MXPA04008088A - Sistema de expresion del virus de parainfluenza recombinante y vacunas que comprenden antigenos heterologos derivados del metapneumovirus. - Google Patents

Sistema de expresion del virus de parainfluenza recombinante y vacunas que comprenden antigenos heterologos derivados del metapneumovirus.

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MXPA04008088A
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MXPA04008088A
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Gerarda Van Den Hoogen Bernadetta
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Abstract

La presente invencion se refiere al ANDc o ARN del virus de parainfluenza bovino (bPIV), que se puede usar para expresar los productos geneticos o de genes heterologos en sistemas de celulas hospederas apropiadas para rescatar los virus recombinantes del ARN de hebra negativa que expresan, empacan y/o presentan el producto del gen heterologo. En particular, los productos de genes heterologos incluyen productos de genes de otras especies de PIV o de otro virus de ARN de hebra negativa, que incluyen pero no se limitan al virus de influenza, virus sincitial respiratorio, metapneumovirus humano y pneumovirus aviar. Los virus quimericos y los productos de expresion se pueden usar ventajosamente en formulaciones de vacunas que incluyen vacunas contra un amplio rango de patogenos y antigenos.

Description

Eur pean p icm (,\T. Bli. BG. CH. CY. C/_ DI-, DK. IÍH. Cor o-lc f codcs and oiher úbbr riülions. ra r ¡o ;h "G ES. ?.1¾. GB. GR. HU. IE. IT. LU, MC. NI.. PT. SE. SI. ivia.' oics on Codcs and AbbrcviGiions" appcaring oí il¡ b »in- SK. TR). ???? paicni (HI-. BJ. Cl". CG. Cl. CM. GA. GN. /ling í üí'h issw: oj ih PCI Oazelic. GQ. G\V. MI.. MR. NE. SN. Tü. TG). Publistied: witlioui ¡nlcrnaiioniil scarc/i repon and 10 bc republishcd upon r cipi ofthat repon SISTEMAS DE EXPRESIÓN DEL VIRUS DE PARAINFLUENZA RECOMBINANTE Y VACUNAS QUE COMPRENDEN ANTIGENOS HETEROLOGOS DERIVADOS DEL METAPNEUMOVIRUS 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al ADNc o ARN del virus de parainfluenza (PIV) recombinante que puede ser usado para expresar los productos genéticos heterologos en sistemas de células hospederas apropiadas y/o para rescatar virus recombinantes del ARN de hebra negativa que expresan, empacan, y/o presentan el producto del gen heterólogo. En particular, la presente invención abarca preparaciones de vacunas que comprenden el PIV quimérico que expresa un producto del gen heterólogo, en donde el producto del gen heterólogo es preferiblemente un péptido o polipéptido antigénico. En una modalidad, el vector del PIV de la invención, expresa uno, dos o tres productos del gen heterólogo, que pueden ser codificados por el mismo o diferentes virus. En una modalidad preferida, la secuencia heteróloga codifica un producto del gen heterólogo que es un polipéptido antigénico de otras especies de PIV o de otros virus de ARN de hebra negativa, incluyendo, pero no limitados al virus de la influenza, el virus sincitial respiratorio (RSV) , el metapneumovirus de mamífero, y el pneumovirus aviar. Las preparaciones de vacunas de la invención abarcan vacunas multivalentes, incluyendo preparaciones de vacunas bivalentes y trivalentes. Las vacunas multivalentes de la invención pueden ser administradas en forma de un vector de PIV que expresa cada secuencia antigénica heteróloga o dos o más vectores de PIV que codifican cada uno diferentes secuencias antigénicas heterologas. Las preparaciones de vacunas de la invención pueden ser administradas aisladamente o en combinación con otras vacunas, agentes profilácticos o agentes terapéuticos. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La infección viral de parainfluenza resulta en la enfermedad seria del tracto respiratorio en infantes (Tao et al. , 1999, Vaccine 17:1100-08). Las infecciones virales de la parainfluenza infecciosa son responsables de aproximadamente el 20% de todas las hospitalizaciones de pacientes pediátricos que sufren de infecciones del tracto respiratorio a nivel mundial. Id. No está disponible una terapia antiviral efectiva para tratar las enfermedades relacionadas con el PIV, y no ha sido aprobada aún una vacuna para prevenir las infecciones por PIV. El PIV es un miembro del genero respirovirus (PIV1, PIV3) o rubulavirus (PIV2, PIV4 ) de la familia paramyxoviridae . El PIV consta de dos módulos estructurales: (1) un núcleo de ribonucleoproteina, o proteina núcleo capsular, que contiene el genoraa viral, y (2) una cubierta de lipoproteina más o menos esférica. Su genoma consiste de una sola hebra de ARN sentido negativo, que es de aproximadamente 15,456 nucleótidos de longitud y codifica al menos ocho polipéptidos . Estas proteínas incluyen la proteína núcleo capsular estructural (NP, NC, o N, dependiendo del género), la fosfoproteina (P), la proteína de matriz (M) , la glicoproteína de fusión (F), la glicoproteína hemaglutinina neuraminidasa (HN), la proteína polimerasa grande (L) , y las proteínas C y D de función desconocida. Id. La proteína núcleo capsular de la parainfluenza (NP, NC, o N) contiene dos dominios dentro de cada unidad proteica. Estos dominios incluyen, un dominio amino terminal, que comprende aproximadamente dos tercios de la molécula e interactúa con el ARN, y un dominio carboxi terminal, que descansa sobre la superficie de la proteína núcleo capsular ensamblada. Se piensa que existe una bisagra en la unión de estos dos dominios, impartiendo por ello alguna flexibilidad a esta proteína (ver Fields et al. (ed. ) , 1991, FUNDAMENTAL VIROLOGY, 2da ed, Raven Press, Nueva York, incorporado aquí como referencia en su totalidad) . La proteína de matriz (M) está involucrada aparentemente en el ensamble viral, e interactúa tanto con la membrana viral como con las proteínas núcleo capsulares. La fosfoproteina (P) esta sometida a fosforilación y ha sido implicada en la regulación de la transcripción, la metilación, la fosforilación y la poliadenilación . Producida inicialmente como un precursor inactivo, la glicoproteína de fusión (F) es escindida tras la traducción para producir dos polipéptidos enlazados por disulfuro. La proteína F activa actúa con la membrana viral donde facilita la penetración del virión de la parainfluenza en las células hospederas, promoviendo la fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática de las células hospederas. Id. La glicoproteína, hemaglutinina neuraminidasa-(NH) , sobresale de la envoltura e imparte actividades de hemaglutinina y neuraminidasa sobre el virus. La HN tiene una amino terminal fuertemente hidrofóbica que funciona para anclar la proteína NH en la bicapa de lípidos. Id. Finalmente, la proteína polimerasa grande (L) juega un papel importante tanto en la transcripción y la replicacion. Id. El virus de parainfluenza de bovino fue aislado primero en 1915 a partir de becerros que mostraban signos de fiebre de embarque. Se ha aislado a partir de ganado normal, fetos abortados, y ganado que exhibe signos de enfermedades respiratorias (Broker-Klassen et al., Can. J. Vet . Res. 60: 228-236. Ver también Shibuta, 1977, Microbiol. Immunol. 23 (7), 617-628). El PIV3 humano y de bovino comparten epítopes neutralizantes, pero muestran distintas propiedades antigénicas. Existen diferencias significativas entre las cepas virales humana y de bovino en la proteina HN . De hecho, una cepa de bovino induce los mismos anticuerpos neutralizantes para la infección hPIV mientras que una cepa humana parece inducir un amplio espectro de anticuerpos neutralizantes contra el PIV3 humano (Van Wyke Coelingh et al., 1990, J. Virol. 64:3833-3843). La replicación de todos los virus de ARN de cepa negativa, incluyendo el PIV, se complica por la ausencia de la maquinaria celular que se requiere para replicar el ARN. Adicionalmente, el genoma de hebra negativa debe ser transcrito en una copia de hebra positiva (ARNm) antes que pueda ocurrir la traducción. Consecuentemente, el ARN genómico sólo no puede sintetizar la ARN polimerasa dependiente de ADN tras entrar en las células. Las proteínas L, P y N deben entras a las células hospederas junto con el ARN genómico. Se hipotetiza que la mayoría o todas las proteínas virales que transcriben el ARNm de PIV también llevan a cabo la replicación del genoma. El mecanismo que regula los usos alternativos (es decir, la transcripción o replicación) del mismo complemento de las proteínas, no ha sido identificado claramente, pero el proceso parece involucrar la abundancia de formas libres de una o más de las proteínas núcleo capsulares. Directamente enseguida de la penetración del virus, se inicia la transcripción por la proteina L usando el ARN de sentido negativo en la cápsula nuclear como una plantilla. La síntesis del ARN viral es regulada de modo tal que produce ARNms monocistronicos durante la transcripción. Enseguida de la transcripción, la replicación del genoma del virus es el segundo evento esencial en la infección por lo virus de ARN de hebra negativa. Como con otros virus de ARN de hebra negativa, la replicación del genoma viral en el PIV está mediada por las proteínas específicas del virus. Los primeros productos de la síntesis de ARN replicativo son las copias complementarias (es decir, polaridad positiva) del ARN genómico de PIV (ARNc) . Estas copias de hebras positivas (anti-genomas ) difieren de los transcriptos de ARNm de hebras positivas en la estructura de su terminal. A diferencia de los trascriptos de ARNm, los ARNcs genómicos no están terminados o metilados en el 5' terminal, y no están truncados ni poliadenilados en el 3' terminal. Los ARNcs son coterminales con sus plantillas de hebra negativa y contienen toda la información genética en la forma complementaria. Los ARNcs sirven como plantillas para la síntesis de los genomas virales de hebra negativa de PIV (ARNvs) . Los genomas de hebra negativa de bPIV (ARNvs) y los antigenomas (ARNcs) son encapsidados por proteínas núcleo cápsidas; las únicas especies de ARN no ensapsidados son los ARNms virales. La replicación y la transcripción del ARN de bPIV ocurren en el citoplasma de las células hospederas. El ensamble de los componentes virales parece tomar lugar en la membrana plasmática de las células hospederas donde el virus maduro es liberado mediante reproducción asexual, cortando una parte pequeña del progenitor. 2.1. PARAMIXOVIRUS De manera clásica, como agentes devastadores de enfermedad, los paramixovirus son responsables de muchas muertes de animales y humanos alrededor del mundo cada año. La forma Paramyxoviridae forma una familia dentro del orden de los Mononegavirales (virus de ARN de hebra individual de sentido negativo) , que consiste de las subfamilias Paramyxovirinae y Paneumovirinae . La última subfamilia esta dividida en la actualidad en el género Pneumovirus y Metapneumovirus (Pringle, 1999, Arch. Virol 144/2, 2065-2070) . El virus sincitial respiratorio humano (hRSV) , una especie del género Pneumovirus, es la causa individual más importante de infecciones de tracto respiratorio inferior durante la infancia y la niñez temprana alrededor el mundo (Domachowske, y Rosenberg, 1999, Clin. Microbio. Reivindicación. 12(2): 298-309) . Otros miembros de género Pneumovirus incluyen los virus sincitiales respiratorios de bovino y ovino y el virus de neumonía de ratones (PVM) .
En las décadas pasadas, varios agentes etiológicos de la enfermedad de mamífero, en particular de afecciones del tracto respiratorio (RTI), en particular de humanos, han sido identificados (Evans, In: Viral Infections of Humans, Epidemiology and Control. 3ra ed. (ed. Evans, A.S) 22-28 (Plenum Publishing Corporation, Nueva York, 1989) ) . Los agentes etiológicos clásicos de RTI con los mamíferos son los virus sincitiales respiratorios que pertenecen al género Pneumovirus encontrados con los humanos (hRSV) y rumiantes tales como el ganado u ovejas (bRSV y/o oRSV) . En el RSV de humanos las diferencias en los análisis de neutralización cruzada reciproca, reactividad de las proteínas G en análisis i munológicos y las secuencias de nucleótidos del gen G se usan para definir dos subgrupos antigénicos de hRSV. Dentro de los subgrupos las secuencias de aminoácidos muestran 94% (subgrupo A) o 98% (subgrupo B) de identidad, mientras que solamente se encuentra 53% de identidad de la secuencia de aminoácidos entre los subgrupos. Se observa variabilidad adicional dentro de los subgrupos en base a análisis anticuerpos monoclonales, RT-PCR y análisis de protección de ARNasa. Los virus de ambos subgrupos tienen una distribución mundial y pueden aparecer durante una sola estación. La infección puede ocurrir en presencia de inmunidad preexistente y la variación antigénica no se requiere estrictamente para permitir la reinfección. Ver, por ejemplo, Sullender, 2000, Clinical Microbiology Reviews 13(1) : 1-15; Collins et al., Fields Virology, ed. B.N. Knipe, Howley, P.M. 1996, Philadelphia : Lippencott-Raven. 1313-1351; Johnson et al., 1987, (Proc Nati Acad Sci EEUU, 84(16) : 5625-9; Collins, en The Paramyxoviruses, D.W. Kingsbury, Editor. 1991, Plenum Press: Nueva York. 103-153. Otro Pneumovirus clásico es el virus de la neumonía de ratón (PVM) , en general encontrado solamente con ratones e laboratorio. Sin embargo, una proporción del padecimiento observado entre los mamíferos no puede ser atribuido aun a patógenos conocidos. 2.2. INFECCIONES POR RSV El virus sincitial respiratorio (RSV) es la causa principal de la enfermedad sería del tracto respiratorio inferior en niños (Feigen et al., Eds . , 1987, En: Texbook of Pedriatic Infectious Diseases, WB Saunders, Filadelfia, en las paginas 1653-1675; New Vaccine Development, Establishing Priorities, Vol. 1, 1985, Nacional Academy Press, Washington DC en las paginas 397-409; y Ruuskanen et al., 1993, Curr. Probl . Pediatr. 23:50-79). La naturaleza epidémica anual de la infección por RSV es evidente a nivel mundial, pero la incidencia y la severidad de la enfermedad RSV en una estación dada, varía con la región (Hall, 1993, Contemp. Pediatr. 10:92-110) . En las regiones templadas del hemisferio norte, comienza usualmente a fines del otoño y termina a fines de la primavera. La infección RSV primaria ocurre más frecuentemente en niños desde 6 semanas a 2 años de edad y extraordinariamente en las primeras 4 semanas de vida durante la epidemia nosocomial (Hall et al., 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396) . Los niños en riesgo creciente de infección de RSV incluyen, pero no se limitan a, infantes prematuros (Hall et al., 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396) y niños con displasia broncopulmonar (Groothuis et al., 1988, Pedriatics 82:199-203), enfermedad cardiaca congénita (MacDonald et al., New Engl. J. Med. 307:307-400), inmunodeficiencia congénita o adquirida (Ogra et al., 1988, Pediatr. Infect. Dis . J. 7:246-249, y Pohl et al., 1992, J. Infect. Dis 165:166-269), y fibrosis cistica (Abman et al., 1988, J. Pediatr. 113:826-830) . La tasa de fatalidad en infantes con enfermedades del corazón o los pulmones quienes son hospitalizados con infección de RSV es del 3%-4% (Navas et al., 1992, J. Pediatr. 121: 348-354) . El RSV infecta a los adultos asi como a los bebes y niños. En adultos saludables, el RSV causa predominantemente enfermedad del tracto respiratorio superior. Se ha vuelto evidente recientemente que algunos adultos, especialmente entrados en años, tienen infecciones de RSV sintomáticas más frecuentemente de lo que ha sido reportado previamente (Evans, A.S., eds., 1989, Viral Infections of Humans . Epidemiology and Control, 3ra ed., Plenum Medical Book, Nueva York en las paginas 525-544). Varias epidemias han sido reportadas también entre pacientes de residencias de ancianos y adultos jóvenes metidos en instituciones (Falsey, A.R., 1991, Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608; y Garvie et al., 1980, Br. Med. J. 281-1253-1254). Finalmente, el RSV puede causar enfermedades serias en personas inmunosuprimidas, particularmente los pacientes con transplantes de médula ósea (Hertz et al., 1989, Medicine 68:269-281). Las opciones de tratamiento para la enfermedad por RSV establecida son limitadas. La enfermedad por RSV severa del tracto respiratorio inferior requiere frecuentemente un cuidado de apoyo considerable, incluyendo la administración de oxigeno humidificado y asistencia respiratorio (Fields et al., eds, 1990, Fields Virology, 2da ed., Vol 1, Raven Press, Nueva York en las páginas 1045-1072). En tanto que una vacuna podría prevenir la infección por RSV, y/o la enfermedad relacionada con el RSV, no esta permitida aun ninguna vacuna para esta indicación. Un obstáculo principal para el desarrollo de vacunas es la seguridad. Una vacuna inactivada por formalina, aunque inmunogénica, causa inesperadamente una incidencia mayor y más severa de enfermedad del tracto respiratorio inferior debido a RSV en los infantes inmunizados que en los infantes inmunizados con una vacuna de parainfluenza trivalente preparada de manera similar (Kim et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:422-434; y Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-421). Varias vacunas de RSV candidatas han sido abandonadas y otras están bajo desarrollo (Murphy et al., 1994, Virus Res. 32:13-36), pero aun si se resuelven las cuestiones de seguridad, la eficacia de las vacunas debe ser mejorada también. Un número de problemas permanecen para ser resueltos. La inmunización debería ser requerida en el periodo neonatal inmediato donde ocurre la incidencia máxima de enfermedades del tracto respiratorio inferior a los 2-5 meses de edad. La inmadurez de la respuesta inmune neonatal junto con altos títulos del anticuerpo de RSV adquiridos maternalmente, puede ser esperado que reduzcan la inmunogenicidad de la vacuna en el periodo neonatal (Murphy et al., 1988, J. Virol. 62:3907-3910; y Murphy et al., 1991, Vaccine 9:185-189). Finalmente, la infección y la enfermedad por RSV primarias no protegen bien contra la enfermedad por RSV subsecuente (Henderson et al., 1979, New Engl. J. Med. 300: 530-534) . Actualmente, el único enfoque aprobado para la profilaxis de la enfermedad RSV es la inmunización pasiva. La evidencia inicial que sugiere un papel protector para IgG fue obtenida de las observaciones involucrando el anticuerpo materno en hurones (Prince, G.A., pH.D. diss., University of California, Los Angeles, 1975), y humanos (Lambrecht et al., 1976, J. Infect. Dis . 134:211-217; y Glezen et al., 1981, J. Pediatr. 98:708-715). Hemming et al., ( orell et al., eds . 1986, Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins, Academia Press, Londres en las paginas 285-294) reconocen la posible utilidad del anticuerpo de RSV en el tratamiento o prevención de la infección de RSV durante los estudios involucrando la farmacocinética de una globulina inmune intravenosa (IVIC) en recién nacidos en sospecha de tener sepsis neonatal. En este estudio, se notó que un infante, cuyas secreciones respiratorias daban RSV, se recuperó rápidamente después de la infusión de IVIC. El análisis subsecuente del lote de IVIC revelo un titulo inusualmente alto de anticuerpo neutralizante de RSV. Este mismo grupo de investigadores examinaron entonces la habilidad del suero hiperinmune o la globulina inmune, enriquecidos por el anticuerpo neutralizante de RSV, para proteger ratas del algodón y primates contra la infección de RSV (Prince et al., 1985, Virus Res. 3:193-206; Prince et al., 1990, J. Virol. 64:3091-3092; Hemming et al., 1985, J. Infect. Dis. 152:1083-1087; Prince et al., 1983, Infect. Immun. 42:81-87; y Prince et al., 1985, J. Virol. 55:517-520). Los resultados de estos estudios indican que el IVIG puede ser usado para prevenir la infección de RSV, además de tratar o prevenir los trastornos relacionados con el RSV. Los estudios clínicos recientes han demostrado la habilidad de esta globulina hiperinmune de RSV administrada pasivamente (RSV IVIC) para proteger niños en riesgo de infecciones respiratorias inferiores severas por RSV (Groothius et al., 1993, New Engl . J. Med. 329:1524-1530; y The PREVENT Study Group, 1997, Pedriatics 99:93-99). En tanto que este es un avance mayor para prevenir la infección de RSV, este tratamiento posee ciertas limitaciones en su uso extendido. Primero, el RSV IVIC debe ser infundido de manera intravenosa durante varias horas para lograr una dosis efectiva. Secundo, las concentraciones de material activo en las globulinas hiperinmunes son insuficientes para tratar adultos en riesgo de o la mayoría de los niños con función cardiopulmonar comprendida. Tercero, la infusión intravenosa necesita visitas hospitalarias mensuales durante la temporada de RSV. Finalmente, puede resultar difícil seleccionar donadores suficientes para producir una globulina hiperinmune para RSV para satisfacer la demanda de este producto. Actualmente, solamente aproximadamente el 8% de los donadores normales tienen títulos del anticuerpo neutralizante de RSV suficientemente altos para calificar para la producción de la globulina hiperinmune . Una manera para mejorar la actividad especifica de la inmunoglobulina seria desarrollar uno o más anticuerpos monoclonales neutralizantes de RSV (MAbs) altamente potentes. Tales MAbs serian humanos o humanizados para retener la farmacocinética favorable y para evitar la generación de una respuesta anticuerpo antiratón humana, ya que seria requerida la dosificación repetida durante la temporada de RSV. Dos glicoproteinas , F y G, sobre la superficie del RSV han sido mostradas para ser objetivos de los anticuerpos neutralizantes (Fields et al., 1990, supra; y Murphy et al., 1994, supra) . Un anticuerpo humanizado dirigido a un epitope en el sitio antigénico A de la proteina F del RSV, SYNAGIS®, está aprobado para la administración intramuscular a pacientes pediátricos para la prevención de enfermedades serias del tracto respiratorio causadas por RSV, a dosis mensuales recomendadas de 15 mg/kg de peso corporal durante la temporada de RSV (Noviembre a Abril en el hemisferio norte) . SYNAGIS© es un compuesto de secuencias de anticuerpos de humano (95%) y murino (5%) . Ver, Jonson et al., 1997, J. Infect. Diseases 176:1215-1224 y la Patente Norteamericana No. 5,824,307, los contenidos completos de los cuales se incorporan aquí como referencia. La secuencia de cadena pesada humana fue derivada de los dominios constantes de IgGI humano y las regiones variables de la estructura de los genes de VH de Cor (Press et al., 1970, Biochem. J. 117:641-660) y Cess (Takashi et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 81:194-198) . La secuencia de cadena ligera humana fue derivada del dominio constante de C y las regiones de las estructuras variables del gene K104 de VL con J-4 (Bentley et al., 1980, Nature 288:5194-5198) . Las secuencias de murino derivadas de un anticuerpo monoclonal de murino, ab 1129 (Beeler et al, 1989, J. Virology 63:2941-2950) , en un proceso el cual involucra el injerto de las regiones deterministicas complementarias de murino en las estructuras del anticuerpo humano. 2.3. PNEUMOVI US AVIAR Las enfermedades respiratorias causadas por un pneumovirus aviar (APV) fueron descritas primero en Sudáfrica al final de los años 1970 (Buys et al., 1980, Turkey 28:36-46) donde tuvieron un efecto devastador en la industria del pavo. La enfermedad de los pavos estuvo caracterizada por sinusitis y rinitis y fue llamada rinotraqueitis del pavo (TRT) . Los aislados Europeos de APV han sido también fuertemente implicados como factores en el síndrome de la cabeza hinchada (SHS) en pollos (O'Brien, 1985, Vet. Rec. 117:619-620) . Originalmente, la enfermedad apareció en bandadas de pollos de parrilla infectados con el virus de la enfermedad de Newcastle (NVD) y se asumió que era un problema secundario asociado con la enfermedad de Newcastle (ND) . El anticuerpo contra el APV Europeo fue detectado en pollos afectados después del ataque de SHS (Cook et al., 1988, Avian Pathol. 17:403-410), implicando por lo tanto al APV como la causa. El pneumovirus aviar (APV) también conocido como virus de rinotraqueitis del pavo (TRTV) , el agente etiológico de la rinotraqueitis aviar, una infección del tracto respiratorio superior de los pavos (Giraud et al., 1986, Vet . Res. 119:606-607), es el único miembro del género Metapneumovirus recientemente asignado, el cual, como se mencionó fue asociado hasta ahora con las infecciones, o lo que es más, con las enfermedades de mamíferos. Los subgrupos serológicos de APV pueden ser diferenciados en base a las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de la glicoproteína G y las pruebas de neutralización usando los anticuerpos monoclonales que también reconocen la glicoproteína G. Sin embargo, otras diferencias en las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser usadas para distinguir los subgrupos serológicos de APV. Dentro de los subgrupos A, B y D, la proteína G muestra 98.5 a 99.7% aa de identidad de la secuencias dentro de los subgrupos mientras entre los subgrupos solamente se observa 31.2-38% aa de identidad. Ver por ejemplo, Collins et al., 1993, Avian Pathology, 22:p. 469-479; Cook et al., 1993, Avian Pathology, 22:257-273; Bayon-Auboyer et al., J. Gen. Virol, 81 (Pt 11) : 2723-33; Seal, 1998, Virus Res, 58(1-2) : 45-52; Bayon-Auboyer et al., 1999, Arch Virol, 144(6) : 91-109; Juhasz, et al., 1994, J Gen Virol, 75(Pt ll) :2873-80. Otro serotípo de APV se proporciona en WO00/20600, incorporada aquí como referencia, la cual describe el aislado de Colorado de APV y lo compara con las cepas conocidas de APV o TRT con pruebas de neutralización de suero in vitro. Primero, el aislado de colorado fue probado contra el antisuero para reconocer aislados de TRT. El aislado de Colorado no fue neutralizado por el antisuero monoespecifico para ninguna de las cepas de TRT. Este fue neutralizado, sin embargo por el antisuero hiperinmune aumentado contra una cepa del subgrupo A. Este antisuero neutralizó el virus homologo a un titulo de 1:400 y el aislado de Colorado a un titulo de 1:80. Usando el método de arriba, el aislado de Colorado fue probado contra los anticuerpos monoclonales de TRT. En cada caso, el titulo de neutralización reciproca fue de <10. El antisuero monoespecifico elevado para el aislado de Colorado se probó contra las cepas de TRT de ambos subgrupos. Ninguna de las cepas de TRT probadas fue neutralizada por el antisuero para el aislado de Colorado. La cepa de Colorado de APV no protegió a los pollos SPF contra el desafío ya sea con una cepa del subgrupo A o un subgrupo B del virus TRT. Estos resultados sugieren que el aislado de Colorado puede ser el primer ejemplo de un serotipo adicional de pneumovirus avial (Ver, Bayon-Auboyer et al., 2000, J. Gen. Vir. 81:2723-2733) . El pneumovirus aviar es un virus de ARN no segmentado, de hebra individual que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxoviridae, género metapneumovirus (Cavanagh y Barreto, 1988, Virus Res. 11:241-256; Ling et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:1709-1715; Yu et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:1355-1363) . La familia Paramyxoviridae se divide en dos subfamilias; la Paramyxovirinae y Pneumovirinae. LA subfamilia Paramyxovirinae incluye, pero no se limita al género: Paramyxovirus , Rubulavirus, y Morbillivirus . Recientemente, la subfamilia Pneumovirinae fue dividida en dos géneros en base al orden genético, y la homología de la secuencia, es decir, pneumovirus y metapneumovirus (Naylor et al., 1998, J. Gen. Virol., 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159). El género pneumovirus incluye, pero no se limita al virus sincitial respiratorio humano (hRSV) , el virus sincitial respiratorio de bovino (bRSV) , el virus sincitial respiratorio de ovino, y el pneumovirus de ratón. El género metapneumovirus incluye, pero no se limita al pneumovirus avial Europeo (subgrupos A y B) , el cual se distingue del hRSV, las especies tipo para el género pneumovirus (Naylor et al., 1998, J. Gen. Virol., 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159) . El aislado de EU de APV representa un tercer subgrupo (Subgrupo C) dentro del género metapneumovirus por que ha sido encontrado que es antigenicamente y genéticamente diferente de los aislados Europeos (Seal, 1998, Virus Res. 58:45-52; Senne et al., 1998, En: Proc. 47ava WPDC, California, pp. 67-68) . La examinación por microscopía electrónica de APV teñido negativamente revela viriones pleomorficos , algunas veces esféricos, que varían desde 80 a 200 nm en diámetro con filamentos largos que varían desde 1000 a 2000 nm de longitud (Collins y Gough, 1988, J. Gen. Virol. 69:909-916) . La envoltura consta de una membrana salpicada con picos de 13 a 15 nm de longitud. La cápsula nuclear es helicoidal, con 14 nm de diámetro y tiene una separación de 7 nm. El diámetro de la cápsula nuclear es más pequeño que el del género Paramyxovirus y Morbillivirus, el cual tiene usualmente un diámetro de aproximadamente 18 nm. La infección del pneumovirus avial es una enfermedad emergente en EUA a pesar de su presencia en algún otro sitio en el mundo en las aves de corral por muchos años. En Mayo de 1996, una enfermedad respiratoria altamente contagiosa de los pavos apareció en Colorado, y un APV fue aislado subsecuentemente en el Nacional Veterinary Services Laboratory (NVSL) en Ames, Iowa (Senne et al., 1997, Proc. 134ava Ann.
Mtg. , AVMA, pp. 190) . Antes de esta fecha, los Estados Unidos y Canadá estaban considerados libres del pneumovirus avial (Pearson et al., 1993, En: Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases. Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control, pp. 78-83; Hecker y Myers, 1993, Vet. Re. 132:172). A comienzos de 1997, la presencia de APV fue detectada serologicamente en pavos en Minnesota. Para cuando fue hecho el primer diagnostico confirmado, las infecciones por APV se habían extendido ya a muchas granjas. La enfermedad está asociada con signos clínicos en el tracto respiratorio superior: ojos espumosos, descarga nasal e inflamación de los senos nasales. Se ve agravado por infecciones secundarias. La Mortalidad en aves infectadas puede ser tan alta como el 100%. La mortalidad pude variar desde el 1 al 90% y es la más alta en pavipollos de seis a doce semanas de edad. El pneumovirus aviar es transmitido por contacto. La descarga nasal, el movimiento de las aves afectadas, agua contaminada, equipo contaminado; camiones de alimentos contaminados y actividades de descarga pueden contribuir a la transmisión del virus. Se piensa que los pavos recuperados son portadores, ya que se muestra que el virus infecta el epitelio del oviducto de los pavos echados y ya que el APV ha sido detectado en pavipollos jóvenes, la transmisión al huevo se considera una posibilidad. Una porción'7^ significativa de las enfermedades respiratorias humanas es causada por los miembros de las subfamilias virales Paramyxovirinae y Pneumovirinae, que aun una necesidad por una vacuna efectiva para conferir protección contra una variedad de virus que resultan en infecciones respiratorias del tracto respiratorio. La Cita o discusión de una referencia de aquí no debería ser considerada como una admisión de que tal es la técnica previa a la presente invención. 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al ADNc y ARN del virus de parainfluenza recombinante que pueden ser modificados para expresar productos genéticos heterólogos o no nativos, en particular, para expresar polipéptidos y péptidos antigénicos. En una modalidad, la presente invención se refiere a los virus de parainfluenza de bovino o humanos recombinantes los cuales son modificados para expresar antígenos heterólogos o fragmentos inmunogénicos y/o antigénicos de antigenos heterólogos. En otra modalidad de la invención, los virus de parainfluenza de bovino y humano recombinantes son modificados para expresar secuencias que son no nativas para el genoma del PIV, incluyendo secuencias e nucleótidos de PIV mutados . En particular, la invención se refiere al virus de parainfluenza tipo 3 de bovino, cepa de Kansas, recombinante asi como a las moléculas de ADNc y ARN que codifican el mismo. La presente invención se refiere también al PIV recombinante que contiene modificaciones que resultan en virus quiméricos con fenotipos más adecuados para usarse en formulaciones de vacunas. La presente invención proporciona por primera vez un PIV quimérico formulado como una vacuna que es capas de conferir protección contra varias infecciones virales, en particular, virus que resultan en infecciones del tracto respiratorio. En una modalidad especifica, la presente invención proporciona una vacuna que es capaz de conferir protección contra la parainfluenza, influenza, o infecciones virales sincitiales respiratorias. La presente invención proporciona por primera vez una vacuna que es capaz de conferir protección contra la infección por metapneumovirus en un hospedero mamífero. De acuerdo con la presente invención, un virus recombinante es uno derivado de un virus de parainfluenza de bovino o un virus de parainfluenza de humano que está codificado por secuencias endógenas o genómicas o secuencias genómicas no nativas. De acuerdo con la invención, una secuencia no nativa es una que es diferente de la secuencia genómica nativa o endógena debido a una o más mutaciones, incluyendo, pero no limitadas a mutaciones de punto, rearreglos, inserciones, eliminaciones, etc. a la secuencia genómica que pueden o no resultar en un cambio fenotipico. De acuerdo con la presente invención, un virus quimérico de la invención es un bPIV o hPIV el cual comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas. De acuerdo con la invención, un virus quimérico puede ser codificado por una secuencia de nucleótidos en la cual las secuencias de nucleótidos heterólogas han sido agregadas al genoma o en la cual las secuencias de nucleótidos han sido reemplazadas con secuencias de nucleótidos heterólogas. La presente invención se refiere también a virus de parainfluenza recombinantes modificados y vectores virales que codifican combinaciones de secuencias heterólogas las cuales codifican los productos genéticos, incluyendo pero no limitados a, genes de cepas diferentes de PIV, virus de influenza, virus sincitial respiratorio, metapneumovirus (por ejemplo, metapneumovirus humano) , pneumovirus aviar, paperas, otros virus, patógenos, genes celulares, antigenos tumorales, o combinaciones de los mismos. Además, la invención se refiere a virus de parainfluenza modificados que contienen una secuencia de nucleótidos derivada de un metapneumovirus en combinación con una secuencia de nucleótidos derivada de un virus sincitial respiratorio. Y además en combinación con una secuencia de nucleótidos derivada de un virus de parainfluenza humana. La invención abarca también vectores y virus de parainfluenza recombinantes que son modificados para codificar los genes de diferentes especies y · cepas del virus de parainfluenza, incluyendo los genes F y HN del PIV3 humano. En una modalidad, el vector de PIV de la invención se modifica para expresar una o más secuencias heterólogas, en donde las secuencias heterólogas codifican los productos genéticos que son preferiblemente productos genéticos antigénicos. En una modalidad preferida, el vector PIV de la invención expresa una, dos o tres secuencias heterólogas que codifican polipéptidos y péptidos antigénicos. En algunas modalidades, las secuencias heterólogas se derivan del mismo virus o de diferentes virus. En una modalidad preferida, las secuencias heterólogas codifican productos genéticos que son polipéptidos antigénicos de otras especies de PIV, tales como un PIV humano, una cepa mutante de PIV, o de otros virus de ARN de hebra negativa, incluyendo pero no limitados al virus de parainfluenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , metapneumovirus de mamífero (por ejemplo, metapneumovirus humano (hMPV) , y pneumovirus aviar. En una modalidad, la secuencia heteróloga codifica un fragmento inmunogenico y/o antigénico de un producto genético heterólogo. En una modalidad preferida, el PIV recombinante es un PIV de bovino tipo 3, o un PIV tipo 3 de humano atenuado. En una modalidad, las secuencias que codifican la proteína de fusión (F), la glicoproteína hemaglutinina (HN) , u otros genes no esenciales del genoma del PIV se eliminan y se substituyen por secuencias antigénicas heterólogas. En aun otra modalidad, el genoma del PIV contiene mutaciones o modificaciones, además de las secuencias de nucleótidos heterólogas, que resultan en un virus quimérico que tiene un fenotipo que es más adecuado para usarse en formulaciones de vacunas, por ejemplo, un fenotipo atenuado o un fenotipo con antigenicidad aumentada. En una modalidad especifica, la secuencia de nucleótidos heteróloga a ser insertada en el genoma del PIV se deriva de las secuencias de nucleótidos que codifican una proteina F, una proteina G o una proteina HN . En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos a ser insertada codifica una proteina F quimérica, una proteina G quimérica o una proteina HN quimérica. En una modalidad especifica, la proteina F comprende un ectodominio de una proteina F de un metapneumovirus , un domino transmembrana de una proteina F de un virus de parainfluenza, y un dominio luminar de una proteina F de un virus de parainfluenza . En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos a ser insertada codifica una proteina F, en donde el dominio transmembrana de la proteina F es eliminado de modo que se expresa una proteina F soluble. En otra modalidad especifica, la invención proporciona un virus quimérico que comprende un genoma de PIV que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga derivada de un metapneumovirus . En una modalidad especifica, el virus PIV es un virus tipo 3 de parainfluenza de bovino, cepa de Kansas . En otra modalidad, el virus PIV es un virus de parainfluenza humana con un fenotipo atenuado. En aún otras modalidades, la invención proporciona un virus tipo 3 de parainfluenza de bovino/virus de parainfluenza humano modificado para contener los genes F y NH de parainfluenza humana en un esqueleto de parainfluenza de bovino. El virus quimérico puede comprender además una secuencia de nucleótidos heteróloga derivada de un metapneumovirus, y/o comprende además una secuencia de nucleótidos heteróloga derivada de un virus sincitial respiratorio . En ciertas modalidades, el virus de la invención comprende secuencias de nucleótidos heterólogas derivadas de al menos dos genes diferentes de un metapneumovirus. En una modalidad especifica, la secuencia heteróloga se deriva de un metapneumovirus, por ejemplo, el pneumovirus avial y el metapneumovirus humano. Más específicamente, la secuencia heteróloga se deriva de un pneumovirus avial, que incluye el pneumovirus tipo A, B, C o D, preferiblemente C. La presente invención proporciona también preparaciones de vacunas y composiciones inmunogénicas que comprenden el PIV quimérico que expresa una o más secuencias antigénicas heterólogas. En una modalidad especifica, la presente invención proporciona vacunas multivalentes , incluyendo vacunas bivalentes o trivalentes. Las vacunas multivalentes de la invención pueden ser administradas en forma de un vector de PIV que expresa cada secuencia antigénica heteróloga o dos o más vectores de PIV que codifica cada uno diferentes secuencias antigénicas heterólogas. En una modalidad, la preparación de vacuna de la invención comprende el PIV quimérico que expresa uno, dos o tres polipéptidos heterólogos, en donde los polipéptidos heterólogos pueden ser codificados por secuencias derivadas de una cepa del mismo virus, diferentes cepas del mismo virus, o diferentes virus. Preferiblemente, las secuencias antigénicas heterólogas se derivan de un virus de ARN de hebra negativa, incluyendo pero no limitados al virus de influenza, virus de parainfluenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , metapneumovirus de mamífero (por ejemplo, metapneumovirus de humano (HMPV) ) , y pneumovirus aviar (APV) . Las secuencias antigénicas heterólogas incluyen, pero no se limitan a las secuencias que codifican la proteína F o HN del virus de parainfluenza humana, la proteína F de RSV, la proteína HA del virus de influenza tipo A, B y C, y la proteína F del MPV humano y el pneumovirus avial. Más preferiblemente, las preparaciones de vacunas de la invención comprenden virus quiméricos atenuados que son viables e infecciosos. En una modalidad preferida, el PIV recombinante es un PIV de bovino tipo 3, o una cepa atenuada de PIV humano. En una modalidad, las preparaciones de vacunas comprenden el virus quimérico de la presente invención, en donde el F, HN u algunos otros genes no esenciales del genoma del PIV han sido substituidos o eliminados. En una modalidad preferida, las preparaciones de vacunas de la presente invención se. preparan modificando una cepa de PIV con un fenotipo atenuado en un anfitrión pretendido. En otra modalidad preferida, las preparaciones de vacunas de la presente invención se preparan modificando una cepa atenuada de PIV. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos heterologa se agrega al genoma completo del PIV. En ciertas modalidades, el genoma del PIV se modifica de modo que las secuencias heterólogas se insertan en las posiciones una, tres cuatro, cinco o seis, de modo que las secuencias heterólogas se expresan como el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto o sexto genes del genoma viral. En modalidades especificas, la secuencia heterologa se inserta en la posición una, dos o tres del genoma viral. En ciertas modalidades, la región intergénica entre el final de la secuencia codificante de un gene heterólogo insertado y el inicio de la secuencia codificante del gen corriente abajo, se altera a una longitud deseable, resultando en la expresión aumentada de la secuencia heteróloga o el crecimiento aumentado del virus quimérico. Alternativamente, se altera la región intergénica a una longitud deseable, con un potencial para alterar la expresión de la secuencia heteróloga o el crecimiento del virus recombinante o quimérico, por ejemplo, el fenotipo atenuado. En algunas modalidades, tanto la posición de la inserción y la longitud de la región intergénica que flanquean una secuencia de nucleótidos heteróloga se modifican para seleccionar un virus recombinante o quimérico con niveles deseables de expresión de la secuencia heteróloga y características de crecimiento viral deseables. En ciertas modalidades, la invención proporciona una formulación de vacuna que comprende el virus recombinante o quimérico de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En modalidades específicas, la formulación de vacuna de la invención se usa para modular la respuesta inmune de un sujeto, tal como un humano, un primate, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un perro, un gato, un roedor o un sujeto de especie avial. En una modalidad específica, la vacuna se usa para modular la respuesta inmune de un infante o niño humano. En otra modalidad, la presente invención se refiere a formulaciones de vacunas para usos veterinarios. Las preparaciones de vacunas de la invención pueden ser administradas solas o en combinación con otras vacunas u otros agentes profilácticos o terapéuticos. 3.1. CONVENCIONES Y ABREVIACIONES ADNc ADN complementario CPE efectos citopáticos L proteina larga M proteina de matriz (lineas dentro de la envoltura) F glicoproteina de fusión HN glicoproteina hemaglutinina neuraminidasa N, NP, o NC nucleoproteina (asociada con el ARN y requerida para la actividad de la polimerasa P fosfoproteina MOI multiplicidad de la infección NA neuraminidasa (glicoproteina de envoltura) PIV virus de parainfluenza bPIV virus de parainfluenza de bovino bPIV3 virus tipo 3 de parainfluenza de bovino hPIV virus de parainfluenza humana hPIV3 virus tipo 3 de parainfluenza humana bPIV/hPIV o bPIV recombinante con secuencias de hPIV PIV b/h PIV3 b/h o bPIV tipo 3 recombinante con secuencias de hPIV bPIV3/hPIV3 tipo 3 nt nucleótido RNP ribonucleoproteina RNPr RNP recombinante ARNv ARN genómico viral ARNc ARN antigenómico viral MPVh metapneumovirus humano APV pneumovirus avial posición cuando se usa la posición con respecto a cualquier virus modificado, se refiere a la posición del genoma viral a ser transcrito. Por ejemplo, si un gen se localiza en la posición 1, es el primer gen de genoma viral a ser transcrito, si un gen se localiza en la posición dos, es el segundo gen del genoma viral a ser transcrito. posición posición del nucleótido 104 del genoma, o 1 de alternativamente, la posición del primer gen del bPIV3,b/h genoma viral a ser transcrito PIV3 y derivados de los mismos posición posición del nucleótido 1774 del genoma, o 2 de alternativamente, la posición entre el primero y bPIV3, el segundo marcos de lectura abiertos del virus PIV3 b/h y de parainfluenza nativo, o alternativamente, la derivados posición del segundo gen del genoma viral a ser de los transcrito mismos Posición posición del nucleótido 3724 del genoma, o 3 de alternativamente, la posición entre el segundo y bPIV3, el tercer marco de lectura del virus de PIV3 b/h y parainfluenza nativo, o alternativamente, la derivados posición del gen del genoma viral a ser de los transcrito mismos posición posición del nucleótido 5042 del genoma, o 4 de alternativamente, la posición entre el tercero y bPIV3, el cuarto marcos de lectura del virus de PIV3 b/h y parainfluenza nativo, o alternativamente, la derivados posición del cuarto gen del genoma viral a ser de los transcrito mismos posición posición del nucleótido 6790 del genoma, o 5 de alternativamente la posición entre el cuarto y bPIV3, el quinto marcos de lectura abiertos del virus PIV3 b/h y de parainfluenza nativo, o alternativamente, la derivados posición del quinto gen del genoma viral a ser de los transcrito mismos posición posición del nucleótido 8361 del genoma, o 6 de alternativamente, la posición entre el quinto y bPIV3, el sexto marcos de lectura abiertos del virus de PIV3 b/h y parainfluenza nativo, o alternativamente, la derivados posición del sexto gen del genoma viral a ser de los transcrito mismos 4. DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Alineaciones en forma de pares de la secuencia de aminoácidos para la proteina F del metapneumovirus humano con diferentes proteínas F de diferentes pneumovirus aviares. Los aminoácidos idénticos entre las dos secuencias se indican por el símbolo de una letra para el aminoácido. Los intercambios de aminoácidos conservados entre las dos secuencias de aminoácidos se indican por un signo " +", y un espacio indica un intercambio de aminoácidos no conservado. A) Alineación de la proteina F metapneumoviral humana con la proteina F de un pneumovirus avial aislado del Pato de Salvaje (85.6% de identidad en el ectodominio) . B) Alineación de la proteina F metapeneumoviral humana con la proteina F de un pneumovirus avial aislado del Pavo (subgrupo B; 75% de identidad en el ectodominio) . Figura 2. Fueron amplificados los fragmentos de PCR de nt 5255 a nt 6255 derivados de tres diferentes aislados del virus quimérico PIV3 b/h. los fragmentos de ADN de 1 kb resultantes, fueron digeridos con enzimas especificas para el gen F del PIV3 humano. Estas enzimas no cortan en el fragmento correspondiente al PIV3 de bovino. El gel de azarosa al 1% mostró el fragmentos no digerido (sendas o carriles 2,5, y 6) y los fragmentos digeridos Sacl o Bglll (sendas 4, 6 y sendas 9, 10, y 11, respectivamente) . La muestra en la senda 10 está sin digerir, sin embargo, tras una repetición de la digestión con Bglll esta muestra fue cortada (no se muestran los datos) . Las sendas 1 y 8 muestran un marcador de tamaño de ADN. Figura 3. Fueron amplificados los fragmentos de PCR desde nt 9075 al nt 10469 de tres diferentes aislados del virus quimérico PIV3 b/h. Los fragmentos de ADN de 1.4 kb resultantes fueron digeridos con enzimas especificas para el gen L del PIV 3 de bovino. Estas enzimas no cortan en el fragmento correspondiente del PIV3 humano. El gel de azarosa al 1% muestra el fragmento de 1.4kb no digerido (sendas 2, 5 y 8) . Los fragmentos de ADN pequeños producidos por la digestión con BamHl y PvuII se muestran en las sendas 3, 4, 6, 7, 9 y 10) . La senda 1 muestra un marcador de tamaño de ADN. Figura 4. Se demuestran seis constructos, incluyendo el vector bPIV3/hPIV3 y el ADNc F o G de RSV victoreados por el PIV3 b/h. El gen F y el gen HN de PIV3 se eliminan y se reemplazan con el gen F y HN de PIV3 humano respectivamente. Los genes F o G de RSV se clonan ya sea en la posición 1 o la posición 2. Los genes All RSV se enlazan a la ' región intergenica N-P de bPIV3 con la excepción de F1*(N-N) de RSV, lo cual es seguido por las secuencias detención del gen N/inicio del gen N de bPIV3 más cortas. Figura 5. El gen F o G de RSV con el vector despliega un efecto posicional. (A) es un análisis por transferencia Western de los lisados celulares infectados por el virus quimérico. Se detectó la proteina F usando anticuerpos monoclonales (MAbs) contra la proteina F de RSV, y la proteina G se detectó usando los anticuerpos monoclonales (PAbs) contra la proteina G de RSV. Una banda de 50 kDa que representa el fragmento Fi se detectó en las células infectadas con los virus quiméricos asi como el RSV del tipo salvaje. Había una gran acumulación de un fragmento F de 20 kDa en los lisados de células infectadas de los virus quiméricos comparados con el RSV del tipo salvaje. El experimento se hizo en MOI de 0.1, excepto que en la senda 1, las infecciones con F1*N-N de RSV con el vector PIV3 se repitieron a un MOI mayor de 1.0. Tanto la forma inmadura y glicosilada de la proteina G de RSV que migraron en aproximadamente 50 kDa y 90 kDa fueron detectadas. (B) es un análisis de transferencia Northern, el cual mostró que la transcripción del ARNm se correlaciona con el resultado de la expresión de proteínas demostrado en la figura 5A. Cantidades iguales de ARN total fueron separadas en geles de azarosa al 1% que contenían 1% de formaldehído y se transfirieron a membranas de nylon. Las transferencias fueron hibridizadas con ribosondas etiquetadas con digoxigenina (DIG) -UTP sintetizadas por la transcripción in vitro usando un equipo de etiquetado de ARN DIG. (C) son las curvas de crecimiento de los virus quiméricos que comprenden la proteína f o G de RSV con vectores de PIV3 en células Vero. Las células Vero fueron cultivadas a 90% de confluencia e infectadas a un MOI de 0.01. Las monocapas infectadas fueron incubadas a 37 °C. Los títulos" del virus para cosecha de punto de tiempo fueron determinados mediante análisis TCID5o, los cuales se llevaron a cabo inspeccionando visualmente el CPE enseguida de la incubación a 37 °C por 6 días. Figura 6. Constructos de proteína de fluorescencia verde (eGFP) vectoreados por PIV3 b/h. El gen de eGPF se introduce en el vector de PIV3 b/h secuencialmente entre todos los genes de PIV3 (solamente las posiciones 1, 2, 3, y 4, se muestran aquí) . El gen de eGFP fue enlazado a la región intergénica N-P de bPIV3. El constructo GFP 1 b/h hospeda el cartucho o cásete del gen de eGFP en la posición más próxima a 3' del genoma de PIV3 b/h. El constructo GFP 2 b/h contiene el cartucho del gen eGFP entre los genes N y P. El constructo de GFP3 b/h contiene el cartucho del gen de eGFP entre el gen P y M, y el constructo GFP4 contiene el gen eGFP entre M y F de PIV3 b/h. Figura 7. Efecto posicional de las inserciones de proteina de fluorescencia verde (eGFP) mejorada en el genoma de PIV3 b/h. (A) muestra la cantidad de células verdes producidas tras infectar las células Vero con el eGFP 1, 2, y 3 con el vector PIV3 b/h a MOI 0.01 por 20 horas. Las células verdes fueron visualizadas usando un microscopio fluorescente. (B) Es un análisis de transferencia Western de lisados de células infectadas. Las transferencias se investigaron con MAb de GFP así como PAb de PIV3. El anticuerpo de PIV3 se uso también para mostrar que las transferencias tenían la misma carga de volumen. (C) son las curvas de crecimiento de los constructos de GFP victoreados por PIV3 b/h (en la posición 1, 2 y 3) en células Vero.
Figura 8. Constructos del gen F de RSV victoreado por PIV3 b/h con diferentes regiones intergénicas . Los tres constructos RSV F1*N-N, RSV F2 N-P, y RSV Fl N-P son los mismos que el RSV F*(N-N), RSV F2 , y RSV Fl en la figura 4 respectivamente. La distancia entre la secuencia inicial del gel N y el codón de inicio de traducción del gen N en RSV F1*N-N es solamente de 10 nucleótidos (nts) de largo. En contraste, esta distancia es de 86 nts de largo en el constructo RSV F2. RSV F1*N-N también utiliza la secuencia inicial del gen N en lugar de la secuencia inicial del gen P como se hace en el constructo RSV F2. Figura 9. La longitud y/o la naturaleza de la región intergenica corriente abajo del gen de RSV insertado, tiene un efecto sobre la replicación del virus. (A) Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteina F de RSV en virus quiméricos. Las transferencias se sondearon con anticuerpos monoclonales contra la proteina F de RSV. Los niveles de proteina Fl expresados por el constructo RSV Fl y medidos a 24 y 48 horas después de la infección, fueron cercanos a los niveles observados para el constructo RSV F2, pero mucho mayores que aquellos del constructo RSV F1*N-N. (B) son las curvas de crecimiento multiciclos que comparan la cinética de replicación del virus de los constructos RSV Fl, RSV F1*N-N y RSV F2 en células Vero a un MOI de 0.1. Los títulos del virus para cada cosecha del punto de tiempo se determinaron mediante análisis en placas, los cuales se llevaron a cabo por inmunoteñido con el antisuero policlonal de RSV para la cuantificación después de 5 días de la incubación . Figura 10. Se muestran aquí los constructos o construcciones de RSV F y hMPV F tratados con vectores PIV3 b/h trivalente. Dos genomas virales, que comprende cada uno un vector de PIV3 b/h quimérico y una primera secuencia heteróloga derivada de un gen F de metapneuraovirus y una segunda secuencia heteróloga derivada del gen F de virus sincitial respiratorio. El virus con cualquiera de los constructos ha sido amplificado en células Vero. El virus modificado por ingeniería genética como se describe puede ser usado como una vacuna trivalente contra la infección por el virus de parainfluenza, la infección por metapneumovirus y la infección por el virus sincitial respiratorio. Figura 11. Un constructo que alberga dos genes F de RSV. Este constructo puede ser usado para determinar la cinética de crecimiento del virus, para la producción de la proteína F de RSV, y la replicación e inmunogenicidad en hámsteres. Figura 12. Los constructos o construcciones F de hMPV tratados con el vector PIV3 b/h quimérico. El gen F del metapneumovirus humano (hMPV) se insertó en la posición 1 o la posición 2 del genoma de PIV3 b/h. El cartucho o cásete del gen F de hMPV albergó la región intergénica N-P de bPIV3. Figura 13. Análisis de inmunoprecipitación y replicación del gen F de hMPV tratado con el vector PIV3 b/h (en la posición 2). (A) muestra la inmunoprecipitación de la proteína F de hMPV usando antisuero anti-hMPV de cobayo o humano. Una banda específica migrando en aproximadamente 80 kDa se observó en los lisados de F2 de hMPV tratado con el vector PIV3. El tamaño corresponde a la proteína precursora de F, Fo. Se observaron también bandas no específicas de diferentes tamaños en las sendas de control PIV3 y falsa. (B) muestra las curvas de crecimiento que fueron llevadas a cabo para determinar la cinética de la replicación del virus de F2 de PIV3 b/h/hMPV y compararla con aquella observada para F2 de PIV3 b/h y PIV3 b/h/RSV en células Vero a un MOI de 0.1. (C) son las curvas de crecimiento que se llevaron a cabo para determinar la cinética de la replicación del virus de Fl de PIV3 b/h /hMPV y comparada con aquella observada de F2 de PIV3 b/h /hMPV y PIV3 b/h en células Vero a un MOI de 0.01. Figura 14. Un constructo o construcción del gen F de RSV soluble tratado con el vector PIV3 b/h quimérico. Este constructo comprende una sola copia del gen F de RSV soluble, una versión del gen F de RSV que carece de los dominios transmembrana y citosólico. La ventaja de este constructo seria la inhabilidad del F de RSV soluble para ser incorporado en el genoma del virión. Figura 15. Los PIV3 b/h /hMPV Fl y PIV3 b/h /hMPV F2 inmunoteñidos . (A) el virus PIV3 b/h /hMPV Fl se diluyó y se usó para infectar células Vero subconfluentes . Las células infectadas fueron sobrecubiertas con medio optiMEM que contenia gentamicina e incubadas a 35°C por 5 días. Las células fueron fijadas e inmunoteñidas con suero anti-hMPV de cobayos. La expresión de hMPV F se visualiza por el desarrollo del color especifico en presencia de sistema del substrato AEC. (B) los virus PIV3 b/h /hMPV F2 fueron diluidos y usados para infectar células Vero. Las células infectadas fueron sobrecubiertas con metil celulosa al 1% en medio EMEM/L-15 (JRH Biosciences: Lenexa, KS) . Las células fueron incubadas, fijadas y después inmunoteñidas con suero de cobayos anti-hMPV. El suero de cobayos anti-hMPV es especifico para la proteina hMPV 001. Figura 16, Fraccionamiento del virión de genes de RSV tratados con el vector PIV3 en gradientes de sucrosa. Estos experimentos en serie investigan si las proteínas de RSV fueron incorporadas en el virión de PIV3 b/h. (A) muestra el gradiente de control de la F de RSV libre (generada en el baculovirus y truncada en la C terminal) . La mayoría de la F de RSV libre estaba presente en las fracciones 3, 4, 5, y 6.
(B) muestra que la concentración más grande de viriones de RSV se observa en las fracciones 10, 11 y 12. las fracciones de RSV fueron sondeadas con antisuero policlonal de RSV así como RSV F MAb. Las fracciones que contenían las cantidades más grandes de viriones de RSV mostraron también la señal más fuerte para RSV F, lo que sugiere que la proteína F de RSV co-migró y está asociada con los viriones de RSV. La última figura en (B) muestra también que las fracciones 10, 11 y 12, desplegaron el título más alto del virus mediante el análisis de placas. (C) los viriones de PIV3 b/h pueden ser más pleomorficos y por lo tanto la distribución de las fracciones máximas que contenían los viriones de PIV3 b/h fue más amplia. (D) Las fracciones de gradiente de sucrosa de PIV3 b/h /RSV F2 fueron analizadas tanto con antisuero policlonal de PIV y RSV F MAb. Las fracciones que contenían la mayoría de los viriones fueron las fracciones 11, 12, 13 y 14, como se mostró por Western usando el antisuero de PIV3. Correspondientemente, existieron también fracciones que desplegaron las cantidades más altas de proteína F de RSV. Algo de F de RSV libre estuvo presente también en las fracciones 5 y 6. Las fracciones 11, 12, 13 y 14 desplegaron los títulos máximos de virus. (E) Las fracciones que contienen la mayoría de los viriones de PIV3 b/h /RSV G2 (9, 10, 11, y 12) también mostraron la señal más fuerte para la proteína G de RSV. Otra vez, estas fueron las fracciones con los títulos de virus más altos. 5. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a constructos o construcciones de ADNc ARN de parainfluenza recombinante , incluyendo pero no limitados a, constructos de ADNc y ARN de PIV bovino y humano recombinante, que pueden ser usados para expresar las secuencias heterólogas o no nativas. De acuerdo con la presente invención, un virus recombinantes es uno derivado de un virus de parainfluenza de bovino o un virus de parainfluenza de humano que es codificado por las secuencias genómicas nativas o las secuencias genómicas no nativas. De acuerdo con la invención una secuencia no nativa es una que es diferente de la secuencia genómica nativa o endógena debido a una o más mutaciones, incluyendo, pero no limitadas a, mutaciones de punto, rearreglos, inserciones, eliminaciones, etc., a la secuencia genómica, que pueden o no resultar en un cambio fenotípico. De acuerdo con la presente invención, un virus quimérico de la invención es un bPIV o hPIV recombinante el cual comprende además una o más secuencias de nucleótidos heterólogas. De acuerdo con la invención, un virus quimérico puede ser codificado por una secuencia de nucleótidos en la cual las secuencias de nucleótidos heterólogas han sido agregadas al genoma o en la cual han sido reemplazadas las secuencias de nucleótidos con secuencias de nucleótidos heterologas. Estos virus recombinantes y quiméricos y los productos de expresión pueden ser usados como vacunas adecuadas para la administración a humanos o animales. Por ejemplo, los virus quiméricos de la invención pueden ser usados en formulaciones de vacunas para conferir protección contra la infección del pneumovirus, virus sincitial respiratorio, virus de parainfluenza o virus de influenza. En una modalidad, la invención se refiere a construcciones o constructos de ADNc y ARN de PIV que se derivan de variantes de PIV de humano o bovino y son modificados por ingeniería genética para expresar una, dos o tres secuencias heterologas, preferiblemente los genes heterólogos que codifican antigenos extraños y otros productos de una variedad de patógenos, genes celulares, antígenos tumorales, y virus. En particular, las secuencias heterologas se derivan de morbillivirus o un virus de ARN de hebra negativa, incluyendo pero no limitados al virus de la influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , metapneumovirus de mamífero (por ejemplo, las variantes Al, A2, Bl, y B2 del metapneumovirus humano) y los subgrupos A, B, C y D del pneumovirus avial. Los MPVs de mamífero pueden ser una variante Al, A2, Bl o B2 del MPV de mamífero. Sin embargo, los MPVs de mamífero de la presente invención pueden abarcar las variantes adicionales de MPV aun a ser identificadas, y no se limitan a las variantes Al, A2, Bl o B2. En otra modalidad de la invención, las secuencias heterólogas con secuencias de PIV no nativas, incluyendo secuencias de PIV mutadas . En algunas modalidades, las secuencias heterólogas se derivan del mismo o de diferentes virus. En una modalidad específica, el virus de la invención es un PIV recombinante que comprende secuencias de nucleótidos heterólogas derivadas del metapneumovirus o el pneumovirus aviar. Las secuencias heterólogas a ser insertadas en el genoma del PIV incluyen, pero no se limitan a, las secuencias que codifican los genes F, G y HN de las variantes Al, A2 , Bl o B2 del metapneumovirus humano, las secuencias que codifican los genes F, G y HN del pneumovirus aviar tipo A, B, C y D y/o los fragmentos antigénicos de los mismos. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga se agrega al genoma viral. En las modalidades alternativas, la secuencia de nucleótidos heteróloga se intercambia por una secuencia de nucleótidos endógena. La secuencia de nucleótidos endógena puede ser agregada insertada en varias posiciones del genoma de PIV, por ejemplo, en la posición 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos heteróloga se agrega o inserta en la posición 1. En otra modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos heteróloga se agrega o inserta en la posición 2. En aún otra modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos heteróloga se agrega o inserta en la posición 3. insertar o agregar las secuencias de nucleótidos heterólogas en las posiciones con numeraciones inferiores del virus, resulta generalmente en expresiones más fuertes de la secuencia de nucleótidos heteróloga en comparación a la inserción en posiciones con numeraciones más altas. Esto se debe al gradiente de trascripción que ocurre a través del genoma del virus. Sin embargo, la eficiencia de replicación del virus debe ser considerada también. Por ejemplo, en el virus quimérico PIV3 b/h de la invención, la inserción del gen heterólogo en la posición 1 retarda la cinética de replicación in vitro y en un menor grado también in vivo (ver la sección 8, ejemplo 3 y Figura 5 asi como la Sección 26, ejemplo. 21) . Por lo tanto, insertar las secuencias de nucleótidos heterólogas en las posiciones con numeraciones inferiores es la modalidad preferida de la invención si se desea una expresión fuerte de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Preferiblemente, una secuencia heteróloga se inserta en la posición 2 del genoma de PIV3 b/h si se desea la expresión fuerte de la secuencia heteróloga (Ver la sección 5.1.2 infra y la sección 8, ejemplo 3) .
