TWI344991B - Metapneumovirus strains as vaccine formulations and as vectors for expression of heterologous antigenic sequences - Google Patents

Metapneumovirus strains as vaccine formulations and as vectors for expression of heterologous antigenic sequences Download PDF

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TWI344991B
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Haller Aurelia
Tang Roderick
Adrianus Maria Fouchier Ronaldus
Gerarda Van Den Hoogen Bernadetta
Dominicus Marcellinus Erasmus Osterhaus Albertus
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Medimmune Vaccines Inc
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Description

0) 0)1344991 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明) 1. 技術領域 本發明係關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，在副 黏液病毒科之肺病毒亞科中的間質肺病毒（MPV)。本發明 亦關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，並可在系統發 生上，確認與間質肺病毒屬及其组份相符或有關。本發明 係關於哺乳動物間質肺病毒之不同分離株的基因组核苷 酸序列，特別是人類間質肺病毒。本發明係關於將哺乳動 物間質肺病毒之不同分離株的序列資訊，用在診斷和治療 的方法上。本發明亦關於編碼間質肺病毒或其一部分之基 因组的核芬酸序列，包括哺乳動物和禽間質肺病毒兩者。 本發明進一步包括由該核苷酸序列編碼之嵌合型或重 組的病毒。本發明亦關於的嵌合型或重組的哺乳動物 MPV，其包括一或多個非-天然或異源的序列。本發明更 關於包括哺乳動物或禽間質肺病毒的疫苗調配物，包括該 病毒之重組和嵌合型形式。本發明之疫苗製品包括多價的 疫苗，包括二價和三價的疫苗製品。 2. 先前技術 在傳統上，副黏液病毒係擔任疾病之破壞者，成為全世 界每年許多動物和人類死亡的原因。副黏液病毒科形成單 負股病毒目（Mononegavirales)(反義單股RNA病毒）中的一 科，由副黏液病毒亞科和肺病毒亞科所組成。後者目前在 分類學上，被分成肺病毒屬和間質肺病毒屬（Pringle, 1999, Arch. Virol. 144/2，2065-2070)。人類呼吸道融合細胞病毒 1344991 (2) (hRSV)，肺病毒屬的物種，在全世界嬰幼兒和較小的兒童 期，是唯一最重要的下呼吸道感染的原因（Domachowske，& Rosenberg，1999，Clin. Microbio. Rev. 12(2):298-309)。肺病毒屬 的其他成員，包括牛和羊呼吸道融合細胞病毒，以及老鼠 的肺炎病毒（PVM) » 在過去10年中，已經確認數個哺乳動物疾病的致病原， 特別是呼吸道疾病，尤其是人類的（Evans, In: Viral Infections of Humans, Epidemiology and Control.第 3版（編輯 Evans, A.S) 22-28(Plenum Publishing Corporation, New York，1989))。在哺乳 動物中，RTI的古典致病原是呼吸道融合細胞病毒，屬於 肺病毒屬，在人類（hRSV)和諸如牛或綿羊之類的反芻動物 (bRSV及/或oRSV)中發現。在人類RSV中，使用在倒數交叉 中和測定中的差異，在免疫學測定中G蛋白質的反應性， 以及G基因之核荅酸序列，來定義兩種hRSV抗原亞群。在 亞群中，胺基酸序列顯示出94%(A亞群）或98%(B亞群）同一 性’然而在亞群之間僅發現53%胺基酸序列同一性。在亞 群内，·以單株抗體、RT-PCR測定和RNA酶保護測定為基 礎，觀察到額外的變異性。得自兩種亞群之病毒具有世界 性的分布，並可在一個季節出現。可在預先-存在之免疫 力的存在下發生感染，且不認為抗原變化是再度-感染所 嚴格需要的。參見，例如 Sullender, 2000，Clinical Microbiology Reviews 13(1): 1 -1 5; Collins 等人 Fields Virology,編輯 Β·Ν· Knipe，Howley, P.M. 1996, Philadelphia: Lippencott- Raven. 1313-1351; Johnson 等人，l987(Proc Natl Acad Sci USA, 1344991 (3) 84(16):5625-9; Collins,在 The Paramyxoviruses, D.W. Kingsbury 編輯者 199 1，Plenum Press: New York.第 103- 1 53 頁中。 其他古典的肺病毒是老鼠肺炎病毒（PVM)，通常僅在實 驗老鼠中發現。然而，一部分在哺乳動物中觀察到的疾 病’仍不能歸因於已知的病原。 2.1.禽間質肺病毒3 在1970年代末期，首先在南美描述了由禽肺病毒（Apv) 引起的呼吸道疾病（Buys等人，1980, Turkey 28:36-46)，在那 裏它成為毁減火雞工廠的原因。該疾病在火雞中的特徵為 竇炎和鼻炎，並被稱為火雞鼻氣管炎（TRT)。亦已經強烈 地暗示’ AP V的歐洲分離株為雞的頭腫徵候群（SHS)的原因 (O'Brien，1985, Vet. Rec. 1 17:619-620) » 最初，該疾病出現在 已感染新城雞瘟病毒（NDV)的肉雞群中，並以為是與新城 雞瘟（ND)有關的二級問題。在SHS發生後，在被感染的雞 中檢測到對抗歐洲APV的抗體（Cook等人，1988，Avian Pathol. 17:403-410) ’因此暗示APV為致病原。 禽肺病毒（APV)亦已知為火雞鼻氣管炎病毒（TRtv)，為 禽鼻氣管炎、火雞之上呼吸道感染的致病原（Giraud等人， 1986, Vet. Res. 119:606-607)，是最近指派為間質肺病毒屬的 唯一成員，直到現在為止，說它與感染無關，或更進一步， 與哺乳動物的疾病無關。可以G糖蛋白之核甞酸或胺基酸 序列’以及使用亦認得G糖蛋白之單株抗體的中和測試為 基礎，來辨別APV的血清學亞群。然而，可使用在核钻酸 和胺基酸序列上的其他差異’來區別ApV的血清學亞群。 1344991
(4) 在A、B和D亞群中’G蛋白質在亞群中顯示出98.5%至 99.7%aa序列同一性但在亞群之間僅觀察到312-38%aa同一 性。參見’例如 Collins等人，1993, Avian Pathology, 22:第 469-479 頁；Cook等人，1993，Avian Pathology，22:257-273; Bayon-Auboyer等人，J Gen Virol，81(Pt 1 1):2723-33; Seal, 1998, Vims Res，58 (l-2):45- 52; Bayon-Auboyer等人，1999，Arch Virol, 144 (6):91-10.9; Juhasz等人，1994, J Gen Virol, 75(Pt 1 1): 2873- 80。
在WO 00/20600中提供了更多的APV血清型，以引用的方 式併入本文中，.其描述了 APV的科羅拉多（Colorado)分離 株’並利用在活體外的血清中和測定，將其與已知的APV 或TRT品系相比較。首先，針對認得TRT分離株的單專_ 性多株抗血清，測試科羅拉多分離株。科羅拉多分離株不 會被對任何TRT品系的單專一性抗血清中和。然而，它卻 被對A亞群品系而升高的過度免疫抗血清中和。該抗血清 中和同系的病毒，至1:400之力價，而科羅拉多分離株則 至1:8〇之力價。使用以上的方法，然後針對TRT單株抗體 測試科.羅拉多分離株。在每個案例中，倒數中和力價均 < 10。亦對兩個亞群的丁RT品系，測試對科羅拉多分離株升 问的單專一性抗血清。沒有任何受試的TRT品系被對抗科 羅扭多分離株的抗血清中和。 APV之科羅拉多品系不能保護sPF雞對抗a亞群或b亞群 °口系< TRT病毒的攻毒。這些結果暗示科羅拉多分離株可 能是禽肺病毒之更多血清型的第一個實例（參見Bayon-Auboyer等人， 2〇〇〇, 】 Gen vir 81:2723-2733) 。 -10- 1344991 (5) 禽肺病毒是單股、非-片斷的RNA病毒，屬於副黏液病
毒科的肺病毒亞科，間質肺病毒屬（Cavanagh和Barrett, 1988, Virus Res. 11:241-256; Ling等人，1992，J. Gen. Virol. 73: 1709-1715; Yu等人，1992, J· Gen. Virol. 73: 1 355- 1363)。將副黏液病 毒科分成兩個亞-科：副黏液病毒亞科和肺病毒亞科。副 黏液病毒亞科包括，.但不限於：副黏液病毒屬、路伯拉病 毒（Rubulavirus)屬和摩比利病毒（Morbillivirus)屬。最近，以 基因順序和序列同種性為基礎，將肺病毒亞科分成兩屬， 即肺病毒和間質肺病毒（Naylor等人，1998, J. Gen. Virol.，79: 1393- 1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159)。肺病毒 屬包括，但不限於人類呼吸道融合細胞病毒（hRSV)、牛呼 吸道融合細胞病毒（bRSV)、羊呼吸道融合細胞病毒和老鼠 肺病毒《間質肺病毒包括，但不限於歐洲禽肺病毒（八和B 亞群），其與肺病毒屬的典型物種hRSV有別（Naylor等人， 1998, J. Gen. Virol., 79:1393- 1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449- 1159)。APV的美國分離株代表在間質肺病毒屬中 的第三·個亞群（C亞群），因為已經發現它在抗原性上和遺 傳上，與歐洲分離株不同（Seal, 1998，Virus Res. 58:45-52; Senne等人，1998，在 proc.第 47次 WPDC, California，第 67-68 頁中）。 負染色APV的電子顯微鏡檢查，顯示多晶的，有時球狀 的病毒粒子，直徑範圍從80至200毫微米，具有長度範圍 從 1000 至 2000 毫微米的長絲（Collins 和 Gough，1998，J. Gen. Vir〇l. 69:909-916)。被膜則由鑲有長度從π至15毫微米之釘 -11 · 1344991 (6) 騙 子的膜構成。殼包核酸是螺旋狀的，直徑為14毫微米，高 度為7毫微米。殼包核酸的直徑比副黏液病毒和摩比利病 毒的更小，後者的直徑通常約為18毫微米。
禽肺病毒感染，在美國是正在發生的疾病，不管在家禽 中，它的全世界發生已持續數年。在1996年5月，在科羅 拉多州出現火雞的高度傳染性呼吸道疾病，接著在Ames, Iowa 的國家獸醫服務實驗室（National Veterinary Services Laboratory(NVSL))中分離出 APV( Senne 等人，1997，Proc.第 134次Ann. Mtg.，AVMA，第190頁）。在此之前，已經認為美 國和加拿大是沒有禽肺病毒的（Pearson等人，1993，在Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control,第 78-83 頁中； Hecker和 Myers，1993，Vet. Rec. 132:172)。在 1997年早期，在 明尼蘇達州，以血清學之方式在火雞中檢測到APV。在那 時’進行第一次證明診斷’而APV感染亦已經散播至許多 農場。該疾病與上呼吸道疾病之臨床症狀有關，包括：多 泡沐的·眼睛、鼻分泌物和竇腫服。藉由二次感染使其惑 化。在被感染鳥類中的發病率可[ij達1〇〇%β死亡率範圍 則可從1至9 0 %，而最高的是在6至12週齡的禽類。 禽肺病毒疋藉奢接觸傳播。鼻分泌物、被感染鳥類的移 動、被污染的水、被污染的環境、被污染的飼料卡車和裝 入-倒出的活動’都有助於病毒的散播。認為恢復的火雞 是帶原者。因為顯示病毒感染產卵火雞的輸卵管上皮，並 因為已經在小烏中檢測到APV ’亦認為可經卵傳播。 -12- 1344991
⑺ 2.2.PIV 感染 副流感病毒的感染，在嬰幼兒和兒童導致嚴重的呼吸道 疾病（Tao等人，1999, Vaccine 17: 1100-08)。傳染性副流感病 毒的感染，佔全世界所有因為呼吸道感染而住院之小兒科 患者的大約20%。同上。
PIV是副黏液病毒科之呼吸道病毒（respirovirus)(PIVl、 PIV3)或路伯拉病毒（PIV2、PIV4)屬的成員。PIV由兩個結構 功能域（module)構成：（1)内部的核糖核蛋白核心或殼包核 酸，含有病毒的.基因組，和（2)外部粗略為球狀的脂蛋白 被膜。其基因组由單股的反義RNA所組成，長度約為15,456 個核苷酸，編碼至少8個多肽。這些蛋白質包括，但不限 於殼包核酸的結構蛋白質（視屬而為NP、NC或N)、磷蛋白 (P)、基質蛋白質（M)、融合糖蛋白（F)、血球凝集素-神經 胺糖酸荅酶糖蛋白（HN)、大聚合酶蛋白質（L)，以及未知 功能的C和D蛋白質。同上。
副流感殼包核酸蛋白質（NP、NC或N)，在每個蛋白質單 元内，由兩個功能部位组成，包括胺基-終端之功能部位， 其包括大約分子的三分之二，並直接與RNA產生交互作 用，以及羧基-終端功能部位，其位在裝配好之殼包核酸 的表面上。認為在這兩個功能部位的接合處存有絞鏈，藉 此給與該蛋白質一些彈性（參見Fields等人（編輯），1991， FUNDAMENTAL VIROLOGY,第 2版，Raven Press，New York,將 其全文以引用的方式併入本文中）。基質蛋白質（M)顯然涉 及病毒的裝配，且其與病毒膜和殼包核酸蛋白質兩者產生 -13 - 1344991
(δ)
交互作用。磷蛋白（ρ)經歷磷酸化作用，認為其在轉綠作 用中扮演調節的角色’亦可能甲基化作用、磷酸化作用和 聚腺苷酸化作用。融合糖蛋白（F)與病毒膜產生交互作 用，並首先以無活性前驅物之形式產生，然後在轉譯之後 被切開’產生兩個二硫連接的多肽。有活性的F蛋白質亦 涉及藉著促使病毒被膜與宿主細胞漿膜融合，而使副流感 病毒粒子貫穿進入宿主細胞内的作用。同上。糖蛋白，血 球凝集素-神經胺糖酸苷酶（ΗΝ)從被膜中伸出，並容許病 毒含有血球凝集，素和神經胺糖酸苷酶活性兩者。ΗΝ在其 胺基終端是強忌水性的，其功能為將ΗΝ蛋白質固定在脂 雙層内。同上。最後，大聚合酶蛋白質（L)在轉錄和複製 作用兩者中，扮演重要的角色。同上。 2.3.RSV 感染
呼吸道融合細胞病毒（RSV)，在嬰幼兒和兒童中，是嚴 重下呼吸道疾病的主因（Feigen等人，編輯，1987，在： Textbook of Pediatric Infectious Diseases, WB Saunders, Philadelphia 弟 1653- 1675 頁中；New Vaccine Development, Establishing Priorities,第 1 冊，1985，National Academy Press, Washington DC 在第 397-409頁中；以及 Ruuskanen等人，1993, Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79)。每年RSV感染的流行性質顯然 是世界性的，但RSV疾病在特定季節的發生率和嚴重性， 隨著區域而有所改變（Hall, 1993，Contemp. Pediatr. 10:92-110)。在北半球的溫帶地區，它通常開始於晚秋，並結束 於晚春。主要的RSV感染最常發生在6週至2歲大的兒童， -14- 1344991
(9)
較不常出現在生命的前4週’在病院流行期間（Hall等人， 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396)。有增加感染 RSV之危險 的兒童，包括但不限於足月前（preterm)嬰兒（Hall等人，1979, New Engl. J. Med. 300:393-396)，以及患有支氣管肺臟發育不 良（Groothuis等人，1988，Pediatrics 82: 199-203)、先天性心臟 病（MacDonald等人，New Engl. J. Med. 307:397-400)、先天或後 天免疫缺陷（Ogra等人，1988, Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249; 和 Pohl等人，1992, J. Infect. Dis. 165: 166- 169)，和胰囊性纖維 變性（Abman等人，1988, J. Pediatr. 113:826-830)的兒童。在患 有心臟和肺臟疾病並因為RSV感染而住院的婴幼兒中，死 亡率為 3%-4%(Navas等人，1992, J. Pediatr. 121:348-354) »
RSV感染成人和嬰幼兒與兒童。在健康的成人中，RSV 主要引起上呼吸道疾病》最近，顯然有些成人，尤其是老 年人’罹患有症狀之RSV感染比先前報告的更頻繁（Evans， A.S.編輯，1989，Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control，第 3版，Plenum Medical Book，New York 在第 525-544 頁）°亦已經在療養院患者和住院的青少人中，報告了數 個"丨。行病（Falsey，A.R,，1991，Infect. Control Hosp. Epidemiol· 12:602-608;和 Garvie等人，mso, Br. Med. J. 281: 1253- 1254)。 最後’ RSV可能在免疫抑制的人中，引起嚴重的疾病，特 別是骨髓移植的患者（Hertz等人，1989，Medicine 68:269-281) » 已確互之RSV疾病的治療選擇是有限的。下呼吸道的嚴 重RSV疾病，經常需要相當大的支持照顧，包括投予濕潤 -15- 1344991 (10) 的氧氣和呼吸協助（Fields等人，編輯，199〇，Fields Virology， 第 2版，第 1 冊，Raven Press, New York 第 1045- 1072 頁）。
雖然疫苗可能預防RSV感染，及/或與RSV有關的疾病， 但對於遠適應症’尚未有獲传s中可的疫苗。疫苗發展的主 要障礙是安全性。以福馬林-失活的疫苗，雖具有免疫原 性，但在經過免疫的嬰幼兒中，意外地引起比在以類似方 式製備之三價副流感疫苗免疫的嬰幼兒中，更高和更嚴重 的由於RSV引起之下呼吸道疾病的發生率（Kim等人，1969, Am. J. Epidemiol. 89:422-434;以及 Kapikian等人，1969，Am. J· Epidemiol. 89:405-421)。已經放棄數個候選的RSV疫苗，而 其他的正在發展中（Murphy等人，1994, Virus Res. 32: 13-36)， 但即使解決了安全性的問題，亦必須改善疫苗效力。許多 問題尚待解決。在新生兒時期，立刻需要免疫接種，因為 下呼吸道疾病的高峰發生率，出現在2-5個月大時。可預 期新生兒不成熟的免疫反應，連同高力價的獲自母體之 RSV抗體，將在新生兒時期降低疫苗的免疫原性（Murphy 等人，1988，J. Virol. 62:3907-3910;和 Murphy等人，1991， Vaccine 9: 185- 189)。最後，初次的RSV感染和疾病，不能完 全保護對抗後續的RSV疾病（Henderson等人，1979，New Engl. J. Med. 300: 530-534)。 目前，唯一批准的預防RSV疾病之方法，是被動免疫》 最初的證據暗示IgG的保護角色，獲自在雪貂（Prince, G.A.， Ph.D. diss·，University of California, Los Angeles，1975)和人類中 (Lambrecht等人，1976, J. Infect. Dis. 134:211-217;和 Glezen等 -16· 1344991 ⑼
人，1981，J. Pediatr. 98:708-715)，涉及母體抗體的觀察。 Hemming 等人（Morell 等人，編輯，1986，Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins, Academic Press, London 在第 285-294頁），在涉及在懷疑患有新生兒敗血症之新生兒 中，靜脈内免疫球蛋白（IVIG)之藥物動力學的研究期間， 承認RSV抗體在治療或預防RSV感染上可能的利用性。在 該研究中，注意到一個嬰兒，它的呼吸分泌物產生RSV， 在IVIG輸液後迅速恢復。後續大批的IVIG分析，顯示不尋 常高力價的RSV中和抗體。然後，同一組研究員檢查高度 免疫血清或免疫球蛋白，增強RSV中和抗體、保護棉鼠和 靈長類對抗RSV感染的能力（Prince等人，1985，Virus Res. 3:193-206; Prince等人，1990，J. Virol·.64:3091-3092; Hemming等 人，1985，J. Infect. Dis. 152: 1083- 1087; Prince等人，1983，Infect· Immun. 42:8 1- 87;和 Prince等人，1985, J. Virol. 55:517-520)。這 些研究的結果表示，除了治療或預防與RSV有關的病症之 外，亦可使用IVIG預防RSV感染。 目前的臨床研究已經證實，該被動投予之RSV高度免疫 球蛋白（RSV IVIG)，保護在危險下之兒童，免於由RSV引 起之嚴重下呼吸道感染的能力（Groothius等人，1993，New Engl. J. Med. 329:1 524- 1530;和 The PREVENT Study Group，1997, Pediatrics 99:93-99)。這是在預防RSV感染上的主要進步， 該處理在其廣泛的用途中，提出某些限制。第一，RSV IVIG 必須在數小時内以靜脈内輸液，達到有效的劑量。其次， 在高度免疫球蛋白中活性物質的濃度，不足以治療在危險 -17- 1344991 (12) mmmm 下的成人，或大多數患有心肺功能不全的兒童。第三，靜 脈内輸液必須在RSV季節每個月到醫院就診。最後，可能 證明不易選擇充分的捐贈者產生rSv的高度免疫球蛋 白，而遭遇該產物的需求。目前，僅有大約8%的正常捐 贈者具有高得足以有資格產製高度免疫球蛋白的RSV中 和抗體力價。
一種改善免疫球蛋白之比活性的方法，將發展出一或多 個高潛力的RSV中和單株抗體（MAbsp這類MAb^該是人 類或人類化的’以便保留有利的藥物動力學，並避免產生 人類抗-老鼠的抗體反應，因為在整個RSV季節中將需要重 覆給藥。已經顯示.在RSV之表面上兩個糖蛋白f和G，是中 和抗體的標靶（Fields等人，1990，在前；以及Murphy等人 1994，在前）。
批准針對在RSV之F蛋白質的A抗原位置中之抗原決定 位的人類化抗體’ SYNAGIS®在整個RSV季節中（在北半球 是從11月至4月），以1 5毫克/公斤體重的建議每月劑量，肌 肉内投予小兒科患者，用來預防RSV引起的嚴重呼吸道疾 病。SYNGIS®人類（95%)和老鼠（5%)抗體序列的混合物。參 見 Johnson等人，1997，J. Infect. Diseases 176:1215-1224和美國 專利第5,824,307號，將其完整内容以引用的方式併入本文 中。人類重鏈序列係衍生自人類IgG的恆定功能部位，以 及 Cor(Press 等人，1970，Biochem. J. 117:641-660)和 Cess (Takashi等人，1984, Proc. Natl· Acad. Sci· USA 81:194- 198)的 VH 基因之可變架構區。人類輕鏈序列係衍生自Ce之恆定功能 -18 - 1344991
(13) 部位，以及帶有Je-4之VL基因K104的可變架構區（Bentley等 人，1980, Nature 288:5194-5 198)。老鼠序列係衍生自老鼠單 株抗體，Mabll29(Beeler 等人，1989， J. Virology 63:2941-2950) ’以涉及將老鼠互補性決定區移植人類抗體 架構内的方法。 大部分的人類啤吸道疾病是由病毒亞科副黏液病毒亞 科和肺病毒亞科引起的。在本文中第一次描述感染人類的 其他哺乳動物肺病毒亞科的身份。 不應將在本文中引述或討論的參考文獻解釋為承認這 類參考文獻為本發明之先前技藝。 3.發明内容 本發明係關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，在副 黏液病毒科之肺病毒亞科中的肺間質肺病毒（MPV)。本發 明亦關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，並可在系統 發生上’確認與間質肺病毒屬及其組份相符或有關。特定 而言’本發明係關於哺乳動物MPV，在系統發生上，其與 以1-261.4之名存放在cnCM，Paris之病毒分離株的關係，比 其與C型APV的關係更密切^在更特定的具體實施例中， 哺乳動物MPV可以是哺乳動物MPV的變種Al、A2、B1或 Β2。然而’本發明之哺乳動物Μρν可包括尚待確認的額外 變種’且不限於變種Ai、Α2或Β1或Β2。 本發明係關於哺乳動物間質肺病毒之不同分離株的基 因組核菩酸序列，特別是人類間質肺病毒。本發明係關於 將哺乳動物間質肺病毒之不同分離株的序列資訊，用在診 -19- 1344991 (14) 斷和治療的方法上。本發明係關於在不同間質肺病毒-分 離株中的基因組核：y：酸序列之差異，以及其在本發明之診 斷和治療方法上的用途。在特定的具體實施例中，可使用 編碼 N、Μ、F、L、P、M2-1、M2-2、SH或 G ORFs的哺乳動 物MPV之核苷酸序列，來確認本發明之病毒。在另一個特 定的具體實施例中，可使用編碼N、Μ、F、L、P、M2-1、 M2-2、SH或G ORFs的哺乳動物MPV之核甞酸序列，將哺乳 動物MPV歸類為變種Al、A2、B1或B2，在特定的具體實施 例中，本發明係關於為了診斷目的，在不同的間質肺病毒 分離株中，使用單一核苷酸多形性（SNPs) β 本發明係關於衍生自哺乳動物MPV或禽肺病毒（Αρν)的 重組或嵌合型病毒。根據本發明，重組的病毒是衍生自哺 乳動物MPV或APV的病毒，其由内源或天然基因組序列， 或非-天然之基因組序列編碼。根據本發明，非-天然序列 是因為一或多個突變，包括但不限於點突變、重排、插入、 J除等等，而與天然或内源的基因組序列不同的序列，對 基因組.序列而言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。 根據本發日月’本發明之嵌合型病毒是重組的Μ”或A”， ^更包括異源的核：y：酸序列。根據本發明，該歲合型病毒 可由其中已經將異源核甞酸序列加至基因組内的核苷酸 序列’或其中已經利用異源核-酸序列置换内源或天然核 :甘、序列的核答酸序列編碼。在某些具體實施例中，本發 明〈嵌合型病毒係衍生自MPV或APV，其中藉著得自間質 肺病毒之其他品系的同種0RF ’ i換—或多個0RFS。在代 -20- 1344991
〇5) 表性的具體實施例中，藉著APV之F基因的ORF置換哺乳動 物MPV之F基因的ORF。在某些其他的具體實施例中，本發 明之嵌合型病毒係衍生自APV，其中藉著哺乳動物MPV的 同種ORF置換一或多個ORFs。
本發明係關於編碼間質肺病毒（包括哺乳動物和禽品系） 之基因組的核荅酸序列，或其一部分。本發明係關於編碼 間質肺病毒之基因產物的核#酸序列。特定而言，本發.明 係關於，但不限於編碼MPV之F蛋白質、G蛋白質、Μ蛋白 質、SH蛋白質、Ν蛋白質、Ρ蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質 的核苷酸序列。本發明特別關於編碼哺乳動物MPV之變種 的F蛋白質、G蛋白質、Μ蛋白質、SH蛋白質、Ν蛋白質' Ρ 蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質的核甞酸序列，像是但不限 於MPV的變種Al、Α2、Β1或Β2。本發明進一步更關於編碼 間質肺病毒之基因組或其一部分的cDNA或RNA，包括哺乳 動物和禽間質肺病毒，除了對該病毒基因組而言為異源或 非-天然的核钻酸序列之外。本發明更包括由該cDNA或 RNA編碼之嵌合型或重組的病毒。 本發明進一步更關於哺乳動物MPV和哺乳動物MPV之不 同變種的F蛋白質、G蛋白質、Μ蛋白質、SH蛋白質、N蛋 白質、Ρ蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質之多肽和胺基酸序 列。本發明進一步更關於對抗哺乳動物MPV和哺乳動物 MPV之不同變種的F蛋白質、G蛋白質、Μ蛋白質、SH蛋白 質、Ν蛋白質、Ρ蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質的抗體。該 抗體可用於診斷和治療方法。在某些較特定的具體實施例 -21 - 1344991 (16) 中，該抗體對哺乳動物MPV是專一的。在某些具體實施例 中，該抗體對哺乳動物MPV之變種是專一的。本發明進一 步更關於包括一或多個下列蛋白質的疫苗調配物和免疫 原組合物：哺乳動物MPV之F蛋白質、G蛋白質、Μ蛋白質、 SH蛋白質、Ν蛋白質、Ρ蛋白質、M2蛋白質，及/或L蛋白 質。
本發明進一步更關於包括哺乳動物或禽間質肺病毒的 疫苗調配物和免疫原組合物，包括該病毒之重組和嵌合形 式。特定而言，本發明包括疫苗製品，其包括MPV及/或 APV之重組或嵌合形式。本發明進一步更關於包括嵌合型 MPV的疫苗，其中該嵌合型MPV編碼一或多個APV蛋白 質，且其中該嵌合型MPV可視需要額外地表現一或多個異 源或非-天然的序列。本發明亦關於包括嵌合型APV的疫 苗，其中該嵌合型APV編碼一或多個hMPV蛋白質，且其中 該嵌合型APV可視需要額外地表現一或多個異源或非-天 然的序列。本發明亦關於多價疫苗’包括二價和三價疫 苗。特定而言，本發明之多價疫苗包括二或多個由相同或 不同肺病毒載體表現的抗原性多肽》多價疫苗之抗原性多 肽，包括但不限於MPV、APV、PIV、RSV、流感或其他負 股RNA病毒、摩比利病毒的抗原性多肽。 本發明進一步更關於在個體中治療呼吸道感染的方 法。在某些具體實施例中，本發明係關於藉著對該個體投 予包括哺乳動物MPV的疫苗調配物，在個體中治療呼吸道 感染。在特定的具體實施例中，在個體中治療呼吸道感染 -22- 1344991
的方法，包括對該個體投予包括重組或嵌合型哺乳動物 MPV或APV的疫苗調配物或免疫原組合物。在更特定的具 體實施例中，該重組或嵌合型哺乳動物MPV是經過減毒 的。在特定的具體實施例中，本發明係關於在人類患者中 治療呼吸道感染，包括對該人類患者投予包括重組或嵌合 型APV，或編碼APV之F蛋白質、G蛋白質、Μ蛋白質、SH 蛋白質、Ν蛋白質、Ρ蛋白質、M2蛋白質或L蛋白質之核站 酸序列的疫苗調配物。 [一旦完成申請專利範圍，可能擴充本章節] 3.1.慣例和縮寫
cDNA 互補 DNA L 大蛋白質 Μ 基質蛋白質（被膜的線内） F 融合糖蛋白 ΗΝ 血球凝集素-神經胺糖酸甞酶糖蛋白
Ν ' ΝΡ或NC 核蛋白（與RNA有關，並為聚合酶活性所必 需的） Ρ 磷蛋白 ΜΟΙ 傳染的多重性 ΝΑ 神經胺糖酸苷酶（被膜糖蛋白） ΡΙV 副流感病毒 hPIV 人類副流感病毒 hPIV3 人類副流感病毒第3型
APV/hMPV 帶有hMPV序列的重組APV -23 - 1344991 (18)
hMPV/APV 帶有APV序歹|J的重組hMPV 哺乳動物MPV哺乳動物間質肺病毒 nt 核益酸 RNP 核糖核蛋白
rRNP 重组的RNP
vRNA 基因組病毒RNA cRNA 反 基 因 組 的 病 hMPV 人 類 間 質 肺 病 APV 禽 肺 病 毒 MVA 經 過 修 改 的 疫 FACS 螢 光 激 活 之 細 CPE 致 細 胞 病 變 作 位 置1 欲 轉 綠 之 病 毒 位 置2 在 天 蚨 病 毒 基 閱 架 構 之 間 的 基 因 組 的 第 二 位 置3 · 在 天 蚨 *»»、 病 毒 基 閱 架 構 之 間 的 基 因 組 的 第 三 位 置4 在 天 蚨 病 毒 基 閱 架 構 之 間 的 基 因 組 的 第 四 位 置5 在 天 蚨 * ' » > 病 毒 基 閱 架 構 之 間 的 毒RNA 毒 苗病毒安卡拉（Ankara) 胞分類器 用 基因組的弟一個基因位置 因組之第一和第二個開放編 位置，或者是欲轉錄之病毒 個基因位置。 因組之第二和第三個開放編 位置，或者是欲轉錄之病毒 個基因位置。 因組之第三和第四個開放編 位置，或者是欲轉錄之病毒 個基因位置。 因组之第四和第五個開放編 位置，或者是欲轉錄之病毒
-24- 1344991
(19) 基因組的第五個基因位置。 位置6 在天然病毒基因組之第五和第六個開放編 閱架構之間的位置，或者是欲轉錄之病毒 基因組的第六個基因位置。 4.實施方式
本發明係關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，在副 黏液病毒科之肺病毒亞科中的間質肺病毒（MPV)及其變 種。本發明亦關於經過分離的哺乳動物負股RNA病毒，可 在系統發生上，確認其與間質肺病毒屬及其組份相符或有 關。本發明之哺乳動物MPV，可以是哺乳動物MPV的變種 A1、A2、B1或B2。然而，本發明之哺乳動物MPV可包括 尚未確認的MPV之額外變種，並不限於變種A 1、A2、B 1 或B2。
本發明係關於哺乳動物間質肺病毒（MPV)之分離株的不 同變種的基因組核苷酸序列，特別是人類間質肺病毒，包 括變種Al、A2、B 1和B2的分離株。本發明係關於將哺乳動 物間質·肺病毒之不同分離株的序列資訊，用在診斷和治療 的方法上。本發明係關於在不同間質肺病毒-分離株中， 基因組核苷酸序列的差異，及其在本發明之診斷和治療方 法中的用途。特定而言，本發明係關於在診斷和治療方法 中，使用在不同間質肺病毒分離株中的單一核苷酸多形現 象（SNPs)。本發明亦關於在診斷和治療方法中，單獨或與 不同分離株的序列資訊一起，使用哺乳動物間質肺病毒之 不同分離株的血清學特徵。 -25 - 1344991
(20)
本發明係關於編碼間質肺病毒或其一部分之基因組的 核苷酸序列，包括哺乳動物和禽類的間質肺病毒（APV)兩 者。本發明係關於編碼間質肺病毒之基因產物的核苷酸序 列，包括哺乳動物和禽類的間質肺病毒兩者。本發明進一 步更關於核酸，包括DNA與RNA，其編碼間質肺病毒之基 因組或其一部分，包括哺乳動物和禽類兩者的，除了對該 病毒基因組而言，為異源或非-天然的核苷酸序列。本發 明進一步更包括由該核茹酸序列編碼的重組或嵌合型病 毒。
根據本發明，重组的病毒是衍生自哺乳動物MPV或APV 的病毒，其由内源或天然基因組序列，或非-天然之基因 組序列編碼。根據本發明，非-天然序列是因為一或多個 突變，包括但不限於點突變、重排、插入、刪除等等，而 與天然或内源的基因组序列不同的序列，對基因組序列而 言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。根據本發明， 嵌合型病毒是重組的mpv或apv，其更包括異源的核：y：酸 序列。根據本發明，該嵌合型病毒可由其中已經將異源核 苷酸序列加至基因組内的核甞酸序列，或其中已經利用異 源核荅酸序列置換内源或天然核苷酸序列的核：y：酸序列 編碼。 本發明進一步更關於包括哺乳動物或禽間質肺病毒之 疫苗調配物，包括該病毒之重組形式。特定而言，本發明 包括疫苗製品，其包括MPV或APV之重组或嵌合形式，其 表現抗原糖蛋白，包括MPV或APV之糖蛋白，及/或非-天 -26- 1344991
(21)
然的MPV或APV糖蛋白。本發明亦包括疫苗製品，其包括 MPV或APV之重组形式，其編碼其他負股RNA病毒的抗原 序列，包括PIV或RSV，或間質肺病毒之其他物種或品系的 異源糖蛋白。本發明進一步更關於包括嵌合型hMPV的疫 苗，其中該嵌合型hiMPV編碼一或多個APV蛋白質，且其中 該嵌合型hMPV可視需要額外地表現一或多個異源或非-天然的序列。本發明亦關於包括嵌合型APV的疫苗，其中 該嵌合型APV編碼一或多個hMPV蛋白質，且其中該嵌合型 APV可視需要額外地表現一或多個異源或非-天然的序 列。本發明亦關於多價疫苗，包括二價和三價疫苗。特定 而1"，本發明之二價和三價疫苗，包括二或多個由相同或 不同肺病毒載體編碼的抗原多肽，其編碼MPV、APV、PIV、 RSV、流感或其他負股RNA病毒，或摩比利病毒的抗原蛋 白質》
4.1.哺乳動物間質肺病毒 哺乳動物間質肺病毒的結構特徵 本發明提供哺乳動物MPV。哺乳動物MPV是反義單股的 RNA病毒，屬於副黏液病毒科的肺病毒亞科。此外，可在 系統發生上，確認哺乳動物MPV與間質肺病毒屬相符，其 中該哺乳動物MPV，在系統發生上與以1-2614之名存放在 CNCM，Paris之病毒分離株（序列識別19號[00-1的基因組序 列])的關係，比其與火雞鼻氣管炎病毒的關係更密切，後 者為禽鼻氣管炎的致病原。可藉著例如獲得病毒之核酸序 列資訊，並在系統發生分析上進行測試，在系統發生上， -27- 1344991 (22)
確認該病毒與間質肺病毒屬相符。可使用熟諳此藝者已知 的任何技術，判定在病毒品系之間的系統發生關係。關於 代表性的方法，參見4.7.15節。在以W0 02/057302發表之國 際專利申請案PCT/NL02/00040中，揭示了其他技術，全部 以引用的方式併入本文中。特定而言，PCT/NL02/00040在 第12頁第27行至第19頁第29行中，揭示了適用於系統發生 分析的核酸序列。可以序列類似性為基礎，按照在下文中 更詳細的說明，進一步確認該病毒為哺乳動物MPV。
除了在本文中·揭示之病毒對哺乳動物MPV的系統發生 關係和序列類似性之外，亦可使用在本文中揭示的病毒之 基因組組織化對哺乳動物MPV之基因組組織化的類似 性，來確認該病毒為哺乳動物MPV。關於代表性的哺乳動 物MPV之基因組組織化，參見圖27。在某些具體實施例 中，哺乳動物MPV之基因組組織化，與在副黏液病毒科之 肺病毒亞科中之肺病毒的基因組組織化有所不同。間質肺 病毒屬和肺病毒屬兩者的分類1主要是以其基因構象為基 礎；間質肺病毒通常缺乏諸如NS1或NS2之類的非-結構蛋 白質亦參見 Randhawa等人，1997，J. Virol. 71:9849-9854)，且 基因順序與肺病毒的不同（RSV:I3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5,，APVi'S-N-P-M-F-Nn-SH-G-L-S'KLung等人，1992, J· Gen. Virol. 73:1709- 1715; Yu等人，1992, Virology 186:426-434; Randhawa等人，1997, J. Virol. 71:9849-9854)。 此外，可藉著其免疫學特性，來確認本發明的哺乳動物 MPV。在某些具體實施例中，可對抗哺乳動物MPV而升高 -28 - 1344991
(23) 的專一抗-血清，可中和哺乳動物MPV。可對抗MPV而升高 的單株和多株抗體，亦可中和哺乳動物MPV。
進一步藉著其感染哺乳動物宿主，即哺乳動物之培養細 胞或哺乳動物的能力，定出本發明之哺乳動物MPV的特 徵。不像APV，哺乳動物MPV不能在雞或火雞中複製，或 僅能以低程度複製。然而，哺乳動物MPV在諸如獼猴之類 的哺乳動物宿主中複製。在某些較特定的具體實施例中， 進一步藉著其在哺乳動物宿主中複製的能力，定出該哺乳 動物MPV的特徵。在某些更特定的具體實施例中，進一步 藉著其引起哺乳動物宿主表現由該哺乳動物MPV之基因 組編碼之蛋白質的能力，定出該哺乳動物iMPV的特徵。在 更特定的具體實施例中，將由該哺乳動物MPV表現的病毒 蛋白質，插入哺乳動物宿主的細胞質膜内》在某些具體實 施例中，本發明之哺乳動物MPV可感染哺乳動物宿主，並 引起該哺乳動物宿主產生該哺乳動物MPV之新的有傳染 性的病毒顆粒。關於本發明之哺乳動物MPV之功能特徵更 詳細的·說明，參見4.1.2節。 在某些具體實施例中，可使用病毒在電子顯微鏡中的外 觀，或其對氯仿的敏感性，確認該病毒為哺乳動物MPV。 本發明之哺乳動物MPV，在電子顯微靜下看來像副黏液病 毒的顆粒。哺乳動物MPV，不變地對利用氣仿處理是敏感 的；哺乳動物MPV最適合在tMK細胞，或在功能上與其相 當的細胞中培養，且它在大多數的細胞培養中，基本上是 色胺酸-依賴性的。此外，哺乳動物Μ P V具有典型的致細 -29- 1344991 (24) 胞病變作用（CPE)，並對紅血球細胞之物種，缺乏血球凝 集活性。由MPV分離株誘發的cpe，類似由hRSV誘發的 CPE，其特徵在於形成融合細胞，接著細胞快速從内部瓦 解’然後從培養盤中脫離。雖然大多數的副黏液病毒具有 血球凝集活性，但大多數的肺病毒沒有（Pringle，C.R. 在：The Paramyxoviruses 中（編輯 DW Kingsbury) uypienum Press, New York, 1991))。哺乳動物mpv在編碼M2蛋白質的核
酸片段中，含有第二個重疊的〇RF(M2_2)。該第二個重疊 ORF的發生’出現在其他肺病毒中’如同在Ahmadian等人， 1999, J. Gen. Vir. 80:2011-2016中所示。
在某些具體實施例中，本發明提供確認病毒分離株為哺 乳動物MPV的方法。可從例如動物或人類中，獲得測試試 樣。然後針對肺病毒亞科之病毒的存在，來測試該試樣。 若出現肺病毒亞科的病毒’便可針對在本文中討論的哺乳 動物MPV之任何特徵’測試該病毒，像是但不限於與哺乳 動物MPV的系統發生關係、對哺乳動物MPV之核荅酸序列 的核芬酸序列同一性、對哺乳動物MPV之胺基酸序列的胺 基酸序列同一性/同種性’以及基因組組織化。此外，可 藉著使用得自MPV分離株之核酸序列的交叉-雜交實驗， 使用對哺乳動物MPV專一之引子的rt-PCR，或以使用針對 哺乳動物MPV分離株之抗體的典型交叉-血清學實驗，確 認該病毒為哺乳動物MPV。在某些其他的具體實施例中， 可利用其藉著與動物抗血清之定量中和作用判定的免疫 學辨別性為基礎，來確認哺乳動物MPV。該抗血清可獲自 -30- 1344991
(25) 例如以哺乳動物MPV感染的雪貂、豬或獼猴（參見，例如 實例8)。
在某些具體實施例中，血清型不與哺乳動物MPV以外的 病毒產生交又-反應。在其他的具體實施例中，血清型在 兩種方向中，顯示同種-對-異種力價比例〉16。若中和作 用顯示在任一或兩種方向中，在兩種病毒之間有若干程度 的交叉-反應（8或16的同種-對-異種力價比例），便評估血 清學的辨別性，是否出現DNA序列的實質生理/生化差 異。若中和作用顯示在任一或兩種方向中，在兩種病毒之 間有不同程度交叉-反應（小於8的同種-對·異種力價比 例），便評估正在研究中之分離株的血清學同一性。可使 用分離株1-2614，在本文中亦稱為MPV分離株00-1作為原 型 。
在某些具體實施例中，可將在本文中揭示之病毒分離株 的胺基酸或核苷酸序列，與序列或存放物相比較，藉著病 毒蛋白質或核酸的序列同種性/同一性，來確認病毒為哺 乳動物MPV。特定而言，當病毒之基因組所含有的核酸序 列，對以1-2614之名存放在CNCM，Paris的病毒分離株所具 有之核酸同一性百分比，比在本文中對編碼L蛋白質、Μ 蛋白質、Ν蛋白質、Ρ蛋白質或F蛋白質之核酸所確認的百 分比更高時，便確認該病毒是哺乳動物MPV，如同在下文 中，與APV-C相比較所確認的（參見表1)。並未與理論結 合，通常已知病毒物種，尤其是RN Α病毒物種，經常構成 準-物種，其中一群病毒的成員，展現出序列異源性。因 31 - 1344991
(26) 此，預期每個個別的分離株，當與APV-C相比較時，可能 多少都具有不同的序列百分比。
迄今，在MPV蛋#白質與同科之任何已知的其他病毒之 間，最高的胺基酸序列同一性是在APV-C和人類MPV之間 的同一性。在人類MPV和APV-C之間，當比較在圖30中提 供的序列時，可推衍出基質蛋白質的胺基酸序列同一性是 87%，核蛋白為88°/。，磷蛋白為68%，融合蛋白質為81%， 且一部分聚合酶蛋白質為56-64%，亦可參見表1。認為含 有編碼具較高同種性、可與這些最大值相比擬之蛋白質的 ORFs的病毒分離株，是哺乳動物MPV。應瞭解，與其他病 毒類似，可在哺乳動物MPVs的不同分離株之間，找到某 種程度的改變。
表1 :在MPV之ORFs與其他副黏液病毒的那些之間的胺基 酸序列同一性 N P M F M2-1 M2-2 L APV A 69 55 78 67 72 26 64 APVB 69 51 76 67 71 27 -2 APVC 88 68 87 81 84 56 -2 hRSVA 42 24 38 34 36 18 42 hRSVB 41 23 37 33 35 19 44 bRSV 42 22 38 34 35 13 44 PVM 45 26 37 39 35 12 -2 其他3 7-11 4-9 7-10 10-18 -4 -4 13-14 註腳： -32- 1344991 (27) L與已知的G和SH蛋白質，沒有發現任何序列同種性’並 因此排除。 2·無可利用之序列》 3 ·其他：人類副流感病毒第2和3型’仙堂病毒、麻療病毒 百立（nipah)病毒、佛赛熱病（phocine distemper)病毒和新 城雞痕病毒。 4·在病毒基因組中缺乏〇RF。 在某些具體實施例中’本發明提供哺乳動物MPV ’其中 該哺乳動物MPV之N蛋白質的胺基酸序列’對序列識別366 號00-1之N蛋白質的胺基酸序列’是至少90%、至少95%或 至少9 8 %相同的。包括在胺基酸序列上，對序列識別3 6 6 號00-1之N蛋白質為至少90%相同的N蛋白質之經過分離的 反義單股RNA間質肺病毒，能夠感染哺乳動物宿主。在某 些具體實施例中，包括在胺基酸序列上’對序列識別366 號00-1之N蛋白質為至少90〇/〇相同的N蛋白質之經過分離的 反義單股RNA間質肺病毒’能夠在哺乳動物宿主中複製。 以N蛋白質的整個長度’來計算胺基酸同一性。在某些具 體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列識別366號00-1 之Ν蛋白質的胺基酸序列，至少90%、至少95%，或至少98°/〇 相同之Ν蛋白質的核苷酸序列。 本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之ρ 蛋白質的胺基酸序列’對序列識別3 7 4號〇 〇 -1之P蛋白吳的 胺基酸序列，是至少70%、至少80%、至少90%、至少95% 或至少98%相同的。包括在胺基酸序列上’對序列識別374 1344991 (28) 號00-1之P蛋白質為至少70%相同的P蛋白質之哺乳動物 MPV，能夠感染哺乳動物宿主。在某些具體實施例中，包 括在胺基酸序列上，對序列識別374號00-1之P蛋白質為至 少70%相同的P蛋白質之哺乳動物MPV，能夠在哺乳動物宿 主中複製。以P蛋白質的整個長度，來計算胺基酸同一性。 在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列識別 374號00-1之P蛋白質的胺基酸序列，至少70%、至少80%、 至少90%、至少95%，或至少98%相同之P蛋白質的核苷酸 序列。 本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之Μ 蛋白質的胺基酸序列，對序列識別358號00-1之Μ蛋白質的 胺基酸序列，是至少90%、至少95%或至少98%相同的。包 括在胺基酸序列上，對序列識別358號00-1之Μ蛋白質為至 少90%相同的Μ蛋白質之哺乳動物MPV，能夠感染哺乳動 物宿主。在某些具體實施例中，包括在胺基酸序列上，對 序列識別358號00-1之Μ蛋白質為至少90%相同的Μ蛋白質 之經過分離的反義單股RN Α間質肺病毒，能夠在哺乳動物 宿主中複製。以Μ蛋白質的整個長度，來計算胺基酸同一 性。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列 識別358號00-1之Μ蛋白質的胺基酸序列，至少90%、至少 95%，或至少98%相同之Μ蛋白質的核甞酸序列。 本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之F 蛋白質的胺基酸序列，對序列識別3 14號00-1之F蛋白質的 胺基酸序列，是至少85%、至少90%、至少95%或至少98% • 34- 1344991
