CN103052401A - 流感疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组合物，其包含至少一种ISCOM复合物以及来自一种或更多种流感病毒的至少一种血凝素(HA)结构域的至少一个胞外结构域和来自一种或更多种流感病毒的至少一种神经氨酸酶(NA)结构域的至少一个胞外结构域，其中所述胞外结构域表示与流感病毒分离的胞外结构域。本发明还涉及药盒。所述组合物可用作免疫刺激药、免疫调节药物或疫苗，例如其针对脊椎动物(例如禽类和哺乳动物)的流感。

Description

流感疫苗
本发明涉及组合物，其包含至少一种ISCOM复合物以及来自一种或更多种流感病毒的至少一种血凝素(HA)结构域的至少一个胞外结构域和来自一种或更多种流感病毒的至少一种神经氨酸酶(NA)结构域的至少一个胞外结构域，其中所述胞外结构域表示与流感病毒分离的胞外结构域。本发明还涉及药盒。所述组合物可用作免疫刺激药、免疫调节药物或疫苗，例如其针对脊椎动物(例如禽类和哺乳动物)的流感。
背景技术
近来出现的流行性猪源2009甲型(H1N1)流感病毒突出强调了流感病毒引起全球范围人群的发病和死亡的可能。全世界超过200个国家和地区或团体报道了经实验室确认的流行性病毒病例，其中包括超过16,000的死亡病例[1]。接种疫苗是预防或降低流感疾病负担的主要方法。但是，如2009大流行的再次说明的，在爆发早期快速反应因耗时的疫苗株制备和当前使用的疫苗制造方法而受阻。这与流感病毒通过抗原漂移(antigenic drift)和转变(shift)来逃脱已有免疫的公知能力相结合强调了对这样的疫苗的需要，即可快速生产并且对新出现的抗原性变体灵活应答的新型安全并且优选广泛有效的疫苗。
当前许可的流感病毒疫苗包含病毒包膜糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。通过这两种大的糖蛋白引发的抗体在针对流感病毒的免疫中具有不同特性。针对HA的抗体通常通过干扰病毒结合至靶细胞上的唾液酸受体，或者随后通过防止病毒与细胞膜融合(由此病毒基因组进入靶细胞)而中和病毒的感染性。针对NA的抗体通过抑制破坏NA相关受体的酶活性使子代病毒不能从被感染细胞释放。HA介导的体液免疫已被最详尽地表征并且被证实预防病毒感染。NA抗体对于预防疾病的贡献研究地较少。它们似乎产生一种许可性免疫(permissive immunity)[2]，其特征在于减少从感染的上皮细胞的顶表面(apical surface)释放感染性病毒[2-8]，降低病毒脱落并且传播至环境中的可能性。
用HA和NA进行组合免疫提供针对流感的加强保护[5，9，10]。尽管HA和NA具有相当的免疫原性[2]，但是针对常规灭活疫苗或病毒感染的体液免疫应答自然地向HA偏移，这是因为HA和NA在病毒表面以约4∶1的比例存在[11]。另外，如在小鼠中所示，在B和T细胞引发(priming)中在完整的病毒粒中HA在免疫上超过NA[12]。当HA和NA分开施用时，在经免疫的动物中没有发现该抗原性竞争[10，13]。当前许可的流行疫苗以及季节性三价疫苗通常由全病毒制备，从而倾向于包含更多的HA抗原而不是NA抗原。在疫苗制剂中改变HA-NA比率以有利于NA可提供更平衡的体液免疫应答，从而引起更高的NA抗体水平并且增加的针对疾病的保护[3，14]。
由于当前灭活流感病毒疫苗仅标准化HA的量，NA含量是可变的，因此向NA的血清转化的频率和水平是可变的，常常非常低[28，29]。
通常对于甲型流感病毒，能够逃避已有的免疫的特定病毒亚型内的HA和NA抗原变体在人群中被逐渐选择。该抗原漂移过程要求几乎每年调整季节性疫苗组合物以响应最近出现的变体。鉴于未来流感大流行(例如由禽H5N1病毒引起)的威胁，需要诱导广泛保护性免疫的疫苗。
发明概述
本发明涉及组合物和药盒，所述组合物包含至少一种ISCOM复合物以及来自一种或更多种流感病毒的至少一种血凝素(HA)结构域的至少一个胞外结构域和来自一种或更多种流感病毒的至少一种神经氨酸酶(NA)结构域的至少一个胞外结构域，其中所述胞外结构域表示与流感病毒分离的胞外结构域。
包含ISCOM佐剂以及HA和NA或其片段的组合物通过例如WO2008157419和[5，9，10]已知。然而，之前并未公开与ISCOM佐剂一起使用的来自HA和NA二者的胞外结构域。
现在证实，使用由ISCOM或ISCOM基质作为佐剂的来自NA和HA二者的胞外结构域进行接种降低病毒复制(例如通过降低肺滴度)并且降低感染的临床效果，例如体重降低和肺病理。
多聚HA和NA胞外结构域具有巨大的疫苗潜力，因为它们可以大量地容易、快速、灵活和安全地生产。在流感疫苗中包含NA显著并且特别地有助于HA的保护。在疫苗中包含NA可能降低所需要的HA剂量并且扩大保护性免疫。
附图说明
图1
设计并且表达2009甲型(H1N1)流感病毒的可溶性多聚HA(sHA)和NA(sNA)蛋白质。A)重组表达的sHA和sNA蛋白质构建体的示意图。sHA：表达的HA胞外结构域(氨基酸17-522)分别具有N端的CD5信号肽以及C端的三聚(GCN4-pII)GCN4结构域和Strep标签(ST)。sNA：表达的NA头部结构域(a.a.75-469)具有N端的CD5信号肽、OneSTrEP(OS)肽和四聚(GCN4-pLI)GCN4结构域。(B)考马斯蓝染色的经亲和纯化的sHA和sNA蛋白质的还原SDS-PAGE。
图2
用多聚2009甲型(H1N1)流感病毒HA和NA抗原进行接种的抗体应答。雪貂在第0天和第20天用以下试剂免疫：3.75μgsHA3+3.75μgsNA4(sHA+sNA)；佐剂中的3.75μgsHA3(ISCOM基质M[IMM]；sHA+IMM)；佐剂中的3.75μgsNA4(sNA+IMM)；佐剂中的3.75μgsHA3+3.75μgsNA4(sHA+sNA+IMM)；PBS或者IMM，如所示。针对2009甲型(H1N1)流感病毒的抗体应答通过凝血抑制(HI；上图)、病毒中和(VN；上方第二幅图)以及神经氨酸酶抑制(NI)测定(下图)进行评价。每个点表示一只雪貂的结果。水平线表示平均值。水平灰色条表示测定的检测限。
图3
用2009甲型(H1N1)流感病毒进行攻击接种后的临床效果。如图2的图例所示免疫雪貂，在第52天用106TCID50的病毒进行气管内接种。体重减少表示为感染前体重的百分比(上图)。肺重量表示为体重的百分比，作为肺实变的指示(中图)。肉眼观察肺并且对显示实变之区域的肺区域百分比进行评级(底图)。显示平均值；误差线表示标准偏差。水平灰色条表示测定的检测限。