En algunas otras modalidades, el genoma de PIV recombinante o quimérico se modifica de modo tal que la región intergénica entre el final de la secuencia codificante del gen heterólogo y el inicio de la secuencia codificante del gen corriente abajo está alterada. En aún alguna otra modalidad, el virus de la invención comprende un genoma de PIV recombinante o quimérico modificado de modo tal que la secuencia de nucleótidos heterologa se inserta en una posición seleccionada del grupo que consiste de las posiciones 1, 2, 3, 4, 5 y 5, y la región intergénica entre la secuencia de nucleótidos heterologa y el siguiente gen corriente abajo está alterada. Los análisis apropiados pueden ser usados para determinar el mejor modo de inserción (es decir, cual posición insertar y la longitud de la región intergénica) para lograr los niveles apropiados de expresión genética y las características de crecimiento viral. Para los detalles, ver la Sección 5.1.2., inf a. En ciertas modalidades, el virus quimérico de la invención contiene dos diferentes secuencias de nucleótidos heterólogas. Diferentes secuencias de nucleótidos heterologas pueden ser insertadas en varias posiciones del genoma del PIV. En una modalidad preferida, una secuencia de nucleótidos heterologa se inserta en la posición 1 y otra secuencia de nucleótidos heterologa se agrega o inserta en la posición 2 o 3. En otras modalidades de la invención, secuencias de nucleótidos heterologas adicionales se insertan en posiciones con numeraciones más altas del genoma del PIV. De acuerdo con la presente invención, la posición de la secuencia heterologa se refiere al orden en el cual se transcriben las secuencias desde el genoma viral, por ejemplo, una secuencia heterologa en la posición 1 es la primera secuencia genética a ser transcrita desde el genoma. En ciertas modalidades de la invención, la secuencia de nucleótidos heterologa a ser insertada en el genoma del virus de la invención se deriva de un virus de ARN de hebra negativa, incluyendo pero no limitados a, virus de la influenza, virus de parainfluenza, virus sincitial respiratorio, metapneumovirus de mamífero, y pneumovirus aviar. En una modalidad específica de la invención, la secuencia de nucleótidos heterologa se deriva de un metapneumovirus humano. En otra modalidad específica, la secuencia de nucleótidos heterologa se deriva de un pneumovirus aviar. Más específicamente, la secuencia de nucleótidos heterologa de la invención codifica el gen F, G o SH o una porción del mismo de un metapneumovirus humano o aviar. En modalidades específicas, una secuencia de nucleótidos heterologa puede ser cualquiera de la SEC ID NO:l, a la SEC ID NO: 5, la SEC ID NO: 14 y la SEC ID NO: 15 (ver la Tabla 16) . En ciertas modalidades especificas, la secuencia de nucleótidos codifica una proteina de cualquiera de la SEC ID NO: 6 a la SEC ID NO: 13, la SEC ID NO: 16 y la SEC ID NO: 17 (ver la Tabla 16) . En ciertas modalidades especificas, la secuencia de nucleótidos codifica una proteina de cualquiera de la SEC ID NO: 314 a la 389. En modalidades específicas de la invención, una secuencia de nucleótidos heteróloga de la invención se deriva de un pneumovirus avial tipo A. En otras modalidades específicas de la invención, una secuencia de nucleótidos heteróloga de la invención se deriva de un pneumovirus aviar tipo B. En aun otras modalidades específicas de la invención, una secuencia de nucleótidos heteróloga de la invención se deriva de un pneumovirus aviar tipo C. Los análisis filogenét icos muestran que el tipo A y el tipo B están relacionados más cercanamente uno al otro que ellos al tipo C (Seal, 2000, Animal Health Res. Rev. 1(1) : 67-72). El tipo A y el tipo B se encuentran en Europa mientras que el tipo C fue encontrado primero en EU. En otra modalidad de la invención, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un polipéptido quimérico, en donde el ectodominio contiene las secuencias antigénicas derivadas de un virus diferente del PIV del cual se deriva el esqueleto del vector, y los dominios transmembrana y luminar se derivan de las secuencias de PIV. El virus quimérico resultante impartiría la antigenicidad del virus de ARN de hebra negativa de elección y tendría un fenotipo atenuado. En una modalidad específica de la invención, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una proteína F quimérica. Particularmente, el ectodominio de la proteína F quimérica es el ectodominio de un metapneumovirus , de modo que el metapneumovirus o el pneumovirus aviar, y el dominio transmembrana así como el dominio luminar son los dominios transmembrana y luminar de un virus de parainfluenza , tal como un virus de parainfluenza humano o bovino. En tanto que no están ligados por ninguna teoría, la inserción de una proteína F quimérica puede atenuar además el virus en un hospedero pretendido pero retiene la antigenicidad de la proteína F atribuida por su ectodominio. Los virus quiméricos de la invención pueden ser usados en formulaciones de vacunas para conferir protección contra varias infecciones, incluyendo pero no limitadas a infección por pneumovirus, infección por el virus sincitial respiratorio, infección por el virus de parainfluenza, infección por virus de influenza, o una combinación de las mismas. La presente invención proporciona preparaciones de vacunas que comprenden el PIV quimérico que expresa una o más secuencias antigénicas heterólogas, incluyendo vacunas bivalentes y trivalentes. Las vacunas bivalentes y trivalentes de la invención pueden ser administradas en forma del vector de PIV que expresa cada secuencia antigénica heteróloga o dos o más vectores de PIV3 que codifica cada uno diferentes secuencias antigénicas heterólogas. Preferiblemente, las secuencias antigénicas heterólogas se derivan de un virus de ARN de hebra negativa, incluyendo pero no limitadas a, virus de influenza, virus de parainfluenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , metapneumovirus de mamífero (por ejemplo metapneumovirus humano) y pneumovirus aviar. Por lo tanto, los viriones quiméricos de la presente invención pueden ser modificados para crear, por ejemplo, la vacuna de influenza anti-humana, la vacuna de parainfluenza anti-humana, la vacuna de RSV anti-humana, y la vacuna de metapneumovirus antihumana. Preferiblemente, las preparaciones de vacunas de la invención comprenden virus quiméricos atenuados que son viables e infecciosos. Las preparaciones de vacunas de la invención pueden ser administradas solas o en combinación con otras vacunas u otros agentes profilácticos o terapéuticos. La presente invención también se relaciona con el uso de vectores virales y virus quiméricos para formular vacunas contra un amplio rango de virus y/o antigenos incluyendo antigenos tumorales. Los vectores virales y los virus quiméricos de la presente invención pueden ser usados para modular el sistema inmune de un sujeto, estimulando una respuesta inmune humoral, una respuesta inmune celular o estimulando la tolerancia a un antigeno. Como se usa aquí, sujeto se refiere a un humano, un primate, un caballo, una vaca, una oveja, un cerdo, una cabra, un perro, un gato, un roedor y un número de especies avíales. Cuando se administran antígenos tumorales, la invención puede ser usada para tratar sujetos que tienen enfermedades tratables por rechazo de la respuesta inmune, tales como tumores no sólidos o tumores sólidos de tamaño pequeño. Se contempla también que la administración de antígenos tumorales mediante los vectores virales y los virus quiméricos descritos aquí será útil para el tratamiento subsecuente para remoción de tumores sólidos grandes . La invención puede ser usada también para tratar sujetos quienes son sospechosos de tener cáncer. La invención puede ser dividida en las siguientes etapas solamente para propósitos de descripción y no a manera de limitación: (a) construcción de plantillas de ADNc ARN recombinantes , (b) expresión de productos genéticos heterólogos usando las platillas de ADNc y ARN recombinantes ; y (C) recate de los genes heterólogos en partículas virales recombinantes . 5.1. CONSTRUCCIÓN DEL ADNc Y ARN RECOMBINANTE La presente invención abarca virus quiméricos recombinantes codificados por vectores virales derivados de los genomas del virus de parainfluenza, incluyendo tanto el virus de parainfluenza de bovino u el virus de parainfluenza de mamífero. De acuerdo con la presente invención, un virus recombinante es uno derivado de un virus de parainfluenza de bovino o un virus de parainfluenza de mamífero que es codificado por las secuencias genómicas nativas o las secuencias genómicas no nativas. De acuerdo con la invención, una secuencia no nativa es una que es diferente de la secuencia genómica nativa o genómica debido a una o más mutaciones, incluyendo pero no limitadas a, mutaciones de punto, rearreglos, inserciones, eliminaciones, etc., a la secuencia genómica que pueden o no resultar en un cambio fenotípico. Los virus recombinantes de la invención abarcan aquellos virus codificados por vectores virales derivados de los genomas del virus de parainfluenza, incluyendo tanto el virus de parainfluenza de bovino y mamífero, y pueden o no incluir los ácidos nucleicos que son no nativos para el genoma viral. De acuerdo con la presente invención, un vector viral el cual se deriva del genoma de un virus de parainfluenza es uno que contiene una secuencia de ácidos nucleico que codifica al menos parte de un ORF de un virus de parainfluenza . La presente invención también abarca virus recombinantes que comprenden un vector viral derivado de un genoma de PIV de bovino y/o mamífero el cual contiene secuencias las cuales resultan en un virus que tiene un fenotipo más adecuado para usarse en formulaciones de vacunas, por ejemplo, fenotipo atenuado o antigenicidad mejorada. Las mutaciones y modificaciones pueden ser en las regiones codificantes, en regiones intergenicas y en las secuencias líderes y las secuencias traseras del virus. De acuerdo con la presente invención, los vectores virales de la invención se derivan del genoma de un virus e parainfluenza de mamífero, en particular un virus de parainfluenza humana (hPIV) . En modalidades particulares de la invención, el vector viral se deriva del genoma de un virus de parainfluenza humano tipo 3. De acuerdo con la presente invención, estos vectores virales pueden o no incluir ácidos nucleicos que son no nativos para el genoma viral. De acuerdo con la presente invención, los vectores virales de la invención se derivan del genoma de un virus de parainfluenza bovino (bPIV) . En modalidades particulares de la invención, el vector viral se deriva del genoma del virus de parainfluenza de bovino tipo 3. De acuerdo con la presente invención, estos vectores virales pueden o no incluir ácidos nucleicos que son no nativos para el genoma viral. De acuerdo con la invención, un virus quimérico es un bPIV o hPIV recombinante el cual comprende además una secuencia de nucleótidos heteróloga. De acuerdo con la invención, un virus quimérico puede ser codificado por una secuencia de nucleótidos en la cual la secuencia de nucleótidos heteróloga ha sido agregada al genoma o en la cual la secuencia de nucleótidos endógena o nativa ha sido reemplazada con la secuencia de nucleótidos heteróloga. De acuerdo con la invención, los virus quiméricos son codificados por los vectores virales de la invención los cuales comprenden una secuencia de nucleótidos heteróloga. De acuerdo con la presente invención, un virus quimérico es codificado por un vector viral que puede o no incluir ácidos nucleicos que son no nativos para el genoma viral. De acuerdo con la invención, un virus quimérico es codificado por un vector viral al cual han sido agregadas secuencias de nucleótidos heterólogas, insertadas o substituidas por secuencias nativas o no nativas. Un virus quimérico puede ser de uso particular para la generación de vacunas recombinantes que protegen contra dos o más virus (Tao et al., J. Virol. 72, 2955-2961; Durban et al., 2000 J. Virol. 74, 6821-6831; Skaidopoulos et al., 1998, J. Virol. 72, 1762-1768 (1998); Teng et al., 2000, J. Virol. 74, 9317-9321) . Por ejemplo, puede visualizarse que un vector viral de hPIV o bPIV que expresa una o más proteínas de otro virus de ARN de hebra negativa, por ejemplo, MPV, o un vector de RSV que expresa una o más proteínas de MPV protegerán a los individuos vacunados con tal vector contra ambas infecciones virales. Un enfoque similar puede ser visualizado para otros paramyxovirus . Los virus atenuados o con replicación defectuosa pueden ser de utilidad para propósitos de vacunación con vacunas vivas como ha sido sugerido para otros virus (Ver, PCT WO 02/057302, en pp. 6 y 23, incorporada aquí como referencia) . De acuerdo con la presente invención, el heterólogo a ser incorporado en los vectores virales que codifican los virus recombinantes o quiméricos de la invención incluyen las secuencias obtenidas o derivadas de cepas diferentes de metapneumovirus, cepas de pneumovirus avial, y otros virus de ARN de hebra negativa, incluyendo pero no limitados a RSV, PIV virus de parainfluenza y otros virus, incluyendo el morbillivirus . En ciertas modalidades de la invención, los virus quiméricos o recombinantes de la invención son codificados por vectores virales derivados de genomas virales en donde una o más secuencias, regiones intergénicas, secuencias terminales, o porciones de ORF completas han sido substituidas con una secuencia heteróloga o no nativa. En ciertas modalidades de la invención, los virus quiméricos de la invención son codificados por vectores virales derivados de genomas virales en donde una o más secuencias heterólogas han sido agregadas al vector.
Una modalidad especifica de la presente invención es un virus quimérico que comprende un esqueleto codificado por secuencias de nucleótidos derivados de un genoma del virus de parainfluenza . En una modalidad preferida, le genoma de PIV se deriva de PIV de bovino, tal como la cepa de Kansas de bPIV3, o de PIV humano. En una modalidad preferida, el genoma de PIV se deriva de la cepa de Kansas de bPIV3, en el cual las secuencias de nucleótidos del virus de parainfluenza de bovino han sido substituidas con secuencias heterologas o en el cual las secuencias heterologas han sido agregadas al genoma de bPIV completo. Una modalidad especifica adicional de la presente invención es un virus quimérico que comprende un esqueleto codificado por secuencias de nucleótidos derivadas de un genoma del virus de parainfluenza humana tipo 3, en el cual las secuencias de nucleótidos del virus de parainfluenza humano han sido substituidas con secuencias heterologas o en el cual las secuencias heterologas han sido agregadas al genoma de hPIV completo. Una modalidad especifica adicional de la presente invención es un virus quimérico que comprende un esqueleto codificado por secuencias de nucleótidos derivadas del genoma del virus de parainfluenza de bovino, tal como la cepa de Kansas de bPIV3, en la cual (a) el gen F y e gen HN del virus de parainfluenza de bovino han sido substituidos con el gen F y el gen HN del virus de parainfluenza humano (bPIV/hPIV) , y en el cual (B) las secuencias heterologas han sido agregadas al genoma de bPIV completo. La presente invención abarca también virus quiméricos que comprenden un esqueleto codificado por secuencias de nucleótidos derivadas del genoma de bPIV, de hPIV, o de bPIV/hPIV que contiene mutaciones o modificaciones, además de las secuencias heterologas, que resultan en un virus quimérico que tiene un fenotipo más adecuado para usarse en formulaciones de vacunas, por ejemplo, fenotipo atenuado o antigenicidad mejorada. De acuerdo con esta modalidad particular de la invención, una secuencia heteróloga en el contexto del esqueleto de PIV3 de bovino puede ser cualquier secuencia heteróloga para bPIV3. Otra modalidad especifica de la presente invención es un virus quimérico que comprende un esqueleto codificado por secuencias de nucleótidos derivadas de PIV humano 1, 2, o 3 en el cual las secuencias de nucleótidos de hPIV han sido substituidas con secuencias heterologas o en el cual las secuencias heterologas han sido agregadas al genoma de hPIV completo, siempre que el virus quimérico resultante no sea un hPIV3 quimérico en el cual la hemaglutinina-neuraminidasa y la glicoproteína de fusión han sido reemplazadas por aquellas del hPIVl. La presente invención abarca también virus quiméricos, que comprenden un esqueleto codificado por secuencias de nucleótidos derivadas de un genoma de hPIV, que contiene mutaciones o modificaciones, además de las secuencias heterólogas, que resultan en un virus quimérico que tiene un fenotipo más adecuado para usarse en formulaciones de vacunas, por ejemplo, fenotipo atenuado o antigenicidad mejorada. Las secuencias codificantes del gen heterólogo flanqueadas por el complemento del sitio de enlazamiento/promotor de la polimerasa, por ejemplo, la terminal viral 3'-PIV de la presente invención, o los complementos de ambas terminales virales 3' - y 5' -PIV pueden ser construidos usando las técnicas conocidas en la técnica. Las plantillas de ARN resultantes pueden ser de polaridad negativa y pueden contener secuencias terminales apropiadas que permiten al aparato de síntesis de ARN viral reconocer la plantilla. Alternativamente, las plantillas de ARN de polaridad positiva, que contienen las secuencias terminales apropiadas las cuales permiten al aparato de síntesis de ARN viral reconocer la plantilla, pueden ser usadas. Las moléculas de ADN recombinante que contienen estas secuencias híbridas pueden ser clonadas y transcritas por una ARN polimerasa dirigida al ADN, tal como la T7 polimerasa de bacteriófago, T3 polimerasa, la SP6 polimerasa o una polimerasa eucariótica tal como una polimerasa I y las similares, para la producción in vitro o in vivo de plantillas de ARN recombinante que poseen las secuencias virales apropiadas y que permiten el reconocimiento y la actividad de la polimerasa viral. En una modalidad, el vector PIV de la invención expresa una, dos o tres secuencias heterologas, que codifican polipéptidos y péptidos antigénicos. En algunas modalidades, las secuencias heterologas se derivan del mismo virus o de diferentes virus. En ciertas modalidades, más de una copia de las mismas secuencias de nucleótidos heterologas se inserta en el genoma de un virus de parainfluenza de bovino, virus de parainfluenza humano, o vector quimérico de bPIV/hPIV. En una modalidad preferida, dos copias de las mismas secuencias de nucleótidos heterologas se insertan al genoma del virus de la invención. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga se deriva de un metapneumovirus, tal como el metapneumovirus humano o un pneumovirus aviar. En modalidades especificas, la secuencia de nucleótidos heteróloga derivada de un metapneumovirus es un gen F del metapneumovirus. En otras modalidades especificas, la secuencia de nucleótidos heteróloga derivada de un metapneumovirus es un gen G del metapneumovirus. En algunas otras modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga se deriva de un virus sincitial respiratorio. En modalidades especificas, la secuencia de nucleótidos heteróloga derivada del virus sincitial respiratorio es un gen F del virus sincitial respiratorio. En otras modalidades especificas, la secuencia de nucleótidos heteróloga derivada del virus sincitial respiratorio es un gen G del virus sincitial respiratorio. Cuando una o más secuencias de nucleótidos heterologas se insertan, la posición de la inserción y la longitud de la región intergenica de cada copia insertada pueden ser manipuladas y determinadas mediante diferentes análisis de acuerdo a la sección 5.1.2. infra. En ciertas modalidades, el rescate del virus quimérico o los productos de expresión puede ser logrado mediante genética invertida en sistemas de células hospederas donde las células hospederas son transíectadas con constructos de ADNc o ARN. Las plantillas de ARN de la presente invención son preparadas mediante la transcripción de secuencias de ADN apropiadas con ARN polimerasa dirigida por ADN. Las plantillas de ARN de la presente invención pueden ser preparadas ya sea in vitro o in vivo por la transcripción de secuencia de ADN apropiadas usando ARN polimerasa dirigida por ADN tal como la T7 polimerasa de bacteriófago, T3 polimerasa, SP6 polimerasa, o una polimerasa eucariótica tal como la polimerasa I. En ciertas modalidad, las plantillas de ARN de la presente invención pueden ser preparadas ya sea in vivo por la transcripción de secuencias de ADN apropiadas usando un sistema de expresión a base de plásmidos, como se describe en Hoffmann et al., 2000, Proc . Nati. Acad . Sci . EUA 97:6108-6113 o el sistema de transcripción ARN polimerasa I-polimerasa II unidireccional, como se describe en Hoffmann y Webster, 2000, J. Gen. Virol. 81:2843-1847. Las plantillas de ARN de polaridad negativa contendrían las secuencias terminales apropiadas que deberían permitir al aparato de síntesis de ARN viral, reconocer la plantilla. Alternativamente, pueden ser usadas también las plantillas de ARN de polaridad positiva que contienen las secuencias terminales apropiadas y permiten al aparato se síntesis de ARN viral, reconocer la plantilla. La expresión de las plantillas de ARN de polaridad positiva puede ser lograda por la transfección de plásmidos que tienen promotores que son reconocidos por la ARN polimerasa dependiente de ADN. Por ejemplo, el ADN de plásmido, que codifica las plantillas de ARN positivas bajo el control del promotor de T7, puede ser usado en combinación con el virus de vacuna o el sistema T7 de difteria aviar (fowlpox) . Los ARNms bicistrónicos pueden ser construidos para permitir la iniciación interna de la traducción de las secuencias virales y para permitir la expresión de secuencias que codifican proteínas extrañas del sitio de iniciales de terminal regular, o viceversa. Alternativamente, una proteína extraña puede ser expresada a partir de una unidad transcripcional interna en la cual la unidad transcripcional tiene un sitio de iniciación y un sitio de poliadenilación . En otra modalidad, el gen extraño se inserta en un gen de PIV de manera tal que la proteina expresada resultante es una proteina de fusión. En ciertas modalidades, la invención se refiere a vacunas trivalentes que comprenden un virus de la invención. En modalidades especificas, el virus usado para una vacuna trivalente es un virus de parainfluenza de bovino tipo 3/parainfluenza de humano tipo 3, quimérico, que contiene una primera secuencia de nucleótidos heterologa derivada de un metapneumovirus, tal como el metapneumovirus humano o el pneumovirus avial, y una segunda secuencia de nucleótidos heterologa derivada del virus sincitial respiratorio. En una modalidad complementaria, tal vacuna trivalente seria especifica para (a) los productos genéticos del gen F y el gen HN del virus de parainfluenza humana; (b) la proteina codificada por la secuencia de nucleótidos heterologa derivada de un metapneumovirus; (c) la proteina codificada por la secuencia de nucleótidos heterologa derivada de un virus sincitial respiratorio. En una modalidad especifica, la primera secuencia de nucleótidos heterologa es el gen F del virus sincitial respiratorio y se inserta en la posición 1, y la segunda secuencia de nucleótidos heterologa es el gen F del metapneumovirus humano y se inserta en la posición 3. Muchas otras combinaciones están abarcadas por la presente invención y algunas se muestran a manera de ejemplo en la Tabla 1 . Para otras combinaciones los genes F o G de un pneumovirus aviar podrían ser usadas. Además, las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas F quiméricas podrían ser usadas (ver supra) . En algunas modalidades menos preferidas, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser insertada en una posición con numeración más alta del genoma viral. Tabla 1 . Arreglos ejemplares de las secuencias de nucleótidos heterólogas en los virus usados para las vacunas trivalentes Combinación Posición 1 Posición 2 Posición 3 1 gen F de hMPV gen F de RSV - 2 gen F de RSV gen F de hMPV - 3 - gen F de hMPV gen F de RSV 4 - gen F de RSV gen F de hMPV 5 gen F de hMPV - gen F de RSV 6 gen F de RSV - gen F de hMPV 7 gen G de hMPV gen G de RSV - 8 gen G de RSV gen G de hMPV - 9 - gen G de hMPV gen G de RSV 10 - gen G de RSV gen G de hMPV 11 gen G de hMPV - gen G de RSV 12 gen G de RSV - gen G de hMPV 13 gen F de hMPV gen G de RSV - 14 gen G de RSV gen F de hMPV - 15 - gen F de hMPV gen G de RSV 16 - gen G de RSV gen F de hMPV 17 gen F de hMPV - gen G de RSV 18 gen G de RSV - gen F de hMPV 19 gen G de hMPV gen F de RSV - 20 gen F de RSV gen G de hMPV - 21 - gen G de hMPV gen F de RSV 22 - gen F de RSV gen G de hMPV 23 gen G de hMPV - gen F de RSV gen F de RSV - gen G de hMPV En algunas otras modalidades, la región intergénica entre una secuencia heteróloga y el inicio de la secuencia codificante del gen corriente abajo pueden ser alterados. Por ejemplo, cada gen listado en la Tabla 1 puede tener una longitud deseable de la región intergénica. En una modalidad ejemplar, una vacuna trivalente comprende un vector PIV3 b/h con un gen F de virus sincitial respiratorio insertado en la posición 1, una región intergénica alterada de 177 nucleótidos (originalmente de 75 nucleótidos para el codón AUG de inicio del gen N corriente abajo) , y un gen de metapneumovirus humano insertado en la posición 3 con su región intergénica natural. Muchas más combinaciones son abarcadas por la presente invención, ya que cada inserción de una secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser manipulada de acuerdo a la sección 5.1.2., infra. En una modalidad más amplia, los productos de expresión y los viriones quiméricos de la presente invención pueden ser modificados para crear vacunas contra un amplio rango de patógenos, incluyendo antigenos virales, antigenos tumorales y auto antigenos involucrados en los trastornos autoinmunes. Una manera para lograr este objetivo involucra modificar los genes de PIV existentes para contener secuencias extrañas en sus respectivos dominios externos. En los casos en que las secuencias heterólogas son epitopes o antigenos de patógenos, estos virus quiméricos pueden ser usados para inducir una respuesta inmune protectora contra el agente de la enfermedad del cual se derivan estos determinantes. Un enfoque para construir estas moléculas híbridas es insertar la secuencia de nucleótidos heteróloga en un complemento de ADN de un genoma de PIV, por ejemplo, un hPIV, un bPIV, o un bPIV/hPIV, de modo que la secuencia heteróloga está flanqueada por las secuencias vírales requeridas para la actividad de la polimerasa viral, es decir, el sitio de enlace/promotor de polimerasa, conocido aquí como el sitio de enlace de polimerasa, y un sitio de poliadenilación . En una modalidad preferida, la secuencia heteróloga codificante está flanqueada por las secuencias virales que comprenden los promotores de replicación de las terminales 5' y 3' , las secuencias de inicio del gen y final del gen, y las señales de empacado que se encuentran en las terminales 5' y/o 3' . En un enfoque alternativo, los oligonucleótidos que codifican el sitio de enlace de polimerasa viral, por ejemplo, el complementó de la terminal 3' o ambas terminales del segmento genómico viral pueden ser ligados a la secuencia codificante heteróloga para construir la molécula híbrida. La colocación de un gen extraño o segmento de un gen extraño dentro de la secuencia objetivo estaba dictada primero por la presencia de los sitios de la enzima de restricción apropiados dentro de la secuencia objetivo. Sin embrago, los avances recientes en la biología molecular han reducido este problema en gran medida. Los sitios de la enzima de restricción pueden ser colocados fácilmente en cualquier sitio dentro de la secuencia objetivo a través del uso de mutagénesis dirigida al sitio (ver, por ejemplo, las técnicas descritas por Kunkel, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 82:488). Las variaciones en la tecnología de reacción de la cadena de polimerasa (PCR). , descrita infra, permiten también la inserción específica de secuencias (es decir, los sitios de la enzima de restricción) y permiten también la construcción fácil de moléculas híbridas. Alternativamente, las reacciones PCR podrían ser usadas para preparar moléculas de ADN de hebra doble que contienen el promotor de ARN polimerasa dirigido al ADN (por ejemplo, el bacteriófago T3, T7 o SP6) y la secuencia híbrida que contiene el gen heterólogo y el sitio de enlace de polimerasa. Las plantillas de ARN podrían ser transcritas después directamente de este ADN recombinante . En aun otra modalidad, las plantillas de ARN recombinante pueden ser preparadas ligando los ARN que especifican la polaridad negativa del gen heterólogo y el sitio de enlace de polimerasa, usando una ARN ligasa . Además, uno o más nucleótidos pueden ser agregados al extremo 3' del gen HN en la región no traducida, para adherirla a la "Regla de Seis" la cual pueden ser importante en le recate viral exitoso. La "Regla de Seis" se aplica a mucho paramyxovirus y requiere que el número de nucleótidos de un genoma de ARN sea un factor de seis para ser funcional. La adición de nucleótidos puede lograrse mediante las técnicas conocidas en la técnica tales como usando los equipos de mutagénesis comerciales como el equipo de mutagénesis QuickChange (Stratagene) . Después de la adición del número apropiado de nucleótidos, el fragmento de ADN correcto, por ejemplo, un fragmento de ADN del gen F y HN de hPIV3, puede ser aislado entonces por digestión con la enzima de restricción apropiada y purificación en gel . Los requerimientos de la secuencia para la actividad de la polimerasa viral y los constructos que pueden ser usados de acuerdo con la invención se describen en las subsecciones de aba o . Sin estar comprometidos por la teoría, varios parámetros afectan la velocidad de replicación del virus recombinantes y el nivel de expresión de la secuencia heteróloga. En particular, la posición de la secuencia heteróloga en bPIV, hPIV, PIV b/h y la longitud de la región intergenica que flanquea la secuencia heteróloga determinan la velocidad de replicación y el nivel de expresión de la secuencia heteróloga . En ciertas modalidades, la secuencia líder y/o trasera del virus son codificadas con relación al virus de tipo salvaje. En ciertas modalidades más específicas, las longitudes de la secuencia líder y/o trasera están alteradas. En otras modalidades, la (las) secuencia (s) líder y/o trasera están mutadas con relación al virus de tipo salvaje. La producción de un virus recombinante de la invención depende de la replicación de una copia parcial o de longitud completa del genoma de ARN viral (ARNv) de sentido negativo o una copia complementaria del mismo (ARNc) . Este ARNv o ARNc puede ser aislado a partir del virus infeccioso, producido por la transcripción in vitro, o las células producidas por la transfección de ácidos nucleicos. Segundo, la producción de virus de hebra negativa recombinantes depende de un complejo de polimerasa funcional. Típicamente, el complejo de polimerasa de los pneumovirus consiste de las proteínas N, P, L y posiblemente M2, pero no se limita necesariamente a las mismas . Los complejos de polimerasa o los componentes de los mismos pueden ser aislados de partículas virales, aisladas de células que expresan uno o más de los componentes, o producidos por la transfección de vectores de expresión específicos .
Las copias infecciosas de MPV pueden ser obtenidas cuando los ARNc, ARNc mencionados arriba o los vectores que expresan estos ARNs son replicados por el complejo de polimerasa 16 (Schnell et al., 1994, EMBO J 13:4195-4203; Collins et al., 1995, PNAS 92 11563-11567; Hoffmann et al., 2000 PNAS 97: 6108-6113; Bridgen et al., 1996, PNAS 93: 15400-15404; Palese et al., 1996, PNAS 93:11354-11358; Peeters et al., 1999, J. Virol. 73:5001-5009; Durban et al., 1997, Virology 235:323-332) . La invención proporciona células hospederas que comprenden un ácido nucleico o un vector de acuerdo a la invención. Los vectores de plásmido o virales que contienen los componentes de polimerasa de PIV (presumiblemente N, P, L y M2 , pero no necesariamente limitados a los mismos) se generan en células procarióticas para la expresión de los componentes en tipos de células relevantes (bacterias, células de insectos, células eucarióticas ) . Los vectores de plásmidos o virales que contienen las copias de longitud completa o parciales del genoma de PIV serán generados en células procarióticas para la expresión de ácidos nucleicos virales in vitro o in vivo. Los últimos vectores pueden contener otras secuencias virales para la generación de virus quiméricos o proteínas de virus quiméricos, pueden carecer de partes del genoma viral para la generación o replicación de virus defectuosos, y pueden contener mutaciones, eliminaciones o inserciones para la generación de virus atenuados. Las copias infecciosas de PIV (que son del tipo salvaje, atenuados, con replicación defectuosa o quiméricos) pueden ser producidas por la coexpresión de los componentes de polimerasa de acuerdo a las tecnologías de vanguardia descritas arriba. Además, pueden ser usadas células eucarióticas , que expresan de manera transitoria o de manera estable una o más proteínas de PIV de longitud completa o parcial. Tales células pueden ser fabricadas por transfección (vectores de proteínas o ácidos nucleicos), infección (vectores virales) o transducción (vectores virales y pueden ser útiles para la complementación de los virus del tipo salvaje, atenuados, con replicación defectuosa o quiméricos mencionados. ...SECUENCIAS GENÉTICAS HETEROLOGAS A SER INSERTADAS La presente invención abarca la modificación de virus de parainfluenza de bovino o humano recombinantes para expresar una o más secuencias heterólogas, en donde las secuencias heterólogas codifican los productos genéticos o fragmentos de productos genéticos que son preferiblemente antigénicos y/o inmunogénicos . Como se usa aquí, el término "antigénico" se refiere a la habilidad de una molécula para enlazar un anticuerpo a moléculas MHC. El término "inmunogénico" se refiere a la habilidad de una molécula para generar la respuesta inmune en un anfitrión. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos heteróloga a ser insertada se deriva de un virus de ARN de hebra negativa, incluyendo pero no limitados al virus de influenza, virus de parainfluenza , virus sincitial respiratorio, metapneumovirus de mamífero (por ejemplo, metapneumovirus humano) y pneumovirus aviar. En una modalidad preferida, la secuencia heteróloga a ser insertada incluye, pero no se limita a, una secuencia que codifica un gen F o HN de PIV humano, un gen F de reivindicación, un gen HA del virus de influenza tipo A, B o C, un gen F de MPV humano, un gen F de pneumovirus aviar, o un fragmento inmunogenico y/o antigénico de los mismos. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga a ser insertada se deriva de un metapneumovirus humano y/o un pneumovirus aviar. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga a ser insertada se deriva de (a) un metapneumovirus humano y un virus sincitial respiratorio; y/o (b) un pneumovirus aviar y un virus sincitial respiratorio. En ciertas modalidades preferidas de la invención, la secuencia de nucleótidos heteróloga a ser insertada se deriva de un gen F de un metapneumovirus humano y/o un pneumovirus aviar. En ciertas modalidades, el gen F se deriva de (a) un metapneumovirus humano y un virus sincitial respiratorio; y/o (b) un pneumovirus aviar y un virus sincitial respiratorio. En ciertas modalidades de la invención, la secuencia de nucleótidos heterologa a ser insertada es un gen G derivado de un metapneumovirus humano y/o un pneumovirus aviar. En ciertas modalidades, el gen G se deriva de (a) un metapneumovirus humano y un virus sincitial respiratorio, y/o (b) un pneumovirus aviar y un virus sincitial respiratorio. En ciertas modalidades, cualquier combinación de genes F diferentes y/o genes G diferentes derivados del metapneumovirus humano, pneumovirus aviar, y virus sincitial respiratorio puede ser insertados en el virus de la invención, siempre que, en todas las modalidades al menos una secuencia heterologa derivada ya sea del metapneumovirus humano o el pneumovirus aviar esté presente en el virus de parainfluenza humano de la invención. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos a ser insertada es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina F de un metapneumovirus humano. En ciertas modalidades diferentes, la secuencia de nucleótidos a ser insertada es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina G derivada de un metapneumovirus humano. En aún otras modalidades, la secuencia de nucleótidos a ser insertada es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina F derivada de un pneumovirus aviar. En aun otras modalidades, la secuencia de nucleótidos a ser insertada es un secuencia de nucleótidos que codifica una proteina G derivada de un pneumovirus avial. Siempre que, en todas las modalidades de la invención, al menos una secuencia de nucleótidos heteróloga se derive de un metapneumovirus , la secuencia de nucleótidos heteróloga a ser insertada codifique una proteina F o una proteina G de un virus sincitial respiratorio. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos a ser insertada codifica una proteina F quimérica o una proteína G quimérica. Una proteína F quimérica comprende partes de las proteínas F de diferentes virus, tales como un metapneumovirus humano, pneumovirus avial y/o virus sincitial respiratorio. Una proteína G quimérica comprende partes de las proteínas G de diferentes virus, tales como un metapneumovirus humano, pneumovirus aviar y/o virus sincitial respiratorio. En una modalidad específica, la proteína F comprende un ectodominio de una proteína F de un metapneumovirus, un domino transmembrana de una proteína F de un virus de parainfluenza , y el dominio luminar de una proteína F de un virus de parainfluenza . En ciertas modalidades, el ácido nucleico a ser insertado, codifica una proteína F, en donde el dominio transmembrana de la proteína F está eliminado de modo que se expresa una proteína F soluble. En ciertas modalidades específicas, la secuencia de nucleótidos heteróloga de la invención es cualquiera de la SEC ID NO: 1 a la SEC ID NO: 5, la SEC ID NO: 14, y la SEC ID NO: 15 (ver la Tabla 16) . En ciertas modalidades específicas, la secuencia de nucleótidos codifica una proteína de cualquiera de la SEC ID NO: 6 a la SEC ID NO: 13, la SEC ID NO: 16, y la SEC ID NO: 17 (ver la Tabla 16) . En ciertas modalidades específicas, la secuencia de nucleótidos codifica una proteína de cualquiera de la SEC ID NO: 314 a 389. Las secuencia de nucleótidos heterólogas derivadas del virus sincitial respiratorio, ver, por ejemplo, PCT/US98/20230, la cual se incorpora por la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad preferida, las secuencias genéticas heterólogas que pueden ser expresadas en los virus quiméricos de la invención incluyen, pero no se limitan a aquellas que codifican los epitopes antigénicos y glicoproteínas de virus, tales como glicoproteínas de influenza, en particular la hemaglutinina H5, H7, epitopes del virus sincitial respiratorio, epitopes del virus de la Enfermedad de New Castle, el virus de Sendai y el virus de Laringotraqueit is infecciosa (ILV), que resultan en enfermedades respiratorias. En una modalidad más preferida, las secuencias de nucleótidos heterologas se derivan de un metapneumovirus , tal como un metapneumovirus humano y/o un pneumovirus aviar. En aún otra modalidad de la invención, las secuencias de genes heterólogos que pueden ser modificadas en virus quiméricos de la incluyen, pero no se limitan a aquellas que codifican epitopes virales y glicoproteinas de virus, tales como el antigeno superficial del virus de hepatitis B, glicoproteinas superficiales del virus de hepatitis A o C del virus de Epstein Barr, glicoproteinas del virus de papiloma humano, virus de simio 5 o virus de paperas, virus del Nilo del Oeste, Virus del Dengue, glicoproteinas de virus del herpes, VPI de poliovirus, y las secuencias derivadas de un virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 o tipo 2. En aun otra modalidad, las secuencias de genéticas heterologas que pueden ser modificadas en virus quiméricos de la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellas que codifican los epitopes del virus de la Enfermedad de Marek (MDV) , epitopes del virus de la Enfermedad de Bursal infecciosa (IBDV), epitopes del virus de Anemia del Pollo, virus de laringotraqueitis infecciosa (ILV), virus de influenza aviar (AIV) , rabia, virus de leucemia felina, virus de irritación canina, virus de estomatitis vesicular, y virus de erupción pustulosa en cerdos (ver, Fields et al., (ed.), 1991, FUNDAMENTAL VIROLOGY, Segunda Edición, Raven Press, Nueva York, incorporados aquí como referencia en su totalidad) . Otras secuencias heterólogas de la presente invención incluyen aquellas que codifican antigenos que son característicos de enfermedades autoinmunes . Estos antígenos se derivaran típicamente de la superficie célula, el citoplasma, el núcleo, mitocondrias y las similares de tejidos de mamíferos, incluyendo los antígenos característicos de diabetes melitus, esclerosis múltiple, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, escleroderma , gastritis atrófica autoinmune, diabetes juvenil y lupus eritematoso discoide. Los antígenos que son alérgenos incluyen generalmente proteínas o glicoproteínas , incluyendo los antígenos derivados de polen, polvo, mohos, esporas, caspa, insectos y alimentos. Además, los antígenos que son característicos de antígenos tumorales se derivarán típicamente de la superficie celular, el citoplasma, el núcleo, los organelos y los similares de las células del tejido tumoral . Los ejemplos incluyen los antígenos característicos de proteínas de tumores, incluyendo las proteínas codificadas por oncogenes mutados, las proteínas asociadas con tumores; y glicoproteínas. Los tumores incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de los tipos de cáncer, de labios, de la faringe superior, faringe y la cavidad oral, esófago, estomago, colon, recto, hígado, vesícula biliar, páncreas, laringe, pulmones y bronquios, melanoma de la piel, pecho, cerviz, uterino, ovárico, de la vesícula, útero, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, próstata, testículos, enfermedad de Hodkin, linfoma no de Hodking, mieloma múltiple y leucemia. En una modalidad específica de la invención, las secuencias heterólogas se derivan del genoma del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) preferiblemente el virus de inmunodeficiencia humana 1 o el virus de inmunodeficiencia humana 2. En otra modalidad de la invención, las secuencias codificantes heterólogas pueden ser insertadas dentro de un secuencia codificante del gen de PIV de manera tal que se expresa un producto genético quimérico, que contiene la secuencia de péptido heterologo dentro de la proteína viral de PIV. En tal modalidad de la invención, las secuencias heterólogas pueden ser derivadas del genoma de un virus de inmunodeficiencia humana, preferiblemente del virus de inmunodeficiencia humana 1 o el virus de inmunodeficiencia humana 2. En los casos por los cuales las secuencias heterólogas se derivan de VIH, tales secuencias pueden incluir, pero no se limitan a, las secuencias derivadas del gen env (es decir las secuencias que codifican todo o parte de gpl60, gpl20, y/o gp41), el gen pol (es decir, las secuencias que codifican todo o parte de la transcriptasa inversa, endonucleasa, proteasa, y/o integrasa) , el gen gag (es decir, las secuencias que codifican todos o partes de p7, p6, p55, pl7/18, p24/25), tat, rev, nef, vif, vpu, vpr y/o vpx . En otra modalidad, las secuencias genéticas heterologas que pueden ser modificadas en los virus quiméricos incluyen aquellas que codifican proteínas con actividades inmunopotenciadoras . Los ejemplos de proteínas inmunopotenciadoras incluyen pero no se limitan a, citocinas, interferona tipo 1, interferona gamma, factores estimulantes de la colonia, e interleucinas -1, -2, -4, -5, -16, -12. Además, otras secuencias genéticas heterologas que pueden ser modificadas en los virus quiméricos incluyen aquellas que codifican antígenos derivados de bacterias tales como glicoproteínas de la superficie bacteriana, antígenos derivados de hongos, y antígenos derivados de una variedad de otros patógenos y parásitos. Loe ejemplos de secuencias de genes heterólogos derivadas de patógenos bacterianos incluyen, pero no se limitan a, aquellas que codifican antígenos derivados de especies de los siguientes géneros; Salmonella, Shigella, Chlamydia, Helicobacter, Yersinia, Bordatella, Pseudomonas, Neisseria, Vibrio, Haemophilus, Micoplasma, Streptomyces , Treponema, Coxiella, Ehrlichia, Brucilla. Streptobacillus , usospiroc eta , Spiríllum , Ureaplas a, Spirochaeta, Mycoplasma, Actinomycetes , Borrelia, Bacteroides, Tricho oras , Branhamella , Pasteurella , Clostridium, Corynebacterium, histeria , Bacillus , Erysipelothrix, Rhodococcus , Escherichia , Klebsiella , Pseudomanas , Enterobacter, Serratia , Staphylococcus , Streptococcus , Legionella , Mycobacterium , Proteus , Campylobacter, Enterococcus, Acinetobacter, Morganella r Moraxella , Citrobacter, Rickettsia , Rochlimeae, así como especies de bacterias tales como: P. aeruginosa; E. coli , P. cepacia , S. epidermis , E. faecalis, S. pneumonías , S. aureus, N. meningítidis , S. pyogenes , Pasteurella multocida, Trponema pallidum y P. mirabilis . Los ejemplos de secuencias genéticas heterólogas derivadas de hongos patogénicos incluyen, pero no se limitan a, aquellas que codifican antigenos derivados de hongos tales como Cryptococcus neoformans; Blastomyces dermatitidis; Aiellomyces dermatitidis; Histoplasma capsulatum ; Coccidioides immitis; especies de Candida, incluyendo C. albicans, C. tropicales , C. parapsilosis , C. guilliermondii y C. krusei, especies de Aspergillus , incluyendo A. fumigatus , A. flavus y A. Níger, especies de Rhizopus ; especies de Rhizomucor; especies de Cunninghammella ; especies de Apophysomyces , incluyendo A. saksenaea , A. mucor y A. absidia ; Sporothrix shenckii, Paracoccidioides brasilensis; Pseudallescheria boydii, Torulopsis glabrata ; especies de Trichophyton , especies de Microsporum y especies de Dermatophyres , asi como otras levaduras u hongos conocidos o identificados más tarde por ser patogénicos. Finalmente, los ejemplos de secuencias genéticas heterologas derivadas de parásitos incluyen pero no se limitan a, aquellas que codifican antigenos derivados de miembros del phylum Apicomplexa tales como, por ejemplo, Babesia, Toxoplasma , Plasmodium, Eimeria, Isospora , Atoxoplasma , Cystoisospora , Hammondia , Besniotia, Sarcocystis, Frenkelia, Haemoproteus, Leucocytozoon , Theileria , Perkinsus y Gregarina spp. ; Pneumocystis carinii; miembros del phylum Microspora tales como, por ejemplo, Nosema, Enterocytozoon , Encephalítozoon , Septata, Mrazekia , Amblyospora , Ameson, Glugea, Pleistophora y Microsporidium spp.; y miembros de phylum Ascetospora tales como, por ejemplo, Haplosporidium spp., asi como las especies que incluyen Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malaria; Toxoplasma gondii; Leishmania mexicana, L. trópica, L. major, L. aethiopica, L. donovani , Trypanosoma cruzi, T brucei, Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonium; Trichinella spiralis ; Wuchereria bañerofti ; Brugia malayli ; Entamoeba histolytica ; Enterobius vermiculoarus; Taenia solium, T. saginata , Trichomonas vaginatis, T. hominis, T. tenax; Giardia lamblia; Cryptosporidium parvum; Pneumocytis carinii , Babesia bovis, B. divergens , B. microtí, Isospora belli, L hominis; Dientamoeba fragilis; Onchocerca volvulus; Ascaris lumbricoides ; Necator americanis; Ancylostoma duodenale; Strongyloides stercoralis; Capillaria philippinensis ; Angiostrongylus cantonensis; Hymenolepis nana; Diphyllobothrium latum; Echinococcus granulosus, E. multilocularis ; Paragonimus westermani, P. caliensis ; Chlonorchis sinensis; Opisthorchis felineas, G. Viverini , Fasciola hepática , Sarcoptes scabiei , Pediculus humanus; Phthirlus pubis; y Dermatobia hominis, asi como otros parásitos conocidos actualmente o identificados mas tarde por ser patogénicos. 5.1.2. SECUENCIAS METAPNEUMOVIRALES A SER INSERTADAS Proteínas de un MPV de mamífero. La invención se refiere además a secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión, en donde la proteína de fusión contiene una proteína de un MPV de mamífero o un fragmento del mismo y uno o más péptidos o proteínas que no se derivan del MPV de mamífero. En una modalidad específica, una proteína de fusión de la invención contiene una proteína de MPV de un mamífero o un fragmento de la misma y una etiqueta peptídica, tal como, pero no limitada a una etiqueta de polihistidina . La invención se refiere además a proteínas de fusión, en donde la proteína de fusión contiene una proteína de MPV de mamífero o un fragmento de la misma y uno o más péptidos o proteínas que no se derivan de MPV de mamífero. La invención se refiere también a derivados de ácido nucleicos que codifican una proteína de MPV de mamífero. La invención se refiere también a derivados de proteínas de MPV de mamífero. Un derivado puede ser, pero no se limita a, las formas mutantes de la proteína, tales como, pero no limitadas a, adiciones, eliminaciones, truncamientos, substituciones e inversiones. Un derivado puede ser además una forma quimérica de la proteína de MPV de mamífero, en donde al menos un dominio de la proteína se deriva de una proteína diferente. Un derivado puede ser también una forma de un MPV de mamífero que está enlazada de forma covalente o de forma no covalente a otra molécula, tal como, por ejemplo, un fármaco. El aislado viral denominado NL/1/00 (también 00-1) es un MPV de mamífero de la variante Al y su secuencia genómica se muestra en la SEC ID NO: 95. El aislado viral denominado NL/17/00 es un MPV de mamífero de la variante A2 y su secuencia genómica se muestra en la SEC ID NO: 96. El aislado viral denominado NL/1/99 (también 99-1) es un MPV de mamífero de la variante Bl y su secuencia genómica se muestra en la SEC ID NO: 94. El aislado viral denominado NL/1/94 es un MPV de mamífero de la variante B2 y su secuencia genómica se muestra en la SEC ID NO: 97. Una lista de las secuencias descritas en la presente solicitud y las SEC ID Nos. correspondientes se establecen en la Tabla 16. La proteina de un MPV de mamífero puede ser una proteina N, una proteína P, una proteína , una proteína F, una proteína M2-1 o una proteína M2-2 o un fragmento de las mismas. Un fragmento de una proteína de un MPV de mamífero puede ser de al menos 25 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos, al menos 75 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 125 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 175 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos, al menos 225 aminoácidos, al menos 250 aminoácidos, al menos 275 aminoácidos, al menos 300 aminoácidos, al menos 325 aminoácidos, al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 425 aminoácidos, al menos 450 aminoácidos, al menos 475 aminoácidos, al menos 500 aminoácidos, al menos 750 aminoácidos, al menos 1000 aminoácidos, al menos 1250 aminoácidos, al menos 1500 aminoácidos, al menos 1750 aminoácidos, al menos 2000 aminoácidos o al menos 2250 aminoácidos de longitud. Un fragmento de una proteína de un MPV de mamífero pueden ser de al menos 25 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos, al menos 75 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 125 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 175 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos, al menos 225 aminoácidos, al menos 250 aminoácidos , al menos 275 aminoácidos , al menos 300 aminoácidos , al menos 325 aminoácidos, al menos 350 aminoácidos , al menos 375 aminoácidos , al menos 400 aminoácidos, al menos 425 aminoácidos , al menos 450 aminoácidos, al menos 475 aminoácidos, al menos 500 aminoácidos, al menos 750 aminoácidos , al menos 1000 aminoácidos , al menos 1250 aminoácidos , al menos 1500 aminoácidos, al menos 1750 aminoácidos , al menos 2000 aminoácidos, o al menos 2250 aminoácidos de longitud . En ciertas modalidades de la invención, la proteina de un MPV de mamífero es una proteína N, en donde la proteína N se relaciona filogenéticamente más cerca a una proteína N de un MPV de mamífero, tal como la proteína N codificada, por ejemplo, el genoma viral de SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97, (ver también la Tabla 16 para una descripción de las SEC ID Nos.) de lo que se relacionada con la proteína N del APV de tipo C. En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína P, en donde la proteína P se relaciona filogenéticamente más cerca de la proteína P de un MPV de mamífero, tal como la proteína P codificada por, por ejemplo, el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteina N del APV tipo C. En ciertas modalidades de la invención, la proteina de un MPV de mamífero es una proteína M, en donde la proteína M se relaciona más cerca de una proteína M de un MPV de mamífero, tal como la proteína M codifica por, por ejemplo, el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína M del APV tipo C. En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína F, en donde la proteína F se relaciona filogenéticamente más cerca de una proteína F de un MPV de mamífero, tal como la proteína F codificada por, por ejemplo, el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína F de APV tipo C. En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína M2-1, en donde la proteína M2-1 se relaciona filogenéticamente más cerca de una proteína M2-1 de un MPV de mamífero, tal como la proteína M2-1 codificada por, por ejemplo, el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína M2-1 del APV tipo C. En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína M2-2, en donde la proteína M2-2 se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-2 de un MPV de mamífero, tal como la proteína M2-2 codificada por, por ejemplo, el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína M2-2 del APV tipo C. En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína G, en donde la proteína G se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína G de un MPV de mamífero, tal como la proteína M2-2 codificada por, por ejemplo, el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: - 96, o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con cualquier proteína del APV tipo C. En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína SH, en donde la proteína SH se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína SH de un MPV de mamífero, tal como la proteína SH codificada por, por ejemplo, el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con cualquier proteína del APV tipo C. En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína L, en donde la proteína L se' relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína L de un MPV de mamífero, tal como la proteína L codificada por, por ejemplo, el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con cualquier proteina del APV tipo C. En ciertas modalidades de la invención, la proteina de un MPV de mamífero es una proteína N, en donde la proteína N es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la secuencia de aminoácido de una proteína N codificada por el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas N respectivas se describen en la SEC ID NO: 366-369; ver también la Tabla 16) . En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína N, en donde la proteína P es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la secuencia de aminoácido de una proteína P codificada por el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas P respectivas se describen en la SEC ID NO: 78-85; ver también la Tabla 16). En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína M, en donde la proteína M es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la secuencia de aminoácido de una proteina M codificada por el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas N respectivas se describen en la SEC ID NO: 358-361; ver también la Tabla 16) . En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína F, en donde la proteína F es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la secuencia de aminoácido de una proteína F codificada por el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas F respectivas se describen en la SEC ID NO: 18-25; ver también la Tabla 16) . En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína M2-1, en donde la proteína M2-1 es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la secuencia de aminoácido de una proteína M2-1 codificada por el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas M2-1 respectivas se describen en la SEC ID NO: 42-49; ver también la Tabla 16) . En ciertas modalidades de la invención, la proteina de un MPV de mamífero es una proteína M2-2, en donde la proteína M2-2 es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la secuencia de aminoácido de una proteína M2-2 codificada por el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas M2-2 respectivas se describen en la SEC ID NO:5C-57; ver también la Tabla 16) . En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína G, en donde la proteína G es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la secuencia de aminoácido de una proteína G codificada por el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas G respectivas se describen en la SEC ID NO: 26-33; ver también la Tabla 16) . En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína SH, en donde la proteína SH es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la secuencia de aminoácido de una proteina SH codificada por el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas SH respectivas se describen en la SEC ID NO: 86-93; ver también la Tabla 16) . En ciertas modalidades de la invención, la proteína de un MPV de mamífero es una proteína L, en donde la proteína L es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la secuencia de aminoácido de una proteína L codificada por el genoma viral de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas L respectivas se describen en la SEC ID NO: 34-41; ver también la Tabla 16) . Un fragmento de una proteína de un MPV de mamífero se al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la proteína homologa codificada por el virus de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97, sobre la porción de la proteína que es homologa al fragmento. En una modalidad específica, ilustrativa, la invención proporciona un fragmento de la proteína F de un MPV de mamífero que contiene el ectodominio de la proteína F y un homólogo del mismo. El homologo del fragmento F de la proteína F que contiene el ectodominio es al menos 60%, al menos 65%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntico al fragmento correspondiente que contiene el ectodominio de la proteína F codificada por un virus de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97 (las secuencias de aminoácido de las proteínas F respectivas se describen en la SEC ID NO: 18-25; ver también la Tabla 16) . En ciertas modalidades, la invención proporciona una proteína de un MPV de mamífero del subgrupo ? y fragmentos de la misma. La invención proporciona una proteína N de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína N se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína N codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteína N codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97. La invención proporciona una proteína G de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína G se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína G codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteína G codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97. La invención proporciona una proteína P de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína P se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína P codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteína G codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97. La invención proporciona una proteína M de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína M se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteína codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97. La invención proporciona una proteína N de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína N se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína N codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteína N codificada por un virus codificado por la SEC ID 'NO: 94 o la SEC ID NO: 97. La invención proporciona una proteína F de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína F se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína F codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteína F codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97. La invención proporciona una proteína M2-1 de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína M2-1 se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteina M2-1 codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteina M2-1 codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97. La invención proporciona una proteina M2-2 de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína M2-2 se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-2 codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteína M2-2 codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97. La invención proporciona una proteína SH de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína SH se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína SH codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteína SH codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97. La invención proporciona una proteína L de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína L se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína L codificada por un virus de la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96, que lo que se relaciona con la proteína L codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97. En otras modalidades, la invención proporciona una proteína de un MPV de mamífero del subgrupo B o fragmento de la misma. La invención proporciona una proteína de un MPV de mamífero del subgrupo B, en donde la proteina N se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína N codificada por un virus de la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97 de lo que se relación con la proteína N codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96. La invención proporciona una proteína G de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína G se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína G codificada por un virus de la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína G codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96. La invención proporciona una proteína P de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína P se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína P codificada por un virus de la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína P codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96. La invención proporciona una proteína M de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína M se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M codificada por un virus de la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína M codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96. La invención proporciona una proteína N de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína F se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína F codificada por un virus de la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína F codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96. La invención proporciona una proteína M2-1 de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína M2-1 se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-1 codificada por un virus de la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína M2 —1 codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96. La invención proporciona una proteína M2-2 de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína M2-2 se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-2 codificada por un virus de la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína M2-2 codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96. La invención proporciona una proteína SH de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína SH se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína SH codificada por un virus de la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína SH codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96. La invención proporciona una proteína L de un MPV de mamífero del subgrupo A, en donde la proteína L se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína L codificada por un virus de la SEC ID NO: 94 o la SEC ID NO: 97, de lo que se relaciona con la proteína L codificada por un virus codificado por la SEC ID NO: 95 o la SEC ID NO: 96. La invención proporciona una proteína G de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la proteína G se una variante Bl de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína G del prototipo de la variante Bl, aislada de NL/1/99, de lo que se relaciona con la proteína G del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, la proteína G del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteína G del prototipo de B2, aislada de NL/1/94. La invención proporciona una proteína G de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína G es al menos 66%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99.5% idéntica a la proteína G de una variante Bl de MPV de mamífero, cuando se representa por el NL/1/99 prototipo (SEC ID NO: 28) . En una modalidad específica, la proteína G de un MPV de mamífero tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 119-153. La invención proporciona una proteína N de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la proteína N de una variante Bl de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína N del prototipo de variante Bl, aislado de NL/1/99, de lo que se relaciona con la proteina N del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, la proteina N del prototipo de A2, aislado de NL/17/00, o la proteina N del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteina N de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de" la proteína N es al menos 98.5% o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína N de una variante Bl de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/99 prototipo (SEC ID NO: 72) . La invención proporciona una proteína P de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la proteína P de una variante Bl de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína P del prototipo de variante Bl, aislado de NL/1/99, de lo que se relaciona con la proteína P del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, la proteína P del prototipo de A2, aislado de NL/17/00, o la proteína P del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína P de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína P es al menos 96%, al menos 98%, o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína M de una variante Bl de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/99 prototipo (SEC ID NO: 80) . La invención proporciona una proteína M de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la proteína M de una variante Bl de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M del prototipo de variante Bl, aislado de NL/1/99, de lo que se relaciona con la proteína M del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, la proteína M del prototipo de A2, aislado de NL/17/00, o la proteína M del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína M de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína M es idéntica a la proteína M de una variante Bl de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/99 prototipo (SEC ID NO: 64) . La invención proporciona una proteína F de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la proteína F de una variante Bl de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína F del prototipo de variante Bl, aislado de NL/1/99, de lo que se relaciona con la proteína F del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, la proteína F del prototipo de A2, aislado de NL/17/00, o la proteína F del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína F de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína F es al menos 99% idéntica a la proteína F de una variante Bl de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/99 prototipo (SEC ID NO: 20) . En una modalidad específica, la proteína F de un MPV de mamífero tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 248-327. La invención proporciona una proteina M2-1 de una variante Bl de PV de mamífero, en donde la proteína M2-1 de una variante Bl de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-1 del prototipo de variante Bl, aislado de NL/1/99, de lo que se relaciona con la proteína M2-1 del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, la proteína 2-1 del prototipo de A2, aislado de NL/17/00, o la proteína N del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína M2-1 de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína M2-1 es al menos 98% o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína M2-1 de una variante Bl de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/99 prototipo (SEC ID NO: 44) . La invención proporciona una proteína M2-2 de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la proteína M2-2 de una variante Bl de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-2 del prototipo de variante Bl, aislado de NL/1/99, de lo que se relaciona con la proteína M2-2 del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, la proteína M2-2 del prototipo de A2, aislado de NL/17/00, o la proteína M2-2 del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína M2-2 de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína N es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína M2-2 de una variante Bl de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/99 prototipo (SEC ID NO: 52) . La invención proporciona una proteína SH de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la proteína SH de una variante Bl de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína SH del prototipo de variante Bl, aislado de NL/1/99, de lo que se relaciona con la proteína SH del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, la proteína SH del prototipo de ?2 , aislado de NL/17/00, o la proteína SH del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína SH de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína SH es al menos 83%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína SH de una variante Bl de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/99 prototipo (SEC ID NO: 88) . La invención proporciona una proteína L de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la proteína L de una variante Bl de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína L del prototipo de variante Bl, aislado de NL/1/99, de lo que se relaciona con la proteína L del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, la proteína L del prototipo de A2, aislado de NL/17/00, o la proteína L del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína L de una variante Bl de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína L es al menos 98.5% o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína L de una variante Bl de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/99 prototipo (SEC ID NO: 36) . La invención proporciona una proteína G de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la proteína G de una variante Al de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína G del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, de lo que se relaciona con la Proteína G del prototipo de la variante Bl, aislada de NL/1/99, la proteína G del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteína G del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína G de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína G es al menos 66%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína G de una variante Al de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/00 prototipo (SEC ID NO: 26) . La invención proporciona una proteína N de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la proteína N de una variante Al de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína N del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, de lo que se relaciona con la proteína N del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína N del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteína N del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína N de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína N es al menos 99.5% idéntica a la proteína N de una variante Al de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/00 prototipo (SEC ID NO: 70) . La invención proporciona una proteína P de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la proteína P de una variante Al de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína P del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, de lo que se relaciona con la proteína P del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína P del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteína P del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína P de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína P es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína P de una variante Al de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/00 prototipo (SEC ID NO: 78) . La invención proporciona una proteína M de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la proteína M de una variante Al de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, de lo que se relaciona con la proteína M del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteina M del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteina M del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteina M de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína M es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína M de una variante Al de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/00 prototipo (SEC ID NO: 62] . La invención proporciona una proteína F de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la proteína F de una variante Al de MPV de mamífero se relaciona filogenét icamente' más cerca con la proteína F del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, de lo que se relaciona con la proteína F del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína F del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteína N del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína F de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína F es al menos 98% o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína F de una variante Al de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/00 prototipo (SEC ID NO: 18) . La invención proporciona una proteína M2-1 de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la proteína M2-1 de una variante Al de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-1 del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, de lo que se relaciona con la proteína M2-1 del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína M2-1 del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteína M2-1 del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína M2-1 de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína M2-1 es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína M2-1 de una variante Al de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/00 prototipo (SEC ID NO: 42) . La invención proporciona una proteína M2-2 de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la proteína M2-2 de una variante Al de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-2 del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, de lo que se relaciona con la proteína M2-2 del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína M2-2 del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteína M2-2 del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína M2-2 de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína M2-2 es al menos 96% o al menos 99.5% idéntica a la proteína M2-2 de una variante Al de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/00 prototipo (SEC ID N0:50) . La invención proporciona una proteína SH de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la proteína SH de una variante Al de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteina SH del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, de lo que se relaciona con la Proteína SH del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína SH del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteína SH del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína SH de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína SH es al menos 84%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína SH de una variante Al de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/00 prototipo (SEC ID NO: 86) . La invención proporciona una proteína L de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la proteína L de una variante Al de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína L del prototipo de la variante Al, aislado de NL/1/00, de lo que se relaciona con la Proteína L del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína L del prototipo de A2, aislada de NL/17/00, o la proteína N del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína L de una variante Al de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína L es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína L de una variante Al de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/00 prototipo (SEC ID NO: 34) .
