JPH05508320A - Ｈｉｖパッケージング配列を含むベクター、パッケージング不全ｈｉｖベクター及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶパッケージング　を　むベクター　パッケージング為　ＨＩＶベ　−びの 本発明は、パッケージ不全ＨＩＶプロウィルスを含むベクターと、ＨＩＶパッケ ージ配列及び移入されるべき遺伝子を含むベクターと、）（ＩＶバッゲージ不不 全細糸系製造するためのパッケージ不全ベクターの使用と、前記ベクター及び細 胞系の使用とに係わる。最も好ましくは、ＨＩＶプロウィルスはＨＩＶ−１プロ ウイルスである。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ、ＬＡＶまたＧ！Ｈ ＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ／ＬＡＶとも称されル）ハ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ Ｓ）及び関連疾患の病因物質である（Ｂａｒｒｅ−８ｉｎｏｕｓｓｉ　ｅｔ　ａ ｌ、。

Ｓ　ｃ　ｉ　ｅ　ｎ　ｃ　ｅ　１１工：　８６８−８７１　（１９８３）　；　 Ｇａ１ｌｏ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４＋５００−５０３（１９８ ４）；Ｌｅｖｙ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：８４０−８４２（１ ９８４）；Ｐｏｐ。

ｖｉａ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：４９７−５００（１９８４） ；　Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ　ｅｔａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２４＋５０ ６−５０８（１９８４）；Ｓｉｅｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎ、Ｅｎ　１．Ｊ。

Ｍｅｄ、３０５　：１４３９−１４４４（１９８１））、この疾患は、長期の無 症状期間の後に免疫系及び中枢神経系が次第に変性することを特徴とする。ウィ ルス研究によって、複製は高度に調節され、組織培養においてＴリンパ球のＣＤ ４陽性ヘルパーサブセツトの潜伏感染及び溶菌感染の両方が生じることが示され ている［：Ｚａｇｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：８５０−８ ５３（１９８６）〕、更に感染患者におけるウィルス発現は、免疫応答の回避を 可能とするように調節されるらしい、ＨＩＶ−Ｉの調節及びゲノム編成の分子研 究は、それが多数の遺伝子をコードすることを示している（Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３−上、ｉ：　２７７−２８４（１９８５）；５ａｎ ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｓｃ　ｉ　ｅ　ｎ　ｃ　ｅ　ｌｌ ｌ：　４８４−４９２　（１９８５）　；　Ｍ　ｕｅｓｔｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４５０−４５７（１９８５）；Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ 　ｅｔａｌ、、Ｃｅ１ｌ　土０　：　９−１７（１９８５＞）。

他の霊長目免疫不全ウィルスＨＩＶ−２及びサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）も 、ｍ、Ｐ二９」工、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ及びｎｅｆといった同じ構造及び調 節遺伝子の多くを有している（Ｇｕｙａｄｅｒ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕ ｒｅ　３２６：６６２−６６９（１９８７）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、Ｌ、、 ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３２８　：　５４３−５４７（１９８７＞、これら の文献は参照により本明細書の一部を構成するものとする〕。

レトロウィルスは典型的には、３つの亜族、即ちオンコウイルス（ｏｎｃｏｖｉ ｒｕｓｅｓ）、スプーマウイルス（Ｓｐｕｍａｖｉ　ｒｕｓｅｓ）及びレンチウ ィルス（ｌｅｎｔｔｖｉｒｕｓｅｓ）のいずれかに属するものと分類される。

オンコウイルスによる感染は典型的には悪性疾患に関係する。かかるウィルスは 典型的には、ｍ、と立ユ及び二１ヱ遺伝子を含む約ｓ、ｏｏｏ〜１０．０００ヌ クレオチドの（＋）鎖ＲＮＡゲノムと、末端繰返し配列（ＬＴＲ）とを含む一重 頒を有する。オンコウイルスは一般に腫瘍遺伝子を含む、一般に、スプーマウイ ルスはＬｎ　ｖｉｖｏで病原性ではないが、組織培養において泡沫状細胞変性を 誘導すると考えられている。レンチウィルスによる感染は通常は緩慢であり、長 期の潜伏期間の後に慢性衰弱性疾患を惹起する。これらのウィルスは、Ｌ且１、 Ｌ立ユ及びｅｎｖ遺伝子のほかに、調節機能を有する多数の他の遺伝子をも有す る。

ヒト免疫不全遺伝子（ＨＩＶ）は、やはりゆっくりと感染し、レンチウィルスと 共通の構造特性を有するが故に、レンチウィルスと分類されている（Ｈａｓｓｅ 、Ａ、Ｔ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３２ユニ　１３０−１３６（１９８６）参照〕。

全ての既知のレトロウィルスは、ウィルスＲＮＡのとりオン中へのパッケージン グ、ターゲット細胞への侵入、ＤＮＡプロウィルスを形成するためのウィルスＲ ＮＡの逆転写、及びターゲット細胞ゲノムへのプロウィルスの安定な組込みを含 む複製サイクルの特性を有する（Ｃｏｆｆｉｎ。

Ｊ、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉ　ｒｏ　１．生ユニ１−２６（１９７９）〕、複製コン ピテントプロウィルスは少なくとも、調節ＬＴＲと、コアタンパク質、プロテア ーゼ、逆転写酵素／ＲＮａｓｅＨ／インテグラーゼ及びエンベロープ糖タンパク 質をそれぞれコードするＬ立１、Ｌ二旦、ＪＬＱ−ユ及びｅｎｖ遺伝子とを含む （Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｔ　ｒｏ　１．４２゜土掻）、ＬＴＲは、組込み、転写及びポ リアデニル化に重要なｃｉｓ作用配列を含む。

ＨｒＶは、ｍ、ｐｒｏ、Ｌ立ユ及びｅｎｖ遺伝子をそれぞれ他のレトロウィルス と同様に有する［Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｗ、Ａ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｃ 　ｕｆｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃ　Ｓ　ｎｄｒｏｍｅ　１：２ １７−２４０（１９８８））、ＨＩＶは更に、ウィルス複製を調節する遺伝子も 有する。ＨＩＶ−１ゲノムはｖｉ　ｆ、　ＬＬ工、１立ユ、ｒｅｖ、ｕ及び旦１ エタンバク質をコードする（Ｈａｓｅ　ｌ　ｔ　ｉ　ｎｅ、Ｗ。

Ａ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉ ｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、土掻〕、更に、ＨＩＶのＬＴＲは、組込み、転写 及びポリアデニル化に重要なｃｉｓ作用配列を含む、他のｃｉｓ作用シグナルは 、新規のＨＩＶ遺伝子産物の幾つかによるＨＩＶ配列の調節を行なう（Ｈａｓ　 ｅ　ｌ　ｔ　ｉ　ｎｅ、Ｗ、Ａ、、Ｊ。

ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　 Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、土掻；５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３１：１５４９−１５５３（１９８６）：Ａｒｙａ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２９：６９−７３（１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：ｔ７１−１７３（１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅ ｔ　ａｔ、。

ｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　生６　：　８０７−８１７（１９８６ ）；Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｔ　ｅｔ　ａｌ、。

ＡＩＤＳ二Ｒｅｓ、＋口しＬニレ」口、ＨＲｅｔユニユニｒｕｓｅｓ　３：３３ −３９（１９８７）、これらの文献（よ全て参照により本明細書の一部を構成す るものとする〕。

５°主要スプライス供与部位とｆｆｌ遺伝子開始コドンの間の領域は、これまで に配列決定された種々のＨＩＶ−１株においては高度に保存されている（Ｍｙｅ ｒｓ、Ｇ、。

ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｌ。

ａｎ圭一旦土ユ１上上ユユエユ、（１９８８））。

上記遺伝子のほとんどは、ウィルス生活側こ必要な産物をコードしている０例え ばｔａｔ遺伝子番よ、ＨＩＶ複製及び遺伝子発現に不可欠な１４ｋＤのタンｌ＜ り質をコードしている（Ｒｏｓｅｎ、Ｃ，Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒ　ｅ 　±＋　５５５−５５９　（１９８６）　；　Ｓ　ｏ　ｄ　ｒ　ｏ　ｓｋｉ、Ｊ 、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２ユニ１７１−１７３（１９８５）；Ａｒ ｙａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｓｃユｅｎｃｅ　２２９．土掻；５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ 　ａｔ。

、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９．土掻；及びＤａｙｔｏｎ、Ａ。

、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４４：９４１−４９７（１９８６）、これらの文献 は全て参照により本明細書の一部を構成するものとする〕、複製に必要な別の遺 伝子はｒｅｖ遺伝子である（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　 ３２１　：４１２−４１７（１９８６）、かかる文献は参照により本明細書の一 部を構成するものとする〕。

ある種のオンコウイルスにおいて、５′末端ＬＴＲとＸ１１遺伝子開始コドンの 間に位置する、ウィルスＲＮＡをピリオン中に効率的にパッケージするのに必要 なｃｉｓ作用配列が確認された（Ｂｅｎｄｅｒ、Ｍ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ　６１：１６３９−１４６４（１９８７）；Ｋａｔｚ、Ｒ，Ａ、、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒ立ユ　５９　：１６３−１６７（１９８６）；Ｍａｎｎ 、Ｒ，。

ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　Ｊ３：１５３−１５９（１９８３）；Ｐｕｇａｔｓｃ ｈ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒ。

１立工１１２８　：　５０５−５１１　（１９８３）　；　Ｗ　ａ　ｔ　ａｎａ ｂｅ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、７９　 ：　５９８６−５９９０（１９８３）；Ｅｇｌｔｔｉｓ、Ｍ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ 、、Ｂｉｏ　ＴｅＬ垣ｌ上ユユヱ」　旦：　６０８−６１４（１９８８＞、これ らの文献は参照により本明細書の一部を構成するものとする〕、上記配列のほか に、ｍ遺伝子と重なり合う配列が、Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスによる ウィルスＲＮＡのキャプシド色込み（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）の効率に寄 与することが判明した（Ａｄａｍ、Ｍ、Ａ、。

ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｔｒｏｌ　６２：３８０２−３８０６（１９８８）；Ｂｅ ｎｄｅｒ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ　６１：１６３９−１６４６（１９８７））、所定のレトロウィルス を使用して、真核細胞において上」−ｖｉｖｏ及びｆｎ　ｖｉｔｒｏで、ターゲ ット細糸のゲノム中に遺伝情報が安定に導入された（Ｃｏｒｎｅｔｔａ。

Ｋ、、Ｐｒｏ　ｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ１１立土旦１１　ｌ亙：　３１１−３２２（１ ９８９）；ＧｉＩｂｏａ、Ｅ、、ＢＬｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　４：５０４−５ １２（１９８６）；　Ｊｏｙｎｅｒ、Ａ、、Ｎａｔｕｒｅ３旦５　：　５５６− ５５８（１９８３）；Ｍａｎｎ、Ｒ，。

ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　Ｌ旦：１５ｊ−１５９（１９８３）〕、所望の遺伝子 及びパッケージ配列を含むベクターは、所定の細胞中に侵入し得るピリオンを生 成するパッケージシグナル欠失ウィルスによって取り込まれた。ピリオン粒子中 へのレンチウィルスＲ，ＮＡ（例えば）（ＩＶ　ＲＮＡ）のパッケージングに必 要なシグナルは同定されていない。

ＨＩ　Ｖ−１を理解することに多大な研究が費やされているが、このレトロウィ ルスの生活環は完全には理解されていない。

更に、かかるウィルスに対するワクチンを開発することにも多大な研究が当てら れているが、これまでに成功したという報告はない、これは、一部にはウィルス の抗原としての活性部位の保存の欠如のため、また一部にはウィルスタンパク質 の機能的に重要な領域及び／または失活ウィルス粒子が免疫原性に乏しいためで ある。

ＨＩＶ！Ｉ＋染個体を治療するために提案された多数の方法は、ＨＩＶ感染細胞 だけでなく非感染細胞にも影響を及ぼす。

従って、ＨＩＶタンパク質を産生ずるが、ウィルスＲＮＡがピリオン中にパッケ ージされないために致死性ではないプロウィルスを得ることは極めて有効である 。このバ・ソゲーシネ全（ｐａｃｋａｇｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）プロウィルス ベクターを使用すると、ウィルスのバ・ラゲージ機構を調査し、更にこのパッケ ージ機構を妨げる方法を開発するのに使用し得るパッケージ不全細胞系を生成す ることができる１重要なことには、このようなパッケージ無効プロウィルスによ って産生されるピリオンは、ワクチンに、また所望の遺伝子を哺乳動物細胞に効 率的に導入するための系として使用することができる。

ＨＩＶターゲット細胞を選択的に標的とし、そうして所望の産物をかかる細胞に 導入し得るベクターを入手し得ることも有効である。

ｉ肌五１１ 本発明者らは、機能的ＨＩＶ遺伝子産物を発現するＨＩｖゲノムに対応する十分 な数のヌクレオチド（ＨＩ　Ｖヌク的にパッケージするための５°主要スプライ ス供与部位とｍ遺伝子開始コドンの間のＨＩＶゲノムのヌクレオチドに対応する 十分な数のヌクレオチド（ＨＩＶ〕ｔ−７ゲ一ジ配列）は含まないベクターを見 い出した。このＨＩＶノｆ・ｙゲージ配列は、５′主要スプライス供与部位とＬ ｌＩ遺伝子開始コドンとの間の領域（ヌクレオチド３０１〜３１９）に対応して いるのが好ましい、この配列は、５°主要スプライス供与部位のすぐ下流で且つ ｍ開始コドンの１４塩基上流のセグメントに対応するのがより好ましい、１つの 実施態様においては、これは、配列ＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＧＣＧＧＡを 有する１９塩基のセグメントである。

このベクターを使用して、予め選択された細胞系を形質転換し、ＨＩＶパッケー ジ不全細胞系を得ることができる。

全体としてはＨＩ　Ｖ　ＬＬＩＬ、　Ｌ立ユ及びｅｎｖ産物を発現するのに必要 なＨＩＶヌクレオチドを含むが、各ベクター単独では、これら３種全ての産物を 発現するのに必要なＨＩＶヌクレオチドは含まない、少なくとも２つのベクター を使用して細胞系を形質転換するのが好ましい、更に各ベクターは、ＨＩＶ　Ｒ ＮＡを効率的にパッケージするための５゛主要スプライス供与部位とｍ遺伝子の 間のＨＩｖゲノムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドは含まない 、各ベクターは、ＨＩＶ遺伝子に対応するヌクレオチドの下流にＬＴＲ配列に対 応する配列を含まないのがより好ましい、各ベクターは異なるマーカー遺伝子を 含むのが好ましい、形質転換細胞系はＨＩＶピリオンを発現するが、ＨＩＶ　Ｒ ＮＡをかかるピリオン中にパッケージすることはできない、従ってかかるピリオ ンは、ワクチンとしてまたは所望の遺伝子産物をＨＩＶに感染し得る種々の細胞 系に移入する方法として、抗体を生産するのに使用することができる。

第２のベクターは、予め選択された遺伝子と、ＨＩＶＲＮＡをパッケージするた めのＨＩＶバッゲージ配列に対応する十分な数のヌクレオチド（ＨＩ　Ｖパッケ ージ配列）とを含んでおり、ＨＩＶバッゲージ配列によってパッケージされるべ き十分な数のＨＩＶＬＴＲヌクレオチド（ＨＩ　ＶＬＴＲ配列）に対応する配列 が両側にフランキング配置されており、ＨＩＶパッケージ配列及びＨＩＶＬＴＲ 配列は同じＨＩＶゲノムに対応している。このベクターをパッケージ不全ベクタ ーと一緒に使用して、予め選択された所望の遺伝子を移入することができる。或 いは、ベクターをＨＩＶ感染細胞に与え、産生されるｆ（ＩＶピリオンによって パッケージすることができる。ＨＩＶ感染細胞は個体中に存在し得る。ＨＩＶバ ッゲージ不全ベクターとヘルパーウィルスとしてのＨＩＶウィルスとを一緒に使 用する組合せも記載する。パッケージ配列は、５°主要スプライス供与部位から ■互１遺伝子の最も５”側部分内の部位腋での領域に位置している。

図面の簡単な説明 図１は、５′主要スプライス供与部位（ＳＤ）及び本発明の１つの実施態様を表 わすベクターｐＨＸＢ　Ｐｉにおける欠失部位を示す、５゛末端ＬＴＲからＬＬ Ｉ７Ｌ開始コドンまでのＨＩＶゲノムの概略図である。

図２ａ〜図２ｅは、本発明の種々の実施態様を表わすベクターの概略図である０ 図２ａはパッケージ不全ベクターＨＸＢΔＰ１である８図２ｂはパッケージ不全 ベクターＨＸＢΔＰ１Δｅｎｖである０図２０はパッケージ不全ベクターｐＳＶ Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｅｎｖ３−２である０図２ｄはパッケージ完全ベクターＨＶＢ＜５ Ｌ３−Ｎｅｏ）である、１１ｇ２ｅはパッケージ完全ベクターＨＶＢ（ＳＬ３− Ｎｅｏ）である。

図３は、２つのパッケージ不全ベクターＨＸＢΔＰ１Δｅｒ＋ｖ及びｐｓＶＩ　 Ｉ　Ｉ　ｅｎｖ３−２を示す、１つの好ましい実施態様の概略図である。

図４は、本発明の種々の実施態様を表わすベクターに感染させたＪｕｒｋａｔ細 胞の培養におけるＰ２４レベルを示すグラフである。

図５ａは、ｐＨＸＢΔＰ１を用いてトランスフェクトしたｃｏｓ−ｉ細胞由来の ｉｓＳ標識ウィつスタンパク質を、ＡＩＤＳ患者血清を用いて免疫沈降したオー トラジオグラムである。

図５ｂは、正常ＨＩＶ−１形態のピリオン粒子を示す、ｐＨＸＢΔＰＩを用いて トランスフェクトしたＣＯ３−１細胞の電子顕微鏡写真である。

図６は、トランスフェクトまたは疑似トランスフェクトしたＣＯ５−１細胞由来 の上清に暴露したＪｕｒｋａｔＴ細砲溶解物ま細糸上清由来の標識ウィルスタン パク質の免疫沈降のオートラジオグラムである。

