ES2640113T3 - Método para producir un vector viral para la transferencia génica - Google Patents

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Abstract

Un método para producir un vector de virus paragripal humano de tipo 2 no proliferativo, que comprende las etapas de: co-cultivar un virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F con una célula Vero que tiene el gen F del virus paragripal humano de tipo 2 de tal manera que el gen F se expresa no induciblemente y aislar partículas virales de un sobrenadante del cultivo.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para producir un vector viral para la transferencia genica Campo tecnico Solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad a la Solicitud de Patente Japonesa N.° 2011-025234 presentada el 8 de febrero de 2011, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un metodo para producir un vector viral para la transferencia genica. Antecedentes de la tecnica
El virus paragripal humano de tipo 2 (hPIV2) infecta la mucosa respiratoria humana y puede inducir inmunidad en la mucosa, por lo que se espera encontrar una aplicacion como un vector de vacuna. Con el fin de llevar a la practica este vector, se requiere que el vector viral tenga la capacidad de infectar celulas humanas y no generar virus transmisibles en el cuerpo humano despues de la infeccion (dicho vector se denomina vector no proliferativo). Por lo tanto, se requiere un sistema que pueda infectar primariamente celulas o tejidos, pero que no produzca virus transmisibles en las celulas o tejidos infectados de modo que no provoque infecciones recurrentes. El procedimiento para la construccion de un sistema de este tipo generalmente incluye la supresion parcial de un gen en un genoma viral, la preparacion de celulas que expresan un producto codificado por el gen delecionado y la complementacion in trans del virus defectuoso en las celulas con el producto codificado por el gen eliminado para preparar un vector no proliferativo. Este sistema se ha introducido en virus de ADN tales como adenovirus (por ej., documento WO 94/28152) y virus de ARN tales como retrovirus (por ej., documento WO 2006/084746). Para los virus de la familia Paramyxoviridae a la que pertenece el virus paragripal humano de tipo 2, se ha propuesto un vector viral Sendai defectuoso en el gen F y similares (documento WO 2000/070070). Tambien se ha descrito que una vacuna para la prevencion de la aparicion de la tuberculosis, que utiliza un vector recombinante no proliferativo derivado del virus paragripal humano de tipo 2 mediante la incorporacion de un gen de antfgeno a (Ag85B) de micobacterias tfpicas tales como Mycobacterium kansasii o Mycobacterium bovis BCG (PCT/JP 2010/069435), tiene un alto efecto supresor de la proliferacion de Mycobacterium tuberculosis.
El virus paragripal humano de tipo 2 con deficiencia del gen F no contiene, por sf mismo, la protema de Fusion (denominada en lo sucesivo “protema F”) del virus paragripal humano de tipo 2 que se requiere durante la replicacion viral y la transcripcion despues de la invasion en una celula hospedadora y gracias a la cual se fusiona la envoltura viral con la membrana celular introduciendo una nucleocapside viral en la celula hospedadora de modo que no se pueden formar partmulas virales competentes para la replicacion. Por lo tanto, la preparacion de un vector del virus paragripal humano de tipo 2 no proliferativo que sea defectuoso del gen F en el genoma pero que contenga la protema F en una envoltura vectorial incluye generar celulas que expresen la protema F del virus, cultivar el virus defectuoso en las celulas con el fin de retener la protema F en la envoltura viral en presencia de la protema F complementada in trans por las celulas y con ello la construccion de partmulas virales infecciosas. Las partmulas de virus paragripal humano de tipo 2 recogidas del sobrenadante del cultivo preparado de acuerdo con el sistema de replicacion anterior contienen un genoma que carece del gen F. La incorporacion de genes terapeuticos o genes que codifican antfgenos vacunales en el vector del virus paragripal humano de tipo 2 defectuoso del gen F puede proporcionar partmulas virales utiles como medicamentos.