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相同的。包括在胺基酸序列上，對序列識別314號00- 1之F 蛋白質為至少85%相同的F蛋白質之哺乳動物MPV，能夠感 染哺乳動物宿主。在某些具體實施例中，包括在胺基酸序 列上，對序列識別314號00-1之F蛋白質為至少85%相同的F 蛋白質之經過分離的反義單股RN A間質肺病毒，能夠在哺 乳動物宿主中複製。以F蛋白質的整個長度，來計算胺基 酸同一性。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼 對序列識別314號00-1之F蛋白質的胺基酸序列，至少 85%、至少90%、至少95%，或至少98%相同之F蛋白質的核 苷酸序列。
本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之 M2-1蛋白質的胺基酸序列，對序列識別338號00-1之M2-1 蛋白質的胺基酸序列，是至少85%、至少90%、至少95%或 至少98%相同的。包括在胺基酸序列上，對序列識別338 號00-1之M2-1蛋白質為至少85%相同的M2-1蛋白質之哺乳 動物MPV，能夠感染哺乳動物宿主。在某些具體實施例 中，包'括在胺基酸序列上，對序列識別33 8號00-1之M2-1 蛋白質為至少85%相同的M2- 1蛋白質之經過分離的反義 單股RNA間質肺病毒，能夠在哺乳動物宿主中複製。以 M2- 1蛋白質的整個長度，來計算胺基酸同一性。在某些具 體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼對序列識別338號00-1 之M2-1蛋白質的胺基酸序列，至少85%、至少90%、至少 95%，或至少98%相同之M2-1蛋白質的核苷酸序列。 本發明更提供哺乳動物MPV，其中該哺乳動物MPV之
A -35- (30) (30)1344991 M2-2蛋白質的胺基酸序列，對序列識別346號⑽-丨之μ2·2 蛋白質的胺基酸序列，是至少6〇%、至少7〇%、至少8〇%、 至少90%、至少95%或至少98%相同的。包括在胺基酸序列 上，對序列識別346號00-丨之Μ2_2蛋白質為至少6〇%相同的 Μ2-2蛋白質之經過分離的哺乳動物MPV ,能夠感染哺乳動 物宿主。在某些具體實施例中，包括在胺基酸序列上，對 序列識別346號00-1之Μ2-2蛋白質為至少60%相同的Μ2-2蛋 白質之經過分離的反義單股rNΑ間質肺病毒，能夠在哺乳 動物宿主中複製。以M2-2蛋白質的整個長度，來計算胺基 酸同一性。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV含有編碼 對序列識別346號00- 1之M2-2蛋白質的胺基酸序列，至少至 少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95% ’或至少 98%相同之M2-2蛋白質的核荅酸序列。 在某些具體實施例中，本發明提供哺乳動物MPV ’其中 該反義單股RNA間質肺病毒，編碼至少2個蛋白質、至少3 個蛋白質、至少4個蛋白質、至少5個蛋白質，或至少6個 蛋白質，選自由下列所组成之群：（i)與序列識別366號00-1 之N蛋白質，具有至少90%胺基酸序列同一性的N蛋白質； (ii)與序列識別374號00-1之P蛋白質，具有至少70%胺基酸 序列同一性的p蛋白質；（iii)與序列識別358號〇〇-1之Μ蛋白 質，具有至少90%胺基酸序列同一性的Μ蛋白質；（1V)與序 列識別314號00-1之F蛋白質’具有至少85%胺基酸序列同 一性的F蛋白質；（ν)與序列識別338號00-1之M2-1蛋白質’ 具有至少85%胺基酸序列同一性的Μ2-1蛋白質；以及（V1) • 36- 1344991
(31) 與序列識別346號00-1之M2-2蛋白質’具有至少60%胺基酸 序列同一性的M2-2蛋白質。 本發明提供哺乳動物MPV的兩種亞群’A亞群和B亞群。 本發明亦提供四種變種A1、A2、B 1和B2。若其在系統發生 上，與分離株〇〇-1(序列識別19號）的關係比與分離株99-1 (序列識別18號）的更密切’則可確認、該哺乳動物為A 亞群。若其在系統發生上’與分離株9 9 · 1 (序列識別1 8號） 的關係比與分離株〇〇- U序列識別19號）的更密切’則可確 認該哺乳動物MPV為B亞群。在其他的具體實施例中’可 使用個別ORFs的核苷酸或胺基酸序列同種性’分類哺乳動 物MPV屬於A或B亞群。 可將哺乳動物MPV的不同分離株分成四個不同的變 種，變種A1、變種A2、變種B1和變種B2(參見圖21和22)。 分離株00-1(序列識別19號）是哺乳動物MPV之變種A1的實 例。分離株99-1(序列識別18號）是哺乳動物MPV之變種B1 的實例。可使用系統發生分析，將哺乳動物MPV分類在四 個變種·之一中。因此，若其在系統發生上，與某變種之已 知成員的關係比其在系統發生上，與哺乳動物之其他 變種之成員的關係更密切，則該哺乳動物MPV屬於特定的 變種》可使用任何0RF之序列和編碼多肽，定出該 離株是屬於那個特定的亞群或變種，包括n、p、L、M、 SH、G、M2或F多肽。在特定的具體實施例中’將哺乳動 物MPV分類為變種，是以G蛋白質之序列為基礎。未與理 論結合，G蛋白質非常適合埠行系統發生分析，因為在哺 1344991 (32) 乳動物MPV之不同變種中的G蛋白質中，有高度的變化。 在本發明的某些具體實施例中，可藉著兩個序列在某種 條件下雜交的能力，來判定序列同種性，如同下文陳述 的。在本發明方法中，可使用與哺乳動物MPV之核酸’或 與其相反互補物，或與其互補物雜交的核酸，判定其序列 同種性，並確認彼此。在某些具體實施例中，使核酸在高 嚴格度的條件下進行雜交。
雜交條件為熟諳此藝者已熟知的，像是但不限於溫度、 鹽濃度、pH值、甲.驢胺濃度（參見，例如Sambrook等人，1989, 第 9至 11 章，Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第 2版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。在某些具體實施例中，在含水溶液中進行雜交， 並將該溶液之離子濃度維持恆定，而雜交溫度則視在待雜 交之序列之間的序列同種性程度而改變。對DNA序列而 言，彼此是100%相同的，且比200個鹼基對更長，便在比 完美雜交之解鏈溫度（Tm)低大約15至25°C的溫度下進行 雜交。可使用下列的等式計算解鏈溫度（Bolton和McCarthy， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1390(1962)) ·
Tm=81.5 °C -16.6 (l〇gl0[Na+]) + (0/〇G+C)-0.63(% 甲醯胺卜 (600/1) 其中（Tin)為解鏈溫度，[Na+]是納濃度，G+C是鳥嗓呤和 胞嘧啶内含量，而1是以鹼基對計之雜化物的長度。可使 用 Bonner等人（Bonner等人，1973, J. Mol· Biol· 8 1: 123- 135)的等 式，計算在序列之間誤配的影響··在雜化物中，每1%的 •38 - 1344991 (33) 鹼基誤配，降低解鏈溫度1 -1 · 5 °C。 因此，藉著判定彼此具有某種同種性百分比的兩個序列 之雜化物的雜交溫度’並將所判定之雜交溫度與形成兩個 序列之完美雜化物的溫度相比較，容許評估在這兩個序列 之間的序列差異。
舉例來說，但不限於使用這類高嚴格度條件的程序如 下。在 65°C 下，在由 6X SSC，50 mM Tris-HCl(pH 7.5)，1 mM EDTA，0.02%PVP，0.02%Ficoll，0.02%BSA和 500微克 / 毫升變性 之鮭精DNA所組成之緩衝溶液中，進行含有DNA之濾紙的 預先雜交作用8小時至過夜。在65°C下，使濾紙在含有1〇〇 微克/毫升變性之鼓精DNA和5-20X 106 cpm 32P-標示之探針 的預先雜交混合物中，雜交48小時。在37°C下，以含有2X SSC，0.01%PVP，0.01%Ficoll和 0.01%BSA的溶液沖洗濾紙 1小 時。接著在50°C下，以0.1X SSC沖洗45分鐘，之後進行放 射自顯術。其他可使用之高嚴格度的條件，為此項技藝中 已熟知的。在本發明其他的具體實施例中，在中等或低嚴 格度的條件下，進行雜交作用，這類條件為熟諳此藝者已 熟知的（參見’例如 Sambrook等人，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ;亦參見 Ausubel等人，編輯，在 Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals 中，1987- 1997 Current Protocols, 1994- 1997 John Wiley and Sons, Inc.)。藉著下列的緩衝溶液系統，提供 解釋性的低嚴格條件：在40°C下，在包括35%甲醯胺，5X -39- 1344991 (34) SSC, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02%PVP, 0.02% Ficoll，0.2%BSA，100微克/毫升變性之鮭精DNA，和10%(重量 /體積）硫酸葡聚醣的緩衝溶液中雜交18-20小時，在55°C 下，以由 2X SSC，25 mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM EDTA，和 0,1% SDS所組成的緩衝溶液沖洗1.5小時，並在60°C下，以 由 2X SSC，25 mM Tris-HCl(pH 7.4)，5 mM EDTA,和 0.1%SDS所 組成之緩衝溶液沖洗1.5小時。
在某些具體實施例中，可使用對哺乳動物MPV之特定變 種專一的探針，將哺乳動物MPV分類成變種之一。這類探 針包括RT-PCR引子和抗體。在下文4.9節中，描述了確認 哺乳動物MPV為特定變種之成員的解釋性方法。
在本發明的某些具體實施例中，可藉著不同病毒蛋白質 之胺基酸序列，互相區別哺乳動物MPV的不同變種（參 見，例如圖42b)。在其他的具體實施例中，可藉著由病毒 基因組編碼之不同ORFs的核苷酸序列，互相區別哺乳動物 MPV的不同變種（參見，例如圖42b)。哺乳動物MPV的變 種，可以是但不限於Al、A2、B 1或B2。然而，本發明亦注 視屬於其他變種之成員的哺乳動物MPV之分離株。本發明 亦注視具有一或多個與一變種之關係較密切的ORF，以及 一或多個在系統發生上，與另一變種之關係較密切的ORFs 的病毒。將這類病毒分類至在系統發生上，與其大多數 ORFs之關係較密切的變種内。亦可使用非-密碼序列，來 判定系統發生的關係。 若其在系統發生上，與病.毒分離株NL/1/99(序列識別18 -40- 1344991 〇5) 1IW1
號）的關係，比其與任何下列其他的病毒分離株之關係更 密切：NL/1/00(序列識別19號）、NL/17/00(序列識別20號） 和NL/l/94(序列識別21號），便將該哺乳動物MPV之分離株 分類為變種B1。可使用哺乳動物MPV的一或多個ORFs ’來 分類哺乳動物MPV的變種。若其G蛋白質之胺基酸序列與 由原型NL/1/99(序列識別.324號）代表之哺乳動物MPV B1變 種的G蛋白質，是至少66%、至少70°/。、至少75%、至少80%、 至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%，或至 少99.5%相同的，便將該哺乳動物肘？¥分類為河？¥81變 種；若其N蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/l/99(序列識 別368號）代表之哺乳動物MPV B1變種的N蛋白質，是至少 98.5%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物 MPV分類為MPV B1變種；若其P蛋白質之胺基酸序列與由 原型NL/1/99(序列識別376號）代表之哺乳動物MPVB1變種 的P蛋白質’是至少96%、至少98%或至少99%，或至少99.5% 相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；若其Μ 蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別360號）代 表之哺乳動物MPV B1變種的Μ蛋白質是相同的，便將該哺 乳動物MPV分類為MPV Β1變種；若其F蛋白質之胺基酸序 列與由原型NL/l/99(序列識別316號）代表之哺乳動物MPV B 1變種的F蛋白質，是至少9 9 %相同的，便將該哺乳動物 MPV分類為MPVB1變種；若其M2-1蛋白質之胺基酸序列與 由原型NL/1/99(序列識別340號）代表之哺乳動物MPV B 1變 種的M2-1蛋白質是至少98%或至少99%，或至少99.5%相同 • 41 · 1344991
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的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種；若其M2-2蛋 白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別348號）代表 之哺乳動物MPV B1變種的M2-2蛋白質是至少99% ’或至少 99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1變種： 若其SH蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99(序列識別 384號）代表之哺乳動物MPV B1變種的SH蛋白質是至少 83%、至少85%、至少90%、至少95°/〇、至少98% ’或至少99% ’ 或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B1 變種；及/或若其L蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/99 (序列識別332號）代表之哺乳動物MPV B1變種的L蛋白質 是至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分 類為MPV B1變種。
若其在系統發生上，與病毒分離株NL/1/〇〇(序列識別19 號）的關係，比其與任何下列其他的病毒分離株之關係更 密切：NL/l/99(序列識別18號）、NL/17/00(序列識別2〇號） 和NL/l/94(序列識別21號），便將該哺乳動物MPV之分離株 分類為·變種A1。可使用哺乳動物MPV的一或多個〇RFs，來 分類哺乳動物MPV的變種。若其G蛋白質之胺基酸序列與 由原型NL/1/00(序列識別322號）代表之哺乳動物MPV A1變 種的G蛋白質’是至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、 至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99% ’或至 少99.5%相同的，便將該哺乳動物]^?乂分類為肘？乂八1變 種；若其N蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識 別366號）代表之哺乳動物MPV A1變種的N蛋白質，是至少 -42- 1344991
(37) 99.5%相同的，便將該哺乳動物]^¥分類為1^乂八1變種； 若其P蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別374 號）代表之哺乳動物MPV A1變種的P蛋白質，是至少96%、 至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動 物MPV分類為MPV A1變種；若其Μ蛋白質之胺基酸序列與 由原型NL/1/〇〇(序列識別358號）代表之哺乳動物MPV Α1變 種的Μ蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的，便將該哺 乳動物MPV分類為MPV Α1變種；若其F蛋白質之胺基酸序 列與由原型NL/1/00(序列識別314號）代表之哺乳動物MPV Α1變種的F蛋白質，是至少98%或至少99% ,或至少99.5% 相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV Α1變種；若其 Μ2-1蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序列識別338 號）代表之哺乳動物MPV A1變種的M2 -1蛋白質，是至少99% 或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物1^乂分類為>/11^八1 變種；若其M2-2蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/00(序 列識別346號）代表之哺乳動物MPV A1變種的M2_2蛋白 質，是.至少96%或至少99% ’或至少99.5%相同的，便將該 哺乳動物MPV分類為MPV A1變種；若其SH蛋白質之胺基酸 序列與由原型NL/1/00(序列識別382號）代表之哺乳動物 MPV A1變種的SH蛋白質’是至少84%、至少9〇0/〇、至少95%、 至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該哺乳動 物MPV分類為MPV A1變種；及/或若其L蛋白質之胺基酸序 列與由原型NL/1/00(序列識別330號）代表之哺乳動物Mpv A1變種的L蛋白質’是至少9 9 %或至少9 9 · 5 %相同的，便將 1344991
(38) 該哺乳動物MPV分類為MPV A1變種。 若其在系統發生上，與病毒分離株NL/17/00(序列識別20 號）的關係，比其與任何下列其他的病毒分離株之關係更 密切：NL/l/99(序列識別18號）、NL/1/00(序列識別19號）和 NL/l/94(序列識別21號），便將該哺乳動物MPV之分離株分 類為變種A2。可使用哺乳動物MPV的一或多個〇RFs，來分 類哺乳動物MPV的變種β若其G蛋白質之胺基酸序列與由
原型NL/17/00(序列識別332號）代表之哺乳動物MPV Α2變 種的G蛋白質’是至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、 至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%，或至 少99.5%相同的，便將該哺乳動物1^\^分類為1^\^2變種； 若其Ν蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別 367號）代表之哺乳動物MPV A2變種的N蛋白質，是至少 99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種； 若其P蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/〇〇(序列識別 375號）代表之哺乳動物MPV A2變種的P蛋白質’是至少 96%、直少98%或至少99%，或至少99.5%相同的，便將該 哺乳動物MPV分類為MPV A2變種；若其μ蛋白質之胺基酸 序列與由原型NL/17/00(序列識別359號）代表之哺乳動物 MPV A2變種的Μ蛋白質，是至少99%或至少99.5%相同的， 便將該哺乳動物MPV分類為MPV Α2變種；若其？蛋白質之 胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別315號）代表之哺 乳動物MPV Α2變種的F蛋白質，是至少98%、至少99%或至 少99.5%相同的’便將該哺轧動物Μρν分類為^變 -44 - 1344991 (39) 種’若其M2-1蛋白質之胺基酸序列與由原型nl/ 17/00(序列 識別339號）代表之哺乳動物MPV A2變種的M2-1蛋白質，是 至少99%或至少99·5%相同的，便將該哺乳動物Mpv分類為 MPV A2變種；若其M2-2蛋白質之胺基酸序列與由原型 NL/17/00(序列識別347號）代表之哺乳動物MPV A2變種的 M2-2蛋白質，是至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5% 相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種；若其SH 蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/00(序列識別383號） 代表之哺乳動物MPVA2變種的SH蛋白質，是至少84%、至 少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5% 相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2變種；及/或 若其L蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/17/〇〇(序列識別 331號）代表之哺乳動物MPV A2變種的L蛋白質，是至少99〇/0 或至少99 5。/〇相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV A2 變種。 若其在系統發生上’與病毒分離株NL/1/94(序列識別21 號）的關係’比其與任何下列其他的病毒分離株之關係更 密切：NL/l/99(序列識別18號）、NL/1/00(序列識別19號）和 NL/17/00(序列識別20號），便將該哺乳動物MPV之分離株分 類為變種B2。可使用哺乳動物MPV的一或多個〇RFs，來分 類哺乳動物MPV的變種。若其G蛋白質之胺基酸序列與由 原型NL/1/94(序列識別325號）代表之哺乳動物MPV B2變種 的G蛋白質，是至少66% '至少7〇°/。、至少75%、至少8〇%、 至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99〇/〇，或至 1344991
(40) 少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2支 種；若其N蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識 別369號）代表之哺乳動物MPV B2變種的N蛋白質’是至少 99.5%相同的，便將該哺乳動物MpV分類為MPV B2變種； 若其p蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別377 號）代表之哺乳動物MPV B2變種的p蛋白質，是至少96%、 至少98%、至少99%或至少99.5%相同的’便將該哺乳動物 MPV分類為MPV B2變種；.若其Μ蛋白質之胺基蔽序列與由 原型NL/1/94(序列識別361號）代表之哺乳動物MPV Β2變種 的Μ蛋白質是相同的，便將該哺乳動物Mpv分類為MPV B2 變種；若其F蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識 別317號）代表之哺乳動物MPV B2變種的F蛋白質，是至少 99%或至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為Mpv B2變種；若其M2 -1蛋白質之胺基酸序列與由原型 NL/l/94(序列識別341號）代表之哺乳動物MPV B2變種的 M2-1蛋白質，是至少98%或至少99%，或至少99.5%相同的， 便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；若其M2-2蛋白質 之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別349號）代表之哺 乳動物MPVB2變種的M2-2蛋白質’疋至少99%或至少99.5/〇 相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；若其SH 蛋白質之胺基酸序列與由原塑NL/1/94(序列識別385號）代 表之哺乳動物MPV B2變種的SH蒼白質’是至少84%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%，或至少99.5% 相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPV B2變種；及/或 -46 - 1344991 (41) 若其L蛋白質之胺基酸序列與由原型NL/1/94(序列識別333 號）代表之哺乳動物MPV B2變種的L蛋白質，是至少99%或 至少99.5%相同的，便將該哺乳動物MPV分類為MPVB2變 種。
在某些具體實施例中，序列同一性的百分比係以全長蛋 白質之排列為基礎。在其他的具體實施例中，序列同一性 的百分比係以蛋白質之相鄰胺基酸序列的排列為基礎，其 中該胺基酸序列的長度可以是25個胺基酸、50個胺基酸、 75個胺基酸、100個胺基酸、125個胺基酸、150個胺基酸、 175個胺基酸、200個胺基酸、225個胺基酸、250個胺基酸、 275個胺基酸、300個胺基酸、325個胺基酸、350個胺基酸、 375個胺基酸、400個胺基酸、425個胺基酸、450個胺基酸、 475個胺基酸、500個胺基酸、750個胺基酸、1000個胺基酸、 1250個胺基酸、1500個胺基酸、1750個胺基酸、2000個胺基 酸或2250個胺基酸。
4.2.哺乳動物MPV之功能特徵 除了哺乳動物MPV之結構定義之外，亦可藉著其功能特 徵來確認哺乳動物MPV。在某些具體實施例中，本發明之 哺乳動物MPV能夠感染哺乳動物宿主。哺乳動物宿主可以 是哺乳動物細胞、組織、器官或哺乳動物。在特定的具體 實施例中，哺乳動物宿主是人類或人類細胞、組織或器 官。可使用熟諳此藝者已知的任何方法，測試哺乳動物宿 主是否已被哺乳動物MPV感染。在某些具體實施例中，測 試病毒與哺乳動物細胞附接的能力。在某些其他的具體實 -47- 1344991
(42)
施例中，測試病毒運送其基因組至哺乳動物細胞内的能 力。在解釋性的具體實施例中，以可檢測之方式標示病毒 的基因組，例如以放射性標示。然後將病毒與哺乳動物細 胞一起培養至少1分鐘、至少5分鐘、至少1 5分鐘、至少3 0 分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時、至少12小時， 或至少1天。接著沖洗細胞，從細胞中移除任何病毒顆粒， 然後藉著可檢測標記，針對病毒基因組的存在，來測試細 胞。在另一個具體實施例中，使用RT-PCR，使用哺乳動物 MPV專一的引子，檢測在細胞中之病毒基因組的存在。
在某些具體實施例中，哺乳動物病毒能夠感染哺乳動物 宿主，但不使哺乳動物MPV之蛋白質插入哺乳動物宿主的 細胞質膜内。哺乳動物宿主可以是培養的哺乳動物細胞、 器官、组織或哺乳動物《在解釋性的具體實施例中，將哺 乳動物細胞與哺乳動物病毒一起培養。接著在從細胞表面 移除病毒的條件下，沖洗細胞。可使用任何熟諳此藝者已 知的技術，檢測插入哺乳動物細胞之細胞質膜中的新近表 現之病 '毒蛋白質。例如，在將細胞與病毒一起培養之後， 將細胞維持在包括以可檢測方式標示之胺基酸的培養基 中。接著收獲細胞，溶解並從膜溶離份中分離出細胞質溶 離份。然後增溶膜溶離份的蛋白質，並使其接受免疫沉 澱，使用對哺乳動物MPV之蛋白質專一的抗體，像是但不 限於F蛋白質或G蛋白質。然後使經過免疫沉澱的蛋白質 接受SDS PAGE。然後藉著放射自顯術，檢測病毒蛋白質的 百分比。在另一個具體實施.例中，可藉著免疫細胞化學 • 48- 1344991 _»ιβ ;^··.·.· · .· τ . ·，..：，<· (43) 法，使用一或多個對哺乳動物MPV專一的抗體，來檢測在 宿主細胞之細胞質膜中的病毒蛋白質之百分比。
在其他的具體實施例中，本發明之哺乳動物MPV能夠感 染哺乳動物宿主，並能夠在哺乳動物宿主中複製。哺乳動 物宿主可以是培養的哺乳動物細胞、器官、組織或哺乳動 物。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，檢測病毒是否能 夠感染哺乳動物細胞，並在哺乳動物宿主中複製。在特定 的具體實施例中，以病毒感染哺乳動物細胞。然後維持該 哺乳動物細胞至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少 5小時、至少12小時、至少1天或至少2天。可使用北方墨 點分析、RT-PCR或就地雜交作用，使用對該病毒基因組專 一的探針，監視在細胞中病毒基因組RNA的含量。病毒基 因組RNA的增加，證實該病毒能夠感染哺乳動物細胞，並 可在哺乳動物細胞内複製。
在其他的具體實施例中，本發明之哺乳動物MPV能夠感 染哺乳動物宿主，其中該感染使哺乳動物宿主產生新的有 傳染性妁哺乳動物MPV。哺乳動物宿主可以是培養的哺乳 動物細胞或哺乳動物。可使用任何熟諳此藝者已知 '的技 術，檢測病毒是否能夠感染哺乳動物細胞，並使哺乳動物 宿主產生新的有傳染性的病毒顆粒》在解釋性的實例中， 以哺乳動物病毒感染哺乳動物細胞。接著沖洗該細胞，並 培養至少3 0分鐘 '至少1小時、至少2小時、至少5小時、 至少1 2小時、至少1天、至少2天、至少1週或至少1 2天。 可藉著熟諳此藝者已知的任何方法，監視病毒的力價。關 -49- 1344991
(44) 於代表性的方法，參見4.8節。 在某些特定的具體實施例中，哺乳動物MPV為人類 MPV。在本節中描述的測試，亦可利用人類MPV進行。在 某些具體實施例中，人類MPV能夠感染哺乳動物宿主，像 是哺乳動物或哺乳動物的培養細胞。
在某些具體實施例中，人類MPV能夠感染哺乳動物宿 主，並使該人類MPV之蛋白質插入哺乳動物宿主的細胞質 膜内。 在其他的具體實施例中，本發明之人類MPV能夠感染哺 乳動物宿主，並在哺乳動物宿主中複製。 在其他的具體實施例中，本發明之人類MPV能夠感染哺 乳動物宿主，其中該感染使哺乳動物宿主產生新的有傳染 性的人類MPV。
在某些具體實施例中，哺乳動物MPV，即使它能夠感染 哺乳動物宿主，亦能夠感染禽類宿主，像是鳥類或禽類的 培養細胞。在某些具體實施例中，哺乳動物MPV能夠感染 禽類宿主，並使該哺乳動物MPV之蛋白質插入該禽類宿主 的細胞質膜内。在其他的具體實施例中，本發明之哺乳動 物MPV能夠感染禽類宿主，並在禽類宿主中複製。在其他 的具體實施例中，本發明之哺乳動物MPV能夠感染禽類宿 主，其中該感染使禽類宿主產生新的有傳染性的哺乳動物 MPV。 4.3.重組和喪合型的間質肺病毒 本發明提供由衍生自間質肺病毒，包括哺乳動物和禽類 〇〇- 1344991
(45)
變種之基因組的病毒載體編碼之重組或嵌合型病毒。根據 本發明，重組病毒是衍生自哺乳動物MPV或APV的病毒， 其由内源或天然的基因組序列，或非-天然的基因組序列 編碼。根據本發明，非-天然的序列是因為一或多個突變， 包括但不限於點突變、重排、插入 '刪除等等，而與天然 或内源的基因組序列不同的序列，對基因組序列而言，可 能或可能沒有導致表現型上的改變。本發明之重組病毒包 括由衍生自間質肺病毒，包括哺乳動物和鳥類變種之基因 組的病毒載體編碼的那些病毒，並可以或可以不包括對病 毒基因组而言，為非-天然的核酸。根據本發明，衍生自 間質肺病毒之基因組的病毒載體，是含有編碼一個哺乳動 物間質肺病毒的ORF之至少一部分的核酸序列的病毒載 體，其中由該ORF編碼之多肽具有在上文4.1節和表1中陳 述的胺基酸序列同一性。
根據本發明，本發明之病毒載體係衍生自哺乳動物間質 肺病毒（MPV)之基因组，特別是人類間質肺病毒。在本發 明特定·的具體實施例中，該病毒載體係衍生自間質肺病毒 Al、A2、B 1或B2變種的基因組。根據本發明，這些病毒載 體可以或可以不包括對病毒基因组而言，為非-天然的核 酸。 根據本發明，本發明之病毒載體係衍生自禽肺病毒（APV) 之基因組，亦稱為火雞鼻氣管炎病毒（TRTV)。在本發明特 定的具體實施例中，該病毒載體係衍生自APV A、B、C或 D亞群之基因組。在較佳的具體實施例中，病毒載體衍生 -51 - 1344991
(46) 自APV C亞群之基因組。根據本發明，這些病毒載體可以 或可以不包括對病毒基因組而言，為非-天然的核酸。
在本發明另一個較佳的具體實施例中，衍生自APV之基 因組的病毒載體，是含有編碼APV C亞群之F-ORF的核酸序 列的病毒載體。在某些具體實施例中，衍生自APV之基因 組的病毒載體，是含有編碼至少APV之N-ORF、P-ORF、 M-ORF、F-ORF、M2-1-0RF、M2-2-ORF或 L-ORF之核酸序列 的病毒載體。 根據本發明，嵌合型病毒是重組的MPV或APV，其進一 步更包括異源核苷酸序列。根據本發明，該嵌合型病毒可 由其中已經將異源核苷酸序列加至基因組内的核茹酸序 列，或其中已經利用異源核苷酸序列置換内源或天然核苷 酸序列的核苷酸序列編碼。
根據本發明，由本發明之病毒載體編碼的嵌合型病毒， 進一步更包括異源核甞酸序列。根據本發明，該嵌合型病 毒可由病毒載體編碼，其可以或可以不包括對病毒基因組 而言，為非-天然的核酸。根據本發明，該嵌合型病毒係 由其中已經加入、插入異源核苷酸序列，或以其置換天然 或非-天然序列的病毒載體編碼。根據本發明，該嵌合型 病毒可由衍生自不同品系之哺乳動物MPV的核苷酸序列 編碼。特定而言，該嵌合型病毒係由編碼衍生自不同品系 之MPV的抗原多肽的核甞酸序列編碼。 根據本發明，該嵌合型病毒可由衍生自APV之基因组的 病毒載體編碼，特別是C亞群，其額外地編碼異源序列， -52- 1344991
(47) 其編碼衍生自MPV之一或多個品系的抗原多肽β
嵌合型病毒在產製重組疫苗，保護對抗二或多種病毒 時，可能是特別有用的（Tao等人，J. Virol· 72，2955-2961; Durbin等人，2000，J. Virol. 74，6821-6831; Skiadopoulos等人， 1 998, J. Virol. 72, 1762- 1768( 1998); Teng等人，2000, J. Virol. 74, 93 17-932 1)。例如，可想像表現一或多個其他負股RNA病 毒，例如RSV之蛋白質的MPV或APV病毒載體，或表現一 或多個MPV之蛋白質的RSV載體，將可保護接種這類疫苗 的個體，對抗兩種病毒感染。可對PIV或其他副黏液病毒， 想像類似的方法。減毒和複製缺陷的病毒，可用在利用活 疫苗來接種疫苗之目的上，如同已經就其他病毒討論過的 (參見PCT WO 02/057302，在第6和23頁，以引用的方式併入 本文中）。
根據本發明，欲併入編碼本發明之重组或嵌合型病毒之 病毒載體内的異源序列，包括獲自或衍生自不同品系之間 質肺病毒、禽肺病毒之品系，以及其他負股RNA病毒，包 括但不·限於RSV、PIV和流感病毒，以及其他病毒，包括摩 比利病毒的序列。 在本發明的某些具體實施例中，本發明之嵌合型或重組 病毒係由衍生自病毒基因組之病毒載體編碼，其中該病毒 基因組已經以異源或非-天然的序列，取代一或多個序 列、基因間區域、終端序列，或一部分或全部的ORF。在 本發明的某些具體實施例中，本發明之嵌合型病毒係由衍 生自病毒基因組之病毒載體編碼，其中已經在該載體中加 -53 - 1344991
(48) 入一或多個異源序列。
在某些具體實施例中，本發明之病毒含有異源核酸。在 較佳的具體實施例中，將該異源核甞酸序列插入或加至病 毒基因組的位置1中。在另一個較佳的具體實施例中，將 該異源核苷酸序列插入或加至病毒基因组的位置2中。在 另一個較佳的具體實施例中，將該異源核甞酸序列插入或 加至病毒基因组的位置3中。在病毒基因組之較低-編號的 位置處插入或加入核酸序列，與在較高-編號的位置處插 入相比較，產生較強或較高程度之異源核苷酸序列的表 現，歸因於跨越病毒基因組的轉錄梯度。因此，若想要異 源核甞酸序列的高程度表現，在較低-編號之位置處插入 或加入異源核荅酸序列是本發明較佳的具體實施例。
未與理論結合，插入或加入異源序列的位置，影響重組 或嵌合型病毒的複製速率。若將異源序列插入或加至病毒 基因組的位置2或位置1處，可達到較高的複製速率。若將 異源序列插入或加至位置3、位置4、位置5或位置6處，便 降低複 '製的速率。 未與理論結合，在病毒基因和異源序列之間的基因間區 域之尺寸，進一步決定該病毒的複製速率，以及該異源序 列的表現程度。 在某些具體實施例中，本發明之病毒載體含有二或多個 異源核苷酸序列。在較佳的具體實施例中，一個異源核苷 酸序列是在病毒基因組的位置1，而第2個異源核苷酸序列 是在位置2。在另一個較佳的具體實施例中，一個異源核 -54- 1344991
(49)
荅酸序列是在病毒基因組的位置1，而第二個異源核苷酸 序列是在位置3。在另一個較佳的具體實施例中，一個異 源核苷酸序列是在病毒基因組的位置2，而第二個異源核 苷酸序列是在位置3。在某些其他的具體實施例中，將異 源核苷酸序列插入病毒基因組的另一個、較高-編號的位 置内。根據本發明，異源序列的位置意指從病毒基因組中 轉錄該序列的順序，例如在位置1處的異源序列，是欲從 基因組中轉錄的第一個基因序列》 病毒載體的選擇，可依據欲治療或防止免於病毒感染之 個體的物種而定。若該個體是人類，此時可使用減毒的哺 乳動物間質肺病毒或禽肺病毒，提供抗原序列。
根據本發明，可設計病毒載體，提供賦與對抗間質肺病 毒感染之保護的抗原序列，包括衍生自哺乳動物間質肺病 毒、人類間質肺病毒' MPV變種Al、A2、B1或B2的序列， 衍生自禽肺病毒的序列，包括APV A、B、C或D亞組，雖 然C是較佳的。可設計病毒載體，提供賦與對抗由其他病 毒引起之感染或疾病之保護的抗原序列，包括負股RNA病 毒，包括流感、RSV或PIV，包括PIV3。可設計病毒載體， 提供一、二、三或更多的抗原序列。根據本發明，該抗原 序列可衍生自相同的病毒、相同類型病毒的不同品系或變 種，或不同的病毒。 在本發明的某些具體實施例中，待插入本發明之病毒基 因組内的異源核：y：酸序列，係衍生自間質肺病毒。在本發 明某些特定的具體實施例中，該異源核甞酸序列係衍生自 -55 - 1344991 (50)
人類間質肺病毒。在另一個特定的具體實施例中，該異源 核苷酸序列係衍生自禽肺病毒。更特定而言，本發明之異 源核苷酸序列係編碼人類間質肺病毒之F基因。更特定而 言，本發明之異源核苷酸序列係編碼人類間質肺病毒之G 基因。更特定而言，本發明之異源核钻酸序列係編碼禽肺 病毒之F基因》更特定而言，本發明之異源核苷酸序列係 編碼禽肺病毒之G基因。在特定的具體實施例中，異源核 荅酸序列可以是序列識別1號至序列識別5號、序列識別14 號和序列識別1 5號中的任一個。在某些特定的具體實施例 中，核苷酸序列編碼序列識別6號至序列識別13號、序列 識別16號和序列識別17號中任一個的蛋白質。
在本發明特定的具體實施例中，該異源核苷酸序列係編 碼嵌合型F蛋白質。在解釋性的具體實施例中，嵌合型F 蛋白質之外功能部位（ectodomain)是人類MPV之外功能部 位，而穿透膜功能部位和魯米那功能部位則衍生自禽間質 肺病毒的F -蛋白質。未與理論結合，編碼由人類外功能部 位和禽'魯米那/穿透膜功能部位所组成之嵌合型F-蛋白質 的嵌合型人類MPV，因為F-蛋白質之禽類部分而為減毒 的，亦因為人類外功能部位，而對hMPV是具高度免疫原 性的® 在某些具體實施例中，可將兩個不同的異源核芸酸序列 插入或加至本發明的病毒載體中，該異源核苷酸序列係衍 生自間質肺病毒基因組，包括哺乳動物和禽類。例如，衍 生自人類間質肺病毒、禽肺病毒、RSV、PIV或流感的異源 -56- 1344991
核#酸序列。在較佳的具體實施例中，該異源序列分別編 碼人類間質肺病毒、禽肺病毒、RSV或PIV的F-蛋白質。在 另一個具體實施例中，該異源序列係編碼流感的HA蛋白 質。
在某些具體實施例中，本發明之病毒載體含有兩個不同 的異源核苷酸序列，其中第一個異源核苷酸序列衍生自間 質肺病毒，像是人類間質肺病毒或禽肺病毒，而第二個核 钴酸序列則衍生自呼吸道融合細胞病毒（參見表2)。在特 定的具體實施例中，該衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源 核芬酸序列，是呼吸道融合細胞病毒的F基因。在其他特 定的具體實施例中，該衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源 核嘗酸序列，是呼吸道融合細胞病毒的G基因。在特定的 具體實施例中，將衍生自間質肺病毒之異源核荅酸序列插 入比衍生自呼吸道融合細胞病毒之異源核荅酸序列更低-編號的位置處。在其他特定的具體實施例中，將衍生自間 質肺病毒之異源核荅酸序列插入比衍生自呼吸道融合細 胞病毒 '之異源核苷酸序列更高-編號的位置處。 在某些具體實施例中，本發明之病毒含有兩個不同的異 源核苷酸序列，其中第一個異源核钻酸序列係衍生自間質 肺病毒，像是人類間質肺病毒或禽肺病毒，而第二個核荅 酸序列則衍生自副流感病毒，像是但不限於PIV3(參見表 2)。在特定的具體實施例中，衍生自ριν之異源核：y：酸序 列是PIV的F基因。在另一個特定的具體實施例中，衍生自 PIV之異源核苷酸序列是PIV的G基因。在特定的具體實施 -57- 1344991
(52) 例中，將衍生自間質肺病毒之異源核茹酸序列插入比衍生 自ριν之異源核：y：酸序列更低-編號的位置處。在另一個特 定的具體實施例中，將衍生自間質肺病毒之異源核苷酸序 列插入比衍生自PIV之異源核#酸序列更高-編號的位置 處。
可在疫苗調配物中，有利地使用根據本發明獲得的表現 產物及/或重組或嵌合型病毒粒子。可設計本發明之表現 產物和嵌合型病毒粒子，創造對抗各種病原的疫苗，包括 病毒和細菌抗原、腫瘤抗原、過敏抗原和涉及自體免疫病 症的自體抗原。特定而言，可設計本發明之嵌合型病毒粒 子，創造保護.個體免於PIV、RSV及/或間質肺病毒感染的 疫苗。
在另一個具體實施例中，可設計本發明之嵌合型病毒粒 子，創造抗- HIV疫苗，其中在糖蛋白HN蛋白質内設計得 自gpl60，及/或HIV之内部蛋白質的免疫原多肽，建構能夠 誘發脊椎動物體液和細胞-調解之免疫反應的疫苗。在另 一個具體實施例中，本發明係關於重組的間質肺病毒載體 和病毒，將其設計成編碼突變種抗原。突變種抗原相對於 從其中衍生出之野外型病毒的蛋白質，具有至少一個胺基 酸取代、刪除或添加。 在某些具體實施例中，本發明係關於包括本發明之重組 或嵌合型病毒的三價疫苗。在特定的具體實施例中，用來 作為三價疫苗之主鏈的病毒，是嵌合型禽-人類間質肺病 毒，或嵌合型人類-禽間質肺.病毒，含有衍生自RSV的第一 -58- 1344991
(53)
個異源核苷酸序列，和衍生自PIV的第二個異源核荅酸序 列。在代表性的具體實施例中，這類三價疫苗將是對下列 專一的：（a)人類間質肺病毒或禽肺病毒各自的F基因及/ 或G基因之基因產物，依據是否使用嵌合型禽-人類或嵌合 型人類-禽間質肺病毒：（b)由衍生自RSV之異源核站酸序 列編碼的蛋白質；以及（c)由衍生自PIV之異源核甞酸序列 編碼的蛋白質。在特定的具體實施例中，第一個異源核荅 酸序列是呼吸道融合細胞病毒的F基因，並將其插入位置1 中，而第二個異源核苷酸序列是PIV的F基因，並將其插入 位置3中。本發明包括多更多的组合，並在表2中舉例出示 一些。此外，亦可使用編碼嵌合型F蛋白質的核甞酸序列 (參見前文）。在一些較差的具體實施例中，可將異源核苷 酸序列插入病毒基因組之較高編號的位置中。
表2.在三價疫苗使用之病毒中，異源核：y：酸序列的代表性 配置 組合 位Ϊ1 位12 位13 1 PIV之F-基因 RSV之F-基因 2 RSV之F-基因 HV之F-基因 3 PIV之F-基因 RSV之F-基因 4 RSV之F-基因 PIV之F-基因 5 PIV之F-基因 . RSV之F-基因 6 RSV之F-基因 PIV之F-基因 7 PIV之HN-基因 RSV之G-基因 8 RSV之G-基因 PIV之ΗΝ-基因 -59- 1344991
9 PIV之ΗΝ-基因 RSV之G-基因 10 RSV之G-基因 PIV之ΗΝ-基因 11 I>IV之HN-基因 RSV之G-基因 12 RSV之G-基因 . PIV之ΗΝ-基因 13 I>IV之F-基因 RSV之G-基因 14 RSV之G-基因 PIV之F-基因 15 之F-基因 RSV之G-基因 16 RSV之G-基因 PIV之F-基因 17 PIV之F-基因 _ RSV之G-基因 18 RSV之G-基因 _ PIV之F-基因 19 HV之ΗΝ-基因 RSV之F-基因 20 RSV之F-基因 PIV之ΗΝ-基因 21 PIV之ΗΝ基因 RSV之F-基因 22 . RSV之F-基因 PIV之ΗΝ-基因 23 PIV之ΗΝ-基因 RSV之F-基因 24 RSV之F-基因 PIV之ΗΝ-基因 在 某些 具體實施例中 ，可設計本發明之表現產物和重組 或嵌合型病毒粒子，創造對抗各種病原 的疫苗，包括病毒 抗原 、腫瘤抗原和涉及 自體免疫病症的 自體抗原。一種達 成該 目的 的方法，涉及修改現存的間質肺病毒基因，在其 各別 的外 部功能部位中 ，含有外來的序 列。在異源序列是 抗原 決定 位或病原的抗 原之處，可使用 這些嵌合型病毒， 誘導保護 性免疫反應，對抗從其中衍生 這些決定位的致病 原。
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(55) 因此，本發明係關於使用病毒載體和重組或嵌合型病 毒，來調配對抗各種病毒及/或抗原的疫苗。可使用本發 明之病毒載體和嵌合型病毒，藉著刺激體液免疫反應、細 胞免疫反應，或藉著刺激對抗原之容忍性，來調節個體的 免疫系統。當在本文中使用時，個體意指：人類、靈長類、 馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、貓、禽類和嗡齒類。
僅為了說明的目的，可將本發明分成下列的階段，但不 限於：（a)建構重組的cDNA和RNA模板；（b)使用重組的cDNA 和RNA模板，表現異源基因產物；（c)在重組的病毒顆粒 中，解救異源的基因；並（d)產製和使用包括本發明之重 組病毒顆粒的疫苗。
4.4·建構重組的cDNA和RNA
