PL238555B1 - Sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hydrofitowej domeny hemaglutyniny wirusa H5. Wynalazek dotyczy nowego sposobu wytwarzania antygenu szczepionkowego. Rozwiązanie według wynalazku prowadzi do uzyskania wysoko immunogennego antygenu co nie wymaga kontaktu z wirusem, a jedynie z genem hemaglutyniny, zaś otrzymana sposobem według wynalazku szczepionka nie zawiera wirusa ani jego fragmentów, nie zawiera komórek innych organizmów ani ich fragmentów, a jedynie oczyszczony antygen.

Grypa jest wirusową chorobą zakaźną występującą na całym świecie zarówno u ludzi, jak i u zwierząt. Epidemie grypy zdarzają się corocznie powodując wysoką zachorowalność i śmiertelność. Grypę wywołuje wielopostaciowy wirus RNA należący do rodziny Orthomyxoviridae, którego cząstki mają średnicę ok. 125 nm. Wyróżnia się trzy główne typy wirusa grypy oznaczone kolejno literami A, B i C. Wirusy grypy typu A dzielą się na podtypy ze względu na dwie powierzchniowe glikoproteiny: hemaglutyninę (HA) i neuraminidazę (NA). Jak dotąd zidentyfikowano 16 podtypów HA (H1 - H16) oraz 9 podtypów NA (N1 - N9). Naturalnym rezerwuarem wszystkich podtypów wirusa grypy są stada dzikiego ptactwa wodnego. Od 1918 roku jedynie trzy podtypy HA (H1, H2 i H3) oraz dwa podtypy NA (N1 i N2) są stale spotykane w populacji ludzkiej. Należy jednak podkreślić, że wirus H5N1, wirus 'ptasiej grypy', który pojawił się w latach 90-tych XX wieku zaraża również ludzi. Istotną cechą wirusa grypy jest zdolność do ciągłej zmiany, której źródłem są mutacje w genach kodujących białka HA i NA [Wiley D. i Skehel J. 1987]. Do zmian tych dochodzi zazwyczaj na skutek działania dwóch mechanizmów: przesunięcia antygenowego i skoku antygenowego. Brak dokładności polimerazy RNA skutkuje wysokim wskaźnikiem błędów transkrypcyjnych co prowadzi do zamiany aminokwasów w sekwencji HA. Ten mechanizm określamy jako przesunięcie antygenowe. Jeśli natomiast podczas jednoczesnego zakażenia organizmu dwoma różnymi wirusami grypy dojdzie między nimi do wymiany segmentów RNA wówczas dochodzi do skoku antygenowego co zwykle wiąże się z powstaniem nowego typu wirusa. Te zmiany genetyczne, zarówno przesunięcie, jak i skok antygenowy, są niemożliwe do przewidzenia i mogą spowodować pojawienie się wysoce patogennego wirusa. Szczepienie jest wciąż najbardziej skuteczną metodą ochrony przeciwko zakażeniom wirusem grypy oraz sposobem na zmniejszenie ryzyka wystąpienia epidemii czy pandemii. Substancją czynną w szczepionce przeciw grypie jest cały inaktywowany i oczyszczony wirion lub jego fragmenty. Dostępne na rynku tego typu szczepionki chronią w 60 - 90% osoby dorosłe i 23 - 72% osoby starsze. Proces otrzymywania szczepionki przeciw grypie obejmuje następujące etapy: (1) izolacja wirusa grypy, (2) genetyczna i antygenowa charakterystyka wyizolowanego wirusa, (3) wytypowanie szczepu wirusa do wykorzystania w nadchodzącym sezonie, (4) przygotowanie wysoko siewnego szczepu wirusa poprzez reasortację, (5) oddanie wysokosiewnego szczepu wirusa producentom szczepionek, (6) ocena przez producentów przydatności otrzymanego szczepu do produkcji szczepionek (7) produkcja szczepionki. Czas potrzebny na wyprodukowanie szczepionki to 7 - 8 miesięcy. Etap (4) tj. przygotowanie wysokosiewnego wirusa przez reasortację wymaga wykorzystania segmentów genomu pochodzącego ze szczepu wirusa wydajnie namnażającego się w zarodkach kurzych. Najczęściej jest to szczep A/PR/8/34. W ten sposób otrzymany szczep szczepionkowy różni się od szczepu wirusa grypy wyizolowanego w danym sezonie. Znanym jest fakt, iż wyizolowane z zakażonych organizmów wirusy grypy słabo namnażają się zarówno w zarodkach kurzych, jak i w liniach komórkowych. Należy zaznaczyć, że produkcja szczepionki przeciw grypie oparta na tradycyjnym namnażaniu wirusa w zarodkach kurzych choć bardzo dobrze opracowana posiada istotne wady i ograniczenia. Poza wspomnianym wyżej brakiem pełnej homologii między wirusem wyizolowanym ze środowiska a tym oddanym do produkcji, istotną wadą tej metody otrzymywania szczepionki jest długi i wieloetapowy proces produkcji oraz wysokie koszty produkcji związane z utrzymaniem wielu tysięcy zapłodnionych jaj kurzych. Warto zaznaczyć, że dla wyprodukowania jednej dawki szczepionki potrzeba średnio dwóch jaj. Jednak najważniejszym aspektem w produkcji szczepionek jest ich bezpieczeństwo. Obecnie obserwuje się stały wzrost liczby osób reagujących silną alergią na zanieczyszczenia białkowe w szczepionkach uzyskanych metodą tradycyjną. Poszukuje się zatem alternatywnych rozwiązań. Jednym z nich jest produkcja szczepionki z wykorzystaniem linii komórkowych. Mimo prowadzenia intensywnych badań rozwijających tę metodę nie znalazła ona szerokiego zastosowania. FDA dopuściła kilka linii komórkowych do wykorzystania w produkcji szczepionki, np. komórki Vero czy MDCK. Jednak z uwagi na możliwą obecność czynników nowotworowych oraz zanieczyszczeń białkowych szczepionki otrzymywane w liniach komórkowych nie wyszły poza etap badań. Ponie

