PT1012244E - ''rabdovírus com revestimentos remanipulados'' - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 012 244/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Rabdovírus com revestimentos remanipulados"
Campo técnico do invento O presente invento refere-se principalmente a rabdovírus competentes para replicação isentos de um gene de glicoproteína funcional e que expressam no revestimento virai pelo menos um polipéptido membranar, tal como um receptor para outro vírus. Os rabdovírus recombinantes do invento tais como o vírus de estomatite vesicular que expressam pelo menos um receptor celular e um co-receptor de outro vírus patogénico, tal como VIH, são úteis para o tratamento de doentes infectados com o vírus patogénico.
Antecedentes do invento
Para causar infecção, os vírus com envelope membranar, tais como o vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (VIH-1) têm que primeiro ligar-se a receptores na superfície celular e subsequentemente fundir a sua própria membrana com a da célula. Este processo de fusão liberta o material genético virai para o citoplasma e inicia a infecção. Sabe-se há bastante tempo que a entrada de VIH-1 nas células requer ligação do vírus à molécula CD4 de superfície celular (Maddon, et al., 1986; Sattentau e Weiss, 1988) e estudos recentes definiram moléculas receptoras de quimioquina, CXCR4 (Feng, et al., 1996; Berson, et al., 1996), CCR5 (Alkhatib, et al., 1996 ; Choe, et al., 1996; Deng, et al., 1996; Doranz, et al., 1996; Dragic, et al., 1996) e CCR3 (Choe, et al., 1996; Doranz, et al., 1996) como co-receptores necessários para a entrada. A entrada de VIH ocorre em etapas: a ligação inicial da proteína de envelope virai (denominada gpl20/41) a CD4 é seguida por alterações conformacionais que permitem a ligação ao co-receptor e subsequente coalescência das membranas virai e celular (Lapham, et al., 1996; Trkola, et al., 1996; Wu, et al., 1996). As células infectadas por VIH expressam gp 120/41 na superfície celular durante a infecção e antes da sua incorporação em partículas de VIH-1 protuberantes. 2 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ
Estudos recentes demonstraram que o vírus da estomatite vesicular (VSV) tem potencialidades como um vector de elevado nível de expressão capaz de incorporar proteínas estranhas no envelope virai (Schnell, et al., 1996a; Schnell, et al., 1996b). O VSV causa uma infecção citopática extremamente rápida na maioria das células animais incluindo células T humanas em cultura, mas normalmente não é patogénico em humanos (para uma revisão consultar Wagner e Rose, 1996). No intervalo de duas a três horas após a infecção, o vsv bloqueia a síntese proteica da célula hospedeira e no intervalo de oito horas produz quantidades muito elevadas de partículas virais de descendência que se projectam da superfície celular antes da lise da célula. 0 VSV apresenta um genoma de ARN não segmentado e de cadeia negativa que é copiado no citoplasma de células infectadas pela ARN-polimerase virai para gerar cinco ARNm que codificam as cinco proteínas estruturais. Somente uma destas proteínas, a glicoproteína denominada G, está presente na membrana virai e é responsável pela muito larga gama de hospedeiros de vsv. A proteína G reconhece as superfícies celulares e catalisa a fusão da membrana virai com membranas celulares (Florkiewicz e Rose, 1984). As proteínas de membrana estranhas, tais como CD4 e outras proteínas de membrana virais podem ser expressas em níveis muito elevados a partir do genoma de VSV recombinantes e estas moléculas são então incorporadas em níveis elevados na membrana virai juntamente com proteína G (Schnell, et al., 1996b).
Schubert et al. (J. Virol. 1992, pl579-1589) refere-se a vírus de estomatite vesicular que expressam CD4 ou fusões de CD4/glicoproteína G codificadas por um plasmídeo EP 0702085 revela vírus mutantes de ARN não segmentado de cadeia negativa, tais como vírus da raiva mutantes, nos quais um gene estranho substitui um pseudogene e o vírus inclui um gene de glicoproteína G de tipo selvagem ou o vírus inclui uma glicoproteína G mutante complementada por uma glicoproteína G exógena.
Resumo do invento
Constitui um objectivo do invento utilizar esta estratégia para manipular vírus recombinantes que podem ser 3 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ utilizados para ter como alvo células infectadas com outros virus, tais como VIH.
Constitui um objectivo adicional e mais específico proporcionar um método para tratar uma pessoa infectada com VIH.
Estes e outros objectivos são conseguidos pelo presente invento, que proporciona rabdovírus recombinantes competentes para replicação, tais como vírus de estomatite vesicular (VSV) isentos de um gene de glicoproteina G funcional e que expressam nos seus envelopes virais pelo menos um polipéptido membranar estranho. Em concretizações preferidas, o polipéptido estranho é um receptor celular para outro vírus e é expresso de uma forma suficiente para ter como alvo células infectadas com o outro virus. Numa concretização, o invento proporciona vírus de estomatite vesicular recombinante competente para replicação isento de um gene de glicoproteina G funcional e que apresenta pelo menos um receptor celular para um vírus patogénico de mamífero. No caso de o outro vírus ser VIH, o polipéptido expresso é um receptor de VIH tal como CD4, um co-receptor de VIH, tal como CXCR4 e/ou suas misturas. 0 invento proporciona consequentemente vírus para utilização em métodos de fabrico de medicamento para tratar doentes infectados com um vírus patogénico. Tal como apresentado seguidamente, revelam-se métodos de tratamento de doentes infectados com VIH-1 e/ou VIH-2.