图4
接种后雪貂肺中的组织病理学结果的实例。A)在用PBS或仅用佐剂(IMM)模拟接种或者用无佐剂的sHA3+sNA4接种的未保护雪貂的肺中观察到炎性浸润，支气管壁中上皮细胞丧失和支气管内腔中细胞碎片。B)在用PBS或仅用佐剂(IMM)模拟接种或者用无佐剂的sHA3+sNA4接种的雪貂肺肺泡中炎性细胞的蛋白质流体(水肿)和浸润。C)用sHA+IMM接种的雪貂支气管中的支气管周浸润和细胞碎片。D)用sHA+IMM接种的雪貂肺中的肺泡隔中的炎性浸润以及II型肺细胞肥大和增生。E)在sNA+IMM组和sHA+sNA+IMM组的雪貂肺中观察到支气管周浸润。F)在sNA+IMM组和sHA+sNA+IMM组的雪貂肺肺泡中无炎性细胞和II型肺细胞增生。H&E染色；放大20×(支气管)和40×(肺泡)。
图5
经攻击接种的动物的肺、鼻和咽中的病毒滴度。如图3的图例所示免疫和攻击雪貂，在接种后第4天分析病毒复制。在肺匀浆(上图)，鼻拭子(中图)和咽拭子(下图)中确定病毒滴度。通过MDCK细胞中的终点滴定来测定滴度。每个点表示一只雪貂的结果。水平线表示平均值。水平灰色条表示测定的检测限。
图6
通过用多聚2009甲型(H1N1)流感病毒sHA3和sNA4抗原接种来诱导交叉中和抗体。(A)如图2中图例所示用均在佐剂中的sHA3或sHA3+sNA4免疫雪貂两次，在HI测定中测试血清针对包括AI/wine/shope/1/56、A/意大利/1443/76、A/NL/386/86、A/衣阿华/15/30、A/NL/25/80、A/新泽西/8/76、A/PR/8/34和IVR/148流感H1N1的不同流感病毒的活性。显示平均滴度；误差线表示标准偏差。(B)将用均在佐剂中的sNA4或sHA3+sNA4免疫一次或两次的雪貂的血清合并并且在NI测定中测试针对A/肯塔基/UR06-0258/2007(H1N1)和A/火鸡/土耳其/1/2005(H5N1)流感病毒的sNA4的活性。取A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)的NA作为阳性对照。特异性针对A/NL/602/09(H1N1)或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5N1)流感病毒的阳性对照血清获自用这些病毒感染的雪貂。显示两次重复的平均滴度；误差线表示标准偏差。水平灰色条表示测定的检测限。
发明详述
本发明涉及组合物，其包含至少一种ISCOM复合物以及来自流感病毒的至少一种HA结构域的至少一个胞外结构域和来自流感病毒的至少一种NA结构域的至少一个胞外结构域，其中所述胞外结构域表示与所述流感病毒分离的胞外结构域。
胞外结构域是膜蛋白延伸至细胞外空间的结构域。胞外结构域一般是启动与的表面接触(这导致信号转导)的蛋白质部分。在所述组合物中，它可作为抗原并且所述组合物可作为疫苗。
分离意指胞外结构域基本上与流感病毒的其他蛋白质以及NA和HA蛋白质各自的剩余部分分离。可存在较少的剩余氨基酸。胞外结构域可以是全部胞外结构域或者其具有相同酶促活性和/或抗原活性的一部分。根据一个实施方案，胞外结构域的一部分可以是其头部结构域。这种为全部胞外结构域或者其具有相同酶促活性和/或抗原活性的一部分的胞外结构域可分离自流感病毒或者合成产生。它们可以彼此分开存在或者连接在一起。
根据一个实施方案，所述胞外结构域为可溶性胞外结构域或可溶性头部结构域。
来自相同或不同流感病毒物种或菌株的至少一种血凝素结构域的一个或更多个胞外结构域和至少一种神经氨酸酶结构域的一个或更多个胞外结构域可以作为杂合蛋白存在，其可以是重组的。
重组产生的HA和NA抗原使得能够开发这样的疫苗，其中可容易地控制两种抗原的相对量。鉴于它们更好地保留蛋白质的天然抗原结构，真核表达系统(哺乳动物和昆虫二者)为生产这种糖蛋白优选的平台。可如实施例1所述和根据Genscripthttp://www.genscript.com/gene_synthesis.html生产杂合蛋白。
流感病毒可选自流感的血清亚型例如HxNy，其中x为1至16并且y为1至9。因而x可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16并且y可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9。流感病毒可来自任何物种，例如人、禽类、牲畜例如牛科动物物种、猪、绵羊、山羊。可使用禽流感病毒例如H1-6N1-9或人流感病毒H1-3N1-2或者来自其NA和HA的胞外结构域的任何组合。NA胞外结构域和/或HA胞外结构域可来自不同物种的流感病毒，例如人和禽流感病毒。因此，一种或更多种人和禽NA胞外结构域可与一种或更多种人和禽HA胞外结构域组合，由此NA和HA可为不同类型的HxNy。
根据一个实施方案，所述流感病毒是甲型流感病毒例如N1H1病毒，例如选自1918H1N1流感病毒(A/南加利福尼亚/1/18)和/或2004H5N1(A/越南/1203/04)H1N1A/加利福尼亚/07/2009病毒和/或A/加利福尼亚/04/2009和/或A/加利福尼亚/09/2009和/或A/肯塔基/UR06-0258/2007(H1N1)和/或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5N1)。
可使用来自NA和来自HA的一个或更多个胞外结构域(多聚体)。组合物可包含来自至少一种血凝素结构域的1至5个胞外结构域和来自至少一种神经氨酸酶结构域的1至5个头部结构域。
根据一个实施方案，所述至少一种血凝素胞外结构域选自A/加利福尼亚/09/2009的三聚HA胞外结构域(氨基酸17-522)。
根据一个实施方案，所述至少一种神经氨酸酶头部结构域选自A/加利福尼亚/09/2009病毒的四聚NA头部结构域(氨基酸75-469)。A/加利福尼亚/09/2009蛋白质的序列为本领域所知，例如通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/227809830和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/227809834。
可将ISCOM复合物用作佐剂和免疫调节剂。其可为ISCOM和/或ISCOM基质复合物。
