ES2307509T3 - Complejo ribonucleoproteico en paramixovirus. - Google Patents

Abstract

Un complejo que comprende (a) un ARN monocatenario de cadena negativa obtenido a partir de un virus de la familia Paramyxoviridae, en donde dicho ARN se modifica de modo que no exprese al menos una de las proteínas de la envoltura de los virus Paramyxoviridae, y (b) una proteína codificada por dicho ARN monocatenario de cadena negativa que se une al mismo, y en donde el complejo es incapaz de liberar partículas víricas infecciosas.

Description

Complejo ribonucleoproteico en paramixovirus.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un complejo ribonucleoproteico obtenido a partir de paramixovirus y a la utilización del mismo.

Técnica anterior

El paramixovirus es un virus que comprende como genoma ARN de cadena con polaridad negativa. Los vectores víricos de ARN de cadena negativa tienen diversas características, significativamente diferentes de los retrovirus, de los virus de ADN o de los vectores de virus de ARN de cadena positiva. Los genomas o los antigenomas de los virus de ARN de cadena negativa no actúan directamente como ARNm, de modo que no pueden iniciar la síntesis de proteínas víricas y la replicación del genoma. El genoma y el antigenoma de ARN de estos virus está siempre en forma de un complejo ribonucleoproteico (RNP), de modo que apenas causa problemas con las cadenas complementarias tales como interferir con el ensamblaje del genoma al RNP debido a que el ARNm se hibrida con el ARN genómico desnudo, como en el caso de los virus de ARN de cadena positiva. Estos virus comprenden sus propias polimerasas de ARN, realizando la transcripción de los ARNm víricos o la replicación de los genomas víricos empleando un complejo de RNP como molde. Es digno de mención que los virus de ARN de cadena negativa (ARNcn) proliferan sólo en el citoplasma de células hospedadoras, causando la falta de integración de los mismos en los cromosomas debido a que pasan a través de una fase de ADN. Además, se ha observado una recombinación no homóloga entre los ARNs. Estas propiedades se consideran que contribuyen en gran medida a la estabilidad y a la seguridad de los virus de ARN de cadena negativa como vectores que expresan genes.

Entre los virus de ARN de cadena negativa, los presentes inventores han dirigido su atención hacia el virus Sendai (VSe). El virus Sendai es un virus de ARN de cadena negativa y del tipo no segmentado, que pertenece al género paramixovirus y es un virus del tipo parainfluenza de múridos. Este virus se describe como no patógeno hacia los seres humanos. Además, se ha aislado una cepa de laboratorio atenuada (cepa Z) del virus Sendai que sólo induce una neumonía leve en roedores, los hospedadores naturales (J. General Virology (1997) 78, 3207-3215). Esta cepa se ha empleado ampliamente como un modelo en la investigación para estudios a nivel molecular del mecanismo de transcripción-replicación del paramixovirus. El virus Sendai se une a la membrana de la célula hospedadora y causa la fusión de las membranas a través de dos glicoproteínas de la envoltura, la hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y la proteína de fusión (F), y libera de forma eficaz su propia polimerasa de ARN y el genoma de ARN que está en forma de complejo ribonucleoproteico (RNP) en el citoplasma de las células hospedadoras, para realizar en el mismo la transcripción del ARNm vírico y la replicación del genoma (Bitzer, M. y col., J. Virol. 71(7):5481-5486, 1997).

Los presentes inventores han desarrollado un método para recuperar partículas infecciosas del virus Sendai, a partir del ADNc correspondiente al genoma del virus Sendai. En este método, por ejemplo, después de infectar células LLC-MK2 con el virus vaccinia que codifica la polimerasa T7 de ARN, las células se transfectan también simultáneamente con tres plásmidos que codifican el antigenoma del virus Sendai, bajo el control del promotor de T7, la nucleoproteína (NP) del virus Sendai y las proteínas (P y L) de las polimerasas de ARN, respectivamente, para formar complejos de ribonucleoproteínas antigenómicas (RNPs) como elementos intermedios en la replicación del genoma vírico en las células, y a continuación se replican los RNPs genómicos biológicamente activos (funcionales), capaces de iniciar la transcripción de proteínas víricas y el ensamblaje de las partículas víricas. Cuando se recupera el virus Sendai de tipo silvestre, estos RNPs genómicos funcionales se inyectan en el saco corioalantoideo de huevos de pollo junto con células reconstituidas para realizar la multiplicación de los viriones (Kato, A. y col., Genes Cells 1, 569-579
(1996)).

Sin embargo, el virus Sendai es conocido por incorporar proteínas de la célula hospedadora en el mismo, durante la formación del virión (J. Biol. Chem. (1997) 272, 16578-16584), y dichas proteínas incorporadas pueden ser la causa posible de antigenicidad y toxicidad cuando se transfieren a las células diana.

Por ello, a pesar de la necesidad obvia que existe de emplear RNP como vectores, sin utilizar partículas del virus Sendai, no se ha descrito ningún uso de este tipo.

Descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es aislar un RNP obtenido a partir de un virus perteneciente a la familia Paramyxoviridae y proporciona su uso como vector. En una realización preferida, se proporcionan vectores que comprenden un complejo de RNP con un compuesto catiónico.

Los presentes inventores han preparado RNPs a partir de virus Sendai, pertenecientes a la familia Paramyxoviridae y han investigado su uso como vector.

Específicamente, en primer lugar, los presentes inventores han preparado un ADNc genómico del virus Sendai carente del gen para la proteína F, que es una de las proteínas de la envoltura del virus, de modo que no se producen virus Sendai de tipo silvestre en las células diana, y además construyeron un vector para expresar el ADNc en células (el gen GFP se inserta en el vector como un gen informador en el sitio carente del gen F). El vector preparado de ese modo, se transfirió a células que expresaban las proteínas necesarias para la formación de RNP para producir una RNP que comprendiera un genoma carente del gen F. A continuación, el RNP se retiró de las células repitiendo ciclos de congelación descongelación de las células, se mezclaron con un reactivo para lipofección catiónico y se transfirieron a células que expresaban el gen F. Como resultado, la expresión de GFP como agente informador se detectó en las células a las que se había transfectado RNP.

Es decir, los presentes inventores tuvieron éxito no sólo preparando RNP funcional a partir del virus Sendai, sino que también encontraron una posibilidad para expresar un gen foráneo comprendido en RNP, incluso cuando este RNP se transfería a células diana utilizando, por ejemplo, un reactivo de transferencia génica tal como un liposoma catiónico, en lugar de sólo infectar las células con RNP como elemento constituyente del virus Sendai, y realizando de este modo esta invención.

Es decir, esta invención se refiere a RNP obtenido a partir de paramixovirus y a su utilización como vector, más específicamente a:

(1)

un complejo que comprende (a) un ARN monocatenario de cadena negativa, obtenido a partir de un paramixovirus, en donde dicho ARN se modifica para que no exprese al menos una de las proteínas de la envoltura de los virus Paramyxoviridae y (b) una proteína codificada por dicho ARN monocatenario y de cadena negativa y que se une al mismo;

(2)

un complejo de acuerdo con (1), en donde dicho ARN monocatenario de cadena negativa, se modifica de modo que exprese las proteínas NP, P y L, pero no las proteínas F, HN o M, o cualquier combinación de las mismos;

(3)

un complejo de acuerdo con (1) o (2), en donde dicho ARN monocatenario de cadena negativa se obtiene a partir del virus Sendai;

(4)

un complejo de acuerdo con cualquiera de (1) a (3), en donde dicho ARN monocatenario de cadena negativa, codifica adicionalmente un gen foráneo;

(5)

una composición para la transferencia de genes que comprende un complejo de acuerdo con (4) y un lípido catiónico;

(6)

una composición para la transferencia de genes que comprende un complejo según (4) y un polímero catiónico; y

(7)

un método para expresar un gen foráneo en una célula, que comprende la etapa de introducir la composición para la transferencia génica de acuerdo con (5) o (6) en una célula, con la condición de que la identidad de la línea germinal de seres humanos no se modifique.

"Genes NP, P, M, F, HN y L" de virus que pertenecen a la familia Paramyxoviridae se refieren a genes que codifican la nucleocápsida, las fosfoproteínas, las proteínas de la matriz, de la fusión, la neuraminidasa de hemaglutinina y las proteínas grandes, respectivamente. Los genes respectivos de virus pertenecientes a las subfamilias de la familia Paramyxoviridae se presentan en general del modo siguiente. Gen NP se describe generalmente también como el "gen N".

1

Los números de entrada en la base de datos para las secuencias de nucleótidos de los genes del virus Sendai, clasificados como Respirovirus de la familia Paramyxoviridae son; M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046 y X17218 para el gen NP, M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007 y X17008 para el gen P, D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584 y X53056 para el gen M, D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152 y X02131 para el gen F, D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808 y X56131 para el gen HN, y D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587 y X58886 para el gen L.

La presente invención se refiere a un complejo ribonucleoproteico (RNP) obtenido a partir de virus pertenecientes a la familia Paramyxoviridae que carece de cualquiera de los genes de la envoltura. El complejo se modifica de modo que se no produzca el virus que tiene la proteína de la envoltura en las células diana en ausencia de la proteína de la envoltura. Es decir, el RNP de acuerdo con esta invención comprende (a) un ARN monocatenario de cadena negativa que se origina en paramixovirus, modificado de modo que no se exprese al menos una de las proteínas de la envoltura de los virus Paramyxoviridae (b) una proteína codificada por dicho ARN monocatenario de cadena negativa y que se une al mismo.

Las proteínas capaces de unirse a un ARN monocatenario de cadena negativa, son proteínas que se unen directa y/o indirectamente al ARN monocatenario de cadena negativa para formar un complejo de RNP con el ARN monocatenario de cadena negativa. En general, el ARN monocatenario de cadena negativa (ARN genómico) del paramixovirus se une a las proteínas NP, P y L. El ARN contenido en este RNP sirve como molde para la transcripción y la replicación del ARN (Lamb, R. A., y D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae: The viruses and their replication, págs. 1177-1204. En Fields Virology, 3ª ed., Fields, B. N., D. M. Knipe y P.M. Howley y col. (compiladores), Raven Press, Nueva York, N. Y.). Los complejos de esta invención incluyen los que comprenden ARNs monocatenarios y de cadena negativa que se originan en los paramixovirus y las proteínas que también se originan en los paramixovirus que se unen a los ARNs. Los complejos de esta invención son complejos de RNP que comprenden, por ejemplo, ARN monocatenario de cadena negativa al cual se unen estas proteínas (proteínas NP, P y L). En general, los complejos de RNP de los paramixovirus son capaces de autorreplicación autónoma en las células hospedadoras. Por tanto, los RNPs transferidos a células intracelularmente, proliferan para incrementar el número de copias del gen (el ARN contenido en el complejo de RNP), conduciendo de este modo a un alto nivel de expresión de un gen foráneo, a partir del RNP que es portador del gen foráneo. Los vectores de esta invención son preferentemente los que son capaces de replicar el ARN comprendido en los complejos (RNP) en células transfectadas.

El origen de los complejos de RNP de esta invención no está limitado, mientras que sea un virus de la familia Paramyxoviridae, pero el virus Sendai que pertenece al género Paramyxovirus, se prefiere especialmente. Además del virus Sendai, los RNPs de esta invención se pueden obtener a partir del virus del sarampión, del virus de la parainfluenza de simios (SV5) y del virus de la parainfluenza humana de tipo 3, sin embargo, el origen no se limita a los anteriores.

Los ARNs monocatenarios de cadena negativa contenidos en los RNPs de esta invención, se construyen de modo que inhiban la expresión de al menos una de las proteínas de la envoltura de los virus Paramyxoviridae. Ejemplos de proteínas de la envoltura, cuya expresión está inhibida, son, la proteína F, la proteína HN o la proteína M, o cualquier combinación de las mismas. Los ARNs monocatenarios de cadena negativa se construyen de modo que se expresen las proteínas NP, P y L que sean necesarias para la formación de los RNPs. Los ARNs monocatenarios de cadena negativa contenidos en los RNPs de esta invención, se pueden modificar, por ejemplo, de modo que se expresen las proteínas NP, P y L pero no las proteínas F y/o HN.

En el caso del virus Sendai (VSe), el genoma del virus silvestre tiene aproximadamente 15.000 nucleótidos de tamaño y la cadena negativa comprende seis genes que codifican las proteínas de NP (nucleocápsida), P (fosfo), M (matriz), F (fusión), HN (neuraminidasa de hemaglutinina) y L (grande), alineadas en una fila siguiendo a la región líder corta 3' y una región remolque 5' en el otro extremo. En esta invención, este genoma se puede modificar de modo que no exprese las proteínas de la envoltura, diseñando un genoma que carezca de cualquiera de los genes F, HN y M o cualquier combinación de los mismos. Se prefiere la carencia del gen F o del gen HN, o de ambos. Puesto que estas proteínas no son necesarias para la formación del RNP, los RNPs de esta invención se pueden preparar transcribiendo este ARN genómico (la cadena negativa o la positiva) en presencia de proteínas NP, P y L. La formación del RNP se puede realizar, por ejemplo, en células LLC-MK2 o similares. Las proteínas NP, P y L se pueden proporcionar introduciendo en células vectores de expresión que sean portadores de los genes respectivos para estas proteínas (véanse los ejemplos). Cada gen se puede incorporar también en los cromosomas de células hospedadoras, con la condición de que la identidad de la línea germinal de seres humanos no se modifique. Los genes NP, P y L que se tienen que expresar para la formación de RNP, no tienen que ser completamente idénticos a los genes codificados en el genoma contenido en RNP. Es decir, las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por estos genes no tienen que ser idénticas a las de las proteínas codificadas por el genoma de RNP, mientras que se puedan unir al ARN genómico y sean capaces de replicar el RNP en las células, y pueden tener mutaciones o se pueden reemplazar con un gen homólogo procedente de otros virus. Una vez que se ha formado un RNP, los genes NP, P y L se expresan a partir de este RNP, para replicar el RNP de forma autónoma en las células.

Para reconstituir y amplificar un RNP en las células, el RNP se transfiere a células (células cooperadoras) que expresan proteínas de la envoltura, cuya expresión se inhibe modificando el ARN monocatenario de cadena negativa contenido en el RNP, o el RNP se puede reconstituir en esas células. Por ejemplo, para amplificar el RNP a partir de ARN monocatenario de cadena negativa que se he modificado de forma que no exprese el gen F, la proteína F se dispone de modo que se exprese junto con las proteínas NP, P y L en las células. De este modo, se construye un vector vírico que conserva las proteínas de la envoltura y se amplifica a través de su infección en células cooperadoras.

Además, también es posible emplear proteínas de la envoltura que sean diferentes de las que se ha inhibido la expresión, modificando el ARN monocatenario de cadena negativa. No hay una limitación particular sobre el tipo de tales proteínas de la envoltura. Un ejemplo de otras proteínas de la envoltura vírica es la proteína G (VSV-G) del virus de la estomatitis vesicular (VSV). Los complejos de RNP de esta invención se pueden amplificar, por ejemplo, empleando células que expresan la proteína G (VSV-G) de VSV.

Los complejos de esta invención se pueden preparar generalmente (a) introduciendo un vector de ADN que codifica ARN monocatenario de cadena negativa, obtenido a partir de paramixovirus, que se ha modificado de modo que no exprese al menos una de las proteínas de la envoltura vírica de los virus Paramyxoviridae, o una cadena complementaria de dicho ARN, en células (células cooperadoras) que expresan proteínas de la envoltura para expresar los ARNs, y (b) cultivando las células para recuperar los complejos de RNP a partir del material sobrenadante del cultivo o de extractos celulares. Mediante la coexpresión de las proteínas NP, L y P al mismo tiempo que se realiza la expresión del ADN del vector, se forman los RNPs y se construye un virus que tiene las proteínas de la envoltura.

El ADN del vector que se va a expresar en las células cooperadoras, codifica ARN monocatenario de cadena negativa (cadena negativa) o su cadena complementaria (cadena positiva), contenido en los complejos de esta invención. Aunque la cadena que se va a transcribir dentro de las células puede ser una cadena positiva o negativa, es preferible disponerlo de forma que se transcriba la cadena positiva para mejorar la eficacia de la reconstitución del complejo. Por ejemplo, el ADN que codifica el ARN monocatenario de cadena negativa o su cadena complementaria, se une aguas abajo a un promotor de T7 que se va a transcribir en ARN con la polimerasa de ARN de T7.

Por ejemplo, un virus que comprende un complejo de RNP se puede reconstituir mediante la transfección a las células hospedadoras de un plásmido que expresa un genoma recombinante del virus Sendai, que carece de los genes de la envoltura, junto con un vector que expresa la proteína que falta en la envoltura y los vectores de expresión de las proteínas NP, P/C y L. Alternativamente, el complejo de RNP se puede preparar empleando, por ejemplo, células hospedadoras que tienen el gen F incorporado en sus cromosomas. Las secuencias de aminoácidos de estos grupos de proteínas aportadas desde el exterior del genoma vírico no es necesario que sean idénticas a las obtenidas a partir del virus. Mientras que estas proteínas sean igualmente activas o más activas que las proteínas de tipo silvestre en la transferencia de ácidos nucleicos a las células, los genes que codifican estas proteínas se pueden modificar introduciendo una mutación o sustituyendo con genes homólogos procedentes de otros virus. Ya que se conoce en general, que el cultivo a largo plazo de células hospedadoras puede ser a veces problemático debido a la citotoxicidad y a la actividad que altera la forma celular de las proteínas de la envoltura, se pueden disponer de modo que se expresen sólo cuando el vector esté reconstituido bajo el control de un promotor inducible (véanse los ejemplos).

Una vez formado el RNP o el virus que comprende el RNP, se pueden amplifica los complejos de esta invención introduciendo de nuevo este RNP o virus en las células cooperadoras mencionadas anteriormente y cultivándolas. Este proceso comprende las etapas de (a) introducir el complejo de esta invención o el vector vírico que comprende el complejo, en células que expresan proteínas de la envoltura, y (b) cultivar las células y recuperar partículas de virus a partir del material sobrenadante del cultivo o de los extractos celulares.

El RNP se puede introducir en células en forma de un complejo formado junto con, por ejemplo, lipofectamina y liposoma policatiónico. Específicamente, se puede utilizar una variedad de reactivos para transfección. Ejemplos de los mismos son DOTMA (Boehringer), SuperFect (QIAGEN, nº 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer nº 1811169), etc. La cloroquina se puede añadir para evitar que el RNP se descomponga en endosomas (Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3015).

Una vez que el vector vírico se ha construido de esta forma en las células hospedadoras, se puede amplificar adicionalmente los complejos de esta invención o el vector vírico que comprende los complejos, mediante el cocultivo de estas células con células que expresan las proteínas de la envoltura. Tal y como se describe en el Ejemplo 12, un ejemplo preferible es el método de células de recubrimiento que expresan proteínas de la envoltura sobre células que producen virus.

Los complejos de esta invención, por ejemplo, pueden comprender un gen vírico codificado en ARN en el complejo que se ha modificado para reducir la antigenicidad o mejorar la eficacia de la transcripción y de la replicación del ARN.

Los complejos de esta invención pueden incluir ARN que codifica un gen foráneo en su ARN monocatenario de cadena negativa. Como gen foráneo se puede emplear cualquier gen que se desee expresar en las células diana. Por ejemplo, cuando se desea una terapia génica, se inserta un gen para tratar la enfermedad en cuestión, en el ADN del vector que codifica el ARN contenido en los complejos. En este caso, cuando un gen foráneo se inserta en el ADN del vector, por ejemplo, el ADN del vector del virus Sendai, se prefiere insertar una secuencia que comprende un número de nucleótidos que sea múltiplo de seis, entre la secuencia de terminación de la transcripción (E) y la secuencia de iniciación de la transcripción (S), etc. (Journal of Virology, vol. 67, nº 8, 1993, págs. 4822-4830). El gen foráneo se puede insertar antes o después de cada uno de los genes víricos (genes NP, P, M, F, HN y L) (véanse los ejemplos). La secuencia E-I-S (secuencia de iniciación de la transcripción -secuencia intercalada- secuencia de terminación de la transcripción) o una porción de la misma, se inserta de forma adecuada antes o después de un gen foráneo, de modo que no interfiera con la expresión de los genes anteriores o posteriores al gene foráneo. El nivel de expresión del gen foráneo insertado se puede regular por el tipo de secuencia de iniciación de la transcripción añadida aguas arriba del gen foráneo, así como el sitio de la inserción del gen y de las secuencias de nucleótidos antes y después del gen. Por ejemplo, en el virus Sendai, cuanto más cercano sea el sitio de inserción al extremo 3' del ARN de cadena negativa (en la disposición génica sobre el genoma del virus de tipo silvestre, el más cercano es el gen NP), mayor será el nivel de expresión del gen insertado. Para asegurar un alto nivel de expresión de un gen foráneo, es preferible insertar el gen foráneo aguas arriba del gen NP (el lado 3' en la cadena negativa), o entre los genes NP y P. Por el contrario, cuanto más cercano sea el sitio de inserción al extremo 5' del ARN de cadena negativa (en la disposición génica sobre el genoma del virus de tipo silvestre, el más cercano es el gen L), menor será el nivel de expresión del gen insertado. Para inhibir la expresión de un gen foráneo hasta un nivel bajo, el gen foráneo se inserta, por ejemplo, en el lado 5' más alejado de la cadena negativa, es decir, aguas abajo del gen L en el genoma del virus de tipo silvestre (el lado 5' adyacente al gen L en la cadena negativa) o aguas arriba del gen L (el lado 3' adyacente al gen L en la cadena negativa). Para facilitar la inserción de un gen foráneo, se puede diseñar un sitio de clonación en la posición de la inserción. El sitio de la clonación se puede disponer para que sea, por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción. Los fragmentos del gen foráneo se pueden insertar en el sitio de las enzimas de restricción en el ADN del vector que codifica el genoma. El sitio de clonación se puede disponer para que sea un sito de denominado de multi-clonación, que comprende una pluralidad de secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. El genoma del ARN en los complejos de esta invención se puede recuperar en los sitios de inserción de los genes foráneos distintos a los descritos anteriormente.

Los vectores víricos comprenden el complejo de RNP, obtenido a partir del virus Sendai recombinante portador de un gen foráneo, se pueden construir del modo siguiente, de acuerdo con, por ejemplo, la descripción en "Kato, A. y col., 1997, EMBO J. 16:578-587" y "Yu, D. y col., 1997, Genes Cells 2:457-466".

En primer lugar, se prepara una muestra de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de ADNc de un gen foráneo deseado. Se prefiere que la muestra de ADN se pueda identificar electroforéticamente como un plásmido aislado, en concentraciones de 25 ng/\mul o superiores. Un caso en el que un gen foráneo se inserta en un ADN que codifica el genoma vírico, utilizando el sitio de NotI, se describirá a continuación como un ejemplo. Cuando el sitio de reconocimiento de NotI está incluido en la secuencia de nucleótidos del ADNc diana, es preferible delecionar el sitio NotI antes, modificando la secuencia de nucleótidos mediante el empleo de mutagénesis específica del sitio y un método tal que no altere la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc. A partir de esta muestra de ADN, se amplifica y se recupera el fragmento génico deseado mediante PCR. Para tener los sitios NotI en ambos extremos del fragmento de ADN amplificado y para añadir adicionalmente una copia de la secuencia de terminación de la transcripción (E), una secuencia intercalada (I) y una secuencia de inicio de la transcripción (S) (secuencia EIS) del virus Sendai en un extremo, se prepara una secuencia de ADN sintética del lado directo y una secuencia de ADN sintético del lado inverso (cadena no codificante), como una pareja de cebadores que contiene la secuencia del sitio de corte para la enzima de restricción NotI, la secuencia de terminación de la transcripción (E), la secuencia intercalada (I), la secuencia de iniciación de la transcripción (S) y una secuencia parcial del gen deseado.

Por ejemplo, para asegurar el corte con NotI, la secuencia de ADN sintético del lado directo, se dispone de forma que se seleccionen dos o más nucleótidos cualquiera (preferentemente 4 nucleótidos, excluyendo GCG y GCC, secuencias que originan en NotI el sitio de reconocimiento, más preferentemente ATCC) sobre el lado 5' del ADN sintético, se añade el sitio de reconocimiento de NotI "gcggccgc" a su lado 3' y al lado 3' del mismo, se añaden 9 nucleótidos cualesquiera deseados o 9 nucleótidos más un múltiplo de 6 nucleótidos como secuencia espaciadora y, al lado 3' del mismo, se añade un ORF equivalente a aproximadamente 25 nucleótidos que incluye el codón de iniciación ATG del ADNc deseado. Es preferible selecciona aproximadamente 25 nucleótidos a partir del ADNc deseado, como la secuencia de ADN sintético del lado directo, de modo que tenga G o C como nucleótido final en su extremo 3'.

