JPH05509232A - 複製効率を増強するためのＨＩＶｎｅｆ遺伝子を含有する発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 複製効率を増強するためのＨｒ　Ｖ　ｎ　ｅ　ｆ遺伝子を本発明は、複製コンピ テントＨｒＶ−１プロウィルス又はＨＩＶ−２プロウイルス、及び上記のプロウ ィルスの複製効率を増強する配列を含有するベクターに関する。 ヒト免疫不全’フィル７、　（ＨＩ　Ｖ　−１，ＨＴＬＶ　−１１ｒ、ＬＡＶ又 はＨＴＬＶ−■■■／ＬＡｖともいう）は後天性免疫不全症候群（Ａ　Ｉ　Ｄ　 Ｓ）及び関連疾患の病因である［Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ、 。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２０：８６８−８７１　（１９８３）；Ｇａ１ｌｏ　ｅｔ　 ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：５００−５０３　（１９８４）；Ｌｅｖｙ　 ｅｔ　ａｌ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２５＋８４０−８４２（１９８４）；Ｐｏｐｏｖｉｃ　ｅｔ 　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４゜４９７−５００　（１９８４）；Ｓａｒｎ ｇａｄｈａｒａｎｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：５０６−５０８（１ ９８４）；Ｓｉｅｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎ、Ｅｎｇｌ。 Ｊ、Ｍｅｄ、３０５：１４３９−１４４４（１９８１）コ。本疾患は長い無症候 性期間とその後の免疫系及び中枢神経系の進行性変性を特徴とする。ウィルスの 研究は、複製が高度に調節され、Ｔリンパ球のＣＤ４陽性ヘルパーサブセツトの 潜伏性及び溶解性感染が組織培養中で生じることを示す［Ｚａｇｕｒｙｅｔ　ａ ｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ２３１：８５０−８５３（１９８６）］。感感染者におけ るウィルスの発現も、免疫反応を回避させるように調節されると考えられる。Ｈ Ｉ　Ｖ−１の調節及びゲノム構成の分子研究は、それが多数の遺伝子をコードす ることを示す［Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７−２８４　（１９８５）；５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅ ｓｃａｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：４８４−４９２　（１９８５）；Ｍｕｅｓｊｎｇ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４５０−４５７　（１９８５）；Ｗａｉｎ −Ｈｏｂｓｏｎｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４０：９−１７　（１９８５）］。 レトロウィルスは一般に、３つの亜科、即ち腫瘍ウィルス、スプマウイルス及び レンチウィルスに分類される。腫瘍ウィルスによる感染は一般に、悪性疾患を伴 う。これらのウィルスは一般に、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、並びに長末 端反復（ＬＴＲ）配列を包含する約８，０００〜１０，０００ヌクレオチドの一 重鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを含有する。腫瘍ウィルスは一般に腫瘍遺伝子を含有 する。スプマウイルスは、組織培養の泡沫状細胞変性的変化を誘発するけれども 、１ｎｖｉｖｏでは病原性ではないと一般的に考えられる。レンチウィルスによ る感染は一般的に時間がかかり、長い潜伏期間後に慢性衰弱性疾咀を引き起こす 。レンチウィルスは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の他に、調節機能を有す る多数の付加的遺伝子を有する。 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＴＶ）は、同じくゆっくりしだ感染を引き起こし、共 通の構造的特性を有するために、レンチウィルスと分類されてきた［Ｈａａ　ｅ 、Ａ、Ｔ、Ｎａｔｕｒｅ３２２　：１３０−１３６　（１９８６）参照］。 ＨＴＶ−１は、他のレトロウィルスとそれぞれｇａｇ。 ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を共有する［Ｈａｓｅ　ｌ　ｔ　ｉｎｅ、Ｗ。 Ａ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｃｑｕｅｒｅｄ　ＩｍｍｕｎｅＤｅｆｉｃｉｅｎ ｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、１：２１７−２４０　（１９８８）］。ＨＩＶ−１は また、ウィルス複製を調節する別の遺伝子を有する。ＨＩＶ−１ゲノムは、ｖｉ ｆ。 ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖＳｖｐｕ及びｎｅｆタンパク質をコードする［Ｈａｓｅ ｌｔｉｎｅ、Ｗ、Ａ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｃｑｕｅｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　 ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ、上記］。さらに、ＨｒＶの長末端反復 （ＬＴＲｓ）は、組込み、転写及びポリアデニル化に重要なＣ１５−作用配列を 含有する。別のｃｉｓ作用信号はいくつかの新規ＨｒＶ遺伝子生成物質によりＨ ＩＶ配列を調節させる［Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｗ、Ａ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡ ｃｑｕｅｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ、上記 ；５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ　２３１　：１５４９−１５５３　（１９８６）；Ａｒｙａ 　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：６９−７３（１９８５）；５ｏｄｒ ｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１７１−１７３　（１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：４１２−４１７　（１９８６）；Ｆｅｉ ｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ。 、Ｃｅ１ｌ　４６：８０７−８１７（１９８６）；Ｗｏｎｇ−３ｔａａｌ　ｅｔ 　ａｌ、、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、ａｎｄＨｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　 ３：３３−３９（１９８７）　、これらの記載内容は参照により本明細書中に含 めるものとする］。 ＨＩＶ−２及びサル免疫不全ウィルス（Ｓ　Ｉ　Ｖ）からのヌクレオチド配列も 、構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ。 