在某些具體實施例中，該病毒載體係衍生自本發明之人 類或哺乳動物間質肺病毒的基因組。在其他的具體實施例 中，該病毒載體係衍生自禽肺病毒之基因組。在某些具體 實施例中，病毒載體含有衍生自哺乳動物MPV和APV的序 列，而得以由該病毒載體編碼嵌合型人類MPV/APV病毒。 在代表性的具體實施例中，已經利用禽肺病毒之F-基因及 /或G-基因代替人類間質肺病毒之F-基因及/或G-基因，建 構嵌合型hMPV/APV病毒。在其他的具體實施例中，病毒 載體含有衍生自APV和哺乳動物MPV的序列，而得以由該 病毒載體編碼嵌合型APV/hMPV病毒。在更具代表性的具 體實施例中，已經利用人類間質肺病毒之F-基因及/或G-基因代替禽肺病毒之F-基因.及/或G-基因，建構嵌合型 -61- 1344991
(56) APV/hMPV病毒。 本發明亦包括重組病毒，其包括衍生自哺乳動物MPV或 APV基因組之病毒載體，其含有結果使該病毒具有更適用 於疫苗調配物之表現型的序列’例如減毒的表現型或增強 的抗原性。突變和修改可位在病毒之密碼區中、基因間區 域中，以及前導和拖尾序列中。
在某些具體實施例中，本發明之病毒載體包括衍生自 hMPV、APV、hMPV/APV或APV/hMPV的核苷酸序列，其中 已經利用異源序列取代天然的核苷酸序列，或其中已經將 異源序列加至天然的間質肺病毒序列中。
在更特定的具體實施例中，該嵌合型病毒包括衍生自 MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中已經 加入衍生自PIV的異源序列。在更特定的具體實施例中， 該重組病毒包括衍生自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV 的病毒載體，其中已經利用衍生自PIV的異源序列置換該 序列。在其他特定的具體實施例中，該嵌合型病毒包括衍 生自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒載體，其中 已經加入衍生自RSV的異源序列。在更特定的具體實施例 中，該嵌合型病毒包括衍生自MPV、APV、APV/hMPV或 hMPV/APV的病毒載體，其中已經利用衍生自RSV之異源序 列置換該序列。 可使用此項技藝中已知的技術，建構位在病毒聚合酶結 合位置/啟動基因之互補物’例如本發明之3，-hMPV病毒終 端的互補物’或3'-和5'-hMPV病毒兩端之互補物側面的異 -62- 1344991 (57)
源基因密碼序列。在更特定的具體實施例中，本發明之重 組病毒含有hMPV或APV之前導和拖尾序列。在某些具體實 施例中，從hMPV或APV中獲得基因間區域。所得的RNA模 板可能具有負-極性，並可含有適當的終端序列，使病毒 RNA-合成裝置能夠認出該模板。或者，亦可使用正-極性 的RNA模板，其含有適當的終端序列，使病毒RNA-合成裝 置能夠認出該模板《可選殖含有這些雜種序列的重組DNA 分子，並藉著DNA-指揮之RNA聚合酶，像是噬菌體T7聚合 酶、T3聚合酶、SP6聚合酶，或真核生物聚合酶，像是聚 合酶I及其類似物轉錄，以便在活體外或在活體内產製具 有適當之病毒序列，並給予病毒聚合酶認知和活性的重組 RNA模板。在更特定的具體實施例中，該RNA聚合酶為禽 痘病毒T7RNA聚合酶，或MVA T7 RNA聚合酶。
一種建構這類雜種分子的解釋性方法，是將異源核茹酸 序列插入 hMPV、APV、APV/hMPV或 hMPV/APV基因組的 DNA 互補物内，使得該異源序列位在病毒聚合酶活性所需之病 毒序列’，即病毒聚合酶結合位置/啟動基因，在後文中稱 為病毒聚合酶結合位置和聚腺苷酸化作用位置的側面。在 較佳的具體實施例中，該異源密碼序列位在包括Y和3’終 端之複製啟動基因，基因開始和基因結束序列，以及在V 及/或3’終端發現之包裝信號的病毒序列的側面》在另一 種方法中，將編碼病毒聚合酶結合位置之寡核苷酸，例如 病毒基因組斷片之3'-終端或兩端的互補物，與異源密碼 序列連接，建構雜種分子。在標靶序列中放置外來基因或 -63· 1344991 (58) mmm, 外來基因的斷片，從前是藉著在標乾序列中出現之適當限 制酵素位置來指揮。然而，最近在分子生物學上的進步， 已經大大地減少了該問題。可經由使用指定位置之突變生 成作用（例如’參見，例 W*Kunkel，1985,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 82: 48 8描述的技術），迅速地將限制酵素位置放在標 乾序列中的任何地方。在下文中描述之在聚合酶連鎖反應 (PCR)技術上的改變，亦容許序列（即限制酵素位置）的指 定插入，並容許輕易地建構雜種分子。或者，可使用pcR 反應，製備重組的模板，而不需要選殖。例如，可使用pCR 反應’製備含有DNA-指揮之RNA聚合酶啟動基因（例如嗟 菌體T3、T7或SP6)的雙股DNA分子，以及含有異源基因和 ριν聚合酶結合位置的雜種序列。然後可從該重组DNa 中’直接轉錄RN A模板。在另一個具體實施例中，可藉著 使用RNA連接酶，使指出異源基因之負極性的rnAs與病毒 聚合酶結合位置連接，來製備重組的RNA模板。 此外，可在未轉譯區域中，加入一或多個核苷酸，與，, 六的規則”附接，該，，六的規則”在獲得病毒解救時，可能 是很重要的。”六的規則，，適用於許多副黏液病毒，且RNa 基因組之核：y：酸的狀態，必須可被6整除’才是有功能的。 可藉著此項技藝中已知的技術，像是使用市售的突變生成 套組，像QuikChange突變生成套組（Stratagene)，完成核菩酸 的加入。在加入適當數目的核甞酸之後，然後可藉著以適 當的限制酵素消化，並以凝膠純化，分離出正確的DNA片 段。可根據在後文之子章節中描述的本發明，使用病毒聚 -64- 1344991
(59) 合酶活性所需之序列和構築禮β 未與理論結合，數個參數影響重組病毒的複製速率，以 及異源序列的表現程度。特定而言，在hMPV、APV、 hMPV/APV或APV/hMPV中異源序列的位置，以及位在異源 序列側面之基因間區域的長度，決定異源序列的複製速率 和表現程度。
在某些具體實施例中，相對於野外型病毒修改病毒的前 導及/或拖尾序列。在某些較特定的具體實施例中，改變 前導及/或拖尾序列的長度。在其他的具體實施例中，相 對於野外型病毒，使前導及/或拖尾之序列（們）突變。關 於更多的細節，參見第4.7節。
本發明之重組病毒的產製，依賴反義病毒RNA( vRNA)基 因組之部分或全長副本，或其互補副本（cRNA)的複製。可 從有傳染性的病毒中分離該vRNA或cRNA，以在活體外的 轉錄作用產製，或在細胞中以核酸之轉移感染作用來產 製。其次，重組負股病毒的產製依賴有功能的聚合酶複合 物。肺病毒之聚合酶複合物通常由N ' P、L蛋白質，可能 還有M2本發明所组成，但不一定僅限於此。 可從病毒顆粒中分離，從表現一或多種組份的細胞中中 分離，或以特定表現載體之轉移感染作用來產製聚合酶複 合物或其组份。 當藉著上文提及之聚合酶複合物16複製上文提及之 vRNA、cRNA，或表現這些RNAs的載體時，可獲得有傳染 性的 MPV 副本（Schnell 等人，.1994，EMBO J 13:4195-4203; -65 - 1344991 (60)
Collins等人，1995, PNAS 92: 1 1563- 1 1567; Hoffmann等人，2000, PNAS 97:6108-61 13; Bridgen等人，1996, PNAS 93:15400- 15404; Palese等人，1996，PNAS 93:1 1354- 1 1358; Peeters等人，1999，J. Virol. 73:5001-5009; Durbin等人，1997, Virology 235:323-332) ° 本發明提供包括根據本發明之核酸或載體的宿主細
胞。在原核生物細胞中，產製含有MPV之聚合酶組份（或 許是N、P、L和M2 ’但不一定僅限於此）的質體或病毒載 體’以便在相關之細胞類型（細菌、昆蟲細胞、真核生物 細胞）中表現該組份。將在原核生物細胞中產製含有MPV 基因組之全長或部分副本的質體或病毒載體，以便在活體 外或在活體内表現病毒的核酸，後者的載體可含有其他的 病毒序列’以便產製嵌合型病毒或嵌合型病毒蛋白質，可 缺之一部分的病毒基因組，以便產製複製缺陷的病毒，並 可含有突變、刪除或插入，以便產製減毒的病毒。 s根據上述應用已有之最高技術，共同-表現聚合酶組
伤時，可獲得有傳染性的Mpv副本（為野外型、減毒的、 複製缺陷的或嵌合型的）。 此外’可使用暫時或穩定地表現一或多個全長或一部分 MPV蛋白質的真核生物紅胞。可藉著轉移感染(蛋白質或 核酸載感3^ (病毒裁體）或轉導作用（病毒載體），製造 這類細胞，並可用央# 水補償所提及之野外型、減毒的、複製 缺陷或嵌合型病毒。 4·4.1·欲插入之異源基因序列 步設計本發明之病毒載體，表現異 根據本發明，可進〜 •66- 1344991
源序列。在本發明之具體實施例中，該異源序列係衍生自 病毒載體以外的來源。舉例來說，但不限於編碼屬於與從 其中衍生該病毒載體之間質肺病毒的物種、亞組或變種不 同的物種、亞组或變種之病毒的抗原蛋白質、多肽或肽的 異源序列。舉例來說，但不限於編碼間質肺病毒以外之病 毒的抗原蛋白質、多肽或肽的異源序列。舉例來說，但不 限於不是起源病毒的異源序列。根據該具體實施例，該異 源序列可編碼具有想要之生物特性或活性的部分、肽、多 肽或蛋白質。這類異源序列可編碼標籤或標記。這類異源 序列可編碼生物反應修改物，其實例包括淋巴細胞活素、 介白素、粒性細胞巨嗟細胞菌落刺激因子和粒性細胞菌落 刺激因子。 在某些具體實施例中，欲插入之異源核苷酸序列係衍生 自間質肺病毒。更特定而言，欲插入之異源核甞酸序列係 衍生自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。
在某些具體實施例中，該異源序列編碼PIV殼包核酸磷 蛋白、PIV L蛋白質、PIV基質蛋白質、PIV HN蛋白質、PIV RNA-依賴性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白質、PIV D蛋白質、PIV C蛋白質' PIV F蛋白質或PIV P蛋白質。在某些具體實施例 中，該異源核苷酸序列編碼與PIV殼包核酸磷蛋白、PIV L 蛋白質、PIV基質蛋白質、PIV HN蛋白質、PIV RNA-依賴性 RNA聚合酶、PIV Y1蛋白質、PIV D蛋白質、PIV C蛋白質、 PIV F蛋白質或PIV P蛋白質至少90%、至少95%、至少98%， 或至少99%同種的蛋白質。可從PIV第1型、PIV第2型或PIV -67- 1344991
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第3型中獲得該異源序列。在更特定的具體實施例中，從 人類PIV第1型、PIV第2型或PIV第3型中獲得該異源序列。 在其他的具體實施例中，該異源序列編碼RSV核蛋白、RSV 磷蛋白、RSV基.質蛋白質、RSV小忌水性蛋白質、RSV RNA-依賴性RNA聚合酶、RSV F蛋白質、RSV G蛋白質或RSV Μ2-1 或Μ2-2蛋白質。在某些具體實施例中，該異源序列編碼與 RSV核蛋白、RSV磷蛋白、RSV基質蛋白質、RSV小忌水性 蛋白質、RSV RNA-依賴性RNA聚合酶、RSV F蛋白質或RSV G蛋白質至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同種的蛋 白質。可從RSVA亞型和RSV Β亞型中獲得該異源序列❶在 更特定的具體實施例中，從人類RSV Α亞型和RSV Β亞型中 獲得該異源序列。在其他的具體實施例中，該異源序列編 碼APV核蛋白、APV磷蛋白、APV基質蛋白質、APV小忌水 性蛋白質、APV RNA-依賴性RNA聚合酶、APV F蛋白質、 APV G蛋白質或APV M2-1或M2-2蛋白質。在某些具體實施 例中，該異源序列編碼與APV核蛋白、APV磷蛋白、APV 基質蛋白質、APV小忌水性蛋白質、APV RNA-依賴性RNA 聚合酉每、APV F蛋白質或APV G蛋白質至少90°/〇、至少95%、 至少98%或至少99%同種的蛋白質》禽肺病毒可以是APV A 亞組、APV B亞組或APV C亞組。在其他的具體實施例中， 該異源序列編碼hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基質蛋 白質、hMPV小忌水性蛋白質、hMPV RNA-依賴性RNA聚合 酶、hMPV F蛋白質' hMPV G蛋白質或hMPV M2_l或M2-2蛋 白質。在某些具體實施例中，該異源序列編碼與hMPV核 • 68- 1344991 (63) 蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基質蛋白質、hMPV小忌水性蛋 白質、hMPV RNA-依賴性RNA聚合酶、hMPV F蛋白質或hMPV G蛋白質至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同種的蛋 白質。人類間質肺病毒可以是hMPV A1變種、hMPV A2變 種、hMPV B1變種或hMPV B2變種。
在某些具體實施例中，可將得自PIV、RSV、人類間質肺 病毒或禽肺病毒之不同異源序列的任何組合，插入本發明 之病毒内。 在本發明某些較佳的具體實施例中，欲插入之異源核苷 酸序列係衍生自得自RSV、PIV、APV或hMPV的F基因。
在某些具體實施例中，該異源核苷酸序列編碼嵌合型蛋 白質。在更特定的具體實施例中，該異源核苷酸序列編碼 RSV、PIV、APV或hMPV之嵌合型F蛋白質。嵌合型F蛋白質 可包括得自不同病毒的部分F蛋白質，像是人類間質肺病 毒、禽肺病毒、啤吸道融合細胞病毒和副流感病毒。在某 些其他的具體實施例中，該異源序列編碼嵌合型G蛋白 質。嵌合型G蛋白質包括得自不同病毒的部分G蛋白質， 像是人類間質肺病毒、禽肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和 副流感病毒。在特定的具體實施例中，該F蛋白質包括間 質肺病毒之F蛋白質的外功能部位、副流感病毒之F蛋白質 的穿透膜功能部位，以及副流感病毒之F蛋白質的魯米那 功能部位。在某些特定的具體實施例中，本發明之異源核 钻酸序列是序列識別1號至序列識別5號、序列識別14號和 序列識別15號中的任一個。在某些特定的具體實施例中， -69- 1344991 (64) 該核苷酸序列編碼序列識別6號至序列識別13號、序列識 別16號和序列識別17號中任一個的蛋白質。 至於衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源核甞酸序列’參 見，例如PCT/US98/20230，將其全文以引用的方式併入本 文中。
在較佳的具體實施例中，可在本發明之重组病毒中表現 的異源基因序列，包括但不限於抗原性的抗原決定位，以 及導致呼吸道疾病的病毒糖蛋白，像是流感糖蛋白，特別 是血球凝集素H5、H7、呼吸道融合細胞病毒之抗原決定 位、新城雞瘟病毒之抗原決定位、仙臺病毒和傳染性喉氣 管炎病毒。在較佳的具體實施例中，該異源核甞酸序列係 衍生自RSV或PIV。在本發明另一個具體實施例中，可設計 成在本發明之嵌合型病毒内的異源基因序列，包括但不限 於病毒抗原決定位和病毒糖蛋白，像是B型肝炎病毒表面 抗原、愛氏頓病毒之A或C型肝炎病毒表面糖蛋白、人類 乳頭狀瘤病毒、猿病毒5或流行性腮腺炎病毒、西尼羅河 病毒（West Nile virus)、登革病毒（Dengue virus)之糖蛋白、疮 疹病毒之糖蛋白、骨髓灰白質炎病毒之VPI，以及衍生自 •fe病毒（lentivirus)的序列，最好，但不限於人類免疫缺陷 病毒（HIV)第1型或第2型。在另一個具體實施例中，可設 計成在本發明之嵌合型病毒内的異源基因序列，包括但不 限於馬立克氏（Marek's)病病毒（MDV)之抗原決定位、傳染 性華氏囊炎病毒（IBDV)之抗原決定位、雞貧血病毒、傳染 性喉氣管炎病毒（ILV)、禽流感病毒（AIV)、狂犬病 '貓白 -70- 1344991 (65) 血病病毒、犬瘟熱病毒、水疱性口炎病毒和豬痘病毒之抗 原決定位（參見Fields等人（編輯），1991，FUNDAMENTAL VIROLOGY,第 2版，Raven Press，New York，將其全文以引用 的方式併入本文中）。
本發明其他的異源序列，包括為自體免疫疾病所特有的 抗原。這些抗原通常將衍生自哺乳動物組織的細胞表面、 細胞質、核、粒線體及其類似物，包括糖尿病、多發性硬 化症、全身性紅斑性狼瘡、風濕性關節炎、惡性貧血、愛 迪森氏（Addison's)病、硬皮病、自體免疫萎縮性胃炎、青 少年糖尿病和盤狀紅斑性狼瘡所特有的抗原。
為過敏原之抗原通常包括蛋白質或糖蛋白，包括衍生自 花粉、塵埃、黴 '孢子、皮屑、昆蟲和食物的抗原。此外， 為腫瘤抗原所特有的抗原，通常將衍生自腫瘤組織細胞的 細胞表面、細胞質、核、胞器及其類似物。實例包括腫瘤 蛋白質所特有的抗原，包括由突變之致癌基因編碼的蛋白 質；與腫瘤有關之病毒蛋白質；以及糖蛋白。腫瘤包括’ 但不限於從下列類型之癌症衍生的那些：唇、鼻咽 '咽和 口腔、食道、冒、結腸、直腸、肝臟、膽囊、胰臟、喉、 肺臟和支氣管 '皮膚之黑色素瘤、乳房、子宮頸、卵巢、 膀胱、腎臟、子宮、腦和神經系統的其他部分、甲狀腺、 前列腺、睪丸、霍奇金氏（Hodgkin's)症、非-霍奇金氏淋巴 瘤、多發性骨趟瘤和白血病。 在本發明一個特定的具體實施例中，該異源序列係衍生 自人類免疫缺陷病毒（HIV)，最好是人類免疫缺陷病毒_1 -71 · 1344991
(66) 或人類免疫缺陷病毒-2的基因組。在本發明其他的具體實 施例中，可將該異源密碼序列插入病毒主鏈之基因密碼序 列中，而得以表現在間質肺病毒蛋白質中，含有該異.源肽 序列的嵌合型基因產物。在本發明的這類具體實施例中， 該異源序列亦可衍生自人類免疫缺陷病毒，最好是人類免 疫缺陷病毒-1或人類免疫缺陷病毒-2的基因組。
在異源序列為HIV-衍生的案例中，這類序列可包括，但 不限於衍生自env基因（即編碼全部或部分gpl60、gpl20及/ 或gp41之序列）、pol基因（即編碼全部或部分逆轉錄酶、核 酸内切酶、蛋白酶及/或接合酶之序列）、gag基因（即編碼 全部或部分p7、p6、p55、pl7/18、p24/25之序列）、tat、rev、 nef、vif、vpu、vpr及 / 或 vpx的序歹丨J 。
在其他的具體實施例中，可設計成在嵌合型病毒内的異 源基因序列，包括編碼具有免疫強化活性之蛋白質的那 些。免疫強化蛋白質的實例，包括但不限於細胞激動素、 干擾素第1型、γ干擾素、菌落刺激因子和介白素-1、-2、 -4、 -5、 -6、 -12° 此外，其他可設計成在嵌合型病毒内的異源基因序列， 包括衍生自細菌的抗原，像是細菌表面糖蛋白、衍生自真 菌的抗原，以及衍生自各種其他病原和寄生蟲的抗原。衍 生自細菌病原之異源基因序列的實例，包括但不限於衍生 自下列屬之物種的抗原：沙門氏桿菌屬（Salmonella)、志賀 桿菌屬（Shigella)、衣原體屬（Chlamydia)、螺桿菌屬 (Helicobacter)、耶爾森氏菌·屬（Yersinia)、博德氏菌屬 -72- 1344991 (67) (Bordatella)、假單抱菌屬（pseud〇monas)、奈瑟菌屬（Neisseria) 、派菌屬（Vibrio)、啥血桿菌屬（Haemophilus)、黴聚菌屬 (Mycoplasma)、鏈黴菌屬（Streptomyces)、密螺旋體屬 (Treponema)、柯克斯體屬（Coxiella)、艾利希體屬（Ehrlichia) 、布氏桿鈿屬（Brucella)、鏈桿菌屬（Streptobacillus)、梭菌螺 旋體屬（Fusospirocheta)、螺菌屬（Spirillum)、脲原體屬 (Ureaplasma)、螺旋體屬（Spirochaeta)、黴漿菌屬、放線菌屬 (Actinomycetes)、疏螺旋體屬（Borrelia)、類桿菌屬 (Bacteroides)、奇可莫拉菌屬（Trichomoras)、布藍漢氏菌屬 (Branhamella)、巴斯德菌屬（pasteureiia)、梭狀芽胞桿菌屬 (Clostridium)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、李士 德菌屬 (Listeria)、桿菌屬（Bacillus)、丹毒絲菌屬（Erysipelothrix)、 紅球.菌屬（Rhodococcus)、埃希桿菌屬（Escherichia)、克雷伯 氏才干菌屬（Klebsiella)、假單抱菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter) 、沙雷菌屬（Serratia)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、鍵球菌 屬（Streptococcus)、軍團菌屬（Legionella)、分枝桿菌屬 (Mycobacterium)、變形桿菌屬（pr〇teus)、彎曲桿菌屬 (Campylobacter)、腸球菌屬（Enterococcus)、不動桿菌屬 (Acinetobacter)、摩根菌屬（Morganella) ' 莫拉菌屬（Moraxella) 、檸檬酸細菌屬（Citrobacter)、立克次體屬（Rickettsia)、羅 查利馬氏體屬（Rochlimeae)，以及細菌物種，像是綠膿桿菌 (P. aeruginosa)、大腸桿菌' 蔥頭假單胞菌（p. cepacia)、表皮 葡萄球菌（S. epidermis)、糞腸球菌（E. faecalis)、肺炎鏈球菌 (S. pneumonias)、金黃色葡萄球菌（s. aureus)、腦膜炎奈瑟 -73- 1344991 (68) 菌（N. menirigitidis)、釀膿鏈球菌（S· pyogenes)、敗血性巴斯 德桿菌（Pasteurella multocida)、梅毒螺旋體（Treponema pallidum)和奇異變形菌（P. mirabilis)。
衍生自病原性真菌之異源基因序列的實例，包括但不限 於衍生自下列.真菌的抗原，像是：新型隱球菌（Cryptococcus neoformans);皮炎芽生徽菌（Blastomyces dermatitidis);皮炎 艾洛徽菌（Aiellomyces dermatitidis);笼膜组織胞聚菌 (Histoplasma capsulatum);粗球黴菌（Coccidioides immitis);念 珠囷屬（Candida)物種’包括白色念珠菌（C. albicans)、熱帶 念珠菌（C_ tropicalis)、近平滑念珠菌（C. parapsilosis)、吉利 蒙念珠菌（C. guilliermondii)和克魯斯念珠菌（C. krusei)，麴 菌屬（Aspergillus)物種’包括煙麴菌（A. fumigatus)、黃麴菌 (A. flavus)和黑麴菌（A. niger)，根徽菌屬（Rhizopus)物種；根 毛黴菌屬（Rhizomucor)物種；克銀漢徽屬（Cunninghammella) 物種；囊托黴菌屬（Apophysomyces)物種，包括沙氏囊托黴 菌（A. saksenaea)、毛黴菌（A. mucor)和棘子鬚黴菌（A. absidia);申克氏抱子絲菌（Sporothrix schenckii)、巴西副球 黴菌（Paracoccidioides brasilie nsis);波迪假黴樣真菌 (Pseudallescheria boydii)、光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata); 毛癖菌屬（Trichophyton)物種、小芽抱菌屬（Microsporum)物 種和皮癬菌屬（Dermatophyres)物種，以及任何目前已知或 稍後確認為病原性的其他酵母菌或真菌。 最後，衍生自寄生蟲之異源基因序列的實例，包括但不 限於衍生自頂複動物門（Apicomplexa)之成員的抗原，像是 -74- 1344991 (69)
例如焦蟲屬（Babesia)、弓纸蟲屬（Toxoplasma)、瘇原蟲屬 (Plasmodium) ' 艾美球蟲屬（Eimeria) ' 等抱球蟲屬（Isospora)、 阿托索漿蟲屬（Atoxoplasma)、囊等抱球蟲屬（Cystoisospora) 、哈蒙蟲屬（Hammondia)、貝諾蟲屬（Besniotia)、肉孢子蟲 屬（Sarcocystis)、福瑞克蟲屬（Frenkelia)、血變形蟲屬 (Haemoproteus) '白血球抱子蟲屬（Leucocytozoon)、赛利爾梨 衆蟲屬（Theileria)、普金蟲屬（Perkinsus)和抱子蟲屬 (Gregarina spp.);卡氏肺抱子蟲（Pneumocystis carinii);微孢 子門（Microspora)的成員，像是例如小抱子蟲屬（Nosema)、 腸微孢子蟲屬（Enterocytozoon)、腦炎微孢子蟲屬 (Encephalitozoon)、赛普塔塔蟲屬（Septata)、馬拉辛訊蟲屬 (Mrazekia)、純孢子蟲屬（Amblyospora)、阿美森蟲屬（Ameson) '格留蟲屬（Glugea)、普抱子蟲屬（Pleistophora)和微抱子屬 (Microsporidium spp.);以及奇異抱子蟲門（Ascetospora)的成 員，像是例如單抱子蟲屬（Haplosporidium spp.)，以及包括 下列的物種：惡性癦原蟲（Plasmodium falcipa-rum)、間日遽 原蟲（Ρ_· vivax)、卵形癔原蟲（P. ovale)、三日癔原蟲（P. malaria);鼠弓聚蟲（Toxoplasma gondii);墨西哥利什曼原蟲 (Leishmania mexicana)、熱帶利什曼原蟲（L. tropica)、碩大利 什曼原蟲（L. major)、埃塞俄比亞利什曼原蟲（L. aethiopica) 、杜氏利什曼原蟲（L. donovani)、克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi)、布氏錐蟲（T. brucei)、曼氏住血吸蟲（Schistosoma mansoni)、埃及住血吸蟲（S. haematobium)、日本住血吸蟲（S_ japonium);旋毛蟲（Trichinella spiralis);班氏吳策絲蟲 -75- 1344991
(70) (Wuchereria bancrofti);馬來布魯線蟲（Brugia malayli);溶組 織内阿米巴（Entamoeba histolytica);虫堯.蟲（Enterobius vermiculoarus);有鈎絛蟲（Taenia solium)、無鈎絛蟲（T. saginata):陰道滴蟲（Trichomonas vaginatis)、人滴蟲（Τ. hominis)、口腔毛滴蟲（T. tenax);腸梨形蟲（Giardia lamblia); 短小隱抱子蟲（Cryptosporidium parvum);卡氏肺抱子蟲、牛 焦蟲（Babesia bovis)、分歧焦蟲（B. divergens)、田鼠焦蟲（Β· microti)、貝氏等抱球蟲（Isospora belli)、人焦蟲（L. Hominis); 脆弱雙核阿米_巴（Dientamoeba fragilis);人盤尾絲蟲 (Onchocerca volvulus);人細蟲（Ascaris lumbricoides);美洲釣 蟲（Necator americanis);十二指腸鈞蟲（Ancylostoma duodenale);糞類圓線蟲（Strongyloides ster-coralis);菲律賓 毛細線蟲（Capillaria philippinensis);廣東血管圓線蟲 (Angiostrongylus cantonensis);短小包膜絛蟲（Hymenolepis nana);闊節裂頭絛蟲（Diphy-llobothrium latum);細粒棘球絛 蟲（Echinococcus granulosus)、多房型棘球絛蟲（Ε· multilocularis);衛氏并殖吸蟲（Paragonimus westermani)、卡 列并殖吸蟲（Ρ· caliensis);中華後睪吸蟲（Clonorchis sinensis) ;描後睪吸蟲（Opisthorchis felineas) '維氏囊腹雙口吸蟲（G. viverini)、肝虫至（Fasciola hepatica)、疥 _ 蟲（Sarcoptes scabiei)、 人兹（Pediculus humanus);陰蟲（Phthir丨us pubis)和人膚虫51 (Dermatobia hominis)，以及任何目前已知或稍後確認為病原 性的其他寄生蟲。 4.4.2.異源基因序列的插入 -76- 1344991
可藉著以異源序列完全置換病毒之密碼區，或藉著部分 置換，或藉著將異源核苷酸序列加至病毒基因組中，完成 將外來基因序列插入本發明之病毒載體内的作用。完全置 換可能最好是經由使用PCR-指定之突變生成作用來完 成。簡言之，PCR-引子A，從5'至3’端，將含有：獨特的限 制酵素位置，像是第11S級的限制酵素位置（即”轉移者 (shifter)"酵素；它認得特定的序列，但切開在該序列上游 或下游的DNA); —片與待置換之基因區互補的核茹酸； 以及一片與異源序列之羧基-端密碼部分互補的核苷酸。 PCR-引子B，從5'至3'端，將含有：獨特的限制酵素位置； 一片與待置換之基因互補的核苷酸；以及一片與異源或非 -天然基因之5'密碼部分互補的核苷酸。在使用這些引子 與異源或非-天然基因之選殖副本的PCR反應之後，可切除 產物，並使用獨特的限制位置選殖。以第11 S級的酵素消 化，並利用經過純化之噬菌體聚合酶轉錄，將產生含有病 毒基因之正確未轉譯末端，其現在帶有異源或非-天然基 因的插入。在另一個具體實施例中，可使用PCR-誘發的反 應，來製備含有噬菌體啟動基因序列和雜種基因序列的雙 股DNA，而得以直接轉錄模板，不需選殖。 可將異源核苷酸序列加入或插入本發明之病毒的各種 位置。在一個具體實施例中，將異源核甞酸序列加入或插 入位置1。在另一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加 入或插入位置2。在另一個具體實施例中，將異源核甞酸 序列加入或插入位置3。在另一個具體實施例中，將異源 •77- 1344991 (72)
核荅酸序列加入或插入位置4。在另一個具體實施例中， 將異源核甞酸序列加入或插入位置5。在另一個具體實施 例中，將異源核苷酸序列加入或插入位置6。當在本文中 使用”位置” 一詞時，意指在該異源核甞酸序列在待轉錄之 病毒基因組上的位置，例如，位置1意指它是第一個待轉 錄的基因，而位置2意指它是第二個待轉錄之基因。在病 毒之較低-編號位置處插入異源核苷酸序列，與在較高-編號位置處的插入相比較，通常產生較強的異源核苷酸序 列表現，是因為跨越病毒基因組存在的轉錄梯度。然而， 轉錄梯度亦產生特定比例的病毒mRNAs。外來基因的插入 將擾亂這些比例，並導致不同量之病毒蛋白質的合成，其 可能影響病毒的複製。因此，在選擇插入位置時，必須考 量轉錄梯度和複製動力學。若想要異源核甞酸序列的強表 現，在較低-編號的位置處插入異源核苷酸序列，是本發 明較佳的具體實施例。在較佳的具體實施例中，在位置1、 2或3處加入或插入異源序列。 當將 '異源核甞酸序列插入本發明之病毒内時，可改變在 異源基因之密碼序列末端與下游基因之密碼序列起點之 間的基因間區域，而達到想要的效果。當在本文中使用” 基因間區域” 一詞時，意指在一個基因之中止信號與下一 個下游開放編閱架構之密碼序列的起始密碼子（例如AUG) 之間的核苷酸序列。基因間區域可包括基因的非-密碼 區，即是在轉錄開始位置與基因之密碼序列的起點（AUG) 之間。該非-密碼區天然存在於一些病毒基因中。 -78- 1344991 (73)
在各種具體實施例中，可彼此獨立地設計在異源核荅酸 序列與下游基因之間的基因間區域，使其長度為至少10 個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核荅酸、至少50個 核甞酸、至少75個核苷酸、至少100個核甞酸、至少125個 核苷酸、至少150個核苷酸、至少175個核甞酸或至少200 個核芬酸。在某些具體實施例中，可彼此獨立地設計在異 源核茹酸序列與下游基因之間的基因間區域，使其長度為 最多10個核苷酸、最多20個核苷酸、最多30個核#酸、最 多50個核苷酸、最多75個核苷酸、最多100個核甞酸、最 多125個核甞酸、最多150個核苷酸、最多175個核#酸或最 多200個核苷酸。在各種具體實施例中，亦可彼此獨立地 設計在病毒基因組中想要基因的非-密碼區，使其長度為 至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至 少50個核苷酸、至少75個核苷酸、至少100個核苷酸、至 少125個核苷酸、至少150個核苷酸、至少175個核穿酸或至 少200個核苷酸。在某些具體實施例中，亦可彼此獨立地 設計在·病毒基因組中想要基因的非-密碼區，使其長度為 最多10個核#酸、最多20個核甞酸、最多30個核荅酸、最 多50個核甞酸、最多75個核站酸、最多100個核苷酸、最 多125個核苷酸、最多150個核苷酸、最多175個核苷酸或最 多200個核芸酸。 當插入異源核苷酸序列時，可合併使用位置的影響和基 因間區域的操縱，以便達到想要的效果。例如，可在選自 由位置1、2、3、4、5和6處所組成之群的位置，加入或插 •79- 1344991
入異源核钻酸序列，並可改變在異源核苷酸序列與下一個 下游基因之間的基因間區域（參見表3)。藉著在表3中的舉 例說明，出示本發明所包括的一些组合。 表3.異源核荅酸序列之插入模式的實例 位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6 IGRa 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20 IGR 21-40 21-40 21-40 21-40 21-40 21-40 IGR 41-60 41-60 41-60 41-60 41-60 41-60 IGR 61-80 61-80 61-80 61-80 61-80 61-80 IGR 81-100 81-100 81-100 81-100 81-100 81-100 IGR 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120 IGR 121-140 121-140 121-140 121-140 121-140 121-140 IGR 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160 IGR 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180 IGR 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200 IGR 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220 IGR 221-240 221-240 221-240 221-240 221-240 221-240 IGR 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260 IGR 261-280 261-280 261-280 261-280 261-280 261-280 IGR 281-300 281-300 281-300 281-300 281-300 281-300 a基因 間區域，以 核苷酸 測量 依據插入異源： 核苷酸序列之目 的（例如 具有強的 免疫原 性）， 可藉著各種 指標來 判定插入的位置 和所插入 之異源 -80- 1344991
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核荅酸序列的基因間區域之長度，包括但不限於複製動力 學，以及藉著下列非-限制性的測定實例，測量到的蛋白 質或mRNA表現程度：溶菌斑測定、螢光·焦點測定、感染 中心測定、轉化測定、終點稀釋測定、電鍍效力、電予顯 微鏡、血球凝集作用、病毒酵素活性的測量、病毒中和作 用、血球凝集抑制作用、補體固定、免疫染色、免疫沉澱 和免疫墨點、酵素連接之免疫吸附測定、核酸檢測（例如 南方墨點分析、北方墨點分析、西方墨點分析）、生長曲 線、報告者基因的使用（例如使用報告者基因，像是綠螢 光蛋白質（GFP)或增強的綠螢光蛋白質（eGFP)，整合到病毒 基因組，以與感興趣之異源基因相同的方式，觀察蛋白質 表現），或其組合。進行這些測定的程序，為此項技藝中 已熟知的（參見，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press第25-56頁，將全文以引用的方式併入本文中）， 並在下文的實例章節中，提供非-限制性的實例。 例如 '，可藉著以本發明之病毒感染培養的細胞，並接著 藉著例如西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之基 因產物專一的抗體，測量蛋白質的表現程度，或藉著北方 墨點分析，使用對該異源序列專一的探針，測量RNA的表 現程度，來判定表現程度。同樣地，可藉著感染動物模式， 並在該動物模式中，測量來自本發明之重組病毒的異源序 列的蛋白質表現程度，來判定該異源序列的表現程度。可 藉著從被感染的動物中獲得组織試樣，然後使該組織試樣 -81 - 1344991 (76) ·1|, . . J f ί>· i》- 接受西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之基因產 物專一的抗體，來測量蛋白質的含量《此外，若使用動物 模式，便可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，包括但不限 於ELISA，來判定該動物對異源序列之基因產物所產生之 抗體的力價。
因為異源序列可以是與在病毒之基因組中的核茹酸序 列同種的，故應小心地採用確實對該異源序列或其基因產 物專一的探針和抗體。
在某些特定的具體實施例中，可藉著熟諳此藝者已知的 任何技術，判定來自嵌合型禽-人類間質肺病毒之hMPV的 F-蛋白質之表現程度。可藉著以本發明之嵌合型病毒，感 染培養的細胞，並藉著例如西方墨點分析或ELISA，使用 對hMPV之F-蛋白質及/或G-蛋白質專一的抗體，測量蛋白 質的表現程度，或藉著例如北方墨點分析，使用對人類間 質肺病毒之F-基因及/或G-基因專一的探針，測量RNA的表 現程度，來判定F-蛋白質的表現程度。同樣地，可使用動 物模式·，藉著感染動物，並在該動物模式中，測量F-蛋白 質及/或G-蛋白質的含量，來判定該異源序列的表現程 度。可藉著從被感染的動物中獲得組織試樣，然後使該组 織試樣接受西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之 F-蛋白質及/或G-蛋白質專一的抗體，來測量蛋白質的含 量。此外，若使用動物模式，便可藉著任何熟諳此藝者已 知的技術，包括但不限於ELIS A，來判定該動物對F-蛋白^ 質及/或G-蛋白質所產生之抗體的力價。 -82- 1344991 (77) 可藉著熟諳此藝者已知的任何技術，判定本發明之重組 病毒的複製速率。
在某些具體實施例中，欲更容易地確認異源序列在病毒 基因组中的最佳位置，以及基因間區域的最佳長度，可使 該異源序列編碼報告者基因。一旦決定最佳的參數，便由 編碼所選出之抗原的異源核苷酸序列代替該報告者基 因。在本發明之方法中，可使用任何熟諳此藝者已知的報 告者基因。關於更多的細節，參見4.7.1 3節。
可藉著任何熟諳此藝者已知的標準技術，判定重組病毒 的複製速率。可以病毒的生長速率表示複製速率，並可藉 著將病毒力價對感染後的時間作圖，來判定之。可藉著任 何熟諳此藝者已知的技術，測量病毒力價。在某些具體實 施例中，將含有病毒的懸浮液與易被該病毒感染的細胞一 起培養。可在本發明之方法中使用的細胞類型，包括但不 限於 Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF 1043(HEL) 細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、tMK細胞、293細胞、QT 6 細胞、QT 35細胞或雞胚纖維母細胞（CEF)。在將病毒與細 胞一起培養之後，判定被感染細胞的數目。在某些特定的 具體實施例中，病毒包括報告者基因。因此，表現報告者 基因之細胞的數目，代表被感染細胞的數目。在特定的具 體實施例中，病毒包括編碼eGFP的異源核Ϋ酸序列，並使 用FACS判定表現eGFP之細胞的數目，即被該病毒感染之細 胞的數目。 在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率， -83 - 1344991 (78) 最多是在相同條件下，從其中衍生該重组病毒之野外型病 毒的複製速率的20%。相同的條件意指相同的開始病毒力 價、相同的細胞品系、相同的培養溫度、生長培養基、細 胞數目，以及其他可能影響複製速率的試驗條件。例如， 在位置1處帶有PIV之F基因的APV/hMPV的複製速率，最多 是APV之複製速率的20%。
在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率， 最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病 毒的複製速率的5%、最多10%、最多20%、最多30%、最多 40%、最多50%、最多75%、最多80%、最多90%。在某些具 體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率，至少是在相 同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速 率的5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少 50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些具體實施例 中，本發明之重組病毒的複製速率，是在相同4件下，從 其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速率的5%到 20%之間、10%到40%之間、25%到50%之間、40%到75%之 間、50%到80%之間，或75%到80%之間。 在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序 列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組 病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的20%。相同的 條件意指相同的開始病毒力價、相同的細胞品系、相同的 培養溫度、生長培養基、細胞數目，以及其他可能影響複 製速率的試驗條件。例如，在hMPV之位置1處，PIV3之F- -84- 1344991
(79) 蛋白質的異源序列的表現程度，最多是hMVP之F-蛋白質 的表現程度的20%。
在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序 列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組 病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的5%、最多 10%、最多20%、最多30%、最多40%、最多50%、最多75%、 最多80%、最多90%。在某些具體實施例中，在本發明之 重組病毒中的異源序列的表現程度，至少是在相同條件 下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表 現程度的5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、 至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些具體實 施例中，在本發明之重組病毒中的異源序列的表現程度， 是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的 F-蛋白質之表現程度的5%到20%之間、10%到40%之間、25% 到50%之間、40%到75%之間、50%到80%之間，或75%到90% 之間。 4.4.3.將異源基因序列插入G基因内 G蛋白質是間質肺病毒的穿透膜蛋白質。在特定的具體實 施例中，將該異源序列插入編碼外功能部位之G-ORF的區 域内，而得以在病毒被膜的表面上表現它。在一種方法 中，可將異源序列插入抗原位置内，不刪除任何病毒的序 列。在另一種方法中，以異源序列置換G-ORF之序列。這 類構築體的表現產物，可用在對抗外來抗原的疫苗中，且 確實可規避重组病毒在接種疫苗之宿主中繁殖的問題。僅 -85- 1344991 (80) 在抗原位置發生取代的完整G分子，仍可給予G功能，並因 此容許建構可存活的病毒。因此，該病毒不需添加額外的 協助者功能便可生長。亦可以其他方式將該病毒減毒，以 避免任何意外逃脫的危險。 可進行其他的雜種建構，在細胞表面表現蛋白質，或得 以從細胞中釋放它們。 4.4.4.二順反子之RNA的建構
可建構二順反子的mRNA，容許從内部開始病毒序列的 轉譯，並容許從正常的終端開始位置，表現外來蛋白質之 密碼序列。或者，可建構二順反子的mRNA序列，其中從 正常終端的開放編閱架構，轉譯病毒序列，而從内部位置 開始外來序列。可使用某些内部的核糖體進入位置（IRES) 序列。應選擇短得足以避免千擾MPV之包裝限制的IRES序 列。因此，為這類二順反子方法所選出的IRES，長度最好 不超過500個核苷酸。在特定的具體實施例中，該IRES係 衍生自細小核糖核酸病毒，且不包括任何額外的細小核糖 核酸病毒之序列。較佳的IRES元件包括，但不限於哺乳動 物BiP IRES和C型肝炎病毒IRES。 或者，可從新的内部轉錄單位來表現外來蛋白質，其中 該轉錄單位具有開始位置和聚腺：y：酸化作用位置。在另一 個具體實施例中，將外來基因插入MPV基因内，使得所得 的表現蛋白質為融合蛋白質。 4.5.使用重組的cDNA和RNA模板，表現異源基因產物 可使用按照上述製備的病毒載體和重組模板，以各種方 -86- 1344991
(81) 式在適當的宿主細胞中，表現異源基因產物，或創造表現 該異源基因產物的嵌合型病毒。在一個具體實施例中，可 使用重组的cDNA，轉移感染適當的宿主細胞，而所得的 RNA可以高程度指揮該異源基因產物的表現。提供高程度 表現之宿主細胞系統，包括供應病毒功能的連續細胞株， 像是分別以APV或MPV重複感染的細胞株、設計補足APV 或MPV功能的細胞株等等。
在本發明另一個具體實施例中，可使用重组模板，轉移 感染表現病毒聚合酶蛋白質的細胞株，以便達成該異源基 因產物的表現。為了這個目的，可利用表現聚合酶蛋白 質，像是L蛋白質的轉化細胞株，作為適當的宿主細胞。 可以類似的方式設計宿主細胞，提供其他的病毒功能，或 額外的功能，像是G或N。
在其他的具體實施例中，協助者病毒可提供由細胞利用 的RNA聚合酶蛋白質，以便達成該異源基因產物的表現。 在另一個具體實施例中，可利用編碼病毒蛋白質，像是 N、P、L和M2- 1蛋白質的載體，轉移感染細胞。 4.6.解救重組的病毒顆粒 為了製備本發明之嵌合型和重組病毒，可使用編碼本發 明之重组或嵌合型病毒之基因組的cDNA，以+或-義轉移 感染提供複製和解救所需之病毒蛋白質和功能的細胞。或 者，可在藉著編碼本發明之重組病毒的DNA或RNA分子轉 移感染之前、期間或之後，以協助者病毒轉移感染細胞。 可藉著幾個熟諳此藝者已知的技術，按照在1992年11月24 -87- 1344991 (82) • -a} ·, * ; ..