En la secuencia de ADN sintético del lado inverso, se seleccionan dos o más nucleótidos cualesquiera (preferentemente 4 nucleótidos, excluyendo las secuencias GCG y GCC que originan el sitio de reconocimiento de NotI, más preferentemente ACTT) a partir del lado 5' del ADN sintético. El sitio de reconocimiento de NotI "gcggccgc" se añade a su lado 3' y a su lado 3' adicional, se añade un oligo ADN como fragmento de inserción para ajustar la longitud. Este oligo ADN se diseña de modo que el número total de nucleótidos que incluyen el sitio de reconocimiento de NotI "gcggccgc", la secuencia complementaria de ADNc y la secuencia de nucleótidos EIS del genoma del virus Sendai que se origina en el virus descrito a continuación, sea un múltiplo de seis (la denominada "regla del seis"; Kolakofski, D. y col., J. Virol. 72:891-899, 1998). Además del lado 3' del fragmento insertado, se añade una secuencia complementaria a la secuencia S del virus Sendai, preferentemente 5'-CTTTCACCCT-3', la secuencia I, preferentemente 5'-AAG-3' y una secuencia complementaria a la secuencia E, preferentemente 5'-TTTTTCTTACTACGG-3' y además al lado 3' del mismo, se selecciona y se añade una secuencia complementaria equivalente a aproximadamente 25 nucleótidos, contados en la dirección inversa, desde el codón de terminación de la secuencia de ADNc deseada, cuya longitud se ajusta para que tenga G o C como nucleótido final, como extremo 3' del ADN sintético del lado inverso.

La PCR se puede realizar de acuerdo con el método usual, por ejemplo, con polimerasa ExTaq (Takara Shuzo). Preferentemente, la PCR se realiza empleando la polimerasa Vent (NEB) y los fragmentos deseados amplificados de este modo, se digieren con NotI, a continuación se insertan en el sitio de NotI del vector del plásmido pBluescript. Las secuencias de nucleótidos de los productos de la PCR obtenidos de este modo, se confirman con un secuenciador para seleccionar un plásmido que tenga la secuencia correcta. El fragmento insertado se escinde del plásmido utilizando NotI y se clona en el sitio de NotI del plásmido portador del ADNc genómico que carece de genes de la envoltura. Alternativamente, también es posible obtener el ADNc del virus Sendai recombinante, insertando directamente el fragmento en el sitio de NotI sin la mediación del vector del plásmido pBluescript.

También es posible transcribir un vector de ADN que codifica el genoma del virus en tubos de ensayo o en células, reconstituir el RNP con las proteínas víricas L, P y NP y producir el vector vírico que comprende este RNP. La reconstitución del virus a partir del vector de ADN se puede realizar según los métodos conocidos en la técnica, empleando células que expresan proteínas de la envoltura (documento WO97/16539 y 97/16538: Durbin, A. P. y col., 1997, Virology 235:323-332; Whelan, S.P. y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8388-8392; Schnell, M. J. y col., 1994, EMBO J. 13:4195-4203; Radecke, F. y col., 1995, EMBO J. 14:5773-5784; Lawson, N. D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4477-4481; Garcin, D. y col., 1995, EMBO J. 14:6087-6094; Kato, A. y col., 1996, Genes Cells 1:569-579; Baron, M. D. y Barrett, T., 1997, J. Virol. 71:1265-1271; Bridgen, A. y Elliott, R. M. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:15400-15404).

Cuando los genes F, HN y/o M se delecionan en un vector de ADN vírico, no forman partículas víricas infecciosas. Sin embargo, es posible formar partículas víricas infecciosas y amplificar el virus que comprende el complejo, transfiriendo separadamente estos genes que faltan, genes que codifican otras proteínas de la envoltura vírica y los parecidos a las células hospedadoras y expresarlos en las mismas.

Los métodos para transferir un vector de ADN a las células, incluyen los siguientes métodos: 1) el método para preparar material de ADN precipitado que puede ser captado por las células diana; 2) el método para preparar un ADN que comprende un complejo que es adecuado para ser captado por las células diana y que tampoco es muy citotóxico y que tiene carga positiva y 3) el método para perforar instantáneamente en la membrana celular diana, poros que sean lo suficientemente anchos para permitir el paso de moléculas de ADN a través de los mismos mediante impulsos eléctricos.

En el Método 2), se puede utilizar una variedad de reactivos de transfección, siendo ejemplos DOTMA (Boehringer), SuperFect (QIAGEN nº 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer nº 1811169), etc. Un ejemplo del Método 1) es un método de transfección que emplea fosfato de calcio, en el que el ADN que ha entrado en las células se incorpora en fagosomas y una cantidad suficiente se incorpora también en el núcleo (Graham, F. L. y Van der Eb, J., 1973, Virology 52:456; Wigler, M. y Silverstein, S., 1977, Cell 11:223). Chen y Okayama han investigado la mejora de la técnica de transferencia, notificando que el material de ADN precipitado óptimo se puede obtener bajo condiciones en las que 1) las células se incuban con ADN en una atmósfera de 2 a 4% de CO_{2} a 35ºC durante 15 a 24 h, 2) se emplea ADN cíclico con una actividad de formación de precipitado superior a la del ADN lineal, y 3) la concentración de ADN en la mezcla precipitada es de 20 a 30 \mug/ml (Chen, C. y Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:2745). El Método 2) es adecuado para una transfección transitoria. Un método antiguo es conocido en la técnica, en el que se prepara una mezcla de DEAE-dextrano (Sigma nº D-9885, P.M. 5 x 10^{5}) con una proporción de concentración de ADN deseada para realizar la transfección. Puesto que la mayoría de los complejos se descomponen dentro de los endosomas, la cloroquina se puede añadir para mejorar los efectos de la transfección (Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3015). Al Método 3) se hace referencia como electroporación y es más versátil comparado con los Métodos 1) y 2) porque no tiene selectividad celular. Se dice que el Método 3) es eficaz bajo condiciones óptimas para una duración de la corriente eléctrica con impulsos, forma de impulsos, potencia del campo eléctrico, conductividad de los tampones, concentración del ADN y densidad celular.

Entre las tres categorías descritas anteriormente, los reactivos de la transfección (Método 2)) son adecuados en esta invención debido a que el Método 2) es de fácil puesta en práctica y facilita el examen de muchas muestras de pruebas, empleando una gran cantidad de células. Preferentemente, se emplea el reactivo de transfección (QIAGEN, nº de cat. 301305) o el reactivo para la transfección de liposomas DOSPER (Boehringer Mannheim, nº de cat. 1811169).

Específicamente, la reconstitución del vector vírico procedente de ADNc se puede realizar del modo siguiente.

Células LLC-MK2 obtenidas a partir del riñón de simios, se cultivan en placas de cultivo de plástico con 24 a 6 pocillos o en una placa de cultivo de 100 mm de diámetro, empleando un medio esencial mínimo (MEM) que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS) y antibióticos (100 unidades/ml de penicilina G y 100 \mug/ml de estreptomicina) hasta obtener una confluencia del 70 a 80%, y se infectan, por ejemplo, con virus vaccinia recombinante vTF7-3 que expresa la polimerasa de T7 con 2 UFP/célula. Este virus ha sido inactivado con un tratamiento con radiación ultravioleta durante 20 minutos, en presencia de 1 \mug/ml de psoraleno (Fuerst, T. R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986; Kato, A. y col., Genes Cells 1:569-579, 1996). La cantidad de psoraleno añadida y el tiempo de la radiación UV se pueden ajustar de forma adecuada. Una hora después de la infección, las células se transfectan con 2 a 60 \mug, más preferentemente con 3 a 5 \mug del ADNc del virus Sendai recombinante descrito anteriormente, por el método de la lipofección y empleando dichos plásmidos (24 a 0,5 \mug de pGEM-N, 12 a 0,25 \mug de pGEM-P y 24 a 0,5 \mug de pGEM-L, más preferentemente 1 \mug de pGEM-N, 0,5 \mug de pGEM-P y 1 \mug de pGEM-L) (Kato, A. y col., Genes Cells 1:569-579, 1996) que expresan las proteínas víricas transactivadas, necesarias para la producción del genoma del virus Sendai de longitud completa, junto con SuperFect (QIAGEN). Las células transfectadas se cultivan en un medio MEM exento de suero que contiene 100 \mug/ml de rifampicina (Sigma) y 100 \mu/ml de arabinósido de citosina (AraC) si se desea, más preferentemente contiene sólo 40 \mug/ml de arabinósido de citosina (AraC) (Sigma) y las concentraciones de los reactivos se determinan de forma óptima de modo que se reduzca al máximo la citotoxicidad debida al virus vaccinia y se aumente al máximo la tasa de recuperación del virus (Kato, A., y col., 1996, Genes Cells 1, 569-579). Después de cultivar durante aproximadamente 48 a 72 h después de la transfección, las células se recuperan, se rompen repitiendo tres ciclos de congelación y descongelación, se transfectan a células LLC-MK2 que expresan proteínas de la envoltura, y se cultivan. Después de cultivar las células durante 3 a 7 días, se recoge la solución del cultivo. Alternativamente, los vectores víricos infecciosos se pueden obtener de forma más eficaz, transfectando las células LLC-MK2 que ya expresan las proteínas de la envoltura con plásmidos que expresan las proteínas NP, L y P o transfectando junto con un plásmido que exprese la envoltura. Los vectores víricos se pueden amplificar cultivando estas células recubiertas sobre células LLC-MK2 que expresan proteínas de la envoltura (véanse, los ejemplos). El título vírico contenido en el material sobrenadante del cultivo, se puede determinar midiendo la actividad hemaglutinadora (HA) que se puede someter a ensayo mediante el "método de dilución de punto final" (Kato, A. y col., 1996, Genes Cells 1, 569-579). La reserva de virus así obtenida se puede almacenar a -80ºC.

El tipo de células hospedadoras empleadas para la reconstitución de los virus no está limitado particularmente, mientras que el complejo de RNP o el vector vírico se pueda reconstituir dentro de las mismas. Por ejemplo, en la reconstitución del vector del virus Sendai o del complejo de RNP, se pueden utilizar células de cultivo tales como células CV-I y células LLC-MK2 obtenidas a partir de riñón de simios y las células BHK obtenidas a partir de riñón de hámster, etc. Las partículas víricas infecciosas que tienen la envoltura, también se pueden obtener expresando proteínas adecuadas de la envoltura en estas células. Para obtener el vector del virus Sendai en grandes cantidades, el virus se puede amplificar, por ejemplo, mediante la inoculación de RNP o de un vector vírico obtenido a partir de las células hospedadoras descritas anteriormente, en embriones de pollo, junto con vectores que expresan los genes de la envoltura. Alternativamente, los vectores víricos se pueden producir empleando huevos de pollo transgénicos incorporados con genes de proteínas de la envoltura. Los métodos para preparar fluido vírico empleando huevos de pollo, ya se han desarrollado (Nakanishi y col., (compiladores), 1993, ``Shinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutu, Protocolo III (High Technology Procotol III of Neuroscience Research), Molecular Neurocyte Physiology, Kosesha, Osaka, págs. 153-172). Específicamente, por ejemplo, los huevos fertilizados se colocan en una incubadora y se incuban durante 9 a 12 días a 37 a 38ºC, para que crezcan los embriones. El vector del virus Sendai o el complejo de RNP se inocula junto con vectores que expresan las proteínas de la envoltura, en la cavidad corioalantoidea de los huevos y se cultivan durante varios días hasta que el virus prolifera. Las condiciones tales como la duración del cultivo, pueden variar dependiendo del tipo de virus Sendai recombinante utilizado. A continuación, el fluido corioalantoideo que comprende el virus, se recoge. La separación y la purificación del vector del virus Sendai se puede realizar según métodos convencionales (Tashiro, M. "Virus Experiment Protocols", Nagai e Ishihama (compiladores), Medicalview, págs. 68-73 (1995)).

Como vector que expresa las proteínas de la envoltura, se pueden utilizar complejos de esta invención o vectores víricos que comprenden ellos mismos los complejos de esta invención. Por ejemplo, cuando dos tipos de complejos de RNP en los que el gen de la envoltura ausente, procedente del genoma vírico es diferente, se transfieren a la misma célula, la proteína de la envoltura que falta en un complejo de RNP, es proporcionada por la expresión del otro complejo para complementarse entre si, conduciendo de este modo a la formación de partículas víricas infecciosas y a la activación del ciclo de replicación para amplificar el virus. De este modo, cuando dos o más tipos de complejos de RNP de esta invención o vectores víricos que comprenden estos complejos, se inoculan en células en combinaciones que se complementen entre sí las proteínas de la envoltura, se pueden producir a gran escala y con bajo coste mezclas de vectores víricos que carecen de las proteínas de la envoltura respectivas. Los virus mezclados así producidos son útiles para la producción de vacunas y similares. Debido a los genes de la envoltura que faltan, estos virus tienen un genoma de menor tamaño, comparado con el del virus completo, de modo que pueden albergar un gen foráneo largo. También, debido a que estos virus originalmente no infecciosos se diluyen de forma extracelular, y a la dificultad de mantener su coinfección, se vuelven estériles, lo que es ventajoso para manipular su liberación al entorno.

La preparación del RNP de esta invención a partir de un virus se puede realizar por ejemplo, empleando el método de ultracentrifugación del modo siguiente. Se añade Triton X-100 a un fluido de filtración que comprende partículas víricas, para que la concentración final sea de 0,5% y la mezcla se deja reposar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. El material sobrenadante así obtenido se deposita en capas sobre un gradiente de densidad de sacarosa de 10 a 40% y se centrífuga de 20.000 hasta 30.000 rpm durante 30 minutos para recuperar las fracciones que comprenden el RNP.

Alternativamente, el virus se disuelve en una mezcla que contiene 0,6% de NP40, 1% de desoxicolato sódico, KCl 1 M, \beta-mercaptoetanol 10 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) y EDTA 5 mM (concentraciones finales), seguido de reposo a 20ºC durante 20 minutos y a continuación centrifugar a 11.000 x g durante 20 minutos. El material sobrenadante que comprende RNP se deposita en capas sobre glicerol al 50% que comprende 0,2% de NP40, NaCl 30 mM, Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM y se centrifuga a 39.000 rpm durante 2 h a 4ºC para recuperar los materiales precipitados. El complejo de RNP contenido en el material precipitado se puede purificar mediante dispersión del material precipitado de nuevo en una solución que contiene Triton X-100 al 0,5%, depositando en capas la dispersión sobre un gradiente de densidad de sacarosa de 10 a 40% y centrifugándolo de 20.000 hasta 30.000 rpm durante 30 min para recuperar una banda aislada que contiene un RNP altamente purificado.

Los complejos de esta invención se pueden diluir de forma adecuada, por ejemplo, con solución salina fisiológica y solución salina fisiológica tamponada con fosfato (PBS) para preparar una composición. Cuando los complejos de esta invención se hacen proliferar en huevos de pollo y similares, la composición puede incluir fluido corioalantoideo. Las composiciones que comprenden los complejos de esta invención pueden contener medios fisiológicamente aceptables, tales como agua desionizada, solución acuosa de dextrosa al 5% y otras, adicionalmente también pueden estar contenidos otros agentes estabilizantes y antibióticos.

Una vez que se ha preparado el ARN que comprende el RNP insertado con un gen foráneo, se puede transferir a las células diana empleando reactivos de transferencia génica. Como reactivos de transferencia génica se prefieren los lípidos catiónicos o los polímeros catiónicos.

Los lípidos catiónicos incluyen compuestos representados por la Fórmula (I) en el documento de la Traducción Japonesa publicada de la Publicación Internacional Hei nº 5-508626. Preferentemente, los lípidos catiónicos también pueden ser compuestos lipídicos sintéticos. Los lípidos catiónicos también pueden ser compuestos de diéteres o de diésteres, preferentemente éteres alifáticos. Ejemplos específicos son los siguientes compuestos:

DOGS (Transfectam®) o DOTMA (Lipofectin®) (compuesto diéter),

DOTAP (compuesto diéster),

DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina),

DOPC (dioleoilfosfatidilcolina),

DPRI inhibidor de Rosenthal (RI) (derivado de dipalmitoilo de bromuro de DL-2,3-diestearoiloxipropil(dimetil)-\beta-hidroxietilamonio (Sigma), y

DORI (derivado de dioleilo del compuesto anterior).

Los polímeros catiónicos son compuestos moleculares muy catiónicos, preferentemente moléculas sintéticas. Ejemplos específicos son polilisina, poliaminas alifáticas, polietilenimina, etc.

Los complejos de esta invención se pueden mezclar con los lípidos catiónicos o los polímeros catiónicos descritos anteriormente, para preparar composiciones para la transferencia de genes. Esta composición para la transferencia génica se puede combinar adecuadamente con un medio tal, como una solución salina fisiológica y solutos tales como sales, agentes estabilizantes, etc. Añadiendo la composición para la transferencia génica de esta invención a las células, el complejo de esta invención se puede transferir a las células para expresar el gen procedente del ARN contenido en el complejo, con la condición de que la identidad de la línea germinal de seres humanos no se modifique.

La terapia génica se permite cuando un gen terapéutico se emplea como el gen foráneo. En la aplicación de complejos de esta invención a la terapia génica, es posible expresar un gen foráneo de cuyo tratamiento se esperan resultados o un gen endógeno que el cuerpo del paciente no aporta suficientemente, mediante administración directa o indirecta (ex vivo) del complejo, con la condición de que la identidad de la línea germinal de seres humanos no se modifique. No existe una limitación particular sobre el tipo de gen foráneo y, además de los ácidos nucleicos que codifican proteínas, puede haber ácidos nucleicos que no codifican proteínas, tales como una hebra complementaria o una ribozima. Adicionalmente, cuando se emplean genes que codifican antígenos de bacterias o de virus implicados en enfermedades infecciosas como genes foráneos, se puede inducir inmunidad en los animales administrando estos genes a los animales. Es decir, estos genes se pueden utilizar como vacunas.

Cuando se emplean como vacunas, se pueden aplicar, por ejemplo, a cánceres, enfermedades infecciosas y otras enfermedades generales. Por ejemplo, como tratamiento del cáncer, es posible expresar genes con efectos terapéuticos sobre las células tumorales o las células presentadoras de antígenos (APC), tales como las células DC. Ejemplos de tales genes son los que codifican el antígeno tumoral Muc-1 o el péptido con repeticiones en tándem de la mutina similar a Muc-1 (Patente de EE.UU. nº 5.744.144), el antígeno gp100 del melanoma, etc. Tales tratamientos con genes se han aplicado ampliamente a cánceres en la glándula mamaria, colon, páncreas, próstata, pulmón, etc. La combinación con citocinas para potenciar el efecto cooperador, también es eficaz en la terapia génica. Ejemplos de tales genes son i) IL-12 monocatenario en combinación con IL-2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, ii) interferón-\gamma en combinación con IL-2 (Patente de EE.UU. nº 5.798.100), iii) factor estimulador de colonias de granulocitos (GM-CSF) empleado de forma aislada y iv) GM-CSF dirigido al tratamiento de un tumor cerebral en combinación con IL-4 (J. Neurosurgery, 90 (6), 1115-1124 (1999)), etc.

Ejemplos de genes empleados para el tratamiento de enfermedades infecciosas, son los que codifican la proteína de la envoltura del tipo de la cepa virulenta H5N1 del virus de la gripe, la proteína quimera de la envoltura del virus de la encefalitis japonesa (Vaccine, vol. 17, nº 15-16, 1869-1882 (1999)), la proteína gag del VIH o gag del VIS del virus del SIDA (J. Immunology (2000), vol. 164, 4968-4978), la proteína de la envoltura del VIH que se incorpora como una vacuna oral encapsulada en micropartículas de copolímero de polilactato-glicol, para la administración (Kaneko, H. y col., Virology 267, 8-16 (2000)), la subunidad B (CTB) de la toxina del cólera (Arakawa, T. y col., Nature Biotechnology (1998) 16 (10): 934-8; Arakawa, T. y col., Nature Biotechnology (1998) 16 (3): 292-297), la glicoproteína del virus de la rabia (Lodmell, D. L. y col., 1998, Nature Medicine 4 (8): 949-52) y la proteína L1 de la cápsida del virus 6 del papiloma humano, que causa el cáncer cérvico-uterino (J. Med. Virol., 60, 200-204
(2000)).

La terapia génica también se puede aplicar a enfermedades generales. Por ejemplo, en el caso de diabetes, la expresión del fragmento peptídico de la insulina, mediante la inoculación del ADN plasmídico que codifica el péptido, se ha realizado en animales con un modelo de diabetes de tipo I (Coon, B. y col., J. Clin. Invest., 1999, 104 (2):189-94).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una fotografía que muestra un resultado analítico de la expresión de la proteína F a través del sistema de expresión inducible con Cre-loxP, mediante transferencia de tipo Western. Se muestra el resultado de detectar proteínas sobre una membrana de transferencia que tiene una reacción cruzada con el anticuerpo anti-SeV-F mediante un método quimioluminiscente.

La Figura 2 indica un diagrama que muestra un resultado analítico de la presentación en la superficie celular de la proteína F, cuya expresión se indujo mediante el sistema Cre-loxP. Se muestran los resultados del análisis con citometría de flujo de LLC-MK2/F7 con el anticuerpo anti-SeV-F.

La Figura 3 indica una fotografía que muestra el resultado que confirma el corte con tripsina de la proteína F expresada, empleando transferencia de tipo Western.

La Figura 4 indica unas fotografías que muestran el resultado que confirma la expresión en la superficie celular de HN en un experimento de adsorción a la superficie celular sobre eritrocitos.

La Figura 5 indica unas fotografías que muestran el resultado obtenido con un intento de recoger los virus ausentes, empleando células que expresaban la proteína ausente. Se reveló que la expresión de la proteína F en la línea de células cooperadoras fue rápidamente detenida por los virus vaccinia empleados en la reconstitución de VSe carente de F.

1.

LLC-MK2 y CV-1 representan material lisado celular de los tipos celulares respectivos aislados.

2.

LLC-MK2/F+ad y CV-1/F+ad representan material lisado celular procedente de las células respectivas que se han sometido a la inducción de la expresión y a las que se ha añadido adenovirus AxCANCre.

3.

LLC-MK2/F-ad y CV-1/F-ad representan material lisado celular procedente de las respectivas líneas celulares en las que se ha introducido el gen F pero no adenovirus AxCANCre.

4.

LLC-MK2/F+ad 3rd representa un material lisado celular procedente de células en las que se indujo la expresión con el adenovirus AxCANCre y con las que luego se realizaron 3 pases adicionales.

5.

1d y 3d indican respectivamente un día y tres días después de la inducción de la expresión.

6.

Vac1d y Vac3d indican respectivamente células un día y tres días después de la infección con virus vaccinia.

7.

AraC1d y AraC3d indican respectivamente células un día y tres días después de la adición de AraC.

8.

CHX 1d y CHX 3d indican respectivamente células un día y tres días después de la adición de inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida.

La Figura 6 indica fotografías que muestran el resultado que se obtuvo observando la expresión de GFP tras transfectarse el ADNc de VSe carente de F, que comprende GFP (pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP) en células LLC-MK2 en las que no se expresó F (detección de RNP). En un grupo testigo, se intercambió el gen F por el gen NP en el extremo 3' y luego se empleó el ADNc de VSe (VSe con F intercambiado), en el que se había introducido GFP en el sitio carente de F. El marcador "todo" indica células transfectadas con plásmidos que dirigen la expresión del gen NP, del gen P y del gen L (pGEM/NP, pGEM/P y pGEM/L), junto con ADNc de VSe al mismo tiempo; "ADNc" indica células transfectadas con ADNc (pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP) solo. Para la transfección de RNP, se recogieron células P0 que expresaban GFP; las células se suspendieron (10^{7} células/ml) en OptiMEM (GIBCO BRL); se mezcló 100 \mul del material lisado preparado después de tratar tres veces con ciclos de congelación-descongelación con 25 \mul de liposoma catiónico DOSPER (Boehringer Mannheim) y se dejó en reposo a temperatura ambiente, durante 15 minutos; y se añadió la mezcla a las células (+ad) en las que se había inducido la expresión de F para conseguir la transfección de RNP. Se emplearon células que expresaban ADN recombinasa Cre, en las que no se había inducido el adenovirus recombinante, como un grupo testigo de células (-ad). El resultado mostró que se expresaba GFP dependiendo de la formación de RNP de VSe en P0 en las células LLC-MK2; y se amplificó el virus carente de F, dependiendo de la inducción de la expresión de F en P1.

La Figura 7 indica fotografías que muestran el resultado que se obtuvo estudiando si se pudiese rescatar el RNP funcional reconstituido con ADNc genómico carente de F, a través de células cooperadoras que expresaban F y formar viriones infecciosos del virus ausente. RNP/o representa las células recubiertas con RNP; RNP/t representa las células que se transfectaron con RNP.

La Figura 8 indica fotografías que muestran la evidencia de que el crecimiento específico de las células que expresaban F del virus carente de F. El material lisado que comprende RNP funcional, construido a partir del genoma que carece del gen se sometió a lipofección en las células que expresaban F,según se describe en el Ejemplo 2; y a continuación se recuperó el material sobrenadante del cultivo. Este material sobrenadante del cultivo se añadió al medio de las células que expresaban F para conseguir la infección; al tercer día, se recuperó el material sobrenadante del cultivo y se añadió de manera concurrente tanto a las células que expresaban F como a las células que no habían expresado F; y después se cultivaron las células en presencia o en ausencia de tripsina durante tres días. El resultado se muestra en esta memoria. Los virus se amplificaron sólo en presencia de tripsina en las células que expresaban F.