Debido a que los virus incluyen generalmente protemas de membrana que son citotoxicas, ha sido convencionalmente necesario suprimir la expresion del gen F viral y similares en tiempos normales estableciendo una lmea celular despues de introducir un vector que esta disenado para expresar el gen F y similares bajo el control de un promotor inducible e inducir la expresion del gen F y similares solo cuando el virus se reconstituye despues de infectar celulas cooperadoras que expresan el gen F y similares. En el documento anterior relativo al vector del virus Sendai (documento WO 2000/070070), por ejemplo, se utiliza un sistema en el que el gen F del virus Sendai no se expresa durante la proliferacion de celulas hospedadoras utilizando el sistema inducible Cre-loxP y su expresion se induce tras la infeccion del virus en las celulas por adicion de un adenovirus.
Sin embargo, la etapa de preparacion y adicion de adenovirus hace que la produccion comercial del vector viral sea complicada. Tambien existe el problema de que la etapa de control de la fabricacion del medicamento se complica porque la eficacia de introduccion del gen por un adenovirus no es constante. Ademas, existe el problema de que durante la produccion real del vector viral con el sistema inducible de expresion de la protema de membrana cultivando celulas y replicando partmulas virales, la capacidad de replicacion viral disminuye con un aumento en el numero de pasajes de las celulas hospedadoras debido a la toxicidad de la protema de membrana expresada, de manera que las celulas pierden la capacidad de produccion del virus despues de aproximadamente 5 pasajes.
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Por lo tanto, existe la necesidad de obtener como una celula que pueda expresar un gen que codifica una protema de membrana y similares que es defectuosa en un virus y que permite la replicacion del vector viral defectuoso, un sistema celular que pueda expresar constitutivamente y de forma estable la protema. Tambien existe la necesidad de un sistema de celula hospedadora que tenga tal robustez que sus propiedades sean estables despues del subcultivo.
A continuacion se muestran las referencias citadas en la presente memoria descriptiva. Los contenidos de estas referencias se incorporan aqu por referencia en su totalidad. Sin embargo, no pretende admitir que cualquiera de estas referencias este disponible como “tecnica anterior” a la presente memoria descriptiva.
Documento de patente 1: WO 94/28152 Documento de patente 2: WO 2006/084746 Documento de patente 3: WO 2000/070070 Documento de patente 4: PCT/JP 2010/069435
Divulgacion de la invencion
Un objeto de la presente invencion es proporcionar, como una celula para la proliferacion de un virus deficiente en el gen F del virus paragripal humano de tipo 2, un sistema celular que pueda expresar constitutivamente y de manera estable la protema F del virus paragripal humano de tipo 2 y proporcionar un metodo para producir un virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F utilizando la celula.
Los presentes inventores han encontrado que las celulas Vero tienen excelentes propiedades para ser utilizadas como celulas empaquetadoras que pueden infectarse con un virus deficiente en el gen F del virus paragripal humano de tipo 2 y producir partfculas virales. Se ha encontrado sorprendentemente que las celulas Vero tienen una alta tolerancia a la protema F del virus paragripal humano de tipo 2, no expresan interferones, pueden proliferar de forma estable bajo la expresion constitutiva del gen F del virus paragripal humano de tipo 2 y pueden producir partmulas virales eficazmente.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo para producir un vector de virus paragripal humano de tipo 2 no proliferativo. El metodo incluye las etapas de co-cultivar un virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F con una celula Vero que tiene el gen F del virus paragripal humano de tipo 2 de tal manera que el gen F se expresa no induciblemente y aislar las partmulas virales de un sobrenadante de cultivo.
En una realizacion preferida del metodo de la presente invencion, el virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F tiene un gen en el que se ha incorporado una vacuna o un gen terapeutico.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona una celula Vero que tiene el gen F del virus paragripal humano de tipo 2 de tal manera que el gen F se expresa no induciblemente.
El metodo de la presente invencion permite la produccion efectiva y estable de vectores virus paragripal humano de tipo 2 no proliferativos.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra una estructura de una partmula y un genoma de virus paragripal humano de tipo 2.
La Figura 2 es la confirmacion de la expresion del gen F en celulas Vero que expresan el gen F despues de un cultivo prolongado (aproximadamente un ano) que muestra la retencion de la expresion del gen F.
La Figura 3 muestra una transferencia Western que confirma la expresion de la protema F en celulas Vero introducidas en el gen F.
La Figura 4 muestra una estructura parcial de un plasmido que contiene un ADNc genomico antisentido de un virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F y el gen GFP y.