Descrição das figuras A Figura 1 ilustra diagramas de genomas de VSV recombinantes. Apresenta-se a ordem dos genes em VSV de tipo selvagem e em VSV recombinantes. Cada gene extra foi inserido de modo a conter os sinais adequados que especificam iniciação e terminação da transcrição por polimerase de VSV. Os detalhes sobre construções de plasmídeos e derivação dos vírus recombinantes apresentam-se nos exemplos. Os genes são transcritos da esquerda para a direita a partir do genoma de ARN de cadeia negativa que se apresenta na orientação 3'-5'. 4 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ A Figura 2 apresenta fotografias de culturas que ilustram que os VSV isentos de gene G formam placas fágicas numa linha celular complementar. Inocularam-se células BHK-G em placas de 6 poços (1,5 x 105 células em cada poço) e induziu-se expressão de proteína G por remoção de tetraciclina. Adicionaram-se as diluições indicadas de 100 μΐ de vírus VSVAG-CD4 (ΙΟ-2, 10~3 e 10~4) 16 h mais tarde, seguido por adição de 2 ml de DME contendo metilcelulose a 2%. incubaram-se as células durante 48 h e seguidamente coraram-se com negro de naftaleno para visualizar as pequenas placas fágicas. As placas fágicas de VSV do tipo selvagem são muito maiores e são visíveis após 18 h, mas a formação de placas fágicas pelo vírus deficiente nesta linha celular é mais lenta, provavelmente devido ao nível reduzido de proteína G de VSV de complementação expressa. A Figura 3 apresenta a visualização por microscopia imunoelectrónica de CD4 nos envelopes de VSVAG-CD4 e VSVAG-CC4. As partículas de VSV do tipo selvagem, VSVAG-CD4 ou VSVAG-CC4 purificadas foram coradas negativamente com ácido fosfotúngstico após marcação com um anticorpo monoclonal dirigido contra CD4 seguido por partículas de igG de cabra anti-ratinho conjugadas com ouro. As partículas de VSV do tipo selvagem continham espigões de trímeros de proteína G de VSV visíveis (setas) e não ligaram o anticorpo contra CD4 (VSV de tipo selvagem, painel esquerdo) , enquanto que VSVAG-CD4 ou VSVAG-CC4 ligaram o anticorpo anti-CD4 e não apresentaram espigões visíveis na superfície. A Figura 4 ilustra a análise de infecção por VIH-1 e VSVAG-CC4 por microscopia de imunofluorescência. Infectaram-se culturas de células Jurkat em duplicado com VIH-1 estirpe IIIB e, cinco dias mais tarde, super-infectaram-se com VSVAG-CC4 (painel D, E, F) ou propagaram-se sem super-infecção (painel A, B, C) . As células Jurkat que não foram infectadas com VIH-1 foram também infectadas com VSVAG-CC4 (painel G, Η, I). Catorze dias após a infecção com VSVAG-CC4, fixaram-se as células e marcaram-se com um anticorpo monoclonal de ratinho contra a proteína N de VSV e um anticorpo secundário, purificado por afinidade, anti-ratinho, conjugado com rodamina (detectado nos painéis C, F, I) e uma globulina imunitária anti-VIH policlonal humana, seguidos por anticorpos anti- 5 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ humanos conjugados com FITC e purificados por afinidade (detectados nos painéis B, E, H) . Os painéis A, D e G apresentam imagens de Nomarski dos mesmos campos de células apresentados corados nas duas imagens à sua direita. A Figura 5 proporciona gráficos de linhas que ilustram a quantificação de infecção por VIH-1 e VSVAG-CC4 em células Jurkat. Infectaram-se culturas de células Jurkat em duplicado com vih-1 iiib no dia 0 e super-infectaram-se com VSVA-CC4 cinco dias mais tarde () ou propagaram-se sem super-infecção (□). A percentagem de células VIH+ foi determinada por microscopia de imunofluorescência nos dias indicados (Figura 5A). A percentagem de células VIH+ que também foram infectadas com VSVAG-CC4 foi determinada por microscopia de imunofluorescência para detectar proteína N de VSV (Figura 5B). Contaram-se cem a duzentas células de múltiplos campos aleatórios para determinar as percentagens de células com coloração positiva para antigénios de VIH ou VSV. A Figura 6 proporciona gráficos de linhas que ilustram o efeito de infecção por VSVáG-CC4 na produção de VIH-1 infeccioso e na libertação de RT. Analisaram-se os meios de cultura de células Jurkat quantos aos títulos de VIH infeccioso e quanto a actividade de RT, tal como descrito nos exemplos. Determinaram-se os títulos (figura 5A) em triplicado e apresentam-se como TCID50/ml (□, infectados só com VIH; , VIH + VSVAG-CC4) . Os títulos determinados neste ensaio foram consistentes com os títulos determinados num ensaio indirecto por imunofluorescência para detectar antigénios de VIH. A actividade de RT (Figura 5B) apresenta-se como contagens totais por minuto (cpm) ligadas a papel DEAE após subtracção de uma linha de base inferior a 50 cpm (□, infectados só com VIH; , VIH + VSVAG-CC4; Δ, infectados só com VSVAG-CC4) . Os dados do gráfico são a média de duplicados concordantes no intervalo de 5%. Recolheram-se amostras de culturas Jurkat nos dias indicados após super-infecção com VSVAG-CC4.
Descrição detalhada do invento O presente invento baseia-se na construção de um novo vírus a partir do vírus de estomatite vesicular (VSV) que é competente para replicação e mata células rapidamente, mas só 6 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ é capaz de infectar células que são primeiro infectadas com VIH. O virus contém uma deleção no gene de glicoproteina de envelope de VSV e expressa na sua vez os genes para o receptor de VIH, CD4, e um co-receptor de vih, CXCR4. O virus mata células infectadas com VIH em cultura e controla a infecção por VIH.
Na prática do presente invento, geram-se rabdovirus recombinantes competentes para replicação que são isentos de um gene de glicoproteina G funcional e que expressam um polipéptido membranar estranho nos seus envelopes virais. "Estranho" significa que não ocorre naturalmente no rabdovirus transformado. O polipéptido membranar estranho é tal que se liga a uma célula de mamífero, tal como um receptor celular e/ou co-receptor para outro vírus em muitas concretizações e um anticorpo noutras concretizações. O invento é particularmente adequado para tomar como alvo células infectadas com vírus de envelope membranar. O invento proporciona uma estratégia geral de direccionar vírus para células infectadas em casos em que é(são) conhecido(s) o(s) receptor(es) reconhecido(s) pelas proteínas de envelope virai e a proteína virai apresenta actividade de fusão membranar. De igual modo, são também conhecidos anticorpos convencionais e híbridos para células patológicas e são utilizados para ter como alvo estas células. Em qualquer dos casos, expressam-se polipéptidos estranhos no rabdovirus de um modo suficiente para tomar como alvo células para serem mortas. Assim, tal como aqui utilizado, "rabdovirus recombinante isento de um gene de glicoproteina G funcional" significa um vírus com uma alteração ou ruptura do gene de glicoproteina G e/ou que expressa uma glicoproteina fracamente funcional ou não funcional, ou suas combinações.
Nos exemplos que se seguem, geram-se VSV recombinantes isentos de um gene de glicoproteina G de envelope funcional ou um gene correspondente e que expressam na sua vez pelo menos um receptor ou co-receptor de um vírus de VIH. Em concretizações preferidas, o gene G foi eliminado, mas pode ser utilizada qualquer mutação do gene que altere a especificidade do VSV para a gama de hospedeiros ou que de outra forma elimine a função da proteína G. 7 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ
Seguidamente insere-se e/ou adiciona-se ao genoma do rabdovirus recombinante um gene para um polipéptido membranar estranho tal como um que se liga a células de mamífero infectadas com um vírus patogénico. Tal como resumido acima, em muitas concretizações típicas, o gene adicionado é um receptor reconhecido por uma glicoproteína do vírus e que se encontra presente na superfície de células de mamífero. Contudo, encontram-se abrangidos pelo invento rabdovirus recombinantes manipulados para matar outras células, e.g., células de cancro. Nestas concretizações, incorporam-se tipicamente genes para anticorpos específicos e uma proteína de fusão membranar em rabdovirus isentos de um gene de glicoproteína funcional. 0 invento proporciona assim utilizações no fabrico de medicamentos médicos ou veterinários para tratar um doente (ser humano ou animal) infectado com um vírus patogénico de mamífero, por administração ao doente de uma quantidade eficaz de um vírus de estomatite vesicular recombinante, competente para replicação, isento de um gene de glicoproteína G funcional, e que apresenta um receptor do vírus patogénico no seu envelope, de um modo suficiente para tomar como alvo células infectadas com o vírus patogénico. Apresenta-se na secção de exemplos seguinte, um exemplo em que o vírus de envelope membranar patogénico é VIH e as proteínas de envelope adicionadas ao VSV são um receptor de VIH e um co-receptor específico. Nessa ilustração, utiliza-se um VIH trópico de células T, mas podem manipular-se VSV recombinantes do invento para expressarem co-receptores de outras estirpes de VIH. Outras concretizações expressam um receptor e não um co-receptor e alguns VSV recombinantes do invento expressam mais do que um co-receptor de VIH.