La Figura 9 indica fotografías que muestran evidencia de liberación específica del virus carente de F, en el material sobrenadante del cultivo, después de la introducción en células que expresaban F. Se sometió a lipofección el material lisado que comprendía RNP funcional, construido a partir del genoma que carecía del gen en las células que expresaban F, según se describe en el Ejemplo 2, y a continuación se recuperó el material sobrenadante del cultivo. Este material sobrenadante del cultivo se añadió al medio de las células que expresaban F, para conseguir la infección; al tercer día, se recuperó el material sobrenadante del cultivo y se añadió de manera concurrente tanto a las células que expresaban F como a las células que no expresaban F; y posteriormente las células se cultivaron en presencia o en ausencia de tripsina durante tres días. El panel inferior muestra el resultado con material sobrenadante de las células que no expresaban F.

La Figura 10 indica fotografías que muestran el resultado obtenido recuperando los virus a partir del material sobrenadante del cultivo de las células que expresaban F, extrayendo el ARN total y realizando una transferencia de tipo Northern empleando F y HN como sondas, para verificar la estructura genómica del virión recuperado a partir del ADNc carente de F. En los virus recuperados a partir de las células que expresaban F, se detectó el gen HN, pero no pudo detectarse el gen F; y por tanto quedó claro que el F no estaba presente en el genoma vírico.

La Figura 11 indica fotografías que muestran el resultado de la RT-PCR que muestra que el gen GFP está presente en el locus en el que se había delecionado F, así como en la estructura artificial del ADNc. 1: +18-NP para la confirmación de la presencia del sitio +18 NotI. 2: M-GFP, para la confirmación de la presencia del gen GFP en la región carente del gen F. 3: gen F, para la confirmación de la presencia del gen F. Las estructuras genómicas de VSe de tipo silvestre y de VSe que expresa GFP carente de F, se muestran en el panel superior. Se verificó que el gen GFP estaba presente en el locus carente de F, el sitio NotI obtenido a partir de +18 estaba presente en el extremo 3' de NP y el gen F estaba ausente en cualquier parte del genoma de ARN.

La Figura 12 indica fotografías que se obtuvieron mediante el examen con microscopio inmunoelectrónico con IgG unida a coloide de oro (anti-F, anti-HN) que reaccionaba específicamente con F o HN del virus. Quedó claro que la estructura puntiaguda de la envoltura del virus, comprendía las proteínas F y HN.

La Figura 13 indica diagramas que muestran el resultado de la RT-PCR, lo que muestra que las estructuras de los genes, excepto del gen GFP, eran las mismas que las del tipo silvestre.

La Figura 14 indica fotografías que muestran el resultado obtenido examinando la morfología de la partícula vírica carente de F, mediante microscopía electrónica. Como las partículas víricas de tipo silvestre, las partículas víricas carentes de F tenían una estructura de RNP helicoidal y dentro una estructura puntiaguda.

La Figura 15 indica fotografías que muestran el resultado de la transferencia génica in vitro a una variedad de células, empleando un vector de VSe carente de F con una alta eficacia.

La Figura 16 indica diagramas que muestran el resultado analítico obtenido, tras la introducción del vector de VSe carente de F, en células primarias de la médula ósea de ratón (BM c-kit+/-). Las barras en blanco representan positivo para PE/negativo para GFP; las barras en negro representan positivo para PE/positivo para GFP.

La Figura 17 indica fotografías que muestran el resultado de la administración in vivo del vector en el ventrículo cerebral de la rata.

La Figura 18 indica fotografías que muestran el resultado obtenido empleando el material sobrenadante del cultivo que comprende virus VSe que carecen de F, recuperados a partir de las células que expresaban F, para infectar células LLC-MK2 que no expresaban F, cultivando las células en presencia o en ausencia de tripsina durante tres días, para confirmar la presencia de virus en el material sobrenadante mediante el ensayo de HA.

La Figura 19 es una fotografía que muestra el resultado obtenido realizando el ensayo de HA de líquidos corioalantoideos, después de incubar durante 2 días un huevo de gallina, fecundado en el que se había inoculado líquido corioalantoideo (pistas 11 y 12) procedente de huevos fecundados positivos para HA en la Figura 18B.

La Figura 20 indica fotografías que muestran el resultado obtenido examinando el líquido vírico que es positivo para HA y no tiene infectividad, mediante microscopía inmunoelectrónica. Se verificó la presencia de las partículas víricas y se observó que la envoltura del virión era reactiva frente al anticuerpo que reconoce la proteína HN marcada con coloide de oro, pero no era reactiva frente al anticuerpo que reconoce la proteína F marcada con coloide de oro.

La Figura 21 indica fotografías que muestran el resultado de la transfección en células de partículas de virus carentes de F.

La Figura 22 indica fotografías que muestran el resultado de la creación de células que coexpresaban F y HN que se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. LLC/VacT7/pGEM/FHN representa las células obtenidas transfectando células LLC-MK2 infectadas con virus vaccinia, con el plásmido pGEM/FHN; LLC/VacT7 representa las células LLC-MK2 infectadas con vaccinia. LLC-MK2/FHNmix representa las células LLC-MK2 en las que se introdujeron los genes F y HN pero que no se clonaron. LLC/FHN representa células LLC-MK2 en las que se introdujeron los genes F y HN y se indujo la expresión con adenovirus (después de 3 días); 1-13, 2-6, 2-16, 3-3, 3-18, 3-22, 4-3 y 5-9 son los números de las líneas celulares (nombres) en la clonación.

La Figura 23 indica fotografías que muestran el resultado para confirmar la generación de virus, dependiendo de la presencia o la ausencia de pGEM/FHN. Se mezcló ADNc de VSe que expresaba GFP carente de FHN, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L y pGEM/FHN y se introdujo en células LLC-MK2. Tres horas después de la transferencia génica, se cambió el medio por MEM que contenía AraC y tripsina y, a continuación, las células se cultivaron adicionalmente durante tres días. Dos días después de la transferencia génica, se llevó a cabo una observación con un microscopio estereoscópico de fluorescencia para evaluar la diferencia dependiendo de la presencia o de la ausencia de pGEM/FHN y se verificó la generación de virus, basándose en la diseminación de las células que expresaban GFP. El resultado se muestra en esta memoria. Cuando se añadía pGEM/FHN en el momento de la reconstitución, se reconocía la diseminación de células que expresaban GFP; pero cuando no se añadía pGEM/FHN, la expresión de GFP se observó únicamente en una sola célula.

La Figura 24 indica fotografías que muestran el resultado de la reconstitución mediante la transfección de RNP y el crecimiento de virus carentes de FHN. Tres días después de inducir la expresión, las células que coexpresaban FHN se sometieron a lipofección (12 pocillos) usando recubrimiento de RNP P0 o DOSPER, y a continuación se observó GFP después de 4 días. Cuando se realizó la transfección de RNP, la recogida de virus fue satisfactoria para las células P1 que expresaban FHN, como lo fue para las carentes de F (parte superior). Se verificó el crecimiento de los virus carentes de FHN, después de inocular un líquido que comprendía los virus en células en las que se había inducido la expresión de la proteína FHN, 6 horas o más, después de la infección con Ade/Cre (panel inferior).

La Figura 25 indica fotografías que muestran el resultado obtenido tras inocular el líquido que comprendía los virus reconstituidos, procedentes de ADNc que expresaba GFP carente de FHN, en LLC-MK2, LLC-MK2/F, LLC-MK2/HN y LLC-MK2/FHN y cultivarlos en presencia o en ausencia de tripsina. Se verificó la diseminación de las células que expresaban la proteína GFP, 3 días después del cultivo. El resultado se muestra en esta memoria. Se observó la expansión de GFP sólo con LLC-MK2/FHN y, por tanto, se verificó que el virus contenido en el líquido se hizo crecer de manera específica para la coexpresión de FHN y dependiente de tripsina.

La Figura 26 es una fotografía que muestra el resultado en el que se realizó la confirmación de la estructura genómica del ARN obtenido a partir de material sobrenadante de las células que expresaban FHN.

La Figura 27 es una fotografía que muestra el resultado en el que se confirmó la estructura genómica del ARN obtenido a partir de material sobrenadante de las células que expresaban F, infectadas con los virus carentes de FHN.

La Figura 28 es un diagrama que muestra la inactivación del virus vaccinia y la actividad de T7 cuando se varió la concentración de psoraleno a psoraleno/radiación UV.

La Figura 29 es un diagrama que muestra la inactivación del virus vaccinia y la actividad polimerasa de ARN de T7 cuando se varió la duración de la radiación UV en psoraleno/radiación UV.

La Figura 30 indica fotografías que muestran una citotoxicidad (CPE) del virus vaccinia después del psoraleno/radiación UV. Se sembraron 3 x 10^{5} células LLC-MK2 en una placa de 6 pocillos. Tras cultivar durante una noche, se infectaron las células con virus vaccinia con moi = 2. Después de 24 horas, se determinó la CPE. El resultado de la CPE con el tratamiento simulado de virus vaccinia, se muestra en A; la CPE después del tratamiento con virus vaccinia durante 15, 20 o 30 minutos se muestra en B, C y D, respectivamente.

La Figura 31 es un diagrama que indica la influencia de la duración del tratamiento con UV del virus vaccinia, sobre la eficacia de la reconstitución del virus Sendai.

La Figura 32 es un diagrama que indica el título de virus vaccinia que puede replicarse que permanece en las células, después de del experimento de reconstitución del virus Sendai.

La Figura 33 es una fotografía que muestra un resultado del análisis de la inmunotransferencia de tipo Western, empleando anticuerpo anti-VSV-G.

La Figura 34 indica un diagrama que muestra los resultados del análisis de la citometría de flujo, empleando anticuerpo anti-VSV-G. Se muestra el resultado del análisis de la línea celular LLC-MK2 (L1) para inducir la expresión de VSV-G al cuarto día después de la infección con AxCANCre (moi = 0, 2,5, 5). El anticuerpo primario usado fue el anticuerpo anti-VSV-G (AcMo I-1); el anticuerpo secundario fue Ig anti-ratón marcada con FITC.

La Figura 35 indica fotografías que muestran un resultado en el que se recuperó el material sobrenadante después de infectar con cantidades alteradas de AxCANCre (MOI = 0, 1,25, 2,5, 5, 10) y una cantidad constante de virus Sendai seudotipo que tenía un genoma del gen F y además se empleó el material sobrenadante para infectar células antes (-) de la inducción VSV-G y después (+) de la inducción, y se observaron las células que expresaban GFP después de 5 días.

La Figura 36 indica fotografías que muestran el resultado obtenido durante el transcurso del tiempo de producción de virus.

La Figura 37 indica fotografías que muestran el resultado obtenido al examinar si la infectividad está influida por el tratamiento del virus Sendai seudotipo, que tiene el genoma carente del gen F, que se estableció con la línea celular que expresaba VSV-G y el virus Sendai carente de FHN, tratado con el anticuerpo anti-VSV.

La Figura 38 indica las fotografías que muestran el resultado de cuando se sometió a ensayo la expresión del gen GFP como un índice para determinar la presencia de producción del virus seudotipo que tenía VSV-G en su cápsida, después de infectar las células LLCG-L1 que expresaban el gen VSV-G, con el virus Sendai carente de F y de HN que comprendía el gen GFP.

La Figura 39 indica fotografía que muestran el resultado que confirma que los virus que se dejaron crecer en las células que expresaban el gen VSV-G, carecían de los genes F y HN, mediante un análisis de tipo Western de las proteínas en el extracto de las células infectadas.

La Figura 40 indica fotografías que muestran el resultado de la observación de células que expresaban GFP con un microscopio de fluorescencia.

La Figura 41 es un diagrama que muestra la mejora en la eficacia para la reconstitución de SeV/\DeltaF-GFP mediante el uso combinado del plásmido que expresa la envoltura y el recubrimiento celular. Se reconoció una mejora considerable en d3 a d4 (día 3 a día 4) de P0 (antes del pase).

La Figura 42 es un diagrama que muestra el resultado de cuando se evaluaron las condiciones del tratamiento para la reconstitución de SeV/\DeltaF-GFP, mediante el uso combinado del plásmido que expresa la envoltura y el recubrimiento celular. Las células positivas para GFP representan la cantidad de virus reconstituido.

La Figura 43 es un diagrama que muestra el resultado en el que se sometió a ensayo el rescate de los virus Sendai carentes de F, a partir del ADNc. Se muestra la mejora en la eficacia para la reconstitución de SeV/\DeltaF-GFP mediante el uso combinado del plásmido que expresa la envoltura y el recubrimiento celular. Todos los ensayos fueron positivos al séptimo día. Sin embargo, se evaluó la eficacia al tercer día en el que la probabilidad de éxito era mediana.

La Figura 44 indica fotografías que muestran el resultado de la expresión de lacZ por el vector del virus Sendai que comprende LacZ y carece de F, que no comprende GFP.

La Figura 45 indica diagramas que muestran la subclonación de un fragmento de ADNc genómico del virus Sendai (A) y estructuras de 5 ADNc genómicos del virus Sendai, construidos con un sitio NotI recién introducido (B).

La Figura 46 es un diagrama que muestra estructuras de plásmidos que van a emplearse para la clonación, para añadir el sitio NotI, la señal de iniciación de la transcripción, la secuencia intercalada y la señal de terminación de la transcripción en SEAP.

La Figura 47 indica fotografías que muestran el resultado del ensayo de placas de lisis de cada vector del virus Sendai. Se muestra una imagen de fluorescencia parcial en el ensayo de placas de lisis, obtenida mediante LAS1000.

La Figura 48 es un diagrama que muestra el resultado de cuando se compararon los niveles de expresión alterados del gen indicador (SEAP) con otro de los respectivos vectores del virus Sendai. Se tomaron los datos de SeV18+/SEAP como 100 y se indicaron los respectivos valores con respecto a él. Se encontró que la actividad, concretamente el nivel de expresión, disminuyó según se puso el gen SEAP más aguas abajo.

La Figura 49 indica fotografías microscópicas que muestran la expresión de GFP en células P1 que coexpresaban FHN.

La Figura 50 indica fotografías que muestran el resultado del análisis de inmunotransferencia de tipo Western de los extractos de las células infectadas con VSe seudotipo VSV-G/\DeltaF-GFP, empleando un anticuerpo anti-F (anti-F), un anticuerpo anti-HN (anti-HN) y un anticuerpo anti-virus Sendai (anti-VSe).

La Figura 51 indica fotografías que muestran la fluorescencia de GFP a partir de células carentes de F y HN, infectadas con VSe seudotipo VSV-G, en presencia o en ausencia de un anticuerpo neutralizante (anticuerpo VGV).

La Figura 52 indica fotografías que muestran resultados del análisis de tipo Western para virus Sendai seudotipo VSV-G que tienen un genoma con el gen F o carente del gen F y del gen HN, que se fraccionaron mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad.

La Figura 53 indica fotografía que muestran el ensayo de hemaglutinación mediada con virus Sendai que tienen un genoma carente del gen F o con virus Sendai seudotipo VSV-G que tienen un genoma carente del gen F o carente del gen F y del gen HN.

La Figura 54 indica diagramas que muestran la especificidad de la infección para las células del cultivo de virus Sendai que tienen un genoma carente del gen F o del virus Sendai seudotipo VSV-G.

La Figura 55 indica fotografías que muestran la confirmación de las estructuras del virus Sendai carente de F que expresa NGF (NGF/SeV/\DeltaF).

La Figura 56 es un diagrama que muestra la actividad de NGF expresado por las células que comprenden NGF infectadas con VSe carente de F. Al inicio del cultivo, se añadió material sobrenadante diluido de las células infectadas con VSe o con proteína NGF (testigo) a un cultivo disociado de neuronas primarias del ganglio de la raíz dorsal (GRD) de pollo. Después de tres días, se contaron las células viables usando como un índice (n = 3), la actividad de reducción mitocondrial. La cantidad de material sobrenadante del cultivo añadido, se correspondía a una dilución de 1000 veces.

La Figura 57 indica fotografías que muestran la actividad de NGF expresado por las células que comprenden NGF, infectadas con VSe carente de F. Al comienzo del cultivo, se añadió material sobrenadante diluido de células infectadas con VSe o con proteína NGF (testigo) a un cultivo disociado de neuronas primarias del ganglio de la raíz dorsal (GRD) de pollo. Después de tres días, se observaron las muestras con un microscopio,

A)

testigo (sin NGF);

B)

adición de proteína NGF (10 ng/ml);

C)

adición de material sobrenadante del cultivo (diluido 100 veces) de células infectadas con SeV/NGF;

D)

adición de material sobrenadante del cultivo (diluido 100 veces) de células infectadas con SeV/NGF;

E)

adición de material sobrenadante del cultivo (diluido 100 veces) de células infectadas con SeV/\DeltaF/NGF; y

F)

adición de material sobrenadante del cultivo (diluido 100 veces) de células infectadas con SeV/\DeltaF- GFP/NGF.

La Figura 58 es una fotografía que muestra la moi de Ad-Cre y el nivel de expresión de la proteína F.

La Figura 59 indica fotografías que muestran la expresión de LLC-MK2/F mediante Adeno-Cre.

La Figura 60 es una fotografía que muestra la durabilidad de la expresión con los pases.

La Figura 61 indica fotografías que muestran la localización de la proteína F con los pases.

La Figura 62 es un diagrama que muestra la correlación entre GFP-UIC y anti-VSe-UIC.

Mejor modo de realizar la invención

La presente invención se ilustra más detalladamente a continuación, haciendo referencia a los Ejemplos, pero no ha de considerarse que está limitada a los mismos.

Ejemplo 1 Construcción del virus Sendai carente de F <1> Construcción de ADNc genómico de VSe carente de F y plásmido que expresa F

El ADNc genómico de longitud completa del virus Sendai (VSe), pSeV18^{+} b(+) (Hasan, M. K. y col., 1997, J. General Virology 78:2813-2820) ("pSeV18^{+} b(+)" también denominado "pSeV18^{+}") se digirió con SphI/KpnI y se recuperó el fragmento resultante (14673 pb) y se clonó en pUC18 que se denominó plásmido pUC18/KS. El sitio interrumpido en F se construyó en este pUC18/KS. Se realizó la interrupción del gen F mediante el uso combinado del método de ligamiento con PCR y como resultado, se eliminó el ORF para el gen F (ATG-TGA = 1698 pb); por tanto se ligó atgcatgccggcagatga (SEQ ID NO: 1) a él para construir el ADNc genómico de VSe carente de F (pSeV18^{+}/\DeltaF). En la PCR, un producto de la PCR generado empleando un par de cebadores (directo: 5'-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO: 2, inverso: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO: 3) se ligó aguas arriba del gen F y otro producto de la PCR generado usando un par de cebadores (directo: 5'-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO: 4, inverso: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO: 5) se ligó aguas abajo del gen F, en el sitio EcoT22I. El plásmido resultante se digirió con SacI y SalI y a continuación se recuperó el fragmento (4931 pb) que abarca la región que comprende el sitio en el que se interrumpe F y se clonó en pUC18 para generar pUC18/dFSS. Este pUC18/dFSS se digirió con DraIII. Se recuperó el fragmento resultante y se sustituyó por un fragmento DraIII de la región que comprende el gen F de pSeV18^{+}; y se realizó el ligamiento para generar el plásmido pSeV18^{+}/\DeltaF.

Además, con el fin de construir un ADNc (pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP) en el que se ha introducido el gen EFGP en el sitio en el que se interrumpió F, se amplificó el gen EGFP con PCR. Para fijar el gen EGFP con un múltiplo de 6 (Hausmann, S. y col., RNA 2, 1033-1045 (1996)), se llevó a cabo una PCR con un cebador con cola NsiI (5'- atgcatatggtgatgcggttttggcagtac: SEQ ID NO: 6) para el extremo 5' y un cebador con cola NgoMIV (5'-Tgccggctattattacttgtacagctcgtc: SEQ ID NO: 7) para el extremo 3'. Los productos de la PCR se digirieron con las enzimas de restricción NsiI y NgoMIV y a continuación, se recuperó el fragmento del gel; el fragmento se ligó en el sitio de pUC18/dFSS entre los sitios de las enzimas de restricción NsiI y NgoMIV en los que se localiza el F interrumpido y se determinó la secuencia. Se eliminó un fragmento DraIII que comprendía el gen EGFP y se recuperó del sitio, y se sustituyó por un fragmento DraIII en la región que comprendía el gen F de pSeV18^{+}; a continuación se hizo un ligamiento para obtener el plásmido pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP.

Por otro lado, se construyó el plásmido de expresión inducible con Cre-loxP para la expresión del gen F amplificando el gen F de SeV con PCR, confirmando la secuencia, e insertándola en el sitio único SwaI del plásmido pCALNdlw (Arai y col., J. Virology 72, 1998, págs. 1115-1121), en el que se había diseñado la expresión de productos génicos para inducirse con la recombinasa de ADN Cre, para obtener el plásmido pCALNdLw/F.

<2> Preparación de células cooperadoras que inducen la expresión de la proteína de SeV-F

Para recuperar partículas víricas infecciosas a partir del genoma carente de F, se estableció una cepa de células cooperadoras que expresaban la proteína SeV-F. La célula utilizada fue la célula LLC-MK2 que se emplea normalmente para el crecimiento de VSe y es una cepa celular obtenida a partir de riñón de mono. Se cultivaron las células LLC-MK2 en MEM que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado, tratado con calor, penicilina G sódica (50 unidades/ml) y estreptomicina (50 \mug/ml) a 37ºC bajo 5% de CO_{2} gas. Dado que el producto del gen SeV-F es citotóxico, se introdujo el plásmido mencionado anteriormente pCALNdLw/F, diseñado para inducir la expresión del producto del gen F a través de la recombinasa de ADN Cre en células LLC-MK2 mediante el método de fosfato de calcio (equipo de reactivos para la transfección en mamíferos (Stratagene)), según el protocolo de transferencia génica.

Se introdujeron 10 \mug de plásmido pCANLdLw/F en células LLC-MK2 que se hicieron crecer para ser confluentes al 40% en una placa de 10 cm y se cultivaron las células en 10 ml de MEM que contenía un 10% de FBS a 37ºC bajo un 5% de CO_{2} durante 24 horas en una incubadora. Después de 24 horas, se rasparon las células y se suspendieron en 10 ml de medio; a continuación se sembraron las células en 5 placas con un diámetro de 10 cm (una placa con 5 ml; 2 placas con 2 ml; 2 placas con 0,2 ml) en MEM que contenía 10 ml de FBS al 10% y 1200 \mug/ml de G418 (GIBCO-BRL) para el cultivo. Se continuó el cultivo durante 14 días mientras que el medio se cambió a intervalos de dos días, para seleccionar las líneas celulares en las que el gen se había introducido de manera estable. Se recuperaron 30 cepas celulares como células resistentes a G418 que se habían hecho crecer en el medio, usando anillos de clonación. Cada clon se cultivó para que fuera confluente en placas de 10 cm.

Después de infectar cada clon con adenovirus AxCANCre recombinante que expresaba la recombinasa de ADN Cre, se sometieron a ensayo las células para determinar la expresión de la proteína SeV-F mediante inmunotransferencia de tipo Western, empleando IgG monoclonal anti-proteína SeV-F (f236; J. Biochem. 123:1064-1072), del modo siguiente.

Después de que los clones crecieran hasta confluencia en placas de 6 cm, se infectó cada uno con adenovirus AxCANCre con moi = 3, según el método de Saito y col., (Saito y col., Nucl. Acids Res. 23:3816-3821 (1995); Arai, T y col., J. Virol. 72, 1115-1121 (1998)). Después de la infección, las células se cultivaron durante 3 días. Se desechó el material sobrenadante del cultivo y las células se lavaron dos veces con tampón PBS, se separaron por rascado con un rascador y se recogieron mediante centrifugación a 1500 x g durante cinco minutos.

Las células se mantienen a -80ºC y pueden descongelarse cuando se usan. Las células recogidas se suspendieron en 150 \mul de tampón PBS y a continuación se añadió al mismo una cantidad igual de tampón de carga de muestra 2x Tris-SDS-BME (Tris 0,625 M, pH 6,8, un 5% de SDS, un 25% de 2-ME, un 50% de glicerol, un 0,025% de BPB; Owl). La mezcla se trató térmicamente a 98ºC durante 3 minutos y a continuación se empleó como muestra para electroforesis. La muestra se fraccionó (1 x 10^{5} células/pista) mediante electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida (Multi Gel 10/20, Daiichi Pure Chemicals). Las proteínas fraccionadas se transfirieron a una membrana de transferencia de PVDF (membranas de transferencia de Immobilon-P; Millipore) mediante inmunotransferencia semiseca. La transferencia se realizó bajo una corriente constante de 1 mA/cm^{2}, durante 1 hora sobre la membrana de transferencia que se había empapado con metanol al 100% durante 30 segundos y a continuación con agua durante 30 minutos.