図７は、ＲＮＡドツトプロットテストである。

図８は、Ｇ４１８耐性ＪｕｒｋａｔＪＩ胞の全ＤＮＡのサザンプロットを示すオ ートラジオグラムである。

の　を 本発明者らは、ＨＩＶパッケージ不全不全へクター及び細胞系を製造し得ること を見い出した６本発明者らは、Ｈ１Ｖウィルスにおける５°主要スプライス供与 部位とＬＸ遺伝子開始コドンとの間の領域が、）（ＩＶ　ＲＮＡをピリオン中に パッケージするのに必要な配列を含むことを見い出した。所望のＨＩＶ産物を発 現するＨＩＶゲノム由来Ａを効率的にパッケージするための５”主要スプライス 供与部位とｍ遺伝子開始コドンの間の領域に対応する十分な数のヌクレオチド（ ＨＩ　Ｖバラゲージ配列）には対応しないヌクレオチド配列を含む、パッケージ 不全ＨＩＶプロウィルスを含むベクターを製造することができる。

上記配列は、ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２及びサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ＞のゲ ノムに対応しているのが好ましい〔Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ 　３１３．土掻；５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２７．土掻；Ｍｕｅｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｅｒ　３１３ ．土掻；Ｖａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１．ｌ　土旦、土掻；Ｇ ｕｙａｄｅｒ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａ　ｕｅｒ　１λ互、土掻（１９８７）： Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｅｒ　３２８．土掻（１９８ ７）；及びＨｉｒｓｃｈ。

Ｖ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４９：３０７−３１９（１９８７）、これらの 文献は全て参照により本明細書の一部を構成するものとする〕。

対応するなる表現は、実質的な変更を含まない（ｃ　ｏ　ｎｓ　ｅ　ｒｖａｔ　 ｉ　ｖｅ）付加、欠失及び置換が許されることを意味する。

ベクターは、５′主要スプライス供与部位のすぐ下流で且つｍ遺伝子開始コドン のちょうど上流にあるセグメントに対応するＨＩＶパッケージ配列を含まないの が好ましい、典型的にはベクターは、ｍ開始コドンの約１４塩基上流から２塩基 上流に広がるヌクレオチド（例えば上流の１４塩基または上流の５塩基）を含み 得るが、それでも尚パッケージ不全性である。１つの実施態様においては、ベク ターは、５゛主要スプライス供与部位の約９塩基下流から始まりｍ開始コドンの 約１４塩基上流まで続くヌクレオチド配列を含まない、除外される必要のある塩 基の数は大幅に変えることができ、ＨＩＶ−１における１９塩基対の欠失、即ち ＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＧＣＧＧＡの欠失（ヌクレオチド３０１〜３１９ ）は、パッケージ能力の損失をもたらすのに十分である。しかしながら、この領 域におけるより小さい欠失でもパッケージ効率の損失をもたらし得る。実際、こ の領域における約５塩基対はどの小さな欠失がパッケージ能力を排除し得ること が推定される。従って特定の欠失のサイズは、本明細書に基づいて当業者には容 易に決定され得る。

ベクターは、機能的ＨＩＶ遺伝子産物を発現するＨＩＶゲノムのヌクレオチドに 対応する十分な数のヌクレオチドを含むＨＩＶヌクレオチドセグメントを含むべ きであるが、上述したように、ウィルスＲＮＡをピリオン中に効率的にパッケー ジし得る５°主要スプライス供与部位と１互１遺伝子開始コドンの間の領域に対 応する十分な数のヌクレオチドを含むべきではない、ＨＩＶパッゲージ不全細胞 系を構築するために上記ベクターを使用する際には、かかる細胞系が感染性ＨＩ Ｖを産生じないことが好ましい、上記パッケージ不全ベクターによって形質転換 された細胞系は、細胞がパッケージ不全性であるがために感染性は低いが、それ でも一部のＲＮＡはピリオン中にパッケージされ得る。

従って、ウィルスＲＮＡの一部がピリオン中にパッケージされたとしても、パッ ケージされたものが複製コンピテントウィルスとならないように、ＨＩＶヌクレ オチドセグメントはＨｒＶゲノム全体には対応しないことが好ましい。

好家しくは、各々がＨＩＶゲノムの異なる部分を含むが、ウィルスパッケージに 必要な配列は含まない、少なくとも２つの異なるベクターを得ることが望まれる 。１つの細胞を各ベクターを用いて同時トランスフェクトすることにより、細胞 は全てのＨＩＶ楕遺タンパク質を発現し、ピリオンを産生じ得る。１つの好まし い実施態様においては、ベクターはＨＩＶ　ＬＴＲに対応する配列を含まず、プ ロモーター領域及び／または別のゲノムのポリアデニル化配列に対応する配列を 含む、特定のプロモーター及びポリアデニル化配列の選択は、特定の宿主細胞に 基づいて容易に行なわれ得る。配列が対応しないＬＴＲは３′末端ＬＴＲである のが好ましい０例えば図３を参照されたい。

１つの実施態様においては、１つのベクターが、ＨＩＶタンパク質の発現を可能 とする配列をｅｎｖの上流に含み、第２ベクターが残りのタンパク質の発現を可 能とする０例えば一方のベクターは、最も５′側の遺伝子産物を発現するために １１Ｎ遺伝子配列に対応する十分な数のヌクレオチドに対応するＨＩＶヌクレオ チド配列を、１ＬＪＬｔｉｔ始コドン上流に含む、他方のベクターは、ｍ遺伝子 配列の下流にあって機能的１旦Σ遺伝子配列を含む十分な数のヌクレオチドに対 応するＨＩＶヌクレオチドセグメントを含む、このようなベクターは、本明細書 の開示（図３）に基づいて当業者はかかるウィルス中の既知の制限エンドヌクレ アーゼ部位を利用することにより、報告されているＨＴｖゲノム配列から化学的 に合成することもできるし、多数の入手可能なＨＩＶＦロウイルスから誘導する こともできる。

興なるマーカー遺伝子を各ベクターに付加すること、即ち予め選択した細胞系を 上記種々のベクターで同時トランスフェクトし、両マーカーを含む細胞を探すこ とにより、２つのベクターで同時トランスフェクトされた細胞系を得ることが好 ましい、このような細胞は、全てのＨＩＶタンパク質を産生じ得る。しかしなが ら、ピリオンは産生されても、全ウィルス配列に対応するＲＮＡはかかるピリオ ン中にパッケージされていない、所望であれば、例えばｍ−ｍベクター、ｅｎｖ ベクター及びｖｉｆ／Ｌ且１ベクターなど、２つ以上のベクターを使用すること もできる。

例えば、機能的ＬＴＲ（好ましくは５゛末端ＬＴＲに対応するもの）をもたらす ５′末端にあるＨＩＶ　ＬＴＲの十分な数のヌクレオチドに対応するヌクレオチ ドと、ＬＴＲの下流にｒｅｖ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子に対応するヌクレオチドと 、配列がもう１つのＬＴＲに対応していない３′末端に、ＳＶ４０ウィルスに対 応するポリアデニル化配列のようなポリアデニル化配列に対応する配列とを含む ベクターを得ることができる（例えば口３のｐｓＶＩ　Ｉ　Ｉｅｎｖ３−２）、 第２ベクターは他のＨＩＶまたはＳＩＶ遺伝子を含み、且つパッケージ配列中の 欠失及びｅｎｖ遺伝子における欠失を含む、このベクターも３′末端ＬＴＲは含 まず、ポリアデニル化配列を含む６例えば、ＨＩＶＲＮＡをパッケージするため のＨＩＶパッケージ配列に対応する十分な数のヌクレオチドは含まないが、機能 的ｍ及びＬ旦ユ産物を発現するＨＩＶ　ＪＬＬ！及びｉ旦ユ遺伝子の十分な数の ヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドに対応するヌクレオチドセグメ ントを含むベクターを得ることができる。このベクターは、機能的ｔａｔ遺伝子 に対応する十分な数のヌクレオチドをも含むのが好ましい。

ベクターは、機能的ｅｎｖタンパク質をコードする十分な数のヌクレオチドは含 まない、ベクターは、Ｖｌ工、ム！旦、ｖｉｆなとの機能的遺伝子産物を発現す る他の１（ＩＶ調節遺伝子に対応するヌクレオチドをも含むのがより好ましい、 他のベクターの組合せも好ましくなり得る０例えば、１つのベクターは、機能的 ｍ遺伝子に対応するのに十分な数のヌクレオチドは含まないが、機能的り立ユ及 び立１ヱ遺伝子に対応するのに十分な数のヌクレオチドを含み、他のベクターは 、機能的り立ユタンパク質をコードするのに十分な数のヌクレオチドは含まず、 別の機能的ＨＩＶタンパク質などをコードするのに十分なヌクレオチドを含む。

本明細書において、十分な数のヌクレオチドなる表現は、要求される機能的能力 が失われない限りは、付加、欠失及び置換が容認される０例えばＨＩＶＲＮＡを パッケージし得る機能的能力と言えば、得られたベクターはＨＩＶＲＮＡをパッ ケージし得る配列を有さねばならない。