La Figura 5 muestra una transferencia Western que confirma la expresion de la protema M2 por un hPIV2 deficiente en el gen F que alberga el gen M2.
Mejor modo para llevar a cabo la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para replicar un virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F usando celulas Vero que tienen el gen F del virus paragripal humano de tipo 2 de tal manera que el gen F se expresa no induciblemente.
El virus paragripal humano de tipo 2 pertenece a la familia Paramyxoviridae y tiene un genoma que es un ARN negativo monocistronico de cadena sencilla de aproximadamente 15.000 bases. La Fig. 1 muestra la estructura de la partmula fundamental del virus paragripal humano de tipo 2 (hPIV2). El acido nucleico se une a una protema de la nucleocapside (NP) para formar un complejo ribonucleosido-protema helicoidalmente simetrico (nucleocapside, RNP). Entre las protemas codificadas por el genoma viral, la protema NP, la protema P (fosfo) y la protema L
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(grande) son necesarias para la formacion de la RNP. La protema F (fusion) y la protema HN (hemaglutinina- neuraminidasa) son protemas de la envoltura e importantes para la infeccion celular. La protema M (matriz) es una protema de membrana que soporta la estructura de la envoltura.
El virus paragripal humano de tipo 2 es un virus de ARN que se replica en el citoplasma de las celulas infectadas y, por lo tanto, el gen del virus no se incorpora en los cromosomas de las celulas hospedadoras. Basandose en los hechos de que se sabe que el virus infecta la mucosa respiratoria humana e induce inmunidad a la mucosa por expresion inducible de la IgA y de que no hasta la fecha no se han descrito casos de infeccion grave en adultos, se cree que el virus es significativamente util como una vacuna o vector viral terapeutico.
El virus paragripal humano de tipo 2 modificado para expresar las protemas NP, P y L pero no la protema F puede infectar principalmente una celula; sin embargo, no puede producir partmulas virales infecciosas en la celula. Por lo tanto, tiene la ventaja de que es altamente seguro como vector terapeutico o vacunal.
La celula Vero que expresa la protema F del virus paragripal humano de tipo 2 de la presente invencion es una celula hospedadora util para la produccion de partmulas virales deficientes en el gen F mediante la replicacion del virus deficiente en el gen F del genoma viral.
Las “celulas Vero” son celulas cultivadas derivadas del epitelio renal del mono verde africano que se caracterizan por la ausencia de produccion de interferon y constituyen una lmea celular que es ampliamente utilizada en todo el mundo principalmente para estudios de infeccion de virus y produccion de vacunas. En la presente invencion, pueden usarse celulas Vero comercialmente disponibles.
El “gen F” es un gen que codifica la protema F del virus paragripal humano de tipo 2. Este termino se utiliza en la presente memoria para referirse no solo al ARN genomico viral, sino tambien al ADN y al ARN que tienen secuencias correspondientes o secuencias complementarias de los mismos.
El termino “se expresa no induciblemente” significa que la expresion esta disenada para proceder sin requerir un sistema de expresion inducible y que la expresion prosigue sin ninguna operacion de induccion. El sistema de expresion inducible se refiere a un sistema basado en una combinacion de celula hospedadora/vector y condiciones de cultivo que estan disenadas de manera que no permitan la expresion sin una operacion de induccion o con una operacion de supresion sino que permitan la expresion solo con la operacion de induccion o con eliminacion de la operacion de supresion. En la tecnica se conocen muchos sistemas de expresion inducibles. Expresion no inducible significa expresion que procede sin una operacion de induccion o eliminacion de una operacion de supresion. La expresion no inducible es generalmente expresion constitutiva. Sin embargo, la expresion “no inducible”, tal como se utiliza en la presente memoria, tambien incluye la expresion que puede suprimirse en una fase particular durante la division celular o el ciclo celular y la expresion que puede suprimirse de acuerdo con las condiciones de cultivo, tales como temperatura de cultivo, composicion de un medio o densidad celular.
La celula Vero que expresa la protema F de la presente invencion se produce de la siguiente manera: primero se prepara un vector plasmfdico recombinante que tiene el gen F y un marcador (por ejemplo resistencia a farmacos) y se utiliza para la transfeccion de celulas Vero. La secuencia del gen F es ya conocida, de manera que el vector plasmfdico recombinante se puede producir facilmente incorporando el gen F en un vector plasmfdico apropiado comercializado.
