KR20110026528A - 메타뉴모바이러스에서 유래한 이종성 항원을 포함하는 재조합 파라인플루엔자 바이러스 발현 시스템 및 백신 - Google Patents

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로날더스 아드리안스 마리아 포쉬어
베르나데타 제라르다 반 덴 호겐
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Abstract

본 발명은 적절한 숙주세포 시스템에서 이종성 유전자 산물을 발현 및/또는 상기 이종성 유전자 산물을 발현, 패키지, 및/또는 표면에 제시(present)하는 역가닥(negative strand) RNA 재조합 바이러스의 구조(rescue)에 사용될 수 있는 재조합 소 파라인플루엔자 바이러스(bPIV) cDNA 또는 RNA에 관한 것이다. 더 구체적으로 상기 이종성 유전자 산물에는 또 다른 파라인플루엔자 바이러스 종의 유전자 산물 또는 인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움(syncytial) 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 및 조류 뉴모바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는 또 다른 역가닥 RNA 바이러스들의 유전자 산물이 포함된다.
상기 키메라성 바이러스 및 발현 산물들은 폭넓은 범위의 병원균들과 항원들에 대한 백신들을 포함하는 백신 제제에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

메타뉴모바이러스에서 유래한 이종성 항원을 포함하는 재조합 파라인플루엔자 바이러스 발현 시스템 및 백신{RECOMBINANT PARAINFLUENZA VIRUS EXPRESSION SYSTEMS AND VACCINES COMPRISING HETEROLOGOUS ANTIGENS DERIVED FROM METAPNEUMOVIRUS}
본 출원은 2002년 2월 21일에 출원된 미국 가출원 제60/358,934호에 근거한 우선권을 주장하며, 이 주장으로 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
발명자들인 Ronaldus Fouchier, BERNADETTA van den Hoogen, Albertus Osterhaus, Aurelia Haller, 및 Roderick Tang가 같은 날에 출원하여 계류 중인 미국출원 "METAPNEUMOVIRUS STRAINS AND THEIR USE IN VACCINE FORMULATIONS AND AS VECTORS FOR EXPRESSION OF ANTIGENIC SEQUENCES"도 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다.
본 발명은 적절한 숙주 세포 시스템에서 이종성(heterologous) 유전자 프로덕트를 발현시키기 위한 및/또는 이종성 유전자 프로덕트를 발현, 패키지 및/또는 함유하는 역 가닥(negative strand) RNA 재조합 바이러스를 구하기 위한 파라인풀루엔자 바이러스(parainfluenza virus, PIV) cDNA 또는 RNA에 관한 것이다. 특히 본 발명은 이종성 유전자 프로덕트를 발현하는 키메라(chimeric) PIV를 포함하는 백신 제제(preparation)를 포함하는데, 여기에서 이종성 유전자는 바람직하게는 항원성(antigenic) 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 일 실시예에서 본 발명의 PIV 벡터는 동일 또는 다른 바이러스에 의해 코딩될 수도 있는 하나, 둘 또는 셋의 이종성 유전자를 포함한다. 바람직한 실시예에서 이종성 서열은 다른 종의 PIV로부터 또는 예를 들어 인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움(syncytial) 바이러스(RSV), 포유류 호흡기메타뉴모바이러스(metapneumovirus) 및 조류 폐렴바이러스(pneumovirus)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 역 가닥 RNA 바이러스로부터 기인한 항원성 폴리펩타이드인 이종성 유전자 프로덕트를 코딩한다. 본 발명의 백신 제제는 2가(bivalent) 및 3가(trivalent) 백신 제제를 포함하여 다가(multivalent) 백신를 포함한다. 본 발명의 다가 백신은 각각의 이종성 항원성 서열을 발현하는 하나의 PIV 벡터 또는 다른 이종성 항원성 서열을 코딩하는 둘 이상의 PIV 벡터의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 백신 제제는 단독으로 또는 다른 백신, 질병 예방 약품, 또는 치료 약품들과 병용하여 투여될 수 있다.
파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus, PIV) 감염은 유아 및 어린이에 있어 심각한 호흡기관 질병을 야기한다(Tao et AL., 1999, Vaccine 17: 1100-08). 감염성 파라인플루엔자 바이러스 감염은 전 세계적으로 호흡기관 감염으로 고통 받고 있는 입원 소아과 환자의 약 20%에 해당한다(전술 문헌과 동일). 항바이러스 치료는 PIV 관련 질환을 치료하기에 효과적으로 유용하지 않고, PIV 감염을 예방하기 위한 백신은 아직까지 개발되지 않았다.
PIV는 paramyxoviridae과의 respirovirus속(PIV1, PIV3) 또는 rubulavirus속(PIV2, PIV4)의 일종이다. PIV는 (1) 바이러스성 게놈을 포함하고 있는 내부 리보핵산단백질 중심부(ribonucleoprotein core) 또는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)와 (2) 외부의 거친 면을 가진(roughly) 구형 지질단백 외피(envelope)로 구성된 두개의 구조적 모듈로 이루어져 있다. PIV의 게놈은 길이가 약 15,456 뉴클레오타이드이고 8개의 폴리펩타이드를 코딩하고 있는 역 센스 RNA의 단일 가닥으로 구성되어 있다. 이러한 단백질은 뉴클레오캡시드 구조 단백질 (속(genus)에 의존하는 NP, NC, 또는 N), 포스포단백질(phosphoprotein(P)), 매트릭스 단백질(matrix protein(M)), 융합 글리코단백질(fusion glycoprotein(F)), 헤마글루티닌-뉴라미니다제(hemagglutinin-neuraminidase) 글리코단백질(HN), 큰 폴리머라제 단백질(L), and 정체불명의 C와 D 단백질을 포함한다(전술 문헌과 동일).
파라인플루엔자 뉴클레오캡시드 단백질(NP, NC, 또는 N)은 각 단백질 유닛 안에 두개의 도메인을 포함한다. 이러한 도메인은 결집한 뉴클레오캡시드의 표면에 위치한 카복실-말단 도메인과 RNA와 직접적으로 상호작용하고 그 분자의 거의 2/3를 차지하는 아미노-말단 도메인을 포함한다. 힌지(hinge)는 이 두개의 도메인의 연결부위에 존재하여, 그것에 의하여 이러한 단백질에 유연성을 부여된다(Fields et AL. (ed.), 1991, FUNDAMENTAL VIROLOGY, 2nd ed, Raven Press, New York 참조), 이로써 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다. 매트릭스 단백질(M)은 바이러스성 에셈블리에 확실하게 포함되고, 그것은 바이러스 막과 뉴클레오캡시드 단백질과 상호작용한다. 포스포단백질(P)은 인산화되며 전사 조절, 메틸화, 인산화 및 폴리아데닐화에 관련된다. 처음에 불활성 전구체로써 만들어진 융합 글리코단백질(F)는 두개의 디설파이드(disulfide)로 링크된 폴리펩타이드를 생산하기 위하여 번역시 절단된다. 활성 F 단백질은 숙주 세포 플라즈마 막과 바이러스 외피의 융합을 촉진함으로써 숙주 세포 안으로 파리인플루엔자 비리온(virion)의 침투를 촉진하는 곳에서 바이러스 막과 상호작용한다(전술 문헌과 동일). 글리코단백질, 헤마글루티닌-뉴라미니다제(HN)은 외피로부터 튀어 나와 바이러스 위에서 헤마글루티닌과 뮤라미니다제 활성을 부여한다. HN은 HN 단백질을 지질 이중막에 고정시키는 역할을 하는 강한 소수성 아미노 말단(terminus)을 가지고 있다(전술 문헌과 동일). 마지막으로 큰 폴리머라제 단백질(L)은 전사와 복제에 있어 중요한 역할을 한다(전술 문헌과 동일).
소 파라인플루엔자 바이러스는 1959년 쉬핑(shipping) 열 증상을 보이는 송아지로부터 처음 분리되었다. 그 이후로 그것은 정상적인 소, 유산된 태아, 그리고 호흡기 질환의 증상을 보이는 소들로부터 분리되었다(Breker-Klassen et AL., 1996, Can. J. Vet. Res. 60: 228-236. See also Shibuta, 1977, Microbiol. Immunol. 23 (7), 617-628). 인간과 소 PIV3는 명백한 항원성 성질을 보여주는 중화(neutralizing) 에피토프를 공유한다. HN 단백질에 있어 인간과 소 바이러스 주(strain) 사이에 중요한 차이가 존재한다. 사실, 인간 주(strain)가 넓은 범위의 다양한 인간 PIV3에 대한 중화항체를 유도하는 반면, 소 주(strain)는 hPIV 감염에 대하여 몇몇 중화 항체를 유도한다(Van Wyke Coelingh et AL., 1990, J. Virol. 64: 3833-3843).
PIV를 포함하여 모든 역-가닥 RNA 바이러스의 복제는 RNA를 복제하기 위해 필요한 세포적 장치(machinery)의 부재에 의하여 복잡하게 된다. 부가적으로, 역-가닥 게놈은 번역이 발생하기 전에 순(positive)-가닥 (mRNA) 카피로 전사되어야 한다. 결과적으로, 게놈 RNA는 단독으로는 세포 내로 진입 시 필요한 RNA-의존 RNA 폴리머라제를 합성할 수 없다. L, P와 N 단백질이 게놈 RNA와 함께 숙주 세포 내로 진입하여야 한다.
PIV mRNA를 전사하는 대부분 또는 모든 바이러스 단백질은 게놈의 복제 또한 수행할 수 있으리라 가정된다. 단백질의 동일 컴플리먼트(complement)의 대안적 용도(예를 들어 전사 또는 복제)를 조절하는 기전은 아직 명확하게 밝혀지지 않았지만, 그 프로세스는 하나 이상의 뉴클레오캡시드 단백질 자유 형태(free form)가 풍부하게 포함되는 것으로 보인다. 직접적으로 바이러스의 침투 후에, 전사는 주형(template)으로 뉴클레오캡시드 안의 역-센스 RNA를 사용하여 L 단백질에 의하여 개시된다. 바이러스 RNA 합성은 전사 동안에 그것이 단일 시스트론(monocistronic) mRNA를 생산하는 것과 같은 것에 의해 조절된다.
전사 후에, 바이러스 게놈 복제는 역-가닥 RNA 바이러스에 의한 감염에 있어 두 번째로 중요한 사건이다. 다른 역-가닥 RNA 바이러스와 같이, PIV에 있어 바이러스 게놈 복제는 바이러스-특이 단백질에 의해 조정된다. 복제 RNA 합성의 첫 번째 프로덕트는 PIV 게놈 RNA(cRNA)의 상보적인 카피(예를 들어 플러스-극성(plus-polarity))이다. 이러한 플러스-가닥 카피(항-게놈)는 그들의 말단 구조에서 mRNA 전사체와 다르다. mRNA 전사체와는 달리, 항-게놈 cRNA는 5' 말단에서 캡핑되거나 메틸화되지 않고, 3'말단에서 끝이 잘려지거나 폴리아데닐화되지 않는다. cRNA는 그들의 역 가닥 주형과 ㅁ말단을 공유(coterminal)하고 상보적 형태 안의 모든 유전적 정보를 가지고 있다. cRNA는 PIV 역-가닥 바이러스 게놈(vRNA)의 합성을 위한 주형으로 작용한다.
소 파라인플루엔자 바이러스 역 가닥 게놈(vRNA)과 상보게놈(cRNA)는 뉴클레오캡시드 단백질에 의하여 캡시드화 되고, 유일한 비캡시드화 RNA 종은 바이러스 mRNA들이다. bPIV RNA의 복제와 전사는 숙주 세포의 세포질에서 일어난다. 바이러스 구성요소의 조립이 일어나는 곳은 성숙한 바이러스가 출아(budding)에 의하여 방출되는 곳인 숙주 세포막으로 보인다.
PARAMYXOVIRUS
예전부터, 질병의 파괴적인 원인인, 파라믹소바이러스는 매년 세계적으로 많은 동물과 인간 사망의 원인이다. Mononegavirales(역-센스 단일 가닥 RNA 바이러스) 계열인 paramyxoviridae 형태의 과는 Paramyxovirinae와 Pneumovirinae 아과(亞科)로 구성된다. 후바의 서브-과는 현재 분류학적으로 Pneumovirus와 메타뉴모바이러스 속으로 나뉜다(Pringle, 1999, Arch. Virol. 144/2,2065-2070). Pneumovirus 속의 일종인 인간 호흡기 신시티움 바이러스(hRSV)는 전 세계적으로 유아 및 어린이 기간 동안 하부 호흡기관 감염의 유일하게 중요한 원인이다(Domachowske, & Rosenberg, 1999, Clin. Microbio. Rev. 12 (2): 298-309). Pneumovirus 속의 다른 멤버로는 소 및 양 호흡기 신시티움 바이러스와 쥐의 폐렴 바이러스(PVM)가 있다.
과거 수십 년 동안 포유류 질병의 여러 병인학적 인자들이, 특히 호흡기관 질병(RTI), 더 특히 인간에 있어, 확인되어 왔다(Evans, In: Viral Infections of Humans, Epidemiology and Control. 3th ed.(ed. Evans,A.S) 22-28 (Plenum Publishing Corporation, New York, 1989)). 포유류에 있어 RTI의 전통적 병인학적 인자들은 인간(HRSV)과 소 또는 양(BRSV 및/또는 ORSV)과 같은 반추동물에서 발견되는 폐렴바이러스 속에 속하는 호흡기 신시티움 바이러스이다. 역 교차(reciprocal cross) 중화 분석에 있어 인간 RSV 차이 내에서, G 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 면역학적 분석에 있어서 G 단백질의 재활성이 hRSV 항원성 서브 그룹을 규정짓기 위해 사용된다. 서브그룹 간에서는 단지 53% 아미노산 서열 동일이 발견되는 반면에, 서브그룹 내에서 아미노산 서열은 94% (서브그룹 A) 또는 98% (서브그룹 B) 동일성을 보인다. 부가적인 변이성이 모노클로날 항체, RT-PCR 분석 및 RNAse 보호 분석에 기초하여 서브그룹 내에서 관측된다. 양 서브그룹의 바이러스는 전 세계적으로 퍼져있고, 단일 계절 동안 발생할 수도 있다. 감염은 사전에 존재하는 면역의 존재 하에서도 발생할 수 있고, 항원성 변이는 재-감염이 되기 위해서 엄격히 요구되는 것은 아니다(예를 들어 Sullender, 2000, Clinical Microbiology Reviews 13 (1) : 1-15; Collins et al. Fields Virology, ed. B.N. Knipe, Howley, P.M. 1996, Philadelphia: Lippencott-Raven. 1313-1351; Johnson et al., 1987, (Proc Natl Acad Sci USA, 84 (16): 5625-9; Collins, in The Paramyxoviruses, D. W. Kingsbury, Editor. 1991, Plenum Press: New York. p.103-153 참조)
다른 전통적 폐렴바이러스는 일반적으로 실험용 생쥐에서 발견되는 쥐의 폐렴 바이러스(PVM)이다. 그러나 포유류 사이에 관측되는 대부분의 질병이 알려진 병원체 때문이라고 할 수 없다.
RSV 감염
호흡기 신시티움 바이러스(RSV)는 유아와 어린아이에 있어 심각한 하부 호흡기관 질환의 중요한 원인이다(Feigen et al., eds., 1987, In: Textbook of Pediatric Infectious Diseases, WB Saunders, Philadelphia at pages 1653-1675; New Vaccine Development, Establishing Priorities, Vol.1, 1985, National Academy Press, Washington DC at pages 397-409; and Ruuskanen et al., 1993, Curr. Probl. Pediatr. 23: 50-79 참조). RSV 감염의 매년적 전염병적 성질은 전 세계적으로 명백하지만, 주어진 계절에 있어 RSV 질병의 빈도와 심각성은 지역에 따라 다르다(Hall, 1993, Contemp. Pediatr. 10: 92-110). 북반구의 온화한 지역에서는 그것은 일반적으로 늦은 가을에 시작하고 늦은 봄에 끝난다. 주 RSV 감염은 대부분 6주부터 2살까지의 어린이에게서 발생하고, 병원 내 유행 동안 처음 4주까지의 신생아에게서는 일반적이지 않다(Hall et AL., 1979, New Engl. J. Med. 300: 393-396). RSV 감염의 고위험군에 속한 어린이는 조산 신생아(Hall et al., 1979, New Engl. J. Med. 300: 393-396)와 기관지허파 형성장애(Groothuis et al., 1988, Pediatrics 82: 199-203), 울혈성 심장 질병(MacDonald et al., New Engl. J. Med. 307: 397-400), 선천적 또는 후천적 면역결핍증(Ogra et al., 1988, Pediatr. Infect. Dis. J. 7: 246-249; and Pohl et al., 1992, J. Infect. Dis. 165: 166-169), 및 낭포성 섬유증(Abman et al., 1988, J. Pediatr. 113: 826-830)를 가진 어린이가 속하지만, 이에 한정되지 않는다. 심장 또는 폐 질병을 가진, RSV 감염으로 입원한 유아에 있어 사망률은 3%-4%이다(Navas et al., 1992, J. Pediatr. 121: 348-354).
RSV는 신생아와 어린이뿐만 아니라 성인도 감염시킨다. 건강한 성인에 있어 RSV주로 상부 호흡기 질환을 야기한다. 최근 몇몇 성인, 특히 노인에 있어, 전에 보고 되었던 것 보다 더 자주 징후적인 RSV 감염을 가진다는 것이 명백해 졌다(Evans, A. S., EDS., 1989, Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control, 3rd ED., Plenum Medical Book, New York at pages 525-544). 몇몇 전염병이 집에 거주하는 환자와 공공시설의 젊은 성인들 사이에서도 보고 되었다(Falsey, A.R., 1991, Infect. Control Hosp. EPIDEMIOL. 12: 602-608; and Garvie et al., 1980, Br. Med. J. 281: 1253-1254). 마지막으로, RSV는 면역억제 환자, 특히 골수 이식 환자에서 심각한 질환을 야기할 수 있다(Hertz et al. , 1989, Medicine 68: 269-281).
확인된 RSV 질병을 위한 치료방법은 제한적이다. 하부 호흡기의 심각한 RSV 질환은 종종 가습된 산소투여와 호흡보조기를 포함하는 상당한 보조적 케어를 필요로 한다(Fields et al., eds, 1990, Fields Virology, 2nd ed., Vol.1, Raven Press, New York at pages 1045-1072).
백신이 RSV 감염 및/또는 RSV-관련 질환을 막을 수도 있다고 생각되지만, 아직가지 허가된 백신은 없다. 백신개발에 있어 주된 장해요소는 안전성이다. 비록 면역원성이 있지만, 포르말린-불활성화된 백신은 기대와 달리 유사하게 제조된 3가 파라인플루엔자 백신으로 면역된 경우보다 그 백신으로 면역된 신생아에서 하부 호흡기 질환의 높고 더 심각한 발생을 야기하였다(Kim et al., 1969, Am. J. EPIDEMIOL. 89: 422-434; and Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 405-421). 여러 RSV 백신 후보들이 폐기되고 다른 것들이 개발 중이다(Murphy et al., 1994, Virus Res. 32: 13-36). 하지만, 안전성 문제가 해결될 지라도, 백신의 효율성 또한 개선되어야 한다. 많은 문제점들이 해결되어야 한다. 하부 호흡기 질병의 최고 발생이 2-5개월 사이에 발생하기 때문에 신생아기 초반에 면역화가 이루어져야 한다. 어머니로부터 획득한 RSV 항체의 높은 함량과 신생아 면역 반응의 불성숙성이 신생아기에 있어 백신의 면역원성을 줄이리라 예상된다(Murphy et al., 1988, J. Virol. 62: 3907-3910; and Murphy et al., 1991, Vaccine 9: 185-189). 마지막으로 주 RSV 감염과 질환은 연속적인 RSV 질환으로부터 잘 보호되지 않는다(Henderson et al., 1979, New Engl. J. Med. 300: 530-534).
최근에, RSV 질환의 예방에 대한 유일한 승인된 방법은 수동 면역이다. IgG의 보호적 역할을 제시한 초기의 증거들이 페렛(ferret)의 모성 항체(Prince, G.A., Ph. D. diss., University of California, Los Angeles, 1975)과 인간의 모성 항체(Lambrecht et al, 1976, J. Infect. Dis. 134: 211-217; and Glezen et al., 1981, J. Pediatr. 98: 708-715)를 포함하는 관측들로부터 얻어졌다. Hemming et al.(Morell et al., eds., 1986, Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins, Academic Press, London at pages 285-294)은 신생아 패혈증을 가진 것으로 의심되는 신생아에 있어 정맥 면역 글로블린(IVIG)의 약물동태를 포함하는 연구에 있어 RSV 감염의 치료 또는 예방에 RSV 항체가 유용하게 이용될 수 있음을 인식하였다. 이 연구에서, 그의 호흡기 분비물에 RSV가 포함된 한 명의 신생아가 IVIG 주입 후에 빠르게 회복되었다. IVIG 롯트의 계속적 분석이 RSV 중화 항체의 비정상적으로 높은 역가(titer)를 보여주었다. 이 그룹의 연구자들은 그 후 RSV 감염에 대항하여 중남미 들쥐(cotton rat)와 영장류를 보호하기 위하여 RSV 중화 항체가 풍부한 면역 글로블린 또는 고면역 혈청의 가능성을 시험하였다(Prince et al., 1985, Virus Res. 3: 193-206; Prince et al., 1990, J. Virol. 64: 3091-3092; Hemming et al., 1985, J. Infect. Dis. 152: 1083-1087; Prince et al., 1983, Infect. Immun. 42: 81-87; and Prince et al., 1985, J. Virol. 55: 517-520). 이러한 연구의 결과는 IVIG가 RSV 감염을 예방하는데 사용될 수도 있음을 보여주었다. 게다가 RSV-관련 장애를 치료 또는 예방할 수 있음을 보여주었다.
최근의 임상 연구는 고 위험의 어린이를 심각한 하부 호흡기 감염으로부터 보호하기 위한 이러한 수동적 투여 RSV 고면역 글로블린(RSV IVIG)의 능력을 보여주었다(Groothius et al., 1993, New Engl. J. Med. 329: 1524-1530; and The PREVENT Study Group, 1997, Pediatrics 99: 93-99). 이러한 것은 RSV 감염의 예방에 있어 큰 진전이지만, 이러한 치료는 넓은 사용에 있어서는 일정 제한이 있다. 먼저 RSV IVIG는 효과적 투여량에 도달하기 위하여는 몇 시간 동안 정맥으로 주입되어야 한다. 둘째, 고면역 글로블린의 활성 물질 농도는 고 위험군의 심폐 기능을 포함하는 성인 또는 어린이를 치료하기에는 충분하지 않다. 셋째, 정맥 내 주입은 RSV 시즌 동안 매달 병원을 방문해야 하는 불편함이 있다. 마지막으로, 그것은 그러한 프로덕트를 위해 필요한 RSV의 고 면역 글로블린을 제조하기 위한 충분한 공여자를 확보하는 것이 어렵다고 판명될 수 있다. 현재, 정상 공여자의 약 8% 만이 고 면역 글로블린의 제조를 위해 충분한 RSV 중화 항체 역가를 가진다.
면역글로블린의 특이 활성을 개선하기 위한 한 가지 방법은 한 가지 이상의 고 능력 RSV 중화 모노클로날 항체(MAbs)를 개발하는 것이다. 그러한 MAbs는 RSV 시즌을 통하여 반복 투여가 요구되어 질 수 있기 때문에 바람직한 약물동태를 가지고, 인간 항-쥐 항체 반응을 생성하는 것을 피하기 위하여 인간으로부터의 또는 인간화된 것이어야 한다. RSV 표면 위의 두개의 글리코단백질, F와 G,이 중화 항체의 타겟으로 알려졌다(Fields et al., 1990, supra; and Murphy et al., 1994, supra).
RSV의 F 단백질의 A 항원 사이트 안의 에피토프에 직접적으로 작용하는 인간화된 항체, SYNAGIS(등록상표)는 RSV 시즌 동안(북반구에서는 11월부터 4월) 체중 1 kg 당 15mg의 매달 투여량으로 RSV에 의한 심각한 하부 호흡기 질병의 예방을 위해 소아과 환자에게 정맥투여하는 것으로 승인받았다. SYNAGIS는 인간(95%)과 쥐(5%) 항체 서열의 복합물이다. 이는 Johnson et al., 1997, J. Infect. Diseases 176: 1215-1224 and U.S. Patent No. 5,824,307를 참조하기 바라며, 이로써 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다. 인간 중쇄(heavy chain) 서열은 Cor(Press et al., 1970, BIOCHEM. J. 117: 641-660)와 Cess(Takashi et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 194-198)의 VH 유전자의 다양한 framework 지역과 인간 IgG1의 고정 도메인으로부터 유래되었다. 인간 경쇄(light chain) 서열은 C의 고정 도메인과 J-4를 가진 VL 유전자 K104의 다양한 framework 지역(Bentley et al., 1980, Nature 288: 5194-5198)으로부터 유래되었다. 쥐 모노클로날 항체, Mab 1129(Beeler et al., 1989, J. Virology 63: 2941-2950)로부터 인간 항체 framework로 쥐의 상보적 중요 지역을 이식하려는 과정 중에 쥐 서열이 유래하였다.
조류 뉴모바이러스
조류 뉴모바이러스(avian pneumovirus, APV) (혹은 조류 폐렴바이러스)로부터 기인한 호흡기 질환은 처음에 1970년대 후반에 남아프리카에서 개시되었다(Buys et al., 1980, Turkey 28: 36-46). 그곳에서 칠면조 산업에 재앙적인 영향을 끼쳤다. 칠면조 질병은 정맥두염(sinusitis)과 비염(rhinitis)에 의하여 특징 지워졌고 칠면조 리노트라케이티스(rhinotracheitis(TRT))라 명명되었다. 유럽의 APV 분리물은 닭에 있어 부푼 머리 증후군(swollen head syndrome(SHS))의 요인으로 강력히 예상되었다(O'Brien, 1985, Vet. Rec. 117: 619-620). 원래, 그 질병은 뉴캐슬 질병 바이러스(NDV)으로 감염된 사육 닭 무리에서 나타나고 뉴캐슬 질병(ND)과 관련된 2차적인 문제로 추측되었다. 유럽 APV에 대한 항체는 SHS의 발병 후에 영향 받은 닭에서 검출되었다(Cook et al., 1988, Avian Pathol. 17: 403-410), 이는 따라서 APV가 원인임을 시사한다.
칠면조 리노프라케이티스 바이러스(turkey rhinotracheitis virus (TRTV))로도 알려진 조류 뉴모바이러스는 칠면조의 상부 호흡기 감염인 조류 리노프라케이티스(Giraud et al., 1986, Vet. Res. 119: 606-607)의 병인학적 인자로서, 최근에 설정된 메타뉴모바이러스 속의 유일한 구성원인데, APV는 지금까지 포유류 감염, 나아가 포유류의 질환과는 관련되지 않은 것으로 알려졌다. APV의 혈청학적 서브그룹은 G 글리코단백질을 인식하는 모노클로날 항체를 사용하는 중화 테스트와 G 글리코단백질의 아미노산 서열 또는 염기 서열로 분화될 수 있다. 그러나, 아미노산과 뉴클레오타이드 서열의 다른 차이는 APV의 혈청학적 서브그룹을 구분하기 위하여 사용될 수 있다. 서브그룹들 사이에서는 단지 31%의 상동성을 보이는 반면에, 서브그룹 A, B 및 D 내에서 G 단백질은 98.5 내지 99.7%의 서열 상동성을 보인다. 이와 관련해서는 예를 들어 Collins et al., 1993, Avian Pathology, 22: p.469-479; Cook et al., 1993, Avian Pathology, 22: 257-273; Bayon-Auboyer et al., J Gen Virol, 81 (Pt 11): 2723-33; Seal, 1998, Virus Res, 58 (1-2): 45-52; Bayon-Auboyer et al., 1999, Arch Virol, 144 (6): 91-109; Juhasz, et al., 1994, J Gen Virol, 75 (Pt 11) : 2873-80를 참조하기 바란다.
APV의 다른 혈청타입은 WO00/20600에 제공되며, 이로써 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다. 이것은 APV의 Colorado 분리물(isolate)을 개시하고 있고 그것을 알려진 APV 또는 TRT 주와 in vitro 혈청 중화 테스트에 의하여 비교하고 있다. 첫째, Colorado 분리물은 알려진 TRT 분리물에 대한 모노특이적 폴리클로날 항혈청에 대하여 시험되었다. Colorado 분리물은 어떠한 TRT 주에 대한 모노특이적 항혈청에 의해 중화되지 않았다. 그러나, 그것은 서브그룹 A 주로 인하여 발생한 고 면역 항혈청에 의해 중화된다. 이러한 항혈청은 동종성 바이러스를 1:400의 역가 비율로 중화하였고, Colorado 분리물은 1:80의 역가 비율이었다. 상기 방법을 사용하여, Colorado 분리물은 그 후 TRT 모노클로날 항체에 대하여 시험되었다. 각 케이스에서, 상효 중화 역가는 10이하이었다. Colorado 분리물로 발생된 모노특이적 항혈청 또한 양 서브그룹의 TRT 주에 대하여 시험되었다. 시험된 TRT 주의 어느 것도 Colorado 분리물에 대한 항혈청에 의해 중화되지 않았다.
APV의 Colorado 분리물은 TRT 바이러스의 서브그룹 A 또는 서브그룹 B로 시험된 경우 SPF 병아리를 보호하지 않는다. 이러한 결과는 Colorado 분리물이 조류 폐렴바이러스의 다른 혈청타입의 첫 번째 샘플일 수도 있다는 것을 의미한다(Bayon-Auboyer et al., 2000, J. Gen. Vir. 81: 2723-2733 참조).
조류 뉴모바이러스는 메타뉴모바이러스 속, paramyxoviridae 과의 아과에 속하는 단일 가닥, 비-세그먼트 RNA 바이러스이다(Cavanagh and Barrett, 1988, Virus Res. 11: 241-256; Ling et al., 1992, J. Gen. Virol. 73: 1709-1715; Yu et al., 1992, J. Gen. Virol. 73: 1355-1363). paramyxoviridae 과는 두개의 아과로 나뉘어 진다: paramyxoviridae와 pneumovirinae. Paramyxoviridae의 아과는 Paramyxovirus, Rubulavirus, 및 Morbillivirus 속을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 최근에, Pneuvirinae 아과는 유전자 순서, 및 서열 상동성에 의해 두개의 속으로, 즉 폐렴바이러스와 메타뉴모바이러스로 나뉘었다(Naylor et al., 1998, J. Gen. Virol., 79: 1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143: 1449-1159). 뉴모바이러스 속은 인간 호흡기 신시티움 바이러스(hRSV), 소 호흡기 신시티움 바이러스(bRSV), 양 호흡기 신시티움 바이러스, 및 쥐 폐렴바이러스를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 메타뉴모바이러스 속은 유럽 조류 뉴모바이러스(서브그룹 A와 B)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는데, 유럽 조류 뉴모바이러스는 뉴모바이러스 속의 대표종인 hRSV로부터 구별된다(Naylor et al., 1998, J. Gen. Virol., 79: 1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143: 1449-1159). APV의 US 분리물은 항원성적으로 및 유전적으로 유럽 분리물과 다른 것으로 밝혀졌기 때문에 메타뉴모바이러스 속 내의 세 번째 서브그룹(서브그룹 C)이다(Seal, 1998, Virus Res. 58: 45-52; Senne et al., 1998, In : Proc. 47th WPDC, California, pp. 67-68).
네거티브하게 염색된 APV의 전자 마이크로 현미경 시험은 다형태이고, 때때로 구형인 직경이 80 내지 200nm이며, 길이로 1000 내지 2000nm의 긴 필라멘트를 가진 비리온을 나타내었다(Collins and Gough, 1988, J. Gen. Virol. 69: 909-916). 외피는 길이 13 내지 15nm의 스파이크로 박아진 막으로 이루어져 있다. 뉴클레오캡시드는 나선모양이고, 직경이 14nm이고 피치(pitch)가 7nm이다. 뉴클레오캡시드 직경은 일반적으로 약 18nm의 직경을 가진 paramyxovirus와 morbillivirus 속의 직경보다 작다.
조류 뉴모바이러스 감염은 수년간 미국 외 전 세계적으로 가금류에서 나타났지만 미국에서는 최근 나타나는 병이다. 1996년 5월 전염성이 높은 칠면조의 호흡기 질환이 콜로라도에서 나타났고, APV는 결과적으로 National Veterinary Services Laboratory (NVSL, Ames, 아이오와, 미국)에서 분리되었다(Senne et al., 1997, Proc. 134th Ann. Mtg., AVMA, pp.190). 이 전에 미국과 캐나다는 조류 폐렴바이러스로부터 자유로운 나라로 생각되었다(Pearson et al., 1993, In: Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control, pp.78-83; Hecker and Myers, 1993, Vet. Rec. 132: 172). 1997년 초, APV의 존재는 미네소타에서 칠면조에서 혈청학적으로 검출되었다. 첫 번째 확인된 진단이 내려질 때까지, APV 감염은 이미 많은 농장에 퍼져 있었다. 이 질병은 거품성(foamy) 눈, 콧물, 동공(sinus) 팽창과 같은 상부 호흡기의 임상학적 징후와 관련되어 있다. 그것은 2차적 감염에 의해 악화된다. 감염된 새들의 사망률은 거의 100%이다. 사망률은 1 내지 90%일 수 있고, 6주 내지 12주된 새끼들에서 가장 높다.
조류 뉴모바이러스는 접촉에 의해 전염된다. 콧물, 감염된 새의 이동, 오염된 물, 오염된 시설, 오염된 음식 트럭 및 로드-아웃(load-out) 활동이 바이러스의 전파에 기여할 수 있다. 회복된 칠면조도 캐리어(전파자)로 생각된다. 바이러스는 누워있는 칠면조의 난관의 상피세포를 감염시키는 것으로 보여 지기 때문에 또 APV는 어린 새끼들에서 검출되기 때문에 달걀 전파도 가능한 것으로 생각된다.
인간 호흡기 질환의 중요한 부분은 바이러스성 paramyxovirinae 와 pneumovirinae 아과 멤버들에 의한 것이고, 호흡기 감염을 야기하는 다양한 바이러스에 대항하여 보호할 수 있는 효과적인 백신에 대한 필요성이 아직까지 존재한다.
본 명세서에서 인용문헌의 언급 또는 개시는 그것이 본 발명의 선행기술이라고 인정하는 것으로 해석돼서는 아니 된다.
본 발명은 적절한 숙주세포 시스템에서 이종성 유전자 산물을 발현 및/또는 상기 이종성 유전자 산물을 발현, 패키지, 및/또는 표면에 제시(present)하는 역가닥(negative strand) RNA 재조합 바이러스의 구조(rescue)에 사용될 수 있는 재조합 소 파라인플루엔자 바이러스(bPIV) cDNA 또는 RNA를 제공하고자 한다. 더 구체적으로 상기 이종성 유전자 산물에는 또 다른 파라인플루엔자 바이러스 종의 유전자 산물 또는 인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움(syncytial) 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 및 조류 뉴모바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는 또 다른 역가닥 RNA 바이러스들의 유전자 산물을 제공하고자 한다.
폭넓은 범위의 병원균들과 항원들에 대한 백신들을 포함하는 백신 제제에 효과적으로 사용될 수 있는 상기 키메라성 바이러스 및 발현 산물들을 제공하고자 한다.
발명의 요약
본 발명은 특히 항원 폴리펩타이드 및 펩타이드를 발현하는 이종성 또는 비 자연적인 유전자 산물들을 발현하기 위하여 제조된 재조합형 파라인플루엔자 바이러스(PIV) cDNA 및 RNA에 관한 것이다.
일 실시예에서 본 발명은 이종성 항원 또는 이종성 항원의 면역 및/또는 항원 절편을 발현하기 위하여 고안된 재조합 소 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스에 관련되어 있다.
또 다른 실시예에서 상기 재조합 소 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스들은 돌연변이된 PIV 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 PIV 게놈에 비자연적인 서열을 발현하기 위하여 고안되어 있다.
특히, 본 발명은 재조합형 캔자스-스트레인 소 파라인플루엔자 타입 3 바이러스 및 그것을 코딩하는 cDNA 및 RNA 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 백신 제제로 사용하기 위하여 더욱 적합한 표현형을 갖는 키메라 바이러스를 야기하는 변형을 포함하는 재조합형 PIV에 관한 것이다.
본 발명은 처음으로 여러 바이러스 감염 특히 호흡기 감염을 야기하는 바이러스에 대하여 보호할 수 있는 백신으로 제제화된 키메라 PIV를 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 파라인플루엔자, 인플루엔자, 또는 호흡기 신시티움 바이러스 감염에 대하여 보호할 수 있는 백신을 제공한다.
본 발명은 처음으로 포유류 숙주에서 메타뉴모바이러스 감염에 대하여 보호할 수 있는 백신을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스는 내생적인 또는 자연적인 유전자 서열 또는 비-자연적인 유전자 서열에 의해 코딩되는 소 파라인플루엔자 바이러스 또는 인간의 파라인플루엔자 바이러스로부터 유래한 것이다.
본 발명에 따른 비-자연적인 서열은 포인트 돌연변이, 재배치, 삽입, 결손 등을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 표현형 변화를 야기하거나 그렇지 아니한 게놈 서열에서의 하나 이상의 돌연변이를 야기하는 자연적 또는 내생적인 게놈 서열과 다른 서열이다.
본 발명에 따른 본 발명의 키메라 바이러스는 하나 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 더욱 포함하는 재조합 bPIV 또는 hPIV이다.
본 발명에 따른 키메라 바이러스는 이종성 뉴클레오타이드 서열이 게놈에 부가되거나 뉴클레오타이드 서열이 이종성 뉴클레오타이드 서열로 대체된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명은 또한 다른 스트레인의 PIV, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스, 포유류 메타뉴모바이러스(예를 들어 인간 메타뉴모바이러스), 조류 뉴모바이러스, 홍역, 유행성 이하선염, 다른 바이러스, 병원균, 세포 유전자, 암 항원 또는 그것의 조합에서 유래하는 유전자를 포함하나 이에 한정하지 아니한 유전자 산물을 코딩하는 이종성 서열의 조합을 코딩하는 고안된 재조합 파라인플루엔자 바이러스들과 바이러스 벡터에 관한 것이다.
게다가, 본 발명은 호흡기 신시티움 바이러스에서 유래한 뉴클레오타이드 서열 및 인간 파라인플루엔자 바이러스에서 유래한 뉴클레오타이드 서열을 더욱 조합한 메타뉴모바이러스에서 유래한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 고안된 파라인플루엔자 바이러스에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간 PIV3의 F 및 HN 유전자들을 포함하는 파라인플루엔자 바이러스의 다른 종이나 스트레인으로부터 온 유전자들을 코딩하기 위하여 고안된 재조합 파라인플루엔자 벡터를 포함한다.
일 실시예에서 본 발명의 PIV 벡터는 바람직하게는 항원 유전자 산물인 유전자 산물을 코딩하는 하나 이상의 이종성 서열을 발현하기 위하여 고안되었다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 PIV 벡터는 항원 폴리펩타이드 및 펩타이드를 코딩하는 하나, 둘 또는 셋 이종성 서열을 발현한다.
일부 실시예에서, 이종성 서열은 같은 또는 다른 바이러스들로부터 유래한다.
바람직한 실시예에서, 상기 이종성 서열은 인간 PIV, PIV의 돌연변이 스트레인과 같은다른 PIV종 및 인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스(RSV), 포유류 메타뉴모바이러스(예를 들어 인간의 메타뉴모바이러스(hMPV)), 및 조류 뉴모바이러스를 포함하나 이에 한정되지 아니한 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에서 유래한 항원 폴리펩타이드인 이종성 유전자 산물들을 코딩한다.
일 실시예에서, 상기 이종성 서열은 이종성 유전자 산물의 면역원 및 항원 절편을 코딩한다.
바람직한 실시예에서, 상기 재조합 PIV는 소 PIV 타입 3, 또는 약독화된 인간의 PIV 타입 3이다.
일 실시예에서, 융합(F) 단백질, 헤마굴루틴(hemagglutinin;HN) 당단백질 또는 PIV 게놈의 다른 비 필수적인 유전자들을 코딩하는 서열들은 결손되고 이종성 항원 서열로 대체되었다.
또 다른 실시예에서 상기 PIV 게놈은 상기 이종성 뉴클레오타이드 서열외에 백식 제제로 사용하기 위하여 더욱 적합한 표현형(예를 들어 약독화된 표현형 또는 증가된 항원성)을 갖는 키메라 바이러스를 야기하는 돌연변이 또는 변형을 포함한다.
특정 실시예에서, PIV 게놈에 사입된 상기 이종성 뉴클레오타이드 서열은 F 단백질, G 단백질 또는 HN 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열들로부터 유래한다.
일 실시예에서, 상기 삽입되는 뉴클레오타이드 서열은 키메라 F 단백질, 키메라 G 단백질 또는 키메라 HN 단백질을 코딩한다.
일 실시예에서, 상기 F 단백질은 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 ecto 도메인, 파라인플루엔자 바이러스의 F 단백질의 트랜스멤브레인 도메인, 및 파라인플루엔자 바이러스의 F 단백질의 루멘 도메인을 포함한다.
일 실시예에서, 삽입되는 뉴클레오타이드 서열은 가용성 F 단백질을 발현하기 위하여 F 단백질의 트랜스멤브레인 도메인이 결손된 F 단백질을 코딩한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 메타뉴모바이러스에서 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 PIV 게놈을 포함하는 키메라 바이러스를 제공한다.
특정 실시예에서 , PIV 바이러스는 캔자스 스트레인 소 파라인플루엔자 타입 3 바이러스이다.
다른 실시예에서 , 상기 PIV 바이러스는 약독화된 표현형을 갖는 인간 파라인플루엔자 바이러스이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 소 파라인플루엔자 골격내에 인간 파라인플루엔자 F 및 HN 유전자들을 포함하기 위하여 고안된 키메라 소 파라인플루엔자 바이러스 타입 3/ 인간 파라인플루엔자 바이러스를 제공한다.
상기 키메라 바이러스는 메나뉴모바이러스로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열 및/또는 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열을 더욱 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 바이러스는 적어도 두개의 다른 메나뉴모바이러스의 유전자로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 이종성 서열은 메타뉴모바이러스, 예를 들어, 조류 뉴모바이러스 및 인간의 메타뉴모바이러스에서 유래한다.
더욱 상세하게는 상기 이종성 서열은 조류 뉴모바이러스 타입 A, B, C, 또는 D, 바람직하게는 C를 포함하는 조류 뉴모바이러스에서 유래한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 이종성 항원 서열을 발현하는 키메라 PIV을 포함하는 백신 제제 및 면역 조성물을 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 2가 그리고 3 가 백신들을 포함하여 다가 백신들을 제공한다.
본 발명의 다가 백신들은 각각 이종성 항원 서열을 발현하는 하나의 PIV 벡터 또는 각각 다른 이종성 항원 서열을 코딩하는 둘 이상의 PIV 벡터의 형태로 투여될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 백신 제제는 같은 바이러스의 한 스트레인, 같은 바이러스의 다른 스트레인 또는 다른 바이러스에서 유래한 서열에 의하여 코딩될 수 있는 하나, 둘 또는 세가지 이종성 폴리펩타이드를 발현하는 키메라 PIV를 포함한다.
바람직하게는 상기 이종성 항원 서열은 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스(RSV), 포유류 메타뉴모바이러스(예를 들어 인간 메타뉴모바이러스;hMPV) 및 조류 뉴모바이러스(APV)를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 네가티브 스트레인 RNA 바이러스에서 유래한다.
상기 이종성 항원 서열은 인간의 파라인플루엔자 바이러스 F 또는 HN 단백질, RSV의 F 단백질, 인플루엔자 바이러스 타입 A, B 및 C의 HA 단백질 및 인간의 MPV와 조류 뉴모바이러스의 F 단백질 코딩하는 서열을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 서열이다.
더욱 바람직하게는 본 발명의 백신 제제는 살아 있고 감염성이 있는 약독화된 키메라 바이러스들을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 재조합 PIV는 소 PIV 타입 3, 또는 인간 PIV 약독화된 스트레인이다.
일 실시예에서, 백신 제제는 상기 PIV 게놈의 F, HN, 또는 몇몇 비 필수적인 유전자들이 대체되거나 결손된 본 발명의 키메라 바이러스를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 백신 제제는 의도된 숙주에서 약독화된 표현형을 갖는 PIV 스트레인을 고안하여 제조된다.
또 다른 바람직한 실시예에서 본 발명의 백신 제제는 PIV의 약독화된 스트레인을 고안하여 제조된다.
또 다른 실시예에서, 상기 이종성 뉴클레오타이드 서열은 전체 PIV 게놈에 부가된다.
일 실시예에서 PIV 게놈은 그 바이러스 게놈의 1번째, 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 또는 6번째 유전자로 발현되게 하기 위하여 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 위치에서 이종성 서열들이 삽입되게 고안되었다.
특정 실시예에서, 상기 이종성 서열은 그 바이러스 게놈의 1, 2, 또는 3 위치에서 삽입된다.
일 실시예에서, 삽입된 이종성 유전자의 코딩서열 말단과 다운 스트림 유전자의 코딩 지역 시작 사이의 유전자간 영역(intergenic region)이 상기 키메라 바이러스의 증가된 성장 또는 상기 이종성 서열의 증가된 발현을 야기하기에 바람직한 길이로 변경되어 있다.
대안적으로 상기 유전자간 영역은 상기 재조합 또는 키메라성 바이러스(예를 들어 약독화된 표현형)의 성장 또는 상기 이종성 서열의 발현을 변경하는 능력을 갖는 바람직한 길이로 변경되어 있다.
일 실시예에서 삽입 위치 및 이종성 뉴클레오타이드 서열의 측면을 둘러싸는 유전자간 영역의 길이와 삽입 위치는 상기 이종성 서열을 바람직한 수준으로 발현하고 및 바람직한 바이러스 성장 특성을 갖는 재조합 또는 키메라성 바이러스를 선택하기 위하여 유전공학적으로 조작되었다.
일 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 또는 키메라 바이러스 및 약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 백신제제를 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 백신 제제는 인간, 영장류, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 개, 고양이, 설치류 또는 조류와 같은 대상의 면역 반응을 조절하는데 사용된다.
더욱 특정한 실시예에서, 상기 백신은 인간의 유아 또는 어린이의 면역반응을 조절하기 위하여 사용된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 수의학적 용도의 백신 제제와 관련된다.
본 발명의 백신 제제는 단독 또는 다른 백신 또는 다른 예방제 또는 치료제와 혼합하여 투여될 수 있다.