Na prática de uma concretização preferida do invento, trata-se um doente infectado com VIH por administração ao doente de uma quantidade eficaz de um vírus de estomatite vesicular recombinante, competente para replicação, isento de um gene de glicoproteína G funcional, e que expressa pelo menos um receptor de VIH, tal como CD4, e pelo menos um co-receptor de VIH, tal como CXCR4, CCR5, CCR3, e/ou suas misturas. Constitui um exemplo de construção a VSVAG-CC4 descrita adiante e ilustrada na Figura 1. 8 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ A administração de um rabdovirus recombinante do invento a uma pessoa ou outro mamífero pode ser feita através de qualquer método local ou sistémico conhecidos dos peritos, mas é de preferência por via sistémica. A administração sistémica inclui administração intravenosa, intramuscular ou intradérmica por injecções estéreis, administração parentérica e semelhantes, tipicamente em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável e/ou outro composto adjuvante ou adjunto que mantém a viabilidade do virus de VSV recombinante ou outros rabdovirus ou aumenta o seu efeito. Podem também ser utilizadas combinações de terapias. A quantidade de rabdovirus recombinante necessária para conseguir um tratamento terapêutico não é fixa per se e depende necessariamente da gravidade ou extensão da doença. A administração é facilitada pelo transportador, que em alguns casos proporciona efeitos terapêuticos adicionais. Quando se utiliza um transportador, é necessário que este seja inerte no sentido de não inactivar o VSV recombinante ou outro rabdovirus e no sentido de não provocar qualquer efeito adverso no doente a que é administrado. Na maior parte das situações, as doses dependem da extensão da doença, da idade, peso e estado clinico do doente a tratar, da potência do vírus recombinante, dos compostos adjuvantes ou adjuntos (caso existam) utilizados e das concentrações de rabdovirus recombinantes e outros ingredientes que são tipicamente adicionados em associação com um transportador farmaceuticamente aceitável. Com maior preferência, a administração dos rabdovirus recombinantes do invento reduz as células doentes no doente de um modo tão significativo que passam a ser dificilmente detectáveis ou indetectáveis.
Constitui uma vantagem do invento o facto dos VSV recombinantes preferidos que incorporam o receptor de um vírus no revestimento de outro, matarem as células infectadas com o outro vírus rapidamente e assim controlarem a infecção. Constitui uma vantagem adicional do invento o facto de os VSV recombinantes ou outros rabdovirus do invento serem geneticamente manipulados para terem alvos específicos e apenas matarem células infectadas ou patogénicas. 9 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ
Os seguintes exemplos apresentam-se para adicionalmente ilustrar e explicar o presente invento e não devem ser interpretados de modo algum como limitativos.
Exemplos
Nos estudos aqui relatados geram-se VSV recombinantes que apresentam uma deleção completa do gene G de VSV e uma substituição deste pelos genes de CD4 e CXCR4. Estes virus montam partículas contendo tanto CD4 como CXCR4 nos seus envelopes e são dirigidos especificamente para infectar células infectadas por VIH-1.
Procedimentos experimentais
Construção de plasmídeo. Utilizou-se digestão com MluI e Sphl para eliminar o gene G de VSV completo de pVSV-CD4 (Schnell et al., 1996b). 0 plasmideo resultante foi denominado pVSVAG-CD4. Foi anteriormente descrito um plasmideo que codifica a proteína CXCR4 com um marcador epitópico HA (Berson et al., 1996). CXCR4 foi amplificado por PCR a partir deste plasmídeo com polimerase VENT (Stratagene) utilizando os iniciadores 5'-ACTGCCCGGGCTCGAGGTTACCATGGAGGGGATCAG-3' (SEQ ID NO : 1) e 5'-AGCTGCGGCCGCTAGCTTAGCTCCCGGGAAGAGA-TGCG-3' (SEQ ID NO:2). O primeiro iniciador contém um local Xhol e o segundo um local NheI (letras em negrito) . O produto de PCR foi digerido com Xhol e NheI e clonado para pVSV-XNl (Schnell et al., 1996a) que foi digerido com Xhol e NheI. O plasmídeo resultante foi denominado pVSV-CXCR4. O gene G foi eliminado de pVSV-CXCR4 com Xhol e MluI. A sequência de codificação para CD4 humana foi amplificada a partir de pCD4 (Shaw et al., 1989) por PCR utilizando os iniciadores 5'-CCGGGTACCACGCGTACAA TGAACCGGGGAGTCCCTTTTAG-3' (SEQ ID NO:3) e 5'-GGGCCCCTCGAGCGTGA TATCTGTTAGTTTTTTTCATACTCAAATGGGGCTACATGTCTTC-3' (SEQ ID NO:4). O primeiro iniciador contém um local MluI (letras em negrito); o segundo iniciador contém um local Xhol (letras em negrito) e um sinal de paragem-iniciação da transcrição de VSV (letras sublinhadas). O gene de CD4 foi inserido no local da deleção G para gerar um plasmídeo que foi denominado pVSVADG-CC4.
Construção de uma linha celular de BHK que expressa proteína G de VSV. O sistema regulado por tetraciclina 10 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ utilizado foi previamente descrito (Shockett et al., 1995). Preparou-se um gene G de VSV a partir de um plasmideo denominado pBSG por digestão com Xhol. Preencheram-se as extensões com enzima de Klenow e ligou-se o fragmento a pTet-Splice (Life Technologies) que tinha sido clivado com EcoRV. O plasmideo resultante foi denominado pTET-G. Transfectaram-se células BHK em placas de 10 cm (20% de confluência) com 1 pg de pTET-G e 10 pg de pTet-TAk (Life Technologies) utilizando o método do CaP04 (kit de transfecção de mamífero; Stratagene). Um dia após transfecção adicionou-se tetraciclina a 0,5 pg/ml para suprimir a expressão de proteína G, que é tóxica para as células BHK, e seleccionaram-se as células transfectadas estavelmente por adição de geneticina (G418) a 0,75 mg/ml. Dez dias após transfecção, isolaram-se colónias de células e, após indução por remoção de tetraciclina, rastrearam-se quanto a expressão de proteína G de VSV por microscopia de imunofluorescência.
