KR20130095251A

KR20130095251A - 인플루엔자 백신

Info

Publication number: KR20130095251A
Application number: KR1020137001862A
Authority: KR
Inventors: 에이.디.엠.이. 오스터하우스; 브로르 모레인; 카린 벵트쏜 뢰브그렌
Original assignee: 이스코노바 에이비; 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담
Priority date: 2010-07-23
Filing date: 2011-07-25
Publication date: 2013-08-27
Also published as: AU2011280259B2; EP2595653A4; AU2011280259B8; CN107281478A; KR102143105B1; EP2595653A1; BR112013001514A2; EP3272359A1; NZ606087A; US20130129770A1; AU2011280259A1; US10736958B2; CN107281478B; RU2013108067A; CA2805741A1; EP2595653B1; CN103052401A; JP2013533270A; AU2011280259A8; KR20170141268A

Abstract

본 발명은 하나 이상의 ISCOM 복합체 및 하나 이상의 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 하나 이상의 하나 이상의 헤마글루티닌 (hemagglutinin,HA) 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인(ectodomain) 및 하나 이상의 뉴라미니다아제 (neuraminidase,NA) 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 엑토도메인은 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 엑토도메인에 해당한다. 또한 본 발명은 키트(kit)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 예를 들어 조류 및 포유류와 같은 척추동물의 인플루엔자에 대항하는 면역 자극 약물(immune stimulating medicine), 면역 조절 제약 (immune modulating pharmaceutical), 또는 백신으로 사용될 수도 있다.

Description

인플루엔자 백신{INFLUENZA VACCINE}

본 발명은 하나 이상의 ISCOM 복합체 및 하나 이상의 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 하나 이상의 하나 이상의 헤마글루티닌 (hemagglutinin,HA) 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인(ectodomain) 및 하나 이상의 뉴라미니다아제 (neuraminidase,NA) 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 엑토도메인은 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 엑토도메인에 해당한다. 또한 본 발명은 키트(kit)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 예를 들어 조류 및 포유류와 같은 척추동물의 인플루엔자에 대항하는 면역 자극 약물(immune stimulating medicine), 면역 조절 제약(immune modulating pharmaceutical), 또는 백신으로 사용될 수도 있다.

최근 세계적 유행성 돼지-기원(pandemic swine-origin) 2009 A(H1N1) 인플루엔자 바이러스의 출현은 인간 개체군에서 세계적 규모로 질병율과 사망률을 초래하는 인플루엔자 바이러스의 잠재력을 매우 강조한다. 세계적으로 200개가 넘는 국가 및 해외 지역 또는 지역사회(communities)에서는 16,000개가 넘는 사망건을 포함하는 세계적 유행성 바이러스의 실험실-확인 사례(laboratory-confirmed case)를 보고했다(선행문헌 1). 백신접종(vaccination)은 인플루엔자 질병부담을 낮추거나 예방할 수 있는 주된 방법이다. 그러나, 2009년 유행성에 의해 다시 설명되듯, 발생의 초기단계 동안 빠른 대응이 많은 시간을 소모하는 백신 스트레인(strain) 준비 및 현재 사용되는 백신 제조 공정에 의해 방해 받았다. 이는, 항원연속변이 및 항원대변이(antigenic drift and shift)에 의해 기존의 면역력(existing immunity)으로부터 벗어날 수 있는 인플루엔자 바이러스들의 악명 높은 능력과 결합되어, 새롭게 발생하는 항원성 변종에 대해 유연하게 반응할 수 있고 빠르게 생산될 수 있는 새롭고, 안전하고, 가급적 광범위하게 효과적인 백신의 필요성을 강조한다.

현재 허가된 인플루엔자 바이러스 백신들은 바이러스 엔벨롭의 당단백질, 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)로 구성되어 있다. 항체는 인플루엔자 바이러스에 대항하는 면역력에서 별개의 성질을 갖는 이러한 두 개의 큰 당단백질들로부터 유도된다. HA에 대한 항체들은 일반적으로 바이러스가 표적 세포의 시알릭산 수용체에 결합하는 것을 방해하는 것에 의해 또는, 이어서, 바이러스 게놈이 표적세포에 접근할 때 통과하는 바이러스 및 세포막의 융합을 방지하는 것에 의해 바이러스의 감염성을 무효화시킨다. NA에 대한 항체들은 효소활성을 파괴하는 NA-관련 수용체를 방해하는 것에 의해 감염된 세포로부터 자손 바이러스의 방출을 할 수 없게 만든다. HA-매개 체액성 면역은 가장 광범위하게 특성화되어 있고, 바이러스 감염을 예방한다고 나타나져 있다. 질병을 예방하는 NA 항체의 기여도는 그리 잘 연구되지 않았다. 그들은 감염된 상피의 선단면(apical surface)으로부터 방출되는 감염성 바이러스들(infectious virus)을 감소시키는 것(선행문헌2-8)과 바이러스 방출(virus shedding)의 확률과 및 주변 환경으로의 확산을 낮추는 것을 특징으로 하는 일종의 허용성 면역(permissive immunity)(선행문헌2)을 생성하는 것으로 보인다.

HA와 NA 조합물에 의한 면역은 인플루엔자에 대항하는 강화된 보호(enhanced protection)를 제공한다(선행문헌 5,9,10). 비록 HA와 NA가 동등하게 면역원성이 있으나(선행문헌 2), 종래의 비활성 백신 또는 바이러스 감염에 대한 체액성 면역 반응은 HA 및 NA가 거의 4:1 비율로 바이러스 표면에 생기게 되므로 자연스럽게 HA로 편향된다(선행문헌 11). 게다가, 온전한 비리온(virion)들 안에서 HA는 면역학적으로 마우스에서 나타나는 B 및 T세포 프라이밍(priming)에서 NA를 능가한다(선행문헌 12). 이 항원성 경쟁은 HA 및 NA가 별도로 투여되는 경우에는 백신 접종된 동물들에게서 보이지 않는다(선행문헌 10,13). 현재 허가된 세계적 유행성 백신(pandemic vaccine)뿐 아니라 계절성 3가 백신(seasonal trivalent vaccine)은 일반적으로 모든 바이러스들로부터 제조되며, 그리고 이러한 이유로 NA 항원 보다는 HA를 더 편향되게 가지고 있다. 백신 제형에서 NA에 유리하게 HA-NA 비율을 맞추는 것은 그 결과로 더 높은 NA항체 수준(level) 및 질병에 대항하는 증가된 보호(protection)를 야기하는 더 균형잡힌 체액성 면역 반응을 제공할 수도 있다(선행문헌 3,14).

현재 비활성화된 인플루엔자 바이러스 백신은 오직 HA의 양에만 표준화 되어있기 때문에, NA 함량(content)은 가변적이고, 결과적으로, NA로의 혈청변환 빈도 및 수준(level)도 가변적인데, 이들은 종종 다소 빈약하다(선행문헌 28.29).

전형적인 인플루엔자 A 바이러스, 즉 기존의 면역력으로부터 벗어날 수 있는 특정 바이러스 서브타입(subtype) 내에 있는 HA 및 NA의 항원성 변종들은 서서히 인간 개체군에게 선택되고 있다. 이 항원연속변이 과정은 새롭게 발생한 변종에 대응하는 계절성 백신 조성물의 거의 연례적 수정을 필요로 한다. 예를 들어 조류(avian) H5N1 바이러스에 의해 초래된 것과 같은 미래 인플루엔자 전국적 유행병(influenza pandemic)의 위협 때문에, 광범위한 보호성 면역력을 유도하는 백신이 필요하다.

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본 발명은 하나 이상의 ISCOM 복합체, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 하나 이상의 헤마글루티닌(HA) 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인, 하나 이상의 뉴라미니다아제(NA) 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인을 포함하는 조성물 및 키트에 관한 것이며, 엑토도메인은 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 엑토도메인에 해당한다.

ISCOM 보조제 및 HA 및 NA 또는 그들의 단편들을 포함하는 조성물은 예를 들어 WO 2008157419 및 선행문헌 5,9,10을 통해 알려져 있다. 그러나 ISCOM 보조제와 함께 HA 및 NA 둘 다로부터 얻어진 엑토도메인을 사용는 것은 전에 공개되지 않았다.

이제는 ISCOM 또는 ISCOM 매트릭스(matrix)가 보조된 NA 및 HA 둘 다로부터 얻어진 엑토도메인을 이용한 백신접종이 바이러스 복제를 줄이고-예를 들어 폐의 역가(pulmonary titer)를 낮추는 것에 의해-, 체중 감소 및 폐 병리(lung pathology)와 같은 감염의 임상 효과(clinical effect)를 감소시키는 것으로 드러나고 있다.

다중결합(multimeric) HA 및 NA 엑토도메인들은 훌륭한 백신 잠재력(potential)을 가지고 있으며, 이들은 높은 품질로 쉽게, 빠르게, 유연하게, 그리고 안전하게 생산될 수 있다. 인플루엔자 백신에 NA를 포함시키는 것은 HA에 의한 보호에 깊이 그리고 명확하게 기여한다. 그것이 백신에 포함되는 것은 필요한 HA 투여량을 줄이고, 방어면역(protective immunity)을 넓힐 것으로 예상된다.