ＨＩ　Ｖ−１は、他のウィルスのエンベローフ糖タンパク質を用いて模造（ｐｓ ｅｕｄｏｔｙｐｅ）Ｌ得る（Ｌｕｓｓｏ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ 　２４７：８４８−８５１（１９９０））、その結果、異なるレトロウィルス由 来の機能的ｅｎｖ遺伝子に対応する十分な数のヌクレオチドを含むベクターを作 製することができる。このベクターの５′末端ＬＴＲは、１旦Δ遺伝子と同じゲ ノムのものであるのが好ましい、ｅｎｖパッケージ不全ベクターに代えてこのよ うなベクターを使用してピリオンを製造することもできる。このような変更によ って、得られたベクター系はより広範な宿主に使用することができる。

実質的に任意の細胞系を使用することができるが、哺乳動物細胞系、例えばＣＶ −１，Ｈｅ　Ｉａ、Ｒａｊ　ｔ−ＲＤ、５Ｗ４８０またはＣＨＯ４ｉ胞系を使用 するのが好ましい。

ウィルス細胞産物の産生を増大するため、５°末端ＬＴＲとは異なるプロモータ ーを使用する、即ち、５′末端ＬＴＲを、特定の細胞系においてその制御下に遺 伝子を優先的に発現するプロモーターと置き換えることができる１例えばＣＭＶ プロモーターは、ＣＶ−１またはＨｅ１ａ細胞において遺伝子を優先的に発現さ せる。使用する特定のプロモーターは、使用する特定の宿主細胞に基づいて当業 者によって容易に決定され得る。

ウィルス細胞産物のレベルを増大するため、ベクターにエンハンサ−配列を付加 してＨＩＶ　ＬＴＲ及び／またはプロモーターを増強することができる。特定の エンハンサ−配列は、宿主細胞系に従って当業者によって容易に決定され得る。

ヘルペスウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスのもののような、ＨＩＶＬＴＲに作用する ウィルスエンハンサ−タンパク質を発現するベクターを付加して、ウィルス産物 または細胞トランスアクチベータータンパク質のレベルを増大することができる 。細胞トランスアクチベータータンパク質としては、ＮＦに〜Ｂ、葉外光応答因 子や、当業者にはよく知られた他のＴ細胞活性化因子を挙げることができる。

全体としては全ＨＩｖゲノムを含む一連のベクターを使用することにより、ＨＩ Ｖピリオンと同一であるが、但しＨＩＶＲＮＡを含まないピリオンを産生する細 胞系を製造することができる。ピリオンはかかる細胞から容易に得ることができ る８例えば細胞を培養して上滑を回収する。

所望の用途に従って、ピリオンを含む上清を使用することもできるし、かかると りオンを標準的な方法によって上清から分離することもできる。典型的には、こ れには密度勾配遠心分離、−過などが含まれる。

このような弱毒化ピリオンは、ワクチンを製造する上でかなり有効である。この とりオンを使用してＨＩＶピリオンに対する抗原応答を引き出すことができ、か かるピリオンは、ピリオン中にウィルスＲＮＡを含まないこと以外は実際のＨＩ Ｖピリオンと同一であるため、製造されたワクチンは特に有効となり得る。

また、かかるピリオンを使用して該ピリオンに対する抗体を産生させることがで き、この抗体は、例えばピリオンをスクリーニングしたり、ピリオンに対するタ ーゲット系を開発するなど、種々の目的で使用することができる。

更に、かかるＨＩＶパッケージ不全不全１系砲系望の遺伝子、例えば異種遺伝子 を哺乳動物細胞中に導入する手段として極めて有効となり得る。

かかるピリオンは、所望の遺伝配列を、ＨＩＶに感染可能なターゲット細胞中に パッケージするのに極めて効率的な方法として使用し得る。これは、ＨＩＶウィ ルスのパッケージヌクレオチド（ＨＩ　Ｖパッケージ領域）に対応する十分な数 のヌクレオチドと、所定の遺伝子と、前記パッケージ配列及び所定の遺伝子にフ ランキング配置する、パッケージング、逆転写、組込み及び遺伝子発現のための ＬＴＲ内及びその近傍に由来する十分な数の配列に対応する配列とを含むヌクレ オチドセグメントを含むベクターを調製することにより行われる。使用するパッ ケージング領域は、少なくとも５°主要スプライス供与部位とｍ開始コドンのち ょうど上流との闇の領域に対応するのが好ましく、５′主要スプライス供与部位 とｍ遺伝子内のＢａｌ　Ｉ部位（ＨＩＶ−１においては２２０２＞との間の領域 に対応するのがより好ましい。

例えば、ターゲット細胞中でパッケージ、逆転写、組込み及び発現される十分な 数のＨＩＶ−１配列としては、ＬＴＲのＵ３、Ｒ及びＵ５配列、パッケージ配列 、並びに（逆転写に必要とされる）ＬＴＲにフランキング配置する幾つかの配列 を挙げることができる。５゛末端ＬＴＲからは、ＨＩＶ−１においては＋１から １８３まで伸びるＲ及びＵ５領域が含まれる。逆転写及びパッケージングに必要 な５゛末端ＬＴＲにフランキング配置する配列は１８３から約３３５まで伸びて いる。理論に制約されるつもりはないが、本出願人らは、ＬＡＪＬ遺伝子由来の 追加配列をベクター中に含める（Ｂａｌｒ部位、ヌクレオチド２２０２まで）と パッケージング効率を増強すると考えている。含まれるべき３°末端ＬＴＲ由来 の領域及びそのフランキング配列は約８６４５から約９２１３（Ｕ３及びＲ領域 ）に伸びている。

ＨｒＶ−２またはＳＩＶをベースとするベクターにおいても類似の領域が含まれ る。

このベクターを使用してＨＩＶパッケージ不全細胞の１つをトランスフェクトす る場合、ピリオン中にパッケージされるのはこのベクター由来のヌクレオチド配 列である。

かかる“ＨＩＶがパッケージされた”遺伝子は、ＨＩＶに感染可能な細胞を標的 とし得る。この形質転換方法は現行の方法よりもはるかに効率的であると推定さ れる。更に、適当な遺伝子を選択することにより、ｆ（ＩＶ感染方法をモニター することもできる。

例えばベクターは、発現、逆転写及び組込みされるべきＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２ またはＳＩＶの５’及び３′の両末端ＬＴＲに対応する十分な数のヌクレオチド と、パッケージされるべきＨＩＶパッケージ配列、例えば５′主要スプライス供 与部位とＩＩＬＪ！始コドンのちょうど上流（例えばヌクレオチド３８１）の間 のセグメントに対応する十分な数のヌクレオチドとを含み得る。ベクターは更に 、機能遺伝子（例えば遺伝子セグメント）を産生ずるように移入されることが望 まれる遺伝子の十分な数のヌクレオチドを含スホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ’ ）とすることができる。

“遺伝子”は、ｔ　ｒａｎｓ優性インヒビター、アンチセンスＲＮＡ、触媒ＲＮ Ａ（ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ＲＮＡ５）または可溶性ＣＤ４誘導体のような、ＨＩ Ｖの複製または組込みに悪影響を及ぼす産物を発現するのがより好ましい。

このような遺伝子によって、本発明のベクターを使用してＨＩＶターゲット細胞 を標的とすることができる。ＬＴＲ配列自体もプロモーターとして作用し得るが 、所望の遺伝子に対するプロモーターを含むことが好ましい、実質的に任意のプ ロモーターを使用し得る。遺伝子が移入された宿主細胞中での遺伝子の発現を容 易にする１０モーターを使用することが好ましい、好ましいプロモーターとして は、５Ｌ−３、ネズミレトロウイルスＬＴＲなどのウィルスプロモーターを挙げ ることができる。エンハンサ−配列をベクター中に使用することも好ましい、ま た、遺伝子に対するポリアデニル化配列を含むことも好ましい、任意のポリアデ ニル化配列、例えば５Ｖ−４０ポモ対応する配列を使用することができる。所望 の遺伝子は本発明のベクター中に、ＬＴＲに対してセンスまたはアンチセンスの いずれかの方向で挿入することができる。ベクターは、複数の該当遺伝子を発現 し得るよう１つ以上の遺伝子または疑似配列を含み得る。

このベクターは、上述のパッケージ不全ベクターと一緒に使用するのが好ましい 、このような状況においては、パッケージ効率を助長するためにパッケージ不全 ベクターのゲノムに対応するベクター中にＨＩＶ　ＬＴＲを使用することが好ま しい、しかしながら、パッケージ不全ウィルスと一緒に使用することに加えて、 このベクターは、遺伝子科人のためにヘルパーウィルスと一緒に使用することも できる０例えば、ＡＩＤＳに感染した個体を治療するために遺伝子を送達したい 場合は、このベクターをその個体中に挿入すると、ベクターはその個体内で産生 されたＨＩＶピリオン中に取り込まれる。これで、所望の遺伝子を適当なターゲ ット細胞に送達するのが容易になる。即ちこれを使用して、ウィルス複製に不可 欠なＨＩ　Ｖ−１機能を阻害することを目的とされたｔｒａｎｓ優性インヒビタ ー、アンチセンスＲＮＡ、触媒ＲＮＡまたは可溶性ＣＤ４誘導体を送達すること ができる。上述のパッケージ不全ベクターまたは感染個体においてＨＩＶウィル スと組み合わせたかかるパッケージ不全ベクターを使用することにより、これら の材料を送達することもできる。

