TWI356848B - Recombinant parainflulenza virus expression system - Google Patents

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TWI356848B
TWI356848B TW098137418A TW98137418A TWI356848B TW I356848 B TWI356848 B TW I356848B TW 098137418 A TW098137418 A TW 098137418A TW 98137418 A TW98137418 A TW 98137418A TW I356848 B TWI356848 B TW I356848B
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Aurelia Haller
Roderick Tang
Ronaldus Adrianus Maria Fouchier
Bernadetta Gerarda Van Den Hoogen
Albertus Dominicus Marcellinus Erasmus Osterhaus
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Medimmune Vaccines Inc
Vironovative Bv
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Description

1356848 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於重組的副流感病毒（PIV) cDNA或RNA，其 可用來在適當的宿主細胞系統中表現異源基因產物，並/ 或解救表現、包裝及/或提交異源基因產物的負股RNA重 組病毒。特定而言，本發明包括疫苗製品，其包括表現異 源基因產物的嵌合型pIV ’其中該異源基因產物最好是抗 原肽或多肽。在一個具體實施例中，本發明之ριν載體表 現一、二或三個異源基因產物，其可由相同或不同的病毒 ’·扁碼。在較佳的具體實施例中’該異源序列編碼異源基因 產物，其為得自其他pIV物種，或得自其他負股RNA病毒 的抗原多肽，包括但不限於流感病毒、呼吸道融合細胞病 ’（RSV)甫乳動物間質肺病毒和禽肺病毒。本發明之疫 苗製品包括多價疫苗，包括二價和三價的疫苗製品。可以 一個表現每個異源抗原序列的;pIV載體，或二或多個分別 編碼不同的異源抗原序列的PIV載體之形式，投予本發明 之多價疫苗。可單獨或與其他疫苗、預防劑或治療劑一起鲁 投予本發明之疫苗製品。 【先前技術】 副流感病毒的感染，在嬰幼兒和兒童導致嚴重的呼吸道 疾病（Tao等人，1999, Vaccine 17:1100-08)。傳染性副流感 病毒的感染，佔全世界所有因為呼吸道感染而住院之小兒 科患者的大約20%。同上。對於治療ριν相關之疾病，沒 有可利用的有效抗病毒治療，亦尚未核准預防ριν感染的 144243.doc 1356848 疫苗。 PIV是副黏液病毒科（paramyxoviridae)之呼吸道病毒 (respirovirus)(PIVl、PIV3)或路伯拉病毒（rubulavirus) (PIV2、PIV4)屬的成員。PIV由兩個結構功能域（module)構 成：（1)内部的核糖核蛋白核心或殼包核酸，含有病毒的基 因組和（2)外部粗略為球狀的脂蛋白被膜。其基因組由單股 的反義RNA所組成，長度約為15,456個核苷酸，編碼至少8 個多肽。這些蛋白質包括殼包核酸的結構蛋白質（視屬而 為NP、NC或N)、磷蛋白（P)、基質蛋白質（M)、融合糖蛋 白（F)、血球凝集素-神經胺糖酸苷酶糖蛋白（HN)、大聚合 酶蛋白質（L)以及未知功能的C和D蛋白質。同上。 副流感殼包核酸蛋白質（NP、NC或N)，在每個蛋白質單 元内，含有兩個功能部位。這些功能部位包括：胺基-終 端的功能部位，其幾乎包括分子的三分之二，並直接與 RNA產生交互作用，以及羧基-終端功能部位，其位在裝 配好之殼包核酸的表面上。認為在這兩個功能部位的接合 處存有絞鏈，藉此給與該蛋白質一些彈性（參見Fields等人 (編輯），1991，FUNDAMENTAL VIROLOGY，第 2版，Raven Press, New York,將其全文以引用的方式併入本文中）。基 質蛋白質（M)顯然涉及病毒的裝配，且其與病毒膜和殼包 核酸蛋白質兩者產生交互作用。磷蛋白（P)經歷磷酸化作 用，並已經涉及轉錄調節作用、甲基化作用、磷酸化作用 和聚腺苷酸化作用。融合糖蛋白（F) —開始以無活性前驅 物的形式產生，在轉譯時將其切開，產生兩個二硫連接的 144243.doc 1356848 多肽。有活性的F蛋白質與病毒膜產生交互作用，在那裏 它藉著促進病毒被膜與宿主細胞漿膜的融合，而使副流感 病毒粒子更容易貫穿進入宿主細胞内。同上。糖蛋白，血 球凝集素-神經胺糖酸苷酶（HN)從被膜中伸出，並給與病 毒血球凝集素和神經胺糖酸甞酶活性。HN具有強忌水性 的胺基終端，其功能為將HN蛋白質固定在脂雙層内。同 上。最後，大聚合酶蛋白質（L)在轉錄和複製作用兩者中， 扮演重要的角色。同上。 牛流感病毒是在1959年，首先從顯示運輸熱症狀的小牛 中分離出。從那時起，已經從正常的牛、流產胎兒和顯露 呼吸疾病症狀的牛中分離出該病毒（Breker-Klassen等人， 1996，Can. J. Vet. Res. 60:228-236。亦參見 Shibuta, 1977, Microbiol. Immunol. 23(7)，617-628)。人類和牛PIV3共享中 和抗原決定位，但顯示出不同的抗原特性。在人類和牛病 毒品系之間，在HN蛋白質中存有顯著的差異。事實上， 牛品系對hPIV感染誘導一些中和抗體，而人類品系似乎對 人類PIV3誘導更大範圍的中和抗體（Van Wyke Coelingh等 人，1990, J. Virol. 64:3833-3843)。 所有負股RNA，包括PIV的複製，均由於缺少複製RNA 所需之細胞結構，而變得很複雜。此外，必須在發生轉譯 之前，將負股的基因组轉錄成正股（mRNA)副本。因此， 在進入細胞内時，單獨的基因組RNA不能合成所需的 RNA-依賴性RNA聚合酶。L、P和N蛋白質必須與基因組 RNA —起進入宿主細胞。 144243.doc 1356848 假設大多數或全部的病毒蛋白質，轉錄PIV mRNA亦進 行基因組的複製。尚未清楚地確認調節蛋白質之相同補體 另一種用途（即轉錄或複製作用）的機制，但該過程顯然涉 及增強一或多種殼包核酸蛋白質的自由形式。在病毒貫穿 之後，就藉由L蛋白質，使用在殼包核酸中的反義RNA作 為模板，開始轉錄作用。調節病毒的RNA合成，使得它在 轉錄期間，產生單順反子的mRNAs。 在轉錄之後，在被負股RNA病毒感染時，病毒基因組的 複製是第二個必要事件。像其他的負股RNA病毒一樣，在 PIV中，由病毒特有的蛋白質調解病毒基因組複製。複製 RNA合成的第一個產物是PIV基因組RNA的互補副本 (cRNA)(即正-極性）。這些正-股副本（反-基因組），在其終 端的結構上，是與正-股mRNA轉錄本不同的。不像mRNA 轉錄本，反-基因組cRNAs在5'端未被加帽或甲基化，且它 們在3'端沒有被截短也沒有被聚腺苷酸化。cRNAs與其負 股模板是同終端的，並以互補的形式含有所有的遺傳資 訊。cRNAs係擔任合成PIV負股病毒基因組（vRNAs)的模 板。 藉著殼包核酸將bPIV負股基因組（vRNAs)和反基因組 (cRNAs)殼體化；只有未殼體化的RNA物種是病毒的 mRNAs。bPIV RNA的複製和轉錄發生在宿主細胞的細胞 質中。病毒組份的裝配似乎發生在宿主細胞漿膜，在那裏 藉著出芽釋放成熟的病毒。 2.1.禽肺病毒 [S ] 144243.doc 1356848 在1970年代末期，首先在南美描述了由禽肺病毒（APV) 引起的呼吸道疾病（Buys等人，1980, Turkey 28:36-46)，在 那裏它成為毁滅火雞工廠的原因。該疾病在火雞中的症 狀，包括竇炎和鼻炎。將該疾病稱為火雞鼻氣管炎 (TRT)。亦已經強烈地暗示，APV的歐洲分離株為雞的頭 腫徵候群（SHS)的原因（O'Brien，1985，Vet· Rec· 117:619-620)。最初，該疾病出現在已感染新城雞痕病毒（NDV)的 肉雞群中，並以為是與新城雞瘟（ND)有關的二級問題。在 SHS發生後，在被感染的雞中檢測到對抗歐洲APV的抗體 _ (Cook等人，1988, Avian Pathol. 17:403-410)，因此暗示 APV 為致病原。 禽肺病毒是單股、非-片斷的RNA病毒，屬於副黏液病 毒科的肺病毒亞科（Pneumovirinae)，間質肺病毒屬 (Cavanagh和 Barrett, 1988, Virus Res. 11:241-256; Ling等人， 1992，J. Gen. Virol. 73:1709-1715; Yu等人，1992，J. Gen.
Virol. 73:1355-1363)。將副黏液病毒科分成兩個亞-科：副 黏液病毒亞科和肺病毒亞科。副黏液病毒亞科包括：副黏 ® 液病毒屬、路伯拉病毒屬和摩比利病毒（Morbillivirus)屬。 最近，按基因順序和序列同種性，將肺病毒亞科分成兩 屬，即肺病毒和間質肺病毒（Naylor等人，1998，J. Gen-Virol.， 79: 1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159)。肺病毒屬包括人類呼吸道融合細胞病毒（HRSV)、 牛呼吸道融合細胞病毒（BRSV)、羊呼吸道融合細胞病毒和 老鼠肺病毒。間質肺病毒包括歐洲禽肺病毒（A和B亞群）， 144243.doc IS1 1356848 其與肺病毒屬的典型物種HRSV有別（Naylor等人，1998，J. Gen. Virol., 79: Π93-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159) ° APV的美國分離株代表在間質肺病毒屬中 的第三個亞群（C亞群），因為已經發現它在抗原性上和遺 傳上’與歐洲分離株不同（Seal, 1998, Virus Res. 58:45-52; Senne 等人，1998,在 Pr〇c 第 47 次 WPDC, California,第 67-68頁中）》 負染色APV的電子顯微鏡檢查，顯示多晶的，有時球狀 的病毒粒子’直徑範圍從8〇至200毫微米，具有長度範圍 從 1000至 2000毫微米的長絲（c〇llins和Gough, 1988，J. Gen. Virol· 69:909-916)。被膜則由鑲有長度從13至15毫微米之 釘子的膜構成。殼包核酸是螺旋狀的，直徑為14毫微米， 尚度為7¾微米。殼包核酸的直徑比來自副黏液病毒和摩 比利病毒之病毒的殼包核酸之直徑更小，後者的直徑通常 為18毫微米。 禽肺病毒感染，在美國是正在發生的疾病，不管在家禽 中’它的全世界發生已持續數年。在1996年5月，在科羅 拉多州出現火雞的高度傳染性呼吸道疾病，接著在Ames, Iowa 的國家獸醫服務實驗室（National Veterinary Services Laboratory (NVSL))中分離出 APV (Senne 等人，1997, Proc. 第134次Ann. Mtg., AVMA，第190頁）。在此之前，已經認 為美國和加拿大是沒有禽肺病毒的（Pearson等人，1993，在 Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and 144243.doc 1356848
Control, ^ 78-83 1 t ； Hecker^ Myers, 1993, Vet Rec 1科在辦早期，在明尼蘇達州，以血清二 工在火料檢測到APV。在那時，進行第—次證明診斷， 而APV感染亦已經散播 的臨^、 與該呼吸道疾病有關 二;正狀’包括.多泡沫的眼睛、鼻分泌物和竇腫脹。 猎由二次感染使其惡化’而被感染鳥類的發病率已高達 二〇%。死亡率範圍從以㈣，而最高的是週齡的 禽類® 禽肺病毒是藉著接觸傳播。鼻分泌物、被感染鳥類的移 動、被污㈣水、被污㈣環境、被污染的飼料卡車和裝 e 出的活動’都有助於病毒的散播。認為恢復的火雞 疋帶原者。因為顯示病毒感染產卵火雞的輸卵管上皮，並 因為已經在小烏中檢測到濟’亦猜測即是傳播的方式。 2.2.人類間質肺病毒 大部分的人類呼吸道疾病是由病毒亞科副黏液病毒亞科 和肺病毒亞科所⑽的，對於賦與保護、對抗各種導致呼 吸道感染之病毒的有效疫苗將仍有需求。 不應將在本文t引述或討論的參考文獻解釋為承認這類 參考文獻為本發明的先前技術。 【發明内容】 本發明係關於重組的副流感病毒cDNA和rna，可將其 加以設計，以便表現異源的或非·天然的基因產物，特定 而έ ’表現抗原多肽和肽。在—個具體實施例中，本發明 係關於設計重組的牛或人_流感病#，其表現異^ 144243.doc 10 1356848 原’或異源抗原之免疫原及/或抗原片段。在特定的具體 實施例中’該異源基因產物是得自其他PIv物種或其他負 股RNA病毒的抗原多肽。在本發明的另一個具體實施例 中，異源基因產物是非_天然的ριν基因產物，包括由突變 之PIV核苷酸序列編碼的那些。特定而言，本發明係關於 重組的堪薩斯（Kansas)_品系的牛副流感第3型病毒，將其 设計成表現編碼相同物的異源序列，以及cDNA和RNA分 子。本發明亦關於重組的ριν，其含有修改，結果產生嵌 合型病毒，具有更適合用來作為疫苗調配物的表現型，以 及含有異源基因或異源基因之片段的重組ριν，包括其他 PIV物種、其他病毒、病原、細胞基因、腫瘤抗原等等的 基因。 本發明首次提供調配成疫苗的嵌合型ριν，它能夠賦與 對抗各種病毒感染的保護。在特定的具體實施例中，本發 明提供能夠賦與對抗呼吸道融合細胞病毒感染之保護的疫 田。本發明首次提供了能夠賦與在哺乳動物宿主中，對抗 間質肺病毒感染之保護的疫苗。 根據本發明，重組的病毒係衍生自牛副流感病毒或人類 副流感病毒，其由内源或天然的基因組序列，或非-天然 的基因組序列編碼。根據本發明，非-天然序列是因為一 或多個突變，包括但不限於點突變、重排、插入、刪除等 等而與天然或内源的基因組序列不同的序列，對基因組 序列而言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。 根據本發明，本發明之嵌合型病毒是重組的卯…或 144243.doc Ϊ356848 hPIV ’其更包括一或多個異源的核苷酸序列。根據本發 明，該嵌合型病毒可由其中已經將異源核苷酸序列加至基 因組内的核苷酸序列，或其中已經利用異源核荅酸序列置 換的核苷酸序列編碼。 本發明亦關於設計重組的副流感病毒和病毒載體，其編 碼異源序列的組合，該異源序列所編碼之基因產物，包括 但不限於得自不同品系之PIV、流感病毒、呼吸道融合細 胞病毒、哺乳動物間質肺病毒（例如人類間質肺病毒）、禽 肺病毋、其他病毒、病原的基因、細胞基因、腫瘤抗原或 其組合。此外’本發明係關於設計重組的副流感病毒，其 含有與衍生自呼吸道融合細胞病毒之核苷酸序列組合的衍 生自間質肺病毒之核甞酸序列，並進一步與衍生自人類副 流感病毒之核苷酸序列組合。本發明亦包括重組的副流感 載體和病毒，設計使其編碼得自副流感病毒之不同物種和 品系的基因’包括人類PIV3的F和HN基因。 在一個具體實施例令，設計本發明之PIV載體，以便表 現或多個異源序列，其中該異源序列所編碼之基因產 物’最好是抗原之基因產物。在較佳的具體實施例中，本 發明之PIV載體表現一、二或三個異源序列，其編碼抗原 多肢和肽。在某些具體實施例中’該異源序列係衍生自相 同的病甘或不同的病毒。在較佳的具體實施例中，該異源 序列編碼異源基因產物，其為得自其他PIV物種，像是人 類PIV、PIV之突變品系，或得自其他負股rna病毒，包括 但不限於流感病毒、呼吸道融合細胞病毒（RSV)、哺乳動 144243.doc IS1 -12- 1356848
物間質肺病毒（例如人類間f肺病毒（hMpv))和禽肺病毒的 抗原多肽。在-個具體實施例巾，該異源序列料異源基 因產物的免疫原及/或抗原片段。在較佳的具體實施例 中’該重組的PIV為牛PIV第3型或減毒的人類ριν第3型。 在一個具體實施财，刪除編仙合帳自#、血球凝 集素⑽)糖蛋白或PIV基因組之其他非_必要基因的序列， 並藉著異源抗原序餘代之。在另—個具體實施例中，除 了異源核芬酸序列之外’還有含有突變或修改的ριν基因 ^ ’結果產生具有更適合在疫苗調配物中使用之表現型的 嵌合型病毒’例如減毒的表現型或具有增強抗原性的表現 在特疋的具體實施例中，待插入ριν基因組内的異源核 接酸序列，係衍生自編W蛋白f、G蛋白質或冊蛋白質 的核苷酸序列。在某些具體實施例中，待插入之核甞酸序 列編碼嵌合型F蛋白質、嵌合㈣蛋白質或嵌合型蛋白
質。在特定的具體實施例中，F蛋白f包括間質肺病毒之F 蛋白質的外功能部位（⑽。d_in)、副流感病毒之f蛋白質 的穿透臈功能部位和副流感病毒之F蛋白質的魯米那功能
15 <在某t具體Λ施例中’待插人之核誓酸序列編碼F 蛋白質’纟中删除該F蛋白質之穿透膜功能部位，而得以 表現可溶的F蛋白質。 在其他敎的具體實施例中，本發明提供包括ριν基因 組的嵌合型病#，該PIV基因組包括衍生自間質肺病毒的 異源核嘗酸序列。在特定的具體實施例中，該ριν病毒是 144243.doc -13· 1356848 堪薩斯-品系的牛副流感第3型病毒。在其他的具體實施例 中，該PIV病毒是具有減毒之表現型的人類副流感病毒。 在其他的具體實施例中，本發明提供嵌合型牛副流感病毒 第3型/人類副流感病毒，設計使其在牛副流感主鏈中，含 有人類曰1]流感病毒F和HN基因。該嵌合型病毒可進一步包 括衍生自間質肺病毒的異源核苷酸序列，及/或進一步包 括衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源核站酸序列。 在某些具體實施例中，本發明之病毒包括衍生自間質肺 病毒之至少兩個不同基因的異源核甞酸序列。在特定的具 體實施例中’該異源序列係衍生自間質肺病毒，例如禽肺 病毒和人類間質肺病毒。更特定而言，該異源序列係衍生 自禽肺病毒，包括禽肺病毒八型、禽肺病毒B型和禽肺病 毒C型。 本發明亦提供包括表現一或多個異源抗原序列之嵌合型 PIV的疫苗製品和免疫原組合物。在特定的具體實施例 中’本發明提供多價疫苗，包括二價和三價的疫苗。本發 明之多價疫苗可以一個表現每個異源抗原序列的PIV載 體，或以二或多個分別編碼不同異源抗原序列的plv載體 之开y式4又予。在一個具體實施例中，本發明之疫苗製品包 括嵌合型PIV，表現-、二或三個異源多肤，其中該異源 多肽可由衍生自相同病#的—個品系、相同病毒的不同品 系’或不同病毒的序列編碼。該異源抗原序列最好是衍生 自負股RNA病毒’包括但不限於流感病毒、副流感病毒、 呼吸道融合細胞病毒（RSV)、哺乳動物間質肺病毒（例如人 144243.doc Ζ質肺病毒（hMPV))和禽肺病毒（Αρν)β該異源抗原序 匕括，但不限於編碼人類副流感病毒F或ΗΝ蛋、 麟之F蛋白質、流感病毒Α、_型的ΗΑ蛋白質以及人 類MPV和禽肺病毒之F蛋白質的序列。更佳的是本發明 之疫苗製品包括減毒的嵌合型病毒，其為可存活並有傳染 性的。在較佳的具體實施例中，重组的爪為牛_型 或人類PIV的減毒品系。 主 〃體實轭例中’疫苗製品包括本發明之嵌合型病 '，其中已經取代或刪除PIV基因組之F、HN或一些其他 非:要的基因。在較佳的具體實施例中，藉著設計在想要 之伤，中，具有減毒表現型的ριν品系，來製備本發明之 疫=製品。在其他較佳的具體實施例中，藉著設計ριν的 減毒品系，來製備本發明之疫苗製品。 在另一個具體實施例中，將異源核芬酸序列加至完整的 基口、且中。在某些具體實施例中，設計PIV基因組，以 便在位置1、2、3、4、5或6處，插人該異源序列，而得以 :毒基因、.且的第i、2、3、4、5或6個基因，來表現該異源 ^ 在特夂的具體實施例中，在病毒基因組的位置1、2 或3處插入異源序列。在某些具體實施例中，將在被插入 之異源基因的密碼序列末端，與下游基因之密碼序列的起 點之間的基因間區域’變更為想要的長度，結果提高了該 異源序列的表現，或促進該嵌合型病毒的生長。或者，將 基因間區域變更為想要的長度，有可能改變該異源序列的 表現，或重組的或嵌合型病毒，例如減毒之表現型的生 [ 144243.doc 1356848 長。在一些具體實施例中，設計插入的位置和位在該異源 核甘1序列側面之基因間區域的長度兩者，以便選擇具有 想要程度之異源序列表現，和想要之病毒生長特徵的重組 或嵌合型病毒。 在某些具體貫施例中，本發明提供包括本發明之重組或 嵌合型病毒，以及在醫藥上可接受之賦形劑的疫苗調配 物。在特定的具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物， 來調節諸如人類、靈長類、馬、牛、錦羊 '豬山羊、 狗、貓、嗡齒動物之類的個體，或禽類個體的免疫反應。· 在f特定的具體實施例中’使用疫苗來調節人類嬰幼兒或 兒里的免疫反應。在其他的具體實施例中 獸醫用途的疫苗調配物。可單獨或與其他疫苗，或其他的 預防或治療劑’-起投予本發明之疫苗調配物。 3.1.慣例和縮寫 cDNA CPE L Μ F ΗΝ Ν、ΝΡ 或 NC Ρ ΜΟΙ 互補DNA 致細胞病變作用 大蛋白質 φ 基質蛋白質（被膜的線内） 融合糖蛋白 血球凝集素-神經胺糖酸苷酶糖蛋白 核蛋白（與RNA有關，並為聚合酶活性所 必需的） 磷蛋白 傳染的多重性 I44243.doc IS] 1356848
神經胺糖酸苷酶（被膜糖蛋白） 副流感病毒 牛副流感病毒 牛副流感病毒第3型 人類副流感病毒 人類副流感病毒第3型 重組的bPIV，具有hPIV序列 b/h PIV
b/h PIV3或 重組的bPIV第3型，具有hPIV第3型的序列 bPIV3/hPIV3 nt 核甞酸 RNP 核糖核蛋白
ΝΑ PIV bPIV bPIV3 hPIV hPIV3 bPIV/hPIV 或 rRNP vRNA cRNA hMPV APV 位置 重組的RNP 基因組病毒RNA 反基因組的病毒RNA 人類間質肺病毒 禽肺病毒 當設計任何病毒而使用位置時，意指欲轉 錄之病毒基因組的基因位置。例如，若基因 位在位置1，則它便是欲轉錄之病毒基因 組的第一個基因，若基因位在位置2，則 它便是欲轉錄之病毒基因組的第二個基 因。 bPIV3 ' b/h 基因組的核荅酸位置104，或者是欲轉錄 144243.doc 1356848 PIV3及其衍生之病毒基因組的第一個基因位置。 物的位置1 bPIV3 ' b/h PIV3及其衍 生物的位置2 bPIV3、b/h PIV3及其衍 生物的位置3 bPIV3 ' b/h PIV3及其衍 生物的位置4 基因組的核甞酸位置1774，或者是在天然副 流感病毒的第一和第二個開放編閱架構之 間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組的 第二個基因位置。 基因組的核苷酸位置3724，或者是在天然 副流感病毒的第二和第三個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第三個基因位置。 基因組的核苷酸位置5042，或者是在天然 副流感病毒的第三和第四個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組
的第四個基因位置。 bPIV3、b/h PIV3及其衍 生物的位置5 bPIV3 ' b/h PIV3及其衍 生物的位置6 基因組的核苷酸位置6790，或者是在天然 副流感病毒的第四和第五個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第五個基因位置。 基因組的核苷酸位置863 1，或者是在天然 副流感病毒的弟五和第六個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第六個基因位置。
【實施方式】 本發明係關於重組的副流感cDNA和RNA構築體，包括 144243.doc •18- IS 1 1356848 但不限於重組的牛和人類PIVcDNA和RNA構築體，其可 來表現異源或非-天然的序列。
根據本發明，重組的病毒是衍生自由内源或天然基因組 $列’或非天然基因組序列編碼之牛副流感病毒或人類 副流感病毒的病毒。根據本發明，非·天然的序列是因為 ::或多個突變，包括但不限於點突變、重排、插入 '刪除 等等，而與天然或内源之基因組序列不同的序列，對基因 組序列而言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。土 根據本發明，本發明之嵌合型病毒是重組的砂^或 贿，其進一步包括_或多個異源核芬酸序列。根據本發 明’該嵌合型病毒可由其中已經在基因組令加入異源核替 酸序列的核:y：酸序列’或其中已經利用異源核誓酸序列代 I之核甞酸序列來編碼。可使用這些重組的和嵌合型病 毋以及表現產物’作$適合投予人類或動物的疫苗。例 如’可在疫苗冑配物中使用本發明之彼合型病毒，賦與對
抗肺病毒、呼吸道融合細胞病毒、副流感病毒或流感病毒 感染的保護。 在-個具體實施例中，本發明係關於PIV eDNA和rna構 築體，其衍生自人類或牛PIV變種，並將其設計成表現 一、一或二個異源序列，最好是編碼外來抗原和得自各種 病原々胞基因、腫瘤抗原和病毒之其他產物的異源基 因。特定而§，該異源序列衍生自負股RNA病毒，包括但 不限於流感病毒、呼⑨道融合細胞病毒（RSV)、哺乳動物 間質肺病毒（例如人類間質肺病毒變種A1、A2、⑴和 144243.doc 1356848 B2)，以及禽肺病毒亞組A、B、C和D。在本發明其他的具 體實施例中，該異源序列是非-天然的PIV序列，包括突變 的HV序列。在一些具體實施例中’該異源序列係衍生自 相同，或衍生自不同的病毒。 在特定的具體貫施例中’本發明之病毒是重組的PIV， 包括衍生自人類間質肺病毒或禽肺病毒的異源核苷酸序 列。待插入PIV基因組内的異源序列，包括但不限於編碼 人類間質肺病毒A1、A2、B1或B2之F、G和HN基因的序 列’編碼禽肺病毒A、B或C型之F、G和HN基因的序列， 以及其免疫原及/或抗原片段。 在某些具體實施例中，將異源核站酸序列加至病毒基因 組内。在另外的具體實施例中，以異源核：y：酸序列交換内 源的核钻酸序列。可將異源核苷酸序列加至或插入PIV基 因組的各種位置’例如在位置1、2、3、4、5或6處。在較 佳的具體實施例中，在位置丨處加入或插入異源核苷酸序 列。在另一個較佳的具體實施例中，在位置2處加入或插 入異源核苷酸序列。在另一個較佳的具體實施例中，在位 置3處加入或插入異源核苷酸序列。在病毒之較低編號的 位置處插入或加入異源核苷酸序列，與在較高編號的位置 處插入相比較，產生較強的異源核钻酸序列表現。這是因 $跨越病毒基因組存在的轉錄梯度。然而，亦必須考量病 毋複製的效率。例如，在本發明之b/h ριν3嵌合型病毒 中在位置1處插入異源基因，在活體外延遲了複製動力 千，而在活體内亦達到較低的程度（參見第8節，實例3和 144243.doc m •20· 1356848 圖5 ’以及第26節，實例21)。因此，若需要異源核：y：酸序 列的強表現’則在較低編號的位置處插入異源核苷酸序 列’是本發明較佳的具體實施例。若需要異源序列的強表 現，最好是將異源序列插入b/h PIV3基因組的位置2處（參 見下文第4_ 1.2.節和第8節，實例3)。 在一些其他的具體實施例中，設計重組或嵌合型PIV基 因組’而得以改變在異源基因之密碼序列末端，和下游基 因之密碼序列起點之間的基因間區域。在另外一些其他的 具體貫施例甲，本發明之病毒包括重組或嵌合型piV基因 組’設計使其得以在選自由位置1、2、3、4、5和6所組成 之群的位置處插入異源核：y：酸序列，並改變在該異源核甞 酸序列與接下來的下游基因之間的基因間區域。可使用適 S的測定’判定最佳的插入方式（即插入那一個位置，以 及基因間區域的長度）’達到適當程度的基因表現，和病 毒生長特徵。關於細節，參見下文第4丨2.節。 在某些具體實施例中’本發明之嵌合型病毒含有兩個不 同的異源核苷酸序列。可在PIV基因組的各種位置，插入 不同的異源核苷酸序列。在較佳的具體實施例中，在位置 1處插入一個異源核苷酸序列’並在位置2或3處，加入或 插入另一個異源核苷酸序列。在本發明其他的具體實施例 中，將額外的異源核荅酸序列插入PIV基因組之較高編號 的位置處。根據本發明，異源序列的位置意指從病毒基因 組中轉澤序列的順序，例如在位置丨處的異源序列，是欲 從基因組中轉錄的第一個基因序列。 144243.doc •21 · 1356848 在本發明的某些具體實施例中，欲插入本發明病毒之基 组内的異源核I酸序列’係衍生自負股RNA病毒，包括 =限於流感病毒、副流感病毒、呼吸道融合細胞病毒、 "、物間貝肺病毒和禽肺病毒。在本發明的特定具體實 施例中，該異源核芬酸序列係衍生自人類間質肺病毒。在 另一個特定的具體實施例甲，該異源核菩酸序列係衍生自 禽肺病毒。更特定而言，本發明之異源核#酸序列，編碼 人，或禽間質肺病毒的F、〇或SH基因，或其一部分。在 —的八體κ轭例中，該異源核甞酸序列可以是序列識別 '序列識別5號、序列識別14號和序列識別1 5號（參見 表16)中的任一個。在某些特定的具體實施例中，該核苷 酉夂序列編碼序列識別6號至序列識別13號、序列識別贼 和序列識和號（參見表16)中任一個的蛋白質。在某些特 定的具體實施例中’該核錢序列編碼序列識別314至389 號中任一個的蛋白質。 在本發明特定的具體實施例中，本發明之異源核嘗酸序 列係衍生自Α型禽肺病毒。在本發明其他特定的具體實施 例中，本發明之異源核|酸序列係衍生自b型禽肺病毒。 在本發明其他特定的具體實施例中，本發明之異源核芬酸 序列係衍生自C型禽肺病毒發生分析顯示，a型和b 型彼此的相關十生，比它們對C型的更密切（Seal 2000
Animal Health Res·細· 1(1):67-72)。在歐洲發現八型和3 型，而C型則首先在美國發現。 在本發明另-個具體實施例中，該異源核菩酸序列編碼 144243.doc -22- 1356848 嵌合变多肽，其中外功能部位含有衍生自與從其中衍生载 體主鏈之PIV品系不同的病毒之抗原序列，以及衍生自 序列的穿透膜和魯米那功能部位。所得的嵌合型病毒，將 給與所選出之負股RNA病毒抗原性，並將具有減毒Z表現 蜇。 在本發明特定的具體實施例中，該異源核苷酸序列編碼 嵌合裂F蛋白質。特定而言，該嵌合型F蛋白質的外功能部 位是間質肺病毒的外功能部位，像是人類間質肺病毒或禽 • 肺病毒，而穿透膜功能部位和魯米那功能部位是副流感病 毒的穿透膜和魯米那功能部位，像是人類或牛副流咸病 毒。未與任何理論結合，嵌合型F蛋白質的插入，可進一 步在預定的宿主中將病毒減毒，但保留藉其外功能部位減 毒之F蛋白質的抗原性。 可在疫苗調配物中，使用本發明之嵌合型病毒，賦與對 抗各種感染的保護，包括但不限於肺病毒感染、呼吸道融 合細胞病t感染、副流感病毒感染、流感病毒感染或其組 合。本發明提供包括嵌合型ριν的疫苗製品，其表現一或 多個異源抗原序列，包括二價和三價的疫苗。可以一個辛 現每個異源抗原序列的PIV載體，或二或多個分別編碼不 同的異源抗原序列的PIV載體之形式，投予本發明之二價 和三價疫苗。該異源抗原序列最好是衍生自負股rna病 毒，包括但不限於流感病毒、副流感病毒、呼吸道融合細 胞病毒（RSV)、哺乳動物間質肺病毒（例如人類間質肺病 毒）和禽肺病毒。因此，可設計本發明之嵌合型病毒粒 •23 · 144243.doc ] 子，創造例如杬-人類流感疫 .#sl?QV;IiE抗-人類副流感疫苗、抗-人通RSV疫田和抗人類間質 口田证6扭沾主认 毋役田。本發明之疫苗製 〇口取好包括減毋的嵌合型病毒，盆 „ '、為可存活並有傳染力 的。可单獨或與其他疫苗，或盆 " 預防劑或治療劑一起投 予本發明之疫苗製品。 本發明亦關於病毒载體和嵌合型 ^•病毒’在調配對抗大範 圍病毒及/或抗原，包括睡逾PjgA — L栝腫瘤抗原之疫苗上的用途。可使 用本發明之病毒載體和嵌合却處表， 瓜Q型病毋，齬著刺激體液免疫反 應、細胞免疫反應，或藉荖刺渤料p 凡秸考刺激對抗原之耐受性，來調節 個體的免疫反應。當在本文中佬用拄 .Α ^ 个又Τ便用時，個體意指人類、靈 長類、馬、牛、綿羊、豬、山呈、并 ^ 狗、豸®、儒齒動物和禽 類的成員。在遞送腫瘤抗原時，可使用本發明來治療罹患 順從調解排斥之免疫反應的疾病，像是非·固體腫瘤，或 小尺寸之固體腫瘤的個體。亦企圖藉著在本文中描述的病 毒載體和嵌合型病毒，來遞送腫瘤抗原，這將可用於移除 大固體腫瘤之後的後續治療。亦可使用本發明來治療懷疑 患有癌症的個體。 為了解釋之目的’並非企圖加以限制，僅將本發明分成 下列的階段.（a)建構重組的cDNA和RNA模板；（b)使用重 組的cDNA和RAN模板表現異源基因產物並（c)在重組的病 毒顆粒t，解救該異源基因。
4.1.建構重組的cDNA和RNA 本發明包括由衍生自副流感病毒’包括牛副流感病毒和 哺乳動物副流感病毒之基因組的病毒載體編碼的重組或嵌 J44243.doc •24- 。型病毒。根據本發明，重組病 或哺乳動物S|| 4 # <Γ生自牛副k感病毒 札助物田彳机感病毒的病毒，t 組序列$ A /、係由内源或天然的基因 序歹j或非-天然的基因組序列 然的庠列甚ra* 根據本發明，非-天 斤歹〗疋因為一或多個突變， 排、你 包括但不限於點突變、重 徘播入、刪除等等，而盥天钬弋如 的序列，對灵心& ......或内源之基因組序列不同 上的改變。太心日+ 了此或可能沒料致表現型 & # Χ之組病骨包括由衍生自副流感病# , ;=哺乳動物副流感病毒之基因組的病毒載體編碼的 那些病毒，可能或可能沒有包 祜對该病毒基因組而言，為 非-天然的核酸。根據本發明 &以> 4 何生自田彳流感病毒之基因 、的病，载體，含有編碼至少—八 口 P刀田1J 丨L感病f的一個 ORF之核酸序列。 根據本發明，本發明之病表 , 届t載體係衍生自哺乳動物副流 感病毒的基因組，特別是人_ 疋人頬釗流感病毒（hPIV)。在本發 明特定的具體實施例中， 土 τ 通病母載體係衍生自人類副流感 病毒第3型的基因、组。根據本發明，這些病毒載體可以或 可以不包含對該病毒基因組而言，為非_天然之核酸。 根據本發明，本發明之病毒載體係衍生自牛副流感病毒 ()之基因組。在本發明特定的具體實施例中，該病毒 載體係何生自牛副流感病毒第3型的基因組。根據本發 :’延些病秦載體可以或可以不包含對該病毒基因組而 言’為非-天然之核酸。 根據本發明，嵌合型病毒為重組bpiv或hpiv ,其進一步 包括異源核^^序列。根據本發明，該嵌合型病毒可由其 144243.doc -25. FI356848 中已經將異源核苷酸序列加至基因組中的核苷酸序列，或 其中已經利用異源核甚酸序列代替的内源或天然核苷酸序 列編碼。根據本發明，該嵌合型病毒係由本發明之病毒載 體編瑪’其進一步包括異源核苷酸序列。根據本發明，該 礙合型病毒係由可以或可以不含對該病毒基因組而言，為 非-天然之核酸的病毒載體編碼。根據本發明，該嵌合型 病毒係由其中已經加入、插入或取代天然或非天然序列 之異源核苷酸序列的病毒載體編碼。 敗σ型病毒對於產製可保護對抗二或多種病毒的重組疫 备’具有特殊的用途（Tao等人，J. Virol. 72, 2955-2961;
Durbin等人，2000, j. Vir〇i. 74，6821-6831; Skiadopoulos等 人，1998, J. Virol. 72, 1762·1768 (1998); Teng等人，2〇〇〇,夂
Virol· 74，9317-9321)。例如，可想像hpiv或bPlV病毒載體 表現一或多個其他負股RNA病毒，例如MPV的蛋白質或
Rsv載體表現一或多個Mpv的蛋白質，將可保護接種這類 疫苗的個體對抗兩種病毒感染。可對其他的副黏液病毒， 想像類似的方法。為了以活毒疫苗接種疫苗之㈣，減毒籲 和複製缺陷的病毒可能是有用的，如同已經針對其他病毒 所討論的（參見PCT W0 02/0573〇2，在第6和23頁，以引用 的方式併入本文中）。 根據本發明，欲併入編碼本發明之重組或嵌合型病毒之 病毒載體内的異源或非-天然序列，包括獲自或衍生自不 同的間質肺病毒品系、禽病毒品系，以及其他負股病 毒’包括但不限於RSV' PIV、流感病毒，及其他病毒， 144243.doc [S3 •26· 1356848 包括摩比利病毒的序列。 在本發明的某些具體實施例中，本發明之嵌合型或重組 病毒係由衍生自病毒基因組的病毒載體編碼，其中已經利 用異源或非·天然之序列，取代一或多個序列、基因間區 域、終端序列或一部分或整個〇RF^在本發明的某些具體 貫施例中’本發明之嵌合型病毒係由衍生自病毒基因組的 病毒載體編碼，其中已經將一或多個異源序列加至該載體 内。 本發明特定的具體實施例是嵌合型病毒，包括由衍生自 副流感病毒基因組之核：y：酸序列編碼的主鏈。在較佳的具 體實施例中，該PIV基因組係衍生自牛ριν，像是卯八^的 堪薩斯品系或衍生自人類PIV。在較佳的具體實施例中， 該PIV基因組係衍生自bPIV3的堪薩斯品系，其中已經利用 異源序列取代牛副流感病毒核每酸序列，或其中已經將異 源序列加至完整的bPIV基因組中。本發明更進一步的特定 具體實施例為嵌合型病毒，包括由衍生自人類副流感病毒 第3型基因組之核苷酸序列編碼的主鏈，其中已經利用異 源序列取代人類副流感病毒核：y：酸序列，或其中已經將異 源序列加至完整的hPlV基因組中。本發明額外特定的具體 實施例為後合型病毒，包括由衍生自牛副流感病毒基因組 之核甞酸序列編碼的主鏈，像是bPIV3的堪薩斯品系，其 中（a)已經利用人類副流感病毒之ρ基因和HN基因取代牛副 流感病毒F基因和HN基因（bPIV/hPIV)，且其中⑻已經將異 源序列加至完整的bPIV基因組中。 [S1 144243.doc -27- 1356848 本發明亦包括嵌合型病毒，其包括由衍生自bPIV、hPIV 或bPIV/hPIV基因組之核苷酸序列編碼的主鏈，除了異源 序列之外尚含有突變或修改，結果使該嵌合型病毒具有更 合適在疫苗調配時使用的表現型，例如減毒的表現型或增 強的抗原性。根據本發明該特定的具體實施例，在牛PIV3 主鏈前後的異源序列，可以是對bPIV3而言為異源的任何 序列。 本發明其他特定的具體實施例是嵌合型病毒，包括由衍 生自人類PIV1、2或3之核苷酸序列編碼的主鏈，其中已經 鲁 利用異源序列取代hPIV核甞酸序列，或其中已經將異源序 列加至完整的hPIV基因組中，其限制條件為所得的嵌合型 病毒，不是其中血球凝集素-神經胺糖酸铝酶和融合糖蛋 白已經被hPIVl的那些取代的嵌合型hPIV3。本發明亦包括 嵌合型病毒，其包括由衍生自hPIV基因組之核铝酸序列編 碼的主鏈，除了異源序列之外尚含有突變或修改，結果使 該嵌合型病毒具有更合適在疫苗調配時使用的表現型，例 如減毒的表現型或增強的抗原性。 ® 可使用此項技藝中已知的技術，建構位在病毒聚合酶結 合位置/啟動基因之互補物，例如本發明之3'-PIV病毒終端 的互補物，或3'-和5'-PIV病毒兩端之互補物側面的異源基 因密碼序列。所得的RNA模板可能具有負-極性，並可含 有適當的終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模 板。或者，亦可使用正-極性的RNA模板，其含有適當的 終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。可選 144243.doc -28- IS] 1356848 殖含有這些雜種序列的重組DNA分子，並藉著DNA-指揮 之RNA聚合酶，像是噬菌體T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚 合酶或真核生物聚合酶，像是聚合酶I及其類似物轉錄， 以便在活體外或在活體内產製具有適當之病毒序列，並給 予病毒聚合酶認知和活性的重組RNA模板。 在一個具體實施例中，本發明之PIV載體表現一、二或 三個編碼抗原多肽和肽的異源序列。在一些具體實施例 中’該異源序列係衍生自相同病毒或衍生自不同病毒。在 某些具體實施例中，將一個以上相同異源核甞酸序列的副 本，插入牛副流感病毒、人類副流感病毒或bpiv/hpiv嵌 合型載體的基因組中。在較佳的具體實施例中，將兩個相 同異源核菩酸序列的副本’插入本發明之病毒的基因組 中。在一些具體實施例中’該異源核苷酸序列係衍生自間 質肺病毒’像是人類間質肺病毒或禽肺病毒。在特定的具 體貫施例中’衍生自間質肺病毒之異源核甞酸序列是間質 肺病毒的F基因》在其他特定的具體實施例中，衍生自間 質肺病毒之異源核苷酸序列是間質肺病毒的G基因。在一 些其他的具體實施例中，該異源核甞酸序列係衍生自呼吸 道融合細胞病毒。在特定的具體實施例中，衍生自呼吸道 融合細胞病秦之異源核站酸序列是呼吸道融合細胞病毒的 F基因。在其他特定的具體實施例中，衍生自呼吸道融合 細胞病毒之異源核苷酸序列是呼吸道融合細胞病毒的G基 ¥插入或多個異源核替酸序列時，可操縱每個被插 入之副本的插入位置和基因間區域之長度，並藉著根據下 144243.doc •29· 1356848 文第4.1.2.節的不同測定來判定之。 在某些具體實施例中，可藉著逆向遺傳學，在其中利用 嵌合型cDNA或RNA構築體轉移感染的宿主細胞中，達成 嵌合型病毒或表現產物的解救。藉著以DNA-指揮之RNA 聚合酶轉錄適當的DNA序列，來製備本發明之RNA模板。 可在活體外或在活體内，藉著使用DNA-指揮之RNA聚合 酶，像是噬菌體T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶或真核 生物聚合酶，像是聚合酶I ，轉錄適當的DNA序列，來製 備本發明之RNA模板。在某些具體實施例中，可在活體外 · 或在活體内，藉著使用以質體為基礎的表現系統，像是在 Hoffmann等人，2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113中描述的，或單一方向的RNA聚合酶I-聚合酶II轉錄 系統，像是在 Hoffmann 和 Webster，2000, J. Gen. Virol. 81:2843-2847中描述的，轉錄適當的DNA序列，來製備本 發明之RNA模板。所得的帶負極性之RNA模板，將含有適 當的終端序列，其將使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模 板。或者，亦可使用正-極性的RNA模板，其含有適當的 · 終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。可藉 著具有被DNA-依賴性RNA聚合酶認出之啟動基因的質體 的轉移感染，完成從正極性之RNA模板中的表現。例如， 在T7啟動基因控制之下，編碼正RNA模板的質體DNA，可 與疫苗病毒或禽痘T7系統一起使用。 可建構二順反子的mRNAs，容許從内部開始病毒序列的 轉譯，並容許從正常的終端開始位置，表現外來蛋白質之 -30· 144243.doc m 1356848 密碼序列，反之亦&。或者， 來f ^ n。丨的轉錄早位表現外 =貝，其中該轉錄單位具有開始位置和聚料酸化作 ::置。在另-個具體實施例中，將外來基因插入ριν基 口内，使得所得的表現蛋白質是融合蛋白質。 在某些具體實施例中，本發明係關於包括本發明之 的三價疫苗。在特定的具體實施例中，可供三價疫苗使用 ^病毒是嵌合型牛副流感第3型/人類副流感第㈣病毒， :含有衍生自間質肺病#，像是人類間質肺病毒或禽肺病 贫的第-個異源料酸序列，以及衍生自呼吸道融合細胞 :毒的第二個異源核#酸序列。在代表性的具體實施例 ’迫類三價疫苗將是對下列專一的：⑷人類副流感病毒 之F基因和HN基因的基因產物；（b)由衍生自間質肺病毒之 異源㈣酸序列編碼的蛋白質以及⑷由衍生自呼吸道融合 ^胞病毒之異㈣料序列編碼的蛋白質。在特定的具體 實施例中，第—個異源核誓酸序列是呼吸道融合細胞病毒 基因，並將其插人位置^，而第二個異源核芬酸序列 是人類間質肺病毒的F基因，並將其插入位置3中。本發明 包括多更多的組合，並在表丨中舉例說明一些。可使用禽 肺病毒之F或G基因的其他組合。此外，亦可使用編碼嵌合 型F蛋白質的核钻酸序列（參見前文）。在—些較差的具體 貫施例中，可將異源核苷酸序列插入病毒基因組之較高編 號的位置中。 144243.doc 31 1356848 表l.在三價疫苗使用之病毒中，異源核苷酸序列的代表 性配置 組合 位置1 位置2 位置1 1 hMPV之F-基因 RSV之F-基因 2 RSV之F-基因 hMPV之F-基因 - 3 - hMPV之F-基因 RSV之F-基因 4 • RSV之F-基因 hMPV之F-基因 5 hMPV之F-基因 RSV之F-基因 6 RSV之F-基因 - hMPV之F-基因 7 hMPV之G-基因 RSV之G-基因 - 8 RSV之G-基因 hMPV之G-基因 9 - hMPV之G-基因 RSV之G-基因 10 - RSV之G-基因 hMPV之G-基因 11 hMPV之G-基因 - RSV之G-基因 12 RSV之G-基因 - hMPV之G-基因 13 hMPV之F-基因 RSV之G-基因 - 14 RSV之G-基因 hMPV之F-基因 - 15 _ hMPV之F·基因 RSV之G-基因 16 RSV之G-基因 hMPV之F-基因 17 hMPV之F·基因 - RSV之G-基因 18 RSV之G-基因 - hMPV之F-基因 19 hMPV之G-基因 RSV之F-基因 - 20 RSV之F-基因 hMPV之G-基因 21 hMPV之G-基因 RSV之F-基因 22 - RSV之F-基因 hMPV之G-基因 23 hMPV之G-基因 - RSV之F-基因 24 RSV之F-基因 - hMPV之G-基因
•32· 144243.doc IS ] 1356848 在一些其他的具體實施财，可改變在異源序列和下游 基因之密碼序列起點之間的基因間區域。例如，在表1中 列舉的每個基因，可具有想要長度的基因間區域。在代表 性的具體實施例中，三價疫苗包括b/h piV3載體，其具有 插入位置1處之呼吸道融合細胞病毒的F基因，改變了的
177個核：y：酸之基因間區域（最初是75個核苷酸，至下游N 基因起始密碼子AUG)，以及插入位置3處之人類間質肺病 毒的F基因，具有其天然的基因間區域。本發明包括多更 多的組合，因為可根據下文的4.12節，操縱每個異源核芸 酸序列的插入。 在更廣泛的具體實施例中，可設計本發明之表現產物和 嵌合型病毒粒子，創造對抗各種病原，包括病毒抗原、腫 瘤抗原和涉及自體免疫病症之自體抗原的疫苗。一種達成 该目的的方式，涉及修改現存的PIV基因，使其在它個別 的外部功能部位中，含有外來序列。在異源序列為抗原決 定位或病原的抗原之處，可使用這些嵌合型病毒誘導保護 性免疫反應’對抗從其中衍生出這些決定位的病原。 一種建構這些雜種分子的方法，是將異源核苷酸序列插 入PIV基因組’例如hPIV、bPIV或bPIV/hPIV之DNA補體 内’而付以使該異源序列位在病毒聚合酶活性所需之病毒 序列，即病秦聚合酶結合位置/啟動基因的側面，在後文 中稱為病毒聚合酶結合位置，以及聚腺:y：酸化作用位置。 在較佳的具體實施例中，該異源密碼序列係位在包括5，和 3'終端之複製啟動基因、基因起點和基因結束序列，以及 144243.doc •33- 1356848 或3〜端中發現之包I信號的病毒序列的側面。在 另種方法中，可將編碼病毒聚合酶結合位置的募核苷 酸’例如病毒基因組斷片之3,_端或兩端的補體，與該異源 密碼序列連接，建構雜種分子。在標乾序列中放置外來基 因或外來基因的斷片’從前是藉著在標乾序列中出現之適 當限制酵素位置來指揮。然而，最近在分子生物學上的進 '已、、二大大地減少了該問題。可經由使用指定位置之突 變生成作用（例如，參見，例如由Kunkel，1985, Pr〇c. Natl·
Acad’ Sci. U.S.A. 82:488描述的技術），迅速地將限制酵素 位置放在標靶序列中的任何地方。在下文中描述之在聚合 酶連鎖反應（PCR)技術上的改變，亦容許序列（即限制酵素 位置）的指定插入，並容許輕易地建構雜種分子。或者， 可使用PCR反應，製備重組的模板，而不需要選殖。例 如可使用PCR反應，製備含有DNA-指揮之RNA聚合酶啟 動基因（例如噬菌體T3、丁7或卯6)的雙股DNa分子，以及 含有異源基因和PIV聚合酶結合位置的雜種序列。然後可 從該重組DNA中，直接轉錄RNA模板。在另一個具體實施 · 例中，可藉著使用RNA連接酶，使指出異源基因之負極性 的RNAs與病毒聚合酶結合位置連接，來製備重組的RNA 模板。 此外’可在未轉譯區域中，在HN基因之3·端加入一或多 個核苷酸’與“六的規則”附接’該“六的規則，，在成功的病 毒解救中，可能是很重要的。“六的規則，’適用於許多副黏 液病毒’且RNA基因組之核：y：酸的數目，必須是6的因 144243.doc t s 1 1356848 數，才是有功能的。可藉著此項技藝中已知的技術，像是 使用市。的犬邊生成套組，像⑽咖抓弘突變生成套組 (Stratagene)，兀成核苷酸的加入。在加入適當數目的核苷 酸之後’可藉著以適當限制酵素消化，並以凝膠純化，分 離出正確的DNA片段，例如hpiV3 F和NH基因的dna片 段。可根據在後文之子章節中摇述的本發明，使用病毒聚 合酶活性所需之序列和構築體。 4 · 1.1.欲插入之異源基因序列 本發明包括設計重組的牛或人類副流感病毒，表現一或 多個異源序列’其中該異源序列編碼基因產物或基因產物 的片段，其最好是抗原性及/或免疫原性的。當在本文中 使用“抗原性的”一詞時，意指分子與抗體或mhc分子結合 的能力。“免疫原性的，，一詞意指分子在宿主中產生免疫反 應的能力。 在較佳的具體實施例中，欲插入之異源核甞酸序列係衍 生自負股RNA病毒’包括但不限於流感病毒 '副流感病 毒、呼吸道融合細胞病毒、哺乳動物間質肺病毒（例如人 類間質肺病毒）和禽肺病毒。在較佳的具體實施例中，欲 插入之異源序列包括，但不限於編碼人類1>1¥之1?或11\基 因、RSV之F基因、流感病毒A、B&c型之HA基因、人類 MPV之F基因、禽肺病毒之F基因或其免疫原及/或抗原片段 的序列。 在一些具體實施例中，欲插入之異源核苷酸序列係衍生 自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。在某些具體實施例 I44243.doc •35· 1356848 (a)人類間質肺病毒 毒和呼吸道融合細 中’欲插入之異源核苷酸序列係衍生自 和呼及道融合細胞病毒及/或（b)禽肺病 胞病毒^ =本發明某些較佳的具體實施例中，欲〜之異源Μ 曼序列係衍生自得自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒的F基 。在某些具體實施例中，該F基因係衍生自⑷人類間質 肺病毒和呼吸道融合細胞病毒及/或(b)禽肺病毒和呼吸道 融合細胞病毒。 在树明的某些具體實施例中’欲插人之異源核芬酸序 歹J為何生自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒的G基因。在某 些具體實施例中，該G基因係^生自⑷人類間質肺病毒^ 呼吸道融0細胞病毒及/或（b)禽肺病毒和呼吸道融合細胞 病毒。 在某些具體實施例中，可將衍生自人類間質肺病毒、禽 肺病毒和呼吸道融合細胞病毒之不同]7基因及/或不同G基 因的任何組合，插入本發明之病毒内，其限制條件為在： 有的具體實施例中，至少有—㈣生自人類間質肺病毒或 禽肺病毒的異源序列，出現在本發明之重組副流感病毒 中。 甘 在某些具體實施例中，欲插入之核苷酸序列是編碼衍生 自人類間質肺病毒之F蛋白質的核苷酸序列。在某些其他 的具體實施例中，欲插入之核甞酸序列是編碼衍生自人類 間質肺病毒之G蛋白質的核苷酸序列。在另外的具體實施 例中，欲插入之核甞酸序列是編碼衍生自禽肺病毒之F蛋 144243.doc
IS -36- 1356848 白質的核苷酸序列。在苴他的且 ，、他的具體貫施例中，欲插入之核 甞酸序列是編碼衍生自禽肺病毒 母之G蛋白質的核：y：酸序 列。其限制條件為在所有的具體實施例中至少有一個異 源核嘗酸序列是衍生自問暂输,左主 自間貝肺病母，欲插入之異源核甞酸 序列係編碼呼吸道融合細胞病毒的F蛋白質或〇蛋白質。
在某些具體實施例中’欲插人之料酸序列係編碼嵌合 型F蛋白質或嵌合型〇蛋白質。.嵌合型F蛋白質包括一部分 得自不同病毒的F蛋白質，像是人類間質肺病毒、禽肺病 毒及/或呼吸道融合細胞病毒。嵌合型G蛋白質包括一部分 得自不同病毒的G蛋白質，像是人類間質肺病4、禽肺病 毒及/或呼吸道融合細胞病毒。在特定的具體實施例中， 該F蛋白f包括f01質肺病毒之F蛋白質的外功能部位，副流 感病毒之F蛋白質的穿透膜功能部位以及副流感病毒之f蛋 白質的魯米那功能部位。