La invención proporciona una proteína G de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la proteína G de una variante A2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína G del prototipo de la variante A2, aislado de NL/17/00, de lo que se relaciona con la proteína G del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína G del prototipo de Al, aislado de NL/1/00, o la proteína G del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína G de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína G es al menos 66%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína G de una variante A2 de MPV de mamífero representada por el NL/17/00 prototipo (SEC ID NO: 27) . La invención proporciona una proteína N de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la proteína N de una variante A2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína N del prototipo de la variante A2, aislado de NL/17/00, de lo que se relaciona con la proteína N del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína N del prototipo de Al, aislado de NL/1/00, o la proteína N del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína N de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína N es al menos al menos 99.5% idéntica a la proteina N de una variante A2 de MPV de mamífero representada por el NL/17/00 prototipo (SEC ID NO: 71) . La invención proporciona una proteína P de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la proteína P de una variante A2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína P del prototipo de la variante A2, aislado de NL/17/00, de lo que se relaciona con la proteína P del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína P del prototipo de Al, aislado de NL/1/00, o la proteína P del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína P de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína P es al menos al menos 96%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína p de una variante A2 de MPV de mamífero representada por el NL/17/00 prototipo (SEC ID NO: 79) . La invención proporciona una proteína M de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la proteína M de una variante A2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M del prototipo de la variante A2, aislado de NL/17/00, de lo que se relaciona con la proteína M del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína M del prototipo de Al, aislado de NL/1/00, o la proteína M del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína M de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteina M es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteina M de una variante A2 de MPV de mamífero representada por el NL/17/00 prototipo (SEC ID NO: 63) . La invención proporciona una proteína F de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la proteína F de una variante A2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína F del prototipo de la variante A2 , aislado de NL/17/00, de lo que se relaciona con la proteína F del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína F del prototipo de Al, aislado de NL/1/00, o la proteína F del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína F de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína F es al menos 98%, al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína F de una variante A2 de MPV de mamífero representada por el NL/17/00 prototipo (SEC ID NO: 19) . La invención proporciona una proteína M2-1 de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la proteína M2-1 de una variante A2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-1 del prototipo de la variante A2, aislado de NL/17/00, de lo que se relaciona con la proteína M2-1 del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína M2-1 del prototipo de Al, aislado de NL/1/00, o la proteína M2-1 del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína M2-1 de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína 2-1 al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína M2-1 de una variante A2 de MPV de mamífero representada por el NL/17/00 prototipo (SEC ID NO: 43) . La invención proporciona una proteína M2-2 de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la proteína M2-2 de una variante A2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-2 del prototipo de la variante A2, aislado de NL/17/00, de lo que se relaciona con la proteína M2-2 del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína M2-2 del prototipo de Al, aislado de NL/1/00, o la proteína M2-2 del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína M2-2 de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína M2-2 al menos 96%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína M2-2 de una variante A2 de MPV de mamífero representada por el NL/17/00 prototipo (SEC ID NO: 51) . La invención proporciona una proteína SH de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la proteína SH de una variante A2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína SH del prototipo de la variante A2 , aislado de NL/17/00, de lo que se relaciona con la proteína SH del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína SH del prototipo de Al, aislado de NL/1/00, o la proteina SH del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteina SH de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína SH es al menos 84%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína SH de una variante A2 de MPV de mamífero representada por el NL/17/00 prototipo (SEC ID NO: 87) . La invención proporciona una proteína L de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la proteína L de una variante A2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína L del prototipo de la variante A2, aislado de NL/17/00, de lo que se relaciona con la proteína L del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína L del prototipo de Al, aislado de NL/1/00, o la proteína L del prototipo de B2, aislado de NL/1/94. La invención proporciona una proteína L de una variante A2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína L es al menos al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína L de una variante A2 de MPV de mamífero representada por el NL/17/00 prototipo (SEC ID NO: 35) . La invención proporciona una proteína G de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la proteína G de una variante B2 de MPV de mamífero se relaciona filogenét icamente más cerca con la proteína G del prototipo de la variante B2, aislado de NL/1/94, de lo que se relaciona con la Proteína G del prototipo de la variante Bl, aislada de NL/1/99, la proteína G del prototipo de Al, aislada de NL/1/00, o la proteína G del prototipo de A2, aislado de NL/17/00. La invención proporciona una proteína G de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína G es al menos 66%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína G de una variante B2 de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/94 prototipo (SEC ID NO: 29) . La invención proporciona una proteína N de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la proteína N de una variante B2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína N del prototipo de la variante B2, aislado de NL/1/94, de lo que se relaciona con la proteína N del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína N del prototipo de Al, aislada de NL/1/00, o la proteína N del prototipo de A2 , aislado de NL/17/00. La invención proporciona una proteína N de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína N es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína N de una variante B2 de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/94 prototipo (SEC ID NO: 73) . La invención proporciona una proteina P de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la proteína P de una variante B2 de MPV de mamífero se relaciona f ilogenéticamente más cerca con la proteína P del prototipo de la variante B2, aislado de NL/1/94, de lo que se relaciona con la proteína P del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína P del prototipo de Al, aislada de NL/1/00, o la proteína P del prototipo de A2, aislado de NL/17/00. La invención proporciona una proteína P de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína P es al menos 96%, al menos 98%, o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína P de una variante B2 de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/94 prototipo (SEC ID NO:81) . La invención proporciona una proteína M de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la proteína M de una variante B2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M del prototipo de la variante B2, aislado de NL/1/94, de lo que se relaciona con la proteína M del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína M del prototipo de Al, aislada de NL/1/00, o la proteína M del prototipo de A2, aislado de NL/17/00. La invención proporciona una proteína M de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína M es idéntica a la proteína M de una variante B2 de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/94 prototipo (SEC ID NO: 65) . La invención proporciona una proteina F de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la proteína F de una variante B2 de MPV de mamífero se relaciona filogenét icamente más cerca con la proteína F del prototipo de la variante B2, aislado de NL/1/94, de lo que se relaciona con la proteína F del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína F del prototipo de Al, aislada de NL/1/00, o la proteína N del prototipo de A2, aislado de NL/17/00. La invención proporciona una proteína F de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína F es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína F de una variante B2 de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/94 prototipo (SEC ID NO: 21) . La invención proporciona una proteína M2-1 de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la proteína M2-1 de una variante B2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-1 del prototipo de la variante B2, aislado de NL/1/94, de lo que se relaciona con la proteína M2-1 del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína M2-1 del prototipo de Al, aislada de NL/1/00, o la proteína M2-1 del prototipo de A2 , aislado de NL/17/00. La invención proporciona una proteína M2-1 de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína M2-1 es al menos 98% o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteina M2-1 de una variante B2 de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/94 prototipo (SEC ID NO: 45) . La invención proporciona una proteína M2-2 de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la proteína M2-2 de una variante B2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína M2-2 del prototipo de la variante B2, aislado de NL/1/94, de lo que se relaciona con la proteína M2-2 del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína M2-2 del prototipo de Al, aislada de NL/1/00, o la proteína M2-2 del prototipo de A2, aislado de NL/17/00. La invención proporciona una proteína M2-2 de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína M2-2 es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína M2-2 de una variante B2 de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/94 prototipo (SEC ID NO: 53) . La invención proporciona una proteína SH de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la proteína SH de una variante B2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína SH del prototipo de la variante B2, aislado de NL/1/94, de lo que se relaciona con la Proteína SH del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína SH del prototipo de Al, aislada de NL/1/00, o la proteína SH del prototipo de A2, aislado de NL/17/00. La invención proporciona una proteína SH de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína SH es al menos 84%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína SH de una variante B2 de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/94 prototipo (SEC ID NO: 89) . La invención proporciona una proteína L de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la proteína L de una variante B2 de MPV de mamífero se relaciona filogenéticamente más cerca con la proteína L del prototipo de la variante B2, aislado de NL/1/94, de lo que se relaciona con la Proteína L del prototipo de la variante Bl, aislado de NL/1/99, la proteína L del prototipo de Al, aislada de NL/1/00, o la proteína N del prototipo de A2, aislado de NL/17/00. La invención proporciona una proteína L de una variante B2 de MPV de mamífero, en donde la secuencia de aminoácido de la proteína L es al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a la proteína L de una variante B2 de MPV de mamífero como se representa por el NL/1/94 prototipo (SEC ID NO: 37) . En ciertas modalidades, el porcentaje de identidad de la secuencia se basa en la alineación de las proteínas completas. En otras modalidades, el porcentaje de identidad de la secuencia se basa en la alineación de las secuencias de aminoácidos contiguas de las proteínas, en donde las secuencias de aminoácidos pueden ser de 25 aminoácidos, 50 aminoácidos, 75 aminoácidos, 100 aminoácidos, 125 aminoácidos, 150 aminoácidos, 175 aminoácidos, 200 aminoácidos , 225 aminoácidos , 250 aminoácidos, 275 aminoácidos , 300 aminoácidos , 325 aminoácidos , 350 aminoácidos , 375 aminoácidos , 400 aminoácidos , 425 aminoácidos , 450 aminoácidos , 475 aminoácidos, 500 aminoácidos , 750 aminoácidos , 1000 aminoácidos , 1250 aminoácidos , 1500 aminoácidos, 1750 aminoácidos , 2000 aminoácidos o 2250 aminoácidos de longitud. La invención proporciona además secuencias de ácidos nucleicos derivados de un MPV de mamífero. La invención proporciona también derivados de secuencias de ácidos nucleicos derivadas de un MPV de mamífero. En ciertas modalidades específicas, los ácidos nucleicos están modificados. En ciertas modalidades, un ácido nucleico de la invención codifica una proteína G, una proteína N, una proteína P, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L de un MPV de mamífero como se definen arriba. En ciertas modalidades, un ácido nucleico de la invención codifica una proteína G, una proteína N, una proteína P, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L del subgrupo A de un MPV de mamífero como se define arriba. En una modalidad específica, el gen G de un MPV de mamífero tiene las secuencias de nucleótidos de las SEC ID NO: 98-132. En una modalidad específica, el gen F de un MPV de mamífero tiene las secuencias de nucleótidos de las SEC ID NO: 168-247. En ciertas modalidades un ácido nucleico de la invención codifica una proteína G, una proteína N, una proteína P, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L del subgrupo B de un MPV de mamífero como se define arriba. En ciertas modalidades, un ácido nucleico de la invención codifica una proteína G, una proteína N, una proteína P, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH o una proteína L de una variante Al de un MPV de mamífero como se define arriba. En ciertas modalidades, un ácido nucleico de la invención codifica una proteína G, una proteína N, una proteína P, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L de la variante A2 de un MPV de mamífero como se define arriba. En ciertas modalidades, un ácido nucleico de la invención codifica una proteína G, una proteína N, una proteína P, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L de la variante Bl de un MPV de mamífero como se define arriba. En ciertas modalidades, un ácido nucleico de la invención codifica una proteina G, una proteina N, una proteina P, una proteina M, una proteina F, una proteina M2-1, una proteina M2-2, una proteina SH, o una proteina L de la variante B2 de un PV de mamífero como se define arriba. En ciertas modalidades, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos que es al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 99.5% idéntica a la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos de la invención es al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 905, al menos 98%, al menos 99% o al menos 99.5% idéntica a un fragmento de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97, en donde el fragmento es de al menos 25 nucleótidos, al menos 50 nucleótidos, al menos 75 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, al menos 150 nucleótidos, al menos 200 nucleótidos, al menos 250 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 750 nucleótidos, al menos 1,000 nucleótidos, al menos 1,250 nucleótidos, al menos 1,500 nucleótidos, al menos 1,750 nucleótidos, al menos 2,000 nucleótidos, al menos 2,00 nucleótidos, al menos 3,000 nucleótidos, al menos 4,000 nucleótidos, al menos 5,000 nucleótidos, al menos 7,500 nucleótidos, al menos 10,000 nucleótidos, al menos 12,500 nucleótidos, o al menos 15,000 nucleótidos de longitud. En una modalidad especifica, la secuencia de ácido nucleico de la invención es al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 655, al menos 70%, al menos 75%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 855, al menos 90%, al menos 95%, al menos 985, al menos 99%, o al menos 99.5% o 100% idéntica a una de las secuencia de nucleótidos de las SEC ID NO: 98-132; las SEC ID NO: 168-247 ; las SEC ID NO: 22-25, las SEC ID NO: 30-33; las SEC ID NO: 38-42, las SEC ID NO: 46-49; las SEC ID NO: 54-17; las SEC ID NO: 58-61; las SEC ID NO: 66-69; las SEC ID NO: 74-77; las SEC ID NO: 82-85, o las SEC ID NO: 90-93. En modalidades especificas de la invención, una secuencia de ácido nucleico de la invención es capaz de hibridizarse bajo condiciones de severidad baja, severidad media o severidad alta, con una de las decencias de ácidos nucleicos de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 96, o la SEC ID NO: 97. En modalidades especificas de la invención, una secuencia de ácido nucleico de la invención es capaz de hibridizarse bajo condiciones de severidad baja, severidad media, o severidad alta, con una de las secuencias de ácidos nucleicos de las SEC ID NO: 98-132; las SEC ID NO: 168-247; las SEC ID NO: 22-25; las SEC ID NO: 30-33; las SEC ID NO: 38-41; las SEC ID NO: 46-49; las SEC ID NO: 54-57; las SEC ID NO: 58-61; las SEC ID NO: 66-69; las SEC ID NO: 74-77; las SEC ID NO: 85-85; o las SEC ID NO: 90-93. En ciertas modalidades, un ácido nucleico se hibridiza sobre una longitud de al menos 25 nucleótidos , al menos 50 nucleótidos, al menos 75 nucleótidos , al menos 100 nucleótidos , al menos 150 nucleótidos , al menos 200 nucleótidos , al menos 250 nucleótidos , al menos 300 nucleótidos , al menos 400 nucleótidos , al menos 500 nucleótidos, al menos 750 nucleótidos , al menos 1, 000 nucleótidos, al menos 1,250 nucleótidos , al menos 1, 500 nucleótidos , al menos 1,750 nucleótidos , al menos 2,000 nucleótidos , al menos 2 , 00 nucleótidos , al menos 3, 000 nucleótidos , al menos 4,000 nucleótidos, al menos 5, 000 nucleótidos, al menos 7,500 nucleótidos , al menos 10,000 nucleótidos , al menos 12 , 500 nucleótidos , o al menos 15,000 nucleótidos , o la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 94, la SEC ID NO: 95, la SEC ID NO: 99 o la SEC : ID NO: 97 La invención proporciona además anticuerpos y fragmentos de enlace a antigenos que se enlazan específicamente a una proteína de un MPV de mamífero. Un anticuerpo de la invención se enlaza específicamente a una proteína G, una proteína N, una proteina P, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o proteína L de un MPV de mamífero. En modalidades específicas, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención se enlaza específicamente a una proteína G, una proteína N, una proteína p, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L de un virus del subgrupo A de un MPV de mamífero. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención se enlaza específicamente a una proteína G, una proteína N, una proteína p, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L del subgrupo B de un MPV de mamífero. En ciertas modalidades, más específicas, un anticuerpo de la invención se enlaza específicamente a una proteína G, una proteína N, una proteína p, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L, de un virus de la variante Al de un MPV de mamífero. En tras modalidades, el anticuerpo de la invención se enlaza específicamente a una proteína G, una proteína N, una proteína p, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L de un virus del subgrupo A2 de un MPV de mamífero. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención se enlaza específicamente a una proteína G, una proteína N, una proteína p, una proteína , una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L de un virus del subgrupo Bl de un MPV de mamífero. En ciertas otras modalidades, un anticuerpo de la invención se enlaza específicamente a una proteína G, una proteína N, una proteína p, una proteína M, una proteína F, una proteína M2-1, una proteína M2-2, una proteína SH, o una proteína L de un virus del subgrupo B2 de un MPV de mamífero. 5.3.1. INSERCIÓN DE LA SECUENCIA GENÉTICA HETEROLOGA La inserción de una secuencia genética extraña en un vector viral de la invención puede ser lograda ya sea mediante el reemplazo completo de una región codificante viral con una secuencia heteróloga, o por un reemplazo parcial de la misma, o agregando la secuencia de nucleótidos heteróloga al genoma viral. El reemplazo completo probablemente sería logrado mejor a través del uso de mutagénesis dirigida por PCR. Concretamente, el cebador A de PCR debería contener desde el extremo 5' al extremo 3' : un sitio de enzima de restricción único, tal como el sitio de enzima de restricción clase IIS (es decir, una enzima "desplazadora" , que reconoce una secuencia específica pero escinde el ADN ya sea corriente arriba o corriente debajo de esa secuencia) ; una extensión de nucleótidos complementaria a una región del gen de PIV; y una extensión de nucleótidos complementaria a la porción codificante de la carboxi terminal de la secuencia heteróloga. El cebador B de PCR debería contener desde el extremo 5' al 3' : un sitio de enzima de restricción único; una extensión de nucleótidos complementaria a un gen de PIV; y una extensión de nucleótidos que corresponde a la porción codificante de 5' del gen extraño. Después de una reacción de PCR usando estos cebadores con una copia clonada del gen extraño, el producto puede ser escindido y clonado usando los sitios de restricción únicos. La digestión con la enzima clase IIS y la transcripción con la polimerasa del fago purificada generaría una molécula de ARN que contiene los extremos no traducidos exactos del gen de PIV con una inserción del gen extraño. En una modalidad alternativa, las reacciones cebadas por PCR podrían ser usadas para preparar ADN de doble hebra que contiene la secuencia promotora del bacteriófago, y la secuencia del gen híbrido de modo que las plantillas de ARN pueden ser transcritas directamente sin clonación. Una secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser agregada o insertada en varias posiciones del virus de la invención. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos heteróloga se agrega o inserta en la posición 1. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos se agrega o inserta en la posición 2. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos heterologa se agrega o inserta en la posición 3. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos heterologa se agrega o inserta en la posición 4. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos heterologa se agrega o inserta en la posición 5. En aun otra modalidad, la secuencia de nucleótidos heterologa se agrega o inserta en la posición 6. Como se usa aquí, el término "posición" se refiere a la posición de la secuencia de nucleótidos heterologa en el genoma viral a ser transcrito, por ejemplo, posición 1 significa que es el primer gen a ser transcrito, y posición 2 significa que es el segundo gen a ser transcrito. Insertar la secuencia de nucleótidos heterologa en posición con numeraciones mas bajas del virus resulta generalmente en la expresión más fuerte de la secuencia de nucleótidos heterologa en comparación a la inserción en las posiciones con numeración más alta, debido al gradiente transcripcional que ocurre a través del genoma del virus. Sin embargo, el gradiente transcripcional también da razones especificas de ARNms virales. La inserción de genes extraños perturbará estas relaciones y resultará en la síntesis de diferentes cantidades de proteínas virales que pueden influenciar la replicación. Por lo tanto, tanto el gradiente transcripcional y la cinética de replicación deben ser considerados cuando se elige un sitio de inserción. Por ejemplo, la inserción de la secuencia de nucleótidos heteróloga en la posición 2 del vector de PIV3 b/h resulta en la mejor velocidad de replicación y el nivel de expresión del gen heterólogo. Insertar las secuencias de nucleotidos en posición con numeraciones más bajas es la modalidad preferida de la invención si se desea una expresión fuerte de la secuencia de nucleotidos heteróloga. En una modalidad preferida, la secuencia heteróloga se agrega o inserta en la posición 1, 2 o 3. Cuando se inserta una secuencia de nucleotidos heteróloga en el virus de la invención, la región intergénica entre el final de la secuencia codificante del gen heterólogo y , el inicio de la secuencia codificante del gen corriente abajo puede ser alterada para lograr un efecto deseado. Como se usa aquí, el término "región intergénica" se refiere a la secuencia de nucleotidos entre la señal de detención de un gen y el codón de inicio (por ejemplo, AUG) de la secuencia codificante del siguiente marco de lectura abierto corriente abajo. Una región intergénica puede comprender una región no codificante de un gen, es decir, entre el sitio de inicio de la transcripción y el inicio de la secuencia codificante (AUG) del gen. Esta región no codificante aparece de manera natural en los ARNms de bPIV3 y otros genes virales, lo cual se ilustra como los ejemplos no limitantes en la Tabla 2: Tabla 2: Longitudes de las Regiones No Codificantes para los ARNms de bPIV3 ...CTT[ Inicio del Gen] AUG- N 45 nucleótidos P 68 nucleótidos M 21 nucleótidos F 201 nucleótidos HN 62 nucleótidos L 12 nucleótidos RSV bíh Fl 10 nucleótidos RSV b/h F2 86 nucleótidos RSV b/h Fl NP-P 83 nucleótidos En varias modalidades, la región intergénica entre la secuencia de nucleótidos heteróloga y el gen corriente abajo puede ser modificada, independientemente una del otro, para ser de al menos 10 nt de longitud, al menos 20 nt de longitud, al menos 30 nt de longitud, al menos 50 nt de longitud, al menos 75 nt de longitud, al menos 100 nt de longitud, al menos 125 nt de longitud, al menos 150 nt de longitud, al menos 175 nt de longitud, o al menos 200 nt de longitud. En ciertas modalidades, la región intergénica entre la secuencia de nucleótidos heteróloga y el gen corriente abajo, puede ser modificada, independientemente una del otro, para ser de al menos 10 nt de longitud, al menos 20 nt de longitud, al menos 30 nt de longitud, al menos 50 nt de longitud, al menos 75 nt de longitud, al menos 100 nt de longitud, al menos 125 nt de longitud, al menos 150 nt de longitud, al menos 175 nt de longitud, o al menos 200 nt de longitud. En varias modalidades, la región no codificante de un gen deseado en un genoma viral, puede ser modificada, independientemente una del otro, para ser de al menos 10 nt de longitud, al menos 20 nt de longitud, al menos 30 nt de longitud, al menos 50 nt de longitud, al menos 75 nt de longitud, al menos 100 nt de longitud, al menos 125 nt de longitud, al menos 150 nt de longitud, al menos 175 nt de longitud, o al menos 200 nt de longitud. En ciertas modalidades, la región no codificante de un gen deseado, en un genoma viral, puede ser modificada, independientemente una del otro, para ser de al menos 10 nt de longitud, al menos 20 nt de longitud, al menos 30 nt de longitud, al menos 50 nt de longitud, al menos 75 nt de longitud, al menos 100 nt de longitud, al menos 125 nt de longitud, al menos 150 nt de longitud, al menos 175 nt de longitud, o al menos 200 nt de longitud. Cuando se inserta una secuencia de nucleótidos heteróloga, el efecto posicional y la manipulación de la región intergénica pueden ser usadas en combinación para lograr un efecto deseado. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser agregada o insertada en una posición seleccionada a partir del grupo que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, y 6, y la región intergénica entre la secuencia de nucleótidos heteróloga y próximo gen corriente abajo pueden ser alterados (ver la Tabla 3) . En una modalidad ejemplar, el gen F de hRSV se inserta en la posición 1 del vector PIV3 b/h, y la región intergénica entre el gen F y el gen N (es decir, el siguiente gen corriente debajo de G) se alteran a 177 nucleótidos. Muchas más combinaciones son abarcadas por la presente invención y algunas se muestran a manera de ejemplo en la Tabla 3.
Tabla 3. Ejemplos del modo de inserción de secuencia de nucleótidos heterólogas Posición 1 Posición 2 Posición 3 Posición 4 Posición 5 Posición 6 IGR2 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20 IGR 2?-40 21-40 21-40 21-40 21-40 Í-40 IGR 41-60 1-60 41-60 41-60 41 -60 41-60 IGR 61 -SO 61 -SO 61-80 61-80 61-80 1 -80 IGR 81-100 81-100 8.1-100 81-100 81-100 81-100 IGR 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120 IGR 121-140 121-140 1 1-140 121-140 121-140 121-340 IGR 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160 IGR 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180 ÍGR 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200 IGR 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220 IGR 221-240 221-240 221-240 221-240 221-240 221 -240 IGR 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260 IGR 261-280 261-280 2 1-2S0 261-280 261-280 261-280 TGR 281-300 781-300 2? 1-200 281-300 2SI- 0 28¡-200 a Región Intergénica, Medida en nucleótidos.
Dependiendo del propósito, (e, para tener inmunogenicidad fuerte) de la secuencia de nucleótidos heteróloga, la posición de la inserción y la longitud de la región intergénica de la secuencia de nucleótidos heteróloga insertada pueden ser determinadas mediante varios índices, incluyendo, pero no limitados a, la cinética de replicación y los niveles de expresión de proteínas o ARNm, medidos siguiendo los ejemplos no limitantes de análisis: análisis en placas, análisis o ensayo de foco fluorescente, análisis de centro infeccioso, análisis de transformación, análisis de dilución de punto final, eficiencia de chapado, microscopía electrónica, hemaglutinación, medición de actividad de enzimas virales, neutralización viral, inhibición de la hemoaglutinación, fijación del complemento, inmunoteñido, inmunoprecipitación e inmunotransferencia , análisis inmunosorbente enlazado a un enzima, detección de ácidos nucleicos (por ejemplo, análisis por transferencia Southern, análisis de transferencia Northern, análisis de transferencia Western) , curva de crecimiento, empleo de un gene reportero (por ejemplo usando un gene reportero, tal como la Proteína de Fluorescencia Verde (GFP) o la Proteína de Fluorescencia Verde mejorado (eGFP) , integrado al genoma viral del mismo modo como el gen heterólogo de interés, para observar la expresión de proteínas), o una combinación de los mismos. Los procedimiento para llevar a cabo estos análisis son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Flint et al., PRINCIPLES OF VIROLOGY MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press pp 25-56, el texto completo se incorpora aquí como referencia) , y los ejemplos no limitantes se dan en las secciones de Ejemplos, infra. Por ejemplo, los niveles de expresión pueden ser determinados infectando células en un cultivo con un virus de la invención y midiendo subsecuentemente el nivel de expresión de proteínas, por ejemplo, análisis de transferencia Western o ELISA usando anticuerpos específicos para el producto genético de la secuencia heteróloga, o midiendo el nivel de expresión del ARN, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern usando sondas específicas para la secuencia heteróloga. De manera similar, los niveles de expresión de la secuencia heteróloga pueden ser determinados infectando un modelo animal y midiendo el nivel de la proteína expresada de la secuencia heteróloga del virus recombinante de la invención en el modelo animal. El nivel de proteínas pueden ser medido obteniendo una muestra de tejido del animal infectado y sometiendo después el tejido a análisis de transferencia Western o ELISA, usando anticuerpos específicos para el producto genético de la secuencia heteróloga. Además, si se usa un modelo animal, el título de los anticuerpos producidos por el animal contra el producto genético de la secuencia heteróloga, puede ser determinado mediante cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados, incluyendo, pero no limitadas a, ELISA. Como las secuencias homologas pueden ser homologas a una secuencia de nucleótidos en el genoma del virus, deberá tenerse cuidado de que las sondas y los anticuerpos sean en verdad específicos para la secuencia heteróloga o su producto genético . En ciertas modalidades específicas, los niveles de expresión de la Proteína F de RSV o la forma quimérica PIV3 b/h RSV o PIV3 b/h hMPV o PIV3 b/h RSV F y hMPV F pueden ser determinados mediante cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados. Los niveles de expresión de la proteína F pueden ser determinados infectando células en un cultivo con el virus quimérico de la invención, y midiendo el nivel de expresión de la proteína, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Western o ELISA, usando anticuerpos específicos para la proteína F y/o la proteína G de hMPV, o midiendo el nivel de expresión de ARN, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern usando sondas específicas para el gen F y/o el gen G del metapneumovirus humano. De manera similar, los niveles de expresión de la secuencia heteróloga pueden ser determinados usando un modelo animal, infectando un animal y midiendo el nivel de proteína F y/o proteína G en el modelo animal. El nivel de proteína puede ser medido obteniendo una muestra de tejido del animal infectado y sometiendo después la muestra de tejido a análisis de transferencia Western o ELISA usando anticuerpos específicos para la proteína F y/o la proteína G de la secuencia heteróloga. Además. Si se usa un modelo animal, el título de los anticuerpos producidos por el animal contra la proteína F y/o la proteína G puede ser determinado mediante cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados, incluyendo pero no limitadas a, ELISA. La velocidad de replicación de un virus recombinante de la invención puede ser determinada mediante cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados . En ciertas modalidades, para facilitar la identificación de la posición óptima de la secuencia heteróloga en el genoma viral y la longitud de la región intergénica, la secuencia heteróloga codifica un gen reportero. Una vez que los parámetros óptimos son determinados, el gen reportero es reemplazado por una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un antígeno de elección. Cualquier gen reportero conocido por los artesanos experimentados puede ser usado con los métodos de la invención. Para más detalles, ver la sección 5.5. La velocidad de replicación del virus recombinante puede ser determinada mediante cualquier técnica estándar conocida por los artesanos expertos. La velocidad de replicación está representada por la velocidad de crecimiento del virus y puede ser determinada graficando el titulo viral durante el tiempo después de la infección. El titulo viral puede ser medido mediante cualquier técnica conocida por un artesano experimentado. En ciertas modas, una suspensión que contiene el virus se incuba con células que son susceptibles de infección por el virus. Los tipos de células que pueden ser usados con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, células Vero, células LLC-MK-2, células Hep-2, Células LF 1043 (HEL) células MRC-5, células WI-38, células 293 T, células QT 6, fibroblastos de embrionarios de pollos (CEF) , o células tMK. Después de la incubación del virus con las células, se determina el número de células infectadas. En ciertas modalidades especificas, el virus comprende un gene reportero. Por lo tanto el número de células que expresan el gene reportero es representativo del número de células infectadas. En una modalidad especifica, el virus comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica eGFP, y el número de células que expresan eGFP, es decir, el número de células infectadas con el virus, se determina usando FACS.
En ciertas modalidades, la velocidad de replicacion del virus recombinante de la invención, es al menos el 20% de la velocidad de replicacion del virus de tipo salvaje del cual se deriva el virus recombinante, bajo las mismas condiciones.
Mismas condiciones se refiere al mismo titulo inicial del virus, la misma cepa de células, la misma temperatura de incubación, el medio de crecimiento, el número de células o tras condiciones de prueba que pueden afectar la velocidad de replicación. Por ejemplo, la velocidad de replicación del PIV3 b/h con el gen F de RSV en la posición 1 es al menos 20% de la velocidad de replicación del bPIV3. En ciertas modalidades, la velocidad de replicación del virus recombinante de la invención es al menos 5% al menos 10% al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, de la velocidad de replicación del virus del tipo salvaje del cual se deriva el virus recombinante, bajo las mismas condiciones. En ciertas modalidades la velocidad de replicación del virus recombinante de la invención es al menos 5% al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 755, al menos 80%, al menos 90%, de la velocidad de replicación del virus de tipo salvaje del cual se deriva el virus recombinante bajo las mismas condiciones. En ciertas modalidades, la velocidad de replicación del virus recombinante de la invención está entre 5% y 20%, entre 10% y 40%, entre 25% y 50%, entre 40% y 75%, entre 50% y 80%, o entre 75% y 90% de la velocidad de replicación del virus de tipo salvaje del cual se deriva el virus recombinante, bajo las mismas condiciones.
En ciertas modalidades, el nivel de expresión de la secuencia heteróloga en el virus recombinante de la invención es al menos 20% del nivel de expresión de la proteina F del virus de tipo salvaje del cual se deriva el virus recombinante bajo las mismas condiciones. Mismas condiciones se refiere al mismo titulo inicial del virus, la misma cepa de células, la misma temperatura de incubación, medio de crecimiento, número de células, y otras condiciones de prueba que pueden afectar la velocidad de replicación. Por ejemplo, el nivel de expresión de la secuencia heteróloga de la proteina F del MPV en la posición 1 de bPIV3 es al menos 20% del nivel de expresión de la proteina F de bovino de bPIV3. En ciertas modalidades, el nivel de expresión de la secuencia heteróloga en el virus recombinante de la invención es al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, del nivel de expresión de la proteina F del virus de tipo salvaje del cual se deriva el virus recombinante, bajo las mismas condiciones. En ciertas modalidades, el nivel de expresión de la secuencia heteróloga en el virus recombinante de la invención es al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, del nivel de expresión de la proteina F del virus de tipo salvaje del cual se deriva el virus recombinante bajo las mismas condiciones. En ciertas modalidades, el nivel de expresión de la secuencia heteróloga en el virus recombinante de la invención está entre 5% y 20%, entre 10% y 40%, entre 25% y 50%, entre 40% y 75%, entre 50% y 80%, o entre 75% y 90% del nivel de expresión de la proteina F del virus de tipo salvaje del cual se deriva el virus recombinante bajo las mismas condiciones. 5.1.4. INSERCIÓN DE LA SECUENCIA DEL GEN HETEROLOGO EN EL GEN DE HN. La proteina responsable de las actividades de la hemaglutinina y la neuraminidasa del PIV son codificadas por un sólo gen, H . La proteina HN es una glicoproteina superficial principal del virus. Se ha mostrado que para una variedad de virus, tal como la parainfluenza, las proteínas hemaglutinina y neuraminidasa contienen un número de sitios antigénicos. Consecuentemente, esta proteína es un objetivo potencial de la respuesta inmune humoral después de la infección. Por lo tanto, la substitución de los sitios antigénicos de HN con una porción de una proteína extraña puede proporciona una vigorosa respuesta humoral contra este péptido extraño. Si se inserta una secuencia dentro de la molécula de HN, y se expresa en la superficie exterior del HN, será inmunogénica . Por ejemplo, un péptido derivado de gpl60 de HIV podría reemplazar un sitio antigénico de la proteína HN, resultando en una respuesta inmune humoral tanto para gpl60 y la proteina HN . En un enfoque diferente, la secuencia del péptido extraño puede ser insertada dentro del sitio antigénico sin eliminar ninguna secuencia viral. Los productos de expresión de tales constructos pueden ser útiles en vacunas contra el antigeno extraño, y pueden superar en verdad un problema discutido antes, de que la propagación del virus recombinante en el anfitrión vacunado. Una molécula de HN intacta con una substitución solamente en los sitios antigénicos puede permitir la función de HN y permite por lo tanto la construcción de un virus viable. Por lo tanto, este virus puede ser cultivado sin la necesidad de funciones auxiliares. El virus puede ser atenuado también en otras maneras para evitar cualquier peligro de escape accidental. Otras construcciones híbridas pueden ser fabricadas para expresar proteínas en la superficie celular o permitirles ser liberadas desde las células. Como una glicoproteína superficial, la HN tiene una secuencia de señal escindible de la amino terminal, necesaria para transportarla a la superficie celular, y una secuencia de carboxi terminal necesaria para el anclaje a la membrana. Para expresar una proteína extraña intacta sobre la superficie celular, puede ser necesario usar estas señales de HN para crear una proteína híbrida. En este caso, la proteína de fusión puede ser expresada como una proteina de fusión separada de un promotor interno adicional. Alternativamente, si sólo están presentes las señales de transporte y el dominio de anclaje a membrana está ausente, la proteina puede ser secretada fuera de la célula. 5.1.5. CONSTRUCCIÓN DE ARN BICISTRONICO . El ARNm bicistrónico podría ser construido para permitir la iniciación interna de la traducción de las secuencias virales y permitir la expresión de las secuencias codificantes de la proteína extraña desde el sitio de iniciación de la terminal regular. Alternativamente, una secuencia de ARNm bicistronica puede ser construida, en donde la secuencia viral es traducida a partir del marco de lectura abierta de terminal regular, en tanto que la secuencia extraña es iniciada a partir de un sitio interno. Ciertas secuencias de sitios de entrada de ribosomas (IRES) pueden ser utilizadas. Las secuencias IRES que se eligen serían suficientemente cortas para evitar la interferencia con las limitaciones de empacado de parainfluenza . Por lo tanto, es preferible que las IRES elegidas para tal enfoque bicistrónico no sean mayores que 500 nucleótidos de longitud, mientras que menos que 250 nucleótidos son de longitud ideal. En una modalidad específica, las IRES se derivan de un picornavirus y no incluyen ninguna secuencia de picornavirus adicional. Los elementos IRES preferidos incluyen, pero no se limitan al IRES de BiP de mamífero e IRES de virus de hepatitis C. Alternativamente, una proteína extraña puede ser expresada a partir de una nueva unidad transcripcional interna en la cual la unidad transcripcional tiene un sitio de iniciación y un sitio de poliadenilación . En otra modalidad, el gen extraño se inserta en un gen de PIV, de modo tal que la proteína expresada resultante es una proteína de fusión. 5.2. EXPRESIÓN DE PRODUCTOS GENÉTICOS HETEROLOGOS USANDO PLANTILLAS DE ADNc Y ARN RECO BINANTES Las plantillas recombinantes preparadas como se describe arriba pueden ser usadas en una variedad de maneras para expresar los productos de genes heterologos en células hospederas apropiadas o para crear virus quiméricos que expresan los productos de genes heterologos. En una modalidad, el ADNc recombinante puede ser usado para transfectar células hospederas apropiadas y el ARN resultante puede dirigir la expresión del producto genético heterólogo a noveles altos. Los sistemas de células hospederas los cuales proporcionan altos niveles de expresión incluyen líneas celulares continuas que suministran funciones viales tales como las líneas celulares infectadas con PIV, líneas celulares modificadas para complementar funciones de PIV, etc. En una modalidad alternativa de la invención, las plantillas recombinantes pueden ser usadas para transfectar lineas celulares que expresan una proteina polimerasa viral para lograr la expresión del producto genético heterólogo. Para este fin, las lineas celulares transformadas que expresan una proteina polimerasa tal como la proteina L pueden ser utilizadas como células hospederas adecuadas. Las células hospederas pueden ser modificadas del mismo modo para proporcionar otras funciones virales o funciones adicionales tales como HN, NP o N. En otra modalidad, un virus auxiliar puede proporcionar la proteina ARN polimerasa utilizada por las células para lograr la expresión del producto genético heterólogo. En aun otra modalidad, las células pueden ser transfectadas con vectores que codifican proteínas virales tales como las proteínas N , o NP, M2-1 y L. Una técnica diferente puede ser usada para detectar la expresión de los productos genéticos heterólogos (ver, por ejemplo., Flint et al., PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY , PATOGÉNESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press pp 25 - 56, el texto completo se incorpora aquí como referencia) . En un ensayo ejemplar, las células infectadas con el virus son permeabili zadas con metanol o acetona e incubadas con un anticuerpo construido contra los productos genéticos heterólogos. Un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo se agrega después. Este segundo anticuerpo se conjuga usualmente con un indicador de modo que la expresión de los productos genéticos heterólogos puede ser visualizada o detectada . 5.3. RESCATE DE LAS PARTÍCULAS VIRALES RECOMBINANTES Para preparar virus quiméricos, los ADNcs modificados, los ARNs virales o el ARN que codifica para el genoma de PIV y/o las proteínas extrañas en el sentido positivo o negativo, pueden ser usados para transfectar células que proporcionan proteínas virales y las funciones requeridas para la replicación y el rescate. Alternativamente, las células pueden ser transíectadas con el virus auxiliar antes, durante, o después de la transfección por la molécula de ADN o ARN que codifica el genoma de PIV y/o las proteínas extrañas. Los ADNs y ARNs de PIV plásmido recombinantes pueden ser replicados y recadaros en partículas virales infecciosas, mediante un número de técnicas conocidas en la técnica, y descritas en la Patente Norteamericana No. 5,166,957 expedida el 24 de noviembre de 1992; en la Patente Norteamericana No. 5,854,037 expedida el 29 de diciembre de 1998; en la Publicación de. la Patente Europea EP 0702085A1, publicada el 20 de febrero de 1996; en la Solicitud de la Patente Norteamericana con Número de serie 09/152,845; en las Publicaciones de las patentes Internacionales PCT WO97/12032 publicada el 3 de abril de 1997; W096/34625 publicada el 7 de noviembre de 1996; en la Publicación de la Patente Europea EP-A780475; WO 99/02657 publicada el 21 de enero de 1999; WO 98/53078 publicada el 26 de noviembre de 1998; WO 98/02530 publicada el 22 de enero de 1998; WO 99/15672 publicada el 1 de abril de 199; WO 98/13501 publicada el 2 de abril de 1998; WO 97/06270 publicada el 20 de febrero de 1997; y EPO 780 47SA1 publicada el 25 de junio de 1997, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En una modalidad de la presente invención, se pueden preparados los ARNs virales recombinantes que contienen las regiones no codificantes del ARN viral de hebra negativa esenciales para el reconocimiento por las polimerasas virales y las señales de empacado necesarias para generar viriones maduros. Existe un número de enfoques diferentes que pueden ser usados para aplicar las genéticas invertidas para rescatar los virus de ARN de hebra negativa. Primero, los ARNs recombinantes son sintetizados a partir de la plantilla de ADN recombinante y reconstituidos in vitro con complejo de polimerasa viral purificada para formar ribonucleopoteinas (RNPs) que pueden ser usadas para transfectar las células. En otro enfoque, una transfección más eficiente se logra si las proteínas de polimerasa viral están presentes durante la transcripción de los ARNs ya sea in vitro o in vivo. Con este enfoque, los ARNs sintéticos pueden ser transcritos a partir de plásmidos de ADNc que son ya sea cotranscritos in vitro con plásmidos de ADNc que codifican las proteínas de polimerasa, o transcritos in vivo en presencia de proteínas de polimerasa, es decir, en las células las cuales expresan transitoriamente o constitutivamente las proteínas de polimerasa. En los enfoques adicionales descritos aquí, la producción de virus quiméricos infecciosos puede ser replicada en sistemas de células hospederas que expresan la proteína polimerasa viral de PIV (por ejemplo, en sistemas de expresión de células virales/hospederas; líneas celulares transformadas, modificadas para expresar una proteína de polimerasa, etc.) de modo que los virus quiméricos infecciosos son rescatados. En este caso, no necesita ser utilizado el virus auxiliar puesto que esta función es proporcionada por las proteínas de polimerasa viral expresadas. De acuerdo con la presente invención, cualquier técnica conocida por aquellas personas con experiencia en la técnica, puede ser usada para lograr la replicación y el rescate de los virus recombinantes y quiméricos. Un .enfoque involucra suministrar las proteínas virales y las funciones requeridas para la replicación in vitro antes de transfectar las células. En tal modalidad, las proteínas virales pueden ser suministradas en forma del virus de tipo salvaje, el virus auxiliar, las proteínas virales purificadas o proteínas virales expresadas recombinantemente . Las proteínas virales pueden ser suministradas antes de, durante o después de la transcripción de los ADNcs o ARNs que codifican el virus quimérico. La mezcla completa puede ser usada para transfectar células hospederas. En otro enfoque, las proteínas virales y las funciones requeridas para la replicación pueden ser suministradas antes de o durante la transcripción de los ADNcs o ARNs sintéticos que codifican el virus quimérico. En tal modalidad, las proteínas virales y las funciones requeridas para la replicación, se suministran en forma del virus de tipo salvaje, el virus auxiliar, extractos virales, los ADNcs o ARNs sintéticos que expresan las proteínas virales se introducen en las células hospederas vía infección o transíección . Esta infección/transfección toma lugar antes de o simultáneamente a la introducción de los ADNcs o ARNs sintéticos que codifican los virus quiméricos. En un enfoque particularmente deseable, las células modificadas para expresar todos los genes virales de los virus recombinantes o quiméricos de la invención pueden resultar en la producción de virus quiméricos infecciosos que contienen el genotipo deseado; eliminando por lo tanto la necesidad de un sistema de selección. Teóricamente, una persona puede reemplazar cualquiera de los seis genes o parte de cualquiera de los seis genes que codifican las proteínas estructurales del PIV con una secuencia extraña. Sin embargo, una parte necesaria de esta ecuación es la habilidad para propagar el virus defectuoso (defectuoso porque un producto genético viral normal está perdido o alterado) . Un número de posibles enfoques está disponible para superar este problema. En un enfoque, un virus que. tiene una proteína mutante puede ser cultivado en líneas celulares que se construyen para expresar constitutivamente la versión del tipo salvaje de la misma proteína. Mediante este medio, la línea celular complementa la mutación en el virus. Las técnicas similares pueden ser usadas para construir líneas celulares transformadas que expresan constitutivamente cualquiera de los genes de PIV. Estas líneas celulares las cuales se fabrican para expresar la proteína viral pueden ser usadas para complementar el defecto en el virus recombinante y propagarlo consecuentemente. Alternativamente, ciertos sistemas de rango hospederas naturales pueden estar disponibles para propagar el virus recombinante . En aún otra modalidad, las proteínas virales y las funciones requeridas para la replicación pueden ser suministradas como material genético en forma de ADNcs o ARNs sintéticos de modo que estos son co-transcritos con los ADNcs o ARNs sintéticos que codifican el virus quimérico. En un enfoque particularmente deseable, los plásmidos que expresan el virus quimérico y la polimerasa viral y/u otras funciones virales son cotransfectadas en células hospederas. Por ejemplo, los plásmidos que codifican el ARN de PIV genómico o antigénico, ya se el tipo salvaje o modificado, pueden ser cotransfectados en células hospederas con los plásmidos que codifican las proteínas NP, o N, M2-1 o L de la polimerasa viral de PIV. Alternativamente, el rescate del virus PIV3 b/h quimérico puede ser logrado mediante el uso de el Virus de Vaccinia Modificado de Ankara (MVA) que codifica la T2 ARN polimerasa, o una combinación de MVA y los plásmidos que codifican las proteínas de polimerasa (N, P y L) . Por ejemplo, MVA-T7 o (escarlatina de pollo) Fowl Pox-T7 pueden ser infectados en células Vero, células LLC-MK-2, células Hep-2, células LF 1043 (HEL) , células tM , LLC-MK2, HUT 292, FRHL-2(rhesus), FCL-1 (mono verde), WI-38 (humanas), MCR-5 (humanas) células 293 T, células QT 6, células QT 35 y células CEF. Después de la infección con MVA-T7 o (escarlatina de pollo) Fow Pox-T2, un ADNc de PIV3 b/h antigenómico de longitud completa puede ser transfectado en las células HeLa o Vero junto con los plásmidos de expresión que codifican a NP, P, M2-1, y L. Alternativamente, la polimerasa puede ser suministrada mediante la transfección de plásmidos. Las células y el sobrenadante de células pueden ser recolectados subsecuentemente y sometidos a un sólo ciclo de congelación-descongelación. El lisado de células resultante puede ser usado entonces para infectar una monocapa fresca de células HeLa o Vero en presencia de 1-beta-D-arabino-furanosilcitosina (para C) , un inhibidor de la replicación del virus vaccinia, para generar una reserva de virus. El sobrenadante y las células de estas placas pueden ser recolectados entonces, congelados-desccongelados una vez, y la presencia de partículas del virus bPIV3 detectada por inmunoteñido de las placas de virus usando el antisuero específico para PIV3. Otro enfoque para propagar el virus recombinante involucra el co-cultivo con el virus del tipo salvaje. Esto podría ser hecho simplemente tomando el virus recombinante y coinfectando las células con este y otro tipo de virus del tipo salvaje (preferiblemente una cepa de vaccine) . El virus de tipo salvaje debería complementar el producto genético del virus defectuoso y permitiría el desarrollo tanto del virus de tipo salvaje y recombinante. Alternativamente, un virus auxiliar puede ser usado para apoyar la propagación del virus recombinante . En otro enfoque, las plantillas sintéticas podrían ser replicadas en células co-ínfectadas con virus recombinantes que expresan la proteína polimerasa del virus de PIV. De hecho, este método puede ser usado para rescatar los virus infecciosos recombinantes de acuerdo con la invención. Para este fin, la proteína polimerasa de PIV puede ser expresada en cualquier sistema vector de expresión/células hospederas, incluyendo pero no limitados a vectores de expresión virales (por ejemplo virus vaccinia, adenovirus, baculovirus, etc.) o líneas celulares que expresan una proteína de polimerasa (por ejemplo, ver Krystal et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 83:2709-2713) . Además, la infección de células hospederas que expresan todas las proteínas de PIV puede resultar en la producción de partículas virales quiméricas infecciosas. Debería notarse que puede ser posible construir un virus recombinante sin alterar la viabilidad del virus. Estos virus alterados serían entonces competentes para el cultivo y no necesitarían las funciones auxiliares para replicarse. 5.4. ATENUACIÓN DE LOS VIRUS RECOMBINANTES Los virus recombinantes de la invención pueden ser además modificados genéticamente para exhibir un fenotipo atenuado. En particular, los virus recombinantes de la invención exhiben un fenotipo atenuado en un sujeto al cual se administra el virus como una vacuna. La atenuación puede ser lograda mediante cualquier método conocido por un artesano experimentado. Sin estar ligados por la teoría, el fenotipo atenuado del virus recombinante puede ser originado, por ejemplo, usando un virus que no se replica bien de manera natural en anfitriones deseados (por ejemplo, usando un vector de PIV3 de bovino en humanos), por la replicación reducida del genoma viral, por habilidad reducida del virus para infectar células hospederas, o por la habilidad reducida de las proteínas virales para ensamblarse en una partícula viral infecciosa con relación a la cepa del tipo salvaje del virus. La viabilidad de ciertas secuencias del virus, tales como la secuencia líder y la trasera pueden ser evaluadas usando un análisis de minigenoma (ver la sección 5.5.1) . Los fenotipos atenuados de un virus recombinante pueden ser evaluado mediante cualquier método conocido por los artesanos (ver, por ejemplo, la sección 5.5) . Un virus candidato puede, por ejemplo, ser evaluado por su habilidad para infectar anfitriones o por la velocidad de replicación en un sistema de cultivo celular. En ciertas modalidades, un sistema de minigenoma se usa para evaluar el virus atenuado cuando el gen que ha sido alterado es N, P, L, M2 o una combinación de los mismos. En ciertas modalidades, las curvas de crecimiento a diferentes temperaturas se usan para evaluar el fenotipo atenuado del virus. Por ejemplo, un virus atenuado es capaz de crecer a 35°C, pero no a 39°C o 40°C. En ciertas modalidades, diferentes líneas celulares pueden ser usadas para evaluar el fenotipo atenuado del virus. Por ejemplo, un virus atenuado puede ser capaz de crecer solos en lineas celulares de mono pero no en lineas celulares de humano, o los títulos alcanzables del virus en diferentes líneas celulares son diferentes para el virus atenuado. En ciertas modalidades, la replicación viral en el tracto respiratorio de un modelo animal pequeño, incluyendo pero no limitados a, hámsteres, ratas de algodón, ratones y cobayos, se usa para evaluar los fenotipos atenuados del virus. En otras modalidades, la respuesta inmune inducida por el virus, incluyendo pero no limitadas a, los títulos de anticuerpos (por ejemplo, analizados mediante el análisis de neutralización por reducción de placas o ELISA) se usa para evaluar los fenotipos atenuados del virus. En una modalidad específica, el análisis de neutralización por reducción de placas o ELISA se lleva a cabo a una dosis baja. En ciertas modalidades, puede utilizarse la habilidad del virus recombinante para producir como respuesta los síntomas patológicos en un modelo animal. Una habilidad reducida del virus para producir como respuesta los síntomas patológicos en un sistema de modelo animal es indicativa de su fenotipo atenuado. En una modalidad específica, los virus candidatos se evalúan en un modelo de mono por la infección nasal, indicada por la producción de moco .
Los virus de la invención pueden ser atenuados de modo tal que una o más de las características funcionales del virus están deterioradas. En ciertas modalidades, la atenuación se mide en comparación con la cepa del tipo salvaje del virus del cual se deriva el virus atenuado. En otras modalidades, la atenuación se determina comparando el crecimiento de un virus atenuado en diferentes sistemas de anfitriones. Por lo tanto, para un ejemplo no limitante, se dice que un PIV3 de bovino está atenuado cuando el crecimiento en un anfitrión humano, si el PIV3 de bovino en el anfitrión o hospedero humano se reduce en comparación con el crecimiento del PIV3 de bovino en un anfitrión bovino. En ciertas modalidades, el virus atenuado de la invención es capaz de infectar un anfitrión, es capaz de replicarse en un anfitrión de modo tal que se producen partículas virales infecciosas. En comparación con la cepa de tipo salvaje, sin embargo, las cepas atenuadas crecen a títulos menores o crecen más lentamente. Cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados puede ser usada para determinar la curva de crecimiento del virus atenuado y compararla con la curva de crecimiento del virus de tipo salvaje. Para métodos ejemplares ver, la sección Ejemplo, infra. En una modalidad específica, el virus atenuado crece a un título menor que 105 pfu/mL, menor que 104 pfu/mL, menor que 103 pfu/mL, o menor que 102 pfu/mL en células Vero bajo las condiciones como se describen.
En ciertas modalidades, el virus atenuado de la invención (por ejemplo, un PIV3 quimérico) no puede replicarse en células humanas asi como lo hace el virus del tipo salvaje (por ejemplo, el PIV3 de tipo salvaje) . Sin embargo, el virus atenuado puede replicarse bien en una linea celular que carece de las funciones de interferona, tal como las células Vero. En otras modalidades, el virus atenuado de la invención es capaz de infectar a un anfitrión, de replicarse en el anfitrión, y de causar que las proteínas del virus de la invención sean insertadas en la membrana citoplasmática, pero el virus atenuado no causa que el anfitrión produzca nuevas partículas virales infecciosas. En ciertas modalidades, el virus atenuado infecta al anfitrión, se replica en el anfitrión, y causa que las proteínas virales sean insertadas en la membrana citoplasmática de del anfitrión con la misma eficiencia como el virus de mamífero del tipo salvaje. En otras modalidades, la habilidad del virus atenuado para causar que las proteínas virales sean insertadas en la membrana citoplasmática en las células hospederas se reduce en comparación con el virus del tipo salvaje. En ciertas modalidades, la habilidad del virus de mamífero atenuado para replicarse en el anfitrión se reduce en comparación con el virus del tipo salvaje. Cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados puede ser usada para determinar si un virus es capaz de infectar células de mamífero, de replicarse dentro del hospedero, y de causar que las proteínas virales sean insertadas en la membrana citoplasmática del anfitrión. Para métodos ilustrativos ver la sección 5.5. En ciertas modalidades, el virus atenuado de la invención es capaz de infectar un anfitrión. En contraste con el PIV de tipo salvaje, sin embargo, el PIV atenuado no puede ser replicado en el anfitrión. En una modalidad específica, el virus atenuado puede infectar un anfitrión y puede causara que el anfitrión inserte las proteínas virales en sus membranas citoplasmáticas , pero el virus atenuado es incapaz de ser replicado en el anfitrión. Cualquier método conocido por los artesanos experimentados puede ser usado para evaluar si el virus atenuado puede infectar las células y ha causado que. el anfitrión u hospedero inserte las proteínas virales en sus membranas citoplasmáticas. En ciertas modalidades, la habilidad de los virus de mamífero atenuados, para infectar a un anfitrión u hospedero se reduce en comparación con la habilidad del virus de tipo salvaje para infectar al mismo anfitrión. Cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados puede ser usada para determinar si un virus es capaz de infectar a un anfitrión. Para métodos ilustrativos ver la sección 5.5.
En ciertas modalidades, las mutaciones (por ejemplo mutaciones de aminoácidos) se introducen en el genoma del virus para generar un virus con un fenotipo atenuado. Las mutaciones (por ejemplo, mutaciones de aminoácidos) pueden ser introducidas en el gen N, el gen P, el gen F, el gen 2 , el gen M2-1, el gen M2-2, el gen SH, el gen G o el gen L del virus recombinante . Las mutaciones pueden ser adiciones, substituciones, eliminaciones o combinaciones de las mismas. En modalidades específicas, se introduce una sola mutación de eliminación de aminoácidos para las proteínas N, P, L o M2, la cual pueden ser seleccionada por su funcionalidad en el sistema de análisis de minigenoma y evaluada por la funcionalidad prevista en el virus. En modalidades más específicas, la mutación de aminoácido es una mutación sensible al frío. En otras modalidades, la mutación de aminoácido es una mutación sensible al calor. En una modalidad, se retiran los sitios de fosforilación principales de la proteína P del virus. En otra modalidad, una mutación o mutaciones se introducen en el gen L del virus para generar una cepa sensible a la temperatura. En aun otra modalidad, el sitio de escisión del gen F es mutado de manera tal que la escisión no ocurre u ocurre a una eficiencia muy baja. En otras modalidades, se introducen eliminaciones en el genoma del virus recombinante. En modalidades más especificas una eliminación puede ser introducida en el gen N, el gen P, el gen F, el gen M2, el gen M2-1, el gen M2-2, el gen SH, el gen G o el gen L del virus recombinante. En modalidades especificas, la eliminación está en el gen 2 del virus recombinante de la presente invención. En otras modalidades especificas, la eliminación está en el gen SH del virus recombinante de la presente invención. En aun otra modalidad especifica, tanto el gen M2 y el gen SH están eliminados. En ciertas modalidades, se altera la región intergénica del virus recombinante. En una modalidad, se altera la longitud de la región intergénica . Ver la Sección 5.1.2. Para ejemplos ilustrativos. En otra modalidad, las regiones intergénicas están desordenadas desde el extremo 5' al 3' del genoma viral . En otras modalidades, la posición del genoma o los genes del virus recombinantes está cambiada. En una modalidad, el gen F o G se mueve al extremo 3' del genoma. En otras modalidades, el gen N se mueve al extremo 5' del genoma. En ciertas modalidades, la atenuación del virus se logra reemplazando un gen del virus de tipo salvaje con un gen del un virus de una especie diferente. En modalidades ilustrativas, el gen N, el gen P, el gen F, el gen M2 , el gen M2-1, el gen M2-2, el gen SH, el gen HN o el gen L de bPIV3 están reemplazados con el gen N, el gen P, el gen F, el gen M2, el gen M2-1, el gen M2-2, el gen SH, el gen HN o el gen L, respectivamente de hPIV3. En otras modalidades ilustrativas, el gen N, el gen P, el gen F, el gen M2, el gen M2-1, el gen M2-2, el gen SH, el gen HN o el gen L de hPIV3 están reemplazados con el gen N, el gen P, el gen F, el gen M2 , el gen M2-1, el gen M2-2, el gen SH, el gen HN o el gen L, respectivamente, de bPIV3. En una modalidad preferida, la atenuación del virus se logra reemplazando uno o más genes asociados con la polimerasa (por ejemplo, N, P, L o M2) con genes de un virus de una especie diferente. En Ciertas modalidades , ta atenuación Qjel virus se logra reemplazando o eliminando uno o más dominios de una proteína del virus de tipo salvaje con los dominios derivados de la proteína correspondiente de un virus de una especie diferente. En una modalidad ilustrativa, el ectodominio de una proteína F de bPIV3 se reemplaza con un ectodominio de una proteína F de un metapneumovirus . En una modalidad preferida, uno o más dominios específicos de la proteína L, N o P se reemplazan con los dominios de las proteínas correspondientes de un virus de una especie diferente. En otra modalidad ilustrativa, el dominio transmembrana de la proteína F está eliminado, de modo que se expresa una proteína F soluble. En ciertas modalidades de la invención, la secuencia líder o remolque del virus recombinante de la invención puede ser modificado para lograr un fenotipo atenuado. En ciertas modalidades, más especificas, la secuencia líder y/o remolque es reducida en longitud con relación al virus de tipo salvaje, en al menos 1 nucleótido, al menos 2 nucleótidos, al menos 3 nucleótidos, al menos 4 nucleótidos, al menos 5 nucleótidos, o al menos 6 nucleótidos. En ciertas otras modalidades, más específicas, la secuencia del líder y/o trasera del virus recombinante esta mutada . En una modalidad específica, la secuencia líder y la secuencia trasera son 100% complementarias una con la otra. En otras modalidades, 1 ' nucleótido^ 2 nucleótidos, 3" nucleótidos , 4 nucleótidos , b nucleótidos, 6 nucleótidos, 7 nucleótidos, 8 nucleótidos, 9 nucleótidos, o 10 nucleótidos son no complementarios unos con otros cuando los restantes nucleótidos de las secuencias líder y remolque o trasera son complementarias una con la otra. En ciertas modalidades, los nucleótidos no complementarios son idénticos unos con otros. En ciertas otras modalidades, los nucleótidos no complementarios son diferentes unos de otros. En otras modalidades, si el nucleótidos no complementario 'en la secuencia trasera es purina, el nucleótido correspondiente en la secuencia líder es también una purina. En otras modalidades, si el nucleótido no complementario ' en la secuencia trasera es pirimidina, el nucleótido correspondiente en la secuencia líder es también una purina.
