno w przypadku dwukrotnego (bez zastosowania techniki in ovo) jak i trzykrotnego szczepienia (z zastosowaniem techniki in ovo). Odnotować należy, że w grupie 2 (immunizowanej trzykrotnie plazmidem K3) odpowiedziało tylko 5 na 7 kurcząt w przeciwieństwie do grupy 7 (immunizowanej dwukrotnie plazmidem K3), ale znaczenie tej obserwacji należy zweryfikować w dalszych eksperymentach. Ponadto, dodanie plazmidu pIL2 raczej nie wpływało pozytywnie na odpowiedź immunologiczną. Najwyższe odpowiedzi dla wszystkich immunizowanych zwierząt otrzymano dla grupy 7, która otrzymała dwie dawki plazmidu K3. Grupy kontrolne były jednoznacznie negatywne, odczyty oscylowały około 0, nie zaobserwowano także niespecyficznego tła.

Analiza wyników uzyskanych dla kurcząt immunizowanych wg schematu B (Fig. 2B) wykazuje wyraźną wprost proporcjonalną zależność uzyskanej odpowiedzi immunologicznej od dawki plazmidu K3. Uzyskane wyniki sugerują również, że podanie plazmidu pIL2 stymuluje odpowiedź immunologiczną anty-HA jedynie w przypadku niższych dawek plazmidu K3. Wynik ten zgadza się z wynikiem dot-blot.

P r z y k ł a d V. Analiza odpowiedzi immunologicznej za pomocą testu inhibicji hemaglutynacji

W celu uzupełnienia wyników otrzymanych metodami immunologicznymi przeprowadzony był także serologiczny test zahamowania (inhibicji) hemaglutynacji (HI), który pozwala na wykrycie przeciwciał zdolnych do inhibicji hemaglutynacji. Test oparty był o powinowactwo przeciwciał obecnych w surowicach immunizowanych kurcząt do antygenu H5 z nisko patogennego szczepu H5N2. Analiza sekwencji hemaglutyniny użytego szczepu i tej z wykorzystanego antygenu wykazała homologię sekwencji aminokwasowej na poziomie 91% (wynik nie pokazany). Test został przeprowadzony zgodnie z obecnie obowiązującymi zaleceniami (Minta, 2008; Avian Influenza in: OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010). Próbki kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń (od 1:8 do 1:512) badanych surowic o objętości 25 μl inkubowano z 4 jednostkami HA inaktywowanego antygenu AIV szczepu A/chicken/Belgium/ 150/1999 (H5N2) (DG Deventer) w 96-dołkowej, V-kształtnej płytce do miareczkowania. Po 25 min inkubacji w temperaturze pokojowej dodawano 25 μl 1% kurzych erytrocytów i inkubowano przez kolejne 25 min. Odwrotność najwyższego rozcieńczenia, które hamowało aglutynację kurzych erytrocytów określało miano HI badanych surowic. Za pozytywne uznawano próbki, które osiągnęły miano co najmniej 8. Miana dla poszczególnych kurcząt przedstawiono jako log2.

Przeciwciał zdolnych do zahamowania hemaglutynacji nie wykryto w żadnej grupie kurcząt w przypadku badania surowic pobranych w pierwszym terminie (doba 21 w grupach immunizowanych wg schematu A oraz doba 18 w grupach immunizowanych wg schematu B; wyniku nie pokazano). W przypadku surowic pobranych w 35 dobie życia kurcząt immunizowanych wg schematu A oraz w 33 dobie życia kurcząt immunizowanych wg schematu B wykrywano przeciwciała neutralizujące w grupach immunizowanych plazmidem K3 (Fig. 3). Najlepsze rezultaty uzyskano dla grup immunizowanych największą dawką plazmidu K3 (A4, B1).