La membrana de transferencia se agitó en una solución de bloqueo que contenía un 0,05% de Tween 20 y un 1% de BSA (BlockAce; Snow Brand Milk Products) durante una hora y, a continuación, se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, con un anticuerpo anti-VSe-F (f236) que se había diluido 1000 veces con una solución de bloqueo que contenía un 0,05% de Tween 20 y un 1% de BSA. La membrana de transferencia se lavó tres veces con 20 ml de PBS-0,1% de Tween 20 mientras que se agitaba durante 5 minutos y a continuación se lavó con tampón PBS mientras que se agitaba durante 5 minutos. La membrana de transferencia se incubó a temperatura ambiente durante una hora en 10 ml de anticuerpo anti-IgG de ratón, conjugado con peroxidasa (anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón; Zymed) diluido 2000 veces con la solución de bloqueo que contenía un 0,05% de Tween 20 y un 1% de BSA. La membrana de transferencia se lavó 3 veces con 20 ml de PBS-0,1% de Tween 20, mientras que se agitaba durante 5 minutos y después se lavó con tampón PBS mientras que se agitaba durante 5 minutos.

Se realizaron detecciones para determinar las proteínas que tienen una reacción cruzada con el anticuerpo anti-SeV-F sobre la membrana de transferencia, por el método de quimioluminiscencia (reactivos de detección de la inmunotransferencia de tipo Western ECL; Amersham). El resultado se muestra en la Figura 1. Se detectó la expresión de SeV-F específica de la infección con AxCANCre, para confirmar la generación de células LLC-MK2 que inducen la expresión de un producto del gen SeV-F.

Se analizó una de las diversas líneas celulares resultantes, la célula LLC-MK2/F7, mediante citometría de flujo con un anticuerpo anti-SeV-F (Figura 2). Específicamente, se precipitaron 1 x 10^{5} células mediante centrifugación a 15.000 rpm a 4ºC, durante 5 minutos, se lavaron con 200 \mul de PBS y se dejó que reaccionaran en PBS con FACS (NIKKEN CHEMICALS) que contenía anticuerpo monoclonal anti-F (f23), diluido 100 veces, un 0,05% de azida sódica, un 2% de FCS a 4ºC durante 1 hora, en un sitio oscuro. Las células se precipitaron de nuevo a 15.000 rpm a 4ºC durante 5 minutos, se lavaron con 200 \mul de PBS y a continuación se dejó que reaccionaran frente a anti-IgG de ratón, marcado con FITC (CAPPEL) de 1 \mug/ml en hielo durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron de nuevo con 200 \mul de PBS y después se precipitaron mediante centrifugación a 15.000 rpm a 4ºC durante 5 minutos. Las células se suspendieron en 1 ml de PBS para FACS y a continuación se analizaron usando un láser de argón FPICS ELITE (Coulter), con una longitud de onda de excitación de 488 nm y con una longitud de onda de fluorescencia de 525 nm. El resultado mostró que LLC-MK2/F7 presentaba una alta reactividad frente al anticuerpo de manera específica para la inducción de la expresión del gen SeV-F y, por tanto, se verificó que expresaba la proteína SeV-F en la superficie celular.

Ejemplo 2 Confirmación de la función de la proteína SeV-F, expresada por células cooperadoras

Se sometió a ensayo si la proteína SeV-F, cuya expresión la habían inducido células cooperadoras, conservaba la función de la proteína original o no.

Después de sembrar las células LLC-MK2/F7 en una placa de 6 cm y dejarlas crecer hasta confluencia, se infectaron con adenovirus AxCANCre con moi = 3, según el método de Saito y col. (descrito anteriormente). A continuación, las células se cultivaron en MEM (exento de suero) que contenía tripsina (7,5 \mug/ml; GIBCO BRL) a 37ºC, bajo un 5% de CO_{2} en una incubadora durante tres días.

El material sobrenadante se desechó del cultivo y las células se lavaron dos veces con tampón PBS, se separaron por rascado con un rascador y se recogieron mediante centrifugación a 1500 x g durante cinco minutos. Se verificó la escisión de la proteína F expresada con tripsina, mediante inmunotransferencia de tipo Western, tal y como se ha descrito anteriormente (Figura 3). La proteína SeV-F se sintetiza como F0 que es un precursor proteico no activo, y a continuación el precursor se activa después de digerirse en dos subunidades F1 y F2, mediante proteolisis con tripsina. Las células LLC-MK2/F7, después de inducir la expresión de la proteína F de este modo, como células ordinarias, continúan expresando la proteína F, incluso tras el pase, y no se observó citotoxicidad mediada por la proteína F expresada de este modo, así como tampoco se observó fusión celular de las células que expresaban la proteína F. Sin embargo, cuando se transfectó el plásmido de expresión de SeV-HN (pCAG/SeV-HN) en las células que expresaban F y las células se cultivaron en MEM que contenía tripsina durante 3 días, se observó frecuentemente fusión celular. La expresión de HN se confirmó en la superficie celular en un experimento que empleaba la adsorción de eritrocitos sobre la superficie celular (ensayo de hematoadsorción; ensayo Had) (Figura 4). Específicamente, se añadió un 1% de eritrocitos de pollo a las células en el cultivo, con una concentración de 1 ml/placa y se dejó reposar la mezcla a 4ºC durante 10 minutos. Las células se lavaron 3 veces con tampón PBS y a continuación se observaron colonias de eritrocitos sobre la superficie celular. Se reconoció fusión celular en células en las que los eritrocitos se agregaban; se encontró que la fusión celular se inducía a través de la interacción de la proteína F con HN; y, por tanto, se mostró que la proteína F, cuya expresión se mantenía en LLC-MK2/F7, conservaba la función original de la misma.

Ejemplo 3 RNP funcional que tiene un genoma carente de F y formación de viriones

Para recuperar los viriones a partir de virus carentes, es necesario emplear células que expresaban la proteína carente. Por tanto, se intentó recuperar los virus carentes con células que expresaban la proteína carente, pero se observó que la expresión de la proteína F en la línea de células cooperadoras estaba detenida debido a los virus vaccinia empleados en la reconstitución de VSe carente de F (Figura 5), y por ello fracasaba la reconstitución vírica, basada en el suministro directo de proteína F a partir de la línea de células cooperadoras. Se ha informado sobre la inactivación de la capacidad de replicación del virus vaccinia, pero la actividad de expresión de T7 no se ve alterada por el tratamiento del virus vaccinia con luz ultravioleta con longitudes de onda largas (UV de onda larga) en presencia de psoraleno añadido (tratamiento PLWUV) (Tsung y col., J. Virol 70, 165-171, 1996). Por tanto, se intentó la reconstitución vírica empleando el virus vaccinia tratado con PLWUV (PLWUV-VacT7). Se emplearon irradiadores UV Stratalinker 2400 (nº de catálogo 400676 (100 V); Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) equipados con cinco bombillas de 15 vatios para la irradiación de luz ultravioleta. El resultado mostró que la expresión de la proteína F se inhibió de las células que expresaban F, usadas en la reconstitución, pero el virus vaccinia apenas creció en presencia de AraC, después de infectar el material lisado de las células reconstituidas con este PLWUV-VacT7 para las células cooperadoras, y también se encontró que la expresión de la proteína F en la línea de células cooperadoras, apenas se vio influida. Además, esta reconstitución de VSe de tipo silvestre empleando este PLWUV-VacT7, permite la recuperación de virus incluso a partir de 10^{3} células, mientras que con los métodos previos, esto no era posible a menos que hubiera más de 10^{5} células o más, y por tanto la eficacia de la reconstitución vírica mejoró enormemente. Empleando este método, se intentó la reconstitución de virus VSe carentes de F.

Reconstitución y amplificación del virus VSe carente de F

Se observó la expresión de GFP después de transfectar células LLC-MK2 con pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP mencionado anteriormente, en el que se había introducido el gen de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) como indicador del sitio en el que se había interrumpido F, según la regla 6n, en la forma descrita a continuación. También se sometió a ensayo la influencia de la presencia de los genes NP, P y L obtenidos a partir del virus, que son los tres componentes necesarios para la formación de RNP.

Las células LLC-MK2 se extendieron en placas Petri de 100 mm, con una concentración de 5 x 10^{6} células/placa y se cultivaron durante 24 horas. Tras completarse el cultivo, las células se trataron con psoraleno y luz ultravioleta de longitud de onda larga (365 nm) durante 20 minutos y las células se infectaron con virus vaccinia recombinante que expresaba la polimerasa de ARN de T7 (Fuerst, T.R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) a temperatura ambiente durante una hora (moi = 2) (moi = 2 a 3; preferentemente moi = 2). Después de lavar 3 veces las células, los plásmidos pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P y pGEM/L (Kato y col., Genes Cells 1, 569-579 (1996)) en cantidades respectivas de 12 \mug, 4 \mug, 2 \mug y 4 \mug/placa en OptiMEM (GIBCO); se añadió al mismo reactivo de transfección SuperFect (1 \mug de ADN/5 \mul de SuperFect; QIAGEN); se dejaron las mezclas en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos; a continuación se añadieron a 3 ml de OptiMEM que contenía un 3% de FBS; se añadieron las células al mismo y se cultivaron. El mismo experimento se realizó empleando ADNc genómico de VSe de tipo silvestre (pSeV(+) (Kato, A. y col., Genes Cells 1, 569-579 (1996)) como testigo en lugar de pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP. Después de cultivar durante 3 horas, las células se lavaron dos veces con MEM que no contenía suero, y a continuación se cultivaron en MEM que contenía \beta-D-arabinofuranósido de citosina (AraC, 40 \mug/ml; Sigma) y tripsina (7,5 \mug/ml; GIBCO) durante 70 horas. Estas células se recogieron y el sedimento se suspendió en OptiMEM (10^{7} células/ml). Después de repetir tres veces el tratamiento de congelación y descongelación, las células se mezclaron con reactivo de lipofección DOSPER (Boehringer Mannheim) (10^{6} células/25 \mul de DOSPER) y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, la línea de células LLC-MK2/F7 que expresa F se transfectó (10^{6} células/pocillo en placas de 12 pocillos) y las células se cultivaron en MEM que no contenía suero (que contenía 40 \mug/ml de AraC y 7,5 \mug/ml de tripsina).

El resultado mostraba que se reconoció la expresión de GFP sólo cuando estaban presentes los tres componentes, NP, P y L obtenidos a partir del virus y se podía generar el virus RNP carente que expresaba genes foráneos (Figura 6).

Confirmación de viriones carentes de F

Se sometió a ensayo si se podía rescatar el RNP funcional reconstituido mediante ADNc genómico carente de F, mediante el método tal y como se describió anteriormente, con las células cooperadoras que expresaban F y formar viriones infecciosos de virus carente de F. Los lisados celulares se mezclaron con liposoma catiónico; los lisados se prepararon mediante la congelación/descongelación de las células reconstituidas en condiciones en las que se forma RNP funcional (condición en la que se transfectan al mismo tiempo pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P y pGEM/L) o condiciones en las que no se forma RNP funcional (condiciones en las que se transfectan dos plásmidos. pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP y pGEM/NP), tal y como se describió anteriormente, los lisados se sometieron a lipofección en células que expresaban F y en células que no lo expresaban; se observó la generación de partículas víricas basándose en la expansión de la distribución de las células que expresaban GFP. El resultado mostraba que la expansión de la distribución de las células que expresaban GFP, sólo se reconocía cuando se llevaba a cabo la introducción en las células que expresaban F, empleando un lisado obtenido en condiciones en las que se reconstituye el RNP funcional (Figura 7). Además, incluso en un ensayo de placas de lisis, sólo se observó la formación de placas de lisis en las mismas condiciones. A partir de estos resultados, se reveló que los RNP funcionales generados a partir del genoma del virus carente de F, se convirtieron adicionalmente en partículas víricas infecciosas, en presencia de proteína F obtenida a partir de células que expresaban F y las partículas se liberaron desde las células.

La demostración de la presencia de viriones infecciosos carentes de F en el material sobrenadante del cultivo, se realizó con el experimento siguiente. El material lisado que comprendía el RNP funcional construido a partir del genoma carente del gen F, se sometió a lipofección en células que expresaban F, según se ha descrito en el Ejemplo 2, y se recuperó el material sobrenadante del cultivo. Este material sobrenadante del cultivo se añadió al medio de células que expresaban F para obtener la infección; al tercer día, se recuperó el material sobrenadante del cultivo y se añadió de manera concurrente tanto a las células que expresaban F como a las células que no expresaban F; y a continuación las células se cultivaron en presencia o en ausencia de tripsina durante tres días. En las células que expresaban F, los virus se amplificaron sólo en presencia de tripsina (Figura 8). También se observó que las partículas víricas no infecciosas se liberaron en el material sobrenadante de las células que no expresaban F (en el panel inferior de la Figura 9) o desde las células que expresaban F, cultivadas en ausencia de tripsina. Un resumen de las descripciones anteriores es el siguiente: el crecimiento de virus carentes de F que expresaban GFP es específico de las células que expresaban F y depende de la proteolisis con tripsina. El título de virus Sendai carentes de F infecciosos, que se hizo crecer así, osciló desde 0,5 x 10^{7} hasta 1 x 10^{7} UIC/ml.

Ejemplo 4 Análisis de virus carentes de F que expresan GFP

Con el fin de confirmar la estructura genómica de los viriones recuperados a partir del ADNc carente de F, se recuperaron los virus a partir del material sobrenadante del cultivo de las células que expresaban F, se extrajo el ARN total y a continuación se realizó un análisis de la transferencia de tipo Northern, usando F y HN como sondas. El resultado mostraba que podía detectarse el gen HN, pero no podía detectarse el gen F en los virus recogidos de las células que expresaban F y quedó claro que el gen F no estaba presente en el genoma vírico (Figura 10). Además, mediante RT-PCR de GFP, se confirmó que el gen estaba presente en el locus delecionado para F, tal y como se mostraba en la estructura artificial del ADNc (Figura 11) y que las estructuras de otros genes eran las mismas que las del tipo silvestre. Basándose en los hallazgos anteriores, se mostró que no se había producido una reestructuración del genoma durante la reconstitución vírica. Además, se examinó la morfología de las partículas víricas carentes de F recuperadas, mediante microscopía electrónica. Como el virus de tipo silvestre, las partículas víricas carentes de F, tenían dentro la estructura helicoidal de RNP y la estructura puntiaguda (Figura 14). Además, se examinaron los virus mediante microscopía inmunoelectrónica con IgG conjugada con coloide de oro (anti-F, anti-HN) que reaccionaba específicamente frente a F o a HN. El resultado mostraba que la estructura puntiaguda de la envoltura del virus comprendía proteínas F y HN (Figura 12), lo que demostró que la proteína F producida por las células cooperadoras estaba incorporada eficazmente en los viriones. El resultado se describirá a continuación con más detalle.

Extracción del ARN total, análisis con transferencia de tipo Northern y RT-PCR

El ARN total se extrajo a partir del material sobrenadante del cultivo, obtenido 3 días después de infectar las células LLC-MK2/F7 que expresaban F, con los virus, empleando el miniequipo de reactivos de ARN vírico QIAamp (QIAGEN), según el protocolo. El ARN total purificado (5 \mug) se separó mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante al 1% que contenía formaldehído, y a continuación se transfirió a una membrana Hybond-N+ en un dispositivo de transferencia a vacío (Amersham-Pharmacia). La membrana preparada se fijó con NaOH 0,05 M, se aclaró con tampón SSC diluido 2 veces (Nacalai tesque) y después se sometió a una prehibridación en una solución de hibridación (Boehringer Mannheim) durante 30 minutos; se añadió a la misma una sonda para el gen F o HN, preparada marcando el ADN con cebadores al azar (equipo de reactivos para marcar ADN con DIG; Boehringer Mannheim) empleando digoxigenina (DIG)-dUTP (sensible al medio alcalino) y a continuación se realizó la hibridación durante 16 horas. Después, se lavó la membrana y se dejó que reaccionara frente al anticuerpo anti-DIG, conjugado con fosfatasa alcalina (anti-digoxigenina-AP); se llevó a cabo el análisis empleando un equipo de reactivos para la detección de DIG. El resultado mostraba que se podía detectar el gen HN, pero no se podía detectar el gen F en los virus recogidos a partir de las células que expresaban F, y se demostró que el gen F no estaba presente en el genoma vírico (Figura 10).

Además, se realizó un análisis detallado mediante RT-PCR. En la RT-PCR, se sintetizó el ADNc de la primera hebra a partir del ARN del virus purificado, empleando el sistema de preamplificación SUPERSCRIPTII (Gibco BRL) según el protocolo; en la PCR se emplearon las siguientes condiciones con el equipo de reactivos para LA PCR (TAKARA ver. 2.1): 94ºC/3 min; 30 ciclos para la amplificación con 94ºC/45 seg., 55ºC/45 seg., 72ºC/90 seg.; incubación a 72ºC durante 10 minutos; después la muestra se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 2% a 100 v durante 30 minutos, el gel se tiñó con bromuro de etidio para obtener una imagen fotográfica. Los cebadores empleados para confirmar que el gen M y EGFP estaban insertados en el sitio carente de F, fueron: directo 1: 5'-atcagagacctgcgacaatgc (SEQ ID NO: 8), e inverso 1: 5'-aagtcgtgctgcttcatgtgg (SEQ ID NO: 9); los cebadores empleados para confirmar que EGFP está insertado en el sitio carente de F y el gen HN fueron: directo 2: 5'-acaaccactacctgagcacccagtc (SEQ ID NO: 10) e inverso 2: 5'-gcctaacacatccagagatcg (SEQ ID NO: 11); y se confirmó la unión entre el gen M y el gen HN empleando el cebador directo 3: 5'-acattcatgagtcagctcgc (SEQ ID NO: 12) y el inverso 2 (SEQ ID NO: 11). El resultado mostraba que el gen GFP estaba presente en el locus carente de F, tal y como se muestra en la estructura artificial del ADNc (Figura 11) y que las estructuras de otros genes eran las mismas que las del tipo silvestre (Figura 13). A partir de los hallazgos mostrados anteriormente, queda claro que no se había producido una reestructuración del genoma durante la reconstitución vírica.

Análisis con microscopio electrónico con inmunoglobulina conjugada con coloide de oro

Se examinó con microscopía electrónica la morfología de las partículas víricas recuperadas, carentes de F. En primer lugar, el material sobrenadante del cultivo de las células infectadas con los virus carentes, se centrifugó a 28.000 rpm durante 30 minutos, para obtener un sedimento vírico; a continuación, el sedimento se resuspendió en PBS diluido 10 veces con una concentración de 1 x 10^{9} UHA/ml; se dejó caer una gota de la suspensión sobre una microrrejilla con un filtro de soporte y a continuación se secó la rejilla a temperatura ambiente: la rejilla se trató con PBS que contenía un 3,7% de formalina durante 15 minutos para la fijación y después se trató previamente con una solución de PBS que contenía un 0,1% de BSA durante 30 minutos; además, se dejó caer anticuerpo monoclonal anti-F (f236) o anticuerpo monoclonal anti-HN (Miura, N. y col., Exp. Cell Res. (1982) 141:409-420) diluido 200 veces con la misma solución sobre la rejilla, y se dejó que reaccionaran en condiciones húmedas durante 60 minutos. Posteriormente, se lavó la rejilla con PBS y luego se dejó caer anticuerpo anti-IgG de ratón, conjugado con coloide de oro, diluido 200 veces y se dejó que reaccionaran en condiciones húmedas durante 60 minutos. A continuación, la rejilla se lavó con PBS y después con agua estéril destilada, y se secó al aire a temperatura ambiente; se puso una solución de acetato de uranio al 4% sobre la rejilla para teñir durante 2 minutos y se secó la rejilla; la muestra se observó y se fotografió en un microscopio electrónico JEM-1200EXII (JEOL.). El resultado mostraba que la estructura puntiaguda de la envoltura del virus comprendía proteínas F y HN (Figura 12), lo que demostraba que la proteína F producida por las células cooperadoras se había incorporado de manera eficaz en los viriones. Además, como el virus de tipo silvestre, las partículas víricas carentes de F, tenían una estructura de RNP helicoidal y una estructura puntiaguda dentro (Figura 14).

Ejemplo 5 Transferencia génica de alta eficacia a una variedad de células mediante un vector de VSe carente de F in vitro Introducción en células de un cultivo primario de células nerviosas de la corteza cerebral de rata

Las células del cultivo primario de neuronas de la corteza cerebral, se prepararon y se cultivaron del modo siguiente: una rata SD (SPF/VAF Crj: CD, hembra 332 g, hasta 9 semanas de edad; Charles River) se anestesió profundamente el decimoctavo día de gestación con éter dietílico y a continuación se sacrificó por sangría desde las arterias axilares. Se extrajeron los fetos del útero a través de una sección abdominal. Se cortaron los huesos y la piel del cráneo y se extirparon los cerebros. Con ayuda de un microscopio estereoscópico, se transfirieron los hemisferios cerebrales a un DMEM de solución de trabajo (que contenía 5% de suero de caballo, 5% de suero de ternera y 10% de DMSO); se hicieron cortes finos y se añadió a los mismos una solución de papaína enfriada en hielo (1,5 U, 0,2 mg de cisteína, 0,2 mg de albúmina sérica bovina, 5 mg de glucosa, ADNasa con 1 mg/ml); la solución que contenía los tejidos cortados se incubó durante 15 minutos, mientras que se agitaba invirtiendo el vial cada 5 minutos a 32ºC. Tras verificarse que la suspensión se había vuelto suficientemente turbia y que las secciones de tejido se habían vuelto translúcidas, las secciones del tejido se trituraron en pequeños trozos mediante pipeteo. La suspensión se centrifugó a 1200 rpm a 32ºC, durante 5 minutos y luego las células se resuspendieron en medio basal neural, complementado con B27 (Gibco BRL, Burlington, Ontario, Canadá). Las células se sembraron en una placa recubierta con poli-d-lisina (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA, EE.UU.) con una densidad de 1 x 10^{5} células/placa y a continuación se cultivaron a 37ºC bajo un 5% de CO_{2}.

Tras realizarse un cultivo primario de las células nerviosas de la corteza cerebral (5 x 10^{5}/pocillo) durante 5 días, las células se infectaron con el vector de VSe carente de F (moi = 5) y se cultivaron adicionalmente durante tres días. Las células se fijaron en una solución de fijación que contenía un 1% de paraformaldehído, un 5% de suero de cabra y un 0,5% de Triton-X a temperatura ambiente, durante cinco minutos. La reacción de bloqueo para las células se realizó empleando BlockAce (Snow Brand Milk Products) a temperatura ambiente durante 2 horas y a continuación se incubaron con IgG de cabra anti-proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP-2) anti-rata diluida 500 veces (Boehringer) a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente, se lavaron las células tres veces con PBS (-) cada 15 minutos y luego se incubaron con IgG anti-ratón conjugada con cys3, diluida 100 veces con un suero de cabra al 5%/ PBS, a temperatura ambiente durante una hora. Además, después de lavar las células tres veces con PBS (-) cada 15 minutos, se añadió a las células medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, EE.UU.); las células que se habían teñido doblemente con inmunotinción de MAP-2 y fluorescencia de GFP, se observaron mediante fluorescencia, empleando un microscopio confocal (Nippon Bio-Rad MRC 1024, Japón) y un microscopio invertido Nykon Diaphot 300, equipado con un filtro de paso de banda de excitación de 470-500 nm o 510-550 nm. El resultado mostró que GFP se había introducido en casi el 100% de las células nerviosas que eran positivas para MAP2 (Figura 15).

Introducción en células humanas normales

Se adquirieron células de músculo liso humanas normales, células hepáticas humanas normales y células endoteliales capilares pulmonares humanas y normales (Cell Systems) de DAINIPPON PHARMACEUTICAL y se cultivaron con un equipo de reactivos de medio SFM CS-C (Cell Systems) a 37ºC bajo un 5% de gas CO_{2}.

Las células humanas normales, tales como células del músculo liso humano normales (Figura 15, músculo), células hepáticas humanas normales (Figura 15, hígado) y células endoteliales capilares pulmonares humanas normales (Figura 15 pulmón), se infectaron con el vector de VSe carente de F (m.o.i.= 5) y a continuación se observó la expresión de GFP. Se verificó que la eficacia de la introducción era casi del 100% y que el gen GFP se expresaba a niveles muy altos en todas las células (Figura 15).

