PL235555B1 - Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA ) wirusa grypy H5N1, kompozycja zawierająca polipeptyd i jej zastosowanie, przeciwciało wiążące się specyficznie z polipeptydem oraz sposób otrzymywania tego polipeptydu - Google Patents
Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA ) wirusa grypy H5N1, kompozycja zawierająca polipeptyd i jej zastosowanie, przeciwciało wiążące się specyficznie z polipeptydem oraz sposób otrzymywania tego polipeptydu Download PDFInfo
- Publication number
- PL235555B1 PL235555B1 PL408649A PL40864914A PL235555B1 PL 235555 B1 PL235555 B1 PL 235555B1 PL 408649 A PL408649 A PL 408649A PL 40864914 A PL40864914 A PL 40864914A PL 235555 B1 PL235555 B1 PL 235555B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- chickens
- coli
- protein
- antibodies
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 196
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 179
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims description 128
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 145
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 145
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 144
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 103
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 346
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 299
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 299
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 299
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 299
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 244
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 111
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 110
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 102
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 90
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 66
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical group [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 65
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 53
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 50
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 46
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 45
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 44
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 22
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 claims description 20
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 claims description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 12
- 241001473385 H5N1 subtype Species 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 10
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 claims description 9
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 7
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 6
- 244000144992 flock Species 0.000 claims description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 343
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 229
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 162
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 161
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 123
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 99
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 80
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 79
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 67
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 66
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 65
- 101001081189 Homo sapiens Rho GTPase-activating protein 45 Proteins 0.000 description 59
- 102100027748 Rho GTPase-activating protein 45 Human genes 0.000 description 59
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 36
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 34
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 33
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 32
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 31
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 30
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 29
- 238000011160 research Methods 0.000 description 29
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 20
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 15
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 15
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 11
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 11
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 9
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 8
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 8
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 241000272813 Anser indicus Species 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 101100514572 Escherichia coli (strain K12) msyB gene Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 5
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 description 5
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 5
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241001316595 Acris Species 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 3
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 description 3
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 3
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 2
- 101100223920 Caenorhabditis elegans rha-1 gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 description 2
- GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N Heroin Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)OC(C)=O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4OC(C)=O GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N 0.000 description 2
- 101001047819 Homo sapiens Heparanase Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000046974 Tscherskia triton Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 2
- AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N 0.000 description 2
- 238000013320 baculovirus expression vector system Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 2
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000012768 mass vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001293109 Anas carolinensis Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N Cyclohexanecarboxylic acid Natural products OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000353621 Eilat virus Species 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000669460 Homo sapiens Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 1
- 241001346242 Morphnus guianensis Species 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000287531 Psittacidae Species 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101100257766 Streptococcus agalactiae serotype III (strain NEM316) strA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100043717 Streptomyces griseus aphD gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 1
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 1
- 102100039357 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000006533 astragalus Nutrition 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 108010029566 avian influenza A virus hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101150109777 cytR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011832 ferret model Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000009191 jumping Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003232 mucoadhesive effect Effects 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 108010042685 trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest białko hemaglutyniny (HA) wirusów grypy (IV) jako antygen szczepionkowy przeciwko wirusom grypy, w szczególności białko hemaglutyniny H5 wysokopatogennego szczepu wirusa ptasiej grypy (HPAIV) H5N1, kompozycja zawierająca rzeczone białko hemaglutyniny mająca zastosowanie do tworzenia szczepionek przeciwko wirusowi grypy, przeciwciało wiążące się z rzeczonym białkiem i sposób otrzymywania białka hemaglutyniny.
Poznanie struktury przestrzennej HA różnych serotypów, rozwój metod projektowania leków in silico, biotechnologii i inżynierii białek otworzyły nowe perspektywy dla szczepionek przeciwko grypie wytwarzanych w bakteryjnym systemie ekspresji. Aktualnie prowadzone prace nad otrzymaniem takiej szczepionki koncentrują się wokół białek HA opartych na podjednostce HA-1, podjednostce HA-2, ektodomenie oraz polipeptydach zawierających powtórzone sekwencje pojedynczego epitopu (ang. single-epitope vaccines) lub kilku epitopów (ang. multi-epitope vaccines) białek wirusa grypy, w tym HA.
Białka zawierające podjednostkę HA-1 i jej fragmenty przeznaczone są do zapewnienia odporności przeciwko wirusom grypy o określonym serotypie HA. Dłuższe fragmenty HA, mimo obecności konserwowanych epitopów neutralizujących podjednostki HA-2 (Ekiert DC i wsp. 2009, Okuno Y i wsp. 1993, Sui J i wsp. 2009), również zaliczane są do grupy tzw. szczepionek serotypowo-specyficznych. Przypuszczalnie domena globularna hamuje rozpoznanie regionu trzonka przez komórki układu odpornościowego przez jego maskowanie albo na skutek immunodominacji (Steel J i wsp. 2010). W konsekwencji szczepionki zwierające przykładowo szczep AIV serotypu H5 wywołują ochronną odpowiedź odpornościową przeciwko zakażeniom przez wirusy H5, natomiast nie zapewniają odporności wobec wirusów innych serotypów albo jest ona na niskim poziomie (van den Berg i wsp. 2008). Ze względu na to, że wysoka zmienność dotyczy dominujących miejsc antygenowych HA, problem indukcji odporności krzyżowej istnieje także w odniesieniu do antygenowych wariantów HA szczepionkowej w spokrewnionych szczepach wirusa grypy. W przypadku AIV H5N1, obserwowana jest słaba reaktywność krzyżowa między przeciwciałami wyindukowanymi wobec wirusów kladu 1 a wirusami kladu 2, mimo ich znacznego podobieństwa (Khurana S i wsp. 2011b).
Prace nad rozszerzeniem zakresu odporności krzyżowej wyindukowanej przez szczepionki podjednostkowe koncentrują się na właściwościach antygenu i adiuwantach. Badania porównawcze zdolności różnych form HA do indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej wskazują, że istotną rolę w tym zakresie może odgrywać oligomeryzacja białka (Khurana S i wsp. 2011b, Verma S i wsp. 2012). Próby otrzymania szczepionek uniwersalnych realizowane są w projektach immunogenów pozbawionych domeny globularnej określanych jako białka HA oparte na domenie trzonka (Bommakanti G i wsp. 2010, 2012, Sagawa H i wsp. 1996, Steel J i wsp., 2010).
Na możliwość zwiększenia zakresu odpowiedzi odpornościowej przez opracowanie skutecznej kompozycji immunogennej wskazują badania Khurany S i wsp. (2010a), którzy stosując MF59 w inaktywowanej szczepionce H5N1 wykazali korzystny wpływ adiuwanta na wiązanie wyindukowanych przeciwciał do konformacyjnych epitopów podjednostki HA-1 korelujący z rozszerzeniem neutralizacji krzyżowej między kladami i przewidywaną ulepszoną protekcją in vivo.
Białka oparte na podjednostce HA-1
Metodą nadekspresji w E. coli wyprodukowano fragment HA HPAIV H5N1 zawierający sekwencję sygnałową oraz podjednostkę HA-1 z (Chiu FF i wsp. 2009) i bez aminokwasów zasadowych miejsca cięcia między podjednostkami HA-1 i HA-2 (Shen S i wsp. 2008).
Krótsze fragmenty podjednostki HA-1 eksprymowane w bakteriach razem z sekwencją sygnałową: 1-330 aa, 1-320 aa wirusów H1N1pdm09 i H5N1 oraz fragment: 1-320 aa HA H5 trzech szczepów należących do kladów: 1, 2.1 i 2.2 wirusa H5N1 otrzymali Khurana S i wsp. (2010b, 2011a, 2011b) i Verma S i wsp. (2012).
Zgodnie z innymi projektami, w bakteryjnym systemie ekspresji wytworzono fragmenty podjednostki HA-1: 57-264 aa, 57-272 aa, 50-280 aa HA H1 wirusa grypy H1N1pdm09 (Xuan C i wsp. 2011) oraz fragment 91-261 aa HA H3 wirusa grypy H3N2 (Jeon SH i Arnon R 2002) zawierające głównie domenę globularną białka (gH). Fragment 63-286 aa HA H1 wirusa H1N1pdm09 eksprymowano w bakteriach E. coli w formie monomerów - mHA63-286 (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010, DuBois RM i wsp. 2011, Sanchez-Arreola P i wsp. 2013), a także dimerów - dHA63-286, w których białka HA połączone są sekwencją 10 reszt aminokwasowych (Sanchez-Arreola P i wsp. 2013).
PL 235 555 B1
Otrzymano również różnej długości białka oparte na domenie glubula rnej HA H1 wirusa grypy H1N1/PR8 (101-276 aa, 53-324 aa, 62-284 aa), z których dwa (53-324 aa, 62-284 aa) połączono z C-końcem flagelliny typu 2 szczepu Salmonella typhimurium (STF2) przez giętki łącznik SGSGSGS (Song L i wsp. 2008). STF2 jest ligandem receptora Toll-like typu 5 (TLR 5) i zgodnie z obecnym stanem wiedzy jego połącznie z białkiem HA powinno zwiększyć zdolność antygenu do inicjowania odpowiedzi odpornościowej. Na podobnej zasadzie co antygen - STF2:HA(62-284 aa) wirusa
H1N1/PR8 uzyskano białka fuzyjne STF z fragmentami HA wirusów H1N1/SI (Song L i wsp. 2008), H1N1 pdm09 (Liu G i wsp. 2011) i H5N1 (Song L i wsp. 2009).
W oparciu o sekwencje HA H5 i H1pdm09 wyprodukowano także inne niż C-końcowy formaty białek STF:HA, które różnią się liczbą cząsteczek HA i ich umieszczeniem w białkach fuzyjnych (Liu G i wsp. 2011, 2012, Song L i wsp. 2009). Konstrukty R0 i R3 otrzymano przez zastąpienie domen, odpowiednio: D0 i D3 flagelliny białkiem HA, natomiast konstrukt R3.2xHA przez połącznie jednej cząseczki HA z C-końcem i drugiej w miejsce domeny D3 flagelliny. Niektóre formaty białek fuzyjnych STF2:HA zostały użyte jako immunogenne składniki szczepionki VAX125 przeciwko wirusowi grypy sezonowej - H1N1/SI (Treanor i wsp. 2010, Taylor DN i wsp. 2011) i trzech wariantów szczepionki VAX128 przeciwko wirusowi grypy pandemicznej - H1N1pdm09 (Taylor DN i wsp. 2012). Kompozycje szczepionek oparte na rozwiązaniach wykorzystujących białko fuzyjne HA połączonej z flagelliną ujawniono w dokumentach EP 2 476 432, WO2009128950, WO2014035989.
Zaprojektowano i wytworzono jedenaście białek HA opartych na domenie globularnej (gH) HA H1 wirusa H1N1/PR8, które zawierały cztery (grupa A), dwa (grupa B) lub jeden (grupa C) mostek dwusiarczkowy (Jegerlehner A i wsp. 2013). Białka z grup A i B połączono in vitro z cząstkami wiruso-podobnymi (VLPs) pochodzącymi z bakteriofaga Qp. Przez dostosowanie strukturalne do prototypowego fragmentu HA (gH1_A_PR8) otrzymano białka gH wirusów: H1N1pdm09, H5N1, H1N1, H3N2 oraz wirusa grypy typu B a następnie związano z Q3-VLPs (Jegerlehner A i wsp. 2013, Skibinski DA i wsp. 2013).
Podjednostka HA-1 i jej fragmenty były eksprymowane w bakteriach E. coli w ciałkach inkluzyjnych jako białka nierozpuszczalne, dlatego też otrzymanie antygenu przeznaczonego do szczepień wymagało rozpuszczenia białek i przeprowadzenia renaturacji HA. Stosując różne procedury otrzymywania białka, wykazano jednoznacznie silną zależność efektywności renaturacji podjednostki HA-1 HA H5 od zastosowanej metody (Chiu FF i wsp. 2009). W przypadku domeny globularnej HA wykazano ponadto, że efektywność i wydajność renaturacji białka w dużym stopniu zależy od tego jaki fragment podjednostki HA-1 wybrano do wytworzenia antygenu szczepionkowego (Jegerlehner A i wsp. 2013, Song L i wsp. 2008, Xuan C i wsp. 2011), co potwierdziło znaczenie struktur Il-rzędu tworzonych przez peptydy sąsiadujące z domeną globularną (Song L i wsp. 2008) oraz mostków dwusiarczkowych (Jegerlehner A i wsp. 2013) dla prawidłowego zwijania białka.
Oczyszczone i renaturowane fragmenty podjednostki HA-1 (1-330 aa, 1-320 aa) HA wirusów grypy H1N1pdm09 oraz H5N1, wytworzone w bakteryjnym systemie ekspresji, w przeciwieństwie do krótszego fragmentu HA H5 (28-320 aa), występowały w większości w formie trimerów i oligomerów (Khurana S i wsp. 2010b, 2011a, 2011b, Verma S i wsp. 2012). Wykazano, że oligomeryzacja podjednostki HA-1 zachodzi z udziałem konserwowanych aminokwasów w sekwencji sygnałowej białka (Khurana S i wsp. 2011b) a fragment 1-320 aa HA H5 i H1 tworzy bardziej stabilne oligomery niż fragment 1-330 aa (Khurana S i wsp. 2011a, 2011b). Oligomery białek HA, utworzone z trimerów, aglutynowały erytrocyty i wiązały się z fetuiną, co wskazuje na zdolność tych białek do wiązania receptorów zawierających reszty kwasu sialowego (Khurana S i wsp. 2010b, 2011b). W wyniku oczyszczenia i renaturacji odpowiadających sobie strukturalnie fragmentów podjednostki HA-1 z bakteryjnego systemu ekspresji, wyprodukowano z wysoką wydajnością prawidłowo zwinięte fragmenty hemaglutynin: H1pdm09, H5, H7 i H3 (Khurana S i wsp. 2011a, 2011b, Verma S i wsp. 2012). Otrzymane białka zawierały dużą frakcję form oligomerycznyeh (> 70%) w postaci struktur rozetowych utworzonych z trimerów, podobnych do tych jakie tworzy natywna HA wyizolowana z wirusów grypy. Natomiast renaturowane i oczyszczone fragmenty podjednostki HA-1 HA, mniejsze niż te, które otrzymali Khurana S i wsp. (2010b, 2011a, 2011b,) oraz Verma S i wsp. (2012), eksprymowane w bakteriach bez sekwencji sygnałowej, nie tworzyły oligomerów i występowały w postaci monomerów zawierających głównie domenę globularną o prawidłowej konformacji (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010, DuBois RM i wsp. 2011, Jegerlehner A i wsp. 2013, Liu G i wsp. 2011, 2012, Skibinski DA i wsp. 2013, Song L i wsp. 2008, 2009, Xuan C i wsp. 2011) albo tworzyły dimery z udziałem łącznika peptydowego (Sanchez-Arreola P i wsp. 2013). Prawidłowo zwinięte białka oparte na domenie globular
PL 235 555 B1 nej HA osiągały aktywność aglutynacji erytrocytów, charakterystyczną dla oligomerycznych form HA, po połączeniu z Q3-VLPs (Jegerlehner A i wsp. 2013).
Badania struktury i/lub antygenowości oczyszczonej i renaturowanej podjednostki HA-1 HA lub jej fragmentów wykazały, że białka otrzymane w bakteryjnym systemie ekspresji posiadają dobrze zachowane konformacyjne epitopy neutralizujące, istotne dla stymulacji odpowiedzi odpornościowej (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010, Chiu FF i wsp. 2009, DuBois RM i wsp. 2011, Hong i wsp. 2013, Khurana S i wsp. 2010b, 2011b, Sanchez-Arreola P i wsp. 2013, Song L i wsp. 2008, Verma S i wsp. 2012, Xuan C i wsp. 2011). Badania porównawcze różnych konstruktów białek fuzyjnych STF:HA wykazały, że antygenowość i aktywność TLR5 zależy od miejsca połączenia białka HA z flagelliną (Liu G i wsp. 2011,2012, Song L i wsp. 2009).
W testach z użyciem wirusów grypy homologicznych z antygenem szczepionkowym, wykazano, że surowice zwierząt zaszczepionych parenteralnie HA: 1-330 aa, 1-320 aa (Khurana S i wsp. 2010b, 2011a), 57-264 aa (Xuan C i wsp. 2011), 63-286 aa (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010) wirusów H1N1pdm09 oraz 1-320 aa wirusa H5N1 (Khurana S i wsp. 2011b, Verma S i wsp. 2012) a także STF2:HA wirusa H1N1/SI (Song L i wsp. 2008) hamują hemaglutynację i/lub neutralizują wirusy in vitro. Dla białek STF2:HA w formacie C-końcowym, R0, R3, R3x2HA udokumentowano zróżnicowaną zdolność do indukcji przeciwciał HI u zwierząt (Liu G i wsp. 2011, 2012, Song i wsp. 2009). Badania immunizacyjne w modelu myszy wykazały, że białka gH sprzężone z Q3-VLPs wywołują znacząco wyższe miana przeciwciał specyficznych wobec natywnej HA, przeciwciał HI i przeciwciał neutralizujących niż ich niesprzężone odpowiedniki i indukują silną odpowiedź typu Th1 (Jegerlehner A i wsp. 2013, Skibinski DA i wsp. 2013).
W przypadku szczepień białkiem HA (1-320 aa) wirusów H5N1, neutralizującą aktywność surowic wykazano również wobec wirusów H5N1 należących do kladów innych niż ten, z którego pochodził antygen szczepionkowy (Khurana S i wsp. 2011a, 2011b). Badania porównawcze antysurowic wyindukowanych przez szczepienie oligomerycznym (1-320 aa) i monomerycznym (28-320 aa) białkiem HA wirusa H5N1 wykazały, że indukcja wysokiego miana przeciwciał neutralizujących o szerokim zakresie reakcji krzyżowych związana jest z oligomeryzacją antygenu szczepionkowego (Khurana S i wsp. 2011b). Znaczenie oligomeryzacji białek HA dla jakości odpowiedzi odpornościowej potwierdziły badania immunizacyjne przeprowadzone przy użyciu oligomerycznej i monomerycznej frakcji białka 1-320 aa HA H5 (Verma S i wsp. 2012).
Zdolność blokowania fuzji błon, która koreluje z aktywnością neutralizującą pseudo lentiwirusowych cząstek HA, wykazały surowice królików zaszczepionych białkiem HA (1-340 aa) wirusa H5N1 (Shen S i wsp. 2008). Badania immunizacyjne myszy przy użyciu fragmentu podjednostki HA-1 (91-261 aa) wirusa H3N2, wykazały zdolność szczepionki do indukcji przeciwciał klasy IgG w surowicy przy podaniu parenteralnym, ale także przeciwciał klasy IgG w surowicy i klasy IgA w płucach przy podaniu donosowym (Jeon SH i Amon R. 2002). Wyindukowane przeciwciała rozpoznawały HA w nienaruszonych cząstkach wirusów H3N2, H1N1 i H2N2. Szczepienia myszy białkiem HA (91-261 aa) wykazały, że białko indukuje zarówno odpowiedź humoralną jak i komórkową przeciwko wirusowi grypy.
Ostatecznym kryterium oceny skuteczności szczepień z użyciem oczyszczonych i renaturowanych białek HA opartych na podjednostce HA-1 z bakteryjnego systemu ekspresji są wyniki badań zakażenia zaszczepionych zwierząt wirusami grypy w warunkach eksperymentalnych (ang. challenge). Zdolność szczepionek do indukowania odporności przeciw wirusom grypy H1N1pdm09 była oceniana w badaniach na modelu fretek (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010, Khurana S i wsp. 2010b, Skibinski DA i wsp. 2013) lub myszy (Xuan C i wsp. 2011, Skibinski DA i wsp. 2013) z użyciem wirusów homologicznych z antygenem szczepionkowym do zakażenia zwierząt. Wykazano, że szczepienie parenteralne zwierząt białkami HA: 1-330 aa (Khurana S i wsp. 2010b), 57-264 aa (Xuan C i wsp. 2011), 63-286 (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010) oraz gH1pdm09-Q3-VLPs (Skibinski DA i wsp. 2013) wywołuje odporność ochronną przeciwko infekcji wirusem grypy. Ochronne działanie szczepień manifestowało się tym, że zwierzęta po zakażeniu nie chorowały na grypę albo przebieg choroby był łagodniejszy niż u zwierząt nie zaszczepionych. Skuteczność immunizacji przy użyciu białek fuzyjnych STF2:H1pdm09 badano w letalnym doświadczeniu challenge stosując wirus infekcyjny H1N1 pdm09 adaptowany do myszy (Liu G i wsp. 2011). Wszystkie testowane formaty białek fuzyjnych w dawkach 3 μg i 0.3 μg zapewniały ochronę zwierząt przed zakażeniem. Stosując dawki 0.03 μg wykazano, że że względna skuteczność trzech formatów szczepionki jest następująca: R3.2xH1 > R3 > C-końcowy. W niektórych doświadczeniach typu challenge wykazano, że szczepienie powoduje znaczną redukcję poziomu wirusa infekcyjnego w drogach oddechowych zwierząt (Liu G i wsp. 2011, Khurana S i wsp. 2010b, Skibinski DA i wsp. 2013).
PL 235 555 B1
Podobnie jak szczepionki przeciwko grypie H1N1pdm09, białka HA oparte na podjednostce HA-1 HPAIV H5N1, otrzymane w bakteryjnym systemie ekspresji, były badane pod względem skuteczności w doświadczeniach typu challenge. Wykazano, że białko HA H5 (1-320 aa), które jest prawidłowo zwinięte i zawiera funkcjonalne oligomery, w przeciwieństwie do monomerycznej frakcji białka 1-320 aa i monomerycznego białka 28-320 aa, użyte do immunizacji parenteralnej, wywołuje ochronną odpowiedź odpornościową u fretek przeciwko HPAIV H5N1 (Khurana S i wsp. 2011b, Verma S i wsp. 2012). Po zakażeniu wirusem homologicznym przeżywalność zwierząt zaszczepionych antygenem o znacznym udziale oligomerów lub wyłącznie oligomerycznym wynosiła 100% a po zakażeniu wirusem heterologicznym, odpowiednio: 80% i 100%. U fretek, które przeżyły zakażenie eksperymentalne stwierdzono również obniżony poziom wirusa infekcyjnego w górnych drogach oddechowych. Badania zdolności białek STF2:H5 do indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej wykazały, że szczepienie białkami w formatach: C-końcowym, R3, R3.2xH5 skutecznie chroni zwierzęta przed zakażeniem homologicznymi wirusami H5N1 w przeciwieństwie do immunizacji białkiem fuzyjnym w formacie R0 (Liu G i wsp. 2012, Song L i wsp. 2009). Wykazano ponadto, że wysokiej przeżywalności zaszczepionych zwierząt towarzyszy obniżony poziom wirusa w tkankach i że najlepszym antygenem szczepionkowym jest białko STF2:H5 w formacie R3.2xHA, skutecznie chroniące zwierzęta przed zakażeniem nawet w dawkach sub-mikrogramowych.
Szczepionki oparte na podjednostce HA-1 HA H3 i H1, wyprodukowane w bakteryjnym systemie ekspresji testowano w doświadczeniach typu challenge przy użyciu wirusów infekcyjnych, odpowiednio: H3N2 i H1N1. W eksperymentalnym zakażeniu wirusem H3N2, wykazano, że donosowe podanie białka HA (91-261 aa) indukuje 80% ochronę myszy przeciwko infekcji, mierzoną ilością zwierząt, u których wykryto wirusy użyte do zakażenia w płucach (Jeon SH i Amon R 2002). Prototypowa szczepionka przeciwko grypie - STF2:H 1_PR8 (62-284 aa) w konfiguracji C-końcowej, podana parenteralnie, całkowicie chroniła myszy przed letalnym zakażeniem wirusem grypy H1N1/PR8 adaptowanym dla myszy (Song L i wsp. 2008). Badania typu challenge szczepionek zawierających białka gH typu A i B oparte na sekwencji HA H1 wirusa H1N1/PR8 wykazały, że białka te w pełni chronią myszy przed letalnym zakażeniem wirusami grypy dopiero po związaniu z QB-VLPs (Jegerlehner A i wsp. 2013). Ponadto wykazano, że szczepionki wykorzystujące QB-VLPs jako nośnik białek gH wirusów H1N1/PR8 i H1N1pdm09 zapewniają szeroki zakres odporności krzyżowej w obrębie serotypu i są skuteczne nawet w dawkach sub-mikrogramowych.
Białka oparte na podjednostce HA-2
Metodą nadekspresji w bakteriach E. coli, wyprodukowano fragment ektodomeny podjednostki HA-2 (347-522 aa wg numeracji dla HA pełnej długości) wirusa grypy H5N1 i oczyszczono przez elektroelucję po denaturującej elektroforezie w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE), otrzymując białko przynajmniej częściowo zdenaturowane (Shen S i wsp. 2008). Surowice królików, zaszczepionych białkiem HA-2, nie rozpoznawały HA eksprymowanej na powierzchni komórek ssaczych, nie blokowały fuzji błon ani nie neutralizowały pseudo lentiwirusowych cząstek HA in vitro, podczas gdy surowice zwierząt immunizowanych białkiem HA-1 (1-340 aa), oczyszczonym w ten sam sposób co białko HA-2, wiązały się z natywną HA i wykazywały obie aktywności.
Koncepcja użycia jako antygenów szczepionkowych białek zawierających głównie podjednostkę HA-2 realizowana jest przez wytwarzanie HA pozbawionej domeny globularnej, w której zachowane są fragmenty podjednostki HA-1, żeby wytworzone białko zachowało konformację prefuzyjną i integralność regionu trzonka (Steel J i wsp. 2010). Białka HA tego typu wyprodukowano w komórkach ssaczych (Sagawa H i wsp. 1996, Steel J i wsp. 2010). W bakteryjnym systemie ekspresji wytworzono immunogeny oparte na domenie trzonka, oznaczone HA6 i H1HA0HA6, różniące się sposobem połączenia fragmentu podjednostki HA-2 z fragmentami podjednostki HA-1 w jeden łańcuch polipeptydowy (Bommakanti G i wsp. 2010, 2012). W obu konstruktach wprowadzono mutacje stabilizujące konformację pre-fuzyjną podjednostki HA-2. Immunogeny oparte na domenie trzonka wyprodukowano w oparciu o sekwencje HA wirusów H3N2, H1N1 i H1N1pdm09, przy czym w niektórych białkach wprowadzono dodatkowe mutacje mostków dwusiarczkowych lub mutacje związane z sekwencją. W badaniach biofizycznych oraz w testach antygenowości potwierdzono pożądaną pre-fuzyjną konformację immunogenów. W przeciwieństwie do białka typu HA0HA6 tworzącego przypadkowe agregaty, białka typu H1HA6 występowały w większości w postaci trimerów. W konwencjonalnych testach nie stwierdzono aktywności neutralizacyjnej antysurowic uzyskanych przy użyciu immunogenów opartych na domenie trzonka. Natomiast w testach wiązania z rHA wirusów heterologicznych oraz w ekspery
PL 235 555 B1 mentach kompetycyjnych z przeciwciałami monoklonalnymi o szerokiej aktywności neutralizującej wykazano zdolność białek do indukcji przeciwciał o reaktywności krzyżowej. Szczepienia immunogenami typu H6 i/lub H1HA0HA o sekwencji pochodzącej z HA różnych szczepów wirusów H1N1, H1N1pdm09 i H3N2 zapewniały pełną ochronę myszy przed zakażeniem wirusami homologicznymi, wysoką przeżywalność (80-90%) zwierząt po zakażeniu wirusami heterologicznymi, natomiast nie zapewniały odporności heteroserotypowej.
Białka oparte na ektodomenie HA
W bakteryjnym systemie ekspresji otrzymano pełnej długości ektodomenę HA H5 HPAIV H5N1 bez sekwencji sygnałowej, zachowując aminokwasy zasadowe miejsca cięcia (Biesova Z i wsp. 2009). Otrzymane białko o masie ~60 kDa było rozpoznawane przez przeciwciała antysurowic fretek przeciwko homologicznemu wirusowi H5N1 w Western blot. Badania immunizacyjne myszy wykazały immunnogenność otrzymanego białka oraz aktywność HI wyindukowanych przeciwciał na poziomie spełniającym wytyczne FDA dla szczepionek przeciwko epidemicznej i pandemicznej grypie. W bakteryjnym systemie ekspresji otrzymano również fragment ektodomeny HA H1 wirusa grypy H1N1pdm09, eksprymowany z sekwencją sygnałową (Khurana S i wsp. 2010b). Oczyszczone i renaturowane białko (1-480 aa), zawierające prawidłowo zwinięte monomery, nie wykazywało funkcji oligomerycznej HA (wiązanie fetuiny, aglutynacja erytrocytów). Prawidłową konformację otrzymanego fragmentu ektodomeny HA, wykazaną przy użyciu spektroskopii dichroizmu kołowego, a jednocześnie obecność istotnych konformacyjnych epitopów neutralizujących potwierdziły testy wiązania antysurowic przeciwko wirusowi H1N1 i adsorpcji aktywności neutralizującej z tych surowic. Badania immunizacyjne królików i fretek przy użyciu HA (1-480 aa) wykazały, że białko jest silnie immunogenne a wyidukowane przeciwciała neutralizują homologiczny wirus in vitro i hamują jego aktywność hemaglutynacyjną. W doświadczeniu typu challenge zaobserwowano, że szczepienie HA (1-480 aa) wywołuje u fretek odporność ochronną przeciwko infekcji homologicznym wirusem grypy, przejawiającą się tym, że zwierzęta wykazywały objawy choroby znacznie łagodniejsze (przejściowy wzrost temperatury bez utraty wagi) niż zwierzęta nie zaszczepione.
W szczepie LMG E. coli wyprodukowano białko HA H5 HPAIV H5N1, o masie cząsteczkowej ~63 kDa (Horthongkham N i wsp. 2007). Myszy immunizowane oczyszczoną rH5 odpowiedziały produkcją przeciwciał, które rozpoznawały antygen użyty do szczepień i neutralizowały heterologiczny wirus H5N1 in vitro. W szczepie E. coli BL21(DE3) wytworzono białko HA H5 HPAIV H5N1, ulegające ekspresji jako rozpuszczalne białko fuzyjne z chaperonem msyB o masie cząsteczkowej ~97 kDA (Xie QM i wsp. 2009). Otrzymane białko msyB:HA było rozpoznawane w analizie Western blot przez H5N1-pozytywne surowice kurcząt. Przeciwciała monoklonalne, uzyskane przy użyciu białka msyB:HA do immunizacji myszy, z dużą czułością wykrywały AIV, co wskazuje na zachowanie epitopów natywnej HA w rekombinowanym białku. Szczepienie kurcząt wysokimi dawkami białka msyB:HA indukowało u zwierząt wytwarzanie przeciwciał HI, jak również zapewniało ochronę przed zakażeniem HPAIV H5N1 w warunkach eksperymentalnych (przeżywalność - 100%, umiarkowane objawy chorobowe).
Oczyszczanie i renaturacja HA
Głównym wyzwaniem w pracach nad otrzymaniem HA w bakteryjnym systemie ekspresji jest sposób przeprowadzenia renaturacji, który zapewniałby otrzymanie antygenu przypominającego HA wirusową, mimo tego, że HA może być wydajnie produkowana w komórkach bakterii jako białko nieglikozylowane, dodatkowo pozbawione regionów uczestniczących w tworzeniu struktur wyższych rzędów białka podczas namnażania wirusa. Dążenie do zachowania natywnej struktury HA antygenu szczepionkowego jest uzasadnione tym, że większość epitopów neutralizujących stanowią konformacyjne miejsca antygenowe (Wiley DC i wsp. 1981). Opublikowane wyniki badań białek HA, uzyskanych w eukariotycznym systemie ekspresji wskazują, że stan oligomeryzacji białka, oprócz właściwej konformacji monomeru HA, ma istotny wpływ na poziom i jakość odpowiedzi odpornościowej. W przeciwieństwie do monomerów, trimery i oligomery rHA wirusa H5N1 z ssaczego i bakulowirusowego systemu ekspresji były skuteczne w indukcji wysokiego poziomu przeciwciał neutralizujących u myszy (Wei CJ i wsp. 2008). Wykazano ponadto, że białko HA wirusa H3N2, wyprodukowane w bakulowirusowym systemie ekspresji z modyfikacją stabilizującą trimery, ma znamiennie większą zdolność do indukcji przeciwciał specyficznych wobec wirusa i przeciwciał H1 u myszy w porównaniu z niezmodyfikowaną formą białka, co koreluje ze zwiększoną odpornością na zakażenie homologicznym wirusem grypy w warunkach eksperymentalnych (Weldon WC i wsp. 2010). Prawdopodobnie monomeryczna
PL 235 555 B1 forma antygenu jest słabiej immunogenna niż formy trimer/oligomer tego samego białka (Wei CJ i wsp. 2008), ale też stan oligomeryzacji może mieć wpływ na repertuar wyindukowanych przeciwciał (Wei CJ i wsp. 2008, Weldon WC i wsp. 2010, Wilson IA i Cox NJ 1990). W celu uzyskania rozpuszczalnej HA tworzącej stabilne struktury oligomeryczne, białka stanowiące ektodomenę antygenu, produkowane w komórkach ssaczych lub owadzich, eksprymowane są łącznie z celowo dodanymi obcymi sekwencjami trimeryzującymi (Bosch BJ i wsp. 2009, Loeffen WL i wsp. 2011, Wei CJ i wsp. 2008, Weldon WC i wsp. 2010).