Cuando se usa una vacuna atenuada viva, su seguridad debe ser considerada también. Las vacunas no deben causar enfermedades. Cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica que puede fabricar una vacuna segura puede ser usada en la presente invención. Además de las técnicas de atenuación, pueden ser usadas otras técnicas. Un ejemplo no limitante es usar un gen heterólogo soluble que no puede ser incorporado en la membrana de los viriones. Por ejemplo, una sola copia del gen F de RSV, una versión del gen de RSV que carece de los dominios transmembrana y citosólico, pueden ser usadas . Puesto que ño puede 5e~r incorporado eñ la membrana ote" los viriones, no se espera que el tropismo cambie. Varios análisis pueden ser usados para evaluar la seguridad de una vacuna. Ver la sección 5.5, infra. Particularmente, los análisis de gradientes de sucrosa y de neutralización pueden ser usados. Un análisis de gradiente de sucrosa puede ser usado para determinar si la proteina heteróloga está insertada en los viriones. Si la proteina heteróloga se inserta en los viriones, los viriones deberán ser analizados con respecto a su habilidad para originar los síntomas aun si la cepa progenitora no causa síntomas. Sin estar ligado por la teoría, si la proteína heteróloga se incorpora en los viriones, el virus puede haber adquirido nuevas propiedades, posiblemente patológicas. 5.5. MEDICIÓN DEL TÍTULO VIRAL, EXPRESIÓN DE SECUENCIAS ANTIGÉNICAS, INMUNOGENICIDAD Y OTRAS CARACTERÍSTICAS DE LOS VIRUS QUIMÉRICOS. Un número de ensayos o análisis puede ser empleado de acuerdo con la presente invención para determinar la velocidad de crecimiento de un virus recombinante o quimérico en un sistema de cultivo celular, un sistema de modelo animal o en un sujeto. Un número de análisis pueden ser empleados además de acuerdo con la presente invención para determinar los requerimientos de los virus quiméricos y recombinantes para viriones . Los análisis descritos aquí pueden ser usados para analizar el titulo viral durante el tiempo, para determinar las características de crecimiento del virus. En una modalidad específica, el título viral se determina obteniendo una muestra de las células infectadas o el sujeto infectado, preparando una dilución serial de la muestra e infectar una monocapa de células que son susceptibles de infección con el virus a una dilución del virus que permita la emergencia de placas individuales. Las placas pueden ser contabilizadas entonces y el título viral expresado como unidades formadas por placa por mililitro de la muestra. En una modalidad específica de la invención, la velocidad de crecimiento de un virus de la invención en un sujeto se estima por el titulo de anticuerpos contra el virus en el sujeto. Sin estar ligados por la teoría, el título del anticuerpo en el sujeto refleja no solamente el título viral en el sujeto sino también la antigenicidad. Si la antigenicidad del virus es constante, el incremento del título de anticuerpos en el sujeto puede ser usado para determinar la curva de crecimiento del virus en el sujeto. En una modalidad preferida, la velocidad de crecimiento del virus en animales o humanos se evalúa mejor muestreando fluidos biológicos de un anfitrión en múltiples purrtrcrs—cte ti~emp"o cte~sprré~s de 1~5 infección y midiendo el titulo viral. La expresión de secuencias genéticas heterólogas en un sistema de cultivo celular o en un sujeto puede ser determinada mediante cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados. En ciertas modalidades, la expresión del gen heterólogo se mide cuantificando el nivel de la transcripción. El nivel de la transcripción puede ser medido mediante el análisis de transferencia Northern o mediante RT-PCR usando sondas o cebadores, respectivamente, que son específicos para la transcripción. La transcripción puede ser distinguida del genoma del virus porque el virus está en la orientación antisentido, en tanto que la transcripción esta en la orientación sentido. En ciertas modalidades, la expresión del gen heterólogo se mide cuantificando el nivel del producto proteinico del gen heterólogo. El nivel de la proteina puede ser medido mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpos que son específicos para la proteína. En una modalidad específica, el gen heterólogo es etiquetado con una etiqueta peptídica. La etiqueta peptídica puede ser detectada usando anticuerpos contra la etiqueta peptídica. El nivel de etiqueta peptídica detectado es representativo del nivel de la proteína expresada desde el gen heterólogo. Alternativamente, la proteína expresada desde el gen freirerólogo puede 'ser aislada en vi tud de Xa etiqueta peptídica. La cantidad de la proteína purificada se correlaciona con el nivel de expresión del gen heterólogo. Tales etiquetas peptídicas y métodos para el aislamiento de proteínas fusionadas con lates etiquetas peptídicas son bien conocidos en la técnica. Una variedad de etiquetas peptídicas conocidas en la técnica pueden ser usadas en la modificación del gen heterólogo, tales como, pero no limitadas a, las regiones constantes de inmunoglobulina, la secuencia de polihistídina (Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, en Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1-3(1994-1998). Ed. Por Ausubled, F.M., Brent, R., Kunston, R.E. Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. y Struhl, K. Publicada por John Wiley and sons, Inc., EUA, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience) , glutationa S-transferasa (GST: Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229), la proteína de enlace a maltosa de E. coli (Guan et al., 1987, Gene 67:21-30), varios dominios de enlace a celulosa (Patente norteamericana 5,496,934; 5,202,247; 5,137,819; Tomme et al., 1994, Protein Eng. 7:117-123), y el epítope FLAG (Short Protocols in Molecular Biology, 1999, Ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. Unidad 10.11) etc. Otras etiquetas peptídicas son reconocidas por las parejas de enlace específicas y facilitan por lo tanto el aislamiento por enlace d~e fffxrnnáHel a 3ra areja c¾ enlace , la cual esta preferiblemente inmovilizada y/o sobre un soporte sólido. Como será apreciado por aquellas personas experimentadas en la técnica, muchos métodos pueden ser usados para obtener la región codificante de las etiquetas peptídicas mencionadas arriba, incluyendo pero no limitadas a, clonación de ADN, amplificación de ADN, y métodos sintéticos. Algunas de las etiquetas peptídicas y los reactivos para su detección y aislamiento están disponibles comercialmente . Las muestras de un sujeto pueden ser obtenidas mediante cualquier método conocido por los artesanos experimentados. En ciertas modalidades, las muestras consisten de aspirado nasal, raspados de garganta, lavados de flemas o bronqueo alveolares. 5.5.1. CONSTRUCTOS MINIGENÓMICOS Pueden ser generados constructos o construcciones de minireplicones para contener un gen reportero antisentido. Cualquier gen reportero conocido por los artesanos experimentados puede ser usado con la invención. En una modalidad especifica, el gen reportero es CAT . En ciertas modalidades, el gen reportero puede estar flanqueado por el líder de bPIV o hPIV de sentido negativo enlazado a la ribozima de hepatitis delta (hep-d Ribo) y a las señales de terminación de T7 polimerasa (TABLA 7), y la secuencia trasera de loPTV-d~TTPTV^r"Hüe¾í¾a por el promotor de T7-ARÑ polimerasa.
En ciertas modalidades, los plásmidos que codifican los minireplicones son transíectados a células hospederas. Las células hospederas expresan la T7 ARN polimerasa, el gen N, el gen P, el gen L, y el gen M2-1. En ciertas modalidades, las células hospederas son transíectadas con los plásmidos que codifican la T7 ARN polimerasa, el gen N, el gen P, el gen L, y el gen M2-1. En otras modalidades, los plásmidos que codifican los minireplicones son transíectados a células hospederas y las células hospederas son infectadas con un virus auxiliar. El nivel de expresión del gen reportero y/o su actividad pueden ser analizados mediante cualquier método conocido por loa artesanos experimentados, tales como, pero no limitados a, los métodos descritos en la sección 5.5.6. En ciertas modalidades, más especificas, los minireplicones comprenden los siguientes elementos, en el orden listado, T7 ARN Polimerasa o ARN polimerasa I, la secuencia líder, el inicio del gen, GFP, la secuencia remolque o trasera, la secuencia de ribozima de Hepatitis delta o la secuencia de terminación de la ARN polimerasa I. Si se usa T7 como la ARN polimerasa, la secuencia de ribozima de Hepatitis delta debería ser usada como la secuencia de terminación. Si s~e txs~a 3ra-ARN po1imeTasa Tr, Ta secuencia de terminación de Ta ARN polimerasa I puede ser usada como una señal de terminación. Dependiendo del sistema de rescate, la secuencia de los minireplicones puede estar en la orientación sentido o antisentido. En ciertas modalidades, la secuencia líder puede ser modificada con relación a la secuencia líder de tipo salvaje del virus de la invención. La secuencia líder puede ser precedida opcionalmente por un AC. La secuencia promotora de T7 puede estar con o sin un doblete o triplete G, en donde el doblete o triplete de G proporciona transcripción incrementada . En una modalidad específica, las células son infectadas con un virus de la invención en T0. 24 horas después de TO, las células son evaluadas por la expresión del gen reportero.
Si se usa un producto del gen reportero fluorescente (por ejemplo, GFP) , la expresión del gen reportero puede ser evaluada usando FACS . En otra modalidad, las células son transíectadas con seis plásmidos en T=0 horas. Las células son recolectadas entonces en T=40 horas y T=60 horas y analizadas por la expresión de CAT o GFP . En aún otra modalidad especifica, las células son infectadas con MVA-T7 a TO. 1 hora después. En TI, las células se infectan con constructos de minireplicones . 24 horas de"Spues ote TtT, Tas células se infectan con ü"ñ virus de Ta invención. 72 horas después de TO, las células son evaluadas por la expresión del gen reportero. Si se usa el producto del gen reportero fluorescente (por ejemplo GFP), la expresión del gen reportero puede ser evaluada usando FACS. 5.5.2. MEDICIÓN DE LA INCIDENCIA DE LA VELOCIDAD DE INFECCIÓN. La incidencia de la infección puede ser determinada mediante cualquier método bien conocido en la técnica, incluyendo pero no limitados a, la evaluación de muestras clínicas (por ejemplo, raspados nasales) por la presencia de una infección, por ejemplo, los componentes de hMPV, RSV, hPIV, o bPIV/hPIV pueden ser detectados mediante el análisis de inmunofluorescencia (IFA) usando un anticuerpo del antígeno anti-hMPV, un anticuerpo del antigeno anti-RSV, un anticuerpo del antigeno anti-hPIV, y/o un anticuerpo que es especifico para el producto genético de la secuencia de nucleótidos heteróloga, respectivamente. En ciertas modalidades, las muestras que contienen células intactas pueden ser procesadas directamente, en tanto que los aislados son células intactas deberán ser cultivados primero en una linea celular permisiva (por ejemplo, células Hep-2). En una modalidad ilustrativa, las suspensiones de células cultivadas son quitadas de en medio mediante ceir rifugaciorr por ejemplo, a 3tnXxg por 5 minutos a" temperatura ambiente, seguido por un lavado con PBS, pH 7.4 (libre de Ca++ y Mg++) bajo las mismas condiciones. Las pelotillas o pellets de células son resuspendidas en un volumen pequeño de PBS para análisis. Los aislados clínicos primarios que contienen las células intactas se mezclan con PBS y se someten a centrifugación a 300xg por 5 minutos a la temperatura ambiente. El moco es removido de la interfaz con una punta de pipeta estéril y las pelotillas de células se lavan una vez con PBS bajo las mismas condiciones, las pelotillas se resuspenden entonces en un volumen pequeño de PBS para análisis. Cinco a diez microlitros de cada suspensión celular se colocan en forma de manchas por pozo de 5 mm sobre laminas de vidrio o portaobjetos supercurados con HTC de 12 pozos, se lavan con acetona y se les permite secarse al aire. Las láminas o portaobjetos se fijan en acetona fría (-20°C) por 10 minutos. Las reacciones se bloquean agregando PBS - 1% BSA por cada pozo seguida por una incubación por 10 minutos a la temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavan tres veces en PBS - 0.1% T een-10 y se secan al aire. Diez microlitros de cada reactivo de anticuerpo primario se diluyen a 250 ng/mL en amortiguador de bloqueo, se colocan en forma de manchas por pozo y las reacciones se incuban en un ambiente humidificado a 37°C por 30 minutos. Las laminas se lavan después extreTrs±vHmT= te en tre~s c~a~rg~a~s de PBrS~= 0 T% Tween-2~0 y se secan al aire. Diez microlitros del reactivos de anticuerpo conjugado secundario apropiado se diluyen a 250 ng/ml en amortiguador de bloqueo, se colocan en forma de manchas por pozo respectivo y las reacciones se incuban en un ambiente humidificado a 37°C por 30 minutos adicionales. Las láminas se lavan entonces en tres cargas de PBS. 0.1% Tween-20. Cinco microlitros de PBS-50% glicerol-10 mM Tris pH 8.0-1 mM EDTA se colocan en forma de manchas por pozo de reacción y las laminas se montan con cubreobjetos. Cada pozo de reacción se analiza subsecuentemente mediante microscopía de fluorescencia a una resolución de 200X usando un filtro B-2A (EX 450-490 nm) . Las reacciones positivas se califican teniendo un trasfondo de autoflorescencia obtenido de las células no teñidas o células con el reactivo secundario sólo. Las reacciones RSV positivas se caracterizan por la fluorescencia brillante acentuada con pequeñas inclusiones en el citoplasma de las células infectadas . 5.5.3. MEDICIÓN DEL TÍTULO DE SUERO El titulo del suero de anticuerpos puede ser determinado mediante cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo, pero no limitados a, la cantidad del anticuerpos o fragmentos del anticuerpo en muestras de suero puede ser cuantificada mediante un ELISA de tipo sánd ich. En pocas p~a~i~a~b~ra~s~ ' s~l ELTrSA consiste de revestir placas microtituladoras durante toda a la noche a 4°C con un anticuerpo que reconoce el anticuerpo o fragmentos del anticuerpo en el suero. Las placas se bloquean entonces durante aproximadamente 30 minutos a la temperatura ambiente con PBS-Tween-0.5% BSA. Las curvas estándar se construyen usando el anticuerpo purificado o fragmentos del anticuerpo, diluidos en PBS-BSA-BSA, y las muestras se diluyen en PBS-BSA. Las muestras y los estándares se agregan a pozos duplicados de las placas de ensayo y se incuban durante aproximadamente 1 hora a la temperatura ambiente. Enseguida, el anticuerpo no enlazado se lava con PBS-TWEEN y el anticuerpo enlazado se trata con un anticuerpo secundario etiquetado (por ejemplo, IgG antihumano de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante) durante aproximadamente 1 hora a la temperatura ambiente. El enlace del anticuerpo etiquetado se detecta agregando un substrato cromatogénico especifico para la etiqueta y midiendo la velocidad de producción del substrato, por ejemplo, mediante un espectrómetro. La concentración del anticuerpo o los niveles de fragmentos del anticuerpo en el suero se determinan por comparación de la velocidad de producción del substrato para las muestras, con la velocidad de producción del substrato para la curva estándar. 5.5.4. ESTUDIOS DE DESAFÍO Este análisis se usa para determinar la habilidad de los virus recombinantes de la invención y de las vacunas de la invención para prevenir infecciones virales del tracto respiratorio inferior en un sistema de modelo animal, incluyendo pero no limitados a ratas de algodón, hámsteres Dorados de Siria, y ratones Balb/c. Los virus recombinantes y/o las vacunas pueden ser administrados mediante ruta intravenosa (IV) mediante la ruta intramuscular (IM) o mediante la ruta intranasal (IN) . El virus recombinante y/o las vacunas pueden ser administrados mediante cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados. Este análisis se usa también para correlacionar la concentración de suero de los anticuerpos con una reducción en el titulo de los pulmones del virus al cual se enlazan los anticuerpos.
En el día O, los grupos de animales, incluyendo pero no limitados a ratas de algodón (Sigmodon hispidis, con peso promedio de 100 g) y hámsteres (por ejemplo, hámsteres Dorados de Siria) se inoculan con el virus recombinante o la vacuna de interés o BSA mediante inyección intramuscular, mediante inyección intravenosa, o mediante la ruta intranasal . Antes, o concurrentemente con, o después de la administración del virus recombinante o la vacuna de la invención, los animales se infectan con el virus de tipo salvaje en donde el virus de tipo salvaje es el virus contra el cual fue generada la vacuna. En ciertas modalidades, los animales se infectan con el virus de tipo salvaje al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 día, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas o al menos 4 semanas subsecuentes a las administración del virus recombinante y/o la vacuna de la invención. En una modalidad preferida, los animales se infectan con el virus del tipo salvaje 21 días subsecuentes a la administración del virus recombinante y/o la vacuna de la invención. En otra modalidad preferida, los animales se infectan con el virus del tipo salvaje 28 días subsecuentes a la administración del virus recombinante y/o la vacuna de la invención. Después de la infección, los animales se sacrifican, y si tejido nasal en forma de espiral y/o el tejido pulmonar se recolectan y se determinan los títulos del virus mediante los análisis adecuados, por ejemplo, análisis en placas y análisis TCID50. La albúmina de suero de bovino (BSA) 10 mg/kg puede ser usada como un control negativo. Las concentraciones del anticuerpo en el suero en el momento del desafío pueden ser determinadas usando un ELISA tipo sándwich. 5.5.5. PRUEBAS CLÍNICAS Las vacunas de la invención o los fragmentos de las mismas que han sido evaluados en análisis in vitro y modelos animales, pueden ser evaluados adicionalmente con respecto a la seguridad, tolerancia, inmunogenicidad, infectividad y farmacocinética en grupos de voluntarios humanos saludables, normales, incluyendo todos los grupos de edades. En una modalidad preferida, los voluntarios humanos, saludables son infantes de aproximadamente 6 semanas de edad o mayores, y adultos. Los voluntarios son administrados intranasalmente, intramuscularmente, intravenosamente o mediante un sistema de administración pulmonar en una sola dosis de un virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención. Múltiples dosis del virus y/o de la vacuna de la invención pueden ser requeridas en niños cero negativos de 6 a 60 meses de edad. Múltiples dosis del virus y/o la vacuna de la invención pueden requerirse también en los primeros seis meses de vida para estimular la inmunidad sistémica y local y para superar la neutralización por el anticuerpo materno. En una modalidad preferida, se usa un régimen de dosificación primario a 2, 4 y 6 meses de edad y una dosis potenciadota al inicio del segundo año de vida. Un virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención pueden ser administrados aisladamente o concurrentemente con las vacunas pediátricas recomendadas a las edades correspondientes. En una modalidad preferida, se usan ensayos clínicos de doble ciego distribuidas aleatoriamente, controladas por placebo. En una modalidad específica, se usa un programa de aleatorizacion generado por computadora. Por ejemplo, cada sujeto en el estudio será enrolado como una unidad individual y se le asignara un número de caso único. Múltiples sujetos dentro de una sola familia serán tratados como individuos para el propósito de enrolamiento. Progenitores/guardianes, sujetos, e investigadores permanecerán ciegos para cuales sujetos del grupo de tratamiento han sido asignados durante la duración del estudio. Los estudios serológicos y virológicos se llevaran a cabo por personal de laboratorio cegado con respecto a la asignación de los grupos de tratamiento. Sin embargo, se espera que el aislamiento del virus de la vacuna del fluido de los raspados nasales obtenido después de la vacunación identificara las probables vacunas para el equipo del laboratorio de virológica. El equipo serológico y virológico y el grupo de serologia serán prevenidos de adquirir cualquier conocimiento de los resultados de los cultivos . Cada voluntario se monitorea preferiblemente por 12 horas antes de recibir el virus recombinante y/o la vacuna de la invención, y cada voluntario será monitoreado durante al menos quince minutos después de recibir la dosis en un sitio clínico. Después, los voluntarios serán monitoreados como pacientes externos en los días 1-14, 21, 28, 35, 42, 49 y 56 después de la dosis. En una modalidad preferida, los voluntarios se monitorean durante el primer mes después de cada vacunación como pacientes externos. Todos los eventos adversos serios relacionados con la vacuna serán reportados durante la duración completa de la prueba. Un evento adverso serio se define como un evento que 1) resulta en la muerte, 2) es inmediatamente riesgoso para la vida, 3) resulta en incapacidad permanente o substancial, 4) resulta en o prolonga la hospitalización del paciente, 5) resulta en una anomalía congénita, 6) es un cáncer, o 7) es el resultado de una sobredosis de la vacuna de estudio. Los eventos adversos serios que no se relacionan con la vacuna serán reportados iniciando el día de la primera vacunación (Día 0) y continuaran por 30 días enseguida de la última vacunación. Los eventos adversos serios no relacionados con la vacuna no serán reportados durante 5 a 8 meses después de los 30 días que reportan el periodo enseguida de la última vacunación. Una dosis de vacuna/placebo no será dada si un niño tiene un evento serio adverso relacionado con la vacuna enseguida de la dosis previa. Cualquier evento adverso que no se considere relacionado con la vacuna, pero el cual es de importancia, será discutido por el monitor del estudio clínico y el monitor medico antes de la que se haga la decisión sobre dar otra dosis . Se recolectan muestras de sangre vía un catéter residente o venopunción directa (por ejemplo, usando tubos Vacutainer de 10 mL red-top) en los siguientes intervalos: (1) antes de administrar la dosis de virus recombinante de la invención y/o la vacuna de la invención; (2) durante la administración de la dosis del virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención; (3) 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, y 48 horas después de administrar la dosis del virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención; y (4) 3 días, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, 35 días, 42 días, 49 días, y 56 días después de administrar la dosis del virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención. En una modalidad específica, se obtiene un total de 5 extracciones de sangre (3-5 mi cada uno) , cada uno justo antes de la primera, la tercera y la dosis potenciadota y aproximadamente un mes enseguida de la tercera dosis y la dosis potenciadota de la administración de la vacuna o el placebo. Se permite a las muestras coagularse a la temperatura ambiente y el suero se recolecta después de la centrifugación.
El suero se evalúa con respecto a los niveles del anticuerpo de inhibición de la hemoaglutinación del suero, especifico de la cepa (HAI) contra el virus de la invención. Otros indicadores de la inmunogenicidad tales como IgG, IgA, o los anticuerpos neutralizantes se evalúan también. Las respuestas del anticuerpo del suero a una o más de las otras vacunas dadas pueden ser medidas concurrentemente. La cantidad de anticuerpos generados contra el virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención, en las muestras, puede ser cuantificada mediante ELISA. La concentración de los niveles del anticuerpo en el suero de los voluntarios se corrigen substrayendo el nivel del suero antes de la dosis (nivel básico) de los niveles de suero a cada intervalo de recolección después de la administración de la dosis del virus recombinante de la invención y/o la vacuna de la invención. Para cada volumen se calculan los parámetros farmacocinéticos de acuerdo al enfoque independiente del modelo (Gibaldi et al., 1982, Pharmacokinetics , 2da edición, Marcel Dekker, Nueva York) a partir de las concentraciones corregidas del anticuerpo o los fragmentos del anticuerpo. Los lavados nasales obtenidos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 días después de cada dosis de vacuna/placebo serán cultivados para detectar el derramamiento del virus de la vacuna de la invención. En una modalidad preferida, los lavados nasales obtenidos 7 días después de cada dosis de la vacuna/placebo se cultivan. Un raspado nasofaríngeo, un raspado de garganta, o un lavado nasal se usan para determinar la presencia de otros virus en los voluntarios con enfermedad febril atendida médicamente (temperatura rectal mayor que o igual a 38.89 °C ( 102 ° F) ) y/o garrotillo, bronquiolitis o neumonía en cualquier momento durante el estudio. Las muestras se embarcan en hielo seco al sitio destinado para el estudio. Se usan análisis para el aislamiento y cuantificación del virus de la vacuna de la invención y los análisis de inmunoteñido usando MAb para identificar el virus de la vacuna de la invención (los ejemplos de tales análisis se dan en las secciones de Ejemplos, infra) . Los especímenes de los lavados nasales pueden ser evaluados con respecto a otros virus u respuestas inmunes incluyendo IgG, IgA y anticuerpo de neutralización . 5.5.6. GENES REPORTEROS En ciertas modalidades, los ensayos o análisis para la medición de la expresión del gen reportero en cultivos de tejido o en modelos animales pueden ser usados con los métodos de la invención. La secuencia de nucleótidos del gen reportero se clona en el virus, tal como bPIV, hPIV, o PIV3 b/h, en donde (i) la posición del gen reportero se cambia y (ii) la longitud de las regiones intergénicas que flanquean al gen reportero son variadas. Se evalúan diferentes combinaciones para determinar la velocidad óptima de expresión del gen reportero y la velocidad de replicación óptima del virus que comprende el gen reportero. En ciertas modalidades, los constructos o construcciones minigenómicos se generan para incluir un gen reportero. La construcción de los constructos minigenómicos se describe en la sección 5.5.1. La abundancia del producto del gen reportero puede ser determinada mediante cualquier técnica conocida por los artesanos experimentados. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, análisis de transferencia Northern o análisis de transferencia Western usando sondas o anticuerpos, que son específicos para el gene reportero. En ciertas modalidades, el gen reportero emite una señal fluorescente que puede ser detectada en un FACS. El FACS puede ser usado para detectar células en las cuales se expresa el gen reportero. Las técnicas para practicar el aspecto especifico de esta invención emplearan, a menos que se indique de otra manera, las técnicas convencionales de la biología molecular, microbiología, y manipulación y producción de ADN recombinante , las cuales se practican rutinariamente por una persona con experiencia en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición; ADN Cloning, Volúmenes I y II (Glover, Ed. 1985); y Transcription and Translation (Hames y Higgins, Eds . 1984) . La actividad bioquímica del producto del gen reportero representa el nivel de expresión del gen reportero. El nivel total de la actividad del gen reportero depende también de la velocidad de replicación del virus recombinante de la invención. Por lo tanto, para determinar el verdadero nivel de expresión del gen reportero a partir del virus recombinante, el nivel de expresión total debería ser dividido entre el título del virus recombinante en el cultivo celular o el modelo animal. Los genes reporteros que pueden ser usados con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, los genes listados en la Tabla 4 de abajo: Tabla 4: Genes reporteros y las propiedades bioquímicas de los productos respectivos de los genes reporteros Gene Reportero Actividad proteinita y medición CAT (cloramfenicol acetiltransferasa) Transfiere grupos acetil radioactivos al cloramfenicol o detección mediante cromatografía en capa fina o autoradiografía GAL (b-galactosidasa) Hidroliza galactosidos incoloros para dar productos coloreados GUS (b-glucoronidasa) Hidroliza glucoronidos incoloros para dar productos coloreados LUC (luciferasa) Oxida la luciferina, emitiendo fotones GFP (proteína fluorescente verde) proteína fluorescente sin substrato SEAP (fosfatasa alcalina secretada) reacción de luminiscencia con substratos adecuados o con substratos que generan cromóforos HRP (peroxidasa de rábano picante) en presencia de óxido de hidrógeno, oxidación de la 3, 3', 5,5 '- tetrametilbencidina para formar un complejo coloreado AP (fosfatasa alcalina) reacción de luminiscencia con substratos adecuados o con substratos que generan cromóforos La abundancia del gen reportero puede ser medida mediante, inter alia, análisis de transferencia Western o análisis de transferencia Northern o cualquier otra técnica usada para la cuantificación de la transcripción de una secuencia de nucleótidos, la abundancia de su ARNm, sus proteínas (ver Short Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., (editores), John Wiley & Sons, Inc. 4ta edición, 1999).
En ciertas modalidades, la actividad del producto del gen reportero se mide como una lectura de la expresión del gen reportero desde el virus recombinante . Para la cuantificación de la actividad del producto del gen reportero, pueden ser investigadas las características bioquímicas del producto del gen reportero (ver la Tabla 1) . Los métodos para medir la actividad bioquímica de los productos del gen reportero son bien conocidos por los artesanos experimentados. Una descripción más detallada de los genes reporteros ilustrativos que pueden ser usados con los métodos de la invención se expone abajo. LUCIFERASA Las luciferasas son enzimas que emiten luz en presencia de oxígeno y un substrato (luciferina) y las cuales han sido usadas para · la formación de imágenes en tiempo real, de baja luminosidad del la expresión de genes en cultivos celulares, células individuales, organismos completos, y organismos transgénicos (revisado por Creer & Salía, 2002, Luminescence 17 (1) :43-74) . Como se usa aquí, el término "luciferasa" cuando se usa con relación a la invención, se destina para abarcar todas las luciferasas, o las enzimas recombinantes derivadas de las luciferasas que tienen actividad de luciferasa. Los genes de luciferasa de luciérnagas han sido caracte izados, por ejemplo, a partir de las especies de Photinus y Lucióla (ver, por ejemplo, la Publicación de la Patente Internacional No. WO 95/25798 para Photinus pyralis, la Solicitud de la Patente Europea No. ?? 0 524 448 para Lucióla cruciata y Lucióla lateralis, y Devine et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1173 (2) : 121-132 para Lucióla mingrelica. Otros genes de luciferasa eucariótica incluyen, pero no se limitan a, la panzy de mar (Renilla reniformes, ver, por ejemplo, Lorenz et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88 (10) : 4438-4441, y el gusano fulgurante (Lampyris noctiluca , ver, por ejemplo, Sula-Newby et al., 1996, Biochem J. 313:761-767) . Los sistemas bacteriales luciferina-luciferasa incluyen, pero no se limitan a los genes lux bacterianos de Photorhabolus luminescens terrestres (ver, por ejemplo, Manukhov et al., 2000, Genética 36 ( 3 ) : 322-30 ) y las bacterias marinas Vibrio fischeri y Vibrio harveyi (ver, por ejemplo, Miyamoto et al., 1988, J. Biol Chem 263 (26) : 13393-9; y Cohn et al., 1983, Proc Nati Acad Sci EUA., 80(l) :120-3, respectivamente. Las luciferasas abarcadas por la presente invención también incluyen las luciferasas mutantes descritas en la Patente Norteamericana No., 6,265,177 por Squirrell et al., la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE La proteina fluorescente verde ("GFP") es una proteína de 238 aminoácidos con los aminoácidos 65 a 67 involucrados en la formación del cromóforo que no requiere substratos o cofactores adicionales para fluorescer (ver, por ejemplo, Prasher et al., 1992, Gene 111:229-233; Yang et al., 1996, Nature Biotechnol. 14:1252-1256; y Cody et al., 1993, Biochemistry 32:1212-1218) . Como se usa aquí, el término "proteína fluorescente verde" o "GFP" cuando se usa con relación a la invención, se destina para abarcar todas las GFPs (incluyendo las varias formas de GFPs que exhiben colores diferentes al verde) , o las enzimas recombinantes derivadas de las GFPs que tienen actividad de GFP. El gen nativo de la GNP se clono a partir del medusa bioluminiscente, Aequorea victoria (ver, por ejemplo, Morin et al., 1972, J. Cell Physiol. 77:313-318) . La GFP del tipo salvaje tiene un pico de excitación mayor a 395 nm y un pico de excitación menor a 470 nm. El pico de absorción a 470 nm permite el monitoreo de los niveles de GFP usando grupo de filtros de fluoresceina isocianato (FITC) estándares. Los mutantes del gen de GFP han sido encontrados útiles para mejorar la expresión y para modificar la excitación y la fluorescencia. Por ejemplo, las GFPs mutantes con alanina, glicina, isoleucina, o tronina substituidas por serina en las posición 65, resultan en GFPs mutantes con desplazamiento en la excitación máxima y fluorescencia mayor que la protelna del tipo salvaje cuando se excitan a 488 nm (ver, por ejemplo, Heim et al., Nature 373:6663-6664); la Patente norteamericana No. 5,625,948; Delagrave et al., 1995, Biotechnology 13:151-154; Cormack et al., 1996, Gene 173:33-38; y Cramer et al., 1996, Nature Biotechnol. 14:315-31 ). La habilidad para excitar la GFP a 488 nm permite el uso de GFP con equipo estándar de clasificación celular por activación fluorescente ("FACS"). En otra modalidad, las GFPs se aislan de organismos diferentes que la medusa, tales como pero no limitados a, la trinitaria marina, Renilla reriformis. La EGFP es una variante desplazada al rojo de la GFP del tipo salvaje (3-5) la cual ha sido optimizada para una fluorescencia más brillante y expresión superior en células de mamíferos. (Máximo de excitación = 488 nm; máximo de emisión = 507 nm) . La EGFP codifica la variante GFPmutl la cual contiene la substitución de doble aminoácido del Phe leu y Ser-65 a Thr. La secuencia codificante del gen EGFP contiene más de 190 cambio de bases silenciosos los cuales corresponden preferencias de uso de codones humanos. BETA GALACTOSIDASA La beta galactosidasa ("ß-gal") es una enzima que cataliza la hidrólisis de las b-galactosidasas , y los análogos de galactósidos o-nitrofenil-p-D-galactopiranosido ("ONPG") y clorofenol rojo-b-D-galactopiranósido ("CPRG") (ver, por ejemplo, Nielsen et al., 1983 Proc Nati Acad Sci EUA 80(17) :5198-5202; Eustice et al., 1991, Biotechniques 11:739-742; y Henderson et al., 1986, Clin Chem 32:1637-1641) . El gen de ß-gal funciona también como un gen reportero ya que el producto proteínico es extremadamente estable, resistente a la degradación proteolitica en Usados celulares, y fácilmente analizable. Cuando el ONPG se usa como el substrato, la actividad de la ß-gal puede ser cuantificada con un espectrómetro o un lector de microplacas. Como se usa aquí, el término "beta galactosidasa" o "ß-gal" se usa con relación a la invención se destina para abarcar todas las b-gals, incluyendo los productos genéticos de lacZ, o las enzimas recombinantes derivadas de b-gals las cuales tienen actividad de b-gal. El gen de b-gal funciona también como un gen reportero porque el producto proteínico es extremadamente estable, resistente a la degradación proteolitica en Usados celulares, y fácilmente analizado. En una modalidad donde el ONPG es el substrato, la actividad de la b-gal puede ser cuantificada con un espectrómetro o lector de microplacas para determinar la cantidad de ONPG convertido a 420 nm. En una modalidad, cuando el CPRG es el substrato, la actividad de la b-gal puede ser cuantificada con un espectrómetro o lector de microplacas para determinar la cantidad de CPRG convertido a 570 a 595 nm.
CLORAMFENICOL ACETILTRANSFERASA La cloramfenicol acetil transferasa ("CAT") se usa comúnmente como un gen reportero en sistemas de células de mamíferos porque las células de mamíferos no tienen niveles detectables de actividad de CAT . El análisis o ensayo de CAT involucra incubar extractos celulares con cloramfenicol o cofactores radioetiquetados , separar los materiales iniciales del producto, por ejemplo, mediante cromatografía en capa fina ("TLC"), seguido por conteo por centelleo (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,726,041, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Como se usa aquí, el término "cloramfenicol acetiltransferasa" o "CAT" cuando se usa con relación a la invención, se destina para abarcar todas las CATs, o las enzimas recombinantes derivadas de CAT, las cuales tienen actividades de CAT. En tanto que es preferible que un sistema de gen reportero el cual no requiere procesamiento por células, radioisótopos, y separaciones cromatográficas , sería más sensible a la selección de alta eficiencia. El CAT como un gen reportero puede ser preferible en las situaciones donde la estabilidad del gen reportero es importante. Por ejemplo, la proteína reportera CAT tiene una vida media in vivo de aproximadamente 50 horas, lo cual es ventajoso cuando se desea un tipo de cambio dinámico versus acumulativo de los resultados . FOSFATASA ALCALINA SECRETADA La enzima fosfatase alcalina secretada ("SEAP") es una forma truncada de fosfatasa alcalina en la cual la escisión del dominio transmembrana de la proteina le permite ser secretada desde las células en el medio circundante. Como se usa aquí, el término "fosfatasa alcalina secretada" o "SEAP" cuando se usa con relación a la invención, se destina para abarcar todas las SEAP o las enzimas recombinantes derivadas de SEAP, las cuales tienen actividades de fosfatasa alcalina. La actividad de la SEAP puede ser detectada mediante una variedad de métodos incluyendo, pero no limitados a, medición de la catálisis de un substrato fluorescente, inmunoprecipitación, HPLC, y detección radiométrica . El método luminiscente se prefiere debido a una sensibilidad incrementada sobre los métodos de detección calorimétrica. Las ventajas de usar SEAP son que no se requiere una etapa de lisis de ululas porque la proteina SEAP es secretada fuera de las células, lo cual facilita la automatización del muestreo y los procedimientos de análisis. Un análisis a base de células que utiliza SEAP para usarse en la evaluación a base de células de los inhibidores de la proteasa del virus de Hepatitis C se describe en la Patente Norteamericana No. 6, 280,940, por Potts et al., la cual se incorpora por la por la presente en su totalidad. 5.5.7. SISTEMAS DE CULTIVO CELULAR, HUEVOS EMBRIONADOS Y MODELOS ANIMALES. Los sistemas de cultivo celular conocidos en la técnica pueden ser usados para propagar o evaluar las actividades de los virus de la presente invención. (Ver, por ejemplo, Flint et al., PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY , PATOGÉNESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press pp 25-29, el texto completo se incorpora aquí como referencia) . Los ejemplos de tales sistemas de cultivo celular incluyen pero no se limitan a, cultivos de células primarias que se prepararon a partir de tejidos animales (por ejemplo, cultivos celulares derivados de ríñones de mono, la placenta embrionaria, los ríñones y el prepucio humanos, y embriones de pollo o ratón) , cepas de células diploides que consisten de una población homogénea de un sólo tipo y pueden dividirse hasta 100 veces antes de morir (por ejemplo, cultivos celulares derivados de embriones humanos, tales como la cepa WI-38 derivada de pulmones embrionarios humanos) ; y líneas celulares continuas consistentes de un sólo tipo celular que pueden ser propagadas indefinidamente en cultivos (por ejemplo, células HEp-2, células Hela, células Vero, células L y 3T3 y células BHK-21) .
Los virus de la invención pueden ser propagados también en huevos de pollos embrionados. A 5 a 14 días después de la fertilización, se taladra un orificio en el cascaron y se inyecta un virus en el sitio apropiado para si replicación. Cualquiera de los modelos animales conocidos en la técnica puede ser usado en la presente invención para lograr varios propósitos, tales como determinar la efectividad y seguridad de las vacunas de la invención. Los ejemplos de tales modelos animales incluyen, pero no se limitan a, ratas de algodón (Sigmodon hispidis) , hámsteres, ratones, monos, y chimpancés. En una modalidad preferida, se usan hámsteres Dorados de Siria. 5.5.8. ANÁLISIS DE NEUTRALIZACIÓN Los análisis de neutralización pueden llevarse a cabo para tratar la importante cuestión de la seguridad de si las glicoproteinas heterólogas de la superficie se incorporan en los viriones, los cual puede resultar en un fenotipo de tropismo del virus alterado. Como se usa aqui, el término "tropismo" se refiere a la afinidad de un virus por un tipo de células particular. El tropismo se determina usualmente por la presencia de receptores celulares sobre células específicas, lo cual permite a un virus entrar a ese y sólo a ese tipo de células particular. Un análisis de neutralización usando ya sea MAbs o la glicoproteína superficial heterologa (un ejemplo no limitante es la proteína F de un virus de ARN de hebra negativa) o el antisuero policlonal que comprende anticuerpos contra la glicoproteina superficial heteróloga. Se evalúa la diferente dilución de los anticuerpos para observar si el virus quimérico de la invención puede ser neutralizado. La glicoproteina superficial heteróloga no estaría presente sobre la superficie de los viriones en una cantidad suficiente para resultar en cualquier enlazamiento del anticuerpo y la neutralización . 5.5.9. ANÁLISIS DE GRADIENTES DE SUCROSA La cuestión de si las proteínas heterólogas se incorporan en los viriones puede ser investigada adicionalmente mediante el uso de un análisis bioquímico. Lisados de células infectadas pueden ser divididos en gradientes de sucrosa al 20%-60%, varias fracciones se recolectan y se analizan por la presencia y la distribución de las proteínas heterólogas y las proteínas vectores, mediante transferencia Western. Las fracciones y las proteínas virales pueden ser analizadas también con respecto a los títulos máximos del virus mediante análisis de placas. Los ejemplos de análisis por gradientes de sucrosa se dan en la sección 23, infra. Cuando las proteínas heterólogas están asociadas con los viriones, estas co-migran con los viriones. 5.6. FORMULACIONES DE VACUNAS USANDO LOS VIRUS QUIMÉRICOS La invención abarca formulaciones de vacunas que comprenden los virus de ARN de hebra negativa modificados de la presente invención. Los virus de PIV recombinantes de la presente invención pueden ser usados como un vehículo para expresar epítopes extraños que inducen una respuesta protectora contra una variedad de patógenos. En una modalidad específica, la invención abarca el uso de los virus de bPIV recombinantes o de hPI atenuados que han sido modificados, en formulaciones de vacunas para conferir protección contra la infección de hPIV. Las preparaciones de vacunas de la invención abarcan vacunas multivalentes , incluyendo preparaciones de vacunas bivalentes y trivalentes. Las vacunas bivalentes y trivalentes de la invención pueden ser administradas en forma de un vector de PIV que expresa cada secuencia heteróloga antigénica o dos o más vectores de PIV que codifica cada uno diferentes secuencias antigénicas heterologas. Por ejemplo, un primer PIV quimérico que expresa una o más secuencias antigénicas heterologas puede ser administrado en combinación con un segundo PIV quimérico que expresa una o más secuencias antigénicas heterologas, en donde las secuencias antigénicas heterologas en el segundo PIV quimérico son diferentes de las secuencias antigénicas heterologas en el primer PIV quimérico. Las secuencia antigénicas heterologas en el primero y el segundo PIV quiméricos pueden ser derivadas del mismo virus pero codifican diferentes proteínas, o se derivadas de diferentes virus. En una modalidad preferida, las secuencias antigénicas heterólogas en el prime Priv. Quimérico se derivan del virus sincitial respiratorio, y las secuencias antigénicas heterólogas en el segundo PIV quimérico se derivan del metapneumovirus humano. En otra modalidad preferida, las secuencias antigénicas heterólogas en el primer PIV quimérico se derivan del virus sincitial respiratorio, y las secuencias antigénicas heterólogas en el segundo PIV quimérico se derivan del pneumovirus aviar. En ciertas modalidades preferidas, las formulaciones de vacunas de la invención se usan para proteger contra infecciones originadas por un virus de ARN de hebra negativa, incluyendo pero no limitados a, virus de influenza, virus de parainfluenza , virus sincitial respiratorio, y metapneumovirus de mamífero (por ejemplo, el metapneumovirus humano) . Más específicamente, las formulaciones de vacunas de la invención se usan para proteger contra infecciones por un metapneumovirus humano y/o un pneumovirus aviar. En ciertas modalidades, las formulaciones de vacunas de la invención se usan para proteger contra infecciones por (a) un metapneumovirus humano y un virus sincitial respiratorio; y/o (b) un pneumovirus aviar y un virus sincitial respiratorio. En una modalidad preferida, la invención proporciona moléculas proteínicas o proteínas virales específicas del metapneumovirus o fragmentos funcionales de las mismas, codificadas por un ácido nucleótido de acuerdo a la invención. Las moléculas proteinicas útiles se derivan por ejemplo de cualquiera de los genes o de los fragmentos genómicos derivables de un virus de acuerdo a la invención. Las proteínas F, SH, y/o G o los- fragmentos antigénicos de las mismas son particularmente útiles para la inclusión como antígenos o inmunógenos de subunidad, pero pueden ser usados también virus completos desactivados. También particularmente útiles son aquellas substancias proteinicas que son codificadas por fragmentos de ácidos nucleicos recombinantes que son identificados por análisis patogénicos, por supuesto se prefieren aquellas que están dentro de los enlaces preferidos y metes de ORFs útiles en análisis filogenéticos, en particular para producir como respuesta el anticuerpo específico de MPV o las respuestas de las células T, ya sea in vivo (por ejemplo, para propósitos protectores o para proporcionar anticuerpos de diagnóstico) o in vivo (por ejemplo, mediante tecnología de despliegue del fago u otra técnica útil para generar anticuerpos sintéticos) . Una composición farmacéutica que comprende un virus, un ácido nucleico, moléculas proteinicas o fragmentos de las mismas, un antígeno y/o un anticuerpo, de acuerdo a la invención, puede ser usado, por ejemplo en un método para el tratamiento o prevención de una infección de MPV y/o una enfermedad respiratoria, que comprende proporcionar a un individuo con una composición farmacéutica de acuerdo a la invención. Esta es más útil cuando dicho individuo es un humano, específicamente cuando dicho humano es menor de 5 años de edad, ya que es más probable que tales infantes y niños jóvenes sean infectados por un MPV humano como se proporciona aquí. Generalmente, en la fase aguda los pacientes sufrirán de síntomas respiratorios superiores que predisponen a enfermedades respiratorias y otras. También pueden ocurrir enfermedades respiratorias menores, que predisponen a condiciones más serias. Las composiciones de la invención pueden ser usadas para el tratamiento de individuos con inmunidad comprometida incluyendo pacientes de cáncer, receptores de transplantes y mayores de edad. La invención proporciona también los métodos para obtener un agente antiviral útil en el tratamiento de enfermedades del tacto respiratorio que comprenden establecer un cultivo celular o un animal experimental que comprende un virus de acuerdo a la invención, tratar dicho cultivo o animal con un agente antiviral candidato, y determinar el efecto de dicho agente sobre dicho virus o su infección de dicho cultivo o animal. La invención proporciona también el uso de un agente antiviral de acuerdo a invención para la preparación de una composición farmacéutica, en particular, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades del tracto respiratorio, cuando son causadas específicamente por infección por PV o enfermedades relacionadas, y proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente antiviral de acuerdo a la invención, útil en un método para el tratamiento o prevención de una infección por MPV o enfermedades respiratorias, dicho método comprende proveer a un individuo con tales composiciones farmacéuticas. En ciertas modalidades de la invención, la vacuna de la invención comprende el metapneumovirus de mamífero. En ciertas modalidades, más específicas, el metapneumovirus de mamífero es un metapneumovirus de humano. En una modalidad preferida, el metapneumovirus de mamífero a ser usado en una formulación de vacuna tiene un fenotipo atenuado. Para los métodos para lograr un fenotipo atenuado, ver la sección 5.4. La invención proporciona formulaciones de vacunas para la prevención y el tratamiento de infecciones con PIV, RSV, APV, y/o hMPV. En ciertas modalidades, la vacuna de la invención comprende los virus recombinantes y quiméricos de la invención. En ciertas modalidades, el virus está atenuado. En una modalidad especifica, las vacunas comprende APV y la vacuna se usa para la prevención y el tratamiento de infecciones por hMPV en humanos. Sin estar ligados por la teoría, a causa del alto grado de homología de la proteína F de APV con la proteína F de hMPV, la infección con APV resulta en la producción de anticuerpos en el anfitrión que reaccionaran de manera cruzada con el hMPV y protegerán al anfitrión de infecciones con hMPV y enfermedades relacionadas.
En otra modalidad específica, la vacunas comprende hMPV y las vacunas se usa para al prevención y el tratamiento para la infección por APV en aves, tales como, pero no limitadas a, en pavos. Sin estar ligados por la teoría, a causa del alto grado de homología de la proteína F de APV con la proteína F del hMPV, la infección con hMPV resultará en la producción de anticuerpos en el anfitrión que reaccionaran de manera cruzada con el APV y protegerán al anfitrión de infecciones con APV y enfermedades relacionadas. En ciertas modalidades, las formulaciones de vacunas de la invención se usan para proteger contra infecciones por (a) metapneumovirus humano y virus de parainfluenza humana; y/o (b) un pneumovirus aviar y un virus de parainfluenza humana y las enfermedades relacionadas. En ciertas modalidades, las formulaciones de vacunas de la invención se usan para proteger contra infecciones por (a) metapneumovirus humano, un virus sincitial respiratorio, y un virus de parainfluenza humana; y/o un pneumovirus aviar, un virus sincitial respiratorio, y un virus de parainfluenza humana y las enfermedades relacionadas. En ciertas modalidades, las formulaciones de vacunas de la invención se usan para proteger contra infecciones por un metapneumovirus humano, un virus sincitial respiratorio, y un virus de parainfluenza humana. En ciertas otras modalidades, las formulaciones de vacunas de la invención se usan para proteger contra infecciones por un pneumovirus aviar, un virus sincitial respiratorio, y un virus de parainfluenza humana, y las enfermedades relacionadas. Debido al alto grado de homología entre las proteínas F de las diferentes especies virales, para comparaciones de las secuencias de aminoácidos ejemplares ver la Figura 1, las formulaciones de vacunas de la invención pueden ser usadas para la protección de virus diferentes del cual se derivó la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína F. en una modalidad ejemplar específica, las formulaciones de vacunas contienen un virus que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga derivada de un pneumovirus- avial tipo A, y las formulaciones de vacunas se usan para proteger de infección por el pneumovirus aviar tipo A y el pneumovirus-aviar tipo B. En otra modalidad específica, las formulaciones de vacunas contienen un virus que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga derivada de un subgrupo C del pneumovirus aviar, y las formulaciones de vacunas se usan para proteger de la infección por el subgrupo C del virus de pneumovirus aviar y el subgrupo D del pneumovirus aviar. La invención abarca formulaciones de vacunas para ser administradas a humanos y animales, que son útiles para proteger contra PIV, hMPV, APV, (incluyendo APV C y APV D) , influenza, RSV, virus de Sendai, paperas, virus de laringotraqueitis , virus de simio 5, virus de papiloma humano, asi como otros virus y las enfermedades relacionadas. La invención abarca además las formulaciones de vacunas para ser administradas a humanos y animales, que son útiles para proteger contra infecciones por metapneumovirus humano, infecciones por pneumovirus aviar y las enfermedades relacionadas. En una modalidad, la invención abarca las formulaciones de vacunas que son útiles contra los agentes que causan enfermedades en animales domésticos incluyendo el virus de la rabia, el virus de leucemia felina (FLV) y el virus de irritación canina. En aun otra modalidad, la invención abarca formulaciones de vacunas que son útiles para proteger al ganado contra el virus de estomatitis vesicular, el virus de la rabia, el virus de la peste bovina el virus de viruela del cerdo, y otras, para proteger animales salvajes contra el virus de la rabia. Los virus atenuados generados mediante el enfoque de la genética invertida pueden ser usados en las formulaciones de vacunas y farmacéuticas descritas aquí. Las técnicas de genética invertida pueden ser usadas también para modificar las mutaciones adicionales para los otros genes virales importantes para la producción de vacunas. Por ejemplo, las mutaciones en la región no codificante de 5' pueden afectar la traducción del ARNm, se cree que las mutaciones en las proteínas núcleo capsulares influencian el ensamble viral, y los mutantes sensibles a la temperatura y adaptados al frío son frecuentemente menos patogénicos que los virus maternos (ver, por ejemplo, Flint et al., PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATOGÉNESIS , AND CONTROL, 2000, ASM Press pp 670-683, el texto completo se incorpora aquí como referencia) . Los epítopes de las variantes de cepas de vacunas útiles pueden ser modificados en el virus atenuado. Alternativamente, los epítopes completamente extraños, incluyendo los antígenos derivados de otros patógenos virales y no virales, pueden ser modificados en la cepa atenuada. Por ejemplo, los antígenos de virus no relacionados tales como el VIH (gpl60, gpl20, gp41), los antígenos de parásitos (por ejemplo, de malaria), los antígenos bacterianos o fúngicos, o los antígenos tumorales pueden ser modificados en la cepa atenuada. Alternativamente, los epítopes los cuales alteran el tropismo del virus in vivo pueden ser modificados en los virus quiméricos atenuados de la invención. Virtualmente cualquier secuencia genética heteróloga puede ser construida en los virus quiméricos de la invención para usarse en vacunas. Preferiblemente, las porciones y los péptidos que actúan como modificadores de la respuesta biológica se construyen en los virus quiméricos de la invención para usarse en vacunas. Preferiblemente, los epitopes que inducen la respuesta inmune protectora para cualquiera de una variedad de patógenos, o los antigenos que enlazan los anticuerpos neutralizantes pueden ser expresados por o como parte de los virus quiméricos. Por ejemplo, las secuencias genéticas heterologas que pueden ser construidas en los virus quiméricos de la invención incluyen, pero no se limitan a la hemaglutinina neuraminidasa de la influenza y la parainfluenza y las glicoproteinas de fusión tales como los genes HN y F del PIV3 humano. En aun otra modalidad, las secuencias genéticas heterologas que pueden ser modificadas en los virus quiméricos incluyen aquellas que codifican proteínas con actividades inmunomoduladoras . Los ejemplos de proteínas inmunomoduladoras incluye, pero no se limitan a, las citocinas, interferona tipo 1, gama interferona, factores estimulantes de la colonia, interleucina -1, -2, -4, -5, -6, -12, y los antagonistas de estos agentes. Además, las secuencias genéticas heterologas que pueden ser construidas en los virus quiméricos de la invención para usarse en vacunas incluyen, pero no se limitan a las secuencias derivadas de un virus de inmunodeficiencia humana (VIH), preferiblemente del tipo 1 o del tipo 2. En una modalidad preferida, un péptido derivado de VIH inmunogénico que puede ser usa fuente de un antigeno puede ser construido en un PIV quimérico que puede ser usado para producir como respuesta una respuesta inmune en los vertebrados. Tales péptidos derivados de VIH pueden incluir, pero no se limitan a las secuencias derivadas del gen env (es decir, las secuencias que codifican todo o parte de gpl60, gpl20, y/o gp41), el gen pol (es decir, las secuencias que codifican todas o partes de la transcriptasa inversa, endonucleasa, proteasa, y/o integrasa) , el gen gag (es decir, las secuencias que codifican todos o partes de p7, p6, p55, pl7/18, p24/25, tat, reivindicación, nef, vif, vpu, vpr, y/o vpx. Otras secuencias heterólogas pueden ser derivadas del antígeno superficial del' virus de la hepatitis B (HBsAg) ; los antígenos superficiales del virus de la hepatitis A o C, ¦ las glicoproteinas del virus de Epstein Barr; las glicoproteíñas del virus del papiloma humano; las glicoproteinas del virus sincitial respiratorio, el virus de parainfluenza , el virus de Sendai, el virus de simio 5, o el virus" de paperas; las glicoproteinas del virus de parainfluenza ; las glicoproteinas del virus de herpes; VPl del virus de la polio; los determinantes antigénicos de patógenos no virales tales como bacterias y parásitos, por nombrar algunos. En otra modalidad, todos o porciones de los genes de inmunoglobulina pueden ser expresados. Por ejemplo, pueden ser construidas en los virus quiméricos de la invención las regiones variables de las inmunoglobulinas anti-idiotipicas que mimetizan tales epitopes . Otras secuencias heterólogas pueden ser derivadas de antigenos tumorales, y los virus quiméricos resultantes pueden ser usados para generar una respuesta inmune contra las células tumorales que llevan a la regresión de los tumores in vivo. Estas vacunas pueden ser usadas en combinación con otros regímenes terapéuticos, incluyendo pero no limitados a, quimioterapias, terapias de radiación, cirugías, transplantes de médula ósea, etc. '.para el tratamiento de tumores. De acuerdo con la presente invención, los virus recombinantes pueden ser modificados para expresar antígenos asociados con tumores (TAAs) , incluyendo pero no limitados a antígenos tumorales humanos reconocidos por- las células T (Robbins y Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol . 8:628-636, incorporado aquí como referencia en su totalidad), proteínas de linaje de los melanocitos, incluyendo gplOO, MART-l/MelanA, TRP-1 (gp75) , tirosinasa; antígenos compartidos ampliamente específicos de tumores, MAGE-1, MAGE-3 , BAGE, GAGE-1, GAGE-1 , N-acetilglucosaminiltransferasa-V, pl5; antígenos mutados específicos de tumores ß-catenina, MUM-1, CDK4; antígenos de no melamoma para el carcinoma de pecho, ovárico, cervical y pancreático, HER-2/neu, virus de papiloma humano E6, E7, Uc-1. En aun otras modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga se deriva dé un metapneumovirus , tal como el metapneumovirus humano y/o el pneumovirus aviar. En aun otras modalidades, el virus de la invención contiene dos secuencias de nucleótidos heterólogas en donde una se deriva de un metapneumovirus, tal como el metapneumovirus humano y/o el pneumovirus avial, y la otra se deriva de un virus sincitial respiratorio. La secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una proteína F o una proteína G del virus respectivo. En una modalidad específica, las secuencias de nucleótidos codifican una proteína F quimérica, en donde la proteína F quimérica contiene el ectodominio de una proteína F de un metapneumovirus y el dominio transmembrana así como el dominio luminar de una proteína F de un virus de parainfluenza . Ya sea una vacuna de virus recombinantes vivo o una vacuna de virus recombinantes inactivados pueden ser formuladas. Una vacuna viva puede ser preferida ya que la multiplicación en el anfitrión lleva a un estimulo prolongado del tipo y magnitud similares a los que ocurren en las infecciones naturales, y por lo tanto, confieren inmunidad substancial, duradera. La producción de tales formulaciones de vacunas de virus recombinantes vivos puede ser lograda usando los métodos convencionales que involucran la propagación del virus en cultivos celulares o en alantoides de embriones de pollo seguido por purificación. Adicionalmente, ya que ha sido demostrado que el bPIV es no patogénico en humano, este virus es altamente adecuado para usarse como una vacuna viva. A este respecto, el uso de PIV modificado genéticamente (vectores) para propósitos de vacunación puede desear la presencia de características de atenuación en estas cepas. La introducción de las mutaciones apropiadas (por ejemplo, eliminaciones) en las plantillas para la transfección puede proveer a los nuevos virus con las características de atenuación. Por ejemplo, las mutaciones de nucleótidos que se asocian con la sensibilidad a la temperatura o la adaptación al frío pueden hacerse en las mutaciones de eliminación. Estas mutaciones serían más estables que las mutaciones puntuales asociadas con los mutantes de sensibilidad al frío o la temperatura y las frecuencias de reversión serían extremadamente bajas. Alternativamente, pueden ser construidos virus quiméricos con características de "suicidio". Tales virus sufrirían solamente uno o unas pocas rondas de replicación dentro del anfitrión. Cuando se usan como una vacuna, los virus recombinantes sufrirían ciclo (s) de replicación limitada e inducirían un nivel suficiente de respuesta inmune pero no continuaría en los anfitriones humanos y causarían enfermedades. Los virus recombinantes que carecen de uno o más de los genes de PIV o que poseen genes de PIV mutados no serían capaces de experimentar rondas sucesivas de replicación. Los virus defectuosos pueden ser producidos en líneas celulares las cuales expresan permanentemente tal (es) gen(es) . Los virus que carecen de un gen(es) esencial(es) serían replicados en estas líneas celulares, sin embargo, cuando se administran a anfitriones humanos, no serían capaces de completar una ronda de replicación. Tales preparaciones pueden transcribir y traducir - es este ciclo abortivo — un número suficiente de genes para inducir una respuesta inmune. Alternativamente, grandes cantidades de las cepas podrían ser administradas, de modo que estas preparaciones sirven como vacunas de virus (eliminados) inactivados . Para vacunas inactivadas, se prefiere que el producto genético heterólogo sea expresado como un componente viral, de modo que el producto genético esta asociado con los viriones. La ventaja de tales preparaciones de modo que estas contienen proteínas nativas y no experimentan inactivación por el tratamiento con formalina u otros agentes usados en la fabricación de vacunas de virus asesinados. Alternativamente, el PIV mutado fabricado a partir del ADNc puede estar altamente atenuado de modo que se replica solamente durante unos cuantos segundos. En ciertas modalidades, las vacunas de la invención comprenden un virus atenuado. Sin estar ligados por la teoría, el virus atenuado puede ser efectivo como una vacuna aun si el virus atenuado es incapaz de causar que las células generen nuevas partículas infecciosas virales a causa de las proteínas virales insertadas en la membrana citoplasmática de las anfitriones, estimulando por lo tanto una respuesta inmune. En otra modalidad de este aspecto de la invención, las formulaciones de vacunas inactivadas pueden ser preparadas usando las técnicas convencionales para "matar" los virus quiméricos. Las vacunas inactivadas están "muertas" en el sentido en que su jnfectividad ha sido destruida. Idealmente, la infectividad de los virus se destruye son afectar su inmunogenicidad . Para preparar vacunas inactivadas, los virus quiméricos pueden ser cultivados en cultivos celulares o en alantoides de embriones de pollo, purificados mediante centrifugación por zonas, inactivados por formaldehído o ß-propiolactona y «se conjuntan. Las vacunas resultantes se inoculan usualmente de manera intramuscular. Los virus inactivados pueden ser formulados con un auxiliar adecuado para mejorar la respuesta inmunológica . Tales auxiliares pueden incluir pero no se limitan a, geles minerales, por ejemplo, de hidróxido de aluminio; substancias tenso activas tales como lisolecitina, polioles de pluronic, polianiones; péptidos; emulsiones de aceite; y auxiliares de potencialmente útiles para humanos tales como BCG, Corynebacterium parvum, ISCOMS, y virosomas. Pueden ser usados muchos métodos para introducir las formulaciones de vacunas descritas arriba, estos incluyen pero no se limitan a las rutas oras, intradérmica , intrámuscular , intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, percutánea, e intranasal e inhalación. Puede ser preferible introducir las formulaciones de vacunas de virus quiméricos vía la ruta natural de la infección del patógeno para la cual se diseña la vacuna . En ciertas modalidades, la invención se refiere a composiciones inmunogénicas . Las composiciones inmunogénicas comprenden un PIV quimérico. En ciertas modalidades, las composiciones inmunogénicas comprenden un PIV quimérico atenuado. En ciertas modalidades, las composiciones inmunogénicas comprenden además un portador farmacéuticamente aceptable . Pueden ser usadas varias técnicas para evaluar la efectividad y seguridad de una vacuna de acuerdo a la presente invención. Una vacuna efectiva es una vacuna que protege a los individuos vacunados de las enfermedades debidas a patógenos, invocando las respuestas apropiadas, innatas, celulares y humorales con efectos laterales mínimos. Las vacunas no deben causar enfermedades. Cualquier técnica que sea capaz de medir la replicación del virus y la respuesta inmune del sujeto vacunado puede ser usada para evaluar la vacuna. Los ejemplos no limitantes se dan en las secciones de Ejemplos, infra. 5.6.1. REGIMENES DE DOSIFICACIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE LAS VACUNAS O LAS PREPARACIONES INMÜNOGÉNICAS DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona vacunas y preparaciones inmunogénicas que comprende PIV quimérico que expresa una o más secuencias antigénicas heterólogas o no nativas. Las vacunas o las preparaciones inmunogénicas de la invención abarcan vacunas únicas o multivalentes, incluyendo vacunas bivalentes o trivalentes. Las vacunas o las formulaciones inmunogénicas de la invención son útiles para proporcionar protecciones contra varias infecciones virales.