PL 238 555 B1 waż przeciwciała neutralizujące wirusa grypy są skierowane głównie przeciwko białku HA obecnie obserwuje się dynamiczny rozwój badań nad szczepionką podjednostkową. Tego typu szczepionka zawiera rekombinowane białko HA, uzyskane metodami inżynierii genetycznej z wykorzystaniem różnych systemów ekspresyjnych. Hemaglutynina jest białkiem najliczniej występującym na powierzchni wirusa. Pełni dwie ważne funkcje w procesie infekcji: umożliwia przyłączenie się wirusa do komórek gospodarza oraz w trakcie endocytozy wirusa pośredniczy w jego fuzji z błoną pęcherzyka endocytarnego. Hemaglutynina na powierzchni wirusa występuje w formie trymerycznej. Każdy monomer składa się z dwóch podjednostek HA1 i HA2 połączonych przez mostek dwusiarczkowy, co stanowi domenę hydrofilową. Cząsteczka monomeru syntetyzowana jest w formie nieaktywnego prekursora HA0. Białko ulega N-glikozylacji a jego końcowa masa cząsteczkowa wynosi ok. 80 kDa. Warunkiem wstępnym dla infekcyjności wirusa jest przecięcie białka prekursorowego (HA0) na dwie podjednostki. Hemaglutynina nisko patogennych wirusów grypy w specyficznym miejscu cięcia posiada pojedynczą resztę argininy i jest aktywowana przez proteazy trypsynowe. U wysoko patogennych wirusów dochodzi do zwielokrotnienia aminokwasów zasadowych w miejscu cięcia białka HA0 tak, że miejsce to jest rozpoznawane przez szereg proteaz gospodarza. Dzięki tej zmianie wirus może się szybko rozprzestrzeniać i replikować niemal w każdym organie powodując ogólnoustrojową infekcję. Hemaglutynina jest najważniejszym antygenem przy definiowaniu serologicznej specyficzności szczepów wirusa. Białko to zawiera wiele miejsc antygenowych rozmieszczonych głównie w obrębie podjednostki HA1. Obecność neutralizujących przeciwciał IgG oraz IgA, specyficznych wobec hemaglutyniny wirusa grypy, jest związana z odpornością organizmu na infekcję i chorobę [Clements, 1992]. Jednym z układów stosowanych do produkcji rekombinowanej szczepionki przeciw grypie jest system ekspresyjny bakulowirusa oparty na komórkach owadzich. Metoda otrzymywania hemaglutyniny w systemie bakulowirusa jest przedmiotem patentu US 5858368. Rozwiązanie to wiąże się jednak z wysokimi kosztami produkcji wynikającymi z konieczności zatrudnienia wysoko wykwalifikowanego personelu i drogich odczynników. Wciąż zatem poszukuje się nowych, niedrogich i bezpiecznych sposobów otrzymywania antygenów szczepionkowych. Systemem ekspresyjnym wzbudzającym duże nadzieje na uzyskanie wysoko immunogennych antygenów jest system oparty o komórki drożdżowe. Patent US4752473 dotyczy metody ekspresji hemaglutyniny w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. System ten umożliwia wydajną produkcję HA jednak nadmierna glikozylacja białka jest znaczną przeszkodą stosowania tej strategii badawczej. Hemaglutyninę wirusa grypy H10N7 otrzymano w komórkach Schizosaccharomyces pombe (Wu et al., 2009) oraz typu H5N2 w drożdżach Kluyveromyces lactis (Su-Ming Tsai i wsp., 2011). W 1999 r. Saelens i wsp. otrzymali HA wirusa H3N2 w komórkach Pichia szczepu GS115. cDNA HA pozbawione C-terminalnej domeny transmembranowej wklonowane było do wektora pPIG9 zawierającego sekwencję α-faktora. Białko produkowane zewnątrzkomórkowo występowało w formie monomeru. Brak było danych wskazujących na obecność form trymerycznych. Białko nie było cięte na podjednostki. Xu Ym i wsp. (2006), w pracy opublikowanej w czasopiśmie chińskim, donosili o ekspresji HA wirusów H5, H7 i H9 w komórkach Pichia szczepu GS115. Użyty wektor - pPIG9. Chi Y. Wang i wsp. (2007) otrzymali w komórkach P. pastoris szczepu GS115 hemaglutyninę wirusa szczepu H5N2, która podlegała cięciu na podjednostki. Pełnej długości gen HA wklonowano do wektora pPICZaA. Uzyskano białko częściowo wydzielane do podłoża hodowlanego a w większości pozostające w komórce. Subatha i wsp. otrzymali pełnej długości białko HA wirusa H5N1 w systemie P. pastoris, ale jedynie wewnątrzkomórkowo. Użyty wektor - pPICZ C. Yang K. i wsp. otrzymali w komórkach P. pastoris jedynie domenę rHA1 wirusa grypy H5N1. Również Shehata i wsp. otrzymali jedynie podjednostkę HA1 wirusa grypy H5N1 w komórkach Pichia szczepu GS115 i SMDI168H stosując wektor p GAPZaC zawierający znacznik his -tag. Athmaram TN.i wsp. (2011) oraz Athmaram i wsp. (2012) otrzymali pełnej długości HA (HAO) wirusa grypy H1N1 w szczepie GS115 P. pastoris. Użyty wektor - pPICK9K z α-faktorem. Produkowana zewnątrzkomórkowo HAO (80 kDa) nie była cięta i występowała również w formie trimerów (ok. 240 kDa).