Recuperação de VSV recombinantes. Mantiveram-se células de rim de hamster bebé (BHK-21, ATCC) em DMEM (meio Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 5%. Infectaram-se células em placas de 10 cm (-80% de confluência) a uma MOI de 10 com vTF7-3 (Lawson et al., 1995). Após 1 hora, transfectaram-se plasmídeos que codificam as proteínas N, P, G e L e o ARN anti-genoma recombinante adequado para as células utilizando um reagente de lipossomas catiónico contendo brometo de dimetildioctadecilamónio e fosfatidiletanolamina (Lawson et al., 1995; Rose et al., 1991). As quantidades de plasmideo foram de 10 pg do respectivo plasmideo completo (VSVAG-CD4 ou VSVAG-CC4), 3 pg de pBS-N, 5 pg de pBS-P, 4 pg de BS-G e 2 pg de pBS-L. Filtraram-se os sobrenadantes dos recuperados através de filtros de 0,22 pm e utilizaram-se 5 ml para infectar células BHK-G em placas de 10 cm que tinham sido induzidas durante doze horas por remoção de tetraciclina. Os sobrenadantes da primeira passagem foram filtrados duas vezes através de um filtro de seringa (porosidade de 0,1 pm) para remover qualquer vírus vaccinia e passaram-se então os vírus em 4 x 106 células BHK-G. Titularam-se os sobrenadantes (10 ml) em células BHK-G e congelaram-se a -80°C. Para a produção de reservas de virus, infectaram-se 2 x 106 células BHK em placas de 10 cm durante 2 h com 10 ml de sobrenadantes de VSVAG-CD4 ou VSVAG-CC4 11 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ cultivados em células BHK-G, lavaram-se três vezes com solução salina tamponada de fosfato (PBS) seguido por adição de 10 ml de meio RPMI com soro fetal bovino (FBS) a 10% ou 10 ml de DMEM com FBS a 5%, Às 16 h após infecção, clarificaram-se os sobrenadantes por centrifugação e utilizaram-se para experiências ou armazenaram-se a -80°C.
Preparação e análise de vírus. Para isolar os viriões, infectou-se uma monocamada de células BHK (-80% de confluência) numa placa de 10 cm com VSVAG-CD4 ou VSVAG-CC4 (multiplicidade de infecção, MOI=5) ou VSV de tipo selvagem (MOI=0,01). Às 16 h após infecção, removeram-se os detritos celulares e núcleos por centrifugação a 1250 x g durante 5 min e purificaram-se então os vírus duas vezes por ultra-centrifugação a 120 000 g através de uma solução de sacarose a 20% contendo Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 e EDTA 1 mM. Ressuspenderam-se as peletes de vírus e analisaram-se por SDS-PAGE (acrilamida a 10%) . Os géis foram corados com azul brilhante de Coomassie ou foram transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com leite em pó magro a 5% em TBST (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, Tween™-20 a 0,05%) durante 1 h à temperatura ambiente e seguidamente foram incubadas com um anticorpo dirigido contra CD4 (a-CD4 de ovelha, AIDS Research Reference and Reagent Program) ou um anticorpo 12CA5 (Boehringer-Mannheim) dirigido contra o epítopo HA em CXCR4. Visualizaram-se as proteínas após incubação com igG de burro anti-ovelha conjugado com peroxidase de rábano ou IgG de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (Jackson Reasearch) durante 1 h à temperatura ambiente utilizando o sistema de quimioluminescência aumentada (ECL; Amersham).
Microscopia electrónica e marcação com anticorpos conjugados com ouro. Recuperaram-se as partículas de vírus a partir da infecção de aproximadamente 107 células numa placa de 15 cm, a partir do meio de cultura, começando por sedimentar numa pelete os resíduos celulares a 1500 x g durante 10 min. Os vírus foram então concentrados e purificados por centrifugação tal como descrito acima. Absorveram-se amostras de vírus em redes revestidas por carbono durante 5 min e seguidamente bloquearam-se com BSA a 1% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. As redes 12 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ foram então colocadas numa gota de 50 μΐ de Mab anti-CD4 OKT4 (Reinherz et al., 1979) diluído a 1:50 em PBS contendo BSA a 1%. Após 1 hora, removeu-se o excesso de anticorpo por colocação das redes sequencialmente em cinco gotas de 50 μΐ de BSA a 1% em PBS durante 2 min de cada vez. As redes foram então colocadas numa gota de 50 μΐ de IgG de cabra anti-ratinho (Fc) marcado com partículas de ouro de 15 nm (AuroProbe, Amersham Inc.). Removeram-se os conjugados de ouro não ligados através de cinco lavagens sequenciais de 2 min. com PBS. Os complexos vírus-imuno-ouro foram então corados negativamente por incubação das redes durante 4 min em gotas de 50 μΐ de ácido fosfotúngstico a 2% (pH 7,2). Removeu-se o excesso de corante e secaram-se as redes ao ar. Obtiveram-se imagens dos vírus num microscópio electrónico Zeiss EM910.
Infecção e microscopia de imunofluorescência de células
Jurkat_infectadas. Inocularam-se aproximadamente 3 x 106 células Jurkat (clone E6-1, ATCC #TIB-125) em frascos T-25 e cultivaram-se em meio RPMI suplementado com FBS a 10%. A infecção com VIH-1 estirpe IIIB foi a uma MOI de aproximadamente 0,01. Aos cinco dias após infecção, super-infectaram-se as células com 5 ml de meio contendo VSVAG-CC4. Como controlos, uma cultura de VIH não foi super-infectada e infectou-se uma terceira cultura só com VSVAG-CC4. Recolheram-se as células para análise em cada ponto temporal da seguinte forma. Recolheu-se metade do volume da cultura e adicionou-se um volume igual de RPMI suplementado com FBS a 10% às culturas originais. Sedimentaram-se as células a 1000 rpm durante cinco minutos a 5°C numa centrífuga refrigerada IEC Centra-7R (Fisher Scientific) . Rejeitou-se o meio, lavaram-se as células uma vez com 5 ml de PBS e sedimentaram-se novamente. Removeu-se o PBS e ressuspenderam-se as células em 100 μΐ de PBS. As células foram então fixadas em 1 ml de paraformaldeído a 3% durante uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Após permeabilização em Triton X-100 a 1%, coraram-se as células com um anticorpo monoclonal para proteína N de VSV e imunoglobulina de VIH policlonal humana (AIDS Research Reference and Reagent Program), seguida por anticorpos anti-ratinho conjugado com rodamina e anti-humano conjugado com FITC (Jackson Research). 13 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ
Examinaram-se as células e fotografaram-se com uma objectiva planapochromat 40X num microscópio Nikon Microphot-FX equipado para epifluorescência. A infecção de células com VIH-1 ou VSVAG-CC4 foi monitorizada por contagem de pelo menos três campos aleatórios de células, que tipicamente continham 100-200 células. Contaram-se sincicios como células individuais.