曰發證之美國專利第5,166,057號；在1998年12月29日發證之 美國專利第5,854,037號；在1996年2月20曰發表之歐洲專利 公開案EP 0702085A1 ;在美國專利申請案第09/ 152,845號； 在1997年4月3日發表之國際專利公開案PCT WO 97/12032 ; 在1996年11月7曰發表之WO 96/34625 ;在歐洲專利公開案 EP-A 780475 ;在 1999年 1 月 21 日發表之 WO 99/02657 ;在 1998 年11月26日發表之WO 98/53078;在1998年1月22日發表之WO 98/02530 ;在 1999年 4月 1 日發表之 WO 99/ 15672 ;在 1998年 4 月2日發表之WO 98/ 13501 ;在1997年2月20日發表之WO 97/06270 ;以及在1997年6月25日發表之EPO 780 47SA1中的 描述，分別將其全文以引用的方式併入本文中，在傳染性 病毒顆粒内複製並解救本發明之合成的重組質體DNAs和 RNAs。
在本發明的一個具體實施例中，可製備合成的重組病毒 RNAs，其含有由病毒聚合酶認出，以及產製成熟病毒粒 子所需之包裝信號所必要的負股病毒RNA之非密碼區。可 使用許 '多不同的方法，將逆向遺傳法應用在解救負股RNA 病毒上。首先，從重組的DNA模板中合成重組的RNAs，並 在活體外利用經過純化的病毒聚合酶複合物重建，形成重 组的核糖核蛋白（RNPs)，可用它來轉移感染細胞。在另一 種方法中，若在活體外或在活體内，在合成RNAs的轉錄 期間出現病毒的聚合酶蛋白質，則達成更有效的轉移感 染。利用該方法，可從cDNA質體轉錄合成的RNAs，其在 活體外與編碼聚合酶蛋白質之cDNA質體共同-轉錄，或在 -88 - 1344991 (83) 活體内，在聚合酶蛋白質的存在下轉錄，即在暫時性或在 组成上表現聚合酶蛋白質的細胞中。
在本文描述的其他方法中，可在表現間質肺病毒聚合酶 蛋白質的宿主細胞系統中（例如，在病毒/宿主細胞表現系 統中；設計成表現聚合酶蛋白質之經過轉化的細胞株，等 等），重複有傳染性之嵌合型病毒的產製，而得以解救有 傳染性之嵌合型或重組病毒。在該例子中，不需使用協助 者病毒，因為藉著所表現之病毒聚合酶蛋白質，提供該功 能。
根據本發明，可使用任何熟諳此藝者已知的技術，達成 重組和嵌合型病毒的複製和解救。一種方法涉及在轉移感 染宿主細胞之前，在活體外供應複製所需的病毒蛋白質和 功能。在這類的具體實施例中，可以野外型病毒、協助者 病毒、經過純化之病毒蛋白質，或以重組表現之病毒蛋白 質的形式，提供病毒蛋白質。可在編碼嵌合型病毒之合成 cDNAs或RNAs的轉錄之前、期間或之後，提供病毒蛋白 質。可使用整個混合物來轉移感染宿主細胞。在另一種方 法中，可在編碼嵌合型病毒之合成cDNAs或RNAs的轉錄之 前或期間，提供複製所需之病毒蛋白質和功能。在這類的 具體實施例中，可以野外型病毒、協助者病毒、病毒萃取 物、合成之cDNAs或RNAs，其經由感染或轉移感染導入宿 主細胞内，來表現病毒蛋白質的形式，提供病毒蛋白質。 該感染/轉移感染，係在導入編碼嵌合型病毒之合成cDNAs 或RNAs之前，或與其同時發生。 -89- 1344991
(84)
在特別想要的方法中，設計細胞使其表現本發明之嵌合 型或重組病毒的所有基因，即APV、MPV、MPV/APV或 APV/MPV，結果可能產生有傳染性的病毒，其含有想要的 基因型；因此排除了對選擇系統的需求。在理論上，可利 用外來序列代替編碼MPV之結構蛋白質的任一個OPFs，或 任一個ORFs的一部分。然而，該等式的必要部分為繁殖有 缺陷之病毒的能力（因為漏掉或改變正常的病毒基因產物 而變成有缺陷的）。可利用許多可能的方法，規避該問題》 在一種方法中，可使具有突變蛋白質的病毒生長在細胞株 中，將該細胞株建構成，或使其在组成上表現相同蛋白質 之野外型版本。以此方式，使該細胞株補足了病毒中的突 變。可使用類似的技術，建構經過轉化的細胞株，使其在 組成上表現任何的MPV基因。可使用這些能夠表現病毒蛋 白質的細胞株，補足在嵌合型或重組病毒中的缺陷，並藉 此繁殖它。或者，可利用某些天然的宿主排列系統，來繁 殖嵌合型或重組病毒。 在另一個具體實施例中，可以合成的cDNAs或RNAs之形 式，作為遺傳材料，來供應複製所需之病毒蛋白質和功 能，使其與編碼嵌合型病毒的合成cDNA或RNAs共同-轉 錄。在特別想要的方法中，將表現嵌合型病毒和病毒聚合 酶，及/或其他病毒功能的質體，共同-轉移感染到宿主細 胞内。例如，可將編碼基因組或反基因組之APV、MPV、 有或無一或多個異源序列的質 體，與編碼間質肺病毒聚合酶蛋白質N、P、L或M2- 1的質 -90· 1344991
(85)
體，共同-轉移感染到宿主細胞内。或者，可藉著使用編 碼T7 RNA聚合酶之經過修改的疫苗病毒安卡拉（Modified Vaccinia Virus Ankara) (MVA)，或MVA與編碼聚合酶蛋白質 (N、P和L)之質體的組合，達成本發明之重組病毒的解救。 例如，可將MVA-T7或禽痘-T7感染到Vero細胞、LLC-MK-2 細胞、Hep-2細胞、LF 1043(HEL)細胞、tMK細胞、LLC-MK2 細胞、HUT 292、FRHL-2(恆河猴）、FCL-1(綠猴）、WI-38(人 類）、MRC-5(人類）細胞、293 T細胞、QT 6細胞、QT 35細胞 和CEF細胞内。在以MVA-T7或禽痘-T7感染之後，可將編碼 本發明之重组病毒的全長反基因組cDNA與編碼N、P、L和 M2-1之表現質體，一起轉移感染到細胞内。或者，可藉著 質體轉移作用，提供聚合酶。接著可收獲細胞和細胞上清 液，並接受單次的冷凍-融解。然後可使用所得的細胞溶 胞產物，在1 - β - D-阿拉伯夫喃糖基胞p密咬（ara C)，一種疫 苗病毒之複製抑制劑的存在下，感染新鮮的HeLa或Vero細 胞單層，產生病毒母液。然後從這些培養盤中收獲上清液 和細胞·，冷凍-融解一次，並藉著病毒溶菌斑的免疫染色， 使用對特定病毒專一的抗血清，測定本發明之重組病毒顆 粒的存在。 其他繁殖嵌合型或重組病毒的方法，可能涉及與野外型 病毒共同-培養。這可藉著簡單地取得重組的病毒，並以 該病毒和其他野外型病毒共同-感染細胞來進行。野外型 病毒應該補足有缺陷的病毒基因產物，並容許野外型和重 组病毒兩者生長。或者，可使用協助者病毒，供應重組病 -91 - 1344991 (86) 毒的繁殖。
在另一種方法中，可在以表現間質肺病毒聚合酶蛋白質 之重組病毒共同-感染的細胞中，複製合成的模板。事實 上，可使用該方法，根據本發明來解救重組有傳染；丨生的病 毒。為了這個目的，可在任何表現載體/宿主細胞系統， 包括但不限於病毒表現載體（例如疫苗病毒、腺病毒、桿 狀病毒等等），或表現聚合酶蛋白質的細胞株中，表現間 質肺病毒聚合酶蛋白質（參見，例如Krystal等人，1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2709-2713)。再者，表現所有間質肺 病毒蛋白質之宿主細胞的感染，可能導致有傳染性之嵌合 型病毒顆粒的產生《請注意有可能建構不改變病毒存活力 的重組病毒。這些經過改變的病毒將能夠生長，且不需協 助者的功能便可複製。
轉移感染的程序為熟諳此藝者已熟知的，包括但不限於 DEAE-葡聚醣-調解、磷酸鈣調解、電穿透作用和微脂粒-調解的轉移感染。 ' 可從數個較小的PCR片段，裝配全長的病毒基因组。在 圖28中出示hMPV之不同分離株的限制舆圖。可使用該限 制位置裝配全長的構築體。在某些具體實施例中，設計 PCR引子，使得由PCR反應所產生之片段具有接近其5'端的 限制位置，以及接近其3'端的限制位置。然後可利用個別 的限制酵素消化該PCR產物，接著連接相鄰的PCR片段。 4.7,重組病毒的減毒 可進一步以遺傳方式設計本發明的重組病毒，以便表現 -92- 1344991 (87)
出減毒的表現型。特別是在對其投予作為疫苗之病毒的個 體中，本發明之重組病毒表現出減毒的表現型。可藉著任 何熟諳此藝者已知的方法，完成減毒作用。未與理論結 合，例如，可藉著在預定之宿主中，使用天生不能完美複 製的病毒（例如在人類中使用APV)，或藉著相對於該病毒 之野外型品系，降低基因組的複製、降低病毒感染宿主細 胞的能力，或降低病毒蛋白質裝配成有傳染性之病毒顆粒 的能力，而引起重组病毒的減毒表現型。可使用迷你基因 组（minigenome)測'定（參見4·5· 1節），測試病毒某些序列，像 是前導和拖尾序列的存活力。
可藉著任何熟諳此藝者已知的方法（參見，例如4.8節）， 來測試本發明之重組病毒的減毒表現型。例如，可針對其 感染宿主的能力，或在細胞培養系統中複製的速率，來測 試候選病毒。在某些具體實施例中，當被改變之基因為 N、P、L、M2、F、G、M2- 1、M2-2或其組合時，使用迷你 基因组系統，測試減毒的病毒。在某些具體實施例中，使 用在不·同溫度下的生長曲線，測試減毒的病毒。例如，減 毒的病毒能夠在35°C下生長，但不能在39或40°C下生長。 在某些具體實施例中，可使用不同的細胞株，評估病毒的 減毒表現型。例如，減毒的病毒僅能在猴子細胞株中生 長，但不能在人類細胞株中生長，或對減毒之病毒而言， 在不同細胞株中可獲得的病毒力價是不同的。在某些具體 實施例中，使用在小動物模式的呼吸道中複製的病毒，包 括但不限於倉屬鼠、棉鼠、老鼠和天竺鼠，來評估病毒的 -93- 1344991 (88) 減毒表現型。在其他的具體實施例中，使用由該病毒引起 的免疫反應，包括但不限於抗體力價（例如，藉著溶菌斑 降低中和測定或ELISA來測定），評估病毒的減毒表現型。 在特定的具體實施例中，以低劑量進行溶菌斑降低中和測 定或ELISA。在某些具體實施例中，可測試重組病毒在動 物模式中誘發病理學徵候的能力。病毒在動物模式中降低 誘發病理學徵候的能力，代表它的減毒表現型。在特定的 具體實施例中，在猴子模式中對鼻感染測試候選的病毒， 並藉著黏液的產生表示。 可將本發明之病毒減毒，而使得病毒的一或多個功能特 徵受損。在某些具體實施例中，與從其中衍生該減毒病毒 的病毒之野外型品系相比較，來測量減毒作用。在其他的 具體實施例中，藉著比較減毒病毒在不同宿主系統中的生 長，來判定減毒作用。因此，關於非-限制性的實例，與 APV在禽類宿主中的生長相比較，若降低了 APV在人類宿 主中的生長，便將在人類宿主中生長的APV稱為減毒的。 在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿 主，能夠在宿主中複製，而得以產生有傳染性的病毒顆 粒。然而，與野外型品系相比較，減毒的品系生長至較低 的力價，或生長得更慢。可使用任何熟諳此藝者已知的技 術，判定減毒病毒的生長曲線，並將其與野外型病毒的生 長曲線相比較。關於代表性的方法，參見下文的實例章 節。在特定的具體實施例中，減毒的病毒在按照實例22 中描述的條件下，在Vero細聦中，生長至低於105 pfu/毫 -94- 1344991 (89) 升、低於104 pfu/毫升、低於103 pfu/毫升，或低於102 pfu/ 毫升的力價。 在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒（例如嵌合型 哺乳動物MPV)在人類細胞中，不能像野外型病毒（例如野 外型哺乳動物MPV) —樣好地複製。然而，減毒的病毒能 夠在缺乏干擾素功能的細胞株，像是Vero細胞中良好地複 製。
在其他的具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿 主、在宿主中複製，並使本發明之病毒的蛋白質插入細胞 質膜内，但減毒病毒不能使宿主產生新的有傳染性的病毒 顆粒。在某些具體實施例中，減毒病毒以與野外型哺乳動 物病毒相同的效力，感染宿主、在宿主中複製，並使病毒 蛋白質插入宿主的細胞質膜内。在其他的具體實施例中， 與野外型病毒相比較，減毒病毒降低了使待插入細胞質膜 内之病毒蛋白質進入宿主細胞内的能力。在某些具體實施 例中，與野外型病毒相比較，減毒的哺乳動物病毒降低了 在宿主 '中複製的能力。可使用任何熟諳此藝者已知的技 術，判定病毒是否能夠感染哺乳動物細胞、在宿主内複 製，並使病毒蛋白質插入宿主的細胞質膜内。關於解釋性 的方法’參見4.8節。 在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿 主。然而，與野外型哺乳動物MPV相反，減毒的哺乳動物 MPV不能在宿主中複製。在特定的具體實施例中，減毒的 哺乳動物病毒可感染宿主，並可使宿主將病毒蛋白質插入 -95 - 1344991 (90) 其細胞質膜内，但減毒病毒不能在宿主中複製。可使用任 何熟諳此藝者已知的方法，測試減毒的哺乳動物MPV是否 感染宿主細胞，並使宿主將病毒蛋白質插入其細胞質膜 内。
在某些具體實施例中，與野外型病毒感染相同宿主的能 力相比較，減毒的哺乳動物病毒降低了感染宿主的能力。 可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定病毒是否能夠感 染宿主。關於解釋性的方法，參見4.8節。
在某些具體實施例中，將突變（例如錯義突變）導入病毒 的基因組内，產生具有減毒表現型的病毒。可將突變（例 如錯義突變）導入重組病毒的N-基因、P-基因、M-基因、 F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因内。突變可 以是添加、取代、刪除或其組合。在特定的具體實施例中， 導入N、P、L、F、G、M2-1、M2-2或M2蛋白質的單一胺基 酸刪除突變，可在迷你-基因组測定系統中，就官能度來 篩選之，並在病毒中評估預期的官能度。在更特定的具體 實施例中，錯義突變是感冷性的突變。在其他的具體實施 例中，錯義突變是感熱性的突變。在一個具體實施例中， 移除病毒之P蛋白質的主要磷酸化作用位置》在另一個具 體實施例中，將突變或突變們導入病毒的L基因内，產生 感溫性的品系。在另一個具體實施例中，以不發生切開， 或以極低之效率發生切開的方式，使F基因之切開位置產 生突變。 在其他的具體實施例中，在重組病毒的基因組中導入刪 -96- 1344991
(91) 除。在更特定的具體實施例中，可將刪除導入重組病毒的 N -基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、 G -基因或L -基因内。在特定的具體實施例中，該刪除是在 本發明之重組病毒的M2-基因中。在其他特定的具體實施 例中，該刪除是在本發明之重組病毒的S Η -基因中。在另 一個特定的具體實施例中，刪除Μ 2 -基因和S Η -基因兩者。
在某些具體實施例中，修改重組病毒的基因間區域。在 一個具體實施例中，改變基因間區域的長度。在另一個具 體實施例中，從病毒基因組的5'至3'，將基因間區域洗牌。 在其他的具體實施例中，改變重組病毒之基因或基因們 的基因組位置。在一個具體實施例中，將F或G基因移至 基因组的3'端。在另一個具體實施例中，將Ν基因移至基 因組的5'端。
在某些具體實施例中，藉著以不同物種、不同亞組或不 同變種之病毒的基因，代替野外型病毒的基因，達成病毒 的減毒作用。在解釋性的具體實施例中，可利用APV的Ν-基因、Ρ-基因、Μ-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因，分別代替MPV的Ν-基因、Ρ-基因、Μ-基因、 F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在其他解 釋性的具體實施例中，可利用哺乳動物MPV的Ν-基因、Ρ-基因、Μ-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因，分別代替APV的Ν-基因、Ρ-基因、Μ-基因、F-基因、 M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在較佳的具體實施 例中，藉著以不同物種之病毒的基因，代替一或多個與聚 -97- 1344991 (92) 合酶有關之基因（例如N、P、L或M2)，達成病毒的減毒作 用。
在某些具體實施例中，藉著以衍生自不同物種之病毒之 相對應蛋白質的功能部位，代替一或多個野外型病毒之蛋 白質的特定功能部位，達成病毒的減毒作用。在解釋性的 具體實施例中，以哺乳動物MPV之F蛋白質的外功能部 位，代替APV之F蛋白質的外功能部位。在較佳的具體實 施例中，以衍生自不同物種之病毒之相對應蛋白質的功能 部位，代替一或多個L、N或P蛋白質的特定功能部位。在 某些其他的具體實施例中，藉著刪除一或多個野外型病毒 之蛋白質的特定功能部位，達成病毒的減毒作用。在特定 的具體實施例中，刪除F-蛋白質的穿透膜功能部位。
在本發明的某些具體實施例中，可修改本發明之重組病 毒的前導及/或拖尾序列，獲得減毒的表現型。在某些較 特定的具體實施例中，相對於野外型病毒，減少前導及/ 或拖尾序列的長度至少1個核甞酸、至少2個核#酸、至少 3個核#酸、至少4個核苷酸、至少5個核甞酸，或至少6個 核苷酸。在某些其他更特定的具體實施例中，使重組病毒 之前導及/或拖尾的序列發生突變。在特定的具體實施例 中，前導和拖尾序列是彼此100%互補的。在其他的具體 實施例中，前導和拖尾序列中有1個核钻酸、2個核甞酸、 3個核苷酸、4個核甞酸、5個核甞酸、6個核苷酸、7個核 苷酸、8個核甞酸、9個核甞酸或10個核甞酸不是彼此互補 的，但剩下的核苷酸是彼此互補的。在某些具體實施例 -98- 1344991
(93) 中，非-互補的核甞酸是彼此相同的。在某些其他的具體 實施例中，非-互補的核甞酸是彼此不同的。在其他的具 體實施例中，若在拖尾中的非-互補核甞酸是嘌呤，則在 前導序列中相對應的核荅酸亦是嘌呤。在其他的具體實施 例中，若在拖尾中的非·互補核嘗酸是π密淀，則在前導序 列中相對應的核荅酸亦是嘌呤。
當使用活減毒疫苗時，亦必須考慮它的安全性。該疫苗 必須不引起疾病。在本發明中，可使用任何使疫苗安全之 此項技藝中已知的技術。除了減毒的技術之外，可使用其 他技術。一個非-限制性的實例是使用可溶性異源基因， 不能將其併入病毒粒子膜内。例如，可使用可溶性RSV F 基因的單一副本、缺乏穿透膜和胞液功能部位的RSV基因 版本。因為不能將其併入病毒粒子膜内，故不預期改變該 病毒的向性。
可使用各種測定來測試疫苗的安全性。參見下文4.8 節。特定而言，可使用蔗糖梯度和中和測定來測試安全 性。可使用蔗糖梯度測定，判定是否將異源蛋白質插入病 毒粒子中。若將異源蛋白質插入病毒粒子中，便應測試該 病毒粒子引起徵候的能力，即使親代品系不引起徵候。未 與理論結合，若將異源蛋白質併入病毒粒子中，該病毒便 可獲得新的、可能為病理學上的特性》 4.8.本發明所使用的測定 根據本發明，可使用許多測定，以便判定嵌合型或重組 病毒在細胞培養系統、動物模式系統或在個體中的生長速 -99- 1344991
率。根據本發明，亦可使用許多測定，以便判定嵌合型和 重組病毒達成病毒粒子之感染、複製和包裝的需求。
可使用在本文中描述的測定，測定一段時間内的病毒力 價，判定該病毒的生長特徵。在特定的具體實施例中，藉 著從被感染之細胞中或被感染的個體中獲得試樣，製備試 樣的連續稀釋，並以容許顯露出單一溶菌斑的病毒稀釋 度，感染易感受該病毒感染的單層細胞。然後可計算溶菌 斑，並以每毫升試樣的溶菌斑形成單位來表示病毒力價。 在本發明特定的具體實施例中，藉著在個體中對抗病毒之 抗體的力價，來評估本發明之病毒在該個體中的生長速 率。未與理論結合，在個體中的抗體力價，不僅反映在該 個體中的病毒力價，亦反映抗原性。若病毒的抗原性是不 變的，則可使用在個體中抗體力價的增加，來判定病毒在 該個體中的生長曲線。在較佳的具體實施例中，最好藉著 在感染後的多個時間點採取宿主的生物體液試樣，並測量 病毒力價，來測試該病毒在動物或人類中的生長速率。 可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，來判定異源基因序 列在細胞培養系統或在値體中的表現。在某些具體實施例 中，藉著定量轉錄本的含量，來測量異源基因的表現。可 藉著北方墨點分析，或藉著RT-PCR，分別使用對轉錄本專 一的探針或引子，來測量轉錄本的含量。可區別轉錄本和 病毒之基因組，因為病毒為反義之方位，而轉錄本則是有 意義的方位。在某些具體實施例中，藉著定量異源基因之 蛋白質產物的量，來測量異源基因的表現。可藉著西方墨 -100- 1344991 (95) 點分析，使用對該蛋白質專一的抗體，來測量蛋白質的含 "4* 。
在特定的具體實施例中，將肽標籤附貼在異源基因上。 可使用對抗該肽標籤的抗體來檢測肽標籤^所檢測到之肽 標籤的含量’代表從異源基因中表現之蛋白質的含量。或 者，可藉著肽標籤來分離從異源基因中表現之蛋白質。經 過純化之蛋白質的含量，與異源基因的表現程度有關。這 類肤標賊’以及分離與這類肤標戴融合之蛋白質的方法為 此項技藝中已熟知的。可使用此項技藝中已知的各種肽標 籤來修改異源基因，包括但不限於免疫球蛋白恆定區、聚 組胺酸序列（Petty, 1996，金屬-螯合親和力層析法（Metal-chelate affinity chromatography),在 Current Protocols in
Molecular Biology，第 1-3 冊（ 1994- 1998)中。由 Ausubel，F.M.， Brent, R., Kunston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. 和 Struhl, K.編輯’由 John Wiley and Sons, Inc., USA, Greene Publish, Assoc. & Wiley Interscience 出版），縠胱甘肽 S-轉移酶 (GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229)、大腸桿 菌甘露糖結合蛋白質（Guan等人，1987, Gene 67:21-30)、各種 纖維素結合功能部位（美國專利第5,496,934號；5,202,247 號；5，137,819號；T〇inme等人，1994, Protein Eng. 7:117-123)， 以及 FLAG抗原決定位（Short Protocols in Molecular Biology, 1999，編輯 Ausubel等人，j〇hn Wiley&Sons，Inc.，單元 10.11)等 等。其他的肽標籤可被專一的結合夥伴認出，並因此有助 於藉著對結合夥伴的親和力結合作用分離，最好是將該結 -101 - 1344991 (96) 合夥伴固定及/或放在固體支撐物上。如同熟諳此藝者所 知曉的，可使用許多方法獲得上文-提及之肽標籤的密碼 區，包括但不限於DNA選殖、DNA擴大和合成方法。一些 肽標籤和用來檢測及分離它們的試劑是可購得的。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，獲得來自個體的試 樣。在某些具體實施例中，該試樣包括鼻抽吸物、咽喉抹 拭物、痰或支氣管-肺泡灌洗液。
4.8.1.迷你複製子構築體 可產製迷你複製子構築體，含有反義報告者基因。本發 明可使用任何熟諳此藝者已知的報告者基因（參見下文 4.7.13節）。在特定的具體實施例中，報告者基因為CAT。 在某些具體實施例中，報告者基因可位在反-義hMPV或 APV前導序列的側面，與肝炎δ核酶（Hep-d Ribo)和T7聚合酶 終止（T-T7)信號連接，而hMPV或APV拖尾序列則在T7 RNA 聚合酶啟動基因之前。
在某些具體實施例中，將編碼迷你複製子的質體轉移感 染到宿主細胞内。該宿主細胞表現T7 RNA聚合酶、N基因、 P基因、L基因和M2-1基因。在某些具體實施例中，以編碼 丁7 RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2-1基因的質體， 轉移感染宿主細胞。在其他的具體實施例中，將編碼迷你 複製子之質體轉移感染到宿主細胞内，並以協助者病毒感 染該宿主細胞。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，測定報告者基因之 表現程度及/或其活性，像是.，但不限於在4.7.13節中描述 -102- 1344991 (97) 的方法。
在某些更特定的具體實施例中，迷你複製子包括下列的 元件，按順序列舉：Τ7 RNA聚合酶或RNA聚合酶I '前導 序列、基因起點、GFP、拖尾序列、肝炎δ核酶序列或RNA 聚合酶I終止序列。若使用Τ7作為RNA聚合酶’則應使用 肝炎δ核酶序列作為終止序列。若使用RNA聚合酶I，則可 使用RNA聚合酶I終止序列作為終止信號。依據解救系 統，迷你複製子的序列可以有意義或反義的方位。在某些 具體實施例中，’可相對於hMPV之野外型前導序列，修改 前導序列。前導序列可視需要在AC之前。T7聚合酶序列 可帶有或沒有G-二聯體或三聯體，在此處G-二聯體或三聯 體提供了增加的轉錄。
在特定的具體實施例中，在TO時以hMPV感染細胞。在 24小時之後，T24時’以迷你複製子構築體轉移感染該細 胞。在TO之後48小時，和在TO之後72小時，針對報告者基 因的表現測試細胞》若使用螢光報告者基因產物（例如 GFP)，則可使用FACS測試報告者基因的表現。 在另一個具體實施例中，在τ=〇小時時，以六個質體轉 移感染細胞。然後在Τ= 40小時和τ=60小時時收獲細胞，並 分析CAT或GFP的表現（參見圖25)。 在另一個特定的具體實施例中，在τ〇時以MVA_T7感染 細胞。在1小時足後，T1時，以迷你複製子構築體轉移感 染該細胞。在T0之後24小時，以hMPV感染該細胞。在τ〇 之後72小時，針對報告者基因的表現測試細胞。若使用螢 •103- 1344991 (98) 光報告者基因產物（例如GFP)，則可使用FACS測試報告者 基因的表現。 4.8.2.報告者基因
在某些具體實施例中，本發明之方法可使用在組織培養 或在動物模式中，測量報告者基因表現的測定。將報告者 基因的核苷酸序列選殖到病毒内，像是APV、hMPV、 hMPV/APV或APV/hMPV，其中（i)改變報告者基因的位置’ 並（ii)變更位在報告者基因侧面之基因間區域的長度°測 試不同的組合，判定報告者基因表現的最佳速率，以及包 括該報告者基因之病毒的最佳複製速率。 在某些具體實施例中，產生包含報告者基因的迷你複製 子構築體。在4.7.2節中描述了迷你複製子構築體的建構。
可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，判定報告者基因產 物的豐富性。這類技術包括，但不限於北方墨點分析或西 方墨點分析，分別使用對該報告者基因專一的探針或抗 體》 在某些具體實施例中，可在FACS中檢測發出螢光信號的 報告者基因。可使用FACS來檢測在其中表現該報告者基 因的細胞。 將使用實行本發明之特定觀點的技術，除非另行指定’ 由熟諳此藝者例行地實行傳統的分子生物學、微生物學和 重组DNA操縱及產製技術》參見，例如Sambrook，1989, Molecular Cloning，A Laboratory Manual,第 2版；第 1-3冊（Cold Spring Harbor Laboratory，1989)，A Laboratory Manual，第 2版； • 104- (99) 1344991 DNA Olonins ^ 和 II 冊（Glover編輯，1985);以及 Transcription d TranSlatl〇n(Hames & Higgins編輯，1984)。 > ° 因產物的生化活性，代表報告者基因的表現程 度 0 報主去其 因活性的總量，亦依據本發明之重組病毒的 被製速率。阳A 、 、 ^ ^ ’欲判疋得自重組病毒之報告者基因的真 賞表現程廣，處4 &您將總表現程度除以在細胞培養或動物模式 中之重组病毒的力價。
本發明之古、、i 法可使用的報告者基因，包括但不限於在下 又表3中列舉的基因： 3 · 免 口百基因及各個報告者基因產物的生化特性 報告者基因 ，-素乙醯轉移酶） 將放射性乙酿基運送至氣黴素或藉著薄層層析 力和放射自顯術檢測 GAL(P-半乳糖苷酶) GUS(p-尿甘酸酶） LUC(蟲勞光素酶） GFP(綠勞.光蛋白質) SEAP(分泌性鹼性磷酸酶) HRP(辣根過氧化酶）
水解無色的半乳糖嘗，產生有顏色的產物 水解無色的尿甘酸，產生有顏色的產物 氧化蟲螢光素，放出光子 螢光蛋白質，無受質 與適當受質或與產生發色團之受質的發光反應 在氧化氫的存在下，氧化3,3'，5,5'-四甲基聯苯 胺’形成有顏色的複合物 AP(鹼性磷酸酶） 與適當受質或與產生發色m的發光反府 特別可藉著西方墨點分析或北方墨點分析，或任何用來 定量核嘗酸序列之轉錄、其邮财或其蛋白質之豐富性的 其他技術，測量報告者基因的豐富性（參見Sh0rt protocoIS m Molecular Biology，Ausubel等人.（編輯），j〇hn wUey & s〇ns, -105 - 1344991
(100) 第4版，1999)。在某些具體實施例中，以得自重组病毒之 報告者基因表現的讀出，來測量報告者基因的活性。為了 定量報告者基因產物的活性，可使用報告者基因產物的生 化特徵（參見表3)。測量報告者基因產物之生化活性的方 法，為熟諳此藝者已熟知的。在下文中陳述本發明之方法 可使用之解釋性報告者基因的更詳細說明。 4.8.3.測量感染速率的發生率
可藉著任何此項技藝中已熟知的方法，判定感染的發生 率，例如，但不限於可藉著免疫螢光測定（IFA)，分別使 用抗-APV-抗原抗體、抗-hMPV-抗原抗體、抗-APV-抗原抗 體，及/或對異源核苷酸序列之基因產物專一的抗體，針 對本發明之病毒的存在，測試臨床試樣（例如鼻抹拭物）。
在某些具體實施例中，可直接處理含有完整細胞的試 樣，而沒有完整.細胞的分離物應先在許可的細胞株（例如 HEp-2細胞）上培養。在解釋性的具體實施例中，應藉著在 室溫下，以例如300xg離心5分鐘，使培養的細胞上清液澄 清，接著在相同的條件下以PBS, pH 7.4(不含Ca++和Mg++)沖 洗。將細胞小球再懸浮於少量體積的PBS中，以供分析。 將含有完整細胞的原始臨床分離物與PBS混合，並在室溫 下以300xg離心5分鐘。利用無菌的吸移管尖端，從界面中 移除黏液，並在相同的條件下，以PBS沖洗細胞小球一次 以上。然後將小球再懸浮於少量體積的PBS中，以供分析。 將細胞懸浮液各5-10微升，點在以丙酮沖洗過之12-孔HTC 超級墙正的（supereured)玻片上每個5毫米的孔中，並容許 -106- 1344991 (101)
風乾。在冰冷的（-20°C )丙酮中固定玻片10分鐘。藉著在每 孔中加入PBS-1%BSA，接著在室溫下培養10分鐘，阻斷該 反應。以PBS-0.1%吐溫-20沖洗玻片三次，並風乾。將各10 微升之以阻斷緩衝溶液稀釋至250毫微克/毫升的初級抗 體試劑，點在每孔中，並在潮濕的37°C環境下培養該反應 30分鐘。然後以PBS-0.1%吐溫-20廣泛地沖洗玻片，更換三 次，並風乾。將10微升之以阻斷緩衝溶液稀釋至250毫微 克/毫升的適當二級共軛抗體試劑，點在每個個別的孔 中，並在潮濕的37°C環境下培養該反應額外的30分鐘。然 後以PBS-0.1%吐溫-20沖洗玻片，並更換三次。將5微升 PBS-50%甘油-10 mM Tris pH 8.0-1 mM EDTA點在每個反應孔 中，並在玻片上覆上蓋玻片。接著藉螢光顯微鏡，以200X 功率，使用B-2A濾光鏡（EX 450-490毫微米），分析每個反 應孔。對獲自未染色細胞，或僅以二級試劑染色之細胞的 自動勞光背景，給陽性反應評分。藉著在被感染細胞之細 胞質中，由小包涵物點出的明亮螢光，來定出陽性反應的 特徵。. 4.8.4.測量血清力價 可藉著任何此項技藝中已熟知的方法，判定抗體的血清 力價，例如，但不限於，可藉著三明治ELISA來定量抗體 或抗體片段在血清試樣中的含量。簡言之，ELISA包括利 用認得在血清中之抗體或抗體片段的抗體塗覆微量滴定 盤，並在4t：下過夜。然後在室溫下，以PBS-吐溫- 0.5% BSA 阻斷該培養盤大約30分鐘。使用以PBS-吐溫-BSA稀釋之經 -107- 1344991 (102)
過純化的抗體或抗體片段，建構標準曲線，並以PBS-BSA 稀釋試樣。以一式兩份，將試樣和標準物加至測定培養盤 的孔中，並在室溫下培養大約1小時。接著，以PBS-吐溫 沖洗掉未-結合的抗體，並在室溫下利用經過標示的二級 抗體（例如與辣根過氧化酶共軛的山羊-抗-人類IgG)處理 已結合的抗體大約1小時。藉著加入對該標示專一的色原 受質，並測量該受質的周轉率，例如藉著分光光度計，來 檢測已標示之抗體的結合作用。藉著在某個稀釋度下，比 較試樣之受質周轉率與標準曲線之受質周轉率，來判定抗 體或抗體片段在血清中的濃度。 4.8.5.血清學測試
在本發明的某些具體實施例中，檢測與哺乳動物MPV之 組份結合的抗體的存在。特定而言，可在個體中檢測針對 哺乳動物MPV之蛋白質的抗體的存在，以便在個體中診斷 哺乳動物MPV的存在。可使用任何熟諳此藝者已知的方 法，檢測針對哺乳動物MPV之組份的抗體的存在。 在解釋性的具體實施例中，將哺乳動物MPV之组份與固 體支撐物連接。在特定的具體實施例中，該哺乳動物MPV 之組份可以是，但不限於F蛋白質或G蛋白質。接著，將 欲測試針對哺乳動物MPV之抗體存在的物質，在有助於該 抗體與哺乳動物MPV組份結合的條件下，與該固體支撐物 一起培養。接著，在移除任何未專一結合之抗體的條件 下，沖洗該固體支撐物。在沖洗步驟之後，可使用任何熟 諳此藝者已知的技術，檢測已結合之抗體的存在。在特定 -108- 1344991 (103)
的具體實施例中，將哺乳動物MPV蛋白質-抗體複合物與 以可檢測方式標示的抗體，在有助於以可檢測方式標示之 抗體與可與哺乳動物MPV組份結合之抗體結合的條件下 一起培養，後者認得由該個體之物種所產生的抗體，例 如，若該個體是棉鼠，則以可檢測方式標示的抗體即針對 大鼠抗體。在特定的具體實施例中，以可檢測方式標示的 抗體是與酵素活性共軛。在另一個具體實施例中，以可檢 測方式標示的抗體是以放射性標示的。然後沖洗哺乳動物 MPV蛋白質-抗體-以可檢測方式標式之抗體的混合物，接 著藉任何熟諳此藝者已知的技術，定量以可檢測方式標示 之抗體的存在，其中所使用之技術將視以可檢測方式標示 之抗體的標記類型而定。 4.8.6.Biacore測定
可藉著例如，在已經於其上固定抗原的感應器晶片表面 上，注射250微升，在含有0.05%吐溫-20之HBS緩衝溶液中 各種濃度的單株抗體（"mAb”），來判定抗體結合的動力學 參數。'抗原可以是哺乳動物MPV的任何組份。在特定的具 體實施例中，該抗體可以是，但不限於哺乳動物MPV的F 蛋白質或G蛋白質。將流速不變地維持在75微升/分鐘下。 收集解離資料1 5分鐘，或按照需要更久。在每個注射/解 離回合之後，使用簡短的、稀酸的1分鐘脈衝，通常是10-100 mM HC1，雖然亦使用其他的再生劑作為環境保證物，從抗 原表面移除已結合的mAb。 更特定而言，關於缔合速.率kQn和解離速率1^。^的測量， -109- 1344991 1» (104)
經由使用標準胺偶聯化學法，即EDC/NHS法（edc = n-二乙 胺基丙基）·碳化二亞胺），將抗原直接固定在感應器晶片 的表面上。簡言之，製備在1〇 mM NaOAc，pH 4或pH 5中， 5-100 nM的抗原溶液，並通過edC/NHS-激活表面，直到固 定大約30- 50 RU's(Biac〇re共振單位）的抗原值為止。之後， 以注射1 M Et-NH2使未反應之活性酯達到高潮。為了參考 的目的’在相同的固定條件下，製備不含抗原的空白表 面。一旦已經製備出適當的表面，便以HBS/吐溫-20製備 每一種抗體試劑的適當連續稀釋，並通過連續連接的抗原 和參考細胞表面。所製備之抗體濃度的範圍，依據估計之 平衡結合4數Kd而改變。如同上述，在每個注射/解離回 合之後，使用適當的再生劑移除已結合的抗體。
一旦收集到全部的資料，便使用由儀器製造者BIAcore， Inc.(Piscataway，NJ)提供的演算法，整體地套入所得的結合 曲線。將所有資料套入1: 1 Langmuir結合模式。這些演算法 計算k。^ kw兩者’以兩個速率常數之比例（即k^/k。。），從 其中推衍出明顯的平衡結合常數KD。可在BIA評估軟體手 冊中，找到如何衍生個別的速率常數之更詳細的處理。 4.8.7.微量中和測定 可藉著微量中和測定，判定抗體或其抗原-結合片段中 和病毒感染力的能力。該微量中和測定是由Anderson等人 描述之程序（ 1985, J. Clin. Microbiol. 22: 1050- 1052，將其揭示 内容全部以引用的方式併入本文中）的修改。亦在Johnson 等人，1999, J. Infectious Diseases 180:35-40中描述該程序，將 -110- 1344991 (105) 其揭示内容全部以引用的方式併入本文中。 使用96-孔培養盤，以一式三份進行抗體稀釋。在37°C 下，在96-孔培養盤的孔中，將1〇6tcid5〇的哺乳動物MPV與
連續稀釋的待測試之抗體或其抗原·結合片段一起培養2 小時。然後在每孔中加入易受哺乳動物MPV感染的細胞’ 像是但不限於Vero細胞（2.5xl04) ’並在37°C下’在5。/。C〇2 中培養5天。在5天之後’吸出培養基，並以80%甲醇和 20%PBS沖洗細胞，並固定在培養盤上。然後藉著病毒抗 原，像是F蛋白質的表現，來判定病毒複製。將經過固定 的細胞與生物素-共軛之抗-病毒抗原’像是抗-F蛋白質單 株抗體（例如泛F蛋白質，C-位置-專一的MAb 133-1H)—起 培養，沖洗並在孔中加入辣根過氧化酶共軛的抗生物素蛋 白。再度沖洗各孔，並在450毫微米處測量受質TMB(硫代 硝基苯T酸）的周轉率》以對在450毫微米（OD45〇)處得自僅 有病毒之對照组細胞的吸收度，引起至少5〇%降低的抗體 濃度來表'中和力價β
中和測定僅是一個實例。或者，可 定病毒如何顯著地受到抗體的影 在本文中描述的微量 使用標準中和剛定來 ^ 4 響。 4.8.8.病毒融合抑制剛< 本測定在原則上θ 抗體之前4小時，二與微量中和測定相同的，除了在加 的存在或缺乏之個別的病毒感染細胞，纟自細胞融 2217-2223)。 〇買叫（Tayl〇r等人，1992, J. Gen. Virol. -Ill . 1344991 (106) 4.8.9.等溫滴定熱量測定法 從對抗體與其個自抗原之交互作用的等溫滴定熱量測 定（ITC)測量，來判定熱動力學結合親和力和焓。 以透析液稀釋抗體，並藉著UV分光鏡的吸收度測量， 利用Perkin-Elmer λ4Β分光光度計，使用217,00.0 Μ·1公分-1之 消光係數，在280毫微米之高峰最大值處，判定濃度《從 原始試樣之質量對經過稀釋之試樣的比例，計算經過稀釋 之哺乳動物MPV-抗原濃度，因為其消光係數太低而不能 判定精確的濃度 '，故不使用並喪失大量的試樣。 ITC測景 從ITC測量，使用Microcal，Inc. VP滴定熱量計，判定抗體 的結合熱動力學》VP滴定熱量計由一對相配的試樣和參 考試管（ 1.409毫升）所組成，以絕熱外罩將試管封入，並旋 轉攪拌器-注射筒，以便將配體溶液滴定至試樣試管内。 該ITC測量係在25°C和35eC下進行。試樣試管含有在鱗酸 緩衝溶液中的抗體，而參考試管僅含有緩衝溶液。該鱗酸 緩衝溶·液為得自HyClone，Inc，pH 7.4的生理鹽水和67 mM P04。將5或10微升等份的0.05或0.1 mM RSV-抗原、pIV•抗原 及/或hMPV-抗原溶液，在3至4分鐘分開滴定至抗體試樣溶 液中，直到藉著缺乏熱交換信號，證實結合作用已達飽和 為止。 使用得自Microcal· Inc.，Origin 5.0的非-線性、最小_乘方 最小化軟體程式，根據下列的等式（I)，套入總熱^對纟帛.胃 定劑濃度Xt之第i次滴定的增加熱（又Q(i))， 1344991 (107)
Qt=nCtAHb V{ l + Xt/nCt+ l/nKbCr [ (l + Xt/nCt+ l/nKbCt)2-4Xt/nCt]1/2}/2 (la) AQ(i) = Q(i) + dVi/2V{Q(i) + Q(i-l)} -Q(i-l)(lb) 其中Ct為在試樣試管中的最初抗體濃度，V為試樣試管之 體積，且η為結合反應的化學計算法，產生Kb、乂Hb·和n之 值。判定Kb之最佳試樣濃度範圍，將視Κ之值b而定，並藉 著下列關係來定義。
CtKbn · 500 (2) 以致於在1 μΜ下，可判定最大的Kb小於2.5X108 Μ·1。若第 一次加入滴定劑不符合結合等溫，則在最後的分析中忽略 它，因為它可能反映在注射筒開口·溶液界面處的氣泡釋 放。 4.8.10.免疫測定 免疫沉澱草案通常包括在溶解緩衝溶液，像是補充有蛋 白質場酸酶及/或蛋白酶抑制劑（例如EDTA、PMSF ' 159抑 肽酶（aprotinin)、飢酸鈉）之RIPA緩衝溶液（1%ΝΡ-40或三通 乂-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1%805、〇.151^他(：1、0.0114磷酸 鈉’在pH 7.2下’ 1%崔絲醇（trasylol))中’使細胞族群溶解， 將感興趣的抗體加至細胞溶胞產物中，在4°C下培養一段 時間，將蛋白質A及/或蛋白質G瓊脂糖小珠加至細胞溶胞 產物中，在4°C下培養大約1小時或更久，以溶解緩衝溶液 沖洗小珠’並將小珠再懸浮於SDS/試樣緩衝溶液中β可藉 著例如西方墨點分析’評估感興趣之抗體使特定抗原免疫 >儿的说力。熟邊此藝者將很清楚可加以修改，以便增加 -113 - 1344991
(108) 抗體對抗原之結合，並降低背景（例如，預先利用瓊脂糖 小珠使細胞溶胞產物澄清）的參數。關於免疫沉澱草案的 進一步討論，參見’例如Ausube丨等人，編輯，1994，Current Protocols in Molecular Biology,第 1冊，J〇hn Wiley & Sons，Inc.，
New York 在第 10.16.1 頁。 西方墨點測定通常包括製備蛋白質試樣，在聚丙晞醯胺 凝膠上進行蛋白質試樣的電泳（例如8%·2〇% SDS-PAGE，視 抗原的分子量而定）’從聚丙缔醯胺凝膠中將蛋白質試樣 移至諸如硝基纖維素、PVDF或尼龍之類的膜，以阻斷緩 衝溶液（例如帶有3%BSA或無脂牛奶的pbs)阻斷該膜，以 沖洗緩衝溶液（例如PBS吐溫20)沖洗該膜，將該膜與以阻 斷緩衝溶液稀釋的初級抗體（感興趣之抗體）一起培養，以 沖洗緩衝溶液沖洗該膜’將該膜與以阻斷緩衝溶液稀釋， 並與酵素受質（例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶）或放射 性分子（例如12p或1211)共軛的二級抗體（其認得初級抗體， 例如抗-人類抗體）一起培養，以沖洗緩衝溶液沖洗該膜， 並檢測·抗原的存在《熟諳此藝者將很清楚可加以修改，以 便增加檢測信號，並降低背景噪音的參數。關於西方墨點 草案的進一步討論，參見，例如Ausube丨等人，編輯，1994, GinTent Protocols in Molecular Bi〇1〇gy，第！冊，j〇hn wney &
Sons，Inc.，New York 在第 10.8.1 頁。 ELISAs包括製備抗體，以抗原塗覆96_孔微量滴定盤，洗 掉未與孔結合的抗原，在孔中加入與可檢測化合物，像是 酵素受質（例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶）共軛的感興 •114· 1344991
(109)
趣之抗體，並培養一段時間，洗掉未結合的抗體或非-專 一結合的抗體，並檢測與塗覆在孔中之抗原專一結合的抗 體的存在。在ELISAs中，不使感興趣的抗體與可檢測化合 物共軛；可改而在孔中加入與可檢測化合物共軛的第二個 抗體（其認得感興趣之抗體）。此外，亦可以抗體塗覆該 孔，代替以抗原塗覆該孔。在該情況下，可檢測分子可以 是與可檢測化合物，像是酵素受質（例如辣根過氧化酶或 驗性磷酸酶）共輛的抗原。可加以修改，以便增加信號檢 測的參數，以及ELIS As的其他變化，均為熟諳此藝者已熟 知的。關於ELIS As的進一步討論，參見，例如Ausubel等人， 編輯，1994，Current Protocols in Molecular Biology,第 1冊，John Wiley & Sons, Inc.，New York 在第 11.2.1 頁。
可藉著競爭性結合測定，判定抗體（包括scFv或其他分 子，包括或另外由抗體片段或其變體所組成）對抗原之結 合親和力，以及抗體-抗原交互作用的關閉-速率》競爭性 結合測定是放射免疫測定，包括將已標示之抗原（例如3H 或1211)與感興趣之抗體，在逐漸增加未標示抗原之含量的 存在下一起培養，並檢測與已標示抗原結合的抗體。 4.8.11.蔗糖梯度測定 可藉著使用任何熟諳此藝者已知的生化測定，進一步調 查異源蛋白質是否被併入病毒粒子内的問題。在特定的具 體實施例中，使用蔗糖梯度測定，判定異源蛋白質是否被 併入病毒粒子内。 可在20- 60%的蔗糖梯度中，分級分離被感染細胞的溶胞 -115 - 1344991 (110) 產物，收集各種溶離份，並藉著例如西方墨點分析，分析 異源蛋白質和載體蛋白質的存在與分布。亦可藉著溶菌斑 測定，就高導病毒力價，測定溶離份和病毒蛋白質。若異 源蛋白質與病毒粒子一起移動，該異源蛋白質便是與病毒 粒子結合。 4.9.確認MPV之新分離株的方法
本發明係關於哺乳動物MPV，特別是hMPV。而本發明提 供兩種MPV之血清學亞組，A和B的特徵，以及MPA四個變 種A卜A2、B 1和B2的特徵，本發明不限於這些亞組和變種。 本發明包括任何尚待確認的MPV之分離株，包括具有屬於 在本文中描述的亞組和變種，或屬於尚待確認的亞組或變 種之特徵的那些。
可使用免疫測定以便定出出現在特定試樣中之蛋白質 組份的特徵。免疫測定是使用病毒之肽组份，比較病毒分 離株而加以確認的有效方法。例如，本發明在本文中提供 進一步確認在本文中提供之MPV分離株的方法，該方法包 括以原'型分離株1-2614或相關分離株接種基本上不感染 MPV或無特定病原的天竺鼠或雪貂（在詳細說明中，以鼻 内接種動物，但其他的接種方式，像是肌肉内或皮内接 種，以及使用其他的實驗動物，亦是可行的）。在第0天、 接種後兩週和三週，從動物中收集血清。以專一之方式對 動物進行血清改變（seroconvert)，在病毒中和（VN)測定（關 於VN測定的實例，參見實例16)和間接IFA(關於IFA之實 例，參見實例11或14)中對個.別的分離株1-2614進行測量， -116- 1344991 (m) 並在該進一步分離株的免疫學檢測士 j中’使用得自該血清改 變之動物的血清。例如，本發明撻桩+ 凡供在副黏液病毒科中之 新成員，人類間質肺病毒或類間皙晚.t ^ 貝肺病毒之病毒（因為其 最後的分類學’尚待病毒分類學委員會討論，例如在本文 中的MPV.，當在分類學上說明時，與APV 一致）（Mpv)的特 徵’其可在人類中引起嚴重的RTI ^由MPV引起之疾病的
臨床症狀，基本上與由hRSV引起的那些類似，像是咳嗷、 肌痛、嘔吐、發燒、支氣管炎或肺炎，可能有結膜炎或其 組合。當看到hRSV感染兒童時，特別是極年幼的兒童， 可能需要住院。例如，於2001年1月19日，以之名將 MPV存放在CNCM，Institute Pasteur, Paris，或在系統發生上與
It此提供的相符之病毒分離株。於是，本發明提供包括在 系統發生上，與序列識別19號之核酸序列一致，或在結構
上與其相符之核酸或功能片段的病毒。特定而言，本發明 提供一病毒’在系統發生樹狀圖分析中測試它之後，定出 其特徵’其中使用100次靴環法和3組亂數，產生最大蓋氏 法的樹'狀圖，發現它在系統發生上，比其與禽肺病毒 (APV) ’亦稱為火雞鼻氣管炎病毒（TRTV)，禽鼻氣管炎的 病原之關係’更當切地與以1-2614之名存放在CNCM，Paris 的病毒分離株一致。在該系統發生樹狀圖分析中，使用 A V P - C病毒作為外群是特別有用的，它是最密切相關的， 縱使基本上是非-哺乳動物病毒》 4.9.1.序列的生物資訊排列 可藉著 BLAST(Altschul，S.F.等人，1990，J. Mol. Biol. 215: -117- 1344991
(112) 403-410)比較二或多個胺基酸序列，判定彼此的序列同種 性和序列同一性。可藉著BLAST(Altschul，S. F·等人，1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)比較二或多個核苷酸序列，判定彼此 的序列同種性和序列同一性。可使用Clustal W法（MacVector (tm))進行BLAST比較。在某些特定的具體實施例中，由電 腦程式排列二或多個序列，可接著由手動再-調整。
可使用數學演算法完成兩個序列之間同一性百分比的 判定。用來比較兩個序列之數學演算法的較佳、非限制性 實例，是 Karlin和 Altschul的演算法，1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268，按照在 Karlin和 Altschul，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877中的加以修改。將這類演算法併 入 Altschul等人，1990, J. Mol. Biol. 215:403-410的 NBLAST和 XBLAST程式中。可利用NBLAST程式進行BLAST核苷酸比 較。可利用XBLAST程式進行BLAST胺基酸序列比較。欲為 了比較之目的獲得加了間隙的排列，可利用間隙BLAST， 按照在 Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 中 的描述、或者，可使用PSI-Blast，進行反覆的搜尋，其檢 測分子之間的疏遠關係（Altschul等人，1997，在前）》當使用 BLAST、間隙BLAST和PSI-Blast程式時，可使用個別程式（例 如 XBLAST和 NBLAST)的預設參數（參見 http://www.ncbi.nlm. nih.gov)。其他用來比較序列之數學演算法的較佳、非限 制性實例，是Myers和Miller的演算法，1988，CABIOS 4:11-17。將這類演算法併入ALIGN程式（第2.0版）中，其為GCG 序列排列套裝軟體的一部分。當使用ALIGN程式來比較胺 -118 - 1344991 (113) msmm 基酸序列時，可使用ΡΑΜΙ20重量殘基表。可由熟諳此藝者 設定間隙長度罰點。可使用類似上述那些的技術，容許或 不容許間隙’通常僅計算精確的相配，來判定在兩個序列 之間的同一性百分比。 4.9.2.雜交條件