약정 및 약어들
cDNA는 complementary(상보적) DNA, CPE는 cytopathic effects(세포 변성효과), L은 large protein, M은 matrix protein (엔벨롭의 안쪽 라인) F는 fusion glycoprotein(융합 당단백질), HN는 hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein(당단백질), N, NP or NC는 RNA와 관련되고 폴리머라제 활성에 필요한 핵 단백질, P는 phosphoprotein, MOI는 multiplicity of infection, NA는 엔벨롭 당단백질인 뉴라미디데이즈(neuraminidase), PIV는 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), bPIV는 소 파라인플루엔자 바이러스(bovine parainfluenza virus), bPIV3는 소 파라인플루엔자 바이러스 타입 3, hPIV는 인간 파라인플루엔자 바이러스(human parainfluenza virus, hPIV3는 인간 파라인플루엔자 바이러스 타입 3(human parainfluenza virus type 3), "bPIV/hPIV 또는 b/h PIV"는 hPIV 서열들을 갖는 재조합 bPIV, "b/h PIV3 또는 bPIV 3/h PIV3"는 hPIV 타입 3 서열들을 갖는 재조합 bPIV 타입 3, nt는 뉴클레오타이드, RNP는 리보핵단백질, rRNP는 재조합 RNP, vRNA는 게놈 바이러스 RNA, cRNA는 항게놈 바이러스 RNA, hMPA는 인간 메나뉴모바이러스, APV는 조류 뉴모바이러스, 위치(position)는 위치가 어떤 바이러스를 고안에 관하여 사용될 때 그것은 전사되는 그 바이러스 게놈의 유전자의 위치를 나타낸다. 예를 들어 한 유전자가 위치 1에 위치한다면 그것은 전사되는 그 바이러스 게놈의 첫번째 유전자이다. 만약 한 유전자가 위치 2에 위치한다면 그것은 전사되는 그 바이러스 게놈의 두번째 유전자이다.
bPIV3, b/h PIV 3 및 그것의 유도체의 위치 1은 게놈의 뉴클레오타이드 위치 104 또는 대안적으로 전사되는 그 바이러스 게놈의 첫번 유전자의 위치이다.
bPIV3, b/h PIV 3 및 그것의 유도체의 위치 2는 게놈의 뉴클레오타이드 위치 1774 또는 대안적으로 그 천연 파라인플루엔자 바이러스의 두번째 오픈 리딩 프레임 또는 대안적으로 전사되는 그 바이러스 게놈의 두번째 유전자의 위치이다.
bPIV3, b/h PIV 3 및 그것의 유도체의 위치 3은 게놈의 뉴클레오타이드 위치 3724 또는 대안적으로 그 천연 파라인플루엔자 바이러스의 두번째와 세번째 오픈 리딩 프레임 사이 위치 또는 대안적으로 전사되는 그 바이러스 게놈의 세번째 유전자의 위치이다.
bPIV3, b/h PIV 3 및 그것의 유도체의 위치 4는 게놈의 뉴클레오타이드 위치 5042 또는 대안적으로 그 천연 파라인플루엔자 바이러스의 세번째와 네번째 오픈 리딩 프레임 사이 위치 또는 대안적으로 전사되는 그 바이러스 게놈의 네번째 유전자의 위치이다.
bPIV3, b/h PIV 3 및 그것의 유도체의 위치 5는 게놈의 뉴클레오타이드 위치 6790 또는 대안적으로 그 천연 파라인플루엔자 바이러스의 네번째와 다섯 번째 오픈 리딩 프레임 사이 위치 또는 대안적으로 전사되는 그 바이러스 게놈의 다섯 번째 유전자의 위치이다.
bPIV3, b/h PIV 3 및 그것의 유도체의 위치 6은 게놈의 뉴클레오타이드 위치 8631 또는 대안적으로 그 천연 파라인플루엔자 바이러스의 다섯 번째와 여섯 번째 오픈 리딩 프레임 사이 위치 또는 대안적으로 전사되는 그 바이러스 게놈의 여섯 번째 유전자의 위치이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 이종성 또는 비-자연성(non-native) 서열을 발현하기 위해 사용될 수 있는 재조합 소 및 인간 PIV cDNA와 RNA 구조물을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 재조합 파라인플루엔자 cDNA와 RNA 구조물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 재조합 바이러스는 내인성 또는 자연적 게놈 서열 또는 비-자연적 게놈 서열에 의해 코딩되는 소 파라인플루엔자 바이러스 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스로부터 유래한다. 본 발명에 따르면, 비-자연적(non-native) 서열은 하나 이상의 변이 때문에, 예를 들어 표현형 변화를 야기하거나 또는 야기하지 않는 게놈 서열에 발생하는 포인트 변이, 재배열, 삽입, 제거 등을 포함하지만, 하지만 이에 한정되지 않는, 변이 때문에 자연적 또는 내인성 게놈 서열과 다른 서열이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 키메라 바이러스는 재조합 하나 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 bPIV 또는 hPIV이다. 본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 그 안에서 이종성 뉴클레오타이드 서열이 게놈에 첨가되거나 그 안에서 뉴클레오타이드 서열이 이종성 뉴클레오타이드 서열로 대체된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 이러한 재조합 및 키메라 바이러스 및 발현 프로덕트는 인간 또는 동물에게 투여되기 위한 적당한 백신으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 바이러스는 폐렴바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 보호기능을 부여하는 백신 제제에서 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 인간 또는 소 PIV 변이체로부터 유래하고 하나, 둘, 또는 세 개의 이종성 서열, 바람직하게는 외래의 항원과 다양한 병원체, 세포 유전자, 암 항원, 및 바이러스를 코딩하는 이종성 유전자을 발현하도록 조작된 PIV cDNA와 RNA 구조물에 관한 것이다. 특히, 이종성 서열은 인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스(RSV), 포유류 메타뉴모바이러스(예를 들어 인간 메타뉴모바이러스 변이체 A1, A2, B1, 및 B2), 및 조류 폐렴바이러스 서브그룹 A, B, C 및 D를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, morbillivirus 또는 역 가닥 RNA 바이러스로부터 유래한다. 포유류 MPV는 변이체 A1, A2, B1, 또는 B2 포유류 MPV일 수 있다. 그러나, 본 발명의 포유류 MPV는 아직 밝혀지지 않는, 변이체 A1, A2, B1, 또는 B2에 한정되지 않는, MPV의 부가적인 변이체를 포함할 수도 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 이종성 서열은 변이된 PIV 서열을 포함하는 비-자연적 PIV서열이다. 몇몇 실시예에서, 이종성 서열은 동일 또는 다른 바이러스로부터 유래한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 바이러스는 인간 메타뉴모바이러스 또는 조류 폐렴바이러스(pneumovirus)로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열를 포함하는 재조합 PIV이다. PIV 게놈에 삽입된 이종성 서열은 인간 메타뉴모바이러스 변이체 A1, A2, B1 또는 B2의 F, G 및 HN 유전자를 코딩하는 서열, 조류 폐렴바이러스 타입 A, B, C 또는 D의 F, G 및 HN 유전자를 코딩하는 서열, 및 그들의 면역원성 및/또는 항원성 절편을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
일정 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 바이러스 게놈에 첨가된다. 대안적 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 내부의 뉴클레오타이드 서열과 교환된다. 이종성 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어 PIV 게놈 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 위치에서 PIV 게놈의 다양한 위치에 첨가 또는 삽입될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 1 위치에 첨가 또는 삽입된다. 다른 바람직한 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 2 위치에 첨가 또는 삽입된다. 더 바람직한 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 3 위치에 첨가 또는 삽입된다. 그 바이러스의 낮은 수치의 위치에서 이종성 뉴클레오타이드 서열을 삽입 또는 첨가하는 것은 높은 수치의 위치에서 삽입된 것과 비교하여 이종성 뉴클레오타이드 서열의 강한 발현을 야기한다. 이것은 그 바이러스의 게놈을 따라 발생하는 전사 그레디언트 때문이다. 그러나, 바이러스 복제 효율 또한 고려되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 b/h PIV3 키메라성 바이러스에서, 1 위치에 이종성 유전자를 삽입하면 시험관내(in vitro) 복제 반응의 진행을 지연시키는데, 생체 내(in vivo)의 경우 복제 지연 정도가 약간 덜하다(실시예 3과 도 5 및 실시예 21 참조). 그러므로, 낮은 수치의 위치에 이종성 뉴클레오타이드 서열을 삽입하는 것은 이종성 뉴클레오타이드 서열의 강한 발현이 요구되는 경우 본 발명의 바람직한 실시예이다. 더욱 바람직하게, 이종성 서열은 이종성 서열의 강한 발현이 요구된다면 b/h PIV3 게놈의 2 위치에 삽입된다(실시예 3 참조).
몇몇 다른 실시예에서, 재조합 또는 키메라 PIV 게놈은 이종성 유전자의 코딩 서열의 말단과 다운스트림 유전자의 코딩 서열의 시작 사이에 존재하는 유전자간(intergenic) 영역의 변경과 같이 조작된다. 또 다른 몇몇 실시예에서, 본 발명의 바이러스는 이종성 뉴클레오타이드 서열이 1, 2, 3, 4, 5 및 6 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 삽입되는 것 및 이종성 뉴클레오타이드 서열과 다음의 다운스트림 유전자 사이에 존재하는 내부유전자 영역의 변경과 같이 조작된 재조합 또는 키메라 PIV 게놈을 포함한다. 적절한 분석법이 적절한 레벨의 유전자 발현과 바이러스 성장 특성을 얻기 위하여 삽입(즉, 삽입 위치, 및 내부유전자 영역의 길이)의 최선 실시예를 결정하는데 사용될 수 있다.
일정 실시예에서, 본 발명의 키메라 바이러스는 두개의 다른 이종성 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 다른 이종성 뉴클레오타이드 서열은 PIV 게놈의 다양한 위치에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 1 위치에 삽입되고 다른 이종성 뉴클레오타이드 서열이 2 또는 3 위치에 첨가 또는 삽입된다. 본 발명의 다른 실시예에서, 첨가된 이종성 뉴클레오타이드 서열은 PIV 게놈의 높은 수치의 위치에 삽입된다. 본 발명에 따르면, 이종성 서열의 위치는 그 안에서 서열이 바이러스 게놈으로부터 전사되는 순서를 말한다. 예를 들어 1 위치의 이종성 서열은 게놈으로부터 전사되는 첫 번째 유전자 서열이다.
본 발명의 일정 실시예에서, 본 발명의 바이러스의 게놈 안으로 삽입되는 이종성 뉴클레오타이드 서열은 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스, 포유류 메타뉴모바이러스 및 조류 폐렴바이러스를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 역 가닥 RNA 바이러스로부터 유래한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 인간 메타뉴모바이러스로부터 유래한다. 다른 특정 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 조류 폐렴바이러스로부터 유래한다. 더욱 특이적으로, 본 발명의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 인간 또는 조류의 메타뉴모바이러스의 F, G 또는 SH 유전자 또는 그들의 일부분을 코딩한다. 특정 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1 내지 서열번호: 5; 서열번호: 14; 및 서열번호: 15 중 하나 일 수 있다(표 16 참조). 일정 특정 실시예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 6 내지 서열번호: 13, 서열번호: 16, 및 서열번호: 17 중 하나의 단백질을 코딩한다(표 16 참조). 특정 실시예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 314 내지 389 중 하나의 단백질을 코딩한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 본 발명의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 타입 A 조류 폐렴바이러스로부터 유래한다. 본 발명의 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 타입 B 조류 폐렴바이러스로부터 유래한다. 본 발명의 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 타입 C 조류 폐렴바이러스로부터 유래한다. 계통발생학적 분석은 타입 A와 타입 B가 그들 서로 타입 C와 보다 더 가깝게 관련되어 있다는 것을 보여준다(Seal, 2000, Animal Health Res. Rev. 1 (1): 67-72). 타입 A와 타입 B는 유럽에서 발견되고 타입 C는 미국에서 처음 발견되었다.
본 발명의 다른 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는데, 여기에서 엑토도메인(ectodomain)은 PIV 바이러스주 이외의 바이러스로부터 유래한 항원성 서열을 포함한다. 벡터 골격(backbone)은 PIV 주로부터 유래하고, 트랜스멤브레인 도메인과 루멘(luminal) 도메인은 PIV 서열로부터 유래한다. 결과적으로 생성되는 키메라성 바이러스는 선택의 역 가닥 RNA 바이러스의 항원성을 부여하고 약화된 표현형을 가진다.
본 발명의 특정 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 키메라 F 단백질을 포함한다. 특히, 키메라 F 단백질의 엑토도메인은 인간 메타뉴모바이러스 또는 조류 폐렴바이러스와 같은 메타뉴모바이러스의 엑토도메인이고, 루멘 도메인과 트랜스멤브레인 도메인은 인간 또는 소 파라인플루엔자 바이러스와 같은 파라인플루엔자 바이러스의 트랜스멤브레인 또는 루멘 도메인이다. 어떠한 이론에 억매이지 않고 설명하자면, 키메라성 F 단백질을 삽입하면 목적한 숙주 안에서 바이러스를 더욱 약화시킬 수 있지만 F 단백질 엑토도메인에 의해 유발되는 항원성은 유지한다.
본 발명의 키메라 바이러스는 폐렴바이러스 감염, 호흡기 신시티움 바이러스 감염, 파라인플루엔자 바이러스 감염, 인플루엔자 바이러스 감염, 또는 그들의 혼합 감염을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 다양한 감염에 대항하는 보호 기능을 부여하는 백신 제제에 사용될 수 있다. 본 발명은 2가 및 3가 백신을 포함하는 하나 이상의 이종성 항원성 서열을 발현하는 키메라 PIV를 포함하는 백신 제제를 제공한다. 본 발명의 2가 및 3가 백신은 각각의 이종성 항원성 서열을 발현하는 하나의 PIV 벡터 형태로 또는 다른 이종성 항원성 서열을 각각 코딩하는 두가지 이상의 PIV 벡터의 형태로 투여될 수 있다. 바람직하게, 이종성 항원성 서열은 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스(RSV), 포유류 메타뉴모바이러스(예를 들어 인간 메타뉴모바이러스) 및 조류 폐렴바이러스를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 역 가닥 RNA 바이러스로부터 유래한다. 따라서, 본 발명의 키메라 비리온은 예를 들어 항-인간 인플루엔자 백신, 항-인간 파라인플루엔자 백신, 항-RSV 백신 및 항-인간 메타뉴모바이러스 백신을 제조하기 위해 조작될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 백신 제제는 생존할 수 있고 감염성이 있는 약화된 키메라 바이러스를 포함한다. 본 발명의 백신 제제는 단독으로 투여될 수도 있고, 다른 백신 또는 다른 예방적 또는 치료적 성분들과 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 다양한 범위의 바이러스 및/또는 암 항원을 포함하는 항원에 대한 백신을 제조하기 위한 바이러스 벡터 및 키메라 바이러스의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스성 벡터와 키메라 바이러스는 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응을 자극함으로써 또는 항원에 대한 내성을 자극함으로써 객체의 면역 시스템을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 여기에서 사용된 것처럼, 객체는 인간, 영장류, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 개, 고양이, 설치류 및 다양한 종류의 조류를 포함한다. 암 항원을 전달할 때, 발명은 비-고형성 종양 또는 작은 크기의 고형성 종양과 같은 면역 반응 매개 거부로 치료될 수 있는 질병을 가진 객체를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 여기에서 설명된 바이러스 벡터 및 키메라 바이러스에 의한 암 항원의 전달은 큰 고형암의 제거 후 연속적인 치료에 매우 유용할 것이라고 판단된다. 본 발명은 또한 암을 가진 것으로 예상되는 객체를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 설명의 목적에 따라 단순하게 다음의 단계로 나뉠 수 있다. 다만 이것에 한정되는 것은 아니다: (a) 재조합 cDNA와 RNA 주형의 구성; (b) 재조합 cDNA와 RNA 주형을 사용한 이종성 유전자 프로덕트의 발현; 및 (c) 재조합 바이러스 파티클 내 이종성 유전자의 구조(rescue).
재조합 cDNA 와 RNA 의 구성
본 발명은 소 파라인플루엔자 바이러스와 포유류 파라인플루엔자 바이러스를 포함하는 파라인플루엔자 바이러스의 게놈으로부터 유래된 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 재조합 또는 키메라 바이러스를 포함한다. 본 발명에 따르면, 재조합 바이러스는 내인성 또는 자연적 게놈 서열 또는 비-자연적 게놈 서열에 의해 코딩되는 소 파라인플루엔자 바이러스 또는 포유류 파라인플루엔자 바이러스로부터 유래하는 바이러스이다. 본 발명에 따르면, 비-자연적 서열은 표현형 변화를 야기하거나 또는 야기하지 않거나 게놈 서열에 발생하는 예를 들어 포인트 변이, 재배열, 삽입, 제거 등을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 변이 때문에 발생하게 되는, 자연적 또는 내인성 게놈 서열과 다른 것이다. 본 발명의 재조합 바이러스는 바이러스 게놈에 비-자연적인 핵산을 포함하거나 하지 않을 수 있는, 소 및 포유류 파라인플루엔자 바이러스를 포함하는 파라인플루엔자 바이러스의 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 바이러스를 포함한다. 본 발명에 따르면, 파라인플루엔자 바이러스의 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터는 적어도 파라인플루엔자 바이러스의 하나의 ORF의 일부를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명은 또한 예를 들어 약화된 표현형 또는 촉진된 항원성과 같이 백신 제제의 사용에 더욱 알맞은 표현형을 가진 바이러스를 생산하는 서열을 포함하는 포유류 및/또는 PIV 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터를 포함하는 재조?? 바이러스를 포함한다. 변이 또는 변경은 코딩 영역, 내부유전자의 영역 및 바이러스의 리더와 트레일러 서열에서 일어날 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 바이러스 벡터는 포유류 파라인플루엔자 바이러스의 게놈, 특히 인간 파라인플루엔자 바이러스(hPIV)의 게놈으로부터 유래한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 바이러스 벡터는 인간 파라인플루엔자 바이러스 타입 3의 게놈으로부터 유래한다. 본 발명에 따르면, 이러한 바이러스 벡터는 바이러스 게놈에 비-자연적인 핵산을 포함할 수도 하지 않을 수도 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 바이러스 벡터는 소 파라인플루엔자 바이러스(bPIV)로부터 유래한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 바이러스 벡터는 소 파라인플루엔자 바이러스 타입 3의 게놈으로부터 유래한다. 본 발명에 따르면, 이러한 바이러스 벡터는 바이러스 게놈에 비-자연적인 핵산을 포함할 수도 하지 않을 수도 있다.
본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 재조합 bPIV 또는 hPIV이다. 본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 그 안에서 이종성 뉴클레오타이드 서열이 게놈에 첨가되거나 그 안에서 내인성 또는 자연적 뉴클레오타이드 서열이 이종성 뉴클레오타이드 서열로 대체된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. 본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 코딩된다. 본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 바이러스 게놈에 비-자연적인 핵산 포함할 수도 하지 않을 수도 있는 바이러스 벡터에 의해 코딩된다. 본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 이종성 뉴클레오타이드 서열이 첨가된, 삽입된 또는 자연적 또는 비-자연적 서열에 대하여 치환된 바이러스 벡터에 의해 코딩된다.
키메라 바이러스는 특히 두 가지 이상의 바이러스에 대항하여 보호하는 재조합 백신의 제조에 사용될 수 있다(Tao et al., J. Virol. 72,2955-2961; Durbin et al., 2000, J. Virol. 74,6821-6831; Skiadopoulos et al., 1998, J. Virol. 72,1762-1768 (1998); Teng et al., 2000, J. Virol. 74,9317-9321). 예를 들어, 양쪽 바이러스 감염에 대하여 그러한 벡터로 면역화된 개인을 보호할 수 있는 MPV의 하나 이상의 단백질을 발현하는 RSV 벡터 또는 MPV 벡터와 같이, 다른 역 가닥 RNA 바이러스의 하나 이상의 단백질을 발현하는 hPIV 또는 bPIV 바이러스 벡터가 예상될 수 있다. 유사한 접근이 다른 paramyxovirus에 대하여 예상될 수 있다. 약화된 및 복제-결핍된 바이러스는 다른 바이러스에 대하여 제안된 것처럼 생 백신을 가지고 면역화 목적으로 사용될 수 있다(PCT WO02/057302, at pp.6 and 23 참조), 이로써 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다.
본 발명에 따르면, RSV, PIV, 인플루엔자 바이러스 및 (morbillivirus를 포함하는) 다른 바이러스를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 다른 역 가닥 RNA 바이러스, 조류 폐렴바이러스의 다른 주, 메타뉴모바이러스의 다른 주로부터 얻어진 또는 유래한 서열을 포함하는 본 발명의 재조합 또는 키메라 바이러스를 코딩하는 바이러스 벡터 안으로 이종성이 도입된다.
본 발명의 일정 실시예에서, 본 발명의 키메라 또는 재조합 바이러스는 그 안에서 하나 이상의 서열, 내부유전자의 영역, 말단 서열, 또는 부분적 또는 전체적 ORF이 이종성 또는 비-자연적 서열로 대체된, 바이러스 게놈으로부터 유래된 바이러스 벡터에 의해 코딩된다. 본 발명의 일정 실시예에서, 본 발명의 키메라 바이러스는 그 안에서 하나 이상의 이종성 서열이 벡터에 첨가된, 바이러스 게놈으로부터 유래하는 바이러스 벡터에 의해 코딩된다.
본 발명의 특정 실시예는 파라인플루엔자 바이러스 게놈으로부터 유래한 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 백본을 포함하는 키메라 바이러스이다. 바람직한 실시예에서, PIV 게놈은 bPIV3의 Kansas 주(strain)와 같은 소 PIV 또는 인간 PIV로부터 유래한다. 바람직한 실시예에서, PIV 게놈은 bPIV3의 Kansas 주로부터 유래하는데, 그 안에서 소 인플루엔자 바이러스 뉴클레오타이드 서열은 이종성 서열로 대체되거나 그 안에서 이종성 서열은 완전한 bPIV 게놈에 첨가된다. 본 발명의 더한 특정 실시예는 인간 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 게놈으로부터 유래하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 백본(backbone)을 포함하는 키메라 바이러스인데, 그 안에서 인간 인플루엔자 바이러스 뉴클레오타이드 서열은 이종성 서열로 대체되거나 그 안에서 이종성 서열은 완전한 hPIV 게놈에 첨가된다. 본 발명의 또 다른 특정 실시예는 bPIV3의 Kansas 주와 같은 소 파라인플루엔자 바이러스 게놈으로부터 유래한 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 백존을 포함하는 키메라바이러스인데, 그 안에서 (a) 소 파라인플루엔자 바이러스 F 유전자와 HN 유전자는 인간 파라인플루엔자 바이러스의 F 유전자와 HN 유전자로 대체되고(bPIV/hPIV), (b) 이종성 서열은 완전한 bPIV 게놈에 첨가된다.
본 발명은 또한 예를 들어 약화된 표현형 또는 강화된 항원성과 같이 백신 제제의 사용에 더욱 적합한 키메라 바이러스를 야기하는, 이종성 서열에 더하여, 변이 또는 변형을 포함하는 bPIV, hPIV, 또는 bPIV/hPIV 게놈으로부터 유래한 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 백본을 가진 키메라 바이러스를 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에 따르면, 소 PIV3 백본에 있는 이종성 서열은 bPIV3에 이종인 어떠한 서열일 수도 있다.
본 발명의 다른 특정한 실시예는 인간 PIV 1, 2, 또는 3으로부터 유래한 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 백본을 포함하는 키메라 바이러스인데, 그 안에서 hPIV 뉴클레오타이드 서열은 이종성 서열로 대체되거나 또는 그 안에서 이종성 서열은 완전한 hPIV 게놈에 첨가된다. 다만 이 경우 결과적으로 생성되는 키메라 바이러스는 헤마글루티닌-뉴라미나다제 및 융합 글리코단백질이 hPIV1의 그것에 의해 대체된 키메라 hPIV3는 아니다. 본 발명은 또한 예를 들어 약화된 표현형 또는 강화된 항원성과 같이 백신 제제의 사용에 더 적합한 표현형을 가진 키메라 바이러스를 야기하는, 이종성 서열에 더하여, 변이 또는 변형을 포한하는, hPIV 게놈으로부터 유래한 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 백본을 포함하는 키메라 바이러스를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 3'-PIV 바이러스 말단의 상보체, 또는 3'-와 5'-PIV 바이러스 양 말단의 상보체와 같은 바이러스 폴리머라제 결합 부위/프로모토와 플랭크된(flanked) 이종성 유전자 코딩 서열은 본 발명이 속한 분야에서 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 결과적으로 생성되는 RNA 주형은 역-극성일 수 있고, 바이러스 RNA-합성 기구가 주형을 인식하게 하는 적절한 말단 서열을 포함할 수도 있다. 대안적으로, 바이러스 RNA-합성 기구가 주형을 인식하도록 하기 위하여 적절한 말단 서열을 포함하는 양(positive)-극성 RNA 주형이 사용될 수도 있다. 하이브리드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자는 바이러스 폴리머라제 인식 및 활동을 용인하는 적절한 바이러스 서열을 포함하는 재조합 RNA 주형의 in vivo 또는 in vitro 제조를 위하여, 박테리오파지 T7 폴리머라제, T3 폴리머라제, SP6 폴리머라제 또는 폴리머라제 I와 같은 진핵생물 폴리머라제 등과 같은 DNA-유도 RNA 폴리머라제에 의해 클론되고 전사될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 PIV 벡터는 항원성 폴리펩타이드와 펩타이드를 코딩하는 하나, 둘 또는 셋의 이종성 서열을 발현한다. 일정 실시예에서, 이종성 서열은 동일한 바이러스 또는 다른 바이러스로부터 유래한다. 어떤 실시예에서, 동일한 이종성 뉴클레오타이드의 한 개의 카피 이상이 소 파라인플루엔자 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스, 또는 bPIV/hPIV 키메라 벡터의 게놈 내로 삽입된다. 바람직한 실시예에서, 동일한 이종성 뉴클레오타이드 서열의 두개의 카피가 본 발명의 바이러스의 게놈에 삽입된다. 몇몇 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 인간 메타뉴모바이러스 또는 조류 폐렴바이러스와 같은 메타뉴모바이러스로부터 유래한다. 특정 실시예에서, 메타뉴모바이러스로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열은 메타뉴모바이러스의 F 유전자이다. 다른 특정 실시예에서, 메타뉴모바이러스로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열은 메타뉴모바이러스의 G 유전자이다. 다른 몇몇 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한다. 특정 실시예에서, 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열은 호흡기 신시티움 바이러스의 F 유전자이다. 다른 특정 실시예에서, 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열은 호흡기 신시티움 바이러스의 G 유전자이다. 하나 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 삽입될 때, 삽입의 위치와 각 삽입된 카피의 내부유전자의 영역의 길이는 후술하는 방법들에 따라 조작되고 여러 가지 다른 분석법에 의하여 결정될 수 있다.
특정 실시예에서, 키메라 바이러스 또는 발현 프로덕트의 구조(rescue)는 숙주 세포가 키메라 cDNA 또는 RNA 구조물로 트랜스펙션된 숙주 세포 시스템 내의 리버스 유전학에 의하여 달성될 수 있다. 본 발명의 RNA 주형은 DNA-유도 RNA 폴리머라제를 가지고 적절한 DNA 서열의 전사를 통해 제조된다. 본 발명의 RNA 주형은 박테리오파지 T7 폴리머라제, T3 폴리머라제, SP6 폴리머라제, 또는 (폴리머라제 1과 같은) 진핵생물 폴리머라제 등과 같은 DNA-유도 RNA 폴리머라제를 사용하여 적절한 DNA서열의 in vivo 또는 in vitro 전사에 의하여 제조될 수 있다. 일정 실시예에서, 본 발명의 RNA 주형은 Hoffmann et al.(2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6108-6113)이 개시한 플라스미드-기초 발현 시스템 또는 Hoffmann과 Webster(2000, J. Gen. Virol. 81: 2843-2847)이 개시한 단일방향(unidirectional) RNA 폴리머라제 I-폴리머라제 II 전사 시스템을 사용하여 적절한 DNA 서열의 in vivo 또는 in vitro 전사에 의하여 제조될 수 있다. 결과적으로 발생되는 네거티브-극성의 RNA 주형은 바이러스 RNA-합성 기구가 그 주형을 인식하기 할 수 있는 적절한 말단 서열을 가지고 있다. 대안적으로, 적절한 말단 서열을 포함하고 바이러스 RNA-합성 기구가 그 주형을 인식하게 하는 포지티브-극성의 RNA 주형이 사용될 수도 있다. 포지티브 극성 RNA 주형의 발현은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터를 가진 플라스미드의 트랜스펙숀에 의해 달성될 수 있다. 예를 efdj, T7 프로모터의 조절 하에서 포지티브 RNA 주형을 코딩하는 플라스미드 DNA는 vaccinia 바이러스 또는 fowlpox T7 시스템과 병용하여 사용될 수 있다.
바이시스트로닉(bicistronic) mRNA는 바이러스 서열의 복제의 내적 시작을 인정하고, 정기적인 말단 개시 부위 또는 그 반대 부위로부터 외래 단백질 코딩 서열의 발현을 허락하도록 구성될 수 있다. 대안적으로 외래 단백질은 개시 부위와 폴리아데닐화 부위를 가진 내부 전사 유닛으로부터 발현될 수 있다. 다른 실시예에서, 외래 유전자는 결과적으로 발생하는 단백질이 융합 단백질이도록 PIV 유전자로 삽입될 수 있다.
일정 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 바이러스를 포함하는 3가 백신에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 3가 백신을 위해 사용된 바이러스는 인간 메타뉴모바이러스 또는 조류 폐렴바이러스와 같은 메타뉴모바이러스로부터 유래한 첫 번째 이종성 뉴클레오타이드 서열, 및 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한 두 번째 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 키메라 소 파라인플루엔자 타입 3/인간 파라인플루엔자 타입 3 바이러스이다. 예시적 실시예에서, 그러한 3가 백신은 (a) 인간 파라인플루엔자 바이러스의 F 유전자와 HN 유전자의 유전자 프로덕트; (b) 메타뉴모바이러스로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질; 및 (c) 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 특이적이다. 특정 실시예에서, 첫 번째 이종성 뉴클레오타이드 서열은 호흡기 신시티움 바이러스의 F 유전자이고 1 위치로 삽입된다. 그리고 두 번째 이종성 뉴클레오타이드 서열은 인간 메타뉴모바이러스의 F 유전자이고 3 위치로 삽입된다. 많은 다른 조합이 본 발명에 의해 포함되고 몇몇은 표 1에 예시적으로 나타내었다. 다른 조합을 위해서 조류 폐렴바이러스의 F 또는 G 유전자가 사용될 수 있다. 게다가, 키메라 F 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 사용될 수도 있다. 몇몇 덜 바람직한 실시예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열이 바이러스 게놈의 높은 수치의 위치에 삽입될 수 있다. 표 1에 3가 백신을 위해 사용된 바이러스 내 이종성 뉴클레오타이드 서열을 예시적 배열로 나타내었다.
Figure pat00001
몇몇 다른 실시예에서, 이종성 서열과 다운스트림 유전자의 코딩 서열의 시작점 사이에 존재하는 내부유전자의 영역이 변경될 수 있다. 예를 들어, 표 1에 제시된 각 유전자는 바람직한 길이의 유전자간(intergenic) 영역을 가질 수 있다. 예시적 실시예에서, 3가 백신은 그것의 자연적 내부유전자 영역과 함께 1 위치에 삽입된 호흡기 신시티움 바이러스의 F 유전자, 177 뉴클레오타이드의 변형된 내부유전자 영역(일반적으로 다운스트림 N 유전자 시작 코돈 AUC까지 75 뉴클레오타이드), 및 3 위치에 삽입된 인간 메타뉴모바이러스의 F 유전자를 가진 b/h PIV3 벡터를 포함한다. 본 발명의 명세서에 기재된 방법에 따라 이종성 뉴클레오타이드 서열의 각각의 삽입이 조작될 수 있는 것과 같이 많은 다른 조합들도 본 발명에 의해 포함된다.
더 넓은 실시예에서, 본 발명의 발현 프로덕트와 키메라 비리온은 바이러스 항원, 암 항원 및 자가면역 장애에 포함된 자가 항원를 포함하는 넓은 범위의 병원체에 대항하여 백신을 제조하기 위해 조작될 수 있다. 이러한 목표를 달성하는 한 가지 방법은 각각의 외부 도메인 내 외부 서열을 함유하도록 존재하는 PIV 유전자를 조정하는 것을 포함한다. 이종성 서열이 병원체의 에피토프 또는 항원인 경우, 이러한 키메라 바이러스는 이러한 결정인자(determinants)가 유래된 질병 물질에 대하여 보호적인 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 하이브리드 분자를 제조하는 한 가지 방법은 예를 들어 hPIV, bPIV, 또는 bPIV/hPIV와 같은 PIC 게놈의 DNA 상보체에 이종성 뉴클레오타이드 서열을 삽입하는 것이다. 이것은 인해 이종성 서열이 바이러스 폴리머라제 활성이 요구되는 바이러스 서열에 의해 플랭크(flanked)된다; 즉 바이러스 폴리머라제 결합 부위/프로모터(이후 바이러스 폴리머라제 결합 부위라 칭함), 및 폴리아데닐화 부위. 바람직한 실시예에서, 이종성 코딩 서열은 5' 및 3'말단의 복제 프로모터, 유전자 시작 및 종결 서열, 및 5' 및/또는 3'에서 발견되는 패키징 시그널을 포함하는 바이러스 서열에 의해 플랭크된다. 대안적 접근으로, 예를 들어 3'-말단 또는 바이러스 게놈 세그먼트의 두 말단의 상보체(complement)와 같은 바이러스 폴리머라제 결합 부위를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드가 하이드리드 분자를 제조하기 위하여 이종성 코딩 서열에 연결될 수 있다. 목표 서열 내의 외래 유전자의 세그먼트 또는 외래 유전자의 위치는 원래 목표 서열 내에 적절한 제한 효소 결합 부위의 존재에 의해 지시된다. 그러나, 최근의 분자 생물학의 진전이 이러한 문제점을 많이 감소시켰다. 제한 효소 부위는 목표 서열 내에 어느 곳이든지 부위-유도 변이의 사용을 통하여 쉽게 위치될 수 있다(예를 들어 the techniques described by Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82; 488 참조). 앞서 설명된 폴리머라제 체인 반응(PCR) 기술의 변형 또한 서열의 특정 삽입을 가능하게 하고(즉, 제한 효소 부위) 하이브리드 분자의 용이한 구성을 가능하게 한다. 대안적으로, PCR 반응은 클로닝의 필요없이 재조합 주형을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, PCR 반응이 DNA-유도 RNA 폴리머라제 프로모터(예를 들어 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6)를 포함하는 이중-가닥 DNA 분자와 이종성 유전자와 PIV 폴리머라제 결합 부위를 포함하는 하이브리드 서열을 제조하기 위해 사용될 수 있다. RNA 주형은 그 후 재조합 DNA로부터 직접적으로 전사될 수 있다. 다른 실시예에서, 재조합 RNA 주형은 이종성 유전자의 역 극성을 특정하는 RNA와 바이러스 폴리머라제 결합 부위를 RNA 리가제를 사용하여 연결함으로써 제조할 수 있다.
첨가적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드가 성공적인 바이러스 구조에 있어 중요한 "Rule of Six"에 고정된 비변역 영역 내의 HN 유전자의 3'말단에 첨가될 수 있다. "Rule of Six"는 많은 paramyxovirus에 적용되고 RNA 게놈의 뉴클레오타이드의 수가 기능적인 6개의 팩터(factor)일 것을 요구한다. 뉴클레오타이드의 첨가는 QuikChange mutagenesis 키트(Stratagene)와 같이 상업적으로 이용 가능한 변이 키트를 사용하는 방법과 같은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 기술에 의하여 수행된다. 적절한 수의 뉴클레오타이드의 첨가 후에, 예를 들어 hPIV3 F 및 HN 유전자의 DNA 절편과 같은 정확한 DNA 절편이 적절한 제한 효소와 겔 정제에 의해 처리되어 분리될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되어질 수 있는 바이러스 폴리머라제 활성과 구조물을 위해 결과적으로 필요한 것들이 아래에서 설명된다.
이론적 제한 없이, 몇몇 파라미터들이 재조합 바이러스의 복제 속도와 이종성 서열의 발현 레벨에 영향을 미친다. 특히, bPIV, hPIV, b/hPIV 내 이종성 서열의 위치와 이종성 서열을 둘러싼 유전자간 영역의 길이가 이종성 서열의 복제 속도와 발현 레벨을 결정한다.
특정 실시예에서, 바이러스의 리더 및/또는 트레일러 서열은 야생형 바이러스와 관련되어 조절된다. 일정 특정 실시예에서, 리더 및/또는 트레일러의 길이는 변경된다. 다른 실시예에서, 리더 및/또는 트레일러의 서열(들)은 야생형 바이러스와 비교하여 변이된다.
본 발명의 재조합 바이러스의 생산은 역 센스 바이러스 RNA(vRNA) 게놈 또는 그들의 상보적 카피의 부분적 또는 총길이적 카피의 복제에 달려있다. vRNA 또는 cRNA는 감염 바이러스로부터 분리되고, in vitro 전사에 의해 생산되거나, 또는 핵산의 트랜스펙션으로 세포 내에서 생산된다. 둘째로, 재조합 역 가닥 바이러스의 생산은 기능적 폴리머라제 복합체에 달려있다. 전형적으로, 폐렴바이러스의 폴리머라제 복합체는 N, P, L 및 가능하게 M2 단백질로 구성되지만, 그것에 반드시 한정되는 것은 아니다.
폴리머라제 복합체 또는 그들의 조성은 바이러스 파티클로부터 분리되거나, 하나 이상의 조성을 발현하는 세포로부터 분리되거나, 또는 특히 발현 벡터의 트랜스펙션으로 생성된다.
MPV의 감염성 카피는 상기 언급한 vRNA, cRNA, 또는 이러한 RNA를 발현하는 벡터가 상기 언급한 폴리머라제 복합체 16에 의하여 복제될 때 얻어진다(Schnell et al., 1994, EMBO J 13: 4195-4203; Collins et al., 1995, PNAS 92: 11563-11567; Hoffmann et al., 2000, PNAS 97: 6108-6113; Bridgen et al., 1996, PNAS 93: 15400-15404; Palese et al., 1996, PNAS 93: 11354-11358; Peeters et al., 1999, J. Virol. 73: 5001-5009; Durbin et al., 1997, Virology 235: 323-332).
본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. PIV(아마도 N, P, L 및 M2, 하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아님)의 폴리머라제 조성을 포함하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 원핵세포 내에서 관련된 세포 타입(박테리아, 곤충 세포, 진핵 세포)의 조성의 발현을 위해서 생성될 수 있다. 플라스미드 PIV 게놈의 총길이 또는 부분적 카피를 포함하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 in vitro 또는 in vivo로 바이러스 핵산의 발현을 위해서 원핵세포 내에서 생성된다. 후자의 벡터는 키메라 바이러스 또는 키메라 바이러스 단백질의 생성을 위해 다른 바이러스 서열을 포함할 수 있고, 복제 불능 바이러스의 생성을 위해 바이러스 게놈의 일부가 없을 수도 있고, 및 약화된 바이러스의 생성을 위하여 변이, 삭제 또는 삽입을 포함할 수도 있다.
PIV(야생형, 약화된, 복제-불능 또는 키메라)의 감염성 카피는 위에서 설명된 최신의 기술에 따라서 폴리머라제 조성의 동시 발현에 의해서도 생산될 수 있다.
부가적으로, 진핵세포, 일시적 또는 안정적으로 총길이 또는 부분적 PIV 단백질을 발현하는 진핵세포가 사용될 수 있다. 그러한 세포는 트랜스펙숀(단백질 또는 뉴클레오캡시드 벡터), 감염(바이러스 벡터) 또는 형질도입(바이러스 벡터)에 의해 만들어질 수 있고, 언급한 야생형, 약화된, 복제-불능 또는 키메라 바이러스의 보충을 위해 사용될 수도 있다.
삽입되는 이종성 유전자 서열
본 발명은 바람직하게는 항원 및/또는 면역성 유전자 산물 또는 그것의 절편을 코딩하는 하나 이상의 이종성 서열을 발현하는 고안된 소 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스들을 포함한다.
본 발명에서 "항원성"이란 항체 또는 MHC 분자에 결합하는 분자의 능력을 의미한다.
"면역성"이란 숙주의 면역반응을 야기하는 분자의 능력을 의미한다.
바람직한 실시예에서, 삽입되는 이종성 뉴클레오타이드 서열은 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스, 포유류 메타뉴모바이러스(예를 들어 인간의 메타뉴보바이러스) 그리고 조류 뉴모바이러스를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 역가닥 RNA 바이러스로부터 유래한다.
바람직한 실시예에서, 삽입되는 이종성 서열은 사람 PIV의 F 또는 HN 유전자, RSV의 F 유전자, 인플루엔자 바이러스 타입 A, B 또는 C의 HA 유전자, 인간 MPV의 F 유전자, 조류 뉴모바이러스의 F 유전자를 암호화하는 서열 또는 이들의 면역성 및/또는 항원성 절편을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
일 실시예에서, 삽입되는 이종 서열은 인간의 메타뉴모바이러스와 조류 뉴모바이러스로부터 유래한다.
일 실시예에서, 삽입되는 이종성 뉴클레오타이드 서열은 (a) 인간의 메타뉴모바이러스 및 호흡기 신시티움 바이러스 ; 및/또는 (b) 조류 뉴모바이러스 및 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한다.
본 발명의 일 실시예에서, 삽입되는 이종성 뉴클레오타이드 서열은 인간의 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스로부터 유래한 F 유전자로부터 유래한다.
일 실시예에서, F 유전자는 (a) 인간의 메타뉴모바이러스 및 호흡기 신시티움 바이러스; 및/또는 (b) 조류 뉴모바이러스 및 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한다.
본 발명의 일 실시예에서, 삽입되는 이종성 뉴클레오타이드 서열은 인간의 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스로부터 유래한 G 유전자로부터 유래한다.
일 실시예에서, G 유전자는 (a) 인간의 메타뉴모바이러스 및 호흡기 신시티움 바이러스; 및/또는 (b) 조류 뉴모바이러스 및 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한다.
또 다른 실시예에서, 인간의 메타뉴모바이러스 조류 뉴모바이러스 및 호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한 여러 F 유전자들 및/또는 다른 G 유전자들은 모든 실시예에서 인간의 메타뉴모바이러스 또는 조류 뉴모바이러스로부터 유래한 적어도 하나의 이종성 서열이 본 발명의 재조합 파라인플루엔자 바이러스에 존재한다는 조건하에서 본 발명의 바이러스에 삽입될 수 있다.
일 실시예에서 삽입되는 뉴클레오타이드 서열은 인간의 메타뉴모바이러스로부터 유래된 F 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
다른 실시예에서 삽입되는 뉴클레오타이드 서열은 인간의 메타뉴모바이러스로부터 유래된 G 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
다른 실시예에서 삽입되는 뉴클레오타이드 서열은 조류의 뉴모바이러스로부터 유래된 F 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
다른 실시예에서 삽입되는 뉴클레오타이드 서열은 조류의 뉴모바이러스로부터 유래된 G 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 모든 실시예에서 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 메타뉴모바이러스로부터 유래한다는 조건하에서 삽입되는 이종성 뉴클레오타이드 서열은 호흡기 신시티움 바이러스의 F 단백질 또는 G 단백질을 코딩한다.
일 실시예에서, 삽입되는 뉴클레오타이드 서열은 키메라 F 단백질 또는 키메라 G 단백질을 코딩한다.
키메라 F 단백질은 인간의 메타뉴모바이러스, 조류 뉴모바이러스 및/또는 호흡기 신시티움 바이러스와 같은 여러 바이러스들로부터 온 F 단백질 부분을 포함한다.
키메라 G 단백질은 인간의 메타뉴모바이러스, 조류 뉴모바이러스 및/또는 호흡기 신시티움 바이러스와 같은 여러 바이러스들로부터 온 G 단백질 부분을 포함한다.
특정한 실시예에서, F 단백질은 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 ecto 도메인, 파라인플루엔자 바이러스의 F 단백질의 트랜스멤브레인 도메인, 그리고 파라인플루엔자 바이러스의 F 단백질의 루멘 도메인을 포함한다.
일 실시에에서, 삽입되는 핵산은 가용성 F 단백질을 발현하기 위해서 F 단백질의 트랜스멤브레인 도메인이 결손된 F 단백질을 코딩한다.
어떤 특정 실시예에서는 본 발명의 상기 이종성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 5, 14, 15(표 16 참조) 중 어느 것을 취해도 무방하다.
특정 실시예에서 본 발명의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 서열번호1에서 5, 14, 그리고 15(표 16 참조) 중 하나이다.
특정 실시예에서 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6에서 13, 16, 그리고 17(표 16 참조) 중 하나의 단백질을 코딩한다.
특정한 실시예에서 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 314에서 번호 389 중 하나의 단백질을 코딩한다.
호흡기 신시티움 바이러스로부터 유래한 이종성 뉴클레오타이드 서열들에 대해서는 여기에 레퍼런스로 언급하고 있는 PCT/US98/20230를 참고하기 바란다.
바람직한 실시예에서 본 발명의 키메라 바이러스로 발현될 수 있는 이종성 유전자 서열은 호흡기 질병을 야기하는 항원성 에피토프, 특히 헤마굴루틴 H5,H7와 같은 인플루엔자 당단백질들과 같은 바이러스 당단백질, 호흡기 신시티움 바이러스 에피토프, 뉴 캐슬 병 바이러스 에피토프, 센다이 바이러스 그리고 전염성 후두기관염(Laryngotracheitis;ILV)들을 코딩하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
가장 바람직한 실시예에서 상기 이종성 뉴클레오타이드 서열들은 인간의 메타뉴모바이러스와 같은 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스로부터 유래한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 키메라 바이러스들로 고안될 수 있는 이종성 유전자 서열은 바이러스 에피토프와 B형 간염 바이러스 표면 항원, A형간염 또는 C, Epstein Barr 바이러스의 표면 당단백질들과 같은 바이러스들의 당단백질들, 인간의 유두종 바이러스의 당단백질들, 원숭이 바이러스 5 또는 유행성 이하선염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기열 바이러스, 헤르페스바이러스의 당단백질들, 소아마비 바이러스의 VPI, 및 인체 면역 결핍 바이러스(HIV) 바람직하게는 타입 1 또는 타입 2을 코딩하는 것을 포함하나 이에 한정되지 아니하다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 키메라 바이러스들로 고안될 수 있는 이종성 유전자 서열은 Marek의 병 바이러스(MDV) 에피토프, 전염성 Bursal 병 바이러스성 질환(IBDV)의 에피토프, 닭 빈혈증 바이러스의 에피토프, 전염성 후두기관염 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 광견병, 고양이 백혈병 바이러스, 개 홍역 바이러스, 소포 구내염 바이러스, 및 swinepox 바이러스(Fields 등 1991, FUNDAMENTAL VIROLOGY, 2판, Raven 출판사, 뉴욕, 참조).
본 발명의 다른 이종성 서열은 자가 면역 질환의 특성을 갖는 항원들을 코딩하는 것을 포함한다.
이 항원들은 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 류머티스성 관절염, 악성 빈혈, 에디슨병, 경피증(scleroderma), 자가 면역 위축증 위염, 소아 당뇨병, 그리고 디스콜드(discold) 홍반성 루푸스의 항원성을 포함하는 포유류 조직의 세포 표면, 원형질, 핵, 미토콘드리아 및 그 유사체에서 전형적으로 유래한다.
일반적으로 알레르겐들인 항원들은 꽃가루들, 먼지, 몰드들, 포자들, 비듬, 곤충들 그리고 음식들로부터 유래한 항원들을 포함하는 단백질들 또는 당단백질들을 포함한다.
추가로, 일반적으로 종양 항원들의 특성이 있는 항원들은 종양 조직의 세포들의 세포 표면, 세포질, 핵, 세포 소기관들 및 세포들의 유사체로부터 유래할 것이다.
실시예들은 돌연변이된 온코진에 의하여 코딩되는 단백질; 종양과 관련된 바이러스 단백질들; 및 당단백질들을 포맣나는 종양 단백질들의 특성을 갖는 항원들을 포함한다.
종양들은 입술, 코인두, 인두와 구강, 식도, 위, 콜론, 직장, 간장, 담낭, 췌장, 후두, 허파와 기관지, 피부의 흑색종, 가슴, 목 , 자궁, 난소, 방광, 신장, 자궁, 뇌와 신경계의 다른 부분, 갑상선, 전립선, 고환들, 호지킨 병, 비-호지킨의 림프종, 다발성 골수종 그리고 백혈병의 암 타입으로부터 유래한 것을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 특정 실시예에서 상기 이종성 서열들은 인체 면역 결핍 바이러스 바람직하게는 인체 면역 결핍 바이러스(HIV)-1 또는 인체 면역 결핍 바이러스(HIV)-2의 게놈으로부터 유래한다.
또 다른 본 발명의 실시예에서, 이종성 코딩 서열은 PIV 바이러스 단백질 내 이종성 펩타이드 서열을 갖는 키메라 유전자 산물이 발현되게 하기 위하여 PIV 유전자 코딩 서열 내에 삽입될 수 있다.
본 발명의 그러한 실시예에서, 상기 이종성 서열들은 또한 인체 면역 결핍 바이러스 바람직하게는 인체 면역 결핍 바이러스(HIV)-1 또는 인체 면역 결핍 바이러스(HIV)-2의 게놈으로부터 유래할 수 있다.
상기 이종성 서열들의 예로 env 유전자(즉 gpl60, gpl20 , 및/또는 GP41의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열), pol 유전자(즉 역전사 효소, 엔도뉴크레아제, 프로테아제, 및/또는 인테그레이즈의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열), gag 유전자(즉 p7, p6, p55, PL 7/18/P24/25의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열), tat, rev, nef, vif, vpu, vpr 및/또는 vpx를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 HIV-유래 서열들이다.
또 다른 실시예에서, 키메라 바이러스들로 고안될 수 있는 이종성 유전자 서열들은 면역증강효과를 갖는 단백질들을 코딩하는 것을 포함한다.
면역증강 단백질들의 예는 사이코카인, 인터페론 타입 1, 감마 인터페론, 콜로니 자극 인자, 및 인터루킨-1, -2, -4, -5, -6, -12을 포함하나 이에 한정되지는 아니한다.
추가로, 키메라 바이러스들로 고안될 수 있는 다른 이종성 유전자 서열은 박테리아 표면 당단백질들과 같은 박테리아 유래한 항원들, 곰팡이 유래한 항원들, 여러가지 다른 병원균들과 기생충들로부터 유래한 항원들을 포함하나 이에 한정되지는 아니한다.