도 1
2009 A(H1 N1) 인플루엔자 바이러스의 가용성 다중결합(multimeric) HA(sHA) 및 NA(sNA) 단백질의 설계 및 발현. A) 재조합적으로 발현된 sHA 및 sNA 단백질 구조체의 도식적 표현. sHA: HA 엑토도메인(a.a.17-522)은 각각, N-터미널 CD5 신호 펩타이드 및 C-터미널 삼량체화(trimerisation) (GCN4-pll) GCN4 도메인 및 Strep-Tag(ST)으로 발현된다. sNA: NA 헤드 도메인(a.a.75-469)은 N-터미널 CD5 신호 펩타이드, OneSTrEP(OS) 펩타이드 및 사량체화(tetramerisation) (GCN4-pLI) GCN4 도메인으로 발현된다. (B) 친화도-정제된 sHA 및 sNA 단백질의 코마시 블루 염색된(Coomassie blue stained) 환원성 SDS-PAGE(reducing SDS-PAGE)
도 2
다중결합 2009 A(H1 N1) 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 항원과 함께 백신접종 한 것에 대한 항체반응. 페렛(ferret)은 0일 및 20일에: 표시된 대로, 3.75 μg sHA₃+3.75 μg sNA₄ (sHA+sNA); 3.75 μg sHA₃ 보조제로 (ISCOM Matrix M [IMM]; sHA+IMM); 3.75 μg sNA₄ 보조제로 (sNA+IMM); 3.75 μg sHA₃+3.75 μg sNA₄ 보조제로 (sHA+sNA+IMM), PBS 또는 IMM으로 면역되었다. 2009 A(H1N1) 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 반응은 적혈구 응집 억제(HI; 제일 위 패널(panel)), 바이러스 중화(VN; 위에서 두 번째 패널), 및 뉴라미니다아제 억제(NI) 분석(밑의 두 패널)에 의해 평가되었다. 각각의 점은 한 페렛의 결과를 나타낸다. 수평선은 평균을 나타낸다. 수평의 회색 막대(bar)는 분석의 검출 한계를 가리킨다.
도 3
2009 A(H1N1) 인플루엔자 바이러스로 공격 접종(challenge inoculated)한 뒤의 임상 효과. 도 2에 대한 설명에서 언급된대로 면역된 페렛은 52일째에 10⁶ TCID₅₀의 바이러스가 기관 내로 접종되었다. 체중 감소는 감염 전 체중의 백분율(percentage)로 표현된다(위쪽 패널). 폐 중량은 폐 경화(consolidation)의 지표로서 체중의 백분율로 표현된다(가운데 패널). 폐는 육안으로 보이게 관찰되었으며, 경화된 영역을 표시하는 폐 영역 백분율에 대해 점수를 부여하였다(밑의 패널). 평균 값으로 표시되었고; 오류 막대(error bar)는 표준편차를 가리킨다. 수평의 회색 막대는 분석의 검출 한계를 가리킨다.
도 4
접종 후 페렛의 폐에서 조직 병리학적 발견의 예. A) 비-보조(non-adjuvanted) sHA₃ + sNA₄로 백신 접종되거나 PBS 또는 보조제만(IMM)으로 거짓-백신접종(mock-vaccinated)된 비보호 페렛(unprotected ferret)의 폐에서 관찰되는 세기관지 루멘(lumen)에 있는 세포 파편(cellular debris) 및 세기관지 벽(branchiobran wall)에서의 염증성 침윤(Inflammatory infiltrate) 및 상피세포의 손실. B) 비-보조 sHA₃ + sNA₄로 백신 접종되거나 PBS 또는 보조제만(IMM)으로 거짓-백신접종(mock-vaccinated)된 페렛의 폐의 폐포(alveoli)에 있는 단백질성 유체(proteinaceous fluid)(부종(edema))및 염증 세포의 침윤. C) sHA+IMM으로 백신접종 된 페렛의 세기관지에 있는 세기관지주위의(Peribronchiolar) 침윤(infiltrate) 및 세포 파편(cellular debris). D) sHA+IMM으로 백신접종 된 페렛의 폐 안의 타입 II 폐세포(type II pneumocyte)의 과다형성(hyperplasia) 및 비대(hypertrophy) 및 폐포중격(alveolar septa)안의 염증 침윤. E) sNA+IMM 및 sHA+sNA+IMM 그룹의 페렛의 폐 안에서 관찰되는 세기관지주위의 침윤. F) sNA+IMM 및 sHA+sNA+IMM 그룹의 페렛의 폐의 폐포(alveoli) 안의 타입 II 폐세포(type II pneumocyte)의 과다형성(hyperplasia) 및 염증 세포의 부재.
H&E 염색; 배율 20x (세기관지) 및 40x (폐포).
도 5
공격 접종(challenge-inoculated)된 동물의 폐, 코, 및 인후(throat)에서의 바이러스 역가(viral titers). 도 3에 대한 설명에서 언급된 대로 공격 접종(challenged) 및 면역된(immunised) 페렛에서 바이러스 복제는 접종 후 4일 뒤에 분석되었다. 바이러스 역가는 폐 균질액(lung homogenate)(위 쪽 패널), 코 표본(nose swap)(가운데 패널) 및 인후 표본(throat swap)(밑 쪽 패널)에서 결정된다. 역가는 MDCK 세포에서 종말점 적정(end-point titration)의 방법에 의해서 분석된다. 각 점은 한 페렛의 결과를 나타낸다. 수평선은 평균을 나타낸다. 수평선의 회색 막대는 분석의 검출 한계를 가리킨다.
도 6
다중결합 2009 A(H1N1) 인플루엔자 바이러스 sHA₃ 및 sNA₄ 항원의 백신접종에 의한 교차-중화 항체(cross-neutralising antibodies)의 유도. (A) 도 2에 대한 설명에서 언급된 대로 모두 보조제가 들어간 sHA₃또는 sHA₃+sNA₄로 두 번 면역화된 페렛의 혈청은 AI/wine/shope/1/56, A/ ltaly/1443/76, A/NL/386/86, A/lowa/15/30, A/NL/25/80, A/NewJersey/8/76, A/PR/8/34 및 IVR/148 인플루엔자 H1N1을 포함하는 서로 다른 인플루엔자 바이러스를 향한 활성이 있는지 HI 분석에서 검사되었다. 평균역가가 표시되었고; 오류막대는 표준편차를 가리킨다. (B) 둘 다 보조제가 들어간 sNA₄ 또는 sHA₃+sNA₄로 한 번 또는 두 번 면역화된 페렛의 혈청은 A/Kentucky/UR06-0258/2007(H1N1) 및 A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1) 인플루엔자 바이러스의 sNA₄ 에 대항하는 활성이 있는지 NI 분석에서 검사되고 취합되었다. A/California/04/2009(H1N1)의 NA는 양성 대조군(positive control)으로 함께 수행되었다. A/NL/602/09(H1N1) 또는 A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1) 인플루엔자 바이러스에 특이적인 양성 대조군(positive control) 혈청은 이러한 바이러스들에게 감염된 페렛으로부터 얻어졌다. 두 복제체(replicate)의 평균 역가가 표시되어있다; 오류 막대(error bar)는 표준편차를 가리킨다. 수평의 회색막대는 분석의 검출한계를 가리킨다.

본 발명은 하나 이상의 ISCOM 복합체, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 하나 이상의 HA 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인, 하나 이상의 NA 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 상기 엑토도메인은 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 엑토도메인에 해당한다.

엑토도메인은 세포밖 공간까지 이어져있는 막 단백질(membrane protein)의 도메인이다. 엑토도메인은 보통 신호 전달(signal transduction)로 이어지는 표면과의 접촉을 개시하는 단백질의 부분이다. 이는 조성물 안에서 항원으로 행동할 수도 있으며, 조성물은 백신으로 사용될 수도 있다.

분리된다는 것(isolated)은 엑토도메인이 다른 단백질 및 인플루엔자 바이러스의 NA 및 HA 단백질 각각의 나머지부분으로부터 실질적으로 분리된다는 것을 의미한다. 소수의 나머지 아미노산(amino acid)들이 존재할 수 있다. 상기 엑토도메인은 전체(full) 엑토도메인 또는 같은 효소적 및/또는 항원성 활성을 가지고 있는 그들의 일부분일 수도 있다. 일 실시예에 따르면 엑토도메인의 일부분은 그들의 헤드 도메인(head domain)일 수도 있다. 전체 엑토도메인 또는 같은 효소적 및/또는 항원성 활성을 가지고 있는 그들의 일부분인 엑토도메인은 인플루엔자 바이러스 또는 합성적으로 생산된(synthetically produced) 것으로부터 분리될 수도 있다. 그들은 서로 분리되거나 연결된 것으로 나타날 수도 있다.

일 실시예에서 상기 엑토도메인은 수용성 엑토도메인 또는 수용성 헤드 도메인이다.

같거나 다른 인플루엔자 바이러스 종(species) 또는 스트레인(strains)으로부터 얻어진 하나 이상의 헤마글루티닌 도메인으로부터 얻어진 상기 하나 이상의 엑토도메인 및 하나 이상의 뉴라미니다아제 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인은 재조합체(recombinant)일 수도 있는 하이브리드단백질(hybridprotein)로 나타날 수도 있다.

재조합형으로 생산된 HA 및 NA 항원은 두 항원의 상대적 양이 쉽게 조절되는 백신의 개발을 가능하게 한다. 진핵 발현 시스템, 포유류 및 곤충 모두,은 단백질의 자연적 항원성 구조의 더 나은 보존을 고려할 때 당단백질(glycoprotein)과 같은 것의 생산을 위한 바람직한 플랫폼(platform)이다. 하이브리드단백질(hybridprotein) 실시예 1의 설명 및 Genscript http://www.genscript.com/gene_synthesis.html 에 따라 생산 될 수도 있다.

상기 인플루엔자 바이러스는 예를 들어 HxNy와 같은 인플루엔자의 서브 혈청형(sub serotype)으로부터 선택될 수도 있으며, 상기 x 는 1-16 및 y는 1-9이다. 따라서 x는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16 일 수 있고 y 는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 일 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 인간, 조류, 가축, 예를 들어 소(bovine), 돼지(swine), 양, 염소, 와 같은 종 중 임의의 종으로부터 얻어진 것일 수도 있다. H 1-6 N 1-9와 같은 조류 인플루엔자 바이러스 또는 인간 인플루엔자 바이러스 H 1-3 N 1-2 또는 그들의 NA 및 HA로부터 얻어진 엑토도메인의 임의의 조합이 사용될 수도 있다. NA 엑토도메인 및/또는 HA 엑토도메인은 인간 및 조류 인플루엔자 바이러스와 같은 인플루엔자 바이러스의 다른 종으로부터 얻어질 수도 있다. 따라서, 하나 이상의 인간 및 조류 NA 엑토도메인은 하나 이상의 인간 및 조류 HA 엑토도메인과 결합될 수도 있으며, 이에 의해 NA 및 HA는 다른 유형(type)의 HxNy일 수도 있다.

일 실시예에 따르면 인플루엔자 바이러스는 1918 H1N1 인플루엔자 바이러스 (A/South Carolina/1/18) 및/또는 2004 H5N1 (A/Vietnam/1203/04) H1N1 및/또는 A/California/07/2009 바이러스 및/또는 A/California/04/2009 및/또는 A/California/09/2009 및/또는 A/Kentucky/UR06-0258/2007(H1N1) 및/또는 A/turkey/Turkey/1 /2005(H5N1) 로부터 선택된 N1H1 바이러스와 같은 인플루엔자 A이다.