Pomimo istniejących do tej pory rozwiązań istnieje ciągła potrzeba opracowania nowego sposobu produkcji antygenu szczepionkowego oraz nowego antygenu. W odniesieniu do istniejących do tej pory rozwiązań opartych na namnażaniu wirusa w zarodkach kurzych istnieje konieczność pracy z wirusem. Poza wieloetapową produkcją konieczne są wysokie koszty produkcji związane z utrzymaniem wielu tysięcy zapłodnionych jaj kurzych. Wysokosiewny wirus przygotowuje się przez reasortację, korzystając z segmentów genomu pochodzącego ze szczepu wirusa wydajnie namnażającego się w zarodkach kurzych. Obserwuje się stały wzrost liczby osób reagujących silną alergią na zanieczyszczenia białkowe w szczepionkach uzyskanych metodą tradycyjną. Możliwa jest też obecność w szczepionce nieatenuowanego wirusa. W przypadku systemu opartego na liniach komórkowych istnieje możliwa obecność

PL 238 555 B1 czynników nowotworowych oraz zanieczyszczeń białkowych szczepionki, przy czym system ten jest nadal na etapie badań. W odniesieniu do systemu opartego na systemie bakulowirusowym odczynniki są drogie, konieczne jest zatrudnienie wysoko wykwalifikowanego personelu i należy się liczyć z wysokimi kosztami produkcji.

Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie nowego sposobu produkcji antygenu szczepionkowego. Choć istnieją doniesienia literaturowe na temat produkcji białka HA w komórkach Pichia niniejsze zgłoszenie patentowe dotyczy rozwiązania, które różni się od opublikowanych w kilku aspektach. Cechą charakterystyczną sposobu produkcji antygenu jest to, że antygen produkowany jest zewnątrzkomórkowo przez komórki Pichia pastoris szczepu KM 71 (his4, aox1::ARG4, arg4), który jest stosowany do selekcji wektorów ekspresyjnych zawierających HIS4 do wygenerowania szczepów z fenotypem Mut^s.