在本發明之方法中，可使用與哺乳動物MPV之核酸，或 與其逆互補物’或與其互補物雜交的核酸，來判定彼此的 序列同種性和同一性。在某些具體實施例中，核酸係在高 度嚴格的條件下雜交。例如但不限於，使用這類高度嚴格 條件的程序如下。在65°C下，在包括6Χ SSC、50 mM Tris-HCl (pH 7.5) ' ImM EDTA、0.020/〇PVP、0.02%Ficoll、〇_〇2%BSA和 500微克/毫升之變性鮭精DNA的緩衝溶液中，進行含有 DNA之濾紙的預先雜交作用。在65°C下，使濾紙在含有1〇〇 微克/毫升之變性鮭精DNA和5-20X 106 cpm之32P-標示之探 針的預先雜交混合物中，雜交48小時。在37°C下，以含有 2乂53(：、0_01%?丫？、〇.〇1%卩4〇11和0.01°/(^3人的溶液沖洗濾紙 1小時。接著在放射自顯術之前，在50°C下以0.1X SSC沖洗 45分鐘。其他可使用之高度嚴格的條件為此項技藝中已熟 知的。在本發明其他的具體實施例中，在中等或低嚴格的 條件下進行雜交作用，這類條件為熟諳此藝者已熟知的 (參見，例如 Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual,第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York;亦參見 Ausubel等人，編輯，在 Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory -119- 1344991
(114) technique manuals, 1987- 1997 Current Protocols, 1994- 1997 John Wiley and Sons, Inc.中）。 4.9.3.系統發生分析
本發明係關於推論在哺乳動物MPV之分離株之間的系 統發生關係。可利用許多方法或途徑，分析系統發生的關 係；這些包括歐氏距離、最大蓋氏法，和最大簡約法 (Swofford，DL·，等人，Phylogenetic Inference.在 Molecular Systematics.中，編輯 Hillis，DM，Mortiz，C，和 Mable，ΒΚ· 1996, Sinauer Associates: Massachusetts, USA.第 407-514 頁； Felsenstein, J·，1981, J· Mol. Evol. 17:368-376)。此外，軌環技 術是製備和檢查結果之系統發生樹狀圖的信賴區間的有 效方法（Felsenstein，J.，1985，Evolution. 29:783-791)。可使用任 何使用核苷酸或肽序列資訊來比較哺乳動物MPV之分離 株的方法或途徑，建立系統發生的關係，包括但不限於歐 氏距離、最大蓋氏法，和最大簡約方法或途徑。可使用任 何此項技藝中已知的方法，分析系統發生資料的品質，包 括但不限於靴環法。可供在系統發生途徑中使用的核甘酸 或肽序列之排列，包括但不限於手工排列、電腦逐對排列 和電腦多重排列。以所需之資訊和所許可的時間為基礎， 熟諳此藝者將熟悉欲使用之較佳的排列方法或系統發生 的途徑。 在一個具體實施例中，使用DNA最大蓋氏法，來推論在 hMPV分離株之間的關係。在另一個具體實施例中，使用 #化環技術’來判定使用該系統發生途徑之一所創造的系統 -120· 1344991
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發生資料的確實性。在另一個具體實施例中，在輸入資料 之前，將亂數技術應用在系統發生途徑上，以便將序列進 入系統發生分析之順序的影響減至最少。在一個特定的具 體實施例中，使用DNA最大蓋氏法與靴環法。在另一個特 定的具體實施例中，使用DNA最大蓋氏法，以及靴環法和 亂數。在其他更特定的具體實施例中，使用DNA最大蓋氏 法，以及50次靴環法。在另一個特定的具體實施例中，使 用DNA最大蓋氏法，以及50次靴環法和3組亂數。在另一 個特定的具體實施例中，使用DNA最大蓋氏法，以及100 次靴環法和3組亂數。
在一個具體實施例中，將得自hMPV之分離株的核酸或 肽序列資訊，與其他hMPV分離株的序列相比較或排成一 直線。該胺基酸序列可以是L蛋白質、Μ蛋白質、N蛋白質、 Ρ蛋白質或F蛋白質的胺基酸序列。在另一個具體實施例 中，將得自hMPV分離株或hMPV分離株之成員的核酸或肽 序列資訊，與其他病毒的序列相比較或排成一直線。在另 一個具 '體實施例中，將系統發生之途徑應用在序列排列資 料上，而得以推論系統發生的關係，及/或建立系統發生 樹狀圖。可使用任何使用核苷酸或肽序列資訊，來比較 hMPV分離株的方法和途徑，推論該系統發生的關係，包 括但不限於歐氏距離、最大蓋氏法和最大簡約方法或途 徑。 在以WO 02/057302發表的國際專利申請案PCT/NL 02/00040中，揭示了系統發生分析的其他方法，將其全文 -121 - 1344991 (116) βΒΒΗΒΗΗΜΒΗΗβΗΗβΒΜ 以引用的方式併入本文中。特定而言’ PCT/NL02/00040在 第12頁27行至第19頁29行，揭示了適用於系統發生分析的 核酸序列，以引用的方式併入本文中。 關於系統發生分析，它在獲得作為外群之非-MPV的核 酸序列上是最有用的，利用該核酸序列與病毒相比較，可 從禽肺病毒血清型C(APV-C)獲得極有用的外群分離株》參 見，例如圖16。
許多方法和程式為此項技藝中已知的，並可用來推論系 統發生的關係，包括但不限於BioEdit、ClustalW、TreeView 和NJPlot。將用來排列序列，並產生系統發生樹狀圖或關 係的方法，將需要輸入待比較之序列資訊。許多方法和格 式為此項技藝中已知的，並可用來輸入序列資訊，包括但 不限於 FASTA、NBRF、EMBL/SWISS.、GDE蛋白質、GDE核 苷酸、CLUSTAL和GCG/MSF »將用來排列序列並產生系統 發生樹狀圖或關係的方法，將需要結果的輸出《可使用許 多方法和格式輸出資訊或結果，包括但不限於CLUSTAL、 NBRF/PIR、MSF、PHYLIP和GDE。在一個具體實施例中， 使用ClustalW，連同DNA最大蓋氏法，以及1〇〇次靴環法和3 组亂數，以谭產生系統發生關係。 4.10.抗體的產製 本發明亦關於對抗由哺乳動物MPV編碼之蛋白質的抗 體的產製。特定而言，本發明係關於對抗所有哺乳動物 MPV抗原，包括哺乳動物MPV的F蛋白質、N蛋白質、M2-1 蛋白質、M2-1蛋白質、G蛋白.質或P蛋白質之抗體的產製。 -122- 1344991
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根據本發明，可使用任何由哺乳動物MPV編碼之蛋白質、 其衍生物、類似物或片段，作為免疫原，產製可以免疫專 一之方式與這類免疫原結合的抗體。本發明之抗體包括， 但不限於多株、單株、多重專一性、人類、人類化或嵌合 型抗體’單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現庫產 製的片段、抗-遺傳性型（抗-Id)抗體（包括例如對抗本發明 之抗體的抗-Id抗體），以及抗原決定位-結合片段。”抗體，， 一詞’當在本文中使用時，意指免疫球蛋白分子和免疫球 蛋白分子之具有免疫活性的部分，即含有以免疫專一之方 式與抗原結合的抗原結合位置的分子》本發明之免疫球蛋 白分子可以是任何類型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、種類（例如 IgG!、IgG2、IgG3、IgG4、IgA# IgA2)，或 亞類的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子之具有免疫活性 部分的實例，包括F(ab)和F(ab)'2片段，其可藉著以諸如胃 蛋白酶或木瓜蛋白酶之類的酵素處理抗體來產製》在特定 的具體實袍例中，產製對抗由人類MPV編碼之蛋白質的抗 體。在另一個具體實施例中，產製對抗由人類MPV編碼之 蛋白質的功能部位的抗體。 可使用此項技藝中已知的各種程序’產製對抗由哺乳動 物MPV編碼之蛋白質的多株抗體、其衍生物、類似物或片 段β關於抗體的產製，可藉著注射天然的蛋白質，或合成 版本，或其衍生物（例如片段）’來免疫各種宿主動物，包 括但不限於兔子、老鼠、大鼠等等。可依據宿主的物種， 使用各種佐劑，來增加免疫學的反應，包括但不限於福瑞 -123 - 1344991 (118) 德氏（完全和不完全）、礦物凝膠，像是氫氧化鋁、表面活 性物質，像是溶血卵鱗脂、普魯尼克（pluronic)多元醇、聚 陰離子、肽、油乳劑、鎖孔蜮血藍蛋白、二硝基酚，以及 可能有用的人類佐劑，像是BCG(卡介苗）和短小棒狀桿菌 (corynebacterium parvum) 0
關於製備針對由哺乳動物MPV、其衍生物、類似物或片 段編碼之蛋白質的單株抗體，可使用任何藉著培養中之連 續細胞株，提供抗體分子之產製的技術β例如，最初由 Kohler和 Milstein發展的融合瘤技術（ 1975，Nature 256: 495-497)，還有三融合瘤（trioma)技術、人類B-細胞融合瘤技術 (Kozbor等人，1983, Immunology Today 4:72)，以及產製人類單 株抗體的EBV-融合瘤技術（Cole等人，1985，在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，Inc.，第 77-96頁）。
在本發明額外的具體實施例中，可在無菌的（germ-free)動 物中，利用最新的技術（PCT/US90/02545)，產製單株抗體。 根據本發明，可使用人類抗體，並可藉著使用人類融合瘤 (Cote等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sci· U.S.A. 80:2026-2030)， 或藉著在活體外以EBV病毒轉化人類B細胞（Cole等人，1985, 在 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，第 77-96頁中）而獲得。事實上，根據本發明，可使用為了產 製"嵌合型抗體"而發展的技術（Morrison等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855; Neuberger等人，1984, Nature 3 12:604-608; Takeda等人，1 985, Nature 3 14:452-454)，其 係藉著將得自對由哺乳動物MPV '其衍生物、類似物或片 -124- 1344991
(119) 段編碼之蛋白質專一的老鼠抗體分子的基因，與得自具有 適當生物活性之人類抗體分子的基因接合在一起；這類抗 體是在本發明的範圍内。
根據本發明，可改編對於產製單鏈抗體所描述的技術 (美國專利第4,946,778號），產生專一的單鏈抗體。本發明 額外的具體實施例係使用對於建構Fab表現庫所描述的技 術（Huse等人，1989, Science 246: 1275- 1281)，容許快速且容易 地確認對由哺乳動物MPV、其衍生物、類似物或片段編碼 的蛋白質，具有想要之專一性的單株Fab片段。 可藉著已知的技術，產製含有分子之遺傳性型的抗體片 段。例如，這類片段包括，但不限於：F(ab’）2片段，其可 藉著抗體分子的胃蛋白酶消化作用來產製；Fab1片段，其 可藉著減少F(aV)2片段的二硫橋來產製；Fab片段，其可 藉著以木瓜蛋白酶和還原劑處理該抗體分子來產製，以及 Fv片段》
在抗體的產製中，可藉著此項技藝中已知的技術，例如 ELISA(酵素-連結之免疫吸附測定），完成想要抗體的篩 選。例如，欲選擇認得由哺乳動物MPV編碼之蛋白質的特 定功能部位的抗體，可針對與由含有這類功能部位之哺乳 動物MPV編碼的蛋白質之片段結合的產物，測定所產製的 融合瘤。 可使用本發明提供的抗體，來檢測MPV，並可供治療MPV 感染的治療方法使用。 可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，測試由本發明方法 -125 - 1344991
(120) 產製之抗體的專一性和結合親和力。在某些具體實施例 中，可按照在第4.8.5、4.8.6、4.8.7、4.8.8或4.8.9節中的描 述，來測試藉著本發明方法產製之抗體的專一性和結合親 和力。 4.11.確認抗病毒劑的篩選測定
本發明提供確認可抑制哺乳動物MPV感染宿主或宿主 細胞之能力的化合物的方法。在某些具體實施例中，本發 明提供確認可降低哺乳動物MPV在宿主或宿主細胞中複 製之能力的化合物的方法。可使用任何熟諳此藝者已熟知 的技術，來篩選將廢止或降低哺乳動物MPV感染宿主，及 /或在宿主或宿主細胞中複製之能力的化合物。在特定的 具體實施例中，該哺乳動物MPV是人類MPV。
在某些具體實施例中，本發明提供確認可抑制哺乳動物 MPV在哺乳動物或哺乳動物細胞中複製之能力的化合物 的方法。更特定而言，本發明提供確認可抑制哺乳動物 MPV感染哺乳動物或哺乳動物細胞之能力的化合物的方 法。在某些具體實施例中，本發明提供確認可抑制哺乳動 物MPV在哺乳動物細胞中複製之能力化合物的方法。在特 定的具體實施例中，該哺乳動物細胞是人類細胞。關於可 用來判定病毒力價之測定的詳細說明，參見第4.7節。 在某些具體實施例中，使細胞與受試化合物接觸，並以 哺乳動物MPV感染該細胞。在某些具體實施例中，在缺乏 受試化合物之下，以哺乳動物MPV感染對照組培養物。可 在以哺乳動物Μ P V感染之前，同時或之後，使細胞與受試 -126- 1344991 (121) 化合物接觸。在特定的具體實施例中，該細胞為哺乳動物 細胞。在更特定的具體實施例中，該細胞為人類細胞。在 某些具體實施例中，將細胞與受試化合物一起培養至少1 分鐘、至少5分鐘、至少15分鐘、至少30分鐘、至少1小時、 至少2小時、至少5小時、至少12小時或至少1天。可在測 定期間的任何時間，測量病毒的力價。在某些具體實施例 中，判定病毒在培養物中生長的時間過程。若在受試化合 物的存在下，病毒的生長受到抑制或降低，則確認該受試 化合物可有效地抑制或降低哺乳動物MPV的生長或感 染。在特定的具體實施例中，測試抑制或降低哺乳動物 MPV生長之化合物，其抑制或降低其他病毒之生長速率的 能力，以便測試其對哺乳動物MPV的專一性。 在某些具體實施例中，將受試化合物投予模式動物，並 以哺乳動物MPV感染該模式動物。在某些具體實施例中， 以哺乳動物病毒感染對照組模式動物，但不投予受試化合 物。可在以哺乳動物MPV感染之前、同時或之後，投予該 受試化'合物。在特定的具體實施例中，該模式動物為哺乳 動物。在更特定的具體實施例中，該模式動物可以是，但 不限於棉鼠、老鼠或猴子。可在測定期間的任何時間，測 量在模式動物中的病毒力價。在某些具體實施例中，判定 病毒在培養物中生長的時間過程。若在受試化合物的存在 下，病毒的生長受到抑制或降低，則確認該受試化合物可 有效地抑制或降低哺乳動物MPV的生長或感染。在特定的 具體實施例中，測試抑制或降低哺乳動物MPV在模式動物 -127- 1344991
(122) 中生長的化合物，其抑制或降低其他病毒之生長速率的能 力，以便測試其對哺乳動物MPV的專一性。 4.12.疫苗、抗體和抗病毒劑之調配物
在較佳的具體實施例中，本發明提供由根據本發明之核 酸編碼的蛋白質分子，或間質肺病毒-專一之病毒蛋白 質，或其功能片段。有用的蛋白質分子，例如係衍生自根 據本發明之病毒的任何基因，或衍生自根據本發明之病毒 的基因组片段。這類分子或其抗原片段，如同在本文中提 供的，例如可用在診斷方法或套組中，以及在諸如次-單 元疫苗之類的醫藥组合物中。特別有用的是F、SH及/或G 蛋白質，或其包括抗原或次單元免疫原的抗原片段，但亦 可使用失活的完整病毒。特別有用的還有由已藉系統發生 分析確認之重組核酸片段編碼的那些蛋白質物質，當然較 佳的是在可用於系統發生測定中之ORFs的較佳範圍和境 界内的那些，特別是為了誘發MPV專一抗體或T細胞反 應，無論是在活體内（例如為了保護之目的，或為了提供 診斷用 '的抗體），或是在活體外（例如藉著溶菌斑展示技 術，或其他可用來產製合成抗體的技術）。 在本文中亦提供抗體，它是天然多株或單株的，或合成 的（例如（噬菌體）庫-衍生之結合分子）抗體，其專一地與包 括根據本發明之蛋白質分子，或其MPV-專一之功能片段 的抗原產生反應。這類抗體可用在確認病毒分離株為MPV 的方法中，包括使該病毒分離株或其組份與在本文中提供 之抗體產生反應。這可藉著.例如，使用經純化或未-經純 -128- (123) -lmmm 化之MPV 同格式的 芫成之。 古典的免 可在治 中，使用 或其片段 根據本發 有用的， 各易被人 性期患者 其他疾病 的嚴重病 體’包括 本發明 的方法，έ 貫驗動物 定該製劑 抗病毒劑 份，如同< 毒劑。本^ 藥组合物 MPV感染 物，並提i 或其部分（蛋白質、肽），使用ELISA ' RIA或不 才凡原檢 /則定（Cuj：rent pr〇t〇c〇ls & Jmmun〇l〇gy)，來 或者可使用被感染之細胞或細胞培養物，使用 疫勞光或免疫組織化學技術，來確認病毒抗原。 療或預K MPV感染，及/或呼吸道疾病的方法 G括例如根據本發明之病毒 '核酸、蛋白質分子 、杬原及/或抗體的醫藥組合物，包括提供個體 明之醫藥組合物。當該個體包括人類時，這是最 特別疋在遠人類小於5歲時，因為這類嬰幼兒最 類MPV感染，如同在本文中提供的。通常，在急 將受上呼吸道徵候所苦，易染患其他的呼吸道和 。亦可能發生下呼吸道疾病，易染患更多和其他 況。可使用本發明之組合物治療免疫-妥協的個 癌症患者、移植接受者和老年人。 5F提供獲得可用於治療呼吸道疾病之抗病毒劑 」括建土包括根據本發明之病毒的細胞培養物或 ，以候選的抗病毒劑處理該培養物或動物，並判 對該病毒或其感染該培養物或動物的效力。這類 的實例，包括MPV-中和抗體，或其有功能的組 έ本文中提供的’但亦獲得具有其他性質的抗病 "亦提供使用抗病毒劑’根據本發明來製備醫 ，特別是製備用來治療呼吸道疾病’尤其是在由 或相關疾病引起之呼吸道疾病時的醫藥組合 共包括根據本發明之抗病毒劑的醫藥組合物，可 -129- 1344991 (124) 用在治療或預防MPV感染或呼吸道疾病的方法中，該方法 包括提供個體這類醫藥組合物。
在本發明的某些具體實施例中，本發明之疫苗包括如同 在本文中定義的哺乳動物間質肺病毒。在某些更特定的具 體實施例中，該哺乳動物間質肺病毒是人類間質肺病毒。 在較佳的具體實施例中，欲在疫苗調配物中使用的哺乳動 物間質肺病毒，具有減毒的表現型。關於獲得減毒表現型 的方法，參見第4.6節。 本發明提供預防和治療PIV、RSV、APV及/或hMPV感染 的疫苗調配物。在某些具體實施例中，本發明之疫苗包括 本發明之重組和嵌合型病毒。在某些具體實施例中，該病 毒是減毒的。
在特定的具體實施例中，該疫苗包括APV，並在人類中 使用該疫苗來預防和治療hMPV感染。未與理論結合，因 為APV之F蛋白質與hMPV之F蛋白質的高度同種性，以APV 感染，結果將在宿主中產生抗體，其將與hMPV產生交互-作用，並保護宿主免於被hMPV感染及相關疾病。 在其他特定的具體實施例中，該疫苗包括hMPV，並在 鳥類中使用該疫苗來預防和治療APV感染。未與理論結 合，因為APV之F蛋白質與hMPV之F蛋白質的高度同種性， 以hMPV感染，結果將在宿主中產生抗體，其將與APV產生 交互-作用，並保護宿主免於被APV感染及相關疾病。 在特定的具體實施例中，本發明包括使用重組和嵌合型 APV/hMPV病毒，已經在疫苗調配物中加以修改，賦與對 -130- 1344991 (125)
抗APV及/或hMPV的保護。在某些具體實施例中，在欲投 予鳥類的疫苗中使用APV/hMPV，保護鳥類免於被APV感 染》未與理論結合，以hMPV基因或核苷酸序列置換APV 基因或核苷酸序列，結果產生減毒的表現型，其容許使用 嵌合型病毒作為疫苗。在其他的具體實施例中，將 APV/hMPV嵌合型病毒投予人類。未與理論結合，APV病毒 載體在人類中提供了減毒表現型，並表現hMPV序列，誘 發hMPV專一的免疫反應》
在特定的具體實施例中，本發明包括使用重組和嵌合型 hMPV/APV病毒，已經在疫苗調配物中加以修改，賦與對 抗APV及/或hMPV的保護。在某些具體實施例中，在欲投 予人類的疫苗中使用hMPV/APV，保護人類免於被hMPV感 染。未與理論結合，以APV基因或核荅酸序列置換hMPV 基因或核：y：酸序列，結果產生減毒的表現型，其容許使用 嵌合型病毒作為疫苗。在其他的具體實施例中，將 hMPV/APV嵌合型病毒投予鳥類。未與理論結合，hMPV主 鏈在烏'類中提供了減毒表現型，並表現APV序列，誘發APV 專一的免疫反應。 在某些較佳的具體實施例中，使用本發明之疫苗調配 物，保護對抗由間質肺病毒和相關疾病引起的感染。更特 定而言，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由人類間質 肺病毒及/或禽肺病毒引起的感染，及相關的疾病《在某 些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由 (a)人類間質肺病毒和呼吸道融合細胞病毒；及/或（b)禽肺 -131 - 1344991
(126) 病毒和呼吸道融合細胞病毒引起的感染。 在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由（a)人類間質肺病毒和人類副流感病毒；及/或（b)禽 肺病毒和人類副流感病毒引起的感染，及相關的疾病。
在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由（a)人類間質肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類 副流感病毒；及/或（b)禽肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和 人類副流感病毒引起的感染，及相關的疾病。 在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由人類間質肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副流 感病毒引起的感染，及相關的疾病。在某些其他的具體實 施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護對抗由禽肺病 毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副流感病毒引起的感染， 及相關的疾病。
因為在不同病毒物種之F蛋白質中的高度同種性，關於 代表性的胺基酸序列比較，參見圖9，故可使用本發明之 疫苗調配物，保護免於與從其中衍生編碼F蛋白質之異源 核苷酸序列的病毒不同的病毒。在特定的代表性具體實施 例中，該疫苗調配物含有包括衍生自禽肺病毒A型之異源 核甞酸序列的病毒，並使用該疫苗調配物，保護免於禽肺 病毒A型和禽肺病毒B型的感染。本發明包括待投予人類 和動物的疫苗調配物，其可用來保護對抗APV，包括APV-C 和APV-D、hMPV、PIV、流感、RSV、仙臺病毒、腮腺炎、 喉氣管炎病毒、猿病毒5、人類乳頭狀瘤病毒、麻療、腊 -132- 1344991 (127) 膝炎，以及其他病毒和病原，及相關的疾病。本發明更進 一步包括待投予人類和動物的疫苗調配物，其可用來保護 對抗人類間質肺病毒感染和禽肺病毒感染，及相關的疾 病。
在一個具體實施例中，本發明包括可用來對抗家畜致病 原，包括狂犬病病毒、描白血病病毒（FLV)和犬痕熱病毒 的疫苗調配物。在另一個具體實施例中，本發明包括可用 來保護家畜對抗水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、牛瘟病 毒、豬痘病毒，並進一步保護野生動物對抗狂犬病病毒的 疫苗調配物。
在本文中描述之疫苗和醫藥組合物中，可使用藉著逆向 遣傳方法產製的減毒病毒。亦可使用逆向遺傳技術，為其 他對產生疫苗很重要的病毒基因，設計額外的突變一即可 將有用的疫苗品系變種之抗原決定位，設計到減毒的病毒 中。或者，可將完全的外來抗原決定位，包括衍生自其他 病毒或非-病毒病原之抗原，設計到減毒品系内。例如可 將無關'病毒的抗原，像是HIV(gpl60、gpl20、gp41)、寄生 蟲抗原（例如瘧疾）、細菌或真菌抗原，或腫瘤抗原，設計 到減毒品系内。或者，可將在活體内改變病毒之向性的抗 原決定位，設計到本發明之嵌合型減毒病毒内。 幾乎可將任何的異源基因序列建構至本發明之嵌合型 病毒内，以便在疫苗中使用。最好是擔任生物反應修改者 的部分和肽。較佳的是，對任何各種的病原誘導保護性免 疫反應的抗原決定位，或與中和抗體結合，可由嵌合型病 -133 - 1344991
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毒表現，或為其一部分的抗原。例如，可建構至本發明之 嵌合型病毒内的異源基因序列，包括但不限於流感和副流 感血球凝集素-神經胺糖酸苷酶，以及融合糖蛋白，像是 人類PIV3的HN和F基因。在另一個具體實施例中，可設計 在嵌合型病毒内的異源基因序列，包括編碼具有免疫強化 活性之蛋白質的那些》免疫強化蛋白質的實例包括，但不 限於細胞激動素、干擾素第1型、γ干擾素、菌落刺激因子、 介白素-1、- 2、- 4、- 5、- 6、- 1 2，和這些製劑的结抗劑。
此外，可被建構至本發明之嵌合型病毒内，並在疫苗中 使用的異源基因序列，包括但不限於衍生自人類免疫缺陷 病毒（HIV)，最好是第1或第2型的序列。在較佳的具體實 施例中，免疫原性之HI V·衍生肽，可以是建構至嵌合型PIV 内之抗原的來源，然後用它來誘發脊椎動物的免疫反應。 這類HIV-衍生之肽，可包括但不限於衍生自env基因（即編 碼全部或部分gpl60、gpl20及/或gp41的序列）、pol基因（即 編碼全部或部分逆轉錄酶、核酸内切酶、蛋白酶及/或接 合酶的序列）、gag基因（即編碼全部或部分p7、p6、p55、 pl7/18、p24/25的序列）、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr及 / 或 vpx的序歹丨J 〇 其他的異源序列可衍生自B型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) ; A或C型肝炎病毒表面抗原、愛氏頓病毒的糖蛋 白；人類乳頭狀瘤病毒的糖蛋白；呼吸道融合細胞病毒、 副流感病毒、仙臺病毒、猿病毒5或腮腺炎病毒的糖蛋白； 流感病毒的糖蛋白；癌療病毒的糖蛋白；骨趙灰白質炎病 -134- 1344991 (129) 毒的VP 1，諸如細菌和寄生蟲之類非-病毒性病原的抗原決 足位’此外還有很多。在另一個具體實施例中，可表現全 郅或部分的免疫球蛋白基因。例如，可將模仿這類抗原決 定位的抗-遺傳性型之免疫球蛋白的可變區建構至本發明 之嵌合型病毒内，
其他的異源序列可衍生自腫瘤抗原，並可使用所得的嵌 合型病毒產生對抗該腫瘤細胞的免疫反應，導致腫瘤在活 aa内退化。為了治療腫瘤，這些疫苗可與其他治療攝生法 併用’包括但不限於化學治療、輕射治療、手術、骨髓移 植等等。根據本發明，可設計重組病毒，表現與腫瘤有關 的抗原（TAAs)，包括但不限於由τ細胞認出的人類腫瘤抗 原（Robbins和 Kawakami，1996，Curr. Opin. Immunol. 8:628-636， 將其全文以引用的方式併入本文中）、黑色素細胞系統的 蛋白質，包括 gplOO、MART-1/MelanA、TRP-l(gp75)、酪胺 酸酶；腫瘤專一的廣泛共享之抗原，MAGE-1、MAGE-3、 B AGE、GAGE-1、GAGE-1、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶-V、 p 1 5 ;腫瘤專一的突變抗原，a·凱特寧（a_ catenin) ' MUM-1 ' CDK4 ;乳房、卵巢、子宮頸和胰臟癌的非黑色素瘤抗原、 HER-2/neu '人類乳頭狀瘤病毒_E6、-E7、MUC-1。 在其他的具體實施例中’異源核荅酸序列係衍生自間質 肺病毒，像是人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。在另外的 具體實施例中，本發明之病毒含有兩個不同的異源核：y：酸 序列，其中一個衍生自間質肺病毒，像是人類間質肺病毒 及/或禽肺病毒’而另一個衍生自呼吸道融合細胞病毒。 -135- 1344991 (130) 異源核苷酸序列編碼個別病毒的F蛋白質或G蛋白質。在 特定的具體實施例中，異源核站酸序列編碼嵌合型F蛋白 質，其中該嵌合型F蛋白質含有間質肺病毒之F蛋白質的外 功能部位，以及副流感病毒之F蛋白質的穿透膜功能部位 和魯米那功能部位。 可調配活的重組病毒疫苗或失活的重組病毒疫苗。活疫 苗可能是較佳的，因為在宿主中增殖，導致與在自然感染 時所發生之刺激類似種類和大小的延長刺激，並因此賦與 實質上長期-持續的免疫力。可使用涉及在細胞培養物或 在雞胚之尿囊中繁殖病毒的傳統方法，接著純化，完成這 類活重組病毒疫苗調配物的產製。 在特定的具體實施例中，重組病毒對於所投予之個體而 言，是非-病原性的。關於這一點，為了疫苗而使用遺傳 設計的病毒，可能希望在這些品系中，有減毒特徵的存 在。將適當的突變（例如刪除）導入用來轉移感染的模板 中，可提供具有減毒特徵的新穎病毒。例如，可將與感溫 性或冷 '適應性有關的特定誤義突變，做成刪除突變。這些 突變應該比與感冷或感溫性突變種有關的點突變更穩 定，且逆轉的頻率應該很低。 或者，亦可建構具有”自殺"特徵的嵌合型病毒。這類病 毒在宿主内將僅完成一次，或數次複製。當用來作為疫苗 時，重组的病毒將完成有限回合的複製，並引起足夠程度 的免疫反應，但它將不會在人類宿主中進一步運轉，並引 起疾病。分別缺乏一或多個野外型APV和hMPV之基因，或 -136- 1344991
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持有突變基因的重組病毒，將不能經歷成功的連續複製。 可在永久表現這類基因（們）的細胞株中，產製有缺陷的病 毒。缺乏必要基因（們）的病毒將在這些細胞中複製，然 而，當投予人類宿主時，它們將不能完成一回合的複製。 這類製品可轉錄和轉譯--在該不成熟的回合中--足夠數 目的基因，而绣導免疫反應。或者，可投予較大量的品系， 使這些製品得以作為失活的（死的）病毒疫苗。關於失活的 疫苗，最好是以病毒組份之形式來表現異源基因產物，使 基因產物得以與病毒粒子結合。這類製品的優點是它們含 有天然蛋白質，且未經歷藉著福馬林或其他用來製造死毒 疫苗之製劑處理的失活作用。或者，可將由cDNA製造的 本發明之重組病毒高度減毒，使其僅可複製數回合。
在某些具體實施例中，本發明之疫苗包括減毒的哺乳動 物MPV。未與理論結合，減毒病毒可有效地作為疫苗，即 使該減毒病毒不能使細胞產生新的有傳染性的病毒顆 粒，因為將病毒蛋白質插入宿主的細胞質膜内，因此刺激 了免疫‘反應。 在本發明該項觀點的其他具體實施例中，可使用傳統技 術來”殺死”嵌合型病毒，製備失活的疫苗調配物。失活的 疫苗是”死的"，在意義上來說，已經破壞了它的傳染性。 確實，破壞病毒的傳染性，但不影響其免疫原性。為了製 備失活的疫苗，可使嵌合型病毒生長在細胞培養物中，或 在雞胚的尿囊中，藉著區域超離心作用純化，藉著甲醛或 a-丙醇酸内酯失活，並收集之。所得的疫苗通常以肌肉内 ，137- 1344991 (132) «Mia 接種。 可利用適當的佐劑調配失活的病毒，以便提高免疫反 應。這類佐劑可包括，但不限於礦物凝膠，例如氫氧化鋁； 表面活性物質，像是溶血卵磷脂、普魯尼克多元醇、聚陰 離子、肽；油乳劑；以及可能有用的人類佐劑，像是BCG、 短小棒狀桿菌、..ISCOMS和病毒體（virosomes)。
可使用許多方法，導入上述的疫苗調配物，這些包括但 不限於口服、皮内、肌肉内、腹腔内、靜脈内、皮下、經 皮和鼻内及吸入的路徑。較佳的是經由用來設計疫苗之病 原的天然感染路徑，導入嵌合型病毒疫苗調配物。
在某些具體實施例中，本發明係關於免疫原組合物。該 免疫原組合物包括哺乳動物MPV。在特定的具體實施例 中，該免疫原組合物包括人類MPV。在某些具體實施例 中，該免疫原組合物包括減毒的哺乳動物MPV，或減毒的 人類MPV。在某些具體實施例中，該免疫原组合物進一步 更包括在藥學上可接受的載劑。 4.1 3 .劑量攝生法、投藥和調配物 本發明提供包括MPV和APV的疫苗和免疫原製品，包括 表現一或多個異源或非-天然抗原序列的病毒之減毒形 式、MPV和APV之重組形式，以及嵌合型MPV和APV。本發 明之疫苗或免疫原製品，包括單一或多價的疫苗，包括二 價和三價的疫苗。本發明之疫苗或免疫原調配物，可用來 提供對抗各種病毒感染的保護。特定而言，本發明之疫苗 或免疫原調配物提供宿主對抗呼吸道感染的保護。 -138- (133)1344991
可單獨或與其他疫苗一 起投予本發明之重組病毒及
苗、流感疫苗、麻奢疫苗、 球菌疫苗、立克次體疫苗、葡萄球菌疫苗、百日咳疫苗或 對抗呼吸道癌症的疫苗。在較佳的具體實施例中，本發明 之病毒及/或疫苗可與在相符年齡建議之小兒科疫苗同時 投予。例如，在2、4或6個月齡時，本發明之病毒及/或疫 苗可與DtaP(IM)、Hib(IM)、骨髓灰白質炎（IPV或〇PV)和b 型肝炎（IM)同時投予《在12或15個月齡時，本發明之病毒 及/或疫苗可與Hib(IM)、骨髓灰白質炎（ipv或OPV)、MMRII® (SubQ) ; Varivax®(SubQ)和B型肝炎（IM)同時投予。在各種出 版物中回顧可與本發明之方法一起使用的疫苗，例如The Jordan Report 2000, Division of Microbiology and Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, United States ’ 將其全文以引用的 方式併入本文中。 不限於呼吸道融合細胞病毒疫 聰腺炎疫苗、風療疫苗、肺炎 可將本發明之疫苗或免疫原調配物本身投予個體’或以 醫藥或治療組合物之形式投予。包括佐劑和本發明之免疫 原抗原（例如病毒、嵌合型病毒 '突變病毒）的醫藥组合 物，可藉著傳統的混合、溶解、粒化、製造糖衣錠、研磨、 乳化、包膠、陷入或冷；東乾燥加工的方法來製造。可使用 一或多種在生理學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或輔 -139- 1344991 (134) 助劑，以傳統的方式調配醫藥組合物，其有助於將本發明 之免疫原抗原加工成可在藥學上使用的製品。其中，適當 的調配物將視所選擇的投藥途徑而定。
當本發明之疫苗或免疫原組合物包括佐劑，或與一或多 種佐劑一起投予時，可使用的佐劑包括，但不限於無機鹽 佐劑或無機鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微顆粒佐劑、黏液的 佐劑和免疫刺激性的佐劑。佐劑之實例包括’但不限於氩 氧化鋁、磷酸鋁凝膠、福瑞德氏完全佐劑、福瑞德氏不完 全佐劑、角鯊烯或角鯊烷水包油佐劑調配物、生物可降解 和生物可相容的聚g旨類、聚合的微脂粒、三格系糖誓或皂 角苷（例如 QuilA和 QS-21，亦以商標 STIMULON、ISCOPREP 販售）、N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異穀胺醯胺（蘇 胺醯基-MDP，亦以商標TERMURTIDE販售）、LPS、單磷醯 基脂質A(3D-MLA，亦以商標MPL販售）。
投予本發明之疫苗或免疫原组合物的個體較好是哺乳 動物，最好是人類，但亦可以是非-人類的動物，包括但 不限於靈長類、牛、馬、绵羊、豬、禽類（例如雞、火雞）、 山羊、描、狗、倉鼠、老鼠和大鼠。 可使用許多方法，導入本發明之疫苗或免疫原組合物， 包括但不限於口服、皮内、肌肉内、腹腔内、靜脈内、皮 下、皮内、鼻内和吸入的路徑，並經由劃痕法（經由皮膚 的上層劃痕，例如使用分又的針頭）。 關於局部投藥，可將本發明之疫苗或免疫原製品調配成 此項技藝中已熟知的溶液、凝膠、軟膏、乳霜、懸浮液等 -140- 1344991
(135) 等。
至於鼻内或藉著吸入投藥，可以從加壓包裝或霧化器提 供之氣溶膠喷霧的形式’便利地遞送根據本發明使用之製 品，並使用適當的推進劑，例如二氯二氟曱烷、三氣氟甲 燒、二氯四氟乙坑、二氧化碳或其他適當的氣體。在加整 氣溶膠的案例中，可藉著提供活門，遞送計量過的含量’ 來判定劑量單位。可調配在吸入器或吹藥器中使用’例如 明膠的膠囊和藥筒，使其含有化合物之散劑混合物，以及 適當的散劑基底，像是乳糖或澱粉。 關於注射，可在含水溶液中，最好是在生理學上可相容 的緩衝溶液，像是漢克氏液、林格氏液或生理鹽水緩衝溶 液中，調配疫苗或免疫原製品。該溶液可含有調配劑，像 是懸浮、穩定及/或分散劑。或者，該蛋白質為散劑形式， 在使用之前，利用適當的媒劑，例如無菌無熱原的水重建。
熟諳此藝者有能力判定投藥用的疫苗或免疫原調配物 的有效含量，特別是根據在本文中提供的詳細揭示内容。 一開始可從在活體外的測定，估計有效劑量。例如，可 使用此項技藝中已熟知的技術，調配在動物模式中達到誘 導免疫反應的劑量。熟諳此藝者可以在本文中描述的結果 為基礎，輕易地充分運用對所有動物物種的投藥。可個別 地調整劑量含量和間隔。例如，當用來作為免疫原組合物 時，適當的劑量是當按照上述投藥時，能夠誘發抗體反應 的組合物量。當用來作為疫苗時，可在1-36週的期間，以 大約1至3個劑量，投予本發明之疫苗或免疫原調配物。較 -141 - 1344991
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佳的是以大約2週至大約4個月的間隔，投予1或2個劑量， 之後定期給予補強的疫苗接種。交替的草案可能適合個別 的動物。適當的劑量是當按照上述投藥時，能夠使在被免 疫動物中的免疫反應升高，足以保護該動物免於感染至少 4至12個月的疫苗調配物量。一般而言、出現在劑量中之 抗原的量，範圍是從每公斤宿主大約1微微克到大約100毫 克，通常是從大約10微微克到大約1毫克，而較佳的是從 大約100微微克到大約1微克。適當的劑量範圍，將視汰射 路徑和患者的尺寸而改變，但通常範圍是從大約0.1毫升 到大約5毫升。
在特定的具體實施例中，以至少103TCID5〇、至少104 TCID50、至少105TCID50、至少106TCID50之開始單一劑量， 投予本發明之病毒及/或疫苗（我們應該有上限嗎？）。在 另一個特定的具體實施例中，以多個劑量投予本發明之病 毒及/或疫苗。在較佳的具體實施例中，使用在2、4和6個 月齡時的最初給藥攝生法，以及在生命第二年開始時的補 強給藥。更佳的是，以多次給藥攝生法，給予至少105 tcid5〇 或至少io6tcid5Q的每個劑量。 4.13.1.攻毒研究 使用該測定來判定本發明之重組病毒和本發明之疫 苗，在動物模式系統，像是但不限於棉鼠或倉鼠中，預防 下呼吸道病毒感染的能力。可藉著靜脈内（IV)路徑、藉著 肌肉内（IM)路徑，或藉著鼻内路徑（IN)，投予該重組病毒 及/或疫苗。可藉著任何熟諳此藝者已熟知的技術，投予 •142- 1344991 mmmm (137) 該重組病毒及/或疫苗。亦使用該測定，使抗體之血清濃 度與降低與該抗體結合之病毒的肺臟力價發生關連。 在第0天，藉著肌肉内注射、藉著靜脈内注射，或藉著 鼻内之路徑，對棉鼠（棉鼠（Sigmodon hispidis)，平均重100 克）和獼猴（Cynomolgous macacques)(平均重2.0公斤）’投予重 組或嵌合型病毒，或感興趣之疫苗，或BSA。在投予本發 明的重組病毒或疫苗之前、同時或之後，以野外型病毒感 染動物，其中該野外型病毒是針對其產製疫苗的病毒。在 某些具體實施例中，在投予本發明之重组病毒及/或疫苗 之後至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、 至少6天、1週或1或多個月，以野外型病毒感染動物。 在感染之後，犧牲棉鼠，並收獲牠們的肺臟組織，再藉 著溶菌斑滴定，判定肺臟的病毒力價。使用牛血清白蛋白 (BSA) 10毫克/公斤作為陰性對照組。使用三明治ELISA，判 定在攻毒時，在血清中的抗體濃度。在獼猴中，同樣地測 定在鼻和肺臟灌洗液中的病毒力價。 4.13.2.標靶族群 在本發明的某些具體實施例中，由年齡定義本發明之治 療和診斷方法的標靶族群。在某些具體實施例中，本發明 之治療及/或診斷方法的標靶族群，其特徵在於除了呼吸 道感染以外的疾病或病症。 在特定的具體實施例中，標靶族群包括2歲以下的幼 兒。在更特定的具體實施例中，2歲以下的兒童不受呼吸 道感染以外的疾病所苦。 • 143 - 1344991 (138) 在其他的具體實施例中，標靶族群包括5歲以上的患 者。在更特定的具體實施例中，5歲以上的患者受額外之 疾病或病症所苦，包括胰囊性纖維變性、白血病和非-霍 奇金氏淋巴瘤，或最近接受骨髓或腎臟移植。 在本發明特定的具體實施例中，標靶族群包括其中 hMPV感染與宿主之免疫抑制結合的患者。在特定的具體 實施例中，該個體是免疫減弱的個體。
在某些具體實施例中，本發明方法的標靶族群包括老年 人0 在特定的具體實施例中，欲利用本發明之方法治療或診 斷的個體，是在冬季的月份被hMPV感染。 4.13.3.臨床試驗
可進一步在正常健康的成年志願者組別中，就其安全 性、耐受性、免疫原性、傳染性和藥物動力學，評估已在 活體外測定和動物模式中測試過的本發明之疫苗或其片 段。以肌肉内、靜酿内之方式，或藉著肺臟遞送系統，將 單一劑·量的本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗投予志 願者。在接受單一劑量的本發明之重组病毒及/或本發明 之疫苗之前至少24小時，監視每個志願者，並在臨床處接 受投藥之後，將監視每個志願者至少48小時。然後在投藥 後第3、7、14、21、28、35、42、49和56天，以門診病患之 方式監視志願者。 以下列之間隔：（1)在投與本發明之重組病毒及/或本發 明之疫苗的給藥之前；（2)在投與本發明之重組病毒及/或 -144- 1344991 (139)
本發明之疫苗的給藥期間；（3)在投與本發明之重組病毒 及/或本發明之疫苗的給藥之後5分鐘、10分鐘、15分鐘、 20分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、 24小時和48小時；以及（4)在投與本發明之重組病毒及/或 本發明之疫苗的給藥之後3天、7天、14天、21天、28天、 35天、42天、49天和56天，經由留置套管或直接靜脈穿刺， 使用10毫升紅蓋的真空採血管，收集血液試樣。容許試樣 在室溫下凝固，並將在離心之後收集血清。 可藉著ELISA定量在得自患者之試樣中，對抗本發明之 重組病毒及/或本發明之疫苗所產生的抗體含量。亦可監 視在PBMC和肺臟及鼻灌洗液中的T-細胞免疫力（細胞毒 性和協助者反應）。
藉著從在投予本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗的 給藥之後，在每個收集間隔處的血清含量，減去給藥前的 血清含量（背景含量），修正在志願者血清中之抗體含量的 濃度》對每個志願者，根據模式-獨立性方法（Gibaldi等人， 編輯， 1982，Pharmacokinetics,第 2 版，Marcel Dekker，New York)，從經過修正的血清抗體或抗體片段濃度，計算藥 物動力學參數。 4·14.檢測和診斷哺乳動物MPV的方法 本發明提供診斷及/或檢測MPV的裝置和方法，使用該 裝置和方法來檢測MPV、其組份及及轉錄.、轉譯、表現、 繁殖和代謝過程的產物。更特定而言’本發明提供在動物 和人類中診斷MPV感染的裝置和方法，該裝置和方法包 -145- 1344991 驪 (140) 括，但不限於檢測MPV之组份、MPV生活史之產物，以及 宿主對MPV暴露或感染之反應的產物。 在一個具體實施例中，本發明提供診斷和檢測MPV的裝 置和方法’該裝置和方法包括’但不限於檢測基因组物 質，以及其他與MPV有關或互補的核酸，檢測MPV的轉錄 和轉譯產物，該產物是經過加工或未經加工的，並檢測宿 主對MPV暴露或感染之反應的組份。 在一個具體實施例中，本發明係關於經由與出現在Mpv 之基因組内的核酸序列互補之寡核甞酸，以及核酸序列之 轉錄產物的製備和使用，來檢測MPV。此外，本發明亦關 於使用該寡核嘗酸作為引子，複窝或擴大MPV基因组的特 定區域及其轉錄本’來檢測出現在MPV之基因組中的核酸 或其序列’及其轉錄產物。可複窝或擴大的mpv基因組之 區域及其轉錄本，包括但不限於一或多片完整或不完整的 下列基因：Ν-基因、Ρ-基因、Μ-基因、F-基因、M2-基因、 SH-基因、G-基因和L-基因。在特定的具體實施例中，為 了確認之目的，使用寡核苷酸作為引子，連同複寫或擴大 MPV之Ν-基因或其轉錄本的方法。該方法包括，但不限於 RT-PCR測定，引子延伸或執行測定，以及其他使用MPV之 遗傳物質或其轉錄本和互補物作為模板，從該寡核穿酸中 延仲核酸序列的方法。 在其他的具體實施例中，本發明係關於經由與出現在 MPV之基因组内的核酸序列互補之寡核甞酸，以及核酸序 列之轉錄產物的製備和使用，來檢測MPV。此外，本發明 -146 - 1344991
(141) 亦關於使闺该寡核苷酸序列作為探針，與在MPV基因組中 或與其互補之特定區域及其轉錄本雜交並檢測它，來檢測 出現在MPV之基因组及其轉錄產物中，或與其互補的核酸 或其序列。町使用雜交探針檢測之MPV基因組的區域及其 轉綠本，包栝但不限於一或多片完整或不完整的下列基 因：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因' SH-基因、G-基因和L-基因。在特定的具體實施例中，為了確 認之目的’使用寡核苷酸作為探針，連同檢測、黏接或與 MPV之N-基因或其轉錄本雜交的方法。該方法包括，但不 限於北方墨點、南方墨點，以及其他使用MPV之遣傳物質 或其轉錄本和互補物作為標乾，與在MPV基因組中，或與 其互補之序列或序列片雜交、黏接或檢測的方法。
可在本發明之方法中，使用可與哺乳動物MPV之核酸， 或其逆向互補物’或其互補物雜交的核酸，來檢測哺乳動 物MPV的存在。在某些具體實施例中，該核酸在高嚴格度 的條件下雜交。舉例來說，但不限於使用這類高嚴格度條 件的過程如下。在65。〇下，在由ssc、5〇 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、〇.〇2〇/0pvP、0.02%FicoU、0.02%BSA和 500 微克/當升之變性鞋精DNA所組成的緩衝溶液中，進行含 有DNA之遽紙的預先雜交8小時至過夜。在65它下，在含 有100微克/毫升之變性鮭精DNA和5-20 X 106 cpm 32P-標示 之·彳未針的預先雜交混合物中，使濾紙雜交48小時。在37°C 下’以含有 2X SSC、〇.01%Pvp、〇.〇i%Ficoll和 0.01%BSA的溶 液’冲洗慮紙1小時。接著在50〇C下，在放射自顯術之前， r1344991 (142) atemi
以0.1 X SSC沖洗45分鐘。其他可使用之高嚴格度的條件， 為此項技藝中已熟知的。在本發明其他的具體實施例中， 在中等或低嚴格度的條件下進行雜交，這類條件為熟諳此 藝者已熟知的（參見，例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York;亦參見 Ausubel 等人，編輯，在 the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals 中，1987- 1997 Current Protocols, 1994- 1997 John Wiley and Sons, Inc.) 0
在其他的具體實施例中，本發明係關於經由抗體的製備 和使用，例如單株抗體（MAbs) ’其對MPV特有的肽或核 酸’或其基因產物是專一的’並可認出它們’在動物或人 類宿主中檢測MPV的感染。可被該MAbs認出之抗原決定位 或抗原決定位，包括但不限於在生命週期和涉及MPV繁殖 之代謝過程期間合成的蛋白質和核酸產物°可用來作為抗 原決定位，產製適當抗體的蛋白質或核酸產物’包括但不 限於一.或多個下列MPV組份.的完整或不芫整轉錄和表現 產物：N-基因、P-基因、M-基因、F_基因、基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一個特定的具體實施例中’使 用對G-基因之蛋白質產物或其部分升高的MAbs ’連同其 他在生物試樣，例如體液中，檢測或證實表現G肽之MPV 的存在的方法。該方法包括但不限於ELISA、放射性-免疫 或競爭測定、免疫-沉澱和其他使用Μ P V之轉錄或表現基 因產物作為標靶，以便藉對該標靶或其部分和關係物升高 -148- 1344991 (143) 的MAbs來檢測的方法。
在其他的具體實施例中，本發明係關於與宿主對MPV暴 露或感染之免疫反應有關，並為其特徵的因子。當暴露或 被MPV感染時，宿主的免疫系統誘發對該暴露或感染的反 應，其涉及針對排除或減弱病毒的影響及/或繁殖，由宿 主產生抗體。本發明提供經由檢測可能因MPV暴露或感染 宿主之結果而產生的該抗體，診斷與MPV有關之疾病的裝 置和方法。由該抗體認出之抗原決定位》包括但不限於月太 及其暴露表面，其可供宿主的免疫反應利用，並可在由宿 主對病毒產生反應反應時，作為抗原決定位。可由宿主免 疫反應用來當作產製抗體之抗原決定位的一些蛋白質和 核物質，包括但不限於一或多個下列MPV組份的產物：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一個具體實施例中，在宿主試樣中檢測 對編碼MPV之肽的N-基因的部分或全部可利用部分的抗 體。在特定的具體實施例中，使用G-基因或其一部分的蛋 白質產.物，連同其他在生物試樣，例如體液中，檢測宿主 衍生之抗體的存在的方法。該方法包括但不限於ELISA、 放射性-免疫或競爭測定，及其他使用MPV之轉錄或表現 基因產物作為標靶，以便藉著認得該產物的宿主抗體來檢 測，並在生物試樣中找到該宿主抗體的方法。 本發明亦提供診斷測定或測試套組的裝置和方法，以及 從各種來源，包括但不限於生物試樣，例如體液中，檢測 MPV之感染原的方法。在一個具體實施例中，本發明係關 -149- 1344991 (144) 於適用於確認MPV核酸或其互補物的測定、套組、草案和 程序。在其他的具體實施例中，本發明係關於適用於確認 MPV表現肽或其一部分的測定、套组、草案和程序。在另 一個具體實施例中，本發明係關於適用於確認宿主對MPV 暴露或感染之免疫學反應之組份的測定、套組、草案和程 序。
除了宿主感染MPV的診斷證明之外，本發明亦提供將 MPV之分離株歸類至不同系統發生組或亞組中的裝置和 方法。在一個具體實施例中，可有利地使用該特徵，區別 MPV的不同變種，變種Al、A2、B1和B2，以便設計更有效 和亞組專一的療法。可以一或多個下列基因之核苷酸或胺 基酸序列為基礎：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因，區別MPV的變種。在 特定的具體實施例中，可使用G基因或糖蛋白的核苷酸或 胺基酸序列，以及使用亦認得G糖蛋白之單株抗體的中和 測試，將MPV區分成特定的亞组。 在一個具體實施例中，使用任何熟諳此藝者已熟知的技 術，例如免疫測定，在人類中進行MPV感染的診斷。可用 來分析免疫專一之結合作用和交叉-反應性的免疫測定， 包括但不限於競爭性和非-競爭性的測定系統，其使用諸 如西方墨點、放射性免疫測定、ELISA(酵素連結之免疫吸 附測定）、三明治免疫測定、免疫沉澱測定、沉澱素反應、 凝膠擴散沉澱反應、免疫擴散測定、血球凝集測定、補體 -結合測定和螢光免疫測定之類的技術，其他還有很多。 -150- 1344991 (145)