更に、細胞はＨＩＶｍ胞タンパク質を発現するがＲＮＡをパッケージしないので 、かかるＨＩＶバッゲージ不全細胞系を使用して、ｉｎ　ｖｉｖｏ及びｆｎ　ｖ ｆｔｒｏの両系においてＨＩＶ生活環の種々の段階を研究することができる。

本発明を以下の実施例によって更に説明する。かかる実施例は、本発明を理解す る上で助けとなるように与えるものであり、本発明の範囲を制限するものではな い。

Ｔ−（Ｉ　Ｖ　−１の５°末端ＬＴＲとＬ１１遺伝子との間の領域を図１に示す 、この図は、５′主主要スワライス供与位（ＳＤ）及び後述するベクターｐＨＸ ＢΔＰ１中の欠失部位を示している。この領域中の１９塩基対の欠失は、Ｆｆｓ ｈｅｒ、Ａ、Ｇ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１６：２６２−２６５（１ ９８５）のプラスミドｐＨＸＢｃ２上に含まれる感染性ＨＩ　Ｖ−１プロウイル スクローンにおいて生成した。このプラスミドは更にＳＶ４０複製開始部を含ん でおり、ＣＯ３−１１ｆｌｌ胞中で遺伝子を効率的に発現し得る。Ｋｕｎｋｅｌ 、Ｔ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　上５４，３６７−３８２（１９８７）に記載さ れている特定部位突然変異誘発によって突然変異を生じさせ、ＤＮＡ配列決定（ Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、７４　：　５４６３−５４６７＜１９７７））によって配列を確認し た。この突然変異プラスミドをｐＨＸＢΔＰ１と命名した。

更にｅｎｖ遺伝子において、ＢｇｌＩＩ部位間に部位−ム外欠失部（ヌクレオチ ド６６２０〜７１９９）を生成した。

図２ｂ参照、ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルを、ＢａｍＨＩ部位（ヌク レオチド８０５３）から始まるｐＨＸＢΔＰ１プロウィルスの３′末端と置き換 えて、ＨＸＢΔＰ１Δｅｎｖを作製した。ｐｓＶｒ　Ｉ　Ｉ　ｅｎｖ３−２１ラ スミドは、ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルによってＨＩＶ−１ｒｅｖ及 びｅｎｖ遺伝子をコートす６．ｐＳＶＩ　Ｉ　Ｉｅｎｖ３−２１ラスミドにおい ては、ＨＩＶ−１のｒｅｖ及びｅｎｖ遺伝子はＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲの制御下にあ る。このベクターの構築は既に記載されている〔５ｏｄｒｏｓｋｉ、ｅｔ　ａｌ 、、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：４１２−４１７（１９８６）及び５ｏｄｒｏｓｋｉ 、ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　１１１：４７０−４７４（１９８６）参照、これ らの文献は参照により本明細書の一部を構成するものとする〕、使用したプラス ミドの関連部分のマツプを図２に示す、ＨＸＢΔＰ１及びＨＸＢΔＰ１Δｅｎｖ ベクターにおいては、ＨＴＶ−１遺伝子の位置を、前述の１９塩基対の欠失部の 位置（Δ１９ｂｐ）と−緒に示す、ＨχＢΔＰ１Δｅｎｖ及びｐＳＶＩ　Ｉ　Ｉ 　ｅｎｖ３−２においては、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ　）及びＳＶ４０ポ リアデニル化シグナル（ＳＶ４０　ｐｏｌｙＡ）を示す。

ＣＯ５−１細患は、１０％ウシ胎児血清（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ　。

Ｌｏｎｇ　Ｉ　ｓ　Ｉ　ａｎｄ　ＮＹ）及び抗生物質を補充したダルベツコ改良 イーグル培地ＤＭＥＭ（Ｈａｚｅ　Ｉ　ｔｏｎＢｉｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｅｎｅｘ ａ）中に維持されていた。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清及び抗生物 質を含むＲＰＭＩ　１６４０内で培養維持した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、感染の２ 週間前にＢ、Ｍ、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｉ及びＩＩ並びにヒト血清を用いて、マイコプ ラズマに対する予ｒＦＪ措ｌがとられていた。ｌ　ＨＸ　Ｂ　Ｃ２（ＬＬＪＬ” 、　Ｌ工」Ｉ、ｌ５ＩＬユ゛、ｖｔｆ”、！−，Ｌｚｌ−１ｔａｔ”、ｒｅｖ” 、ｅｎｖ”、ｎｅｆ−）プロウィルスを全てのプラスミド及びベクター構築物に 使用した。

ウィルスタンパク質発現及びピリオン産生における突然変異の影響を評価するた め、ＣＯ３−１ｍ胞をｐＨＸＢｃ２及びＰＨＸＢΔＰｌプラスミドを用いてＤＥ ＡＥ−デキストラン法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、１２：５７０７−５７１７（１９８４）；Ｑｕｅｅｎ　ａｎｄ　Ｂａｌ ｔｉｍｏｒｅ、Ｃｅ１１３３　：　７４１−７４８（１９８３）；　５ｏｄｒｏ ｓｋｉ、Ｊ。

、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：１５４９−１５５３（１９８６）、 これらの文献は参照により本明細書の一部を構成するものとする〕によってトラ ンスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に３ｓＳシステインを用 いて放射性１ｌｌｌ！ＩｌシたＣＯ５−１細胞溶解物及び上清〔５ｏｄｒｏｓｋ ｉ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅλ旦ユ、玉揚〕を１９５０１　ＡＩＤ Ｓ患者血清を用いて沈澱させた。細胞溶解物中で検出されたウィルスタンパク質 の合計レベルは、野生型ＨＸＢｃ２及びＨＩＶパッケージ不全ＨＸＢΔＰＩを含 むベクターに匹敵していた０図５Ａ参照、この図は、ＤＮＡなしくレーン１及び ４）、１０μｇ　ｐＨＸＢｃ２（レーン２及び５）または１０μｇ　ｐＨＸＢΔ Ｐｉ（レーン３及び６）を用いてトランスフェクトした後のＣｏＳ細胞の溶解物 （レーン１〜３）及び上清（レーン４〜６）由来の”ＳＳ＊ウィルスタンパク質 を、１９５０１患者血清を用いて免疫沈降したものを示している。細胞溶解物に おいて検出された全ウィルスタンパク質レベルは、ＨＸＢｃ２またはＨＸＢΔＰ １のいずれかによってトランスフェクトした細胞に匹敵した。ＣＯ５−１１１１ 胞の上清から沈降したウィルスタンパク質レベルは、ＨＸＢｃ２よりもＨＸＢΔ Ｐ１の方がわずかに低かった。ｐＨＸＢΔＰ１を用いてトランスフェクトしたＣ ０５−ＩＪＩＩＩ胞の上清において測定された逆転写酵素（ＲＴ）活性量は、Ｈ ＸＢｃ２ベクターを用いてトランスフェクトした細胞において測定されたものの ６０％であった（データは示さない）＠ｐＨＸＢΔＰＩを用いてトランスフェク トしたｃｏｓ−ｉ細胞を、トランスフェクトした４８時間後に固定し、電子顕微 鏡によって調査した。正常ＨＩＶ−１形態の出芽形態を含むウィルス粒子が認め られた９図５Ｂは、正常ＨＩＶ−１形態のウィルス粒子を示す、ｐＨＸＢΔＰ１ でトランスフェクトしたＣＯ５−１細胞の電子顕微鏡写真である。

）（ＩＶ−１複製に及ぼすＨＸＢΔＰ１突然変異の影響を評価するため、ｐ　Ｈ Ｘ　Ｂ　ｃ　２及びＰＨＸＢΔＰ１でトランスフェクトしたＣＯ５−１４１１１ 由来の上滑を一過しく０．２μ）、ＲＴを測定した。突然変異ウィルス及び野生 型ウィルスの同量のＲＴ活性を含む上清をＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球に加えた 。Ｊｕｒｋａｔ培養液と疑似感染培養液を、培地を３日おきに替えながら維持し た２時間を置いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞のアリコートを標識し、１９５０１ＡＩＤ Ｓｆｉ者血清を用いて免疫沈降することによりＨＩＶ−１タンパク質の発現を評 価した０図６は、疑似トランスフェクト（レーン１．４．１０．１３及び１６） したかまたはｐＨＸＢｃ２（レーン２．５．８．１１．１４及び１７）もしくは ｐ）（ＸＢΔＰｉ（レーン３．６．９．１２．１５及び１８）でトランスフェク トしたＣ０５−ＩＪｉ胞由来の上滑に暴露した、ＪｕｒｋａｔＴ細胞溶解物（レ ーン１〜３．７〜９及び１３〜１５）または上清くレーン４〜６．１０〜１２及 び１６〜１８）由来の標識ウィルスタンパク質の免疫沈降を示す、感染後７日日 （レーン１〜６）、１４日目（レーン７〜１２）及び２１日目（１３〜１８）に Ｊｕｒｋａｔ細胞を調査した。ＨＸＢΔＰ１に暴露したＪｕｒｋａｔ培養液は、 野生型ウィルスｐ　ＨＸ　Ｂ　ｃ　２に暴露したものと比較して、ウィルスタン パク質産生において著しい遅延及びレベル低下を示した。ＨＸＢΔＰ１によって トランスフェクトしたヒトＴリンパ球におけるウィルス複製は、ＨＸＢＣ２によ ってトランスフェクトした細胞と比較して著しい減衰が見られた。