Nieoczekiwanie okazało się, że rozwiązanie według wynalazku prowadzi do uzyskania wysoko immunogennego antygenu co nie wymaga kontaktu z wirusem, a jedynie z genem hemaglutyniny. Szczepionka nie zawiera wirusa ani jego fragmentów, nie zawiera komórek innych organizmów ani ich fragmentów, a jedynie oczyszczony antygen. Sposób jej wytwarzania jest prosty i tani w porównaniu do już istniejących rozwiązań. Ponadto w szczepionce według wynalazku brak jest zanieczyszczeń białkowych. W kontekście szybko mutującego wirusa uzyskuje się szczepionkę homologiczną do szczepu wirusa grypy wyizolowanego w danym sezonie, przy jednoczesnym zapewnieniu szybkiego jej wyprodukowania w odpowiedzi na zaistniałe zapotrzebowanie.

Niniejsze zgłoszenie dotyczy nowego sposobu wytwarzania antygenu szczepionkowego. Cechą charakterystyczną sposobu wytwarzania antygenu jest to, że (1) antygen produkowany jest zewnątrzkomórkowo przez komórki Pichia pastoris szczepu KM 71. Cechą charakterystyczną otrzymanego antygenu jest to, że (1) jest on białkiem przeciętym przynajmniej w jednym miejscu, przy czym jedno z tych miejsc jest miejscem cięcia rozpoznawanym przez proteazy, łączącym domenę HA1 z domeną HA2, (2) białkiem połączonym 'trwale' mostkiem dwusiarczkowym, (3) białkiem glikozylowanym, (4) występującym w formie trimerów i oligomerów, (5) występującym jednocześnie jako mieszanina dwóch domen HA1 i HA2, białka połączonego mostkiem dwusiarczkowym i białka w formie trimerów i oligomerów, (6) białkiem posiadającym etykietę powinowactwa np. His-tag lub nie posiadającym etykiety powinowactwa.

W sposobie według wynalazku, nieoczekiwanie okazało się, że komórki Pichia pastoris szczepu KM 71 produkują do medium hodowlanego białko HA przecięte przynajmniej w jednym miejscu na domeny HA1 i HA2, występujące w formie pełnego białka połączonego mostkiem dwusiarczkowym i jednocześnie występującym w formie oligomerów, które wykazuje silne zdolności immunogenne.

Sposób wg wynalazku pozwala uzyskać antygen stosowany w różnorakich zastosowaniach, w tym jako antygen do WB, ELISA, korzystnie do przygotowania szczepionek przeciw grypie, ale nie ograniczających się do nich. Niniejszy wynalazek nie nakłada ograniczeń na szczep wirusa grypy. Na przykładzie hemaglutyniny wirusa H5 biegli w dziedzinie stwierdzą, że możliwe jest uzyskanie wysoko immunogennego antygenu wirusa grypy H1N1, H3N1 itp.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 obejmującej aminokwasy 17-531 charakteryzujący się tym, że obejmuje:

a) wprowadzenie sekwencji kodującej białko hemaglutyniny wirusa grypy typu H5, do drożdżowego wektora ekspresyjnego, zawierającego sekwencję kierującą białko na drogę sekrecji, pod kontrolą promotora genu oksydazy alkoholowej I (AOXI)

b) wprowadzenie wektora określonego w pkt. a) do komórek Pichia pastoris szczepu KM 71 na drodze elektroporacji;

c) hodowlę transformantów Pichia pastoris szczepu KM 71 otrzymanego w pkt. b), gdzie promotor AOXI jest indukowany metanolem,

d) izolację hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa grypy typu H5, obejmującej aminokwasy 17-531 z medium pohodowlanego.

W celu lepszego zobrazowania wynalazku przedstawiono rysunek, na którym:

Figura 1 przedstawia identyfikację rekombinowanego białka HA w supernatantach hodowlanych szczepu KM 71 i SMD 1168. Figura 1A przedstawia analizę Western Blot przeciwciała anty - HisTag, zaś Figura 1B analizę Western Blot przeciwciała anty-HA1;

Figura 2 przedstawia analizę frakcji elucyjnych uzyskanych przy oczyszczaniu His6-HA na złożu Ni-NTA agaroza (12% SDS-PAGE, zabarwiono Coomassie), przy czym Figura 2A - szczep KM 71 i Figura 2B - szczep SMD 1168;

PL 238 555 Β1

Figura 3 przedstawia wydajność nadekspresji białka HA w komórkach P. pastoris szczepu KM 71; (przykład 3);