Większość opisanych powyżej białek HA: podjednostka HA-1 i jej fragmenty, fragment ektodomeny i ektodomena pełnej długości ulegały ekspresji w bakteriach E. coli w ciałkach inkluzyjnych jako białka nierozpuszczalne ze znacznikiem affmitywnym, zwykle 6xHis, wyjątkowo z innym znacznikiem np. GST (Shen S i wsp. 2008) lub bez znacznika affinitywnego (Liu G i wsp. 2011,2012, Song L i wsp. 2008, 2009, Xuan C i wsp. 2011). Białka STF2:HA ulegały ekspresji jako białka rozpuszczalne i/lub nierozpuszczalne (Liu G i wsp. 2011,2012, Song L i wsp. 2008, 2009). Przez dołączenie na N-końcu, oprócz znacznika affinitywnego (6xHis), sekwencji sygnałowej dla ekspresji peryplazmatycznej, otrzymano również fragment podjednostki HA-1 ulegający ekspresji w formie rozpuszczalnej (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010). Wydajność otrzymywania tego białka była jednak 2 rzędy wielkości niższa niż jego renaturowanego odpowiednika eksprymowanego w ciałkach inkluzyjnych. Białko HA 63 kDa (Horthongkham N i wsp. 2007) i białko fuzyjne msyB:HA 97 kDA (Xie QM i wsp. 2009) ulegały ekspresji w bakteriach E. coli z ogonem histydynowym jako białko rozpuszczalne. Renaturację białek HA zawartych w ciałkach inkluzyjnych, po ich rozpuszczeniu w standardowych buforach denaturujących, przeprowadzono przez powolne lub szybkie rozcieńczenie albo na kolumnie ze złożem dla chromatografii metalo-powinowactwa. Dla zapewnienia efektywnej renaturacji białek HA, w niektórych procedurach renaturacji zastosowano L-argininę lub L-argininę oraz utleniony i zredukowany glutation. Białka fuzyjne z ogonem histydynowym były oczyszczane przez chromatografię metalopowinowactwa. Białka eskprymowane bez znacznika affinitywnego oczyszczano z zastosowaniem standardowych procedur chromatograficznych (Liu G i wsp. 2011, 2012, Song L i wsp. 2008, 2009, Xuan C i wsp. 2011). Proces, który wykorzystuje bakterie E. coli do produkcji szczepionki zawierającej domenę globularną hemaglutyniny H1 wirusa grypy H1N1pdm09, przedstawili w ostatniej publikacji Sanchez-Arreola P i wsp. (2013).
Podsumowując, celem dotychczasowych prac nad otrzymaniem antygenu HA w bakteryjnym systemie ekspresji były przede wszystkim białka eksprymowane w ciałkach inkluzyjnych, w tym szczególnie te, które zawierają podjednostkę HA-1 lub jej fragmenty i przeznaczone są do produkcji szczepionki serotypowo-specyficznej (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010, Chiu FF i wsp. 2009, DuBois RM i wsp. 2011, Jegerlehner A i wsp. 2013, Jeon SH i Arnon R2002, Khurana S i wsp. 2010b, 2011a, 2011b, Liu G i wsp. 2011, 2012, Sanchez-Arreola P i wsp. 2013, Shen S i wsp. 2008, Skibinski DA i wsp.2013, Song L i wsp. 2008, 2009, Verma S i wsp. 2012, Xuan C i wsp. 2011). W ten sposób otrzymano białka HA serotypów: H1, H3, H5, H7 pandemicznych, sezonowych albo prototypowych wirusów grypy typu A. Dla większości białek opartych na podjednostce HA-1 HA udokumentowano konformacyjną integralność przy użyciu metod spektroskopowych i/lub testów reaktywności z przeciwciałami o właściwościach neutralizujących. Zdolność wytworzonych białek do indukcji funkcjonalnych przeciwciał przeciwko HA wykazano w testach zahamowania hemaglutynacji i neutralizacji wirusów grypy in vitro a w doświadczeniach typu challenge do wywołania ochronnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko grypie. Tę grupę białek reprezentują testowane w badaniach klinicznych szczepionki przeciwko grypie oparte na opatentowanych technologiach: TLR (Vaxlnnate) i Q 3-VLPs (Cytos Biotechnology).
Innym dobrze scharakteryzowanym białkiem HA, wytworzonym w bakteriach jest fragment ektodomeny HA eksprymowany z sekwencją sygnałową (Khurana S i wsp. 2010b). Dla białka 1-480 aa wykazano prawidłowość konformacji, obecność istotnych konformacyjnych epitopów neutralizujących, zdolność indukcji przeciwciał neutralizujących homologiczny wirus grypy in vitro i hamujących jego aktywność hemaglutynacyjną, która koreluje z ochroną przed grypą w warunkach zakażenia eksperymentalnego. Właściwości pełnej długości ektodomeny HA syntetyzowanej bez sekwencji sygnałowej nie zostały w pełni udokumentowane (Biesova Z i wsp. 2009). Zdolność białka do indukcji przeciwciał HI została wykazana, natomiast nie potwierdzono jego potencjału do indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej przez zbadanie zachorowalności i przeżywalności zaszczepionych zwierząt po infekcji wirusami grypy. Spośród białek HA eksprymowanych w ba kteriach w formie rozpuszczalnej (Horthongkham N i wsp. 2007, Xie QM i wsp. 2009), zdolność zapewnie
PL 235 555 B1 nia ochronnej odpowiedzi odpornościowej w doświadczeniu challenge wykazano jedynie dla białka fuzyjnego z chaperonem msyB (Xie QM i wsp. 2009).
Doświadczenia z ekspresją HA w komórkach bakterii udowodniły, że białka HA różnej długości eksprymowane w komórkach bakterii jako białka rozpuszczalne lub w postaci ciałek inkluzyjnych mogą być wartościowymi immunogenami. Białka rHA-E. coli mogą przyjmować prawidłową konformację, mimo że nie są glikozylowane i nawet wtedy, gdy nie zawierają regionów uczestniczących w tworzeniu natywnej struktury białka w warunkach infekcji wirusowej, takich jak regiony hydrofobowe: sekwencja sygnałowa i/lub domena transbłonowa. W przypadku antygenów z dominującą domeną globularną, wykazano znaczenie długości fragmentów peptydów sąsiadujących z domeną globularną dla jej prawidłowego zwijania (Jegerlehner A i wsp. 2013, Song L i wsp. 2008, Xuan C i wsp. 2011). Białka rHA-E. coli mogą również tworzyć funkcjonalne oligomery, co ma istotne znaczenie dla indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej i zostało wykazane w badaniach rHA zarówno z eukariotycznego (Wei CJ i wsp. 2008, Weldon WC i wsp. 2010) jak i prokariotycznego systemu ekspresji (Khurana S i wsp. 2011b, Verma S i wsp. 2012).
Spośród białek HA produkowanych w komórkach bakterii, także tych, dla których wykazano prawidłowość struktury III rzędu, tworzenie funkcjonalnych oligomerów udokumentowano jedynie dla określonych fragmentów podjednostki HA-1 ulegających ekspresji z sekwencją sygnałową (Khurana S i wsp. 2010b, 2011a, 2011b, Verma S i wsp. 2012). Oligomery natywnej HA indukują wysoki poziom przeciwciał neutralizujących przez obecność epitopów zależnych od trimeru (Wilson IA, Cox NJ 1990) i przypuszczalnie także przez ograniczenie dostępności niektórych epitopów takich jak te występujące na powierzchniach granicznych między monomerami (Wei CJ i wsp. 2008, Weldon WC i wsp. 2010). Fragmenty podjednostki HA-1 HA eksprymowane bez sekwencji sygnałowej (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010, DuBois RM i wsp. 2011, Jegerlehner A i wsp. 2013, Liu G i wsp. 2011, 2012, Skibinski DA i wsp.2013, Song L i wsp. 2008, 2009, Xuan C i wsp. 2011), jak również syntetyzowany z sekwencją sygnałową fragment ektodomeny białka: 1-480 aa (Khurana S i wsp. 2010b) występowały w formie monomerów. Zdolność oligomeryzacji innych fragmentów HA, otrzymanych w bakteriach, nie była badana. Zmianę sposobu prezentacji białek opartych na domenie globularnej HA uzyskano przez tworzenie dimerów HA (dHA63-286) z udziałem łącznika peptydowego (Sanchez-Arreola P i wsp. 2013) lub przez użycie Q3-VLPs jako nośnik antygenu (Jegerlehner A i wsp. 2013, Skibinski DA i wsp. 2013). Wyniki badań immunogenności dHA63-286 nie zostały jeszcze opublikowane. Korzystny wpływ związania białek gH z Q3-VLPs na jakość odpowiedzi odpornościowej został dobrze udokumentowany.
Prace nad otrzymaniem białek HA w ciałkach inkluzyjnych bakterii, dowodzą, że podstawowym warunkiem uzyskania antygenu o prawidłowej konformacji, zdolnego do tworzenia struktur oligomerycznyeh jest określenie fragmentu białka przeznaczonego do ekspresji, oczyszczania i renaturacji. Precyzyjne wyznaczenie sekwencji HA do produkcji antygenu szczepionkowego, szczególnie w wypadku użycia krótkich fragmentów białka, wymaga często przeprowadzenia krystalograficznych badań HA i analizy jej struktury in silico. Analizy tego typu wykonano w trakcie realizacji projektów, w których domena globularna stanowiła dominujący fragment HA w szczepionce (Aguilar-Yanez JM i wsp. 2010, DuBois RM i wsp. 2011, Jegerlehner A i wsp. 2013, Song L i wsp. 2008, Xuan C i wsp. 2011). Istotnym warunkiem otrzymania wartościowego antygenu jest również opracowanie efektywnej metody renaturacji, co wykazano jednoznacznie w badaniach porównawczych antygenu renaturowanego z zastosowaniem różnych procedur (Chiu FF i wsp. 2009). Większość białek HA otrzymanych metodą nadekspresji w komórkach bakterii eksprymowano ze znacznikiem affmitywnym i oczyszczano przez chromatografie metalo-powinowactwa, co stwarza problem jakości produktu końcowego związany z obecnością nawet śladowych ilości metali.
Pomimo intensywnych badań zmierzających do otrzymania podjednostkowych szczepionek przeciwko grypie, opartych na użyciu HA produkowanej metodami inżynierii genetycznej, nadal istnieje zapotrzebowanie na skuteczny antygen szczepionkowy jak również technologię, która umożliwiłaby wydajną produkcję antygenu szczepionkowego w stosunkowo krótkim czasie i stanowiłaby alternatywę wobec długotrwałej procedury wytwarzania szczepionek konwencjonalnych.
Dostępność takiej technologii ma szczególnie duże znaczenie w przypadku wystąpienia zagrożenia pandemią grypy. Nadal aktualnym problemem epidemiologicznym jest HPAIV H5N1 wykazujący potencjał pandemiczny - istnieje zagrożenie, że wirus nabędzie zdolność bezpośredniej transmisji pomiędzy ludźmi. Pojawiające się ogniska choroby wśród ptaków, przyjmujące często rozmiar epizoocji, powodują dużą śmiertelność zwierząt i zmuszają do wybijania ptactwa domowego, co przynosi duże straty w prze
PL 235 555 B1 myśle drobiarskim. Ponadto istnieje ciągłe ryzyko reasortacji krążących wirusów Al z wirusami ssaków prowadzącej do powstania nowych szczepów wirusa zagrażających zdrowiu ludzi i zwierząt.
Celem wynalazku jest zatem dostarczenie rozwiązania wychodzącego naprzeciw zapotrzebowaniu na tanią, bezpieczną szczepionkę przeciwko grypie, produkowaną szybko i wydajnie zwłaszcza w obliczu zagrożenia pandemią lub zoonozą, wykorzystując sprawdzony w produkcji biofarmaceutyków potencjał bakteryjnego systemu ekspresji do wytwarzania antygenu szczepionkowego.
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA) wirusa grypy H5N1 składający się z podjednostki HA-1 obejmującej aa 17-340 oraz fragmentu podjednostki HA-2 obejmującego aa 347-522, przy czym polipeptyd został otrzymany metodą nadekspresji w komórkach prokariotycznych, zwłaszcza komórkach bakteryjnych jak E. coli, w postaci ciałek inkluzyjnych.
Korzystnie, wirusem grypy jest HPAIV H5N1.
Korzystnie, wirusem grypy jest szczep HPAIV H5N1 A/swan/Poland/305-135V08/2006 (EpiFlu Database Nr dostępu EPI156789).
Korzystnie, polipeptyd stanowi sekwencja HA szczepu HPAIV H5N1 A/swan/Poland/305-135V08/2006 (EpiFlu Database Nr dostpu EPI156789).
Korzystnie, polipeptyd posiada sekwencję aminokwasową SEKW NR ID 2.
Korzystnie, polipeptyd wytwarzany jest w prokariotycznym systemie ekspresji.
Korzystnie, polipeptyd wytwarzany jest w E. coli.
Korzystnie, polipeptyd eksprymowany jest w postaci ciałek inkluzyjnych.
Kolejnym przykładem wynalazku jest kompozycja zawierająca nośnik i skuteczną do wywołania odpowiedzi immunologicznej i/lub leczenia zakażenia wirusem grypy ilość rzeczonego polipeptydu.
Korzystnie, nośnikiem jest adiuwant stymulujący odpowiedź humoralną i/lub komórkową wybrany z grupy obejmującej sole mineralne, emulsje olejowe, produkty mykobakterii, saponiny, produkty syntetyczne i cytokiny.
Korzystnie, adiuwantem jest wodorotlenek glinu, sole chitosanu jak glutaminian chitosanu, MF59, AS03 lub ISCOMATRIX.
Korzystnie, kompozycja podawana jest podskórnie, śródskórnie, domięśniowo albo dośluzówkowo, w tym donosowo, przez układ pokarmowy a w przypadku immunizacji ptaków także dospojówkowo, donosowo-dospojówkowo, in ovo.
Innym przedmiotem wynalazku jest określona powyżej kompozycja do zastosowania do profilaktycznych szczepień ludzi lub do immunizacji ptaków przeciwko wirusowi grypy, zwłaszcza niosek stad towarowych oraz stad rodzicielskich niosek i brojlerów.
Korzystnie, wirusem grypy jest szczep wirusa ptasiej grypy HPAIV H5N1.
Innym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało wiążące się specyficznie z określonym powyżej polipeptydem.
Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania określonego powyżej polipeptydu, w którym
a) wyznacza się sekwencję rzeczonego polipeptydu w naturalnie występującym białku hemaglutyniny (HA) H5 wirusa grypy;
b) transformuje się komórki prokariotyczne wektorem ekspresyjnym zawierającym kwas nukleinowy kodujący rzeczony polipeptyd;
c) hoduje się transformowane komórki prokariotyczne produkujące rzeczony polipeptyd w postaci ciałek inkluzyjnych;
d) izoluje się i rozpuszcza powstałe ciałka inkluzyjne;
e) renaturuje się i oczyszcza wyprodukowany polipeptyd.
Korzystnie, wirusem grypy jest HPAIV H5N1.
Korzystnie, komórkami prokariotycznymi są komórki bakteryjne, zwłaszcza E. coli.
Korzystnie, wyizolowane ciałka inkluzyjne rozpuszcza się w buforze DRCI (50 mM TrisHCl, pH 8,0; 8 M mocznik; 10 mM beta-merkaptoetanol; 0,01% Triton X-100).
Korzystnie, roztwór polipeptydu uzyskany w wyniku rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych oczyszcza się na kolumnie ze złożem DEAE Sepharose Fast Flow.
Korzystnie, polipeptyd renaturuje się metodą rozcieńczeń w buforze BR (40 mM TrisHCl pH 8,0; 100 mM NaCl).
Korzystnie, polipeptyd po renaturacji oczyszcza się na kolumnie ze złożem Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub.
PL 235 555 B1
Białko hemaglutyniny (HA) wirusów grypy (IV) wg wynalazku jest częścią naturalnie występujących hemaglutynin różnych serotypów i wariantów antygenowych i stanowi fragment ektodomeny białka zawierający sekwencje tworzące w natywnym białku epitopy dla przeciwciał neutralizujących działających przez dwa różne mechanizmy hamowania infekcji, opisane dla IV.
W przykładowym rozwiązaniu białkiem HA według wynalazku jest HA H5 HPAIV H5N1. Nie nakłada to jednak ograniczeń na serotyp i szczep wirusa, przeciwko któremu może być skierowana szczepionka zawierająca białko HA według wynalazku. Białko według wynalazku może być wydzielone ze wszystkich serotypów i wariantów antygenowych HA albo łączyć fragmenty HA różnych seroptypów lub wariantów antygenowych jako np. sekwencja consensus.
Obecność podjednostki HA-1 i fragmentu podjednostki HA-2 w białku HA według wynalazku, powoduje, że antygen zawiera sekwencje tworzące w natywnym białku epitopy dla przeciwciał neutralizujących, które działają przez dwa mechanizmy hamowania infekcji, opisane dla wirusów grypy: blokowanie wiązania wirusów grypy do komórek gospodarza (HA-1) i hamowanie fuzji otoczki lipidowej wirusa z błoną endosomu komórek gospodarza (HA-2), a przez to wejście patogenów do komórek gospodarza. Pozostawienie w białku HA, według wynalazku, długiego fragmentu podjednostki HA-2, która uczestniczy w powstawaniu struktur oligomerycznych podczas biosyntezy wirusowej HA, tworzy korzystne warunki dla optymalnej renaturacji białka.
Białko HA według wynalazku ma cechy wyróżniające je spośród innych białek produkowanych w bakteriach - sekwencja HA przeznaczona do ekspresji powstała przez usunięcie obojętnych immunologicznie regionów białka: sekwencji sygnałowej, domeny transbłonowej i domeny cytoplazmatycznej oraz C-końcowego fragmentu ektodomeny białka za miejscem cięcia dla bromelainy a w przypadku wysokopatogennych (HP) szczepów IV (HA HPAIV) także aminokwasów zasadowych z miejsca cięcia między podjednostkami HA-1 i HA-2 białka.
Usunięcie hydrofobowych regionów HA: peptydu sygnałowego oraz domeny transbłonowej umożliwia wydajną ekspresję HA w komórkach bakterii i jest dodatkowo uzasadnione tym, że peptyd sygnałowy nie występuje w dojrzałym białku HA a usunięte fragmenty nie mają istotnego znaczenia dla antygenowości i immunogenności białka. Ponieważ białko nie zawiera większości sekwencji hydrofobowych natywnej HA, dobrze rozpuszcza się w roztworach wodnych i może ulegać wydajnej ekspresji w komórkach prokatiotycznych.
Białko HA szczepów HPAIV nie zawiera sekwencji bogatej w aminokwasy zasadowe: lizynę (L) i argininę (K), podatnej na trawienie przez enzymy proteolityczne z grupy trypsyn i subtylizyn, co zapobiega jego przecięciu i rozpadowi na podjednostki w procesie wytwarzania.
Białko HA wirusów grypy, w szczególnej realizacji wynalazku, jest białkiem HA H5 HPAIV H5N1, uzyskanym metodą nadekspresji w bakteriach E. coli w postaci ciałek inkluzyjnych, i stanowi rozpuszczalny w roztworach wodnych fragment ektodomeny HA H5 (17-522 aa) pozbawiony miejsca cięcia podatnego na trawienie przez enzymy proteolityczne (ARRRKKR). Białko HA H5 (17-522 aa) zasadniczo odpowiada cząsteczkom HA uwalnianym z wirusów grypy przy użyciu bromelainy - BHA (ang. bromelain-released hemagglutinin).
Białko HA H5 HPAIV H5N1, otrzymano w oparciu o sekwencję polskiego izolatu wirusa: A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) (EpiFluDatabase Accession No. EPI156789). Identyfikację regionów białka izolatu polskiego AIV przeprowadzono przez porównanie jego sekwencji aminokwasowej z sekwencją HA szczepu A/Hong Kong/156/97(H5N1) (GenBank Accession No. AAC32088). Poszczególne regiony HA HPAIV A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) tworzone są przez następujące sekwencje aminokwasowe:
region sygnałowy - 1..16 aa;
podjednostka HA-1 - 17..345;
podjednostka HA-2 - 347..568;
domena transbłonowa - 532..552;
domena cytoplazmatyczna - 553..568;
miejsce cięcia przez proteazy z grupy trypsyn i subtylizyn, bogate w aminokwasy zasadowe - QGERRRKKRG - 338-347 aa;
miejsce trawienia przez bromelainę - G-521..V-522.
W przypadku HA H5 polskiego izolatu HPAIV, cząsteczka BHA tworzona jest przez aminokwasy 17-521 aa HA wirusowej. Izolowane cząsteczki BHA stanowią nieinfekcyjny immunogen zdolny do indukcji odpowiedzi odpornościowej nadal wykorzystywany do wytwarzania antysurowic referencyjnych w celu ich wykorzystania w teście immunodyfuzji radialnej (SRID) do oznaczania mocy szcze
PL 235 555 B1 pionek przeciwko grypie (Khurana S i wsp. 2011a). Wyznaczenie sekwencj i białka HA, według wynalazku, dla różnych wariantów i serotypów białka wirusów grypy typu A do produkcji antygenu szczepionkowego wymaga identyfikacji miejsca odcinania HA z cząstek wirusowych przez bromelainę a badania krystalograficzne białek i analizy ich struktury in silico nie są konieczne.
Sekwencje odpowiadające strukturalnie sekwencji aminokwasowej wybranego polipeptydu HA zawierają homologiczne struktury wyższych rzędów białka i w konsekwencji charakterystyczne dla białka HA regiony o określonych właściwościach i funkcjach. Sekwencje odpowiadające strukturalnie niekoniecznie odpowiadają liniowej sekwencji aminokwasowej, stąd numeracje aminokwasów odpowiadających sobie strukturalnie fragmentów białka mogą się różnić.
Przykładowo, sekwencja aminokwasowa odpowiadająca strukturalnie sekwencji 17-522 aa HA szczepu H5N1 wirusa ptasiej grypy (AIV) A/swan/Poland/305-135V08/2006 składa się z podjednostki HA-1, która tworzy domenę globularną HA wirusowej z miej scem wiązania białka z receptorami komórek gospodarza i uczestniczy w tworzeniu domeny trzonka natywnej HA, oraz fragmentu podjednostki HA-2 z peptydem fuzyjnym na N-końcu, tworzącej domenę trzonka natywnej HA, przy czym polipeptyd pozbawiony jest sekwencji obecnych w prekursorowej (HAO) i/lub dojrzałej formie HA wirusowej: peptydu sygnałowego na N-końcu oraz C-końcowego regionu białka za miejscem cięcia dla bromelainy, w którym występują domeny transbłonowa i cytoplazmatyczna.
Białko HA według wynalazku nie było dotychczas wyprodukowane w bakteryjnym systemie ekspresji ani też przebadane i opisane jako skuteczny antygen do szczepień przeciwko grypie, w szczególności przeciwko HPAIV H5N1.
W korzystnych wariantach do produkcji białka według wynalazku stosuje się wektory pIGKesHA17522A, pDBHa17522A, zawierające gen HA17522A kodujący białko HA 17-522 aa, szczepu HPAIV H5N1 A/swan/Poland/305-135V08/2006 (EpiFluDatabase Accession No. EPI156789) z delecją reszt lizyny (K) i argininy (R) z miejsca cięcia (ARRRKKR, Δ341-346 aa), zoptymalizowany dla ekspresji w bakteriach E. coli i zapewniający wysoki poziom ekspresji antygenu. Szczepy bakterii transformowane w/w wektorami to odpowiednio E. coli BL21(DE3) i E. coli Z 0526.
Oczyszczone i zrenaturowane białko HA (17-522 aa, ΔRRRKKR) szczepu HPAIV H5N1, otrzymane metodą nadekspresji w bakteriach E. coli w ciałkach inkluzyjnych - rH5-E. coli wykazuje kluczowe właściwości HA szczepionkowej: zachowuje epitopy neutralizujące rozpoznawane przez przeciwciała specyficzne wobec serotypu H5 HA oraz przeciwciała hamujące hemaglutynację (HI) i występuje, przynajmniej częściowo, w formie oligomerów.
W przeciwieństwie do ektodomeny 1-480 aa występującej w formie monomerów rH5-E. coli tworzy funkcjonalne oligomery w nieobecności obcych sekwencji trimeryzujących prawdopodobnie przy udziale fragmentu podjednostki HA-2. Oligomeryzacja białka HA ma korzystny wpływ na jakość odpowiedzi odpornościowej, ale także powoduje obniżenie poziomu efektywnej dawki antygenu a przez to obniżenie kosztu jednostkowego szczepionki przeciwko grypie.
Otrzymane białko rH5-E. coli indukuje u kurcząt produkcję przeciwciał klasy IgY specyficznych wobec HA H5, przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 (IDVet) oraz hamujących hemaglutynację przez homologiczny HPAIV H5N1 i heterologiczny LPAIV H5N2. Użycie HA jako antygenu szczepionkowego umożliwia wykrycie ptaków zakażonych w populacji ptaków szczepionych przy zastosowaniu różnicujących testów serologicznych, które wykrywają przeciwciała przeciwko białkom AIV innym niż antygen użyty do immunizacji zwierząt. Zapewnienie możliwości odróżnienia zwierząt zakażonych od szczepionych - DIVA (ang. differentiation of infected from vaccinated animals) jest podstawowym warunkiem wykonywania szczepień przeciwko grypie ptaków (Suarez DL 2005).
Szczepionka przeciwko grypie zawiera białko HA według wynalazku, adiuwant lub adiuwanty dopuszczone w immunizacji ludzi i zwierząt odpowiednie do drogi podania, a także inne składniki np. konwencjonalne składniki kompozycji farmaceutycznych.
Szczepionka zawiera hemaglutyninę określonego serotypu i wariantu antygenowego (szczepionka monowalentna) albo hemaglutyniny różnych serotypów lub wariantów antygenowych (szczepionka poliwalentna) albo HA z sekwencją różnych wariantów antygenowych określonego serotypu (szczepionka serotypowo-specyficzna o zwiększonej protekcyjności względem wirusów różnych kladów) albo HA z sekwencją różnych serotypów np. consensus (szczepionka uniwersalna).
Szczepionka może zawierać wymienione białka HA związane fizycznie z peptydami lub polipeptydami, w tym ze znacznikiem, peptydem z miejscem cięcia dla proteaz, sekwencją trimeryzującą, immunomodulatorami, czy innymi antygenami.
PL 235 555 B1
W korzystnej realizacji wynalazku szczepionka przeciwko grypie zawiera białko rH5-E. coli, wodorotlenek glinu jako adiuwant i wywołuje u kurcząt zaszczepionych podskórnie produkcję przeciwciał specyficznych wobec HA H5, w tym przeciwciał funkcjonalnych: aktywnych w teście FLUAc H5 (IDVet) oraz w testach HI z homologicznym HPAIV H5N1 i heterologicznym LPAIV H5N2 oraz zapewnia ochronę przeciwko infekcji wirusami grypy i ogranicza siewstwo wirusów w warunkach zakażenia eksperymentalnego. W korzystnej realizacji wynalazku szczepionka zawiera białko rH5-E. coli oraz PROTASANTM UP G 113 (NovaMatrix/FMC Corp.) jako adiuwant i wykazuje zdolność wzmacniania produkcji przeciwciał specyficznych wobec HA H5 przy podaniu donosowym kurczętom uczulonym przez podskórne podanie rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem, w tym przeciwciał funkcjonalnych: aktywnych w teście FLUAc H5 (IDVet) oraz w teście HI z heterologicznymi LPAIV H5N2.
W sposobie wytwarzania białka HA, według wynalazku, antygen jest eksprymowany w ciałkach inkluzyjnych bakterii transformowanych przy użyciu wektorów ekspresyjnych, w których sekwencja kodująca białko jest zoptymalizowana dla bakteryjnego systemu ekspresji. W sposobie wytwarzania białka HA, według wynalazku, zastosowano bardzo wydajną i efektywną metodę renaturacji bez użycia aminokwasów: L-argininy, zredukowanego i utlenionego glutationu, często stosowanych w buforach do renaturacji bakteryjnej rHA, co obniża koszt produkcji HA szczepionkowej. W przeciwieństwie do większości produkowanych w bakteriach rHA, które oczyszczane są z zastosowaniem chromatografii metalo-powinowactwa, w metodzie wytwarzania białka HA według wynalazku wykorzystywane są standardowe metody chromatograficzne. W związku z tym obecność jonów metali w produkcie końcowym, wytworzonym metodą według wynalazku, nie podlega ocenie a badania jakości mogą być przeprowadzone przy użyciu procedur wypracowanych dla biofarmaceutyków, powszechnie wytwarzanych w bakteryjnym systemie ekspresji.
Istotą wynalazku jest również sposób wywoływania ochronnej odpowiedzi odpornościowej. Sposób wywoływania odpowiedzi odpornościowej obejmuje szczepienia przy użyciu białka HA otrzymanego metodą według wynalazku wykonane przez podanie parenteralne antygenu, w tym podskórnie, śródskórnie, domięśniowo albo dośluzówkowe, w tym donosowo, przez układ pokarmowy a w przypadku immunizacji ptaków także dospojówkowo, donosowo-dospojówkowo, in ovo albo w inny sposób dopuszczony w szczepieniach ptaków; wykonane przy zastosowaniu jednakowych lub różnych dróg podania antygenu szczepionkowego w danym cyklu szczepień; przez podanie antygenu z adiuwantami dopuszczonymi w immunizacji zwierząt i ludzi oraz odpowiednimi do drogi podania; przez błony śluzowe w szczepieniach masowych. Schemat immunizacji ludzi lub określonego gatunku zwierząt przy użyciu białka otrzymanego metodą według wynalazku jest optymalizowany w kierunku zwiększenia skuteczności, zakresu indukowanej odporności krzyżowej oraz obniżenia poziomu efektywnej dawki. Optymalizacja schematu immunizacji obejmuje: poziom i ilość dawek, rodzaj użytego adiuwantu i drogi podania oraz odstęp czasu między dawkami. Sposób wywoływania odpowiedzi odpornościowej indukuje produkcję przeciwciał przeciwko HA, w tym przeciwciał funkcjonalnych, takich jak neutralizujące przeciwciała serotypowo-specyficzne, przeciwciała hamujące hemaglutynację przez wirusy grypy, przeciwciała neutralizujące wirusy grypy in vitro, zapewnia ochronę przed grypą, ogranicza siewstwo i transmisję wirusów do osób lub zwierząt wrażliwych na infekcję IV.
W przykładowych rozwiązaniach sposób wywoływania odpowiedzi odpornościowej obejmuje 2-krotną podskórną immunizację kurcząt typu mięsnego przy użyciu 25 gg białka rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem w odstępie 4 tygodni jako znacznie skuteczniejszą w indukcji przeciwciał klasy IgY specyficznych wobec HA H5, przeciwciał aktywnych w testach HI z homologicznym HPAIV H5N1 i heterologicznym LPAIV H5N2 a w przypadku indukcji przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 (IDVet) jedynie skuteczną w porównaniu do immunizacji w odstępie 2 tygodni.
Dwukrotna podskórna immunizacja kurcząt typu mięsnego przy użyciu 25 gg białka rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem w odstępie 4 tygodni wywołuje produkcję przeciwciał klasy IgY specyficznych wobec HA H5, przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 (IDVet) oraz testach HI z homologicznym HPAIV H5N1 i heterologicznym LPAIV H5N2 (miano > 1:8) odpowiednio u: 100%, 37,5%, 75% i 62,5% zwierząt.
Dwukrotna podskórna immunizacja kurcząt typu nieśnego przy użyciu białka rH5-E. coli w dawkach: 5, 10, 15 i 25 gg z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem w odstępie 4 lub 6 tygodni wywołuje produkcję przeciwciał klasy IgY specyficznych wobec HA H5, przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 (IDVet) oraz w teście H1 z heterologicznym LPAIV H5N2 (miano ochronne > 1:16) odpowiednio u: 100%, 74% ± 16,5 i 85% ± 14 zwierząt.
PL 235 555 B1
Donosowe podanie II dawki szczepionki zawierającej 20 μο rH5-E. coli oraz PROTASANTM UP G 113 (NovaMatrix/FMC Corp.) jako adiuwant 4 tygodnie po podskórnej immunizacji przy użyciu 25 μο rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu wzmacnia produkcję przeciwciał klasy IgY przeciwko HA H5 u 10 z 15 zaszczepionych zwierząt, a u niektórych z nich także funkcjonalnych przeciwciał przeciwko HA H5: aktywnych w teście FLUAc H5 (IDVet) i teście HI z heterologicznym LPAIV H5N2.
Opis figur i tabel
Fig. 1. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową hemaglutyniny wirusa ptasiej grypy A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1)
Fig. 1. 2 przedstawia mapę plazmidu pIGCmT7Kes, gdzie ARG t-RNA - gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG; ORI - origin replikacji; CatAI - gen kodujący acetylotransferazę chloramfenikolu, T7 promotor - Promotor faga T7, Stop Transkrypcji - terminacja transkrypcji z promotora faga T7; Stop+Term+APH- nukleotydowy fragment kasety, gdzie Stop- kodon stop translacji; Term-sekwencja terminatora tryptofanowego; APH-zmodyfikowana sekwencja kodująca 3’-fosfotransferazę aminoglikozydową.