上記培養液由来の上清を０．２μフイルターで一過し、等量の逆転写酵素活性を 、１２０００Ｘｇ、２０℃で１時間遠心することによりベレット化した。ウィル スベレットをバナジルリボヌクレオチドの存在下にＮＰ４０によって溶解し、ウ ィルス希釈物をニトロセルロースフィルター上にドツトプロットした。ドツトプ ロットする前に試料の一部を水酸化ナトリウムで処理した（５Ｍ、６０℃で１５ 分間）、フィルターを、ＨＩＶ−Ｉ　ＬＬＩＬ及びｅｎｖ遺伝子配列からなるＤ ＮＡプローブとハイブリダイズし、洗浄し、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ｅｔ　ａ ｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に既に記載されているようにオート ラジオグラフ処理した。野生型ＨＸＢＣ２ウィルスに対しては、１０００逆転写 酵素単位の濾過後上清をブロッティングした後にＲＮＡに特異的なシグナルが検 出され得る（図示なし）、ＨＸＢΔＰ１に対しては、５Ｘ１０’逆転写酵素単位 の上清さえも検出可能なシグナルを与えなかった０図７は、Ｊｕｒｋａｔ培養液 由来の濾過後の上清をブロッティングした後に水酸化ナトリウム処理をしない（ カラム１）及びした（カラム２　）ＲＮ　Ａドツトプロットである。上清は、） （ＸＢΔＰ１においては５Ｘ１０’ｃｐｍ（Ａ行）、ＨＸＢｃ２においては５Ｘ １０’ｃｐｍ（Ｂ行）またはＨＸＢｃ２においてはＩ　Ｘｌ　０’ｃｐｍ２（Ｃ 行）の逆転写活性を含んでいた。これらの結果は、本発明のパッケージ不全ウィ ルスベクターを用いてトランスフェクトした細胞においてウィルス特異的ＲＮＡ をピリオン中にパッケージングする効率が野生型ウィルスの２％未満であること を示している。

上記結果ハ、ＨＩＶ−１の５’末端ＬＴＲとｍ遺伝子との間の領域が、ウィルス ＨＭＡをピリオン中にパッケージングするのに重要であることを示している。こ の領域内の突然変異は、トランスフェクション後のタンパク質及びピリオン粒子 を産生ずるプロウィルスの能力への影響は最小であるが、ヒトＣＤ４陽性リンパ 球系におけるピリオンＲＮＡのレベルを著しく低下させ、ウィルス複製を減衰さ せる。ＨＩＶ−１は、培＠ＣＤ４陽性ＩＩＩＩ！Ｉｌ中で無＃ＩＩ胞伝播及び細 胞対細胞伝播によって複製し、後者は感染細胞と非感染細胞の接触を含む（Ｆｉ ｓｈｅｒ、Ａ、Ｇ、、ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　Ｌ上６　：　２６２−２６５ （１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　ｚ旦 ユニ　１５４９−１５５３（１９８６）、５ｔｒｅｂｅｌ、に、、ｅｔ　ａｌ、 、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：　７２８−７３０（１９８７））。

ＨＩ　Ｖ−１バツク一ジ配列に基づくベクターを構築した。

ｐＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）センＸ（ｐＨＶＢ（ＳＬ３−ＮｅＯ））及びｐＨＶ Ｂ（ＳＬ３−Ｎｅ　ｏ）アンチセンス（ＰＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ））プラスミ ドは、ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルと一緒に、５Ｌ３−３ネズミ白血 病ウイルスＬＴＲの制御下のｎｅｏ遺伝子のコーディング配列を含む、ｐＨＶＢ （ＳＬ３−Ｎｅｏ）センス及びｐ　ＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）アンチセンスプラ スミドは、５°及び３゜末端の完全ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲと、５°末端ＬＴＲ近傍 のフランキングウィルス配列ヌクレオチド１８３〜３８１及び３゛末端ＬＴＲに 隣接するヌクレオチド８５０４〜８６６１とを含む、ＨＸＢｃ２プロウィルスく ヌクレオチド３８２〜８５９３）中の主要欠失部の境界に、固有のＢ　ａｍＨ１ 部位を挿入し、ＳＬ３　ＬＴＲ−Ｎｅｏ転写単位を、ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲＧ、１ ｍ対して一１＝ンス（ｐＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ））またはアンチセンス（ｐＨ ＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ））の向きでこの部位中にクローニングした。全てのプラ スミドはＳＶ４０複製開始部を含んでいた０図２参照、これらのベクターは、ウ ィルスＲＮＡをパッケージするのに重要となる、欠失によって示した１９塩基対 の配列を含んでいる。

ベクターはＨＩ　Ｖ　−１遺伝子産物を全くコードし得ない。

ベクターは、Ｔリンパ球において効率的なプロモーターとして機能する５Ｌ３− ３ネズミレトロウイルスＬＴＲがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎ　 ｅ　ｏ　ｌｌ）遺伝子の発現を促進する挿入物を含んでいる。Ｎｅｏ転写のため のポリアデニル化シグナルはＳＶ４０由来の配列によって与えられる１図２のプ ラスミド上の番号は、プロウィルス／挿入物の境界を形成するＨＸＢｃ２配列の ヌクレオチドを示している。５Ｌ３−３ネズミ白血病ウイルスＬＴＲはＳＬ３で 示されている。主要５°スプライス供与部位（ＳＤ）の位置及びＬ立１遺伝子開 始コドン（ＪＬＬＩＬＡ　Ｔ　Ｇ　）も図に示す。

５０％薬密ＣＣ０５−Ｌ胞を、ＨＸＢＡＰ　１＋ＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）セン ス系、ＨＸＢΔＰ１＋ＨＶＢ＜５Ｌ３−Ｎｅｏ）アンチセンス；ＨＶＢ（ＳＬ３ −Ｎｅｏ）センス＋ｐＨＸＢΔＰ１Δｅｎｖ十ｐＳＶＩ　Ｉ　Ｉｅｎｖ３−２系 ；及びＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）アンチセンス＋ｐＨＸＢΔＰ１Δｅｎｖ＋ｐｓ ＶＩ　Ｉ　Ｉｅｎｖ３−２系に対するプラスミドＤＮＡを各々１０μｇ　／　ｍ 　Ｉ使用し、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｃ ｅ１ｌ。

トランスフェクトして組換えウィルスを生成した。トランスフェクトした１２時 間後、ＣＯ５−１細胞培養液中に、Ｆｅ２及び抗生物質を含むＤＭＥＭを入れた 。トランスフェクションの７２時ｒｇＪ後に、ｃｏｓ−ｉ上清を回収し、０゜２ μｍフィルター（Ｍｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｅ）で−過した。ｃ。

Ｓ−１上滑中のｐ２４レベルを、ｐ２４ラジオイムノアッ七イ（Ｄｕｐｏｎｔ＞ によって決定した。

ウィルスに感染されるべきＪｕｒｋａｔ細胞を６ウ工ル培畳プレート内に、１ウ エル当たり２．５ｍｌの完全培地中２゜５Ｘ１０’細胞で播種した。トランスフ ェクトしたＣ０８−１上渭の１０倍までの段階的希釈液を各ウェルに与え、ウィ ルスをＪｕｒｋａｔ細胞に３７℃で４時間吸着させた。その後、Ｊｕｒｋａｔ細 胞をベレット化し、完全培地中に再懸濁させた。２４時間後、培地を、Ｇ４１８ （Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を活性濃度０．８ｍｇ／ｍｌで含む完全培地で置き換え、 細胞を２４ウエル培養プレート中に１．０×１０４細胞／ウエルで分配した。培 地は４日ごとに取り替えた。生存可能な０４１８耐性細胞集団を含む陽性ウェル を同定し、感染の１８日後に培養液中でカウントした。

感染Ｊｕｒｋａｔ細胞培地におけるｐ２４レベルを、感染の５．１０及び２０日 後にラジオイムノアッセイによって測定した。更に、感染Ｊｕｒｋａｔ細胞によ るシンシチウム形成レベルを、感染の５〜２０日後の培養液中で測定した。

Ｇ４１８耐性Ｊｕ　ｒｋａｔ細胞をクローニングするため、１１服をリン８１１ １１１塩類溶液中で洗浄し、培地１００μｍ当たりの生存可能線取濃度が０．５ となるまで希釈した。１００μｍの細胞懸濁液を、９６ウエル培養プレートの各 ウェル中に分配した。単一細胞を含むウェルを位相差顕微鏡によって同定し、個 々の細胞を、０．８ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を含む完全培地中で１０７細砲まで増 殖させた。