Introducción en células primarias de la médula ósea de ratón

A continuación, se realizó un experimento en el que se separaron células primarias de la médula ósea de ratón, utilizando marcadores de la estirpe y se infectaron con el vector de VSe carente de F. En primer lugar se administró 5'-fluorouracilo (5-FU, Wako Pure Chemical Industries) a un ratón C57BL (macho de 6 semanas de edad) con una dosis de 150 mg/kg, mediante inyección intraperitoneal (inyección i.p.); 2 días después de la administración, se recogieron las células ósea del fémur. Se separaron las células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad, usando Lympholyte-M (Cedarlane). Se añadió una mezcla (3 x 10^{7}) de perlas magnéticas de estreptavidina (Pharmingen; Funakoshi) que se habían recubierto con anti-CD45R marcado con biotina (B220), anti-Ly6G (Gr-1), anti-Ly-76 (TER-119), anti-1 (Thy1.2) y anti-Mac-1, a las células mononucleares (3 x 10^{6} células) y se permitió que la mezcla resultante reaccionara a 4ºC durante 1 hora; se recuperó una fracción de la que se habían eliminado las células Lin^{+} mediante un imán (células Lin^{-}) (Erlich, S. y col., Blood 1999, 93(1), 80-86). Se añadió VSe de 2 x 10^{7} UHA/ml, con 4 x 10^{5} células de las células Lin^{-} y además se añadieron a las mismas SCF de rata recombinante (100 ng/ml, BRL) e IL-6 humana recombinante (100 U/ml). También se añadió VSe carente de F de 4 x 10^{7} UHA/ml, a 8 x 10^{5} de las células de la médula ósea totales y se añadió GFP-VSe de 5 x 10^{7} UHA/ml a 1 x 10^{6} células. Se preparó GFP-VSe insertando un fragmento NotI amplificado por PCR, que contenía el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) (la longitud del gen estructural es de 717 pb) al que se añadieron una señal de iniciación de la transcripción (R1), una de terminación (R2) y una secuencia intercalada (IG), al sitio de escisión NotI de la enzima de restricción, de la unidad de transcripción de VSe pUC18/T7HVJRz.DNA(+18) (Genes Cells, 1996, 1:569-579). La reconstitución de los virus que comprenden el gen GFP se realizó según un método conocido (Genes Cells, 1996, 1:569-579), usando células LLC-MK2 y embriones de pollo, y a continuación se recuperaron los virus que comprendían el gen de interés. Después de cultivar durante 48 horas después de la infección con GFP-VSe, las células se dividieron en dos grupos; uno de ellos se dejó que reaccionara frente a anti-CD117 marcado con ficoreritrina (PE) (c-kit; Pharmingen) durante 1 hora; el otro era un grupo testigo. Las células se lavaron 3 veces con PBS, a continuación se analizaron en un citómetro de flujo (EPICS Elite ESP; Coulter Miami, FL).

El resultado mostraba que el vector de VSe carente de F, también había infectado las células de la médula ósea enriquecidas, mediante anticuerpo anti-c-kit que se había utilizado como marcador para las células madre primitivas sanguíneas y se observó la expresión del gen GFP (Figura 16). Se confirmó la presencia de partículas infecciosas en el material sobrenadante del cultivo, determinando la presencia de células que expresaban GFP, tres días después de la adición del material sobrenadante del cultivo celular, tratado con tripsina, a las células LLC-MK2. Quedó claro que ninguna de estas células liberaba partículas víricas infecciosas.

Ejemplo 6 Administración del vector en el ventrículo cerebral de ratas

Ratas (F334/Du Crj, hembras, de 6 semanas de edad, Charles River) se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de solución de nembutal sódico (Dainabot) diluida 10 veces (5 mg/ml) con solución salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd). El virus se administró empleando un aparato estereotáxico cerebral para animales pequeños (DAVID KOPF). Se inyectaron 20 \mul (10^{8} UIC) en el punto a 5,2 mm hasta el bregma desde la línea interauricular, 2,0 mm hasta el oído derecho desde lambda, 2,4 mm por debajo de la superficie cerebral, empleando agujas intercambiables 30G (Hamilton). Se observó un alto nivel de expresión de la proteína GFP en las células ependimarias ventriculares (Figura 17). Además, en el caso del vector de VSe carente de F, sólo se observó la expresión de la proteína GFP en células ependimarias o en células nerviosas alrededor del sitio de la inyección, que entran en contacto con el virus, y no se encontró una lesión en esta región. No se observaron anomalías en el comportamiento, ni cambios en el peso corporal en las ratas, con la administración hasta la disección. Después de la disección, no se observó ninguna lesión en el cerebro ni en ninguno de los tejidos ni órganos analizados, tales como el hígado, el pulmón, el riñón, el corazón, el bazo, el estómago, el intestino, etc.

Ejemplo 7 Formación de partículas víricas sin F a partir del genoma de VSe carente de F

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Se infectaron células LLC-MK2 que no expresaban F y células LLC-MK2 que expresaban F (LC-MK2/F7) con virus VSe carentes de F y se cultivaron con (+) y sin (-) tripsina. En la Figura 18A, se muestra el resultado del ensayo de HA del material sobrenadante del cultivo celular después de 3 días. El material sobrenadante del cultivo se inoculó en embriones de pollo y el resultado del ensayo de HA de líquidos corioalantoideos tras un cultivo de 2 días se muestra en la Figura 18B. "C" en la parte superior del panel indica PBS empleado como grupo testigo. Los números indicados bajo "Dilución" indican las veces que se diluyó la solución vírica. Además, los líquidos corioalantoideos positivos para HA en los embriones de pollo (pistas 11 y 12), se inocularon de nuevo en embriones de pollo, y después de cultivar durante dos días, se examinó el líquido corioalantoideo con el ensayo de HA (Figura 19C). Como resultado, se encontró que las células que no expresaban F o los embriones de pollo, infectados con virus VSe carentes de F, eran positivos para HA. Sin embargo, los virus no se habían propagado después de la reinoculación en embriones de pollo, lo que prueba que la solución vírica positiva para HA no tiene infectividad secundaria.

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La solución vírica no infecciosa amplificada en células que no expresaban F, se examinó para determinar la existencia de partículas víricas. Se realizó un análisis de transferencia de tipo Northern para el ARN total, preparado a partir del material sobrenadante del cultivo de las células que expresaban F, del líquido corioalantoideo no infeccioso positivo para HA y VSe de tipo silvestre, mediante el miniequipo de reactivos de ARN vírico QIAamp (QIAGEN), empleando el gen F y el gen HN como sondas. Como resultado se detectaron bandas para el ARN obtenido a partir del líquido corioalantoideo o de virus en el material sobrenadante del cultivo de las células que expresaban F, cuando se empleó el gen HN como sonda, mientras que no se detectaron bandas cuando se empleó la sonda del gen F (Figura 10). Se mostró que el líquido no infeccioso, positivo para HA, tiene partículas de tipo vírico no infecciosas con un genoma carente de F. Además, el análisis de la solución vírica no infecciosa, positiva para HA mediante microscopía inmunoelectrónica, reveló la existencia de partículas víricas y la envoltura del virión reaccionó frente al anticuerpo que reconoce la proteína HN marcada con coloide de oro, pero no frente al anticuerpo que reconoce la proteína F marcada con coloide de oro (Figura 20). Este resultado mostró la existencia de viriones sin F, probando que el virus puede formarse como un virión con la proteína HN aislada, incluso sin la existencia de la proteína F. Se ha mostrado que el virión de VSe puede formarse sólo con F (Leyer, S. y col., J. Gen. Virol 79, 683-687 (1998)) y el presente resultado probó por primera vez que el virión de VSe se puede formar sólo con proteína HN. Por tanto, el hecho de que se puedan producir de forma transitoria viriones sin F en masa, en embriones de pollo, muestra que los viriones que empaquetan el RNP carente de F de VSe, se pueden producir en masa.

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Tal y como se ha descrito anteriormente, los viriones de virus sin F, amplificados de forma transitoria en embriones de pollo, no son infecciosos en absoluto frente a células infectadas con el virus Sendai. Para confirmar que las estructuras de RNP funcionales se empaquetan en las envolturas, se mezclaron las células que expresaban F y las células que no lo expresaban con liposoma catiónico (DOSPER, Boehringer Mannheim) y se transfectaron mediante incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente. Como resultado no se observaron en absoluto células que expresaban GFP cuando no se mezclan las células con el liposoma catiónico, mientras que todas las células expresaron GFP cuando se mezclaron con liposoma catiónico. En las células que no expresaban F, sólo se observó la expresión de GFP en células individuales y no se extendió a las células adyacentes, mientras que en las células que expresaban F, se extendieron las células que expresaban GFP para formar colonias (Figura 21). Por tanto, quedó claro que los viriones no infecciosos, amplificados de forma transitoria en embriones de pollo, podrían expresar un gen cuando se introducen en células por métodos tales como la transfección.

Ejemplo 8 Reconstitución y amplificación del virus a partir del genoma de VSe carente de FHN Construcción del ADNc genómico carente de FHN

Para construir el ADNc genómico de VSe carente de FHN (pSeV18^{+}/\DeltaFHN), se digirió pUC18/KS en primer lugar con EcoRI para construir pUC18/Eco y, a continuación, se delecionó la secuencia completa desde el codón de iniciación del gen F hasta el codón de terminación del gen HN (4866-8419), después se ligó en el sitio BsiwI (cgtacg). Tras confirmarse la secuencia de la región con FHN delecionado, mediante secuenciación de las bases, se recuperó el fragmento EcoRI (4057 pb) de los geles para sustituirlo por el fragmento EcoRI de pUC18/KS, para realizar la construcción. Se recuperó un fragmento KpnI/SphI (14673 pb) que comprendía la región con FHN delecionado de los geles, para sustituirlo por el fragmento KpnI/SphI de pSeV18^{+}, para obtener el plásmido pSeV18^{+}/\DeltaFHN.

Por otro lado, se consiguió la construcción de ADNc de VSe carente de FHN con GFP introducido del modo siguiente. Se recuperó el fragmento SalI/XhoI (7842 pb) de pSeV18^{+}/\DeltaFHN y se clonó en pGEM11Z (Promega). El plásmido resultante se denominó pGEM11Z/SXdFHN. En el sitio carente de FHN de pGEM11Z/SXdFHN se ligó el producto de la PCR con los sitios BsixI en ambos extremos de ATG-TAA (846 pb) de d2EGFP (Clontech), digiriendo con la enzima BsixI. El plásmido resultante se denominó pSeV18^{+}/\DeltaFHN-d2GFP.

Establecimiento de la línea celular que coexpresa la proteína, carente de FHN

El plásmido que expresa el gen F es idéntico al empleado para el establecimiento de la línea celular que coexpresa la proteína, carente de FHN y se construyó de manera similar el plásmido que expresa el gen HN y el fragmento que comprende el ORF de HN se insertó en el único sitio SwaI de pCALNdlw (Arai y col., descrito anteriormente) para obtener el plásmido denominado pCALNdLw/HN.

Las células LLC-MK2 se mezclaron con la misma cantidad o con una cantidad diferente de pCALNdLw/F y pCALNdLw/HN, para introducir los genes usando un equipo de reactivos para la transfección en mamíferos (Stratagene), según el protocolo del fabricante. Las células se clonaron después de seleccionar durante tres semanas con G418. Los clones obtenidos resistentes a los fármacos se infectaron con un adenovirus recombinante (Ade/Cre, Saito y col., descrito anteriormente) (moi = 10), que expresaba la recombinasa de ADN Cre. A continuación, se recogieron las células 3 días después de inducir la expresión de la proteína F y HN, después de lavar 3 veces con PBS(-) y se trataron con una sonda con IgG monoclonal de anti-proteína F de VSe y anti-proteína HN de VSe, usando un método de inmunotransferencia de tipo Western (Figura 22).

Construcción de pGEM/FHN

Los fragmentos de F y HN empleados para la construcción de pCALNdLw/F y pCALNdLw/HN se clonaron en pGEM4Z y pGEM3Z (Promega) para obtener pGEM4Z/F y pGEM3Z/HN, respectivamente. Se recuperó un fragmento obtenido mediante digestión con PvuII de la región que comprende el promotor de T7 y HN de pGEM3Z/HN y se ligó en el sitio de extremos romos cortado en el sitio único de SacI, aguas abajo del gen F de pGEM4Z/F. Se confirmaron las proteínas F y HN mediante inmunotransferencia de tipo Western, usando anticuerpos monoclonales anti-F o anti-HN que van a expresarse simultáneamente cuando se alinean en la misma dirección.

Reconstitución del virus carente de FHN

Se realizó la reconstitución del virus carente de FHN (P0) de dos formas. Una fue usando el método de transfección de RNP empleado en la reconstitución del virus carente de F, y el otro fue empleando T7 para suministrar plásmidos que se coexpresaban. Concretamente, con la regulación del promotor de T7, se construyeron por separado plásmidos que expresaban las proteínas F y HN, y empleando estos plásmidos se suministraron las proteínas F y HN para la reconstitución. En ambos métodos, se amplificaron los virus reconstituidos por células que coexpresaban FHN. El ADNc de VSe carente de FHN que expresaba GFP (pSeV18^{+}/\DeltaFHN-d2GFP), pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L y pGEM/FHN se mezcló en la proporción de 12 \mug/placa de 10 cm, 4 \mug/ placa de 10 cm, 2 \mug/ placa de 10 cm, 4 \mug/placa de 10 cm y 4 \mug/placa de 10 cm (volumen total final, 3 ml/placa de 10 cm) para introducir los genes en células LLC-MK2 de la misma forma que en la reconstitución de VSe carente de F, descrita anteriormente. Tres horas después de introducir los genes, se cambió el medio a MEM que contenía AraC (40 \mug/ml, SIGMA) y tripsina (7,5 \mug/ml, GIBCO) y se cultivó adicionalmente durante 3 días. Se realizó la observación mediante un microscopio estereoscópico de fluorescencia, 2 días después de la introducción de los genes. Se analizó el efecto de la adición de pGEM/FHN y se confirmó la formación de virus mediante la diseminación de las células que expresaban GFP. Como resultado, se observó una diseminación de las células que expresaban GFP cuando se añadía pGEM/FHN en la reconstitución, mientras que no se observó diseminación cuando no se añadió pGEM/FHN y sólo se observó la expresión de GFP en una sola célula (Figura 23). Se muestra que la adición en la reconstitución de la proteína FHN, produjo la formación del virión del virus. Por otro lado, en el caso de la transfección de RNP, se logró satisfactoriamente la recuperación del virus en células que expresaban FHN de P1, como en el caso de la falta de F (Figura 24, panel superior).

La amplificación vírica se confirmó después de la infección de la solución vírica carente de FHN en células inducidas para que expresaran proteína FHN, 6 horas o más después de la infección con Ade/Cre (Figura 24, panel inferior).

La solución de virus reconstituidos a partir del ADNc de VSe carente de FHN que expresa GFP, se infectó en células LLC-MK2, LLC-MK2/F, LLC-MK2/HN y LLC-MK2/FHN y se cultivaron con o sin la adición de tripsina. Después de cultivar durante 3 días, se analizó la diseminación de las células que expresaban la proteína GFP. Como resultado, sólo se observó la diseminación de GFP en LLC-MK2/FHN, confirmando que la solución vírica puede amplificarse específicamente mediante la coexpresión de FHN y de manera dependiente de tripsina (Figura 25).

Para confirmar el genoma vírico carente de FHN, se centrifugó el material sobrenadante del cultivo recuperado a partir de células LLC-MK2/FHN y se extrajo el ARN empleando el miniequipo de reactivos para ARN vírico de QIAamp (QIAGEN) según el protocolo del fabricante. Se empleó el ARN para la síntesis del molde de la RT-PCR, empleando el sistema de preamplificación Superscript para la síntesis de la primera hebra (GIBCO BRL) y se realizó la PCR usando TAKARA Z-Taq (Takara). Se usó el virus carente de F como grupo testigo. Se seleccionaron conjuntos de cebadores para la PCR como la combinación del gen M y el gen GFP, o la combinación del gen M y el gen L (para la combinación del gen M y el gen GFP (M-GFP), directo: 5'-atcagagacctgcgacaatgc/SEQ ID NO: 13, inverso: 5'-aagtcgtgctgcttcatgtgg/SEQ ID NO: 14; para la combinación del gen M y el gen L (M-L), directo: 5'-gaaaaacttagggataaagtccc/SEQ ID NO: 15, inverso: 5'-gttatctccgggatggtgc/SEQ ID NO: 16). Como resultado se obtuvieron bandas específicas para virus, tanto carentes de F como carentes de FHN, en condiciones de RT, cuando se empleaban los genes M y GFP como cebadores. En el caso en el que se emplearon los genes M y L como cebadores, se detectaron bandas alargadas con el tamaño que comprenden el gen HN por el carente de F. Por tanto, se comprobó la carencia de FHN en la estructura genómica (Figura 26).

Por otro lado, se infectó un virus carente de FHN en células que expresaban F de manera similar a cuando se empleaba el virus carente de F, y se recuperó el material sobrenadante del cultivo después de 4 días, para realizar el experimento de la infección frente a LLC-MK2, LLC-MK2/F y LLC-MK2/FHN. Como resultado, no se observaron células con expresión de GFP en ninguna de las células infectadas, lo que muestra que el virus no tenía infecciosidad frente a estas células. Sin embargo, ya se ha notificado que la proteína F aislada es suficiente para formar partículas víricas (Kato, A. y col., Genes Cells, 1, 569-579 (1996)) y que el receptor de la asialoglucoproteína (ASG-R) mediaba en la infección específica de hepatocitos (Spiegel y col., J. Virol. 72, 5296-5302, 1998). Por tanto, se pueden liberar viriones que comprenden el genoma de ARN carente de FHN, con la envoltura vírica configurada sólo con la proteína F, en el material sobrenadante del cultivo de las células que expresaban F. Por tanto, se recuperó el material sobrenadante del cultivo de las células que expresaban F, infectadas con virus carente de FHN, y tras la centrifugación, se extrajo el ARN tal y como se ha descrito anteriormente y se analizó mediante RT-PCR con el método descrito anteriormente. Como resultado se comprobó la existencia de ARN que comprendía el genoma carente de FHN, tal y como se muestra en la Figura 27.

El análisis de la inmunotransferencia de tipo Western del virión vírico, convertido en seudotipo con VSV-G, muestra claramente que las proteínas F y HN no se expresaban. Podría decirse que en la presente memoria se estableció el sistema de producción de viriones víricos carentes de FHN.

Además, los viriones liberados de las células que expresaban la proteína F, se recubrieron sobre células LLC-MK2 que expresaban o no FHN, con o sin mezclado con un liposoma catiónico (50 \mul de DOSPER/500 \mul/pocillo). Como resultado se observó la diseminación de las células que expresaban GFP cuando se recubrieron como mezcla con DOSPER, mientras que sólo el virión sin HN no tuvo infecciosidad en absoluto, sin mostrar células que expresaban GFP, tal y como se observó en el caso de las partículas sin F, descrito anteriormente. En las células que no expresaban FHN, se observaron células que expresaban GFP, pero no se encontraron evidencias de una nueva formación y diseminación de los virus.

Estas partículas de tipo vírico recuperadas a partir de células que expresaban F, pueden infectar células que expresaban continuamente el gen de ASG-R, células que no expresaban ASG-R o hepatocitos, y se puede examinar si la infección es específica del hígado o específica de ASG-R, mediante el método de Spiegel y col.

Ejemplo 9 Aplicación del vector del virus de ARN con genoma ausente

1.

El RNP carente de F, amplificado en el sistema descrito anteriormente, está encerrado por la envoltura del virus sin F. La envoltura puede introducirse en las células, añadiendo cualquier capacidad deseada de introducción en células, en la envoltura mediante métodos de modificación química y similares, o mediante reactivos para la introducción de genes o pistolas génicas o similares (transfección de RNP o inyección de RNP) y el genoma de ARN recombinante puede replicarse y producir proteínas de manera autónoma y continua en las células.

2.

Puede producirse vector que puede dar direccionamiento específico, cuando se deja tal cual el dominio intracelular de HN y se fusiona el dominio extracelular de HN con ligandos que pueden dirigirse a otros receptores de manera específica, y se incorpora un gen recombinante que puede producir proteína quimérica en el genoma vírico incorporado. Además, se puede preparar el vector en células que producen la proteína recombinante. Estos vectores pueden ser aplicables a la terapia génica, como vacunas o similares.

3.

Puesto que se ha realizado con éxito la reconstitución del virus VSe carente de ambos FHN, se puede producir el vector de direccionamiento, introduciendo el gen de la proteína quimérica de la envoltura que puede dar direccionamiento hacia el sitio de la deleción de FHN, en lugar del gen GFP, reconstituyéndolo mediante el mismo método que en el caso del vector carente de FHN, amplificando el resultante una vez en las células que expresan FHN, infectando el resultante en las células que no lo expresan y recuperando los viriones formados sólo con la proteína de la envoltura quimérica que puede dar direccionamiento, transcrita desde el genoma vírico.

4.

Se ha informado sobre un minigenoma del virus Sendai y un virión formado sólo con la proteína F que se empaqueta en el minigenoma introduciendo el gen NP, P, L y F en las células (Leyer y col., J. Gen. Virol 79, 683-687, 1998). También se ha informado sobre un vector en el que el virus de la leucemia de múridos se convierte en seudotipo mediante la proteína F de Sendai (Spiegel y col., J. Virol 72, 5296-5302, 1998). También se ha informado hasta la fecha, el direccionamiento específico de la proteína F escindida con tripsina hacia hepatocitos, mediado con ASG-R (Bitzer y col., J. Virol. 71, 5481-5486, 1997). Los sistemas en los informes previos son sistemas de formación de partículas transitorias, lo que hace difícil recuperar de manera continua las partículas del vector. Aunque Spiegel y col. han informado sobre el vector de retrovirus convertido en seudotipo por la proteína F de Sendai, este método conlleva problemas intrínsecos, como que el retrovirus sólo puede introducir genes en células mitóticas. Las partículas víricas recuperadas en la presente invención con un genoma vírico de VSe cocarente de FHN y sólo la proteína F como la proteína de la envoltura, son vectores de ARN eficaces que pueden dar replicación autónoma en el citoplasma independientemente de la mitosis celular. Son partículas víricas novedosas, y es un sistema práctico que facilita la producción en masa.

Ejemplo 10 Reconstitución y amplificación vírica a partir del genoma de VSe carente de FHN

Se han establecido las técnicas de reconstitución de partículas víricas infecciosas a partir de ADNc que clonó el genoma vírico para muchos virus de ARN de cadena negativa monocatenaria, tales como el virus Sendai, el virus del sarampión.

En la mayoría de los sistemas, se lleva a cabo la reconstitución introduciendo plásmidos introducidos con ADNc, genes NP, P y L aguas abajo del promotor de T7 en las células y expresando el ADNc y cada gen usando polimerasa de T7. Para suministrar polimerasa de T7, se usa principalmente virus vaccinia recombinante que expresa polimerasa de T7.

El virus vaccinia que expresa T7 puede expresar la polimerasa de T7 de manera eficaz en la mayoría de las células. Sin embargo, debido a la citotoxicidad inducida por el virus vaccinia, las células infectadas sólo pueden vivir durante 2 o 3 días. En la mayoría de los casos, se usa rifampicina como reactivo anti-vaccinia. En el sistema de Kato y col. (Kato, A. y col., Genes Cells 1, 569-579 (1996)), se empleó AraC junto con rifampicina para inhibir el crecimiento del virus vaccinia hasta un nivel mínimo, y la reconstitución eficaz del virus Sendai.

Sin embargo, la eficacia de la reconstitución de virus de ARN de cadena negativa, representados por el virus Sendai, es de varias partículas o menos en 1 x 10^{5} células, bastante inferior a otros virus tales como los retrovirus. Puede darse citotoxicidad debida al virus vaccinia y al proceso de reconstitución del complejo (la proteína transcrita y traducida se une por separado al ARN desnudo para formar una estructura similar a RNP, y tras ésto, se produce la transcripción y la traducción con una polimerasa) como los motivos de esta baja eficacia de la reconstitución.

Además del virus vaccinia, se examinó un sistema de adenovirus como medio para suministrar polimerasa de T7, pero no se obtuvo un buen resultado. El virus vaccinia codifica la enzima de formación de la caperuza de ARN que funciona en el citoplasma como la enzima por sí misma, además de la polimerasa de T7 y se cree que la enzima mejora la eficacia traduccional mediante la formación de la caperuza del ARN transcrito por el promotor de T7 en el citoplasma. La presente invención trató de mejorar la eficacia de la reconstitución del virus Sendai, tratando virus vaccinia con el método de psoraleno-UV de onda larga para evitar la citotoxicidad debida al virus vaccinia.

Mediante la reticulación del ADN con psoraleno y luz ultravioleta de onda larga, se puede obtener el estado en el que se inhibe la replicación del virus con genoma de ADN, sin efectuar la expresión génica temprana en particular. El notable efecto observado por la inactivación del virus en el sistema, puede atribuirse al virus vaccinia que tiene un genoma largo (Tsung, K. y col., J. Virol. 70, 165-171 (1996)).

En el caso del virus de tipo silvestre que puede propagarse de manera autónoma, incluso una sola partícula de virus formada mediante reconstitución, hace posible que se propague el virus Sendai, inoculando las células transfectadas en los embriones de pollo. Por lo tanto, no hay que tener en cuenta la eficacia de la reconstitución y el virus vaccinia residual.

Sin embargo, en el caso de una reconstitución de diversos virus mutantes para investigar la replicación vírica, el mecanismo de formación de partículas, etc., puede ser obligatorio usar líneas celulares que expresan una proteína derivada de virus y similares, no embriones de pollo, para la propagación del virus. Además, puede ser muy posible que el virus mutante o el virus carente se propague de manera marcadamente más lenta que el virus de tipo silvestre.

Para propagar el virus Sendai con tales mutaciones, las células transfectadas deben recubrirse sobre células de la siguiente generación y cultivarse durante un largo periodo de tiempo. En tales casos, la eficacia de la reconstitución y el título residual de los virus vaccinia, pueden ser problemáticos. En el presente método, el título de virus vaccinia supervivientes disminuyó satisfactoriamente, mientras que la eficacia de la reconstitución aumentó.