在某些特定的具體實施例中，本發明之異源核苷酸序列 是序列識別1號至序列識別5號、序列識別丨4號和序列識別 15號中的任一個（參見表16)。在某些特定的具體實施例 中，該核苷酸序列編碼序列識別6號至序列識別13號、序 列識別16號和序列識別17號中任一個的蛋白質（參見表 16)。在某些特定的具體實施例中，該核苷酸序列編碼序 列識別314至389號中任一個的蛋白質。 至於衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源核苷酸序列，參 見，例如PCT/US98/20230 ’將其全文以引用的方式併入本 文中。 144243.doc •37· 1356848 在較佳的具體實施例中，可在本發明之嵌合型病毒内表 現的異源基因序列，包括但不限於編碼病毒之抗原決定位 和糖蛋白的那些，像是流感病毒之糖蛋白，特別是血球凝 集素H5、H7、呼吸道融合細胞病毒之抗原決定位、新城 雞瘟病毒之抗原決定位、引起呼吸道疾病之仙臺病毒 (Sendai virus)和傳染性喉氣管炎病毒（ILV)。在最佳的具體 實施例中，該異源核苷酸序列係衍生自間質肺病毒，像是 人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。在本發明另一個具體實 施例中，可設計成在本發明之嵌合型病毒内的異源基因序 · 列，包括但不限於編碼病毒抗原決定位和病毒糖蛋白，像 是B型肝炎病毒表面抗原、愛氏頓病毒之A或C型肝炎病毒 之表面糖蛋白、人類乳頭狀瘤病毒、猿病毒5或流行性腮 腺炎病毒、西尼羅河病毒（West Nile virus)、登革病毒 (Dengue virus)之糖蛋白 '癌療病毒之糖蛋白、骨髓灰白質 炎病毒之VPI以及衍生自人類免疫缺陷病毒（HIV)，最好是 第1型或第2型之序列的那些。在另外的具體實施例中，可 設計成在本發明之嵌合型病毒内的異源基因序列，包括但 ® 不限於編碼馬立克氏（Marek's)病病毒（MDV)之抗原決定 位、傳染性華氏囊炎病毒（IBDV)之抗原決定位、雞貧血病 毒、傳染性喉氣管炎病毒（ILV)、禽流感病毒（AIV)、狂犬 病、貌白血病病毒、犬痕熱病毒、水癌性口炎病毒和緒症病 毒之抗原決定位的那些（參見Fields等人（編輯），1991， FUNDAMENTAL VIROLOGY,第 2 版，Raven Press, New York，將其全文以引用的方式併入本文中）。 • 38 - 144243.doc IS 1 1356848 本發明其他的異源序列，包括編碼為自體免疫疾病所特 有之抗原的那些。這些抗原通常將衍生自哺乳動物組織的 細胞表面、細胞質、核、粒線體及其類似物，包括糖尿 病、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、風濕性關節炎、 惡性貧血、愛迪森氏（Addis(m，s)病、硬皮病自體免疫萎 縮f·生月火、月少年糖尿病和盤狀紅斑性狼瘡所特有的抗 原。 為過敏原之抗原通常包括蛋白質或糖蛋白，包括衍生自 花粉、塵埃、黴、孢子、皮屑 '昆蟲和食物的抗原。此 外，為腫餘相特有的Μ，Μ將衍生㈣瘤組織之 細胞的表面、細胞質、肖、胞器及其類似物。實例包括腫 瘤蛋白質所特有的抗原，包括由突變之致癌基因編碼的蛋 白質；與腫瘤有關之病毒蛋白質；以及糖蛋白。腫瘤包 括仁不限於從下列類型之癌症衍生的那些：唇、鼻咽、 因和口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝臟、膽囊、胰臟、
喉、肺臟和支惫普·、+ A ^ B 皮膚之黑色素瘤、乳房、子宮頸、卵 巢膀胱、腎臟、子宮、腦和神經系統的其他部分、甲狀 腺⑴歹隱、筆丸、霍奇金氏（H〇dgkin，s)症非霍奇金氏 淋巴瘤、多發性骨髓瘤和白血病。 在本發明一個特定的具體實施例中，該異源序列係衍生 自人類免疫缺陷病毒（HIV)，最好是人類免疫缺陷病毒心或 人颏免疫缺陷病毒_2的基因組。在本發明其他的具體實施 例中可將該異源密碼序列插人基因密碼序列中，而 付以表現在PIV病毒蛋白f中，含有該異源肽序列的嵌合 144243.doc -39- 1356848 型基因產物。在本發明的這類具體實施例中，該異源序列 '可衍生自人a免疫缺陷病毒，最好是人類免疫缺陷病 毒-1或人類免疫缺陷病毒_2的基因組。 在異源序列為HIV-衍生的案例中，這類序列可包括但 不限於衍生自enV基因（即編碼全部或部分gp 1 60、gp 120及/ 或gp41之序列）、po丨基因（即編碼全部或部分逆轉錄酶核 酸内切酶、蛋白酶及/或接合酶之序列）、㈣基因(即編碼 全部或部分P7、P6、P55、P17/18、P24/25之序列）、tat、 rev、nef、vif、vpu、vpr及/或邛乂的序列。 在其他的具體實施例中，可設計成在嵌合型病毒内的異 源基因序列，包括編碼具有免疫強化活性之蛋白質的那 些。免疫強化蛋白質的實例，包括但不限於細胞激動素、 干擾素第1型、γ干擾素、菌落刺激因子和介白素_丨、_2、 -4、-5、-6、-12° 此外’其他可設計成在嵌合型病毒内之異源基因序列， 包括編碼衍生自細菌之抗原的那些，像是細菌表面糖蛋 白、衍生自真菌的抗原以及衍生自各種其他病原和寄生蟲 的抗原。衍生自細菌病原之異源基因序列的實例，包括但 不限於編碼衍生自下列屬之物種的抗原的那些：沙門氏桿 菌屬（Salmonella)、志賀桿菌屬（ShigeUa)、衣原體屬 (Chlamydia)、螺桿菌屬（Helicobacter)、耶爾森氏菌屬 (Yersinia)、博德氏菌屬（B〇rdateiia)、假單孢菌屬 (Pseudomonas)、奈瑟菌屬（Neisseria)、弧菌屬（Vibrio)、嗜 血桿菌屬（Haemophilus)、黴漿菌屬（Mycoplasma)、鏈黴菌 I44243.doc • 40- 1356848
屬（Streptomyces)、密螺旋體屬（Treponema)、柯克斯體屬 (Coxiella)、 艾利希體屬（Ehrlichia)、布氏桿菌屬 (Brucella)、鍵桿菌屬（Streptobacillus)、梭菌螺旋體屬 (Fusospirocheta)、螺菌屬（Spirillum)、月尿原體屬 (Ureaplasma)、螺旋體屬（Spirochaeta)、徽聚菌屬、放線菌 屬（Actinomycetes)、疏螺旋體屬（Borrelia)、類桿菌屬 (Bacteroides)、奇可莫拉菌屬（Trichomoras)、布藍漢氏菌屬 (Branhamella)、巴斯德菌屬（Pasteurella)、梭狀芽胞桿菌屬 (Clostridium)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、李士 德菌屬 (Listeria)、 桿菌屬 （Bacillus)、 丹毒絲菌屬 (Erysipelothrix)、紅球菌屬（Rhodococcus)、埃希桿菌屬 (Escherichia)、克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella)、假單孢菌 屬、腸桿菌屬（Enterobacter)、沙雷菌屬（Serratia)、葡萄球 菌屬（Staphylococcus)、鏈球菌屬（Streptococcus)、軍團菌 屬（Legionella)、分枝桿菌屬（Mycobacterium)、變形桿菌屬 (Proteus)、‘彎曲桿菌屬（Campylobacter)、腸球菌屬 (Enterococcus)、不動桿菌屬（Acinetobacter)、摩根菌屬 (Morganella)、莫拉菌屬（Moraxella)、檸樣酸細菌屬 (Citrobacter)、立克次體屬（Rickettsia)、羅查利馬氏體屬 (Rochlimeae)，以及細菌物種，像是綠膿桿菌（Ρ· aeruginosa)、大腸桿菌、蔥頭假單胞菌（P. cepacia)、表皮 葡萄球菌（S. epidermis)、糞腸球菌（E. faecalis)、肺炎鏈球 菌（S. pneumonias)、金黃色葡萄球菌（S. aureus)、腦膜炎奈 瑟菌（N. meningitidis)、釀膿鏈球菌（S_ pyogenes)、敗企性 144243.doc -41 - 1356848 巴斯德桿菌（Pasteurella multocida)、梅毒螺旋體 (Treponema pallidum)和奇異變形菌（p. mirabilis) 0 衍生自病原性真菌之異源基因序列的實例，包括但不限 於編碼衍生自下列真菌之抗原的那些，像是··新型隱球菌 (Cryptococcus neoformans);皮炎芽生黴菌（Blastomyces dermatitidis)，皮炎艾洛徽菌（Aiellomyces dermatitidis);莢 膜組織胞漿菌（Histoplasma capsulatum);粗球黴菌 (Coccidioides immitis);念珠菌屬（Candida)物種，包括白 色念珠囷（C. albicans)、熱帶念珠菌（C· tropicalis)、近平滑 念珠菌（C. parapsilosis)、吉利蒙念珠菌（C. guilliermondii) 和克魯斯念珠菌（C_ krusei) ’麵菌屬（Aspergillus)物種，包 括煙麴菌（A. fumigatus)、黃麴菌（A. flavus)及黑麴菌（A. niger) ’根黴菌屬（Rhizopus)物種；根毛黴菌屬 (Rhizomucor)物種；克銀漢徽屬（Cunninghammella)物種； 囊托黴菌屬（Apophysomyces)物種，包括沙氏囊托黴菌（A. saksenaea)、毛黴菌（A. mucor)和棘子鬚黴菌（A. absidia); 申克氏抱子絲菌（Sporothrix schenckii)、巴西副球黴菌 (Paracoccidioides brasiliensis)；波迪假徽樣真菌 (Pseudallescheria boydii)、光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata);毛癬菌屬（Trichophyton)物種、小芽孢菌屬 (Microsporum)物種和皮癖菌屬（Dermatophyres)物種，以及 任何目前已知或稍後確認為病原性的其他酵母菌或真菌。 最後’衍生自寄生蟲之異源基因序列的實例，包括但不 限於編碼衍生自下列物種之抗原的那些：頂複動物門 144243.doc •42- 1356848
(Apicomplexa)的成員，像是例如焦蟲屬（Babesia)、弓漿蟲 屬（Toxoplasma)、瘧原蟲屬（Plasmodium)、艾美球蟲屬 (Eimeria)、等抱球蟲屬（Isospora)、阿托索漿蟲屬 (Atoxoplasma)、囊等孢球蟲屬（Cystoisospora)、哈蒙蟲屬 (Hammondia)、貝諾蟲屬（Besniotia)、肉抱子蟲屬 (Sarcocystis)、福瑞克蟲屬（Frenkelia)、血變形蟲屬 (Haemoproteus)、白企球抱子蟲屬（Leucocytozoon)、赛利 爾梨漿蟲屬（Theileria)、普金蟲屬（Perkinsus)和孢子蟲屬 (Gregarina spp.);卡氏肺孢子蟲（Pneumocystis carinii);微 孢子門（Microspora)的成員，像是例如小抱子蟲屬 (Nosema)、腸微孢子蟲屬（Enterocytozoon)、腦炎微抱子蟲 屬（Encephalitozoon)、赛普塔塔蟲屬（Septata)、馬拉辛凱蟲 屬（Mrazekia)、鈍孢子蟲屬（Amblyospora)、阿美森蟲屬 (Ameson)、格留蟲屬（Glugea)、普孢子蟲屬（Pleistophora) 和微孢子屬（Microsporidium spp.);以及奇異孢子蟲門 (Ascetospora)的成員’像是例如單孢子蟲屬 (Haplosporidium spp.)，以及包括下列的物種：惡性瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)、間日癔原蟲（p. vivax)、卵形瘧原 蟲（P. ovale)、三日遽原蟲（p. malaria);鼠.弓黎蟲 (Toxoplasma gondii);墨西哥利什曼原蟲（Leishmania mexicana)、熱帶利什曼原蟲（L_ tropica)、碩大利什曼原蟲 (L. major)、埃塞俄比亞利什曼原蟲（L. aethiopica)、杜氏利 什曼原蟲（L. donovani)、克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi)、布 氏錐蟲（T. brucei)、曼氏住血吸嘉（Schistosoma mansoni)、 [ 144243.doc -43- 1356848
埃及住jk吸蟲（S. haematobium)、曰本住it吸蟲（S. japonium);旋毛蟲（Trichinella spiralis);班氏吳策絲蟲 (Wuchereria bancrofti);馬來布魯線蟲（Brugia malayli);溶 組織内阿米巴（Entamoeba histolytica);蟯蟲（Enterobius vermiculoarus);有鈎絛蟲（Taenia solium)、無釣條蟲（T. saginata);陰道滴蟲（Trichomonas vaginatis)、人滴蟲（T. hominis)、口腔毛滴蟲（T. tenax);腸梨形蟲（Giardia lamblia);短小隱抱子蟲（Cryptosporidium parvum);卡氏肺 抱子蟲、牛焦蟲（Babesia bovis)、分歧焦蟲（B. divergens)、 田鼠焦蟲（Β· microti)、貝氏等抱球轰（Isospora belli)、人焦 蟲（L. hominis);脆弱雙核阿米巴（Dientamoeba fragilis); 人盤尾絲蟲（Onchocerca volvulus);人始蟲（Ascaris lumbricoides);美洲鈎蟲（Necator americanis);十二指腸钩 蟲（Ancylostoma duodenale);糞類圓線蟲（Strongyloides stercoralis);菲律賓毛細線蟲（Capillaria philippinensis); 廣東血管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis);短小包膜 絛蟲（Hymenolepis nana);闊節裂頭絛蟲（Diphyllobothrium _ latum);細粒棘球絛蟲（Echinococcus granulosus)、多房型 棘球絛蟲（E. multilocularis);衛氏并殖吸蟲（Paragonimus westermani)、卡列并殖吸蟲（P. caliensis);中華後睪吸蟲 (Chlonorchis sinensis);猶後睪吸蟲（Op isthor chi s felineas)、維氏腹囊雙 口吸蟲（G. viverini) ' 肝經（Fasciola hepatica)、济癖蟲（Sarcoptes scabiei)、人蟲（Pediculus humanus);陰蟲（Phthirlus pubis)和人膚 4¾ (Dermatobia -44- 144243.doc IS ] 1356848 h〇miniS)，以及任何目前已知或賴後確認為病原性的1他 寄生蟲。 4.1.2.異源基因序列的插入 可藉著以外來基因完全置換.病毒之密碼區，或藉著相同 物的部分置換，或藉著將異源核#酸序列加至病毒基因組 中，完成將外來基因序列插入ριν之未分斷基因組内的作 用。70全置換可能最好是經由使用PCR-指定之突變生成作 來疋成。簡5之，PCR-引子A，從5'至3,端，將含有：獨 特的限制酵素位置，像是第ns級的限制酵素位置（即"轉移 者（shifter)酵素，它認得特定的序列，但切開在該序列上 =或下游的DNA);-片與ριν基因區互補的核嘗酸；以及 片〃外來基因產物之羧基_端密碼部分互補的核苷酸。 PCR_引子B’從5,至3,端，將含有：獨特的限制酵素位置； =片與附基因互補的核菩酸；以及一片與外來基因之5, 密碼部分.互補的核货酸。在使用這些引子與外來基因之選 • 殖副本的PCR反應之後，可切除產物，並使用獨特的限制 ，置選殖。以第IIS級的酵素消化，並利用經過純化之嗟 :體聚合酶轉錄’將產生含有ριν基因之正確未轉譯末 端，並帶有外來基因插人的RNA分子。在另—個具體實施 例中，可使用PCR-誘發的反應，來製備含有嗟菌體啟動基 因序列和雜種基因序列的雙股屬，而得以直接轉錄⑽ 模板，不需選殖。 可將異源《酸序列加人或插人本發明之病毒的各種位 置。在-個具體實施例中，將異源核菩酸序列加入或插入 144243.doc -45· I356848 位置l。在另一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加入 或插入位置2。在另一個具體實施例中，將異源核苷酸序 歹J加入或插入位置3。在另一個具體實施例中，將異源核 甞酸序列加入或插入位置4。在另一個具體實施例中，將 異源核甞酸序列加入或插入位置5。在另一個具體實施例 中，將異源核苷酸序列加入或插入位置6。當在本文中使 用位置’’ 一詞時，意指在該異源核荅酸序列在待轉錄之病 毒基因組上的位置，例如，位置丨意指它是第一個待轉錄 的基因，而位置2意指它是第二個待轉錄之基因。在病毒 之較低-編號位置處插入異源核苷酸序列，與在較高-編號 位置處的插入相比較，通常產生較強的異源核苷酸序列表 現，是因為跨越病毒基因組存在的轉錄梯度。然而，轉錄 梯度亦產生特定比例的病毒mRNAs。外來基因的插入將擾 亂這些比例，並導致不同量之病毒蛋白質的合成，其可能 影響病毒的複製。因此，在選擇插入位置時，必須考量轉 錄梯度和複製動力學。例如，在b/h piV3載體的位置2處插 入異源核荅酸序列，產生最佳的複製比例和異源基因的表 現程度。若想要異源核苷酸序列的強表現，在較低-編號 的位置處插入異源核苷酸序列，是本發明較佳的具體實施 例。在較佳的具體實施例中，在位置丨、2或3處加入二: 入異源序列。 當將異源核芬酸序列插入本發明之病毒内時，可改變在 異源基因之密碼序列末端與下游基因之密碼序列起點之間 的基因間區域，而達到想要的效果。當在本文中使用，美 144243.doc IS] •46- 1356848 因間區域” 一詞時，意指在一個基因之中止信號與下一個 下游開放編閱架構之密碼序列的起始密碼子（例如AUG)之 間的核甞酸序列。基因間區域可包括基因的非-密碼區， 即是在轉錄開始位置與基因之密碼序列的起點（AUG)之 間。該非-密碼區天然存在於bPIV3 mRNAs和其他病毒基因 中，在表2中以非-限制性實例說明之： 表2 : bPIV3 mRNAs之非-密碼區的長度
…CTT[基因起點] AUG... N P Μ F ΗΝ L b/h RSV FI b/h RSV F2 45個核：y：酸 68個核:y：酸 21個核荅酸 201個核:y：酸 62個核:y：酸 12個核甞酸 10個核苷酸 b/h RSV FI NP-P 86個核荅酸
____83個核甞酸___ 在各種具體實施例中，可彼此獨立地設計在異源核荅酸 序列與下游基因之間的基因間區域，使其長度為至少10個 核甞酸、至少20個核甞酸、至少3〇個核苷酸、至少5〇個核 苷酸、至少75個核甞酸、至少1〇〇個核钻酸、至少125個核 苷酸、至少150個核铝酸、至少175個核甞酸或至少2〇〇個 核誓酸。纟某些具體實施财，彳彼此獨立地設計在異源 核苷酸序列與下游基因之間的基因間區域’使苴 為 多H)個核料、最多2G個料酸、最多3Q個料酸^多 144243.doc -47- 1356848 50個核芬酸、最多75個核苷酸、最多100個核苷酸、最多 125個核誓酸、最多150個核甞酸、最多175個核甞酸或最 多200個核誓酸。在各種具體實施例中，亦可彼此獨立地 設計在病毒基因組中想要基因的非-密碼區，使其長度為 至少10個核苷酸、至少20個核芬酸、至少30個核：y：酸、至 少50個核苷酸、至少75個核甞酸、至少1〇〇個核苷酸、至 少125個核站酸、至少15〇個核甞酸、至少175個核苷酸或 至少200個核苷酸。在某些具體實施例中，亦可彼此獨立 地設計在病毒基因組中想要基因的非_密碼區，使其長度 為最多10個核:y：酸、最多2〇個核苷酸、最多3〇個核甞酸、 最多50個核苷酸、最多75個核苷酸、最多1〇〇個核苷酸、 最多125個核甞酸、最多15〇個核甞酸、最多175個核苷酸或 最多200個核苷酸。 當插入異源核|酸序列時’可合併使用位置的影響和基 因間區域的操縱，以便達到想要的效果。例如，可在選自 由位置卜2、3、4、5和6處所組成之群的位置，加入或插 入異源核荅酸序列，並可改變在異源核茹酸序列與下一個 下游基因之間的基因間區域（參見表3)。在代表性的且體實 施例中’將hRSVF基因插入b/hPlV3載體的位置旧，並將 在F基因和N基因(即F的下一個下游基因)之間的基因間區 域改為177個核料。本發明包括多更多的組合，並在表3 中舉例顯示其中的一些。 144243.doc
ISJ 工356848
表3.異源核站酸序列之插入模式的實例 位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6 IGR3 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20 IGR 21-40 21-40 21-40 21-40 21-40 21-40 IGR 41-60 41-60 41-60 41-60 41-60 41-60 IGR 61-80 61-80 61-80 61-80 61-80 61-80 IGR 81-100 81-100 81-100 81-100 81-100 81-100 IGR 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120 IGR 121-140 121-140 121-140 121-140 121-140 121-140 IGR 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160 IGR 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180 IGR 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200 IGR 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220 IGR 221-240 221-240 221-240 221-240 221-240 221-240 IGR 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260 IGR 261-280 261-280 261-280 261-280 261-280 261-280 IGR 281-300 281-300 281-300 281-300 281-300 281-300 基因間區域，以核嘗酸測量 依據插入異源核：y：酸序列之目的（例如具有強的免疫原 性），可藉著各種指標來判定插入的位置和所插入之異源 核誓酸序列的基因間區域之長度，包括但不限於複製動力 于，以及藉著下列非-限制性的測定實例，測量到的蛋白 質或mRNA表現程度：溶菌斑測定、榮光-焦點測定、感染 中“測疋、轉化測定、終點稀釋測定、電鍍效力、電子顯
144243.doc •49- 1356848 微鏡、血球凝集作用、病毒酵素活性的測量、病毒中和作 用、血球凝集抑制作用、補體固定、免疫染色、免疫沉澱 和免疫墨點、酵素連接之免疫吸附測定、核酸檢測（例如 南方墨點分析、北方墨點分析、西方墨點分析）、生長曲 線、報告者基因的使用（例如使用報告者基因，像是綠螢 光蛋白質（GFP)或增強的綠螢光蛋白質（eGFP) ’整合到病 毒基因組，以與感興趣之異源基因相同的方式’觀察蛋白 質表現）或其組合。進行這些測定的程序’為此項技藝中 已熟知的（參見，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY， MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2〇00，ASM Press第25-56頁，將全文以引用的方式併入本 文中），並在下文的實例章節中，提供非-限制性的實例。 例如’可藉著以本發明之病毒感染培養的細胞，並接著 藉著例如西方墨點分析或ELISa，使用對該異源序列之基 因產物專一的抗體，測量蛋白質的表現程度，或藉著北方 墨點分析，使用對該異源序列專一的探針，測量RNA的表 現程度，來判定表現程度。同樣地’可藉著感染動物模 式，並在該動物模式中，測量來自本發明之重組病毒的異 源序列的蛋白質表現程度，來判定該異源序列的表現程 度。可藉著從被感染的動物中獲得組織試樣，然後使該組 織試樣接受西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之 基因產物專一的抗體，來測量蛋白質的含量。此外，若使 用動物模式，便可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，包括 但不限於ELISA，來判定該動物對異源序列之基因產物所 144243.doc m •50· 1356848 產生之抗體的力價。 因為異源序列可以是與在病毒之基因组中的核甞酸序列 同種的，故應小心地採用確實對該異源序列或其基因產物 專一的探針和抗體。 在某些特定的具體實施例中，可藉著熟諳此藝者已知的 任何技術’判定來自嵌合型b/h PIV3 RSV或b/h piv3 hMpv 或b/h PIV3 RSV F及hMPV F之RSV或hMPV的F-蛋白質表現 程度。可藉著以本發明之嵌合型病毒，感染培養的細胞， 9並藉著例如西方墨點分析或ELISA ,使用對hMPV之F·蛋白 貝及/或G-蛋白質專一的抗體，測量蛋白質的表現程度， 或藉著例如北方墨點分析，使用對人類間質肺病毒之Μ f及/或G·基因專_的探針，測量舰的表現程度來判 疋F蛋白貝的表現程度。同樣地，可使用動物模式，藉著 感染動物’並在該動物模式中，測量F-蛋白質及/或G_蛋白 質的含量，來判定該異源序列的表現程度。可藉著從被感 籲*的動物中獲得組織試樣，並使該組織試樣接受西方墨點 刀析或ELISA ’侍用普f' g，広产 1史用對該異源序列之F-蛋白質及/或G-蛋白 f專-的抗體，來測量蛋白質的含量。此外，若使用動物 模式’便可藉著任何熟諳此藝者已知的技術’包括但不限 於ELISA，來判定該動物•蛋白質及/或&蛋白質所產生 之抗體的力價。 可藉著熟諸此藝者已知的任何技術，判；t本發明之重組 病毒的複製速率。 在某些具體實施例中，欲更容易地確認異源序列在病毒 144243.doc •51 · 1356848 2組中的最佳位置，以及基因間區域的最佳長度，可使 二=編碼報告者基因。一旦決定最佳的參數，便由 、出之抗原的異源《酸序列代㈣報告者基因。 :本發明之方法中，可使用任何熟諳此藝者已知的㈣ 基因。關於更多的細節，參見4·5節。 ::著任何熟諳此藝者已知的標準技術，判定 的複製速率…病毒的生長速率表示複製速率，並可藉 考將病毒力價對感染後的時間作圖，來判定之。可藉著‘ 何熟諸此藝者已知的技術，測量病毒力價。在某些I體實 施例中’將含有病毒的懸浮液與易被該病毒感染的細胞— 起培養1在本發明之方法中使用的細胞類型，包括但不 限於Vero細胞、LLC_MK_2細胞、Η—細胞、Μ购 (祖）細胞、MRC_5細胞、WI_3_胞或細月包。在將病 毒與細胞一起培養之後，判定被感染細胞的數目。在某些 特定的具體實施财，病毒包括報告者基因。因此，表現 報告者基因之細胞的數目’代表被感染細胞的數目。在特 定的具體實施例中，病毒包括編碼eGFp的異源核苷酸序 列，並使用FACS判定表現eGFp之細胞的數目，即被該病 毒感染之細胞的數目。 在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率， 最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病 毒的複製速率的2G%。相同的條件意指相同的開始病毒力 價、相同的細胞品系、相同的培養溫度、生長培養基、細 胞數目以及其他可能影響複製速率的試驗條件。例如，在 144243.doc 52· 1356848 位置1處帶有RSV之F基因的b/h PIV3的複製速率，最多是 bPIV3之複製速率的20%。 在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率， 最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病 毒的複製速率的5%、最多10%、最多20%、最多30%、最 多40%、最多50%、最多75%、最多80%、最多90%。在某 些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率，至少是 在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複 製速率的5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、 至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些具體實 施例中，本發明之重組病毒的複製速率，是在相同條件 下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速率的5% 到20%之間、10%到40%之間、25%到50%之間、40%到75% 之間、50%到80%之間或75%到90%之間。 在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序 列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組 病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的20%。相同的 條件意指相同的開始病毒力價、相同的細胞品系、相同的 培養溫度、生長培養基、細胞數目以及其他可能影響複製 速率的試驗條件。例如，在bPIV3之位置1處，MPV之F-蛋 白質的異源序列的表現程度，最多是bPIV3之牛F-蛋白質 的表現程度的20%。 在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序 列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組 144243.doc -53- 1356848 病毒之野外型病毒的F_蛋白質之表現程度的5%、最多 10%、最多20%、最多30%、最多4〇%、最多5〇%、最多 75%、最多8G%、最多㈣。在某些具體實施例中在本發 明之重組病毒中的異源序列的表現程度，至少是在相同條 件下，攸其中衍生該重組病毒之野外型病毒的F蛋白質之 表現程度的5%、至少10%、至少2〇%、至少3〇%、至少 40%、至少50%、至少75%、至少8〇%、至少9〇%。在某些 具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序列的表現 程度，是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型 病毒的F-蛋白質之表現程度的5%到20%之間、1〇〇/。到4〇% 之間、25%到50%之間、40。/。到75°/0之間、50〇/〇到80。/。之間或 75%到90%之間。 4.1.3 ·將異源基因序列插入hn基因内 由單基因HN ’編碼負責ριν之血球凝集素和神經胺糖 酸芸酶活性的蛋白質。該HN蛋白質是病毒的主要表面糖 蛋白。對各種病毒而言，像是副流感病毒，已經顯示血球 凝集素和神經胺糖酸甞酶蛋白質含有許多抗原位置。結 果’該蛋白質在感染之後，是體液免疫反應的可能標靶。 因此’以一部分外來的蛋白質取代HN之抗原位置，可提 供對抗該外來肽之旺盛的體液反應。若將序列插入hn分 子内’並在HN的外表面上表現它，則它是免疫原性的。 例如，可用衍生自HIV之gpl60的肽來代替HN蛋白質的抗 原位置’結果產生對gP16〇和HN蛋白質兩者的體液免疫反 應。以不同的方法，可將外來的肽序列插入抗原位置内， 144243.doc •54· 1356848 而不刪除任何病毒的序列。這類構築體的表現產物，可’用 在對抗外來抗原的疫苗中，且確實可規避稍早討論的問 題，即是重組病毒在接種疫苗之宿主中繁殖。僅在抗原位 置發生取代的完整HN分子，仍可給予HN功能，並因此容 許建構可存活的病毒。因此，該病毒不需添加額外的協助 者功能便可生長。亦可以其他方式將該病毒減毒，以避免 任何意外逃脫的危險。
可進行其他的雜種建構，在細胞表面表現蛋白質或得以 從細胞中釋放它們。作為表面糖蛋白，HN具有運送至細 胞表面所需之胺基-終端的可切開信號序列，以及膜固定 所需之羧基-終端序列。為了在細胞表面上表現完整的外 來蛋白質，可能需要使用這些HN信號，創造雜種蛋白 質。在該情泥下，可以與額外之内部啟動基因分開的融合 蛋白質形式’來表現該融合蛋白質。或者，若只出現運送 信號，但缺乏膜以功能部位，則可將蛋白f分泌至細胞 外0
1 π /入丁 < KiN A的建構 可建構二順反子的mRNA，容許從内部開始病毒序列 轉譯，並容許從正常的終端開始位置，表現外來蛋白質 密碼序列。或者’可建構二順反子的mRNA序列，其中 正常終端的開放編閱架構，轉譯病毒序列，而從内部位 開始外來序列。可使用某些内部的核糖體進人位置_ 序列。應選擇短得足以避免干擾副流感病毒之包裝限制 删序列n為這&順反子方法所選㈣咖， 144243.doc •55· 刀〇848 度最好不超過500個核芸酸，而理想的長度是小於25〇個核 苷酸。在特定的具體實施例中，該IRES係衍生自細小核糖 核酸病毒’且不包括任何額外的細小核糖核酸病毒之序 歹】較佳的IRES元件包括，但不限於哺乳動物BiP IRES — C型肝炎病毒IRES。 或者，可從新的内部轉錄單位來表現外來蛋白質，其中 °玄轉錄單位具有開始位置和聚腺甞酸化作用位置。在另一 個具體實施例中，將外來基因插入ριν基因内，使得所得 的表現蛋白質為融合蛋白質。 4-2·使用重組的cDNA& RNA模板，表現異源基因產物 可使用按照上述製備的重組模板，以各種方式在適當的 伯主細胞中’表現異源基因產物或創造表現該異源基因 產物的砍合型病毒。在一個具體實施例中，可使用重組的 cDNA轉移感染適當的宿主細胞’而所得的rNa可以高 程度指揮該異源基因產物的表現。提供高程度表現之宿主 細胞系統，包括供應病毒功能的連續細胞株，像是以PIV 重複感染的細胞株、設計補足pIV功能的細胞株等等。 在本發明另一個具體實施例中，可使用重組模板，轉移 感木表現病毒聚合酶蛋白質的細胞株，以便達成該異源基 因產物的表現。為了這個目的，可利用表現聚合酶蛋白 質’像是L蛋白質的轉化細胞株，作為適當的宿主細胞。 可以類似的方式設計宿主細胞，提供其他的病毒功能，或 額外的功能’像是HN、NP或N。 在其他的具體實施例中，協助者病毒可提供由細胞利用 144243.doc IS] -56 * 1356848 的RNA聚合酶蛋白質，以便達成該異源基因產物的表現。 在另一個具體實施例中，可利用編碼病毒蛋白質，像是N 或NP、P和L蛋白質的載體，轉移感染細胞。 可使用不同的技術，檢測異源基因產物的表現（參見， 例如 Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press第25-56頁，將全文以引用的方式併入本文中）。在實 例的測定中，利用曱醇或丙酮，使以病毒感染的細胞變成 可通透的，並與對該異源基因產物升高的抗體一起培養。 然後加入認得第一個抗體的第二個抗體。該第二個抗體通 常與指示劑結合，而得以用肉眼看到或檢測出該異源基因 產物的表現。 4.3.解救重組的病毒顆粒 為了製備嵌合型病毒，可使用編碼PIV基因組及/或外來 蛋白質之經過修改的cDNAs、病毒RNAs或RNA，以+或-義 轉移感染提供複製和解救所需之病毒蛋白質和功能的細 胞。或者’可在藉著編碼PIV基因組及/或外來蛋白質之 DNA或RNA分子轉移感染之前、期間或之後，以協助者病 毒轉移感染細胞。可藉著幾個熟諳此藝者已知的技術，按 照在1992年11月24曰發證之美國專利第5,166,057號；在 1998年12月29日發證之美國專利第5,854,037號；在1996年 2月20日發表之歐洲專利公開案EP 0702085 A1 ;在美國專 利申請案第09/152,845號；在1997年4月3曰發表之國際專 利公開案PCT WO97/12032 ;在1996年11月7日發表之 144243.doc •57· 1356848 W096/34625 ;在歐洲專利公開案EP-A780475 ;在1999年1 月21日發表之WO99/02657 ;在1998年11月26日發表之 WO98/53078 ;在 1998 年 1 月 22 日發表之 W098/02530 ;在 1999年4月1日發表之W099/15672 ;在1998年4月2曰發表之 WO98/13501 ;在1997年2月20日發表之W097/06270以及在 1997年6月25日發表之EPO 780 47SA1中的描述，分別將其 全文以引用的方式併入本文中，在傳染性病毒顆粒内複製 並解救合成的重組質體PIV DNAs和RNAs。 在本發明的一個具體實施例中，可製備合成的重組病毒 _ RNAs，其含有由病毒聚合酶認出，以及產製成熟病毒粒 子所需之包裝信號所必要的負股病毒RNA之非密碼區。可 使用許多不同的方法，將逆向遺傳法應用在解救負股RN A 病毒上。首先，從重組的DNA模板中合成重組的RNAs， 並在活體外利用經過純化的病毒聚合酶複合物重建，形成 重組的核糖核蛋白（RNPs)，可用它來轉移感染細胞。在另 一種方法中，若在活體外或在活體内，在合成RNAs的轉 錄期間出現病毒的聚合酶蛋白質，則達成更有效的轉移感 · 染。利用該方法，可從cDNA質體轉錄合成的RNAs，其在 活體外與編碼聚合酶蛋白質之cDNA質體共同-轉錄，或在 活體内，在聚合酶蛋白質的存在下轉錄，即在暫時性或在 組成上表現聚合酶蛋白質的細胞中。 在本文描述的其他方法中，可在表現PIV病毒聚合酶蛋 白質的宿主細胞系統中（例如，在病毒/宿主細胞表現系統 中；設計成表現聚合酶蛋白質之經過轉化的細胞株等 -58 - I44243.doc m 1356848 等）重複有傳染性之嵌合型病毒的產製，而得以解救有 2染性之嵌合型病毒。在該例子中，不需使用協助者病 毒，因為藉著所表現之病毒聚合酶蛋白質，提供該功能。 根據本發明，可使用任何熟諳此藝者已知的技術，達成 嵌合型病毒的複製和解救。一種方法涉及在轉移感染宿主 細胞之前，在活體外供應複製所需的病毒蛋白質和功能。 在這類的具體實施例中，可以野外型財、協助者病毒、 經過純化之病毒蛋白質，或以重組表現之病毒蛋白質的形 式，提供病秦蛋白質。可在編碼嵌合型病毒之合$cdnas 或RNAs的轉錄之前、期間或之後，提供病毒蛋白質。可 使用整個混合物來轉移感染宿主細胞。在另一種方法中， 可在編碼嵌合型病毒之合成cDNA4RNAs的轉錄之前或期 間，提供複製所需之病毒蛋白質和功能。在這類的具體實 施例中’可以野外型病#、協助者病毒、病#萃取物、合 成之cDNAs或RNAs，其經由感染或轉移感染導人宿主細胞 内，來表現病毒蛋白質的形式，提供病毒蛋白質。該感染 /轉移感染，係在導入編碼嵌合型病毒之合成cDNAs* RNAs之前，或與其同時發生。 在特別想要的方法中，設計細胞使其表現ριν病毒的所 有基因，結果可能產生有傳染性的嵌合型病毒，其含有想 要的基因型；因此排除了對選擇系統的需求。在理論上， 可利用外來序列代替編碼PIV之結構蛋白質的六個基因中 的任一個，或六個基因中任一個的—部分。然而，該等式 的必要部分為繁殖有缺陷之.病毒的能力（因為漏掉^改^ 144243.doc •59· 1356848 正常的病毒基因產物而變成有缺陷的）。可利用許多可能 的方法，規避該問題。在一種方法中，可使具有突變蛋白 質的病毒生長細胞株中，將該細胞株建構成，或使其在組 成上表現相同蛋白質之野外型版本。以此方式，使該細胞 株補足了病毒中的突變。可使用類似的技術，建構經過轉 化的細胞株，使其在組成上表現任何的PIV基因。可使用 這些能夠表現病毒蛋白質的細胞株，補足在重組病毒中的 缺陷，並藉此繁殖它。或者，可利用某些天然的宿主排列 系統，來繁殖重組的病毒。 在另一個具體實施例中，可以編碼嵌合型病毒之合成 cDNAs或RNAs的形式，作為遺傳材料，來供應複製所需之 病毒蛋白質和功能，使其與編碼嵌合型病毒的合成cDNA 或RNAs共同-轉錄。在特別想要的方法中，將表現嵌合型 病毒和病毒聚合酶，及/或其他病毒功能的質體，共同-轉 移感染到宿主細胞内。例如，可將編碼野外型或經過修改 的基因組或反基因組之PIV RNA的質體，與編碼PIV病毒 聚合酶蛋白質NP或N、P或L的質體，共同-轉移感染到宿 主細胞内。或者，可藉著使用編碼T7 RNA聚合酶之經過 修改的疫苗病毒安卡拉（Modified Vaccinia Virus Ankara)(MVA)或MVA與編碼聚合酶蛋白質（N、P和L)之質 體的組合，達成嵌合型b/h PIV3病毒的解救。例如，可將 MVA-T7或禽痘-T7感染到HeLa、Hep-2或Vero細胞内。在 以MVA感染之後，可將全長的反基因組b/h PIV3 cDNA與 編碼NP、P和L之表現質體，一起轉移感染到HeLa或Vero 144243.doc •60- 1356848 細胞内。接著可收獲細胞和細胞上清液，並接受單次的冷 凍-融解。然後可使用所得的細胞溶胞產物，在卜P_D阿拉 伯呋喃糖基胞嘧啶（ara c)，一種疫苗病毒之複製抑制劑的 存在下，感染新鮮的HeLa或Vero細胞單層，產生病毒母 液。然後從這些培養盤中收獲上清液和細胞，冷凍-融解 一次’並藉著病毒溶菌斑的免疫染色，使用pIV3 •專—的 抗血清，檢測bPIV3病毒顆粒的存在。 其他繁殖重組病毒的方法’可能涉及與野外型病毒共 同·培養。這可藉著簡單地取得重組的病毒，並以該病毒 和其他野外型病毒（最好是疫苗品系）共同·感染細胞來進 行。野外型病毒應該補足有缺陷的病毒基因產物並容許 野外型和重组病毒兩者生長。或者，可使用協助者病毒， 供應重組病秦的繁殖》 在另一種方法中，可在以表現PIV病毒聚合酶蛋白質之 重組病毒共同_感染的細胞中，複製合成的模板。事實 上，可使用該方法，根據本發明來解救重組有傳染性的病 毒。為了這個目的，可在任何表現載體/宿主細胞系統， 包括但不限於病毒表現載體（例如疫苗病毒、腺病毒、桿 狀病毒等等）’或表現聚合酶蛋白質的細胞株中，表現㈣ 聚合酶蛋白質（參見’例如Krystal等人，1986, pr。。祕
Acad· Sci· USA 83:2709_2713)e 再者，表現所有六個 ριν蛋 白質之宿主細胞的感染’可能導致有傳染性之嵌合型病毒 顆粒的i生。請注意有可能建構不改變病毒存活力的重組 病毒。這些經過改變的病毒將能夠生&，且不需協助者的 144243.doc 6848 功能便可複製。 4_4·重組病毒的減毒 可進-步以遺傳方式設計本發明的重組病毒，以便表現 出減毒的表現型。特别是在將其投予作為疫苗之病毒的個 中本心明之重組病毒表現出減毒的表現型。可藉著任 何熟諳此藝者已知的方法’完成減毒作用 :，例如’可藉著在特定之宿主中，使用自然不能完美;; I的病毒（例如在人類t使料piV3載體），或藉著相對於 =的野外型品系，降低病毒基因組的複製、降低病毒感 '“百主細胞的能力’或降低病毒蛋白f裝配成有傳毕性之 病毒顆粒的能力，而引起重組病毒的減毒表現型。可使用 地你基因組（minigen〇me)測定（參見4 5」節），測試病 些序列的存活力。 一 二藉著任何熟諸此藝者已知的方法（參見’例如㈣）， =財發明之重㈣毒的減毒表現型。例如，可針對盆 的能力’或在細胞培養系統中複製 : Γ候選病毒。在某些具體實施例中，可測試重組病毒= =式中’誘發病理學之徵候的能力。病毒在動物模 中’降低誘發病理學之徵候的能力，代表其減毒的表現 ^在特U具ϋ實施例中’在鮮模式 候選的病毒，並編液的產生表示。 …測或 可將本發明之病毒減毒，而使得 徵受損。在某些具體實施例的功能特 * 一攸再中何生該減毒症主 毒之野外型品系相比較，來 , j里減肯作用。在其他的 144243.doc 1356848 具體Λ知例1j7，藉著比較減毒病毒在不同宿主系統中的生 長，來判定減毒作用。因此，關於非-限制性的實例，與牛 PIV3在牛宿主中的生長相比較’若降低了牛piV3在人類宿 主中的生長，便將在人類宿主中生長的牛piV3稱為減毒 的。 在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿 主，能夠在宿主中複製，而得以產生有傳染性的痔毒顆 粒。然而，與野外型品系相比較，減毒的品系生長至較低 的力價，或生長得更慢。可使用任何熟諳此藝者已知的技 術，判定減秦病毒的生長曲線，並將其與野外型病毒的生 長曲線相比較。關於代表性的方法，參見下文的實例章 節。在特定的具體實施例中，減毒的病毒在按照實例3、 4、5和10中描述的條件下，在Ver〇細胞中’生長至低於ι〇5 ㈣毫升、低於Η)4 pfu/毫升、低於1〇3 pfu/毫升或低於Μ pfu/毫升的力價。 在某些具體實施财，本發明之減毒病毒（例如嵌合型 PIV3)在人類細胞中’不能像野外型病毒（例如野外型附3) 一樣好地複製。例如，減毒的b/hpiV3/RSVF在人類HEp_2 細胞中，不像野外型PIV3或RSV 一樣好地複製。然而，減 毒的病毒能夠在缺乏干擾 丁儍京功Sb的細胞株，像是Vero細胞 中良好地複製。 在其他的具體實施例中，太狢> 士 J T本發明之減毒病毒能夠感染宿 主、在宿主令複製，並使本發明之病毒的蛋白質插入細胞 質膜内’但減毒病毒不能使宿主產生新的有傳染性的病毒 144243.doc • 63 · 1356848 顆粒。在某些具體實施例中’減毒病毒以與野外型哺乳動 物病毒相同的效力’感染宿主、在宿主中複製，並使病毒 蛋白質插入宿主的細胞質膜内。在其他的具體實施例中， 與野外型病毒相比較，減毒病毒降低了使待插入細胞質膜 内之病毒蛋白質進入宿主細胞内的能力。在某些具體實施 例中，與野外型病毒相比較，減毒病毒降低了在宿主中複 製的能力。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定病毒 是否能夠感染哺乳動物細胞、在宿主内複製，並使病毒蛋 白質插入宿主的細胞質膜内。關於解釋性的方法，參見 民戶0 在某些具體實施射，本發明之減毒病毒能夠感染宿 主。然而，與野外型哺乳動物MPV相反，減毒的哺乳動物 MPV不能在宿主中複製。在特定的具體實施例中，減毒的 :乳動物病毒可感染宿主，並可使宿主將病毒蛋白質插入 質膜内，但減毒病毒不能在宿主中複製。可使用任 何熟諸此蓺去p +、!· ,, : 的方法，測試減毒的哺乳動物MPV是否 主細胞，並使宿主將病毒蛋白質插入其細胞質膜 :某：具體實施例中，與野外型病毒感染相同宿主的 可使用!=的哺乳動物病毒降低了感染宿主的能力 毕宿主者已知的技術’判定病毒是否能夠 5主°關於解釋性的方法，參見4.5節。 的基=體::r，將突變(例如錯義突變)導入病- 生具有減毒表現型的病毒。可將突變0 144243.doc
IS J •64· 1356848 如錯義突變）導入重組病毒的N_基因、P_基因、M_基因、 F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因内。在更特 定的具體實施例中，錯義突變是感冷性的突變。在其他的 具體實施例中，錯義突變是感熱性的突變。在—個具體實 施例中，移除病毒之p蛋白質的主要磷酸化作用位置。在 另一個具體實施例中，將突變或突變們導入病毒的L基因 内’產生感溫性的品系。
在其他的具體實施例中，在重組病毒的基因組中導入刪 除。在更特定的具體實施例中，可將刪除導入重組病毒的 N-基因、P-基因、M_基因、F_基因、M2基因、sH-基因、 G-基因或L-基因内。在特定的具體實施例中，該刪除是在 本發明之重組病毒的M2_基因中。在其他特定的具體實施 例中，该刪除是在本發明之重組病毒的SH_基因中。
在某些具體實施例中’藉著以不同物種之病毒的基因代 替野外型病毒的基因’達成病毒的減毒作用。在解釋性的 具體實施例中，可利用hPIV3&N_基因、p基因、M-基 因、F·基因、M2_基因、SH_基因、心基因或卜基因分另 代替bPIV3的N-基因、P-基因、M·基因、F_基因、M2_差 因、SH_基因、G_基因或L_基因。在其他解釋性的具體賓 施例中，可利用bPIV3的N_基因、p_基因、m_基因、^ 因、鮮基因、SH-基因、G_基因或L-基因，分別㈣ 贈3的N-基因、P_基因、M_基因、F基因、基因、 SH-基因、G·基因或L-基因。 可修改本發明之重組病 在本發明的某些具體實施例中 144243.doc •65- 1356848 毒的前導及/或拖尾序列，獲得減毒的表現型。在某些較 特定的具體實施例中，相對於野外型病毒，減少前導及/ 或拖尾序列的長度至少丨個核苷酸、至少2個核苷酸、至少 3個核苷酸、至少4個核：y：酸、至少5個核苷酸或至少6個核 菩酸。在某些其他更特定的具體實施例中，使重組病毒之 前導及/或拖尾的序列發生突變。在特定的具體實施例 中4 ^和拖尾序列是彼此100%互補的。在其他的具體實 施例令，前導和拖尾序列中有丨個核甞酸、2個核荅酸、3 個核苷酸、4個核菩酸、5個核苷酸、6個核甞酸、7個核甞 酸、8個核苷酸、9個核苷酸或1〇個核苷酸不是彼此互補 的，但剩下的核苷酸是彼此互補的。在某些具體實施例 中，非-互補的核甞酸是彼此相同的。在某些其他的具體 實施例中，非·互補的核：y：酸是彼此不同的。在其他的具 體實施例巾，若在拖尾巾的非·互補核#酸是嗓吟，則在 月j導序列中相對應的核苷酸亦是嘌呤。在其他的具體實施 例中，若在拖尾中的非-互補核苷酸是嘧啶，則在前導序 列中相對應的核:y：酸亦是嘌呤。 當使用活減毒疫苗時，亦必須考慮它的安全性。該疫苗 必須不引起疾病。在本發明中，可使用任何使疫苗安全之 此項技二中已知的技術。除了減毒的技術之外，可使用其 他技術。一個非-限制性的實例是使用可溶性異源基因， 不此將其併入病毒粒子膜内。例如，可使用可溶性RSV F 基口的單一副本、缺乏穿透膜和胞液功能部位的RSV基因 版本因為不能將其併入病毒粒子膜内，故不預期改變該 144243.doc 1356848 病毒的向性。 可使用各種測定來測試疫苗的安全性。參見下文4 5 節。特別是使用蔗糖梯度和中和測定。 4.5.測置嵌合型病毒的病毒力價、抗原序列的表現、免 疫原性及其他特徵 可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定本發明之病毒 在細胞培養系統或在個體中的生長速率。在某些具體實施
例中，在以該病毒感染細胞或個體之後的某些時間點，判 疋病常的力彳貝。然後將病毒力價對時間作圖，判定該病毒 的生長特孩文。在特疋的具體實施例中，肖著從被感染的細
胞或被感染的個體中獲得婦，製備該試樣之連續稀釋， 並以容許顯現出單—溶菌斑之病毒稀釋程度，感染易感受 該病毒錢的細胞單層，㈣定病毒力價1後可計算溶 :班’並以每毫升試樣的溶菌斑形成單位來表示病毒力 ^可使用任何熟諳此藝者已知的技術，測試減毒活疫苗 的安全性，包括但不限於中和測定和蔗糖梯度測定。 在本I明待疋的具體實施例中，藉著在個體中測量對招 該病毒之抗體的力價’來評估本發明之病毒在個體中的生 長速率。未與任何理論結合，在個體中的抗體力價，不僅 反映在該個體中的病毒力價，亦反映抗原性。若病毒的拍 原性是不變的，則可使用在個體中抗體力價的增加，來岁， 定病毒在該個體中的生長曲線。 可精者任何熟諸此藝者已知的技術，來判定異源基因片 列在細胞培養系統或在個體中的表現。在某些具體實❹ 144243.doc -67- 1356848 中，藉著定量轉錄本的含量，來測量異源基因的表現。可 藉著北方墨點分析，或藉著RT-PCR，分別使用對轉錄本專 一的探針或引子，來測量轉錄本的含量。可區別轉錄本和 病毒之基因組，因為病毒為反義之方位，而轉錄本則是有 意義的方位。在某些具體實施例中，藉著定量異源基因之 蛋白質產物的量，來測量異源基因的表現。可藉著西方墨 點分析，使用對該蛋白質專一的抗體，來測量蛋白質的含 量。在特定的具體實施例中，將肽標籤附貼在異源基因 上。可使用對抗該肽標籤的抗體來檢測肽標籤。所檢測到 之肽標籤的含量，代表從異源基因中表現之蛋白質的含 量。或者，可藉著肽標籤來分離從異源基因中表現之蛋白 質。經過純化之蛋白質的含量，與異源基因的表現程度有 關。這類肽標籤，以及分離與這類肽標籤融合之蛋白質的 方法為此項技藝中已熟知的。可使用此項技藝中已知的各 種肽標籤來修改異源基因，包括但不限於免疫球蛋白恆定 區、聚組胺酸序列（Petty, 1996，金屬-螯合親和力層析法 (Metal-chelate affinity chromatography),在 Current Protocols in Molecular Biology,第 2 冊，編輯 Ausubel 等人，Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience 中），榖胱甘肽 S-轉移 酶（GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229)、 大腸桿菌甘露糖結合蛋白質（Guan等人，1987, Gene 67:21-30)、各種纖維素結合功能部位（美國專利第5,496,934號； 5,202,247號；5,137,819號；Tomme等人，1994, Protein Eng. 7:117-123)，以及 FLAG 抗原決定位（Short Protocols in -68 - 144243.doc