PL 220 281 B1

P r z y k ł a d VI. Porównanie odpowiedzi na immunizację szczepionką zawierającą cDNA zmodyfikowane oraz cDNA bez modyfikacji

Dwie grupy kurcząt (każda składająca się z 5-ciu osobników) immunizowano dwukrotnie (w 6 oraz 21 dobie życia) poprzez podskórne podanie preparatu zawierającego 250 pg plazmidowego DNA. Pierwszą grupę immunizowano plazmidem K3 (zawierającym zmodyfikowane cDNA; SEQ2), drugą grupę immunizowano plazmidem zawierającym cDNA niezmodyfikowane (SEQ1). Obecność przeciwciał anty-HA sprawdzano w surowicach uzyskanych od kur w 42 dniu życia. Wstępne określenie poziomu odpowiedzi immunologicznej za pomocą opisanej w Przykładzie III techniki dot blot (Fig. 4A) oraz sprawdzenie zdolności do inhibicji hemaglutynacji za pomocą metody opisanej w przykładzie V (Fig. 4B) wykazało, że immunizacja szczepionką zawierającą zmodyfikowane cDNA jest bardziej skuteczna niż immunizacja szczepionką zawierającą DNA niezmodyfikowane.

Lista sekwencji

SEQ Π) nr 1

Sekwencja genu HA polskiego szczepu AIV z 2006

ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTG

CATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAA

CGTCACTGTTACACACGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTG

CGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTAAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTC

CTCGGGAACCCAATGTGTGACGAATTCCTCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGG

AGAAGATCAATCCAGCCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAATTTCAACGACTATGAAGA

ACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAA

AGTTCTTGGTCAGATCATGAAGCCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCAGG

GAAGGTCCTCCTTTTTTAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGGACAATGCATACCC

AACAATAAAGAGAAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGG

GATTCACCATCCAAATGATGCGGCAGAGCAGACAAGGCTCTATCAAAACCCAACCAC

CTATATTTCCGTTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAAAATAGCTACT

AGATCCAAGGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTTTGGACAATTTTAAAAC

CGAATGATGCAATAAACTTTGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAAAATGCATA

CAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAA

CTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATAGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCAC

AACATCCACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAG

TCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAGGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAG

GACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATG

GTTGGTATGGGTACCACCATAGCAACGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAG

AATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTAACA

AAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAATAACTTAGAAAGGAGAA

TAGAAAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGATTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGC

TGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTC

AAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTTGGT

AACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAGATGTGATAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAA

ACGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCAAGATTAAAAAGAGAGGAAA

TAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAACCTACCAAATACTGTCAATTTATTCAAC

AGTGGCGAGCTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCT

CCAATGG ATCGTTAC AAIGC AG A AITTGC ΑΤΤΤΑΛ

PL 220 281 B1

SEQ ID nr 2

Sekwencja genu HA (ARRRKK.R) zoptymalizowanego dla Gallus gałlus

ATGGAAAAGATTGTGCTGCTGTTTGCTATCGTGTCCCTGGTGAAAAGCGACCAGATTT

GTATCGGGTATCATGCCAATAACTCAACCGAACAGGTGGATACTATTATGGAGAAAAA

CGTGACTGTGACCCACGCCCAGGACATCCTGGAGAAGACCCATAACGGCAAACTGTG

CGATCTGGACGGAGTGAAGCCCCTGATCCTGCGCGATTGCAGCGTGGCTGGCTGGCTG

CTGGGAAACCCTATGTGCGACGAGTTCCTGAATGTGCCAGAATGGTCCTACATCGTGG

AGAAAATTAACCCAGCAAATGATCTGTGCTACCCCGGCAACTTCAATGACTATGAGGA

ACTGAAGCACCTGCTGTCTAGGATCAACCATTTCGAAAAGATCCAGATCATCCCTAAG

AGCTCCTGGAGCGATCACGAGGCTTCTTCAGGCGTGAGTAGCGCATGTCCATACCAGG

GACGCTCCTCTTTCTTTCGGAACGTGGTGTGGCTGATTAAGAAAGACAATGCTTACCC

AACTATCAAACGCAGCTATAACAATACCAACCAGGAAGATCTGCTGGTGCTGTGGGG

AATCCACCATCCCAACGACGCCGCTGAGCAGACACGGCTGTACCAGAATCCTACCACA

TATATTAGTGTGGGGACAAGCACTCTGAACCAGAGACTGGTGCCCAAGATCGCAACA

AGGAGCAAAGTGAATGGCCAGTCCGGAAGAATGGAGTTCTTTTGGACTATCCTGAAGC

CAAACGATGCCATTAATTTCGAATCTAACGGCAACTTCATCGCACCCGAGAACGCCTA

CAAGATTGTGAAGAAAGGAGACTCCACTATCATGAAATCTGAGCTGGAATATGGGAA

CTGCAATACCAAGTGTCAGACACCTATCGGTGCAATTAACTCAAGTATGCCCTTTCAC aatatccatcctctgaccattggggagtgccccaagtacgtgaaaagtaaccgcctgg

TGCTGGCCACAGGTCTGCGGAATAGCCCTCAGGGGGAAGGTCTGTTCGGGGCTATCGC

AGGTTTTATTGAGGGCGGATGGCAGGGAATGGTGGATGGGTGGTACGGTTATCACCAT

TCAAACGAACAGGGCAGTGGATACGCAGCCGATAAGGAGTCAACACAGAAAGCCATT

GACGGAGTGACTAACAAGGTGAACTCCATCATTAACAAAATGAACACCCAGTTCGAG

GCTGTGGGGAGAGAGTTCAACAATCTGGAGAGAAGGATCGAAAACCTGAATAAGAAA

ATGGAAGATGGCTTCCTGGACGTGTGGACTTACAACGCTGAGCTGCTGGTGCTGATGG

AGAATGAAAGGACCCTGGATTTTCACGACAGCAACGTGAAGAATCTGTATGATAAAG

TGAGACTGCAGCTGAGGGACAACGCAAAGGAACTGGGGAATGGTTGTTTCGAGTTTTA

CCATAGATGCGATAACGAGTGTATGGAATCCGTGAGGAATGGCACATACGACTATCCA

CAGTATTCTGAGGAAGCCCGCCTGAAGCGGGAGGAAATTTCTGGGGTGAAACTGGAG

TCAATCGGTACCTACCAGATCCTGTCTATCTACTCAACAGTGGCTAGCTCCCTGGCCCT

GGCTATCATGGTGGCTGGCCTGAGCCTGTGGATGTGCTCTAACGGTAGCCTGCAGTGT

AGGATCTGTATTTGA

SEQIDnr3

Sekwencja genu chIL2 (GenBank AF017645)

ATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGTAGCAATGCTAATGACTACAGC

TTATGGAGCATCTCTATCATCAGCAAAAAGGAAACCTCTTCAAACATTAATAAAGGAT

TTAGAAATATTGGAAAATATCAAGAACAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTG

AGACCCAGGAGTGCACCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCT

GAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTGAAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATTCA

AAATATCGAAAAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAAATCACACCGGAAGTGAATG

CAAGATCTGTGAAGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATTTTCTCCATGAACTGACC

AACTTTGTGAGATATCTGCAAAAATAA

PL 220 281 B1

L i t e r a t u r a

Avian Influenza in: OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010 [http://www.oie.int/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/].

Fynan, E.F., Robinson, H.L., and Webster, R.G. (1993a). Use of DNA encoding influenza hemagglutinin as an avian influenza vaccine. DNA Cell Biol 12, 785-789.

Fynan, E.F., Webster, R.G., Fuller, D.H., Haynes, J.R., Santoro, J.C., and Robinson, H.L. (1993b). DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. Proc Natl Acad Sci USA 90, 11478-11482.

Gromadzka, B., Smietanka, K., Dragun, J., Minta, Z., Gora-Sochacka, A., and Szewczyk, B.