並びにｔａｔ、ｒｅｖ及びｎｅｆ：Ａ節配列を含有する［Ｇｕｙａｄｅｒ、Ｍ、 、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ。 ３２６：６６２−６６９　（１９８７）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、Ｌ、、ｅｔ 　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３２８　：　５４３−５４７　（１９８７）、　これら の記載内容は参照に依り本明細書中に含めるものとする］。 霊長類免疫不全ウィルスＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶのｎｅｆ遺伝子は、 これらのウィルスと他のレトロウィルスとを識別する。これらの霊長類免疫不全 ウィルスに最も密接に関連したレトロウィルスであるビスナウィルス、ヤギ関節 炎及び脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）並びにウマ感染性貧血ウィルス（Ｅ　Ｉ　ＡＶ ）のような有蹄類レンチウィルスは、ｎｅｆ、即ちエンベロープ（ｅｎｖ）の３ ′付近で開始し、３°　ＬＴＲに延びる長開放読み取り枠を指定する領域を欠く 。 ＨＩＶ及びＳＩＶウィルスにより指定されるｎｅｆは、脂肪酸であるミリスチン 酸のアミノ末端及び保存アミノ酸配列での付加による翻訳後修飾を含めた共通の 特徴を有する。ＨＩＶ−１ｎｅｆ遺伝子によりコードされるタンパク質は一般に 、２０６アミノ酸長であるが、しかし鎖によっていくつかの変動が生じる。さら に、ｎｅｆタンパク質に対する抗体は、感染個体及び感染サル中で見いだされる 。これは、ｎｅｆが自然感染において重要な役割を演じることを示唆する。しか しながら、これは他のデータにより否定される。例えば、ｎｅｆタンパク質は、 多数の複製コンピテントＨＩＶ−１単離体中で時期尚早に切頭される。 ＨＩＶ−１の１１１８株に由来するプロウィルスを用いた初期の研究は、ｎｅｔ タンパク質を発現するウィルスはｎｅｆを欠くウィルスよりもわずかに遅＜ＣＤ ４＋Ｔ細胞培養中で複製することを明らかにした［Ｔｅ　ｒｗｉ　］　Ｉ　ｉ　 ｇｅ　ｒ。 Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６０バ５４−７６０（１９８６）、この記 載内容は参照により本明細書中に含めるものとする］。この所見は、ＢＲＵ及び ＮＹ５株由来の同−遺伝子対を含めたウィルスの他のいくつかの対を用いて確証 された［Ｌｕｃｉｗ、Ｐ、、、ｅｔａｌ、、ＰＮＡＳ　８４：１４３４−１４３ ８　（１９８７）　；Ｎｉｅｄｅｒｍａｎ、Ｔ。 Ｍ、、ｅ　ｔ　ａ　Ｉ、、ＰＮＡＳ　８６　：１１２８−１１３２（１９８９） 　；Ａｈｍａｄ、Ｎ、、ｅｔ　ａｌ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４１＋１４８１−１４８５　（１９８８）　；及びＣｈｅｎ ｇ−Ｍｙｅｒ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１６２９−１６ ３２（１９８９）、これらの記載内容は参照により本明細書中に含めるものとす る］。 ｎｅｆ−ウィルスと比較した場合のｎｅｆ　の複製の５〜１０倍の差が、Ｔ細胞 中でのこれらのウィルスの増殖に関して報告されている。ｎｅｆを構造的に発現 するＣＤ４　Ｔ細胞系がＨＩＶ−１の多数の株の増殖を遅らせることも報告され ている［Ｃｈｅｎｇ、ｅｔ　ａｔ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．上記コ。しかし ながら、ｎｅｆ　及びｎｅｆ−ウィルス間のこの差はいつも認められるわけては ない。いくつかの研究では、ｎｅｆ陽性ウィルスはｎｅｆ欠損ウィルスと同様に 又はそれよりわずかに良好に複製した。 多くの研究がヒト免疫不全ウィルス（特にＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）の理解に 費やされてきたけれども、その生活環を十分に理解するには問題があった。これ らのウィルスに感染した個体は一般に長い無症候期間を示し、この間、ウィルス 力価は低く、Ｔ４＋リンパ球のレベルは正常であって、このような時期は一般に 何年にも及ぶ。本ウィルスはさらに、はとんどの動物において感染を引き起こさ ない。チンパンジーは感染し得るが、しかしチンパンジー中のウィルスは感染の 徴候を容易に示さず、非上記少量のタンパク質又はＲＮＡしか作らないので、そ れらを追跡するのは非常に難しい。 したがって、病気の治療のための動物モデルを開発するために、複製コンピテン トＨＩＶプロウィルス、及びそのプロウィルスを用いて広範囲の細胞及び広範囲 の動物に感染を引き起こすのを容易にする配列に対応するヌクレオチドを含有す るベクターを有するのは非常に有用である。 とくに、感染を阻止する薬剤をスクリーニングし、ある種の細胞における感染を 停止又は最小限にし得る薬剤を開発し得るために、広範囲の細胞でｉｎ　Ｖｉｔ ｒＯ及びｉｎ　ｖｉｖ。 でウィルスを追跡し得る系においてこのようなベクターの使用は有用である。 ＨＩＶの病因の異なる側面を調べるための生育可能な動物モデルを開発するに際 して、ウィルスをｉｌ　ｖｉｖｏで追跡し得る系におけるこのようなベクターの 使用も有用である。 ワクチン及び／又は抗体を開発するために、より強力且つ有効な免疫反応を誘発 するために動物の免疫系に対してより可視的な標的を提供するより活動的なウィ ルスを有することも有用状々はここに、ウィルス複製及び感染性に必要なＩ−Ｔ 　Ｉ　Ｖ遺伝子生成物質（ＨＩＶセグメント）を発現するための、ＥＬＩ株の全 構造遺伝子以外のＨＩＶゲノムに対応する十分なスプマウイルスのヌクレオチド を包含し、さらにＨ［ＶのＥＬＩ株のｎｅｆ遺伝子に対応するヌクレオチドの一 配列（ｎｅｆ遺伝子セグメント）を含有するベクターを開発した。好ましくは、 このベクターのＨＩ　Ｖセグメントは、機能的ｖｐｕ遺伝子セグメント又は機能 的ｖｐｒ遺伝子セグメントをも含有する。さらに好ましくは、このベクターのＨ ＩＶセグメントは機能的ｖｐｕ及び機能的ｖｐｒ遺伝子セグメントの両方を含有 する。 第二の態様において、我々はＥＬＩ遺伝子セグメントを包含するベクターを記載 する。好ましくは、このベクターも異種遺伝子を含有する。 本ベクターは広範囲の細胞系をトランスフェクトするためにｉｎ　ｖｉｖｏ及び ｉｎ　ｖｉｔｒｏで用い得る。 図面の簡単な説明 図１は、Ｈ［Ｖゲノム及び調製された一連のベクターの略図である。 図２は、ＨＸＢ　ＥＬＩ　１−ｆｓベクターの一部の略図である。 図３は、ＨＸＢ　ＥＬＩ　２及びＨＸＢ　ＥＬＴ　２−ｆｓベクターの一部の略 図である。 図４は、ＨＩＶセグメント、機能的ｎｅｆ遺伝子、機能的ｖｐｕ遺伝子及び機能 的ｖｐｒ遺伝子を含有するベクターの略図である。 図５は、ＨＸＢ−ＢＨ８ベクターの一部の略図である。 図６は、種々のベクターによる経時的末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）中のｐ２４ 産生のグラフである。 図７は、時間を追った種々のベクターによりトランスフェクトされた単核球／マ クロファージ中のｐ２４産生のグラフである。 図８は、時間を追った種々のベクターによりｌ・ランスフェクトされたＰＢＬ中 のｐ２４産生のグラフである。 本発明の詳細な説明 我々はここに、ウィルス複製及び感染性に必要なＨＩＶ遺伝子生成物質（ＨＩＶ セグメントと呼ぶ）を発現するためのＨＩＶゲノムに対応する十分なスプマウイ ルスのヌクレオチド及びウィルス複製を増強するためのＥ　Ｌ　１株のｎｅｆ遺 伝子に対応するヌクレオチドの一配列（ＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子セグメントと呼ぶ ）を含有するベクターを開発した。 好ましくは、Ｉ］■ＶセグメントはＨＩＶ−１又ハＨＩ　Ｖ　−２ゲノムのヌク レオチドに対応する。さらに好ましくは、ＨＩ　ＶセグメントはＨＩＶ−１ゲノ ムのヌクレオチドに対応する。好ましくは、ＨＩ　Ｖセグメントは）ＩＩＶ−１ の全ＥＬＩ株に対応しない。 