Figura 4 przedstawia analizę frakcji elucyjnych uzyskanych przy oczyszczaniu Hise-HA na złożu Ni-NTA agaroza (12% SDS-PAGE, zabarwiono Coomassie) - przy czym Figura 4A przedstawia szczep SMD 1168, hodowla prowadzona w 28°C, Figura 4B przedstawia szczep KM 71, hodowla prowadzona w 30°C, Figura 4C przedstawia szczep KM 71, hodowla prowadzona w 30°C w obecności kwasu kazaminowego; (przykład 3);

Figura 5 przedstawia analizę stopnia N-glikozylacji podjednostki Hise-HA1 po reakcji z EndoH. Figura 5A przedstawia analizę Western Blott, przeciwciała anty - HisTag, a Figura 5B przedstawia analizę SDS-PAGE;

Figura 6 przedstawia żel natywny z przykładu 5;

Figura 7 przedstawia miano przeciwciał klasy IgG przeciwko H5 w surowicach mysz po podaniu antygenu rHA otrzymanego w komórkach Pichia pastoris. Figura 7A przedstawia różne dawki antygenu, a Figura 7B przedstawia różne drogi podania antygenu w dawce 25 μg (przykład 6);

Figura 8 przedstawia (przykład 7).

Poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania według wynalazku.

Przykład 1. Klonowanie i nadprodukcja/ekspresja rekombinowanego białka HA

Do konstrukcji wektora ekspresyjnego pPICZaC/HAHise wykorzystano plazmid pPICZaC (lnvitrogen) oraz plazmid pGEM-Easy/HA niosący gen hemaglutyniny wirusa grypy H5N1 szczepu (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)). Plazmid pPICZaC posiada promotor genu oksydazy alkoholowej I (ΑΟΧΙ) indukowany metanolem. Plazmid ten posiada również sekwencję czynnika a pochodzącego z Saccharomyces cerevisiae zapewniającą sekrecję rekombinowanego białka do medium. Fragment cDNA o wielkości 1545 pz kodujący domenę hydrofitową (17-531 aa) hemaglutyniny wirusa grypy H5N1 szczepu (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)) powielono w dwuetapowej reakcji POR z wykorzystaniem następujących starterów: 5’CATCATCATCATGATCAGATTTGCATTGGTTAC-3' _oraz 3'CCTTGGATGGTTACTCGCCGGCGATAGCG-5'. _{w drugim} etapie wykorzystano parę starterów: 5'GCĄęGATCGATGCATCATCATCATCATCATGATCAGA-3' oraz 3^,CCTrGGAlGGTTACTCGCęGGCGATAGCG-5'.g_e|ę_Wencj_a kodująca znacznik His-Tag została dodana do sekwencji cDNA poprzez odpowiednio zaprojektowane startery. Produkt POR został wklonowany do wektora ekspresyjnego pPICZaC pod kontrolę promotora ΑΟΧ. Komórki Pichia pastoris szczepu KM 71 (his4, aox1::ARG4, arg4) oraz SMD 1168 (his4, pep4) (lnvitrogen) transformowano plazmidem pPICZaC/HAHise wykorzystując technikę elektroporacji. Integracja cDNA hemaglutyniny do genomu P. pastoris została potwierdzona za pomocą reakcji POR. Selekcję transformantów szczepu KM 71 oraz SMD 1168 prowadzono na podłożu zawierającym antybiotyk Zeocynę (kilkakrotne pasażowanie). Podłoże pełne BMGY (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton, 100 mM fosforan potasu pH 6,0, 1,34% YNB 0,00004% biotyna, 0,5% glicerol) zaszczepiono pojedynczą kolonią szczepu P. pastoris transformowanego plazmidem pPICZaC/HAHise. Hodowlę prowadzono w temperaturze 28°C z wytrząsaniem (160 obr/min) do osiągnięcia wysokiej gęstości optycznej ODeoo > 3. Po żwirowaniu komórki zawieszono w podłożu BMMY (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton, 100 mM fosforan potasu pH 6,0, 1,34% YNB 0,00004% biotyna, 5% metanol). Obecność rekombinowanego białka, zarówno w medium pohodowlanym, jak również w komórkach (kontrola), badana była za pomocą SDS-PAGE i Western blotting (z użyciem przeciwciała anty-HisTag i anty-HA). Identyfikacja rekombinowanego białka HA w supernatantach hodowlanych szczepu KM 71 i SMD 1168 została przedstawiona na fig. 1.