ISCOM-基质复合物和/或ISCOM复合物可与旨在引发针对流感感染的免疫应答的一种或更多种抗原一起使用。抗原以及ISCOM-基质复合物和/或ISCOM-复合物可混合或分开施用。
ISCOM基质复合物包含至少一种糖苷和至少一种脂质。所述糖苷具有佐剂作用并且优选为尤其来自皂皮树(Quillaja saponaria Molina)的皂苷(Quil A)。所述脂质至少为固醇例如胆固醇和任选地还有磷脂。ISCOM基质复合物还可包含一种或更多种其他免疫调节(佐剂活性)物质(不一定是糖苷)，并且可如EP 0436620B1所描述的产生。
ISCOM复合物包含至少一种糖苷、至少一种脂质和至少一种抗原物质或表位。这些抗原物质可以是不同类型例如蛋白质和肽、糖蛋白和糖肽、碳水化合物等。糖苷具有佐剂作用并且优选为尤其来自皂皮树的皂苷(Quil A)。这些复合物增强所包含的抗原的免疫原性并且还可包含一种或更多种免疫调节(佐剂活性)物质。ISCOM可如EP0109942B1、EP0242380B1和EP 0180546B1所描述的制备。另外，如EP 9600647-3(PCT/SE97/00289)所描述的，可使用转运(transport)抗原和/或过客(passenger)抗原。
胞外结构域抗原可与ISCOM基质复合物和/或ISCOM复合物混合，结合或缀合至ISCOM基质复合物或与ISCOM混合，或者连接至ISCOM复合物。除了胞外结构域抗原之外，所制备的ISCOM复合物可包含一种或更多种其他抗原。根据一个实施方案，可使用一种或更多种胞外结构域抗原整合至ISCOM复合物中。之后，这种ISCOM复合物可与一种或更多种胞外结构域抗原混合。可使用一种或更多种抗原并且可使用如EP9600647-3(PCT/SE97/00289)中所述的转运抗原和过客抗原。
为了整合至ISCOM颗粒中，抗原需要具有一些疏水性部分或是附于ISCOM基质的静电。不具有疏水性部分的抗原可连接至这种分子。疏水性分子和连接方法在EP 180564中有所描述。
在免疫原性复合物中包含的脂至少为固醇例如胆固醇以及任选地还有磷脂。所使用的一种或更多种脂质尤其为在申请人的专利EP 0109942B1(尤其第3页上)和专利EP 0436620B1第7页第7至24行中所描述的那些。使用的尤其是固醇例如胆固醇以及磷脂例如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。
可使用结合至细胞结合组分(例如糖脂)的含脂质受体(包括霍乱毒素受体(其为神经节苷脂GM1))和岩藻糖化血型抗原。之后细胞结合组分可作为粘液靶向分子并且通过将该组分与含有该组分的复合物简单混合来结合至含脂质物质。包含受体的ISCOM复合物在例如WO 97/30728中有所描述。
在本发明的一个实施方案中，在用于针对流感的接种的免疫原性复合物中的糖苷为来自皂皮树的皂苷级分。
也可使用皂皮树皂苷的任何亚片段。另外，可使用皂皮树的亚片段的任何组合。因此，两种或更多种亚片段可各自整合至ISCOM复合物或ISCOM-基质复合物中。
在本说明书和权利要求全文中使用的术语“来自皂皮树的皂苷级分”是皂皮树半纯化的或限定的皂苷级分或者基本纯的级分。重要的是，所述级分不包含这样多的任何其他级分：即对使用基本包含一种级分之ISCOM复合物或ISCOM基质复合物的混合物时获得的良好结果有不利影响。
根据一个实施方案，提供的用于本发明的免疫原性复合物，其(作为免疫原性复合物的一部分或在与其混合)除了来自皂皮树的皂苷级分之外还包含至少另外的佐剂，或者除了整合至ISCOM基质或ISCOM复合物中的一种或更多种之外还包含至少一种其他的糖苷或皂苷。有用的非皂苷佐剂的实例为不同的油和Al(OH)3。
可分别整合入ISCOM复合物和ISCOM基质复合物或者与其混合的另外的佐剂的实例为任何天然或合成的具有期望的免疫调节作用的佐剂，例如天然、或其衍生物、来源于皂皮树粗皂苷提取物的合成或半合成皂苷分子；例如来自Quil A的皂苷和皂苷级分，细胞壁骨架，嵌段聚合物例如亲水性嵌段共聚体例如CRL-1005，TDM(海藻糖二霉菌酸酯，threhalose di mucolate)，脂肽，LPS和LPS衍生物，来自多种细菌物种的脂质A及其衍生物(例如单磷酰脂质A、胞壁酰二或三肽或者胞壁酰二肽)，MDP衍生物(例如脂肪酸衍生物)，取代的MDP，MDP(及其衍生物)的苏氨酰类似物，CpG变体，CpGODN变体，内源性人和动物免疫调节剂(例如GM-CSF)，IL-2，佐剂活性的细菌毒素，天然或修饰的毒素(例如霍乱毒素CT及其亚组分CTB和CTA1)，大肠杆菌(E.coli)的热不稳定毒素(LT)，百日咳杆菌(Bordetella pertussis)(BP)毒素和BP的纤维状血凝素(filamentus heamagglutenin)，DDA，聚阴离子例如硫酸葡聚糖以及脂多糖例如皂苷(除了QuilA之外其他的)，参见(″Futureprospects for vaccine adjuvants″，Warren，H.S.(1988)CRC Crit.Rev.Immunol.8：2，83-101；″Characterisation of a non-toxic monophosphoryllipid A″，(1987)Johnson，A.G.等，Rev.Infect.Dis.9：5，5512-5516；″Developmental status of synthetic immunomodulators″，Berendt，M.J.等(1985)，Year Immunol.193-201；″Immunopotentiating conjugates″，Stewart-Tull，D.E.，Vaccine，85，3：1，40-44)，其全部通过引用并入本文。
ISCOM颗粒可为由任何皂苷制得的ISCOM复合物或ISCOM基质复合物。佐剂级分A和其他至少一种佐剂也可结合至不同或相同的ISCOM颗粒或ISCOM基质颗粒，或者一种或更多种佐剂可与ISCOM颗粒混合。
为了整合至ISCOM颗粒中，佐剂需要具有一些疏水性分子。不具有疏水性部分的佐剂可连接至这种分子。疏水性分子和连接方法在EP180564中有所描述。优选地，佐剂整合至不同的ISCOM颗粒中。
在本发明的另一个实施方案中，Quil A的佐剂级分A整合至ISCOM颗粒中，而其他至少一种佐剂没有整合至ISCOM颗粒中并且以游离形式在组合物中使用。