NA 및 HA로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인들(다중결합체들)이 사용될 수도 있다. 상기 조성물은 하나 이상의 헤마글루티닌 도메인으로부터 얻어진 1-5개의 엑토도메인 및 하나 이상의 뉴라미니다아제 도메인으로부터 얻어진 1-5개의 헤드 도메인을 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면 상기 하나 이상의 헤마글루티닌 엑토도메인은 A/California/09/2009의 삼량체 HA 엑토도메인(a.a. 17-522)으로부터 선택된 것이다.

일 실시예에 따르면 상기 하나 이상의 뉴라미니다아제 헤드도메인은 A/California/09/2009 바이러스의 삼량체 NA 헤드 도메인(a.a. 75-469)으로부터 선택된 것이다. A/California/09/2009 단백질의 염기서열(sequence)은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/227809830 및 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/227809834 와 같은 것을 통해 당업계에 알려져 있다.

ISCOM 복합체는 보조제(adjuvant) 및 면역조절제(immune modulating agent)로 사용될 수도 있다. 그들은 ISCOM 및/또는 ISCOM 매트릭스(matrix) 복합체일 수도 있다.

ISCOM-매트릭스 복합체 및/또는 ISCOM 복합체는 인플루엔자 감염에 대한 면역 반응(immune response)을 이끌어내려는 하나 이상의 항원과 함께 쓰일 수도 있다. 항원(antigen) 및 ISCOM-매트릭스 복합체 및/또는 ISCOM-매트릭스는 혼합물(mixture) 또는 별도로 투여될 수도 있다.

ISCOM 매트릭스 복합체는 하나 이상의 글리코시드(glycoside) 및 하나 이상의 지질(lipid)을 포함한다. 상기 글리코시드는 보조제 효과를 가지고 있으며, 바람직하게는 특히 퀄라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)(Quil A)로부터 얻어진 사포닌(saponin)이다. 상기 지질은 콜레스테롤과 같은 하나 이상의 스테롤(sterol) 및 선택적으로 또한 인지질(phospholipid)이다. 또한 ISCOM 매트릭스 복합체는 하나 이상의 다른 면역조절성(immunomodulatory)(보조제-활성)물질, 반드시 글리코시드는 아닌, 을 함유 할 수도 있으며, EP 0 436 620 B1에 설명된 대로 생산될 수도 있다.

ISCOM 복합체는 하나 이상의 글리코시드, 하나 이상의 지질, 및 하나 이상의 항원 물질 또는 에피톱(epitope)과 같은 종류의 것을 함유한다. 이러한 항원 물질들은 예들 들어 단백질 및 펩타이드(peptide), 당단백질 및 글리코펩타이드(glycopeptides), 탄수화물(carbohydrate)등과 같이 종류가 서로 다른 것일 수도 있다. 상기 글리코시드는 보조제 효과를 가지고 있으며, 바람직하게는 특히 퀄라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)(Quil A)로부터 얻어진 사포닌(saponin)이다. 이러한 복합체는 포함된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 강화하고 하나 이상의 면역조절성(보조제-활성)물질을 함유할 수도 있다. ISCOM들은 EP 0 109 942 B1 , EP 0 242 380 B1 및 EP 0 180 546 B1에 설명된 대로 제조될 수도 있다. 게다가, 트랜스포트(transport) 및/또는 패신저(passenger) 항원은 EP 9600647-3 (PCT/SE97/00289)에 설명된 대로 사용될 수도 있다.

상기 엑토도메인 항원은 ISCOM 매트릭스 복합체 및/또는 ISCOM 복합체와 혼합 될 수도 있으며, ISCOM 매트릭스 복합체에 연관되거나 접합될 수도 있고 또는 ISCOM과 혼합 될 수도 있으며 또는 ISCOM 복합체에 커플링될 수도 있다. 상기 제조된 ISCOM 복합체는 엑토도메인 항원과 다른 하나 이상의 항원을 포함할 수도 있다. 일 실시예에 따르면 하나 이상의 엑토도메인 항원은 ISCOM 복합체에 통합되는 것으로 사용될 수도 있다. 그런 뒤 이 ISCOM 복합체는 하나 이상의 엑토도메인 항원과 혼합될 수도 있다. 하나 이상의 항원 및 트랜스포트 및 패신저 항원은 EP 9600647-3 (PCT/SE97/00289)에 설명된 대로 사용될 수도 있다.

ISCOM 입자(particle)에 통합되기 위해서 항원은 몇몇의 소수성 부분(hydrophobic portion)을 가지거나 또는 ISCOM 매트릭스에 정전기적으로 부착될 필요가 있다. 소수성 부분을 가지지 않은 항원은 이런 분자들과 커플링될 수도 있다. 소수성 분자 및 커플링 방법은 EP 180564에 설명되어 있다.

면역원성 복합체에 포함된 지질은 콜레스테롤과 같은 하나 이상의 스테롤(sterol) 및 선택적으로 또한 인지질(phospholipid)이다. 사용된 지질은 특히 EP 0 109 942 B1 의 3페이지 및 EP 0 436 620 B1의 7페이지 7-24번째 줄에 설명되어 있다. 특히 콜레스테롤과 같은 스테롤 및 포스파티딜-에타놀아민(phosphatidyl-ethanolamin) 및 포스파티딜콜린(phosphatidylcolin)과 같은 인지질이 사용되었다.

콜레라 독소의 수용체(cholera toxin's receptor)인 갱글리오시드(ganglioside) GM1을 포함하는 당지질(glycolipids)과 같은 세포-부착 요소(component)에 부착된 지질-함유 수용체 및 푸코오스가 달린(fucosed) 혈액군항원(blood group antigen)이 쓰일 수도 있다. 그런 뒤 세포-부착 요소는 점액(mucus) 표적화(targeting) 분자로 기능 할 수 있고, 그들을 포함하고 있는 복합체와 그들을 간단히 혼합하는 것을 통해 지질-함유 물질에 결합 될 수 있다. 수용체를 포함하는 ISCOM 복합체는 예를 들어 WO 97/30728와 같은 것에 설명되어 있다.

발명의 일 실시예에서, 인플루엔자에 대항하는 백신 접종에 사용되기 위한 면역원성 복합체 내의 글리코시드(glycoside)는 퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 사포닌 분획이다.

퀄라자 사포나리아 몰리나 사포닌의 임의의 서브 단편(sub fragment)도 또한 사용될 수도 있다. 게다가, 퀄라자 사포나리아 몰리나의 서브 단편의 임의의 조합도 사용될 수 있다. 따라서, 둘 이상의 서브 단편은 각각 ISCOM 복합체 또는 ISCOM-매트릭스 복합체로 통합될 수도 있다.

본 명세서 및 청구항에 걸쳐서 “퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 사포닌 분획”이라는 용어는 퀄라자 사포나리아의 반-정제된 또는 한정된(defined) 사포닌 분획 또는 실질적으로 순수한 분획의 속(generic)개념의 표현으로 사용되었다. 본질적으로 한 분획을 포함하는 ISCOM 복합체 또는 ISCOM 매트릭스 복합체의 혼합물이 사용될 때 얻어지는 좋은 결과에 부정적 영향을 끼치는 정도로 많이 다른분획을 함유하고 있지 않은 것이 중요하다.

일 실시예에 따르면, 면역원성 복합체의 일부로서 또는 그것과의 혼합물로서 퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 사포닌 분획 외에 하나 이상의 추가적인 보조제 또는 ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합체로 통합된 것 외에 하나 이상의 글루코시드 또는 사포닌을 더 포함하는 본 발명에 따라 사용하기 위한 면역원성 복합체가 제공된다. 유용한 비 사포닌 보조제의 예는 다양한 오일(oil)들 및 Al(OH)3이다.

ISCOM 복합체 및 ISCOM 매트릭스 복합체에 포함 될 수 있는 추가적인 보조제의 예에는, 각각 또는 그와 함께 섞인, 임의의 보조제, 천연 또는 합성, 원하는 면역조절성 효과를 갖는, 예를 들어 자연적 발생, 또는 그들의 유도체, 퀄라자 사포나리아 몰리나의 조사포닌(crude saponin) 추출물로부터 유도된 합성 또는 반합성 사포닌 분자; 예를 들어 Quil A로부터 얻어진 사포닌 및 사포닌 분획, 세포벽 골격성분(cell wall skeleton), CRL-1005와 같은 블록 혼성중합체(block copolymers)를 예로 하는 블록 중합체(block polymer), TDM (threhalose di mucolate), 지질펩타이드(lipopeptides), LPS 및 LPS-유도체, 다양한 박테리아 종 또는 그들의 유도체로부터 얻어지는 지질 A(예를 들어 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A), 무라밀 디 또는 트리 펩티드(muramyl di or tri peptide) 또는 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide)), MDP-유도체, (예를 들어 지방산 유도체(fatty acid derivatives)), 치환된(substituted) MDP, MDP의 트레오닐 유사체(threonyl analogues)(및 그들의 유도체), 변종 CpG, 변종 CpGODN, 내생의(endogenous) 사람 및 동물 면역조절제(예를 들어 GM-CSF), IL-2, 보조제 활성의(adjuvant active) 세균 독소(bacterial toxins), 천연 또는 변형 독소(modified toxins), (예를 들어 콜레라 독 CT, 및 그것의 서브요소인 CTB 및 CTA1 ), E. coli 의 이열성독소(thermo labile toxin) (LT), 보르데텔라 페르투시스 독소(Bordetella pertussis (BP) toxin) 및 BP의 사상(filamentus) 헤마글루티닌, DDA, 덱스트란 설페이트(dextran sulphate)와 같은 다 음이온(poly anion) 및 사포닌과 같은 지질다당류(lipopolysaccaride) (Quil A외의)가 있다. 문헌들("Future prospects for vaccine adjuvants", Warren, H.S. (1988) CRC Crit. Rev. Immunol. 8:2, 83-101 ; "Characterisation of a non-toxic monophosphoryl lipid A", (1987) Johnson, A.G. et a!, Rev. Infect. Dis. 9:5, 5512-5516; "Developmental status of synthetic immunomodulators", Berendt, M.J. et al (1985), Year Immunol. 193-201 ; "Immunopotentiating conjugates", Stewart-Tull, D.E., Vaccine, 85, 3:1 , 40-44) 를 참조하라. 상기 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 참조로서 통합된다.