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Biology，1999，編輯Α議bd等人，_ %㈣& 人’單元1〇.U)等等。其他的肽標籤可被專一的結 。夥伴⑽出’it因此有助於藉著對結合夥伴的親和力結合 作用分離’最好是將該結合夥伴固定及/或放在固體支揮 物上如同热諳此藝者所知曉的，可使料多方法獲得上 文提及之肽標籤的密碼區，包括但不限於Ο·選殖、 DNA擴大和合成方法。—些肽標籤和用來檢測及分離它們 的試劑是可購得的。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，獲得來自個體的試 樣。在某些具體實施例中，該試樣包括鼻抽吸物、咽喉抹 拭物、痰或支氣管_肺泡灌洗液。 4 · 5.1 ·迷你基因組構築體 可產製迷你基因組構築體，含有反義報告者基因。本發 明可使用任何熟諳此藝者已知的報告者基因（參見下文 4.5.6.節）。在特定的具體實施例中，報告者基因為cAT。 在某些具體實施例令，報告者基因可位在反_義bpIV3或 hPIV3前導序列的側面，與肝炎5核酶（Hep_d Rib〇)和丁7聚 合酶終止（T-T7)信號連接，而bPIV3或hpiv3拖尾序列則在 T7RNA聚合酶啟動基因之前。 在一個具體實施例中，以協助者噬菌體，例如MVA_T7 或禽痘-T7轉移感染的細胞，提供了 T7 RNA聚合酶的來 源。在另一個具體實施例中，以編碼T7 RNA聚合酶之質 體轉移感染細胞。 在一些具體實施例中，然後以編碼N、p、L基因之質體 144243.doc •69- 1356848 和編碼迷你基因組之質體（所有的質體均在T7啟動基因的 控制之下）’轉移感染表現Τ7 RNA聚合酶的細胞。在一些 其他的具體實施例中，以編碼Ν、Ρ、L和Μ2· 1基因之質體 和編碼迷你基因組之質體，轉移感染表現Τ7 RNA聚合酶的 細胞。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，測定報告者基因之 表現程度及/或其活性’像是，但不限於在4 5 6節中描述 的方法。 4.5.2.測量感染速率的發生率 $ 可藉著任何此項技藝中已熟知的方法，判定感染的發生 率’包括但不限於針對感染的存在，測試臨床試樣（例如 鼻抹拭物），例如’可藉著免疫螢光測定（IFA)，分別使用 抗-hMPV-抗原抗體、抗-RSV-抗原抗體、抗_hPIV_抗原抗 體，及/或對異源核4酸序列之基因產物專一的抗體，來 檢測 hMPV、RSV、hPIV或 bPIV/hPIV組份。 在某些具體實施例中，可直接處理含有完整細胞的試 樣，而沒有完整細胞的分離物應先在許可的細胞株（例如鲁 HEp-2細胞）上培養《在解釋性的具體實施例中，應藉著在 室溫下，以例如300xg離心5分鐘，使培養的細胞上清液澄 清，接著在相同的條件下以PBS，pH 7 4(不含Ca++和Mg++) 冲洗。將細胞小球再懸浮於少量體積的pBS中，以供分 析。將含有完整細胞的原始臨床分離物與pBS混合，並在 室溫下以300xg離心5分鐘。利用無菌的吸移管尖端，從界 面中移除黏液，並在相同的條件下，以pBS沖洗細胞小球 144243.doc m -70- 1356848 一次以上。然後將小球再懸浮於少量體積的PBs中，以供 分析。將細胞懸浮液各5-10微升，點在以丙嗣沖洗過之j2_ 孔HTC超級矯正之（supercured)玻片上每個5毫米的孔中， 並容許風乾。在冰冷的（-20。〇丙酮中固定玻片丨〇分鐘。藉 著在每孔中加入PBS-1%BSA，接著在室溫下培養1〇分鐘， 阻斷該反應。以PBS_〇.1%吐溫_2〇沖洗玻片三次，並風 乾。將各10微升之以阻斷緩衝溶液稀釋至250毫微克/毫升 的初級抗體試劑’點在每孔中，並在潮濕的37〇c環境下培 養該反應30分鐘。然後以PBS-0.1%吐溫·2〇廣泛地沖洗玻 片，更換三次，並風乾。將1 〇微升之以阻斷緩衝溶液稀釋 至250毫微克/毫升的適當二級共軛抗體試劑，點在每個個 別的孔中，並在潮濕的37。(：環境下培養該反應額外的3〇分 鐘。然後以PBS-0.1%吐溫-20沖洗玻片，並更換三次。將5 微升 PBS-50%甘油-10 mM Tris pH 8.0-1 mM EDTA點在每個 反應孔中，並在玻片上覆上蓋玻片。接著藉螢光顯微鏡， 以200X功率，使用B-2A濾光鏡（EX 450-490毫微米），分析 母個反應孔。對獲自未染色細胞，或僅以二級試劑染色之 細胞的自動螢光背景’給陽性反應評分。藉著在被感染細 胞之細胞質中’由小包涵物點出的明亮螢光，來定出RSv 陽性反應的特徵。 4.5.3.測量血清力價 可藉著任何此項技藝中已熟知的方法，判定抗體的血清 力價，例如，但不限於’可藉著三明治elisa來定量抗體 或抗體片段在血清試樣中的含量。簡言之，ELISA包括利 144243.doc •71 · 1356848 用認得在血清中之抗體或抗體片段的抗體塗覆微量滴定 盤’並在4°C下過夜。然後在室溫下’以PBs•吐溫_〇 5〇/〇 BSA阻斷該培養盤大約30分鐘》使用以pblbsa bsa稀釋 之經過純化的抗體或抗體片段’建構標準曲線，並以pBS_ BSA-BSA稀釋試樣。以一式兩份，將試樣和標準物加至測 定培養盤的孔中，並在室溫下培養大約1小時。接著，以 PBS-吐溫沖洗掉未-結合的抗體，並在室溫下利用經過標 示的二級抗體（例如與辣根過氧化酶共軛的山羊抗_人類 IgG)處理已結合的抗體大約H、時。藉著加入對該標示專 一的色原受質，並測量該受質的周轉率，例如藉著分光光 度計’來檢測已標示之抗體的結合作用。藉著比較試樣之 义貝周轉率與&準曲線之受質周轉率，來判定抗體或抗體 片段在血清中的濃度。 4.5.4.攻毒研究 使用該測定來判定本發明之重組病毒和本發明之疫苗， 在動物模式系統，包括棉鼠、敘利亞黃金倉鼠和Baib/c老 鼠中’預防下呼吸道病毒感染的能力。可藉著靜脈内（ιν) 路徑、藉著肌肉内（IM)路徑或藉著鼻内路徑（IN)，投予該 重組病毒及/或疫苗。可藉著任何熟諳此藝者已熟知的技 術，投予该重組病毒及/或疫苗。亦使用該測定，使抗體 之血清濃度與降低與該抗體結合之病毒的肺臟力價發生關 連。 在第0天，藉著肌肉内注射、藉著靜脈内注射或藉著鼻 内之路徑，以重組病毒或感興趣之疫苗或BSA接種動物 144243.doc -12- is] 1356848 組’包括但不限於棉鼠（棉鼠（Sigmodon hispidis)，平均重 100克）和倉鼠（例如敘利亞黃金倉鼠）^在投予本發明的重 組病毒或疫苗之前、同時或之後，以野外型病毒感染動 物’其中該野外型病毒是針對其產製疫苗的病毒。在某些 具體實施例中，在投予本發明之重組病毒及/或疫苗之後 至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6 天、至少1週、至少2週、至少3週或至少4週，以野外型病 毒感染動物。在較佳的具體實施例中，在投予本發明之重 組病毒及/或疫苗之後21天，以野外型病毒感染動物。在 另一個較佳的具體實施例中，在投予本發明之重組病毒及 /或疫苗之後28天，以野外型病毒感染動物。 在感染之後，犧牲動物，並收獲牠們鼻部的鼻甲骨組織 及/或肺組織，再藉著適當的測定，例如溶菌斑測定和 TCIDw測定，來判定病毒力價。可使用牛血清白蛋白 (BSA) 1〇毫克/公斤作為陰性對照組。可使用三明治 ELISA，判定在攻毒時，在血清中的抗體濃度。 4.5.5.臨床試驗 可進一步在正常健康的人類志願者組別中，包括所有年 齡的組別[就其安全性、耐受性、免疫原性 '傳染性和 藥物動力學’評估已經在活體外測定和動物模式中測試過 的本發明之疫苗或其片段。在較佳的具體實施例中，健康 的人類志願者是大約6週大的嬰兒，或較大的兒童和成 人。以經鼻、肌肉内、靜脈内之方式，或藉著肺臟遞送系 統，將單一劑f的本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗 144243.di [S1 -73- 1356848 投予志願者。在6至60個月齡之血清陰性的兒童中，可能 而要夕個劑里的本發明之病毒及/或疫苗。在生命中前6個 月刺激局部和全身免疫力，並克服母體抗體的中和作 用，亦可能需要多個劑量的本發明之病毒及/或疫苗。在 較佳的具體實施例中，使用在2、4和6週齡時的最初劑量 攝生法，以及在生命第二年開始時的補㈣量。可單獨或 在相*年齡時所建議之小兒科疫苗一起，投予本發明之 重組病毒及/或本發明之疫苗。 在較佳之具體貫施例中，使用雙盲隨機的、安慰劑-對 _ 之臨床試驗·»在特定的具體實施例中，使用電腦產生的 Ik機计畫。例如，將在研究中的每個個體登記為單一的單 位’並指派獨特的案號。為了登記之目&，將個別處理在 一個家族中的多個個體。在研究期間，將仍使患者/監護 人個體和研究者不知道個體已被分配到那一個處理組。 將由不知處理組分配的實驗室人員來進行血清學和病毒學 研九然而，預期在接種疫苗之後，從鼻沖洗液中獲得 疫苗病毒的分離，將可能使病毒學實驗室的人員確認疫 · 田將血清學和病毒學的人員分開，並將避免血清學組獲 得任何培養結果的知識。 最好在接党本發明的重組病毒及/或本發明的疫苗之 月’】，先監視每個志願者至少12小時，並在臨床處接受投藥 之後，將監視每個志願者至少15分鐘。然後在投藥後第卜 14 21、28、35、42、49和56天，以門診病患之方式監視 ^願者在較佳的具體實施例中，在每次接種疫苗之後的 144243.doc IS 1 -74- 1356848 苐1個月，以門診病患之方式監視志願者。在整個試驗期 間’將報告與所有疫苗有關的嚴重不利事件。將嚴重不利 的事件定義為1)導致死亡，2)立刻威脅生命的，3)導致永 久或實際上的無能，4)導致患者住院，或延長現正住院之 患者的住院期間，5)導致先天異常，6)是癌症或7)是研究 疫苗藥量過多之結果的事件。在第一次接種疫苗的當天 (第0天）開始報告與疫苗無關的嚴重不利事件，並持續至最 後-人接種疫苗之後30天。在最後一次接種疫苗之後的3〇 • 天報告期間之後5至8個月，將不再報告與疫苗無關的嚴重 不利事件。在先前的劑量之後，若兒童有與疫苗有關之嚴 重不利事件，將不再給予疫苗/安慰劑的投藥。並未將任 何不利事件視為是與疫苗有關的，但若擔心，將在決定進 行另一次投藥之前，由臨床研究監視者與醫療監視者先進 行討論。 以下列之間隔：（1)在投與本發明之重組病毒及/或本發 ^ 月之疫田的給藥之刖，（2)在投與本發明之重組病毒及/或 本發明之疫苗的給藥期間；（3)在投與本發明之重組病毒及 /或本發明之疫苗的給藥之後5分鐘、1〇分鐘、15分鐘、2〇 分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、 2 4小時和4 8小時以及（4 )在投與本發明之重組病毒及/或本 發明之疫苗的給藥之後3天、7天、14天、21天、28天、％ 天、42天、49天和56天，經由留置套管或直接靜脈穿刺 (例如，藉著使用10毫升紅蓋的真空採血管），收集血液試 樣。在特定的具體實施例中，獲得總共5次抽血（各3_5毫 l44243.doc •75- 1356848 升）’分別在投予疫苗或安慰劑的第一次、第三次和補強 給藥之前，以及在第三次給藥和補強給藥之後大約1個 月。谷許试樣在室溫下凝固’並在離心之後收集血清。 就對抗本發明之病毒的品系-專一之血清球凝集素抑 制作用（HAI)抗體含量，測試血清。亦測試其他免疫原性 的指示劑’像是IgG、IgA或中和抗體》可測量對一或多個 其他同時給予之疫苗的血清抗體反應。可藉著ELISA定量 在得自患者之試樣中’對抗本發明之重組病毒及/或本發 明之疫苗所產生的抗體含量。 ， 藉著從在投予本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗的 給藥之後，在每個收集間隔處的血清含量，減去給藥前的 血清含量（背景含量）’修正在志願者血清中之抗體含量的 濃度。對每個志願者，根據模式-獨立性方法（Gibaidi等 人’編輯，1982，Pharmacokinetics,第 2版，Marcel Dekker，
New York)，從經過修正的血清抗體或抗體片段濃度，計 算藥物動力學參數。 培養在每次投予疫苗/安慰劑之後大約2、3、4、5、6、 7或8天時獲得的鼻沖洗液，檢測本發明之疫苗病毒的排 毒。在較佳的具體實施例中，培養在每次投予疫苗/安慰 劑之後7天時獲得的鼻沖洗液。亦使用鼻咽抹拭物、咽喉 抹拭物或鼻沖洗液，判定在志願者中，在研究期間的任何 時間，在醫學上伴隨著發燒疾病（直腸溫度大於或等於 102T)，及/或喉炎、支氣管炎或肺炎而至之其他病毒的存 在。將試樣放在乾冰上運送至指定的研究場所。使用分離 144243.doc
IS -76- 1356848 和疋S本發明之疫苗病毒的測定，以及使用MAb來確認本 發明之疫苗病毒的免疫染色測定（在下文的實例章節中， 提供這類測定的實例）。可針對其他的病毒和免疫反應， 包括IgG、IgA和t和抗體，測試鼻沖洗液的樣本。 4.5.6.報告者基因 在某些具體實施例中，本發明之方法可使用在組織培養 或在動物模式中，測量報告者基因表現的測定。將報告者 基因的核：y：酸序列選殖到病毒内，像是bpiv、hpiv或b/h piv3，其中⑴改變報告者基因的位置並（Η)變更位在報告 者基因側面之基因間區域的長度。測試不同的組合，判定 報告者基因表現的最佳速率以及包括該報告者基因之病毒 的最佳複製速率。 在某些具體實施例中，產生包含報告者基因的迷你基因 組構築體。在4.5」節中描述了迷你基因組構築體的建構。 可藉著任何热諳此藝者已知的技術，判定報告者基因產 物的豐富性。這類技術包括，但不限於北方墨點分析或西 方墨點分析，分別使用對該報告者基因專一的探針或抗 體。 在某些具體實施例中，可使用發出可在FACS中檢測到 之螢光信號的報告者基因。可使用FACs來檢測在其中表 現3玄報告者基因的細胞。 將使用實行本發明之特定觀點的技術，除非另行指定， 由熟諳此藝者例行地實行傳統的分子生物學、微生物學和 重組DNA操縱及產製技術。參見，例如Sambr〇〇k, 1989, 144243.doc •77· 1356848
Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版；DNA Cloning,第 I和 II冊（Glover編輯，1985);以及 Transcription and Translation (Hames & Higgins編輯，1984)。 報告者基因產物的生化活性，代表報告者基因的表現程 度。報告者基因活性的總量，亦依據本發明之重組病毒的 複製速率。因此，欲判定得自重組病毒之報告者基因的真 實表現程度，應將總表現程度除以在細胞培養或動物模式 中之重組病毒的力價。 本發明之方法可使用的報告者基因，包括但不限於在下 表4中列舉的基因： 表4 :報告者基因及各個報告者基因產物的生化特性 報告者基因 蛋白質活性&測量 CAT (氣黴素乙醯轉移酶） 將放射性乙醯基運送至氣黴素或藉 著薄層層析法和放射自顯術檢測 GAL (b-半乳糖甞酶） 水解無色的半乳糖1，產生有顏 色的產物 GUS (b-尿甘酸酶） 水解無色的尿甘酸，產生有顏色 的產物 LUC (蟲螢光素酶） 氧化蟲營光素，放出光子 GFP (綠螢光蛋白質） 螢光蛋白質，無受質 SEAP (分泌性鹼性磷酸酶） 與適當受質或與產生發色團之受 質的發光反應 HRP (辣根過氧化酶） 在氧化氫的存在下，氧化3,3·,5,5'-四 甲基聯苯胺，形成有顏色的複合物 AP (鹼性磷酸酶） 與適當受質或與產生發色團之受 質的發光反應 144243.doc -78- 1356848 ㈣可藉著西方墨點分析或北方墨點分析，或任何用來 定1核誓酸序列之轉錄、其mRNAsil其蛋白m富㈣ 其他技術，測量報告者基因的豐富性(參見沾⑽㈣⑽is ln M〇lecular,Blology，Ausubel 等人（編輯），j〇hn 初㈣ & Sons，Inc.，第4版’ 1999)。在某些具體實施例中，以得自 重組病毒之報告者基因表現的讀出，來測量報告者基因的 活性。為了；t量報告者基因產物的活性，可調查報告者基 因產物的生化特徵（參見表。測量報告者基因產物之生化 活性的方法，為熟諳此藝者已熟知的。在下文中陳述本發 明之方法可使用之解釋性報告者基因的更詳細說明。 蟲螢光素酶 蟲螢光素酶是在氧和受質(蟲螢光素)存在下發光的酵 素，並已經在細胞培養、個別細胞、整個生物和基因轉質 之生物中，用於基因表現的真_時、低_光顯影（由&
Szalay，2002, Luminescence 17(1):43-74回顧）。 當在本文中使用時，關於本發明所使用之“蟲螢光素酶” 一闺，企圖包括所有的蟲螢光素酶，或衍生自具有蟲螢光 素酶活性之蟲螢光素酶的重組酵素。已經完全定出得自螢 火蟲之蟲螢光素酶基因的特徵，例如得自螢火蟲屬 (Photinus)和絲角螢屬（Luci〇ia)之物種（參見，例如國際專 利公開案第WO 95/25798號的北美螢火蟲（Ph〇Unus pyralis) ’歐洲專利申請案第EP 〇 524 448號的.十字絲角勞 (Luciola cruciata)和側絲角螢（Luciola lateralis)，以及
Devine# 人，1993, Biochim. Biophys· Acta 1173 (2):121-132 t S 1 144243.doc -79- 1356848 的明格里卡絲角螢（Luciola mingrelica)。其他真核生物的 蟲螢光素酶基因包括，但不限於海三色堇（sea panzy)(海三 色莖（Renilla reniformis)，參見，例如 Lorenz 等人，1991， Proc Natl Acad Sci USA 88(10):4438-4442)，以及無翅螢火 蟲（無翅螢火蟲（Lampyris noctiluca)，參見，例如Sula-Newby等人，1996, Biochem J. 313:761-767)。細菌的蟲螢光 素-蟲螢光素酶系統，包括但不限於陸生螢光光桿菌
(Photorhabdus luminescens)的細菌 lux 基因（參見，例如 Manukhov等人，2000, Genetika 36(3):322-30)，和海洋細菌 費氏弧菌（Vibrio fischeri)和哈氏弧菌（Vibrio harveyi)(分別 參見，例如 Miyamoto 等人，1988， J Biol Chem. 263(26):13393-9 和 Cohn 等人，1983，Proc Natl Acad Sci USA.，80(1):120-3)。本發明所包括之蟲螢光素酶，亦包含 在Squirrell等人之美國專利第6,265，177號中描述的突變種 蟲螢光素酶，將其全文以引用的方式併入本文中。 綠螢光蛋白質 綠螢光蛋白質（“GFP”）是238個胺基酸的蛋白質，其中胺 籲 基酸65至67涉及發色團的形成，不需額外的受質或輔因子 來發出螢光（參見，例如Prasher等人，1992，Gene 111 :229-233; Yang 等人，1996，Nature Biotechnol. 14:1252-1256和 Cody等人，1993, Biochemistry 32:1212-1218)。 當在本文中使用時，關於本發明所使用之“綠螢光蛋白 質”或“GFP” 一詞，企圖包括所有的GFPs (包括顯示出綠色 以外的顏色的各種形式之GFPs)，或衍生自具有GFP活性之 • 80 - 144243.doc IS 1 1356848 GFPs的重組酵素。從生物發光的水母（水母（Aequorea victoria))中，選殖GFP的天然基因（參見，例如Morin等人， 1972, J. Cell Physiol. 77:313-318)。野外型 GFP 在 395 毫微米 處具有主要的激發高峰，並在470毫微米處具有次要的激 發高峰。在470毫微米處的吸光度高峰，容許使用標準的 螢光素異硫代氰酸酯（FITC)濾紙組來監視GFP含量。已經 發現GFP基因的突變種，可用來增強表現，並修改激發和 螢光。例如，以丙胺酸、甘胺酸、異亮胺酸或蘇胺酸取代 在位置65處之絲胺酸的突變種GFPs，結果使突變種GFPs在 激發最高點出現位移，並當在488毫微米處激發時，有比 野外型蛋白質更大的螢光（參見，例如Heim等人，1995, Nature 373:663-664;美國專利第 5,625,048 號；Delagrave 等 人，1995, Biotechnology 13 :1 5 1 -1 54; Cormack 等人，1996, Gene 173:33-38 和 Cramer 等人，1996，Nature Biotechnol. 14:315-319)。在488毫微米處激發GFP的能力，容許將GFP 用於標準螢光激活細胞分類（“FACS”）設備。在另一個具體 實施例中，從水母以外的生物中分離GFPs，像是但不限於 海三色堇，海三色蓳。 EGFP是野外型GFP (3_5)的變紅變種，為了在哺乳動物 細胞中更明亮的螢光和更高的表現，而充分運用它。（最 大激發=488毫微米；最大發射=507毫微米）。EGFP編碼 GFPmutl，其含有Phe-64至Leu和Ser-65至Thr的雙-胺基酸 取代。EGFP基因之密碼序列含有超過190個無聲鹼基變 化，其與人類的密碼子-使用偏好一致。 144243.doc -81· 1356848 β_半乳糖芬酶 β-半乳糖-苷酶（“b-gal”）是催化b_半乳糖站，包括乳糖，以 及半乳糖站類似物鄰-硝苯基-b-D-吡喃半乳糖甚（“onpg，》
和氣酚紅-b-D-吡喃半乳糖芬（“cprg”）之水解作用的酵素 (參見，例如Nielsen等人，1983 Proc Natl Acad ^丨 USA 80(Ι7)··5198-5202; Eustice等人，1991，Bi〇techniqUes 1I:739-742 以及 Henderson等人，1986, Clin. Chem. 32:1637-1641)。 b-gal基因非常適合作為報告者基因，因為其蛋白質產物是 極穩定的，對於在細胞溶胞產物中之蛋白水解的降解作用 馨 有抵抗力，並容易測定^當使用〇NPG作為受質時，可利 用为光光度计或微盤讀取器來定量b_gal活性。 當在本文中使用時，關於本發明所使用之"半乳糖 贫酶”或"b-gal"—詞’企圖包括所有的b_gals，包括lacZ基 因產物，或衍生自具有b-gal活性之b_gals的重組酵素。b_ gal基因非常適合作為報告者基因，因為其蛋白質產物是極 穩定的，對於在細胞溶胞產物中之蛋白水解的降解作用有 抵抗力，並容易測定。在〇NPG為受質的具體實施例中，籲 可利用分光光度計或微盤讀取器判定在42〇毫微米處轉變 之ONPG的量，來定量b-gal活性。在cpRG為受質的具體實 把例中，可利用分光光度計或微盤讀取器判定在57〇至595 毫微米處轉變之CPRG的量，來定量b-gai活性。 氯倒t素乙酿轉移酶 氯黴素乙醯轉移酶（“CAT”）在哺乳動物細胞系統中，經 常用來作為報告者基因，因為哺乳動物細胞沒有可檢測之 -82- 144243.doc m 1356848 含量的CAT活性。CAT的測定涉及將細胞萃取物與放射性 標示之氯黴素和適當辅因子一起培養，藉著例如薄層層析 法（“TLC”）從產物中分離起始物質，接著是閃爍計數（參 見，例如美國專利第5,726,041號，將其全文以引用的方式 併入本文中）。 當在本文甲使用時，關於本發明所使用之“氯黴素乙醯 轉移酶”或“CAT”一詞，企圖包括所有的CATs，或衍生自 具有CAT活性之CAT的重組酵素。雖然最好是不需要細胞 加工、放射性同位素和層析分離的報告者系統，將更可接 受高輸貫量的篩選，但在報告者基因之穩定性極為重要的 情況下，以CAT作為報告者基因可能是較佳的。例如， CAT報告者蛋白質具有大約5〇小時的在活體内之半衰期， 當想要累積對動力學變化類型之結果時，這是有利的。 分泌性驗性磷酸酶 分泌性鹼性磷酸酶（“SEAP”）酵素是鹼性磷酸酶的截短形 式，其中蛋白質之穿透膜功能部位的切開，容許將其從細 胞中分泌至周圍培養基内。 當在本文令使用時，關於本發明所使用之“分泌性鹼性 磷酸酶，，或“SEAP”一詞，企圖包括所有的SEAp，或衍生自 具有鹼性磷酸酶活性之SEAP的重組酵素。可藉著各種方 法檢測SEAP活性’包括但不限於測量螢光受質之催化作 用、免疫沉澱法、HPLC和放射檢測。發光法是較佳的， 因為它增加的敏感性勝過熱量檢測法。使用SEAp的優點 是不需要細胞溶解步驟，因為SEAP蛋白質被分泌到細胞 144243.doc -83- 1356848 外，其有助於採樣和測定程序的自動化。在Potts等人之美 國專利第6,280,940號中描述了以細胞為基礎，使用SEAP 的測定，可用在C型肝炎病毒蛋白酶抑制劑之以細胞為基 礎的評估中，將其全文以引用的方式併入本文中。 4.5.7.細胞培養系統、胚胎卵和動物模式 可使用此項技藝中已知的細胞培養系統，繁殖或測試本 發明之病毒的活性（參見，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL，2000, ASM Press 第 25-29 頁，將其全文以 籲 引用的方式併入本文令）。這類細胞培養系統的實例，包 括但不限於從動物組織製備的原始細胞培養物（例如衍生 自猴腎、人類胚胎羊膜、腎臟和包皮以及雞或老鼠胚胎的 細胞培養物）；由單一類型之均一族群所組成的二倍體細 胞品系，在染色之前可分裂高達100次（例如衍生自人類胚 胎的細胞培養物，像是衍生自人類胚胎肺臟的WI-38品 系）；以及由單一細胞類型組成的連續細胞株，並可在培 養中無限期地繁殖（例如HEp-2細胞、Hela細胞、Vero細 鲁 胞、L和3T3細胞以及BHK-21細胞）。 亦可在雞胚中繁殖本發明之病毒。在受精後5至14天， 在殼上鑽孔，並將病毒注射到適合其複製的地方。 在本發明中可使用任何此項技藝中已知的動物模式，達 成各種目的，像是判定本發明之疫苗的效力和安全性。這 類動物模式的實例包括，但不限於棉鼠（棉鼠（Sigmodon hispidis))、倉鼠、老鼠、猴子和黑猩猩。在較佳的具體實 -84- 144243.doc m 1356848 施例中，使用敘利亞黃金倉鼠。 4.5.8.中和測定 可進行中和測定，提出將異源表面糖蛋白併入病毒粒子 内’是否可能產生改變病毒向性表現型之結果的重要安全 性爭論。當在本文中使用時，“向性，’_詞意指病毒對特： 細胞類型的親和力。通常藉著出現在特定細胞上的細胞受 體’來判定向性，其容許病毒侵入並僅限於該特定細胞類 型。藉著使用異源表面糖蛋白的祕3 (非限制性的實例為 負股RNA病毒的F蛋白質），#包括對抗該異源表面糖蛋白 之抗體的多株抗血清，來進行中和測定。測試不同稀釋度 的抗體’看是否可中和本發明之嵌合型病毒。異源表面糖 蛋白不應該以；L以導致抗體結合和t和作用的量，出現在 病毒粒子表面上。 4.5.9.蔗糖梯度測定 可藉著使用生化測定，進一步調查異源蛋白質是否被併 入病毒粒子内的問題。可在2〇_6〇%的蔗糖梯度中，分級分 離被感染細胞的溶胞產物，收集各種溶離份，並藉著西方 墨點法，分析異源蛋白質和載體蛋白質的存在與分布。亦 可藉著/谷菌斑测定，就高峰病毒力價，測定溶離份和病毒 蛋白質。在下文第23節中提供了蔗糖梯度測定的實例。當 異源蛋白質與病毒粒子結合時，它們將與病毒粒子一起移 動。 4.6.使用敢合型病毒的疫苗調配物 本發明包括含有本發明之經過設計之負股RNA病毒的疫 144243.doc -85- 1356848 苗調配物。可使用本發明之重組ριν病毒，作為表現外來 抗原決定位的料，該抗原決定位誘導對任何各種病原的 保護性反應。在特定的具體實施例中，本發明包括在疫苗 調配物中使用已經修改的重組bpiv病毒或減毒的hpiv 與對hPIV感染的保護。 一本T明之疫苗製品包括多價疫苗，包括二價和三價的疫 田製可以一個表現每個異源抗原序列的pIV載體，哎 二或多個分別編石馬不㈣異源抗原彳列之PIV載體的形 式扠予本發明之二償和三價疫苗。例如，可將表現一或 多個異源抗原序列的第—個嵌合型PIV，與表現―或多個 異源抗原序列的第二個嵌合型PIV-起投予，#中在第二 個嵌。型PIV中的異源抗原序列，與在第—個嵌合型PIV中 的異源抗原序列不同。在第—和第二個嵌合型PIV中的里 源抗原序列，可衍生自相同的病毒，但編碼不同的蛋白 質或何生自不同的病毒。在較佳的具體實施例令，在第 -個嵌合型PIV中的異源抗原序列，係衍生自呼吸道融合 :胞病’’而在第二個嵌合型PIV中的異源抗原序列係 4丁生自人類間質肺病毒。在另—個較佳的具體實施例中， 在第-個嵌合型PIV巾的㈣抗原序列係衍生自啤吸曾 融合細胞病毒，而在第二個嵌合型PIV中 ： 列，係衍生自禽肺病毒。 原序 在某些較佳的具體實施例中，使用本發明之疫配 物’保護對抗由負股RNA病毒引起的感染，包括但不限於 流感病毒、—毒、呼吸道融合細胞病毒和哺乳動物 144243.doc IS1 •86- 1356848 間質肺病毋（例如人類間質肺病毒）。更特定而言，使用本 發明之疫苗調配物’保護對抗自人類間質肺病毒及/或禽 肺病毒引起的感染。在某些具體實施例中，使用本發明之 疫Ϊ9調配物#護對抗由⑷人類間質肺病毒和呼吸道融合 、’’田胞病骨及/或（b)禽肺病毒和呼吸道融合細胞病毒引起的 感染。 在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由（a)人類間質肺病毒和人類副流感病毒及/或（b)禽肺 病毒和人類副流感病毒引起的感染。 在某些具體實把例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由（a)人類間質肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副 流感病毒及/或（b)禽肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類 w1】流感病毒引起的感染。 在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物’保護 對杬由人類間質肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副流 感病毒引起的感染。在某些其他的具體實施例中，使用本 發明之疫苗調配物，保護對抗由禽肺病毒、呼吸道融合細 胞病毒和人類副流感病毒引起的感染。 因為在不同病毒物種之F蛋白質中的高度同種性，關於 代表性的胺基酸序列比較，參見圖1，故可使用本發明之 疫苗調配物’保護免於與從其中衍生編碼F蛋白質之異源 核苷酸序列的病毒不同的病毒。在特定的代表性具體實施 例中’該疫苗調配物含有包括衍生自禽肺病毒A型之異源 核菩酸序列的病毒，並使用該疫苗調配物，保護免於禽肺 144243.doc •87- 1356848 病毒A型和禽肺病毒B型的感染。在另一個特定的代表性 具體實施例中，該疫苗調配物含有包括衍生自禽肺病毒C 類之異源核苷酸序列的病毒，並使用該疫苗調配物，保護 免於禽肺病毒C類和禽肺病毒D類的感染“。 本發明包括待投予人類和動物的疫苗調配物，其可用來 保護對抗PIV、流感、RSV、仙臺病毒、腮腺炎、喉氣管 炎病毒、猿病毒5、人類乳頭狀瘤病毒以及其他病毒和病 原。本發明更進一步包括待投予人類和動物的疫苗調配 物，其可用來保護對抗人類間質肺病毒感染和禽肺病毒感 鲁 染。 在一個具體實施例中，本發明包括可用來對抗家畜致病 原，包括狂犬病病毒、描白血病病毒（FLV)和犬痕熱病毒 的疫苗調配物。在另一個具體實施例中，本發明包括可用 來保護家畜對抗水癌性口炎病毒、狂犬病病毒、牛癌病 毒、豬痘病毒，並進一步保護野生動物對抗狂犬病病毒的 疫苗調配物。 在本文中描述之疫苗和醫藥組合物中，可使用藉著逆向 ® 遺傳方法產製的減毒病毒。亦可使用逆向遺傳技術，為其 他對產生疫苗很重要的病毒基因，設計額外的突變。例 如，在5'非-密碼區中的突變，可影響mRNA轉譯，咸相信 在衣殼蛋白質中的突變會影響病毒的裝配，而感溫性和感 冷性的突變種，通常具有比親代病毒更低的病原性（參 見，例如 Flint 等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, -88 - 144243.doc IS 1 丄 2000, ASM Press第67G_683頁，將其全文以引用的方式併 入本文中）。可將有用病毒品系變種的抗原決定位対 錢毒病毒内。或者，可將完全外來的抗原決定位，包括 何生自其他病毒或非-病毒病原的抗體設計在減毒品系 内例如，可將無關的病毒，像是hiv㈣、咖2〇、 g:41)、寄生蟲抗原(例如瘧疾)、細菌或真菌抗原，或腫瘤 抗原’設計在減毒品系内。或者，可將在活體外改變病毒 向！·生的抗原決疋位’設計在本發明之喪合型減毒病毒内。 主幾乎可將任何的異源基因序列建構至本發明之嵌合型病 毋内X便在疫田中使用。較佳的是，對任何各種的病原 誘導保護性免疫反應的抗原決^位，或與中和抗體結合， 可由嵌合型病毒表現’或為其一部分的抗原。例如，可建 構至本發明之嵌合型病毒㈣異源基因序列，包括但不限 於流感和副流感血球凝集素·神經胺糖酸芬酶，以及融合 糖蛋白’像是人類PIV3的酬。F基因。在另一個具體實施 例中，可設計在嵌合型病毒内的異源基因序列，包括編碼 具有免疫強化活性之蛋白質的那些。免疫強化蛋白質的實 例包括，但不限於細胞激動素、干擾素第丨型、丫干擾素、 菌落刺激因子、介白素-1、_2、-4、-5、-6、-12。 此外，可被建構至本發明之嵌合型病毒内，並在疫苗中 使用的異源基因序列’包括但不限於衍生自人㈣疫缺陷 病毒（HIV) ’最好是第1或第2型的序列。在較佳的具體實 施例中，免疫原性之HIV·衍生肽，可以是建構至嵌合型 PIV内之抗原的來源，然後用它來誘發脊椎動物的免疫反 144243.doc -89- 1356848 應。這類HIV·衍生之肽，可包括但不限於衍生自env基因 (即編碼全部或部分gpl60、gpl2〇及/或gp41的序列）、p〇1基 因（即編碼全部或部分逆轉錄酶、.核酸内切酶、蛋白酶及/ 或接合酶的序列）、gag基因（即編碼全部或部分p7、p6、 p55、pl7/18、p24/25 的序列）、tat、rev、nef、vif、vpu、 vpr及/或vpx的序列。 其他的異源序列可衍生自B型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) ; A或C型肝炎病毒表面抗原、愛氏頓病毒的糖蛋 白；人類乳頭狀瘤病毒的糖蛋白；呼吸道融合細胞病毒、 副流感病毒、仙臺病毒、猿病毒5或腮腺炎病毒的糖蛋 白；流感病毒的糖蛋白；疱疹病毒的糖蛋白；骨髓灰白質 炎病毒的VP1 ;諸如細菌和寄生蟲之類非_病毒性病原的抗 原決定位，此外還有报多。在另一個具體實施例中，可表 見王口P或。p刀的免疫球蛋白基因。例如，可將模仿這類抗 原決定位的抗-遺傳性型之免疫球蛋白的可變區建構至本 發明之嵌合型病毒内。 其他的異源序列可衍生自腫瘤抗原，並可使用所得的嵌 δ尘病毋產生對抗該腫瘤細胞的免疫反應，導致腫瘤在活 體内退化。為了治療腫瘤，這些疫苗可與其他治療攝生法 併用，包括但不限於化學治療、輻射治療、手術、骨髓移 植等等。根據本發明，可設計重組病毒，表現與腫瘤有關 的抗原（TAAs)，包括但不限於由丁細胞認出的人類腫瘤抗 原（Robbins和 Kawakami，1996, Cun·· Opin. Immimol. 8:628- 636 ’將其全文以引用的方式併人本文中）、黑色素細胞系 144243.doc 1356848 統的蛋白貝’包括 gpl〇〇、MART-l/MelanA、TRP-l (gp75)、酪胺酸酶；腫瘤專一的廣泛共享之抗原，mage_ 1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、N-乙醯葡萄糖胺基轉移 酶-V、Pl5 ;腫瘤專一的突變抗原，S-凱特寧“-catenin)、 MUM-1、CDK-4 ;乳房、印巢、子宮頸和膜臟癌的非黑色 素瘤抗原、HER-2/neu、人類乳頭狀瘤病毒_E6、_E7、 MUC-1。
在另一個具體實施例中，異源核苷酸序列係衍生自間質 肺W H人類間質肺病毒及/或切病#。在另外的 -體貫；例令，本發明之病毒含有兩個不同的異源核替酸 序列’其中-個衍生自間質肺病毒，像是人類間質肺病毒 及/或禽肺病毒，而另—個衍生自呼吸道融合細胞病毒。 異源核嘗酸序列編碼個別病毒的F蛋白質或G蛋白質。在特 定的具體實施例十，異源核芬酸序列編碼嵌合型F蛋白 質：其中該嵌合型F蛋白質含有間質肺病毒之F蛋白質的外 功能部位以及副流感病毒U蛋白質的穿透膜功能部位和 魯米那功能部位。 /調配活的重組病毒疫苗或失活的重組病毒疫苗。活疫 日較佳因為在宿主中增殖，導致與在自然感染 ―斤毛生之刺激類似種類和大小的延長刺激，並因此賦與 持續的免疫力…吏用涉及在細胞培養物或 尿囊中繁殖病毒的傳統方法，接著純化，完成這 二父r疫苗調配物的產製。另外，已經證實瞒 人類中疋非-病原性的，該病毒極適合用來作為活疫苗。 I44243.doc -91 - 1356848 關於這點’為了疫苗而使用遺傳設計的piv (载體），可 能希望在這些品系中，有減毒特徵的存在。將適當的突變 (例如刪除）導入用來轉移感染的模板中，可提供具有減毒 特徵的新穎病毒。例如，可將與感溫性或冷適應性有關的 特定誤義突變，做成刪除突變。這些突變應該比與感冷或 感溫性突變種有關的點突變更穩定，且逆轉的頻率應該很 低。 或者，亦可建構具有”自殺"特徵的嵌合型病毒。這類病 毒在宿主内將僅完成一次，或數次複製。當用來作為疫苗 時，重組的病毒將完成有限回合的複製，並引起足夠程度 的免疫反應，但它將不會在人類宿主中進一步運轉，並引 起疾病。缺乏-或多個PIV基因，或持有突變PIV基因的重 組病毒，將不能經歷成功的連續複製.可在永久表現這類 基因（們）的細胞株中，產製有缺陷的病毒。缺乏必要基因 (們）的病毒將在這些細胞中複製，然而，當投予人類宿主 時’它們將不能完成-回合的複製。這類製品可轉錄和轉 譯·-在該不成熟的回合中―足夠數目的基因，而誘導免疫反 應。或者’可投予較大量的品系，使這些製品得以作為2活 的(死的)病毒疫苗。關於失活的疫苗，最好是以病毒組份 之形式來表現異源基因產物，使基因產物得以與病毒粒； 結合。這類製品的優點是它們含有天然蛋白質， 藉者福馬林或其他用來製造死毒疫苗之製劑處理的失活作 用。或者’可將由⑽八製造的突變PIV高度減毒复 可複製數回合》 /、僅 144243.doc ^56848 在本發明該項觀點的並 ，、他具體貫施例中，可使用傳統技 術來"殺死”嵌合型病毒，制 文 衣備失活的疫苗調配物。失活的 疫苗是"死的”，在責義i & 士― 心莪上耒說，已經破壞了它的傳染性。 破只，破壞病毒的傳举袖 仁不影響其免疫原性。為了製 備失活的疫苗，可使嵌合 里病节·生長在細胞培養物中，或 在雞胚的尿囊中，葬签 錯者&域超離心作用純化，藉著甲醛或 备-丙醇酸内酯失活，並收隹 收木之。所得的疫苗通常以肌肉内 接種。
可使用各種技術來評估根據本發明之疫苗的效力和安 全。有效的疫苗是藉著弓，起適當天生的細胞和體液反應， 保護接種疫苗之個體免於病原弓丨起的疾病，並具有最低副 用的疫苗《田不;起疾病。可使用任何能夠測量病 毒之複製，以及接種疫苗之個體的免疫反應的技術，來評 估病毒。在下文的實例章節中提供非_限制性的實例。 4.6丄本發明t疫苗或免疫原製品的劑量攝生法和投藥 本發明提供疫苗和免疫原製品，包括表現一或多個異源 或非-天餘原序列的嵌合型PIV。本發明之疫苗或免疫源 製品’包括單一或多價的疫苗’包括二價和三價的疫苗。 本發明之疫苗或免疫原調配物，可用來提供對抗各種病毒 感染的保護。特定而言，本發明之疫苗或免疫原調配物提 供宿主對抗呼吸道感染的保護。 可單獨或與其他疫苗一起投予本發明之重組病毒及/或 疫苗或免疫原調配物。較佳的是，與其他提供對抗呼吸道 疾病之保護的疫苗或免疫原調配物，一起投予本發明之疫 [S1 144243.doc -93- 苗或免疫原調配物，像是但不限於呼吸道融合細胞病毒疫 苗、流感疫苗、肺炎球菌疫苗、立克次體疫苗、葡萄球菌 疫苗、百日咳疫苗或對抗呼吸道癌症的疫苗。在較佳的具 體實施例中，本發明之病毒及/或疫苗可與在相符年齡建 議之小兒科疫苗同時投予。例如，在2、4或6個月齡時， 本發明之病毒及/或疫苗可與DtaP (IM)、Hib (IM)、骨髓灰 白質炎（IPV或OPV)和B型肝炎（IM)同時投予。在12或15個 月齡時，本發明之病毒及/或疫苗可與Hib (IM)、骨髓灰白 質炎（IPV或 OPV)、MMRII® (SubQ) ; Varivax® (SubQ)和 B型 肝炎（IM)同時投予。在各種出版物中回顧可與本發明之方 法一起使用的疫苗，例如The Jordan Report 2000, Division of Microbiology and Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health，United States，將其全文以引用的方式併入本文 中〇 可將本發明之疫苗或免疫原調配物本身投予個體，或以 醫藥或治療組合物之形式投予。包括佐劑和本發明之免疫 原抗原（例如病毒、嵌合型病毒、突變病毒）的醫藥組合 物，可藉著傳統的混合、溶解、粒化、製造糖衣錠、研 磨、乳化、包膠、陷入或冷;東乾燥加工的方法來製造。可 使用一或多種在生理學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑 或輔助劑，以傳統的方式調配醫藥組合物，其有助於將本 發明之免疫原抗原加工成可在藥學上使用的製品。其中， 適當的調配物將視所選擇的投藥途徑而定。 144243.doc -94- 1356848 當本發明之疫苗或免疫原組合物包括佐劑或與一或多種 佐劑一起投予時，可使用的佐劑包括，但不限於無機鹽佐 劑或無機鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微顆粒佐劑、黏液的佐 劑和免疫刺激性的佐劑。佐劑之實例包括，但不限於氫氧 化鋁码鲅鋁凝膠、福瑞德氏完全佐劑、福瑞德氏不完全 佐劑角鯊烯或角鯊烧水包油佐劑調配物、生物可降解和 生物可相容的聚酯類、聚合的微脂粒、三萜系糖苷或皂角
甘（例如 QuilA和 QS-21 ’ 亦以商標 STIMULON、ISCOPREP 販售）、N-乙醯基_胞壁醯基_l-蘇胺醯基_d_異穀胺醯胺（蘇 胺醯基-MDP，亦以商標TERMURTIDE販售）、Lps、單磷 醯基脂質A (3D-MLA ’亦以商標MPL販售）。 投予本發明之疫苗或免疫原組合物的個體較好是哺乳動 物，最好是人類，但亦可以是非_人類的動物，包括但不 限於靈長類、牛、馬、綿羊、豬、禽類（例如雞、火雞）、 山羊、貓、狗、倉鼠、老鼠和大鼠。 可使用許多方法，導入本發明之疫苗或免疫原組合物， 包括但不限於口服、皮内、肌肉内、腹腔内、靜脈内、皮 下、鼻内的路徑，並經由劃痕法（經由皮膚的上層劃痕， 例如使用分叉的針頭）。 關於局部投藥’可將本發明之疫苗或免疫原製品調配成 此項技藝中已熟知的溶液、凝膠、軟膏、乳霜、懸浮液等 等。 至於吸入投藥’可以從加壓包裝或霧化器提供之氣溶膠 喷霧的形式，便利地遞送根據本發明使用之製品，並使用 144243.doc •95- ⑽ 48 適當的推進劑，例如二氣二氟尹烷、三氣氟甲烷、二氯四 氟乙貌、二氧化碳或其他適當的氣體。在加麼氣溶膠的案 ::丨中，可藉著提供活門’遞送計量過的含量，來判定劑量 早位。可調配在吸入器或吹藥器中使用的膠囊和藥筒，使 其含有化合物之散劑混合物，以及適當的散劑基底，像是 乳糖或殺粉。 關於注射’可在含水溶液中，最好是在生理學上可相六 的緩衝溶液，像是漢克氏液、林格氏液或生理鹽水緩衝: 液中’調配疫苗或免疫原製品。該溶液可含有調配劑，像 X在使用之前，利用適當的媒劑，例如無菌無熱 重建。 熟諸此藝者有能力判定投藥用的疫苗或免疫原調配物的 有效含量，特別是根據在本文中提供的詳細揭示内容。 一開始可從在活體㈣測定，估計有效劑量1如，可 使用此項技藝中已熟知的技術，調配在動物模式中達到誘 反應的劑量。熟諸此藝者可以在本文中描述的結果 礎，輕易地充分運用對所有動物物種的投藥。可個別 地調整劑量含量和間隔。 ^ 例如，當用來作為免疫原組合物 時，適當的劑量是當按昭 的組合物量。當用來作2又樂時，能夠誘發抗體反應 作為疫备時’可在1-36週的期間，以 大約1 曰至3個劑量’投予本發明之疫苗或免疫原調配物。較 佳的是以大約2週至夫的 約4個月的間隔’投予1或2個劑量， 之後定期給予補強的疫苗接種。交替的草案可能適合個別 144243.doc IS] -96- 1356848 的動物。適當的劑量是當按照上述投藥時，能夠使在被免 疫動物中的免疫反應升高，足以保護該動物免於感染至少 4至12個月的疫苗調配物量。一般而言，出現在劑量中之 抗原的量，範圍是從每公斤宿主大約丨微微克到大約1〇〇毫 克，通常是從大約10微微克到大約丨毫克，而較佳的是從 大約100微微克到大約丨微克。適當的劑量範圍，將視注射 路徑和患者的尺寸而？文變，但通常範圍是從大約01毫升到 大約5毫升。 在特定的具體實施例中，以至少1〇3 TCID5〇、至少1〇4 TCID50、至少105 TCId5〇、至少1〇6 Tci〇5。之開始單一劑 量，投予本發明之病毒及/或疫苗。在另一個特定的具體 實施例中’以多個劑量投予本發明之病毒及/或疫苗。在 較佳的,、體實;^例中，使用在2、4和6個月齡時的最初給 藥攝生法’以及在生命第二年開始時的補強給藥。更佳的 是，以多次給藥攝生法’給予至少1〇5 TciD5〇或至少1〇6 TCID5〇的每個劑量。在臨床試驗中，可使用病毒的複製速 率作為調正疫田劑1的指標。例如，可使S測試病毒複製 速率的測定（例如生長曲、線，關於可利用的測定，參見4.5 節）’比較本發明之病毒及/或疫苗的複製速率與bPIV3的速 率在先別的研九中已證實之（參見Clements等人，J. Clin Microbiol. 29：Π75-82(1991); Karron ^ Λ , Infect. Dis. 171.1107-14 (1995)； Karron # A, Ped. Inf. Dis. J. 5:650-654(1996)。這些研究顯示牛piV3疫苗通 健康的人類志願者所能完全忍受的，包括成一二 144243.doc -97- 1356848 齡的兒童以及2-6個月齡的嬰兒。在這些研究中’個體接 受至少一個劑量從1〇3 TCID5〇至106 TCID5〇的bPIV3疫苗。 12個兒童改而接受兩個劑量的1〇5 TCID5〇 PIV3疫苗代替一 個劑量，沒有不利的影響）。可與bPIV3相比擬的複製速 率，暗示在臨床試驗中可使用可相比擬的劑量。與bPIV3 相比較，較低的複製速率暗示可使用較高的劑量。 下列的實例係用來解釋，而非限制本發明。如下維持在 實例ΐ使用的細胞和病毒·使RSV A2品糸和載有牛副流感 第3型/人類副流感第3型之RSV病毒（bPIV3/hPIV3/RSV病 毒），在健大黴素的存在下生長在在〇pti-MEM (Gibco/BRL) 中的Vero細胞中。使表現噬菌體T7 RNA聚合酶的經過修改 之疫苗病毒安卡拉（MVA-T7)或禽-痘-T7 (FP-T7)生長在雞 胚腎臟細胞（SPAFAS)中。將Vero、HeLa和Hep-2細胞維持 在補充有10%胎牛血清（FBS)、2mM L-穀胺醯胺、非-必要 胺基酸和抗生素的MEM (JRH Biosciences)中。
實例1 :建構並選殖嵌合型牛副流感3/人類副流感3 cDNA 為了以hPIV3的F和HN基因取代bPIV3的那些，將額外的 限制酵素位置導入傳染性的bPIV3 cDNA内，使用指定位 置之突變生成作用，在bPIV3 cDNA的核苷酸位置5041處， 導入獨特的Nhe I位置，並在核站酸8529處，導入Sail位 置。以Nhel和Sail限制酵素處理經過修改的全長bPIV3 cDNA ’並藉著凝膠純化作用，分離包括除了 F和HN基因 之外所有病毒bPIV3序列的14 kb DNA片段。 欲獲得hPIV3F和HN基因序列，以hPIV3品系（hPIV3/Tex/ 144243.doc -98· 1356848
12084/1983)感染10公分培養皿的匯合Vero細胞。在37°C下 培養3天之後，收獲細胞，並使用RNA STAT-LS 50 (Tel-Test Inc.)分離總 RNA。 藉 著逆轉錄作用 ，使用 hPIV3 專一 的寡，在hPIV3基因組的位置4828處黏接，產生病毒 cDNA。藉著PCR (聚合酶連鎖反應），使用Taq聚合酶，擴 大hPIV3卩和HN基因。將PCR產物選殖到pT/A TOPO選殖載 體（Invitrogen)内，並從兩個純種系（11號和14號）中，定序 hPIV3 F和HN基因。序列分析顯示，關於純種系11號，F基 因是正.確的，但HN基因含有反常的序列；關於純種系14 號，HN基因是正確的，但F基因含有反常的中止密碼子。 因此，藉著以下列方式混合11號的正確F基因與14號的正 確HN基因，建構包含具有功能之hPIV3 F和HN基因的質 體。以Nhe 1和EcoRl消化兩個hPIV3質體（11號和14號）。一 個1.6 kb之片段，藏有分離自純種系11號的正確F基因，以 及一個8.5 kb之片段，含有分離自純種系14號的正確HN基 因和質體序列。連接兩個片段，產生含有完整hPIV3 F和 HN基因的質體。藉著DNA序列分析證實正確的序列。最 後，在非轉譯區域中之HN基因的3'末端處，加入一個核茹 酸，以便滿足“六的規則”。可藉著使用QuikChange突變生 成套組（Stratagene)完成單一核|酸的加入，並藉著DNA定 序證實之。然後藉著以Nhe 1和Sal 1消化，分離正確的 hPIV3 F和HN基因DNA片段，並以凝膠純化；3·5 kb之DNA片 段。 藉著連接上述之藏有bPIV3序列的14.5 kb DNA片段與含 [S 1 144243.doc -99- 1356848 有hPIV3 F和HN基因的3.5 kb DNA片段，建構全長的b/h PIV3嵌合型cDNA (參見圖3)。藉著延伸限制酵素作圖，證 實全長的嵌合型質體DNA。此外，可藉著對兩個含有 bPIV3和hPIV3序列，以及Nhe 1和Sal 1限制酵素位置分別 進行DNA定序，證實嵌合型構築體的M/F和HN/L基因接合 點。 實例2 :建構並選殖載有呼吸道融合細胞病毒F或G cDNAs 的嵌合型牛副流感3/人類副流感3 為了判定在b/h PIV3基因組之位置1或2中，插入RSV抗 · 原對病毒複製的影響，將呼吸道融合細胞（RSV)F和G基因 選殖到嵌合型牛副流感3/人類副流感3載體（b/h PIV3載體） 的不同位置内。參見圖4。 為了將外來基因插入牛/人類（b/h) PIV3 cDNA内，藉著 指定位置之突變生成作用，使用QuickChange套組 (Stratagene)，將AvrII限制酵素位置導入b/h PIV3 cDNA質 體（Haller等人，2000; 2001，這是與在實例5中相同的構築 體）内。使用下列的募 5'GAA ATC CTA AGA CCC TAG GCA · TGT TGA GTC3·及其互補物，將一個AvrII位置導入b/h PIV3基因組中的核苷酸（nt) 104處，使四個核茹酸改變。 使用該限制酵素位置，在病毒基因組的第一個（最靠近3’） 位置中插入RSV基因。使用下列的寡 5'CCACAACTCAATCAACCTAGGATTCAT GGAAGACAATG3,及其互補物，將另一個AvrII位置導入在 nt 1774處的N-P基因間區域中，使兩個核甞酸改變。使用 -100- 144243.doc m 1356848 該限制位置，在b/h PIV3之N和P基因之間的第二個位置中 插入RSV基因（圖4)。藉著逆向遺傳學，針對病毒恢復之官 能性，測試在nts 104和1774處藏有AvrII位置的全長b/h PIV3 cDNAs。 RS V G卡匣（N-P基因中止/開始）的建構：使用b/h PIV3 cDNA作為PCR模板，產生DNA片段，其含有bPIV3 N-P基因間 區域，以及RSV G基因的3'端序列。藉著PCR，使用下列的 募 ：
5'CCCAACACACCACGCCAGTAGTCACAAAGAGATGACCACTATCAC3' 和 5'CCCAAGCTTCCTAGGTGAATCTTTGGTTGATTGAGTTGTGG3· 產生該片段。然後使用該片段進行重疊PCR，將RSV G基 因加至bPIV3 N-P基因間區域。至於第二個PCR反應，使用 含有RS V G和F基因的質體作為DNA模板，並使用寡 5'CAGCG GATCCTAGGGGAGAAAAGTGTCGAAGAAAAATGTCC3’ 和 從上文之短PCR片段產生的寡作為引子。將所得的含有 RSV G基因（其與bPIV3 N-P基因間區域連接，並位在AvrII 限制酵素位置側面）之PCR片段，選殖到pGEM3内。定出 RSV G基因之序列，證實完整的開放編閱架構和預測之胺 基酸序列的存在。使用在僅藏有bPIV3基因組前5200個核 甞酸（1-5 bPIV3)，並以AvrII弄直之繼代純種系内的AvrII限 制酵素位置，將藏有RSV G基因的DNA片段插入第一或第 二個位置内。當在此處和其他實例中使用時，1-5 bPIV3意 指牛PIV3基因組的核苷酸1至5196 (或5200)。在該處有 144243.doc • 101 · 1356848