対応するという用語は、保存的付加、欠失及び置換が可能であることを意味する 。 ＥＬＩのｎｅｆ遺伝子は、ｅｎｖ読み取り枠の末端の直後にあって３°　ＬＴＲ のＵ３領域の大半を経て延びる、８８２２位置に位置するその開始フトンを有す る。この遺伝子は、約２５〜２７Ｋｂの見掛けの分子量を有するタンパク質をコ ードする。 ｎｅｆ機能についてのほとんどの研究が、原型Ａｍｅｒｉｃａｎ　１１１８株［ Ｇａｌ　ｌｏ、　Ｒ，Ｃ，、ｅｔａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：５００　（１ ９８４）；Ｒａｔｎｅｒ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７　 （１９８５）　）　コ　、　Ｆｒｅｎｃｈ　株　ＬＡＶ　ＢＲＵ［Ｂａｒｒｅ− ３ｉｎｏｕｓｓｉ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２０：８６８（１９８３）；Ｖａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、Ｓ、 、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４０：１９（１９８５）］　（これはｒｌｌＢと約 ９８％相同な配列を共有する）、又はＡｍｅｒｉｃａｎ　５Ｆ−２株［Ｌａｖｙ 、Ｊ。 Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：８４０（１９８４）；５ａｎｃ ｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ、Ｒ，。 ｅｔ　ａｌ、、５ｉｅｎｃｅ　２２７＋４８４　（１９８５）コ（これはＤＮＡ レベルてＩＩＩＢ及びＢＲＵの両方と９０％以上相同である）に由来するクロー ンを用いた。これらはすべて、強力なＴ細胞刺激株である。これに対比して、Ｌ ＡＶ　ＥＬＴは、Ｔ　Ｉ　ＩＢ、５Ｆ−２及びＢＲＵ株と対照的により分岐的な りローンの１つである。本クローンは公知の全ＨＴ　Ｖ調節機能に関して無傷で ある［Ｃｏｈｅｎ、Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、。 Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５３２　（１９８８）；Ｃｏｈｅｎ、ＥＡ、、ｅｔａｌ 、、Ｊ、ＡＩＤＳ、３＋１１　（１９９０）。 Ａｌｉｚｏｎ９Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１．４６：８３（１９８６）、これ らの記載内容はけ参照により本明細書中に含めるものとする］。Ｚａｉｒｉａｎ 単離物から得られたＬＡＶ　ＥＬＩ　Ｆｒｅｎｃｈクローンは、新鮮なＰＨＡ刺 激Ｐ　ＢＭＣを用いて患者の末梢血リンパ球を共培養することにより２４歳の女 性ＡＩＤＳ、１！者から、１９８３年に単離された。 ＬＡＶ　ＥＬＩのｎｅｆ生成物質とｎｅｆについての我々の前研究［Ｔｅｒｗｉ 　Ｉ　］　１ｇｅｒ、Ｅ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、ＪＶｉｒｏｌ、６０ニア５４　 （１９８６）］で用いたＩＩＩＢ由米Ｈｘｏｒｆクローンのｎｅｆ生成物質との 間にはアミノ酸配列（総数２０７のうち）において４７の差異が認められる。 機能的ｎｅｆセグメントを含有する本発明のベクターの調製に際しては、多数の 技術を用い得る。例えば、機能的ｎｅｆ遺伝子を含有するクローン、例えばＬＡ Ｖ　ＥＬＴを用い得る。 標準的技法により、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用により、ＬＡＶ　ＥＬ ＋プロウィルスクローンからこのセグメントを得ることができる。例えば、８５ ０６位置に原ＢａｍＨ［Ｖ部位が及び９６０７位置に５ａｃ１部位がある。この セグメントは全ｎｅｔ遺伝子を含有する。標準技法により、ＥＬＴｎｅｆ遺伝子 セグメントにのみ対応し、他のＥＬＩ遺伝子セグメントのほとんどに対応しない ようこのセグメントを切り取ることができる。例えば、Ｅｃｏ　Ｒ１を、ｎｅｆ 開始コドンから３０塩基対だけ上流にある位１ｔ８７９２に挿入し得る。 ｒＩＩＢ株よりもＥＬＩ株とより相同のｎｅｆ配列を含有する他の）ＴＴＶクロ ーンの１つを用いることもできる。本明細書中で用いた場合、ＩＩＩＢ株よりも ＥＬＩ株とより相同なｎｅｆ配列を基礎にしたこれらのヌクレオチド配列はウィ ルス複製を増強し、ＥＬＩ　ｎｅｆと等価であると考えられる。この特性は、本 発明の開示を基礎にして当業者が容易に確定し得る。あるいは、機能的”ＥＬｒ 　ｎｅｆセグメント”ヌクレオチドセグメントを化学的に合成し得る。本発明の 開示を基礎にした当業者に公知の他の技術を用いてＥＬＩｎｅｆセグメントを調 製してもよい。 本ＥＬＦ　ｎｅｆセグメントは、好ましくは使用する他のＨＩＶ−１又はＨＩＶ −２株から得られるｎｅｆセグメントカ存在し得る位置におけるＨＩＶセグメン トを含有する本明細書に記載のベクター中に挿入し得る。ｎｅｆ遺伝子を有する Ｈ　Ｉ　Ｖセグメントを用いる場合は、ｎｅｆ遺伝子を切り取り、ＥＬＩ　ｎｅ ｆセグメントを挿入し得る。 ＨＩＶセグメントは、複製及び感染に必要な全ＨＴＶ遺伝子に対応する十分な数 のヌクレオチドを含有する。好ましくは、このセグメントは、機能的ｖｐｕ遺伝 子又は機能的ｖｐｒ遺伝子に対応するヌクレオチドをも含有する。さらに好まし くは、それは機能的ｖｐｕ及びｖｐｒ遺伝子の両方に対応するヌクレオチドを含 有する。 例えば、ＨＸＢ２プロウィルス中のｖｐｕ配列はｖｐｕに対する開始コドンを含 有せず、したがって機能的ｖｐｕ遺伝子を発現しない。ＨＴＶセグメントがＨＸ Ｂ２株に対応するヌクレオチドを有する場合は、開始コドンをｖｐｕ配列を有す る枠のすぐ上流及び枠内に挿入し得る。あるいは、機能的ｖｐｕ遺伝子を含有す るＤＮＡの配列を機能的ｖｐｕ遺伝子を含有しない配列に置換し得る。これは、 ヌクレオチド配列中の種々の制限部位を利用して実施し得る。クローンＢＨ８、 Ｂ　Ｈ１０、ＬＡＶＥＬ■等は、機能的ｖｐｕ遺伝子を生しるヌクレオチド配列 を含有する。 ＨＸＢ２株は未熟終止コドンを有し、機能的ｖｐｒタンパク質を発現しない。機 能的であるとは考えられないこのようなりｐｒ遺伝子に対応するＨ［Ｖセグメン トを用いる場合は、ＬＡＶ　ＢＲＵ、ＬＡＶ　ＥＬＴ等のような機能的ｖｐｒ遺 伝子生成物質を発現する株からの機能的ｖｐｕ遺伝子を挿入し得る。 前記のように、ベクターは、当業者に公知の種々の方法により合成し得る。調製 し得る種々の異なるベクターを図１〜４に示す。 ＥＬＴ　ｎｅｆ配列を含有する配列の異なる組み合わせを構築し、ＨＩＶ配列の ３′端内に挿入し得るが、このような配列は複製コンピテントＨＸＢ２　（ＨＸ Ｂｃ２とも呼ばれる）プロウィルスに対応するヌクレオチドを有する。適合性制 限部位は、必要な標準技法により、例えば特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘 発により生成し得る。例えば、ＬＡＶ　ＥＬＩ内のＢ　ａ　ｍ　Ｈ１部位、並び にＬ　Ａ　Ｖ　Ｅ　Ｔ−Ｔ及びＨＸ　Ｂ　２両配列内の新規のＥｃｏ　Ｒ１部位 。好ましくは、制限部位を“挿入”するために作られた各ヌクレオチド変化を用 いる場合、変化は任意の遺伝子によりコードされる予定のアミノ酸配列を変えな いか、又は最小度に保存的アミノ酸変化を引き起こす。構築物はシーケンシング により確証し得る。ＨＸＢ−Ｅｌｌ　１は、位１１８５０６の原ＢａｍＨＴ部位 と同様３°離れて、ｅｎｖ及びｒｅｖ遺伝子配列内の、ｎｅｆの上流の全ＨＸＢ ２配列、並びにその位置と位１９６０７のＳａｃ１部位との開のＬＡＶＥＬＩ配 列から成る。残りの３’　ＬＴＲ配列は、ＨＸＢ２に由来する。図１及び２を参 照して頂きたい。ＨＸＢ−ＥＬ　ｒ−２においては、ＨＸ　Ｂ　２及びＬＡＶＥ ＬＩ配列間の５゛接合部は、ｎｅｆ開始コドンから３０塩基対（ｂ　ｐ）だけ上 流の位置８７９２の新規のＥｃｏ　ＲＴ部位に対して下流に移される。 