박케리아 병원균으로부터 유래한 이종성 유전자 서열의 예들은 다음과 같은 속들의 종들로부터 유래한 것; Salmonella, Shigella, Chlamydia, Helicobacter, Yersinia, Bordatella, Pseudomonas, Neisseria, Vibrio, Haemophilus, Mycoplasma, Streptomyces, Treponema, Coxiella, Ehrlichia, Brucella, Streptobacillus, Fusospirocheta, Spirillum, Ureaplasma, Spirochaeta, Mycoplasma, Actinomycetes, Borrelia, Bacteroides, Trichomoras, Branhamella, Pasteurella, Clostridium, Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Erysipelothrix, Rhodococcus, Escherichia, Klebsiella, Pseudomanas, Enterobacter, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, Legionella, Mycobacterium, Proteus, Campylobacter, Enterococcus, Acinetobacter, Morganella, Moraxella, Citrobacter, Rickettsia, Rochlimeae 뿐 만 아니라 P.
aeruginosa ; E.coli, P.cepacia, S.epidermis, E.faecalis, S.pneumonias, S.aureus, N.meningitidis, S.pyogenes, Pasteurella multocida, Treponema pallidum, 및 P. mirabilis와 같은 박테이라 종을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
병원성 곰팡이로부터 유래한 이종성 유전자 서열들의 예들은 Cryptococcus neoformans ; Blastomyces dermatitidis ; Aiellomyces dermatitidis ; Histoplasma capsulatum ; Coccidioides immitis ; C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii 및 C.krusei를 포함하는 Candida 종, A. fumigatus, A. flavus 및 A. niger를 포함하는 Aspergillus 종, Rhizopus 종; Rhizomucor 종; Cunninghammella 종; A.saksenaea, A.mucor 및 A. absidia을 포함하는 Apophysomyces 종; Sporothrix schenckii, Paracoccidioides brasiliensis ; Pseudallescheria boydii, Torulopsis glabrata ; Trichophyton 종, Microsporum 종 및 Dermatophyres 종 뿐만 아니라 현재 또는 미래에 병원성으로 알려진 다른 효모 및 곰팡이류와 같은 곰팡이로부터 유래한 항원들을 코딩하는 것를 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
결론적으로 기생충으로부터 유래한 이종성 유전자 서열의 예들은 예를 들어, Babesia, Toxoplasma, Plasmodium, Eimeria, Isospora, Atoxoplasma, Cystoisospora, Hammondia, Besniotia, SARCOCYSTIS, Frenkelia, Haemoproteus, Leucocytozoon, Theileria, Perkinsus and Gregarina spp.; Pneumocystis carinii와 같은 첨복포자충문(Apicomplexa phylum)의 멤버들; members of the Microspora phylum such as, 예를 들어 Nosema, Enterocytozoon, Encephalitozoon, Septata, Mrazekia, Amblyospora, Ameson, Glugea, Pleistophora 및 Microsporidium spp.와 같은 Microspora phylum 멤버들; 및 예를 들어 Haplosporidium spp., Plasmodium falciparum; P.vivax, P.ovale, P.malaria ; Toxoplasma gondii ; Leishmania mexicana, L.tropica, L.major, L.aethiopica, L.donovani, Trypanosoma cruzi, T. brucei, Schistosoma mansoni, S.haematobium, S. japonium ; Trichinella spiralis ; Wuchereria bancrofti ; Brugia malayli ; Entamoeba histolytica ; Enterobius vermiculoarus ; Taenia solium, T.saginata, Trichomonas vaginatis, T. hominis, T. tenax ; Giardia lamblia ; Cryptosporidium parvum ; Pneumocytis carinii, Babesia bovis, B.divergens, B.microti, Isospora belli, L hominis ; Dientamoeba fragilis ; Onchocerca volvulus ; Ascaris lumbricoides ; Necator americanis ; Ancylostoma duodenal ; Strongyloides stercoralis ; Capillaria philippinensis ; Angiostrongylus cantonensis ; Hymenolepis nana ; Diphyllobothrium latum ; Echinococcus granulosus, E. multilocularis ; Paragonimus westermani, P.caliensis ; Chlonorchis sinensis ; Opisthorchis felineas, G.Viverini, Fasciola hepatica, Sarcoptes scabiei, Pediculus humanus ; Phthirlus pubis ; 및 Dermatobia hominis와 같은 Ascetospora phylum 멤버 뿐 만 아니라 현재 또는 미래에 병원성으로 알려질 다른 기생충을 포함하나 이에 한정하지 아니한다.
삽입되는 메타뉴모바이러스 서열
포유류 MPV의 단백질들. 본 발명은 포유류 MPV 단백질 또는 그것의 절편 및 포유류 MPV로부터 유래하지 아니한 하나 이상의 펩타이드들 또는 단백질들을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열들을 더욱더 포함한다.
특정한 실시예에서 본 발명의 융합 단백질은 포유류 MPV 단백질 또는 그것의 절편 및 폴리히스티딘 태그과 같은 그러나 이에 한정되지 아니하는 펩타이드 태그를 포함한다.
본 발명은 포유류 MPV 단백질 또는 그것의 절편 및 포유류 MPV로부터 유래하지 아니한 하나 이상의 펩타이드들 또는 단백질들을 포함하는 융합 단백질과 더욱 관련되어 있다.
본 발명은 또한 포유류 MPV의 단백질을 코딩하는 핵산들의 유도체와 관련된다.
본 발명은 또한 포유류 MPV의 단백질들의 유도체와 관련된다.
유도체는 추가, 결손, 끝을 자름(truncations), 대체 및 역위(inversions)와 같은 그러나 이에 한정되지 아니하는 단백질의 돌연변이체 형태일 수 있으나 이에 한정되지 아니한다.
유도체는 적어도 상기 단백질의 한 도메인이 다른 단백질로부터 유래한 포유류 MPV 단백질의 키메라 형태일 수 있다.
유도체는 예를 들어 약과 같은 다른 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 포유류 MPV 단백질의 키메라 형태일 수 있다.
NL/1/00(또는 00-1)으로 명명된 바이러스 분리체(isolate)는 포유류 MPV의 Al 변이체이고, 서열번호 95에서 보여주는 유전자 서열을 갖는다.
NL/17/00으로 명명된 바이러스 분리체는 포유류 MPV의 A2 변이체이고, 서열번호 96에서 보여주는 유전자 서열을 갖는다.
NL/1/99로 명명된 바이러스 분리체(또는 99-1)는 포유류 MPV의 B1 변이체이고, 서열번호 94에서 보여주는 유전자 서열을 갖는다.
NL/1/94로 명명된 바이러스 분리체는 포유류 MPV의 B2 변이체이고, 서열번호 97에서 보여주는 유전자 서열을 갖는다.
본 명세서에서 기재된 서열 목록 및 이에 해당하는 서열 번호는 표16에 기재하였다.
포유류 MPV의 단백질은 N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질 또는 M2-2 단백질 또는 그것의 절편일 수 있다.
포유류 MPV의 단백질의 절편은 적어도 25 아미노산, 적어도 50 아미노산, 적어도 75 아미노산, 적어도 100 아미노산, 적어도 125 아미노산, 적어도 150 아미노산, 적어도 175 아미노산, 적어도 200 아미노산, 적어도 225 아미노산, 적어도 250 아미노산, 적어도 275 아미노산, 적어도 300 아미노산, 적어도 325 아미노산, 적어도 350 아미노산, 적어도 375 아미노산, 적어도 400 아미노산, 적어도 425 아미노산, 적어도 450 아미노산, 적어도 475 아미노산, 적어도 500 아미노산, 적어도 750 아미노산, 적어도 1000 아미노산, 적어도 1250 아미노산, 적어도 1500 아미노산, 적어도 1750 아미노산, 적어도 2000 아미노산 또는 적어도 2250 아미노산 길이를 가질 수 있다.
포유류 MPV의 단백질의 절편은 많아야 25 아미노산, 많아야 50 아미노산, 많아야 75 아미노산, 많아야 100 아미노산, 많아야 125 아미노산, 많아야 150 아미노산, 많아야 175 아미노산, 많아야 200 아미노산, 많아야 225 아미노산, 많아야 250 아미노산, 많아야 275 아미노산, 많아야 300 아미노산, 많아야 325 아미노산, 많아야 350 아미노산, 많아야 375 아미노산, 많아야 400 아미노산, 많아야 425 아미노산, 많아야 450 아미노산, 많아야 475 아미노산, 많아야 500 아미노산, 많아야 750 아미노산, 많아야 1000 아미노산, 많아야 1250 아미노산, 많아야 1500 아미노산, 많아야 1750 아미노산, 많아야 2000 아미노산 또는 많아야 2250 아미노산 길이일 수 있다.
일 실시예에서 포유류 MPV의 단백질은 APV 타입 C의 N 단백질과 관련된 것 보다 예를 들어 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(서열번호에 대하여는 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 N 단백질과 유전적 연관관계가 더 밀접한 N 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 APV 타입 C의 N 단백질과 관련된 것 보다 예를 들어 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(서열번호에 대하여는 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 P 단백질과 유전적 연관관계가 더 밀접한 P 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 APV 타입 C의 M 단백질과 관련된 것 보다 예를 들어 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(서열번호에 대하여는 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 M 단백질과 유전적 연관관계가 더 밀접한 M 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 APV 타입 C의 F 단백질과 관련된 것 보다 예를 들어 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(서열번호에 대하여는 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 F 단백질과 유전적 연관관계가 더 밀접한 F 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 APV 타입 C의 M2-1 단백질과 관련된 것 보다 예를 들어 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(서열번호에 대하여는 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 M2-1 단백질과 유전적 연관관계가 더 밀접한 M2-1 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 APV 타입 C의 M2-2 단백질과 관련된 것 보다 예를 들어 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(서열번호에 대하여는 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 M2-2 단백질과 유전적 연관관계가 더 밀접한 M2-2 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 APV 타입 C의 어느 단백질과 관련된 것 보다 예를 들어 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(서열번호에 대하여는 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 G 단백질과 유전적 연관관계가 더 밀접한 G 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 APV 타입 C의 어느 단백질과 관련된 것 보다 예를 들어 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(서열번호에 대하여는 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 SH 단백질과 유전적 연관관계가 더 밀접한 SH 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 APV 타입 C의 어느 단백질과 관련된 것 보다 예를 들어 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(서열번호에 대하여는 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 L 단백질과 유전적 연관관계가 더 밀접한 L 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(해당하는 N 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 366-369에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 N 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치하는 N 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(해당하는 P 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 78-85에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 P 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치하는 P 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(해당하는 M 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 358-361에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 M 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치하는 M 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(해당하는 F 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 18-25에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 F 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치하는 F 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(해당하는 M2-1 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 42-49에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 M2-1 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치하는 M2-1 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(해당하는 M2-2 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 50-57에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 M2-2 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치하는 M2-2 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(해당하는 G 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 26-33에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 G 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치하는 G 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(해당하는 SH 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 86-93에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 SH 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치하는 SH 단백질이다.
본 발명의 실시예에서, 포유류 MPV의 단백질은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스 게놈(해당하는 L 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 34-41에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 L 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치하는 L 단백질이다.
포유류 MPV의 단백질의 절편은 그 절편의 동족성(homologous) 단백질의 일부에 대하여 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스에 의하여 코딩되는 동족성 단백질과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치한다.
특정 실시예에서 본 발명은 F 단백질의 ecto 도메인 및 그것의 동족체를 포함하는 포유류 MPV 단백질의 절편을 제공한다. ecto 도메인을 포함하는 F 단백질의 절편의 동족체는 서열번호 94, 95, 96, 또는 97 바이러스(해당하는 F 단백질의 아미노산 서열들은 서열 번호 18-25에 기재; 표16을 참조)에 의하여 코딩되는 F 단백질의 ecto 도메인을 포함하는 해당하는 절편과 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 일치한다.
일 실시예에서, 본 발명은 포유류 MPV의 서브 A 단백질 및 그것의 절편을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 N 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 N 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군(subgroup) A의 N 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 G 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 G 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 A의 G 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 P 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 P 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 A의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 M 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 M 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 A의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 F 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 F 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 A의 F 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 M2-1 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 M2-1 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 A의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 M2-2 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 M2-2 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 A의 M2-2 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 SH 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 SH 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 A의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 L 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 L 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 A의 L 단백질을 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 포유류 MPV의 서브군 B 단백질 및 그것의 절편을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 N 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 N 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 B의 N 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 G 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 G 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 B의 G 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 P 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 P 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 B의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 M 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 M 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 B의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 F 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 F 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 B의 F 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 M2-1 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 M2-1 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 B의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 M2-2 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 M2-2 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 B의 M2-2 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 SH 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 SH 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 B의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 서열번호 94 또는 97에 의하여 코딩하는 바이러스에 의하여 코딩되는 L 단백질과 관련된 것 보다 서열번호 95 또는 96 바이러스에 의하여 코딩되는 L 단백질과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV의 서브군 B의 L 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 G 단백질이 변이체 A1의 표현형의 G 단백질, NL/1/00 분리체, 변이체 A2의 표현형의 G 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 G 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B1의 표현형의 G 단백질, NL/1/99와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B1의 G 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 G 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/L/99(서열번호 28)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 BL의 G 단백질과 적어도 66 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B1의 G 단백질을 제공한다.
특정한 실시예에서, 포유류 MPV의 G 단백질은 서열번호 119 － 153의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질이 변이체 A1의 표현형의 N 단백질, NL/1/00 분리체, 변이체 A2의 표현형의 N 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 N 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B1의 표현형의 N 단백질, NL/1/99와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/L/99(서열번호 72)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질과 적어도 98.5 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질이 변이체 A1의 표현형의 P 단백질, NL/1/00 분리체, 변이체 A2의 표현형의 P 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 P 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B1의 표현형의 P 단백질, NL/1/99와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/L/99(서열번호 80)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질과 적어도 96%, 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M 단백질이 변이체 A1의 표현형의 M 단백질, NL/1/00 분리체, 변이체 A2의 표현형의 M 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 M 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B1의 표현형의 M 단백질, NL/1/99와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B1의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/L/99(서열번호 64)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 M 단백질과 동일한 포유류 MPV 변이체 B1의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 F 단백질이 변이체 A1의 표현형의 F 단백질, NL/1/00 분리체, 변이체 A2의 표현형의 F 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 F 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B1의 표현형의 F 단백질, NL/1/99와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B1의 F 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 F 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/L/99(서열번호 20)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 F 단백질과 적어도 99% 동일한 포유류 MPV 변이체 B1의 F 단백질을 제공한다.
특정한 실시예에서 포유류 MPV의 F 단백질은 서열번호 248 - 327의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질이 변이체 A1의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/00 분리체, 변이체 A2의 표현형의 M2-1 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B1의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/99와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/L/99(서열번호 44)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질과 적어도 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-2 단백질이 변이체 A1의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/00 분리체, 변이체 A2의 표현형의 M2-2 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B1의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/99와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-2 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-2 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/L/99(서열번호 52)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-2 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-2 단백질이 변이체 A1의 표현형의 SH 단백질, NL/1/00 분리체, 변이체 A2의 표현형의 SH 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 SH 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B1의 표현형의 SH 단백질, NL/1/99와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B1의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 SH 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/L/99(서열번호 88)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 SH 단백질과 적어도 83%, 적어도 85%,적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%,적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B1의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 L 단백질이 변이체 A1의 표현형의 L 단백질, NL/1/00 분리체, 변이체 A2의 표현형의 L 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 LH 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B1의 표현형의 L 단백질, NL/1/99와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B1의 L 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 L 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/L/99(서열번호 36)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 L 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B1의 L 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 G 단백질이 변이체 B1의 표현형의 G 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A2의 표현형의 G 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 G 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A1의 표현형의 G 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A1의 G 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 G 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/00(서열번호 26)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A1의 G 단백질과 적어도 66 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A1의 G 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 P 단백질이 변이체 B1의 표현형의 P 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A2의 표현형의 P 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 P 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A1의 표현형의 P 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A1의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 P 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/00(서열번호 78)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A1의 P 단백질과 적어도 96 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A1의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M 단백질이 변이체 B1의 표현형의 M 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A2의 표현형의 M 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 M 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A1의 표현형의 M 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A1의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/00(서열번호 62)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A1의 M 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A1의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 F 단백질이 변이체 B1의 표현형의 F 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A2의 표현형의 F 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 F 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A1의 표현형의 F 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A1의 F 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 F 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/00(서열번호 18)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A1의 F 단백질과 적어도 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A1의 F 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-1 단백질이 변이체 B1의 표현형의 M2-1 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A2의 표현형의 M2-1 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A1의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-1 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/00(서열번호 42)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-1 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-2 단백질이 변이체 B1의 표현형의 M2-2 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A2의 표현형의 M2-2 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A1의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-2 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-2 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/00(서열번호 50)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-2 단백질과 적어도 96% 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-2 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 SH 단백질이 변이체 B1의 표현형의 SH 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A2의 표현형의 SH 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 SH 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A1의 표현형의 SH 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A1의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 SH 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/00(서열번호 86)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A1의 SH 단백질과 적어도 84% 또는 적어도 90 % 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A1의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 L 단백질이 변이체 B1의 표현형의 L 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A2의 표현형의 L 단백질, NL/17/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 L 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A1의 표현형의 L 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A1의 L 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 L 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/00(서열번호 34)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A1의 L 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A1의 L 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 G 단백질이 변이체 B1의 표현형의 G 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 G 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 G 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A2의 표현형의 G 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A2의 G 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 G 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/17/00(서열번호 27)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 G 단백질과 적어도 66 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV의 변이체 A2의 G 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 N 단백질이 변이체 B1의 표현형의 N 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 N 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 N 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A2의 표현형의 N 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A2의 N 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 N 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/17/00(서열번호 71)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 N 단백질과 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV의 변이체 A2의 N 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질이 변이체 B1의 표현형의 P 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 P 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 P 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A2의 표현형의 P 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/17/00(서열번호 79)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질과 적어도 96 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질이 변이체 B1의 표현형의 M 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 M 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 M 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A2의 표현형의 M 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/17/00(서열번호 63)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 F 단백질이 변이체 B1의 표현형의 F 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 F 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 F 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A2의 표현형의 F 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A2의 F 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 F 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/17/00(서열번호 19)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 F 단백질과 적어도 98 %, 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질이 변이체 B1의 표현형의 M2-1 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A2의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/17/00(서열번호 43)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질이 변이체 B1의 표현형의 M2-2 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A2의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/17/00(서열번호 51)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질과 적어도 96 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질이 변이체 B1의 표현형의 SH 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 SH 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 SH 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A2의 표현형의 SH 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/17/00(서열번호 87)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질과 적어도 84% 또는 적어도 90 % 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질이 변이체 B1의 표현형의 L 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 L 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 B2의 표현형의 L 단백질, NL/1/94 분리체에 관련된 것 보다 변이체 A2의 표현형의 L 단백질, NL/1/00과 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/17/00(서열번호 35)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질이 변이체 B1의 표현형의 G 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 G 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 A2의 표현형의 G 단백질, NL/17/00 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B2의 표현형의 G 단백질, NL/1/94와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/94(서열번호 29)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질과 적어도 66 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질이 변이체 B1의 표현형의 N 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 N 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 A2의 표현형의 N 단백질, NL/17/00 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B2의 표현형의 N 단백질, NL/1/94와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/94(서열번호 73)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질이 변이체 B1의 표현형의 P 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 P 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 A2의 표현형의 P 단백질, NL/17/00 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B2의 표현형의 P 단백질, NL/1/94와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/94(서열번호 81)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질과 적어도 96 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질이 변이체 B1의 표현형의 M 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 M 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 A2의 표현형의 M 단백질, NL/17/00 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B2의 표현형의 M 단백질, NL/1/94와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/94(서열번호 65)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질과 동일한 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질이 변이체 B1의 표현형의 F 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 F 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 A2의 표현형의 F 단백질, NL/17/00 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B2의 표현형의 F 단백질, NL/1/94와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/94(서열번호 21)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질이 변이체 B1의 표현형의 M2-1 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 A2의 표현형의 M2-1 단백질, NL/17/00 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B2의 표현형의 M2-1 단백질, NL/1/94와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/94(서열번호 45)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질과 적어도 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질이 변이체 B1의 표현형의 M2-2 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 A2의 표현형의 M2-2 단백질, NL/17/00 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B2의 표현형의 M2-2 단백질, NL/1/94와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/94(서열번호 53)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 SH 단백질이 변이체 B1의 표현형의 SH 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 SH 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 A2의 표현형의 SH 단백질, NL/17/00 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B2의 표현형의 SH 단백질, NL/1/94와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B2의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 SH 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/94(서열번호 89)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질과 적어도 84 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B2의 SH 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질이 변이체 B1의 표현형의 L 단백질, NL/L/99 분리체, 변이체 A1의 표현형의 L 단백질, NL/1/00 분리체 또는 변이체 A2의 표현형의 L 단백질, NL/17/00 분리체에 관련된 것 보다 변이체 B2의 표현형의 L 단백질, NL/1/94와 유전적으로 더욱 밀접한 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질을 제공한다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질의 아미노산 서열이 표현형 NL/1/94(서열번호 37)로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질과 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 % 동일한 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질을 제공한다.
일 실시예에서, 서열 동일성의 퍼센트는 전장 단백질의 배열에 기초한다.
다른 실시예에서, 서열 동일성의 퍼센트는 아미노산 서열이 25 아미노산, 50 아미노산, 75 아미노산, 100 아미노산, 125 아미노산, 150 아미노산, 175 아미노산, 200 아미노산, 225 아미노산, 250 아미노산, 275 아미노산, 300 아미노산, 325 아미노산, 350 아미노산, 375 아미노산, 400 아미노산, 425 아미노산, 450 아미노산, 475 아미노산, 500 아미노산, 750 아미노산, 1000 아미노산, 1250 아미노산, 1500 아미노산, 1750 아미노산, 2000 아미노산 또는 2250 아미노산 길이일 수 있는 단백질의 연속적인 아미노산 서열의 배열에 기초한다.
본 발명은 포유류 MPV로부터 유래한 핵산 서열을 더 제공한다.
본 발명은 또한 포유류 MPV로부터 유래한 핵산서열의 유도체를 제공한다.
특정한 실시예에서 상기 핵산들은 변형된다.
일 실시예에서, 본 발명의 핵산은 상기 기재된 것과 같은 포유류 MPV의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 코딩한다.
일 실시예에서, 본 발명의 핵산은 상기 기재된 것과 같은 포유류 MPV의 서브 군 A의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 코딩한다.
특정 실시예에서, 포유류 MPV의 G 유전자는 서열번호 98 - 132의 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
특정 실시예에서, 포유류 MPV의 G 유전자는 서열번호 168 - 247의 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
일 실시예에서, 본 발명의 핵산은 상기 기재된 것과 같은 포유류 MPV의 서브 군 B의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 코딩한다.
일 실시예에서, 본 발명의 핵산은 상기 기재된 것과 같은 포유류 MPV의 변이체 A1의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 코딩한다.
일 실시예에서, 본 발명의 핵산은 상기 기재된 것과 같은 포유류 MPV의 변이체 A2의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 코딩한다.
일 실시예에서, 본 발명의 핵산은 상기 기재된 것과 같은 포유류 MPV의 변이체 B1의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 코딩한다.
일 실시예에서, 본 발명의 핵산은 상기 기재된 것과 같은 포유류 MPV의 변이체 B2의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 코딩한다.
일 실시예에서 본 발명은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 50 %, 적어도 55 %, 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 동일한 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
일 실시예에서 본 발명은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97의 뉴클레오타이드 서열의 절편과 적어도 50 %, 적어도 55 %, 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 동일한 뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 여기서 그 절편은 적어도 25 뉴클레오타이드, 적어도 50 뉴클레오타이드, 적어도 75 뉴클레오타이드, 적어도 100 뉴클레오타이드, 적어도 150 뉴클레오타이드, 적어도 200 뉴클레오타이드, 적어도 250 뉴클레오타이드, 적어도 300 뉴클레오타이드, 적어도 400 뉴클레오타이드, 적어도 500 뉴클레오타이드, 적어도 750 뉴클레오타이드, 적어도 1,000 뉴클레오타이드, 적어도 1,250 뉴클레오타이드, 적어도 1,500 뉴클레오타이드, 적어도 1,750 뉴클레오타이드, 적어도 2,000 뉴클레오타이드, 적어도 2,00 뉴클레오타이드, 적어도 3,000 뉴클레오타이드, 적어도 4,000 뉴클레오타이드, 적어도 5,000 뉴클레오타이드, 적어도 7,500 뉴클레오타이드, 적어도 10,000 뉴클레오타이드, 적어도 12,500 뉴클레오타이드, 또는 적어도 15,000 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
일 실시예에서 본 발명의 핵산 서열은 서열번호 98 - 132 ; 168 - 247 ; 22 - 25 ; 30 - 33 ; 38 - 41 ; 46 - 49 ; 54 - 57 ; 58 - 61 ; 66 - 69 ; 74 - 77 ; 82 - 85 ; 또는 90 - 93 중의 하나의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 50 %, 적어도 55 %, 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99.5 % 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 본 발명의 핵산 서열은 낮은 스트린젠시(stringency), 중간 스트린젠시 또는 높은 스트린젠시 조건 하에서 서열번호 94, 95, 96, 또는 97의 뉴클레오타이드 서열 중 하나와 하이브리다이제이션을 할 수 있다.
본 발명의 특정한 실시예에서, 발명의 핵산 서열은 서열번호 98 - 132 ; 168 - 247 ; 22 - 25 ; 30 - 33 ; 38 - 41 ; 46 - 49 ; 54 - 57 ; 58 - 61 ; 66 - 69 ; 74 - 77 ; 82 - 85 ; 또는 90 - 93 중의 하나의 뉴클레오타이드 서열과 낮은 스트린젠시(stringency), 중간 스트린젠시 또는 높은 스트린젠시 조건 하에서 하이브리다이제이션을 할 수 있다.
특정 실시예에서 핵산은 서열번호 94, 95, 96, 또는 97의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 25 뉴클레오타이드, 적어도 50 뉴클레오타이드, 적어도 75 뉴클레오타이드, 적어도 100 뉴클레오타이드, 적어도 150 뉴클레오타이드, 적어도 200 뉴클레오타이드, 적어도 250 뉴클레오타이드, 적어도 300 뉴클레오타이드, 적어도 400 뉴클레오타이드, 적어도 500 뉴클레오타이드, 적어도 750 뉴클레오타이드, 적어도 1,000 뉴클레오타이드, 적어도 1,250 뉴클레오타이드, 적어도 1,500 뉴클레오타이드, 적어도 1,750 뉴클레오타이드, 적어도 2,000 뉴클레오타이드, 적어도 2,00 뉴클레오타이드, 적어도 3,000 뉴클레오타이드, 적어도 4,000 뉴클레오타이드, 적어도 5,000 뉴클레오타이드, 적어도 7,500 뉴클레오타이드, 적어도 10,000 뉴클레오타이드, 적어도 12,500 뉴클레오타이드, 또는 적어도 15,000 뉴클레오타이드 크기의 하이브리다이제이션을 한다.
본 발명은 포유류 MPV의 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 및 항원-결합 절편을 더 제공한다.
본 발명의 항체는 포유류 MPV의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다.
특정한 실시예에서 상기 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 서브 군 A의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 서브 군 B의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 변이체 A1의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 서브 군 A2의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 서브 군 B1의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 서브 군 B2의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다.
5.1.3. 이종성 유전자 서열의 삽입
본 발명의 바이러스 매개체 내부에 대한 외래 유전자 서열의 삽입은 이종성 서열로 바이러스 코딩 지역을 완전히 또는 부분적으로 대체하거나, 또는 이종성 뉴클레오티드 서열을 바이러스 게놈에 부가하므로서 이루어질 수 있다. 완전 대체는 아마도 PCR-유도 돌연변이의 사용을 통하여 가장 잘 달성할 수 있을 것이다. 간단히 말하면, PCR-프라이머 A는 5'에서 3' 말단: 클래스 IIS 제한 효소부위(예를 들어, 특별한 서열을 인식하나 그 서열의 상류 또는 하류로 DNA를 절단하는 "시프터(shifer)" 효소)와 같은 단일의 제한 효소부위; PIV 유전자 지역에 대하여 상보성이 있는 뉴클레오티드의 신장; 및 이종 서열의 카르복시-말단 코딩부에 대하여 상보성이 있는 뉴클레오티드의 신장을 포함한다. PCR-프라이머 B는 5'에서 3' 말단: PIV 유전자에 대하여 상보성이 있는 뉴클레오티드의 신장; 및 외래 유전자의 5' 코딩부에 대응하는 뉴클레오티드의 신장을 포함한다. 이러한 프라이머들을 이용한 외래 유전자의 클론화된 복제와 PCR 반응 후에, 그 프로덕트는 단일의 제한 부위를 이용하여 삭제 및 클론화될 수 있다. 클래스 IIS 효소에 의한 소화 및 순수 파지 폴리머라아제에 의한 전사는 외래 유전자 삽입으로 인한 PIV 유전자의 비해독 말단 추출물을 포함하는 RNA 분자를 생산한다. 교호적인 일실시예에서, PCR 프라이머 결합(primed) 반응은 박테리오파지 촉진자 서열을 포함하는 두가닥 DNA와, RNA 주형이 클로닝 없이 직접 전사될 수 있도록 하이브리드 유전자 서열을 제조하는데 사용될 수 있다.
이종성 뉴클레오티드 서열은 본 발명에 따른 바이러스의 다양한 위치에서 부가되거나 삽입될 수 있다. 일실시예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 1 위치에서 부가되거나 삽입될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 2 위치에서 부가되거나 삽입될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 3 위치에서 부가되거나 삽입될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 4 위치에서 부가되거나 삽입될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 5 위치에서 부가되거나 삽입될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 6 위치에서 부가되거나 삽입될 수 있다. 여기서 사용한 "위치"라는 용어는 전사된 바이러스 게놈 상의 이종성 뉴클레오티드의 위치를 의미한다. 예를 들어, 1 위치는 전사된 첫번째 유전자를 의미하고, 2 위치는 전사된 두번째 유전자를 의미한다. 바이러스 게놈의 낮은 숫자 위치에 이종성 뉴클레오티드 서열을 삽입하면 일반적으로 높은 숫자 위치에 삽입하는 것보다 이종성 뉴클레오티드 서열이 강하게 발현되는데, 이는 바이러스의 게놈에 절쳐서 형성되는 전사 구배(transcription gradient) 때문이다. 그러나, 전사 구배는 또한 바이러스 mRNA를 특정 비율로 산출하기도 한다. 외래 유전자의 삽입은 이들 비율을 교란시키고 합성되는 바이러스 단백질 양이 달라지는 결과를 가져와 바이러스 복제에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 전사 기울기와 복제 반응 속도 특성 모두 삽입 부위를 선택할 때 고려하여야만 한다. 예를 들어, b/h PIV3 벡터의 2 위치에서 이종성 뉴클레오티드 서열의 삽입하면 이종성 유전자의 복제 속도와 발현 수준은 가장 높게 나타낸다. 본 발명의 실시예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열의 강한 발현을 원한다면 낮은 숫자 위치에서 이종성 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시예에서, 이종성 서열은 1, 2 또는 3 위치에 부가되거나 삽입된다.
본 발명에 따라 바이러스 내부로 이종성 뉴클레오티드 서열을 삽입할 때, 이종성 유전자의 코팅 서열의 말단과 하류 유전자의 코딩 서열의 시작점 사이에 유전자간 영역은 바라는 효과를 달성할 수 있도록 변화될 수 있다. 여기에서 사용된 "유전자간 영역(intergenic region)"이라는 용어는 한 유전자의 정지 신호와, 다음 하류 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열의 개시 코돈(예를 들어, AUG) 사이의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 유전자간 영역은 예를 들어, 전사 개시 부위와 유전자의 코딩 서열의 개시점(AUG) 사이에 유전자의 비코딩 부분을 포함할 수 있다. 이러한 비코딩 부분은 bPIV3 mRNA와 다른 바이러스 유전자 내에서 자연적으로 발생하는데, 하기 표 2에 이를 예시하였다.
bPIV3 mRNA 에서의 비코딩 부분의 길이
Figure pat00002
다양한 실시예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열과 하류 유전자 사이의 유전자간 영역은 적어도 10nt의 길이, 적어도 20nt의 길이, 적어도 30nt의 길이, 적어도 50nt의 길이, 적어도 75nt의 길이, 적어도 100nt의 길이, 적어도 125nt, 적어도 150nt의 길이, 적어도 175nt의 길이 또는 적어도 200nt의 길이로 서로 독립적으로 조절될 수 있다. 다른 실시예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열과 하류 유전자 사이의 유전자간 영역은 최대 10nt의 길이, 최대 20nt의 길이, 최대 30nt의 길이, 최대 50nt의 길이, 최대 75nt의 길이, 최대 100nt의 길이, 최대 125nt, 최대 150nt의 길이, 최대 175nt의 길이 또는 최대 200nt의 길이로 서로 독립적으로 조절될 수 있다. 다양한 실시예에서, 바이러스 게놈 내의 바라는 유전자의 비코딩 부분은 적어도 10nt의 길이, 적어도 20nt의 길이, 적어도 30nt의 길이, 적어도 50nt의 길이, 적어도 75nt의 길이, 적어도 100nt의 길이, 적어도 125nt, 적어도 150nt의 길이, 적어도 175nt의 길이 또는 적어도 200nt의 길이로 서로 독립적으로 조절될 수 있다. 다른 실시예에서, 바이러스 게놈 내의 바라는 유전자의 비코딩 부분은 최대 10nt의 길이, 최대 20nt의 길이, 최대 30nt의 길이, 최대 50nt의 길이, 최대 75nt의 길이, 최대 100nt의 길이, 최대 125nt, 최대 150nt의 길이, 최대 175nt의 길이 또는 최대 200nt의 길이로 서로 독립적으로 조절될 수 있다.
이종성 뉴클레오티드 서열을 삽입할 때, 바라는 효과를 얻기 위하여 위치적 효과와 유전자간 영역 조작을 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 이종성 뉴클레오티드 서열을 1, 2, 3, 4, 5 및 6 위치 중에서 그 위치를 선택하여 부가 또는 삽입할 수 있고, 이종 뉴클레오티드 서열과 다음 하류 유전자 사이의 유전자간 영역을 변경시킬 수 있다(표 3 참조). 대표적인 실시예에서, hRSV F 유전자는 b/h PIV3 벡터의 1 위치에 삽입되고, F 유전자와 N 유전자(예를 들어, F의 다음 하류 유전자) 사이의 유전자간 영역은 177 뉴클레오티드로 변경될 수 있다. 본 발명에 포섭되는 좀 더 많은 조합들이 있으며, 표 3에 몇몇 조합을 예시하였다.
이종성 뉴클레오티드 서열의 삽입 모드의 예
Figure pat00003
삽입된 이종성 뉴클레오티드 서열의 목적(예를 들어, 강한 면역원성을 갖는 것)에 따라, 삽입 위치와 삽입된 이종성 뉴클레오티드 서열의 유전자간 영역의 길이를 예를 들어, 다음에 예시된 분석법에 따라 측정된 복제의 반응 속도 특성과 단백질 또는 mRNA 발현 수준과 같은 다양한 지표에 의해 결정될 수 있다; 플라크 분석(plaque assay), 형광성-포커스 분석(fluorescent-focus assay), 감염성 중심 분석(infectious center assay), 형질전환 분석(transformation assay), 종말점 희석 분석(endpoint dilution assay), 플레이팅 효율(efficiency of plating), 전자현미경 분석(electron microscopy), 헤마글루틴화(hemagglutination), 바이러스 효소 활성 측정, 바이러스 중화법, 헤마글루틴화 억제(hemagglutination inhibition), 컴플리멘트 픽세이션(compliment fixation), 면역 염색(immunostaining), 면역침전법과 면역흡입법(immunoprecipitation and immunoblotting), 효소-연계 면역 측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 핵산 검출법(nuclei acid detection, 예를 들어 Southern blot analysis, Nothern blot analysis, Western blot analysis), 성장 곡선법(growth curve), 리포터 유전자 사용법(employment of a reporter gene, 예를 들어 단백질 발현을 관찰하기 위하여 관심있는 이종성 유전자와 같은 류의 바이러스 게놈에 통합된, Green Fluorescence Protein(GFP) 또는 enhanced Green Fluorescence Protein(eGFP)와 같은 리포터 유전자를 사용하여) 또는 이들의 조합. 이러한 분석법을 실시하는 방법은 당업계(예를 들어, Flint et al., PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press pp 25-56, 전체 텍스트는 본 명세서에 레퍼런스로 통합된다)에 잘 알려져 있으며, 아래 예시에 한정되지 않는다.
예를 들어, 발현 레벨은 본 발명에 따른 바이러스로 배양하여 세포를 감염시키고,이어서 예를 들어 이종성 서열의 유전자 프로덕트에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블로트 분석이나 ELISA에 의해 단백질 발현 레벨을 측정하거나, 예를 들어, 이종성 서열에 특이적인 탐지자(probe)를 사용한 노턴 블로트 분석에 의해 RNA 발현 레벨을 측정하므로서 결정될 수 있다. 유사하게, 이종성 서열의 발현 레벨은 동물 모델을 감염시키고 동물 모델 내에서 본 발명의 재조합 바이러스의 이종성 서열로부터 발현된 단백질의 레벨을 측정하므로서 결정될 수 있다. 단백질 수준은 감염된 동물로부터 조직 샘플을 얻은 다음 그 조직 샘플을 이종성 서열의 유전자 프로덕트에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 흡입 분석하거나 ELISA를 이용함으로써 측정할 수 있다. 더불어, 동물 모델이 사용된다면, 이종성 서열의 유전자 프로덕트에 대하여 동물에 의해 생산된 항체가(titer of antibodies)는 ELISA를 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업자에게 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다.
이종성 서열이 바이러스 게놈 내에서 뉴클레오티드 서열에 동종화됨에 따라, 탐촉자와 항체가 이종성 서열 또는 그 유전자 프로덕트에 정말로 특이적인지 주의를 기울여야 한다.
특정한 실시예에서, 키메라 b/h PIV3 RSV 또는 b/h PIV3 hMPV 또는 b/h PIV3 RSV F 및 hMPV F로부터 RSV 또는 hMPV의 F 단백질의 발현 레벨은 당업자에게 알려진 기술로 결정될 수 있다. F 단백질의 발현 레벨은 본 발명에 따른 키메라 바이러스로 배양하여 세포를 감염시키고, 예를 들어 hMPV의 F 단백질 및/또는 G 단백질에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블로트 분석이나 ELISA에 의해 단백질 발현 레벨을 측정하거나, 또는 예를 들어, 인간 메타뉴모바이러스의 F 유전자 및/또는 G 유전자에 특이적인 탐촉자(probe)를 사용한 노턴 블로트 분석에 의해 RNA 발현 레벨을 측정하므로서 결정될 수 있다. 유사하게, 이종성 서열의 발현 레벨은 동물 모델을 감염시키고 동물 모델 내에서 F 단백질 및/또는 G 단백질의 레벨을 측정한 동물 모델을 사용하므로서 결정될 수 있다. 단백질 레벨은 감염된 동물로부터 조직 샘플을 얻은 다음, 그 조직 샘플을 이종성 서열의 F 단백질 및/또는 G 단백질에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블로트 분석이나 ELISA를 이용하므로서 측정될 수 있다. 더불어, 동물 모델이 사용된다면, F 단백질 및/또는 G 단백질에 대하여 동물에 의해 생산된 항체가(titer of antibodies)는 ELISA를 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업자에게 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 재조합 바이러스의 복제 속도는 당업자에게 알려진 기술로 결정될 수 있다.
특정한 실시예에서, 바이러스 게놈 내에서 이종성 서열의 최적 위치 및 유전자간 지역의 최적 길이 확인을 촉진하기 위하여, 이종성 서열은 리포터 유전자를 코딩한다. 일단 최적의 파라미터가 결정되면, 리포터 유전자는 항원을 선택하는 이종성 뉴클레오티드 서열로 대체된다. 당업자에게 알려진 어떤 리포터 유전자도 본 발명의 방법에 사용될 수 있는데, 5.5절에서 좀 더 자세히 설명한다.
재조합 바이러스의 복제 속도는 당업자에게 알려진 모든 표준 기술로 결정될 수 있다. 복제 속도는 바이러스의 성장속도로 대표되며, 감염 경과 시간에 대한 바이러스가(virus titer)를 플로팅하므로서 결정될 수 있다. 바이러스가는 당업자에게 알려진 어떠한 기술로도 측정될 수 있다. 특정한 실시예에서, 바이러스를 포함하는 현탁액은 바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포로 배양된다. 본 발명의 방법으로 사용될 수 있는 세포 타입은 베로(Vero) 세포, LLC-MK-2 세포, Hep-2 세포, LF 1043(HEL) 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, 293 T 세포, QT 6 세포, QT 35 세포, 닭 엠브리오 피브로블라스트(CEF) 또는 tMK 세포 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다. 세포로 바이러스를 배양한 후에는 감염된 세포의 수가 결정된다. 특정한 실시예에서, 바이러스는 리포터 유전자를 포함한다. 이 경우, 리포터 유전자를 발현하는 세포의 수는 감염된 세포의 수를 대표한다. 특정한 실시예에서, 바이러스는 eGFP를 코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하며, eGFP를 발현하는 세포의 수 즉, 바이러스로 감염된 세포의 수가 FACS를 사용하여 결정된다.
특정한 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 복제 속도는 동등한 조건하에서 야생 바이러스의 복제속도의 최대 20% 정도인데, 이 재조합 바이러스는 상기 야생 바이러스에서 유래한 것이다. 동등한 조건이란, 최초의 바이러스가, 세포의 스트레인, 배양온도, 성장 매개체, 세포의 수 및 복제속도에 영향을 줄 수 있는 다른 테스트 조건이 모두 동일하다는 의미이다. 예를 들어, 1 위치에서 RSV's F 유전자로 b/h PIV3를 복제하는 속도는 bPIV3의 복제속도의 최대 20%이다.
특정한 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 복제속도는 동등한 조건하에서 유도된 재조합 바이러스로부터 야생형 바이러스의 복제 속도의 최대 5%, 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 90%이다. 특정한 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 복제 속도는 동등한 조건하에서 얻어진 야생형 바이러스 복제 속도의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%이다. 특정한 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 복제 속도는 동등한 조건하에서 얻어진 야생형 바이러스 복제 속도의 5% 내지 20%, 10% 내지 40%, 25% 내지 50%, 40% 내지 75%, 50% 내지 80% 또는 75% 내지 90%이다.
다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스 내에서 이종성 서열의 발현 레벨은 동등한 조건하에서 얻어진 야생형 바이러스의 F 단백질 발현 레벨의 최대 20%이다. 동등한 조건이란, 최초의 바이러스가, 세포의 스트레인, 배양온도, 성장 매개체, 세포의 수 및 복제속도에 영향을 줄 수 있는 다른 테스트 조건이 모두 동일하다는 의미이다. 예를 들어, bPIV3의 1 위치에서 MPV의 F 단백질의 이종성 서열의 발현 레벨은 bPIV3의 소(bovine) F 단백질의 발현레벨의 최대 20%이다.
특정한 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스 내에서 이종성 서열의 발현 레벨은 동등한 조건하에서 유도된 재조합 바이러스로부터 야생형 바이러스의 F 단백질 발현 레벨의 최대 5%, 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 90%이다. 특정한 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스 내에서 이종성 서열의 발현 레벨은 동등한 조건하에서 얻어진 야생형 바이러스의 F 단백질 발현 레벨의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%이다. 특정한 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스 내에서 이종성 서열의 발현 레벨은 동등한 조건하에서 유도된 야생형 바이러스의 F 단백질 발현 레벨의 5% 내지 20%, 10% 내지 40%, 25% 내지 50%, 40% 내지 75%, 50% 내지 80% 또는 75% 내지 90%이다.
5.1.4. HN 유전자 내부로 이종성 유전자 서열의 삽입
PIV의 헤마굴루틴과 뉴라미니다아제 활성을 초래하는 단백질은 단일의 유전자인 HN에 의해 코팅된다. HN 단백질은 바이러스의 주된 표면 당단백질이다. 파라인플루엔자, 헤마굴루틴 및 뉴라미니다아제 단백질과 같은 다양한 바이러스들이 많은 항원성 부위를 포함하는 것으로 알려져 있다. 결론적으로, 이러한 단백질은 감염 후에 체액 면역 반응을 위한 잠재적인 타겟이다. 따라서, HN의 항원성 부위를 외래 단백질의 부분으로 치환하는 것은 이러한 외래 펩타이드에 대하여 강력한 체액 면역 반응을 제공할 수 있다. 만일 HN 분자 내에 한 서열이 삽입되어 그 HN의 외표면 위에서 발현된다면, 그것은 면역원성이다. 예를 들어, HIV의 gp160으로부터 유도된 펩타이드가 HN 단백질의 항원성 부위에 대체된다면, gp160과 HN 단백질 양자에 대한 체액 면역 반응을 가져온다. 다른 접근법으로서, 외래 펩타이드 서열이 어떠한 바이러스 서열을 제거함이 없이도 항원성 부위 내에 삽입될 수 있다. 그러한 구조의 발현 프로덕트는 외래 항체에 대한 백신으로 유용할 수 있고, 일찌기 제기된 문제, 종두 숙주(vaccinated host) 내에서 재조합 바이러스의 증식을 실제로 회피할 수 있다. 항원성 부위에만 치환된 손상되지 않은 HN 분자는 HN이 기능하도록 하며, 바이러스가 생육가능한 구조를 갖도록 한다. 그러므로, 이러한 바이러스는 부가적인 도움 없이도 자랄 수 있다. 바이러스는 또한 돌발적인 일탈의 위험성을 피하기 위하여 다른 방법으로 약독화(attenuate)될 수 있다.
다른 히브리드 구조체는 세포 표면위에서 단백질들을 발현하거나 또는 이들이 세포로부터 방출될 수 있도록 제조될 수 있다.
표면 당단백질로서, HN은 세포 표면으로 운반하는데 필요한 아미노 말단 절단성 신호 서열과, 막 고정에 필요한 카르복시 말단 서열을 갖고 있다. 세포 표면 상에 손상되지 않은 외래 단백질을 발현하기 위하여, 히브리드 단백질을 생성할 수 있도록 이러한 HN 신호를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 이 경우, 융합 당백질은 부가적인 내부 촉진자로부터 분리된 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 교호적으로, 오직 운반 신호만 존재하고 막 고정 도메인이 존재하지 않는다면, 단백질은 세포 밖으로 분리된다.
5.1.5. 비시스트로닉 ( bicistronic ) RNA 의 구조
비시스트로닉 mRNA는 바이러스 서열 운반의 내부적 개시를 허용하고, 규칙성 말단 개시 부위로부터 외래 단백질 코딩 서열의 발현을 고려하도록 구성될 수 있다. 교호적으로, 비시스트로닉 mRNA 서열은 바이러스 서열이 규칙성 말단 오픈 리딩 프레임으로부터 해독되는 경우 구성될 수 있는 반면, 외래 서열은 내부 부위로부터 개시된다. 일정한 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 서열이 이용될 수 있다. 선택된 IRES 서열은 파라인플루엔제 패킹 제한에 의해 간섭받는 것을 피할 수 있도록 충분히 짧아야 한다. 따라서, 이러한 비시스트로닉 접근을 위해 선택된 IRES는 길이적으로 500개의 뉴클레오티드보다 적은 것이 선호되며, 길이적으로 250개의 뉴클레오티드보다 적은 것이 이상적이다. 특정 실시예에서, IRES는 피코르나바이러스로부터 유래되고, 어떠한 부가적인 피코르나바이러스 서열을 포함하지 않는다. 바람직한 IRES 요소는 포유류 BiP IRES와 씨형 간염 바이러스 IRES를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
교호적으로, 외래 단백질은 개시 부위와 폴리아데닐레이션 부위를 갖는 새로운 내부 전사 유니트로부터 발현될 수 있다. 다른 실시예에서, 외래 유전자는 PIV 유전자 내부로 삽입되어 그 결과, 발현된 단백질이 융합 단백질로 된다.
5.2 재조합 cDNA 및 RNA 주형을 이용한 이종성 유전자 프로덕트의 발현
전술한 바와 같이 제조된 재조합 주형은 적절한 숙주 세포 내에서 이종성 유전자 프로덕트를 발현하거나 이종성 유전자 프로덕트를 발현하는 키메라 바이러스를 생성하는 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 일실시예에서, 재조합 cDNA는 적절한 숙주 세포를 감염시키는데 사용될 수 있고, 그 결과로 생기는 RNA는 높은 레벨에서 이종성 유전자 프로덕트의 발현을 지시할 수 있다. 높은 레벨의 발현을 제공하는 숙주 세포 시스템은 PIV로 중복감염되어 PIV 기능 등을 보충하도록 조절된 세포 라인과 같은 바이러스 기능을 제공하는 연속적인 세포 라인을 포함한다.
본 발명의 교호적인 실시예에서, 재조합 주형들은 이종성 유전자 프로덕트의 발현을 달성할 수 있도록 바이러스 폴리머라아제 단백질을 발현하는 세포 라인을 감염(transfect)시키는데 사용될 수 있다.
이 때문에, L 단백질과 같은 폴리머라아제 단백질을 발현하는 감염된 세포 라인은 적절한 숙주 세포들로서 활용될 수 있다. 숙주 세포는 HN, NP 또는 N과 같은 다른 바이러스 기능이나 부가적인 기능을 제공하기 위하여 마찬가지로 설계될 수 있다.
다른 실시예에서, 보조 바이러스는 이종성 유전자 프로덕트의 발현을 달성하기 위하여 세포들에 의하여 활용된 RNA 폴리머라아제 단백질을 제공할 수 있다. 다른 실시예에서, 세포들은 N 또는 NP, P, M2-1 및 L 단백질들과 같은 바이러스 단백질들을 코딩하는 벡터들로 감염될 수 있다.
다른 기술들이 이종성 유전자 프로덕트의 발현을 검출하는데 사용될 수 있다(예를 들어, Flint et al., PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press pp 25-56를 참조하라. 전체 텍스트가 여기에 레퍼런스로 통합된다). 대표적인 분석으로서, 바이러스로 감염된 세포들에 메탄올 또는 아세톤으로 침투시켜 이종성 유전자 프로덕트들에 대해서 대항하는 항체로 배양된다. 첫번째 항체를 인식한 두번째 항체가 그 다음에 부가된다. 이 두번째 항체는 보통 이종성 유전자 프로덕트의 발현이 보여지거나 또는 검출될 수 있도록 인디케이터에 접합된다.
5.3. 재조합 바이러스 입자의 레스큐( RESCUE )
키메라 바이러스성 바이러스를 마련하기 위하여, 변형된 cDNA, 바이러스 RNA, 또는 플러스 또는 마이너스 방향으로 PIV 게놈 및/또는 외래 단백질을 암호화하는 RNA를 사용하여 세포를 감염시켜, 복제와 레스큐에 필요한 바이러스 단백질 및 기능을 제공하는 세포를 얻을 수 있다.