상기 ISCOM 입자는 임의의 사포닌으로부터 만들어진 ISCOM 복합체 또는 ISCOM 매트릭스 복합체일 수도 있다. 또한 보조제 분획 A 및 하나 이상의 다른 보조제는 서로 다른 또는 같은 ISCOM 입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자에 커플링 될 수도 있으며, 또는 하나 이상의 보조제가 ISCOM 입자와 혼합될 수도 있다.

ISCOM 입자에 통합되기 위해 보조제는 몇몇의 소수성 분자를 가질 필요가 있다. 소수성 부분을 가지지 못한 보조제는 이런 분자들과 커플링될 수도 있다. 소수성 분자들 및 커플링 방법은 EP 180564에 설명되어있다. 보조제는 바람직하게는 서로 다른 ISCOM 입자에 통합된다.

발명의 다른 실시예에서 Quil A의 보조제 분획(adjuvant fraction) A는 ISCOM 입자로 통합되나, 반면 다른 하나 이상의 보조제는 ISCOM 입자로 통합되지 않으며 조성물 안에서 자유 형태(free form)로 사용된다.

발명의 다른 바람직한 실시예에서 Quil A의 보조제 분획들은 ISCOM 입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자로 통합되나, 반면 다른 보조제는 ISCOM 입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자로 통합되지 않으며 조성물 안에서 자유형태로 사용된다.

특히 바람직한 다른 실시예에서 조성물은 ISCOM 입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자에 통합된 Quil A의 분획 A 및, ISCOM 입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자로 통합되지 않은 하나 이상의 다른 보조제를 포함한다.

바람직한 다른 실시예에서 적어도 그밖에 보조제는 MPL 또는 콜레라 독소이다. MPL 또는 콜레라 독소는 동일한 ISCOM 입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자로 통합될 수도 있고 또는 서로 다른 ISCOM입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자로 각각 통합될 수도 있다. MPL 또는 콜레라 독소는 바람직하게는 자유형태(free form)이다.

ISCOM 매트릭스 복합체, ISCOM 복합체 및/또는 하나 이상의 추가적 보조제에 사용하기 위해 퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 사포닌 분획은 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획(fraction) A, 분획 B, 분획 C, 퀄라자 사포나리아 몰리나의 조분획(crude fraction), QA 1-21로부터 선택될 수도 있다. 그런데, 강력한 현대 분리 기술(modern powerful separation technique)로 인해 서로 다른 60개가 넘는 구조들이 보고되고 설명되고 있다(Bankefors et al., J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci in press; Bankefors et al., Rapid Commun Mass Spectrom 22:3851 ; Broberg et al., J Mass Spectrom 39:691 ; Nyberg et al., Anal Chem 75:268; Guo and Kenne

Phytochemistry 55:419; Nord and Kene Carbohydr Res 329:817; Guo and Kenne

Phytochemistry 54:615; Guo et al., Phytochemistry 53: 861 ; Nyberg et al., Carbohyd. Res 323:87: Nord and Kenne Carbohyd. Res 320:70 Guo et al., Phytochemistry 48:175).

본원에서 설명된 대로 제조될 때, 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 A,B 및 C 각각은 한정가능한(definable) 성질과 화학적으로 밀접하게 관련된 분자의 그룹(groups) 또는 군(family)을 나타낸다. 그들이 얻어지는 색층 분석 조건(chromatographic condition)은 용리 분석표(elution profile) 및 생리 활성(biological activity)의 관점에서 회분식(batch-to-batch) 재현성이 매우 일관적이 되도록 한다.

본 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐서 “퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 하나의 사포닌”이라는 용어는, 사포나리아의 반-정제된 또는 한정된(defined) 사포닌 분획 또는 실질적으로 순수한 분획의 속(generic)개념의 표현으로 사용되었다. 본질적으로 한 분획을 포함하는 ISCOM 복합체 또는 ISCOM 매트릭스 복합체의 혼합물이 사용될 때 얻어지는 좋은 결과에 부정적 영향을 끼치는 정도로 많이 다른분획을 함유하고 있지 않은 것이 중요하다. 상기 사포닌 제조는, 바란다면, 예를 들어 40 중량% 이하, 30 중량%이하, 25 중량%이하, 20 중량%이하, 15 중량%이하, 10 중량%이하, 7 중량%이하, 5 중량%이하, 2 중량%이하, 1 중량%이하, 0.5 중량%이하, 0.1 중량%이하와 같은 미량의 그 밖의 사포닌 또는 그 밖의 보조제 물질(material)과 같은 그 밖의 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명에 다른 사포닌 분획 A,B 및 C는 WO 96/1 711에 설명되어 있고, B3, B4 및 B4b 분획은 EP 0 436 620에 설명되어 있고; QA1 -21 분획은 EP 0 3632 279 B2에 설명되어 있다. EP 0 3632 279 B2의 QA-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20 및 21 분획, 특히 QA-7, 17-18이 사용될 수 있다.

그들은 EP 0 362 279 B2에 설명된 대로 얻어지며, 특히 6페이지 및 8,9페이지에 있는 실시예 1에 의해 그러하다.

퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 사포닌의 조(crude) 또는 부분-정제된 분획의 임의의 유형(type)이 사용될 수도 있다. 본 특허의 목적을 위해 사용되는 퀄라자 사포나리아 몰리나의 조분획(crude fraction)은 그 밖의 지방친화성(lipophilic) 비-사포닌 요소로부터 다소 정제되는 임의의 사포닌 조성물이다. 이는 정제되었지만 분획되지는 않은 퀄라자 사포나리아 몰리나 제제인 임의의 사포닌 분획일 수도 있다. 사포닌들이 서로 분리되지 않은 조분획은 하기로부터 생산되거나 인도될 수 있다, 예를 들어 Desert King Chile (www.desertkingchiie.cl), Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com), erghausen (www.berghausen.com), Brenntag Biosector (www.brenntaq-biosector.com).

WO 96/11711에 설명된 분획 A,B 및 C는 퀄라자 사포나리아 몰리나의 수성 조추출물의 색층 분석 분리상(chromatographic separation) 및 지방친화성 분획을 분리하기 위해 70% 아세토니트릴수용액을 사용한 용리에서 얻어진 지방친화성(lipophilic) 분획으로부터 제조된다. 그런 뒤 지방친화성 분획은 산성수에 25%부터 60%까지 아세토니트릴의 구배(gradient)를 사용하는 용리를 이용하여 반-분취 HPLC(semi preparative HPLC)에 의해 분리된다. 본원에서 “분획 A” 또는 “QH-A” 로 지칭되거나 또는 그것에 상응하는 분획은 약 39% 아세토니트릴에서 용리된 분획이다. 본원에서 “분획 B” 또는 “QH-B” 로 지칭되거나 또는 그것에 상응하는 분획은 약 47% 아세토니트릴에서 용리된 분획이다. 본원에서 “분획 C” 또는 “QH-C” 로 지칭되거나 또는 그것에 상응하는 분획은 약 49% 아세토니트릴에서 용리된 분획이다.

일 실시예에 따르면, 사포닌의 조분획이 사용된다.

또 다른 실시예에 따르면 사포닌의 조분획은 상기 언급된 각각 다른 사포닌 분획들과 같은 다른 임의의 정제된 사포닌과 함께 쓰일 수도 있다.

발명의 일 실시예에 따르면 퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 것으로 ISCOM 매트릭스 복합체 또는 ISCOM 복합체로 통합된 사포닌 분획 또는, 또한 ISCOM 또는 ISCOM 매트릭스 복합체 또는 그들의 조합으로 통합된 하나 이상의 추가적 보조제는 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 A, 분획 B, 분획 C, 퀄라자 사포나리아 몰리나의 반-정제 제제, 퀄라자 사포나리아 몰리나의 정제된 제제, 또는 QA 1-21와 같은 임의의 정제된 서브-분획으로부터 선택된 것이다.

각각 퀄라자 사포나리아의 둘 이상의 사포닌 분획을 포함하는 ISCOM 매트릭스 및/또는 ISCOM 복합체가 사용될 수도 있다. 각각 다른 사포닌 분획의 중량퍼센트(weight %)의 임의의 조합물이 사용될 수도 있다. 임의의 두 분획의 중량퍼센트의 임의의 조합물이 사용될 수 있다, 예를 들어 분획 A의 임의의 중량퍼센트 및 각각 퀄라자 사포나리아 몰리나의 임의의 조사포닌 분획 또는 분획 C와 같은 또 다른 분획의 임의의 중량퍼센트와 같은. 상기 ISCOM 매트릭스 및/또는 ISCOM 복합체는 의 ISCOM 매트릭스 및/또는 ISCOM 복합체안의 퀄라자 사포나리아 몰리나의 중량의 합으로 계산될 때 0,1 부터 99,9 중량%까지, 5 부터 95중량%까지, 10 부터 90중량%까지 15 부터 85 중량%까지, 20 부터 80중량%까지, 25 부터 75중량%까지, 30 부터 70중량%까지, 35 부터 65중량%까지, 40 부터 60중량%까지, 45 부터 55중량%까지, 40 부터 60중량%까지, 50 부터 50중량%까지, 55 부터 45중량%까지, 60 부터 40중량%까지, 65 부터 35중량%까지, 70 부터 30중량%까지, 75 부터 25중량%까지, 80 부터 20중량%까지, 85 부터 15중량%까지, 90 부터 10중량%까지, 95 부터 05중량%까지, 50 부터 99중량%까지, 60 부터 90중량%까지, 70 부터 90중량%까지, 75 부터 85중량%까지의 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 A와 같은 하나의 사포닌 분획, 및 합이 100%가 되도록 하는 중량%의 또 다른 사포닌, 예를 들어 임의의 조분획 또는 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 C와 같은 임의의 다른 분획을 포함할 수도 있다.