図１及び３参照。ＨＸ　Ｂ　−Ｅ　Ｌ　ｒ　−２は、このＥｃｏ　Ｒ１部位と同 じく３′離れたＨ　Ｘ　Ｂ　２配列のみを含有する。ＬＡＶＥＬＩ配列は、Ｉ− Ｉ　Ｘ　Ｂ　−Ｅ　Ｌ、　Ｉ　−２の場合と同様に、この位置３°から９６０７ のＳａｃ　］部位まで延びる。これらのベクターは機能的ｖｐｒ又はｖｐｕ遺伝 子を含有しない。しがしながら、機能的遺伝子は上記のように容易に付加し得る 。例えば、位１１２００８のＡｐａ　１部位及び位ｆｆｉ！５８２０のＳａｌ　 １部位間の配列に対応するこれらのベクター中の配列を切り取って、それを機能 的ｖｐｒ読み取り枠を含有する、クローンＬＡＶ　ＢＲＵからの対応する配列と 置換する。 同様に、位ｉ１５８２　ＱのＳａｌ　１部位及び位ｆ１６３８２のｋｐｎ　１部 位間の配列に対応するベクターからの配列を切り取って、機能的ｖｐｕ遺伝子を 含有する、ＢＨＩＯからの対応するセグメントき置換し得る。上記のように、そ の他のストラテジー及びこのストラテジーの変法を、本発明の開示を基礎にして 当業者は用い得る。 ＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子を含有するプロウィルスプラスミド、及び上記のＨＴＶセ グメントベクターは、制限酵素部位の使用によるといった公知の方法によりこの 配列をプラスミド主鎖中に挿入することにより容易に作製し得る。 本明細書中で用いる場合、十分数のヌクレオチドという用語は、特許請求された 機能的能力が失われない限り、付加、欠失及び置換を可能にする。例えば、ウィ ルス複製に換算してｎｅｆ遺伝子の機能的能力を言及する場合には、その結果束 じるウィルスの複製は同−遺伝子性ｎｅｆウィルスによるよりも多くなければな らない。 ベクターを用いて、標準的方法により望ましい細胞をトランスフェクトする。例 えば、リン酸カルシウム同時沈殿法又はＤＥＡＥデキストラン法を用いて、ｉｎ 　ｖｉｔｒｏで細胞をトランスフェクトし得る。あるいは、このベクターを用い て、ｉｎ　ｖｉｖｏで生細胞をトランスフェクトし得る。このような方法は、当 業者には公知である。 本発明のｎｅｆ遺伝子セグメントの使用により、ＨＩ　Ｖ株、例えば末梢血単核 球（ＰＢＭＣ）　、並びに精製−次ヒト単核球又は単核球様細胞系中で十分に複 製しないＨＸＢ２株を得ることができるし、このような細胞系における感染性の 増強が得られる。 理論的に結びつけるつもりはないが、ＨＩＶゲノムの種々の遺伝子間の複雑な一 連の相互作用が認められ、これらは本ウィルスを用いて観察されるより急性の作 用のいくつかに関与し得ると思われる。例えば、ＨＩ　Ｖが感染個体における免 疫反応をかわすことにより提案されたストラテジーのひとつは、大半の感染細胞 内で、ウィルスが休眠状態にあるか又は非常に低レベルで複製する低レベル感染 状態の確立によるものである。したがって、宿主ＤＮＡ中へのウィルスの取り込 みを経てウィルスは安定感染を確立し得る。このような目的を達成するために、 非常に“攻撃的”であるとは見えないように、原ウィルスを最初に注意深く調節 する。本発明のｎｅｆ遺伝子セグメントを取り出して、それを他の株又はＨＩＶ −２ゲノムとともに挿入することにより、いくつかの相互作用を克服し得ると考 えられる。 したがって、ベクターにより構成されるブａウィルスはより攻前駆体はＰＢＭＣ 中であまり複製しなかった。代償的突然変異が、ＨＸＢ２に対する前駆体の３’ ｅｎｖ配列中に生じ、ＰＢＭＣ中で十分に複製し得るウィルスを産生した。ＨＸ Ｂ２ウィルスは、原ｎｅｆ突然変異並びに３’　ｅｎｖ配列における代償的突然 変異を含有する。さらに、３’ｅｎｖ代償的突然変異は、ＢＩ３及びＢＨ１０ｎ ｅｆ遺伝子のような密接に関連したｎｅｔ配列の存在下で増殖に陰性の作用を及 ぼす。この陰性相互作用は、ＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子のような分岐的ｎｅｆ配列に は及ばない。 その結果として、ｎｅｆの外側のＨＩＶの配列はｎｅｆ機能に影響を及ぼす。遺 伝子性配列との相互作用に関してｎｅｆ対立遺伝子に差異が認められる。ＢＩ３ 及びＢＨＩＯｎｅｆは、ＨＸＢ２　３°　ｅｎｖ配列を伴う陰性調節遺伝子であ る。 ＥＬＩ　ｎｅｆは、ＨＸＢ２又はＥＬＴ３’　ｅｎｖ配列を伴う陽性調節遺伝子 である。ＥＬＩ　ｎｅｆは、−次単核球及びマクロファージの増殖のための必須 遺伝子である。したがって、ＨＩＶ株が示す種々の向性を本発明のベクターは示 さない。したがって、このようなベクターを用いて、本株が一般的になし得るよ り広い範囲の細胞を形質転換し得る。 標準的技法を用いて、本ベクターを用いて動物の抗原反応を生じさせ、次いで生 じた抗体を治療に用い得る。 ｎｅｆの簡単なフレームシフト突然変異を含有するクローン化８１部位ＩＤ１ｅ ウイルスはｎｅｆ読み取り枠の復位に関してｉｎ　ｖｉｖｏで戻り復帰体に対す る強い傾向を有するということが報告されている。しばしば提案されるように、 単核球がｉｎ　ｖｉｖｏでのＨｒＶ感染の一次初期標的であるか及び／又は感染 マクロファージが系内のウィルスの大型プールを保持するための重要な長期貯蔵 所を構成する場合に、なぜ無傷ｎｅｆ機能に対する強力な選択圧がｉｎ　ｖｉｖ ｏに存在し、しかし必然的にｉｎ　ｖｉｔｒｏには存在しないかを、即ちＥＬＩ 　ｎｅｆＪｌ伝子により示される同性を我々の発見は説明する。 理論的に結びつけるつもりはないが、異なる種類のＣＤ４−陽性細胞に対する向 性の大きな変化は事実、明瞭なウィルス調節現象である。 このベクターを用いてｉｎ　ＶｉｔｒＯ又はｉｎ　ｖｉｖ。 で細胞をトランスフェクトすると、薬剤をスクリーニングし、ウィルスの病原性 を理解するための系を改良することができる。 このベクターにより形質転換される細胞の範囲はＩＴＩＢ株のような他の実験呈 味を用いた場合よりも広いため、一般的なものより広い範囲の感染細胞における ウィルスの拡散に及ぼす薬剤の作用を調べることができる。 例えば、それを−次細胞培養における試験に用いて、ＥＬＩｎｅｆが単核球中で の抗レベルの複製を可能にする機序を確定し得る。このような情報は、特にウィ ルスの単核球向性株が、免疫学的損傷が明らかであるか否かとは関係なく、中枢 神経系疾患の発症における重要な役割を演じることを示唆する証拠の点で、ＡＩ ＤＳの疾病進行の機序を理解ための極めて重要な関連性の１つである［Ｋｏｙａ ｎａｇｉ、Ｙ、、ｅｔ　ａｔ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：８１９　（１９８７）］。 ある検定において、予定の化合物を細胞又は体液に添加し、その後それらの細胞 を本発明のベクターでトランスフェクトしようと試み得る。多量のベクターを、 このような細胞を形質転換するのに有効であることが予め確定された細胞に添加 する。 その後、その細胞の感染性のレベルを測定して、ウィルスの拡散を防止するに際 しての化合物の有効性を確定する。あるいは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又は１ｎｖｉｖ ｏで本発明のベクターを用いて先ず細胞をトランスフェクトし、その後予定の化 合物を細胞に添加し、次いてウィルスの拡散を防止するに際しての化合物の有効 性を確定する。観察したパラメーターとしては、シンシチウム形成、単一細胞殺 害、Ｒ■Ａにより測定されるようなＨＩＶｐ２４コアタンパク質の上清のレベル 、ＡＩＤＳ患者血清を用いた代謝的標識化ウィルスタンパク質の免疫沈降等が挙 げられる。 ベクターは、好ましくは一次単核球／′マクロファージを用いてｉｎ　ｖｉｔｒ ｏで使用する。 ベクターは、ｉｎ　ｖｉｖｏで細胞を“感染”するために用いてもよい。概して 、ＨＩＶの伝統的実験呈味は、伝統的動物モデル系中では、例えば幾人かの研究 者達がＨＴＶ病原性のあ□　Ｃ る観点に関して生育可能な動物モデル中で発症させようとしている５ＣＩＤ−Ｈ Ｕマウス系においては、非常に不十分に複製した。前記のように、本発明は典型 的実験呈味よりも積極的に一次リンパ球中で複製し、５ＣＩＤ−ＨＵマウスの場 合よりももっと有効に複製するに違いないプロウィルスクローンを生じる。