在本发明的另一个优选的实施方案中，Quil A的佐剂级分整合至ISCOM颗粒或ISCOM基质颗粒中，而其他佐剂没有整合至ISCOM颗粒或ISCOM基质颗粒中并且以游离形式在组合物中使用。
在另一个尤其优选的实施方案中，组合物包含整合至ISCOM颗粒或ISCOM基质颗粒中的Quil A的级分A和至少一种没有整合至ISCOM颗粒或ISCOM基质颗粒中的其他佐剂。
在另一个优选的实施方案中，所述至少其他佐剂为MPL或霍乱毒素CT。MPL或霍乱毒素可整合至同一ISCOM颗粒或ISCOM基质颗粒或者各整合至不同的ISCOM颗粒或ISCOM基质颗粒。优选地，MPL或霍乱毒素为游离形式。
来自皂皮树的用于ISCOM基质复合物、ISCOM复合物和/或至少一种另外的佐剂的皂苷级分可选自皂皮树的级分A、级分B、级分C，皂皮树的粗级分，QA 1-21。然而，伴随现代强大的分离技术，报道并描述了多于60种不同的结构(Bankefors等，J Chrom B Analyt Technol BiomedLife Sci待印；Bankefors等，Rapid Commun Mass Spectrom 22：3851；Broberg等，J Mass Spectrom 39：691；Nyberg等，Anal Chem 75：268；Guo和Kenne Phytochemistry 55：419；Nord和Kene Carbohydr Res 329：817；Guo和Kenne Phytochemistry 54：615；Guo等，Phytochemistry 53：861；Nyberg等，Carbohyd.Res 323：87；Nord和Kenne Carbohyd.Res 320：70；Guo等，Phytochemistry 48：175)。
当如文中所描述的制备时，皂皮树的级分A、B和C各表示化学上紧密相关的具有可定义特性的分子的组或家族。获得它们的色谱条件使得在洗脱谱和生物活性方面各批次之间的重复性高度一致。
在本说明书和权利要求全文中使用的术语“一种来自皂皮树的皂苷级分”是皂皮树半纯化或限定的皂苷级分或者基本纯的级分的通用描述。重要的是，所述级分不包含这样多的任何其他级分，其对使用基本包含一种级分之ISCOM或ISCOM基质的混合物时获得的良好结果有不利影响。如果期望，皂苷制品可包含少量(例如按重量计多至40％，例如按重量计多至30％、按重量计多至25％、按重量计多至20％、按重量计多至15％、按重量计多至10％、按重量计多至7％、按重量计多至5％、按重量计多至2％、按重量计多至1％、按重量计多至0.5％、按重量计多至0.1％)的其他化合物例如其他皂苷或其他佐剂物质。
根据本发明的皂苷级分A、B和C为WO 96/11711中所描述的，B3、B4和B4b级分为如EP 0436620中所描述的；级分QA 1-21为如EP 03632279B2所描述。可使用EP 03632279B2中描述的级分QA-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20和21，尤其是QA-7、17-18。如EP 0362279B2中(尤其是第6页和第8和9页上的实施例1)所描述的获得它们。
可使用来自皂皮树的任何类型的粗制或半纯化的皂苷级分。用于本专利目的的一种皂皮树粗级分为从其他亲脂性非皂苷组分中稍纯化的任何皂苷组合物。这可以是纯化而未分级的皂皮树制备物的任何皂苷级分。可生产这种粗级分(其中皂苷没有彼此分离)和购自例如Desert King Chile(www.desertkingchiie.cl)、Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com)、Berghausen(www.berghausen.com)、Brenntag Biosector(www.brenntaq-biosector.com)。
WO 96/11711中所描述的级分A、B和C由亲脂性级分制备，该亲脂性级分通过色谱分离粗制水性皂皮树提取物并用水中的70％乙腈洗脱以分离亲脂性级分而获得。之后，该亲脂性级分通过半制备型HPLC分离，使用酸性水中的25％至60％乙腈梯度洗脱。这里称作或“级分A”或“QH-A”的级分是或对应以大约39％乙腈洗脱的级分。这里称作或“级分B”或“QH-B”的级分是或对应以大约47％乙腈洗脱的级分。这里称作或“级分C”或“QH-C”的级分是或对应以大约49％乙腈洗脱的级分。
根据一个实施方案，使用皂苷的粗级分。
根据另一个实施方案，皂苷的粗级分可与任何其他纯化的皂苷级分(例如上述不同的皂苷级分)一起使用。
根据本发明的一个实施方案，整合至ISCOM基质复合物或ISCOM复合物的来自皂皮树的皂苷级分或者也整合至ISCOM或ISCOM基质复合物或与其混合的至少一种另外的佐剂选自皂皮树的级分A、级分B、级分C，皂皮树的半纯化制品、皂皮树的纯化制品或者任何纯化的亚级分例如QA 1-21。
可使用分别包含至少两种皂皮树的皂苷级分的ISCOM基质和/或ISCOM复合物。可使用不同皂苷级分的重量百分比的任何组合。可使用任何两种级分的任何重量百分比组合，例如级分A的任何重量百分比和另一种级分的任何重量百分比(例如分别为皂皮树的任何粗皂苷级分或级分C)。在ISCOM基质和/或ISCOM复合物中，ISCOM基质和/或ISCOM复合物可包含按重量计0.1至99.9、按重量计5至95％、按重量计10至90％、按重量计15至85％、按重量计20至80％、按重量计25至75％、按重量计30至70％、按重量计35至65％、按重量计40至60％、按重量计45至55％、按重量计40至60％，、按重量计50至50％、按重量计55至45％、按重量计60至40％、按重量计65至35％、按重量计70至30％、按重量计75至25％、按重量计80至20％、按重量计85至15％、按重量计90至10％、按重量计95至05％、按重量计50至99％、按重量计60至90％、按重量计70至90％、按重量计75至85％的一种皂苷级分例如皂皮树的级分A，和在每种区间中剩余直到100％的另一种皂苷例如皂皮树的任何粗级分或任何其他级分例如皂皮树的级分C(根据ISCOM基质和/或ISCOM复合物中皂苷的皂苷级分的重量总和)。
根据一个实施方案，提供用于本发明的ISCOM基质和/或ISCOM复合物，其包含按重量计5至99％的一种级分例如皂皮树的级分A，和剩余直到按重量计100％的另一种级分例如皂皮树的粗皂苷级分或级分C(根据级分A和级分C的重量)。