mmmM 這類測定是例行的，並為此項技藝中已熟知的（參見，例 如 Ausubel 等人，編輯，1994，Current Protocols in Molecular Biology,第 1冊，j〇hn Wiley & Sons, Inc.，New York,將其全文 以引用的方式併入本文中），並在第4.7.10節中，說明免疫 測定的非限制性實例。
在一個具體實施例中，本發明係關於使用寡核：a：酸，連 同PCR或引子延伸方法，複寫或擴大MPV基因組之區域， 該區域包括但不限於基因或基因的部分，例如N、Μ、F、 G、L、Μ、Ρ和M2基因，來檢測MPV感染。在特定的具體 實施例中，使用寡核：y：酸，連同rt-pct方法。在更進一步 的具體實施例中，可利用與在各種hMPV品系之間受到保 留，或在各種hMPV品系中是不同的特定序列互補的寡核 苷酸，來探測擴大產物及/或遺傳物質。後面的寡核甞酸 組將容許確認造成感染宿主之hMPV的特定品系。
本發明提供在hMPV的不同亞組和變種之間’區別能夠 感染宿主之hMPV的方法。在一個特定的具體實施例中’ 將造成.宿主感染之hMPV歸類為特定的亞組’例如亞組A或 亞组B。在另一個特定的具體實施例中，將造成宿主感染 之hMPV歸類為亞組的特定變種，例如變種A1、A2、B1或 B2。在另一個具體實施例中，本發明提供將造成宿主感染 之hMPV歸類為新亞組及/或新或现存亞組之新變種的裝 置和方法。能夠區分hMPV品系為亞組及/或變種組的方 法，將是熟諳此藝者已知的。在〆個具體實施例中使用多 株抗體來確認感染的病原為hMPV之品系’並使用二級抗 -151 · 1344991 (146)
體區別該品系是否具有hMPV之新的或已知亞組及/或新 的或已知變種的特徵。在一個具體實施例中，使用對hMPV 有選擇性的抗體，連同免疫反應性測定，例如ELISA或 RIA，在生物試樣中確認hMPV暴露或感染的存在。在更進 一步的具體實施例中，使用對在hMPV蛋白質之肽序列 中，特定抗原決定位有選擇性的二級抗體，進一步將該經 過確認之hMPV感染的病原歸類為亞組或變種。在一個特 定的具體實施例中，使用對在所有hMPV亞組之間共享之 肽抗原決定位升高的抗體，確認該感染之病原為hMPV。 在更特定的具體實施例中，使用對hMPV之不同亞組及/或 變種特有的肽抗原決定位升高的抗體，將造成宿主感染之 hMPV歸類為已知或新的亞組及/或變種。在一個特定的具 體實施例中，該抗體能夠區別不同的hMPV之亞組及/或變 種，認出亞組或變種特有之hMPV肽的斷片，該肽包括但 不限於由N、Μ、F、G、L、Μ、P和M2基因編碼的那些。 可使用在各種hMPV蛋白質之已知肽序列中的差異，連同 親水性·計畫，判定在診斷測定中預期它將與溶劑接觸或可 使用的適當肽斷片，來選擇可用來產製能夠區別不同的 hMPV亞組或變種之抗體的肽或肽斷片。在一個具體實施 例中，能夠區別hMPV之不同亞組的抗體，認得hMPV之不 同亞组所特有之F蛋白質中的差異，例如在全長F蛋白質之 位置286、296、312、348和404處的胺基酸。在其他特定的 具體實施例中，能夠區別hMPV之不同亞組及/或變種的抗 體，認得特定亞組或變種所特有之hMPV G蛋白質的斷片， • 152- 1344991 (147) 例如可使用符合序列識別119號之胺基酸5〇至6〇的G肤序 * 列，來區別亞組A和B，以及變種Al、A2、B1和B2。在本 發明的另一個具體實施例中’使用hMPV分離株的核贫酸 序列，來區別hMPV的不同亞組及’或不同變種。在一個具 體實施例中，使用與在hMPV基因組中之序列互補的寡核 苷酸序列' 引子及/或探針，連同熟諳此藝者已知的方法， 將hMPV感染之病原歸類為亞組及/或變種，例如RT_PCR、 PCH、引子執行測定和各種墨點技術。在一個特疋的具體 _ 實施例中’使用RT-PCR，使用生物試樣來複寫或擴大hMPV 基因組的特定斷片》在更進一步的具體實施例中’獲得該 斷片的序列，並與hMPV的已知序列相比較，並使用該比 較將hiMPV品系歸類為不同的亞組或變種，或將hMPV品系 歸類為新的亞組或變種。在另一個具體實施例中，本發明 : 係關於可用來區別hMPV之不同亞組及/或變種的診斷套 組。 在較佳的具體實施例中，利用對引起該感染之特定病毒 _ 最專一.的試劑，進行特定病毒感染的診斷及/或治療°在 該情況下，係利用對MPv最專一之試劑’進行該診斷及/ 或治療MPV的較佳方法。舞而’這並非意指排除了較不專 —的可能性，但使用例如具有充分交叉反應性的試劑代 替，因為它們是較易辞得的，並足以完成手邊的工作。例 如，在此處舉例提供利用衍生自APV之試劑’特別是衍生 自APV-C的試劑，在哺乳動物中’進行MPV感染之病毒學 及/或血清學診斷，在本久中.的詳細說明中，例如，顯示 -153- 1344991 (148)
可藉著使用特別為了檢測鳥類之APV抗體設計的ELISA， 完成哺乳動物之MPV感染的充分可靠之血清學診斷。為了 該目的而特別有用的測試，是為了檢測APV抗體（例如在 血清或卵黃中）所設計的ELISA測試，已知其一市售版本是 APV-Ab SVANOVIR®係由 SVANOVA Biotech AB，Uppsal Science Park Glunten SE- 75 1 83 Uppsala Sweden製造。逆向的狀況亦是 例證，在此處舉例提供利用衍生自MPV之試劑，在哺乳動 物中，進行APV感染之病毒學及/或血清學診斷，在本文中 的詳細說明中，例如，顯示在哺乳動物中，可藉著使用為 了檢測MPV抗體設計的ELISA，完成鳥類之APV感染的充分 可靠之血清學診斷。考量抗原和抗體具有鎖與鑰匙的關 係，可藉著選擇具有充分交叉-反應性的適當抗體，完成 各種抗原的檢測。當然，為了依賴這類交叉-反應性，最 好是在存在於各種病毒之各種（糖）蛋白之間的胺基酸同 種性的指導之下選擇試劑（像是抗原或抗體），藉此使欲在 依賴該交叉-反應性之測試中使用，與最具同種性之蛋白 質有關的試劑，將是最有用的。 至於核酸檢測，甚至是更直接地，改而以各種病毒之異 種核酸序列為基礎來設計引子或探針，並因此檢測本質上 在哺乳動物或禽類間質肺病毒之間的差異，它滿足以那些 顯示出高同種性的病毒專一之核酸序列片為基礎，設計或 選擇引子或探針。通常，對核酸序列而言，90%或更高， 保證足夠的交叉反應性，將依賴在診斷測定中，所使用的 雜交嚴格條件。 -154- 1344991 (149)
本發明舉例提供以血清學之方式診斷動物之MPV感染 的方法，特別是哺乳動物，更特定而言是人類，包括在該 動物之試樣中，藉著使該試樣與根據本發明之MPV的特定 核酸或抗體反應，判定病毒分離株或其組份的存在，且該 i血清學之方式診斷哺乳動物之MPV感染的方法，包括在 該哺乳動物之試樣中，藉著使該試樣與MPV-專一之蛋白 質分子或其片段，或根據本發明之抗原反應，判定專一地 針對MPV或其組份之抗體的存在。本發明亦提供診斷MPV 感染，包括MPV、MPV-專一之核酸、其蛋白質分子或片段、 根據本發明之抗原及/或抗體的診斷套组，且更佳的是檢 測該MPV、MPV-專一之核酸、其蛋白質分子或片段，抗原 及/或抗體的裝置，該裝置包括例如可刺激之基團，像是 在此項技藝中使用的螢光團或酵素檢測系統（適當之診斷 套組格式的實例，包括IF、ELISA、中和測定、RT-PCR測 定）。欲判定一尚未確認之病毒組份或其合成類似物，像 是核酸、其蛋白質分子或片段是否為MPV-專一的，其足 以分析.該组份之核酸或胺基酸序列，例如對一片該核酸或 胺基酸而言，較佳的是至少10個，更佳的是至少25個，再 更佳的是至少40個核苷酸或胺基酸（分別），藉著序列同種 性比較，按照在本文中提供的，使用例如系統發生分析， 與已知的MPV序列比較，並與已知的非- MPV序列比較（最 好使用APV-C)。依據與該MPV或非-MPV序列之關係的程 度，可確認组份或合成類似物。 本發明亦提供以病毒學之方式診斷哺乳動物之MPV感 -155- 1344991
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染的方法，包括在該哺乳動物之試樣中，藉著使該試樣與 衍生自APV(最好是血清型C)之交又反應性的核酸，或與該 APV起反應之交叉-反應性抗體反應，來判定病毒分離株 或其組份的存在，且該以血清學之方式診斷哺乳動物之 MPV感染的方法，包括在該哺乳動物之試樣中，藉著使該 試樣與蛋白質分子或其片段，或衍生自APV之抗原反應， 來判定亦針對APV或其組份之交叉反應性抗體的存在。此 外，本發明亦提供最初為了 APV或APV-抗體檢測而設計之 診斷套組的用途.，以便用來檢測MPV感染，特別是在人類 中檢測該MPV感染。
本發明亦提供在鳥類中，以病毒學之方式診斷APV感染 的方法，包括在該鳥類之試樣中，藉著使該試樣與衍生自 MPV之交又-反應性核酸，或與該MPV有反應之交又反應性 的抗體反應，來判定病毒分離株或其組份的存在，且該以 血清學之方式診斷鳥類APV感染的方法，包括在該鳥類的 試樣中，藉著使該試樣與衍生自MPV之蛋白質分子，或其 片段或抗體反應，來判定亦針對MPV或其組份之交叉-反 應性抗體的存在。此外，本發明亦提供最初為了 MPV或 MPV-抗體檢測而設計之診斷套組的用途，以便用來檢測 APV感染，特別是在諸如雞、鴨或火雞之類的禽類中，檢 測該APV感染。 至於可供治療用的診斷，可使用在不同哺乳動物MPVs 中，以及在MPV與其他病毒之間的高度同種性，像是例如 APV，特別是當手邊的情況使用較具同種性，較不直'接的 -156- 1344991 (151)
途徑時。當不能獲得較具同種性的MPV疫苗時，例如，可 利用衍生自APV(最好是C型）分離株的疫苗製品，進行不能 等的疫苗接種，像是對MPV感染之緊急疫苗接種，且反之 亦然，可預期利用衍生自MPV的疫苗製品，進行對抗APV 感染的疫苗接種。再者，逆向遺傳技術使其可能產生嵌合 型APV-MPV病毒構築體，其可用來作用疫苗，且與每個欲 減毒至想要程度之個別品系的田野分離株是充分不同 的。對我們而言，在疫苗製備上，類似的逆向遣傳技術， 將使其可能產生嵌合型副黏液病毒-間質肺病毒構築體， 像是RSV-MPV或P13-MPV構築體。這類構築體在作為對抗 呼吸道疾病之混合疫苗上是特別有用的。 因為MPV CPE幾乎不能與在tMK或其他細胞培養物中， 由hRSV或hPIV- 1引起的區另，故未曾充分地注意到MPV，
直到現在為止。tMK(三級猴腎細胞，即在細胞培養中第三 次繼代的MK細胞）是最偏好使用的，因為與原始或二級培 養物相比較，它是較低成本的。CPE之特徵為形成融合細 胞，像某些典型的副黏液病毒一樣，隨後細胞顯示出迅速 的内部瓦解，接著細胞從單層中脫離。細胞通常（但並非 總是）在病毒從最初之材料三次繼代之後，在接種後10至 14天，展現出CPE，比由諸如hRSV或hPIV-Ι之類的其他病 毒略晚一些。 例如，本發明提供不是先前確認的副黏液病毒，其得自 28個罹患嚴重RTI之兒童的鼻咽抽吸試樣。這些兒童的臨 床症狀相當類似由hRSV引起的症狀。27個患者是小於5歲 -157- 1344991 (152) 的兒童，而其中的一半是在1到12個月大之間。另一個患 者是1 8歲。所有的個體均受上RTI之苦，症狀範圍從咳嗷、 肌痛、p區吐和發燒到支氣管炎和嚴重的肺炎。這些患者大 部分都住院1至2週。 得自這些患者的病毒分離株，在負對比電子顯微鏡中， 具有副黏液病毒之形態學，但不與對抗已知之人類和動物 副黏液病毒的專一抗血清反應。藉著間接免疫螢光測定 (IFA)，利用對分離株中的兩個升高的血清，判定它們互 相都是密切相關.的。這些分離株中九個的序列分析，顯示 該病毒多少與APV有關。以病毒學資料、序列同一性和基 因組的組織化為基礎，我們提出該病毒是間質肺病毒屬的 成員。血清學的調查顯示該病毒是相對上較普遍的病原， 因為在荷蘭的血清流行，5歲的人接近100%。此外，在1958 年中收集自人類的血清中，發現血清流行是同樣地高，表 示該病毒已經流傳在人類族群中，超過40年。所提出之間 質肺病毒屬新成員的確認，現在亦提供診斷測定或測試套 組之裝.置和方法，以及病毒性呼吸道感染之疫苗或血清或 抗體组合物，以及測試或篩選可用來治療MPV感染之抗病 毒劑之方法的發展。 在本文中提供之方法和裝置，在診斷MPV感染之診斷套 組中是特別有用的，不管其藉著病毒學或血清學的診斷。 例如，這類套組或測定可包括病毒、核酸、蛋白質分子或 其片段、根據本發明之抗原及/或抗體。病毒、核酸、蛋 白質分子或其片段、根據本發明之抗原及/或抗體的使 -158- 1344991
(153) 用，亦可供產製醫藥組合物’例如用來治療或預防MPV感 染及/或治療或預防呼吸道疾病’特別是在人類。可藉著 建立為了該目的而發展的方法，達成病毒的減毒，包梧但 不限於使用其他物種的相關病毒、經由實驗室動物及/或 組織/細胞培養的連續繼代、分子選殖的指定位置之突變 生成作用，以及在相關的病毒之間交換基因或基因片段。 5.病毒分離及定出特徵 5.1.實例1:樣本收集、病毒分離，定出病毒之特徵 從宿主中獲得鼻咽抽吸物的試樣，測定病毒的存在，並 亦定出那些已確認者的特徵。從受呼吸道感染（RTI)之苦 的兒童中收集鼻咽抽吸物。為了判定致病者的身份，藉著 直接免疫螢光測定（DIF)測試所有的鼻咽抽吸物（參見在 實例9中的方法）’使用對抗流感病毒A和B型、hRSV，和人 類副流感病毒（hPIV)第1、2和3型之螢光標示的抗體。亦使 用快速殼瓶（rapid shell vial)技術（Rothbarth等人，1999，J of Virol. Methods 78: 163- 169)，在各種細胞株上，從鼻咽抽吸 物中分.離病毒，包括VERO細胞、三級獼猴腎臟（tMK)細 胞、人類内皮肺臟（HEL)細胞和馬彬達克（marbin dock)腎臟 (MDCK)細胞。藉著間接免疫螢光測定（IFA)(參見在實例11 中的方法）’剛試在2至3次繼代之後顯示出致細胞病變作 用’並在DIF測定中為陰性的試樣，使用對抗流感病毒a、 B和C ' hRSV八和b型、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類副流 感病毒（hPIV)第1至4型、仙臺病毒、猿病毒第5型和新城雞 痕病毒的病毒專一性抗體》雖然對許多案例而言，可能確 • 159· 1344991 (154) 丨 MW删 認出致病原，但有些試樣對所有受試的病毒是陰性的。
這28個未確認之病毒分離株，在tMK細胞中緩慢生長， 在VERO細胞和A549細胞中生長不佳，而在MDCK細或雞胚 纖維母細胞中幾乎不生長"大多數的病毒分離株，.在第10 至14天之間，在tMK細胞上引起CPE。這比由其他病毒，像 是hRSV或hPIV引起的CPE略晚一些。該CPE幾乎不能與hRSV 或hPIV在tMK或其他細胞培養物中引起的CPE區別，且其特 徵為融合細胞的形成。一些在細胞上觀察到的影響，包括 快速的内部瓦解.，接著細胞從單層中脫離。
使用被感染之tMK細胞的上清液，進行電子顯微鏡（EM) 分析，而其顯示直徑範圍從150至600毫微米之類-副黏液病 毒的病毒顆粒的存在，具有範圍從13至17毫微米的短被膜 突起。與有被膜病毒，像是副黏液病毒科之病毒的生化特 性一致，標準氣仿和链處理（Osterhaus等人，1985，Arch, of Virol. 86:239-25)，結果在tMK細胞的感染性上，產生超過104 TCID5〇的降低。被病毒感染之tMK細胞培養物的上清液， 對火雞雞和天竺鼠的紅血球，並未顯示出血球凝集活 性。在培養期間，病毒複製似乎是胰蛋白酶依賴性的。這 些综合的病毒學資料，證實新確認的病毒是副黏液病毒科 分類學上的成員。 從利用1 5個未經確認之病毒分離株感染的tMK細胞中萃 取出RNA，用來進行逆轉錄和聚合酶連鎖反應（RT-PCR)分 析，使用對副黏液病毒專一的引子组（K.B. Chua等人，2000, Science 288: 1432- 143 5)，像是：hPIVl-4、仙臺病毒、猿病毒 -160- 1344991 (155) 第5型、新城難瘟病毒、hRSV、摩比利、腮腺炎、立百、 亨德拉（Hendra)、塔派亞（Tupaia)和瑪普拉（Mapuera)病毒。 在低嚴格度的條件下進行RT-PCT測定，以便檢測可能有關 的病毒。使用從同種病毒母液中分離出的RNA，作為對照 組。可獲得之對照組與個別病毒-專一的引子有陽性的反 應，但新確認之病毒分離株不與任何引子組反應，表示該 病毒與受試病毒並不是密切相關的。
使用病毒-感染之tMK細胞培養物上清液中的兩個，以鼻 内接種天竺鼠和雪貂。在接種後第0夭、2週和3週，從這 些動物中收集血清試樣。動物們並未出現臨床症狀，然 而，在病毒中和（VN)(參見在實例1 6中的方法）測定，以及 對抗同種病毒之間接IFA中，檢測並測量到所有動物的血 清轉變。在間接IFA中，血清並未與任何上述已知的副黏 液病毒，或與老鼠的肺病毒（PVM)反應。篩選到目前為止 尚未確認的病毒分離株，使用天竺鼠和雪貂感染-前和後 的血清。藉著間接IFA，其中28個對感染-後的血清是明顯 陽性的·’因此暗示尚未確認之病毒分離株是密切相關或相 同的。 為了進一步定出病毒的特徵，在細胞株上檢查病毒感染 的表現型影響9簡言之，以補充有10%胎牛血清（31〇-Whittaker，Vervier，Belgium)的下述培養基，在含有玻片 (Costar，Cambridge, UK)的24孔培養盤中培養tMK細胞。在接 種之前，以PBS沖洗培養盤，並補充帶有漢克氏（Hank's) 鹽的鷹氏（Eagle’s)MEM(ICN，Costa mesa, CA) ’ 其中每 0.5 毫升 -161 - 1344991 (156) 補充 0.26克 NaHC〇3 ' 0.025 M Hepes(Biowhittaker)、2 mM L-穀 胺酿胺（Biowhittaker)、100單位青黴素、100微克鍵黴素 (Biowhittaker)、0.5克乳清蛋白（Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，The Netherlands) 、 1.0 克 D-葡萄糖（Merck, Amsterdam, The
Netherlands)、5.0 克月東（Oxoid，Harrlem，The Netherlands)和 0.02% 月夷蛋白酶（Life Technologies, Bethesda，MD)。以鼻咽抽吸試樣 的上清液接種培養盤（每孔〇·2毫升，一式三份），接著以 8 4 Oxg離心1小時。在接種之後’在37C下培養該盤取多14 天，並每週更換培養基一次，並每天就CPE檢查培養物。 在14天之後，從第二次繼代中刮下細胞，並培養14天。重 覆該步驟至第三次繼代。使用玻片，藉著按照下述的間接 IFA，證實病毒的存在。
通常在第三次繼代之後，在第8至14天之間，視分離株 而定，觀察到CPE。該CPE幾乎不能與由hRSV或hPIV在tMK 或其他細胞培養物中引起的CPE區別，除了 hRSV在大約第 4天引起CPE之外。CPE之特徵為融合細胞的形成，隨後細 胞顯示迅速的内部瓦解，接著細胞從單層中脫離。至於有 些分離株，不易觀察到CPE，而在這些培養物中使用ifa 證實病毒的存在。CPE不能與其他病毒之CPE區別的觀 察，表示不能從臨床症狀的肉眼檢查來進行診斷》 5.2.實例2 :在人類族群中的血清流行 欲研究該病毒在人類族群中的血清流行，藉著間接 IFA，使用以未確認病毒分離株之一感染的tMK細胞，分析 得自不同年齡群之人類的血清。研究顯示可在25%的6至12 -162- (157) (157)1344991
個月齡的兒童巾，檢測到對該病毒之抗體H 5歲兒 童中，將近100%是血清陽性的。藉著間接IFA和藉著VN測 疋，總共檢查了 56個血清試樣3其中51個或91%的試樣， VN測足的結果，即力價大於8，與間接所獲得的結果， 即力價大於32的符合。發現4個試樣在ΙρΑ中為陽性，在 測定中為陰性，即力價小於8，而一個試樣在ifa中為陰 性’即力彳貝小於32，但在VN測定中為陽性，即力價為16(圖 2)。 對72個於195 8年蒋白/扣认，+ &目人類的血清試樣進行IFA，其中年齡 範圍是從8-99歲，顯子ΐΛ/Λ0/ΛΑ .' 100 /〇的血清流行率，表示該病毒已 經流傳在人類族群中 Α „ γ ’超過40年。此外，許多在VN測定 中使用的這些血清該& 、樣’證貫了 IFA資料（圖2)。血清流行 資料表示，該病毒已細 -疋許多年來感染人類族群的重要來 源。 從得自罹患嚴重^ 疋兒童的臨床試樣中重覆分離出該 病毒，指出MPV在臨& 冰和經濟上的影響可能很高^以病毒 檢測和·血清學為基雄 %的新穎診斷測定，將產生發生率，還 有該病毒性病原在臨& w床和經濟上之影響的更詳細分析。 在IFA和VN結果之pE( 间的輕微差異（5個試樣），已經可歸因 於在IFA中，只檢測！ ρ 清抗體，而VN測定則檢測抗體之 種類和亞類兩者的審每 ^ ’貫。或者，差異可歸因於在兩種測定 之間，在敏感性上的至 1差異。關於IFA，使用16之閾值，對 VN而言，則使用8之值。 在IFA和VN測定結果、a a y — κ <間的差異，亦可表示在該新近確 • 163· 1344991 謹 (158) 認之病毒的血清型之間的可能差異。因為MPV似乎與APV 的關係最密切，推測該人類病毒可能是起源於鳥類。在 1958年取自人類之血清試樣的分析，顯示MPV已廣泛分布 在人類族群中，超過40年，代表該假設的動物傳染病事 件，已早在1958年的很久以前發生。 5.3.實例3 : hMPV分離株00-1的基因組序列
為了獲得未知病毒分離株的序列資訊，使用已知為RAP-PCR的擴大策略（Welsh等人，1992，NAR 20:4965-4970)(參見 實例19)。簡言之.，以一種病毒分離株（分離株00-1)，和作 為陽性對照組的hPIV-1感染tMK細胞。在兩個培養物展現 出類似程度的CPE之後，在連續的20-60%蔗糖梯度上，純 化在培養物上清液中的病毒。藉著EM，就類似病毒之顆 粒，來檢查梯度溶離份，並從其中觀察到核包核酸，含有 大約50%蔗糖的溶離份中，分離RNA。使用從兩種病毒溶 離份中分離出的等量RNA，進行RAP-PCR，隨後在3%NuSieve 瓊脂糖凝膠上，使試樣並排地跑。接著從凝膠中純化對未 確認病·毒專一的20個差別呈現的譜帶，選殖到質體 pCR2· 1 (Invitrogen)内，並利用載體-專一之引子定序（參見實 例 20)。使用經由 National Library of Medicine獲得的 BLAST程 式，對在Genebank資料庫中的序列搜尋同種性，在20個片 段中找出10個對APV/TRTV序列展現出類似性。 這10個片段係位在編碼核蛋白（N ;片段1和2)、基質蛋 白質（M ;片段3)、融合蛋白質（F ;片段4、5、6、7)和聚合 酶蛋白質（L ;片段8、9、10)的基因中（圖3)。以RAP PCR片 -164- 1344991 (159)
段和已公開之肺病毒亞科的前導和拖尾序列（Randhawa等 人，1997, J. Virol. 71:98^9854)為基礎，設計PCR引子，使病 毒基因組之3'末端的序列資訊完整。擴大3個片段，其中 片段A跨越N開放編閱架構（ORF)的最3’末端，片段B跨越磷 蛋白（F)ORF，而片段C靠近在Μ和F PRF之間的間隙（圖16)。 這三個片段的序列分析，顯示在病毒基因組的最3'端，缺 少NS1和NS2 ORFs，且將F ORF配置在緊鄰M ORF之處。該 基因組的組織化，類似間質肺病毒APV的組織化，其亦與 序列同種性相符。可藉著比較圖4的胺基酸序列，與其他 病毒個別的Ν蛋白質之胺基酸序列，來推論在不同病毒之 間的關係。Ν、Ρ、Μ和F ORFs的轉譯序列，整體上對肺病 毒屬的成員，顯示出平均30-33%的同種性，並對間質肺病 毒屬的成員，顯示出66-68%的同種性。至於SH和G ORFs， 與任一屬之成員，沒有發現可辨別的同種性。對於N ORF 之胺基酸序列所發現的胺基酸同種性，顯示與hRSV有大 約40%的同種性，而與在遺傳上關係最密切的APV-C則有 8 8%。P ORF之胺基酸序列，顯示與hRSV有大約25%的同種 性，而與APV-C則有大約66-68%，M ORF顯示與hRSV有大 約36-39%的同種性，而與APV-C則有大約87-89%，F ORF顯 示與hRSV有大約40%的同種性，而與APV-C則有大約81%， M2-1 ORF顯示與肺病毒有大約34-36%的同種性，而與 八卩乂-(：則有84-86%，？^2-2 01^顯示與肺病毒有15-17%的同 種性，而與APV-C則有56%，而獲自L ORF之片段顯示與肺 病毒有平均44%的同種性，而與APV-C則有64%。 -165 - 1344991 (160) N、Μ、P和F基因的遺傳分析，顯示MPV對最近提出之間 質肺病毒亞科，與肺病毒亞科相比較，有較高的序列同種 性，並因此證實基因組之組織化，類似並與APV/TRTV的 組織化相似。與 RSVs(，3-NSl-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5，） 的組織化相反，間質肺病毒缺乏NS 1和NS2基因，且亦具有 不同的基因組组織化，特別是在Μ和L('3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')基因之間。在本發明之病毒分離株中，缺乏在Μ和 F基因之間的ORFs，缺乏與Ν相鄰的NS1和NS2，並在APV中 發現高度的胺基酸同種性，引導建議將分離自人類的MPV 歸類為哺乳動物，更特定而言為人類之間質肺病毒屬.的第 一個成員。 系統發生分析顯示，從其中獲得序列資訊的九個MPV分 離株，是密切相關的。雖然序列資訊是有限的，但它們彼 此之間的關係，似乎比對任何禽間質肺病毒的關係更密 切。已經描述了 APV的四種血清型，血清型C似乎與MPV 的關係最密切。該結論係以Ν、P、Μ和F基因的核苷酸序 列類似性為基礎。然而，請注意，對血清型D而言，只能 從Genebank中獲得F基因的部分序列，對血清型Β而言，只 能獲得Μ、N和F序列。在系統發生樹狀圖中，我們的MPV 分離株形成兩叢。對hRSV和APV兩者而言，已經描述了不 同的遺傳和血清學亞型。MPV分離株的兩個遺傳叢，是否 代表在功能上亦有差異之血清學亞組，目前仍是未知的。 我們的血清學調查顯示，MPV是普遍的人類病原。 5.4.實例4 :進一步定出相關基因的特徵 -166- 1344991 (161)
MPV之核蛋白（N)、磷蛋白（p)、基質蛋白質（M)和融合蛋 白質（F)基因的序列分析，顯示與在美國主要在鳥類中發 現的禽肺病毒’ A P V血清型C，有最高程度的序列同種性。 這些分析亦顯示在病毒基因組的3，端，缺乏非-結構性蛋 白質NS1和NS2’並將融合蛋白質配置在緊鄰基質蛋白質之 處。確認出22K(M2)基因、小忌水性（SH)基因、附接（G)基 因、聚合酶（L)基因、基因間區域和拖尾序列。與先前描 述的序列組合，在此處提供之序列，使Mpv之基因組序列 芫整，除了基因組終端的最終12-15個核芬酸之外，並建 jl MPV的基因組組織化。並排地比較mpv基因組之序列與 APV亞型A、B和C，RSV亞型A和B，PVM和其他副黏液病毒 的那些，提供了將MPV歸類為間質肺病毒屬強有力的證 據》
編碼核蛋白（N)的基因·•如同上文所示，在MPV之基因 組舆圖中的第一個基因，係編碼394個胺基酸（aa)蛋白質， 並對其他肺病毒之N蛋白質顯示出廣泛的同種性。N ORF 的長度與APV-C之N ORF的長度相同（表4)，但比其他副黏 液病毒的那些更小（Barr等人，1991，J Gen Virol 72:677-85)。 胺基酸序列的分析，顯示與APV-C有最高的同種性（88%)， 與其他副黏液病毒僅有7-11%(表5) » 確認出在屬於單負股病毒目之病毒之間三個區域的類 似性：A、B和 C(圖 22) (Barr等人，1991，J Gen Virol 72:677-85)。 雖然在病毒科中的類似性是最高的’但在所觀察的病毒科 之間’這些區域是高度保留的。在所有的三個區域中， -167- 1344991 (162) MPV對APV-C顯示出97%aa的序列同一性，與APV-B顯示出 89%aa的序列同一性，與APV-A顯示出92%aa的序列同一 性，並與RSV和PVM顯示出66-73%aa的序列同一性。在aa 殘基160至340之間的區域，似乎在間質肺病毒中是高度保 留的，並比肺病毒亞科略小（Miyahara等人，199 1，Arch Viral 124:255-68; Li等人，1996, Virus Res 41: 185-91; Barr，1991，J Gen Virol 72:677-85)。
編碼磷蛋白（P)的基因：在基因組舆圖中的第二個ORF， 編碼294aa的蛋白質，其與APV-C的P蛋白質共享68%aa之序 列同一性，但與RSV之P蛋白質僅有22-26%aa的序列同一性 (表6)。MPV之P基因含有一個實質的ORF，就那一點來說， 與得自許多其他副黏液病毒的P基因類似（在Lamb等人， Fields virology(B.K. Knipe，Hawley, P.M·，編輯.，LippencottRaven)， Philadelphia, 1996; Sedlmeier 等人，1998，Adv Virus Res 50: 101-39 中回顧）。
與APV A和B，以及PVM相反，但與RSV和APV-C類似， MPV P ORF缺乏半胱胺酸殘基。在所有肺病毒之間高度類 似的區域（胺基酸1 85-241)，在RNA合成過程，或維持殼包 核酸複合物之結構完整上，扮演某種角色（Ling等人，1995, Virus Res 3 6:247-57)。該高度類似的區域，亦出現在MPV中 (圖6)，特別是在考慮保留性置換時，對APYC顯示出100% 的類似性，對APV-A和B為93%，而對RSV約為81%。MPV P 蛋白質之C-終端富含穀胺酸殘基，如同已經對APVs描述的 (Ling等人，1995，Virus Res 36:247-57)。 -168· 1344991 (163) 編碼基質（M)蛋白質的基因：MPV基因組的第三個ORF 編碼254aa的蛋白質，其與其他肺病毒的M ORFs類似。MPV 之M ORF具有剛好與其他間質肺病毒之M ORFs完全相同的 尺寸，並對APV之基質蛋白質顯示出高的aa序列同種性 (78-87%)，而對iRSV和PVM的那些顯示出較低的同種性 (3 7-38%)，且對其他副黏液病毒的那些，顯示出10%或更 低的同種性（表5)。
比較所有肺病毒的基質蛋白質之序列，並發現在殘基14 至19處受到保留的七肽，在MPV中亦受到保留（圖7)(Easton 等人，1997, Virus Res，48:27-33)。至於 RSV、PVM和 APV，已 經確認在Μ之主要ORF中，或與其重疊之小的二級ORFs(在 bRSV 中為 52aa和 51aa，在 RSV 中為 75aa，在 PVM 中為 46aa， 而在 APV 中為 51aa)(Yu等人，1992, Virology 186:426-34; Easton 等人，1997, Virus Res 48:27-33; Samal等人，1991，J Gen Virol 72:715-20; Satake等人，1995, J Virol 50:92-9)。在主要的 M ORF 中發現一個小的ORF，具有54 aa殘基（片段1，圖8)，始於 核苷酸2281，以及與Μ之主要ORF重疊的一個小的ORF，具 有33aa殘基，始於核苷酸2893(片段2，圖8)。與RSV和APV 的二級ORFs類似，在這些二級ORFs與其他肺病毒的二級 ORFs之間，沒有顯著的同種性，且明顯缺乏開始或中止信 號。此夕卜，尚未有任何發生自這些二級ORFs之蛋白質合成 的報告。 編碼融合蛋白質的基因：MPV之F ORF的位置與M ORF相 鄰，這是間質肺病毒屬之成員特有的特徵。MPV之F基因 • 169· 1344991 (164)
編碼539aa的蛋白質，它比APV-C的F更長2個aa殘基。aa序 列的分析，顯示與APV-C有81%同種性，與APV-A和B有 67% ’與肺病毒F蛋白質有33-39%，而與其他副黏液病毒僅 有10-18°/。（表5) »在副黏液病毒之F蛋白質中，有一個保留 的特徵’亦在MPV中看到，就是半胱胺酸殘基的分布 (Morrison等人，1988, Virus Res 10: 113-35; Yu等人，1991，J Gen Virol 72:75-81)。間質肺病毒在El共享12個半胱胺酸殘基（7 個被保留在所有的副黏液病毒中），並在E2中共享2個（1個 被保留在所有的副黏液病毒中）。在出現在MPV之F ORF中3 個可能的N-連接之糖基化作用位置中，沒有任何一個與 RSV共享，而有2個（位置74和389)與APV共享。MPV之第三 個獨特的、可能的N_連接之糖基化作用位置係位在位置 206處（圖 9)。
不管與其他副黏液病毒的低序列同種性，MPV之F蛋白 質顯示出典型的融合蛋白質特徵，與針對其他副黏液病毒 科成員之F蛋白質所作的那些描述相符（Morrison等人，1988, Virus Res 10: 113-35) »副黏液病毒科成員的F蛋白質，是以 失活前驅物（F0)的形式合成，由宿主細胞蛋白酶將其切 開，產生胺基終端的E2次單元和大的羧基終端之F1亞單 元。提出之切開位置（Collins等人，Fields virology, (B.N. Knipe， Howley，Ρ.Μ.，編輯·，Lippencott-Raven)，Philadelphia，1996)，被 保留在副黏液病毒科的所有成員中。MPV之切開位置含有 殘基RQSR。兩個精胺酸（R)殘基與APV和RSV共享，但穀胺 醯胺（Q)和絲胺酸（S)殘基與其他的副黏液病毒共享，像是 • 170- 1344991 (165) 人類副流感病毒第1型、仙臺病毒和摩比利病毒。
認為在F1之胺基終端的忌水性區域，具有像膜融合功能 部位一樣的功能，並在副黏液病毒和摩比利病毒中顯示出 高序列類似性，但對肺病毒的程度較低（Morrison等人，1988, Virus Res 10: 113-35) » 在 MPV與 APV-C之間，保留了這 26個 殘基（位置137- 163，圖9)，其與在間質肺病毒中高度保留 的該區域一致（Naylor等人，1998，J Gen Virol 79:1393- 1398; Seal等人，2000, Virus Res 66:139-47)。
如同在APV和其他副黏液病毒之F2次單元中看到的，與 RSV相比較，顯示MPV刪除了 22aa殘基（位置107-128，圖9)。 此外，對RSV和APV而言，發現在亞型中保留了信號肽和 固定功能部位，並在亞型之間展現出高度的變異性（Plows 等人，1995，Virus Genes 11:37-45; Naylor等人，1998，J Gen Virol 79: 1393- 1398)。在F2之胺基終端的MPV信號肽（aa 10-35，圖 9)，對APV-C顯露出一些序列類似性（26aa殘基中有18個是 類似的），但對其他的APVs或RSV則較少保留。在E1之羧基 終端的·膜固定功能部位中，在亞型之間看到多很多的變異 性，雖然仍對APV-C有一些同種性。 編碼M2蛋白質的基因：M2基因是肺病毒亞科所特有 的，並在所有的肺病毒中觀察到2個重疊的ORFs。第一個 主要ORF代表M2-1蛋白質，其提高病毒聚合酶的加工性 (processivity)(Collins等人，1995，Proc Natl Acad Sci USA 92: 11563-7; Collins等人，Fields virology(B.N. Knipe，Howley，P.M.， 編輯·，Lippencott-Raven)，Philadelphia, 1996)，及其基'因間區 -171 - 1344991 (166) 域的通讀（readthrough)(Hardy等人，1998，J Virol 72:520-6; Fearns等人，1999, j Virol 73:5852-64)。MPV的 M2-1基因與 F基 因相鄰’編碼187aa之蛋白質，並對APV-C的M2-1顯示出最 高的同種性（84%)。比較所有的肺病毒M2-1蛋白質，顯示 在蛋白質胺基終端的那一半中，有最高的保留（c〇Hins等人， 1990, J Gen Virol 71:3015-20; Zamora等人，1992, J Gen Virol 73: 737-41; Ahmadian等人，1999, J Gen Virol 80:2011-6)，其與在該
蛋白質前80個aa殘基中，對APV-C展現出100%類似性之 MPV的觀察（圖1〇)—致。MPV M2-1蛋白質含有3個半胱胺酸 殘基’位在前30個aa殘基内，其被保留在所有的肺病毒 中。經常在含鋅的蛋白質中，發現這類半胱胺酸的濃縮 (Cuesta等人，2000, Gen Virol 74:9858-67)。
與肺病毒之M2-1 ORFs重疊的二級〇RFs(M2-2)，被保留在 某處，但不是在序列中，並認為涉及在病毒RNA複製與轉 錄之間轉換的控制（Collins等人，1985，J Virol 54:65-71; Elango等人，1985，J Virol 55: 101-10; Baybutt等人，1987，J Gen Virol 68:2789-96; Collins等人，1990，J Gen Virol 71:3015-21; Ling等人，1992，J Gen Virol 73:1709- 15; Zamora等人，1992，J Gen Virol 73:737-41; Alansari等人，1994, J Gen Virol 75:4(H-4〇4; Ahmadian等人，1999，J Gen Virol 80:2011-6)。對 MPV而言，M2-2
ORF始於在M2-1 ORF中的核苷酸512處（圖8)，其剛好與 APV-C的開始位置相同。M2-2 ORFs的長度與APV-C和MPV 一樣，71 aa殘基。M2-2 ORF的序列比較（圖10)，在MPV和 APV-C之間，顯示有64% aa序列同種性，而在MPV與APV-A -172- 1344991 (167) 和Β之間，僅有44-48% aa序列同種性。
小忌水性（SH)基因ORF :該基因與hMPV之M2相鄰，或許 編碼183 aa之SH蛋白質（圖8)。在該ORF與其他RNA病毒基因 或基因產物之間，沒有可區別的序列同一性。這並不令人 驚訝，因為在肺病毒SH蛋白質之間的序列類似性通常很 低。SH ORF之aa組成，相對上較類似APV、RSV和PVM的組 成，具有高百分比的蘇胺酸和絲胺酸殘基（hMPV、APV、 RSV A、RSV B、bRSV和 PVM分別為 22%、18%、19%、20.0%、 21%和28%)。hMPV之SH ORF含有10個半胱胺酸殘基，而APV SH含有16個半胱胺酸殘基。hMPV之SH ORF含有2個可能的 N-連接之糖基化作用位置（aa 76和121)，而APV有1個，RSV 有2或3個，且PVM有4個。
假定之hMPV SH蛋白質和APV與RSV之SH的親水性輪 廓，顯露出類似的特徵（圖11B)。APV和hMPV之SH ORFs具 有親水性的N-終端，中央的忌水性功能部位，其可作為可 能的膜跨越功能部位（hMPV之aa30-53)，第二個忌水性功能 部位（aa 15 5- 170)，以及親水性的C-終端。相反的，RSV SH 似乎缺少APV和hMPV ORFs的C-終端部份。在所有的肺病毒 SH蛋白質中，忌水性功能部位均位在鹼性aa殘基的侧面， 這亦在hMPV之SH ORF中發現（aa 29和54)。
編碼附接蛋白質（G)的基因：hMPV之假定的G ORF與假定 的SH基因相鄰’並編碼236aa之蛋白質（nt 6262-6972’圖8)。 在該ORF之後’立刻找到二級的小〇RF，可能編碼68 aa殘 基（nt 6973-7179)，但缺少起妨密碼子。第三個可能的ORF -173- 1344991
(168)
在第二個編閱架構中，具有194 aa殘基，與這些ORFs的兩 者重疊，但亦缺少起始密碼子（nt 6416-7000)。在該ORF之 後，是可能的第四個ORF，具有65 aa殘基，在相同的編閱 架構中（nt 7001-7198)，再度缺少起始密碼子。最後，在第 三個編閱架構中找到可能的ORF(nt 6444-6737，圖8)，具有 97 aa殘基（但缺少起始密碼子）。不像第一個ORF，其他的 ORFs沒有明顯的基因開始或基因結束序列（參見下文）。雖 然236 aa之G ORF或許代表至少一部分的hMPV附接蛋白 質，它可能未排除以不同蛋白質來表現，或經由一些RNA 編輯事件，以附接蛋白質之一部分來表現的額外密碼序 列。應注意對APV和RSV而言，已經確認在主要的G ORF之 後，沒有二級ORFs，但APV和RSV兩者，在G之主要ORF中 均具有二級ORFs。然而，缺乏表現這些ORFs的證據，且在 不同病毒的預測aa序列之間，沒有序列同一性（Ling等人， 1992, J Gen Virol 73: 1709- 15)。在 hMPV G中的二級 ORFs，未 顯露出其他G蛋白質的特徵，且是否表現額外的ORFs，尚 需進一 ·步的調查。 利用所有ORFs的BLAST分析，顯示在核苷酸與aa序列層 面上，與其他已知的病毒基因或基因產物，沒有可區別的 序列同一性。這與對其他G蛋白質，像是hRSV A和B(53%) (Johnson等人，1 987, J Virol 61: 163-6)和 APV A和 B(3 8%) (Juhasz 和 Easton, 1994，J Gen Virol 75:2873-80)的那些所發現之低百 分比序列同一性一致。 大多數的hMPV ORFs，在長度和序列兩方面，與APV的 -174- 1344991 (169)
那些相似，假定的hMPV之G ORF具有236 aa殘基，比APV之 G ORF小很多（表4)。aa序列顯示絲胺酸和蘇胺酸内含量為 34%，甚至比RSV的32%和APV的24%更高。假定的G ORF亦 含有8.5%的脯胺酸殘基，比1^¥的8%和八1>¥的7%更高》在 APV ' RSV和hMPV之G蛋白質中，脯胺酸殘基的不尋常富 含量，亦已經在為蛋白質三次元結構之主要決定位的糖蛋 白中觀察到（Collins和 Wertz，1983，PNAS 80:3208- 12; Wertz等 人，1985，PNAS 82:4075-9; Jentoft，1990，Trends Biochem Sci 15:291-4)。hMPV之G ORF含有5個可能的N-連接之糖基化作 用位置，而hRSV有7個，bRSV有5個，且APV有3至5個。
hMPV G之預測的親水性輪廓顯露出類似其他肺病毒的 特徵。N-終端含有親水性區域，接著是短的忌水性區 (hMPV之aa 33- 53)，和主要的親水性C-終端（圖12B)。整體 的組織化與在APV和RSV之G蛋白質中的區域完全一致。假 定的hMPV之G ORF僅含有1個半胱胺酸殘基，與RSV和 APV(分別為5和20個）相反。注意到在G基因中的4個二級 ORFs中 '，只有2個含有1個額外的半胱胺酸殘基，而這4個 可能的ORFs顯示12-20%的絲胺酸和蘇胺酸，以及6-11%的 脯胺酸殘基。 聚合酶基因（L):與其他負股病毒類似，MPV基因組的最 後一個ORF是複製和轉錄複合物的RNA-依賴性RNA聚合酶 組份。MPV之L基因編碼2005 aa之蛋白質，其比APV-A蛋白 質的長1個殘基（表4)。MPV之L蛋白質與APV-A共享64%同 種性，與RSV共享42-44%，並與其他副黏液病毒共享大約 -175- 1344991 (170)
13%(表5)。確認在非-斷片之負股RNA病毒的L蛋白質中，6 個保留的功能部位；發現功能部位3含有四個核心聚合酶 基序，認為它對聚合酶功能是不可或缺的（Poch等人，1990, J Gen Virol 71: 1 153- 62; Poch等人，1989, EMBO J 8:3867-74)。這 些基序（A、B、C和D)在MPV L蛋白質中是完全保留的：在 基序A、B和C中：MPV與所有的肺病毒共享100%類似性， 而在基序D中，MPV與APV共享100%類似性，並與RSV共享 92%。至於全部的功能部位111(在L ORF中的aa 627-903)， MPV與APV共享77%同一性，與RSV共享61-62%，並與其他 的副黏液病毒共享23-27% (圖13)。除了聚合酶基序之外， 肺病毒L蛋白質還含有符合一致ATP結合基序K(X)21 GEGAGN (Χ)2〇Κ的序列（Stec等人，1991，¥卜〇1〇§>^ 183:273-87)。MPV L ORF含有像APV—樣的基序，其中中間殘基的 間隔有一個殘基的改變：K(X)22GEGAGN(X)19K>
表4 : MPV和其他副黏液病毒之ORFs的長度 N1 P M F M2-1 M2-2 SH G L MPV •394 294 254 539 187 71 183 236 2005 APV A 391 278 254 538 186 73 174 391 2004 APVB 391 279 254 538 186 73 本氺 414 本氺 APVC 394 294 254 537 184 71 氺氺 氺氺 APVD ** 伞* 氺氺 ** ** 氺氺 ** 389 本氺 hRSV A 391 241 256 574 194 90 64 298 2165 hRSVB 391 241 249 574 195 93 65 299 2166 bRSV 391 241 256 569 186 93 81 257 2162 -176- (171) 1344991
PVM 393 295 257 537 176 77 92 396 其他3 418-542 225-709 335-393 539-565 **** **** **** **** 2183-2262 表4的長度：、以胺基酸殘基計之長度，·_ =無法獲得的序 列’ =其他·人類副流感病毒弟2和3型、仙堂病毒、麻 療病毒、百立病毒、佛赛熱病病毒和新城雞痕病毒，= 在病毒基因组中未出現ORF。
表5 :在MPV ORFs和其他副黏液病毒的那些之間的胺基酸 序列同一性 N P Μ F Μ2-1 Μ2-2 L APV A 69 55 78 67 72 26 64 APVB 69 51 76 67 71 27 本本 APVC 88 68 87 81 84 56 ** hRSVA 42 24 38 34 36 18 42 hRSVB 41 23 37 33 35 19 44 bRSV. 42 22 38 34 35 13 44 PVM 45 26 37 39 33 12 氺氺 其他3 7-11 4-9 7-10 10-18 本氺氺氺 木氺木木 13-14 表5的長度：_ =與已知之G和SH蛋白質無序列同種性，並因 此排除，"=無法獲得的序列，·"=參見表4中列舉的，以 相同的（“。表示，在病毒基因组中缺乏ORF。
5.5.實例5 : hMPV分離株1-99的基因組序列 亦確認並定序hMPV的其他分離株（1-99)。為了這樣做， -177- 1344991 (172)
精確地按照之前的描述（van den Hoogen等人，2001, Nature Medicine 7(6):719-724)，在三級猴腎細胞上繁殖hMPV分離 株 1-99。使用 MagnaPure LC分離系統（Roche Applied Science)， 以及總核酸套組草案，分離病毒RNA。使用標準草案，將 RNA轉變為cDNA，利用隨機的六聚體（Progema Inc. Leiden) 作為引子。將該cDNA保持在- 20°C下或更低，直到用來進 行序列分析為止。在整個計畫中所使用的引子，係以可獲 自原型hMPV 1-00品系的序列，或在使用hMPV品系1-99的 序列分析之後所獲得的序列為基礎。
所製造之PCR片段，尺寸範圍高達1600個鹼基對，產生 重疊的片段。對該PCR片段進行序列分析，使用標準技術 和 ABI 3100毛細管序列儀器（Applied Biosystems，Nieuwerkerk Issel)。一開始將所產生之核钻酸序列與原型hMPV品系1-00 相比較。使用Blast軟體，與在GenBank資料庫中的相關序 列做比較。關於進一步的序列分析，使用DNASTAR軟體 (DNASTAR Inc.，Madison WI，U.S.A.)，至於系統發生分析， 則使用ClustalW軟體程式。 最初，使用以得自1-00分離株之序列資訊為基礎來設計 的引子，獲得1-99分離株的序列。然而，因為以得自卜00 分離株的資訊為基礎，不能定序某些部分的基因組，故使 用以得自1-99分離株之序列資訊，以及從經由定序1-00分 離株之3’和V端而獲得之資訊為基礎的新引子。 hMPV分離株1-99的原型序列，含有13,223個鹼基對，在 總共227個，平均長度為404個鹼基對的個別序列中定序。 -178- (173) 1344991 該序列為序列識別18號β
在表6中，以絕對尺寸和胺基酸同一性百分比兩者，出 示hMPV 1-99和其他副黏液病毒的開放編閱架構的長度。 在編碼 N蛋白質（95.2%)、M(97.3%)、F(93.7%)、L(94.1%)和 M2- 1( 94.1%)之基因中，觀察在1-99和1-00品系之間的最大 同一性，具有超過90%的同種性百分比。發現在兩種品系 之間，P和M2-2基因的同種性分別為86.1和88‘9%。再者， 分離株與禽間質肺病毒之C亞型的關係最密切，在n蛋白 質（88.6%)、Μ蛋白質（87.1%)和M2-1蛋白質（84.3%)中具有胺 基酸同一性。卩和Μ2_2蛋白質之同一性較低，分 ⑴ A 67.8% 和 56.9%。 原型1-00和1-99品系的基因，在基因組舆圖 β Μ上疋相同 的’就Ν、Ρ、Μ、F、Μ21和Μ2-2蛋白質而言，夏右知 , ^ “胥相同數 目的胺基酸。假定的SH基因短6個胺基酸，G蛋白質知 個胺基酸，但1-〇〇和1-99品系的L基因是相同尺寸的。2
取後，已經在表7中概述在基因組舆圖上的基因起罢 以及位.在基因之間的非-密碼序列。 ^點， 總括而έ ，人類間質肺病毒之1-99品系的序列資訊，尤 楚地證實卜"與原型品系1-00的遺傳關係，從相同的 组舆圖組織化開始。觀察到與濟之c亞&，有較:/因 統發生關係。 χ /的系 179· 1344991 (174) mmmm 表6 : hMPVl-99與其他副黏液病毒之〇RFs的長度(胺基酸殘基之數目）
N P M F Μ21 Μ22 SH G L A B c ^ ^ ^ -99-00HRSVRSVRSVM 1 1 Λ \ Ί Ί p p 441141113 i999999999 333333333 448941115 9 9 7 7 9 4 4 9 222222222 444446667 555555555 222222222 99887444 333337773 555555555 776644566 8908889987 i. 1 1 HI 1 ^— i— 1 1 717173737190909098 177 224 1937 183 236 2005 174 391 2004 414 64 298 2165 65 299 2166 81 257 2162 92 396
在hMPVl-99和其他副黏液病毒之間的胺基酸序列同一性百分比
P Μ
F M21 M22 si!