교호적으로, 세포들은 PIV 게놈 및/또는 외래 단백질을 위해 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자에 의해 감염되는 동안 또는 그 전이나 후에 보조 바이러스로 감염될 수 있다. 합성 재조합 플라스미드 PIV DNAs와 RNA가 복제될 수 있고 당업계에 알려진 모든 기술들, 예를 들어, 1992. 11. 24에 특허된 미국 특허 5,166,057; 1998. 12. 29에 특허된 미국 특허 5,854,037; 1996. 2. 20에 공고된 유럽 특허공고 EP 0702085A1; 미국 출원번호 09/152,845; 1997. 4.3에 공개된 국제출원공개 PCT WO97/12032; 1996.11.7에 공개된 W096/34625; 유럽특허공고 EP-A780475; 1999. 1. 21에 공개된 WO99/02657; 1998. 11.26에 공개된 WO98/53078; 1998. 1. 22에 공개된 WO98/02530; 1999. 4. 1에 공개된 WO99/15672; 1998. 4. 2에 공개된 WO98/13501; 1997. 2. 20에 공개된 WO97/06270; 및 1997. 6. 25에 공개된 EPO 47SA1에 개시된 기술들에 의해서 감염성 바이러스 입자들 내부로 레스큐될 수 있다. 여기에 상기 레퍼런스의 전문에 통합된다.
본 발명의 일실시예에서, 바이러스 폴리머라아제에 의한 인식과 성숙한 바이러스 입자(virion)를 생산하는데 필요한 패키징 신호에 요구되는 역 가닥 바이러스 RNA의 비코딩 지역을 포함하는 합성 재조합 바이러스 RNA가 제조될 수 있다. 역 가닥 RNA 바이러스들을 레스큐하기 위한 상반된 유전학적 접근을 적용하는데 사용될 수 있는 다른 많은 접근방법들이 있다. 먼저, 재조합 RNA들은 재조합 DNA 주형으로부터 합성되고 정제된 폴리머라아제 컴플렉스로 시험관 내에서 재구성되어, 세포를 감염(transfect)시키는데 사용될 수 있는 재조합 리보뉴클레오프로테인(RNP)을 형성한다. 다른 실시예에서, 만일 바이러스 폴리머라아제 단백질이 합성 RNA들의 전사가 시험관 내 또는 생체 내에서 이루어지는 동안 존재한다면 보다 효과적인 감염(transfection)이 달성될 수 있다. 이러한 접근법으로, 합성 RNA들은 폴리머라아제 단백질들을 코딩하는 cDNA 플라스미드들과 시험관 내에서 함께 전사되거나 또는 폴리머라아제 단백질의 존재하에서 생체 내에서, 예를 들어 일시적으로 또는 구조적으로 폴리머라아제 단백질을 발현하는 세포 내에서, 전사되는 cDNA 플라스미드들로부터 전사될 수 있다.
여기에 기술된 부가적인 접근법에서, 감염성 키메라 바이러스의 생산은 PIV 바이러스 폴리머라아제 단백질을 발현하는 숙주 세포 시스템 내에서 복제될 수 있고(예를 들어, 폴리머라아제 단백질을 발현하도록 설계된 변형 세포 라인 등과 같은 바이러스/숙주 세포 발현 시스템 내에서), 따라서 감염성 키메라 바이러스들은 레스큐된다. 이러한 경우, 이 기능이 발현된 바이러스 폴리머라아제에 의해 제공되기 때문에 보조 바이러스가 활용될 필요가 없다.
본 발명에 따르면, 당업계에 알려진 어떠한 기술도 재조합 및 키메라 바이러스의 복제와 레스큐에 사용될 수 있다. 한가지 접근법으로서 숙주 세포를 감염시키기 전에 시험관 내에서 복제에 필요한 바이러스 단백질과 기능을 공급하는 것을 포함한다. 이러한 실시예에서, 바이러스 단백질은 야생형 바이러스, 보조 바이러스, 정제된 바이러스 단백질 또는 재조합되어 발현된 바이러스 단백질의 형태로 공급될 수 있다. 바이러스 단백질은 키메라 바이러스를 코딩하는 합성 cDNA들이나 RNA들이 전사되는 동안 또는 그 전이나 그 후에 공급될 수 있다. 전체 혼합물이 숙주 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 다른 접근법으로서, 복제에 필요한 바이러스 단백질과 기능이 키메라 바이러스를 코딩하는 합성 cDNA들이나 RNA들이 전사되는 동안 또는 그 전이나 그 후에 공급될 수 있다. 이러한 실시예에서, 복제에 필요한 바이러스 단백질과 기능이 감염 또는 세포감염을 통하여 숙주 세포 내로 유입되는 바이러스 단백질을 발현하는 야생형 바이러스, 보조 바이러스, 바이러스 추출물, 합성 cDNA 또는 RNA의 형태로 공급될 수 있다. 이러한 감염/세포감염은 키메라 바이러스를 코딩하는 합성 cDNA 또는 RNA의 유입과 동시에 또는 그 전에 이루어진다.
특히 바람직한 접근법으로서, 본 발명의 재조합 또는 키메라 바이러스의 모든 바이러스 유전자를 발현하도록 설계된 세포들은 바라는 유전자형을 포함하는 감염성 키메라 바이러스의 제조를 가져올 수 있으므로, 시스템 선택의 필요성이 없어진다. 이론적으로, PIV의 구조적 단백질을 코딩하는 6개의 유전자 또는 6개의 유전자중 일부를 외래 서열로 대체할 수 있다. 그러나, 이러한 공식에서 필요한 부분은 결손된 바이러스(정상적인 바이러스 유전자 프로덕트가 빠지거나 변경되기 때문에 결손된)을 증식시킬 능력이다. 가능한 많은 접근법이 이러한 문제를 회피하는데 사용이 가능하다. 한 접근법에서, 돌연변이 단백질을 갖는 바이러스는 같은 단백질의 야생형 버젼을 구조적으로 발현하도록 구성된 세포 라인에서 배양될 수 있다. 이러한 방법으로, 세포 라인은 바이러스 내에서 돌연변이를 보충한다. 유사한 기술이 모든 PIV 유전자를 구조적으로 발현하도록 전환된 세포 라인을 구성하는데 사용될 수 있다. 바이러스 단백질을 발현하도록 제조된 이들 세포 라인들은 재조합 바이러스 내에서 결손을 보충하도록 사용될 수 있고, 이로 인해 증식이 이루어진다. 교호적으로, 소정의 야생 숙주 분포 시스템이 재조합 바이러스를 증식하는데 이용될 수 있다.
다른 실시예에서, 복제에 필요한 바이러스 단백질과 기능은 키메라 바이러스를 코팅하는 합성 cDNA 또는 RNA와 함께 전사될 수 있도록 유전 물질로서 합성 cDNA 또는 RNA의 형태로 공급될 수 있다. 특히 바람직한 접근으로서, 키메라 바이러스와 바이러스 폴리머라아제 및/또는 다른 바이러스 기능을 발현하는 플라스미드가 숙주 세포들 내부로 함께 감염(transfect)된다. 예를 들어, 야생 또는 변형된 게놈나 반게놈 PIV RNA를 코딩하는 플라스미드는 PIV 바이러스 폴리머라아제 단백질 NP 또는 N, P, M2-1 또는 L을 코딩하는 플라스미드와 숙주 세포 내부로 함께 감염(transfect)될 수 있다. 교호적으로, 키메라 b/h PIV3 바이러스의 레스큐는 T7 RNA 폴리머라아제를 코딩하는 Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) 또는 폴리머라아제 단백질(N, P 및 L)을 코딩하는 플라스미드와 MVA의 조합을 사용하므로서 달성될 수 있다. 예를 들면, MVA-T7 또는 조류 Pox-T7은 베로 세포, LLC-MK-2 세포, Hep-2 세포, LF 1043(HEL) 세포, tMK 세포, LLC-MK2, HUT 292, FRHL-2(rhesus), FCL-1(green monkey), WI-38(human), MRC-5(human) 세포, 293 T 세포, QT 6 세포, QT 35 세포 및 CEF 세포들 내부로 감염될 수 있다. MVA-T7 또는 Fow Pox-T7로 감염된 후, 전체 길이의 반게놈 b/h PIV3 cDNA는 플라스미드 발현을 코딩하는 NP, P, M2-1 및 L과 함께 HeLa 또는 Vero 세포 내부로 감염(transfect)될 수 있다. 교호적으로, 폴라머라아제는 플라스미드 감염(transfection)에 의해 제공될 수 있다. 세포들과 세포 상청액은 연속적으로 수확될 수 있고, 하나의 결빙-해동 사이클을 거친다. 이어서, 도출된 세포 라이세이트는 백신 바이러스의 복제 억제제, 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine(ara C)의 존재하에서 신선한 HeLa 또는 베로 세포 단일층을 감염시키는데 사용되어 바이러스 스톡(stock)을 생산한다. 이들 플레이트로부터 상청액과 세포들은 수확될 수 있고, 한번 결빙-해동될 수 있고, PIV3 특이적 항형청을 사용하여 바이러스 플라크의 이뮤노스테이닝(immunostaining)에 의해 BPIV3 바이러스 입자의 존재가 검출될 수 있다.
재조합 바이러스를 증식시키는 다른 접근법은 야생형 바이러스와 공동 배양하는 것을 포함한다. 이는 단지 재조합 바이러스를 취하여, 이와 다른 야생형 바이러스(바람직하게는 백신 스트레인)를 함께 세포와 동시 감염을 시키는 것으로 수행될 수 있다. 야생형 바이러스는 결손된 바이러스 유전자 프로덕트를 보충해야 하고, 야생형 및 재조합 바이러스 양자를 성장할 수 있도록 해야 한다. 교호적으로, 보조 바이러스는 재조합 바이러스의 증식을 지원하는데 사용될 수 있다.
다른 접근법에서, 합성 주형들은 PIV 바이러스 폴리머라아제 단백질을 발현하는 재조합 바이러스들과 함께 감염된 세포 내에서 복제될 수 있다. 사실상, 이 방법은 본 발명에 따라 재조합 전염성 바이러스를 레스큐하는데 사용될 수 있다.
이 때문에, PIV 폴리머라아제 단백질은 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 백신 바이러스, adenovirus, baculovirus 등) 또는 폴리머라아제 단백질을 발현하는 세포 라인(예를 들어, Krystal et AL., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2709-2713를 보라)을 포함하나 이에 한정되지 않는 어떠한 발현 백터/숙주 세포 시스템 내에서도 발현될 수 있다. 게다가, 6개의 PIV 단백질을 발현하는 숙주 세포의 감염은 키메라 바이러스 입자들의 생산을 가져올 수 있다. 바이러스의 생존능력을 변화시키지 않고 재조합 바이러스를 제조하는 것이 가능할 수 있다는 것을 유의해야 한다. 이들 변형된 바이러스들은 충분히 성장되면 복제를 위해 보조 기능이 필요치 않다.
5.4. 재조합 바이러스의 약독화
본 발명의 재조합 바이러스들은 유전적으로 약독화된 표현형을 나타내도록 더 설계될 수 있다. 특히, 본 발명의 재조합 바이러스들은 바이러스가 백신으로서 투여될 수 있도록 약독화된 표현형을 나타낸다. 약독화는 당업자에게 알려진 어떠한 방법으로도 달성될 수 있다. 어느 이론에 구애받지 않고, 재조합 바이러스를 약독화된 표현형으로 구성할 수 있는데, 예를 들어, 의도된 숙주(예를 들어, 인간에 소 PIV3 벡터를 사용한) 내에서 자연적으로 잘 복제되지 않는 바이러스를 사용하거나, 바이러스 게놈의 복제를 줄이거나, 숙주 세포를 감염시키는 바이러스의 능력을 줄이거나 또는 바이러스 단백질이 야생형 바이러스주에 견주었을 때 감염성이 커진 바이러스 입자로 조립하는 능력을 줄이므로서 이루어질 수 있다. 리더 및 트레일러 서열과 같은 바이러스의 소정 서열의 생존능력은 미니게놈(minigenome) 분석을 사용하여 테스트할 수 있다(5.5.1절을 보라).
본 발명의 제조합 바이러스의 약독화 표현형은 당업자에게 알려진 어떠한 방법으로도 테스트할 수 있다(5.5절을 보라). 캔디데이트(candidate) 바이러스는 예를 들어, 세포 배양 시스템 내에서 숙주를 감염시키는 능력 또는 복제 속도를 테스트할 수 있다. 특정한 실시예에서, 미니-게놈 시스템은 변경된 유전자가 N, P, L, M2 또는 그 조합일 때의 약독화된 바이러스를 테스트하는데 사용된다. 특정 실시예에서, 다른 온도에서의 성장 곡선은 바이러스의 약독화된 표현형을 테스트하는데 사용된다. 예를 들어, 약독화된 바이러스는 35℃에서 성장할 수 있으나 39℃ 또는 40℃에서는 그렇지 않다. 특정 실시예에서, 다른 세포 라인은 바이러스의 약독화된 표현현을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 약독화된 바이러스는 원숭이 세포 라인에서 성장할 수 있을 뿐만 아니라 인간 세포 라인에서도 성장할 수 있으나, 다른 셀 라인에서 달성가능한 바이러스가(virus titer)는 약독화된 바이러스와는 다르다. 특정 실시예에서, 햄스터, 중남미 들쥐(cotton rat), 쥐 및 기니아 피그를 포함하는 작은 동물 모델의 호흡기 속 바이러스 복제를 이용하여 바이러스의 약독화된 표현형을 평가하는데, 동물 모델은 상기 동물에 한정되는 것은 아니다. 다른 실시예에서, 항체가(antibody titer, 예를 들어, plaque reduction neutralization assay 또는 ELISA에 의해 분석된)를 포함하나 이에 한정되지 않는, 바이러스에 의해 유도된 면역반응은 바이러스의 약독화 표현형을 평가하는데 사용된다, 특정 실시예에서, 전술한 항체가 분석방법은 낮은 투여량에서 수행된다. 소정 실시예에서, 재조합 바이러스가 동물 모델 내에서의 병리학적 증상을 도출해 내는 능력이 테스트될 수 있다. 바이러스가 동물 모델 시스템에서 약리학적 증상을 도출해내는 능력이 감소한다는 것은 그것이 약독화된 표현형이라는 것을 의미한다. 특정한 실시예에서, 후보 바이러스들은 코 감염의 원숭이 모델로 테스트되는데, 여기서는 점액 생산량이 감염의 지표이다.
본 발명의 바이러스들은 약독화되어 바이러스의 기능적 특성을 하나 이상 감소시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 약독화는 약독화된 바이러스가 유래한 야생형 바이러스 주와 비교하여 측정된다. 다른 실시예에서, 다른 숙주 시스템에서 약독화된 바이러스의 성장과 비교하여 약독화가 결정된다. 따라서, 비제한적인 예로서, 소 숙주 내에서 소 PIV3의 성장과 비교할 때 인간 숙주 내에서 소 PIV3의 성장이 감소하였다면, 소 PIV3는 인간 숙주에서 성장할 때 약독화된 것으로 말할 수 있다.
소정 실시예에서, 본 발명의 약독화 바이러스는 숙주를 감염시킬 수 있고, 숙주 내에서 복제할 수 있으므로, 감염성 바이러스 입자가 생산된다. 그러나, 야생형 스트레인과 비교할 때, 약독화된 스트레인은 더 낮은 역가(titer)로 성장하거나 좀 더 천천히 자란다. 당업자에게 알려진 모든 기술이 약독화된 바이러스의 성장 커브를 결정하고 야생형 바이러스에 대한 성장 커브와 비교하는데 사용될 수 있다. 대표적인 방법은 명세서 내의 실시예를 참조하라. 특정 실시예에서, 약독화된 바이러스는 전술한 바와 같은 조건하에서 베로 세포 내에서의 역가가 105 pfu/ml 미만, 104 pfu/ml 미만, 103 pfu/ml 미만, 102 pfu/ml 미만으로 성장한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 약독화 바이러스(예를 들어, 키메라 PIV3)는 야생형 바이러스(예를 들어, 야생형 PIV3)이 복제하는 것만큼 인간 세포 내에서 복제될 수 없다. 그러나, 약독화된 바이러스는 베로 셀과 같은 인터페론 기능이 부족한 세포 라인 내에서 잘 복제될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 약독화된 바이러스는 숙주를 감염시킬 수 있고, 숙주 내에서 복제할 수 있고, 본 발명의 바이러스의 단백질이 사이토플라스믹 막(cytoplasmic membrane) 내로 삽입되도록 할 수 있으나, 약독화된 바이러스는 숙주가 새로운 감염성 바이러스 입자를 생산하도록 하지는 않는다. 특정한 실시예에서, 약독화된 바이러스는 숙주를 감염시키고, 숙주 내에서 복제하고, 바이러스 단백질이 야생형 포유류 바이러스와 같은 효율로 숙주의 사이토플라스믹 막 내에 삽입되도록 한다. 다른 실시예에서, 바이러스 단백질이 숙주 세포의 사이토플라스믹 막 내부로 삽입되도록 하는 약독화된 바이러스의 능력은 야생형 바이러스보다 감소된다. 소정 실시예에서, 숙주 내에서 약독화된 포유류 바이러스가 복제하는 능력은 야생형 바이러스보다 감소된다. 바이러스가 포유류 세포를 감염시킬수 있는지, 숙주 내에서 복제할 수 있는지, 바이러스 단백질을 숙주의 사이토플라스믹 막의 내부로 삽입시킬 수 있는지를 결정하는데는 당업자에게 알려진 모든 기술들이 이용될 수 있다. 5.5절에 방법이 예시되어 있다.
소정 실시예에서, 본 발명의 약독화된 바이러스는 숙주를 감염시킬 수 있다. 그러나, 야생형 PIV와는 대조적으로, 약독화된 PIV는 숙주 내에서 복제될 수 없다. 특정 실시예에서, 약독화된 바이러스는 숙주를 감염시킬 수 있고, 숙주가 그 사이토플라스믹 막 내에 바이러스 단백질을 삽입하도록 할 수 있다. 약독화된 바이러스가 숙주를 감염시켰는지 그리고 숙주가 그 사이토플라스믹 막 내에 바이러스 단백질을 삽입하도록 하였는지를 결정하는데는 당업자에게 알려진 모든 기술들이 이용될 수 있다.
소정 실시예에서, 약독화된 포유류 바이러스의 숙주를 감염시키는 능력은 야생형 바이러스가 동일한 숙주를 감염시키는 능력보다 감소된다. 바이러스가 숙주를 감염시킬 수 있는지를 결정하는데는 당업자에게 알려진 모든 기술들이 이용될 수 있다. 5.5절에 방법이 예시되어 있다.
소정 실시예에서, 약독화된 표현현을 갖는 바이러스를 생산하도록, 돌연변이(예를 들어, 과오돌연변이)가 바이러스의 게놈 내에 도입된다. 돌연변이(예를 들어, 과오돌연변이)는 재조합 바이러스의 N-유전자, P-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1-유전자, M2-2-유전자, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자에 도입될 수 있다. 돌연변이는 부가, 치환, 결손 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 실시예에서, N, P, L 또는 M2 단백질에 단일의 아미노산 결손 돌연변이가 도입되어, 미니-게놈 분석 시스템 내에서 기능성이 스크린될 수 있고 바이러스 내에서 예측된 기능성이 평가될 수 있다. 좀 더 특정한 실시예에서, 과오돌연변이(missense mutation)는 저온민감 돌연변이이다. 다른 실시예에서, 과오돌연변이는 열민감 돌연변이이다. 일 실시예에서, 바이러스의 P 단백질의 주된 인산화 부위가 제거된다. 또 다른 실시예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들이 바이러스의 L 유전자에 도입되어 온도 민감성 바이러스주를 생산하도록 한다. 또 다른 실시예에서, F 유전자의 절단 부위는 절단이 일어나지 않거나 매우 낮은 효율로 일어나는 방법으로 변화된다.
다른 실시예에서, 재조합 바이러스의 게놈 내부로 결손이 도입된다. 좀 더 특정한 실시예에서, 결손은 재조합 바이러스의 N-유전자, P-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1-유전자, M2-2-유전자, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자에 도입될 수 있다. 특정한 실시예에서, 결손은 본 발명의 재조합 바이러스의 M2-유전자 내에 존재한다. 다른 특정한 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 SH-유전자 내에 결손이 존재한다. 또 다른 특정한 실시예에서, M2-유전자와 SH-유전자 모두가 결손된다.
소정 실시예에서, 재조합 바이러스의 유전자간 영역이 변경된다. 일실시예에서, 유전자간 영역의 길이가 변경된다. 5.1.2절에 예가 기재되어 있다. 다른 실시예에서, 유전자간 영역은 바이러스 게놈의 5'에서 3' 말단까지 섞여 있다.
다른 실시예에서, 재조합 바이러스의 유전자 또는 유전자들의 게놈 위치는 변화된다. 일 실시예에서, F 또는 G 유전자는 게놈의 3' 말단으로 이동된다. 또 다른 실시예에서, N 유전자는 게놈의 5' 말단으로 이동된다.
소정 실시예에서, 바이러스의 약독화는 야생형 바이러스의 유전자를 다른 종의 바이러스의 유전자로 대체함으로서 달성된다. 예시적인 실시예에서, bPIV3의 N-유전자, P-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1-유전자, M2-2-유전자, SH-유전자, HN-유전자 또는 L-유전자가, hPIV3의 N-유전자, P-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1-유전자, M2-2-유전자, SH-유전자 또는 L-유전자로 각각 대체된다. 다른 예시적인 실시예에서, hPIV3의 N-유전자, P-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1-유전자, M2-2-유전자, SH-유전자, HN-유전자 또는 L-유전자가, bPIV3의 N-유전자, P-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1-유전자, M2-2-유전자, SH-유전자 또는 L-유전자로 각각 대체된다. 바람직한 실시예에서, 바이러스의 약독화는 하나 이상의 폴리머라아제 부착 유전자들(예를 들어, N, P, L 또는 M2)을 다른 종의 바이러스의 유전자들로 대체하므로서 달성할 수 있다.
소정 실시예에서, 바이러스의 약독화는 야생형 바이러스의 단백질의 하나 이상의 도메인을, 다른 종 바이러스의 대응 단백질로부터 얻은 도메인으로 대체하거나 결손시킴으로서 달성할 수 있다. 예시적인 실시예에서, bPIV3의 F 단백질의 엑토도메인(ectodomain)은 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 엑토도메인으로 대체된다. 바람직한 실시예로서, L, N 또는 P 단백질의 하나 이상의 특이적 도메인이 다른 종 바이러스의 대응 단백질로부터 얻어진 도메인으로 대체된다. 다른 예시적인 실시예에서, F 단백질의 막 도메인(transmembrane domain)은 용해성 F 단백질이 발현될 수 있도록 결손된다.
본 발명의 소정 실시예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 리더 및/또는 트레일러 서열은 약독화 표현형을 달성하기 위하여 변형될 수 있다. 더욱 특정한 실시예에서, 리더 및/또는 트레일러 서열은 야생형 바이러스와 비교할 때 그 길이가 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드 또는 적어도 6 뉴클레오티드만큼 감소된다. 더욱 특정한 다른 실시예에서, 재조합 바이러스의 리더 및/또는 트레일러의 서열은 돌연변이화된다. 특정한 실시예에서, 리더와 트레일러 서열은 서로 100% 상보적이다. 다른 실시예에서, 1 뉴클레오티드, 2 뉴클레오티드, 3 뉴클레오티드, 4 뉴클레오티드, 5 뉴클레오티드, 6 뉴클레오티드, 7 뉴클레오티드, 8 뉴클레오티드, 9 뉴클레오티드 또는 10 뉴클레오티드가 서로 상보적이지 않은 반면, 리더와 트레일서 서열의 잔존하는 뉴클레오티드는 서로 상보적이다. 소정 실시예에서, 비상보적인 뉴클레오티드는 서로 동일하다. 다른 소정 실시예에서, 비상보적인 뉴클레오티드는 서로 다르다. 다른 실시예에서, 만일 트레일러 내의 비상보적인 뉴클레오티드가 퓨린이라면, 리더 서열 내에서 대응하는 뉴클레오티드 역시 퓨린이다. 다른 실시예에서, 만일 트레일러 내의 비상보적인 뉴클레오티드가 피리미딘이라면, 리더 서열 내에서 대응하는 뉴클레오티드는 역시 퓨린이다.
활동적인 약독화 백신이 사용될 때, 그 안전성 또한 고려되어야 한다. 백신은 질병을 일으키지 않아야 한다. 본 발명에서, 당업계에 알려진 모든 기술들이 백신을 안전성이 있도록 만드는데 사용될 수 있다. 약독화 기술에 부가하여, 다른 기술들이 사용될 수 있다. 바이러스 입자 막(virion membrane) 내부로 통합될 수 없는 가용 이종성 유전자를 사용하는 것을 예시할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 예를 들어, 가용성 RSV F 유전자의 단일 카피, 막(transmembrane)을 결손시킨 RSV 유전자 버젼 및 사이토솔릭 도메인이 사용될 수 있다. 이것은 바이러스 입자 막 내부로 통합될 수 없기 때문에 바이러스 향성은 변화되지 않는다.
백신의 안전성을 테스트하기 위하여 다양한 분석법이 사용될 수 있다. 명세서 내의 5.5절을 보라. 특히, 수크로오스 그래디언트(sucrose gradients) 및 뉴크럴라이제이션(neutralization) 분석법이 사용될 수 있다. 수크로오스 그래디언트 분석법은 이종성 단백질이 바이러스 입자 내에 삽입되었는지를 결정하는데 이용될 수 있다. 만일 바이러스 입자 내에 이종성 단백질이 삽입되었다면, 바이러스 입자는 그 부모 스트레인이 증상을 일으키지 않을지라도 증상을 일으키는 능력이 테스트어야 한다. 이론적인 바운드가 없이도, 바이러스 입자 내에 이종성 단백질이 통합되었다면 바이러스는 새롭고, 가능한 병리학적 성질을 얻을 수 있을 것이다.
5.5 바이러스 역가의 측정, 항원성 서열의 발현, 면역원성 및 키메라성 바이러스의 다른 특징.
세포배양 시스템, 동물 모델 시스템 또는 대상에서 키메라 또는 재조합형 바이러스의 성장률을 판단하기 위하여 다수의 분석들이 본 발명에 따라서 채용될 수 있다. 또한, 비리온의 감염, 복제, 패키징을 완수하기 위하여 키메라 또는 재조합형 바이러스에 필요한 조건들을 판단하기 위하여, 다수의 분석 방법을 본 발명에 따라서 채용할 수 있다.
상술한 분석법들은 바이러스의 성장 특징을 판단하기 위하여 시간 경과에 따른 바이러스 역가를 분석하는데 이용할 수 있다. 일정 실시예에서, 감염된 세포 또는 감염된 대상의 샘플의 획득, 샘플의 연속적인 희석액을 제조하고, 및 단일 플라크 돌연변이를 발생시키는 바이러스의 희석률에서 바이러스 감염성인 세포단층을 감염시켜서 바이러스 역가를 결정한다. 본 발명의 실시예에서, 대상에 본 발명의 바이러스 성장률은 대상 내부의 바이러스 대항 항체의 역가에 위해 측정된다. 이론에 의하지 않고, 대상의 항체 역가는 대상의 바이러스 역가 뿐 아니라 항원성을 반영한다. 만일 상기 바이러스 항원성이 일정하다면, 대상에 있어 항체 역가의 증가는 대상 내의 바이러스 성장 곡선을 판단하는데 이용될 수 있다. 바람직한 실시예에서는, 감염 후에 복수의 횟수에 걸쳐서 호스트의 생물 체액을 채취하거나 바이러스 역가를 측정함으로써, 동물 또는 인간의 성장률이 최상으로 테스트될 수 있다.
세포 배양 시스템 또는 대상에서 이종성 유전자 시퀀스의 발현은 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 결정될 수 있다. 일정 실시예에서, 이종 유전자의 발현은 전사 레벨량을 측정함으로써 판단된다. 전사 레벨은 비교적 전사에 특이한 노던 블럿 분석 또는 프로브 또는 프라이머를 사용하는 RT-PCR 분석으로써 측정될 수 있다. 상기 전사는 바이러스의 게놈과 구별될 수 있는데, 이는 상기 전사는 센스 오리엔테이션으로 진행되는 데 반해 상기 바이러스는 안티센스 오리엔테이션에 있기 때문이다. 일정 실시예에서, 이종성 유전자의 발현은 이종성 유전자의 단백질 프로덕트 레벨량으로써 측정된다. 단백질 레벨은 단백질에 특이한 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 분석으로써 측정된다.
구체적인 실시예에서, 이종성 유전자는 펩타이드 태그로 태그된다. 펩타이드 태그는 펩타이드 태그에 대항하는 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다. 상기 검출된 펩타이드 태그의 레벨은 이종성 유전자로부터 발현된 단백질의 레밸을 나타낸다. 대안으로, 상기 이종성 유전자로부터 발현된 단백질은 펩타이드 태그에 의하여 분리될 수 있다. 정화된 단백질의 양은 이종성 유전자의 발현 레벨과 상호 관련된다. 상기 펩타이드 태그 및 상기 펩타이드 태그에 융합된 단백질의 분리 방법은 기존에 잘 알려져 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 다양한 펩타이드 태그는 이종성 유전자 변형에 이용될 수 있는 바, 면역글로불린 불변부위, 폴리히스티딘 시퀀스(Petty, 1996, 금속 킬레이트 친화 크로마토그래피, in Current Protocols in Molecular Biology, volumn 1-3(1994-1998). Ed. by Ausubel,F.M., Brent, R., Kunston, R.E., Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith,J.A. 및 Struhl, K. Publishde by John Wiley and sons, Inc., USA, Green Publish. Assoc.&Wiley Interscience), 글루타티온 에스-트랜스페라제(GST;Smith,1993,Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229), 단백질 결합 이-콜리 말토오스(Guan et al.,1987,Gene67:21-30), 도메인 결합 다양한 셀룰로오스(미국특허 5,496,934;5,202,247;5,137,819;Tomme et al.,1994, Protein Eng.7;117-123), 및 플래그(FLAG) 에피토프(Short Protocols in Molecular Biology,1999,Ed.Ausubel et al.,John Wiley&Sons,Inc.,Unit 10.11) 등에 제한되지 않는다. 다른 펩타이드 태그는 특정 결합 파트너에 의해 인식되고 결합 파트너에 친화 결합함으로써 분리를 용이하게 하며, 바람직하게 고체 서포트 상에 고정된다. 종래에 알려진 기술에 의해 이해되는 바와 같이, 다수의 방법이 상술한 펩타이드 태그의 코딩영역을 획득하는데 사용될 수 있는바 이는 DNA 복제, DNA 확대, 및 합성방법에 한정되지 않는다. 상기 검출과 분리를 위한 상기 펩타이드 태그 및 시약은 상업적으로 구입가능 하다.
대상으로부터의 샘플은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 얻을 수 있다. 일정 실시예에서 코흡입물, 인후삽입면봉, 가래 또는 기관지-꽈리 세척물으로 구성된다.
5.5.1. 소형게놈( minigenome ) 구성체
소형복제단위 구성체는 안티센스 정보제공 유전자를 포함하여 발생될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 정보제공 유전자는 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 구체적인 실시예에서, 상기 정보제공 유전자는 CAT이다. 일정 실시예에서, 상기 정보제공 유전자는 간염 델타 리보자임(Hep-d Ribo)에 링크된 네거티브-센스 bPIV 또는 hPIV 리더 및 T7 폴리머라제 종료(T-T7) 신호와 측면으로 접하게 되며, T7RNA 폴리머라제 프로모터는 bPIV 또는 hPIV 추적자 시퀀스에 우선한다.
일정 실시예에서, 플라스미드 코딩 소형복제단위는 호스트 세포로 감염된다. 상기 호스트 세포는 T7RNA 폴리머라제, N 유전자, P 유전자, L 유전자, 및 M2.1 유전자를 발현시킨다. 일정 실시예에서, 상기 호스트 세포는 T7RNA 폴리머라제, N 유전자, P 유전자, L 유전자, 및 M2.1 유전자로 코딩된 플라스미드로 감염된다. 다른 실시예에서는 상기 플라스미드 코딩 소형복제단위는 호스트 세포로 감염되고 상기 호스트 세포는 헬퍼 바이러스로 감염된다.
정보제공 유전자 및/또는 그것의 활성도의 발현레벨은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 분석될 수 있으며, 이는 섹션 5.5.6에 상술된 방법에 한정되지 않는다.
더욱 상세한 실시예에서, 소형복제단위는 순서대로 열거된 다음 구성요소들을 포함하는바 이는 다음과 같다:T7RNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제 I, 리더 시퀀스, 시작유전자, GFP, 추적자 시퀀스, 간염 델타 리보자임 시퀀스 또는 RNA 폴리머라제 I 종결 시퀀스. 만일 T7가 RNA 폴리머라제로 사용된다면, 간염 델타 리보자임 시퀀스는 종결 시퀀스로 사용되어야 한다. 만일 RNA 폴리머라제 I가 사용된다면, RNA 폴리머라제 I 종결 시퀀스는 종결 신호로 사용될 수 있다. 구조시스템에 의존하여, 소형복제단위의 시퀀스는 센스 또는 안티센스 오리엔테이션을 따를 수 있다. 일정 실시예에서, 리더 시퀀스는 본 발명의 바이러스의 와일드 타입 리더 시퀀스와 관련하여 변형될 수 있다. 상기 리더 시퀀스는 선택적으로 AC에 후속할 수 있다. 상기 T7 프로모터 시퀀스는 G-이중 또는 삼중을 구비하거나 또는 구비하지 않을 수 있으며, 상기 G- 이중 또는 삼중은 증가된 전사를 제공한다.
상세한 실시예에서, 세포는 T0에서 본 발명의 바이러스ㅔ 의해 감염된다. 24시간 후에, T24에서, 상기 세포는 소형복제단위 구성체로 감염된다. 48 시간 후에 T0 및 72시간 후에 T0에서, 상기 세포는 정보제공 유전자의 발현을 위해 테스트된다. 만일 형광 정보제공 유전자 프로덕트가 사용된다면(예를 들어 GFP), 정보제공 유전자의 발현은 FACS를 사용하여 테스트 될 수 있다.
다른 실시예에서, 세포는 T=0시간에서 여섯개의 플라스미드로 감염된다. 그러면 세포는 T=40 시간 및 T=60 시간에서 채취되고 CAT 또는 GFP 발현이 분석된다.
다른 상세한 실시예에서, 세포는 T0에서 MVA-T7로 감염된다. 한시간 후에, T1에서 상기 세포는 소형복제단위 구성체로 감염된다. 24시간 후에 T0 에서, 상기 세포는 본 발명에 따른 바이러스로 감염된다. 72시간 후에 T0에서, 상기 세포는 정보제공 유전자의 발현이 테스트된다. 만일 형광 정보제공 유전자 프로덕트가 사용된다면(예를 들어 GFP), 상기 정보제공 유전자는 FACS를 사용하여 테스트될 수 있다.
5.5.2. 감염 발생률의 측정
감염의 발생수는 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의하여 판단될 수 있는 바, 예를 들어 비교적 이종성 뉴클레오타이드 시퀀스의 유전자 프로덕트에 특이한 안티-hMPV-항원항체, 안티-RSV-항원항체, 안티-hPIV-항원항체, 및/또는 항체를 사용한 면역형광분석(IFA)에의해 검출될 수 있는 hMPV, RSV, hPIV, 또는 bPIV/hPIV 성분으로 현재 감염된 임상 샘플(예를 들어 코삽입 면봉)의 테스트에 한정되지 않는다.
일정 실시예에서, 무손상 세포를 포함하지 않는 분리는 증식 세포 라인(예를들어 HEp-2) 상에 처음으로 배양되어야 하는 것에 반해 무손상 세포를 포함하는 샘플은 직접 처리될 수 있다. 예시적인 실시예에서, 배양된 세포 현탁물은 예를 들어, 상온에서 5분 동안 300xg 에서 원심분리기에 의해 제거되며, 이어서 PBS, pH7.4(자유 Ca++ 및 Mg++)로 상기와 같은 조건에서 세척된다. 세포 파렛트는 분석을 위하여 PBS의 소형 용량에서 재부유된다. 무손상 세포를 포함하는 첫번째 임상 분리는 PBS와 혼합되고 상온에서 5분 동안 300xg에서 원심 분리된다. 점액은 무균 피펫 팁과의 계면에서 제거되고 세포 파렛트는 상기와 같은 조건에서 PBS와 함께 한번에 세척된다. 그러면 파렛트는 분석을 위하여 소형 용량의 PBS에서 재부유된다. 각 세포 현탁물의 5 내지 10 마이크로리터는 아세톤으로 세척되고 공기에 건조된 12-웰 HTC 슈퍼큐어된(supercured) 글래스 슬라이드에 5mm 웰당 스폿팅된다. 슬라이드는 10분동안 냉아세톤(-20℃)에 고정된다. 반응물은 상온에서 10분 동안 배양한 후 PBS-1%BSA를 각 웰에 첨가함으로써 덩어리화된다. 슬라이드는 PBS-0.1% Tween-20으로 세차례 세척된 후 공기에 건조된다. 블록킹 버퍼에서 250ng/ml로 희석화된 각 첫번째 항체 시약 10 마이크로리터가 각 웰에 스폿팅되고 반응물은 습성으로 37℃ 환경에서 30분 동안 배양된다. 그 후 슬라이드는 PBS-0.1%Tween-20으로 세번에 걸쳐 집중적으로 세척되고 공기에 건조된다. 블로킹 버퍼에서 250ng/ml로 희석된 알맞게 두번째로 결합된 항체 시약은 각각의 웰에 스폿팅되고 반응물은 습성으로 37℃ 환경에서 추가적인 30분 동안 배양된다. 그 후 슬라이드는 PBS-0.1%Tween-20으로 세번에 걸쳐 세척된다. 5마이크로리터의 PBS-50% 글리세롤-10mM Tris pH8.0-1mM EDTA가 각 반응웰에 스폿팅되고 슬라이드는 커버슬립이 장착된다. 각 반응웰은 B-2A 필터(EX450-490)를 사용하여 200X에서 파워형광 현미경사용에 의해 연속적으로 분석된다. 오염되지 않은 세포 또는 두 번째 시약만을 넣은 오염된 세포로부터 얻어진 자동 형광 배경에 대하여 양성 반응물이 기록된다. RSV 양성 반응물은 감염된 세포의 세포질에서 소형 함유물로 강조된 빛나는 형광물질로 인해 특징지어진다.
5.5.3. 혈청 역가의 측정
항체 혈청 역가는 종래 기술의 임의의 발법에 의하여 결정될 수 있는 바, 예를 들면, 혈청 샘플에서 항체 또는 항체 조각의 양을 샌드위치 ELISA에 의해 측정될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 간단하게, 상기 ELISA는 혈청에서 항체 또는 항체 조각을 인식하는 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 평판 배양한 코팅 마이크로티터로 구성된다. 그러면 평판은 상온에서 PBS-Tween-0.5%BSA로 대략 30 분동안 덩어리화 된다. 표준 곡선은 정화된 항체 또는 PBS-BSA-BSA로 희석된 항체 조각을 사용하여 구성되고 샘플은 PBS-BSA에서 희석된다. 상기 샘플 및 표준은 분석 평판의 웰을 복사하기 위하여 첨가되고 대략 1시간동안 상온에서 배양된다. 다음, 결합되지 않은 항체는 PBS-TWEEN으로 세척되어 버려지고 결합항체는 라벨된 두번째 항체(예를 들어 염소-안티-인간 IgG와 결합된 홍당무과산화효소)로 대략 1시간 동안 상온에서 처리된다. 라벨된 항체의 결합은 라벨에 특이한 발색성의 기질을 첨가하고 기질의 전환 비율을 측정함으로써 검출되는바 예를 들면 분광검출기에 의하여 검출한다. 혈청 중에 항체 또는 항체 조각 레벨의 농축은 샘플 기질의 전환 비율을 표준 곡선의 기질 전환 비율과 비교함으로써 판단된다.
5.5.4. 감염 방지력 연구( challenge studies )
본 분석은 본 발명의 재조합형 바이러스와 중남미 들쥐(cotton rat), 시리아 골든 햄스터, 및 Balb/c 쥐같은 동물 모델 시스템에서 아래 기도바이러스 감염을 예방하기 위한 본 발명에 따른 백신의 능력을 판단하는데 사용되되, 상기 동물에 한정되지 않는다. 상기 재조합형 바이러스 및/또는 백신은 정맥(IV)경로, 근육(IM)경로 또는 코안경로(IN)에 의하여 투여될 수 있다. 상기 재조합형 바이러스 및/또는 백신은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의하여 투여될 수 있다. 또한 본 분석은 상기 바이러스의 폐 역가의 감소와 함께 항체의 혈청 농축을 항체의 결합과 상호 관련시키는데 사용된다.
제 0일에 중남미 들쥐(Sigmodon hispidis 평균 100g 체중) 및 햄스터(예를 들어 시리아 골든 햄스터)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 일군의 동물에 대하여 본 발명의 재조합 바이러스, 원하는 백신 또는 BSA를 근육내 주사, 정맥내 주사, 또는 코안경로를 통하여 접종된다. 본 발명에 따른 재조합형 바이러스 또는 백신의 투여에 앞서거나, 동시에 또는 후속하여, 상기 동물들은 야생형 바이러스에 감염되게 되는데, 여기서 상기 야생형 바이러스는 상기 백신을 제조하는데 쓴 바이러스이다. 일정 실시예에서, 상기 동물들은 본 발명에 따른 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여 후에 와일드 타입 바이러스에 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주일, 적어도 2주일, 적어도 3주일, 또는 적어도 4주일 감염된다. 바람직한 실시예에 의하면, 상기 동물들은 본 발명에 따른 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여에 후에 와일드 타입 바이러스에 21일 감염된다. 다른 바람직한 실시예에 의하면, 상기 동물들은 본 발명에 다른 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여 후에 28일 감염된다.
감염 후에, 상기 동물들은 희생되고, 그들의 코선반 조직 및/또는 폐조직은 채취되고 바이러스 역가는 적정한 분석, 예를 들면 플라크 분석 및 TCID50분석에 의해 판단된다. 소혈청알부민(BSA) 10mg/kg은 음성 제어에 사용될 수 있다. 공격중의 혈청내의 항체 농축은 샌드위치 ELISA를 사용하여 판단될 수 있다.
5.5.5. 임상 시험
시험관내 분석법과 동물 모델로 테스트 받은 본 발명의 백신 또는 상기 백신의 조각들은 정상적인 건강한 자원자들에 대하여 안전성, 내성, 면역성, 감염성 및 약동학 면에서 추가적인 평가를 받을 수 있다. 바람직한 실시예에서, 건강한 인간 지원자는 6주 정도의 유아들, 그보다 나이가 많은 어린이 및 어른들이다. 지원자는 코 내부로, 근육 내로, 동맥내로, 또는 폐 전달 시스템으로 본 발명에 다른 재조합형 바이러스 및/또는 백신을 일회 복용량 투여받는다. 본 발명에 따른 바이러스 및/또는 백신의 복수 투여량은 음성혈청반응의 6 내지 60 개월의 어린이에게 요구될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 바이러스 및/또는 백신의 복수 투여량은 부분 그리고 전신의 면역을 자극하고 모체의 항체에 의한 중화를 극복하기 위하여 생의 처음 6개월에 주입될 것이 요구될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 2, 4, 및 6 개월 나이의 첫번째 투여 섭생 및 생의 두번째 해의 시작에 두번째 투여하는 방법이 이용된다. 본 발명에 따른 재조합형 바이러스 및/또는 백신은 단독으로 투여되거나 상응하는 나이에 추천되는 소아과적 백신과 함께 투여될 수 있다.
바람직한 실시예에 따르면, 이중맹 무작위 시험되고, 위약 임상 시험이 사용된다. 상세한 실시예에 의하면, 무작위 계획을 발생시키는 컴퓨터가 사용된다. 예를 들어, 본 연구에서 각 대상은 단일 유닛으로 등록되고 특별 케이스 숫자를 할당받는다. 동일 가족내의 복수 대상은 등록을 위해 개인으로 취급받을 것이다. 부모/후견인, 대상, 및 조사자는 어떤 그룹 대상들이 할당받는지 본 연구 동안에 모르게 진행될 것이다. 혈청학 및 바이러스학의 연구가 어떤 그룹을 할당받았는지 모른채 실험실 인원에 의해 수행된다. 그러나, 백신주입 후에 얻은 코 세척 액으로부터 백신 바이러스의 분리가 바이러스학 실험실 직원에게 마치 백신을 투여받은 인간과 동일시할 것이다. 혈청학 및 바이러스학 직원들은 분리되고 혈청 그룹은 배양 결과에 대한 어떤 지식을 얻는 것이 금지되어야 할 것이다.
바람직하게, 각각의 지원자는 본 발명에 따른 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 주입받기 전에 최소한 12시간은 모니터링되고, 각각의 지원자는 임상장소에서 투여받은 후 최소한 15분동안 모니터링된다. 그러면 지원자들은 낮에 1-14,21,28,35,42,49,및 56 후속투여를 받아 외출환자로서 모니터링된다. 바람직한 실시예에서, 상기 지원자들은 외출환자로서 각 백신을 주입받은 후에 첫번째 달 동안에는 모니터링된다. 심각한 부작용과 관련한 모든 백신은 실험의 전 기간에 걸쳐 보고될 것이다. 심각한 부작용은 1)사망을 초래하고 2) 급작스러운 생명 위협 3) 영구적이고 중요한 장애를 초래하고 4) 환자입원 또는 입원의 연장, 5) 선천적인 변형초래,6) 암, 또는 7) 연구 백신의 과투여이다. 백신과 관련되지 않은 심각한 부작용은 처음 백신 투여 시 및 다음 마지막 백신 투여 30일 동안 보고될 것이다. 백신과 관련되지 않은 심각한 부작용은 마지막 백신투여 후의 30일의 보고 기간 후에 5 내지 8 개월동안 보고되지 않을 것이다. 어린이가 첫 복용 후 백신과 관련된 심각한 부작용을 보인다면 백신/플라시보는 투여되지 않을 것이다. 관련된 백신이 고려되지 않은 임의의 부작용은 다른 투여를 하는 결론이 나기 전에 임상 연구 모니터 및 의학 모니터에 의해 논의될 것이다.
혈액 샘플은 다음 간격으로 유치 카테터 또는 직접 정맥을 뚫음(예를 들어 10ml red-top Vacutainer tubes)으로써 채집된다. (1)본 발명에 다른 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 복용량을 투여하기 전에; (2) 본 발명에 따른 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 복용량을 투여하는 동안 ;(3)본 발명에 따른 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여 후 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 및 48시간 (4) 본 발명에 따른 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여 후 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일, 및 56일. 상세한 실시예에서는, 총 5 혈액 인출(각 3 내지 5ml)이 얻어지고, 각각은 첫번째, 세번째 및 후속 투여 및 세번째 투여 후 대략 한달, 백신 또는 플라시보의 후속투여에 선행한다. 샘플은 상온에서 엉기도록 하며 혈청은 원심분리 후 채집한다.
혈청은 본 발명에 따른 바이러스에 대항한 헤마글루티네이션 억제(HAI) 항체 레벨 테스트를 받는다. 또한 IgG, IgA 또는 중립 항체같은 면역원성의 다른 지표들도 테스트된다. 동시에 주입된 하나 또는 그 이상의 다른 백신에 반응하는 혈청 항체가 측정될 수 있다. 환자의 샘플에서 본 발명에 따른 재조합형 바이러스 또는 백신에 대항하여 생성된 항체의 양은 ELISA에 의하여 측정된다.
지원자의 혈청 속 항체 농도는 본 발명에 따른 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여 후에 각각의 채집 간격에서 혈청 레벨에서 선투여 혈청 레벨(백그라운드 레벨)을 뺌으로써 정정된다. 각 지원자의 약동학 변수는 모델-독립적 방식(Gibaldi et al., eds.,1982,Pharmacokinetics,2thedition, Marcel Dekker, New York)에 따라 정정된 혈청 항체 또는 항체 조각 농축으로부터 추정된다.
대략 백신/플라시보의 각 투여 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 일 후에 얻어진 코내부 세척액은 본 발명에 따른 백신의 흘림을 검출하기 위하여 배양된다. 바람직한 실시예에서는, 백신/플라시보의 각 투여 후 7일에 얻은 코 내부 세척액이 배양된다. 또한 코인두 면봉채취법, 인후면봉법, 또는 코세척액은 본 연구동안에 의학적으로 열병(직장 온도가 102℉와 같거나 그보다 높은), 및/또는 상기도막힘증, 세기관지염 또는 폐렴을 일으키는 지원자에게 다른 바이러스가 현존하는 가를 판단하는데 사용된다. 샘플은 연구를 위해 지정된 곳의 드라이 아이스 위에 이송된다. 분리 분석 및 본 발명에 따른 백신 바이러스의 측정 및 본 발명의 백신 바이러스를 확인하기 위한 MAb면역염색 분석이 사용된다.(상기 분석의 예는 실시예 섹션에 제시되어 있다. 아래를 보시오) 코내부 세척 종은 다른 바이러스 및 IgG, IgA, 및 항체 중립화를 포함하여 면역 반응을 테스트된다.