Particularmente, las vacunas o las formulaciones inmunogénicas de la invención proporcionan protección contra infecciones del tracto respiratorio en un anfitrión u hospedero. Un virus recombinante y/o una vacuna o una formulación inmunogénica de la invención pueden ser administrados sólo o en combinación con otras vacunas. Preferiblemente, una vacuna o formulación inmunogénica de la invención se administra en combinación con otras vacunas o formulaciones inmunogénicas que proporcionan protección contra enfermedades del tracto respiratorio, tales como pero no limitadas a, vacunas contra el virus sincitial respiratorio, vacunas contra la influenza, vacunas contra el sarampión, vacunas contra paperas, vacunas contra rubéola, vacunas contra neumococos, vacunas contra la ricketsia, vacunas contra estafilococos, vacunas contra la tos ferina o vacunas contra canceres del tracto respiratorio. En una modalidad preferida, los virus y/o las vacunas de la invención se administran concurrentemente con las vacunas pediátricas recomendadas a las edades correspondientes. Por ejemplo, a los dos, cuatro o seis meses de edad, los virus y/o las vacunas de la invención pueden ser administrados concurrentemente con DtaP (M) , Hib (IM), Polio (IPV u OPV) y Hepatitis B (IM) . A los doce o quince meses de edad, los virus y/o las vacunas de la invención pueden ser administrados concurrentemente con Hib (IM) , Polio (IPV u OMP) , MMRII® (subQ) ; Varivax® (SubQ) , y * hepatitis B (IM). Las vacunas que pueden ser usadas con los métodos de la invención son revisadas en varias publicaciones, por ejemplo, The Jordán Report 2000, División of Microbiology and Infectious Diseases, Nacional Institute of Allergy and Infectious Diseases, Nacional Institutes of Health, Estados Unidos, los contenidos de los cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Una vacuna o formulación inmunogénica de la invención puede ser administrada a un sujeto per se o en forma de una composición farmacéutica o terapéutica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden un auxiliar y un antigeno inmunogénico de la invención (por ejemplo, un virus, un virus quimérico, un virus mutado) pueden ser fabricadas por medio de cualquiera de los procesos de mezclado, disolución, granulación, reducción a polvo, emulsificación, encapsulación, o liofilización . Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas de manera convencional usando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables los cuales facilitan el procesamiento del antigeno inmunogénico de la invención en preparaciones las cuales pueden ser usadas farmacéuticamente. La formulación apropiada depende, entre otros de la ruta de administración elegida. Cuando una vacuna o composición inmunogénica de la invención comprende auxiliares o se administra junto con uno o más auxiliares, los auxiliares que pueden ser usados incluyen, pero no se limitan a, auxiliares de sales minerales o auxiliares en geles de sales minerales, auxiliares particulados, auxiliares microparticulados, auxiliares de mucosa, y auxiliares inmunoestimulantes . Los ejemplos de auxiliares incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de aluminio gel de fosfato de aluminio, Auxiliar Completo de Freund, Auxiliar Incompleto de Freund, formulaciones de aceite en agua de auxiliar de escualeno o escualano, poliésteres biodegradables y biocompatibles , liposomas polimerizadas, glucósidos o saponinas triterpenoides (por ejemplo, QuilA y QS-21, también vendidos bajo la marca comercial STIMULON, ISCOPREP) , N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (Treonil-MDP, vendido bajo el nombre comercial TERMURTIDE), LPS, Lipido A de monofosforilo (3D-MLA vendido bajo el nombre comercial MPL) . El sujeto al cual se administran las vacunas o una composición inmunogénica de la invención es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano, pero puede ser también un animal no humano, incluyendo pero no limitados a primates, vacas, caballos, ovejas, cerdos, aves de corral (por ejemplo, pollos, pavos), cabras, gatos, perros, hámsteres, ratones y roedores. Muchos métodos pueden ser usados para introducir las vacunas o las composiciones inmunogénicas de la invención, incluyendo pero no limitados a, las rutas oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, percutánea, intranasal e inhalación, y vía escarificación (raspado a través de las capas superiores de la piel, por ejemplo, usando una aguja bifurcadá) . Para la administración tópica, las vacunas o las preparaciones inmunogénicas de la invención pueden ser formuladas como soluciones, geles, ungüentos, cremas, suspensiones, etc. como es bien conocido en la técnica. Para administración intranasal o por inhalación, las preparaciones para usarse de acuerdo a la présente invención pueden ser administradas convenientemente en forma de una presentación de rocío en aerosol de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono, u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden ser formuladas cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para usarse en un inhalador o insuflador, que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón . Para inyección, las vacunas o . las preparaciones inmunogénicas pueden ser formuladas en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o amortiguador de solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, las proteínas pueden estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos, estéril, antes del uso. La determinación de una cantidad efectiva de la vacuna o la formulación inmunogénica para la administración está también dentro de las capacidades de aquellas personas experimentadas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada aquí. Una dosis efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de análisis in vitro. Por ejemplo, una dosis puede ser formulada en modelos animales para lograr una inducción de una respuesta de inmunidad usando las técnicas que son bien conocidas en la técnica. Una persona que tiene experiencia ordinaria en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a todas las especies animales en base a los resultados obtenidos aquí. La cantidad y los intervalos de dosificación pueden ser ajustados individualmente. Por ejemplo, cuando se usan como una composición inmunogénica, una dosis adecuada en una cantidad de la composición que cuando se administra como se describe arriba, es capaz de provocar una respuesta del anticuerpos cuando se usan como vacuna, las vacunas o las formulaciones inmunogenicas de la invención pueden ser administradas en aproximadamente 1 a 3 dosis durante un periodo de 1-36 semanas. Preferiblemente, 1 o 2 dosis se administran, a intervalos de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 4 meses, y las vacunaciones potenciadoras pueden ser administradas periódicamente después. Los protocolos alternados pueden ser apropiados para animales individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de las formulaciones de vacunación que, cuando se administran como se describe arriba, es capaz de dar lugar a una respuesta inmune en un anima inmunizado, suficiente para proteger al animal de un infección durante al menos 4 a 12 meses. En general, la cantidad del antigeno presente en una dosis varia desde aproximadamente 1 pg a aproximadamente 100 mg por kg del anfitrión u hospedero, típicamente, desde aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg, y preferiblemente desde aproximadamente 100 pg a aproximadamente 1 pg. El rango de la dosis adecuado variará con la ruta de la inyección y el tamaño del paciente, pero típicamente variará desde aproximadamente 0.1 mL a aproximadamente 5 mL. En una modalidad específica, los virus y/o las vacunas de la invención se administran en una sola dosis inicial de al menos 103 TCID50, al menos 104 TCID50, al menos 105 TCID50, al menos 106 TCID50. En otra modalidad específica, el virus y/o las vacunas de la invención se administran en dosis múltiples.
En una modalidad preferida, se usa un régimen de dosificación primario a 2, 4, y 6 meses de edad y una dosis potenciadora al inicio del segundo año de vida. Más preferiblemente, cada dosis de al menos 105 TCID50 o al menos 105 TCID se da en un régimen de codificación múltiple. La velocidad de replicación de un virus puede ser. usada como un índice para ajustar la dosificación de las vacunas en una prueba clínica. Por ejemplo, pueden ser usados lo análisis para evaluar la velocidad de replicación de un virus (por ejemplo, una curva de crecimiento ver la Sección 5.5. para los análisis disponibles) , para comparar la velocidad de replicación de los virus y/o las vacunas de la invención con la del bPIV3, la cual se demostró en los estudios previos (ver Clements et al., J. Clin. Microbiol. 29:1175-82(1991); Karron et al., J. Infect. Dis. 171:1107-14 (1995); Karron et al., Ped. Inf. Dis. J. 5:650-654(1996) . Estos estudios mostraron que una vacuna de PIV3 de bovino es segura de manera general y bien tolerada por voluntarios humanos saludables, incluyendo adultos, niños de 6-60 meses de edad, e infantes de 2-6 meses de edad. En estos estudios, los sujetos habían recibido al menos una sola dosis de vacuna de bPIV3 de 103 TCID50 a 106 TCID50. Doce niños recibieron dos dosis de 105 TCID5 de vacuna de PIV3 en lugar de una dosis sin efectos adversos) . Una velocidad de replicación comparable en cuanto al bPIV3 sugiere que una dosis comparable puede ser usada en una prueba clínica. Una velocidad de replicación menor que la del bPIV3 sugiere que puede ser usada una dosificación mayor. 5.6.1.1. ESTUDIOS DE DESAFÍO Este análisis o ensayo se usa para determinar la habilidad de los virus recombinantes de la invención y de las vacunas de la invención para prevenir infecciones virales de tracto respiratorio inferior en un sistema de modelo animal, tales como, pero no limitados a ratas de algodón o hámsteres. El virus recombinante y/o la vacuna pueden ser administrados mediante la ruta intravenosa (IV), mediante la ruta intramuscular (IM) u mediante la ruta intranasal (IN). El virus recombinante y/o la vacuna pueden ser administrados mediante cualquier técnica bien conocida por los artesanos experimentados. Este análisis se usa también para correlacionar la concentración de suero de los anticuerpos con una reducción en el titulo de los pulmones del virus al cual se enlazan los anticuerpos." En el día 0, se administra a los grupos de animales, tales como, pero no limitados a ratas de algodón (Sigmodon hispidis, con peso promedio de lOOg) , cybomolgous macacques (peso promedio 2.0 kg) el virus recombinante o quimérico o la vacuna de interés o BSA mediante inyección intramuscular, o por la ruta intranasal. Antes o concurrentemente con, o después de la administración del virus recombinante o la vacuna de la invención, los animales son infectados con el virus del tipo salvaje en donde el virus del tipo salvaje es el virus contra el cual fue generada la vacuna. En ciertas modalidades, los animales son infectados con el virus del tipo salvaje al menos 1 días, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, 1 semana o 1 o más meses subsecuentes a la administración del virus recombinante y/o la vacuna de la invención. Después de la infección, se sacrifican las ratas de algodón, y su tejido pulmonar se recolecta y se determinan los títulos pulmonares del virus, determinados mediante titilación en placas. Se usa albúmina de suero de bovino (BSA) 10 mg/kg como un control negativo. Las concentraciones del anticuerpo en el suero en el momento del desafío se determinan usando un ELISA tipo sándwich. De manera similar, en los macacos, pueden ser medidos los títulos del virus en los lavados nasales y pulmonares . 5.6.1.2. POBLACIONES OBJETIVOS En ciertas modalidades de la invención, la población objetivo para los métodos terapéuticos y de diagnostico de la invención se definen por la edad. En · ciertas modalidades, la población objetivo para los métodos terapéuticos y/o de diagnóstico de la invención se caracteriza por una enfermedad o trastorno además de una infección del tracto respiratorio. En una modalidad especifica, la población objetivo abarca niños jóvenes, menores a 2 años de edad. En una modalidad más especifica, los niños menores a 2 años de edad no sufren aun de enfermedades diferentes a infección del tacto respiratorio.
En otras modalidades, la población objetivo abarca pacientes sobre 5 años de edad. En una modalidad más específica, los pacientes sobre 5 años de edad sufren de una enfermedad adicional o trastorno incluyendo fibrosis cística, leucemia, y linfoma no de Hodgkin, o recibieron recientemente transplantes de médula ósea o de riñon. En una modalidad específica de la invención, la población objetivo abarca sujetos en los cuales la infección por h PV se asocia con inmunosupresión de los anfitriones. En una modalidad específica, los sujetos son individuos con inmunidad comprometida . En ciertas modalidades, la población objetivo para los métodos de la invención abarca a las personas entradas en años . En una modalidad especifica, los sujetos a ser tratados con los métodos de la invención fueron infectados con hMPV en los meses de invierno. 5.6.1.3. PRUEBAS CLÍNICAS Las' vacunas de la invención o los fragmentos de las mismas evaluadas en análisis in vitro y modelos animales pueden ser evaluados además con respecto a la seguridad, tolerancia y farmacocinética en grupos de voluntarios adultos, saludables, normales. Se administra a los voluntarios intramuscularmente, intravenosamente o mediante un sistema de administración pulmonar una dosis única de un virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención. Cada voluntario se monitores al menos 24 horas antes de recibir la dosis única del virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención y cada voluntario será monitorea durante al menos 48 horas después de recibir la dosis, en un sitio clínico. Los voluntarios son monitoreados como pacientes externos en los disk 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, y 56 después de la dosis. Se recolectan muestras de sangre vía un catéter residente o venopunción directa, usando tubos Vacutainer red top de 10 mL en los siguientes intervalos (1) antes de administrar la dosis del virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención; (2) durante la administración de la dosis del virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención; (3) 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, .2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, y 48 horas después de administrar la dosis del virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención; y (4) 3 días, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, 35 días, 42 días, 49 días, y 56 días después de administrar la dosis del virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención. Se permite a las muestras coagularse a la temperatura ambiente y será recolectado el suero después de la centrifugación . La cantidad de anticuerpos generados contra el virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención en las muestras de los pacientes puede ser cuantificada mediante ELISA. La inmunidad de las células T (respuestas citotóxica y auxiliar) en PBMC y los lavados pulmonares y nasales pueden ser monitoreados también. La concentración de los niveles del anticuerpo en el suero de los voluntarios se corrige substrayendo el nivel del suero antes de la dosis (nivel de referencia) de los niveles de suero a cada intervalo de recolección después de la administración de la dosis del virus recombinante de la invención y/o una vacuna de la invención. Para cada voluntario se calculan los parámetros farmacocinéticos de acuerdo al enfoque independiente del modelo (Gibaldi et al., eds . , 1982, Pharmacokinetics, 2da edición, Marcel Dekker, Nueva York) de las concentraciones del anticuerpo o los fragmentos del anticuerpo del suero. Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitantes, de la presente invención. Las células y los Virus usados en los ejemplos se mantienen como sigue: la cepa A2 de RSV y los virus de parainfluenza de bovino tipo 3/parainfluenza humana tipo 3 tratados con vectores RSV (virus bPIV3/hPIV3/RSV) fueron cultivados en células Vero en Opti-MEM (Gibco/BRL) en presencia de gentamicina. El virus vaccinia Ankara ( VA-T7) o (escarlatina de pollo) fowl-pox-T7 (FP-T7) los cuales expresan la ARN polimerasa del fago T7 fueron cultivados en células de ríñones embrionarios de pollo (SPAFAS) . Las células Vero, HeLa y Hep-2 fueron mantenidas en MEM (JRH Biosciences) suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS), 2mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales y antibióticos . 6. EJEMPLO 1: CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DEL ADNc QUIMÉRICO DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 HUMANA Para sustituir los genes F y HN del bPIV3 con los del hPIV3 se introdujeron sitios de enzimas de restricción adicionales en el ADNc del bPIV3 infeccioso. Usando mutagénesis dirigida al sitio, se introdujo un sitio Nhe I único en la posición del nucleótido 5041 y un sitio Sal I se introdujo en et 8529 del ADNc de bPIV3. El ADNc de bPIV3 de longitud completa modificado se trató con enzimas de restricción Nhe I -y Sal I y se aisló mediante purificación de gel un fragmento de ADN de -14 kb que abarcaba todas las secuencias virales de bPIV3 excepto los genes F y NH. Para obtener las secuencias del gen F y HN, un plato de 10 cm de células Vero confluentes se infectó con una cepa de hPIV3 (hPIV3/Tex/12084/1983) . Después de 3 días de incubación a 37°C; las células fueron cosechadas y se aisló el ARN total usando ARN STAT-LS 50 (Tel-Test Inc.). El ADNc viral se generó mediante transcripción inversa usando una hibridación por calor y frío de oligo específico de hPIV3 en la posición 4828 del genoma de hPIV3. Los genes F y HN de hPIV3 se amplificaron mediante PCR (reacción de la cadena de polimerasa) usando la polimerasa de Taq. El producto de PCR fue clonado en el vector de clonación Pt/A TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron los genes F y HN de hPIV3 a partir de dos clones (#11 y #14) . El análisis de la secuencia reveló que para el clon #11, el gen F estaba correcto, pero el gen HN contenía secuencia aberrantes; para el clon #14, el gen HN estaba correcto, pero el gen F contenida codones de detención aberrantes. Por lo tanto fue contrito un plásmido, que contenía los genes F y HN de hPIV3 funcionales, combinando el gen F correcto de #11 con el gen HN correcto de #14 en la siguiente manera. Ambos plásmidos de hPIV3 (#11 y #14) fueron digeridos con Nhel y EcoRl . Un fragmento' de 1.6 kb que albergaba el gen F correcto se aisló del clon #11 y un fragmento de 8.5 kb que contenía el gen HN correcto y las secuencias del plásmido, se aisló a partir del del clon #14. Los dos fragmentos fueron ligados para producir el plásmido que contenia los genes F y HN de hPIV3 intactos. La secuencia correcta fue confirmada mediante análisis de la secuencia del ADN. Finalmente, se agregó un sólo nucleótido en el extremo 3' del gen HN en la región no traducida para satisfacer la "Regla de seis". La adición del nucleótido individual fue lograda usando el equipo de mutagénesis QuickChange (Stratagene) y fue confirmada mediante secuenciación de ADN. El fragmento de ADN del gen f y HN de hPIV3 correcto fue aislado entonces mediante digestión con Nhe 1 y Sal y se purificó con gel un fragmento de ADN de 3.5 kb . Al ADNc quimérico de PIV3 b/h de longitud completa se construyó ligando el fragmento de ADN de 14.5 kb que albergaba las secuencias de bPIV3 descritas arriba y el fragmento de ADN de 3.5 kb que contenia los genes F y HN de hPIV3 (ver la Figura 3) . El ADN del plásmido quimérico de longitud completa fue confirmado por mapeado de la enzima de restricción extensiva. Además, las uniones de los genes M/F y HN/L del constructo quimérico fue confirmadas mediante secuenciación de ADN que contenían tanto las secuencias de bPIV3 y hPIV3 así como el sitio de enzima de restricción Nhel y Sal 1 respectivamente . 7. EJEMPLO 2 : CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DE LOS ADNcs QUIMÉRICOS DE F O G PARA EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA DE BOVINO 3/PARAINFLUENZA HUMANA 3. Para determinar los efectos sobre la replicación del virus de las inserciones del antigeno de RSV en la posición 1 o 2 del genoma de PIV3 b/h, los genes F y G del virus sincitíal respiratorio (RSV) fueron clonados en diferentes posiciones del vector de parainfluenza de bovino 3/parainfluenza humana 3 (vector PIV3 b/h) . Ver la Figura 4. Para insertar los genes extraños en el ADNc de PIV3 de bovino/humano (b/h) fueron introducidos los sitios de enzimas de restricción Avrll en el plásmido de ADNc de PIV b/h (Haller et al., 2000; 2001, este es el mismo constructo como en el Ejemplo 6) mediante mutagénesis dirigida al sitio usando el equipo QuickChange (Stratagene) . Un sitio Avrll fue introducido en el nucleótido (nt) 104 en el genoma del PIV3 b/h, alterando cuatro nucleótidos usando el oligo 5'GAA ATC CTA AGA CCC TAG GCA TGT TGA GTC3 ' y su complemento. Este sitio de enzima de restricción se uso para insertar los genes de RSV en la primera posición (most 3') del genoma viral. Otro sitio Avrll se introdujo en la región intergénica N-P en nt 1774 cambiando dos nucleótidos usando el siguiente oligo 5' CCACAACTCAATCAACCTAGGATTCATGGAAGACAATG3 ' y su complemento.
Este sitio de restricción se uso para insertar los genes de RSV en la segunda posición entre los genes N y P del PIV3 b/h (Figura 4) . Los ADNcs de PIV b/h de longitud completa que albergaban los sitios Avrll en los nts 104 y 1774 fueron probados por su funcionalidad recuperando los virus mediante genética invertida. Construcción del cartucho G de RSV (detención/inicio del gen N-P) : se generó un fragmento de ADN que contenia la región interregno N-P de bPIV3 asi como las secuencias terminales 3' del gen G de RSV, usando el ADNc de PIV b/h como plantilla de PCR. Este fragmento se generó mediante PCR usando los siguientes oligos 5' CCCAACACACCACGCCAGTAGTCACA AAGAGATGACCACTATCAC3 ' Y 5 ' CCCAAGCTTCCTAGGTGAATCTTTGGTTGATTGAGT TGTGG3' . Este fragmento se uso después para llevar a la PCR de traslape para agregar la región intergénica N-P de bPIV3 al gen G de RSV. Para la segunda reacción de PCR, se uso un plásmido que contenia el gen G y F de RSV como una plantilla de ADN, la oligo 5 ' CAGCGGATCCTAGGGGAGAAAAGTGTCGAAGAAAAATGTCC3 ' y un oligo generado a partir del fragmento . corto de la PCR de arriba se usaron como cebadores. El fragmento de PCR resultante que contenia el gen G de RSV enlazado a la región intergénica N-P de bPIV3 y flanqueando los sitios de la enzima de restricción Avrll, se clono en pGEM3. El gen G de RSV fue secuenciado para confirmar la presencia de un marco de lectura abierto y las secuencia de aminoácidos previstas. Los fragmentos de ADN que albergaban el gen G de RSV se insertaron en la primera y la segunda posición usando los sitios de la enzima de restricción Avrll en un subclon que albergaba solamente los primeros 5200 nucleótidos del genoma de bPIV3 (1-5 bPIV3) que fue lineaLizado con Avrll. Como se usa aquí y otros Ejemplos, 1-5 bPIV3 se refiere a los nucleótidos 1-5196 (o 5200) de genoma de PIV3 de bovino. Existe un sitio de BstBl en esta posición. Construcción del cartucho de F de RSV (inicio/detención del den N-P) : El fragmento del gen F de RSV se aisló mediante PCR a partir de un plásmido de ADNc de F+G de bPIV3/RSV de longitud completa usando oligos que agregaron los sitios de Avrll en el extremo 5'' y 3' del gen F de RSV, y se introdujo en el plásmido 1-5 de bPIV3 que albergaba el sitio de Avrll en el nt 1774, el cual fue linealizado con Avrll. La región intergénica N-P de bPIV3 fue aislada mediante PCR usando 1-5 bPIV3/RSV G2 - como una plantilla. El oligo 5 ' GACGCGTCGACCACAAAGAGATGACCACTATCACC3 ' y un oligo hibridizado por calor y frió en el gen F de bPIV3 se usaron para generar un fragmento de PCR que contenia la región intergénica N-P de bPIV3, el sitio de Avrll, y la secuencia de bPIV3 hasta nt 5200. El fragmento de PCR fue digerido con Salí y Nhel y agregado al plásmido de 15- bPIV3 que albergaba el gen F ce RSV en la posición 2, el cual se trató con Salí y Nhel. Para introducir la región el gen F de reivindicación que contenia la región intergénica N-P en la posición 1, el cartucho o cásete F de RSV de 1.8 kb fue escindido usando Avrll, y ligado en 15 bPIV3 que contenia el sitio de Avrll en nt 104, el cual fue linearizado con Avrll. Construcción del cartucho F de RSV con una región intergénica corta (detención de N/inicio de N) : La generación del gen F de RSV con la región intergénica N-N corta se logró llevando a cabo una reacción de PCR usando 1-5 bPIV3/RSV F2 como una plantilla, el oligo 5' GCGCGTCGACCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAACCCTAGGACTGTA3 ' , y un oligo hibridizado con calor y frío corriente arriba del extremo 5' del gen F de RSV abarcando el sitio de la enzima de restricción Avrll. El producto de PCR que contenía el gen F de RSV y la región intergénica N-N corta fue digerido con Avrll e introducido en 1-5 bPIV3 nt 104 el cual fue linealizado con Avrll. Después de confirmar la orientación apropiada mediante mapeado de la enzima de restricción, los plásmidos que albergaban los genes de RSV en la primera posición fueron digeridos con Sphl'y BssHIII y fueron aislados fragmentos de ADN de 4 kb (1-5 bPIV3/RSV Gl) o de 4.8 kb (1-5 bPIV3/RSV Fl) . En un segundo paso de clonación, el resto del genoma de PIV3 b/h se agregó como un fragmento de ADN de 15.1 kb Sphl-BssHII 15.1, dando los ADNcs de longitud completa. Los subclones de bPIV3, que albergaban los genes de RSV en la segunda posición, fueron cortados con Sphl y Nhel, y se aislaron los fragmentos de ADN de 5.8 kb (bPIV3/RSV G2) y de 6.5 kb (bPIV/RSV F2 ) en un segundo paso de clonación el resto del genoma de PIV3 fue agregado como el fragmento de ADN Nhel-Sphl de 14 kb de tamaño. Los plásmidos de PIV3 b/h/RSV de longitud completa fueron propagados en células STBL-2 (Gibco/BRL) que proporcionaron altos rendimientos de los plásmidos de ADNc virales de. longitud completa. 8. EJEMPLO 3: F O G DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO DESPLEGARON UN EFECTO DE POSICIÓN CON RESPECTO A LA PRODUCCIÓN DE ARNm Y EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS SI COMO REPLICACIÓN DEL VIRUS IN VITRO Se llevaron a cabo tres experimentos para confirmar la expresión efectiva del gen f o G de RSV en los constructos del Ejemplo 2,. y para -determinar los efectos de posición de las inserciones de los genes en el genoma de PIV3. Primero, para demostrar la expresión de la proteina de RSV por los virus quiméricos, se llevó a cabo una transferencia Western de lisados celulares infectados con el virus quimérico y se ¿ondearon con antisuero especifico del RSV. Ver la figura 5?. Las transferencia Western se llevaron a cabo como sigue se usaron virus quiméricos para infectar células Vero subconfluentes (70-80%) a un MOI de 0.1 o 1.0. cuarenta y ocho horas después de la invención el medio que sobreyace fue removido y las monocapas infectadas fueron lavadas una vez con 1 mi de PBS. Las células fueron Usadas subsecuentemente en 400 mL de amortiguador de Laemmli (Bio-Rad) conteniendo 0.05% B-Mercaptoetanol (Sigma) . 15 mL de cada muestra fueron separados en Gel Ready 12% Tris-HCl (Bio-Rad) y se transfirieron a membranas de nylon usando una célula de transferencia semiseca (Bio-Rad) . Las membranas de nylon se enjuagaron en PBS [pH 7.6] que contenia 0.5% (v/v) Tween-20 (Sigma) (PBST) y se bloquearon con PBST que contenia 5% (p/v) de leche seca (PBST-M) durante 20-30 minutos a la temperatura ambiente. Las membranas se incubaron ya sea con una mezcla de anticuerpos monoclonales de RSV F (WHO 1269, 1200, 1153, 1112, 1243, 1107) a una dilución de 1:1000 en PBST-M o el anticuerpo policlonal RSV G 10181 (Orbigen) a una dilución de 1:2000 en PBST-M durante 1 hora a la temperatura ambiente. Enseguida de cuatro lavados con PBST, las membranas se incubaron con anticuerpo antiratón conjugado con peroxidasa de rábano picante secundaria (Dako) a una dilución de 1:2000 en PBST-M durante 1 hora a la temperatura ambiente. Las membranas se lavaron 4 veces -con PBST y se desarrollaron usando un substrato quimioluminiscente (Amersham Pharmacia) y se expusieron a Película Luminosa Biomax (Kodak) para la visualización de las bandas de proteína. Consistente con la eficiencia de replicación reducida de RSV b/h F1*N-N en células Vero (Figura 5C, ver abajo), la cantidad de RSV i detectada a 48 horas después de la infección fue aproximadamente 10 veces menor que la presente en las células infectadas con PIV3 b/h/RSV F2 o RSV A2 del tipo salvaje (comparar las sendas 1, 3 y 4, Figura 5A) . Una banda de 50 kDa representativa del fragmento Fi se detectó en las células infectadas con todos los virus quiméricos así como el RSV del tipo salvaje. Sin embargo, existió una acumulación más grande de un fragmento F de 20 kDa en lisados de células infectadas de los virus quiméricos en comparación con el RSV del tipo salvaje. Cuando se repitieron las infecciones con PIV3 b/h /RSV F1*N-N a un mayor de 1.0 (Figura 5A, senda 1), el fragmento i en las células infectadas con PIV3 b/h/RSV Fl acumuladas a los niveles de RSV del tipo salvaje a 48 horas después de la infección. La cantidad relativa de los fragmentos de 50 kDa y 20 kDa en las células infectadas con PIV3 b/h/RSV Fl o PIV3 b/h/RSV F2 fue de aproximadamente 1:5. No se detectó F0 en las células infectadas con los virus quiméricos, indicando que los precursores de F0 fueron procesados eficientemente durante las infecciones con PIV3 b/h/RSV Fl y PIV3 b/h/RSV F2 como se observó también en las infección con RSV del tipo salvaje. La expresión relativa de RSV G en las células infectadas con PIV3 b/h/RSV Gl, PIV3 b/h/RSV G2 y RSV del tipo salvaje se muestra en la Figura 5?· Fueron detectadas tanto las formas inmadura y glicosilada de RSV G que migraron a aproximadamente 50 kDa y 90 kDa, respectivamente. Las células infectadas con PIV3 b/h/RSV Gl mostraron niveles de expresión de RSV G similares a las observadas en las células infectadas con el RSV del tipo salvaje (sendas o carriles 1 y 3, Figura 5A) . Sin embargo, en las células infectadas con PIV3 b/h/RSV G2 la acumulación de RSV G fue de aproximadamente 2-3 veces mayor que la presente en las células infectadas con el RSV del tipo salvaje (sendas 2 y 3, figura 5A) . Colectivamente estos datos mostraron que el PIV3 b/h/RSV quimérico expresaban eficientemente las proteínas de RSV en cualquier posición 1 o 2. Sin embargo, los virus que albergaban los genes de RSV en la posición 2 expresaron niveles mayores de proteínas de RSV.
Enseguida, el análisis de transferencia Northern mostró que la transcripción de ARNm se correlaciona con el resultado de la expresión de proteínas mostrado mediante la transferencia Western, ver la Figura 5B. Se llevó a cabo la transferencia Western como sigue, el ARN celular total se preparo a partir de células infectadas con el virus usando Trizol LS (Life Technologies) . El ARN se purifico adicionalmente mediante una extracción con fenol-cloroformo y se precipitó con etanol. Las pelotillas de ARN se resuspendieron en agua tratada con pirocarbonato de dietilo y se almacenaron a -80°C. Cantidades iguales del ARN total se separaron en geles de azarosa al 1% conteniendo 1% de formaldehído y se transfirieron a membranas de nylon (Amersham Pharmacia Biotech) usando un aparato Turboblotter (Schleicher & Schuell) . Las transferencias se hibridizaron con ribosondas etiquetadas con digoxigenina (DIG)-UTP sintetizadas mediante transcripción in vitro usando un equipo de etiquetado de ARN DIG (Roche Molecular Biochemicals ) . Las hibridación se llevó a cabo a 68°C durante 12 h en solución Express Hyb (Clonetech) . Las transferencias se lavaron a 68 °C dos veces con 2X SSC (Ix SCC que contenia 0.015 M NaCl con 0.015 M de citrato de sodio) -0.1% de dodecil sulfato de sodio (SSD) seguido por un lavado con 0.5XSSC-0.1% SDS y un lavado final con 0.1XSSC-0.1%SDS . Las señales de las sondas hibridizadas se detectaron usando , el Equipo de detección luminiscente DIG (Roche Molecular Biochemicals) y se visualizaron mediante exposición a la película Biomax mL (Kodak) . El análisis Northern de PIV3 b/h/RSV F*1N-N, PIV3 b/h/RSV F2, PIV3 b/h/RSV Gl y PIV3 b/h/RSV G2 mostró que los niveles de ARNm viral para RSV F o RSV G se correlacionaban bien con los niveles de proteínas de RSV observados (Figura 5B) . Los niveles más bajos de ARNms de RSV F se observaron para PIV3 b/h/RSV F1*N-N el cual también desplegó la menor cantidad de proteína RSV F producida. PIV3 b/h/RSV G2 produjo menos ARNms de RSV G resultando en menores niveles de proteína RSV G de lo que fueron observados para PIV3 b/h/RSV G2. Finalmente, el crecimiento de los diferentes virus (con el gen F o G de RSV ya sea en la posición 1 o la posición 2) se correlaciona con los resultados de la expresión de proteínas de la transcripción de ARN. La curva de crecimiento mostrada en la figura 5C se obtuvo como sigue: células Vero se cultivaron a 90% confluencia y se infectaron a un MOI de 0.01 o 0.1 con PIV3 b/h, PIV3 b/h RSV Fl, PIV3 b/h RSV Gl, PIV3 b/h RSV F2 y PIV3 b/h RSV G2. Las monocapas infectadas se incubaron a 37°C. ? las 0, 24, 28, 72, 96 y 120 horas después de la infección las células y medio se recolectaron juntos y - se almacenaron a -70°C. Los títulos del virus para cada punto de tiempo cosechado se determinaron mediante TCID50 o análisis de placas en células Vero. Los análisis de TCID50 se inspeccionaron visualmente por CPE enseguida de la incubación a 37°C por 6 días, en tanto que los análisis de placas se inmunotiñeron con antisuero policlonal de RSV para la cuantificación después de 5 días de incubación. A un MOI de T.01 en células Vero, los virus quiméricos que albergaban los genes g o F de RSV en la primera posición (PIV3 b/h RSV Gl y PIV3 b/h RSV F1*N-N) se replicaron a una velocidad baja dando títulos máximos menores, y exhibieron una fase de retraso más grande que los virus que contenían los genes de RSV en la segunda posición. Los títulos máximos de PIV3 b/h /RSV F1*N-N y PIV3 b/h /RSV Gl a 96 horas después de la infección fueron 106'7 y 105'5 TCID50/mL, respectivamente (Figura 5C) . En contraste, los títulos máximos de PIV3 b/h /RSV F2 y PIV3 b/h/RSV G2 fueron 108·0 y 107·4 a 72 y 96 horas después de la infección respectivamente (Figura 5C) , el virus de control PIV3 b/h desplegó títulos máximos de 108'0 TCIDso/mL, respectivamente (Figura 5C) . El PIV3 b/h /RSV F2 dio 1.3 log10 mayores que PIV3 b/h/RSV F1*N-N. El PIV3 b/h /RSV G2 se replicó a 1.9 logio títulos más alto que el PIV3 b/h /RSV Gl. Los resultados indican que los virus quimérico que albergaban los genes de RSV eh la primera posición fueron desplegados al principio para la replicación in vitro en comparación con los virus quiméricos que contenían . los genes de RSV en la segunda posición . Para determinar si acaso podrían ser alcanzados títulos mayores de PIV3 b/h /RSV F1*N-N y PIV3 b/h /RSV Gl, se repitieron las curvas de crecimiento a un MOI mayor de 0.1. Aun MOI de 0.1 los títulos máximos de PIV3 b/h /RSV F1*N-N y PIV3 b/h /RSV Gl se incrementaron en 0.5 a 1.3 log10 (no se muestran los datos) . Las fases de retraso de estos virus se redujeron y los títulos máximos se lograron antes durante el ciclo de crecimiento. 9. EJEMPLOS 4: EFECTO POSICIONAL DE LAS INSERCIONES DE eGFP EN PARAINFLÜENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLÜENZA 3 DE HUMANO, SOBRE LA REPLICACION DEL VIRUS. El efecto de inserciones de genes en esqueleto del vector del vector de PIV3'de bovino/humano se evaluó sistemáticamente introduciendo el gen de eGFP secuencialmente entre todos los genes de PIV3 y observando el efecto sobre la replicación del virus y la expresión de eGFP (Figura 6) . Este tipo de análisis investiga la importancia del gradiente transcripcional observado para los paramyxovirus que dan relaciones específicas de ARNms virales. La inserción de genes extraños perturbaría estas relaciones y resultaría en la síntesis de cantidades diferentes de proteínas virales las cuales pueden influenciar la replicación de virus. El gen de eGFP fue elegido para este análisis porque no será incorporado en la membrana de los viriones, y por lo tanto no interferiría con los procesos virales tales como el empacado, germinación, entrada, etc. El gen de eGFP fue insertado en cuatro posiciones del genoma de PIV3 b/h, tres de las cuales fueron caracterizadas por la expresión de eGFP y la replicación del virus. El cartucho del gen de eGFP se enlazó a la región intergénica N-P de bPIV3. El GFP1 bh albergó el cartucho del gen de eGFP en la posición más próxima a 3' del genoma de PIV3 b/h. PIV3 b/h /GFP2 contenia el cartucho del gen de eGFP entre los genes n y P del genoma de PIV3 b/h. PIV3 b/h /GFP3 estaba localizado entre P y M, y PIV3 b/h /GFP4 tenia el genoma de eGFP entre M y N de PIV bh (Figura 6) . Construcción del cartucho del gen de eGFP: la plantilla del gen de eGFP está disponible comercialmente, por ejemplo, puede ser comprada de BD Biosciences (pIRES2-EGFP) o Clontech (pEGFP-Nl) . Ver Hoffmann et al., Virology 267:310-317 (2000) . El gen de eGFP se aisló mediante PCR y la región intergénica N-P de PIV 3 bh se agregó empleando el método PCR de traslape, usando los siguientes oligos: 5' ATTCCTAGGATGGTGAGCAAGGGCG3' , 5' GGACGAGCTGTACAAAGTAAAAAAATAGCACCTAATCATG3 ' , y 5 ' CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3 ' . El cartucho de eGFP se insertó en pCR2.1, fue secuenciado,. y fue confirmada la adherencia a la regla de seis. Después, el cartucho de eGFP fue digerido con Avrll, purificado con gel, e insertado en las posiciones 1, 2, 3 y 4 de PIV3 b/h como se describe abajo. Generación de ADNcs de longitud completa que albergan el gen de eGFP en las posiciones 1 y 2: el cartucho del gen de eGFP se insertó en los plásmidos 1-5 bPIV3 los cuales contenían las secuencias de bPIV3 desde nts 1-5200 y un sitio de la enzima de restricción Avrll ya sea en nt 104 (posición 1) o nt 1774 (posición 2). Después de confirmar la orientación apropiada mediante mapeo de enzima de restricción, el plásmido que alojaba el gen de eGFP en la primera posición fue digerido con Sphl y BssHII y fueron asilados fragmentos de ADN de 4 kb (1-5 eGFPl) . Enseguida, el resto del genoma de PIV3 b/h se agregó como el fragmento de ADN Sphl-BssHII de 15.1 kb, dando los ADNcs de longitud completa. Para la generación del ADNc de longitud completa que comprende el eGFP en la posición 2, los subclones de bPIV3 que alojaban los genes de eGFP en la segunda posición fueron cortados con Sphl y Nhel y se aislaron fragmentos de ADN de 5.8 kb (1-5 eGFP2). Enseguida, el resto del genoma de PIV3 se agregó como un fragmento de ADN Nhel-Sphl de 14 kb de tamaño. Los plásmidos de PIV3 b/h/eGFP de longitud completa fueron propagados en células STBL-2 (Gibco/BRL) que proporcionaron a los rendimientos de los plásmidos de ADNc del virus de longitud completa. Generación de los ADNcs de longitud completa que albergan el gen de eGFP en las posiciones 3 y : para insertar el cartucho de eGFP en la posición 3 del genoma de PIV3 b/h, un sitio de la enzima de restricción Avrll se introdujo en nt 3730 en la región intergénica P- de un subclon que contenia nts 1-5200, alterando dos nucleótidos. El siguiente oligo y su complemento se usaron en una reacción de PCR QuickChange para introducir el sitio de Avrll: 5' GGACTAATCAATCCTAGGAAACAATGAGCATCACC3' . El cartucho de eGFP se digirió con Avrll y se ligó en el subclon 1-5 bPIV3 linearizado con Avrll que alojaba el sitio Avrll en nt 3730. Se aisló un fragmento de ADN de 5.5 kb de Sphl a Nhel a partir del subclon que contenia GFP y se introdujo en el ADNc de PIV3 b/h digerido con Sphl y Nhel para producir un plásmido de longitud completa. Para agregar el cartucho de gen de eGFP en la posición 4 del genoma de PIV3 b/h, se generó un subclon que contenia las secuencias de PIV3 b/h desde nts 1- 8500. Este subclon fue linealizado con Nhel (nt 5042), y se insertó el cartucho de eGFP que contenia los extremos de Avrll compatibles. Después, el cartucho de eGFP que fue digerido con Sphl y Xhol y se aislaron fragmentos de ADN de 7.1 kb. El plásmido de PIV3 b/h se trató con. Sphl y Xhol y se produjeron fragmentos de 11 kb. Estos dos fragmentos de ADN se ligaron para generar el PIV3/GFP4. La cantidad de eGFP producida por el PIV3 b/h /GFP1, 2, 3, fue evaluada en dos maneras. Primero, se determinó la cantidad de células verdes producidas tras infectar células Vero con PIV3 b/h GFP1, 2, y 3 a MOIs de 0.1 durante 20 horas, usando un microscopio fluorescente (Figura 7A) . El PIV3 b/h /GFP3 produjo notablemente muchas menos células vedes que el PIV3 b/h /GFP1 o 2. En segundo lugar, se llevó a cabo el análisis Western en células infectadas y las transferencias se sondearon con GFP MAb asi como PIV3 PAb. La observación inicial de que el PIV3 b/h /GFP3 produjo dramáticamente menos proteina eGFP, fue confirmada (Figura 7B) . Los PIV3 b/h GFP1 Y GFP2 produjeron cantidades similares de proteina eGFP. Los métodos de las transferencias Western controlados por la misma carga de volumen sondeando con anticuerpos de PIV3 (Figura 7B) . De manera interesante, todos los tres virus mostraron cantidades similares de proteínas de PIV3 (la proteína HN es la banda más prominente) producidas. Estos resultados sugieren que el PIV3 b/h/GFP3 transcribió menos ARNms de GFP en la posición 3 cuando se compara con las posiciones 1 y 2. Estos datos confirman la presencia de un gradiente transcripcional de ARNms virales en paramyxovirus . El nivel de producción de la proteína HN de PIV3 no fue afectada por las inserciones de genes de eGFP (Figura 7B) . Para determinar si las inserciones del gen de eGFP tenían un efecto sobre la cinética de la replicación del virus de PIV3 b/h /GFP1, 2, y 3, llevaron a cabo las curvas de crecimiento multiciclos en células Vero (Figura 7C) . Las curvas de crecimiento mostraron que el PIV3 b/h /GFP1 tenía un inicio retardado de la replicación del virus a 24 y 48 horas después de la infección que el PIV3 b/h /GFP2 o GFP3. Sin embargo, los títulos máximos finales obtenidos fueron similares para los tres virus. La cinética de replicación para PIV3 b/h/GFP2 y GFP3 fueron cercanamente idénticos (Figura 7C) . De manera interesante, las relaciones alteradas de ARNms virales no parecieron afectar significativamente la replicación del virus. 10. EJEMPLO 5: CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DE F DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO CON DIFERENTES REGIONES INTERGÉNICAS . Se usaron tres diferentes constructos para determinar el efecto de la región intergénica (los nucleótidos entre cada ARNm, por ejemplo, los nucleótidos entre el gen F y el gen N) sobre la expresión de proteínas y la replicación viral. Ver la Figura 8. El primer constructo fue RSV F1*N-N tratado con vectores de PIV3 b/h en la posición 1, el cual tenia una secuencia de detención del gen N/inicio del gel N de bPIV más corta (RSV F1*N-N en la Figura 4); el segundo constructo fue F de RSV tratado con vectores con PIV3 b/h en la posición 1 (RSV F2 en la Figura 4); y el último fue RSV tratado con vectores por PIV3 b/h en la posición 1 (RSV Fl en la Figura 4). Los tres constructos fueron generados de acuerdo a las estrategias de clonación descritas en la sección 7, Ejemplo 2. La diferencia más dramática entre los dos cartuchos es la distancia entre la secuencia de inicio del gen N y el codón de inicio de la traducción de N en PIV3 b/h/RVS F1*N-N, la cual fue solamente de 10 nts de largo. En contraste, esta distancia es de 86 nts de largo en PIV3 b/h/RSV F2. La otra diferencia es el uso de la secuencia de inicio del gen N en PIV3 b/h/RSV F1*N-N en lugar de la secuencia de inicio del gen P como se hizo en PIV3 b/h/RSV F2. Para determinar si la distancia entre el inicio de transcripción del gen y el inicio de traducción de una unidad de transcripción viral" tenia un efecto sobre la replicación del virus, se generó el constructo de PIV3 b/h/RSV Fl que contenia el cartucho del gen F de RSV idéntico como el usado para PIV3 b/h/RSV F2. 11. EJEMPLO 6: LA LONGITUD Y/O LA NATURALEZA DE LA REGIÓN INTERGENICA CORRIENTE ABAJO DEL GEN DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TIENE UN EFECTO SOBRE LA REPLICACIÓN DEL VIRUS . Los tres constructos en el Ejemplo 5 se usaron en los siguientes experimentos para determinar los efectos de la región intergénica sobre la expresión de proteínas virales y la replicación viral. Ver la Figura 9. Primero, se compararon la expresión de la proteína F de RSV para PIV3 b/h /RSV Fl, PIV3 b/h /RSV F1*N-N, y PIV3 b/h /RSV F2 a 24 y 48 hrs después de la infección a un MOI de 0.1 en células Vero, usando transferencias Western. Las transferencias Western se llevaron a cabo como sigue: se usaron virus quiméricos para infectar células Vero subconfluentes (79-80%) a un MOI de 0.1. veinticuatro horas y cuarenta y ocho horas después de la infección fue removido el medio de cubierta y las monocapas infectadas se lavaron una vez con 1 mL de PBS . Las células se Usaron subsecuentemente en 400 mL de amortiguador de Laemmli (Bio-Rad) que contenia 0.05% de b-Mercaptoetanol (Sigma) . 15 mL de cada muestra se separaron en gel Ready 12% Tris-HCl (Bio-Rad) y se transfirieron a membranas de nylon usando una celda de transferencia semiseca (Bio-Rad) . Las membranas de nylon se enjuagaron en PBS (pH 7.6) que contenia 0.5% (v/v) de Tween-20 (Sigma) (PBST) y se bloquearon con PBST conteniendo 5% (p/v) de leche seca (PBST-M) durante 20-30 minutos a la temperatura ambiente. Las membranas se incubaron ya sea con una mezcla de anticuerpos monoclonales de RSV F (WHO 1269, 1200, 1153, 112, 1243, 1107) a una dilución de 1:1000 en PBST-M durante 1 hora a la temperatura ambiente. Enseguida de 4 lavados con PBST, las membranas se incubaron con un anticuerpo antiratón (Dako) conjugado con peroxidasa de rábano picante secundaria a una dilución de 1:2000 en PBST-M por 1 hora a la temperatura ambiente. Las membranas se lavaron 4 veces con PBST y se desarrollaron usando un substrato quimioluminiscente (Amersham Pharmacia) y se expusieron Película Luminosa Biomax (Kodak) para la visualización de las bandas de proteína.
Los PIV3 b/h /RSV Fl expresaron niveles de proteina Fi de RSV a 24 y 48 horas después de la infección, cercanos a los niveles observados para PIV3 b/h /RSV F2 pero mucho mayores que aquellos para PIV3 b/h /RSV F1*N-N. Por lo tanto, el espaciamiento entre el elemento inicial del gen y el codón de inicio de la traducción puede ser critico para la replicación del virus. Las secuencia de inicio del gen N fueron cambiadas por las secuencias de inicio del gen P, sin embargo, este cambio incurrió solamente en la alteración de una sólo nucleótido. Cualquiera de estos factores puede ser responsable de rescatar el fenotipo de la proteina F de RSV. Enseguida, se llevaron a cabo las curvas de crecimiento para comparar la cinética de replicación del virus de PIV3 b/h /RSV Fl, PIV3 b/h /RSV F1*N-N, y PIV3 b/h /RSV F2 en células Vero a un MOI de 0.1 (ver la Figura 9B) , lo cual se llevó a cabo como sigue: se cultivaron células Vero a una confluencia del 90% y se infectaron a un MOI de 0.1 con PIV3 b/h, PIV3 b/h /RSV F1*N-N, PIV3 b/h /RSV Fl, y PIV3 b/h /RSV F2. Las monocapas infectadas se incubaron a 37°C. A las 0, 24, 48, 72, y 96 horas después de la infección, las células y el medio se recolectaron juntos y se almacenaron a-70°C. Los títulos del virus para cada punto de tiempo de recolección se determinaron mediante análisis de placas en células Vero. Los análisis de placas se inmunotiñeron con antisuero policlonal de RSV para la cuantificación después de 5 días de incubación. Como se mostró en la Figura 9B, el inicio de la replicación de PIV3 b/h /RSV F1*N-N estaba retardado y los títulos máximos fueron menores que aquellos para PIV3 b/h /RSV F2. En contraste, PIV3 b/h /RSV Fl desplegó una curva de crecimiento que fue cercanamente idéntica a aquella observada para PIV3 b/h/RSV F2. 12. EJEMPLO 7 : CLONACIÓN DE CONSTRUCTOS TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 HUMANA. Los siguientes ejemplos se refieren a la generación de vacunas trivalentes que albergan las glicoproteínas superficiales (F y HN) de hPIV3, RSV F, y hMPV F, para proteger a niños contra las enfermedades causadas por el RSV, hMPV y hPIV3, usando una sola vacuna de virus atenuados vivos. Estos virus trivalentes fueron recuperados mediante genética invertida. La construcción de dos genomas virales, que comprende cada uno un esqueleto de PIV3 b/h quimérico con dos inserciones heterologas adicionales, en donde una secuencia de nucleótidos heteróloga se deriva de un gen F de metapneumovirus y otra secuencia de . nucleótidos se deriva de un gen F del virus sincitial respiratorio, se hizo como sigue (ver la Figura 10) : los plásmidos de PIV3 b/h /RSV F2 o PIV3 b/h /RSV F2 se digirieron con Sphl y Nhel y se aisló un fragmento de 6.5 kb. El ADNc de longitud completa para PIV3 b/h /RSV Fl o PIV3 b/h /hMPV Fl se digirió con Sphl y Nhel y se aisló un fragmento de ADN de 14.8 kb y se ligó con el fragmento de ADN de 6,5 kb derivado del plásmido PIV3 b/h /RSV F2 o PIV3 b/h /hMPV F2 para generar los ADNcs virales de longitud completa. El virus con los constructos escritos arriba ha sido amplificado en células Vero. El virus modificado como se describe arriba puede ser usado como una vacuna trivalente contra la infección del virus de parainfluenza , la infección de metapneumovirus , y la infección del virus sincitial respiratorio . 13. EJEMPLO 8: CLONACIÓN DE DOS F DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO AL VECTOR DE PARAINFLUENZA 3 DE BOCINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO. Se diseñaron dos virus guiméricos gue transportaban dos copias del gen F de RSV, para determinar sin más proteina de RSV producida por los virus guiméricos resultaría en inmunogenicidad mejorada. Este virus fue rescatado mediante genética invertida, clonado biológicamente o amplificado en células Vero para dar una casta del virus con un título de lxlO6 pfu/mL. Este virus, PIV3 b/h /RSV F1F2, puede ser usado para evaluar la cinética de crecimiento del virus, para la producción de la proteína F de RSV, y para la replicación e inmunogenicidad en hámsteres. Los constructos se generaron de la siguiente manera (ver a Figura 11) : el plásmido 1-5 RSV F2 se digirió con Sphl y Nhel y se aisló un fragmento de 6.5 kb. El ADNc de longitud completa para PIV3 b/h RSV Fl se digirió con Shpl y Nhel y se aisló un fragmento de ADN de 14.8 kb y se ligó con el fragmento de ADN de 6.5 kb derivado de 1-5 bPIV3/RSV F2 para generar los ADNcs virales de longitud completa. 14. EJEMPLO 9: CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DEL ADNc DE F DEL METAPNEUMOVIRUS DE HUMANO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO. El gen del metapneumovirus humano (hMPV) se insertó en las posiciones 1 y 2 del genoma de PIV3 b/h (Figura 12) . El cartucho del gen F de hMPV alberga la región intergénica N-P. Se uso el plásmido del gen F de hMPV (pRF515), y se corrigió una sola mutación de nucleótido en el gen f de hMPV (es decir, el nucleótido 3352 se corrigió de C a T (tipo salvaje)), generando pRF515-M4. La región intergénica N-P de bPIV3 se agregó en el extremo 3' del gen F de hMPV usando el PCR de traslape. Para hMPV F, el oligo de PCR de traslape fue 5 ' GGCTTCATACCACATAATTAGAAAAATAGCACCTAATCATGTTCTTACAATGGTCG ACC3' . Durante este paso de clonación se usaron en el extremo 5' ( 5 ' GCAGCCTAGGCCGCAATAACAATGTCTTGGAAAGTGGTG ATC 3') y en el extremo 3' del cartucho del gen F de hMPV (5' CTACCTAGGTGAATCTT TG3' ) en la reacción de PCR que contenia los sitios de la enzima de restricción Avrll-, El cartucho del gen F de hMPV se ajustó para estar de acuerdo a la regla de seis, usando el equipo de mutagénesis QuickChange y los siguientes oligos (5' CCTAGGCCGCAATAGACAATGT CTTGG3' , 5 ' CCAAGACATTGTCTATTGCGG CCTAGG3' ) . Los plásmidos de ADNc de PIV3 b/h/hMPV Fl (posición 1) y F2 (posición 2) de longitud completa se generaron en la misma manera como se describe en la sección 9, Ejemplo 4, supra, para PIV3 b/h/eGFPl y eGPF2. 15. EJEMPLO 10: ANÁLISIS DE INMUNOPRECIPITACIÓN Y REPLICACIÓN DE METAPNEUMOVIRUS F TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO Para confirmar que la proteina F era expresada en el metapneumovirus F humano vectoreado por PIV3 b/h en la posición 2, se uso antisuero de cobayos o humano para inmunoprecipitar la proteina F de hMPV (ver la Figura 13A) . Para la inmunoprecipitación de la proteina F de hMPV expresada por PIV3 b/h, se infectaron células. Vero con PIV3 b/h o PIV3 b/h/hMPV F2 a un MOI de 0.1 o 0.05. Veinticuatro horas después de la infección, las células se lavaron una vez con DME sin cisterna y menos metionina (ICN) y se incubaron en el mismo medio por 30 min. El medio se removió y se agregaron a las células 0.5 mL de DME que carecía de cisterna y metionina conteniendo 100 \iCi de [ S]-Pro-Mix ( ersham) . Las células infectadas se incubaron en presencia de isótopos 35S durante 5 horas a 37°C. Se removió el medio y las células infectadas se lisaron en amortiguador RIPA 0.3 M que contenia inhibidores de proteasa. El lisado celular se incubo con antisuero policlonal hMPV de cobayo o humano y se enlazó a IgG-agarosa (Sigma) . Después de lavar tres veces con amortiguador RIPA 0.5M, las muestras se fraccionaron en un gel de proteina al 10%. El gel se secó y se expuso a película de rayos X. La expresión de la proteína F de hMPV por el PIV3 b/h/hMPV F2 se mostró mediante inmunoprecipitación usando antisuero anti hMPV gp y humano (Figura 13A) . De manera interesante, una banda específica migrando a aproximadamente 80 kDa se observó en los lisados de PIV3 b/h/hMPV F2. Este tamaño corresponde a la proteína precursora de F, F0. Se observaron también bandas no específicas de diferentes tamaños en las sendas PIV3 b/h y de control falso (Figura 13) . Estos datos sugieren que el PIV3 b/h/hMPV expresó la proteína F de hMPV. Sin embargo los reactivos anticuerpos de hMPV disponibles son limitados y estos antisueros interactúan sólo con el precursor de la proteína F de hMPV. Podría ser posible que la Fl escindida sea inestable y por lo tanto no se visualiza fácilmente usando este método. Las curvas de crecimiento se llevaron a cabo para determinar la cinética de la replicación de virus de PIV3 b/h /hMPV F2 y compararlas con aquellas observadas para PIV3 b/h y PIV3 b/h /RSV F2 en células Vero a un MOI de 0.1 (Figura 13B) . Los datos mostraron que el PIV3 b/h /hMPV F2 desplegó un inicio atrasado de la replicación a 24 horas después de la infección en comparación con PIV3 b/h /RSV F2. Sin embargo, a 48 horas después de la infección y más allá, no se observó ya una diferencia en la replicación. Las curvas de crecimiento se llevaron a cabo también para determinar la cinética de la replicación viral de PIV3 b/h /hMPV Fl y compararla con aquellas observadas para PIV3 b/h /hMPV F2 y PIV3 b/h en células Vero a un MOI de 0.01 (Figura 13C) . Los datos mostraron que el PIV3 b/h /hMPV Fl tenia un inicio atrasado de la replicación y daba títulos máximos menores en comparación con PIV3 b/h" /hMPV F2 o PIV3 b/h. El tamaño de las placas de hMPV b/h Fl es también más pequeño en comparación con hMPV b/h F2. Los virus quiméricos PIV3 b/h/hMPV Fl y F2 fueron evaluados también con respecto a su habilidad para infectar y replicarse en hámsteres Dorados de Siria (Tabla 5) . Los resultados mostraron que PIV3 b/h/hMPV Fl y F2 se replican en los cornetes nasales y los pulmones de los hámsteres a niveles observados para el PIV3 b/h. aun el hMPV se replica a títulos de 5.3 y 3.6 logio TCID5o/g de tejido en los tractos respiratorios superior e inferior de los hámsteres. Estos datos mostraron que el PIV3/hMPV Fl y F2 podrían infectar eficientemente y replicarse en el tracto respiratorio de los hámsteres, demostrando por ello que los hámsteres representan un modelo animal pequeño adecuado para determinar la inmunogenicidad del hMPV así como utilizar este modelo animal para evaluar las vacunas candidatas de hMPV. Tabla 5 Replicación de PIV3 b/h que expresa la proteína F de hMPV en las Posiciones 1 o 2 en Hámsteres Virus3 Título promedio del virus en el día 4 después de la infección j. (logio TCI D50/g de tejido ±S.E.)b * Cornetes nasales Pulmones PIV3 b/h 4.8±0.2 5.6±0.6 hMPV Fl b/h 5.3±0.5 5.7±0.4 hMPV F2 b/h • 5.7±0.5 4.6±0.3 hMPV * 5.3±0.1 3.6±0.3 aGrupos de seis hámsteres fueron inoculados intranasalmente con lxlO6 pfu del virus indicado bError estándar ^ Nota: los análisis de TCID50 se leyeron para CPE en el Día 10. 16. EJEMPLO 11: CLONACIÓN DEL CONSTRUCTO DEL GEN F DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO SOLUBLE. Un constructo o construcción que contenía una sola copia de un gen F de RSV soluble, se generó también una versión del gen F de RSV que carece de los dominios transmembrana y citosólico (Figura 14). Este constructo puede ser usado para evaluar la inmunogenicidati . Su ventaja seria la inhabilidad de la RSV F soluble para ser incorporada en la membrana de los viriones. Por lo tanto este virus puede ser visualizado como un virus quimérico más seguro ya que no se espera que cambie su tropismo. El plásmido de ADNc para PIV3 b/h /sol RSV F puede ser recatado medi-ente genética invertida. El plásmido 1-5/RSV F2 (descrito previamente) se uso como i una plantilla de · ADN para PCR. El oligo de RSV f.2 ( 5 ' GCTGTAACAGAATTGCAGTTGC3 ' ) (el cual se hibridiza en nt 5946 de RSV) y el oligo 5 ' CGTGGTCGACCATTGTAAGAACATGATTAGGTGCATA TTTTATTTAATTTGTGGTGGATTTACCGGC3 ' se emplearon para remover los dominios transmembrana y citopAasmático de RSV F, eliminando 150 nucleótidos. El fragmento de PCR resultante fue digerido con hpal y Salí e introducido en 1-5 RSV F2 tratado con Hpal y Salí para dar 1-5 be¿V3/sol RSV F. Este plásmido se digirió con Sphl y Nhel y el fragmento resultante se introdujo en un ADNc de PIV3 b/h diferido con Sphl y Nhel para generar un ADNc de longitud completa. 17. EJEMPLO 12 : EXPRESIÓN DE F DE METAPNEUMOVIRUS HUMANO EN CÉLULAS INFECTADAS CON EL METAPNEUMOVIRUS F HUMANO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO. Las existencias del virus b/h 104 hMPV F fueron diluidas serialmente 10 veces y se usaron para infectar células Vero subconfluentes . Las células infectadas se cubrieron con medio optiMEM conteniendo gentamicina y s'e incubaron a 35 °C por 5 días. Las células sé fijaron con metanol al 100% y se inmunotiñeron con dilución 1:1000 de suero de cobayo anti-hMPVOOl seguido por- dilución 1:1Q00 de anticuerpos conjugados a HRP anti cerdo de guinea. £a expresión de hMPV F se visualizó mediante el desarrollo del color específico en presencia del sistema de substrato de AEC (DAKO corporation) . Ver la Figura 15A. Las existencias del virus b/h NP-P hMPV F se diluyeron en serie 10 veces y ¾e usaron para infectar células Vero subconfluentes . Las cé'lulas se cubrieron con metil celulosa al 1% en medio EMEM/L-15. (JRH Biosciences ; Lenexa, KS) suplementado con medio lxL15/MEM que conteniendo penicilina/estreptomicina, L-glutamina y suero de bovino fetal. Las células infectadas se incubaron a 35°C por 5 días, se fijaron con metanol al 100% y se inmunotiñeron con dilución 1:1000 de suero de cerdo de guinea anti hMPVOOl seguido por dilución 1:1000 de anticuerpos conjugados a HRP anti-cobayo. (Ver la Figura 15B) . El suero de cerdo de guinea anti hMPVOOl es específico para las proteínas de hMPVOOl y no se enlaza a las proteínas de PIV3 h/b. '· 18. EJEMPLO 13: RECATE DEL VIRUS QUIMÉRICO DE PARAINFLUENZA TIPO 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA TIPO 3 DE HUMANO EN CÉLULAS HELA Y CÉLULAS VERO El recate del virus PIV3 b/h quimérico se hizo usando un procedimiento similar como para el rescate de bPIV3. El rescate del virus quimérico PIV3 b/h mediante genética invertida se llevó a cabo en células HeLa usando LipofecTACE (Gibco/BRL) . Las células 80% confluentes, células Hep-2, o células Vero se infectaron con MVA a un MOI de 4. Una hora después de la infección, el ADNc de PIV3 b/h antigenómico (4 Mg) se transfectó en las células HeLa o Vero infectadas junto con los plásmidos de expresión NP (0.4 pg) , P (0.4 pg) , y L/pCITE (0.2 ig) ¦ Cuarenta horas después de la transfección, las células y el sobrenadante se recolectaron (P0) y se sometieron a un sólo ciclo de congelación-descongelación. El lisado resultante se uso entonces para infectar una monocapa de células Vero frescas en presencia de 1-beta-D-arabinofuranosilcitosina (ara C) , un inhibidor de replicación del virus de la vacuna, para generar una existencia de virus Pl. El sobrenadante y las células de estas placas se recolectaron, se congelaron-descongelaron una vez y se analizó la presencia de partículas del virus bPIV3 mediante inmunoteñido o placas del virus usando el antisuero específico para PIV3. Los lisados celulares y la cosecha de Pl resultaron en CPE completo de las monocapas de células Vero y el inmunoteñido indicó la presencia de una infección extensiva del virus. 19. EJEMPLO 14: RECATE DE VIRUS DE METAPNEUMOVIRUS F HUMANOS , TRATADOS CON VECTORES, DE PARAINFLUENZA TIPO 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA TIPO 3 DE HUMANO. Los virus PIV3 b/h que. expresan F de hMPV en una posición uno (b/h 104 hMPV F) o posición dos (b/h NP-P hMPV F) se obtuvieron como sigue. Células HEp-2 o Vero a una confluencia de 80-90% en platos de 6 pozos se infectaron con Folpox-T7 a una multiplicidad de infección (m.o.i) se 0.1 a 0.3. Enseguida de la infección con Fowlpox-T7, las células se lavaron una vez con PBS y se transfectaron con las siguientes cantidades del ADN de plásmido: ADNc de b/h 104 hMPV F o b/h NP-P hMPV F ADNc 2.0 iq, pCite N 0.4 \iq, pCite P 0.4 µg, pCite L 0.2 yg. (Los plásmidos pCite tienen un promotor de T7 seguido por el elemento IRES derivado del virus de encefalomiocarditis (EMCV) ) . La transfección de llevó a cabo en presencia de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones de fabricante. La reacción de transfección se incubó a 33°C por 5 a 12 horas enseguida de lo cual se reemplazo el medio que contenia la lipofectine 2000 con. 2 mL de OptiMEM fresco conteniendo gentamicina. Las células transfectadas se incubaron adicionalmente a 33°C por dos días. Las células se estabilizaron con SPG y se Usaron mediante un ciclo de congelación-descongelación a -80°C. El lisado celular crudo" se uso para infectar una nueva monocapa de células Vero para amplificar los virus recatados. 20. EJEMPLO 15; RECATE DE LOS GENES DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TRATADO CON VECTORES, DE PARAINFLUENZA TIPO 3 DE BOVINO/PARAINFLUE ZA TIPO 3 DE HUMANO, MEDIANTE GENÉTICA INVERTIDA. Los virus infeccioso se recuperaron mediante genética invertida en células HeLa o HEp-2, usando los métodos de transfección descritos previamente (ver Ejemplo 13) . En pocas palabras, las células HEp-2 o Vero a 80-90% de confluencia en platos de 6 pozos se infectaron con FP-T7 o MVA-T7 a una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 0.1-0.3 o 1-5 respectivamente. Enseguida de la infección con FP-T7 o MVA-T7, las células se lavaron una vez con y se transfectaron con las siguientes cantidades de ADN de plásmido (2.0 yg de ADNc de PIV3 b/h RSV F o G, 0.4 pg de pCITE/N, 0.4 \iq de pCITE/P, 0.2 g de pCITE/L) . Las transfecciones se llevaron a cabo en presencia de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las reacciones de transfección se incubaron a 33°C por 5 a 12 horas enseguida de lo cual se reemplazó el medio que contenia Lipofectamine 2000 con 2 mL de OptiMEM fresco conteniendo gentamicina. Las células transfectadas se incubaron adicionalmente a 33°C por dos días. Las células se estabilizaron con SPG y se lisaron con un ciclo de congelación-descongelación a -80°C. El lisado de células crudo se uso para infectar una nueva monocapa de células Vero para amplificar los virus recatados. Los virus quiméricos se purificaron mediante diluciones limitantes en células Vero y se generaron reservas de virus con altos títulos de 106 - 108 PFU/mL. Los genes de RSV se los virus quiméricos se aislaron mediante RT-PCR y se confirmaron las secuencias. Se confirmó la expresión de las proteínas de RSV mediante inmunoteñido de las monocapas de células Vero infectadas con antisuero policlonal de cabra de RSV. (Biogénesis). 21. EJEMPLO 16: CONFIRMACIÓN DEL RECATE DEL VIRUS QUIMÉRICO DE PARAINFLUENZA TIPO 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA TIPO 3 DE HUMANO, MEDIANTE RT-PCR. Para determinar que el virus recatado es de naturaleza quimérica, es decir, el virus contiene las secuencias del gen F y HN del hPIV en un esqueleto de bPIV3, el genoma de ARN viral se analizó adicionalmente mediante RT-PCR. Células Vero, infectadas con las reservas de virus Pl de tres aislados derivados independientemente de b/h PIV3 se recolectaron y se aisló el ARN total. El ARN viral se amplificó usando un oligo que se hibridiza con calor y. frío en la posición 4757 de bPIV3. Una región viral desde nt 5255 a 6255 · se amplificó mediante PCR. El fragmento de PCR de 1 kb resultante debería contener las secuencias de hPIV3. Esto se confirmó mediante digestión con enzimas (Sacl y Bgl II) específicas para el hPIV3 y que no cortan en la región complementaria del PIV3 (ver la Figura 2) . Como se espera, Sacl y Bgl II cortan el fragmento de PCR en fragmentos pequeños, confirmando que las secuencias aisladas se derivan de hPIV3 (ver las sendas 3, 5, 7) . Además, una región en el gen L de polimerasa desde nt 9075 a nt 10496 se amplificó mediante PCR. Esta región deberá contener las secuencias de bPIV3. Otra vez, el fragmento de PCR de 14 kb se digirió usando enzimas específicas para bPIV3 (Pvull y BamHl) que no cortan en la región equivalente de hPIV3 (Figura 3). El fragmento de 1.4 kb fue realmente digerido tanto por Pvull y BamHl confirmando que el gen de la polimerasa es bPIV3 de origen (ver las sendas 3, 4, 6, 7, 9, y 10 de la Figura 3) . En resumen, el análisis de RT-PCR muestra que el virus PIV3 b/h rescatado es de naturaleza quimérica. Este contiene los genes F y HN de hPIV3 en un esqueleto genético de bPIV3. 22. EJEMPLO 17: ESTABILIDAD GENÉTICA DE LOS GENES DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA TIPO 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA TIPO 3 DE HUMANO. Para demostrar que los virus quimérico PIV3 b/h/RSV son genéticamente estables y mantienen los cartuchos de los genes de RSV introducidos, se hacen pasar en serie en forma ciega diez veces en células Vero. Células Vero subconfluentes en frascos T25 se infectaron con PIV3 b/h/RSV a un MOI de 0.1 y se incubaron por 4 días a 33°C o hasta que el CPE fue visible. Al final del periodo de incubación se recolectaron las células infectadas y el medio, se congelaron y descongelaron dos veces, y el lisado de células resultante se uso para infectar un nuevo frasco de T25 de células Vero. Este ciclo se repitió diez veces. Todos los lisados de células desde el Pl al PIO se analizaron mediante análisis de placas e inmunoteñido con antisuero policlonal de RSV por la expresión de las proteínas de RSV y los títulos del virus. En el pasaje 10, los cartuchos genéticos de RSV se aislaron mediante RT-PCR y las secuencia genéticas de RSV se verificaron mediante análisis de la secuencia de ADN (para identificar las posibles alteraciones de nucleótidos ) . Todos los aislados mantuvieron los cartuchos genéticos de RSV y la expresión de proteínas de RSV para los 10 pasajes analizados (no se muestran los datos) . 23. EJEMPLO 18. FRACCIONAMIENTO DE LOS VIRIONES DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA TIPO 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA TIPO 3 DE HUMANO, EN GRADIENTES DE SUCROSA La cuestión de si las proteínas de RSV fueron incorporadas en los viriones de PIV3 b/h, se investigó adicionalmente mediante el uso de un análisis bioquímico. Células Vero fueron inoculadas con cada uno de los virus PIV3 b/h /RSV quiméricos a una MOI de 0.1. Cuando fue visible el CPE máximo las monocapas infectadas se congelaron, descongelaron, y se hicieron girar por 10 minutos a 2000 rpm. Los sobrenadantes clarificados se hicieron girar a través de un colchón de sucrosa al 20% a 100,000x g durante 90 minutos. La pelotilla se resuspendió entonces en PBS y se cubrió suavemente por encima de un gradiente de sucrosa al 20-66%. Las gradientes se hicieron girar a 100,000 x g por 20 horas para lograr el equilibrio. Dieciocho fracciones de 2 mL se recolectaron iniciando desde la parte superior del gradiente. 0.4 mL de cada fracción se removieron para la determinación del título del virus. Cada fracción se resuspendió en 2 volúmenes de PBS al 20% y se concentraron mediante giros a 100,000 x g durante 1 hora. La pelotilla se resuspendió entonces en 0.05 mL de amortiguador de Laemmli (Biorad) y se analizó por las proteínas de RSV y PIV3 mediante transferencia Western, usando un antisuero policlonal de RSV F MAb (NuMax LIAR-S28R) , RSV (biogénesis) y bPIV3 (VMRD) . La proteína F de RSV truncada en la C terminal expresada en el báculovirus que se purificó a homogeneidad, se analizó también en gradientes de sucrosa.