Przykład 2. Oczyszczanie rekombinowanego białka HA

Rekombinowana hemaglutynina została oczyszczana z podłoża hodowlanego drogą chromatografii powinowactwa z użyciem złoża Ni-NTA agarozowego. Etap wiązania białka do złoża był przeprowadzony w obecności buforu PBS pH 7,4 i 450 mM NaCI. Wiązanie prowadzono w temperaturze 4°C przez 3 godz. przy ciągłym mieszaniu. Złoże przemyto buforem PBS pH 7,4 zawierającym 25 mM imidazol. Białko HA wymywano z kolumny buforem elucyjnym zawierającym 250 mM imidazol w buforze PBS pH 7,4. Odpowiednią ilość roztworu elucyjnego z każdej zebranej próbki przeznaczono do oznaczenia stężenia białka oraz analizy typu SDS-PAGE. Stężenie białka oznaczano spektrofotometrycznie przez pomiar absorbancji przy długości fali 595 nm wg metody Bradford. Następnie białko dializowano w obecności buforu PBS pH 7,4. Po dializie białko liofilizowano i przechowywano w temperaturze -20°C.

PL 238 555 B1

Na fig. 2 przedstawiono analizę frakcji elucyjnych uzyskanych przy oczyszczaniu Hise-HA na złożu Ni-NTA agaroza szczepu KM 71 i szczepu SMD 1168.

P r z y k ł a d 3. Optymalizacja warunków hodowli

Hodowle na etapie indukcji prowadzono przez 1 - 7 dni z codziennym pobieraniem prób. Obecność rekombinowanego białka badana była za pomocą SDS-PAGE i Western blotting (z użyciem przeciwciała anty-HisTag). Przeprowadzono optymalizację warunków hodowli, która dotyczyła zarówno temperatury, składu pożywki (np. użycie różnych inhibitorów proteaz), pH czy też stężenia metanolu. Najwyższą wydajność ekspresji uzyskano przy indukcji 5% metanolem. Fig. 3 przedstawia analizę wydajności nadekspresji białka HA w komórkach P. pastoris szczepu KM 71. W temperaturze 28°C i wyższej zaobserwowano degradację białka. Hodowla prowadzona w temperaturze > 28°C prowadziła do uzyskania rHA w formie zdegradowanej pomimo stosowania inhibitorów proteaz, czy też kwasu kazaminowego. Na fig. 4 przedstawiono analizę frakcji elucyjnych uzyskanych przy oczyszczaniu Hise-HA na złożu Ni-NTA agaroza (12% SDS-PAGE, zabarwiono Coomassie) - dla szczepu SMD 1168, szczepu KM 71, szczepu KM 71 w obecności kwasu kazaminowego.

P r z y k ł a d 4. Analiza glikozylacji rekombinowanego białka HA metodą enzymatyczną oraz za pomocą MS/MS

4,7 μg białka rHA inkubowano z 750 U endoglikozydazy H (New England BioLabs) w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Próbki po reakcji analizowano na żelu (Western Blot, SDS-PAGE) (Fig. 5). Prążek odpowiadający formie deglikozylowanej białka rHA wycięto z żelu w celu wykonania analizy MS/MS. Prążek poddano trawieniu trypsyną. Mieszaninę peptydów (bez redukcji i alkilacji) naniesiono na prekolumnę RP-18 (Waters nanoAcquity 20 mm x 180 μm) w obecności wody i 0,1% kwasu trifluorooctowego a następnie na kolumnę HPLC RP-18 (Waters nanoAcquity UPLC Column 250 mm x 75 μm), wykorzystując liniowy gradient acetonitrylu (0-50% w 30 min.) z dodatkiem 0,1% kwasu mrówkowego. Frakcja elucyjna z kolumny HPLC kierowana została bezpośrednio do komory jonowej spektormetru mas (LTQ-FTICR, Thermo Electron). Otrzymane widma masowe analizowano z wykorzystaniem białkowej bazy danych - National Center of Biotechnology Information (NCBI no. version 20080624) przy pomocy programu Mascot (www.matrixscience.com). Wiadomo, że w sekwencji HA (Qinghai) znajduje się 6 potencjalnych miejsc N-glikozylacji (5 miejsc w domenie HA1 i 1 miejsce w domenie HA2). Nasze badania wskazują, że wszystkie potencjalne miejsca N-glikozylacji ulegają glikozylacji. N-glikozylacja podjednostki rHA1 została potwierdzona za pomocą MS/MS preparatu rHA uprzednio traktowanego EndoH. Wykazano również, za pomocą MS/MS, obecność łańcuchów cukrowych w jedynym miejscu N-glikozylacji w domenie HA2.