La transfeccion se puede realizar de acuerdo con un metodo convencional usando diversos reactivos de transfeccion comercializados o por electroporacion. A continuacion, los transformantes se identifican utilizando el marcador, los cuales se afslan y se someten a expansion celular. La expresion de la protema F en las celulas Vero transformadas puede analizarse mediante inmunotincion utilizando un anticuerpo; analisis de la expresion en el nivel de protema mediante transferencia Western como se describe en los ejemplos siguientes; o analisis de la expresion en el nivel de ARN por RT-PCR y similares. La expresion de la protema F puede ser confirmada de forma alternativa observando la formacion de sincitio durante la fusion celular de las celulas infectadas. La formacion de sincitio se refiere a la formacion de celulas gigantes que contienen una pluralidad de nucleos celulares debido a la co-expresion de la protema F y otra protema de la membrana viral, una protema HN de union al receptor, en una sola celula que provoca la fusion de celulas adyacentes. Cuando las celulas Vero a las que se espera incorporar el gen F se transfectan con un plasmido que contiene el gen HN y se confirma la formacion de sincitio, se confirma que las celulas expresan funcionalmente el gen F. Por consiguiente, las celulas Vero recombinantes deseables que expresan el gen F pueden ser clonadas.
En otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para producir un vector de virus paragripal humano de tipo 2 no proliferativo deficiente en el gen F. El metodo comprende las etapas de co-cultivar un virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F con la celula Vero de la presente invencion que tiene el gen F del virus paragripal humano de tipo 2 de tal manera que el gen F se expresa no induciblemente y aislar partmulas virales de un sobrenadante del cultivo.
El termino “vector viral” significa una partmula viral en la que se empaqueta un gen a expresar en una celula infectada y un gen genomico vmico.
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El gen genomico vmco que carece del gen F puede construirse a partir de un plasmido que contiene un ADNc antisentido correspondiente al gen genomico completo del hPIV2 usando la tecnica de recombinacion genica convencional suprimiendo un gen F total o parcial o introduciendo una mutacion del codon de parada dentro del gen F. Es preferible que el gen F entero se elimine con el fin de evitar que el vector viral administrado a un sujeto vuelva a adquirir la funcion del gen F debido a la mutacion. El vector viral no proliferativo de acuerdo con la presente invencion esta disenado preferiblemente para incluir un sitio de clonacion para incorporar diversos genes terapeuticos.
Con el fin de producir partmulas virales deficientes en el gen F del gen genomico viral que carece del gen F, se utiliza un plasmido construido para expresar el gen genomico viral que carece del gen F bajo el control de un promotor T7 para la transfeccion de celulas que expresan una ARN polimerasa de T7 junto con cuatro vectores que expresan la protema F y una unidad de polimerasa (protema NP, protema P y protema L) del hPIV2 o para la transfeccion de celulas Vero que expresan el gen F junto con cuatro vectores que expresan la ARN polimerasa de T7 y una unidad de polimerasa (protema NP, protema P y protema L) del hPIv2. Las celulas infectadas se cultivan durante 3 a 6 dfas y las partmulas virales deficientes en el gen F se pueden recoger de un sobrenadante del cultivo.
La infeccion de las partmulas virales deficientes en el gen F asf obtenidas con las celulas Vero que expresan el gen F de la presente invencion permite la produccion de partmulas virales infecciosas que son proliferadas en las celulas, son partmulas virales deficientes en el gen F y tienen la protema F en la envoltura viral.
En una realizacion preferida de la presente invencion, el vector viral basado en el virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F se incorpora con un gen terapeutico o de vacuna, de manera que la infeccion del vector viral no proliferativo obtenido por el presente metodo con una celula diana permite la introduccion del gen terapeutico en la celula diana. El gen terapeutico es un gen que se expresa en una celula infectada y ejemplos del mismo pueden incluir un gen que codifica una protema derivada de mairnferos incluyendo humanos o una parte de los mismos; un gen que codifica un antfgeno tumoral o una parte del mismo; un gen derivado de bacterias o virus; un gen que codifica un anticuerpo terapeutico o una parte del mismo y un fragmento del mismo; y un gen que se obtiene introduciendo una mutacion en el gen descrito anteriormente. El vector viral que contiene el gen derivado de bacterias o virus o un fragmento del mismo es util como vacuna. El gen terapeutico puede incorporarse al gen del virus paragripal humano de tipo 2 de acuerdo con un metodo convencional que utiliza tecnicas de ADN recombinante convencionales y tecnicas de genetica inversa.