Determinação de títulos de vih. Obtiveram-se títulos de VIH utilizando sobrenadantes de culturas infectadas e fazendo diluições em série de três vezes em placas de 96 poços. Adicionaram-se a cada poço dez mil células MT-2 proporcionadas por AIDS Research Reference and Reagent Program (ARRRP) e misturaram-se os vírus e as células por pipetagem. As placas foram incubadas a 37°C durante 3-5 dias e pontuaram-se quanto a presença de sincicios. Os títulos em cada ponto temporal foram determinados em triplicado e classificaram-se dois ou mais sincicios por poço como positivos para infecção por VIH. Calcularam-se os títulos tal como previamente descrito (Reed e Muench, 1938) e são apresentados como doses infecciosas para 50% das culturas de tecidos (TCID50) por ml.
Ensaios de transcriptase inversa. Cada ensaio foi efectuado em placas de 96 poços em duplicado (Willey et al., 1988). Adicionaram-se vinte e cinco microlitros de mistura de transcrição inversa (NP-40 a 0,05%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,8, KC1 75 mM, DTT 2 mM, MgCl2 5 mM, 5 unidades de oligonucleótido (dT) 12-18, poli A a 5 mg/ml), seguido por adição de 10 μΐ de sobrenadantes de cultura isentos de células. Adicionaram-se 25 μΐ adicionais de mistura reaccional contendo a-[ P]-dTTP a 10 pCi/ml e colocou-se a reacção a 37°C durante 90 minutos. Colocaram-se gotas de cinco microlitros de cada amostra em papel Whatman DE81, que foi seco ao ar. Lavou-se então o papel DE81 em tampão SSC 2x (NaCl 0,3 M, citrato de sódio 20 mM) quatro vezes, cada vez à temperatura ambiente durante cinco minutos, seguido por duas lavagens de um minuto em etanol a 95% à temperatura ambiente. Após secagem ao ar, expôs-se o papel a um gerador de imagem Phosphorimager Molecular Dynamics durante a noite. Quantificaram-se directamente as amostras no gerador de imagem e por contagem num espectrómetro de cintilação após excisão do papel. As amostras em duplicado eram concordantes num intervalo de 5%. 14 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ
Neutralização de infecção por VSVDG-CC4. Tratou-se por calor a 56°C durante uma hora soro policlonal de ovelha anti-CD4 e soro anti-gpl20 (ARRRP) para inactivar o complemento. O anticorpo monoclonal neutralizante anti-VSV (I1) foi um fluido ascitico de ratinho. As neutralizações foram efectuadas da seguinte forma. Misturou-se virus VSVAG-CC4 (1 ml derivado de ~106 células BHK infectadas) com 100 μΐ de anti-CD4 ou 100 μΐ de anti-VSV durante uma hora a 37°C e seguidamente adicionou-se a mistura a ~106 células Jurkat que tinham sido infectadas com uma MOI de 0,01 de VIH-1 IIIB cinco dias antes. Alternativamente, adicionou-se 100 μΐ de soro anti-gpl20 directamente a 1 ml de células Jurkat infectadas com VIH durante uma hora a 37°C. Seguidamente, adicionou-se 1 ml de VSVAG-CC4 às células. Após 3 dias, sedimentaram-se as células a 1000 rpm numa centrífuga clínica durante 5 minutos e lavaram-se uma vez com PBS. Fixaram-se as células e coraram-se para detectar antigénios de VIH e de proteína N de VSV.
Resultados
Recuperação de VSV recombinantes que expressam CD4 e CXCR4. A manipulação genética de vírus de ARN não segmentado de cadeia negativa, tais como VSV, é complicada pelo facto da unidade infecciosa mínima do vírus não ser ARN, mas sim o genoma de ARN virai num complexo de ribonucleoproteína composto de proteínas de nucleocápside (N) e polimerase (L e P) . Os vsv infecciosos podem ser recuperados a partir de adn plasmídico da seguinte forma. Quatro plasmídeos independentes que expressam o ARN de VSV antigenómico completo e os genes N, P e L sob controlo de promotores de bacteriófago T7 são transfectados para células já infectadas com um vírus vaccinia recombinante que expressa ARN-polimerase de T7 (vTF7-3). A montagem intracelular do ARN antigenómico em nucleocápsides é seguida por replicação e transcrição de VSV para gerar VSV infeccioso, competente para replicação (Fuerst et al., 1986; Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995). Os genes adicionais podem ser expressos a partir de unidades de transcrição extra introduzidas no genoma de VSV (Schnell et al., 1996a). A construção de um VSV recombinante que expressa a proteína CD4 além das cinco proteínas de VSV N, P, M, G e L foi previamente relatada (Schnell et al., 1996b). Para gerar 15 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ um recombinante que expressa CD4 e CXCR4 em vez de G de VSV, eliminou-se o gene V de VSV a montante da construção VSVCD4 (Figura 1). A recuperação do vírus, denominado VSVAG-CD4, foi então conseguida por inclusão de um plasmideo de complementação que codifica a proteína G de VSV além dos que codificam N, P e L. Foi seguidamente adicionado o gene que codifica CXCR4 na posição a jusante de CD4 e recuperou-se o vírus denominado VSVAG-CC4. Dado que os vírus recuperados são capazes apenas de um único ciclo de infecção em células BHK, eles foram inicialmente recuperados e cultivados em células infectadas com um vírus vaccinia que codifica ARN-polimerase de T7 e que expressa transitoriamente uma proteína G de VSV de complementação a partir de um plasmideo de ADN transfectado.
Uma linha celular que expressa proteína G de VSV permite o crescimento dos vírus deficientes. De modo a cultivar os vírus VSVÚG-CD4 e VSVhG-CC4 na ausência de vírus vaccinia, gerou-se uma linha celular BHK que expressa a proteína G de VSV a partir de um promotor indutível (Shockett et al., 1995). A Figura 2 demonstra que o vírus VSVAG-CC4 forma placas nesta linha celular indicando ciclos de infecção múltiplos. Os títulos obtidos após cultura dos vírus deficientes nesta linha encontravam-se na gama de 0,5-1 x 106 pfu/ml. Estes títulos são reduzidos pelo menos 1000 vezes comparativamente aos de VSV de tipo selvagem, presumivelmente devido aos níveis de proteína G proporcionada pela linha celular de complementação serem baixos comparativamente aos expressos em infecção de tipo selvagem.
Incorporação de CD4 e CXCR4 nos vírus recombinantes. Para determinar se as moléculas CD4 e CXCR4 foram expressas a partir dos vírus deficientes e incorporadas em partículas virais, infectaram-se células BHK (que não expressam G de VSV) com VSVAG-CD4 ou VSVAG-CC4 que tinham sido cultivados na linha BHK-G (MOI = 5). Após 16 horas, quando todas as células tinham sido mortas, purificaram-se as partículas de vírus do meio. Separaram-se então as proteínas virais por SDS-PAGE e detectaram-se por coloração com azul de Coomassie. O vírus de tipo selvagem contém as proteínas L, G, N e Μ (P é uma proteína minoritária que co-migra com N) enquanto que os vírus VSVÚG-CD4 e VSVAG-CC4 são isentos de G mas contêm uma nova proteína de cerca de 55 000 dalton, o tamanho esperado para 16 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ CD4. A presença de CD4 nas partículas foi também verificada por hibridação de Western com anticorpo anti-CD4 de ovelha ou anticorpo monoclonal 12CA5 para o marcador epitópico HA em CXCR4. A proteína CXCR4 não foi detectada em VSVAG-CC4 por coloração, talvez porque contém sete segmentos transmembranares que não se ligam ao corante, mas foi facilmente detectada por hibridação de Western.