クローンからゲノムＤＮＡを調製し、Ｓａｃ　Ｉを用いて消化し、５ｏｕｔｈｅ ｒｎ、Ｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｍｏ　１．ＢｉＬ上エユ上：５０３−５１７（１９７５＞ によって既に記載されているようにサザンプロットした。サザンプロットを、オ リゴヌクレオチドを用いてランダムプライミングすることにより標識したＳＬ３ 　ＬＴＲ，ｎｅｏ遺伝子及びＳ■４０ポリアデニル化配列全配列３．３ｋｂのフ ラグメントとハイブリダイズした。サザンプロットを高緊縮条件下で洗浄した。

ｐＨＸＢΔＰ１プラスミド及びＨｉ　Ｖ−１ベクターを上述のごと（ＣＯ８−１ ４８１胞中に同時トランスフェクトした。

表１は、トランスフェクションの３日後のトランスフェクト細胞の上清中でＨＩ Ｖ−１のＬＬＩＬｐ２４タンパク質が検出可能であることを示している。−過し たＣ０８−１上清を段階的に希釈し、Ｊｕｒｋａｔリンパ球と一緒にインキュベ ートし、Ｇ４１８耐性について選択した。生成されたＧ４１８耐性Ｊｕｒｋａｔ ｌ［ｌ！！の数（表１）は、ＣＯ５−１上清１ｍｌ当たり１０’　〜１０’であ り、ＨＶＢ＜５Ｌ３−Ｎｅｏ）アンチセンスベクターはＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ ）センスベクターよりも高い力価を与えた。ＤＮＡを含まないもの、ベクターの み家たはｐＨＸＢΔＰ１プラスミドのみを用いてトランスフェクトしなｃｏｓ− ｚｍ胞から誘導した上溝と一緒にインキュベートしても、Ｇ４１８耐性Ｊｕｒｋ ａｔ［胞は生成されなかった。

Ｆ（ＸＢΔＰ１１０ウィルスは完全には複製不全性でなかった。従って、ウィル スル２４抗原の産生及びシンシチウムの形成を調査してＧ４１８耐性Ｊｕｒｋａ ｔ細胞中の感染性ウィルスの量を測定した９図４は、Ｊｕｒｋａｔ培養液の上清 中でＨＩＶ−１ｐ２４抗原が検出可能であったことを示している。シンシチウム 形成は肉眼で確認でき、かかる培養液中で経時的に増加しており、これは、ター ゲット細胞中でのＨＩ　Ｖ−１エンベロープ糖タンパク質の発現を示すものであ る。かかる培養液中の有意な細胞変性効果の誘導は、Ｇ４１８耐性Ｊｕｒｋａｔ 細胞のクローニングを困難にしており、更に、複製コンピテントウィルスがター ゲット細胞中に存在することを示している。更に表２も参照されたい。

虹 トーンスフエ　トＣＯ３−１の　の　イルス　４　の挾え皇工止Δ方通 トランスフェクトＤ　Ｎ　Ａ　ｐ２４（ｎｇ／ｍｌ）’″　Ｇ４１８耐性力価（ ｃｆｕ／ｍｌ）’ｐＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）センス　０ＯｐＨＶＢ（ＳＬ３− Ｎｅｏ）アンチセンス　００ｐＨＸＢＡＰ１　０．６　０ ｐｓＶＩＩＩｅｎｖ３−２　０　０ ｐ１１ＸＢΔＰ１Δｅｎｖ　５．６　０）ＩＸＢΔＰ１プロウィルスに代えて、 ＨＩ　Ｖ　−１タンパク質をコードする上述の２つの他のプラスミドを使用した 。

ｐＨＸＢΔＰ１Δｅｎｖプラスミドは、その中のプロウィルスがｅｎｖ遺伝子中 に欠失部を含み且っ３°末端ＬＴＲの代わりにＳＶ４０由来のポリアデニル化シ グナルを含むことを除き、ｐＨＸＢΔＰ１プラスミドと同一である。ｐＳＶＩ　 Ｉ　Ｉｅｎｖ３−２プラスミドは、）（ＩＶ−Ｉ　ＬＴＲの制御下にあるＨＩＶ −１のｒｅｖ及びｅｎｖの両遺伝子を、ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナル によってコードする。これら２つのプラスミドをｐＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）セ ンスまたはｐＨＶＢ（ＳＬ３　Ｎｅｏ）アンチセンスプラスミドと一緒にＣ０８ −１ｍ胞中に上述の方法によって同時トランスフェクトすると、トランスフェク ションの３日後に上清中でＰ２４ＬＡｉ抗原が検出され得る（表１）、この上清 をＪｕｒｋａｔリンパ球と一緒にインキュベートし、Ｇ４１８を用いてＪｕｒｋ ａｔ細胞を選択すると、組換えウィルスレベルは、ｒ過後の上滑１ｍｌ当たり１ ０４〜１０’コロニー形成単位であることが判った。これらの実験において、実 験間で有意な差は認められず、３種の別個の実験において、ＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎ ｅ　ｏ）センスとＦ（ＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）アンチセンスとでも有意な差は認 められなかった。

上記Ｇ４１８耐性Ｊｕｒｋａｔ細胞をクローニングし、ＤＮＡの単離に使用した 。ゲノムＤＮＡをＳａｃ　Ｉを用いて消化すると、Ｓａｃ　Ｉはベクターを各Ｈ ＩＶ−Ｉ　ＬＴＲにおいて１度だけ切断して３．３ｋｂフラグメントを生成した 。５Ｌ３−３　ＬＴＲ由来の配列と、Ｎｅ　ｏ’遺伝子とを含むフラグメントを プローブとして使用した。ＨＶＢ＜５Ｌ３−Ｎｅｏ）センス及びＨＶＢ（ＳＬ３ −Ｎｅｏ＞アンチセンスの両ベクターから誘導したクローンは、対照Ｊｕｒｋａ ｔ細胞には見られない３．３ｋｂの単一ハイブリダイズバンドを示した０図８＃ 照、これは、ＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）センス及びＨＶＢ＜５Ｌ３−Ｎｅｏ）ア ンチセンス配列が、再構成または組換えされずにＧ４１８耐性Ｊｕｒｋａｔ［胞 中にトランスフェクトされたことを示している。

細胞上清においてｐ２４１ＬＪＬタンパク質を測定し、最初の感染から４０日後 までシンシチウムを評価しな、調査した全てのクローンにおいて、シンシチウム は認められず。

ｐ２４抗原は検出不可能であった０表２参照、これは、かかるＧ４１８耐性Ｊｕ ｒｋａｔ細胞中に複製コンピテントウィルスが存在しなかったことを示している 。

表２ Ｑ　Ｊｕｒｋａｔ　”番　シンシ　ム　１ｃｏｓ−ｉａ＋胞中にトランス　感染 後の日数フェクトしたＤＮＡ　５　１０　２０　４０１シンシチウムは次の基準 に従って評価した：−シンシチウムは認められない；＋１〜５シンシチウム／ｈ ｐｆ　；　＋＋　５〜１０シンシチウム／ｈｐｆ　；　＋＋＋　１０より高いシ ンシチウム／ｈｐｆ（ｈｐｆ＝ｈｉｇｈ　ｐｏｗｅｒｆｉｅｌｄ、高電場）。

上記結果は、パッケージ不全ＨＸＢΔＰ１１０ウィルスは、ＨＩＶ−１ベクター をＪｕｒｋａｔリンパ球に移入するのに必要なｔｒａｎｓ作用ウィルス機能を提 供し得ることを示している。ウィルスＲＮＡをパッケージするのに重要であると 定義された配列を含むＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ及びそのフランキング配列は、パッケ ージング、逆転写及び組込みを可能とするのに十分であると考えられる。各々が ３′末端ＬＴＲを欠いた２つの別個のプラスミド上にｔｒａ１互作用機作用機能 ることにより、複製コンピテントウィルスの見掛けの不在下にもベクター配列の 移入が起こる。

このヘルパーウィルス非含有物における組換えウィルスの力価は、恐らくは複製 コンピテントウィルスによる有意な細胞変性効果の誘導のために、複製コンピテ ントウィルスの存在下に認められるものと比較して向上していると思われる。複 製コンピテントウィルスの存在下にＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）アンチセンスベク ターに対して認められる力価の方がＨＶＢ（ＳＬ３−Ｎｅｏ）センスベクターと 比較して高いのは、一部には、ヘルパーウィルス複製におけるＳＬ３プロモータ ーからのアンチセンス方向読取り転写の抑制効果に関係し得る。

本明細書に記載のＨＩ　Ｖ−１ベクターは、注目の個々の遺伝子をＨＩＶ−１タ ーゲツトとなり得る細胞中に導入する単純で効率的な手段を提供する。ＨＩＶ− １は他のウィルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて模造し得ることを示す最 近の知見のもとに、かかるベクターに対してより多くの宿主が使用可能となって いる。複数遺伝子産物をコードする野生型ＨＩＶ−１ゲノムの能力があれば、か かるベクターは、ターゲット細患中で注目の複数遺伝子を発現するように容易に 適合し得る。

上記開示のもとに当業者は、本発明の概念から離れることなく、本発明の種々の 変形態様及び本明細書に記載の特定の実施態様からの派生態様を製造し得、本発 明は、請求項の範囲及び主旨によってのみ制限される。