5.5.6. 정보제공 유전자( reporter genes )
일정실시예에서, 조직 배양 또는 동물 모델에서 정보제공 유전자 발현의 측정을 위한 분석은 본 발명에 따른 방법과 함께 사용될 수 있다. 상기 정보제공 유전자의 뉴클레오타이드 시퀀스는 예를 들어, bPIV, hPIV, 또는 b/hPIV3 과 같은 바이러스로 클론되되, (ⅰ)정보제공 유전자의 위치는 변화하고 (ⅱ)정보제공 유전자와 측면 접하는 내부 유전자영역의 길이는 변한다. 다른 조합이 상기 정보제공 유전자발현의 최적비 및 상기 정보제공 유전자를 포함하는 상기 바이러스의 최적 복제율을 판단하기 위하여 테스트된다.
일정 실시예에서, 소형게놈 구조체는 정보제공 유전자를 포함하여 발생된다. 소형게놈 구조체의 구성은 섹션 5.5.1 에서 설명된다.
댜량의 상기 정보제공 유전자 프로덕트는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 판단될 수 있다. 상기 기술은 각각 상기 정보전달 유전자에 특이한 탐지자 또는 항체를 사용하는 또는 항체 노던 흡입 분석 또는 웨스턴 흡입 분석을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일정 실시예에서, 상기 정보제공 유전자는 FACS에서 검출될 수 있는 형광 신호를 발산한다. FACS는 상기 정보전달 유전자가 발현되는 세포를 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 측면을 실시하는데 필요한 기술은, 특별한 언급이 없는 한, 분자생물학, 미생물학과 재조합 DNA의 조작과 생산에 관한 종래 기술을 사용하는데, 이러한 기술은 당업자가 상용하는 것이다. 예를 들어 Sambrook, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition; DNA Cloning, Volumn Ⅰand Ⅱ(Glover, Ed.1985); 및 Transcription and Translation(Hames & Higgins, Eds. 1984)를 참조하시오.
상기 정보제공 유전자 프로덕트의 생화학적인 활성도는 정보제공 유전자의 발현량을 나타낸다. 또한 상기 정보제공 유전자의 총 레벨은 본 발명에 따른 재조합형 바이러스의 복제율에 의존한다. 그리하여, 상기 재조합형 바이러스로부터의 상기 정보제공 유전자의 실질 발현 레벨을 판단하기 위해서는, 총 발현 레벨이 세포 배양 또는 동물 모델 내의 상기 재조합형 바이러스의 적가로 나뉘어야 한다.
본 발명의 방법으로 사용될 수 있는 정보전달 유전자가 아래 표 4에 기록되어 있으나, 본 발명은 이에 한정되지는 않는다.
Figure pat00004
다량의 상기 정보전달 유전자는 특히 웨스턴 블럿 분석 또는 노던 블럿 분석 또는 뉴클레오타이드 시퀀스의 전사, 그의 mRNA ,그의 단백질의 양을 측정하기 위해 사용되는 다른 기술로써 측정될 수 있다(Short Protocol in Molecular Biology, Ausubel et al.(editor), John Wiley&Sons, Inc.,4thedition,1999를 참조하라). 일정 실시예에서, 상기 정보전달 유전자 프로덕트의 활성도는 상기 재조합형 바이러스로부터 정보전달 유전자의 발현을 해독함으로 측정된다. 상기 정보전달 유전자 프로덕트의 활성도를 측정하기 위해서는, 정보전달 유전자 프로덕트의 생화학적 특징이 조사될 수 있다(표 1을 참조하라). 상기 정보전달 유전자 프로덕트의 생화학적 활성도를 측정하는 방법은 당업자에게 잘 알려진 내용이다. 본 발명에 따른 방법과 함께 사용될 수 있는 정보전달 유전자에 대한 더욱 상세한 설명은 이하에 한다.
루시페라제
루시페라제는 산소 및 기질(루시페린)의 존재하에 빛을 발산하는 효소이며 이는 실시간, 세포 배양, 개인 세포, 전체 기관, 및 트랜스제닉 생체(Greer&Szalay,2002,Luminescence17(1):43-74를 참조하면)에 있어 유전자 발현의 실시간, 낮은 빛 이미징에 사용되어 왔다.
본 명세서에서 사용함에 있어, 본 발명과 관련되어 사용되는 용어 "루시페라제"는 모든 루시페라제 또는 루시페라제 활성이 있는, 루시페라제로부터 파생된 재조합형 효소를 모두 포함한다. 예를 들어 Photinus 및 Luciola 종 같은 반딧불이로부터의 루시페라제 유전자는 잘 특성화되어 있다(예를 들어 국제 특허 공개 번호 WO 95/25798 Photinus pyralis, 유럽 특허 출원 번호 EP0524448 Luciola cruciata 및 Luciola lateralis , 및 Devine et al.,1993,Biochim.Biophys.Acta 1173(2):121-132 Luciola mingrelica를 참조하라). 다른 진핵생물 루시페라제 유전자는 바다 팬지(panzy)(Renilla reniformis,예를 들어 Lorenz et al.,1991, Proc Natl Acad Sci USA 88(10):4438-4442를 참조), 및 날개 없는 반딧불이(예를 들어 Lampyris noctiluca, Sula-Newby et al.,1996,Biochem J 313:761-767를 참조)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 박테리아 루시페린-루시페라제 시스템은 육생의 Photorhabdus luminescens(예를 들어, Manukhov et al.,2000,Genetika 36(3):332-30를 참조)의 박테리아 럭스 유전자와 마린 박테리아 Vibrio fischeri 및 Vibrio harveyi(예를 들어, 각각 Miyamoto et al.,1988,J Biol Chem.263(26):13393-9, 및 Cohn et al.,1983,Proc Natl Acad Sci USA.,80(1):120-3을 참조). 상기 루시페라제는 본 명세서에 참조로써 병합된 미국 특허번호 6,265,177에 설명된 변형 루시페라제도 역시 포함한다.
녹색 형광 단백질
녹색 형광 단백질("GFP")은 238개의 아미노산으로 된 단백질로서, 아미노산 65 내지 67이 형광을 위하여 추가적인 기질이나 조효소가 필요하지 않은 발색단의 형성에 관여한다(예를 들어 Prasher et al.,1992,Gene 111:229-233:Yang et al.,1996,Nature Biotechnol.14:1252-1256:및 Cody et al.,1993,Biochemisty 32:1212-1218을 참조).
본 명세서에서 사용됨에 있어서,"녹색 형광 단백질" 또는"GFP"는 모든 GFP(녹색 뿐아니라 다른 색을 갖는 GFP의 다양한 형태를 포함한다) 또는 GFP 활성이 있는, GFP로부터 파생된 재조합형 효소를 포함한다. GFP의 원래 유전자는 생물발광 해파리 Aequorea victoria로 부터 클론된것이다(예를 들어, Morin et al.,1972,J.Cell Physiol.77:313-318을 참조). 야생형 GFP는 395 nm에서 주된 들뜸 봉우리(excitation peak)를 갖고 470nm에서 보조 들뜸 봉우리를 갖는다. 470 nm의 흡수 봉우리 덕택에 표준적인 이소티오시안산 플로레사인(FITC) 필터를 사용하여 GFP 수준을 감시할 수 있다. GFP 유전자의 변종은 들뜸 및 형광 특성을 변형하고 발현을 강화하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 65 위치의 세린을 알라닌, 글리신, 이소루신, 또는 트레오닌으로 치환하면, 488 nm에서 들뜨게 될 때 야생형 단백질에 비교하였을 때 최대 들뜸 위치가 바뀌고 형광이 늘어난 GFP 돌연변이체를 낳게 된다(예를 들어, Heim et al., 1995, ature373:663-664; 미국 특허 제5,625,048호; Delagrave et al., 1995, Biotechnology 13: 151-154; Cormack et al., 1996, Gene 173:33-38; 및 Cramer et al., 1996, Nature Biotechnol. 14: 315-319를 참조). GFP를 488 nm에서 여기시킬 수 있는 능력은 GFP를 표준적인 형광 표지 세포 분리("FACS") 장비와 함께 쓸 수 있게 하여 준다. 다른 실시예에서, GFP는 해파리가 아닌 Renilla reniformis와 같은 다른 동물로부터 분리된다.
EGFP는 더 밝은 형광 및 포유류 세포의 더 높은 발현을 위해 최적화된, 야생형 GFP(3 내지 5)의 적색 파장 변이체이다(여기 최고=488nm;발산 최고=507nm). EGFP는 Phe-64를 Leu로 그리고 Ser-65를 Thr로 대체한 아미노산 이중 치환을 포함하는 GFP mut1 돌연변이체를 암호화한다. EGFP 유전자의 암호화 서열은 인간 코돈-용법 선택물에 상응하는, 190 개보다 더 많은 침묵 염기 변이(silent base change)를 포함한다.
베타 갈락토시다아제
베타 갈락토시다아제("β-갈")은 b-갈락토시드, 락토오즈, 및 갈락토시드 아날로그 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드("ONPG") 및 클로로페닐 레드-b-D갈락토피가노시드("CPRG")의 가수분해를 촉매 작용하는 효소이다.(예를 들어, Nielsen et al.,1983 Proc Natl Acad Sci USA 80(17):5198-5202;Eustice et al.,1991, Biotechnique 11:739-742;및 Henderson et al.,1986,Clin.Chem.32:1637-1641를 참조). 상기 β-갈 유전자는 정보제공 유전자로 잘 기능하는데 이는 단백질 프로덕트가 극도로 안정되어 세포의 용해질에서 프로테올리틱 악화에 저항하고 쉽게 분석되기 때문이다. ONPG가 기질로 사용될 때, β-갈 활성도는 분광광도계 또는 마이크로플레이트 판독계로 측정될 수 있다.
본 발명과 관련하여 본 명세서에서 사용된 "베타 갈락토시다제" 또는"β-갈"은 lacZ 유전자 프로덕트 또는 b-갈 활성을 갖는 b-갈로부터 파생된 재조합형 효소를 포함하는 모든 b-갈을 포함한다. 상기 b-갈 유전자는 정보전달 유전자로서 기능하는데 이는 상기 단백질 프로덕트가 극도로 안정적이고, 세포 용해질에서 프로테올리틱 악화에 저항하여 쉽게 분석되기 때문이다. 실시예에서 ONPG가 기질로 사용될 때, b-갈 활성도는 420nm에서 전환되는 ONPG의 양을 판단하기 위하여 분광광도계 또는 마이크로플레이트 판독기로 측정될 수 있다. 실시예에서 CPRG가 기질로 사용될 때에는, b-갈 활성도는 570 내지 595nm에서 전환되는 CPRG의 양을 판단하기 위하여 분광광도계 또는 마이크로 플레이트 판독기로 측정될 수 있다.
클로람페니콜 아세틸트란스페라제
클로람페니콜 아세틸 트란스페라아제("CAT")는 일반적으로 포유류계 세포 시스템에서 정보전달 유전자로 사용되는데 이는 포유류계 세포는 검출할 수 있는 CAT 활성도 레벨을 갖고 있지 않기 때문이다. CAT의 분석은 방사선 라벨된 클로람페니콜 및 적절한 보조인자를 배양하고, 예를 들어 섬광계측(본 명세서에서 참조로 병합된 미국 특허 번호 5,726,041을 참조)이 수반되는 박막크로마토그래피("TLC")에 의한 프로덕트에서 초기 물질을 분리하는 것을 포함한다.
본 발명과 관련하여 본 명세서의 사용에 있어서, "클로람페니콜 아세틸트란스페라아제" 또는 "CAT" 는 CAT 활성을 갖는 CAT로부터 파생된 재조합형 효소 또는 모든 CATs류를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 세포 공정에서 요구되지 않는 정보전달 시스템이 바람직한 반면에, 방사성동위원소 및 크로마토그래픽 분리는 고선별완료에 더욱 적합하며, 정보전달 유전자의 안정성이 중요한 때 정보 전달 유전자로서 CAT가 바람직하다. 예를 들어, 상기 CAT 정보전달 단백질은 생체내에서 약 50시간의 반생을 갖는데, 이는 바람직한 결과의 활동적인 변화 타입에 대비하여 누적적인 경우에 유리하다.
분비 알카라인 포스파타아제
분비된 알카라인 포스파타아제("SEAP") 효소는 알카라인 포스페이트의 절단된 형태이며, 단백질 막영역의 분열은 세포로부터 주변 매체로 알카라인 포스파타아제가 분비되게 한다.
본 발명과 관련하여 본 명세서에서 사용함에 있어, "분비 알카라인 포스파타아제" 또는 "SEAP"는 알카라인 포스파타아제 활성을 갖는 SEAP 로부터 파생된 모든 SEAP 또는 재조합형 효소를 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. SEAP 활성도는 형광 기질의 촉매, 면역침전, HPLC, 및 방사선 검출의 방법을 포함하는 다양한 방법에 의해 검출될 수 있으며, 본 발명은 이에 한정되지는 않는다. 상기 발광 방법은 열량측정 탐지 방법의 증가된 민감도로써 수행되는 것이 바람직하다. 상기 SEAP사용의 이점은 세포 용해 단계가 상기 SEAP 단백질이 세포로부터 분비된 이후로는 요구되지 않는다는 것이며, 이는 자동 샘플링 및 공정의 분석을 용이하게 한다. C형 간염 바이러스 프로테아제의 억제제의 세포-기초 평가에 있어 사용을 위하여 SEAP를 이용한 세포-기초 분석은 Potte에게 허여된 미국특허번호 6,280,940에 설명되어 있으며 이는 본 명세서에 참조로 병합된다.
5.5.7. 세포배양 시스템, 발육란 , 및 동물 모델
종래에 알려진 세포 배양 시스템은 본 발명에 관한 바이러스의 활성도를 전달하고 테스트하는데 사용될 수 있다.(예를 들어, Flint et al.,PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL,2000,ASM Press pp25-29을 참조, 상기 문서의 전문은 참조로 병합된다). 상기 세포 배양 시스템의 실시예는 동물조직(예를 들어, 원숭이 신장에서 채취한 세포 배양, 인간 배아 양막, 신장 및 포피, 그리고 닭 또는 쥐의 배)에서 준비된 첫번째 세포 배양; 단일 타입의 동종 인구로 구성되며 염색전에 100번에 걸쳐 분할하는 배수 염색체 세포 계통(예를 들어, 인간의 배아 폐에서 채취한 WI-38계통인간 배의 세포 배양); 배양에 무기한 유전될 수 있는 단일 세포 타입으로 구성된 연속적인 세포 라인(예를 들어, HEp-2 세포, 헬라 세포, 베로 세포, L 및 3T3세포, 및 BHK-21 세포)
또한, 본 발명의 바이러스는 발육 계란에 전파될 수 있다. 수태후 5 내지 14일에 껍질에 구멍이 뚫이고 바이러스는 복제를 위하여 적당한 위치에 주입된다.
종래에 알려진 임의의 동물 모델은 다양한 목적을 달성하기 위한 본 발명에서 사용될 수 있는바, 본 발명에 따른 백신의 유효성 및 안전성을 결정한다. 상기 동물 모델의 실시예는 코튼랫(시그모돈 히스피디스), 햄스터, 쥐, 원숭이 및 침팬지를 포함하나 본 발명은 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 실시예에서는 시리아 골든 햄스터가 사용된다.
5.5.8 중화 분석
중화분석은 이종성 표면 글리코단백질이 개선된 바이러스 향성 표현을 유발하는 비리온에 병합되는 지 여부의 중요한 안정성을 검토하기 위하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서 "향성"이라는 용어는 특히 세포 타입의 바이러스의 친화성을 가르킨다. 향성은 보통 바이러스가 주입하는 특정 세포 및 특정 세포 타입 상에 세포 수용기가 존재하는가 로써 판단된다. 중화분석은 이종성 표면 글리코단백질(음성 가닥 RNA 바이러스의 F 프로틴의 예에 한정되지 않는다)의 MAb 또는 이종 표면 글리코프로틴에 대항하는 항체를 포함하는 폴리클로날 항혈청을 사용함으로써 수행된다. 상기 항체의 다른 희석은 본 발명의 키메라 바이러스가 중화되었는지 여부를 확인하기 위하여 테스트된다. 상기 이종성 표면 글리코단백질은 항체의 결합 및 중화를 유발하기에 충분한 비리온 표면에 존재해서는 안된다.
5.5.9. 슈크로스 농도 구배 분석( SUCROSE GRADIENT ASSAY )
이종성 단백질이 비리온에 병합되었는지에 대한 의문은 생화학적 분석을 사용하여 더 조사함으로써 해결될 수 있다. 감염된 세포 용해질은 20 내지 60% 당 경사로 분류될 수 있고 다양한 부분이 수집되고 웨스턴 블럿에 의하여 이종성 단백질 및 벡터 단백질의 존재와 희석을 알기 위한 분석이 행해질 수 있다. 또한 상기 부분 및 상기 바이러스 단백질은 플라크 분석을 통해 바이러스 최고 역가가 분석될 수 있다. 당 경사 분석의 예는 아래 섹션 23의 실시예를 참조한다. 이종성 단백질이 비리온과 결합되면, 이종성 단백질은 비리온과 상호 이동한다.
5.6 키메라성 바이러스를 이용하는 백신제제
본 발명은 역가닥 RNA 바이러스로 구성된 백신제제를 포함한다. 본 발명의 재조합형 PIV 바이러스는 다양한 모든 병원균에 보호반응을 유도하는 외래 항원 결정기(epitope)를 발현하는 수단으로서 이용할 수 있다. 특정 실시예에서는, 본 발명은 재조합형 bPIV 바이러스 또는 hPIV 감염으로부터 보호능을 주도록 변형된 백신 제제에 쓰이는 약독화 hPIV의 사용을 포함한다.
본 발명의 백신제제는 이가 및 3가 백신 제제를 포함해서 다원자가의 백신을 포함한다. 본 발명의 이가 백신 및 3가 백신은, 각각 다른 이종성 항원성 순서를 코딩하는 둘 이상의 PIV 벡터 또는 각각 이종성 항원성 순서를 발현하는 하나 이상의 PIV 벡터의 형태로 투여된다. 예를 들어 하나 이상의 이종성 항원성 순서를 발현시키는 제 1 키메라 PIV는 하나 이상의 이종성 항원성 순서를 발현시키는 제 2 키메라 PIV 와 더불어 투여할 수 있는데, 제 2 키메라 PIV에 있는 이종성 항원성 순서는 제 1 키메라 PIV에 있는 이종성 항원성과는 다른 것이다. 제 1 및 제 2 키메라 PIV에 있는 이종성 항원성 순서는 동일한 바이러스로부터 얻어지거나 또는 다른 단백질을 코딩하거나 다른 바이러스로부터 얻어진다. 발명의 일실시예에서 제 1 키메라 PIV에 있는 이종성 항원성 순서는 호흡기 신시티움 바이러스로부터 얻어지고, 제 2 키메라 PIV에 있는 이종성 항원성 순서는 인간의 메타뉴모바이러스(metapneumovirus)로부터 얻어진다. 발명의 다른 실시예에서는, 1 키메라 PIV에 있는 이종성 항원성 순서는 호흡기 신시티움 바이러스로부터 얻어지고, 제 2 키메라 PIV에 있는 이종성 항원성 순서는 조류 뉴모바이러스(pneumovirus)로부터 얻어진다.
발명의 실시예를 보면, 본 발명의 백신제제는 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자(parainfluenza), 호흡기 신시티움 바이러스, 포유류의 메타뉴모바이러스(예를 들어 인간의 메타뉴모바이러스)를 포함하여 역가닥 RNA 바이러스에 의해 유발된 감염에 대하여 보호시키는데 적용될 수 있으나 상기 열거한 것에만 한정되지는 않는다. 보다 상세하게는, 본 발명의 백신제제는 인간의 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스에 의한 감염에 대하여 보호하는데 이용된다. 발명의 실시예에서 본 발명의 백신제제는 인간의 메타뉴모바이러스와 호흡기 신시티움 바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스와 호흡기 신시티움 바이러스에 의한 감염에 대하여 보호하는데 이용된다.
일실시예에서 본 발명은 단백질성 분자(proteinaceous molecule) 또는 메타뉴모바이러스-특정 바이러스 단백질 또는 본 발명에 따라서 핵산에 의해 코딩된 기능성조각(functional fragment)을 제공한다. 유용한 단백질성 분자란 예를 들어 본 발명에 따라서 바이러스로부터 얻어질 수 있는 게놈조각 또는 유전자중 어느것으로부터나 얻어질 수 있는 것을 말한다. 특히 유용한 것으로는 F, SH 및/또는 G 단백질이나 항원이나 소단위 면역원으로서 포함시키기 위한 항원성조각이나, 불활성화백신 전체도 이용될 수 있다. 특히 유용한 것으로는 계통발생학적 분석을 위해 구분된 재조합형 핵산 조각에 의해 코딩된 단백질성 물질(proteinaceous substances)이다. 물론 생체내(예를 들어 보호목적 또는 진단항체를 제공하기 위하여) 또는 시험관내(예를 들어 파지디스플레이기술이나 복제항체를 만들어내는데 유용한 다른 기술에 의하여)이거나 특히 MPV 특정항체나 T-세포 반응을 유도하기 위하여 계통발생학적 분석에서 유용한 것으로서 ORFs의 할당(metes)과 바람직한 경계내에 있다.
바이러스, 핵산, 단백질성 분자 또는 그 조각, 항원 및/또는 항체로 구성된 본 발명의 약학적 조성물은 예를 들어서 MPV 감염 및/또는 호흡기질환의 방지나 처치용 방법에 이용되어 어떤 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 제공하는 것으로 구성된다. 상기 개체가 인간일때 특히 5세 이하의 아동 및 유아는 인간 MPV에 가장 쉽게 감염되므로 본 발명을 가장 유용하게 적용할 수 있다. 일반적으로, 급성 시기에 환자들은 기타 호흡기 및 다른 질환에 가장 걸리기 쉬운 상부 호흡기증상으로 시달리게 된다. 하부 호흡기 질환 또한 더욱 심각한 상태로 진행할 수 있는데, 본 발명의 조성물은 암환자, 장기이식을 받은 환자와 노인들처럼 면역이 약화된 개인의 처치에 이용된다.
본 발명은 바이러스로 구성된 세포배양을 하거나 실험동물을 거친 시험적인(candidate)항바이러스성 약물로 상기 배양 또는 동물을 처치하고, 상기 바이러스나 배양 또는 동물의 감염에 상기 약물의 효과를 결정하는 것으로 구성되어 호흡관 질환의 처치에 유용한 항바이러스성 약물을 얻기 위한 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 약학적 조성물의 조제에 특히 MPV 감염 또는 관련질환에 의해 유발된 호흡관 질환의 처치를 위한 약학적 조성물의 조제에 본 발명에 따른 항바이러스성 약물의 사용을 제공하고, MPV 감염이나 호흡기질환의 처치나 방지를 위하여 유용한 항바이러스성 약물로 구성된 약학적 조성물을 제공하는데, 상기 설명된 본 발명의 방법은 이러한 약학적 조성물을 개인에게 제공하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 백신은 포유류의 메타뉴모바이러스로 구성된다. 보다 상세한 실시예를 보면 포유류의 메타뉴모바이러스란 인간의 메타뉴모바이러스이다. 일실시예에서 백신제제에서 사용될 포유류의 메타뉴모바이러스는 독성약화된 표현형이다. 독성약화된 표현형을 얻는 방법에 대해서는 상기 5.4를 참조한다.
본 발명은 PIV, RSV, APV, hMPV 감염을 방지하고 처치하는 백신제제를 제공한다. 실시예에서, 본 발명의 백신은 재조합형 및 키메라 바이러스이다. 바이러스는 독성이 약화된 것이다.
백신은 APV로 구성되며, 인간의 hMPV 감염을 방지하고 처치하는데 이용된다. APV의 F 단백질과 hMPV의 F 단백질의 높은 성동성으로 인하여 APV의 감염은 숙주에 항체를 만들게 되어 hMPV와 교차반응하고 hMPV와 관련 질환의 감염으로부터 숙주를 보호하게 된다.
다른 실시예를 보면, 백신은 hMPV로 구성되어 칠면조 등의 조류의 APV 감염을 방지하고 처치하는데 이용된다. APV의 F 단백질과 hMPV의 F 단백질의 높은 성동성으로 인하여 hMPV의 감염은 숙주에 항체를 만들게 되어 APV와 교차반응하고 APV와 관련 질환의 감염으로부터 숙주를 보호하게 된다
본 발명의 백신제제는 (1)인간의 메타뉴모바이러스 및 인간의 파라인플루엔자 및/또는 (2)조류 뉴모바이러스 및 인간의 파라인플루엔자와 관련질환에 의한 감염으로부터 보호하는데 이용된다.
본 발명의 백신제제는 (1)인간의 메타뉴모바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스, 인간의 파라인플루엔자 바이러스 및/또는 (2)조류 뉴모바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스, 인간의 파라인플루엔자 바이러스 및 관련질환에 의한 감염으로부터 보호하는데 이용된다.
본 발명의 백신제제는 인간의 메탄뉴모바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스, 인간의 파라인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 보호하는데 이용된다. 또한, 본 발명의 백신제제는 조류 뉴모바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스, 인간의 파라인플루엔자 바이러스 및 관련 질환의 감염으로부터 보호하는데 이용된다.
다른 바이러스종의 F 단백질들이 상동성이 높기 때문에--예를 들어 아미노산서열 비교는 도 1을 참조한다--본 발명의 백신제제는 F 단백질을 코딩하는 이종성 뉴클레오타이드 서열이 만들어지는 것과는 다른 바이러스로부터 보호하기 위하여 이용된다. 실시예를 보면, 백신제제는 조류 뉴모바이러스 A형으로부터 얻어진 이종성 뉴클레오타이드 서열로 구성된 바이러스를 포함하고, 백신제제는 조류 뉴모바이러스 A형과 조류 뉴모바이러스 B형에 의한 감염으로부터 보고하는데 이용된다. 발명의 다른 실시예를 보면, 본 발명의 백신제제는 조류 뉴모바이러스 소그룹인 C형으로부터 얻어진 이종성 뉴클레오타이드 서열로 구성된 바이러스를 포함하며, 조류 뉴모바이러스 소그룹인C형과 조류뉴모바이러스 소그룹D형에 의한 감염으로부터 보호하는데에도 백신제제가 이용된다.
본 발명의 백신제제는 PIV, hMPV, APV (APV C와 APV D를 포함), 인플루엔자, RSV, 센다이(Sendai)바이러스, 볼거리, 라린고트라체이티스(laryngotracheitis)바이러스, 시미안바이러스(simianvirus)5, 인간의 파필로마바이러스, 기타 바이러스, 병원균 및 기타 질환으로부터 보호하는데 유용하도록 인간과 동물에게 투여되는 백신제제를 포함한다.
본 발명은 광견병 바이러스, 고양이 백혈병바이러스(FLV), 개의 디스템퍼바이러스를 포함하여 병원체를 유발하는 가축질환에 유용한 백신제제를 포함한다. 다른 실시예에서는 소포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 우역바이러스, 돈두바이러스에 대하여 가금류를 보호하고 더 나아가 광견병바이러스로부터 야생동물을 보호하는데 유용한 백신제제를 포함한다.
역 유전학 접근에 의해 생성된 독성약화 바이러스는 백신과 약학적 제제에서 사용된다. 역 유전학 기술은 백신제조에 중요한 다른 바이러스성 유전자로 부차적인 변이를 꾀하는데 사용된다. 예를 들어, 5' 논코딩 영역에서의 변이는 mRNA 번역시키고, 캡시드 단백질의 변이는 바이러스 어셈블리에 영향미친다고 보여지고, 온도에 민감하고 냉각 적응된 돌연변이체는 모바이러스(parental virus)보다 병원균 독성이 덜하다 (예를 들어, Flint et al., Principles of Virology, Molecular Biology, Pathogenesis, And Control, 2000, ASM press, 670-683페이지). 유용한 백신 균주 변형의 에피토프는 독성약화바이러스로 된다. 다른 바이러스성의 또는 비바이러스성의 병원균으로부터 만들어진 항원을 포함하는 완전한 이종 에피토프는 독성약화된 균주로 된다. 예를 들어, HIV(gp160, gp120, gp41) 등의 비연관(non-related) 바이러스의 항원, 기생충항원(말라리아), 박테리아성 또는 진균 항원, 또는 종양 항원은 독성약화된 균주로 된다. 변형적으로, 생체내 바이러스의 친화성을 변화시키는 에피토프는 본 발명의 키메라 독성약화된 바이러스가 된다.
실질적으로는, 모든 이종성 유전자 서열이 백신을 사용하기 위하여 본 발명의 키메라 바이러스로 만들어진다. 바람직하게는, 생물학적 반응 조절제로서 역할하는 반(moieties)과 펩타이드가 백신에서 사용되기 위하여 본 발명의 키메라 바이러스로 만들어진다. 다양한 병원균으로 보호 면역 반응을 유도하는 에피토프나 중화항체를 묶는 항원은 키메라 바이러스의 일부에 의해 발현된다. 예를 들어, 본 발명의 키메라 바이러스로 만들어진 이종성 유전자 서열은 인플루엔자 및 파라인플루엔자 적혈구응집소 뉴라미니다제(neuraminidase) 및 인간 PIV3의 HN 유전자와 F 유전자와 같은 융합 당단백질을 포함하며 이에 한정되지는 않는다). 다른 실시예에서는, 키메라 바이러스로 만들어지는 이종성 유전자 서열은 면역조절반응력으로 단백질을 코딩시키는 것을 포함한다. 면역조절 단백질의 예는 시토카인, 인터페론 1형, 감마인터페론, 집락 자극 인자, 인터루킨 -1, -2, -4, -5, -6, -12 및 이러한 약물의 길항제를 포함하며 이에 한정되지는 않는다.
또한, 백신으로 사용하기 위하여 본 발명의 키메라 바이러스로 만들어지는 이종성 유전자 서열은 HIV 1, 2형으로부터 만들어진 서열을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.본 발명의 일실시예에서 항원의 근원이 되는 면역원성 HIV-파생된 펩타이드는 vertebrate 면역 반응을 유도하기 위하여 이용되는 키메라 PIV로 만들어진다. 이렇게 HIV-유도된 펩타이드는 env gene(즉, gp160,gp120 및/또는 gp41의 일부 또는 전부를 코딩하는 서열), pol gene(즉, 역전사효소, 엔도뉴클레아제, 단백분해효소 및/또는 인테그라제(integrase)의 일부 또는 전부를 코딩하는 서열), gag gene(p7, p6, p55, p17/18, p24/25), tat, rev, nef, vif, vpu, vpr 및/또는 vpx으로부터 만들어진 서열을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에서의 기타 이종성 서열은, 몇가지를 나열하자면, B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg)A형 또는 C형 간염 바이러스 항원, 엡스타인바르(Epstein Barr)바이러스의 당단백질; 인간의 파필로마바이러스의 당단백질; 호흡기 신시티움 바이러스의 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스; 헤르페스바이러스의 당단백질; 폴리오바이러스의 VP1, 박테리아 및 기생충 등의 비바이러스성 병원균의 항원결정기로부터 만들어진다. 다른 실시예에서는 면역글로불린 유전자의 일부 또는 전부가 발현된다. 예를 들어, 그러한 항원결정기와 유사한 항-이디오타입 면역글로불린의 가변 영역이 본 발명의 키메라성 바이러스로 만들어진다.
다른 이종성 서열은 종양 항원으로부터 만들어지고, 그 결과 만들어진 키메라 바이러스가 종양세포에 대하여 면역반응을 반들어내는데 이용되어 생체내 종양퇴행으로 되게 한다. 이러한 백신은 종양의 처치를 위하여 화학요법, 방사선 요법, 수술, 골수이식 등과 같은 다른 치료학적인 처방계획과 함께 이용된다. 본 발명에 따르면 재조합형 바이러스가 종양 연관 항원(tumor associated antigen, TAA)을 발현하도록 조작할 수 있는데, 이 TAA로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 다음 항원들을 들 수 있다:
T-세포가 인식하는 사람 종양 항원(Robbins and Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628-636 참조), gp100, MART-1/Melan 1, TRP-1(gp75) 및 티로시나제(tyrosinase)를 포함하는 멜라닌세포 계통 단백질들, 종양에 특이적이고 널리 공유되는 항원들인 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, N-아세틸글루코사민 전달효소-V(acetylglucosaminyl transferase-V) 및 p15, 종양-특정 돌연변이 항원인 β-카테닌(catenin), MUM-1 및 CDK4, 유방암·난소암·자궁암·췌장암종의 비흑색종 항원들과 HER-2/neu, 사람 파필로마바이러스 -E6, E7 및 MUC-1.
다른 실시예에서는 인간의 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스 등의 메타뉴모바이러스로부터 이종성 뉴클레오타이드 서열이 만들어진다. 본 발명의 바이러스는 두가지의 다른 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 그중 하나는 인간의 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스 등의 메타뉴모바이러스로부터 만들어진 것이고 다른 하나는 호흡기 신시티움 바이러스로부터 만들어진 것이다. 이종성 뉴클레오티드 서열은 각 바이러스의 F 단백질 또는 G 단백질을 코딩한다. 실시예에서 이종성 뉴클레이타이드 서열은 키메라 F 단백질을 코딩하는데, 키메라 F 단백질은 파라인플루엔자 바이러스의 F 단백질의 루멘 도메인(luminal domain)은 물론이고 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)과 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 엑토도메인(ectodomain)을 포함한다.
재조합형 바이러스성 생백신 또는 재조합형 바이러스성 사백신이 제제된다. 생백신을 더 선호하는데 그 이유는 숙주 내에서 바이러스가 증식하면 자연 상태의 감염에서 발생하는 것과 종류와 크기가 유사한 자극의 지속으로 이어지는 결과, 실질적이고 장기 지속적인 면역성을 부여하기 때문이다. 이러한 재조합형 바이러스 생백신 제제는 세포배양 또는 닭 배아의 요막에서의 바이러스의 증식에 이은 정제 과정을 수반하는 종래의 방법을 이용하여 만들어진다. bPIV는 인간에게는 비병원성이기 때문에 이 바이러스는 생백신으로 사용하기에 매우 적합하다.
이러한 측면에서, 백신 용도로 유전공학 처리된 PIV(벡터)를 사용하려면 이들 바이러스 주가 약화 특성(attenuation characteristics)을 갖추고 있는 것을 선호할 수 있다. 적절한 돌연변이(예를 들어 결손)를 형질전환용 유전 주형에 도입하면 상기 새로운 바이러스에 약화 특성을 갖추게 할 수도 있다. 예를 들어, 온도 민감성 또는 저온 적응과 관련한 특정한 과오(missense)돌연변이를 결손돌연변이 형태로 만들 수 있다. 이러한 돌연변이들은 저온 또는 온도 민감성 바이러스주에 연관된 점돌연변이보다 보다 안정적이어야 하고 복귀 빈도가 매우 낮아야 한다.
한편으로 "자살"특성이 있는 키메라 바이러스가 만들어진다. 이 바이러스들은 숙주내에서 하나 이상의 복제 횟수만을 거친다. 백신으로 사용될 때에는 재조합형바이러스가 제한된 복제 사이클을 거쳐서 충분한 면역 반응도를 유도해 내나, 인간숙주에서는 더 이상 진행이 되지 않고 질병을 일으키게 된다. 하나 이상의 PIV 유전자가 결여되거나 변이된 PIV 유전자를 소유하는 재조합형 바이러스는 연속적인 복제 횟수를 견뎌낼 수 없다. 결손바이러스는 그러한 유전자를 영구적으로 발현하는 세포라인에서 만들어진다. 기본적인 유전자가 결손된 바이러스는 이러한 셀 라인에서 복제되나 인간숙주에게 투여될 때에는 복제횟수를 다할 수 없다. 그러한 제제는 - 불완전 사이클내에서 - 충분한 수의 유전자를 전사하고 번역하여 면역반응을 유도해낸다. 충분한 양의 균주가 투여되는데, 이러한 제제는 비활성 바이러스 사백신으로 작용한다. 사백신에 대해서는 이종성 유전자 프로덕트가 바이러스 성분으로 발현되어, 유전자 프로덕트가 비리온(virion)과 관련된다. 이러한 제제는 선천단백질(native protein)을 포함하고 사백신 바이러스를 제조하는데 이용된 다른 약물 또는 포르말린 처치에 의한 불활성을 겪지 않는다. cDNA로부터 만들어진 변이 PIV는 급격하게 약화되어 단지 몇회 만큼만 복제된다.
본 발명의 백신은 독성약화된 바이러스로 구성된다. 바이러스성 단백질은 숙주의 세포질막내에 삽입되어 면역반응을 자극시키므로 약화된 바이러스가 세포로 하여금 새로운 바이러스성 감염 입자를 발생시키도록 할 수 없더라도 약화된 바이러스는 백신으로서 효과적이다.
본 발명의 다른 실시예를 보면 불활성 백신 제제는 키메라 바이러스를 "죽이는" 종래의 기술을 이용하여 준비된다. 감염력이 파괴된 것이라는 의미에서 불활성 백신은 "죽은 것"이다. 바이러스의 감염력은 면역원성에 영향을 미치지 않고 파괴된다. 불활성 백신을 준비하기 위해서는 키메라 바이러스가 세포배양에서 생장하거나 닭배양의 요막에서 생장하여, 띠모양의 초원심분리에 의해 정제되며, 포름알데히드 또는 β-프로피오락톤(propiolactone)에 의하여 불활성되고, 풀된다(pooled). 그 결과 만들어지는 백신은 대부분 근육내로 접종된다.
면역학적 반응을 높이기 위하여 불활성 바이러스는 적절한 항원보강제로 제제된다. 이 항원보강제는 미네랄젤, 예를 들어 알루미늄 수산화물; 리소레시틴(lysolecithin), 플루로익 폴리올(pluroic polyols), 폴라니온(polyanions)등의 표면활성물질; 펩타이드; 오일 에멀전(oil emulsions); BCG, 코리네박테륨 파르븀(Corynebacterium parvum), ISCOMS, 비로솜(virosome)처럼 잠재적으로 인간에게 유용한 항원보강제를 포함하나 이것에만 한정되지는 않는다.
상기 설명된 백신제제를 도입하는데 이용된 많은 방법들이 있으나 이것들은 경구 경로, 진피내 경로, 근육내 경로, 복막내 경로, 정맥 경로, 피하 경로, 경피 경로, 코안 경로, 흡입 경로를 포함하나 여기에만 한정되지는 않는다. 백신이 들어갈 병원균 감염의 자연경로를 통하여 키메라 바이러스 제제를 도입하는 것이 바람직하다.
본 발명은 면역원성 조성물에 관한 것으로, 상기 면역원성 조성물은 키메라 PIV로 구성된다. 일실시예에서 면역원성 조성물은 약화된 키메라 PIV로 구성된다. 다른 실시예에서 면역원성 조성물은 또한 약학적으로 수용가능한 보균자로 구성된다.
본 발명에 따른 백신의 효과와 안전성을 평가하기 위해서 다양한 기술들이 사용되었다. 효과적인 백신은 최소한의 부작용으로 적절한 선천 반응과 세포반응과 체액반응을 일으켜서 병원균으로 인한 질환으로부터 종두 개체를 보호하는 것이다. 바이러스의 복제와 종두된 대상물의 면역반응을 측정할 수 있는 모든 기술은 백신을 평가하는데 사용된다. 제한되지 않는 실시예들이 하기 실시예부분에 나타나 있다.
5.6.1. 본 발명의 백신 또는 면역성 제제의 처방( REGIMENS ) 및 투여
본 발명은 이종성이나 후천적 항원 서열을 발현하는 키메라 PIV를 포함하는 면역성 제제와 백신을 제공한다. 상기 백신이나 면역성 제제는 단일 백신이나 2가와 3가 백신을 포함하는 다가 백신을 포함한다. 상기 백신이나 면역성 제제는 여러 가지 바이러스성 감염을 막는데에 유용하게 쓰인다. 특히, 본 발명의 백신이나 면역성 제제는 투여 대상의 호흡계 감염을 보호할 수 있다.
재조합형 바이러스 및/또는 본 발명의 백신이나 면역성 제제는 단독으로 또는 다른 백신들과 함께 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 백신이나 면역성 제제는 호흡계 질병을 예방하는 호흡기 신시티움바이러스(respiratory syncytial virus) 백신, 인플루엔자 백신, 홍역 백신, 볼거리(mumps) 백신, 루벨라(rubella) 백신, 폐렴알균(pneumococcal) 백신, 리케차(rickettsia) 백신, 포도상구균 백신, 백일해(whooping) 백신이나 호흡계 암을 예방하는 다른 백신들과 면역성 제제들과 함께 투여된다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 바이러스 및/또는 백신은 나이에 따라 권고된 소아과(pediatric) 백신과 동시에 투여된다.
예를 들면, 두 달, 네 달이나 여섯 달의 나이에 대해서는, 본 발명의 바이러스 및/또는 백신은 DtaP (IM), Hib (IM), Polio (IPV or OPV)와 Hepatitis B (IM)과 함께 투여될 수 있다. 열두 달이나 열다섯달의 나이에 대해서는 Hib (IM), Polio (IPV or OPV), MMRII (SubQ); VARIVAXX (SubQ)와 hepatitis B (IM)가 공동으로 투여될 수 있다. 발명의 방법과 사용될 수 있는 백신들은 여러 출판물에 검토되어졌다. 예를 들면, 그 전체 내용이 참고문헌으로 여기에 첨부되어 있는 “The Jordan Report 2000, Division of Microbiology and Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, United States”이다.
본 발명의 백신이나 면역성 제제는 그 자체로 투여되거나 약학적 조성물이나 치료조성물의 형태로 투여될 수 있다. 보조제와 본 발명의 면역적 항원(예를 들면, 바이러스, 키메라 바이러스, 변이(mutated) 바이러스)으로 구성된 약학적 조성물(pharmaceutical compositions)은 전형적인 혼합, 융해, 당과형(糖菓形 dragee) 제조; 제조, 연화(levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화, 약물 봉입(entrapping)이나 동결 건조 과정에 의해 만들어진다. 본 발명의 면역성 항원을 약학적으로 사용 가능한 제형으로 처리하는 공정을 촉진하는, 생리적으로 수용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 하나 이상 이용한 종래의 방식으로 약학 조성물을 제제화할 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 경로에, 혹은 경로를 포함한 다른 요소에 좌우된다.
본 발명의 백신이나 면역성 조성물에 보조제를 포함하거나 하나 또는 그 이상의 보조제와 함께 투여될 때, 보조제로는 무기염 보강제나 무기염 겔 보강제, 입자 보강제(particulate adjuvants), 마이크로입자 보강제(microparticulate adjuvants), 점막 보강제(mucosal adjuvants), 면역촉진 보강제(immunostimulatory adjuvants) 등이 사용될 수 있다. 보조제의 예로는 알루미늄 수산화물(aluminum hydroxide), 알루미늄 인산염 겔(aluminum phosphate gel), 프로인트 완전 항원 보강제(Freund's Complete Adjuvant), 프로인트 불완전 항원 보강제(Freund's Incomplete Adjuvant), 스쿠알렌(squalene)이나 스쿠알렌 오일-인-워터 보강제제 (squalane oil-in-water adjuvant formulations), 생물분해성(biodegradable)/바이오 콤퍼터블 폴리에스터(biocompatible polyesters), 폴리머라이즈드 리포솜, 트리터페노이드(triterpenoid) 글리코시드나 사포닌(예를 들면, ST1MULON, ISCOPREP 상표로 판매되는 QuilA와 QS-21), 엔-아세틸-뮤라밀-엘-트레오닐-디-아이소글루타민(N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine) (TERMURTIDE 상표로 판매되는 Threonyl-MDP), LPS, monophosphoryl Lipid A (MPL 상표로 판매되는3D-MLA)등을 들 수 있다.
본 발명의 백신이나 면역성 조성물이 투여되는 객체로는 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하는 인간이다. 하지만, 인간이 아닌 영장류, 소, 말, 양, 돼지, 가금류(예를 들면, 닭, 칠면조), 염소, 고양이, 개, 햄스터, 쥐, 설치동물 등이 될 수도 있다.
본 발명의 백신이나 면역성 조성물을 투여하는 데에는 구강의, 피내의, 근육내의, 복막의, 정맥내의, 피하의, 경피의, 근육내의, 흡입경로를 통한 방법, 난자법(표피층을 할퀴는, 예를 들면, 주사기를 이용하여)을 통한 방법 등이 사용될 수 있다.
국부 투여를 위해서는, 본 발명의 백신이나 면역성 제제는 용액, 젤, 오인트먼트, 크림, 서스펜션이나 기타 당업계에서 잘 알려진 형태로 형성될 수 있다.
흡입에 의하거나 코안으로의 투여를 위해, 본 발명에 따른 사용을 위한 제제는 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로메탄, 탄소산화물이나 다른 적당한 가스와 같은 적절한 분사제를 이용하여 압축된 팩이나 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제제의 형태로 편리하게 전달될 수 있다.
압축된 에어로졸의 경우에 투여유닛은 측정된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정되어진다. 흡입기나 취입기에서의 사용을 위해 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 화합물과 젖당이나 녹말과 같은 적절한 파우더 베이스의 파우더 믹스를 포함하는 형태로 형성될 수 있다.
주입(injection)을 위해서는, 백신이나 면역성 제제는 수성액의 형태로, 바람직하게는 Hank 용액, 링거액과 같은 생리적으로 융화가능한 완충제나 생리적 염성 완충제의 형태로 형성될 수 있다. 상기 용액은 부유제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 약품을 포함할 수 있다. 한편으로, 단백질은 적당한 매체와의 융화를 위해 분말 형태로 형성될 수 있다. 예를 들면, 단백질은 적절한 매개체와의 구성을 위해 사용 전에 멸균발열성물질제거수(sterile pyrogen-free water)와 같은 분말 형태로 있게 된다.
백신이나 면역성 제제의 효과적인 투여량의 결정은 당업자의 재량에 달려 있으며, 상세한 내용에 대해서는 이하에서 기술하기로 한다.
효과적인 1회 투약량은 시험관 분석(in vitro assay)으로부터 예측할 수 있다. 예를 들면, 1회 투약량은 업계에서 잘 알려진 기술을 이용하는 면역반응의 유발을 일으키기 위한 동물모델에서 처방될 수 있다. 당업자는 여기에 기술된 결과에 기초하여 모든 동물의 종에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있다. 1회 투약량과 간격은 개별적으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 면역성 조성물로서 사용되는 경우에 있어서는, 적절한 1회 투약량은 항체반응을 유도할 수 있는 조성물의 양이 된다. 백신으로서 사용되는 경우에는, 본 발명의 백신이나 면역성 제제는 1주 내지 36주의 기간동안 약 1회 내지 3회 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약 2주 내지 4개월의 간격으로 1회 또는 2회 투약량이 투여되며, 그 이후에 정기적으로 백신접종이 주어진다. 대안적인 방법이 개개의 동물에 대해 적절하게 적용될 수 있다. 적절한 투약량은 해당 동물을 감염으로부터 최소한 4개월 내지 12개월동안 보호하기에 충분한 면역반응을 동물체 내에서 일으킬 수 있는 백신 조성물의 양이 된다. 일반적으로, 1회 투약량에 존재하는 항원의 양은 투여대상의 kg당 약 1pg 내지 100mg 범위이며, 일반적으로는 약 10pg 내지 1mg, 바람직하게는 약 100pg 내지 1ug의 범위이다. 적당한 투약량의 범위는 주입경로와, 환자의 크기에 따라 다양하지만, 일반적으로는 약 0.1mL 내지 5mL의 범위이다.
바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 바이러스 및/또는 백신들은 최소한 103 TCID50, 104 TCID50, 105 TCID50, 106TCID50의 1회 투약량을 시작으로 투여된다. 다른 실시예에 있어서, 상기 바이러스 및/또는 백신들은 수회 투약량으로 투여된다. 바람직한 실시예에 있어서, 2,4, 6개월의 나이에 있어서의 제1기 투약과 2년 초기에 있어서의 예방접종이 사용된다. 보다 바람직하게, 최소한 105 TCID50이나 106TCID5의 각 투약은 수회 투약계획으로 이루어진다. 바이러스의 복제율은 임상실험에 있어서 백신의 투약량을 조절하는 지표로 사용될 수 있다. 예를 들면, 바이러스의 복제율(예를 들면, 성장곡선, 5.5절 참조)을 테스트하기 위한 실험은
본 발명의 바이러스 및/또는 백신의 복제율과 선행 연구에서 제시된 bPIV3의 복제율을 비교하는데에 이용될 수 있다 (Clements et AL., J. Clin. Microbiol. 29: 1175-82 (1991); Karron et al., J. Infect. Dis. 171: 1107-14 (1995); Karron et al., Ped. Inf. Dis. J. 5: 650-654 (1996)참조. 이 연구는 bovine PIV3 백신이 대체적으로 안전하고 성인, 6개월 내지 60개월의 아이, 2개월 내지 6개월의 유아를 포함하는 건강한 지원들에게 내성이 있다는 것을 보여준다.
이 연구에 있어서, 대상자는 103TCID50 내지 106TCID50 범위의 bPIV 백신의 1회 투약량을 투여받았다. 12명의 어린이들은 적절한 효과가 나타나지 않는 1회 투약량이 아닌 105TCID50 PIV3 백신의 2회 투약량을 투여받았다). bPIV3와 비슷한 복제율은 비슷한 투약량이 임상실험에서 이용되었음을 알려준다. bPIV3의 복제율보다 낮은 복제율은 더 많은 투약량이 사용되었음을 암시한다.