G 1-00 95,2 \PV-A 68,9 \PV-B 69,1 kPM-0 88,6 3RSV 41,1 iRSV-A 41,1 iRSV-B 40,6 =>VM 43,7
86,1 97,3 93,7 58,1 76,1 67,5 53,9 76,5 66,8 67,8 87,1 80,5 28,1 36,9 35 26 37,6 32,2 26 36,9 34,4 22,4 39,2 38,8 Μ, 9 8— 3丨 6’ 6 ,46 5 4 2 534 9 6 8 3 3 C Β8,9256.46:99,73,9 8 2 5 9 1 5 Μ 2*2 2*4 13126,21 4, 2’ 2, 4’ 3 1 Μ 6 5’ 1’ 7’ 5 9 J463464647 -I80- 1344991 (175) wmmm 表7:在基因組與圖上之基因起點序列，以及位在基因之 間非-密碼序列的概述 位址 ORF 中at . 非-密碼序列 基因起點 起點 位置ORF 1 Le \CGAGAAAAAAACGCGUAUAAAUUAAA JUCCAAACAAAAC GGGACAAAUAAAA AUG 54 N 1238 N UAA JUAAAAAACU GGGACAAGUCAAA AUG 1262 P 2146 P UAG JUUAAUAAAAAUAAACAAU GGGACAAGUCAAG AUG 2179 M 2943 Μ UAA \aaumcugucuuaaucaauaauugcuu fMJAUMCUCUAG \GAUUAAUAAGCUUAUUAUUAUAGUUAL f\UAAAAAUAAAU JAGAAUUAGAAGGGCAUCAAUAGAAAG GGGACAAAUAAAA ) AUG 3065 F • 4ΒΗ4 F UAC3 JUAAUUAAAAAAU (JCiUACAAAUCAUC AU(j"' 471Ί 1¾ 5437 M2 UAG JAAAAAAUAAAAAUAGAAU GGGAUAAAUGACA AUG 5470 SH 6003 SH UAA \AUAACACGGSUUUSAACAUUAAAAUSA 3AACAACCUCCA XCAGGUCUAUCAAUACAGUGGUUUAGC ：AUUUAAAAACC 3AAUAUUAUCUAGGCUGCACGACACUUU 3CAAUAAUAUGC ^AUAGUCAAUAGUUAAACCACUGCUGCA V\CUCAUCCAUA \UAUAAUCACUGACUAAUACAAAACAAG \AAAU GGGACAAGUGGCU AUG 6210 G • "bSS4 ϋ UAG ^GAGGUGCAAAACUCAAAUGACSCACAA ：ACACAAACAUYC 3AUCCAAGUAGUUAACAAAAAACCACAA VVUAACCUUGAA ^ACCAAAAAACCAAAACAUAAACCCAG ACCCAGAAAAACA JAGACACCAUAUGGAAGGUUCUAGCAUA JGCACCMUGAG \UGGCAUCUGUUCAUGUAUCAAUAGCAC >CCAUCAUUCA \GGAAUAAGAAGAGGCGAAAAUUUAA ""(jCjUAUAAAUGACA AUG 7124 L— 13009 L UGA 3 % - ： J J \UUAAACUAUGAUUUCUUUGAAGCAUUA 3AGAACACAUAC ：CCAAUAUGAUCAAGCUUAUAGAUAAUU JGGGAAAUGCAG OXAUAAAGAAACUAAUCMAGGUCMCUG 5GUAUAUGCUUGU 5AGUAAGAAGUAAUAAUAAUGAUAAUG .UUAACCAUAAUC CMCMCMACUGAGAAAAUAAUCGUCUM AGUUUAGUUGA CAUUAGUUAUUUAAAAUUAUAAAAUAG MCUA AUG 13243 Tr -181 - 1344991
(176) 5·6.實例6 :系統發生的關係 可使用系統發生法’以便確認在病毒組別中，即在Μρν 與其他病毒之間的關係。此外’可對相同類型之病毒的不 同分離株’判定系統發生的關係。判定系統發生樹狀圖， 以便判定在MPV與其他病毒之間的關係，亦可判定在hMpv 的不同分離株之間的關係。例如’可使用核贫酸或蛋白質 序列資料，產生系統發生樹狀圖，以便解釋在Mpv與不同 病毒之間的關係。或者，可使用核甞酸或蛋白質序列資 料’產生系統發生樹狀圖，以便解釋在hMpv的各種分離 株之間的關係。 在hMPV與不同病毒之間的系統發生關係：雖然使用獲 自未確認之病毒分離株之核苷酸序列的BLAST搜尋，顯示 主要是與肺病毒亞科之成員有同種性，但該同種性係以對 其他副黏液病毒顯露出某些類似性的蛋白質序列為基 礎》如同在新近確認之病毒分離株與肺病毒亞科的成員之 間的關係所示，以這些病毒的N、P、Μ和F ORFs為基礎， 建構系铳發生樹狀圖。在所有4個系統發生樹狀圖中，新 近確認之病毒分離株與APV的關係最密切（圖14)。從已經 描述的APV之4個血清型中（Bayon-Auboyer等人，2000，J Gen. Virol 81:2723-2733)，APV血清型C，主要在美國的烏類中找 到的間質肺病毒，對新近確認的病毒顯示出最密切的類似 性。然而，應注意僅可獲得APV血清型D的部分序列資訊。 關於所有的系統發生樹狀圖，使用ClustalW套裝軟體將 DNA序列排成一直線，並使用.DNA-ML套裝軟體的Phylip 3.5 1344991 (177) 1
程式，使用50或100次靴環法和3組亂數’產生最大蓋氏樹 狀圖（Brandenburg等人，1997, J Med Virol 52:97- 104)。為了產 生系統發生樹狀圖所使用之先前公開的序列，係以下列之 登錄編號獲自Genbank :關於所有的ORFs : hRSV:NC001781 ; bRSV:NC001989;至於FORF: PYM，D11128; MV-A，D00850; MV-B，Y14292 ; MV-C，AF187152 ;至於 N ORF : PVM，D1033 1 ; MV-A，U39295 ; MV-B，U3 9296 ; MV-C，M176590 ;至於 M ORF : PMV, U66893 ； MV-A, X58639 ； MV-B, U37586 ； MV-C, AE262571 ;至於 P ORF ·· PVM，09649 ; MV-A，U22110 ; MV-C， AF176.591 » 如同在MPV與肺病毒亞科的成員之間的關係所示，先前 以N、P、Μ和F ORFs為基礎，建構系統發生樹狀圖（ van den
Hoogen等人，2001，Nat Med 7(6):19-24)，並顯示在 MPV與 APV-C之間的密切關係。因為MPV SH和G基因與其他副黏 液病毒的那些基因的低同種性，不能為這些基因建構可靠 的系統發生樹狀圖。此外，在肺病毒與間質肺病毒之間， 不同的基因組組織化，亦使其不可能以整個基因組的序列 為基礎’產生系統發生樹狀圖。除了先前公開的那些之 外，亦建構M2和L基因的樹狀圖。這兩個樹狀圖均證實， 在肺病毒亞科中之APV與MPV之間的密切關係（圖15)。 欲建構系統發生樹狀圖，使用裝軟體，將dnA 序列排成一直線，並使用DNA_ML套裝軟體的phyHp 3 5程 式，使用100次靴環法和3組亂數，產生最大蓋氏樹狀圖。 對利用PHYLIP—致套裝軟體創造的一致樹狀圖，計算靴環 •183· 1344991
(178) 值。 以到目前為止所獲得之hMPV之不同分離株的系統發生 分析為基礎，已經確認兩個主要的基因型，病毒分離株 00-1是基因型A的原型，而分離株99-1是基因型B的原性。
假設基因型與亞型有關連，且在預先-存在之免疫力的 存在下，發生得自兩個亞組之病毒的再度-感染，而抗原 變化可能不是容許再度-感染所嚴格需要的。此外，hMPV 似乎與禽肺病毒，一種主要在禽類中發現的病毒，是密切 相關的。兩種病毒的核甞酸序列，顯示高百分比的同種 性，除了 SH和G蛋白質之外。在主要以核蛋白和基質蛋白 質為基礎的測試中，病毒似乎產生交叉-反應，然而，它 們在以附接蛋白質為基礎的測試中，以不同的方式反應。 在病毒中和力價上的差異，進一步證明兩種hMPV的基因 型是一個病毒的兩種不同的血清型，而APV則是不同的病 毒。
在不同的hMPV分離株之間的系統發生關係：亦可使用 系統發生法，以便確認在MPV之不同分離株中的關係。例 如，可使用MPV之核苷酸或蛋白質序列資料，產生系統發 生樹狀圖，以便解釋在許多獲自不同個體的MPV分離株之 間的關係。該方法亦可用來瞭解出現在MPV病毒之族群中 的差異。 欲判定我們新近確認的各種病毒分離株的關係，以獲自 8至9個分離株（對F為8個，對N、Μ和L為9個）的序列資訊為 基礎，建構系統發生樹狀圖。使用RT-PCR，利用為了擴大 -184· 1344991 (179) I MMfei
在N、M、F、P、SH和L ORFs中之短片段而設計的引子， 接著直接將其定序。亦發現先前從血清學之觀點（參見上 文）發現有關連的9個病毒分離株，在遺傳上是密切相關 的《事實上，所有的9個分離株彼此的關係比與APV之關 係更密切。雖然這些系統發生樹狀圖所使用的序列資訊是 有限的，似乎可將這9個分離株分成兩組，將分離株94- 1、 99-1和99-2聚集成一組，而其他6個分離株（94-2、93-1、 93-2、93-3、93-4、00-1)為另一组（圖 16)。 在圖17中出示hMPV之所有4個變種，變種Al ' A2、B1或 B2的不同分離株之F基因的排列。 在圖18中出示hMPV之所有4個變種，變種Al、A2、B1或 B2的不同分離株之F蛋白質的排列。 在圖19中出示hMPV之所有4個變種，變種Al、A2、B1或 B2的不同分離株之G基因的排列。
在圖20中出示hMPV之所有4個變種，變種Al、A2、B1或 B2的不同分離株之G蛋白質的排列。 以F基因序列為基礎的系統發生樹狀圖，顯示不同的 hMPV分離株的系統發生關係，並在圖21中出示其與hMPV 之個別變種的關連。此外，以G基因序列為基礎的系統發 生樹狀圖，顯示不同的hMPV分離株的系統發生關係，並 在圖22中出示其與hMPV之個別變種的關連。使用DNA最大 蓋氏法，以50次靴環法和3組亂數，計算系統發生樹狀圖。 在表8中列舉在hiMPV分離株00-1之不同基因與hMPV分離 株99- 1、APV血清型C，以及APV血清型A之間的序列同一 •185· 1344991
(180) 性。 表8 在hMPV分離株00-1和其他病毒之間的ORF序列同一性
N P Μ F M2-1 M2-2 SH G L hMPV分離株99-1 95 86 98 94 95 90 57 33 94 APV血清型C 88 68 87 81 84 56 N.A. N.A. N.A. APV血清型A 69 55 78 68 72 25 18 9 64
最初，僅對9個不同的分離株推論系統發生關係。藉著 在病毒分離株之N、M、F和L ORFs中，部分核钻酸序列的 分析，來確認兩個可能的遺傳群。在群中觀察到90- 100% 的核苷酸同一性，並在兩群之間觀察到8卜88%同一性。對 更多病毒分離株獲得的序列資訊，證實了兩種基因型的存 在。病毒分離株00- 1，為A群的原型，而病毒分離株99- 1， 為B群的原型，已經將其用在交又中和測定中，測試基因 型是否與不同的血清型或亞組有關。 使用RT-PCR測定，利用位在聚合酶基因中的引子，從鼻 咽抽吸試樣中確認出30個額外的病毒分離株。使用這些新 分離株的部份基質和聚合酶基因之序列資訊，連同先前9 個分離株的那些，來建構系統發生樹狀圖（圖15)。這些樹 狀圖的分析，證實兩種遣傳群的存在，病毒分離株00-1為 在A群中的原型病毒，而病毒分離株99- 1為在B群中的原型 病毒》在群中的核#酸同一性超過92%，而在兩群之間的 同一性為81-85%。 -186- 1344991
(181) 5.7.實例7 :人類間質肺病毒（hMPV)NL/l/00基因組RNA的前 導序列 雖然定出大多數的基因組组合，但缺乏在兩端處可靠的 終端序列。使用聚腺苷酸化作用和3’RACE法的組合，定出 可靠的核苷酸序列（圖54)。此外，亦確認在hMPV NL/1/00 之3’前導終端處的外核苷酸。
在本研究中，使用生長在Vero上的hMPV NL/1/00病毒。 包括作為對照組的有關之反義RNA病毒，呼吸道融合細胞 病毒（RSV)A2，它具有類似的基因組尺寸，以及已經確認 的終端序歹1J。使用QIAamp病毒RNA迷你套組（Qiagen)，依據 製造者的指示，分離病毒的RNA。
藉著在3 7°C下，將病毒之RNA與聚（A)聚合酶（Ambion) — 起培養1小時，將病毒的RNA聚腺甞酸化，接著使用Nuc-Away自旋管柱（Ambion)淨化。然後使用與互補聚（A)尾區的 引子，以及逆轉錄酶，Superscript I(Invitrogen)，逆轉錄病 毒的RNA。使用hMPV專一的引子，與終端並排，進行PCR 和巢式PCR反應，擴大想要的產物，其具有定序分析預期 的尺寸。使用TA選殖套組（Invitrogen)，進一步將PCR產物 選殖到pCRH載體内。欲揭露終端的可靠核站酸序列，進 行PCR DNA和選殖之PCR產物的直接定序。 在圖55中僅出示hMPV資料。使用RSV-A2 RNA的對照組 實驗，指出RSV-A2之前導序列仍維持完整，並可利用相 同的方法檢測。直接對PCR產物（圖55)和對PCR純種系進行 的定序分析，兩者均指出hMPV之前導區，在前導序列中 -187- 1344991 (182) 最接近3’的20個核苷酸是由i ACG CGA AAA AAA CGC GTA TA所組成（以正義cDNA方位來表示）。在圖101中，將兩個 新近確認的核苷酸加下標線。 5.8.實例8 :定出MPV分離株的血清型和亞組
使用病毒中和測定（參見，例如實例16)，判定hMPV之病 毒分離株是否可藉著血清型或基因型來區別。使用病毒分 離株00-1和99-1接種雪绍，以便使病毒-專一之抗血清升 高。關於00-1分離株，藉著實驗性鼻内感染飼養在個別的 加壓手套箱中、兩隻無特定病原的雪绍和兩隻天竺鼠，產 生雪貂和天竺鼠對該病毒的專一抗血清。在2至3週之後， 藉著心臟穿刺，採取所有動物的血液，並使用其血清作為 參考血清。按照下述，針對所有先前描述的病毒，以間接 IFA測試該血清。在利用兩種病毒的病毒中和測定中，使 用這些抗血清，連同使用99-1分離株製備的抗血清（表9)。 表9:病毒中和力價 分離株00-1 分離株99-1 前血清雪绍A(00-1) 2 2 雪貂 A22DPI(00-1) 64 2 前血清雪貂B(99-l) 2 2 雪貂 B22DPI(99-1) 4 64 對分離株00-1而言， 力價差異32(64/2)倍 對分離株99-1而言， 力價差異16(64/4)倍
此外，以任一病毒，即00-1和99-1接種6隻天竺鼠。對鼻 -188 - 1344991 (183)
咽抽吸試樣的RT-PCR測定 到第10天。在感染後第7〇天 顯示病毒複製從感染後第2天 以同種或異種病毒攻毒天竺 清的病毒中和測定’顯示 定中相同的結果（在VN力 鼠，注意到所有4種病毒的複製 在第一次攻毒之後’進行抗血 本質上與利用雪貂進行之VN測
價中>16-倍的差異）。 在本實例中提供的結果 MPV的兩種血清型相符合 感染的可能性。_ ，證實兩種基因型的存在，與 龙顯帝以異種和同種病毒重覆 表 10 一 初次感染 病毒複契__一 二次感染 病毒複製 天竺鼠1-3 00-1 3 隻 99-1 2隻中有1 天#鼠4-6 00-1 3 隻 〇〇-1 3隻中有1 天#鼠7-9 99-1 3隻中有3 00-1 2隻中有2 天竺鼠10-12 99-1 3隻中有3 99-1 3隻中有1 註解：天竺 鼠2和9不再進行二次感染。
6.診斷測定/檢測方法 6.1.實例9 :直接免疫螢光測定（DIF)法 按照描述，藉著DIF分析得自罹患RTI之患者的鼻咽抽吸 試樣（Rothbarth等人，1999, J. of Virol. Methods 78:163-169)。將 試樣儲存在- 70°C下。簡言之，以5毫升杜貝可氏（Dulbecco) MEM (BioWhittaker，Walkersville，MD)稀釋鼻咽抽吸物，並在 旋轉混合器上徹底混合1分鐘。以840 xg離心懸浮液1〇分 -189- 1344991 (184) 鐘。將沉降物塗抹在多點玻片（Nutacon，Leimuiden，The Netherlands)上’並使用上清液進行病母分離。在乾燥之 後，在室溫下以丙酮固定細胞1分鐘°在沖洗玻片之後’
在37。(：下，將其與對諸如流感人和Β、hRSV* hPIV1至3(Dako, Glostrup，Denmark)之類的病毒專 的市售FITC-標示之抗-血清，一起培養15分鐘。在以PBS沖洗3次’並以自來水沖 洗1次之後，將玻片浸入甘油/PBS溶液（Citifluor，υκο, Canterburg，UK)中，並加蓋。然後使用AxioscoP螢光顯微鏡， 分析玻片。 6.2.實例10:]^?¥的病毒培養 檢測在得自宿主之培養試樣中的病毒，直接指出該宿主 目前及/或過去冒暴露或感染该病毒。
使用在第一次繼代後展現CPE的試樣，接種在24-孔培養 盤中，在培養基中之匯合不足（sub-confluent)的單層tMK細 胞。每天針對CPE檢查培養物，並一週更換培養基一次。 因為每個分離物的CPE不同，故在第12和14天時，以IFA測 試所有 '的培養基，利用對抗新病毒分離株的雪貂抗體。將 陽性的培養物冷凍-融解3次，隨後藉著低速離心使上清液 澄清，等分並冷凍儲存在-70°C下。按照描述判定在培養 物上清液中的病毒50%組織培養感染劑量（TCID5〇)(Lennette， D.A.等人，在 DIAGNOSTIC PROCEDURES FOR VIRAL, RICKETTSIAL, AND CHLAMYDIAL INFECTIONS,第 7版（編輯 Lennette, E.H., Lennette, D.A. & Lennette, E.T.) 3-25; 37- 138; 431-463; 481-494; 539-563(American public health association, -190- 1344991 _ΜΒβ (185)
Washington，1995)中）。 6.3.實例11 :藉著間接免疫螢光測定（IFA)檢測抗原 可使用抗體，看到在被感染細胞或組織中的病毒蛋白 質。間接免疫螢光測定（IFA)是一種敏感性的方法，其中 二級抗體與認得在病毒-專一之抗體上的普通抗原決定位 的螢光指示劑偶聯。IFA比DIF更有利，因為它較高程度的 敏感性。
為了進行間接IFA，以5毫升杜貝可氏MEM培養基 (BioWhittaker, Wal'kersville，MD)稀釋所收集之樣本，並在旋 轉混合器上徹底混合1分鐘。然後以840xg離心懸浮液10分 鐘。將沉降物塗抹在多點玻片上。在乾燥之後，在室溫下 以丙酮固定細胞1分鐘。或者，在含有玻璃片的24孔玻片 上，在tMK細胞上培養病毒。以PBS沖洗這些玻璃片，並 在室溫下以丙酮固定1分鐘。
進行兩個間接IFAs。在第一個間接IFA中，以PBS沖洗含 有被感染tMK細胞的玻片，然後在37°C下，與病毒專一的 抗血清·一起培養30分鐘。使用抗流感A、B和C、hPIV第1 至3型和hRSV的單株抗體。至於hPIV第4型、腮腺炎病毒、 麻療病毒、仙臺病毒、猿病毒第5型和新城雞瘂病毒，則 使用多株抗體（RIVM)，以及雪貂和天竺鼠參考血清。在以 PBS沖洗3次，並以自來水沖洗1次之後，利用對抗在第一 次培養時使用之血清的二級抗體，將玻片染色。多株抗血 清的二級抗體是山羊-抗-雪貂（KPL，Guilford，UK，40倍稀 釋）、老鼠-抗-兔（Dako，Glostrup，Denmark，20倍稀釋）、兔- -191 - (186) (186)1344991 抗-雞（KPL，20倍稀釋）和老鼠-抗·天竺鼠（Dak〇, 2〇倍稀釋）。 在第二個IFA中，在以pBS沖洗之後，在37艺下，將玻片 與在PBS中稀釋1:5〇至1: 100的2〇個多株抗體一起培養3〇分 鐘。使用經過免疫的雪貂和天竺鼠，獲得多株抗體，但這 些抗體可在各種動物中升高，並可為了每次免疫改變多株 抗體的工作稀釋度。在以pBS沖洗3次，並以自來水沖洗} 次之後，在37t下，將玻片與FITC標示之山羊-抗-雪貂抗
體（KPL，Guilford, UK，40倍稀釋）一起培養30分鐘。在以PBS 沖洗3次’並以自來水沖洗1次之後，在甘油/pBS溶液 (Citifluor，UKO，Canterbury, UK)中培養玻片，並加蓋。使用 Axioscop螢光顯微鏡（Carl Zeiss B.V·，Weesp，the Netherlands)， 分析玻片。 6.4.實例12 :血球凝集測定、氯仿敏感性測試和電子顯微 鏡 可利用病毒的不同特徵來檢測病毒。例如，許多病毒含 有可與紅血球結合的蛋白質，結果產生晶格。將該特性稱 為血球凝集作用，並可在檢測病毒的血球凝集測定中使 用。在電子顯微鏡（EM)下，亦可看見病毒，或可藉著pCr 技術檢測之。
按照描述進行血球凝集測定和氯仿敏感性測試 (Osterhaus等人，1985, Arch, of Virol 86:239-25; Rothbarth等人，J of Virol Methods 78:163- 169) β
至於EM分析，在4°C下，以17000 xg微量離心從被感染細 胞培養物上清液中濃縮的病毒，隨後將小球再懸浮於PBS -192- 1344991 (187) 中，並藉著負對比EM檢查。 6.5.實例13 :檢測lgG、IgA和IgM種類的hMPV/AVP抗體 在感染/’生病的期間，對抗病毒之特定抗體升高。因此， 在宿主中檢測病毒·專一的抗體，是宿主目前及/或過去被 該病毒感染的指標。
使用間接酵素免疫測定（EIA)，檢測IgG種類的hMPV抗 體。在微量滴定盤中進行該測定，基本上按照先前的描述 (Rothbarth等人，1999，J. of Vir. Methods 78: 163- 169)。簡言之， 藉著以1%三通X-100處理，促使濃縮的hMPV溶解》在藉著 棋盤方格滴定，判定最佳的工作稀釋度之後，在室溫下將 其塗覆在微量滴定盤中的PBS内》接著，在孔中加入100 微升體積，以ElA緩衝溶液1: 100稀釋的人類血清試樣，並 在3 7°C下培養1小時。藉著加入山羊-抗-人類IgG過氧化酶 共輛物（Biosource，USA)，加入作為受質的TMB，展開培養 盤，並在450毫微米處測量光密度（0D)，檢測人類IgG的結 合作用。以0D的S(信號）/N(陰性）比例來表示結果。若S/N 比例超出陰性對照組加三倍標準值，便認為該血清是IgG 陽性的。 藉著捕捉EIA ’基本上按照先前的描述（Rothbarth等人， 1999, J Vir Methods 78: 163- 169) ’ 在血清中檢測 lgM和 IgA種類 的hMPV抗體。為了檢測1gA和IgM，使用塗覆有抗人類IgM 或IgA專一單株抗體之市售的微量滴定盤。血清按1: 1〇〇稀 釋。在37。(：下培養1小時之後，在37°C下培養1小時之前， 將最佳工作稀釋度的hMPV加至每個孔中（100微升）。在沖 -193- 1344991 (188) rnmmm. 洗之後，加入以過氧化酶標示的多株抗-hMPV抗體，並在 37°C下培養該盤1小時。加入作為受質的TMB，展開該盤， 並在450毫微米處測量0D。以0D的S(信號）/N(陰性）比例來 表示結果。當S/N比例超出陰性對照組加三倍標準值時， 便代表IgG的陽性結果。
在APV抑制測定中，檢測APV抗體。APV抑制測試的草 案，包括在由 SVANOVA Biotech AB, Uppsala Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala Sweden製造的 APV-Ab SVANOVIR44 簿嬪K疫測定中。以OD的S(信號）/N(陰性）比例來表示結 果。若S/N比例超出陰性對照組加三倍標準值，便認為該 血清是IgG陽性的。 6.6. 實例14 :藉著間接IFA，在人類、哺乳動物、反籍動物 或其他動物中檢測抗體
為了檢測病毒專一的抗體，在蓋玻片上利用丙酮，將以 MPV感染的tMK細胞固定（按照上述），以PBS沖洗，並在37 °C下與按1至16稀釋的血清試樣一起培養30分鐘。在以PBS 沖洗兩 '次，並以自來水沖洗1次之後，在37°C下，將玻片 與FITC-標示之專用的二級抗體（Dako)—起培養30分鐘。按 照上述處理玻片。 可直接利用螢光染料標示抗體，這將產生直接的免疫螢 光測定。可以任何螢光染料來置換FITC。 6.7. 實例15 :藉著ELISA，在人類、哺乳動物、反籍動物或 其他動物中檢測抗體 在副黏液病毒科中，N蛋白質是最豐富的蛋白質，並在 -194- 1344991 (189)
感染早期發生對該蛋白質的免疫反應。為了這些理由’最 好是使用重組來源的N蛋白質’發展檢測對MPV之抗體的 ELISA測定。適用於抗體檢測的抗原’包括任何MPV蛋白 質，將其與任何暴露或感染MPV病毒之患者的MPV·專一性 抗體混合。本發明較佳的抗原包括在暴露於1^1>乂病毒下的 患者中，優先產生免疫反應的那些，因此，通常最容易被 患者的抗體認出。特佳的抗原包括MPV的N、F、乂和G蛋 白質β可供免疫學技術使用的抗原，可以是天然的抗原’ 或可以是其經過修改的版本°可使用已熟知的分子生物學 技術，改變MPV抗原的胺基酸序列’產生可在免疫學技術 中使用的抗原之修改版。
選殖基因、操縱基因並形成表現載體’以及在異種宿主 中表現由該基因編碼之蛋白質的方法是已熟知的，並可使 用這些技術，提供表現載體、宿主細胞，並在宿主中表現 編碼抗原的選殖基因，產生可供在診斷測定中使用的重組 抗原。參見，例如 MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL AND CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY。 可使用各種表現系統來產製MPV抗原。例如，已經描述 了適合在大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、昆蟲細胞和哺乳 動物細胞中產製蛋白質的各種表現載體，可使用其中的任 何一種來產製適合在已暴露的患者中，檢測抗-MPV抗體 的MPV抗原。 桿狀病毒表現系統具有提供蛋白質之必要加工的優 -195- 1344991
(190) 點’並因此疋較佳的。該系統使用多面素（polyhedrin)啟動 基因，指揮MPV抗原的表現（Matsuura等人，1987, J. Gen. Virol. 68:1233-1250)。 可在各·種免疫學測定中使用由重組桿狀-病毒產製的抗 原’在患者中檢測抗_MPV抗體。已完全確立實際上在任 何檢測病毒專一之抗體的免疫學測定中，可使用重組的抗 原來代替天然的病毒。該測定包括直接和間接測定、三明 治測定、固相測定’像是其中使用培養盤或小珠的那些， 以及液相測定。適合的測定包括使用初級和二級抗體的那 些’以及使用諸如蛋白質A之類抗體結合試劑的那些。再 者，在本發明中可使用任何檢測方法，包括比色' 螢光、 磷光、化學發光 '發光和放射性法。 例如’可進行使用重組N蛋白質（在昆蟲（Sf9)細胞中利用 重組的桿狀病毒產製）作為抗原的間接IgG EIA。關於抗原 製備’以重組的桿狀病毒感染Sf9細胞，並在感染後3_7天 收獲。以PBS，ρΗ7·2沖洗細胞懸浮液2次，調整細胞密度為 5_0Χ106個細胞/毫升，並冷凍-融解3次。藉著低速離心 (5OOxg 15分鐘）使大的細胞碎屑形成小球，並收集上清液， 並儲存在-70 °C下直到使用為止。以同樣的方式處理未感 染的細胞，作為陰性對照組抗原。 一旦製備好抗原，使用100微升冷凍-融解的溶胞產物， 以範圍從1:50至1:1000之稀釋度，塗覆微量滴定盤。以一 式兩孔，執行未感染細胞的溶胞產物，並作為陰性對照 組。在培養過夜之後，以PBS/0.05。/。吐溫沖洗培養盤2次。 -196- 1344991
(191) 以ELISA緩衝溶液（PBS，補充有2°/°正常山羊血清和〇·5<)/ο牛 血清白蛋白’以及〇· 1 %牛乳）’按1: 50至1: 200 ’稀釋受試的 血清，接著在37。(：下培養各孔1小時。 以PBS/0.05%吐溫沖洗培養盤2次。在孔中加入按照 1:3000至1:5000 ’以ELISA缓衝溶液稀釋之辣根過氧化酶標 示的山羊抗-人類（或對抗其他物種WgG ’並在37°C下培養1 小時。然後以PBS/0.05%吐溫沖洗培養盤2次’並以自來水 沖洗一次，在室溫下與酵素受質TMB，像是獲自Sigma的 3,3，，5,5'-四甲基聯苯胺一起培養15分鐘’並以100微升2M^ 酸使該反應中止。在450毫微米處’使用自動微量滴定盤 讀取器，測量比色的讀數β <5.8.實例16 :病毒中和測定 當個體被病毒感染時，產生對抗該病毒的軍隊。這些抗 體中有些與病毒顆粒結合，益中和其傳染性。通常藉著將 稀釋的血清或單株抗體與病毒混合’培養它們’並測定對 培養細胞、難胚或動物剩下的傳染性’來進行病毒中和測 定（VN)。可使用中和抗體來定義在病毒顆粒上特定抗原的 類型，例如，可使用中和抗體定義病毒的血清型。此外， 亦可能存有各種中和抗體。 利用從8-倍稀釋開始’連續2-倍稀釋的人類和動物血 清，來進行VN測定。在接種生長在96孔培養盤中的tMK細 胞之前，先將經過稀釋之血清與100 TCIC>5<)的病毒一起培 養1小時，隨後以840xg離心該培養盤°在3和6夭後更換培 養基，並在接種後8天，以FTIC-標示之抗MPV的雪绍抗體 .197- 1344991 (192) 囊 進行IFA。按照結果為陰性IFA，並在細胞培養中抑制CPE 之血清試樣的最低稀釋，定義VN力價β 6.9·實例17 : RNA分離 亦可藉著在得自宿主之試樣中，檢測病毒的核酸’來診 斷病毒出現在宿主中（參見，例如在實例18中的RT-PCR ’ 以及在實例19中的RAP-PCR)。
使用High Pure RNA分離套組，根據製造者的指示（Roche Diagnostics, Ahnere，The Netherlands)，從被感染的細胞培養 物，或蔗糖梯度溶離份中分離RNA β亦可依據此項技藝中 已知的其他程序分離RNA(參見，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,第 1 -3冊（1994- 1998) ’ 編輯 Ausubel， F.M.等人，由 John Wiley and Sons，Inc,，USA出版）。
6.10·實例18 :以RT-PCR來檢測/診斷MPV
可使用複寫或擴大病毒之基因組物質的方法，在生物試 樣中檢測病毒。在本實例中，在下文中描述對已知的副黏 液病毒，進行病毒-專一之寡核荅酸序列的RT-PCR測定。 在 50微升含有 50 mM Tris.HCl pH 8.5、50 mM NaCl、4 mM MgCl2、2 mM二硫蘇糖醇、dNTP各200 μΜ、10單位重組的RNA 素（RNAsin)(Promega，Leiden，The Netherlands)、10單位 AMV RT (Promega，Leiden, The Netherlands)、5單位 Amplitaq Gold DNA 聚合酶（PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands)和5微升RNA的反應中，進行單一-步驟的 RT-PCR。循環條件為42eC 45分鐘和95t 7分鐘一次，95°C 1 分鐘、42°C 2分鐘和72°C 3分鐘重覆40次，以及72°C 10分鐘 -198- 1344991 (193)
一次°在序列一覽表中提供引子序列》更特定而言，核蛋 白基因所使用的引子為N3和N4，分別有與序列識別28和29 號一致的核苷酸序列，並用來擴大151個核荅酸的片段。 基質蛋白質基因所使用的引子為M3和M4，分別有與序列 識別3〇和31號一致的核苷酸序列，並用來擴大252個核芸 酸的片段。聚合酶蛋白質基因所使用的引子為L6和L7，分 別與序列識別34和35號一致，並用來擴大173個核苷酸的 片段。F蛋白質基因所使用的引子為F7和F8，分別與序列 識別32和33號一致，並用來擴大221個核苷酸的片段。 此外，亦使用探針來證實hMPV基因組序列的存在。用 來檢測Μ基因的探針，具有與序列識別36號一致的核：y：酸 序列。用來檢測N基因的探針，具有與序列識別37號一致 的核钻酸序列。用來檢測L基因的探針，具有與序列識別 38號一致的核菩酸序列。
在另一個實例中，可以已知或經由定序獲得的MPV序列 為基礎來設計引子和探針β同樣地，為了特殊目的而使用 不同序列的引子，以及不同的緩衝溶液和測定條件，將是 熟諳此藝者已知的。 為了檢測已知的副黏液病毒，使用RT-PCR也一樣好。在 屋子裏發展hPIVl-4、腮腺炎、麻疹、塔派亞、瑪普拉和 亨德拉的引子，並以可獲得之序列的排列為基礎°從Seal， J·, J.等人，Clin. Microb.，2624-2630, 1995中取得新城雞瘟病毒 的引子。從Chua等人，2000，Science, 288中取得百立和普通 副黏液病毒- PCR的引子。用來檢測其他已知之副黏液病毒 -199* (194) (194)1344991 的引子如下··以與序列識別58和59號之序列一致的引子， 分別為前進和逆向引子，來檢測hPIV_1，以與序列識別60 和61號之序列一致的引子’分別為前進和逆向引子，來檢 測hPIV-2，以與序列識別62和63號之序列一致的引子，分 別為前進和逆向引子’來檢測hpIV·3 ’以與序列識別64和 65號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢剛 hPIV-4，以與序列識別66和67號之序列一欵的引子，分別 為前進和逆向引子’來檢測胳腺炎，以與序列識別68和69 號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測 NDV，以與序列識別7〇和71號之序列一致的引子，分別為 前進和逆向引子，來檢測塔派亞，以與序列識別72和73號 之序列一致的引子，分別為前進和逆向引予，來檢測瑪普 拉，以與序列識別74和75號之序列一致的幻子，分別為前 進和逆向引子，來檢測亨德拉，以與序列識別76和77號之 序列一致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測立百， 以與序列識別78和79號之序列一致的引子，分別為前進和 逆向引子，來檢測hRSV，以與序列識別8〇和81號之序列一 致的引子，分別為前進和逆向引子，來檢測麻疹，以與序 列識別82和83號之序列一致的引子，分別為前進和逆向引 子，來檢測普通副黏液病毒科的病毒。 6.11.實例19:尺入？-?€11 可使用與在基因組中之區域雜交，並以特定方向延伸， 而得以擴大該遺傳物質的引子，檢測或擴大MPV或其他病 毒的遣傳物質。當不能獲得特定的序列資訊，或在試栉中 1344991
(195) 進行遺傳物質的初步擴大作用時，這類技術是有用的。一 種這類的技術稱為RAP-PCR。 基本上按照描述（Welsh等人，1992，NAR 20: 4965-4970)進 行RAP-PCR。關於RT反應，在10微升含有10毫微克/微升寡 核苷酸、10 mM二硫蘇糖醇、dNTP各 500 μΜ ' 25 mM Tris-HCl pH 8·3、75 mM KC1和3 mM MgCl2的反應中，使用2微升RNA。 在70°C下培養該反應混合物5分鐘，並在37°C下5分鐘，隨 後加入 200單位的 Superscipt RT酵素（LifeTechnologies) β 繼續 在37°C下培養55分鐘，並藉著在72°C下培養5分鐘中止該 反應。稀釋RT混合物，得到50微升含有8毫微克/微升寡核 甞酸、dNTP各 300微升、15 mM Tris-HCl pH 8.3、65 mM KC1、 3.0 mM MgCl2和 5單位丁aqDNA聚合酶（FE Biosystems)的 PCR反 應。循環條件為95°C 5分鐘、40°C 5分鐘和72°C 1分鐘一次， 接著是94°C 1分鐘、56eC 2分鐘和72°C 1分鐘重覆40次’以及 72°C 5分鐘一次。 RAP-PCR所使用的引子為··引子ZF1具有與序列識別46 號一致的核苷酸序列，引子ZF4具有與序列識別47號一致 的核苷酸序列，引子ZF7具有與序列識別48號一致的核芬 酸序列，引子ZF10具有與序列識別49號一致的核替酸序 列，引子ZF13具有與序列識別號一致的核誓奴序列，引 子Z F1 6具有與序列識別51號一致的核芬酸序列，引子匸S1 七tVO具有與序列識別52號一致的核苷酸序列’引子CS4具有與 1序列識別53號一致的核荅酸序列，引子CS7具有與序列識 f別54號一致的核甞酸序列’引子CS10具有與序列識別55號 -201 - 1344991 (196)
一致的核站酸序列，引子CS13具有與序列識別56號一致的 核苷酸序列，而引子cs 16具有與序列識別57號一致的核：y： 酸序列。在3%NuSieve瓊脂糖凝膠（FMC BioProducts， Heerhugowaard，The Netherlands)上，並排地跑產物。利用 Qiaquick凝膠萃取套組（Qiagen，Leusden，The Netherlands)，從 凝膠中純化對MPV專一之以不同方式展現的片段，並根據 得自製造者的指示’選殖到pCR2.1載體（Invitrogen，Groningen， 丁he Netherlands)内。成功地純化並定序20個片段。在10個片 段中，發現對APV的序列同種性，即使用ZF7引子分離的 片段1，產生335個鹼基對的片段，對N基因有同種性，使 用ZF10引子分離的片段2，產生235個鹼基對的片段，對N 基因有同種性，使用ZF10引子分離的片段3，產生800個鹼 基對的片段，對Μ基因有同種性，使用CS1引子分離的片 段4，產生1250個鹼基對的片段，對F基因有同種性，使用 CS10引子分離的片段5，產生400個鹼基對的片段，對F基 因有同種性，使用CS13引子分離的片段6，產生1450個驗 基對的片段，對F基因有同種性，使用CS13引子分離的片 段7，產生750個鹼基對的片段，對F基因有同種性，使用 ZF4引子分離的片段8，產生780個鹼基對的片段，對L基因 有同種性，使用ZF10引子分離的片段9，產生330個鹼基對 的片段，對L基因（蛋白質層面）有同種性，以及使用ZF10 引子分離的片段10，產生250個鹼基對的片段，對L基因（蛋 白質層面）有同種性。 可使用TaqMan測定，測量基因表現的程度。改編Taq-Man -202- 1344991 (197) 測定，以便檢查L-基因和N-基因的表現。然而β在這些測 定中使用的引子，不需要對hMPV组任一個是專一的，在 下文中出示實例。在50微升總反應體積中，利用500 nM濃 度的前進引子、250 nM濃度的逆向引子、250 nM濃度的寡 核荅酸探針、25微升萬能的PCR主要混合物（獲自ABI) ’和 5微升cDNA進行反應。在ABI 7000序列檢測系統上，循環 條件為：95t 10分鐘的第一個步驟，接著是由95°C 30秒和 6(TC 60秒組成的45次第二個步驟》 欲在TaqMan測定中使用之hMPV N基因的引子的其他實 例如下：對於分離株 NL/1/00、BI/1/01、FI/4/01、NL/8/01 和FI/2/01，均為亞組A卜可使用具有序列識別39號之核苷 酸序列的引子。至於分離株NL/30/01，為亞組A1 ’可使用 具有序列識別40號之核甞酸序列的引子。至於分離株 NL/22/01和NL/23/01，為亞組A2 ’可使用具有序列識別41 號之核芬-酸序列的引子。至於分離株NL/17/01，為亞組 A2，可使用具有序列識別42號之核甞酸序列的引子。至於 分離株NL/17/00，為亞組A2，可使用具有序列識別43號之 核每酸序列的引子。至於分離株NL/1/99、 和NL/9/01，為亞組B1，可使用具有序列識別44號之核芬酸 序列的引子。至於分離株FI/1/01和FI/10/01，為亞组B1 ’可 使用具有序列識別45號之核苷酸序列的引子。 可供A1亞組使用的可能探針，與序列識別39〇號一致， 可供B1亞組使用的探針，與序列識別3 91號一致’而可供 B2亞組使用的探針，與序列識別392號一致。 1344991
(198) 6.12. 實例20:尺八？-?^1產物的序列分析 在使用RAP-PCR擴大斷片之後，可在經過擴大的斷片上 獲得序列資訊。為了這樣做，將所產生的片段選殖到之前 定序的載體中是有利的β
將RAP-PCR產物選殖到利用Μ13-專一之寡核甞酸定序的 pCR2.1載體（Invitrogen)内。從瓊脂糖凝膠中，使用Qiaquick 凝膠萃取套組（Qiagen，Leusden，The Netherlands)，純化藉著 RT-PCR獲得的DNA片段，並利用與PCR所用相同的寡核# 酸直接定序。使用Dyenamic ET終止序列定序套組（Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal，The Netherlands)，和 ABI 373 自 動DNA定序器（PE Biosystem)，進行序列分析。所有的技術 均根據製造者的指示進行。 6.13. 實例21 :藉著RT-PCR產製基因組片段
RAP-PCR方法可在序列中留下不被擴大或複寫的間 隙。為了獲得完整的序列，可使用RT-PCR獲得間隙的序列 資訊。 欲產製跨越在RAP-PCR片段之間間隙A、B和C的PCR片段 (圖3)，按照先前的描述，對分離自病毒分離株00-1的RAN 試樣，使用RT-PCR測定。 使用下列的引子來產製片段A :在前導序列中設計 TR1 ’與序列識別22號之核苷酸序列一致，並在以N獲得之 RAP-PCR片段的3'端處設計N1，且與序列識別23號之核苷 酸序列一致。使用下列的引子來產製片段B :在以N獲得 之RAP-PCR片段的5,端處設計N2，且與序列識別24號之核 -204- 1344991 (199) 甞酸序列致，並在以M獲得之RAP-PCR片段的Y端處設計 Ml，且與序列識別25號之核甞酸序列一致。使用下列的引 子來產製片段C:在以Μ獲得之RAP-PCR片段的5'端處設計 M2，且與序列識別26號之核钻酸序列一致，並在以F獲得 之RAP-PCR片段的3'端處設計F1，且與序列識別27號之核 苷酸序列一致。
在凝膠電泳之後純化片段，並按照先前的描述選殖和定 序。 6.14.實例25:使用重組的核蛋白，捕捉抗-!^1?乂121^丑1八 為了檢測hMPV病毒，免疫學測定可在各種宿主中檢測 抗體的存在。在一個實例中，使用對抗N蛋白質的抗體， 因為它是所產生之蛋白質中最豐富的。該特徵歸因於跨越 病毒之基因組發生的轉錄梯度。
可藉著修改先前由Erdman等人，1990，J. Clin. Microb. 29: 1466- 1471描述的測定，進行使用重組核：y：酸或任何其他之 重組蛋白質作為抗原的捕捉IgM EIA。 將以親和力純化的抗-人類IgM捕捉抗體（或對抗其他的 物種），像是獲自Dako的，以在0.1 Μ碳酸鹽緩衝溶液pH 9.6 中，每孔250毫微克之濃度，加至微量滴定盤的孔中。在 室溫下過夜培養之後，以PBS/0.05%吐溫沖洗培養盤兩 次。將100微升，以ELISA緩衝溶液稀釋成1:200至1:1000的 受試血清，加至一式三份的孔中，並在37°C下培養1小時。 然後以PBS/0.05%吐溫沖洗兩次。 將以ELISA緩衝溶液稀釋成1: 100至1:500的冷凍-融解（以 -205 - 1344991