Fig. 1. 3 przedstawia sekwencję kodującaą HA17522, włączoną do pIGCmT7Kes w miejsca powstałe po trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ndel i XhoI. Pogrubioną czcionką oznaczono zmienione kodony, podkreśleniem oznaczono sekwencję usuniętą z HAA, pogrubioną czcionką oznaczono fragmenty sekwencji: atg - kodon start, taa - kodon stop.
Fig. 1. 4 przedstawia wektor pIGKesHAl 7522Δ z wklonową wstawką HA17522Δ.
Fig. 1.5a przedstawia sekwencje aminokwasową rekombinowanej HA17522 (rH5) (SEKW NR 1). Podkreślono aminokwasy, które usunięto z sekwencji HA17522 aby uzyskać sekwencję HA17522Δ.
Fig. 1.5b sekwencja HA17522 ΔRRRKKR (SEKW NR 2).
Fig. 1.6 przedstawia rozdział elektroforetyczny izolowanych ciałek inkluzyjnych zawierających rH5 (17-522 aa, ΔRRRKKR) ze szczepu E. coli B121(DE3). Ścieżki: 1) Wzorzec mas białkowych LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa, 2) lizat komórek bakteryjnych ekspresjonujących rH5-E. coli (17-522 aa, ΔRRRKKR), 3) preparat ciałek inkluzyjnych zawierających rH5-E. coli (17-522 aa, ΔRRRKKR).
Fig. 2. 1 przedstawia wektor pDBHa17522Δ z wklonową wstawką HA17522Δ
Fig. 2. 2 przedstawia rozdział elektroforetyczny izolowanych ciałek inkluzyjnych zawierających rH5 (17-522 aa, ΔRRRKKR) ze szczepu E. coli Z0526. Ścieżki: 1) Wzorzec mas białkowych LMW 14,4 kDa, 20,1 kDa, 30,0 kDa, 43,0 kDa, 67,0 kDa, 94,0 kDa, 2) supernatant po odwirowaniu izolowanych ciałek inkluzyjnych, 3) lizat komórek bakteryjnych ekspresjonujących rH5-E. coli (17-522 aa, ΔRRRKKR), 4) preparat ciałek inkluzyjnych zawierających rH5-E. coli (17-522 aa, ΔRRRKKR).
Fig. 3.1 przedstawia wektor pIBAHa17522Δ z wklonową wstawką HA17522Δ
Fig. 4 przedstawia obrazy chromatograficzne z kolejnych etapów oczyszczania białka rH5-E. coli: a - rozdział na kolumnie DEAE Sepharose FF, b - rozdział na kolumnie Phenyl Sepharose FF. AU - jednostka pomiaru UV, nS/cm - jednostka przewodnictwa.
Fig. 5. 1 przedstawia elektroforegram z kolejnych etapów oczyszczania rH5-E. coli, przy czym użyte cyfry oznaczają: 1 - standard LMW (kolejne prążki o masie: 94 kDa; 67 kDa; 43 kDa; 30 kDa; 20,1 kDa; 14,4 kDa); 2 - ciałka inkluzyjne rozpuszczone w buforze DRCI; 3 - białka niezwiązane do złoża DEAE Sepharose Fast Flow; 4 - białka wyeluowane ze złoża DEAE Sepharose Fast Flow; 5 - białka po renaturacji metodą rozcieńczania; 6 - białka niezwiązane do złoża Phenyl Sepharose Fast Flow; 7 - białka wyeluowane ze złoża Phenyl Sepharose Fast Flow.
Fig. 5. 2 przedstawia przykład elektoforegramu z analizy końcowego preparatu rH5-E. coli na Bioanalizatorze Agilent 2100 z użyciem chipów High Sensitivity Protein 250 kit, gdzie FU - oznacza poziom fluorescencji; s - oznacza czas migracji; pierwszy pik o wysokim poziomie fluorescencji pochodzi od dolnego markera wewnętrznego; liczby nad pikami oznaczają masę białek w kDA wyznaczoną z dokładnością +/- 10%.
Tab. 1 przedstawia ilościową analizę składu jednego z preparatów rH5-E. coli. Pogrubioną czcionką zaznaczone są wyniki dla monomeru i dimeru hemaglutyniny.
Fig. 5. 3 przedstawia widmo masowe przykładowego preparatu rH5-E. coli.
PL 235 555 B1
Tab. 2 przedstawia wyniki badań immunoreaktywności przeciwciał monoklonalnych (Mab) i poliklonalnych (Pab) przeciwko HA z rH5 różnych szczepów AIV o serotypie H5. Białka HA uzyskano w bakulowirusowym (Oxford Expression Technologies) lub ssaczym (Immune Technology Corp.) systemie ekspresji. Homologię hemaglutynin wyznaczono dla białka pełnej długości (1-568 aa) oraz dla podjednostki HA-1 (17-340 aa) względem HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1). W teście użyto komercyjnie dostępne Mab (Acris Antibodies, ABR/Thermo Scientific, USBiological) i Pab (Immune Technology Corp.). Badania przeprowadzono metodą ELISA na płytkach Ni-NTA (Qiagen).
Fig. 5. 4 przedstawia wyniki badań immunoreaktywności przeciwciał monoklonalnych (Mab) i poliklonalnych (Pab) przeciwko HA z rH5-E. coli. Białko HA (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis), wytworzone w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) w bakulowirusowym systemie ekspresji (Oxford Expression Technologies) oraz szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05 (H5N1) w ssaczym systemie ekspresji (Immune Technology Corp.), stanowiły antygeny referencyjne. W teście użyto komercyjnie dostępne Mab (1, 2, 6, 7, 9, Acris Antibodies; Mab 3, ABR/Thermo Scientific; Mab 4, 5, 8, USBiological) i Pab przeciwko podjednostce HA-1 (Pab 1) lub HA-2 (Pab 2) HA (Immune Technology Corp.). Badania przeprowadzono metodą ELISA na płytkach MediSorp (NUNC).
Tab. 3 przedstawia wyniki testu hemaglutynacji (HA) prz eprowadzonego na erytrocytach kurcząt dla przykładowego preparatu rH5-E. coli. Zredukowane białko rH5-E. coli stanowiło kontrolę negatywną testu HA dla hemaglutyniny z bakteryjnego systemu ekspresji. Białko HA (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis), wytworzone w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) w bakulowirusowym systemie ekspresji (Oxford Expression Technologies) - rH5-BEVS (OET) oraz szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) w ssaczym systemie ekspresji (Immune Technology Corp.) - rH5-ssaczy (ITC), stanowiły antygeny referencyjne.
Fig. 6. 1 przedstawia wyniki pośredniego testu ELISA (H5-ELISA) wykrywającego przeciwciała klasy IgY przeciwko H5 w surowicy kurcząt, które uzyskano dla poszczególnych zwierząt zaszczepionych podskórnie przy użyciu jednej, 25-ug dawki rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Wyniki dla grupy szczepionej (A) przedstawiono jako wartości sygnałów (A450) przewyższające wartości „cut off” (A450 - cut off). Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupa A) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem A.
Fig. 6. 2 przedstawia wyniki pośredniego testu ELISA (H5-ELISA) wykrywającego przeciwciała klasy IgY przeciwko H5 w surowicy kurcząt, które uzyskano dla poszczególnych zwierząt szczepionych 2 razy podskórnie w odstępie 2-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Wyniki dla grupy szczepionej (B) oraz grupy kontrolnej (K) przedstawiono jako średnia wartość A450 ± SD. Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupa B) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem A.
Fig. 6. 3 przedstawia wyniki pośredniego testu ELISA (H5-ELISA) wykrywającego przeciwciała klasy IgY przeciwko H5 w surowicy kurcząt, które uzyskano dla poszczególnych zwierząt szczepionych 2 razy podskórnie w odstępie 4-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Wyniki dla grupy szczepionej (C) oraz grupy kontrolnej (K) przedstawiono jako średnia wartość A450 ± SD. Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupa C) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem A.
Fig. 6. 4 przedstawia wyniki oznaczeń miana punktu końcowego przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 w surowicach kurcząt, które szczepiono rH5-E. coli podskórnie 2 razy w odstępie 2-tygodniowym (grupa B) lub 4-tygodniowym (grupa C), stosując 25 μg antygenu w dawce i wodorotlenek glinu jako adiuwant. Surowice otrzymane z krwi pobranej 2, 3 lub 4 tygodnie (grupa B) albo 1 lub 2 tygodnie (grupa C) po podaniu dawki wzmacniającej oraz surowice przygotowane równolegle w kontrolnej grupie kurcząt (K) łączono i miareczkowano przy użyciu pośredniego testu ELISA (H5-ELISA). Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupy: B, C) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem A.
PL 235 555 B1
Tab. 4.1 przedstawia wyniki kompetycyjnego testu ELISA - FLUAc H5 (IDVet) do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 w surowicy ptaków, które uzyskano dla kurcząt zaszczepionych podskórnie przy użyciu jednej, 25-ng dawki rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Analizie poddano próby surowicy, które zawierały najwyższy u poszczególnych kurcząt poziom przeciwciał klasy IgY przeciwko H5, wykazany w teście H5-ELISA i były przygotowane z krwi pobranej 2 (*), 4 (**) lub 5 (***) tygodni po immunizacji. Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt wykonano zgodnie z harmonogramem dla grupy A, przedstawionym na schemacie A.
Tab. 4.2 przedstawia wyniki kompetycyjnego testu ELISA - FLUAc H5 (IDVet) do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 w surowicy ptaków, które uzyskano dla kurcząt szczepionych 2 razy podskórnie w odstępie 2-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt wykonano zgodnie z harmonogramem dla grupy B, przedstawionym na schemacie A.
Tab. 4.3 przedstawia wyniki kompetycyjnego testu ELISA - FLUAc H5 (IDVet) do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 w surowicy ptaków, które uzyskano dla kurcząt szczepionych 2 razy podskórnie w odstępie 4-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt wykonano zgodnie z harmonogramem dla grupy C, przedstawionym na schemacie A.
Tab. 5.1 przedstawia wyniki testów HI, które uzyskano dla kurcząt zaszczepionych podskórnie przy użyciu jednej, 25-ng dawki rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Testy przeprowadzono przy HIU = 1:8, stosując jako antygeny homologiczny HPAIV H5N1 i heterologiczny LPAIV H5N2, opisane w zestawieniu A. Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt wykonano zgodnie z harmonogramem dla grupy A, przedstawionym na schemacie A.
Tab. 5.2 przedstawia wyniki testów HI, które uzyskano dla kurcząt zaszczepionych 2 razy podskórnie w odstępie 2-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Testy przeprowadzono przy HIU = 1:8, stosując jako antygeny homologiczny HPAIV H5N1 i heterologiczny LPAIV H5N2, opisane w zestawieniu A. Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt wykonano zgodnie z harmonogramem dla grupy B, przedstawionym na schemacie A.
Tab. 5.3 przedstawia wyniki testów HI, które uzyskano dla kurcząt szczepionych 2 razy podskórnie w odstępie 4-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Testy przeprowadzono przy HIU = 1:8, stosując jako antygeny homologiczny HPAIV H5N1 i heterologiczny LPAIV H5N2, opisane w zestawieniu A. Badania przeprowadzono na kurczętach typu mięsnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt wykonano zgodnie z harmonogramem dla grupy C, przedstawionym na schemacie A.
Tab. 6 przedstawia wyniki badań immunizacyjnych kurcząt typu mięsnego, które uzyskano przy użyciu pośredniego i kompetycyjnego testu ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 w surowicy kurcząt (H5-ELISA; FLUAc H5, IDVet) oraz testów HI z wirusami Al opisanymi w zestawieniu A: homologicznym HPAIV H5N1 i heterologicznym LPAIV H5N2. Zwierzętom podano podskórnie jedną (grupa A) lub dwie 25-ng dawki (grupy: B, C) rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Szczepienie wzmacniające grupy B wykonano 2 tygodnie, natomiast grupy C - 4 tygodnie po szczepieniu uczulającym. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt wykonano zgodnie z harmonogramami dla grup A, B i C, przedstawionymi na schemacie A. W tabeli uwzględniono wyniki analiz dostępnych prób surowicy ze wszystkich pobrań krwi w grupach A, B i C kurcząt (*), z pobrań krwi po podaniu II dawki rH5 kurczętom grupy B i C (**) lub z krwi pobranej od zwierząt grupy A, które zawierały najwyższy u poszczególnych kurcząt poziom przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 i były przygotowane 2, 4 lub 5 tygodni po immunizacji (***).
Fig. 7. 1 przedstawia wyniki testów HI, które uzyskano dla kurcząt SPF typu nieśnego w doświadczeniu challenge. Zwierzęta immunizowano podskórnie 2-krotnie w odstępie 4- lub 4½-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta, zgodnie ze schematami: B i C. Analizie poddano próby surowicy pobrane 3 tygodnie po podaniu II dawki antygenu tj. bezpośrednio przed zakażeniem homologicznym (doświadczenie 1) lub hete
PL 235 555 B1 rologicznym (doświadczenie 2) HPAIV H5N1. Testy HI wykonano przy HIU 1:8, stosując jako antygeny homologiczny i heterologiczny HPAIV H5N1, opisane w zestawieniu B. Wyniki analiz przy użyciu dwóch testów HI przedstawiono jako poziom miana przeciwciał HI w surowicy poszczególnych zwierząt oraz jako średnia wartość miana przeciwciał HI w każdej z badanych grup. Wartości miana < 1:8 zaznaczono na wykresie jako wartość 1,0.
Fig. 7. 2 przedstawia wyniki testu FLUAc H5 (IDVet) do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 w surowicy ptaków, które uzyskano dla kurcząt SPF typu nieśnego w doświadczeniu challenge. Zwierzęta immunizowano podskórnie 2-krotnie w odstępie 4- lub 4½-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta, zgodnie ze schematami: B i C. Analizie poddano próby surowicy pobrane 3 tygodnie po podaniu II dawki antygenu tj. bezpośrednio przed zakażeniem homologicznym (doświadczenie 1) lub heterologicznym (doświadczenie 2) HPAIV H5N1. Wyniki analiz przedstawiono jako wyrażoną w % wartość kompetycji prób surowicy poszczególnych zwierząt oraz jako średnia wartość % kompetycji surowic każdej z badanych grup.
Fig. 7. 3 przedstawia wyniki ekperymentalnego zakażenia szczepionych i kontrolnych kurcząt HPAIV H5N1: A - homologicznym z kladu 2.2, B - heterologicznym z kladu 1. Kurczęta SPF typu nieśnego immunizowano podskórnie 2-krotnie w odstępie 4- lub 4½-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Zakażenie przeprowadzono 3 tygodnie po powtórnej immunizacji przez donosowe/dospojówkowe (i.n./i.o.) podanie wirusa w dawce 106 EID50. Szczepienia i zakażenie kurcząt HPAIV H5N1 wykonano zgodnie ze schematami: B i C. Dane przedstawiono jako % przeżywalności kurcząt w grupie kurcząt szczepionych (10 sztuk), kontaktowych (2 sztuki) i kontrolnych (5 sztuk).
Tab. 7 przedstawia wyniki testu IDEXX AI MultiS-Screen (Idexx Laboratories) do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusom Al w surowicy ptaków, które uzyskano dla kurcząt SPF typu nieśnego w doświadczeniu challenge. Zwierzęta immunizowano podskórnie 2-krotnie w odstępie 4- lub 4½-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Zakażenie przeprowadzono przez donosowe/dospojówkowe (i.n./i.o.) podanie wirusa w dawce 106 EID50. Szczepienia i zakażenie kurcząt wykonano zgodnie ze schematami: B i C. Analizie poddano próby surowicy pobrane 3 tygodnie po podaniu II dawki antygenu tj. bezpośrednio przed zakażeniem oraz 2 tygodnie po infekcji HPAIV H5N1: homologicznym z kladu 2.2 (doświadczenie 1) i heterologicznym z kladu 1 (doświadczenie 2). Kurczęta, które padły 3, 2, 8, 7-8 dpi oznaczono, odpowiednio: a, b, c, d. Kurczęta wykazujące objawy choroby z mniejszym lub większym nasileniem oznaczono, odpowiednio: *, **.
Tab. 8 przedstawia wyniki badań przy użyciu real time RT-qPCR wymazów z gardła (G) i kloaki (K), które pobrano od kurcząt SPF typu nieśnego zaszczepionych rH5-E. coli i zakażonych HPAIV H5N1 oraz od kurcząt kontaktowych. Kurczęta immunizowano podskórnie 2-krotnie w odstępie 4- lub 4½-tygodniowym przy użyciu 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Zakażenie przeprowadzono 3 tygodnie po powtórnej immunizacji przez donosowe/ dospojówkowe (i.n./i.o.) podanie wirusów HPAIV H5N1: homologicznego z kladu 2.2 lub heterologicznego z kladu 1 w dawce 106 EID50. Szczepienia i zakażenie kurcząt wykonano zgodnie ze schematami: B i C. Wymazy od zwierząt, które przeżyły zakażenie, pobrano 3, 7, 10 i 14 dni po zakażeniu (dpi). Wymazy od kurcząt padłych 3, 2, 8, 7-8 dpi, oznaczonych, odpowiednio: a, b, c, d, pobrano post mortem (pm). Kurczęta wykazujące objawy choroby z mniejszym lub większym nasileniem oznaczono, odpowiednio: *, **. Ilości wirusowego RNA wyrażono w jednostkach PCR ElDsc/ml i podano jako log10 EIDsc/ml.
Fig. 8.1 przedstawia wyniki oznaczeń pośredniego testu ELISA - H5-ELISA do wykrywania przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 w surowicy kurcząt, które uzyskano dla zwierząt zaszczepionych rH5-E. coli podskórnie 2 razy w odstępie 4-tygodniowym (grupy: 1A, 2A, 3A, 4A) lub 6-tygodniowym (grupy: 1B, 2B, 3B, 4B) przy użyciu 25 μg (grupy: 1A, 1B), 15 μg (grupy: 2A, 2B), 10 μg (grupy: 3A, 3B) lub 5 μg (grupy: 4A, 4B) antygenu w dawce i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Wyniki przedstawiono jako poziom seropozytywności w poszczególnych grupach na określonych etapach doświadczenia, oznaczony w surowicach rozcieńczonych 1:200 i wyrażony w procentach. Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupy: 1A-4A, 1B-4B) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem D.
PL 235 555 B1
Fig. 8.2 przedstawia wyniki oznaczeń miana punktu końcowego przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 w surowicach kurcząt, które zaszczepiono rH5-E. coli podskórnie 2 razy w odstępie 4-tygodniowym (grupy: 1A, 2A, 3A, 4A) lub 6-tygodniowym (grupy: 1B, 2B, 3B, 4B), stosując 25 μg (grupy: 1A, 1B), 15 μg (grupy: 2A, 2B), 10 μg (grupy: 3A, 3B) lub 5 μg (grupy: 4A, 4B) antygenu w dawce i wodorotlenek glinu jako adiuwant. Surowice otrzymane z krwi pobranej 1 i 2 tygodnie po podaniu dawki wzmacniającej oraz surowice przygotowane równolegle w kontrolnej grupie kurcząt (K) łączono i miareczkowano przy użyciu pośredniego testu ELISA (H5-ELISA). Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupy: 1A-4A, 1B-4B) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem D.
Fig. 8.3 przedstawia wyniki kompetycyjnego testu ELISA - FLUAc H5 (IDVet) do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 w surowicach ptaków, które uzyskano dla kurcząt zaszczepionych rH5-E. coli podskórnie 2 razy w odstępie 4-tygodniowym (grupy: 1A, 2A, 3A, 4A) lub 6-tygodniowym (grupy: 1B, 2B, 3B, 4B) przy użyciu 25 μg (grupy: 1A, 1B), 15 μg (grupy: 2A, 2B), 10 μg (grupy: 3A, 3B) lub 5 μg (grupy: 4A, 4B) antygenu w dawce i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Wyniki przedstawiono jako udział kurcząt seropozytywnych w każdej z badanych grup na poszczególnych etapach doświadczenia, wyrażony w procentach. Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupy: 1A-4A, 1B-4B) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem D.
Fig. 8. 4 przedstawia wyniki testu HI, które uzyskano dla kurcząt zaszczepionych rH5-E. coli podskórnie 2 razy w odstępie 4-tygodniowym (grupy: 1A, 2A, 3A, 4A) lub 6-tygodniowym (grupy: 1B, 2B, 3B, 4B) przy użyciu 25 μg (grupy: 1A, 1B), 15 μg (grupy: 2A, 2B), 10 μg (grupy: 3A, 3B) lub 5 μg (grupy: 4A, 4B) antygenu i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Test przeprowadzono przy HIU = 1:8, stosując jako antygen heterologiczny LPAIV H5N2, opisany w zestawieniu A. Wyniki przedstawiono jako udział kurcząt z ochronnym mianem HI (> 1:16) w każdej z badanych grup na poszczególnych etapach doświadczenia, wyrażony w procentach. Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupy: 1A-4A, 1B-4B) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem D.
Tab. 9 przedstawia wyniki kompetycyjnego testu ELISA - FLUAc H5 (IDVet) do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 w surowicy ptaków oraz testu HI przeprowadzonego przy HIU = 1:8 z heterologicznym LPAIV H5N2, opisanym w zestawieniu A, które uzyskano w badaniach immunizacyjnych kurcząt. Zwierzęta zaszczepiono rH5-E. coli podskórnie 2 razy w odstępie 4-tygodniowym (grupy: 1A, 2A, 3A, 4A) lub 6-tygodniowym (grupy: 1B, 2B, 3B, 4B) stosując 25 μg (grupy: 1A, 1B), 15 μg (grupy: 2A, 2B), 10 μg (grupy: 3A, 3B) lub 5 μg (grupy: 4A, 4B) antygenu w dawce i wodorotlenek glinu jako adiuwant. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie procentowego udziału kurcząt seropozytywnych w teście FLUAc H5 oraz wykazujących ochronne miano przeciwciał HI (> 1:16) 1 i 2 tygodnie po powtórnym podaniu 25, 15, 10 lub 5 μg rH5-E. coli (n = 4) oraz wszystkich zastosowanych dawek antygenu (n = 16). Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupy: 1A-4A, 1B-4B) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem D.
Fig. 8. 5 przedstawia wyniki testu HI, które uzyskano dla kurcząt zaszczepionych rH5-E. coli podskórnie 2 razy w odstępie 4-tygodniowym (grupy: 1A, 2A, 3A, 4A) przy użyciu 25 μg (grupa 1A), 15 μg (grupa 2A), 10 μg (grupa 3A) lub 5 μg (grupa 4A) antygenu w dawce i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Test przeprowadzono przy HIU =1:8, stosując jako antygen heterologiczny LPAIV H5N2, opisany w zestawieniu A. Wyniki analiz surowic, przygotowanych 4 tygodnie po podaniu I oraz 1 i 2 tygodnie po podaniu II dawki antygenu, odpowiednio w 49, 56 i 63 dniu życia (d.ż.) kurcząt przedstawiono jako poziom miana przeciwciał HI w surowicy poszczególnych zwierząt oraz jako średnia wartość miana przeciwciał HI w każdej z badanych grup. Wartości miana < 1:8 zaznaczono na wykresie jako wartość 1,0. Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupy: 1A-4A) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem D.
PL 235 555 B1
Fig. 8. 6 przedstawia wyniki testu HI, które uzyskano dla kurcząt zaszczepionych rH5-E. coli podskórnie 2 razy w odstępie 6-tygodniowym (grupy: 1B, 2B, 3B, 4B) przy użyciu 25 μg (grupa 1B), 15 μg (grupa 2B), 10 μg (grupa 3B) lub 5 μg (grupa 4B) antygenu w dawce i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Test przeprowadzono HIU = 1:8, stosując jako antygen heterologiczny LPAIV H5N2, opisany w zestawieniu A. Wyniki analiz surowic, przygotowanych 6 tygodni po podaniu I oraz 1 i 2 tygodnie po podaniu II dawki antygenu, odpowiednio w 63, 70 i 77 dniu życia (d.ż.) kurcząt przedstawiono jako poziom miana przeciwciał HI w surowicy poszczególnych zwierząt oraz jako średnia wartość miana przeciwciał HI w każdej z badanych grup. Wartości miana < 1:8 zaznaczono na wykresie jako wartość 1,0. Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupy: 1B-4B) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem D.
Fig. 8. 7 przedstawia wyniki testów do badania funkcjonalnych przeciwciał przeciwko H5: testu HI i testu kompetycyjnego ELISA - FLUAc H5 (IDVet), które uzyskano dla kurcząt typu nieśnego i typu mięsnego zaszczepionych rH5-E. coli podskórnie 2 razy w odstępie 4 tygodni przy użyciu 25 μg antygenu i wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Test HI przeprowadzono HIU = 1:8, stosując jako antygen heterologiczny LPAIV H5N2, opisany w zestawieniu A. A - wyniki analiz surowic przy użyciu testów: HI-H5N2 oraz FLUAc H5 przedstawiono jako udział kurcząt z ochronnym mianem HI (> 1:16) oraz kurcząt seropozytywnych w teście FLUAc H5 w każdej z badanych grup, wyrażone w procentach. B - wyniki analiz surowic przy użyciu testu HI-H5N2 przedstawiono jako poziom miana przeciwciał HI w surowicy poszczególnych zwierząt oznaczony w próbach pobranych 4 tygodnie po podaniu I oraz 1 i 2 tygodnie po podaniu II dawki antygenu, odpowiednio w 49, 56 i 63 dniu życia (d.ż.) kurcząt typu nieśnego oraz w 35, 42 i 49 d.ż. kurcząt typu mięsnego oraz jako średnia wartość miana przeciwciał HI w każdej z badanych grup. Wartości miana < 1:8 zaznaczono na wykresie jako wartość 1,0. Szczepienia oraz pobieranie prób od kurcząt typu nieśnego wykonano zgodnie z harmonogramem dla grupy 1A, przedstawionym na schemacie D a kurcząt typu mięsnego zgodnie z harmonogramem dla grupy C, przedstawionym na schemacie A.
Fig. 9. 1 przedstawia wyniki pośredniego testu ELISA wykrywającego przeciwciała klasy IgY przeciwko H5 w surowicy kurcząt (H5-ELISA), które uzyskano dla poszczególnych zwierząt szczepionych 2-krotnie rH5-E. coli w odstępie 4 tygodni przez podanie podskórne dawki uczulającej (25 μg z wodorotlenkiem glinu) oraz donosowe dawki wzmacniającej (20 μg z PROTASAN™ UP G 113). Wyniki przedstawiono jako wartości sygnałów (A450) przewyższające wartości „cut off” (A450 - cut off), otrzymane dla 10 z 15 zaszczepionych kurcząt, które odpowiedziały na immunizację donosową. Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupa nr 5) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem E.
Fig. 9. 2 przedstawia wyniki kompetycyjnego testu ELISA - FLU Ac H5 (IDVet) do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 w surowicy ptaków, które uzyskano dla poszczególnych zwierząt szczepionych 2-krotnie rH5-E. coli w odstępie 4 tygodni przez podanie podskórne dawki uczulającej (25 μg z wodorotlenkiem glinu) oraz donosowe dawki wzmacniającej (20 μg z PROTASAN™ UP G 113). Zaprezentowano dane z analiz surowic kurcząt, które zgodnie z wynikami pośredniego testu H5-ELISA odpowiedziały na immunizację donosową (10/15). Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupa nr 5) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem E.
Tab. 10 przedstawia wyniki testu HI, które uzyskano dla kurcząt szczepionych 2-krotnie rH5-E. coli w odstępie 4 tygodni przez podanie podskórne dawki uczulającej (25 μg z wodorotlenkiem glinu) oraz donosowe dawki wzmacniającej (20 μg z PROTASAN™ UP G 113). Testy przeprowadzono przy HIU = 1:8, stosując jako antygen heterologiczny LPAIV H5N2, opisany w zestawieniu A. Zaprezentowano dane z analiz surowic kurcząt, które zgodnie z wynikami pośredniego testu H5-ELISA odpowiedziały na immunizację donosową (10/15). Badania przeprowadzono na kurczętach typu nieśnego. Szczepienia oraz pobieranie prób od zwierząt eksperymentalnych (grupa nr 5) i kontrolnych (grupa K) wykonano zgodnie ze schematem E.
Wynalazek przedstawiono w przykładowych rozwiązaniach.
PL 235 555 B1
P r z y k ł a d 1 Otrzymywanie fragmentu hemaglutyniny (17-522 aa, ARRRKKR) wysokopatogennego wirusa ptasiej grypy (HPAIV) H5N1 w komórkach Escherichia coli BL21(DE3)
Otrzymano fragment sekwencji kodującej HA 17-522 aa z delecją rejonu cięcia HA0 pomiędzy podjednostkami HA-1 i HA-2 (ARRRKKR). Sekwencja ta koduje podjednostkę HA-1 i fragment podjednostki HA-2 i jest pozbawiona aminokwasów zasadowych RRRKKR w rejonie 341-346 aa antygenu HA.
Fragment cDNA zawierający pełnej długości ramkę odczytu dla hemaglutyniny uzyskano metodą odwrotnej transkrypcji, a następnie amplifikacji (RT-PCR) na matrycy RNA polskiego szczepu wirusa grypy z 2006 r (A/swan/Poland/305-135V08/2006; EpiFlu Database; numer dostępu EPI156789; http://platform.gisaid.org) (Gromadzka et al., 2008). Na podstawie uzyskanej sekwencji nukleotydowej (Fig. 1.1), określono sekwencję aminokwasową białka hemaglutyniny. Otrzymano konstrukt zawierający wklonowany fragment sekwencji kodującej hemaglutyninę. Stał się on podstawą otrzymania zmodyfikowanej sekwencji kodującej hemaglutyninę. Zmodyfikowana sekwencja obejmuje aminokwasy 17-522 z delecją aminokwasów 341-346 (RRRKKR, w miejscu cięcia pomiędzy podjednostkami HA1 i HA2).
Szczepy E. coli użyte w trakcie prac:
NM522 supE thi Δ (lac-proAB) hsd5 ΠproAB+ lackq lacZJ M15]
BL21(DE3) hsdS gal (Xclts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1)
Wektory użyte do klonowania:
Nieekspresyjny plazmid bakteryjny
Do klonowania fragmentów DNA po powieleniu PCR używano nieekspresyjnego plazmidu (sekwencja dostępna w Banku Genów pod numerem X52324 S52394). Plazmid ten posiada: origin replikacji ColE1, promotory (dla RNA polimeraz fagowych) T3 i T7 flankujące polilinker oraz gen oporności na ampicylinę.
Bakteryjny system ekspresyjny:
Do produkcji białka rekombinowanego użyto bakteryjnego systemu ekspresyjnego opracowanego w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie. System jest przedmiotem zgłoszenia patentowego P379905 (2007), PCT/PL2007/000037 i amerykańskiego patentu US 8628954 B2. Produkcja białek w tym systemie odbywa się w komórkach gospodarza, takiego jak Escherichia coli, zawierającego gen kodujący polimerazę RNA z faga T7. Do komórek gospodarza wprowadza się wektor zawierający docelowy gen związany funkcjonalnie z promotorem rozpoznawanym przez polimerazę RNA z faga T7 i hoduje się komórki gospodarza w znanych warunkach umożliwiających ekspresję. Wykorzystany system umożliwia stabilną w czasie ekspresję białek dzięki zastosowaniu kasety ekspresyjnej zawierającej promotor fagowy funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą polipeptyd docelowy oraz z sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy. W kasecie pomiędzy sekwencją kodującą polipeptyd docelowy a sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, znajduje się terminator transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe.
Zastosowanie zmodyfikowanego wektora ekspresyjnego pozwala na eliminowanie z prowadzonej hodowli komórek bakteryjnych, w chromosomie których pojawiła się mutacja powodująca brak produkcji funkcjonalnej polimerazy faga T7 i/lub w których, w wyniku mutacji, stracił funkcjonalność promotor faga T7.
Kaseta stabilizująca ekspresję włączona jest w wektorze pIGCmT7Kes (Fig. 1.2). Plazmid pIGCmT7Kes zawiera gen acetylotransferazy chloramfenikolu (CatA1), wprowadzającą oporność na chloramfenikol, polilinker wraz z promotorem rozpoznawanym przez polimerazę RNA z faga T7 oraz sekwencją kodującą kodon stop transkrypcji pochodzącą z faga T7. Plazmid pIGCmT7Kes niesie gen kodujący tRNA dla kodonów AGA i AGG. Kodony AGA i AGG tRNA uzupełniają niedobór tych tRNA wynikający z częstości użycia kodonów w E. coli.
Otrzymanie wektora pIGKesHA17522A z włączonym fragmentem hemaglutyniny (17-522 aa, ARRRKKR) HPAIV H5N1
Schemat otrzymania wektora pIGKesHA17522
Etap I. Otrzymanie plazmidu pGEM-T Easy zawierającego sekwencję genu kodującego hemaglutyninę (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)).
PL 235 555 B1
Pierwszym etapem było pozyskanie materiału genetycznego wirusa ptasiej grypy z zastosowaniem wydajnej metody oczyszczania materiału genetycznego wirusa. Materiałem wyjściowym do tych reakcji były próbki dostarczone przez lekarzy weterynarii i ornitologów. Metodą odwrotnej transkrypcji a następnie amplifikacji (RT-PCR) na matrycy RNA polskiego szczepu wirusa grypy z 2006 r (A/swan/Poland/305-135V08/2006) uzyskano fragment cDNA. Fragment ten zawierał pełnej długości ramkę odczytu dla hemaglutyniny. Otrzymany fragment wklonowano do plazmidu pGEM-T Easy (Promega) używanego w celu analizy sekwencji DNA.