5.6.1.1. 감염 예방 능력 연구( CHALLENGE STUDIES )
본 실험은 본 발명의 재조합형 바이러스와 백신이 쥐나 햄스터와 같은 동물모델 시스템에서의 바이러스성 하기도 감염을 예방할 수 있는 능력을 결정하기 위해 쓰인다. 상기 재조합형 바이러스 및/또는 백신은 정맥하(IV) 경로(route)를 통하거나, 근육내(IM) 경로나 비강내(intranasal, IN) 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기 재조합형 바이러스 및/또는 백신은 당업자에게 잘 알려진 기법을 통해 투여될 수도 있다. 본 실험은 항체의 혈청 집중과 항체가 걸린 바이러스의 폐 역가(titer)의 감소를 관련시키는 데에도 사용된다.
제 0일에, 중남미 들쥐(cotton rat 학명 Sigmodon hispidis, 평균 무게 100g)와 시노몰구스 마카크(Cynomolgous macacques) 원숭이(평균 무게 2.0kg)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 일군의 동물에 대하여 근육 내 주입이나, 정맥 내 주입이나. 코내 경로를 통하여 특정 재조합형이나 키메라 바이러스를 투여한다. 본 발명의 재조합형 바이러스나 백신의 투여 이전에, 동시에, 또는 이후에 동물들은 백신이 발생할 때 생기는 야생형 바이러스에 감염된다. 일 실시예에 있어서, 동물들은 본 발명의 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여 이후에 최소한 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주일이나 1달 또는 그 이상의 달 동안 와일드 타입 바이러스에 감염되었다.
감염 후에, 쥐는 희생되었고, 그들의 폐 조직은 채취되었으며, 침범된 바이러스 역가(titer)는 플라크 적정(titration)에 의해 결정되어진다. 보바인 혈청 알부민(BSA) 10mg/kg은 부정조절(negative control)로서 이용된다. 공격(challenge)시의 혈청에서의 항체집중은 샌드위치 ELISA를 이용하여 결정된다. 유사하게, macacque에서, 코와 폐 세척(lavages)에서 바이러스 역가(titer)는 측정될 수 있다.
5.6.1.2. 목표 대상 집단( TARGET POPULATIONS )
본 발명의 실시예에 있어서, 본 발명의 치료와 진단방법에 대한 대상집단은 나이에 의해 정의된다. 일 실시예에 있어서, 본 발명의 치료 및/또는 진단방법에 대한 대상집단은 호흡계 감염과 더불어 질병이나 장애에 의해 특징지어진다.
일 실시예에 있어서, 대상집단은 2살 미만의 어린이를 포함한다. 보다 세부적인 실시예에 있어서, 상기 어린이는 호흡계 감염 이외의 질병은 걸리지 않은 어린이이다.
다른 실시예에 있어서, 대상집단은 5살 이상의 환자를 포함한다. 보다 세부적으로는, 5살 이상의 어린이는 방광 섬유증(cystic fibrosis), 백혈병, non-Hodgkin 임파종 등의 질병이나 장애를 겪은 경험이 있으며, 최근에 골수나 신장이식을 받은바 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 대상집단은 객체 내에 hMPV 감염균이 보유된 대상을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 객체는 면역능력이 손상된 개체이다.
다른 실시예에 있어서, 본 발명의 방법을 위한 대상집단은 중장년층을 포함한다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명의 발명을 시험하기 위한 객체는 겨울철에 hMPV에 감염된 이를 대상으로 한다.
5.6.1.3. 임상 실험
시험관내 분석법과 동물 모델로 테스트 받은 본 발명의 백신 또는 상기 백신의 조각들은 정상적인 건강한 자원자들에 대하여 안전성, 내성, 면역성, 감염성 및 약동학 면에서 추가적인 평가를 받을 수 있다. 지원자들은 본 발명의 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 1회 투약량을 근육내로, 정맥내로 투여받거나 폐운반시스템에 의해 투여받는다. 각 지원자들은 본 발명의 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 1회 투약량을 투여받기 이전에 최소한 24시간 동안 체크를 받게 되며, 임상실험실에서 투약받은 후에 최소한 48시간 동안 또 체크를 받는다. 지원자들은 투여받은 후 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 56일 째날에 외래환자로서 체크받게 된다.
혈액 샘플들은 다음의 간격으로 10ml 베큐테이너 튜브(Vacutainer tubes)를 이용하여 인드웰링 카테터(indwelling catheter)나 다이렉트 정맥천자(venipuncture)를 통하여 수집된다.
(1) 본 발명의 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여량을 투여받기 전
(2) 본 발명의 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여량을 투여받는 동안
(3) 본 발명의 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여량을 투여받은 후 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간 이후
(4) 본 발명의 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여량을 투여받은 후 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일, 56일 이후
샘플들은 응고시키는 것이 허용되며, 혈청은 원심분리 후에 수집된다.
환자로부터 채취된 샘플에서 본 발명의 재조합형 바이러스 및/또는 백신에 대항하여 생성된 항체의 양은 ELISA에 의해 평가될 수 있다. PBMC 내의 T-cell 면역성(세포독성과 헬퍼반응)과 폐와 코 세척은 모니터될 수 있다.
지원자들의 혈청 속 항체 농도는 본 발명의 재조합형 바이러스 및/또는 백신의 투여량의 투여 이후에 각 채취 간격에서의 혈청 레벨로부터 이전 투여량 혈청 레벨(백그라운드 레벨)을 뺌으로써 이루어진다. 각 지원자에 대한 약물동태학 인자들은 채취된 혈청 항체나 항체 단편 농도(antibody fragment concentrations)로부터 모델-독립적 접근법(model-independent approach)에 따라 계산된다 (Gibaldi et AL., eds. , 1982, Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel DEKKER, New York).
본 발명은 적절한 숙주세포 시스템에서 이종성 유전자 산물을 발현 및/또는 상기 이종성 유전자 산물을 발현, 패키지, 및/또는 표면에 제시(present)하는 역가닥(negative strand) RNA 재조합 바이러스의 구조(rescue)에 사용될 수 있는 재조합 소 파라인플루엔자 바이러스(bPIV) cDNA 또는 RNA를 제공한다.더 구체적으로 상기 이종성 유전자 산물에는 또 다른 파라인플루엔자 바이러스 종의 유전자 산물 또는 인플루엔자 바이러스, 호흡기 신시티움(syncytial) 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 및 조류 뉴모바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는 또 다른 역가닥 RNA 바이러스들의 유전자 산물이 포함된다.
상기 키메라성 바이러스 및 발현 산물들은 폭넓은 범위의 병원균들과 항원들에 대한 백신들을 포함하는 백신 제제에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 다양한 조류 뉴모바이러스들의 다양한 F 단백질과 인간 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 아미노산 서열을 쌍으로(pairwise) 정렬한 그림이다. 두 서열 사이에 동일한 아미노산은 그 아미노산에 대하여 1 문자 심볼에 의하여 표시되었다. 두 아미노산 서열에서 교체된 아미노산 중 보존적인(conservative) 것은 "+" 부호로 표시하였고, 빈 칸은 비보존적인 아미노산 교체를 나타낸다. A)는 인간 메타뉴모바이러스성 F 단백질과 청둥오리(Mallard Duck)로부터 분리된 조류 뉴모바이러스의 F 단백질을 정렬한 것이다(엑토도메인 내 85.6% 상동성). B)는 인간 메타뉴모바이러스성 F 단백질과 칠면조로부터 분리된 조류 뉴모바이러스의 F 단백질 사이의 정렬이다(서브그룹 B: 엑토도메인 내 75% 상동성).
도 2는 b/h PIV3 키메라 바이러스의 3가지 다른 분리물로부터 유래한 뉴클레오타이드(nt) 5255부터 뉴클레오타이드 6255까지의 PCR 절편이 증폭된 것이다. 결과적으로 생성되는 1kb의 DNA 절편은 인간 PIV3의 F 단백질 특이 효소로 처리되었다. 이러한 효소는 소 PIV3의 대응 절편에는 작용하지 않는다. 1% 아가로스 겔은 처리되지 않는 절편(2, 5 및 6 레인)과 Sacl 또는 BgIII로 처리된 절편(각각 4, 6 레인과 9, 10, 11 레인)을 나타낸다. 10 레인 샘플은 처리되지 않은 것이나, BgIII로 반복하여 처리 시 이 샘플도 절단되었다(데이타는 보여 지지 않았음). 1 레인과 8 레인은 DNA 크기 마커를 나타낸다.
도 3은 b/h PIV3 키메라 바이러스의 3가지 다른 분리물로부터 유래한 nt 9075부터 nt 10469까지의 PCR 절편이 증폭된 것이다. 결과적으로 생성되는 1.4kb의 DNA 절편은 소 PIV3의 L 단백질 특이 효소로 처리되었다. 이러한 효소는 인간 PIV3의 대응 절편에는 작용하지 않는다. 1% 아가로스 겔은 처리되지 않는 1.4kb의 절편(2, 5 및 8 레인)을 나타낸다. BamH1 또는 PvuII로 처리되어 생성된 작은 DNA 절편은 3, 4, 6, 7, 9, 및 10 레인에 나타내었다. 1 레인은 DNA 크기 마커를 나타낸다.
도 4는 BPIV3/HPIV3 벡터 및 b/h PIV3를 벡터 삼은(vectored) RSV F 또는 G cDNA를 포함하는 6개의 구조물을 나타낸다. 소 PIV3 F 유전자와 HN 유전자는 제거되었고 각각 인간 PIV3 F 유전자와 HN 유전자로 대체되었다. RSV F 또는 G 유전자는 위치 1 또는 위치 2에 클론되었다. RSV F1* (N-N)를 제외하고는 모든 RSV 유전자는 bPIV3 N-P 유전자간 영역에 연결되었는데, RSV F1* (N-N)은 더 짧은 bPIV3 N 유전자 중단(stop)/N 유전자 시작(start) 서열이 그 뒤를 따른다.
도 5는 b/h PIV3를 벡터 삼은 RSV F 또는 G 유전자가 위치적(positional) 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. (A)는 키메라 바이러스-감염 세포 용해물(lysate)의 웨스턴 흡입 분석이다. F 단백질은 RSV F 단백질에 대한 단일클론 항체(MAbs)를 사용하여 검출되었고, G 단백질은 RSV G 단백질에 대한 다중클론 항체(PAbs)를 사용하여 검출되었다. 50 kDa의 밴드가 나타내는 F1 절편은 야생형 RSV 및 모든 키메라성 바이러스로 감염된 세포 내에서 검출되었다. 야생형 RSV와 비교하여 키메라 바이러스의 감염된 세포 용해물 내에서 20 kDa의 F 절편이 더 많이 축적되었다. 본 실험은 1 레인을 제외하고는 0.1의 MOI에서 행하여졌고, b/h PIV3를 벡터 삼은 RSV Fol* N-N 감염은 1.0 MOI의 높은 농도에서 반복되었다. 약 50 kDa와 90 kDa에서 이동하는 비성숙 및 글리코실화된 두가지 RSV G 단백질이 모두 검출되었다. (B)는 도 5A에 나타나는 단백질 발현의 결과와 관련된 mRNA 전사를 보여주는 노던 흡입 분석이다. 동일한 양의 총 RNA가 1% 포름알데히드를 포함하는 아가로스 겔에서 분리되었고, 나일론 막으로 옮겨졌다. 흡입은 DIG RNA 표지 키트를 사용하여, 시험관내 전사에서 합성된, 디곡시게닌(DIG)-UTP-표지된 리보핵산 탐지자와 혼성화 되었다. (C)는 신장 세포(Vero cell)에서 b/h PIV3 벡터된 RSV F 또는 G 단백질을 포함하는 키메라 바이러스의 성장 곡선이다. 신장 세포(vero cell)는 90% 컨플루언스(confluence)로 배양되고, 0.01의 MOI에서 감염되었다. 감염된 모노레이어는 37도에서 배양하였다. 각 시점에 있어 바이러스 역가(titer)는 TCID50 분석에 의해 결정되었는데, 그것은 6일 동안 37도에서 배양한 후 CPE에 대한 육안적 검사를 통하여 수행되었다.
도 6은 b/h PIV3를 벡터 삼은 향상된 녹색 형광 단백질(enhanced GFP, eGFP) 구조물(construct)을 나타낸다. eGFP 유전자는 모든 PIV3 유전자 사이에 연속적으로 b/h PIV3 벡터 내로 도입되었다(여기에서는 단지 1, 2, 3, 및 4번 위치만 보여졌다). eGFP 유전자는 bPIV3 N-P 유전자간 영역에 연결되었다. b/h GFP 1 구조물은 b/h PIV3 게놈의 3' 쪽 가장 말단 위치의 eGFP 유전자 카셋트를 가지고 있다. b/h GFP 2 구조물은 eGFP 유전자 카셋트를 N 유전자와 P 유전자 사이에 포함하고 있다. b/h GFP 3 구조물은 eGFP 유전자 카셋트를 b/h PIV3의 P 유전자와 M 유전자 사이에 포함하고 있고, b/h GFP 4 구조물은 eGFP 유전자 카셋트를 b/h PIV3의 M 유전자와 F 유전자 사이에 포함하고 있다.
도 7은 b/h PIV3 게놈 내에서 촉진된 향상된 녹색 형광 단백질(eEGFP) 삽입의 위치적 효과를 나타내는 도이다. (A)는 PIV3를 벡터 삼은 eGFP 1, 2, 및 3를 가지고 MOI 0.1과 0.01에서 20시간 동안 신경 세포(Vero cell)를 감염 시킬 때 생성되는 녹색 세포의 양을 나타낸다. 녹색 세포는 형광 현미경을 사용하여 관찰한다. (B)는 감염된 세포 용해물의 웨스턴 흡입 분석이다. 흡입은 PIV3 PAb와 GFP MAb로 프로브화된다. PIV3 항체 또한 흡입이 동일한 양의 로딩을 가진다는 것을 보여주기 위하여 사용되었다. (C)는 신경 세포(vero cell) 내 b/h PIV3를 벡터 삼은 GFP 구조물(1, 2, 및 3의 위치에서)의 성장 곡선이다.
도 8은 서로 다른 유전자간 영역을 갖는, b/h PIV3를 벡터 삼은 RSV F 유전자의 구조물이다. 3가지 구조물인, RSV F1* N-N, RSV F2 N-P, 및 RSV F1 N-P는 도 4의 RSV F* (N-N), RSV F2, 및 RSV Fl와 각각 동일한 것이다. RSV F1* N-N에 있어 N 유전자 시작 서열과 N 유전자 번역 시작 코돈 사이의 거리는 단지 10 뉴클레오타이드 길이이다. 대조적으로 이러한 거리는 RSV F2 구조물에서는 86 nts 길이이다. RSV F1* N-N 또한 RSV F2 구조물에서 행해진 것처럼 P 유전자 시작 서열 이외에 N 유전자 시작 서열을 사용할 수 있다.
도 9. 삽입된 RSV 유전자 다운스트림 위치의 유전자간 영역의 길이 및/또는 특성은 바이러스 복제에 영향을 미친다. (A)는 키메라성 바이러스 내 RSV F 단백질 발현을 웨스턴 흡입 분석한 것이다. 흡입은 RSV F 단백질에 대한 단일클론항체를 가지고 프로브화 되었다. RSV F1 구조물에 의하여 발현되고 감염 후 24 및 48시간 후에 측정된 F1 단백질 레벨은 RSV F2 구조물의 경우 관측된 레벨과 유사하였다. 하지만 RSV F1* N-N 구조물의 레벨보다는 높았다.(B)는 0.1의 MOI에서 Vero 세포 내의 RSV F1, RSV F1* N-N과 RSV F2 구조물의 바이러스 복제 반응 속도를 비교하는 다중주기(multicycle) 성장 곡선을 나타낸 것이다. 배양 각 시점에 있어 바이러스 역가는 플라크(plaque) 분석에 의해 결정되었는데, 분석은 배양 5일 후에 정량 평가를 위하여 RSV 다중클론 항혈청을 사용한 면역염색을 통하여 이루어졌다.
도 10은 3가 b/h PIV3 벡터된 RSV F 와 hMPV F의 구조물이다. 각각 키메라 b/h PIV3 벡터와 메타뉴로바이러스 F 유전자로부터 유래한 첫 번재 이종성 서열과 호흡기 신시티움 바이러스 F 유전자로부터 유래한 두 번째 이종성 서열을 포함하는 두개의 바이러스 게놈을 여기에 나타내었다. 이러한 구조물 중 어느 하나를 가진 바이러스는 신경 세포 내에서 증폭되었다. 설명된 바와 같이 조작된 바이러스가 파라인플루엔자 바이러스 감염, 메타뉴모바이러스 감염 및 호흡기 신시티움 바이러스 감염에 대한 3가 백신으로 사용될 수 있다.
도 11은 두개의 RSV F 유전자를 갖고 있는 구조물이다. 이러한 구조물은 RSV F 단백질 생산을 위한 바이러스 성장 키네틱과 햄스터에서 복제와 면역원성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
도 12는 키메라 b/h PIV3 벡터된 hMPV F 구조물이다. 인간 메타뉴모바이러스(hMPV)의 F 유전자가 b/h PIV3 게놈의 1 위치 또는 2 위치에 삽입되었다. hMPV F 유전자 카셋트는 bPIV3 N-P 내부유전자의 영역을 갖는다.
도 13은 b/h PIV3 벡터된 hMPV F 유전자(위치 2)의 면역침강과 복제 분석을 나타내는 도이다. (A)는 기니아 피그 또는 인간 항-hMPV 항혈청을 사용한 hMPV F 단백질의 면역침강을 보여준다. 약 80kDa로 이동하는 특정 밴드들이 b/h PIV3 벡터된 hMPV F2의 용해물에서 관찰되었다. 그 크기는 F 전구체 단백질인 FO와 일치한다. 다른 크기의 비-특이적 밴드 또한 b/h PIV3와 목크(mock) 컨트롤 레인에서 관찰되었다. (B)는 b/h PIV3/HMPV F2의 바이러스 복제의 키네틱을 결정하고, 그것을 0.1의 MOI에서 신경 세포 내 b/h PIV3과 b/h PIV3/RSV F2에 대하여 관측된 결과들과 비교하기 위하여 수행된 성장 곡선을 나타낸다. (C)는 b/h PIV3/HMPV F1의 바이러스 복제의 키네틱을 결정하고, 그것을 0.01의 MOI에서 신경 세포 내 b/h PIV3과 b/h PIV3/RSV F2에 대하여 관측된 결과들과 비교하기 위하여 수행된 성장 곡선을 나타낸다.
도 14는 키메라 b/h PIV3 벡터된 가용성 RSV F 유전자 구조물을 나타낸다. 이러한 구조물은 가용성 F 유전자의 단일 카피, 트랜스멤브레인과 세포질 도메인이 없는 RSV F 유전자 버전을 포함한다. 이러한 구조물의 이점은 가용성 RSV F가 비리온 게놈 속으로 편입될 수 없다는 점일 것이다.
도 15는 면역염색된 b/h PIV3/hMPV F1과 b/h PIV3/hMPV F2를 나타낸다. (A)는 b/h PIV3/hMPV F1 바이러스가 희석되고 서브컨플르언트(subconfluent) 신경 세포를 감염시키기 위해 사용된 것을 보여준다. 감염된 세포는 겐타마이신을 포함하는 optiMEM 배지에 오버레이되고, 5일 동안 35도에서 배양되었다. 세포는 고정되고 기니아 피그 항-hMPV 혈청으로 면역염색되었다. hMPV F의 발현은 AEC 기질 시스템의 존재 하에 특이 칼라 전개에 의해 관측된다. (B)는 b/h PIV3/hMPV F2 바이러스가 희석되고 신경 세포(vero cell)를 감염시키기 위해 사용된 것을 보여준다. 감염된 세포는 EMEM/L-15 배지(JRH Biosciences; Lenexa, KS)에 1% 메틸셀룰로오스와 같이 오버레이되고, 배양되고, 고정되고, 그 후 항-hMPV 기니아 피그 혈청으로 면역염색되었다. 항-hMPV 기니아 피그 혈청은 hMPV 001 단백질에 특이적이다.
도 16은 슈크로스 그레디언트 하에서 b/h PIV3 벡터된 유전자의 비리온 분별을 나타낸다. 이러한 계열의 실험은 RSV 단백질이 b/h PIV3 비리온에 포함되었는지를 확인할 수 있다. (A)는 자유로운 RSV F(baculovirus에서 생성되고, C-말단 절단된)의 컨트롤 그레디언트를 보여준다. 대부분의 자유 RSV F는 3, 4, 5, 및 6 프랙션에 존재한다. (B)는 10, 11 및 12 프랙션에서 가장 높은 농도의 RSV 비리온이 관찰된다는 것을 보여준다. RSV 프랙션은 RSV 폴리클로날 항혈청과 RSV F MAb로 프로브화된다. 가장 많은 양의 RSV 비리온이 포함된 프랙션은 또한 가장 강력한 RSV F에 대한 시그널을 보이는데, 이것은 RSV F 단백질이 RSV 비리온과 같이 이동하고 관련되어 있다는 것을 암시한다. (B)의 마지막 그림은 10, 11 및 12 프랙션이 플라크 분석에서 가장 높은 바이러스 역가를 나타낸다는 것을 보여준다. (C)는 b/h PIV3 비리온은 다형성 이상일 수 있고, 그래서 b/h PIV3 비리온을 포함하는 피크 프랙션의 폭이 매우 넓다는 것을 보여준다. (D)는 b/h PIV3/RSV F2의 슈크로스 그레디언트 프랙션을 PIV 폴리클로날 항혈청과 RSV F MAb 두 가지를 가지고 분석한 것을 나타낸다. 대부분의 비리온을 포함하는 프랙션은 PIV3 항혈청을 사용한 웨스턴에서 나타나는 것처럼 11, 12, 13 및 14 프랙션이다. 동일하게 이것은 또한 가장 많은 양의 RSV F 단백질을 보여주는 프랙션이다. 약간의 자유로운 RSV F는 또한 5와 6 프랙션에 존재한다. 11, 12, 13 및 14 프랙션은 피크 바이러스 역가를 나타낸다. (E)는 b/h PIV3/RSV G2의 대부분의 비리온을 포함하는 프랙션(9, 10, 11 및 12)은 또한 가장 강력한 RSV G 단백질의 시그널을 나타낸다. 다시, 이것은 가장 높은 바이러스 역가를 가진 프랙션이다.
다음의 실시예들은 한정적이 아닌 본 발명의 예시적인 실시예들이다.
실시예에서 사용된 셀과 바이러스들은 다음과 같이 유지된다. RSV A2 바이러스 주와 소 파라인플루엔자 타입3/사람 파라인플루엔자 타입 3을 벡터 삼은(vectored) RSV 바이러스(bPIV3/hPIV3/RSV 바이러스)는 겐타마이신의 존재 하에서 Opti-MEM(Gibco/BRL) 배양액 속 신장 세포(Vero cell)에서 생성된다. 변형된 백시니아(vaccinia) 바이러스 안카라(Ankara) (MVA-T7) 또는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소를 발현하는 계두(鷄頭)-T7(fowl-pox-T7, FP-t7) 바이러스는 닭 배아 신장 세포(SPAFAS) 속에서 배양된다. 신장(Vero), HeLa와 Hep-2 세포는 10% 태아 소(fetal bovine) 혈청 (FBS), 2 mM 엘-글루타민(L-glutamine), 비필수 아미노산과 항생물질로 보충된 MEM(JRH Biosciences) 속에 유지된다.
실시예 1: 키메라 소 파라인플루엔자 3/ 인간 파라인플루엔자 3 cDNA 의 구성물 및 클로닝
bPIV3의 F와 HN 유전자와 hPIV3의 유전자를 치환하기 위하여, 추가적인 억제 효소 부위가 전염성의 bPIV3 cDNA로 삽입된다. 부위-유도 돌연변이화(site-directed mutagenesis)를 이용하여, 단일 Hhe I 부위는 뉴클레오타이드 위치 5041에 삽입되고, Sal I 부위는 bPIV3 cDNA의 nt 8529에 삽입된다. 변형된 총-길이(full-length) bPIV3 cDNA는 Nhe I과 Sal I 억제 효소와 F, HN 유전자를 제외한 모든 바이러스 유래 bPIV3 서열을 포함하는 14 kb DNA 단편으로 치료되고, 겔 정제에 의해 분리된다.
hPIV3 F와 HN 유전자 서열을 얻기 위하여, 융합성 신장 세포(Vero cell)의 10cm dish는 hPIV3 주(strain)로 감연된다. 37C에서 배양을 한 3일 후에, 상기 세포는 수집되고 전사 RNA는 RNA STAT-LS 50(Tel- Test INC.)를 이용하여 분리된다. 바이러스(viral) cDNA는 hPIV3 유전자의 포지션 4828에서의 hPIV3 올리고(oligo) 붙임(annealing)을 이용하는 역전사에 의해 생성된다. hPIV3 F와 HN 유전자는 Taq 폴리머라제를 이용하는 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭된다. 상기 PCR 프로덕트는 pT/A TOPO cloning vector (Invitrogen)로 클론되고, 두 클론(#11 과 #14)으로부터 hPIV3 F와 H유전자는 연쇄된다. 서열분석을 통해 보면, 클론 #11에 대해서는 F유전자는 정확하지만, HN유전자는 이상 서열을 포함한다. 클론 #14에 대해서는 HN유전자는 정확하지만, F유전자는 이상 스탑 코돈(aberrant stop codons)을 포함한다. 그래서, 기능성 hPIV3 F와 HN유전자를 포함하는 플라즈미드는 클론 #11의 정확한 F유전자와 #14의 정확한 HN유전자를 다음과 같은 방법으로 결합함으로써 생성된다. 양 hPIV3 플라즈미드(#11과 #14)는 Nhel과 EcoRl으로 증해(digest)된다. 정확한 F유전자를 포함하는 1.6kb 단편은 클론 #11과 정확한 HN유전자를 포함하는 8.5kb 단편과 플라즈미드 서열로부터 분리되고, 클론 #14로부터 분리된다. 상기 두 단편은 플라즈미드를 포함하는 인택트(intact) hPIV3 F와 HN 유전자를 생성하기 위하여 결합된다. 정확한 서열은 DNA 서열 분석에 의하여 확인된다. 최종적으로, "Rule of Six"를 충족시키기 위하여 단일 뉴클레오타이드는 비해독 부위 내의 HN 유전자의 3 ‘종단에 첨가된다. 이러한, 단일 뉴클레오타이드의 추가는 QuikChange mutagenesis kit (Stratagene)을 이용하여 수행되며, DNA 염기순서분석에 의하여 확인된다. 정확한 hPIV3 F와 HN 유전자 DNA 단편은 Nhe 1과 Sal 1의 흡수에 의해 분리되며, 3.5kb DNA 단편은 겔 정화된다.
총-길이 b/h PIV3 키메라 cDNA는 상술한 bPIV3 서열을 포함하는 14.5 kb DNA 단편과 hPIV3 F와 HN 유전자를 포함하는 3.5kb DNA 단편을 결합시킴으로써 생성된다(Figure3 참조). 총-길이 키메라 플라즈미드 DNA는 방대한(extensive) 억제 효소 매핑에 의해 확인된다.
그리고, 키메라 컨스트럭트의 M/F와 HN/L 유전자 결합은 Nhe 1과 Sal 1 억제 효소 부위 뿐만 아니라 bPIV3와 hPIV3 서열을 포함하는 DNA 서열에 의해 확인된다.
실시예 2 : 키메라 소 파라인플루엔자 3/ 인간 파라인플루엔자 3 벡터된 호흡기 신시티움 F 또는 G cDNAs 구조물 및 클로닝
바이러스 복제에 있어서, b/h PIV3 유전자의 포지션 1이나 2으로의 RSV 항원 삽입의 효과를 결정하기 위하여, 호흡기 신시티움 바이러스(RSV) F와 G 유전자는 키메라 보빈 파라인플루엔자 3/휴먼 파라인플루엔자 3 벡터(b/h PIV3 벡터)의 다른 포지션으로 클론된다. 도 4를 참조하라.
이종 유전자를 소/사람 PIV3 cDNA(b/h PIV3 cDNA)로 삽입시키기 위하여, Avr II 제한 효소 부위를 QuickChange kit (Stratagene)를 이용하는 부위-유도 돌연변이에 의하여 b/h PIV3 CDNA 플라즈미드에 도입하였다(Haller et AL., 2000; 2001, 이것은 실시예 6과 동일한 구조이다). 하나의 Avr II 부위는 b/h PIV3 유전자 내의 뉴클레오타이드(nt) 104 위치에 다음의 올리고 5'GAA ATC CTA AGA CCC TAG GCA TGT TGA GTC3'와 그것의 상보 가닥(complement)을 이용하여 네 개의 뉴클레오타이드를 변경함으로써 도입하였다. 상기 제한 효소 부위는 바이러스 게놈의 첫째(가장 3' 방향) 위치에 RSV 유전자를 삽입시키는 데에 쓰인다. 다른 Avr II 부위는 뉴클레오타이드 1774 위치의 N-P 유전자간 영역에 다음 올리고 5'-CCACAACTCAATCAACCTAGGATTCATGGAAGACAATG-3’와 그 상보가닥을 이용하여 두 개의 뉴클레오타이드를 변화시켜 도입하였다. 이러한 억제 부위는 b/h PIV3의 N과 P 유전자 사인의 두 번째 포지션으로 RSV 유전자를 삽입시키는 데에 이용된다. nts 104와 1774에서 AVRII 부위를 포함하는 총-길이 b/h PIV3 cDNA들은 바이러스를 회복시키고 유전자를 바꿈으로써 기능에 대해 테스트된다.
RSV G cassette (N-P gene stop / start )의 생성 : PCR 모형과 같은 b/h PIV3 cDNA를 이용하여, RSV G 유전자의 3’ 말단 서열 뿐만 아니라 bPIV3 N-P 유전자간 영역을 포함하는 DNA 단편이 형성된다. 이 단편은 다음의 올리고 5'CCCAACACACCACGCCAGTAGTCACAAAGAGATGACCACTATCAC3'와 올리고 단편 5’CCCAAGCTTCCTAGGTGAATCTTTGGTTGATTGAGTTGTGG3'를 이용하는 PCR에 의해 생성된다. 이 단편은 bPIV3 N-P 유전자간 영역을 RSV G에 결합시키기 위한 오버랩핑(overlapping) PCR을 수행하는 데에 사용된다. 두 번째 PCR 반응을 위하여, RSV G와 F 유전자를 포함하는 플라즈미드는 DNA 주형으로 이용된다. 그리고, 올리고뉴클레오타이드 5’CAGCGGATCCTAGGGGAGAAAAGTGTCGAAGAAAAATGTCC3’와 상기 짧은 PCR 단편으로부터 생성된 올리고는 프라이머로서 이용된다. 그 결과 생성되는, bPIV3 N-P 유전자간 영역이 연결된 RSV G 유전자와 이를 둘러싼 Avr II 제한 효소 부위들을 포함하는 PCR 단편은 pGEM3속에 클론된다. RSV G 유전자는 ORF에 이상이 없고 예측된 서열을 가지는지 확인하기 위하여 서열을 분석받았다. RSV G 유전자를 가지는 DNA 단편은 Avr II 제한 효소 부위를 이용하여 Avr II와 선형화된 bPIV3 (1-5 bPIV3) 유전자의 첫 번째 5200개 뉴클레오타이드만을 포함하는 서브클론의 첫 번째나 두 번째 위치에 삽입된다. 여기와 다른 예에서 사용된 1-5 bPIV3는 보빈 PIV3 유전자의 뉴클레오타이드 1부터 5196(또는 5200)을 지칭한다. BstB I 부위가 이 위치에 있다.
RSV F cassette (N-P gene start / stop ) DML 생성 : RSV F 유전자는 전체 길이의 bPIV3/RSV F+G cDNA 플라즈미드로부터 PCR로 분리되었는데, 이를 위하여 RSV F 유전자의 5’와 3’말단에 Avr II 부위를 삽입하는 올리고를 이용하였다. 분리된 RSV F는 nt 1774 위치에 Avr II 부위를 포함하는 1-5 bPIV3 플라즈미드에 삽입된 다음, Avr II를 이용하여 선형화되었다.
bPIV3 N-P 유전자간 영역은 1-5 bPIV3/RSV G2를 주형으로 이용하는 PCR에 의해 분리되었다. 올리고뉴클레오타이드 5’GACGCGTCGACCACAAAGAGATGACCACTATCACC3'와 bPIV3 F 유전자에 어닐링(annealing)하는 올리고는 bPIV3 N-P 유전자간 영역, Avr II 부위와 nt 5200까지의 bPIV3 서열을 포함하는 PCR 단편을 생성하는 데에 사용된다. 상기 PCR 단편은 Sal I과 Nhe I으로 처리되고, 2 위치에 RSV F 유전자를 포함하는 1-5 bPIV3 플라즈미드에 삽입되었는데, 이 플라즈미드도 Sal I과 Nhe I으로 처리되었다. N-P 유전자간 영역을 포함하는 RSV F 유전자를 1 위치에 도입하기 위하여, 1.8 kb RSV F 카세트(cassette)를 Avr II를 이용하여 절단한 다음, Avr II로 선형화한, nt 104 위치에 Avr II 부위를 포함하는 1-5 bPIV3에 연결시켰다.
짧은 유전자간 영역을 갖는 RSV F cassette 의 생성(N stop /N start ):
짧은 N-N 유전자간 영역을 갖는 RSV F 유전자는 1-5 bPIV3/RSV F2를 주형으로 이용하고 올리고 5'GCGCGTCGACCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAACCCTAGGACTGTA3'와 Avr II 제한 효소 부위를 포함하고 RSV F 유전자의 5’ 말단의 업스트림(upstream) 부위에 어닐링(annealing)하는 올리고를 이용한 PCR을 수행하여 생성하였다.
제한 효소 맵핑에 의하여 적절한 방향을 확인한 이후에, 첫 번째 위치에 RSV 유전자를 포함하는 플라즈미드들을 Sph I과 BssH II로 처리하여, 4 kb (1-5 bPIV3/RSV G1) 또는 4. 8 kb (1-5 bPIV3/RSV FL) 길이의 DNA 단편들을 분리하였다. 두 번째 클로닝 단계에서, b/h PIV3 게놈의 나머지 부분은 15.1 kb 짜리 Sph I-BssH II 단편의 형태로 추가되어 전체 길이 cDNA를 낳았다. 두 번째 위치에 RSV 유전자를 포함하는 bPIV3 서브클론은 Sph I와 Nhe I으로 절단되고, 5.8 kb (BPIV3/RSV G2)와 6.5 kb (BPIV3/RSVF2) 길이의 DNA 단편들이 분리되었다. 두 번째 클로닝 단계에서, b/h PIV3 게놈의 나머지 부분은 14 kb 크기의 Nhe I-Sph I DNA 단편 형태로 추가된다. 전체 길이의 키메라성 b/h PIV3/RSV 플라즈미드는 전체 길이 바이러스 cDNA 플라즈미드를 높은 수율로 제공하는 STBL-2 세포(Gibco/BRL) 속에서 번식시켰다.
실시예 3 : 소 파라인플루엔자 3/사람 파라인플루엔자 3을 벡터 삼은 호흡기 신시티움 바이러스 F 또는 G는 mRNA 생산과 단백질 발현 및 시험관내 바이러스 복제 측면에서 위치 의존적 효과(positional effect)를 나타낸다.
실시예 2의 구조물에서 RSV F 또는 G 유전자가 효과적으로 발현되는지 확인하고, PIV3 게놈에서 유전자 삽입에 관한 위치 의존적 효과를 판단하기 위해 세 가지 실험을 행하였다.
우선, 키메라 바이러스에 의한 RSV 단백질 발현을 검증하기 위해, 키메라 바이러스에 의해 감염된 세포 용해질의 웨스턴 블럿이 행해졌으며, RSV-특수 항혈청이 조사되었다. 도 5A를 참조하라. 웨스턴 블럿은 다음과 같이 행해졌다 : MOI 0.1 또는 1.0에서 서브컨푸루언트 신장세포(vero cell)를 감염(70-80%)시키기 위해 키메라 바이러스가 사용되었다. 감염후 48시간이 지난후, 중간 오버레이는 제거하고, 감염된 모노오버레이는 1㎖의 PBS로 한번 세척하였다. 이어서, 세포들은 0.05%의 b-메캅토에탄올(Mercaptoethanlo)(시그마)을 포함하는 래믈리(Laemmli) 완충액 (바이오-라드) 400㎖에서 용해되었다. 12%의 3-염산 레디 겔(바이오-라드)에서 각 샘플의 15㎖가 분리되어, 반건조 이동세포(바이오-라드)를 사용하는 나일론 막에 옮겨졌다. 나일론 막은, 0.5%(v/v) 트윈-20(시그마)(PBST)를 포함하는 PBS[ph7.6]에서 세척되고, 5%(w/v) 건조우유(PBST-M)를 포함하는 PBST에 상온에서 20-30분 정도 담가졌다. 막은 1:1000으로 희석된 PBST-M(WHO 1269, 1200, 1153, 1112, 1243, 1107)에서 RSV F 단클론항체의 혼합체 또는 1:2000으로 희석된 PBST-M에서 RSV G 10181 복합클론항체(오르비겐 : Orbigen)의 혼합체에서 상온에서 1시간정도 배양된다. PBST로 네번 세척을 한후, 막은 1:2000으로 희석된 PBST-M에서 두번째 호오르라디쉬 퍼옥시다제-결합 고우트항 마우스 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse)(다코:Dako)에서 상온에서 1시간 정도 배양되었다. 막은 PBST에서 네번 세척되고, 화학발광 기질(chemiluminescence substrate)(아메샴 파마샤 : Amersham Pharmacia)을 사용하여 현상되고, 단백질 밴드의 시각화를 위해서 바이오맥스 라이트 필름(Biomax Light Film)에 노출된다.
신장세포(vero cell)에서 b/h/RSV F1*N-N의 감소된 복제 효율과 마찬가지로(하기 도 5C 참조), 감염후 48시간이 지난후, 검출된 RSV F1 의 양은 b/h PIV3/RSV F2 또는 와일드-타입(wild-type) RSV A2에 감염된 세포에서 검출된 것보다 약 10배나 적었다(도 5A의2,3 및 4레인 참조). F1조각을 나타내는 50kDa 밴드는 와일드 타입(wild-type) RSV뿐만 아니라 모든 키메라 바이러스에 감염된 세포에서 검출되었다. 그러나, 와일드 타입(wild-type)RSV와 비교하여 키메라 바이러스의 감염된 세포 용해질에서는 20kDA F 조각이 더 많이 축적되었다. b/h PIV3/RSV F1*N-N 감염이 1.0의 높은 MOI에서 반복되는 경우(도 5A, 레인 1 참조), b/h PIV3/RSV F1 감염된 세포에서 F1조각은 감염후 48시간이 지난 와일드 타입(wild-type) RSV 레벨에 축적되었다. b/h PIV3/RSV F1 또는 b/h PIV3/RSV F2에 감염된 세포에서 50kDa와 20kDa F1 조각의 상대적인 양은 거의 1:5정도였다. 키메라 바이러스에 감염된 세포에서 F0가 전혀 검출되지 않은 것은, 와일드 타입(wild-type)RSV감염에서 관찰된 것과 같이, F0 전구물질이 b/h PIV3/RSV F1 및 b/h PIV3/RSV F2 감염동안에 효과적으로 처리되었다는 것을 의미한다.
b/h PIV3/RSV G1, b/h PIV3/RSV G2 감염세포와 야생형 RSV 감염세포에서 RSV G의 상대적인 발현 정도는 도 5A에 나타내었다. 각각 약 90 kDa와 50 kDa 위치에서 이동하는 당화된(glycosylated) 형태와 미성숙(immature) 형태의 RSV G가 모두 검출되었다. b/h PIV3/RSV G1 감염세포는, 야생형 RSV 감염세포(도 5A의 레인 1,3 참조)에서 나타난 것과 유사한 RSV G 발현 수준을 보여준다. 그러나, b/h PIV3/RSV G2 감염세포에서, RSV G의 축적 정도는 야생형 RSV 감염세포(도 5A의 레인 2,3 참조)에서 나타나는 양의 약 2~3배였다. 종합하여 보면, 이러한 데이타들은 키메라성 b/h PIV3/RSV가 위치 1 또는 2에서 RSV 단백질을 효과적으로 발현시킨다는 것을 나타냈다. 그러나 2 위치에서 RSV 유전자를 포함하는 바이러스는 RSV 단백질을 보다 높은 수준으로 발현하였다.
다음으로, 도 5B를 참조하면, 노턴 블럿(Northern blot) 분석은 mRNA 전사가 웨스턴 블럿(Western blot)에 의해 검증된 단백질 발현의 결과와 상호 관련이 있다는 것을 보여주었다. 노턴 블럿(Northern blot)은 다음과 같이 행해졌다. : 트리졸 LS(Trizol LS)를 사용한 바이러스 감염 세포로부터 총 세포 RNA가 제조되었다. RNA는 단일 페놀-클로로폼 적출(one phenol-chloroform extraction)에 의해 정제되고, 에탄올에 의해 침전되었다. RNA 침전물은 다이에틸 피로카본네이트 처리된(diethyl pyrocarbonate-treated) 물에서 재부유되고, 영하 80℃에서 저장되었다. 총 RNA와 똑같은 양은 1% 포말디하이드(formaldehyde)를 포함하는 1% 아가로우즈(agarose) 겔에서 분리되고, 터보블러터(Turboblotter) 장치(Schleicher & Schuell)를 사용하는 나일론 막(아메샴 파마샤 바이오테크: Amersham Pharmacia Biothch)으로 옮겨진다. 블럿은 DIG RNA 레벨링 키트(labeling kit)(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 시험관 내 전사에 의해 합성된 다이고신게닌(digoxigenin)(DIG)-UTP-레벨의 리보프로브(riboprobe)와 교배시켰다. 교배는 발현 Hyb 용액(Clontech)에서 12시간동안 68℃에서 행해졌다. 블럿은 2X SSC(0.015M 나트륨 구연산과 0.015M 염화나트륨을 포함하는 1X SSC)-0.1% 나트륨 도디실(dodycyl) 황산염(SDS)에서 68℃에서 두번 세척되고, 0.5X SSC-0.1% SDS에서 한번 세척되고, 마지막으로 0.1X SSC-0.1% SDS에서 세척되었다. 교배 프로브(hybridezed probe)로부터의 신호는 DIG-발광 검출 키트(DIG-Luminescent detection kit)(Roche Molecular Biochemicals)를 사용함으로써 검출되며, 바이오맥스 ML 필름(BioMax ML film)(Kodak)에 노출되어 시각화되었다.
b/h PIV3/RSV F1*N-N, b/h PIV3/RSV F2, b/h PIV3/RSV G1 및 b/h PIV3/RSV G2에 대한 노턴 분석은, RSV F 또는 RSV G 에 대한 바이러스 mRNA 레벨이 관찰된 RSV 단백질 레벨과 잘 관련되 있다는 것을 보여주었다(도 5B 참조). RSV F mRNA의 가장 낮은 레벨은 b/h PIV3/RSV F1*N-N에 대해서 관찰되었는데, 여기서는 제조된 RSV F 단백질도 가장 적다는 것이 밟혀졌다. b/h PIV3/RSV G1은, b/h PIV3/RSV G2에서 관찰된 것보다 더 적은 RSV G 단백질에서 더 적은 RSV G mRNA를 결과적으로 제조하였다.
마지막으로, 상이한 바이러스의 성장(위치 1 또는 2에서 RSV F 또는 G 유전자와 함께)은 단백질의 발현과 RNA 전사의 결과와 상호관련된다. 도 5C에 나타난 곡선의 성장은 다음과 같이 얻어졌다. : 신장세포(Vero cell)는 90% 콘플루언스(confluence)까지 성장하였고, b/h PIV3, b/h PIV3 RSV F1, b/h PIV3 RSV G1, b/h PIV3 RSV F2, 및 b/h PIV3 RSV G2에서 0.01 또는 0.1의 MOI에서 감염되었다. 감염된 단일 레이어는 37℃에서 배양되었다. 감염후 0, 24, 48, 72, 96, 및 120시간이 지난후, 세포와 매체는 함께 수확되었고, 영하 70℃에서 보관되었다. 각 시간별 수확량에 대한 바이러스 적정량(titer)은 TCID50 또는 신장세포 내 플라크 분석(plaque assays)에 의해 판별되어졌다. TCID50 분석은 37℃에서 6일동안 배양된 CPE에 대해 시각적으로 검사되어지며, 반면에 플라크 분석(plaque assays)은 5일 동안의 배양후에 정량에 대한 RSV 다세포 항혈청으로 면역염색되어졌다.
0.01의 MOI의 신장세포(Vero cell)에서, 첫번째 위치(b/h PIV3 RSV G1 및 b/h PIV3 RSV F1*N-N)에서 RSV G 또는 F 유전자를 가지는 키메라성 바이러스는 낮은 비율로 복제를 하며, 더 낮은 피크 적정량(peak titer)를 허용하며, 두번째 위치에 있는 RSV 유전자를 포함하는 바이러스보다 더 긴 잠복기(lag phase)를 나타내었다. 감염후 96시간이 지난후, b/h PIV3/RSV F1*N-N과 b/h PIV3/RSV G1 피크 적정량(peak titer)은 상대적으로 106.7 및 105.5 TCID 50/㎖였다(도 5C 참조). 반대로, 감염후 72 및 96시간이 지난후, b/h PIV3/RSV F2 와 b/h PIV3/RSV G2의 피크 적정량(peak titer)은 상대적으로 108.0 및 107.4였다(도 5C 참조). b/h PIV3 조절 바이러스(control virus)는 상대적으로 108.0TCID 50/㎖의 피크 적정량(peak titer)을 나타내었다(도 5C 참조). b/h PIV3/RSV F2 는 b/h PIV3/RSV F1*N-N보다 1.3 log10 더 큰 적정량(titer)을 허용하였다. b/h PIV3/RSV G2는 b/h PIV3/RSV G1보다 1.9log10 더 큰 적정량을 복제하였다. 위의 결과는, 두번째 위치에서 RSV 유전자를 포함하는 키메라 바이러스와 비교하여, 첫번째 위치에서 RSV 유전자를 숨기는 키메라 바이러스는 시험관 내 복제에 대해 시작시에 지연되는 것을 나타내었다.
b/h PIV3/RSV F1*N-N 및 b/h PIV3/RSV G1 의 피크 적정량(peak titer)이 결국은 달성될 것인가를 판별하기 위해서, 더 높은 0.1 MOI에서 성장 곡선이 반복되었다. 0.1 MOI에서, b/h PIV3/RSV F1*N-N 및 b/h PIV3/RSV G1 의 피크 적정량(peak titer)은 0.5를 증가시켜 1.3 log10이 되었다(미도시). 바이러스의 지연 위상은 감소되며, 피크 적정량(peak titer)는 성장 싸이클동안에 더 빨리 달성되었다.
실시예 4 : 바이러스 복제에서 소 파라인플루엔자 3/ 인간 파라인플루엔자 3 게놈에 eGFP 삽입이 나타내는 위치 의존적 효과
소/인간 PIV 3 벡터 골격에 대한 유전자 삽입의 효과는 PIV3의 모든 유전자 사이에 차례로 eGFP 유전자를 도입하고 바이러스 복제 및 eGFP 발현 효과를 관찰함으로써 체계적으로 평가되어졌다(도 6참조). 이러한 분석은, 바이러스 mRNA의 특이 비율(specific ratio)을 허용하는 파라믹소바이러스(paramyxoviruses)에서 관찰되는 전사구배(transcriptional gradient)의 중요성을 조사한다. 외래 유전자의 삽입은 이런 비율을 교란하게 되며, 바이러스 복제에 영향을 미치는 바이러스 단백질의 상이한 양의 합성으로 나타난다. eGFP 유전자는 비리온(virion) 막에 병합되지 않으며, 패키징(packaging), 출아(budding), 진입(entry)과 같은 바이러스 과정을 방해하지 않아야 하므로 이번 조사에서 선택되었다. eGFP 유전자는 b/h PIV3 게놈의 네군데 위치에 삽입되었다. 이중의 세군데는 eGFP 발현과 바이러스 복제에 대해 특성을 갖는다. eGFP 유전자 카세트(cassette)는 bPIV3 N-P 유전자간 영역에 연결되었다. b/h GFP1은 eGFP 유전자 카세트(cassette)를 b/h PIV3 게놈에서 3′가장 가까운 위치에서 숨겨준다. b/h PIV3/GFP2 는 b/h PIV3게놈의 N 및 P 유전자 사이에 eGFP 유전자 카세트(cassette)를 포함하였다. b/h PIV3/GFP3은 P와 M 사이에 위치하고, b/h PIV3/GFP4는 b/h PIV3의 M 과 F 사이에 eGFP 유전자를 갖는다(도 6 참조).
eGFP유전자 카세트(cassette)의 구조 : eGFP 유전자의 모형은 상업적으로 이용가능하며, 그것은 BD Biosciences(pIRES2-EGFP) 또는 클론테크(Clontech)(pEGFP-N1)에서 구입가능하다. 호프만(Hoffmann)외 공저의 바이러스학(Virology) 267:310-317(2000) 참조하라. eGFP 유전자는 PCR에 의해 분리되며, bPIV3 N-P 내부유전자 지역(intergenic region)은, 다음과 같은 올리고스 : 5′ATTCCTAGGATGGTGAGCAAGGGCG3′, 5′GGACGAGCTGTACAAGTAAAAAAATAGCACCTAATCATG3′, 및 5′CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3′를 사용하여, 오버래핑(overlapping) PCR 방법을 채택함으로써 첨가된다. eGFP 카세트(cassette)는 pCR2.1에 삽입되고, 연속되며, the rule of six 에 대한 고수가 확인된다. 그리고 나서, eGFP 카세트(cassette)는 AvrⅡ와 함께 소화되고, 겔은 정제되며, 아래 설명하는 대로 b/h PIV3의 위치 1, 2, 3, 및 4에 삽입된다.
eGFP 유전자를 위치 1과 2 사이에 숨기는 풀 길이(full-length) cDNA의 생성 : eGFP유전자 카세트(cassette)는, nts 1-5200으로부터 bPIV3 시퀀스(sequence)와 nt 104(위치 1) 또는 nt 1774(위치 2)에 AvrⅡ 제한 엔자임(enzyme)를 포함하는 1-5 bPIV3 플라스미드(plasmids)에 삽입되었다. 제한 엔자임(enzyme) 맵핑(mapping)에 의해 적절한 방향을 확인한 후, 첫번째 위치에 eGFP 유전자를 숨기는 플라스미드(plasmid)는 SphⅠ과 BssHⅡ와 함께 소화되었으며, 4kb(1-5 eGFP) DNA 조각은 분리되었다. 다음으로, b/h PIV3 게놈의 나머지는 SphI-BssHⅡ 15.1 kb DNA 조각으로써 첨가되었고, 풀 길이(full-length)의 cDNA를 허용한다. 위치 2에서의 eGFP를 구성하는 풀 길이(full-length)의 cDNA의 생성을 위해, 두번째 위치에서 eGFP 유전자를 숨기는 bPIV3 서브클론(subclones)은 SphI과 NheI에 의해 절단되었고, 5.8 kb (1-5 eGFP2)조각은 분리되었다. 다음으로, b/h PIV3 게놈의 나머지는 크기에서 14kb의 NheI-SphI 조각으로써 첨가되어졌다. 풀 길이(full-length)의 키메라 b/h PIV3/eGFP 플라스미드(plasmids)는, 풀 길이(full-length)의 바이러스 cDNA 플라스미드(plasmids)의 높은 yield를 제공하는 STBL-2 세포(Gibco/GRL)에서 번식되었다.