根据另一个实施方案，提供用于本发明的ISCOM基质和/或ISCOM复合物，其包含按重量计40％至99％的一种级分例如皂皮树的级分A，和按重量计1％至60％的另一种级分例如皂皮树的粗皂苷级分或级分C(根据级分A和级分C的重量)。
根据又一个实施方案，提供用于本发明的ISCOM基质和/或ISCOM复合物，其包含按重量计70％至95％的一种级分例如皂皮树的级分A，和按重量计30％至5％的另一种级分例如皂皮树的粗皂苷级分或级分C(根据级分A和级分C的重量)。
在一个实施方案中，提供用于本发明的ISCOM基质和/或ISCOM复合物，其中来自皂皮树的皂苷级分选自QA 1-21之一。
根据本发明的一个方面，提供组合物例如疫苗，其包含至少一种根据本发明的ISCOM基质和/或ISCOM复合物以及一种或更多种胞外结构域抗原和一种或更多种可药用赋形剂、载体和/或稀释剂和/或其他佐剂，以用于针对流感的接种。
这种组合物可包含一种或更多种不同类型的ISCOM-基质复合物颗粒和/或一种或更多种不同类型的ISCOM复合物颗粒，每种类型的复合物颗粒包含一种来自皂皮树的皂苷级分，其中一种复合物中的皂苷级分不同于其他复合物颗粒中的皂苷级分。组合物可包含数种颗粒。然而，根据一个实施方案，一种颗粒可仅包含一种单一类型的皂皮树级分。
因此，一种类型的基本纯的皂苷级分或粗皂苷级分可整合至一种ISCOM基质复合物或颗粒中，另一种类型的基本纯的皂苷级分或粗皂苷级分可整合至另一种ISCOM基质复合物或颗粒中。组合物或疫苗可包含至少两种类型复合物或颗粒，每种类型具有一种类型的整合至物理上不同的颗粒中的皂苷。
在组合物中，可使用ISCOM基质复合物颗粒和/或ISCOM复合物颗粒的混合物，其中一种皂皮树皂苷级分和另一种皂皮树皂苷级分分别整合入不同的ISCOM基质复合物颗粒和/或ISCOM复合物颗粒。基于一种皂苷级分和任何其他皂苷级分的含量，可使用不同ISCOM复合物的任何重量百分比组合，例如可分别使用级分A和另一种级分，例如皂皮树的任何粗皂苷级分或级分C。这些百分比数字可与以上对一个或同一个ISCOM基质复合物颗粒和/或ISCOM复合物颗粒中(然而此处是在分开的ISCOM基质复合物颗粒和/或ISCOM复合物颗粒中)的可能皂苷级分混合物所述的相同。
在又一个实施方案中，整合入ISCOM颗粒或ISCOM基质颗粒中Quil A级分A与至少一种其他佐剂各整合入不同的ISCOM颗粒或ISCOM基质颗粒，或者一种或更多种Quil A的其他级分或者一种或更多种其他佐剂整合入相同的ISCOM或ISCOM基质颗粒但是不同于Quil A级分A整合入的颗粒，或者其他至少一种佐剂为游离形式。
在组合物中，在相同或不同的ISCOM复合物和/或ISCOM-基质复合物中，级分A可与来自皂皮树的级分C和粗皂苷级分(例如级分Q)中的至少一种组合。
通过组合包含不同皂皮树级分的ISCOM-基质复合物，可以产生对动物毒性很小的组合物。因此，在一个实施方案中，用于本发明的组合物在相同或不同的ISCOM复合物和/或ISCOM-基质复合物中包含与级分C和Q中的至少一种组合的级分A。
组合物还可包含一种或更多种可药用赋形剂、载体和/或稀释剂以及其他佐剂。
除了整合至ISCOM复合物颗粒或ISCOM基质颗粒中的皂苷之外，组合物可包含至少一种其他佐剂。该其他佐剂可以是来自皂皮树的皂苷级分，其可结合至免疫原性ISCOM基质复合物颗粒或ISCOM复合物颗粒或者与其混合。它也可以是另一种类型的皂苷，或任何其他类型的可整合至、结合至免疫原性ISCOM基质复合物颗粒或ISCOM复合物颗粒或者与其混合的佐剂，。
组合物可以是疫苗。
文中的术语“疫苗”指能够产生免疫应答的物质。根据本发明的疫苗可产生针对流感的免疫。
组合物可以用于预防以预防感染发生，或者可以用于治疗以治疗已有的感染，或者可用于生产免疫试剂。
除了来自流感病毒的胞外结构域的抗原之外，其他抗原可整合至ISCOM复合物、连接至ISCOM复合物或连接至ISCOM基质复合物或者与ISCOM复合物或ISCOM基质复合物混合。本发明还涉及组合疫苗或组合兽药用于治疗。
根据本发明的组合物的制剂为本领域技术人员所公知。合适的可药用载体和/或稀释剂包括任何和全部的常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水性溶液、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂在药物活性物质中的用途为本领域所公知，并且例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PublishingCompany，Pennsylvania，USA中描述的。除了目前与活性成分不相容的任何常规介质或试剂外，考虑它们在本发明药物组合物中的使用。补充的活性成分也可掺入该组合物。
根据另一方面，该组合物可用作免疫刺激药、免疫调节药物或疫苗，例如其针对脊椎动物(例如禽和哺乳动物)的流感。哺乳动物可以是人，伴侣动物例如猫、狗、马、禽例如鹦鹉，有经济价值的物种例如牲畜，例如牛科动物物种、猪、绵羊、山羊或雪貂、水貂。
本发明还涉及药盒，其包含至少两个室，其中一个室包含组合物，所述组合物包含至少一种ISCOM复合物以及来自一种或更多种流感病毒的至少一种血凝素结构域的至少一个胞外结构域和至少一种神经氨酸酶结构域的至少一个胞外结构域，另一个室包含使用说明书。
根据另一个方面，本发明涉及药盒，其包含至少两个室，其中一个室包含ISCOM复合物和/或ISCOM基质复合物，另一个室包含来自至少一种血凝素结构域的至少一个胞外结构域和来自至少一种神经氨酸酶结构域的至少一个胞外结构域。
申请人尤其讨论了重组产生的2009甲型(H1N1)流感病毒的HA和NA亚基作为针对雪貂模型中同型流感病毒的疫苗的功效，并且尤其强调了NA抗原的贡献。可溶性多聚体形式的大流行H1N1病毒的HA和NA抗原已经在哺乳动物表达系统中表达。通过一步亲和色谱纯化糖蛋白，随后用一种或两种抗原在具有或不具有ISCOM基质M作为佐剂的情况下免疫雪貂。动物对两种抗原均有血清上的应答，但是仅当与佐剂一起施用时如此。
有趣的是，在疫苗中包含NA增强了HA抗体和病毒中和活性的水平。尤其如同显著(5log10单位)降低的病毒肺滴度所判断的，在用与ISCOM基质M组合的含HA疫苗免疫的动物中进行同源攻击后观察到显著的保护。有趣的是，以ISCOM基质M为佐剂的含NA制剂明显降低了感染的临床效果。
本文提及的全部出版物以法律允许的最大程度通过引用并入本文。