Las fracciones se analizaron también por lo títulos máximos del virus mediante análisis de placas. Se llevaron a cabo inicialmente gradientes de control de la F de RSV (generada en el báculovirus y truncada en la C terminal), RSV A2, y PIV3 b/h. La mayoría de la F de RSV estuvo presente en las fracciones 3, 4, 5 y 6 en la porción superior del gradiente (Figura 16A) . La mayor concentración de viriones de RSV se observó en las fracciones 10, 11 y 12 (Figura 6B) . Las fracciones de RSV se sondearon con antisuero policlonal de RSV así como . RSV F MAb . . Las fracciones que contenían las cantidades mayores de viriones de RSV mostraron también las señal más fuerte para F de RSV, sugiriendo que la' proteína F de RSV comiera y se asocia con los viriones de RSV (Figura 16B) . Estas fracciones despliegan también los títulos más altos del virus (Figura 16B) . Los viriones de PIV3 b/h fueron más amplios. Los viriones de PIV3 b/h estaban presentes en las fracciones 9, 10, 11, 12, y 13 (Figura 16C) . Otra vez, las fracciones que albergan las cantidades mayores de viriones, despliegan también los títulos más altos del virus mediante el ensayo de placas (Figura 16C) . Las fracciones del gradiente de sucrosa de PIV3 b/h/RSV F2 se analizaron tanto con el antisuero policlonal de PIV3 y un RSV F MAb (Figura 16D) . Las fracciones que contenían la mayoría de los viriones fueron las fracciones 11, 12, 13 y 14 como se mostró por Western usando el anticuerpo de PIV3. Correspondientemente, estas fueron también las fracciones que desplegaron las cantidades más altas de proteina F de RSV. Sin embargo, algo de la proteina F de RSV estaba presente también en las fracciones 5 y 6. Las fracciones 11, 12, 13, y 14 desplegaron los títulos máximos del virus (Figura 16D) . De manera similar, las fracciones que contenían la mayoría de los viriones de PIV3 b/h/RSV G2 (fracciones 9, 10, 11, y 12) mostraron también la señal más fuerte para la proteína G de RSV (Figura 16E) . Otra vez, estas fueron las fracciones con los títulos mayores del virus (Figura 16E). Colectivamente, estos datos sugieren que las mayoría de las proteínas F y G de RSV comigran y se asocian con los viriones de PIV3 b/h. sin embargo, algunas proteínas de RSV libres estaban presentes también en las fracciones superiores de los gradientes. 24. EJEMPLO 19: EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO (RSV) TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA TIPO 3 DE BOVINO/ ARAINFLUENZA TIPO 3 DE HUMANO, PODRÍA NO SER NEUTRALIZADO CON EL ANTISUERO DE RSV Para tratar la importante cuestión de seguridad de si las glicoproteínas superficiales de RSV incorporadas en los viriones de PIV3 b/h resultan en un fenotipo de tropismo alterado del virus, se llevaron a cabo análisis ensayos de neutralización (Tablas 6 y 7). RSV F MAb (WHO 1200 MAb) neutraliza 50% del RSV del tipo salvaje a una dilución de 1:2000 (Tabla 6). En contraste, aun una dilución de 1:25 no neutraliza nada del ' PIV3 b/h /RSV quimérico. De manera similar, una dilución de 1:400 del antisuero de RSV policlonal (Biogénesis) neutralizó 50% de RSV A2, pero aun una dilución de 1:15.6 no neutraliza el PIV3 b/h RSV (Tabla 6).
Tabla 6 Los virus Quiméricos PIV3 b/h RSV no son neutralizados por los anticuerpos de RSV Virus usados en el análisis Dilución del anticuerpo de neutralización 50% reciproca de neutralización RSV F MAb RSV Ab RSV * 2000 400.0 PIV3 b/h . · <25 <15.6 RSV b/h Fl *N-N " <25 <15.6 RSV b/h F2 <25 <15.6 RSV b/h Gl ND <15.6 RSV b/h G2 ND <15.6 hPIV3 MAb C19/19 neutraliza el 50% de PIV3 b/h asi como el PIV3 b/h /RSV, a una dilución de 1:500 (Tabla 7). Un hPIV3 HN MAb 68/2 neutraliza el PIV3 b/h a una dilución de 1:16,000 y el PIV3 b/h /RSV a una dilución de 1:32,000 (Tabla 7).
Tabla 7 Los virus Quiméricos PIV3 b/h RSV son Neutralizados por hPIV3 Mabs Virus usados en el análisis Dilución del anticuerpo de neutralización 50% reciproca de neutralización hPIV3 F MAb hPIV3 HN MAb RSV 62.5 <500 PIV3 b/h ¦ 500 16000 RSV b/h Fl*N-N 500 32000 RSV b/h F2 500 32000 RSV b/h Gl NDd 32000 RSV b/h G2 ND 32000 d No determinado. 25. EJEMPLO 20': EL PIV DE BOVINO QUIMÉRICO DEMUESTRA FENOTIPOS ATENUADOS Y PROVOCA FUERTES RESPUESTAS PROTECTORAS CUANDO SE ADMINISTRA IN VIVO Hámsteres Dorados, de Siria de cinco semanas de edad se infectaron con 5x 105 pfu de bPIV3 del tipo salvaje, bPIV3 recombinante, hPIV3, PIV3, de humano/bovino, y placebo. Los cinco diferentes grupos de animales se mantuvieron separados en jaulas aislantes de microbios, cuatro días después de la infección, los animales se sacrificaron. Los cornetes nasales y los pulmones de los animales se homogeneizaron y almacenaron a -80°C. El virus presente en los tejidos se determinó mediante análisis de TCID50 en células MDBK a 37°C. La infección del virus se confirmó mediante hemoabsorción con células rojas de sangre de cerdos de guinea. La Tabla 8 muestra los títulos de replicación de las diferentes cepas de PIV3 en los hámsteres en los pulmones y los cornetes nasales.
Nótese que los virus BIV3 recombinante y PIV3 quimérico e atenuados en los pulmones de los hámsteres: Tabla 8 replicación de los virus PIV3 en Hámsteres Dorados de Siria en los Cornetes Nasales y Pulmones aGrupos de cuatro hámsteres fueron inoculados intranasalmente con 5 x 105 PFU del virus indicado. bError Estándar. Además, se recolectaron muestras de suero de los hámsteres antes de la infección y en el día 21 después de la infección se analizaron en un análisis de inhibición de hemoaglutinación . Las muestras de suero se trataron con la enzima destructora de los receptores (RDE, DENKA, Seiken Co.) y las aglutininas no especificas se retiraron mediante incubación con células rojas de sangre de cerdos de guinea por 1 hora en hielo. El bPIV3 y el hPIV3 del tipo salvaje se agregaron a muestras de suero de hámster diluidas serialmente dos veces. Finalmente, las células (0.5%) sanguíneas rojas de de cobayo se agregaron, y se permitió ocurrir la hemoaglutinación a la temperatura ambiente. La Tabla 9 muestra la respuesta del anticuerpo generada en los hámsteres tras ser infectados con las diferentes cepas de PIV3. Nótese que los virus quiméricos de PIV3 b/h generan una respuesta del anticuerpo tan fuerte contra el hPIV3 como lo hace el hPIV3, excediendo la respuesta generada por el bPIV del tipo salvaje: Tabla 9 Análisis de Inhibición de la Hemoaglutinación Usando Suero de Hámsteres Infectados con Diferentes Virus PIV3 Virus Usados para la inoculación de los Títulos del Suero de los Hámsteres para Hámsteres wt bPIV3 hPIV3 bPIV3 recombinante 1 : 16 1 : 16 Wt bPIV3 1 : 16 1 :8 wt hPIV3 1 :4 1 : 128 virus quimérico PIV3 b/h 1 :8 1 : 128 placebo <1 :4 <1 :4 Estos resultandos demuestran las propiedades de los virus quiméricos de PIV3 b/h de la presente invención las cuales hace a estos recombinantes adecuados para usarse para formular vacunas. Los virus PIV3 b/h quiméricos no sólo demuestran un fenotipo atenuado cuando se administran in vivo, sino que también generan una respuesta de anticuerpos tan fuerte como el hPIV3 del tipo -salvaje. Por lo tanto, ya que los virus quiméricos de la presente invención tienen la combinación única de tener un fenotipo atenuado. y provocar una respuesta tan fuerte como un hPIV del tipo salvaje, estos virus quiméricos tienen las características necesarias para usarse exitosamente en humano para inhibir y/o proteger contra la infección con PIV. 26. EJEMPLO 21: REPLICACIÓN DE LA PROTEÍNA G O F DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA TIPO 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA TIPO 3 DE HUMANO, EN EL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR E INFERIOR DE HAMSTERES . Hámsteres Dorados de Siria de cinco semanas de edad (seis animales por grupo) se infectaron intranasalmente con 1 x 106 pfu o 1 x 104 pfu de PIV3 h/b, PIV3 h/b /RSV, RSV A2, o medio de placebo en un volumen de 100 mL. Los diferentes grupos se mantuvieron separados en bajas 'aislantes de microbios. Cuatro r días después de la infección se recolectaron los cornetes nasales y los pulnjones de los animales, se homogenei zaron y se almacenaron a -70°C. Se determinaron los títulos del virus, presentes en los tejidos mediante análisis de TCID50 en células Vero. Para los análisis de desafio, los animales se inocularon en el día 28 intranasalmente con 1 x 106 pfu/mL de hPIV3 o RSV A2. Cuatro días después de la prueba de inmunidad, los cornetes nasales y los pulmones de los animales se aislaron y se analizaron por la replicación del virus de la prueba de inmunidad mediante análisis de placas en células Vero que fueron inmunoterfídas ^para su cuantificación . La Tabla 10 muestra los títulos de replicación de las diferentes cepas en masteres en los pulmones y los cornetes nasales.
Tabla 10 Replicación de PIV3 bovino/humano que expresa las proteínas G o F de RSV, en el Tracto Res iratorio Su erior e Inferior de Hámsteres aGrupos de cuatro hámsteres fueron inoculados intranasalmente con 5 x 106 PFU del VLÍUS indicado. bError Estándar.
Los hámsteres Dorados de Siria representan un modelo de animal pequeño adecuado para evaluar la replicación y la inmunogenicidad de los virus bPIV3 ' y el hPIV3 recombinantes modificados genéticamente. Se esperó que la introducción de los antigenos de RSV no alterara la habilidad del PIV3 b/h quimérico para replicarse en hámsteres. Los resultados muestran que todos los virus quiméricos se replican a niveles similares a aquellos del PIV3 b/h en los cornetes nasales de los hámsteres (Tabla 10) . « En contraste, los virus quiméricos que albergan los genes de RSV en la primera posición, despliegan títulos reducidos 1-1.5 logio en los pulmones de los hámsteres en compararon con el PIV3 b/h (Tabla 10) . Los virus quiméricos que contienen los genes de RSV en la segunda posición se replican a los títulos similares observados en el tracto respiratorio i ferior de los hámsteres (Tabla 10) . 27. EJEMPLO 22: LOS HÁMSTERES INMUNIZADOS CON EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO FUERON PROTEGIDOS TRAS LA PRUEBA DE INMUNIDAD CON EL VIRUS SINCITIAL ^RESPIRATORIO A2 Y DE PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO. t En el día 28 después de la inmunización, los hámsteres fueron desafiaos ¾on 1 x 106 PFU ya sea de RSV A2 o hPIV3 para evaluar la inmunogenicidad inducida por el PIV b/h /RSV. Los animales que recibieron el PIV3 b/h /RSV fueron protegidos completamente del RSV así como del hPIV3 (Tabla 11) . Solamente los animales que fueron a los que se les administró el medio de placebo desplegaron altos títulos del virus desafiante en los tactos respiratorios inferior y superior. Este análisis mostró también que los animales inmunizados con RSV, no fueron protegidos contra la prueba de inmunidad con hPIV3. De manera similar, los animales, vacunados con hPIV3, desplegaron altos títulos del virus de la prueba de inmunidad RSV (Tabla 11) .
Tabla 11 Los Hámsteres Inmunizados con PIV3 b/h/RSV fueron Protegidos Tras el Desafío aVirus usado para inmunizar los grupos de seis hámsteres en el día 0. bEn el día 28, los hámsteres fueron desafiados con 105 pfu de hPIV3 o RSV A2. Cuatro días después de la prueba de inmundad, los pulmones y los cornetes nasales de los animales fueron recolectados. cError Estándar. 28. EJEMPLO 23: LA VACUNACION DE HAMSTERES CON EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO - TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO INDUCE EL HAI DEL SUERO Y LOS ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Antes de la prueba de inmunidad, se obtuvieron muestras de suero de los animales en el Día 28. El suero de los hámsteres se analizó por la presencia de los anticuerpos neutralizantes de RSV usando reducción de placas al 50%, y por los anticuerpos del suero de PIV3 HAI llevando a cabo análisis de inhibición e la hemoaglutinación (HAI) (Tabla 8). El análisis de reducción de placas al 50% (análisis de neutralización) se lleyó a cabo como sigue: el suero de los hámsteres se diluyó serialmente dos veces y se incubó con 100 PFU de RSV A2 por una hora. Después, las mezclas de suero virus se transfirieron a monocapas de células Vero y se cubrieron con metilcelulosa . Después de 5 días de incubación a 35°C, las monocapas se inmunotiñeron usando antisuero policlonal de RSV para la cuantificación . Los análisis de inhibición de la hemoaglutinación (HAI) se llevaron a cabo mediante la incubación de diluciones seriales dos veces del suero de hámsteres del Día 28 a 25°C por 30 rain con hPIV3 en palcas de fondo en V de 96- pozos. Subsecuentemente se agregaron eritrocitos de cobayo a cada pozo, se continuó la incubación por 90 minutos adicionales, y se registró la presencia o ausencia de hemoaglutinación en cada pozo. Los resultados muestran que los virus que expresan la proteína de RSV desplegaron títulos del anticuerpo neutralizante de RSV tan altos como aquellos observados con el suero obtenido de los animales vacunados con RSV del tipo salvaje (Tabla 12 ) . En contraste, los que virus que expresan la proteína G de RSV mostraron niveles menores de anticuerpos neutralizantes de RSV (Tabla 12 ) todos los sueros de hámsteres con PIV3 b/h/RSV quiméricos mostraron niveles de anticuerpos de suero HAI que estaban cercanos a los niveles observados para PIV3 b/h (Tabla 12 ) . Los resultados mostraron que el PIV3 b/h quimérico puede infectar y replicarse eficientemente en masteres y provocar una respuesta inmune protectora.
Tabla 12 La Vacunación de Hámsteres con PIV3 b/h/RSV Induce el HAI del Suero y los Anticuer os Neutralizantes aVirus usados para inmunizar los hámsteres. bLos títulos del anticuerpo neutralizante se determinaron mediante un análisis de reducción de placas al 50 % . cLos títulos del anticuerpo neutralizante antes del suero fueron <0 . 1 y los títulos del anticuerpo HAI fueron <4 . 0 . 29. EJEMPLO 24: LA VACUNACIÓN DE HÁMSTERES CON DOSIS BAJAS DE VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO, PROTEGE A LOS HÁMSTERES DE LA PRUEBA DE INMUNIDAD CON EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO A2 , E INDUCE EL HAI DEL SUERO Y LOS ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES Para identificar la mejor vacuna candidata, se usaron dosis bajas de diferentes constructos (ver el Ejemplo 2) para inmunizar hámsteres. Los resultados de los experimentos de prueba de inmunidad se resumen en la Tabla 13.
Tabla 13 Los Hámsteres Inmunizados con Dosis Bajas de PIV3 b/h/RSV son Protegidos del Desafío con RSV A2 Replicación Desafío con RSV A2 Título Promedio del Virus en el Título Promedio del Virus en Día 4 Después de la Infección el Día 4 Después de 1 a (logio TCID50 lg de tejido ± Infección (logio pfu /g de S.E. c tejido ± S.E.) Virus Inmunizante3 .Cornetes Pulmones Cornetes Pulmones nasales nasales PIV3 b/h 4.9±05 4.8±1.0 ND ND RSV Gl b/h 3.0±0.8 3.1±0.5 <0.9±0.5 <0.7±0.4 RSV b/h Fl NP-P 3.4±0.1 3.5±0.1 <1.4±0.7 <0.5±0.0 RSV G2 b/h 4.1±0.6 3.8±0.4 <0.8±0.0 <0.5±0.1 RSV F2 b/h 5.2*±0.6 3.9±0.4 <0.7±0.1 <0.5±0.1 RSV A2 2.8±0.3 2.7±0.6 <0.8±0.1 <0.5±0.0 Placebo NDd ND 3.0±0.8 3.2±0.9 aVirus usado para inmunizar los grupos de seis hámsteres en el día 0 con una dosis baja de 10" PFU/mL. bEn el dia 28 les hámsteres fueron enfrentados cor. : pfu de RSV A2. Cuatro días después de la prueba de inmunidad , los pulmones y los cornetes nasales de los animales fueron recolectados. cError estándar. dNo determinado.
Enseguida se determinaron los títulos del anticuerpo neutralizante mediante un análisis de reducción de placas al 50% (análisis de neutralización) . Los análisis de neutralización se llevaron a cabo para los virus quiméricos PIV3 b/h, PIV3 b/h /RSV o RSV usando células Vero. Diluciones seriales al doble de antisuero policlonal de RSV (Biogénesis, Poole, Inglaterra), y RSV F MAb ( HO 1200 MAb) obtenido de Medlmmune o hPIV3 F (C191/9) y HN (68/2) Mabs, se incubaron con aproximadamente 100 PFU ya sea de los virus quiméricos PIV3 b/h, PIV3 b/h /RSV o RSV en 0.5 mL de OptiMEM a TA por 60 min. Enseguida de la incubación, las mezclas de virus-suero se transfirieron a monocapas de células Vero, se incubaron a 35 DC durante 1 hora, se cubrieron con metil celulosa al 1% en medio EME /L-15 (JRH Biosciences; Lenexa, KS) y se incubaron a 35°C. Seis días después de la inoculación, las monocapas de células infectadas se inmunotiñeron . Los títulos de neutralización se expresaron como el reciproco de la dilución de suero más alta que inhibió el 50% de las placas virales. Los análisis de neutralización se llevaron a cabo también para el suero obtenido en el Día · 28 después de la infección, de los hámsteres inmunizados con los virus quiméricos PIV3 b/h, PIV3 b/h/RSV o RSV A2. Los sueros de los hámsteres se diluyeron serialmente dos veces, y se incubaron con 100 PFU de RSV A2 por una hora. Después, las mezclas de virus suero se transfirieron a monocapas de células Vero y se cubrieron con metilcelulosa . Después'- de 5 días de incubación a 35°C las monocapas se inmunotiñeron usando antisuero policlonal de RSV para la cuantificación . Los títulos del anticuerpo neutralizante antes del suero fueron <1.0 y los títulos del anticuerpo HAI fueron <4.0. Los análisis de inhibición de la hemoaglutinación (HAI) se llevaron a cabo incubando diluciones seriales dos veces del suero de los hámsteres en el Día 28 a 25°C por 30 min con hPIV3 en placas de 96 pozos con fondo en V. Subsecuentemente, se agregaron eritrocitos de cerdo de guinea a cada pozo,, se continuó la incubación por 90 minutos adicionales, y se registró la presencia de hemoaglutinación en cada pozo. La Tabla- 14 resume los resultados: Tabla 14 La Vacunación de Hámsteres con Dosis Bajas de PIV3 b/h/RSV Induce el HAI del suero los Anticuerpo Neutralizantes aVirus usado para inmunizar los hámsteres a una dosis baja de 104 pfu/mL. bLos títulos del anticuerpo neutralizante se determinaron mediante un análisis de reducción de placas al 50%. cLos títulos del anticuerpo neutralizante se los hámsteres antes del suero fueron <1.0 y los títulos del anticuerpo HAI fueron <4.0. El fenotipo de replicación restringida de los virus quiméricos que poseen genes de RSV en la primera posición fue exacerbado cuando se redujo la dosis de inoculación a 1 x 10q PFU por animal. El 'PIV3 b/h/RSV Fl y Gl replicados en los tractos respiratorios superiores de hámsteres a títulos que fueron reducidos en 1.0-2.0 logio en comparación 3 aquellos del PIV3 b/h (Tabla 13) . En contraste, el PIV3 b/h/RSV con los genes en la posición 2, . se replicaron en el tracto respiratorio superior a niveles observados para el PIV3 b/h. la replicación en los pulmones de los hámsteres estuvo también más restringida para el PIV3 b/h/RSV que albergaba los genes de RSV en la primera posición (Tabla 13).. En contraste b/h PIV3/RSV F2 se replicó a títulos altos de 105 2 y 103;9 en los cornetes nasales y pulmones, respectivamente (Tabla 13) . Los hámsteres vacunados fueron desafiados en el Día 28 con 1 x 106 pfu de RSV A2 (Tabla 13) . A pesar- de los bajos niveles de replicación observados en los tractos respiratorios de la invención, los animales fueron protegidos tanto en el tracto respiratorio inferior y superior de la prueba de inmunidad con RSV (Tabla 13) . El grado de protección fue bueno cuando se observó para los animales vacunados con wt RSV. Sólo los animales que recibieron el medio de placebo mostraron títulos altos del virus en los cornetes nasales y los pulmones (Tabla 13) . El suero se recolectó de loa hámsteres inmunizados en el Día 28, y se analizó, por la presencia de los anticuerpos neutralizantes de RSV y PIV3 HAI del suero (Tabla 14). Se observó una caída de aproximadamente 50% en los títulos del anticuerpo neutralizante de RSV en los sueros obtenidos de los hámsteres inmunizados con PIV3 b/h/RSV cuando se compararon con los títulos observados para los sueros de wt RSV (Tabla 14). Pero los sueros obtenidos de los animales que habían recibido el PIV3 b/h que albergaba los genes de RSV en la posición 2, desplegaron aun altos títulos del anticuerpo neutralizante de RSV que los observados para los sueros de PIV3 b/h/ RSV con los genes de RSV en la posición 1. Los títulos del anticuerpo del suero de PIV3 HAI fueron también ligeramente reducidos en comparación con el suero de PIV3 b/h (Tabla 14) . 30. EJEMPLO 25: LOS HÁMSTERES INMUNIZADOS CON METAPNEUMOVIRUS F DE HUMANO TRATADO CON VECTORES DE PARAINFLUENZA 3 DE BOVINO/PARAINFLUENZA 3 DE HUMANO FUERON PROTEGIDOS CONTRA LA PRUEBA DE INMUNIDAD CON EL VIRUS 3 DE PARAINFLUEZA DE HUMANO O EL METAPNEUMOVIRUS DE HUMANO NL/001 Cinco grupos de Hámsteres Dorados de Siria (cada grupo tenia seis hámsteres) fueron inmunizados con PIV3 b/h, hMPV Fl b/h, hMPV F2 b/h, hMPV o placebo respectivamente. Los cinco diferentes grupos de animales se mantuvieron separados en jaulas de aislamiento de microbios. En el Dia 28 después de la inmunización, los hámsteres fueron desafiados con 1 x 106 PFU ya sea de hPIV3 o hMPV . (cepa NL/001) para evaluar la inmunogenicidad inducida por el PIV3 b/h /hMPV F. "cuatro dias después del desafio, los animales fueron sacrificados. Los cornetes nasales y los pulmones de los animales fueron homogeneizados y almacenados a -80°C. El virus presente en los tejidos se determinó mediante análisis de TCID50 en células MDBK a 37 °C. La infección del virus se confirmó mediante hemoabsorción con células sanguíneas rojas de cerdos de guinea. La Tabla 15 muestra los títulos de replicación de la cepa de PIV3 y la cepa de MPV en hámsteres en los pulmones y los cornetes nasales.
Tabla 15 Los Hámsteres Inmunizados con PIV3 b/h/hMPV F Fueron Protegidos al Recibir el Desafío con hPIV o hMPV/NL/001 aVirus usado para inmunizar los- grupos de seis hámsteres en el día 0. En el día 28, los hámsteres fueron desafiados con 106 pfu de hPIV3 o hMPV. Cuando días después del desafio, los pulmones y los cornetes nasales de los animales fueron recolectados . ND=No Determinado. Los resultados muestran que los animales que recibieron el PIV3 b/h /hMPV F2 (F en la posición 2) fueron protegidos del hMPV asi como del hPIV3 (Tabla 15) . Sin embargo PIV3 b/h /hMPV Fl (F en la posición uno) sólo redujo los títulos del hMPV infectado en el tracto respiratorio superior (por ejemplo, los cornetes nasales) en 2.5 logs, en tanto que proporcionó protección completa en el tracto respiratorio inferior (por ejemplo, los pulmones) tanto del hMPV y el hPIV3 (Tabla 15) . Los animales a los que se les administro el medio de placebo desplegaron títulos altos de virus del desafío en los tractos respiratorios inferior y superior (Tabla 15) . La presente invención no deberá ser limitada en su ámbito por las modalidades específicas escritas que se destinan como simples ilustraciones de los aspectos individuales de la invención, y cualquier constructo, virus, o enzimas que son funcionalmente equivalentes están dentro del ámbito de esta invención. En realidad, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí se volverán aparentes para aquellas personas experimentadas en la técnica a partir de la descripción precedente y los dibujos anexos. Se considera que tales modificaciones caen dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas. Se citan aquí varias publicaciones, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en su totalidad.
Tabla 16 LEYENDAS PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO:l Genes de la proteína matriz (M) y la proteína de fusión de 00-1 aislado del metapneumovirus humano SEC ID NO: 2 Gen de la proteína de fusión del pneumovirus aviar SEC ID NO: 3 ARNm, cds completos de la proteína de fusión Ib aislada del pneumovirus aviar SEC ID NO: 4 Gen del virus de rinotraqueitis de Pavo para la proteína de fusión (subunidades Fl F2 ) , cds completos SEC ID NO: 5 Cds parciales del gen de la proteína matriz (M) del pneumovirus aviar y cds completos del gen de la proteína de fusión (F) del pneumovirus aviar SEC ID NO: 6 hRSV B de la proteína F de paramyxovirus SEC ID NO: 7 hRSV A2 de la proteína F de paramyxovirus SEC ID NO: 8 01-71 de, metapneumovirus humano (secuencia parcial) SEC ID NO: 9 Genes de la proteína matriz (M) y proteína de fusión '(F) de 00-1 aisladas del metapneumovirus humano SEC ID NO: 10 Gen de la proteína de fusión del pneumovirus avial, cds parciales SEC ID NO: 11 ARNm de la proteína de fusión Ib aislada del pneumovirus avial, cds completos SEC ID NO: 12 Gen del virus de rinotraqueitis de pavo para la proteína de fusión (subunidades Fl y F2 ) cds completos SEC ID NO: 13 Gen de la glicoproteína de fusión (F) del pneumovirus avial, cds completos SEC ID NO: 14 ARNm de la proteína de adhesión (G) del virus de rinotraqueitis avial (cepa CVL14/1), cds completos SEC ID NO: 15 Proteína de adhesión (G) del virus de rinotraqueitis de pavo (cepa 6574), cds completos SEC ID NO: 16 ARNm de la proteína de adhesión (G) del virus de rinotraqueitis de pavo (cepa CVL14/1), cds completos SEC ID NO: 17 Proteína de adhesión (G) del virus de rinotraqueitis de pavo (cepa 6574), cds completos SEC ID NO: 18 Secuencia de la proteína F para NL/1/00 aislado de *HMPV SEC ID NO: 19 Secuencia de la proteína F para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 20 Secuencia de la proteina F para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 21 Secuencia de la proteina F para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 22 Secuencia del gen F para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO:23 Secuencia del gen F para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 24 Secuencia del gen F para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 25 Secuencia del gen F para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 26 Secuencia de la proteina G para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 27 Secuencia de la proteina G para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO:28 Secuencia de la proteina G para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 29 Secuencia de la proteina G para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 30 Secuencia del gen G para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 31 Secuencia del gen G para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 32 Secuencia del gen G para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 33 Secuencia del gen G para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 34 Secuencia de la Proteina L para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 35 Secuencia de la Proteina L para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 36 Secuencia, de la Proteina L para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 37 Secuencia de la Proteina L para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 38 Secuencia del gen L para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 39 Secuencia del gen L para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 40 Secuencia del gen L para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 41 Secuencia del ge'n L para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 42 Secuencia de la proteina M2-1 para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 3 Secuencia de la 'proteina M2-1 para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 44 Secuencia de la proteína M2-1 para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 5 Secuencia de la proteína M2-1 para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 46 Secuencia del gen M2-1 para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 47 Secuencia del gen M2-1 para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 48 Secuencia del gen M2-1 para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 49 Secuencia del gen M2-1 para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 50 Secuencia de la proteína M2-2 para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO:51 Secuencia de la proteína M2-2 para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 52 Secuencia de la proteína M2-2 para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 53 secuencia de la proteína M2-2 para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 54 Secuencia del gen M2-2 para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 55 Secuencia del gert M2-2 para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 56 Secuencia del gen M2-2 para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 57 Secuencia del gen M2-2 para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 58 Secuencia del gen M2 para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 59 Secuencia del gen M2 para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 60 Secuencia del gen M2 para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 61 Secuencia del gen M2 para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 62 Secuencia de la proteína M para NL/1/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 63 Secuencia de la proteína M para NL/17/00 aislado de HMPV SEC ID NO: 64 Secuencia de la proteína M para NL/1/99 aislado de HMPV SEC ID NO: 65 Secuencia de la proteína M para NL/1/94 aislado de HMPV SEC ID NO: 66 Secuencia del gen M 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Secuencia de la proteina F para NL/9/00 aislado SEC ID NO: 316 Secuencia de la proteina F para NL/19/00 aislado SEC ID NO: 317 Secuencia de la proteina F para NL/28/00 aislado SEC ID NO: 318 Secuencia de la proteina F para NL/3/01 aislado SEC ID NO: 319 Secuencia de la proteina F para NL/4/01 aislado SEC ID NO: 320 Secuencia de la proteina F para NL/11/01 aislados SEC ID NO: 321 Secuencia de la proteina F para NL/15/01 aislado SEC ID NO: 322 Secuencia de la proteína F para NL/18/01 aislado SEC ID NO: 323 Secuencia de la proteína F para FL/6/01 aislado SEC ID NO: 324 Secuencia de la proteína F para UK/5/01 aislado SEC ID NO: 325 Secuencia de la proteína F para UK/8/01 aislado SEC ID NO: 326 Secuencia de la proteína F para NL/12/02 aislado SEC ID NO:327 Secuencia de la proteína F para HK/1/02 aislado LISTADO DE SECUENCIAS <110> Medlmmune Vaccines, Inc. ViroNovative BV <120> SISTEMAS DE EXPRESIÓN DEL VIRUS DE PARAINFLUENZA RECOMBINANTE Y VACUNAS QUE COMPRENDEN ANTÍGENOS HETERÓLOGOS DERIVADOS DEL METAPNEUMOVIRUS <130> 7682-061-228 <140> Para asignarse <141> Con la misma <150> 60/358,934 <15l> 2002-02-21 <160> 327 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 2507 <212> ADN <213> metapneumovirus <220> <221> CDS <222> (1) ... (2507) <223> Genes de la proteina matriz (M) y la proteina de fusión (F) de 00-1 aislado del metapneumovirus humano <400> 1 atggagtcct acctagtaga cacctatcaa ggcattcctt acacagcagc tgttcaagtt 60 gatctaatag aaaaggacct gttacctgca agcctaacaa tatggttccc tttgtttcag 120 gccaacacac caccagcagt gctgctcgat cagctaaaaa ccctgacaat aaccactctg 180 tatgctgcat cacaaaatgg tccaatactc aaagtgaatg catcagccca aggtgcagca 240 atgtctgtac ttcccaaaaa atttgaagtc aatgcgactg tagcactcga tgaatatagc 300 aaactggaat ttgacaaact cacagtctgt gaagtaaaaa cagtttactt aacaaccatg 360 aaaccatacg ggatggtatc aaaatttgtg agctcagcca aatcagttgg caaaaaaaca 420 catgatctaa tcgcactatg tgattttatg gatctagaaa agaacacacc tgttacaata 480 ccagcattca tcaaatcagt ttcaatcaaa gagagtgagt cagctactgt tgaagctgct 540 ataagcagtg aagcagacca agctctaaca caggccaaaa ttgcacctta tgcgggatta 600 attatgatca tgactatgaa caatcccaaa ggcatattca aaaagcttgg agctgggact 660 caagtcatag tagaactagg agcatatgtc caggctgaaa gcataagcaa aatatgcaag 720 acttggagcc atcaagggac aagatatgtc ttgaagtcca gataacaacc aagcaccttg 780 gccaagagct actaacccta tctcatagat cataaagtca ccattctagt tatataaaaa 840 tcaagttaga acaagaatta aatcaatcaa gaacgggaca aataaaaatg tcttggaaag 900 tggtgatcat tttttcattg ttaataacac ctcaacacgg tcttaaagag agctacttag 960 aagagtcatg tagcactata actgaaggat atctcagtgt tctgaggaca ggttggtaca 1020 ccaatgtttt tacactggag gtaggcgatg tagagaacct tacatgtgcc gacggaccca 1080 gcttaataaa aacagaatta gacctgacca aaagtgcact aagagagctc agaacagttt 11 0 ctgctgatca actggcaaga gaggagcaaa ttgaaaatcc cagacaatct agattcgttc 1200 taggagcaat agcactcggt gttgcaactg cagctgcagt tacagcaggt gttgcaattg 1260 ccaaaaccat ccggcttgaa agtgaagtaa cagcaattaa gaatgccctc aaaaagacca 1320 atgaagcagt atctacattg gggaatggag ttcgtgtgtt ggcaactgca gtgagagagc 1380 tgaaagattt tgtgagcaag aatctaacac gtgcaatcaa caaaaacaag tgcgacattg 1440 ctgacctgaa aatggccgtt agcttcagtc aattcaacaq aaggttccta aatgttgtgc 1500 ggcaattttc agacaacgct ggaataacac cagcaatatc tttggactta atgacagatg 1560 ctgaactagc cagagctgtt tccaacatgc caacatctgc aggacaaata aaactgatgt 1620 tggagaaccg tgcaatggta agaagaaaag ggttcggatt cctgatagga gtttacggaa 1680 gctccgtaat- ttacatggtg caactgccaa tctttggggt tatagacacg ccttgctgga 1740 tagtaaaagc agccccttct tgttcaggaa aaaagggaaa ctatgcttgc ctcttaagag 1800 aagaccaagg atggtattgt caaaatgcag ggtcaactgt ttactaccca aatgaaaaag 1860 actgtgáaac aagaggagac catgtctttt gcgacacagc agcaggaatc aatgttgctg 1920 agcagtcaaa ggagtgcaac ataaacatat ctactactaa ttacccatgc aaagttagca 1980 caggaagaca tcctatcagt atggttgcac tatctcctct tggggctttg gttgcttgct 2040 acaagggagt gagctgttcc attggcagca acagagtagg gatcatcaag caactgaaca 2100 aaggctgctc ttatataacc aaccaagacg cagacacagt gacaatagac aácactgtat 2160 accagctaag caaagttgaa ggcgaacagc atgttataaa aggaaggcca gtgtcaagca 2220 gctttgaccc agtcaagttt cctgaagatc aattcaatgt tgcacttgac caagttttcg 2280 agagcattga gaacagtcag gccttggtgg atcaatcaaa cagaatccta agcagtgcag 2340 agaaaggaaa cactggcttc atcattgtaa taáttctaat tgctgtcctt ggctctacca 2400 tgatcctagt gagtgttttt atcataataa agaaaacaaa gagacccaca ggagcacctc 2460 cagagctgag tggtgtcaca aacaatggct tcataccaca taattag 2507 <210> 2 <211> 1596 <212> ADN <213> pneumovirus <220> <221> CDS <222> (1) ... (1596) <223> Gen de la proteina de fusión del pneumovirus aviar, cds parcial <400> 2 atgtcttgga aagtggtact gctattggta ttgctagcta ccccaacggg ggggctagaa 60 gaaagttatc tagaggagtc atgcagtact gttactagag gatacctgag tgttttgagg 120 acaggatggt atacaaatgt gttcacactt ggggttggag atgtgaaaaa tctcacatgt 180 accgacgggc ccagcttaat aagaacagaa cttgaactga caaaaaatgc acttgaggaa 240 ctcaagacag tatcagcaga tcaattggca aaggaagcta ggataatgtc accaagaaaa 300 gcccggtttg ttctgggtgc catagcatta ggtgtggcaa ctgctgctgc tgtgacggct 360 ggtgtagcga tagccaagac aattaggcta gaaggagaag tggctgcaat caaaggtgcg 420 ctcaggaaaa caaatgaggc tgtatctaca ttaggaaatg gcgtgagggt acttgcaaca 480 gctgtgaatg atctcaagga ctttataagt aaaaaattga cacctgcaat aaacaggaac 540 aagtgtgaca tctcagacct taagatggca gtgagctttg gacaatacaa tcggaggttc 600 ctcaatgtgg taagacagtt ttctgacaat gcaggtatta cgcctgcaat atctctagat 660 ttaatgactg acgctgagct tgtaagagct gtaagcaaca tgcccacatc ttcaggacag 720 atcaatctga tgcttgagaa tcgggcaatg gtcagaagga aaggatttgg gattttgatt 780 ggagtttatg gtagctctgt ggtctatata gtgcagcttc ctattttcgg tgtgatagat 840 acaccgtgtt ggagggtgaa ggctgctcca ttatgttcag ggaaagacgg gaattatgca 900 tgtctcttgc gagaggacca aggttggtat tgtcaaaatg ctggatccac agtttattat 960 ccaaatgagg aggactgtga agtaagaagt gatcatgtgt tttgtgacac agcagctgcg 1020 ataaatgtag caaaggagtc agaagagtgc aacaggaata tctcaacaac aaagtaccct 1080 tgcaaggtaa gtacagggcg tcacccaata agcatggtgg ccttatcacc actgggtg t 1140 ttggtagcct gttatgacgg tatgagttgt tccattggaa gcaacaaggt tggaataa'c 1200 agacctttgg ggaaagggtg ttcatacatc agcaatcaag atgctgacac tgttacaazz 1260 gacaacacag tgtaccaatt gagcaaagtt gaaggagaac aacacacaat taaagggaag 1320 ccagtatcta gcaattttga ccctatagag ttccctgaag atcagttcaa cgtagccc g 1380 gatcaggtgt ttgaaagtgt tgagaagagt cagaatctga tagaccagtc aaacaaga'a 1440 ttggatagca ttgaaaaggg gaatgcagga tttgtcatag tgatagtcct cattgtcc-g 1500 ctcatgctgg cagcagttgg tgtgggtgtc ttctttgtgg ttaagaagag aaaagctcci: 1560 cccaaattcc caatggaaat gaatggtgtg aacaac 1596 <210> 3 <211> 1666 <212> ADN <213> pneumovirus <220> <221> CDS <222> (14) ... (1627) <223> RNAra de la proteína de fusión Ib aislada del pneumovirus aviar, cds completa <400> 3 gggacaagtg aaaatgtctt ggaaagtggt actgctattg gtattgctag ctaccccaac 60 gggggggcta gaagaaagtt atctagagga gtcatgcagt actgttacta gaggatacct 120 gagtgttttg aggacaggat ggtatacaaa tgtgttcaca .cttgaggttg gagatgtgga 180 aaatctcaca tgtaccgacg ggcccagctt aataagaaca gaacttgaac tgacaaaaaa 240 tgc cttgag gaactcaaga cagtatcagc agatcaattg gcaaaggaag ctaggataat 300 gtcaccaaga aaagcccggt ttgttctggg tgccatagca ttaggtgtgg caactgctgc 360 tgctgtgacg gctggtgtag cgatagccaa gacaattagg ctagaaggag aagtggctgc 420 aatcaagggt gcgctcagga aaacaaatga ggctgtatct acattaggaa atggcgtgag 480 ggtacttgca acagctgtga atgatctcaa ggactttata agtaaaaaat tgacacctgc 540 aataaacagg aacaagtgtg acatctcaga ccttaagatg gcagtgagct ttggacaata 600 caatcggagg ttcctcaatg tggtaagaca gttttctgac aatgcaggta ttacgcctcc 660 aatatctcta gatttaatga ctgacgctga gcttgtaaga gctgtaagca acatgccca 720 atcttcagga cagatcaatc tgatgcttga gaatcgggca atggtcagaa ggaaaggatr 780 tgggattttg attggagttt atggtagctc tgtggtctat atagtgcagc ttcctatttt 840 cggtgtgata gatacaccgt gttggaaggt gaaggctgct ccattatgtt cagggaaaca 900 cgggaattat gcatgtctct tgcgagagga ccaaggttgg tattgtcaaa atgctggatc 960 cacagtttat tatccaaatg aggaggactg tgaagtaaga agtgatcatg tgttttgtga 1020 cacagcagct gggataaatg tagcaaagga gtcagaagag tgcaacagga atatctcaac 1080 aacaaagtac ccttgcaagg taagtacagg gcgtcaccca ataagcatgg tggccttatc 1140 accactgggt gctttggtag cctgttatga cggtatgagt tgttccattg gaagcaacaa 1200 ggttggaata atcagacctt tggggaaagg gtgttcatac atcagcaatc aagatgctgs 1260 cactgttaca attgacaaca cagtgtacca attgagcaaa gttgaaggag aacaacacac 1320 aattaaaggg aagccagtat ctagcaattt tgaccctata gagttccctg aagatcagtt 1380 caacgtagcc ctggatcagg tgtttgaaag tgttgagaag agtcagaatc tgatagacca 1440 gtcaaacaag atattggata gcattgaaaa ggggaatgca ggatttgtca tagtgatagt 1500 cctcattgtc ctgctcatgc tggcagcagt tggtgtgggt gtcttctttg tggttaagaa 1560 gagaaaagct gctcccaaat tcccaatgga aatgaatggt gtgaacaaca aaggatttat 1620 cccttaattt tagttattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1666 210> 4 <211> 1636 <212> ADN <213> virus de rinotragueitis <220> <221> CDS <222> (13) ... (1629) <223> Gen del virus de rinotraqueitis de Pavo para la proteína ce fusión (subunidades Fl y F2) , cds completa <400> 4 gggacaagta ggatggatgt aagaatctgt ctcctattgt tccttatatc taatcctac- 60 agctgcatac aagaaacata caatgaagaa tcctgcagta ctgtaactag aggttataag 120 agtgtgttaa ggacagggtg gtatacgaat gtatttaacc tcgaaatagg gaatgttgag 180 aacatcactt gcaatgatgg acccagccta attgacactg agttagtact cacaaagaa 240 gctttgaggg agctcaaaac agtgtcagct gatcaagtgg ctaaggaaag cagactatcc 300 tcacccagga gacgtagatt tgtactgggt gcaatagcac ttggtgttgc gacagctgct 360 gccgtaacag ctggtgtagc acttgcaaag acaattagat tagagggaga ggtgaaggca 420 attaagaatg ccctccggaa cacaaatgag gcagtatcca cattagggaa tggtgtgagg 480 gtactagcaa ctgcagtcaa tgacctcaaa gaatttataa gtaaaaaatt gactcctgct 540 attaaccaga acaaatgcaa tatagcagat ataasgatgg caattagttt tggccaaaat 600 aacagaaggt tcctgaatgt ggtqaggcaa ttctctgata gtgcaggtat cacatcagct 660 gtgtctcttg atttaatgac agatgatgaa cttgttagag caattaacag aatgccaact 720 tcatcaggac agattagttt gatgttgaac aatcgtgcca tggttagaag gaaggggttt 780 ggtatattga ttggtgttta tgatggaacg gtcgtttata tggtacaact gcccatattc 840 ggcgtgattg agacaccttg ttggagggtg gtggcagcac cactctgtag gaaagagaaa 900 ggcaattatg cttgtatact gagagaagat .caagggtggt actgtacaaa tgctggctct 960 acagcttatt atcctaataa agatgattgt gaggtaaggg atgattatgt áttttgtgac 1020 acagcagctg gcattaatgt ggccctagaa gttgaacagt gcaactataa catatcgact 1080 tctaaatacc catgcaaagt cagcacaggt agacaccctg tcagtatggt agccttaacc 1140 cccctagggg gtctagtgtc ttgttatgag agtgtaagtt gctccatagg tagcaataaa 1200 gtagggataa taaaacagct aggcaaaggg tgcacccaca ttcccaacaa cgaagctgac 1260 acgataacca ttgataacac tgtgtaccaa ttgagcaagg ttgtaggcga acagaggacc 1320 ataaaaggag ctccagttgt gaacaatttt aacccaatat tattccctga ggatcagttc 1380 aatgttgcac ttgaccaagt atttgagagt atagatagat ctcaggactt aatagataag 1440 tctaacgact tgctaggtgc agatgccaag agcaaggctg gaattgctat agcaatagta 1500 gtgctagtca ttctaggaat cttcttttta cttgcagtga tatattactg ttccagagtc 1560 cggaagacca aaccaaagca tgattacccg gccacgacag gtcatagcag catggcttat 1620 gtcagttaag ttattt 1636 <210> 5 <211> 1860 <212> ADN <213> pneumouirus <220> <221> CDS <222> (1) ... (110) <223> Gen de la proteina matriz (M) del pneumovirus aviar, cds parcial <220> <221> CDS <222> (216) ... (1829) <223> Gen de la glicoproteina de fusión (F) del pneumovirus aviar, cds completa <400> 5 gagttcaggt aatagtggag ttaggggcat acgttcaagc agaaagcata agcagaatct 60 gcaggaactg gagccaccag ggtacgagat atgtcctgaa gtcaagataa acacagagag 120 tacacttacc aaatcacagt aacaatttcg tttttaaccc tctcatagtt attacctagc 180 ttgatattat ttagaaaaaa ttgggacaag tgáaaatgtc ttggaaagtg gtactgctat 240 tggtattgct agctacccca acgggggggc tagaagaaag ttatctagag gagtcatgca 300 gtactgttac tagaggatac ctgagtgttt tgaggacagg atggtataca aatgtgttca 360 cacttgaggt tggagatgtg gaaaatctca catgtaccga cgggcccagc ttaataagaa 420 cagaacttga actgacaaaa aatgcacttg aggaactcaa gacagtatca gcagatcaat 480 tggcaaagga agctaggata atgtcaccaa gaaaagcccg gtttgttctg ggtgccatag 540 cattaggtgt ggcaactgct gctgctgtga cggctggtgt agcgatagcc aagacaatta 600 ggctagaagg agaagtggct gcaatcaagg gtgcgctcag gaaaacaaat gaggctgtat 660 ctacattagg aaatggcgtg agggtacttg caacagctgt gaatgatctc aaggacttta 720 taagtaaaaa attgacacct gcaataaaca ggaacaagtg tgacatctca gaccttaaga 780 tggcagtgag ctttggacaa tacaatcgga ggttcctcaa tgtggtaaga cagttttctg 840 acaatgcagg tattacgcct gcaatatctc tagatttaat gactgacgct gagcttgtaa 900 gagctgtaag caacatgccc acatcttcag gacagatcaa tctgatgctt gagaatcggg 960 caatggtcag aaggaaagga tttgggattt tgattggagt ttatggtagc tctgtggtct 1020 atatagtgca gcttcctatt ttcggtgtga tagatacacc gtgttggaag gtgaaggctg 1080 ctccattatg ttcagggaaa gacgggaatt atgcatgtct cttgcgagag gaccaaggtt 1140 ggtattgtca aaatgctgga tccacagttt attatccaaa tgaggaggac tgtgaagtaa 1200 gaagtgatca tgtgttttgt gacacagcag ctgggataaa tgtagcaaag gagtcagaag 1260 agtgcaacag gaatatctca acaacaaagt acccttgcaa ggtaagtaca gggcgtcacc 1320 caataagcat ggtggcctta tcaccactgg gtgctttggt agcctgttat gacggtatga 1380 gttgttccat tggaagcaac aaggttggaa taatcagacc tttggggaaa gggtgttcat 1440 acatcagcaa tcaagatgct gacactgtta caattgacaa cacagtgtac caattgagca 1500 aagttgaagg agaacaacac acaattaaag ggaagccagt atctagcaat tttgacccta 1560 tagagttccc tgaagatcag ttcaacatag ccctggatca ggtgtttgaa agtgttgaga 1620 agagtcagaa tctgatagac cagtcaaaca agatattgga tagcattgaa aaggggaatg 1680 caggatttgt catagtgata gtcctcattg tcctgctcat gctggcagca ¦gttggtgtgg 1740 gtgtcttctt tgtggttaag aagagaaaag ctgctcccaa attcccaatg gaaatgaatg 1800 gtgtgaacaa caaaggattt atcccttaat tttagttact aaaaaattgg gacaagtgaa 1860 <210> 6 <211> 574 <212> PRT <213> paramyxovirus <400> 6 Met Glu Leu Leu lie His Arg Leu Ser Ala lie Phe Leu Thr Leu Ala 1 5 10 15 lie As Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn lie Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val lie Thr lie Glu Leu Ser Asn lie 50 55 60 Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu lie Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn' Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 Gln Tyr Met Asn Tyr Thr lie Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125 lie Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala lie Ala Ser Gly lie Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys lie Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr lie Asn Asn Gln Leu Leu Pro lie Val Asn 195 20Ó 205 Gln Gln Ser Cys Arg lie Ser Asn lie Glu Thr Val lie Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu lie Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu lie Asn Asp Met Pro lie Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Ser Asn Val Gln lie Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser lie 275 280 285 Met Ser lie lie Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 lie Tyr Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn lie Lys Glu Gly Ser Asn lie Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr 370 375 380 Asp lie Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys lie Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp lie Ser Ser Ser Val lie Thr Ser Leu Gly Ala lie Val Ser Cys 405 410 415 Tyr 'Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly lie lie 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly 450 455 460 Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro lie lie Asn Tyr Tyr Asp Pro 465 470 ' 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser lie Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys lie Asn Gln Ser Leu Ala Phe lie Arg Arg Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn lie Met lie Thr 515 520 525 Thr lie lie lie Val lie lie Val Val Leu Leu Ser Leu lie Ala lie 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly lie Asn Asn lie Ala Phe Ser Lys 565 570 <210> 7 <211> 574 <212> PRT <213> paramyxovirus <400> 7 Met Glu Leu Leu lie Leu Lys Ala Asn Ala lie Thr Thr lie Leu Thr 1 5 . 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn lie Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val lie Thr lie Glu Leu Ser Asn lie 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu lie Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala lie Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys lie 'Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr lie Asp Lys Gln Leu Leu Pro lie Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser lie Ser Asn lie Glu Thr Val lie Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu lie Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala 'Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu lie Asn Asp Met Pro lie Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln lie Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser lie 275 280 285 Met Ser lie lie Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn lie Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu lie Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp lie Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys lie Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val lie Thr Ser Leu Gly Ala lie Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly lie lie 420 425 430 · Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro lie lie Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 . ¦ 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser lie Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys lie Asn Gln Ser Leu Ala Phe lie Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn lie Met lie Thr 515 520 525 Thr lie lie lie Val lie lie Val lie Leu Leu Ser Leu lie Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly lie Asn Asn lie Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 8 <211> 121 <212> PRT <213> metapneumovirus <400> 8 Leu Leu lie Thr Pro Gln His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Ser Cys Ser Thr lie Thr Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly 20 25 30 Trp Tyr Thr Asn Val Phe Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr 50 55 60 Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala 65 70 75 80 Arg Glu Glu Gln lie Glu Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly 85 90 95 Ala lie Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val 100 105 110 Ala lie Ala Lys Thr lie Arg Leu Glu 115 120 <210> 9 <211> 539 <212> PRT <213> metapneumovirus <400> 9 Met Ser Trp Lys Val al lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 . 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 . 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly "Phe Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie- Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp' His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn' lie Ser Thr hr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser' Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 42U 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met lie Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Arg Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro Kis Asn 530 535 <210> 10 <211> 532 <212> PRT <213> pneumovirus aviar <400> 10 Met Ser Trp Lys Val Val Leu Leu Leu Val Leu Leu Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Gly Gly Leu Glu Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Val Thr 23 25 30 Arg Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Gly Val Gly Asp Val Lys Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Arg Thr Glu Leu Glu Leu Thr Lys Asn Ala Leu Glu Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Lys Glu Ala Arg lie Met 85 90 95 Ser Pro Arg Lys Ala Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 10b 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Gly Glu Val Ala Ala lie Lys Gly Ala Leu Arg Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe lie Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 lie Asn Arg Asn Lys Cys Asp lie Ser Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Gly Gln Tyr Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp 'Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Val Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ser Gly Gln 225 230 235 240 lie Asn Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr lie Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp Arg Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Leu Cys Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 . 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala C-ly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Glu Asp Cys Glu Val Arg Ser Asp His Val Phe Cys Asp 325 330. 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Lys Glu Ser Glu Glu Cys Asn Arg 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Lys Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Asp Gly Met Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Lys Val Gly lie lie 335 390 395 400 Arg Pro Leu Gly Lys Gly Cys Ser Tyr lie Ser Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 " 425 430 Glu Gln His Thr lie Lys Gly Lys Pro Val Ser Ser Asn Phe Asp Pro 435 440 445 lie Glu Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser Val Glu Lys Ser Gln Asn Leu lie Asp Gln Ser Asn Lys lie 465 470 475 480 Leu Asp Ser lie Glu Lys Gly Asn Ala Gly Phe Val lie Val lie Val 465 430 495 Leu lie Val Leu Leu Met Leu Ala Ala Val C-ly Val Gly Val Phe Phe 500 505 510 Val Val Lys Lys Are Lys Ala Ala Pro Lys ?r.e Pro Met Glu Met Asn 515 520 525 Gly Val Asn Asn 530 <210> 11 <211> 537 <212> PBT <213> pneuniovirus aviar <400> 11 Met Ser Trp Lys Val Val Leu Leu Leu Val Leu Leu Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Gly Gly Leu Glu Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Val Thr 20 25 30 Arg Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Arg Thr Glu Leu Glu Leu Thr Lys Asn Ala Leu Glu Glu 65 ·. 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Lys Glu Ala Arg lie Met 85 90 95 Ser Pro Arg Lys Ala Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr 11e 115 120 125 Arg Leu Glu Gly Glu Val Ala Ala lie Lys Gly Ala Leu Arg Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe lie Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 " 175 lie Asn Arg Asn Lys Cys Asp lie Ser Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Gly Gln Tyr Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 ' 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Val Arg Ala Val Ser Asn Met Fro Thr Ser Ser Gly Gln 225 230 235 240 lie Asn Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met val Arg Arg Lys 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Val Phe 450 455 460 Glu Ser- Val Glu Lys Ser Gln Asn Leu lie Asp Gln Ser Asn Lys lie 465 470 475 480 Leu Asp Ser lie Glu' Lys Gly Asn Ala Gly Phe Val lie Val lie Val 485 490 495 Leu lie Val Leu Leu Met Leu Ala Ala Val Gly Val Gly Val Phe Phe 500 505 510 Val Val Lys Lys Arg Lys Ala Ala Pro Lys Phe Pro Met Glu Met Asn 515 520 525 Gly Val Asn Asn Lys Gly Phe lie Pro 530 535 <210> 12 <211> 538 <212> PRT <213> virus de rinotraqueitis de pavo <400> 12 Met Asp Val Arg lie Cys Leu Leu Leu Phe Leu lie Ser Asn Pro Ser i b 10 15 Ser Cys lie Gln Glu Thr Tyr Asn Glu Glu Ser Cys Ser Thr Val Thr 20 25 30 Arg Gly Tyr Lys Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Asn Leu Glu lie Gly Asn Val Glu Asn lie Thr Cys Asn Asp Gly Pro . 50 55 60 Ser Leu lie Asp Thr Glu Leu Val Leu Thr Lys Asn Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Lys Glu Ser Arg Leu Ser 85 90 95 Ser Pro Arg Arg Arg Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Leu Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Gly Glu Val Lys Ala lie Lys Asn Ala Leu A.rg Asn Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Asn Asp Leu Lys Glu Phe lie Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 . 170 175 lie Asn Gln Asn Lys Cys Asn lie Ala Asp lie Lys Met Ala lie Ser 180 ' 185 190 Phe Gly Gln Asn Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Ser Ala Gly lie Thr Ser Ala Val Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Asp Glu Leu Val Arg Ala lie Asn Arg Met Pro Thr Ser Ser Gly Gln 225 230 235 240 lie Ser Leu Met Leu Asn Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly lie Leu lie Giy Val Tyr Asp Gly Thr Val Val Tyr Met Val Gln 260 " 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Glu Thr Pro Cys Trp Arg Val Val Ala 275 280 285 Ala Pro Leu Cys Arg Lys Glu Lys Gly Asn Tyr Ala Cys lie Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Thr Asn Ala Gly Ser Thr Ala Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Lys Asp Asp 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Ala Tyr Val Ser 530 535 <210> 13 <211> 537 <212> PRT <213> pneumovirus aviar <400> 13 Met Ser Trp Lys Val Val Leu Leu Leu Val Leu Leu Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Gly Gly Leu Glu Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Val Thr 20 25 · 30 Arg Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Arg Thr Glu Leu Glu Leu Thr Lys Asn Ala Leu Glu Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Lys Glu Ala Arg lie Met 85 90 95 Ser Pro Arg Lys Ala Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Gly Glu Val Ala Ala lie Lys Gly Ala Leu Arg Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe lie Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 lie Asn Arg Asn Lys Cys Asp lie Ser Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Gly Gln Tyr Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Val Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ser Gly Gln 225 230 235 240 lie Asn Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr lie Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp Lys Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Leu Cys Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Glu Asp Cys Glu Val Arg Ser Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Lys Glu Ser Glu Glu Cys Asn Arg 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Lys Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Asp Gly Met Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Lys Val Gly lie lie 385 390 395 400 Arg Pro Leu Gly Lys Gly Cys Ser Tyr lie Ser Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Thr lie Lys Gly Lys Pro Val Ser Ser Asn Phe Asp Pro 435 440 445 lie Glu Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn lie Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser Val Glu Lys Ser Gln Asn Leu lie Asp Gln Ser Asn Lys lie 465 470 475 480 Leu Asp Ser lie Glu Lys Gly Asn Ala Gly Phe Val lie Val lie Val 485 "490 495 Leu lie Val Leu Leu Met Leu Ala Ala Val Gly Val Gly Val Phe Phe 500 505 510 Val Val Lys Lys Arg Lys Ala Ala Pro Lys Phe Pro Met Glu Met Asn 515 520 525 Gly Val Asn Asn Lys Gly Phe lie Pro 530 535 <210> 14 <211> 1193 <212> ADN <213> virus de rir.otraqueitis <220> <221> CDS <222> (16) ... (1191) <223> RNAm de la proteina de adhesión (G) del virus de rinotraqueitis ¦de pavo (cepa CVL14/1), cds completa <400> '14 gggacaagta tctctatggg gtccaaacta tatatggctc agggcaccag tgcatatcaa 60 actgcagtgg ggttctggct ggacatcggg aggaggtaca tattggctat agtcctatca 120 gctttcgggc tgacctgcac agtcactatt gcactcactg ttagcgtcat agttgaacag 180 tcagtgttag aggagtgcag aaactacaat, ggaggagata gagattggtg gtcaaccacc 240 caggagcagc caactactgc accaagtgcg actccagcag gaaattatgg aggattacaa 300 acggctcgaa caagaaagtc tgaaagctgt ttgcatgtgc aaatttctta tggtgatatg 360 tatagccgca gtgatactgt actgggtggt tttgattgta tgggcttatt ggttctttgc 420 aaatcaggac caatttgtca gcgagataat caagttgacc caacagccct ctgccattgc 480 agggtagatc tttcaagtgt ggactgctgc aaggtgaaca agattagcac taacagcagc 540 accácctctg agccccagaa gaccaacccg gcatggccta gccaagacaa cacagactcc 600 gatccaaatc cccaaggcat aaccaccagc acagccactc tgctctcaac aagtctgggc 660 ctcatgctca catcgaagac tgggacacac aaatcagggc ccccccaagc cttgccgggg 720 agcaacacca acggaaaaac aaccacagac cgagaaccag ggcccacaaa ccaaccaaat 780 tcaaccacca atgggcaaca caataaacac acccaacgaa tgacaccccc gccaagtcac 840 gacaacacaa gaaccatcct ccagcacaca acaccctggg aaaagacatt cagtacatac 900 aagcccacac actctccgac caacgaatca gatcaatccc tccccacaac tcaaaacagc 960 atcaactgtg aacattttga cccccaaggc aaggaaaaaa tctgctacag agtaggttct 1020 tacaactcca atattacaaa gcaatgcaga attgatgtgc ctttgtgttc cact tatagc 1080 acagtgtgca tgaaaacata ctataccgaa ccattcaact gttggaggcg tatctggcgt 1140 tgcttgtgtg atgacggact tggtctggtt gagtggtgtt gcactagtta act 1193 <210> 15 <211> 1260 <212> ADN <213> virus de rinotraqueitis <220> <221> CDS <222> (16) ... (1260) <223> Proteína de adhesión (G) del virus de rinotraqueitis de pavo (cepa 6574), cds completa <400> 15 gggacaagta tccagatggg gtcagagctc tacatcatag agggggtgag ctcatctgaa 60 atagtcctca agcaagtcct cagaaggagc caaaaaatac tgttaggact ggtgttatca 120 gccttaggct tgacgctcac tagcactatt gttatatcta tttgtattag tgtagaacag 180 gtcaaattac gacagtgtgt ggacacttat tgggcggaaa atggatcctt acatccagga 240 cagtcaacag aaaatacttc aacaagaggt aagactacaa caaaagaccc tagaagatta 300 caggcgactg gagcaggaaa gtttgagagc tgtgggtatg tgcaagttgt tgatggtgat 360 atgcatgatc gcagttatgc tgtactgggt ggtgttgatt gtttgggctt attggctctt 420 tgtgaatcag gaccaatttg tcagggagat acttggtctg aagacggaaa cttctgccga 480 tgcacttttt cttcccatgg ggtgagttgc tgcaaaaaac ccaaaagcaa ggcaaccact 540 gcccagagga actccaaacc agctaacagc aastcaactc ctccggtaca ttcagacagg 60? gccagcaaag aacataatcc ctcccaaggg gagcaacccc gcagggggcc aaccagcagc 660 aagacaacta ttgctagcac cccttcaaca gaggacactg ctaaaccaac gattagcaaa' 720 cctaaactca ccatcaggcc ctcgcaaaga ggcccatccg gcagcacaaa agcagcctcc 780 agcaccccca gccacaagac caacaccaga ggcaccagca agacgaccga ccagagaccc 840 cgcaccggac ccactcccga aaggcccaga caaacccaca gcacagcaac tccgcccccc 900 acaaccccaa tccacaaggg ccgggcccca acccccaaac caacaacaga cctcaaggtc 960 aacccaaggg aaggcagcac aagcccaact gcaatacaga aaaacccaac cacacaaagt 1020 aatcttgttg actgcacact gtctgatcca gatgagccac aaaggatttg ttaccaggta 1080 ggaacttaca atcctagtca atcgggaacc tgcaacatag aggttccaaa atgttccact 1140 tatgggcatg cttgtatggc tacattatat gacaccccat tcaactgctg gcgcaggacc 1200 aggagatgca tctgtgattc cggaggggag ctgattgagt ggtgctgtac tagtcaataa 1260 <210> 16 <211> 391 <212> PRT <213> virus de rinotraqueitis de pavo <400> 16 , Met Gly Ser Lys Leu Tyr Met Ala Gln Gly Thr Ser Ala Tyr Gln Thr 1 5 10 15 Ala Val Gly Phe Trp Leu Asp lie Gly Arg Arg Tyr lie Leu Ala lie 20 25 30 Val Leu Ser Ala Phe Gly Leu Thr Cys Thr Val Thr lie Ala Leu Thr 35 40 45 Val Ser Val lie Val Glu Gln Ser Val Leu Glu Glu' Cys Arg Asn Tyr 50 55 60 Asn Gly Gly Asp Arg Asp Trp Trp Ser Thr Thr Gln Glu Gln Pro Thr 65 70 75 80 Thr Ala Pro Ser Ala Thr Pro Ala Gly Asn Tyr Gly Gly Leu Gln Thr 85 90 95 Ala Arg Thr Arg Lys Ser Glu Ser Cys Leu His Val Gln lie Ser Tyr 100 105 110 Gly Asp Met Tyr Ser Arg Ser Asp Thr Val Leu Gly Gly Phe Asp Cys 115 120 125 Met Gly Leu Leu Val Leu Cys Lys Ser Gly Pro lie Cys Gln Arg Asp 130 135 140 Asn Gln Val. Asp Pro Thr Ala Leu Cys His Cys Arg Val Asp Leu Ser 145 150 155 160 Ser Val Asp Cys' Cys Lys Val Asn Lys lie Ser Thr Asn Ser Ser Thr 165 170 175 Thr Ser Glu Pro Gln Lys Thr Asn Pro Ala Trp Pro Ser Gln Asp Asn 180 185 190 Thr Asp Ser Asp Pro Asn Pro Gln Gly lie Thr Thr Ser Thr Ala Thr 195 200 205 Leu Leu Ser Thr Ser Leu Gly Leu Met Leu Thr Ser Lys Thr Gly Thr 210 215 220 His Lys Ser Gly Pro Pro Gln Ala Leu Pro Gly Ser Asn Thr Asn Gly 225 230 235 240 Lys Thr Thr Thr Asp Arg Glu Pro Gly Pro Thr Asn Gln Pro Asn Ser 245 250 255 Thr Thr Asn Gly Gln His Asn Lys His Thr Gln Arg Met Thr Pro Pro 260 265 270 Pro Ser His Asp Asn Thr Arg Thr lie Leu Gln His Thr Thr Pro Trp 275 280 285 Glu Lys Thr Phe Ser Thr Tyr Lys Pro Thr His Ser Pro Thr Asn Glu 290 295 300 Ser Asp Gln Ser Leu Pro Thr Thr Gln Asn Ser lie Asn Cys Glu His 305 310 315 320 Phe Asp Pro Gln Gly Lys Glu Lys lie Cys Tyr Arg Val Gly Ser Tyr 325 330 335 Asn Ser Asn lie Thr Lys Gln Cys Arg lie Asp Val Pro Leu Cys Ser 340 345 350 Thr Tyr Ser Thr Val Cys Met Lys Thr Tyr Tyr Thr Glu Pro Phe Asn 355 360 365 Cys Trp Arg Arg lie Trp Arg Cys Leu Cys Asp Asp Gly Val Gly Leu 370 " 375 380 Val Glu Trp Cys Cys Thr Ser 385 390 <210> 17 <211> 414 <212> PRT <213> virus de rino.traqueitis <400> 17 Met Gly Ser Glu Leu Tyr lie lie Glu Gly Val Ser Ser Ser Glu lie 1 5 10 15 Val Leu Lys Gln Val Leu Arg Arg Ser Gln Lys lie Leu Leu Gly Leu 20 25 30 Val Leu Ser Ala Leu Gly Leu Thr Leu Thr Ser Thr lie Val lie Ser 35 40 45 lie Cys lie Ser Val Glu Gln Val Lys Leu Arg Gln Cys Val Asp Thr 50 55 60 Tyr Trp Ala Glu Asn Gly Ser Leu His Pro Gly Gln Ser Thr Glu Asn 65 70 75 80 Thr Ser Thr Arg Gly Lys Thr Thr Thr Lys Asp Pro Arg Arg Leu Gln 85 90 95 Ala Thr Gly Ala Gly Lys Phe Glu Ser Cys Gly Tyr Val Gln Val Val 100 105 110 Asp Gly Asp Met His Asp Arg Ser Tyr Ala Val Leu Gly Gly Val Asp 115 120 125 Cys Leu Gly Leu Leu Ala Leu Cys Glu Ser Gly Pro lie Cys Gln Gly 130 135 140 Asp Thr Trp Ser Glu Asp Gly Asn Phe Cys Arg Cys Thr Phe Ser Ser 145 150 155 160 His Gly Val Ser Cys Cys Lys Lys Pro Lys Ser Lys Ala Thr Thr Ala 165 170 175 Gln Arg Asn Ser Lys Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Pro Pro Val His 180 185 190 Ser Asp Arg Ala Ser Lys Glu His Asn Pro Ser Gln Gly Glu Gln Pro 195 200 205 Arg Arg Gly Pro Thr Ser Ser Lys Thr Thr lie Ala Ser Thr Pro Ser 210 ¦ 215 220 Thr Glu Asp Thr Ala Lys Pro Thr lie Ser Lys Pro Lys Leu Thr lie 225 230 235 240 Arg Pro Ser Gln Arg Gly Pro Ser Gly Ser Thr Lys Ala Ala Ser Ser 245 250 255 Thr Pro Ser His Lys Thr Asn Thr Arg Gly Thr Ser Lys Thr Thr Asp 260 265 270 Gln Arg Pro Arg Thr Gly Pro Thr Pro Glu Arg Pro Arg Gln Thr His 275 280 285 Ser Thr Ala Thr Pro Pro Pro Thr Thr Pro lie His Lys Gly Arg Ala 290 295 300 Pro Thr Pro Lys Pro Thr Thr Asp Leu Lys Val Asn Pro Arg Glu Gly 305 310 315 320 Ser Thr Ser Pro Thr Ala lie Gln Lys Asn Pro Thr Thr Gln Ser Asn 325 330 335 Leu Val Asp Cys Thr Leu Ser Asp Pro Asp Glu Pro Gln Arg lie Cys 340 345 350 Tyr Gln Val Gly Thr Tyr Asn Pro Ser Gln Ser Gly Thr Cys ASP. lie 355 360 365 Glu Val Pro Lys Cys Ser Thr Tyr Gly His Ala Cys Met Ala Thr Leu 370 375 380 Tyr Asp Thr Pro Phe Asn Cys Trp Arg Arg Thr Arg Arg Cys lie Cys 385 390 395 400 Asp Ser Gly Gly Glu Leu lie Glu Trp Cys Cys Thr Ser Gln 405 410 <210> 18 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 18 Met Ser Trp Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 . 