위치 3 및 4에서의 eGFP를 숨기는 풀 길이(full-length)의 cDNA의 생성 : b/h PIV3 게놈의 위치 3에 eGFP 카세트(cassette)를 삽입하기위해, AvrⅡ제한 엔자임(enzyme) 부위는, 두개의 뉴클레오티를 바꾸는 bPIV3 nts 1-5200을 포함하는 서브클론(subclone)의 P-M 내부유전자 지역(intergenic region)에서 nt 3730 에 도입되었다. 다음 올리고(oligo)와 그것의 보충물은, AvrⅡ 부위를 도입하기위한 퀵체인지(QuickChange) PCR 반응에서 사용되어졌다 : 5′GGACTAATCAATCCTAGGAAACAATGAGCATCACC3′. eGFP 카세트(cassette)는 AvrⅡ와 함께 소화되며, nt 3730에서 AvrⅡ부위를 숨기는 AvrⅡ의 일직선의 1-5 bPIV3 서브클론(subclone)에 매어졌다. SPhI로부터 NheI까지의 5.5kb DNA 조각은, 서브클론을 포함하는 GFP 로부터 분리되고, 풀길이(full-length)의 플라스미드를 생산하기위해 SphI 및 NheI와 함께 소화되는 b/h PIV3 cDNA를 도입하였다. eGFP 유전자 카세트를 b/h PIV3 게놈의 위치 4에 첨가하기 위해, nts 1-8500의 b/h PIV3 시퀀스(sequence)를 포함하는 서브클론(subclone)이 생성되었다. 상기 서브클론은 NheI(nt 5042)와 함께 일직선이 되었으며, 융화성(compatible)의 AvrⅡ 끝을 포함하는 eGFP 카세트(cassette)가 삽입되었다. 그리고 나서, eGFP 카세트를 숨기는 서브클론은 SphI 및 XhoI와 함께 소화되며, 7.1 kb DNA 조각은 분리되었다. b/h PIV3 플라스미드(plasmid)는 SphI 및 XhoI와 함께 다루어지고, 11kb 조각이 도입되었다. 이러한 두개의 DNA 조각은 b/h PIV3/GFP4를 생산하기 위해 매어졌다.
b/h PIV3/GFP1, 2, 및 3에 의해 생산되는 eGFP 의 양은, 두가지 방법으로 평가되었다. 첫째로, 20시간동안 MOI 0.1과 0.01에서 b/h PIV3 GFP1, 2, 및 3이 신장세포(Vero cell)을 감염시키는 경우, 생산되는 그린 셀(green cell)의 양은, 발광 마이크로스코프(fluorescent microscrope)를 사용하여 판단되었다(도 7A참조). b/h PIV3/GFP3는 b/h PIV3/GFP 1 또는 2보다 그린 셀(green cell)을 현저하게 적게 생산하였다.
두번째로, 웨스턴 분석(western analysis)이 감염된 세포에 대해서 행해졌으며, 블럿(blots)은 PIV3 PAb뿐만 아니라 GFP MAb와 함께 조사되었다. b/h PIV3/ GFP3이 극적으로 eGFP 단백질을 적게 생산한다는 초기 관찰은 확인되었다(도 7B참조). b/h PIV3 GFP1 및 GFP 2는 eGFP 단백질의 양과 유사하게 생산되었다. 웨스터 블럿(western blot) 방법은 PIV3 항체와 함께 프로빙함으로써 동일한 볼륨을 로딩하도록 조절하였다(도 7B참조). 흥미롭게, 모든 세가지 바이러스는 생산된 PIV3 단백질(HN 단백질은 가장 유명한 밴드(band)이다.)과 유사한 양을 나타낸다.이러한 결과는, b/h PIV3/GFP3이 위치 1 및 2와 비교하여 위치 3에서 더 적은 GFP mRNA로 복사된다는 것을 나타내었다. 이러한 데이타는 파라미소바이러스(paramyxoviruses)에서 바이러스 mRNA의 복사 기울기의 존재를 확인하였다. PIV3 HN 단백질의 생산 레벨은 삽입된 eGFp 유전자에 의해 영향받지 않았다(도 7B참조).
GFP 유전자 삽입이 b/h PIV3/GFP1, 2, 및 3의 바이러스 복제의 활동에 영향을 미치는지 판단하기 위해서, 신장세포(Vero cells)에서 멀티싸이클(multicycle) 성장 곡선이 도시되었다(도 7C참조). 성장곡선은 b/h PIV3/GFP2 또는 GFP3에 비해, b/h PIV3/GFP1이 감염된 후 24 및 48 시간이 지난후에 바이러스 복제의 개시시에 지연되었음을 나타냈다. 그러나, 얻어진 최종 피크 적정량(peak titer)은 모든 세가지 바이러스에 대해 유사하였다. b/h PIV3/GFP2 및 GFP3의 복제 활동은 거의 동일하였다(도 7C 참조). 흥미롭게, 바이러스 mRNA의 변환된 비율은 바이러스 복제에 중요하게 영향을 미치지 않은 것으로 보여졌다.
실시예 5 : 서로 다른 유전자간 영역을 가지는 키메라성 소 파라인플루엔자 3/사람 파라인플루엔자 3을 벡터 삼은 호흡기 신시티움 바이러스 F의 제조와 클로닝
단백질 발현 및 바이러스 복제에 대한 유전자간 영역(각 mRNA 사이의 뉴클레오타이드, 예를 들어 F 유전자와 N 유전자 사이의 뉴클레오티드)이 미치는 효과에 대해서 판단하기 위해서 세 가지 상이한 구조물을 사용되었다. 도 8을 참조하라. 첫번째 구조는 위치 1에서 RSV F1*N-N 을 전파하는 b/h PIV3였는데, 이것은 더 짧은 bPIV N 유전자 정지/N 유전자 출발 시퀀스(sequence)(도 4의 RSV F1*N-N )를 가졌다; 두번째 구조는 위치 1(도 4의 RSV F2)에서 RSV F 를 전파하는 b/h PIV3 였다 ; 마지막 구조는 위치 1(도 4의 RSV F1)에서 RSV 를 전파하는 b/h PIV3였다. 모든 세가지 구조는 실시예 2, 섹션 7에서 설명된바와 같은 클로닝 전략에 의해 생성되었다.
두가지 카세트 간의 가장 극적인 차이는, 단지 10nts길이를 갖는 b/h PIV3/RSV F1*N-N에서 유전자 스타트 시퀀스와 N 복사 스타트 코돈(codon)간의 거리차였다. 반대로, 이 길이는 b/h PIV3/RSV F2에서는 86nts가 된다. 다른 차이점은, g/h PIV3/RSV F2에서 행해진것처럼 P 유전자 스타트 시퀀스에 비해 b/h PIV3/RSV F1*N-N에서는 N 유전자 스타트 시퀀스를 사용했다는 점이다. 전사 유전자 스타트와 바이러스 전사 유니트의 해독 스타트 사이의 거리가 바이러스 복제에 영향을 미치는지 판단하기 위해, b/h PIV3/RSV F2에서 사용되었던 동일한 RSV F 유전자 카세트를 포함하는 b/h PIV3/RSV F1구조가 생성되었다.
실시예 6 : 호흡기 신시티움 바이러스 유전자의 다운스트림 위치에 있는 유전자간 영역의 길이 및/또는 특성은 바이러스 복제에 영향을 미친다.
실시예 5의 세가지 구조는 바이러스 단백질 발현 및 바이러스 복제에 유전자간 영역이 미치는 영향을 판단하기 위해서 다음 실험에서도 사용되었다. 도 9를 참조하라.
우선, b/h PIV3/RSV F1, b/h PIV3/RSV F1*N-N, 및 b/h PIV3/RSV F2에 대한 RSV F 단백질 발현이 웨스턴 블럿을 사용하여 신장세포에서 0.1 MOI에서 감염후 24 및 48 시간이 지난후 비교되었다. 웨스턴 블럿은 다음과 같이 행해졌다 : 키메라 바이러스가 0.1 MOI에서 서브콘플루언트(subconfluent) 신장세포를 감염(70-80%)시키기위해 사용되었다. 감염후 24 및 48 시간이 지난 후, 매체 오버레이는 제거되었고, 1㎖의 PBS에서 감염된 단일레이어(monolayers)가 세척되었다. 세포들은 0.05%의 b-메캅토에탄올(Mercaptoethanlo)(시그마)을 포함하는 래믈리(Laemmli) 완충액 (바이오-라드) 400㎖에서 용해되었다. 12%의 3-염산 레디 겔(바이오-라드)에서 각 샘플의 15㎖가 분리되어, 반건조 이동세포(바이오-라드)를 사용하는 나일론 막에 옮겨졌다. 나일론 막은, 0.5%(v/v) 트윈-20(시그마)(PBST)를 포함하는 PBS[ph7.6]에서 세척되고, 5%(w/v) 건조우유(PBST-M)를 포함하는 PBST에 상온에서 20-30분 정도 담가졌다. 막은 1:1000으로 희석된 PBST-M에서 RSV F 단클론항체(WHO 1269, 1200, 1153, 1112, 1243, 1107)의 혼합체에서 상온에서 1시간정도 배양된다. PBST로 네번 세척을 한후, 막은 1:2000으로 희석된 PBST-M에서 두번째 호오르라디쉬 퍼옥시다제-결합 고우트항 마우스 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse)(다코:Dako)에서 상온에서 1시간 정도 배양되었다. 막은 PBST에서 네번 세척되고, 화학발광 기질(chemiluminescence substrate)(아메샴 파마샤 : Amersham Pharmacia)을 사용하여 현상되고, 단백질 밴드의 시각화를 위해서 바이오맥스 라이트 필름(Biomax Light Film)에 노출된다.
b/h PIV3/RSV F1는, b/h PIV3/RSV F2에서 관찰된 것과 유사하지만, b/h PIV3/RSV F1*N-N에서의 그것보다는 더 높은 RSV F1 단백질 레벨을 감염후 24 및 48시간이 지난 후 발현하였다. 그러므로, 유전자 스타트 요소와 해독 스타트 코돈(codon)사이의 공간은 바이러스 복제에 있어서 매우 결정적일 수 있다. N 유전자 스타트 시퀀스는 P 유전자 스타트 시퀀스로 바뀌지만, 이러한 변화는 오직 단일 뉴클레오티드의 변화에서만 발생하였다. 이러한 요소 중의 어느 하나가 RSV F 단백질 발현 표현형을 구하는데 책임이 있을 수 있다.
다음으로, 멀티 싸이클 성장 곡선이, 0.1 MOI의 신장세포에서 b/h PIV3/RSV F1, b/h PIV3/RSV F1*N-N,및 b/h PIV3/RSV F2의 바이러스 복제의 활동을 비교하기 위해 수행되었는데(도 9B참조), 이것은 다음과 같이 행해졌다 : 신장세포는 90%콘플루언스까지 성장하였고, 0.1 MOI에서 b/h PIV3, b/h PIV3/RSV F1*N-N, b/h PIV3/RSV F1, 및 b/h PIV3/RSV F2로 감염되었다. 감염된 단일 레이어(monolayers)는 37℃에서 배양되었다. 감염후 0, 24, 48, 72, 및 96 시간이 지난후, 세포와 매체는 함께 수확되었고, 영하 70℃에서 보관되었다. 각 시간별 수확량에 대한 바이러스 적정량(titer)은 신장세포에서 플라크 분석(plaque assays)에 의해 판별되어졌다. 플라크 분석(plaque assays)은 5일 동안의 배양후에 정량에 대한 RSV 다세포 항혈청으로 면역염색되어졌다.
도 9B를 참조하면, b/h PIV3/RSV F1*N-N의 복제의 개시시에 지연되었으며, 피크 적정량(peak titer)은 b/h PIV3/RSV F2에서 보다 더 낮았다. 반대로, b/h PIV3/RSV F1은 b/h PIV3/RSV F2에서 관찰된 것과 거의 동일한 성장 곡선을 나타낸다.
실시예 7 : 삼가( trivalent ) 소파라인풀루엔자 3/ 인간 파라인플루엔자 3 벡터 구조의 클로닝
다음 실시예는, 약독화바이러스(attenuated virus) 백신을 사용하여 아이들을 RSV, hMPV, hPIV3에 의해 발생하는 병으로부터 보호하기 위해 hPIV3, RSV F, hMPV F의 표면 글리코단백질(F 및 HN)을 숨기는 삼가(trivalent) 백신의 제조에 관련된다. 이런한 삼가 바이러스는 역 유전자(reverse genetics)에 의해 발견되었다.
두개의 바이러스 게놈의 구조는, 각각 두개의 추가적인 헤테로(heterologous) 시퀀스 삽입을 갖는 키메라 b/h PIV3 백본으로 구성되며, 여기서 하나의 헤테로 뉴클레오티드 시퀀스는 메타뉴모바이러스(metapneumovirsu) F 유전자에서 유도되고, 다른 헤테로 뉴클레오티드 시퀀스는 호흡기 신시티움 바이러스 F 유전자로부터 유도되며, 다음과 같이 행해졌다(도 10참조) : 플라스미드 b/h PIV3/RSV F2 또는 b/h PIV3/hMPV F2는 SphI와 NheI와 함께 소화되었고, 6.5 kb 조각은 분리되었다. b/h PIV3 RSV F1 또는 b/h PIV3/hMPV F1에 대한 풀 길이의 cDNA는 SphI와 NheI와 함께 소화되었고, 14.8 kb 조각은 분리되었으며, 풀 길이의 바이러스 cDNA를 제조하기위해 플라스미드 b/h PIV3/RSV F2 또는 b/h PIV3/hMPV F2에서 유도된 6.5 kb DNA 조각은 잡아매진다(ligated)
위에서 설명된 구조를 갖는 바이러스는 신장세포에서 증대되었다. 여기서 설명된 엔지니어(engineered)바이러스는 파라인플루엔자 바이러스 감염, 메타뉴모바이러스 감염, 및 호흡기 신시티움 바이러스 감염에 대한 삼가(trivalent)백신으로 사용될 수 있다.
실시예 8 : 소파라인풀루엔자 3/ 인간 인풀루엔자 3 벡터에 대한 두개의 호흡기 신시티움 바이러스 F 의 클로닝
RSV F 유전자의 두개의 복사본을 가지는 키메라 바이러스는, 키메라 바이러스에 의해 생산되는 좀다 많은 RSV 단백질이 면역성을 향상시킬 것인가를 판단하기 위해 디자인 되었다. 이 바이러스는 1×106 pfu/㎖의 적정량(titer)을 갖는 바이러스 스탁(stock)을 허용하기위해, 역 유전자(reverse genetic)에 의해 구조되었고, 생물학적으로 클론(cloned)되었고, 신장세포에서 증대되었다. 이 b/h PIV3/RSV F1F2 바이러스는, 바이러스 성장 활동, RSV F 단백질 제조, 복사, 햄스터에 있어서 면역성에 대한 측정을 하기위해 사용될 수 있다.
구조는 다음과 같은 방법으로 제조되었다(도 11 참조) : 1-5 RSV F2 플라스미드는 SphI와 NheI와 함께 소화되었고, 6.5 kb 조각은 분리되었다. b/h PIV3 RSV F1에 대한 풀길이의 cDNA는 SphI와 NheI와 함께 소화되었고, 14.8 kb DNA 조각은 분리되었으며, 풀길이의 바이러스 cDNA를 제조하기 위해 1-5 bPIV3/RSV F2로부터 유도된 6.5 kb DNA 조각은 잡아매진다.
실시예 9 : 소 파라인플루엔자 3/사람 파라인플루엔자 3을 벡터 삼은 사람 메타뉴모바이러스 F cDNA 의 제조와 클로닝
인간 메타뉴모바이러스(metapneumovirus)(hMPV)의 F 유전자는 b/h PIV3 게놈의 위치 1과 2에 삽입되었다(도 12). hMPV F 유전자 카세트는 bPIV3 N-P 유전자간 영역을 포함하였다. hMPV F 유전자 플라스미드(pRF515)가 사용되었으며, hMPV F 유전자에서 단일 뉴클레오티드 변이(mutation)가 정정되어(즉, 뉴클레오티드 3352가 C에서 T(야생형)으로 정정), pRF515-M4를 제조하였다. bPIV3 N-P 유전자간 영역은, 오버래핑 PCR을 사용하여 hMPV F 유전자의 3′말단에 첨가되었다. hMPV F의 경우, 오버래핑 PCR 올리고(oligo)는 5'-GGCTTCATACCACATAATTCGAAAAATAGCACCTAATCATGTTCTTACAATGGTCGACC-3'이었다.. 이러한 클로닝 단계의 PCR 반응에서, hMPV F 유전자 카세트의 5' 말단에 사용된 올리고 (5'-GCAGCCTAGGCCGCAATAACAATGTCTTGGAAAGTGGTGATC-3')와 3' 말단에 사용된 올리고(5'-CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG-3')는 AvrⅡ 제한 효소 부위를 포함하였다. hMPV F 유전자 카세트는 퀵체인지 돌연변이유발(QuickChange mutagenesis) 키트 및 올리고( 5′CCTAGGCCGCAATAGACAATGTCTTGG3′,5′CCAAGACATTGTCTATTGCGGCCTAGG3′)를 사용하는 rule of six에 순응하기위해 조정되었다. 풀길이의 b/h PIV3/hMPV F1(위치 1)과 F2(위치 2) cDNA 플라스미드는 b/h PIV3/eGFP1 과 eGFP2에 대해서 섹션 9, 실시예 4, 수프라(supra)에서 설명한 바와 동일한 방식으로 제조되었다.
실시예 10 : 소 파라인플루엔자 3/사람 파라인플루엔자 3을 벡터 삼은 사람 메타뉴모바이러스 F에 대한 면역 침전법과 복제 분석
b/h PIV3를 벡터 삼은 인간 메타뉴모바이러스 F의 2 위치(hMPV F2)에서 F 단백질이 발현되는 것을 확인하기위해, 기니아 피그(guinea pig) 또는 인간 항혈청을 hMPV 이용하여 F 단백질을 면역 침전시켰다(도 13A 참조). b/h PIV3에의해 발현되는 hMPV F 단백질의 면역침전을 위해서, 신장세포가 0.1 또는 0.05 MOI에서 b/h PIV3 또는 b/h PIV3/hMPV F2에 감염되었다. 감염되고 24시간이 지난후, 세포들은 시스테인(cysteine)와 마이너스 메티오닌(minus methionine)(ICN)이 없는 DME에서 한번 세척되었고, 30분동안 같은 배양액 속에서 배양되었다. 배양액을 제거한 다음, 시스테인과 메티오닌이 없고 100 μCi의 [35S]-Pro-Mix(Amersham社)를 포함하는 0.5㎖ DME를 세포에 첨가하였다. 감염된 세포는 37℃에서 5시간동안 -동위원소에 의해 배양되었다. 매체는 제거되었고, 감염된 세포는 단백질 가수분해 효소 억제제를 포함하는 0.3 M RIPA 완충액에서 용해되었다. 세포 용해질(lysate)은 hMPV 기니 돼지 또는 인간 다세포 항혈청과 함께 배양되었고, IgG-아가로우즈(agarose)(시그마 : sigma) . 0.5M RIPA 완충액에서 세번 세척되고 난 후, 샘플은 10% 단백질 겔에서 분류되었다. 겔은 건조되었고, 엑스레이 필름에 노출되었다.
b/h PIV3/hMPV F2에의해 hMPV F 단백질의 발현은 gp와 인간 항-hMPV 항혈청(도 13A 참조)을 사용하는 면역침전에 의해 나타났다. 흥미롭게, 약 80 kDa에서 이동하는 특이적 밴드(specific band)가 b/h PIV3/hMPV F2의 용해질에서 관찰되었다. 이 크기는 F 전구물질 단백질인 F0 에 대응한다. 상이한 크기의 비특이 밴드(non-specificband)도 b/h PIV3와 가상 조절 레인(mock control lanes)(도 13)에서 또한 관찰되었다. 이 데이타는 b/h PIV/hMPV F2가 hMPV F 단백질을 발현시켰다는 것을 나타냈다. 그러나, hMPV 항체 시약의 사용은 제한되며, 이러한 항혈청은 단지 hMPV F 단백질의 전구물질(precursor)에 반응한다. 쪼개진 F1(cleaved )은 불안정하고, 따라서, 이런 방법을 사용하여 시각화하는것이 쉽지 않게 된다.
성장 곡선이 b/h PIV3/hMPV F2의 바이러스 복사의 활동과 0.1MOI 에서 신장세포에서 b/h PIV3, b/h PIV3/RSV F2에서 관찰되는 것과 비교하기 위해 나타냈다(도 13B). 이 데이타는 b/h PIV3/hMPV F2가 b/h PIV3/RSV F2와 비교하여 감염후 24시간이 지난후, 복사의 개시가 늦었졌다는 것을 나타냈다. 그러나, 감염후 48시간이 지난후에는, 복사에 있어서 차이점이 더이상 발견되지 않았다.
성장 곡선이 b/h PIV3/hMPV F1의 바이러스 복사의 활동과 0.01 MOI 에서 신장세포에서 b/h PIV3, b/h PIV3/hMPV F2에서 관찰되는 것과 비교하기 위해 또한 나타냈다(도 13C). 이 데이타는 b/h PIV3/hMPV F1이 복사의 개시가 늦었졌으며, b/h PIV3, 또는 b/h PIV3/hMPV F2와 비교하여 더 적은 피크 적정량(peak titer)을 허용한다. 이러한 b/h hMPV F1의 플라크 크기(plaque size)는 또한 b/h hMPV F2와 비교하여 더 작다.
상기 키메라성 바이러스인 b/h PIV3/hMPV F1과 F2에 대하여 시리안 골든 햄스터(Syrian Golden hamsters)를 감염시키고 그 안에서 복제하는 능력을 평가하였다(표 5). 그 결과는 b/h PIV3/hMPV F1과 F2가 b/h PIV3에서 관찰되는 수준으로 햄스터의 폐와 코 선반(nasal turbinate)에서 복제하였음이 나타났다. 심지어 hMPV는 햄스터의 상부와 하부 기도에서 조직 1 g 당 5.3과 3.6 log10 TCID50의 역가 수준으로까지 복제하였다. 이런한 데이타는, b/h PIV3/hMPV F1과 F2가 햄스터의 기도를 효과적으로 감염시키고 복제할 수 있으며, 따라서 햄스터를 hMPV 백신 후보를 평가하기 위한 동물 모델에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, hMPV의 면역원성을 판단하기 위한 소형 동물 모델로 적합하다는 것을 증명하였다.
Figure pat00005
a 6마리의 햄스터 그룹은 바이러스 1×106pfu에 접종되었다.
b 표준 에러(standard error)
주 : TCID50보고는 10일째 CPE에 대해서 읽은것임.
실시예 11 : 가용성 호흡기 신시티움 바이러스 F 유전자 구조의 클로닝
트랜스멤브레인 도메인과 세포질 도메인이 없는 RSV F 유전자형인 가용성 RSV F 유전자형을 하나 포함하는 구조물 또한 제조되었다(도 14). 이 구조는 면역원성을 테스트용으로 사용될 수 있다. 이 구조의 장점은, 가용성 RSV F가 비리온(virion) 막에 편입되는 것이 불가능하다는 데 있다. 이 바이러스는 바이러스 친화성(virus tropism)이 변하지 않을 것으로 예상되므로, 더 안전한 키메라성 바이러스로서 볼 수 있다. b/h PIV3/sol RSV F에 대한 cDNA 플라스미드는 역 유전학(reverse genetics) 방법에 의해 구조(rescue)될 수 있다.
플라스미드 1-5/RSV F2 (이미 설명되었다)는 PCR을 위한 DNA 모형으로써 사용되었다. 올리고(oligo) RSV f.2(5′GCTGTAACAGAATTGCAGTTGC3′)(RSV nt 5949에서 단련되는)와 올리고 5′CGTGGTCGACCATTGTAAGAACATGATTAGGTGCTATTTTTATTTAATTTGTGGTGGATTTACCGGC3′가 150개의 뉴클레오티드를 삭제하면서, RSV F의 트랜스 막과 세포질 영역을 제거하기 위해 채택되었다. 나머지 PCR 조각은 HpaI 와 SalI와함께 소화되었고, 1-5 bPIV3/sol RSV F를 허용하기 위한 HpaI 와 SalI를 다루는 1-5 RSV F2를 도입하였다. 이 플라스미드는 SphI 와 NheI와 함께 소화되었고, 나머지 조각은 풀길이의 cDNA를 제조하기위해 SphI와 NheI와 함께 소화되는 b/h PIV3 cDNA를 도입하였다.
실시예 12 : 소 파라인플루엔자 3/사람 파라인플루엔자 3을 벡터 삼은 사람 메타뉴모바이러스 F 에 감염된 세포에서의 인간 메타뉴모바이러스 F 의 발현
b/h 104 hMPV F 바이러스 원액(stocks)을 연속적으로 10 배 희석한 다음, 서브콘플루언트(subconfluent) 신장 세포(Vero)를 감염시키기 위해 사용되었다. 감염된 세포에 겐타마이신(gentamycin)을 포함하는 옵티(opti)MEM 배양액을 덮어 주었고, 5일 동안 35℃에서 배양하였다. 세포는 100% 메탄올과 혼합되었고, 1:1000으로 희석된 항-hMPV001 기니 돼지 혈청에 의해 면역염색되었고,이어서, 1:1000으로 희석된 항-기니 피그 HRP 접합 항체에 의해 면역염색되었다. hMPV F 의 발현은 AEC 기질 시스템(substrate system)에서 특이 색 현상에 의해 시각화된다. 도 15A 를 참조하라.
b/h NP-P hMPV F 바이러스 스택(stock)은 연속적으로 희석된 10 폴드(fold)이고, 서브콘플루언트(subconfluent) 신장세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 감염된 세포는, 태아 소 혈청과 L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 1×L15/MEM 매체에 의해 보충되는 EMEM/L-15 매체(JRH 바이오사이언스;Lenexa, KS)에서 1%메틸 셀루로스(cellulose)과 함께 오버레이되었다. 감염된 세포는 5일동안 35℃에서 배양되었고, 100% 메탄올과 혼합되었고, 1:1000으로 희석된 항-hMPV001 기니 돼지 혈청에 의해 면역염색되었고, 이어서, 1:1000으로 희석된 항-기니 피그 HRP 접합 항체에 의해 면역염색되었다(도 15B 참조). 항 hMPV001 기니 돼지 혈청은 hMPV001 단백질에 특이성이 있으며, b/h PIV3 단백질에 매이지 않는다.
실시예 13 : 헬라(HeLa)세포와 신장세포( Vero )에서 키메라성 소 파라인플루엔자 타입 3/사람 파라인플루엔자 타입 3 바이러스의 구조(rescue)
키메라 b/h PIV3 바이러스의 구조(rescue)는 bPIV3 구조(rescue)와 유사한 과정을 사용하여 행해졌다. 역 유전자(reverse genetics)에 의한 b/h PIV3 키메라 바이러스의 구조(rescue)는 LipofecTACE(Gibco/BRL)를 사용하는 헬라세포(HeLa cells)에서 수행되었다. 80% 콘플루언트(confluent) 헬라세포,헵-2(Hep-2)세포, 또는 신장세포는 MOI 4에서 MVA에 의해 감염되었다. 감염후 1시간후, 풀길이(full length)항-게놈 b/h PIV3 cDNA(4㎍)은 NP(0.4㎍), P(0.4㎍), 및 L/pCITE(0.2㎍) 발현 플라스미드와 함께 감염된 헬라 또는 신장세포로 옮겨졌다. 감염후 48시간후에는, 세포와 세포 상청액(supernant)은 채취되었고(P0), 단일 냉동-해빙 사이클에 종속되었다. 나머지 세포 용해질은 그다음에, 1-베타-D-아라비노푸라노실사이토신(arabinofuranosylcytosine)(ara C), P1 바이러스 스택(stock)을 제조하기 위해 백신 바이러스의 복제 억지제에서 신선한 신장세포 단일레이어를 감염시키기 위해 사용되었다. 이 기판에서 상청액(supernant)과 세포가 채취되었고, 냉동-해빙은 한번 행해지고, bPIV3 바이러스 파티클의 존재가 PIV3-특이 항혈청을 사용한 바이러스 플라크(plaques)의 면역염색에 의해 보고되었다. P1 채취의 세포 용해질은 신장세포 단일 레이서에서 CPE, 및 광범위한 바이러스 감염의 존재를 가리키는 면역염색을 완성하였다.
실시예 14 : 키메라 소파라인플루엔자 타입 3/ 인간 파라인플루엔자 타입 3 벡터 인간 메타뉴모바이러스 F 바이러스 의 구조(rescue)
위치 1(b/h 104 hMPV F) 또는 위치 2(b/h NP-P hMPV F)에서 hMPV F를 발현시키는 b/h PIV3 바이러스는 다음과 같이 얻어졌다 : 6번 잘 세척된 80-90% 콘플루언시(confluency)의 헵(HEp)-2 또는 신장세포는 0.1에서 0.3의 (m.o.i)의 감염의 다중성에서 포울폭스(Fowlpox)-T7에 의해 감염되었다. 포울폭스(Fowlpox)-T7에 의해 감염된후, 세포는 한번 세척되고, PBS와 플라스미드 DNA의 다음 양에 의해 옮겨졌다 : 풀길이의 b/h 104 hMPV F 또는 b/h NP-P hMPV F cDNA 2.0㎍, pCite N 0.4㎍, pCite P 0.4㎍, pCite L 0.2㎍.(pCite 플라스미드는 엔셉할로미오카디닛(encephalomocarditis) 바이러스 (EMCV)에서 유도되는 IRES 요소에 의해 T7 프로모터(promoter)를 갖는다. 트랜스펙션(transfection)은 작업자의 인솔에 따라 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(인비트로겐 : Invitrogen)의 존재하에 행해졌다. 트랜스펙션(transfection) 반응은 33℃에서 5에서 12시간 정도 배양되고, 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 포함하는 매체는 겐타미신(gentamicin)을 포함하는 신선한 옵티(Opti)MEM의 2㎖와 대체되었다. 트랜스펙티드 세포는 33℃에서 이틀동안 더 배양되었다. 세포는 SPG와 함께 안정화되고, 영하 80℃에서 한번 냉동-해빙 사이클에 의해 용해되었다. 천연 세포 용해질은, 구조된 바이러스를 증대시키기 위해 새로운 신장 단일 레이어가 감염되었는지 사용되었다.
실시예 15 : 역 유전학에 의한 소 파라인플루엔자 타입 3/ 인간 파라인플루엔자 타입 3를 벡터 삼은 호흡기 신시티움 바이러스 유전자의 구조(rescue)
감염 바이러스는 이미 설명한 바와 같이 트랜스펙션(transfection)방법을 사용하여(실시예 13 참조) 헬라(HeLa) 또는 헵(HEp)-2 세포에서 역유전자(reverse genetics)에 의해 발견되었다. 간단하게, 6 조직 배양접시(tissue culture dishes)에서 80-90% 콘플루언트(confluent) 헵(HEp)-2 또는 신장세포가, 상대적으로 0.1-0.3 또는 1-5(m.o.i)의 감염의 다원성에서 FP-T7 또는 MVA-T7에 감염되었다. P-T7 또는 MVA-T7에 감염되고나서, 세포는 PBS에 의해 한차례 세척되었고, 플라스미드 DNA(2.0㎍ 풀길이 b/h PIV3 RSV F 또는 G cDNA, 0.4㎍ pCITE/N, 0.4㎍ pCITE/P, 0.2㎍ pCITE/L)의 하기양에 의해 감염되었다(transfected). 트랜스펙션(transfections)은 작업자의 인솔에 따라 리포펙타민2000(Lipofectamine)(인비트로겐 : Invitrogen)의 존재하에서 행해졌다.트랜스펙션 반응(transfection reaction)은 리포펙타민2000(Lipofectamine)이 2㎖의 겐타미신(gentamicin)을 포함하는 신선한 옵티(Opti)MEM로 대체된 매체에서, 33℃에서 5에서 12시간정도 배양되었다. 트랜스펙티드(transfected) 세포는 2일동안 33℃에서 더 배양되었다. 세포는 SPG와 함께 안정화되었고, 영하 80℃에서 한차례 냉동-해동 사이클을 거쳐 용해되었다. 크루드(crude) 세포 용해질은 구조된 바이러스를 증대시키기위해 새로운 신장세포 단일레이어를 감염시키도록 사용되었다. 키메라 바이러스는 신장세포에서 제한된 희석에 의해 정제되었고, 106-108 PFU/㎖의 더 높은 적정량 바이러스 스택(stock)이 제조되었다. 키메라 바이러스의 RSV 유전자는 RT-PCR에 의해 분리되었고, 시퀀스(sequence)는 확인되었다. RSV 단백질의 발현은, RSV 고트(goat) 다세포 항혈청 (q바이오제네시스 : Boigenesis)과 함께 감염된 신장세포 단일레이어(monolayers)의 면역염색에 의해 확인되었다.
실시예 16 : RT - PCR 에 의한 키메라 소파라인플루엔자 타입 3/ 인간 파라인플루엔자 타입 3 바이러스 구조 확인
구조된 바이러스가 기질상 키메라라는것을 확인하기 위해, bPIV3 백본(backbone)에서 hPIV3 F 및 HN 유전자 시퀀스를 포함하는 바이러스, 바이러스 RNA 게놈이 RT-PCR에 의해 좀더 분석되었다. b/h PIV3 분리체(isolates)에 의해 유도되는 세가지 독립적인 P1 바이러스 스택에 의해 감염된 신장세포는 채취되었고, 모든 RNA는 분리되었다. 바이러스 RNA는 bPIV3의 위치 4757에서 단련하는 올리고(oligo)을 사용하여 증대되었다. nt 5255에서 6255까지의 바이러스 지역은 PCR에 의해 증대되었다. 나머지 1 kb PCR 조각은 hPIV3 시퀀스를 포함해야한다. 이것은 hPIV3에대한 특이성을 갖는 엔자임(Sac1 및 BglⅡ)과 함께 소화됨으로써 확인되었고, bPIV3의 보조부위(complementary region)에서 잘리지 않았다(도 2 참조). 예상대로, Sac1과 BglⅡ은 PCR 조각을 잘라서, 더 작은 조각을 만들어서, 분리된 시퀀스가 hPIV3(레인 3,5,7 참조)로부터 유도되도록 해준다. 덧붙여, nt 9075에서 nt 10469까지의 폴리머라아제(ploymerase) L 유전자의 부위는 PCR에 의해 증대되었다. 이 부위는 bPIV3 시퀀스를 포함해야한다. 반복하여, 나머지 1.4 kb PCR 조각은, hPIV3(도 3)의 동일한 부위에서 잘리지 않는 bPIV3(Pvull 및 BamH1)에 대해 특이성을 갖는 엔자임을 사용하여 소화되었다. 1.4 kb 조각은, 폴리머라아제(polymerase) 유전자가 원래 bPIV3라는 것을 확인하면서, 정말로 Pvull 및 BamH1에 의해 소화되었다(도 3의 레인 3,4,6,7,9 및 10). 요약하면, RT-PCR 분석은 구조된 b/h PIV 3 바이러스가 원래 키메라라는 것을 보여준다. 이것은 bPIV3 유전자 백본(backbone)에 hPIV3 F 및 HN 유전자를 포함한다.
실시예 17 : 소라파인플루엔자 타입 3/ 인간 파라인플루엔자 타입 3 벡터 호흡기 신시티움 바이러스 유전자의 유전적 안정성
b/h PIV3/RSV 키메라 바이러스가 유전적으로 안정하고 도입된 RSV 유전자 카세트를 유지하는 것을 증명하기 위해, 감염된 세포 용해질은 연속적으로 신장(Vero)세포에서 열번 블라인드 계대 배양(blind passage)되었다. T25 플라스크(flask)에서 서브 콘플루언트(sub-confluent) 신장세포는 0.1 MOI에서 b/h PIV3/RSV에 의해 감염되었고, CPE가 보일 때까지 33℃에서 4일동안 배양되었다. 배양주기의 마지막에는, 감염된 세포와 배양액을 채취하였고, 두차례 냉동-해동하여 얻은 세포 용해질은 신장세포의 새로운 T25 플라스크(flask)를 감염시키기 위해 사용되었다. 이 싸이클은 열차례 반복되었다. P1에서 P10까지의 모든 세포 용해질은 플라크 보고(plaque assay)에 의해 분석되었고, RSV 단백질과 바이러스 적정량(titer)의 발현을 위해 RSV 다세포 항혈청에 의해 면역염색되었다. 10 번째에, RSV 유전자 카세트(cassette)는 RT-PCR 에 의해 분리되었고, RSV 유전자 시퀀스는 DNA 시퀀스 분석(가능한 뉴클레오티드 변화를 확인하기위해)에 의해 증명되었다. 분리체(isolates) 모두는 RSV 유전자 카세트를 유지하였고, 10 번째의 RSV 단백질 발현은 분석되었다(데이타 미도시).
실시예 18: 소 파라인플루엔자 타입 3/사람 파라인플루엔자 타입 3을 벡터 삼은 호흡기 신시티움 바이러스 유전자의 슈크로스 농도 구배에 의한 바이러스 분리
RSV 단백질들이 b/h PIV3 바이러스내에 삽입되었는지를 생화학적 분석에 의하여 더욱더 조사하였다.
Vero 세포들을 0.1의 MOI에서 키메라 b/h PIV3/RSV 바이러스들로 접종하였다.
최대 CPE을 나타낼 때, 감염된 모노레이어를 냉각시키고, 해동시키고, 2000 rpm에서 10 분동안 처리하였다.
정화된 상등액은 90 분동안 100,000 x g에서 20 % 수크로오스 쿠션하에서 원심분리하였다.
펠렛을 PBS에 재부유하고 20에서 66 % 수크로오스 그레디언트 상단에 조심스럽게 올렸다.
그 그레디언트를 평형 상태를 이루기 위하여 20 시간동안 100,000 x g에서 원심분리하였다.
그레디언트의 상단으로부터 출발하여 18개의 2 ml 분획을 모았다. 각 분획의 0.4ml을 바이러스 적정 결정을 위하여 취하였다.
각 분획은 2 부피의 20 % PBS에 재부유하고 1 시간동안 100,000 x g에서 원심분리하여 농축하였다.
그 펠렛을 0.05 ml Laemmli 버퍼(Biorad)에 재부유하고 RSV F MAb (NuMax L1FR-S28R), RSV (Biogenesis) 및 bPIV3 (VMRD) 폴리클로날 항혈청을 사용하는 웨스턴 블럿에 의하여 RSV와 PIV3 단백질들을 분석하였다.
동종으로 정제된 baculovirus에서 발현된 C-말단 끝을 자른 RSV F 단백질을 또한 수크로오스 그레디언트로 분석하였다.
그 분획들을 또 프라크 분석에 의하여 피크 바이러스 타이터를 분석하였다.
RSV F (baculovirus에서 생산되고 C-말단이 잘려진)이 없는 대조군 그레디언트, RSV A2 및 b/h PIV3를 처음으로 실행하였다.
RSV F 없는 대조군 그레디언트의 대부분이 그레디언트 상당 부위에 있는 3, 4, 5, 및 6 분획에 존재하였다(도 16A 참조).
RSV 바이러스의 가장 큰 농축은 10,11 및 12 분획에서 관찰되었다(도 16B 참조).
RSV 분획은 RSV F MAb와 뿐만 아니라 RSV 폴리클로날 항혈청으로도 검출되었다.
또한 RSV 바이러스 중에서 가장 많은 양을 포함하였던 분획은 RSV F 단백질에 대한 강한 신호를 보였고, 그 RSV F 단백질은 RSV 바이러스와 동시에 이동하고 연관되어 있다는 것을 암시한다(도 16B 참조).
이 분획들은 또한 가장 높은 바이러스 타이터를 보인다(도 16B 참조).
b/h PIV3 바이러스들은 더 다면형태(pleiomorphic)일 수 있고 따라서 b/h PIV3 바이러스를 갖는 피크 분획의 확장이 더 넓다.
b/h PIV3 바이러스들은 분획 9, 10, 11,12, 및 13에 존재한다(도 16C 참조).
또 가장 많은 양의 바이러스들을 갖는 분획은 프라크 어세이에 의하여 최고의 바이러스 타이터를 나타낸다(도 16C 참조).
b/h PIV3/RSV F2의 수크로오스 그레디언트 분획은 PIV3 폴리클로날 항혈청과 RSV F MAb로 분석하였다(도 16D 참조).
바이러스들의 대부분을 포함하는 분획은 PIV3 항혈청을 사용한 웨스턴 블럿에 의하여 볼 수 있는 바와 같이 분획 11,12, 13, 및 14이었다.
상응하게, 이것들은 또한 RSV F 단백질중에서 가장 높은 양들을 나타낸 분획들이었다.
그러나, 일부 RSV F 없는 분획이 분획 5 그리고 6에 존재하였다.
분획 11,12, 13 그리고 14는 피크 바이러스 타이터를 나타내었다(도 16D 참조).
마찬가지로, 또한 b/h PIV3/RSV G2(분획 9,10, 11, 및 12)의 최대 바이러스를 갖는 분획들은 RSV G 단백질에 대한 가장 강한 신호를 보였다(도 16E 참조).
또 이것들은 가장 높은 바이러스 타이터를 갖는 분획들이었다(도 16E 참조).
총제척으로 이들 데이터들은 RSV F와 G 단백질들의 대부분은 같이 이동하고 b/h PIV3 바이러스 입자들과 연관되어 있다는 것을 암시한다.
그러나, 일부 RSV 단백질들이 없는 것도 그레디언트의 최상 분획에 존재한다.
실시예 19 : 키메라 소 파라인플루엔자 타입 3/ 인간 파라인플루엔자 타입 3 벡터 호흡기 신시티움 바이러스(RSV)는 RSV 항혈청에 의해 중화될 수 없다.
안전성 면에서 중요한 질문인, b/h PIV3 비리온(virion)에 편입된 RSV 표면 당단백질(glycoproteins)이 바이러스 친화성(torpism)이 변화한 표현형을 낳을 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 중화 분석(neutralization assay)을 수행하였다(표 6및 7). RSV F MAbs(WHO 1200MAb)은 1:2000으로 희석된 와일드 타입(wild type) RSV A2의 50% 까지 중화되었다(표 6). 반대로, 1:25로 희석된 경우에는 어떤 케메라 b/h PIV3/RSV도 중화하지 않았다. 유사하게, 다세포 RSV 항혈청(Biogenesis)의 1:400 희석화의 경우에는 RSV A2를 50% 까지 중화하였으나, 1:15.6의 희석화의 경우에는 b/h PIV3 RSV를 중화하지 않았다(표6).
Figure pat00006
hPIV3 F MAb C191/9는 1:500의 희석화에서 b/h PIV3/RSV 뿐만아니라 b/h PIV3도 중화하였다(표 7). hPIV3 HN MAb 68/2는 1:16,000의 희석화에서 b/h PIV3를, 1:32,000의 희석화에서 b/h PIV3/RSV를 중화하였다(표 7).
Figure pat00007
실시예 20: 키메라성 소 PIV 는 생체 내 투여되었을 때 독 약화(attenuated) 표현형을 나타내고 강한 보호반응을 유발한다
5주 된 시리아 골든 햄스터가 5 x 105 pfu의 야생형 bPIV3, 재조합형 bPIV3, hPIV3, 인간/소 PIV3, 및 플라시보에 감염되었다. 서로 다른 다섯 개의 동물군이 마이크로-아이솔레이터 우리(micro-isolator cage)에 따로 보관되었다. 감염되고 4일 후, 동물을 죽였다. 동물의 비개골(nasal turbinates) 및 폐가 균질화되어 -80℃에 보관되었다. 조직 내에 나타나는 바이러스는 37℃의 MDBK 셀에서 TCID50 분석시험에 의해서 판단되었다. 바이러스 감염은 기니피그 적혈구의 혈구흡착에 의해 확인되었다. 표 8은 폐 및 비개골에서 햄스터 내의 서로 다른 PIV3 착색제(stains)의 복제 타이터(replication titers)를 보여준다. 재조합형 bPIV3 및 b/h PIV3 키메라 바이러스는 햄스터의 폐에서 독성이 약화된다는 것을 주의해야 한다.
Figure pat00008
a 네 마리 햄스터로 이루어진 그룹에게 5 x 505 PFU의 지시된 바이러스를 코 내부에 접종하였다.
b 표준 오차
더욱이, 감염전 그리고 감염후 21일째 햄스터로부터 채취한 혈청 샘플은 응집억제 분석시험(hamagglutination inhibition assay)에 의해 분석되었다. 혈청 샘플은 수용체 박멸 효소 (receptor destroying enzyme; RDE, DENKA Seiken Co.)로 처리되었고 비특정 응집소(non-specific agglutinins)는 얼음 위에서 1시간 동안 기니피그 적혈구로 배양하여 제거되었다. 야생형 bPIV3 및 hPIV3은 두 겹의 연속해서 희석된 햄스터 혈청 샘플에 추가되었다. 마지막으로, 기니피그 적혈구 (0.5%)가 추가되고, 상온에서 응집되도록 허용되었다. 표 9는 서로 다른 PIV3 착색제(stains)로 감염된 순간 햄스터 내에서 발생하는 항체반응을 나타낸다. b/h PIV3 키메라 바이러스가 야생형 hPIV3에서 만큼 hPIV3에 강한 항체반응을 발생시키고, 이는 재조합형 또는 야생 bPIV3에 의한 반응을 훨씬 능가한다는 것을 주목해야 한다.
Figure pat00009
이 결과는 상기 재조합물을 백신 제제로 사용하기에 적합하게 하는, 본 발명의 b/h PIV3 키메라 바이러스의 특성을 나타낸다. b/h PIV3 키메라 바이러스는 생체 내에 투여될 때 독약화 표현형(attenuated phenotype)을 나타낼 뿐만 아니라, 야생형 hPIV3만큼 강한 항체반응을 발생시킨다. 따라서, 본 발명의 키메라 바이러스가 독약화 표현형을 구비하고 야생형 hPIV만큼 강한 면역반응을 유도하는 독창적인 조합을 갖기 때문에, 이 키메라 바이러스는 PIV 감염의 억제 및/또는 보호를 위해 인간에 대한 성공적 사용을 위해 필요한 특성을 갖는다.
실시예 21: 햄스터의 상하 호흡기계 내의 소 파라인플루엔자 3/인간 파라인플루엔자 3 벡터 호흡기신시티움 바이러스 G 또는 F 단백질 복제(REPLICATION OF BOVINE PARAINFLUENZA 3/HUMAN PARAINFLUENZA 3 VECTORED RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS G OR F PROTEIN IN THE UPPER AND LOWER RESPIRATORY TRACT OF HAMSTERS)
5주 된 시리아 골든 햄스터(한 그룹당 여섯 마리)가 100 ml 체적의, 1 x 106 pfu 또는 1 x 104 PFU의 b/h PIV3, b/h PIV3/RSV, RSV A2, 또는 , 재조합형 bPIV3, hPIV3, 인간/소 PIV3, 및 플라시보 배지로 코 내에 감염되었다. 서로 다른 그룹이 마이크로-아이솔레이터 우리(micro-isolator cage)에 따로 보유되었다. 감염되고 4일 후, 동물의 비개골(nasal turbinates) 및 폐를 채취하고, 균질화하고, -80℃에 보관하였다. 조직 내에 나타나는 바이러스의 타이터(titers)는 Vero 셀에서 TCID50 분석시험에 의해서 판단되었다. 접종 분석시험(challenge assays)을 위해서, 동물은 28일째 날에 1 x 106 pfu/ml의 hPIV3 또는 RSV V2을 코 내에 접종하였다. 접종 분석시험 후 4일째 날, 동물의 비개골 및 폐는 분리되어, 정량화를 위해 면역-착색된 Vero 셀 에서의 플라크 분석시험에 의해서 공격 바이러스 복제를 위해 분석시험되었다. 표 10은 폐 및 비개골에서 햄스터 내의 서로 다른 착색제(stains)의 복제 타이터(replication titers)를 보여준다.