现在本发明将进一步通过以下非限制性实施例进行描述
实施例
实施例1HA和NA抗原的制备
材料和方法
甲型流感攻击病毒
流感病毒A/荷兰/602/2009通过接种11日龄的鸡胚分离自在荷兰第一例实验室确认的2009甲型(H1N1)感染[15]。通过感染汇合的Madin-Darby狗肾(MCCK)细胞制备流感病毒A/荷兰/602/2009(H1N1)的病毒储液。完成细胞病理学变化之后，通过低速离心除去培养物上清液并且贮存在-70℃。感染性病毒滴度在MCCK细胞中如之前所描述地确定[16]。所有使用这些病毒的实验在生物安全水平(BSL)-3的条件下进行。
HA和NA抗原的制备
合成(GenScript)编码流感病毒A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)的可溶性血凝素胞外结构域(sHA；氨基酸17-522)和神经氨酸酶头部结构域(sNA；氨基酸75-469)的人密码子优化序列，然后克隆至表达质粒pS1-lg的衍生物[17]中用于在HEK293T细胞中表达。在HA基因之前加上编码N端CD5信号肽的序列，之后加上编码C端人工GCN4三聚结构域(GCN4-Dll)[18]和最近描述的用于亲和纯化(IBA GmbH)的Strep标签[19，20]的序列。NA基因之前加上相继编码N端CD5信号肽、双Strep标签(OneSTrEP；IBA GmbH)和人工GCN4四聚结构域(GCN4-pLI)[18]的序列。
sHA 3 和sNA 4 抗原的产生
如图1A所示，设计构建体以表达2009甲型(H1N1)流感病毒的三聚HA胞外结构域(氨基酸17-522)和四聚NA头部结构域(a.a.75-469)。sHA3和sNA4蛋白质通过以下产生：在HEK293T细胞中表达，然后通过亲和色谱法从培养物中纯化，从而获得预期大小的糖蛋白(图1B)。凝胶过滤分析表明HA和NA亚基各自的三聚和四聚寡聚特性(数据未显示)。如通过它们的唾液酸结合(sHA3；制备手稿)和神经氨酸酶活性(sNA4；下文)所判断的，多聚复合物也具有生物活性，进一步确认了它们的天然状态。
实施例2.蛋白质表达和纯化
利用1∶5比率(μgDNA∶μgPEI)的sHA和sNA表达质粒与聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293T细胞。6小时孵育期后，将转染培养基替换为补充了碳酸氢钠(3.7g/升)、葡萄糖(2.0g/升)、Primatone RL-UF(3.0g/升)、青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μq/ml)、glutaMAX(Gibco)和1.5％DMSO的293SFM II表达培养基(Invitrogen)。转染后5至6天收集组织培养物上清液，然后利用Strep-Tactin亲和色谱(IBA GmbH)从培养基中纯化sHA和sNA蛋白质。通过使用Strep-Tractin-HRP缀合物(IBA GmbH；数据未给出)的western印迹和SDS-PAGE分析确认sHA和sNA蛋白质的表达和纯化。通过凝胶过滤色谱和考马斯亮蓝非变性PAGE(blue-native-PAGE)分析确定蛋白质的寡聚化。使用BSA作为参考进行蛋白质的量的定量。
实施例3.免疫和感染
雪貂
健康年轻成年远交雌性雪貂(Mustela putorius furo；6至12月龄)购自商业饲养员。通过凝血抑制测定检查动物是否缺乏针对循环季节性A/H1N1和A/H3N2流感病毒和针对猪源流感A/NL/602/09病毒的抗体。在开始实验之前，独立的动物伦理委员会批准该实验方案。
如WO2004/004762中所描述的制备ISCOM基质M佐剂。将PBS中的包含85％基质A和15％基质C的75微克组合物添加至抗原中。
免疫和感染
将36只血清反应阴性的雪貂分成6组，每组6只，用以下制剂接种两次：磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的3.75μgsHA3+3.75μgsNA4(组1)；ISCOM基质M(IMM、Isconova、Uppsala、Sweden)中的3.75μgsHA3(组2)；IMM中的3.75μg sNA4(组3)；IMM中的3.75μg sHA3+3.75μgsNA4(组4)；PBS(组5)；IMM(组6)。在氯胺酮麻醉下，在后腿的四头肌中以总体积1ml间隔20天进行接种。雪貂成组饲养并且随意获取食物和水。在最后接种后的第32天，动物用氯胺酮/美托咪定麻醉(用阿替美唑逆转)，称重，然后用3ml体积PBS中的1×106TCID50流感A/NL/602/09(H1N1)气管内攻击[21，22]。随后每天监测雪貂三次用于生成临床指标。感染前以及感染后第2天和4天，在用氯胺酮麻醉雪貂时收集每只雪貂的鼻拭子和咽拭子。接种后第4天，称重动物，然后在用氯胺酮和美托咪定麻醉下通过放血处死动物。根据标准方法进行尸检。由于与实验无关的原因，组1的一只雪貂在第一次和第二次接种之间死亡。
血清学
在接种前、第二次接种当天(第20天)和攻击当天(第52天)采集血清样品。将血清在-20℃下贮存直到使用。如之前所描述的，用1％火鸡红细胞利用凝血抑制测定(HI测定)测试血清是否存在抗HA抗体，利用微病毒中和测定(VN测定)测试血清是否存在病毒中和抗体[23，24]。测试血清中是否存在与流感A/NL/602/09(H1N1)反应的抗体。为此，生成了反向遗传学病毒。用这些病毒获得的滴度与针对野生型菌株的那些相当(数据未给出)。特异性针对流感A/NL/602/09(H1N1)的阳性对照血清获自用该病毒感染的雪貂[15]。其他用于HI测定的H1N1流感病毒为A/荷兰/386/86(NL/86)、A/荷兰/25/80(NL/80)、A/新泽西/8/76(NJ/76)、A/猪/shope/1/56(Sw/56)、A/意大利/1443/76(It/76)、A/衣阿华/15/30(lo/30)、A/波多黎各/8/34(Pr/34)和A/布里斯班/59/07(IVR-148疫苗株；IVR/148)。用这些病毒感染的雪貂的血清样品用作该测定中的阳性对照[25]。