El vector viral producido de acuerdo con la presente invencion puede administrarse generalmente a celulas de mamffero incluyendo celulas humanas en forma de una pulverizacion. La pulverizacion se puede preparar de acuerdo con un metodo convencional. Por ejemplo, el pulverizador puede prepararse concentrando opcionalmente un sobrenadante del cultivo que contiene el vector viral, suspendiendolo con un vehnculo o excipiente apropiado en un tampon tal como PBS o solucion salina, opcionalmente esterilizando el mismo a traves de un filtro y similares y luego cargando el mismo en un recipiente esterilizado. La pulverizacion puede contener opcionalmente un estabilizante, un conservante y similares. El vector de expresion asf obtenido puede administrarse a un sujeto por inhalacion.
Las realizaciones descritas con la expresion “que comprende” tal como se usan en la presente memoria, abarcan las realizaciones descritas con la expresion “que consisten esencialmente en” y las realizaciones descritas con la expresion “que consiste en”.
Los contenidos de todas las patentes y referencias citadas explfcitamente en la presente memoria se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad.
Ejemplos
La presente invencion se ilustra adicionalmente a continuacion a modo de ejemplos que no limitan la presente invencion.
Ejemplo 1: Preparacion de celulas Vero que expresan el gen F
En un plasmido que alberga un gen resistente a neomicina (Neo), asf como una secuencia promotora de la p-actina aviar y una secuencia poliA de p-globina de conejo se introdujo el gen F escindido del gen genomico de hPIV2 para construir un plasmido pCXN2-F. Se uso un plasmido de control pCAL-F que se construyo de manera que expresara el gen F a traves del sistema inducible Cre-loxP. Las celulas Vero se transfectaron con estos plasmidos usando Nucleofector de Amaxa.
Las celulas transfectadas se cultivaron en un medio que contema neomicina (1 mg/ml) con el fin de seleccionar las celulas en cuanto a resistencia farmacologica a neomicina. Se aislaron 20 y 27 colonias con resistencia farmacologica a partir de las celulas en las que se introdujo pCXN2-F y de las celulas en las que se introdujo pCAL- F, respectivamente, y se examinaron en cuanto a la expresion del gen F. Las celulas en las que se uso el plasmido pCAL-F se infectaron con adenovirus que contema el gen Cre para eliminar el fragmento genico innecesario en las
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secuencias loxP e inducir la expresion del gen F.
A continuacion, se examino la formacion de sincitio. Se preparo un plasmido SRa-HN que alberga el gen HN y se uso para la transfeccion de las celulas Vero resistentes a neomicina obtenidas usando Nucleofector. Despues de 1 o 2 dfas, las celulas se observaron por microscopfa para determinar la formacion de sincitio y las celulas que forman sincitio se seleccionaron como celulas que expresan el gen F en esta seleccion secundaria. De los 20 clones aislados de las celulas en las que se introdujo pCXN2-F, 12 clones mostraron la capacidad de formar sincitio.
La expresion del gen F a nivel de ARN se midio a continuacion mediante RT-PCR. Como resultado, de los 20 clones aislados de las celulas en las que se introdujo pCXN2-F, 12 clones mostraron la capacidad de formar sincitio, de los cuales 9 clones eran positivos en RT-PCR. De los 27 clones aislados de las celulas en las que se introdujo pCAL-F, 9 clones mostraron la capacidad de formar sincitio, de los cuales 7 clones eran positivos en RT-PCR. Las celulas Vero (2 * 106) en las que el gen F se introdujo a traves de pCXN2-F y cultivadas durante un ano se sometieron a RT-PCR de una sola etapa (QIAGEN). Los cebadores para la PCR se disenaron para obtener un producto de amplificacion por PCR de aproximadamente 550 pb cuando estaba presente el genoma viral deficiente en el gen F. Como resultado, se observaron bandas de productos de amplificacion de PCR de alrededor de 550 pb en la PCR para tres clones diferentes, lo que confirmo ademas que el gen F permaneda para ser expresado (Fig. 2). De este modo, las celulas Vero que expresan constitutivamente el gen F podfan obtenerse con una eficiencia equivalente a la de las celulas Vero que expresan induciblemente el gen F, siendo la expresion estable durante un penodo de tiempo prolongado. Esto indica que las celulas Vero tienen una alta tolerancia a la protema F y pueden proliferar establemente incluso cuando el gen F se expresa constitutivamente durante un penodo de tiempo prolongado.