他の 好ましい動物モデルとしては、ヒト以外の哺乳類が挙げられる。このような哺乳 類の好ましい例としては、ウサギ、マウス、らっと、ネコ及び霊長類が挙げられ る。好ましい霊長類としては、チノパンツー及びサルが挙げられる。 感染を確立するために動物に投与するのに必要な有効量のベクターは容易に確定 し得る。例えば、０．１μｇ〜約Ｉ　ＱｍＨのベクター／体重１ｋｇである。投 与は、筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下といったような非経口的投与を含めた任 意の種々の経路が可能である。 “感染″（トランスフェクション）を確立するために必要な量及び条件が分かれ ば、予め選択した化合物の１ｎｖｉｖｏでの有効性を確立するためのモデル検定 の開発が可能になる。標準的手段により、例えば注射によって動物に化合物を投 与する。 その後、感染を正常に確立し、感染が発症するか否かを、そして発症した場合に は感染の程度を測定するために動物を観察するのに十分な量のベクターを投与す る。あるいは、先ず動物における感染を確立するのに十分な量のベクターを投与 し、次いで予め選択した化合物を投与する。その後、ベクターによる“感染”に 及ぼす予選走化合物の作用を測定するために動物を観察する。 別の態様では、ウィルス複製を増強するためのＨＩＶ−１のＥＬＩ株のｎｅｆ遺 伝子に対応する十分数のヌクレオチド（ＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子セグメント）、プ ロモーター配列及びポリアデニル化配列は含有するがヌクレオチド配列をコード する全ＥＬＩは含有しないベクターを調製する。好ましくは、ベクターは、ＬＴ Ｒ配列を含有し、さらに好ましくはＨＩＶＬＴＲ配列を含有する。プロモーター は、ＬＴＲであるか又は別のウィルスプロモーター、例えばＳＬ３プロモーター のような別個のプロモーターであり得る。このベクターは、好ましくは異種遺伝 子を含有する。ある態様においては、異種遺伝子はマーカー遺伝子である。マー カー遺伝子は、当業界で十分公知であって、例えばクロラムフェニコールアセチ ルトランスフェラーゼ（ＣＡ　Ｔ）遺伝子、又はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の ような成長ホルモンである。ベクターは、複製コンピテントＨＩＶプロウィルス を含有するベクターを用いて細胞中に、あるいは複製コンピテントＨｒ　Ｖ、例 えばＨＸＢ２又はＨＸＢ−ＢＩ３によりトランスフェクトされる細胞系中に共ト ランスフェクトされ得る。これにより、ＥＬＩ　ｎｅｆセグメント及び他のウィ ルス遺伝子間の相互作用の分析がさらに可能になる。 このベクターを用いるれば、このようなウィルスにトランスフェクトされる宿主 の範囲も増大するに違いない。 以下の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を理解す るためのものであって、本発明を限定するものではない。 ＨＸ　Ｂ　２　ハ、）（ＩＶ−１１１７）Ｉ　Ｉ　１８株由来の全長感染性プロ ウィルスであって［Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ、Ｇ、、ｅｔ　ａｌ、。 Ｎａｔｕｒｅ　３１６：２６２−２６５　（１９８５）］、各遺伝子における単 一点突然変異の結果としてｎｅｆ、ｖｐｒ及びｖｐｕ遺伝子を欠く。ヌクレオチ ド８５０６にＢａｍＨ１部位が認められ、この位置を種々のプラスミドの調製に 用いた（図１参照）。 適合性制限部位−特にＬＡＶ　ＥＬＩ内のＢ　ａ　ｍ　Ｈｒ部位、並びにＬＡＶ 　ＥＬＩ及びＩ−Ｉ　Ｘ　Ｂ　２両配列内の新規のＥｃ。 Ｒｒ部位を、必要な場合は特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発により生成し た。各々の場合、任意の遺伝子によりコードされる予定のアミノ酸配列を変えな い変化を生じさせた。構築物はシーケンシングにより確証した。 ＨＸＢ−ＥＬＩ　１は、位置８５０６の原Ｂ　ａ　ｍ　ＨＴ部位と同様３“離れ て、ｅｎｖ及びｒｅｖ遺伝遺伝列配列内ｎｅｆの上流の全ＨＸＢ２配列、並びに その位置と位置９６０７のＳａｃ１部位との間のＬＡＶＥＬＩ配列から成る（図 １及び２参照）。残りの３“　ＬＴＲ配列は、ＨＸ　Ｂ　２に由来する。 ＨＸＢ−ＥＬＴ−２においては、ＨＸＢ２及びＬ　Ａ　Ｖ　Ｅ　Ｔ−１配列間の ５″接合部は、ｎｅｆ開始コドンから３０塩基対（ｂ　ｐ）だけ上流の位ｆｆ１ ８７９２の新規のＥｃｏＲＩ部位に対して下流に移される。図１及び３参照。Ｈ ＸＢ−ＥＬ　Ｉ−２は、このＥｃｏ　Ｒ１部位と同しく３′離れたＨＸＢ２配列 のみを含有する。ＬＡＶ　ＥＬＩ配列は、ＨＸＢ−ＥＬ　Ｔ−２（Ｄ場合と同様 に、この位置３゛から９６０７のＳａｃ　１部位まで延びる。 ＥＬＦ配列による置換も、ｒｅｖの二次コードエクソン内、トランスメンブラン タンパク質のカルボキシ末端をコードするｅｎｖ遺伝子のその部分、並びにｎｅ ｆと重複する３゜ＬＴＲのＵ３領域内に変化をもたらした［５ｏｄｒｏｓｋｉ。 Ｊ、Ｇ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３７１：４１２（１９８６）］。した がって、フレームシフトを組換え体のｎｅｆ読み取り枠内に導入して、機能障害 性ｎｅｆ−ＨＸＢ−ＥＬＴ　１−ｎｅｆを含有する二次同一遺伝子クローンを生 成した。４塩基対フレームシフトを、位置８９２８の原Ｘｈｏ１部位を充填する ことによりＨＸＢ−ＥＬ　ｒ−１及び２のｎｅｆコード配列内に導入して、同一 遺伝子ｎｅｆ欠損プロウィルスを生成した。それぞれ図２及び３を参照していた だきたい。 ＨＸＢ−ＢＩ３においては、原Ｘｈｏ１部位の３°末端は、ＢＨ８プロウィルス 由来の配列を含有した。この株は、全ｎｅｆ開放読み取り枠を含有する１１１８ 株であって、元は十　季 ＨＸＢ−ｏｒｆと呼ばれた（図５参照）ｏ　ｖｐｒ　、ｖｐｕＨＸＢ−ＢＩ３− Ｒプロウィルスは、ｖｐｒ−１ｖｐｕ−ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８１，：由来した。 位置２００８のＡｐａ　１部位と位置５８２０のＳａｌ　１部位との間のＨＸＢ −ＢＨ８のプロウィルス配列を、クローンＬＡＶ　ＢＲＵからの対応する配列と 置換した。このセグメントは機能的ｖｐｒ読み取り枠を含む。 次に、５８２０及び位置６３８２のｋｐｎ　１部位間のＨＸＢ−ＢＨ８配列を切 り取って、密接に関連するＴＩＩＢクローンであるＢＨＩＯからの対応するセグ メントで置換した。このセグメントは機能的ｖｐｕ遺伝子を含む。ＨＸＢ−ＥＬ Ｉ　１において同一の置換を行なって、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒを生成した（図 ４参照）。 ＨＸＢ−ＥＬＴ　１−Ｒ配列を、ＥｃｏＲ部位及びＰｖｕ　Ｉ　Ｔ部位間の公知 のプラスミドｐＢＲ３２２中に挿入して、プラスミドＤＦＣＩ−ＨＴを生成した 。これはｐＢＲ３２２主鎖を伴うＨＸＢ−Ｅｌ、、Ｉ　１−Ｒ配列を含有する。 このプラスミドの標本は、ブダペスト条約下で、寄託番号６８３４３号としてＡ ｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ ）に寄託ＬｏｐａｔａＳｅｔ　ａｔ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ。 １２：５７０７−５７１７　（１９８４）；Ｑｕｅｅｎ　ａｎｄＢａｌｔｉｍｏ ｒｅ、Ｃｅ１ｌ　３３ニア４ｌ−７４８（１９８３）；５ｏｄｒｏｓｋｉ、Ｊ、 、ｅｔ　ａｔ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：１５４９−１５５３（１９８６）に記載されているよ うに、各プロウィルスプラスミド１０ｍｇを用いて０日目にＤＥＡＥ−デキスト ラン法により１０７個のＪｕｒｋａｔ細胞をトランスフェクトした。その後、培 養を１２．５ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％ウシ胎仔血清中ウシ保持し、毎日の全培地 変化を生じさせた。