ｒ町 く　口 〜　〜 特表千５−５０８３２０　（１６） ＦＩＧ、６ ０牛１官詐ｊａＪｕ＊に、４丁細Ｓ乙つクワ−２赤来。

グーノ・ム−ＤＮＡ　っ　Ｓａｔエク肖１θＦＩＧ、８ ！若 バラゲージ不全ＨＩＶベクター及びパッケージ完全ＨＩＶベクターを開示する。

これらのベクターを使用してＨＩＶパッケージ不全細胞系を構築したり、所望の 遺伝子をパッケージすることができる。かかる細胞系は、ワクチン及びＨＩＶ抗 体を開発することに、また遺伝子移入用の系の一部として、使用することができ る。パッケージ完全ベクターは、ＨＩＶターゲット細胞を標的とするのに使用す ることができる。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ＨＩＶセグメントと表記する、ＨＩＶゲノムに対応しており機能性Ｈ ＩＶタンパク質をコードするのに十分な数のヌクレオチドを含んでいるが、ＨＩ Ｖパッケージングセグメントと表記する、ＨＩＶゲノムの５′主要スプライス供 与部位とｇａｇ遺伝子の間のヌクレオチドに対応しておりＨＩＶ　ＲＮＡを有効 にパッケージするのに十分な数のヌクレオチドは含んでおらず、 （ｂ）前記ＨＩＶセグメントの上流にあるプロモーターを含んでおり、 （ｃ）前記ＨＩＶセグメントの下流にありポリアデニル化配列に対応する十分な 数のヌクレオチドを含んでいるが、機能性ＬＴＲに対応する十分な数の配列は含 まないベクター。 ２．全てのＨＩＶ遺伝子に対応するヌクレオチドのうち全てのＨ１Ｖ遺伝子によ ってコードされる機能性タンパク質をコードするのに十分な数のヌクレオチドを 含まない請求項１に記載のベクター。 ３．ｅｎｖ遺伝子に対応するヌクレオチドのうち機能性ｅｎｖタンパク質をコー ドするのに十分な数のヌクレオチドを含まない請求項２に記載のベクター。 ４．ｇａｇ遺伝子に対応するヌクレオチドのうち機能性ｇａｇタンパク質をコー ドするのに十分な数のヌクレオチドを含まない請求項２に記載のベクター。 ５．ＨＩＶ構造遺伝子に対応するヌクレオチドのうち全ての構造遺伝子によって コードされる機能性タンパク質をコードするのに十分な数のヌクレオチドを含ま ない請求項１に記載のベクター。 ６．前記プロモーターがＨＩＶ　ＬＴＲである請求項１に記載のベクター。 ７．前記ＨＩＶパッケージングセグメントが、５′主要スプライス供与部位から 下流に向かってｇａｇ遺伝子開始コドンの約５塩基上流までのヌクレオチド配列 である請求項１に記載のベクター。 ８．前記ＨＩＶゲノムが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶからなる群から選 択されている請求項１に記載のベクター。 ９．前記ＨＩＶゲノムがＨＩＶ−１ゲノムである請求項１に記載のベクター。 １０．前記ＨＩＶゲノムがＨＩＶ−２ゲノムである請求項１に記載のベクター。 １１．前記ＨＩＶセグメントが、ｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子に対応すろヌク レオチドのうち機能性ｇａｇ及びｐｏｌタンパク質を産生するのに十分な数のヌ クレオチドを含む請求項２に記載のベクター。 １２．前記ＨＩＶセグメントが、ｅｎｖ遺伝子に対応するヌクレオチドのうち機 能性ｅｎｖタンパク質を産生するのに十分な数のヌクレオチドを含む請求項２に 記載のベクター。 １３．前記プロモーターがＨＩＶ　ＬＴＲである請求項１１に記載のベクター。 １４．前記プロモーターがＨＩＶ　ＬＴＲである請求項１２に記載のベクター。 １５．前記ポリアデニル化配列がＳＶ４０ポリアデニル化配列である請求項１に 記載のベクター。 １６．前記ポリアデニル化配列がＳＶ４０ポリアデニル化配列である請求項１１ に記載のベクター。 １７．前記ポリアデニル化配列がＳＶ４０ポリアデニル化配列である請求項１２ に記載のベクター。 １８．前記ＨＩＶセグメントが、ｒｅｖ遺伝子に対応するヌクレオチドのうち機 能住ｒｅｖタンパク質を産生するのに十分な数のヌクレオチドを含む請求項１７ に記載のベクター。 １９．（ａ）予め選択した遺伝子及び前記予め選択した遺伝子のためのプロモー ターと、 （ｂ）ＨＩＶパッケージング配列と表記する、ＨＩＶパッケージング配列に対応 しておりＨＩＶ　ＲＮＡをパッケージするのに十分な数のヌクレオチド とを含むベクターであって、ＨＩＶ　ＬＴＲ配列と表記する、発現、逆転写及び 親込みされるのに十分な数のＨＩＶＬＴＲ及びそのフランキング配列に対応する ヌクレオチドに対応する配列で各側部がブランキングされており、前記ＨＩＶパ ッケージング配列及びＨＩＶ　ＬＴＲ配列が同じＨＩＶゲノムに対応しているベ クター。 ２０，前記ＨＩＶ　ＬＴＲ配列の１つが、前記予め選択された遺伝子のためのプ ロモーターとして作用する請求項１９に記載のベクター。 ２１．前記予め選択された遺伝子のためのプロモーターとして前記ＨＩＶ　ＬＴ Ｒ配列に加えて別のプロモーター配列がある請求項１９に記載のベクター。 ２２．前記予め選択された遺伝子の隣にポリアデニル化配列に対応するヌクレオ チド配列がある請求項１９に記載のベクター。 ２３．第２の予め選択された遺伝子を含む請求項１９に記載のベクター。 ２４．前記ＨＩＶパッケージング配列が、５′主要スプライス供与部位からｇａ ｇ遺伝子の最も５′側にある部位までのヌクレオチドに対応している請求項１９ に記載のベクター。 ２５．前記ｇａｇ遺伝子の最も５′側にある部位が、ＨＩＶ−１ヌクレオチドの 約３３８〜３８５の間である請求項２４に記載のベクター。 ２６．前記部位が、ＨＩＶ−１ヌクレオチドの約３５０〜約３８１の間にある請 求項２５に記載のベクター。 ２７．前記ＨＩＶパッケージング配列が、５′主要スプライス供与部位からおお よそｇａｇ遺伝子の３′末端にあるＢａｌ　Ｉ部位までの十分な数のヌクレオチ ドに対応するセグメント内にある請求項１９に記載のベクター。 ２８．前記プロモーターがウイルスプロモーターである請求項１９に記載のベク ター。 ２９．前記ウイルスプロモーターがＳＬ３プロモーターである請求項２８に記載 のベクター。 ３０．前記予め選択された遺伝子が、ｔｒａｎｓ優性インヒビクー、アンチセン スＲＮＡ、触媒ＲＮＡまたは可溶伯ＣＤ４誘導体をコードする請求項１９に記載 のベクター。 ３１．遺伝子を哺乳動物細胞に移入する方法であって、（ａ）ＨＩＶ感染個体の 細胞を請求項１９に記載のベクターを用いてトランスフェクトし、 （ｂ）ステップ（ａ）における細胞が形質転換され、ビリオンを産生するのを待 ち、 （ｃ）ステップ（ｂ）の細胞から産生されたビリオンを他の細胞と接触させて所 望の遺伝子を移入することからなる方法。 ３２．前記ＨＩＶ感染個体の細胞をｉｎ　ｖｉｖｏでトランスフェクトする請求 項３１に記載の方法。 ３３．前記ＨＩＶ感染個体の細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏでトランスフェクトする請 求項３１に記載の方法。 ３４．遺伝子を哺乳動物細胞に移入する方法であって、（ａ）細胞を請求項１９ に記載のベクターを用いてトランスフェクトし、 （ｂ）前記細胞を、全体としては機能性ＨＩＶｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ及び調節 産物を発現するのに十分な数のＨＩＶゲノムに対応するヌクレオチドを含むが、 各ベクターは、全ての機能性ＨＩＶ　ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ及び調節産物を発 現する十分な数のヌクレオチドは含まない、少なくとも２つのベクターを用いて 同時トランスフェクトし、前記ベクターが、ＨＩＶ　ＲＮＡを有効にパッケージ するための５′主要スプライス供与部位とｇａｇ遺伝子の間のＨＩＶゲノムのヌ クレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドは含まず、前記各ベクターは、そ れらの３′末端に、ＨＩＶパッケージング配列によってパッケージされるべきＨ ＩＶ　ＬＴＲに対応する十分な数のヌクレオチドを含まず、 （ｃ）ステップ（ｂ）で形質転換された細胞を培養してビリオンを産生させ、 （ｄ）ステップ（ｃ）で産生されたビリオンを哺乳動物細胞と接触させる ことからなる方法。 ３５．前記哺乳動物細胞を組織培養において増殖させる請求項３４に記載の方法 。 ３６．前記哺乳動物細胞が動物宿主細胞中に存在している請求項３４に記載の方 法。