BstBl位置。 RSV F卡匣（N-P基因開始/中止）的建構：藉著PCR，使用 在RSV F基因之5·和3·端加入AvrII的寡，從全長的bPIV3/ RSV F+G cDNA質體中，分離RSV F基因片段，並導入在nt 17*74處藏有AvrII位置，並以AvrII弄直之1-5 bPIV3質體 内。藉著PCR，使用1-5 bPIV3/RSV G2作為模板，分離 bPIV3 N-P 基因間 區域。 使用募 5丨GACGCGTCGACCACAAAGAGATGA CCACTATCACC3,和 在bPIV3 F基因中黏接的寡，產生含有bPIV3 N-P基因間區 域、AvrII位置和高達nt 5200之bPIV3序列的PCR片段。以 Sail和Nhel消化PCR片段，並加至以Sail和Nhel處理，並在 位置2中藏有RSV F基因的1-5 bI>IV3質體中。欲將含有N-P 基因間區域的RSV F基因導入位置1内，使用AvrII切除1.8 kb RSV F卡匣，並連接到在nt 104處含有AvrII位置，並以 AvrII弄直的 1-5 bPIV3 内。 建構帶有短基因間區域之RSV F卡匣（N中止/N開始）：藉 著進行PCR反應，使用1-5 bPIV3/RSV F2作為模板，寡 5'GCGCGTCGACCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAA CCCTAGGACTGTA3'以及在包括AvrII限制酵素位置之RSV F基因5’端上游黏接的寡，完成帶有短N-N基因間區域之 RSV F基因的產製。以AvrII消化含有RSV F基因和短N-N基 因間區域的PCR產物，並導入以AvrII弄直的1-5 bPIV3 nt 104 内。 在藉著限制酵素作圖，證實合宜的方位之後。以SphI和 144243.doc -102- 1356848
BssHII消化在第一個位置藏有RSV基因的質體，並分離4 kb (卜5 bPIV3/RSV G1)或 4·8 kb (1-5 bPIV3/RSV FI) DNA片 段。在第二個選殖步驟中，以Sphl-BssHII 15.1 kb之DNA 片段，加入剩下的b/h PIV3基因組，產生全長的cDNAs。 利用SphI和Nhel切開在第二個位置藏有RSV基因的bPIV3繼 代純種系，並分離5_8 kb (bPIV3/RSV G2)和6.5 kb (bPIV3/RSV F2)的DNA片段。在第二個選殖步驟中，以尺 寸為14 kb之Nhel- SphI DNA片段’加入剩餘的b/h PIV3基 因組。在STBL-2細胞（Gibco/BRL)中繁殖全長的嵌合型b/h PIV3/RSV質體，其提供高產量的全長病毒cDNA質體。 實例3 :載有呼吸道融合細胞病毒F或G的牛副流感3/人類 副流感3，對於在活體外的mRNA產生和蛋白質表現，以及 病毒複製，展現出位置的影響 進行3個實驗，證實在實例2之構築體中的RSV F或G基 因的有效表現，並欲判定在PIV3基因組中之基因插入的位 置影響。 首先，為了證實由嵌合型病毒表現RSV蛋白質，進行嵌 合型病毒-感染之細胞溶胞產物的西方墨點分析，並以 RSV-專一抗血清來探測。參見圖5 A。如下進行西方墨點分 析：以0.1或1.0之MOI，使用嵌合型病毒感染（70-80%)匯合 不足的Vero細胞。在感染後48小時，移出覆蓋的培養基’ 並以1毫升PBS沖洗被感染單層1次。接著以400毫升含有 0.05%b-疏基乙醇（Sigma)的 Laemmli緩衝溶液（Bio-Rad)，溶 解細胞。在12% Tris-HCl準備好的凝膠（Bio-Rad)上，分離 144243.doc -103- 1356848 試樣各15毫升，並使用半-乾的運送細胞（Bio-Rad)將其運 送至尼龍膜。以含有0.5% (體積/體積）之吐溫-20 (Sigma)的 PBS [pH 7.6](PBST)沖洗尼龍膜，並在室溫下以含有5% (重量/體積）奶粉的PBST (PBST-M)阻斷20-30分鐘。在室溫 下，將該膜與在PBST-M中，以1:1000稀釋之RSV F單株抗 體（WHO 1269、1200、1153、1112、1243、1107)的混合 物，或在PBST-Μ中，以1:2000稀釋之RSV G 10181多株抗 體（Orbigen)—起培養1小時。在以PBST沖洗四次之後，在 室溫下將該膜與在PBST-Μ中，以1:2000稀釋之二次辣根過 氧化酶-共輛的山羊抗-老鼠抗體（Dako)—起培養1小時。以 PBST沖洗四次，並使用化學發光受質（Amersham Pharmacia)展開，使Biomax Light軟片（Kodak)曝光，看到 蛋白質譜帶。 與在Vero細胞中降低b/h/RSV fTN-N的複製效率（圖5C， 參見下文）一致，在感染後48小時檢測到的RSV F!含量， 大約比出現在b/h PIV3/RSV F2或野外型RSV A2感染細胞 中的更低10倍（比較跑道2、3和4，圖5A)。50 kDa之譜帶代 表在以所有嵌合型病毒和野外型RSV感染之細胞中檢測到 的F,片段。然而，與野外型RSV相比較，在嵌合型病毒感 染細胞的溶胞產物中，有較多20 kDa F片段的堆積。當以 1.0的較高MOI，重複b/h PIV3/RSV fTN-N感染時（圖5A， 跑道1)，在感染後48小時，b/h PIV3/RSV F1感染細胞中的 F,片段，堆積至野外型RSV的含量。在b/h PIV3/RSV F1或 b/h PIV3/RSV F2感染細胞中，50 kDa和20 kDa F丨片段的相 144243.doc •104- 1356848 對含量為大約1:5。在以嵌合型病毒感染的細胞中未檢測 .到 F〇，表示在b/h PIV3/RSV F1 和 b/h PIV3/RSV F2感染期 間，有效地加工F〇前驅物，如同亦在野外型RSV感染中觀 察到的。 在圖 5A 中顯示 RSV G在 b/h PIV3/RSV Gl、b/h PIV3/RSV G2和野外型RSV感染之細胞中的相對表現。檢測到兩個 RSV G的不成熟和糖基化形式，分別移動至大約50 kDa和 90 kDa。b/h PIV3/RSV G1感染的細胞，顯示出類似在野外 型RSV感染細胞中看到的RSV G表現程度（跑道1和3，圖 5A)。然而’在b/h PIV3/RSV G2感染的細胞中，RSV G的 堆積比‘在野外型RSV感染細胞中出現的更多大約2-3倍（跑 道2和3，圖5A)。這些資料集體地顯示嵌合型b/h PIV3/RSV，在位置1或2處，有效地表現RSV蛋白質。然 而，在位置2藏有RSV基因的病毒，表現較高程度的RSV蛋 白質。 接下來，北方墨點分析顯示與藉著西方墨點分析證實之 蛋白質表現結果相關的mRNA轉錄作用，參見圖5B。如下 進行北方墨點分析：使用Trizol LS (Life Technologies)，從 病毒感染的細胞中製備總細胞RNA。藉著一次酚·氣仿萃 取作用進一步純化RNA ’並以乙醇使其沉澱。將rna小球 再懸浮·於焦碳酸二乙醋處理過的水中，並儲存在-80 下。在含有1%甲醛的1%瓊脂糖凝膠上分離等量的總 RNA，並使用 Turboblotter裝置（Schleicher & Schuell)，移至尼 龍膜（Amersham pharmacia Biotech)上。使墨點與藉著在活 144243.doc •105· 1356848 體外之轉錄作用，使用DIG RNA標示套組（Roche Molecular Biochemicals)合成的毛地黃毒：y： (DIG)-UTP-標示之核糖探 針雜交。在68°C下’在Express Hyb溶液（Clontech)中進行 雜交作用12小時。在68°C下，以2X SSC (IX SSC含有 0.015M NaCl與0.015 Μ擰檬酸鈉）-0.1%十二烷基硫酸鈉 (SDS)沖洗墨點兩次，接著以0.5X SSC-0.1% SDS沖洗一 次，最後再以0.1X SSC-0.1%SDS沖洗》藉著使用DIG-發光 檢測套組（Roche Molecular Biochemicals)，檢測來自雜交 探針的信號，並藉著使BioMax ML軟片（Kodak)曝光，而得 修 •以看到。 b/h PIV3/RSV F1*N-N ' b/h PIV3/RSV F2 > b/h PIV3/RSV G1和b/h PIV3/RSV G2的北方墨點分析，顯示RSV F或RSV G之病毒mRNA含量，與觀察到的RSV蛋白質含量頗有關連 (圖5B)。對b/h PIV3/RSV F1.N-N觀察到最低含量的RSV F mRNAs，其亦展現出產生最低量的RSV F蛋白質。b/h PIV3/RSV G1產生少量的RSV G mRNAs，結果產生比在b/h PIV3/RSV G2中觀察到更低的RSV G蛋白質含量。 ® 最後，不同病毒（在位置1或位置2處有RSV F或G基因）的 生長，亦與蛋白質表現和RNA轉錄的結果有關連。如下獲 得在圖5C中所示的生長曲線：使Vero細胞生長至90%匯 合，並以 0.01 或 0.1 之 MOI，以 b/h PIV3、b/h PIV3 RSV FI、b/h PIV3 RSV G卜 b/h PIV3 RSV F2和 b/h PIV3 RSV G2感染。在37°C下培養被感染的單層。在感染後〇、24、 48、72、96和120小時，一起收獲細胞和培養基，並儲存 -106- 144243.doc tsi 1356848 在-70°C下。藉著在vero細胞中的TCID50或溶菌斑測定，判 定每個時間點收獲的病毒力價。TCID5Q測定是在37T：下培 養6天之後，以肉眼檢查CPE，而溶菌斑測定則是在培養5 天之後’利用RSV多株抗血清進行免疫染色，來定量之。 在Vero細胞中，以〇.〇1之MOI，在第一個位置藏有RSV G 或F基因的嵌合型病毒（b/h PIV3 RSV G1和b/h PIV3 RSV fTn-n)，比起在第二個位置含有RSV基因的病毒，以更慢 的速率複製，產生更低的高峰力價，並顯示出較大的遲滞 期。在感染後96小時，b/h PIV3/RSV FrN-N和b/h PIV3/RSV G1的高峰力價，分別為106·7和1 05 5TCID5〇/毫升 (圖5C)。相反的，在感染後72和96小時，b/h PIV3/RSV F2 和b/h PIV3/RSV G2的高峰力價，分別為108 G和107 4 TCID50/毫升（圖5C)。b/h PIV3對照組病毒，展現出 108 GTCID5〇/毫升的高峰力價（圖5C)。b/h PIV3/RSV F2產生 比 b/h PIV3/RSV FTN-N 更高 1.3 log10 的力價。b/h PIV3/RSV G2複製比 b/h PIV3/RSV G1 更高 1.9 logl。的力 價。結果表示與在第二個位置藏有RSV基因的嵌合型病毒 相比較，在第一個位置藏有RSV基因的嵌合型病毒’延遲 開始在活體外複製。 欲判定到底能不能達到b/h PIV3/RSV fTN-N和b/h PIV3/RSV G1的較高力價’以0.1的較高MOI ’重複生長曲 線。在0.1 之MOI時，b/h PIV3/RSV Fl’N-N和b/h PIV3/RSV G1的高峰力價增加0.5至1_3 log1()(資料未顯示）。在生長週 期中，較早降低了這些病毒的遲滯期’並達到高峰力價。 [S 1 144243.doc -107- 1356848 實例4 :在牛副流感3/人類副流感3基因組中插入eGFP，對 病毒複製的位置影響 藉著實質上在PIV3的所有基因之間，導入eGFP基因，並 觀察對病毒複製和eGFP表現的影響（圖6)，系統性地評估 將基因插入牛/人類PIV3載體主鏈中的影響。這類型的測 定調查對副黏液病毒所觀察到之轉錄梯度的重要性，其產 生特定比例的病毒mRNAs。外來基因的插入將擾亂這些比 例，結果合成不同含量的病毒蛋白質，其可影響病毒的複 製。為了該測定選出eGFP基因，因為它不會被併入病毒粒 籲 子的膜内，並因此應該不干擾病毒的加工，像是包裝、出 芽、侵入等等。將eGFP基因插入b/h PIV3基因組的四個位 置内，其中三個是eGFP表現和病毒複製所特有的。將 eGFP基因卡匣與bPIV3 N-P基因間區域連接。b/h GFP1在 b/h PIV3基因組最接近3’的位置中，藏有eGFP基因卡匣。 b/h PIV3/GFP2在b/h PIV3基因組的N和P基因之間，含有 eGFP基因卡匣。b/h PIV3/GFP3則是在P和Μ之間，b/h PIV3/GFP4是在b/h PIV3的Μ和F之間，含有eGFP基因（圖 · 6)。
eGFP基因卡匣的建構：eGFP基因的模板是市售的，例 如可從 BD Biosciences (pIRES2-EGFP)或 Clontech (pEGFP-N1)購買。參見 Hoffmann 等人，Virology 267:310-317 (2000)。藉著PCR分離eGFP基因，並藉著使用重疊PCR 法，使用下列的寡：5'ATTCCTAGGATGGTGAGCAAGGGCG3·、 5'GGACGAGCTGTACAAGTAAAAAAATAGCACCTAATCAT -108- 144243.doc IS 3 1356848 G3,*5，CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3'，MAbPIV3N-P基因間區域。將eGFP卡匣插入pCR2.1内，定序，並證實 堅守六的規則。然後以AvrII消化eGFP卡ϋ，凝膠純化， 並按照下述插入b/h PIV3的位置1、2、3和4内。
產生在位置1和2處藏有eGFP基因的全長cDNAs :將eGFP 基因卡匣插入含有從nts 1至5200之bPIV3序列，並在ntl04 (位 置1)或nt 1774 (位置2)處含有AvrII限制酵素位置的1-5 bPIV3質體内。在藉著限制酵素作用證實合宜的方位之 後，以SphI和BssHII消化在第一個位置藏有eGFP基因的質 體，並分離4 kb (1-5 eGFPl) DNA片段。接著，WSphI-BssHII 15.1 kb之DNA片段，加入剩餘的b/h PIV3基因組， 產生全長的cDNAs。至於在第2個位置中包括eGFP之全長 cDNA的產製，以SphI和Nhel切開在第二個位置藏有eGFP 基因的bPIV3繼代純種系，並分離5.8kb(l·5eGFP2)DNA 片段。接下來，以尺寸為14 kb的Nhel-SphI DNA片段，加 入剩餘的b/h PIV3基因組。在STBL-2細胞（Gibco/BRL)中繁 殖全長的嵌合型b/h PIV3/eGFP質體，其提供高產量的全長 病毒cDNA質體。 產生在位置3和4處藏有eGFP基因的全長cDNAs :為了將 eGFP卡匣插入b/h PIV3基因組的位置3内，在含有bPIV3 nts 1-5200之繼代純種系的P-Μ基因間區域中，在nt 3730處 導入AvrII限制酵素位置，改變兩個核荅酸。在 QuickChange PCR反應中使用下列的寡及其互補物： 5'GGACTAATCAATCCTA GGAAACAATGAGCATCACC3'， 144243.doc •109· 1356848 導入AvrII位置。以AvrII消化eGFP卡匣，並連接到以AvrII 弄直’在nt 3730處藏有AvrII位置的1-5 bPIV3繼代純種系 内。從含有0??之繼代純種系中，分離從8卩111至1^1^1的5.5 kb DNA片段，並導入以SphI和Nhel消化的b/h PIV3 cDNA 内，產生全長的質體。為了將eGFP基因卡匣加至b/h PIV3 基因組的位置4内，產製含有從nts 1-8500之b/h PIV3序列 的繼代純種系。以Nhel (nt 5042)弄直該純種系，並插入含 有可相容之AvrII末端的eGFP卡ϋ。然後以SphI和Xhol消化 藏有eGFP卡匣的繼代純種系，並分離7.1 kb之DNA片段。 春 以SphI和Xhol處理b/h PIV3質體，產生11 kb之片段。連接這 兩個DNA片段，產生b/h PIV3/GFP4。 以兩種方式評估b/h PIV3/GFP1、2和3所產生的eGFP 量。首先使用螢光顯微鏡，判定以0.1和0.01之MOI，利用 b/h PIV3/GFP1、2和3感染Vero細胞20小時時，所產生之綠 細胞的量（圖7A)。b/h PIV3/GFP3產生的綠細胞，明顯比 b/h PIV3/GFP1 或 2 更少。 其次，對被感染的細胞進行西方墨點分析，並以GFP 籲 MAb和PIV3 PAb探測墨點。最初的觀察證實b/h PIV3/GFP3 產生戲劇化少量的eGFP蛋白質（圖7B)。b/h PIV3 GFP1和 GFP2產生類似含量的eGFP蛋白質。西方墨點法控制相同 的裝載體積，以供使用PIV3抗體探測（圖7B)。有趣的是， 所有的三種病毒均顯示產生類似含量的PIV3蛋白質（HN蛋 白質是最突出的譜帶）。這些結果暗示與位置1和2相比 較，b/h PIV3/GFP3在位置3轉錄較少的GFP mRNAs。該資 •110· 144243.doc IS 1 1356848 料證實了在δ彳黏液病毒中，存有病毒mRNAs的轉錄梯度。 PIV3 HN蛋白質的產量，不受eGFP基因插入的影響（圖 7B) ° 為了判定GFP基因插入是否對b/h PIV3/GFP1、2和3之病 毒複製的動力學有影響，在Vero細胞中進行多回合的生長 曲線（圖7C)。生長曲線顯示b/h PIV3/GFP1在感染後24和48 小時，具有比b/h PIV3/GFP2或GFP3延遲發生的病毒複 製。然而，所有三種病毒最後獲得的高峰力價是類似的。 b/h PIV3/GFP2和GFP3的複製動力學，幾乎是相同的（圖 7C)。有趣的是，改變了的病毒mRNAs比例’似乎未顯著 地影響病毒複製。 實例5 :建構並選殖載有呼吸道融合細胞病毒F與不同基因 間區域的嵌合型牛副流感3/人類副流感3 使用三種不同的構築體，判定基因間區域（在每個mRNA 之間的核普酸，例如在F基因和N基因之間的核甞酸）對蛋 白質表現和病毒複製的影響。參見圖8。第一個構築體是 在位置1中載有RSV F1*N-N的b/h PIV3 ’其具有較短的 bPIV N基因中止/N基因開始序列（RSV FI N-N ’在圖4 中）；第二個構築體是在位置1中載有RSV F的b/h PIV3 (RSV F2，在圖4中）；而最後一個是在位置1中載有RSV的 b/h PIV3 (RSV F1，在圖4中）。根據在第6節’實例2中描述 的選殖策略’產製所有三種構築體。 在兩個卡£之間最戲劇化的差異’是在b/h PIV3/RSV F1 *N-N中，在N基因開始序列與N轉譯開始密碼子之間的 144243.doc 1356848 距離，它僅有10個核牮酸長。相反的，在b/h PIV3/RSV F2 中，該距離為86個核苷酸長。另一個差異是在b/h PIV3/RSV FrN-N中使用N基因開始序列，而非在b/h PIV3/RSV F2中使用的P基因開始序列。為了判定在病毒轉 錄單元之轉錄基因起點和轉譯起點之間的距離，是否影響 病毒的複製，產製b/h PIV3/RSV F1構築體，其含有與b/h PIV3/RSV F2所使用的相同的RSV F基因卡匣。 實例6:在呼吸道融合細胞病毒基因下游之基因間區域的 長度及/或性質，對病秦複製的影響 · 在下列的實驗中，使用在實例5中的三種構築體，判定 基因間區域對病毒蛋白質表現和病毒複製的影響。參見圖 9 〇 首先，使用西方墨點分析，在以0.1之MOI感染Vero細胞 後 24 和 48小時，比較b/h PIV3/RSV FI、b/h PIV3/RSV fTN-N和b/h PIV3/RSV F2的RSV F蛋白質表現。如下進行 西方墨點分析：以0.1之MOI，使用嵌合型病毒感染（70-80%)匯合不足的Vero細胞。在感染後24和48小時，移出覆 籲 蓋的培養基，並以1毫升PBS沖洗被感染的單層1次。接著 以400¾升含有0.05% b-疏基乙醇（Sigma)的Laemmli緩衝溶 液（Bio-Rad)，溶解細胞。在12% Tris-HCl準備好的凝膠 (Bio-Rad)上，分離試樣各15毫升，並使用半-乾的運送細 胞（Bi〇-Rad)將其運送至尼龍膜。以含有0.5% (體積/體積） 之吐溫-20(Sigma)的PBS(pH7.6)(PBST)沖洗尼龍膜，並在 室溫下以含有5% (重量/體積）奶粉的PBST (PBST-M)阻斷 112 144243.doc IS1 1356848 20-30分鐘。在室溫下，將該膜與在PBST-Μ中，以PBST-M 稀釋 1:1000之 RSV F單株抗體（WHO 1269、1200、1153、 1112、1243、1107)的混合物，一起培養1小時。在以PBST 沖洗四次之後，在室溫下將該膜與在PBST-Μ中，以1:2000 稀釋之二次辣根過氧化酶-共軛的山羊抗-老鼠抗體（Dako) 一起培養1小時。以PBST沖洗四次，並使用化學發光受質 (Amersham Pharmacia)展開，使Biomax Light軟片（Kodak)曝 光，看到蛋白質譜帶。 在感染後24和48小時，b/h PIV3/RSV F1表現的RSV尸!蛋 白質含量，接近對b/h PIV3/RSV F2所觀察到的含量，但比 b/h PIV3/RSV fTN-N的那些高很多β因此，在基因開始元 件與轉譯開始密碼子之間的間隔，對病毒複製可能是很重 要的。將Ν基因開始序列變更成Ρ基因開始序列，然而，該 變更僅招致單一核苷酸的改變。這些因素中任一個，可能 負責解救RSV F蛋白質表現的表現型。 接下來，進行多回合的生長曲線，以便在以0.1之ΜΟΙ感 染的 Vero細胞中，比較b/h PIV3/RSV FI、b/h PIV3/RSV fTN-N和b/h PIV3/RSV F2之病毒複製的動力學（參見圖 9B)，如下進行之：使Vero細胞生長至90%匯合，並以0.1 之 MOI，利用 b/h PIV3 ' b/h PIV3/RSV F1*N-N、b/h PIV3/RSV FI和b/h PIV3/RSV F2感染。在37°C 下培養被感 染的單層。在感染後0、24、48、72和96小時時，一起收 獲細胞和培養基，並儲存在- 70°C下。藉著在Vero細胞中的 溶菌斑測定，判定每個時間點收獲的病毒力價。溶菌斑測 144243.doc -113· 1356848 定是在培養5天之後，利用RSV多株抗血清進行免疫染 色，來定量之。 如同在圖9B中所示，與b/h PIV3/RSV F2相比較，延遲了 b/h PIV3/RSV F1*N-N的複製發生，且高峰力價較低。相反 的，PIV3/RSV F1展現出與對b/h PIV3/RSV F2所觀察到的 幾乎相同的生長曲線。 實例7 :選殖三價載有牛副流感3/人類副流感3的構築體 下列的實例係關於三價疫苗的產製，它藏有hPIV3之表 面糖蛋白（F和HN)、RSV F和hMPV F ’以便使用單一的活 春 減毒病毒疫苗，保護兒童免於由RSV、hMPV和hPIV3引起 的疾病。此等三價病毒藉逆向遺傳回收。 如下進行兩個病毒基因組的建構（參見圖10)，其分別包 括帶有兩個額外之異源序列插入的嵌合型b/h PIV3主鏈， 其中一個異源核：y：酸序列係衍生自間質肺病毒F基因，而 另一個異源核苷酸序列係衍生自呼吸道融合細胞病毒F基 因：以 SphI 和 Nhel 消化質體 b/h PIV3/RSV F2 或 b/h PIV3/hMPV F2，並分離6.5 kb之片段。以SphI和Nhel消化 ® b/h PIV3 RSV F1 或 b/h PIV3/hMPV F1 的全長cDNA，並分離 14.8 kb之DNA片段，再將其與衍生自質體b/h PIV3/RSV F2 或b/hPIV3/hMPV F2的6.5 kb片段連接，產生全長的病毒 cDNAs。 已經在Vero細胞中擴大帶有上述構築體的病毒。可使用 按照在本文中之描述設計的病毒，作為三價疫苗，對抗副 流感病毒感染、間質肺病毒感染和呼吸道融合細胞病毒感 -114· 144243.doc m 1356848 染。 實例8 :選殖兩種呼吸道融合細胞病毒至牛副流感3/人類 副流感3載體 設計攜帶兩個RSV F基因之副本的嵌合型病毒，以便判 定由嵌合型病毒產生較多的RSV蛋白質，是否將導致改良 的免疫原性。可藉著在Vero細胞中的逆向遺傳、生物學選 殖和擴大，解救該病毒，產生具有lxl06pfu/毫升之力價的 病毒母液。可使用該病毒b/h PIV3/RSV F1F2，來評估病毒 生長動力學、RSV F蛋白質的產製以及在倉鼠中的複製和 免疫原性。 以下列方式產製構築體（參見圖11):以SphI和Nhel消化 1-5 118¥卩2質體，並分離6.5 1<^之片段。以8?111和：^1161消化 b/h PIV3 RSV F1 的全長CDNA，並分離 14.8 kb 之 DNA 片 段，再與衍生自1-5 bPIV3/RSV F2的6.5 kb DNA片段連 接，產生全長的病毒cDNAs。 實例9 :建構和選殖載有人類間質肺病毒F cDNA的牛副流 感3/人類副流感3
將人類間質肺病毒（hMPV)的F基因插入b/h PIV3基因組 的位置1和2中（圖12)。hMPV F基因卡匣藏也bPIV3 N-P基 因間區域。使用hMPV F基因質體（pRF515)，並修正在 hMPV F基因中的單一核:y：酸突變（即將核：y：酸3352從C修正 為T (野外型）），產生pRF515-M4。使用重疊PCR，將bPIV3 N-P基因間區域加至hMPV F基因的3’端。至於hMPV F，重 疊 PCR 寡為 5'GGCTTCATACCACATAATTAGAAAAATAGC 144243.doc -115- 1356848 ACCTAATCATGTTCTTACAATGGTCGACC3'。在該選殖步 驟期間，在5'端使用的寡（5'GCAGCCTAGGCCGCAATAA CAATGTCTT GGAAAGTGGTGATC3')以及在 PCR 反應中 hMPV F 基因卡匣的 3·端（5'CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3·)， 含有AvrII限制酵素位置。使用QuickChange突變生成套組 和下列的寡（5，CCTAGGCCGCAATAGACAATGTCTTGG3，， 5，CCAAGACA TTGTCTATTGCGGCCTAGG3I)，調整 hMPV F 基因卡匣，使其符合六的規則。以與在上文第8節，實例4 中，關於b/h PIV3/eGFPl和eGFP2之描述相同的方式，產 製全長的b/h PIV3/hMPV F1(位置1)和F2 (位置2) cDNA質 體。 實例10 :載有人類間質肺病毒F之牛副流感3/人類副流感3 的免疫沉澱和複製測定 欲證實在在位置2處載有人類間質肺病毒F (hMPV F2)之 b/h PIV3中表現F蛋白質，使用天竺鼠或人類抗血清，對 hMPV F蛋白質進行免疫沉澱（參見圖13A)。關於由b/h PIV3表現之hMPV F蛋白質的免疫沉澱作用，以0.1或0.05 之 MOI，利用 b/h PIV3 或 b/h PIV3/hMPV F2感染 Vero細胞。 在感染後24小時，以沒有半胱胺酸且無甲硫胺酸（ICN)的 DME沖洗細胞1次，並在相同的培養基中培養30分鐘。移 出培養基，並將0.5毫升缺乏半胱胺酸和甲硫胺酸，含有 100微居里[35S]-Pro-Mix (Amersham)的 DME加至細胞中。 在37°C下，在35S-同位素的存在下，培養被感染的細胞5小 時。移出培養基，並以含有蛋白酶抑制劑的0.3 M RIPA缓 144243.doc •116- 1356848 衝溶液，溶解被感染的細胞。將該細胞溶胞產物與hMPV 天竺鼠或人類多株抗血清一起培養，並與IgG-瓊脂糖 (Sigma)結合。在以0.5 M RIPA緩衝溶液沖洗三次之後，在 10%蛋白質凝膠上分級分離試樣。將凝膠脫水，並使χ_光 軟片曝光。 藉著免疫沉澱作用，使用gp和人類抗-hMPV抗血清，顯 示由b/h PIV3/hMPV F2表現的hMPV F蛋白質（圖13A)。有 趣的是，在b/h PIV3/hMPV F2之溶胞產物中，觀察到移動 至大約80 kDa的特定譜帶。該尺寸符合F前驅物蛋白質 F〇。亦在b/h PIV3和模仿對照組跑道中，觀察到不同尺寸 的非-特異譜帶（圖13)。這些資料暗示b/h PIV3/hMPV F2表 現hMPV F蛋白質。然而，可利用之hMPV抗體試劑是有限 的，且這些抗血清僅與hMPV F蛋白質之前驅物產生交互 作用。被切開的F1亦可能是不穩定的，並因此不易使用該 方法呈像。 進行生長曲線，判定b/h PIV3/hMPV F2之病毒複製的動 力學，並將其與在Vero細胞中，以0.1之MOI，對b/hPIV3 和b/h PIV3/RSV F2所觀察到的那些相比較（圖13B)。資料 顯示在感染後24小時，與b/h PIV3/RSV F2相比較，b/h PIV3/hMPV F2展現出延遲的複製發生。然而，在感染後48 小時和之後，不再觀察到複製上的差異。 亦進行生長曲線，判定b/h PIV3/hMPV F1之病毒複製的 動力學，並將其與在Vero細胞中，以0.01之MOI，對b/h PIV3/hMPV F2和b/h PIV3所觀察到的那些相比較（圖13C)。 144243.doc -117- 1356848 資料顯示，與b/h PIV3/hMPV F2或b/h PIV3相比較，b/h PIV/hMPV F1具有延遲的複製發生，並產生較低的高峰力 價。b/h hMPV F1的溶菌斑尺寸，亦比b/h hMPV F2更小。 亦評估嵌合型病毒b/h PIV3/hMPV F1和F2，在敘利亞黃 金倉鼠中感染和複製的能力（表5)。結果顯示b/h PIV3/hMPV F1和F2在倉鼠鼻甲骨和肺臟中，複製達在b/h PIV3中觀察到的程度。甚至在倉鼠的上和下呼吸道中， hMPV亦複製至5.3和3.6 logi〇TCID5〇/克組織的力價。這些 資料顯示b/h PIV3/hMPV F1和F2在倉鼠的呼吸道中，可有 效地感染和複製，藉此證實倉鼠代表適合用來判定hMPV 之免疫原性的小動物模式，並可使用該動物模式來評估 hMPV疫苗候選者。 表5 在位置1或2中表現hMPV F蛋白質的 b/h PIV3，在倉鼠中的複製 病毒a 在感染後4天的平均病毒力價 (log10TCID50/克組織 zfcS.E.)b 鼻曱骨 肺臟 b/h PIV3 4.8 ± 0.2 5.6 ± 0.6 b/h hMPV FI 5.3 ± 0.5 5.7 ± 0.4 b/h hMPV F2 5.7 ± 0.5 4.6 ± 0.3 hMPV 5.3 ± 0.1 3·6 士 0·3 a以1X106pfu的指定病毒，鼻内接種一組六隻倉鼠 15標準偏差 144243.doc -118 - [S] 1356848 注解：對第10天的CPE讀取TCID5〇測定
實例11 :選殖可溶性呼吸道融合細胞病毒F基因構築體 亦產製含有可溶性RSV F基因之單一副本，RSV F基因 缺乏穿透膜和胞液功能部位之版本的構築體（圖14)。可使 用該構築體測試免疫原性。其優點將是該可溶性RSV FT 會被併入病秦粒子膜内的能力。因此，可將該病毒視為較 安全的病毒，因為不預期它的病毒向性會改變。可藉著逆 向遺傳，解救b/hPIV3/solRSVF的cDNA質體。
使用質體1-5/RSV F2 (前述）作為PCR的DNA模板。使用 寡 RSV f.2 (5，GCTGTAACAGAATTGCAGTTGC3，）（其黏接 RSV 的 nt 5946)和寡 5'CGTGGTCGACCATTGTAAGAACATGATT AGGTGCTATTTTTATTTAATTTGTGGTGGATTTACCGGC3' 移除RSV F的穿透膜和細胞質功能部位，刪除150個核苷 酸。以Hpal和Sail消化所得的PCR片段，並導入以Hpal和 Sail處理過的 1-5 RSV F2内，產生 1-5 bPIV3/sol RSV F。以 SphI和Nhel消化該質體，並將所得的片段導入以SphI和 Nhel消化過的b/hPIV3 cDNA内，產生全長的cDNA。
實例12 :在以載有人類間質肺病毒F之牛副流感3/人類副 流感3感染的細胞中，表現人類間質肺病毒F 連續10倍稀釋b/h 104 hMPV F病毒母液，並用來感染匯 合不足的Vero細胞。以含有健大黴素的optiMEM培養基覆 蓋被感染的細胞，並在35°C下培養5天。以100%甲醇固定 細胞，並以1:1000稀釋的抗-hMPVOOl天竺鼠血清’接著是 144243.doc -119- 1356848 1:1000稀釋的抗-天竺鼠HRP共軛抗體，進行免疫染色。藉 著比色展開，在AEC受質系統（DAKO corporation)的存在 下，使hMPV F的表現呈像。參見圖15A。 連續10倍稀釋b/h NP-P hMPV F病毒母液，並用來感染匯 合不足的Vero細胞。以補充有1 X L15/含有青黴素/鏈黴 素、L-穀胺醯胺和胎牛血清之MEM培養基的1%在 EMEM/L-15培養基（JRH Biosciences; Lenexa，KS)中之曱基 纖維素，覆蓋被感染的細胞。在35°C下培養被感染的細胞 5天，以100%甲醇固定細胞，並以1:1000稀釋的抗-鲁 hMPVOOl天竺鼠血清，接著是1:1000稀釋的抗-天竺鼠HRP 共軛抗體，進行免疫染色（參見圖15B)。抗hMPVOOl天竺 鼠血清，是對hMPVOOl蛋白質專一的，且不與b/h PIV3蛋 白質結合。 實例13 :在HELA細胞和VERO細胞中，解救嵌合型牛副流 感第3型/人類副流感第3型病毒 使用與bPIV3解救類似的程序，進行嵌合型b/h PIV3病毒 的解救。在 HeLa細胞中，使用 LipofecTACE (Gibco/BRL)， · 藉著逆向遺傳，進行b/h PI V3嵌合型病毒的解救。以4之 MOI，利用MVA感染80%匯合的HeLa細胞、Hep-2細胞或 Vero細胞。在感染1小時之後，將全長的反-基因組b/h PIV3 cDNA (4微克），連同NP (0.4微克）、P (0.4微克）和 L/pCITE (0.2微克）表現質體，一起轉移感染至被感染的 HeLa或Vero細胞内。在感染後4〇小時，收獲細胞和細胞上 清液（P0) ’並使其接受一回合的冷凍-融解。然後使用所得 -120- 144243.doc IS 3 1356848 的細胞溶胞產物，在Ι-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶〇ra C) 一種疫苗病毒的複製抑制劑的存在下，感染新鮮的Vero細 胞單層，產生P1病毒母液。收獲得自這些培養盤的上清液 和細胞，冷凍融解一次，並使用PIV3-專一抗血清，藉著 病毒溶菌斑的免疫染色，測定bPIV3病毒顆粒的存在。P1 收獲物的細胞溶胞產物，導致Vero細胞單層的完全CPE， 且免疫染色表示出現廣泛的病毒感染。 實例14 :解救載有人類間質肺病毒F病毒的牛副流感第3型 /人類副流感第3型 如下獲得在位置l(b/h 104 hMPV F)或位置2 (b/h NP-P hMPV F)處表現hMPV F的b/h PIV3病毒。以0_1至0.3之傳染 多重性（m.o.i)，利用禽痘-T7感染在6孔培養皿中，80-90% 匯合度的HEp-2或Vero細胞。在以禽痕-T7感染之後，以 PBS沖洗細胞一次，並以下歹ij用量的質體DNA轉移感染： 全長的 b/h 104 hMPV F 或 b/h NP-P hMPV F cDNA 2.0 微克， pCite N 0.4微克，pCite P 0.4微克，pCite L 0.2微克（pCite 質體具有T7啟動基因，接著是衍生自腦心肌炎病毒 (EMCV)的IRES元件）。根據製造者的指示，在脂染胺 (Lipofectamine) 2000 (Invitrogen)的存在下，進行轉移感 染。在33°C下培養轉移感染反應5至12小時，接著以2毫升 含有健大黴素的新鮮OptiMEM，取代含有脂染胺2000的培 養基。在33°C下進一步培養經過轉移感染的細胞2天。以 SPG使細胞穩定，並藉著在-80°C下一回合的冷凍融解，使 細胞溶解。使用粗製的細胞溶胞產物感染新的Vero單層， 144243.doc • 121 · 1356848 以便擴大解救的病毒。 實例15 :藉著逆向遺傳，解救載有呼吸道融合細胞病毒基 因的牛副流感第3型/人類副流感第3型 藉著逆向遺傳，在HeLa或HEp-2細胞中，使用前述的轉 移感染法（參見實例13)，回收有傳染性的病毒（Haller等人， 2000)。簡言之，分別以0.1至0·3或1-5的傳染多重性 (m.o.i)，利用FP-T7或MVA-T7，感染在6孔組織培養皿中， 80-90%匯合度的HEp-2或Vero細胞。在以FP-T7或MVA-T7 感染之後，以PBS沖洗細胞一次，並以下列用量的質體 _ DNA轉移感染（2.0微克全長的b/h PIV3 RSV F或G cDNA， 0.4微克 pCITE/N，0.4微克 pCITE/P，0.2微克 pCITE/L) ° 根 據製造者的指示，在脂染胺2000 (Invitrogen)的存在下，進 行轉移感染。在33°C下培養轉移感染反應5至12小時，接 著以2毫升含有健大黴素的新鮮OptiMEM，取代含有脂染 胺2000的培養基。在33°C下進一步培養經過轉移感染的細 胞2天。以SPG使細胞穩定，並利用在-80°C下一回合的冷 束融解，使細胞溶解。使用粗製的細胞溶胞產物感染新的 ® Vero細胞單層，以便擴大解救的病毒。藉著在Vero細胞中 有限的稀釋，純化嵌合型病毒，並產製l〇6-l〇8PFU/毫升的 高力價病毒母液。藉著RT-PCR分離嵌合型病毒的RSV基 因，並證實其序列。藉著以RSV山羊多株抗血清 (Biogenesis)對被感染之Vero細胞單層進行免疫染色，證實 RSV蛋白質的表現。 實例16 :證實藉著RT-PCR解救之嵌合型牛副流感第3型/人 144243.doc -122- [S1 1356848 類副流感第3型病毒
欲確定所解救之病毒在性質上是嵌合的，即該病毒在 bPIV3主鏈中含有hPIV3 F和HN基因序歹，J，藉著RT-PCR進 一步分析病毒的RNA基因組。收獲利用三種獨立衍生之b/h PIV3的分離株之P1病毒母液感染的Vero細胞，並分離總 RNA。使用在bPIV3之位置4757處黏接的寡，擴大病毒 RNA。藉著PCR擴大得自5255至6255的病毒區域。所得的1 kb PCR片段應含有hPIV3序列。這可藉著以對hPIV3專一的 酵素（Sac 1和Bgl II)消化來證實之，且它不切開bPIV3的互 補區（參見圖2)。如同預期的，Sac 1和Bgl II切開PCR片 段，成為較小的片段，證實該經過分離的序列是衍生自 hPIV3 (參見跑道3、5、7)。此外，藉著PCR擴大在聚合 酶L基因中，從nt 9075至nt 10469的區域。該區域應含有 bPIV3序歹|J。再度使用對bPIV3專一的酵素（Pvull和 BamHl)，消化所得的1.4 kb PCR片段，它不切開hPIV3的 相等區域（圖3)。藉著Pvull和BamHl實在地消化1.4 kb片 段，證實該聚合酶基因的來源是bPIV3(參見圖3的跑道3、 4、6、7、9和10)。總而言之，RT-PCR分析顯示該解救的 b/h PIV3病毒在性質上是嵌合型的。它在bPIV3遺傳主鏈中 含有hPIV3 F和HN基因。 實例17 :載有呼吸道融合細胞病毒基因之牛副流感第3型/ 人類副流感第3型的遺傳穩定性 為了判定b/h PIV3/RSV嵌合型病毒在遺傳上是穩定的， 並保持導入的RSV基因卡匣，在Vero細胞中，連續盲目地 144243.doc -123· 1356848 繼代被感染細胞之溶胞產物1 〇次。以〇. 1之MOI ’利用b/h PIV3/RSV感染在T25燒瓶中，匯合不足的Vero細胞，並在 33°C下培養4天，或直到看見CPE為止。在培養期間結束 時，收獲被感染的細胞和培養基，冷凍並融解兩次，並使 用所得的細胞溶胞產物感染新的T25燒瓶中的Vero細胞。 重複該循環10次。針對RSV蛋白質的表現和病毒力價，藉 著溶菌斑測定，分析得自P1至P10的所有細胞溶胞產物， 並以RSV多株抗血清進行免疫染色。在第10次繼代時，藉 著RT-PCR分離出RSV基因卡匣，並藉著DNA序列分析證實 RSV基因序列（以便確認可能的核苷酸改變）。所有的分離 株均保持RSV基因卡匣，並分析10次繼代的RSV蛋白質表現 (資料未顯示）。 實例1 8 :在蔗糖梯度上，載有呼吸道融合細胞病毒基因之 牛副流感第3型/人類副流感第3型的病毒粒子分級分離 藉著使用生化測定，進一步調查是否將RSV蛋白質導入 b/h PIV3病毒粒子内的問題。以0.1之MOI，利用每種嵌合 型b/h PIV3/RSV病毒接種Vero細胞。當看見最大CPE時， 冷;東、融解被感染的單層，並以2000 rpm旋轉10分鐘。通 過20°/。蔗糖墊，以100,000 X g旋轉澄清的上清液90分鐘。 然後將小球再懸浮於PBS中，並在20-66%蔗糖梯度的上 方，輕輕地分出層次。以100,000 X g旋轉梯度20小時，達 成平衡。從梯度的上方開始，收獲18個2毫升等份的溶離 份。每個溶離份中各移出0.4毫升，進行病毒力價判定。將 每個溶離份再懸浮於2倍體積的20% PBS中，並藉著以 144243.doc •124· 1356848 100,000 X g旋轉1小時離心，然後將小球再懸浮於0.05毫升 Laemmli緩衝溶液（Biorad)中，並藉著西方墨點法，使用 RSV F MAb (NuMax L1FR-S28R)、RSV(Biogenesis)和 bPIV3 (VMRD)多株抗血清，分析RSV和PIV3蛋白質。純化在桿 狀病毒中表現的C-終端截短之RSV F蛋白質至均質，亦在 蔗糖梯度上分析之。 亦藉著溶菌斑測定，分析溶離份的高峰病毒力價。一開 始進行自由RSV F之對照組梯度（在桿狀病毒中產製，並為 C-終端截短的）、RSV A2和b/h PIV3。大部分的自由RSV F 出現在梯度上方的溶離份3、4、5和6中（圖16 A)。在溶離 份10、11和12中觀察到最大濃度的RSV病毒粒子（圖16B)。 利用RSV多株抗血清，並以RSV F MAb探測RSV溶離份。 含有最大量RSV病毒粒子的溶離份，亦顯示最強的RSV F 信號，暗示RSV F蛋白質共同-移動，並與RSV病毒粒子結 合（圖16B)。這些溶離份亦展現出最高的病毒力價（圖 16B)。b/h PIV3病毒粒子可能是更多形的，並因此含有b/h PIV3病毒粒子之高峰溶離份的散布是更廣泛的。b/h PIV3 病毒粒子出現在溶離份9、10、11、12和13中（圖16C)。藏 有最大量病毒粒子的溶離份，藉著溶菌斑測定再度展現出 最高的病毒力價（圖16C)。利用PIV3多株抗血清和RSV F MAb兩者，分析b/h PIV3/RSV F2的蔗糖梯度溶離份（圖 16D)。含有大多數病毒粒子的溶離份，是溶離份11、12、 13和14，如同藉著西方墨點法，使用PIV3抗血清所示。同 樣的，這些亦是展現出最高含量之RSV F蛋白質的溶離 [s ] 144243.doc -125- 1356848 份。然而，亦有些自由RSV F出現在溶離份5和6中。溶離 份11、12、13和14展現出高峰病毒力價（圖16D)。類似的， 含有b/h PIV3/RSV G2之大多數病毒粒子的溶離份（溶離份 9、10、11和12)，亦顯示最強的RSV G蛋白質信號（圖 16E)。這些再度是具有最高病毒力價的溶離份（圖16E)。這 些資料集體地暗示大部分的RSV F和G蛋白質共同-移動， 並與b/h PIV3病毒粒子結合。然而，有些自由的RSV蛋白 質亦出現在梯度上方的溶離份中。 實例19 :不能以RSV抗血清，中和載有呼吸道融合細胞病 毒（RSV)之嵌合型牛副流感第3型/人類副流感第3型 為了尋求是否將RSV表面糖蛋白併入b/h PIV3病毒粒子 内，結果改變病毒向性表現型之重要安全問題性的解答， 進行中和測定（表6和7)。RSV F MAbs (WHO 1200 MAb)在 1:2000的稀釋度下，中和50%的野外型RSV A2(表6)。相反 地，即使是1:25之稀釋度，亦不能中和任何嵌合型b/h PIV3/RSV。同樣地，1:400稀釋度的多株RSV抗血清 (Biogenesis)中和了 50%RSV A2，但即使是 1:15.6 之稀釋 度，亦不能中和b/h PIV3 RSV (表6)。 126- 144243.doc IS 3 1356848
表6 不能藉著RSV抗體中和b/h PIV3 RSV嵌合型病毒 在中和測定中 50%中和抗體稀釋度之倒數 使用的病毒 RSV F MAb RSV Ab RSV 2000 400.0 b/h PIV3 <25 <15.6 b/h RSV F1*N-N <25 <15.6 b/h RSV F2 <25 <15.6 b/h RSV G1 ND <15.6 b/h RSV G2 ND <15.6 hPIV3 F MAb C191/9，在1:500的稀釋度下，中和50%的 b/h PIV3 以及 b/h PIV3/RSV(表 7)。hPIV3 HN MAb 68/2在 1:16,000的稀釋度下， 中和了 b/h PIV3， 並在1:32,000的稀 釋度下，中和了 b/h PIV3/RSV (表7)。 表7 藉著hPIV3 Mabs中和b/h PIV3 RSV嵌合型病毒 在中和測定中 50%中和抗體稀釋度之倒數 使用的病毒 hPIV3 F MAb hPIV3 HN MAb RSV 62.5 <500 b/h PIV3 500 16000 b/h RSV F1*N-N 500 32000 b/h RSV F2 500 32000 b/h RSV G1 NDd 32000 b/h RSV G2 ND 32000 £1未判定。 實例20 :當在活體内投藥時，嵌合型牛PIV證實了減毒表 144243.doc •127- 1356848 現型，並誘發強的保護性反應 以5 X 105 pfu之野外型bPIV3、重組的bPIV3、hPIV3、人 類/牛PIV3和安慰劑感染5週齡的敘利亞黃金倉鼠》將五組 不同的動物分開關在微生物隔離籠中。在感染後4天，犧 牲動物。將動物的鼻甲骨和肺臟均質化，並冷凍在-80〇c 下。藉著在37°C下，在MDBK細胞中的TCID50測定，判定 出現在組織中的病毒。藉著紅血球吸附作用，利用天竺鼠 紅血球細胞，證實病秦感染。表8顯示不同pIV3品系在倉 鼠肺臟和鼻甲骨中的複製力價。注意到重組的bpiv3和b/h ^ PIV3嵌合型病毒在倉鼠肺臟中是減毒了的： 表8 PIV3病毒在敘利亞黃金倉鼠中，在鼻 _曱骨和肺臟中的褶劁 bPIV3 ' r-bPIV2 倉 ί、r-bPIV3(l)、hPIV3和牛/人類 pIV3⑴在 鼠之上和下呼吸道中的福率 在感染後4天時的平均病毒力價 (l〇gi〇TCID5。/克組織=s.F )b 病毒a 鼻甲骨 肺臟 bPIV3 5.3 ± 0.3 —--^ 5.3 ± 0.2 r-bPIV3 5.0 ± 0_3 3.5 ± 0.2 r-bPIV3(l) 5.5 ± 0.2 5.4 ± 0.2 hPIV3 4.9 ± 0.2 5.4 ± 0.2 牛/人類PIV3(1) 4·9 ± 0.2 ’ 4.5 ± 0.2 a以5x105PFU之指定病秦’鼻内接種一組四隻倉鼠 b標準偏差。 此外’在感染之刖和在感染後21天’從倉鼠中收集血液 -128· 144243.doc IS 3 試樣，以血球凝集抑制測定來分析之。以受體破壞酵素 (RDE、DENKA Seiken Co.)處理血清試樣，並藉著在冰上 與天竺鼠紅血球細胞一起培養1小時，移除非-特異性的凝 集素。將野外型bPIV3和hPIV3加至2-倍連續稀釋的倉鼠血 清試樣中。最後，加入天竺鼠紅血球細胞（0.5%)，並容許 在室溫下發生血球凝集作用。表9顯示在以不同PIV3品系 感染之倉鼠中產生的抗體反應。注意到b/h PIV3嵌合型病 毒對hPIV3，產生像野外型hPIV3 —樣強的抗體反應，遠超 過由重組體或野外型bPIV3所產生的反應： 表9 使用得自以不同PIV3病毒感染之倉鼠的 血清的血球凝集抑制測定 接種倉鼠所用的病毒 倉鼠血清力價 野外型 bPIV3 HPIV3 重組的bPIV3 1:16 1:16 野外型bPIV3 1:16 1:8 野外型hPIV3 1:4 1:128 b/h PIV3嵌合型病毒 1:8 1:128 安慰劑 <1:4 <1:4 '這些結果證實本發明之b/h PIV3嵌合型病毒的性質，其 使這些重組體更適合用於疫苗調配物。當在活體内投藥 時，b/h PIV3嵌合型病毒不僅證實減毒的表現型，亦產生 像野外型hPIV3 —樣強的抗體反應。因此，因為本發明之 嵌合型病毒具有具減毒表現型，並誘發像野外型hPIV—樣 強之免疫反應的獨特組合，故這些嵌合型病毒具有在人類 中成功地用來抑制及/或保護對抗PIV感染所必需的特徵。 144243.doc -129- 1356848 實例21 :載有呼吸道融合細胞病毒G或F蛋白質之牛副流感 3/人類副流感3，在倉鼠之上和下呼吸道中的複製 利用 100毫升體積之 lxl〇6 pfu或 lxlO4 pfu的 b/h PIV3、b/h PIV3/RSV、RSV A2或安慰劑培養基，鼻内感染5週齡的敘 利亞黃金倉鼠（每組6隻動物）。將不同組的動物分開關在微 生物隔離籠中。在感染後4天，收獲動物的鼻曱骨和肺 臟’均質化並储存在-70°C下。在Vero細胞中，藉著TCID5〇 測定’判定出現在組織中之病毒的力價。關於攻毒測定， 在第28天時以lxlO6 pfu/毫升的hPIV3或RSV A2鼻内接種動 鲁 物。在攻毒後4天，分離動物的鼻曱骨和肺臟，並藉著溶 菌斑測定’在Vero細胞上測定攻毒病毒的複製，以免疫染 色來定量。表10顯示在倉鼠中，不同品系在肺臟和鼻甲骨 中的複製力價。 表10 表現RSV G或F蛋白質之牛/人類PIV3，在倉鼠 之上和下呼吸道中的複製 在感‘後4天時的平均病毒力價 __(l〇gi〇TCID5。/克組鐵f 吵 病毒a 鼻甲骨 肺臟 · ~ b/h PIV3 1 4.8 ± 0.4 4.4 + 〇.3 ~~ RSV A2 3.4 ± 0.5 3.3 ± 0.5 b/h RSV G1 4.2 ± 0.7 2.9 ± 0.7 b/h RSV FI 3.9 ± 0.4 2.7 ± 0.2 b/h RSV FI N-P 4.6 ± 0.4 3.5 + 〇 2 b/h RSV G2 4.2 ± 0.9 4.3 + 0.2 b/h RSV F2 4.6 ± 0.6 4.4 ± 〇.5 以5x10 PFU之^日疋病毒’鼻内接種一組四隻倉鼠。 130· 144243.doc IS 1 1356848 b標準偏差 敘利亞黃金倉鼠代表適用於評估重組之bPIV3和hPIV3遺 傳設計病毒的複製和免疫原性的小動物模式。預期導入 RSV抗原將不會改變嵌合型b/h PIV3在倉鼠中複製的能 力。該結果顯示所有的嵌合型病毒，均以類似b/h PIV3在 倉鼠鼻曱骨中的程度複製（表10)。相反的，在第1個位置藏 有RSV基因的嵌合型病毒，與b/h PIV3相比較，在倉鼠肺 臟中展現出1-1.5 log10降低的力價（表10)。在第2個位置藏 有RSV基因的嵌合型病毒，以類似在倉鼠的下呼吸道中， 對b/h PIV3觀察到的力價複製。 實例22 :當以人類副流感病毒3和呼吸道融合細胞病毒A2 攻毒時，以載有呼吸道融合細胞病毒G或F蛋白質之牛副流 感3/人類副流感3免疫的倉鼠得到保護 在免疫之後28天，以1x106PFU的RSV A2或hPIV3攻毒倉 鼠，評估由b/h PIV3/RSV引起的免疫原性。接受b/h PIV3/ RSV的動物，受到完全免於RSV和hPIV3的保護（表11)。只 有投予安慰劑培養基的動物，在下和上呼吸道展現出高力 價的攻毒病毒。該測定亦顯示以RSV免疫的動物，未得到 免於hPIV3攻毒的保護。同樣地，接種hPI V3疫苗的動物， 顯示出高力價的RSV攻毒病毒（表11)。 144243.doc • 13】- 1356848 表11 當以 hPIV3和 RSVA2攻毒時，b/hPIV3/RSV _ 免疫之倉鼠受到保護 攻毒病毒· hPIV3 RSV Α2 在攻毒後4天的平均病 毒力價（l〇gi〇TCID50/克 組織士 S.E.)bc 在攻毒後4天的平均病 毒力價（logio pfu50/克組 織土S.E.)b 免疫病毒a 鼻甲骨 肺臟 鼻曱骨 肺臟 b/h PIV3 <1.2 ± 0.0 <1.0 ± 0.1 ND ND b/h RSV G1 <1.2 ± 0.1 <1.1 ± 0.1 <1.0 ± 0.3 <0.7 + 〇 1 b/h RSV FI <1.2 ± 0_2 <1.0 ± 0.0 <1.1 ± 0.5 <0.6 + 〇〇 b/h RSV FI NP-P <1.0 ± 0.0 <1.0 ± 0.0 <0.8 ± 0.1 <0.5 + 〇 〇 b/h RSV G2 <1.2 ± 0.2 <1.1 ± 0.2 <0.8 ± 0.1 <0.8 + 〇 3 b/h RSV F2 <1·2 ± 0.1 <1.0 ± 0.1 <1.3 + 0.6 ^1.6+ 1 π RSV A2 4.5 ± 0.6 4.8 ± 0.6 <0.6 + 0.2 <0.6 + π 1 安慰劑 4_4 ± 0.1 4.1 ± 0.1 3.6 ± 0.8 -u.丄_ ± 0.7 a在第0天，用來免疫每組6隻倉鼠的病毒。 b在第28天’以1〇6 pfu的hPIV34RSV A2攻毒倉鼠。在攻主 後4天，收獲動物的肺臟和鼻曱骨。 e標準偏差。 實例23 :以載有呼吸道融合細胞病毒之牛副流感3/ 买具副 流感3接種倉鼠，誘導企清HAI和中和抗體 在攻毒之前’在第28天從免疫動物中獲得血清試樣。 〇使 144243.doc IS 3 •132· 1356848 用50%溶菌斑降低測定，對倉鼠血清分析RSV中和抗體的 存在，並藉著進行血球凝集素抑制（HAI)測定（表8)，分析 PIV3 HAI血清抗體的存在。如下進行50%溶菌斑降低測定 (中和測定）：連續2-倍稀釋倉鼠血清，並與100 PFU的RSV A2—起培養1小時。然後將病毒-血清混合物移至Vero細胞 單層，並以甲基纖維素覆蓋。在35°C下培養5天之後，使 用RSV多株抗血清將單層免疫染色，以便定量。藉著在V 型底的96-孔培養盤中，在25°C下，將第28天之倉鼠血清 的連續2-倍稀釋與hPIV3—起培養30分鐘，進行血球凝集-抑制（HAI)測定。接著在每孔中加入天竺鼠紅血球，連續 培養額外的90分鐘，並記錄在每孔中血球凝集作用的出現 或缺乏。 結果顯示表現RSV F蛋白質的病毒，展現出幾乎像在獲 自以野外型RSV接種之動物的血清中觀察到的那些一樣高 的RSV中和抗體力價（表12)。相反的，表現RSV G蛋白質 的病毒則顯示出低很多的RSV中和抗體（表12)。所有的嵌 合型b/h PIV3/RSV倉鼠血清，所顯示出之HAI血清抗體的 含量，接近對b/h PIV3觀察到的含量（表12)。結果顯示嵌 合型b/h PIV3可在倉鼠中有效地感染和複製，並誘發保護 性免疫反應。 144243.doc •133- 1356848 表12 以b/h PIV3/RSV接種倉鼠，誘發血清HAI和中和抗體 病毒a 對RSV反應的中和抗體1^ (平均值倒數log2 土 SE) 對hPI V3反應的HAI抗體e (平均值倒數l〇g2 土 SE) RSV 7.9 土 1.00 ND b/hRSVFl*N-N 7.8 ± 0.85 6.6 ± 0.5 b/h RSV FI 5.5 ± 0.53 5.5 ± 0.5 b/h RSV G1 3.4 ± 0.50 6.6 ± 0.7 b/h RSV F2 6.9 ± 0.65 6.7 ± 0.8 b/h RSV G2 3.4 ± 0.50 5.2 ± 0.4 b/h PIV3 ND 7.2 ± 0.5 3用來免疫倉鼠的病毒。 b藉著50%溶菌斑降低測定判定的中和抗體力價。 e倉鼠前-血清的中和抗體力價<1.0，且HAI抗體力價<4.0。 實例24 :以低劑量之載有呼吸道融合細胞病毒的牛副流感 3/人類副流感3接種倉鼠，保護倉鼠免於呼吸道融合細胞 病毒A2的攻毒，並誘導血清HAI和中和抗體 為了確認最佳的疫苗候選者，使用低劑量的不同構築體 (參見實例2)來免疫倉鼠。在表13中概述攻毒的結果。 144243.doc -134- 1356848 表13 b/h PIV3/RSV-低劑量免疫的倉鼠，受到 _ 免於RSV A2攻毒護 複製 ------ 在接種疫苗後4天的平均 病毒力價(log10 TCED50/克 組織土S.E.)bc ---- ___^以 RSVA2 攻毒 _ 在接種疫苗後4天的平均 病毒力價(logio pfu50/克組 織土S.E.V5 免疫的疫苗a 鼻甲骨 肺臟 鼻曱骨 肺臟 b/h PIVE 4.9 ± 0.5 4.8 ± 1.0 ND ND b/h RSV G1 3.0 ± 0.8 3.1 ± 0.5 <0.9 ± 0.5 <0.7 + 0.4 b/hRSVFl*N-N 3.4 ± 0.1 3_5 ± 0.1 <1.4 土 0.7 <0.5 + 0.0 b/h RSV G2 4.1 ± 0.6 3.8 ± 0.4 <0.8 ± 0.0 <0.5 + 0.1 b/h RSV F2 5.2 ± 0.6 3.9 + 0.4 <0.7 ± 0.1 <0.5 + 0.1 RSV A2 2.8 ± 0.3 2.7 ± 0.6 <0.8 ± 0.1 <0.5 + 0.0 安慰劑 NDd ND 3.0 土 0.8 3.2 ± 0.9 在第0天，以l〇4PFU/毫升之低劑量，用來免疫一組6隻動 物的病毒。 b在第28天’以106 pfl^RSV A2攻毒倉鼠。在攻毒後4天， 收獲動物的肺臟和鼻甲骨。 e標準偏差。 <1未判定。