Etap II. Z plazmidu pGEM-T Easy zawierającego sekwencję genu kodującego hemaglutyninę (A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1)) powielono metodą PCR gen kodujący hemaglutyninę, z zastosowaniem primerów Ha17522 (primer wiodący
5’-GAGGGGATGCATATGGATCAGATTTGCATTGGTTACC-3’ i HaFr522 (primer odwrotny 5’-GGCCCTCGAGTTATACTCCACTTATTTCCTCGCG-3’). Użyte do reakcji PCR primery zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującego hemaglutyninę. Podkreślono sekwencję primera komplementarną do sekwencji powielanego genu.
Primer Ha17522 wprowadza miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Bam HT i Ndel. Primer HaFr522 wprowadza miejsca rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną Xhol. Otrzymany po reakcji PCR produkt rozdzielono elektroforetycznie i wyizolowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i XhoI i odbiałczano. Uzyskany fragment ligowano z wektorem Bluescript SK(-) trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z komórek transformowanych E. coli potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej obecność wklonowanej wstawki HA, a poprawność sekwencji zweryfikowano przez sekwencjonowanie.
Etap III. Przeprowadzono optymalizację kodonów sekwencji insertu HA pozwalającą na zwiększenie wydajności ekspresji w bakteriach E. coli. W tym celu przeprowadzono zamianę wybranych kodonów w sekwencji pochodzącej z wirusa tak aby zawierała kodony najczęściej występujące w E. coli. Zamianę przeprowadzono w reakcji ukierunkowanej mutagenezy. Zamienione kodony zaznaczono pogrubioną czcionką na sekwencji (Fig. 1.3).
Etap IV. Z wektora Bluescript wytrawiono sklonowany fragment DNA enzymami restrykcyjnymi Ndel i XhoI i odbiałczono. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pIGCmT7Kes, trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Obecność wklonowanej wstawki HA 17-522 aa w otrzymanym wektorze pIGKesHA17522 potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej.
Schemat otrzymania wektora pIGKesHA17522A
W reakcji powielania użyto jako matrycę wektor pIGKesHA17522. Przeprowadzono reakcję PCR z wykorzystaniem primerów zaprojektowanych na podstawie sekwencji kodującej hemaglutyninę. Uzyskano sekwencję kodującą HA 17-522 aa pozbawioną fragmentu kodującego aminokwasy od 341 do 346, są to aminokwasy RRRKKR. Usunięty rejon od 341 do 346 aminokwasu to rejon cięcia HA0 pomiędzy podjednostkami HA-1 i HA-2. Wyłączone aminokwasy zaznaczono podkreśloną czcionką na nukleotydowej sekwencji (Fig. 1.3). Otrzymany fragment HA z delecją RRRKKR (HAA) stanowił matrycę do reakcji PCR, w której primer Ha17522 wprowadza miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne BamHI i Ndel. Primer HaFr522 wprowadza miejsca rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną XhoI.
Otrzymany po reakcji PCR produkt rozdzielono elektroforetycznie i wyizolowano z żelu agarozowergo, a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi Ndel i XhoI i odbiałczono. Uzyskany fragment ligowano z wektorem pIGCmT7Kes trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z komórek transformowanych E. coli potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej obecność wklonowanej wstawki HA17522A w wektorze pIGKesHA17522A (Fig. 1.4), a poprawność sekwencji zweryfikowano przez sekwencjonowanie.
Otrzymanie szczepu E. coli BL21(DE3) z ekspresją fragmentu hemaglutyniny (17-522 aa, ARRRKKR) HPAIV H5N1
Plazmidem pIGKesHA17522A zawierającym sprawdzoną sekwencję kodującą HA17522A transformowano komórki E. coli szczep BL21(DE3). Do transformacji komórek E. coli wykorzystano metodę transformacji kompetentnych komórek bakteryjnych E. coli opisaną przez Chung i Miller [Chung CT, Miller RH. A rapid and convenient method for preparation and storage of competent bacterial cells.
PL 235 555 B1
Nucleic Acids Res. 1988 Apr 25; 16(8):3580]. Selekcję transformantów przeprowadzono na podłożu LB z dodatkiem chloramfenikolu (stęż. 12 ug/ml).
Otrzymano szczep E. coli BL21(DE3) z ekspresją genu HA17522A z delecją rejonu cięcia HA0 pomiędzy podjednostkami HA1 i HA2 (ARRRKKR). Szczep ten ekspresjonuje rekombinowane białko rH5 obejmujące podjednostkę HA-1 i fragment podjednostki HA-2 i jest pozbawiony rejonu obejmującego aminokwasy RRRKKR w rejonie 341-346 aa antygenu HA. Sekwencję aminokwasową białka rH5 przedstawiono na Fig. 1.5.
Ekspresja fragmentu hemaglutyniny (17-522 aa, ARRRKKR) HPAIV H5N1 w szczepie E. coli BL21(DE3)
Bakterie E. coli szczep BL21(DE3) niosące zrekombinowny plazmid hodowano w pożywce LB zawierającej chloramfenikol (12 ug/ml) w 25°C, z wytrząsaniem (150 rpm) do uzyskania OD600~0,6. Ekspresję rH5 indukowano przez dodanie isopropyl-thio-3-D-galactoside (IPTG, do końcowego stężenie 0,1 ug/ml). Bakterie hodowano 4,5 godziny bez zmiany warunków hodowli, a następnie zwirowano.
Izolacja ciałek inkluzyjnych zawierających rH5 z E. coli
Osad komórek zawieszono w buforze do lizy (0,5 M NaCl; 0,05 M Tris HCl pH 7,5; 0,01 M EDTA pH 7,5; 0,005 M 2-Mercaptoethanol; 0,35 mg/ml lizozym; 1% PMSF) i inkubowano 30 minut w 20°C. Dodano Triton X-100 do uzyskania stężenia 1%. Zawiesinę sonifikowano i zwirowano. Osad ciałek inkluzyjnych zawieszano w buforze PBS zawierającym 1% Triton X-100, a następnie PBS zawierający 2 M mocznik i wirowano. Wyizolowane ciałka inkluzyjne dwukrotnie przemywano buforem PBS. Końcowo ciałka inkluzyjne zawieszono w buforze PBS porcjowano i zamrażano w -20°C do czasu dalszych analiz.
Analiza ciałek inkluzyjnych izolowanych z E. coli BL21(DE3)
Obecność frakcji ciałek inkluzyjnych zawierających rH5 potwierdzono poddając próby rozdziałowi elektroforetycznemu w 15% żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE). Białka wizualizowano barwnikiem Coomassie Brillant Blue G. Obrazy rozdziałów elektroforetycznych prób izolowanych ciałek inkluzyjnych przedstawiono na Fig. 1.6.
P r z y k ł a d 2 Otrzymywanie fragmentu hemaglutyniny (17-522 aa, ARRRKKR) wysokopatogennego wirusa ptasiej grypy (HPAIV) H5N1 w szczepie Escherichia coli Z0526
Otrzymano fragment sekwencji kodującej HA 17-522 aa z delecją rejonu cięcia HA0 pomiędzy podjednostkami HA-1 i HA-2 (ARRRKKR). Sekwencja ta koduje podjednostkę HA-1 i fragment podjednostki HA-2 i jest pozbawiona aminokwasów zasadowych RRRKKR w rejonie 341-346 aa antygenu HA.
Fragment cDNA zawierający pełnej długości ramkę odczytu dla hemaglutyniny uzyskano metodą odwrotnej transkrypcji, a następnie amplifikacji (RT-PCR) na matrycy RNA polskiego szczepu wirusa grypy z 2006 r (A/swan/Poland/305-135V08/2006; EpiFlu Database; numer dostępu EPI156789; http://platform.gisaid.org) (Gromadzka et al., 2008). Na podstawie uzyskanej sekwencji nukleotydowej (Fig. 1.1), określono sekwencję aminokwasową białka hemaglutyniny. Otrzymano konstrukt zawierający wklonowany fragment sekwencji kodującej hemaglutyninę. Stał się on podstawą otrzymania zmodyfikowanej sekwencji kodującej hemaglutyninę. Zmodyfikowana sekwencja obejmuje aminokwasy 17-522 z delecją aminokwasów 341-346 (RRRKKR, w miejscu cięcia pomiędzy podjednostkami HA1 i HA2).
Szczepy E. coli użyte w trakcie prac:
NM522 supE thi Λ (lac-proAB) hsd5 F]proAB+ lack lacZ.I M15]
Z0526 F- cyt R, str A
Wektory użyte do klonowania:
Ekspresyjny plazmid bakteryjny
Plazmid pDB zawiera konstytutywny promotor deoP1P2. Pod kontrolą promotora deoP1P2 ekspresjonowane są białka rekombinowane otrzymywane z użyciem plazmidu pDB. Plazmid pDB niesie również gen oporności na tetracyklinę umożliwiający selekcję komórek po transformacji tym plazmidem. Bakteryjny system ekspresyjny:
Produkcja białek w tym systemie odbywa się w komórkach gospodarza, takiego jak Escherichia coli Z0526. W szczepie tym znajduje się gen kodujący polimerazę rozpoznającą promotor deoP1P2. Rozpoznawany promotor deoP1P2 znajduje się w plazmidzie ekspresyjnym pDB. W szczepie Escherichia coli Z0526 w obrębie chromosomu zmutowano sekwencję genów cytR i strA. Do komórek go
PL 235 555 B1 spodarza wprowadza się na drodze transformacji wektor zawierający docelowy gen kodujący białko rekombinowane. Transformowane komórki gospodarza hoduje się w znanych warunkach umożliwiających ekspresję. Zastosowany system umożliwia konstytutywną ekspresję białka rekombinowanego.
Otrzymanie wektora pDBHA17522A z włączonym fragmentem hemaglutyniny (17-522 aa, ARRRKKR) HPAIV H5N1
Schemat otrzymania wektora pDBHA17522A
W reakcji powielania użyto jako matrycę wektor pIGKesHA17522A (Fig. 1.4). Przeprowadzono reakcję PCR z wykorzystaniem primerów zaprojektowanych na podstawie sekwencji kodującej hemaglutyninę. Otrzymany po reakcji PCR produkt rozdzielono elektroforetycznie i wyizolowano z żelu agarozowergo. Uzyskany fragment trawiono enzymami restrykcyjnymi, a następnie ligowano z wektorem pDB trawionym enzymami restrykcyjnymi Ndel i Xbal. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z komórek transformowanych E. coli potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej obecność wklonowanej wstawki HA17522A w wektorze pDBHA17522A (Fig. 2.1), a poprawność sekwencji zweryfikowano przez sekwencjonowanie.
Otrzymanie szczepu E. coli Z0526 z ekspresją fragmentu hemaglutyniny (17-522 aa, ARRRKKR) HPAIV H5N1
Plazmidem pDBHA17522A zawierającym sprawdzoną sekwencję kodującą HA17522A transformowano komórki E. coli szczep Z0526. Do transformacji komórek E. coli wykorzystano metodę transformacji kompetentnych komórek bakteryjnych E. coli opisaną przez Chung i Miller [Chung CT, Miller RH. A rapid and convenient method for preparation and storage of competent bacterial cells. Nucleic Acids Res. 1988 Apr 25; 16(8):3580]. Selekcję transformantów przeprowadzono na podłożu LB z dodatkiem tetracykliny (stęż. 12,5 μg/ml).
Otrzymano szczep E. coli Z0526 z ekspresją genu HA17522A z delecją rejonu cięcia HA0 pomiędzy podjednostkami HA1 i HA2 (ARRRKKR). Szczep ten ekspresjonuje rekombinowane białko rH5 obejmujące podjednostkę HA-1 i fragment podjednostki HA-2 i jest pozbawiony rejonu obejmującego aminokwasy RRRKKR w rejonie 341-346 aa antygenu HA. Sekwencję aminokwasową białka rH5 przedstawiono na Fig. 1.5.
Ekspresja fragmentu hemaglutyniny (17-522 aa, ARRRKKR) HPAIV H5N1 w szczepie E. coli Z0526
Bakterie E. coli szczep Z0526 niosące zrekombinowany plazmid hodowano w pożywce mineralnej zawierającej tetracyklinę (12,5 μg/ml) w 37°C, z wytrząsaniem (150 rpm) do uzyskania OD600~1,2, a następnie zwirowano.
Izolacja ciałek inkluzyjnych zawierających rH5 z E. coli Z0526
Osad komórek zawieszono w buforze do lizy (0,5 M NaCl; 0,05 M Tris HCl pH 7,5; 0,01 M EDTA pH 7,5; 0,005 M 2-Mercaptoethanol; 0,35 mg/ml lizozym; 1% PMSF) i inkubowano 30 minut w 20°C. Dodano Triton X-100 do uzyskania stężenia 1%. Zawiesinę sonifikowano i zwirowano. Osad ciałek inkluzyjnych zawieszano w buforze PBS zawierającym 1% Triton X-100, a następnie PBS zawierający 2 M mocznik i wirowano. Wyizolowane ciałka inkluzyjne dwukrotnie przemywano buforem PBS. Końcowo ciałka inkluzyjne zawieszono w buforze PBS porcjowano i zamrażano w -20°C do czasu dalszych analiz.
Analiza ciałek inkluzyjnych izolowanych z E. coli Z0526
Obecność frakcji ciałek inkluzyjnych zawierających rH5 potwierdzono poddając próby rozdziałowi elektroforetycznemu w 15% żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE). Białka wizualizowano barwnikiem Coomassie Brillant Blue G. Obrazy rozdziałów elektroforetycznycłi prób izolowanych ciałek inkluzyjnych przedstawiono na Fig. 2.2.
P r z y k ł a d 3 Renaturacja i oczyszczanie hemaglutyniny H5 (17-522 aa, ARRRKKR) z bakteryjnego systemu ekspresji (rH5-E. coli)
Wyizolowane ciałka inkluzyjne rozpuszczano w buforze DRCI o składzie: 50 mM TrisHCl pH 8,0; 8 M mocznik; 10 mM beta-merkaptoetanol; 0,01% Triton X-100. Rozpuszczanie ciałek inkluzyjnych prowadzono przez 1-2 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie roztwór wirowano, a następnie filtrowano przez filtry 0,2 μm. Na tym etapie stężenie białka, oznaczane metodą Bradforda (Bradford, 1976), wynosiło 5-6 mg/ml.
PL 235 555 B1
Roztwór białka, uzyskiwany w wyniku rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych, nanoszono na kolumnę o pojemności 10 ml wypełnioną złożem DEAE Sepharose Fast Flow firmy Amersham Pharmacia Biotech AB. Kolumnę ze złożem równoważono buforem kalibracyjnym o składzie: 50 mM TrisHCl pH 8,0; 6 M mocznik; 0,1% Triton Χ-100. Białka niezwiązane do złoża wymywano buforem kalibracyjnym. Wymycia białek związanych do złoża dokonywano buforem elucyjnym o składzie: 50 mM TrisHCl pH 8,0; 6 M mocznik; 800 mM NaCl. Zbierano frakcje zawierające rH5-E. coli. Stężenie eluowanego białka oznaczano metodą Bradforda. Przykładowy chromatogram rozdziału białek na tym etapie przedstawia Fig. 4a.
Białko wyeluowane ze złoża DEAE Sepharose Fast Flow renaturowano metodą rozcieńczeń w buforze BR o składzie: 40 mM TrisHCl pH 8,0; 100 mM NaCl. W tej metodzie renaturacji białko rozcieńczano do stężenia 0,07-0,09 mg/ml, a następnie renaturację kontynuowano przez 15-16 h w 4°C z mieszaniem. Po zakończonej renaturacji roztwór filtrowano przez filtry 0,4 gm, a następnie oznaczano stężenie białka metodą Bradforda. Na tym etapie straty białka wynosiły ok. 1-2%, co czyni opracowaną metodę renaturacji szczególnie wydajną. Roztwór białka po renaturacji nanoszono na kolumnę o pojemności 7 ml wypełnioną złożem Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub firmy Amersham Pharmacia Biotech AB. Kolumnę ze złożem równoważono buforem kalibracyjnym o składzie: 40 mM TrisHCl pH 8,0; 100 mM NaCl. Białka niezwiązane do złoża wymywano buforem kalibracyjnym, wymycia białek związanych do złoża dokonywano woda dejonizowaną. Zbierano frakcje zawierające rH5-E. coli. Stężenie eluowanego białka oznaczano metodą Bradforda. Przykładowy chromatogram rozdziału białka na tym etapie przedstawia Fig. 4b.
Do wyeluowanego roztworu białka dodawano 1 M TrisHCl pH 8,0 do stężenia końcowego 40 mM oraz inhibitory proteaz (Sigma, Nr kat. P8430) według zaleceń producenta, następnie roztwór białka filtrowano przez filtry 0,2 gm i oznaczano stężenie białka metodą Bradforda. Otrzymany w wyżej opisany sposób preparat rH5-E. coli przechowywano w 4°C.
Wszystkie etapy oczyszczania mogą być realizowane w zakresie temperatur od 4-24°C.
P r z y k ł a d 5 Analiza oczyszczonej i renaturowanej rH5-E. coli
Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE)
Po każdym etapie uzyskiwania końcowego preparatu rH5-E. coli zbierano próby, których skład analizowano metodą nieciągłej elektroforezy w warunkach denaturujących SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Elektroforezę białek w żelu poliakryloamidowym z detergentem SDS prowadzono w nieciągłym systemie buforowym w układzie dwóch żeli poliakryloamidowych (3,5% żel zagęszczający pH 6,8 i 15% żel rozdzielający pH 9,2). Przykład jednej z takich analiz przedstawia Fig. 5.1.
Elektroforeza chipowa Bioanalyzer 2100
Ilościowy skład uzyskanego preparatu rH5-E. coli był badany przy pomocy Bioanalizatora Agilent 2100 firmy Agilent Technologies z użyciem chipów o podwyższonej czułości High Sensitivity Protein 250 kit. Analiza została wykonana zgodnie z załączonym protokołem producenta. Metoda ta jest w stanie wykryć w badanej próbie białka o masach w zakresie 10-250 kDa, w stężeniach od 1 pg/gl.
Uzyskane tą metodą wyniki wskazują na 75-85% zawartość rH5-E. coli w ostatecznym produkcie białkowym. Przykładowy wynik analizy jakościowej końcowych preparatów rH5-E. coli ilustruje Fig. 5.2 i Tab. 1.
PL 235 555 Β1
Tabela 1
| Masa [kDa] | Stężenie [pg/μΐ] | Pole powierzchni piku | Zawartość [%] | Uwagi | |
| 1 | 5,0 | 0,0 | 14 461,0 | 0,00 | Dolny Maker |
| 2 | 10,0 | 28,3 | 24,5 | 1,22 | |
| 3 | 18,5 | 200,4 | 173,3 | 8,60 | |
| 4 | 24,7 | 115,9 | 100,2 | 4,97 | |
| 5 | 39,8 | 60,4 | 52,3 | 2,59 | |
| 6 | 42,8 | 22,8 | 19,8 | 0,98 | |
| 7 | 48,5 | 32,7 | 28,3 | 1,40 | |
| 8 | 58,1 | 1 823,5 | 1 577,1 | 78,23 | Monomer HA |
| 9 | 114,3 | 46,8 | 40,5 | 2,01 | Dimer HA |
Spektrometria mas (MS)
Dokładną masę hemaglutyniny rH5-E. coli określano przy pomocy spektrometru mas MALDI TOF/TOF MDS SCIEX 4800 Plus firmy Applied Biosystems z wykorzystaniem Matryca CHCA tj. a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (Fluka 70990-1G-F).
Masa cząsteczkowa rH5-E. coli, wyznaczona przy użyciu MS, wynosi 56,7 kDa (Fig. 5.3).
Przeciwciała do badań antygenowości rH5-E. coli
Badania antygenowości oczyszczonej i renaturowanej HA (17-522 aa, ARRRKKR), otrzymanej metodą nadekspresji w bakteriach E. coli (rH5-E. coli), przeprowadzono przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych przeciwko HA H5 AIV. Przeciwciała monoklonalne (Mab) pochodziły z firm: Acris Antibodies (5 klonów), ABR/Thermo Scientific (1 klon) i USBiological (3 klony). Mab otrzymano stosując jako immunogeny oczyszone AIV H5N1 (8 klonów) lub rekombinowaną HA AIV H5N1 szczepu A/Vietnam/1203/04 (1 klon). Zgodnie ze specyfikacjami producentów, przeciwciała opisane dalej jako Mab 1-2 i 6-9, reagują z wirusami grypy: H5N1, H5N2 i H5N9, z HA H5 w teście HI i nie reagują krzyżowo z hemaglutyninami serotypu innego niż H5. Specyficzność pozostałych klonów Mab jest opisywana jako zdolność rozpoznawania antygenu H5 w próbach wirusowych (Mab 3) lub w teście HI (Mab 5). Według informacji producenta, przeciwciała, oznaczone dalej jako Mab 4, są specyficzne wobec HA szczepu A/Vietnam/1203/04 (H5N1) AIV, reagują z wirusami grypy H5N1 różnych szczepów (kłady, podkłady) i nie dają reakcji krzyżowych z hemaglutyninami innych podtypów. Specyfikacje dla wszystkich użytych Mab wskazują, że przeciwciała rozpoznają epitopy konformacyjne. W oznaczeniach immunoreaktywności użyto również poliklonalne (Pab) przeciwciała przeciwko podjednostce HA-1 i HA-2 HA H5. Przeciwciała, opisane dalej jako Pab 1 i Pab 2, uzyskano stosując jako immunogeny, odpowiednio: HA-1 (1-345 aa) szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) i fragment podjednostki HA-2 (347-523 aa) szczepu A/VietNam/1203/2004(H5N1) (Immune Technology Corp.). Można spodziewać się, że Pab przeciwko HA będą rozpoznawały zarówno epitopy konformacyjne jak i liniowe białka.
W celu oznaczenia specyficzności Mab i Pab, przeznaczonych do badań właściwości rH5E. coli, przeprowadzono badania ich reaktywności z dostępnymi komercyjnie rekombinowanymi hemaglutyninami różnych szczepów AIV. W oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1), w bakulowirusowym systemie ekspresji wytworzono fragment 17-530 aa białka z delecją miejsca cięcia (ARRRKKR) i dołączonym na C-końcu ogonem histydynowym - 6xHis (Oxford Expression Technologies). Hemaglutyniny 5 szczepów H5N1 i 1 szczepu H5N2 AIV, użyte w przeprowadzonych testach, wyprodukowano w ssaczym systemie ekspresji bez sekwencji sygnałowej, domeny transbłonowej i cytoplazmatycznej białka (Immune Technology Corp.). Antygen stanowiły fragmenty HA (17-530 aa, 18-530 aa lub 19-506 aa), zawierające podjednostkę HA-1 i część podjed
PL 235 555 B1 nostki HA-2. W 4 z 5 hemaglutynin usunięto region cięcia (ARRRKKR) i białka te, zgodnie ze specyfikacją, występują w większości w formie trimerów/oligomerów. Oligomeryzacja wyprodukowanych antygenów upodabnia je do HA w otoczce wirusa, gdzie białko występuje w postaci trimerów.
W panelu hemaglutynin, przeznaczonych do badań reaktywności przeciwciał przeciwko H5, znalazły się również rekombinowane fragmenty HA odpowiadające podjednostce HA-1 (Immune Technology Corp.), która w natywnym białku zawiera istotne epitopy neutralizujące białka i charakteryzuje się większą zmiennością sekwencji niż podjednostka HA-2. Rekombinowane HA-1 wybranych szczepów wirusa H5N1, były eksprymowane w komórkach ssaczych z (1-345 aa) lub bez (17-346 aa) sekwencji sygnałowej. Konformacja fragmentów HA, odpowiadających podjednostce HA-1, nie była specyfikowana. Wszystkie rekombinowane hemaglutyniny, uzyskane w ssaczym systemie ekspresji, zawierały ogon histydynowy - 6xHis.
Badania specyficzności Mab i Pab wobec rekombinowanych hemaglutynin różnych szczepów wirusa grypy o serotypie H5 przeprowadzono metodą ELISA przy użyciu płytek Ni-NTA (Qiagen). Na płytki nakładano białka HA rozcieńczone w 1% BSA/PBS do stężenia 1 μg/ml i inkubowano w temperaturze 2-8°C w ciągu nocy. W celu kontroli poziomu niespecyficznego wiązania przeciwciał, część dołków płytki napełniano 1% BSA/PBS i inkubowano równolegle z dołkami opłaszczonymi antygenami. Na płytki nakładano Mab i Pab przeciwko H5, rozcieńczone do stężenia 1 μg/ml w 2% BSA/PBS i inkubowano w ciągu nocy, w temperaturze 2-8°C. Do wywołania płytki stosowano przeciwciała poliklonalne przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec całej cząsteczki, wyznakowane HRP (Sigma) lub wyznakowane HRP przeciwciała monoklonalne przeciwko króliczym przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ (Sigma). Wtórne przeciwciała rozcieńczano 1:1000 przy użyciu 1% BSA/PBST i inkubowano na płytkach w temperaturze pokojowej w ciągu 45 minut. TMB (Sigma) stosowano jako substrat peroksydazy chrzanowej. Reakcję hamowano po 30 minutach przy użyciu 1,25 M roztworu H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm. Test ELISA nie był optymalizowany dla poszczególnych antygenów i przeciwciał.
Wyniki badań reaktywności przeciwciał z rH5 różnych szczepów AIV o serotypie H5 przedstawiono w Tab. 2 wraz z danymi dotyczącymi użytych hemaglutynin (EpiFluDatabase, GenBank Accession No., fragment HA, system ekspresji do produkcji białek, producent). Homologię hemaglutynin, zamieszczoną w Tab. 2, wyznaczono względem HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1) dla białka pełnej długości (1-568 aa) oraz dla podjednostki HA-1 (17-340 aa). Wykorzystane w badaniach hemaglutyniny charakteryzowała zróżnicowana homologia z HA polskieg o izolatu AIV - od bardzo wysokiej, jak w przypadku hemaglutynin szczepów H5N1 AIV: A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05 i A/chicken/India/NIV33487/2006 do najniższej, jaką wykazuje HA szczepu H5N2 AIV: A/American green-winged teal/California/HKWF609/2007.
PL 235 555 Β1
Tabela 2
| Lp | Homologia identyczne/bad ane % | Mab przeciwko HA H5 (Mab * Acris Antibodies, **ABR/Th Pab przeciwko podjednostkc ****lmmune Technology Cor | 1-9) srmo Scientific, ***USBiological >m: HA-1 (Pab 1), HA-2 (Pab 2) p. | |||||||||
| HA 1-568 aa | HA-1 17340 aa | Mab 1* | Mab 2* | Mab 3** | Mab | Mab | Mab 6* | Mab 7* | Mab 8*** | Pab ή | Pab 2*·** | |
| 1 | 568/5 68 100% | 324/3 24 100% | >4 | >4 | >4 | 0,8 | >4 | >4 | 3,6 | 3,8 | 0,2 | 0,1 |
| 2 | 562/5 66 99% | 322/3 24 99% | >4 | >4 | >4 | >4 | >4 | >4 | >4 | >4 | 1,1 | 2,2 |
| 3 | 564/5 68 99% | 322/3 24 99% | >4 | >4 | >4 | >4 | >4 | >4 | >4 | >4 | 1,1 | 2,1 |
| 4 | 549/5 68 96% | 308/3 24 99% | >4 | >4 | >4 | >4 | >4 | > 4 | 0,3 | 0,2 | 1,3 | 1,6 |
| 5 | 522/5 56 93% | 300/3 24 92% | >4 | >4 | >4 | >4 | 1,4 | 0,0 | 0,3 | 0,1 | 1,1 | 1,4 |
| 6 | 506/5 68 89% | 285/3 24 87% | >4 | >4 | >4 | >4 | 3,4 | >4 | 0,3 | 0,2 | 0,3 | 0,5 |
| 7 | - | 308/3 24 99% | > 4 | > 4 | > 4 | > 4 | 3,8 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,2 | 0,1 |
| 8 | - | 303/3 24 93% | >4 | >4 | >4 | >4 | 0,6 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,2 | 0,1 |
| 1 | HA (H5 EPI156 HA (17Techno | N1) (A/swan/Poland/305-135V08/2006), Epi FI u Database Accession No. 789 530 aa, ARRRKKR, 6xHis) - bakulowirusowy (Oxford Expression ogies) | ||||||||||
| 2 | HA (H5N1) (A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05), Genbank Accession No. ABE68927 HA (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis) - ssaczy (Immune Technology Corp.) | |||||||||||
| 3 | HA (H5N1) (A/chicken/lndia/NIV33487/2006), Genbank Accession No. ABG45850 HA (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis) - ssaczy (Immune Technology Corp.) | |||||||||||
| 4 | HA (H5N1) (A/Vietnam/1203/2004), Genbank Accession No. AAW80717 HA (18-530 aa, ARRRKKR, 6xHis) - ssaczy (Immune Technology Corp.) | |||||||||||
| 5 | HA (H5N1) (A/goose/Guiyang/337/2006), Genbank Accession No. ABJ96698 HA (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis) - ssaczy (Immune Technology Corp.) | |||||||||||
| 6 | HA (ATM) (H5N2), Genbank Accession No. ACF47563 HA (19-506 aa, ARRRKKR, 6xHis) - ssaczy (Immune Technology Corp.) | |||||||||||
| 7 | HA1 (H5N1) (A/Vietnam/1203/2004), Genbank Accession No. AAW80717 HA-1 (1-345 aa, 6xHis) - ssaczy (Immune Technology Corp.) | |||||||||||
| 8 | HA1 (H5N1) (A/Hong Kong/483/97), Genbank Accession No. AAC32099 HA-1 (17-346 aa, 6xHis) - ssaczy (Immune Technology Corp.) |
Przeciwciała monoklonalne 1-5 wiązały się ze wszystkimi użytymi w teście rH5 (17-530 aa, ± ARRRKKR) oraz rHA-1 (1-345 aa, 17-346 aa) z ssaczego systemu ekspresji, przy czym Mab 1-4 rozpoznawały wszystkie antygeny z wysokim powinowactwem (A450 > 4). Przeciwciała monoklonal
PL 235 555 B1 ne 6-8 wykazały specyficzność wobec niektórych rH5-ssaczych, w tym wobec HA o wysokiej homologii z HA izolatu polskiego AIV. Większość rH5-ssaczych, związanych na płytce Ni-NTA, była wykrywana przez przeciwciała poliklonalne (Pab 1,2). Siedem spośród ośmiu testowanych Mab rozpoznawało rH5 (17-530 aa, ARRRKKR) z bakulowirusowego systemu ekspresji z wysokim powinowactwem. Reaktywność Mab 4, Pab 1 i Pab 2 z rH5- bakulowirusowym była znacznie niższa niż z białkami o podobnej długości z ssaczego sytemu ekspresji, co było prawdopodobnie efektem różnic w wiązaniu tych antygenów na płytkach Ni-NTA.
Wyniki badań imunoreaktywności przeciwciał monoklonalnych (Mab) i poliklonalnych (Pab) z rH5 i rHA-1 (Tab. 2), uzyskanymi w eukariotycznym systemie ekspresji, łącznie z informacjami jakie zamieszczono w specyfikacjach użytych Mab, Pab i rH5, wskazują, że:
- Mab rozpoznają hemaglutyniny o cechach natywnego białka, przez co mogą być wykorzystane w badaniach konformacji rH5,
- Mab rozpoznają odmienne epitopy HA, co umożliwia sprawdzenie przy ich zastosowaniu różnych determinant antygenowych rH5,
- większość Mab ma zdolność hamowania aglutynacji erytrocytów przez HA H5, stąd mogą być wykorzystane w badaniach antygenu na obecności epitopów istotnych dla indukcji przeciwciał typu HI, co z kolei pozwala ocenić potencjał szczepionkowy rH5,
- niektóre Mab wykazują cechy przeciwciał specyficznych wobec serotypu H5 hemaglutyniny - ich użycie w badaniach rH5 pozwala sprawdzić, czy istotne neutralizujące epitopy HA są zachowane w rH5 a przez to czy otrzymany antygen jest wartościowym immunogenem,
- Mab o ograniczonej specyficzności wobec hemaglutynin różnych szczepów AIV, rozpoznają rH5 o sekwencji identycznej lub zbliżonej do sekwencji szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006 (H5N1), przez co mogą być użyte w badaniach rH5-E. coli, którą wytworzono w oparciu o sekwencję HA polskiego izolatu AIV,
- Mab 4, Pab 1 i Pab 2 różnicują rH5 w sposób niezależny (Mab 4) lub tylko częściowo zależny (Pab 1, 2) od sekwencji HA, stąd mogą być wykorzystane w badaniach porównawczych antygenów różnego pochodzenia.
Oznaczenia immunoreaktywności przeciwciał przeciwko HA H5 z rH5 o zróżnicowanej homologii, potwierdziły przydatność przetestowanych Mab i Pab w badaniach właściwości rH5-E. coli i uzasadniają interpretację uzyskanych wyników.