Sabe-se que gemulação de vsv na ausência de proteína G de VSV é aproximadamente 20 vezes menos eficaz do que a gemulação na sua presença (Knipe et al., 1977). Obtiveram-se resultados semelhantes para vírus da raiva (Mebatsion et al., 1996). Embora as quantidades de proteína detectada por coloração com azul de Coomassie pareçam semelhantes para todos os vírus, os vírus carregados nas pistas de ensaio eram derivados de 107 células BHK infectadas, enquanto que o vírus de tipo selvagem na pista de controlo eram de apenas 2 x 105, ou seja 50 vezes menos células infectadas para obter uma coloração semelhante. Os resultados não só confirmam a importância da proteína G de VSV em promover formação altamente eficaz gemulação de vírus, mas também ilustram que ocorrem quantidades significativos de produção de vírus mesmo na ausência de proteína G de VSV.
Para examinar a morfologia das partículas de vírus recombinante e para verificar que CD4 se encontrava exposta na membrana virai, examinaram-se partículas de vírus purificadas por microscopia electrónica após marcação com anticorpo contra CD4 e um anticorpo secundário conjugado com ouro. Apresentam-se fotografias de partículas de vírus coradas negativamente na Figura 3. As partículas de VSV de tipo selvagem continham espigões de proteína G visíveis (setas) e não ligavam o anticorpo contra CD4, enquanto que os vírus VSVAG-CD4 ou VSVAG-CC4 não apresentavam espigões visíveis e ligavam anticorpos anti-CD4. O anticorpo contra CXCR4 utilizado em hibridação de Western reconhece o marcador HA no terminal C interno em CXCR4 e consequentemente não é adequado para marcação de partículas de vírus.
Infecção de células infectadas com VIH-1 por VSVAG-CC4. Dado que as células infectadas com VIH-1 apresentam a proteína de envelope gp 120/41 na sua superfície, pode ser possível 17 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ infectar estas células com VSVAG-CC4. As moléculas gp 120/41 presentes na superfície celular devem ligar-se a CD4 e CXCR4 na superfície do virus e promover fusão das membranas do virus e da célula. Para ensaiar esta possibilidade, infectou-se uma linha de células T humanas (Jurkat) com VIH-1 IIIB. Cinco dias após a infecção esperava-se, a partir de experiências anteriores, que cerca de metade das células estariam infectadas com VIH-1 e adicionou-se virus VSVAG-CC4. Seguiram-se em paralelo duas culturas de controlo, uma infectada só com VIH-1 e outra infectada só com VSVAG-CC4.
Inicialmente seguiu-se a infecção com VIH-1 e VSVAG-CC4 utilizando microscopia de imunofluorescência indirecta para detectar proteínas de VIH-1 e proteína de nucleocápside de VSV (N). Apresenta-se na Figura 4 um exemplo de resultados de análise de imunofluorescência 19 dias após infecção com VIH, conjuntamente com uma imagem de Nomarski do mesmo campo de células. Na Figura 5 apresenta-se um gráfico com uma compilação dos dados de imunofluorescência obtidos ao longo da experiência. Os campos apresentados na Figura 4 ilustram que na cultura de controlo infectada só com VIH-1 quase todas as células coraram positivamente para antigénios de VIH (A e B), enquanto que nenhuma das células corou positivamente para proteína N de VSV (C) . Nas células infectadas com VIH-1 e VSVAG-CC4, apenas uma pequena fracção das células foram positivas para antigénios de VIH-1 (D e E) e a maioria dessas células foram também positivas para proteína N de VSV (F), indicando que tinham sido super-infectadas com VSVAG-CC4. Também se verificou que as poucas células que eram fortemente positivas para expressão de proteína N de VSV, não apresentavam ou apresentavam pouca proteína de VIH. Estas células podem resultar do cancelamento de síntese de proteínas celular e de VIH por VSVAG-CC4 ou por outros mecanismos de infecção (consultar Discussão adiante). Em células Jurkat infectadas só com VSVAG-CC4, nenhuma das células evidenciou presença de antigénios de VIH ou de N de VSV (Η, I e J).
Da quantificação na Figura 5 é evidente que quando as células foram infectadas só com VIH-1, a percentagem de células VIH-1+ aumentou para quase 100% e manteve-se alta ao longo da experiência. Quando as células foram primeiro infectadas com VIH-1 e subsequentemente infectadas com VSVAG- 18 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ CC4, a percentagem de células VIH+ começou a diminuir ao dia 14 e atingiu um patamar ao dia 21, a níveis entre 5 e 10% de VIH+. Além disso, a Figura 5 demonstra que a percentagem de células VIH-1+ que também foram infectadas por VSVAG-CC4 aumentou e então atingiu um patamar a cerca de 90-95%. Assim, parece que as células infectadas com VIH-1 são super-infectadas rapidamente com VSVAG-CC4 e mortas antes de poderem ser libertados níveis elevados de VIH-1. Atinge-se assim um equilíbrio entre os dois vírus, em que a infecção por VIH é controlada pela infecção por VSVAG-CC4 e mantida a níveis reduzidos. Obtiveram-se resultados muito semelhantes numa experiência efectuada com a linha de células T H9, outra linha celular em que VIH-1 IIIB cresce bem.