接下來’藉著50%溶菌斑降低測定（中和測定），判定中 和抗體力價。使用Vero細胞，對b/h PIV3、b/h PIV3/RSV 144243.doc •135· 1356848 嵌合型病毒或RSV，進行中和測定。在室溫下’在〇·5毫升 OptiMEM中，將連續2-倍稀釋的RSV多株抗血清 (Biogenesis; Poole, England)、獲自 Medlmmune 的 RSV F MAb (WHO 1200 MAb)或 hPIV3 F (C191/9)和 HN (68/2) MAbs，與大約 100 PFU之b/h PIV3、b/h PIV3/RSV嵌合型病 毒或RSV —起培養60分鐘。在培養之後，將病毒-血清混合 物移至Vero細胞單層，在35°C下培養1小時，以在EMEM/L-15培養基（JRH Biosciences; Lenexa，KS)中的 1°/〇 曱基纖維素 覆蓋，並在35°C下培養。在接種之後6天，將被感染的細 胞單層免疫染色。以抑制50%病毒溶菌斑之最高血清稀釋 度的倒數來表示中和力價。亦對在感染後28天，獲自以 b/h PIV3、b/h PW3/RSV嵌合型病毒或RSV A2免疫之倉鼠 的血清，進行中和測定。以連續倍稀釋倉鼠血清，並與 100 PFU之RSV A2—起培養1小時。然後將病毒_血清混合 物移至Vero細胞單層，並以曱基纖維素覆蓋。在35。〇下培 養5天之後’使用RSV多株抗金清，將該單層免疫染色， 以便定量。倉鼠前-血清之中和抗體力價<1〇，而HAI抗體 力價<4_0。藉著在25ΐ下，在v型底的％•孔培養盤中，將 連續2-倍稀釋的第28天倉鼠血清與hpiV3一起培養，進行 血球凝集-抑制（HAI)測定。接著，在每孔中加入天竺鼠紅 血球細胞，繼續培養額外的90分鐘，並記錄在每孔中血球 凝集作用的出現或缺乏。表14概述該結果： 144243.doc .136- 1356848 表14 以較低劑量之b/hPIV3/RSV接種倉鼠，誘 _ 導血清HAI和中和抗體 病毒a 對RSV的中和抗體反應bx 對hPIV3的HAI抗體反應e (平均值倒數log2土SE) (平均值倒數log2±SE) RSV 6.5 ± 0.7 ND b/h RSVFrN-N 2.5 ± 0.7 5.7 ± 0.6 b/h RSV G1 2.0 ± 〇.〇 6.0 士 0.0 b/h RSV F2 3.8 ± 1.5 6.7 ± 0.6 b/h RSV G2 3.8 ± 1.3 5.5 ± 0.6 b/h PIV3 ND 6_5 ± 0.7 3以104 pfu/毫升之低劑量，用來免疫倉鼠的病毒。 b藉著50%溶菌斑降低測定，判定中和抗體力價。 c倉鼠前-血清之中和抗體力價<1.0，而HAI抗體力價<4.0。 當將接種劑量降低至每隻動物1 X 104 PFU時，加劇了在 第一個位置具有RSV基因之嵌合型病毒的受限複製表現 型。b/h PIV3/RSV F1和G1在倉鼠之上呼吸道中複製的力 價，與b/h PIV3的那些相比較，降低1.0-2.0 log1()(表13)。 相反的，在位置2帶有RSV基因的b/h PIV3/RSV，在上呼吸 道中複製，達到在b/h PIV3中觀察到的程度。在第一個位 置藏有RSV基因的b/h PIV3/RSV，在倉鼠肺臟中的複製亦 較受限制（表13)。相反的，b/h PIV3/RSV F2在鼻曱骨和肺 臟中的複製，仍分別達105·2和103·9的高力價（表13)。在第 [S] 144243.doc •137- 1356848 28天，以1 x 106 pfu的RSV A2攻毒接種疫苗的倉鼠（表 13)。不管在倉鼠的呼吸道中觀察到低程度的複製，動物 仍在下和上呼吸道兩處，得到免於RSV攻毒的保護（表 13)。保護的程度，像在以野外型RSV接種之動物中觀察到 的一樣好。只有接受安慰劑培養基的動物，在鼻曱骨和肺 臟顯示出高病毒力價（表13)。在第28天，從免疫倉鼠中收 集血清，並分析RSV中和抗體和PIV3 HAI血清抗體的存在 (表14)。與在野外型RSV血清中觀察到的力價相比較。在 獲自以b/h PIV3/RSV免疫之倉鼠的血清中，在RSV中和抗 鲁 體力價方面，觀察到大約50%的下降（表14)。但獲自接受 在位置2中藏有RSV基因之b/h PIV3的動物的血清，仍展現 出比得自在位置1中帶有RSV基因之PIV3/RSV的血清，更高 的RSV中和抗體。與b/h PIV3血清相比較，PIV3 HAI之血 清抗體力價亦稍微降低（表14)。 實例25 :當以人類副流感病毒3或人類間質肺病毒NL/001 攻毒時，以載有人類間質肺病毒F之牛副流感3/人類副流 感3免疫的倉鼠得到減 ® 分別以 b/h PIV3、b/h hMPV FI、b/h hMPV F2、hMPV或 安慰劑免疫五組敘利亞黃金倉鼠（每組有六隻倉鼠）。將5組 不同的動物分開關.在微生物隔離籠中。在免疫後28天，以 1 X 106 PFU之hPIV3或hMPV (NL/001品系）攻毒倉鼠，以便 評估由b/h PIV3/hMPV F引起的免疫原性。在攻毒後4天， 犧牲動物。將動物的鼻曱骨和肺臟均質化，並儲存在-80°C下。藉著在37°C下，在MDBK細胞中的丁(：1〇50測定， 144243.doc - 138- IS1 1356848 判定出現在組織中的病毒。藉著紅血球吸附作用，利用天 竺鼠红血球細胞，證實病毒感染。表15顯示PIV3品系和 MPV品系在倉鼠肺臟和鼻曱骨中的複製力價。 表15 當以hPIV3或hMPV/NL/ΟΟΙ攻毒時，以 b/h PIV3/hMPV F-免疫的倉鼠得到保護 攻毒病毒· hPIV3 hMPV 在攻毒後4天的平均病 毒力價（logl〇TCID50/克 組織士 S.E)b 在攻毒後4天的平均病 毒力價（l〇g1()TCID5()/克 組織土S.E)b 免疫病毒a 鼻甲骨 肺臟 鼻甲骨 肺臟 b/h PIV3 <1.3 ± 0.2 <1.1 ± 0.1 ND b/h hMPV FI <1.3 ± 0.1 <1.1 ± 0.1 3.5 ± 〇.8 <0.5 ± 0.2 b/h hMPV F2 <1.2 ± 0‘1 <1-2 ± 0.1 <0.9 ± 0.4 <〇_5 ± 0.1 hMPV ND <0.8 ± 0.3 <0.4 土 0.0 安慰劑 4.3 ± 0.3 4.5 ± 0.5 6.0 ± 〇.3 4.5 ± 1.3 a在第0天用來免疫每組6隻倉鼠的病毒。 b在第28天，以106pfu之hPIV3或hMPV攻毒倉鼠。在攻毒後 4天，收獲動物的肺臟和鼻甲骨。 ND=未判定。 結果顯示接受b/h PIV3/hMPV F2(F在位置2)的動物，完 全得免於hMPV和hPIV3的保護（表15)。然而，b/h PIV3/hMPV FI (F在位置1)僅在上呼吸道（例如鼻曱骨）中， 144243.doc •139· 丄356848 降低感染hMPV力價2·5 l〇gS，雖然其在下呼吸道（例如肺 臟）中，提供完全免於hMPV和hPIV3兩者感染的保護（表 15)。投與安慰劑之動物在下呼吸道及上呼吸道顯示有高 攻毒病毒之力價（表15)。 本發明之範圍，不受特別說明之具體實施例的限制，其 企圖作為本發明之個別觀點的單一解釋，且任何在功能上 相等的構築體、病毒或酵素，亦在本發明的範圍内。實際 上，除了在本文中出示和描述的那些之外，熟諳此蓺者應 可從前述的說明和附錄的圖式中，了解本發明的:種ς 改。企圖將這類修改包括在附錄之巾請專利範圍的範圍 内0 在本文中提及的各種出版物，將其揭示内容全部以引用 的方式併入本文中。 【圖式簡單說明】 圖1·人類間質肺病毒的F蛋白質，與得自不同禽肺病毒 的不同F蛋白質之胺基酸序列的逐對排列。藉著胺基酸的 單-·字母-符號，確認在兩個序列之間相同的胺基酸。以 "+ ”符號指出在兩個胺基酸序列之間的保留胺基酸交換， 而間隔表示非保留性胺基酸錢。Α)人類間質肺病如蛋 白質與分離自Mallard鴨之禽肺病毒〇蛋白質（在外功能部 位中有85.6%同-性）的排列ββ)人類間質肺病毒f蛋白質 與分離自火雞之禽肺病毒之F蛋白質（Β亞組；在外功能部 位中有75%同一性）的排列。 圖2.擴大得自衍;ηγΛ7，Λ人 何生自b/h PIV3嵌合型病毒之三種不同分 J44243.doc IS] -140· 離株的核甞酸5255至核苷酸6255的PCR片段。利用對人類 PIV3之F基因專一的酵素，消化所得的1 kb DNA片段。這 些酵素不能切開牛PIV3的相對應片段。1%瓊脂糖凝膠顯示 未消化的片段（跑道2、5和6)以及經Sacl或Bglll消化的片段 (分別為跑道4、6和跑道9、10和11)。在跑道10中的試樣是 未經消化的，然而，當以Bglll重複消化時，切開該試樣 (資料未顯示）。跑道1和8顯示DNA尺寸標記。 圖3.擴大得自衍生自b/hPIV3嵌合型病毒之三種不同分 離株的核苷酸9075至核苷酸10469的PCR片段。利用對牛 PIV3之L基因專一的酵素，消化所得的1.4 kb DNA片段。 這些酵素不能切開人類PIV3的相對應片段。1%瓊脂糖凝 膠顯示未消化的1.4 kb片段（跑道2、5和8)。在跑道3、4、 6、7、9和10中，顯示藉著以BamHl和PvuII消化所產生之 較小的DNA片段。跑道1顯示DNA尺寸標記。 圖4.顯示解救載有RSV之bPIV3/hPIV3的構築體的表現。 六個構築體，包括bPIV3/hPIV3載體，並證實b/h PIV3載有 RSV F或G cDNA。刪除牛PIV3 F基因和HN基因，並分別以 人類PIV3 F和HN基因代替。將RSV F或G基因選殖到位置1 或位置2内。所有的RSV基因連接到bPIV3 N-P基因間區 域，除了 RSV FT(N-N)之外，其在較短的bPIV3 N基因終 止/N基因開始序列之後。 圖5.載有RSV F或G基因的b/h PIV3，展示出位置影 響。（A)是嵌合型病毒-感染細胞之溶胞產物的西方墨點分 析，以顯示得自嵌合型牛/人類PIV3之RSV F及G白質之表 144243.doc -141 - 1356848 現。使用抗RSV F蛋白質的單株抗體（MAbs)，刪除F蛋白 質，並使用抗RSV G蛋白質的多株抗體（PAbs)，刪除G蛋白 質。50 kDa譜帶代表在利用所有嵌合型病毒，和野外型 RSV感染之細胞中檢測到的片段。與野外型RSV相比 較，在敌合型病毒感染細胞之溶胞產物中，有較多20 kDa F片段的堆積。以0.1之MOI進行實驗，除了在跑道1中，以 1.0的較高MOI，重複載有RSV fTN-N之b/h PIV3的感染。 檢測到RSV G蛋白質的兩種不成熟和糖基化形式，移動至 大約50 kDa和90 kDa。（B)為顯示得自嵌合型牛/人類PIV3 # 之RSV F及G mRNAs之表現的北方墨點分析，其顯示與在 圖5 A中證實之蛋白質表現結果有關的mRNA轉錄。在含有 1 %甲醛的1 %瓊脂糖凝膠上，分離出等量的總RN A，並移 至尼龍膜上。使墨點與毛地黃毒苷（DIG)-UTP-標示之核糖 探針（riboprobe)雜交，該探針係使用DIG RNA標示套組， 藉著在活體外的轉錄作用而合成的。（C)為嵌合型病毒， 包括載有RSV F或G蛋白質.之b/h PIV3，在Vero細胞中的生 長曲線（ΜΟΙ=0·01)。使Vero細胞生長至90%匯合，並以 ® 0.01之MOI感染。在37°C下培養被感染的單層。藉著 TCID5〇測定判定每個時間點收獲的病毒力價，其係藉著在 37°C下培養6天之後，以肉眼檢查CPE來進行。 圖6.顯示在PIV3基因組中eGFP插入對病毒複製的位置影 響。b/h PIV3載有增強綠螢光蛋白質（eGFP)之構築體。隨 後，在PIV3的所有基因（在本文中僅顯示位置1、2、3和4) 之間，將eGFP基因導入b/h PIV3載體内。將eGFP基因連接 -142- 144243.doc [S ] 1356848 到bPIV3 N-Ρ基因間區域。b/h GFP1構築體，在3'最接近b/h PIV3基因組的位置藏有eGFP基因卡匣。b/h GFP2構築體， 在N和P基因之間含有eGFP基因卡匣。b/h GFP3構築體，在 P和Μ基因之間含有eGFP基因卡匣，而b/h GFP4構築體， 則在Μ和b/h PIV3的F之間含有eGFP基因卡匣。 圖7.在b/h PIV3基因組中增強綠螢光蛋白質（eGFP)插入 的位置影響。（A)顯示b/h PIV3-GFP 1，2，3的GFP表現； 並顯示當利用載有eGFPl、2和3的b/h PIV3，以MOI 0.1和 MOI 〇.〇1感染Vero細胞20小時時，所產生之綠細胞的量。 藉著使用螢光顯微鏡，以肉眼檢查綠細胞。（B)為被感染 細胞之溶胞產物的西方墨點分析，以顯示在b/h PIV3中， 在位置1，2和3中，eGFP的表現（MOI為0.1，在Vero細胞中 感染後24小時）。利用GFP MAb和PIV3 PAb探測該墨點。亦 使用PIV3抗體，顯示墨點有相同體積的負荷。（C)為載有 GFP構築體（在位置1、2和3處）之b/h PIV3，在Vero細胞中 的生長曲線（MOI=0.1)。 圖 8.顯示在 b/h PIV3 RSV F1*和 b/h PIV3 RSV F2基因間 區域之間的差異。利用不同的基因間區域，載有RSV F基 因的b/h PIV3構築體。三個構築體118¥卩1\-：^、113¥?2>1-P和RSV FI N-P，分別與在圖 4中之RSV F*(N-N)、RSV F2 和RSV F1相同。在RSV F1*N-N中，在N基因開始序列和N 基因轉譯開始密碼子之間的距離，僅為10個核：y：酸（nts) 長。相反的，在RSV F2構築體中的該距離為86個核：y：酸 長。RSV F1‘N-N亦使用N基因開始序列，而非在RSV F2構 144243.doc -143- 1356848 築體中使用的p基因開始序列。 圖9.在被插入之RSV基因下游，基因間區域的長度和性 質，對病毒複製有影響。（A)為在嵌合型病毒中，RSV F蛋 白質表現的西方墨點分析。利用抗RSV F蛋白質之單株抗 體，來探測墨點。由RSV F1構築體表現，並在感染後24和 48小時測量到的F1蛋白質含量，接近對RSV F2構築體所觀 察到的，但比RSV fTN-N構築體的那些高很多。（B)為b/h RSV FI N-P的生長曲線；且為比較RSV FI、RSV fTN-N 和RSV F2構築體，·以0.1之MOI，在Vero細胞中之病毒複製 動力學的多周期生長曲線。藉著溶菌斑測定來判定每個時 間點收獲的病毒力價，其係藉著在培養5天之後，以定量作 用之RSV多株抗血清進行免疫染色來進行。 圖10.載有RSV F和hMPV F的三價b/h PIV3構築體。在 本文中顯示兩個病毒基因組，分別包括嵌合型b/h PIV3載 體和衍生自間質肺病毒F基因的第一個異源序列以及衍生 自呼吸道融合細胞病毒F基因的第二個異源序列。已經在 Vero細胞中，擴大帶有任一構築體的病毒。可使用按照描 述設計的病毒，作為三價疫苗，對抗副流感病毒感染、間 質肺病毒感染和呼吸道融合細胞病毒感染。 圖11.顯示選殖兩個RSVF至b/hPIV3載體内。藏有兩個 RSV F基因的構築體。可使用該構築體判定病毒生長動力 學、RSV F蛋白質產製以及在倉鼠中的複製和免疫原性。 圖12.載有hMPV F構築體的嵌合型b/h PIV3。將人類間 質肺病毒（hMPV)之F基因插入b/h PIV3基因組的位置1或位 置2中。hMPV F基因卡匣藏有bPIV3 N-P基因間區域。 •144- 144243.doc [S 1 1356848 圖13.載有hMPV F基因（在位置2)之b/h PIV3的免疫沉澱 法和複製測定。（A)顯示使用天竺鼠或人類抗-hMPV抗血清 之hMPV F蛋白質的免疫沉澱法。在載有hMPV F2之b/h PIV3的溶胞產物中，觀察到移動至大約80 kDa的特異譜 帶。該尺寸相當於F前驅物蛋白質F〇。亦在b/h PIV3和假對 照組跑道中，觀察到不同尺寸的非-特異譜帶。（B)顯示生 長曲線，其可用來判定b/h PIV3/hMPV F2的病毒複製動力 學，並將其與在Vero細胞中，以0.1之MOI，對於b/h PIV3 和b/h PIV3/RSV F2所觀察到的那些相比較。（C)為生長曲 線，其可用來判定b/h PI V3/hMPV F1的病毒複製動力學， 並將其與在Vero細胞中，以0.01之MOI，對於b/h PIV3/hMPV F2和b/h PIV3所觀察到的那些相比較。 圖14.載有可溶性RSV F基因構築體的嵌合型b/h PIV3。 該構築體包括可溶性RSV F基因的單一副本，缺乏穿透膜 和胞液功能部位之RSV F基因的版本。該構築體之優點是 可溶性RSV F不能被併入病毒粒子基因組内。 圖 15.經免疫染色的 b/h PIV3/hMPV F1 和 b/h PW3/hMPV F2。（A)稀釋b/h PIV3/hMPV F1病毒，並用來感染匯合不足 的（subconfluent) Vero細胞。以含有健大黴素之optiMEM培 養基覆蓋被感染的細胞，並在35°C下培養5天。固定細 胞，並以天竺鼠抗-hMPV血清進行免疫染色。在AEC受質 系統的存在下，藉著特異的顏色展開，以肉眼檢查hMPV F 的表現。（B)稀釋b/h PIV3/hMPV F2病毒，並用來感染Vero細 胞。以在EMEM/L-15培養基中的1%曱基纖維素（JRH Biosciences; Lenexa，KS)覆蓋被感染的細胞。培養細胞， t S 1 144243.doc -145- 1356848 固定，然後以抗-hMPV天竺鼠血清進行免疫染色。抗_ hMPV天竺鼠血清是對hMPVOOl蛋白質專一的。
圖16.在蔗糖梯度上，載有RSV基因之b/h PIV3的病毒 粒子分級分離。這些連續實驗調查RSV蛋白質是否被併入 b/h PIV3病毒粒子中。（A)顯示自由RSV F(在桿狀病毒中產 製，並截短C-終端）在20-66%蔗糖梯度的對照組梯度。大 多數的自由RSV F出現在溶離份3、4、5和6。（B)顯示RSV 蔗糖梯度（以25,000 rpm旋轉15小時），及顯示在溶離份 10、11和12中觀察到的RSV病毒粒子之最大濃度。利用 RSV多株抗血清以及RSV F MAb，探測RSV溶離份。含有 最大量之RS V病毒粒子的溶離份，亦對rs V F顯示出最強 的信號，暗示RSV F蛋白質一起移動，並與RSV病毒粒子 有關。在（B)中最後的圖，亦顯示溶離份1〇、11和12，藉著 溶菌斑測定，展示最高的病毒力價。（C)顯示b/h PIV3嚴糠 梯度（以25,000 rpm旋轉15小時）。b/h PIV3病毒粒子可以是 較具多型性的，並因此含有b/h PIV3病毒粒子之高峰溶離 份的散布是較廣泛的。（D)顯示b/h PIV3/RSV F2蔗糖梯度 (以25,000 rpm旋轉15小時）。利用PIV多株抗血清和RSV F MAb兩者’分析b/h PIV3/RSV F2的蔗糖梯度溶離份。含有 最多病毒粒子的溶離份，是溶離份11、12、13和14，如同 使用PIV3抗jk清之西方法所示。同樣地，這些亦是展示最 高量RSV F蛋白質的溶離份。在溶離份5和6中，亦出現一 些自由的RSV F。溶離份11、12、13和14展示高峰病毒力 價。（E)顯示b/h PIV3/RSV G2蔗糖梯度（以25,000 rpm旋轉 15小時）。含有最多b/h PIV3/RSV G2病毒粒子的溶離份 144243.doc 1356848 (9、10、11和12)，亦對RSV G蛋白質顯示出最強的信號。 再者，這些也是具有最高病毒力價的溶離份。
144243.doc 147- 1356848 tiggtagcct gtogacgg tatg^tEgt tccattggaa gcaacaaggt tggaalastc 12<30 agacctitgg ggaaagggcg ttcatacalc agca2tcaag atgctgacac tgttacaatt 1260 gacaacacag tgtaccaatt gagcaaagri gaaggagaac aacacacast la^agggaag 1320 ccagtatcia gcaattttga ccctatagag ticcctgaag aicagttcaacgtagcccig 1380 gatcaggtgt ttgaaagtgt tgagaagagt cagaatctga tagaccagtc aaacaagata 1440 ttggatagca Ugaaa2ggg gaatgcagga titgrcatag igatagtcct cattgtcctg 1500 ctcatgctgg cagcagttgg tgigggtgtc acmgigg riaagaagag aaaagctgct 1503 cccaaattcc caatggaaat saatggtgtg aacaac ]596 <210>3 <211> 1666 <212>DNA <2D>肺病毒 <220>
<221> CDS <222> (14),.,(1627) ...
<223>畲肺病毒分‘株11>融>蛋白質mRNA，完整的cds <400>3
gggacaagtg aaaatgtctt ggaaagtggt actgctattg gtatlgctag ctacccc^ac 60 gggggg 购 gaagaaagtt aictagagga gtcatgcagt actgitacia gaggatacct 120 gagEgttttg aggac2ggat ggtatacaaa tg^ltcaca ctigaggttg gagatgtgga 180 aaatctcaca tgtaccgacg ggcccaictt aataagaaca gaacttgaac tgacaaaaaa 240 tgcacttgag gaactcaaga cagialcagc agatcaattg gcaa2ggaag ctaggaiaat 300 gtcaccaaga aaagcccggt ctgttctggg tgccjatagca ttaggtgtgg caactgctgc 360 tgctgtgacg gct£gt2t££ cgatagccaa gacaattagg ctagaaggag aagtggcigc 420 aatcasgggt gcgctcagga aaaca^itga ggctgtaict acattaggaa acggcglgag 480 ggtacttgca acagctgtga atgatctcaa ggactttats agtaaaaaat tgacacctgc 540 aataaacsgg aacaagtgts acatctcaea ccttaagatg gcagtgagct ttggacaata 600 c^tcggagg itcctcaatg tgglaagaca gttttctgac aatgcaggta tc^gcctgc 660 aatatctcta gatuaatga cigacgc^ga gcctgtaaga gctgtaagca acatgcccac 720 atct^gga cagatcaatc tgargcttga gaalcgg£ca atggtcagaa ggaaaggatt 7¾) tggEattctg attggagttt atggisgctc tgtggtctai atagtgcagc ucciantt 840 cggtgtgata gatacaccgt gttggaaggt gaaggctgctccauatgtt cagggaaaga $00 cgggaattat gcatgtctct tgcgagagga ccaaggttgg tattgtcaaa atgctggatc 960 cacagtttat tatccaaatg aggaggactg tgaagtaaga agtgatcatg tgttagtga 1020 cacagcagct gggataaatg tagcaaagga gicagaagag tgcaacagga atatctcaac 10S0 ^acaaagtac ccttgcaagg tsagtacagg gcgtcacccs ataagcatgg tggcctiatc 1140 accactgggt gcaiggtag cctgttatga cggtatgagt tgttccattg gaagcaacaa 1200 ggttggaata atcagacctt tggggaaagg gtgttcatac atcagcaatc aagalgctga 1260 cactgttaca attgacaaca ca£tgtacca attgagcaaa gttgaaggag aacaacacac 1320 aatiaaaggg aagccagiat ctagcaaitt tgaccctata gagttccct£ aagzlczgn L380 caacgtagcc ctggatcagg tgtttgaaag tgttgagaag agtcagaatc tgatagacca 1440 gtcaaacaag atattggata gcattgaaaa ggggaaigca ggatttgtca tag^atagt 1500 ccicai^tc'ctgctcatgc t£gcagcagt tggtgtgggt stcitctttg tggttaaosa 1560 〇2gaaaagct gctcxcaaat tcccaatgga aatgaatggt gtgaacaaca aaggattiat 1620 cccttaatU tagttattaa saaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1666
<210>4 <211> 1636 <212>DNA 鼻氣管炎病毒 144243-序列表.doc 1356848 <220> <221>CDS <222> 03)...(1629) 火,I鼻考Ί為融合胥▲.食之基因 (F1和&次莩先/，龛-整巧cds <400> 4 ----------'
gggacaagta ggatgeatgt aagaatctgt ctcctattgt tccttaiatc taatcctagt 60 agctgcatac aagaaacata caatg2ggaa tcctgcagla ctgtaactag aggttataag 120 agtgtgttaa ggacaggglg gtatacgaat gtatttaacc tcgaaatagg gaatgtt£ag 180 aacatcacti gcaaigatgg acccagccta attgacactg agnagiactcacaaagaat 240 gctttgaggg agctcaaaac agtgtcagct gatcaagtgg claaggaaag cagaclalcc 300 tcacccagga gacgtagatt tgtactgggt gcaatagcac ttggtgttgc gacasctgct 30) gccgtaacag ctggtgtagc acttgcaaag acaatlagat tagagggaga ggtgaaggca 420 aoaagaatg ccctccggaa cacaaatgag £cagtatcca cattagg〇aa tggtgtgagg 480 gtaccagcaa ctgcagtcaa tgacctcaaa gaatrtaiaa gtaaaaaatt gactcctgct 540 attaaccaga acaaatgcaa tatagcagai ateaagalgg ca2ttagta tggccaaaat 600 aacagaaggt t^aatgt ggtgaggcaa ctctctgata gtgcaggtat cacatcagct 660 gtgtctcttg atttaatgac agatgatgaa cttgttagag caattaacag aatgccaact 720 tcatcaggac agattagttt gatgttgaac aatcgtgcca tggUagaag gaaggggttt 780 ggtaiaitga ttg£tgttta tgatggaxg £tcgtttata tggtacaact gcccatattc 840 ggcgtgattg agacaccug uggagggtg gtggcagcac cacctgtag gaaagagaaa 900 ggcaattatg cttgtatact gagagaagat caagggtggt actgtacaaa tgctgictct S60 acagcttatt atcctaataa agatgattgt gaggtaaggg atgattatgt attt^tgac 1020 acagcagctg gcattaatgt ggccctagaa gttgaacagt gcaactataa catatcgact 1080 tctaaatacc catgcaaagt cagcacagg! agacaccctg icagia^gt agccitaacc 1140 cccctagggg gtcugtgtc aguatgag agtgtaagti gctccatagg tagcaataaa 12CX) gt2gg£ataa taaaacagct aggcaaaggg tgcacccaca ttcccaacaa cgaagctgac 1260 acgataacca ttgataacac tgtgtaccaa ttgagcaagg ugtaggcga acagaggacc 1320 ataaaaggag ctccagttgt gaaca^ttt aacccaatat tattccctga ggatcagttc 1380 aatgttgcac ttgaccaagt atttfiagafit atafiatagatctcaggactt aatagataag 1440 tctaacgact tgctaggtgc agatgccaag agcaaggctg gaanicui agcaatagta 1500 gtgctagtca ttctaggsat cttcttttta cttgcagtga tatattactg ttccagagtc 1560 cggaagacca aaccaaagca tgattacccg gccacgacag gtcatagcag catggcttat 1620 gtcagttaag ttattt 1636
<210>5 <211> 1860 <212>DNA <213>肺病毒 <220> <221〉CDS <222> (1)..,(11〇) 禽肺病毒基質蛋白質（M)基因，部分的cds -----—_ <220> <221> CDS <222> (216),.,(1829) <2?3>.貪肺病毒融合糖蛋白（F)基因，完整的cds *·丨丨 I丨·， 144243-序列表.doc 4- m 1356848 <400>5
gagttcaggt aatagtggag ttageggcat acgncaagc agaaagcata agcagaata 60 £C2£gaactg gagccaccag ggtacgagat atgtcctgaa gtcaagatza acacagagag i20 tacacttacc a2atcacagt aaeaatttcg tuttaaccc ictcat2gtt attacctagc 180 ugat2ttat ttsgaaaaaa ttgggacaag tgaaaatgtc Uggaaagtg giactgctat 240 tggtatigct agctacccca acgsgggggc tsgaagaaag ttatctagag gagtcatgca 300 gtactgttac t2gaggatac ctgagtgttt tgaggacagg aiggtataca aatgtgttca 360 cacttga£gt tggagatgtg 取 aa2tctca caibtoccga cgggcccagc Uaataagaa 420 cagaacttga sctgacaaaa aatgcacttg aggaactcaa gacagtatca gcagatcaat 480 tggcaaagga agctaggata atgtcaccaa gaaaagcccg gtUgttctg ggtgccatag 540 catisggtgt ggcaactgct£ctgctgtga cggctggtgl agcgatagcc aagacaatta 600 ggctagaagg agaagtggct gcaatcaagg gtgcgctcag gaaaacaaat gaggctgtat 660 ctacattagg aaatggcgtg agggtacttg caacagctgt gaatgaictc aaggactrta 720 iaaglaaaaa attgacacct gcaaia2aca ggaacaagtg tgacaictca gaccttaaga 780 tggcagtgag ctttggacsa tacaatcgga ggrtcctcaa tgtggtcaga cagttttctg 840 acaatgcagg tattacgcct gcaataictc tagatttaat gactgacgct gagcttgtaa 900 gagctgtaag caacatgccc acatcttcag gacagatc£a tctgatgctt gagaatcggg 960 caatggtcag aaggaaa£ga tngggattt tgattggagt ttatggtagc tctgtggtct 1020 atatagtgca gcttcciatt ttcg〇tgtga tagatacacc gtgttggaag gtgaaggctg 1080 ctccattatg ttcagggaaa g2cgggaatt atgcatgtct cttgcgagag gaccaaggtt 1140 ggtattgtca 2aatgctgga tccacagttt attatccaaa tgaggaggac tgtgaagtaa 1200 gaa£tgatca tgtgtutgt gacacagcag ctgggataaa tgtagcaaag gagtcagaag 1260 agtgcaacag gaatatctca acaacaaagt acccttgcaa ggtaagtaca gggcgtcacc 1320 caataagcat ggtggcctta tcaccactgg gtgctltggtagcclgttat gacggtatga 1380 gttgttccat tggaagcaac aaggttggaa taatcagacc tttg£ggaaa gggtgttcat 1440 acatcagcaa tcaagatgct gacactgtta caattgacaacacagtgtac caattgagca 15CX) aagttgaagg agaacaacac acaattaaag ggaagccagt atctagcaat tttgacccta 1560 tagagttccc tgaagatcag ttcaacatag ccctggatca ggtgtttgaa agtgttgaga 1620 agagtcagaa tctgatagac cagtcaaaca a£atattgga tagcattgaa aaggggaatg 1680 caggatttgt catagtgata gtcctcattg tcctgctc&t gc^gcagca gttggtgtgg 1740 gtgtcttctt tgtggttaag aagagaaaag ctgctcccaa attcccaatg gaaatgaatg 1800 gtgtgaacaa caa2ggattt atcccttaat tuagttact aaaaaattgg gacaagtgaa I860
<210>6 <211>574 <212>蛋白質 <213>副黏液病毒 <400> 6
Met Glu Leu Leu He His Arg Leu Ser Ala Be Phe Leu Tlir Leu Ala 15 10 15 lie Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser G!n Asn lie Thr Glu Glu Phe 20 25 30
Tyr Gin Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Qy Tyr Phe Ser Ala Leu 35 40 45
Arg Thr Gly Tip Tyr Thr $er Val De Thr lie Glu Leu Ser Asn De 50 55 60
Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ώιτ Lys Val Ly$ Leu He Lys 65 70 75 80
Gin Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gin Leu Leu 85 90 95 •Met Gin Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 144243-序列表.doc 1356848
Gin Tyr Met Asn Tyr Thr De Asn Thr Tlir Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125
De Ser Lys Lys Arg Lys Aig Arg Pbe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140
Gly Ser Ala lie Ala Ser Gly lie Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160
Glu Gly CHu Val Asn Lys lie Lys Asn Ala Lai Leu Ser Thr 人sn Lys 165 170 175 .
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Vai Leu Tnr Ser Lys Val 180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr He Asa Asn G!n Leu Leu Pro lie Val Asn 195 200 205
Gin Gin Ser Cys Arg De Ser Asn De Glu Thr Val He Glu Phe Gin 210 215 220
Gin Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu He Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240
Ala Gly Val Tor Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu :245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ue Asn Asp Met Pro Πε Thr Asn Asp G!n Lys Lys 260 265 270
Leu Met Ser Ser Asn Val Gin De Val Arg Gb Gin Scr Tyr Scr lie 275 280 285
Mec Ser lie lie Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gb Leu Pro 290 295 300 lie Tyr Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320
Leu Cys Thi Thr Asn De Lys Glu Gly Ser Asn He Cys Leu Thr Arg 325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Aia Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350
Pro Gin Ala Asp Thr Cys Lys Val Gin Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 '
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pio Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr 370 375 380
Asp De Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Ly$ lie Met Ώιτ Scr Lys Thr 385 390 395 400
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Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asr Lys Asn Arg Gly De De 420 425 430
Lys Thr Hie Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445
Thr Val Ssr Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly 450 455 ^
Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Fro De He Asn Tyr Tyr Asp Pro 465 . 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Pbe Asp Ala Ser lie Ser Gin Val Asn 485 490 495
Glu Lys De Asn Gin Ser Leu Ala Pte lie Aig Axg Ser Asp Glu Leu 500 505 510
Leu His Asn Val Asn TTir Gly Lys Ser Tnr Thr Asn De Met lie Thr 515 520 525 Τΐτ De De De Val Qe De Val Val Lea Leu Sct Leu He Ala He 144243·序列表,doc -6- IS 3 1356848 530 535 540
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Arg Fht Met Asn Tyr Tnr Leu Asn Asn A!a Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Ai? Phe Leu Giy Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140
Gly Ser Ala lie Ala Ser Gly Val Ala Yal Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 G]u Gly G】u Val Asn Lys lie Lys $er Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175
Ala Val Vsl Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 18S 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr De Asp Lys Gin Leu Leu Pro lie Val Asn 195 200 205
Lys Gin S» (¾¾ Sa* De Ser Asn Ee Glu Thr Vai De Glu Phe Gin 210 215 220
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Leu Leu Ser Leu He Asn Asp Met Pro De Thr Asn Asp Gin Lys Lys 260 265 270
Leo Wet Ser Asn Asn Val Gla De Val Arg Gin Gin Ser Tyr Ser De 275 280 285
Mel Ser lie lie Lys Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gin Leu Pro 290 295 300
Leu Tyr Gly Vai lie Asp Thr Pro Cys Tip Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320
Leu Cys Th-r Tnr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn De Cys Leu Thr Arg 144243-序列表.doc 1356848 325 330 335
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Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser De Ser Gin Val Asn 485 490 495
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<210>8 <211> 121 <212>蛋白質 <213>間質肺病毒 <400> 8
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Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gin Leu Ala Ar£ Glu Glu Gin De Glu 85 90 95
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Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175
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Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300
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•9- 144243·序列表.doc 1356848 355 360 365
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Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met He Leu Val Scr Val Phe lie 500 505 510
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Ala Val Asn Asp Leu Lk Asp Phe He Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 lie Asn Arg Asn Lys Cys Asp Dc Scr Asp Ltu Lys Met Ala Val Scr 144243-序列表.doc -10- [S1 1356848 180 185 190
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Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr fle Val GLn 260 265 270
Leu fto lie Phe Gly W1 He Asp Thr Pro Cys Trp “ Val Lys Ala 275 280 285 .
Ala Pro Lea Cys Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300
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Leu Asp Ser fle Glu Lys Gly Asa Ala Gly Phe Val De Val De Val 485 490 495
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Gly Gly Leu Glu Glu Ser Tyr Le^ Glu Glu Scr Cys Ser Thr Val Thr 20 25 30
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Ser Pro Arg Lys Ala Arg Phe Val Lea Gly Ala lie Ala Leu Gly Val 100 105 110
Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala De Ala Lys Thr lie 115 120 125
Arg Leu Glu Gly Glu Val Ala Ala De Lys Gly Ala Leu Aig Lys Thr 130 135 140
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Gly De Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr De Val Gin 260 265 270
Leu Pro He Phe Gly Val He Asp Thr Pro Cys Trp Lys Val Lys Ala 275 280 285
Ala Pro Leu C>(s Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 .