Antygenowość rH5-E. coli
Badania właściwości rH5-E. coli przy użyciu panelu Mab i Pab przeciwko HA H5 o specyficzności opisanej powyżej przeprowadzono w obecności dwóch antygenów referencyjnych. Jednym z nich był fragment H5 (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis), wytworzony w bakulowirusowym systemie ekspresji (Oxford Expression Technologies) w oparciu o sekwencję HA tego samego szczepu AIV co rH5-E. coli (A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1)). Drugim antygenem referencyjnym był fragment (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis) HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1), wytworzony w ssaczym systemie ekspresji (Immune Technology Corp.). Sekwencja HA szczepu Qinghai była najbardziej zbliżona do HA polskiego izolatu AIV wśród dostępnych komercyjnie HA, wyprodukowanych w ssaczym systemie ekspresji. Homologia białek mierzona ilością aminokwasów identycznych wynosi 99%, przy czym zamiana konserwatywna aminokwasów występuje w sekwencji sygnałowej, natomiast pozostałe 3 zamiany mają charakter semikonserwatywny i występują w podjednostkach HA-1 i HA-2 białka. Zgodnie ze specyfikacją, białko, oczyszczone do przynajmniej 95%, występuje w większości w formie trimerów/oligomerów. W przeciwieństwie do rH5-E. coli, hemaglutyniny referencyjne produkowane w eukariotycznym systemie ekspresji są białkami glikozylowanymi, podobnie jak natywna HA AIV.
Badania antygenowości rH5-E. coli w obecności antygenów referencyjnych przeprowadzono metodą ELISA. Płytki MediSorp (NUNC) opłaszczano rH5-E. coli, rH5-ssaczą i rH5-bakulowirusową w stężeniach 5 μg/ml PBS, w temperaturze 2-8°C w ciągu nocy. Niespecyficzne miejsca wiązania na płytce blokowano przy użyciu 10% FBS/PBS. Na płytki nakładano Mab i Pab przeciwko H5 rozcieńczone do stężenia 1 μg/ml (Mab) lub 10 μg/ml (Pab) w 2% BSA/PBS. Płytki inkubowano w ciągu nocy, w temperaturze 2-8°C. Do wykrywania Mab związanych z antygenami stosowano wyznakowane HRP przeciwciała poliklonalne przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ (Sigma), które rozcieńczano 1:1000 w 2% BSA/PBS. Do wykrywania Pab związanych z antygenami stosowano wyznakowane HRP przeciwciała monoklonalne przeciwko króliczym przeciwciałom
PL 235 555 B1 klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ (Sigma), które rozcieńczano 1:1000 w 1% BSA/PBST. Wtórne przeciwciała inkubowano na płytkach w ciągu 1 godziny, w temperaturze 37°C. TMB (Sigma) stosowano jako substrat HRP. Reakcję hamowano po 30 minutach przy użyciu 0,5 M roztworu H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Badania rH5-E. coli wykazały, że HA z bakteryjnego systemu ekspresji jest rozpoznawana przez wszystkie użyte przeciwciała, podobnie jak hemaglutyniny referencyjne (Fig. 5.4). Różnice immunoreaktywności przeciwciał przeciwko H5 z rekombinowanymi białkami obserwowano w wypadku, gdy zastosowano Mab 4 i Pab 2 (przeciwko podjednostce HA-2) jako przeciwciała wykrywające. Reaktywność tych przeciwciał z rH5 -E. coli, mierzona poziomem A450, była porównywalna do ich reaktywności z rH5 -ssaczą i wyższa niż z rH5-bakulowirusową. W oznaczeniach specyficzności Mab i Pab przeciwko H5 wobec rH5 z bakteryjnego (rH5-E. coli) i eukariotycznego systemu ekspresji (ssacza i bakulowirusowa rH5), wykonanych metodą ELISA w sposób opisany powyżej, nie stwierdzono, żeby glikozylacja białka miała wpływ na reaktywność użytych przeciwciał z hemaglutyninami. Wyniki badań HA (17-522 aa, ARRRKKR) z bakteryjnego systemu ekspresji - rH5-E. coli (Fig. 5.4), które przeprowadzono przy użyciu przeciwciał o uprzednio określonym profilu specyficzności (Tab. 2) równolegle z rH5-ssaczą (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis) o cechach natywnego antygenu, wskazują, że rH5-E. coli ma właściwości HA H5. W wytworzonym białku zachowane są kluczowe dla HA szczepionkowej neutralizujące epitopy serotypowo-specyficzne oraz epitopy wiążące przeciwciała typu HI.
Test hemaglutynacji (HA)
Hemaglutynina o prawidłowej konformacji ma zdolność oligomeryzacji, natywnie występując w postaci trimerów. Takie kompleksy białkowe mają właściwość aglutynowania erytrocytów, co jest wykorzystywane w teście hemaglutynacji (HA). Erytrocyty, które ulegają aglutynacji nie opadają na dno, tylko tworzą jednolitą zawiesinę. Erytrocyty, które nie ulegają aglutynacji szybko opadają tworząc wyraźną czerwoną kropkę na dnie probówki. Test ten jest prostym sposobem na sprawdzenie jakości antygenu HA.
W teście zastosowano świeży preparat erytrocytów pobranych z krwi kurcząt SPF, uzyskany ze sterylnej hodowli w Zakładzie Chorób Drobiu w Państwowym Instytucie Weterynaryjnym - Państwowym Instytucie Badawczym (PIWet-PIB) w Puławach. Test hemaglutynacji wykonano z użyciem 0,5% zawiesiny kurzych erytrocytów w PBS na 69 dołkowych płytkach V-dennych firmy Cellstar. Do każdego dołka dodano 50 μl PBS, następnie odpowiednią ilość antygenu i dopełniono do 100 μl PBS. Następnie do każdego dołka dodano 50 μl 0,5% zawiesiny kurzych erytrocytów w PBS i delikatnie wymieszano przez pipetowanie. Płytkę inkubowano w 20°C przez 45 min., po tym czasie odczytywano wynik. Jako kontrole pozytywną użyto wirus AI - H5N2 (x-OvO). Kontrolą negatywną były: 50 mM TrisHCl pH 8,0; 50 mM TrisHCl pH 8,0 z + 30 mM β-merkaptoetanol; PBS oraz zredukowane 30 mM β-merkaptoetanolem białko rH5-E. coli.
W celu porównania rH5-E. coli z hemaglutyninami z innych systemów ekspresji, w teście hemaglutynacji zbadano również rH5 HA (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis): tego samego szczepu AIV co rH5- E. coli (A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1)), wytworzoną w bakulowirusowym systemie ekspresji przez firmę Oxford Expression Technologies (OET) oraz szczepu AIV A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1), wyprodukowaną w ssaczym systemie ekspresji przez firmę Immune Technology Corp. (ITC). Hemaglutyniny badane w teście HA były również zastosowane jako antygeny referencyjne w opisanych powyżej badaniach antygenowości rH5-E. coli. Zgodnie ze specyfikacją, rH5 z ssaczego systemu ekspresji (ITC), o czystości przynajmniej 95%, występowała w większości jako trimer/oligomer.
Test HA wykonany z użyciem kurzych erytrocytów wykazał, że rH5-E. coli ma zdolność hemaglutynacji, podobnie jak rH5-bakulowirusowa i rH5-ssacza (Tab. 3). Do pełnej aglutynacji kurzych erytrocytów wymagane jest niższe stężenie białka rH5-E. coli niż HA z bakulowirusowego systemu ekspresji. Uzyskane wyniki wskazują, że otrzymane białko rH5-E. coli występuje przynajmniej częściowo w postaci oligomerów, co jest korzystną cechą HA szczepionkowej.
PL 235 555 Β1
Tabela 3
| rH5-system ekspresji | Ilość hemmaglutyniny w teście HA | ||||||
| 10 pg | 5 pg | 2,5 pg | 1 pg | 0,5 pg | 0,25 pg | 0,1 pg | |
| rH5-E.coli | + | + | 4- | + | + | - | - |
| rH5-E.coli zredukowany | - | - | - | - | - | - | - |
| rH5-BEVS (OET) | 4- | + | + | +/- | - | - | - |
| rH5-ssaczy (ITC) | 4* | 4- | 4' | + | 4 | + | 4* |
Przykład 6 Przygotowanie szczepionki zawierającej rH5-E. coli, immunizacja kurcząt oraz pobieranie prób do badań serologicznych
W celu oceny przydatności oczyszczonej i renaturowanej HA (17-522 aa, ARRRKKR), otrzymanej metodą nadekspresji w bakteriach E. coli (rH5-E. coli), jako antygenu szczepionkowego, opracowano kompozycję szczepionkową z użyciem rH5-E. coli oraz przeprowadzono badania immunizacyjne na kurczętach jako jednej z docelowych grup dla szczepień przeciwko ptasiej grypie.
Do przygotowania szczepionki przeciwko ptasiej grypie przy użyciu rH5-E. coli wykorzystano wodorotlenek glinu jako adiuwant. Zawartość białka w preparatach rH5-E. coli, przeznaczonych do przygotowania szczepionki, oznaczano metodą Bradforda. Zawartość HA w preparatach rH5-E. coli szacowano na podstawie ich składu ilościowego, który badano przy użyciu chipów o podwyższonej czułości High Sensitivity Protein 250 kit i Bioanalizatora Agilent 2100 firmy Agilent Technologies. Wynik oznaczenia dla jednego z preparatów białka przedstawiono w Tab. 1. Do przygotowania szczepionki stosowano preparat rH5-E. coli w ilości zapewniającej pożądane stężenie rH5 w dawce. Wodorotlenek glinu - 1,3% Alhydrogel (Brenntag) stanowił % objętości szczepionki. Preparat rH5-E. coli dodawano do żelu wodorotlenku glinu w PBS, wytrząsano na mieszadle vortex przy 2500 rpm w ciągu 5 minut, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 20 min. Po inkubacji szczepionkę ponownie wytrząsano na mieszadle vortex w ciągu 5 minut przy 2500 rpm. Szczepionkę przygotowano bezpośrednio przed szczepieniem.
Badania immunizacyjne przy użyciu rH5-E. coli przeprowadzono w produkcyjnych warunkach chowu na kurczętach typu mięsnego rasy Ross 308. Doświadczenia wykonano równolegle na 4 grupach zwierząt, oznaczonych A, B, C i K. Kurczęta grup: A, B i C, po 8 sztuk każda, poddawano szczepieniom, natomiast 15 kurcząt nie immunizowanych tworzyło kontrolną grupę K. Pierwszą immunizację wykonano w 7 dniu życia zwierząt. Kurczętom grupy A podano jedną , natomiast grupy B i C dwie dawki antygenu. Kurczęta grupy B były zaszczepione po raz drugi w 21 dniu życia tj. 2 tygodnie po podaniu I dawki, natomiast grupy C w 35 dniu życia tj. 4 tygodnie po podaniu I dawki. W immunizacji kurcząt stosowano jednakowe dla wszystkich grup dawki antygenu, podawane w ten sam sposób. Jedna dawka szczepionki zawierała 25 μg rH5-E. coli oraz wodorotlenek glinu j ako adiuwant. Szczepionkę podawano podskórnie w trzech miej scach na karku w obj ętości 200 μΙ.
W celu monitorowania odpowiedzi kurcząt na immunizację, pobierano krew od szczepionych zwierząt w 21, 35, 42 i 48 dniu życia. W ten sposób przygotowano próby do badań serologicznych z następujących etapów doświadczenia w poszczególnych grupach: w grupie A - 2, 4, 5 i 6 tygodni po immunizacji, w grupie B - 2 tygodnie po I oraz 2, 3 i 4 tygodnie po II immunizacji, natomiast w grupie C - 2 i 4 tygodnie po I oraz 1 i 2 tygodnie po II immunizacji. Próby pobrane równolegle od kurcząt nie szczepionych stanowiły materiał kontrolny. Krew pobraną z żyły skrzydłowej kurcząt pozostawiano do wykrzepienia w temperaturze pokojowej przez 1 h i 30 min., po czym przechowywano w temperaturze 2-8°C w celu obkurczenia skrzepu. Surowicę, otrzymaną przez odwirowanie skrzepu (5 000 x g, 10 min, 4°C), porcjowano i przechowywano w temperaturze -70°C do czasu analizy. Harmonogram immunizacji kurcząt oraz pobrań krwi od zwierząt szczepionych i kontrolnych był zgodny ze schematem A, który zamieszono poniżej.
PL 235 555 Β1
Schemat A immunizacji kurcząt rH5-E. coli oraz pobieranie prób do badań serologicznych.
Kurczęta typu mięsnego (Ross 308)
I dawka s.c.
pg rH5+AI(OH)3 Grupy: A, B, C
II dawka s.c.
pg rH5 + AI(OHh Grupa B
II dawka s.c.
2S pg rH5 + AI(OH)a Grupa C
1 2
Tygodnie życia
Krew Krew Krew Krew
Grupy: A, B, C, K
Surowice przygotowane w trakcie eksperymentów analizowano przy użyciu pośredniego i kompetycyjnego testu ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 AIV. Próby surowicy były badane również na aktywność hamowania aglutynacji erytrocytów (HI) przez homologiczny HPAIV H5N1 i heterologiczny LPAIV H5N2. Oznaczenia wykonano na próbach surowicy ze wszystkich pobrań krwi lub z krwi pobranej z wybranych etapów doświadczenia. Niektóre próby nie były analizowane we wszystkich testach ze względu na brak lub niewystarczającą ilość surowicy, co na figurach i w tabelach opisano jako n.d.
Przykład 7 Analiza odpowiedzi odpornościowej przy użyciu testów ELISA
Badania serologiczne prób pobranych w trakcie doświadczeń immunizacyjnych, opisanych w przykładzie 6, przeprowadzono przy użyciu testów ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 AIV: pośredniego (H5-ELISA) i kompetycyjnego (FLUAc H5, IDVet).
Pośredni test ELISA (H5-ELISA)
Pośredni test ELISA (H5-ELISA) skonstruowano z zastosowaniem rekombinowanej HA H5 (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis), homologicznej z antygenem szczepionkowym, którą wyprodukowano w bakulowirusowym systemie ekspresji (Oxford Expression Technologies). Poziom przeciwciał przeciwko HA był traktowany jako podstawowy wskaźnik odpowiedzi humoralnej kurcząt na szczepienie i immunnogenności rH5-E. coli.
W celu wykonania testu H5-ELISA, płytki MediSorp (NUNC) opłaszczano rH5 (17-530 aa, ARRRKKR, 6xHis) szczepu (A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1)) z bakulowirusowego systemu ekspresji (Oxford Expression Technologies) w stężeniu 3 μg/ml PBS albo napełniano PBS (kontrola niespecyficznego wiązania). Płytki inkubowano w temperaturze 2-8°C w ciągu nocy, po czym blokowano przy użyciu “Protein-Free T20 (PBS) Blocking Buffer” (Pierce/Thermo Scientific) w ciągu 1 h, w temperaturze pokojowej. Surowice kurcząt rozcieńczano 1:200 przy użyciu 2% BSA/PBSS (bufor fosforanowy zawierający 0,3 M NaCI + KCI). W celu wyznaczenia miana punktu końcowego, łączono surowice z poszczególnych pobrań krwi badanej grupy kurcząt, po czym rozcieńczano seryjnie w 2% BSA/PBSS. Płytki z próbami surowicy i próbami kontrolnymi - BLK (2% BSA/PBSS) inkubowano w temperaturze 2-8°C w ciągu nocy. Wywoływanie płytek obejmowało 1-godzinną inkubację w 37°C z wyznakowanymi HRP przeciwciałami przeciwko przeciwciałom klasy IgY kurcząt, specyficznymi wobec fragmentu Fc (Pierce/Thermo Scientific), które rozcieńczanio 1:13 000. Płytki płukano buforem PBS zawierającym Tween 20 w stężeniu 0,05% (PBST) albo 0,1% (PBSTT). Bufor PBSTT używano do płukania płytek wyłącznie po inkubacji z próbami surowicy. Po opłaszczeniu stosowano 4, po blokowaniu 2 a między pozostałymi etapami procedury 5 cykli płukania. Reakcję barwną peroksydazy chrzanowej wywoływano przy
PL 235 555 B1 użyciu TMB (Sigma). Płytkę inkubowano z substratem w ciągu 30 min, po czym dodawano 0,5 M roztwór H2SO4 w celu zahamowania reakcji HRP. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Wartości A450 uzyskane dla prób BLK odejmowano od wartości A450 odczytanych dla prób surowicy. Wyniki oznaczeń surowic na płytkach nie opłaszczonych rH5 stanowiły kontrolę poziomu niespecyficznego wiązania surowic (tło). Próby surowicy uznawano za H5-dodatnie, jeśli wartość A450 dla tych prób była wyższa niż średnia wartość A450 dla prób grupy kontrolnej powiększona o 2 wartości odchylenia standardowego (cut off). Miano punktu końcowego zdefiniowano jako największe rozcieńczenie surowicy immunizowanych kurcząt dające wartość absorpcji 4-krotnie wyższą niż średnia wartość absorpcji prób kontrolnych.
Wyniki testu H5-ELISA
Badania odpowiedzi humoralnej kurcząt na podskórne podanie jednej 25-Lig dawki rH5-E. coli w obecności wodorotlenku glinu, przeprowadzone przy użyciu testu H5-ELISA na próbach pobranych 2, 4, 5 i 6 oraz 2 lub 2 i 4 tygodnie po immunizacji w grupach A, B i C kurcząt, wykazały obecność przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 w 200-krotnie rozcieńczonych surowicach 23 z 24 (96%) immunizowanych zwierząt (Fig. 6.1, 6.2, 6.3). Wysoka wykrywalność antygenowo-specyficznych przeciwciał w znacznie rozcieńczonych próbach oznacza, że szczepionka rH5-E. coli ma dobre właściwości uczulające.
U 6 z 8 (75%) zwierząt grupy A, szczepionych jednokrotnie rH5-E. coli, poziom przeciwciał przeciwko H5 był najwyższy po 2 tygodniach od immunizacji (Fig. 6.1). Poziom H5-specyficznych przeciwciał w surowicach tych zwierząt obniżał się w każdym kolejnym badaniu tak, że 5 i 6 tygodni po immunizacji przeciwciała nie były wykrywane w surowicach większości kurcząt tej grupy przy rozcieńczeniu prób 1:200. Poziom przeciwciał specyficznych wobec H5, najwyższy po 2 tygodniach od podania pierwszej dawki antygenu i obniżający się między 2 a 4 tygodniem po immunizacji zaobserwowano również w grupie C kurcząt (Fig. 6.3). Prawidłowość ta dotyczyła wszystkich zwierząt, dla których wykazano seropozytywność po pierwszym szczepieniu (7/7). Podobieństwo kinetyki pierwotnej odpowiedzi odpornościowej kurcząt na podanie szczepionki zwierającej rH5-E. coli jest korzystne dla optymalizacji i standaryzacji szczepień. Badania immunizacyjne kurcząt przy użyciu jednej 25 ng dawki rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta (Fig. 6.1, 6.3) wykazały dobre właściwości uczulające użytej szczepionki, ale też udowodniły, że jednokrotne szczepienie zwierząt jest niewystarczające do wywołania na tyle silnej odpowiedzi humoralnej, by zapewnić odporność zwierząt na zakażenie AIV.
Badania serologiczne kurcząt po podskórnej immunizacji uczulającej z zastosowaniem 25-Lg rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta, przeprowadzone przy użyciu testu H5-ELISA na próbach pobranych bezpośrednio przed podaniem II dawki antygenu tj. 2 lub 4 tygodnie po pierwszym szczepieniu kurcząt grupy B i C, wykazały wykrywalność przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 w surowicach, rozcieńczonych 1:200, na poziomie, odpowiednio: 100% i 50% (Fig. 6.2, 6.3). Dwa tygodnie po podaniu II dawki rH5-E. coli kurczętom grupy B i jeden tydzień po powtórnej immunizacji kurcząt grupy C, obserwowano u wszystkich szczepionych zwierząt silny wzrost poziomu przeciwciał w surowicy, typowy dla wtórnej odpowiedzi odpornościowej (Fig. 6.2, 6.3). Wysoki poziom przeciwciał przeciwko H5 w surowicach zwierząt szczepionych 2-krotnie, znacznie przewyższający poziom przeciwciał wyindukowanych przez jednokrotne szczepienie, obserwo wano przez cały okres badań. U kurcząt grupy C nieznaczne wahania poziomu przeciwciał w surowicy były obserwowane w ciągu 2 tygodni po podaniu dawki wzmacniającej (Fig. 6.3). U kurcząt grupy B poziom przeciwciał przeciwko H5 w surowicy obniżał się stopniowo między 2 a 4 tygodniem od podania II dawki antygenu (Fig. 6.2).
Oznaczenia miana punktu końcowego surowic przygotowanych 2, 3 i 4 tygodnie po podaniu II dawki antygenu kurczętom grupy B oraz 1 i 2 tygodnie po po podaniu II dawki antygenu kurczętom grupy C, wykazały, że rH5-E. coli indukuje wysokie miano przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 przy powtórnym podskórnym podaniu antygenu w obecności wodorotlenku glinu (Fig. 6.4). Najwyższe średnie miano tych przeciwciał, wynoszące 1:129 200, oznaczono w surowicach, pobranych 1 tydzień po powtórnej immunizacji od kurcząt grupy C, które szczepiono 2-krotnie w odstępie 4 tygodni. Między 1 i 2 tygodniem po powtórnym szczepieniu tej grupy zwierząt, średnie miano przeciwciał specyficznych wobec H5 obniżyło się 1,6-krotnie. W grupie B kurcząt, szczepionych 2-krotnie w odstępie 2 tygodni, miano punktu końcowego surowic pobranych 2 tygodnie po podaniu dawki wzmacniającej, wynosiło 1:28 300 i było 2,8-krotnie niższe niż oznaczone 2 tygodnie po szczepieniu wzmacniającym
PL 235 555 B1 miano surowic kurcząt grupy C. Trzy tygodnie po powtórnej immunizacji, miano przeciwciał przeciwko H5 w surowicach grupy B kurcząt obniżyło się 2, 3 razy. Znacznie niższe miano tych przeciwciał, wynoszące 1:1 600, oznaczono w surowicach grupy B zwierząt 4 tygodnie po immunizacji.
Kompetycyjny test ELISA (FLUAc H5, IDVet)
Do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 wykorzystano również komercyjny test ELISA: „ID Screen® Influenza H5 Competition ELISA kit” (FLUAc H5, IDVet). Test stosowany jest w diagnostyce zakażenia ptaków AIV o serotypie H5. Wyniki tego testu były traktowane jako wskaźnik indukcji przeciwciał rozpoznających przypuszczalnie serotypowy, konformacyjny epitop neutralizujący AIV. Test FLUAc H5, obok testów HI, umożliwił funkcjonalną ocenę antysurowic wytworzonych w wyniku szczepienia rH5-E. coli i potencjał szczepionkowy HA (17-522 aa, ARRRKKR), wyprodukowanej w bakteryjnym systemie ekspresji.
Test FLUAc H5 wykonano zgodnie z instrukcją producenta (IDVet), stosując warunki zwiększające czułość testu (próby surowicy rozcieńczone 1:5, inkubowane na płytkach w ciągu nocy, w temperaturze 2-8°C). Każda analiza prób surowicy kurcząt immunizowanych rH5-E. coli spełniała wymogi walidacyjne testu. Poziom kompetycji określano przez obliczenie stosunku średnich wartości absorpcji analizowanych prób przy λ = 450 (A450) do średniej wartości A450 kontroli negatywnej (NC). Wartości kompetycji prób surowicy wyrażono w procentach. Zgodnie z informacją producenta FLUAc H5, wartości kompetycji > 40%, między 35 i 40% i < 35% oznaczają, że próby są, odpowiednio: seroujemne, wątpliwe i serododatnie.
Wyniki testu FLUAc H5
Badania odpowiedzi humoralnej kurcząt grupy A na podskórne podanie 25 μg rH5-E. coli w obecności wodorotlenku glinu, które przeprowadzono przy użyciu testu FLUAc H5 na próbach zawierających najwyższy u poszczególnych kurcząt poziom przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 (Fig. 6.1), wykazały brak lub co najwyżej nieznaczną kompetycję analizowanych surowic (Tab. 4.1). Obliczone wartości kompetycji surowic tej grupy mieściły się w zakresie 73-103%. Dla 5 z 8 zaszczepionych kurcząt wykazano wartości kompetycji wyższe niż 90% a dla 3 pozostałych zwierząt niższe niż 90% (73% lub 82%). Żadna z przebadanych surowic nie mieściła się w grupie klasyfikowanej jako dodatnia, czy wątpliwa według kryteriów testu FLUAc H5.
Analiza serologiczna przeprowadzona przy użyciu testu FLUAc H5 na próbach pobranych 2, 3 i 4 tygodnie po immunizacji wzmacniającej od kurcząt grupy B, zaszczepionych podskórnie 2 razy w odstępie 2-tygodniowym 25-ug dawkami rH5-E. coli w obecności wodorotlenku glinu, wykazała zróżnicowany poziom kompetycji przebadanych surowic (Tab. 4.2). Obliczone wartości kompetycji prób surowicy kurcząt grupy B mieściły się w zakresie 47-97% (Tab. 4.2) i były przeważnie niższe niż te, które uzyskano w grupie kurcząt szczepionych jednokrotnie (Tab. 4.1). Żadna z przebadanych surowic grupy szczepionej 2 razy w odstępie 2 tygodni nie była dodatnia ani też wątpliwa według kryteriów klasyfikacyjnych testu FLUAc H5.
Wartości % kompetycji surowic poszczególnych zwierząt grupy B zwiększały się w kolejnych badaniach (Tab. 4.2). W konsekwencji zakres wartości kompetycji surowic, otrzymanych 2 tygodnie po immunizacji wzmacniającej (47-69%), przesuwał się w kierunku wyższych wartości wraz z upływem czasu od powtórnej immunizacji i wynosił 59-86% po 3 tygodniach oraz 72-97% po 4 tygodniach od podania II dawki antygenu. Wyniki badań, uzyskane przy użyciu testu FLUAc H5 (Tab. 4.2), wskazują na obniżanie się poziomu przeciwciał rozpoznających epitop przypuszczalnie serotypowospecyficzny w surowicach grupy B kurcząt w ciągu 4 tygodni po powtórnej immunizacji, co może być związane z obniżaniem się ogólnego poziomu przeciwciał przeciwko H5 w surowicach, które wykazał test H5-ELISA (Fig. 6.2).
PL 235 555 Β1
Tabela 4.1
| —-__FLUAc H5 ID | kompetycja % wynik | |
| A-1* | 82 | - |
| A-2* | 73 | - |
| A-3* | 92 | - |
| A-4* | 82 | - |
| A-5** | 103 | - |
| A-6* | 101 | - |
| A-7* | 102 | - |
| A-8*** | 103 | - |
| Grupa A | 73 -103 | - |
| 35% <kompetycja < 40% wątpliwe | 0/8 (0%) | |
| kom petycja < 35% serododatnie | 0/8 (0%) | |
| * 2 tygodnie po immunizacji rH * * 4 tygodnie po immunizacji “* 5 tygodni po immunizacji r | 5 H5 H5 |
Tabela 4.2
| Po 11 dawce rH5 | ||||||
| ^^TbUĄc H5 ID | 2 tygodnie | 3 tygodnie | 4 tygodnie | |||
| kompetycja % wynik | kompetycja % wynik | kompetycja % wynik | ||||
| B-1 | 69 | - | 68 | - | 91 | - |
| B-2 | 67 | - | 86 | - | 97 | - |
| B-3 | 48 | - | 63 | - | 73 | - |
| B-4 | n.d. | n.d. | 62 | - | 78 | - |
| B-5 | n.d. | n.d. | 68 | - | 84 | - |
| B-6 | 56 | - | 82 | - | 94 | - |
| B-7 | n.d. | n.d. | 59 | - | 72 | - |
| B-8 | 47 | - | 70 | - | 87 | - |
| Grupa B | 47 -69 | - | 59 - 86 | - | 72 -97 | - |
| 35% <kom petycja < 40% wątpliwe | 0/5 (0%) | 0/8 (0%) | 0/8 (0%) | |||
| kompetycja < 35% serododatnie | 0/5 (0%) | 0/8 (0%) | 0/8 (0%) | |||
| n.d. - nie oznaczono |
Badania przeprowadzone na próbach pobranych 1 i 2 tygodnie po immunizacji wzmacniającej od kurcząt grupy C, szczepionych 2 razy podskórnie przy użyciu 25 |_ig rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta w odstępie 4 tygodni, wykazały aktywność znacznej części analizowanych surowic w kompetycji z przeciwciałami testu FLUAc H5 (Tab. 4.3). Zakres wartości kompetycji surowic grupy C kurcząt wynosił 10-95% (Tab. 4.3) i obejmował wartości znacznie niższe niż te, które uzyskano w grupie B kurcząt, szczepionych 2-krotnie w odstępie 2 tygodni (Tab. 4.2). Wśród 14 przebadanych
PL 235 555 Β1 surowic grupy C, 7 prób wykazywało % kompetycji niższy niż 40% (Tab. 4.3), który wskazuje że próby są dodatnie lub wątpliwe według klasyfikacji testu. Próby te były pobrane od 5 z 8 przebadanych kurcząt, wśród których 3, zgodnie z kryteriami testu FLUAc H5, należy uznać za serododatnie (kompetycja < 35%). Seropozytywność pozostałych 2 kurcząt była wątpliwa, gdyż pobrane od nich próby surowicy wykazywały kompetycję na poziomie 37 i 38%.
U 3 z przebadanych kurcząt grupy C,% kompetycji surowicy obniżył się o 6-13% między 1 i 2 tygodniem od podania dawki wzmacniającej a u 3 innych zwiększył się w tym czasie o 4-9% (Tab. 4.3). Nieznaczne wahania poziomu przeciwciał w ciągu 2 tygodni po immunizacji wzmacniającej były obserwowane również w teście H5-ELISA do oznaczania ogólnego poziomu przeciwciał przeciwko H5 (Fig. 6.3). Wyniki badań surowic zwierząt szczepionych 2-krotnie rFI5-E. coli w odstępie 4-tygodniowym (Tab. 4.3) wskazują na potencjał użytej szczepionki do indukcji przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5, których miano może dorównać temu, jakie towarzyszy zakażeniu ptaków AIV.
Tabela 4.3
| Po II dawce rH5 | ||||
| 1 tydzień | 2 tygodnie | |||
| ^-ElJJAcH5 ID | kompetycja % wynik | kompetycja % wynik | ||
| C-1 | 38 | + | 25 | + |
| 0-2 | 34 | + | 43 | - |
| C-3 | 50 | - | 37 | ± |
| C-4 | 55 | - | n.d. | n.d. |
| C-5 | 10 | + | 14 | + |
| C-6 | 44 | - | 38 | + |
| C-7 | 95 | - | n.d. | n.d. |
| C-8 | 82 | - | 91 | - |
| Grupa C | 10-95 | +, ±, - | 14-91 | + + 3 ----5 |
| 35% <kompetycja < 40% wątpliwe | 1/8 (12,5%) | 2/6 (33%) | ||
| kompetycja < 35% serododatnie | 2/8 (25%) | 2/6 (33%) | ||
| n.d. - nie oznaczono |
Podsumowanie
Badania odpowiedzi humoralnej kurcząt typu mięsnego rasy Ross 308 na podskórne podanie jednej lub dwóch dawek szczepionki zawierającej 25 gg rH5-E. coli i wodorotlenek jako adiuwant, które przeprowadzono przy użyciu testów ELISA (H5-ELISA, FLUAc H5) wykazały, że:
- rekombinowana HA H5 (17-522 aa, ARRRKKR) z bakteryjnego systemu ekspresji - rH5-E. coli jest silnie immunogenna,
- szczepionka wykazuje dobre właściwości uczulające - wywołuje u kurcząt pierwotną odpowiedź humoralną o międzyosobniczo podobnej kinetyce, co jest korzystne dla optymalizacji i standaryzacji szczepień,
- dwie dawki szczepionki są niezbędne ale i wystarczające do wywołania silnej odpowiedzi humoralnej u wszystkich szczepionych kurcząt (H5-dodatnie/badane - 16/16),
- dwukrotna immunizacja kurcząt rH5-E. coli w odstępie 4 tygodni jest znacznie skuteczniejsza w indukcji przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 i przeciwciał przeciwko H5 współzawodniczących z przeciwciałami testu FLUAc H5 niż immunizacja w odstępie 2 tygodni,
- szczepionka indukuje przeciwciała rozpoznające przypuszczalnie konformacyjny epitop neutralizujący AIV specyficzny dla serotypu H5 HA; miano przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 może osiągać poziom, obserwowany w trakcie zakażenia zwierząt AIV.
PL 235 555 Β1
Przykład 8 Analiza odpowiedzi odpornościowej przy użyciu testów zahamowania hemaglutynacji (HI)
Próby surowicy pobrane w trakcie doświadczeń immunizacyjnych, opisanych w przykładzie 6, badano na obecność przeciwciał hamujących hemaglutynację (HI) przez AIV o serotypie H5. Miano przeciwciał typu HI w surowicach kurcząt oznaczano przy użyciu testów zahamowania hemaglutynacji, stosując jako antygeny homologiczny HPAIV H5N1 i heterologiczny LPAIV H5N2 oraz jednostkę zahamowania hemaglutynacji (HIU) 1:8. Testy HI, powszechnie stosowane w diagnostyce zakażenia wirusem grypy, umożliwiły funkcjonalną ocenę przeciwciał wytworzonych w wyniku szczepienia rH5-E. coli i ich potencjalnej zdolności do ochrony przed zakażeniem homologicznym i heterologicznym AIV. Zasadę testów HI oraz sposób ich przeprowadzenia opisano poniżej.