Foi também ensaiada a possibilidade do vírus VSVAG-CD4 isento do gene de co-receptor poder infectar células infectadas com VIH-1. Numa experiência, verificou-se que ocorreu um baixo nível de infecção por VSVAG-CD4 (cerca de 10% do verificado com VSVAG-CC4). No entanto, a infecção inicial pôde ser completamente neutralizada com anticorpo para G de VSV, indicando que deve ter estado presente nos viriões uma quantidade vestigiária de proteína G suficiente para iniciar infecção. Esta proteína G foi presumivelmente transportada para a linha celular de BHK pelo vírus de entrada cultivado na linha BHK-G e seguidamente incorporado nos viriões de saída. Curiosamente, uma vez estabelecida a infecção em células Jurkat infectadas por vih, esta persistiu durante várias semanas, indicando que o vírus pôde propagar sem codificar o seu próprio co-receptor. Presumivelmente, os viriões protuberantes podem captar o co-receptor codificado pela célula e ficam então aptos a propagar. Contudo, o controlo da infecção por VIH-1 não foi tão forte como com VSVAG-CC4, indicando que é preferível que o vírus codifique níveis elevados de co-receptor. Dado que o controlo da infecção por VIH foi menos eficaz sem co-receptor, não se efectuaram estudos adicionais com este vírus. A infecção por VSVAG-CC4 controla a libertação de VIH-1 infeccioso. Para obter medições dos efeitos de VSVAG-CC4 na produção de VIH-1 infeccioso e na libertação de partículas de VIH-1, repetiram-se as experiências apresentadas nas Figuras 4 e 5, mas seguiram-se os títulos de VIH-1 e libertação de 19 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ transcriptase inversa (RT) para o meio (Figuras 6A e 6B) . Na altura da adição de VSVAG-CC4, três dias depois de infecção com VIH-1, os titulos de VIH e os niveis de RT no meio eram baixos. Nas células de controlo infectadas só com vih-1 ou nas células super-infectadas com VSVAG-CC4, tanto os titulos de VIH, como a actividade de RT apresentaram um máximo dez dias após infecção. Verificou-se então uma diminuição da actividade de RT no dia 14 em células super-inf ectadas com VSVAG-CC4 e uma diminuição para um nivel estável de cerca de 10% do nível de RT verificado nas células de controlo. Os resultados com títulos de VIH-1 infeccioso foram muito mais drásticos, com um desaparecimento completo de VIH-1 infeccioso (> 4 unidades logarítmicas inferior ao controlo) ao dia 14 seguido por uma flutuação a níveis de apenas 0-39 partículas infecciosas por mililitro até ao dia 34. Estes títulos devem ser comparados com títulos persistentes de ~104/ml para a cultura de controlo que não foi infectada com VSVAG-CC4.
Os resultados de RT foram consistentes com o que se tinha verificado previamente por imunofluorescência na Figura 5, mas as muito maiores diminuições nos títulos de VIH infeccioso não eram esperadas. Estes títulos mais baixos poderiam ser explicados se a infecção por VSVAG-CC4 seleccionasse células infectadas com VIH que expressam pouco ou nenhum envelope de VIH e assim produzissem partículas de VIH sem envelope mas contendo RT.
Anti-CD4 ou anti-qpl20 bloqueiam a infecção por VSVAG-CC4. Foram também efectuadas experiências de neutralização de controlo (Tabela 1) para verificar que a entrada de VSVAG-CC4 em células infectadas por VIH era dependente de CD4 e gpl20. Incubou-se VSVAG-CC4 com anticorpo para CD4, anticorpo de neutralização para VSV-G ou sem anticorpo, antes de adição a células Jurkat que tinham sido infectadas com VIH-1 durante cinco dias, tal como na Figura 5. A tabela 1 demonstra que anti-CD4 eliminou completamente a infecção por VSVAG-CC4, enquanto que o anticorpo contra G não o fez. 20 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ
Tabela 1. Neutralização de infectividade de VSVAG-CC4 Anticorpoa % de células VIH+ b % de células N de VSV+ b Nenhum 60 39 anti-G de VSV 59 37 anti-CD4 74 0 anti-gp 120 de VIH 71 0 a Os vírus crescidos em células BHK que não expressam G de VSV foram incubados com anti-G de VSV ou anti-CD4, ou as células foram incubadas com anti-gpl20 de VIH antes da mistura dos vírus com as células. b As células positivas para VIH e N de VSV+ foram identificadas por microscopia de imunofluorescência indirecta tal como nas Figuras 4 e 5. Contaram-se aproximadamente 100 células de campos aleatórios para cada determinação. Indica-se a percentagem de células positivas para antigénios de VIH ou para proteína N de VSV.
De igual modo, a pré-incubação de células infectadas por VIH com um anticorpo anti-gpl20 policlonal evitou completamente a infecção por vsvag-CC4. Dado que CD4 pode ligar MHC de classe II às superfícies celulares (Doyle e Strominger, 1987), era possível que pudesse ocorrer algum nível de infecção baixo após ligação de VSVAG-CC4 a MHC de classe II nas células, embora tal não fosse esperado sem uma proteína de fusão membranar. Para ensaiar esta possibilidade utilizaram-se células Daudi, uma linha celular de linfócitos que se sabe que expressa quantidades abundantes de proteína de MHC de classe II (Till et ai., 1988). Estas células foram facilmente infectadas por VSV de tipo selvagem, mas não se verificou qualquer infecção por VSVAG-CC4.
Discussão
Construiu-se um VSV recombinante que não contém o seu próprio gene de proteína de envelope (G) e expressa em substituição o receptor de VIH-1 e moléculas co-receptoras, CD4 e CXCR4. Este novo vírus é deficiente para entrada em células normais, mas pode ser propagado em células que expressam uma proteína de envelope de VSV de complementação. O vírus complementado pode então ser cultivado em células que 21 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ não expressam proteína G onde provoca a gemulação de partículas contendo CD4 e CXCR4 na membrana virai. Estes vírus são competentes para replicação, mas só podem entrar e propagar-se em células que são primeiro infectadas com VIH-1 e expressam proteína de envelope de VIH-1. A infecção destas células por VSVAG-CC4 é neutralizada por anticorpo contra CD4 adicionado ao vírus ou por anticorpo contra gpl20 de VIH adicionado às células.
Os resultados demonstraram que numa população mista de células em que cerca metade estavam infectadas com VIH-1 e metade não estavam infectadas, a super-infecção com VSVAG-CC4 em última análise limitou a produção de VIH-1 infeccioso a níveis que eram dificilmente detectáveis ou indetectáveis, pelo menos 300 a 104 vezes inferiores aos títulos de VIH produzidos por células de controlo que não estavam super-infectadas com VSVAG-CC4. Esta redução presumivelmente é resultado da morte das células infectadas com VIH-1 pelo vírus VSVAG-CC4. A redução nos títulos de vih-1 foi superior ao que seria de esperar por análise do número de células infectadas com VIH-1 ou de ensaios à RT. O número de células positivas para VIH foi diminuído cerca de dez vezes pela infecção com VSVAG-CC4 e a libertação de RT foi reduzida numa extensão semelhante. Considerando o mecanismo de acção de VSVAG-CC4, esta discrepância é razoável dado que VSVAG-CC4 dirigir-se-á e matará as células que expressam proteína de envelope de VIH e assim selecciona células que produzem pouco ou nenhum envelope de VIH. Tais células ainda se classificam positivamente para produção de antigénio de VIH-1 e produziriam níveis normais de partículas do tipo VIH contendo RT, mas a maioria destas partículas seria não infecciosa. A persistência de um nivel baixo de co-infecção com VIH-1 e VSVAG-CC4 por mais de um mês em cultura indica que ambos os vírus continuam a replicar e que atingiram um equilíbrio. Com base nos dados, parece pouco provável que VSVAG-CC4 consiga alguma vez eliminar completamente a infecção por VIH-1 na cultura. Este baixo nível de persistência pode ocorrer porque VSVAG-CC4 só pode infectar células infectadas com VIH-1 após expressão de gpl20/41 na superfície celular e tais células provavelmente libertam algum VIH-1 antes de serem mortas. 22 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ Ο vírus VSVAG-CC4 infecta células que foram já infectadas com VIH-1, mas também se pode estar a fundir directamente com viriões de VIH-1. Estes vírus fundidos conteriam as nucleocápsides de vih e vsv e seriam capazes de iniciar infecção se ainda estivesse presente na membrana gpl20/41 suficiente. Tal infecção favoreceria provavelmente a replicação de VSV7\G-CC4 porque VSV cancelaria a síntese proteica celular em 2-3 horas, mesmo antes de VIH ter tempo suficiente para transcrição inversa e integração. A infecção por estes vírus fundidos poderia explicar a presença de células (Figura 4) que produzem proteínas VSV mas que não parecem ter sintetizado proteínas VIH. Embora não querendo restrições teóricas, é também possível que VSV tenha inibido a síntese de proteínas VIH nestas células. A infecção de células não infectadas por VSVAG-CC4 pode também ocorrer caso se tenham gerado pseudotipos VSVAG-CC4 portadores de proteína de envelope de VIH em células infectadas com VIH. A incorporação do envelope de VIH de tipo selvagem em partículas VSV é extremamente ineficaz (Johnson et al., 1997) e consequentemente este último mecanismo seria provavelmente raro. Para ensaiar directamente tais pseudotipos, efectuou-se uma infecção a curto prazo de células Jurkat com sobrenadantes de células co-infectadas com VIH-1 e VSVAG-CC4. Não se detectou expressão de proteínas de VSV nestas células, enquanto que foi facilmente detectada por utilização do mesmo sobrenadante para infectar células Jurkat infectadas com VIH. Concluiu-se que os pseudotipos VSVAG-CC4(vih) são extremamente raros, se é que existem.