P r z y k ł a d 5. Ocena stopnia oligomeryzacji białka rHA

Dokonano oceny stopnia oligomeryzacji białka rHA. Żel natywny został przedstawiony na Fig. 6.

P r z y k ł a d 6. Ocena immunogenności białka rHA

Immunogenność uzyskanego preparatu rHA sprawdzono na modelu mysim. W pierwszym eksperymencie grupy badane zawierały po 5 sztuk 7-tygodniowych myszy Balb/c. Uwzględniono grupę kontrolną (10 sztuk), której podawany był jedynie adiuwant. Zwierzęta utrzymywano w środowisku o stałej temperaturze 22-24°C. Myszy immunizowano trzykrotnie. Antygen zawieszony w roztworze soli fizjologicznej podawano w trzech dawkach: 1, 5 oraz 25 μg. Preparaty w objętości 100 μl podawano śródskórnie (s.c.) w podeszwową część tylnej łapy. Surowice kontrolne zostały pobrane od wszystkich grup na tydzień przed podaniem pierwszej dawki. Wykonano trzy nastrzyki (pierwsze podanie antygenu i/lub adiuwanta + dwie dawki przypominające) w odstępie trzech tygodni w celu monitorowania odpowiedzi immunologicznej. W pierwszej immunizacji zastosowano Sigma Adiuvant System w dawce 25 μg. Dwie dawki przypominające zawierały monofosforyl lipidu A oraz dwupeptyd muramylowy w dawce po 25 μg każdy. Grupom kontrolnym podano jedynie odpowiedni adiuwant. Dwa tygodnie po każdym szczepieniu pobierana była krew w celu oznaczenia poziomu przeciwciał. Surowice przechowywano w temperaturze -20°C. W drugim eksperymencie grupy badane zawierały po 7 sztuk 7-tygodniowych myszy Balb/c. Kontrolę stanowiła grupa zawierająca 5 sztuk myszy. Antygen zawieszony w roztworze soli fizjologicznej podawano jedynie w dawce 25 μg natomiast sprawdzono dwie drogi podania: podanie śródskórne (s.c.) w podeszwową część tylnej łapy oraz podskórne (i.d.) w fałd skórny na karku. Zastosowano harmonogram immunizacji opisany wyżej. Objętość podawanego preparatu wynosiła 100 μl. W pierwszej immunizacji zastosowano Sigma Adiuvant System w dawce 25 μg. Dwie dawki przypominające zawierały monofosforyl lipidu A oraz dwupeptyd muramylowy w dawce po 25 μg każdy. Grupie kontrolnej podano podskórnie jedynie odpowiedni adiuwant. Podobnie jak w pierwszym eksperymencie, dwa tygodnie po każdym szczepieniu pobierana była krew w celu oznaczenia poziomu

PL 238 555 B1 przeciwciał. Surowice przechowywano w temperaturze -20°C. W próbach surowicy pobranych od badanych zwierząt został oznaczony poziom specyficznych przeciwciał klasy IgG skierowanych przeciwko hemaglutyninie wirusa grypy H5N1. Poziom przeciwciał został oznaczony z wykorzystaniem testu ELISA. W celu wykonania testu H5-ELISA, płytki MediSorp (NUNC) opłaszczano rH5 (17-530 aa, ARRRKKR, 6 x His) szczepu (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)) z bakulowirusowego systemu ekspresji (Oxford Expression Technologies) w stężeniu 6 gg/ml PBS albo napełniano PBS (kontrola niespecyficznego wiązania). Płytki inkubowano w temperaturze 2-8°C w ciągu nocy, po czym blokowano 2% BSA w buforze PBS przez 1,5 godziny, w temperaturze 37°C. Przygotowano serię rozcieńczeń surowic mysich w zakresie 1:2000 1:2000000. Surowice rozcieńczano przy użyciu 2% BSA/PBS. Płytki z próbami surowicy i próbami kontrolnymi - BLK (2% BSA/PBS) inkubowano w temperaturze 2-8°C w ciągu nocy. Wywoływanie płytek obejmowało 1-godzinną inkubację w 37°C z wyznakowanymi HRP przeciwciałami przeciwko przeciwciałom klasy IgG mysz, specyficznymi wobec łańcucha γ (SigmaAldrich), które rozcieńczano 1:1 000. Płytki płukano buforem PBS zawierającym Tween 20 w stężeniu 0,05% (PBST). Po opłaszczeniu stosowano 4, po blokowaniu 2 a między pozostałymi etapami procedury 5 cykli płukania. Reakcję barwną peroksydazy chrzanowej wywoływano przy użyciu TMB (Sigma). Płytkę inkubowano z substratem w ciągu 30 min., po czym dodawano 0,5 M roztwór H2SO4 w celu zahamowania reakcji HRP. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm. Wartości A450 uzyskane dla prób BLK odejmowano od wartości A450 odczytanych dla prób surowicy. Wyniki oznaczeń surowic na płytkach nie opłaszczonych rH5 stanowiły kontrolę poziomu niespecyficznego wiązania surowic (tło). Próby surowicy uznawano za H5-dodatnie, jeśli wartość A450 dla tych prób była wyższa niż średnia wartość A450 dla prób grupy kontrolnej powiększona o 2 wartości odchylenia standardowego (cut off). Miano punktu końcowego zdefiniowano jako największe rozcieńczenie surowicy immunizowanych kurcząt dające wartość absorpcji 4-krotnie wyższą niż średnia wartość absorpcji prób kontrolnych.