Glu Asp Gin Gly Trp Tyr Cys Gin Asn Ala Gly Ser Tm： Val Tyr Tyr 305 310 315 320
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Leu De Val Leu Leu Met Leu Ala Ala Val Gly Val Gly Val Fne Phe 500 505 510
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<210> 12 <2U>538 <212>蛋白質 <2i3>火雞鼻氣f求肩毒·. <40Q>12
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Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160
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Asp Glu Leu Val Arg Ala Ik Asn Arg Met Pro Thr Ser Ser Giy Gbi 225 - 230 235 240 fle Ser Leu Met Leu Asn Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255
Gly He Leu He Gly Val Tyr Asp Gly Thr Val Val Tyr Met Val Gin 13· 144243·序列表.doc 1356848 260 265 270
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Ala Pro Lea Cys Arg Lys Glu Lys Gly Asn Tyr AJa Cys lie Leu Arg 290 295 300
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<210>13 <211> 537 <212>蛋白質 ^&禽肺病毒 <400> 13
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Ala Glu Leu Val Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Tnr Ser Ser Gly Gin 225 230 235 240
De Asn Leu Met Leu Giu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255
Gly Be Leu Dc Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr He Vel Gin 260 265 270
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Glu Ser Val Glu Lys Ser Gin Asn Leu De Asp Gin Ser Asn Lys He 465 470 475 480
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Gly Va] Asn Asn Lys Gly Phe He Pro 530 535 <210> 14 <211>1193
<212>DNA <213>鼻氣管炎病毒 <220> <221>CDS <222> (16)...(1191) <223>火雞鼻氣管炎病毒（品系CVL 14/1) 酧接蛋白質（G) mRNA >完整的cds <400> 14
gg£acsagla tctciatggg £tccaaacta tatatggctc asggcaccag t£catatcaa 60 ac(gca£tgg gguctg^ct ggacaicggg aggaggiaca tsnggctat agtcctatca 120 gctitcg£gc tgacctgcac agicaaatt gcactcactg ttagcgtcat agttgaacag 180 tcagtgttag aggagtgcag aaactacaat ggaggagata gagaUggtg gtcaacca:c 240 caggagcagc caactactgc accaagtgcg 2ctccagcag gaaattatgs aggattacaa 300 acggcicgaa caagaaagtc tgaaagctgt ttgcatgtgc aaatttctta tggtgatatg 360 tatagccgca gtgatactgt act£ggtggt tttgattgia rgggcttatt ggttctttgc 420 aaatcaggac caatttgtca gcgagataat caagttgacc caacagccct ctgccattgc 480 agggtagatc tttcaagtgt ggactgctgc aaggtgaaca agattagcac taacagcagc 540 accacctctg agccccagaa gaccaacccg gcatggccta gccaagacaa cacagactcc 600 gatccaaatc cccaaggcat aaccaccagc acagccactc tgctctcaac aagtctgggc 660 cccatgctca calcgaagac tgggacacac aaatcagsgc ccrcccaagc cngccgggg 720 agcaacacca acggaaaaac aaccacagac cgagaaccag ggcccacaaa ccaacca^at 730 tcaaccacca atgggcaaca caataaacac acccaacgaa tgacaccccc gccaagtcac 840 gacaacacaa £aaccatcct ccagcacaca scacrctggg aaaagscan cagtacaiac900 aagcccacac actctccgac caacga2tca galcaatccc tccccacaac tc22aacagc 960 atcaactgtg aacattttga cccccaaggc aaggaaaaaa tctgctacag agtaggttct 1020 tacaactcca aiactacaaa gcaatgcaga attgatgtgc ctttgtgttc cacttatagc 1080 acagtgtgca tgaaaacata ctataccgaa ccattcaacf gttggaggcg tatctggcgt 1140 igcugigig atgacggagt tggcaggu gagtggtgtt gcaciagtm aa 1193 <210> 15 <211> 1260 <212> DNA <213>鼻氟管炎病毒 <220>
<221> CDS <222> (16)...(1260) t <223>火雞鼻氣管炎病毒(品系6574) 附接蛋白質（G)，完整的cds <400>15 gggacaagla tccagatggg gtcagagctc t2catcatag agggggtgag ctcatctgaa 60 aagtcctca agcaagtcct cagaaggagc caaaaaaiac tgttaggact ggtgttatca 120 gccttaggct tgacgctcac tagcactatt gttatatcta tttgtattag tgtagaacag 180 £icaaatiac gacagigist ggacacttat igggcgg2aa atggaicctt acaicc2gga 240 -16-
144243-序列表.doc IS 3 1356848 cagtcaacag a22at2cuc 2acaagaggt aagaciacaa caaaagaccc t2gaagatta 300 caggcgactg gagcaggaaa gutgagagc tgtgggtatg tgcaagttgt tgatggtgat 360 a^catgatc gcagltatgc tgtaagggt ggtgttgatt gtttgg£ctt attggcictt 420 tgtgaatcag £2ccaaEttg tcagggagat scttggtctg aagacgga2a cttctgccga 480 tgcacttttt cttcccatgg ggigagttgc tgcaaaaaac ccaaaagcaa ggcaaccact 540 gcccagagga actccaaacc agctaacagc asatcaactc ctccggtaca itcagacagg 600 gccagcaaag aacat2stcc ctcccaaggg gagcaacccc gcagggggcc aaccagcagc 660 aagacaacia ttgctagcac cccticaaca gaggacactg ctaaacc2ac gaitagcaaa 720 cciaaactca ccaic2ggcc ctcgcaaaga ggtccaiccg gca£cacaaa aecagcctcc 780 agcaccccca gccacaagac caacaccaga gicaccagca agacgaccga ccagagaccc 840 cgcaccggac ccacicccga aaggcccaga caaacccaca gcacagcaac tccgcccccc 900 acaaccccaa tccacaaggg ccgggcccca acccccaaac caacaacaga ccic2aggtc 960 aaccca2ggg aaggcagcac aagcccaact gcaatacaga aaaacccaac cacacaaagt 1020 aatcct£ng acigcacact gtctgaicca gatgagccac aaaggatug ciaccaggia 1080 gga2Cttaca aEcctagtca atcgggaacc tgcaacatag aggttccaaa atgttccact 1140 tatgggcatg cttgtatggc lacattatat gacaccccat tcaactgctg gcgcaggacc 12(X) aggagatgca tctgtgattc cgg2〇gggag ctgattgagt ggtgcigEac tagtcaataa 1260
<2I0>26 <2il>391 <212>蛋白質 火雞鼻氣管炎病毒 <400〉16 ·
Met Gly Ser Lys Leu Tyr Met Ala GLn Gly Thr Ser Ala Tyr Gin Tkr I 5 10 】5
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Val Leu Ser Ala Phe Gly Leu Thr Cys Thr Val Thr De Ala Leu Thr 35 40 . 45
Val Ser Val lie Val Glu Gin Ser Val Leu Ghi CJhi Cys Aii Asn Tyr 50 55 60
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Val Leu Lys Gin Val Leu Arg Arg Ser Gin Lys lie Leu Leu Gly Leu 20 25 30
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Cys Leu Gly Leu Leu Ala Leu Cys Glu Ser Gly Pro De Cys Gin Gly 130 135 140
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His Gly Val Ser Cys Cys Lys Lys Pro Lys Scr-Lys Ala Thr Thr Ala 165 170 175
Gin Arg Asn Ser Lys Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Pro Pro Val His 180 185 190
Ser Asp Arg Ala Ser Lys Glu His Asn Pro Ser Gin Gly Glu Gin Pro 144243-序列表.doc -18- IS ] 1356848 195 200 205
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Aia Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Γητ Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp Be Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190
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Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Ήιγ Ser Ala Gly Gin 225 230 235 240
De Lys Leu Met Lsu Glu Asn Arg Ala Met Va] Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255
Gly He Leu De Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gin 260 265 270
Leu Pro Be Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Tip He "Val Lys A】a 275 280 285
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Asn Glu Ala Val Ser Tar Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 255 160
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Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gin 225 230 235 240 lie Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Vai Arg Lys Gly Phe 245 250 255
Gly lie Leu He Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val He Tyr Thr Val Gin 260 265 270 i
Leu Pro lie Phe Gly Val De Asp Ibr Pro Cy$ Tip lie Val Lys Ala 275 280 285
Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300
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Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gin Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430
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144243·序列表.doc IS ] 1356848 225 230 235 240
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Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gin Leu Ala Arg Glu Glu Gin He Glu 85 90 95
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Ala Val Arg Glu Leu Lys Glu Phe Va! Ser Lys Asn Leu Thr Ser Ah 165 170 175
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Gly lie Leu De Gly Val Tyr Gly Ser Ser Vai He Tyr Met Val Gb 260 265 270
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Thr Val Thr He Asp Asn Thr Val Tyr Gin Leu Ser Lys Va! Glu Gly 420 · 425 430
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Gly Vai Thr Asn Gly Gly Fae lie Pro His Ser 530 535
<210> 22 <211>1620 <212>DHA <2】3>人類間質肺病毒 <400>22
atgtcctgga aagtggtgat cattttttca Ugtlaataa cacc&:aaca c£gtc〇aaa 60 gagagctact tagaagagic atgtagcact ataactgaag gatalctcag tgctctgagg 120 acaggttggt acaccaatgl ttttacactg gaggtaggcg atgtagagaa ccttacatgt 180 gccgBxggzc ccagctcaat aaaaacagaa ttagacctga ccaaaagtgc actaagagag 240 acagsac埤 ttic丨gctga icaactggca agagaggagc aaattgaaaa tcccagacaa 300 tctagattcg ttctaggagc aatagcacic ggtgttgcaa ctgcagctgc agttacagca 360 ggtgttgcaa ttgccaaaac catccggcttgaaagtgaag taacagcaat taagaatgcc 4¾) ctcaaaaaga ccaatgaagc agtatctsca trggggaatg gagttcgtgt git£gcaact 480 gcagtgagag agctgaaaga tutgtgagc aagaatctaa cacgtgcaat caacaaaaac 540 aagtgcgaca ccgcigacci gaaaatggcc gttagcttca gtcaaiicaa cagaageuc 600 ctaaatgttg tgcggcaatt ttcagacaac gctggaaiaa caccagcaat atctttggac 660 ttaatgacag atgctgaact agccagagct gtttccaaca tgccaacatc tgcaggacaa 720 aiaaaactga tgttggagaa ccgtgcaatg staagaagaa aagggttcgg aatcctg^a 780 ggagtttacg gaagctccgt aatttacatg gfecaactgc caatctttgg ggttatagac 840 acgccttgct ggatagtaaa ^cagcccct icttgttcag gaaaaaaggg aaaciatgct 900 ^ccictiaa gagaagacca aggatggtat tgtcaaaatg cagggtcaac tgtttactac 960 ccaaatgaaa aagactgtga aacaagaggagaccacgtct tttgcgacac sgcagcagga 1020 atcaatgttg ctgagcagtc aaaggagtgc aacalaaaca tatctactac taattaccca 10S0 tgcaaagtta gcacaggaag acatcctatc ^tatggng cactatctcc tcttggggct 1140 ttggttgctt gccacaaggg sgtgagccgt iccattggca gcaacagagt agggatcatc 12CX) aagcaactgii acaaaggctg etcttatata accaacc^ag acgcagacac agtgacaata 】2S) gacaacactg tataccagct aagcaaagtt gaaggcgaac agcatgttat aaaaggaagg 1320 ccagtgrcaa gcagctttgacccagtcaag tttcctgaag atcaaucaa t£ttgcactt 1380 gaccaagttt tcgagagcat tg^aacagt caggccttgg tggatcaatc ^acagaatc 1440 ctaagcagtg cagagaaagg aaac^iggc ttcatcattg raataattct aattgc^tc 1500 cttggctcta ccatgatcct agtgagtgtt titatcataa taaagaaaac aaagaaaccc 1560 acaggagcac ctccag^ct gagtggtgtc acaaacaatg gcttcatacc scataattag 1620
<210>23 <211> 1620 <212>DNA <213>人類間質肺病毒 <40〇>23 atgtcctgga aagtggtgat cattttttca ctgctaataa cacctcaaca cggtcttaaa 60 gagagctacc lagaagaatc atgtagcact ataactgagg gatatctiag tgttctgagg 120 acaggttggt ataccaacgt tatacatta gaggcgggig atgt^aaaa ccttacatgt 180 tctgatggac ctagcctaat aaaaacagaa ttagatctsa ccaaaagtgc actaagagag 240 -25- 144243·序列表.doc 1356848
ctcaaaacag tcictgctga ccaattggca agagaggaac eaai^agaa tcaagacea 300 tctaggtttg ttctaggagc aatagcaccc ggtgtigcaa cagcagctgc agtcacagca 360 ggtgttgcaa ttgccaaaac catccggctt gagagtgaag icacagcaat taagaatgcc 420 ctcaaaacga ccaatgaagc agtatetaca ttggggaatg gagltcgagt gttggcaact 480 gcagcgsgag agctaaEaga ctrtgigagc aagaatttaa cicgtgcaar caacaaaaac 540 aagigcgaca ngaigacct aaaaatggct gttagcttca gtcaattcaa cagaaggiU 600 ctaaatgttg tgcggcaatt ncagscaat gctggaataa caccagcaat atcttiggac 660 uaaigacag atgcigaact agcc2gggcc gtctctaaca tgccgacatc tgcaggacaa 720 ataaaat^a tgttggegaa ccgtgcgatg gtgcgaagaa aggggttcgg aatcctgata 780 ggggtctacg ggagctccgt aamacacg gtgcagctgc caatctttgg cgtiatagac 840 acgccUgct ggatagiaaa agcagcccct tcttgrtccg aaaaaaaggg aaactatgct 900 tgcctcttaa gagaagacca sgggtggtat tgicagaatg cagggtcaac tgtuactac 960 ccaaatgaga aagactg【g£ aacaagagga gaccatgtct tt^cgacac agcagcagga 1020 auaatgug ctgagcaa^: &aaggagtgc aacaicaaca tatccactac aaattaccca 1080 tgcaaagtca gcacaggaag acatcctstc agtatggttg cactgtctcc tct^gggct 1140 ciggctgctt gctacaaagg agtaagctgt tccattgsca gcaacagagt agggarcaic 1200 aagcagctga acaaaggtig ctcctatata accaaccaag atgcagacac agtgacaata 1260 gacaacactg tatatcagct aagcaaagtt gagggtgaac agcatgttat aaaaggcaga 1320 ccagtgtcaa gcagctttga tccaatcaag tttcctga^ atcaattcaa tgt^cactt 1380 gaccaagttt ttgagaacat tgaaaacagc caggccitag tagatcaatc aaacagaatc 1440 ctaagcagtg cagagaaagg gaatactggc tttatcactg taacaaitct sattgctgtc 1500 cttggctcta gcatgatcct agtgagcatc ttcattataa tcaagaaaac aaagaaacca 1560 acgggagcac ctccagagct gagtggtgtc acaaacaatg gcttotacc acacagttag 1620 <2i0>24 <211> 1620 <212> DNA <2]3>人類間質肺病毒 <400>24 atglcttgga aagtgatg^ catcatttcg itacicataa caccccagca cgggclaaag 60 gagagtiatt t£gaagaatc acgtagtact ataactgagg gatacctcag tgttttaaga 120 acaggctggt acactaatgt cttcacatta gaagttggcg atgttgaaaa tcuacatgt 180 actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgatctaa camagtgc tttaagggaa 240 ctcaaaacag tctctgctga tcagttggcg agagaggagc aaatigaaaa Ecocagacaa 300 tcaagatUg tcttaggtgc gatagctctc ggagttgcta cagt^cagc aglcacagcS 360 ggcattgcaa tagccaaaac caiaaggctt s^S^g^iS tgaatgcaat taaaggtgct 420 ctcaaacaaa ctaatgaaic agtatccaca tt£g£gaatg gtgtgcgggtcctagccact 480 gcagtgagag agctaaaaga autgigagc aaaaacctga ctagtgcaat caacaggaac 540 aaatgtgaca tt^tgatct gzzgBXggci gtcagcrtca gtcaattcaa cagaagattt 600 ctaaatgttg tgcggcagtt ctcagacaat gcagggaiaa caccagcaat atcattggac 660 ctgatgactg atgctgag^ ggccagagct gtatcataca tgccaacatc tgcagggcag 720 ataaaactga tgttggagaa ccgcgcaatg gtaaggagaa aaggatttgg aalcctgata 780 ggggtctacg gaagctctgt gatttacatg gttca^ugc cgactttgg tgtcatagat 840 acaccttgtt ggatcatcaa ggcagctccc tcttgctcag aaaaaaacgg gaattatgct 900 tgccicctaa gagaggaica aggg^gtat tgtaaaaatg caggatctac tgittactac 960 ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggl gatcatgttt cugtgacac agcagc^gg 1(^0 atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctact^: caactaccca 1080 tgcaaagtca gcacaggaag acaccciaia agcatggitg cactatcacc tctcggcgct 1140 Uggtggctt gctataaagg ggteagctgc icgattggca gcmtgggt tggaatcatc 1200 aaacaattac ccaaaggctg ctcatacata acca^agg atgcagacac tgtaacaaa 1260 gacaataccg igtatcaaa aagcaaagtt gaaggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320 ccagtucaa gcagttitga tcxaatcaag ttlcctgagg aicagticaa tgttgcgctt 1380 -26-
144243-序列表.doc IS! 1356848
gatcaagtct tcgaaagcat igagaacagt caggcactag iggaccagtc aaacaaaatt 1440 ctaaacagtg cagaaaaagg aaacactggt ttcattaicg tagtaatttt ggttgctgtt 15(X) cttggtctaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaagaaaac aagga2gccc 1560 acaggagcac ctccagagct gaatsgtgtc accaacggcg gtttcatacc acataguag 1620 <210>25 <211> 1620 <2L2>DNA <2!3>人類問質肺病毒 <400>25
atgtcttgga aaglgatgal tatcatttcg ctactcalaa cacctcagca cggaclaaaa 60 gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120 acaggttggt ecaccaatgt cUtacatta gaagttggte atgttgaaaa tcttacatgt 180 ac;gatggac ctagcdaat caaaac^aa cttgacctaa ccaaaagtgc tctgagagaa 240 ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg agagaaga^: aaattgaaaa tcccagacaa 300 tcaaggtttg tccl2£gtgc aaiagctctt ggagttgcca cagcagc^c agtcacagca ZOO ggcattgcaa tagccaaaac caiaagaca gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgct 420 ctcaaaacaa ccaacgzggc agtatccaca ctaggaaa^ gagtgcgagt cctagccact 480 gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcgat caacaagaac 540 aaatgtgaca ttgctgaict gaagatggci gtcagcttca g^caattcaa cagaagattc 600 ccaaatgtts tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcatiggsc 660 ctaaigactg atgctgagct ggccagagcc gtatcaiaca tgccaacatc tgcaggacag 720 ataaaactaa tgttagagaa ccgcgcaatg gt^aggggaa aaggattegg aatcttgata 7¾) ggagtctacg gaagctctgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcmagat 840 acacctcgn ggataatcaa ggc&gciccc tcngvcng aasaagacgg aaattatgct 9CO tgcctcctaa gagaggatca agggtggiat tgcaaaaatg caggstccac rgntact2c 960 ccasacgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac a£〇agcaggg 1020 atcaatgttg ctgsgcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctaccac caaciaca:a 1080 tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcalggttg cactatcacc tctcggtgct 1140 ttgglagctt gctacaaggg gstlagctgc icgaitggca gtaatcgggt tggaata2tc 1200 aaacaactac claaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacsc tgtaacaait 1260 gacaacactg (gtaicaacl aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320 ccagutcaa gcagttttga iccaatcagg cttcctgasg atcagttcaa tgttgcsctt 138G gatcaagtct ttgaaagcargaaaacagi caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440 ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggt ttealtal^ taataatttt gattgc^tt 15(X) cttgggrtaa ccatgatttc agigagcaic atcatcataa ccaaaaaaac aaggaagccc 1560 acaggggcac ctccagagcl gaatggtgtt accaacggcg gtttlatacc gcalagttag 1620 <210> 26 <211> 236 <212>峑白督 ^^人類間質赌病毒 <4〇〇>26
Met GIu Val Lys Val Glu Asn He Arg Thr lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15
Arg Val Lys Asn Ai?： Vai Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala S«r 20 25 30
Leu Val Leu He Gly lie Thr Thr Leu Ser Qe Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45
Leu lie He Asn Tyr Lys Met Gin Lys Asa Thr Ser Gla Ser Glu His -27- 144243-序列表.doc 1356848 50 55 60
His Thr Scr Scr Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg GIu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80
Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser Pro Gin His Pro Thr Gin 85 90 95
Gin Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phc Ala Ala Ser Ala Ser Ser ICO 〖05 110
Pro Glu Thr Qu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Tlir Thr Asn Arg Pro Pro 115 120 125
Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Scr AJa Ser Arg Thr Lys Τΐτ 130 135 140
Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg Thr Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160
His Ser Pro pro Arg Ala Thr Thr Arg Thr Ala Ate Arg Thr Tor Thr 165 170 175
Leu Arg Thr Ser Ser Thr Ars Lys Arg Pro Ser Thr Ala So* Val Gin 180 185 190
Pro Asp He Ser Ala Thr Trn* His Lys Asn Glu Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 205
Ser Pro Gin Thr Ser Ala Ssr Thr Thr Arg Ce Gin Arg Lys Ser Val 210 215 220
Glu Ala Asn Thr So* Thr Thr Tyr Asn Gin Tnr Ser 225 230 235 <210>27 <21]>219 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <4〇0>27
Met Glu Vai Lys Val Glu Asn He Arg Ala He Asp Mel Leu Lys Ala 1 5 30 15
Arg Val Lys Asn Ais Val Ala Arg Ser Lys Cys Fne Lys Asn Ala Ser 20 25 30
Leu lie Leu Πε Gly De Thr Thr Leu Scr lie Ala Leu Asn He Tyr 35 40 45
Leu lie De Asn Tyr Thr He Gin Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60
His Thr Ser Ser Pro Fro Thr Glu Pro Asn Lys Glu Ala Ser Thr He 65 70 75 80
Ser Thr Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Ser Ser Gin His Pro Thr Gin 85 90 95
Gin See Thr Glu Asn Pro Thr Leu Asn Pro Ak Ala Ser Ala Ser Pro 100 105 Π0
Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Asp Thr Tnr .^sn Aig Leu Ser 115 120 *125
Ser Val Asp Arg Scr Thr Ala Gin Pro Scr Glu Scr Arg Thr Lys Thr 130 135 140
Lys Pro Thr Val His Thr Be Asn Asn Pro Asn Tor Ala Ser Sct Thr 145 150 155 160
Gin Ser Pro Pro Arg Thr Tnr Thr Lys Ala De Arg Arg Ala Thr Thr 165 170 175
Pte Arg Met Scr Scr Thr Gly Lys Arg Pro Thr Thr Τϊγ Leu Val Gin 144243-序列表.doc •28- ts 1 1356848 180 185 190
Ser Asp Ser Ser Thr Tlir Thr Gin Asn His G!u Glu Tnr Gly Ser Ala 195 200 205
Asn Pro Gin Ala Ser Ala Ser Thr Met Gin Asn 210 215 <2!0>28 <2il>224 <2i2>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <4(K)>28
Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala De Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15
Lys lie Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Arg Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30
Leu JJe Leu lie Gly Leu Ίΐτ A]a Leu Ser Met Ala Leu Asn Ils Phe 35 40 45
Leu De Be Asp His Ala Thr Leu Aig Asn Met De Lys Thr Glu Asn 50 55 60
Cys Ala Asn Met Pro Ser Ala Glu Pro Ser Lys Lys Tor Pro Met Thr 65 70 75 80
Ser Tor Ala Gly Pro Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gin Gin Ala Thr Gin 85 - 90 95
Tip Thr Thr Giu Asn Ser Thr Ser Pro Val Ak Thr Pro Glu <31y His 100 105 no
Pro Tyr Thr Gly Thr Thr Gin Thr Ser Asp Thr Thr Ala Pro Gin Gin 115 120 125
Tnr Thr Asp Lys His Thr Ala Pro Leu Lys Ser Tnr Asn Glu Gin De 130 135 · 140
Thr Gin Thr Thr Thr Glu Lys Lys Ήιτ lie Arg Ala Thr Thr Gh Lys 145 150 155 160
Arg Glu Lys Gly Lys Glu Asn Thr Asn Gin Thr Thr Ser Thr Ak Ala 165 170 175
Thr Gin Ήιτ Thr Asn Thr Thr Asn Gin Ite Arg Asn Ala Ser Glu Thr 180 185 190
De Thr Thr Ser Asp Arg Pro Arg Thr Asp Thr Thr Thr Gin Ser Ser 195 200 205
Glu (3In Thr Thr Arg Ala Thr Asp Pro Ser Ser Pro Pro Hig Ala 210 215 220 <210>29 * <211>236 <212>蛋白質 、 <213>人類間質肺病毒 <400〉29
Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15
Lys Met Lys Asn Asg He Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30
Leu lie Leu He Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Lea Asn lie Phe -29· 144243-序列表.doc 1356848 35 40 45
Lee ϋε lie Asp Tyr Ala Met Leu Lys Asn Met Thr Lys Val Glu His 50 55 60
Cys Val Asn Met Pro Pro Val Giu Pro Ssr Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80
Ser Ala Val Asp Leu Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gin Gin Ala Thr Glu 85 90 95
Leu Ala Ala Glu Asp Ser Thr So: Leu Ala Ala Tor Ser Gla Asp His 100 105 110
Leu His Thr Gly Thr Thr Pro Thr Pro Asp Ala Thr Vsl Ser Gin Glr； 115 120 125
Thr Thr Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Leu Axg Ser Thr Asn Arg Gin Oir '130 135 140
Thr Thr Thr Thr Glu Lys Lp Pro Thr Oly Ah Thr Thr Lys Lys 145 150 155 i60
Glu Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gin Thr Leu Asn 165 170 175
Thr Thr Asn Gin Thr Ser Tyr Val Arg Glu Ala Thr Xtt Thr Ser Ala 180 185 】90
Arg Ser Arg Asn Ser Ala Thr Thr Gin Ser Ser Asp Gin Thr Thr Gin 195 200 205
Ala Ala Asp Pro Ser Ser Gin Pro His His Thr Gin Lys Ser Thr ITir 210 215 220
Thr Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Ser Pro Ser Ser 223 230 · 235 <210>30 <211>708
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 30 gaggtgaaag iggsgaacat tcgaacaaia gatatgetea aagcaagsst aaaaaatcgt S) gtggcacgca gcaaagctt taaaaacgcc tctttggtcc tcaiaggaar aaciscattg 120 agtaugccc ccaataccta tctgatcata aactataaaa tgcaaaaaaa cacatcigaa ISO tcagaacatc acaccagctc atcacccatg gaatccagca gagaaactcx aacggtcccc 240 acagacaact cagacaccaa ctcaagccca cagcatccaa ctcaacegtc cacagaaggc 300 tccacactct aetttgeage ctcagcaagc tcacca£aga cagaaccaac atcaacaixa 360 gatacaacaa accgcccgcc cttcgtcgac acacacacaa OEccaccaag cgcaagcaga 420 acaaagacaa giccggcagt ccacacaaaa aacaacccaa ggaraagcic tagaacacat 480 cctccaccac gggcaacgac aagg2cggca cgcagaacca ccactctccg cacaagcagc 540 acaagaa^a gaccgtccac ^caicagic caacctgacs. icagcgcax eacccacaaa 600 aacgaaga2g caagxcagc gagcccacaa acatctgcaa ^acaacaag aatacaaagg 660 aaaa〇cgtgg aggccaacac atcaacaaca tacaaccaaa cragttaa 708 <210>3!
<211> 660 <212>DNA <213>人類間質肺病養 <400>31 aiggaggtga aagtagagaa caitcgagca atagacatgc tcaaagcaag agtgaaaaat 60 cgtgtggcac gtagcaaaig ccnaaaaat gcticinaa iccicaiagg aaiaactaca 120 -30-
144243-序列表,doc 1356848
ctgagtatag ctctcaaia ciatagatc ataaactacacaaiacaaaa aaccacatcc 180 g2atcagaac accacacc^ cicaccaxc acagaaccca ac^iaggasgc «caacaalc 240 tccacagaca acccagacat caatcc^agc tcacagcetc caactca^a gtccacagaa 300 aEccccacac tcaaccccgc agcatcagcg agcccaccag aaacagaacc agcatcatca 360 ccag2cacaa caasccgcct glcclccgta gacaggtcca cagcacaacc aagtgaaagc 420 agaacaaaga caaaaccgac agtcracaca atcaacaacc caaacacagc Uccagiaca 480 eaaicccc£t: cacggacaac aacgaaggca atccgcagag cc^ccacltt ccgcatgagc 540 agcacaggaa 2aag2ccaac caceacatta gtccagtccg acsgcagcac cacaacccaa S30 aaccacgaag Eaacag^nc agcgaaccca caggcgtcig caagcacaat gcaaaactag 660 <210>32 <211> 675 <212>DNA
<213>人類間質肺病毒 <40Q> 32 at£g£agtaa gagtggagaa cattcgagcg atagacatgt tcaaagcaaa gataaaaasc 60 cgtata2gaa gcagcaggrg cratagaaat gctacactga tccttattig actaacagcg 120 ttaagcatgg cacttaatat titrate atcgatcatg caacauaag aaacatgatc 180 aaaacagaaa actgtgctaacatgccgtcggcagaaccaa gcaaaaagac cccaatgacc 240 tccacagcag gcccaaacac caaaccoiat ccscagcaag caacacagtg gaccacagag 300 aactcaacat ccccagtagc aaccxcagag ggccatccat acacagggac aactcaaaca 360 tcagacacaa cagctcccca ^aaacraca gacaaacacacagcaccgct aaaatcaacc 420 aatgaacaga tcscccagacaaccacagag aaaaagacaa tcagagcsac aacccaaaaa 480 agggaaaaag gaaaagaaaa cacaaaccaa ^cacaagca cagctgcaac ccaaacaacc 540 aacaccacca accaaatcag aaatgcaagi gagacaatca caacacccga cagaccc^a 600 actgacacca caacccaaag cagcgaacag acaacccggg caacagaccc aagctcccca 660 ccacaccatg catag 675 <210>33 <211>711
<212>DNA
<213>人類間質肺病毒 <400>33 atggaagtaa gagtggagaa cattcgggca atagaca^c tcaaagcaaa aatgaaaaac 60 cgtataagaa gtagcaagtg ctatagaaat gctacactga tcctxatigg aitaacagca 120 ttaagta^g ca^taatat timtaatc attgattatg caatgttaaa aaacatgacc 180 aaagiggaac actgtgtm tatgccgccg gugaaccaa gcaagaagac cccaatgacx: 240 tetgeagtag acttaaacac caaacccaatccacagcagg caacacagit ggcc^ragag 3(X) gsttcaacat ctctagcagc aacctcagag gaccatctac acacagggac aactccasca 360 ccagatgcaa cagictctca gcaaaccaca gacgaglaca caacattgct gagatcaacc 420 aicagacaga ccacccaaac aaccacagag aaaaagccaa ccggagcaac aaccaaaaaa 480 gaaaccacaa ctcgaactac eagcacagct gcaacaaaa cactcaacac taccaaccaa 540 actagctatg tgagagagge aaccacaaca tccgccagat ccagaaacag tgccacaact 600 caaagcagcg accaaacaac ccaegcagca gacccaagct cccaaccaca ccatacacag 6&) aaaagcacaa caacaacata caacacagac acatcctetc caagtagtra a 711 <210>34 <211> 2005 <2丨2>蛋白質 <21>人類間質肺病秦 -31 - 144243-序列表.doc 1356848 <400> 34
Met Asp Pro Lea Asn GIu Ser Thr Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser 15 10 15
Tyr Leu Lys Gly Val He Ser Phe Ser Glu Thr Asn Aia lie Gly Ser 20 25 30
Cys Leu Leu Lys Arg Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Asn Thr A!a Lys Val 35 40 45
Ala Ils Glu Asn Pro Val He Glu His Val Arg Leu Lys Asn Aia Val 50 55 60
Asn Ser Lys Met Lys De Ser Asp Tyr Lys lie Val Glu Pro Va! Asn 65 70 75 80
Mel Gin His Glu Ee Met Lys Asn Val His Ser Cys Glu Leu Thr Leu 85 90 95
Leu Lys Gin Phe Lea Thr Aii Ser Lys Asn lie Ser Thr Leu Lys Leu LOO 105 110
Asn Met lie Cys Asp Tip Leu Gin Leu Lys Ser Thr Ser Asp Asp Thr 115 120 125
Ser Βε Leu Ser Phe lie Asp Val Glu Phe lie Pro Ser Tip Val Ser 130 135 140
Asn Trp Phe Ser Asn Trp Tyr Asn Leu Asn Lys Leu He Lea Glu Phe 145 150 丨55 160
Arg Lys Glu Glu Val lie Arg Thr Gly Ser lie Leu Cys Arg Scr Leu 165 170 175
Gly Lys Leu Val Phe Val Val Ser Ser Tyr Gly Cys lie Val Lys Ser 1B0 · 185 190
Asn Lys Ser Lys Arg Val Ser Phe Phe Tnr Tyr Asn Gin Leu Leu Thr 195 200 205
Trp Lys Asp Va] Met Leu Ser Arg Phe Asn Ala Asn Hie Cys lie Trp 210 215 220
Val Ser Asn Ser Leu Asn Glu Asn Gin Glu Gly Leu Gly Leu Arg Ser 225 230 235 240
Asn Leu Gin Gly De Leu Thr Asn Lys ILeu Tyr Glu Thr Val Asp Tyr 245 250 255
Met Leu Ser Leu Cys Cys Asn Glu Gly Phe Ser Leu Val Lys Glu Phe 260 265 270
Glu Gly Phe He Met Ser Glu lie Leu Arg Ils Thr Glu His Aia Gin 275 280 285
Phe Ser Tnr Arg Phe Arg Asn Thr Leu Leu Asn Gly Leu Thr Asp G!n 290 295 300
Leu Thr Lys Leu Lys Asn Lys Asn Arg Leu Arg Val His Gly Thr Val 305 310 315 320
Leu Glu Asn Asn Asp Tyr Pro Met Tyr Gla Val Val Leu Lys Leu Leu 325 330 335
Gly Asp Thr Leu Arg Cys lie Lys leu Leu lie Asn Lys Asn Leu Glu 340 345 350
Asn Ala Ala Giu Leu Tyr Tyr lie Phe Arg lie Phe Gly His Pro Met 355 360 365
Val Asp Glu Arg Asp Ala Met Asp Ala Val Lys Leu Asn Asn Glu lie 370 375 380
Thr Lys Πε Leu Arg Trp Glu Ser Leu Thr Glu Leu Arg Gly Ala Phs 385 390 395 400 lie Leu Arg De He Lys Gly Phe Val Asp Asn Asn Lys .^rg Trp Pro 405 410 415
Lys lie Lys Asa Leu Lys Va] Leu Ser Lys Ai^ Trp Thr Met Tyr Phe 144243-序列表.doc -32- IS1 1356848 420 425 430
Lys Ala Lys Ser Tyr Pro Ser Gin Leu Glu Leu Ser Glu Gin Asp Rie 435 440 445
Leu Glu Leu Ala Ala He Gin Ρηε Glu Gin Glu Bie Ser Val Pro Glu 450 455 460
Lys Thr Asn Leu Glu Met Val Leu Asn Asp Lys Ala De Ser Pro Pro 465 470 475 480
Lys Arg Leu lie Trp Ser Val Tyr Pro Lys Asn Tyr Leu Pro Glu Lys 485 490 495 lie Lys Asn Arg Tyr Leu Glu Glu Thr Phe Asn Ala Ser Asp Ser Leu 500 505 510
Lys Thr Arg Arg Val Leu Glu Tyr Tyr Leu Lys Asp Asn Lys Phe Asp 515 520 525
Gin Lys Glu Leu Lys Ser Tyr Val Val Lys Gin Glu Tyr Leu Asn Asp 530 535 540
Lys Asp His He Val Scr Leu Thr Gly Lys Glu krg Glu Leu Ser Val 545 550 555 560
Gly Arg Met Phe Ala Met Gin Pro Gly Lys Gin Arg Gin He Gin lie 565 570 575
Lea Ala Glu Lys Uu Leu Aia Asp Asn He Val Pro Phe Phe Pro Gto 580 585 590
Thr Leu Thr Lys Tyr Gly Asp Leu Asp Leu Gla Ais He Met Glu De 595 600 605
Lys Ser Glu Leu Ser Ser lie' Lys Thr Arg Arg Asa Asp Ser Tyr Asn 610 615- 620
Asn Tyr lie Ala Arg AJa Ser De Val Thr Asp Leu Ser Lys Phe Asn 625 630 · 635 640
Gin Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Thr Ala lie Cys Ala Asp Val Ala Asp 645 650 655
Glu I^eo His Gly Thr Gin Scr Leu Phe Cys Trp Leu His Leu lie Val 660 665 670
Pro Met Thr Thr Met He Cys Aia Tyr Arg His Ala Rro ?to Glu Thr 675 680 685
Lys Gly Glu Tyr Asp He Asp Lys De Glu Glu Gin Ser Gly Leu Tyr 690 695 700
Arg Tyr His Met Gly Gly lie Glu Gly Trp Cys Gin Lys Leu Trp Thr 705 710 715 720
Met GSu A]a He Ser Leu Leu Asp Val Val Ser Val Lys Thr Arg Cys 725 730 735
Gin Met Thr Ser Leu Leu Asn Gly Asp Gin Ser lie Asp Val Ser 740 745 750
Lys Pro Val Lys Leu Ser Glu Gly Leu Asp Glu Val Lys Ala Asp Tyr 755 760 765
Ser Ixu Ah Val Lys Met Leu Lys Glu De Arg Asp Ala Tyr Arg Asn 770 775 780
De Gly His Lys Leu Lys Glu Qy Glu Thr Tyr lie Ser Arg Asp Leu 785 790 795 800 '
Gin Phe lie Ser Lys Val Be Gin Ser Glu Gly Val Met His Pro Thr 805 810 815
Rro Lys Lys lie Leu Arg Val Gly Pro Trp lie Asn Thr I】e Leu 820 825 830
Asp Asp [le Lys Thr Ser Ala Glu Ser He Gly Ser Leu Cys Gin Giu 835 840 845
Leu Glu Phe Arg Gly Glu Ser He De Val Ser Leu De Leu Axg Asn -33· 144243-序列表.doc 1356848 850 855 860
Phe Trp Leu Tyr Asn Leu Tyr Met His Glu Ser Lys Gin His Pro Leu 865 870 875 8B0
Ala Gly Lys Gin Leu Phs Lys Gin Leu Asa Lys Thr Leu Thr Ser Val 885 390 895
Gbi Arg Phe Phe Glu lie Lys Lys Glu Asn Glu V?.l Val Asp Leu Τφ 900 SOS 910
Met Asn lie Pro Met Gin Phe Gly Gly Gly Asp Pro Val Val i%e Tit 915 920 925
Arg Ser Phe Tyr Arg Arg Thr Pro Asp Phe Leu Thi Glu Ala lie Ser 930 935 940
His Val Asp He Leu Leu Arg Πε Ser Ah Asn He Arg Asn Glu Ala 945 950 955 960
Lys He Ser Phe Phe Lys Ala Leu Leu Ser De Glu Lys Asn Glu Arg 965 970 975
Ala Thr Leu Thr Thr Leu Met Arg Asp Pro Gin Ala Val Gly Ser Glu 980 9B5 990
Arg Gin Ala Lys Val Thr Ser Asp De Asn Arg Thr Ala Vd Thr Ssr 995 1000 1005 lie Leu Ser Leu Ser Pro Asn Gin Leu Phe Ser Asp Ser Ala De His J010 1015 1020
Tyr Ser Arg Asn Glu Glu Glu Val Gly lie lie Ala Asp Asn Oe Thr 1025 1030 1035 1040
Pro Val Tyi Pro His Gly Leu Arg Val Leu Tyr Glu Ser Leu Pro Phe 1045 - 1050 1055
His Lys Ala Glu Lys Val Asn Met lie Ser Gly Thr Lys Ser De 1060 1065 1070
Thr Asn Leu Leu Gin Arg ΊΊιτ Ser Ala Ue Asn Gly Glu Asp lie Asp 1075 1080 1085
Arg Ala Val SeT Met Met Leu G!u Asn Leu Gly Leu Leu Ser Aig lie 1090 1095 1100
Leu Ser Val Val Val Asp Ser lie Giu De Pro Thr Lys Ser Asn Gly 1105 1110 1115 1120
Arg Leu lie Cys Cys Gin lie Ser Arg Thr Leu Arg Glu Thr Ser Trp 1125 1130 1135
Asn Asn Met Glu De Val Gly Val Thr Ser Pro Ser lie Thr Thr Cys 3140 1L45 1150
Met Asp Val He Tyr Ala Thr Ser Ser His Leu Lys Gly lie lie He 1155 1160 1165
Glu Lys Pbe Ser Thr Asp Arg Thr Thr Arg C-ly Gin Arg Gly Pro Lys 1170 1175 1180
Ser Pro Trp Val Gly Ser Ser Thr Gin Glu Lys Lys Leu Val Pro Val 1】85 1190 1195 1200
Tyr Asn Arg Gin lie Lea Ser Lys Gin G!n Arg Giu Gin Leu Glu Ala 1205 1210 1215 lie Gly Lys Met Arg Tcp Val Tyr Lys Gly Thr Pro Gly Leu Arg Arg 1220 1225 1230
Leu Leu Asn Lys He Cys Leu Gly Ser Leu Gly De Ssr Tyr Lys Cys 1235 1240' 1245
Val Lys Pro Leu Leu Pro Arg Phe Met Ser Val Asn Phe Leu His Arg 1250 1255 1260
Leu Sw Val Ser Ser Arg Pro Met Glu Fas Pro Ala Ser Val Pro Ala 1265 1270 1275 1280
Tyr Arg Thr Thr Asn Tyr His Phe Asp Thr Ser Pro He Asn Gin Ala 144243-序列表.doc -34- m 1356848 1285 1290 1295
Leu Ser Qu Axg Phe Gly Asn Glu Asp lie Asn Leu Val Phe Gin Asn 1300 1305 1310
Ala lie Ser Cys Gly lie Ser He Met Ser Val Vai Glu Gin Lm Tnr 1315 1320 1325
Gly Ar£ Ser Pro Lys Glu Lea Val Leu De Pro G!n Leu Glu Glu De 1330 1335 1340
Asp lie Met Pro Pro Pro Val Phe Gin Gly Lys Pbe Asn Tyr Ly5 Leu 1345 1350 1355 1360
Val Asp Lys He Thr Ser Asp Gin His He Phe Ser Pro Asp Lys lie 1365 1370 1375
Asp Met Leu Thr Leu Gly Lys Met Leu Met Pro Thr lie Lys Gly Gla 1380 1385 1390
Lys Thr Asp Gin Phe Lea Asn Lys Arg Glu Asn Tyr Phe His Gly Asn 1395 1400 1405
Asn Leu Ds Glu Ser Leu Ser Ak Ala Leu Ala Cys His Trp Cys Gly 1410 1415 1420
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Leu Cys Val Phe Lys Thi Lys uu Leu Cys Ser Trp Gly Ser Gin Gly 1460 1465 】470
Lys Asn He Lys Asp Glu Asp De Val Asp Glu Ser lie Asp Lys Lea 1475 1480 】485
Leu Arg lie Asp Asn Thr Rie Trp Axg Met Phe Ser Lys Val Met Phe 1490 1495 1500
Glu Ser Lys Val Lys Lys Arg De Met Leu Tyr Asp Val Lys Phe Leu 1505 1510 1515 1520
Ser Leu Val Gly Tyr Dc Gly Phe Lys Asn Trp Phe De Glu Gin Leu 1525 1530 1535 .Arg Ser Ala Glu Leu His Glu Val Pro Tip He Val Asn Aia Glu Gly 1540 1545 1550
Asp Leu Val Qu lie Lys Ser lie Lys lie Tyr Leu Gin Leu De Glu 1555 1560 1565
Gb Ser Leu Phe Leu Arg I!e Thr Val Leu Asn Tyr Thr Asp Met Ala 1570 1575 1580·
His Ala Leu Thr Arg Leu lie Axg Lys Lys Leu Met Cys Asp Asn Ala 1585 1590 1595 1600
Leu Leu Thr Pro He Pro Ser Pro Met Vai Asn Leu TTrr Gin "Vallk 1605 1610 1615
Asp Pro Thr Glu Gin Leu Ala Tyr Phe Pro Lys De Thr Phe Glu Arg 1620 1625 1630
Leu Lys Asn Tyr Asp Thr Scr Ser Asn Tyr Ala Lys Gly Lys Lsu Thr 1635 1640 1645
Arg Asn Tyr Met He Leu Leu FVo Trp Gin His Val Asn Arg Tyr Asn 1650 1655 1660
Phe Val Phe Ser Ser Tnr Gly Cys Lys V?J Ser Leu Lys Thr Cys lie 1665 1670 1675 1680
Gly Lys Leu Met Lys Asp Lea Asn Pro Lys Val Leu Tyr Phe He Gly 1685 1690 1695
Glu Gly Ala Gly Asn Trp Met Ala Arg Thr Ala Cys Glu Tyr Pro Asp 1700 1705 1710
He Lys Phe Vai Tyr Arg Ser Leu Lys Asp Asp Lea Asp His His Tyr •35- 144243·序列表.doc 1356848 1715 1720 1725
Pro Leu Glu Tyr Gin Arg Val lie Gly G!u Leu Scr Arg Be Be Asp 1730 1735 1740 .
Ser Gly Glu Gly Leu Ser Met Giu Thr Tlir Asp Ala Ths Ola Lys Thr 1745 ' 〗750 1755 】760
His Tip Asp Leu lie His Arg Vai Ser Lys Asp Ala Leu Leu De Thr 1765 1770 1775
Leu Cys Asp Ala Glu Phe Lys Asp Arg Asp Asp Phe Phe Lys Met Val 1780 1735 1790 lie Leu Tip Arg Lys His Val Leu Scr Cys Arg lie Cys Thr Thr Tyr 1795 1800 1805
Gly Thr Asp Leu Tyr Leu Phe Ala Lys Tyr His Ala Lys Asp Cys A$n 1810 1815 1820
Val Lys Leu Pro Phe Phe Val Ajs Ser Val Ala Thr Phe He Mei Gin 1825 1830 3835 1840
Gly Str Lys Leu Ser Gly Ser Glu Cys Tyr He Leu Leu Thr Leu Gly 1845 1850 1855
His His Asn Asn Leu Pro Cys His Gly Glu He Gtn Asn Ser Lys Met 1860 1865 1870
Lys Be Aia Val Cys Asn Asp Phe Tyr AJa Ala Lys Lys Leu Asp Asn 1875 1880 1885
Lys Ser lie Glu Ala Asn Cys Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Aj^ lit 1890 1895 1900
Pro He Asn Lys Ly$ Glu Leu Asn Ai^ Cln Arg Arg Leu Leu Thr Leu 1905 1910 . 1915 1920
Gin Ser Asn His Ser Ser Val Ala Thr Val Gly Gly Scr Lys Val lie 1925 1930 1935
Glu Ser Lys Trp Leu Thr Asn Lys Ala Asn Thr De lie Asp Trp Leu 1940 1945 1950
Glu His lie Leu Asn Ser Pro Lys Gly Glu Leu Asn Tyr Asp Phe Phe 1955 1960 1965
Qu Ala Leu Glu Asn Thr Tyr Pro Asn Met lie Lys Leu lie Asp Asn 1970 1975 1980
Leu Gly Asn Ala Glu lie Lys Lys Leu He Lys Val Thr Gly Tyr Met 1985 1990 1995 2000
Leu Val Ser Lys Lys 2005 <210>35 <211> 2005 <212>蛋白質 dm人類間贸肺病毒 <400>35
Met Asp Pro Leu Asn Glu Ser Thr Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser 15 10 15
Tyr Leu Lys Gly Val De Ser Fne Ser Glu Thr Asn Ala De Gly Scr 20 25 30
Cys Leu Leu Lys Arg Pro Tyr L©j Lys Asn .^sp Asn Thr Ala Lys Val 35 40 45
Aia lie Glu Asn Pro Val De Glu His Val Arg Leu Lys Asn Ala Val 50 55 50
Asn Ser Lys Met Lys lie Ser Asp Tyr Lys Val Val Glu Pro Val Asn 144243-序列表.doc •36· IS! 1356848 65 70 75 80
Met Gin His Glu fle Met Lys Asti Val His Set Cys Glu Leu Thr Leu 85 90 95
Leu Lys Gin Phs I^u Ίΐτ Arg Ser Lys Asn De Ser Thr Leu Lys Leu 100 105 110
Asn Met He Cys Asp Trp Leu Gin Leu Lys Ser Thr Ser Asp Asp Thr 115 120 125
Ser He Leu Ser Phe He Asp Val Glu Phe He Pro Ser Trp Va! Ser 130 [35 HO
Asn Trp Phe Ser Asn Trp Tyr Asn Leu Asn Lys Leu lie Leu Glu Phe 145 150 155 160
Arg Arg Glu Glu Val Be Arg Thr Gly Ser lie Lsu Cys Axg Ser Leu 165 170 175
Gly Lys Leu Val Phe lie Val Sex Ser Tyr Giy Cys De Val Lys Ser 180 '185 190
Asn Lys Ser Lys Arg Val Ser Phe Pbe Thr Tyr Asn Gin Leu Leu Thr 195 200 205
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Asn Leu GJn Gly Met Leu Thr Asn Lys Ixu Tyr Glu Thr Val Asp Tyr 245 250 255
Met Leu S^* Leu Cys Cys Asn Glu Gly Phe Ser Leu Val Lys Glu Phe 260 . 265 270 *
Glu Gly Phe He Met Ser Glu De Leu Arg He Thr Glu Kis Ala Gin 275 280 285.
Phe Ser Thr Arg Phe Arg Asn Thr Leu Leu Asn Gly Leu Thr Asp Gh 290 295 300
Leu Thr Lys Leu Lys Asn Lys Asn Arg Leu Arg Val His Giy Thr Val 305 310 315 320
Leu Glu Asn Asn Asp Tyr Pro Met Tyr Glu Val Val Leu Lys Lsu Leu 325 330 335
Gly Asp Thr Leu Arg Cys He Lys Leu Ι^υ lie Asn Lys Asn Leu Glu 340 345 350
Asn Ala Ala Glu Leu Tyr Tyr lie Phe Arg lie Phe Gly His Pro Met 355 360 365
Val Asp Glu Arg Asp Ala Met Asp Ala Val Lys Leu Asn Asn Glu lie 370 375 380
Thr Lys lie Leu Arg Leu Glu Ser Leu Γητ Glu Leu An Gly Ala Phe 385 390 395 400
Ils Leu Arg lie lie Lys Gly Phe Val Asn Α5Π Lys Arg Trp Pro 405 410 415
Lys He Lys Asn Leu lie Val Leu Ser Lys Arg Trp Thr Met Tyx Phe 420 425 430
Lys Ala Lys Asn Tyr Pro Ser Gin Leu Glu Leu Ssr Giu Gin Asp Phs 435 440 445
Leu Glu Leu Ala Ala De Gin Phe Glu Gin Glu Phe Ser Val Pro Glu 450 455 460
Lys Thr Asn Leu Glu Met Val Leu Asn Asp Lys Ala Be Ser Pro Pro 465 470 475 480
Lys Arg Leu lie Tip Stx Val Tyr Pro Lys Asn Tyr Leu Pro Glu Thr 485 490 495 •37- 144243-序列表.doc 1356848 lie Lys Asn Arg Tyr Leu Glu Glu Thr Phe Asn Ala Ser Asp Ser Leu 500 505 510
Lys Thr Arg Arg Val Leu Glu Tyr Tyr Leu Lys Asp Asn Lys Phe Asp 515 520 525
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Lys Glu His lie Val Ser Leu Thr Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ser Val 545 550 555 560
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Leu Ala Glu Lys Leu Leu Ala Asp Asn lie Val Pro Phe Phe Pro Glu 580 585 590
Thr Leu Thr Lys Tyr Gly Asp Leu Asp Leu Gin Arg lie Met Glu lie 595 600 605
Lys Ser Glu Leu Ser Ser lie Lys Thr Arg Arg Asn Asp Ser Tyr Asn 610 615 620
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Gin Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Thr Ala lie Cys Ala Asp Val Ala Asp 645 650 655
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Lys Gly Glu Tyr Asp De Asp Lys lie Glu Glu Gin Ser Gly Leu Tyr 690 695' 700
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Gin Met Thr Ser Leu Leu Asn Gly Asp Asn Gin Ser De Asp Val Ser 740 745 750
Lys Pro Val Lys Leu Ser Glu Gly Leu Asp Glu Val Lys Ala Asp Tyr 755 760 765
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Gin Phe lie Ser Lys Val De Gin Ser Glu Gly Val Met His Pro Thr 805 810 815
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Ala Gly Lys Gin Leu Phe Lys Gin Leu Asn Lys Thr Leu Thr Ser Val 885 . 890 895
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Met Asn lie Pro Met Gin Phe Gly Gly Gly Asp Pro Val Val Phe Tyr 915 920 925 144243-序列表.doc -38- [S ] 1356848
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Ala Tnr Leu Thr Thr Leu Met Arg Asp Pro Gin Aia Val Gly Ser Glu 980 985 990
Arg Gin Ala Lys Val Tlir Ser Asp He Asn Arg Hir Ala Val Thr Ssr 995 1000 1005
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Pro Val Tyr Pro Kis Gly Leu Aig Val Leu Tyr Glu Ser Leu Pro Phs 1045 1050 1055
His Lys Ala Glu Lys Val Vz\ Asn Met De Ser Gly Thr Lys Ser De 1060 1065 1070
Tnr Asn Leu Leu Gin Arg Thr Ser Ala De Asn Gly Glu Asp He Asp 1075 1080 1085
Arg Ala Val Ser Met Met Leu Glu Asn Leu Gly Leu Leu Ser Arg De 】090 1095 1100
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Arg Leu He Cys Cys Qln lie Ser Axg Thr Leu Arg Glu 丁hr Ser Trp 1125 1130 1135
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Gk Lys Phe Ser ITir Asp Arg Thr Thr Arg Gly Gin Arg Gly Pro Lys 1370 1175 1180
Ser Pro Trp Val Gly Ser Ser Thr Gin Glu Lys Lys Leu Vai Pto Val 1185 1190 1195 1200
Tyr Asn Gin He Leu Ser Lys Gn Gin Arg Glu Gin Leu Ghi Ala L205 1210 1215 lie Gly Lys Met Arg Trp Val Tyr Lys Gly Thr Pro Gly-Lcu Arg： fiag 1220 1225 1230 ·
Leu Leu Asn Lys De Cys Leu Gly Ser Leu Gly lie SctT>t Lys Cys 1235 1240 1245
Val Lys Pro Leu Leu Pro Arg Phe Met Ser Val Asn Phe L^u His Arg 1250 1255 1260
Leu Ser Val Ser Ser Arg Pro Met Glu Phe Pro Ala Ser Val Pro Ala i265 1270 1275 1280
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Leu Ser Glu Arg Phe Gly Asn Glu Asp Be Asn Leu VaJ Phe Gin Asn }300 1305 1310 • Ala He Ser Cys Gly He Scr lie Met Ser Val Val Glu G]n Leu Thr 1315 1320 1325
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Asp Lai Val Glu lie Lys Ser De Lys Dc Tyr Leu Gin Leu lie Glu 1555 1560 1565
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Leu Leu Thr Pro lie Ser Ser fto Met Val Asn Leu Thr Gin Val He 1605 1610 1615
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Leu Lys Asn Tyr Asp Thr Ser Ser Asr. Tyr Ala Lys Gly Lys Leu Thr 1635 1640 1645
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Gly Lys Leu Met Lys Asp Leu Asn Pro Lys Val Leu Tyr Phe De Gly 1685 1690 1695
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Ser Gly Glu Gly Leu Ser Met Glu Thr Thr Asp Ala Thr Gin Lys Thr 1745 1750 1755 1760
His Trp Asp Leu lie His Arg Val Ser Lys Asp Ala Leu Leu fle Thr 1765 1770 1775
Leu Cys Asp Ala Glu Phe Lys Asp Arg Asp Asp Pbe Phe Lys Met Val 1780 1785 1790 -40-
144243-序列表.doc m 1356848 lie Leu Trp Arg Lys His Val Leu Ser Cys Arg De Cys Thr Thr Tyr 1795 1800 1805
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Leu Val Ser Lys Lys 2005 <210> 36 <211> 2005 <2】2>蛋白質 <213>人類間質肺病毒
<400> 36
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Tyr Leu Lys Gly Val lie Ser Phe Ser Glu Thr Asn Ala lie Gly Ser 20 25 30
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Ser lie Leu Asn Phe lie Asp Val Glu Phe He Pro Val Trp Val Ser 130 135 140 -41 - 144243-序列表.doc 1356848
Asn Trp Pbe Ser Asn Tit Tyr Asn Leu Asn Lys Leu lie Leu Gk Phe -145 150 155 160 .^rg Arg Glu Glu Val De Arg Thr Gly Ser lie Leu Cys Arg Ser Leu 165 170 175
Gly Lys Leu Val Phe De Val Ser Ser Tyr Gly Cys Vai Val Lys Ser 180 185 190
Asn Lys Ser Lys Arg Val Ser Phe Phe Thr Tyr Asn Gin Leu Leu Thr 195 200 205
Trp Lys Asp Val Met Leu Ser Arg Phe Asn Ala Asn Phe Cys De Tip 210 215 220
Val Ser Asn Asn Leu Asn Lys Asn Gin Glu Gly Leu Gly Leu Arg Ser 225 230 235 240
Asn Leu Gin Gly Met Leu Thr Asn Lys Leu Tyr Glu Thr Val Asp Tyr 245 250 255
Met Leu Ser Leu Cys Cys Asn Glu Gly Phe Ser Leu Val Lys Glu P!ie 260 265 270
Glu Gly Phe lie Met Ser Glu He Leu Lys lie Thr Glu His Ala Gin 275 280 285
Phe Scr Thr Arg Phe Arg Asn Tlir Leu Leu Asn Gly Leu Thr Glu Gin 290 295 300
Leu Ser Val Leu Lys Aia Lys Asn Arg Ser Arg Val Leu Gly Tor De 305 310 315 320
Leu Glu Asn Asn Asn Tyr Pro Met Tyr Glu Val Val Leu Lys Leu Leu 325 330 · 335
Gly Asp Thr Leu Lys Ser lie Lys Leu Leu lie Asn Lys Asn Leu Glu 340 345 350
Asn Ala Ala Gia Leu Tyr Tyr lie Phe Arg De Phe Gly His Pro Met 355 360 365
Val Asp Glu Arg Glu Ala Met Asp Ala Val Lys Leti Mn Asn Glu De 370 375 380
Thr Lys He Leu Lys Lcii Glu Ser Leu Thr Glu Leu Arg Gly Ala Phe 385 390 395 400
De Leu Arg lie lie Lys Gly Rie Val Asp Asn Asn Lys Arg Trp Pro 405 410 415
Lys He Lys Asn Leu Lys Val Leu Ser Lys Arg Trp Ala Met Tyr Phe 420 425 430
Lys Ala Lys Ser Tyr Pro Ser Gin Leu Glu Leu Ser Val Gin Asp Fne 435 440 445
Leu Glu Leu Ala Ala Vai Gin Phe Glu Gin Glu Phe Ser Val Pro Glu 450 455 460
Lys Thr Asn Leu Glu Met Val Lea Asa Asp Lys Ala De Scr Pro ho 465 470 475 4«0
Lys Lys Leu He Trp Ser Val Tyr Pro Lys Asn Tyr Leu Pro Glu Tor 485 - 490 495 lie Lys Asn Gin Tyr Leu Glu Glu Ala Phe Asn-Ala Ser Asp Ser Gin 500 505 510
Arg Thr An Ais Val Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Asp Cys Lys Phe Asp 515 520 525
Gin Lys Glu Leu Lys Arg Tyr Val He Lys Gin Gla Tyr Leu Asn Asp 530 535 540
Lys Asp His De Val Ser Leu Thr Gly Lys Glu Arg Giu Leu Sa Val 545 550 555 560
Gly Arg Met Phe Ala Met Gin Pro Gly Lys Gin Arg Gin He Qn lie 565 570 575 144243-序列表.doc • 42· IS ] 1356848
Leu Ala Qu Lys Leu Leu Ala Asp Asn De Yal FYo Phe Phe Pro Glu 580 585 590
Thr Lea Thr Lys Tyi Gly Asp Leu Asp Leu Gin Arg lie Met Glu He 595 600 605
Lys Ser Glu Leu Ser Ser lie Lys Thr Arg Lys Asn Asp Ser Tyr Asn 610 615 620
Asn Tyr lie A!a Arg Ala Ser De Val Thr Asp Leu Ser Lys Phe Asn 625 630 635 640
Gbi Ala Fte Arg Tyi (3!u Thr Thr Ala Ik Cys A!a Asp Val Ala Asp 645 650 . 655
Glu Leu His Gly Thr Gin Ser Leu Phe Cys Trp Leu His Leu lie Val 660 665 670
Pro MetThr Thr Met lie Cys Ala Tyr Aig His Ala Ro Pro Thr 675 680 685
Lys Gly Glu Tyr Asp lie Asp Lys lie Gin Glu Gin Ser Gly Leu Tyr 690 695 700
Arg Tyi His Met Gly Gly lie Glu Gly Trp Cys Gin Lys Leu Trp Thr 705 710 715 720
Met Glu Ala lie Ser Leu Leu Asp Val Val Ser Yai Lys Thr Arig Cys 725 730 735
Gin Met Thr Ser Leu Leu Asn Gly Asp Asn Gin Ser De Asp Val Ser 740 745 750
Lys Pro Val Lys Leu Ser Glu Giy De Asp Glu Val Lys AJa Asp Tyr 755 760 765
Ser Leu Ala lie Arg Met Leu Lys Glu lie Arg Asp ^la Tyr Lys Asn 770 775 780
He Gly His Lys Leu Lys Gb Giy Glu Thr Tyr He So: Arg Asp Leu 785 790 795 800
Gin Phe lie Ser L^s Val He Gin Ser Glu Gly Val Met His Pro Thr 805 810 815
Pro De Lys Lys He Leu Arg Val Gly Pro Trp De Asn Thr lie Leu 820 825 830
Asp Asp De Lys Thr Ser Ala Glu Ser De Gly Ser Leu Cys Gin Glu 835 840 845
Leu Glu Phe Arg Gly Glu Ser De Leu Val Ser Leu Tit Leu Arg Asn 850 855 860
Phe Trp Leu Tyr Asn Leu Tyr Met Tyr Glu Ser Lys Gin His Pro Leu · 865 870 875 880
Ala Gly Lys Gin L^u Rie Lys Gin Leu Asn Lys Thr Leu Thr Ssr Vai 885 890 895
Gin Arg Phe Phe Glu Leu Lys Lys Glu Asn Asp Val Val Asp Leu Trp 900 905 910
Met Asn He Pro Met Gin Phe Giy Gly Gly Asp Pro Val Val Phe Tyr 915 920 -925
Aig Ser Phe Tyr Arg Arg Thr Pro Asp Phe Leu Thr Glu Ala He Ser 930 935 940
His Val Asp Leu Leu Leu Lys Val Ser Asn Asn He Lys Asp Glu Thr 945 950 955 960
Lys lie Aig Pl?e Phe Lys Ala Leu Leu Ser De Glu Lys Asn Glu Arg 965 970 975
Ala Thr Leu Thr Thr Leu Met Arg Asp Pro Gin Ala Val Gly Ser Glu 980 985 990
Arg Gin Ala Lys Val Thr Ser Asp lie Asn Arg Thr Ala Val Thr Ser 995 1000 1005 -43- 144243-序列表.doc 1356848
He Leu Ser Leu Ser Pro Asn Gin Leu Phe Cys Asp Ser Ala He His 1010 1015 1020
Tyr Ser Arg Asn Glu Glu Glu Val Gly lie Ala Asp Asn Ds Thr 1025 1030 1035 1040
Pro Val Tyr Pro His Gly Leu Arg Val Leu Tyr Glu Ser Leu Pro Phe 1045 1050 1055
His Lys Ala Glu Lys Val Val Asn Met lie Ser Gly Thr Lys Ser lie 1060 1065 1070
Thr Asn Leu Leu Gin Ai^ Thr So: Ala Ik Asn Gly Glu Asp Ik Asp 1075 1080 1085
Arg Ala Val Ser Met Met Leu Glu Asn Leu Gly Leu Leu Ser Arg He 1090 1095 1100
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Tyr Asn Arg Gin lie Leu Ser Lys Gin Gin Lys Glu Gin Leu Glu Ala 1205 ' * 1210 1215 lie Gly Lys Met Arg Trp Val Tyr Lys Gly Thr Pro Gly Leu Arg Arg 1220 1225 1230
Leu Lea Asn Lys lie Cys lie Gly Ser Lea Gly lie Ser Tyr Lys Cys 1235 1240 1245
Val Lys Pro Leu Leu Pro Arg Phe Met Ser Val Asn Phe Leu His Arg 1250 1255 1260
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Leu Ser Glu Arg Phe Gly Asn Glu Asp De Asn Leu Vai Phe Gin Asn 1300 1305 1310
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Gly Arg Ser Pro Lys Gin Leu Val Leu De Pro Gin Leu Glu Glu lie 1330 1335 1340
Asp De Met Pro Pro Pro Val Phe Gin Gly Lys Phe Asn Tyr Lys Leu 1345 1350 1355 1360
Val Asp Lys lie Thr Ser Asp Gin ifis lie Phe Ser Pro Asp Lys He 1365 1370 1375
Asp De Leu Thr Leu Gly Lys Met Leu Met Pro Thr He Lys Gly Gin 1380 1385 1390
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Asn Leu He Glu Ser Leu Sei Ala Ala Leu Ala Cys His Tip Cys Gly 1410 1415 1420
He Leu Thr Gu Gin Cys lie G丨u Asn Asn De Fae Arg Lys Asp Trp 1425 1430 1435 1440 144243-序列表.doc 44· IS 1 1356848
Gly Asp Gly Rje lie Ser Asp His Ala Phe Met Asp Phe Lys Val B)e 1445 1450 1455
Leu Cys Val Phe Lys Tlir Lys Leu Lea Cys Ser Trp Gly Ser Gin Giy 1460 1465 1470
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Leu Arg lie Asp Asn Hit Ris Trp Arg Met Phe Scr Lys Val Mec Phe 1490 1495 1500
Glu Ser Lys Val Lys Lys Arg Be Met Leu Ίγχ Asp Val Lys Phe Leu 1505 1510 1515 1520
Ser Leu Val Gly Tyr He Gly Phe Lys Asa Trp Phe He Glu Gin Leu 1525 1530 1535
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Ser Gly Glu Gly Leu Scr Met Glu Tnr Thr Asp Ala Thr Gin Lys Thr 1745 1750 1755 1760
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Gly Thr Asp Leu Tyr Leu Phe Ala Lys Tyr His Ala Val Asp Cys Asn 1810 1815 1820 lie Lys Leu Pro Phe ?hc Val Arg Scr Val Ala Thr Phe lie Met Gin 1825 1830 1835 1840
Gly Ser Lys Leu Ser Gly Ser Glu Cys Tyr lie L&x Leu Thr Leu Gly ms 1850 1SS5
His His Asn Asn Leu Pro C>;s His Gly Glu lie Gin Asn Scr Lys Met 1860 1865 1870 -45- 144243-序列表,doc 1356848
Arg lie Ala Val Cys Asn Asp Phe Tyr AJa Ser Ly$ Lys Leu Asp Asn 1875 18S0 1885
Lys Ser He Glu A!a Asn Cys Lys Ser Leu Leu Ser Giy Leu Arg Ds 1890 1895 1900
Pro De Asn Lys Lys Glu Leu Asn An Gin Lys Lys Leu Leu Tbr Leu 1905 1910 1915 1920
Gin Ser Asn His Ser Ser He Ala Thr Val Gly Gly Sei Lys lie ile 1925 1930 1935
Glu Ser Lys Tip Leu Lys Asn Lys Ala Ser Thr Ile lie Asp Trp Leu 1940 1945 1950
Giu His lie Leu ,^sn Ser Pro Lys Gly Glu Leu Asn Tyr Asp Phe Phe 1955 1960 1965
Glu Ala Leu Glu Asn Thr T>t Pro Asn Met He Lys Leu Ile Asp Asr 1970 1975 1980
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Leu Val Ser Lys Lys 2005 <210> 37 <211>2005 <212>蛋白質 <213>人類問質肺病毒 <400>37
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Tyr Leu Lys Gly Val lie Ser Phe Ser Glu Thr Asn Ala lie Gly Ser 20 25 30
Cys Leu Leu Lys Arg Pro Tyr Leu Lys Lys Asp Asn Thr Ala Lys Val 35 40 45
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Met Gin His Glu lie Met Lys Asn Ile His Scr Cys Glu Leu Thr Leu 85 90 95
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So- Met De Cys Asp Trp Leu Gin Leu Lys Ser Thr Ser Asp Asn Thr 115 120 125
Ser lie Leu Asn Phe Be Asp Val Glu Phe Ile Pro Val Ttp Val Ser 130 135 140-
Asn Trp Phe Ser Asn Trp Tyr Asn Leu Asn Lys Leu De 3Leu Giu Hie 145 150 155 160
Arg Arg Giu Glu Val lie Arg Tar Gly Ser lie Leu Cys Arg Ser Leu 165 170 175
Gly Lys Leu Val Phe lie Vai Ser Ser Tyr Giy Cys Val Vai Lys Ser 180 丨 85 190
Asn Lys Ser Lys Aj£ Val Ser Fae Phe Thr Tyr Asn Gin Leu Leu Thr 195 200 205
Trp Lys Asp Val Met Leu Ser Arg Foe Asj Ala Aai Phe Cys He Trp 210 215 220 144243-序列表.doc -46- iS ] 1356848
Val Ser Asn Asn Leu Asn Lys Asn Gin Glu Cly Lea Gly Rie Arg Ser 225 230 235 240
Asn Leu Gin Gly Met Leu Thr Asn Lys Leu Tyr Glu Thr Val Asp Tyr 245 250 255
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Leu Ser Met Leu Lys Ala Lys Asn Arg Ser Arg Val Lea Gly Thr De 305 310 315 320
Leu GJu Asn Asn Asp Tyr Pro Met Tyr Glu Val Val Leu Lys Leu Leu 325 330 335 .