일 실시예에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한, 5-99중량%의 한 분획과 합이 100%가 되도록 하는 다른 분획을 포함하는 ISCOM 매트릭스 및/또는 ISCOM 복합체가 제공되며, 상기 한 분획은 예를 들어 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 A과 같은 것이고 다른 분획은 예를 들어 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 C 또는 조사포닌 분획과 같은 것이며, 상기 중량%는 분획 A 및 분획 C의 중량으로 계산된 것이다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한, 40중량%부터 99중량%까지의 한 분획과 1중량%부터 60중량%까지의 다른 분획을 포함하는 ISCOM 매트릭스 및/또는 ISCOM 복합체가 제공되며, 상기 한 분획은 예를 들어 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 A과 같은 것이고 다른 분획은 예를 들어 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 C 또는 조사포닌 분획과 같은 것이며, 상기 중량%는 분획 A 및 분획 C의 중량으로 계산된 것이다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한, 70중량%부터 95중량%까지의 한 분획과 30중량%부터 5중량%까지의 다른 분획을 포함하는 ISCOM 매트릭스 및/또는 ISCOM 복합체가 제공되며, 상기 한 분획은 예를 들어 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 A과 같은 것이고 다른 분획은 예를 들어 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 C 또는 조사포닌 분획과 같은 것이며, 상기 중량%는 분획 A 및 분획 C의 중량으로 계산된 것이다.

일 실시예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 ISCOM 매트리스 및/또는 ISCOM 복합체가 제공될 수 있으며, 상기 퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 사포닌 분획은 QA 1-21 중 임의의 하나로부터 선택된다.

발명의 한 양상에 따라, 인플루엔자에 대항하는 백신 접종에 사용하기 위해 발명에 따라 하나 이상의 엑토도메인 항원 및 하나 이상의 약학적으로 허용된, 부형제(excipient) 담체(carrier) 및/또는 희석제(diluent) 및/또는 추가 보조제와 함께 하나 이상의 ISCOM 매트릭스 및/또는 ISCOM 복합체를 포함하는 백신과 같은 조성물이 제공된다.

그러한 조성물은 하나 이상의 각각 다른 ISCOM-매트릭스 복합체 입자 및/또는 하나 이상의 각각 다른 유형 ISCOM 복합체 입자의 유형을 포함할 수도 있으며, 각 개별적 유형 복합체 입자는 퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 하나의 사포닌 분획을 포함하는 것이며, 하나의 복합체에 있는 상기 사포닌 분획은 다른 복합체 입자에 있는 사포닌 분획과 다르다. 상기 조성물은 여러 입자를 포함할 수도 있다. 그러나, 일 실시예에 따르면 하나의 입자는 오직 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획의 한 단일 유형만을 포함할 수도 있다.

따라서, 실질적으로 순수한 사포닌 분획 또는 조사포닌 분획의 한 유형은 한 ISCOM 매트릭스 복합체 또는 입자에 통합될 수도 있으며, 실질적으로 순수한 사포닌 분획 또는 조사포닌의 또 다른 유형은 또 다른 ISCOM 매트릭스 복합체 또는 입자에 통합 될 수도 있다. 조성물 또는 백신은 두 유형 이상의 복합체 또는 입자를 포함할 수 있으며, 각 유형은 물리적으로 다른 입자에 통합된 사포닌의 한 유형을 가지고 있다.

하나의 사포닌 분획 퀄라자 사포나리아 몰리나 및 또다른 사포닌 분획 퀄라자 사포나리아 몰리나가 서로 다른 ISCOM 매트릭스 복합체 입자 및/또는 ISCOM 복합체 입자로 통합된 ISCOM 매트릭스 복합체 입자 및/또는 ISCOM 복합체 입자의 혼합물이 사용될 수 있다. 하나의 사포닌 분획 및 임의의 다른 사포닌 분획인 그들의 함량(content)을 기준으로 한 각각 다른 ISCOM 복합체의 중량%의 임의의 조합은 분획 A 및 또 다른 분획과 같은 것을 사용할 수도 있으며 또 다른 분획에는 예를 들어 임의의 조사포닌 분획 또는 퀄라자 사포나리아 몰리나의 분획 C과 같은 것이 각각 사용될 수도 있다. 이러한 퍼센트(%) 수치는 하나 및 같은 ISCOM 매트릭스 복합체 입자 및/또는 ISCOM 복합체 입자에 있는, 지금은 그러나 각각 따로 ISCOM 매트릭스 복합체 입자 및/또는 ISCOM 복합체 입자에 있는 사포닌 분획의 가능한 혼합물에 관한 것으로 위에서 언급된 것과 같다.

또 다른 실시예에서 Quil A 분획 A는 하나의 ISCOM 입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자로 통합되며 하나 이상의 다른 보조제는 각각 다른 ISCOM 입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자로 통합되거나 또는 Quil A의 하나 이상의 다른 분획 또는 하나 이상의 다른 보조제는 동일하지만 Quil A 분획 A이 통합된 입자와는 다른 ISCOM 또는 ISCOM 매트릭스 입자로 통합되거나 또는 나머지 하나이상의 보조제는 자유형태 이다.

조성물에서, 분획 A는 하나 이상의 분획 C 및 퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 조사포닌 분획, 예컨대 분획 Q와 조합될 수 있으며, 조사포닌 분획은 같은 또는 다른 ISCOM 복합체 및/또는 ISCOM-매트릭스 복합체에 있을 수 있다.

퀄라자 사포나리아 몰리나의 각각 다른 분획을 포함하는 ISCOM-매트릭스 복합체와의 조합으로 인해 동물에게 독성이 적은 조성물을 생산하는 것이 가능하다. 이러한 이유로, 일 실시예에서, 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 같은 또는 다른 ISCOM 복합체 및/또는 ISCOM-매트릭스 복합체에 하나 이상의 분획 C 및 Q와 조합한 분획 A를 포함한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용된 부형제, 담체 및/또는 희석제 및 추가 보조제를 더 포함한다.

상기 조성물은 ISCOM 복합체 입자 또는 ISCOM 매트릭스 입자에 통합된 사포닌 보다 하나 이상의 다른 보조제를 포함할 수도 있다. 이 추가 보조제는 면역원성 ISCOM 매트릭스 복합체 입자 또는 ISCOM 복합체 입자와 결합되거나 혼합된 것일 수도 있는 퀄라자 사포나리아 몰리나로부터 얻어진 사포닌 분획일 수도 있다. 이것은 또한 사포닌의 다른 유형 또는 면역원성 ISCOM 매트릭스 복합체 입자 또는 ISCOM 복합체 입자로 통합되거나, 그 입자와 결합되거나, 혼합된 보조제의 다른 유형 일 수도 있다.

조성물은 백신일 수도 있다.

본원에서 “백신”이라는 용어는 면역 반응을 생성할 수 있는 물질을 지칭한다. 본 발명에 따른 백신은 인플루엔자에 대항하는 면역력을 생성한다.

상기 조성물은 발병으로부터의 감염을 예방하는 예방약(prophylactic)으로 쓰일 수도 있고, 이미 존재하는 감염을 치료하는 치료제(therapeutic)가 될 수도 있고, 면역학적 시약의 생산이 될 수도 있다.

인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 엑토도메인으로부터 얻어진 항원외에 항원이 ISCOM 복합체에 통합 될 수도 있고, ISCOM 복합체 또는 ISCOM 매트릭스 복합체와 커플링할 수도 있으며, ISCOM 복합체 또는 ISCOM 매트릭스 복합체와 혼합될 수도 있다. 또한 본 발명은 조합 백신(combination vaccine) 또는 치료를 위한 동물용 조합 약물(combination veterinary medicine)에 관한 것이다.

발명에 따른 조성물의 제형(formulation)은 당업자에게 잘 알려져 있다. 약학적으로 허용된 적절한 담체 및/또는 희석제는 임의의 및 모든 통상의 용매, 분산매(dispersion media), 필러(filler), 고체 담체(solid carrier), 수용액(aqueous solution), 코팅(coating), 항세균 및 항진균제, 등장(isotonic) 및 흡수 지연제(absorption delaying agent), 및 기타 같은 종류의 것이다. 약학적 활성물질(pharmaceutically active substance)을 위한 이러한 매질(media)및 시약(agent)의 사용은 당업계에 잘 알려져 있으며, 한 예로서 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA에 설명되어 있다. 임의의 통상의 매질(media) 또는 시약(agent)이 유효 성분(active ingredient)과 양립할 수 없는 경우를 제외하고서는, 본 발명의 약학적 조성물에서 그것의 사용이 고려된다. 보조 유효 성분(supplementary active ingredient)은 또한 상기 조성제로 통합 될 수 있다.

다른 한 양상에 따르면 조성물은 면역 자극 약물(immune stimulating medicine), 면역 조절 제약(immune modulating pharmaceutical) 또는 백신, 예를 들어 조류 또는 포유류와 같은 척추동물의 인플루엔자에 대항하는 것으로 사용될 수도 있다. 포유류는 인간, 반려동물일 수도 있으며, 반려동물은 고양이, 개, 말, 앵무새와 같은 조류이고, 경제적으로 중요한 종은 가축과 같은 것으로 예를 들어 보바인 종(bovine species), 돼지, 양, 염소 또는 페렛, 밍크이다.

본 발명은 또한 둘 이상의 구획을 포함하는 키트(kit)에 관한 것이며, 상기 한 구획은 하나 이상의 ISCOM 복합체 및 하나 이상의 헤마글루티닌 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인 및 하나 이상의 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 하나 이상의 뉴라미니다아제 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인을 포함하는 조성물을 포함하며, 다른 구획은 사용상 지침을 포함한다.

또 다른 양상에 따르면 본 발명은 둘 이상의 구획을 포함하는 키트와 관련되며, 상기 한 구획은 ISCOM 복합체 및/또는 ISCOM 매트릭스 복합체를 포함하는 것이며 다른 구획은 하나 이상의 헤마글루티닌 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인 및 하나 이상의 뉴라미니다아제 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인을 포함하는 것이다.

출원인은 특히 페렛 모델에서 2009 A(H1N1) 인플루엔자 바이러스의 재조합형으로 생성된 HA 및 NA 서브유닛의(subunit) 호모타입의(homotypic) 인플루엔자 바이러스에 대항하는 백신으로서의 효능에 대해, NA항원의 기여도에 대한 특별한 강조와 함께 언급해왔다. 세계적으로 유행한 H1N1 바이러스의 HA 및 NA 항원의 가용성 다중결합 형태는 포유류의 발현시스템에서 발현되어왔다. 당단백질이 단일-단계 친화력 크로마토그래피(single-step affinity chromatography)에 의해서 정제되고 그 뒤에 페렛이 두 항원 중 어느 하나 또는 모두로 및 보조제로 ISCOM 매트릭스 M과 함께 또는 그것 없는 상태로 면역되었다. 동물은 오직 보조제와 함께 투여될 때만을 제외하고는 두 항원에 모두 대해 혈청학적으로 반응했다.