Na fig. 7 przedstawiono miano przeciwciał klasy IgG przeciwko H5 w surowicach mysz po podaniu antygenu rHA otrzymanego w komórkach Pichia pastoris przy różnych dawkach antygenu oraz przy różnych drogach podania antygenu w dawce 25 gg.

P r z y k ł a d 7. Charakterystyka / Immunogenność antygenów rHA

Immunogenność białek rH5 oznaczono z wykorzystaniem testu ELISA. Płytki MediSorp (NUNC) opłaszczano trzema wariantami białka rH5 szczepu (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)):

1. rH5 OET (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis) z bakulowirusowego systemu ekspresji (Oxford Expression Technologies),

2. rH5 (17-531,6xHis) z komórek P. pastoris szczepu KM 71

3. rH5 (17-531,6xHis) z komórek P. pastoris szczepu SMD 1168 w stężeniu 6 gg/ml PBS albo napełniano PBS (kontrola niespecyficznego wiązania). Płytki inkubowano w temperaturze 4°C przez noc. Następnie płytki przepłukano buforem PBST (PBS + 0,05% Tween 20) i blokowano 2% BSA w buforze PBS przez 1,5 godziny w temperaturze 37°C. Surowice badane uzyskane od zaszczepionych kur (AS-169, AS-184, EK-23.7) oraz myszy (EK-1.3, EK-1.4) rozcieńczono w stosunku 1:200 przy użyciu buforu 2% BSA/PBSS (bufor fosforanowy zawierający 0,3 M NaCl + KCl). Płytki z próbami surowicy i próbami kontrolnymi - PBS 2-8°C przez noc. Wywoływanie płytek obejmowało 1-godzinną inkubację w 37°C z wyznakowanymi HRP przeciwciałami przeciwko orzeciwciałom klasy IgY kurcząt, specyficznymi wobec łańcucha γ (próby As-169, As-184, EK-23.7) (Thermo Scientific) oraz wyznakowanymi HRP przeciwciałami przeciwko przeciwciałom klasy IgG mysz, specyficznymi wobec łańcucha γ )próby EK-1,3, EK-1,4) (Sigma Aldrich). Płytki płukano buforem PBS zawierającym Tween 20 w stężeniu 0,05% (PBST). Reakcję barwną peroksydazy chrzanowej wywoływano przy użyciu TMB (Sigma). Płytkę inkubowano z substratem w ciągu 30 min., po czym dodawano 0,5 M roztwór H2SO4 w celu zahamowania reakcji HRP. Absorbcję prób odczytywano przy λ = 450 nm wykorzystując czytnik do mikropłytek (Synergy 2; BioTek Instruments, USA) [fig. 8].

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   1. Sposób wytwarzania hydrofilowej domem hemaglutyniny wirusa H5 obejmującej aminokwasy 17-531, znamienny tym, że obejmuje:

   a) wprowadzenie sekwencji kodującej białko hemaglutyniny wirusa grypy typu H5, do drożdżowego wektora ekspresyjnego, zawierającego sekwencje kierującą białko na drogę sekrecji, pod kontrolą promotora genu oksydazy alkoholowej I (AOXI);

   PL 238 555 Β1

   b) wprowadzenie wektora określonego w pkt. A) do komórek Pichia pastoris szczepu KM 71 na drodze elektroporacji;

   c) hodowlę transformantów Pichia pastoris szczepu KM 71 otrzymanego w pkt. b), gdzie promotor ΑΟΧΙ jest indukowany metanolem;

   d) izolację hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa grypy typu H5, obejmującej aminokwasy 17-531 z medium pohodowlanego.