Usando el presente método, se ha obtenido satisfactoriamente un virus mutante mediante reconstitución, que podría no haberse obtenido nunca con el sistema previo que empleaba un virus vaccinia no tratado (virus carente de FHN, F). El presente sistema sería una gran herramienta para la reconstitución de un virus mutante que se haría en el futuro. Por tanto, los presentes inventores examinaron la cantidad de psoraleno y de luz ultravioleta (UV) y las condiciones de la inactivación del virus vaccinia.

Experimento

En primer lugar, se sometió a ensayo la concentración de psoraleno con un tiempo de radiación fijo de 2 min. Se sometió a ensayo la inactivación midiendo el título de virus vaccinia mediante la formación de placas de lisis y midiendo la actividad polimerasa de T7 con el plásmido pGEM-luci, bajo el control del promotor de T7 y el minigenoma del virus Sendai. La medición de la actividad de la polimerasa de T7 del minigenoma del virus Sendai es un sistema en el que se transfectan células de manera concomitante con plásmido del minigenoma del virus Sendai y los plásmidos pGEM/NP, pGEM/P y pGEM/L, que expresan proteína NP, P y L del virus Sendai a través de T7, para examinar la transcripción de la proteína enzima luciferasa con la polimerasa de ARN del virus Sendai tras la formación del complejo de ribonucleoproteína.

Después de irradiar con luz UV durante 2 min, se observó una disminución en el título del virus vaccinia que dependía de la concentración de psoraleno. Sin embargo, la actividad polimerasa de T7 permaneció inalterada para una concentración de psoraleno de hasta 0, 0,3 y 1 \mug/ml, pero disminuyó hasta aproximadamente una décima parte con 10 \mug/ml (Figura 28).

Además, fijando la concentración de psoraleno en 0,3 \mug/ml, se examinó el tiempo de radiación UV. De acuerdo con el aumento en el tiempo de radiación, disminuyó el título de virus vaccinia, aunque no se encontró ningún efecto sobre la actividad polimerasa de T7 hasta una radiación de 30 min. En este caso, en las condiciones de 0,3 \mug/ml y radiación de 30 min, se pudo disminuir el título hasta 1/1000 sin afectar a la actividad polimerasa de T7 (Figura 29).

Sin embargo, en virus vaccinia con un título disminuido de 1/1000, la CPE 24 horas después de la infección con una moi = 2, calibrada para el título de pretratamiento (moi = 0,002 como título residual después del tratamiento), no fue diferente a la del virus no tratado infectado con una moi = 2 (Figura 30).

Usando el virus vaccinia tratado en las condiciones descritas anteriormente, se examinó la eficacia de la reconstitución del virus Sendai. Se llevó a cabo la reconstitución mediante el procedimiento descrito a continuación, modificando el método de Kato y col., mencionado anteriormente. Se sembraron células LLC-MK2 en microplacas de 6 pocillos con 3 x 10^{5} células/pocillo, y después de cultivar durante una noche, se diluyó el virus vaccinia hasta el título de 6 x 10^{5} ufp/100 \mul, calibrado antes del tratamiento con PLWUV y se infectó en células lavadas con PBS. Una hora después de la infección, se añadieron 100 \mul de OPTI-MEM añadidos con 1, 0,5, 1 y 4 \mug de plásmido pGEM-NP y se añadió además P, L y ADNc, respectivamente con 10 \mul de SuperFect (QIAGEN) y se dejó en reposo durante 15 min. a temperatura ambiente, y tras añadir 1 ml de OPTI-MEM (GIBCO) (que contenía rif. y AraC), se recubrió sobre las células.

Dos, tres y cuatro días después de la transfección, las células se recuperaron, se centrifugaron y se suspendieron en 300 \mul/pocillo de PBS. Se inocularon 100 \mul de la solución que contenía las células, preparada a partir de la propia suspensión o diluyendo la suspensión 10 o 100 veces, en embriones de pollo en el día 10 después de la fertilización, 4 huevos para cada dilución (1 x 10^{5}, 1 x 10^{4} y 1 x 10^{3} células, respectivamente). Tres días después, se recuperó el líquido alantoideo y se examinó con el ensayo de HA (Tabla 1). Los huevos con actividad HA, se puntuaron con 1 punto, 10 puntos y 100 puntos para los huevos inoculados con 1 x 10^{5}, 1 x 10^{4} y 1 x 10^{3} células, respectivamente, para calcular la puntuación de la reconstitución (Figura 31). La fórmula es tal como la que se muestra en la Tabla 1.

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TABLA 1 Efecto de la duración del tratamiento con UV del virus vaccinia sobre la eficacia de la reconstitución del virus Sendai

2

También los títulos residuales del virus vaccinia medidos 2, 3, y 4 días después de la transfección en las células, fueron inferiores en el grupo tratado en proporción al título dado, antes de la transfección (Figura 32).

Inactivando el virus vaccinia mediante PLWUV, pudo disminuirse el título hasta 1/1000 sin afectar a la actividad polimerasa de T7. Sin embargo, la CPE obtenida a partir del virus vaccinia no difirió de la del virus no tratado, con un título 1000 veces superior, tal y como se reveló mediante observaciones microscópicas.

Usando los virus vaccinia tratados con la condición descrita anteriormente, para la reconstitución del virus Sendai, la eficacia de la reconstitución aumentó desde diez hasta cien veces (Figura 31). Al mismo tiempo, el título residual del virus vaccinia tras la infección no era 5 ufp/10^{5} células o más. Por tanto, la supervivencia del virus vaccinia replicable se mantuvo al 0,005% o menos.

Ejemplo 11 Construcción del virus Sendai seudotipo <1> Preparación de células cooperadoras en las que se induce el producto del gen VSV-G

Debido a que el producto del gen VSV-G tiene citotoxicidad, se creó un transformante estable en células LLC-MK2 usando el plásmido pCALNdLG (Arai T. y col., J. Virology 72 (1998) pág. 1115-1121) en el que se puede inducir el producto del gen VSV-G mediante la recombinasa Cre. Se logró la introducción del plásmido en las células LLC-MK2 mediante el método del fosfato de calcio (equipo de reactivos para la transfección en mamíferos Cal-PhosTM, Clontech), según el manual adjunto.

Se introdujeron diez microgramos de plásmido pCALNdLG en las células LLC-MK2 hechas crecer hasta una confluencia del 60% en una placa de cultivo de 10 cm. Se cultivaron las células durante 24 horas con 10 ml de medio MEM-FCS al 10% en una incubadora con 5% de CO_{2} a 37ºC. Después de 24 horas, se separaron las células por rascado y se suspendieron en 10 ml de medio y, a continuación, usando cinco placas de cultivo de 10 cm, se sembraron 1, 2 y 2 placas con 5 ml, 2 ml y 0,5 ml, respectivamente. A continuación se cultivaron durante 14 días en 10 ml de medio MEM-FCS al 10% que contenía 1200 \mug/ml de G418 (GIBCO-BRL) cambiando el medio cada dos días para seleccionar los transformantes estables. Se recuperaron 28 clones resistentes a G418, hechos crecer en el cultivo, empleando anillos de clonación. Cada clon se expandió hasta confluencia en una placa de cultivo de 10 cm.

Para cada clon, se examinó la expresión de VSV-G mediante inmunotransferencia de tipo Western, descrita a continuación, empleando un anticuerpo monoclonal anti-VSV-G, después de infectar con adenovirus AxCANCre recombinante que contenía recombinasa Cre.

Cada clon se hizo crecer en una placa de cultivo de 6 cm hasta confluencia y tras eso, se infectó adenovirus AxCANCre MOI = 10, mediante el método de Saito y col. (véase más arriba), y se cultivó durante 3 días. Después de eliminar el material sobrenadante del cultivo, las células se lavaron con PBS y se separaron de la placa de cultivo añadiendo 0,5 ml de PBS que contenía 0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) e incubando a 37ºC, 5 min. Después de suspender en 3 ml de PBS, las células se recogieron mediante centrifugación a 1500 x g, 5 min. Las células obtenidas se resuspendieron en 2 ml de PBS y a continuación se centrifugaron de nuevo a 1500 x g, 5 min. para recoger las células.

Las células se pueden almacenar a -20ºC y se pueden usar mediante descongelación según las necesidades. Las células recogidas se lisaron en 100 \mul de solución de lisis celular (tampón RIPA, Boehringer Mannheim) y se realizó la inmunotransferencia de tipo Western, usando la proteína completa de las células (1 x 10^{5} células por pista). El material lisado celular se disolvió en tampón de la muestra de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (tampón que comprende Tris-HCl 6 mM (pH 6,8), 2% de SDS, 10% de glicerol, 5% de 2-mercaptoetanol) y se presentaron como muestras para electroforesis, después de calentar a 95ºC, 5 min. Las muestras se separaron mediante electroforesis empleando un gel de SDS-poliacrilamida (Multigel 10/20, Daiichi, Pure Chemicals Co., Ltd.) y después la proteína separada se transfirió a la membrana de transferencia (membranas de transferencia Immobilon-P, Millipore) mediante el método de inmunotransferencia semiseca. La transferencia se realizó usando la membrana de transferencia empapada con metanol al 100% durante 20 seg. y con agua durante 1 hora, a una corriente constante de 1 mA/cm^{2} durante 1 hora.

La membrana de transferencia se agitó en 40 ml de solución de bloqueo (Block-Ace, Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) durante 1 hora y se lavó una vez con PBS.

La membrana de transferencia y 5 ml de anticuerpo anti-VSV-G (clon P4D4, Sigma) diluido 1/1000 con PBS que contenía un 10% de solución de bloqueo, se sellaron en una bolsa de vinilo y se dejaron en reposo a 4ºC.

La membrana de transferencia se empapó dos veces con 40 ml de PBS-Tween 20 al 0,1% durante 5 min y después de lavar, se empapó con PBS durante 5 min. para el lavado.

La membrana de transferencia y 5 ml de anticuerpo IgG anti-ratón marcado con peroxidasa (inmunoglobulina anti-ratón, Amersham) diluido hasta 1/2500 en PBS que contenía 10% de solución de bloqueo, se sellaron en una bolsa de vinilo y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora.

Después de agitar, la membrana de transferencia se empapó dos veces con PBS-0,1% de Tween 20 durante 5 min. y después del lavado, se empapó con PBS durante 5 min. para lavar.

La detección de proteínas en la membrana que reaccionan de manera cruzada con el anticuerpo anti-VSV-G, se realizó con el método de luminiscencia (reactivos de detección de la inmunotransferencia de tipo Western ECL, Amersham). El resultado se muestra en la Figura 33. Tres clones mostraron una expresión de VSV-G específica de la infección con AxCANCre, lo que confirma el establecimiento de las células LLC-MK2 en las que se puede inducir el producto del gen VSV-G.

Entre los clones obtenidos, un clon denominado LLCG-L1 se sometió a un análisis de citometría de flujo usando el anticuerpo anti-VSV (Figura 34). Como resultado, se detectó la reactividad con un anticuerpo específico para la inducción del gen VSV-G en LLCG-L1, lo que confirmaba que la proteína VSV-G se expresaba en la superficie celular.

<2> Preparación del virus Sendai seudotipo que comprende un genoma carente del gen F, empleando células cooperadoras

Se infectó el virus Sendai que comprende un genoma carente del gen F, en células que expresaban el gen VSV-G y se examinó si se puede observar o no la producción de virus seudotipo con VSV-G como cápsida, empleando un virus Sendai carente de F que comprende el gen GFP descrito en los ejemplos anteriores, y la expresión del gen GFP como un índice. Como resultado, se introdujo el gen vírico en LLCG-L1 sin infección de adenovirus AxCANCre recombinante que comprende la recombinasa Cre, mediante infección con el virus Sendai carente de F y se detectaron las células que expresaban GFP, aunque no aumentó el número de células con expresión. En las células inducidas con VSV-G, se encontró un aumento cronológico de las células que expresaban GFP. Cuando se añadió adicionalmente 1/5 del material sobrenadante a las células recién inducidas con VSV-G, no se observó una introducción de los genes en el primer material sobrenadante; aunque se observó que el aumento de las células que expresaban GFP, así como una introducción de genes en el segundo material sobrenadante. También, en el caso de que el material sobrenadante segundo, se añadiera a las células LLCG-L1 sin inducción de VSV-G, se introdujo el gen, pero no se observó un aumento de las células que expresaban GFP. Resumiendo, se encontró una propagación vírica específica para las células que expresaban VSV-G y se observó la formación de virus carente de F seudotipo, con VSV-G.

<3> Evaluación de las condiciones para producir virus Sendai seudotipo con genoma carente del gen F

Una cierta cantidad de virus Sendai seudotipo con genomas carentes del gen F, se infectó cambiando la cantidad de infección de AxCANCre (MOI = 0, 1,25, 2,5, 5 y 10) y se recuperó el material sobrenadante del cultivo el día 7 o el día 8. A continuación, el material sobrenadante se infectó en las células antes y después de la inducción de VSV-G y después de 5 días, se comparó el número de células que expresaban GFP para observar el efecto de la cantidad de expresión del gen VSV-G. Como resultado, no se encontró una producción vírica con MOI = 0 y se encontró producción máxima con MOI = 10 (Figura 35). Además, cuando se analizó el transcurso del tiempo de la producción vírica, el nivel de producción empezó a aumentar desde el día 5 o después, continuando hasta el día 8 (Figura 36). Se logró la medición del título vírico calculando el número de partículas infectadas en las células en la solución vírica (UIC), contando las células que expresaban GFP, 5 días después de la infección con soluciones víricas diluidas en serie (10 veces cada una) de las células aún no inducidas con VSV-G. Como resultado, se encontró que la producción vírica máxima era de 5 x 10^{5} UIC/ml.

<4> Efecto del anticuerpo anti-VSV sobre la infecciosidad del virus Sendai seudotipo con genoma carente del gen F

Para examinar si el virus Sendai seudotipo con genoma carente del gen F, obtenido empleando células que expresaban VSV-G, comprendía la proteína VSV-G en la cápsida, se evaluó la actividad neutralizadora para observar si la infecciosidad se veía afectada usando el anticuerpo anti-VSV. La solución vírica y el anticuerpo se mezclaron y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación se infectaron en células LLCG-L1 sin inducción de VSV-G. El día 5, se examinó la capacidad de introducción de genes, mediante la existencia de células que expresaban GFP. Como resultado, se observó una inhibición perfecta de la infecciosidad mediante el anticuerpo anti-VSV, mientras que en el virus Sendai con el genoma carente del gen F, que tiene la cápsida original, no se observó la inhibición (Figura 37). Por tanto, se mostró claramente que el presente virus obtenido es un virus Sendai seudotipo, que comprende la proteína VSV-G en su cápsida, en el que se puede inhibir específicamente la infecciosidad del virus mediante un anticuerpo.

<5> Confirmación de la posesión del virus Sendai seudotipo de genoma carente de F

Se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Western de un extracto celular de las células infectadas, para examinar si el presente virus propagado en las células que expresaban el gen VSV-G es del tipo carente de F. Se realizó un análisis de tipo Western mediante el método descrito anteriormente. Como anticuerpos primarios, se emplearon anticuerpo policlonal anti-virus Sendai, preparado a partir de conejo, anticuerpo monoclonal anti-proteína F preparado a partir de ratón y anticuerpo monoclonal anti-proteína HN, preparado a partir de ratón. Como anticuerpos secundarios se emplearon anticuerpo IgG anti-conejo marcado con peroxidasa en el caso del anticuerpo policlonal anti-virus Sendai y anticuerpo IgG anti-ratón marcado con peroxidasa en el caso de anticuerpo monoclonal anti-proteína F y anticuerpo monoclonal anti-proteína HN. Como resultado, no se detectó proteína F, mientras que se detectó proteína obtenida a partir del virus Sendai y proteína HN, lo que confirma que es del tipo carente de F.

<6> Preparación de virus Sendai seudotipo con genoma carente del gen F y HN, empleando células cooperadoras

Se analizó si se observa una producción de virus seudotipo con VSV-G en su cápsida, después de infectar el virus Sendai con genoma carente del gen F y HN en células LLCG-L1 que expresaban el gen VSV-G empleando la expresión del gen GFP como indicador y el virus Sendai carente del gen F y de HN que comprende el gen GFP, descrito en los ejemplos anteriores, mediante un método similar al descrito en los ejemplos anteriores. Como resultado, se observó una propagación vírica específica de las células que expresaban VSV-G y se observó la producción de virus Sendai carente de F y de HN que es un seudotipo con VSV-G (Figura 38). Se llevó a cabo la medición del título vírico, calculando el número de partículas infectadas en las células en la solución vírica (UIC), contando las células que expresaban GFP, 5 días después de la infección de soluciones víricas diluidas en serie (10 veces cada una) en células no inducidas aún con VSV-G. Como resultado, la producción vírica máxima fue de 1 x 10^{6} UIC/ml.

<7> Confirmación de la posesión del virus Sendai seudotipo con genoma carente de F y de HN

Se realizó una inmunotransferencia de tipo Western de proteínas en un extracto celular de células infectadas, para analizar si el presente virus propagado en células que expresaban VSV-G, es del tipo carente de F y de HN. Como resultado, no se detectaron las proteínas F y HN, mientras que se detectaron proteínas obtenidas a partir del virus Sendai, lo que confirma que es del tipo carente de F y de HN (Figura 39).

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Ejemplo 12 Análisis del método de reconstitución vírica Método convencional

Se sembraron células LLC-MK2 en placas de cultivo de 100 mm, con 5 x 10^{6} células/placa. Después de cultivar durante 24 horas, las células se lavaron una vez con medio MEM sin suero, y a continuación se infectaron con virus vaccinia recombinante que expresaba la polimerasa de ARN de T7 (Fuerst, T.R. col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) (vTF7-3) a temperatura ambiente durante 1 hora (moi = 2) (moi = 2 a 3, preferentemente se usa moi = 2). El virus empleado en el presente documento se trató previamente con 3 \mug/ml de psoraleno y luz ultravioleta de onda larga (365 nm) durante 5 min. Los plásmidos pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P y pGEM/L (Kato, A. y col., Genes Cells 1, 569-579 (1996)) se suspendieron en medio Opti-MEM (GIBCO), a una razón de 12 \mug, 4 \mug, 2 \mug y 4 \mug/placa, respectivamente. A continuación, se añadió reactivo de transfección SuperFect (1 \mug de ADN/5 \mul, QIAGEN) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 15 min. y se añadieron 3 ml de medio Opti-MEM que contenía un 3% de FBS. Después, las células se lavaron dos veces con medio MEM sin suero y se añadió mezcla de ADN-SuperFect. Después de cultivar durante 3 horas, las células se lavaron dos veces con medio MEM sin suero y se cultivaron 70 horas en medio MEM que contenía 40 \mug/ml de \beta-D-arabinofuranósido de citosina (AraC, Sigma). Se recogieron las células y el material sobrenadante del cultivo como muestras P0-d3. Los sedimentos de P0-d3 se suspendieron en medio Opti-MEM (10^{7} células/ml). Se congelaron y se descongelaron tres veces y a continuación se mezclaron con reactivos de lipofección DOSPER (Boehringer Mannheim) (10^{6} células/25 \mul de DOSPER) y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación se transfectaron las células LLC-MK2/F7 que expresaban F con la mezcla (10^{6} células/pocillo en placas de 24 pocillos) y se cultivaron con medio MEM sin suero (que contenía 40 \mug/ml de AraC y 7,5 \mug/ml de tripsina). Se recuperó el material sobrenadante del cultivo en día 3 y el día 7 y las muestras se denominaron P1-d3 y P1-d7.

Método de recubrimiento de células que expresan F + plásmido de la envoltura

Se llevó a cabo la transfección de manera similar a como se ha descrito anteriormente, excepto que se añadieron 4 \mug/placa de plásmido de la envoltura pGEM/FHN. Después de cultivar durante 3 h, las células se lavaron dos veces con medio MEM sin suero y se cultivaron 48 horas en medio MEM que contenía 40 \mug/ml de \beta-D-arabinofuranósido de citosina (AraC, Sigma) y 7,5 \mug/ml de tripsina. Después de eliminar el material sobrenadante del cultivo, las células se recubrieron con 5 ml de solución de suspensión celular de una placa de 100 mm de células LLC-MK2/F7 que expresaban F, suspendidas con medio MEM sin suero (que contenía 40 \mug/ml de AraC y 7,5 \mug/ml de tripsina). Después de cultivar durante 48 h, las células y el material sobrenadante se recuperaron y las muestras se denominaron P0-d4. Los sedimentos de las muestras P0-d4 se suspendieron en medio Opti-MEM (2 x 10^{7} células/ml) y se congelaron y se descongelaron tres veces. A continuación, se recubrieron las células LLC-MK2/F7 que expresaban F, con la suspensión (2 x 10^{6} células/pocillo, placas de 24 pocillos) y se cultivaron en medio MEM sin suero (que contenía 40 \mug/ml de AraC y 7,5 \mug/ml de tripsina). Se recuperó el material sobrenadante del cultivo el día 3 y el día 7, y se denominaron muestras P1-d3 y P1-d7, respectivamente. Como testigo se realizó el experimento empleando el mismo método, tal y como se ha descrito anteriormente, pero sin recubrimiento y añadiendo sólo el plásmido de la envoltura.

Medición de UIC (unidades infecciosas celulares) contando las células que expresan GFP (GFP-UIC)

Se sembraron las células LLC-MK2 en una placa con 12 pocillos, con 2 x 10^{5} células/pocillo, y después de cultivar durante 24 h, se lavaron los pocillos una vez con medio MEM sin suero. Después las células se infectaron con 100 \mul/pocillo de las muestras diluidas de manera adecuada, tal y como se ha descrito anteriormente (P0-d3 o P0-d4, P1-d3 y P1-d7) en las que se diluyeron las muestras de modo que contenían de 10 a 100 células positivas en 10 cm^{2}. Después de 15 min., se añadió 1 ml/pocillo de medio MEM exento de suero y tras otro cultivo de 24 h, se observaron las células bajo microscopio de fluorescencia para contar las células que expresaban GFP.

Medición de UIC (unidades infecciosas celulares)

Se sembraron células LLC-MK2 en una placa de 12 pocillos con 2 x 10^{5} células/placa y después de cultivar durante 24 h, se lavaron las células una vez con medio MEM sin suero. A continuación, las células se infectaron con 100 \mul/pocillo de las muestras descritas anteriormente, en las que el vector vírico contenido se designó SVe/\DeltaF-GFP. Después de 15 min, se añadió 1 ml/pocillo de medio MEM sin suero y se cultivó durante otras 24 horas. Tras el cultivo, las células se lavaron con PBS (-) tres veces y se secaron dejándolas en reposo a temperatura ambiente, durante aproximadamente 10 min. a 15 min. Para fijar las células, se añadió 1 ml/pocillo de acetona y se eliminó inmediatamente y después las células se secaron de nuevo dejándolas en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 min. a 15 min. Se añadió a las células 300 \mul/pocillo de anticuerpo policlonal anti-VSe (DN-1) preparado a partir de conejo, diluido 100 veces con PBS(-) y se incubaron durante 45 min. a 37ºC. A continuación se lavaron tres veces con PBS(-) y se añadieron 300 \mul/pocillo de anticuerpo secundario marcado con fluorescencia IgG (H+L) anti-conejo (Alexa® 568, Molecular Probes), se diluyeron 200 veces con PBS (-) y se incubaron durante 45 min a 37ºC. Después de lavar con PBS (-) tres veces, se observaron las células bajo microscopio de fluorescencia (emisión: 560 nm, absorción: 645 nm, filtros Leica) para hallar las células fluorescentes (Figura 40).

Como testigos, se infectaron las muestras descritas anteriormente (SeV/\DeltaF-GFP) con 100 \mul/pocillo y después de 15 min, se añadió 1 ml/pocillo de MEM sin suero y tras un cultivo de 24 h, se observaron las células bajo microscopio de fluorescencia (emisión: 360 nm, absorción: 470 nm, filtros Leica) para hallar las células que expresaban GFP sin el procedimiento después del cultivo.

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Ejemplo 13 Evaluación de las condiciones de tratamiento con PLWUV (psoraleno y luz UV de onda larga) más adecuadas para el virus vaccinia (vTF7-3) para aumentar la eficacia de la reconstitución del vector del virus Sendai de tipo carente

Las células LLC-MK2 se sembraron en placas de cultivo de 100 mm con 5 x 10^{6} células/placa y después de cultivar durante 24 h, se lavaron las células una vez con medio MEM sin suero. A continuación, se infectaron las células con virus vaccinia recombinante (vTF7-3) (Fuerst, T.R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) que expresaba la polimerasa de ARN de T7 a temperatura ambiente, durante 1 hora (moi = 2) (moi = 2 a 3 preferiblemente se emplea moi = 2). El virus empleado en esta memoria, se trató previamente con 0,3 a 3 \mug/ml de psoraleno y luz ultravioleta de onda larga (365 nm) durante 2 a 20 min. Los plásmidos pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P y pGEM/L (Kato, A. y col., Genes Cells, 1 569-579 (1996)) se suspendieron en medio Opti-MEM (GIBCO) a una razón de 12 \mug, 4 \mug, 2 \mug y 4 \mug/placa, respectivamente. A continuación, se añadió el reactivo de transfección SuperFect (1 \mug de ADN/5 \mul, QIAGEN) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 15 min. y se añadieron 3 ml de medio Opti-MEM que contenía 3% de FBS. Después, las células se lavaron dos veces con medio MEM sin suero y a continuación se añadió la mezcla de ADN-SuperFect. Después de cultivar durante 3 h, las células se lavaron dos veces con medio MEM sin suero y se cultivaron 48 horas en medio MEM que contenía 40 \mug/ml de \beta-D-arabinofuranósido de citosina (AraC, Sigma). Se observó aproximadamente 1/20 del campo de visión en una placa de cultivo de 100 mm, con un microscopio de fluorescencia y se contaron las células que expresaban GFP. Para someter a ensayo la inactivación del virus vaccinia (vTF7-3), se llevó a cabo la medición del título mediante la formación de placas de lisis (Yoshiyuki Nagai y col., Virus Experiment Protocols, págs. 291-296, 1995).