各上清のアリコートを、後の検定のために各給餌時間に取っ ておいた。上清のＨＩＶ　ｐ２４コアタンパク質のレベルの他に、シンシチウム 形成及び総細胞数に関して培養をモニタリングした。 Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｏｌ。 ６０．７５４−７６０　（１９８６）に記載されて０るようζこ、各トランスフ ェクトＪｕｒｋａｔ培養のアリコートを代謝的Ｉこ標識化して、免疫沈降用に採 集した。各試料の半分をＡＩＤＳ患者の血清を用いて免疫沈降させた。他の半分 ＋１、ｎｅｆタンパク質抗血清と反応させた。Ｌａ　ｅｍｍ　ｌ　ｉ、Ｕ、に、 。 Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５　（１９７０）ｌ：記載されているよう に、免疫沈降及びポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。 健常血清陰性血液ドナーから得られた淡黄色被膜からのＦｉｃｏｌ１分離により 、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣ培養を、１０％ウシウシ血 清及び抗体並びに２０％Ｐ　ＨＡ状態調節培地を含有するＲＰＭＩ−１６４０中 の２４ｍｍ組織培養ウェル（Ｃｏ　ｓ　ｔ　ａ　ｒ、　ＭＡ）に４×１０６の密 度で植付けた。４８時間培養後、ウィルスを各ウェルに添加した。Ｊ　ＩＪ　ｒ 　ｋ　ａ　を細胞培養のトランスフェクションから滴定ウィルスストックを得た 。ｐ２４　２０ｎｇと等価の感染上清を一次細胞の各ウェルに添加した。感染細 胞培養を一夜インキユベートし、次いて成長培地を注意して各ウェルからデカン トし、新鮮な培地に交換した。最終培地交換後、培養に給餌する前に３日毎にｐ ２４検定用の試料を採集した。市販のＲ１Δキット（Ｄｕｐｏｎｔ、ＮＥＮ）を 用いて、ｐ２４を測定した。 次に、等量の細胞無含有ウィルスを用いて新鮮な活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭ Ｃ）なら精製−次ヒト単核球を上記と同一手段によって感染させた。上清中のｐ ２４コア抗原を測定することにより、各ウィルスの複製を時間を追って検定した 。 単核球は、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上での分別により、ＰＢＭＣから得た。汚染Ｔ細 胞は、ノイラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球を用いてロゼツト化することにより除 去した低密度細胞からのものであった。 単核球集団の純度は、単離単核球のサイドピンスピン細胞標本のイムノペルオキ シダーゼ染色により立証した。Ｌ　ｅ　ｕ　３−Ｍで染色した細胞の９５％以上 、及び〈５％がＬｅｕ　１８（ＣＤ２０）　、Ｌｅｕ　３　（ＣＤ４）又はＬｅ ｕ（ＣＤ８）ｌ：対して陽性であった。４×１０６個の単核球をＰ　８ＭＣ培養 用に上記のように培養し、比較可能な増殖環境を保持した。ウィルスストックを ＰＢＭＣに関して記載されているのと同様に用い、ｐ２４検定用試料を同時に収 穫した。 前記のように、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１を生成するに際して３′ＬＡＶ　ＥＬＩ配列 のｌ、ｌＫｂセグメントを挿入すると、ｒｅｖの二次コードエクソン内、トラン スメンブランタンパク質のカルボキシ末端をコードするｅｎｖ遺伝子のその部分 、並びにｎｅｆと重複する３’　ＬＴＲのＵ３領域内に変化が生じた。 フレームシフトベクターＨＸＢ−ＥＬＦ　１−ｆｓを生成して、機能障害性ｎｅ ｆを含有する二次同一遺伝子クローンを生じた。次に、プロウィルス構築物のこ の対を上記のようにＪｕｒｋａｔ細胞中にトランスフェクトし、ウィルス複製の 動力学的所見を比較した。 ＴＴＴＢ由来ｎｅｆ陽性（ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８）及び陰性（ＨＸＢ２）ウィル スの対も、対照としてトランスフェクトした。上記のように、ＨＸＢ２はｎｅｆ 内に点突然変異を含有し、その結果アミノ酸１２３の後の読み取り枠中に挿入さ れている未熟停止コドンを生しる。この切頭化ｎｅｆタンパク質は機能性でない 。ＨＸＢ−Ｂ）Ｔ８（以前はＨｘ−ｏｒｆと呼ばれた）はこの突然変異を含有せ ず、全長ｎｅｆ生成物質を産生するＥＴｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ、Ｅ、Ｆ、、ｅｔ 　ａｌ、、Ｊ。 Ｖｉ　ｒｏ　１．６０　：　７５４　（１９８６）］。 上清ｐ２４のレベルの遅延は、初期トランスフェクト後にＨＸＢ　２を含有する ものと比較した場合、ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｔ−Ｔ　８でトランスフェクトした培養 に検出された。シンシチウム形成のパターンの顕著な差異も、明らかであった。 トランスフェクト後のＨＸＢ−ＥＬＩ　１由来のウィルスの複製は、事実上ＨＸ 　Ｂ２とは異ならなかった。別の実験ては、Ｔ−Ｔ　Ｘ　Ｂ　−Ｅ　Ｌ　Ｔ　１ によってしめされるウィルス感染の動力学的所見は、ＩＴ　Ｘ　Ｂ　２の場合と 同等であるか又はわずかに増強された。 しかしながら、測定されたすべてのパラメーターにより、同−遺伝子性ｎｅｆ欠 損組換え体プロウィルス（ＨＸＢ−ＥＬＴｌ−ｆｓ）由来のウィルスの複製は顕 著に減衰した。ｎｅｆ陰性ウィルス培養中の上清ｐ２４レベルは、同−遺伝子性 ｎｅｆ！Ｉｔ性ウィルス培養と比較して、この実験において１００分の１に減少 した。ピーク細胞関連ウィルスタンパク質産生もこのウィルス培養中で劇的に減 少したが、これは免疫沈降処理におけるかすかなウィルスバンドで示された。こ れらの測定値は、シンシチウム形成により評価したかあるいは経時的総細胞数の 現象により評価したかに関係なく、感染細胞に及ぼすＨＸＢ−ＥＬ　Ｉ−ｎｅｆ ウィルスの細胞変性作用の劇的な減衰と平行した。同様の結果が反復実験から得 られ、時折ｎｅｆ陽性及びｎｅｆ陰性ＨＸＢ−ＥＬ　Ｉ−１クロ一ン間の動力学 の大きな差異さえ認められた。ｎｅｆ特異性ボリクａ−ナルウサギ血清を用いた 代謝的標識化感染細胞溶解物は、ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８又はＨＸＢ−Ｅｌｌ　１ ウイルスに感染した細胞からの溶解物中の２７Ｋｂ　ｎｅｆタンパク質の存在を 明示した。このバンドはＨＸＢ２又はＨＸＢ−ＥＬＩ　１−ｆｓでトランスフェ クトされた細胞からの溶解物中には認められなかった。 ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８によるトランスフェクトは、機能的ｎｅｆ遺伝子のＨＸ　 Ｂ　２プロウイルスへの導入によりｎｅｆ一対部分よりもＣＤ４　Ｔｍｍ上上ゆ っくりと複製するウィルスが生したという初期の報告を確証した。 ＬＡＶ　ＥＬＴ　ｎｅｆ遺伝子は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中のウィルスの複製に及ぼ す顕著な増強作用を示すと考えられた。この陽性作用は大きく、それとは逆に、 ウィルスのＨＸＢ−ＢＨ８／ＨＸＢ２対に関連して観察されたｒｒｒＢ　ｎｅｆ の陰性作用は小さかった。プロウィルスのＨＸＢ−ＥＬＦ　１対の別々に得られ たクローンを用いた反復実験は、比較可能な結果を生し、ある構築物内の多少能 れた部位での無作為二次変化が結果に関与するという可能性を排除した。 われわれの実験計画における人工生成物質の生成野可能性を最小限にするために 、別のプロウィルス構築物を上記と同様に調製した。動力学的試験も、トランス フェクト化安定Ｔ細胞系に対するものとして、細胞無含有ウィルスで試験した新 たに培養した一次細胞にも及んた。ＨＸＢ−ＥＬＩ　２は、ＨＸＢ−ＥＬｒ　Ｌ より小さなＬＡＶ　ＥＬＩ配列挿入を含有した（図１及び３参照）。