Hemaglutynina - białko występujące na powierzchni wirusów grypy - ma zdolność aglutynacji erytrocytów. Cecha ta jest podstawą testu identyfikacji izolatów wirusa grypy. W teście HI wykorzystuje się fakt, że specyficzne wiązanie przeciwciał do miejsc antygenowych na cząsteczce HA zmienia zdolność wiązania tego białka z receptorami na powierzchni erytrocytów uniemożliwiając aglutynację. Testy zostały wykonane zgodnie z obecnie obowiązującymi zaleceniami (Minta, 2008; Avian Influenza in: OIE Manuał of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2012).
Testy HI z użyciem wirusów Al
Przeprowadzono dwa testy HI, w których użyto wirusy Al serotypu H5 i antysurowice opisane w zestawieniu A.
Zestawienie A Wirusy i surowice użyte w testach HI
| ΙΙ1-ΪΙ5Νl, IIP Test III r. homologicznym IIPAIY II5N1 | Pochodzenie |
| Antygen HPAIV szczep A/turkey/Poland/35/07(H5Nl) | ZCHD PIWet-PIB |
| Kontrola Surowica anty HPAIY szczepu A/turkey/Poland/35/07(H5N1) | ZCHD |
| pozytywna | PIWet-PIB |
| Kontrola Surowica kurcząt SPF negatywna | AHLA |
PL 235 555 Β1
| H1-H5N2, LP | Test HI z heterologicznymLPAIY H5N2 | Pochodzenie |
| Antygen | LPAIV szczep A/turkey/Italy/80(H5N2) | x-OvO |
| Kontrola pozytywna | Surowica anty LPA1V szczepu A/turkey/ltaly/80(H5N2) | x-OvO |
| Kontrola negatywna | Surowica anty AIV szczepów: A/macaw/England/626/80(H7N7) A/mallard/Italy/4810-79/04(H7N4) | x-OvO |
| ZCHD PIWet-PIB | Zakład Chorób Drobiu Państwowy Instytut Weterynaryjny-Państwowy Instytut Badawczy, Puławy, Polska |
| AHLA | Animal Health and Veterinary Laboratories Agency, Waybridge, Wielka Brytania |
| x-OvO | x-OvO Limited, Dunfermline, Wielka Brytania |
Testy wykonywano na świeżym preparacie erytrocytów pobranych z krwi kurcząt SPF, uzyskanym ze sterylnej hodowli w ZCHD PIWet-PIB. Do każdego testu HI wyznaczano jednostkę hemaglutynacji (HAU). Każdy wykonany test HI uwzględniał 3 kontrole: kontrolę krwinek (kontrola wewnętrzna dla oznaczenia) czyli próby nie zawierające wirusa, kontrolę pozytywną oraz kontrolę negatywną zawierające surowice opisane w zestawieniu A. Za wynik pozytywny uznaje się efekt zahamowania hemaglutynacji oceniany wzrokiem w porównaniu do prób z kontroli krwinek. W obu przypadkach komórki nie hemaglutynują opadając swobodnie na dno studzienki na płytce 96-pozycyjnej o V-kształtnych dnach studzienek.
Na potrzeby oceny uzyskanych w wyniku szczepień surowic kurzych wykorzystano protokół z rozcieńczeniem surowicy począwszy od 1:8. Każda badana i kontrolna surowica miała swoją kontrolę krwinek celem wykluczenia potencjalnej obecności niespecyficznych inhibitorów w próbie. Korzystając z serii dwukrotnych rozcieńczeń badano zakres od 1:8 do 1:512. Próbki kolejnych rozcieńczeń badanych surowic o objętości 25 μΙ inkubowano z 4 jednostkami HA (25 μΙ) inaktywowanego AIV. Szczepy wirusów użyte w poszczególnych testach HI opisano w zestawieniu A. Po 25 minutach wstępnej inkubacji w temperaturze pokojowej dodawano 25 μΙ 1% zawiesiny kurzych erytrocytów. Wynik obserwowano po minimum 30 minutach inkubacji. Odwrotność najwyższego rozcieńczenia, które hamowało aglutynację kurzych erytrocytów określało miano HI badanych surowic. Za pozytywne uznawano próbki, które osiągnęły miano co najmniej 1:8. Za wynik wskazujący na protekcyjne działanie wyindukowanych przeciwciał uznano odczyt miana > 1:16, zgodnie z obowiązującymi wymaganiami dla szczepionek przeciwko grypie.
Wyniki testów HI
Badania odpowiedzi humoralnej kurcząt na podskórne podanie jednej (grupa A) albo dwóch 25-pg dawek rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu w odstępie 2- (grupa B) lub 4-tygodniowym (grupa C) przeprowadzone przy użyciu testów HI na próbach pobranych 2, 4, 5 i 6 oraz 2 lub 2 i 4 tygodnie po immunizacji w grupach kurcząt: A, B i C, wykazały silną zależność indukcji przeciwciał typu HI od schematu immunizacji rH5-E-coli (Tab. 5.1, 5.2, 5.3). W grupie A kurcząt, szczepionych jednokrotnie rH5-E. coli, oznaczono tylko 1 pozytywną próbę surowicy, która wykazywała miano najniższe z oznaczanych (1:8) i to wyłącznie w obecności homologicznego wirusa H5N1 (Tab. 5.1). Wśród prób pobranych od kurcząt grupy B, szczepionych 2-krotnie rH5-E. coli w odstępie 2 tygodni, wykryto 9 prób serododatnich z wirusem H5N1 o mianie HI 1:8 lub 1:16 oraz 2 próby serododatnie z wirusem H5N2 o mianie HI 1:8 (Tab. 5.2). Minimalne ochronne miano HI tj. 1:16 wykazano wyłącznie z homologicznym AIV i surowicami pobranymi po podaniu II dawki antygenu od 2 kurcząt grupy B.
PL 235 555 Β1
W grupie C kurcząt, szczepionych 2-krotnie rH5-E. coli w odstępie 4 tygodni, przebadano 32 próby testem HI z użyciem homologicznego i heterologicznego AIV i wykazano pozytywność, odpowiednio: 15 i 8 prób surowicy (Tab. 5.3). Surowice pobrane od wszystkich kurcząt grupy C były dodatnie w teście z wirusem H5N1 i/lub H5N2, przy czym miana HI surowic 5 kurcząt przekraczały wartość 1:8. Minimalny poziom ochronny przeciwciał typu HI w surowicy (miano 1:16) wykazano dla 2 immunizowanych kurcząt, pożądane (> 1:64) dla 2 innych kurcząt, natomiast u pozostałego zwierzęcia maksymalne miano HI wynosiło 1:32.
Tabela 5.1
| ID | HI AIV | Po immunizacji rH5 | ||||||
| 2 tygodnie | 4 tygodnie | 5 tygodni | 6 tygodni | |||||
| H5N1 HP | H5N2 LP | H5N1 HP | H5N2 LP | H5N1 HP | H5N2 LP | H5N1 HP | H5N2 LP | |
| A-1 | <8 | < 8 | n.d. | < 8 | <8 | < 8 | <8 | < 8 |
| A-2 | 8 | < 8 | <8 | < 8 | <8 | < 8 | <8 | < 8 |
| A-3 | <8 | < 8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | < 8 |
| A-4 | <8 | < 8 | <8 | < 8 | <8 | < 8 | <8 | < 8 |
| A-5 | <8 | < 8 | <8 | < 8 | <8 | < 8 | <8 | < 8 |
| A 6 | <8 | < 8 | <8 | < 8 | <8 | < 8 | <8 | < 8 |
| A-7 | <8 | < 8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | < 8 |
| A-8 | <8 | < 8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | < 8 |
| Serododatnie Miano HI | 1/8 (12,5%) 8 | 0/8 (0%) < 8 | 0/7 (0%) <8 | 0/8 (0%) <8 | 0/8 (0%) < 8 | 0/8 (0%) <8 | 0/8 (0%) <8 | 0/8 (0%) < 8 |
Tabela 5.2
| Po I dawce rH5 | Po II dawce rH5 | |||||||
| 2 tygodnie | 2 tygodnie | 3 tygodnie | 4 tygodnie | |||||
| HI AIV ID | H5N1 HP | H5N2 LP | H5N1 HP | H5N2 LP | H5N1 HP | H5N2 LP | H5N1 HP | H5N2 LP |
| B-l | <8 | <8 | 8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| B-2 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| B-3 | 8 | <8 | 16 | <8 | 8 | <8 | 8 | <8 |
| B-4 | <8 | <8 | n.d. | <8 | 8 | <8 | <8 | <8 |
| B-5 | <8 | 8 | n.d. | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| B-6 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| B-7 | <8 | <8 | 16 | <8 | 16 | 8 | 16 | <8 |
| B-8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| Serododatnie Miano HI | 1/8 (12,5%) 8 | 1/8 (12,5%) 8 | 3/6 (50%) 8-16 | 0/8 (0%) < 8 | 3/8 (37,5%) 8-16 | 1/8 (12,5%) 8 | 2/8 (25%) 8-16 | 0/8 (0%) < 8 |
PL 235 555 Β1
Tabela 5.3
| ID | HI AIV | Po 1 dawce rH5 | Po II dawce rH5 | |||||
| 2 tygodnie | 4 tygodnie | 1 tydzień | 2 tygodnie | |||||
| H5N1 HP | H5N2 LP | H5N1 HP | H5N2 LP | H5N1 HP | H5N2 LP | H5N1 HP | H5N2 LP | |
| C-l | 8 | <8 | 8 | 64 | <8 | 64 | 32 | 32 |
| C-2 | 8 | <8 | <8 | <8 | 32 | 32 | 64 | < 8 |
| C-3 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 | 16 |
| C-4 | <8 | <8 | 8 | <8 | 8 | <8 | 8 | < 8 |
| C-5 | <8 | <8 | <8 | 32 | 32 | <8 | 16 | 16 |
| C-6 | <8 | <8 | <8 | <8 | 8 | <8 | 8 | < 8 |
| C-7 | <8 | <8 | <8 | 16 | <8 | <8 | <8 | < 8 |
| C-8 | <8 | <8 | <8 | <8 | 8 | <8 | 8 | < 8 |
| Serododatnie Miano HI | 2/8 (25%) 8 | 0/8 (0%) < 8 | 2/8 (25%) 8 | 3/8 (37,5%) 16-64 | 5/8 (62,5%) 8-32 | 2/8 (25%) 32-64 | 6/8 (75%) 8-64 | 3/8 (37,5%) 16-32 |
Podsumowanie
Badania odpowiedzi humoralnej kurcząt typu mięsnego rasy Ross 308 na podskórne podanie szczepionki zawierającej 25 μg rH5-E. coli i wodorotlenek glinu jako adiuwant, które przeprowadzono przy użyciu testów HI z homologicznym HPAIV H5N1 i heterologicznym LPAIV H5N2 wykazały, że:
- dwukrotna immunizacja kurcząt rH5-E. coli w odstępie 4 tygodni jest znacznie skuteczniejsza w indukcji przeciwciał hamujących hemaglutynację niż immunizacja w odstępie 2 tygodni,
- szczepienie przy użyciu rH5-E. coli daje możliwość indukcji przeciwciał hamujących hemaglutynację przez AIV (Hl-dodatnie z H5N1 i/lub H5N2/badane - 8/8 kurcząt szczepionych 2-krotnie w odstępie 4 tygodni),
- miano HI przeciwciał wyidukowanych przez szczepienie rH5-E. coli osiąga poziom uznawany za ochronny (> 1:16), w tym również miano pożądane w prewencji zakażenia AIV (>1:64).
Przykład 9 Skuteczność immunizacji kurcząt rH5-E. coli przy zastosowaniu różnych schematów immunizacji
W celu oceny potencjału szczepionkowego rH5-E. coli, w niniejszym przykładzie podsumowano wyniki analiz surowic przygotowanych w trakcie badań immunizacyjnych kurcząt typu mięsnego rasy Ross 308, opisanych w przykładzie 6. Oznaczenia wykonano przy użyciu pośredniego i kompetycyjnego testu ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 w surowicy kurcząt (H5-ELISA; FLUAc H5, IDVet). Testy HI wykonano stosując jako antygeny wirusy Al: homologiczny HP H5N1 i heterologiczny LP H5N2 oraz jednostkę zahamowania hemaglutynacji (HIU) 1:8. Sposób przeprowadzenia testów serologicznych (ELISA, HI) oraz wyniki tych testów dla kurcząt immunizowanych rH5-E. coli opisano szczegółowo w przykładach 7 i 8 z uwzględnieniem kinetyki humoralnej odpowiedzi odpornościowej i osobniczego charakteru tej odpowiedzi.
Analiza odpowiedzi odpornościowej kurcząt na szczepienie, przeprowadzona w niniejszym przykładzie, obejmuje wyniki uzyskane ze wszystkich pobrań krwi w grupach A, B i C kurcząt (detekcja przeciwciał, H5-ELISA), z pobrań krwi po podaniu II dawki rH5 kurczętom grupy B i C (miano punktu końcowego, H5-ELISA; FLUAc H5) albo z krwi pobranej 2, 4 lub 5 tygodni po immunizacji rH5 zwierząt grupy B (FLUAc H5). Pozytywność poszczególnych zwierząt w testach oceniano tutaj niezależnie od tego, na jakim etapie doświadczenia została wykazana.
Ocena efektywności immunizacji kurcząt typu mięsnego przy użyciu rH5-E. coli uwzględni statystykę odpowiedzi zwierząt na szczepienie, miano przeciwciał klasy IgY przeciwko H5, miano przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 oraz miano przeciwciał typu HI. Pożądane jest, aby miano wyedukowanych przeciwciał hamujących aglutynację erytrocytów przez AIV wynosiło przynajmniej 1:16 (minimalny poziom ochronny), optymalnie, żeby osiągało poziom 1:64 lub wyższy. Ocena możliwości zastosowania testowanej szczepionki do immunizacji ptaków przeciwko ptasiej grypie powinna uwzględnić obok efektywności szczepień z jej użyciem także jednostkowy koszt wytworzenia szcze
PL 235 555 Β1 pionki oraz koszty immunizacji zwierząt. Ilość i wielkość dawek antygenu niezbędnych do wywołania odpowiedzi odpornościowej u zwierząt oraz rodzaj adiuwantu w kompozycji szczepionkowej są istotnymi składnikami tych kosztów.
Wyniki badań odpowiedzi humoralnej kurcząt typu mięsnego rasy Ross 308 na podskórne podanie jednej lub dwóch dawek szczepionki zawierającej 25 pg rH5-E. coli i wodorotlenek glinu jako adiuwant, które przeprowadzono przy użyciu testów ELISA (H5-ELISA, FLUAc H5) i testów HI (HI-H5N1, HI-H5N2) podsumowano wTab. 6. Przedstawione dane wskazują, że:
- Dwie dawki szczepionki są niezbędne ale i wystarczające do wywołania silnej odpowiedzi humoralnej u wszystkich szczepionych kurcząt (H5-dodatnie/badane - 16/16).
- Dwukrotna immunizacja kurcząt rH5-E. coli w odstępie 4 tygodni jest znacznie skuteczniejsza w indukcji przeciwciał klasy IgY przeciwko H5, przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 oraz przeciwciał typu HI niż immunizacja w odstępie 2 tygodni.
Wyniki uzyskane dla kurcząt szczepionych 2-krotnie w odstępie 4 tygodni przy użyciu 25-pg dawek rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu (Tab. 6) udowodniły, że szczepionka u określonej liczby zwierząt w grupie indukuje przeciwciała o następujących właściwościach:
- klasy IgY specyficzne wobec HA H5 u wszystkich immunizowanych kurcząt (H5-dodatnie/badane - 8/8); miano punktu końcowego antygenowo-specyficznych przeciwciał osiąga wysoki poziom (1:129 200 - 1 tydzień, 1:80 000 - 2 tygodnie po II dawce rH5),
- rozpoznające przypuszczalnie serotypowy, konformacyjny epitop neutralizujący AIV; miano przeciwciał współzawodniczących z przeciwciałami testu FLUAc H5 może osiagać poziom, obserwowany w trakcie zakażenia zwierząt AIV (FLUAc H5 dodatnie/badane - 3/8, FLUAc H5 wątpliwe/badane - 2/8),
- hamujące hemaglutynację przez homologiczne i heterologiczne AIV (Hl-dodatnie z H5N1/badane - 6/8, Hl-dodatnie z H5N2/badane - 5/8); miano przeciwciał typu HI osiąga poziom uznawany za ochronny (> 1:16), w tym również miano pożądane w prewencji zakażenia AIV (> 1:64).
Tabela 6
| RODZAJ TESTU | GRUPA KURCZĄT | ||
| A | B | C | |
| H5-EL1SA | * | * | -* |
| dodatnie/badane | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| pozytywność [%] | 100% | 100% | 100% |
| miano punktu końcowego 2 tygodnie po II dawce rH5 | - | 28 300 | 80 000 |
| FLUAc H5 | *** | ** | ** |
| kompetycja <90% | 3/8 | 8/8 | 7/8 |
| 35% <kompetycja < 40% (±) | 0/8 | 0/8 | 2/8 |
| kompetycja < 35% (+) | 0/8 | 0/8 | 3/8 |
| pozytywność [%] | 0% | 0% | 37,5% |
| HI-H5N1 (HP) HIU=1:8 | * | * | * |
| dodatnie/badane | 1/8 | 4/8 | 6/8 |
| pozytywność [%] | 12,5% | 50% | 75% |
| miano HI | 8 | 8-16 | 8-64 |
| HI-H5N2 (LP) HIU=1:8 | * | * | * |
| dodatnie/badane | 0/8 | 2/8 | 5/8 |
| pozytywność [%] | 0% | 25% | 62,5% |
| miano HI | < 8 | 8 | 16-64 |
próby surowicy ze wszystkich pobrań krwi ' próby surowicy z pobrań krwi po podaniu II dawki rH5 *** próby surowicy z krwi pobranej 2, 4 lub 5 tygodni po immunizacji rH5
PL 235 555 B1
Dobre wyniki immunizacji kurcząt typu mięsnego rH5-E. coli uzyskano podając tylko dwie dawki antygenu w obecności wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Wodorotlenek glinu jest powszechnie stosowanym od ponad 80 lat adiuwantem, wzmacniającym przede wszystkim humoralną odpowiedź odpornościową. Jego działanie wzmacniające komórkową odpowiedź jest kontrowersyjne. Skuteczność dopuszczonego do immunizacji zwierząt i ludzi taniego adiuwantu, j akim jest wodorotlenek glinu, w kompozycji szczepionkowej z rH5-E. coli, powoduje, że przewidywany koszt jednostkowy szczepionki nie będzie nadmiernie obciążony przez cenę jej dodatkowych składników. Efektywność 2-krotnych szczepień rH5-E. coli w obecności wodorotlenku glinu korzystnie wpływa na koszty immunizacji zwierząt przy użyciu testowanej szczepionki.
Badania serologiczne kurcząt szczepionych 2-krotnie w odstępie 4 tygodni przy użyciu 25-ng dawek rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu wykazały reaktywność wszystkich zwierząt na szczepienie, której wskaźnikiem jest wysoki poziom przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 w surowicach zwierząt (Tab. 6). Aktywność wyindukowanych przeciwciał w testach oceniających ich właściwości immunoprotekcyjne (FLUAc H5, HI-H5N1, HI-H5N2) była zróżnicowana w obrębie zaszczepionej grupy zwierząt (Tab. 6). Pozytywność w grupie, osiągająca poziom 37,5% w teście FLUAc H5, 75% w teście HI-H5N1 i 62,5% w teście HI-H5N2 dokumentuje potencjał szczepionki w zakresie indukcji pożądanych przeciwciał funkcjonalnych a jednocześnie wskazuje na konieczność optymalizacji szczepień w kierunku zwiększenia liczby zwierząt, które po zaszczepieniu będą seropozytywne w wymienionych testach. Wykazanie, że 2-krotna immunizacja kurcząt typu mięsnego w odstępie 4 tygodni jest znacznie skuteczniejsza, jeśli nie wyłącznie skuteczna, w indukcji przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 i testach HI niż 2-krotne szczepienie w odstępie 2 tygodni (Tab. 6) wyznacza kierunek optymalizacji szczepień zwierząt przeciwko ptasiej. Ustalenie optymalnego odstępu czasu między dawką uczulającą i wzmacniającą wydaje się kluczowe dla zwiększenia skuteczności szczepień kurcząt typu mięsnego przy użyciu szczepionki rH5-E. coli.
Immunizacje kurcząt typu mięsnego i kontrole odpowiedzi na szczepienie przeprowadzono w okresie między 7 dniem życia, kiedy układ odpornościowy ptaków jest już dojrzały i obniża się poziom przeciwciał matczynych we krwi zwierząt a zakończeniem cyklu produkcyjnego kurcząt (45 dzień życia). Umożliwiło to sprawdzenie immunogenności fragmentu rH5 (17-522 aa, ARRRKKR), wytworzonego metodą nadekspresji w bakteriach E. coli (rH5-E. coli) oraz przetestowanie skuteczności różnych schematów immunizacji. Krótki cykl życiowy kurcząt typu mięsnego w produkcyjnych warunkach chowu w znacznym stopniu ogranicza możliwości optymalizacji szczepień, ale też nie ma ekonomicznego uzasadnienia dla użycia testowanej szczepionki do masowych szczepień tej grupy zwierząt. Badania nad optymalizacją dawki i schematu szczepień przy użyciu rH5-E. coli będą skierowane na grupy kurcząt o długim cyklu życiowym, jakimi są nioski stad towarowych oraz stad rodzicielskich niosek i brojlerów.
Ostatecznym kryterium oceny skuteczności szczepień z użyciem rH5-E. coli są wyniki eksperymentalnego zakażenia kurcząt wirusami Al. Doświadczenie typu challenge zostało przeprowadzone na kurczętach SPF typu nieśnego. Kurczęta zaszczepione rH5-E. coli zakażono HPAIV H5N1. Sposób przeprowadzenia i wyniki eksperymentu challenge opisano w przykładzie 10.
P r z y k ł a d 10 Eksperymentalne zakażenie kurcząt, zaszczepionych rH5-E. coli, wysoko patogennymi (HP) wirusami ptasiej grypy (AIV) H5N1 (challenge)
W celu oceny zdolności szczepionki zawierającej rH5-E. coli do ochrony przed zakażeniem AIV, przeprowadzono eksperymentalne zakażenie zaszczepionych kurcząt wirusami HPIV H5N1: homologicznym, kladu 2.2 (doświadczenie 1) oraz heterologicznym, kladu 1 (doświadczenie 2). Doświadczenia typu challenge przeprowadzono na kurczętach SPF typu nieśnego, rasy White Leghorn, w Państwowym Instytucie Weterynaryjnym - Państwowym Instytucie Badawczym (PIWet-PIB) w Puławach, w zwierzętarni PCL3.
Immunizacja rH5-E. coli, zakażenie HPAIV H5N1 oraz pobieranie prób do badań
Grupę 3- (doświadczenie 1) lub 3½ (doświadczenie 2) tygodniowych kurcząt SPF (10 sztuk) zaszczepiono podskórnie przez podanie 25 μg rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem w objętości 200 μΙ Kompozycję szczepionkową przygotowano w sposób opisany w przykładzie 6. Dawkę wzmacniającą - 25 μg rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu, podano po 4 (doświadczenie 1) lub 4½ (doświadczenie 2) tygodniach. Dwa i cztery tygodnie po podaniu I dawki oraz dwa i trzy tygodnie po podaniu II dawki antygenu pobrano krew do badań serologicznych.
PL 235 555 Β1
Trzy tygodnie po powtórnej immunizacji, kurczęta zakażono homologicznym HPAIV - A/turkey/Poland/35/07(H5N1) z kładu 2.2 (doświadczenie 1) albo heterologicznym HPAIV - A/crested eagle/Belgium/01/2004(H5N1) z kładu 1 (doświadczenie 2). Miano infekcyjne wirusów wynosiło 109 EID5o/ml. Wirusy podano donosowo i dospojówkowo (i.n./i.o.) w dawce 106 EID50 w 0,1 ml (rozc. 1:100). W celu zbadania możliwości transmisji wirusów Al od kurcząt zakażonych po zaszczepieniu do ptaków w pełni wrażliwych, ok. 24 godziny po infekcji HPAIV do każdej z grup doświadczalnych dołączono 2 nie szczepione kurczęta SPF (kurczęta kontaktowe). W ciągu 14 dni po zakażeniu prowadzono obserwacje kliniczne zwierząt. Trzy, siedem i dziesięć dni po zakażeniu, od kurcząt szczepionych i kontaktowych pobrano wymazy z gardła i kloaki do badań przy użyciu real time RT-qPCR. Czternaście dni po zakażeniu, od wszystkich ptaków, które przeżyły challange pobrano krew do badań serologicznych oraz wymazy z gardła i kloaki do badań przy użyciu real time RT-qPCR.
Kontrolę pozytywną dla doświadczeń typu challenge stanowiły kurczęta SPF, po 5 sztuk w grupie, które w tym samym wieku co kurczęta grup eksperymentalnych zakażono wirusem A/turkey/Poland/35/07(H5N1) z kładu 2.2 (doświadczenie 1) albo A/crested eagle/Belgium/01/2004(H5N1) z kładu 1 (doświadczenie 2) z zastosowaniem identycznych dawek i sposobu ich podania jak zwierzętom szczepionym tj. i.n./i.o., dawka: 106 EID50 w 0,1 ml, (rozc. 1:100). Od kurcząt, padłych w okresie obserwacji, pobrano wymazy z gardła i kloaki oraz narządy (płuca, śledziona, nerki, mózg) do badań przy użyciu real time RT-qPCR.
Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z wymaganiami testowania szczepionek w doświadczeniach typu challenge m.in. w zakresie dawki (106 EID50) i odstępu czasu między szczepieniem i zakażeniem eksperymentalnym (3 tygodnie), które opisano w: “Manuał of Diagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial Animals, 2012” OIE.
Przebieg immunizacji, zakażenia i pobierania prób do badań w doświadczeniu 1 i 2 były zgodne ze schematami, odpowiednio: B i C, które zamieszono poniżej.
Schemat B immunizacji kurcząt rH5-E. coli, eksperymentalne zakażenie homologicznym HPAIV H5N1 oraz pobieranie prób do badań.
Kurczęta SPF typu nieśnego (White Leghorn)
I dawka s.c.
pg rH5 + AI{OH)3
II dawka s.c.
pg rH5 + AI(OH),
Zakażenie i.n./i.o.
H5N1 - kład 2.2 106EIDs
I—I--1—I--1—I—I—I—I—I—i—I—I—I--1—I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tygodnie życia lilii
Krew Krew Krew Krew Krew im
Wymazy z gardła i kloaki
Obserwacja
PL 235 555 Β1
Schemat C immunizacji kurcząt rH5-E. coli, eksperymentalne zakażenie heterologicznym HPAIV H5N1 oraz pobieranie prób do badań.
Kurczęta SPF typu nieśnego (White Leghorn)
I dawka s.c.
pg rH5 + A1(OH)3
II dawka s.c.
pg rH5 + AI(OH)3 Zakażenie i.n./i.o. !
H5N1 - kład 1 j ________1OeEID.,o__________J
I—I—I—I—I—I—I—I—:—I—I—ł—I—I—I—I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tygodnie życia | | | | I
Krew Krew Krew Krew Krew
Illl
Wymazy z gardła I kloaki
Obserwacja
Badania serologiczne
Próby surowicy pobrane w trakcie eksperymentu analizowano przy użyciu testów zahamowania hemaglutynacji (HI) oraz komercyjnych testów ELISA: FLUAc H5 (IDVet) i IDEXX Al MultiS-Screen (ldexx Laboratories). Wyniki badań testami HI z wirusami o serotypie H5 oraz testem FLUAc H5 do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 AIV umożliwiły ocenę odpowiedzi humoralnej kurcząt na szczepienie rH5-E. coli oraz poziomu funkcjonalnych przeciwciał w surowicach szczepionych zwierząt bezpośrednio przed infekcją HPAIV H5N1. Test IDEXX Al MultiS-Screen (ldexx Laboratories) przeznaczony jest do wykrywania przeciwciał przeciwko AIV w surowicy ptaków. Wykonanie tego testu na próbach pobranych w trakcie doświadczeń challenge miały na celu kontrolę ekspozycji kurcząt na wirusy Al. Badania serologiczne prób pobranych po infekcji HPAIV od kurcząt szczepionych i kontaktowych przy użyciu testu IDEXX Al MultiS-Screen miały charakter uzupełniający w stosunku do badań poziomu materiału genetycznego wirusa w wymazach, jakie przeprowadzono stosując real time RT-qPCR.
Aktywność HI surowic kurcząt pobranych w trakcie doświadczeń typu challenge była testowana przy użyciu inaktywowanych HPAIV H5N1: homologicznego i heterologicznego. Wirusy i antysurowice użyte w testach HI opisano w zestawieniu B.
PL 235 555 Β1
Zestawienie B Wirusy i surowice użyte w testach HI
| Hl-H5Nl/homologiczny - test HI z homologicznym HPAIV H5N1 | Pochodzenie | |
| Antygen | HPA1V szczep A/turkcy/Poland/35/07(H5Nl) | ZCHD PIWet-PIB |
| Kontrola pozytywna | Surowica anty HPAIV szczepu A/turkcy/Poland/35/07(H5Nl) | ZCHD PIWet-PIB |
| Kontrola negatywna | Surowica kurcząt SPF | AHLA |
| HI-H5Nl/lieterologiczny - test HI z heterologicznym HPA1V H5N1 | Pochodzenie | |
| Antygen | HPAIV szczep A/CK/Scot/59(H5Nl) | AHLA |
| Kontrola pozytywna | Surowica anty HPAIV szczepu A/CK/Scot/59(H5N1) | AHLA |
| Kontrola negatywna | Surowica kurcząt SPF | AHLA |
ZCHD PIWct-PIB Zakład Chorób Drobiu Państwowy Instytut Wctcrynaryjny-Państwowy Instytut Badawczy. Puławy, Polska
AHLA Animal Health and Yctcrinary Laboratories Agcncy, Waybridgc, Wielka
Brytania
Test HI przeprowadzono przy użyciu erytrocytów kurcząt SPF, stosując jednostkę zahamowania hemaglutynacji (HIU) 1:8. Testy wykonano w sposób opisany w przykładzie 8 Miano HI surowic > 1:16 uznawano za wskazujące na ochronne działanie wyind u kowanych przeciwciał, zgodnie z obowiązującymi wymaganiami dla szczepionek przeciwko grypie.
Test FLUAc H5 wykonano według instrukcji producenta (IDVet), przy czym nie zastosowano warunków zwiększających czułość testu. Zgodnie z podstawowym protokołem, próby surowicy rozcieńczano 1:5, po czym inkubowano na płytkach w ciągu 1 godziny, w temperaturze 37°C. Sposób obliczania poziomu kompetycji oraz interpretację wyników, zgodne z informacją producenta, opisano w przykładzie 7. Test IDEXX Al MultiS-Screen przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta (ldexx Laboratories). Interpretacja wyników tego testu jest zależna od wartości odczytu absorpcji dla próby badanej (S) względem wartości odczytu dla kontroli negatywnej (N). Obliczone wartości S/N > 0,5 i < 0,5 uzyskane dla badanych prób, oznaczają, że próby są, odpowiednio: negatywne i pozytywne w kierunku przeciwciał przeciwko AIV.
Oznaczenia poziomu AIV po infekcji
Celem badań real time RT-qPCR było wykrycie materiału genetycznego wirusa w wymazach z gardzieli i kloaki a w przypadku padłych zwierząt również w ich w narządach (płuca, śledziona, nerki, mózg). Wyniki tych badań umożliwiły określenie stopnia rozprzestrzeniania się i namnażania
PL 235 555 B1
AIV w organizmach zakażonych zwierząt oraz prawdopodobieństwo siewstwa wirusów do środowiska i ich transmisji do innych ptaków.
Próby pobrane do badań przy użyciu real time RT-qPCR przechowywano w uniwersalnym medium do transportu (COPAN Diagnostics Inc.). Z 0,1 ml medium ekstrahowano całkowity RNA przy użyciu RNeasy Mini Kit (Qiagen). Real time mRT-PCR przeprowadzono w sposób, który opisali Spackman E i wsp. (2002). Oligonukleotydy: M-25 (5’-AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3‘) i M-124 (5’-TGCAAAAACATCTTCAAGTCTCT-3‘) były użyte jako primery, natomiast sondę stanowił M-64 (5’-FAM-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-TAMRA-3‘). W celu przekształcenia wartości Ct real time RT-qPCR do wartości równoważnych EID50 (eqEID50) na ml płynu z wymazów lub gram tkanki, zastosowano ilościowe standardy RNA o znanym mianie wirusa, wyekstrahowane z 10-krotnych rozcieńczeń wirusów użytych do eksperymentalnego zakażenia kurcząt. Ilości wirusowego RNA w badanych próbkach były ekstrapolowane z krzywej standardowej.
Poziom funkcjonalnych przeciwciał przeciwko H5 przed infekcją
Wyniki badań serologicznych kurcząt SPF typu nieśnego po podskórnym podaniu dwóch dawek rH5-E. coli, po 25 ug każda, z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem, przeprowadzone na próbach pobranych 3 tygodnie po podaniu II dawki antygenu przy użyciu testów HI przedstawiono na Fig. 7.1, natomiast testu FLUAc H5 (IDVet) na Fig. 7.2. Bezpośrednio przed zakażeniem homologicznym (doświadczenie 1) lub heterologicznym (doświadczenie 2) HPAIV H5N, żadne zwierzę z grup szczepionych rH5-E. coli w obu doświadczeniach nie wykazywało ochronnego miana przeciwciał tj. > 1:16 hamujących hemaglutynację przez heterologiczny HPAIV H5N1(Fig. 7.1). Ochronne miano przeciwciał w testach HI z użyciem homologicznego HPAIV H5N1 w zakresie 1:16-1:128 stwierdzono u 5 z 10 kurcząt zaszczepionych w pierwszym doświadczeniu a w zakresie 1:16-1:256 u wszystkich przebadanych kurcząt (9/9) zaszczepionych w drugim doświadczeniu challenge.