Existem vários aspectos deste sistema que são de realçar. Primeiro, dado que VSVAG-CC4 tem como alvo especificamente células já infectadas com VIH-1, será de esperar que o nível de infecção de VSAG-CC4 seja paralelo à infecção com VIH e desapareça com a depuração do VIH. Segundo, VSVAG-CC4 codifica apenas proteínas humanas como suas proteínas de envelope e assim não induz produção de anticorpos neutralizantes. Será de esperar que as proteínas de VSV internas induzam respostas de células T citotóxicas, mas tais respostas podem ajudar ao desaparecimento da infecção pelo VIH matando rapidamente células infectadas com VIH-1 e VSVAG-CC4. Em terceiro lugar, as mutações de resistência a fármacos são seleccionadas rapidamente em VIH-1, mas a resistência a infecção com VSVáG- 23 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ CC4 necessitaria de perda da capacidade do VIH ligar CD4 ou co-receptor e assim não seria seleccionada.
Os resultados ilustram também um aspecto importante de formação de gemulação e montagem de VSV. Com base nos rendimentos e titulos de proteina de virus, estima-se que cada célula BHK infectada com VSV de tipo selvagem produza aproximadamente 100 000 partículas e até 10% destas partículas são infecciosas. A deleção do gene G de VSV reduziu os rendimentos de partículas de VSVAG-CC4 ou VSVAG-CD4 aproximadamente 30-50 vezes, indicando um papel substancial para G na promoção de gemulação. Contudo, apesar desta reduzida gemulação, pelo menos 2000 partículas de VSVAG-CC4 ou VSVAG-CD4 são produzidas a partir de cada célula BHK na ausência de proteina G. Presume-se que ocorra incorporação de CD4 e CXCR4 nestas partículas por um processo passivo de captura de proteína, quando o vírus gemula na superfície celular, dado que não é de esperar que nenhuma das proteínas contenha sinais específicos que promovam a incorporação. Dado que o VSV bloqueia a síntese de proteína no hospedeiro e expressa quantidades extremamente elevadas do seu ARNm e proteínas, é provável que CD4 e CXCR4 sejam as principais proteínas presentes na superfície celular e consequentemente as principais proteínas no envelope de VSVAG-CC4.
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Matthias Schnell Erik Johnson
Revestimentos (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Rabdovírus com
Remanipulados (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Yale School of Medicine (B) RUA: 310 Cedar Street Street (C) CIDADE: New Haven (D) ESTADO: Connecticut (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 06510 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete de 3,5" 1,44 Mb
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(A) DESCRIÇÃO: ADN (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: iniciador utilizado em construções (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: 30 ΕΡ 1 012 244/ΡΤ GGGCCCCTCG AGCGTGATAT CTGTTAGTTT TTTTCATACT 40 CAAATGGGGC TACATGTCTT C 61
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Yale University
<120> RABDOVÍRUS COM REVESTIMENTOS REMANIPULADOS
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<210> 4 <211> 61 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador < 4 0 0 > 4 gggcccctog agcgtgatat ctgttagttt ttttcatact caaatggggc tacatgtctt 60 c 61
Lisboa,
Claims (12)
- ΕΡ 1 012 244/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Vírus de estomatite vesicular ("VSV") recombinante competente para replicação que não apresenta um gene de glicoproteína G de rabdovírus funcional e cujo genoma codifica pelo menos um polipéptido membranar estranho, de modo que o polipéptido membranar estranho é expresso no envelope virai do referido VSV recombinante.
- 2. VSV recombinante de acordo com a reivindicação 1 em que um dos pelo menos um polipéptido membranar estranho é um receptor celular de outro vírus, que é expresso no VSV de uma forma suficiente para ter como alvo células infectadas com o outro vírus.
- 3. VSV recombinante de acordo com a reivindicação 1 em que o pelo menos um polipéptido membranar estranho é pelo menos um receptor celular de um vírus de mamífero patogénico.
- 4. VSV recombinante de acordo com a reivindicação 3 em que o vírus de mamífero patogénico é VIH-1 ou VIH-2.
- 5. VSV recombinante de acordo com a reivindicação 4 em que o vírus de mamífero patogénico é VIH-1.
- 6. VSV recombinante de acordo com a reivindicação 4 que expressa no seu envelope virai pelo menos um receptor de vih, pelo menos um co-receptor de VIH, ou suas misturas.
- 7. VSV recombinante de acordo com a reivindicação 3 cujo genoma codifica CD4 e CXCR4.
- 8. VSV recombinante de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que o gene de glicoproteína G é substituído por pelo menos um gene que codifica o referido pelo menos um polipéptido membranar estranho.
- 9. VSV recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-8, para utilização no tratamento de um doente infectado com um vírus de mamífero patogénico, em que o VSV recombinante expressa no seu envelope virai pelo menos um ΕΡ 1 012 244/ΡΤ 2/2 receptor do vírus de mamífero patogénico, de modo a ter como alvo as células do doente portadores do vírus.
- 10. vsv recombinante de acordo com a reivindicação 9 em que o doente está infectado com VIH-1 ou VIH-2.
- 11. Utilização de um VSV recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-8 no fabrico de um medicamento para tratar um doente infectado com um vírus de mamífero patogénico, em que o VSV recombinante expressa no seu envelope virai o referido pelo menos um receptor do vírus de mamífero patogénico, de modo a ter como alvo as células do doente portadoras do vírus.
- 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11 em que o doente está infectado com VIH-1 ou VIH-2. Lisboa,
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