Gly Asp Thr Leu Lys Ser lie Lys Leo Leu De Asn Lys Asn Leu Glu 340 345 ’ 350
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He Leu Arg He lie Lys Gly Phe Val Asp Asn Asn Lys Arg Tip Pro 405 410 415
Lys lie Lys Asn Leu Lys V2I Leu Ser Lys Arg Trp Val Met Tyr Phe 420 425 430
Lys Aia Lys Ser Tyr Pio Ser Gin Leu Glu Leu Ser Val Gin Asp Phe 435 440 445
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Lys Lys Leu lie Trp Ser Val Tyr Pro Lys Asm Tyr Leu Pro Glu He 485 490 495
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Gly Arg Met Phe Ala Met Gin Pro Gly Lys Gin Arg Gin lie Gin He 565 570 575
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Lys Ser Glu Leu Ser Ser lie Lys Thr Axg Lys Asn Asp Ser Tyr Asn 610 615 520
Asn Tyr He Ala Arg Ala Ser He Val Tlir Asp Leu Ser Lys Phe Asn 625 630 635 640
Gin Ράζ Phe Arg Tyr Glu Thr Thr Ala De Cys Ala Asp Val Aia Asp 645 650 655 •47· 144243·序列表.doc 1356848
Glu Leu His Giy Thr Gbi Ser Leu Phe Cys Trp Leu His Leu De Va] 660 665 670
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Arg Tyr His Mer Gly Gly He Glu Gly Tip Cys G!n Lys Leu Tip Thr 705 710 715 720
Mel Glu Ala He Ser Leu Leu Asp Val Val Ser Val Lys Thr Arg Cys 725 730 735
Gin Met Thr Ser Lsu Leu Asn Gly Asp Asn Gin Ser lie As? Val Ser 740 745 750 •Lys Pro Val Lys Leu Ser Glu Gly lie Asp Glu Val Lys Ala Asp Tyr 755 760 765
Ser Leu Ala lie Lys Met Leu Lys Glu He Arg As? Ala Tyr Lys Asn 770 775 780
lie Gly His Lys Leu Lys Glu Gly Glu Thr Tyr He Ser Arg Asp Leu 785 790 795 800
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Ser Leu Val Gly Tyr De Gly Phe Lys Asn Trp Phe lie Glu Gin Leu 1525 1530 1535
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Leu Lys Ser Tyr Asp Tlir Ser Ser Asp Tyr Asr Lys Gly Lys Leu Thr 1635 1640 1645
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Phe Val Phe Ser SerTlir Gly Cys Lys He Ser Leu Lys Thr Cys He 1665 1670 1675 1680
Gly Lys Leu De Lys Asp Leu Asn Pro Lys Val Leu Tyr Phe lie Gly 1685 1690 1695
Glu Gly Ala Giy Asn Trp Met Ala Arg Thr Ala Cys Glu Tyr Pro Asp 1700 1705 1710 lie Lys Phe Val Tyr Arg Ser Leu Lys Asp Asp Leu Asp His His Tyr 1715 1720 1725
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Gly Gly Glu Qly Leu Ser Met Glu Thr Thr Asp Ala Thr Gin Lys Thr 1745 1750 1755 1760
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Glu Ser Lys Trp Leu Lys Asn Lys Ala Ser Thr He De Asp Tip Leu 1940 1945 1950 144243-序列表.doc -50- iS 1 1356848
Glu His lie Leo Asn Ser Pro Lys Gly Glu Leu Asn Tyr Asp Phs Fne 1955 1960 】965
Glu Ala Leu Glu Asn Thr Tyr fto Asn Met De Lys Leu lie Asp Asn 1970 1975 1980
Leu Gly Asn Ala Glu P.e Lys Lys Lsn De Lys Vai Rro Gly Tyr Met 1985 1990 1995 2000
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<213>人類間質肺病毒 <4(X1> 40
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I860 gatagctaca acaattatat Igcaagggcc Ictatagtaa cagacttaag taagttcaat 1920 caggccctta gatatgaaac cacagctata tgtgcagacg tagccgatga gtcacatggg 1980 . acacaaagct tattctgrcg gitacatctt attgttccca tgactacaat gatatgtgca 2040 -55- 144243-序列表.doc tacagacatg caccaccaga a^caaaaggg gaatacgaia tagacaaaat acaagagcaa 2100 agcggatiat acagatatca tatgggaggg attgaagggtEgtgccagaa gttatggaca 2160 atggaagcaa tatccitgtt agatgiagta ictgtgaaga ctcgctgtca gatgacctct 2220 ciattsaacg gagacaatca gtcaatagat gttagtaaac cagtaaaau gtctgaaggt 2280 atagatg 捣 g taaaagcagactatagctta scaattsgaa tgcttaaaga aaiaagagat 2340 gcuataaaa acattggtca taaactcaaa gaagglgaaa catatatatc aagggatctc 2400 caattiataa gtaaggtgat tcaatctgaa ggagtcatgc atcctacccc tataaaaaag 2460 atatlaagag taggtccttg gataaataca atactagatg atauaaaac cagtgcagaa 2520 tcaataggaa gtctatgtca agaactagaa ttcagagggg agaglatact agtiagcng 2580 atattaagga atttclggct gtataacttg -acatgutg agtcaaaaca gcacccatta 2640 gctgggaagc asctgttcaa gcaaugaac aaaacattaa catctgt£ca gagadtttt 2700 gaactgaaga a@aaaatga tgtggttgac ctatggatga atataccaat gcagtttgga 2760 gggggagatc csgcagcnt ttacagatct tutacagaa ggactcccga tttataact2820 gaagcaatca gccatgtgga tttactgtta aaagtgtcaa acaatatcaa agatgagact 2880 aa£atacgat ttttcaEagc cttaitatct atagaaaaga atgaacgtgc tacauaaca 2940 acactaatga gagaccctca ggcagtagga tcagaacgac aagctaaggt aacaagtgat 3000 ataaatagaa cagcagttac cagcatactg agtctatctc cgaatcagct cttctgtgat 3060 agtgctauc attatagtag aaatgaggaa gaagttggge teattgcaga caacataaca 3120 cctgtctatc ctcatgggct gagagtgctc tatgaatcac taccttuca taaggctgaa 3180 aaggtigtca atatgatatc aggcacaaag tctataacta atctauaca gagaacatct 3240 gctatcaatg gtgaagatat tgatagagca gigtcfalga tgttagagaa cttagggtt£ 3300 ttatct£gas tatt£tx:agt aataattaat agtaiagaaa taccaatcaa gtccaatggc 3360 agattgaut gctgtcaaat ttccaagacc ttgagagaaa aatcatggaa caatatggaa 3420 atagtaggag tgacatctcc tagtattgtg acatgtatgg atgttgtgia tgcaactagt 3480 tctcamaa aaggaaiaat tattgaaaaa trcagtactg acaagaccac aagaggtcag 3540 aggggacxraa aaagcccctg ggtaggatca agcactcaag agaaaaaatt ggttcctgtt 3600 tataacagac aaattctttc aaaacaacaa aaagagcaac tggaagcaat agggaaaatg 3660 a22tg£gtgt acaaaggaac tccagggcta agaagaitgc tcaacaagat ttgcatagga 3720 agcttaggta ttagctataa atgtgtgaaa cctttauac caagattcat gagtgtaaac 3780 ttcttacata ggttatct£t iagtagtaga cccatggaat icccagcttc tgttccagct 3840 tacaggacaa caaattacca ttttgacact agtccaatca accaagcatt aagigagagg 3900 ttcgggaacg aagacattaa tttagtgttc caaaatgcaa ic2gctgcgg aauagtata 3960 tagaacagu aactggtaga agcccaa2ac aattagtcct aatccctcaa 4020 ttagaagaga lagatattat gccuxtcct gtatttcaag gaaaattcaa ttataaacta 4080 £tt£alaaga taacctccga tcaacacatc ttcagtcctg acaaaataga catattaaca 4140 ctagggaaga tgcttatgcc taccataaaa ggtcaaaaaa ctgatcagtt cttaaataag 4200 agagaaaact auttcatgg aeaiaattta augaalcu taic®:sgc acttgc 扯gc 似 60 cactggtgtg ggatattaac agaacagtgc atagaaaaca atatctttag gaaagattgg 4320 ggtgatgggt tcatctcaga tcatgccttc atggatttca aggtattict aigtgtattt 4380 aaaaccaaac tutatglag ttggggaict caaggaaaga atstaaaaga tfiaagatata 4440 atagatgaat ccattg^aa attattaaga attgacaaca ccttttggag aatgttcagc 4500 aaagtcatgt ttgaatcaaa agtcaaaaaa agaalaa^t iatatgatgt gaaatlccta 4560 icatlagtag gitalatagg attlaaaaac iggatatag aacagltaag aglggiagaa 4620 ttgcacgagg tacct^gat cgK：aatgct gaaggagagt lagttgaaat taaaicaatc 4680 aaaatttatc tgcaguaat agaacaaagt ctatcttiga gaataactgt attgaaitat 4740 acagacalgg cacatgctct tacacgatta attaggaaaa aattgatgtg tgataatgca 4800 ctctttaatc caagttcatc accaatgttt aatctaactc aggltattga tcctacaaca 4860 caactagact atatcct2g gataatattt gagagguaa aaagttatga taccagttca 4920 gaclacaaca aagggaagU aacaaggaat tacatgacat mttarcaig gcaacacgta 4980 aacaggtaca attttgtctt lagttctaca ggttgtaaag tc^tttgaa gacatgcatc 5040 ggga2aUga taaaggattl aeatcctaaa gttctttact ttattggaga aggagcaggt 5100 aactggatgg.caagaacagc atgigaatat ccigaiataa aatttgtata taggagma 5160 aagga^acc ttgatcacca ttacccaita gaatatcaaa gggtaatagg tgatctaaat 5220 agggtgatag atagtggtga aggattatca atggaaacca cagatgcaac icaaaaaact 5280 -56- 144243-序列表.doc 1356848 cattgggact tgatacacag aataagtaaa gatgcttt2t tgaia2〇aa grgtgatgca 5340 gaartcaaaa acagagatga Ettcttlaag at^taaicc tttggagaaa acatgiatta 54(X) tcttgtagaa tctgtacsgc ttatggaaca gatctrt2ct tatttgcaaa gtatcatgcg 5460 gtggactgca atataaaatt accautut gtzagatctg tagctactit laaatgcaa 5520 ggaagcaaat tatcagggtc agaatguac atacttuaa catta^tca tcacaataat 5580 claccctgtc atggagaaat acaaaattcc aaaatgagaa taicagigig taatgatltc 5640 tatgcctcaa agaeactgga caacaaaica attgaagcaa actgcaaatc icttctslca 5700 ggattgagaa lacctataaa ca2aaaggag ttasacagac aaaagaaaa gtta^acta 578) caaa〇taacc attcttctat agcaacagtt ggcggcagia agaltataga atccaaatgg 5S20 ttaaagaata aagcaagt^c aataattgai tggttagagc aiattttgaa ttclccaaaa 5880 ggtgaaitaa actatgatit ctugaagca tugagaaca cataccccaa tatgatcaag 5540 cttaiagata amgggaaa rgcagaaata aagaaactaa tcaaggtcac tgggtai^g 6(XX) cttgtgagta agaagtaa 6018
<210>41 <211> 6018 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400>41
atggatccat tngtgaatc cactgicaat gtttatcuc ctgactcata ictcaaagga 60 gtaatatctt tcagtgasac csatgcaatt ggctcatgcc tmgaaaag accctatcta 320 aaaaaagata acactgctaa ^gitgctgta gaaaaccctg ttgttgaaca t£icaggctt 180 agaaatgcag tcatgaccaa aatga2gata tcagattata aagtggttga accaattaar 240 aigcagc^g aaataatgaa aaataiacac agttgtgagc tcacanatt aaaacaattc 300 ttaacaagaa gtaaaaacat tagctctcta aaattaagta tgatatgtga ttggttacag 360 ttaaaatcca cctcagataa cacatcaatt cttaatttta lagatgtgga gttiatacxt 420 gtttgggtga gcsattggtt tagtaactgg tataatctca ataaattaat citagagat 480 agaagagagg aagtaataag ^ictggttca aittcatgta gatcactagg caagttagtt 540 tlcaitgtat catcttatgg gtgtgtagia aaaagcaaca aaagtaaaag agtaasUU 600 ucacatata accaactgtt aacatggaaa gatgtgatgi taagtaggtt caatgcaaac 660 ttttgtalat gggtaagtaa caacctgaac aaaaatcaag aaggactagg atoaga^l 720 aatctgcaag gtatgttaac caacaaatta tatgaaac^ ttgattatat gttaagtcta 780 tgtagtaatg aagggttctc accag^aaa gagttcg鄉 gctuaitat gagtgaaau 840 cttaaaalta ctgagcatgc tcaattcagt actaggttta ggaatacitt attaaatggg 900 ttgactgaac aatlatcaat gttgaaagct aaaascagat ctagagitct tggcaccata 960 ttagaaaaca atgactaccc catgtatgaa gtagiactta aatiattagg ggacactttg 1020 aaaagtataa aattattaat taacaagaat ttagaaaatg ctgcagaatt atattatata 1080 ttcagaatit tiggacaccc tEtggtagat gagagggaag caatggatgc tgtlaaatta 1140 aaiaatgs^a itacaaaaat u^taaactg gagagcrtaa cagaactaag aggagcartt 12CX) atactaagaa ttataaaagggtugtagat aataataaaa gatggcctaa aattaagaat 1260 ciaaaagtgc tcagtaaaag atgggrtatg tatticaaag ccaaaagtta ccctagccaa 1320 cttgagctaa gtgtacaaga ttttttagaa cttgctgcag tacaattcga acaggaatu 1380 tctgtccctg aaaaaaccaaccugagatg gtaitaaatg ataaagcaat atctcctcca 1440 aaaaagtlaa laiggtcggt atatccaaaa aattatctac ctgaaattat aasaaalcaa 1500 【atttag 肪 g aggtcttcaa tgcaagigac agtcaaagaa cgaggagagt cttagaattt 1560 tacttaaaag attgcaastc tgatcaaaaa gaccitaaac gttatglact taaacaagag 1620 tatciaaarg acaaagaccacattgtctca ctaactggga a^aaagaga attaagtgta 16S0 ggcaggatgt ttgcaatgca accaggcaaa caaagacm tacagatact agctgagaaa 1740 ctcctagctg at2atattgt accctttUc ccagaaactt taacaaagta rggtgacitg 1800 gatctccaaa gaauatgga aatgaaatca gaactttcu ccattaaaac taggaagaat 183) gacaguaca acaattatat tgcaagagcc tccatagtaa cag^ta^ taaattcaat 1920 -57- 144243-序列表.doc 1356848
caagccuta gatatgaaac cacagctatc tgigcagaig lagcagaiga gttacatggt 1980 acgcaaagct tactUgttg gitacaictt attguccca tgeccacaat gatatgtgca 2040 tacagacatg caccaccaga aacsaagggg gagtatgaca ta^caaaat agaagagcaa 2100 agtgggctat acagatatca tatgggaggg atlgaagggt ggigicsgaa gitatggaca 2160 atggaagcga tatccttgtt agalgtagia tctgtiaaga ctcgtlglca gaigacccct 2220 ctattaaacg gagacaatca atcaatagat gtcagtaaac cagtaaaatt gtctgaaggt 2280 atafiatgaag i2mgcaga ttatagctta ccaattaaaa tgcoaaaga gataagagat 2340 gcctataaaa acattggcca taaactcaaa gaagg^aaa catataiatc aagagatctc 2400 caautataa gtaaggtgat tcaalctgag ggggtcatgc atcctacccc cataaaaaag 2460 atauazggg taggtccctg gataaataca atactagatg acattaaaac cagtgcagaa 2520 tcaaiag£ga gtctgtgcca agaactagag acagaogag aaagiatgct agttgci^ 2580 atattaagga atttctggct gtataactta tacatgcatg agtcaaaaca gcatccgtta 2640 gctggaaaac aactgtttaa gcaattgaac aaaacactaa catctgtgca aagatttctt 27C0 gagcrgaaga aaga2aatga tgtggtfesc ctatggatga atataccaat gcagtttgga 2760 gggggagacc cagtagtttt ttacagatct ttctacagaa ggactcctga tucctgact 2820 gaagcaatca gccatgtgga tttactgtta aaagtttc£a acaatauaa aaatgagact· 2880 aagatacgat tctttaaagc cttattatct atagaaaaga atgaacgtgc aacattaaca 2940 acactaaiga gagaccccx:a ggcggiagga icggaaagac aagciaaggc aacaagtgat 3CX10 ataaatagaa cagcagttac tagcatactg agtctatctc cgaatcagct ctmgtgat 3060 agtgctatac actatagcag aaatgaa£aa gaagtcggga tcattgcaga caacataaca 3120 cctgtltatc cccacggatt gagagt£ctc tatgaatcac taccttttca taaggccgaa 3180 aaggltgtea atalgatatc aggtacaaag tctataacta acctattgca gagaacatct 3240 gctatcaatg gtgaagat2t tgatagagca gtetctatea tgttagagaa cttagggttg 3300 ttacctagga caugtcagt aataattaat agtatagaaa taccaattaa gvccaatggc 3360 agattgatat gctgtcaaat nctaagact ttgagagaaaaatc^tggaa caatatggaa 3420 atagtaggag tgacatctcc aagtattgta acatgtacgg atgttgtgta tgcaactagt 3480 tctcatttaa aaggaataat tattgaaaaa ctcagtactg acaagaccac aagaggtcag 3540 aggggaccaa aaagcccctg ggtaggatca agcactca^g agaaaaaatt agttcctgtt 3600 tataatagac aaattctttc aaaacaacaa aaggascaac tggaagcaat aggaaaaatg 36^) aggtgggfet aiaaaggaac tccagggcta agaagatigc tcaataagat ttgcatagga 3720 agtttaggta ttagctataa atgtgtaaaa cctctattac caagattcat gagtgtaaac 3780 ttcttacata ggttatctgt tagtagcaga cccatggaattcccagcuc tgttccagct 3840 tataggacaa caaatiacca ctttgacact agtccaatca accaagcatt aagtgagagg 3900 ttcgggaacg aagacattaa tciagtgttc caaaa^caa tc^ctgcgg aattaglaia 3960 atgagtgttg tagaacagtt aac^gtaga agcccaaaac aattegtctt aatcccccaa 4020 uagaagaga tagatatrat gcctcctcct gtatttcaag gaaaaucaa ttataaacta 4080 gttgataasia taacctctga tcaacacatc Ucaglccig acaaaataga catatiaaca 4140 ctagggaags tgcttatgcc tactateaaa ggtcaaaaaa ctgatcagtt cttaaataag 4200 agagaaaact atttccatgfi aaataattta attgaatcti tatct£ca£c acttgcatgc 4260 cactggtgtg gaatattaac agaacagtgc giagaaaaca aiatctaag gaaagactgg 4320 g£tgatgggt tcaiatcaga tcatgccttc et|gat〇caagatattict atgtgtattt4380 aaaaccaaac ttttatgtag aggggaicc caa^gaaaa atgtaa&aga tgaagatata 4440 aiagatgaat ccaugacaa attaitaaga attgacaacacutiiggag aatgucagc 45CO aaagtcatgt ttgaatcaaa ggtcaaaaaa agaataatgt tatatgatgt aaaattccta 4560 tcattagtag gttatatagg atttmaac tggtttatag agcagttaag agtagtagaa 4620 tt£cacgaag tgccctggat tgicaatgct gaaggegagc tagttgaaat laaaccaaic 4680 aa2acttatt tgcagttaat agaacaaagt cialctttaa gaataacigt tttgaattat 4740 acagacatgg cacatgctct tacacgatta atiaggaaga aattgatgtg tgataatgca 4800 ctcttcaatc caagitcatc accaatgttt agtciaactc aagtratcga tcctacaaca 4860 cagctagact attttcctaa ggtgalattt gaaaggttaa aaagttatga taccagttca 4920 gacia:aaca aagggaagu aacaagaaac tacaigacat tattaccatg gcagcacgta 4980 aacaggtaia auttgtcti tafittcaaca ggatgtaaaa tcagcttgaa gacalgcatc 5040 gggaaauga taaaggacu aaaccctaag gitctuact ttattggaga aggagcaggt 5100 aactggatgg caagaacagc algtgaglat cctgacataa aattigtata taggagllta 5160 144243-序列表.doc -58 - m 1356848 aaggatgatc tigatcatca ttacccatta gaataicaaa gggiaatagg tgatitaaat 5220 agggtaatag atggtggtga aggactatca atggagacca cagatgcaac tcaaaagact 5280 catigggact Eaatacacag aaiaagiaaa gaigcittar tgaiaacaa gtgtgaigca 5340 gaaitcaaaa acagagatga mctitaaa ategtasttc tttggaEaaa aca^taita 54{X) icatgtagaa tctgtacagc ttatggaaca gatctttact taiitgcaaa gtatcalgcg 5460 acggactgca ata〖aaaatt accatuttt gtaaggtcig lagctaciu tattatgcaa 5520 ggaagcaaat tgtcagfiatc atacttUaa cauaggtca tcacaaiaat 55¾) ctgccatgcc atggagaaat acaaaattoc aasatgagaa tagcagtgtg taatgatttc 5640 catgccicaa aaaaactaga caacaaatca attgaagcia actgtaaatc tjOtctatca 5700 ggattaagaa taccaataaa caaaaaagag ttaaatagac aaaagaaact gttaacacia 5760 caaagcaatc attcttccat agcaac^tt ggcggcagia agattat^a atcca22tgg 5820 ttaaagaata aagcaagtac aataattgai tggnagagc atatcttgaa tictccaaaa 5880 ggtgaattaa actatgaut cttt£aagca itagagaaca cataccccaa tatgatcaag 5940 cttatagata 2cctgggaaa tgcagagaia aaaaaactaa tcaaagncc igfgtatatg 6(XX) cltgtgagta agaagtaa 6018
<210>42 <211>187 <212>蛋白質 d1%人類間質肺病毒 <400> 42
Met Ser Arg Lys Ala Pro Cys Lys Tyr Glu Val Arg Gly Lys Cys Asn 15 10 15
Arg.CSy Ser Glu Cys Lys Phe Asn His Asn Tyr Trp Ser Trp Pro Asp 20 25 30
Arg Tyr Leu Leu lie Arg Ser Asn Tyr Leu Leu Asn Gin Leu. Lea Arg 35 40 45
Asn Thr Asp Arg Ala Asp Gly Leu Ser He He Ser Gly Ala Gly Aig 50 55 60 G!u Asp Arg Thr Gin Asp Phe Val Leu Gly Ser Thr Asn Val VaJ Gin 65 70 75 80
Gly Tyr lie Asp Asp Asn Gin Ser He Thr Lys Ala Ala Ala Cys Tyr 85 90 95
Ser Leu His Asn lie lie Lys Gin Leu Gin Glu Val Glu Val Arg Gh 100 105 Π0
Ala Arg Asp Asn Lys Leu Ser Asp Ser Lys His Val Ala Leu His Asn 115 120 125
Leu Val Leu Ser Tyr Met Glu Met Ser Lys Tnr Pro Ala Scr Leu lie 130 135 140
Asn Asn Leu Lys Arg Leu Pro Arg Glu Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys 145 150 . 155 160
Leu He lie Asp Leu Ser Ala Gly Ala Glu Asn Asp Ser Ser Tyr Ala 165 170 175
Leu Gin Asp Ser Glu Ser Thr Asn Gin Vai Glri 180 185 <210> 43 <211> 187 <212>蛋白質 ❹^人類間質肺病毒 144243-序列表.doc -59- [S 1 1356848 <400> 43
Met Ser Axg Lys Ala Pro Cys Lys Tyr Glu Val Arg Gly Cys /'jn 1 5 10 15
Arg Gly Ser Glu Cys Lys Phe Asn His Asn Tyr Trp Ser Tip Pro Asp 20 25 30
Arg Tyr Leu Leu He Arg Ser Asn Tyr Leu Leu Asn Gta Leu Leu Arg 35 40 45
Asn Thr Asp Ail Ala Asp Gly Leu Ser De Ds Ser Gly Ala Gly Arg 50 55 60
Glu Asp Arg Thr Gin Asp Fne Val Leu Giy Ser Thr Asn Val Val Gin 65 70 75 80
Gly Tyr He Asp Asp Asn Gin Ser lie Tnr Lys Ala Ala Ala Cys Tyr 85 90 95
Ser Leu His Asn lie De Lys Gin Leu Gin Glu Val Glu Val Arg Gin 100 105 110
Ala Arg Asp Ser Lys Lea Scr Asp Ser Lys His Val Ala Leu His Asn 115 120 125
Leu De Leu Ser Tyr Met Glu Met Ser Lys Thr Pro Ala Ser Leu De 130 135 140
Asn Asn Leu Lys Axg Leu Pw Aii Glu Lys Leu Lys Lys Leu Aia Lys 145 150 155 160
Leu lie De Asp Leu Ser Ala Gly Ala Asp Asn Asp Ser Ser Tyr Ala 165 170 .175
Leu Gin Asp Ser Glu §er Thr Asn Gin Val Gin 180 185 <210>44 <21i>187 <2]2>蛋白質 <2]3>人類間質肺病毒 <400>44
Met Ser Arg Lys Ala Pro Cys Lys Tyr Glu Val Arg Gly Lys Cys Asn 15 10 15
Arg Gly Ser Asp Cys Lys Phe Asn His Asn Tyr Tip Ser Trp Pro Asp 20 25 30
Arg Tyr Leu Leu Leu Arg Ser Asn Tyr Leu I^eu Asn Ghi Leu Leu Arg 35 40 45
Asn Thi Asp Lys Ala Asp Gly Leu Ser De fle Ser Gly Ala Gly Arg 50 55 60
Glu Asp Arg Thr Qn Asp Phe Val Leu Gly Ser Thr Asn Val Val Gin 65 7 0 75 80
Gly Tyr Be Asp Asp Asn <31n Gly He Thr Lys Aia Ala Ala Cys Tyr 85 90 95
Scr Leu His Asn lie lie Lys Gin Leu Gin Glu Thr Glu Val Arg Gin 100 105 110
Ala Arg Asp Asn Lys Leu Ser Asp Ser Lys His Val Ala Leu His Asn 115 120 125
Leu Dc Leu Ser Tyr Met Glu Met So: Lys Thr Pro AJa Ser Leu lie 130 135 140
Asn Asn Leu Lys Lys Len Pro Arg Glu Lys Leu Lys Lys Leu Ala Arg -60-
144243-序列表.doc IS 1 1356848 145 【50 丨 55 160
Leu lie He Asp Leu Ser Ala Gly Thr Asp Asn Asp Ser Ssr Tyr Ala 165 170 175
Leu Gin Asp So- Glu Ser Thr Asn Gin Val Gin 180 185 <2I0>45 <21l> 187 <2i2>蛋白質 <2丨3>人類間質肺病毒 <400>45
Met Ser Arg Lys Ala Pro Cys Lys T>t Glu Val Arg Gly Lys Cys Asn 1 5 10 15
Arg Gly Sct Glu Cys Lys Phe Asn His Asn Tyr Trp Ser Tip Pro Asp 20 25 30
Arg Tyr Leu Leu Leu Arg Ser Asn Tyr Leu Leu Asn Gin Leu Leu Axg 35 40 45
Asn Thr Asp Lys Ala Asp Gly Leu Ser He He Ser Gly Ala Gly Aig 50 55 60
Glu Asp Arg Thr Gin Asp Phe Vsl Leu Gly Ser Thr Asn Val Val Gin 65 70 75 80
Gly Tyr lie Asp Asn Asn Gb Gly lie Thr Lys Ala Ala Ala Cys Tyr 85 90 95
Ser Leu His Asn lie De Lys Gin Leu Gin Glu lie Glu Val Arg Gin 100 〖05 110
Ala Arg Asp Asn Lys Leu Ser Asp Ser Lys His Val Ala Leu His Asn 115 120 125 ·
Leu He Leu Ser Tyr Met Glo Met Ser Lys Thr Pro Ala Ser Leu lie 130 135 140
Asn Asn Leu Lys Lys Lea Pro Arg Glu Leu Lys Lys Leu Ala Lys 145 〖50 255 160
Leu lie lie Asp Leu Ser Ala Gly Thr Asp Asr» Asp Ser Ser Tyr Ala 165 170 175
Lsu Gin Asp Ser Glu Ser Thr Asn Gin Val Gin 180 185 <210> 46 <21i>564
<212>DNA <213>人類問質肺病毒 <400> 46 atgtetegea aggctccgtg caaaiatgaa gtgcggggca aatgcaatag aggaagtg^ 60 tgcaagttta accacaatta ctggagitgg ccagatagat acmttaat aagatcaaat 120 tatttattaa atcaactm aaggaacact gatagagcEg atggettate aataatatca 180 ggageaggea gagaasatag gacaca^at tttgtcctag guccaccaa tgtggttcaa 240 ggttaratig atgataacca aagcataaca aaagctgcag cctgctacag tctacataat 300 ataatcaaac aacracaaga agng^gtt aggeaggeta gagataacaa actatctgac 360 agcaaacatg tageaettea caacttagte etatettata tggagaigag caaaactcct 420 gcstctttaa tcaacaatct caagagactg ccgagagaga aactgaaaaa atiagcaaag 4S0 ctcataattg acttatcagc aggtgctgaa aacgactctt catat^cct gcaagacagt 540 144243-序列表.doc -61 - [S ] 1356848 gaaagcacta atcaagtgca gtga 564 <210>47 <211>564
<212>DNA 切3〉人類間質肺病毒 <400>47
aigtctcgca aggctccatg caaatatgaa gigcgggsca aatgcaacag aggaaglgag 60 tgtaagttta accacaatta ctggasttgg ccagatagat actiattaat aagatcaaac 120 tatctatiaa atcagctm aaggaacact gai£〇agctg aiggcctatc aataatatca 180 ££cgcaggcii gagaagacag aacgcaagat cttgttctag gttccaccaa tgtggttcaa 240 ggttatattg atgataacca aagcata2ca aaagctgcag cccgctacag tctacacaac 3(X) alaaicaagc aactacaaga agrigaagtt aggcaggcta £sgatagcaa actatctgac 360 agcaagcatg iggcactcca taacttaatc ttatcttaca tggagatgag caaaactccc 420 gcatctttaa tcaacaatct taaa^actg ccgagagaaa aact£aaaaa anagca2ag 480 ctgataaitg acttatcagc aggcgctgac aatgactctt catatgccct gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtga 564
<210> 48 <211> 564 <212> DNA <2〗3>人類間質肺病毒 <400>48 ^ . aigtctc^ta aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag agggagtgat 60 igcaaattca atcacaatta ctggagttgg cctgalagautttatigtt aagatcaaat 120 tatctcttaa atcagctttt aagaaacaca gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag aactcaagac tttgttcttg gtictactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg algacaacca aggaataacc aaggctgcag cagctatag tctacacaac 3(K3 ataatcaagc aactacaaga aacagaagta agacaggcta gagacaacaa gctttctgat 360 agcaaacatg tggcgctcca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatcicua ccaacaacct aaagaaacta ccaagggaaa aactgaagaa attagcaaga 480 ttaataattg atttatcagc asgaactgac aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaa 564
<210>49 <211>564 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400>49 atgtctcgca aa£ctccatg caaatatgaa gtacggggca agtgcaacag gggaagtgag 60 tgcaaattca accacaaita ctggagctgg cccgataggc a^ugtt aagatcaaat 120 tatctcttga atcagctttt aagaaacact gataaggctg stggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag gactcaagac tttgucug gttctactaa tgiggctcaa240 gggtacattg ataacaatca aggsata2ca aaggctgcag cttgctatag tctacataac 300 ataataaaac agctacaaga aatagaagta agacaggcta gagataacaa gcutctgac 360 agcaaacatg tggcacttcacaacttgat2 ttatcctata tggagatgag caa2actcct420 gcatccctga ttaataacct aaagaa^ta ccaagagaaa aactgaagaa attagcgaaa 480 oaaiaang atttaccagc aggaactgat aatgactctt calatgcctt gcaa^cagt 540 gaaagcacta atc^gtgca gtaa 564 <210> 50 144243-序列表.doc -62· [S3 1356848 <211>71 <212>蛋白質 ^&人類間質肺病毒 <400> 50
Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 5 10 15
Ser GIu His Gly Pro Vsl Phe Dc Thr lie Gh Vd Asp Asp Met lie 20 25 30
Trp Thr His Lys Asp Leu Lys Clu Ala Leu Sex A$p Gly Dc Val Lys 35 40 45
Ser His Thr Asn He Tyr Asn Cys Tyr Leu G!u Asn Dc G!u lie 11c 50 55 60
Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70
<210>51 <211> 7] <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400>51
Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Vai Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 5 . 10 15
Ser Gla His Gly Pro Val Phe ne Thr De Glu Val Asp Glu Met He 20 25 30
Trp Thr Gin Lys Glu Leu Lys Glu Ala Lsu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45
Ser His Tnr Asn De Tyr Asn Cys Tyr Leu Glu Asn He Glu lie Ee 50 55 60
Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Scr 65 70
<210> 52 <211>71 <2!2>蛋白質 <2!3>人類間質肺病毒. <400>52
Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Vai Lys Ala Leu fle Lys Cys 15 10 15
Sec Lys His Gly Pro Lys Phe lie Thr He Giu Ala Asp Asp Met lie 20 25 30
Tip Thr His Lys Glu Leu Lys Glu Thr Leu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45 '
Ser His Thr Asn lie Tyr Ser Cys Tyr Leu Glu Asn He Glu lie He 50 55 60
Tyr Val Lys Tbr Tyr Leu Ser 65 70 <210> 53
63- 144243-序列表.doc 1356848 <211>71 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400>53
Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu lie Lys Cys 15 10 15
Ser Lys His Gly Pro Lys Pbe De Thr He Glu Ala Asp Asp Met De 20 25 30
Trp Thr His Lys Glu Leu Lys Glu Thr Leu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45 ·
SeT His Thr Asn lie Tyr Ssr Cys Tyr Leu Glu Asa lie Glu lie lie 50 55 60
Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70
<210>54 <211>216 <212> DNA <2!3>人類間質肺病毒 <400>54 atgactcttc c 泣gacagfe aaagcactaa tcaagtgcag tgagcatggt 60 ccagttttca ttactataga ggttgatgac atgatatgga ctcacaagga cttaaaagaa 120 gcittatctg atgggatagt gaagtctcat actaacaat acaattgtis tuagaaaac 180 atagaaatta tatatgtcaa ggettaetta agttag 216 <T210>55 <21!>216
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>55
atgactcttc atatgccctg caagacaglg aaagcactaa tcaagigcag tgagcatggt 60 cctgttttca ttaefatc^a ggttgatgaa atgatatggactcaaaaaga attaaaagaa 120 gcutgtccg at£ggatagt gaagtctcac accaacattt acaattgtta tttaga2aac 180 at2g3aatia tatatgtcaa ggettaetta agttag 216 <210> 56 <211>216
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <40〇> 56 atgactcttc atatgeettg caagacagtg aaagcaciaa tca£〇tgcag taaacatsgt 60 ccca^tca Uaccziaga ggcagatgat algat^tgga ctcacaaaga allaaaagaa 120 acactgicig atg£gatagt aaaatcacac accaatatu atagt^tta cttagaaaat 180 at2gaaataa tatatgtlaa aacctactta agtlag 216 <210>57 <211>216
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 144243-序列表.doe -64- m 1356848 <40Q>57 atgactcttc statgccttg caagacaglg aaagcaaaa tCEagtgcag taagcetggt 60 cccaaattca ttaccataga ggcagatgat atgataigga cacacaaaga attaaaggag 120 acacigtctg atgggatagcaaaatcacac accaauiu acagugtta litagaaaat 180 atagaa&taa tatatgttaa agcttactta agttag 216 <210>58 <2il>727
<212>DNA 也3>人類間質肺病毒 <400〉58 ·
axgtclcgca aggctccgtg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaatag aggaagtgag 60 tgcaagttia accacaatta ctggagttgg ccagatagat acttattaat aagatcaaat 120 tacttauaa atcaactttt saggaacact gatsgagctg acggcrtatc aataatatca 180 ggagcaggca gagaagatag gacacaagat trtgtcctag gttccaccaa ^tggttcaa 240 ggtiatattg atgataacca aagcataaca aaagcigca£ cctanacag tctacataar 300 aiaatcmc aactacaaga agttgaagtt aggcaggcta gagataacaa actatctgac 360 agcaaacatg tagcacttca caacttagtc clatcrtata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctriaa rcaacaaictcaagagactg ccga£agaga aactgaaaaa attagcaaag 480 cicataaug acttatcagc aggtgctgaa aatgactcti catatgccu gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagrgcagtgagcatgg tccagttttc attsctatag aggttgatga SX) catgatatgg actcacaagg acttaaaaga agctttarct gatgggatag cgaagtctca 660 tactaacatt tacaattgtt atttagaaaa catagaaatt atatatgtca aggcttactt 720 aag^ag 727 <210> 59 <211>727
<212>DHA <213>人類間質肺病毒 <400>59
atgtcrcgca aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag aggaagfeag 60 tgtaagEtta accacaattactggagttgg ccagatagat acitattaat aagatcaaac 120 tatctattaa atcagctut aaggaacactgatagagctg atggcctatc aataatatca 180 ggcgcaggca gagaagacag aacgcaagai tttgttctag gttccaccaa tgtggucaa 240 ggttacattg atgataacca aagcataaca aaagctgcag cctgctacag tctacacaac 3(X) ataaicaagc aactacaaga agttgaagtt aggcaggcta gagatagcaa actatctgac 360 agcaagcatg tggcactcca taacctaatc ttatcttaca tggaga^ag caaaactccc 420 gcatctttaa icaacaatct taaaagactg ccgagagaaa aactgaaaaa attagcaaag 4S0 ctgataat^ aacatcagc aggcgctgac aatgacM catatgccct gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaag^ca gtgagca^g tcctgttttc attactatag a^ttgatga 600 aatgatatgg actcaaaaag aattaaaaga agctttgtcc gaigggatag tgaagtctca 660 caccaacatt cacaactgtt atttagaaaa cat^aaart atatatgtca aggctiaat 720 aagctag 727 <210>60 <211>727
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <4〇0>60 atgtctcgta aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag agggagtgai -65- 144243-序列表.doc 1356848 tgcaaauca atcacaatta ctggagttgg ccigatagal atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttaa atcagctut aagaaacaca gataaggcfe atggtttgtc aataaiatca 180 ggagcaggta gagaagatag aactcaagac U^ttcttg gitctactaa tgtggticaa 240 gggtacattg aigacaacca aggaataacc aaggctgcag c^ctatag tctacacaac 300 ataatcaagc a^iacasga aacagaagta agac^gcta gagacaacaa gcmctgai 360 agcaaacatg tggcgctcca caacttgata rtatcctata iggagatgag caaaactcct 420 gcarctctaa tcaaca^ct aaagaaacta ccaagggaaa aactgaagaa attagcaaga 480 ttaataaitg atttaicagc aggaactgac aatgactcu cataigcctt gcaagacagt 540 gaaagcacia atcaagtgcs gtaaacatgg tcccaaattc altaccatag aggcag^ga 830 iatgatatgg acicacaaag aauaaaaga aacactgtct gatgggalag taaaatcaca 660 caccaatatt tatagttgtt acttagaaaa iatagaasta atalatgtla aaacttactt 720 aagitag 727
<210>61 <211 >727 <212>DNA <213>人類間質肺病毒，
<Αω>61 atgtctcgca aagctccaig caaatatgaa gtacggggca agtgcaacag gggaagtgag 60 tgcaaaitca accacaatta ctggagctgg cctgataggt atttatvgU aagatcaaat 120 tatctcttga atcagctcu aagaaacact gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag gactcaagac tugttcttg gttctactaa fetggttcaa 240 gggtacattg ataacaatca aggaataaca a^gctgcsg cttgciaiag tctacataac 300 ataataaaac agctacaaga^aatagaagta agacaggcta gagataataa gcittctgac 360 agcaascatg tggcacttca caacttgata ttatcctata tgg^tgag caaaactcct 420 gcatccctga ttaataacct aaagaaacta ccaagagaaa aactgaagaa attagcgaaa 480 ttaataaag atttatcagc aggaactgat aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta arcaagt^ca gtaagcatgg tcccaaattc attaccaiag aggcaga^a 600 tatgatatgg acacacaaag aaltaaagga gacactgtct gatgggatag taaaatcaca 660 caccaatatt tacagttgtt atttagaaaa tatagaaata atata^tta aagcttactt 720 aagttag 727
<210>62 <21I> 254 <212>蛋白質 ❹仏人類間質肺病毒 <400>62
Met Gla Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gin Gly De Pro Tyr Thr Ala 15 10 15
Ala Va! Gin Val Asp Leu lie Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 20 25 30
Thr lie Trp Phs Pro Leu Fat Gin Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 40 45
Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Thr He Thr Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60 .
Gin Asn Gly Pro Dc Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gin Gly Ala Ala 65 70 75 80
Met Ser Val Leu Pro Lys Phe Qu Val Asn Ala Thr Val Ala Leu 85 90 95
Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Glu Phe Asp Lys Leu Thr Val Cys Glu Val 100 105 110
Lys Thr V&l Tyr Leu Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Va! Ser Lys 144243-序列表.doc -66- IS 3 1356848 115 120 125
Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Lea De 130 135 140
Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asn Tnr Pro Val Thr De 145 150 155 160
Pro Ala Phe De Lys Ser Val Ser fle Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175
Val Glu Ala Ala He Ser Ser Glu Ala Asp Gin Ala Leu Thr Gin Ala 180 185 190
Lys De Ala Pro Tyr Ala Qy Leu He Met lie Met Thr Met Asn Asn 195 200 205
Pro Lys Gly lie Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr G!n Val De Val 210 215 220
Giu Leu Gly Ala. Tyr Val Gin Ala Glu Ser De Ser Lys De Cys Lys 225 230 235 240
Thr Trp Ser His Gin Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Arg 245 250
<2I0>63 <211>254 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400> 63 .
Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gin Gly lie Pro Tyr Thr Ala 1 5 . 10 . 15
Ala Val Gin Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 20 25 30
Thr He Trp Phe Pro Leu Phe Gin Ala Asn Thr Rpo Pro Ala Val Leu 35 40 45
Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Thr De Thr Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60
Gin Ser Gly Pro lie Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gin Gly Ala Ala 65 70 75 80
Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala Thr Val Ala Leu 85 90 95
Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Glu Phe Asp Lys Leu Thr Val Cys Glu Val 100 105 110
Lys Thr Val Tyr Leu Thr Thr Mei Lys Pro Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 m 125
Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu lie 130 135 140
Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asr； Thr Pro Val Thr lie 145 150 155 160
Pro Ala Phe He Lys Ser Val Ser lie Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175
Val Glu Aia Ala He Ser Ser Glu Ala Asp Gk Ala Leu Thr Gbi Ala 180 285 190
Lys lie Ala Pro Tyr Ala Gly Leu Be Met Qe Met Thr Met Asn Asn 195 200 205
Pro Lys Gly lie Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Tnr Gin Val De Val 210 215 220
Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gin Ala Glu Ser lie Ser Lys lie Cys Lys •67· 144243·序列表.doc 1356848 225 230 235 240
Thr Trp Ser His Gin Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Ser 245 250 <2I0>64 <211> 254 <212〉蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400>64
Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gin Gly He Pro Tyr Thr Ala i 5 10 * 15
Ala Val Gin Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Leu Lea Pro Ala Ser Leu 20 25 30
Thr He Tip Phe Pro Leu Phe Gin Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 * 40 45
Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Thr tie Thr Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60
Gin Asn Gly Pro He Leu Lys Val Asn Ala Ser Ak GLn Gly Ala Ala 65 70 75 80
Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala Thr Ala Leu 85 90 95
Asp Glu Tyr Scr Lys Leu Asp Phe Asp Lys Leu Thr Val Cys Asp Val 100 . 105 110
Lys Thr Val Tyr Lau Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Val Set Lys 115 120 125
Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu De 130 135 140
Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asn He Pro Val Thr lie 145 〖50 155 160
Pro Ala Phe He Lys Ser Vai Ser lie Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr )65 170 175
Val Giu Ala Ala lie Ser Ser Glu Ala Asp Gin Ala Leu Thr Gin Ala 180 185 190
Lys He Ala Pro Tyr Ala Gly Leu Re Met lie Met Thr Met Asn Asn 195 200 205
Pro Lys Gly lie i%e Lys Lys Leu Gly Ala Gly Tm· Gin Val De Val 210 215 220
Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gta Ala Glu Ser lie Ser Arg He Cys Lys 225 230 235 240
Ser Trp Scr His Gin Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Arg 245 250 <210>65 <211>254 ' <212>蛋白質 ^&人類間質肺病毒 <4O0>65
Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gin Gly He Pro Tyr Thr Ala 15 10 15
Ala Val Gin Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 144243-序列表.doc -68 - IS! 1356848 20 25 30
Tnr He Trp Phe Pro Leu Phe Gin Ala Asn Thr Pro Pro Al^ Val Leu 35 40 45
Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Thr Dc Thr Thr Leu Tyr A!a AJa Scr 50 55 60
Gin Asn Gly Pro lie Leu Lys VbL Asn Ala Ser Ala Gin Gly Aia Ala 65 70 75 80
Met Ser Val Lea Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala ITir Val Ala Leu 85 90 95
Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Asp Phe Asp Lys Leu Thr Val Cys Asp Val 100 105 110
Lys Thr Val Tyr Lsu Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 120 125
Phe Va] Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu lie 130 135 140
Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asn He Pro Val Thr I!s 145 150 155 160
Pro Ala Phe Be Lys Ser Val Ser He Lys Glu Scr Glu Ser Ala Thr 165 170* 175
Val Glu Ala Ala lie Ser Ser Giu Ala Asp Gin Ala Leu Thr Gin Ala 180 185 190
Lys Oe Ala Pro Tyr Ala Gly L&j lie Met lie Met Thr Met Asn Asn 】95 200 205
Pro Lys Gly lie Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr Gla Val lie Val 210 215- 220
Glu Le-α Gly Ala Tyr Val GLn Ala Giu Ser 11c S^: Arg De Cys Lys 225 230 235 240
Ser Trp Ser His Gin Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Arg 245 250 <210> 66 <211>765
<212>DNA
<213>人類間質肺病毒 <400>66
Etggagtcct acct£gtaga cacccatcaa ggcattcctt acacagcagc tgttcaagti 60 gatetaatag aaaaggacct gttacctgca agccta^aa tatggticcc utgnt〇2g ]20 gccaacacac caccagcagt getgetegat cagctaaaaa ccctgacaat asccactctg ISO tacgccg〇2t cacaaaatgg tccaatactc aaagtga^g catcagccca aggtgcagca 240 atgtagEac ttcccaaaaa attigaagtc aatgc^cig tagcactcga tgaaiatagc 300 aiuurtggaat ttgacaaactcacagictgt gaagtaaaaa caglttactt aaca^catg 3K) aaaccaiacg gga^giatc aaaatttgtg agc^cagcca astcagttgg caaaaaaaca 420 catgatctaa tcgcactaig tgattttatg gatetagaaa agaacacacc tgttacaata 480 ccagcattca tcaaaicagt ttcaatcaaa gagagtgagt cagciactgl; tgaagctgct 540 ataageagtg aagcagacca agctctaaca caggccaaaa ttgcacciia tgc^gacta 600 attatgatca tgactaxgaa caatcccaaa ggeatattea aaaascttsg agctgggact 660 ceagtcalag tagaactagg ageataegte caggctgaaa gcaiaagcaa aatargeas^ 720 acaggagcc atca^ggac aagata^tc ttgaagtcca gataa 765 <210>67 <2il> 765 <212> DNA 69- 144243-序列表.doc 1356848 <213>人類間質肺病毒 <400>67 aigg£gtcct atctggtaga cacuatcaa ggcatccctc acacagcagc tgitcaagu 60 gatctagtag aa22ggacct gttacctgca agcctaacaa tatggilccc cttgcttcag 120 gccaatacac caccagcagt tctgcttgai cagctaaap ctctgacUt aaclactctg 180 tatgctgc^ cacaaagtgg tc〇2alacta aaagtgaatg catcagccca gggtgcagca 240 aigtctgtac ttccc^aaa gtttgaegtc aatgcgactg t2gcacttge cgaatatagc 300 aaaitagaat ttgacaaact tacagtctgt gaagtaaaaa cagtttactt aacaaccatg 360 aaaccatatg gg2lggtaic aaagittgtg agaeggcca aatcagugg c^iaaaaaca 420 catgatctaa tcgcattatg tgattttatg gatctagaaa agaacacacc agttacaaia 480 ccagcattta tcaaatcagt Uclatca^ gagagtgaat cagccsctgt igaagctgca 54〇 aiaa^cagtg aagcagscca agctciaaca caagccaaaa tigcacctta tgcgggactg 600 atcatgatta tgaccatgaa caatcccaaa ggcatattca agaagcttgg agctgggacc 660 caagttatag lagaactagg agcatatgtc caggctgaaa gcataagtaa aatatgcaag 720 acttggagcx: stcaaggaac aagatatgtg ctgaagicca gttaa 765
<2!0>68 <21I>765
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>68
atgg2®tcct aiciagt^a cacttaicaa ggcattccai atacagctgc tgttca^tt 60 gacctggiag aaaaagalit ^clgccagca agtttgacaa tatggtucc ctiatacag 120 gccaacacac caccagcagt tcigcttgat cagctaaaaa ccttgacaat eacaactctg 130 tatgctgcat cacagaatgg tccaatactc a^gtaaatg catctgaxa aggtgctgcc 240 atgtctgtac ttcccaaaaa attcgaggta aatgcasctg tagcsctt^a tgaatacagt 3(X) aaacttgatt ctgacaagct gacggtctgc gatgttaaaa cagtttattt gacaactatg 360 aaaccgtacg ggaiggtgtc aaaatttgtg agticagcca aatcagttgg caaaaagaca 420 catgatctaa ttgcactatg tgacttcatg gacctagaga aaaatatacc igtgacaata 480 ccagcattca taaagtcagt ttcaatcaaa gagagtgaat cagccactgt tgaagctgca 540 aiaagcagcg aagccsacca agcct^aca caagccaaga ttgcgcccta ^caggacta 600 attatgatga tgaccatgaa caatccaaaa ggtatattca agaaaciagg ggccggaaca 660 caagtgarag tag^ctggg ggcatatgtt ctggctgm gcatcagtag gatctgcaag 720 agctsgagte accaaggaac aagatacgia ctaaaaicca gataa 765
<210>69 <211> 765 <212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>69 atggagtcci atctagtgga cacaaicaa ggcactcca acacagctgc igncaagtt 60 gatctgglag aaaaagactt act^cagca agatgacaa tatggittcc tctauccaa 120 gccaacacac caccagcggi tttgctcgat cagctaaaaa ccttgactat aacaactctg 180 tatgctgcat cacagaatgg tccaatactc aa^staaats caicagctca gggtgctgct 240 aigtctgtac ticccaaaaa acicgaagta aa^caaccs tggcacttga tgaatacagc 300 aaacitgaci ttgacaagu aacggttigc gatgttaaaacagtctatrt gacaaccatg 3fi) aagccatatg ggaiggtgtc aaaatttgtg agttcagcca aatcagugg caaaaag^ 420 catgatctaa ttgcactgtB tgacttcatg gacctagaga aaaatatacc cglgacaaia 480 ccagcattca iaaagtcagt ttcaatcaaa gagagtgagt cagccactgt tgaagctgca 540 ataagcagcg aggocgacca agcattaaca csagccaaaa U£cacccta tficaggacta 600 aicaigaLca tgaccatgaa caaiccaaaa ggtaiauca agaa^tagg agctggaaca 660 144243·序列表.doc •70· IS 1 1356848 ca2gtgaiag tagagctagg ggcatatgu caagcc^ga gcatcagcag gatctgcaag 720 agctggagtc Eccaaggaac aagatatgta ctaaaatcca gataa 765 <210>70 <211>394 <212>蛋白質 •^七人網間質肺病辜 <400>70
Met So* Leu Gin Gly Ik His Leu Ser Asp Leu Scr Tyr Lys His Ala 2 5 10 15 lie Leu L% GIu Ser Gin Tyr Thr He Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30
Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gin GLn Gla De Thr Leu Leu Cys 35 40 45
Gly Glu Be Leu Tyr Ala His Ala Asp Tyr Lys Tyr Ala Ala Glu 50 55 60
He Gly De Gin Tyr De Ser Thr Ala Leu Gly Sei Glu Axg Val Gin 65 70 75 80
Gin fle Leu Arg Asn Scr Gly Scr Gla Val Gin Val Val Leu Thr Arg 85 SO 95
Thr Tyr Ser Leu Gly Lys De Lys Asn Asn Lys Gly Giu Asp Leu Gin 100 105 110
Met Leu Asp lie His Gly Val Glu Lys Ser Trp Val Glu Giu lie Asp 115 120 125
Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Ala Thr Leu Leu Ly$ Glu Ser Ser Gly 130 135 140
Asn lie Pro Gin Asn Gin Arg Pro Ser Ala fto Asp Tiir Pro He He 145 150 155 160
Leu Leu Cys Val Gly Ak Leu De Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr lie 165 170 175
Glu Val Gly Leu Git Tbr Thr Val Arg Arg Ala Asn Arg Vai Leu Ser 180 185 190
Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg Met lie Pro Lys 11s Ala Arg 195 200 205
Ser Phe Tyr Asp Leu Phe Glu GLn Lys Val Tyr His Arg Ser Leu Phe 210 215 220 Πε Glu Τγ Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly S«r Lys Ala 225 230 235 240
Glu Ser Leu Pbc Val Asn He Phe Met Gin Ala Tyr Gly Ala Gly Gin 245 250 255
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Leu Gly His Val Ser Val Gin Ala Qu Leu Lys Gin Val Thr Glu Val 275 280 2S5
Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu 290 295 300
Aig Gla Ser Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320
Phe Ala Ser Val Va] Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly De lie Gly 325 330 335
Met Tyr Arg Gly Ate Val Pro Asn Tnr Glu Leu Phe Ser Ala Ala Glu 340 345 350
Ser Tyr Ala Lys Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys He Asn Phe Ser Ser -71 - 144243-序列表.doc 1356848 355 360 365
Leu Gly Leu Ήιτ Asp Glu Glu Lys Glu Ala Ala Giu His Phe Leu Asn 370 375 380
Val Ser Asp Asp Sa Gin Asn Asp Tyr Glu 385 390 <210>71 <211〉394 <212>蛋白質 <2丨3>人類間贫肺病毒 <400>71
Met Scr 3Leu Gin Gly lie Hls Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 1 5 10 IS
lie Leu Lys Glu Ser Gin Tyr Thr I!c Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30
Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gb Gin Glu De Thr Leu Leu Cys 35 40 45
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Met Leu Asp lit His Gly Vai Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu He Asp 115 120 125
Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Ala Thr I^eu Leu Lys Glu Ser Ser Gly 130 135 140
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Leu Leu Cys Val Gly Ala Leu ne Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr De 165 170 175
G]u Val Gly Leu Ghi Thr Val Arg Arg Ala Asn Arg Vd Leu Ser 180 185 190
Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Rro Axg M«t Asp De Pro Lys He Ala Ars 195 200 205
Ser Phe Tyr Asp Leu Phe Glu Gin Lys Val Tyr Tyr Arg Ser Leu Phe 210 215 220 lie Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gy Ser Lys Aja 225 230 235 240
Glu Ser Leu Phe Val Asn De Phe Met Gin Ala Tyr Gly Ala Gly Gin 245 250 255
Thr Met Leu Ail Trp Gly Val He Ala Aig Ser Scr Asn Asn lie Met 260 265 . 270
Leu Gly His Vai Ser Val Gin Ala Glu Leu Lys Gin Val Thr Gla Val 275 280 285 丁yr Asp Leu Val Arg Ου Met Pro G]u Ser G】y Leu Leu His Lsu 290 295 300
Aig Gb Ser Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala A^i Cys Pro Asn 305 310 315 320
Phe Ala Scr Val Val Leu Gly A$n Ala Scr Gly Leo Gly 11c lie Gly 144243-序列表.doc -72· m 1356848 325 330 335
Met Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Thr G!u Leu Phe Scar Ala Ala Glu 340 345 350
Ser Tyr Ala Lys Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys P.e Asn Phe Ser Ser 355 360 365
Leu Gly I>eu Thr Asp Giu Glu Lys Glu Ala Ala Glu His Phe Lsu Asn 370 375 380
Val Ser Asp Asp Ser GLn Asn Asp Tyr Glu 385 390 <210>72 <2il> 394 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒
<400>72
Met Leu Gla Gly De His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 】 5 10 15
He Leu Lys Glu Ser Gin Tyr Tor Πε Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30
Thr Ala Val Ήιτ Pro Ser Ser Leu Gin Gin Glu lie Thr Leu Leu Cys 35 40 45
Gly Glu He Leu Tyr Thr Lys His Thr Asp Lys Tyr Ala Ak Glu 50 55 . * 60
Oe Gly lie Gin Tyr-lie Cys Thr Ala Leu Giy Ser Glu Arg Val Gin 65 70 75 80
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Thr Tyr Ser Gly Lys Gly Lys Asn Ser Lys Giy Glu Glu Leu Gin 100 105 110
Met Leu Asp lie His Gly Val Glu Lys Ser Τφ Πε Glu Glu De Asp 115 120 ' 125
Lys Qu AJa Arg Lys Thr Met Val Thr Leu Leu Lys Glu Ser Scr Gly 130 135 140
Asn lie Pro Gin Asn Gin Arg Pro Ser Ala Pro Asp Thr Pro De De 145 150 155 160
Leu Leu Cys Val Gly Ala Leu De Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr De 165 170 175
Glu Vs] Gly Leu Glu Thr Thr Val Arg Arg Ak Asn Arg Val Leu Ser 180 135 190
Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg lie Asp He Pro Lys lie Ala Arg 1S5 200 . 205
Scr Phe Tyr Glu Leu Phe Qlu Gin Lys Val Tyr Tyr Arg Scr Leu Phe 210 215 220 lie Gla Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240
Glu Ser Leu Phe Val Asn He Phe Met Gin Ala Tyr Gly Ala Gly Gin 245 250 255
Thr Leu Leu Arg Trp Gly Val lie Ala Arg Ser Ser Asn Asn He Met 260 265 270
Leu Gly Kis Val Scr Val Gin Ser Glu Leu Lys Gin Val Thr Glu Val 275 280 285 -73- 144243-序列表.doc 1356848
Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu 290 295 300
Arg G3n Ser Pro Lys Ala Gy Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320
Phe Ala Ser Val Val Lai Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly lie Fxe Gly 325 330 335
Met Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Hir Glu Leu Hie Ser Ala Ala Glu 340 345 350
Ser Tyr Ala .^rg Ser Lea Lys Glu Ser Asn Lys lie Asn Phe Ser Ser 355 360 365
Leu Gly Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ala Ala Glu His Phe Leu Asn 370 375 380
Met Ser Gly Asp Asn Gin Asa Asp Tyr Glu 385 390
<210>73 <211>394 <212>蛋白質 ^^人類間質肺病毒 <400> 73
Met Ser Leu Gin Gly lie His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 1 5 10 15
De Leu Lys Glu Ser Gin Tyr Thr lie Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30
Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gin Gta Glu De Thr Leu Leu Cys 35 40 45
Gly Glu lie Leu Tyr Thr Lys His Tea Asp Tyr Lys Tyr Ala Ala Glu 50 55 60
De Gly He Gin Tyr He Cys Thr Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val Gin 65 70 75 80
Gin De Leu Arg Asn Ser Gly Sct Glu Val Gin Val Val Leu Tht Lys 85 90 95
Thr Tyr Ser Leu Gly Lys Gly Lys Asn Ser Lys Gly Giu Glu Leu Gin 100 105 110
Met Leu Asp lie His Gly Val Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu He Asp 115 120 125
Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Val Thr Leu Leu Lys Glu Ser Ser Gly 130 135 140
Asn lie Pro Gin Asn G!n Arg Pro Ser Ala Pro Asp Thr Pro De He 145 150 155 160
Leu Leu Cys Val Gly Ala Leu lie Phe Thr Lys Leu AJa Ser Thr lie 165 170 , 175
Glu Val Gly Leu Glu Thr Thr Val Arg Arg Ala Asn Arg Val Leu Ser 180 185 190
Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg Val Asp lie Pro Lys He Ala Arg 195 200 205
Ser Fne Tyr Gu Leu Phe Glu Gb Lys Val Tyr Tyr Arg Ser Leu Phe 210 215 220 lie Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240
Glu Ser Leu F^ie Val Asn De Fne Met Gin Ala Tyr Gly Ala Gly G!n 245 250 255 144243-序列表.doc -74- [S ] 1356848
Thr Met Leu Arg Trp Gly Val Re AJa Aig Ser Ser Asn Asn De Met 260 265 270
Leu Gly His Val Ser Val Gin Ala Glu Leu Lys Gin Val Thr G!u VeI 275 280 285
Tyr Asp Leu Vai Ai? Glu Mel Gly Pto Glu Sgt Gly Leu Leu His Lea 290 295 300
Arg Gin Ser Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Aia Asn Cys ?to Asn 305 3i0 315 320
Rie Aia Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly lie lie Gly 325 330 335
Met Tyr Arg Gly Arg Vai Pro Asn Thr Glu Leu Rie Ser Ala Ala Glu 340 345 350
Ser Tyr Ala Arg Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys lie Asn Phe Ser So: 355 360 365
Leu Gly Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ak Ala Glu His Phe Leu Asn 370 375 380
Met Ser Asp Asp Asn Gin Asp Asp Tyr Glu 385 390
<210>74 <211>1185 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <4(K)> 74
atgtetette aagggattca cctgagtgat ttatcataca agcatgctac atiaaaagag 60 ictcagtaca caataaaaag agatgtgggt acaacaactg cagtgacacc cicaicatcg 120 caacaagasa taacacrgu gtgtggasaa aitclgtatg ctaaacatgc rgactacaaa 180 tatgctgcag aaataggaat acaatatatt agcacagcu laggatcaga ^gagtgcag 240 cagarcctgaggaactcagg caigtgaaglc caagtggtct taaccagaac gta:tctetg 300 gggaaaatta aaaacaate aggagaagat ttacagatgt tagacataca cggggtagag 360 aagagctggg tagaagagat agacaa^aa gcaaggaaaa caatggcaac ettgenaag 420 gaaicaicdg gt^atatccc acamtcag aggccctcag caccagacac acccataatc 480 uattatglg taggtgcctt aatattcact aaactagcat caaccaraga agtgggacta 540 gagaccacag teaga^gge taaccgtgta ctaagtgatg cactcaagag ataccctsga 600 aiggacatac caaagattgc cagatccttc catgK：Uat ugaacaaaa agt£iatcac agaagtitgucattgaguuggcaaagca oaggctcac catetacagg cagcaaagca 720 gaaagictat ttgttaatat attcatgcaa gcttatg£gg ccggtcaaac aatgetaagg 780 tggggggtca ttgccaggtc atccaacaat ataatgttag gacatgtatc cgtccaagct S40 gagtlaaaac aggtcacag2> agtciatgac ttggtgciag aaacgggcix tgaatctgga900 cttctacatt taaggcaa^ cccaaaagct ggactguat cactagccaa ctgtcccaac 9&) mgeasgtg ttgricrcgg aaatgcctca sgcaaggca taatcggiat gtatcgaggg 1020 agagtaccaa acacagaatt attttcagca gctgaaagu atgccaaaag tttgaaagaa 1080 agcaataaaa taaacctctc Ucallagga cit2cagatg aagagaaaga ggc^cagaa 1140 camcEaa atgtgagtga cgacagtcaa aatgattatg agtaa 1185
<210> 75 <211> 1185 <212> DNA <213>•人類間質肺病毒 <400>75 atgtetette aagggattca cctgagtgat ciatcataca agcaigctat attsaaagag 60 -75- 144243-序列表.doc 1356848
tctcagtata caataaagag agatglaggc aca2caaccg cagigacacx: ctcaccaug 120 caacaagaaa taacactait gtgtggagaa attct2ta^ ctaagcatgc igattacaaa 180 tatgctgcas aaatasga2l acaatatatt agcacagctc taggatcaga gagagtacag 240 cagattctaa gaaactcagg tagtgaagtc caagtggtu laaccagaac glactccltg 300 gggaaagtta aaaacaacaa aggagaagat ttacagatgi tapcataca cgiagiagsg 360 aaaagctggg tggaagagat agacaaagaa gcaagaaaaa caatggcaac ragcuaaa 420 gsatcatcag gcaatattcc acaaaatcsg aggccttcag caccagacac acccataatc 480 ttattatgtg taggtgcctt aatatttacc aaactagcat caactataga agtgggatta 540 gagaccacag tcagaagagc taaccgtgta ctaagtgatg cactcaaaag ataccctagg 6(X) atggacatac caaaaatcgc tagatctttc tatgacttat Ugaacaaaa agtgtattac 660 agaagttt£t tcsttgagta tggcaaagca ttaggctcat cctctacagg cagcaaagca 720 gaaagtttac tcguaatat attcatgcea gctiacggtg ctggtcaaic aatgctgagg 780 tggggagtca t^ccsggtc scctaacaat ataatgaag g^atstacc tgltcaagct 840 gagttaaasc aagtcacaga agtctatgac ctggcgcgag aaatgggccc tg&atctggg 900 ctcclacatt iaa£g<^aag cccaaasgct £gactgit£tcactagccaa ttgicccaac 960 tnsctagis tigttcicgg caatgcctca ggcttaggca t2ataggtat gtatcgcggg 1020 agagtgccaa acacagaact attttcagca gcagaaagct atgccaagag ttrgaaagaa 1080 agcaataaaa ttaacuuc Uc扒ugga ctcacagmg aagaaaaaga ggctgcagaa 1140 cacttcctaa atgtgagtga 〇£2ca£tcaa aatgattafe agtaa 1】85
<210>76 <21I> 1185 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <40076
atgtctctcc aagggattca cctaagtgai ctatcaiata sacatgciat attaaa2gag 60 tctcaataca caataaaaag agatgtaggc accacaactg cagtgacacc ttcatcatta 120 caacaagaaa taacactttt gtgtggg〇aa atactttaca ctaaacacac igattacaaa 180 tatgctgctg agataggaac acaatatatt tgcacagctc taggatcaga aag^tacaa 240 cagattttga gaaactcagis tagtgaagtt caggtggttc taaccaaaac atactcctta 300 gggaaaggca aaaacagtaa aggggaagag ctgczgztgi tagatataca tggagtggaa 360 tagaagaaat agacaaagas gcaagaaaga caatggtaac tttgcttaag 420 gaaicatcag gtaacatccc acaaaaccag agaccucag caccagacac accaataatt 480 tiattatgig laggtgccct aamucact aaaaagcat caacaHtaga agugga贴 540 gagactacag ttagaagagc taatagagtg ctaagtgatg cactc&aaag amcccaagg 600 atagalatac caaagatLgo tagatctta tatgaaclat ttgaacaaa^ agtgtactac 660 agaagtttat tcattgagta cggaaaagct tlaggctcat cltcaacagg aa^caaagca 720 gaaagtttgt tt£taaatat atttatgcaa gcttatggag ctggccaaac acigctaagg 780 tggSStgtca ttgcccgalc atccaacaac ataatgctag ggcaigtatc tgtgcaatct 840 g挞ttgaagc aagttacaga ggtttatgac tiggtga辟g aaateggtcc tgaatctggg 900 cttttacatc taagacaaag tccaaasgca gggctgttat cattggcca2 ttgccccaat 960 mgciagtg ttgttcugs caatgcttca ggtctag^ra taatcggaat £tacagaggg 1020 agagtaccaa acacagagct atttrctgca gcagaaagtt atgccagaag cttaaaagaa 10S0 agcaataaaa tcaacttcic ctcgttaggg ctiacsgatg aagaaaaaga agctgcagaa 1140 cacucttaa acatgagtgg tgacaatcaa aatgatlatg agtaa 1185 <210>77 <211>1L85
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <4〇Q>77 stgtctcttc aagggattca cctaagtgst ctgtcatata aacatgcial atlaaaagag 60 144243-序列表.doc -76- IS 1 1356848
tctcaetaca caalaaaaag agatgtaggc accacaactg cagtgacacc ttcatcattg 120 cagcaagaga ta2cacttrt gigtggagag aticrtiaca ctaaacatac tgattac^aa 180 tatgc^cag asatagggat acaatat2tt tgcacagccc caggatcaga aagagtacaa 240 cagattttaa gaaattcagg tagtgaggtt caggtggitc laaccaagac aiaocuta 300 gggaaaggia aaaaia^caa aggggaagag ttgcaaiagt ragstataca tggagrggaa 360 aagagttggg tagaagaaat agacaasgag gcaagaa^a caatggtgac tttgcta^g 420 gaatcatcag gcaacatccc acaaaaccag aggccttcag caccagacac accsataatt 480 ttartgtgtg taggigcttt aatattcact aaactagcat cascaataga agtiggacta 540 gagactacag ttagaagggc taacagagtg ttaagtgatg cgacaaaag ataccctagg 600 gtsgaiatac caaagattgc tagatctttt tatgaactat ttgegce^ia agtgtattac 660 aggagtctat tcattgagta tg&gaaagct tiaggctcai cUcaacagg aagcaaagca 720 gaaagtttgr trgtaaatat atttatgcaa gcttatggag ccggtcagac aatgctaagg 780 tgiggtgtca ttgccagatc atctaac^c ataatgctag ggcatgtatc Egtgcaagct 840 gaattgaiiac aagttacaga ggtttatgat ttggiaagag aaatgggicc tgaataggg 9(X) cttttacaic taaga:aaag tccaaaggca ggactgttat cgttggctaa ttgccccaat 960 tugctagtg ttgttcugg taatgcttca ggtctaggta taatcggaat giacagggga 1020 agagtgccaa acacagsgct attttctgca gcagaaagtt acgccag2ag cttaaaagaa 1080 agcaacaaaa tcaacuctc ctcattaggg ctcacagacg aagaaaaaga agctgcagaa 1140 cactcclta2 acatgagtga tgacaatcaa gatgattatg agtaa 1185
<21C>7B <211>294 <212>蛋白質 ^^^人類間質肺病毒 <400> 78
Mel Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asp De Leu Phe Met Giy Asn Glu AJa 1 S 10 15 AJa Lys Leu Ala Glu Ala Phe Gh Lys Ser Leu Arg Lys Pro Gly His 20 25 30
Lys Axg Ser Gin Ser De He Gly Glu Lys Val Asn Tkr Val Ser Glu 35 40 45
Thr Leu Glu Leu Pro Thr He Ser Aig Pro Ala Lys Pro Thr lie Pro 50 55 60
Ser Glu Pro Lys Leu Ala Trp Thr Asp Lys Gly Gly Ala Thr Lys Thr 65 70 75 80
Glu lie Lys Gin Ala De Lys Va! Met Asp Pro He Glu Glu Glu Glu 85 90 95
Ser Thr Glu Lys Lys Val Leu Pro Ser Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ala 100 105 110
Glu Lys Lys Leu Lys Pro Ser Thr Asa Thr Lys Lys Lys Val Ser Phe 115 120 125
Thr Pro Asn Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Glu Lys Asp Ala Leu 130 135 MO
Asp Leu Leu Ser Asp Asn Glu Glu Glu Asp Ala Glu Ser Sex lie Lea 145 150 155 160
Thr Phe Glu Glu Arg Asp Thr Ser Ser Leu Ser He Giu Ala Arg Leu 165 170 175
Glu Ser lie Giu Glu Lys Leu Ser Met lie Leu Gly Leu Leu Arg Thr 180 185 190 L^u Asn He Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly He Arg 195 200 205
Asp Ala Met lie Gly Val Arg GSu Glu Leu He Ala Asp lie De Lys 210 215 220 -77- 144243·序列表.doc 1356848
Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu Met Met Glu Glu Glu Met Ser Gb 225 230 235 240
Arg Ser Lys He Gly Asn Gly Ser Val Ly$ Leu Thr Glu Lys Ala Lys 245 250 255
Giu Leu Asn Lys lie Val Glu Asp Glu Ser Thr Ser G】y Gk Ser Glu 260 265 270 G]u Glu Glu Glu Pro Lys Asp Thr Gin Asp Asn Ser Gin Qu Asp Asp 275 280 285 lie Tyr Gin Leu lie Met 290 <210>79 <2I1>294 <212>蛋白質
<213>人類間質肺病毒 <400>79
Met Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asp De Leu Phe Met Gly Asn Glu A3a 15 10 15
Ala Lys Leu Ala Glu Ala Fhe Gin Lys Ser Lea Arg Lys Pro Asa His 20 25 30
Lys Arg Ser Gin Ser De De Gly Glu Lys VaJ Asn Thr Val Ser Glu 35 40 45 .
Thr Leu Glu Leu Pro Thr lie Ser Aig Pro Thr Lys Pro Thr He Leu 50 55 60
Ser Glu Pro Lys Leu Ala Tip Thr Asp Lys Gly Gly Ala lie Lys Thr 65 70 75 80
Glu Ala Lys Gin Thr lie Lys Val Met Asp Pro lie Glu Glu Glu Glu 85 90 95
Phe Thr Glu Lys Arg Va] Leu Pro Scr Ssr Asp Gly Lys Thx Pro Ala 100 105 110
Glu Lys Lys Leu Lys Pro Scr Thr Asn Thr Lys Lys Lys Val Ser Fte 115 120 125
Thr Pro Asn Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Glu Lys Asp Ala Leu 130 135 140
Asp Leu Leu Ser Asp Ain Glu Glu Glu A.sp Ala Glu Ser Ser De Leu 145 150 155 160
Thr Rie Glu Glu Arg Asp Thr Ser Ser Leu Ser He Glu Ala Ar〇 Leu 165 170 175
Glu Ser lie Gu Glu Lys Leu Ser Mel He Leu Gly Leu Leu Arg Thr 180 185 190
Leu Asn De Ala Thr Aia Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly 11c Arg 195 200 205
Asp Ala Met lie Gly He Arg Glu Glu Leu He Ala Asp lie lie Lys 210 215 220
Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu Met Met Glu Glu CHu Met Asn Gin 225 230 235 240
Arg Thr Lys lie Gly Asn Gly Ser Val Lys Leu Thr Glu Lys Ala Lys 245 250 255
Glu Leu Asn Lys De Val Glu Asp Glu Ser Thr Ser Gly Glu Sa Glu 260 265 270
Glu Glu Giu Glu Pro Lys Asp Thr Gin G!u Asn Asn Gin Qu Asp Asp 275 280 285 144243-序列表.doc • 78 · [S ] 1356848
IlcTyrGlnLeuDeMet 290 <210>80 <211>294 <2I2>蛋白質 ' <2I3>人類間質肺病毒 <400>80
Met Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asp He Leu Phe Met Giy Asn GIu Ala 15 10 15
Ala Lys lie Ala Gla AJa Phe Gin Lys Ser Leu Lys Lys Ser Gly His 20 25 30
Lys Arg Thr Gin Ser De Val Gly Glu Lys Val Asn Thr lie Ser GIu 35 40 45
Thr Leu Glu Leu Rro Thr He Ser Lys Pro Ala Arg Ser Ser TTj* Leu 50 55 60
Leu Gla Pro Lys Lea Ala Trp Ala Asp Asn Ser Gly De Thr Lys De 65 70 75 80
Thr Glu Lys Pro Ala Thr Lys Thr Thr Asp Pro Val GIu Glu Glu Glu 85 90 95
Hie Asn Glu Lys Lys Val Leu Pro Ser Ser Asp Gly Lys 1¾ Pro Ala 100 105 110
Glu Lys Lys Ser Lys Phe Scr Thr Ser Val Lys Lys Lys Val Ser Phe 115 120 125
Thr Ser Asti Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Giu Lys Asp Ala Leu 130 135 140
Asp Leu Leu Ser Asp Asn Glu Glu Glu Asp Ala Glu Ser Ser lie Leu 145 150 155 160
Thr Eic Glu Glu Lys Asp Thr Scr Scr Leu Scr De Glu Ala Arg Leu 165 170 175
Glu Ser De Glu Glu Lys Lea Ser Met lie Leu Gly Leu Leu Arg Thr 180 185 190
Leu Asn De Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly Dc Arg 195 200 20S
Asp Ala Met lie Gly De Arg Glu Qu Leu He Ala Glu lie lie Lys 210 215 220
Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu Met Met Glu Glu Glu Met Asn Gin 225 230 235 240
Aig Ser Lys He Gly Asn Gly Ser Val Lys Leu Thr Glu Lys Ala Lys 245 250 255
Glu Leu Asn Lys lie Val Glu Asp Glu Ser Thr Ser Gly Gla Ser Glu 260 265 270
Glu Glu Glu Glu Pro Lys GluTtir Gin Asp Asn Asn Gin Gly Glu Asp 275 280 285
Tic Tyr Gin Leu lie Met 290 <2I0> 81 <211> 294 . <212>蛋白質 ^^人類間質胂病毒 79- 144243-序列表.doc 1356848 <400>81
Met Ser Phe Pro GIu Gly Lys Asp He Leu Phe Met G!y Asn Glu Ala 15 10 15
Ala Lys He Ala Glu Ala Phe Gin Lys Ser Leu Lys Arg Ser Gly His 20 25 30
Lys Arg Thr Gb Scr De Val Gly Giu Lys VaJ Asn Hit He Ser Glu 35 40 45
Thr Leu Glu Leu Pro Thr He So: Lys fto Ala Arg Ser Scr Thr Leu 50 55 60
Leax Glu Pro Lys Leu Ala Ttp Ala Asp Ser Ser Giy Ala Tht Lys Thr 65 70 75 SO
Thr Glu Lys Gin Thr Thr Lys Thr Thr Asp Pro Val Glu Glu Glu Glu 85 90 95
Leu Asn Glu Lys Lys Vsl Ser Pro Ser Ser Asp Gly Lys Thr Pro Ala ]〇0 105 no
Glu Lys Lvs Ser Lys Ser Thr Asn Val Lys Lys Lys Val Ser Phe 115 120 125
Thr Ser Asn Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Glu Lys Asp Ala Leu 130 135 140
Asp Leu Leu Ser Asp Asn Glu Glu Glu Asp Ala Glu Ser Scr Re Leu 145 150 155 160
Thr Phe Ghi Glu Arg Asp Thr Ser Ser Leu Ser He Glu AJa Arg Leu 165 丨70 175
Glu Ser lie Glu Glu Lys Leu Ser Met He Leu Gly Leu Leu Arg TTir 180 185 190
Leu Asn lie AJa Thr Ala Gly Pro Tor Ala Ala Arg Asp Gly lie Arg 195 200 205
Asp Ala Met He Giy Ik Arg Glu Glu Leu He Ala Glu lie Be Lys 210 215 220
Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu Met Mei Glu Glu Glu Met Asn Gin 225 230 235 240
Arg Ser Lys lie Gly Asn Gly Ser Val Lys Leu Thr Glu Lys Ala Lys 245 250 255
Glu Leu Asn Lys De Vai Glu Asp Glu Ser Thr Ser Giy Glu Ser Glu 260 265 270
Giu Glu Giu Giu Pro Lys Glu Thr Gin Asp Asn Asn Gin Gly Glu Asp 275 280 285 lie Tyr Gta Leu He Met 290
<210> 82 <2L1>885 <212> DMA <213>人類間質肺病毒 <400> 82 atgtcaucc ctgaaggaaa agaiauca ttcargggta atgaagcagc asaatiagca gaagcttxc agaaatcatt aagaaaacca ggtcataaaa gatctcaatc tattatagga 120 gaaaaagtga at^tgtatc agaaacattg gaanaccia ctatcagtag acctgcaaa2 1¾) ccaaccaiac cgccagaacc aaaguagca tggacagata aaggcggggc aac^aaaci 240 gaaataaagc aagcaatcaa agtcatggal cccattgaag aagaagagic taccgagaag 300 aaggtgctac ccxccagiga tgggaaaacc ccigcagaaa agaaactgaa accatcaac! 360 144243·序列表.doc •80- IS1 1356848 aacaccaaaa agaaggtnc attiacacca aatgaaccag ggaaatatac a^gttggaa 420 aaagatgctc tagantgct ctcagataat g£agaa£aag atgcagaatc Itca^tctta 480 acctttgaag aa^agatac ttcaicatta agcaUgagg ccagattgga 2tcaatagag 540 gagaaattaa gcatgatait agggctatta agaacactca acattgciac agcaggaccc ^)0 2〇a£cagcaa gagatgggat cagagatgca atgatiggcg taagagagga auaatagca 660 gacataat2a aggaagctaa agegaaagca scagaaatga tgga^agga aatgagtcaa 720 cgatcaaaaa taggaasigg ugigtaaaa ttaacsgaaa aa^caaaaga gctca2caaa 780 attgctgaag at£aa5gcac aagtggagaa tccgaagaag aagaagaacc aaaagacaca 840 caagacaata g：caagaaga cgacamac cs£〇aaua t£tag 885 <210> 83 <211>885 <212> DNA . <2]3>人類簡赀肺病毒 <400>83
atgtcattcc ctgaaggaaa agatactcu ttcatgggia atgaagcagc aaaattggca 60 gaagctcttc aaaaatcstt aagaaaaccc aatcataaaa gatctcaatc tatratagga 120 gaaaaagtga acactgiatc tgaaacat^ gaatiaccla ctatcaglag acctaccaaa 180 ccgaccatat tgtcagagcc gsagttagc^ tggacagaca aaggt^ggc aatcaaaact 240 gaagcaaagc aaacaatcaa agciafegat cctaitgaag aagaagagtt tactgagaaa 300 sg£gtgctgc cctccagiga tgggaaaact cctgcagaaa agaagttgaa accaicaacc 360 aacactaaaa agaaggtctc attiacacca aatgaaccag gaaaatacac aaagttggag 420 aaagatgctc tagacttgct ncagacaat gaaga^aag atgcagaatc cjcaatctta 480 accttcgaag aaagagatac itcatcatta agcattgaag ccagactaga alcgaltgag 540 gagaaattaa gcaigatatt agggctaua agaacactca acattgctac agcaggaccc 6CH3 acagcagcaa gagatgggat cagagatgca atgattggca taagggagga actaatagca 660 gacataai^. aagaagccaa gggaaaagca gcagaaaiga ^gaagaaga afitgaaccog 720 cggacaaaaa taggaaacgg tagtgtam ttaactgaaa aggcaaagga gctcaacaaa 7¾) attgttgaag acgaaagcac aagtggtgaa ^cgaagaag aagaagaacc aaaagacaca 840 ceggaaaata atcaagaaga vgacatuac cagttaana tgtag 885
<210>84 <231> 885 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <4〇〇>84 atgtcattcc ctgsaggaaa ggataccctg ricstgggta atgaagcagc asasatagcc 50 gaagctttcc aga^tcact gaaaaaatca ggtcacaaga gaactcaatc lattgtasgg 120 gaaaaagtta acactaiaic agaaacicta gaacteccia ccaicagcES acctgcacga ISO tcatctacac tgctggaacc aaaattggca tgggcagaca acagcggaat cacc^iaatc 240 acagaaaaac cagcaacaa aacaacagat cctgttg&ag a&gagga&tt ca£t£aaaag 300 aaagtgttac cttccag^a cggga^act cctgcagaga aaaaatcaas-gtmcaacc 360 a£tgtaaaaa agaaagtac cttiacatca aatgaaccag ggaaatacac caaaciagag 420 aaagatgccc tagaittgct ctcagacaal gaggaagaag acgc^aatc ctcaatccta 480 actTtgagg agaaagatac atc^cacta agcattsaag ctag2ctaga atctatagaa 540 gagaagttga gcatgatatt aggactgctt cgt^ractla acattgcaac agcaggacca 6(X3 acagctgcac gagatggaat tagggatgca atgattggia taagagaaga gcraatagca 660 gagataatta aggaagccaa gggaaaagca gctgaaatga tggaagaaga gatgaatcaa 72) agatcaaaaa taggaaatgg cagtgtaaaa ctaaccsaga aggcsaaaga gctcaacaaa 780 attgttgaag acgagagcac aagcggtgaa tcagaagaag aagaagaacc aaaagaaact 840 caggataaca atcaaggaga agacacuat cagttaatca ^tag 885 -81 - 144243-序列表.doc 1356848
<210> 85 <211>885 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400>85
atgtcattcc ctgaaggaaa agatatcctg ttcatgggta atgaagcagc aaaaata〇ca 60 gaagctttcc apa2tcact aaaaagatca ggtcacaaaa gaacccagtc attgtaggg 120 gaaaaagtaa acaccatatc agaaactcta gagctaccta ccatcagcaa acctgcscga 180 tcatctacac tgctagagcc aaaattggca tgggcagaca gcagcggagc cacxaaaacc-240 acagaaaaac aaacaaccaa aacaacagat cctgttgaag aagaggaact caaigaaaag 3(X) aaggiatcac cticcagtga tgggaagact ccticagaga aaaaatcaaa atctccaacc 360 aatgtaaaaa agaaagtttc cttcacatca aatgaaccag ggaaatatac t扯actagaa 420 aaagatgccc tagatttgct ctcagacaat gaggaagaag acgcagagtc ctcaatccia 480 acctttgaag agagagacac atcatcacta agcattgaggctagactaga atcaatagaa 540 gagaagctaa gcatgatatt aggactgcti cgiacactta acattgcaac agcaggacca 600 acggctgcaa gggatggaat cagagatgca atgattggta taagagaaga actaatagca 660 gaaataataa aagaagcaaa gggaaaagca gccgaaatga tggaagagga aatgaatcaa 720 aggtcaaaaa taggiaatgg cagtgtaaaa ctaaccgaga aggcaaaaga acttaataaa 780 atfettgaag acgagagcac aagtggtgaa tcagaagaag aagaagaacc aaaagaaact 840 caggataaca atcaaggaga agatatctac cagttaatca tgtag 885 <210> 86 <211> 183 <212>杳白質 人類間質肺病毒 <4(X)> 86
Met He Thr Leu Asp Val He Lys Ser Asp Gly Ser Ser Lys Thr Cys 1 5 10 15
Thr His Leu Lys Lys lie He Lys Asp His Ser Gly Lys Val Leu De 20 25 30
Val Leu Lys Leu lie Leu Ala Leu Leu Thr Phe Leu Thr Va! Thr ne 35 40 45
Thr He Asn Tyr lie Lys Val Gla Asn Asn Leu Gin lie Cys Gin Ser 50 55 60
Lys Tnr Glu Ser Asp Lys Lys Asp Ser Ser Ser Asn Thr Thr Ser Val 65 70 75 80
Thr Lys Thr Thr Leu Asn His Asp lie Thr Glr: Tyr Phe Lys Ser 85 90 95
Leu lie Gin Arg Tyr TT)r Asn Ser Ala lie Asn Ser Asp Thr Cys Trp 100 105 110
Lys He Asn Arg Asn Gin Cys Thr Asn De Tnr Thr Tyr Lys Phe Lea 115 120 125
Cys Phe Lys Ser Glu Asp Tnr Lys Thr Asn Asn Cys Asp Lys Leu Tnr 130 135 140
Asp Leu Cys Arg Asn Lys Pro Lys Pro Ala Val Gly Val Tyr His lie 145 150 155 160
Val Glu Cys His Cys fle Tyr Thr Val Lys Tip Lys Cys Tyr His Tyr 165 170 175
Pro Thr Asp Glu Thr Gin Ser 180 144243-序列表.doc 82- IS ] 1356848 <2!0>87 <211> 179 蛋白質 ^&人類間質肺病毒 · <CO>87
Met lie Thr Leu Asp Val lie Ser Asp Gly Ser Ser Ly$ Thr Cys 1 5 10 15
Thr His Leu Lys Lys De De Lys Asp His Ser Gly Lys Va] Leu He 20 25 30
Ala Leu Lys Leu De Leu Ala Leu Leu Thr Pfce Phe Thr De Thr He 35 40 45
Thr Tit Asn Tyr Ee Lys Vai Glu Asa Asn Leu Gin lie Cys Gin Ser 50 55 60
Lys Thr Gla Ser Asp Lys Glu Asp Ser Pro Ser A^n Thr Thr Scr Vai 65 70 75 80
Thr Thr Lys Thr Thr Leu Asp ffi$ Asp De Thr GLn Tyr Phe Lys Arg 85 90 95
Leu Ee Gin Arg Tyr Thr Asp Ser Vai lie Asn Lys Asp Thr Cys Trp 100 105 1J0
Lys lie Ser Arg Asn Gla Cys Thr Asn He Thr Thr Tyr Lys Phe Leti 115 120 125
Cys Phe Lys Pro Glu Asp Ser Lv^ He Asn Ser Cys Asp Ai^ Leu Thr 130 135 140
Asp Leu Cys Arg Asn Lys Ser Lys Ser Ala Ala Glu Ala Tyr Kis Thr 145 150 155 160
Vai Glu Cys His Cys He Tyr Thr De Glu Trp Lys Cys Tyr His His 165 170 175
Pro lie Asp
<210>88 <2il> 177 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400>88
Met Lys Thr Leu Asp Vai De Lys Ser Asp Gly Ser Ser Glu Thr Cys i 5 10 25
Asa Gb Leu Lys Lys Ik lie Lys Lys His Ser Gly Lys Vai Leu He 20 25 30
Ala Leu Lys Leu lie Leu AJa Leu Leu Thr Phe Phe Thr Ala Thr He 35 40 45
Thr Vai Asa Tyr De Lys Vai Glu Asn Asn Lai Gin Ala Cys Gin IYo 50 55 60
Lys Asn Glu Ser Asp Lys Lys Vai Thr Lys Pro Asn Thr Thr Ser Thr 65 70 75 80
Thr Ue Arg Pro Thr Pro Asp Pro Thr Vai Vai His His Leu Lys Arg 85 90 95
Leu lie Gin Arg His Thr Asn Ser Vai Thr Lys Asp Ser Asp Thr Cys 100 105 ilO
Trp Arg He His Lys Asn Gin Arg Thr Asn He Lys He Tyr Lys Phe 115 120 125 -83- 1442«-序列表.doc 1356848
Leu Cys Ser Gly Phe Thr Asn Ser Lys Gly Thr Asp Qfs Glu Glu ?ro 130 135 140
Thr Ala Leu Cys Asp Lys Lys Leu Lys Tnr He Val Glu Lys His Arg 145 150 155 160
Lys Ala Glu Cys His Cys Leu His Thr Γατ Glu Tip Gly Cys Leu His 】65 170 175
Pro <2 Kb 89 <211>177 <2l2>蛋白質 <^3>人類間質肺病毒 <400> 89
Met Lys Thr Leu Asp Val Us Lys Ser Asp Gly Ser Ser Glu Thr Cys 15 10 15
Asn Gin Leu Lys Lys De He Lys Lys His Ser Gly Lys Leu Leu De 20 25 30
Ala Leu Lys Leu lie Leu Ala Ua Len Thr Phe Phe Thr Val Thr He 35 40 45
Tar Val Asn Tyr He Lys Val Glu Asn Asn Leu Gin Ala Cys Gin Leu 50 55 60
Lys Asn Glu Scr Asp Lys Lys Asp Hr Lys Leu Asn Thr Thr Ser Thr 65 70 75 80
Thr He Arg Pro lie Pro Asp Leu Asn Ala Val dn Tyr Leu Lys Axg 85 SO 55
Leu He Gta Lys His Thr Asn Phe Val lie Lys Asp Arg Asp Thr Cys 100 105 110
Tip Arg lie His Thr Asn G!n Cys Thr Asn Ue Lys lie Tyr Lys Phe 115 120 125
Leu Cys Phe Gly Phe Met Asn Ser Tnr Asa Ί\ιτ Asp Cys Glu Glu Leu 130* 135 140
TTir Val Leu Cys Asp Lys Lys Ser Lys Thr Met Thr Glu Lys His Arg 145 〗50 155 160
Lys Ala Glu Cys His Cys Leu His Thr Thr Glu Trp Tip Cys Tjt Tyr 165 170 175
Leu
<210>90 <2U> 552 <222>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>90 atgataacat tagatgteae taaa^tgat gggtcttcas aaaca;gtac tcaccicaaa 60 aaaataatla aagaccactc tggtaaagtg cttaUgtac ttaagttaat attageota 120 cc2acatttc icaczgmc aatc^catc aattacataa aagigsaaaa caatctgcaa 180 aiatgccagt caaa&actga atcagacaaa aaggacicat catcaaatac cgcatcagtc 240 acaaccaaga ciactctaaa tealgatate acacagm tiaaaagttt gaticaaagg 300 tatacaaaci: crgcaataas cagtgacaca igctggaaaa taaacagaaa tcaatgcaca 3® 144243·序列表.doc -84- [S ] 1356848 aatataacaacatacaaati Utatgtttt aaatctgaag acacaa2aac caacaattgt420 gataaactga cagatttatg cagaaacaaa cca2aaccag cagttggagt giatcacata 4S0 gtagaatgcc atigtatata cacagttaaa tggaagtga atcattaccc aaccgaigaa 540 acccaatai aa 552
<210> 91 <211>540 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400〉 91
atgataacat lagatetcat taaaa£tgat gggtcttcaa aaacatgtac tcacctcaaa 60 aaaatsatca aagaccattc tggtaaagtg cttattgcac ttaagttaat attagcttta 120 oaacami【cacaaiaac aatcactata aattaca【S2 aagiagaaaacaatctacaa 180 atatgccagt caaaaactga atcagacaaa gaagactcac catcaaatac cacatccgtc 240 acaaccaaga ctactctaga ccatgatata acacagtatt rtaaaasatt aaitcaaagg 300 . tatacagatt dgtgataaa caaggacaca t^tggaaaa taagcagaaa tcaatgcaca 360 aatataacsa catataaatt tttatgcitt asacctgagg actcaaaaat caacagttgt 420 gatagactga cagatctatg cagaaacaaa tmsatcag cagctgaagc atatcai2ca480 gtagaatgcc aagcaiata cacaaugag tggaagtgct atcaccaccc aaiagattaa 540 <210> 92 <211>534
<212>DNA <2】3>人類pq質肺病毒 <400>92
atgaaaacat tagatgtcat aaaaagtgat ggatcctcag aaacgtgtaa tcaacicaaa 60 aaaataataa aaaaacactc aggtaaagtg cttattgcac taaaactgat attggccita 120 ctgacatttt tcacagcaac aatcactgtc aactatataa aagtagaaaa caatttgcag 180 gcargtcaac caaaaaatga atcagacaaa aaggtcacaa agccaaatac cacatcaaca 240 acaatcagac ccacacccga iccaaagta gtacatcatt tgaaaaggct gattcagaga 300 cacaccaact ctgtcacaaa agacagcgat acttgttgga gaatacacaa gaatcaacgt 360 acaaatataa aaatatacaa gcicttatgc ictgggttca caaattcaaa aggtacagat 420 tgtgaggaac caacagccct atgcgacaaa aaguaaaaa ccatagtaga aaaacataga480 aaagcagaat gtcactgtct acatacaacc gagtgggggt gccttcatccctaa 534
<210>93 <211>534 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <4〇〇>93 atgaaaacattagatgfcat aaaaagtgat ggaicctcag aaacatgtaa tcaactcaaa 60 aaaataataa aaaaacactc aggtaaattgcttatigcat taaaactgat attggccita 120 tLgacgtttt tcacagtaac aattactgtt aactatataa aa£t2£aaaa caatugcag 180 gcatgtcaat taaaaaatga atcagacaaa aaggacacaa agctaaatac cacatcaaca 240 acaatc^ac ccaitcctga tctaaatgca gtacagtact igaaaaggct gattcagaaa 3(X) cacaccaact ttgtcataaa agacagagat acctgitgga gaatacacac gaaicaatgc 360 acaaatataa aaatatataa gttctiatgt ttcgggttta tgaattcaac aaatacagac 420 tgtgaagaac taacagtttt atgtgataaa aagtcaaaaa ccatgacaga aaaacatagg 480 aaagcagagt gtcactgtct ^atacaacc gagtggiggt gttattatct ctaa 534 • 85 - 144243-序列表.doc

Claims (1)

  1. 七、申請專 7—^曰修(更)# 慕母8137418號專利申請案 申請專月) 公告本 1. 一種嵌合型重組第3型牛副流感病毒（bPIV3)/第3型人類 副流感病秦（hPIV3)，其中該病毒包括： (i) 編碼bPIV3之N、P、Μ及L基因的核甞酸序列； (ii) 編碼hPIV3之F及ΗΝ基因的核苷酸序列，該核苷酸 序列係插入病毒基因組以取代編碼bPIV3之F及HN 基因的核苷酸序列，其中該hPIV3核苷酸序列係位於 編碼Μ蛋白質之bPIV3核苷酸序列及編碼L蛋白質 之bPIV3核苷酸序列之間；及 (iii) 異源核苷酸序列，其中該異源核苷酸序列包括編 碼呼吸道融合細胞病毒（RSV)多肽之核普酸序列， 其中該異源序列係插入在位置1或2。 2. 如請求項1之病毒，其中該病毒包括編碼hPIV3之F及HN 基因的核苷酸序列，該核苷酸序列係插入bPIV3基因組 之核苷酸位置5041及8529間，以取代編碼>PIV3之F及 HN基因的核苷酸序列。 3. 如請求項1或2之病毒，其中該RSV多肽係為RSV F蛋白 質、RSV G蛋白質或RSV F蛋白質之可溶性外部功能部 位。 4. 如請求項3之病毒，該異源序列係插入在1774核苷酸位 置。 5. 如請求項3之病毒，其中該hPIV3係hPIV3/Tex/ 12084/1983 。 6. 如請求項1或2之病毒，其中該異源核苷酸序列進一步包 144243-1000926.doc 1356848 括bPIV N基因終止/N基因起始區域，其中該N基因起始 序列與該N轉譯起始密碼子間之距離為10個核苷酸。 7. 如請求項6之病毒，其t該RSV多肽之編碼序列之終點與 該N基因起始序列間之距離為65個核苷酸。 8. 如請求項1或2之病毒，其中該異源核苷酸序列進一步包 括bPIV N-P基因起始/終止區域，其中該P基因起始序列 與該N轉譯起始密碼子間之距離為83個核苷酸。 9. 如請求項8之病毒，其中該RSV多肽之編碼序列之終點與 該P基因起始序列間之距離為94個核苷酸。 10. 如請求項1或2之病毒，其中該異源核苷酸序列進一步包 括bPIV N-P基因起始/終止區域，其中該P基因起始序列 與該P轉譯起始密碼子間之距離為86個核苷酸。 11. 如請求項10之病毒，其中該RSV多肽之編碼序列之終點 與該P基因起始序列間之距離為94個核苷酸。 12. 如請求項1之病毒，其中該bPIV3係為堪薩斯（Kansas)-品 系的牛副流感第3型病毒。 13. —種嵌合型重組第3型牛副流感病毒（bPIV3)/第3型人類 副流感病毒（hPIV3)，其中該病毒包括： (i) 編碼bPIV3之N、P、Μ及L基因的核苷酸序列； (ii) 編碼hPIV3之F及ΗΝ基因的核苷酸序列，該核苷酸 序列係插入病毒基因組以取代編碼bPIV3之F及HN 基因的核苷酸序列，其中該hPIV3核苷酸序列係位 於編碼Μ蛋白質之bPIV3核苷酸序列及編碼L蛋白 質之bPIV3核苷酸序列之間；及 144243-1000926.doc 1356848 (111)異源核苷酸序列，其中該異源核苷酸序列包括編 碼増強的綠螢光蛋白質（eGFP)多肽之核苷酸序列， 其中該異源序列係插入在位置I或2或3或4。 14. 如請求項13之病毒，其中該異源核苷酸序列進一步包括 bPIV N-P基因起始/終止區域。 15. 如請求項丨、2、13或14中任一項之病毒其中該病毒之 基因組包括突變或基因修改。 | 16.如請求項！、2、13或14中任一項之病毒，其中該病毒係 減毒的表現型或具有增強抗原性的表現型。 17. —種重組DNA或RNA分子，其編碼如請求項丨至丨6中任一 項之病毒的基因組。 18. —種疫苗調配物，其包括如請求項1至μ中任一項之重 組病毒及醫藥上可接受之賦形劑。 19. 如請求項18之疫苗調配物，其中該修改或突變係衍生自 天然發生的突變。 • 20. —種免疫原調配物，其包括如請求項1至16中任一項之 重組病毒及醫藥上可接受之賦形劑。 21. 如請求項20之免疫原調配物’其中該修改或突變係衍生 自天然發生的突變。 22. —種如請求項18或19之疫苗調配物的用途，其係用以製 備用於在哺乳動物中治療或預防呼吸道感染之醫藥品。 23. 根據申清專利範圍第22項之用途，其中該呼吸道减染是 RSV感染。 24. 根據申請專利範圍第22項之用途，其中該呼吸道感染是 144243-1000926.doc 1356848 RSV、hPIV感染或其組合β 25. 根據申請專利範圍第22項之用途，其中該哺乳動物是人 類。 26. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該人類個體小於$ 歲。 27. 根據申請專利範圍第25項之用途’其中該人類個體小於2 歲。 ' 28. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該人類個體 呼吸道感染之外的疾病或病況。 29. 根據申請專利範圍第28頊之用途，其中該疾病或病况a 胰囊性纖維變性、白血病、非-霍奇金氏淋巴瘤、氣嘴以 及骨髓移植和腎臟移植》 30. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該個體是免疫& 弱的個體。 31. 根據申請專利範圍第25項之用途，每中該個體是老年 人0 32_ —種如請求項20或21之免疫原調配物的用途’其係用以 製備用於在哺乳動物中治療或預防呼吸道感染之醫藥 品。 I44243-I000926.doc
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