Además, al fijar el tiempo de recuperación tras la transfección hasta el día 3, se examinó el psoraleno y el tiempo de radiación UV. Empleando virus vaccinia (vTF7-3) tratado con cada tratamiento con PLWUV, se examinó la eficacia de la reconstitución del virus Sendai. Se realizó la reconstitución modificando el método de Kato y col, concretamente mediante el procedimiento descrito a continuación. Se sembraron células LLC-MK2 en una microplaca de 6 pocillos con 5 x 10^{5} células/pocillo y después de cultivar durante una noche, (se consideró que las células crecían hasta 1 x 10^{6} células/pocillo), se infectaron las células lavadas con PBS, con virus vaccinia (vTF7-3) diluido hasta 2 x 10^{6} ufp/100 \mul, calibrado mediante el título antes del tratamiento con PLWUV. Después de infectar durante 1 hora, se añadieron 50 \mul de medio Opti-MEM (GIBCO) con 1, 0,5, 1 y 4 \mug de plásmido pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L y ADNc de VSe de tipo adicional (pSeV18^{+}b(+)) (Hasan, M. K. y col., J. General Virology 78:2813-2820, 1997), respectivamente. Se añadieron adicionalmente 10 \mul de SuperFect (QIAGEN) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, se añadió 1 ml de medio Opti-MEM (que contenía 40 \mug/ml de AraC) y se recubrió sobre las células. Se recuperaron las células 3 días después de la transfección, a continuación se centrifugaron y se suspendieron en 100 \mul/pocillo de PBS. La suspensión se diluyó 10, 100 y 1000 veces y se inocularon 100 \mul de la solución celular resultante en los embriones de pollo, 10 días después de la fertilización, empleando 3 huevos para cada dilución (1 x 10^{5}, 1 x 10^{4}, 1 x 10^{3} células, respectivamente). Después de 3 días, se recuperó el líquido alantoideo de los huevos y se examinó la reconstitución vírica mediante el ensayo de HA. Para calcular la eficacia de la reconstitución, los huevos que mostraban actividad de HA, a los que se había inoculado 1 x 10^{5}, 1 x 10^{4}, 1 x 10^{3} células, se contaron como 1, 10 y 100 puntos, respectivamente.

Resultados

En las Figuras 40 a 43 y en la Tabla 2, se muestran los resultados de los Ejemplos 12 y 13. La combinación del plásmido que expresa la envoltura y el recubrimiento celular aumentó la eficacia de la reconstitución de SeV/\DeltaF-GFP. Se obtuvo una mejora notable en d3, a d4 (día 3 a día 4) de P0 (antes del subcultivo) (Figura 41). En la Tabla 2, se inocularon los huevos con células 3 días después de la transfección. Se obtuvo la mayor eficacia de la reconstitución el día 3 cuando se trataron con 0,3 \mug/ml de psoraleno durante 20 min. Por tanto, estas condiciones se consideraron como óptimas (Tabla 2).

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TABLA 2 Efecto del tratamiento con PLWUV del virus vaccinia sobre la reconstitución del virus Sendai (los huevos se inocularon con células, 3 días después de la transfección)

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Ejemplo 14 Preparación del vector del virus Sendai que comprende LacZ, que carece de F, y no comprende GFP Construcción del ADNc del vector de VSe de tipo carente de F que comprende el gen LacZ

Para construir el ADNc que comprende el gen LacZ en el sitio de restricción de NotI existente en la región aguas arriba del gen NP de pSeV18^{+}/\DeltaF descrito en el Ejemplo 1 (pSeV(+18:LacZ)/DF), se realizó una PCR para amplificar el gen LacZ. Se llevó a cabo una PCR ajustando el gen LacZ a múltiplos de 6 (Hausmann, S. y col., RNA 2, 1033-1045 (1996)) y empleando el cebador (5'-GCGCGGCCGCCGTACGGTGGCAACCATGTCGTTTACTTTGACCAA-3'/SEQ ID NO: 17) que comprende el sitio de restricción de NotI para el extremo 5', y el cebador (5'-GCGCGGCCGC
GATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGCTATTACTTCTGACACCAGACCAACTGGTA3'/
SEQ ID NO: 18) que comprende la señal de terminación de la transcripción de VSe (E), la secuencia intercalada (I), la señal de iniciación de la transcripción (S) y el sitio de restricción de NotI para el extremo 3', usando pCMV-\beta (Clontech) como molde. Las condiciones de la reacción fueron del modo siguiente. Se mezclaron 50 ng de pCMV-\beta, dNTP 200 \muM (Pharmacia Biotech), cebadores 100 pM, 4 U de polimerasa Vent (New England Biolab), con el tampón acompañante y se usaron 25 ciclos con una temperatura de reacción de 94ºC durante 30 seg., 50ºC durante 1 min, 72ºC durante 2 min. Los productos resultantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. A continuación, se cortó un fragmento de 3,2 kb y se digirió con NotI después de la purificación. Se obtuvo pSeV(+18:LacZ)/\DeltaF mediante ligamiento con el fragmento digerido con NotI de pSeV18^{+}/\DeltaF.

Método convencional

Se sembraron células LLC-MK2 en placas de cultivo de 100 mm a 5 x 10^{6} células/placa y tras un cultivo de 24 horas, las células se lavaron una vez con medio MEM sin suero. A continuación, las células se infectaron con virus vaccinia recombinante (vTF7-3) (Fuerst, T. R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8122-8126 (1986)) que expresa polimerasa de ARN de T7 a temperatura ambiente durante 1 hora (moi = 2 a 3, preferentemente se emplea moi = 2). El virus empleado en la presente memoria se trató previamente con 3 \mug/ml de psoraleno y luz ultravioleta de onda larga (365 nm) durante 5 min. El ADNc del vector del virus Sendai que comprende LacZ, del tipo carente de F (pSeV(+18:LacZ)/\DeltaF), pGEM/NP, pGEM/P y pGEM/L (Kato, A. y col., Genes Cells 1, 569-579 (1996)) se suspendieron en medio Opti-MEM (GIBCO) a una razón de 12 \mug, 4 \mug, 2 \mug y 4 \mug/placa, respectivamente, se añadieron 4 \mug/placa de plásmido de la envoltura pGEM/FHN y el reactivo de transfección SuperFect (1 \mug de ADN/5 \mul, QIAGEN) y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación se añadieron 3 ml de medio Opti-MEM que contenía un 3% de FBS y las células se lavaron dos veces con medio MEM sin suero y después se añadió la mezcla de ADN-SuperFect. Tras un cultivo de 3 h, las células se lavaron dos veces con medio MEM sin suero y se cultivaron durante 24 horas en medio MEM que contenía 40 \mug/ml de \beta-D-arabinofuranósido de citosina (AraC, Sigma) y 7,5 \mug/ml de tripsina. El material sobrenadante de los cultivos se eliminó y las células se recubrieron con 5 ml de una suspensión de una placa de cultivo de 100 mm de células LLC-MK2/F7, que expresaban F, en medio MEM sin suero (que contenía 40 \mug/ml de AraC y 7,5 \mug/ml de tripsina). Después de cultivar durante 48 h, las células y el material sobrenadante se recuperaron y se designaron muestras P0-d3. Los sedimentos de P0-d3 se suspendieron en medio Opti-MEM (2 x 10^{7} células/ml) y después de congelar-descongelar 3 veces, se mezclaron con reactivo de lipofección DOSPER (Boehringer Mannheim) (10^{6} células/25 \mul de DOSPER) y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, las células LLC-MK2/F7 que expresaban F, se transfectaron con la mezcla (10^{6} células/pocillo, placas de 24 pocillos) y se cultivaron con medio MEM sin suero (que contenía 40 \mug/ml de AraC y 7,5 \mug/ml de tripsina). Se recuperó el material sobrenadante del cultivo el día 7 y las muestras se designaron P1-d7. Además, se infectaron los volúmenes totales de material sobrenadante para las células LLC-MK2/F7 que expresaban F, sembradas en placas de 12 pocillos, a 37ºC durante 1 hora. A continuación, después de lavar una vez con medio MEM, las células se cultivaron en medio MEM sin suero (que contenía 40 \mug/ml de AraC y 7,5 \mug/ml de tripsina). El material sobrenadante del cultivo se recuperó el día 7, y se designó muestras P2-d7. Además se infectaron los volúmenes totales de material sobrenadante para las células LLC-MK2/F7 que expresaban F sembradas en placas de 6 pocillos a 37ºC durante 1 horas. A continuación, después de lavar una vez con medio MEM, las células se cultivaron en medio MEM sin suero (que contenía 7,5 \mug/ml de tripsina). El material sobrenadante se recuperó el día 7, y se designaron muestras P3-d7. Además, se infectaron los volúmenes totales de material sobrenadante de las células LLC-MK2/F7 que expresaban F, sembradas en placas de 10 cm, a 37ºC durante 1 hora. A continuación, después de lavar una vez con medio MEM, las células se cultivaron en medio MEM sin suero (que contenía 40 \mug/ml de AraC y 7,5 \mug/ml de tripsina). El material sobrenadante del cultivo se recuperó del cultivo el día 7 y se designó muestras P4-d7.

Medición de UIC contando las células que expresan LacZ (LacZ-UIC)

Las células LLC-MK2 se sembraron en placas de 6 pocillos con 2,5 x 10^{6} células/pocillo y después de cultivar 24 h, las células se lavaron una vez con medio MEM sin suero y se infectaron con series de dilución en serie de 1/10 veces de P3-d7 preparadas usando medio MEM a 37ºC durante 1 hora. A continuación, las células se lavaron 1 vez con medio MEM y se añadió 1,5 ml de medio MEM que contenía un 10% de suero. Después de cultivar durante tres días a 37ºC, las células se tiñeron con el equipo de reactivos de tinción de \beta-Gal (Invitrogen). El resultado del experimento repetido tres veces se muestra en la Figura 44. Después de contar las células positivas para la tinción con LacZ, se obtuvo en cualquier caso 1 x 10^{6} UIC/ml de virus en las muestras P3-d7.

Ejemplo 15 Regulación de los niveles de expresión génica, usando un efecto de polaridad en el virus Sendai Construcción del ADNc genómico de Vse

Se introdujeron sitios NotI adicionales en el ADNc genómico de longitud completa del virus Sendai (VSe), concretamente pSeV(+) (Kato, A. y col., Genes to Cells 1:569-579, 1996) entre la señal de inicio y la señal de iniciación de la traducción ATG de los genes respectivos. Específicamente, se separaron fragmentos de pSeV(+) digeridos con SphI/SalI (2645 pb), ClaI (3246 pb) y ClaI/EcoRI (5146 pb), con electroforesis en gel de agarosa y se cortaron las bandas correspondientes y a continuación se recuperaron y se purificaron con el sistema de extracción en gel QIAEXII (QIAGEN), tal y como se muestra en la Figura 45 (A). El fragmento digerido con SphI/SalI, el fragmento digerido con ClaI y el fragmento digerido con ClaI/EcoRI se ligaron con LITMUS38 (NEW ENGLAND BIOLABS) pBluescriptII KS+ (STRATAGENE) y pBluescriptII KS+ (STRATAGENE), respectivamente, para la subclonación. Se empleó el equipo de reactivos para mutagénesis dirigida al sitio, Quickchange (STRATAGENE) para la introducción sucesiva de los sitios NotI. Los cebadores sintetizados y empleados para cada introducción, fueron, cadena codificadora: 5'-ccaccgaccacacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3' (SEQ ID NO: 19), cadena no codificante: 5'-ccgaagccgtggctgtcgcggccgctgggtgtggtcggtgg-3' (SEQ ID NO: 20) para NP-P, cadena codificadora: 5'-gaaattt
cacctaagcggccgcaatggcagatatctatag-3' (SEQ ID NO: 21), cadena no codificante: 5'-ctatagatatctgccattgcggccgcttaggt
gaaatttc-3' (SEQ ID NO: 22) para P-M, cadena codificadora: 5'-gggataaagtcccttgcggccgcttggttgcaaaactctcccc-3' (SEQ ID NO: 23), cadena no codificante: 5'-ggggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc-3' (SEQ ID NO: 24) para M-F, cadena codificadora: 5'-ggtcgcgcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3' (SEQ ID NO: 25), cadena no codificante: 5'-ccatgatctgtgcttgtttgaggcggccgctaaagtaccgcgcgacc-3' (SEQ ID NO: 26) para F-HN, cadena codificadora: 5'-cctgcccatccatgacctagcggccgcttcccattcaccctggg-3' (SEQ ID NO: 27), cadena no codificante: 5'-cccagggtgaatgg
gaagcggccgctaggtcatggatgggcagg-3' (SEQ ID NO: 28) para HN-L.

Como moldes se emplearon fragmentos SalI/SphI para NP-P, fragmentos ClaI para P-M y M-F y fragmentos ClaI/EcoRI para F-HN y HN-L que se subclonaron tal y como se ha descrito anteriormente, y se llevó a cabo la introducción según el protocolo que acompaña al equipo de reactivos de mutagénesis dirigida al sitio Quickchange. El material resultante se digirió de nuevo con la misma enzima empleada para la subclonación, se recuperó y se purificó. A continuación, se ensambló con el ADNc genómico del virus Sendai. Como resultado se construyeron 5 clases de ADNc genómico del virus Sendai (pSeV(+)NPP, pSeV(+)PM, pSeV(+)MF, pSeV(+)FHN y pSeV(+)HNL) en los que se habían introducido sitios NotI entre cada gen, tal y como se muestra en la Figura
45(B).

Como gen indicador para someter a ensayo el nivel de expresión génica, se subclonó fosfatasa alcalina humana del tipo secretado (SEAP) mediante PCR. Como cebadores se sintetizó el cebador 5': 5'-gcggcgcgccatgctgctgctgctgctgctg
ctgggcctg-3' (SEQ ID NO: 29) y el cebador 3': 5'-gcggcgcgcccttatcatgtctgctcgaagcggccggccg-3' (SEQ ID NO: 30) a los que se añadieron sitios de restricción AscI y se realizó una PCR. Se empleó pSEAP-Basis (CLONTECH) como molde y se usó la polimerasa de ADN Pfu turbo (STRATAGENE) como enzima. Después de la PCR, los productos resultantes se digirieron con AscI, luego se recuperaron y se purificaron mediante electroforesis. Como plásmido para la subclonación, se construyó pBluescriptII KS+ con ADN bicatenario, incorporado en su sitio de NotI (cadena codificadora: 5'-gcggccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3' (SEQ ID NO: 31), cadena no codificante: 5'-gcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggatttaaatggcgcgccgtttaaacgcggccgc-3' (SEQ ID NO: 32) que comprendía un sitio de clonación múltiple (PmeI-AScI-SwaI) y una señal de terminación -secuencia intercalada- señal de iniciación (Figura 46). Para el sitio AscI del plásmido, se ligó el producto de la PCR recuperado y purificado y se clonó. El material resultante se digirió con NotI y se recuperó el fragmento del gen SEAP y se purificó mediante electroforesis para ligarse en los 5 tipos de ADNc genómico del virus Sendai y el sitio NotI de pSeV18+ respectivamente. Los vectores víricos resultantes se designaron pSeV(+)NPP/SEAP, pSeV(+)PM/SEAP, pSeV(+)MF/SEAP, pSeV(+)FHN/SEAP, pSeV(+)HNL/SEAP y pSeV18(+)/SEAP, respectivamente.

Reconstitución vírica

Las células LLC-MK2 se sembraron en placas de cultivo de 100 mm con 2 x 10^{6} células/placa y después de cultivar durante 24 horas, las células se infectaron con virus vaccinia recombinante (PLWUV-VacT7) (Fuerst, T.R. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8122-8126, 1986, Kato, A., y col., Genes Cells 1:569-579, 1996) que expresa polimerasa de T7, durante 1 hora (moi = 2) a temperatura ambiente durante 1 hora, en donde el virus se trató previamente con psoraleno y luz UV. Cada ADNc del virus Sendai al que se había incorporado SEAP, pGEM/NP, pGEM/P y pGEM/L, se suspendió en medio Opti-MEM (GIBCO) a una razón de 12 \mug, 4 \mug, 2 \mug y 4 \mug/placa, respectivamente, se añadieron 110 \mul del reactivo de transfección SuperFect (QIAGEN) y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos y se añadieron 3 ml de medio Opti-MEM que contenía 3% de FBS. A continuación, las células se lavaron y se añadió la mezcla de ADN-SuperFect. Después de cultivar durante 3 a 5 horas, las células se lavaron dos veces con medio MEM sin suero y se cultivaron 72 horas en medio MEM que comprendía \beta-D-arabinofuranósido de citosina (AraC). Estas células se recuperaron y los sedimentos se suspendieron con 1 ml de PBS, se congelaron y se descongelaron tres veces. Los 100 \mul de producto resultante se inocularon en huevos de gallina que se preincubaron 10 días y se incubaron otros 3 días a 35ºC, a continuación, se recuperó el líquido alantoideo. Los líquidos alantoideos recuperados se diluyeron desde 10^{-5} hasta 10^{-7} y se inocularon de nuevo en huevos de gallina para que estuvieran exentos de virus vaccinia, después se recuperaron de forma similar y se almacenaron en partes alícuotas a -80ºC. Los vectores víricos se designaron SeVNPP/SEAP, SeVPM/SEAP, SeVMF/SEAP, SeVFHN/SEAP, SeVHNL/SEAP y SeV18/SEAP.

Medición del título mediante un ensayo de placas de lisis

Se sembraron células CV-1 en placas de 6 pocillos con 5 x 10^{5} células/pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Después de lavar con PBS, las células se incubaron 1 hora con VSe recombinante diluido hasta 10^{-3}, 10^{-4}, 10^{-5}, 10^{-6} y 10^{-7} mediante BSA/PBS (BSA al 1% en PBS), se lavaron de nuevo con PBS, a continuación se recubrieron con 3 ml/pocillo de BSA/MEM/agarosa (0,2% de BSA + 2x MEM, mezclado con un volumen equivalente de agarosa al 2%) y se cultivaron a 37ºC, un 0,5% de CO_{2} durante 6 días. Después de cultivar, se añadieron 3 ml de etanol/ácido acético (etanol:ácido acético= 1:5) y se dejaron en reposo durante 3 horas, después se eliminaron con agarosa. Después de lavar tres veces con PBS, las células se incubaron con anticuerpo de conejo anti-virus Sendai, diluido 100 veces a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, después de lavar tres veces con PBS, las células se incubaron con Ig (G+H) de cabra anti-conejo, marcada con Alexa Flour® (Molecular Probe) diluido 200 veces a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar tres veces con PBS, se obtuvieron imágenes de fluorescencia mediante el analizador de imágenes luminiscentes LAS1000 (Fuji Film) y se midieron las placas de lisis. Los resultados se muestran en la Figura 47. Además, se muestran los resultados de los títulos obtenidos en la Tabla 3.

TABLA 3 Resultados de los títulos de cada virus Sendai recombinante medido a partir de los resultados del ensayo de las placas de lisis

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Comparación de la expresión del gen indicador

Se sembraron células LLC-MK2 en una placa de 6 pocillos con 1 a 5 x 10^{5} células/pocillo, y después de cultivar durante 24 horas, se infectó cada vector vírico con moi = 2. Después de 24 horas, se recuperaron 100 \mul del material sobrenadante del cultivo y se llevó a cabo un ensayo de SEAP. El ensayo se realizó con el equipo de reactivos para el ensayo de indicador - SEAP - (Toyobo) y se midió mediante el analizador de imágenes luminiscentes LAS1000 (Fuji Film). Los valores medidos se indicaban como valores relativos, designando el valor de SeV18+/SEAP como 100. Como resultado, se detectó actividad de SEAP independientemente de la posición en la que se insertó el gen SEAP, indicado en la Figura 48. Se encontró que la actividad de SEAP disminuía hacia aguas abajo del genoma, es decir, disminuía el nivel de expresión. Además, cuando se insertaba el gen SEAP entre los genes NP y P, se detectó un nivel de expresión intermedio, en comparación con cuando se inserta el gen SEAP aguas arriba del gen NP y cuando se insertaba el gen SEAP entre los genes P y M.

Ejemplo 16 Aumento de la eficacia de la propagación de VSe carente, mediante el método de recubrimiento de \DeltaF-HN carente doble

Ya que el método empleado para la de reconstitución del virus VSe, utiliza ahora un virus vaccinia recombinante que expresa ARN-polimerasa de T7 (vTF7-3), una parte de las células infectadas se destruye por la citotoxicidad del virus vaccinia. Además, la propagación vírica sólo es posible en una parte de las células y es preferible si se pudiese realizar la propagación vírica de forma eficaz y persistente en más células. Sin embargo, en el caso de Paramyxovirus, la fusión celular se produce cuando existen al mismo tiempo proteínas F y HN de la misma clase de virus en la superficie celular, provocando la formación del sincitio (Lamb y Kolakofsky, 1996, Fields Virology, pág. 1189). Por lo tanto, fue difícil subcultivar células que coexpresaban FHN. Por lo tanto, los inventores pensaron que la eficacia de la recuperación del virus carente se puede aumentar con el recubrimiento de las células cooperadoras que expresaban la proteína delecionada (F y HN) sobre las células reconstituidas. Examinando las células del recubrimiento con diferentes tiempos de expresión de FHN, la eficacia de la recuperación vírica del virus cocarente estaba muy incrementada.

Las células LLC-MK2 (1 x 10^{7} células/placa) que crecieron hasta una confluencia del 100% en placas de cultivo de 10 cm, con virus vaccinia tratado con PLWUV, con moi = 2, durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, mezclando 12 \mug/placa de 10 cm, 4 \mug/placa de 10 cm, 2 \mug/placa de 10 cm, 4 \mug/placa de 10 cm y 4 \mug/placa de 10 cm de ADNc carente de FHN que comprendía d2EGFP (pSeV18^{+}/\DeltaFHN-d2GFP (Ejemplo 8)), pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L y pGEM/FHN, respectivamente (3 ml/placa de 10 cm como volumen final) y usando el reactivo de introducción de genes SuperFect (QIAGEN), se introdujeron genes en las células LLC-MK2, empleando un método similar al que se describió anteriormente para la reconstitución del virus carente de F. Después de 3 horas, las células se lavaron tres veces con medio sin suero, a continuación se recuperaron las células desprendidas, mediante centrifugación a baja velocidad (1000 rpm/2 min) y se suspendieron en medio MEM exento de suero que contenía 40 \mug/ml de AraC (Sigma) y 7,5 \mug/ml de tripsina (GIBCO) y se añadieron a las células y se cultivaron durante una noche. Las células que coexpresaban FHN preparadas por separado, que eran placas de cultivo de 10 cm confluentes al 100%, se indujeron con adenovirus AxCANCre con moi = 10, y las células se lavaron a las 4 horas, 6 horas, 8 horas, día 2 y día 3, una vez con 5 ml de PBS (-) y se desprendieron mediante solución de disociación celular (Sigma). Las células se recogieron mediante centrifugación a baja velocidad (1000 rpm/2 min) y se suspendieron en medio MEM exento de suero que contenía 40 \mug/ml de AraC (Sigma) y 7,5 \mug/ml de tripsina (GIBCO). A continuación se añadieron a células en las que el virus co-carente de FHN estaba reconstituido (P0) y se cultivaron durante 1 noche. Dos días después del recubrimiento de las células, se observaron las células usando microscopía de fluorescencia para confirmar la diseminación del virus mediante la expresión de GFP dentro de las células. Los resultados se muestran en la Figura 49. Cuando se comparó con el caso convencional (panel izquierdo) sin recubrimiento con células, se observaron claramente que había más células que expresaban GFP cuando se recubrieron las células con las células (derecha). Estas células se recuperaron, se suspendieron con 10^{7} células/ml de medio Opti-MEM (GIBCO) y se congelaron-descongelaron tres veces para preparar un material lisado celular. A continuación, las células que coexpresaban FHN, se infectaron 2 días después de la inducción con el material lisado, con 10^{6} células/100 \mul/pocillo y se cultivaron durante 2 días en medio MEM exento de suero que contenía 40 \mug/ml de AraC (Sigma) y 7,5 \mug/ml de tripsina (GIBCO), a 37ºC en una incubadora con un 5% de CO_{2} y se midió el título vírico del material sobrenadante del cultivo de las células P1, mediante GFP-UIC (Tabla 4). Como resultado no se detectó ningún efecto de amplificación vírica, 4 horas después de la inducción de FHN, y se detectaron efectos notables de la amplificación 6 horas o más, después de la inducción debido al recubrimiento celular. Especialmente, los virus liberados en el material sobrenadante del cultivo de las células P1, eran 10 veces más después de 6 horas, cuando se realizó el recubrimiento celular, comparando con cuando no se realizó el recubrimiento celular.