La expresion de la protema F se examino a continuacion en las celulas Vero que expresan el gen F. Todas las protemas de la membrana celular se biotinilaron utilizando 1 ml de solucion Sulfo-NHS-LC-Biotina al 0,03% en 9,5 x 105 F celulas Vero que expresan el gen y se prepararon 500 p l de lisado celular en condiciones suaves. El lisado celular (300 pl) se sometio a inmunoprecipitacion utilizando 80 pl de un anticuerpo espedfico de la protema F con el fin de recuperar selectivamente y concentrar solo la protema F mediante la union al anticuerpo. La cantidad total de la muestra se sometio a SDS-PAGE y se transfirio a una membrana de PVDF. La protema F en esta etapa ya estaba biotinilada, de modo que formo un complejo de avidina-biotina mediante un metodo de formacion de complejo avidina-biotina. Usando peroxidasa de rabano picante (HRP) conjugada con avidina, la protema F biotinilada se detecto por emision de luz de HRP despues de la reaccion con un reactivo de ECL (Fig. 3).
Ejemplo 2: Construccion del genoma de hPIV2 antisentido deficiente en el gen F
Se preparo un plasmido (hPIV2-AF-GFP) a partir de un plasmido que contema un ADNc antisentido correspondiente al gen genomico entero de hPIV2 en direccion 3' de un promotor T7 suprimiendo completamente la secuencia que contema la region que codifica el gen F total e incorporando una GFP (protema de fluorescencia verde) en un sitio de restriccion Not I (Fig. 4). La construccion se realizo mediante PCR multi-etapa usando cebadores que fueron disenados basandose en las secuencias en sentido 3' y 5' del gen F; un fragmento genico de GFP escindido de un vector que contiene GFP comercializado y el plasmido que contiene el gen genomico de hPIV2 como molde.
Ejemplo 3: Recuperacion de las partfculas virales deficientes en el gen F usando celulas Vero que expresan F
Las celulas que expresan una ARN polimerasa de T7 se transfectaron con el plasmido (hPIV2-AF-GFP) preparado en el Ejemplo 2 usando lipofectamina o FUGENE 6 como un reactivo de transfeccion. Al mismo tiempo, se usaron tambien para la co-transfeccion 4 vectores que expresan la protema F y una unidad de polimerasa (protema NP, protema P y protema L) de hPIV2.
Las celulas se cultivaron durante 3 dfas y se recogio un sobrenadante que se uso para la infeccion de las celulas Vero que expresaban el gen F o celulas Vero normales sin expresion del gen F. Despues de 6 dfas de la infeccion, se examinaron las celulas para determinar la fluorescencia GFP. La fluorescencia GFP se observo en todas las celulas Vero que expresan el gen F, mientras que el numero de celulas Vero normales que emitfan fluorescencia GFP fue mucho menor que el de las celulas Vero que expresan el gen F.
El sobrenadante del cultivo de las celulas Vero que expresan el gen F que emitfa fluorescencia GFP se recogio y se uso para la infeccion de celulas Vero que expresan el gen F distinto en una placa de la que se recogio el sobrenadante. Estos procedimientos se repitieron tres veces antes de la centrifugacion de 1,5 ml del sobrenadante a 1.000 xg durante 1 minuto para eliminar el residuo. El sobrenadante se centrifugo a continuacion a 20.000 x g durante 30 minutos, de los cuales se desecho un sobrenadante y se suspendio un precipitado en 20 pl de agua libre de ARNasa. La suspension (0,5 pl) se sometio a RT-PCR de una etapa (QIAGEN). Los cebadores para la PCR se disenaron de manera que resultara una banda de aproximadamente 400 pb cuando estuviera presente el genoma viral deficiente en el gen F y una banda de aproximadamente 500 pb cuando se insertara el gen de GFP. Como resultado, las bandas de los productos de amplificacion de PCR a aproximadamente 400 pb y aproximadamente 500 pb se observaron en las respectivas reacciones de PCR. Por lo tanto, se sugiere que se recupero el virus PIV2 deficiente en el gen F.