８００塩基 対挿入物の３゛末端は同しままであるが、しかし５°末端はｎｅｆ開始コドンに 対する５°をちょうど３０塩基対だけ下流に移動する。ＨＸＢ−Ｅｌｌ　２及び ＨＸＢ２間のｎｅｆタンパク質の予定アミノ酸配列中の４７の差異の他には、Ｈ ＸＢ−ＥＬＩ　２の予定ｅｎｖ生成物質中の単一アミノ酸変化のみが認められる 。位置８５４でのＨＸＢ２ｅｎｖ生成物質中のイソロイシン、即ちｇｐ４１のカ ルボキシ末端前の２残基たけがＨＸＢ−ＥＬＩ　２中のセリンに変換された。そ の他のいかなるコード枠にも変化は認められない。 ＨＸＢ−ＥＬ［２プロウイルスの同一遺伝子ｎｅｆ欠損形態も、上記のようにｎ ｅｆ、ＨＸＢ−ＥＬＴ　２−ｆｓへのフレームンフトの挿入により生成した。　 前記のように、ＨＸＢ２はｎｅｆ、ｖｐｕ　［Ｃｏｈｅｎ、Ｅ、Ａ、、ｅｔ　ａ ｌ、、Ｊ。 Ａｒｏｓ　３：１１　（１９９０）］及びｖｐｒ　［ＡＩ　１ｚｏｎ。 Ｍ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃｅ１ｌ　４６：８３　（１９８６）］遺伝子の 他に、他の２つの調節遺伝子を欠いている。ＨＸＢ−ＢＩ３に由来するＨＸＢ− ＢＩ３−Ｒ（修復用）プロウィルスでは、無傷ｖｐｒ及びｖｐｕ枠は、他のＴＴ ＩＢクローン及び前記のＬＡＶ　ＥＬＩからの配列を用いた組換えにより修復し た（図１参照）。したがって、ＨＸＢ−ＢＩ３−Ｒは）ＴＩＶ遺伝子のすべてに 対して十分に機能的であると予測されるプロウィルスを表わす。ＨＸＢ−ＥＬＴ 　１において同一の組換えを行なって、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒを生成した（図 ４参照）。 したがって、ＨＸＢ−ＢＩ３−Ｒ及びＨＸＢ−ＥＬＴ　１−Ｒは同−遺伝子性で あるが、但し、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒ中の１、ＩＫｂのＬＡ、Ｖ　ＥＬＩ配列 ＋！ＨＸＢ−ＢＨＩ　Ｃ１−Ｒ中の対応するＩＴＩＢ配列に取って代わる。 ＴＩＩＢはＴ細胞系中では非常によく複製するが、しかしＰＢＭＣ中ではあまり 複製せず、特に−次単核球又は単核球用細胞系中では弱い［Ｋｏｙａｎａｇｉ、 Ｙ、ｅｔａｌ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ、２３６：８１９　（１９８７）］。かろうじて検出可能なレベ ルのｐ２４抗原産生が、ＨＸＢ２ウィルスに感染したＰＢＭＣの上清内に観察さ れた（図６参照）。同様に、ＨＸＢ−ＢＩ３及びＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８−Ｒウィ ルスも、ＨＸ　Ｂ　２上のＰＢＭＣ中で有意の活性増大を示さなかった（図６） 。これら３つのいかなるウィルスによる検出可能な複製も、単核球マクロファー ジ培養中には観察されなかった（図７）。 図６及び７はともに、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１（ＥＬＴ−１ｎｅｆ　、中空丸）　、 ＨＸＢ−ＥＬ　Ｉ　２　（ＥＬ　Ｔ−２ｎｅｆ　Ｈ中実矩形）、ＨＸＢ−ＢＩ３ 　（ＢＩ３　ｎｅｆ　。 中空矩形）；ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−ｆｓ（ＥＬＩ−１ｆｓｎｅｆ＋、中実丸）； ＨＸＢ−ＥＬＩ　２−ｆｓ　（ＥＬＩ　−２ｆｓ　ｎｅｆ−、中実三角）及びＨ ＸＢ２（ＨＸＢｃ２ｎｅｆ−、中空三角）でトランスフェクトされた細胞に関す る時間を追ったｐ２４産生を示す。 これに対比して、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１及びＨＸＢ−ＥＬ　１２ウイルスはＰＢＭ Ｃ内で強力な複製を示し、ｐ２４抗原産生の最大レベルは感染後１７及び２０日 回心それぞれ約２６ｎｇ／ｍｌ及び約３３ｎｇ／ｍｌに達した。反復実験では、 ２つのウィルスの活性レベルの一貫した差異は認められなかった。 ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒウィルスは攻撃的でさえあって、ピークウィルス産生レ ベルはＨＸＢ−ＥＬＩ　１又はＥＬＩ　２より３〜５倍高くなった。これは、Ｔ ＴＴＢ　ｎｅｆ配列を含有する任意のウィルスによって得られた最大ウィルス力 価の５０倍以上であった。これに対比して、同一遺伝子ｎｅｆフレーシーフトＨ ＸＢ−ＥＬＩ　１−ｆｓ及びＨＸＢ−ＥＬＩ　２−ｆｓウィルスのいずれかに感 染させた培養中では、上清ｐ２４レベルはわずかに検出限界内又はそれ以下であ った。 ３つのｎｅｆ陽性ＨＸ　Ｂ　−Ｅ　Ｌ　１組換え体ウィルスはすべて、−次単核 球培養内で非常に元気に複製した。例えば、典型的実験におけるＨＸＢ−ＥＬＩ 　１は、感染後２０日回心単核球中で約３５　ｎ　ｇ／ｍ　ｌのピーク産生レベ ルに達した。ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒはまた、他の２つのウィルスより数倍高い 最大力価に達した。ｐ２４は、ＨＸＢ−ＥＬ　Ｉ−ｎ　ｅ　ｆ−欠損同一遺伝子 ウィルスのいずれかで感染させた単核球の上清中には検出されなかった。例えば 図８を参照すると、ＨＸＢ−ＥＬ　１１−Ｒは中空矩形て、ＨＸＢ−ＥＬ　Ｉは 中空三角で、ＨＸ　Ｂ　２は中空丸で表されて、別の典型的実験の結果を示す。 Ｊｕｒｋａｔ、ＰＢＭＣ及び単核球感染から得られた結果はすべて、ＬＡＶＥＬ Ｉ配列を含有しないウィルスと比較して、ＬＡＶ　ＥＬＩ組換え体ウィルスの行 動の劇的な変化を際立たせ、特にこの変化が無傷ＬＡＶＥＬ＋遺伝子の存在を要 することを示す。ｎｅｔコード配列は無傷であったがＩＴＩＢが関与しなかった ＨＸＩ３−ＢＩ３のようなウィルスは、この新規の表現型を示さなかった。 この差異は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中の同一遺伝子ｎｅｆ陽性及びｎｅｆ陰性ウィル スを比較した場合でさえ明白であって、この場合、ＩＩＩＢ　ｎｅｆはウィルス 複製に小陰性作用を発揮し、一方ＬＡＶ　ＥＬＩ　ｎｅｆは大きな陽性作用を生 じるのが認められる。しかしながら、最も驚くべきは、無傷ＬＡＶＥＬＩ　ｎｅ ｆ遺伝子の存在が組換え体ウィルスに単核球細胞に対する新規の向性を付与する ことであって、これもＰ　ＢＭＣにおける活発な複製のためのその能力に反映さ れる。ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒウィルスによる感染単核球中でのウィルス産生の レベルは、おそらく単核球向性のＨＴＶ株に関して報告されたものと同じ高さで ある［Ｋｏｙａｎａｇｉ、Ｙ、、ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３６：８１９ 　（１９８７）。 Ｓｈｗａｒｔｚ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ、８６：７２００（１９８９） 、Ｃｏｌｌｍａｎ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、。 Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７０　：　５７１　（１９８９）］。 おそらく、例えば、３’　ＬＴＲのＵ３領域内の付加的重複要素は、ＬＡＶ　Ｅ ＬＩ組換え体の表現型変化に関与し得るがしかし、ＨＸＢ−ＥＬＴ　２はＨＸＢ −ＥＬＩ　１と同様に単核球中で複製すると考えられるため、ｅｎｖ及びｒｅｖ 遺伝子中に存在するＨＸＢ２及びＨＸＢ−ＥＬＩ　１間の付加的配列差は表現型 に関与するとは思えない。しかしながら、ｎｅｆ欠損ＬＡＶ　ＥＬＩウィルスの 両方を用いて得られた陰性結果から、無傷ＬＡＶ　ＥＬＦ　ｎｅｆが表現型に不 可欠であることは明瞭である。これに対比して、ｖｐｕ陽性、ｖｐｒ陽性ＨＸＢ −ＥＬＩ　１−Ｒウィルスによる一次細胞中のウィルス産生のレベルの約５倍の 増強が、これらの機能を欠く親ＨＸＢ−ＥＬ　１１と比較した場合に認められる 一方、ＨＸＢ−ＢＨ８におけるｖｐｕ及びｖｐｒの復帰は単核球中のこのウィル スによる複製に対する遮断を軽減するためにもＰＢＭＣ中での低レベルの感染を 増強するためにも何もしなかった。