흥미롭게도, 백신 안에 NA의 포함은 HA 항체 및 바이러스 중화 활성(virus neutralising activity)의 수준을 강화한다. 특히 극적으로(5log₁₀ 단위) 감소된 바이러스성의 폐 역가(viral lung titer)에 의해 판단되는, ISCOM 매트릭스 M과 조합된 HA-함유 백신으로 면역화된 동물에서의 동종 공격(homologous challenge)시 현저한 보호(significant protection)가 관찰되었다. 흥미롭게도, NA를 함유하는 ISCOM 매트릭스 M 보조된 제제가 감염의 임상 효과를 명백하게 감소시켰다.

본원에 언급된 모든 간행물은 법이 허용하는 가장 큰 범위까지 본원의 명세서에 참조로써 통합된다.

본 발명은 하기 비-제한적 실시예에 의해 더 설명될 것이다.

실시예(example)

실시예 1 HA 및 NA 항원의 제조

재료 및 방법

인플루엔자 A 공격 바이러스(Influenza A challenge virus)

인플루엔자 바이러스 A/Netherlands/602/2009는 생후 11일된 계란(embryonated chicken eggs)의 접종에 의해 실험실에서 확인된 네덜란드에서 2009 A(H1N1) 감염의 첫 번째 사례로부터 분리되었다(선행문헌 15). 인플루엔자 바이러스 A Netherlands/602/2009(H1N1)의 바이러스 스탁(stock)은 컨플루언트(confluent) Madin-Darby Canine Kidney (MCCK) 세포를 감염시키는 것에 의해 제조되었다. 세포병리학적 변화(cytopathologic change)가 완성된 뒤에, 배양 상층액은 저속 원심분리(low speed centrifugation)에 의해서 분리하고(cleared) -70 °C에서 보관되었다. 감염성 바이러스 역가는 이전에 설명된 대로 MCCK 세포에서 정해졌다(선행문헌 16). 이러한 바이러스들을 이용한 모든 실험은 생물안전도(Bio Safety Level) (BSL)-3 환경에서 수행되었다.

HA 및 NA 항원의 제조

인플루엔자 바이러스 A/California/04/2009(H1N1)의 가용성 헤마글루티닌 엑토도메인(sHA; a.a.17-522) 및 뉴라미니다아제 헤드 도메인 (sNA; a.a.75-469)을 암호화 하는 인간 코돈 최적화된 서열을 합성하였고(GenScript) HEK293T 세포에서 발현을 위한 발현 플라스미드(expression plasmid) pS1-lg(선행문헌 17)의 유도체로 클로닝되었다. HA 유전자(gene)는 N-터미널 CD5 신호 펩타이드를 암호화 하는 서열에 의해 선행되었고 C-터미널 인공의(artificial) GCN4 삼량화(trimerisation) 도메인 (GCN4-pll)(선행문헌 18) 및 최근에 설명된 친화성 정제(affinity purification)( IBA GmbH) (선행문헌 19,20)의 Strep-tag에 의해 뒤따라졌다. NA 유전자는 N-터미널 CD5 신호 펩타이드, 이중 Strep-tag (OneSTrEP; IBA GmbH) 및 인공적(artificial) GCN4 사량화(tetramerisation) 도메인(GCN4-pLI) (선행문헌 18)을 연속적으로 암호화하는 서열에 의해 선행되었다.

sHA₃ 및sNA₄ 항원의 생산

도1의 A에 보이는 구조체는 2009 A(H1N1) 인플루엔자 바이러스의 삼량체 HA 엑토도메인 (a.a.17-522) 및 사량체 NA 헤드 도메인 (a.a.75-469)을 발현하기 위해 설계(designed)되었다. sHA₃ and sNA₄ 단백질은 HEK293T 세포의 발현에 의해 생산되었고, 예상되는 크기의 당단백질을 산출하는(yielding) 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)(도 1.B)에 의해 배양 배지(culture medium)로부터 정제되었다. 겔 여과 분석(gel filtration analysis)은 HA 및 NA 서브유닛의 삼량체 및 사량체 올리고머릭 특성(oligomeric nature)을 각각 가리켰다(데이터는 나타나지 않음). 다중결합의 복합체는 또한 그들의 자연적 상태에서 더 확인되는, 그들의 시알릭 산(sialic acid) 결합 (sHA₃; 제조법의 원고) 및 뉴라미니다아제 활성(이하 sNA₄)에 의해 판단되는 생리활성이 있었다.

실시예 2. 단백질 발현 및 정제

HEK293T 세포는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)(PEI)을 1 :5 비율(pg DNA: pg PEI)로 사용하는 sHA 및 sNA 발현 플라스미드에 의해 트랜스펙션되었다. 6시간의 배양 기간(incubation period)후에 트랜스펙션(transfection) 배지는 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate) (3.7 g/liter), 포도당(glucose) (2.0 g/liter), Primatone RL-UF (3.0 g/liter), 페니실린 (100 units/ml), 스트렙토마이신 (100 uq/rnl), glutaMAX (Gibco사), 및 1.5% DMSO가 추가된 293 SFM II 발현 배지(Invitrogen사)로 교체되었다. 조직 배양 상층액은 트랜스펙션 후 5-6일째에 채취되었으며, sHA 및 sNA 단백질은 Strep-Tactin 친화 크로마토그래피 (IBA GmbH사)를 사용한 배양 배지로부터 정제되었다. sHA 및 sNA 단백질의 발현 및 정제는 Strep-Tractin-HRP 컨쥬게이트(conjugate) (IBA GmbH사;데이터는 나타나지 않음) 및 SDS-PAGE 분석을 사용한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 확인되었다. 단백질의 올리고머화(oligomerization)는 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography) 및 blue-native-PAGE 분석에 의해서 정해졌었다. 단백질 양의 정량화는 참조로서 BSA를 사용하여 수행되었다.

실시예 3. 면역 및 감염

페렛

이계 교배된(outbred) 건강한 어린 성인 암컷 페렛(Mustela putorius furo; 태어난지 6 및 12개월 사이인)은 상업적 사육자(commercial breeder)로부터 구매되었다. 동물들은 헤마글루티닌 저해 검정에 의해 돼지-기원(swine-origin) 인플루엔자 A/NL/602/09 바이러스 및 순환 계절성(circulating seasonal) A/H1N1 및 A/H3N2 인플루엔자 바이러스에 대항하는 항체가 없는지 확인되었다. 독립된 동물 윤리 위원회는 실험의 시작 전에 실험 규약(experimental protocol)을 승인하였다.

ISCOM 매트릭스 M 보조제는 WO2004/004762에 설명된 대로 제조되었다. PBS에 있는 85% 매트릭스 A 및 15% 매트릭스 C를 포함하는 조성물의 75 마이크로그람(microgram)이 항원에 첨가되었다.

면역화 및 감염

36마리의 혈청반응 음성(thirty-six seronegative) 페렛은 각각 6마리 페렛의 6그룹으로 나눠졌으며, 아래 제형에 따라 2번 백신 접종되었다: 인산완충식염수(phosphate buffered saline) (PBS)중의 3.75 μg sHA₃ + 3.75 μg sNA₄ (그룹 1); ISCOM 매트릭스 M (IMM, Isconova, Uppsala, Sweden)중의 3.75 μg sHA₃ (그룹 2); IMM중의 3.75 μg sNA₄ (그룹 3); IMM중의 3.75 μg sHA₃ + 3.75 μg sNA₄ (그룹 4); PBS (group 5); IMM (group 6). 백신 접종은 20일 간격으로 수행되었으며, 케타민(ketamine) 마취 조건에서 뒷다리(hindleg) 사두근(quadriceps muscles)에 총 1ml의 부피로 수행되었다. 페렛은 그룹으로 보관되었고, 임의로 음식과 물을 받았다. 마지막 백신접종으로부터 32일이 지난 뒤, 동물은 케타민/메데토미딘(medetomidine)으로 마취되었고(아티파메졸의 반대인), 계량되었고, 그 뒤에 기관내에 3ml PBS의 부피로 1 x10⁶ TCID₅₀ 의 인플루엔자 A/NL/602/09(H1N1)로 공격접종되었다(challenged)(선행문헌 21,22). 페렛은 그 뒤에 임상 증상(clinical sign)의 발전에 대해 매일 3번씩 모니터링되었다. 감염 전 및 감염 후 2일에서 4일이 지난 후에, 각 페렛의 코 및 인후 표본(throat swab)은 페렛이 케타민으로 마취된 동안 채취되었다(collected). 접종 후 4일째엔, 동물은 계량되었고, 그 뒤에 케타민 및 메데토미딘으로 마취된 동안 방혈에 의해 안락사 되었다(euthanized by exsanguinations). 표준 절차(standard procedure)에 따라서 부검(necropsy)이 수행되었다. 그룹 1의 하나의 페렛은 실험과 관련이 없다는 이유로 1차 및 2차 백신접종 사이에 죽었다.

혈청 테스트(Serology)

혈청 샘플은 백신 접종 이전, 즉 두 번째 백신접종 하는 날(20일째) 및 공격 접종되는 날(52일째)에 수집되었다. 혈청은 사용되기까지 -20°C에서 보관되었다. 혈청은 1% 칠면조 적혈구(erythrocyte)를 포함한 헤마글루티닌 저해 분석(HI-분석)을 사용하여 항-HA 항체 및 이전에 설명된 대로(선행문헌 23,24) 마이크로 바이러스 중화 분석(VN-분석)을 사용하여 바이러스 중화 항체가 존재하는지 검사되었다. 혈청은 인플루엔자 A/NL/602/09(H1N1)에 반응하는 항체가 존재하는지 검사되었다. 이런 목적으로, 역 유전학(reverse genetic) 바이러스가 생산되었다. 이러한 바이러스들에게서 얻은 역가는 이러한 야생형 스트레인(wild-type strain)(데이터는 나타나지 않음)대하여 비교할 만하였다. 인플루엔자 A/NL/602/09(H1N1)에 특이적인 양성 대조군 혈청(positive control serum)은 그 바이러스에 감염된 페렛으로부터 얻어졌다(선행문헌 15). HI-분석에 사용되는 다른 H1N1 인플루엔자 바이러스는 A/Netherlands/386/86 (NL/86), A/Netherlands/25/80 (NL/80), A/New Jersey/8/76 (NJ/76), A/Swine/shope/1/56(Sw/56), A/ltaly/1443/76 (It/76), A/lowa/15/30 (lo/30), A/Puerto Rico/8/34 (Pr/34) and A/Brisbane/59/07 (IVR-148 백신 스트레인; IVR/148)이었다. 이러한 바이러스들에 감염된 페렛의 혈청 샘플은 이 분석에서 양성 대조군으로 쓰였다(선행문헌 25).