45 ' Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 „ 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu' Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 · 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln. Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu L'ys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met lie Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro His Asn 530 535 <210> 19 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 19 Met Ser Trp Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ser Asp Gly Pro 50 . 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 - 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Thr Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Asp Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Thr Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360. 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 lie Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Asn lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg lie 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Ser Met lie Leu Val Ser lie Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys L s Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser '515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe lie Pro His Ser 530 535 <210> 20 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 20 Met Ser Trp Lys Val Met lie lie lie Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser al Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 ~0 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 '105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly lie Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Asn Ala lie Lys Gly Ala Leu Lys Gln Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Glu Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Ser Ala 165 170 175 lie Asn Arg Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Tyr Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Glr. 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Are 290 ' 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Trp Val Gly lie lie 385 390 335 40C Lys Gln Leu Pro Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Prc 435 440 445 lie Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Lys lis 465 470 475 . 480 Leu Asn Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val Val lie 485 490 495 Leu Val Ala Val Leu Gly Leu Thr Met lie Ser Val Ser lie lie 11e 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Arg Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Asr. 515 520 525 Gly Val Thr Asn Gly Gly Phe lie Pro His Ser 530 535 <210> 21 <211> 539 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 21 Met Ser Trp Lys Val Met lie lie lie Ser Leu Leu lie Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro 50 55 60 Ser . Leu lie Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln lie Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly lie Ala lie Ala Lys Thr lie 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Asn Ala lie Lys Gly Ala Leu Lys Thr Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Glu Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Ser Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp lie Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn- Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly lie Thr Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Tyr Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Lys Asn' Ala Gly Ser Thr Val Tyr T r 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie 340 345 350 Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie 385 390 395 40C Lys Gln Leu Pro Lys Gly Cys Ser Tyr lie Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 ^hr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 lie Arg P e Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser lie Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Lys lie 465 470 475 480 Leu Asn Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495 Leu lie Ala Val Leu Gly Leu Thr Met lie Ser Val Ser lie lie lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Arg Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Asn 515 520 525 Gly Val Thr Asn Gly Gly Phe lie Pro His Ser 530 535 <210> 22 <211> 1620 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 22 atgtcttgga aagtggtgat cattttttca ttgttaataa cacctcaaca cggtcttaaa 60 gagagctact tagaagagtc atgtagcact ataactgaag gatatctcag tgttctgagg 120 acaggttggt acaccaatgt ttttacactg gaggtaggcg atgtagagaa ccttacatgt 180 gccgatggac ccagcttaat aaaaacagaa ttagacctga ccaaaagtgc actaagagag 240 ctcagaacag tttctgctga tcaactggca agagaggagc aaattgaaaa tcccagacaa 300 tctagattcg ttctaggagc aatagcactc ggtgttgcaa ctgcagctgc agttacagca 360 ggtgttgcaa ttgccaaaac catccggctt gaaagtgaag taacagcaat taagaatgcc 420 ctcaaaaaga ccaatgaagc agtatctaca ttggggaatg gagttcgtgt gttggcaact 480 gcagtgagag agctgaaaga ttttgtgagc aagaatctaa cacgtgcaat caacaaaaac 540 aagtgcgaca ttgctgacct gaaaatggcc gttagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600 ctaaatgttg tgcggcaatt ttcagacaac gccggaataa caccagcaat atctttggac 660 ttaatgacag atgctgaact agccagagct gtttccaaca tgccaacatc tgcaggacaa 720 ataaaactga tgttggagaa ccgtgcaatg gtaagaagaa aagggttcgg aatcctgata 780 ggagtttacg gaagctccgt aatttacatg gtgcaactgc caatctttgg ggttatagac 840 acgccttgct ggatagtaaa agcagcccct tcttgttcag gaaaaaaggg aaactatgct 900 tgcctcttaa gagaagacca aggatggtat tgt.caaaatg cagggtcaac tgtttactac 960 ccaaatgaaa aagactgtga aacaagagga gaccatgtct tttgcgacac agcagcagga 1020 atcaatgttg ctgagcagtc aaaggagtgc aacataaaca tatctactac taattaccca 1080 tgcaaagtta gcacaggaag acatcctatc agtatggttg cactatctcc tcttggggct 1140 ttggttgctt gctacaaggg agtgagctgt tccattggca gcaacagagt agggatcatc 1200 aagcaactga acaaaggctg ctcttatata accaaccaag acgcagacac agtgacaata 1260 gacaacactg tataccagct aagcaaagtt g-aaggcgaac agcatgttat aaaaggaagg 1320 ccagtgtcaa gcagctttga cccagtcaag tttcctgaag atcaattcaa tgttgcactt 1380 gaccaagttt tcgagagcat tgagaacagt caggccttgg tggatcaatc aaacagaatc 1440 ctaagcagtg cagagaaagg aaacactggc ttcatcattg taataattct aattgctgtc 1500 cttggctcta ccatgatcct agtgagtgtt tttatcataa taaagaaaac aaagaaaccc 1560 acaggagcac ctccagagct gagtggtgtc acaaacaatq gcttcatacc acataattag 1620 <210> 23 <211> 1620 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 23 atgtcttgga aagtggtgat cattttttca ttgctaataa cacctcaaca cggtcttaaa 60 gagagctacc tagaagaatc atgtagcact ataactgagg gatatcttag tgttctgagg 120 acaggttggt ataccaacgt ttttacatta gaggtgggtg atgtagaaaa ccttacatgt 180 tctgatggac ctagcctaat aaaaacagaa ttagatctga ccaaaagtgc actaagagag 240 ctcaaaacag tctctgctga ccaattggca agagaggaac aaattgagaa tcccagacaa 300 tctaggtttg ttctaggagc aatagcactc ggtgttgcaa cagcagctgc agtcacagca 360 ggtgttgcaa ttgccaaaac catccggctt gagagtgaag tcacagcaat taagaatgcc 420 ctcaaaacga ccaatgaagc agtatctaca ttggggaatg gagttcgagt gttggcaact 480 gcagtgagag agctaaaaga ctttgtgagc aagaatttaa ctcgtgcaat caacaaaaac 540 aagtgcgaca ttgatgacct aaaaatggct gttagcttca 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ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660 ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgccaacatc tgcaggacag 720 ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttga _a 780 ggggtctacg gaagctctgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 340 acaccttgtt ggataatcaa ggcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900 tgcctcctaa gagaggatca agggtggtat tgcaaaaatg caggatccac tgtttactac 960 ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcagcg 1020 atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctaccac caactaccca 1080 tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggr g cactatcacc tctcggtcct 1140 ttggtagctt gctacaaggg ggttagctgc tcgattggca gtaatcgggt tggaataa.c 1200 aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt 1260 gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaca 1320 ccagtttcaa gcagttttga tccaatcagg tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgc t 1380 gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagc ct g tggaccagtc aaacaaaatr 1440 ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggt ttcattattg taataatttt gattgctg- t 1500 cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaagccc 1560 acaggggcac ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620 <210> 26 <211> 236 <212> P T <213> Metapneumo virus humano <400> 26 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Thr He Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 * 30 Leu Val Leu lie Gly He Thr Thr Leu Ser He Ala Leu Asn He Tyr 35 40 45 Leu He He Asn Tyr Lys Met Gln Lys Asn ~ r Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 "5 80 Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser ?ro Gln His Pro Thr Glr. 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Ser Ser 100 105 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg Thr Ser Ser Arg Thr-145 . 150 155 160 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cttcgtcgac acacacacaa caccaccaag cgcaagcaga 420 acaaagacaa gtccggcagt ccacacaaaa aacaacccaa ggacaagctc tagaacacat 480 tctccaccac gggcaacgac aaggacggca cgcagaacca ccactctccg cacaagcagc 540 acaagaaaga gaccgtccac agcatcagtc caacctgaca tcagcgcaac aacccacaaa 600 aacgaagaag caagtccagc gagcccacaa acatctgcaa gcacaacaag aatacaaagg 660 aaaagcgtgg aggccaacac atcaacaaca tacaaccaaa ctagttaa 708 <210> 31 <211> 660 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 31. atggaggtga aagtagagaa cattcgagca atagacatgc tcaaagcaag agtgaaaaat 60 cgtgtggcac gtagcaaatg ctttaaaaat gcttctttaa tcctcatagg aataactaca 120 ctgagtatag ctctcaatat ctatctgatc ataaactaca caatacaaaa aaccacatcc 180 gaatcagaac accacaccag ctcaccaccc acagaaccca acaaggaagc ttcaacaatc 240 tccacagaca acccagacat caatccaagc tcacagcatc caactcaaca gtccacagaa 300 aaccccacac tcaaccccgc agcatcagcg agcccatcag aaacagaacc agcatcaaca 360 ccagacacaa caaaccgcct gtcctccgta gacaggtcca cagcacaacc aagtgaaagc 420 agaacaaaga caaaaccgac agtccacaca atc'aacaacc caaacacagc 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Met Asp Pro Leu Asn Glu Ser Thr Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser 1 5 10 15 Tyr Leu Lys Gly Val lie Ser Phe Ser Glu Thr Asn Ala lie Gly Ser 20 25 30 Cys Leu Leu Lys Arg Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Asn Thr Ala Lys Val 35 40 45 Ala lie Glu Asn Pro Val lie Glu His Val Arg Leu Lys Asn Ala Val 50 55 60 Asn Ser Lys Met Lys lie Ser Asp Tyr Lys lie Val Glu Pro Val Asn 65 70 75 - 80 Met Gln His Glu lie Met Lys Asn Val His Ser Cys Glu Leu Thr Leu 85 90 95 Leu Lys Gln Phe Leu Thr Arg Ser Lys Asn lie Ser Thr Leu Lys Leu 100 105 110 Asn Met lie Cys Asp Trp Leu Gln Leu Lys Ser Thr Ser Asp Asp Thr 115 120 125 Ser lie Leu Ser Phe lie Asp Val Glu Phe lie Pro Ser Trp Val Ser 130 135 140 Asn Trp Phe Ser Asn Trp Tyr Asn Leu Asn Lys Leu lie Leu Glu Phe 145 150 155 160 Arg Lys Glu Glu Val lie Arg Thr Gly Ser lie Leu Cys Arg Ser Leu 165 170 175 Gly Lys Leu Val Phe Val Val Ser Ser Tyr Gly Cys lie Val Lys Ser 180 185 190 Asn Lys Ser Lys Arg Val Ser Phe Phe Thr Tyr Asn Gln Leu Leu Thr 195 200 205 Trp Lys Asp Val Met 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ggtcattggg taaattagtt 540 tttgttgtat catcatatgg atgtatagtc aagagcaaca aaagcaaaag agtgagcttc 600 ttcacataca atcaactgtt aacatggaaa gatgtgatgt taagtagatt caatgcaaat 660 ttttgtatat gggtaagcaa cagtctgaat gaaaatcaag aagggctagg gttgagaagt 720 aatctgcaag gcatattaac taataagcta tatgaaactg tagattatat gcttagttta 780 tgttgcaatg aaggtttctc acttgtgaaa gagttcgaag gctttattat gagtgaaatt 840 cttaggatta ctgaacatgc tcaattcagt actagattta gaaatacttt attaaatgga 900 ttaactgatc aattaacaaa attaaaaaat aaaaacagac tcagagttca tggtaccgtg 960 ttagaaaata atgattatcc aatgtacgaa gttgtactta agttattagg agatactttg 1020 agatgtatta aattattaat caataaaaac ttagagaatg ctgctgaatt atactatata 1080 tttagaatat tcggtcaccc aatggtagat gaaagagatg caatggatgc tgtcaaatta 1140 aacaatgaaa tcacaaaaat ccttaggtgg gagagcttga cagaactaag aggggcattc 1200 atattaagga ttatcaaagg atttgtagac aacaacaaaa gatggcccaa aattaaaaac 1260 ttaaaagtgc ttagtaagag atggactatg tacttcaaag caaaaagtta ccccagtcaa 1320 cttgaattaa gcgaacaaga ttttttagag cttgctgcaa tacagtttga 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tgcaaattca atcacaatta ctggagttgg cctgatagat atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttaa atcagctttt aagaaacaca gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag aactcaagac tttgttcttg gttctactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg atgacaacca aggaataacc aaggctgcag cttgctatag tctacacaac 300 ataatcaagc aactacaaga aacagaagta agacagccta gagacaacaa gctttctgat 360 agcaaacatg tggcgctcca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactccc 420 gcatctctaa tcaacaacct aaagaaacta ccaaggcaaa aactgaagaa attagcaaga 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgac aatgact ctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaa 564 <210> 49 <211> 564 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 49 atgtctcgca aagctccatg caaatatgaa gtacggggca agtgcaacag gggaagtgag 60 tgcaaattca accacaatta ctggagctgg cctgataggt atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttga atcagctttt aagaaacact gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag gactcaagac tttgttcttg gttctactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg ataacaatca aggaataaca aaggctgcag cttgctatag tctacataac 300 ataataaaac agctacaaga aatagaagta agacaggcta gagataataa gctttctgac 360 agcaaacatg tggcacttca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatccctga ttaataacct aaagaaacta ccaagagaaa aactgaagaa attagcgaaa 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgat aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaa 564 <210> 50 <211> 71 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 50 Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 5 10 15 Ser GÍu His Gly Pro Val Phe lie Thr lie Glu Val Asp Asp Met lie 20 25 30 Trp Thr His Lys Asp Leu Lys Glu Ala Leu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45 Ser His Thr Asn lie Tyr Asn Cys Tyr Leu Glu Asn lie Glu lie lie 50 55 60 Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70 <210> 51 <211> 71 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 51 Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 - 5 10 15 Ser Glu His Gly Pro Val Phe lie Thr lie Glu Val Asp Glu Met lie 20 25 30 Trp Thr Gln Lys Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45 Ser His Thr Asn lie Tyr Asn Cys Tyr Leu Glu Asn lie Glu lie lie 50 55 60 Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70 <210> 52 <211> 71 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 52 Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 5 10 15 Ser Lys His Gly Pro Lys Phe lie Thr lie Glu Ala Asp Asp Met lie 20 25 30 Trp Thr His Lys Glu Leu Lys Glu Thr Leu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45 Ser His Thr Asn lie Tyr Ser Cys Tyr Leu Glu Asn lie Glu lie lie 50 55 60 Tyr Val Lys Thr Tyr Leu Ser 65 <210> 53 <211> 71 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 53 Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 5 10 15 Ser Lys His Gly Pro Lys Phe lie Thr lie Glu Ala Asp Asp Met lie 20 25 30 Trp Thr His Lys Glu Leu Lys Glu Thr Leu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45 Ser His Thr Asn lie Tyr Ser Cys Tyr Leu Glu Asn lie Glu lie lie 50 55 60 Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70 <210> 54 <211> 216 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 54 atgactcttc atatgccttg caagacagtg aaagcactaa tcaagtgcag tgagcatggt 60 ccagttttca ttactataga ggttgatgac atgatatgga ctcacaagga cttaaaagaa 120 gctttatctg atgggatagt gaagtctcat actaacattt acaattgtta tttagaaaac 180 atagaaatta tatatgtcaa ggcttactta agttag 216 <210> 55 <211> 216 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 55 atgactcttc atatgccctg caagacagtg aaagcactaa tcaagtgcag tgagcatggt 60 cctgttttca ttactataga ggttgatgaa atgatatgga ctcaaaaaga attaaaagaa 120 gctttgtccg atgggatagt gaagtctcac accaacatct acaattgtta tttagaaaac 180 atagaaatta tatatgtcaa ggcttactta agttag 216 <210> 56 <211> 216 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 56 atgactcttc atatgccttg caagacagtg aaagcactaa tcaagtgcag taaacatcjt 60 cccaaattca ttaccataga ggcagatgat atgatatgga ctcacaaaga attaaaagaa 120 acactgtctg atgggatagt aaaatcacac accaatattt atagttgtta cttagaaas 180 atagaaataa tatatgttaa aacttactta agttag 216 <210> 57 <211> 216' <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400>· 57 atgactcttc atatgccttg caagacagtg, aaagcactaa tcaagtgcag t agcatggt 60 cccaaattca ttaccataga ggcagatgat atgatatgga cacacaaaga attaaaggag 120 acactgtctg atgggatagt aaaatcacac accaatattt acagttgtta tttagaaaat 180 atagaaataa tatatgttaa agcttactta agttag 216 <210> 58 <211> 727 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 58 atgtctcgca aggctccgtg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaatag aggaagtgag 60 tgcaagttta accacaatta ctggagttgg ccagatagat acttattaat aagatcaaat 120 tatttattaa atcaactttt aaggaacact gatagagctg atggcttatc aataatatca 180 ggagcaggca gagaagatag gacacaagat tttgtcctag gttccaccaa tgtggttcaa 240 ggttatattg atgataacca aagcataaca aaagctgcag cctgttacag tctacataat 300 ataatcaaac aactacaaga agttgaagtt aggcaggcta gagataacaa actatctgac 360 agcaaacatg tagcacttca caacttagtc ctatcttata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctttaa tcaacaatct caagagactg ccgagagaga aactgaaaaa attagcaaag 480 ctcataattg acttatcagc aggtgctgaa aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtgagcatgg tccagttttc attactatag aggttgatga 600 catgatatgg actcacaagg acttaaaaga agctttatct gatgggatag tgaagtctca 660 tactaacatt tacaattgtt atttagaaaa catagaaatt atatatgtca aggcttactt 720 aagttag ¦ 727 <210> 59. <211> 727 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 59 atgtctcgca aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag aggaagtgag 60 tgtaagttta accacaatta ctggagttgg ccagatagat acttattaat aagatcaaac 120 tatctattaa atcagctttt aaggaacact gatagagctg atggcctatc aataatatca 180 ggcgcaggca gagaagacag aacgcaagat tttgttctag gttccaccaa tgtggttcaa 240 ggttatattg atgataacca aagcataaca aaagctgcag cctgctacag tctacacaac 300 ataatcaagc aactacaaga agttgaagtt aggcaggcta gagatagcaa actatctgac 360 agcaagcatg tggcactcca taacttaatc ttatcttaca tggagatgag caaaactccc 420 gcatctttaa tcaacaatct taaaagactg ccgagagaaa aactgaaaaa attagcaaag 480 ctgataattg acttatcagc aggcgctgac aatgactc catatgccct gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtgagcatgg tcctgttttc attactatag aggttgatga 600 aatgatatgg actcaaaaag aattaaaaga agctttgtcc gatgggatag tgaagtctca 660 caccaacatt tacaattgtt atttagaaaa catagaaatt atatatgtca aggcttactt 720 aagttag 727 <210> 60 <211> 727 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 60 atgtctcgta aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag agggagtgat 60 tgcaaa'ttca atcacaatta ctggagttgg cctgatagat atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttaa atcagctttt aagaaacaca gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag aactcaagac tttgttcttg gttctactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg atgacaacca aggaataacc aaggctgcag cttgctatag tctacacaac 300 ataatcaagc aactacaaga aacagaagta agacaggcta gagacaacaa g'ctttctgat 360 agcaaacatg tggcgctcca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctctaa tcaacaacct aaagaaacta ccaagggaaa aactgaagaa attagcaaga 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgac aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaaacatgg tcccaaattc attaccatag aggcagatga 600 tatgatatgg actcacaaag aattaaaaga aacactgtct gatgggatag taaaatcaca 660 caccaatatt tatagttgtt acttagaaaa tatagaaata atatatgtta aaacttactt 720 aagttag 727 <210> 61 <211> 727 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 61 atgtctcgca aagctccatg caaatatgaa gtacggggca agtgcaacag gggaagtgag 60 tgcaaattca accacaatta ctggagctgg cctgataggt atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttga atcagctttt aagaaacact gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag gactcaagac tttgttcttg gttctactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg ataacaatca aggaataaca aaggctgcag cttgctatag tctacataac 300 ataataaaac agctacaaga aatagaagta agacaggcta gagataataa gctttctgac 360 agcaaacatg tggcacttca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatccctga ttaataacct aaagaaacta ccaagagaaa aactgaagaa attagcgaaa 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgat aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaagcatgg tcccaaattc attaccatag aggcagatga 600 tatgatatgg acacacaaag aattaaagga gacactgtct gatgggatag taaaatcaca 660 caccaatatt tacagttgtt atttagaaaa tatagaaata atatatgtta aagcttactt 720 aagttag 727 <210> 62 <211> 254 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 62 Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gln Gly lie Pro Tyr Thr Ala 1 5 10 15 Ala Val Gln Val Asp Leu lie Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 20 1 25 30 Thr lie Trp Phe Pro Leu Phe Gln Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 40 45 Leu Asp Gln Leu Lys Thr Leu Thr lie Thr Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60 Gln Asn Gly Pro lie Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gln Gly Ala Ala 65 70 75 80 Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala Thr Val Ala Leu 85 90 95 Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Glu Phe Asp Lys Leu Thr Val Cys Glu Val 100 105 110 Lys Thr Val Tyr Leu Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 120 125 Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu lie 130 135 140 Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asn Thr Pro Val Thr lie 145 150 155 160 Pro Ala Phe lie Lys Ser Val Ser lie Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175 Val Glu Ala Ala lie Ser Ser Glu Ala Asp Gln Ala Leu Thr Gln Ala 180 185 190 Lys lie Ala Pro Tyr Ala Gly Leu lie Met lie Met Thr Met Asn Asn 195 200 205 Pro Lys Gly lie Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr Gln Val lie Val 210 215 220 Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gln Ala Glu Ser lie Ser Lys lie Cys Lys 225 230 235 240 Thr Trp Ser His Gln Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Arg 245 250 <210> 63 <211> 254 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 63 Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gln Gly lie Pro Tyr Thr Ala 1 5 10 15 Ala Val Gln Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 20 25 30 Thr lie Trp Phe Pro Leu Phe Gln Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 40 45 Leu Asp Gln Leu Lys Thr Leu Thr lie Thr Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60 Gln Ser Gly Pro lie Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gln Gly Ala Ala 65 . 70 75 80 Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala Thr Val Ala Leu 85 90 95 Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Glu Phe Asp Lys Leu T?hr Val Cys Glu Val 100 105 110 Lys Thr Val Tyr Leu Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 120 125 Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu lie 130 135 · 140 Ala Leu Cys Asp Phe. Met Asp Leu Glu Lys Asn Thr Pro Val Thr lie 145 150 155 - 160 Pro Ala Phe lie Lys Ser Val Ser lie Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175 Val Glu Ala Ala lie Ser Ser Glu Ala Asp Gin Ala Leu Thr Gln Ala 180 185 " 190 Lys lie Ala Pro Tyr Ala Gly Leu lie Met lie Met Thr Met Asn Asn 195 200 205 Pro Lys Gly lie Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr Gln Val lie Val 210 215 220 Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gln Ala Glu Ser lie Ser Lys lie Cys Lys 225 230 235 240 Thr Trp Ser His Gln Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Ser 245 250 <210> 64 <211> 254 •<212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 64 Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gln Gly lie Pro Tyr Thr Ala 1 5 10 15 Ala Val Gln Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala' Ser Leu 20 " 25 30 Thr lie Trp Phe Pro Leu Phe Gln Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 40 45 Leu Asp Gln Leu Lys Thr Leu Thr lie Thr Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60 Gln Asn Gly Pro lie Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gln Gly Ala Ala 65 70 75 80 Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala Thr Val Ala Leu 85 90 95 Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Asp Phe Asp Lys Leu Thr Val Cys Asp Val 100 105 110 Lys Thr Val Tyr Leu Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 120 125 Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu lie 130 135 140 Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asn lie Pro Val Thr lie 145 150 155 160 Pro Ala Phe lie Lys Ser Val Ser lie Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175 Val Glu Ala Ala lie Ser Ser Glu Ala Asp Gln Ala Leu Thr Gln Ala 180 185 190 Lys lie Ala Pro Tyr Ala Gly Leu lie Met lie Met Thr Met Asn Asn 195 200 205 Pro Lys Gly lie Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr Gln Val lie Val 210 215 220 Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gln Ala Glu Ser lie Ser Arg lie Cys Lys 225 230 235 240 Ser Trp Ser His Gln Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Arg 245 250 <210> 65 <211> 254 <212> PRT . -<213> Metapneumo virus humano <400> 65 Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gln Gly lie Pro Tyr Thr Ala 1 5 10 15 Ala Val Gln Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 20 ' 25 30 Thr lie Trp Phe Pro Leu Phe Gln Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 40 45 Leu Asp Gln Leu Lys Thr Leu Thr lie Thr Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60 Gln Asn Gly Pro lie Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gln Gly Ala Ala 65 70 75 80 Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala Thr Val Ala Leu 85 90 95 Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Asp Phe Asp Lys Leu Thr Val Cys Asp Val 100 105 110 Lys Thr Val Tyr Leu Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 120 125 Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu lie 130 135 140 Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asn lie Pro Val Thr lie 145 150 155 160 Pro Ala Phe lie Lys Ser Val Ser lie Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175 Val Glu Ala Ala lie Ser Ser Glu Ala Asp Gln Ala Leu Thr Gln Ala 180 185 .190 Lys lie Ala Pro Tyr Ala Gly Leu lie Met lie Met Thr Met Asn Asn 195 200 205 Pro' ' Lys Gly lie Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr Gln Val lie Val 210 215 220 Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gln Ala Glu Ser lie Ser Arg lie Cys Lys 225 230 235 240 Ser Trp Ser His Gln Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Arg 245 250 <210> 66 <211> 765 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 66 atggagtcct acctagtaga cacctatcaa ggcattcctt acacagcagc tgttcaagtt 60 gatctaatag aaaaggacct gttacctgca agcctaacaa tatggttccc tttgtttcag 120 gccaacacac caccagcagt gctgctcgat cagctaaaaa ccctgacaat aaccactctg 180 tatgctgcat cacaaaatgg tccaatactc aaagtgaatg catcagccca aggtgcagca 240 atgtctgtac ttcccaaaaa atttgaagtc aatgcgactg tagcactcga tgaatatagc 300 aaactggaat ttgacaaact cacagtctgt gaagtaaaaa cagtttactt aacaaccatg 360 aaaccatacg ggatggtatc aaaatttgtg agctcagcca aatcagttgg caaaaaaaca 420 catgatctaa tcgcactatg tgattttatg gatctagaaa agaacacacc tgttacaata 480 ccagcattca tcaaatcagt ttcaatcaaa gagagtgagt cagctactgt tgaagctgct 540 ataagcagtg aagcagacca agctctaaca caggccaaaa ttgcacctta tgcgggatta 600 attatgatca tgactatgaa caatcccaaa ggcatattca aaaagcttgg agctgggact 660 caagtcatag tagaactagg agcatatgtc caggctgaaa gcataagcaa aatatgcaag 720 acttggagcc atcaagggac aagatatgtc ttgaagtcca gataa 765 <210> 67 <211> 765 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 67 atggagtcct atctggtaga cacttatcaa ggcatccctt acacagcagc tgttcaagtt 60 gatctagtag aaaaggacct gttacctgca agcctaacaa tatggttccc cttgtttcag 120 gccaatacac caccagcagt tctgcttgat cagctaaaga ctctgactat aactactctg 180 tatgctgcat cacaaagtgg tccaatacta aaagtgaatg catcagccca gggtgcagca 240 atgtctgtac ttcccaaaaa gtttgaagtc aatgcgactg tagcacttga cgaatatagc 300 aaattagaat ttgacaaact tacagtctgt gaagtaaaaa cagtttactt aacaaccatg 360 aaaccatatg ggatggtatc aaagtttgtg agctcggcca aatcagttgg caaaaaaaca 420 catgatctaa tcgcattatg tgattttatg gatctagaaa agaacacacc agttacaata 480 ccagcattta tcaaatcagt ttctatcaag gagagtgaat cagccactgt tgaagctgca 540 ataagcagtg aagcagacca agctctaaca caagccaaaa ttgcacctta tgcgggactg 600 atcatgatta tgaccatgaa caatcccaaa ggcatattca agaagcttgg agctgggacc 660 caagttatag tagaactagg agcatatgtc caggctgaaa gcataagtaa aatatgcaag 720 acttggagcc atcaaggaac aagatatgtg ctgaagtcca gttaa 765 <210> 68 <211> 765 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 68 atggagtcct atctagtaga cacttatcaa ggcattccat atacagctgc tgttcaagtt 60 gacctggtag aaaaagattt actgccagca agtttgacaa tatggtttcc tttatttcag 120 gccaacacac caccagcagt tctgcttgat cagctaaaaa ccttgacaat aacaactctg 180 tatgctgcat cacagaatgg tccaatactc aaggtaaatg catctgccca aggtgctgcc 240 atgtctgtac ttcccaaaaa attcgaggta aatgcaactg tagcacttga tgaatacagt 300 aaacttgatt ttgacaagct gacggtctgc gatgttaaaa .cagtttattt gacaactatg 360 aaaccgtacg ggatggtgtc aaaatttgtg ag tcagcca aatcagttgg caaaaagaca 420 catgatctaa ttgcactatg tgacttcatg gacctagaga aaaatatacc tgtgacaata 480 ccagcattca taaagtcagt ttcaatcaaa gagagtgaat cagccactgt tgaagctgca 540 ataagcagcg aagccgacca agccttgaca caagccaaga ttgcgcccta tgcaggacta 600 attatgatca tgaccatgaa caatccaaaa ggcatattca agaaactagg ggctggaaca 660 caagtgatag tagagctggg ggcatatgtt caggctgaga gcatcagtag gatctgcaag 720 agctggagtc accaaggaac aagatacgta ctaaaatcca gataa 765 <210> 69 <211> 765 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 69 atggagtcct atctagtgga cacttatcaa ggcattccct acacagctgc tgttcaagtt 60" gatctggtag aaaaagactt actaccagca agcttgacaa tatggtttcc tctattccaa 120 gccaacacac caccagcggt tttgctcgat cagctaaaaa ccttgactat aacaactctg 180 tatgctgcat cacagaatgg tccaatactc aaagtaaatg catcagctca gggtgctgct 240 atgtctgtac ttcccaaaaa attcgaagta aatgcaactg tggcacttga tgaatacagc 300 aaacttgact ttgacaagtt aacggtttgc gatgttaaaa cagtttattt gacaaccatg 360 aagccatatg ggatggtgtc aaaatttgtg agttcagcca aatcagttgg caaaaagaca 420 catgatctaa ttgcactgtg tgacttcatg gacctagaga aaaatatacc tgtgacaata 480 ccagcattca taaagtcagt ttcaatcaaa gagagtgagt cagccactgt tgaagctgca 540 ataagcagtg aggccgacca agcattaaca caagccaaaa ttgcacccta tgcaggacta 600 atcatgatca tgaccatgaa caatccaaaa ggtatattca agaaactagg agctggaaca 660 caagtgatag tagagctagg ggcatatgtt caagccgaga gcatcagcag gatctgcaag 720 agctggagtc accaaggaac aagatatgta. ctaaaatcca gataa ' 765 <210> 70 <211> 394 <-212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 70 Met Ser Leu Gln Gly lie His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 1 5 10 15 lie Leu Lys Glu Ser Gln Tyr Thr lie Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30 Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gln Gln Glu lie Thr Leu Leu Cys 35 40 45 Gly Glu lie Leu Tyr Ala Lys His Ala Asp Tyr Lys Tyr Ala Ala Glu 50 55 60 lie Gly lie Gln Tyr lie Ser Thr Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val Gln 65 70 75 80 Gln lie Leu Arg Asn Ser Gly Ser Glu Val Gln Val Val Leu Thr Arg 85 90 95 Thr Tyr Ser Leu Gly Lys lie Lys Asn Asn Lys Gly Glu Asp Leu Gln 100 105 110 Met Leu Asp lie His Gly Val Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu lie Asp 115 120 125 Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Ala Thr Leu Leu Lys Glu Ser Ser Gly 130 135 140 Asn lie Pro Gln Asn Gln Arg Pro Ser Ala Pro Asp Thr Pro lie lie 145 150 155 160 Leu ' Leu Cys Val Gly Ala Leu lie Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr lie 165 170 175 Glu Val Gly Leu Glu Thr Thr Val Arg Arg Ala Asn Arg Val Leu Ser 180 185 190 Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg Met Asp lie Pro Lys lie Ala Arg 195 200 205 Ser Phe Tyr Asp Leu Phe Glu Gln Lys Val Tyr His Arg Ser Leu Phe 210 215 220 lie Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240 Glu Ser Leu Phe Val Asn lie Phe Met Gln Ala Tyr Gly Ala Gly Gln 245 250 255 Thr Met Leu Arg Trp Gly Val lie Ala Arg Ser Ser Asn Asn lie Met 260 265 270 Leu Gly His Val Ser Val Gln Ala Glu Leu Lys Gln Val Thr Glu Val 275 280 285 Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu 290 295 300 Arg Gln Ser Pro Lys .Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320 Phe Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly lie lie Gly 325 330 335 Met Tyr Árg Gly Arg Val Pro Asn Thr Glu Leu Phe Ser Ala Ala Glu 340 345 350 Ser Tyr Ala Lys Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys lie Asn Phe Ser Ser 355 360 365 Leu Gly Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ala Ala Glu His Phe Leu Asn 370 375 380 Val Ser Asp Asp Ser Gln Asn Asp Tyr Glu 385 390 <210> 71 <211> 394 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 71 Met Ser Leu Gln Gly lie His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 1 5 10 15 lie Leu Lys Glu Ser Gln Tyr Thr lie Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30 Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gln Gln Glu lie Thr Leu Leu Cys 35 40 45 Gly Glu lie Leu Tyr Ala Lys His Ala Asp Tyr Lys Tyr Ala Ala Glu 50 55 60 lie Gly lie Gln Tyr lie Ser Thr Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val Gln Gln lié Leu Arg Asn Ser Gly Ser Glu Val Gln Val Val Leu Thr Arg 85 90 95 Thr Tyr Ser Leu Gly Lys Val Lys Asn Asn Lys Gly Glu Asp Leu Gln 100 105 110 Met Leu Asp lie His Gly Val Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu lie Asp 115 120 125 Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Ala Thr Leu Leu Lys Glu Ser Ser Gly 130 135 140 Asn lie Pro Gln Asn Gln Arg Pro Ser Ala Pro Asp Thr Pro lie lie 145 150 155 160 Leu ''Leu Cys Val Gly Ala Leu lie Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr lie 165 170 175 Glu Val Gly Leu Glu Thr Thr Val Arg Arg Ala Asn Arg Val Leu Ser 180 185 190 Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg Met Asp lie Pro Lys lie Ala Arg 195 200 205 Ser Phe Tyr Asp Leu Phe Glu Gln Lys Val Tyr Tyr Arg Ser Leu Phe 210 215 220 lie Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240 Glu Ser Leu Phe Val Asn lie Phe Met Gln Ala Tyr Gly Ala Gly Gln 245 250 255 Thr Met Leu Arg Trp Gly Val lie Ala Arg Ser Ser Asn Asn lie Met 260 265 270 Leu Gly His Val Ser Val Gln Ala Glu Leu Lys Gln Val Thr Glu Val 275 280 285 Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu 290 295 300 Arg Gln Ser Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320 Phe Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly lie lie Gly 325 330 335 Met Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Thr Glu Leu Phe Ser Ala Ala Glu 340 34 5 350 Ser Tyr Ala Lys Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys lie Ásn Phe Ser Ser 355 360 365 Leu Gly Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ala Ala Glu His Phe Leu Asn 370 375 380 Val Ser Asp Asp Ser Gln Asn Asp Tyr Glu 385 390 <210> 72 <211 > 394 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 72 Met Ser Leu Gln Gly lie His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 1 5 10 15 lie Leu Lys Glu Ser Gln Tyr Thr lie Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30 Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gln Gln Glu lie Thr Leu Leu Cys 35 40 45 Gly Glu lie Leu Tyr Thr Lys His Thr Asp Tyr Lys Tyr Ala Ala Glu 50 55 60 lie Gly lie Gln Tyr lie Cys Thr Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val Gln 65 70 75 80 Gln lie Leu Arg Asn Ser Gly Ser Glu Val Gln Val Val Leu Thr Lys 85 90 95 Thr Tyr Ser Leu Gly Lys Gly Lys Asn Ser Lys Gly Glu Glu Leu Gln 100 105 110 Met Leu Asp lie His Gly Val Glu Lys Ser Trp lie Glu Glu. lie Asp 115 120 125 Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Val Thr Leu Leu Lys Glu Ser Ser Gly 130 135 140 Asn lie Pro Gln Asn Gln Arg Pro Ser Ala Pro Asp Thr Pro lie lie 145. 150 155 160 Leu Leu Cys Val Gly Ala Leu lie Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr lie 165 . 170 175 Glu Val Gly Leu Glu Thr Thr Val Arg Arg Ala Asn Arg Val Leu Ser 180 185 190 Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg lie Asp lie Pro Lys lie Ala Arg 195 200 205 Ser Phe Tyr Glu Leu Phe Glu Gln Lys Val Tyr Tyr Arg Ser Leu Phe 210 215 220 lie Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240 Glu Ser Leu Phe Val Asn lie Phe Met Gln Ala Tyr Gly Ala Gly Gln 245 250 255 Thr Leu Leu Arg Trp Gly Val lie Ala Arg Ser Ser Asn Asn lie Met 260 265 270 Leu Gly His Val Ser Val Gln Ser Glu Leu Lys Gln Val Thr Glu Val 275 280 285 Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu 290 295 300 Arg Gln Ser Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320 Phe Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly lie lie Gly 325 330 335 Met Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Thr Glu Leu Phe Ser Ala Ala Glu 340 345 350 Ser Tyr Ala Arg Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys lie Asn Phe Ser Ser 355 360 365 Leu Gly Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ala Ala Glu His Phe Leu Asn 370 375 380 Met Ser Gly Asp Asn Gln Asn Asp Tyr Glu 385 390 <210> 73 <211> 394 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 73 Met Ser Leu Gln Gly lie His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 1 5 10 15 lie Leu Lys Glu Ser Gln Tyr Thr lie Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30 Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gln Gln Glu lie Thr Leu Leu Cys 35 40 45 Gly Glu lie Leu Tyr Thr Lys His Thr Asp Tyr Lys Tyr Ala Ala Glu 50 55 60 lie Gly lie Gln Tyr lie Cys Thr Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val Gln 65 , 70 75 80 Gln lie Leu Arg Asn Ser Gly Ser Glu Val Gln Val Val Leu Thr Lys 85. 90 95 Thr Tyr Ser Leu Gly Lys Gly Lys Asn Ser Lys Gly Glu Glu Leu Gln 100 105 110 Met Leu Asp lie His Gly Val Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu lie Asp 115 120 125 Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Val Thr Leu Leu Lys Glu Ser Ser Gly 130 135 140 Asn lie Pro Gln Asn Gln Arg Pro Ser Ala Pro Asp Thr Pro lie lie 145, 150 155 160 Leu Leu Cys Val Gly Ala Leu lie Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr lie 165 170 175 Glu Val Gly Leu Glu Thr Thr Val Arg Arg Ala Asn Arg Val Leu Ser 180 185 190 Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg Val Asp lie Pro Lys lie Ala Are 195 200 205 Ser Phe Tyr Glu Leu Phe Glu Gln Lys Val Tyr Tyr Arg Ser Leu Phe 210 215 220 lie Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240 Glu Ser Leu Phe Val Asn lie Phe Met Gln Ala Tyr Gly Ala Gly Gln 245 250 255 Thr Met Leu Arg Trp Gly Val lie Ala Arg Ser Ser Asn Asn lie Met 260 265 270 Leu Gly His Val Ser Val Gln Ala Glu Leu Lys Gln Val Thr Glu Val 275 280 285 Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu 290 295 300 Arg Gln Ser Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320 Phe Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly lie lie Gly 325 330 335 Met Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Thr Glu Leu Phe Ser Ala Ala Glu 340 345 350 Ser Tyr Ala Arg Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys lie Asn Phe Ser Ser 355 360 365 Leu Gly Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ala Ala Glu His Phe Leu Asn 370 375 380 Met Ser Asp Asp Asn Gln Asp Asp Tyr Glu 385 390 <210> 74 <211> 1185 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 74 atgtctcttc aagggattca cctgagtgat ttatcataca ageatgetat attaaaag 60 tetcagtaca caataaaaag agatgtgggt acaacaactg cagtgacacc ctcatcat.r 120 caacaagaaa taacactgtt gtgtggagaa attctgta LC ctaaacatgc tgactacaaa 180 tatgctgcag aaataggaat acaatatatt agcacagctc taggatcaga gagagtgc=? 240 cagattctga ggaactcagg cagtgaagtc caagtggtct taaccagaac gtactctc r 300 yggaaaatta aaaacaataa aggagaagat ttacagatgt tagacataca cggggtagag 360 aagagctggg tagaagagat agacaaagaa gcaaggaaaa caatggcaac cttgcttaag 420 gaatcatcag gtaatatccc acaaaatcag aggccctcag caccagacac acccataatc 480 ttattatgtg taggtgcctt aatattcact aaactagcat caaccataga agtgggacta 540 gagaccacag tcagaagggc taaccgtgta ctaagtga g cactcaagag ataccctaga 600 atggacatac caaagattgc cagatccttc tatgacttat ttgaacaaaa agtgtatcac 660 agaagtttgt tcattgagta tggcaaagca ttaggctcat catctacagg cagcaaagca 720 gaaagtctat ttgttaatat attcatgcaa gcttatgggg ccggtcaaac aatgctaagg 780 tggggggtca ttgccaggtc atccaacaat ataatgttag gacatgtatc cgtccaagct 840 gagttaaaac aggtcacaga agtctatgac ttggtgcgag aaatgggccc tgaatctgga 900 cttctacatt taaggcaaag cccaaaagct ggactgttat cactagccaa ctgtcccaac 960 tttgcaagtg ttgttctcgg aaatgcctca ggcttaggca taatcggtat gtatcgaggg 1020 agagtaccaa acacagaatt attttcagca gctgaaagtt atgccaaaag tttgaaagaa 1080 agcaataaaa taaatttctc ttcattagga cttacagatg aagagaaaga ggctgcagaa 1140 catttcttaa atgtgagtga cgacagtcaa aatgattatg agtaa 1185 <210> 75 <211> 1185 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 75 atgtctcttc aagggattca cctgagtgat ctatcataca agcatgctat attáaaagag 60 tctcagtata caataaagag agatgtaggc acaacaaccg cagtgacacc ctcatcattg 120 caacaagaaa taacactatc gtgtggagaa attctatatg ctaagcatgc tgattacaaa 180 tatgctgcag aaataggaat acaatatatt agcacagctc taggatcaga gagagtacag 240 cagattctaa gaaactcagg tagtgaagtc caagtggttt taaccagaac gtactccttg 300 gggaaagtta aaaacaacaa aggagaagat ttacagatgt tagacataca cggagtagag 360 aaaagctggg tggaagagat agacaaagaa gcaagaaaaa caatggcaac tttgcttaaa 420 gaatcatcag gcaatattcc acaaaatcag aggcct tcag caccagacac acccataatc 480 ttattatgtg taggtgcctt aatatttacc aaactagcat caactataga agtgggatta 540 gagaccacag tcagaagacc taaccgtgta ctaagtgatg cactcaaaag ataccctagg 600 atggacatac caaaaatccc tagatctttc tatgacttat ttgaacaaaa agtgtattac 660 agaagtttgt tcattgagta tggcaaagca ttaggctcat cctctacagg cagcaaagca 720 gaaagtttat tcgttaatat attcatgcaa gcttacggtg ctggtcaaac aatgctgagg 780 tggggagtca ttgccaggtc atctaacaat ataatgttag gacatgtatc tgttcaagct 840 gagttaaáac aagtcacaga agtctatgac ctggtgcgag aaatgggccc tgaatctggg 900 ctcctacatt taaggcaaag cccaaaagct ggactgttat cactagccaa ttgtcccaac 960 tttgctagtg ttgttctcgg caatgcctca ggcttaggca taataggtat gtatcgcggg 1020 agagtgccaa acacagaact att ttcagca gcagaaagct atgccaagag tttgaaagaa 1080 agcaataaaa ttaacttttc ttcattagga ctcacagatg aagaaaaaga ggctgcagaa 1140 cacttcctaa atgtgagtga cgacagtcaa aatgattatg agtaa 1185 <210> 76 <211> 1185 <21'2> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 76 atgtctcttc aagggattca cctaagtgat ctatcataca aacatgctat attáaaagag 60 tctcaataca caataaaaag agatgtaggc accacaactg cagtgacacc ttcatcatta 120 caacaagaaa taacactt" gtgtggggaa atactttaca ctaaacacac tgattacaaa 180 tatgctgctg agataggaa- acaatatatt tgcacagctc taggatcaga aagagtacaa 240 cagattttga gaaactcagg tagtgaagtt caggtggttc taaccaaaac atactcctta 300 gggaaaggca aaaacagtaa aggggaagag ctgcagatgt tagatataca tggagtggaa 360 aagagttgga tagaagaas _ agacaaagag gcaagaaaaa caatggtaac tttgcttaag 420 gaatcatcag gtaacatccc acaaaaccag agaccttcsg caccagacac accaataatt 480 ttattatgtg taggtgccct aatattcact aaactagcat caacaataga agttggatta 540 gagactacag ttagaagagc taatagagtg ctaagtgatg cactcaaaag atacccaagg 600 atagatatac caaagattgc tagatctttt tatgaactat ttgaacaaaa agtgtactac 660 agaagtttat tcattgagta cggaaaagct ttaggctcat cttcaacagg aagcaaagca 720 gaaagtttgt ttgtaaatat atttatgcaa gcttatggag ctggccaaac actgctaagg 780 tggggtgtca ttgccagatc atccaacaac ataatgctag ggcatgtatc tgtgcaatct 840 gaattgaagc aagttacaga ggtttatgac ttggtgagag aaatgggtcc tgaatctggg 900 cttttacatc taagacaaag tccaaaggca gggctgttat cattggccaa ttgccccaat 960 tttgctagtg ttgttcttgg caatgcttca ggtctaggca taatcggaat gtacagaggg 1020 agagtaccaa acacagagct attttctgca gcagaaagtt atgccagaag cttaaaagaa 1080 agcaataaaa tcaacttctc ttcgttaggg. cttacagatg aagaaaaaga 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atttatgcaa gcttatggag ccggtcagac aatgctaagg 780 tggggtgtca ttgccagatc atctaacaac ataatgctag ggcatgtatc tgtgcaagct 840 gaattgaaac aagttacaga ggtttatgat ttggtaagag aaatgggtcc tgaatctggg 900 cttttacatc taagacaaag tccaaaggca ggactgttat cgttggctaa ttgccccaat 960 tttgctagtg ttgttcttgg taatgcttca ggtctaggta taatcggaat gtacagggga 1020 agagtgccaa acacagagct attttctgca gcagaaagtt atgccagaag cttaaaagaa 1080 agcaacaaaa tcaacttctc ctcattaggg ctcacagacg aagaaaaaga agctgcagaa 1140 cacttcttaa acatgagtga tgacaatcaa gatgattatg agtaa 1185 <210> 78 <211> 294 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 78 Met Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asp "lie Leu Phe Met Gly Asn Glu Ala 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Glu Ala Phe Gln Lys Ser Leu Arg Lys Pro Gly His 20 25 ' 30 Lys Arg Ser Gln Ser lie lie Gly Glu Lys Val Asn Thr Val Ser Glu 35 40 45 Thr Leu Glu Leu Pro Thr lie Ser Arg Pro Ala Lys Pro Thr lie Pro 50 55 60 Ser Glu Pro Lys Leu Ala Trp Thr Asp Lys Gly Gly Ala Thr Lys Thr 65 70 75 " 80 Glu lie Lys Gln Ala lie Lys Val Met Asp Pro lie Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Ser Thr Glu Lys Lys Val Leu Pro Ser Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ala 100 105 110 Glu Lys Lys Leu Lys Pro Ser Thr Asn Thr Lys Lys Lys Val Ser Phe 115 120 125 Thr Pro Asn Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Glu Lys Asp Ala Leu 130 135 140 Asp Leu Leu Ser Asp Asn Glu Glu Glu Asp Ala Glu Ser Ser lie Leu 145 150 155 160 Thr Phe Glu Glu Arg Asp Thr Ser Ser Leu Ser lie Glu Ala Arg Leu 165 170 175 Glu Ser lie Glu Glu Lys Leu Ser Met lie Leu Gly Leu Leu Arg Thr 180 185 190 Leu Asn lie Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly lie Arg 195 200 205 Asp "Ala Met lie Gly Val Arg Glu Glu Leu lie Ala Asp lie lie Lys 210 215 220 Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu Met Met Glu Glu Glu Met Ser Gln 225 230 235 240 Arg Ser Lys lie Gly Asn Gly Ser Val Lys Leu Thr Glu Lys Ala Lys 245 250 255 Glu Leu Asn Lys lie Val Glu Asp Glu Ser Thr Ser Gly Glu Ser Glu 260 265 270 Glu Glu Glu Glu Pro Lys Asp Thr Gln Asp Asn Ser Gln Glu Asp Asp 275 280 285 lie Tyr Gln Leu lie Met 290 <210> 79 <211> 294 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 79 Met Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asp lie Leu Phe Met Gly Asn Glu Ala 1 - 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Glu Ala Phe Gln Lys Ser Leu Arg Lys Pro Asn His 20 25 . 30 Lys Arg Ser Gln Ser lie lie Gly Glu Lys Val Asn Thr Val Ser Glu 35 40 45 Thr Leu Glu Leu Pro Thr lie Ser Arg Pro Thr Lys Pro Thr lie Leu 50 55 60 Ser Glu Pro Lys Leu Ala Trp Thr Asp Lys Gly Gly Ala lie Lys Thr 65 70 · " 75 80 Glu Ala Lys Gln Thr lie Lys Val Met Asp Pro lie Glu Glu Glu Glu 85 90 ¦ 95 Phe Thr Glu Lys Arg Val Leu Pro Ser Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ala 100 105 110 Glu Lys Lys Leu Lys Pro Ser Thr Asr. 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Glu Ala Phe Gln Lys Ser Leu Lys Lys Ser Gly His 20 25 30 Lys Arg' Thr Gln Ser lie Val Gly Glu Lys Val Asn Thr lie Ser Glu 35 40 45 Thr Leu Glu Leu Pro Thr lie Ser Lys Pro Ala Arg Ser Ser Thr Leu 50 55 60 Leu Glu Pro Lys Leu Ala Trp Ala Asp Asn Ser Gly lie Thr Lys lie 65 70 75 80 Thr Glu Lys Pro Ala Thr Lys Thr Thr Asp Pro Val Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Phe Asn Glu Lys Lys Val Leu Pro Ser Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ala 100 105 110 Glu Lys Lys Ser Lys Phe Ser Thr Ser Val Lys Lys Lys Val Ser Phe 115 120 125 Thr Ser Asn Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Glu Lys Asp Ala Leu 130 135 140 Asp Leu Leu Ser Asp Asn Glu Glu Glu Asp Ala Glu Ser Ser lie Leu 145 150 · 155 160 Thr Phe Glu Glu Lys Asp Thr Ser Ser Leu Ser lie Glu Ala Arg Leu 165 170 175 Glu Ser lie Glu Glu Lys Leu Ser Met lie Leu Gly Leu Leu Arg Thr 180 185 £.90 Leu Asn lie Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly lie Arg 195 200 205 Asp Ala Met lie Gly lie Arg Glu Glu Leu lie Ala Glu lie lie Lys 210 215 220 Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu 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gaagcttttc aaaaatcatt aagaaaacct aatcataaaa gatctcaatc tattatagga 120 gaaaaagtga acactgtatc tgaaacattg gaattaccta ctatcagtag acctaccaaa 180 ccgaccatat tgtcagagcc gaagttagca tggacagaca aaggtggggc aatcaaaact 240 gaagcaaagc aaacaatcaa agttatggat cctattgaag aagaagagtt tactgagaaa 300 agggtgctgc cctccagtga tgggaaaact cctgcagaaa agaagttgaa accatcaacc 360 aacactaaaa agaaggtctc atttacacca aatgaaccag gaaaatacac aaagttggag 420 aaagatgctc tagacttgct ttcagacaat gaagaagaag atgcagaatc ctcaatctta 480 accttcgaag aaagagatac ttcatcatta agcattgaag ccagactaga atcgattgag 540 gagaaattaa gcatgatatt agggctatta agaacactca acattgctac agcaggaccc 600 acagcagcaa gagatgggat cagagatgca atgattggca taagggagga actaatagca 660 gacataataa aagaagccaa gggaaaagca gcagaaatga tggaagaaga aatgaaccag 720 cggacaaaaa taggaaacgg tagtgtaaaa ttaactgaaa aggcaaagga gctcaacaaa 780 attgttgaag acgaaagcac aagtggtgaa tccgaagaag aagaagaacc aaaagacaca 840 caggaaaata atcaagaaga tgacatttac cagttaatta tgtag 885 <210> 84 <211> 885 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 84 atgtcattcc ctgaaggaaa ggatattctg ttcatgggta atgaagcagc aaaaatagcc 60 gaagctttcc agaaatcact gaaaaaatca ggtcacaaga gaactcaatc tattgtaggg 120 gaaaaagtta acactatatc agaaactcta gaactaccta ccatcagcaa acctgcacga 180 tcatctacac tgctggaacc aaaattggca tgggcagaca acagcggaat caccaaaatc 240 acagaaaaac cagcaaccaa aacaacagat cctgttgaag aagaggaatt caatgaaaag 300 aaagtgttac cttccagtga tgggaagact cctgcagaga aaaaatcaaa gttttcaacc 360 agtgtaaaaa agaaagtttc ctttacatca aatgaaccag ggaaatacac caaactagag 420 aaagatgccc tagatttgct ctcagacaat gaggaagaag acgcagaatc ctcaatccta 480 acttttgagg agaaagatac atcatcacta agcattgaag ctagactaga atctatagaa 540 gagaagttga gcatgatatt aggactgctt cgtacactta acattgcaac agcaggacca 600 acagctgcac gagatggaat tagggatgca atgattggta taagagaaga gctaatagca 660 gagataatta aggaagccaa gggaaaagca gctgaaanga tggaagaaga gatgaatcaa 720 agatcaaaaa taggaaatgg cagtgtaaaa ctaaccgaga aggcaaaaga gctcaacaaa 780 attgttgaag acgagagcac aagcggtgaa tcagaagaag aagaagaacc 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cagtgtaaaa ctaaccgaga aggcaaaaga acttaataaa 780 attgttgaag acgagagcac aagtggtgaa tcagaagaag aagaagaacc aaaagaaact 840 caggataaca atcaaggaga agatatctac cagttaatca tgtag 885 <210> 86 <211> 183 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 86 Met lie Thr Leu Asp Val lie Lys Ser Asp Gly Ser Ser Lys Thr Cys. 1 5 10 15 Thr His Leu Lys Lys lie lie Lys Asp His Ser Gly Lys Val Leu lie 20 25 30 Val Leu Lys Leu lie Leu Ala Leu Leu Thr Phe Leu Thr Val Thr lie 35 40 45 Thr lie Asn Tyr lie Lys Val Glu Asn Asn Leu Gln lie Cys Gln Ser 50 55 60 Lys Thr Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ser Ser Ser Asn Thr Thr Ser Val 65 70 75 80 Thr Thr Lys Thr Thr Leu Asn His Asp lie Thr Gln Tyr Phe Lys Ser 85 90 95 Leu lie Gln Arg Tyr Thr Asn Ser Ala lie Asn Ser Asp Thr Cys Trp 100 105 ' 110 Lys lie Asn Arg Asn Gln Cys Thr Asn lie Thr Thr Tyr Lys Phe Leu 115 120 125 Cys Phe Lys Ser Glu Asp Thr Lys Thr Asn Asn Cys Asp Lys Leu Thr 130 135 140 Asp Leu Cys Arg Asn Lys Pro Lys Pro Ala Val Gly Val Tyr His lie 145 150 155 160 Val Glu 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taagcagaaa tcaatgcaca 360 aatataacaa catataaatt tttatgcttt aaacctgagg actcaaaaat caacagttgt 420 gatagactga cagatctatg cagaaácaaa tcaaaatcag cagctgaagc atatcataca 480 gtagaatgcc attgcatata cacaattgag tggaagtgct atcaccaccc aatagattaa 540 <210> 92 <211> 534 <212> ADN <213> etapneumo virus humano <400> 92 atgáaaacat tagatgtcat aaaaagtgat ggatcctcag aaacgtgtaa tcaactcaaa 60 aaaataataa aaaaacactc aggtaaagtg cttattgcac taaaactgat attggcctta 120 ctgacatttt tcacagcaac aatcactgtc aactatataa aagtagaaaa caatttgcag 180 gcatgtcaac caaaaaatga atcagacaaa aaggtcacaa agccaaatac cacatcaaca 240 acaatcagac ccacacccga tccaactgta gtacatcatt tgaaaaggct gattcagaga 300 cacaccaact ctgtcacaaa agacagcgat acttgttgga gaatacacaa gaatcaacgt 360 acaaatataa aaatatacaa gttcttatgc tctgggttca caaattcaaa aggtacagat 420 tgtgaggaac caacagccct atgcgacaaa aagttaaaaa ccatagtaga aaaacataca 480 aaagcagaat gtcactgtct acatacaacc gagtgggggt gccttcatcc ctaa 534 <210> 93 <211> 534 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 93 ¦ atgáaaacat tagatgtcat aaaaagtgat ggatcctcag aaacatgtaa tcaactcaaa 60 aaaataataa aaaaacactc aggtaaattg cttattgcat taaaactgat attggcctta 120 ttgacgtttt tcacagtaac aattactgtt aactatataa aagtagaaaa caatttgcag 180 gcatgtcaat taaaaaatga atcagacaaa aaggacacaa agctaaatac cacatcaaca 240 acaatcagac ccattcctga tctaaatgca gtacagtact tgaaaaggct gattcagaaa 300 cacaccaact ttgtcataaa agacagagat acctgttgga gaatacacac gaatcaatgc 360 acaaatataa aaatatataa gttcttatgt ttcgggttta tgaattcaac aaatacagac 420 tgtgaagaac taacagtttt atgtgataaa aagtcaaaaa ccatgacaga aaaacatagg 480 aaagcagagt gtcactgtct acatacaacc gagtggtggt gttattatct ttaa 534 <210> 94 <211> 13294 <212> ADN <21?> Metapneumo virus humano <220> <221> misc_feature <222> (0) ... 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acaaacacta tatgaattgt ttgagcgtat atactaatga aatagcatct gtttgtgcat 840 caataatacc atcattattt aagaattaag aagaagctaa aattcaa 887 <210> 131 <211> 887 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 131 atggaagtaa gagtggagaa cattcgggca atagacatgt tcaaagcaaa gatgaaaaac 60 cgtataagaa gtagcaagtg ctatagaaat gctacactga tccttattgg attatcagca 120 ctaagtatgg cacttaatat ttttttaatc attgattatg caaaatcaaa aaccatgacc 180 agagtggaac actgtgttaa tatgccgccg gtagaaccaa gcaagaagac cccaatgacc 240 tctgcagtag acttaaacac caaacccaat ccacagcagg caacacagtt gaccacagag 300 gattcaacat ctccagcagc aaccctagag ggccatctac acacagggac aactccaaca 360 ccagatgcaa cagtctctca gcaaaccaca gacgagcaca caacactgct gagatcaacc 420 aacagacaga ccacccaaac aaccgcagag aaaaagccaa ccagagcaac aaccaaaaaa 480 gaaaccataa ctcgaaccac aagcacagct gcaacccaaa cactcaacac caccaaccaa 540 accagcaatg gaagagaggc aaccacaaca tctgccagat ccagaaacaa tgccacaact 600 caaágcagcg accaaacaac ccaggcagca gacccaagct cccaatcaca acatacaaag 660 aaaagcacaa caacaacata caacacagac acatcttctc caagtagtta acaaaaaaac 720 tataaaataa ccatgaaaac caaaaaaact agaaaagtta atttgaactc agaaaagaac 780 acaaacacta tatgaattgt ttgagcgtat atactaatga aatagcatct gtttgtgcat 840 caataatacc atcattattt aagaattaag aagaagctaa aattcaa 887 <210> 132 <211> 886 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 132 atggaagtaa gagtggagaa cattcgggca atagacatgt tcaaagcaaa gatgaaaaac 60 cgtataagaa gtagcaagtg ctatagaaat gctacactga tccttattgg attaacagca 120 ctaagtatgg cacttaatat ttttttaatc attgattatg caacattaaa aaacatgacc 180 aaagtggaac actgtgttaa tatgccgccg gtagaaccaa gcaagaagac cccaatgacc 240 tctgcagtag acttaaacac caaacccaat ccacagcagg caacacagtt gaccacagag 300 gactctacat ctttagcagc aaccctagag gaccatccac acacagggac aactccaaca 360 ccagatgcaa cagtctctca gcaaaccaca gacgagcaca caacactgct gagatcaacc 420 aacagacaga ccacccaaac aactgcagag aaaaagccaa ccagagcaac aaccaaaaaa 480 gaaaccacaa ctcgaaccac aagcacagct gcaacccaaa cactcaacac caccaaccaa 540 actagcaatg gaagagaggc aaccacaaca tctgccagat ccagaaacaa tgccacaact 600 caaagcagcg atcaaacaac ccaagcagca gaaccaaact cccaatcaca acatacacag 660 aaaagcacaa caacaacata caacacagac acatcttctc taagtagtta acaaaaaaac 720 tataaaataa ccatgaaaac caaaaaacta gaaaagttaa tttgaactca gaaaggaaca 780 caaacactat atgaattatt tgagcgtata tactaatgaa atagcatctg tttgtgcatc 840 aataatacca tcattattta agaaataaga agaagctaaa attcaa 886 <210> 133 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 133 Met'-Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Thr lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu Val Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Lys Met Gln Lys Asn Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80 Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser Pro Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Ser Ser 100 105 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg Thr Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160 His Ser Pro Pro Arg Ala Thr Thr Arg Thr Ala Arg Arg Thr Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser Thr Arg Lys Arg Pro Ser Thr Ala Ser Val Gln 180 185 190 Pro Asp lie Ser Ala Thr Thr His Lys Asn Glu Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 205 Ser Pro Gln Thr Ser Ala Ser Thr Thr Arg lie Gln Arg Lys Ser Val 210 215 220 Glu Ala Asn Thr Ser Thr Thr Tyr Asn Gln Thr Ser 225 230 235 <210> 134 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 134 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Thr lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu Val Leu He Gly He Thr Thr Leu Ser He Ala Leu Asn He Tyr 35 40 45 Leu He He Asn Tyr Lys Met Gln Lys Asn Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 ' 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80 Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser Pro Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Ser Ser 100 105 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg Thr Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160 His'" Ser Pro Pro Arg Ala Thr Thr Arg Thr Ala Arg Arg Thr Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser Thr Arg Lys Arg Pro Ser Thr Ala Ser Val Gln 180 185 190 Pro Asp He Ser Ala Thr Thr His Lys Asn Glu Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 205 Ser Pro Gln Thr Ser Ala Ser Thr Thr Arg He Gln Arg Lys Ser Val 210 215 220 Glu Ala Asn Thr Ser Thr Thr Tyr Asn Gln Thr Ser 225 230 235 <210> 135 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 135 Met Glu Val Lys Val Glu Asn He Arg Thr He Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu Val Leu He Gly He Thr Thr Leu Ser He Ala Leu Asn He Tyr 35 40 45 Leu He He Asn Tyr Lys Met Gln Lys Asn Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80 Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser Pro Gln His Pro Thr Gln 85 · -90 · 95 Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Asn Ser 100 ' 105 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg He Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160 His Ser Pro Pro Trp Ala Thr Thr Arg Thr Ala Arg Arg Thr Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser Thr Arg Lys Arg Pro Ser Thr Ala Ser Ala Gln 180 185 190 Pro Asp lie Ser Ala Thr Thr Hi s Lys Asn G2 u Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 205 Ser Pro Gln Thr Ser Ala Ser Thr Thr Arg Thr Gln Arg Lys Ser Val 210 215 220 Glu Ala Asn Thr Ser Thr Thr Tyr Asn Gln Thr Ser 225 230 235 <210> 136 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 136 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Thr lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg' Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu Val Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 ' 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Lys Met Gln Lys Asn Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80 Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser Pro Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Asn Ser 100 105 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asp Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg lie Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160 His Ser Pro Pro Trp Ala Thr Thr Arg Thr Ala Arg Arg Thr Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser Thr Arg Lys Arg Pro Ser Thr Ala Ser Val Gln 180 185 . 