(200)
重組病毒感染之）Sf21細胞的溶胞產物，加至孔中，並在37 °C下培養2小時。未感染細胞的溶胞產物係作為陰性對照 組，並以一式兩孔執行。然後以PBS/0.05%吐溫沖洗三次， 並在37°C下，與100微升以ELISA緩衝溶液最適切地稀釋的 抗MPV之多株抗體一起培養1小時。在以PBS/0.05%吐溫沖 洗兩次之後，將培養盤與辣根過氧化酶標示之二級抗體 (像是兔子抗雪貂）一起培養，並在37 °C下培養該盤20分 鐘。 然後以PBS/0.05%吐溫沖洗培養盤5次，在室溫下與酵素 受質TMB，像是例如獲自"Sigma"的3,3,5,5-四甲基聯苯胺， 一起培養15分鐘，並以100微升2 Μ磷酸使該反應中止。在 450毫微米處，使用自動微量滴定盤讀取器，測量比色的 1買數。
使用得自有臨床MPV病毒感染之人的急性期和恢復期 血清對，—來比較使用重组核蛋白質（或其他重组蛋白寶） 和完整MPV病毒之捕捉IgM EIAs的敏感性。藉著測試得'自 健康的人和感染其他副黏液病毒的人之血清樣本，判定重 组核蛋白捕捉EIA的專一性。 EIAs可能使用藉著桿狀病毒表現所產製之重組的MPV融 合蛋白質和糖蛋白。 糖蛋白G和F是MPV病毒粒子的兩個穿透膜被膜糖蛋 白，並代表主要的中和和保護抗原。這些糖蛋白在諸如桿 狀病毒系統之類的載體病毒系統中表現，提供了可用在檢 測MPV專一抗體之測定中的重組抗原的來源。此外，其與 -206- 1344991
(201) 核蛋白併用，例如，在對抗MPV之抗體的檢測中，進一步 提高了酵素免疫測定的敏感性》 可使用各種其他的免疫學測定（Current Protocols in
Immunology，第 1-3 册。由 Coligan， J.E., Kruisbeek, Α·Μ.， Margulies，D.H.，Shevach，Ε·Μ.和 Strobe, W.編輯，由 John Wiley and Sons，Inc.，USA出版），作為那些在本文中描述之方法的 其他選擇。 為了發現病毒分離株，可檢查最好是得自，但不限於人 類、食肉動物（狗、貓、海豹等等）、馬、反芻動物（牛、 綿羊、山羊等等）、豬、兔子、烏類（禽類、駝烏等等）的 鼻咽抽吸物、喉和鼻抹拭物、支氣管肺泡灌洗液和喉抹拭 物。可檢查得自烏類的泄殖腔和腸抹拭物，烏糞也一樣 好。對所有的試樣而言，為了檢測病毒，可進行血清學（抗 體和抗原檢測等等）' 病毒分離和核酸檢測技術。可藉著 以經過純化的MPV或其部分（蛋白質、肽）免疫老鼠（或其他 動物）’並接著使用已確立的融合瘤技術（Current Protocols in
Immunology,由 John Wiley and Sons, Inc.，USA出版），來產製 單株抗體。或者，可為了該目的，使用噬菌體展示技術 (Current Protocols in Immunology,由 John Wiley and Sons, Inc” USA出版）》同樣地，可從被感染的人類或動物中，或從 尤疫的人類或動物中，獲得多株抗體（Current Protocols in
Immunology,由 John Wiley and Sons, Inc.，USA出版）。 可使用西方墨點法、IFA、免疫沉澱技術，使用各種抗 體製品’進行NS1和NS2蛋白質之存在或缺乏的檢測《可使 1344991 (202) 用PCR，利用以已知nsi及/或NS2基因為基礎設計的引子 組’並利用各種核酸雜交技術，在病毒分離株中，進行 NS1和NS2基因或其同系物之存在或缺乏的檢測。 欲判定NS1和NS2基因是否出現在病毒基因组的3,端，可 進行PCR ’利用對該基因組之3,端專—的引子。在我們的 情況下’我們使用對病毒基因組之3,未轉譯區域專一的引 子’以及在N 〇RF中的引子β可為了相同的目的，設計其 他的引子。藉著PCR產物的長度及/或核苷酸序列，顯示缺 乏NS1/NS2基因。.對NS1及/或NS2基因專一的引子，可與對 病毒基因組之3,端的其他部分（像，是未轉譯區域或Ν、μ或F ORFs)專一的引子併用，容許明確地確認NS1或NS2基因的 存在。除了 PCR之外，可為了相同的目的，使用諸如分子 選殖、核酸雜交之類的各種技術。 7.MPV之細胞培養系統和動物模式，以及mpv的重組設計 7_ 1 ·實例22- : hMPV在不同細胞株中的生長 可在不同的細胞株中培養病毒分離株，以便檢查每個病 毒的特徵。例如，可以在培養時測量到的力價含量為基 礎，定出不同病毒分離株之傳染性的特徵，並區別之。或 者’可在培養時使用細胞來繁殖或擴大病毒的品系，以供 進一步的分析》 在一個實例中，使用三級猴腎細胞擴大hMPV。然而， 三級猴腎細胞是衍生自初級細胞，其僅可繼代有限的次 數’並已經在活體内繼代3次。不知道那一類的永存不死 細胞株將支持hMPV病毒生長至高力價。測試許多猴子細
工344991 (203) 胞株’像是Vero ' LLC-MK2、HEp-2和肺纖維母細胞（lfi〇43) 細胞’看看它們是否可支持hMPV病毒複製（表11}。所使甩 之胰蛋白酶’是濃度為0.001毫克/毫升的TpCK_騰蛋白g每 (Worthington) »亦在已受精之10日齡雞蛋中，測試該病毒 的生長。在AF收獲之前，在37χ：下培養已感染之蛋之和： 天。藉著被感染細胞之溶胞產物，在無胰蛋白酶之Ver〇細 胞上的溶菌斑測定，在35。(：下培養1〇天，並使用天歧鼠
V抗血清造行免疫染色，來判定病毒力價。結果顯；，
Ve r 〇細胞和L· L C - Μ Κ 2細胞，县a ;态人 疋取適合faMPV病毒複製的細胞 受質’結果產生106- 107 Pfu/享斗认产电 笔升的病毒母液力價。這政力 價類似從tMK細胞中獲得的那此。 1 一 以〇_〇1毫克/毫升之濃度 添加腺蛋白酶，不會以可·玟 了祭知的程度增加病毒力價（表 11) 〇 細胞株中的生長 白酶· 上的病 选遶毒生長 isfiViihl 有 2.1xl〇7 »·♦% UxlO7 有 2.3xl〇5 有 細胞死亡 有 無病毒回收 無 無病毒回收 有 l.OxlO7 «»»、 無病毒回收
表11 : hMPV病毒在不同 >胞受質
Vero LLC-MK2
Hep-2 LF 1043(HEL)
tMK 蛋(10天） -209- 1344991 (204)
為了研·究生長在Vero細胞中之hMPV病毒的病毒動力 學，使用0.1之MOI，完成生長曲線（圖23p每隔24小時收 獲細胞和細胞上清液，並為了病毒力價的定量，藉著溶菌 斑測定分析之。結果顯示，在第5天觀察到接近高峰的 hMPV力價》在第8天達到5.4 logl0 pfu/毫升的絕對高峰力 價。病毒力價是極穩定的’高達第1〇天。在相同時間，僅 利用細胞上清液進行的生長曲線，只顯示出極低的病毒力 價。該資料證實在所使用的條件（〇·1之MOI)下，hMPV複製 在感染後第8天睁達到高峰，且hMPV主要是與細胞結合的 RNA病毒。
293細胞的轉移感染：每隔3-4天，使293細胞（人類腎臟 上皮細胞）在補充有FCS(10%)、L-穀胺醯胺（1: 1〇〇)和青黴素 /鍵黴素（1:100)的DMEM中繼代，並以1:10分配β小心不要 讓細胞生長至匯合，以便提高可轉移感染的能力》細胞不 是極黏附—的；在胰蛋白酶-EDTA中簡短地培養（2分鐘或更 少），通常便足以將其從塑膠表面釋放。在以胰蛋白醃_ 處理之後’立刻以培養基稀釋細胞。 在轉移感染前一天，分配細胞。在轉移感染時，細胞的 匯合度約為50-75%。使用膠凝的塑膠，預防細胞在轉移感 染過程之間分開。以0,1%明膠（以！：2〇稀釋2%之母液），覆 蓋培養盤或燒瓶10分鐘，並以PBS沖洗一次。欲獲得正確 的細胞密度，以每個Τ75燒瓶或100毫米培養盤（在1〇毫升 中）1χ107個細胞，或6-孔培養盤（在2毫升中）每孔1χ1〇6個細 胞的濃度使用細胞。 -210· (205) 1344991
轉移感.染最少持續7小時，然而，最好是容許轉移感染 過夜發生。接著在無菌的試管中，混合：30毫克DNA與石2 毫升2 M CaCl2，並加H2〇至500毫升（T75) ’或3毫克DNA與6·2 毫升2 M CaCl2，並加H2〇至50毫升（6-孔培養盤）；簡單地混 合。逐滴加入500或50毫升的2xHBS，並容許該溶液混合5 分鐘，直到形成沉澱為止。小心照顧，即不加以旋轉。以 新鮮預熱的培養基置換舊的培養基（每個τ75燒瓶10毫 升，或6-孔培養盤每孔1毫升）。藉著以Gilson吸移管將氣泡 吹過試管，小心地混合DNA，並將沉澱物逐滴加至培養基 中，覆蓋細胞。在37。(：，C02氣壓下培養細胞。 細胞似乎被少量微粒（沉澱物）覆蓋。從細胞中移出轉移 感染培養基，並以PBS小心地沖洗細胞’然後以新鮮的培 養基置換β 在37°C C02氣壓下培養細胞，直到需要為止，通常在8-24 小時之間
以 8.18%NaCn、5.94%Hepes和 0.2%Na2HPO4(均為重量 /體積） 製備HB.S的10x母液。將該溶液過濾滅菌，並儲存在4°C下。 藉著以H20稀釋10x母液，並以1 M NaOH將PH值調整到 7·12，製備2x溶液。將該溶液等分，並儲存在- 20°C下。小 心精確地滴定該溶液之pH值》在使用該溶液進行轉移感 染程序之前，才調整pH值。 7.2.實例23 : MPV的迷你複製子構築體 可產製含有反義報告者基因的迷你複製子構築體。在圖 24中出示迷你複製子的實例，CAT-hMPV。在圖26中出示用 -211 - 1344991
(206)
來產製迷你複製子構築體的前導和拖尾序列。為了比較， 亦在圖26中出示APV、RSV和PIV3前導和拖尾序列的排列 測試兩種版本的迷你複製子構築體：一個在前導末端帶 有終端AC殘基（Le+AC)，而一個在前導末端沒有終端AC殘 基（Le-AC) »兩個構築體在測定中均是有功能的（圖25) ^可 在圖25中看到，在48小時之後發生的CAT表現，比在24小 時之後的高很多。在48小時之後，觀察到每500,000個轉移 感染的細胞約有14毫微克的CAT。該實驗完全由質體驅 動：迷你複製子與T7聚合酶質體共同轉移感染，並從 pCITE-2a/3a(pCite質體，具有T7聚合酶，接著是衍生自腦心 肌炎病毒（EMCV)的IRES元件）中表現N、P、L、M2-1基因。 當排除L、P和M2- 1時，完全廢除了 CAT表現。當從載體中 排除N表現時，明顯地降低了 CAT表現。
亦可藉著以hMPV聚合酶組份（NL/1/00和NL/1/99)或得自 APV-A、APV-C、RSV或PIV的聚合酶組份，超感染迷你複 製子-轉移感染的細胞，來測試迷你複製子系統的專一性 (歸因於異源病毒）和前導之終端殘基的影響（歸因於同種 病毒）。亦可測試6個質體各自的差異量，以便判定最佳條 件。 可使用其他的報告者基因來代替CAI^在其他的實例 中，可將GFP插入迷你複製子構築體内，來代替CAT。
7.3.實例24 :產製全長有傳染性的CDNA 可建構表現hMPV之基因的全長cDNA，而得以產生有傳 染性的病毒。例如，可建構編碼hMPV之所有基因，或所 -212- 1344991
(207) 有必要基.因的cDNA ;然後可表現基因组，產生有傳染性 的病毒。 '
為了以遺傳之方式操縱hMPV，選殖該RNA病毒的基因 組。關於hMPV的00-1分離株，產生8個PCR片段，長度上的 變化是從1至3kb(圖27)。定出PCR片段之序.列，並藉著與存 放在Genbank中的hMPV序列比較，分析序列的錯誤。兩個 無聲突變（在SH基因中核荅酸5780 ile:ile，在L基因中核苷 酸12219 cys:cys)未被修正。不改變另一個在L基因中，在 核苷酸8352(1吓：^11)處的改變，因為在兩個獨立產生的？01 片段（C和H)中，以及在hMPV 99-1序列中觀察到該突變。 同樣地，不修正在F-M2基因間區域中核苷酸471 5處的5個 核苷酸插入。這兩個改變可能反映hMPV的野外型序列。 相反的，在核甞酸1242處在N-P基因間區域移除單一的A殘 基；在核菩酸3367處，在F基因中修正ser:pro;在核芬酸6296 處，在G基因中改變asp:val ;並在核苷酸7332處，在L基因 中將中止密碼子改為glu。在圖28中出示hMPV之不同分離 株的限制舆圖。可使用限制位置來裝配全長的構築體。 然後依順序裝配8個經過修正的PCR片段，利用獨特的限 制酵素位置（圖29)。將遺傳標記導入核苷酸75處，產生Aflll 限制酵素位置，但不改變胺基酸序列。在hMPV序列的3' 端加入獨特的限制酵素位致Xhol»在hMPV序列的3'端加入 嗜菌體T7聚合酶啟動基因，接著加入兩個G殘基。在hMPV 基因組的5'端，加入肝炎δ核酶序列和BssHII限制酵素位 置。 *213- 1344991 (208) 亦產製在pCITE質體中，編碼hMPV L、N、P和M2- 1基因 的協助者質體。一旦產生全長的hMPV cDNA，便在Vero細· 胞中，使用禽痘T7或MVA-T7作為T7聚合酶的來源，進行藉 著逆向遺傳法回收病毒的工作。 7.4.實例26 :以hMPV之亞型感染動物宿主
可感染動物宿主，以便定出MPV品系的毒力特徵。例 如，可使用不同的宿主，以便判定每種品系在生物中如何 感染。 尚未確認hMPV的小動物模式。使用1.3x106pfu/動物之劑 量，以hMPV感染Balb/c老鼠、棉鼠和敘利亞黃金倉鼠。以 0.1毫升之體積，利用1.3xl06pfu的hMPV，鼻内接種動物。 藉著溶菌斑測定，在第9天以hMPV天竺鼠抗血清免疫染 色，來定量組織試樣。在感染後4天，犧牲動物，分離鼻 曱骨和肺臟，並藉著免疫染色的溶菌斑測定，定量hMPV 力價。
表12 :在被感染動物中的hMPV力價 動物 動物數目 在感染後4天的平均病喜力價 (loginPFU/幻組織±標準偏差 鼻甲骨 肺臟 老鼠(Balb/c) 6 2.7±0.4 2.2±0_6 棉氣 5 <1.7±0.0 <1.8土0‘0 敘利亞黃金倉鼠 6 5.3 士 0.2 2.3±0_6 結果顯示hMPV在敘利亞黃金倉鼠中複製達高力價。在 -214- 1344991 __ (209) 鼻甲骨和肺臟中，分別獲得5.3和2.3 logl。pfu/克組織的力 價。hMPV不能在棉鼠的呼吸道中，複製至任何可察知的 力價含量。老鼠在上和下呼吸道中，分別顯示2.7和2.2 log10 pfu/克組織的力價。這些結果暗示敘利亞黃金倉鼠應該是 研究hMPV複製和免疫原性，以及評估hMPV疫苗候選者的 適當小動物模式。
天竺鼠的感染。使用兩種病毒分離株，00-1(Α亞型）和 99-1(B亞型），每種亞型各接種6隻天竺鼠（氣管内、鼻和眼 睛）。以 hMPV 00-.1( 10e6，5TCID50)感染 6 隻天竺鼠。以 hMPV 99-l(10e4，lTCID5〇)感染6隻天竺鼠》容許最初的感染進行 54天，此時以同種或異種的亞型（10e4 TCID5〇/毫升）接種天 竺鼠，即兩隻天竺鼠最初以00-1感染，並以99- 1二次感染， 以便達到異種感染，3隻天竺鼠最初以00-1感染，並以00-1 二次感染，以便達到同種感染，2隻天竺鼠最初以99-1感 染，並以-00-1二次感染，以便達到異種感染，而3隻天竺 鼠最初以99_ 1感染，並以99- 1二次感染，以便達到同種感 染。 在感染後12天（最初的感染）或8天（二次感染）收集喉和 鼻抹拭物，並藉著RT-PCR測定，測試病毒的存在。RT-PCR 測定的結果（圖32)，顯示以病毒分離株00-1接種的天竺 鼠，在感染後第1至10天，顯示出上呼吸道的感染。以病 毒分離株99-1接種的天竺鼠，在感染後第1至5天，顯示出 上呼吸道的感染。感染99-1的天竺鼠，似乎比利用00-1的 感染更不嚴重。按照上文建議，以異種病毒二次接種天竺 -215- 1344991
(210) 鼠，結果·在4隻天竺鼠中有3隻再度-感染。同樣的，在同 種病毒的案例中，在6隻天竺鼠中有2隻發生再度·感染v 在這些二次感染的動物中，注意到較少或沒有臨床症狀， 且在受到對抗再度-感染之保護的那些動物中，沒有看到 臨床症狀，證實即使利用野外型病毒，亦可能出現歸因於 第一次感染的保護效果》這亦顯示可使用異種和同種分離 株作為疫苗®
兩種hMPV亞型均可感染天竺鼠，雖然利用亞型B(99-l) 的感染似乎較不嚴重，即病毒出現在鼻和喉中的期間比利 用亞型A(00-1)的感染更短。這可能歸因於給予較高劑量 的亞型A，或因為亞型B的毒力較低。雖然預先-存在之免 疫力的存在，不能完全保護對抗利用同種和異種病毒兩者 的再度-感染，但感染似乎是較不顯著的，注意到病毒存 在的期間較短，且不是所有的動物均成為病毒陽性的。
檢查以hMPV兩種亞型感染之天竺鼠的血清學。在第〇、 52、70、80、90、110、126和160天，從天竺鼠中收集血清， 並以1: 100之稀釋度，在完整病毒ELISA中，對00-1和99- 1 抗原進行測試。（參見圖33A和B，顯示每個個別天竺鼠對 抗00-1和99-1的IgG反應。亦參見圖34，顯示00-1和99-1 ELISA的專一性，但注意到只有使用得自同種再度感染之 天竺鼠的資料。亦參見圖35，顯示三隻同種，即00-1和 ΟΟ]，兩隻同種，即99-1和99-1，兩隻異種，即99-1和00-1， 以及兩隻異種，即00-1和99-1感染之天竺鼠對抗00-1和99-1 ELISA的平均IgG反應）。 -216- 1344991 (211) 在兩個不同ELISAs中僅觀察到最小的差異。不可使用完 整病毒ELISA對抗00-1或99-1來區別兩個亞型。 '
檢查在天竺鼠中對hMPV升高之血清對APV抗原的反應 性。從被感染的天竺鼠中收集血清，並利用APV抑制ELISA 測試之^ (參見圖36，顯示hMPV感染天竺鼠之APV抑制作 用的平均百分比）。以類似其在hMPV IgG ELISA’s中反應的 方式，使在天竺鼠中對hMPV升高之血清，在APV抑制測試 中進行反應。對99-1升高的血清，在APV抑制ELISA中，顯 示出比對00-1升高之血清更低的抑制百分比。被99-1感染 的天竺.鼠，可能具有比在hMPV ELISAs中所見更低的力 價。或者，99-1與APV之交又-反應，可能比與00-1的更低。 儘管如此，可使用APVAb抑制ELISA，來檢測在天竺鼠中的 hMPV抗體。
利用在天竺鼠中對hMPV升高之血清，進行病毒中和測 定。在感-染後第0天、52天、70天和80天收集血清，並用 在利用00-1、99-1和APV-C的病毒交叉-中和測定中。所使 用的開始稀釋度為每孔1至10和100 TCID50個病毒。在中和 作用之後，使病毒與tMK細胞（15毫米）接觸，並以3500 RPM 離心，隨後更新培養基。使APV培養物生長4天，並使hMPV 培養物生長7天。以80%丙酮固定細胞，並利用已標示之 猴-抗hMPV，進行IFAs。將染色時為陰性的孔，定義為中 和力價。對於每種病毒，包括病毒母液的10-log滴定和工 作溶液的2倍滴定。（參見圖37，顯示00-1和99-1感染之天 竺鼠對00- 1、99- 1和APV-C的病毒中和力價）。 -217- 1344991 (212) 獼猴的·感染。使用病毒分離株00-1( A亞型）和99-1 (B亞 型）（le5 TCID5。），每種亞型接種2隻獼猴（氣管内、鼻和眼 睛）。在最初感染之後6個月，第二次以00- 1接種獼猴。在 感染後第14天（最初的感染）或第8天（二次感染）’收集喉抹 拭物，並藉著RT-PCR測定測試病毒的存在（圖38)。
以病毒分離株00- 1接種的獼猴，在感染後1至1 0天，顯示 上呼吸道的感染。臨床症狀包括化膿性鼻炎。以同種病毒 二次接種的獼猴，由PCR證實產生再度-感染，然而，沒有 看到5¾床症狀。 在最初感染之後6個月的期間内，從接受00-1的獼猴中 收集血清（對猴子3，在第240天發生再度-感染，且對猴子6 則在第239天發生）》使用該血清測試對抗00-1或APV之 IgG(圖3 9B)抗體的存在，以及對抗00-1之IgA和IgM的存在 (圖 39A)。
成功地以00-1感染2隻獼猴，並在對抗00-1之抗體的存在 下，以同種病毒再度感染。對IgA和IgM抗體的反應，顯示 在第一次感染之後，IgM抗體升高，但在再度感染之後缺 乏它。僅在再度-感染之後檢測到IgA抗體，顯示在第一次 感染之後直接的免疫反應。在APV抑制ELISA中，測試在 獼猴中對hMPV升高的血清，顯示出類似hMPV IgG ELISA的 反應。 以APV抑制ELISA測試在獼猴中對抗hMPV的抗體，使用 像在hMPV ELISA中所用的類似的敏感性，因此APV抑制EIA 適合用來針對hMPV抗體的存在，測試人類試樣。 -218- 1344991
(213)
在收集.自hMPV感染獼猴的血清上，進行病毒交又-中和 測定。在最初感染之後第〇天至第229天取得血清，並顯示 僅有低的抗00-1病毒中和力價（0-80)，在二次感染之後取 得血清，則顯示高的抗00_1中和力價’即大於1280。只有 在二次感染之後取得的血清，顯示出抗9 9 -1的中和力價 (80-640) ’且沒有血清能夠中和APV C病毒。在病毒交又-中和測定中，在APV-C與hMPV之間沒有交叉反應，然而， 在抗體反應的補強之後’在〇 〇 -1與9 9 -1之間有交叉反應。
人類的感染。先前使用IFA和對抗00- 1的病毒中和測定， 測試年齡範圍在6個月以下或20歲以上之患者的血清。在 對抗00-1的ELISA中，針對IgG、IgM和IgA抗體的存在，來 測試這些血清。亦就其在APV ELISA中的抑制能力，測試 這些試樣。為了在人類血清中檢測IgG抗體，比較hMPV ELISA和APV抑制ELISA的用途，並注意到在IgG hMPV測試 與APV-Ab·測試之間強有力的關連，因此APV-Ab測試基本 上能夠在人類中檢測對抗hMPV的IgG抗體（圖40)。 禽類的感染。針對對抗APV之IgG抗體的存在，使用APV 抑制ELISA和00-1 ELISA來測試雞。hMPV ELISA和APV抑制 ELISA兩者均可檢測出對抗APV的抗體。 7.5.實例27 : APV在人類中作為疫苗 可在人類中使用APV作為疫苗，預防被人類MPV感染， 或降低人類MPV在人類宿主中的感染力。該疫苗可以是完 整的APV，或嵌合型或重組版本，或其衍生物，它除了 APV 的序列之外，還包括其他間質肺病毒的異源序列。可使用 -219- rI344991 (214)
apv的基因组作為主鏈，創造重組的病毒疫苗。例如，可 製造其中以人類MPV之F-基因或G-基因取代APV之F-基因 及/或G-基因的疫苗。或者，可製造包括取代APV主鏈之序 列，或加至其中的得自PIV之序列的疫苗。關於在建構重 組/嵌合型疫苗上的更多資訊，參見，例如重組cDNA和RNA 的建構。可藉著熟諳此藝者已熟知的各種方法，將疫苗投 予志願者（參見前文第4.13節），包括但不限於皮下注射、 鼻内投藥或吸入。以至少在103 TCID50至106 TCID50之間的 開始劑量，投與本發明之病毒及/或疫苗。以單一或多次 給藥，投與病毒及/或疫苗，例如可投予最初的給藥，並 在宿主的生命中，按一定的時間間隔，投予一或多次的後 續或補強給藥。在臨床試驗中，可使用病毒的複製速率作 為調整疫苗劑量的指標，而得以判定有效劑量攝生法。可 在病毒在研究族群中的複製速率與已知有效的預定速率 之間進行-比較。
7.6.實例28 : MPV在鳥類中作為疫苗 可在鳥類中使用人類MPV作為疫苗，預防被APV感染， 或降低APV在鳥類宿主中的感染力》該疫苗可以是完整的 MPV，或嵌合型或重組版本，或其衍生物，它除了 MPV的 序列之外，還包括其他間質肺病毒的異源序列。可使用人 類MPV的基因組作為主鏈，創造重组的病毒疫苗。例如， 可製造其中以APV之F-基因或G-基因取代人類MPV之F-基 因及/或G -基因的疫苗。關於在建構重组/嵌合型疫苗上的 更多資訊，參見，例如重組cDNA和RNA的建構。 -220- 1344991
(215) 可藉著各種方法，將疫苗投予志願者，包括但不限於皮 下注射、鼻内投藥或吸入。以至少在1〇3 TCID50至1〇6 丁CID- 5 0
之間的開始劑量，投與本發明之病毒及/或疫苗β以單_ 或多次給藥’投與病毒及/或疫苗’例如可投予最切的給 藥’並在宿主的生命中，按一定的時間間隔，投予—或多 次的後續或補強給藥。在臨床試驗中，可使用病毒的複製 速率作為碉整疫苗劑量的指標，而得以判定有效劑量攝.生 法。可在病毒在研究族群中的複製速率與已知有效的預定 速率之間進杆比較。 8.圖式簡單說明 圖1:在分離株〇〇·ΐ和肺病毒亞科之其他成員的胺基酸 序列之間，發現的同種性百分比。給予Ν、Ρ、Μ、F和L 中的兩個RAP-PCR片段（8和9/10)胺基酸序列百分比 (X100)。 圖2 :在-藉著年齡群分類的人類中，MPV的血清患病率·， 使用兄疫勞光和病毒中和測定》
圖3 : ·的APV之基因組的圖解表示’帶有在病毒分離株 00-1(Α1)上，利用RAP-PCR和RT-PCR獲得之片段的位置和尺 寸。利用在RAP-PCR片段1和2中之引子，以及以APV和RSV 之前導和拖尾序列的排列為基礎所設計的引子，獲得片段 A(Randhawa等人，1997，J. Virol. 71:9849-9854)。使用在 RAP-PCR片段1和2，以及RAP-PCR片段3中設計的引子，獲 得片段B °使用在raP-PCR片段3，以及在RAP-PCR片段4、 5、6和7中設計的引子，獲得片段C。 -221 - 1344991 (216)
圖4:比較肺病毒亞科之成員和病毒分離株00-1(Α1)的 N、P、Μ和F ORFs。排列顯示病毒分離株OO-l(Al)之完整N、 F、Μ和P蛋白質，以及部分L蛋白質的胺基酸序列。顯示 在分離株00-1( A1)和其他病毒之間不同的胺基酸，藉著句 點代表相同的胺基酸。以破折號表示間隙。號碼與在蛋白 質中的胺基酸位置一致。縮寫如下：APV-A、B或C ·· A、B 或C型禽肺病毒；hRSV:牛或人類呼吸道融合細胞病毒； PVM :老鼠的肺炎病毒。L8 :利用位在L中的RAP-PCR獲得 的片段8 ; L9/10 :利用位在L中之RAP-PCR獲得的片段9和 10之構築體。關於L的排列，僅獲得bRSV、hRSV和APV-A 序列。 圖5 : MPV之核蛋白的預測胺基酸序列，與其他肺病毒 的那些的排列。藉著盒子表示保留區，並標示A、B和C。 以灰色並加陰影，顯示在肺病毒中的保留區。以破折號表 示間隙，句·點代表與MPV相比較，相同胺基酸殘基的位置、
圖6 : MPV之磷蛋白與其他肺病毒的那些的胺基酸序列 比較。框起高類似性的區域，灰色並加陰影的是富含穀胺 酸之區域。以破折號表示間隙。句點代表與MPV相比較， 相同胺基酸殘基的位置。 圖7 :比較MPV之基質蛋白質的推衍胺基酸序列，與其 他肺病毒的那些。保留的六肽序列是灰色並加陰影的。以 破折號表示間隙。句點代表相對於MPV，相同胺基酸殘基 的位置。 圖8 : MPV分離株00- 1(A1)的基因組作圖。在每個ORF下， -222 - 1344991
(217) 指出開始和中止密碼子的核苷酸位置。跨越L ORF的雙線 表示L基因的縮短表示。在圖下的三個編閱架構表示主要 的G ORF(nt 6262-6972)和有可能重疊的二級ORFs。
圖9 : MPV之融合蛋白質的推衍胺基酸序列，與其他肺 病毒的那些的排列。框起保留的半胱胺酸殘基。將N-連接 的糖基化作用位置加下標線。F0之切開位置則加雙線的下 標線；以灰色並加陰影，來顯示融合肽，信號肽和膜固定 功能部位。以破折號表示間隙，且句點代表相對於MPV， 相同胺基酸'殘基的位置。 圖10 :比較MPV之M2 ORFs的胺基酸序列，與其他肺病毒 的那些。三個保留的半胱胺酸殘基以粗體字印刷，並藉# 表示。在方格B中顯示M2-2 ORFs的排列。以破折號表示間 隙，且句點代表相對於MPV，相同胺基酸殘基的位置。
圖11 : MPV之SH ORF的胺基酸序列分析。（A)MPV之SHORF 的胺基酸-序列，其中絲胺酸和蘇胺酸殘基是灰色並加陰影 的，半胱胺酸是粗體的，且忌水性區域加雙線的下標線。 可能的N-連接之糖基化作用位置加單線的下標線。箭頭指 出位在忌水性功能部位側面之鹼性胺基酸的位置。 (B)MPV、APV-A和hRSV-B之SH蛋白質的忌水性作圖之排 列。使用17個胺基酸的窗口。箭頭指出強忌水性功能部 位。在X-軸上提供ORF中的位置。 圖12 : MPV之G ORF的胺基酸序列分析。（A)MPV之G ORF 的胺基酸序列，其中絲胺酸、蘇胺酸和脯胺酸殘基是灰色 並加陰影的。半胱胺酸是粗體的，且忌水性區域加雙線的 • 223 - 1344991
(218) 下標線。·可能的N-連接之糖基化作用位置加單線的下標 線。（B)MPV、APV-A和hRSV-B之G蛋白質的忌水性作圖之 排列。使用17個胺基酸的窗口。箭頭指出忌水性功能部 位，並在X-軸提供ORF中的位置。
圖13 :比較MPV和其他副黏液病毒之聚合酶基因的保留 功能部位之胺基酸序列。在功能部位III中，框起以四個 保留的聚合酶基序（motif)(A、B、C、D)顯示的功能部位 III(Poch等人，1989 EMBO J 8:3867-74; Poch等人，1990 】.〇611· Virol 71: 1 153-62)。以破折號表示間隙，且句點代表相對於 MPV，相同胺基酸殘基的位置。使用的縮寫如下：hPIV-3 : 人類副流感病毒第3型；SV :仙臺病毒（Sendai virus); hPIV-2 :人類副流感病毒第2型；NDV :新城雞瘟病毒； MV :麻療病毒；nipah :百立（Nipah)病毒。
圖14:肺病毒屬之成員和病毒分離株〇〇-1(A1)之N、F、 Μ和P ORF-s的系統發生分析。在得自下列基因的病毒序列 上，進行系統發生分析：F(方格A)、Ν(方格Β)、Μ(方格C)， 和Ρ(方格D)。系統發生樹狀圖是以最大蓋氏分析為基礎， 使用100次靴環法和3組亂數。刻度代表每個樹狀圖顯示之 核站酸改變的數目。 圖15 : MPV和所選出之副黏液病毒的Μ2-1和L ORFs的系 統發生分析。將M2-1 ORF與肺病毒亞科（A)之其他成員的 Ml 1 ORFs排成一直線，並將L ORF與肺病毒屬之成員，以 及所選出之其他副黏液病毒的L ORFs排成一直線，按照在 圖13之說明中的描述。藉著最大蓋氏分析產生系統發生樹 -224- 1344991 mm (219) 狀圖，使用100次靴環法和3组亂數。刻度代表每個樹狀圖 顯示之核甞酸改變的數目。樹狀圖上的數目代表以一致之 樹狀圖為基礎的靴環值。
圖16 :九個帶有APV-C之原始MPV分離株的一部分F(方 格A)、N(方格B)、Μ(方格C)20和L(方格D)ORFs的系統發生 關係，其在遺傳上是密切相關的。系統發生樹狀圖是以最 大蓋氏分析為基礎。刻度代表每個樹狀圖顯示之核穿酸改 變的數目。APV-C之登錄編號：方格A : D00850 ;方格B : U39295 ;方格 C : X58639 ;和方格 D : U65312。 圖17 :所有四個變種，變種Al、A2、B1或B2之hMPV的 不同分離株之F基因的排列。 圖18 :所有四個變種，變種Al、A2、B1或B2之hMPV的 不同分離株之F蛋白質的排列》 圖19 :所有四個變種，變種Al、A2、B1或B2i hMPV的 不同分離株之G基因的排列。
圖20 :所有四個變種，變種Al、A2、B1或B2i hMPV的 不同分離株之G蛋白質的排列》 圖21 :以F基因序列為基礎的系統發生樹狀圖，顯示帶 有個別變種之hMPV的不同hMPV分離株的系統發生關係。 圖22 :以G基因序列為基礎的系統發生樹狀圖，顯示帶 有在圖13中所示之個別變種之hMPV的不同hMPV分離株的 系統發生關係。 圖23 : hMPV分離株00-1( A1)在Vero細胞中的生長曲線β 以0.1之ΜΟΙ感染Vero細胞。 -225 - 1344991
(220) 圖24 : CAT-hMPV迷你複製子構築體的序列。在序列下方 指出由該序列之斷片編碼的功能。 ' 圖25 :從CAT-hMPV迷你複製子中表現CAT。在X-軸指出 用來轉移感染的不同構築體；在y-軸指出CAT的表現量。 圖片顯示在感染後24小時的CAT表現，以及在感染後48小 時的CAT表現。標準物為CAT蛋白質之稀釋物。
圖26 :前導和拖尾序列的比較：按照指示顯示不同變種 之前導和拖尾序列的排列。 圖27 : hMPV基因组分析：顯示hMPV基因組序列之PCR 片段，與hMPV基因組之組織化有關。在代表PCR片段的直 柱下方，顯示突變的位置。 圖28 : hMPV分離株00-1(Α1)和hMPV分離株99-1(Β1)的限 制舆圖。在顯示hMPV之基因组组織化的圖式下方，指出 個別分離株中的限制位置。在圖式上方的刻度代表在 hMPV基因組中的位置，按kb計。
圖29A和29B : hMPV cDNA的裝配。圖式上方顯示hMPV的 基因組組織化，下方的長條拄代表裝配產生編碼該病毒之 全長cDNA的RCR片段（參見圖27) »在長條柱上方的號碼， 代表PCR片段，指出在病毒基因組中的位置，按鹼基對計。 圖30 :得自MPV分離株00- 1(A1)之基因組3'端的核甞酸和 胺基酸序列資訊《提供ORFs。N :核蛋白的ORF ; P :磷蛋 白的ORF ; Μ ··基質蛋白質的ORF ; F :融合蛋白質的ORF ; GE :基因末端；GS :基因起點。 圖31八和6:得自在“？乂分離株00-1(八1)之聚合酶基因（1〇 -226- 1344991 (221) 中獲得之.片段的核甞酸和胺基酸序列資訊。在L中的片段 定位，是以與APV-A(登錄編號U653 12)之奎白質同種性為 基礎。轉譯片段8(圖31A)係位在APV-A L ORF之胺基酸第8 至243號，而一致的片段9和10(圖3 1B)係位在胺基酸第1358 至1464號。 圖 32:對 12隻接種 ned/00/01(Al)及 /或 ned/99/01(Bl)之天竺 鼠的咽喉和鼻抹拭物之RT-PCR測定的結果。
圖 33A:以 ned/00/01(Al)感染，並以 ned/00/01(Al)(GP4、5 和6)，或ned/99/0.1(Bl)(GPl和3)再度-感染的天竺鼠，對抗 ned/00/01(Al)和 ned/99/01(Bl)的 IgG反應。 圖 33B :以 ned/99/Ol感染，並以 ned/00/01(Al)(GP，s8和 9)， 或以ned/99/01(Bl)(GP'sl0、11和12)再度-感染的天竺鼠，對 抗 ned/00/01(Al)和 ned/99/01(Bl)的 IgG反應。 圖 34 : ned/00/01(Al)和 ned/99/01(Bl)ELISA，對取自以 ned/00/01(Al)或ned/99/01(Bl)感染之天竺鼠的血清的專一 性。
圖 35 :對抗 ned/00/01(Al)和 ned/99/01(Bl)ELISA之 3 同種 (00-1/00-1) 、 2同種（99-1/99-1) 、 2異種（99-1/00-1)和 2異種 (00-1/99-1)感染之天竺鼠的平均IgG反應。 圖36 ·· hMPV感染天竺鼠之APV抑制作用的平均百分比。 圖37: ned/00/01(Al)和ned/99/01(Bl)感染之天竺鼠，對抗 ned/00/01(Al)、ned/99/01(Bl)和 APV-C的病毒中和力價。 圖38 :以ned/00/01(Al)接種（兩次）之獼猴的咽喉抹拭物 之RT-PCR測定的結果。 -227- 1344991
(222) 圖39A(上方兩格）：以ned/00/01(Al)(再度）感染之2隻獼 猴，對抗 ned/00/01(Al)之 IgA、IgM 和 IgG反應。 · 圖39B(下方的方格）：以ned/00/01(Al)感染之2隻獼猴， 對抗APV之IgG反應。 圖40 :比較在人類血清中，使用hMPV ELISA和APV抑制 ELISA來檢測IgG抗體。
圖41 :比較兩種原型的hMPV分離株，與APV-A和APV-C ; 編碼各種病毒蛋白質之核酸的DNA類似性矩陣。 圖42 :比較兩種原型的hMPV分離株，與APV-A和APV-C ; 各種病毒蛋白質的蛋白質類似性矩陣。 圖43 :兩種原型hMPV分離株之核蛋白的胺基酸排列。 圖44 :兩種原型hMPV分離株之磷蛋白的胺基酸排列。 圖45 :兩種原型hMPV分離株之基質蛋白質的胺基酸排 列。 圖46 :.兩種原型hMPV分離株之融合蛋白質的胺基酸排 列。
圖47 :兩種原型hMPV分離株之Μ2· 1蛋白質的胺基酸排 列0 圖48 :兩種原型hMPV分離株之M2-2蛋白質的胺基酸排 列。 圖49 :兩種原型hMPV分離株之短忌水性蛋白質的胺基 酸排列。 圖50 :兩種原型hMPV分離株之附接糖蛋白的胺基酸排 列。 -228 - 1344991
(223) 圖5 1:兩.種原型hMPV分離株之聚合酶蛋白質之N-終端的 胺基酸排列。 —
圖52 : hMPV分離株00- 1(A1)的非密碼序列。（A)以正義顯 示在ORFs之間，和在基因組終端的非密碼序列。從左至 右，顯示指定之ORFs之中止密碼子，接著是非密碼序列， 指定之後續ORFs的開始信號和開始密碼子。號碼表示在 hMPV舆圖中開始和中止密碼子的第一個位置。將對公開 之基因末端信號展現出類似性的序列加下標線，並以在序 列上方的線'，表示對UAAAAAU/A/C展現出類似性的序列。 (B)hMPV之基因組終端的核甞酸序列。將hMPV之基因組終 端彼此排成一直線，並與APV的那些排成一直線。加下標 線的區域代表在RT-PCR測定中使用的引子序列，其係以 APV和RSV的3'和5’末端序列為基礎。粗斜體的核甞酸為N 基因之基因開始信號的一部分。Le :前導，Tr :拖尾。
圖53 : hMPV分離株00-1(Α1)與hMPV分離株99-1(Β1)之基 因組序列的序列比較。 圖54 ;使用聚腺苷酸化作用和3'RACE法的組合，判定人 類間質肺病毒（hMPV)NL/l/00(Al)基因組RNA的前導序列。 圖55 :直接對PCR產物，以及對PCR純種系兩者的定序分 析，指出hMPV之前導區，在前導序列中最靠近3’端的20 個核甞酸，係由5, ACG CGA AAA AAA CGC GTA TA所組成（以 正義cDNA方位表示）。將兩個新近確認的核苷酸加下標 線。 -229-

Claims (1)

1344991 第092103641號專利申請案 中文申請專利範圍替月 I |
-：! I - - ·. . J · 拾、申請專利旄圍 • -· ··'··' · · . · • ·. 該病毒 1· 一種經過分離的反義單股RNA間質肺病毒，其中 之基因組包括序列識別21號之核芸酸序列。 2· —種經過分離的核酸，其中該核酸且女 有與序列識別21 號至少9〇%相同的核：y：酸序列，其中該 °x列同—性係 序列識別21號的完整長度判定。 3. 下列的蛋 一種經過分離的核酸，其中該核醆蝙碼包括 白質： (i) 與哺乳動物MPV變種B2之G蛋白皙, 買（序列識別325 至少95%相同的胺基酸序列； ; (ii) 與哺乳動物MPV變種B2之N蛋白質 列識別369號、 至少97%相同的胺基酸序列； ' > (iii) 與哺乳動物MPV變種Β2之Ρ蛋白暂广由， 貝（序列識別377 至少96%相同的胺基酸序列； 、 (iv) 與哺乳動物MPV變種B2之Μ蛋白柄 貝（序列識別361 號）相同的胺基酸序列； (ν)與哺乳動物MPV變種Β2之F蛋白皙r & 號 曰買（序列識別317 至少99%相同的胺基酸序列； (vi) 與哺乳動物MPV變種Β2之Μ2-1蛋& 0 貝（序列識別 341號）至少98%相同的胺基酸序列； (vii) 與哺乳動物MPV變種B2之M2-2蛋白# 貝（序列識別 349號）至少99%相同的胺基酸序列； (viii) 與哺乳動物MPV變種B2之SH蛋白皙,由, 貝（斤列識別38ί 83861-990331.doc 1344991
號）至少95%相同的胺基酸序列；或 (ix)與哺乳動物MPV變種B2之L蛋白質（序列識別333號） 至少99%相同的胺基酸序列。 4. 一種經過分離的核酸，其中該核酸在高嚴格度的條件 下’專一地與根據申請專利範圍第3項之核酸雜交。
5. 根據申請專利範圍第4項之經過分離的核酸，其中該高 嚴格度的條件，包括在65°C下，在由6又88(：、5〇111]^丁1^-HCl(pH=7.5)、1 mM EDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA 和100微克/毫升之變性鮭精蛋白所組成的緩衝溶液中 雜交48小時，在37°c下，以由2X SSC、0.01%PVP ' 0.01%Ficoll和〇.〇l%BSA所組成的緩衝溶液沖洗45分鐘， 並在50°C下，以由0.1X SSC所組成的緩衝溶液沖洗45分 鐘0 6. —種在試樣中檢測變種B2哺乳動物MPV的方法，其中該 方法包括使該試樣與根據申請專利範圍第3項之核酸 接觸6 7. —種經過分離的蛋白質’其中該蛋白質包括： (i)與哺乳動物MPV變種B2之G蛋白質（序列識別325號） 至少95%相同的胺基酸序列； (Π)與哺乳動物MPV變種B2之N蛋白質（序列識別369號） 至少97%相同的胺基酸序列； (iii)與哺乳動物MPV變種B2之P蛋白質（序列識別377號） 至少96%相同的胺基酸序列； (lv)與哺乳動物MPV變種B2之Μ蛋白質（序列識別361 83861-990331.doc -2- 1344991
號）相同的胺基酸序列； (V)與哺乳動物MPV變種B2之F蛋白質（序列識別317號） 至少99%相同的胺基酸序列； 〇i)與哺乳動物MPV變種B2之M2-1蛋白質（序列識別 341號）至少98%相同的胺基酸序列； (vii) 與哺乳動物MPV變種B2之Μ2·2蛋白質（序列識別 349號）至少99%相同的胺基酸序列； (viii) 與哺乳動物MPV變種Β2之SH蛋白質（序列識別385 號）至少95%相同的胺基酸序列；或 (ix) 與哺乳動物MPV變種B2之L蛋白質（序列識別333號） 至少99%相同的胺基酸序列。 8. —種抗體，其中該抗體專一地與由下列組成蛋白質結 合： (i) 與哺乳動物MPV變種B2之G蛋白質（序列識別325號） 至少95%相同的胺基酸序列； (ii) 與哺乳動物MPV變種B2之N蛋白質（序列識別369號） 至少9 7 %相同的胺基酸序列； (iii) 與哺乳動物MPV變種B2之P蛋白質（序列識別377號） 至少96%相同的胺基酸序列； (iv) 與哺乳動物MPV變種B2之Μ蛋白質（序列識別361 號）相同的胺基酸序列； (ν)與哺乳動物MPV變種Β2之F蛋白質（序列識別317號） 至少99%相同的胺基酸序列； (vi)與哺乳動物MPV變種Β2之Μ2-1蛋白質（序列識別 83861-990331.doc 1344991
341號）至少98%相同的胺基酸序列； (vii) 與哺乳動物MPV變種B2之M2-2蛋白質（序列識別 349號）至少99%相同的胺基酸序列； (viii) 與哺乳動物MPV變種B2之SH蛋白質（序歹|J識別385 號）至少95%相同的胺基酸序列；或 (ix) 與哺乳動物MPV變種B2之L蛋白質（序列識別333號） 至少99%相同的胺基酸序列。
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