(2008). Detection of changes in avian influenza genome fragments by multitemperature single-strand conformational polymorphism. Mol Cell Probes 22, 301-304.

Kodihalli, S., Kobasa, D.L., and Webster, R.G. (2000). Strategies for inducing protection against avian Influenza A virus subtypes with DNA vaccines. Vaccine 18, 2592-2599.

Minta Z. (2008) HPAI-PLAN Instrukcje przeprowadzania laboratoryjnych badań diagnostycznych w kierunku grypy ptaków

Park, J.H., Sung, H.W., Yoon, B.L, and Kwon, H.M. (2009). Protection of chicken against very virulent IBDV provided by in ovo priming with DNA vaccine and boosting with killed vaccine and the adjuvant effects of plasmid-encoded chicken interleukin-2 and interferongamma. J Vet Sci 10, 131-139.

Rao, S., Kong, W.P., Wei, C.J., Yang, Z.Y., Nason, M., Styles, D., DeTolla, L.J., Panda, A., Sorrell, E.M., Song, H., Wan, H., Ramirez-Nieto, G.C., Perez, D., and Nabel, G.J.

(2008). Multivalent HA DNA vaccination protects against highly pathogenic H5N1 avian influenza infection in chickens and mice. PLoS One 3, e2432.

Robinson, H.L., Hunt, L.A., and Webster, R.G. (1993). Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a haemagglutinin-expressing plasmid DNA. Vaccine 11,

957-960.

Swayne, D.E. (2009). Avian influenza vaccines and therapies for poultry. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 32, 351-363.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczepionka DNA zawierająca zmodyfikowane cDNA kodujące białko hemaglutyniny H5, znamienna tym, że zawiera delecję regionu kodującego aminokwasy w miejscu cięcia proteolitycznego pomiędzy podjednostkami HA1 i HA2 oraz kodony zmienione na optymalne dla kur w celu zapewnienia maksymalnej wydajności produkcji białka H5 w komórkach ptaków.
2. Szczepionka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję określoną jako SEQ. ID nr 2.
3. Szczepionka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że delecja obejmuje między 15 a 21 par zasad kodujących aminokwasy w miejscu cięcia pomiędzy podjednostkami HA1 i HA2, korzystnie 18 par zasad.
4. Sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego, w którym wytwarzane są specyficzne przeciwciała u immunizowanego drobiu rozpoznające białko hemaglutyniny H5, znamienny tym, że stosuje się szczepionkę DNA określoną zastrzeżeniami 1 do 3.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że odpowiedź immunologiczną wzmacnia się poprzez podanie plazmidu zapewniającego ekspresję cDNA dla kurzej interleukiny 2 określonego sekwencją SEQ. ID nr 3.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że pierwsza dawka szczepionki podawana jest in ovo na 3 doby przed wykluciem.
7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że pierwsza dawka szczepionki podawana jest do 8-ej doby po wykluciu.
8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że obejmuje przygotowanie plazmidów ekspresyjnych oraz preparatów do immunizacji z wykorzystaniem do tego celu lipidowych nośników.
9. Przeciwciała specyficznie rozpoznające białko hemaglutyniny H5 wirusa grypy, znamienne tym, że są uzyskane przez zastosowanie szczepionki określonej zastrzeżeniami 1 do 3.

PL 220 281 B1
10. Przeciwciała według zastrz. 9, znamienne tym, że są aktywne bądź nie w teście inhibicji hemaglutynacji z wykorzystaniem antygenu H5 wirusa grypy.
11. Przeciwciała według zastrz. 9, znamienne tym, że neutralizują wirusa grypy bądź są niezdolne do neutralizacji wirusa grypy.
12. Zastosowanie szczepionki DNA określonej zastrzeżeniami od 1 do 3 do otrzymywania przeciwciał specyficznie rozpoznających białko hemaglutyniny H5 wirusa grypy.