还用之前描述的基于胎球蛋白的测定(fetuin-based assay)测试血清中是否存在神经氨酸酶抑制(NI)抗体[26]。简言之，将96孔NuncMaxiSorp板在4℃下用100μl 5μg/ml胎球蛋白包被过夜。将60μl体积连续稀释的血清样品在37℃下用等体积含有sNA4的培养物上清液(在PBS-Ca/Mg[0.901mM/0.493mM]中预稀释以给出1.5的半数最大OD450)中孵育30分钟，之后将100μl混合物添加至胎球蛋白包被的孔中。在37℃孵育1小时后，洗涤板，然后通过以下测量神经氨酸酶活性：添加过氧化物酶标记的花生凝集素(2.5μg/ml；Sigma)，在室温下孵育1小时，洗涤板，然后向每孔添加100μl过氧化物酶底物(TMB)。5分钟后，通过添加100μl 0.3M磷酸来终止反应，使用ELISA阅读器(EL-808[BioTEK])测量450nm下的OD值。为了测试血清的交叉反应性NI抗体，还制作sNA4表达构建体(类似上述用于A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)的那些)用于A/肯塔基/UR06-0258/2007(H1N1)(氨基酸75-470)和A/火鸡/土耳其/1/2005(H5N1)流感病毒(氨基酸55-449)的头部结构域。特异性针对流感A/NL/602/09(H1N1)和A/火鸡/土耳其/1/2005(H5N1)的血清获自用这些病毒感染的雪貂，并且该血清用作阳性对照。
上呼吸道和下呼吸道中的病毒复制
右肺的所有叶和副叶的样品采集自感染的雪貂，在干冰上与乙醇急速冷冻并且贮存在-70℃直到进一步使用。将肺样品称重，然后用FastPrep-24(MP Biomedicals，Eindhoven，The Netherlands)在含有0.5％乳清蛋白、10％甘油、200U/ml青霉素、200μg/ml链霉素、100U/ml硫酸多粘菌素B、250μg/ml庆大霉素和50U/ml制霉菌素(ICNPharmaceuticals，Zoetermeer，The Netherlands)的Hank′s平衡盐溶液中进行匀浆，之后短暂离心。将鼻拭子和咽拭子在-70℃直接贮存于与匀浆肺样品所用相同的培养基中。如前述[16]，将一式四份10倍连续稀释的咽、鼻和肺样品用于感染MDCK细胞。将接种后5天采集的培养物上清液的HA活性用作感染的指示。根据Spearman-Karber方法计算滴度，并且对于肺组织表示为log TCID50/克或者对于拭子表示为log TCID50/ml[27]。
组织病理学
用流感A/NL/602/09病毒的个感染后4天(day post inoculation，dpi)，处死雪貂，肉眼观察肺并称重，之后采集来自右肺的样品用于确定病毒滴度。然后用10％中性缓冲福尔马林充满左肺叶。固定后包埋在石蜡中，将肺以4μm切片，然后通过用苏木精和伊红(HE)染色来检查组织切片。
统计分析
在动物组中的显著性通过单因素ANOVA和ANOVA之后的杜凯氏检验(Tukey test)进行分析。p＜0.05则认为差异显著。
结果
通过用sHA3和sNA4免疫诱导的抗体应答
测试了糖蛋白诱导针对同源病毒攻击的保护性免疫的能力。在第0天和第20天用没有佐剂的sHA3+sNA4(sHA+sNA)、用ISCOM基质M作为佐剂的sHA3+sNA4(IMM；sHA+sNA+IMM)或者用类似的作为佐剂的sHA3(sHA+IMM)或sNA4(sNA+IMM)免疫雪貂。在第二次免疫当天和攻击前(第20天和第52天)采集血清，然后通过针对同源病毒的HI和VN测定以及NI测定来测量抗体应答(图2)。在仅用PBS或佐剂接种的对照动物中未观察到这些测定中有应答，而且在用无佐剂的sHA3和sNA4的混合物免疫的动物中也未观察到。与此相反，用有佐剂的sHA3(sHA+IMM)免疫引起了高HI滴度，在攻击当天几何平均滴度为91。有趣的是，另外添加sNA4(sHA+sNA+IMM)显著地将平均HI滴度增加至468(p＜0.05；单因素ANOVA和杜凯氏检验)。另外，NI滴定显示NA抗体的佐剂依赖性诱导，在一次免疫后低(图2)但是在两次免疫后极大加强(图2)。然而，在这种情况下由于共施用sHA3这些滴度没有明显的增加。与观察到的HI滴度一致，在sHA+IMM和sHA+sNA+IMM接种动物中都发现高VN滴度(图2)。另外，这里sNA4抗原与sHA+sNA+IMM疫苗的共施用引起平均VN滴度的增加，在sHA+IMM组和sHA+sNA+IMM组中平均值分别为1∶202至1∶468。
保护对抗用2009甲型(HtNt)流感病毒感染后的临床信号
第二次接种后的第5周用106TCID502009A(H1N1)攻击经接种的雪貂。从接种后的第2天起，在经接种的雪貂中观察临床指标，包括呼吸困难、嗜睡、食欲减少和体重减轻。一般而言，在组2、3和4的雪貂中仅观察到轻微的临床指标，而在组1、5和6的雪貂中观察到更严重的症状。在PBS和IMM接种的对照组以及无佐剂的sHA+sNA疫苗组中体重减轻明显(图3)。有趣的是，用sHA+IMM免疫的动物表现出几乎类似的体重减轻，而在用含sNA4的两种制剂(sNA+IMM组和sHA+sNA+IMM组)接种后体重没有显著变化。几乎一致的是，尸检后确定的雪貂的肺重量显示这样的相应趋势：有佐剂的sNA4接种的动物具有最少疾病相关增加(由于肺实变)(图3)。
雪貂肺中总的病理和组织病理结果
用流感病毒2009A(H1N1)病毒接种后第4天，肉眼观察雪貂的肺并且称重，之后取得样品用于评估病毒复制和组织病理学变化。在经接种的雪貂肺中肉眼观察到暗红色和坚实的实变区域。评估受影响的肺组织的百分比，它们在组之间是不同的。在组1、5和6的雪貂中观察到肺中受影响的区域的平均百分比为约50％，而在组2、3和4的雪貂中实变的范围较不明显，显示受影响的肺区域少于25％(图3)。另外，与组1、5和6的雪貂相比，这些组中的相对肺重量更轻(图3)。
接种后的第4天，用PBS或仅佐剂(IMM)模拟接种或者用无佐剂的sHA3+sNA4接种的雪貂的肺中观察到的组织病理学变化的特征在于中度至严重的坏死性支气管间质性肺炎。这些雪貂肺的肺泡中存在多病灶的，许多中性粒细胞和巨噬细胞以及不同数目的红细胞、水肿流体和纤维蛋白存在于。另外，炎性浸润存在于肺泡隔、细支气管、支气管以及支气管和细支气管的壁中。在有佐剂的sNA4接种的动物(sNA+IMM组和sHA+sNA+IMM组)中观察到组织病理学变化显著减少，而用sHA+IMM免疫的雪貂部分免于发生症状(图4)。
针对上呼吸道和下呼吸道中病毒复制的保护