혈청은 또한 이전에 설명된 페투인-기반 분석(fetuin-based assay)을 사용하는 뉴라미니다아제 저해(NI) 항체가 존재하는지 검사되었다. 간단히, 96-웰(well) Nunc MaxiSorp 플레이트(plate)는 하룻밤 동안 4°C에서 5 g/ml 페투인의 100 μl로 도포되었다(coated). 60-μl 부피의 연속적으로 희석된 혈청 샘플는 그 혼합물의 100μl가 페투인-도포된 웰에 첨가된 뒤에 배양 상층액(1.5의 절반-최대(half-maximum) OD450를 제공하기 위해 PBS-Ca/Mg [0.901 mM/0.493mM]에서 미리 희석된) 을 함유하는 sNA₄의 같은 부피와 함께 37°C에서 30분 동안 배양되었다. 37°C에서 한 시간 배양 후에, 플레이트가 세척되었고, 그 뒤에 뉴라미니다아제 활성이 페록시데이즈-표지된(peroxidase-labelled) 땅콩 응집소(peanut agglutinin) (2.5 μg/ml; Sigma사)를 첨가하고, 상온에서 한 시간 배양하고, 플레이트를 씻고 및 100μl의 페록시데이즈 기질(TMB)를 각 웰(well)에 첨가함으로써 측정되었다. 5분 후에, 반응은 0.3M 인산(phosphoric acid) 100μl의 첨가로 정지되며 ELISA reader (EL-808 [BioTEK])를 사용하여 450nm에서 OD 값이 측정되었다. 교차반응을 일으킬 수 있는(cross-reactive) NI 항체에 대해 혈청을 검사하기 위해, 위에서 A/California/04/2009(H1N1)에 대해 설명된 것과 유사한 sNA₄ 발현 구조체가 A/Kentucky/UR06-0258/2007(H1N1) (a.a.75-470) 및 A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1) 인플루엔자 바이러스 (a.a.55-449)의 헤드 도메인을 위해 만들어졌다. 이러한 바이러스들에 감염된 페렛으로부터 얻어진 인플루엔자 A/NL/602/09(H1N1) 및 A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1)에 특이적인 항체는 양성 대조군으로 사용되었다.

호흡기관 위쪽 및 아래쪽에서의 바이러스 복제

모든 우측폐엽(lobes of the right lung) 및 부폐엽(accessory lobe)의 샘플은 감염된 페렛에서 수집되었고, 에탄올과 함께 드라이 아이스에서 잠깐 냉동되고(snap frozen) 추가적인 처리를 할 때까지 -70°C에서 보관되었다. 폐 샘플은 계량되었고 그 뒤에 0.5% 락트알부민(lactalbumin), 10% 글리세롤, 200 U/ml 페니실린, 200 μg/ml 스트렙토마이신, 100 U/ml 폴리믹신비황산염(polymyxin B sulfate), 250 μg/ml 겐타마이신(gentamycin), 및 50 U/ml 니스타틴(nystatin)을 포함한 한크스 염류완충액(Hank's balanced salt solution)에서 FastPrep-24 (MP Biomedicals, Eindhoven, The Netherlands)을 사용하여 균질화 되었으며 (ICN Pharmaceuticals, Zoetermeer, The Netherlands) 그리고 간단히 원심분리되었다. 코 및 인후 표본은 폐 샘플을 균질화 하는데 사용된 배지와 같은 것으로 -70°C에서 직접적으로 보관되었다. 인후, 코 및 폐 샘플의 10의 네제곱 연속희석액은 이전에 설명된 대로 MDCK 세포를 감염시키기 위해 사용되었다(선행문헌 16). 접종 후 5일 뒤에 채취된 배양 상층액의 HA 활성은 감염의 지표로 사용되었다. 역가는 Spearman-Karber법에 따라서 계산되었으며, 폐 조직에 대해 그램당 log TCID₅₀또는 표본에 대해 밀리리터 당 log TCID₅₀로 표현되었다(선행문헌 27).

조직병리학(Histopathology)

인플루엔자 A/NL/602/09 바이러스 접종 후 4일 뒤에, 페렛은 안락사되었으며 폐는 육안으로 관찰되었으며 우측폐로부터 얻은 샘플이 바이러스 역가를 정하기 위해 채취되기 전에 계량되었다. 그 뒤로 좌측폐엽은 10% 중화 완충 포르말린(neutral buffered formalin)에 의해 부풀려졌다. 파라핀에 고정화(fixation) 및 포매(embedding)한 뒤에, 폐는 4μm로 섹션되었고 조직 섹션(section)은 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오진(eosin) (HE) 염색으로 검사되었다.

통계분석(Statistical Analysis)

동물 그룹 중 유의성은(significance) 일원변량분석(one-way ANOVA) 및 변량분석에 이은 터키 검정(Tukey test)에 의해서 분석되었다. 편차의 유의수준은 P<0.05이다.

결과(result)

sHA₃ 및 sNA₄의 면역화로 유도된 항체 반응

당단백질은 상동 바이러스 공격(homologous virus challenge)에 대항하는 보호성 면역력을 유도시키는 그들의 능력이 있는지 검사되었다. 페렛은 0일에서 20일 동안 보조제가 없는sHA₃+sNA₄(sHA+sNA), ISCOM 매트릭스 M이 보조된 sHA₃+sNA₄ (IMM; sHA+sNA+IMM), 또는 비슷하게 보조된 sHA₃ (sHA+IMM) 또는 sNA, (sNA+IMM)으로 면역되었다. 혈청은 2차 면역접종 및 예비-공격접종(pre-challenge)(20일 및 52일)일에 채취되었으며 항체반응은 NI 분석 및 상동 바이러스 (homologous virus)에 대항하는 HI 및 VN 분석에 의해서 측정되었다(도 2). 임의의 이러한 분석에서 무반응(no response)이 PBS 또는 보조제만으로 백신 접종된 대조군 동물에서 관찰되었을 뿐 아니라, sHA₃ 및 sNA₄의 비-보조 혼합물(non-adjuvanted mixture)로 면역된 동물에서도 그러하였다. 반면, sHA₃로 보조된 면역접종은 공격 접종일에 91의 기하학적 평균가와 함께 높은 HI 역가를 유도하였다. 흥미롭게도, sNA₄의 추가적 포함은 HI 역가의 평균을 468까지 상당히 증가시켰다(p<0.05; one-way ANOVA and Tukey test). 또한 NI 적정은 NA 항체의 보조제-의존 유도를 드러냈고, 이는 1차 면역 뒤에는 낮았으나(도 2), 2차 면역 뒤에는 매우 증가하였다(도 2). 그러나, 이 사례에서는 sHA₃의 병용투여(coadministration) 때문에 이러한 역가들의 명확한 증가율이 관찰되지 않았다. 관찰된 HI 역가와 일치하는 높은 VN 역가는 sHA+IMM 및 sHA+sNA+IMM로 면역된 동물 모두에서 발견되었다(도 2). 또한 여기서 sNA₄ 항원과 sHA+sNA+IMM 백신의 병용투여는 평균 VN 역가를 상승시키는 결과를 가져오며, 평균값의 범위는 sHA+IMM 및 sHA+sNA+IMM 그룹에서 각각 1:202 부터 1:468 까지 이른다.

2009 A(Ht Nt) 인플루엔자 바이러스에 감염된 뒤의 임상 증상에 대항하는 보호

백신 접종된 페렛은 2차 백신 접종 후 5주 뒤에 10⁶ TCID₅₀ 2009 A(H1N1)에 공격접종되었다. 접종 후 2일 뒤부터 계속, 호흡 곤란(breathing difficulties), 무기력증(lethargy), 식욕 감퇴(decreased appetite), 체중 감소(weight loss)가 포함된 임상 증상이 접종된 페렛에서 관찰되었다. 일반적으로, 오직 경증 임상 증상(mild clinical sign)만이 그룹 2,3, 및 4의 페렛에서 관찰되었으며, 반면에 더 심한 증상이 그룹 1,5 및 6의 페렛에서 관찰되었다. 체중 감소는 비-보조 sHA+sNA 백신 그룹을 비롯하여 PBS- 및 IMM-백신접종된 대조군 그룹에서 확실해 졌다(도 3). 흥미롭게도, sHA+IMM로 면역된 동물들은 거의 비슷한 체중 감소를 보였으나, 반면 체중 감소는 제형(sNA+IMM 및 sHA+sNA+IMM 그룹들)을 함유하는 sNA₄ 둘 다로 면역 접종 뒤에는 큰 영향을 받지 않았다.

다소 지속적으로, 사후에(post mortem) 정해진 페렛의 폐 무게는 폐 경화로 인한 최소한의 질병-관련 증가를 가지는 보조된 sNA₄-백신접종된 동물과 상응하는 경향을 보였다(도 3).

페렛의 폐에서의 총체적(gross) 병리학적(pathologic)및 조직병리학적(histopathologic)발견

인플루엔자 바이러스 2009 A(H1N1) 바이러스에 접종 후 4일 뒤, 페렛의 폐는 육안으로 검사었되고 바이러스 복제 및 병리조직학적 변화를 가늠하기 위해 샘플이 취해지기 전에 계량되었다. 암적색(dark red) 및 단단하게 경화된 영역은 접종된 페렛의 폐에서 육안으로 관찰되었다. 영향받은 폐 조직의 백분율(percentage)은 그룹간에 측정되었고 달라졌다. 약 50%의 폐에서 영향받은 영역의 평균 백분율은 그룹 1, 5 및 6의 페렛에서 관찰되었으나, 반면 경화 정도는 그룹 2, 3 및 4의 페렛에서 덜 명확했으며, 이는 25% 미만의 영향 받은 폐 영역을 보였다(도 3). 또한 상대적인 폐 무게도 그룹 1, 5 및 6의 페렛과 비교했을 때 이러한 그룹이 더 낮았다(도 3).