190 Pro Asp He Ser Ala Thr Thr His Lys Asn Glu Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 205 Ser Pro Gln Thr Ser Ala Ser Thr Thr Arg Thr Gln Arg Lys Ser Val 210 215 220 Glu Ala Asn Thr Ser Thr Thr Tyr Asn Gln Thr Ser 225 230 235 <210> 137 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 137 Met Glu Val Lys Val Glu Asn He Arg Thr He Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu Val Leu He Gly He Thr Thr Leu Ser He Ala Leu Asn He Tyr 35 40 45 Leu lie He Asn Tyr Lys Met Gln Lys Asn Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80 Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser Pro Gln His Pro Thr Gin 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Ser Ser 100 105 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asp Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg He Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160 His Ser Pro Pro Trp Ala Thr Thr Arg Thr Ala Arg Arg Thr Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser Thr Arg Lys Arg Pro Ser Thr Ala Ser Val Gln 180 185 190 Pro Asp He Ser Ala Thr Thr His Lys Asn Glu Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 205 Ser Pro Gln Thr Ser Ala Ser Thr Thr Arg Thr Gln Arg Lys Ser Val '210 215 220 Glu Ala Asn Thr Ser Thr Thr Tyr Asn Gln Thr Ser 225 230 235 <210> 138 <211> 236 <212> PRT <213> etapneumo virus humano <400> 138 Met Glu Val Lys Val Glu Asn He Arg Thr He Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu He Leu He Gly He Thr Thr Leu Ser He Ala Leu Asn He Tyr 35 40 45 Leu He He Asn Tyr Thr Met Gln Glu Asn Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 75 8C Pro He Asp Asn Ser Asp Thr Asn Pro Gly Ser Gln Tyr Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Asp Ser Thr Leu His Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ser 100 10-5- 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Ser Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Arg Thr 130 135 140 Ser Pro Ala 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Ser Ala Ser Ser 100 ° 105 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Ser Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Ser Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Leu Arg lie Ser Pro Arg Thr 145 150 155 160 His Ser Pro Pro Trp Ala Met Thr Arg Thr Val Arg Gly Thr Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser lie Arg Lys Arg Pro Ser Thr Ala Ser Val Gln 180 185 190 Pro Asp Ser Ser Ala Thr Thr His Lys His Glu Glu Ala Ser Pro Val 195 200 205 Ser Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Ala Arg Pro Gln Arg Lys Gly Met 210 215 220 Glu Ala Ser Thr Ser Thr Thr Tyr Asn Gln Thr Ser 225 230 235 <210> 140 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 140 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Thr lie Asp Me Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr Met Gln Glu Asn Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80 Pro Met Asp Asn Ser Asp Thr Asn Pro Gly Ser Gln Tyr Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu His Phe Ala Ala Ser Ala Ser Ser 100 105 110 Pro Glü Thr Glu Pro Thr Ser "Thr Pro Asp Thr Thr Ser Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Ser Ser Ala Ser Arg lie Arg Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Leu Arg lie Ser Pro Arg Thr 145 150 155 160 His Ser Pro Pro Trp Ala Met Thr Arg Thr Val Arg Gly Thr Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser lie Arg Lys Arg Pro Ser Thr Ala Ser Val Gln 180 185 190 Pro Asp Ser Ser Ala Thr Thr His Lys His Glu Glu Ala Ser Pro Val 195 200 205 Ser Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Ala Arg Pro Gln Arg Lys Gly Met 210 215 220 Glu Ala Ser Thr Ser Thr Thr Tyr Asn Gln Thr Ser 225 230 235 <210> 141 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <220> <221> VARIANTE <222> 220 <223> Xaa = aminoácido desconocido u otro <400> 141 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 " 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Pro Asn Lys Glu Ala Ser Thr lie 65 70 75 80 Ser Thr Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Ser Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 . 95 Gln Ser Thr Glu Asn Pro Thr Leu Asn Pro Ala Ala Ser Ala Ser Pro 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Val Asp Arg Ser Thr Ala Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Lys Pro Thr Val His Thr lie Asn Asn Pro Asn Thr Ala Ser Ser Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Pro Are Thr Thr Thr Lys Ala lie Arg Arg Ala Thr Thr 165 170 175 Phe Arg Met Ser Ser Thr Gly Lys Arg Pro Thr Thr Thr Leu Val Gln 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Xaa His Thr Asn Asn 210 215 220 lie Lys Pro Asn 225 <210> 142 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 142 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie. Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Thr Ser Thr lie 65 70 75 80 Pro lie Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Ala Ala Ser Val Ser Pro 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Val Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Lys Pro Thr Val His Thr Lys Asn Asn Pro Ser Thr Val Ser Arg Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Leu Arg Ala Thr Thr Lys Ala Val Leu Arg Ala Thr Ala 165 170 175 Phe Arg Thr Ser Ser Thr Arg Lys Arg Pro Thr Thr Thr Ser Val Gln 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Ser Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Ser Gln His Thr Asn Asn 210 215 220 lie Lys Pro Asn 225 <210> 143 <211> 228 . <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 143 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala Val Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu Val Gly He Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie Val Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Thr Glu Ser Asn Lys Gly Thr Ser Thr lis 65 70 75 80 Pro Thr Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Ser Pro Thr -Leu Asn Thr Ala Ala Ser Val Ser Pro 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro" Ala Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Ala Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Lys Leu Thr Val His Thr Lys Asn Asn Leu Ser Thr Ala Ser Arg Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Pro Arg Ala Thr Thr Lys Ala Val Leu Arg Asp Thr Ala 165 170 175 Phe '-His Thr Ser Ser Thr Gly Lys Arg Pro Thr Thr Thr Ser Val Glr. 180 185 190 Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Ser Ser Ser 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asp Gln Asp Thr Asn Asr. 210 ' 215 220 Thr Lys Gln Asn 225 <210> 144 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <220> <221> VARIANTE <222> 81 <223> Xaa = cualquier aminoácido <400> 144 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala Val Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu Val Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie Val Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Thr Glu Ser Asn Lys Gly Thr Ser Thr lie 65 70 75 80 Xaa Thr Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Glr. 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Ser Pro Thr Leu Asn Thr Ala Ala Ser Val Ser Prc 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Asp hr Thr Asn Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Ala Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Lys Leu Thr Val His Thr Lys Asn Asn Leu 3er Thr Ala Ser Arg Thr 145 150 155 16C Gln Ser Pro Pro Arg Ala Thr Thr Lys Ala Val Leu Arg Asp Thr Ala 165 170 ' 175 Phe His Thr Ser Ser Thr Gly Lys Arg Pro Thr Thr Thr Ser Val Gln 180 185 190 Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Ser Ser Ser 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asp Gln Asp Thr Asn Asn 210 215 220 Thr Lys Gln Asn 225 <210> 145 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <221·> VARIANTE <222> 220 <223> Xaa = aminoácido desconocido u otro <400> 145 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Met Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Thr Ser Thr lie 65 70 75 80 Pro lie Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn . Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Ser Leu Thr Leu Asn Pro Ala Ala Ser Val Ser Pro 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Val Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 ' 135 140 Lys Leu Thr Val His Lys Lys Asn lie Pro Ser Thr Val Ser Arg Thr 145 150 155 160 Gln Ser Ser lie Arg Ala Thr Thr Lys Ala Val Leu Arg Ala Thr Ala 165 170 175 Phe Arg Thr Ser Ser Thr Gly Glu Arg Pro Thr Thr Thr Ser Val Gln 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Xaa His. Thr Asn lie 210 215 220 Val Lys Pro Asn 225 <210> 146 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <221> VARIANTE <222> 220 <223> Xaa = aminoácido desconocido u otro <400> 146 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 - 5 - 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Thr Ser Thr lie 65 70 75 80 Ser lie Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Ser Leu Thr Leu Ser Pro Thr Ala Ser Val Ser Pro 100 105 ¦ 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Ser Asp Thr Thr Ser Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Val Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Ala Arg Thr 130 135 140 Lys Pro Thr Val His Lys Lys Asn lie Pro Ser Thr Val Ser Arg Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Leu Arg Ala Thr Thr Lys Ala Val Leu Arg Ala Thr Ala 165 170 175 Phe Arg Thr Ser Ser Thr Gly Glu Gly Pro Thr Thr Thr Ser Val Gln 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Xaa His Thr Asn lie 210 215 220 Val Lys Pro Asn 225 <210> 14.7 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumovirus humano <220> <221> VARIANTE <222> 220 <223> Xaa = aminoácido desconocido u otro <400> 147 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Ala Ser Thr lie 65 70 75 80 Ser Thr Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Asn Pro Thr Leu Asn Pro Ala Ala Ser Val Ser Ser 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Leu >Ser 115 120 125 Ser Val Asp Arg Ser Thr Ala Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Lys Pro Thr Val His Thr Arg Asn Asn Pro Ser Thr Ala Ser Ser Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Pro Arg Val Thr Thr Lys Ala lie Leu Arg Ala Thr Val' 165 170 - 175 Phe Arg Met Ser Ser Thr Gly Lys Arg Pro Ala Thr Thr Leu Val Gln 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn' Ser Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Xaa His Ser Asn Asn 210 215 220 lie Lys Pro Asn 225 <210> 148 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 148 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie He Asn Tyr Thr He Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Thr Ser Thr He 65 70 75 80 Ser He Asp Asn Ser Asp He Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Ser Leu Thr Leu Ser Pro Thr Ala Ser Val Ser Pro 100 105'" 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Ser Asp Thr Thr Asn Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Val Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Ala Arg Thr 130 135 . .· 140 Lys Pro Thr Val His Lys Lys Asn He Pro Ser Thr Val Ser Arg Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Leu Arg Ala Thr Thr Lys Ala Val Leu Arg Ala Thr Ala 165 170 175 Phe Arg Met Ser Ser Thr Gly Glu Gly Pro Thr Thr Thr Ser Val Gln 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Gln His Thr Asn He 210 215 220 Ala Lys Pro Asn 225 <210> 149 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 149 Met Glu Val Lys Val Glu Asn He Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 ' 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Thr Ser Thr lie 65 70 75 80 Pro'. lie Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Ser Leu Thr Leu Tyr Pro Thr Ser Ser Val Ser Ser 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Gly lie Thr Asn His Leu Ser 115 120 125 Phe Val Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Asn Arg Thr Val Kis Lys Lys Asn lie Ser Ser Thr Val Ser Arg Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Pro Arg Thr Thr Ala Lys Ala Val Pro Arg Ala Thr Ala 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser Thr Gly Glu Arg Pro Thr Thr Thr Pro Val Gln 180 185 190 Pro Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Gln His Thr Asn lie 210 215 220 Ala Arg Pro Asn 225 <210> 150 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 150 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 . ...10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Thr Ser Thr lie 65 70 75 80 Pro lie Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Ala Glu Ser Leu Thr Leu Tyr Pro Thr Ser Ser Val Ser Ser 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Gly lie Thr Asn His Leu Ser 115 120 125 Phe Val Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Asn Arg Thr Val His Lys Lys Asn lie Ser Ser Thr Val Ser Arg Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Pro Arg Thr Thr- Ala Lys Ala Val Pro Arg Ala Thr Ala 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser Thr Gly Glu Arg Pro Thr Thr Thr Pro Val Gln 180 185 190 Pro Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Gln His Thr Asn lie 210 215 220 Ala Arg Pro Asn 225 <210> 151 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 151 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 . Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Thr Ser Thr lie 65 70 75 80 Pro lie Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Ser Leu Thr Leu Tyr Pro Thr Ser Ser Val Ser Ser 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Gly lie Thr Asn His Leu Ser 115 120 125 Phe Val Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Asn Arg Thr Val His Lys Lys Asn lie Ser Ser Thr Val Ser Arg Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Pro Arg Thr Thr Ala Lys Ala Val Pro Arg Ala Thr Ala 165 .- 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser Thr Gly Glu Arg Pro Thr Thr Thr Pro Val Gln 180 185 190 Pro Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Gln His Thr Asn lie 210 215 220 Ala Arg Pro Asn 225 <210> 152 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 152 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Gln Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Ala Ser" Thr lie 65 70 75 80 Ser Thr Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Asn Pro Thr Leu Asn Pro Ala Ala Ser Ala Ser Pro 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Ser Ala Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Val Asp Arg Ser Thr Val Gln Pro Ser Glu Asn Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Lys Leu Thr Val His Thr Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ala Ser Ser Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Pro Arg Ala Thr Thr Lys Ala lie Arg Arg Ala Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Met Ser Ser Thr Gly Arg Arg Pro Thr Thr Thr Leu Val Gln 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Gln His Thr Asn Asn 210 215 220 lie Lys Pro Asn 225 <210> 153 <211> 228 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 153 Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 - - 30 Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40' 45 Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Ala Ser Thr lie 65 70 75 80 Ser Thr Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Asn Pro Thr Leu Asn Pro Ala Ala Ser Ala Ser Pro 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Ser Ala Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Val Asp Arg Ser Thr Val Gln Pro Ser Glu Asn Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Lys Leu Thr Val His Thr Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ala Ser Ser Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Pro Arg Ala Thr Thr Lys Ala lie Arg Arg Ala Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Met Ser Ser Thr Gly Arg Arg Pro Thr Thr Thr Leu Val Gln 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205 Asn Pro Gln Ala Ser Ala Ser Thr Met Gln Asn Gln His Thr Asn Asn 210 215 220 lie Lys Pro Asn 225 <21u> 154 <211> 231 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <220> <221> VARIANTE <222> 225 <223> Xaa = aminoácido desconocido u otro <400> 154 Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15 Lys lie Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Arg Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly Leu Thr Ala Leu Ser. 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Thr 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45 Leu lie lie Asp His Ala Thr Leu Arg Asn Met lie Lys Thr Glu Asn 50 55 60 Cys Ala Asn Met Pro Pro Ala Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80 Ser Thr Ala Gly Leu Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln 85 90 95 Trp.Thr Thr Glu Asn Ser Thr Ser Pro Ala Ala Thr Pro Glu Gly His 100 105 110 Leu His Thr Gly Thr Thr Gln Thr Pro Asp Thr Thr Ala Pro Gln Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Lys His Thr Ala Leu Pro Lys Ser Thr Asn Glu Gln lie 130 135 140 Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Thr Thr Arg Ala Thr Thr Gln Arg 145 150 155 160 Arg Glu Lys Gly Lys Glu Asn Thr Asn Gln Thr Thr Ser Thr Ala Ala 165 170 175 Thr Gln Thr Thr Asn Thr Thr Asn Gln lie Arg Asn Ala Ser Glu Thr 180 185 190 lie Thr Thr Ser Asp Arg Pro Arg Thr Asp Ser Thr Thr Gln Ser Ser 195 200 ( 205 Glu Gln Thr Thr Arg Ala Thr Asp Pro Ser Ser Pro Pro His His Ala 210 215 220 Gln Gly Ser Ala Lys Pro Lys 225 230 <210> 159 <211> 231 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 159 Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15 Lys lie Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Arg Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45 Leu lie lie Asp His Ala Thr Leu Arg Asn Met lie Lys Thr Glu Asn 50 55 60 Cys Ala Asn Met Pro Pro Ala Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 ""5 80 Ser Thr Ala Gly Pro Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln 85 90 95 Trp Thr Thr Glu Asn Ser Thr Ser Pro Ala Ala Thr Pro Glu Gly His 100 105 110 Leu His Thr Gly Thr Thr Gln Thr Pro Asp Thr Thr Ala Pro Gln Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Lys His Thr Ala Leu Pro Lys Ser Thr Asn Glu Gln lie 130 135 140 Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Thr Thr Arg Ala Thr Thr Gln Arg 145 150 155 160 Arg Glu Lys Gly Lys Glu Asn Thr Asn Gln Thr Thr Ser Thr Ala Ala 165 170 175 Thr Gln Thr Thr Asn Thr Thr Asn Gln lie Arg Asn Ala lie Glu Thr 180 185 190 lie Thir Thr Ser Asp Arg Pro Arg Thr Asp Ser Thr Thr Gln Ser Ser 195 200 205 Glu Gln Thr Thr Arg Ala Thr Asp Pro Ser Ser His Pro His His Ala 210 215 220 Gln Gly Ser Ala Lys Pro Lys 225 230 <210> 160 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 160 Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15 Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45 Leu lie lie Asp Tyr Ala Met Leu Lys Asn Met Thr Lys Val Glu His 50 55 60 Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80 Ser Ala Val Asp Leu Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln 85 90 95 Leu Ala Ala Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Ser Glu Asp His 100 105 11.0 Leu His Thr Gly Thr Thr Pro Thr Pro Asp Ala Thr Val Ser Gln Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Leu Arg Ser Thr Asn Arg Gln Thr 130 135 140 Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Lys 145 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gln Thr Leu Asn 165 170 175 Thr Thr Asn Gln Thr Ser Tyr Val Arg Glu Ala Thr Thr Thr Ser Ala 180 185 190 Arg Ser Arg Asn Ser Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asp Gln Thr Thr Gln 195 200 205 Ala Ala Asp Pro Ser Ser Gln Pro His His Thr Gln Lys Ser Thr Thr 210 215 220 Thr Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Ser Pro Ser Ser 225 230 235 <210> 161 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <220> <221> VARIANTE <222> 220, 227 <223> Xaa = aminoácido desconocido u otro <400> 161 Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Thr lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5 ' 10 15 Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45 Leu lie lie Asp Tyr Ala Thr Phe Lys Asn Met Thr Lys Val' Glu His 50 55 60 Cys Ala Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80 Ser Thr Val Asp Ser Ser Thr Gly Pro Asn Pro Gln Gln Thr Thr Gln 85 90 95 Trp Thr Thr Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Ser Glu Asp His 100 105 110 Leu His Thr Gly Thr Thr Pro Thr Leu Asp Ala Thr Val Ser Gln Gln 115 120 125 Thr Pro Asp Lys His Thr Thr Pro Leu Arg Ser Thr Asn Gly Gln Thr 130 135 140 Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Pro Thr Arg Ala lie Ala Lys Lys 145 150 155 160 Glu Thr Thr Asn Gln Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gln Thr Phe Asn 165 170 175 Thr Thr Asn Gln Thr Arg Asn Gly Arg Glu Thr Thr lie Thr Ser Ala 180 185 . 190 Arg Ser Arg Asn Asp Ala Thr Thr Gln Ser Ser Glu Gln Thr Asn Gln 195 200 205 Thr Thr Asp Pro Ser Ser Gln Pro His His Ala Xaa lie Ser Thr lie 210 215 220 Thr lie Xaa Thr Gln His Arg His lie Phe Ser Lys 225 230 235 <210> 162 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <220> <221> VARIANTE <222> 208 <223> Xaa = aminoácido desconocido ü otro <400> 162 Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15 Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 * 30 Leu lie Leu lie Giy Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 " 40 45 Leu lie lie Asp Tvr Ala Met Leu Lys Asn Met Thr Lys Val Glu His 50 " 55 60 Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80 Ser Ala Val Asp Leu Asn Thr Lys Leu Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln 85 90 95 Leu Thr Thr Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Ser Glu Asp His 100 105 110 Leu Leu Thr Gly Thr Thr Pro Thr Pro Asp Ala Thr Val Ser Gln Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Glu His Thr Thr Leu Leu Arg Ser Thr Asn Arg Gln Thr 130 135 140 Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Lys 145 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gln Thr Leu Asn 165 170 175 Thr Thr Asn Gln Thr Ser Asn Gly Arg Glu Ala Thr Thr Thr Ser Thr 180 185 190 Arg Ser Arg Asn Gly Ala Thr Thr Gln Asn Ser Asp Gln Thr Thr Xaa 195 200 205 Thr Ala Asp Pro Ser Ser Gln Pro His His Thr Gln Lys Ser Thr Thr 210 215 220 Thr Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Ser Pro Ser Ser 225 230 235 <210> 163 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 163 et Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15 Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45 Leu lie lie Asp Tyr Ala Thr Leu Lys Asn Met Thr Lys Val Glu His 50 55 60 Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80 Ser Ala Val Asp Leu Asn Thr Lys Leu Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln 85 90 95 Leu Thr Thr Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Ser Glu Gly His 100 105 110 Pro His Thr Gly Thr Thr Pro Thr Pro Asp Ala Thr Val Ser Gln Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Glu His Thr Thr Leu Leu Arg Ser Thr Asn Arg Gln Thr 130 135 140 Thr Gln Thr Ala Thr Glu Lys Lys Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Lys 145 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gln Thr Pro Asn 165 170 175 Thr Thr Asn Gln Thr Ser Asn Gly Arg Glu Ala Thr Thr Thr Ser Ala 180 185 190 Arg Ser Arg Asn Gly Ala Thr Thr Gln Asn Ser Asp Gln lie Thr Gln 195 200 205 Ala Ala Asp Ser Ser Ser Gln Pro His His Thr Gln Lys Ser Thr Thr 210 215 220 Thr Ala Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Phe Pro Ser Ser 225 230 235 <210> 164 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneurao virus humano <400> 164 Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5. 10 15 Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 ¦ 30 . Leu lie Leu lie Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn. lie Phe 35 40 45 Leu lie lie Asp Tyr Ala Thr Leu Lys Asn Met Thr Lys Val Glu His 50 55 60 Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 . 70 75 80 Ser Ala Val Asp Ser Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln 85 90 95 Leu Thr Thr Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Leu Glu Asp His 100 105 110 Pro His Thr Gly Thr Thr Pro Thr Pro Asp Ala Thr Val Ser Gln Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Glu His Thr Thr Leu Leu Arg Ser Thr Asn Arg Gln Thr 130 135 140 Thr Gln Thr Thr Ala Glu Lys Lys Pro Thr Arg Ala Thr Thr Lys Lys 145 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gln Thr Leu Asn 165 170 175 Thr Thr Asn Gln Thr Ser Asn Gly Arg Glu Ala Thr Thr Thr Ser Ala 180 185 190 Arg Ser Arg Asn Asn Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asp Gln Thr Thr Gln 195 200 205 Ala Ala Glu Pro Ser Ser Gln Ser Gln His Thr Gln Lys Ser Thr Thr 210 215 220 Thr Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Ser Leu Ser Ser 225 230 235 <210> 165 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 165 Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5 " 10 15 Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly Leu Ser Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45 Leu lie lie Asp Tyr Ala Lys Ser Lys Asn Met Thr Arg Val Glu His 50 " 55 60 Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80 Ser Ala Val Asp Leu Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gln Arg Ala Thr Gln 85 90 95 Leu Thr Thr Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Leu Glu Gly His 100 105 110 Leu His Thr Gly Thr Thr Pro Thr Pro Asp Val Thr Val Ser Gln Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Glu His Thr Thr Leu Leu Arg Ser Thr Asn Arg Gln Thr 130 135 140 Thr Gln Thr Ala Ala Glu Lys Lys Pro Thr Arg Val Thr Thr Asn Lys 145 150 155 160 Glu Thr lie Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gln Thr Leu Asn 165 170 175 Thr Thr Asn Gln Thr Asn Asn Gly Arg Glu Ala Thr Thr Thr Ser Ala 180 185 190 Arg Ser Arg Asn Asn Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asp Gln Thr Thr Gln 195 200 205 Ala Ala Asp Pro Ser Ser Gln Ser Gln His Thr Gln Lys Ser lie Thr 210 215 220 Thr Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Ser Pro Ser Ser 225 230 235 <210> 166 <211> 236 <212> PRT ¦ <213> Metapneumo virus humano <400> 166 Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 . 5 10 15 Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30 Leu lie Leu lie Gly Leu Ser Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45 Leu lie lie Asp Tyr Ala Lys Ser Lys Thr Met Thr Arg Val Glu His 50 55 60 Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80 Ser Ala Val Asp Leu Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln 85 90 95 Leu Thr Thr Glu Asp Ser Thr Ser Pro Ala Ala Thr Leu Glu Gly His 100 105 110 Leu His Thr Gly Thr Thr Pro Thr Pro Asp Ala Thr Val Ser Gln Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Glu His Thr Thr Leu Leu Arg Ser Thr Asn Arg Gln Thr 130 135 140 Thr Gln Thr Thr Ala Glu Lys Lys Pro Thr Arg Ala Thr Thr Lys Lys 145 150 155 160 Glu Thr lie Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gln Thr Leu Asn 165 170 175 Thr Thr Asn Gln Thr Ser Asn Gly Arg Glu Ala Thr Thr Thr Ser Ala 180 185 190 Arg Ser Arg Asn Asn Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asp Gln Thr Thr Gln 195 200 205 Ala Ala Asp Pro Ser Ser Gln Ser Gln His Thr Lys Lys Ser Thr Thr 210 215 220 Thr Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Ser Pro Ser Ser 225 230 235 <210> 167 <211> 236 <212> PRT <213> Metapneumo virus humane <400> 167 Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15 Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 ' 25 30 Leu lie Leu lie Gly- Leu Thr Ala Leu Ser Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45 Leu lie lie Asp Tyr Ala Thr Leu Lys Asn Met Thr Lys Val Glu His 50 55 60 Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80 Ser Ala Val Asp Leu Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln 85 90 95 Leu Thr- Thr Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Leu Glu Asp His 100 105 110 Pro His Thr Gly Thr Thr Pro Thr Pro Asp Ala Thr Val Ser Gln Gln 115 120 125 Thr Thr Asp Glu His Thr Thr Leu Leu Arg Ser Thr Asn Arg Gln Thr 130 135 140 Thr Gln Thr Thr Ala Glu Lys Lys Pro Thr Arg Ala Thr Thr Lys Lys 145 ' 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gln Thr Leu Asn 165 170 175 Thr Thr Asn Gln Thr Ser Asn Gly Arg Glu Ala Thr Thr Thr Ser Ala 180 185 190 Arg Ser Arg Asn Asn Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asp Gln Thr Thr Gln 195 200 205 Ala Ala Glu Pro Asn Ser Gln Ser Gln His Thr Gln Lys Ser Thr Thr 210 215 220 Thr Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Ser Leu Ser Ser 225 230 235 <210> 168 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 168 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgtt caggaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga ccaaggatgg tattgtcaaa atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg aaaaagactg tgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag t-gcaacataa acatatetac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacag'g aagacatcct atcagtatgg ttgcactatc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gcagcaacag agtagggatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgetetta 449 <210> 169 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 169 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgct cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga tcaaggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg aaaaagactg cgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag tgcaacatca acatatccac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacagg aagacatcct atcagtatgg ttgcactgtc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gcagcaacag agtagggatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 170 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 170 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgct cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga tcaaggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg aaaaagattg cgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag tgcaacatca acatatccac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacagg aagacatcct atcagtatgg ttgcactgtc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gcagcaacag agtagggatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 171., <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 171 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgct cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga tcaaggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg aaaaagactg cgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag tgcaacatca acatatccac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacagg aagacatcct atcagtatgg ttgcactgtc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gcagcaacag agtagggatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 172 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 172 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgct cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga tcaaggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg aaaaagattg cgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag tgcaacatca acatatccac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacagg aagacatcct atcagtatgg ttgcactgtc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gtagcaacag agtaggga.c 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 173 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 173 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgtt cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga ccaaggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaáatg aaaaagactg tgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag tgcaacataa acatatctac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacagg aagacatcct atcagtatgg ttgcactgtc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gcagcaacag agtagggatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 174 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 174 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgtt cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga ccaaggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg aaaaagactg tgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag tgcaacataa acatatctac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacagg aagacatcct atcagtatgg ttgcactgtc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gcagcaacag agtagggatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 175 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 175 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgtt cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga ccaaggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg aaaaagactg tgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag tgcaacataa acatatctac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacagg aagacatcct atcagtatgg ttgcactgtc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gcagcaacag agtagggatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 176 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 176 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgct cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga tcagggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg aaaaagactg tgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag tgcaacatca acatatccac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacagg aagacatcct atcagtatgg ttgcactgtc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gcagcaacag agtaggaatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 177 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 177 ataggagttt 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360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccat tg gcagcaacag agtagggatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 179 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 17.9 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggagttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcggcc ccttcttgct cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgcctct taagagaaga tcaaggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg aaaaagactg cgaaacaaga ggagaccatg tcttttgcga cacagcagca 240 ggaatcaatg ttgctgagca gtcaaaggag tgcaacatca acatatccac tactaattac 300 ccatgcaaag ttagcacagg aagacatcct atcagtatgg ttgcactgtc tcctcttggg 360 gctttggttg cttgctacaa gggagtgagc tgttccattg gcagcaacag agtagggatc 420 atcaagcaac tgaacaaagg ctgctctta 449 <210> 180 <211> 449 <212> ADN <213> Metapneumo virus humano <400> 180 ataggagttt acggaagctc cgtaatttac atggtgcaac tgccaatctt tggggttata 60 gacacgcctt gctggatagt aaaagcagcc ccttcttgct cagaaaaaaa gggaaactat 120 gcttgccttt taagagaaga tcaaggatgg tattgtcaga atgcagggtc aactgtttac 180 tacccaaatg 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Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 254 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 254 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie As Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 . 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 1*15 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 255 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 255 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 2„ 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 . 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser'Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 256 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 256 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr. Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 257 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 257 lie Gly Val Tyr- Gly Ser Ser Val lie Tyr Me.t Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 35 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 258 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 258 lie 'Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 259 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 259 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 -10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys As lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 260 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 260 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe ' Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 8b 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 261 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 261 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu •Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25. 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 ' 45 Arg Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 7C 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 VaL Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 262 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 262 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys '¦Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser S5 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 263 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 263 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 264 <211> 149 <212> 'PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 264 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro He 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp He Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly' Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn He Asn He Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro He Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly He lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 265 ¦ <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 265 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val He Tyr Met Val Gln Leu Pro He 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp He Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn He Asn He Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Prc Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro He Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly He He Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 266 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 266 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5. 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu- Leu Arg Glu /Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys-vGlu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly' lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser <210> 267 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 267 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cy= Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 - - 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 268 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 268 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 1 20 25 30 Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 / Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 : 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr¾ Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 269 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 269 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr- Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr T r Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser- 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Al-a- Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 270 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 270 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly rp Tyr Cys Gln As Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser •400 105 110 Met. Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn. Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser <210> 271 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 271 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys As lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg 'Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser <210> 272 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 272 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys 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/Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly -•-Cys Ser 1 5^ <210> 275 <211> 149 ' <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 275 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 ¦135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 276 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 276 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys 'Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 145 <210> 277 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 277 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys As lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly ¦ 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser <210> 278 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 278 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly He Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn He Asn He Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro He Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu 1 'Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser He Gly Ser Asn Arg Val Gly He He Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 279 <211> 149 <212> PRT" <213> Metapneumo virus humano <400> 279 He Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val He Tyr Met Val Gln Leu Pro He 1 5 10 15 Phe Gly Val He Asp Thr Pro Cys Trp He Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Val Ala 65 70 75 80 Gly He Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn He Asn He Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro He Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser He Gly Ser Asn Arg Val Gly He He Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 280 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 280 He Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val He Tyr Met Val Gln Leu Pro He 1 5 10 15 Phe Gly Val He Asp Thr Pro Cys Trp He Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln As Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val ?he Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser'Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 281 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneümo virus humano <400> 281 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie i 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 282 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneümo virus humano <400> 282 - -lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 ' 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie Lys Gln Leu 130 135 Asn Ly¾ Gly Cys Ser 1 145 <210> 283 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 283 lie'- Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 284 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 284 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp T r Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 285 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 285 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phev Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr" Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 286 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 286 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 . 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 55 70 75 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 287 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 287 lié Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Va1- le Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 . 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 288 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 288 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 289 <211> 149 <212> F T <213> Metapneumo virus huma lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu /Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glü--iys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly" Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser . Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 290 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 290 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 - - 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser 145 <210> 291 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 291 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser 'Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5. 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu/Ásp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys-?lu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 70 75 80 Gly" lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Asn Lys Gly Cys Ser <210> 292 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 292 He Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val He Tyr Met Val Gln Leu Pro He 1 5 10 15 Phe Gly Val He Asp Thr Pro Cys Trp He He Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn He Asn He 3er 85 90" 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro He Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser He Gly Ser Asn Arg Val Gly He He Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 293 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 293 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser t 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp yr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr' Ala Ala 65 ' 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 90 95 Thr^ Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Trp Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 294 <21 1> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 294 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala-"Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie -Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser <210> 295 <211 > 14 9 <212 > PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 295 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 '40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn-' lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser ,100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser <210> 296 . <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 296 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie. lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser- Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 297 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 297 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly 'Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro /lie 100 105 110' Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys ¦115 120 125 Val Ser Cys--.Ser lie Gly Ser As Arg Val Gly lie lie Lys Gln 130 135 140 Pro' 'Lys Gly Cys Ser 145 <210> 298 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 298 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 299 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 299 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lyo Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro- Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lié Asn Val Ala Glu Gln 'Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85. 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Ser lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr .Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly~-Qys Ser <210> 300 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 300 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys As Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 301 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 301 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys /Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 302" <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 302 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly •115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys 3er 145 <210> 303 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 303 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro He 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu *Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser /' 145 <210> 304 \ <213> Metapneumo virus humano <400> 304 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser o o 90 ¦ 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 305 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 305 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser' Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <2Í0> 306 <211> 149 <212> PRT \ <213> Metapneumo virus humano <400> 306 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 307 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 307 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala 65 70 75 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 1 145 <210> 308 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 308 lie''"Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 309 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 309 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 - - 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 310 <211> 149 <212> PRT . / <213> Metapneumo virus humano <400> 31-0 lie Gly Val -.Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe*' Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 311 <211> 14-9 <212> PRT <213 Metapneumo virus humano <400> 311 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 ' 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 312 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 312 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val. ,Ile Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys"' 'Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 313 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 313 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 314 <211> 149 <212> PRT ' <213> Metapneumo virus humano <400> 314 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu-vLys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly' 'Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser <210> 315 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 315 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 316 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 316 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu-' Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 '· —· 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 317 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 317 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser <210> 318 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 318 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro ' ! Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro /Asn Glu 50 55 60 Lys ñsp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn-..Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr" Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 319 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 319 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25" 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln ¦.35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr A g Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105- 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 320 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 320 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 /' 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn' lie Ser 85 90 95 Thr Thr .Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser .100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly IT5 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser <210> 321 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 321 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro As Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg- Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 322 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 322 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly1 Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro /lie Ser 100 105 110' Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys., Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro"- Lys Gly Cys Ser 145 <210> 323 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 323 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 - <210> 324 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virui> humano <400> 324 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly Il'e Asn Val Ala Glu Gln1 Ser Arg Glu Cys As lie Asn lie Ser Q 0 ^D 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr/Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser He Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130. 135 140 Pro Lys Gly,. Cys Ser 145 <210> 325 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 325 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val T r Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 326 <211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 326 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 " 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys 'Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val. Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys /Sin Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <2;> 327-<211> 149 <212> PRT <213> Metapneumo virus humano <400> 327 lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gln Leu Pro lie 1 5 10 15 Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys . Trp lie lie Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu. Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys As Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly lie Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn lie Asn lie Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro lie Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly ,115 120 125 Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Arg Val Gly lie lie Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145

Claims (48)

  1. 499
  2. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. un virus quimérico de parainfluenza de bovino del tipo 3, caracterizado porque comprende una secuencia de t nucleótidos heteróloga que codifica un polipéptido de metapneumovirus. / 2. Un virus quimérico de parainfluenza de humano tipo 3, ca-racterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un polipéptido de metapneumovirus .
  3. 3. Un virus quimérico de parainfluenza de bovino tipo 3/virus de parainfluenza de humano tipo 3, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un polipéptido de metapneumovirus.
  4. 4. El virus de ia reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque dicho virus comprende las secuencias de nucleótidos heterólogas derivadas del mismo gen o de un metapneumovirus.
  5. 5. El virus de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque, dicho virus comprende las secuencias de nucleótidos heterólogas derivadas de al menos dos diferentes genes de un metapneumovirus.
  6. 6. El virus de la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque uno o más de los marcos o estructuras de lectura abiertos en el gemona del virus, han sido reemplazados por un ORF el cual codifica uno o más de (i) una 500 proteina F del pneumovirus avial (APV) (ii) una proteina G de APV, (iii) una proteina SH de APV; (iv) una proteina N de APV; (v) una proteina P de APV; (vi) una proteina M2 de APV; (vii) una proteina M2-1 de APV; (viii) una proteina M2-2 de APV; o (ix) una proteina L de APV.
  7. 7. El virus de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque uno o más de los marcos o estructuras de lectura abiertos en el genoma del virus ha sido reemplazado por un ORF el cual codifica una o más de (i) una proteina F de metapneumovirus de mamífero (MPV) ; (ii) una proteína G de MPV de mamífero, (iii) una proteína SH de MPV de mamífero; (iv) una proteína N de MPV de mamífero; (v) una proteína P de MPV de mamífero; (vi) una proteína M2 de MPV de mamífero; (vii) una proteína M2-1 de MPV de mamífero; (viii) una proteína M2-2 de MPV de mamífero; o (ix) una proteína L de MPV de mamífero.
  8. 8. El virus de la reivindicación 6, caracterizado porque el pneumovirus avial es APV tipo A, APV tipo B, APV tipo C, o APV tipo D.
  9. 9. El virus de la reivindicación 7, caracterizado porque el MPV de mamífero es la variante Al, variante A2, variante Bl o variante B2.
  10. 10. El virus de la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos heteróloga se agrega al genoma completo de dicho virus. 501
  11. 11. El virus de la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos se agrega en una posición del genoma del virus de parainfluenza de 104, 1774 y 3724.
  12. 12. El virus de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos de dicho virus de parainfluenza, ha sido substituido por dicha secuencia de nucleótidos heteróloga.
  13. 13. El virus de la reivindicación 1, 2, o 3 caracterizado porque las secuencias de nucleótidos heterólogas se insertan en el gemona del dicho virus de parainfluenza, en donde el genoma ha sido eliminado de uno o más genes.
  14. 14. El virus de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho virus de parainfluenza de bovino es un virus de parainfluenza de bovino tipo 3, cepa de Kansas.
  15. 15. El virus de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos heteróloga se deriva de las secuencias de nucleótidos que codifican una proteina F, una proteina G o un fragmento de las mismas.,
  16. 16. El virus de la reivindicación 15, caracterizado porque dicha proteina F comprende un ectodominio de una proteina F de un metapneumovirus , un dominio transmembrana de una proteina F de un virus de parainfluenza y el dominio 502 luminal de una proteína F de un virus de parainfluenza .
  17. 17. El virus de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque dichas secuencias de nucleótidos son las SEC ID Nos: 1 a 5, 14, o 15.
  18. 18. El virus de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína de las SEC ID Nos: 6 a 13, 16, o 17.
  19. 19. El virus de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque dicho virus comprende además una secuencia de nucleótidos heteróloga derivada de un virus sincitial respiratorio o una forma mutada del virus sincitial respiratorio .
  20. 20. El virus de la reivindicación 19, caracterizado porque el virus sincitial respiratorio es un virus sincitial respiratorio tipo A, un virus sincitial respiratorio tipo B, un virus sincitial respiratorio de bovino, o un virus sincitial respiratorio de ovino.
  21. 21. El virus de la reivindicación 19, caracterizado porque dicha secuencia se deriva de las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína F una proteína G, o un fragmento de las mismas de dicho virus sincitial respiratorio .
  22. 22. El virus de parainfluenza quimérico de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque el genoma de dicho virus contiene mutaciones o modificaciones, además de 503 dichas secuencias heterólogas de nucleótidos, lo cual resulta en un virus quimérico que tiene un fenotipo más' adecuado para usarse en formulaciones de vacunas tales como el fenotipo atenuado o un fenotipo con antigenicidad mejorada.
  23. 23. El virus de parainfluenza quimérico de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque la región intergénica de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga está alterada.
  24. 24. El virus de parainfluenza quimérico de la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos heteróloga se agrega en una posición del genoma del virus de parainfluenza, seleccionada del grupo que consiste de la posición 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y en donde la región intergénica de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga está alterada.
  25. 25. Una molécula de ADN o ARN recombinante que codifica el genoma del virus de la reivindicación 1, 2, o 3.
  26. 26. Una molécula de ADN o ARN recombinante que codifica el genoma del virus de la reivindicación 18.
  27. 27. Una molécula de ADN o ARN que comprende el virus quimérico de la reivindicación 1, 2, o 3, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  28. 28. Una formulación de vacuna, caracterizada porque, comprende el virus quimérico de la reivindicación 18 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 504
  29. 29. La formulación de vacuna de la reivindicación 27, caracterizada porque dicho virus quimérico comprende una modificación o mutación genómica la cual resulta en un fenotipo atenuado o antigenicidad mejorada.
  30. 30. La formulación de vacuna de la reivindicación 29, caracterizada porque dicha modificación d mutación se deriva de un mutante que se presenta de manera natural.
  31. 31. La formulación de vacuna de la reivindicación 27, caracterizada porque dicha vacuna se usa para modular la respuesta inmune de humanos, primates, caballos, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, especies de aves, o roedores.
  32. 32. La formulación de vacuna de la reivindicación 30, caracterizada porque la vacuna se usa para modular la respuesta inmune de un infante o un niño humano.
  33. 33. Una formulación inmunogénica caracterizada porque comprende el virus quimérico de la reivindicación 1, 2, o 3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  34. 34. Una formulación inmunogénica caracterizada porque comprende el virus quimérico de la reivindicación 18 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  35. 35. La formulación inmunogénica de la reivindicación 33, caracterizado porque dicho virus quimérico comprende una modificación o. mutación genómica la cual resulta en un fenotipo atenuado o antigenicidad mejorada.
  36. 36. La formulación inmunogénica de la 505 reivindicación 35, caracterizada porque dicha modificación o mutación se deriva de un mutante que se presenta de manera natural .
  37. 37. La formulación de vacuna de la reivindicación 33, caracterizada porque dicha vacuna se usa para modular la respuesta inmune de humanos, primates, caballos, vacas, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, especies de aves, o roedores.
  38. 38. La formulación de vacuna de la reivindicación 36, caracterizada porque la vacuna se usa para modular la respuesta inmune de un infante o niño humano.
  39. 39. Un método para tratar o prevenir una infección del tracto respiratorio en un mamífero, dicho método se caracteriza porque comprende administrar una vacuna de la reivindicación 27.
  40. 40. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque la infección del tracto respiratorio es una infección por PV.
  41. 41. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque la infección del tracto respiratorio es una infección con MPV, RSV, hPIV, o una combinación de los misinos .
  42. 42. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque el sujeto es un humano.
  43. 43. el método de la reivindicación 42, 506 caracterizado porque el sujeto humano es menor de 5 años de edad.
  44. 44. El método de a reivindicación 42, caracterizado porque el sujeto humano es menor de 2 años e edad.
  45. 45. El método de la reivindicación 42, caracterizado porque el sujeto humano sufre de una enfermedad o una condición además de la infección del tacto respiratorio .
  46. 46. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad o una condición es de fibrosis quistica, leucemia, linfoma no de Hodgkin, asma, y transplante de médula ósea y transplante de ríñones.
  47. 47. El sujeto humano de la reivindicación 42, caracterizado porque el sujeto humano es un individuo con inmunidad comprometida.
  48. 48. El sujeto humano de la reivindicación .42, caracterizado porque, el sujeto humano es una persona entrada en años.
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