Kurczęta oznaczone 2-2..2-10 silniej odpowiedziały na szczepienie rH5-E. coli produkcją przeciwciał HI aktywnych z homologicznym HPAIV H5N1 niż kurczęta oznaczone 1-1..1-10, na co wskazuje ilość kurcząt serododatnich w grupie (100% vs 50%) oraz poziom miana przeciwciał HI (wartości średnie: 65,8 vs 26,4). W teście FLUAc H5, seropozytywność kurcząt 2-2..2-10, zaszczepionych z przeznaczeniem do infekcji heterologicznym HPAIV H5N1, wynosiła 56% i była niższa niż kurcząt 1-1..1-10 z grupy zaszczepionej w doświadczeniu challenge z homologicznym HPAIV H5N1, w której 100% zwierząt było serododatnich (Fig. 7.2). Poziom kompetycji surowic kurcząt seroujemnych w teście FLUAc H5, oznaczonych 2-7..2-10 był zróżnicowany i mieścił się w zakresie 51-96%.
Zachorowalność na grypę i przeżywalność po infekcji
Wyniki eksperymentalnego zakażenia szczepionych i kontrolnych kurcząt SPF typu nieśnego wirusami HPAI H5N1: homologicznym z kladu 2.2 (doświadczenie 1) i heterologicznym z kladu 1 (doświadczenie 2), wyrażone jako % przeżywalności zwierząt zakażonych i kontaktowych w ciągu 14 dni po infekcji przedstawiono na Fig. 7.3. Kurczęta zaszczepione przy użyciu rH5-E. coli a następnie zakażone homologicznym HPAIV H5N1 jak również kurczęta kontaktowe żyły i nie wykazywały klinicznych objawów grypy przez cały okres obserwacji (Fig. 7.3.A). Zwierzęta grupy kontrolnej, które nie były szczepione, padły 2 dni (2 kurczęta) lub 3 dni (3 kurczęta) po zakażeniu.
W doświadczeniu z użyciem heterologicznego HPAIV H5N1 z kladu 1, 3 z 10 zaszczepionych kurcząt padły - jedno zwierzę w drugim a dwa pozostałe w trzecim dniu po infekcji (Fig. 7.3.B). Wśród 7 kurcząt, które przeżyły challenge, u 4 nie stwierdzono objawów chorobowych a 3 zachorowały na grypę. Zwierzę, oznaczone 2-6 wykazywało objawy grypy między 4 i 11 dniem po infekcji: obrzęk zatok podoczodołowych, wyraźne osłabienie z przysiadywaniem w skokach, zasinienie i obrzęk grzebienia. Dwa kurczęta, oznaczone: 2-3 i 2-5 chorowały od 5 dnia po infekcji z mniejszym nasileniem niż zwierzę 2-6 - u kurcząt obserwowano obrzęk zatok podoczodołowych i osłabienie. Kurczęta: 2-3, 2-5 i 2-6 wyzdrowiały i w 14 dniu po zakażeniu nie wykazywały objawów chorobowych. Kurczęta kontaktowe żyły do 7 dnia po zakażeniu kurcząt zaszczepionych. Między 7 i 8 dniem po zakażeniu padło jedno a 8 dnia po zakażeniu drugie zwierzę kontaktowe. Kurczęta grupy kontrolnej, które nie były szczepione, padły 2 dnia po zakażeniu.
Przeciwciała przeciwko H5 a odporność na infekcję
Wyniki testu FLUAc H5 oraz testu HI z homologicznym HPAIV H5N1, uzyskane dla kurcząt bezpośrednio przed infekcją homologicznym HPAIV H5N1 (Fig. 7.1, Fig. 7.2) wskazują, że odporność kurcząt na zakażenie homologicznym wirusem HPAl była prawdopodobnie związana przede
PL 235 555 Β1 wszystkim z wysokim poziomem przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 (IDVet) a u 5 z 10 kurcząt prawdopodobnie także z obecnością przeciwciał hamujących hemaglutynację przez homologiczny HPAIV H5N1.
Wyniki testu FLUAc H5 oraz testu HI z heterologicznym HPAIV H5N1, uzyskane dla kurcząt bezpośrednio przed infekcją heterologicznym HPAIV H5N1 (Fig. 7.1, Fig. 7.2) wskazują, że odporność 7 z 10 zaszczepionych kurcząt na zakażenie nie jest efektem indukcji przeciwciał HI. Zakażenie heterologicznym HPAIV H5N1 przeżyły wszystkie kurczęta serododatnie w teście FLUAc H5 oraz tylko jedno zwierzę, oznaczone 2-7, wśród 4 zwierząt seroujemnych, którego surowica wykazała najniższą wartości kompetycji w użytym teście (Fig. 7.2). Pozwala to przypuszczać, że odporność kurcząt na zakażenie heterologicznym HPAIV była związana z wysokim mianem przeciwciał współzawodniczących z przeciwciałami testu FLUAc H5 przypuszczalnie o serotypowo-specyficzny epitop neutralizujący H5 AIV.
Poziom przeciwciał przeciwko AIV
Wyniki badań serologicznych kurcząt SPF typu nieśnego przeprowadzone przy użyciu testu IDEXX Al MultiS-Screen (ldexx Laboratories) na próbach pobranych 3 tygodnie po podaniu II dawki rH5-E. coli oraz 2 tygodnie po zakażeniu eksperymentalnym homologicznym (doświadczenie 1) i heterologicznym (doświadczenie 2) HPAIV H5N1 oraz równolegle od kurcząt kontaktowych przedstawiono w Tab. 7 Bezpośrednio przed zakażeniem wirusami HPAI, wszystkie przebadane kurczęta z grup szczepionych rH5-E. coli i kontaktowych były seroujemne. Dwa tygodnie po zakażeniu homologicznym HPAIV H5N1, wszystkie zaszczepione kurczęta oraz 1 z 2 zwierząt kontaktowych, oznaczone 1-KK-2, wytworzyły przeciwciała przeciwko AIV. Spośród 7 kurcząt, które przeżyły zakażenie heterologicznym wirusem HPAIV H5N1, 4 były serododatnie, natomiast 3 pozostałe seroujemne w teście IDEXX Al MultiS-Screen. Spośród 3 kurcząt: 2-3, 2-5 i 2-6, które wykazywały objawy grypy po zakażeniu heterologicznym HPAIV H5N1, zwierzęta 2-5 i 2-6, w przeciwieństwie do 2-3, wytworzyły przeciwciała wykrywane testem.
Tabela 7
| Doświadczenie 1 | Doświadczenie 2 | ||||
| z homologicznym HPAIV H5 | N1 (kład 2.2) | z heterologicznym HPAIV F | 5N1 (kład 1) | ||
| \ IDEXXAI ^'sMultiSSemen ID \ | Przed infekcją | 2 tygodnie po infekcji | \ IDEXX Al ^sMultiSSemen ID \ | Przed infekcją | 2 tygodnie po infekcji |
| wynik | wynik | wynik | wynik | ||
| 1-1 | - | + | 2-1 | n.d. | - |
| 1-2 | - | + | 2-2 | - | - |
| 1-3 | - | + | 2-3* | - | - |
| 1-4 | - | + | 2-4 | - | + |
| 1-5 | - | + | 2-5* | - | + |
| 1-6 | - | + | 2-6** | - | + |
| 1-7 | - | + | 2-7 | - | + |
| 1-8 | - | + | 2-8a | - | n.d. |
| 1-9 | - | + | 2-9a | - | n.d. |
| 1-10 | - | + | 2-10b | - | n.d. |
| Szczepione serododatnie | 0/10 | 10/10 | Szczepione serododatnie | 0/9 | 4/7 |
| 1-KK-1 | - | - | 2-KK-1c | - | n.d. |
| 1-KK-2 | - | + | 2-KK-2d | n.d. | n.d. |
| Kontaktowe serododatnie | 0/2 | 1/2 | Kontaktowe serododatnie | 0/1 | n.d. |
| n.d. - nie oznaczono Kurczęta z przejściowymi objawami grypy: *, ** - silniejsze objawy choroby Kurczęta padły: a - 3 dpi, b - 2 dpi, c - 8 dpi, d - 7-8 dpi |
PL 235 555 B1
Uzyskane wyniki potwierdziły, że kurczęta, wybrane do doświadczeń challenge, nie miały kontaktu z AIV przed zakażeniem eksperymentalnym a odporność na zakażenie została wyindukowana wyłącznie przez szczepienie rH5-E. coli. Spośród 17 zaszczepionych kurcząt, które przeżyły zakażenie wirusami HPAI, większość tj. 82% zwierząt wytworzyło przeciwciała przeciwko AIV, wykrywane testem IDEXX Al MultiS-Screen. Oznaczenia poziomu przeciwciał przeciwko AIV u kurcząt kontaktowych, które dołączono do grupy zakażonej homologicznym HPAIV H5N1 po zaszczepieniu, wskazują, że tylko jedno z dwóch w pełni wrażliwych zwierząt miało kontakt z AIV pochodzącym od zakażonych zwierząt.
Ilość RNA HPAIV w wymazach po infekcji
Wyniki badań poziomu wirusowego RNA w wymazach z gardła (G) i kloaki (K), które pobrano od kurcząt zaszczepionych rH5-E. coli oraz od kurcząt kontaktowych po zakażeniu wirusami HPAI H5N1 - 3, 7, 10 i 14 dni po zakażeniu (dpi) albo post mortem, przedstawiono w Tab. 8. W grupie zaszczepionych kurcząt poddanych infekcji przy użyciu homologicznego HPAIV H5N1, materiał genetyczny wirusa wykryto u 8 z 10 kurcząt 3 dpi i to wyłącznie w wymazach z gardła, gdzie jego poziom osiągnął wartości w zakresie 2,4-3,8 logio EID50/ml. W kolejnych dniach po infekcji tj. 7 i 10 dpi, wirusowy RNA był nie wykrywany w wymazach tej grupy zwierząt. Siedem dni po infekcji zaszczepionych zwierząt, wirusowy RNA oznaczono w wymazie z gardła 1 z 2 kurcząt kontaktowych (1-KK-2), ale już 10 dpi nie został wykryty.
PL 235 555 Β1
Tabela 8
Poziom wirusowego RNA w wymazach z gardła (G) i kloaki (K) po infekcji HPAIV [logtoEIPso/ ml]
| ID | Dni po Infekcji (d | pi) homologicznym HPAIV H5N1 z kładu 2.2 (dośw. 1) | ||||||
| 3 | 7 | 10 | 14 | |||||
| G | K | G | K | G | K | G | K | |
| 1-1 | U | U | U | U | U | U | n.d. | n.d. |
| 1-2 | U | U | U | U | U | U | n.d. | n.d. |
| 1-3 | 3,4 | U | u | u | U | U | n.d. | n.d. |
| 1-4 | 2,7 | U | u | u | U | U | n.d. | n.d. |
| 1-5 | 3,8 | U | u | u | U | U | n.d. | n.d. |
| 1-6 | 2,8 | U | u | u | U | U | n.d. | n.d. |
| 1-7 | 3,5 | U | u | u | U | U | n.d. | n.d. |
| 1-8 | 2,4 | U | u | u | U | U | n.d. | n.d. |
| 1-9 | 3,8 | U | u | u | u | U | n.d. | n.d. |
| 1-10 | 3,3 | U | u | u | u | U | n.d. | n.d. |
| Szczepione dodatnie | 8/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | - | - |
| 1-KK-1 | U | u | u | u | u | U | n.d. | n.d. |
| 1 KK 2 | U | u | 4,9 | u | u | u | n.d. | n.d. |
| Kontaktowe dodatnie | 0/2 | 0/2 | 1/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | ||
| ID | Dni po infekcji (dpi) heterologicznym HPAIV H5N1 z kładu 1 (dośw. 2) | |||||||
| 3 2b lub 3a pm | 7 | 10 8C d pm | 14 | |||||
| G | K | G | K | G | K | G | K | |
| 2-1 | U | u | U | u | U | u | U | u |
| 2-2 | U | u | U | u | U | u | U | u |
| 2-3* | U | u | u | u | u | u | U | u |
| 2-4 | U | u | u | u | u | u | U | u |
| 2-5* | U | u | u | u | u | u | U | u |
| 2-6** | 4,9 | u | 4,6 | u | u | u | U | u |
| 2-7 | 3,8 | u | 6,2 | 7,1 | u | 6,0 | U | u |
| 2-8a | 7,0 | u | - | - | - | - | - | - |
| 2-9a | 6,7 | 6,7 | - | - | - | - | - | - |
| 2-10b | 8,3 | 7,2 | - | - | - | - | - | - |
| Szczepione dodatnie | 5/10 | 2/10 | 2/7 | 1/7 | 0/7 | 1/7 | 0/7 | 0/7 |
| 2-KK-1c | U | U | 5,4 | 5,3 | 6,8 | 7,2 | - | - |
| 2-KK-2d | U | U | 4,9 | 5,0 | 7,0 | 7,7 | - | - |
| Kontaktowe dodatnie | 0/2 | 0/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | - | - |
ElDso- dawka infekująca 50% jaj (ang. 50% Egg Infectious Dose)
U - nie wykryto materiału genetycznego AIV n.d. - nie oznaczono
Kurczęta z przejściowymi objawami grypy: *, ** - silniejsze objawy choroby
Kurczęta padły: a - 3 dpi, b - 2 dpi, C - 8 dpi, d - 7-8 dpi - wymazy pobrano post mortem (pm)
W grupie kurcząt szczepionych rH5-E. coli, a następnie zakażonych przy użyciu heterologicznego HPAIV H5N1, materiał genetyczny wirusa nie był wykryty w wymazach z gardła i kloaki 5 z 10 zaszczepionych zwierząt w żadnym z badań przeprowadzonych na próbach pobranych w 2-tygodniowym okresie obserwacji. Analizy prób pobranych post mortem od 3 kurcząt, oznaczonych 2-8, 2-9 i 2-10, które padły 2 lub 3 dpi, wykazały obecność znacznych ilości wirusowego RNA w zakresie 6,7-8,3 logio EID5o/ml w wymazach z gardła lub z gardła i kloaki. Wśród kurcząt, które przeżyły zakażenie heterolo
PL 235 555 B1 gicznym HPAIV, u 2 zwierząt wykryto materiał genetyczny wirusa. U zwierzęcia, oznaczonego 2-6, materiał genetyczny wirusa oznaczono na poziomie 4,9 i 4,6 logio ElDso/ml w wymazach z gardła pobranych 3 i 7 dpi, a u zwierzęcia, oznaczonego 2-7, w wymazach z gardła, z gardła i kloaki oraz z kloaki, odpowiednio 3, 7 oraz 10 dpi na poziomie w zakresie 3,8-7,1 logio ElDso/ml. Wyniki badań poziomu wirusa w wymazach pobranych od zwierzęcia 2-7 dodatkowo uzasadniają przypuszczenie o kluczowej roli przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 w odporności na infekcję, które przedstawiono w rozdz. „Przeciwciała przeciwko H5 a odporność na infekcję”. Dwa tygodnie po infekcji, wirusowy RNA nie był wykrywany w wymazach pobranych od wszystkich zwierząt, które przeżyły challenge (7/10). Spośród 3 kurcząt: 2-3, 2-5 i 2-6, które wykazywały objawy grypy po zakażeniu heterologicznym HPAIV H5N1, tylko u zwierzęcia z nasilonymi objawami choroby, oznaczonego 2-6, wykazano obecność wirusa w wymazach. U 2 pozostałych kurcząt: 2-3 i 2-5 nie oznaczono wirusowego RNA w próbach pobranych z gardła i kloaki, co może wskazywać na systemiczny charakter zakażenia. U kurcząt kontaktowych nie wykryto materiału genetycznego wirusa w 3 dpi, natomiast w 7 dpi oznaczono wirusowe RNA w zakresie 5,0-5,4 logio ElDso/ml w wymazach zarówno z gardła jak i kloaki, co wskazuje na replikację wirusów Al pochodzących od zaszczepionych kurcząt z wykrywalnym poziomem cząstek wirusowych. Analiza prób pobranych post mortem od kurcząt kontaktowych w 8 dpi wykazała jeszcze większe ilości wirusowego RNA w wymazach, gdzie jego poziom osiągnął wartości w zakresie 6,8-7,7 logio EID5o/ml.
Wyniki pierwszego doświadczenia challenge wykazały jednoznacznie, że szczepienie rH5-E. coli indukuje u kurcząt odpowiedź ochronną, która uniemożliwia namnażanie się homologicznego HPAIV H5N1. Ponadto, szczepienie ograniczyło siewstwo wirusów HPAl do co najwyżej kilku dni po infekcji, maksymalnie do 7 dpi, oraz wyeliminowało efektywną transmisję HPAIV do w pełni wrażliwych kurcząt kontaktowych. Wyniki drugiego doświadczenia challenge wykazały, że szczepienie rH5-E. coli indukuje u 7 z 10 kurcząt odpowiedź ochronną, która uniemożliwia (5 kurcząt) lub w znacznym stopniu ogranicza (2 kurczęta) namnażanie się heterologicznego HPAIV H5N1. Ponadto, szczepienie zmniejszyło o 70% ilość kurcząt wydalających heterologiczny AIV w okresie dłuższym niż 10-14 dpi i w tym sensie spowodowało ograniczenie siewstwa wirusów HPAl, a także opóźniło efektywną transmisję HPAIV do w pełni wrażliwych zwierząt kontaktowych, ale jej nie zapobiegło.
Podsumowanie
Wyniki doświadczeń typu challenge, w którym kurczęta SPF typu nieśnego (Wbite Leghorn) zaszczepiono 2-krotnie w odstępie 4- lub 414-tygodniowym przy użyciu 25-pg dawek rH5-E. coli (17-522 aa, ARRRKKR) z wodorotlenkiem glinu a następnie zakażono HPAIV H5N1: homologicznym z kladu 2.2 lub heterologicznym z kladu 1, wykazały, że:
- immunizacja rH5-E. coli zapewnia 100% protekcję kurcząt przed zakażeniem homologicznym HPAIV H5N1; siewstwo zwierząt zakażonych po szczepieniu zostało zminimalizowane; nie nastąpiła transmisja wirusów HPAl do w pełni wrażliwych kurcząt kontaktowych,
- szczepienie rH5-E. coli chroni 70% kurcząt przed zakażeniem heterologicznym HPAIV H5N1; siewstwo zwierząt zakażonych po zaszczepieniu zostało ograniczone; poziom AIV u kurcząt zakażonych po zaszczepieniu był wystarczający dla efektywnej transmisji wirusów HPAl do kurcząt kontaktowych, ale padnięcia zwierząt nastąpiły dopiero między 7 a 8 lub 8 dnia po infekcji kurcząt zaszczepionych,
- odporność kurcząt na zakażenie HPAIV H5N1 związana jest z poziomem przeciwciał aktywnych w teście FLUAc H5 (IDVet).
Na obecnym etapie badań, szczepionka zawierająca rH5-E. coli wykazała skuteczność zwiększając odporność na infekcję, obniżając zachorowalność i śmiertelność przy zakażeniu różnymi wariantami wirusów tego samego serotypu oraz ograniczając siewstwo wirusów HPAl do środowiska.
P r z y k ł a d 11 Optymalizacja schematu szczepień przy użyciu rH5-E. coli
W celu określenia optymalnej dawki rH5-E. coli oraz korzystnego dla skuteczności immunizacji odstępu czasu między dawkami, przeprowadzono badania immunizacyjne na kurczętach typu nieśnego stosując dawki antygenu w zakresie 5-25 pg oraz 4- i 6-tygodniowy odstęp między I i II immunizacją. Immunizacja kurcząt oraz pobieranie prób do badań serologicznych
Szczepionkę zawierającą rH5-E. coli i wodorotlenek glinu jako adiuwant przygotowano bezpośrednio przed użyciem w sposób opisany w przykładzie 6. Doświadczenia wykonano równocześnie na 8 grupach kurcząt typu nieśnego rasy Rossa 1 w produkcyjnych warunkach chowu. Kurczę
PL 235 555 Β1 ta grup: 1A - 4A, 1B - 4B, po 10 sztuk każda, poddawano szczepieniom, natomiast 15 kurcząt nie immunizowanych tworzyło kontrolną grupę K. Pierwszą immunizację wykonano w 3 tygodniu życia zwierząt. Kurczęta grup: 1A - 4A były zaszczepione po raz drugi w 7 tygodniu życia tj. 4 tygodnie po podaniu I dawki, natomiast grup: 1B - 4B w 9 tygodniu życia tj. 6 tygodni po podaniu I dawki. W immunizacji zwierząt stosowano rH5-E. coli w dawkach 25, 15, 10 i 5 gg, które podawano podskórnie w trzech miejscach na karku w objętości 200 gl z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem.
W celu monitorowania odpowiedzi kurcząt na immunizację, pobierano krew od szczepionych zwierząt bezpośrednio przed oraz 1 i 2 tygodnie po podaniu II dawki antygenu. Próby pobrane równolegle od kurcząt nie szczepionych stanowiły materiał kontrolny. Próby surowicy przygotowywano i przechowywano w sposób opisany w przykładzie 6. Harmonogram immunizacji kurcząt oraz pobrań krwi od zwierząt szczepionych i kontrolnych był zgodny ze schematem D, który zamieszono poniżej.
Schemat D immunizacji kurcząt rH5-E. coli oraz pobieranie prób do badań serologicznych.
Kurczęta typu nieśnego (Rossa 1)
I dawka s.c.
rH5 t AI(OH);
A, 1B 25 pg it dawka s.c.
2A, 2B-15pg rH5 + AI(OHh
3A, 3B -10 pg 1A - 25 pg u dawka s.c.
4A, 4B - 5 pg 2A-15pg rH5 + AI(OH)3 3A-10pg iB-25pg 4A - 5 pg 2B . 15 μ9 3B -10 pg '4B - 5 pg
O 1 2 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15
Tygodnie życia ί l I
Krew Krew Krew Grupy: 1 A, 2A, 3A, 4A
III Krew Krew Krew ‘ I Grupy: IB, 2B, 38, 48
Analiza odpowiedzi odpornościowej przy użyciu testów serologicznych
Surowice przygotowane w trakcie eksperymentu analizowano przy użyciu testów ELISA: pośredniego - H5-ELISA i kompetycyjnego - FLUAc H5 (IDVet) do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 AIV oraz testu zahamowania hemaglutynacji (HI). Test wykrywający przeciwciała, które rozpoznają prawdopodobnie serotypowy, konformacyjny epitop neutralizujący AIV (FLUAc H5) oraz test HI, wykrywający przeciwciała rozpoznające miejsca antygenowe HA w cząstkach wirusowych istotne dla ich wiązania z receptorami komórkowymi, umożliwiły funkcjonalną ocenę antysurowic wytworzonych w wyniku szczepienia.
Test H5-ELISA wykonano zgodnie z opisem zamieszczonym w przykładzie 7. Test FLUAc H5 wykonano zgodnie z instrukcją producenta (IDVet), stosując warunki zwiększające czułość testu (próby surowicy rozcieńczone 1:1, inkubowane na płytkach w ciągu 1 godziny, w temperaturze 37°C). Sposób obliczania poziomu kompetycji oraz interpretację wyników, zgodne z informacją producenta, opisano w przykładzie 7. Test HI przeprowadzono przy użyciu erytrocytów kurcząt SPF, stosując heterologiczny LPAIV H5N2 jako antygen i oraz jednostkę zahamowania hemaglutynacji (HIU) 1:8. Zasadę testu HI oraz sposób jego przeprowadzenia przedstawiono w przykładzie 8. Oznaczenia wykonano na próbach surowicy ze wszystkich pobrań krwi. Za pozytywne uznawano próbki, które osiągnęły miano > 1:8. Przyjęto, zgodnie z obowiązującymi wymaganiami dla szczepionek przeciwko grypie, że miano HI wskazujące na protekcyjne działanie wyind u kowanych przeciwciał powinno być > 1:16.
PL 235 555 Β1
Wyniki badań serologicznych
Badania serologiczne kurcząt typu nieśnego po podskórnej immunizacji uczulającej z zastosowaniem 25 μg (grupy: 1A, 1B), 15 μg (grupy: 2A, 2B), 10 μg (grupy: 3A, 3B) lub 5 μg (grupy: 4A, 4B) rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta, przeprowadzone przy użyciu testu H5-ELISA na próbach pobranych 4 tygodnie (grupy: 1A-4A) lub 6 tygodni (grupy: 1B-4AB) po szczepieniu, wykazały wykrywalność przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 w surowicach, rozcieńczonych 1:200, na poziomie w zakresie, odpowiednio: 60% - 100% i 0% - 33% (Fig. 8.1) Jeden i dwa tygodnie po podaniu dawki wzmacniającej antygenu, stwierdzono wysoki poziom przeciwciał przeciwko H5 u wszystkich zaszczepionych kurcząt, oznaczający 100% seropozytywność. Miano punktu końcowego przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 w surowicy wszystkich grup zwierząt po 2-krotnej immunizacji było bardzo wysokie - 1 tydzień i 2 tygodnie po podaniu II dawki antygenu osiągało wartości z zakresu, odpowiednio: 320 000-850 000 i 200 000-430 000 (Fig. 8.2).
Zmianom poziomu przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 po powtórnej immunizacji towarzyszyły zmiany poziomu funkcjonalnych przeciwciał, wykrywanych testem FLUAc H5 (IDVet) oraz HI z użyciem heterologicznego LPAIV H5N2. Bezpośrednio przed podaniem II dawki antygenu nie wykryto prób pozytywnych w teście FLUAc H5 (Fig. 8.3). Test HI-H5N2 wykazał, że tylko 11% zwierząt zaszczepionych jedną dawką antygenu w 2 z 8 badanych grup ma ochronne miano przeciwciał HI (> 1:16) w surowicy (Fig. 8.4). Jeden tydzień po powtórnej immunizacji, pozytywność w teście FLUAc H5 w grupach szczepionych rH5- E. coli w dawkach 10, 15 i 25 μg osiągnęła wartości w zakresie 70-100%, natomiast w grupach szczepionych przy użyciu 5 μg antygenu 50 i 60% (Fig. 8.3). W tym samym czasie kurczęta z ochronnym mianem przeciwciał HI stanowiły 80-100% kurcząt zaszczepionych 2-krotnie przy użyciu 5-25 μg rH5-E. coli (Fig. 8.4). Wysoki poziom pozytywności kurcząt w testach HI i FLUAc H5 utrzymywał się w okresie obserwacji, czyli do 2-go tygodnia po szczepieniu (Fig. 8.3, 8.4).
WTab. 9 podsumowano wyniki oznaczeń pozytywności kurcząt w ciągu 2 tygodni po szczepieniach, uzyskane przy użyciu testów FLUAc H5 oraz HI-H5N2. Pozytywność w teście FLUAc H5 w grupach szczepionych rH5-E. coli w dawkach 10, 15 i 25 μg osiągnęła wartości w zakresie 68-90%, w grupie szczepionej przy użyciu 5 μg antygenu wynosiła 52,5% ±10, natomiast odsetek kurcząt zaszczepionych 2-krotnie przy użyciu 5-25 μg rH5-E. coli, które wykazywały ochronne miano przeciwciał HI mieścił się w zakresie 81-87%.
Tabela 9
| Grupa | Odstęp między dawkami [tygodnie] | Dawka [pg] | FLUAc H5 (IDVet) pozytywne po II dawce średnia (n=4) | HI - H5N2 LPAIV HI > 1:16 po II dawce średnia (n=4) |
| 1A | 4 | 25 | 90% ± 8 | 87% ± 12,5 |
| 1B | 6 | |||
| 2A | 4 | 15 | 68%± 4 | 85% ± 19 |
| 2B | 6 | |||
| 3A | 4 | 10 | 85% ± 6 | 87% ± 12,5 |
| 3B | 6 | |||
| 4A | 4 | 5 | 52,5% ± 10 | 81 %± 15 |
| 4B | 6 | |||
| 2 x 5 - 25 pg rH5-E. coli odstęp 4 lub 6 tygodni średnia (n=16) | 74% ±16,5 | 85% ± 14 |
Wyniki analiz surowic pobranych 1 i 2 tygodnie po podaniu dwóch dawek rH5-E. coli po 5, 10, 15 lub 25 μg każda, przedstawione na Fig. 8.5 i Fig. 8.6 jako poziom miana przeciwciał HI w surowicy poszczególnych zwierząt oraz jako średnia wartość miana HI w każdej z badanych grup, wskazują, że znaczna część zwierząt wykazywała nie tylko minimalne ochronne miano przeciwciał HI (> 1:16), ale także miano pożądane w prewencji zakażenia AIV (> 1:64). Wśród kurcząt przebadanych po poda
PL 235 555 B1 niu II dawki antygenu w zakresie 5-25 μg, 50% stanowiły zwierzęta, których surowice pobrane 1 i/lub 2 tygodnie po powtórnej immunizacji wykazywały miano na poziomie 1:64 lub wyższym, osiągając u 3 kurcząt wartość 1:512.
Podsumowanie
Badania odpowiedzi humoralnej kurcząt typu nieśnego rasy Rossa 1 na podskórne podanie w odstępie 4 lub 6 tygodni dwóch dawek szczepionki zawierającej 5-25 μg rH5-E. coli i wodorotlenek jako adiuwant, które przeprowadzono na 8 grupach kurcząt, po 10 sztuk każda, przy użyciu testów ELISA (H5-ELISA; FLUAc H5, IDVet) oraz testu HI z heterologicznym LPAIV H5N2 wykazały, że:
- rekombinowana HA H5 (17-522 aa, ARRRKKR) z bakteryjnego systemu ekspresji - rH5-E. coli jest silnie immunogenna,
- dwie dawki szczepionki, podane w odstępie 4- lub 6-tygodniowym, są niezbędne ale i wystarczające do wywołania silnej odpowiedzi humoralnej u wszystkich szczepionych kurcząt (H5-dodatnie - 100%); miano punktu końcowego antygenowo-specyficznych przeciwciał osiąga wysokie wartości (200 000-850 000 - w ciągu 2 tygodni po II dawce rH5),
- dwukrotna immunizacja kurcząt rH5-E. coli w dawkach 5-25 μg z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem, w odstępie 4 lub 6 tygodni, indukuje u większości zwierząt funkcjonalne przeciwciała przeciwko H5:
- aktywne w teście FLUAc H5 (IDVet) na poziomie obserwowanym w trakcie zakażenia wirusami Al serotypu H5 (FLUAc H5-pozytywne - 74% ± 16,5% kurcząt),
- hamujące hemaglutynację przez H5N2 LP AIV na poziomie uznawanym za ochronny (z mianem HI > 1:16 - 8 5% ± 14% kurcząt) a także na poziomie pożądanym w prewencj i zakażenia AIV (z mianem HI > 1:64 - 50% kurcząt).
Badania immunizacyjne kurcząt typu nieśnego rasy Rossa 1, w których zwierzętom podano 2-krotnie w odstępie 4 tygodni 25 μg rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem, opisane w przykładzie 11, wykazały znacznie większą skuteczność szczepień niż przeprowadzone z zastosowaniem identycznej dawki antygenu, adiuwantu oraz odstępu czasu między dawkami badania immunizacyjne kurcząt typu mięsnego rasy Ross 308, opisane w przykładach: 6-9. Schematy immunizacji różniły się wyłącznie tym, że immunizację kurcząt typu nieśnego rozpoczęto w trzecim, natomiast kurcząt typu mięsnego z konieczności w pierwszym tygodniu życia. Różnica odpowiedzi humoralnej kurcząt typu nieśnego i mięsnego na szczepienie, dotycząca przede wszystkim obecności i poziomu funkcjonalnych przeciwciał przeciwko H5 (Fig. 8.7), była raczej efektem odmiennej immunnoreaktywności obu grup zwierząt niż różnicy wieku zwierząt poddawanych immunizacji. Niższą immunoreaktywność kurcząt typu mięsnego niż kurcząt typu nieśnego wykazali Koenen ME i wsp. w badaniach, w których zwierzęta obu typów będące w tym samym wieku immunizowano przy użyciu modelowego antygenu TNP-KLH (Koenen ME i wsp. 2002). Obserwowane różnice odpowiedzi kurcząt typu mięsnego i nieśnego na szczepienie są prawdopodobnie związane z odmiennym metabolizmem, długością życia i masą ciała zwierząt.
P r z y k ł a d 12 Wzmocnienie odpowiedzi odpornościowej przez donosowe podanie rH5-E. coli
W celu zbadania potencjału rH5-E. coli do indukcji odpowiedzi odpornościowej u ptaków przez błony śluzowe, opracowano kompozycję szczepionkową zawierającą rH5-E. coli i mukoadhezywny adiuwant (glutaminian chitosanu) do immunizacji dośluzówkowej oraz przeprowadzono doświadczenie immunizacyjne na kurczętach typu nieśnego, w którym uczulonym parenteralnie zwierzętom podano donosowo dawkę wzmacniającą.