TABLA 4 Amplificación de VSe carente mediante el método de recubrimiento con células \DeltaF-HN doblemente carentes

5

Ejemplo 17 Confirmación de la posesión de virus Sendai seudotipo con genoma carente de F

Se realizó un análisis con inmunotransferencia de tipo Western de extractos proteicos de células infectadas, para confirmar que el virus que se propagaba mediante la expresión del gen VSV-G, descrito anteriormente, es del tipo carente de F. Como resultado, se detectaron proteínas obtenidas a partir del virus Sendai, mientras que no se detectó proteína F, confirmando que el virus es del tipo carente de F (Figura 50).

Ejemplo 18 Efecto del anticuerpo anti-VSV sobre la infecciosidad del virus Sendai seudotipo que comprende el genoma carente del gen F y HN

Para hallar si el virus Sendai seudotipo que comprende un genoma carente del gen F y HN, que se obtuvo empleando una línea que expresa VSV-G, comprende la proteína VSV-G en su cápsida, se examinó si con la actividad neutralizante se ve afectada la infecciosidad o no, empleando anticuerpo anti-VSV. Se mezcló la solución vírica y el anticuerpo y se dejaron en reposo durante 30 min. a temperatura ambiente. A continuación, se infectaron células LLCG-L1 en las que no se había inducido la expresión de VSV-G con la mezcla y se analizó la capacidad de introducción de genes el día 4 por la existencia de células que expresaban GFP. Como resultado, se observó una inhibición perfecta de la infecciosidad por el anticuerpo anti-VSV en el virus Sendai seudotipo que comprende el genoma carente del gen F y HN (VSV-G en la Figura), mientras que no se detectó inhibición en el virus Sendai que comprendía la cápsida apropiada (F, HN en la Figura) (Figura 51). Por tanto, se mostró que el virus obtenido en el presente ejemplo era el virus Sendai seudotipo que comprende la proteína VSV-B como su cápsida y que su infecciosidad puede inhibirse específicamente con el anticuerpo.

Ejemplo 19 Purificación del virus Sendai seudotipo que comprende genomas carentes del gen F y carente del gen F y HN mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad

Empleando un material sobrenadante del cultivo de células infectadas con el virus, se llevó a cabo una centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, para fraccionar y purificar el virus Sendai seudotipo que comprende genomas carentes del gen F y los genes F y HN. Se añadió solución vírica sobre un solución de sacarosa con un gradiente del 20 al 60%, a continuación se sometió a ultracentrifugación durante 15 a 16 horas a 29.000 rpm, empleando un rotor SW41 (Beckman). Tras la ultracentrifugación, se realizó un orificio en el fondo del tubo, después se recogieron fracciones de 300 \mul empleando un colector de fracciones. Para cada fracción, se llevó a cabo un análisis con inmunotransferencia de tipo Western, para someter a ensayo si el virus es un virus Sendai seudotipo que comprende un genoma carente del gen F o de los genes F y HN, y la proteína VSV-G como cápsida. El análisis con inmunotransferencia de tipo Western se logró mediante el método tal y como se ha descrito anteriormente. Como resultado, en el virus Sendai seudotipo carente de F, se detectaron proteínas obtenidas a partir del virus Sendai, proteína HN y proteína VSV-G en la misma fracción, mientras que no se detectó proteína F, confirmando que es un virus Sendai seudotipo carente de F. Por otro lado, en virus Sendai seudotipo carentes de F y HN, se detectaron proteínas obtenidas a partir del virus Sendai y proteína VSV-G en la misma fracción, mientras que no se detectó proteína F ni HN confirmando que es un virus Sendai seudotipo carente de F y de HN (Figura 52).

Ejemplo 20 Superación de la hemaglutinación mediante virus Sendai seudotipo que comprende genomas carentes del gen F y carentes del gen F y HN

Se infectaron células LLC-MK2 bien con el virus Sendai seudotipo que comprende un genoma carente del gen F o un genoma carente de los genes F y HN, o bien con virus Sendai con cápsida normal, y el día 3, se añadió una suspensión de glóbulos rojos aviares al 1% y se dejó en reposo durante 30 min a 4ºC. A continuación, se observó la superficie celular de las células infectadas que expresaban GFP. Como resultado, en los virus con genoma carente del gen F y en los virus Sendai seudotipo carentes de F (SeV/\DeltaF y SeV/\DeltaF seudotipo (VSV-G) mediante VSV-G), se observó una reacción de aglutinación sobre la superficie de las células infectadas, así como en el virus Sendai con la cápsida original. Por otro lado, no se observó una reacción de aglutinación sobre la superficie de células infectadas con el virus Sendai seudotipo que comprende un genoma carente del gen F y HN (SeV/\DeltaF-HN (VSV-G)) (Figura 53).

Ejemplo 21 Especificidad de la infección del virus Sendai seudotipo VSV-G que comprende un genoma carente del gen F para células en cultivo

Se midió la eficacia de la infección del virus Sendai seudotipo VSV-G que comprende un genoma carente del gen F, para células en cultivo, por el grado de expresión de GFP en células supervivientes, 3 días después de la infección usando citometría de flujo. Se emplearon células LLC-MK2 que mostraban casi la misma eficacia infectiva en virus Sendai seudotipo que comprendía un genoma carente del gen F, que en virus Sendai con cápsida original como testigos para la comparación. Como resultado, no se encontraron diferencias en la eficacia de la infección en células HRA de cáncer de ovario humano, mientras que en células Jurkat de la estirpe de linfocitos T, se observó un aumento de aproximadamente 2 veces en la eficacia de la infección del virus Sendai seudotipo VSV-G que comprendía un genoma carente del gen F, comparado con los testigos (Figura 54).

Ejemplo 22 Construcción del vector del virus Sendai de tipo carente de F, que comprende NGF Reconstitución de NGF/SeV/\DeltaF

Se logró la reconstitución de NGF/SeV/\DeltaF según el "método de recubrimiento con células que expresaban F + plásmido de la envoltura", descrito anteriormente. Se logró la medición del título, mediante un método que usa anticuerpo policlonal anti-VSe.

Confirmación del genoma vírico de NGF/SeV/\DeltaF (RT-PCR)

Para confirmar el genoma vírico de NGF/SeV/\DeltaF (Figura 55, panel superior), se centrifugó el material sobrenadante del cultivo recuperado de las células LLC-MK2/F7 y se extrajo el ARN empleando el miniequipo de reactivos para ARN vírico QIAamp (QIAGEN), según el protocolo del fabricante. Empleando el molde de ARN, se llevó a cabo la síntesis y la PCR de tipo RT-PCR, empleando el sistema de RT-PCR SUPERSCRIPT® ONE-STEP® (GIBCO-BRL).
Como grupos testigo, se empleó ADNc de VSe de tipo adicional (pSeV18^{+} b(+) (Hasan, M. K. y col., J. General Virology 78:2813-2820, 1997). Se emplearon NGF-N y NGF-C como cebadores de la PCR. Para NGF-N, directo: ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAGTAATGTCCATGTTGTTCTACACTCTG (SEQ ID NO: 33) y para NGF-C, inverso: ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGCCTCTTCTTGTAGCCTT
CCTGC (SEQ ID NO: 34). Como resultado, cuando se usaron NGF-N y NGF-C como cebadores, se detectó una banda específica de NGF para NGF/SeV/\DeltaF en condiciones de RT. No se detectó ninguna banda para el grupo testigo (Figura 55, panel inferior).

Ejemplo 23 Cuantificación de la proteína NGF y medición de la actividad in vitro expresada tras la infección de VSe de tipo carente de F que comprende el gen NGF

Se logró la infección y la expresión de la proteína NGF empleando células LLC-MK2 que se hicieron crecer hasta ser casi confluentes sobre placas de cultivo de 10 cm o 6 cm de diámetro. Se infectó con NGF/SeV/\DeltaF y NGF/SeV/\DeltaF-GFP las células LLC-MK2/F y se infectó con NGF/SeV y GFP/SeV las células LLC-MK2 con una moi de 0,01 y se cultivaron durante 3 días en medio MEM sin suero que contiene 7,5 \mug/ml de tripsina (GIBCO). Después de cultivar durante 3 días, en los que se infectaron casi el 100% de las células, se cambió el medio por medio MEM sin tripsina ni suero y se cultivaron durante otros 3 días. A continuación, se recuperó el material sobrenadante del cultivo y se centrifugó a 48.000 x g durante 60 min. Después se llevó a cabo la cuantificación de proteína NGF y se midió la actividad in vitro del material sobrenadante. Aunque en los presentes ejemplos se infectó con VSe de tipo carente de F (NGF/SeV/\DeltaF, NGF/SeV/\DeltaF-GFP) (véase la Figura 55), las células LLC-MK2/F, si se infectaban células con una moi elevada (por ejemplo, de 1 o 3), es decir, se infectan células que son confluentes hasta casi el 100% desde el comienzo, se pueden realizar experimentos que dan resultados similares empleando células que no expresaban F.

Para la cuantificación de la proteína NGF, se empleó el sistema de inmunoensayo Emax de NGF con el equipo de reactivos de ELISA (Promega) y el protocolo adjunto. Se detectaron 32,4 \mug/ml, 37,4 \mug/ml y 10,5 \mug/ml de proteína NGF en el material sobrenadante del cultivo de células infectadas con NGF/SeV/\DeltaF, NGF/SeV/\DeltaF-GFP y NGF/SeV, respectivamente. En el material sobrenadante del cultivo de células infectadas con NGF/SeV/\DeltaF y NGF/SeV/\DeltaF-GFP, existe una alta concentración de proteína NGF similar al material sobrenadante del cultivo de células infectadas con SeV/NGF, confirmando que el VSe del tipo carente de F, expresa suficiente NGF.

La medición de la actividad in vitro de la proteína NGF, se logró empleando un cultivo disociado de ganglio primario de la raíz dorsal de pollo (DRG; una neurona sensitiva de pollo), empleando la actividad de supervivencia como índice (Nerve Growth Factors (Wiley, Nueva York), págs. 95-109 (1989)). Se extirpó el ganglio de la raíz dorsal de embriones de pollo de 10 días y se dispersó tras un tratamiento con tripsina al 0,25% (GIBCO), a 37ºC durante 20 min. Empleando medio D-MEM con alto contenido en glucosa, que contenía 100 unidades/ml de penicilina (GIBCO), 100 unidades/ml de estreptomicina (GIBCO), anfotericina B 250 ng/ml (GIBCO), 2-desoxiuridina 20 \muM (Nakarai), 5-fluorodesoxiuridina 20 \muM (Nakarai), L-glutamina 2 mM (Sigma) y un 5% de suero, se sembraron las células sobre placas de 96 pocillos, con aproximadamente 5.000 células/pocillo. Se recubrieron adicionalmente placas de 96 pocillos recubiertas previamente con polilisina (Iwaki) con laminina (Sigma) antes de su uso. En el punto de inicio, se añadió proteína NGF testigo o material sobrenadante del cultivo, preparado previamente tras la infección con VSe. Después de 3 días, se observaron las células con un microscopio así como realizando una cuantificación de las células supervivientes añadiendo azul de Alamer (CosmoBio) y usando la actividad de reducción por mitocondrias como índice (midiendo la fluorescencia a 590 nm con excitación a 530 nm). Se obtuvieron señales de fluorescencia equivalentes en el testigo (sin adición de NGF) y cuando se añadió material sobrenadante del cultivo diluido 1/1000 células infectadas con VSe/GFP de tipo adicional (GFP/SeV), mientras que la adición de material sobrenadante del cultivo diluido 1/1000 de células infectadas con (NGF/SeV/\DeltaF, NGF/SeV/\DeltaF-GFP y NGF/SeV, provocó un aumento notable de la intensidad de la fluorescencia y se consideró que comprendía un alto número de células supervivientes y actividad de supervivencia (Figura 56). El valor del efecto fue comparable a la adición de la cantidad de proteína NGF calculada a partir del ELISA. La observación con un microscopio mostró un efecto similar. Concretamente, añadiendo material sobrenadante del cultivo de las células infectadas con NGF/SeV/\DeltaF, NGF/SeV/\DeltaF-GFP y NGF/SeV, se observó un aumento en las células supervivientes y un alargamiento notable de los axones (Figura 57). Por tanto, se confirmó que NGF expresada después de la infección de VSe de tipo carente de F que comprende NGF, es una forma activa.

Ejemplo 24 Análisis detallado de las células que expresan F 1. moi y transcurso de tiempo de la inducción de Adeno-Cre

Empleando una moi diferente de Adeno-Cre, se infectaron células LLC-MK2/F y después de la inducción de la proteína F, se analizó la cantidad de expresión de la proteína y el cambio en la forma celular.

El nivel de expresión fue ligeramente superior con moi = 10, comparado con moi = 1 (Figura 58). Cuando se analizaron las cantidades de expresión en los puntos de tiempo de 6 h, 12 h, 24 h y 48 h tras la inducción, se detectó un alto nivel de expresión de la proteína F, 48 h después de la inducción en todos los casos.

Además, se monitorizaron los cambios en la forma celular en el transcurso del tiempo, a medida que se infectaban las células con moi = 1, 3, 10, 30, y 100. Aunque se encontró una diferencia notable hasta moi = 10, se observó citotoxicidad para moi = 30 o superior (Figura 59).

2. Número de pases

Después de inducir la proteína F en las células LLC-MK2/F, empleando Adeno-Cre, las células se sometieron a 7 pases y se analizó el nivel de expresión de la proteína F y la morfología de las células con una observación microscópica. Por otro lado, se usó microscopía láser para el análisis de la ubicación intracelular de la proteína F después de la inducción de proteína F en las células que se sometieron a pases hasta la 20ª generación.

Para la observación con microscopía láser, las células LLC-MK2/F con expresión de la proteína F inducida, se colocaron en el vidrio de la cámara y, tras un cultivo durante una noche, se retiró el medio y se lavaron una vez con PBS, a continuación se fijaron con formalina-PBS al 3,7% durante 5 min. Después de lavar las células una vez con PBS, se trataron con Triton X100-PBS al 0,1% durante 5 min. y se trataron con anticuerpo monoclonal anti-proteína F (\gamma-236) (dilución 1/100) y anticuerpo IgG de cabra anti-conejo, marcado con FITC (dilución 1/200) en este orden, y finalmente se lavaron con PBS y se observaron con un microscopio láser.

Como resultado, no se encontró ninguna diferencia en los niveles de expresión de la proteína F, en las células que se sometieron hasta 7 pases (Figura 60). No se observó ninguna diferencia notable en el cambio morfológico, la infecciosidad de VSe ni la productividad. Por otro lado, cuando se analizaron células que se habían sometido hasta 20 pases, para determinar la ubicación intracelular de la proteína F usando el método de inmunoanticuerpo, no se encontró ninguna gran diferencia hasta los 15 pases pero se observó una tendencia de la ubicación de la proteína F en las células que se habían sometido a más de 15 pases (Figura 61).

Tomado en conjunto, se considera que las células antes de los 15 pases son deseables para la producción de VSe carente de F.

Ejemplo 25 Correlación entre GFP-UIC y anti-VSe-UIC

Se analizó la correlación de los resultados de la medición de las unidades infecciosas celulares (UIC) mediante dos métodos. Se sembraron células LLC-MK2 sobre una placa de 12 pocillos con 2 x 10^{5} células/placa y después de cultivar durante 24 horas, las células se lavaron una vez con medio MEM sin suero y se infectaron con 100 \mul/pocillo de SeV/\DeltaF-GFP. Después de 15 minutos, se añadió 1 ml/pocillo de medio MEM exento de suero y se cultivó durante otras 24 horas. Después del cultivo, las células se lavaron tres veces con PBS (-) y se secaron (se dejaron en reposo durante aproximadamente 10 a 15 min a temperatura ambiente) y se añadió 1 ml/pocillo de acetona para fijar las células y se eliminó inmediatamente. Las células se secaron de nuevo (se dejaron en reposo durante aproximadamente 10 a 15 min. a temperatura ambiente). A continuación, se añadieron 300 \mul/pocillo de anticuerpo policlonal anti-VSe (DN-1) preparado a partir de conejos y diluido 1/100 con PBS (-), a las células y se incubaron a 37ºC durante 45 min. y se lavaron tres veces con PBS (-). A continuación, se añadió a las células 300 \mul/pocillo de anticuerpo secundario marcado con fluorescencia IgG anti-conejo (H + D) (Alex® 568, Molecular Probes), diluido 1/200 con PBS (-) y se incubaron a 37ºC durante 45 min. y se lavaron tres veces con PBS (-). Posteriormente, se observaron las células con fluorescencia con un microscopio de fluorescencia (emisión: 560 m, absorción: 645 nm, filtros: Leica).

Como testigo, se infectaron células con 100 \mul/pocillo de SeV/\DeltaF-GFP y después de 15 min. se añadió 1 ml/pocillo de MEM sin suero. Después de cultivar durante otras 24 horas, se observaron células que expresaban GFP con microscopía de fluorescencia (emisión: 360 nm, absorción: 470 nm, filtros: Leica) sin manipulaciones adicionales.

Se obtuvo una buena correlación evaluando la intensidad de la fluorescencia mediante cuantificación (Figura 62).

Ejemplo 26 Construcción del sitio de clonación múltiple

Se añadió un sitio de clonación múltiple al vector de VSe. Los dos métodos empleados se enumeran a continuación.

1. Se interrumpieron varios sitios de restricción en el ADNc genómico de longitud completa del virus Sendai (VSe) y el ADNc genómico de pSeV18^{+}, y se introdujo otro sitio de restricción que comprendía el sitio de restricción interrumpido entre la señal de inicio y la señal de iniciación de la traducción ATG de cada gen.

2. En el ADNc del vector de VSe ya construido, se añadió una secuencia del sitio de clonación múltiple y una señal de iniciación de la transcripción -secuencia intercalada- señal de terminación y se incorporaron en el sitio NotI.

En el caso del método 1, como método de introducción, se separó un fragmento digerido con EagI (2644 pb), un fragmento digerido con ClaI (3246 pb), un fragmento digerido con ClaI/EcoRI (5146 pb) y un fragmento digerido con EcoRI (5010 pb) de pSeV18^{+}, mediante electroforesis en gel de agarosa y las bandas se cortaron correspondientes, a continuación el fragmento se recuperó y se purificó mediante el sistema de extracción en gel QIAEXII (QIAGEN). El fragmento digerido con EagI se ligó y se subclonó en LITMUS38 (NEW ENGLAND BIOLABS) y se ligó el fragmento digerido con ClaI, el fragmento digerido con ClaI/EcoRI y el fragmento digerido con EcoRI y se subclonaron en pBluescriptII KS+ (STRATAGENE). Se empleó el equipo de reactivos para mutagénesis dirigida al sitio Quickchange (STRATAGENE) para la interrupción y la introducción sucesivas de sitios de restricción.

Para la interrupción de los sitios de restricción SalI se sintetizaron: (cadena codificadora) 5'-ggagaagtctcaacaccgtc
cacccaagataatcgatcag-3' (SEQ ID NO: 35), (cadena no codificante) 5'-ctgatcgattatcttgggtggacggtgttgagacttctcc-3' (SEQ ID NO: 36), NheI: (cadena codificadora) 5'-gtatatgtgttcagttgagcttgctgtcggtctaaggc-3' (SEQ ID NO: 37), (cadena no codificante) 5'-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3' (SEQ ID NO: 38), XhoI: (cadena codificadora) 5'-caatgaactctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3' (SEQ ID NO: 39) (cadena no codificante) 5'-ccaggtaactctttagt
gactccagcctctctagagagttcattg-3' (SEQ ID NO: 40) y para la introducción de sitios de restricción, NP-P: (cadena codificadora) 5'-gtgaaagttcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccaccg-3' (SEQ ID NO: 41) (cadena no codificante) 5'-cggtggggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3' (SEQ ID NO: 42), P-M: (cadena codificadora) 5'-cttaggg
tgaaagaaatttcagctagcacggcgcaatggcagatatc-3' (SEQ ID NO: 43), (cadena no codificante) 5'-gatatctgccattgcgccgtgc
tagctgaaatttctttcaccctaag-3' (SEQ ID NO: 44), M-F: (cadena codificadora) 5'-cttagggataaagtcccttgtgcgcgcttggttgcaaa
actctcccc-3' (SEQ ID NO: 45), (cadena no codificante)5'-ggggagagttttgcaaccaagcgcgcacaagggactttatccctaag-3' (SEQ ID NO: 46), F-HN: (cadena codificadora) 5'-ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaagcacagatcatgg-3' (SEQ ID NO: 47) (cadena no codificante) 5'-ccatgatctgtgcttgtttgaggtgtcgactaaagtaccgcgcgacc-3' (SEQ ID NO:48), HN-L: (cadena codificadora) 5'-cccagggtgaatgggaagggccggccaggtcatggatgggcaggagtcc-3' (SEQ ID NO: 49), (cadena no codificante) 5'- ggactcctgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3' (SEQ ID NO: 50), y se usaron para la reacción. Tras la introducción, se recuperó cada fragmento y se purificó de manera similar a tal y como se describió anteriormente, y se ensambló el ADNc.

En el caso del método 2, se sintetizaron (cadena codificadora) 5'-ggccgcttaattaacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataa
gaaaaacttagggtgaaagttcatcac-3' (SEQ ID NO: 51), (cadena no codificante) 5'-ggccgtgatgaactttcaccctaagtttttcttatcaa
cactgttggcgcgcgtttaaaccgttaattaagc-3' (SEQ ID NO: 52) y tras la fosforilación, se hibridaron a 85ºC durante 2 min, 65ºC durante 15 min, 37ºC durante 15 min y temperatura ambiente durante 15 min para incorporarse en el ADNc de VSe. Alternativamente, se subclonaron los sitios de clonación múltiple de pUC18 o pBluescriptII o similares, mediante PCR, empleando cebadores que comprendían la señal de terminación - secuencia intercalada - señal de iniciación y a continuación se incorporó el resultante en ADNc de VSe. La reconstitución vírica mediante el ADNc resultante puede realizarse tal y como se describió anteriormente.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un RNP obtenido a partir del virus Paramyxoviridae que carece al menos de un gen de la envoltura y su uso como vector. En una realización preferida, se proporcionan los vectores que comprenden un complejo de RNP y un compuesto catiónico. Aplicando la presente invención, se pueden evitar los problemas de la antigenicidad y de la citotoxicidad cuando se introducen los vectores en las células diana.

<110> DNAVEC Research Inc.

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<120> RNP derivado de paramixovirus

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<130> D3-102PCT

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<140>

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<141>

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<150> JP 1999-200740

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<151> 18-05-1999

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<160> 52

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<400> 1

6

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<210> 2

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<211> 18

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 3

8

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<210> 4

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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9

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 5

10

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<210> 6

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<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 6

11

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<210> 7

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 7

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 21

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<210> 11

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<210> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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28

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<210> 24

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<220>

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<210> 29

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<400> 29

34

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<210> 30

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

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<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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36

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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39

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<211> 72

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<212> ADN

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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41

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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43

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<400> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<212> ADN

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<212> ADN

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<210> 44

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<212> ADN

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia sintetizada artificialmente

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<212> ADN

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<400> 50

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<210> 51

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<211> 72

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<400> 52

58

Claims (10)

1. Un complejo que comprende (a) un ARN monocatenario de cadena negativa obtenido a partir de un virus de la familia Paramyxoviridae, en donde dicho ARN se modifica de modo que no exprese al menos una de las proteínas de la envoltura de los virus Paramyxoviridae, y (b) una proteína codificada por dicho ARN monocatenario de cadena negativa que se une al mismo, y en donde el complejo es incapaz de liberar partículas víricas infecciosas.

2. El complejo según la reivindicación 1, en donde al menos uno de los genes que codifica las proteínas de la envoltura ha sido delecionado en dicho ARN.

3. El complejo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho ARN monocatenario de cadena negativa se modifica de modo que exprese las proteínas NP, P y L, pero no exprese las proteínas F, HN o M o cualquier combinación de las mismas.

4. El complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho ARN monocatenario de cadena negativa se obtiene a partir del virus Sendai.

5. El complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho ARN monocatenario de cadena negativa codifica adicionalmente un gen foráneo.

6. Una composición para la transferencia génica, que comprende un complejo según la reivindicación 5 y un lípido catiónico.

7. Una composición para la transferencia génica, que comprende un complejo según la reivindicación 5 y un polímero catiónico.

8. Un método in vitro para expresar un gen foráneo en una célula, que comprende la etapa de introducir la composición para la transferencia génica según la reivindicación 6 ó 7 en una célula, con la condición de que la identidad de la línea germinal de los seres humanos no se modifique.

9. Uso del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para preparar una composición para la transferencia génica, en donde la composición comprende un reactivo para la transfección.

10. Uso según la reivindicación 9, en donde el reactivo para la transfección es un lípido catiónico o un polímero catiónico.