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El sobrenadante del cultivo asf obtenido de las celulas Vero que expresan el gen F que expresan GFP se pasaron a traves de un filtro de 0,45 pm para eliminar el residuo. El sobrenadante del cultivo se sometio a una dilucion en serie de 10 veces y se uso para la infeccion de celulas Vero sin expresion del gen F. Despues de tres dfas, las celulas fueron examinadas en cuanto a la fluorescencia GFP. Como resultado, se observaron celulas que emiten fluorescencia GFP y el numero de celulas positivas para GFP disminuyo proporcionalmente al factor de dilucion. Asf se confirmo que el sobrenadante del cultivo de las celulas Vero que expresan el gen F contema el virus hPIV2 deficiente en el gen F que infecto las celulas Vero sin expresion del gen F. El sobrenadante del cultivo de las celulas Vero sin expresion del gen F no proporciono partfculas virales infecciosas.
La infeccion de las celulas NIH-3T3 de raton con el virus hPIV2 deficiente en el gen F que alberga el gen GFP dio como resultado las celulas NIH-3T3 positivas para GFP. Sin embargo, la eficacia de la infeccion fue menor que la de las celulas Vero.
Ejemplo 4: Preparacion del virus PIV2 deficiente en el gen F que expresa la proteina M2 del virus de la gripe
De la misma manera que en el Ejemplo 2, se construyo un plasmido (hPIV2-AF-M2) incorporando, en un sitio de restriccion Not I del genoma de hPIV2 antisentido deficiente en el gen F, un gen de una proteina M2 (canal ionico M2) que existe en una membrana de la capa lipfdica del virus de la gripe. Las celulas que expresan una ARN polimerasa de T7 se transfectaron con el plasmido (hPIV2-AF-M2) usando lipofectamina o FUGENE 6 como un reactivo de transfeccion de la misma manera que en el Ejemplo 3. Al mismo tiempo, se usaron tambien para co- transfeccion 4 vectores que expresan la proteina F y una unidad de polimerasa (proteina NP, proteina P y proteina L) del hPIV2. El virus se recupero de la misma manera que en el Ejemplo 3 y se uso hPIV2 deficiente en el gen F que contema el gen M2 para la infeccion de las celulas Vero que expresan el gen F (2 x 106). Las celulas se recogieron despues de 2 dfas y se sometieron a transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-M2. En consecuencia, se confirmo la expresion de M2 (Fig. 5). Por lo tanto, se confirmo que el virus PIV2 deficiente en el gen F podfa recuperarse tambien cuando se utilizaba un gen distinto a GFP.
Basandose en los resultados anteriores, se observo que el uso de las celulas Vero que expresan el gen F permitfa la recuperacion del virus hPIV2 no proliferativo deficiente en el gen F y que este virus puede proliferar solo en celulas que expresan el gen F y puede infectar principalmente las celulas sin expresion del gen F sin producir virus infecciosos.
Aplicabilidad industrial
La presente invencion es util para la produccion de vectores virales para terapia genica.

Claims (2)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para producir un vector de virus paragripal humano de tipo 2 no proliferativo, que comprende las etapas de:
    co-cultivar un virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F con una celula Vero que tiene el gen F del virus paragripal humano de tipo 2 de tal manera que el gen F se expresa no induciblemente y aislar partfculas virales de un sobrenadante del cultivo.
    10 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el virus paragripal humano de tipo 2 deficiente en el gen F
    tiene un gen en el que se ha incorporado una vacuna o un gen terapeutico.
  2. 3. Una celula Vero que tiene el gen F del virus paragripal humano de tipo 2 de tal manera que el gen F se expresa no induciblemente.
    15
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