以前に報告されているように、これらの因子 の各々は、ウィルス複製を増強するために機能する［Ｃｏｈｅｎ、Ｅ、Ａ、、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ。 ＡＩＤＳ、３　：　１１　（１９９０）、Ａｌ　１ｚｏｎ、Ｍ、、ｅｔａｌ、、 Ｃｅ１ｌ、４６：８３　（１９８６）］。その他の読み取り枠中のコード化変化 を、原ＨＸＢ−ＥＬＴ　１と比較してＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒに導入した一方で 、Ｊｕｒｋａｔ細胞のウィルス感染中のｖｐｕ及びｖｐｒに関して我々が特性化 した作用の大きさは、ＨＸＢ−ＥＬＴ　１−Ｒで感染させたＰＢＭＣ及び単核球 培養の両方で観察されたウィルス力価の増強を説明するのに全く十分である。 異なる型のＣＤ４陽性細胞に対する向性の大きな変動は、事実上明瞭な天然のウ ィルス調節現象であると考えられる。 ｎｅｆがトランスのＨＩＶ　ＬＴＲからの発現を適度に下げ調節し得るという他 の研究者の観察を、我々は首尾よく繰り返した。これは、ｎｅｆ発現ベクター又 はｎｅｆ配列抽出物にフレームシフトを含有する同一遺伝子ベクターと一緒にＨ ＩＶＬＴＲ−ＣＡＴ構築物をＣＯ３−７細胞中に共トランスフェクションするこ とにより達成した。各プラスミドは、複製の５ｖ４０原を包含した。しかしなが ら、同様の結果は、ＨＸＢ２又はＬＡＶ　ＥＬＩからクローン化されたＨＴＶ　 ＬＴＲ要素を用いて、ｎｅｆのどの株が発現中であるかには無関係に得られた。 複製試験とともに、これは下げ調節作用が二次的現象であることを示唆する。 前記の開示の利点により、本発明の概念から逸脱しない限り、本明細書に記載の 実施例の多数の修正及び変更が可能であり、本発明は添付の請求の範囲の範囲及 び精神によってのみ限定されるものであることは、当業者には明らかである。 ｌ＼　／′＼ム ＦＩＧ　＋ 特表千５−５０９２３２　（１４） Ｆ　Ｉ　Ｇ、６ 要　約 複製コンピテントであるために必要なＨＴＶ遺伝子生成物質を発現するための十 分数のヌクレオチドを含有し、さら：こＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子セグメントを含有 するベクターを開示する。これらのベクターを用いて、検定系で使用するための 広範囲の細胞及び宿主をトランスフェクトし得る。 国際調査報告

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の： （ａ）ウイルス複製及び感染性に必要なＨＩＶ遺伝子生成物質即ちＨＩＶセグメ ントを発現するためのＨＩＶゲノムに対応するが、しかしＥＬＩ株からのウイル ス複製及び感染性に必要な遺伝子の全てには対応しない十分数のヌクレオチド； 及び（ｂ）ウイルス複製を増強するためのＨＩＶ−１のＥＬＩ株のｎｅｆ遺伝子 に対応する十分数のヌクレオチド、即ちＥＬＩｎｅｆ遺伝子セグメントを含有す るベクター。
2. ２．ＨＩＶセグメントが機能的ｖｐｕタンパク質を産生するための機能的ＨＩＶ ｖｐｕ遺伝子に対応する十分数のヌクレオチドを含有する請求項１記載のベクタ ー。
3. ３．ＨＩＶセグメントが機能的ｖｐｒタンパク質を産生するための機能的ＨＩＶ ｖｐｒ遺伝子に対応する十分数のヌクレオチドを含有する請求項１記載のベクタ ー。
4. ４．ＨＩＶセグメントが機能的ｖｐｕタンパク質を産生するための機能的ｖｐｕ 遺伝子に対応する十分数のヌクレオチドを含有する請求項３記載のベクター。
5. ５．ＨＩＶセグメントが機能的ｅｎｖタンパク質を産生するための十分数のヌク レオチドに対応するが、ＥＬＩ株のｅｎｖヌクレオチドには対応しない請求項１ 記載のベクター。
6. ６．ＨＩＶセグメントが機能的ｇａｇタンパク質を産生するための十分数のヌク レオチドに対応するが、ＥＬＩ株のｇａｇヌクレオチドには対応しない請求項１ 記載のベクター。
7. ７．ＨＩＶセグメントが機能的ｐｏｌタンパク質を産生するための十分数のヌク レオチドに対応するが、ＥＬＩ株のｐｏｌヌクレオチドには対応しない請求項１ 記載のベクター。
8. ８．ＨＩＶゲノムがＨＩＶ−２ゲノムである請求項１記載のベクター。
9. ９．ＨＩＶセグメントがＨＩＶ−１ゲノムのヌクレオチドに対応する請求項１記 載のベクター。
10. １０．ＨＩＶセグメントが機能的ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖ ｐｕ及びｖｐｒタンパク質を産生するためのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎ ｖ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子、ｔａｔ遺伝子、ｖｐｕ遺伝子及びｖｐｒ遺伝子に対応 する十分数のヌクレオチドを含有する請求項１記載のベクター。
11. １１．以下の： （ａ）ウイルス複製を増強するためのＨＩＶ−１のＥＬＩ株のｎｅｆ遺伝子に対 応する十分数のヌクレオチド、即ちＥＬＩｎｅｆ遺伝子セグメント； （ｂ）プロモーター配列；及び （ｃ）ポリアデニル化配列 を包含するベクターであって、すべてのＥＬＩコード化ヌクレオチド配列を含有 するわけではないベクター。
12. １２．ＬＴＲ配列に対応する十分数のヌクレオチドを含有する請求項１１記載の ベクター。
13. １３．異種遺伝子をも含有する請求項１１記載のベクター。
14. １４．ＨＩＶウイルスによる感染に対して有効な化合物に関するｉｎｖｉｖｏ検 定方法であって、以下の：（ａ）動物に請求項１記載のベクターを、その動物が 感染するのに十分な量で投与し； （ｂ）予定化合物を動物に添加し；そして（ｃ）動物を観察して、ベクターによ る感染に及ぼす予定化合物の作用を確定する 工程から成る方法。
15. １５．ＨＩＶウイルスによる感染に対する化合物の有効性の検定方法であって、 以下の： （ａ）予定化合物を予め選定した動物に添加し；（ｂ）請求項１記載のベクター を、感染を引き起こすのに十分であると確定された量で予め選定した動物に投与 し；そして （ｃ）動物を観察して、ベクターによる感染における予め選定した化合物の作用 を確定する 工程から成る方法。
16. １６．動物がヒト以外の哺乳類である請求項１４記載の方法。
17. １７．哺乳類が霊長類である請求項１６記載の方法。
18. １８．哺乳類が、ウサギ、マウス、ラット、ネコ、チンパンジー及びサルから成 る群から選択される請求項１６記載の方法。
19. １９．動物がチンパンジーである請求項１４記載の方法。
20. ２０．予め選定した動物がヒト以外の哺乳類である請求項１５記載の方法。
21. ２１．哺乳類が霊長類である請求項１５記載の方法。
22. ２２．哺乳類がウサギ、マウス、ラット、ネコ、チンパンジー及びサルから成る 群から選択される請求項１５記載の方法。
23. ２３．予め選定した動物がチンパンジーである請求項１５記載の方法。
24. ２４．ＨＩＶウイルスに対して有効な化合物の検定方法であって、以下の： （ａ）十分な量の請求項１記載のベクターで細胞系をトランスフェクトして感染 培養物を得て； （ｂ）感染培養物に予定化合物を添加し；そして（ｃ）培養物をスクリーニング して、トランスフェクト化培養物に及ぼす化合物の作用を確定する 工程から成る方法。
25. ２５．細胞系が一次単核球である請求項２４記載の方法。
26. ２６．ＨＩＶウイルスによる感染性に対する化合物の有効性の検定方法であって 、以下の： （ａ）予定化合物を細胞の培養物に添加し；（ｂ）細胞の培養物をトランスフェ クトするのに十分であると予め確定された量の請求項１記載のベクターで工程（ ａ）の細胞の培養物をトランスフェクトしょうと試みて；そして（ｃ）培養物を スクリーニングして、培養がトランスフェクトされたかを、そしてトランスフェ クトされた場合には、工程（ｂ）のベクターによるトランスフェクションの程度 を確定する 工程から成る方法。
27. ２７．細胞の培養物が一次単核球の培養物である請求項２４記載の方法。