为了测量接种对呼吸道中病毒复制的影响，接种后第4天在肺、咽和鼻中确定病毒滴度。如图5所示，在对照雪貂(PBS组和IMM组)和用无佐剂的sHA3和sNA4混合物免疫的动物(sHA+sNA组)的肺中攻击病毒有效地复制，平均病毒滴度为约107至108TCID50/克组织。这些病毒载量在用佐剂中的sHA3蛋白质免疫的动物(sHA+IMM组)和佐剂中的sHA3和sNA4共免疫的动物(sHA+sNA+IMM组)中降低约5log10单位。在用有佐剂的sNA4抗原免疫的动物(sNA+IMM组)中平均病毒载量降低2至3log10单位。
在攻击后的第4天在对照动物(PBS组和IMM组；图5)中观察到鼻中的高病毒载量。尽管由于组内滴度变化大而在统计上不显著，但是与用有佐剂的sHA3或有佐剂的sNA4或者无佐剂的sHA3+sNA4组合免疫的动物相比，这些病毒载量表现出略微降低。在用有佐剂的sHA3和sNA4抗原组合免疫的动物中发现鼻病毒滴度减少最大。咽中的病毒滴度一般地较高，并且除了在用有佐剂的sHA3和sNA4组合免疫的动物中之外，受接种的影响不显著。这些雪貂的咽中不具有可检测的滴度。
通过sHA 3 和sNA 4 免疫诱导的交叉反应性抗体应答
为了研究由sHA3和sNA4抗原诱导的抗体是否与其他H1N1流感病毒交叉反应，我们用接种后的血清进行了另外的HI和NI测定。如期望地，针对同源病毒测量到最高的HI滴度，而用其他H1毒株观察到不同程度的交叉反应(图6A)。因此，对于A/猪/shope/1/56、A/意大利/1443/76、A/衣阿华/15/30、A/PR/8/34和IVR/148没有检测到交叉反应，而针对A/NL/25/80和A/新泽西/8/76尤其针对NL/386/86测量到显著的交叉反应(或多或少地与它们的抗原结构域的序列相似性一致)(参见表1)。
表1：不同H1N1菌株的HA内抗原区域的序列同源性
Figure BDA00002757127500201
＊序列不可获得    ；n.a.不适用
来自sHA3+IMM和sHA3+sNA4+IMM二者接种之动物的血清情况均是如此。与之前在针对同源病毒的HI活性中所观察到的区别一致(图2)，与sHA3+sNA4+IMM免疫之雪貂的血清的交叉反应性的水平明显高于sHA3+IMM免疫的动物，再次确认了sNA4抗原的增强作用。在用同源流感A/H1N1病毒感染之雪貂的对照血清中检测针对每种毒株的HI滴度(数据未给出)。
为了研究NA抗体的交叉反应性，我们生产了两种其他N1流感病毒(人H1N1株A/肯塔基/UR06-0258/2007和禽H5N1菌株A/火鸡/土耳其/1/2005)的sNA4糖蛋白复合物。当在我们的NI测定中进行测试时，针对禽H5N1病毒sNA4蛋白质，sNA4+IMM和sHA3+sNA4+IMM免疫动物的合并血清有强的神经氨酸酶抑制活性，同时对季节性H1N1病毒sNA4蛋白质观察到一些抑制(图68)。应注意，源自H5N1病毒感染的鸡的对照血清针对两种人H1N1病毒sNA4蛋白质均测试为阴性。
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Claims (15)

1.组合物，其包含至少一种ISCOM复合物以及来自一种或更多种流感病毒的至少一种血凝素结构域的至少一个胞外结构域和来自一种或更多种流感病毒的至少一种神经氨酸酶结构域的至少一个胞外结构域，其中所述胞外结构域表示与所述流感病毒分离的胞外结构域。
2.根据权利要求1的组合物，其中来自至少一种血凝素结构域的一个或更多个胞外结构域和来自至少一种神经氨酸酶结构域的一个或更多个胞外结构域以杂合蛋白的形式存在。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述杂合蛋白是重组的。
4.根据权利要求1至3中任一项的组合物，其中来自至少一种血凝素结构域的一个或更多个胞外结构域和来自至少一种神经氨酸酶结构域的一个或更多个胞外结构域为头部结构域。
5.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述流感病毒选自流感的血清亚型，例如选自HxNy，其中x为1至16并且y为1至9。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述流感病毒为H1N1病毒，例如选自1918H1N1流感病毒(A/南加利福尼亚/1/18)和/或2004H5N1(A/越南/1203/04)H1N1A/加利福尼亚/07/2009病毒和/或A/加利福尼亚/04/2009和/或A/加利福尼亚/09/2009，和/或A/肯塔基/UR06-0258/2007(H1N1)和/或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5N1)。
7.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述组合物包含来自至少一种血凝素结构域的1至5个胞外结构域和来自至少一种神经氨酸酶结构域的1至5个头部结构域。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述至少一种血凝素胞外结构域选自A/加利福尼亚/09/2009的三聚HA胞外结构域(氨基酸17-522)。
9.根据权利要求7的组合物，其中所述至少一种神经氨酸酶头部结构域选自A/加利福尼亚/09/2009病毒的四聚NA头部结构域(氨基酸75-469)。
10.根据权利要求1至9中任一项的组合物，其中所述ISCOM复合物为包含至少一种皂苷、至少一种脂质和至少一种抗原的ISCOM。
11.根据权利要求1至9中任一项的组合物，其中所述ISCOM复合物为包含至少一种皂苷和至少一种脂质的ISCOM基质。
12.根据权利要求1至11中任一项的组合物，其还包含添加剂、赋形剂、其他佐剂。
13.根据包含权利要求1至12中任一项的组合物，其用作免疫刺激药、免疫调节药物或疫苗，例如其针对脊椎动物如禽类和哺乳动物的流感。
14.根据权利要求13的组合物，其中所述哺乳动物为人，伴侣动物如猫、狗、马、禽类如鹦鹉，有经济价值的物种例如牲畜如牛科动物物种、猪、绵羊、山羊或雪貂、水貂。
15.包含至少两个室的药盒，其中一个室包含组合物，所述组合物包含至少一种ISCOM复合物以及来自一种或更多种流感病毒的至少一种血凝素结构域的至少一个胞外结构域和来自一种或更多种流感病毒的至少一种神经氨酸酶结构域的至少一个胞外结构域，并且另一个室包含使用说明书。
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