Przygotowanie szczepionek, immunizacja kurcząt oraz pobieranie prób do badań serologicznych
Zawartość białka i hemaglutyniny w preparatach rH5-E. coli, przeznaczonych do przygotowania szczepionek oznaczano zgodnie z opisem zamieszczonym w przykładzie 6. Szczepionkę do immunizacji parenteralnej zawierającą rH5-E. coli i wodorotlenek glinu jako adiuwant przygotowano bezpośrednio przed użyciem w sposób opisany w przykładzie 6. Do przygotowania donosowej szczepionki z użyciem rH5-E. coli zastosowano PROTASAN™ UP G 113 (NovaMatrix/FMC Corp.), który jest wysoce oczyszczonym glutaminianem chitosanu - bioadhezywnym polimerem o lepkości < 20 mPa-s, masie cząsteczkowej < 200 kDa i stopniu deacetylacji 75-90%. PROTASAN rozpuszczano w wodzie dejonizowanej przez intensywne wytrząsanie na mieszadle vortex, a następnie dodawano 10 x stężony roztwór PBS, pH = 7,4 w objętości zapewniającej rozcieńczenie buforu i wytrząsano na mieszadle
PL 235 555 Β1 vortex w ciągu 1 minuty przy 2500 rpm, otrzymując w ten sposób 1% (wag./obj.) roztwór adiuwantu w PBS, pH ~6. Do przygotowanego roztworu PROTASAN-u dodawano preparat rH5-E. coli w stosunku 1:1 (obj./obj.), po czym całość wytrząsano na mieszadle vortex przy 2500 rpm w ciągu 5 minut. Kompozycja szczepionkowa o pH ~6,5, zawierająca antygen oraz 0,5% (wag./obj.) PROTASAN™ UP G 113, była przygotowywana bezpośrednio przed wykonaniem szczepień.
Doświadczenia immunizacyjne wykonano na grupie 15 kurcząt typu nieśnego rasy Rossa 1 (grupa nr 5) w produkcyjnych warunkach chowu. Kontrolną grupę (K) tworzyło 15 kurcząt nie poddawanych immunizacji. Pierwsze szczepienie wykonano w 3 tygodniu życia zwierząt przez podskórne podanie 25 μg rH5-E. coli z wodorotlenkiem glinu w trzech miejscach na karku w objętości 200 μΙ. W 7 tygodniu życia tj. 4 tygodnie po podaniu I dawki przeprowadzono donosowe szczepienie zwierząt podając 25 μg rH5-E. coli z PROTASAN-em w objętości 272 μΙ naprzemiennie do lewego i prawego otworu nosowego. W celu monitorowania odpowiedzi kurcząt na immunizację, pobierano krew od szczepionych zwierząt bezpośrednio przed podaniem dawki wzmacniającej oraz w ciągu jednego miesiąca po podaniu II dawki antygenu w odstępach 1-tygodniowych. Próby pobrane równolegle od kurcząt nie szczepionych stanowiły materiał kontrolny. Próby surowicy przygotowywano i przechowywano w sposób opisany w przykładzie 6. Harmonogram immunizacji kurcząt oraz pobrań krwi od zwierząt szczepionych i kontrolnych był zgodny ze schematem E, który zamieszono poniżej.
Schemat E immunizacji kurcząt rH5-E. coli oraz pobieranie prób do badań serologicznych.
Kurczęta typu nieśnego (Rossa 1)
I dawka - s.c.
pg rH5 + AI(OH)3 Grupa 5
II dawka - l.n.
PO rH5 + PROTASAN™ UP G 113 Grupa 5 l
I---------!----------1---------!----------!---------1---------1----------1----------1----------1---------!---------1----------!---------,---------11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415
Tygodnie życia | | | ||
Krew Krew krew Krew Krew
Grupy; 5, K
Analiza odpowiedzi odpornościowej kurcząt przy użyciu testów serologicznych
Surowice przygotowane w trakcie eksperymentu analizowano stosując testy do wykrywania przeciwciał przeciwko H5 AIV: pośredni i kompetycyjny typu ELISA (H5-ELISA; FLUAc H5, IDVet) oraz zahamowania hemaglutynacji (HI). Testy zostały przeprowadzone w celu zbadania odpowiedzi humoralnej kurcząt na szczepienie przez podanie podskórnej dawki uczulającej i donosowej dawki wzmacniającej. Test H5-ELISA umożliwił oznaczenie poziomu antygenowo-specyficznych przeciwciał klasy IgY, natomiast testy FLUAc H5 oraz HI ocenę funkcjonalnych właściwości wyedukowanych przeciwciał.
Test H5-ELISA wykonano w sposób opisany w przykładzie 7 z tym, że miano punktu końcowego wyznaczono dla wybranych prób pobranych od poszczególnych zwierząt. Sposób obliczania wartości punktu odcięcia (cut-off) dla H5-pozytywnych prób surowicy oraz definicję miana punktu końcowego przedstawiono w przykładzie 7. Test FLUAc H5 wykonano zgodnie z instrukcją producenta (IDVet), stosując warunki zwiększające czułość testu (próby surowicy rozcieńczone 1:1, inkubowane na płytkach w ciągu 1 godziny, w temperaturze 37°C). Sposób obliczania poziomu kompetycji oraz interpretację wyników, zgodne z informacją producenta, opisano w przykładzie 7. Test HI przeprowadzono przy użyciu erytrocytów kurcząt SPF, stosując heterologiczny H5N2 LPAIV jako antygen i oraz jednostkę zahamowania hemaglutynacji (HIU) 1:8. Zasadę testu HI oraz sposób jego przeprowadzę
PL 235 555 Β1 nia przedstawiono w przykładzie 8. Oznaczenia wykonano na próbach surowicy ze wszystkich pobrań krwi. Za pozytywne uznawano próby surowicy, które osiągnęły miano co najmniej 1:8.
Wyniki badań serologicznych
Badania serologiczne kurcząt po podskórnej immunizacji uczulającej z zastosowaniem 25 |_ig rH5-E. coli i wodorotlenku glinu jako adiuwanta, przeprowadzone przy użyciu testu H5-ELISA na próbach pobranych bezpośrednio przed podaniem II dawki antygenu tj. 4 tygodnie po pierwszym szczepieniu kurcząt, wykazały obecność przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 w 200-krotnie rozcieńczonych surowicach 13 z 15 (87%) immunizowanych zwierząt. Po donosowym podaniu szczepionki zawierającej 20 |_ig rH5-E. coli oraz PROTASAN™ UP G 113 jako adiuwant, u 10 z 15 szczepionych zwierząt obserwowano wzrost poziomu przeciwciał w surowicy, typowy dla wtórnej odpowiedzi odpornościowej (Fig. 9.1). Poziom odpowiedzi w grupie szczepionej po podaniu II dawki antygenu był zróżnicowany tak, że u 7 z 10 kurcząt wzmocnienie odpowiedzi wykazano w próbach rozcieńczonych 200-krotnie, natomiast u pozostałych 3 kurcząt w próbach rozcieńczonych 800-krotnie. U większości kurcząt, które pozytywnie zareagowały na szczepienie donosowe, poziom przeciwciał anty H5 osiągnął maksymalną wartość 1 tydzień (9/10), wyjątkowo 2 tygodnie (1/10) po powtórnej immunizacji. Dalsze analizy prób zawierających najwyższy u poszczególnych zwierząt poziom przeciwciał klasy IgY przeciwko H5 po immunizacji donosowej wykazały, że u 6 z 10 kurcząt miano punktu końcowego przeciwciał osiągnęło wysokie wartości przekraczające 1:10 000 i mieściło się w zakresie 1:11 200-1:80 600.
Oznaczenia surowic pobranych od kurcząt 4 tygodnie po podskórnym podaniu uczulającej dawki antygenu przy użyciu testu FLUAc H5 wykazały, że żadna z badanych prób nie jest seropozytywna wg kryteriów klasyfikacyjnych testu a wartości kompetycji mieszczą się w zakresie 49-93% (Fig. 9.2). Obniżenie wartości % kompetycji prób surowicy po podaniu donosowej dawki wzmacniającej obserwowano wyłącznie w grupie 10 kurcząt, u których stwierdzono wzrost poziomu przeciwciał przeciwko H5 po szczepieniu donosowym, wykazany testem H5-ELISA (Fig. 9.1, Fig. 9.2). U 5 z 10 zwierząt tej grupy obserwowano obniżenie wartości% kompetycji po szczepieniu donosowym, największe 1 tydzień po tym szczepieniu, przy czym wyniki uzyskane dla 2 kurcząt wykazały ich seropozytywność(Fig. 9.2). Pojawienie się funkcjonalnych przeciwciał przeciwko H5 w surowicy lub wzrost ich poziomu po donosowym podaniu antygenu obserwowano również w teście HI dla 4 z 10 kurcząt reagujących na szczepienie donosowe produkcją przeciwciał klasy IgY przeciwko H5, wykrywanych w testem H5-ELISA (Fig. 9.1, Tab. 10).
Tabela 10
| X. HI \aiv ID X. | Po I dawce rH5 - s.c. | Po II dawce rH5 - i.n. | |||
| 4 tygodnie | 1 tydzień | 2 tygodnie | 3 tygodnie | 4 tygodnie | |
| H5N2 LP | H5N2 LP | H5N2 LP | H5N2 LP | H5N2 LP | |
| 5-2 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| 5-4 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| 5-7 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| 5-8 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| 5-9 | <8 | 8 | 16 | <8 | <8 |
| 5-10 | 8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| 5-11 | <8 | <8 | <8 | <8 | <8 |
| 5-12 | <8 | 16 | <8 | <8 | <8 |
| 5-14 | 8 | 16 | <8 | 8 | <8 |
| 5-15 | 8 | 8 | 8 | 16 | nd. |
| Serododatnie Miano HI | 3/10 (30%) 8 | 4/10 (40%) 8-16 | 2/10 (20%) 8- 16 | 1/10 (10%) 16 | 0/9 (0%) < 8 |
PL 235 555 B1
Wszystkie przeprowadzone testy serologiczne wykazały znaczne zróżnicowanie odpowiedzi zwierząt na immunizację donosową, co było najprawdopodobniej spowodowane obserwowanym połykaniem części szczepionki przez kurczęta podczas jej podawania w zbyt dużej objętości (272 μΙ).
Podsumowanie
Badania odpowiedzi humoralnej kurcząt typu nieśnego rasy Rossa 1 na donosowe podanie dawki wzmacniającej zawierającej 20 μο rH5-E. coli oraz PROTASAN™ UP G 113 (NovaMatrix/FMC Corp.) jako adiuwant, które przeprowadzono przy użyciu testów serologicznych (H5-ELISA, FLUAc H5, HI-H5N2) pozwalają stwierdzić, że:
- donosowe wzmocnienie odpowiedzi odpornościowej u kurcząt przy użyciu białkowego antygenu - rH5-E. coli w zastosowanej kompozycji szczepionkowej jest możliwe,
- opracowana szczepionka wykazuje potencjał indukcji wysokiego miana antygenowospecyficznych przeciwciał klasy IgY oraz funkcjonalnych przeciwciał przeciwko H5, takich jak przeciwciała współzawodniczące z przeciwciałami testu FLUAc H5 o przypuszczalnie konformacyjny epitop neutralizujący wirusów AI o serotypie H5 oraz przeciwciała hamujące hemaglutynację przez heterologiczny AIV H5N2.
LITERATURA
Avian Influenza in: OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2012
[http://www.oie.int/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/]
Aguilar-Yanez JM, Portillo-Lara R, Mendoza-Ochoa GI, Garcia-Echauri SA, López-Pacheco F, Bulnes-Abundis D, Salgado-Gallegos J, Lara-Mayorga IM, Webb-Vargas Y, León-Angd FO, RiveroAranda RE, Oropeza-Almazan Y, Ruiz-Palacios GM, Zertuche-Guerra MF DuBois RM, White SW, Schultz-Cherry S, Russell CJ, Alvarez MM. An influenza A/H1N1/2009 hemagglutinin vaccine produced in Escherichia coli. PLoS One. 2010; 5:e11694.
Biesova Z, Miller MA, Schneerson R, Shiloach J, Green KY, Robbins JB, Keith JM. Preparation, characterization, and immunogenicity in mice of a recombinant influenza H5 hemagglutinin vaccine against the avian H5N1 A/Vietnam/1203/2004 influenza virus. Vaccine. 2009; 27:6234-8.
Bommakanti G, Citron MP, Hepler RW, Callahan C, Heidecker GJ, Najar TA, Lu X, Joyce JG, Shiver JW, Casimiro DR, ter Meulen J, Liang X, Varadarajan R. Design of an HA2-based Escherichia coli expressed influenza immunogen that protects mice from pathogenic challenge. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107:13701-6.
Bommakanti G, Lu X, Citron MP, Najar TA, Heidecker GJ, ter Meulen J, Varadarajan R, Liang X. Design of Escherichia coli-expressed stalk domain immunogens of H1N1 hemagglutinin that protect mice from lethal challenge. J Virol. 2012; 86:13434-44.
Bosch BJ, Bodewes R, de Vries RP, Kreijtz JH, Bartelink W, van Amerongen G, Rimmelzwaan GF, de Haan CA, Osterhaus AD, Rottier PJ. Recombinant soluble, multimeric HA and NA exhibit distinctive types of protection against pandemic swine-origin 2009 A(H1N1) influenza virus infection in ferrets. J Virol. 2010; 84:10366-74.
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976; 72:248-54.
Chiu FF, Venkatesan N, Wu CR, Chou AH, Chen HW, Lian SP, Liu SJ, Huang CC, Lian WC, Chong P, Leng CH. Immunological study of HA1 domain of hemagglutinin of influenza H5N1 virus. Biochem Biophys Res Commun. 2009; 383:27-31.
Chung CT, Miller RH. A rapid and convenient method for preparation and storage of competent bacterial cells. Nucleic Acids Res. 1988; 16:3580.
DuBois RM, Aguilar-Yanez JM, Mendoza-Ochoa GI, Oropeza-Almazan Y, Schultz-Cherry S, Alvarez MM, White SW, Russell CJ. The receptor-binding domain of influenza virus hemagglutinin produced in Escherichia coli folds into its native, immunogenic structure. J Virol. 2011; 85:865-72.
Ekiert DC, Bhabha G, Elsliger MA, Friesen RH, Jongeneelen M, Throsby M, Goudsmit J, Wilson IA. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 2009; 324:246-51.
PL 235 555 B1
Gromadzka B, Śmietanka K, Dragun J, Minta Z, Gora-Sochacka A, Szewczyk B. Detection of changes in avian influenza genome fragments by multitemperature single-strand conformational polymorphism. Mol Cell Probes. 2008; 22:301-4.
Hong M, Lee PS, Hoffman RM, Zhu X, Krause JC, Laursen NS, Yoon SI, Song L, Tussey L, Crowe JE Jr, Ward AB, Wilson IA. Antibody recognition of the pandemic H1N1 Influenza virus hemagglutinin receptor binding site. J Virol. 2013; 87:12471-80.
Horthongkham N, Srihtrakul T, Athipanyasilp N, Siritantikorn S, Kantakamalakul W, Poovorawan Y, Sutthent R. Specific antibody response of mice after immunization with COS-7 cell derived avian influenza virus (H5N1) recombinant proteins. J Immune Based Ther Vaccines. 2007; 5:10.
Jegerlehner A, Zabel F, Langer A, Dietmeier K, Jennings GT, Saudan P, Bachmann MF. Bacterially produced recombinant influenza vaccines based on virus-like particles. PLoS One. 2013; 8:e78947.
Jeon SH, Arnon R. Immunization with influenza virus hemagglutinin globular region containing the receptor-binding pocket. Viral Immunol. 2002; 15:165-76.
Khurana S, Chearwae W, Castellino F, Manischewitz J, King LR, Honorkiewicz A, Rock MT, Edwards KM, Del Giudice G, Rappuoli R, Golding H. Vaccines with MF59 adjuvant expand the antibody repertoire to target protective sites of pandemic avian H5N1 influenza virus. Sci Transi Med. 2010; 2:15ra5.
Khurana S, Verma S, Verma N, Crevar CJ, Carter DM, Manischewitz J, King LR, Ross TM, Golding H. Properly folded bacterially expressed H1N1 hemagglutinin globular head and ectodomain vaccines protect ferrets against H1N1 pandemic influenza virus. PLoS One. 2010; 5:e11548.
Khurana S, Larkin C, Verma S, Joshi MB, Fontana J, Steven AC, King LR, Manischewitz J, McCormick W, Gupta RK, Golding H. Recombinant HA1 produced in E. coli forms functional oligomers and generates strain-specific SRID potency antibodies for pandemic influenza vaccines. Vaccine. 2011; 29:5657-65.
Khurana S, Verma S, Verma N, Crevar CJ, Carter DM, Manischewitz J, King LR, Ross TM, Golding H. Bacterial HA1 vaccine against pandemic H5N1 influenza virus: evidence of oligomerization, hemagglutination, and cross-protective immunity in ferrets. J Virol. 2011; 85:1246-56.
Koenen ME, Boonstra-Blom AG, Jeurissen SH. Immunological differences between layer- and broiler-type chickens. Vet Immunol Immunopathol. 2002; 89:47-56.
Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227:680-5.
Liu G, Song L, Reiserova L, Trivedi U, Li H, Liu X, Noah D, Hou F, Weaver B, Tussey L. Flagellin-HA vaccines protect ferrets and mice against H5N1 highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) infections. Vaccine. 2012; 30:6833-8.
Liu G, Tarbet B, Song L, Reiserova L, Weaver B, Chen Y, Li H, Hou F, Liu X, Parent J, Umlauf S, Shaw A, Tussey L. Immunogenicity and efficacy of flagellin-fused vaccine candidates targeting 2009 pandemic H1N1 influenza inmice. PLoS One. 2011; 6:e20928.
Loeffen WL, de Vries RP, Stockhofe N, van Zoelen-Bos D, Maas R, Koch G, Moormann RJ, Rottier PJ, de Haan CA. Vaccination with a soluble recombinant hemagglutinin trimer protects pigs against a challenge with pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. Vaccine. 2011; 29:1545-50.
Minta Z. 2008 HPAI-PLAN Instrukcje przeprowadzania laboratoryjnych badań diagnostycznych w kierunku grypy ptaków.
Okuno Y, Isegawa Y, Sasao F, Ueda S. A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinins of influenza A virus H1 and H2 strains. J Virol. 1993; 67:2552-8.
Sagawa H, Ohshima A, Kato I, Okuno Y, Isegawa Y. The immunological activity of a deletion mutant of influenza virus haemagglutinin lacking the globular region. J Gen Virol. 1996; 77:1483-7.
Sanchez-Arreola PB, López-Uriarte S, Marichal-Gallardo PA, Gonzalez-Vazquez JC, Perez-Chavarria R, Soto-Vazquez P, López-Pacheco F, Ramirez-Medrano A, Rocha-Pizana MR, Alvarez MM. A baseline process for the production, recovery, and purification of bacterial influenza vaccine candidates. Biotechnol Prog. 2013; 29:896-908.
Shen S, Mahadevappa G, Oh HL, Wee BY, Choi YW, Hwang LA, Lim SG, Hong W, Lal SK, Tan YJ. Comparing the antibody responses against recombinant hemagglutinin proteins of avian influenza A (H5N1) virus expressed in insect cells and bacteria. J Med Virol. 2008; 80:1972-83.
PL 235 555 B1
Skibiński DA, Hanson BJ, Lin Y, von Messling V, Jegerlehner A, Tee JB, Chye de H, Wong SK, Ng AA, Lee HY, Au B, Lee BT, Santoso L, Poidinger M, Fairhurst AM, Matter A, Bachmann MF, Saudan P, Connolly JE. Enhanced neutralizing antibody titers and Th1 polarization from a novel Escherichia coli derived pandemic influenza vaccine. PLoS One. 2013; 8:e76571.
Song L, Nakaar V, Kavita U, Price A, Huleatt J, Tang J, Jacobs A, Liu G, Huang Y, Desai P, Maksymiuk G, Takahashi V, Umlauf S, Reiserova L, Bell R, Li H, Zhang Y, McDonald WF, Powell TJ, Tussey L. Efficacious recombinant influenza vaccines produced by high yield bacterial expression: a solution to global pandemic and seasonal needs. PLoS One. 2008; 3:e2257.
Song L, Zhang Y, Yun NE, Poussard AL, Smith JN, Smith JK, Borisevich V, Linde JJ, Zacks MA, Li H, Kavita U, Reiserova L, Liu X, Dumuren K, Balasubramanian B,Weaver B, Parent J, Umlauf S, Liu G, Huleatt J, Tussey L, Paessler S. Superior efficacy of a recombinant flagellin:H5N1 HA globular head vaccine is determined by the placement of the globular head within flagellin. Vaccine. 2009; 27:5875-84.
Spackman E, Senne DA, Myers TJ, Bulaga LL, Garber LP, Perdue ML, Lohman K, Daum LT, Suarez DL. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 2002; 40:3256-60.
Steel J, Lowen AC, Wang TT, Yondola M, Gao Q, Haye K, Garcia-Sastre A, Palese P. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. MBio. 2010; 1(1).
Suarez DL. Overview of avian influenza DIVA test strategies. Biologicals. 2005; 33:221-6.
Sui J, Hwang WC, Perez S, Wei G, Aird D, Chen LM, Santelli E, Stec B, Cadwell G, Ali M, Wan H, Murakami A, Yammanuru A, Han T, Cox NJ, Bankston LA, Donis RO, Liddington RC, Marasco WA. Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol. 2009; 16:265-73.
Taylor DN, Treanor JJ, Sheldon EA, Johnson C, Umlauf S, Song L, Kavita U, Liu G, Tussey L, Ozer K, Hofstaetter T, Shaw A. Development of VAX128, a recombinant hemagglutinin (HA) influenza-flagellin fusion vaccine with improved safety and immune response. Vaccine. 2012 30:5761-9.
Taylor DN, Treanor JJ, Strout C, Johnson C, Fitzgerald T, Kavita U, Ozer K, Tussey L, Shaw A. Induction of a potent immune response in the elderly using the TLR-5 agonist, flagellin, with a recombinant hemagglutinin influenza-flagellin fusion vaccine (VAX125, STF2.HA1 SI). Vaccine. 2011 29: 4897-902.
Treanor JJ, Taylor DN, Tussey L, Hay C, Nolan C, Fitzgerald T, Liu G, Kavita U, Song L, Dark I, Shaw A. Safety and immunogenicity of a recombinant hemagglutinin influenza-flagellin fusion vaccine (VAX125) in healthy young adults. Vaccine. 2010; 28:8268-74.
van den Berg T, Lambrecht B, Marche S, Steenseis M, Van Borm S, Bublot M. Influenza vaccines and vaccination strategies in birds. Comp Immunol Microbiollnfect Dis. 2008; 31:121-65.
Verma S, Dimitrova M, Munjal A, Fontana J, Crevar CJ, Carter DM, Ross TM, Khurana S, Golding H. Oligomeric recombinant H5 HA1 vaccine produced in bacteria protects ferrets from homologous and heterologous wild-type H5N1 influenza challenge and controls viral loads better than subunit H5N1 vaccine by eliciting high-affinity antibodies. J Virol. 2012; 86:12283-93.
Wei CJ, Xu L, Kong WP, Shi W, Canis K, Stevens J, Yang ZY, Dell A, Haslam SM, Wilson IA, Nabel GJ. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J Virol. 2008; 82:6200-8.
Weldon WC, Wang BZ, Martin MP, Koutsonanos DG, Skountzou I, Compans RW. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 2010; 5:e12466.
Wiley DC, Wilson IA, Skehel JJ. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 1981; 289:373-8.
Wilson IA, Cox NJ. Structural basis of immune recognition of influenza virus hemagglutinin. Annu Rev Immunol. 1990; 8:737-71.
Xie QM, Ji J, Du LQ, Cao YC, Wei L, Xue CY, Qin JP, Ma JY, Bi YZ. Preparation and immune activity analysis of H5N1 subtype avian influenza virus recombinant protein-based vaccine. Poult Sei. 2009; 88:1608-15.
Xuan C, Shi Y, Qi J, Zhang W, Xiao H, Gao GF. Structural vaccinology: structure-based design of influenza A virus hemagglutinin subtype-specific subunit vaccines. Protein Cell. 2011; 2:997-1005.
Claims (22)
- Zastrzeżenia patentowe1. Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA) wirusa grypy H5N1 składający się z podjednostki HA-1 obejmującej aa 17-340 oraz fragmentu podjednostki HA-2 obejmującego aa 347-522, przy czym polipeptyd został otrzymany metodą nadekspresji w komórkach prokariotycznych, zwłaszcza komórkach bakteryjnych jak E. coli, w postaci ciałek inkluzyjnych.
- 2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że wirusem grypy jest HPAIV H5N1.
- 3. Polipeptyd według zastrz. 2, znamienny tym, że wirusem grypy jest szczep HPAIV H5N1 A/swan/Poland/305-135V08/2006 (EpiFlu Database Nr dostępu EPI156789).
- 4. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi sekwencję HA szczepu HPAIV H5N1 A/swan/Poland/305-135V08/2006 (EpiFlu Database Nr dostępu EPI156789).
- 5. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada sekwencję aminokwasową SEKW NR ID 2.
- 6. Polipeptyd według któregokolwiek z zastrz. 1-5, znamienny tym, że wytwarzany jest w prokariotycznym systemie ekspresji.
- 7. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarzany jest w E. coli.
- 8. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że eksprymowany jest w postaci ciałek inkluzyjnych.
- 9. Kompozycja zawierająca nośnik i skuteczną do wywołania odpowiedzi immunologicznej i/lub leczenia zakażenia wirusem grypy ilość polipeptydu jak określono w zastrz. 1-8.
- 10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że nośnikiem jest adiuwant stymulujący odpowiedź humoralną i/lub komórkową wybrany z grupy obejmującej sole mineralne, emulsje olejowe, produkty mykobakterii, saponiny, produkty syntetyczne i cytokiny.
- 11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że adiuwantem jest wodorotlenek glinu, sole chitosanu jak glutaminian chitosanu, MF59, AS03 lub ISCOMATRIX.
- 12. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że podawana jest podskórnie, śródskórnie, domięśniowo albo dośluzówkowo, w tym donosowo, przez układ pokarmowy a w przypadku immunizacji ptaków także dospojówkowo, donosowo-dospojówkowo, in ovo.
- 13. Kompozycja jak określono w którymkolwiek z zastrz. 9-12 do zastosowania do profilaktycznych szczepień ludzi lub do immunizacji ptaków przeciwko wirusowi grypy, zwłaszcza niosek stad towarowych oraz stad rodzicielskich niosek i brojlerów.
- 14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że wirusem grypy jest szczep wirusa ptasiej grypy HPAIV H5N1.
- 15. Przeciwciało wiążące się specyficznie z polipeptydem jak określono w którymkolwiek z zastrz. 1-8.
- 16. Sposób otrzymywania polipeptydu jak określono w którymkolwiek z zastrz. 1-8, znamienny tym, żea) wyznacza się sekwencję rzeczonego polipeptydu w naturalnie występującym białku hemaglutyniny (HA) H5 wirusa grypy;b) transformuje się komórki prokariotyczne wektorem ekspresyjnym zawierającym kwas nukleinowy kodujący rzeczony polipeptyd;c) hoduje się transformowane komórki prokariotyczne produkujące rzeczony polipeptyd w postaci ciałek inkluzyjnych;d) izoluje się i rozpuszcza powstałe ciałka inkluzyjne;e) renaturuje się i oczyszcza wyprodukowany polipeptyd.
- 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że wirusem grypy jest HPAIV H5N1.
- 18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że komórkami prokariotycznymi są komórki bakteryjne, zwłaszcza E. coli.
- 19. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że wyizolowane ciałka inkluzyjne rozpuszcza się w buforze DRCI (50 mM TrisHCl, pH 8,0; 8 M mocznik; 10 mM beta-merkaptoetanol; 0,01% Triton X-100).
- 20. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że roztwór polipeptydu uzyskany w wyniku rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych oczyszcza się na kolumnie ze złożem DEAE Sepharose Fast Flow.
- 21. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że polipeptyd renaturuje się metodą rozcieńczeń w buforze BR (40 mM TrisHCl pH 8,0; 100 mM NaCl).
- 22. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że polipeptyd po renaturacji oczyszcza się na kolumnie ze złożem Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408649A PL235555B1 (pl) | 2014-06-24 | 2014-06-24 | Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA ) wirusa grypy H5N1, kompozycja zawierająca polipeptyd i jej zastosowanie, przeciwciało wiążące się specyficznie z polipeptydem oraz sposób otrzymywania tego polipeptydu |
| EP15744381.3A EP3160501B1 (en) | 2014-06-24 | 2015-06-24 | Influenza virus hemagglutinin protein as a vaccine antigen |
| US15/320,484 US10398770B2 (en) | 2014-06-24 | 2015-06-24 | Influenza virus hemagglutinin protein as a vaccine antigen |
| PCT/PL2015/050025 WO2015199564A1 (en) | 2014-06-24 | 2015-06-24 | Influenza virus hemagglutinin protein as a vaccine antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408649A PL235555B1 (pl) | 2014-06-24 | 2014-06-24 | Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA ) wirusa grypy H5N1, kompozycja zawierająca polipeptyd i jej zastosowanie, przeciwciało wiążące się specyficznie z polipeptydem oraz sposób otrzymywania tego polipeptydu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL408649A1 PL408649A1 (pl) | 2016-01-04 |
| PL235555B1 true PL235555B1 (pl) | 2020-09-07 |
Family
ID=53761469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL408649A PL235555B1 (pl) | 2014-06-24 | 2014-06-24 | Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA ) wirusa grypy H5N1, kompozycja zawierająca polipeptyd i jej zastosowanie, przeciwciało wiążące się specyficznie z polipeptydem oraz sposób otrzymywania tego polipeptydu |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10398770B2 (pl) |
| EP (1) | EP3160501B1 (pl) |
| PL (1) | PL235555B1 (pl) |
| WO (1) | WO2015199564A1 (pl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2011235220B2 (en) | 2010-03-30 | 2016-03-10 | Mount Sinai School Of Medicine | Influenza virus vaccines and uses thereof |
| MX2014003308A (es) | 2011-09-20 | 2015-03-09 | Sinai School Medicine | Vacunas para el virus de la influenza y usos de las mismas. |
| CN108641002A (zh) | 2012-12-18 | 2018-10-12 | 西奈山伊坎医学院 | 流感病毒疫苗及其用途 |
| WO2014159960A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof |
| US10736956B2 (en) | 2015-01-23 | 2020-08-11 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus vaccination regimens |
| EP3463447A4 (en) * | 2016-06-03 | 2020-05-27 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | INFLUENZA VIRUSES |
| JP7237344B2 (ja) | 2016-06-15 | 2023-03-13 | アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ | インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質及びその使用 |
| CA3058652A1 (en) | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007022425A2 (en) * | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Hawaii Biotech, Inc. | Influenza recombinant subunit vaccine |
| TW200745158A (en) | 2006-03-07 | 2007-12-16 | Vaxinnate Corp | Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof |
| PL216037B1 (pl) | 2006-06-09 | 2014-02-28 | Inst Biotechnologii I Antybiotykow | Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu |
| EP3115060A1 (en) | 2008-04-18 | 2017-01-11 | VaxInnate Corporation | Deletion mutants of flagellin and methods of use |
| CN107281478B (zh) * | 2010-07-23 | 2022-04-01 | 诺瓦瓦克斯公司 | 流感疫苗 |
| PL220281B1 (pl) * | 2011-09-23 | 2015-09-30 | Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk | Szczepionka DNA, sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej, przeciwciała specyficznie rozpoznające białko hemaglutyniny H5 wirusa grypy i zastosowanie szczepionki DNA |
| GB201116416D0 (en) * | 2011-09-23 | 2011-11-02 | Isis Innovation | Composition |
| US8932598B2 (en) | 2012-08-28 | 2015-01-13 | Vaxinnate Corporation | Fusion proteins and methods of use |
| PL238555B1 (pl) * | 2013-12-20 | 2021-09-06 | Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk | Sposób wytwarzania hydrofilowej domeny hemaglutyniny wirusa H5 |
-
2014
- 2014-06-24 PL PL408649A patent/PL235555B1/pl unknown
-
2015
- 2015-06-24 EP EP15744381.3A patent/EP3160501B1/en active Active
- 2015-06-24 US US15/320,484 patent/US10398770B2/en active Active
- 2015-06-24 WO PCT/PL2015/050025 patent/WO2015199564A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3160501B1 (en) | 2021-08-04 |
| PL408649A1 (pl) | 2016-01-04 |
| WO2015199564A1 (en) | 2015-12-30 |
| EP3160501A1 (en) | 2017-05-03 |
| US10398770B2 (en) | 2019-09-03 |
| US20170165352A1 (en) | 2017-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10398770B2 (en) | Influenza virus hemagglutinin protein as a vaccine antigen | |
| JP7094103B2 (ja) | インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 | |
| AU2012343981B2 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof | |
| US10328144B2 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof | |
| AU2010303568B2 (en) | Immunopotentiator-linked oligomeric influenza immunogenic compositions | |
| AU2020263900A1 (en) | Recombinant influenza antigens | |
| EP3743106A1 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof | |
| To et al. | Recombinant influenza A virus hemagglutinin HA2 subunit protects mice against influenza A (H7N9) virus infection | |
| US9896484B2 (en) | Influenza virus recombinant proteins | |
| Sączyńska | Influenza virus hemagglutinin as a vaccine antigen produced in bacteria | |
| JP2018052953A (ja) | インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 | |
| NZ625973B2 (en) | Influenza virus vaccines and uses thereof |