접종 후 4일째에 PBS 또는 보조제 만으로(IMM) 거짓-백신접종 되었거나 비-보조 sHA₃+sNA₄로 백신 접종됐던 페렛의 폐에서 관찰된 병리조직학적 변화는 심각한 괴사성 기관지-침입형 폐렴(necrotizing broncho-interstitial pneumonia)을 완화하는(moderate) 특성이다. 다초점적으로(multifocally), 많은 뉴트로필(neutrophils) 및 매크로파지(macrophages) 및 다양한 수의 적혈구(variable numbers of erythrocyte), 부종 유체(edema fluid) 및 피브린(fibrin)은 이러한 페렛의 폐의 폐포에서 나타났다. 게다가, 염증 침윤(inflammatory infiltrate)은 폐포 중격(alveolar septa), 세기관지(bronchiole), 기관지들(bronchi) 및 기관지들 및 세기관지들의 벽에서 나타났다. 조직병리학적 변화에서 극적인 감소는 보조된 sNA₄-백신접종된 동물(sNA+IMM 및 sHA+sNA+IMM 그룹)에서 관찰되었으며, 반면 sHA+IMM로 면역된 페렛은 발달하는 병리(developing pathology)로 부터 부분적으로 보호되었다.

호흡기관 위쪽 및 아래쪽에서 바이러스 복제에 대항하는 보호

호흡기관에서 바이러스 복제에 대한 면역접종의 효과를 측정하기 위해, 접종 후 4일 뒤에 폐, 인후 및 코에서 바이러스 역가가 정해졌다. 도 5에 나와있듯이 공격 바이러스는 대조군 페럿의 폐(PBS 및 IMM 그룹) 및 sHA₃ 및 sNA₄의 비-보조 혼합물로 면역된 동물에서 그램 조직 당 대략 10⁷-10⁸ TCID₅₀의 바이러스 평균 역가로 스스로를 효율적으로 복제했다. 이러한 바이러스량(viral load)은 보조제에 sHA₃ 단백질을 넣은 것(sHA+IMM 그룹)으로 면역화된 동물 및 보조제에 sHA₃ 및 sNA₄ 를 넣은 것(sHA+sNA+IMM 그룹)으로 병용 면역(co-immunized)된 동물에서 약 5log₁₀단위로 줄어들었다. 평균 바이러스량은 보조된 sNA₄ 항원(sNA+IMM 그룹)으로 면역화된 동물에서 2-3 log₁₀ 단위로 줄어들었다.

코에서 높은 바이러스량이 공격접종(challenge)후 4일 뒤에 대조군 동물(PBS 및 IMM 그룹; 도 5)에서 관찰되었다. 그룹 내에서 역가의 큰 차이 때문에 통계적으로 유의미하지 않을지라도, 이러한 바이러스량은 보조된 sHA₃ 또는 보조된 sNA₄으로 면역되거나 비-보조 sHA₃ + sNA₄ 조합물로 면역된 동물에서 어느 정도 낮게 나타났다. 코 바이러스 역가의 가장 높은 감소는 sHA₃ 및 sNA₄ 항원의 보조된 조합물로 면역된 동물에서 발견되었다. 인후에서 바이러스 역가는 일반적으로 높았으나 sHA₃ 및 sNA₄의 보조된 조합물로 백신 접종된 동물을 제외하고 백신 접종에 의해서 영향을 크게 받지 않았다. 이러한 페렛은 인후에 감지할 수 있는 역가를 가지고 있지 않았다.

sHA₃ 및 sNA₄로 면역 접종된 것에 의한 교차반응성 항체 반응(cross-reacting antibody response)

sHA₃ 및 sNA₄ 항원에 의해 유도되는 항체가 다른 H1N1 인플루엔자 바이러스와 교차반응 할 수 있는지 없는지 조사하기 위해 우리는 면역 접종 후의 혈청으로 HI 및 NI 분석을 추가적으로 수행했다. 예상대로, 교차반응성의 다양한 범위가 다른 H1-스트레인의 범위와 함께 관찰되는 동안에 상동 바이러스(homologous virus)에 대항하는 가장 높은 역가가 측정되었다(도 6A). 따라서, A/Swine/shope/1/56, A/ltaly/1443/76, A/lowa/15/30, A/PR/8/34 and IVR/148 에서는 교차반응성이 검출되지 않았다, 반면 A/NL/25/80 및 A/NewJersey/8/76 및, 특히, A/NL/386/86에 (표 1 참조) 대해서는 그들의 항원성 도메인의 서열유사성이 다소 일관되는 유의미한 교차반응성이 측정되었다.

[표 1]

각각 다른 H1N1 스트레인의 HA내에 있는 항원성 영역의 서열 상동성(sequence homology)

* 서열이 제공되지 않음; n.a. 해당없음

이는 sHA₃+IMM 및 sHA₃+sNA₄+IMM 모두로 면역된 동물로부터 얻어진 혈청을 쓴 케이스였다. 상동 바이러스에 대항하는 HI 활성의 차이가 미리 관찰되었던 것과 일관되게(도 2), 교차반응성의 수준은 sHA₃+IMM로 면역된 동물로부터 얻어진 혈청보다 sHA₃+sNA₄+IMM로 면역된 페렛으로부터 얻어진 혈청에서 현저하게 높았으며, 이는 sNA₄ 항원의 강화 효과를 다시금 확인시켰다. 각 스트레인에 대항하는 HI 역가는 상동 인플루엔자 A/H1N1 바이러스에 감염된 페렛의 대조군 혈청에서 검출되었다(데이터는 나타나지 않음).

NA 항체의 교차반응성을 조사하기 위해 우리는 두 개의 다른 N1 인플루엔자 바이러스, 인간 H1N1 스트레인 A/Kentucky/UR06-0258/2007 및 조류 H5N1 스트레인 A/turkey/Turkey/1/2005의 sNA₄ 당단백질 복합체를 생산하였다. 우리의 NI 분석에서 검사했을 때 계절성 H1N1 바이러스 sNA₄ 단백질의 저해가 관찰되는 동안 조류 H5N1 바이러스 sNA₄ 단백질에 대항해 sNA₄+IMM 및 sHA₃+sNA₄+IMM 면역된 동물의 취합된 혈청에서 강력한 뉴라미니다아제 저해 활성을 가졌다(도 6). 중요한 것은, H5N1 바이러스에 감염된 닭으로부터 유도된 대조군 혈청이 인간 H1N1 바이러스 sNA₄ 단백질에 대해서 음성반응을 보였던 것이다.

Claims

조성물로서,
상기 조성물은, 하나 이상의 ISCOM 복합체(complex);
하나 이상의 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 하나 이상의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인(ectodomain); 및
하나 이상의 뉴라미니다아제(neuraminidase) 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인(ectodomain)을 포함하며
상기 엑토도메인은 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 엑토도메인인 조성물.
제 1항에 있어서,
하나 이상의 헤마글루티닌 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인; 및
하나 이상의 뉴라미니다아제 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인은 하이브리드단백질(hybridprotein)로서 제시된 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 하이브리드단백질(hybridprotein)은 재조합체(recombinant)인 조성물.
제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 헤마글루티닌 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인; 및
하나 이상의 뉴라미니다아제 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인은 헤드 도메인(head domain)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 4항중 어느 한 항에 있어서,
인플루엔자 바이러스는 예를 들어, HxNy와 같은 서브 혈청형(serotype) 인플루엔자로부터 선택된 것을 특징으로 하며 상기 x는 1-16, y는 1-9인 조성물.
제 5항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 N1H1 바이러스이며 N1H1 바이러스는 예를 들어, 1918 H1N1 인플루엔자 바이러스 (A/South Carolina/1/18) 및/또는 2004 H5N1 (A/Vietnam/1203/04) H1N1 A/California/07/2009 바이러스 및/또는 A/California/04/2009 및/또는 A/California/09/2009 및/또는 A/Kentucky/UR06-0258/2007(H1N1) 및/또는 A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1)로 부터 선택된 것인 조성물.
제 1항 내지 6항중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 하나 이상의 헤마글루티닌 도메인으로부터 얻어진 1-5개 엑토도메인 및 하나 이상의 뉴라미니다아제 도메인으로부터 얻어진 1-5개 헤드 도메인(head domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7항에 있어서,
하나 이상의 헤마글루티닌 엑토도메인은 A/California/09/2009의 삼량체(trimeric) HA 엑토도메인 (a.a. 17-522)으로부터 선택된 것인 조성물.
제 7항에 있어서,
하나 이상의 뉴라미니다아제 헤드 도메인(head domain)은 A/California/09/2009 바이러스의 사량체(tetrameric) NA 헤드도메인 (a.a. 75-469)으로부터 선택된 것인 조성물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
ISCOM 복합체는 하나 이상의 사포닌, 하나 이상의 지질, 및 하나 이상의 항원을 포함하는 ISCOM인 것인 조성물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
ISCOM 복합체는 하나 이상의 사포닌 및 하나 이상의 지질을 포함하는 ISCOM 매트릭스인(matrix) 조성물.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
첨가제(additive), 부형제(excipient) 및 추가적 보조제(adjuvant)를 더 포함하는 조성물.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 예를 들어 척추동물(예를 들어 조류 및 포유류) 인플루엔자에 대항하는 면역 자극 약물용(immune stimulating medicine), 면역 조절 제약용 (immune modulating pharmaceutical), 또는 백신용인 조성물.
제 13항에 있어서,
상기 포유류는 인간, 개, 고양이, 말, 앵무새와 같은 조류와 같은 반려동물(companion animal), 경제적으로 중요한 종들로(economical important species) 예를 들어 소(bovine), 돼지, 양, 염소, 또는 페렛(ferrets), 밍크(minks)와 같은 가축인 것을 특징으로 하는 조성물.
둘 이상의 구획을 포함하는 키트로서,
한 구획은 하나 이상의 ISCOM 복합체 및 하나 이상의 헤마글루티닌 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인 및 하나 이상의 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 하나 이상의 뉴라미니다아제 도메인으로부터 얻어진 하나 이상의 엑토도메인을 포함하는 조성물을 포함하며 다른 구획은 사용 지침을 포함하는 키트.