Figure pat00010
a 네 마리 햄스터로 이루어진 그룹에게 5 x 506 PFU의 지시된 바이러스를 코 내부에 접종하였다.
b 표준 오차
시리아 골든 햄스터는 유전공학 바이러스인 재조합형 bPIV3 및 hPIV3의 복제 및 면역원성(immunogenicity)를 평가하기에 적절한 작은 동물모델임을 보여주었다. RSV 항원을 도입하는 것은 햄스터 내의 복제를 위한 키메라 b/h PIV3의 능력을 변경시키기 않을 것으로 기대되었다. 이 결과는 모든 키메라 바이러스가 햄스터의 비개골에서의 b/h PIV3의 것과 유사한 수준으로 복제된다는 것을 보여주었다 (표 10). 대조적으로, RSV 유전자를 첫 번째 위치에 보유하는 키메라 바이러스는 b/h PIV3와 비교하여 힘스터의 폐에 1~1.5 log10 감소된 타이터(titers)를 보여주었다 (표 10). RSV 유전자를 두 번째 위치에 함유하는 키메라 바이러스는 햄스터의 하부 호흡기계 내의 b/h PIV3에서 관찰된 타이터와 유사하게 복제된다 (표 10).
실시예 22: 소 파라인플루엔자 3/인간 인플루엔자 3 벡터 호흡기 신시티움 바이러스 면역 햄스터는 인간 파라인플루엔자 3 및 호흡기 신시티움 바이러스 A2의 공격으로부터 보호되었다(BOVINE PARAINFLUENZA 3/HUMAN PARAINFLUENZA 3 VECTORED RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS IMMUNIZED HAMSTERS WERE PROTECTED UPON CHALLENGE WITH HUMAN PARAINFLUENZA 3 AND RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS A2)
면역 후 28일째 날, 햄스터는 b/h PIV3/RSV에 의해 유도된 면역원성을 평가하기 위해서 1 x 106 PFU의 RSV A2 또는 hPIV3으로 접종되었다. b/h PIV3/RSV를 투여한 동물은 hPIV3 뿐만아니라 RSV로부터 완전히 보호되었다 (표 11). 플라시보 매트릭스를 투여한 동물만이 상하 호흡기계에서 높은 타이터의 공격 바이러스를 나타내었다. 이 분석시험은 또한 RSV에 면역된 동물이 hPIV3의 공격으로부터 보호되지 않는다는 것을 보여주었다. 유사하게, hPIV3로 백신접종을 한 동물은 높은 타이터의 RSV 공격 바이러스를 나타냈다 (표 11).
Figure pat00011
a 0번째 날 여섯 마리 햄스터로 이루어진 그룹을 면역시키기 위해 바이러스가 사용되었다.
b 28일째, 햄스터에게 106 pfu의 hPIV3 또는 RSV A2가 접종되었다. 접종 후 4일째, 동물의 폐 및 비개골이 채취되었다.
c 표준 오차
실시예 23: 햄스터에 대한 소 파라인플루엔자 3/인간 인플루엔자 3 벡터 호흡기 신시티움 바이러스의 백신접종은 혈청 HAI 및 중화항체를 유발한다(VACCINATION OF HAMSTERS WITH BOVINE PARAINFLUENZA 3/HUMAN PARAINFLUENZA 3 VECTORED RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS INDUCES SERUM HAI AND NEUTRALIZING ANTOBODIES)
접종 전에, 혈청 샘플은 28일째 날 면역된 동물로부터 얻어진다. 햄스터 혈청은 존재여부 또는 50% 플라크 감소 분석시험을 이용한 RSV 중화항체를 위해 분석되고, 또한 응집 억제 (hemaggluination inhibition; HAI) 분석시험을 수행하여 PIV3 HAI 혈청 항체를 위해 분석된다(표 8). 50% 플라크 감소 분석시험(중화 분석시험)은 다음과 같이 수행되는데, 햄스터 혈청은 두 겹으로 연속해서 희석되고, 100 PFU의 RSV A2로 한 시간동안 배양된다. 그 후, 바이러스-혈청 혼합물은 Vero 셀 단층(monolayers)으로 이송되고, 메틸셀룰로우스 위에 놓여진다. 35℃에서 5일간 배양한 후, 단층은 정량화를 위해 RSV 다클론성 면역항체를 사용하여 면역-착색되었다. 응집 억제(HAI) 분석시험은 V-바닥 96-웰 플레이트 내에서 hPIV3으로 25℃에서 30분동안 연속해서 두 겹으로 희석된 28일째의 햄스터 혈청을 배양함으로써 수행되었다. 연속적으로, 기니피그 적혈구가 각 웰에 추가되었고, 배양은 추가적으로 90분동안 계속되었으며, 각 웰에서의 응집의 존재유무가 기록되었다.
그 결과, RSV F 단백질을 나타내는 바이러스는 거의 야생의 RSV로 백신접종된 동물로부터 얻어진 혈청으로 관철되는 것만큼 높은 RSV 중화항체 타이터를 보이는 것으로 나타났다 (표 12). 대조적으로, RSV G 단백즐을 나타내는 바이러스는 RSV 중화항체보나 훨씬 낮은 수준을 보여주었다 (표 12). 모든 키메라 b/h PIV3/RSV 햄스터 혈청은 b/h PIV3에 대해서 관찰된 수준에 근접하는 HAI 혈청 항체 수준을 보여주었다 (표 12). 그 결과는 키메라 b/h PIV3이 햄스터를 효율적으로 감염시키고 복제할 수 있으며 보호면역반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pat00012
a 바이러스는 햄스터 면역시키기 위해 사용되었다.
b 중화항체 타이터는 50% 플라크 감소 분석시험에 의해서 판단되었다.
c 햄스터 프리-혈청의 중화항체 타이터는 1.0 미만이고, HAI 항체 타이터는 4.0 미만이었다.
실시예 24: 적은 양의 소 파라인플루엔자 3/인간 파라인플루엔자 3 벡터 호흡기 신시티움 바이러스를 햄스터에 백신접종하는 것은 햄스터를 호흡기 신시티움 바이러스 A2의 공격으로부터 보호하고 혈청 HAI 및 중화항체를 유도한다(VACCINATION OF HAMSTERS WITH LOW DOSE OF B0VINE PARAINFLUENZA 3/HUMAN PARAINFLUENZA 3 VECTORED RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS PROTECTED HAMSTERS FROM CHALLEGE WITH RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS A2, AND INDUCES SERUM HAI AND NEUTRALIZING ANTIBODIES)
최선의 백신 선택을 확인하기 위하여, 다른 구성(실시예 2 참조)을 갖는 적은 투여량의 바이러스가 햄스터를 면역시키는데 사용되었다. 접종실험의 결과는 표 13에 요약되었다.
Figure pat00013
a 0번째 날 여섯 마리 햄스터로 이루어진 그룹을 면역시키기 위해 104 PFU/ml의 투여량으로 바이러스가 사용되었다.
b 28일째, 햄스터에게 106 pfu의 RSV A2가 접종되었다. 접종 후 4일째, 동물의 폐 및 비개골이 채취되었다.
c 표준 오차
d 미정
다음으로, 중화항체 타이터는 50% 플라크 감소 분석시험(중화 분석시험)에 의해 판단되었다. 중화 분석시험은 Vero 셀을 이용하여 b/h PIV3, b/h PIV3/RSV 키메라 바이러스 또는 RSV에 수행되었다. RSV 다클론성 면역항체 (Biogenesis; Poole, England), MedImmune로부터 입수한 RSV F MAb (WHO 1200 MAb), 또는 hPIV3 F (C191/9) 및 HN (68/2) MAbs의 연속된 두 겹의 희석물이 실온에서 60분동안 0.5 ml의 OptiMEM에서 대략 100 PFU의 b/h PIV3, b/h PIV3/RSV 키메라 바이러스 또는 RSV로 배양되었다. 배양 후에, 바이러스-항체 혼합물은 Vero 셀 단층으로 운반되고, 35℃에서 1시간 동안 배양되고, EMEM/L-15 매트릭스(JRH Biosciences; Lenexa, KS)의 1% 메틸 셀룰로우스 위에 놓여지며, 35℃에서 배양되었다. 접종 6일 후, 감염된 셀 단층은 면역-착색되었다. 중화 타이터는 50%의 바이러스성 플라크를 억제하는 최고의 혈청 희석의 역수로 표현되었다. 중화 분석시험은 또한 b/h PIV3, b/h PIV3/RSV 키메라 바이러스 또는 RSV A2로 면역된 햄스터로부터 접종 후 28일째 얻어진 혈청에 대하여 수행되었다. 햄스터 혈청은 두 겹으로 연속해서 희석되고, 한 시간 동안 100 PFU의 RSV A2로 배양되었다. 그 후, 바이러스-혈청 혼합물은 Vero 셀 단층으로 운반되고 메틸셀룰로우스 위에 놓여졌다. 35℃에서 배양한지 5일째 날, 상기 단층은 정량화를 위해 RSV 다클론성 항혈청을 사용하여 면역-착색되었다. 햄스터 프리-혈청의 중화항체 타이터는 1.0 미만이었고 HAI 항체 타이터는 4.0 미만이었다. 응집-억제 (HAI) 분석시험은 V-바닥 96-웰 플레이트 내에서 hPIV3으로 25℃에서 30분동안 연속해서 두 겹으로 희석된 28일째의 햄스터 혈청을 배양함으로써 수행되었다. 연속적으로, 기니피그 적혈구가 각 웰에 추가되었고, 배양은 추가적으로 90분동안 계속되었으며, 각 웰에서의 응집의 존재유무가 기록되었다. 표 14는 그 결과를 요약하고 있다.
Figure pat00014
a 바이러스는 104 pfu/ml의 적은 투여량으로 햄스터 면역시키기 위해 사용되었다.
b 중화항체 타이터는 50% 플라크 감소 분석시험에 의해서 판단되었다.
c 햄스터 전혈청(preserum) 중화항체 타이터는 1.0 미만이고, HAI 항체 타이터는 4.0 미만이었다.
RSV 유전자를 첫 번째 위치에 보유하는 키메라 바이러스의 제한된 복체 표현형은 각 동물에 대한 접종 투여량이 1 x 104 PFU로 감소될 때 악화되었다. b/h PIV3/RSV F1 및 G1은 b/h PIV3과 비교할 때, 1.0~2.0 log10만큼 감소된 타이터로 햄스터의 상부 호흡기계 내에서 복제되었다 (표 13). 대조적으로, 두 번째 위치에 RSV 유전자를 갖는 b/h PIV3/RSV는 b/h PIV3에 대해서 관찰된 수준으로 상부 호흡기계 내에서 복제되었다. 햄스터의 폐 내에서의 복제는 또한 첫 번째 위치에 RSV 유전자를 보유하는 b/h PIV3/RSV에 대해서 더욱 제한되었다 (표 13). 대조적으로, b/h PIV3/RSV F2는 여전히 비개골 및 폐 각각에서 105.2 및 103.9의 높은 타이터로 복제되었다 (표 13). 백신접종된 햄스터는 28일째 날 1 x 106 pfu의 RSV A2로 접종되었다 (표 13). 햄스터의 호흡기계에서 낮은 수준의 복제가 관찰되었음에도 불구하고, 동물은 상하 호흡기계 모두에서 RSV의 공격으로부터 보호되었다 (표 13). 단백질 등급은 wt RSV로 백신접종된 동물에게서 관찰된 것만큼 좋았다. 플라시보 매트릭스를 투여받은 동물만이 비개골 및 폐에서 높은 바이러스 타이터를 보였다 (표 13). 혈청은 28일째 날 면역된 햄스터로부터 채집되었고, RSV 중화항체 및 PIV3 HAI 혈창항체의 존재유무에 대해서 분석되었다 (표 14). b/h PIV3/RSV로 면역된 햄스터로부터 채취된 혈청에서 RSV 중화항체 타이터는 wt RSV 혈청에서 관찰된 것과 비교할 때 대략 50% 하락한 것으로 관찰되었다 (표 14). 그러나, 두 번째 위치에 RSV 유전자를 보유하는 b/h PIV3을 투여받은 동물로부터 얻어진 혈청은 여전히, 첫 번째 위치에 RSV 유전자를 갖는 b/h PIV3/RSV로부터 얻은 혈청에서 관찰된 것보다 더 높은 RSV 중화항체 타이터를 보여주었다. PIV3 HAI 혈청 항체 타이터는 또한 b/h PIV3 혈청과 비교할 때 다소 감소되었다 (표 14).
실시예 25: 소 파라인플루엔자 3/인간 파라인플루엔자 3 벡터 인간 메타뉴모바이러스 F 면역 햄스터는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3 또는 인간 메타뉴모바이러스 NL/001의 공격에 대해 보호된다(BOVINE PARAINFLUENZA 3/HUMAN PARAINFLUENZA 3 VECTORED HUMAN METAPNEUMOVIRUS F IMMUNIZED HAMSTERS WERE PROTECTED UPON CHALLENGE WITH HUMAN PARAINFLUENZA VIRUS 3 OR HUMAN METAPNEUMOVIRUS NL/001)
다섯 그룹의 시리아 골든 햄스터(각 그룹에 여섯 마리)은 각각 b/h PIV3, b/h hMPV F1, b/h hMPV F2, hMPV 또는 플라시보로 면역되었다. 다섯의 서로 다른 동물군이 마이크로-아이솔레이터 우리에 개별적으로 보관되었다. 면역 이후 28일째 날, 햄스터는 b/h PIV3/hMPV F에 의해 유도된 면역원성을 평가하기 위해서 1 x 106 PFU의 hPIV3 또는 hMPV(NL/001 착색제)으로 접종되었다. 접종 후 4일째 날, 동물을 죽였다. 동물의 비개골 및 폐는 균질화되고 -80℃에서 보관되었다. 조직 내에 존재하는 바이러스는 37℃에서 MBDK 셀 내의 TCID50 분석시험에 의해서 판단되었다. 바이러스 감염은 기니피그 적혈구의 혈구흡착에 의해 확인되었다. 표 15는 폐 및 비개골에서 햄스터 내의 PIV3 착색제(stains) 및 MPV 착색제의 복제 타이터(replication titers)를 보여준다.
Figure pat00015
a 0번째 날 여섯 마리 햄스터로 이루어진 그룹을 면역시키기 위해 바이러스가 사용되었다.
b 28일째, 햄스터에게 106 pfu의 hPIV3 또는 hMPV가 접종되었다. 접종 후 4일째, 동물의 폐 및 비개골이 채취되었다.
c 미정
이 결과는 b.h PIV3/hMPV F2(F는 두 번째 위치)를 투여받은 동물이 hPIV3뿐만 아니라 hMPV에 완전히 보호된다는 것을 보여주었다(표 15). 그러나, b/hPIV3/hMPV F1(F는 첫 번째 위치)은 상부 호흡기계(예를 들어, 비개골) 내의 감염된 hMPV의 타이터를 단지 2.5 로그만큼 줄이고, 반면 하부 호흡기계(예를 들어, 폐) 내에서는 hMPV 및 hPIV3 감염 모두에 대해서 완전한 보호를 제공하였다(표 15). 플라시보를 투여한 동물은 상하 호흡기계에서 공격 바이러스의 높은 타이터를 보여주었다(표 15).
본 발명은 발명의 각 양태를 단지 설명하려고 의도된 상술한 구체적인 실시예에 의해서 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 등가인 임의의 구조, 바이러스 또는 효소는 본 발명의 범위 내에 속한다. 실제로, 여기서 도시되고 설명된 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형이 상술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하도록 의도되었다.
여기서는 다양한 공보가 언급되었는데, 이들은 온전히 참조로서 병합되었다.
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
Figure pat00024
Figure pat00025
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029
Figure pat00030
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune Vaccines, Inc. ViroNovative BV <120> RECOMBINANT PARAINFLUENZA VIRUS EXPRESSION SYSTEMS AND VACCINES COMPRISING HETEROLOGOUS ANTIGENS DERIVED FROM METAPNEUMOVIRUS <130> 7682-061-228 <140> To be assigned <141> Herewith <150> 60/358,934 <151> 2002-02-21 <160> 327 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2507 <212> DNA <213> metapneumovirus <220> <221> CDS <222> (1)...(2507) <223> Human metapneumovirus isolate 00-1 matrix protein (M) and fusion protein (F) genes <400> 1 atggagtcct acctagtaga cacctatcaa ggcattcctt acacagcagc tgttcaagtt 60 gatctaatag aaaaggacct gttacctgca agcctaacaa tatggttccc tttgtttcag 120 gccaacacac caccagcagt gctgctcgat cagctaaaaa ccctgacaat aaccactctg 180 tatgctgcat cacaaaatgg tccaatactc aaagtgaatg catcagccca aggtgcagca 240 atgtctgtac ttcccaaaaa atttgaagtc aatgcgactg tagcactcga tgaatatagc 300 aaactggaat ttgacaaact cacagtctgt gaagtaaaaa cagtttactt aacaaccatg 360 aaaccatacg ggatggtatc aaaatttgtg agctcagcca aatcagttgg caaaaaaaca 420 catgatctaa tcgcactatg tgattttatg gatctagaaa agaacacacc tgttacaata 480 ccagcattca tcaaatcagt ttcaatcaaa gagagtgagt cagctactgt tgaagctgct 540 ataagcagtg aagcagacca agctctaaca caggccaaaa ttgcacctta tgcgggatta 600 attatgatca tgactatgaa caatcccaaa ggcatattca aaaagcttgg agctgggact 660 caagtcatag tagaactagg agcatatgtc caggctgaaa gcataagcaa aatatgcaag 720 acttggagcc atcaagggac aagatatgtc ttgaagtcca gataacaacc aagcaccttg 780 gccaagagct actaacccta tctcatagat cataaagtca ccattctagt tatataaaaa 840 tcaagttaga acaagaatta aatcaatcaa gaacgggaca aataaaaatg tcttggaaag 900 tggtgatcat tttttcattg ttaataacac ctcaacacgg tcttaaagag agctacttag 960 aagagtcatg tagcactata actgaaggat atctcagtgt tctgaggaca ggttggtaca 1020 ccaatgtttt tacactggag gtaggcgatg tagagaacct tacatgtgcc gatggaccca 1080 gcttaataaa aacagaatta gacctgacca aaagtgcact aagagagctc agaacagttt 1140 ctgctgatca actggcaaga gaggagcaaa ttgaaaatcc cagacaatct agattcgttc 1200 taggagcaat agcactcggt gttgcaactg cagctgcagt tacagcaggt gttgcaattg 1260 ccaaaaccat ccggcttgaa agtgaagtaa cagcaattaa gaatgccctc aaaaagacca 1320 atgaagcagt atctacattg gggaatggag ttcgtgtgtt ggcaactgca gtgagagagc 1380 tgaaagattt tgtgagcaag aatctaacac gtgcaatcaa caaaaacaag tgcgacattg 1440 ctgacctgaa aatggccgtt agcttcagtc aattcaacag aaggttccta aatgttgtgc 1500 ggcaattttc agacaacgct ggaataacac cagcaatatc tttggactta atgacagatg 1560 ctgaactagc cagagctgtt tccaacatgc caacatctgc aggacaaata aaactgatgt 1620 tggagaaccg tgcaatggta agaagaaaag ggttcggatt cctgatagga gtttacggaa 1680 gctccgtaat ttacatggtg caactgccaa tctttggggt tatagacacg ccttgctgga 1740 tagtaaaagc agccccttct tgttcaggaa aaaagggaaa ctatgcttgc ctcttaagag 1800 aagaccaagg atggtattgt caaaatgcag ggtcaactgt ttactaccca aatgaaaaag 1860 actgtgaaac aagaggagac catgtctttt gcgacacagc agcaggaatc aatgttgctg 1920 agcagtcaaa ggagtgcaac ataaacatat ctactactaa ttacccatgc aaagttagca 1980 caggaagaca tcctatcagt atggttgcac tatctcctct tggggctttg gttgcttgct 2040 acaagggagt gagctgttcc attggcagca acagagtagg gatcatcaag caactgaaca 2100 aaggctgctc ttatataacc aaccaagacg cagacacagt gacaatagac aacactgtat 2160 accagctaag caaagttgaa ggcgaacagc atgttataaa aggaaggcca gtgtcaagca 2220 gctttgaccc agtcaagttt cctgaagatc aattcaatgt tgcacttgac caagttttcg 2280 agagcattga gaacagtcag gccttggtgg atcaatcaaa cagaatccta agcagtgcag 2340 agaaaggaaa cactggcttc atcattgtaa taattctaat tgctgtcctt ggctctacca 2400 tgatcctagt gagtgttttt atcataataa agaaaacaaa gagacccaca ggagcacctc 2460 cagagctgag tggtgtcaca aacaatggct tcataccaca taattag 2507 <210> 2 <211> 1596 <212> DNA <213> pneumvirus <220> <221> CDS <222> (1)...(1596) <223> Avian pneumovirus fusion protein gene, partial cds <400> 2 atgtcttgga aagtggtact gctattggta ttgctagcta ccccaacggg ggggctagaa 60 gaaagttatc tagaggagtc atgcagtact gttactagag gatacctgag tgttttgagg 120 acaggatggt atacaaatgt gttcacactt ggggttggag atgtgaaaaa tctcacatgt 180 accgacgggc ccagcttaat aagaacagaa cttgaactga caaaaaatgc acttgaggaa 240 ctcaagacag tatcagcaga tcaattggca aaggaagcta ggataatgtc accaagaaaa 300 gcccggtttg ttctgggtgc catagcatta ggtgtggcaa ctgctgctgc tgtgacggct 360 ggtgtagcga tagccaagac aattaggcta gaaggagaag tggctgcaat caaaggtgcg 420 ctcaggaaaa caaatgaggc tgtatctaca ttaggaaatg gcgtgagggt acttgcaaca 480 gctgtgaatg atctcaagga ctttataagt aaaaaattga cacctgcaat aaacaggaac 540 aagtgtgaca tctcagacct taagatggca gtgagctttg gacaatacaa tcggaggttc 600 ctcaatgtgg taagacagtt ttctgacaat gcaggtatta cgcctgcaat atctctagat 660 ttaatgactg acgctgagct tgtaagagct gtaagcaaca tgcccacatc ttcaggacag 720 atcaatctga tgcttgagaa tcgggcaatg gtcagaagga aaggatttgg gattttgatt 780 ggagtttatg gtagctctgt ggtctatata gtgcagcttc ctattttcgg tgtgatagat 840 acaccgtgtt ggagggtgaa ggctgctcca ttatgttcag ggaaagacgg gaattatgca 900 tgtctcttgc gagaggacca aggttggtat tgtcaaaatg ctggatccac agtttattat 960 ccaaatgagg aggactgtga agtaagaagt gatcatgtgt tttgtgacac agcagctggg 1020 ataaatgtag caaaggagtc agaagagtgc aacaggaata tctcaacaac aaagtaccct 1080 tgcaaggtaa gtacagggcg tcacccaata agcatggtgg ccttatcacc actgggtgct 1140 ttggtagcct gttatgacgg tatgagttgt tccattggaa gcaacaaggt tggaataatc 1200 agacctttgg ggaaagggtg ttcatacatc agcaatcaag atgctgacac tgttacaatt 1260 gacaacacag tgtaccaatt gagcaaagtt gaaggagaac aacacacaat taaagggaag 1320 ccagtatcta gcaattttga ccctatagag ttccctgaag atcagttcaa cgtagccctg 1380 gatcaggtgt ttgaaagtgt tgagaagagt cagaatctga tagaccagtc aaacaagata 1440 ttggatagca ttgaaaaggg gaatgcagga tttgtcatag tgatagtcct cattgtcctg 1500 ctcatgctgg cagcagttgg tgtgggtgtc ttctttgtgg ttaagaagag aaaagctgct 1560 cccaaattcc caatggaaat gaatggtgtg aacaac 1596 <210> 3 <211> 1666 <212> DNA <213> pneumovirus <220> <221> CDS <222> (14)...(1627) <223> Avian pneumovirus isolate 1b fusion protein mRNA, complete cds <400> 3 gggacaagtg aaaatgtctt ggaaagtggt actgctattg gtattgctag ctaccccaac 60 gggggggcta gaagaaagtt atctagagga gtcatgcagt actgttacta gaggatacct 120 gagtgttttg aggacaggat ggtatacaaa tgtgttcaca cttgaggttg gagatgtgga 180 aaatctcaca tgtaccgacg ggcccagctt aataagaaca gaacttgaac tgacaaaaaa 240 tgcacttgag gaactcaaga cagtatcagc agatcaattg gcaaaggaag ctaggataat 300 gtcaccaaga aaagcccggt ttgttctggg tgccatagca ttaggtgtgg caactgctgc 360 tgctgtgacg gctggtgtag cgatagccaa gacaattagg ctagaaggag aagtggctgc 420 aatcaagggt gcgctcagga aaacaaatga ggctgtatct acattaggaa atggcgtgag 480 ggtacttgca acagctgtga atgatctcaa ggactttata agtaaaaaat tgacacctgc 540 aataaacagg aacaagtgtg acatctcaga ccttaagatg gcagtgagct ttggacaata 600 caatcggagg ttcctcaatg tggtaagaca gttttctgac aatgcaggta ttacgcctgc 660 aatatctcta gatttaatga ctgacgctga gcttgtaaga gctgtaagca acatgcccac 720 atcttcagga cagatcaatc tgatgcttga gaatcgggca atggtcagaa ggaaaggatt 780 tgggattttg attggagttt atggtagctc tgtggtctat atagtgcagc ttcctatttt 840 cggtgtgata gatacaccgt gttggaaggt gaaggctgct ccattatgtt cagggaaaga 900 cgggaattat gcatgtctct tgcgagagga ccaaggttgg tattgtcaaa atgctggatc 960 cacagtttat tatccaaatg aggaggactg tgaagtaaga agtgatcatg tgttttgtga 1020 cacagcagct gggataaatg tagcaaagga gtcagaagag tgcaacagga atatctcaac 1080 aacaaagtac ccttgcaagg taagtacagg gcgtcaccca ataagcatgg tggccttatc 1140 accactgggt gctttggtag cctgttatga cggtatgagt tgttccattg gaagcaacaa 1200 ggttggaata atcagacctt tggggaaagg gtgttcatac atcagcaatc aagatgctga 1260 cactgttaca attgacaaca cagtgtacca attgagcaaa gttgaaggag aacaacacac 1320 aattaaaggg aagccagtat ctagcaattt tgaccctata gagttccctg aagatcagtt 1380 caacgtagcc ctggatcagg tgtttgaaag tgttgagaag agtcagaatc tgatagacca 1440 gtcaaacaag atattggata gcattgaaaa ggggaatgca ggatttgtca tagtgatagt 1500 cctcattgtc ctgctcatgc tggcagcagt tggtgtgggt gtcttctttg tggttaagaa 1560 gagaaaagct gctcccaaat tcccaatgga aatgaatggt gtgaacaaca aaggatttat 1620 cccttaattt tagttattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1666 <210> 4 <211> 1636 <212> DNA <213> rhinotracheitis virus <220> <221> CDS <222> (13)...(1629) <223> Turkey rhinotracheitis virus gene for fusion protein (F1 and F2 subunits), complete cds <400> 4 gggacaagta ggatggatgt aagaatctgt ctcctattgt tccttatatc taatcctagt 60 agctgcatac aagaaacata caatgaagaa tcctgcagta ctgtaactag aggttataag 120 agtgtgttaa ggacagggtg gtatacgaat gtatttaacc tcgaaatagg gaatgttgag 180 aacatcactt gcaatgatgg acccagccta attgacactg agttagtact cacaaagaat 240 gctttgaggg agctcaaaac agtgtcagct gatcaagtgg ctaaggaaag cagactatcc 300 tcacccagga gacgtagatt tgtactgggt gcaatagcac ttggtgttgc gacagctgct 360 gccgtaacag ctggtgtagc acttgcaaag acaattagat tagagggaga ggtgaaggca 420 attaagaatg ccctccggaa cacaaatgag gcagtatcca cattagggaa tggtgtgagg 480 gtactagcaa ctgcagtcaa tgacctcaaa gaatttataa gtaaaaaatt gactcctgct 540 attaaccaga acaaatgcaa tatagcagat ataaagatgg caattagttt tggccaaaat 600 aacagaaggt tcctgaatgt ggtgaggcaa ttctctgata gtgcaggtat cacatcagct 660 gtgtctcttg atttaatgac agatgatgaa cttgttagag caattaacag aatgccaact 720 tcatcaggac agattagttt gatgttgaac aatcgtgcca tggttagaag gaaggggttt 780 ggtatattga ttggtgttta tgatggaacg gtcgtttata tggtacaact gcccatattc 840 ggcgtgattg agacaccttg ttggagggtg gtggcagcac cactctgtag gaaagagaaa 900 ggcaattatg cttgtatact gagagaagat caagggtggt actgtacaaa tgctggctct 960 acagcttatt atcctaataa agatgattgt gaggtaaggg atgattatgt attttgtgac 1020 acagcagctg gcattaatgt ggccctagaa gttgaacagt gcaactataa catatcgact 1080 tctaaatacc catgcaaagt cagcacaggt agacaccctg tcagtatggt agccttaacc 1140 cccctagggg gtctagtgtc ttgttatgag agtgtaagtt gctccatagg tagcaataaa 1200 gtagggataa taaaacagct aggcaaaggg tgcacccaca ttcccaacaa cgaagctgac 1260 acgataacca ttgataacac tgtgtaccaa ttgagcaagg ttgtaggcga acagaggacc 1320 ataaaaggag ctccagttgt gaacaatttt aacccaatat tattccctga ggatcagttc 1380 aatgttgcac ttgaccaagt atttgagagt atagatagat ctcaggactt aatagataag 1440 tctaacgact tgctaggtgc agatgccaag agcaaggctg gaattgctat agcaatagta 1500 gtgctagtca ttctaggaat cttcttttta cttgcagtga tatattactg ttccagagtc 1560 cggaagacca aaccaaagca tgattacccg gccacgacag gtcatagcag catggcttat 1620 gtcagttaag ttattt 1636 <210> 5 <211> 1860 <212> DNA <213> pneumovirus <220> <221> CDS <222> (1)...(110) <223> Avian pneumovirus matrix protein (M) gene, partial cds <220> <221> CDS <222> (216)...(1829) <223> Avian pneumovirus fusion glycoprotein (F) gene, complete cds <400> 5 gagttcaggt aatagtggag ttaggggcat acgttcaagc agaaagcata agcagaatct 60 gcaggaactg gagccaccag ggtacgagat atgtcctgaa gtcaagataa acacagagag 120 tacacttacc aaatcacagt aacaatttcg tttttaaccc tctcatagtt attacctagc 180 ttgatattat ttagaaaaaa ttgggacaag tgaaaatgtc ttggaaagtg gtactgctat 240 tggtattgct agctacccca acgggggggc tagaagaaag ttatctagag gagtcatgca 300 gtactgttac tagaggatac ctgagtgttt tgaggacagg atggtataca aatgtgttca 360 cacttgaggt tggagatgtg gaaaatctca catgtaccga cgggcccagc ttaataagaa 420 cagaacttga actgacaaaa aatgcacttg aggaactcaa gacagtatca gcagatcaat 480 tggcaaagga agctaggata atgtcaccaa gaaaagcccg gtttgttctg ggtgccatag 540 cattaggtgt ggcaactgct gctgctgtga cggctggtgt agcgatagcc aagacaatta 600 ggctagaagg agaagtggct gcaatcaagg gtgcgctcag gaaaacaaat gaggctgtat 660 ctacattagg aaatggcgtg agggtacttg caacagctgt gaatgatctc aaggacttta 720 taagtaaaaa attgacacct gcaataaaca ggaacaagtg tgacatctca gaccttaaga 780 tggcagtgag ctttggacaa tacaatcgga ggttcctcaa tgtggtaaga cagttttctg 840 acaatgcagg tattacgcct gcaatatctc tagatttaat gactgacgct gagcttgtaa 900 gagctgtaag caacatgccc acatcttcag gacagatcaa tctgatgctt gagaatcggg 960 caatggtcag aaggaaagga tttgggattt tgattggagt ttatggtagc tctgtggtct 1020 atatagtgca gcttcctatt ttcggtgtga tagatacacc gtgttggaag gtgaaggctg 1080 ctccattatg ttcagggaaa gacgggaatt atgcatgtct cttgcgagag gaccaaggtt 1140 ggtattgtca aaatgctgga tccacagttt attatccaaa tgaggaggac tgtgaagtaa 1200 gaagtgatca tgtgttttgt gacacagcag ctgggataaa tgtagcaaag gagtcagaag 1260 agtgcaacag gaatatctca acaacaaagt acccttgcaa ggtaagtaca gggcgtcacc 1320 caataagcat ggtggcctta tcaccactgg gtgctttggt agcctgttat gacggtatga 1380 gttgttccat tggaagcaac aaggttggaa taatcagacc tttggggaaa gggtgttcat 1440 acatcagcaa tcaagatgct gacactgtta caattgacaa cacagtgtac caattgagca 1500 aagttgaagg agaacaacac acaattaaag ggaagccagt atctagcaat tttgacccta 1560 tagagttccc tgaagatcag ttcaacatag ccctggatca ggtgtttgaa agtgttgaga 1620 agagtcagaa tctgatagac cagtcaaaca agatattgga tagcattgaa aaggggaatg 1680 caggatttgt catagtgata gtcctcattg tcctgctcat gctggcagca gttggtgtgg 1740 gtgtcttctt tgtggttaag aagagaaaag ctgctcccaa attcccaatg gaaatgaatg 1800 gtgtgaacaa caaaggattt atcccttaat tttagttact aaaaaattgg gacaagtgaa 1860 <210> 6 <211> 574 <212> PRT <213> paramyxovirus <400> 6 Met Glu Leu Leu Ile His Arg Leu Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala 1 5 10 15 Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125 Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys 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tcacagcatc caactcaaca gtccacagaa 300 aaccccacac tcaaccccgc agcatcagcg agcccatcag aaacagaacc agcatcaaca 360 ccagacacaa caaaccgcct gtcctccgta gacaggtcca cagcacaacc aagtgaaagc 420 agaacaaaga caaaaccgac agtccacaca atcaacaacc caaacacagc ttccagtaca 480 caatccccac cacggacaac aacgaaggca atccgcagag ccaccacttt ccgcatgagc 540 agcacaggaa aaagaccaac cacaacatta gtccagtccg acagcagcac cacaacccaa 600 aatcatgaag aaacaggttc agcgaaccca caggcgtctg caagcacaat gcaaaactag 660 <210> 32 <211> 675 <212> DNA <213> human Metapneumo virus <400> 32 atggaagtaa gagtggagaa cattcgagcg atagacatgt tcaaagcaaa gataaaaaac 60 cgtataagaa gcagcaggtg ctatagaaat gctacactga tccttattgg actaacagcg 120 ttaagcatgg cacttaatat tttcctgatc atcgatcatg caacattaag aaacatgatc 180 aaaacagaaa actgtgctaa catgccgtcg gcagaaccaa gcaaaaagac cccaatgacc 240 tccacagcag gcccaaacac caaacccaat ccacagcaag caacacagtg gaccacagag 300 aactcaacat ccccagtagc aaccccagag ggccatccat acacagggac aactcaaaca 360 tcagacacaa cagctcccca gcaaaccaca gacaaacaca cagcaccgct 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ttatcgagca tgttagactc 180 aaaaatgcag tcaattctaa gatgaaaata tcagattaca agatagtaga gccagtaaac 240 atgcaacatg aaattatgaa gaatgtacac agttgtgagc tcacattatt aaaacagttt 300 ttaacaagga gtaaaaatat tagcactctc aaattaaata tgatatgtga ttggctgcag 360 ttaaagtcta catcagatga tacctcaatc ctaagtttta tagatgtaga atttatacct 420 agctgggtaa gcaattggtt tagtaattgg tacaatctca acaagttgat tctggaattc 480 aggaaagaag aagtaataag aactggttca atcttgtgta ggtcattggg taaattagtt 540 tttgttgtat catcatatgg atgtatagtc aagagcaaca aaagcaaaag agtgagcttc 600 ttcacataca atcaactgtt aacatggaaa gatgtgatgt taagtagatt caatgcaaat 660 ttttgtatat gggtaagcaa cagtctgaat gaaaatcaag aagggctagg gttgagaagt 720 aatctgcaag gcatattaac taataagcta tatgaaactg tagattatat gcttagttta 780 tgttgcaatg aaggtttctc acttgtgaaa gagttcgaag gctttattat gagtgaaatt 840 cttaggatta ctgaacatgc tcaattcagt actagattta gaaatacttt attaaatgga 900 ttaactgatc aattaacaaa attaaaaaat aaaaacagac tcagagttca tggtaccgtg 960 ttagaaaata atgattatcc aatgtacgaa gttgtactta agttattagg agatactttg 1020 agatgtatta aattattaat caataaaaac ttagagaatg ctgctgaatt atactatata 1080 tttagaatat tcggtcaccc aatggtagat gaaagagatg caatggatgc tgtcaaatta 1140 aacaatgaaa tcacaaaaat ccttaggtgg gagagcttga cagaactaag aggggcattc 1200 atattaagga ttatcaaagg atttgtagac aacaacaaaa gatggcccaa aattaaaaac 1260 ttaaaagtgc ttagtaagag atggactatg tacttcaaag caaaaagtta ccccagtcaa 1320 cttgaattaa gcgaacaaga ttttttagag cttgctgcaa tacagtttga acaagagttt 1380 tctgtccctg aaaaaaccaa ccttgagatg gtattaaatg ataaagctat atcacctcct 1440 aaaagattaa tatggtctgt gtatccaaaa aattacttac ctgagaaaat aaaaaatcga 1500 tatctagaag agactttcaa tgcaagtgat agtctcaaaa caagaagagt actagagtac 1560 tatttgaaag ataataaatt cgaccaaaaa gaacttaaaa gttatgttgt taaacaagaa 1620 tatttaaatg ataaggatca tattgtctcg ctaactggaa aagaaagaga attaagtgta 1680 ggtagaatgt ttgctatgca accaggaaaa cagcgacaaa tacaaatatt ggctgaaaaa 1740 ttgttagctg ataatattgt accttttttc ccagaaacct taacaaagta tggtgatcta 1800 gatcttcaga gaataatgga aatcaaatcg gaactttctt ctattaaaac tagaagaaat 1860 gatagttata ataattacat tgcaagagca tccatagtaa cagatttaag taagttcaac 1920 caagccttta ggtatgaaac tacagcgatc tgtgcggatg tagcagatga actacatgga 1980 acacaaagcc tattctgttg gttacatctt atcgtcccta tgacaacaat gatatgtgcc 2040 tatagacatg caccaccaga aacaaaaggt gaatatgata tagataagat agaagagcaa 2100 agtggtttat atagatatca tatgggtggt attgaaggat ggtgtcaaaa actctggaca 2160 atggaagcta tatctctatt agatgttgta tctgtaaaaa cacgatgtca aatgacatct 2220 ttattaaacg gtgacaacca atcaatagat gtaagtaaac cagttaagtt atctgagggt 2280 ttagatgaag tgaaagcaga ttatagcttg gctgtaaaaa tgttaaaaga aataagagat 2340 gcatacagaa atataggcca taaacttaaa gaaggggaaa catatatatc aagagatctt 2400 cagtttataa gtaaggtgat tcaatctgaa ggagtaatgc atcctacccc tataaaaaag 2460 atcttaagag tgggaccatg gataaacaca atattagatg acattaaaac cagtgcagag 2520 tcaataggga gtctatgtca ggaattagaa tttagggggg aaagcataat agttagtctg 2580 atattaagga atttttggct gtataattta tacatgcatg aatcaaagca acacccccta 2640 gcagggaagc agttattcaa acaactaaat aaaacattaa catcagtgca 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aagaggtcaa 3540 agaggtccaa agagcccttg ggtagggtcg agcactcaag agaaaaaatt agttcctgtt 3600 tataacagac aaattctttc aaaacaacaa agagaacagc tagaagcaat tggaaaaatg 3660 agatgggtat ataaagggac accaggttta agacgattac tcaataagat ttgtcttgga 3720 agtttaggca ttagttacaa atgtgtaaaa cctttattac ctaggtttat gagtgtaaat 3780 ttcctacaca ggttatctgt cagtagtaga cctatggaat tcccagcatc agttccagct 3840 tatagaacaa caaattacca ttttgacact agtcctatta atcaagcact aagtgagaga 3900 tttgggaatg aagatattaa tttggtcttc caaaatgcaa tcagctgtgg aattagcata 3960 atgagtgtag tagaacaatt aactggtagg agtccaaaac agttagtttt aatacctcaa 4020 ttagaagaaa tagacattat gccaccacca gtgtttcaag ggaaattcaa ttataagcta 4080 gtagataaga taacttctga tcaacatatc ttcagtccag acaaaataga tatgttaaca 4140 ctggggaaaa tgctcatgcc cactataaaa ggtcagaaaa cagatcagtt cctgaacaag 4200 agagagaatt atttccatgg gaataatctt attgagtctt tgtcagcagc gttagcatgt 4260 cattggtgtg ggatattaac agagcaatgt atagaaaata atattttcaa gaaagactgg 4320 ggtgacgggt tcatatcgga tcatgctttt atggacttca aaatattcct 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human Metapneumo virus <400> 39 atggatcctc ttaatgaatc cactgttaat gtctatctcc ctgattcgta ccttaaagga 60 gtaatttctt ttagtgaaac taatgcaatt ggttcatgtc tcttaaaaag accttactta 120 aaaaatgaca acactgcaaa agttgccata gagaatcctg ttattgagca tgtgagactc 180 aaaaatgcag tcaattctaa aatgaaaata tcagattaca aggtagtaga gccagtaaac 240 atgcaacatg aaataatgaa gaatgtacac agttgtgagc tcacactatt gaaacagttt 300 ttaacaagga gtaaaaacat tagcactctc aaattaaata tgatatgtga ttggctgcaa 360 ttaaagtcta catcagatga tacctcaatc ctaagtttca tagatgtaga atttatacct 420 agttgggtaa gcaactggtt tagtaattgg tacaatctca ataagttaat tttggaattc 480 agaagagagg aagtaataag aaccggttca atcttatgca ggtcattggg taaattagtt 540 tttattgtat catcatacgg atgtatcgtc aagagcaaca aaagcaaaag agtgagcttc 600 ttcacataca atcaactgtt aacatggaaa gatgtgatgt taagtagatt taatgcgaat 660 ttttgtatat gggtaagcaa tagtctgaat gaaaatcagg aagggctagg gttaagaagt 720 aatctacaag gtatgttaac taataaacta tatgaaactg tagattatat gctaagttta 780 tgttgcaatg aaggtttctc acttgtaaaa gagttcgaag gttttattat 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attagcaaag 480 ctcataattg acttatcagc aggtgctgaa aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtga 564 <210> 47 <211> 564 <212> DNA <213> human Metapneumo virus <400> 47 atgtctcgca aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag aggaagtgag 60 tgtaagttta accacaatta ctggagttgg ccagatagat acttattaat aagatcaaac 120 tatctattaa atcagctttt aaggaacact gatagagctg atggcctatc aataatatca 180 ggcgcaggca gagaagacag aacgcaagat tttgttctag gttccaccaa tgtggttcaa 240 ggttatattg atgataacca aagcataaca aaagctgcag cctgctacag tctacacaac 300 ataatcaagc aactacaaga agttgaagtt aggcaggcta gagatagcaa actatctgac 360 agcaagcatg tggcactcca taacttaatc ttatcttaca tggagatgag caaaactccc 420 gcatctttaa tcaacaatct taaaagactg ccgagagaaa aactgaaaaa attagcaaag 480 ctgataattg acttatcagc aggcgctgac aatgactctt catatgccct gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtga 564 <210> 48 <211> 564 <212> DNA <213> human Metapneumo virus <400> 48 atgtctcgta aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag agggagtgat 60 tgcaaattca atcacaatta 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gccaacacac caccagcggt tttgctcgat cagctaaaaa ccttgactat aacaactctg 180 tatgctgcat cacagaatgg tccaatactc aaagtaaatg catcagctca gggtgctgct 240 atgtctgtac ttcccaaaaa attcgaagta aatgcaactg tggcacttga tgaatacagc 300 aaacttgact ttgacaagtt aacggtttgc gatgttaaaa cagtttattt gacaaccatg 360 aagccatatg ggatggtgtc aaaatttgtg agttcagcca aatcagttgg caaaaagaca 420 catgatctaa ttgcactgtg tgacttcatg gacctagaga aaaatatacc tgtgacaata 480 ccagcattca taaagtcagt ttcaatcaaa gagagtgagt cagccactgt tgaagctgca 540 ataagcagtg aggccgacca agcattaaca caagccaaaa ttgcacccta tgcaggacta 600 atcatgatca tgaccatgaa caatccaaaa ggtatattca agaaactagg agctggaaca 660 caagtgatag tagagctagg ggcatatgtt caagccgaga gcatcagcag gatctgcaag 720 agctggagtc accaaggaac aagatatgta ctaaaatcca gataa 765 <210> 70 <211> 394 <212> PRT <213> human Metapneumo virus <400> 70 Met Ser Leu Gln Gly Ile His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 1 5 10 15 Ile Leu Lys Glu Ser Gln Tyr Thr Ile Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30 Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu 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<212> DNA <213> Human metapneumo virus <400> 128 atggaagtaa gagtggagaa cattcgggca atagacatgt tcaaagcaaa gatgaaaaac 60 cgcataagaa gtagcaagtg ctatagaaat gctacactga tccttattgg attaacagca 120 ttaagtatgg cacttaatat ttttttaatc attgattatg caacattaaa aaacatgacc 180 aaagtggaac actgtgttaa tatgccgccg gtagaaccaa gcaagaagac cccaatgacc 240 tctgcagtag acttaaacac caaactcaat ccacagcagg caacacagtt gaccacagag 300 gattcaacat ctctagcagc aacctcagag ggccatccac acacaggaac aactccaaca 360 ccagacgcaa cagtctctca gcaaaccaca gacgagcaca caacactgct gagatcaacc 420 aacagacaga ccacccaaac agccacagag aaaaagccaa ctggagcaac aaccaaaaaa 480 gaaaccacaa cccgaactac aagtacagct gcaacccaaa cacccaacac caccaaccaa 540 accagcaatg gaagagaggc aaccacaaca tccgccaggt ccagaaacgg tgccacaact 600 caaaacagcg atcaaataac ccaggcagca gactcaagct cccaaccaca ccatacacag 660 aaaagcacaa caacagcata caacacagac acatcttttc caagtagtta acaaaaaact 720 ataaaataac catgaaaacc aaaaaactag aaaagttaat ttgaactcag aaaagaacac 780 aaacactata tgaattgttt gagcgtatat 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Xaa = unknown amino acid or other <400> 146 Met Glu Val Lys Val Glu Asn Ile Arg Ala Ile Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu Ile Leu Ile Gly Ile Thr Thr Leu Ser Ile Ala Leu Asn Ile Tyr 35 40 45 Leu Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Thr Ser Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asp Asn Pro Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Ser Leu Thr Leu Ser Pro Thr Ala Ser Val Ser Pro 100 105 110 Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Ser Asp Thr Thr Ser Arg Leu Ser 115 120 125 Ser Val Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Ala Arg Thr 130 135 140 Lys Pro Thr Val His Lys Lys Asn Ile Pro Ser Thr Val Ser Arg Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Leu Arg Ala Thr Thr Lys Ala Val Leu Arg Ala Thr Ala 165 170 175 Phe Arg Thr Ser Ser Thr Gly Glu Gly Pro Thr Thr Thr Ser Val Gln 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gln Asn His Glu Glu Thr 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Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 326 <211> 149 <212> PRT <213> Human metapneumo virus <400> 326 Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile 1 5 10 15 Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Ile Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145 <210> 327 <211> 149 <212> PRT <213> Human metapneumo virus <400> 327 Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile 1 5 10 15 Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Ile Lys Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu 50 55 60 Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser 85 90 95 Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser 100 105 110 Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly 115 120 125 Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Cys Ser 145

Claims (4)

  1. 재조합 타입 3 소 파라인플루엔자 바이러스(bPIV3) 게놈을 포함하며,
    상기 bPIV3 게놈은
    뉴클레오단백질(N), 인단백질(P), 매트릭스(M) 단백질, 및 거대 단백질(large protein, L)을 코딩하는 타입 3 소 파라인플루엔자 바이러스(bPIV3) 뉴클레오타이드 서열들;
    퓨전(fusion) 단백질(F) 및 적혈구응집소(hemagglutinin)-뉴라미니다제 당단백질(HN)을 코딩하는 인간 타입 3 파라인플루엔자 바이러스(hPIV3) 뉴클레오타이드 서열들; 및
    호흡기 신시티움(syncytial) 바이러스(RSV) F 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며,
    상기 RSV F 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 상기 bPIV3 게놈의 1774번 뉴클레오타이드 위치에 삽입되는 것을 특징으로 하는
    재조합 파라인플루엔자 바이러스(PIV).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 hPIV3는 hPIV3/Tex/12084/1983인 것을 특징으로 하는 재조합 파라인플루엔자 바이러스(PIV).
  3. 제 1항에 있어서, 상기 bPIV3는 캔사스-균주(Kansas-strain) bPIV3인 것을 특징으로 하는 재조합 파라인플루엔자 바이러스(PIV).
  4. 제 1항에 있어서, 상기 RSV F 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
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